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エレクトロスプレー・冷却イオントラップ法によるカリウムイオンチャネルのイオン選択性に対する水和効果
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東工大科創院化生研，2東工大生命理工、3イリノイ大、4東工大WRHI○根来拓己1,2，石内俊一1,2，James M. Lisy3,4，藤井正明1,2,4

Hydrogen effect on ion selectivity of K+ channel by using electrospraycryogenic ion trap technique1○Takumi Negoro1, Shun-ichi Ishiuchi1, James M. Lisy1,2, Masaaki Fujii1
Laboratory for Chemistry and Life Science, Institute of Innovative Research, Tokyo Instituteof Technology, Japan
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School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, Japan3
Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, USA
4World Research Hub Initiatives, Institute of Innovative Research,Tokyo Institute ofTechnology, Japan【Abstract】 The K+ channel is permeable to K+, while Na+ cannot go through even though
its ion radius is smaller than that of K+. Local interactions between the selectivity filter, aspecific domain which binds K+, and the ions are responsible for the selectivity. This
ion-selectivity is explained by energetical competition between ion-selectivity filter andion-water interactions. In this work, in order to clarify the role of hydration for theion-selectivity experimentally, we applied IR spectroscopy combined with electrospray / cold
ion trap technique to Na+ and K+ complexes of AcYNHMe peptide, which is a partial peptideof the selectivity filter, and their hydrated clusters. It was revealed that the hydrated structuresof the two complexes is significantly different.
【序】K+チャネルは K+を選択的に透過する膜タンパク質である。Na+はイオン半径が1.16 Åで K+ (1.51 Å)よりも小さいにも関わらずほとんど通過しない。このような選択的イオン透過のメカニズムの解明のために多くの研究が報告されている。K+チャネ
ルの１つである KcsA はその結晶構造が解かれ、選択フィルターと呼ばれるアミノ酸配列 Gly-Tyr-Gly (GYG)が K+に特異的に配位していることが明らかになった[1]。K+チ
ャネルに入る前は、K+は水和された状態で存在しているが、チャネルを透過するには脱水和しなければならない。K+の場合、GYG への配位構造が K+の水和構造に近いた
め、K+の脱水和によるエネルギー損失を、選択フィルターに結合して得られるエネルギー利得が相殺するため、水和イオンから選択フィルターに容易に移行できる。しかし、Na+の場合は水和構造と選択フィルターとの配位構造が異なり、水和構造の方が安定となるため、チャネル内へ侵入できないと考えられている。つまり、イオン選択性は、金属イオンと選択フィルターの結合と水和との競合によって生み出されていると考えられている。K+イオンが選択フィルターに結合する様子は X 線結晶構造解析で明らかになった。一方、Na+が水和と競合して選択フィルターから除外
Fig.1. AcYNHMe
される様子は理論計算[2]による類推のみで、実験的には観測されていない。そこで、イオン選択性のメカニズムを解明するために、選択フィルターの部分ペプチド AcYNHMe (Fig.1)のアルカリ金属イオン錯体とその水和クラスターの構造を気相クラスター分光の手法を用いて調べることを着想した。
本研究では、AcYNHMe の K+及び Na+錯体の水和クラスターをエレクトロスプレー・冷却イオントラップ法で生成し、赤外光解離分光法によりそれらの構造の差異を明らかにすることでイオン選択性のメカニズムを解明することを目的とした。
【実験方法】図 2 に装置図を示す。エレク
トロスプレーイオン化法を用いてAcYNHMe・M+ (M=Na, K)錯体を気相中に取り出し、クラスター生成トラップに導入した。ここでイオンを保持し、水蒸気を含む低温のヘリウムガスと衝突させ、AcYNHMe ・ M+ 水 和 ク ラ ス タ ー
Fig.2. Experimental setup（AcYNHMe・M+-(H2O)n ）を生成した。その後、四重極質量分析器で特定のサイズのクラスターを選び出し、冷却イオントラップで保持・冷却（~10 K）した[3]。ここに波長可変赤外レーザーを導入し、水クラス
ターの赤外吸収によって解離生成したモノマーイオン（AcYNHMe・M+）を飛行時間型質量分析器で検出した。赤外吸収が起きたときだけモノマーイオンが生成するので、このモノマーイオン量をモニターしながら赤外レーザーを波長掃引することで赤外光解離（IRPD）スペクトルを測定した。
【結果・考察】図 3 に(a) AcYNHMe・K+-(H2O)1 と(b) AcYNHMe・Na+-(H2O)1 の IRPDスペクトル（赤）を示す。水由来のバンドを帰属するために、D2O によるクラスターの IRPD スペクトル（青）も測定した。クラスター生成トラップでは、冷却しながら水和クラスターを生成しているため、H/D 交換反応は起こらない。従って、図中に示した振動数領域では、H2O クラスターのみに観測されているバンドが水由来のバンドと一義的に帰属できる。水由来のバンドのうち、3700~3750 cm-1 のバンドは水分子のOH 逆対称伸縮振動と帰属できる。K+錯体のみに観測された 3550 cm-1 のバンドは、振動数からプロトンドナーとして水素結合している水の OH 伸縮振動と考えられる[4]。その様な水素結合構造は、水分子がペプチドに結合したときしか起こりえないので、K+錯体では水分子がペプチドに水素結合した構造も取りうることが示唆された。一方で、Na+錯体ではその様なバンドは観測されておらず、水分子の酸素原子が Na+に配位した構造のみが生成していると考えられる。これらの結果
は、Na+は水和構造の方が安定で、K+は選択
Fig.3. IRPD spectra of hydrated cluster. (a) Red:
フィルターと水和の安定性が拮抗している
AcYNHMe・K+-(H2O)1, Blue : AcYNHMe・とする従来の説を支持している。講演ではさK+-(D2O)1, (b) Red: AcYNHMe・Na+-(H2O)1,らに大きなサイズの水和クラスターの結果についても議論する。
Blue: AcYNHMe・Na+-(D2O)1【参考文献】[1] J. H. Morais-Cabral, et al., Nature. 414, 37-42 (2001)., Y. Zhou, et.al., Nature. 414, 43-48 (2001).
[2] T. Allen, et al., Biophys. J., 77, 2502-2516 (1999).
[3] S. Ishiuchi, et al., J. Mol. Spectrosc. 332, 45-51 (2017).
[4] D. J. Miller, J. M. Lisy, J. Am. Chem. Soc. 130, 15393-15404 (2008)