原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

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繊毛虫の起源
遠藤 浩（金沢大・理・生物）

Derivation of ciliate from a dinoflagellate-like ancestor
Hiroshi ENDOH (Department of Biology, Faculty of Science, Kanazawa University)
SUMMARY
When compared with simple flagellates, extant ciliates are so complicated in constitution that their evolutionary
pathway has been unknown. Expanding molecular data appear to have recently led to a general agreement that ciliates areclosely related with dinoflagellates and apicomplexans, the three phyla being grouped in Alveolata. On the other hand,parasitic opalinids are generally grouped in heterokonts, but a β-tubulin gene phylogeny brought opalinids within alveolates (A. Nishi, in this meeting). Based on this information, I propose a possible evolutionary pathway of ciliates from amulticellular dinoflagellate-like ancestor such as a genus Polykrikos, from which oplainids might have also originated. In
this scenario, the common ancestor of ciliates and opalinids might have attained multinuclear and multiciliary state bymulticellularization and a subsequent reunicellularization. Then the ancestor would have started parasitism, and all
opalinids remain parasitic even now. After an ancestral ciliate diverged from opalinids, ciliates might have elaborated
DNA elimination, resulting in spatial differentiation of germline and soma within a single cell. This compaction of thesomatic genome might be a reflection of an adaptation to parasitism, as frequently seen in parasitic organisms. Ciliates
could have recovered a free-living life shortly after the adaptation, followed by cytostome formation and development ofpolyploid macronucleus accompanied with DNA amplification. Formation of the macronucleus might have resulted in theloss of mitotic ability because of a large number of fragmented chromosomes, as seen in the primitive ciliates, karyorelictids, until ciliates invented amitotic division later.
［Background］ 繊毛虫類は、原生動物の中でもっと「・・繊毛虫に先行する特徴 〜おそらく繊毛虫とも複雑な体制をもつもののひとつである。その出現の相同の、それゆえ繊毛虫の起源についての証拠をもた経緯についてはわずかに理論的考察がある（Orias,

らす特徴〜 を示す非繊毛虫類はいるのだろか。
・・・・

1976 など）が、いまだ謎のままである。最近の rDNA

口のない動物性鞭毛虫類と繊毛虫類をつなぐ＜現存系統樹や β-tubulin 等タンパク質をコードする遺伝子の中間的な生物＞を見つけることは期待できそうも系統樹は、繊毛虫と胞子虫類（アピコンプレクサ）、 ない。・・」（Hanson, 1977）。
渦鞭毛藻類との近縁性を示しており、アルベオラスを

このように繊毛虫類と他の原生動物とは構造的に共有形質としてアルべオラータという分類群として大きな断層がある。その間をうめるような現存する原ひとくくりにされている (Cavalier-Smith, 1993)。前世

生動物はいないというのが一般的な認識であったよ紀の代表的な論文を見ると、繊毛虫類のステータスにうである。それは現在も変わっていない。

ついて以下のような認識が示されている。

［Theory］オパリナは多繊毛・多核の大型の細胞であ「・・・これらすべての事実を検証してみると、繊毛虫類が到達した分化の程度は、そのでき初めからき
わめて大きかった事がわかる。このことは、単一細胞内に生殖要素（小核）と体細胞要素（大核）を合わせ持つ異型核細胞という特徴と結びついて、繊毛虫類を＜偽後生動物＞の地位へと引き上げるのである。・・」（Faure-Fremiet, 1952）。
「・・多くの点で繊毛虫類は原生動物の他のグループとはちがった孤立した特徴をもっている。原生動物の進歩的進化のクライマックスは繊毛虫類において達成されたという立場は擁護されうるだろう。・・」（Hadzi, 1963）。

り、古典的には鞭毛虫と繊毛虫をつなぐミッシング・
リンクであるとする説もあったが（Metcalf, 1923）、その後否定され、現在はクロミスタ界のヘテロコント（不等毛）類に分類されることが多い。
しかしβ-tubulin
遺伝子による分子系統樹は、オパリナ類が繊毛虫を含むアルベオラータ内の生物であることを示唆している（西・石田・遠藤、論文準備中）。ライフサイクル
を詳しくみてみると、オパリナ類は宿主のカエルが繁殖期に入ると Palintomy と呼ばれる分裂を経てシスト化し、オタマジャクシに移行する。オタマジャクシの腸内に入ったシストは脱シスト化し、減数分裂を経て

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異型配偶子を形成し、互いに融合する。半数体の異型という進化の経路が想定できる。多細胞渦鞭毛藻類お配偶子と、受精後の発生初期のオパリナは繊毛がまばよび発生初期のオパリナ類についての形態・分子レベらで、鞭毛虫的な動きを見せる。その後、細胞の成長

ルでの情報を今後増やすことによって、この説を検討にともなって核数と繊毛数を増し、一定の核数に達すしていく必要があるだろう。

ると二分裂で増殖するようになる。繊毛虫の大核を思［Perspective］繊毛虫は、祖先生物の多細胞化、そのわせる大きな二核性のプロトオパリナも現存している。一方、繊毛虫と近縁な渦鞭毛藻類には、Polykrikosなどのような葉緑体をもった群体性の多細胞化した種が散見される。これらの種は多核で多鞭毛の状態にあり、発生初期のオパリナと似ている。近年の原生生物の分類では、藻類は多系統であり、ひとつの系統群
内に葉緑体を持つ藻類と持たない生物が混在することが明らかになりつつあり、植物性鞭毛虫、動物性鞭毛虫という概念は系統的にはもはや意味をなさない。
アルベオラータの共通祖先は葉緑体を保持していたという可能性も指摘されている。
これらを考慮すると、単純な構造をした祖先的渦鞭毛虫（藻）類から複雑な構造を持つ繊毛虫への進化がオパリナをはさんで合理的に説明できる。すなわち、後の細胞融合による再単細胞化による多核化にその起源を求められる可能性が出てきた。大核分化時にみられるＤＮＡの再配列は、多核化によって空間的に生殖系列と分離した体細胞系列におけるゲノムのコン
パクト化ととらえることができるかもしれない。このようなＤＮＡ・クロマチンの削減は、ウマカイチュウや線虫、中生動物ニハイチュウなど、寄生性生物において頻繁にみられる現象である。このことは、オパリナ類がすべて寄生性であるように、繊毛虫の祖先が進化のある時点で寄生性の時代をすごし、それに対する適応として体細胞系列のゲノムのコンパクト化を成し遂げた反映なのかもしれない。今後、繊毛虫の中に、寄生生活の名残が発見されることを期待したい。
［Reference］

単細胞渦鞭毛藻類↓
多細胞渦鞭毛藻類↓
多繊毛・多核の祖先的単細胞生物↓↓
大型オパリナ類
繊毛虫類

Cavarier-Smith, T. (1993) Microbiol. Rev., 57: 953-994.
Faure-Fremiet, E (1952). Bull. Soc. Zool., 77: 274-281.
Hadzi, J. (1963) The evolution of the metazoa. Pergamon
Press.
Hanson, E, D, (1976) The origin and early evolution ofanimals. Wesleyan University Press.
Metcalf, M. M. (1923) Bull. U. S. Nat. Mus., 120: 1-484.
Orias, E. (1976) Trans. Amer. Micros. Soc., 95: 415-429.

オパリナ類はアルベオラータか？
西 あかね（金沢大・理・生物）

Are opalinids alveolates?
Akane NISHI (Department of Biology, Faculty of Science, Kanazawa University)
SUMMARY
Opalinids are endosymbionts that inhabit the large intestine of anuran amphibians. Opalinids possess many nuclei
and are uniformly covered with numerous cilia, so that they look like ciliates. Opalinids share some characteristics withboth flagellates and ciliates, so opalinids have been placed in various systematic positions since their discovery. At present
researchers in the field seem to agree that opalinids are classified into the Class Opalinea in heterokonts, based on thepresence of a ciliary transitional helix which is characteristic of heterokonts. However, opalinids do not share anothersynapomorphy of heterokonts, flagellar hair (mastigonemes). Here I propose a new phylogenetic position of opalinids
based on β-tubulin gene phylogeny. Because of the difficulty of pure preparation of opalinid cells, molecular biology of

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opalinids has not been reported at all so far. In order to avoid contamination, DNA was extracted after repeated washing of
10 opalinid cells by micropipette. Thereafter the 18S rRNA gene and β-tubulin gene of opalinids were amplified. Partial
18S rDNA sequences commonly contained an opalinid-specific insertion in the 3’ portion of the coding region, indicating
no contamination by other protists. Phylogenetic analysis of the β-tubulin gene placed opalinids within alveolates, consisting of ciliates, apicomplexans and dinoflagellates, notin heterokonts. In fact, opalinids share more characteristics, e.g.
multinucleate, many cilia, double stranded ciliary necklace, with alveolates than heterokonts. Considering these results,
opalinids should be given an independent phylum in Alveolata, unlike the previous view.
［目的］オパリナ類は、主に無尾両生類の直腸に共生がアルベオラータである可能性は十分にあり得るとする原生生物である。オパリナ類は多数の核をもち、 思われる。そこで、オパリナ類のもつ形態的特徴におその体表は多数の繊毛で一様に覆われており、外見上いて検討した。まずHeterokontと共有している形質には繊毛虫らしくみえる。オパリナ類は鞭毛虫的特徴とついてまとめると、オパリナ類がHeterokontと共有し繊毛虫的特徴をあわせもっており、1683年レーウェンている特徴は、鞭毛基部の構造のみである上、オパリ

フックによって発見されて以来、様々な分類群に置かナ類はHeterokontの重要な特徴であるflagellar hairや、れてきた。初期の分類では原始的な特徴をもつ繊毛虫

四重膜の葉緑体をもたないということから、必ずしもであるとして、繊毛虫の中の無口類繊毛虫として分類

形態的特徴においてHeterokontに分類されるべきであされていたが、その後も分類がはっきりと定まらず、 るとは言えない。一方、オパリナ類はアルベオラータ
様々な議論がくり返されてきた。現在では、形態的特といくつかの重要な形質を共有していると考えられ徴の類似から同じ分類群とされているProteromonads

る。まず、ライフサイクルにおいては、異形配偶子のがクロミスタ界に移されたのにあわせ、鞭毛基部の構

完全な融合による有性生殖を行うという、渦鞭毛虫や造からクロミスタ界のHeterokontにオパリナ綱としてアピコンプレクサと共通した特徴を持つ。分裂様式に分類される考えが主流となっている（Cavalier-Smith,

おいては、断裂を行い、シストを形成するという点で1993）。しかし、オパリナ類のもつ鞭毛虫的特徴や繊アピコンプレクサと共通した性質をもつ。また、中心毛虫的特徴も無視できず、鞭毛基部の構造のみでは体が核内に存在するという点で繊毛虫と同じ形質をはっきりと分類を決定できないのが現状である。そこ共有している。さらに繊毛虫とは、多核化・多繊毛化で本研究では、オパリナ類のDNAを解析し、これまでしているという特徴を共有しており、また繊毛基部の報告のなかった分子的な側面からその系統的位置を

繊毛ネックレスとよばれる構造において共通した特明らかにしようと試みた。

徴を持つ。アルベオラータは、アルベオラスと呼ばれ［方法］18S rRNAとβ-tubulinにおいて、数種の原生生物の共通配列からプライマーを設計した。DNAサンプ
ルは、完全にコンタミを防ぐため、単離・洗浄したオ
パリナ類１０個体から抽出した。これらを用いてPCRを行い、増幅された断片の解析を行った。

る表層構造を持つことが知られているが、オパリナ類
においては、アルベオラスらしき構造があるという報告がされているが、これがそれらと等価な構造であるのかは明らかでない。
アルベオラータの中でも、オパリナ類は比較的繊毛虫と重要な形質を共有していると考えられるが、他の［結果］18S rRNAでは約280 bpの領域を増幅させるこ生物と共有している形質を考えると、オパリナ類は繊とに成功した。解析を行ったところ、オパリナ類に特毛虫とも異なる分類群であると思われる。従って、現有なinsertionと、オパリナ類と繊毛虫に特有なdeletion

在のところの結論としては、繊毛虫と比較的近縁なアがみられた。β-tubulinでは約1200 bpの領域を増幅させルベオラータの中の新しい一門として、オパリナ類をることに成功したので、NJ、MP、ML法によって系統分類すべきであると考えている。今後、α-tubulinや樹を作成した。計算方法やアウトグループに関わらmtDNAなど他の遺伝子についても解析を行い、オパ

ず、オパリナ類は現在分類されているHeterokontではリナ類と繊毛虫の関係を明らかにしていきたい。

なく、繊毛虫、渦鞭毛虫、アピコンプレクサからなる
アルベオラータに位置することが高いbootstrap値で示された。アルベオラータ内でのオパリナ類の分岐は、はっきりしなかった。
［考察］18S rRNAとβ-tubulinの解析から、オパリナ類［文献］
Cavalier-Smith, T. (1993) Kingdom protozoa and its 18
phyla. Microbiol. Rev., 57: 953-994.
Corliss, J. O. (1955) The opalinid infusorians: Flagellates orciliates? J. Protozool., 2: 107-114

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Noirot-Timothée, C. (1967) Etude en microscope électronique des inclusions cytoplasmiques de Cepedea di-17

mitochondries ou corps de Zeller. Protistologica, 3, 301312.

midiata (Prtozoa Opalinata) et plus specialement des

共生藻を持たないミドリゾウリムシParamecium bursariaへのイーストの細胞内感染
洲崎敏伸1，大村現1，ハンス‑デイエテル ゲルツ2
（1神戸大・理・生物，2シュトウットガルト大・生物学研

Infection of symbiont-free Paramecium bursaria with yeasts
Toshinobu SUZAKI1, Gen OMURA1 and Hans-Dieter GÖRTZ2(1Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ.; 2Biol. Inst., Univ. Stuttgart)
SUMMARY
Chlorella-free Paramecium bursaria is known to be infected with various species of free-living microorganisms
including yeasts and bacteria. In an attempt to understand the mechanism of establishment of the symbiosis, infection withthree different species of yeasts was examined. When Saccharomyces cerevisiae was mixed with Chlorella-free P. bursaria in sterile conditions, ingested yeasts were retained in the cytoplasm of P. bursaria for more than one week. The yeasts
did not associate with the cortical layer of cytoplasm, but kept moving around in the streaming cytoplasm. The yeasts werereadily ejected from the cytoproct when P. bursaria was fed with food organisms (Chlorogonium elongatum or Micrococcus luteus) or Chlorella that had been cultured outside P. bursaria. When other species of yeasts (Rhodotorula rubra or
Yarrowia lipolytica) were introduced, the ingested yeasts stayed permanently in the cortical cytoplasm among the trichocysts and multiplied in the cytoplasm. With these species, yeast retention is not disturbed by food uptake, but they disappear when the paramecia are re-infected with Chlorella. When P. bursaria was fed with Chlorella or yeasts, trichocysts
became detached from the cell cortex, and finally disappeared allowing the ingested symbionts to approach the cell cortex.
At the same time, many small vesicles of about 0.5 µm in diameter were observed instead. These observations suggest thatclose association of yeast cells with the inner surface of the cell cortex may be important for establishing stable interaction
with the host paramecia.
［目的］ミドリゾウリムシParamecium bursariaから共内にどのようなプロセスで共生するのかを観察した。

生クロレラを除去した白色P. bursariaには、イースト

また、クロレラが再感染することによって、イーストやバクテリアなど、様々な微生物が共生することが知がP. bursariaの細胞内からどのように消失していくのられている（Görtz, 1982）。また、このようにイース

かについても調べた。

トを共生させたP. bursariaは、更にクロレラを取りこ
むともできる。しかし、クロレラを取りこむと、それまで共生していたイーストはP. bursariaの細胞から消失していく。すなわち、P. bursariaは複数の種の共生体を受け付けないらしく、共生する度合いの強弱が存在するらしい。このような共生体の相互関係や共生の度合いを制御する仕組みを調べるこにより、細胞内共生の基本的な機構を理解することができるかもしれな
い と 考 え た。そ こ で 今 回 は、３ 種 の イ ー ス ト（Saccharomyces cerevisiae, Rhodutorula rubra, Yarrowia lipolytica）を白色P. bursariaに与え、それらが細胞［材料と方法］ミドリゾウリムシParamecium bursaria
は、餌にChlorogonium elongatumを用いた二者培養法
によって無菌的に培養した（Omura and Suzaki, 2002）。
クロレラを含有しないP. bursariaは、細胞をシクロヘキシミドで処理することにより作成し、クロレラを含む場合と同様に無菌的に培養した。実験に用いたイース ト は、Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9080)、
Rhodotorula rubra (Tü 8093)、Yarrowia lipolytica (DSM
1345) であり、これらはすべてnutrient agar培地で培養したものをSMB液に懸濁させてP. bursariaに与えた。
クロレラの再感染は、無菌的に培養したP. bursariaを

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強いピペッティング操作により破砕し、軽い遠心でクトが20-30 個/100 µm2 の密度でぎっしりと存在していロレラのみを集め、SMBで洗浄後、イーストを共生さた。しかし、クロレラやイーストを取りこむと、数時せたP. bursariaに与えることによって行った。このと間後にはほとんどのトリコシストが消失していた。わきのクロレラとP. bursariaの細胞密度は、それぞれずかに残ったトリコシストも、細胞表層からは離脱し

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1.7×10 cells/mlと10 cells/mlだった。
［結果と考察］実験に用いた全てのイーストがクロレ
ラを除去したP. bursariaに対して細胞内共生を行った。R. rubraとY. lipolyticaは、P. bursariaの細胞表層に定着して増殖し、恒久的な共生関係を確立させた。R.
rubraはしかし、S. cerevisiaeは細胞内に一週間から10日程度は保持されたが、その後は自然に消失した。P.
bursariaの細胞内に保持されている状態のS. cerevisiae
は、細胞の表層には定着せず、常に細胞内部の流動す
る原形質中に存在していた。このように、P. bursariaの細胞表層に定着することのできる種類のイーストは
恒久的な共生関係を確立し、細胞表層に定着できない
S. cerevisiaeは完全な共生関係を確立できなかった。さらに、イーストやクロレラがP. bursariaの細胞内に定ていた。また、トリコシストの消失と同時に多数の直径約0.5 µmの顆粒が出現し、少数のトリコシストと共に細胞内部の原形質流に乗って流動していた。このとき、原形質流動は細胞膜直下にまで及んでいた。イーストやクロレラを与えて約24時間後には、多くの共生体が細胞表層にドッキングしており、同時に多くのトリコシストが再生していた。以上の結果より、トリコ
シストが消失して接近しやすくなった細胞表層へ共生体が結合することが、共生の確立には重要であるという可能性が示唆された。また、イーストを共生させたP. bursariaにクロレラを与えると、イーストは生きたままで即座にP. bursariaの細胞肛門より排出されていることがわかった。細胞内で消化されて排出されるイーストも存在した。

着する様子を観察したところ、共生の開始時にはP.

［文献］

bursariaの細胞表層直下に存在するトリコシストの形

Görtz, H.-D. (1982) J Cell Sci., 58:445-53.

態変化が生じることがわかった。クロレラを有さない

Omura, G. and Suzaki, T. (2002) Jpn. J. Protozool., 35: 57.

P. bursariaにおいては、細胞表層直下にはトリコシス

MPN法による土壌繊毛虫のバイオマス推定の試み
高橋忠夫１，赤崎由梨耶１，野田千史１，橋口貞子１，福田博美１，百崎さおり１，
渡邊晋代１，橋本知義２（１西九州大・生物，２九州沖縄農研・土微研）

Preliminary studies on the estimation of biomass of soil ciliates by the MPN method
Tadao TAKAHASHI1, Yurika AKASAKI1, Chifumi NODA1, Sadako HASHIGUCHI1, Hiromi FUKUDA1, Saori MOMOSAKI1, Kuniyo WATANABE1 and Tomoyoshi HASHIMOTO2(1Biol. Lab., Nishikyushu Univ., 2Natl. Agr. Res. Cent. Kyushu Okinawa Reg.)SUMMARY
In order to understand the role of ciliates in the soil ecosystem, it is very important to determine their fauna andbiomass. However, the methodology for the estimation of their biomass has not yet been sufficiently established. The
purpose of this study is to examine whether the MPN (Most Probable Number) method, which is frequently used in theestimation of the biomass of soil bacteria and fungi, is applicable to soil ciliates. In this work, soil samples were collectedfrom a farm, which had been supplied livestock slurry for a long period, in the Kyushu Okinawa agriculture research centerat Miyazaki. The biomass of the soil ciliates was estimated using two MPN sub-methods. In sub-method 1, a 10-folddilution series of soil samples was transferred to a 96-well microplate, 0.1 ml sample per well. The plates were maintained
at 23°C and monitored regarding the appearance of ciliates in each well for about one month. In sub-method 2, a 10-folddilution series of soil samples was transferred to 3-well-depression slides with 0.7 ml sample each. These were also
maintained and monitored regarding the appearance of ciliates for about 2 weeks. Furthermore, we transferred the ciliatesJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

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which were found in the depression slides to 1% methylcellulose and identified their genus. We obtained significantly
different estimations of the biomass for the same soil samples when using different sub-methods. The cause of thesedifferences should be investigated in the future.
［目的］水生生物である繊毛虫が土壌中にも生息して［結果と考察］方法1では、土壌1g当りの繊毛虫数は、いることは良く知られている2,3,4,5。土壌生態系におい0t区では27,000、60t区では215,000、150t区では129,000、て土壌繊毛虫は細菌や菌類その他の捕食者として、ま300t区では247,000であった。すなわち、60t区と300t区

た上位消費者の栄養供給源として重要な役割を演じには有意差が認められず、家畜スラリー投与量と繊毛ていると考えられているが、それらに関する情報は極虫バイオマスとの関係は不明瞭であった。また、このめて少ない。我々の研究室では、様々な土壌タイプに方法では、最も多く生息していた繊毛虫の個体数を見おける繊毛虫相について調べてきたが5、食物連鎖に積もったことになるので、繊毛虫全体のバイオマスとおける土壌繊毛虫の役割を解明するためには、それらしては過小評価である可能性があることと、個々の種のバイオマスを明らかにすることも重要である。そこがどの程度生息していたのかが分らない。この欠点をで、土壌微生物や菌類のバイオマス推定に良く利用さ補うため、方法2によって、個々の種のバイオマスの推れているMPN法 1,4が繊毛虫のバイオマス推定にも適定を試みた。その結果、土壌1g当り、最も多く生息し用できるかどうか検討した。

ていたと推定された種の繊毛虫数は、0t区から150t区［材料と方法］実験に用いた土壌サンプルは、宮崎県都城市の九州沖縄農業研究センターにある長期家畜
スラリー連用圃場で、2002年3月25日（2002年度家畜スラリー投与前）に採取した。この圃場では、1985年以来家畜スラリーを長期にわたって投与し続けており、各区画の投与量その他が厳重に管理されている。採取した区画は、1ha当り、0t、60t、150t、300tの家畜スラリーを投与してある４区画で、深さ20cmまでの表層土壌を採取し、室温で保存した。
MPN法による土壌繊毛虫のバイオマス推定は2つの方法で検討した。
方法1では、土壌試料0.5gにバクテリアを含むKCM
塩溶液（0.7g KCl, 0.6g CaCl2, 0.8g MgSO4･7H2O, 1000ml
DW、使用時に100倍稀釈）5mlを加えたものを10−1稀釈
試料とし、土壌粒子を振盪分散させたのち10倍稀釈系
列を作製した。それらを、96穴マイクロプレートに0.1mlずつ分注し、23℃で培養し、各ウエル中に繊毛虫が生息しているかどうかを約1ヶ月間追跡した。
方法2では、土壌試料1gにバクテリアを含むレタス
浸出液 9mlを加えたものを10−1稀釈試料とし、土壌粒
子を振盪分散させたのち10倍稀釈系列を作製し、それらを窪みスライドに分注して、23℃で培養した。その後、2週間、繊毛虫の出現を記録するだけでなく、それらを1％メチルセルロースに移して運動を抑制した
後、種の同定を行なった。

では、6,500から7,000で有意差が認められなかった。これに対して、300t区のCyrtorophosis sp.1のバイオマス
は19,000、Colpoda sp.8は17,000で、これは他の出現種のバイオマスに比べて有意に大きかった。しかし、この値は、方法1の推定値に比べると極端に小さい。さらに、方法2の各区で出現した種の合計個体数で比較しても、方法2の推定値は方法1の1/2以下であり、0t区のみ有意差がなかった。このような差が何故生じたのかは、現在のところ不明で、方法の改良を含めて、今後さらに検討していく必要がある。さらに、土壌中で、活動している繊毛虫とシストになっているものの区別法および採取した土壌サンプルの最適な処理法についても今後の検討課題である。
［文献］
1) 土壌微生物研究会編 (1992) 新編土壌微生物実験法,
養賢堂
2) Fenchel, T. (1987) Ecology of Protozoa, SpringerVerlag, Berlin.
3) Foissner, W. (1987) Prog. Protistol., 2, 69-212.
4) 橋本知義 (2000)土の原生動物のはたらき, 新・土の微生物 (7) 第2章、pp.55-91.
5) 高橋忠夫 (2000)土の原生動物, 新・土の微生物 (7)第1章、pp. 5-54.

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原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

赤痢アメーバのファルネシル転移酵素の解析
熊谷正広1，牧岡朝夫1，竹内 勤2，野崎智義3,4 (1慈恵医大・熱帯医学，2慶大・医・
熱帯医学・寄生虫学，3感染研・寄生動物，4PRESTO・科技団）

Molecular cloning and characterization of farnesyltransferase of Entamoeba histolytica
Masahiro KUMAGAI1, Asao MAKIOKA1, Tsutomu TAKEUCHI2 and Tomoyoshi NOZAKI3,4 (1Dept.
Trop. Med., Jikei Univ. Sch. Med., 2Dept. Trop. Med. Parasitol., Keio Univ. Sch. Med., 3Dept. Parasitol., Natl. Inst. Infect. Dis., 4PRESTO, JST)SUMMARY
Farnesylation, one of the post-translational lipid modifications of proteins such as Ras, is catalyzed by farnesyltransferase (FT). Since farnesyaltion is essential for Ras to function, FT has been attracted attention as a target of cancer
chemotherapy. We studied FT of Entamoeba histolytica biochemically to assess its biological importance and possibility asa target of chemotherapy. cDNA of α and β subunit (FTα, FTβ) of the enzyme were PCR amplified using primers designed
on homology search of E. histolytica genome databases at NCBI. Those encoded 298 and 375 amino acid open reading
frames, respectively, with 24-36% positional identity with those of human, Saccharomyces cerevisiae and Trypanosoma
brucei. The coding regions of both subunits, and ribosome binding sites between them, were cloned in tandem in pQE31,
and were expressed in Escherichia coli. Thirty-eight and 43 kD proteins, corresponding to FTα and FTβ were produced.
The recombinant proteins farnesylated human recombinant H-Ras(-CVLS), and showed little activity on mutant Ras(CVLL), when assayed by incorporation of [3H]farnesyl pyrophosphate. Among 4 recombinant E. histolytica Ras homologues (-CIMF, -CELL, -CSVM, -CVVA), only Ras homologue-CVVA was the substrate. This suggests a difference insubstrate specificity between human and E. histolytica FT, which may be exploitable for chemotherapy.
［目的］タンパク質の翻訳後の脂質修飾であるプレニ

ン・タグを用いて精製した。 酵素活性はヒトRasへのル化は細胞内情報伝達分子として重要な低分子量G[3H]ファルネシル・ピロリン酸の取り込みによって測タンパク質等の膜への付加に必須であるばかりでな定した。

く、他のタンパク質との相互作用においても重要な働きをしている。プレニル化にはファルネシル転移酵素(FT) に触媒されるファルネシル化とゲラニルゲラニ
ル転移酵素(GGT)によるゲラニルゲラニル化がある。
低分子量Gタンパク質の一つであるRasはFTによりプレニル化されるが、Rasに突然変異が生じると細胞が癌化することが知られている。このRasの機能発現にプレニル化が必須であることから、FTは抗癌剤の標的分子としても注目されている。今回、抗原虫治療薬の開発を目的として赤痢アメーバのFT遺伝子のクロー
ニング、組換えタンパク質の酵素学的解析を行った。

［結果及び考察］FTα、FTβはそれぞれ298、375アミノ酸からなり、ヒト、Arabidopsis thaliana、Saccharomyces
cerevisiae、Trypanosoma bruceiのFTα・FTβと24−36%の同一性を示した。 FTαおよびFTβ組換えタンパク質は38kD・43kDタンパク質複合体として精製された。この組換えFTはヒトのRas(-CVLS) に対して活性を示したが、変異型のRas(-CVLL)に対しては活性が認められなかった。次に、赤痢アメーバRasの組換えFTに対する基質活性を調べた。FTの場合と同様に赤痢アメーバのゲ
ノム・データベースから得られた塩基配列を用いてPCRによる増幅、発現プラスミドの作成を行い、カル［方法］赤痢アメーバの両サブユニットFTαとFTβ遺

ボキシ末端の異なる４種の組換えRasタンパク質 (-伝子のアミノ末端とカルボキシ末端の塩基配列をゲ

CIMF、-CELL、-CSVM、-CVVA)を調製した。赤痢ア

ノム・データベースから得てFTαとFTβそれぞれのメーバ組換えFTがこれらの組換えRasに対して活性をcDNA全長をPCRで増幅・クローニングし、塩基・アミ示すかどうか調べた結果、Ras(-CVVA) のみが基質活

ノ酸配列を決定した。次に、FTαとFTβのORFを同一プ性を示した。以上の結果から、赤痢アメーバFTと高等ラスミド (pQE31)上にリボゾーム結合部位をはさんで動物FTとの相違が明らかになり、標的分子としての重つなげ、大腸菌発現プラスミドを作成した。発現した要性が示唆された。

FT複合体はFTαのアミノ末端側に付加したヒスチジ

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)21

わが国で初めて分離されたNaegleria australiensis
朝倉登喜子，八木田健二，泉山信司，下河原理江子，遠藤卓郎（国立感染症研究所・寄生動物部）

First isolation of pathogenic Naegleria australiensis in Japan
Tokiko ASAKURA, Kenji YAGITA, Shinji IZUMIYAMA, Rieko SHIMOGAWARA and Takuro
ENDO (Dept. Parasitol., National Institute of Infectious Disease, Japan.)
SUMMARY
Free-living amoeboflagellates of the genus Naegleria are found worldwide in varieties of waters. In this genus, there
have been three species living in thermal waters reported to be pathogenic to human and animals (N. fowleri) or to havepotential to kill experimental animals (N. australiensis, N. italica). The objective of this study is to demonstrate a possible
occurrence of pathogenic Naegleria in man-made thermal waters including whirlpool baths commonly used in Japan.
Water samples were collected mainly from whirlpool baths, and cultured at 42°C for up to 7 days on nonnutrient agar plates
coated with heat inactivated Escherichia coli. Amoebae isolated from the culture with the morphology of Vahlkampfiidae
were cloned and analyzed by means of PCR/RFLP for the ITS region according to the method of Pelandakis and Pernin(2002) with slight modifications. The 400 bp PCR product can be obtained from amoebae in the genus Naegleria, of which
RFLP for Mse I gives a major fragment of 330 bp for N. australiensis and two fragments of 287 bp and 100 bp for N.
fowleri. Among 26 Naegleria isolates so far examined, 11 isolates showed the PCR/RFLP pattern of Naegleria including
N. australiensis. Further investigation by the direct sequencing of the ITS region revealed that there were two types of N.
australiensis; one had ITS sequence identical to the authentic strain of N. australiensis (PP-397) while the other one had an
insertion of 2 thymine residues at +322 in the sequence. These two strains were also confirmed to have identical isozyme
patterns for both acid phosphatase and propionyl esterase to those of PP-397. This is the first report for the isolation of N.
australiensis in Japan. The isolates are presently processed to test for their ability to kill mice after intranasal instillation.
［目的］近年、浴槽中のレジオネラ汚染問題に付随しに特異的なバンド(約400 bp)が観察されたものを制限て、レジオネラの宿主であるアメーバ類が問題視され

酵素MseⅠで切断し、得られた反応産物を5％ポリアクている。一方で、アメーバ類はそれ自体が強い病原性

リドアミドゲルで電気泳動した。さらにPCR-RFLP法をもつことが知られ、温水環境を好むアメーバ類のうによりNaegleriaと判断された試料についてDNA塩基

ち Naegleria fowleri はアメーバ性髄膜脳炎の起因とな配列決定を行った。同時に、IEF (Isoelectric forcusing)でる。本研究班は、昨年より全国14自治体に協力を得て、 ア イ ソ ザ イ ム パ タ ー ン を 分 析 し た。泳 動 条 件 は無作為に選出された温水環境よりアメーバ類の汚染

Prefocussing 10W 40min、Forcussing 20W 3.5kVhであ実態の調査を行っている（遠藤, 2002）。今回、実験的り、対象とした酵素はACP(Acid phosphatase) 及びPEに病原性が証明されている N. australiensis が分離、同(Propionyl esterase)で確認した。

定されたので報告する。
［材料と方法］浴用水等の試料水50 mlを1750×g、5分［結果と考察］昨年の本研究班の調査では、Naegleria
属と同定されたアメーバのうち、N. fowleri と同一環境

間遠心沈殿した。上清を除去し、沈査（0.5 mlに調整） に生息する N. lovaniensis が約半数をしめ、それ以外はの全てを平板培地上に塗布し、アメーバをクローニン

未知種が多いという結果が得られている。本年度はグした。増殖中の栄養虫体を適当量とり、Triton X-100

PCR、RFLP、DNA配列決定を行うという手順で進めて溶液を加え、熱処理したものをPCRのテンプレートといたところ、これまでの Naegleria とは異なる株が分した。

離された。本アメーバは42℃の培養条件で増殖するこ

PCRはITS（Internal Transcribed Spacer Region）領域をとが確認された。得られた環境株１及び２はPCRの結標的としたプライマー（5’- GAA CCT GCG TAG GGA

果、Naegleria 属に特異的な約400 bpのバンドの増殖が

TCA TTT -3’ 及び5’- TTT CTT TTC CTC CCC TTA

みられ、MseⅠによるRFLPパターンでは330 bpのバン

TTA -3’）を用い、アニーリング温度55℃、35サイクル

ドが観察された。これは N. fowleri、N. lovaniensis のパで実施した（Pelandakis and Pernin, 2002）。Naegleria属

ターンとは異なり、N. australiensis と一致した。分離さ原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

22

れた環境株１及び２についてDNA塩基配列決定をび２は本邦初の N. australiensis と同定された。現在、行ったところ、N. australiensis とそれぞれ100％、99.4％

マウスによる病原性試験を行っている。

の相同性を示した。後者では、（N. australiensisのPCR
産物を基準として）ITS領域の+322の位置に、2つのT
塩基の挿入が確認された。さらにIEFによるACP及びPEのアイソザイムパターンは N. australiensis に一致した。
以上の結果により、本年度進行中の温水環境におけるアメーバの調査から得られた Naegleria 環境株１及［文献］
Pelandakis, M. and Pernin, P. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68, 2061-2065.
遠藤卓郎 （2002） 厚生科学研究費補助金 生活安全総合研究事業 平成13年度 総括・分担研究報告所 H13生活-042 pp. 9-58, 77-91.

Naegleria fowleriとN. lovaniensisのタンパク質の2D−PAGEによる比較(2)小村麻子，八木田健司，泉山信司，下河原理江子，遠藤卓郎（国立感染症研究所）

Comparative study of protein profiles on pathogenic and nonpathogenic Naegleria
species by 2D-PAGE (2)Mako OMURA, Kenji YAGITA, Shinji IZUMIYAMA, Rieko SHIMOGAWARA and Takuro ENDO
(Dept Parasitol., NIID, Japan)
SUMMARY
Naegleria fowleri, a causative agent of primary amoebic meningoencephalitis (PAM), is known to be morphologically indistinguishable from non-pathogenic N. lovaniensis. Their protein profiles by isoelectric focusing (IEF) separation
were reported to be also quite the same. Recent technological progress of protein analyses makes it possible to compare
proteomes of the genus Naegleria by analyzing the spots into amino acid level after being separated by 2D-PAGE. An
average gel of N. fowleri which ideally represented protein spot patterns common in the species was obtained from the 5
strains of this species, such as 4 authentic strains (Nf66, KUL, LEE, 76/14/S3) and one Japanese isolate (KURUME), anddetected 228 protein spots common in the species. Similarly, an average gel of N. lovaniensis was obtained from 2 strains(Aq/9/1/45D, TS), and detected 246 spots. The pairwise comparison of average gels using computer-assisted spot matching
showed that these two species exhibited marked diversity, with percentage of matching being 38.6% (88 common spots).
Among 140 spots specific for N. fowleri, 16 were selected and analyzed the N-terminal amino acid sequences, and revealed
that a 17 kDa protein (pI ~ 5.2) was identified as Mp2CL5 membrane protein specific for N. fowleri. Four additional protein
spots could be demonstrated to be highly related to other known proteins, namely HSP-70 and three enzymes of carbohydrate metabolism.
［目的］強い病原性を持ち原発性アメーバ性髄膜脳炎を引き起こす N. fowleri と、本種と形態的同一種である N. lovaniensis は形態のみならず、生息域、温度耐性、培養細胞に対する細胞障害性などといった生物学的性状も共通している。両者の分類学的な独立性の根拠
は、病原性を欠くこと、一部のアイソザイムパターンに差異が認められることのみとされて来た。
本研究では、N. fowleri および N. lovaniensis の類似点
お よ び 相違 点 を網 羅 的に 比較 す る 手段 と して 2DPAGEを行い、両者の比較を行った後、特徴的なタンパ
クスポットについてN末端アミノ酸配列解析を行った。
［材料と方法］N. fowleri 5株（NF66株、KUL株、LEE
株、76/14/S3株 及 び Kurume 株）、N. lovaniensis 2 株（Aq/9/1/45D株及びTS株）をSCGYEMを用いて30℃で無菌培養し、約10７個の虫体を得た。虫体を凍結融解
し、TCA（10%）沈殿により得られたタンパク画分を用いて2次元電気泳動を行ない（1D：ｐH3‐10、18cm
Immobiline DryStrip、35KVh，2D：12.5％、SDS−PAGE）
CBBで染色した。ゲル間の株差によるスポットのばら
つきを平均化するため、同一種ごとにアベレージゲル

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

を作成してImage Master 2D Elite ver.3.0(Amersham-

23

個、N. lovaniensisで158個であった。

biosciences社)で画像解析して両者の比較を行った。得

画像解析で得られた情報をもとに、N. fowleri Nf66

られたタンパクスポットの情報をもとにN末端アミ株を代表としてN末端アミノ酸配列解析を行った。現ノ酸配列解析を行った。N. fowleri Nf66株を代表とし在までに16個のタンパクスポットについて20残基程て、2D‐PAGE後のゲルをPVDF膜にブロッティング

度のアミノ酸配列が得られ、それらについてFASTAにした後目的のスポットを気相シークエンサー（Procise

よるホモロジー検索を行った。その結果、未知が11ス

494cLC、Applied Biosystems社）で分析した。得られた

ポット、糖代謝に関わる酵素3スポット、またHSP 70と配列についてFASTAによるホモロジー検索を行った。 高い相同性を認めるスポット1個を分離した。さらに［結果と考察］N. fowleri 5株及び、N. lovaniensis 2株で２D-PAGEの結果、同一種内の異なる株間におけるスポットの相同性は70％前後であり、株間における差異

N. fowleriで共通の17kDaタンパクスポット1個については、N. fowleri membrane protein MP2Cl5と同定され、今回初めて2次元電気泳動による分離に成功した。

を認めた。この株差を除く為、それぞれの種につき［文献］

Max Absence = 0、すなわちグループ内のすべてのゲル

Amphizoic Amoebae Human Pathology, 1987, ed. Ron-に共通するスポットを採用するという条件でアベ
レージゲルを作製したところ、N. fowleri で228個、N.
lovaniensis で246個のスポットが種内の共通スポット

danelli E. G., Piccin Nuova Libraria ; Padova
Freshwater and Soil Gymnamoebae, 1988, ed. Page. F. C.,
Titus Wilson & Son Ltd.; Kendal

として選択された。この両者を比較したところ、88個

Reveiller, F.L., Suh, S.J., Sullivan, K., Cabanes, P.A. andの種間共通スポットが得られ、相同率は38.6％であっ

Marciano-Cabral, F. (2001) J. Eukaryot. Microbiol. 48,

た。また、種間で非共通なスポットはN. fowleriで140676-682.

紫外線によるジアルジア嚢子の不活化試験
泉山信司、八木田健司、朝倉登喜子、遠藤卓郎（感染研・寄生動物）

Inactivation of Giardia lamblia cysts by ultraviolet irradiation
Shinji IZUMIYAMA, Kenji YAGITA, Tokiko ASAKURA and Takuro ENDO
(Dept. Parasitol., National Institute of Infectious Disease, Japan.)
SUMMARY
The present paper deals with the sensitivity of G. lamblia cysts to ultraviolet irradiation as a possible measure for theinactivation of enteric pathogens transmitted via the drinking water. G. lamblia cyst suspensions to be irradiated wereplaced in open 6cm plastic Petri dishes. The depth of the suspensions was 4.7 mm. The ultraviolet source was a 5 W lowpressure mercury lamp, which gave an intensity of 0.05 mW/cm2 at a distance of 39 cm for the G. lamblia exposures. The
cyst suspensions were exposed at the constant ultraviolet intensity mentioned above with varying exposure time so as togive exposure doses for up to 1.2 mJ/cm2 at varying water temperatures ranging from 4 to 30°C. The cysts viability wastested by cultivation in TYI-S-33 culture medium. Briefly, the irradiated cysts were treated with excystation medium, andwere concentrated into inocula - 0.1 mL each, containing between 100 and 104 cysts with decimal dilutions — which weretransferred into screw-capped glass vials filled with the culture medium to minimize gas phase. The cultures were observed
microscopically for signs of Giardia growth for up to 2 weeks, and titers were calculated as most probable numbers (MPN).
A 2-log10 reduction in activity, namely 99% inactivation, was obtained at 1 mJ/cm2 (= mW · s/cm2) regardless of watertemperatures examined. The results obtained in the present experiment demonstrate that ultraviolet irradiation is a plausible
method for the inactivation of G. lamblia cysts.

24

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年［目的］Giardia症の感染経路はいわゆる糞-口感染で、 ずれかで行った。
従来は人と人の接触や食品を介した感染が中心で照射後の嚢子は脱嚢処理を行い、10倍希釈系列を作あったが、今日では水道水を介した大規模な集団感染

成後、希釈段階毎に3本の培養試験管に接種した。培地が問題となっている（Levy et al., 1998）。Giardiaをはには抗生物質を添加したTYI-S-33培地を用いた。35℃じめとする原虫類は塩素消毒に強い抵抗を示し、現行で培養を行い、約2週間にわたり倒立型位相差顕微鏡の浄水処理では対応しきれない状況に陥る恐れがあを用いて定期的に観察を行った。培養試験管の内壁にることから、現行の処理に加えて新たな消毒処理技術

付着している栄養体の増殖がセルシート状に達したの検討がなされている。検討の対象となっている処理

試験管を陽性と判断し、活性を持つ嚢子数を最確値方法としては、紫外線照射、オゾン等の処理が挙げら（MPN）として求めた。

れるが、管理とコストの面から紫外線照射に期待が寄せられつつある。本研究では紫外線照射によるGiardia
嚢子の不活化効果を検討した。

［結果と考察］Giardia嚢子に対して紫外線照射を
2
0.5 mW･sec/cm2）では約1-log行った結果､0.5 mJ/cm（=（90％）の増殖阻害が、1 mJ/cm2付近の照射では約2-［材 料 と 方 法］米 国 ATCC よ り G. lamblia WB 株

log（99％）の増殖阻害効果が観察された。照射時の水（#30957）を入手し、TYI-S-33培地を用いて準嫌気条

温を4℃および30℃とした場合でもこの増殖阻害効果

6

件で継代培養した（Keister, 1983）。栄養体（10 個/head） に変化は見られなかった。
をスナネズミ（Meriones unguiculatus、MON/Jms/Gbs）

栄養体に対して行った紫外線照射試験では、1 mJ/に胃ゾンデを用いて投与し、感染動物を得た。排泄さcm2の照射量で5-log近い不活化効果が得られた。カモ

れた新鮮便を0.1%のTween 80を含む精製水に溶き、シカ分離株を用いて同様の試験を行ったところ、WB

ショ糖浮遊法を繰り返すことで嚢子の精製を行った。 株との差異は見られなかった。なお、栄養体に対する当該研究室では平成13年1月に山形県産カモシカよ紫外線の不活化効果は嚢子に対するそれよりも効果

りGiardia sp.を分離し､TYI-S-33培地にて継代培養し的であったが、嚢子の被嚢していることが効果の差とている。この株は蛍光抗体染色による観察、および微なって現れたのではないかと見られる。例えば、嚢子

分干渉顕微鏡での観察において、G. lamblia WB株とのが休眠状態にあり染色体の立体構造も濃縮状態にあ

形態学的な差異は認められない｡

るものと推測されること、形態的に嚢子の核が栄養体

紫外線照射のバイオセンサーとしてBacillus subtilis
Marburg-168 strain（枯草菌）を使用した。
紫外線により核酸に損傷を受けたGiardiaの増殖阻に比べて小さいこと､細胞に含まれる核の数が嚢子では4、栄養体では2と2倍違うこと、あるいは嚢子壁による紫外線の吸収が影響しているのかもしれない。

害を評価する方法として、培養による増殖試験（in対照として枯草菌を用いた紫外線照射を行ったが、vitro cell culture viability assay）を用いた。紫外線ランプ

1 mJ/cm2の照射条件では増殖阻害効果が認められず、は極大波長が254 nmの5W低圧水銀ランプ（岩崎製作

Giardiaはきわめて紫外線の感受性が高い生物である

所）を用いた。クランプで固定したランプの直下約39と考えられた。

cmにGiardia 浮遊液10 mlを入れた6 cmシャーレを置き（水層の深さ: 4.7 mm）、所定の線量を照射した。線量計には紫外線積算光量計UIT-150-A+UVD-S254（ウシオ電機）を使用し、センサーをシャーレと並置して照射毎に積算量を求めた。5分以上ランプを予熱した
後に照射を行い、照射時間は遮蔽板を用いて制御した。照射時の水温は4℃、22〜23℃（室温）、30℃のい［文献］
Keister, D. B. (1983) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77,
487-488.
Levy, D. A., Bens, M. S., Craun. G. F., Calderon. R. L. and
Herwaldt, B. L. (1998) MMWR CDC Surveill. Summ.
47, 1-34.

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

25

クリマコストールのミトコンドリア呼吸鎖阻害作用
武藤吉徳1，田辺裕美子2，河合清2，飯尾英夫3（ 岐阜大・医・基礎看護，2中京女子大・健康科学，3大阪市大・院理・物質科学）
1

Inhibition of mitochondrial respiration by climacostol
Yoshinori MUTO1, Yumiko TANABE2, Kiyoshi KAWAI2 and Hideo IIO3
( Dept. Basic Health Sci. and Fundamental Nurs., Gifu Univ. School of Med., 2Fac. Wellness, Chukyo
Women's Univ., 3Dept. Material Sci. Graduate School Sci., Osaka City Univ.)
1

SUMMARY
Climacostol, found by Miyake et al., is a resorcinol derivative that exists in ciliate Climacostomum virens. Exposure to purified climacostol results in lethal damage to the predatory ciliate Dileptus margaritifer and several other ciliates. To elucidate the mechanism of climacostol action, we investigated the effects of this compound on the swimming
behavior of Tetrahymena and respiration of rat liver mitochondria. When added to living Tetrahymena cells, climacostol
markedly increased the turning frequency that is accompanied by a decrease in swimming velocity and subsequently
followed by cell death. Observation by fluorescence microscopy showed morphological changes in mitochondria stainedwith Mitotracker, indicating that mitochondria may be a target site for climacostol. Furthermore, climacostol inhibited
NAD-linked respiration in rat liver mitochondria, but had no apparent effect on succinate-linked respiration in submitochondrial particles. This finding indicates that climacostol specifically inhibits respiratory chain complex I in mitochondria. Taken together, these results suggest that the inhibition of mitochondrial respiration may be a cytotoxic mechanismof climacostol’s defenses against predatory protozoa.
［目的］三宅らによって見いだされたクリマコストー

ンドリア画分を用いて酸素電極法により測定した。

ル（Climacostol）は，繊毛虫Climacostomum virensに存

NADH及びコハク酸を直接の基質として測定する際在するレゾルシノール誘導体である（Masaki et al.,は，ミトコンドリアを超音波破砕することにより得ら

1999）。本化合物は捕食性の繊毛虫に対して致死活性れる亜ミトコンドリア粒子を用いた。

を有しており，防御毒素として機能していることが明らかにされている（Miyake，2002）。しかしながら，
その詳細な作用機構については，ほとんど明らかにされていない。一方，クリマコストール以外にも多くのレゾルシノール誘導体が既に知られており，それらの中の幾つかはミトコンドリアの機能を抑制することが報告されている（Komolova et al., 1989）。そこで，
本研究ではクリマコストールの細胞毒性のメカニズ
ムを明らかにするために，ミトコンドリアに注目して解析した。

［結果と考察］Tetrahymena懸濁液にクリマコストー
ルを加えて運動軌跡を経時的に観察すると，添加直後には細胞の方向転換頻度が増加し，遊泳速度が低下した。その後，２分〜３分後には運動性が回復するが，５分以降になると運動はほぼ完全に停止した。このときの細胞の形態を微分干渉顕微鏡で観察すると，細胞は球形や楕円形を呈しており，一部の細胞は溶解していた。MitoTrackerを用いるとTetrahymenaのミトコン
ドリアが繊毛列に沿って配列していることが観察されるが，クリマコストールによって球形化した細胞で［材料と方法］Tetrahymena thermophila の運動軌跡は， はミトコンドリアの配列は大きく乱れていた。これら
無機塩類溶液中の細胞集団を暗視野照明下で観察し， の結果は，クリマコストールがTetrahymenaに対して
CCDカメラで取得した0.1秒おきのTime-lapse画像かも細胞毒性を及ぼすことができることを示している。

ら再構成した。画像解析及び画像処理の一部には，

次に，ミトコンドリア機能に対するクリマコストー

NIH Imageを用いた。また，Tetrahymenaのミトコンド

ルの影響を明らかにするために，Tetrahymenaの酸素

リ ア を 観 察 す る た め に は，MitoTracker Green FM

消費を測定した。酸素電極を用いて細胞懸濁液のO2濃(Molecular Probes)を用い，
直径10 µmのラテックスビー

度を経時的に測定すると，内在性の基質の利用に基づズを支持物として生細胞を保持して観察した。ラット

いたO2濃度の減少が検出された。この条件下で，細胞肝ミトコンドリアの呼吸活性は，分離精製したミトコ

外液にクリマコストールを加えると酸素消費は著し

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

26

く阻害された。また，ラット肝から分離精製したミト

た，本化合物の繊毛虫に対する細胞毒性の少なくともコンドリアでも，NADHを基質とした酸素消費が抑制

一部は，ComplexⅠの電子伝達阻害に基づいたミトコされた。しかしながら，コハク酸を基質とした電子伝

ンドリア機能の障害であることが推測される。

達は全く影響を受けなかった。一般に，ミトコンドリ
アのNADH依存性呼吸はComplex Ⅰを経由しており，
コハク酸依存性呼吸はComplex Ⅰとは別の成分であるをComplex Ⅱを経由することが知られている。したがって，クリマコストールはComplexⅠを特異的に阻害していると考えられる。
以上の結果は，クリマコストールが広汎な生物のミ
トコンドリア呼吸を阻害することを示唆している。ま［文献］
1.三宅章雄 (2002) Jpn. J. Protozool. 35, 97-117.
2. Masaki, M.E., Harumoto, T., Terazima, M.N., Miyake,A., Usuki, Y. and Iio, H. (1999) Tetrahedron Lett. 40,
8227-8229.
3.Komolova, G.S., Gorskaia, I.A., Kaverinskaia, T.V. andSheveleva, I.D. (1989) Biokhimiia 54, 1847-1851.

小麦若葉粉末に含まれるゾウリムシに対する毒物質を無毒化するバクテリア由来タンパク質の精製
溝渕直美1，横井川久己男2, 1，春本晃江3, 1，藤澤裕美1, 3，高木由臣3, 1，（1奈良女大・院・人間文化，2奈良女大・生環・食物，3奈良女大・理・生物）

Purification of bacteria-derived protein that neutralizes toxin in WGP
used for the growth of Paramecium
Naomi MIZOBUCHI1, Kumio YOKOIGAWA2, 1, Terue HARUMOTO3, 1, Hiromi FUJISAWA1, 3 andYoshiomi TAKAGI3, 1
1( Div. Human Envir. Sci., Grad. Sch. Human Cult., Nara Women’s Univ.; 2Dept. Food Sci. Nutr., Fac.
Human Life Envir., Nara Women’s Univ.;3Dept. Biol., Fac. Sci., Nara Women’s Univ.)
SUMMARY
Paramecium cells are usually cultured in bacterized plant infusion; wheat grass powder (WGP) infusion inoculatedwith Klebsiella pneumoniae. However, WGP infusion without bacteria is toxic to paramecia, and bacteria derived substances detoxifies the killing substance. Here, the detoxifying substance, which was found proteinaceous, was purified tohomogeneity from K. pneumoniae. The protein had an apparent molecular mass of about 200 kDa by gel filtration and 92
kDa by SDS-gel electrophoresis. Although the amino acid sequence of amino terminal region did not show sequence
identity with any reported proteins, amino acid sequences of internal regions of the protein were almost identical withcatalase HPII from Escherichia coli. When the WGP infusion (3 ml) was treated at 25oC for 1 h with 0.8 unit of commercially available catalase from bovine liver, the toxicity of the infusion against paramecia was completely abolished.
The initial concentration of hydrogen peroxide in the WGP infusion was about 30 µM and completely decomposed by thecatalase treatment. Therefore, the toxic substance in the WGP infusion and the detoxifying substance from K. pneumoniae
are considered hydrogen peroxide and catalase, respectively.
［目的］ゾウリムシの培養には、通常、植物の浸出液

物質が含まれており、この毒物はバクテリアにより無にバクテリアを接種したものを培養液として用いて毒化される1)。これまでに、無毒化の機構については、いる。我々の研究室では、小麦若葉粉末 Wheat Grass

バクテリア由来のタンパク質によることを示唆した2)

Powder（WGP）浸出液にバクテリアKlebsiella pneu-

が、このタンパク質および毒物質についてはまだ同定

moniaeを接種し、２日間２５℃でインキュベーション

されていない。なお、これまでの研究では、バクテリしたものを培養液として用いている。このバクテリア

ア由来無毒化物質の粗精製サンプルとして菌体外物を接種する前のWGP浸出液にはゾウリムシを殺す毒質を用いてきたが、その後の実験で菌体抽出物の方

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)27が、無毒化作用が強く、安定していることが分かった。 れのアミノ酸配列はまだ決定されていない。そこで、そのため、本研究では、バクテリア由来無毒化物質の既にアミノ酸配列が決定されているE. coliおよび近縁同定を目的とし、菌体抽出物からの精製および部分的のいくつかの細菌由来カタラーゼの配列について、ア

アミノ酸配列の決定を行った。

ライメント解析を行い、保存領域を調べた。その結果、［材料と方法］K. pneumoniae (IFO 14940) は、Luria
Bertani (LB) 培地で、２８℃、２日間培養し、遠心分離により菌体を回収し、超音波破砕により菌体抽出物を得た。これをタンパク質精製のためのサンプルとした。精製はすべて４℃で行った。カラムクロマトグラ
フィーには、Äcta Purifier system (Pharmacia Biotech) を用いた。すべてのカラムはPharmacia Biotechから購入した。それぞれの精製段階での活性は、SMBを用い適当な濃度に希釈した溶出フラクションと１％WGP浸
出液を等量混合した液中での、カナマイシン処理によりバクテリアを除去したゾウリムシの１２時間目の生死で判定した。精製したタンパク質のN末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列はエドマン分解法を用いて分析した。

N末端に近い配列は、それぞれの生物種で変異が大きいことが分かった。そのため、今回の精製タンパク質のN末端アミノ酸配列は既知カタラーゼの配列と高い相同性を示さなかったが、部分的内部アミノ酸配列との高い相同性に基づき、無毒化物質はカタラーゼと推定した。そこでカタラーゼの無毒化作用を確かめる
ため、WGPに牛肝臓由来カタラーゼを加え２５℃で１時間処理したところゾウリムシに対する毒作用が消失した。このことより無毒化物質がカタラーゼであることが強く示唆された。また、K. pneumoniaeに存在する３種のカタラーゼのうち、KpTとKpCPは四量体であるのに対し、KpAは二量体であることより、今回、我々が精製したタンパク質は、KpAであると推測した。
また、カタラーゼが無毒化物質であるという結果［結果と考察］硫安分画（３０〜７０％）および各種

より毒物質は過酸化水素ではないかと推測した。そこ

クロマトグラフィーにより精製したタンパク質を、

でWGP浸出液中の過酸化水素量を測定したところ、Native-PAGE後のゲルからの切りだしにより単一に精

約３０μMの過酸化水素が含まれていることが分製した。このタンパク質はゲルろ過クロマトグラ

かった。またこの濃度の過酸化水素を含むSMB中でゾ

フィーでの溶出部位から、分子質量は約200,000 Daとウリムシは死滅した。このことより、毒物質は過酸化推定され、また、SDS-PAGEでは分子質量約92,000

水素であることが強く示唆された。

Daであった。このことより、このタンパク質は二量体構造を有すると考えられた。また、精製タンパク質のN末端アミノ酸配列と相同性の高いタンパク質は検索できなかったが、２箇所決定した内部アミノ酸配列
はいずれもK. pneumoniaeと近縁のEscherichia coli由来
カタラーゼ（HPII）ときわめて高い相同性を示した。
K. pneumoniaeには、KpT, KpCP, KpAという３種のカタ
3)ラーゼが存在することが報告されている が、それぞ［文献］
1) Tokusumi, Y. and Takagi, Y. (2000) Zool. Sci., 17. 341348.
2) Mizobuchi, N. and Takagi, Y. (2000) Zool. Sci., 17(Suppl.), 28.
3) Goldberg, I. and Hochman, A. (1989) Arch. Biochem.
Biophys., 268. 124-128.

28

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

繊毛虫ゾウリムシにおける表層パターン形成の顕微手術法における解析
三好孝和，高橋忠夫（西九州大・生物）

Analysis of mechanisms of cortical pattern formation in the ciliate Paramecium
using a microsurgical technique
Norikazu MIYOSHI and Tadao TAKAHASHI (Bio. Lab., Nishikyushu Univ.)
SUMMARY
It is well known that the cell surface of the ciliate Paramecium consists of cortical units which are arranged in acertain regular pattern. It was previously considered that the organizing center of the cortical structures might exist in thecenter of the ventral equatorial region. In contrast, Takahashi et al. (1998) reported that in P. trichium the special corticalunits, which are located in the most posterior position of 1C-2BB (two basal bodies with one cilium) units region, might
contribute continuously to cortical reproduction; that is, they may be the stem units. The purpose of this study was to
examine this hypothesis using a microsurgical technique. We transected and removed the posterior 1/4 region of the cell,which probably included the hypothetical stem unit region, by using a fine glass needle, and then traced their regeneration
processes during the three cell generations. We found that the missing part of the cell was gradually regenerated andcompletely recovered until the completion of the third cell division after the operation. These observations suggest that theformation of the whole cell surface structures is accomplished according to the positional information which is assumed toexist along the longitudinal cell axis, although the stem units may continuously supply new cortical units.
定時間間隔で固定し、シャトン・ルボッフの鍍銀法2)で位が、ある一定のパターンで配列して構成されてい 染色した。また、必要に応じて走査電子顕微鏡によるる。ゾウリムシの分裂時に、古い口部装置は、前娘細 観察も行った。この場合、ゾウリムシはParducz’sの液4)で固定し、SEMpore法でSEM標本を作製した。
胞に受け継がれ、後娘細胞のものは新たに作られる。
［目的］ゾウリムシの表層は、表層単位と呼ばれる単

さらに、前娘細胞では細胞の後半部分の、後娘細胞で［結果と考察］分裂間期の対照区の1繊毛列は、平均36は前半部分の表層単位を新たに構築しなければなら個の表層単位で構成されているが、手術後には、平均ない。その場合、細胞の赤道部付近では、表層単位が23.9±1.8単位（±SD）になっており、非増殖領域に特盛んに増殖するので、従来、ゾウリムシの表層構造の異的な1bb（基粒体1個の表層単位）領域を持っておら形成中心は、細胞の赤道部付近にあるといわれてきた

ず、すべて2bb（基粒体2個の表層単位）で構成されて3)。これに対して、高橋ら5)は、細胞の後方1/5付近の表いた。このような手術個体は、約48時間後に第1回細胞層単位の増殖領域と非増殖領域の境界部に表層単位分裂を行い、前娘細胞では平均35.9±1.0単位、後娘細の形成中心として機能しているstem unitsが存在す

胞では平均26.7±3.5単位であった。また、第1回細胞分ると主張している。本研究では、この仮説の検証を目裂における分裂溝の位置は、前から平均17単位目に的とし、この仮説上のstem unitsを含むと思われるゾ

入ったことから、将来の後娘細胞が受け取った古い表

ウリムシの後端、約1/4を切除し、手術後、第3回分裂

層単位は7単位と推定された。このとき、対照区の細胞までの細胞表層構造の再構築過程を詳細に調べた。
［材 料 と 方 法］実 験 に は、ゾ ウ リ ム シ Paramecium
trichiumのクローンO419b-12bを用い、レタス浸出液（0.1g/1000ml）にバクテリアEnterobacter aerogenesを加え、23±1℃で培養した。これを、実験開始前日に新しい培地に植えかえ、翌日、分裂細胞を15分以内に多数集め、23±1℃に保ち、分裂を完了させた。細胞分裂
完了2時間後にゾウリムシを1％メチルセルロース液に移して、運動を抑制し、stem unitsを含むと思われる
ゾウリムシの後端、約1/4を微小ガラス針を用いて切除した。その後、それらの再生過程を知るために、一では、分裂溝付近で1つのunitから3つのunitsが作られるのに対して、手術体では、１つのunitから、4つのunits
が 作 ら れ て い た。そ の た め、7 つ の 表 層 単 位 が4,4,4,4,4,4,3倍に増殖して27個の表層単位が構築されたと考えられる。この手術体は、手術の約70時間後に第2回細胞分裂を行った。その結果、第1回細胞分裂の後娘細胞由来の後娘細胞の1繊毛列の表層単位数は、
平均32.6±2.5単位になっていた。第1回および第2回の細胞分裂において、後娘細胞は、1bb領域を持っていな
かった。これに対して、第3回目の細胞分裂は、手術後、

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

29

約90時間に生じたが、第2回細胞分裂の後娘細胞由来

位置も決めている可能性が考えられる。第2回細胞分の後娘細胞における1繊毛列の表層単位数は、平均裂までは、1bb領域が生じなかったのは1つの表層単位

36.4±2.5単位であり、それまで細胞後端に存在しなは、4倍以上に増殖できないという制約のためであっかった1bb領域が、対照区の細胞とほぼ同様の位置にたことが考えられる。

再び出現した。細胞の後端部で2bb領域からどのよう［文献］
1) Frankel, J. (1989) Pattern formation, Oxford Univ. Press,
は、分裂毎に1〜2個の表層単位しか供給しないが、手New York.
術体の後娘細胞では、1繊毛列を構成する表層単位数 2) Gillies, C. G. & Hanson, E. D. (1968) Acta Protozool., 6:
が、分裂回数が増すとともに徐々に増加している。し13-31.
かも、対照区では1つのunitが3倍に増殖するのに対し 3) Iftode, F., Cohen, J., Ruiz, F., Rueda, A. T., Chen-Shan,て、手術体由来の後娘細胞では4倍に増殖していた。こL., Adoutte, A. & Beisson, J. (1989) Development, 105:
191-211.
のことは、stem unitsは、表層構造の供給源としての働
4)
Parducz,
B. (1967) Intl. Rev. Cytol., 21: 91-128.
いているのだが、細胞全体の表層構造の形成には、細1)5)Takahashi,T., Okubo, M. & Hosoya, H. (1998) J. Euk.
胞の前後軸に沿った位置情報があり 、それに従って、Microbiol.,45(4): 369-380.
表層単位を増殖させるとともに、分裂溝や1bb領域のにして1bb領域を生じたのかは、不明である。stem units

ヨツヒメゾウリムシの長いオートガミー未熟期をもつ突然変異株の遺伝解析
小森理絵1，春本晃江2, 1，藤澤裕美1, 2，高木由臣2, 1（1奈良女大・院・人間文化，2奈良女大・理・生物）

Breeding analysis of the mutant with long autogamy-immaturity in
Paramecium tetraurelia
Rie KOMORI1, Terue HARUMOTO2, 1, Hiromi FUJISAWA1, 2 and Yoshiomi TAKAGI2, 1( Div. Human Envir. Sci., Grad. Sch. Human Cult., Nara Women’s Univ., 2Dept. Biol. Sci., Fac. Sci.,
Nara Women’s Univ.)
1

SUMMARY
We have attempted to isolate mutants with modified life cycle features in order to anatomize time-measuring process
in Paramecium. We reported the stock d4-RK with unusually long autogamy-immaturity: 0% autogamy at the age of 27
fissions when 97.3% autogamy on average was observed in the wild-type stock 51. Autogamy in d4-RK began to be
induced at about age 50 in some clones and scarcely even after age 200 in other clones. This phenotype was expressed only
at 25oC, and at 32oC there occurred frequent autogamy, indicative of a conditional mutant. Breeding analysis indicated that
this mutant phenotype is attributable to a single recessive mutation. We expected that this mutation might also extend theclonal life span, because the correlation between the length of sexual maturation and the life span was reported in mammals
and ciliates. However, d4-RK was shorter in the clonal life span and slower in fission rate than the wild-type. This result,however, does not rule out the possibility that some mutations other than the mutation in question caused by mutagentreatment may be responsible for these phenotypes. To examine this possibility, progeny clones after repeating backcrosses should be studied about their clonal life span.
［目的］ヨツヒメゾウリムシParamecium tetraureliaの生る突然変異株の分離を試みてきた。これまでにオート

活史は有性生殖（オートガミー、接合）に始まり、オー

ガミー未熟期が延長された突然変異株d4-RKを分離しトガミー未熟期、成熟期、老衰期を経てクローン死にたことを昨年の大会で報告した。今回、この株に関し至る。我々は、生物の発生時間制御メカニズムを遺伝て遺伝解析を行うとともに、付随するいくつかの性質学的に解明したいと考え、P. tetraureliaで生活史に関すについて調べた。

30

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年［材料と方法］長いオートガミー未熟期をもつ突然変スト放出可能株と不能株が166：168で現れたのに対し異株d4-RKを用いた。野生株51の27回分裂齢では平均（1：1に分離したとする仮説でχ2＝0.012、P＞0.9）、

97.3%（62〜100%）という高率でオートガミーが誘導さオートガミー未熟期の長さは野生型と変異型が181：

れる1)が、d4-RK株では全く誘導されない。このことか

153となり、野生型と変異型が1：1で現れたとする仮説

ら、以下の遺伝解析では27回分裂齢頃のオートガミーは棄却されない（χ2＝2.347、P＞0.1）。以上のことか

率が60%以上を野生型、0%を変異型と判定した。まず、 ら、d4-RK株のオートガミー未熟期が長いという形質
飽和ピクリン酸刺激によりd4-RK株がトリコシスト放は、nd242遺伝子とは独立な単一劣性遺伝子（rie: remote

出可能株であることを確認した上で、初期定常期にあ

immaturity exitと命名）により決まる可能性が示唆され

るd4-RK株とd4N-131株（いずれもオートガミー未熟

た。いくつかの哺乳類、繊毛虫類では、性成熟までの期）を混合して接合を誘導し、接合対を単離した。d4N-期間が長いほど長寿であるという相関関係が知られ131株はオートガミー未熟期の長さは野生型であるている。d4-RK株ではオートガミー未熟期だけでなくが、トリコシストを放出できない突然変異株であり、クローン寿命も延長されている可能性が考えられた

この形質には単一劣性遺伝子（nd242）が関与しているが、クローン寿命を調べてみると野生株51と比較してことが分かっている2）。nd242遺伝子を有性生殖のマーやや短くなっている傾向がみられた。また、生活史全

カー遺伝子として遺伝解析を進めた。接合後、一対の体を通して分裂速度が遅いという傾向があった。これ

接合完了体クローンがともにトリコシスト放出可能は、d4-RK株においてオートガミー未熟期を延長してとなったものを選んで単離培養により分裂齢を進行いるrie遺伝子が寿命は短縮させているという可能性させた。単離後に残ったカルチャーでオートガミーをも考えられるが、注目遺伝子以外にも多数の突然変異誘導し、100%オートガミーが誘導されたカルチャーよが誘発され、寿命短縮や分裂速度低下に作用している

り45細胞をクローニングしてトリコシスト放出能と可能性もある。野生株との戻し交雑を繰り返して遺伝

27回分裂齢頃のオートガミー誘導率を調べ、野生型と的背景を野生株に近付けた上でクローン寿命を調査

変異型の分離比についてχ2 検定を行った。

し、rie遺伝子がクローン寿命延長遺伝子でもあるか否［結果と考察］d4-RK株とd4N-131株の接合後に生じた子孫株では、27回分裂齢頃に高率のオートガミーが誘かを検討するとともに、この遺伝子を単離することが今後の課題である。

導されるという野生型の形質を示した。このことか［文献］

ら、d4-RK株のオートガミー未熟期が長いという形質

1) Komori, R., Harumoto, T., Fujisawa, H. and Takagi, Y.

には劣性突然変異が関与していることが示された。
オートガミー誘導後に得られた子孫株では、トリコシ(2002) Zool. Sci. 19 (11), 1245-1249.
2) Nyberg, D. (1978) J. Protozool. 25 (1), 107-112.

ゾウリムシ（Paramecium caudatum）の接合型物質の単離
鈴木梢，高橋三保子（筑波大・生物科学）

Purification and molecular identification of mating-type substances
in Paramecium caudatum
Kozue SUZUKI and Mihoko TAKAHASHI (Institute of Biological Sciences, Univ. of Tsukuba)
SUMMARY
In the mating reaction of Paramecium caudatum, specific cell-cell recognition between complementary mating types
takes place due to the interaction between mating-type substances. Although previous studies have shown that the matingtype substances are proteins, none has succeeded in the direct identification of the molecules. To identify the molecules,
two analyses were performed. After mild treatment with trypsin, ciliary supernatant was subjected to 2D-PAGE, nativePAGE and SDS-PAGE. Alternatively, it was subjected to a Mono Q column, ammonium sulfate fractionation and a Phenyl
Superose column. Mating-type substances were monitored with a mating-type specific monoclonal antibody. The twoJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

31

analyses identified only a 95 kDa protein in common. The 95 kDa protein appeared at mating-reactive periods in cultureage. These results suggest that the 95 kDa protein is a mating-type substance.
［目的］ゾウリムシはその種の中にsyngenという性的の１程度であったが、膜画分をまったく含まないたに隔離された１６の同胞種を持つ。それぞれのsyngen

め、ここからの精製が容易であると考えた。このサンは Even型と Odd型と いう２種類 の相補的な 接合型

プルをカラムにより精製したところ、95, 28, 26 kDaの(mating-type) からなり、お互いの性を認識して有性生

３つのタンパク質が抗原を含むフラクションに特異殖を行うことが知られている。接合型物質(mating-type

的に存在した。これらのうちのいずれかに抗原物質がsubstances)は細胞の性を決定し、有性生殖の第一段階含まれていると予想される。また、SDSを除いた条件である交配反応（mating reaction）を引き起こす物質とでの電気泳動とimmuno-blotにより、一本のバンドがして定義された。これまでの研究により接合型物質検出された。このバンドに含まれるタンパク質を明確

は、細胞の口部側の繊毛に局在する膜タンパク質であにするため、２次元電気泳動による解析を行った。

ることが示唆されている。しかし、接合型物質の分子SDSを除いた条件での電気泳動を１次元目とし、２次そのものは、未だ単離同定されていない。
我々は、交配反応を阻害するモノクローナル抗体を元目にSDS-PAGEを行ったところ、95, 58, 32 kDaの３つのタンパク質が確認された。

単離し、これらの抗体はO３型接合型物質を認識してこれらの２種類の解析から、共通している95 kDaのいるという結果を得た。しかし、タンパク質の変性にタンパク質が抗原である可能性が高いと判断し、約60より抗原決定基が失われることから、抗原が直接同定ℓの培養（試験管３０００本）から95 kDaのタンパク質

されてはいなかった。今回、生化学的手法により抗原を精製しN末端アミノ酸配列を分析した。しかし、タ分子を同定したので、報告する。

ンパク質の量が少ないために、信頼できる配列が得ら［材料と方法］接合活性の高いsyngen3のO型細胞（G3株）から繊毛を単離し、タンパク質分解酵素である
trypsinで弱く処理して抗原を可溶化した。このサンプ
ルを、陰イオン交換カラム、硫安沈殿、疎水性カラム
によって分画し、それぞれのフラクションをdot-blot法
によって抗原の存在を確認しながら精製した。抗原を含む画分をSDS-PAGEによって解析した。また、抗原を変性させる要因であるSDSを除いたバッファーでれなかった。そのため、再びアミノ酸配列を分析する
ために、抗原の精製を進めている。
95 kDaタンパク質のアミノ酸配列、また、遺伝子を同定し、さらに解析を行えば、接合型物質であるかど
うかが明らかになる。もし今回同定した分子が接合型物質であれば、Sonnebornによる接合型の発見以来７０年余りにわたっての謎を解き明かすことができると考えている。

の電気泳動とimmuno-blot、そして、２次元電気泳動に［文献］

よる解析を行った。

Azuma. Y. et al. (1996) Europ. J. Protistol., 32: 4-9
東 他 (2000) Jpn. J. Protozool., 33: 97［結果と考察］繊毛をtyrpsinで処理することで、繊毛膜から界面活性剤を用いずに、抗原を可溶化することができた。可溶化された抗原の量は繊毛全体の１０分

Xu, X. et al. (2001) J. Euk. Microbiol., 48: 683-689

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

32

ゾウリムシの接合後における旧大核の運命
木村 直美（金沢大・理・生物）

A destiny of maternal macronuclei after conjugation in Paramecium caudatum
Naomi KIMURA (Dept. of Biology, Kanazawa Univ.)
SUMMARY
In Paramecium caudatum, a maternal macronucleus which is fragmented into 40 pieces during conjugation does notdegenerate at once, but persists until the 8th cell cycle after conjugation. It is known that during the period their fragments
maintain their regeneration competence and are simply distributed to daughter cells without dividing. Their subsequent
fate has been still uncertain. Here I demonstrate that the initiation of the maternal macronuclear degeneration occurs at the
5th cell cycle after conjugation. When the fragments were measured, the size continued to increase from the 1st to 4th cell
cycle, and then shifted to rapidly decrease, while a new macronucleus gradually grew and reached the maximum in size atthe 4th cell cycle. In addition, small pycnotic fragments were observed at the 6th or later stage, suggesting DNA degradation of the maternal macronucleus. In order to detect the degradation, total DNAs were isolated from conjugants andexconjugants in various stages. Southern blot analysis revealed that a slightly sized-down DNA appeared around at 5th cell
cycle. These observations lead me to the following conclusion: The moment the new macronucleus is completed at the 4thcell cycle, the maternal macronuclear fragment might be destined to degenerate. Until then, the maternal fragments would
assist the function of the imperfect new macronucleus.
［目的］繊毛虫ゾウリムシ（Paramecium caudatum ）は、 まで旧大核の存在及びその形態を調べたところ、第8大核と小核という機能及び形態の異なる2種類の核を細胞周期まで旧大核断片が観察され、第9細胞周期で持ち、有性生殖後、小核から新たに4つの新大核と１つは、観察されなかった。特に第7細胞周期から第8細胞の小核が分化1)し、旧大核は、約40個に断片化する。4周期へかけて、旧大核断片を保持しない細胞が顕著につの新大核は分裂することなく、接合後2回目の細胞現れることも明らかになった。これらのことから推測

分裂までに分配され、その後は通常に分裂する。一方、 すると第7細胞周期で退化しているのではないかと考断片化した旧大核は4細胞周期までDNA合成をしていえ、旧大核のサイズを測定した。接合完了時、第1細胞

る2)が、9細胞周期には消失する。他の繊毛虫では、旧周期で観察された約40個の旧大核（断片）の大きさは、

大核は、アポトーシス様のメカニズムで消失すること

小核くらいに相当し、その後、約４倍に増加する。第がわかっている。しかし、ゾウリムシの旧大核はどの

4細胞周期をピークとして、それ以降は核サイズが小ように消失するのか明らかではない。

さくなっていく。第7細胞周期では第1細胞周期のサイ

本研究では、接合後の旧大核の数や大きさ、DNAのズよりも小さく、核が凝縮している像を観察できた。

断片化について調べ、旧大核の運命について考察す

これは、アポトーシス様の現象が起こり退化するといる。

われるTetrahymenaやP.tetraureliaなどと同様に、ゾウ［材料と方法］ゾウリムシ（P.caudatum）syngen 3に属す、野生型株KNZ 5（接合型 O）およびKNZ 2（接合型E）を使用し、培養及び接合は、25±1℃でおこなった。
また、DNAの断片化を調べるため、接合中、接合後の細胞からDNAを抽出し、トータルDNAをプローブとして、サザンブロット解析をおこなった。
染色は、細胞をカルノア液で固定し、5N HClで10分処理したあと水洗いし、2%酢酸オルセインで染色、光学顕微鏡で観察した。
［結果と考察］接合後7分裂後、すなわち第8細胞周期

リムシでも、旧大核が退化しているという新たな確証がつかめた。
また、接合後（0, 17, 18, 48, 72, 84, 94, 103, 111, 120,129h）にDNAを抽出し、電気泳動した結果、第5細胞周期（接合後103時間）でDNAがわずかに壊れている可能性がサザンハイブリダイゼーションの結果から示唆された。しかし、アポトーシスの特徴である、DNAのラダー状分解が見られなかった。これは、1)ゾウリム
シの旧大核の消失の仕方が他の繊毛虫とは違っているか、2)接合後100時間も経過しているために、細胞の分裂同調率が低いか、3) 旧大核断片よりも新大核のJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

33

DNA量の方が遙かに多い為、検出感度が低い、といっ不可欠であると考えられる。しかし、一端新大核が完た可能性が考えられる。また、旧大核が紐状化する接成すると、旧大核は退化の方向（DNA合成の抑制、核合後17,18時間にもわずかにDNAが壊れている可能性

サイズの減少、DNAの崩壊）へと運命づずけられる。

が示唆された。

これはTetrahymenaやP.tetraureliaなどと同じ現象であ

これらの結果に加え、旧大核の再生能力やDNA合成

ると考えられるが、他繊毛虫に比べて、新大核の完成

能は第5細胞周期以後、急速に低下することがこれま時期が遅いため、退化させる時期が遅くなっているとで明らかにされている。一方、新大核のサイズは、第いえる。

4細胞周期に通常サイズに達すること、IESの除去は第3あるいは第4細胞周期に起こることが明らかになっている。これらを考慮すると、新大核は事実上、第4細胞周期頃に機能的・構造的に完成し、それまでの間、［文献］
1) Mikami, K. (1980) Develop. Biol., 80: 46-55.
2) Mikami, K. (1979) Chromosoma (Berl.), 73: 131-142.

旧大核の存在は、新大核の機能を補完するために必要

Paramecium caudatumの生殖核・栄養核分化決定時期に発現する遺伝子の解析
高瀬明子１、柴崎晶彦２、菊池英明２、見上一幸１（１宮城教育大・EEC，２東北大・加齢研・遺伝子機能）

Analysis of genes expressed prior to nuclear differentiation of Paramecium caudatum
Akiko TAKASE1, Masahiko SHIBAZAKI2, Hideaki KIKUCHI2 and Kazuyuki MIKAMI1(1 EEC Miyagi Univ. Edu., 2 IDAC Tohoku Univ.)
SUMMARY
Paramecium caudatum is a unicellular animal having a large somatic macronucleus and a small germinal micronucleus. The macronuclei and micronuclei differentiate from division products of the micronucleus after conjugation. In
order to understand the nuclear differentiation mechanism, we investigated genes that were expressed at the time of macroand micronuclear differentiation by using differential mRNA display. In this study, we obtained fragments of about 30
genes that were expressed specifically at the stage of nuclear differentiation. A BLAST search with the BLASTN program
revealed that some of these fragments had homology with the mitochondrial large ribosomal RNA (lrRNA) gene (P.
tetraurelia), the alpha-tubulin gene (P. caudatum), or the 14-3-3-protein gene (Tetrahymena pyriformis). So far, the remaining fragments have not been found to be homologous with already known genes. The mitochondrial lrRNA brings tomind a determining factor in germ cells in Drosophila melanogaster. However, we did not obtain any evidence to show thatthe same system as in Drosophila is present in protozoa. We then investigated whether the transcriptional activity of mitochondria has any effect on nuclear differentiation. When an antibiotic, rifampicin (Wako) (1 mM, 20–30 pl per cell), wasinjected into cells, no macronuclear anlagen developed. This suggests that the transcriptional activity of mitochondria hassome relationship with macronuclear differentiation.
［目的］繊毛虫ゾウリムシ(Paramecium caudatum)は、

現を調べ、受精核の核分裂サイクルから核の分化とい生殖核である小核と、栄養核である大核という機能もう方向に転換させる遺伝子や、核の分化決定に直接的

大きさも異なる２つの核を持つ。これらの核は、有性に関わる遺伝子を単離しその機能を解析することに生殖過程において、受精核形成後、３回の有糸分裂をより、生殖核と栄養核への分化機構がより明らかにで経て８核になった小核から分化する。この核分化にはきると考え、研究を始めた。

位置情報が深く関わっていると考えられるものの、そ本研究では、ディファレンシャルディスプレイ法をの分子機構については、詳しくは明らかになっていな

用いて、まず核分化の時期に、核分化決定に先行してい。そこで、接合過程後期の核分化決定期の遺伝子発どのような遺伝子の発現が起こっているのかという原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

34
分子レベルの解析を試みた。

同性の低いサンプルは、新規遺伝子である可能性が高［材料と方法］ゾウリムシ (P.caudatum) の野生型株
KNZ5（接合型O）とKNZ2（接合型E）の子孫である
KK0021(接合型O)とKK0007（接合型E）を用いた。培養及び接合は、25±１℃で行った。
ディファレンシャルディスプレイ法では、サンプルには核分化決定期に作用する遺伝子が発現していると予想される時期の細胞とし、比較サンプルとして栄養期の細胞を用いた。TRIZOL

Reagent(GIBCO BRL)

により抽出したTotal RNAから、FITC標識されたアン
カーオリゴ(dT)プライマーを用いて、ｍRNAを選択的に逆転写してｃDNAを作成した。さらに、このｃDNAを鋳型にして、FITC標識されたアンカーオリゴ(dT)プライマーと任意プライマー（OPERON）を用いてPCRを行い、６％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行った。泳動後、蛍光検出器によりFITC検出をし、バンドの解析を行った。

いということも考えられるので、現在RACE-PCRによる解析を進めているところである。
すでに他の生物と相同性が高いと思われるDNA断片のうち、ミトコンドリアのlrＲＮＡは、多細胞生物
ショウジョウバエの生殖細胞形成において、極細胞形成に関わる分子の一つであることを思い起こさせる。
この多細胞生物における生殖細胞形成機構と似たシステムが原生動物にあるかどうかは別として、ミトコ
ンドリアのlrＲＮＡの合成がゾウリムシにおいて核の分化に関わるのかどうか、あるいはこの時期のミトコ
ンドリアの転写活性が核分化に影響を与えるのかど
うかを知るために、原核生物のRNA合成阻害剤として知られるリファンピシンを細胞内に注射することでその効果を調べた。その結果、小核への影響は認められなかったが、大核の分化成長が阻害された。従って、核分化直前のミトコンドリアの転写活性が大核分化に何らかの関連を持つことが示唆された。しかし、［結果と考察］ディファレンシャルディスプレイによ

ショウジョウバエのgerm plasmで認められたようなミり得られた塩基配列をもとに、BLASTにより相同性検

トコンドリアのlrＲＮＡの生殖核（小核）への関与があ索を行った。その結果比較的相同性の高いものに、ミ

るとは、まだ断定できない。

トコンドリアのlrＲＮＡ遺伝子や、チューブリン遺伝
子、テトラヒメナにおいて分裂を制御する遺伝子等があり、DNA断片約30種の内、既に明らかになっている
もの以外のサンプルに関しては、既知の遺伝子配列については相同性が低く、どのような遺伝子ホモロ−グ［文献］
1) 見上（1996）原生動物学雑誌, 29: 1-9.
2) Kobayashi, S., Amikura, R., Okada, M. (1993) Science,
260: 1521-1524.

であるかの推定はできなかった。しかし、これらの相

ゾウリムシの配偶子形成および受精時期に発現する遺伝子の解析
多賀郁乃1、熊坂真由子2、山本博章2、見上一幸1(1宮教大･EEC、2東北大･院生命)

Analysis of genes expressed at gametogenesis and fertilizationin Paramecium caudatum
Ikuno TAGA1, Mayuko KUMASAKA2, Hiroaki YAMAMOTO2 and Kazuyuki MIKAMI1(1EEC, Miyagi Univ. Edu., 2Biol. Inst., Grad. Sch., Tohoku Univ.)
SUMMARY
The germ micronucleus undergoes meiosis and produces four haploid nuclei when conjugation is induced in Paramecium caudatum. Three of the nuclei disappear but one of them survives. This remaining nucleus divides once and produces gametes (migratory nucleus and stationary nucleus). The degeneration of meiotic products seems to be a type of
apoptosis, because they became pycnotic and produced oligonucleosomal-length fragments during degeneration. We
consider this nuclear apoptosis according to Mpoke et al (1997). It is known that expression of some key genes for degeneration versus survival of meiotic products occurs just after meiosis I. In this study, we cloned some specific genes thatwere expressed at this stage by the method of subtractive hybridization. We sequenced 100 clones but, so far, these clones

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)35

do not contain genes that participate in the cascade of caspase in apoptosis. We also investigated whether the process of
nuclear apoptosis was caspase-dependent. To probe the possibility, conjugating pairs were isolated into solutions of a
caspase inhibitor, Z-VAD-FMK (0.2 - 2.0 mM, LD50 = 0.75 mM), just after meiosis I. Moreover, the solutions (0.2, 2 or 20
mM, 20–30 pl per cell) were injected into conjugational pairs just after meiosis I or meiosis II. However, neither of thesetreatments had any effect on nuclear degeneration. These results suggest that nuclear apoptosis of haploid nuclei does notdepend on caspase, though we cannot prove it.
[目的] Paramecium caudatumの接合中、小核は減数分

ころ、約9割が同じ塩基配列を持つクローンだった。残裂を行い、4個の半数体核を形成する。この4核のうちり1割のクローンの塩基配列の決定を進めているが、1核だけが生き残り、残りの3核はクロマチンの凝集が現在、いわゆるアポトーシスの実行因子と思われる配起こり退化して消える。この核退化は減数第一分裂後列は得られていない。また、アポトーシスの系にはに大核から退化命令が出されていること、TUNEL法

caspase依存型と非依存型があり、caspase阻害剤であるによりDNAのヌクレオソーム単位の断片化が起こっ

Z-VAD-FMKで処理したところ、これによる半数体核ていることがわかっており(2001.本大会発表)、多細胞の退化阻害は見られなかった。このことから、半数体生物に見られるアポトーシスに似ていることから核核の退化はcaspase非依存型の核アポトーシスである

アポトーシスと呼ばれる(Mpoke, et al.,1997) 。どのよう可能性が示唆される。一般にcaspase非依存型のアポなメカニズムでこの核アポトーシスが起こっている

トーシスでは、ミトコンドリアからAIF (apoptosis-のかを解明するために、この時期特異的に発現する遺inducing factor) が放出されクロマチン凝縮を引き起こ

伝子の解析を試み、その一方で、この核アポトーシス

すと言われる。電子顕微鏡写真による半数体核の退化がcaspase依存型か、あるいは非依存型かを知るために像では核のまわりを取り囲むようにミトコンドリア

阻害剤の影響についても調べた｡

由来と思われる多重膜構造が見られることから、ミト[材料と方法] 本研究では、P. caudatumの野生型株
KNZ5(接合型O型) とKNZ2(接合型E型) の子孫である
KK0021(O)とKK0007(E)を用いた。ゾウリムシの接合を誘導し、小核の減数第一分裂後の細胞とVegetative期の細胞からmRNAを抽出し、減数第一分裂後の時期
特異的に発現している遺伝子をサブトラクション法
によりCLONTECH PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(# K1804-1)、CLONTECH PCR-SelectTM Differential
Screening Kit (#1808-1)を用い単離した。
一 方、0.02~20mM の caspase 阻 害 剤 Z-VAD-FMK(Promega, #G7231)で減数第一分裂後と減数第2分裂後

コ ン ド リ ア が 関 与 し て い る と 考 え ら れ る｡
Tetrahymenaの接合過程で見られる旧大核のアポトー
シス様退化はcaspase阻害剤により阻害される。ゾウリ
ムシの旧大核退化も同じ核退化機構を持つのか、ある
いは減数分裂後の核アポトーシスと旧大核の核アポ
トーシスとは異なる機構によるものかが興味あるところである｡今後、サブトラクションで得られた配列
未決定遺伝子の解析を進めるとともに、その中に
caspaseのカスケードに関わる遺伝子が含まれるのかという点に特に着目し、細胞死を伴わない核アポトー
シスの機構を解明していきたい｡の細胞を処理し、核退化がcaspase依存性であるかどう[文献]かを検討した。

1) Mikami, K. (1992) Develop. Biol., 149: 317-326.

[結果と考察] サブトラクションの後ディファレン
シャルスクリーニングを行い、約1000個のクローンが得られた。得られたクローンの塩基配列を決定したと

2) Mpoke, SS., Wolfe, J. (1997) J. Histochem. Cytochem.,
45: 675-83.
3) Ejercito, J., Wolfe, J. (1998) Mol. Biol. Cell, 9S: 245a.

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

36

最晩年のゾウリムシにおける安定した遺伝子発現
竹中康浩1，芳賀信幸2（1農業生物資源研，2石巻専修大・理工）

Stable expression of GFP-gene in the last cells of the life history in Paramecium
Yasuhiro TAKENAKA1 and Nobuyuki HAGA2( National Institute of Agrobiological Science, 2Dept. of Biotech. Ishinomaki Senshu Univ.)
1

SUMMARY
We have examined the pattern of gene expression in the last phase of clonal aging in Paramecium using the GFPgene as a reporter. Many cells unable to undergo cell division because of aging were collected from subclonal culturesderived from a single cell that was injected with the GFP-gene. Although the morphological characteristics of the last cellsof the life history were slim and clean in most cases, with occasional abnormal shape and incomplete cell division, all cells
examined showed strong green fluorescence in cytoplasm and nuclei. This indicates the presence of a stable protein synthesis pathway from the GFP-gene in the last phase of clonal aging. On the other hand, the pattern of longevity in the
subclones showed two subgroups; one with a relatively short life span and the other long. Both groups had a normal distribution pattern with similar standard deviations. This result suggests that random events are involved in the causes of
longevity in clonal aging. It is important to analyze DNA sequences in the region where the GFP-gene is located in thegemone. An understanding of stable GFP-gene expression in the last phase of clonal aging may provide the way for extending the life span in Paramecium.
［目的］Immaturinは成熟期の細胞に対しては性的能［結 果 と 考 察］本 研 究 で は、GFP を 発 現 す る力の発現を抑制するように働き、老衰期の細胞に対しtransformantは数クローン取れたが、安定して発現するては促進するように働く。また、成熟期の細胞にもクローンは一つだけであったので、このクローンから

Immaturinと相同の分子組成を持つ若返り因子が存在32のサブクローンを作り、サブクローン間での寿命とすることが明らかになり、さらにこの分子は老衰期のGFP発現との相関について調べた。その結果、サブク細胞に対しては性的能力の促進作用のほかに、分裂能ローン内での最長寿命分裂回数は大きく二つのグ

力も高める効果があることが新に明らかになった。そループに分けられることが明らかになった。第一のグこで、我々は老衰期の細胞に潜む潜在的な回復力の秘

ループは注射後80-100分裂で分裂停止となる短寿命

密を解き明かすために、クラゲから抽出されたGFP遺系で、第二のグループは130-200回分裂まで分裂を続伝子を用いて最晩年のゾウリムシにおける遺伝子発ける長寿命系である。短寿命系は一つのピークをもつ

現の安定性について調べた。

正規分布型で、長寿命系は180回を境にした二つの［材料と方法］クラゲから抽出されたGFP遺伝子はゾウリムシで効率よく発現するように、ゾウリムシの最適コドンに適するように数十箇所で塩基配列が置換された（Takenaka et al, 2002）。このGFP遺伝子を組み込んだvectorを一細胞当たりおよそ10 pg大核に注射し、経時的に蛍光顕微鏡下で観察して、GFP遺伝子が発現しているクローンをスクリーニングした。GFPが強く発現しているクローンは試験管で細胞分裂回数を測定しながら連続的に培養した。注射後約70回分裂に達したところで、数十匹の細胞をデプレッションス
ライドグラスに単離し、分裂が停止するまでDaily
isolation line cultureを続けた。この間、分裂を停止した細胞のGFP発現を調べ、subclone間での最長寿命分裂回数との相関について検討した。

ピークを持つ分布パターンを示した。第一と第二のグループの分離比は約1:1であった。
一方、分裂停止に至った全ての細胞でGFPの発現を調べたところ、形態異常、分裂異常などの老化形質を表わしている細胞も含めて全ての細胞でGFPは強い発現を示した。
GFP遺伝子を注射してから分裂停止に至り、寿命を迎えるまでのパターンを見ると、短寿命系は正規分布に近似されるパターンを示した。これは分裂停止の裏には一定の分散を持つランダムな出来事が関わっていることを暗示している。また、長寿命系は二つの正規分布に近似される集団の混合であるようなパターンを示した。従って、長寿命系においてもランダムな出来事が分裂停止と密接に関わっていることをうかがわせる。しかし、ランダムな現象がどの遺伝子にもJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)37

同じ確率で起こるとするならば、GFP遺伝子の安定しおいても安定した遺伝子発現を保証する機構が明らた発現を説明するのは困難になる。そこで、我々は次かになるのではないかと期待される。

のような仮説を考えた。すなわち、ゾウリムシには細Immaturinによる老衰期の細胞に対する分裂能力の胞分裂がいつまでも続くように働いている仕組みが回復効果は、本研究で見たようにサブクローン内の短内包されており、その機構は分子プログラムの形で制寿命系の細胞に対する長寿命系へのシフト効果によ御されている。この分裂維持機構にランダムな事象がる可能性が考えられる。かつて我々がイメージしてい

衝突し、その機能を阻害することによって分裂停止がたのとは異なり、老化形質の発現様式にも理解可能な起こる。一方、GFP遺伝子の発現パターンは、細胞の美しい法則が働いているのかも知れない。

中にはランダムな事象による遺伝子発現の阻害がきわめて起こりにくい領域が存在する可能性を示唆している。
今後、GFP遺伝子が組み込まれている周辺の塩基配［文献］
Takenaka, Y, Haga, N, Harumoto, T, Matsuura, T and
Mitsui, Y. (2002) GENE 284, 233-240.

列を分析することによって、分裂停止に至った細胞にゾウリムシのclonal aging における染色体DNAサイズの安定性について
太田 聡，芳賀信幸（石巻専修大・理工）

Stability of genomic DNA during clonal aging in Paramecium caudatum
Satoshi OHTA and Nobuyuki HAGA (Dept. of Biotech. Ishinomaki Senshu Univ.)
SUMMARY
During clonal aging, the cells of Paramecium show remarkable changes in cellular functions, such as decline of cell
growth ratio, decrease in mating activity, increase in progeny mortality and aberration in cell morphology. In P. tetraurelia,
dramatic changes in chromosomal DNA size according to clonal aging were also reported. To analyze the stability ofchromosomal DNA size distribution during clonal aging in P. caudatum, we have established a method for the separationof intact chromosomal DNA by a modified method of CHEF (clumped homogeneous electric fields electrophoresis). The
DNA banding pattern examined in cells of three different ages, 100, 300 and 600 fissions after conjugation, showed five
major DNA bands (1100, 900, 97, 48 and 25 Kbp) in all ages of cell lines. These results indicate that all chromosomal DNA
is stably maintained during clonal aging in P. caudatum. The cells at a 600 fission-age, however, showed a significant
reduction in cell division ratio in comparison with the other two cell lines. Therefore, it is important to analyze local
changes in chromosomal DNA to detect the genetic causes of this reduction in cell division ratio.
［目的］ゾウリムシ(Paramecium caudatum)は細胞分裂下についても検討した。また染色体末端構造である

齢約700回で死を迎えるまでに、細胞分裂速度の低下

telomereサイズをsouthern blot法により測定した。

や子孫の生存率の低下などの生理機能の低下を起こす。これまでゾウリムシではclonal agingに伴って大核DNAの含有量が減少する(Takagi et al., 1982)、ヨツヒメ
ゾウリムシ (P.tetraurelia) では染色体DNAが短くなる(Gilley et al., 1994)という報告があり、細胞老化との関わりが示唆されている。ではゾウリムシの染色体DNA
サイズはclonal agingに伴って変化するのだろうか。この事を明らかにするため細胞分裂齢の異なる細胞間で染色体DNA サイズを比較し、細胞の生理機能の低［材料と方法］ゾウリムシの2つの株について,細胞分裂 齢 の 異 な る 細 胞 (KNZ52 f=100,300,600. SOS2
f=50,500)を準備し、同じ株内の分裂齢の異なる細胞間で染色体DNAｻｲｽﾞを比較した。染色体DNAｻｲｽﾞの比
較には数MbpのDNAを分離できるﾊﾟﾙｽﾌｨｰﾙﾄﾞ電気泳動(CHEF, counter-clamped homogeneous electric field)を用いた。
細胞の生理機能の低下の指標として細胞分裂速度を計測した。計測には、毎日新しい培養液の入ったデ原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

38

プレッションスライドに1細胞ずつ植え継いでいく

ムシのtelomereはf=170までは細胞分裂1回ごとに約

daily isolation culture を用いた。

3bpずつ伸張することが報告されている (Takenaka etsouthern blot法にはAmersham Pharmacia Biotech社のal., 2001)が、それ以降f=600まで伸張することが本研究

ADLD systemを使用し、制限酵素はSspⅠ、hybridization

により明らかになった。また、KNZ52とSOS2ではのプローブにはゾウリムシのtelomere配列(TTGGGG)3

telomereサイズが大きく異なることから、株による多を用いた。

様性があることが示唆された。しかし、clonal agingに［結果と考察］CHEFにより各分裂齢の染色体DNAを分離した結果、KNZ52ではいずれの細胞でも５本のバンドが同様の位置に検出された(約1100, 900, 90, 48, 25
Kbp)。また、SOS2ではいずれの細胞においても3本のバンドがそれぞれ同様の位置に検出された（約90, 48,
25 Kbp）。この事から、400〜450回の細胞分裂を経た細胞でも、染色体DNAサイズは変化することなく安定に維持されていることが示唆された。一方、細胞分裂速度を計測したところ、SOS2のf=500 (mean. 2.74±
0.27 (S.D.) fission/day, n=21)ではf=50 (3.81±0.36, n=21)に比べ1日あたりの分裂回数が有意に少ないという結ともなったtelomereの伸張は2つの株に共通していた。
このことから、ゾウリムシにおいては細胞分裂回数に比例したtelomereの短縮は起こらずに老化した細胞でも染色体DNAサイズを安定に維持していると考えられる。
しかし、clonal agingによって染色体DNAサイズが変化しないもう一つの可能性として、切断や構造の変化を起こしたDNAを直ちに消化し、新しく複製するという可能性も考えられる。これらの可能性を考えながら
clonal agingに伴う染色体DNAの安定性と細胞機能の低下との関連を明らかにするのは今後の課題である。

果を得た。このことは染色体DNAが安定に維持されて［文献］いる細胞でも生理機能が低下することを示唆していD. Gilley., E. H. Blackburn. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.

る。

USA. 91, 1955-1958.

各分裂齢のtelomereサイズは、KNZ52のf=100, 300で

Y. Takagi., N. Kanazawa. (1982) J. Cell Sci. 54, 137-147.

はともに1.4Kbps. f=600 では2.2Kbpsであった。SOS2の

Y. Takenaka., T. Matsuura., N. Haga., Y. Mitsui. (2001)

f=50では0.2Kbps. f=500では0.7Kbpsであった。ゾウリ

Gene. 264, 153-161.

Paramecium caudatumの低温耐性と順応
佐々木 大，芳賀信幸（石巻専修大学・理工）

Tolerance and adaptation to of low temperature in Paramecium
Hajime SASAKI and Nobuyuki HAGA (Dept. of Biotech., Ishinomaki Senshu Univ.)
SUMMARY
Adaptation to low temperature seems to be an essential strategy for wild animals and plants to survive in the winterseason. Little is known about the lifestyle of ciliates in the winter season. To understand the wintering of Paramecium at
low temperature, we have examined cell growth ratio under low temperature conditions using 8 cell lines of P. caudatum.
We found that KNZ2 showed remarkable tolerance to low temperature compared with the other 7 cell lines. The cells of
KNZ2 underwent several cell divisions at 5°C during the 20 days of single cell isolation-line culture. The progeny ofselfing conjugation of KNZ2 showed 4 different types of growth pattern under low temperature conditions: 1) stable
growth, 2) unstable growth with a mixture of live and dead cells in the daughter cell population, 3) living, without cell
division, and 4) dying, without cell division. The segregation ratio of these 4 types was approximately 1:1:2:1. These
results suggest that several genes may be involved in growth regulation under low temperature conditions. We think that it
is useful to assume the existence of "wintering genes" in a working hypothesis of tolerance and adaptation to low temperature.

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)［目的］日本には四季があり夏が過ぎれば秋、そして39

くり増殖していくというものであった。これに対して冬が来る。Paramecium属の生息している地域の水温もKNZ2は他の株とは異なり、ほとんど淘汰は起こらず、冬になれば当然低下する。そこで本研究ではゾウリム

分裂速度も他の株と比較しても格段に速い事がわ

シはどのようにして越冬しているのか、という問題にかった。このことから、KNZ2は低温に対して他の株よ

ついて細胞遺伝学的にを解明することを目的とした。 りも順応能力に長けていると考えられる。次に、KNZ2
今回は８系統のP. caudatumを低温条件下で培養し、 と他の株との低温順応能力の差が環境要因によるも増殖曲線を比較解析した。
［材料と方法］P. caudatumのKNZ2 KNZ5 KNZ8 Kos4
Kos14 c103 KoscA3 KoscA4という株を用いた。これらの細胞には採取された場所や、野外株や実験株といった違いがある。今回の実験の手順としては、１細胞ごとに一穴に４００μℓずつ培養液の入ったデプレッ
ションスライドに単離し、各株１５匹ずつ、５℃に設定したインキュベータに入れそれらの２０日間の生存と増殖状況の観察を行った。培養液は３日に一度交換し、細胞が常に富栄養条件下にあるようにした。同
様の実験を４〜５回繰り返し、その平均値からグラフを作成し、また、その平均分裂回数と標準誤差を算出した。

のなのか、それとも遺伝的な要因によるものなのかを調べるために、KNZ2からselfing conjugationによる子孫をとり、同様の実験を行った。子孫は２２系列を用
いて低温条件下で観察した結果、増殖可能なタイプ（増殖型）・死滅していく細胞が多いがなんとか増殖
していくことが出来るタイプ（不安定増殖型）・細胞数にほとんど変化が見られないタイプ（微変動型）・
２０日間で死滅してしまうタイプ（死滅型）の４タイ
プに分類出来ることがわかった。これら４つのタイプはそれぞれ1：1：2：1（増殖型：不安定増殖型：微変動型：死滅型）という割合で出現することがわかった。
以上の結果からゾウリムシが低温で生存するためにはいくつかの遺伝子が関与している可能性が示唆される。仮にこれらの遺伝子を「越冬遺伝子」と想定し［結果と考察］KNZ2を除く、ほとんどの株は観察開始て今後その存在の証明を中核にすえたプロジェクト

当日から低温による淘汰がしばらくの間起こり、わずを推進することは、北国の野生生物の越冬システムをかに生き残った細胞がゆっくりとしたペースで分裂理解するうえで新しい視点を与えるものと期待されを行っていくか、もしくは淘汰がわずかに起こりゆっる。

Tetrahymena thermophilaにおける12kDa FK506結合蛋白質（TFKBP12）の機能解析
大沢涼子，中嶋泰夫，上野裕則，沼田治（筑波大・生物科学系）

Studies on 12 kDa FK506-binding protein (TFKBP12) in Tetrahymena thermophila
Ryoko OSAWA, Yasuo NAKASHIMA, Hironori UENO and Osamu NUMATA(Univ. of Tsukuba, Institute of Biological Science)
SUMMARY
The 12-kDa FK506-binding protein (FKBP12) is well conserved from yeast to human, and is known to bind with the
immunosupressant FK506 (2). FKBP12 is also known to bind with a calcium channel called type-1 ryanodine receptor(1,3,4,5). This FKBP12 also exists in Tetrahymena thermophila. The present study was undertaken to investigate the functionsof FKBP12 in Tetrahymena thermophila (TFKBP12). The TFKBP12s ORF size was 330 bp, the domain for PPIase wasconserved, and the TFKBP12 gene was a single gene. TFKBP12 was localized around basal bodies and studies with immuno-EM showed that TFKBP12 was localized on the epiplasmic layer near basal bodies. From the results of our studies
and the fact that other FKBP12s work as regulators of calcium, TFKBP12 may be working as part of a calcium regulating
system near cilia. References: 1Brillantes, A. B., Ondrias, K., Scott, A., Kobrinsky, E., Moschelle, M. C., Jayaraman, T.,
Landers, M., Ehrlich, B. E., and Marks A. R (1994) Cell 77, 513-523. 2Hamilton, G. S. and Steiner, J. P. (1998) J. Med.
Chem. 41, 5779-5143. 3Jayaraman, T., Brillantes, A-M. B., Timerman, A. P., Erdjument-Bromage, H., Fleicher, S.,

40

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

Tempst. P., and Marks, A. R (1992) J. Biol. Chem. 267, 9474-9477. 4Show W., Agdasi B., Hamilton S. L., Matzuk M. M.
(1998) Nature 39 489-492. 5Schiene-Fischer C.,Yu C. (2001) FEBS letters 495 1-6.
［目的］12kDa-FK506結合蛋白質 (FKBP12) はイムノ

［結果と考察］TFKBP12配列の解析を行った結果、フィリンと呼ばれる免疫抑制剤のターゲット蛋白質

ORFは 330bp で あ り、FKBP フ ァ ミ リ ー に 特 異 的 な群に属する分子量12kDaの蛋白質である。この蛋白質

PPIase domainを保持していることが判った。サザンブ

は、酵母からヒトまでの広い生物種間において存在

ロットの結果、遺伝子は一種類であることが明らかにし、免疫抑制剤FK506と結合し、カルシニューリンのなった。蛍光抗体法でTFKBP12の局在を共焦点レー活性化を抑制することで免疫抑制効果をもたらす

ザー顕微鏡で観察したところ、TFKBP12は繊毛基部を（reviewed by Hamilton et al.,1998）。また、心筋の筋小取り囲むように局在していた。さらに免疫電子顕微鏡胞体に存在するリアノジン受容体タイプ1に結合し、法で詳細に局在性を調べた結果、TFKBP12は繊毛基部

このカルシウムチャンネルの開閉の安定化に関与す周辺のepiplasmic layerに存在していることが判った。

る( Jayaraman et al.,1992 ; Brillantes et al., 1994 ; Shou et

Epiplasmic layerはカルシウムを蓄積するalveolar sacに

al.,1998)。このFKBP12は繊毛虫テトラヒメナにも存在

接して存在する。したがって、TFKBP12は繊毛基部周する。本研究ではTetrahymena thermophilaのFKBP12辺のepiplasmic layerに存在し、カルシウムが関与する(TFKBP12)の機能解析を行った。

現象に関係する事が予測された。そこでTFKBP12結合［材料と方法］材料：Tetrahymena thermophila B株の、増殖期の細胞を用いた。TFKBP12のクローニングと組み換え蛋白質の作成：3’RACE法、5’RACE法を用いて、配列を決定した後、TFKBP12遺伝子中のTAAをCAAに置換し、大腸菌で発現させた。サザンブロッティン

蛋白質の探索を行ったところ、約20 kDa、と約50 kDaのTFKBP12結合蛋白質が存在することが判った。これ
らの蛋白質の解明が進めばTFKBP12がどのような機能を持っているかを解明する手がかりとなると考えられる。

グ：50 µgのゲノムDNAを制限酵素処理し、DIGラベル［文献］

した全長TFKBP12遺伝子をプローブとして検出を

Brillantes, A. B. , Ondrias, K. , Scott, A. , Kobrinsky, E. ,行った。イムノブロッティング：テトラヒメナ細胞抽Moschelle, M. C. , Jayaraman, T . , Landers, M., Ehr-

出物をSDS-PAGEで分離し、蛋白質をイモビロンフィ

lich, B. E. , and Marks A. R (1994) Cell 77,513-523
ルターに移し、ウサギ抗TFKBP12抗体で反応させて、 Hamilton, G. S. and Steiner, J. P. (1998) J. Med. Chem．41,
蛋白質を検出した。蛍光抗体染色法：細胞を0.5％ホル

5779-5143

ムアルデヒドをふくむ100％メタノールで固定した

Jayaraman, T. , Brillantes, A-M. B. , Timerman, A. P. ,後、抗体処理をして、共焦点レーザー顕微鏡で観察しErdjument-Bromage, H. , Fleicher, S. , Tempst. P. , andた。免疫電子顕微鏡法：蛍光抗体法と同様の固定をしMarks, A. R. (1992) J. Biol. Chem. 267 , 9474-9477

た細胞と、4％グルタルアルデヒドとパラホルムアルShow W. , Agdasi B. ,Hamilton S. L. , Matzuk M. M.

デヒド固定した細胞をLR-White樹脂に包埋後、超薄切(1998) Nature 39 489-492

片した。この切片を抗体処理し、酢酸ウラン染色後、 Schiene-Fischer C. ,Yu C. (2001) FEBS letters 495 1-6
透過型電子顕微鏡で観察した。

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)41

有性生殖過程におけるテトラヒメナ接合変異株bcd2、cnj7、cnj10でのTCBP-25と微小管の挙動解析
中川知美1，Eric S. Cole2，藤生健太1，沼田 治1，（1筑波大・生物，2St. Olaf College Biology）

Analysis of TCBP-25 and tubulin in the conjugation mutants, bcd2, cnj7 and cnj10,
during sexual reproduction
Tomomi NAKAGAWA1, Eric S. COLE2, Kenta FUJIU1 and Osamu NUMATA1(1University of Tsukuba, 2 St. Olaf College.)
SUMMARY
The Tetrahymena Ca2+-binding protein of 25 kDa ,TCBP-25, is a calmodulin family protein containing four calciumbinding domains of the EF-hand type. TCBP-25 is localized around both the migratory and stationary gametic pronuclei
and in the conjugation junction at the pronuclear exchange stage during sexual reproduction (Hanyu et al., 1995). To
investigate the function of TCBP-25 during conjugation, we have analyzed the localization of TCBP-25 in the conjugation
mutants bcd2 (Cole, 1991), cnj7 and cnj10 (Cole and Soelter, 1997). Our data indicate that TCBP-25 is not involved in the
distinction between the pronuclei and the degenerative nuclei, and there is no relation between the localization of TCBP-25
and pronuclear fusion, and also that TCBP-25 plays some role in migratory pronuclear exchange. We further analyzed thecnj10 mutant, which is unable to exchange pronuclei, by investigating the localization of α-tubulin. We observed astral
localization of α-tubulin around migratory pronuclei only in wild type pairs. Our data suggest that the localization of
TCBP-25 around pronuclei could be related to astral localization of α-tubulin. We propose that TCBP-25 and tubulin playsome role in migratory pronuclear exchange.
［目的］Tetrahymena Ca2+-binding protein of 25 kDa

cnj7においても、核交換時に移動核・静止核の周辺に、(TCBP-25) は、カルモジュリンスーパーファミリーに

TCBP-25は局在しなかった。一方、核融合の起きない

属するCa2+結合タンパク質である。TCBP-25は有性生bcd2では、野生株と同様に移動核・静止核の周辺に殖過程の核交換期特異的に、移動核・静止核の周辺に

TCBP-25が局在した。以上の結果からTCBP-25の機能局在する。この局在性からTCBP-25の機能に関して、に関する仮説の検証をおこなった。仮説①生殖核の選仮説①生殖核選別シグナル、仮説②移動核の交換、仮

別：cnj10では選択されなかった小核が正しく選別さ説③核の融合が提唱されている。我々はこれらの仮説

れ消失する。cnj10においてTCBP-25が局在しないにもの検証を試みるため、核の挙動が異常な変異株におけかかわらず、生殖核以外の核が正常に消失しているこる、TCBP-25の挙動を解析した。あわせてTCBP-25の機とから、TCBP-25が「生殖核の選別」に働く可能性は能に関する知見を得るため微小管の挙動解析を行否定された。仮説②移動核の交換：核交換の起こらななった。

いcnj10では、移動核・静止核周辺にTCBP-25は局在し［材料と方法］細胞を10mM Tris (pH 7.4)溶液中で20hr
飢餓状態においた後、接合タイプの異なる細胞を混合し接合を誘導した。用いた細胞は、野生株（接合型IIとVII）・変異株cnj10 (VとVII)・cnj7 (IIとV)・bcd2 (IIとVI)である。混合後5.5〜7hrの細胞におけるTCBP-25およびα-tubulinの局在を間接蛍光抗体法で明らかにし、
共焦点レーザースキャン顕微鏡LSM510(Carl Zeiss社)
で観察した。DNAの染色にはPropidium Iodideを用いた。

なかった。このことより、TCBP-25が移動核の交換に関与する可能性は残された。仮説③核の融合：核融合が起こらないbcd2ではTCBP-25が正常に局在した。一方で、cnj7では核融合が起こるがTCBP-25は局在しなかった。TCBP-25の局在と核融合との間に関係が見られないことから、TCBP-25は核融合には関与しないと考えられた。以上、接合変異株での局在解析より、
TCBP-25が移動核の交換に関与する可能性が示唆された。
そこで次に、TCBP-25が局在せず核交換をしない［結果と考察］小核の接合面への付着、核交換、核融

cnj10において、核交換に重要である微小管が機能し合が起こらないcnj10では、移動核、静止核の周辺にているかどうかを検証するため、TCBP-25とα-tubulin

TCBP-25は局在せず、核交換直前の第三分裂がないの二重染色を行ない、微小管の局在性を解析した。野原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

42

生株では、微小管は移動核・静止核の周辺に局在し、 微小管の局在とに何らかの関係があると考えられた。
さらに核から放射状に伸びる微小管も観察された。

本研究により、有性生殖過程においてTCBP-25は移

cnj10 に お い て 接 合 面 に 付 着 で き な い 生 殖 核 に は

動核の交換に働く可能性が高いこと、移動核・静止核

TCBP-25は局在せず、放射状の微小管も観察されなへのTCBP-25の局在と微小管の局在との間に何らかかった。野生株と異なる局在性を示すことから、cnj10の関係があることが示唆された。

では核交換期に微小管が機能していないと予想された。またこの結果より、移動核の接合面への付着に放射状の微小管が関わっていること、cnj10遺伝子産物
が微小管と生殖核周辺との連結に関わる因子である
ことが示唆された。加えて野生株での観察から、微小管とTCBP-25では時間的に微小管のほうが早く局在すること、微小管の局在なしにTCBP-25のみが移動
核・静止核に局在することはないことが明らかになった。これより、移動核・静止核へのTCBP-25の局在と［文献］
Cole, E. S. (1991) Dev. Biol. 148, 403-19.
Cole, E. S., and Soelter, T. A. (1997) Dev. Biol. 15, 233-45.
Gaertig, J. and Fleury, A. (1992) Protoplasma 167, 74-87
Hanyu, K., Takemasa, T., Numata, O., Takahashi, M., and
Watanabe, Y. (1995) Exp. Cell Res. 219, 487-93.
Orias, J. D., Hamilton, E. P. and Orias, E. (1983) Science
14;222:181-4.

P. tetraurelia における形態異常変異体の遺伝解析
菅野 恵，三輪五十二（茨城大・理・自然機能）

Genetic analysis of a morphological mutant in Paramecium tetraurelia.
Megumi KANNO and Isoji MIWA (Dept. Biol., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)
SUMMARY
We isolated four trichocyst-nondischarge mutants of Paramecium tetraurelia by treatment with N-methyl-N’-nitroN-nitrosoguanidine. Furthermore, we found a slow-growing clone among the mutants. The cells of this clone showed anormal shape like wild type cells in mass culture, but they became bigger and more spherical when they were cultured inisolated conditions. To analyze its genetic characteristics, F1 progeny cells were obtained after crossing with the wild type.
F1 cells were then allocated to two experiments. In one, autogamy was induced, and in the other, they were backcrossedwith parent cells of the mutant. In autogamy progeny, the ratio of spherical cells to normally shaped cells was different inevery experiment. On the other hand, the ratio in the progeny obtained from backcrossing was close to 1:1. Therefore, theshape-altering phenotype of the mutant seems to be controlled by the gene.
［目的］P. tetraurelia細胞をニトロソグアニジンで処

トロソグアニジンで1時間処理し、その後細胞を10数理することにより、トリコシストを放出せず、細胞分回分裂させた後飢餓状態に入れ、オートガミーを誘導

裂速度の遅い形態異常変異体を分離した。この変異体する。60穴マルチプレートに細胞を1個体ずつ960個体

は試験管での集団培養中では野生株とほぼ同じ形態

単離し、3回分裂した後試験管に入れクローンにしてを示すが、デプレッションスライドを用いた単離培養増やす。トリコシストを放出できない変異体を分離すに移すと形態が異常に大型で球形になるという特徴

るため、これらのクローンにピクリン酸を滴下し調べをもっている。この変異体の遺伝様式を解析し、細胞たところ、4クローンのトリコシストを放出できない分裂に関する遺伝子について調べ形態異常との関わ変異体を分離した。この4クローンの培養を継続するりを探る。

うち1クローンに形態異常変異体を見出した。形態異［材料と方法］突然変異を誘導するために処理した株はP. tetraurelia hrd(Ⅶ)である。オートガミー成熟期の細胞を最終濃度80 µg/mlのN-メチル-N’-ニトロ-N-ニ

常変異体を遺伝解析するため、野生株とかけあわせて
F1 を単離し、そのF1 にオートガミーを誘導した場合と、F1を変異体と戻し交配した場合について子孫の表
現型の分離比を調べた。

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

43［結果と考察］この形態異常変異体の特徴は、トリコ

異常、遅い分裂速度を示す要因は核内の遺伝子にあるシストを放出できず、単離培養に移すと細胞の形態がと考えられる。また、トリコシストの放出と形態、分異常に大型で球形になり、遊泳速度が遅く、致死率も裂速度についての形質は別々に遺伝するので、トリコ高くなる。しかし、試験管での集団培養の場合、細胞シストを放出できないことが形態異常や分裂速度がの形態は野生株とほとんど変わらない。分裂速度は集遅いことの直接的な要因ではないといえる。さらにF1団培養では野生株と比較すると多少遅いが、単離培養の子孫において、遅い分裂速度を示した細胞は形態異に移すと分裂速度はさらに低下する。野生株は1日約常も示した。このことより、形態が大型化するのは、

4.12回という分裂速度を示したのに対し、変異体は約細胞分裂が遅いことが原因で起こる現象ではないか

0.68回を示した。また、単離培養の際、分裂を停止しと考えられる。また、F1の戻し交配の結果では子孫のて死んでしまう細胞がよく見られた。野生株と形態異表現型は一定の分離比を示したのに対し、オートガ

常変異株とをかけあわせて単離したF1は野生株と同ミー後の結果では一定の分離比を示さず、いろいろなじ表現型を示す。

パターンが見られた。これは、接合時の核交換や、オー

F1をオートガミーさせ、その子孫の表現型の分離比

トガミー時の大核形成などが正常に行われていないを調べたところ、トリコシストの放出と分裂速度につなどの原因が推測される。今後、このことについて詳

いては実験を行うたびに一定の分離比を示すことはしく調べる必要がある

なく、いくつかのパターンが見られた。そこで、F1と形態異常変異体を戻し交配し、その子孫の示す表現型の分離比について調べた。その結果、トリコシストの放出の有無についても、分裂速度が正常か遅いかについても、ほぼ1:1という一定の分離比を示した。以上の［文献］
1) Pollack, S. (1974) J. Protozool., 21:352-362.
2) Takagi, Y., Izumi, K., Kinoshita, H., Yamada, T., Kaji,
K. and Tanabe, H. (1989) Genetics, 123:749-754.

ことより、この変異体の形質は核遺伝するので、形態

ミドリゾウリムシの概日リズム発現に対する共生クロレラの影響
大森智志，三輪五十二 (茨城大・理・自然機能)

Effects of symbiotic Chlorella on the expression of circadian rhythmin Paramecium bursaria
Satoshi OHMORI and Isoji MIWA (Dept. Biol., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)
SUMMARY
Paramecium bursaria shows many kinds of circadian rhythm, including a mating reactivity rhythm and a photoaccumulation rhythm. Cells of P. bursaria normally contain several hundred cells of the green alga Chlorella established in
the cytoplasm as endosymbionts. Chlorella-free white cells can be obtained from natural green cells by rapid growth inconstant darkness (DD). Symbiotic Chlorella were isolated easily from their host cells and re-infected into Chlorella-freewhite cells. It is known that the phase of photoaccumulation rhythms in re-infected cells was shifted in constant light (LL)
depending on the phase of infecting Chlorella which had been kept under a light and dark cycle. Moreover, symbiotic
Chlorella play a similarly important role in the expression of mating reactivity rhythms. The phase shift of photoaccumulation and mating reactivity rhythms in LL occurred 3 days after the white cells were infected with Chlorella entrained by
the opposite phase of the LD cycle. This time, we infected Chlorella cultured under the temperature cycle (CW12:12) into
white cells, and measured the mating reactivity rhythm. The phase of the mating reactivity rhythm of recipient cells wasshifted by infecting Chlorella after 4 days in LL. But a phase shift did not occur in DD.

44

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年［目的］原核生物から真核生物まで、地球上に生息し取り除いた。接合活性リズムの測定は、３時間ごとにているほとんどすべての生物の生理機能や行動に概60個体の細胞をデプレッションスライドの６穴に10日リズムが見られ、単細胞生物ミドリゾウリムシ

個体ずつ単離して、そこに色の異なるテスター細胞を(Paramecium bursaria)も例外ではない。ミドリゾウリ

約100個体ほど入れ、５分後にテスター細胞と交配反

ムシは細胞内に数百個のクロレラを共生させており、 応を示している細胞数を数えて、接合活性を発現して接合活性の発現や集光性などに概日リズムを示す。これらのリズムは光の明暗サイクルや温度の高低サイ
クルに同調させることができる。共生クロレラが集光
性リズムの発現に主導的役割を果たしていることは知られているが、今回接合活性リズムの発現においても同様の結果が得られた。さらに、感染させるクロレ
ラの同調に明暗サイクルのほかに温度サイクルで同調させても同じ主導的効果が見られることから、同調因子と接合活性の発現機構との関係を考察した。

いる細胞の割合を計算した。
［結果と考察］高温期25℃、低温期15℃(10℃差)の温度サイクルで逆位相に同調させたOS1から単離した
クロレラ (以下、逆位相のクロレラ) をOS1wに感染させ、その後LL(恒明)、25℃の条件下におくと4日後に接合活性リズムの位相が逆転した。同様の実験を温度差
15℃の温度サイクルで同調させた逆位相クロレラを用いて行なっても4日目に位相の逆転が見られた。温
度差10℃の逆位相のクロレラをOS1wに感染させ、DD［材 料 と 方 法］使 用 し た 株 は ミ ド リ ゾ ウ リ ム シ(恒暗)、25℃で接合活性リズムを測定した時は位相の(Paramecium bursaria) のsyngen1に属するOS1株、OS1

逆転は見られなかった。これらの結果から、明暗サイ

株から共生クロレラを取り除いたOS1w株、HK2株、クルで同調させた逆位相クロレラを感染させた白色HK2株から共生クロレラを取り除いたHK2w株、T316

細胞で見られた位相の逆転と同様のことが、光より弱株から共生クロレラを取り除いたT316w株である。

い同調因子の温度でも引き起こされることがわかっ

OS1株、OS1w株、T316w株は接合型Ⅳ、HK2株、HK2w

た。DDでは位相の逆転が起こらなかったことから、感株は接合型Ⅱを示す。接合活性リズムの測定はOS1w

染させたクロレラが光合成を行なうことによって位株で行ない、クロレラの採取はOS1株を用いた。HK2

相が逆転したと考えられる。このことは、共生クロレ

株、HK2w株は接合活性リズムを測定する際のテス

ラの光合成は明暗サイクルと同様に温度サイクルでター株で、T316w株でテスター株の接合活性の強さをも同調され、光合成産物(マルトース、O2)がゾウリムチェックした。培養液にはK-ドリル氏液にレタス

シ細胞の位相変位を引き起こしたことになる。今後はジュースを加えたものに、Klebsiella pneumoniaeを接種

マルトースまたはO2を接合活性リズムの活性消失時して使用した。共生クロレラの単離・感染方法は次のに白色細胞に与えてみて、位相変位が起こるかどうか

ように行なった。１ℓフラスコで大量培養したOS1を調べる必要がある。

ガーゼで濾過してごみを取り除き、遠心で細胞を集めた。集めた細胞を超音波破砕機でゾウリムシ細胞のみを破壊し、ナイロンメッシュ(15 µm)で濾過してクロレラを単離した。単離したクロレラをOS1w１細胞あたり10,000クロレラになるように感染させ、１時間後にゾウリムシ細胞内に取り込まれなかったクロレラを［文献］
Miwa, I., Fujimori, N. and Tanaka, M. (1996) Europ. J.
Protistol., 32, Suppl. I: 102-107.
Tanaka, M. and Miwa, I. (1996) Zool. Sci., 13, 685-692.

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)45

繊毛虫６種とクサリヒメウズムシの一種 Stenostomum sphagnetorum（扁形動物）との捕食者ー被食者間相互作用
三宅章雄，サラタンブリーニ，フェデリーコブォナンノ，ピエロサルタラマキア（伊 カメリーノ大・分子細胞動物）

Predator-prey interaction between 6 species of ciliates and the turbellarian
Stenostomum sphagnetorum
Akio MIYAKE, Sara TAMBURRINI, Federico BUONANNO, Piero SALTALAMACHIA(Dept. Mol. Cell. Animal Biol., Univ. Camerino, Italy)
SUMMARY
The haptorian ciliate Dileptus margaritifer attacked with the toxicysts-bearing proboscis the catenulid turbellarian
Stenostomum sphagnetorum. The Stenostomum released a mass of cloudy material from the attacked site and swam away,
while the Dileptus ate the released material. If the attack was repeated, the Stenostomum was gradually destroyed. On theother hand, Stenostomum preyed on Dileptus by engulfing it. Dileptus required a numerical superiority over Stenostomum
to prey on it. Lysozyme, which induces a massive discharge of extrusomes in various ciliates, induced (at 500 µg/ml) a
rapid and massive secretion from all over the surface of Stenosstomum. The secreted material formed a capsule around thetreated Stenostomum, just as in the "capsule shedding" in ciliates. Such an induction of massive secretion by lysozyme(125 µg/ml, 10 min) did not affect the ability of Stenostomum to reproduce, but it significantly reduced the capacity of
Stenostomum to defend itself against Dileptus, suggesting that the secretion is effective for defense against predators just as
the discharge of defensive extrusomes in ciliates. Stenostomum took into the pharynx Blepharisma japonicum, Climacostomum virens, Loxodes striatus, Paramecium tetraurelia and Spirostomum teres, but Loxodes and Spirostomum wereregurgitated, apparently unharmed. The phenomenon was similar to the regurgitation of engulfed Paramecium by Climacostomum (Sugibayashi & Harumoto, 2000).
［目的］繊毛虫と渦虫がいろいろな点でよく似ている

対する防御の機能があるエクストルソーム（放出体）

ことは昔から度々指摘されており、多細胞動物の繊毛を持っている。すなわち、Paramecium のトリコシス

虫起源説 (Hadži，1963, 西村, 1983) の根拠の一つにもト、Blepharisma と Loxodes の色素顆粒、Climacostomum

なっている。我々はこれまで行って来た繊毛虫の捕食と Spirostomum の表層顆粒で、それぞれ、Dileptus に対者ー被食者間相互作用の研究に渦虫を加え、研究の幅

す る 防 御 に 有 効 で あ る (Miyake, 2002, Harumoto,を広げるとともに、繊毛虫ー渦虫間の相似や相違を新2002)。ステノストマムはこれら繊毛虫すべてを一旦しい角度から調べようと試みた。

咽頭内に取り込むが、Loxodes と Spirostomum は生きた［材料と方法］用いた繊毛虫は Dileptus margaritifer(捕食者として)、Climacostomum virens (捕食者、被食者として)、Blepharisma japonicum, Loxodes striatus,
Paramecium tetraurelia, Spirostomum teres (被食者として) で あ る。渦 虫 に は ク サ リ ヒ メ ウ ズ ム シ（Stenostomum ）の一種 S.sphagnetorum（以下ステノストマム）を用いた。ステノストマムは体長約 1 mm、種々の繊毛虫を捕食し、二分裂で無性的に増殖する。
獲物は前方下部にある口から先ず咽頭に取り込まれ、次いで消化管に送られる。培養は繊毛虫 Sathrophilus
sp.およびヒメゾウリムシを餌とし、SMB（生理的塩類
溶液）中で行った。
［結果と考察］上述の５種の被食者繊毛虫は捕食者にまま吐き出してしまう。 すなわち、これら２種の繊毛虫はステノストマムに対し吐き出し反応を誘導して防御する。捕食者としての Climacostomum はステノ
ストマムと同様に、Paramecium、Blepharisma、Loxodes、および Spirostomum を口腔に取り込むが、Paramecium
は 生 き た ま ま 吐 き 出 す (Sugibayashi, & Harumoto2000)。従 っ て、こ れ ら の 繊 毛 虫 がDileptus、

Climacostomum およびステノストマムに対して有効な防御を行うかどうかは、捕食者が繊毛虫であるか、渦虫であるかとは直接関係がない様に思われる。
Dileptus はトキシシストを持ったプロボーシスで獲物を攻撃する。ステノストマムに

Dileptusのプロ

ボーシスがあたると、ステノストマムはその場所から分泌物を放出して逃げるが、繰り返し攻撃されると破原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

46

壊され捕食される。ステノストマムをリゾチーム

この様に、繊毛虫と渦虫の間の捕食者ー被食者間相（種々の繊毛虫にエクストルソームを放出させる）で互作用は、繊毛虫と繊毛虫の間の相互作用とよく似て処理すると (500 µg/ml) 全体表から大量の分泌物が一おり、この問題に関しては繊毛虫と渦虫の間にはっき斉に放出され、繊毛虫の capsule shedding のような現りした断絶がない様に思われる。

象がおこる。この様に大量の分泌物を放出させても(125 µg/ml リゾチーム, 10 分) ステノストマムの増殖能に変化はなかったが、Dileptus に対する抵抗性は減少した。従ってこの分泌物は Dileptus に対する防御の機能を持っていると考えられる。これは上述の種々の繊毛虫に防御用のエクストルソームを人工的に放出させた場合とよく似ている。渦虫には、エクストルソー
ムの様な放出性の細胞小器官である棒状小体があり、上記分泌物はこの細胞小器官から放出されるものと考えられる。

［文献］
Hadži, J. (1963) The evolution of the metazoa. Pergamon
Press, New York.
西村三郎 (1983) 動物の起源論 − 多細胞体制への道
中公新書, 685, 中央公論社、東京.
Miyake, A. (2002) Jpn. J. Protozool., 35, 97-117.
Harumoto, T. (2002) Jpn. J. Protozool., 35, 125-133.
Sugibayashi, R. and Harumoto, T. (2000) Europ. J. Protistol., 36, 415- 422.

タイヨウチュウActinophrys solの単離核におけるCa2+依存性収縮系の解析
有川幹彦，洲崎敏伸（神戸大・理・生物）

Ca2+-dependent contraction of isolated nuclei in the heliozoon Actinophrys sol.
Mikihiko ARIKAWA and Toshinobu SUZAKI (Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ.)
SUMMARY
In this study, isolated nuclei of the heliozoon Actinophrys sol were found to show Ca2+-dependent contraction. The
isolated nuclei showed 50 - 80% contraction despite variation in their size. Nuclear contraction was not induced by addition of Mg2+, and was inhibited by neither colchicine nor cytochalasin B. The nuclear contraction was repeatedly inducedby alternate addition of Ca2+ and EGTA. The degree of nuclear contraction and Ca2+ concentration showed a sigmoidal
relationship, with the threshold level of Ca2+ in the order of 10-7 M. The nuclear contractility remained even after treatment
with 2 M NaCl, suggesting a possible involvement of nucleoskeletal components in the nuclear contraction. Electron
microscopy showed that thin filaments which were spread in the nucleus as a meshwork structure became aggregated into
thicker filaments when nuclear contraction occurred. These observations suggest that Ca2+-dependent transformation of
the thin filaments may be responsible for the nuclear contraction. Similar nuclear contractility was found to exist in nuclei
of other protozoon species and even in HeLa cells, and the possibility is presented that eukaryotic cells in general possess aCa2+-dependent nuclear contractility.
［目的］原生動物の核は、細胞周期中に、その形や大［材料と方法］タイヨウチュウActinophrys solは、

きさを様々に変化させることが知られているが、これ

Sakaguchi and Suzaki （1999）の方法に従って無菌的にまでに、核が収縮性を保持しているという報告例はほ培養した。集めた細胞を1% Triton X-100処理によってと ん ど な い。核 膜 の 収 縮 に よ っ て 核 が 収 縮 す る

破 砕 し、遠 心 に よ り 核 分 画 を 得、さ ら に percoll と（Wunderlich et al., 1978）、あるいは核膜孔の形態変化

sucroseを用いて遠心することにより単離核を集めた。

によって核の収縮が起こる（Oberleithner, 1999）というPoly-L-lysineを塗布したスライドグラス上に得られた報告例があるが、今回、界面活性剤によって脱膜処理

単離核を貼り付け、Ca2+を含む溶液を加えて、その反を行った後の太陽虫の単離核において、Ca2+依存的な応を観察した。すべての光学顕微鏡観察は、プレパ収縮機構が存在することを見出した。この収縮性につラート内に片側からテスト溶液を流し、他方から濾紙

いて、いくつか検討を行った。

によって吸い取る灌流法を用いた。核の収縮に伴う核Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)47

内微細構造の変化を観察するため、電子顕微鏡によるな密度変化が起こっている可能性が示された。高塩処観察も行った。

理（2 M NaCl, 30 min）によっても核の収縮性は失われ［結 果 と 考 察］本研 究に おい て、タイ ヨウ チュウ
Actinophrys solの核にCa2+依存性の収縮機構が存在することが明らかになった。核の平均直径を測定したと2+ころ、生きた細胞では約15 µm、Ca を含まない溶液中で単離した核では約16 µmであったのに対し、Ca2+を含む溶液中で単離した核では約11 µmと、著しく減少していた。また、Mg2+を含む溶液中で単離した核の平均直径は約15 µmであり、生きた細胞の場合とほぼ同じ結果であった。収縮前後の核の直径をそれぞれ測定
した結果、核は、その大きさに関わらず、ほぼ同じ程度の収縮度合い（50%から80%）を示した。このような単離核の収縮は、colchicineやcytochalasin Bによっても阻害されなかった。スライドグラス上に貼り付けた単離核にCa2+を加えることによって収縮し、EGTAを加えてCa2+を除去することによって弛緩した。この収縮2+

弛緩は、Ca とEGTAを交互に加えることにより、何度も繰り返し生じさせることができた。このことは、核の収縮-弛緩がCa2+のみによって制御されていることなかったことから、核の収縮運動には核骨格系が関わっていると考えられる。透過型電子顕微鏡による観察の結果、収縮前の単離核では、生きた細胞の核と同様に、微細な繊維構造が核内部に均一に広がっているのに対して、Ca2+添加による収縮後の核では、それらが凝集して太い繊維構造を形成していた。EGTAを加えて核をふたたび弛緩させた状態では、太い繊維構造が崩れるように拡散し、核内に均一に散在していた。
これらの結果から、Ca2+依存的な核内微細繊維構造の凝集-拡散が、核の収縮-弛緩の原動力となっている可能性が示唆された。また、このようなCa2+依存的な核の収縮運動は、太陽虫Actinophrys solだけでなく、別種の太陽虫Echinosphaerium akamaeや、繊毛虫Euplotes
aediculatus、Paramecium bursaria、さらにはヒト培養細胞（HeLa cell）の単離核においても観察された。このことから、Ca2+依存的な核の収縮性は、真核生物の核に普遍的に存在しており、進化の過程において保存されている可能性が示唆された。

を示している。また、単離核の収縮度合いとCa2+濃度［文献］との関係を調べた結果、グラフはシグモイド曲線を描

Oberleithner, H. (1999) Steroids., 64, 42-50.

き、収縮過程、弛緩過程、いずれの場合においても、 Sakaguchi, M. and Suzaki, T. (1999) Eur. J. Protistol. 35,
核の収縮はCa2+濃度に依存しており、その閾値は10-7
411-415.
Mのオーダーであることが分かった。単離核の収縮前後における輝度の変化を微分干渉顕微鏡の観察像をWunderlich, F., Giese, G. and Bucherer, C. (1978) J. Cell
Biol., 79, 479-490.

用いて調べると、核の収縮に伴って核内構造の局所的Amoeba proteus から単離した収縮胞の収縮
西原絵里，鶴 剛貴，新免輝男，園部誠司（姫路工大・院・理・生命）

Contraction of contractile vacuole isolated from Amoeba proteus
Eri NISHIHARA, Gohki TSURU, Teruo SHIMMEN, and Seiji SONOBE(Dep. Life Sci., Grad. Sch. Sci., Himeji Inst. Tech.)
SUMMARY
The contractile vacuole (CV) of Amoeba proteus is an osmoregulatory organelle and its mechanism of contraction ispoorly understood. CV is not fixed at the cell surface and moves in the cytoplasm, contracting about every 3 minutes.
Prusch, R. D. (1970) reported that isolated CV of A.proteus shrank in the presence of 5 mM ATP. We re-examined
Prusch’s experiment with slight modifications. When a cell was squashed between slide glass and cover glass, CV wasreleased into the medium. Contraction of isolated CV was induced by ATP, but not by GTP, ITP, ADP, AMP-PNP and
ATPγS. To examine a possibility that contraction was caused by breakdown of CV membrane due to mechanical pressure,isolated CV was burst mechanically. In this case CV was broken without contraction. Since the presence of actin and48

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

myosin around CV has been reported in Acanthamoeba, cell fragments containing CV were obtained by centrifugation ofcells in Percoll. The surface of CV in the cell fragments was strongly stained with rhodamine-palloidin, suggesting that
actin filaments are associated with CV and involved in contraction.
［目的］収縮胞は原生動物に見られる液胞の一種で、 （GTP、ITP、ADP）やATPの類似体（AMP-PNP、ATP
浸透圧調節が主な機能である。しかし、その収縮機構

γS）を含むEMH液による灌流では収縮しなかった。

については解明されていない。Pruschは単離したA.

以上の結果より、ATPに特異的な反応であることがわ

proteus の収縮胞が5 mM ATP存在下で収縮することをかった。

報告している(1)。私たちはこの追試を行ない、収縮胞の機能解明を試みた。

ATPによる収縮が、灌流時の機械的圧力による収縮
胞膜の壊裂である可能性も考えられたので、これを検［材 料 と 方 法］材 料 に は Amoeba proteus を 用 い、Tetrahymenaを餌として与えた。実験には2日以上飢餓状態にした細胞を用いた。
EMH 液（5 mM EGTA、6 mM MgCl2、30 mM HEPES、
27 mM KOH、145 mM Sorbitol (pH 7.5)）(2) で 20 分間処
理した細胞をスライドガラスとカバーガラスの間に挟み、押しつぶして収縮胞を単離した。単離収縮胞に1 mM ATP を含む EMH 液（以後、ATP 液）で灌流して、その効果を調べた。また、その他のヌクレオチドおよび ATP の類似体についても検討した。さらに、MgCl2の代わりに EDTA を含む ATP 液、高濃度の Ca2 ＋を含む ATP 液の効果についても検討した。
アクチンの関与を調べるために、cytochalasin Dを含むEMH液中で収縮胞を単離し、ATP液による灌流を行った。また、収縮胞の大量単離を試みた。A.proteus
3をPercollによる密度勾配遠心（40×10 rpm）を行い、収縮胞を含む細胞片を得た。この細胞をrhodamine-

討した。単離した収縮胞をスライドガラスとカバーガラスの間でさらに押しつぶした。この場合は、ATP添加によって引き起こされた急速な収縮とは異なり、
ゆっくりと内液が出ていくようにして収縮胞が小さくなった。
Acanthamoebaの収縮胞周辺にアクチンやミオシンの局在が報告されている(3)。密度勾配遠心により調製した細胞片をrhodamine-phalloidin染色すると、収縮胞周辺にアクチンが局在していた。これらの結果から収縮胞の収縮にアクチンが関与していることが示唆された。
ATPの類似体であるAMP-PNPはATPaseによって加水分解を起こさないことが知られている。このAMPPNP が 収 縮 胞 の 収 縮 を 起 こ さ な か っ た こ と か ら
ATPaseが関係していることが示唆された。
今後は、微細構造学的研究や大量に単離することによる生化学的研究を行なっていきたい。

phalloidinで染色した。

［文献］［結果と考察］ ATPを含まないEMH液で灌流した場

1. Prusch, R. D. (1970) J. Cell Biol. 46:431-434.

合、収縮胞は収縮しなかった。EMH液灌流後、1 mM

2. Shimmen, T. and MacRobbie, E. A. C. (1987) Plant &ATPを含むEMH液で灌流した結果、すばやい収縮が観察された。単離した収縮胞の6割において収縮がみられた。単離してすぐにATP液で灌流した場合においても6割の収縮胞で収縮した。その他のヌクレオチド

Cell Physiol. 28:1023-1037.
3. Baines, I. C., Corigliano-Murphy, A., and Korn, E. D.
(1995) J Cell Biol. 130:591-603.

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

49

Entamoeba の増殖と分化に及ぼすプロテアソーム阻害剤の効果牧岡朝夫1、熊谷正広1、大友弘士1、小林正規2、竹内 勤2（1慈恵医大・熱帯医学、2慶大・医・熱帯医学・寄生虫学）

Effect of proteasome inhibitors on the growth and differentiation of Entamoeba
Asao MAKIOKA1, Masahiro KUMAGAI1, Hiroshi OHTOMO1, Seiki KOBAYASHI2
and Tsutomu TAKEUCHI2
1( Dept. Trop. Med., Jikei Univ. Sch. Med., 2Dept. Trop. Med. Parasitol., Keio Univ. Sch. Med.)SUMMARY
Protein degradation by ubiquitin-proteasome pathway plays an essential role for a wide variety of cellular processes
in eukaryotic cells. Studies with selective proteasome inhibitors such as lactacystin have demonstrated possible contribution of protein degradation by this pathway in cellular processes. Therefore, we examined whether proteasome inhibitors
affect growth and encystation as well as excystation of Entamoeba. Three proteasome inhibitors, lactacystin, clastolactacystin β-lactone, and MG-132 inhibited E. histolytica growth, with lactacystin being most potent. E. invadens wasmore resistant to these drugs than E. histolytica. Encystation of E. invadens was also inhibited by these inhibitors and wasmore sensitive to the drugs than the growth, with the β-lactone being most potent. The inhibitory effect of lactacystin andthe β-lactone on encystation was slightly or little abrogated by the removal of the drug, respectively. Multinucleation
occurred in E. histolytica trophozoites treated with these drugs, being most marked by lactacystin. Electron microscopy
revealed that treatment of E. histolytica trophozoites with lactacystin led to an increase in the number of cells with many
glycogen granules in the cytoplasm. These inhibitors had no or little effect on the excystation and metacystic developmentof E. invadens. These results show that proteasome function plays an important role for Entamoeba growth and encystation, but has no obvious effect on the excystation and metacystic development.
［目的］プロテアソームはシグナルを提示するユビキ果を示した。E. invadensも増殖が阻害されたが、E.

チンをパートナーとする真核生物のATP依存性プロhistolyticaの場合よりも抵抗性が認められた。E. histo-

テアーゼであり細胞内蛋白質分解において中心的な

lyticaに対するlactacystinの増殖阻害の経過を調べた結役割を果たしている。しかし、Entamoebaの増殖と分化果、1 µMおよび5 µMでは栄養型の細胞分裂が阻害さにおけるプロテアソームの関与に関してはまだ不明

れており、10 µMでは細胞障害的に作用しているこな部分が多い。そこで今回、プロテアソーム阻害剤をとが明らかになった。２）嚢子形成に対する効果：

用いてEntamoebaの増殖、嚢子形成および脱嚢に及ぼ

３種のプロテアソーム阻害剤は阻害効果を示し、そす効果について検討した。

の効果は増殖に対してよりも強く３種のうちβ-［方法］実験にはE. histolyticaとE. invadensを用いたが、E. histolyticaはin vitro嚢子形成系が未確立のため増殖についてのみ調べた。プロテアソーム阻害剤として
lactacystin、β-lactone、MG-132を用いた。嚢子形成は栄養型を嚢子形成液(47%LG)中での３日間の培養により誘導し、脱嚢は得られた嚢子を栄養型培養液(B-I-S-33)に戻すことにより誘導した。

lactoneが最も強い阻害効果を示した。lactacystinとβlactoneにつきこの効果の可逆性を調べた結果、薬剤の除去によりlactacystinの場合にはわずかな回復がみられたが、β-lactoneでは全く回復が認められなかった。３）虫体内の変化：lactacystinで処理したE. histolytica栄養型虫体では核数の増加が認められ、電顕により虫体の細胞質に多数のグリコーゲン粒の蓄積が観察され、グリコーゲン代謝への関与が示唆され［結果及び考察］１）増殖に及ぼす効果：種々の濃た。４）脱嚢に対する効果：in vitroで形成させた嚢度の阻害剤存在下で３日間(E. histolytica)、７日間(E.

子を用い、脱嚢ならびに脱嚢後アメーバ虫体の発育

invadens)培養後の栄養型の虫体数を比較した結果、に対する効果を調べた結果、β-lactoneがわずかな阻３種のプロテアソーム阻害剤は増殖阻害効果を示し害効果を示したがlactacystinとMG-132には阻害効果た。E. histolyticaに対する阻害効果はlactacystinが最もは認められなかった。以上の結果から、Entamoebaの

強く、次にβ-lactone、MG-132は高濃度でのみ阻害効

増殖および嚢子形成へのプロテアソームの関与が明原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

50

らかになったが、脱嚢への関与は低いことが示唆さ

［文献］

れた。

1) Makioka, A. et al. (2002). Parasitol. Res. 88, 454-459.

好酸球によるLeishmania amazonensis 排除機構の解析
渡部嘉哉，古谷正人（高知医科大学附属動物実験施設）

Killing mechanism of Leishmania amazonensis by eosinophils.
Yoshiya WATANABE and Masato FURUYA (Kochi Medical School, Institute for Lab. Animals)
SUMMARY
Leishmaniasis is an important endemic currently affecting 12 million people in 88 countries on 4 continents.
Leishania are intracellular obligate protozoan parasites that infect host macrophages and cause a number of diseases with awide spectrum of clinical features such as cutaneous, visceral and mucocutaneous leishmaniasis. It is reported that thetissue eosinophilia is remarkable in the chronic phase of murine cutaneous leishmaniasis, but a role of eosinophils in thisdisease is unknown. To determine the possible role of eosinophils in Leishmania infection, both interleukin-5 transgenic
mice (IL-5 Tg) with a constant eosinophilia condition and back ground mice (non-Tg) were infected with Leishmania
amazonensis (L.amazonensis). IL-5 Tg mice demonstrated greater resistance than non-Tg mice to L.amazonensis infection.
Furthermore, the killing activity of eosinophils to L.amazonensis was induced by IL-4 and IFN-γ in vitro, and this activity
was specifically inhibited by catalase. It is an accepted theory that protection of mice against Leishmania infection depends
on the ability to generate macrophage-activating Th1 responses resulting in production of IFN-γ. However, we show thateosinophils which induced by Th2 cytokine of IL-5 were effective in controlling L. amazonensis infection and found thathydrogen peroxide produced by eosinophils in response to either IFN-γ or IL-4 effectively killed this protozoan parasites.
［背景と目的］リーシュマニア症は熱帯地方を中心に快な解答が得られていない。好酸球は、顆粒性白血球

世界の88カ国に分布し、1200万人以上の感染者がいるの一つで、喘息やアトピー性皮膚炎等のアレルギー疾1）と推定されており WHO の『当面取り組むべき重要患時に増加することが知られている。そして、アレルな６大疾患』の一つに挙げられている重要な疾患であ

ギー性炎症疾患の中心的なエフェクター細胞でありる。本原虫はベクターであるサシチョウバエの吸血行

生体にとって不利に機能している細胞という認識が動によって、ヒトをはじめとした宿主に経皮的に感染強い。しかしながら、ある種の寄生虫や腫瘍細胞に対し、好中球、マクロファージに貪食される。好中球にしては排除の一翼を担っており、生体防御に機能する

貪食された原虫は速やかに消化されるが、マクロ細胞でもある。本研究はリーシュマニア排除におけるファージ内では増殖する。

好酸球の役割解明を目的として行った。

現在、リーシュマニア排除のメカニズム以下のように考えられている。感染後1型ヘルパーT細胞 (Th1) が活性化することでIFN-γが産生されマクロファージが活性化する。その結果、マクロファージが NO を産生し細胞内の原虫が殺傷される。逆に2型ヘルパーT細胞 (Th2) が活性化すると IL-4 が産生し、IFN-γの産生が抑制され病態が増悪する。
他方、Th2の代表的なサイトカインであるIL-5よって誘導される好酸球がリーシュマニア感染部位周辺へ浸潤していることが古くから報告されている2）。しかしながらこの時の好酸球の役割・機能については明［材料と方法］好酸球増多状態にある IL-5 トランス
ジェニックマウス(IL-5TGマウス)（C3H/HeN-TgN(IL5)Imeg）及び、遺伝的背景であるC3H/HeNマウスの
footpad にLeishmania amazonensis (L.a.) を感染させ、経時的に腫脹を測定するとともに、感染部位の免疫組織化学的解析を行った。また、in vitro で、好酸球に様々な刺激を行い、L.a.に対する傷害活性を検討し、好酸球に由来する抗L.a.活性を引き起こす機能分子の同定を試みた。さらに、本原虫に感受性が非常に高く致死性を示すBALB/cマウスにIL-5を投与することで好酸球増多状態を誘導した。このマウスにL.a.を感染させ、好Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

酸球による治療効果を検討した。
［結果と考察］in vivoで、IL-5TGマウスはC3H/HeN マ
ウスに対して、腫脹を有意に抑制した。また、感染部
位の組織学的解析でも、IL-5TGマウスでは、L.a.の増殖が顕著に抑制され、また原虫周辺への好酸球の浸潤が確認された。in vitro では、好酸球を IL-4、あるいはIFN-

IFN-γ共に増加していた。
現在のところ、Leishmania の排除は、Th1 由来のIFN-γにより活性化したマクロファージが産生する
NO が主に関与していると考えられている。しかし本
結果は、Th2 由来の IL-5 で増殖した好酸球もリーシュ
マニア原虫排除に関与する可能性を示唆している。

γで刺激することにより、好酸球による L.a. 傷害活性［文献］が誘導された。この活性はカタラーゼによって特異的

1. WHO : Leishmania & HIV in gridlock WHO / CTD /に阻害されたことから、中心となるエフェクター分子

51

LEISH, pp. 1-28 (1998)

は H2O2 であると考えられた。さらに、好酸球増多状態

2. Grimaldi G Jr, Soares MJ, Moriearty PL. : Tissue eosi-のBALB/cマウスでも腫脹の抑制が認められ、リー

nophilia and Leishmania mexicana mexicana eosino-

シュマニア症において好酸球が治療手段として利用

phil interactions in murine cutaneous leishmaniasis. :できる可能性を見出した。この時の末梢血中サイトカ

Parasite Immunol. 6(5): 397-408. (1984)

イン量を測定したところ、Th2由来のIL-4、Th1由来の土壌に棲息する繊毛虫は植物病原菌を食べるか？
島野智之1，山初和美1，高橋忠夫2（1東北農研，2西九州大・生物）

Does the soil ciliate eat the plantpathogenic fungi?
S. SHIMANO1, K. YAMAHATSU1 and T. TAKAHASHI2(1 Nat. Agri. Res. Cent. Tohoku, 2 Nishikyusyuu Univ.)
SUMMARY
Colpoda cucullus and Platophrya spumacola were isolated by culture with phytopathogenic fungi, Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans, from soil of a field and a hydroponic culture, respectively. When F. o. cong. was given to theciliates as food, the highest cell density (cells/ml) of C. cucullus (mean ± S.D.) was 1938 ± 226, 3280 ± 113, 1205 ± 186
and 245 ± 25 at 30°C, 25°C, 20°C and 15°C, respectively. On the other hand, the highest cell density of P. spumacolareached 128 ± 36, 3133 ± 324, 4426 ± 746 and 1150 ± 105 at 30°C, 25°C, 20°C and 15°C. These results suggest that theadaptation temperature for C. cucullus is higher than that for P. spumacola. When C. cucullus were given the transformantof phytopathogenic fungus, F. o. cong. as food, fungal fragments expressing GFP were taken in the food vacuole of C.
cucullus. These results suggest that C. cucullus feed on the transformant of phytopathogenic fungus, F. o. cong. We
conclude that the use of the mycophagous ciliate, C. cucullus, and a newly produced transformant would be hopeful toclarify how the mycophagous ciliates control phytopathogenic fungi in the field.
［目的］土壌原生動物相において繊毛虫は重要なメンするために病原糸状菌にマーカー遺伝子を導入し摂バーであることがよく知られているにも関わらず、土

食実験を行った。

壌環境における繊毛虫の役割はまだ未知の部分が多い。一方、アメーバ類においては、土壌伝播性植物病
原体に対する生物学的防除の観点から、食菌性のものが報告されている(Cook & Homma, 1979; Old & Patrick,
1979; Chakraborty and Warcup, 1983)。
本研究では、同様に生物学的防除の観点から、食菌性土壌繊毛虫を選抜するとともに、その菌食能を確認［材料と方法］土壌中および養液栽培中から採取した繊毛虫をふくむと思われる試料から、土壌伝播性であるキャベツ萎黄病菌Fusarium oxysporum f. sp. conglutinansをもちいて、小麦浸出液中で培養を行い、得られた繊毛虫をハンドソーティングで、1個体ずつ培養し、株(stock)の作成を試みた。
このようにして得られた2種

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

52

について、土壌伝染病菌を含む培養液 200ml と共に、 は128±36 (30℃), 3133±324 (25℃), 4426±746 (20℃) ,15℃、20℃、25℃、30℃の各温度条件に維持し、細胞1150±105 (15℃)であった。GFPをマーカーとした病原の数を10日間毎日数えることによって細胞密度を決

糸状菌を小麦浸出液中で、Colpoda cucullusとともに二定し成長率・細胞密度を測定した。次に植物病原菌に、 員培養し、その様子を蛍光顕微鏡下において観察した
GFP (Green Fluorescent Protein) 遺伝子を導入し、そのところ、繊毛虫の細胞内から未消化のGFPを発現する導入した遺伝子の発現性が高く、発病能をよく維持し植物病原菌が確認されたことにより、繊毛虫が植物病ている株を得た。選抜された繊毛虫と得られた病原糸原糸状菌を摂食していることが示唆された。また、こ状菌の双方を蛍光顕微鏡下において、摂食試験に供しの形質転換糸状菌を用いることによって、菌食繊毛虫

た。

との相互作用がより明確に解析できることが期待さ［結果と考察］土壌中および養液栽培中おのおのかられる。

得られた繊毛虫株は、細部形態の特徴によりColpoda［文献］

cucullus およびPlatophrya spumacolaと同定された。いChakraborty, S. and Warcup, J. (1983) Soil Biol. Biochem.

ずれも、F.o.cong.のみを繊毛虫に与えてもよく成長し

15: 181-185.

た。成長率からみたC. cucullusの増殖至適温度条件はCook, R. and Homma, Y. (1979) Phytopathology, 69: 914.

30℃であり，最高細胞密度 (cells/ml) は (mean±S.D)

Old, K. and Patrick, Z. 1979. Giant soil amoebae: potential

1938±226 (30℃), 3280±113 (25℃), 1205±186 (20℃),

biocontrol agents. Soil-borne Plant Pathogens. Aca-

245±25 (15℃)であった。一方P. spumacolaの成長率か

demic Press, London. 617-628. pp.

らみた増殖至適温度条件は25℃であり、最高細胞密度

繊毛虫相を指標とした白川水系の水質調査
後藤紀子1，松坂理夫2（1熊本大・自然科学・自然システム，2熊本大・理・環境理学）

Survey for the water quality of the Shirakawa River using ciliate community
Noriko GOTO1 and Tadao MATSUSAKA2( Syst. Nat. Env., Grad. Sch. Sci. Technol., 2Dept. Env. Sci., Fac. Sci., Kumamoto Univ.)
1

SUMMARY
Many investigators have described that freshwater ciliate community structure reflects the water quality, stressing its
effectiveness of biological evaluation of watercourses. We clearly demonstrated that the water quality is well correlatedwith the total numbers of ciliates and with the percentage based on the numbers classified by their feeding preferences(Nagata, N. et al. (2002) Jpn. J. Protozool. 35, 48). Since our and most of other reports were performed on the wide rangeof pollution levels, the present study examines if the ciliate community structure could be a bioindicator even among thestations of similar pollution levels in a single river. Samplings were done at monthly intervals from January to October
2002 at 8 stations from the upper to lower streams of the Shirakawa River, Kumamoto Pref. Ciliate species were categorized by their feeding preferences; bacteriovore, omnivore, and carnivore. Pollution was determined by bacterial counts
and by several physico-chemical parameters (temperature, pH, DO, COD, total nitrogen, NO3--N, NH4+-N, total phosphorus, PO4--P and alkyl benzene sulphonate). Total numbers of ciliates reflected well positively with the pollution levels.
Although clear correlations between pollution and species numbers, or the percentages based on the numbers categorized
as above were not found, the percentage of bacteriovorous species correlated well positively with the pollution and thepercentage of omnivorous species well correlated negatively.
［目的］淡水の繊毛虫相は水質を反映しており、生物に繊毛虫個体数や食性別個体数％と、汚染度の相関が指標としての有用性に関する研究がなされている。特明らかになっている１）。１つの河川水系内、また汚染Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

53の比較的低い範囲にある地点間でも同じように有用

繊毛虫の個体数、種数、食性別個体数％、食性別種な生物指標となりうるか否かを明らかにすることを数％と、物理・化学的分析結果を比較すると、これま目的とした。

での研究で明らかにされてきたように、個体数と水質［方法］熊本県内を流れる白川水系の上流域（湧水地付近）から下流域（河口付近）にかけての8地点で、2002
年1月から10月までの10ヶ月間、月１回の間隔で繊毛虫相の調査と水質の物理・化学的分析を行った。繊毛虫相の調査としては、プラスチックチューブで河川の底のほうから採水し、100 ml中の繊毛虫の種数と個体数を算出した。種の同定は、微分干渉顕微鏡による生体観察と、プロタルゴール染色を施した標本観察によって行った。またこれらの繊毛虫をFoissner & Bergerの食性による分類2)に従って、肉食性、雑食性、細菌食性の３グループに分類した。ただし、細菌食性に分類されている繊毛虫の中で、培養過程でChlorogoniumを食べると判断された種については、雑食性に分類しなおした。
水質の物理・化学的分析としては、水温、pH、溶存
酸素（DO）、全窒素、硝酸性窒素、アンモニア性窒素、
全リン、リン酸、陰イオン界面活性剤、化学的酸素消費量（COD）を測定し、一般細菌数も測定した。
［結果及び考察］物理・化学的分析結果を見てみると、予想されるように一貫して下流にいくほど、汚染度が上昇した。しかし、上流においても汚染度が高い地点があった。これは、その付近に畑や水田が存在するために起こる肥料の影響や、温泉街による汚染のためで汚染度に正の相関が見られた。種数と汚染度の間には強い相関は認められなかった。Nagata et al. (2002) １）の研究で、汚染度との相関が見られた食性別個体数％
は、本研究では強い相関が見られなかった。これは、Nagata et al. (2002) １）の研究で明らかになったように、
本研究では比較的汚染度の低い水域を調査地点としているため、雑食性繊毛虫個体数％がどの地点でも高くなっており、比較にならなかったためであると考えられる。そこで、汚染度と食性別種数％で比較を行った。その結果、雑食性種数％と汚染度に負の相関がみられ、細菌食性種数％と汚染度に正の相関が見られた。
以上の繊毛虫相と物理・化学的分析の比較の結果か
ら、１つの河川水系で、かつ比較的汚染度の低い範囲にある地点間においても、繊毛虫相は有用な生物指標となりうることが明らかとなった。特に、繊毛虫個体
数は汚染度の高低に関わらず、一貫して汚染度と正の相関があることが明らかとなり、有用で簡便な水質指標として用いることができることが示唆された。
［文献］
1) Nagata, N. et al. (2002) Jpn. J. Protozool. 35, 48.
2) Foissner, W. & Berger, H. (1966) Freshwater Biol., 35,
375-482.

あると考えた。

シロアリ類共生鞭毛虫の群集組成についての多変量解析
北出理（茨城大・理）Multivaliate analysis on symbiotic flagellate community of termites
Osamu KITADE (Fac. Sci., Ibaraki Univ.)
SUMMARY
Most of the termite families and a xylophagous cockroach genus Cryptocercus possess symbiotic flagellate community in their hindguts. The symbiotic flagellates belong to orders Trichononadida, Hypermastigida and Oxymonadida
and most of them have mutualistic relationship with their hosts through cellulose degradation. Usually, the symbiont
composition is host-species specific and is expected to reflect host phylogeny. In this study, similarity of the symbiotic
flagellate community was analyzed to describe its property and evaluate the effect of host phylogeny. The flagellatecomposition data were extracted from a checklist by Yamin (1979) and some descriptive papers, and through field investigation. A total of 81 flagellate genera have been reported from 38 host genera. Results of cluster analysis based on the

54

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

similarity of symbiont generic composition (similarity index: 1-r, clustering: UPGMA) indicated that the host genera in
Rhinotermitidae and Kalotermitidae formed almost exclusive clusters. Serriterimitidae was included in the cluster ofRhinotermitidae. Cryptocercus and Mastotermitidae had characteristic symbiont composition. Results of Hayashi's
quantification type III was almost the same as that of the cluster analysis, which corresponded to the tentative phylogeny ofhosts inferred from mitochondrial gene sequences.
［目的］シロアリ目７科中６科を含む「下等シロアリ」 ［結果と考察］分析対象にした7科38属の宿主から81のグループは消化管内に鞭毛虫を多数共生させてい（亜）属の鞭毛虫が見出されていることが明らかにる。ゴキブリ目キゴキブリ科に属する食材性のキゴキなった。うち39属は1属の宿主のみに特異的に見出さブリ属 Cryptocercus spp. もシロアリと同様な共生鞭毛れている。最も多くの宿主属から見出されている鞭毛虫を消化管内に保有する。これらは超鞭毛虫目、トリ虫の属は超鞭毛虫目のTrichonympha 属であり、17属のコモナス目およびオキシモナス目に属する嫌気性鞭宿主から見出された。

毛虫であり、かなりの種が摂食した木材の分解を通して宿主と相利共生関係にあると考えられている。

クラスター分析の結果、レイビシロアリ科とミゾガ
シラシロアリ科では、わずかな例外を除いて同じ科にシロアリ類は1種の宿主が複数種の原生生物を消化属する宿主属が固まってクラスタリングされる結果管内に保有し、その組成はシロアリの種に特異的であとなった。ノコギリシロアリ科はミゾガシラシロアリ

る。新生虫には巣内の他個体の保有する鞭毛虫が糞食科のクラスターに完全に含まれた。この結果は現在のを通じて感染し、また有翅繁殖虫が新たに創設した巣

シロアリ類に想定されている系統関係と整合性を持

は母巣の組成を受け継ぐ。このため原生生物組成にはち、宿主系統が組成に強く影響していることがが示唆

宿主の系統関係が強く反映されている可能性がある。 される。数量化３類による解析結果からも特にレイビ
本報告ではシロアリ類の保有する原生生物の群集組

シロアリ科について同様な結果が得られた。キゴキブ

成の類似性を解析することにより、その特性と宿主系

リ科やムカシシロアリ科の原生生物組成は特殊であ統の影響を考察することを試みた。

り、オオシロアリ科の諸属は多様な原生生物組成を［材料と方法］分析にはYamin(1979) のシロアリと共生鞭毛虫のチェックリスト、それ以降に発表された記載論文等のデータ、および自ら野外調査により確認した原生生物の組成データを用いた。まず、１）各属の宿主がどの属の鞭毛虫を保有するかについてまとめ、
２）各属の宿主の保有する鞭毛虫の属組成の類似性にもとづいて、宿主属のクラスター分析を行った。類似持っていたが、これはこれらの科あるいは属レベルに対応するような系統の分岐が古い時期に起こったことと対応していると考えられる。一方でミゾガシラシ
ロアリ科のヤマトシロアリ属Reticulitermesやレイビ
シロアリ科のParaneotermes属など特殊な組成をもつ
宿主属は原生生物の水平感染の影響を強く受けている可能性がある。

度の指標には1-ｒ（相関係数）とJaccardの係数を用い、 ［文献］
クラスタリングはUPGMAにより行った。また３）各鞭毛虫の属の有無にもとづいて宿主属の数量化３類による分析を行った。

Yamin, M. A. (1978) Sociobiology. 4, 1-119.

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

55

繊毛虫Blepharisma japonicumのもつ色素の生物活性 ―ミトコンドリア毒性―
寺嶋昌代1，春本晃江2，田辺裕美子3，河合 清3（ 東海女子短大，2奈良女子大・理・生物，3中京女子大・健康科学）
1

Bioactivity of pigment of ciliate Blepharisma japonicum – mitochondria toxicity –Masayo TERAZIMA1, Terue HARUMOTO2, Yumiko TANABE3 and Kiyoshi KAWAI3( Tokai Women’s Junior College, 2Dep. Biol., Fac. Sci., Nara Women’s Univ., 3 Fac. Wellness,
Chukyo Women's Univ.)
1

SUMMARY
Blepharismin markedly suppressed the oxygen uptake of a protozoan Tetrahymena thermophilia, suggesting theimpairing effect on the respiratory system of the Tetrahymena mitochondria. The effects of blepharismin on the
mitochondrial reactions have been therefore investigated by means of isolated rat liver mitochondria andsubmitochondrial particles (SMP), which are the reverted membrane vesicles of the inner membranes, to gain insight into
the molecular mechanism of the toxicity. Because the isolation procedure of rat liver mitochondria is now wellestablished and the mechanism of respiratory system is elucidated in detail. Blepharismin exhibited a weak uncoupling
and inhibitory effects on the NAD-linked respiration oxidizing L-glutamate and exerted the uncoupling effect on
succinate-linked respiration. NADH oxidase of SMP was not interfered by blepharismin, indicating that blepharismin
inhibits the NAD-linked respiration by disturbing ion translocation systems of mitochondrial inner membrane.
Blepharismin induced a swift swelling of mitochondria suspended in the isotonic solutions of alkali metal chlorides,
indicating the induction of the ion permeability transition of the inner membrane. These results suggest that
blepharismin may interfere mitochondrial reactions in Tetrahymena by the similar mode of reactions as those to rat liver
mitochondria, though the detailed mechanism is not available at present.
［目的］繊毛虫Blepharisma japonicumの赤色色素ブレ
ファリズミンは毒性と光毒性をもち１）、捕食性原生動物の捕食に対する防御機能があることがわかっているが２）、毒性の作用機構はまだよくわかっていない。
本研究では、ブレファリズミンの毒性の作用機構を調べる目的で、単離ラット肝ミトコンドリアの呼吸系ならびにイオン透過性に対する影響を調べた。

定した。
［結果及び考察］ブレファリズミンの添加により、ミトコンドリアのstate4呼吸が若干加速されたが、ADP
添加後のstate3呼吸は強く抑制された。State4呼吸の加速がわずかであるのは、呼吸抑制作用により、除共役
作用がマスクされた結果と考えられる。ブレファリズ
ミンの呼吸抑制作用は、ミトコンドリアの構造を破壊［方法］色素の精製：ブレファリズミンはBlepharisma

して得られた亜ミトコンドリア粒子では再現されな

japonicum (R1072株)より得た色素を薄層クロマトグラ

いことから、電子伝達鎖の直接の阻害によるものでは

フィ−で精製したものを用いた。

なく、呼吸基質を含めたイオン透過性への阻害作用でミトコンドリアの調整：Wistar系白色ラットの肝臓をあると考えられる。ヒペリシンについても、ブレファ

冷ショ糖等張液 (pH7.4) で洗浄した後、ホモジナイズ

リズミンとの比較のため、同様の実験を行った。ヒペし、遠心分離法によりミトコンドリア画分を得、少量リシンの添加によるstate4呼吸の開放は見られず、呼の冷ショ糖等張液に懸濁したものを用いた。

吸の抑制作用のみが見られた。ヒペリシンもブレファミトコンドリア呼吸活性測定法：ミトコンドリアの呼リズミンと同様にstate3呼吸を抑制し、ADP添加によ

吸活性は、Galvani型酸素電極を用いて測定した３）。ミるstate3呼吸は再現されなかった。等張LiCl, NaCl, KCl,

トコンドリアのタンパク量は、BSAを標準タンパク質

RbCl溶液にミトコンドリアを懸濁させ、ブレファリズ

としてコール酸存在下に280nm吸光度を測定するこミンを作用させて経時的に吸光度 (700nm)の変化を測とにより定量した。ミトコンドリアは膨潤化により内定したところ、吸光度の急速な低下が観測された。膨膜のクリステが消失し、懸濁液の光透過性が高まる。 潤化の速度にイオンによる顕著な差が見られないこ
この現象を利用して、ブレファリズミンによるミトコとから、ブレファリズミンにより、ミトコンドリア内

ンドリアの膨潤化を吸光度の低下により経時的に測膜の電位が瞬時に消失したことが示唆された。

56

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

本実験の結果、ブレファリズミンがミトコンドリア
毒性を有することが明らかになった。ミトコンドリア
毒性のみが本物質の毒性メカニズムか否かは明確で［文献］
1) Terazima, M. N. and Iio, H. and Harumoto, T. (1999)
Photochem. Photobiol. 69, 47-54.

はないが、本実験結果はブレファリズミンがミトコン

2) Harumoto, T., Miyake, A., Ishikawa, N., Sugibayashi,

ドリアを含めた生体膜系の膜電位変化をもたらすこ

R., Zenfuku, K. and Iio, H. (1998) Europ. J. Protistol. 34,とを示唆しており、今後さらに詳細に検討していきた

458-470.
3) 河合清 (1991) 毒性試験講座、毒性生化学＜上＞、い。

地人書館、p96-101.

繊毛虫テトラヒメナ（Tetrahymena thermophila）における新規クエン酸シンターゼ（citrate synthase）遺伝子の単離：Lateral Gene Transfer の検証
向 敦史（金沢大学・理・生物）

A novel citrate synthase gene in Tetrahymena thermophila:
Evidence for lateral gene transfer
Atsushi MUKAI (Dept. Biol., Fac. Sci., Kanazawa Univ.)
SUMMARY
Citrate synthase in Tetrahymena thermophila is known to catalyze the initial reaction of TCA cycle in mitochondria,
while forms 14-nm filament in cytosol. In this study, a new citrate synthase gene homolog (CSH) was identified. Characterization of the CSH revealed the following characteristics: 1) The cloned fragment contains 3’ region of ORF and 3’
UTR; 2) ORF is interrupted by a 52-bp intron; 3) TAA is used for glutamine, indicating ciliate-specific codon usage; and 4)
The CSH is constitutively expressed in vegetative phase and conjugation. Based on the molecular phylogeny of citratesynthase genes, I provide evidence for lateral gene transfer of Tetrahymena CSH. Surprisingly, Tetrahymena CSH wasfound to be closely related to citrate synthase genes of green sulfur bacteria and somewhat to alpha-proteobacteria, but not
related to mitochondria-type genes. The clade including Tetrahymena CSH additionally contains a few sequences from
cellular slime mold and two plants, suggesting that CSH may be used in glyoxylate cycle. In addition, Southern blot
analysis showed the absence of the corresponding gene in other relatives of ciliates such as Blepharisma japonicum, Colpoda inflata and Paramecium tetraurelia. These results suggest that Tetrahymena CSH might have directly derived fromgreen sulfur bacteria by lateral gene transfer after Tetrahymena diverged from other ciliate lineage.
［目的］クエン酸シンターゼ(citrate synthase)はミトコとの相同性が高かった。この遺伝子がテトラヒメナ特

ンドリアのクエン酸回路において、アセチルCoA とオ有のものなのか、繊毛虫共通にもつものなのかを明ら

キサロ酢酸を縮合させクエン酸とCoA を生成する反かにし、その由来を推定する。

応を触媒する。テトラヒメナにおけるこの酵素は14nm Filament protein として以前に報告されている（1）。
一方、多くの細菌と植物にはグリオキシル酸回路（glyoxylate cycle）（2）があり、酢酸を利用し生育できる。この回路ではミトコンドリアのものとは異なる
タ イ プ の ク エ ン 酸 シ ン タ ー ゼ（glyoxysomal citratesynthase）が働いている。 今回、繊毛虫テトラヒメナから得られたクエン酸シンターゼの DNA 断片 (CSH:［材 料 と 方 法］Tetrahymena thermophila 株 CU428,
CU813 ( kindly provided by P. J. Bruns )を用いた。PCR,
RT-PCR, Southern blot 等の分子生物学的実験は Morecular Cloning ( Cold spring harbor laboratory press )、バイ
オ実験イラストレイテッド（秀潤社）等を参照した。
系 統 樹 はClustalW(Neighbor-joining),

Phylip(parsimony)、をもちいて作成した。

Citrate synthase homologue ) は、動物や原生動物、菌類［結果と考察］今回得られたPCR断片(CSH)は 細胞性のものとの相同性が低く、細菌のクエン酸シンターゼ

粘菌（Dictyostelium）や、二種の植物の glyoxysomalJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

citrate synthase を除けば、バクテリアのクエン酸シン

57

ターゼと高い相同性が見られた。対照的に、テトラヒ(Blepharisma japonicum, Paramecium tetraurelia, Colpoda inflata）では、シグナルは検出されなかった。こメナで見つかっている 14nm-filament protein をはじめのことから、今回得られたクローン(CSH)は繊毛虫のとする真核生物の mitchondrial citrate synthase とは低中ではテトラヒメナに特異的な遺伝子であると考え

い相同性しか見られなかった。このORFに繊毛虫特異られる。また、バクテリアとの相同性がもっとも高い的な[TAA]をグルタミンとして使用している箇所があことから、この遺伝子は、テトラヒメナが他の繊毛虫り、また使用されるコドンの頻度もテトラヒメナの他と分岐した後に、ある種の緑色硫黄細菌から水平的にの遺伝子の頻度と一致した（3）。さらに、半定量的RT-

移行（Lateral gene transfer）（4, 5）してきた可能性が

PCRやNorthern blot により、CSH の発現解析を行った示唆される。

ところ、この遺伝子がどの Stage でも発現していることが確認された。
このCSHと他のクエン酸シンターゼとの関係を調べるために Neighbor-joiningと Parsimonyの二つの方法
で系統樹解析をおこなった。その結果、CSH は緑色硫
黄細菌やProteobacteria などと単系統になり、動物や菌類、原生動物のクエン酸シンターゼとは全く異なるク
レードに位置した。
一方、 Southern blot により、CSHがテトラヒメナ由来であるこ とが確認でき た。しかし、細胞性粘菌（Dictyostelium discoideum）でシグナルが検出できる［文献］
1) Osamu Numata (1996) Int. Rev.Cytol. 104, 1-35.
2) A. Kato, M. Hayashi, H. Mori and M. Nishimura (1995)
Plant. Mol. Biol. 27, 377-390.
3) Wuitschick J. D, Karrer K. M. (1999) J. Eukaryot. Microbiol. 46(3):239-47.
4) W. Ford Doolittle (1998) Trends in Genet, 14(8), 307309.
5) R. M. Figge, M. Schubert, H. Brinkmann and R. Cerff(1999) Mol. Biol. Evol, 16(4): 429-440.

実 験 条 件 で あ る に も 関 わ ら ず、他 の 繊 毛 虫

hsp70遺伝子を分子指標としたParamecium caudatumのsyngenの解析
堀 学，富川 泉, 藤島政博（山口大・理・生物）

Molecular phylogenetic analysis of syngens of Paramecium caudatum
based on cytosolic hsp70 sequences
Manabu HORI, Izumi TOMIKAWA and Masahiro FUJISHIMA(Biol. Inst., Fac. of Sci., Yamaguchi Univ.)
SUMMARY
Morphological species P. caudatum comprise several syngens that can be distinguished by their mating reaction.
However, attempts to classify them by isozyme analyses and RFLP analyses have not succeeded yet. The aim of thepresent study was to classify syngens of P. caudatum using the cytosolic hsp70 gene as a molecular phylogenetic marker.
Previously, we demonstrated that a phylogenetic tree of the genus Paramecium can be reliably constructed based on thecytosolic hsp70 gene. In the present study, sequences of 428 bases of the cytosolic hsp70 molecule from 32 strains of 6
syngens in P. caudatum were isolated by the polymerase chain reaction. A Paramecium phylogenetic tree was constructed
for each set of sequences using the MOLPHY program package on the basis of maximum likelihood. The resultant tree
had two clusters of P. caudatum, implying that P. caudatum has two cytosolic hsp70 genes. Within either cluster, however,
the relationships between the syngens were not clear.
［目的］Paramecium属は、形態的特徴や大小核の形やら、各々の種の系統的な位置関係を調べるとともに、数、繊毛列、口部装置の位置などで分類されているが、 種を明確に判別できる指標が必要とされている。
形態的に差異のない遺伝的種も、多数存在することか

一昨年、cytosol型hsp70遺伝子を分子指標として、遺原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

58

伝的種であるaurelia species complexを分類できること

caudatumにも、2つのタイプのcytosol型hsp70が存在しを示した (Hori et al. 2001)。P. caudatumのsyngenは、たことから、高等生物との中間に位置することがが示

aurelia species complexよりも進化距離が短く、凝集反唆される。

応以外で区別する方法がないことから、今回、cytosol

これらの塩基配列をもとにした最尤系統樹では、P.

型hsp70遺伝子を分子指標として、syngen間の関係を

caudatumは、type1, type2の２つのクラスターを形成し調べることを試みた。
［材料と方法］P. caudatumの6つのsyngenに属する33系統の細胞を用いた。cytosol型hsp70遺伝子をPCRで増幅するために、P. caudatum SE2株で得られた塩基配列をもとに、primerを作成し、428bpの断片を増幅した。
templateは、細胞をドリル液で洗浄後、そのまま、PCR
tubeに加えて、95℃で10分加熱したものを用いた。得られたcytosol型 hsp70遺伝子の断片は、pGEM-T easy
vectorにクローニングし、塩基配列を決定した。分子系
統樹の作成には、既知のaurelia group, bursaria groupのcytosol型hsp 70遺伝子をoutgroupとして、最尤法による分子系統樹推定プログラムMOLPHYを用いた。
［結果と考察］今回用いたP. caudatum のすべての株において、428bpのPCR産物が得られた。それらの塩基配列をアライメントしたところ、２つのタイプに分類できることがわかった。これまで、原生生物などの下等と呼ばれる生物では、ER型やmitochondria型hsp70
は、複数のタイプが存在し、cytosol型hsp70は、1つのた。しかし、それぞれのクラスター内部でsyngen間の差異を反映する分岐はなかった。これまで、syngenを分類するために、アイソザイムパターン (Agatsuma etal. 1980)やmtDNAのRFLP解析(Tsukii 1994)が行われてきたが、syngen間の差異よりも、生息地の差異を反映する結果が得られている。しかし、今回の系統樹では、生息地の差異を示す分岐も見られなかった。
outgroupとして用いた遺伝的種であるaurelia speciesと比べて、P. caudatumのsyngenは、進化距離が極端に短く、P. caudatumのsyngen間の関係を明らかにするためには、接合型物質をコードする遺伝子を分子指標とした分子系統樹を作成する必要があると考えられる。
［文献］
Hori, M., Tomikawa, I. and Fujishima, M. (2001) Jpn. J.
Protozool. 34, 21.
Agatsuma, T. and Tsukii, Y. (1980) Biochem. Genet. 18,
77-85.
Tsukii, Y. (1994) Jpn. J. Genet. 69, 307-319.

タイプしか存在しないと考えられていた。しかし、P.

ゾウリムシ大核内共生細菌Holospora obtusaの感染型特異的タンパク質の抗体の作製と遺伝子のクローニング
道羅英夫1，櫻井英巳2（1静岡大・遺伝子実験施設，2静岡大・理工・生物地球環境科学）

Antibody to a protein specific for the infectious form of Holospora obtusa of theciliate Paramecium caudatum.
Hideo DOHRA1 and Hidemi SAKURAI2( Inst. for Genet. Res & Biotech., 2Grad. School of Sci. & Engin., Shizuoka Univ.)
1

SUMMARY
We detected a 63-kDa protein (MW 63 kDa, pI 8.9) specific for the infectious form of H. obtusa, a macronuclear
endosymbiont of the ciliate P. caudatum by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using the immobilized pH
gradient system. We developed anti-63-kDa protein antiserum by injecting the purified protein into a mouse. Immunoblotting with the antiserum showed that the 63-kDa protein is present only in the infectious form of H. obtusa, but notin the reproductive form. Indirect immuno-fluorescent microscopy with anti-63-kDa protein antiserum showed that theprotein localized in the recognition tip of the infectious form of H. obtusa, suggesting that the protein was involved in theinfection process of H. obtusa. Cloning and sequencing of the gene encoding for the 63-kDa protein showed that the geneJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

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encoded a protein composed of 523 amino acids, and the polypeptide is preceded by a putative signal peptide of 14 aminoacids, which was involved in the transport of the 63-kDa protein from cytoplasm to periplasm. The function of the 63-kDa
protein during the infection process of H. obtusa is not clear yet, because the 63-kDa protein did not show any domains andamino acid similarity with any known proteins.
［目的］ゾウリムシParamecium caudatumの大核内共［結果と考察］H. obtusaの感染型に特異的な分子量約

生細菌Holospora obtusaは宿主の食胞に取り込まれた

63 kDa、pI 8.9のタンパク質に対する抗血清を作製し、後、細胞質に脱出し、大核核膜を貫通して核内に侵入

H. obtusaの間接蛍光抗体法を行った結果、63 kDaタン

することによって宿主大核内に感染する。しかしなが

パク質は感染型のRecognition tipに局在していること

ら、このH. obtusaの初期感染過程に関わるタンパク質が明らかになった。この結果はこの63 kDaタンパク質はほとんど見つかっておらず、感染の分子機構はほとがH.obtusaの宿主大核への感染に関与している可能性

んど明らかになっていない。そこで、本研究ではH.

を示唆している。この抗血清を用いたイムノブロット

obtusaの感染型に特異的に存在する感染に関わるタン

では、感染型で63 kDaのバンドと少し低分子のバンド

パク質の探索を目的として研究を行った。従来よく行（約55 kDa）が検出された。この低分子のバンドが分われてきたO’Farrellの２次元電気泳動は中性付近のpI解産物であるのか、同じ抗原決定基を持つタンパク質をもつタンパク質の分離には適しているが、塩基性タであるのかはまだ不明である。間接蛍光抗体法でもインパク質の分離には適さない。そこで、アマシャムバ

ムノブロットでも増殖型には63 kDaタンパク質は検イオサイエンスのImmobilized pH gradient (IPG) dry

出されなかった。63 kDaタンパク質をコードしている

strip (pI 3-10) を用いた２次元電気泳動を行い、塩基性遺伝子の全塩基配列を決定した結果、この遺伝子はタンパク質に注目して感染型と増殖型のタンパク質

547個のアミノ酸をコードしていることが明らかに組成を比較した。その結果、塩基性側にいくつかの感なった。しかしながら、63 kDaタンパク質のN末端のア染型特異的タンパク質が検出され、その中から分子量

ミノ酸配列から、63 kDaタンパク質は15番目のアミノ

約63kDa、pI 8.9のタンパク質を選択し、抗体の作製、 酸から始まり、523個のアミノ酸から成るタンパク質
遺伝子のクローニングを行った。
［材料と方法］H. obtusaの感染型と増殖型のタンパク質組成をIPG dry strip (pI 3-10) を用いた２次元電気泳動により比較し、塩基性の感染型特異的タンパク質の中から分子量約63 kDa、pI 8.9のタンパク質を選択した。このスポットを切り出し、ゲルごとホモジナイズ
してマウスを感作し、抗63 kDaタンパク質抗血清を得た。この抗血清を一次抗体、Alexa-Fluor 488でラベルした抗マウスIgGを二次抗体として感染型と増殖型の間接蛍光抗体法を行い、63 kDaタンパク質の細胞内局在性を調べた。また、63 kDaタンパク質のN末端とV8プ
ロテアーゼを用いたクリーブランド法によって得らであることが示唆された。１〜14番目のアミノ酸は63kDaタンパク質がペリプラズムに輸送されるためのシ
グナルペプチドであると考えられる。すなわち、63kDaタンパク質の計算上の分子量は62.2 kDa、pI 8.92となり、二次元電気泳動から推測された値とほぼ一致した。63 kDaタンパク質のアミノ酸配列をBLASTにより相同性とドメインの検索を行ったが、相同性のある既知のタンパク質やドメインは見つからなかった。今後はまず大腸菌内で組換えタンパク質を発現させ、これに対する抗体を作製するとともに、大腸菌内での局在性や機能を調べることによって、63 kDaタンパク質の機能解析を行っていく予定である。

れたフラグメントのアミノ酸配列から混合配列プラ［文献］

イマーを作製し、PCRによってその遺伝子の一部を増Fujishima, M., Nagahara, K. and Kojima, Y. (1990)

幅し、塩基配列を決定した。この配列からさらにプラ

Changes in morphology, buoyant density and protein

イマーを作製し、PCRによって上流と下流の領域を増

composition in differentiation from the reproductive

幅し、63 kDaタンパク質をコードしている遺伝子の全

short form to the infectious long form of Holospora

塩基配列を決定した。

obtusa, a macronucleus-specific symbiont of the ciliate
Paramecium caudatum. Zool. Sci. 7, 849-860.

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

60

スパズモネームのヒスチジン残基の特異的修飾
方 杰1，張 蓓2，浅井 博1 （1早稲田大学・理工，2南開大学）

Chemical modification of histidine residues in spasmoneme
1

Jie FANG , Bei ZHANG2 and Hiroshi ASAI1 (1Waseda University, 2Nankai University, China)
SUMMARY
Glycerinated stalk of Vorticella can repeat contraction/extension cycle many times by the addition/removal of Ca2+.
In order to identify the essential amino acid residues for spasmoneme contraction, glycerinated spasmoneme in the stalk
was modified with diethl-pyrocarbonate (DEPC). We observed that the inhibition of spasmoneme contractility degree wasdependent on DEPC concentration and modification time at 0°C and pH6.0. Hydroxylamine treatment the modified spasmoneme can partially restore the contractility degree. Ca2+ provides almost complete protection against inhibition andmodification. Those suggested histidine residue was critical for spasmoneme contraction.
［目的］ツリガネムシのスパズモネームは機械刺激にしかし、 pH 6.0時に、他のヒスチジン残基修飾試薬と反応して収縮する。その収縮においてCa2+結合タンパ

比べて、DEPCは高い反応性をもち、特異的に修飾がでク質（スパズミン）が重要な役割をしている。過去のきる［2-3］。リン酸緩衝液（pH 6.0）中でスパズモネー

スパズモネーム研究においては、主としてスパズミン

ムをDEPCで修飾したとき、DEPC濃度が高くなるにつのみが注目され、研究されてきた。近年になって、約れてスパズモネームの収縮度が減少するという変化

50 kDaのタンパク質や約200 kDaのタンパク質が当研を示した。次にスパズモネームの収縮度とDEPC濃度

究室で発見された。スパズモネームを構成し、収縮性と処理時間との関係の結果は，スパズモネームの収縮に関係するタンパク質は、他にないと考えられる。ア

度がDEPC濃度と処理時間とに依存していることを示

ミノ酸残基特異的な化学修飾はスパズモネームの収した。この変化とともに、DEPC濃度が高くなるにつれ

縮メカ二ズム解明のために有用な方法である。一般的て244 nm吸収スペクトルが増大する。逆に4 mM DEPCに、ヒスチジン残基は多くの酵素の触媒機能に関与すで修飾されたスパズモネームを300 mM hydroxylamineる。そこで本研究では、ヒスチジン残基がスパズモで処理した場合、スパズモネームの収縮度が修復されネームの収縮運動に重要であるかどうか、特異的化学

吸収スパクトルも減少する。そして、ヒスチジンがス修飾によって検証した。

パズモネームの収縮運動に重要なアミノ酸であるこ［材料と方法］Vorticellasp.を中国の天津市紀庄子

下水処理所から採取し、十分に洗浄したのち、レタス
ジュースで培養を行った。その後、培養したVorticellasp.はグリセリン処理し、DEPC溶液（0-5 mM DEPC，
4 mM EGTA, 0.1 M KCl, and 20 mM sodium phosphate,
pH 6.0）でヒスチジン残基特異的化学修飾する。同時にzooidを取り除いたVorticellaのストークから6 M塩酸グアニジンによってスパズモネームのタンパク質を抽出する。抽出方法は浅井らの論文を参考にした［1］。

とを確認するため、我々はCa2+ で予め処理してからDEPC修飾する実験も行った。Ca2+ で処理してからDEPC修飾するとスパズモネームの収縮度が減少しにくくなる。
以上の結果、ヒスチジンがスパズモネームの収縮に重要なアミノ酸であることが証明された。しかもDEPCで修飾されたヒスチジン残基をDEPCで処理す
ると、スパズモネームはその収縮性を可逆的に回復することも分かった。ところで、スパズミンはスパズモ
ネームの主要なタンパク質であって、EFハンド構造を持つCa2+結合タンパク質である。ヒスチジン残基はス

修飾後の平均コイル数

パズミンのアミノ酸配列内には含まれているが、一般

収縮度 = ——————————— × 100%
修飾前の平均コイル数

的にスパズミンを含めCa2+結合タンパク質のEFハンド(Ca2+結合サイト)の保存領域内にない。しかし、ヒス
チジン残基がスパズモネームの収縮に重要なアミノ［結果と考察］タンパク質中のヒスチジン残基に対し酸であるという本研究の結果から、収縮でのタンパクて、完全な特異性をもつ修飾試薬は知られていない。 質構造変化においてヒスチジン残基を重要な部位にJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

61

持つスパズミン以外のタンパク質の存在が示唆され［文献］る。特に最近注目されている50 kDaと200 kDaタンパ[1] K. Yamada, H.Asai, J. Biochem. 91 (1992) 1187-1195.

ク質のヒスチジン残基、これらタンパク質のスパズモ[2] J. Cousineau, E. Meighen, Biochemistry 15(23) (1976)

ネームの収縮における役割を解析することが今後重要になった。

4992-5000.
[3] S. Ding, Y. Li, L. Zhu, Biochim. Biophys. Acta. 1594(1)(2002) 100-108.

太陽虫Raphidiophrys contractilisにおける細胞外Ca2+と外部刺激によって引き起こされる軸足収縮の観察と微細構造解析
Khan, S. M. Mostafa Kamal, 洲崎敏伸（神戸大・理・生物）

Axopodial contraction evoked by extracellular Ca2+ and external stimuli,
and ultrastructural observation in the heliozoon Raphidiophrys contractilis
S. M. Mostafa Kamal KHAN, and Toshinobu SUZAKI (Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ., Kobe)
SUMMARY
In this study, we investigated axopodial contraction of the centrohelid heliozoon Raphidiophrys contractilis induced
by external stimuli. To induce axopodial contraction, extracellular Ca2+ was found to be required. In the absence of Ca2+,
axopodial contraction could not be induced at all. The threshold level of extracellular Ca2+ was between 10-6 and 10-7 M.
The axopodial contraction took place within one frame of a video recording and just after application of a mechanicalshock, which indicates that the velocity of the contraction was more than 3.0 µm/s. Re-elongation of axopodia was observed immediately after the contraction, and its velocity was about 0.7 µm/s. For electron microscopic observation, an
improved fixative using ruthenium red and Taxol was developed and applied to the heliozoons, which prevented artificial
retraction of the axopodia during fixation and resulted in better preservation of the cytoskeleton. A bundle of hexagonallyarranged microtubules was observed in an axopodium, but no other filamentous structures were detected at all. This observation suggests that the contractile machinery in the axopodia of R. contractilis may be different from that in the actinophryid heliozoons in which Ca2+-dependent contractile structures (contractile tubules) are employed for contraction.
［目的］原生動物にとって、エサの捕獲は生きていくに関しては、これまでに多くの研究があるが有中心粒ために重要な現象である。多くの原生動物はエンドサ

目に関してはほとんど調べられていない。そこで今イトーシスによって餌をとらえる。これは、細胞間相回、R. contractilisにおける軸足の収縮運動を調べてみ互作用の原始的な形態としても興味のある現象であたところ、いくつかの点でA. solと異なっていること

るし、生体防御機構の進化を考える上でも重要であがわかった。

る。太陽虫は、細胞体から多数の軸足という仮足を伸ばしており、それを使って餌を捕獲する。Actionophryssolなどを含むアクティノフィリス目と、Raphidiophrys
contractilisのなどを含む有中心粒目の太陽虫は、類似した外形を有し、軸足の内部には微小管の束が存在し［材料と方法］R. contractilisは、10％人工海水をベースとする培地中で、餌の鞭毛虫Chlorogonium elongatumとの無菌二者培養を行った (Sakaguchi and Suzaki,1999)。

ている。これらの目の間では、微小管の配列の様式や［結果と考察］R. contractilisが A. solと異なる点の一つ

餌の捕獲に用いられるエクストルソームの形が異なは、R. contractilis の軸足が機械的刺激や電気的刺激にるが、どちらの太陽虫も、軸足を急速に収縮させて餌対して反応して収縮することである。一方、A. solはこを捕獲するという点では共通している(Kinoshita et al.,

れらの刺激に対しては全く反応しなかった。これらの1995, 2001)。アクティノフィリス目の軸足の収縮運動

太陽虫は、微細構造などでもいくつかの違いがあった62

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

が、今回は R. contractilisで新たにわかった現象としルシウムイオンの存在下でのみ、収縮が生じることがて、機械的・電気的刺激による軸足の収縮運動についわかった。このように、今回太陽虫R. contractilisにおいて報告する。刺激を与える前の太陽虫では、細胞体のて、電気的刺激や機械的刺激に応じて軸足の収縮が生

直径は約20 µmで、そこから約100 µmの長さの軸足がじることを見出した。また、この現象には細胞外液の放射状に伸張している。機械的刺激として、顕微鏡のカルシウムイオンが必要なこともわかった。近縁種のステージ上のクリップを用いてスライドグラスを軽太陽虫A. solでは、軸足の収縮はcontractile tubulesとい

くたたくと、一瞬にして全ての軸足が収縮した。このう収縮構造によって引き起こされるということがわような収縮現象をビデオ観察した結果、軸足の主食はかっている（Arikawa and Suzaki, 2002）。ところが、R.

ビデオ映像の1フレーム以内の現象であり、速度にす

contractilisには、軸足中にはそのような繊維構造が存ると秒速3 mm以上のスピードで収縮していることが在していないことが、電顕的観察によって示された。

わかった。これは、生物の示す収縮現象としては、極

この種の太陽虫における軸足の収縮の仕組みはまっ

めて高速なものといえる。また、収縮後の軸足の伸長たく不明である。今後は、さらに詳細な電子顕微鏡的のスピードは、毎秒約 0.7 µmであることもわかった。 解析や生化学的解析などを行って、運動の仕組みを追
このことは、軸足中の微小管重合のスピードとしても、極めて高速なものである。太陽虫は機械的ショッ
クに対して軸足の収縮を繰り返し示した。軸足が完全な長さにまで回復するのには約 10 分間かかったが。
軸足が伸長する途中で刺激を与えても、その時点で収縮が生じた。また、細胞に電気的な刺激を与えても、まったく同じような結果が得られた。さまざまな濃度の遊離カルシウム濃度の溶液の中での軸足の収縮の様子を調べたところ、機械的刺激や、電気的刺激に対するR. contractilisの軸足の収縮現象には、細胞外液のカルシウムイオンが必要であることがわかった。ま及していきたいと考えている。
［文献］
Kinoshita, E., Suzaki, T., Sugiyama, M. and Shigenaka, Y.
(1995) J. Euk. Microbiol., 42: 283-288.
Kinoshita, E., Suzaki, T. and Shigenaka, Y. (2001) J. Euk.
Microbiol., 48: 519-526.
Sakaguchi, M. and Suzaki, T. (1999) Eur. J. Protistol., 35:
411-415.
Arikawa, M. and Suzaki, T. (2002) Cell Motil. Cytoskel.,
53: 267-272.

た、10-6 〜 10-7 Mを閾値として、それ以上の濃度のカ

テトラヒメナ（Tetrahymena pyriformis）繊毛外腕ダイニンの頭部構造の解析
石田秀樹1，増山悦子2（1島根大・生資・生物科学，2県立広島女大・生活・健康）

Structural analysis of outer-arm dynein heads from Tetrahymena cilia.
Hideki ISHIDA1 and Etsuko MASUYAMA2 (1Dept. Biol. Sci., Fac. Life and Environmental Sci.,
Shimane Univ., 2Dept. Health Sci., Hiroshima Pref. Women’s Univ.)
SUMMARY
Axonemal dyneins are force-generating ATPases that produce movement of eukaryotic cilia and flagella. The outerarm dynein from Tetrahymena cilia is a large particle (Mr 2,000 kD) and contains three heavy chains (Mr > 500 kD; α, β,and γ), each forming a large globular head and a short tail domain. Due to their large size and complex compositions, it has
been difficult to investigate molecular interactions between dynein and tubulin. We tried to prepare small and simple
dynein fragments by limited proteolysis of outer-arm dynein. Dynein digested with thermolysin yielded two stable fragments (Mr 400 kD) which were derived from β and γ heavy chains. Transmission electron microscopic analysis revealed
that negatively stained fragments were ellipsoidal or spherical in shape with approximate sizes of 10 - 20 nm. This observation implies that the fragment might correspond to the head domain of a dynein molecule. Furthermore, conformational changes of the fragments were examined by using acrylodan, a cystein-specific fluorescence probe. Binding ofbovine brain tubulin to acrylodan-labeled fragments induced a significant blue shift (from 506 nm to 457 nm). Moreover,Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

63

with the addition of 1 mM ATP, fluorescence intensity increased 1.5 times in quantum yield coupled with stimulation of
ATPase activity. These results indicate that dynein heads cause conformational changes by interaction with tubulin andATP, since acrylodan is known to show a blue-shifted emission spectrum on exposure to a hydrophobic environment.
［目的］真核細胞の繊毛・鞭毛運動を駆動する軸糸ダイニンは、異なる複数の重鎖、中間鎖、軽鎖から構成される分子量約200万の巨大なタンパク質粒子として存在する。テトラヒメナ繊毛軸糸の外腕ダイニンは、
α、β、γ重鎖のヘテロ三量体で、それぞれはATP加
水分解作用と微小管との相互作用を担う頭部と幹部から形作られている。さらに頭部は球状ドメインと柄からなり、球状ドメインは６個の相同性のあるサブド
メイン（D1からD6）で構成されている。D1からD4はヌクレオチド結合部位であるP-loop（P1からP4）を持ち、そのうちP1だけがATP加水分解部位とされている。微小管とATP依存性で相互作用する 柄 はD4とD5の間に位置し、P1とかけ離れている。ATP分解時にはダイニン頭部は何らかの構造変化を起こし 柄 へと伝播して微小管と相互作用をしていると思われる。
ダイニンは分子量が大きく複雑であるため組換え体の発現、精製が困難であることから、さまざまなダイ
ニンが微小管との相互作用の解析に用いられている。
我々はタンパク質分解酵素で消化し、より小さい機能部位を保持したダイニン標品で解析することにした。
本研究では精製したフラグメントダイニンの形状を
ネガティブ染色法による電子顕微鏡像で明らかにし、
チューブリンダイマーとの相互作用を蛍光プローブ
でラベルしたフラグメントダイニンの構造変化を基に解析することにした。

トダイニンにラベルした。
［結果と考察］粗ダイニン分画をサーモリシンで消化した分解パターンをPAGEで追跡した。2本のATPase
活 性 を 持 つ 主 要 な バ ン ド が 得 ら れ た 条 件 下 で QSepharoseカラムクロマトグラフィーによる精製を試みた。2種のATPase活性を持つダイニンフラグメントが得られ、さらにゲルろ過カラムで分子量を推定すると、ともに約400ｋDaであることが分かった。作成した2種のフラグメントダイニンの抗体は、外腕ダイニンの３つのα、β、γ重鎖のうちβとγ重鎖に結合した。
すなわち2種のフラグメントは外腕ダイニンβ、γ重鎖由来のフラグメントβ、γであることが明らかになった。これらは約540 kDaの重鎖のうち幹部を除く
ATP結合、分解部位を持つ頭部に相当すると推定される。ネガティブ染色を施してフラグメントβ、γの形
態を電子顕微鏡で観察すると、ともに球形や卵型をしたタンパク質像が得られ、その径も約10-20 nmである
ことからもフラグメントβ、γは頭部であることが裏付けられた。
AD標識フラグメントγにチューブリンダイマーを添加すると、蛍光スペクトル極大が、506 nmから457nmにブルーシフトし、蛍光強度も6倍上昇した。さらに1 mM ATPと反応させるとAD標識フラグメントの457 nmの蛍光強度が1.5倍上昇した。フラグメントのAD標識近傍の環境はチューブリン、ATPと相互作用［材料と方法］Tetrahymena pyriformis strain GLを大量することにより大きく疎水性に変化したことを示唆

培養して集め、カルシウム-エタノール法で繊毛を単している。フラグメントダイニンは頭部を形作ってお離した。繊毛を除膜して得た軸糸を低イオン強度の緩り、微小管との相互作用を解析する単位として適して衝液に対して一晩透析し、その上清を粗ダイニン分画いると思われる。今後さらに、構造変化の解析を詳細とし、サーモリシン消化の後、カラムによる精製をに検討することは、ダイニンと微小管との相互作用の行った。フラグメントダイニンに対する抗体はウサギ

機構解明に寄与できると思われる。

に免疫感作して作成した。フラグメントダイニンは、
2%リンタングステン酸でネガティブ染色し、透過型
電子顕微鏡で形態観察を行った。チューブリンはウシ
脳から重合・脱重合、PCカラムで精製した。周囲の微小環境に応じて蛍光スペクトル極大が変化するチオール標識蛍光色素アクリロダン（AD）をフラグメン［文献］
1) Ogawa, K. (1991) Nature 352, 643-645.
2) Asai, D. J. (2000) Jpn. J. Protozool. 33, 15-27.
3) Mocz, G. and Gibbons, I. R. (2001) Structure 9, 93-103.

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

64

繊毛逆転時の繊毛内カルシウムイメージング
岩楯 好昭（徳島大・総合科学）

Intraciliary calcium imaging during ciliary reversal in Didinium nasutum.
Yoshiaki IWADATE (Fac. Integr. Arts Sci., The Univ. Tokushima)
SUMMARY
Internal Ca2+ level controls the pattern of ciliary and flagellar beating in eukaryotes. In ciliate, many authors havesuggested that the reversal of the direction of ciliary beating (ciliary reversal) is induced by a rise in intra-ciliary Ca2+ level.
However, this putative increase in intra-ciliary Ca2+ level have not as yet been recorded during ciliary reversal. We injected
the fluorescent Ca2+ indicator Calcium Green into a ciliate Didinium nasutum and observed the intra-ciliary Ca2+ level
during spontaneous ciliary reversal. D. nasutum showed a rise in Ca2+ level all over the cilium accompanied by the ciliary
reversal. We injected caged Ca2+ into D. nasutum and applied ultraviolet light to the middle region of the cilia. The cilia
bent at the UV applied region. These results strongly suggest that not only Ca2+ influx region but also Ca2+ binding sites
and bending devices for ciliary reversal is distributed all over the cilium.
[目的] 多くの真核生物の繊毛・鞭毛の運動パターン

た。細胞をサクションピペットで保持したまま、自発は内部のCa2+ レベルによって変化する。繊毛虫の繊毛

的な繊毛逆転が起きたときの繊毛のCalcium Greenの2+

レベルの上昇によって逆転によるといわ蛍光強度の変化を画像として記録した。すると繊毛はれる1-9。にもかかわらず、これまで繊毛逆転時の繊毛

繊毛内の蛍光強度を増大させながら逆転した。繊毛の逆転はCa

内のCa2+ レベルを直接計測した例は無い。そのため、 基部から異なる距離の地点の蛍光強度の変化を比較
Ca2+ がどのようにして繊毛逆転を起こすのかは曖昧

すると、繊毛の基部からの距離にかかわらず、繊毛逆なままである。本研究では、太い大きな繊毛を持つ繊転に伴い蛍光強度は同じ時間経過で増大した。一方

毛虫ディディニウム（Didinium nasutum）を用い、Ca2+

Ca2+ 非感受性の蛍光色素 FITC を注射したディディニ

2+

イメージング法と caged Ca

光分解法によって繊毛逆転とCa2+の関係を検討した。
[方法]

ウムでは繊毛逆転に伴う蛍光強度の変化は見られなかった。この結果は Calcium Greenを注射したときのCa2+ プローブ、Calcium Green、を注射された

ディディニウムを落射型倒立顕微鏡のステージ上に固定し、自発的な繊毛逆転が生じるときの蛍光強度の変化を CCD カメラで撮影し、コンピュータで解析した。蛍光強度の変化が確かに繊毛内のCa2+ レベルを反2+映していることを確認するためCa

非感受性の蛍光色素 FITCをCalcium Greenのかわりに顕微注射し同様の実験を行った。細胞本体は繊毛に比べて非常に大き

繊毛の蛍光強度の増大が確かに繊毛内Ca2+ レベルの増大によることを示している。caged Ca2+ を注射した
ディディニウムの繊毛の根本に紫外線を照射すると繊毛は根本から屈曲し、中間に照射するとその箇所で屈曲した。
以上の結果は、繊毛逆転のCa2+ レベル上昇エリア、
Ca2+ 受容体及び機械的な逆転装置は全て繊毛全域に渡り存在することを示唆する。

いため、細胞全体に励起光を照射すると、細胞本体か[文献]

らの強い Calcium Green の蛍光が繊毛からの蛍光に重1) Naitoh, Y. and Eckert, R. (1969) Science 164, 963-965.

なって、繊毛からの蛍光を非常に S/N 比の悪くしてし

2) Naitoh, Y., Eckert, R. and Friedman, K. (1972) J. Exp.

まう。そのため、励起光が細胞本体に当たらないよう

Biol. 56, 667-681.
に励起光の照射エリアを繊毛に限定した。caged Ca2+、 3) Ogura, A. and Takahashi, K. (1976) Nature 264, 170NP-EGTA、を注射されたディディニウムの繊毛各所
172.
に紫外線を照射し、繊毛の応答を観察した。
[結果・考察] 繊毛１本１本からの Calcium Greenの蛍光をそれぞれ独立して確認することはできないものの、繊毛全体からのCalcium Greenの蛍光が確認でき

4) Dunlap, K. (1977) J. Physiol. 271, 119-133.
5) Machemer, H. and Ogura, A. (1979) J. Physiol. 296, 4960.
6) Naitoh, Y. and Kaneko, H. (1972) Science 176, 523-524.

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

7) Naitoh, Y. and Kaneko, H. (1973) J. Exp. Biol. 58, 657676.

658) Saeki, M. and Hiramoto, Y. (1975) Cell Struct. Funct.
1, 33-41.

ゾウリムシの外液Naイオンに対する行動反応と膜電位反応
大網一則，高橋三保子（筑波大、生物科学）

Behavioral and membrane potential responses of Paramecium caudatum
to external Na+
Kazunori OAMI and Mihoko TAKAHASHI (Inst. Biol. Sci. Univ. Tsukuba)
SUMMARY
To understand the mechanisms underlying the sensation of the external inorganic ions in Paramecium caudatum, we
examined behavioral and membrane potential responses of the cells to external Na+. Wild-type cells immersed in the Na+containing solution (32 mM or more) exhibited initial continuous backward swimming followed by repeated transient
backward swimming. A wild-type impaled by a microelectrode showed initial action potential followed by sustained
membrane depolarization in response to an application of the Na+-containing test solution. Depolarizing afterpotential
took place subsequently after termination of the application. CNR mutant defective in voltage-gated Ca2+ channels showed
only sustained membrane depolarization but not the action potential and the depolarizing afterpotential to the application.
Both wild-type and CNR exhibited transient depolarization overlapping the sustained depolarization when the application
was prolonged. It is concluded that Paramecium shows two kinds of behavioral responses to Na+. The initial backward
swimming is controlled by the mechanism similar to that underlying the K+-induced backward swimming while the repeated backward swimming is controlled by the transient depolarization.
［目的］ゾウリムシは、有機化合物だけで無く、外液ウリムシを小さなピペットで刺激溶液に移して調べ中の無機イオンに対しても顕著な行動反応を示す。高た。Ｎａ刺激溶液は標準溶液にNaCl を加えたものを

濃度Ｋイオン溶液中での後退遊泳は良く知られてお用いた。ゾウリムシの膜電位反応は微小電極法によりり（Naitoh, 1968）、細胞の興奮性の指標として長く使記録した。

われてきた。最近、我々は、ゾウリムシのＫイオン中で生じる後退遊泳を制御するＣａコンダクタンスを見い出した（Oami & Takahashi, 2002）。このＫ依存性
Ｃａコンダクタンスの性質は、活動電位に対応する電位依存性Ｃａコンダクタンスの性質とは全く異なっていた。これは、ゾウリムシが生理的なＫイオン受容機構を持つことを示しており、更に、その他の外液無機イオンに対する受容システムの存在も示唆している。今回、外界に普遍的に存在する陽イオンであるＮ
ａイオンに着目し、ゾウリムシがＮａイオンをどのように受容しているかを調べた。

［結果と考察］ゾウリムシは標準溶液からＮａイオンを含む刺激溶液に移すと、初めに持続性の後退遊泳（初期後退遊泳）を行い、その後、前進遊泳と一過性の後退遊泳をくり返す行動反応を示した。初期後退遊
泳は、Ｎａ濃度を増すに従い持続時間が長くなった。
一方、繰り返し生じる一過性の後退遊泳は、Ｎａ濃度が高い溶液中でのみ顕著にあらわれた。
次に、ゾウリムシに微少電極を刺入し、Ｎａイオン
に対する行動を制御する膜電位反応を調べた。野生型
ゾウリムシにＮａイオンを含む刺激液を約５秒間投与すると、初めに活動電位が生じ、続いて膜の持続的［材料と方法］野生型ゾウリムシ（Paramecium cau-

脱分極が生じた。投与終了後には脱分極の延長、すな

datum）と電位依存性Ｃａチャンネル機能に欠陥を持

わち、脱分極性後電位が生じた。ゾウリムシは脱分極

つＣＮＲミュータント（ cnrD; 18D613 ）を実験に用い性後電位を含んだ脱分極の期間、繊毛逆転を示した。

た。Ｎａ溶液中での行動反応は、標準溶液（4mM KCl,

また、脱分極性後電位の持続時間は、Ｎａ刺激液の投

1mM CaCl2, 1mM Tris-HCl pH 7.3）中で順応させたゾ

与時間を長くするにつれて短くなった。一方、ＣＮＲ

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

66

ミュータントでは脱分極性後電位は見られなかった。 ダクタンスはＫイオン受容機構に関与するものと同脱分極性後電位は、Ｃａコンダクタンスの活性化を表じであると考えられ、膜興奮性を失ったＣＮＲミュー

していると考えられる。

タントでは消失した。もう一つは、Ｎａ溶液中で繰り野生型細胞にＮａ刺激溶液を長く投与すると、膜の返し生じる一過性後退遊泳である。この後退遊泳はＮ

定常的脱分極に重畳して一過性の脱分極がくり返し

ａ刺激液中で繰り返し生じる一過性の脱分極により生じるようになった。ゾウリムシは、この一過性の脱電位依存性Ｃａチャンネルが活性化されて生じると分極に対応して繊毛逆転を示した。Ｎａ溶液中で見ら考えられる。この一過性脱分極は、その活性化、不活れる自発性の後退遊泳はこのような一過性の脱分極性化の機構、イオン機構などが明らかではないが、Ｃにより誘発されると考えられる。この一過性の脱分極

ＮＲミュータントでも野生型と同様に見られた。

はＣＮＲ細胞でも生じた。
以上のべたように、ゾウリムシは外液中のＮａイオンに対し２種類の異なる行動反応を示すことが明かとなった。一つは、Ｎａ刺激の初めだけに生じる持続性後退遊泳である。この後退遊泳に対応するＣａコン［文献］
Naitoh, Y. (1968). J. Gen. Physiol. 51, 85-103.
Oami, K. and Takahashi, M. (2002). J. Memb. Biol. 190,
159-165.

テトラヒメナ細胞の同調分裂におけるスフィンゴシンキナーゼおよびホスホリパーゼDの活性変動
上野 修1,2，王 樹林3，香田昌宏4，大口健司2，野澤義則2，坂野喜子4（ 国際科学振興財団，2岐阜県バイオ研，3Univ. Pennsylvania, Sch. Med.，4岐大・医・細胞情報）1

Activity change of sphingosine kinase and phospholipase D in synchronized cell
division process of Tetrahymena cell
Osamu UENO1,2, Shulin WANG3, Masahiro KOHDA4, Kenji OOGUCHI2, Yoshinori NOZAWA2and Yoshiko BANNO4
1
2
3( FAIS Gifu Intl. Inst. Biotech. Univ Pennsylvania, 4Dept. of Biochemistry, Gifu Univ. Sch. of Med.)SUMMARY
Sphingosine kinase (SPHK) and phospholipase D (PLD) have attracted increasing attention as signal transduction
factors associated with cell survival, growth, and death. SPHK and PLD activities were examined during the synchronous
cell division induced by cyclic heat treatments in Tetrahymena cells. SPHK and PLD activity transiently increased at 30 to
45 min after the end of heat treatment (EHT) prior to initiation of the synchronous cell division (75 min after EHT). Synchronous cell division was delayed and decreased by these enzyme inhibitors. Moreover, PLD activity changes were
inhibited by SPHK and SPHK activity changes were inhibited by PLD inhibitor. These results suggest that these activity
changes were associated with the cell cycle and that the up-regulated SPHK and PLD activity would be required for the
initiation of the oncoming synchronous cell division in Tetrahymena cells.
［目的］スフィンゴシン1リン酸を生成するスフィン

およびSPHKの細胞周期および細胞分裂に対する効果

ゴシンキナーゼ (SPHK)、およびホスホリパーゼＤを明らかにするため、同調分裂期の活性変動および酵(PLD) はこれまで哺乳類において複数のアイソフォー素阻害剤による細胞分裂に対する効果を検討した。

ムの存在が報告され、細胞増殖・生存・死に関わる情報伝達因子として注目されている。Tetrahymenaにおいても両酵素は強い活性が認められる。
TetrahymenaにおけるSPHKの部分精製を行い、PLD［材料と方法］培養：Tetrahymena pyroformisをNozawaThompsonの方法に従いProteose Peptone 栄養培地にて26℃恒温回転振盪培養により生育させた。

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

SPHK活性測定：Oliverらの方法に従い、20 µMス

67性阻害がみられた。

フィンゴシンを基質として2 µCi[γ-32P] ATP 存在下

Tetrahymena のSPHK活性は培養時期によって変動

37℃30min反応させた。抽出した脂質をTLC展開し生し対数増殖期中期で増加しその後徐々に減少するこ成したスフィンゴシン1リン酸をオートラジオグラとからSPHK活性の上昇は細胞の増殖に関与している

フィで可視化し定量した。PLD活性測定：Tetrahymena可能性が示唆された。細胞周期を同調化した後DHSお

pyroformisを 1 µCi/ml 3Hパルミチン酸(PA)で８時間ラ

よびDMSを投与したところDHS投与群のみ同調分裂

ベルし、0.2% nButOHで15 min反応させた。Bligh Dyer

時期が遅延し分裂細胞が抑制された。SPHK活性は同の方法に従い脂質抽出を行いTLC展開で得られたホ調処理終了後45 minをピークとして一過性に増加し、スファチジルブタノール(PBut)画分の放射活性を総放

この活性上昇はDHS投与によって抑制された。

射活性に対する割合で示しPLD活性とした。

またもう一つの細胞増殖に関わる情報伝達因子と細胞周期同調 化：対数増殖期 (1 x 105cell/ml) のされるPLD活性について検討した。PLD活性を阻害す

Tetrahymena pyroformisを常法に従い温度処理によるる0.3% n-ButOHを細胞周期同調処理終了後に投与し細胞周期の同調化を行った。すなわち26℃30 min,

たところ同様に同調分裂時期が遅延し分裂細胞が抑34℃ 30 minの熱処理を８回繰り返した後、元の26℃恒制された。この同調分裂遅延抑制は2-ButOHでは減少

温振盪培養条件に戻した。この終了時 (EHT: End of

しt-ButOHではほとんど抑制がみられなかった。PLD

Heat Shock) を0 minとして75 min後に分裂期の細胞が活性は同調処理終了後30〜45 minをピークとする一80%以上揃う同調分裂が誘導される。

過性の増加がみられた。

［結果と考察］SPHK: Tetrahymena pyroformisにおいてPLDの一過性の活性上昇はDHS投与においても抑SPHK活性は約80%が膜画分に存在することが確認さ制され、SPHKの一過性の活性上昇はButOH投与におれた。βオクチルグルコシドで可溶化した膜画分をいても抑制された。同調分裂前の両酵素の一過性の活

MonoQカラムクロマトグラフィーによって溶出した性上昇はPLDが時期的に僅かに先に活性化されるが、ところ、SPHK活性のピークを示すF1(約140 kDa), F2

単純なカスケードあるいは独立ではないものの細胞(約80 kDa)の２つの画分が得られた。この分子量は哺

周期・分裂過程に関与している可能性が示唆された。

乳類で報告されている40〜60 kDaと比して大きい。
Tetrahymena pyroformisにおいて２種類のSPHKが膜画分に存在することが示唆された。
L-threo-dihydrosphingosine(DHS) お よ び N,N-

dimethylsphingosine (DMS) はSPHKの阻害剤として用いられるが、F1, F2のいずれもDMSでは阻害効果がみ［文献］
Wang, S., Banno, Y., Nozawa, Y. (2002) J Eukaryot. Microbiol., 49: 305-11.
Wang, S., Ueno, O., Banno, Y., Kohda, M., Ooguchi, K.
and Nozawa, Y. (2002) Seikagaku, 74: 931.

られず、DHSではF1画分のみ濃度依存的にSPHKの活接合期のゾウリムシ小核の形態変化：生体連続観察による解析
岩田賢一，庄司祐太，見上一幸（宮教大，EEC）

Morphological changes of germ-nucleus in conjugation of Paramecium caudatum:
Continuous observation on living cells
Kenichi IWATA, Yuta SHOJI and Kazuyuki MIKAMI (EEC, Miyagi Univ. of Education)
SUMMARY
It is known that the germ-nucleus (micronucleus) of Paramecium caudatum changes its form from ovoid to crescentshaped. To study the specific morphological change of micronuclei, the micronucleus in a living cell was observed undera phase contrast microscope and recorded on videotape continuously. We employed Cell-takTM (BD Biosciences) to stickcells on a glass slide. Prior to observation, cells were treated in DAPI solution (1 µg/ml). After observation under phase

68

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

contrast, the micronucleus stained with DAPI was irradiated with UV and recorded on videotape for some seconds. The
area of DNA stained with DAPI was compared with the nuclear area that was observed under the phase microscope. Speedof protoplasmic streaming was also determined on the monitor screen by measuring migration distance of a small granule(0.5 µm). The speed of protoplasmic streaming tended to be faster than that of vegetative cells after 2 hrs of conjugation.
The micronucleus moved around the macronucleus in accordance with protoplasmic streaming, and changed its form fromovoid to a long form, and eventually to a crescent. This means that the micronucleus is elongated by development of theintranuclear cytoskeleton. At 6 hrs after conjugation, the shape of the micronucleus became a typical crescent under phase
contrast. However the area of DNA became thinner and a DNA-free area appeared around the DNA area. The function of
the DNA-free area in the micronucleus remains to be resolved.
［目的］ゾウリムシ（Paramecium caudatum）の接合時倍率に対応した物差しを用意しておく。その後モニの減数分裂前期において、生殖核である小核は三日月

ター上に映し出された細胞の顆粒の2秒間における移形となる。この時期に，なぜそのような形態変化をす

動距離を透明なシートにトレースする。トレースを終るのか明らかになっていない。そこでまず生態を連続えたら手元の物差しを用い2点間の距離を測る。位相

観察し細胞内の構造変化との関係について調べるこ差顕微鏡像とDAPI像の比較にもセルタックをほぼ前ととした。さらに形態変化する核内の生殖核の核域お述どおり用いる。異なる点はカバーガラスをかぶせる

よびＤＮＡの所在と染色体分布領域の比較検討も前にDAPIを一滴、滴下する点である。その後、生細胞行った。また原形質流動の速さについては小林(1999)の小核の状態を観察したのち、すぐにUVをあてた細が、接合過程の各時期（三日月期を含む）で計測して胞を観察する。

いるが、三日月形の形成との関係は述べられていないことから接合過程前期にある細胞の原形質流動速度を計測し小核の伸長との相関を明らかにしようと試みた。さらにまた，核の形態変化に伴って細胞内の核の移動や極在についても調べられていないことから、連続観察により明らかにしようと考えた。

［結果と考察］小核において核域と染色体分布領域が一部、一致しない細胞を確認することが出来た。接合
後６時間の小核では、核域が三日月形に近い形をしているのに対して、染色体分布領域は一部欠けているよ
うな形をしていた。染色体が分布していない領域に、小核の伸長に関してどのような役割があるのかは明［材料と方法］ゾウリムシを位相差顕微鏡下で長時間らかにされていないが、そこを調べることで、三日月撮影（２時間から６時間）するため、細胞を接着させ形になっていく仕組みを解明する一つの手がかりをるセルタックを用いた。核域と染色体分布領域の比較得ることが出来るのではないだろうか。原形質流動速には上記のセルタックTM（日本ベクトン・ディッキン

度測定の結果から、小核が三日月形になっていくにつソン）を用い、DAPI染色をしたのち①位相差顕微鏡、 れ、原形質流動の速度も上昇していった。細胞間でば以上２種類をビデオ撮影した。

らつきは見られたものの、今回の結果を元にさらに測またほぼ同時期の細胞をフォイルゲン染色し比較に定細胞数を増やし解析をすれば、原形質流動速度と言用いた。細胞はP. caudatum (16B001sⅡB5株、16BKNS2

う側面から小核の三日月形への変化のメカニズムを株)を用いた。ビデオ撮影の方法は、まずスライドガラ

解明できるのではないだろうか。ビデオ撮影からは、②UVをあてた状態

スにセルタックを薄く塗り広げ、乾くまで静置する。 小核は常に一ヶ所とどまって伸長することはなく、活次にワセリンで枕をつくる。ワセリンで枕を作る上で発な原形質流動の流れに乗って動き、動きながら伸長の利点は、最も小核が見える高さまでカバーガラスをするということが明らかになった。このことから、核ある程度押し下げて調節できること、長時間撮影の場

外ではなく核内の微小管などの働きで小核の伸長が合の乾燥を防ぐことが出来ることである。そこへ細胞起こっていることが示唆される。

を数匹移しスライドガラス表面に接着するのを待つ。
接着したことを確認したらカバーガラスをかけ、小核が見えるように適当な高さまでガラス棒などの先で軽くたたきながら押し下げていく。ここで撮影した細胞で原形質流動測ることにした。はじめに、観察した［文献］
Kobayashi, K., Yoshimura, C. and Mikami, K. (1999) Zool.
Sci., 16: 885-892.

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

69

Paramecium bursaria のクロレラの再感染にともなうトリコシストの変化
大村 現，洲崎敏伸（神戸大・理・生物）

Changes in trichocysts during re-infection of white Paramecium bursaria
by Chlorella
Gen OMURA and Toshinobu SUZAKI (Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ.)
SUMMARY
Trichocysts in Paramecium bursaria are regularly arranged in the cell cortex. The density of trichocysts in Chlorella-bearing “green” P.bursaria was less than that in Chlorella-free “white” P. bursaria. This indicates that, during reinfection of white P. bursaria with Chlorella, trichocysts become diminished in the cell cortex. Light microscopy showedthat many granules appeared in the cytoplasm of white P. bursaria that were re-infected with Chlorella for 6 hours. In
parallel with the appearance of the granules, the number of trichocysts decreased. The granules were not derived from foodvacuoles, because the granules remained unchanged even after the paramecia were washed extensively and continuouslywith fresh culture medium for 15 hours. Trichocyst discharge was not observed at all during the entire process of reinfection with Chlorella. Electron microscopy showed that the granules consist of electron dense material without apparent covering membranes. The granules were observed particularly in the vicinity of trichocysts, with frequent attachment
to trichocysts. Some of the granules were observed to be fused with trichocysts. In the paramecia re-infected with
Chlorella and successively washed for 15 hours, many granules were observed but almost all trichocysts had disappeared.
These observations suggest that trichocysts were transformed into smaller electron-dense granules during the process of
Chlorella infection.
［目的］繊毛虫Paramecium bursaria は体内に数百個のりと観察できる。クロレラと6時間混合した直後の白クロレラを共生させている。人工的にクロレラを取り色P. bursaria ではその細胞前端部以外の細胞全縁お除いた白色P. bursaria と通常のP. bursariaの細胞表層

よび細胞質流中に、細かな透明の顆粒が大量に出現しを観察すると、白色P. bursaria ではParamecium属などていた。この時点では、白色P. bursaria は大量のクロがもつ特殊な放出器官であるトリコシストが密に存

レラを取り込んでおり、取り込まれたクロレラのう

在するのに対し、通常のP. bursariaではそこにクロレ

ち、白色P. bursaria の細胞表層に定着していたものはラが入り込んで定着しているため、密度が低くなって数個から十数個程度だった。15時間の洗浄後の白色P.

いた。このことはクロレラの再感染にともないトリコ

bursaria では、取り込まれていたクロレラの大部分はシストが排除されていることを示唆している。そこで消化されるなどして排出され、数十個程度の細胞表層

今回、クロレラの再感染に伴うトリコシストの変化に定着したクロレラがはっきりと観察できた。顆粒はを、光学・電子顕微鏡で観察した。

依然として大量に存在しており、それらに埋もれて、［方法］エサを絶って一日後の白色P. bursaria と通常のP. bursaria から単離して洗浄した新鮮なクロレラを混合し、明光下、20℃で6時間インキュベート後、遠心で細胞を回収し、11 µm径のメッシュ上に細胞を保持し、KHをペリスタリックポンプ（流速 1 ml/min）で注いで細胞を洗い続けながら、15時間インキュベートした。白色P. bursaria との混合時のクロレラの濃度は約107 cells/mlであった。また、KHは、10 mM HEPESKOH (pH 7.0)を含む0.01 % Knop液である。

細胞前端部以外のトリコシストを確認することはできなかった。
つぎに電子顕微鏡で観察したところ、クロレラと混合して1時間後の白色P. bursaria では細胞内に特に変わったところは見られなかったが、6時間後の細胞では細胞内全体に、直径約0.5 µmの電子密度の高い顆粒が大量に観察された。とくにトリコシストの周囲にまとわりつくようにして存在し、その大きさと位置、出現のタイミングから、この顆粒は光学顕微鏡で観察された顆粒と同一のものであると考えられた。またこの［結果および考察］光学顕微鏡で観察すると、白色P.

顆粒のうちあるものはトリコシストと融合しており、

bursaria ではその細胞の全縁にトリコシストがはっき

融合部分にははっきりとした構造の連続性が認めら

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年70れた。15時間の洗浄後の細胞では大量の顆粒は観察で毛虫のChlorogonium elongatum を与えたところ、光学

きたが、細胞前端部以外でトリコシストはほとんど見

顕微鏡下において顆粒の出現が観察されたことから、

つからなかった。

すくなくとも顆粒の出現はクロレラを与えたときだ

今回の観察結果から、顆粒の出現とトリコシストの減けに起こる特異的な現象ではないと考えられる。今後

少には関係があると考えられるが、顆粒がいつ・どこはさらに詳細な観察を行うとともに、トリコシストのから出現するのかについては分からなかった。また白放出試薬のAEDなどを用いて、クロレラの再感染とト色P. bursaria に普段エサとして与えている植物性鞭リコシストの減少との関係を調べる予定である。

無色ユーグレナPeranema trichophorumの無菌培養法及び鞭毛単離法の確立
末友靖隆1，齊藤育1,2，洲崎敏伸1(1神戸大・理・生物，2広島大・院・医歯薬・組織細胞生物)

Bacteria-free culture of a colorless euglenoid flagellate Peranema trichophorum
and establishment of a method for flagellar isolation
Yasutaka SUETOMO1, Akira SAITO1,2 and Toshinobu SUZAKI1( Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ., 2Dept. Histol. Cell Biol., Grad. Sch. Biomed. Sci., Hiroshima Univ.)
1

SUMMARY
We have recently shown that the anterior flagellum and its mastigonemes play an important role in gliding movement
in a colorless euglenoid flagellate Peranema trichophorum. For further biochemical analysis of the molecular mechanismof flagellar surface motility, we have developed an improved monoxenic sterile culture method for P. trichophorum and amethod for flagellar isolation. By adjusting initial cell densities of P. trichophorum and co-existing food flagellates,
Chlorogonium elongatum, to 800 and 30,000 cells/ml, respectively, P. trichophorum reached its maximum cell density of
10,000 cells/ml in only one week. A brief cold-shock procedure allowed an efficient isolation of flagella. Light andelectron microscopic observations showed that the isolated flagella retained their structure with abundant mastigonemes.
［目的］無色ユーグレナ類Peranema trichophorumの 滑培養した。この方法における増殖を調べた結果、走運動には、細胞前端から突出した鞭毛が重要な働き

Peranemaは約21日で1mlあたり10,000匹に達し、またをしていることが、我々の研究によりすでに明らかにChlorogonium は 約 23 日 で 全 て 消 費 さ れ る こ と が わなっている。しかし、過去に確立された培養法(Chen,

かった。しかしこの培養法では実験に利用できるまで

1950) では短期間で十分な量の細胞を得ることが不可に3週間以上を必要とし、さらなる改良が必要であっ能であったため、鞭毛の生化学的解析が困難であった。そこで培地の振とうやフラスコの底面積、培養液た。そこで本研究では、簡便な無菌大量培養法と、効の容積、PeranemaとChlorogoniumの初期密度が増殖に率の良い鞭毛法の確立を試みた。

与える影響を調べた。

［材 料 と 方 法］抗 生 物 質 で 洗 っ て 無 菌 化 し た(Sakaguchi and Suzaki., 1999) Peranema を、200 mlフラスコ内の100 mlの滅菌済培地 (1.47 mM Na-acetate,
0.02% Polypepton, 0.04% Trypepton, 0.04% Yeast extract,

1日で全作業行程が完了でき、毎回ダメージの少ない状態で、かつ安定して鞭毛を採取できる方法を考案した。Cold-shockは急速に冷却できるほどサンプルの損傷が少なくて良いとされる。そこで、短時間で冷却できる方法を検証した。
13.6 µM CaCl2, 0.24 mM Ca(NO3)2, 0.14 mM KNO3, 58µM MgSO4, 0.1 mM KH2PO4)に、Peranema を4.5匹/1 ml、 ［結果と考察］従来の無菌培養法の調査結果から、①餌として植物性鞭毛虫Chlorogonium elongatum を140

振とう培養による個体数の増加促進は見込めないが、匹/1 mlになるように移し、23℃、明暗周期12 hr/12 hrで40 rpm以上で振とうするとPeranema をフラスコ中でJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)71

長期間維持できる、②底面積と容積が大きなフラスコ

ずつ移し、70% ethanolでチューブとの隙間を満たした

で、Peranema の初期密度を高く、Chlorogoniumを低く

Ice Rack (Towa) に2分間静置した。その後すぐに、用意して培養を開始することで、Peranemaの速い増殖

Vortexで2分間攪拌した。400 gで遠心して上澄みを回と、Chlorogonium の短期間での減少が可能である、と収し、沈殿に再びKH液を投入して遠心した。この作業いうことがわかった。これらの結果から、Peranemaがを2〜3回行い、鞭毛の外れた細胞を除去した。集めた

１万匹/ml以上に達し、Chlorogonium を全て消費した

上澄み液を10,000 gで遠心し、鞭毛だけからなる沈殿培地から8 mlのPeranema を、また、予め無菌培養したを回収したところ、保存状態の良い鞭毛を大量に得る

Chlorogonium 2mlを、300 mlフラスコ内の100 mlの滅菌ことができた。また、透過型電子顕微鏡観察から、鞭済培地(組成は同じ)に移し、23 ℃、明暗周期12 hr/12 hr

毛塊の中に、滑走運動に関与していると考えられる大で培養するという方法が最良であると結論付けた。こ量のmastigonemeが確認できた。さらにChlorogoniumの方法により、１週間で大量のPeranema のみの無菌の鞭毛と単離鞭毛を同縮尺で比較したところ、大きさ培地を得ることができ、多数のサンプルを必要とするが全く異なることが確認できた。このことから、この実験を容易に行える環境が整った。

単離鞭毛中にはChlorogonium の鞭毛は混在していな

短時間で冷却できる方法を検証した結果、70 %いことがわかった。今後は、これらの手法を利用してethanolでチューブとの隙間を満たした金属製のIce

Peranema の滑走運動における前鞭毛の機能を、生化

Rackを氷水100 g：NaCl 30 gの割合で調合した氷水中学的な手法を用いて研究していきたい。

に浸して用いる方法が、最も短時間で冷却させられる
ことがわかった。この結果を踏まえて、以下の鞭毛単離法を考案した。前述の培養法で1週間程度培養した
Peranema を、400 gの遠心とKH液 (0.01% Knop＋10
mM HEPES-KOH)で洗浄濃縮し、1.5 mlチューブに1 ml［文献］
Chen, Y.T. (1950) Quart.J.Microsc.Sci., 91: 279-308.
Sakaguchi, M. and Suzaki, T. (1999) Europ. J. Plotistol.,
35: 411-415.

テトラヒメナの接合中の核退化過程におけるミトコンドリアの関与の可能性
小林 孝（金沢大・理・生物）

A possible involvement of mitochondria in apoptotic nuclear death of conjugating
Tetrahymena thermophila
Takashi KOBAYASHI (Dept. Biol., Kanazawa Univ.)
SUMMARY
In the ciliated protozoan Tetrahymena thermophila, old parental macronucleus is degenerated via apoptosis-likeprocess during conjugation. This process controlled by a set of specific genes is called Programmed Nuclear Death (PND).
Previously caspase-like activity was detected in macronuclear degradation stage during PND. Here we demonstrate mitochondrial association in PND. It is well known that various apoptosis-related molecules are released from mitochondria
in apoptosis of metazoans, resulting from the loss of mitochondrial membrane potential (∆Ψm). Using the dye(DePshipher) to detect change (∆Ψm) of mitochondrial potential, conjugants and exconjugants were stained. The dye
unexpectedly localized in the degenerating parental macronucleus as well as mitochondria. Other nuclei, macronuclear
anlagen and micronuclei, were not stained. The degenerating macronucleus in this stage is known to be surrounded by
autophagosome. The localization of the dye in the autophagosome containing the degenerating macronucleus did notcoincide with that of acidic organelles detected by Acridine Orange staining, suggesting that it is not the response to low
pH. In addition, other mitochondria staining method (MitoTracker) also supported mitochondrial localization in the
autophagosome. These results suggest that part of mitochondria are taken in autophagosome together with the degenerating macronucleus. The mitochondria in the autophagosome would lose their membrane potential and then degrade. In this

72

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

mechanism, it can be rationalized why the release of apoptosis inducing factors and the subsequent caspase activation are
restricted in autophagosome.
［目的］繊毛虫の有性生殖（接合）過程中の核退化過があるため、Acridine Orange (AO)による染色をおこな

程は、アポトーシス様の特徴を示すことが知られていい細胞内の低pH の場所を染色した。その結果、AOにる。昨年度大会（第34回）において、接合中のテトラよる染色像では、退化中の核が染色される他に、細胞ヒメナにおいて、旧大核退化の時期特異的にアポトー

質中に無数のリソソームと考えられる染色が観察さシスに重要であるカスパーゼの活性を確認した。現在れた。AOとDePsipherの染色像を比べると、DePsipher

までのところ、カスパーゼ-8と-9に似た活性を検出しでは細胞質中にある無数のリソソームは染色されてている。一般にこれら2つの活性はカスパーゼ-3の活いないことがわかる。このことから、DePsipherがpHに性誘導をする他に、ミトコンドリア経路と深いかかわ

依存した局在をしていないことを確認した。以上のこりがある。一般的なアポトーシス過程では、ミトコンとから、DePsipherによる退化核の染色は特異的に起ドリアからチトクロームCやAIFなどの様々なアポこっていると考えられる。またさらに、ミトコンドリ

トーシス関連分子が放出されることが広く知られてアの膜脂質を特異的に染色するMitoTrackerによる染いる。これらの分子の放出時に、ミトコンドリアの膜色でも退化中の旧大核が染色されることからミトコ電位の低下が観察されている。このような膜電位の低ンドリアが旧大核を含む自食胞に取り込まれている

下は、一部の原生生物のアポトーシス時にも観察され可能性がある。

ている。今回、テトラヒメナの接合中の核退化過程にミトコンドリアが自食胞に取り込まれるには、1）ミミトコンドリアの関与があるのかを検証するため、こトコンドリアが積極的に自食胞内に取り込まる。2）核の膜電位の低下を観察した。

の周辺にあったミトコンドリアが自食胞形成に伴い［方法］接合過程中のTetrahymena thermophila (CU428
x CU813) の細胞をミトコンドリア膜電位依存蛍光試
薬 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (DePsipher Kit, TREVIGEN社)をもちいて染色した。観察には蛍光顕微用を用い、G filter
及び B filterで観察した。通常の観察は生細胞であるが、写真撮影時には、染色後、最終濃度 0.5%の フォル
マリンで固定した。

一緒に取り込まれる。可能性が考えられる。その後ミトコンドリアは自食胞内で、膜電位を失う又は破壊されることにより、アポトーシス関連分子を自食胞内に放出すると考えられる。このようにして、テトラヒメ
ナの核退化にミトコンドリア経路が使われているのかもしれない。
繊毛虫は単細胞生物であり、接合中の核退化は細胞死を伴わないアポトーシス過程である。核退化をする
時には、同一細胞内に生き残る核と死ぬ核が共存して［結果及び考察］DePsipherは正常な膜電位をもつミいることになる。生き残る核と死ぬ核の識別をどのよ

トコンドリアでは集合して赤色の蛍光を発色する（ポうにおこなっているのかは今のところ明らかではな

リマー）が、電位が低下した場合分散し緑色の蛍光をいが、核の破壊（消化）は、自食胞内でのみでおこなっ発する（モノマー）。接合前の細胞ではミトコンドリている。このことから、自食胞で消化する核を限定し、アが赤色に染色され、細胞質中に若干の緑色のスポッ

その中でアポトーシスと同じシステムを使い核を退トが観察された。また、接合前半の細胞の染色像も同化させているのかもしれない。

様であった。しかしながら、旧大核退化中の細胞を染色すると退化中の大核が緑色に染色された。また、退化中の減数分裂核も同様な染色像を示したが、退化していない小核、大核、大核原基は全く染色されなかった。退化中の核は自食胞内で消化されることから、蛍光試薬は自食胞内に局在していると考えられる。このことから、蛍光試薬の低pHに依存した局在の可能性［文献］
Davis MC et al. (1992) Dev. Biol. 154: 419-432.
Mpoke S and Wolfe J (1996) Exp. Cell. Res. 225: 357-365.
Bernardi P et al. (1999) Eur. J. biochem. 264: 687-701.
Desagher S and Martinou JC (2000) TICB 10: 369-377.
Crompton M (1999) Biochem. J. 341: 233-249.

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

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繊毛虫フロントニア属（Frontonia）の系統解析
月井雄二（法政大・自然科学センター）

Genetic structure of the genus Frontonia (Peniculida, Nassophorea)
Yuuji TSUKII (Lab. Biol., Sci. Res. Cent., Hosei Univ.)
SUMMARY
To know genetic relationships within and between species of Frontonia, RAPD (Random Amplified PolymorphicDNA) profiles of 25 stocks belonging to 5 different species (F. leucas, F. vernalis, F. marina, F. acuminata, F. depressa)
were examined. Totally 257 RAPD bands were detected using 20 primers. RAPD profiles of all species except F. leucas
were highly variable (up to 95% of dissimilarity). On the contrary, those of all 7 stocks of F. leucas were quite similar (upto 25% of dissimilarity or nearly identical when only major bands were compared). This is peculiar to this species whencompared to other Frontonia species as well as other ciliate species, e.g. Paramecium caudatum (Tsukii, 1996) or otherprotists, e.g. Chilomonas paramecium (Tsukii, 2001), suggesting that F. leucas is very young in the evolutionary history of
Frontonia or some unknown mechanism keeps this species homogenous. Two stocks of F. vernalis were found clearly
separated from those of F. leucas. Thus, it is highly possible that F. vernalis is not a variety of F. leucas as described by
Kahl (1933) but a valid species. Furthermore, 11 stocks of F. marina were subdivided into two groups based on their cell
shapes and these two subgroups were also separated on the RAPD tree.
［目的］フロントニア属の種内および種間の系統関係

そして0.5 U Taq polymerase (Perkins Elmer-Cetus)からを探るため，25の野外株から抽出した大核DNAを鋳型なる。PCR反応は変性が90℃で0.5分, annealing が30℃とするRAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 系

で1.0分，鎖の延長反応が50℃で4.0分のセットを30回

統樹を作成した。

繰り返した。

［材料と方法］実験に使用したフロントニア25株は日本（21株），U.S.A. (2株, 高橋 et al., 2000) および，ウルグアイ (2株, 高橋 et al., 2000)から採集された。その内訳はF. leucas ７株, F. marina 11株, F. vernalis 2株, F.
acuminata 4株 , F. depressa 1株であった。

アガロースゲル電気泳動によりバンドとして検出されたRAPD断片は，目視により各サンプルごとに比較し，一致するバンド数とバンドの総数を記録した。
これを元に，PHYLIP version 3.5 (Felsenstein, 1989) を用いてUPGMA法による系統樹を作成した。

細胞はプラスチック製のシャーレ（直径12cm，［結果と考察］ 25株のフロントニア細胞（F. leucas 7

Falcon 35-3025）に入れたKCM液（8μg/ml KCl, 13 μg/

株, F. vernalis 2株, F. marina 11株, F. acuminata 4株, F.

ml CaCl2, 25μg/ml MgSO47H2O）中で培養した。餌にdepressa 1株）から抽出した大核DNAを鋳型とし，20種は，F. vernalis 以外はChlorogonium elongatumを用いのプライマーでRAPD-PCRを行った。その結果，総数た。Chlorogoniumは無菌培養（8mg/ml 酵母エキス, 2mg/

257 本 の RAPDバ ン ド が 検 出さ れ た。そ の 中で，F.

ml 酢酸ナトリウム, 2mg/ml ブドウ糖）したものを遠心

leucas７株のRAPDバンドは非常に類似しており（不（1000 rpm, 3 min）してKCMで洗ってから与えた。

一致率は最大25％），主要なバンドだけで比較すると

F. vernalis (Hsf-31 ＆Hsf-32株)用には，緑藻類（接合ほぼ一致していた。

藻）の一種であるPenium margaritaceium を用いた。

これとは対照的に，他種のRAPD profiles（F. marina,

Penium細胞は，滅菌した0.02%ハイポネックス (5:10:5)

F. acuminata）は非常に変異に富んでいた（不一致率はとKCM液中で蛍光灯の下で培養した。

最大95%）。そのため，UPGMA法で作成した系統樹上

PCRに用いた鋳型DNAには，細胞を1% 酢酸, 1%

では種ごとに明瞭なグループを形成しなかった。これ

Nonidet P-40 及び 0.25Mショ糖液中で破砕して単離しは，フロントニア属では，RAPD法の検出感度が非常にた大核をSDS-phenol抽出したものを用いた。反応液は高かったことが影響していると思われる。すなわち，

総量30μlで，10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 2.5

いわゆる「変異が飽和」した状態に近づいたため，系

mM MgCl2, 300 μMずつのdATP, dCTP, dGTP, 及び統樹が正確な進化の道筋を表せなくなったのであろ

TTP, 0.01% Triton X-100, 0.6 μg primer, 5 ng 鋳型DNAう。類似の結果は，他の繊毛虫（Paramecium caudatum,

74

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

Tsukii 1996)，お よ び，他 の 原 生 生 物（Chilomonas
paramecium, Tsukii 2001）でも観察されている。
一方，共生藻をもつ２株（F. vernalis）は，系統樹上ではF. leucasから離れた位置にあった。これらの株は形態的にもF. leucas株とは明らかに異なっていた。このことはF. vernalis はF. leucasの変種（Kahl 1931）ではなく独立した種である可能性を強く示唆している。
なお，調査した25株のフロントニア細胞がもつ小核の形と数はいずれも各種に特徴的なものだった。また，細胞の外部形態もおおよそ記載にある特徴を示し
たが，11株のF. marinaは，典型的なF. marinaの特徴を示すもの（3株，先端部が幅広）と，やや異なるもの（8株，先端部は幅広ではない）に分かれた。これらは系統樹上でも明瞭な２グループに分かれた。したがって，今回，F. marinaとした8株は系統的にはF. marinaではなく，別種として扱うべきかも知れない。今後より詳しい調査が必要である。
［文献］
Felsenstein, J. (1989) Cladistics 5, 164-166.
Kahl, A. (1931) Urtiere oder Protozoa. I. Wimpertiere oder
Ciliata (Infusoria) p.316-322.
高橋 et al., (2000) ゾウリムシの種進化の研究, 平成11年度基盤研究(B)(2)(学術調査)研究成果報告書
Tsukii, Y. (1996) Europ. J. Protistol. 32, suppl. I, 165-169.
Tsukii, Y. (2002) Jpn. J. Protoz. p.50.

ミドリゾウリムシを用いたアクリルアミド毒性のバイオアッセイ
高橋利幸1，吉井昌信2，河野智謙1，小阪敏和1，細谷浩史1（1広島大・院理・生物科学，2㈱タイムアソシエイツ）

Bioassay of acrylamide cytotoxicity using the ciliate Paramecium bursaria
Toshiyuki TAKAHASHI1, Masanobu YOSHII2, Tomonori KAWANO1, Toshikazu KOSAKA1 andHiroshi HOSOYA1 (1Department of Biological Science, Graduate School of Science, Hiroshima
University, 2Time Associates Inc.)SUMMARY
The Swedish National Food Administration has announced that acrylamide (AA), a known carcinogen, has beenfound in elevated levels in starch-containing foods cooked at high temperatures (Press Release, WHO/32, 26 April, 2002).
Thus, elucidation of the mechanism of AA cytotoxicity to animal cells and a search for an inhibitor of AA cytotoxicity areurgently required. We have established a bioassay system using P. bursaria for assessing the effect of environmental
indicator substances. In this study, various amounts of AA were added to the culture medium of P. bursaria to investigate
AA cytotoxicity. At high concentrations (≥ 0.15%, w/v), a lethal effect of AA was observed on P. bursaria. At low concentrations (0.0015-0.05%, w/v), an inhibitory effect on proliferation of P. bursaria and a decrease in the number of endosymbiotic algae in P. bursaria were observed. Interestingly, in the presence of 0.005-0.015% AA, algae-free paramecia
were observed in the culture medium. These results indicate that the endosymbiotic algae in P. bursaria are more sensitive
to AA than other organisms such as brown trout and Crustacea. Taken together, these data indicate that P. bursaria as wellas its endosymbiotic algae are very useful indicators for assessing the effect of AA and AA cytotoxicity on animal cells.
［目的］最近、デンプンを含む食品を高温で加熱処理

室ではミドリゾウリムシ（ Paramecium bursaria ）を用すると食品中に発ガン性物質アクリルアミド（AA）がいて河川水を含む環境中の重金属イオンなど種々の生成されることが報告された（WHO, 2002; DS. Mot-

環境指標物質の生物毒性を検定するシステムを開発

toram et al., 2002; RH. Stadler et al., 2002）。この問題はしてきた（M. Tanaka et al., 2003）。本研究ではミドリ

我々が日常口にするポテトチップスやビスケットなゾウリムシを用いてAAの生物毒性を解析したのでそどの食品に有毒なAAが含まれているということを意の結果を報告する。

味しており、AAの作用機序の解明とその毒性を抑制する物質の探索を行うことは急務である。我々の研究［材料と方法］ 実験にはP. bursaria、MB-1株を用いJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

75

た。AAを含む培養液（濃度：0〜1.5％、w/v ）に対数に対するAAの影響を定量化するためにフローサイト

増殖期のミドリゾウリムシを加え細胞密度20 cells/ml

メトリーを用いて共生藻の細胞数及び共生藻あたりで培養した。ミドリゾウリムシをAA存在下で23±のクロロフィル蛍光強度を調べたところ、AA処理に

1℃、明暗サイクル12L:12D、照度1500 luxで７日間培よる共生藻の細胞数と共生藻あたりのクロロフィル

養し増殖を解析した。さらに光学顕微鏡と蛍光顕微鏡

蛍光強度の低下がみられた。

で AA 処 理 後 の ミ ド リ ゾ ウ リ ム シ を 観 察 し た（M.

すでに一部の魚類、甲殻類を用いてAAの毒性が調べ

Tanaka et al., 2002）。またAA処理５日後と７日後の培られている。今回の実験でミドリゾウリムシは魚類と養液中のミドリゾウリムシを超音波破砕し同程度のLC50値を示したが、共生藻はミドリゾウリム（BRANSON SONIFIER 450, BRANSON；out put 3； 90

シより低いLC50値を示し、AAに非常に高い感受性を秒）、フローサイトメトリー（Becton-Dickinson Im-

示す事が明らかになった。そのため、ミドリゾウリム

munocytometry system, San Jose, CA）を用いて共生藻のシは内部の共生藻を指標にすると高い感度でAAの毒細胞数及び共生藻あたりのクロロフィル蛍光強度の性を評価できる事が可能であることが明らかになっ変化を調べた。

た。

［結果及び考察］AAの生物毒性をミドリゾウリ［文献］

ムシの増殖を指標として調べるために、AA存在下で1 ) Press Release WHO / 32, 26 April 2002

ミドリゾウリムシを培養したところ、高濃度AA (≧2 ) DS. Mottram et al., ( 2002 ) Nature, 419,448-49.

0.15％、w/v ) 存在下でミドリゾウリムシは培養3日以3 ) RH. Stadler et al., ( 2002 ) Nature, 419, 449-50.

内に死滅した。また低濃度（0.0015−0.05％、w/v )では4 ) M. Tanaka et al., ( 2003 ) Environ. Chem. in press.

ミドリゾウリムシの増殖阻害と蛍光顕微鏡観察で細5 ) M. Tanaka et al., ( 2002 ) Acta Protozool., 41, 255-

胞内での共生藻数の減少が認められた。さらに共生藻

61.

核内共生細菌Holospora obtusaは宿主Paramecium caudatumのsurface antigen遺伝子の発現を抑制する
中村欽光，堀 学，藤島政博（山口大・理・生物）

Infection of endosymbiotic bacterium Holospora obtuse depresses surface antigen
gene expression of the host Paramecium caudatum
Yoshimitsu NAKAMURA, Manabu HORI and Masahiro FUJISHIMA(Biol. Inst., Fac. Sci., Yamaguchi Univ.)
SUMMARY
Holospora obtusa is an endonuclear symbiotic bacterium of the ciliate Paramecium caudatum. In order to identify
host genes of which expressions are altered by infection of H. obtusa, mRNAs expressed in bacteria-bearing cells(symbiotic cells) and non-bearing cells (aposymbiotic cells) were compared by differential display analyses. Twelve
aposymbiotic cell-specific and three symbiotic cell-specific cDNAs were detected. The putative amino acid sequence ofan aposymbiotic-specific cDNA bore a 64.9% similarity to a surface antigen of P. primaurelia stock 168G. Northernblot analysis with DIG-labelled cDNA as a probe showed that the surface antigen G homologous gene expressed only inthe aposymbiotic cell whereas not in the symbiotic cell. It was found that the cell surface antigen-like protein with morethan 200 kDa in molecular mass was extracted from the aposymbiotic cell by salt/alcohol extraction method, whereas notfrom the symbiotic cell. Indirect immunofluorescence microscopy with a monoclonal antibody specific for the extracted
surface antigen-like protein also showed that FITC-fluorescence appeared only on the cell surface of the aposymbiotic
cell, but not on the symbiotic cell. These results strongly suggest that infection of H. obtusa depresses surface antigen
gene expression of the host Paramecium caudatum.

76

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年［目 的］グ ラム 陰 性 細 菌 Holospora obtusaは、宿主
Paramecium caudatumの核内に共生する核内共生細菌である。この細菌は、宿主核に感染すると宿主と同調的に二分裂で増殖し、また宿主の生理状態に応じてその形態を変化させる(1)。ホロスポラと宿主の共生関係
は現在までのところ、次のようなことが明らかになっている。１）ホロスポラを持つパラメシウムは、寒冷地において見つかる。２）ホロスポラの影響により、宿主は温度ショック耐性の形質を獲得する。３）感染、維持は宿主株特異的である(2)。４）宿主、共生体双方のヒートショックタンパクの発現増加が見られる。こ
れらの事実は、ホロスポラの感染により宿主の遺伝子発現が変化することを示唆する。よって本研究は、発現の変化する宿主遺伝子の同定を、Differential display
法(3)でホロスポラを持つ細胞（Symbiotic cell）と、持たない細胞（Aposymbiotic cell）のmRNA発現を比較することによって行った。

細胞表面全体を認識する抗体を得た。
［結 果 と 考 察］Differential

display 法 に よ り、

Aposymbiotic cell特異的発現を12種類、Symbiotic cellで3種類同定した。Aposymbiotic cell特異的発現の1種類について今回詳しく調べた結果、推定のアミノ酸配列はP. primaurelia stock 168G surface antigen(4)（Accession
No. X52133）と64.9%の相同性を示した。またノーザン
ブロット解析により、このsurface antigen Gホモログ遺伝子の発現抑制を確認した。そこで実際にP. caudatumのsurface antigen様タンパクの発現量を比較した結果、Aposymbiotic cellでのみ検出され、その分子量は約300KDaであることが確認された。 P. primaureliaにおけるsurface antigenは分子量約300KDaのファミリータ
ンパクである(4)。繊毛を含む細胞表面タンパクに対するモノクローナル抗体を用いたAposymbiotic cell、Symbiotic cellの間接蛍光抗体法においても、この抗原がAposymbiotic cell特異的であることが示された。こ［材料と方法］細胞はP. caudatum Rb-1株を用いた。

れらの結果は、ホロスポラの感染により宿主の遺伝子

Aposymbiotic cell、Symbiotic cellそれぞれから抽出した発現が変化したことを強く示唆する。

mRNAをテンプレートとし、3’-anchored primerを用いてcDNAを合成した。このcDNAを用いて5’-arbitrary
primer、3’-anchored primerによるPCRを行った。PCR産
物は7M Ureaを含む、6%シーケンスゲルで電気泳動を行い、銀染色により検出した。特異的発現を示した
cDNA断片をクローニング、シーケンスし、相同性検索を行った。ノーザンブロット解析は、cDNA断片を再増幅しDIG-11-dUTPでラベルしたものをプローブとして用いた。salt/alcohol抽出法(5)でP. caudatumのsurface
antigenを抽出し、SDS-PAGE、銀染色で検出した。さらにその局在性を確認するため、モノクローナル抗体の作製を行った。抗原はWhole cellを用い、繊毛を含む［参考文献］(1) Fujishima, M., Nagahara, K. & Kojima, Y. (1990). Zool.
Sci., 7: 849-860.
(2) Fujishima, M. & Fujita, M. (1985). J. Cell. Sci., 76:
179-187.
(3) Liang, P. & Pardee, A. B. (1992). Science ., 257: 967971.
(4) Prat, A. (1990). J. Mol. Biol., 211: 521-535(5) Preer, J. R., Jr., Preer, L. B. & Rudman, B. M. (1981).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 11: 6776-6778.

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)77

ゾウリムシは核内共生細菌ホロスポラの感染によってヒートショック耐性を獲得する
河合美紀，山本亮，藤島政博（山口大・理・生物）

Paramecium caudatum acquires a heat-shock resistant nature by infection ofendonuclear symbiotic bacterium Holospora obtusa
Miki KAWAI, Ryo YAMAMOTO and Masahiro FUJISHIMA(Biol. Inst., Fac. Sci., Yamaguchi Univ.)
SUMMARY
Holospora obtusa is a macronucleus-specific bacterium of the ciliate Paramecium caudatum. Aposymbiotic cells,
reproductive form of H. obtusa-bearing and predominantly infectious form of H. obtusa -bearing cells were cultivated at
25°C, and then these cells were transferred to 4, 10, 25, 35, and 40°C . During 2-3 min after the temperature-shifts, thecells were photographed for 2 sec exposures and their mean swimming velocities were measured from lengths of theirswimming traces. Although the aposymbiotic cell almost ceased their swimming activity at both 4 and 40°C, the reproductive form-bearing cell showed active swimming velocities even under these temperatures. Predominantly infectious
form-bearing cell also showed similar swimming velocities with the reproductive form-bearing cell though the effect was
lower than that of the reproductive form-bearing cell. These results show that the host cell can acquire a heat-shock resistant nature if the cell was infected by H. obtusa in the macronucleus. This is the first evidence to show that Holospora
contributes to the host survival at unsuitable temperatures.
［目的］核内共生細菌ホロスポラ属はこれまでに９種鏡のステージに置いてから2-3分の１分間の間に２秒類が発見されているが（Fokin, et. al., 1996）、主に寒冷の露出時間で写真撮影した。フイルムはFujichrome

地に生息するパラメシウム属で発見されている。ま1600を使用し、顕微鏡のステージの温度の上昇を引きた、パラメシウム株を長期保存のために10 度で保存起こさないガラスファイバー照明をステージの左右すると、ホロスポラに感染している株の方が悲感染株から入れた。２秒間の露出時間に細胞が泳いだ軌跡のより生存率が高いことがよく起こる。これらの結果

長さをマップメーターで計り、各温度で87-100細胞のは、ホロスポラが感染したパラメシウムが低温耐性を軌跡を測定し、遊泳速度を平均値±SE (mm/sec)で示し獲得する可能性を示している。そこで、ホロスポラをた。遊泳速度の測定には、４，10，25，35，40±0.1度感染させた細胞と感染させていない細胞とを様々なの温度を使った。

温度条件下におき、その遊泳速度を比較した。

［結果と考察］ホロスポラオブツサが大核に感染した［材料と方法］Paramecium caudatumの株RB-1(接合型ゾウリムシの遊泳速度を測定すると、ホロスポラが感E4)の大核にHolospora obtusaのF1株を感染させた株と染してないゾウリムシでは沈殿して遊泳をほぼ停止

感染させていない株を実験に用いた。これらの株はレする４度や40度でも、遊泳できることが明らかになっタス培地を用いて25度で試験管培養した。実験には、 た。４，10，25，35，40度でのホロスポラが感染して最後に培養液を加えてから16−18時間の間の細胞をないゾウリムシの平均遊泳速度は、0.29±0.03、0.47±

使った。

0.04、1.42±0.07、1.78±0.08、0.32±0.04 mm/secであっ増殖曲線の定常期初期の約100細胞をスライドガラ

た。一方、増殖型ホロスポラオブツサを持ち感染型をスに乗せ、24 x 50 mmのカバーバラスをかけた。カバー

持たない宿主の平均遊泳速度は、0.49±0.02、0.76±

バラスの四隅には、4.5 x 24 mmのカバーガラスをはさ0.03、1.37±0.09、2.00±0.11、1.82±0.09 mm/sec、感染み、スライドガラスとカバーガラスの間に0.12-0.17 μ型を多数大核内に持つ宿主の場合は、0.299±0.03、mの隙間ができるようにし、この隙間で細胞が横方向

0.56±0.05、1.79±0.07、1.92±0.10、1.27±0.10 mm/secに自由に泳げるようにした。その後、このスライドガであった。３種の宿主は、温度の上昇が35度までなら、ラスを、温度を変化させることが可能なThermo plate

遊泳速度を上昇させた。しかし、４度では、増殖型を(Tokai Hit) の上に置いた。このThermo plateを実体顕微もつ宿主はホロスポラを持たない宿主の約1.7倍早く

78

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

泳いだ。さらに、40度では、増殖型のみをもつ宿主は間で失われることが原因と思われる（Fujishima et al.,ホロスポラを持たない宿主の約5.7倍早く泳ぐことが1991）。

できた。感染型を主に持つ宿主は、増殖型のみを持つ

宿主の生存に不適な温度条件下でも遊泳を可能に

宿主とは異なって、４度では、ホロスポラを持たないするヒートショック耐性の獲得は、悪温度環境からの宿主とほぼ同じ遊泳速度を示したが、40度ではホロス

早期脱出を可能にするもので、ホロスポラが宿主の生ポラを持たない宿主よりやや遊泳速度を早めたこと

存を助けていることを証明する証拠である。

が分かる。
この研究から、予測された低温だけでなく高温条件
でもホロスポラは宿主の生存に貢献していることが明らかになった。それにもかかわらず、赤道付近の高温地域に済むゾウリムシでホロスポラが発見された記録がない理由は、40度では感染型の感染能力が短時［文献］
Fokin, S.I., Brigge, T., Brenner, J. and Goertz, H.-D.
(1996). Europ. J. Protistol. Suppl. I, 19-24.
Fujishima, M., Nagahara, K., Kojima, Y. and Sayama, Y.
(1991). Europ. J. Protistol. 27, 119-126.

テトラヒメナの多機能タンパク質II：ペプチド伸長因子1αの多機能性の調節安藤邦恵，武内史英，上野裕則，沼田治（筑波大・生物科学系）

Tetrahymena multifunctional proteins II: regulation of multiple functions of peptide
elongation factor 1α
Kunie ANDO, Fumihide BUNAI, Hironori UENO and Osamu NUMATA(Inst. Biol. Sci., Univ. Tsukuba)
SUMMARY
Elongation factor-1α (EF-1α) is known to be a multifunctional protein. On ribosomes it functions as a peptide elongation factor, while in the cytoskeleton it functions as an actin-binding protein. In Tetrahymena, EF-1α has been reported to
localize to the division furrow during cytokinesis and has the ability to bind to filamentous actin (F-actin) and to form Factin bundles. With Ca2+/calmodulin (CaM), EF-1α cannot bundle F-actin even though it still binds to F-actin. Using gel
filtration column chromatography, we examined the native molecular weight of purified EF-1α in the presence or absenceof Ca2+/CaM, and revealed that EF-1α itself exists as a monomer, a dimer or a tetramer. Furthermore, EF-1α dimer seems tobe the most stable under conditions where it bundles F-actin in vitro. When Ca2+/CaM was added to EF-1α, EF-1α monomer increased, while the dimer decreased, suggesting that Ca2+/CaM changes EF-1α dimer into monomer and inhibits Factin bundle formation. On the other hand, EF-1α monomer functions as a peptide elongation factor on ribosomes. Therefore, these results support the idea that the multiple functions of EF-1α are regulated by oligomer formation.
［目的］ヒューマンゲノムプロジェクトの結果、遺伝に、いろいろなステップに対応する多機能蛋白質が存子 の 数 は 31,000-39,000 で あ る こ と が 判 っ た

在することにより、生物は限られた遺伝子を効率的に(International Human Genome Sequencing Consortium,2001)。生命現象に関わる蛋白質の数は約40万〜100万

利用している。」という仮説を提唱する。この仮説をと言われている。約４万の遺伝子から転写されたくみを検討してきた。今回は繊毛虫テトラヒメナの多証明するために我々は多機能蛋白質の機能発現のしmRNAのalternative splicingや蛋白質の翻訳後修飾に機能蛋白質の１つであるペプチド伸長因子1α（EF-1

よって、40万以上の蛋白質が合成されていると考えらα）に注目した。EF-1αはペプチド伸長因子として機れている。しかし、我々は一つの蛋白質が多数の機能能するとともに、アクチン繊維に結合してアクチン繊を持つ多機能蛋白質の存在も重要であると考え、「生維を束ねる働きがあり(Kurasawa et al., 1996)、細胞質分命現象の各ステップに1:1で対応する蛋白質ととも裂時には分裂溝に局在して収縮環アクチン繊維束形

Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

成に関与している(Numata et al., 2000)。EF-1αのアク2.

チン繊維束を束ねる働きがどのように調節されているかを検討し、オリゴマー形成が重要であることを明79

Ca2+/カルモデュリンはEF-1αのダイマーを壊し
モノマーにする働きがある。

3.

EF-1αはダイマーを作ってアクチン繊維を束ね、Ca2+/カルモデュリンはEF-1αダイマーをモノらかにしたので報告する。
［材料と方法］テトラヒメナEF-1αのオリゴマー形成を80 mM KCl条件下でゲルろ過カラムSuperdex 200(Amersham Pharmacia)を用いて検討した。また、EF-1αのオリゴマー形成に及ぼすCa2+/カルモデュリンの影
響もゲルろ過カラムを用いて検討した。オリゴマーの分子量はゲルろ過カラム分子量測定キット(Amersham
Pharmacia)を用いて決定した。

マーにすることによって、EF-1αのアクチン繊維束形成能を阻害する。
以上の結果から、我々はEF-1αのアクチン繊維束形
成に関してEF-1αダイマーモデルを提唱する。
Condeelisらは細胞性粘菌を用いて、pHが上昇するとEF-1αはアクチン繊維から離れてアミノアシル
tRNAに結合し、ペプチド伸長過程で機能すると報告している(Liu et al., 1996)。

［結果と考察］80 mM KCl条件下で、EF-1αを Su-したがって、EF-1αのペプチド伸長因子としての機

perdex 200にかけた結果、EF-1αが３つのピーク、ピー

能とアクチン繊維結合能はpHによって調節されておク１、２、３を形成することが判った。ゲルろ過カラ

り、EF-1αのアクチン繊維束形成はEF-1αのダイマー

ムの溶出量から分子量の検量線を作成し、３つのピー形成によって調節されいると考えられる。

クの分子量を決定した。ピーク１は分子量50kDa、ピー
ク２は100 kDa、ピーク３は220 kDaであった。したがって、ピーク１はEF-1αのモノマー、ピーク２はダ
イマー、ピーク３はテトラマーであることが判った。
2+

次に、これらEF-1αオリゴマーに対するCa /カルモ
デュリンの影響を調べた。Ca2+/カルモデュリンはEF-1
αダイマーを減少させ、EF-1αモノマーを増加させていることが判った。
今回の結果から次の結論が得られた。
1.

EF-1αはオリゴマーを作る性質がある。

［文献］
International Human Genome Sequencing
Consortium. (2001) Nature 409, 860-921.
Kuraswa, Y., Hanyu, K., Watanabe, Y. and Numata, O.
(1996) J. Biochem. 119, 791- 798.
Liu, G., Tang, J., Edmond, B. T., Murray, J., Levin, S.
and Condeelis, J. (1996) J. Cell Biol. 135, 953-963.
Numata, O., Kurasawa, Y., Gonda, K. and Watanabe,
Y. (2000) J. Biochem. 127, 51-56.

ゾウリムシを用いた負の走地性の解析
木下豊彰（早大・理工・生命理工）

Analysis of negative-gravi-responses in Triton-extracted models
of Paramecium caudatum
Toyoaki KINOSHITA (Dept. of Physics, School of Science and Engineering, Waseda Univ.)
SUMMARY
I analysed gravitactic behavior of Paramecium caudatum and Triton-extracted-models of Paramecium in media
whose specific gravities had been increased from 1.00 to 1.04 and 1.08 by addition of Percoll. Paramecium in the solution
with a specific gravitiy of 1.08 showed positive gravitaxis, and in a specific gravity of 1.04 showed no gravitaxis. However, Triton-extracted-models in the solution with a specific gravity of 1.08 showed negative gravitaxis. This could beinterpreted to mean that Triton-extracted-models show negative gravitaxis but rise due to buoyancy. Then, I recorded andanalysed the sedimentation rate (S), the gravity-independent rate of propulsion (P), and the inclination angle of the cell (θ;0°=horizontal) of Triton-extracted-models. The upward speed of Triton-extracted-models is given by ∆Y = S + P sinθ.
Integrating this, the result is positive, suggesting that the Triton-extracted-model essentially shows negative gravitaxis.
This suggests that the physical structure of Paramecium is one factor in negative gravitaxis.

原生動物学雑誌 第36巻 第1号 2003年

80［目的］多くの単細胞生物は，重力に逆らって上方へ

験液中では、配向角は負であったが、時間とともに泳ぐ「負の走地性」なる性質を有する。なぜこのよう増加傾向にあった。また、細胞の比重は生きた細な現象が起きるのかを解明することは、生物と重力の胞・triton モデル細胞共に増加傾向であった。このこ

関わりを考える上で非常に重要である。負の走地性をとより、Triton モデルは、比重 1.08 の実験液中で考える上でのモデルとして、大きく次の二つが考えらは、本来は下向きの走地性であるが、triton モデルはれる。細胞の物理的特性から負の走地性を説明する

推進力が弱い為、浮力に負けて上に向かったと予測「物理モデル」、そして重力が繊毛打の方向や強さにされる。また、沈降速度 S(t)、推進速度 P(t)、細胞の影響を与え、その結果負の走地性が生じるという「生配向角θ(t) として、それぞれを実験で求めた値から近理学モデル」である。ここでは物理モデル的側面から、 似すると、ほぼ一次関数となる。
負の走地性のメカニズムを解明するヒントを得ることが目的である。
［材料と方法］比重が 1.00、1.04、1.08 の 3 種類の実験
液を Percoll を用いて用意し、生きた P.caudatum とTritonX-100 で処理し ATP で再活性化させた Triton モ
デルを用いて、走地性を調べた。実験容器は縦 20 mm、横 10 mm、暑さ 2 mm で、それを垂直に立てて使用する。容器を上下半分に区切り、上下それぞれの細胞数を B、A とし、走地性指数Φ＝ (B-A)/(B+A) とする。容器内で泳がせた細胞をビデオ撮影し、細胞の平均配向
角θ (垂直方向を 0 とする) を求めた。また比重 0.002単位の実験液を用意し、一定時間 1.08 の実験液に放置∫ (S(t)+P(t)sinθ(t))dtを求めると正になる。
以上より、外液の比重が 1.00 では上向き、
外液の比重が1.04では横ばい、外液の比重が 1.08 では下向きに向かい、かつ細胞自身の比重が増加するにしたがって、走性が下向きの傾向は弱まっていき、これはゾウリムシの構造的な要素によるものであるといえる。すなわちこれは、外液の比重 1.00 と細胞の比重約 1.04 の差によって負の走地性を生ずるような細胞体の構造を、ゾウリム
シは持っていることを示唆する。

した細胞を移し、さらにニッケル麻酔を施し、沈降を［文献］調べることにより、比重 1.08 中での細胞の比重の時間

Mogami,Y. et al. (1993) 10th ISAS Space Utilization
Symposium July 82-85.

変化を測定した。
［結果と考察］生きた細胞での走地性Φは、比重1.00 の実験液では上向き、比重 1.04 で横ばい、比重1.08 で下向きの走性を示した。一方 Triton モデル細胞では 1.00、1.04 では同じような走性であったが、Braucker, R. et al.(1994) J. exp. Biol., 197: 271-294.
Mogami,Y et al. (1995) 宇宙生物科学 Vol.9 No.1, 17-34.
Shigenaka,Y. (1988)原生動物の観察と実験法-共立出版
Fukui,K. Asai,H (1985) Biophys. J., 47: 479-482.

1.08 では上向きの走性を示した。また比重 1.08 の実

３ナノメタ−直径バイオフィラメントのCa2+結合シグナル変換機構
浅井 博，板橋岳志（早稲田大・理工・生命理学）

Transduction of Ca2+-signaling and its energy in 3 nm-diameter biofilaments
Hiroshi ASAI and Takeshi ITABASHI (Graduate School of Science and Engineering, Waseda Univ.)
The spasmoneme composed of a bundle of 2-4 nm-diameter filaments in a stalk of protozoan ciliate Vorticellidae
contracts in the presence of micrmolar amounts of free calcium ions (Ca2+) in vitro and in vivo. The contraction can takeplace many times by changing the ambient Ca2+ in the medium without involving in a direct hydrolysis of ATP or any
other organic substrate. Thus, the binding of Ca2+ to a spasmoneme protein is thought to be the immediate source of contraction energy. We have determined cDNA sequences encoding the two kinds of Ca2+-binding proteins (spasmin 1 andJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 1. (2003)

81

spasmin 2) in spasmoneme of Zoothamnium arbuscula strain Kawagoe. Furthermore, it was demonstrated that a thermally flexible protein in 2-4 nm-diameter filament is a probable candidate for elastically, in another word entropically,
contractile one (200 kDa or its monomeric 50 kDa protein). Transduction of Ca2+-signalling and its energy in the 3 nmdiameter bofilaments was discussed.
［目的］直径が約３ナノメ−タ−の細いバイオフィ

３ナノメ−タ−フィラメントは、少数の折れ曲がり

ラメントは、動物および植物のあらゆる真核生物細セグメントからなる。絶対温度vs．張力発生の関係

胞内に存在すると、著者らは考えている。0.3 µMのでは、温度依存性が高い。温度変化または張力変化

溶媒中のカルシウムイオン（Ca2+）濃度で、収縮すに伴い水素結合の解離・再結合をくりかえしているる。Ca2+ 濃度を下げれば、再び伸長する。３ナノメ

可能性が高い。上記どちらもゴム弾性の（セグメン−タ−巾バイオフィラメントの収縮の直接的なエネト 数）×（１ セ グ メ ン ト の 分 子 量）は 同 じ で、約2+

ルギーは、スパズミンと呼ばれるCa 結合タンパク

50 kDaとなった。スパズミンは、Ca2+ 存在中で二量とカルシウムイオンとの結合のエネルギーによる。

体を形成し易い。ヴォルチセラやカルケシウムでは

そのエネルギーの大きさは、ＡＴＰの加水分解エネ

そうでないが、ズーサムニウムの巨大種のスパズミ

ルギーとほぼ同じ大きさである。ちなみに、この結ン１とスパズミン２のCa2+ 結合能は、夫々大きく食合エネルギーもＡＴＰ加水分解エネルギーも、８個い違っている可能性が高い。したがって、半分収縮の分子または原子の常温中での三次元的運動エネル

でのCa2+ 結合のヒルパラメーターは、1.2 ~ 1.7 と小ギーの大きさに相当する。緑藻類などの鞭毛の基部さくなる。スパズミンによるCa2+ 結合のエネルギーの鞭毛小根にも、３ナノメ−タ−巾バイオフィラメ

が何らかのメカニズムで、50 kDaタンパクに移送さ

2+ントの束が存在し、Caの添加によって収縮するこれる。言い換えれば、スパズミンは張力エネルギー

しセンサーの役割とファイマンの言うラチェットの役

かし、スパズミンではなくて、カルトラクチンとか割を担っている。以上の所見から３ナノメ−タ−巾セントリンと呼ばれる。セントリンは、Yeast Cell や

バイオフィラメントのCa2+ 励起収縮メカニズムのモ

Hella Cell にも存在する。セントロゾームに存在する

デルが容易に浮かんでくる。

とが、１９７８年以降知られるようになった。

からである。しかしYeast Cell を含めて多細胞生物の細胞では、３ナノメ−タ−フィラメントは、まだ見つかっていないし、セントロゾーム内のセントリンの役割もまったく不明のままである。スパズミン、
カルトラクチン、セントリンは、４個乃至４個以下のCa2+ 結合 EF-hand モチーフを持ち、カルモデュリ
ンのスーパーファミリーに属する。

［結語］以上述べてきたように、単細胞繊毛虫類ツ
リガネムシの３ナノメ−タ−巾フィラメントのCa2+励起収縮のメカニズムを、ほぼ明らかにしたと、本発表者は考えている。１９３０年代から１９５０年
代にかけて、筋肉の運動メカニズムは、ゴム弾性的
すなわちエントロピー的であると、多くの著名な高分子学者や生物物理学者は、素朴にまた期待をこめ［ゴム弾性的収縮の３ナノメ−タ−フィラメントのて、考えてきた。その夢が、まったく異なる運動器

構造モデル］ズーサムニウムの巨大種（Zoothamnium

官の３ナノメ−タ−巾バイオフィラメントで、実現

arbuscula strain

Kawagoe）の 分 離 し た ス パ ズ モ

され た。今後の 問題は、３ナノメ−タ −巾バイオ

ネームの伸長度 vs. 張力発生の実験、その他タンパク

フィラメント（多細胞生物にも有るとして）の生物

質類の性質などの研究から、次のことが解った。

学的役割を解明することであろう。

2+

多分、Ca2+ シ

Ca 存在中の３ナノメ−タ−フィラメントは、ほぼ

グナリングを伴う機械受容機構と関係しているかも

完全にゴム 弾性的である。すなわ ち、等尺 性張力しれない。

は、絶対温度に比例した。Ca2+ が存在しないときの