ごあいさつ
生命科学は、発生・分化や細胞増殖などの生命現象を理解する基礎科学として重要であると同時に、医学・薬学分野の飛躍的な発展や食糧、環境、エネルギーの問題解決に向けた応用科学として、国民の健康や社会生活の向上と産業の発展に大きな貢献が期待されています。平成15年4月にヒト全遺伝情報の解読が終了した後、ゲノム構造に関連する基盤データが体系的に保管・整備され、ゲノムの多様性に基づいた疾患関連遺伝子の探索を目指すゲノム医学研究と生体のゲノム関連情報やタンパク質情報、代謝産物情報を包括的に解析して複雑な生命現象を理解しようとする、いわゆるオミックス研究が全世界で急速に進展しています。
わが国ではポストヒトゲノムシーケンス研究として平成16年度から5年間、文部科学省「ゲノムネットワークプロ
ジェクト（GNP）」を実施しました。このプロジェクトでは、ヒト遺伝子の発現調節機能やタンパク質と生体分子間との相互作用について網羅的に創出し、その成果をデータベース化して整備するとともに、ゲノム情報が機能情報に転換する初期段階の「転写」に焦点を当て、様々な転写制御因子が多数の遺伝子発現を調和的に制御する転写制御の分子
ネットワークの基本骨格を明らかにしてきました。
この間、従来型に比べて桁外れの処理能力をもつ次世代シーケンサー（NGS）が登場して超大量のゲノム関連情報の産出が可能となり、膨大な生命情報データベースを基盤として生命の法則を導き出そうとする「ビックサイエンス」が生命科学研究の重要な位置を占めるに至っています。
このような状況の下、文部科学省ではGNPで整備された基盤データを活用するとともに、革新的技術を用いた研究を促進し、生命現象の理解を深めることを目的として、平成21年度より「革新的細胞解析研究プログラム（セルイノ
ベーション）」を開始しました。このプログラムでは基盤整備の中核を担う2つの拠点として、各種のNGSを導入・整備して種々のアプリケーションを整備、開発する「シーケンス拠点」と超大量のシーケンスデータを処理・保管するサーバーと様々な解析ツールや解析パイプラインを整備・開発する「データ解析拠点」を構築しています。これら拠点を最大限に活用して、多様かつ大量のデータを細胞機能の解明に結びつける革新的な「先導研究」を実施し、細胞・生命プ
ログラムや病態の解明に挑むことにより、創薬・医療分野に波及効果を与えることを目指しています。
これまで両拠点においては、プログラム外への支援も含めた基盤整備を着実に進展させるとともに、両拠点と先導研
究間の情報共有・連携システムを確立してきました。一方、先導研究では、単一細胞での遺伝子発現解析や超微量レベ
ルの試料を用いたエピゲノム解析などのシーケンス解析技術と蛍光タンパク質を駆使したイメージング高度化技術を開発して、世界最高水準の研究成果をあげるとともに、これら研究成果の技術移転や知的財産権取得に向けて取り組んできました。また、生命現象や病態の理解を目指す先導研究として、膨大なデータ産出能力をもつNGSを活用し、発生・分化やがん、難病疾患に焦点を当てています。受精卵やがん、難病患者由来の細胞について、ゲノム関連情報を網羅的に解析して多数の標的因子の同定や遺伝子発現の動態計測を行うとともに、イメージング解析や細胞生物学、分子生物学的手法を組み入れることで、生命プロセスや病因メカニズムの理解につながる数多くの研究成果が得られています。
これらの研究成果をさらに発展させることにより、創薬、診断や臨床試験等の医療分野への応用も期待されています。
この度、プログラムが最終年度を迎えるにあたり、全課題で得られた研究成果について、できるだけわかりやすく紹
介するパンフレットを作成いたしました。本パンフレットを通じて、セルイノベーションで手掛けた革新的な技術開発や最先端の細胞解析研究を活用した医学・生物学の進展について多くの方々にご理解をいただくとともに、このような先端科学研究への取り組みについて、今後ともご支援、ご協力を賜れば幸甚に存じます。
平成26年1月

革新的細胞解析研究プログラム（セルイノベーション）
プログラムディレクター

榊 佳之（豊橋技術科学大学 学長／理化学研究所 特任顧問）
プログラムオフィサー

山本 雅（沖縄科学技術大学院大学 教授）
菅野純夫（東京大学 教授）

2

ごあいさつ

■研究課題一覧

研究課題
分担研究サブテーマ

代表機関
分担機関

代表研究者
分担研究者

研究期間

ページ

シーケンス
次世代シーケンサー拠点整備および運営
拠点

理化学研究所
ライフサイエンス技術 渡辺恭良
基盤研究センター

平成 21 ～
25 年度

6

データ解析
データ解析拠点の構築と情報研究開発
拠点

情報システム研究機構
池尾一穂
国立遺伝学研究所

平成 21 ～
25 年度

8

オミックス統合解析による高精度センシング技術の開発、および、イメージ解析のアノテーション DB 構築への対応

理化学研究所
情報基盤センター

豊田哲郎

平成 21 ～
25 年度

10

イン・シリコ細胞システム解析のための技術開発

東京大学
森下真一
大学院新領域創成科学研究科

平成 21 ～
25 年度

11

細胞がん化シグナルネットワークの統合システム解析

京都大学
松田道行
大学院生命科学研究科

平成 21 ～
25 年度

12

秋山 徹

平成 21 ～
25 年度

13

理化学研究所
統合生命医科学研究センター

岡田眞里子

平成 21 ～
25 年度

14

東京大学
大学院医学系研究科

井上 聡

平成 21 ～
25 年度

15

平成 21 ～
25 年度

16

間野博行

平成 21 ～
25 年度

17

先導研究
課題 A1

遺伝子発現解析を基盤とする細胞がん化シグナルのシステム解析・
東京大学
時系列リン酸化プロテオミクスによる癌細胞増殖浸潤制御システムの解明 分子細胞生物学研究所
シグナル転写ネットワークのインフォマティクス解析

先導研究
課題 A2

次世代シーケンサーを活用した
前立腺がんと乳がんの細胞制御システム機構の解明
ホルモン治療抵抗性モデルがん細胞の作製と乳がん臨床検体におけるホルモン受容体標的因子群の発現機能解析
乳がん細胞におけるマイクロ RNA 発現プロファイルの網羅的解析

埼玉医科大学堀江公仁子
ゲノム医学研究センター
自治医科大学
ゲノム機能研究部（現 東京大学）

先導研究
課題 A3

細胞比率制御ネットワークと細胞ヘブ学習則の解明

理化学研究所上田泰己
生命システム研究センター

平成 21 ～
25 年度

18

先導研究
課題 A4

初期発生における
雌雄染色体コリオグラフィーについての革新的研究

東京大学
エピゲノム疾患研究センター

白髭克彦

平成 21 ～
25 年度

19

東京工業大学伊藤武彦
大学院生命理工学研究科

平成 21 ～
25 年度

20

ライブイメージングと細胞生物学的手法による
雌雄染色体コリオグラフィーの研究

先導研究
課題 A5

神経細胞機能に着目した、
ミトコンドリア呼吸鎖異常を起こす遺伝子変異の系統的な探索

埼玉医科大学
ゲノム医学研究センター

岡﨑康司

平成 22 ～
25 年度

21

先導研究
課題 A6

網羅的スプライシング暗号解析に基づくRNA 病の解明と治療技術の探索

京都大学
大学院医学研究科

萩原正敏    平成 22 ～
25 年度

22

スプライシング操作化合物の開発

東京医科歯科大学
生体材料工学研究所

細谷孝充

平成 22 ～
25 年度

23

エクソン特異的アレイ・CLIP によるスプライシング制御配列の網羅的解析

名古屋大学
大学院医学系研究科

大野欽司

平成 22 ～
25 年度

24

先導研究
課題 B1

細胞個別的シーケンス解析のための
光学的サンプリング技術の開発

理化学研究所
脳科学総合研究センター

宮脇敦史    平成 21 ～
25 年度

25

先導研究
課題 B2

細胞解析研究革新のための高性能エピゲノムシーケンス技術の開発

東京大学
大学院理学系研究科

伊藤隆司    平成 21 ～
25 年度

26

先導研究
課題 B3

単一細胞由来 mRNA の網羅的定量分析用前処理技術の開発

日立製作所
中央研究所

神原秀記

平成 22 ～
25 年度

27

研究課題一覧

3

革新的細胞解析研究プログラム（セルイノベーション）
はじめに
ライフサイエンスは、複雑かつ精緻な生命現象メカニズム

一方、これとほぼ時を同じくして、塩基配列の読み取り技の解明を目指す科学であり、新たな医薬品の開発、食料生産

術にブレイクスルーが起こりました。ヒトゲノム計画で使の増大、新たな産業の創出など、わが国の産業競争力強化のわれたシーケンサーの100～1000倍もの読み取り速度をもつ

鍵となる重要な研究分野です。

「次世代シーケンサー」が登場したのです。この技術革新を生物のもつすべての遺伝子のセットはゲノムとよばれ、細もとに、米国、英国、中国、シンガポールなどにおいては、胞の核にある染色体上にDNAの塩基配列というかたちで保シーケンス拠点の整備が行われ、国際協力研究も進められて持されています。ヒトのゲノムは30億の塩基対からなり、います。

2003（平成15）年に、そのすべての配列がヒトゲノム計画という国際プロジェクトにより解読されました。

このように先進的ゲノム研究が活発化している中で、文部科学省では、平成21年度から、「革新的細胞解析研究プロ

これを受けて文部科学省では、平成16年度から20年度まグラム（セルイノベーション）」を開始しました。本プログ

で、「ゲノムネットワークプロジェクト」を実施しました。

ラムでは、ゲノムネットワークプロジェクトで得られた成果

細胞では、ゲノムにある遺伝子の塩基配列に基づいてタンパ

や、機器・設備、人材、データなどを活用しつつ、次世代シーク質がつくられ、他の遺伝子やタンパク質と複雑に相互作用

ケンサーを利用して、これまでなしえなかった大規模かつ多しながら機能しています。このプロジェクトでは、ヒトの遺面的なゲノム関連情報の解析を行うとともに、細胞イメージ

伝子やタンパク質のネットワークについて解析を進め、得ら

ングなどの手法も駆使して、ゲノムサイエンスの観点から、れた成果をデータベースとして整備して、生命現象の理解や細胞を舞台とした生命のしくみを解読することを目指してき

病気の治療法開発に向けた研究に取り組みました。

ました。

■革新的細胞解析研究プログラム（セルイノベーション）の概要

期待される効果4細胞プログラムの解析により、がん、遺伝病などの様々な礎知識や技術の提供が可能になります。また、発生・分化を疾患について、発症メカニズムの解明、新たな予防法、診断

はじめ、重要な生命現象のメカニズムが明らかになることが法、および再生医療や治療薬創出等の治療法開発に向けた基期待されます。

革新的細胞解析研究プログラム（セルイノベーション）

プログラムの構成
セルイノベーションは、1）シーケンス拠点、2）データ解

胞内の複雑な生命現象を理解するためのプラットフォーム構

析拠点、3）先導研究から構成されます。

築を進めました。

1）シーケンス拠点

3）先導研究次世代シーケンサーの技術革新により、ゲノムだけでな

次世代シーケンサーを活用して得られるデータを細胞機能

く、mRNAの総体であるトランスクリプトームや遺伝子のの解明に結びつけるために、課題A、課題Bに分けて研究を使われ方を決めるエピゲノムなど、多種多様なゲノム関連情行いました。

報が高速に得られるようになってきました。そこで、これら課題Aでは、がん、遺伝性難病や発生・分化にかかわる細の配列情報を大規模かつ体系的に収集することができるよ胞について、次世代シーケンサーで取得される種々のデータ

う、複数台の特色の異なる次世代シーケンサーを整備した拠に基づき、トランスクリプトームの挙動や遺伝子・染色体の点を構築し、様々な配列情報を読み取るための技術を開発し構造変化を解析しました。また、細胞内でタンパク分子の挙てきました。

動を可視化するイメージング技術や、システムバイオロジー

2）データ解析拠点の研究を同時に行い、細胞機能の解明を目指してきました。

シーケンス拠点から産出される多様かつ大量のデータを

課題Bでは、従来の技術では配列データを取得できなかっ

取り扱うため、計算機資源を整備した拠点を構築しました。

た単一細胞や超微量の細胞について、次世代シーケンサーを

シーケンス拠点で読み取った配列データから意味のある情報利用した革新的なシーケンス技術を開発するとともに、細胞を抽出する技術を開発するとともに、本プログラムで産出さイメージング技術を高度化して、これら技術を活用した細胞れるデータをデータベース化し、既知データも統合して、細機能解析研究を行ってきました。

研究推進体制プログラムの円滑な実施を図るため、プログラムディレク

関して検討を行う「協力機関選定に関するワーキンググルー

ター（PD）およびプログラムオフィサー（PO）を配置していプ（WG）」、個人のゲノム情報等の取り扱いに関して検討をます。また、プログラム運営を順調に行うことを目的として、行う「倫理ワーキンググループ（WG）」を設置しています。

年間スケジュールの企画・検討、プログラム運営状況の把またPD、POおよび研究実施者と連携し、2つの拠点と先握・指導、その他適宜必要な事項の検討などを行う「運営委

導研究との間の情報の共有化、運営委員会などの実施、およ員会」、研究課題間の連携や意見交換等を通して、事業をス

び研究成果の社会への発信などのプログラム全体の円滑な運ムーズに推進するための「実施者会議」、外部開放の方針に営を行う事務局を設けています。

■プログラム運営体制

革新的細胞解析研究プログラム（セルイノベーション）5シーケンス
拠点

代表機関

次世代シーケンサー拠点整備
および運営

理化学研究所ライフサイエンス技術基盤研究センター

代表研究者

渡辺恭良

◆次世代シーケンサーの活用により、従来なしえなかった大規模・多面的なゲノム情報等の解析が可能になる。
◆しかし、様々な機種を維持・管理し、試料に合わせたシーケンスを行うことは、個別の研究室では困難

背景

である。
◆このため、次世代シーケンサーを整備した拠点で解析サービスを提供することが求められていた。
◆次世代シーケンサーの代表的な機種を合計 18 台揃え、バージョンアップも行って、年間 70 テラ塩基以上のシーケンス能力を整備した。

成果◆多様な解析プロトコールの導入と開発を行った。合わせて試料調製の自動化、解析データの品質向上も行った。
◆これらにより、先導研究機関から依頼を受けた 222 件のシーケンスを行った。外部協力機関に対しても、解析サービスを提供した。

細胞機能を理解するためには、ゲノム（DNAの配列情報）、

まな研究課題に必要なシーケンス解析のニーズを把握し、次トランスクリプトーム（遺伝子の転写状況）、エピゲノム（遺世代シーケンサーおよび1次データ解析のためのインフォマ

伝子の働きを左右するDNAやタンパク質の修飾状況）など

ティクス基盤を整備することを目標としてきました。5年間のシーケンス情報を大規模かつ多面的に得ることが重要でで、この目標は達成でき、周辺技術の開発やシーケンス技術

す。近年、次世代シーケンサーが次々に開発され、こうしたの普及も進めました。おもな成果は以下の通りです。

シーケンス情報を高速に得ることが可能になってきました。
しかし、次世代シーケンサーによるデータの取得や、膨大なデータの管理・解析は、個々の研究室にとって負担の大きいものです。
そこで、シーケンス拠点では、先導研究をはじめ、さまざ

1．次世代シーケンサーの整備
次世代シーケンサーは、メーカーや機種によってそれぞれ特徴があり、適する解析対象が異なります。このため、プログラム開始当初に、複数機種の代表的な次世代シーケンサー【図 1 】 シーケンス速度の進歩と当拠点のシーケンサー

次世代シーケンサーには様々な方式のものがあり、それぞれ特徴があるが、全体としてシーケンシング速度は年々向上している。当拠点では、セル
イノベーション開始時におもな機種を整備し、以後、バージョンアップと新規機種の導入を図ってきた。

6

次世代シーケンサー拠点整備および運営

を整備しました。シーケンス技術の革新は速いため、整備後の研究者が解析状況を確認できる一方、他の研究者はアクセ

も随時バージョンアップを行う一方、新規機種も導入し、次スできないなど、保守性に優れています。

世代シーケンサーは最終的に18台となりました（図1）。

また、シーケンスデータの品質を管理するため、国際的に定評のあるISO9001を取得しました。

2．周辺技術の開発・整備
次世代シーケンサーによる解析には、対象とするサンプル

4．シーケンス実績

や取得したいシーケンス情報に応じたプロトコール（解析手

平成25年9月末までに、先導研究機関から累計222件の依順）が必要となります。先導研究機関、外部協力機関からの頼を受け、シーケンス解析を行いました。9月末までに解析

多様な解析要求に応えるため、ゲノム、RNA、エピゲノムを終えた179件（1979サンプル）のデータ産出量は13テラ塩の解析用にプロトコールの導入・開発に努めました。

基（ヒトゲノム4300人分）にのぼり、その7割以上がRNAと

特に、理研が開発したCAGE法を応用したプロトコール

エピゲノムに関するものです（図2）。これらの中から、先導

や、directional RNA-seq（細胞内での転写方向を反映し研究での論文発表につながる成果も多数生まれています。

たRNAの発現を検出する方法）の改良プロトコールを開発

一方、外部協力機関からは、多様な生物のシーケンス依頼

し、機関等に提供しました。また、先導研究課題A4（代表がありました。次世代シーケンサー技術に詳しくない場合が研究者：白髭克彦・東京大学教授）で開発された微量サンプ多かったため、綿密なコンサルテーションを行った上で、解ルからのChIP-seqプロトコールと、B2（代表研究者：伊藤析サービスを提供しました。

隆司・東京大学教授）で開発されたはPBAT（Post-Bisulfite
Adaptor Tagging）プロトコールを当拠点でに導入するた

5．シーケンス技術の普及活動
シーケンサー利用技術講習会（図3）を平成21～25年度にめの実習を行いました。
一方、サンプルからシーケンス用のライブラリを自動で作製できる装置を導入し、スループットを向上させました。

10回開催し、全体で約170名の参加がありました。機種ごとにライブラリ作製、シーケンス、データ解析について講習・実習を行ったほか、理研独自のCAGE法や解析パイプラインの説明なども行い、好評でした。

3．運営管理
当拠点で行う解析プロジェクトの情報と進捗を管理するラ産業界との連携としては、平成23年度に、バイオインダス

ボラトリ情報管理システム（LIMS）として、LS-Archiveをトリー協会主催の勉強会をシーケンス拠点で行いました。こ構築しました。LS-Archiveには、解析の3つの工程（ライブのほか、「よこはまサイエンスカフェ」「サイエンスアゴラ」

ラリ作製、シーケンス、データ解析）に必要な情報が網羅さなどの機会をとらえて、アウトリーチ活動にも積極的に取りれ、プロジェクトの進捗管理もできるようになっています。

組んでいます。

収納された情報へのアクセス権は細かく管理され、先導研究【図 2 】 シーケンスデータ量の内訳（平成 25 年 9 月末現在）
DNA-seq
ゲノム

CAGE

nAnT-iCAGE【図 3 】 シーケンサー利用技術講習会のようす

エキソーム
RNA-seq
MeDIP-seq
MBD-seq
FAIRE-seq

ChIP-seqbisulfite-seq
CLIP,iCLIP

directional
RNR-seq

小分子 RNA

9月末までに解析を終えた179 件のプロジェクトで、13テラ塩基のデータが産出された。7 割以上が RNA（ RNA-seqなど）とエピゲノム（ ChIPseq、bisulfite-seqなど）に関するもの。
次世代シーケンサー拠点整備および運営

7

データ解析
拠点

代表機関

背景

データ解析拠点の構築と情報研究開発情報システム研究機構国立遺伝学研究所

代表研究者

池尾一穂

◆次世代シーケンサー（NGS）では大量のデータが産出され、その解析は、経験のない研究室では困難である。
◆データ量が膨大なため、直感的に特徴を把握することが難しく、必要な情報の検索、データの統計解析等に情報解析の手法が必須である。

◆ NGS データのための解析サーバと多数の解析パイプライン（ 300 種以上）を整備し、情報技術者がいない

成果

研究室でも、ユーザがデータを解析できる解析プラットフォームを構築・公開した。
◆先導研究機関と外部協力機関のデータ解析を支援した。
◆解析データを俯瞰できるビューワを複数開発し、Webから利用可能な状態で公開した。

次世代シーケンサーから産出されるデータの量は膨大で、部協力機関で実績をあげた約500本の整備を進めており、すその解析により得られる情報も多岐にわたっています。しかでに300本以上を公開しました。おもな解析メニューは、ト

し、多くの研究室にとっては、大規模なデータを取り扱う

ランスクリプトーム解析、リシーケンシング解析、メチレー

こと自体も、それを解析して必要な情報を引き出すことも、

ション解析、クロマチン解析、メタゲノム解析、de novo

ハードルが高いのが現状です。

ゲノムシーケンシング解析、CAGE解析などです。

そこで、当拠点では、次世代シーケンサーに対応した解析

また、解析結果の理解や絞り込みを容易にするためのしく環境の開発や基盤整備を行うとともに、新規技術開発およびみとして、各種インターフェイス（ビューワ）も整備しまし

データ解析等の研究活動を進めてきました。おもな成果は以た。マッピング結果を全ゲノム領域レベルで俯瞰するため

下の通りです。

の独自ビューワの中で、Genome Explorer（ショートリー
ドのリファレンスへのマッピングデータを可視化）、gGraph1．解析プラットフォームの構築と解析メニューの整備
次世代シーケンサーから産出されるデータは、従来に比べて大規模なため、その解析処理のスピードが研究効率を左右する状況にあります。そこで、当拠点では、解析
サーバを整備するとともに、利用頻度の高い解析（染色体全体のマッピング状況を俯瞰）、iGene（遺伝子名を複数指定して周辺領域を段階的解像度で表示）は、ユーザの利便性向上のためWeb 版を作成し、公開しています。

【図 1 】 解析プラットフォーム

処理をパイプラインとして整備し、次世代シーケ
ンサーのデータを高速かつ効率的に扱うプラット
フォームを構築しました（図1）。
さ ら に、ユーザ が、Web ブ ラ ウ ザ か ら こ の
プ ラット フォーム を 利 用 す る た め の シ ス テ ム
Maser（ Management and Analysis System
for Enormous Reads）を開発し、公開しました（ http://cell-innovation.nig.ac.jp/ ）。ユーザはMaserを通して、自分のデータの登録、解析処理の実行、処理過程の閲覧、解析結果の表示・ダウン
ロードを、一貫して行うことができます。
一方、解析処理のために開発したパイプライン
は約1,400本にのぼります。そのうち先導研究や外8データ解析拠点の構築と情報研究開発

ユーザ登録を行えば、誰でもWebブラウザからこのプラットフォームを利用できる。

【図 2 】 パノラミックセルデータベース
配列情報

遺伝子と疾患の関連

パスウェイ（ 3D ）細胞周期とイメージングデータ

GNPリンク：発現情報

タンパク質情報

パスウェイ（ 2D ）TPRP：構造情報

相互作用表示TPRP：化合物との相互作用

さらに、先導研究機関および外部協力機関に対しては、

2．パノラミックセルデータベースの開発
次世代シーケンサーからの大量のショートリードを解析して得られた種々のデータは、他の手法で得られたデータと合データ解析の支援だけでなく、トレーニング・講習会およびサーバの貸し出しなども行いました。

わせて検討することにより、細胞内での生命現象の解明に大きく貢献します。そこで、当拠点では、様々なデータをデジ

4．次世代シーケンサーに関する情報発信

タルシート化し、高次元の細胞内機序を自在に閲覧すること

当拠点の活動の情報を広く一般に発信し、蓄積した経験ををコンセプトに、パノラミックセルデータベース（図2）の開役立てていただくことを目的としてWebポータルを立ち上発を進めてきました。前述のビューワもその一環ですが、そげました。なかでも人気のページは「NGS Surfer’s Wiki」でれと並行して、イメージングデータの取り込みと、異なるデす（図3）。このページでは、データ解析の現場担当者のノウ

ジタルシート間のデータを俯瞰するユーザインタフェースの

ハウを、NGS 現場の会（NGS-Field）と協力して情報発信し開発を進めました。

ています。ページビュー累計は平成25年11月末現在5,433,953に達し、アカデミアのみならず産業分野からのアクセスも増加しています。平成25年9月には、ライフサイエンス統合

3．解析支援シーケンス拠点との間のデータ転送システムを構築し、円滑なデータ転送を実施しています。これと、上で述べた解析

データベースセンター主催の“Open Science Award 2013”のウェブ部門において審査員特別賞を受賞しました。

プラットフォームにより、解析処理を迅速に行える体制が整

また、公共の次世代シーケンスデータの統計を作成し、閲いました。平成25年11月末までに、先導研究と外部協力機関

覧用のサイトを設けました。統計は随時更新しており、次世代の18グループに対して36件の解析支援（サンプル数：2,079、シーケンサーの技術動向や研究動向を知ることができます。

解析実行数：29,803）を実施しています。
また、ユーザが様々な角度から解析を【図 3 】 NGS Surfer’s Wiki

行える環境を整備するため、ゲノムネッ
トワークプロジェクトで得られたデータ
や、公共のシーケンスデータをパイプラインで処理して、Webブラウザから閲覧できるようにしました。平成24年8月から
は、ヒトゲノム解析や疾患研究のための基盤として、国際コンソーシアムが行った「1000人ゲノムプロジェクト」のデータの解析・整備を推進しました。

次世代シーケンサーの基礎知識から始まり、アプリケーション、サンプル調製、解析フローなどの情報が満載されている。
データ解析拠点の構築と情報研究開発

9データ解析
拠点
分担研究

分担機関

オミックス統合解析による高精度センシング技術の開発、および、
イメージ解析のアノテーション DB 構築への対応

理化学研究所情報基盤センター

豊田哲郎

分担研究者

◆ RNA-seq データは断片情報なので、そのままでは遺伝子構造の推定やその変化を検出することは難しい。

背景◆細胞イメージングデータの解析は手作業で行われることが多い。

◆ RNA-seq データから遺伝子の構造を精密に推定するソフトウエアを開発した。

成果◆その技術をスプライシング変化の定量的な検出手法まで発展させ、先導研究課題の解析に貢献した。
◆細胞イメージングデータを自動的に追跡するソフトウエアを開発した。

細胞内のmRNAを網羅的に観測するRNA-seqのデータは、

TG003の作用機序を明らかにするため、RNA-seqデータを遺伝子の構造（どんなエキソンとイントロンからなるか）を

我々の方法で解析し、TG003が作用する部位と作用の仕方推定するのに有効ですが、シーケンスされるRNAは断片化を解明しました（図）。ARTADE2-因子分析法は、解析パイされているため、遺伝子の構造を精密に推定することは難プラインの1つとして、データ解析プラットフォームに搭載しいのが実情でした。そこで、我々は、複数のサンプルの予定です。

RNA-seqデータについてゲノム座標での発現相関関係を利また、先導研究課題A6では、あるスプライシング制御因

用する「ポジショナル相関解析法」を考案しました。サンプ

子をノックアウトすると、発生段階で脳がつくられなくなる

ル間で高い相関を示す箇所は、同じ遺伝子の発現に由来することを見いだしています。我々はポジショナル相関解析法をだろうという発想です。そして、この方法により遺伝子の全応用して、RNA-seqデータから、このノックアウトにより長構造を再構築するためのプログラム「ARTADE2」を開発

発現が消失する遺伝子を同定しました。さらに、RNA-seq

し、公開しました。

のデータと、ノックアウトマウスの表現型情報を統合的に解

さらに、この技術を発展させ、「ARTADE2-因子分析法」

析する研究も進めています。

を開発しました。この方法ではRNA構造の変化を同定する

これらとは別のテーマとして、先導研究課題A1（代表研ことで、スプライシング等の変化がわかります。実際に、究者：松田道行・京都大学教授）の細胞イメージングデータ

先導研究課題A6（代表研究者：萩原正敏・京都大学教授）のの解析技術も開発しました。多数の細胞が移動するのを1個サンプルにこの方法を適用しました。この課題では、デュずつ自動的に追跡し、蛍光強度などの変化を定量化するもの

シェンヌ型筋ジストロフィーの原因となる遺伝子スプライシ

で、少数の細胞を手作業で追跡していたときに比べ、短時間ングに作用する低分子化合物TG003を見いだしています。

で信頼性のある結果を得られるようになりました。

【図】 RNA-seq データからのスプライシング変動パターン解析
遺伝子発現量に対する選択的スプライシング領域の相対発現量

低分子化合物 “TG003” 処理あり

[

］ [

］

TG003 処理でスプライシングが変化するエキソンの例

Exon Inclusion 型のスプライシング変動 (A)スプライシング
変動なし (B)mock

TG003 treatment
Exon skipping 型のスプライシング変動 (C)
低分子化合物処理なし

TG003 処理細胞においてエキソンの使用率が著しく減少している。

細胞を TG003 で処理したときとしないときの RNA-seq データを ARTADE2- 因子分析法で解析した結果、TG003 が作用しうるエキソンを新規に 200 個程度同定した。TG003 では、skipping が促進されるタイプと inclusion が促進されるタイプの両方が存在した。

10

オミックス統合解析による高精度センシング技術の開発、および、イメージ解析のアノテーション DB 構築への対応

データ解析
拠点
分担研究

分担機関

背景

成果

イン・シリコ細胞システム解析のための技術開発

東京大学大学院新領域創成科学研究科

分担研究者

森下真一

◆次世代シーケンサーでゲノム全域にわたるエピゲノム情報が収集できるようになり、その分析が注目されている。
◆次世代シーケンサーのデータ解析には解析ニーズに応じたパイプラインが必要である。
◆エピゲノム情報の解析を加速するソフトウエアを開発し、先導研究の解析を支援した。
◆ DNA メチル化と周辺の DNA 配列の進化速度に関係があることを見いだした。
◆データ解析パイプラインを構築するためのソフトウエアを完成させた。

本分担研究のテーマは大きく2つに分けられ、どちらも顕著な成果をあげました。

メチル化部位近辺のDNA配列の進化速度が有意に低いことを見いだしました。さらに、全ゲノム重複後の遺伝子進化とエピゲノムの関係にも、研究を進めています。

1．ゲノムワイド・エピゲノム解析ソフトウエアの開発
エピゲノムのうちでもDNAメチル化を中心として、次世

2．細胞統合解析パイプラインソフトウエアCelliPの開発

代シーケンサーのデータを解析するためのソフトウエア群をCelliPは、グラフィカルにデータ解析パイプラインを作成

開発・整備しました。これらによりメダカ初期胚などのデーできるツールで、シーケンス解析や遺伝子ネットワーク解析

タを解析し、その結果を独自開発のブラウザーで表示できるなど300以上の様々なデータ解析機能、可視化・シミュレー

ようにしました（図）。これらを通して、エピゲノムに関すションする機能があり、データ解析・可視化・シミュレー

る新たな性質をいくつか発見しました。

ション解析を統合的に行うことができます。解析サーバに接DNAのメチル化部位はバイサルファイト処理の有無で配続したパイプラインをつくることもできます。CelliPはJava

列データを比較して同定しますが、この解析を加速する手で実装されており、オープンソースで利用可能となっていま

法を開発しました。これを活用して、先導研究課題B2（代す。導入・利用法の説明（英文・和文）を作成し、ビデオ講表研究者：伊藤隆司・東京大学教授）の解析を支援しました。

習教材とともに公開しました（http://cellip.hgc.jp/）。

さらに、遺伝子が進化過程で保存される性質に対して、DNAメ【図】 メダカの全ゲノムメチル化データベース

チル化がどう影響するかを分析するソフトウエアを開発しました。また、ヌクレオソームコアのDNA断片数億本の配列デー
タからヌクレオソーム構造の特徴を抽出するソフトウエア、転写開始点と転写量のデータを解析するソフトウエアも開発しました。
以上のソフトウエアを駆使して、DNAメチル化とDNA配列の進化速度の関連性を調べた結果、ゲノム上の低メチル化領域
では、高メチル化領域に比べて、本分担研究で独自開発したブラウザー UTGB で表示したもの。

イン・シリコ細胞システム解析のための技術開発

11

先導研究
課題

A1

代表機関

細胞がん化シグナルネットワークの統合システム解析

京都大学大学院生命科学研究科

代表研究者

松田道行

◆がんの増殖や浸潤・転移には、がん化シグナルを伝えるシグナル伝達系が大きな影響をもつ。

背景◆シグナル伝達系の中では、タンパク質リン酸化酵素や低分子量 G タンパク質などが重要な役割を果たしている。
◆細胞内、生体内でこれらのシグナル伝達分子の活性を可視化する技術が求められている。
◆ FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用して、シグナル伝達分子の活性を可視化するセンサーを多数開

成果

発した。
◆そのセンサーを安定発現する培養細胞やトランスジェニックマウスの作製に成功した。
◆それらを用いて、シグナル伝達分子の時空間変化をイメージングし、多くの知見を得た。

がん細胞の増殖や浸潤・転移は、細胞表面の受容体が受けデータベースとして公開しました。さらに、シグナル伝達分

取ったシグナルが、細胞内のシグナル伝達系を通して伝わ子の活性のゆらぎが転写系にどのような影響を与えるかをり、遺伝子の発現を制御することによって起こります。この調べるFRET-GTという技術を開発しました。この技術は、ようながん化シグナルの伝達系では、タンパク質をリン酸化

FRETバイオセンサーを利用して分子の活性の強さに応じてする酵素や低分子量Gタンパク質が重要な役割をもっていま細胞を分取し、次世代シーケンサーによる遺伝子発現解析をす。そこで本課題では、分担機関と協力して、がんのシグナ行うもので、いくつかのシグナル伝達分子について解析が進ル伝達系で働く分子の活性を網羅的かつ定量的に解析し、遺んでいます。また、薬剤スクリーニング系については、次世

伝子発現情報と統合したがん化シグナルネットワークモデル

代がん研究プロジェクトで実際に使用し、すでにヒット化合を構築することを目標としてきました。この目標に向けて、物を得ています。
一方、受容体ががん化シグナルを受け取って活性化されて我々が行った研究とその成果は以下の通りです。
まず、シグナル伝達分子の活性を蛍光で示す、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動：Fluorescence resonance energy
transfer）バイオセンサーを40種類以上作製しました。次に、FRETバイオセンサーを安定にから、遺伝子が発現するまでの統合ネットワークモデルを構築しました。

【図】 生きたマウスでリン酸化酵素の活性を可視化発現する培養細胞株を確立し、これを用いて薬剤スクリーニング系も作製しました。さらに、FRETバイオセンサーを発現するトランスジェ
ニックマウスの作製にも成功しました（図）。
これらのFRETバイオセンサー作製法について
は特許を出願しており、米国の製薬企業等に技術移転する話が進んでいます。アカデミアには、FRETバイオセンサーを過去４年間に500件以上配布し、トランスジェニックマウスは医薬基盤研究所を通じて配布しています。
これらの技術基盤を確立したことにより、培養細胞や組織浸潤過程のがん細胞において、シグナル伝達分子の時空間変化をイメージングすることに成功しました。そのデータの一部は

12

2 匹のうち右側が FRET バイオセンサーを安定発現するトランスジェニックマウス。この FRET バイオセンサーは、がん化シグナルを受け取った上皮増殖因子受容体からのシグナル伝達経路の下流にある ERK というリン酸化酵素の活性を示す。右は、このマウスの小腸を生きたまま観察し、ERK の活性を可視化した像。

細胞がん化シグナルネットワークの統合システム解析

先導研究
課題 A1
分担研究

分担機関

背景

遺伝子発現解析を基盤とする細胞がん化シグナルのシステム解析・時系列リン酸化プロテオミクスによる癌細胞増殖浸潤制御システムの解明

東京大学分子細胞生物学研究所

分担研究者

秋山 徹

◆近年、非コード RNA（ ncRNA ）ががんに深くかかわっていることが知られるようになった。
◆がん化シグナルネットワークにおける ncRNA の機能を解明することが求められている。
◆がん化シグナル伝達系において、タンパク質のリン酸化は重要である。
◆遺伝子ノックダウン実験により、がん化に必須な遺伝子や ncRNA を多数見いだした。

成果◆それらの遺伝子や ncRNA の一部について、詳細な機能を明らかにした。
◆リン酸化プロテオーム解析のための手法を確立し、増殖因子でがん細胞を刺激したときにリン酸化される
タンパク質群を明らかにした。

本分担研究では、がん化シグナルネットワークの解明に向造腫瘍能に必須であることを見いだしました。

けて、がんのモデル細胞株・がん幹細胞・がん検体を用いた

さらに、大腸がんと卵巣がんの造腫瘍能に必須なncRNA

遺伝子発現解析と、リン酸化プロテオーム解析を行ってきまを見いだし、ASBELと命名しました。ASBELは、ANA/した。

BTG3というがん抑制遺伝子のmRNAと相補的な配列を含遺伝子発現解析においては、RNAiライブラリーや程久美

んでおり、このmRNAと二本鎖をつくることで核から出る子・東京大学准教授が作成したshRNAを用いたノックダウのを抑えていると考えられました（図）。また、ASBELのン実験を行い、RNA-seqやChIP-seqを用いて、造腫瘍性に発現を抑制した細胞を用いてRNA-seqなどの解析を行い、関与するタンパク質や非コードRNA（ncRNA）を網羅的に

ASBELの影響を受ける遺伝子群を解析しました。

探索してきました。これにより、3つの大きな成果をあげました。

リン酸化プロテオーム解析は、尾山大明・東京大学准教
授が構築した次世代型質量分析システムを用いて行ってい

まず、RNAiライブラリーを用いたノックダウン実験によます。膠芽腫由来細胞にEGF刺激を与えて解析した結果、り、神経膠芽腫幹細胞の造腫瘍能に、ゲノムのヒドロキシメ

2282種類のリン酸化タンパク質に由来する6072種類のリンチル化にかかわるTET1という遺伝子が必須であることを見

酸化ペプチドが見いだされました。これらのうち、がん化のいだしました。さらに、ヒドロキシル化シトシンに対する抗シグナル伝達で鍵となる分子について、ネットワーク解析を体を用いてhMeDIP-seqを行うことにより、造腫瘍能に重要進めています。

な複数の遺伝子がヒドロキシメチ
ル化されていることも明らかにし【図】 ASBEL によるがん抑制遺伝子 ANA/BTG3 制御モデル

ました。
次に、多くの大腸がんで異常亢進を起こしているWntシグナル伝達系について、シグナルの標的である
がん遺伝子c-Mycの発現を抑制した
大腸がん細胞株を用いたRNA-seq
およびc-Myc抗体を用いたChIPseqのデータから、c-Mycが直接発現を制御している標的長鎖ncRNAの同定を行いました。さらにノッ
クダウン実験により、得られた新規長鎖ncRNAががん細胞の生存・

我々が ASBELと名づけたncRNA の一部は、がん抑制遺伝子 ANA/BTG3 の mRNA の一部と相補的な配列をもち、二本鎖を形成する。これにより、ANA/BTG3 の mRNAが核外に出るのが抑えられ、細胞が造腫瘍能をもつようになる。

遺伝子発現解析を基盤とする細胞がん化シグナルのシステム解析・時系列リン酸化プロテオミクスによる癌細胞増殖浸潤制御システムの解明

13

先導研究
課題 A1

シグナル転写ネットワークのインフォマティクス解析

分担研究

分担機関

背景

成果

理化学研究所統合生命医科学研究センター

分担研究者

岡田眞里子

◆がん化シグナルネットワークを明らかにするには、シグナル伝達系、転写因子、遺伝子発現の 3 つを統合した解析が必要である。
◆しかし、そのような研究はこれまでほとんど行われてこなかった。
◆遺伝子発現データから、活性化された転写因子とシグナル伝達系を推定する手法を開発した。
◆さらに、これを応用して、シグナル伝達阻害剤の効果を判定するアルゴリズムを作成した。
◆ NF-κB シグナル伝達系の応答機構を、実験データに基づく数理モデルで明らかにした。

がん細胞の増殖や浸潤・転移にかかわるシグナルは、細胞行った乳がん細胞の次世代シーケンスデータの転写活性か膜にある受容体で受容され、細胞内のシグナル伝達系を経てら、シグナル伝達阻害剤の効果を評価するアルゴリズムを作

転写因子を活性化します。そして、活性化された転写因子が成しました。この解析の結果、シグナル伝達阻害剤を単剤ま遺伝子の発現を制御します。がんの分野では、シグナル伝達、たは2剤併用で投与した場合、シグナル伝達系そのものをモ

転写因子、遺伝子発現のそれぞれの研究はさかんですが、こニターする場合よりも転写活性をモニターした場合のほう

れらを1つのネットワークとして解析する研究はほとんど行が、精度の高い評価ができることが明らかになりました。

われてきませんでした。

一方、がん細胞の増殖・浸潤・転移にかかわる転写因子

そこで、私たちは遺伝子発現からさかのぼって、どんな転

NF-κBの シグナル伝達系について、実験データに基づいた

写因子とシグナル伝達系が活性化されたかを推定する手法を数理モデルを構築しました。シミュレーション解析と検証開発しました。この手法を、遺伝子発現データ（RNA-seqや実験を繰り返すことにより、NF-κBシグナル伝達系におけChIP-seqのデータ）に適用することにより、着目しているシるIKKからTAK1への正のフィードバック制御を同定しまし

グナル-転写ネットワークを構築することができます。

た。さらに細胞イメージング解析により、この制御機構が、さらに、このような手法を展開することにより、シグナル伝達系の酵素を阻害する薬の効果を、転写活性の阻害の程度

NF-κBの転写活性を単一細胞レベルで決定していることを明らかにしました（図）。

から評価することができます。そこで、実際に、薬剤投与を

細胞膜
細胞質

TAK1 活性（相対値）【図】 B 細胞における NF- κ B シグナル伝達のモデル化
タイムコース活性(90 秒間隔 )
120
100
80
60

TAK1

40
20
0

0

実験により、シグナル伝達系中の1.5 3 4.5 6 7.5 9分子（ TAK1、IKKなど）のリン酸化レベルを時系列で測定した。こ

細胞質
核

遺伝子発現
増殖

14

分化

IKK 活性（相対値）

刺激後時間（分）れらのデータに基づいて数理モデ

120
100
80
60

ルを構築し、シミュレーションを行っ

IKK

40
20
0

生存

シグナル転写ネットワークのインフォマティクス解析たところ、CARMA1 のリン酸化を介した新たな正のフィードバック回
路が見いだされた。この制御が、

0

1.5 3 4.5 6 7.5 9

刺激後時間（分）NF-κB 活性が単一細胞レベルでの応答を示すのに重要な役割を果たしている。

先導研究
課題

A2

代表機関

次世代シーケンサーを活用した
前立腺がんと乳がんの細胞制御システム機構の解明

東京大学大学院医学系研究科

代表研究者

井上 聡

◆前立腺がんと乳がんは性ホルモンに応答して増殖するため、治療にはホルモン療法として性ホルモン受背景

容体を阻害する薬剤が使われてきた。
◆しかし、がんが進行するとホルモン療法が効かなくなり、治療抵抗性を示す場合が多い。
◆このため、ホルモン応答性と治療抵抗性の両方のしくみを解明することが求められていた。
◆ホルモン応答性がん細胞で、性ホルモン受容体の標的となる遺伝子群、マイクロRNA・非コードRNAと、

成果

DNA 中の受容体結合部位・ヒストン修飾部位を同定した。
◆治療抵抗性がん細胞モデルについても次世代シーケンサーを活用した解析を行った。
◆これらにより、ホルモン応答性がんの診断・治療標的となりうる新しい因子とその作用メカニズムを明らかにした。

アンドロゲン（男性ホルモン）とエストロゲン（女性ホル

るのかが明らかになり、また、新たな標的として、マイクモン）は、ホルモン依存性がんとして知られる前立腺がん、ロRNA（miRNA、遺伝子の働きを調節する効果をもつ短い

乳がんの増殖、悪性化に深くかかわっています。これらの性RNA）や長鎖非コードRNA（lncRNA、タンパク質に翻訳さホルモンは、がん細胞にある性ホルモン受容体に結合し、これずにRNAのままで働く長いRNA）を同定することができの信号が細胞内で次々に分子（タンパク質やRNA）を変化さました。

せます。このため、治療には性ホルモン受容体に結合するが、さらに、分担研究で作製された治療抵抗性モデルがん細胞

内部に信号を伝えない薬剤等がホルモン療法として使われてについても、次世代シーケンサーを用いて、同様の解析を行きました。しかし、前立腺がんや乳がんが進行すると、これいました。この解析により、治療抵抗性にかかわる標的因子

らの薬剤では、もはや受容体からの信号を抑えることができが、がん増殖、悪性化においてどのような役割を果たしていなくなってしまい、治療が奏功しなくなってしまいます（治るかが明らかになりました。特に、長鎖非コードRNAの1つ

療抵抗性の獲得）。

（CTPB1-AS）が治療抵抗性前立腺がんの新しい診断・治療

我々は、この問題の解決に資するため、がん細胞が性ホルモンに応答するしくみと、治療抵抗性を獲得するしくみを解明することを目指し、研究を行ってきました。

標的になることを示すことができ、特許を日米に申請しました。

【図】 前立腺がんと乳がんにおける性ホルモン応答因子のネットワークの解析
一次応答
遺伝子

具体的には、まず、ホルモン応答性のがん培養細胞から、ChIP-chip法を

標的因子

遺伝子（標的遺伝子）を独自に同定しました。さらに、次世代シーケンサー
だけ発現しているかの解析（RNA-seq

RNA-seq

ChIP-seq

用いて性ホルモン受容体が働きかけるを用いて、どのような遺伝子がどれ

二次応答
遺伝子

性ホルモン

性ホルモン
受容体

性ホルモン
作用

法、CAGE法など）と、受容体結合部
位やヒストン修飾部位の解析（ChIPseq法）を行い、性ホルモン応答ネッ
トワークの解析を進めました（図）。
これらにより、受容体の標的遺伝子の発現がどのように制御されてい転写因子ならびに
転写調節にかかわる
タンパク質群

ユビキチンリガーゼ
タンパク修飾酵素

基質タンパク質 1
基質タンパク質 2

Proteomics

次世代シーケンサーを活用した前立腺がんと乳がんの細胞制御システム機構の解明

15

先導研究
課題 A2
分担研究

分担機関

背景

ホルモン治療抵抗性モデルがん細胞の作製と乳がん臨床検体におけるホルモン受容体標的因子群の発現機能解析

埼玉医科大学ゲノム医学研究センター

分担研究者

堀江公仁子

◆乳がんの約 6 割はエストロゲン受容体（ ER ）陽性であり、ホルモン療法が有効である。
◆ しかし、ホルモン療法は、5 年以内に約 3 割が耐性化することが問題である。
◆ このため、耐性化に至る乳がんの病態解明と新しい分子標的の同定が求められていた。
◆前立腺がんのアンドロゲン受容体作用に抑制的な転写因子 FOXP1は、乳がんでは ER 作用を増強させる

成果

ER 標的因子であった。
◆ FOXP1高発現乳がんは術後ホルモン療法の予後良好なマーカーであった。
◆ FOXP1は他の転写因子と協調して ER 作用を調節することを見いだした。

本分担研究では、前立腺がんおよび乳がんの標準細胞からさらに、各因子をノックダウンした状態でエストロゲンに反治療抵抗性モデルがん細胞を作製し、研究班内の研究機関に応する遺伝子発現をRNA-seqにて解析しました。以上を統供給しました。

合的に解析して、エストロゲン受容体ネットワークにおけ乳がんに関して、我々はエストロゲン受容体（ER）の標的

るER転写作用とその共役因子の調節作用を明らかにし、ホ因子群の発現と機能を解析し、ホルモン療法耐性化に至る病

ルモン療法耐性を克服しうる乳がんの新たな分子標的を同定態の解明と新しい分子標的を同定することを目指してきました。

し、臨床応用を目指したいと考えています。

乳がんの約6割はER陽性であり、エストロゲン依存性の増殖を呈するため、おもに術後に抗エストロゲン薬のタモキシ
フェンや、閉経後ではエストロゲン産生酵素アロマターゼの【図】 乳がん組織におけるFOXA1/FOXP1の免疫染色性と術後タモキシフェン治療予後の相関性阻害薬を用いるホルモン療法が有効です。しかし、タモキシ
フェン療法開始5年以内に約3割は耐性化することが臨床上問題となっています。
ERなどのホルモン受容体には転写作用を調節する共役因子の存在が知られていますが、我々は先に、前立腺がんのアンドロゲン受容体（AR）標的因子であるフォークヘッド

FOXA1

FOXP1

転写因子FOXP1は、AR作用を抑制することを明らかにしました。一方、乳がんではFOXP1はER標的因子であるものの、ER作用を増強する共役因子であることを細胞実験で見いだしました。さらに、乳がん臨床検体の病理組織学的検討により、FOXP1の発現がERや他のフォークヘッド転写因子FOXA1の発現と正に相関し、乳がんの予後にかかわる因子であることがわかりました。特に、FOXP1とFOXA1の同時陽性がんでは、タモキシフェン治療の予後良好マーカーとなることを見いだしました（図）。以上から、FOXP1とFOXA1は協調して、ERによる転写調節にかかわっていると予想されました。
FOXP1がERおよびFOXA1とどのように協調して作用するかを分子レベルで解析するため、乳がん細胞におけるFOXP1とFOXA1が同時陽性症例では、術後タモキシフェン療法での無ChIP-seqを行って、3因子のゲノム結合領域を調べました。

再発生存率が良好である。

16

ホルモン治療抵抗性モデルがん細胞の作製と乳がん臨床検体におけるホルモン受容体標的因子群の発現機能解析

先導研究
課題 A2
分担研究

分担機関

乳がん細胞におけるマイクロRNA発現
プロファイルの網羅的解析

自治医科大学ゲノム機能研究部※

分担研究者

間野博行

※分担研究者の現在の所属は東京大学大学院医学系研究科

背景◆エストロゲン依存性乳がんの治療抵抗性獲得には、エストロゲン受容体のシグナル伝達経路が関与していると考えられる。
◆遺伝子の発現を制御するマイクロ RNA の中に、治療抵抗性獲得に関係しているものがあると予想される。
◆次世代シーケンサーによるデータと独自の解析パイプラインにより、乳がん細胞と治療抵抗性細胞で発成果

現が変化する miRNA を同定した。
◆前立腺がんにおいても同様の miRNA を同定した。
◆これらは、がん細胞の治療抵抗性獲得に関与していることが示唆される。

乳がんの治療では、はじめは奏功していたタモキシフェン

ました（図）。これらの中には、乳がんにおいて発現上昇をが、治療を続けるうちに効かなくなることがあります。閉経示すことがすでに報告されているmiR-21 に加え、機能が未後の患者さんに使われるアロマターゼ阻害剤も同様です。こ同定のmiRNA も多数含まれていました。これらのmiRNAのような治療抵抗性の獲得には、エストロゲン受容体（ER）の乳がん臨床サンプルにおける発現を解析し、がん組織で発からのシグナル伝達経路が密接にかかわっていると考えられ現変動するものを明らかにしました。これらのmiRNAは、ます。

治療抵抗性に関与していることが示唆されます。

なかでも私たちが注目しているのは、マイクロ RNA

同様に、アンドロゲン依存性前立腺がん細胞株LNCaP、（miRNA）です。miRNAは長さが20数塩基のRNAで、自分

アンドロゲン阻害剤抵抗性の細胞株BicR、アンドロゲン枯と相補的な配列をもつメッセンジャーRNA（mRNA）の翻

渇処理を行ったLTAD/BicRを用いて、前立腺がんの治療抵

訳をブロックします。乳がんの増殖・転移などにかかわるこ抗性に関与すると考えられるmiRNAを同定しました。

とが明らかにされつつありますが、治療抵抗性獲得との関係

こうして得られたデータを、本分担研究
で独自に開発したパイプラインにより解析しました。その結果、MCF-7と比較して、TamR やLTED において発現上昇も
しくは発現減少を示すmiRNA が同定され

0.3

6

0.10

0.2

4
2

0.1

0

0

0.05
0
LTED

て次世代シーケンサーで配列決定しました。

0.15

TamR

な時系列の細胞から低分子RNAを抽出し0.4

MCF-7 No.2

はタモキシフェンをそれぞれ添加し、様々

8

0.20

MCF-7 No.1

れら3種類の細胞株にエストロゲンあるい

10

miR-C

0.25

0.5

LTED

つ）を用いました。代表機関において、こ

12

TamR

アロマターゼ阻害剤耐性に似た性質をも

miR-B

0.6

MCF-7 No.2

ストロゲン枯渇処理を行った株（LTED：

0.7

MCF-7 No.1

株、タモキシフェン耐性株（TamR）
、エ

14

LTED

されたヒト乳がんモデル細胞MCF-7の親

miR-A

TamR

解析には、堀江准教授の分担研究で作製

16

MCF-7 No.2

miRNAの探索を行いました。

【図】 乳がん細胞と治療抵抗性細胞で発現が変化する miRNA の同定

MCF-7 No.1

担研究では治療抵抗性の獲得に関係する

miRNA 発現量（内部標準に対する相対値）

はまだわかっていません。そこで、本分

次世代シーケンサーで得た低分子 RNA の配列データから、乳がんモデル細胞（ MCF-7 ）と治療抵抗性モデル細胞（ TamR、LTED ）で発現が変化するmiRNAを抽出し、実際の発現量変化を定量
PCRにより確認した。ここでは3つの例を示す。
乳がん細胞におけるマイクロ RNA 発現プロファイルの網羅的解析

17

先導研究
課題

A3

代表機関

細胞比率制御ネットワークと細胞ヘブ学習則の解明

理化学研究所生命システム研究センター

代表研究者

上田泰己

◆発生・再生現象では、1 種類の細胞から複数種類の細胞が適切な比率で生成されるが、この比率制御のし背景くみは解明されていない。
◆細胞は分化状態を記憶しているが、その基盤となる、細胞のエピジェネティック状態の変化の法則は理解されていない。
◆高精度な1細胞RNA-seq法の開発により、マウス初期胚の細胞比率制御にかかわると想定される因子の同定を行った。

成果◆高効率なゲノム編集技術とマウス初期胚の細胞比率制御を組み合わせることで、発生工学の手法に革新をもたらす高速・並列なマウス遺伝学の確立を試みた。
◆エピジェネティクス学習則の数理モデルの構築を行った。

発生・再生現象では、1種類の細胞から複数種の細胞が適性が変化する遺伝子を利用して、分化状態のレポーター系を切な比率で生成される必要がありますが、この比率を制御す確立しました。この系を用いて、各分化段階での概日リズムる遺伝子ネットワークは解明されていません。一方、「細胞遺伝子のプロモーター領域におけるDNAメチル化を網羅的は分化状態を記憶し、生涯忘れない」というヘブ学習則が知に探索し、振動を学習する素過程に必要なエピジェネティク

られています。そのしくみは、細胞が分化するときに、遺伝

ス変化の同定を進めました。また、ヘブ学習則の数理モデル

子発現量の速い微小な変動（ゆらぎ）が、クロマチン状態のを構築し、エピジェネティクス学習則による遺伝子ネット

安定で顕著な差に変換されることだと考えられていますが、ワークからの振動の発信を立証しました。これらの研究をさ

この変換のダイナミクスは包括的・定量的には理解されていらに進め、遺伝子発現のゆらぎがクロマチン状態の変化に移ません。そこで本課題では、マウスの初期発生を対象とし、り変わるしくみの解明を目指していきます。

細胞比率制御とヘブ学習則という2つの原理の解明を目指し【図 1 】 Quartz-seq： 高精度 1 細胞 RNA-seq

ました。
マウスの受精卵は2細胞、4細胞・・と分裂し、最終的には
栄養外胚葉・原始内胚葉・エピブラストの3つになります。
本課題では、1細胞に含まれる微量のRNAを増幅して高精度に検出できる新規のRNA-seq法（Quartz-seq）を開発しましES細胞

高い定量性により、細胞状態マーカー
遺伝子の細胞ごとの発現ゆらぎが検
出可能

PrE細胞

た（図1）
。この手法を応用し、8細胞期胚の1細胞シーケンス
を進め、8細胞期胚の細胞中のゆらぎがその後の細胞運命決定にどのように影響するかを検討しました。同時に、受精卵から桑実胚にいたる胚の遺伝子発現のデータを得て、細胞比

Sasagawa et al. Genome

Biology 2013

【図 2 】 セルイノベーションから個体イノベーションへ
次世代型発生工学に資する技術基盤の開発
3i 培地＋
8-cell インジェクション

率制御にかかわると想定される因子の同定を進めました。これら平均とゆらぎの情報を組み合わせることで、16細胞期
胚以降の内層と外層の細胞比率制御の一端を解明できると考

ES細胞
樹立
ゲノム
改変

ゲノム改変 100%キメラを用いた F0 表現型解析

えています。さらに、初期胚における細胞比率を人為的に制御することで、高効率なESマウス（100％キメラマウス）法と高効率なゲノム改変法とを組み合わせた次世代型マウス遺伝学手法の確立を進めています（図2）。

最初に生じる「差異」の制御

一方、ヘブ学習則については、分化によって現れる表現型
として概日周期に着目し、概日周期によってプロモーター活18

細胞比率制御ネットワークと細胞ヘブ学習則の解明

解析個体の高速な交配なし作製→次世代の医科学への応用

先導研究
課題

A4

代表機関

背景

初期発生における雌雄染色体
コリオグラフィーについての革新的研究

東京大学エピゲノム疾患研究センター

代表研究者

白髭克彦

◆哺乳類の初期発生では、受精直後に卵と精子の染色体において、大規模なゲノムの再構築が起こる。
◆しかし、大量の試料の準備が難しいことなどから、ゲノム科学的な研究は進んでいなかった。

◆良質なマウス卵を大量に採取する方法を確立し、140,000 個以上を採取した。

成果◆これらを用いて、未受精卵、正常発生、単為発生における全転写産物を解析し、発生プログラム開始の鍵となる遺伝子群を同定した。
◆ ChIP-seq の高感度化技術を開発し、シーケンス拠点での解析に協力した。

哺乳類では、受精直後に卵染色体と精子染色体のゲノムがます。

それぞれ再構築されて別々の前核となり、2-４細胞期までは、以上の研究を進める過程で、微量サンプルからChIP-seq

雌雄の染色体が混じり合わないまま、発生プログラムが進みを行えるよう、解析系を改良して感度を上げることにも成ます。この過程は個体形成においてきわめて重要ですが、ゲ

功し、この技術を中心にシーケンス拠点の解析に協力しま

ノム解析に必要な量の哺乳動物の卵や初期胚を調製するのがした。さらに、新規のエピゲノム修飾として、コヒーシン

困難なことなどから、これまでゲノム科学的な知見はほとん（DNAに結合するタンパク質の一種）のアセチル化を明らかど得られていませんでした。

にしました。

そこで、本課題ではまず、手作業によるマウス卵の大量採取方法を確立し、140,000個以上もの高品質卵を採取しました。これらを用いて未受精卵、正常発生（8細胞期直前まで）、【図】 マウス初期胚の大規模 RNA-seq 解析で明らかになった転写産物の内訳と推移

単為発生（1細胞期と4細胞期）における全転写物を次世代シーケンサーで解析し、遺伝子発現を網羅的かつ高解像度に明らかにしました（図）。その結果、新たに5364個の新規転写産物を同定しました。さらに、精子に関する既存データも利用して、正常な発生プログラム開始の鍵となる約800個の遺伝子群を特定しました。
従来、発生開始段階の転写プログラムはあくまで卵が主役であり、卵が転写制御ネットワークを巧みに操り発生を促進する能力を備えていると考えられてきました。しかし、転写解析からは、精子が正常な発生のための転写プログラムに必須の役割を果たしていることが明らかになりました。また、新規に同定した遺伝子の多くが、プロモーター領域に特徴的な転写因子結合部位をもち、受精後に速やかに転写が開始されると考えられました。
さらに、精子、卵、2細胞期胚のDNAメチル化とヒストン
修飾のプロファイルも解析し、精子と卵のクロマチン構造を明らかにしました。これらと上の転写産物解析と合わせることにより、受精段階では雌雄染色体が従来考えられていた以詳しい解析データはhttp://dbtmee.hgc.jp/で公開中。

上にダイナミックな動態を示すことを明らかにしつつあり
初期発生における雌雄染色体コリオグラフィーについての革新的研究

19

先導研究
課題 A4
分担研究

分担機関

背景

ライブイメージングと細胞生物学的手法による
雌雄染色体コリオグラフィーの研究

東京工業大学大学院生命理工学研究科

分担研究者

伊藤武彦

◆受精に伴って精子クロマチンでは、大規模な再構築が起こる。
◆この過程を解明するには、無細胞系で精子クロマチンの再構築を起こさせる必要があるが、哺乳類では成功例がない。
◆精子クロマチンの再構築を無細胞系で再現できる条件を見いだし、再構築を効率よく起こさせることに

成果

成功した。
◆代表機関に協力して雌雄染色体の DNA メチル化解析とタンパク結合プロファイル解析のためのプログラ
ムを開発した。

卵と精子のクロマチンは、受精直後に再構築され、大きく見いだしました。これらの知見を生かし、精子核をまず透明構造が変わります。精子の中では、DNAがプロタミンとい画分で処理（1st 処理）してから、透明画分と不透明画分でうタンパク質によって強く凝集していますが、受精によって処理（2nd 処理）することにより、前核の形成と膨大化が効

この凝縮がとけ、今度はヒストンなどのタンパク質と結合し率よく起こることを見いだしました（図）。

ます。さらに、核膜が形成されて雄性前核となり、これが膨

この無細胞系を用いて、精子核が雄性前核に変化する過程

大化します。

を蛍光顕微鏡でライブイメージング観察することができまし精子クロマチンが再構築される過程についての研究は、こた。また、この過程で働く酵素を細胞生物学的な手法で解析れまでおもにツメガエル由来の無細胞系を用いて行われてきしました。

ました。しかし、再構築過程やその機構は、動物種によってこれらの研究とは別に、代表機関に協力して、ChIP-seq

異なることが明らかとなってきています。哺乳類での再構築

データとRNA-seqデータの一次解析プログラムを開発し、の研究には、哺乳類由来の無細胞系が必要ですが、これまで

雌雄染色体のDNAメチル化解析とタンパク結合プロファイ実現された例はありませんでした。そこで、本分担研究では、

ル解析に貢献しました。

大杉美穂・東京大学准教授とともにマウス由来の無細胞系の開発に取り組みま【図】 卵抽出液処理法の違いによる精子核の形態変化の違いした。

精子核の経時的な形態変化

無細胞系は、卵細胞から卵クロマチン

0分を起こさせるには、様々な条件の検討が必要でした。まず、マウスから採取した卵細胞をそのまま処理して卵抽出液を得た場合には、再構築が進みませんでし

抽出液処理
1st 処理構築への影響がそれぞれ異なることも

20

精子核

2nd 処理

脱凝縮
核膜小胞集合ヒストン取込

核膜小胞融合

前核形成

前核膨大化

・精子核は形態変化しない
・DNA の認められない前核様構造物形成

不透明画分

不透明画分に分かれ、精子クロマチン再

180 分

不透明画分

細胞を電気刺激で賦活化し、少し時間をますが、その際、卵抽出液が透明画分と150 分

精子核の脱凝縮およびヒストン取込

透明画分

また、卵抽出液は遠心分離によって得

120 分

透明画分

た。検討の末、卵抽出液を得る前に、卵おく必要があることを見いだしました。

90 分

受精卵

を除いた卵抽出液と精子核を組み合わせたものです。精子クロマチンの再構築

45 分

精子核は脱凝縮せず，核膜形成因子が集積

+

透明画分

透明画分
+

不透明画分

膨大化前核の形成

最下段の2 段階処理により、前核の形成と膨大化を効率よく実現できた。

ライブイメージングと細胞生物学的手法による雌雄染色体コリオグラフィーの研究

先導研究
課題

A5

代表機関

神経細胞機能に着目した、
ミトコンドリア呼吸鎖異常を起こす
遺伝子変異の系統的な探索

埼玉医科大学ゲノム医学研究センター

代表研究者

岡﨑康司

◆ミトコンドリア呼吸鎖異常症（ MRCD ）は難病に指定されており、有効な治療法はほとんど確立されていない。

背景◆ MRCD 患者の約 70%ではミトコンドリア DNA に異常が見つからず、そのほとんどが、核 DNA にコードされた遺伝子異常によると考えられている。
◆ MRCD の原因遺伝子をつきとめ、診断と治療に応用することは喫緊の課題である。
◆次世代シーケンサーで患者の DNA 塩基配列を読むことにより、MRCD の原因候補遺伝子を同定した。

成果◆患者由来の細胞に対して正常型の遺伝子を導入する実験や、健常人細胞を用いて遺伝子を抑制する実験
により、いくつかの症例で原因遺伝子を確定した。
◆患者由来の iPS 細胞から分化誘導した神経細胞において、ミトコンドリア機能の異常を描出できた。

ミトコンドリア呼吸鎖異常症（MRCD）は、小児の先天代謝異常症の中では最も頻度が高く、特に神経や筋肉に症状がられていなかった新規遺伝子についても原因遺伝子として確定できる可能性が高いと考えています。

現れます。その原因は、核DNAやミトコンドリアDNAにあ

一方、患者由来の線維芽細胞からiPS細胞を作製し、それる遺伝子の異常と考えられていますが、核DNAの原因遺伝

を神経細胞に分化させて患者の病態を再現する試みも進めま子の同定と発病メカニズムの解明は、これまであまり進んでした。ヒトiPS細胞作製方法を改良して従来の30倍の効率でいません。本課題では、核DNAに存在する原因遺伝子を同

良質なiPS細胞を得る技術を確立し、さらに、iPS細胞から定し、その知見を診断や治療に応用することを目指してきま神経細胞への分化能を従来の60倍に向上させることにも成した。

功しました（どちらも特許申請済み）。これらの技術により、埼玉医科大学には、MRCDの患者さんの臨床検体が数多6検体から神経細胞の分化誘導に成功し（図2）、この神経細く蓄積されています。私たちは、呼吸鎖酵素活性測定法と呼胞を用いてミトコンドリアの動態を観察し、異常所見を描出

吸鎖の複合体形成を検出するBN-PAGE電気泳動法を組み合することができました。

わせて、これら検体の呼吸鎖タンパク質複合体の機能異常を調べました。これにより確定診断がついた検体について、シーケンス拠点の協力を得て、核DNAのエキソーム（ゲノ【図 1 】 患者検体のエキソーム解析により同定された
MRCD の原因候補遺伝子

ムDNAのうち、タンパク質をコードする部分の全塩基配列）

12 12

データを得ました。
2013年12月現在、148検体のデータを解析し、図1のように候補遺伝子の結果を得ています。これらが原因遺伝子かど
うかを最終的に確定するため、細胞レベルでミトコンドリア
機能への影響を調べる実験を行いました。患者由来の細胞に変異のない原因候補遺伝子を導入したときにミトコンドリア
機能が回復するかどうか（レスキュー実験）と、健常人の細胞で原因候補遺伝子を抑制したときにミトコンドリア機能が低下するかどうか（ノックダウン実験）を検証し、148検体のうち16例で原因遺伝子を確定、9例でほぼ確定しました。

0

31

25

11
50

53
75

100

29
125

150

●ミトコンドリア DNA 変異 12 例（変異 10 例＋変異疑い 2 例）
●染色体の微細構造異常 12 例
●既知の原因遺伝子における変異 31 例
●ミトコンドリア局在と考えられる遺伝子における変異 11 例
●上記に当てはまらない検体での新規原因遺伝子候補 53 例
●候補が得られなかった検体 29 例

【図 2 】 患者由来 iPS 細胞からの神経分化誘導例
iPS 細胞

神経細胞

これらの多くは、すでにMRCDの原因遺伝子としては知られているものの、これまでに報告のない新しい変異をもつものでしたが、今後はこれまでMRCDへの関与がまったく知神経細胞機能に着目した、ミトコンドリア呼吸鎖異常を起こす遺伝子変異の系統的な探索

21

先導研究
課題

A6

代表機関

背景

網羅的スプライシング暗号解析に基づくRNA病の解明と治療技術の探索

京都大学大学院医学研究科

代表研究者

萩原正敏

◆高等動物では、選択的スプライシングにより限られた数の遺伝子から多様なタンパク質がつくられる。
◆選択的スプライシングの異常は、様々な病気に関係することがわかってきた。
◆選択的スプライシングの制御機構の解明は、発生現象の理解や病気の治療法開発に役立つ。
◆ mRNA 制御因子である RNA 結合タンパク質のノックアウトマウスの作成・解析を行い、その制御配列の成果

同定と機能を明らかにした。
◆ mRNA 制御機構の重要性を見いだし、スプライシング暗号の解読に成功した。
◆独自のレポーターを用いて選択的スプライシングを操作できる化合物を見いだし、医療応用への道を開いた。

次世代シーケンサーによる大規模なトランスクリプトーを哺乳類培養細胞やマウス生体でイメージングする独自技術

ム解析により、哺乳類のような高等生物の発生過程や臓器・をさらに改良・発展させることで、筋ジストロフィーの原因

細胞の機能を司る上で、限られた数の遺伝子から多様なタ

遺伝子ジストロフィン、家族制自律神経失調症の原因遺伝子

ンパク質を創出するmRNAの選択的スプライシングの重要

IKBKAPなどについて、選択的スプライシング制御パター性が明らかになってきました。本課題は、組織あるいは発ンを可視化できるレポーターを作成しました。これらを用い生段階に特異的な選択的スプライシング制御機構を解明し、て、疾患特異的なスプライシング機構を解明するとともに、

mRNA制御異常に起因する難治のRNA病治療技術への展望

化合物ライブラリーをスクリーニングし、このスプライシンを開くことを目的として行われました。

グを是正する候補化合物を見いだしました。特に、TG003

未成熟mRNAから、特定のタンパク質をつくるのに必要な部分だけを切り出してつなぐスプライシングは、未成熟
mRNA中の制御配列に、制御因子であるRNA結合タンパクという化合物がデュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状緩和に有効である可能性を見いだしました。
【図】 大脳皮質形成過程におけるスプライシング制御の解析

質が結合することにより制御されています。我々は、最新のiCLIP（RNA結合タンパク質を免疫沈降して、結合している
RNAを高速シーケンサーで同定する手法）を用いて未同定の制御配列を解析する一方、種々のRNA結合タンパク質について網羅的な発現解析と組織特異的ノックアウトマウスの作成・解析を行いました。これらにより、スプライシング暗号を網羅的に解読することができました。
その成果の1つとして、RNA結合タンパク質PSFが、発生過程のマウス胎仔脳において大脳皮質板の神経細胞に特異的に発現することを見いだしました。PSFを神経特異的にノッ
クアウトしたホモ変異体では、大脳皮質を中心とした著しい脳欠損が見られ、PSFが神経発生に必須の因子であることがわかりました。さらに、ノックアウトマウスの脳サンプルを用いたトランスクリプトーム解析とCLIP解析から、PSFの機能を明らかにしました（図）。この成果は、精神神経疾患の発症とmRNA制御異常の関係を探る手がかりともなるものです。

ク質 PSF をノックアウトした脳サンプルで、トランスクリプトーム
解析と CLIP 解析を行った結果、PSF は未成熟 mRNA の転写中に結合すること、PSF の欠損により 100kb を超える長鎖未成熟 mRNA

また、我々の開発した、選択的スプライシングのパターン

22

発生過程のマウス胎仔脳において特異的に発現する RNA 結合タンパの発現が特異的に減少することを見いだした。

網羅的スプライシング暗号解析に基づく RNA 病の解明と治療技術の探索

先導研究
課題 A6
分担研究

分担機関

背景

成果

スプライシング操作化合物の開発

東京医科歯科大学生体材料工学研究所

分担研究者

細谷孝充

◆デュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因である異常スプライシングを操作し、症状を軽減する可能性のある化合物が見つかった。
◆異常スプライシングを是正できる化合物は、関連する病気に対する治療薬になりうる。
◆合理的な設計指針によって化合物の構造を最適化し、阻害活性が高く、副作用を起こしにくい薬剤の候
補化合物を取得できた。
◆この設計指針は、副作用の低減を目指した他の薬剤の設計にも活用できると期待される。

本分担研究では、代表機関と共同で見いだしたスプライシした。さらに、DYRK1Aに対する阻害活性をもつことが知ング操作化合物の構造最適化を図ってきました。特に、デュられているHarmineという植物アルカロイドの骨格をもとシェンヌ型筋ジストロフィーの原因遺伝子であるジストロに、5種類の化合物を設計・合成し、TMD-552を得ました（図フィンの異常スプライシングを是正する化合物TG003（図1）2）。Harmineは別の酵素も阻害しますが、TMD-552は阻害の標的の一つであるリン酸化酵素DYRK1Aに対する阻害剤

しませんでした。

の開発に力を入れました。

このように、特異性が高く、副作用を起こしにくい化合物

TG003がDYRK1Aの阻害剤として働くことがわかったのを取得できたことは、我々の設計指針が正しかったことを示で、その構造をもとに、より特異性が高く、かつ低毒性が期しています。今後は、TMD-446とTMD-552の体内での代謝待できる化合物の取得を目指して分子設計を行い、約50種類

安定性を高めることを目指して研究を展開するとともに、今の化合物を合成しました。分子設計にあたっては、TG003

回の設計指針が他のリン酸化酵素阻害剤にも応用できるか、のベンゾチアゾール骨格をもとにした展開に加え、別の骨格検討していきます。

でTG003と同様のファーマコフォアをもつ化合物からの展
開も行いました。ファーマコフォアとは、薬剤が標的酵素に【図 1 】 TG003 の構造O

S

対して活性を発揮するのに必要な官能基とその配置のことです。DYRK1Aと阻害剤の共結晶構造などから、TG003のメ

N

H₃CO

トキシ基とカルボニル基が重要であると考え、それらの配置が維持されるように化合物を設計しました。
ab

そのタンパク質量を減少させることが見いだされました。
TMD-446はTG003とは異なり、DYRKファミリーの他の酵素には作用せず、特異性の高い阻害剤であることもわかりました。また、澁谷浩司・東京医科歯科大学教授との共同研究

EGFP
GAPDH（コントロール）

1

2

4

8

16

100

50

0

（−）

誘導される神経系発生異常を、TMD-446が是正できること

Harmine

により、ツメガエル受精卵へのDYRK1A過剰発現によって濃度（μ M ） 0
FLAG-DYRK1A

TMD-552

TMD-552

討した結果、新規化合物TMD-446がDYRK1Aを阻害し、【図 2 】 TMD552 の作用
MAO-A 活性（相対値）（%）

合成した化合物のDYRK1Aに対する作用を代表機関で検を確かめました。

30 μ M

さらに、伊藤暢聡・東京医科歯科大学教授との共同研究に

a) FLAGタグを付加したDYRK1A（FLAG-DYRK1A ）とEGFPを発現する

より、DYRK1AとTMD-446との結合様式を予測し、構造展細胞をTMD-552で処理後、それぞれのタンパク質量を調べた。TMD-552

開を進めました。新たに12種類の化合物を合成し、その中か
ら阻害活性が高く安定な化合物であるTMD-538を取得しま

は濃度依存的にFLAG-DYRK1Aを減少させた。b) モノアミン酸化酵素
MAO-Aに対する阻害作用をHarmineとTMD-552で比較した。Harmineはこの酵素を阻害するのに対し、TMD-552はほとんど阻害しなかった。
スプライシング操作化合物の開発

23

先導研究
課題 A6
分担研究

分担機関

背景

成果

エクソン特異的アレイ・CLIP によるスプライシング制御配列の網羅的解析

名古屋大学大学院医学系研究科

分担研究者

大野欽司

◆選択的スプライシングを制御する RNA 結合タンパク質は、がんや神経疾患など様々な病気に関係する。
◆ CLIP-seq 法により、RNA 結合タンパク質の結合部位を網羅的に解析することが可能である。

◆がんや神経疾患に関係する FUS という RNA 結合タンパク質について、CLIP-seq 法と他の手法を組み合わせて機能解析を行った。
◆FUSはRNAポリメラーゼII（ Pol II）による転写を遅くするように働き、本来より短い転写産物をつくらせることがわかった。

スプライシングの制御は、未成熟mRNA中の制御配列に、的に解析しました。また、マウス培養細胞でshRNAにより制御因子であるRNA結合タンパク質が結合することによりFus 遺伝子をノックダウンし、エクソンアレイを用いて網羅行われます。我々は、目的のタンパク質が、生体内でRNA的スプライシング解析を行いました。さらに、Fus 遺伝子をのどの部位に結合しているかを網羅的に解析できるCLIP-

ノックダウンしたN2A細胞を用いて、Pol IIのChIP-seqをseq法と、エクソンアレイを用いて、疾患に関連する種々の行い、Pol IIによる転写の制御を解析しました。これらによRNA-seq結合タンパク質の生理的機能を解析しています。

り、FUSが部位特異的にPol IIの転写を抑制し、細胞特異的

ここでは、集中的な解析を行ったFUSというRNA結合タンに様々なスプライシングを制御することを見いだしました。

パク質についての解析結果をご紹介します。

さらに、この研究の過程で、FUSが本来より短い転写産

FUSは、腫瘍や筋萎縮性硬化症（ALS）にかかわることが物（short isoform transcript）の発現に関与していること知られていますが、その機能は、RNAポリメラーゼII（Polが明らかになってきました。そこで、RNA-seq によりFus

II）と相互作用することなどが断片的にわかっているだけで遺伝子をノックダウンしたN2A細胞で発現が低下するshort

した。Pol IIによる転写の速度が遅くなることにより、スプ

isoformを検出し、その転写終結点周辺に多量のFUSが結合

ライシングが促進されることは知られており、その点に注目していることをCLIP解析から、Pol IIも集積していることをしつつ、研究を進めました。

ChIP-seqから明らかにしました。これらの結果から、FUS

我々は、マウス大脳とマウス神経芽腫由来細胞株N2Aを用いてCLIP-seq解析を行い、FUSのRNA結合部位を網羅による転写の早期終結制御について、図のようなモデルを提案しました。

【図】 FUS による早期転写終結制御モデル

FUSが、新生 RNAの代替ポリAシグナル下流に結合し、Pol II による転写を抑制する。FUSは、CPSFのポリA
シグナルへの結合を促し、ポリアデニル化を進行させる。これにより、短い転写産物の発現量が増加する。失速したPol II は、ポリアデニル化の進行に伴い、早期転写終結を生じる。以後の転写が行われないため、長い転写産物の発現量は減少する。

24

エクソン特異的アレイ・CLIP によるスプライシング制御配列の網羅的解析

先導研究
課題

B1

理化学研究所脳科学総合研究センター

代表機関

背景

成果

細胞個別的シーケンス解析のための
光学的サンプリング技術の開発
代表研究者

宮脇敦史

◆遺伝的に均一な細胞群でも、個々の細胞の細胞周期、日内周期、ストレスなどの状態は異なる。
◆従来は、こうした異質性を無視して多数の細胞を集め、遺伝子産物のシーケンスを行ってきた。
◆特定の状態にある細胞の遺伝子発現を解析するには、そうした細胞だけを選別する技術が必要である。
◆細胞周期プローブ Fucciを段階的に発展させ、G1、S、G2に加えてG0を検出できるプローブを作製した。
◆ Fucci プローブは本プログラム外でも、がんや幹細胞などの研究に大きく貢献している。
◆酸化ストレスプローブと、レチノイン酸プローブを開発した。

細胞社会は常に異質です。たとえ遺伝的に均一な細胞からす。プローブを利用した光学顕微鏡下でのサンプリング技術

なる社会においても、個々の細胞は、細胞周期、日内周期、に関しても、蛍光タンパクを用いるアイデアはできあがってストレスなどの程度が異なる状態にあります。従来は、こうおり、今後、次世代シーケンサーの高感度化を待ちながらそした異質性を無視して十把一絡げにたくさんの細胞を集め、の実現を目指していきます。

遺伝子産物をサンプリングしてシーケンス解析を行ってきました。しかし、状態に応じて縦横に変化する遺伝子発現を解析するためには、特定の状態にある細胞群を選別する技術が【図 1 】 細胞周期を可視化できるプローブの開発とそれを発現するマウスの作製必要です。

SCFSkp2

そ こ で、我々は リ ア ル タ イ ム に 個々の 細 胞 の 細 胞 周

S/G2
late M/G1

APCCdh1late M/G1

S/G2

期 進 行 を 可 視 化 す る 蛍 光 プ ローブ Fucci（ Fluorescent

Geminin

Cdt1

Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator）を開発し、改(accumlation in S/G2/M)(accumlation in G1)

良・改善を進めてきました。第三世代Fucciプローブを導入したHeLa細胞を、細胞周期G1、S、G2、Mに沿って7分画にFACS でソートし、CAGE法による遺伝子発現解析を行っ

Red Fluorescent Protein

hCdt1（ 30/120 ）たところ、従来の細胞分別手法に比べて信頼性が高いこと

Green Fluorescent Protein

hGem（ 1/110 ）が確認できました。さらに、7分画のうち特定の画分で発現が増減する機能未知の遺伝子およびマイクロRNAを新たに同定しています。G1、S、G2期を区別できる第四世代Fucci
プローブや、G0を同定するFucciプローブなどの開発を達成

第一世代 Fucci
開発・改良
第三、四世代 Fucci
2011, BMC CB
2013, Development

しています（図1）。また、Fucciプローブを恒常的に発現する形質転換マウスを作製しました。
さらに我々は、細胞内の酸化ストレスを可視化するプロー【図 2 】 レチノイン酸を検出するプローブ GEPRA

ブを開発しました。それを恒常的に発現する細胞株を用いると、薬物に応答して起こる酸化ストレスを再現性よく検出することができます。また、レチノイン酸を検出するFRET

レチノイン酸
レチノイン酸受容体 LBD型プローブGEPRAを開発しました（図2）。GEPRAは、生体の様々な場におけるレチノイン酸分布の観測に役立つと期CFP待されます。

FRET 効率

Fucciをはじめとする機能プローブの開発によって、細胞の異質性が生まれるメカニズムの理解が深まると考えていま

YFP

細胞個別的シーケンス解析のための光学的サンプリング技術の開発

25

先導研究
課題

B2

代表機関

細胞解析研究革新のための高性能エピゲノムシーケンス技術の開発

東京大学大学院理学系研究科

代表研究者

伊藤隆司

◆ DNA のシトシンメチル化は、遺伝子の働き方を調節するエピゲノムの機構の 1つとして重要である。

背景◆全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ WGBS ）により、DNA メチル化を一塩基解像度でゲノム全体にわたって調べることが可能になった。
◆しかし、従来法では、多量のDNAを出発材料として必要とする上に、DNAを増やすための増幅操作も必要だった。

成果◆従来法の150分の1というわずかな量のDNAから、増幅操作なしでWGBSを行える新技術「PBAT法」を開発した。
◆PBAT法により、少量しか採取できない細胞でもDNAメチル化のゲノムワイド一塩基解像度解析が可能になった。
◆プログラム内外の研究者への技術講習を通じて、PBAT 法の普及を図っている。

DNAのシトシンメチル化は、遺伝子の働き方を調節するうためであることを突き止めました。そして、これを解決す

エピゲノムの重要な機構の1つです。メチル化部位は細胞のる手段として、バイサルファイト処理をしてからアダプター

分化や病気の進行に伴って変化するため、メチル化のパターを付加するPBAT（Post-Bisulfite Adaptor Tagging）法をンを解析することは、細胞の機能を理解する上で大きな意味考案しました。実験操作の順序を変えただけですが、その効をもっています。

果は絶大で、従来の150分の1にあたる30ngのDNAから、増我々は以前から、次世代シーケンサーを用いてゲノム全体幅なしでWGBSを行うことが可能になりました。

のメチル化部位を一塩基解像度で明らかにする全ゲノムバ

PBAT法を用いた分担研究（平成23年度終了）や共同研究

イサルファイトシーケンシング（WGBS）の開発に取り組ん

では、各発生段階のマウス胎仔から分離した神経幹細胞の解できました。しかし、従来の方法では、出発材料として哺乳析（図）やマウスの卵子の解析など、少数しか得られない細類細胞100万個に相当する5µgものDNAを必要とする上に、胞の一塩基解像度メチローム解析が成功して、新しい知見にDNAを増やすための増幅操作も必要でした。そこで、本課

つながっています。さらに、PBAT法を広く使っていただけ

題では、「従来の10分の1以下のDNAから出発し、増幅操作

るよう、海外や企業も含むプログラム内外の研究者に対してなしで哺乳類ゲノムの解析を行う」ことを目標としました。

技術講習を行ってきました。

従来法では、WGBSの試料を「DNAの断片化→配列決定

その一方で、様々なニーズに応じてPBAT法のさらなる高に必要なアダプターの付加→バイサルファイト処理」という度化を進める研究や、近年重要性がわかってきたDNAのヒ手順で作製します。我々は、この手順で試料が失われるおもドロキシメチル化部位の一塩基解像度解析技術の開発にも取な原因は、バイサルファイト処理でDNAが切断されてしま

り組んでおり、その成果もあがりつつあります。

【図】 PBAT 法によるマウス神経細胞分化のメチル化部位マップの一部

上から順に、胎生 11.5日の神経幹細胞、胎生 14.5日の神経幹細胞、胎生 14.5日の神経幹細胞を4日間培養したもの、胎生 18.5日の神経幹細胞、ニューロン、アス
トロサイト、オリゴデンドロサイト。

26

細胞解析研究革新のための高性能エピゲノムシーケンス技術の開発

先導研究
課題

B3

代表機関

背景

成果

単一細胞由来 mRNA の網羅的定量分析用前処理技術の開発

日立製作所中央研究所

代表研究者

神原秀記

◆単一細胞での遺伝子発現を解析する技術は、生物学、医学の様々な分野で必要とされている。
◆しかし、従来の解析手法では、数十万個から数百万個もの細胞の平均値しか得られない。
◆このため、微量の RNA を精度よく定量するための試料調製法が求められていた。
◆磁気ビーズの利用と反応条件の最適化により、遺伝子間での偏りが非常に少ない試料増幅法を実現した。
◆この方法で調製した試料のシーケンス結果は、従来法に比べて再現性が高い。
◆また、従来法に比べて、低発現量の遺伝子を感度よく検出できる。

1個の細胞の中で、どの遺伝子がどれだけ発現するかは、まで増幅することに成功しました。増幅バイアス（遺伝子に細胞の種類や置かれた環境によって異なります。このため、よる増幅率の違い）も2倍以内に抑えることができました。

細胞集団ではなく、1個1個の細胞の遺伝子発現を調べること

従来の標準的な方法や最近開発されたSMART法と、我々ができれば、生命現象をより深く理解することができます。

の方法で、単一細胞に相当する量（2pg）のRNAから試料を

例えば、動物の発生では、受精卵から様々な種類の細胞がつ調製し、実際にシーケンスを行ったところ、我々の方法がいくられますが、そのメカニズム解明に役立ちます。また、がちばん再現性に優れていました。さらに、発現量の少ない遺ん組織を構成する細胞の性質を知り、効果的な治療につなげ伝子を、他の方法よりも多く観測できることがわかりましるといった、医学への応用も期待されます。

た。今後は、我々の方法を普及させ、多くの研究に役立てて

次世代シーケンサーで遺伝子発現量（mRNA量）を解析す
るには、一定量のサンプル（DNAとして数百ng程度）が必要です。そいただきたいと思います。

【図】 磁気ビーズを利用した次世代シーケンサー用 cDNA ライブラリー作製法のために、従来の標準的な方法では、mRNAを断片化してから逆転
写してDNAとし、それを増幅します。しかし、この方法では試料のロスが起こりやすく、1細胞からの微量のmRNAには使えません。
そこで我々は、増幅効率を高める
ことと、増幅の際にもとのmRNA組成を変化させないことを目標に、単一細胞からの試料調製法の開発に取り組みました（図）。我々
は、磁気ビーズを利用して、1個の細胞に含まれるmRNAからcDNA（mRNAをつくるもとになった遺伝子と実質的に同じ配列をもつDNA）のライブラリーを作製する技術をもっています。本課題では、この技術を発展させるとともに各反応の条
件の最適化を進め、DNAを目的量①第 1 のプローブを固定化した磁気ビーズでmRNAを捕捉し、逆転写反応によりcDNAを合成。②ポリA
配列を付加。③第 2 のプローブを用いて、最初の cDNAと相補的な cDNA（ 2nd strand ）を合成。④
PCRによりDNAを増幅。VN 配列（ V=A またはGまたはC、N=AまたはGまたはCまたは T ）。
単一細胞由来 mRNA の網羅的定量分析用前処理技術の開発

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平成 26 年1月発行