栃木農試研報 No.63：9～16（2008）
Bull. Tochigi Agr. Exp. Stn. No.63.：9～16（2008）

イチゴ品種「とちおとめ」のカルス誘導および再分化条件
高野純一・生井潔

摘要：とちおとめ無菌培養植物の葉片を外植体として，カルス誘導および再分化条件を検討した．1/3MS を基本にショ糖 30g/l，TDZ 1.0mg/l および 2,4-D 0.1mg/l を添加した培地でカルス誘導を行い，MS を基本にショ糖 30g/l および TDZ 1.0mg/l を添加した培地での再分化誘導がそれぞれ最適条件であった．供試組織は，多芽体由来培養植物を植物生長調節物質の含まない MS 培地で１ヶ月程度培養した個体の最上位葉および次葉の葉身が適していた．この葉片培養法により，年間を通して再分化個体を得ることが可能となった．葯培養法
では， LS を基本にショ糖３g/l，BA 2.0mg/l および NAA 0.02mg/l を添加した培地で葯を培養することにより再分化個体が得られた．

キーワード：イチゴ，カルス誘導，再分化，葉片培養，葯培養Callus Induction and Shoot Regeneration of Strawberry ‘Tochiotome’Junichi TAKANO, Kiyoshi NAMAI

Summary：Optimal conditions for callus induction and shoot regeneration in the strawberry cultivar ‘Tochiotome’ werestudied using in vitro culture of plant leaves. Callus induction on a 1/3-strength MS medium supplemented withsucrose (30g/L), TDZ (1.0mg/L), and 2, 4- D (0.1mg/L) was found to be the most optimal condition, whereas afull-strength MS medium supplemented with sucrose (30g/L) and TDZ (1.0mg/L) was found to be the most optimalcondition for shoot regeneration. The youngest two leaves of plants transplanted from in vitro cultures for ~1 month tohormone-free MS medium were suitable for use as explants. This leaf culture method can supply regenerated plants
throughout the year.
As for the anther culture method, regenerated plants were obtained by culturing anthers from flower buds containing
unicellular pollen on LS medium supplemented with sucrose (3g/L), BA (2.0mg/L), and NAA (0.02mg/L).
Key words：strawberry, callus induction, shoot regeneration, leaf culture, anther culture（2008.8.18 受理）

9栃木県農業試験場研究報告 第 63 号

Ⅰ 緒 言

した培地はすべて pH5.7 に調整した．
2.葉片培養法における再分化条件の検討

現在，イチゴの現地栽培ほ場では，萎黄病７）が多発し1)カルス培養時の処理条件の検討ており，安定生産の大きな阻害要因となっている．そのとちおとめ多芽体由来培養植物を供試した．外植体は，ため，生産者からは，果実品質の優れた本病耐病性品種小葉を約 5 ㎜角に調製した．外植体は，2.0ml/枚の前処が強く望まれている．一般に，イチゴ育種は交配により

理培地５）（MS，2,4-D 0.2mg/l，BA 1.0mg/l，ショ糖３％）行われているが，とちおとめ 10）と同等の果実品質を有すに 25℃，暗黒，100rpm の条件で 1 日間浸漬処理した．

る本病耐病性品種の育成には至っていない．一方，培養前処理時にフェノール様物質を除去する目的で PVP 添

変異を利用した育種は，原系統の特徴を残し一部形質の加（500mg/l）の影響について検討した．

みに変異を生じた個体の作出が期待でき，これまでにア

次にカルス培養における基本培地（MS，1/3MS，NN14））

スパラガス８），アマ 18）、セロリ９）およびイチゴ 22)等いくおよびサイトカイニン種（BA，チジアズロン（TDZ））

つかの植物において，フザリウム病耐病性個体選抜の報とその濃度（1.0，2.0mg/l）について検討した．オーキシ

告がある．

ンは，2,4-D 0.1mg/l をそれぞれ供試培地に添加した．MS

そこで，とちおとめの優良形質を維持しつつ，耐病性はイチゴの再分化に一般的に用いられていることから５，を付加した系統を作出するために培養変異を利用するこ17）とが有効と考えた．本手法を利用するためには，変異をNN は穀物の再分化に用いられていることからそれぞれ誘発すると考えられるカルスを経由し，再分化する培養用いた．BA は，国内品種で一般的に用いられているこ，1/3MS は窒素成分を低減させた培地として，およびは，イチゴ萎黄病耐病性とから 5, 23)，TDZ は海外品種で報告 17)があることからそ個体選抜にあたり，罹病性品種宝交早生由来の再分化個れぞれ用いた．それぞれ供試培地は，20φ×95 ㎜の平底体 1225 個体より耐病性個体２個体を選抜している．また，試験管に 10ml ずつ分注後，オートクレーブした．1/3MS系が必須となる．Toyoda ら22）

19）

は，イチゴ黒斑病耐病性個体選抜にあたり，罹病培地は，MS 成分の KNO3，NH4NO3 および KH2PO4 を 1/3性品種盛岡 16 号由来の再分化個体 1196 個体より耐病性に改変した．再分化誘導は，MS 培地にショ糖 30g/l，寒個体 3 個体を選抜している．このように，培養変異の変天 8g/l ならびに BA2.0mg/l を添加した培地４）を用い，葉異誘発頻度は，非常に低いことが想定されることから，片置床 60 日後に移植した．

高橋

多数の再分化個体を効率的に作出する技術が必要である．

培養条件は，カルス誘導時の光強度が 7μmol m-2sec-1，しかし，とちおとめを用いた例はない．以下に，とちお

再分化誘導時は光強度 40μmol m-2sec-1 とし 16 時間日長，とめの再分化培養系の検討を行い，効率的なカルス誘導25℃で管理した．葉片置床 40 日後にカルス形成率，90および再分化条件を確立したので報告する．

日後に再分化率を調査した．
2）再分化誘導時に添加する TDZ 濃度の検討

Ⅱ 材料および試験方法

供試材料，外植体の調製および前処理は，1）と同様に行った．ただし，前処理時の PVP は無添加とした．カル

1.多芽体由来培養植物の育成

ス培養は，1)で最も再分化率の高かった 1/3MS 培地に，供試材料として，とちおとめおよび女峰の多芽体由来

ショ糖 30g/l，寒天 8g/l ならびに TDZ 1.0mg/l および 2,4-D培養植物を育成した．多芽体由来培養植物は，ランナー0.1mg/l を添加した培地を用いた．再分化培地は，MS 培先端部を 70％エタノールで 30 秒間，0.5％次亜塩素酸ナ

地に，ショ糖 30g/l，寒天 8g/l およびカルス培養時に添加トリウムで 10 分間表面殺菌後，滅菌水で３回洗浄し，0.5した TDZ を再分化誘導に使用する 1.0，2.0，4.0mg/l の 3～1.0 ㎜の大きさで生長点を摘出した．その後，高野ら水準で添加した．対照として，1）で使用した BA 2.0mg/l20)を添加した培地を用いた．供試培地は，20φ×95 ㎜の平13)の報告をもとに MS 培地の無機塩組成を 2 倍に希釈した 1/2MS 培地にベンジルアデニン（BA）0.2mg/l，ポリビニルピロリドン（PVP）500mg/l，ショ糖２％，寒天８g/l を添加した培地に置床して培養した．
生存個体は，MS 培地にショ糖３％，寒天８g/l ，BA0.125mg/l，カイネチン（KIN）0.25mg/l を含む増殖培地15）で無菌的に継代した．培養条件は，20℃，光強度 40-2-1μmol m sec ，12 時間日長とした．なお，本報告で供試10底試験管に 10ml ずつ分注後，オートクレーブした．
培養条件は，1）と同様とした．葉片置床 120 日後に再分化率を調査した．
3)供試組織の違いがカルス形成および再分化に及ぼす影響の検討
供試材料は，とちおとめ多芽体由来培養植物を用い，対照として女峰を用いた．外植体は，多芽体由来培養植イチゴ品種「とちおとめ」のカルス誘導および再分化条件

物を植物生長調節物質の含まない MS 培地で１ヶ月程度

培地は，オートクレーブ後，滅菌シャーレ（90φ×20 ㎜）

培養した個体より摘出した．多芽体由来培養植物を植物に 40ml ずつ分注した．培養条件は，カルス誘導時の光生長調節物質外植体の調製および供試部位は，第 1 表お強度を 40μmol m-2sec-1 とし 16 時間日長，25℃で管理した．

よび第 1 図に示した．前処理は，外植体を前処理培地

規模は，大沢ら６）の方法により 1 シャーレあたり 9 外植（1/3MS，2,4-D 0.1mg/l，TDZ 1.0mg/l，ショ糖 3％）に体（葯 3 個/外植体）で行った．

25℃，暗黒，30rpm の条件で 1 日間浸漬処理した．カル調査は，置床 110 日後にカルス形成外植体数および再ス誘導は，1)で最も再分化率の高かった 1/3MS 培地に，分化外植体数を調査した．また，連続的に不定芽を誘導

ショ糖 30g/l，寒天 8g/l ならびに TDZ 1.0mg/l および 2,4-Dするために，得られたカルスを経時的に同一培地に継代0.1mg/l を添加した培地を用いた．再分化誘導は，2）でし得られた不定芽数を調査した．

再分化率の最も高かった MS 培地にショ糖 30g/l，寒天８４．フローサイトメーターによる再分化個体の倍数性g/l ならびに TDZ 1.0mg/l を添加した培地を用いた．各供調査

試培地は，オートクレーブ後，滅菌シャーレ（90φ×20

供試材料は，とちおとめ葯由来および葉片由来再分化㎜）に 40ml ずつ分注した．培養条件は 1）と同様にした．

個体を用い，内部標準として水稲を用いて倍数性変異を

葉片置床 30 日後にカルス形成率，60 日後に再分化率を調査した.
各供試材料と内部標準の葉身（それぞれ約 0.25 ㎝２ ）調査した．

は，DAPI（4’,6-diamidino-2-phenylindole）濃度を 2.0mg/lに改変した DAPI 染色液 12)を数滴加えて細かく切り刻

第１表 イチゴ供試組織および外植体の大きさんだ後，さらに 2.0ml の DAPI 染色液を加えて 5 分間放供試組織

外植体の大きさ５㎜角
葉身 (最上位葉および次葉）５㎜角〃 （最下位葉および次葉）
葉柄 （上部）
10㎜長〃 （中央部）10㎜長〃 （基部）10㎜長
根 （端部）
10㎜長〃 （中央部）10㎜長〃 （基部）
10㎜長

置した．その後，50μｍのメッシュでろ過し，DNA の蛍光強度をフローサイトメーター（partec 社 PA）で測定した．
各系統の相対的蛍光強度は，内部標準との相対値で示した．さらに，対照であるとちおとめの相対的蛍光強度と比較し，その結果から倍数性を推定した．

Ⅲ 結 果
1.葉片培養法における再分化条件の検討

上部葉柄根1)カルス誘導時の処理条件の検討

中央部

前処理での PVP 添加の効果を検討した結果，MS，基部中央部

基部端部1/3MS，NN いずれの基本培地でも PVP 無添加が添加と托葉比較して再分化率が高かった（第 2 表）．よって，これ以降の前処理は PVP 無添加とした．

第１図

外植体として供試されたイチゴ組織

PVP による前処理の有無にかかわらずカルス形成率は，すべての基本培地において BA 添加区が TDZ 添加区に比較して低かった．また，再分化率は PVP 無添加で前処理し，サイトカイニンとして TDZ を 1.0mg/l 添加した

3.葯培養法における再分化条件の検討
供試材料は，ガラス温室内で育成されたとちおとめ養1/3MS 培地で 34.3％と最も高かった．次いで，TDZ を液栽培苗を用いた．直径 4～5 ㎜の蕾を採取し，1％次亜2.0mg/l 添加した MS および 1/3MS 培地が，それぞれ塩素酸ナトリウムで 10 分間表面殺菌，滅菌水で 3 回洗浄26.5％と高かった． NN 培地の再分化率は，TDZ を後，実体顕微鏡下で葯（花粉ステージ：1 核期）を摘出2.0mg/l 添加した区が最も高く 8.6％であり，MS および11)の報告

1/3MS 培地と比較して劣る結果であった（第 2 表）
．これをもとに LS 培地に，ゲランガム３g/l，BA 2.0mg/l，NAA

らから，基本培地は 1/3MS とし TDZ を 1.0mg/l および0.02 mg/l およびショ糖を 3.0g/l に改変した培地を用いた．

2,4-D を 0.1mg/l 添加する培地を採用した．

した．カルス誘導および再分化誘導は，森下ら

11栃木県農業試験場研究報告 第 63 号

2)再分化誘導時に添加する TDZ 濃度の検討
TDZ 添加区の再分化率（15.0～35.0％）は，対照の BA添加区（10.0％）に比較して高かった．また，TDZ の添加濃度は，低くなるほど再分化率が向上し，1.0mg/l で最も高く 35.0％であった（第 3 表）
．よって，再分化培地のTDZ 添加濃度は 1.0mg/l とした．
3）供試組織の違いがカルス形成および再分化に及ぼす影響の検討
とちおとめのカルス形成率は，葉身を用いた場合に，100％（最上位葉および次葉），97.0％（最下位葉および次葉）であり，葉柄（76.2～85.6％）および根（55.8～91.5％）に比較して高かった．また，葉柄および根では，それぞれ基部においてカルス形成率が高く，先端に向か

写真１

とちおとめ葉片からの再分化状況

うに従って低下した．再分化率は，葉身最上位葉および（葉片培養 60 日後）次葉を用いた場合に 15.3％であり，最下位葉および次葉（4.0％），葉柄（9.5～2.2％）および根（0％）に比較して高かった．また，葉柄の再分化率は，基部から上部に向かって上昇する傾向が見られ，カルス形成率と異なる傾向を示した．対照の女峰の再分化率は，とちおとめと比較して全ての区において高かった（第４表）．これらから，とちおとめの再分化に供試する部位は，最上位葉および次葉の葉身が最適で，次いで葉柄の上部，中央部が望ましく，最下位葉および次葉の葉身および葉柄の基部は劣った．また，根は適さなかった．
2.葯培養法における再分化条件の検討
カルス形成率は，置床 110 日後で 88.9％であり，そのほとんどは緑色カルス（GC）であった．再分化率は，70.4％であった（第５表）．GC からの不定芽は,培養を 8

写真２

とちおとめ葉柄からのカルス形成および再分化状況（葉柄置床 60 日後）ヶ月間行うことにより合計 195 芽得られた．褐変化カルス（BC）からの不定芽形成は 1 芽のみであり，再分化には GC が適していた．
不定芽は，3 回の継代までに連続的に不定芽が形成されたが，それ以降はカルスの褐変化が進行して得られなかった．また，不定芽数はカルスにより産生能に差がみられ，最高で 19 芽であり，最低で 1 芽であった（第 6表）．
3.フローサイトメーターによる再分化個体の倍数性
調査
葉片培養による再分化個体は，フローサイトメーターによる倍数性調査によりすべて 8 倍体と推定された．葯
培養由来の再分化個体は，75 個体中 71 個体が 8 倍体，残り 4 個体が 16 倍体と推定された（第 7 表，第 2 図）
．

12

写真３

とちおとめ再分化個体の発根状況（発根培養 30 日後）イチゴ品種「とちおとめ」のカルス誘導および再分化条件

第2表 イチゴ品種とちおとめ葉片を用いたカルス形成，再分化に及ぼすPVP，基本培地およびサイトカイニン種の影響
前処理時の 基本
添加サイトカイニン供試
カルス形成
再分化PVP添加培地
種類 濃度(ml/l) 葉片数
葉片数率(%)
葉片数率(%)
BA1.0321443.8412.5MSTDZ1.03232100.039.4
TDZ
2.0
34
34
100.0
9
26.5
BA
1.034
1441.225.9
無1/3MS
TDZ
1.0
35
34
97.1
1234.3TDZ
2.034
2985.3
926.5
BA
1.036
32
88.9
25.6
NN
TDZ
1.0
35
33
94.3
12.9
TDZ
2.0
35
34
97.1
38.6
BA
1.0
1915
78.9
00.0MS
TDZ
1.0
20
15
75.0
00.0
TDZ
2.0
22
22
100.0
29.1
BA
1.0
22
20
90.9
14.5
有1/3MS
TDZ
1.0
22
22
100.0
00.0
TDZ
2.021
2095.2
419.0
BA
1.035
2982.912.9
NNTDZ
1.0393487.200.0
TDZ2.0353085.7411.4
注１．カルス形成は置床40日後に観察．
２．置床60日後に，2.0mg/lのBAを添加したMS培地に移植し，再分化を誘導した．
３．再分化は置床90日後に調査．ただし，茎葉分化が不完全なものも含めた．

第３表 イチゴ品種とちおとめ再分化に及ぼす再分化培地中のサイト
カイニン濃度の影響
濃度
供試
再分化 再分化率
サイトカイニン（mg/l）
カルス数
葉片数（％）
TDZ

1.0
2.0
4.0202020（対照）BA
2.020
注．調査は葉片置床120日後に調査した．

75335.025.015.0

210.0

第４表 イチゴ培養苗供試組織の差異によるカルス形成および再分化状況
品種

供試組織

供試
葉片数

カルス形成
葉片数率（％）

9898
100.0
葉身と999697.0ち
上部
1058076.2お葉柄 中央部
1128676.8と基部
907785.6め
端部
432455.8
根中央部
453577.8基部
474391.51009292.0
最上位葉および次葉
葉身
936974.2
最下位葉および次葉
女
上部
160
142
88.8
峰
葉柄 中央部
133
110
82.7
基部
156
132
84.6
端部
37
2054.1
根中央部
58
712.1
基部
61
813.1
注１．カルス形成葉片数は，外植体置床30日後に調査した．
２．再分化カルス数は，外植体置床60日後に調査した．
３．再分化率は，供試数に対する再分化したカルス数の割合
最上位葉および次葉
最下位葉および次葉再分化
葉片数率（％）

154
108
2000
7778805257
42015.3
4.09.57.1
2.20.00.00.0
77.0
83.9
50.0
39.1
36.5
10.8
3.40.013栃木県農業試験場研究報告 第 63 号

第５表 イチゴ品種とちおとめ葯からのカルス形成および再分化結果
カルス形成
再分化
供試
基本培地 BA（mg/l） NAA（mg/l）
外植体数 外植体数 率（％）
外植体数 率（％）
LS2.00.02
544888.9
注． カルス形成および再分化は置床110日後に調査した．

3870.4

第６表 イチゴ品種とちおとめ葯由来カルス性状が不定芽形成数に及ぼす影響
供試
不定芽形成数
カルス性状
不定芽数／カルス
カルス数
継代１
継代２
継代３
合計
緑色カルス
45729033
195
1～１９
褐変化カルス
3001
1０～１
注． 培養は平成16年５月24日に葯を置床し，９月14日（継代１），11月22日（継代２）および１月２８日（継代３）の３回継代を行った．

第７表 イチゴ品種とちおとめ再分化個体の倍数性に及ぼす培養法の差異

培養法

供試再分
化個体数

８x

推定倍数性（%）
16x（%）

葉片培養

252510000葯培養

757194.645.3

第２図

フローサイトメーターによるイチゴ未展開葉（とちおとめ），イチゴ再分化個体葉の蛍光強度分布

注．サンプルの相対的蛍光強度（右）／対照の平均相対的蛍光強度の値（左）が，0.9～1.1 以内であれば８倍体とみなした．

14

イチゴ品種「とちおとめ」のカルス誘導および再分化条件

Ⅳ 考 察

とちおとめ再分化に関する試験は，これまでにも行われてきたが，再分化個体は得られていない（平成 10 年度

効率的な再分化培養系の確立は，培養変異を利用する

野菜試験成績書ｐ14）．本報告では，前培養およびサイトために必要不可欠である．一般的に，イチゴの再分化能カイニンとして TDZ を使用することにより，葉片からのには，品種間差異があることが知られており，遺伝的要再分化率を向上することができた．また，本培養法は女因が関与していることが想定されている

17)

．荒井ら

５）

は，イチゴ葉片を褐変化させ再分化の妨げの主因と考え峰においても高い再分化率が得られ，本県育成の他品種にも適用できるものと考えられる．

られる誘導性フェノール物質を除去する目的で，カルス再分化個体は，高次倍数性の変異が出現することが多誘導を行う前に液体培地による前培養を行っている．まくの作物で報告されている 16）．本報告においても森下ら

た天谷ら２）は,デルフィニウムが代謝する黒褐色物質の11）

障害を回避するために，増殖培地に PVP を添加すること

イトメーターによる倍数性調査により倍数性変異個体がにより，植物体の活性を保ちながら培養することに成功出現した．よって，再分化個体については倍数性変異がしている．そこで本報告では，PVP を前培養時に添加す出現する可能性があるので倍数性調査を行う必要があるることによりその効果を検討した．しかし，添加の効果と考えられる．これまで、イチゴの倍数性調査は、根端は認められなかった．葉片中に残存した本物質が再分化組織を用いた染色体観察法やフローサイトメーターを用時に必要な植物生長調節物質を吸着したため，再分化がいた場合でも夾雑物が少ないと考えられる花弁組織を材低下したものと考えられる．置床前にカルス誘導培地で料にして行われてきた.しかし、三柴らの DAPI 染色液 12)

葉片に付着した PVP を洗浄するなどの工夫が必要であを使用することにより熟練を要する染色体観察や開花をる．

待たずに早期に調査可能になった。の報告と同様に葯培養由来の再分化個体からフローサ

とちおとめの最適なカルス誘導および再分化条件は，とちおとめ葯培養法の再分化率は，高率であったこと

最上位葉および次葉の葉身を外植体とし，1/3MS を基本

から材料の採取時期が開花時期に限定されるものの，葉にショ糖 30g/l，TDZ 1.0mg/l および 2,4-D 0.1mg/l を添加片培養法との併用が可能であると考えられた．また，葉した培地でカルス誘導を行い，MS を基本にショ糖 30g/l

片培養法は，女峰に比較して再分化率が低いが，新しいおよび TDZ 1.0mg/l を添加した培地で再分化誘導するこ突然変異原として注目されているイオンビーム１）と併用とであった．カルス誘導時の基本培地は，1/3MS を採用することにより，効率的に変異個体を作出することがで

21）

は，イチゴのジャファメーターによる大きると考えられる．今後は，葉片へのイオンビーム照射量増殖試験で，MS 基本培地の NH4NO3,KNO3 および条件の検討および再分化率向上のさらなる向上のためにCaCl2 成分を段階的に希釈して培養したところ，2 倍希釈培養条件を検討していきたいと考えている．

した．高山らした 1/2MS 培地が最も効率的に増殖したと報告している．
MS はナス科植物の培養のために開発された培地であり，イチゴにとっては栄養過剰の可能性も考えられる．

謝辞

再分化培養個体は、容易に発根培地（1/2MS 培地）で本研究を遂行するにあたり，終始ご指導頂いた石川成

発根し，バーミキュライトを用いて人工気象室内で順化

寿環境技術部長（前生物工学部長）、葉片培養法についてすることにより得られる．

貴重なご意見を頂いた奈良県農業技術センター浅尾浩史23）

は，イチゴランナーの若い展開葉を外植博士に心より感謝する．また、臨時職員手塚依子氏には体として用いて再分化個体を作出しているが，供試時期作業補助として多大なるご協力いただいた．ここに記しがランナー発生時期に限定されてしまうという欠点があて感謝の意を表す．

Toyoda らる．また，アンチホルミンや 70％エタノールなどの滅菌操作による外植体のダメージも考えられる．大塚ら３）は，キクのプロトプラスト培養において無菌培養植物を利用することにより，植物体を育成することに成功している．
材料に無菌培養植物を用いることは優れた方法と思われた．本報告では，供試材料として無菌培養植物の葉片を利用することにより，年間を通してとちおとめから再分化順化苗を得ることが可能になった．

15栃木県農業試験場研究報告 第 63 号

農業および園芸 58：1465－1467

引用文献

17. Passey, A., Barrette, K., James, D.(2003)

１．阿部知子・鈴木賢一（2002）重イオン変異育種の可能性．農業および園芸 77：580-586

Adventitious

shootregenerarion

from

seven

commercial strawberry cultivars.

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