ワクチン製造等に利用可能なウイルス増殖促進技術
静岡県立大学薬学部 薬学科
助教 紅林 佑希
2021年10月26日

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背景：感染シグナル研究をワクチン産生へ応用• ウイルスの増殖に必須のシグナルを阻害⇒ 新規治療薬/予防薬の創出• 生体防御機構を阻害：

ウイルスは効率的に増幅⇒ 高効率なワクチン製造（希望：鶏卵を超える）＜鶏卵培養法（従来の方法）＞••••

時間がかかるウイルスはよく増える
抗原の変化（ワクチン効果の低下）
パンデミックへの対応×＜細胞培養法＞••••

短期間で培養可能
ウイルス増殖性に課題（コスト）
抗原の変化が少ない（ワクチン効果が高い）
パンデミックへの対応○

高効率なワクチン製造においてウイルスの増殖性亢進が重要な課題である
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インフルエンザウイルス
HA (ヘマグルチニン)
NA (ノイラミニダーゼ)
M1
M2
NP
vRNP complex

100~200 nm
3

インフルエンザウイルスの感染機構
エンドサイトーシス

吸着

H+H+
H+
エンドソーム/リソソーム
膜融合
核放出
複製
翻訳

修飾 (ゴルジ装置)
4背景：企業との共同研究知見
ミトコンドリア膜上におけるアポトーシス制御因子がインフルエンザウイルス増殖に関与する可能性

＜抑制＞
Bcl-2
Mcl-1
BCL-XL
BCLXL＜誘導＞
BimBaxBak
BCL-XS

BCLXL

BCLXs

BCLXs

5

Mechanisms of efficient viral growth➢Sulfatide dependent cell-signaling

6Mechanisms of efficient viral growth➢Expression profile of sulfatide in three cells
Cell
MDCK

Sulfatide
Internally expressed

COS7
SulCOS1

Not expressed
Over expressed

Virus titer(log10FFU/mL)➢Virus efficiently growth in MDCK and SulCOS1 cells
6.0
4.0
2.00.0MDCKCOS7

SulCOS1MDCKH1N1pdm

COS7

SulCOS1

H3N2

MOI = 0.001, 24h p.i.

7Mechanisms of efficient viral growth➢Sulfatide dependent cell-signaling

8背景：企業との共同研究知見
Bax-Ku70 interaction inhibiting peptide: PMLKE (human)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014, 3; 321: 961-6301008060402002520151050

対照

PMLKE
100 μM

304倍
ウイルス価(105 FFU/mL)

8倍
ウイルス価(104 FFU/mL)

ウイルス価(106 FFU/mL)

120

パンデミック株

A型H3N22倍

252015105PMLKE
100 μM

4倍25201510500
対照

B型
ウイルス価 (105 PFU/mL)

A型H1N1対照

PMLKE
100 μM

対照

PMLKE
100 μM

Focus assay: N=3, significance: student’s t-test

Bax阻害(ペプチド添加)によりウイルスの力価（感染性ウイルス量）が増加
2019年2月 特許を共同出願 (静岡県立大学-花王)
9結果：Bax阻害剤添加によるウイルス増殖性評価
MDCK, Moi=0.001
Bax inhibitor (VPMLK) treatment: after 1h incubation of each virus

HA Assay98765432
1085422021

HA titer (log2)

HA titer (log2)

H3N2
10H1N1876455Cont
754

100μM-Baxinhibitor

Val-Pro-Met-Leu-Lys

2024Time (p.i.)

48212448

阻害剤の添加でウイルス増殖性を4~8倍に亢進10結果：Bax阻害剤添加によるウイルス増殖性評価
MDCK, Moi=0.001
Bax inhibitor (VPMLK) treatment: after 1h incubation of each virus

Focus Assay
7.0

***
6.2

6.0

5.8

5.0

Virus titer(log10 ffu/mL)

Virus titer(log10 ffu/mL)

**

7.0

6.8
6.6

6.0

5.0
Cont

Bax inhibitor

H3N2 (24h p.i.)

Cont

Bax inhibitor

H1N1 pdm (21h p.i.)

11

Growth analysis of Influenza virus➢Examination of dose-dependency for viral growth
H3N2H1N1pdm

58765432
10

HA titer (log2)

HA titer (log2)

4321001050100200

VPMLK(μM),
MOI (μM)= 0.001, 24h p.i.
Bax阻害剤

01050100200VPMLK(μM),
MOI =(μM)
0.001, 24h p.i.
Bax阻害剤

5 aa peptide improved viral growth with more than 10 μM.
12Growth analysis of Influenza virus

Cont

150
100500PMLKE
100 μM

H1N1Cont

PMLKE
100 μM

Viral titer(105 FFU/mL)

3020100

H3N2

Viral titer(105 PFU/mL)

Viral titer(106 FFU/mL)

Viral titer(104 FFU/mL)➢Diversity of viral types and subtypes
3020100H1N1pdm

Cont30PMLKE
100 μM

IBV20100Cont

PMLKE
100 μM

Several types of influenza virus were efficiently growthwith 5 aa peptide in MDCK cells.

13発育鶏卵におけるウイルス増殖亢進データ
動物： ホワイトレグホン受精卵 N=10×３群

Virus：A/Puerto Rico/8/1934

Day 11-13で感染増殖① Cont (5×102 EID50)② VSALK (5×102 EID50)

HA assay
Focus assay③ Cont×10倍量ウイルス(5×103 EID50)
1.2倍

Bax阻害剤の添加により発育鶏卵におけるウイルス増殖亢進を確認

Cont

Bax阻害 Cont×1014

まとめ• 本発表技術は、発表者らの行ってきたインフルエンザウイルス感染機構の解析に基づく発見である。
• 本技術はBaxシグナルに対する阻害物質（ペプチド）を添加することでウイルスの増殖を促進させる技術である。
• 本技術はワクチン製造やウイルス研究における培養効率を高め、低コスト化やウイルス培養時間の短縮が期待される。

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本技術の特徴と想定される用途
本技術の特徴• 添加剤のみでウイルスの増殖を促進させることができる。
• 添加剤自体は合成委託等で誰でも合成が可能な構造。
• 添加剤自体の供給量等による制約は極めて少ない。

想定される使用用途（例）• ワクチン製造におけるウイルス増殖促進剤• ウイルス研究におけるウイルス増殖促進試薬16企業への期待• ワクチン製造開発の技術を持つ、製薬企業等との連携や事業化を希望。
• また、ワクチンを開発中の企業、ワクチン分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：増殖方法• 出願番号 ：特願2020-019900• 特許番号 ：特許第6918320号• 出願人：静岡県公立大学法人
花王株式会社• 発明者：紅林佑希、鈴木隆、大西慎太郎、森卓也
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お問い合わせ先ご連絡をお待ちしております。
静岡県立大学
教育研究推進部 地域・産学連携推進室T E L 054－264－5124
e-mail renkei@u-shizuoka-ken.ac.jp

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