／【Ｋ：】Ｓｅｒｖｅｒ／１１０２０３１５ 新潟県厚生農業協同組合／本文／１８ｂ

長谷川

０４６‐０４９ 2011.0

病理組織標本中の疑コンタミネーション組織に対する
厚生連医誌 第２０巻 DNA
１号解析による識別
４６〜４９ ２０１１

原著

病理組織標本中の疑コンタミネーション組織に対するDNA 解析による識別長岡中央綜合病院、病理部；臨床検査技師１）、病理医２）
はせがわ ひで ひろいからし とし ひこ長谷川秀浩１）、五十嵐俊彦２）
目的：胃癌手術後の患者の腹膜から摘出された結節の病理組織標本に認められた腫瘍組織が患者本人に由来するものであるのか標本作製過程でコンタミネーションしたものであるかを DNA 解析により調べた。
方法：パラフィン包埋された結節と腫瘍組織それぞれから抽出された DNA をサンプルとして３番、５番、１２番染色体上に存在する短塩基縦列反復配列の回数を PCR 法により解析を行なった。
結果：解析に用いた遺伝子領域の塩基の反復回数を示
す泳動パターンは全て異なっていた事から病理組織標本中に認められた腫瘍組織は標本を作製する過程で混入したコンタミネーション組織と判断された。
結論：病理組織検体の取り違えの可能性やコンタミネーションが疑われる組織が認められた際の識別法として法医学的技術を用いた遺伝子解析法は極めて厳密に個体識別が可能な事から客観的判断材料として有用な手段であった。

被害患者には甚大な肉体的、精神的苦痛を与える。現
実に様々な注意が払われていながらも全国各地において検体の取り違えを原因とした医療訴訟が後をたたない。
今回、我々は病理組織標本に認められた腫瘍組織がコンタミネーションしたものか否かを判断するにあた
り、簡易でかつ識別能力が高い方法として、それぞれの組織から抽出された DNA のマイクロサテライト領域の短塩基縦列反復配列（Short tandem repeat : STR）の解析が判断根拠として有用だった事例について報告する。

対象および方法

キーワード：病理組織標本、コンタミネーション、短塩基縦列反復配列（Short tandem repeat : STR）、個体識別

緒言

病理診断は組織学的に診断を確定する事であり、その後の患者の治療に大きく影響を及ぼす事から決して間違いが在ってはならない検査業務である。しかし、正確・確実な検体処理と標本作製が要求されているもののその作業工程のほとんどは基本的に手作業である
ことから標本作製に携わる検査技師は医療事故に直結するリスクが大きいと言える。病理診断を行なう上で検体の取り違えや紛失、シビアなコンタミネーションは致命的なミスであり、その発生を防止する為にそれぞれの施設において発生防止のためのトレ サ ビ リティーを確立するなどの対策が講じられている（１）−（３）。
特に生検材料において、採取された臓器の部位と個数が同一であり、取り違えや誤認である事が認識不可能な状況の中で標本が病理診断へと提出された場合、その双方が良性または悪性である時には各々の正確な真実は不確定ながらも最悪な事態は回避できるものの片方が悪性であり、もう一方が良性と判断され依頼者に間違った報告がなされ摘出手術が施行された際には

１：症例
症例は３５才女性、２００６年に他院にて胃癌と診断され幽門側胃切除が施行された。術後の病理検査でpor２，sci, se, ly１，v１，DM（＋）, n２＋との結果から進行度 stage Ⅳと判断され、当院にて化学療法による治療が行なわれていた。２００９年４月に腹痛が出現し精査にて空腸の通過障害と診断され開腹術が施行された。術中、腹膜に直径０．
５cm 大の結節が認められたため切除され病理検査に提出された。その組織像は緻密性結合組織からなり悪性所見は認められなかった。しかし、結節に隣接して明らかに悪性と判断される組織の混在が認められた（図１）。その組織型は胃癌のそれとは異なる事から播種は否定的であったが他の患者からの腫瘍組織がコンタミネーションしたものか本人由来の組織かの判断が求められた。
２：DNA 抽出
パラフィン包埋された結節および腫瘍組織それぞれの組織からスモールスケール抽出法により組織を採 取 し TaKaRa DEXPAT を 添 加 し 能 書 に 沿 っ てDNA 抽出を行なった（４）。
さらに居雑物除去のため抽出液１００!"を採取し１００％エタノール２００!"と３M酢酸ナトリウム１０!"を加え−８０℃のデープフリー
ザー内で DNA を析出させた後、低温高速遠心分離機 に て１６０００rpm で３０分 間 DNA 沈 降 を 行 い７０％エタノールで洗浄し乾燥後、TE 液に溶解し DNA サンプルとした。
３：STR マーカーと PCR 条件
DNA 解析による個人識別に利用可能な遺伝子情― 46 ―

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厚生連医誌

第２０巻

長谷川

０４６‐０４９ 2011.0

１号 ４６〜４９ ２０１１

報の中で、今回解析に用いた塩基配列はホルマリン固定パラフィン包埋組織から抽出された DNA にも使用可能 と 判 断 さ れ た１２番 染 色 体 上 に 存 在 す る
vWA、５番染色体上の D５S８１８と３番染色体上の D
３S１３５８の３種類の STR 領域である。DNA 解析に用いた STR マーカーの詳細については表１にプライマーの配列は表２に示す。PCR 反応液は全量を２０!"系とし、その組成は d-DW：１４!"、
１０×PCR buffer
with１５mM MgCl２：２!"、２mM dNTP：２!"、２５pM
F-primer：０．
５!"、２５pM R-primer：０．
５!"、Ampli Taq
Gold１U、DNA サンプル１!"で調整し DNA 増幅にはプログラムテンプコントロールシステム PC７０７（Astec Japan）を使用した。サーマルプログラムは
９５℃１０分の Hot start の後、denature９４℃１分、annealing ５０℃１分、extension ７２℃１分を４０サイクル繰り返し Last extension として７２℃１０分間伸張させた。
４：増幅産物の確認
PCR 反応液３!"を１
２．
５％ポリアクリルアミドゲ
ルにより電気泳動後、エチジウムブロマイド（EtBr）染色を施し UV イルミネーターにより増幅産物の泳動パターンの確認を行なった。

結果

個体識別のために実施した STR マーカーの泳動パ
ターンは図２に示すように全て異なっていた事から二つの組織は異なる人物に由来する組織と判断され、本事例は標本製作過程の段階に混入したコンタミネーション組織である可能性が極めて高いと判断された。

考察

病理検査室で作製された病理組織標本の中には通常、そこには在り得ない組織が出現する場合も極稀に存在する。そのような場合、病理医はその経験に裏打ちされた主観的、客観的判断力において、その組織の存在自体の有無を含めて判断を行なってきた。病理標
本作製過程で異なる組織が混入した可能性がある場
合、病理医にその判断責任を託し続けるだけでなく標本を作製する検査技師側が客観的に自らで証明しうる解析技術の確立こそが必要であり病理診断の精度を維持向上するためにも最も必要とされるべきものと考える。
バイオマトリックスとは血液型、指紋、静脈パターン、虹彩、DNA などにより個人を識別する方法あり、各種セキュリティーシステムや犯罪捜査、親子鑑定などに用いられてきた。このような生物学的個人識別技術の発展に伴い Ota 等は病理組織標本内のコンタミネーションが疑われた組織について誰に由来する臓器の一部であるかを証明する方法として血液型物質に対する免疫組織化学染色により混入した組織の識別を行なった（５）。
その後、血液型抗血清を用いた識別方法が病理検査室ではコンタミネーションや検体の取り違えの確認方法として広く普及し定着している。しかし、この方法を用いた個体識別法では高い確率で同一の血液型に一致し、判断困難な場合や腫瘍部分において血液型物質は合成阻害される事から偽陰性化を起こすな― 47 ―

どの問題がある（６）。これらの問題を解決する為に我々は疾患に関係なく、更に精度の高い識別可能な方法として法医学領域で用いられている識別技術の中で病理組織に応用可能な技術の確立が必要であると考えた。
病理組織材料から抽出された DNA からも個人が断定可能な方法としてマイクロサテライト領域の短塩基縦列反復配列の回数を検索する事による個体識別が可能であると判断した。STR は両親に由来する遺伝子領域であり、その反復回数は他人では当然であるが、親や兄弟間においても異なるため厳密な個人識別法としてこの部分の解析を行なうことが望ましいものと判断された。実際、日本の警察や米国 FBI をはじめ世界各国において犯罪捜査における個体識別法として用いている方法であり、専用の解析ソフトによる解析では一度に１３種類の STR を検出できる AmpFLSTR SGM
Plus PCR Amplification Kit（Applied Biosystems, Japan）
や Power Plex（Promega）がキットとしてすでに市販されている。双方とも PCR で増幅されるフラグメントを解析するためには専用のキャッピラリー式電気泳動システムと解析ソフトが必要であり、それにより僅かな波形の違いをも読み取る事が可能である。丸川等
はこれ等、市販されているキットを用いて HE 標本内および細胞診スメアー標本内に認められたコンタミネーションが疑われた組織や細胞集団の判別を行なった（７）。しかし、この一連のシステムは個人を識別する能力については充分であるが解析に要する試薬や器機にかかる設備投資は極めて高額であり現実的ではない。市販されている STR マーカーは通常、犯罪捜査における個人識別を念頭に作製されており、その識別能力は最大で地球上の全人口を網羅できる数値になると言われているが、我々が病理検査室で直面している問題はそのような地球規模の話ではなく顕微鏡を通して見える良性の組織像の脇にたたずむ癌細胞の小さな集団や検体の取り違えなどの過失が起きてしまった場
合の個人と個体を証明または否定するための客観的事実を持って問題を解決するというレベルの技術である。今回、我々が使用した STR マーカーのうち D５S８１８を解析するためのプライマーの塩基配列は Li Jin 等により、vWF については C.kimpton 等、さらに D３S１３５８については Hua Li 等により報告されており合成費用は数千円と極めて安価である
（８）
−（１０）
。同時にこれ等の STR マーカーによって増幅される両親由来の二本のフラグメントは、そのほとんどは通常のアクリルアミドゲルで泳動パターンの違いを識別する事が可能であり特別な解析システムの必要はない。更に、この三種類の STR マーカーの日本人における出現頻度 は
vWA：１/１
１．
５、D３S１３５８：１/４．
１、D５S８１
８：１/７．
３と 報
告されており STR マーカー三種類の泳動パターンが偶然に一致する確率は１/３４４．
２となる
（１１）
。
これに血液型や性別などの因子を含めると最大で約１/７０００である
ことから、この識別能力をもってすればプレパラート上の問題は充分解決できるものと考えられた。今回、我々が用いた解析法は形態学的に判別困難なコンタミネーションが疑われた症例について個体を識別する客観的な判断材料として用いる事は極めて有用であると判断された。

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０４６‐０４９ 2011.0

病理組織標本中の疑コンタミネーション組織に対する DNA 解析による識別

参 考 文献英 文 抄

１．田直樹、込山真実、安田玲子．当院における検体取り違いに対する取り組み．神臨技誌．２
００９；４４（２）：１−６．
２．詰浩一．当院における検体過誤防止に対する取り組み．神臨技誌．２
００９；４４（２）：７−１０．
３．磯崎勝．病理検査におけるデジタル画像の有用性．神臨技誌．２
００９；４４（２）：１１−８．
４．野口雅之．分子生物学的手法に用いる検体の保存．病理と臨床．１
９９６；１４（臨時増刊号）：２
３４−７．
５．Ota M, Fukushima H, Akamatsu T, et al. Availabilityof immunostaining methods for identification of mix-uptissue specimens. Am.J.Clin.pothole.１９８９；
９２：６
６５−９.
６．Murata K, Egami H, Shibata Y, et.al. Expression ofblood group-related antigens, ABH, Lewis（a）, Lewis（b）, Lewis（x）, Lewis（y）, CA１９−９ and CSLEX１ inearly cancer, intestinal metaplasia, and uninvolved mucosa of stomach. Am J Clin Pathol１９９２；９８：
６７−７５.
７．丸川活司、吉田繁、伊藤智雄．病理検査における縦列反復配列（Short tandem repeat）解析を用いた個人識別解析法．検査と技術．
２００６；３４（９）：８３１−８３５．
８．Li Jin, Peter A, et al. Defining microsatellite alleles
by genotyping global indigenous human populations
and non-human primates. J. Forensic sciences.１９９６；
２３：
４９６−９.
９．Kimpton C, Walton A, Gill P. A further tetranucleotide repeat polymorphism in the vWF gene. Human
Molecular Genetics.１９９２；
１（４）
：２８９.
１
０．Li H, Schmidt L, Wei M et al. Three tetranucleotide
polymorphisms for loci : D３S１３５２; D３S１３５８; D３S１３５
９.
Human Molecular Genetics.１９９３；２（８）：１３２７.
１
１．中西祥徳、橋本良明 改定 PCR 実験ノート PCRを用いた個人識 別 ２版 東 京：羊 士 社；２００５；
１５４−６４．

録

Original article
Genetic individual identification of paraffin-embedded
pathological preparations to rule out the sporadic contamination of other patient s tissue during preparation of paraffin sections of pathological examination
Nagaoka Central General Hospital, Department of pathology ; medical technologist1）, pathologist2）
Hidehiro Hasegawa1）, Toshihiko Ikarashi2）
Purpose : Tissue contamination of other patient in paraffin-embedded preparation prevented accurate
pathological diagnosis. But these technical errors
were inevitable in a routine processing because alarge number of specimens of plural patients werehandled in a same box during tissue preparation ata time. A case with tissue contamination fragments
was examined to confirm them as the contamination of another patient by a forensic gene analysis.
Method : Peritoneal tissue with few cancer cells frompostoperative patient of gastric cancer was genetically examined whether this cancer fragment wasderived from correct patient himself or contamination of other patient. Paraffin-embedded specimens
were sectioned and used for genetic analysis. Shortbase tandem repeat sequence（Short tandem repeat : STR）analysis on chromosome ＃３, ＃５,
and ＃１２ was done by Polymerase chain reaction（PCR）.
Results : As for all the electrophoretic patterns of STR,
the contamination specimen was very different
from the correct individual one.
Conclusion : The forensic genetic analysis is very usefulfor an individual identification with pathologicalspecimens. Correct individual pathological specimens was discriminated from other patient s ones
as so-called contamination.
Keyword : pathological specimen, contamination of otherperson s tissue, short base tandem repeat sequence（Short tandem repeat : STR）, genetic individualidentification― 48 ―

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第２０巻

長谷川

０４６‐０４９ 2011.0１号 ４６〜４９ ２０１１

図１

図２

表１STRvWA
D３S１３５８D５S８１８D３S１
３５８
D５S８１８

各 STR マーカーの泳動パターン

DNA 解析に用いた STR マーカとその電気泳動パターン存在する染色体
１２p１
２
３p５q２
１−３１
表２vWA

作製された病理組織標本とその拡大

Allele の種類
８７８

増幅産物（bp）
１５７−１９７
１１４−１４２
１３５−１７１

日本人での一致率
１１．
５人に１人
４．
１人に１人７．
３人に１人DNA 解析に用いた STR マーカのプライマーシーケンス

vWA１ ５ −CCC TAG TGG ATG ATA AGAATA ATC−３vWA２ ５ −GGA CAG ATG ATA AAT ACA TAG GAT GGA TGG−３F
５ −ACT GCA GTC CAA TCT GGG T−３R
５ −ATG AAA TCA ACA GAG GCT TG−３F
５ −GGG TGA TTT TCC TCT TTG GT−３R
５ −TGA TTC CAA TCA TAG CCA CA−３２０１１／０１／１
７ 受付（２０１１−３０）― 49 ―