Track Hubを使ってオリジナルデータと公共データを比較した図を作成する
UCSC Track Hubには、さまざまな公共データが登録されており、ゲノム情報を必要に合わせてカスタマイズすることができます。また、Custom trackでUCSC genome browser

上にファイルをアップロード、もしくはURLを指定することで、ゲノム地図上にオリジナルデータなどを載せ、目的とする遺伝子座などの地図を作成して論文のfigureなどを作成することができます。

UCSC GB上で可視化し、図を作成する際は、主にエピゲノムデータなどの 定性的な情報を表示してオーバーラップを確認できる図 を作成することが多いと思います。今回は先ほど紹介したATF3遺伝子について、その上流シス領域に注目して、さらにATF3のChIP-seqデータを加えることで、ATF3が自身の転写制御（autoregulation)に関係している可能性を示唆するデータを作成してみたいと思います。

Track Hubからテストデータをつくる
オリジナルデータの例として、すでにUCSC GBに存在するATF3 ChIP-seqデータのダウンロードを行いたいと思います。UCSC GBのTrack Hubには、おおよそbigWigファイルとよばれるバイナリーデータが読み込まれています。in-Houseでのデータは、ゲノムへマップ

後のBAMファイルが多いと思いますが、UCSC GBに存在するUtility スクリプトで変換することでデータを読み込むことができます。今回はURLが公開できる公共サーバーにアップロードできる場合は、bigWigファイルを作成してアップロードできますが、UCSC GBにアップロードする場合はファイルサイズを小さくして、目的の箇所だけを可視化する必要があります。今回は実習を簡単にするために、BigWigファイルからbedGraph（テキストファイル）に変換し、そのファイルに設定を書き込み、UCSC GBにアップロードしたいと思います。

補足: オリジナルのBAMファイルからBigWigファイルを作成するには、 こちらのパイプラインを利用すると可能です。samtools, bedtoolsそしてUtilityのスクリプトであるbedGraphToBigWigをインストールすると利用することができます。
まず、Track Hubへ移動します。

Track Hubでは、UCSC GBに登録されている接続可能なデータを横断的に検索することができます。Search termsにATF3,assemblyにhg38を入力してsubmitしてください。すこし時間がかかりますが結果が表示されます。

ATF3に関連するデータセットが接続されているHubとして、5つの候補が存在するようです。この中からChIP-seqのデータを得るためにENCODE DNA Track hubのSearch detailsをクリックして階層を辿っていきます。

ATF3のChIP-seqの複数のデータに辿り着くことができました。このHubに接続したいと思いますのでConnectボタンを押します。成功すれば ~ Successful という表示が一瞬だけ現れてgatewayに飛びます。gatewayから、genomes -> hg38をクリックしてください。

ゲノムブラウザは、 ATF3遺伝子座が表示された以前の状態のままですが、その下段にENCODE DNA Trackhubが上段にきて接続されている様子がわかります（実は元からあるのですが練習のため）。この中から、TF ChIP-seq by targetの文字をクリックしてください。

ChIP-seqのデータ一覧が表示されます。ATF3を上記のようにdenseモードでsubmitして表示させましょう。

最下段にATF3のChIP-seqのpeak summitが現れました。この遺伝子座の面白いのは、ATF3のプロモーターなどのシス領域にATF3自身が結合してそうなところです。さらに、最長ATF3の上流にあるENCODEでは遺伝子アノテーションとして登録されている exon1つの領域がReMap, ATF3の結合サイト、GenHancerと密にオーバーラップしています（みなさんのブラウザでは、これらのトラックをONにしていないので、わからないかもしれません、実習のために先に表示してATF3が自己応答することをcheckしていました。ONの方法は後ほど）。

さあ、ATF3の自己応答の目処がつきました。トラックにすでにシス情報を載せて確認している時点でチートで恐縮ですが、このChIP-seqデータをオリジナルデータだと思っていた

だいて、このATF3遺伝子領域への結合性を図示するために、擬似オリジナルデータを用意するためにこのデータをダウンロードします。ATF3/liver signalのtrackの上で右クリックして、Configure ATF3/liver signal (by target) ATF3 track set...を選択してください。

するとtrackの設定をいろいろ変更するページが出てきます。ATF3/liver peaksの右側にあるSchemaをクリックしてください。

すると、そのデータの詳細な情報（実験の情報、論文の情報など）を閲覧することができます。ここで実はこのデータが一体どこにあるかが記載されています。上段のURLに実はデータが存在していて、track hubはweb上にあるそのデータを読み込んでブラウザに表示していることがわかります。今回このデータをダウンロードしてまるで自分のデータであるよ
うにテストデータとして利用します。データはご覧の通り bigWigファイルですね。ダウンロードには20分ほどかかりますし、その後のファイル整形はあくまで例として記載します。レクチャー内では行わないでください。?proxy=trueを除いてwgetでダウンロードします。

wget
https://www.encodeproject.org/files/ENCFF608OBE/@@download/ENCFF608OBE.bigWig

ダウンロードしたbigWigファイルを編集し、UCSC GBで読み込みやすいように染色体1番だけのbedGraphファイルを作成します。そのためにbedGraphにファイル変換操作を行います。

# 必要なツールとファイルをダウンロード
wget
http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/macOSX.x86_64/bigWigToBedGraph
wget https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hg38.chrom.sizes
chmod 755 bigWigToBedGraphchmod 755 bedGraphToBigWig# 変換を実行# ./bigWigToBedGraph -chrom=chr1 ENCFF608OBE.bigWig
ENCFF608OBE.chr1.bedGraph./bigWigToBedGraph -chrom=chr1 -start=212509895 -end=212676211
ENCFF608OBE.bigWig ENCFF608OBE.chr.1212509895.212505D9895.bedGraph

これでテスト用のbedGraphファイル が完成しました。さてこのデータにグラフの設定用のheaderを追加します。テキストエディタ でENCFF608OBE.chr.1212509895.212505D9895.bedGraphファイルを開き、先頭に以下の文字を入力し、保存します。
browser position chr1:212509895-212676211
browser hide all
track type=bedGraph name=ATF3_ChIP description="ATF3 ChIP-seq"
visibility=full color=200,128,0 altcolor=0,100,200#chrom chromStart chromEnd score

この設定の詳細は、こちらに記載されています。編集したbedGraphをCustom Tracksから読み込みます。

ファイルを選択し、submitしてください。

無事読み込まれたら、Manage Custom Tracksにデータが表示されているはずです。return to current positionを押して、genome browserに移動します。

ATF3のChIP-seqデータが表示されました。このように、custom trackでデータをロードすると他のtrackの情報は失われてしまうので、ここから必要な情報を足していきます。

公共データベースの情報をゲノム地図に追加する
地図の下にあるデータのコレクションからGENCODE V41,、DNase-seq、CpGの情報、そしてエンハンサー候補を眺めるために ReMap, GeneHancerをONにしていきます。初めは画面を見やすくするようにdenseやpackモードで表示するといいかもしれません。
GeneHancerは相互作用の推定が見えるようにfullで設定します。

最後に一番底にあるrefreshボタンを押すと選んだデータが表示されます。

次に、表示したデータの順番を変更します。トラックの左端をドラックアンドドロップすると上下を入れ替えることができます。入れ替えた後は次のような図です。どう見せるかは好みなので、見えやすい順序を模索してください。

一番上の段にGENCODEアノテーションにしました。ATF3の結合がプロモーター付近や、gene body最長のATF3より上流の位置にシグナルがみられます。そして、 GeneHancerによって推定されたエンハンサー領域の相互作用として、この２つが繋がっていますね。もしかすると上流シスはindirectなATF3結合をChIP-seqでみているのではないかと想像させる一枚です。

さて、このfigure、ChIP-seqのデータが少し背が高い気がするので調節します（これでいいかもしれませんが、練習のため）。ATF3-ChIPのトラック上で右クリックをしてください。

ここでさまざまな設定ができますが、ひとまずTrack heightを60、smoothing windowを5ぐらいにセットします。

このように、trackの高さも好みに合わせて調整が可能です。

論文用の図のために、魅せたいところをハイライトする最後に、この図を完成させるために、ATF3プロモータとエンハンサー相互作用の場所をハイライトして見たいと思います。GeneHancerによる推定が相互作用を想わせるよいfigureと思いますが、さらに見た目にこだわるには、重要な箇所をハイライトすると良いと思います。

まず、Shift keyを押しながら上流シスを左クリックで囲います。

すると薄青い枠でかこまれた後、オプションのwindowがあらわれますので、zoom inしてください。

ChIP-seqのpeakを拡大することができました。この領域を綺麗に囲ってハイライト（もしくはGenHancerのエリアを囲ってもいいかもしれません）したいので拡大しました。先ほどと同様にShiftを押しながら左クリックで囲ってください。

この領域にハイライトを加えます。色はデフォルトの水色にして、 Add Highlightしてください（Single Highlightを選択した場合、１つのエリアをハイライトしたら他のハイライトしていたエリアが消えてしまいます）。同様の操作を下流のプロモータ領域でも行いましょう。

これで図の完成です。

完成した図はPDF or EPSで保管作成した図をillustratorなどで編集可能なPDF, EPSで保管する方法になります。ViewからPDF/PSを選択してください。

PDFやEPSとしてダウンロードすることができます。フォントや線の太さ、いらない空白などの削除など細かい設定は描画ソフトで調整する方がよいでしょう。また、保存したファイルはトラックが縦に長くてもしっかり保存されますので、必要な情報を全て載せておいて保存することもできます。

おまけ: Track Collection Builderはトラックを統合する
UCSC genome browserで複数のオリジナルファイルを一つのトラックで表示 したり、ファイルを結合したい場合にTrack Collection Builderを利用します。MyDataからTrackCollection Builderを選択してください。

まず、利用するデータをコレクションするフォルダ（兼トラック）を右のAdd Collectionから作成します。この時の名前がトラックに表示されるので、中に入れるファイルや、そのファイルから作成するファイルを意識した名前にしたほうがいいです。

saveを押した後、そのフォルダにファイルを加えていきます。

右のファイルリストから加えたいファイルの plusボタンを押すと、右に追加されていきます。その後、右上にあるGO!ボタンを押しましょう。

先ほどの図に6つのATF3 ChIP-seqのトラックが追加されました。このようにグループにまとめて１つのトラックにしていると編集にも便利だと思います。色が薄いですが、これは私の色の選択ミスです（後で修正しています）。つぎにこれはあまり需要があるかわかりませんが、この６つのファイルのシグナルを一つのファイルに統合してみたいと思います。 トラック上で右クリックを押して、configureを選択します。

このsetting画面では今までとは異なり、Merge methodが加わっています。addを選択する
ことで6つのシグナルをマージしたデータをブラウザ上で表示してくれます。他には、transpalent, solid, stacked, subtractがあります。一番需要がありそうなのは、たとえばtranspalentで正規化後のシグナルを比較表示するのは使えるのではないか？と思います。

まず試しにaddを行い、somoothing windowを5で可視化してみたものを表示します。

auto scaleのため、あんまり変わらなくみえるかもしれませんが、データが足されたものが表示されています。次にtranspalentを試してみましょう。

Peakの変化が見えてなかなかエレガントな図が作れそうですね。 時系列データなどでこの描画を行うと美しい変化を描画できるかもしれません。

このコレクションの情報はMySessionで保存しなければ残りませんので、必要な場合はかならず保存するようにしてください。また、コレクションの名前や色はTrack Collection
Builderの画面に戻って、ダブルクリックすれば後からでも変更することができます。