ミドリゾウリムシとシロミドリゾウリムシについて
４年Ｃ組 髙畑 菜々子
４年Ｃ組 中村 友柚
４年Ｃ組 西村 咲野
指導教諭 櫻井 昭

１．要約
ミドリゾウリムシとシロミドリゾウリムシ（ミドリゾウリムシから細胞内共生細菌であるクロレラを除去した個体）を培養して、増殖曲線（成長曲線）を描き、そこにクロロゴニウムの増殖を追う形でミドリゾウリムシとシロミドリゾウリムシが増殖するという関係性を確かめることを目標とし、実験、培養の経過の観察、個体数の計測を重ねてきた。
キーワード

ミドリゾウリムシ、シロミドリゾウリムシ、増殖曲線

２．研究背景、目的
私たちは、細胞内共生への興味と石油を分泌するバクテリアの改良への興味をそれぞれ持っていた。ミドリゾウリムシが細胞内共生細菌としてクロレラを体内に共生させているという点、マルトース（糖）を分泌し、その糖はバイオマスエネルギーとして利用価値があるという点から、ミドリゾ

図１ Paramecium.ursaria

ウリムシを共通の研究対象とした。そこで、ミドリゾウリムシ）ミドリゾウリムシの培養を始めたが、培養中にカビが生え、フラスコ内のミドリゾウ

３．研究内容リムシの全滅が何度も起こってしまった。

３．１ 目的そのためまずは、培養の安定をめざし、そミドリゾウリムシは細胞内共生細菌であの指標としてのシロミドリゾウリムシ、ミるクロレラがあるため、養分であるマルトドリゾウリムシの増殖曲線を描くことにしースが供給され、エサがなくなってもあるた。

程度の期間個体数を維持でいると思われる。
これに対して、シロミドリゾウリムシは細胞内共生をしているクロレラが存在しないため、餌であるクロロゴニウムの減少に伴い最大数になった後は減少の一途を辿ると思われる。これらの現象を確認する。

③ フラスコの口を綿栓で塞ぎ、綿栓をアルミホイルで包む。その後オートクレーブ

３．２ 仮説同じ条件下で、異なるフラスコに同数のに入れ、121℃、20 分、20atm で滅菌する。

ミドリゾウリムシとシロミドリゾウリムシ※培地は植え継ぎ前日に作製するか、まとを培養した場合、ミドリゾウリムシとシロめて作製した場合は 22℃の暗所で保管

ミドリゾウリムシがフラスコ内で最大数にされた培地（作製より二か月以内のもの）

増えた後、ミドリゾウリムシのみが最大数を使用する。のままある程度の期間保たれる。
3.3.3 ミドリゾウリムシ、シロミドリゾウ
３．３ 実験

リムシ、クロロゴニウムの植え継ぎ方法

3.3.1 実験に用いた培地（簡易クロロゴニ① アルコールでフラスコ等器具類の表面ウム培地）の作成方法① 100ml のメスシリンダーに酢酸ナトリを消毒し、クリーンベンチ内に入れる。
② クロロゴニウム、シロミドリゾウリムシ、ウムを 2ｇ（酢酸ナトリウム三水和物のミドリゾウリムシの順に 3.3.1 で作製場合は 3.3ｇ）、Yeast extract を 10ｇ入した培地に植え継ぐ。

れる。
② そ の上 から 蒸留 水を加 えて 、全 量を100ml にする。
③ よく混合し、50ml チューブ 2 本に分注して冷凍保存する。
※濃縮培地をミドリゾウリムシ培地作成時には 100 倍、クロロゴニウム培地作成時③ 植え継いだフラスコは、温度が 23℃で保たれるインキュベーターで保管する。
※クロロゴニウムが 4 日で最大数に達し、ミドリゾウリムシとシロミドリゾウリム
シは 1 週間から 2 週間で最大数に達するとされたため、植え継ぎはまとめて 1 週間に 1 度行った。には 20 倍に希釈して使用する。
3.3.3 個体数のカウント方法
3.3.2 ミドリゾウリムシ、シロミドリゾウ

ミドリゾウリムシ、シロミドリゾウリム

リムシ、クロロゴニウム培地の作成方法

シ共にフラスコ内から 1ml を採集する。そ① 前述した簡易クロロゴニウム培地を解こからさらに 100μl を採集し、シャーレ上凍し、2ml ずつ 100ml フラスコ（クロに 10 ドロップに分ける（1 ドロップは約 10ロゴニウム用）、300ml フラスコ（ミドμl）。その後、実体顕微鏡で観察し、10 ドリゾウリムシ、シロミドリゾウリムシ用）

ロップ内に確認されたミドリゾウリムシとに入れる。

シロミドリゾウリムシ、それぞれの総数を② Volvic（KIRIN のミネラルウォーター）カウントする。同様の操作を 3 回行い、そを 40ml（100ml フラスコの場合）、の総数の平均を、その日確認できたミドリ200ml（300ml フラスコの場合）の線まゾウリムシ及びシロミドリゾウリムシの総で入れる。

数とした。

３．４ 実験結果

10月21日 10月22日 10月23日 10月24日 10月25日 10月26日 10月27日 10月28日 10月29日 10月30日 10月31日
1.3
1.5
2.7
15.7
40.7
21.3
3731.2

11月1日

11月2日
12.3

10月28日 10月29日 10月30日 10月31日
000.67

11月1日

11月2日
111月8日

11月9日 11月10日
0.67
0

11月4日
011月8日11月9日 11月10日 11月11日 11月12日 11月13日 11月14日 11月15日 11月16日 11月17日
0.33
1.3
0.33
0.33
27.78.7

11月5日
011月6日
0.33

11月7日

11月3日

11月4日
4.7

11月5日
4.3

11月6日
2

11月7日

11月11日 11月12日 11月13日 11月14日 11月15日 11月16日 11月17日 11月18日 11月19日 11月20日 11月21日 11月22日 11月23日 11月24日
000
0.33
10.66
1.72
11.3

グラフ１ ミドリゾウリムシの増殖曲線とデータ

10月21日 10月22日 10月23日 10月24日 10月25日 10月26日 10月27日 10月28日 10月29日 10月30日 10月31日
1.3
1.5
2.7
15.7
40.7
21.33731.2

11月1日

11月2日
12.3

10月28日 10月29日 10月30日 10月31日
0
00.67
0

11月1日
0

11月2日
1

11月8日
0

11月9日 11月10日
0.67
0

11月4日
0

11月8日
0

11月9日 11月10日 11月11日 11月12日 11月13日 11月14日 11月15日 11月16日 11月17日
0.33
1.3
0.33
0.33
2
00
7.7
8.7

11月5日
0

11月6日
0.33

11月7日
0

11月3日
0

11月4日
4.7

11月5日
4.3

11月6日
2

11月7日
0

11月11日 11月12日 11月13日 11月14日 11月15日 11月16日 11月17日 11月18日 11月19日 11月20日 11月21日 11月22日 11月23日 11月24日
00
0000.3310.661.7200011.3

グラフ２ シロミドリゾウリムシの増殖曲線とデータグラフ３ ミドリゾウリムシとシロミドリゾウリム
グラフ１ とグラフ２は、1 週間以上続け変動をみることができなかった。て 200ml フラスコ(培地量は 100ml)で培養したものである。
グラフ３は、ミドリゾウリムシとシロミ５．今後の課題＜現時点での問題点＞

ドリゾウリムシを各 200ml フラスコ（培地①植え継ぎの際、3.3.3 で出された平均値量は 100ml）で、10 月 27 日から 11 月 10を利用し、フラスコ内の個体数が同数に日まで培養したものであり、植え継ぎの際なるように計算した上で植え継いでいるにはそれぞれ個体数が同じになるようにしのだが、全溶液量 100ml 中の 100μl をた。

採取し、その中の個体数を計測するという方法を取っているため、統計的な誤差

４．考察
シロミドリゾウリムシがミドリゾウリム
シに比べて培養が難しいことが分かった。
このことはグラフ２の個体数が増えないことから読み取れる。またグラフ３より、植が生じる。
②シロミドリゾウリムシの増殖が不安定である。
③土日分のデータの欠損が増殖曲線を描く
うえで、大きな障害である。

え継いだ当初は、ミドリゾウリムシとシロ④植え継いでから数日は、3.3.3 の方法でミドリゾウリムシとで増殖速度の差があまミドリゾウリムシとシロミドリゾウリム

り無かったが、植え継いで一週間ぐらい経シの個体数をカウントしても、個体が存つと数値の伸び方に差が現れたことからも在しないことが多い。

いえる。しかし、平日のみに計測を行った＜解決策＞

ためデータが欠損している。そのため曲線①問題点の②については、個体数を計測すという形で仮説を実証できるような数値のる際、フラスコではなく、ディプレッションスライドガラス(容量１ml くぼみを3 つ持つスライドガラス)で培養することにより全体の数を減らし、常に培地内の個体数を把握できるようにする。または、個体数の計測のために取り出す培地量を100μl から 1000μl(1ml) に変更する。
②シロミドリゾウリムシがミドリゾウリム
シに比べ増殖しにくい理由ははっきりとはわかっていない。おそらくシロミドリゾウリムシの増殖を抑制する理由は、到達できる最高の細胞密度がミドリゾウリムシのものよりも低いためであるか、クロロゴニウムを取り出したことによって、カビなどに対する免疫のようなものが欠如していると私たちは予想した。今後、原因を確定させていきたい。
③植え継いでから数日は、ミドリゾウリム
シとシロミドリゾウリムシの培地から1ml を採集した後、それを 10 ドロップに分け、100μl 中の個体数をカウントし、ある程度個体数が増えたら、3.3.3 の方法に移行していきたい。

６．謝辞
今回の研究を行うにあたってご指導してくださった櫻井先生及び、ミドリゾウリム
シ、シロミドリゾウリムシを提供していただき、ご指導くださった神戸大学の洲崎先生にこの場をかりて御礼申し上げます。