Mycobacterium 属細菌が有するユニークな酸化酵素の機能解析と応用
早稲田大学理工学術院

古屋 俊樹

1. はじめにフェノールのパラ位にヒドロキシル基が結合したヒドロキノンは樹脂重合抑止剤等として有用な化合物であるが、現行の化学合成法の多くはオルト位にヒドロキシル基が結合したカテコールを副生してしまう。そこで(株)日本触媒の仙波らは生体触媒に着目し、フェノールからヒドロキノンを位置選択的に合成可能な微生物のスクリーニングを実施した。その結果、自然界から取得した
Mycobacterium goodii 12523 に当該活性を見出し、さらに本株の培養菌体を触媒としてグラムスケールでのヒドロキノン生産を達成している（1）。
このようにフェノールをヒドロキノンに変換する M. goodii 12523 は実用的に有望な微生物であるが、学術的にも興味深い性質を有している。当該活性はアセトン存在下において強く誘導されるが、本株はフェノールを分解して資化することはできず、当該酵素の生理機能については興味が持たれるところである。本研究では、M. goodii 12523 および近縁の Mycobacterium smegmatis mc2155が有するフェノールのパラ位選択的酸化に関わる酵素を遺伝子レベルで解析した。さらに、当該酵素の詳細な機能解明と生体触媒としての実用に向けて異種細胞内での活性発現を試みた。

2. フェノールのパラ位選択的酸化に関わる酵素遺伝子の同定
M. goodii 12523 のフェノールに対する酸化活性はアセトンにより誘導されることに着目して、二次元電気泳動によりアセトン存在下においてのみ発現するタンパク質を解析した。その結果、アセトン依存的に発現するタンパク質がいくつか検出され、そのうちの 1 つはゲノム配列が解読されている M. smegmatis mc2155 のオープンリーディングフレーム（ORF）Msmeg_1971 と N 末端アミノ酸配列が一致した。Msmeg_1971 は機能未知の ORF だが、Msmeg_1971、Msmeg_1972、Msmeg_1973、Msmeg_1974に相当する遺伝子はゲノム配列上で二核鉄型モノオキシゲナーゼ遺伝子クラスターを構成していることが推定されたため、本遺伝子クラスターがフェノールに対する酸化活性に関与しているのではないかと予想した。M. smegmatis mc2155 の特性を確認したところ、本株もフェノールに対する酸化活性を有していた。そこで、M. smegmatis mc2155 から本遺伝子クラスターを、また M. goodii 12523からそのホモログ遺伝子クラスターをクローニングし、それぞれ mimABCDsm（Msmeg_1971～1974 に相当）、mimABCDgo と命名した（図 1）。mimABCDsm と mimABCDgo の各コンポーネントはアミノ酸配列で 93～96％の相同性を示した。
つぎに、mimABCD がフェノールのヒドロキノンへの変換活性に関与していることを検証した。形質転換系の確立されている M. smegmatis mc2155 において、本株の mimAsm を破壊したところフェノールに対する酸化活性は消失した。さらに、この mimAsm 破壊株に mimAsm もしくは mimAgo を導入したところ、酸化活性は回復した。これより、mimABCD がフェノールのパラ位選択的酸化酵素をコードしていることが明らかとなった。また興味深いことに、M. goodii 12523 と M. smegmatis mc2155 はアセトンやプロパンを炭素源として資化することができるが、mimAsm 破壊株はこれらの資化性を失っており、mimAsm もしくは mimAgo を相補することで、その資化性は回復した。これより mimABCD は、これらの Mycobacterium 属細菌がアセトンやプロパンを資化するうえで重要な役割を担っていることが示唆された(2)。

3. mimABCD 遺伝子の転写活性化因子の同定
M. goodii 12523 および M. smegmatis mc2155 のフェノールに対する酸化活性のアセトン誘導機構を遺伝子レベルで解析した。M. smegmatis mc2155 のゲノム配列上において mimAsm（Msmeg_1971）の上流に存在する ORF Msmeg_1970 は NtrC ファミリーの転写活性化因子と相同性を示すため、本 ORFに相当する遺伝子（mimRsm と命名）が mimABCDsm のアセトン誘導発現に関与しているのではないかと

O
H3C C CH3

MimR

RNA polymerase

AcetoneSigma factor

mimD(Msmeg_1974)

mimR

mimA

mimB

mimC

mimG

(Msmeg_1970)(Msmeg_1971)(Msmeg_1972)(Msmeg_1973)(Msmeg_1978)

Transcription

MimG
Translation
MimABCD

MimA: oxygenase large subunit
MimB: reductase
MimC: oxygenase small subunit
MimD: coupling protein
MimR: transcriptional activator

HOHO

PhenolO
H3C C CH3

MimG: chaperonin-like protein

AcetoneOH

Hydroquinone

図1O

H2C C CH3OH

mimABCD 遺伝子クラスター?

および関連遺伝子と活性発現機構

Acetol予想した（図 1）。そこで、mimAsm のプロモーター領域を GFP 遺伝子に連結してレポータープラスミドを構築し、MimRsm およびアセトンに対する応答性を評価した。その結果、構築したプラスミドを
M. smegmatis mc2155 に導入した場合にはアセトン存在下においてのみ GFP による蛍光が検出されたが、mimRsm 破壊株に導入した場合にはアセトンの有無に関わらず蛍光は検出されなかった。M. goodii
12523 にも M. smegmatis mc2155 と同様、mimRsm および mimAsm プロモーター領域と相同の配列が存在し、アセトンで誘導発現されることを確認した。これより、MimR はアセトン存在下において mimABCDの転写を活性化することが強く支持された。また、フェノールやヒドロキノンでは転写が進まないことも確認した。このことからも、MimABCD は本来アセトン関連化合物の酸化反応を触媒し、フェノールのパラ位選択的酸化活性も偶発的に有していることが強く示唆された。NtrC ファミリーの転写活性化因子はグラム陰性菌やバチルス属細菌の窒素代謝や芳香族化合物分解等において報告されているが、放線菌では初めての報告である(3)。

4. mimABCD 遺伝子の異種発現大腸菌を宿主として mimABCD の異種発現を試みたが、SDS-PAGE 分析において MimBCD は発現が確認されず、MimA は不溶化しており、結果としてフェノールに対する酸化活性を検出することはできなかった。そこで近縁の Rhodococcus 属細菌を宿主として異種発現を試みた。方法としては、mimABCDgoおよび mimABCDsm を pTip ベクター（産総研、田村具博教授より分譲）に連結し、R. opacus B-4（大阪大学、大竹久夫教授、本田孝祐准教授より分譲）に導入した。しかしながら、本発現系においても活性を検出することはできなかった。他に必要な因子の存在を考慮して M. smegmatis mc2155 のゲノム配列を精査したところ、mimABCDsm の下流に存在する ORF Msmeg_1978 がシャペロニン様タンパク質と相同性を示すことを突き止めた（図 1）。そこで本 ORF に相当する遺伝子（mimGsm と命名）をクローニング後、mimABCDgo および mimABCDsm と R. opacus B-4 内で共発現させて活性を評価した。
その結果、MimGsm を共存させることにより MimABCD のフェノールに対する酸化活性を発現させることに成功した（未発表）。現在、異種発現株を利用して MimABCD および MimGsm の詳細な機能解析および生体触媒への応用研究を実施中である。

本研究の遂行においてご教示いただいた木野邦器教授（早稲田大学）、仙波尚博士（(株)日本触媒）、および研究に携わられた方々に感謝申し上げます。また、異種発現の研究でご協力いただいた大竹久夫教授、本田孝祐准教授（大阪大学）、田村具博教授（産総研）に御礼申し上げます。

参考文献
1. H. Semba, M. Mukouyama, K. Sakano, Appl. Microbiol. Biotechnol., 46, 432-437 (1996).
2. T. Furuya, S. Hirose, H. Osanai, H. Semba, K. Kino, Appl. Environ. Microbiol., 77, 1214-1220(2011).
3. T. Furuya, S. Hirose, H. Semba, K. Kino, J. Bacteriol., 193, 5817-5823 (2011).