iPSC由来ヒト軟骨前駆細胞を使用した形状型軟骨組織体の開発
岡山大学

学術研究院医歯薬学域（医）組織機能修復学
教授 宝田 剛志
2023年9月26日

現状

間葉系組織を構成する細胞
間葉系
幹/前駆細胞
骨芽細胞
軟骨細胞

多能性幹細胞 最終分化細胞の(ES,iPS細胞) 誘導効率を重視した
分化誘導方法

研究後

脂肪細胞

筋芽細胞

腱/靭帯細胞PRRX1陽性細胞集団（各前駆細胞の集合体）

問題点１
実験者間・iPS細胞株間での分化誘導効率のばらつき⇒安定的な結果が出ない!!
⇒疾患iPS細胞研究の遅延
問題点２
目的細胞への分化誘導効率の低さ⇒移植先での供給効率が低い!!
⇒再生医療研究の遅延

目印分子A

脂肪細胞
目印分子B

目印分子E

多能性幹細胞(ES,iPS細胞)

発生過程の模倣（側板中胚葉）（沿軸中胚葉）

目印分子C
目印分子D

骨芽細胞

軟骨細胞
繊維芽細胞

腱/靭帯細胞

目印分子による分化指向性前駆細胞の選別・単離期待される成果１
分化状態の質の管理⇒安定的な分化誘導⇒疾患iPS細胞研究に有用期待される成果２
選択的な分化誘導⇒安定した目的細胞の供給⇒細胞移植治療に有用運動器を構成する間葉系細胞は、PRRX1陽性肢芽間葉系細胞より⽣み出される
PRRX1+肢芽間葉系細胞

Prrx1-Cre; ROSA26LacZ (E16.5)

SOX9+
軟⾻細胞

SCX/MKX+腱靭帯細胞

RUNX2/OSX+⾻芽細胞

Prrx1-Cre; ROSA26-LSL-tdTomato (⽣後1⽇⽬)

Prrx1陽性細胞とその系譜細胞をtdTomatoにて可視化

⾻軟⾻

腱/靭帯

真⽪PRRX1陽性肢芽間葉系細胞への誘導⽅法の開発
PRRX1-tdTomato reporter hiPSC line
Western Blotting

Immunocytochemistry
Day 4
PRRX1

tdTomato

Merge

PRRX1
ACTB

Day 2

Day 4

FCM analysis
Day 0Day 4

PRRX1+
側板中胚葉

Lateral plate
mesoderm

Wnt on 肢芽間葉系細胞
TGF off
Limb bud
Mesenchyme(LBM)
BMP off

Yamada et al, Nature Biomedical Engineering, 2021
Takao et al, STAR Protocols, 2022

PRRX1-tdTomato

3PRRX1-tdTomato

肢芽間葉系細胞の拡⼤培養⽅法の開発（ExpLBM）●Growth curve of ExpLBM●PRRX1-tdTomato expression
in ExpLBM

Stableexpansion

1010 fold

Lim budmesenchymal
cells (LBM)

Wnt on
FGF onExpanded LBM(ExpLBM）●SOX9 expression in ExpLBM●Karyotype of ExpLBM

iPSCExpLBM

Control
414C2 hiPSC
1383D2 hiPSC
SEES4 hESC
SEES7 hESC

SOX9（chondrocyte marker）

Yamada et al, Nature Biomedical Engineering,20214

拡⼤培養肢芽間葉系細胞(ExpLBM)は、硝⼦軟⾻組織体を形成できる
3-Dimentinal Chondrogenic Induction (3DCI)

Cartilaginous particle

1 mm
10%FBS

5

Yamada et al, Nature Biomedical Engineering, 2021︔Takao et al, STAR Protocols, 2022

拡⼤培養肢芽間葉系細胞(ExpLBM)は、⽣体内で軟⾻細胞への分化能⼒を有する

iPSC由来ExpLBM

Yamada et al, Nature Biomedical Engineering, 2021

拡⼤培養肢芽間葉系細胞(ExpLBM)の品質管理⽅法の開発
Expand
CD90陽性 CD82陰性
CD140B陽性PRRX1highExpLBM
ヒト軟⾻前駆細胞

Chondrocytes/Cartilage軟⾻細胞/軟⾻組織培養維持⽅法の不備（ExpLBM維持時の細胞密度など）

Expand
CD90陰性 CD82陽性CD140B陰性

PRRX1low
ExpLBM

Chondrocytes/Cartilage
軟⾻細胞/軟⾻組織

ExpLBMから軟⾻細胞/組織を安定的に供給するには、
CD90陽性、CD140B陽性、CD82陰性の状態でExpLBMを維持することが重要ヒト軟⾻前駆細胞の開発 (PCT/JP2020/035517)

拡⼤培養可能軟⾻分化誘導軟⾻細胞

ヒトiPS細胞を⽤いて、軟⾻分化能を有する拡⼤培養可能で、品質管理可能な肢芽間葉系細胞 (ExpLBM、ヒト軟⾻前駆細胞)を開発することに成功した。
8

Yamada et al, Nature Biomedical Engineering, 2021︔Takao et al, STAR Protocols, 2022

臨床グレードのiPS株を利⽤した研究開発

HLAホモ
iPSC

ストック化ExpLBM

軟⾻⽟各臨床株（CiRAクローン由来ExpLBMの3DCICiRA-22

CiRA-62

CiRA-23

CiRA-74

CiRA-92

軟⾻移植⽤素材の開発

凝集下での軟⾻細胞分化誘導(3DCI)

平⾯化での軟⾻細胞分化誘導(2DCI)凝集下での軟⾻細胞分化誘導(3DCI, withCAT polymer)

シート化
軟⾻細胞バイオリアクター

Takao et al, Stem Cell Research & Therapy, 2023

Ota et al, Biomed Res, in revsion

Fujisawa et al,BBRC, in submission

運動器の医学研究への応⽤（再⽣医療への応⽤）
変形性関節症

巨⼤⾻⽋損（5 cm以上）

半⽉板のすり減り

健常組織への侵襲
⾃家組織・細胞、間葉系幹細胞には採取量の限界

関節軟⾻のすり減り

⾻軟⾻柱

⾃家軟⾻培養細胞（JACC）

間葉系幹細胞

⼈⼯関節

⾎管柄付き⾻移植

Ilizarov法

Masquelet法↓Off-the-shelfタイプ（棚から取り出してすぐに使える）
軟⾻移植⽤製品の開発が必要

ExpLBM由来球状軟⾻組織体の膝関節軟⾻⽋損部への移植●SCIDラットの膝関節軟⾻⽋損部位への移植
HE染⾊

Safranin O染⾊

移植前

13
⽣検トレパン(1 mm)でSCIDラットの膝関節軟⾻に⽳(直径約1.5mm, 深さ約1mm)を空け、軟⾻組織塊を押し込んで移植●免疫抑制剤投与したミニブタ膝関節軟⾻⽋損部位への移植

Safranin O

hVIMENTIN

棏平将太先⽣⼤腿⾻膝顆部に⽳(直径約4mm, 深さ約2mm)を空け、軟⾻組織塊を押し込んで移植

Takihira et al, in preparation

Chondro-Sheetの開発

Takao et al, in submission

ExpLBM由来シート状軟⾻組織体の膝関節軟⾻⽋損部への移植

Takao et al, Stem cell research ＆therapy, 2023

⾜場材料なしに、任意の形状の組織体を形成する技術（＝Cell self Aggregation Technology, CAT）を開発（特許5746240号、Journal of Biomedical materials research, 2017）

ＣＡＴを塗布した培養⽫に細胞を添加するだけで3次元の細胞凝集体が得られる

接着リング形

十字形

凝集棒形●動画①球状の凝集塊の作製●動画②板状の凝集塊の作製

CATを⽤いた組織作
製法では、⾜場材料なしに任意の形状の組織体を得ることができるiPS由来軟⾻前駆細胞×CATを⽤いた形状型培養軟⾻の作製
リング状凝集塊の軟⾻分化誘導
iPS軟⾻由来軟⾻前駆細胞

 FBS濃度とリング状軟⾻の形態

FBS濃度検討 リング状軟⾻の組織像と遺伝⼦発現

特願2021-145753

Ota et al, in preparation.

iPS由来軟⾻前駆細胞×CATを⽤いた形状型培養軟⾻の作製
 重ね合わせ時期と癒合傾向
リング状凝集塊の重ね合わせ チューブ状軟⾻の組織像
Safranin O

Day 6Day 21

特願2021-145753

Ota et al, in preparation.

iPS由来軟⾻前駆細胞×CATを⽤いた形状型培養軟⾻の作製

 リング状軟⾻

3 mm

 チューブ状軟⾻（断⽚） 板状軟⾻50 mm
5 mm

特願2021-145753

Ota et al, in revisionミニブタでの⾮臨床試験
ゲッチンゲンミニブタ

⽋損部の作成板状軟⾻⽋損部に移植直後⽋損部に移植２週間後

運動器の医学研究への応⽤（再⽣医療への応⽤）
変形性関節症

巨⼤⾻⽋損（5 cm以上）

半⽉板のすり減り

健常組織への侵襲
⾃家組織・細胞、間葉系幹細胞には採取量の限界

関節軟⾻のすり減り↓Off-the-shelfタイプ（棚から取り出してすぐに使える）
軟⾻移植⽤製品の開発が必要
⾻軟⾻柱

⾃家軟⾻培養細胞（JACC）

間葉系幹細胞

⼈⼯関節

⾎管柄付き
⾻移植

Ilizarov法Masquelet法

ExpLBM由来ヒト軟⾻前駆細胞を使⽤した軟⾻再⽣イメージ

PRRX1+
ヒト多能性幹細胞（HLAホモドナーiPSC）

球状拡⼤培養された
ヒト軟⾻前駆細胞（ExpLBM）

⽬印分⼦による品質管理
ストック化ヒト軟⾻前駆細胞（品質管理済み）⇒バンク化

シート状

懸濁状

板状

⾊々な形状の軟⾻移植素材の量産

Lotチェック後保存バッグ梱包⇒出荷

患者来院⇒医師による形状の微調整⇒移植

既製品化しロット形成することで、必要な時に、必要な患者に、迅速に使⽤可能なoff-the-shelfタイプの「ヒト軟⾻移植素材」を開発する

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ︓移植軟⾻組織の内軟⾻性⾻化抑制⽅法• 出願番号 ︓特願2022-158123• 出願⼈ ︓岡⼭⼤学• 発明者 ︓宝⽥剛志ら
他、関連特許3件

お問い合わせ先
岡⼭⼤学
研究推進機構知的財産本部

ＴＥＬ︓086-251-8417
e-mail︓chizai@okayama-u.ac.jp
URL︓https://www.orsd.okayama-u.ac.jp/