ＤＮＡによる雌雄判別の確立
４年Ｂ組 米田 江里奈
４年Ａ組 吉田 彩乃
指導教諭 櫻井 昭

１．要約
私たちは、ピスタチオの DNA による雌雄判別に向けて、研究を行っている。そこで、すでに確立されているイチョウの雌雄判別方法を、ピスタチオへ応用できないかと考えた。
そのため、昨年はピスタチオからの DNA 抽出にむけ、まず、イチョウから DNA の抽出を試み、DNA の抽出を安定的にできるようになった。今年は、DNA の判別に必要である PCR法、電気泳動法の確立に向け、実験を進めていった。
キーワード

ピスタチオ、アスパラガス、PCR 法、DNA、抽出

２．研究の背景と目的にすることができた。今年は、DNA からのピスタチオは、雌雄異株であり、実をつ雌雄判別に必要な PCR 法と電気泳動法のけるためにはどちらの木も必要となる。ま

確立を目標に、実験を行うことにした。そた成長が遅く、実をつけるまで成長するのこで、論文検索を再度行ったが、イチョウに約 10 年かかり、成木となるのに約 20 年の雌雄判別法の詳細を見つけることができかかると言われている。つまり、実をつけなかった。しかし、DNA によるアスパラガてから、雄株、雌株の判断をしていたら、スの雌雄判別法の詳細を見つけることが出生産の効率が悪い。そこで、私たちは、ピ来た。そこで、アスパラガスに研究材料をスタチオがまだ実のならない苗木の間に切り替え、そこからピスタチオへの応用を

DNA を利用し雌雄の判別を行い、雌株を多検討することにした。

く育てることで多くの実を得られるのではと考え、研究を始めることにした。そこで、

３．研究内容この方法を確立するのにあたり、雌雄判別

３．１ ＤＮＡの抽出実験法が確立されているイチョウの DNA によアスパラガスからの DNA 抽出実験

る雌雄判別の研究を行い、ピスタチオに応用しようと考えた。そして昨年は、雌雄判

3.1.1 目的別に必要な DNA の抽出方法の確立を目指イチョウで確立した DNA の抽出法を利用し、イチョウの葉からの DNA 抽出を試みし、アスパラガスからの DNA を安定的に抽ることにした。結果、安定的な抽出を可能出する方法を確立する。

った。しかし、アスパラガスでは、純度の3.1.2 仮説
イチョウと同じ DNA 抽出キットを用い値も 2.0 に近く、安定的に抽出できたといることで、アスパラガスからも DNA の抽出える。このため、抽出した DNA を用いて、ができる。

PCR 法による DNA 断片の増幅を試みることにした。

3.1.3 実験方法

表１ アスパラガスからの DNA 抽出結果

＜材料＞
アスパラガスの葉DNA キット（2 種類使用）
・Plant Genomic

DNA Extraction

System・Dneasy Plant Mini Kit＜事前準備＞
TE(10mM Tris-Hcl,1mM EDTApH8.0）の作製
・1M Tris-Hcl(pH8.0) 2mL ― (i)・0.5M EDTA(ph8.0)400μL ― (ii)(i)と(ii)混ぜ、200mL に純水でメスアップする。その後、オートクレーブで滅菌し、4℃で保存。
＜抽出方法＞

DNA抽出Kit サンプル
①-1
Plant
①-2
Genomic①-3
DNA②-1
Extraction②-2
System
②-3
③-1
③-2
③-3
③-4
③-5
③-6
Dneasy③-7
Plant Mini
④-1
Kit
④-2
④-3
④-4
④-5
④-6
④-7

抽出量
54.7
6.8
8.3
36.5
56.9
33
×0.3
-0.1
1.6
0.1
0.2
2.1
3.4
2.7
1.6
1.9
1.6
3.10.1

純度
1.73
1.67
1.59
1.43
1.43
1.48
1.23
2.21
0.33
0.84
1.02
0.39
0.93
2.05
1.52
1.44
1.96
2.2
2.130.81

アスパラガスの葉をすりつぶし、DNA 抽出キットを用い、DNA を抽出。DNA の抽３．２ アスパラガスの DNA を用いた雌出確認は、分光高度計によって測定した。

雄判別実験

3.1.4 実験結果

3.2.1 目的

表１のような結果が得られた。①は 6/14、アスパラガスから抽出した DNA を用い②は 12/16、③は 10/29、④は 12/14 に実施て、PCR 法、電気泳動法を利用した、アスしたことを表している。抽出量はμg／μLパラガスの雌雄判別を行う。

である。純度は、260nm/280nm の値であり、2.0 に近いほど良いと判断される。

3.2.2 仮説
先行研究の論文に従い、実験を再現する

3.1.5 実験の考察
昨年度までは、DNA 抽出量の値が大きかったため、DNA 以外の不純物を測定してしまっているのではないか、という疑いがあことでアスパラガスの雌雄判別を行うことができる。

3.2.3 実験方法

より増幅した DNA 断片を電気泳動法によ3.2.3.1

り、DNA 長さにより分ける。このとき、ＰＣＲ法を用いたＤＮＡ断片の100V で 30 分泳動を行った。その後、DNA増幅方法
1 つのサンプルにおける、PCR を行うたを染色し確認する。

めの各溶液の濃度は以下の通りとした。
Genomic DNA25ngdNTPs

2.5mM

3.2.4 実験結果

Primer(forward)

5pmol

表３ ゲルのレーンと溶液の対応表

Primer(reverse)

5pmol

レーン プライマー名 GenomicDNA① Asp1-T7-R/F サンプル④-2②④-4③ Asp2-SP6-R/F サンプル④-2④④-4⑤ Asp4-SP6-R/F サンプル④-2⑥④-4⑦ Asp8-T7-R/F サンプル④-2⑧④-4

10×PCR buffer

2.5μL

Taq DNA polymerase 1.0U
Genomic DNA には、表 1 のサンプル④-2と④-4 を使用した。
Primers の名称と塩基配列は、以下の通りである。
表２ プライマーの塩基配列
プライマー名
塩基配列
Asp1-T7- F CTTGGCGTGAATACGTTGC
Asp1-T7-R TCTCTTGTTCAATATACTC
Asp2-SP6-F
GCTCTTTGAGGGTGTTT
Asp2-SP6-R
TGCTCCTCCACTCTCA
Asp4-SP6-F
AGGCCTCTCAAGTTTCA
Asp4-SP6-F
AGCAGATCCCACATTGA
Asp8-T7-F AGATCTGAGATCCGGTTCC
Asp8-T7-R AATAGTTTCATGGAGGAAGGPCR のリアクションプログラムは以下の

図 １ 電気泳動結果１ように行った。
94℃ 30 秒①94℃ 30 秒
60℃ 30 秒②③④⑤⑥⑦⑧5kb

32 回繰り返す

72℃ 40 秒

1500bp1kb1000bp

72℃ 5 分500bp

3.2.3.2 電気泳動法を用いた DNA 断片の確認方法
1%アガロースゲルを作成し、PCR 法に

図２ 電気泳動結果２

中央のレーン⑤と⑥のあたりにバンドがし正確に値が出るように改善が必要と考え見られたが、ローディングバッファーが重られた。また、すり潰す際に、液体窒素をなっていたため見えにくかった。よって、用いることで、すり潰す時間の軽減、細か確実にバンドがでたとはいえない。レーン

く粉砕することができたが抽出量に変化は⑤と⑥はいずれも Asp4-SP6 のプライマー見られなかった。

で増やした DNA で Genomic DNA が異なる。

５．今後の課題論文によると Asp4-SP6 のプライマーはDNA を Dneasy Plant Mini Kit で抽出し389bp に現れ、ただし雌雄で現れるプライた際に値がうまく出なっかたので、改善点マーは同じである。

を考える必要がある。また、抽出を雌雄判別したいのでアスパラガスの雌雄の違いを3.2.5 考察調べ、区別し DNA を抽出する。PCR で前のキットで抽出した DNA を用いて先DNA を増やすことが可能なことがわかっ

行研究をもとに行った実験では、確認できたので、再度考え直し、PCR を行い、アスなかったが、先行研究で用いられていたパラガスの雌雄判別法の確立を目指す。そDNA 抽出の新しいキットと新しい塩基配の後、ピスタチオからの DNA 抽出を試み、列のプライマー、そして PCR 法での増やし

PCR 法を用いた雌雄判別法を確立させた方も変えてみたところ、図１、図２のようい。そのためには、新たにピスタチオのに、Asp4-SP6(-R/-F)の部分のプライマーでDNA の塩基配列を検索するとともに、ピスバンドが確認されたことから、DNA 抽出はタチオと同属の植物において、調べられてPCR を行えるだけの量と純度があること

いる DNA 断片を文献検索し、PCR 法に使がわかった。

えそうなプライマーを考案する必要がある。

４. 考察および改善点

６．参考文献昨年の実験でイチョウから DNA の抽出[１] BAC-derived diagnostic markers forを安定的にすることができるようになり、

sex determination in asparagus,それをアスパラに応用することができた。

A.Jamsari, 2003.

また、抽出した DNA を用いて PCR 法を行[2] DNA polymorphisms amplified by

い、一つのプライマーの増幅を行うことがarbitrary primers are useful as出来た。しかし、他のプライマーでは確認

genetic markers, John G.K.Williams,

できず、3 日後には消えてしまったため、1990.

再度実験を行う必要がある。PCR 法でうまくバンドが出なかったため、先行研究で用いられていた異なるキットを用いて抽出を行うことにした。新しく用いたキットでは、うまく値が出ないものもあったのでもう少７．謝辞
植野先生、櫻井先生、いろいろなアドバイスを頂きありがとうございました。