栃木農試研報 No.68：15 ～22（2012）
Bull. Tochigi Agr. Exp. Stn. No.68：15 ～22（2012）

両性生殖性系統と単為発生性連鎖マーカーを利用した
ニラ四倍体 F1 集団における休眠性および抽だい期の変動齋藤容徳１）・大島一則２）・松本紀子３）・癸生川真也・中澤佳子・天谷正行４）

摘要：両性生殖性ニラ系統と単為発生性に連鎖した DNA マーカーを利用することで，これまでは不可能であった規模の大きい F1 集団を作成することに成功した．特に，ニラの休眠性に関しては晩生が優性であることと複数の遺伝子が関与することが明らかとなった．また,開花期についても同様に複数の遺伝子が関与していることが明らかとなった．両性生殖性で，開花期や草姿等の農業形質に優れる 5 つの中間母本系統を育成した．

キーワード：ニラ，交雑育種，単為生殖，単為発生，中間母本，抽だいNovel breeding system of Chinese chive( Allium ramosum, syn. A.tuberosum
2n=4x=32）using the amphimixis strain: Parthenogenesis-linked
marker revealed a quantitative variation of dormancy
and flowering time in the F1 cross population

Yoshinori Saito, Kazunori Osima, Noriko Matumoto, Shinya Kebukawa,
Yoshiko Nakazawa,，and Masayuki Amagai

Summary: A chinese chive (Allium ramosum)F1 cross population was prepared by means of theamphimixis strains and parthenogenesis-linked markers against apomixis. The dormancy and flowering
pattern were investigated in these F1 populations, and the results revealed that a late type of dormancy
seemed to be dominant and controlled by the quantitative trait locus (QTL). In the same way, theflowering pattern varied significantly and continuously over a month; this pattern also seemed to becontrolled by the QTL. On the basis of the results of this study, five amphimictic strains were selected asparental lines with three degrees of dormancy and two types of flowering times..

Key words: Chinese chive , Cross breeding,Apomixis, Parthenogenesis, Parental line,flowering1)現栃木県塩谷南那須農業振興事務所，2)現栃木県上都賀農業振興事務所，3)現栃木県農業大学校, 4)現栃木県農政部経営技術課 （2012.3.8受理）

15栃木県農業試験場研究報告Ⅰ

第 68 号

らかとなった(中澤ら，2006)．さらに天谷ら(2010)は非緒 言

単為発生系統「97-12-102」×単為生殖品種「テンダーポ

栃木県では，1985 年からニラ（Allium ramosum，syn．

ール」の交配から作成した F1 集団を利用し，バルクセグ

A．tuberosum 2n=4x=32）の品種育成に取り組んでおり，レガント法（Michelmore ら，1991）により単為発生性にこれまでに「きぬみどり」(木村，1995),ネギとニラの種連鎖する DNA マーカー（PLM:Parthenogenesis Linked

間雑種「なかみどり」(天谷ら，1995)を開発した．しかMarker）を開発した．

し，ニラは一般的に条件的単為生殖性を有しているため

本論文では，両性生殖性個体と単為発生性連鎖マーカ(Kojima and Nagato，1992)，交雑率が低く遺伝的変異導ーを利用し，ニラの交雑育種に取り組み，重要な選抜形入の障壁となっている．ニラの単為生殖は複相胞子生殖質である開花期と休眠性の変動について調査を行うとと(Diprospory）と呼ばれており，非減数性卵細胞を生じるもに，優れた農業形質を持つ両性生殖性中間母本の育成

複相大胞子形成（Apomeiosis）に続き，偽受精（Pseudogamy）に成功したので報告する．

を経て単為発生（Parthenogenesis）が起こることで，胚Ⅱ材料および試験方法

珠親と同じ遺伝子型のクローン種子が形成される ．
中澤ら(2005)は，F1 交雑個体の早期選抜を目的として，

試験１

花粉親に特異的な RAPD（Random Amplified Polymorphic

両性生殖性個体を胚珠親とした交雑集団の作成DNA）マーカーを利用した．この結果，栃木農試で 1997

第 1 図に示す方法により 2004～2007 年に両性生殖性個～2006 年に単為生殖性品種・系統同士を交配した 48 組体（｢97-12-102」および｢00-3-81」）を胚珠親とし，花粉合せから得られた実生 6,445 個体において，交雑個体と親に単為生殖性個体を用いて 17 組合せの交配を実施し判定されたのは全体の 7.5%であった．定植前に交雑個体た（第 1 表）．得られた種子はそれぞれ翌年の 3 月に播種選抜が可能となったことで定植個体数は従来の約 1/10し，実生の葉身から CTAB 法(Cetyl Trimethyl Ammoniumに減ったが，育種に必要な集団の規模を確保するためにBromide)により DNA 抽出を行い，単為発生性連鎖マーカは，依然として交雑率の高い胚珠親の育成が望まれる結ー検定を行った．2004 年は PLM1 のみを使用し，その他果であった．そこで交雑を確認した F1 個体に着目し，受の年次では PLM1 および PLM3 を使用して生殖性の検定を

粉前に胚珠の分裂を観察したところ非単為発生個体行った．

「97-12-102」，「00-3-81」が見つかり，その後の検定交
試験２

配により 100％の交雑率が確認されたことから，これら交雑集団の休眠性および抽だい性の特性調査は両性生殖性（Amphimixis）であることが判明した．さ

試験 1 の結果，2004 年交配の交雑集団で PLM1 が有る

らに，単為発生性に関する遺伝解析の結果，ニラの単為360 個体と，2005～2007 年交配の交雑集団で PLM1 と PLM3

発生性は優性の１因子によって支配されていることが明がともに有る 787 個体およびともに無い 384 個体を露

1 年目

胚珠親×

花粉親

採種

（両性生殖性） （単為生殖性）

2 年目

播種

葉身から DNA を抽出し，PLM で生殖性確認（１ケ月後）

PLM 有り単為発生性個体
１株毎にほ場定植（品種育成）

PLM 無し非単為発性個体
１株毎にほ場定植（中間母本育成）

２～３年目

系統選抜：ほ場に定植した株の休眠性，抽だい性及び農業形質で選抜

４年目以降

特性検定，生産力検定へ

第 1 図 ニラの両性生殖性個体を胚珠親とした育種システム
16

両性生殖性系統と単為発生性連鎖マーカーを利用したニラ四倍体 F1 集団における休眠性および抽だい期の変動

地ほ場に定植し，同年 12 月に休眠性を調査した．休眠性オリンパス社）で卵細胞分裂の有無を観察した．各系統

は，極端に生育の悪い個体は除き，株の枯上がり等で判とも 50 個の卵細胞について調査した．

断し，｢スーパーグリーンベルト」との比較で，「浅い」，「並」，「深い」の 3 段階で区別した．

試験４

また，交雑集団の抽だい性は，定植翌年の 6～9 月に調両性生殖性中間母本と単為生殖品種｢ワンダーグリーンベルト」との交雑集団の休眠性および査した．調査は極端に生育の悪い個体を除き，個体毎に抽だい性の特性

出蕾の有無を 7～10 日毎に行い，出蕾開始時期から出蕾

試験 3 で選抜した 5 系統（「05-2-196」，「05-2-223」，終了時期の期間で分類し，その種類数を出蕾パターン数「05-2-273」，「05-4-172」，「05-4-185」）を胚珠親とし，として算出した．

2008 年 7～9 月に単為発生性連鎖マーカー（PLM1 およびPLM3）がともに有る単為生殖品種｢ワンダーグリーンベル

試験３

両性生殖性ニラ中間母本の育成ト」を花粉親とした交配を実施した．2009 年 3 月に，得2005 年の交配で得られた，単為発生性連鎖マーカーられた種子を播種したところ 607 個体が発芽した．これ（PLM1 および PLM3）がともに無い 142 個体を，2006 年 8らについて単為発生性連鎖マーカーによる検定を実施し，

月 25 日に露地ほ場に定植した．休眠性を 2006 年 12 月に単為発生性連鎖マーカーがともに有る個体および単為発試験 2 と同様の方法で調査し， 2007 年 9 月に，株当た生性連鎖マーカーがともに無い個体を，2009 年 7 月 31

りの茎数，葉幅（葉の中間の位置），葉鞘長および草姿（開日に露地ほ場に定植した．また，PLM1 および PLM3 がと帳性～立性）を測定し，抽だい性を試験 2 と同様の方法

もに無い個体の一部については中澤ら(2005)の方法によで調査した．形質の優れた 5 個体を選抜し，胚珠透明化

り花粉親に特異的な RAPD マーカーを用いて，交雑の確認法で生殖性の確認を行った．開花当日の小花から柱頭をを行った（データ未掲載）．2009 年 12 月に交雑集団の休除去し，未受粉で 4 ないし 5 日経過後の胚珠を観察材料

眠性を調査し，2010 年 7～9 月に交雑集団の抽だい性をとし，小島（Kojima and Nagato，1992）の方法に従い透調査した．調査方法は試験 2 と同様とした．

明化処理を行い，ノマルスキー型微分干渉顕微鏡（BX61，
第 1 表 ニ ラ 両 性 生 殖 性 個 体 を 胚 珠 親 に 用 い た F １集 団 に お け る 単 為 発 生 性 連 鎖 マ ー カ ー による選抜結果
交配組み合わせ供試
PLM1とPLM3がPLM1とPLM3が個体ともに有る個体 １） ともに無い個体

2004年交配04-1-2

97-12-102
97-12-102

×ｽｰﾊﾟｰｸﾞﾘｰﾝﾍﾞﾙﾄ

10460

44×

ﾜﾝﾀﾞｰｸﾞﾘｰﾝﾍﾞﾙﾄ

80

67

13-397-12-102

×

漢中冬ニラ西安116-400-3-81

×ｽｰﾊﾟｰｸﾞﾘｰﾝﾍﾞﾙﾄ

71

69( 3 2 ) 2)
36

35

86

42-500-3-81

×ﾜﾝﾀﾞｰｸﾞﾘｰﾝﾍﾞﾙﾄ

128-600-3-81×

漢中冬ニラ西安265

203( 7 9 )２）

4762

2005年交配
05-1

×

中国ニラ

236

95

8-2

97-12-102
97-12-102

×

ｻﾝﾀﾞｰｸﾞﾘｰﾝﾍﾞﾙﾄ

262

82

81-300-3-81

×

中国ニラ

28

69-400-3-81

×

ｻﾝﾀﾞｰｸﾞﾘｰﾝﾍﾞﾙﾄ

190

5844

2006年交配06-1×

ﾀﾌﾎﾞｰｲ19386

33-297-12-102
97-12-102×

SK78

1504380-397-12-102×

ニコニコ太郎200

10658

2007年交配07-1-297-12-102
97-12-102×04-4-431169318×

ﾊﾟﾜﾌﾙｸﾞﾘｰﾝﾍﾞﾙﾄ

161

77

13-397-12-102×

杭州ニラ

141

113

23-400-3-81×

漢中冬ニラａ50

281724911308627

小計

注1.2004年の6組み合わせはPLM1で検定し，2005～2007年の11組み合わせはPLM1,3で検定した.
2.ほ場の都合でカッコ内の数量を定植し，供試材料とした．

17栃木県農業試験場研究報告

Ⅲ

結果

第 68 号の深い｢パワフルグリーンベルト」を用いた交雑集団からも休眠性の浅い個体が出現した（第 2 表）．

試験 1 両性生殖性個体を胚珠親とした交雑集団の作成

胚珠親に休眠性が深い｢00-3-81」を用いた 6 組合せの17 組合せの交配から，計 2,491 個の種子が得られた．

交雑集団では，花粉親に休眠性が浅い｢ワンダーグリーン

これらから得られた実生苗について DNA マーカーによベルト」を用いた場合のみ休眠性の浅い個体が出現した

る生殖性の調査を行った結果，PLM1 と PLM3（2004 年が，他の組合せでは休眠性の程度に関係なく出現しなかについては PLM1 のみ）をともに持ち，単為発生性と推った．特に，休眠性の浅い｢中国ニラ」と，休眠性の深い定された個体が 1308 個体(52.5%），PLM がともに無く非｢漢中冬ニラ西安」および｢漢中冬ニラ a」を交雑した集単為発生性と推定された個体が 627 個体(25.2%）が得ら団では，全ての個体の休眠性が深いと判定された（第 2れた（第 1 表）．

表）．
交雑集団内での抽だい性の変異幅が大きく，出蕾開始

試験 2交雑集団の休眠性および抽だい性の特性時期から出蕾終了時期の期間で分類した出蕾パターン数

胚珠親に休眠性が並の｢97-12-102」と，花粉親に休眠は，交雑集団（｢97-12-102」×｢ワンダーグリーンベルト」）性が浅い｢ワンダーグリーンベルト」他 6 品種・系統を交が一番多く，25 パターンが確認された．2004 年交配で，雑した集団では，花粉親が｢ワンダーグリーンベルト」，胚珠親に｢97-12-102」および｢00-3-81」に｢ワンダーグリ｢04-4-43」，｢杭州ニラ」および｢サンダーグリーンベルト」ーンベルト」を交配すると，出蕾パターン数はそれぞれの交雑集団では休眠性が浅い個体が出現した．特に｢ワン25 パターンおよび 22 パターンであったが，｢漢中冬ニラダーグリーンベルト」との組合せでは 15％の休眠性の浅西安」で交配した抽だいパターン数は，それぞれ 10 パタい個体が出現した．休眠性の浅い個体が出現しなかったーンおよび 13 パターンと少なかった．また，胚珠親に3 組合せでは，休眠性の深い個体の割合が並の個体の割｢00-3-81」より｢97-12-102」を用いたほうがその交雑集団合よりも多い傾向が認められた．また，花粉親に休眠性の出蕾開始期は早まった（第 2 表）．

18両性生殖性系統と単為発生性連鎖マーカーを利用したニラ四倍体 F1 集団における休眠性および抽だい期の変動殖性であることが強く示唆された．

試験 4

両性生殖性中間母本と｢ワンダーグリーンベルト」との交雑集団における休眠性および抽だい性の特性

両性生殖性中間母本と｢ワンダーグリーンベルト」との交雑集団の休眠性は，胚珠親により異なる傾向を示した．
最も休眠性の浅い個体の出現頻度が高かったのは，共に休眠性の浅い同士の組合せとなった｢05-2-196」×｢ワンダーグーンベルト」であったが，その次に高かったのは休眠性がやや深い｢05-4-185」×｢ワンダーグリーンベルト」の組合せであった．その他の 3 組合せからは休眠性の浅い個体は出現しなかったが，休眠性が並の｢05-2-223」
試験 3

両性生殖性ニラ中間母本の育成

2005 年に交配した 4 集団において，単為発生性連鎖マーカーPLM1 と PLM3 がともに無い 142 個体の中から，農業形質，休眠性および抽だい性が優れる 5 系統を用いた集団では，休眠性がやや深い｢05-4-172」 と｢05-2-273」を用いた集団に比べて並の個体の出現頻度が若干高い傾向が認められた（第 4 表）．
また，交雑集団の抽だい性も胚珠親に用いた中間母本（｢05-2-196」，｢05-2-223」，｢05-2-273」，｢05-4-172」，系統毎に異なっており，出蕾開始時期の変動幅は約 1 ｹ｢05-4-185」）を選抜した（第 3 表）．｢05-2-196」は休眠月にも渡っていた．｢05-4-185」×｢ワンダーグリーンベ性が｢スーパーグリーンベルト」より浅く，｢05-2-223」

ルト」の交雑集団が最も早く 7 月第 2 週より出蕾が確認

は休眠性が｢スーパーグリーンベルト」並で草姿が立性でされたが，｢05-4-172」 ×｢ワンダーグリーンベルト」のあり茎数が多く，｢05-2-273」および｢05-4-172」は草姿交雑集団ではこれより 1 ヶ月後の 8 月第 2 週から出蕾がが立性で抽だい期間が短く，｢05-4-185」は立性で葉幅が確認された．開花期間についても中間母本系統毎に異な広いという特徴を持っている．これらについて胚珠観察っており，抽だい開始時期が早い系統ほど，開花していによる生殖性の確認を行った結果，｢05-4-172」は卵細胞る期間も長い傾向が認められた．交雑集団の出蕾パターが不明瞭で確認できなかったが，他の 4 系統は卵細胞のンは，｢05-2-273」 ×｢ワンダーグリーンベルト」が一番分裂が確認されなかったため，両性生殖性であると推察

多く 35 通りで，｢05-2-223」 ×｢ワンダーグリーンベルされた． また，試験 4 のワンダーグリーンベルトとの交ト」が一番少なく 7 通りであった（第 5 表）．

雑集団において，PLM1 と PLM3 による交雑検定以外にもワンダーグリーンベルト特異的な RAPD マーカーを利用した確認を行った結果，検定した全ての個体で交雑が確認されたたことから，選抜した中間母本 5 系統は両性生
19栃木県農業試験場研究報告20

第 68 号

両性生殖性系統と単為発生性連鎖マーカーを利用したニラ四倍体 F1 集団における休眠性および抽だい期の変動

Ⅳ考察

休眠性は晩生が優性であると推察された．しかし，休眠性が浅いもの同士を交配した｢05-2-196」×｢ワンダーグ

野菜品種の約 82%は F1 品種であり(伊東，2009)，ニラ

リーンベルト」の F1 において，休眠性が深い個体の出現と同じネギ属のタマネギ(勝又，2003)およびネギ(馬上・頻度は低下するものの，休眠性が浅い個体の出現頻度が上原，1985)では，細胞質雄性不稔の特性を利用した F1有意に高くはならなかった．この結果は，休眠性が単純育種が行われ，生産性と品質の向上が図られている．しな主動遺伝子に支配されておらず，複数の遺伝子が関与かし，ニラは条件的単為生殖性植物であるため交雑率がすることを示しており，同時に休眠性という形質の評価低く，現在のところ交雑育種はほとんど行われていない．

方法について，今回用いた 3 段階評価は適切ではなく，本研究ではニラ育種手法発展のための第１歩として，こ連続的な変動性を考慮し，評価段階数をより多くするなれまでに開発した単為発生性連鎖マーカーを実際の育種どの工夫が必要であろう．また，休眠性が深い｢05-4-185」に利用し，多様な農業形質を持つ優良な両生生殖性中間×｢ワンダーグリーンベルト」の F1 集団からも休眠性の母本を育成することができた．

浅い個体が出現したが，同様の結果が 2004 年交配系統の今回育成した両生生殖性中間母本の最も有用な特徴は，休眠性が深い｢00-3-81」×｢ワンダーグリーンベルト」か全てが交雑率が高いことである．これまでの単為生殖性らも得られている．さらに，休眠性が並の｢97-12-102」

胚珠親を用いた交雑率は，1997～2006 年の試験結果では×｢ワンダーグリーンベルト」では休眠性の浅い個体の出7.5%であったことから，今回育成した両生生殖性胚珠親現頻度が最も高い結果が得られた．｢ワンダーグリーンベを用いることで大幅な交雑率の向上が可能である(中澤ルト」には休眠性の浅い個体の出現頻度を高める因子がら，2006)．本研究において供試した 2,491 粒の F1 種子を存在しているのかもしれない．休眠性の評価を詳細に行

従来の単為生殖性品種同士の交雑で得るには，33,000 粒

い QTL 解析を行えば，ニラの休眠性に関する知見が得ら以上もの種子が必要であることからも，両性生殖性は交れるであろう．あるいは，単為発生性に関するマーカー

雑育種において最も効果的な形質である．また，選抜し開発に使用したバルクセグレガント法(Michelmore ら，た 5 系統の中間母本系統に対し，｢ワンダーグリーンベル1991)を用いることで，休眠性の浅い形質に連鎖する DNA

ト」を共通花粉親として交雑した結果，F1 集団の農業形マーカーを開発することは可能と考えられる．

質が様々に変動することが確かめられ，これまで単為生また，交雑集団では出蕾パターンや時期が連続的に変殖性によりマスクされていた遺伝的に未固定な遺伝資源異しており，抽だいの早晩性についても偏りは見られなとしての能力が本研究により初めて明らかとなった．

いため，抽だい性についても休眠性と同様に単一の主働両性生殖性中間母本の利用に加えて，単為発生性連鎖遺伝子支配ではなく，複数の遺伝子が関与していることマーカーである PLM を用いることでも交雑育種が効率が推察された．開花時期の異なる品種の開発は，夏期に的に実施できた．PLM は花ニラ品種｢テンダーポール」

抽だいした花茎を除く調整作業を軽減するためにも要望の単為発生因子に由来するものであるが，多くの単為生されているが，両性生殖性母本を利用することで幅広い殖性（単為発生性でもある）品種・系統にも保存されて開花期の変動を導入することが十分可能であることが今いることが明らかにされている(天谷ら，2010)．本研究

回の研究結果から示唆された．

でも，2005 年の交配に使用した｢中国ニラ」と｢サンダーアポミクシス育種は，すでにケンタッキーブルーグラグリーンベルト」の集団において，単為発生因子を持たス，ギニアグラス，ブッフェルグラスなどの牧草で行わない両性生殖性個体の選抜が PLM の有無と一致していれているが(中島，1991)，園芸作物であるニラにおいてることが確かめられ，本マーカーの幅広い応用性が確認

も，本研究で明らかにした両性生殖性系統と単為発生性された．ニラは通常，開花するまで 2 年間を要すること

連鎖マーカーを利用することで，交雑育種により休眠性から，胚珠観察や検定交配をすぐに行うことは不可能でや抽だい性の大幅な改良および耐病虫性の導入などが可あったが，マーカー選抜を行うことで播種後 3 ヶ月の幼能となり，既存のニラ品種にない優れた農業形質をもつ苗での検定が可能となった．

新品種の開発が期待される．

ニラの需要は鍋料理の食材として 11 月頃より増加す
るが，休眠期により出荷量が減少するため休眠性の浅い品種が望まれている．2004～2007 年に実施した｢97-12-102」および｢00-3-81」を用いた交雑集団や，中謝間母本系統を用いた交雑集団の休眠性調査から，ニラの栃木県農業試験場福田正孝氏，堀井数己氏，田中祐氏

辞21栃木県農業試験場研究報告には本試験の遂行にあたり栽培管理等に多大な協力をいただいた．ここに記して厚く深謝の意を表する．

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第 68 号