認定宿主ベクター系

ロドコッカス属細菌発現ベクター

pTip, pNit, pCpi Vector シリーズ
pTip シリーズ（製品コード：RE-0001 ～ RE-0008）
pNit シリーズ（製品コード：RE-0009 ～ RE-0016）
pCpi シリーズ（製品コード：RE-0017 ～ RE-0024）※ 本製品は国立研究開発法人産業技術総合研究所よりライセンスを受け、北海道システム・サイエンス株式会社が製造・販売しています。

1．製品説明発現を制御するチオストレプトン誘導型プロモーター（pTip）、中程度の発現（pNit）、高発現（pCpi）の構成型プロモーターと、異なる複製開始起点 (θ-type、rolling circle-type) をもつベクターとの組み合わせで、発現レベルの制御から共発現系まで多様な実験系をカバーすることが可能です。導入タンパク質の発現実験を行う際には、Rhodococcus erythropolis L88 Competent Cells（ 製品コード：RE-L88）を宿主としてご利用頂けます。R. erythropolis L88 株は 4℃から 30℃で生育を示し、４℃という低温条件下で外来遺伝子のコードするタンパク質を発現産生させることが可能です。それに伴い、中高温で発現させると「宿主細胞にとって致死性があるタンパク質」、「宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質」および「封入体を形成し凝集するタンパク質」など、大腸菌では発現させることが困難であった組換えタンパク質の発現が期待できます。R. erythropolis L88 株の形質転換効率は 1×104 colonies/μg 以上であり、高い形質転換効率を示します。本製品はシャトルベクターであり、クローニングやコンストラクトの際には大腸菌を宿主として使用することができます。大腸菌を宿主とした場合、高コピーベクター（コピー数：300-500）として機能します。また、抗生物質耐性はアンピシリン (50 μg/ml) となります。pTip Vector シリーズはチオストレプトン誘導型プロモーターを有しており、チオストレプトン添加により濃度依存的に発現誘導を行うことが可能です。培養温度 28℃における誘導条件として、OD600 が 0.6 ～ 0.8 の培養液（pTip ベクター導入シングルコロニー由来）に、終濃度 0.1 ～ 0.2 μg/ml のチオストレプトンを添加し、16 時間の振盪培養を行うことで多くの場合は誘導遺伝子産物の最大細胞内蓄積量を得ることができます。さらに、両末端（あるいはそのいずれか一方）にヒスチジンタグが付加できるベクター構造となっているため、汎用カラムによる簡易精製にて、目的タンパク質を容易に精製することができます。

2．製品内容
容量：

10 μg

溶媒：

T10E1

体積：

100 μl

保存：

-20℃

濃度：

100 ng/μl

3．ベクターマップ
Replication origin
theta or rolling circle(for R. erythropolis)

Promoter (tipA)

MCS

type 1 or type 2thior(for R. erythropolis)
Selection marker
tetr or chmr
(for R. erythropolis)

Replication origin
theta or rolling circle(for R. erythropolis)

BsrGIPromoter(nit or cpi)

pTip series(8.2 – 8.5 kbp)

MCS

type 1 or type 2ori(for E. coli amplification)

tipA(for R. erythropolis)
ampr(for E. coli selection)

Selection marker
tetr or chmr
(for R. erythropolis)

pNit, pCpi series(5.9 – 6.2 kbp)

ori(for E. coli amplification)

ampr(for E. coli selection)

4．マルチクローニングサイト
MCS type 1
His-tag

NcoI

NdeI

EcoRI

SnaBI

NotI

BamHI

CC ATG GGC CAC CAT CAC CAT CAC CAT ATG GGA ATT CTA CGT AGC GGC CGC GGAMGHHH
H HH MGIL RS
GR
GHindIII

BglII

His-tag

XhoI

TCC AAG CTT AGA TCT CTC GAG CAT CAC CAT CAC CAT CAC TGA*SKLRSLEH H
H H
H H

MCS type 2NdeI

His-tag

NcoIEcoRI

SnaBI NotIBamHI

CAT ATG GGC CAT CAC CAT CAC CAT CAC GCC ATG GGA ATT CTA CGT AGC GGC CGC GGAM
GH HHHH HA M
GILRSGR
GHindIII

BglII

His-tag

XhoI

TCC AAG CTT AGA TCT CTC GAG CAT CAC CAT CAC CAT CAC TGA*SKLRSLEH H
HH
H
H

5．取り扱いベクターラインナップ
pTip Vector series
Name

Promoter

Selection

Replication

MCS

Size (bp)

Accession

Product code

pTipQT1

tipA (inducible)

tetracycline

theta type

type1

8207

AB127592.1

RE-0001

pTipQT2

tipA (inducible)

tetracycline

theta type

type2

8211

AB127593.1

RE-0002

pTipRT1

tipA (inducible)

tetracycline

rolling circle

type1

8275

AB127596.1

RE-0003

pTipRT2

tipA (inducible)

tetracycline

rolling circle

type2

8279

AB127597.1

RE-0004

pTipQC1

tipA (inducible)

chloramphenicoltheta type

type1

8343

AB127590.1

RE-0005

pTipQC2

tipA (inducible)

chloramphenicoltheta type

type2

8388

AB127591.1

RE-0006

pTipRC1

tipA (inducible)

chloramphenicolrolling circle

type1

8452

AB127594.1

RE-0007

pTipRC2

tipA (inducible)

chloramphenicolrolling circle

type2

8456

AB127595.1

RE-0008

Name

Promoter

Selection

Replication

MCS

Size (bp)

Accession

Product code

pNitQT1

nit(constitutive)

tetracycline

theta type

type1

5984

AB127600.1

RE-0009

pNitQT2

nit(constitutive)

tetracycline

theta type

type2

5988

AB127601.1

RE-0010pNitRT1

nit(constitutive)

tetracyclinerolling circle

type1

6058

AB127604.1

RE-0011

pNitRT2nit(constitutive)

tetracycline

rolling circle

type2

6062

AB127605.1

RE-0012

pNitQC1nit(constitutive)

chloramphenicoltheta type

type1

6153

AB127598.1

RE-0013

pNitQC2nit(constitutive)

chloramphenicoltheta type

type2

6157

AB127599.1

RE-0014

pNitRC1nit(constitutive)

chloramphenicolrolling circle

type1

6227

AB127602.1

RE-0015

pNitRC2nit(constitutive)

chloramphenicolrolling circle

type2

6231

AB127603.1

RE-0016

Name

Promoter

Selection

Replication

MCS

Size (bp)

Accession

Product code

pCpiQT1

Cpi(constitutive)

tetracycline

theta type

type1

5923

-

RE-0017

pCpiQT2

Cpi(constitutive)

tetracycline

theta type

type2

5926

-RE-0018

pCpiRT1

Cpi(constitutive)

tetracycline

rolling circle

type1

5997

-RE-0019

pCpiRT2

Cpi(constitutive)

tetracycline

rolling circle

type2

6000

-

RE-0020

pCpiQC1

Cpi(constitutive)

chloramphenicoltheta type

type1

6092

-

RE-0021

pCpiQC2

Cpi(constitutive)

chloramphenicoltheta type

type2

6095

-RE-0022

pCpiRC1

Cpi(constitutive)

chloramphenicolrolling circle

type16166-RE-0023

pCpiRC2

Cpi(constitutive)

chloramphenicolrolling circle

type26169-RE-0024

pNit Vector series

pCpi Vector series

6．操作手順（R. erythropolis L88 株を宿主とした場合）
pTip Vector シリーズを用いた組換えタンパク質の誘導方法<seed 培養 >1．発現ベクター導入シングルコロニーを適当な抗生剤を含む LB 培地に植菌
抗生剤終濃度 ： ・テトラサイクリン 5 μg/ml

・クロラムフェニコール 20 μg/ml

2．28℃にて定常期に入るまで振盪培養（通常 2 ～ 3 日）
< 本培養 >
1．よく懸濁した seed 培養液 1 mL を 9 mL の新たな LB 培地に植菌※ R. erythropolis L88 株は培養中に凝集しやすいため、バッフル付きフラスコを用いることが望ましい
2．OD600 が 0.6 ～ 0.8 に達するまで 28℃にて振盪培養
3．終濃度 0.1 ～ 0.2 µg/mL となるようにチオストレプトンを添加※チオストレプトンストック溶液の作成
DMSO に 10 mg/mL チオストレプトンを溶解し、-20℃で保存
4．28℃にて 16 時間の振盪培養を継続
pNit, pCpi Vector シリーズを用いた組換えタンパク質の誘導方法<seed 培養 >1．発現ベクター導入シングルコロニーを適当な抗生剤を含む LB 培地に植菌
抗生剤終濃度 : ・テトラサイクリン 5 μg/ml・クロラムフェニコール 20 μg/ml
2．28℃にて定常期に入るまで振盪培養（通常 2 ～ 3 日）
< 本培養 >
1．よく懸濁した seed 培養液 1 mL を 9 mL の新たな LB 培地に植菌※ R. erythropolis L88 株は培養中に凝集しやすいため、バッフル付きフラスコを用いることが望ましい
2．28℃にて 24 ～ 48 時間の振盪培養細胞破砕方法
1．培養にて得られた 10 mL の培養液を 4℃, 3000 x g にて 10 分間遠心
2．上清を捨て菌体ペレットを回収※回収後、凍結融解操作を実施することで溶菌効率が向上する

3．1 mL のリン酸バッファー（pH8.0）に懸濁
4．終濃度 1 mg/mL 以上となるようにリゾチームを添加※ リゾチーム濃度が高いほど溶菌効率が向上する
5．氷上で 1 時間放置
6．超音波法やガラスビーズ法により細胞を破砕※時間・出力等は機種に依存※試料温度が高くならないように注意する
7．4℃, 20,000 x g にて遠心し、上清を細胞破砕液として回収
使用上の注意項目
・R. erythropolis L88 株の形質転換効率は一般的な大腸菌と比べて低いことから、ベクター構築等のクローニング用ホストとして使用することができません。ベクター構築の際は、大腸菌を宿主として発現ベクターを構築し、精製したプラスミドを R. erythropolis L88 株に導入されることを推奨致します。
・本製品は宿主とする大腸菌株によってはプラスミドが不安定になる場合がございます。推奨株は、DH5αおよびXL1-blue となります。
・大腸菌を宿主とした場合、抗生物質耐性はアンピシリン (50 μg/ml) となります。
・上記培養及び細胞破砕方法は一例であり、組換えタンパク質の必要量に応じて適宜培養スケールを増減させることが可能です。
・共発現系を構築する際には、複製開始起点の異なるベクターを 2 種同時に形質転換せず 1 種ずつ細胞に導入することを推奨します。

7．参考文献
1)

Nakashima and Tamura. "A novel system for expressing recombinant proteins over a wide temperature range from 4 to 35 ℃."

2)

田村具博 , 田村範子 . "Rhodococcus 属細菌を利用した宿主 - ベクター系の開発 ( 特集総説 Rhodococcus のバイオロジーとBiotechnology and bioengineering 86.2 (2004): 136-148.
バイオテクノロジー )." 環境バイオテクノロジー学会誌 7.1 (2007): 3-10.
3)Nakashima and Tamura. "Isolation and characterization of a rolling-circle-type plasmid from Rhodococcus erythropolis andapplication of the plasmid to multiple-recombinant-protein expression." Applied and environmental microbiology 70.9 (2004):5557-5568.

4)

Kagawa et al. "Identiﬁcation of a methanol-inducible promoter from Rhodococcus erythropolis PR4 and its use as an expression
vector." Journal of bioscience and bioengineering 113.5 (2012): 596-603.

8．注意点
・本製品の再販、改変、商用製品の製造をすることは禁止させて頂きます。
・弊社の許可なく、本製品を第三者に譲渡することは禁止させて頂きます。
・基礎研究用途以外の目的で本製品のご利用はおやめください。
・ ご注文に際しまして、別途「ライセンス同意書」をご提出頂く必要がございます。

9．関連製品・Rhodococcus erythropolis L88 Competent Cells ( 製品コード：RE-L88)〒001-0932 札幌市北区新川西2条1丁目2－1
0120-613-190
TEL:011-768-5901 FAX:011-768-5951
Email:goods@hssnet.co.jp
URL:http://www.hssnet.co.jp

R-150528-01