マツタケの人工培養を目指して
４年Ｃ組 結崎 祈
２年Ｂ組 加藤 大翔
指導教員

櫻井 昭

１．要約
私たちの班は、マツタケの人工培養を目指し、マツタケ菌の純粋培養を試み、なぜマツタケ菌の人工培養が困難であるのか、培養するにはどのような培地条件が必要なのか検討を行っている。昨年はマツタケ菌の菌糸を維持することに成功し、今年は培地の形や成分を変えて成長速度を早める研究を行った。また、私たちが培養している菌糸がマツタケの菌糸であることを証明するために、DNA キットを用いた鑑定を行った。
キーワード

マツタケ、クエン酸回路、DNA、菌糸の立体化

２．研究の背景と目的

マツタケの菌糸は、通常の培地では横方マツタケの人工培養の成功例はいまだ報向へ広がっている。しかしマツタケの子実告されていない。私たちは、なぜマツタケ体は、平面的ではなく立体的である。マツ

は人工培養が困難なのか興味をもち、マツタケの菌糸を平面的ではなく立体的に伸びタケの人工培養を目指して研究を平成 23

広げれば、子実体形成へと近づくのではな

年度から始めた。1 年目はシイタケの人工いかと考え、今回の実験を行った。

培養を成功させ、2 年目からマツタケの人工培養をめざして研究を始め、3 年目にマ＜実験仮説＞

ツタケ菌糸の維持に成功した。今年は昨年

マツタケが本来生育する環境である土壌維持することができるようになったマツタにできるだけ近づけた形状の培地を用いれケ菌糸を用いて成長速度を早めるための培

ば、立体的に菌糸が広がる。

地の検討を行うことにした。また、私たちが培養している菌糸がマツタケであるという証明をするために、DNA キットを使用した鑑定を行った。

＜事前準備＞
実験を行う場をビニールカーテンで区切り、その中でプラズマクラスターを約 24 時間つけ放しにすることで、できるだけ菌の３.実験内容少ない状態を作る。また、マツタケ菌を扱

３．１ マツタケ菌糸の立体化

うときは、クリーンベンチ内で行う。

3.1.1 クラッシュ培地の作成＜研究目的＞

以下のすべての実験において、この無菌操作は共通で行う。

＜マツタケ培地＞が広がった範囲内のかけらの表面は全面均IFO-7 培地と浜田培地の 2 種類の培地を採用している（結崎祈 2014）。培地の組成は以下の通りである。

等に菌糸が広がっているものとする。
かけらの個数とかけらの表面積の積が菌糸の広がった面積となる。計算の際、円周IFO-7 培地

率πは 3.14 とする。

乾燥酵母

1.5ｇ

グルコース6.0ｇ

寒天

5.4ｇ

蒸留水

Σ300ml浜田培地

56123478

9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 19 20
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

乾燥酵母

1.5ｇ

グルコース6.0ｇ

寒天5.4ｇ燐酸カリウム0.6ｇ

51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

硫酸マグネシウム0.3ｇ

61 62 63 64 65 66 67 68

蒸留水

Σ300ml69 70 71 72 73 74 75 76

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

77 78 79 80＜実験方法＞●クラッシュ培地の作成＜実験結果＞

メスを使用して、シャーレ内の培地を約

通常のものは培地の表面上にしか菌糸が5 ㎜角にきざみ、クラッシュ状にする。イ

広がらなかったが、クラッシュ培地では培ンキュベータ内で、28 度で約 7 ヵ月間培養

地の隙間に菌糸が入り込み、表面上だけでした。マツタケ菌の培地には今回は 2 種類なく下方向にも伸びた。表面上の広がりは、の培地においてクラッシュ状のものと、通クラッシュ培地の場合、通常のものよりも常のものをそれぞれ 1 枚ずつ使用した。

１㎝ほどせまくなっていた。算出法に従って面積を算出したところ、通常のものが●菌糸の広がった面積の算出法
菌糸の広がった所を円と考え、その円に5mm 方眼の円に外接する正方形を重ねる。
円の中に含まれたマス目を数え、その数をクラッシュ培地の菌糸が殖えた培地のかけらの個数とする。このとき、マス目に円の3846.5mm2 ， ク ラ ッ シ ュ し た も の が12000mm2 となった。
なお、計算式は以下のとおりである。
・通常の培地35(mm)×35(mm)×3.14＝3846.5(mm2)・クラッシュ培地

境界がある場合、円内の面積が広ければ円5(mm)×5(mm)×6＝150(mm2)に含まれ、円外の面積が広ければ円に含ま150(mm2)×80(個)＝12000(mm2)れないものとする。クラッシュ培地のかけらはすべて 5mm 角の立方体と考え、菌糸＜実験考察＞＜実験考察＞

この実験により、培地をクラッシュ状に培地をクラッシュし、その中に菌糸を埋するとマツタケ菌糸は横だけでなく下方向め込んだため、フラスコの外側から菌糸のにも広がることがわかった。また、クラッ広がりを観察することが困難になり、全方シュ培地で広がった菌糸の総面積は通常の向に増えたかどうかを確認できなかった。

培地の約 4 倍になっていたことから、菌糸固体の培地では、クラッシュされた培地のの成長速度は培地をクラッシュすることで隙間をぬって立体的に菌糸が広がると考え、上げることができるといえる。以上のこと

実験を行ったが、この方法では培地が不透より、さらに厚みのある培地を作成し、菌明なため菌糸の観察が困難である。菌糸の糸を植え継げば上下左右に菌糸が広がり、広がりを正確に観察するためには、何らかさらに立体的に菌糸を広げられる可能性がの工夫が必要と考えられる。

考えられた。そこで、次により厚みのあるクラッシュ培地を作り、培養することにし

3.1.3 液体培地た。

＜実験仮説＞
液体培地を使用すれば菌糸の伸びを妨げ3.1.2 フラスコクラッシュ培地の作成ず、なおかつ菌糸の観察が可能になるので＜実験仮説＞

はないか。

より厚みのあるクラッシュ培地を作成し、菌糸を埋め込めばより立体的に菌糸が広がるのではないか。

＜実験方法＞
3.1.1 で用いた培地の組成から寒天を抜き、IFO-7 培地と浜田培地の液体培地を＜実験方法＞
3.1.1 で用いた組成の培地をシャーレよりも深さのある 200ml の三角フラスコに作500ml の三角フラスコに作成し、植え継ぎを行う。28℃のインキュベータ内で、約 5ヵ月間培養した。

成し、薬匙を使用して約 5 ㎜角にクラッシュする。この時メスを使用すると、メスの＜実験結果＞

柄が短く作業がしづらいため、柄の長い薬植え継いだ菌糸の塊を核として、放射状匙を使用した。表面から約 1 ㎝の深さのとに菌糸が伸びたが、半径 1.5cm ほどにしかころに菌糸を植え継ぎ、フラスコにパラフ広がらなかった。

ィルムを二重に巻いた後、28℃のインキュベータ内で約 7 ヵ月間培養した。

＜実験考察＞
液体培地では固形培地と比べてあまり菌＜実験結果＞
植え継いだ周辺の培地が白っぽくなっており、菌糸の広がりが確認できた。

糸の広がりが見られなかった。このことか
ら菌糸が伸び広がるためには、つたい広がるための地盤が必要だと考えられる。

３．２ 新規培地の検討

まい殖えなかった。フマル酸を加えた培地

3.2. クエン酸およびフマル酸培地は殖えたが、浜田培地や IFO-7 培地に比べ＜実験目的＞て菌糸の成長速度が非常に遅かった。

マツタケ菌の成長速度は非常に遅く、現在実験に使用している浜田培地と IFO-7 培＜実験考察＞地では成長に多くの時間がかかってしまう。

問題点を解決したが仮説は証明されなか

そこで 3 年前「グルコースの代わりにクエった。今回の培地は pH を 7 にしたが、通ン酸回路で作られる有機酸を培地に直接加常の培地は pH を 5.5 にしているため、こえれば、マツタケ菌の成長速度が上がるのの pH の差が、菌糸が殖えにくい原因の 1ではないか」という仮説を立て実験を試みつだと考えられる。今回の結果がクエン酸たが、実験環境が整っていなかったこと、とフマル酸のみで見られるものなのかを確pH 調整をしなかったため培地が固まらな認するために、他の有機酸の場合も実験すかったことなどが原因でマツタケ菌が殖える必要があると考えられる。

なかった。
今回は実験環境を整え pH 調整を行い、再度実験を行った。

3.2.2 おがくず培地＜実験目的＞
3.1.1 での実験では寒天培地をクラッシ＜実験仮説＞

ュし、本来生育する環境である土壌に近づグルコースの代わりにクエン酸回路で作けた。新規培地の検討にあたり、シイタケられる有機酸を培地に直接加えれば、マツの培養に使われているおがくず培地を使用

タケ菌の成長速度が上がるのではないか。

すれば寒天培地よりも土壌に近い培地になると考え、実験を行った。

＜実験方法＞
IFO-7 培地のグルコースの代わりに、それぞれクエン酸、フマル酸を加え、pH を 7にできるだけ近づけた培地を作成し植え継＜実験仮説＞
おがくず培地を使用すれば寒天培地よりもより立体的に菌糸が広がる。

ぎを行う。
クエン酸とフマル酸は 250ml の IFO-7 培地に含まれているグルコース 5ｇの分子量と、同じ分子量になるように加えた。

＜実験方法＞
材料をすべて混ぜた後ポットに入れ、減菌のためにオートクレーブにかけて培地を植え継ぎ後、シャーレにパラフィルムを作成する。表面から約 2cm の深さの所に菌二重に巻き、28℃のインキュベータ内で糸を植え継ぎ、28℃のインキュベータ内で約 9 ヵ月間培養した。

7 ヵ月間培養した。培地の組成をまとめると以下のようになる。

＜実験結果＞
クエン酸を加えた培地は菌糸が枯れてし

きた DNA と濃度を計測する。計測の結果

おがくず培地おがくず(シラカバ)

900ml

米ぬか300ml

水715ml＜実験結果＞
培地を 5 つ作成したが、3 つはカビに汚は以下のとおりである。
純度

抽出量

260um/280um

サンプル 18.5µg/µL

1.25

サンプル 26.4µg/µL

1.25

サンプル 326.7µg/µL

25.8

染されてしまった。残った 2 つの培地もポットの外側からは菌糸の広がりを確認でき

これらのサンプルのうち、今回はサンプなかった。1 つだけポットを開け、中を観ル 1 とサンプル 2 を PCR 法に用いた。PCR察したが、菌糸の広がりは見られなかった。

reaction mix の組成は以下のとおりである。

＜実験考察＞

・12.5nｇのゲノミック DNA

寒天培地作成時と同環境で行ったのにもサンプル A

0.085μｇ/μL

かかわらず、カビに汚染されてしまったた

サンプル B

0.064μｇ/μL

め、この原因を突き止める必要がある。ま・TmF

10nm/μL

た、おがくずに使用されている木材の種類

・TmR

10nm/μL

・PCRbuffer(×10)

2.5μL

・dNTP

2.5μL

・Tug polymerase

0.625U・DW

Σ25μL

によって違いが生じるかどうかも検討したい。
３．３ マツタケのＤＮＡを用いた判別法
3.3.1 実験目的
私たちは植え継ぎを繰り返し、マツタケ菌を増やしている。培養している菌糸が本
当にマツタケの菌糸であるのかを確認するために DNA 抽出キットを使用し、判別を行った
3.3.2 実験仮説
現在培養している菌糸はマツタケの菌糸である。
3.3.3 実験方法
DNA 抽出キット（DNeasy® Plant Mini
Kit (50)）に記されている操作手順に従いDNA を抽出する。その後、分光器で抽出で使用したプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
TmF CATTTTATTATACACTCGGTTmR GACGATTAGAAGCCCGACCTA
また、サーマルサイクラーの reaction
program は以下のとおりである。
①95℃

10 分

②95℃

30 秒

③55℃

30 秒

④72℃

1.5 分

②～④を 35 サイクル
⑤72℃

8.5 分

⑥4℃

∞

その後、1.5% の agarose gel を使用してれないが、loading buffer と重なってしまい

電気泳動を行った。

確認ができなかった。

3.3.4 実験結果

3.3.5 実験考察
電気泳動のとき、agarose gel にある穴にマーカーとサンプルをマイクロピペットを使用して入れるのだが、これがうまく穴に入らず、バッファーへ流れ出てしまったことが、バンドが出なかった原因と考えられる。しかし、300bp の位置には印が出ているため、サンプルがマツタケである可能性が高いと考えられる。

４．考察
今回の研究で、マツタケの菌糸は培地をクラッシュすれば培地の隙間をぬって広がるが、液体の培地では広がらなかった。このことからマツタケ菌糸が広がるためには、培地に強度が必要だと考えられる。しかし、マツタケは液体中でも菌糸を広げられるということから、酸素の少ない状態でも生育できると考えられる。

５．今後の課題
今回の実験はいずれも大きな成果を得ることはできなかった。しかし、今回の実験からマツタケの菌糸が広がるためには培地に強度が必要だと考察できたので、どのぐらいの強度があれば菌糸は広がることがで
図１

きるのかを調べるために固体と液体の中間であるゲル状の培地を作成し、実験を行いサンプルがマツタケである場合、図１のたい。また、マツタケはアカマツの木の付楕円の位置にバンドが現れる。しかし、今近に生育するため、現在アカマツとマツタ回の実験では 300bp の位置（図下側の楕円）ケ菌の関係性を調べるためのアカマツを育にしかバンドが見られなかった。500bp の成している。このアカマツを利用した新規位置（図上側の楕円)にも現れていたかもし培地の検討も行いたいと考えている。3.3

節の実験が操作ミス等によりうまくいかなかったため、再度実験を行いたい。

６.謝辞
本研究活動において、顧問の櫻井先生に、多大なご指導を受け賜わりました。また、DNA の抽出、PCR 法、電気泳動法について、DNA 班の米田さんにご指導を受け賜りました。この場をかりて、深く感謝申し上げます。