栃木農試研報 No.87：19～28 （2023）
Bull. Tochigi Agr. Exp. Stn. No.82：19～28 （2023）

8 倍体イチゴ品種・系統を識別する SSR マーカーの開発と利用
中澤佳子・田﨑公久 1)・飯村一成 2)・田村有紀子・若桝睦子・天谷正行 3)
摘要：イチゴは栃木県の園芸を代表する作物であり，栽培品種は本県育成品種が中心である．本研究では，
なつおとめや栃木 i27 号の育成者権保護を目的として，2010～2011 年に，とちおとめ由来の genomic-SSR
マーカー及び EST-SSR マーカーの中から，品種識別に適した SSR マーカーを 7 種類選定した．それらのマーカーは，それぞれ異なる相同染色体上に位置し，2 倍体的な挙動を示す共優性マーカーであることから，育成品種の親子鑑定にも利用可能であった．また，国内外の 137 品種・系統すべてで増幅し，女峰と新女峰（女峰の培養変異株）以外の品種・系統については，7 種類のうち 4 種類の組合せで識別が可能であった．マーカー検出は，ポストラベル法による PCR を行い、DNA シーケンサーを用いた。2018 年に新品種
栃木 iW1 号，栃木 i37 号が育成され，新品種を含む 24 品種・系統を追加したところ， 5 種類のマーカー組
合せで識別が可能で，新品種にすぐに利用できる汎用性の高いマーカーであることが実証された．さらに，迅速な DNA 鑑定に対応するため，簡易な DNA 抽出法を用いた検定法を確立した．

キーワード：SSR マーカー，親子鑑定，イチゴ，品種識別，ポストラベル法

Development and utilization of SSR markers identifying octoploidstrawberry cultivars and breeding lines
Yoshiko NAKAZAWA, Kimihisa TASAKI, Kazunari IIMURA,Yukiko TAMURA, Mutsuko WAKAMASU,
Masayuki AMAGAI

Summary: Strawberry is a representative crop of horticulture in Tochigi Prefecture, and the cultivars bredby the prefecture have exclusively been cultivated in the prefecture. The present study was carried out toprotect the breeder's rights of ‘Natsuotome’ and ‘Tochigi i27’ in 2010 – 2011. Seven SSR markers suitablefor cultivar identification were selected from ‘Tochiotome’-derived genomic-SSR markers and EST-SSR
markers. These markers were located on different homologous chromosomes, and co-dominant showing
diploid behavior, which indicated additional use as parentage analysis of breeding cultivars. The markers
enabled amplification of all of the 137 domestic and foreign cultivars and strains tested. The combinationsof 4 out of the 7 markers additionally allowed the distinction of the cultivars and strains except for ‘Nyoho’,and ‘Shinnyoho’, which was culture mutant of the former. These markers were detected with a DNA
sequencer following PCR using post-labeling method. In 2018 the combinations of the 5 markers provided
the distinction of additional 24 cultivars and strains containing new cultivars ‘Tochigi iW1’ and ‘Tochigii37’, which confirmed the extreme versatility of the markers. In addition, we established the analysis
method using a simple DNA extraction tequnique for rapid identification.
Key words： SSR marker, parentage analysis, strawberry, cultivar identification, post-labeling method

1)現栃木県農政部経営技術課，2) 現栃木県下都賀農業振興事務所，3) 現栃木県塩谷南那須農業振興事務所（2023.3.7 受理）

19栃木県農業試験場研究報告 第 87 号

Ⅰ

緒 言Bringhurst(1990)が提唱した AAA’A’BBB’B’説が有力である．さらに，SSR マーカーを用いたイチゴの染色体数(n=28)とイチゴは栃木県を代表する作物であり，作付面積 518ha，同数に収束した連鎖地図が作成され，異質 8 倍体であること

収穫量 22,700ｔ(農林水産統計データ ｢野菜生産出荷統計が示唆されている（Sargent et al., 2012，Isobe et al., 2013）．

(令和 2 年産)｣)，産出額 238 億円（農林水産統計データ ｢生イチゴのゲノム解析では，栽培種に先立ち，2 倍体野生種

産農業所得統計(令和 2 年)｣）で，特に収穫量についてはである F. vesca の全ゲノム解読が発表された（Shuaev, et al.,1968 年産から 2020 年産の 53 年間連続で全国一位である．

2011）．その後，かずさ DNA 研究所を中心とした日中の研究

栽培品種は本県育成品種が中心となっており，これまでに，グループによって，F. vesca のゲノムを参考にして 8 倍体イチ

女峰(赤木ら，1985)，新女峰（高野ら，1989），栃の峰（植木ら，ゴの全ゲノムが解読されている（Hirakawa et al., 2014）.

1993），栃木県内はもとより国内で最も多く生産されていると2005～2007 年に，イチゴ連鎖地図作成のため，とちおとめ

ちおとめ(石原ら 1996) ，観光栽培用品種とちひめ (栃木ら，由来の Genomic-SSR マーカー及び EST(expressed sequence2001)，夏秋採り用品種とちひとみ（植木ら，2006），なつおとtag)-SSR マーカーの大量開発を行った（田﨑, 2020）．さらに，め(小林ら，2015)，贈答用品種として極めて大果で，収量性それらのマーカーは，イチゴ炭疽病耐病性遺伝子領域のや外観品質に優れた栃木 i27 号 (スカイベリー，重野ら，

QTL 解析及びイチゴ萎黄病抵抗性遺伝子領域の QTL 解析2015)を育成してきた．これらの品種は，種苗登録することでに利用された（飯村ら, 2012，2021，田﨑, 2020）．本研究では，育成者権が与えられ，知的財産として保護されるが，ブランド

2010～2011 年に，それらの SSR マーカー情報を利用して，本農産物は高値で取引されるため，品種名の偽装や無断栽培

県育成品種のブランド価値を守るために，新品種や海外品種など育成者権の侵害が問題となっている．

も識別可能な 7 種類の品種識別用マーカーを開発した．それ

イチゴの品種識別法に関する研究は，2000 年代初頭，日
本国内で育成された品種の苗が違法に海外に持ち出され，らのマーカーは品種間多型性が高く， 2 倍体的な挙動を示
す共優性マーカーであった．

栽培後，その収穫物が輸入された事例が報告されたことから2018 年には，白色果栃木 iW1 号 (ミルキーベリー，鶴見ら，始まった．DNA マーカーによるイチゴの品種識別法としては，

2020)，極早生でイチゴ萎黄病耐病性の栃木 i37 号 (とちあいcleaved amplified polymorphic sequences（CAPS）法（Kunihisa

か，大橋ら，2020) が品種登録出願されたため，7 種類の品

et al., 2003, 2005 ） ， ramdom amplified polymorphic DNA

種識別用マーカーによって，新品種や近縁種を識別できるこ（RAPD）法（Degani et al., 1998），amplified fragment lengthとを明らかとした．また，迅速に鑑定が行えるように，簡易なpolymorphism（AFLP）法（Degani et al., 2001，Tyrka et al.,DNA 抽出法による検定法も確立したので報告する．

2002, 下 村 ら , 2005 ） ， simple sequence repeat （ SSR ） 法（Shimomura and Hirashima, 2006, Honjo et al., 2011）を用いた技術が報告されている．栃木県でも，田﨑ら（2008a）が，と

Ⅱ

試験方法

１．供試品種・系統及び DNA 抽出

ち お と め ， と ち ひ め の 育 成 者 権 保 護 を 目 的 に ， RAPD-

イチゴ品種・系統は，栃木県農業試験場で保有していた

STS(sequence tagged site)及び AFLP-STS マーカーとマルチ

161 品種・系統を供試した（第１表）．DNA 抽出は，新葉約 1g

プレックス PCR 法により，国内主要８品種を含む 25 品種・系

を液体窒素で凍結粉砕し，Yamamoto et al. （2001）の Cetyl

統内から，1 回の PCR で品種識別する技術を開発した．さら

Trimethy Ammonium Bromide（CTAB）法または，新葉約 0.1gに，田﨑ら（2008b）は，違法輸入農産物に対する抑止力とすから DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）で抽出した（ただし，るため，３組のプライマーセットを設計し，25 品種・系統を品種

buffer AP1 添加時に，約 40mg の polyclarVT を加えた）．とち

識別する技術を開発した．

おとめ及び栃木 i27 号については，果実のがく片及び果肉かその後，イチゴの品種開発は全国で盛んに行われ，各地
で新品種が誕生し，輸出もされるようになった． 本県では，

ら上記抽出法または，Noh et al. (2017)を一部改変したアルカ
リボイル法を用いて行った．

2009 年になつおとめ，2011 年に栃木 i27 号が品種登録出願されたことを契機に，より広範囲の品種に対応でき，新品種にもすぐに利用できる DNA マーカーの開発の必要性が高まっ
た．

２．供試 SSR プライマー
とちおとめ由来の Genomic-SSR 及び EST-SSR プライマー（ 飯 村 ら , 2012 ， 田 﨑 , 2020 ） の 中 か ら ， 144 種 類

イチゴ栽培種（Fragaria × ananassa）は 8 倍体（2n=8x=56）（Genomic:130，EST:14）を供試した．144 種類のうち 94 種類と非常に高い倍数性を持ち，そのゲノム構造は，國久（2008）

は，炭疽病耐病性マーカー開発のための連鎖地図作成に使の ゲ ノ ム 特 異 的 な CAPS マ ー カ ー の 研 究 に よ り ，

用したプライマーであり，50 種類は新しく合成した Genomic-208 倍体イチゴ品種・系統を識別する SSR マーカーの開発と利用

SSR プライマーである．本研究では，シーケンサーによって多Dye4 を標識したものまたは M13（-21）配列に Beckman Dye3型検出を行うため， Schuelke (2000)の方法（以下，ポストラベを標識したものを使用した．

ル法）に準じて，ユニバーサル蛍光標識プライマーがアニーリ
ングするように，フォワードプライマーの 5’側に付加した pig-

３．SSR マーカーの検出

tail 配列を，M13Rv 配列（5’- ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃ）またはマーカーの検出は，Schuelke（2000）の方法を参考に行っM13（-21）配列（5’- ｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ）に変更した．

た ． 2018 年 以 前 は ， DNA 増 幅 酵 素 に Hybripol DNA

ユニバーサル蛍光標識プライマーは M13Rv 配列に Beckman

Polymerase(BIOLINE)を用いていたが，以降は，My Taq DNA

第１表

供試品種・系統一覧（161品種・系統）

栃木県育成品種(10)栃木県育成系統(38)

国内育成品種・系統（103）

品種・系統名品種・系統名導入先(育成者)

導入年度 品種・系統名

導入先(育成者)導 入年度 品種・系統名 導入先

女峰＊

アイストロ

愛知県

2004

しゆうこう

静岡県

新女峰

アイベリー

(愛三種苗)

春訪

千葉県

栃の峰

あかしゃのみつこ木下清和

するがエース

静岡県

とちおとめ＊

あかねっ娘

愛知県

スルガレッド静岡県

Dauglus

とちひめ

章姫

萩原章弘

セリ－ヌ

ホープ

とちひとみ

アスカウェイブ

奈良県

1995

促成3号

野菜試(注4

なつおとめ

アスカルビー

奈良県

1998

ダナー＊

栃木i27号(スカイベリー)あまおとめ

愛媛県

2006

千葉S4号(チーバベリー)
千葉県

栃木i37号(とちあいか)

徳島県

あわなつか

外国品種(10)1995

野菜・茶業試験場(注52000

Bolero

北海道立道南農試(注62000

Chandler

キューピー

1998

Florida69-266野菜試(注51975Frorida693

キューピー

1989

2018

Hecker

野菜・茶業試験場(注52000

1967

Selva

ベルギー

1998

Sweet Charlieフランス

1999

2000

1995

2008

筑紫

野菜試(注4

栃木iW1号(ミルキーベリー)
いちご中間母本農1号 野菜試(注41995

デコルージュ

野菜試(注5

栃木1号

いちご中間母本農2号 野菜試(注4

1998

てるのか

野菜試(注41989

栃木4号

いばらキッス

茨城県

2017

とねほっぺ

群馬県

1999

栃木9号

越後姫

新潟県

1995

とよのか＊

野菜試(注4

1989

栃木12号

エバーベリー

野菜試(注5

なつあかり

野菜試(注5

栃木14号

愛媛農試V1号

愛媛県

ニューダナー

野菜試(注4

1971

栃木16号

王香

(山口照男)

濃姫

岐阜県

2000

栃木17号

大石四季成り

富山県

はつくに

奈良県

1983

栃木19号

大鈴

千葉県

華かがり

岐阜県

2017

栃木20号

大錦

みかど

はるのか

野菜試(注4

1967

栃木21号

大村朱

(松田昇)

1968

はるよい

野菜試(注4

栃木22号

尾瀬はるか

群馬県

2003

ピーストロ

愛知県

2004

栃木23号

おとめ心

山形県

2008

東12-16

東北種苗

1995

栃木24号

かおり野

三重県

2010

ひたち姫

茨城県

2006

栃木26号

夏芳

キューピー

1998

ひのみね

野菜試(注4

1989

栃木28号

北の輝

野菜試(注5

ひむか

宮崎県

1989

栃木29号

熊研い548(ひのしずく)
熊本県

2004

媛育

愛媛県

栃木30号

熊本VS03(ゆうべに) 熊本県

2017

ファーストベリー

太田宣明

1995

栃木31号

久留米49号

野菜試(注4福岡S6号(あまおう)

福岡県

2005

栃木32号

久留米63号

九州沖縄農業研究センター
2011

福羽＊

栃木33号

けいきわせ

静岡県

2000

ふさの香

千葉県

2006

栃木34号

けんたろう

北海道立道南農試(注6

2006

ペチカ

ホープ

2003

栃木35号

こいのか

九州沖縄農業研究センター
2008

紅孔雀

富山県

1969

栃木36号

紅寿

(神奈川県)

紅滝

栃木38号

紅姫

富山県

紅光

野菜試(注4

1967

栃木W2号

紅宝満

(福岡県)

紅富士

野菜試(注4

1967

系210

紅露

富山県

1970

紅ほっぺ

静岡県

2000

系511

古都果

奈良県

2011

ベリースター

埼玉県

1975

栃木素材2号

彩のかおり

埼玉県

1996

ベルマーレ

東北種苗

1995

00-24-1

さがほのか

佐賀県

2000

ベルルージュ

野菜試(注500-25-1

さちのか

野菜試(注4

1993

芳玉

徳島県

05-108-88

さつまおとめ

鹿児島県

2004

宝交早生

埼玉県

1968

09-48-5

さぬき姫

香川県

2005

美濃娘

岐阜県

2006

09-52-1

サマーアミーゴ

徳島県

2017

宮崎＊

野菜試(注41967

12-8-4

サマーエンジェル

長野県

2017

みよし

徳島県

1989

14-w1-1

サマーキャンディ

宮城県

2005

もういっこ

宮城県

2005

15-15-3

サマーティアラ

山形県2008

八雲(幸玉と同一)＊

15-15-8

サマーフェアリー

徳島県

2008

やよいひめ

群馬県

2003

S4-1

サマープリンセス

長野県

2004

夢甘香

兵庫県

2000

サマーベリー

奈良県

ゆめのか

愛知県

2006

サンチーゴ

三重県

リンダモール

(愛知県)

しずたから

静岡県

麗紅＊

千葉県

1970

1969

2000

導入年度

Aptos

Dover＊

1983

しずちから
静岡県
注１．＊は、品種識別用SSRマーカーの選定において、多型検索を行った８品種
注２．緑色セルは、品種識別用SSRマーカーの選定に用いた48品種・系統
注３．橙色セルは，2019年度に品種識別用SSRマーカーのアレル型を調査した24品種・系統
注４．現：農研機構 九州沖縄農業研究センター
注５．現：農研機構 東北農業研究センター
注６．現：地方独立行政法人北海道立総合研究機構道南農業試験場
注７．空欄は、詳細が不明

21

栃木県農業試験場研究報告 第 87 号

Polymerase（BIOLINE）を用いた． PCR 反応組成は，0.25U

Dye4 を標識した蛍光標識プライマーを用いた場合には，増My Taq DNA Polymerase, 1×My Taq Reaction Buffer，0.04

幅が悪かったが，M13（-21）配列を付加したフォワードプライ

μM フォワードプライマー，0.16μM リバースプライマー，

マーと M13（-21）配列に Beckman Dye3 を標識した蛍光標識

0.08 µM ユニバーサル蛍光標識プライマー，10ng 鋳型 DNA

プライマーを用いたところ，改善を図ることができた．同じく，とし，反応液量は 10µL とした．反応条件は 94℃・5 分の後，

RsaIGA030115 も M13Rv 配列を付加した場合は，非特異的な（94℃・30 秒，56℃・45 秒，72℃・45 秒）を 30 回繰り返し，ピークが検出されていたが，M13（-21）配列を付加した場合

さらに（94℃・30 秒，53℃・45 秒，72℃・45 秒）を 8 回繰りには，非特異的なピークが検出されなくなった．さらに， 8 品

返 し た 後 ， 72 ℃ ・ 7 分 と し た ． サ ー マ ル サ イ ク ラ ー は ，種のアレル型より， AluICA030103 ， AluICA030259 及びGeneAmp PCR System 9700 または Veriti（Applied Biosystems）

HaeⅢCA030216 は，複数のローカスを増幅するマーカーでを用いた．Dye4 標識の PCR 産物は 1/10TE で 20 倍希釈し，あると推定した．また，一次選抜した 12 種類の SSR マーカー

Dye3 標識の PCR 産物は 10 倍希釈し，1µL の希釈液に 25µL

はすべてゲノム由来で，EST 由来の SSR マーカーは，全体的の ホ ル ム ア ミ ド ， 0.08µL の DNA SizeStandard Kit-400に多型性が低い傾向にあった（田﨑， 2020）．

（Beckman Coulter）を加えた後，シーケンサーGenomeLab

次に， 栃木県育成品種・系統及び国内主要品種を含む

GeXP（Beckman Coulter）で検出した．

48 品種・系統（第１表 緑色セル）のマーカー検出を行い，48
品種・系統すべて安定して増幅した 7 種類の SSR プライマー

４．Blast 検索

を品種識別用 SSR マーカーとして選定した（第３表）． 48 品

品種識別用 SSR マーカーについて，プライマー設計時に種・系統のアレル型からも，

AluICA030103 及 び

用いた濃縮ライブラリーのクローン配列及びプライマー配列を

AluICA030259 は，２つのローカスを増幅するマーカーである

データベースサイト Strawberry Garden（https://strawberry-と推定できた（第４表）．

garden.kazusa.or.jp/)の FAN_r2.3 で Blast 検索を行った．

Ⅲ

DNA 鑑定を行う場合，葉だけではなく，がく片や果実（種子を含まない）から抽出した DNA を用いて分析をすることが結果想定されるため，とちおとめ及び栃木 i27 号について，葉，果１．品種識別用 SSR マーカーの選定

実のがく片及び果肉から抽出した DNA でマーカー検出結果

144 種類の SSR プライマーを用いて，多くの国内育成品種が異なるかどうかを確認したところ，7 種類すべての品種識別の祖先となっているとちおとめ，女峰，ダナー，とよのか，福羽，用 SSR マーカーで組織による検出結果に違いはなかった（デ宮崎，八雲，麗紅の 8 品種間で多型検索を行った．品種識別ータ省略）．

用マーカーの選抜基準は，①8 品種すべてで増幅が良く，ス
タッターピークが少ないこと，②各品種で検出されるアレル数

２．国内外の品種・系統における SSR マーカー検出が 4 以下であること，③8 品種のうち同じアレル型が 3 品種以2011 年に栃木 i27 号が品種登録出願されたことから，前述下であることとした．その結果，12 種類の SSR プライマーを一の 48 品種・系統に栃木 i27 号の近縁系統及び国内外育成次選抜した（第２表）．AluICA030253 は，5’側に M13Rv 配列

89 品種・系統（第１表 白色セル）を加えた 137 品種・系統にを付加したフォワードプライマーと M13Rv 配列に Beckman

ついて，7 種類の SSR マーカーのアレル型を調査し，それら第２表 一次選抜されたSSRプライマーによる８品種の検出アレル
プライマー名

付加配列

Alu ICA030103
Alu ICA030109
Alu ICA030253

M13Rv
M13Rv

各品種における検出アレル(注1（nt）
ダナー

とよのか

250 252 272 250 252 272 299

250 252 272 299

252 272 299 252 293 299 250 252 272 299

252 272 299 252 293 299

249

249 253239 249

239 249

237 241249

237 249

253 280

M13(-21) 203

187 203187 192

192 203180 203

203

192

187 203

M13Rv
220 232
220
Alu ICA030259 (注2175 177
157 175
Hae ⅢCA030216 (注3 M13Rv
Rsa ICA030303
M13Rv
211 225
213 223
Alu IGA030216
M13Rv
135
123 135
Hae ⅢGA030107
M13Rv
151
151 153
Rsa IGA030115
M13(-21) 194
182 194
Rsa IGA030150
M13Rv
196 202202
Rsa IGA030153
M13Rv
171
171
Rsa IGA030221
M13Rv
256
256
注１．シーケンサーによる検出サイズを示す
注２．全品種に検出された190アレルを除く
注３．全品種に検出された190及び196アレルを除く

220 232

220 232

209 228

209 217209 220220

175 177175

157 175 194 157 177

175

157 177

213 223

211 215215

211 223211

215 223

113 123

113 135

113

113 151

135 151

113 135

153

153 165

139 153

143 165

153 165

151 153

178 182

180 194

182 194180

178 180

182 194

202 212196

194212 218212

202 212171 179

171 181179

185 189

179 183

171 179

238 256

247 267

228 247

230 267

267

247

22

とちおとめ

女峰

福羽

宮崎

八雲

麗紅

8 倍体イチゴ品種・系統を識別する SSR マーカーの開発と利用がすべて識別可能かを検討した．
女峰と新女峰（女峰の培養変異株）はすべてのマーカーで同じアレル型を示した．また，しずちからとその父親である宝交早生は，AluICA030259 のみで異なるアレル型を示した．新女峰を除く 136 品種・系統は，7 種類のうち 4 種類の組合せ（ AluICA030109 ， AluICA030259 ， RsaICA030303 に 加 え て

HaeⅢGA030107 または RsaIGA030115）で識別が可能であった．
2018 年に栃木 iW1 号及び栃木 i37 号が相次いで品種登録出願されたことから，両品種の他に近縁系統及び国内育成の 24 品種・系統（第 1 表 橙色セル）を追加して 7 種類のSSR マーカーで識別したところ，栃木 31 号とその父親である
05-108-88 は，RsaIGA030115 のみで異なるアレル型を示した．新女峰を除く 160 品種・系統は， 7 種類のうち 5 種類の組 合 せ （ AluICA030109 ， AluICA030259 ， RsaICA030303 ，

RsaIGA030115 に加えて AluICA030103 または AluIGA030216）
で識別が可能であった．
また，新女峰を除く栃木県育成 9 品種については，7 種類の う ち 2 種 類 の 組 合 せ （ AluICA030103 に 加 え てAluIGA030216 または RsaICA030303）で識別することができた（第１図）．

３．品種識別用 SSR マーカーの特徴
田 﨑 （ 2020 ） に よ り ， AluIGA030216 ， Hae Ⅲ GA030107 ，

AluICA030259，RsaICA030303 は，とちおとめといちご中間母
本農 2 号の F1 94 個体の SSR 多型分離比より， 2 倍体的な挙動を示す共優性マーカー関係を示すことが明らかとなっていたが，残り３種類の SSR マーカーについては不明であった．

第３表 品種識別用SSRマーカーのプライマー配列及び48品種におけるアレル多型数
SSRマーカー名

プライマー配列（5'- 3')
上段：フォワード，下段：リバース

反復配列

ローカス アレル
数
数

アレル
多型数

Alu ICA030103

caggaaacagctatgaccttgttgtttccaatcaggcttcct
gtttctacatgcagttcaaggttccca(tg)3tt(tg)18tttgtgcgc(gt)3

2

7

11

Alu ICA030109

caggaaacagctatgacctaaaggggagggaaggttggacta
gtttgtggaggtgatgaatttggaa(ta)7ggttcactgagttcacttt(ac)13(tc)8

1

6

11

Alu ICA030259

caggaaacagctatgaccgggtgatcacacttatgtcccgat
gtttgcaacaatgatatcctcccacctc(tg)182

6

8

Rsa ICA030303

caggaaacagctatgacctgacatgctttgaattggaaggtc
gtttcaattttgacatcttggagggctt(ac)11

1

5

13

Alu IGA030216

caggaaacagctatgaccgtacaaaatattcgctgcggggta
gtttataattgcgctttcctggctttc(ag)16

1

5

10

Hae ⅢGA030107 caggaaacagctatgaccgacggaggcagagaaatccagtag (ag)3aatcgggagggaggagacaga(ag)17
gtttaggagttggactggtttggaaaaa

1

6

10

Rsa IGA030115

1

4

9

tgtaaaacgacggccagtgggatggctgaccattatttttga
gtttgaccaggtaggcttctacccaa(ag)14ggagg(ga)323

栃木県農業試験場研究報告 第 87 号

そこで，品種識別用 SSR マーカーのプライマー設計に用い多く，第６，７染色体上に位置するマーカーはなかった．そした濃縮ライブラリーのクローン配列及び SSR プライマー配列をて，第１染色体上に位置する３マーカー（ AluICA030103 ，Strawberry Garden の FAN_r2.3 で Blast 検索を行った結果，

RsaICA030303， Hae ⅢGA030107）は，異なる相同染色体上相同性の高い配列が検出され，座乗染色体が推定された．

に位置しており，各マーカーの独立性が示唆された．さらに，選定した品種識別用 SSR マーカーは，相同染色体上に位置

AluICA030103，AluICA030259 は，結果１で推定したとおり，することから，2 倍体的な挙動を示す共優性マーカーであるこ

２つのローカスを増幅していることも確認できた（第５表）．

とが示唆された．また，第１染色体上に位置するマーカーが４．栃木県育成品種の親子鑑定への利用

第５表 SSRマーカーの座乗染色体の推定結果
SSRマーカー名

品種識別用 SSR マーカーは，2 倍体的な挙動を示す共優座乗染色体性マーカーであることから，8 倍体のイチゴでも親子鑑定に利Alu ICA030103
ch1Ava ch1Avb
ch0
Alu ICA030109
ch3Ava ch3Avb
Alu ICA030259
ch4X1a ch4X1b
ch0
Rsa ICA030303
ch1X1a ch1X1b
Alu IGA030216
ch5X1a ch5X1b
Hae ⅢGA030107 ch1Bia ch1Bib
Rsa IGA030115
ch2Ava ch2Avb
注１．ch1Avaとch1Avbは相同染色体（他も同様）
注２．ch0は染色体が未特定のDNA領域を示す

用可能であると推察された．本県育成品種を用いて，親子鑑定が可能かを検討したところ，両親の DNA がある 7 品種（女峰，栃の峰，とちおとめ，とちひめ，なつおとめ，栃木 i27 号，
栃木 i37 号）及び，父親のみの DNA がある２品種（とちひとみ，
栃木 iW1 号）の親子関係に矛盾はなかった（第６表）．以上より，品種識別用 SSR マーカーはイチゴの親子鑑定にも利用できることが示唆された．

第６表 品種識別用SSRマーカーによる栃木県育成品種の親子鑑定結果
続柄 品種・系統名

各SSRマーカー（注１による対立アレル型（bp）

（注２

AC103

AC109

AC259

RC303

AG216

HG107

RG115

母親 麗紅
父親 系210
子 女峰
母親 系511
父親 女峰

252/252 293/299
250/252 272/299
250/252 272/299
252/252 293/299
250/252 272/299

253/280249/249
249/253
239/253
249/253

220/220220/220220/220220/228220/220215/223
213/213213/223
223/225
213/223

113/135
113/123
123/135
135/135
123/135

151/153
153/153
151/153
153/153
151/153

182/194
182/194
182/194
178/182
182/194

子 栃の峰
母親 久留米49号
父親 栃の峰子 とちおとめ
母親 栃の峰父親 久留米49号
子 とちひめ父親 さちのか子 とちひとみ
母親 00-25-1

250/252 272/299
252/252 272/272
250/252 272/299
250/252 272/272
250/252 272/299
252/252 272/272
252/252 272/272
252/252 272/299
252/252 293/299
250/252 262/272

249/253
239/249
249/253
249/249
249/253
239/249
239/249
239/249
239/239239/249

220/220220/232220/220220/232220/220220/232220/232220/232220/232220/232

213/225
211/213213/225
211/225
213/225
211/213211/225
215/223
213/223
213/223

135/135
113/135
135/135
135/135
135/135
113/135
113/135
113/135
113/135
113/135

151/153
151/153
151/153
151/151
151/153
151/153
151/151
151/153
153/153
151/153

182/194
180/194
182/194
194/194
182/194
180/194
194/194
182/194
180/182
182/182

父親 栃木24号
子 なつおとめ
母親 00-24-1
父親 栃木20号
子 栃木i27号
母親 栃木32号
父親 09-48-5
子 栃木i37号
父親 09-52-1
子 栃木iW1号

252/252 272/272
252/252 262/272
250/252 272/272
250/252 272/272
250/252 272/272
252/252 272/272
252/252 272/299
252/252 272/299
250/252 272/272
252/252 272/293

249/249
239/249
239/249
249/249
239/249
249/253
249/253
249/253
249/253
249/280

217/220217/220220/220220/232220/232220/220228/232220/232220/232220/220223/225
213/223
213/223
213/223
213/213213/223
223/223
213/223
215/225
211/215

113/115
115/135
115/135
113/135
113/135
135/135
113/135
113/135
113/135
135/135

151/153
151/153
151/153
151/165
153/165
151/151
151/153
151/151
153/153
153/153

194/194
182/194
182/194
182/194
182/194
194/194
182/194
182/194
194/194
194/194

注１．AC103：Alu ICA030103，AC109：Alu ICA030109，AC259：Alu ICA030259，RC303：Rsa ICA030303、AG216：Alu IGA030216、HG107：Hae ⅢGA030107、RG115：Rsa IGA030115
注２．すべての品種・系統に共通に検出される190ntのアレルは除く.
注３．母親由来のアレルは赤字.父親由来のアリルは青字.どちらの両親由来か判断できないアレルは緑色セル.
24

8 倍体イチゴ品種・系統を識別する SSR マーカーの開発と利用

第４表 48品種におけるSSRマーカーのアレル多型一覧（注２

品種・系統名
AC103
AC109
AC259
RC303
AG216
HG107
RG115
女峰
250/252 272/299 249/253
220/220213/223 123/135 151/153 182/194
栃の峰
250/252 272/299 249/253
220/220213/225 135/135 151/153 182/194
とちおとめ
250/252 272/272 249/249
220/232
211/225 135/135 151/151 194/194
とちひめ
252/252 272/272 239/249
220/232
211/225 113/135 151/151 194/194
とちひとみ
252/252 293/299 239/239
220/232
213/223 113/135 153/153 180/182
なつおとめ
252/252 262/272 239/249
217/220213/223 115/135 151/153 182/194
栃木i27号（スカイベリー） 250/252 272/272 239/249
220/232
213/213 113/135 153/165 182/194
栃木24号
252/252 272/272 249/249
217/220223/225 113/115 151/153 194/194
栃木26号
252/252 272/272 249/253
232/232
223/225 113/135 151/151 182/194
栃木28号
250/252 262/272 239/249
220/232
213/225 113/135 151/165 182/194
栃木29号
252/252 272/272 249/249
232/232
223/223 113/135 151/165 194/194
栃木30号
252/252 272/299 249/253
220/220213/223 113/151 151/151 194/194
00-25-1
250/252 262/272 239/249
220/232
213/223 113/135 151/153 182/182
章姫
250/252 299/299 241/253
209/220211/213 113/135 151/165 194/194
アスカルビー
250/252 272/299 249/253
220/232
211/213 113/123 151/153 178/182
あまおとめ
252/252 272/272 249/253
220/220211/223 113/135 151/151 194/194
あわなつか
252/252 282/293 237/253
220/220213/223 113/135 137/165 180/182
いちご中間母本農2号
252/252 262/272 249/249
209/220223/225 113/115 143/153 182/194
おとめ心
252/252 272/272 239/239
209/220213/213 113/123 153/153 178/194
熊研い548(ひのしずく)
252/252 272/272 249/253
220/232
215/215 135/135 151/151 194/194
さがほのか
252/252 272/272 249/253
220/220215/223 113/113 151/165 180/194
さちのか
252/252 272/299 239/249
220/232
215/223 113/135 151/153 182/194
さつまおとめ252/252 272/272 239/249
220/220223/223 113/135 151/165 182/194
さぬき姫
252/252 272/272 239/253
220/232
215/223 113/135 151/165 194/194
サマーキャンディ
252/252 262/272 249/253
220/220211/213 113/135 151/153 194/194
サマーフェアリー
252/252 272/282 253/280
220/220213/223 113/135 151/165 178/182
サマープリンセス
250/252 272/299 253/280
209/220213/223 113/123 151/165 182/182
サンチーゴ
252/252 272/299 249/249
220/232
211/213 113/135 137/165 182/194
春訪
252/252 272/272 239/253
220/232
211/223 123/135 153/165 182/194
セリ－ヌ
252/252 293/299 239/253
220/232
211/213 113/135 137/153 180/194
ダナー
250/252 272/299 239/249
220/232
213/223 113/123 153/153 178/182とねほっぺ
252/252 272/272 239/249
209/220213/223 115/123 153/165 182/194
とよのか
252/252 272/299 239/249
220/232
211/215 113/135 153/165 180/194
はるのか
252/252 272/299 249/249
209/220213/215 113/123 153/153 182/194
ひたち姫
252/252 272/299 249/253
220/232
211/225 135/135 151/165 194/194
福岡S6号（あまおう）
252/252 299/299 239/239
209/232
215/223 113/135 151/153 180/194
福羽
252/252 293/299 237/241
209/228
215/215 113/113 139/153 182/194
ふさの香
252/252 272/272 249/253
220/232
211/223 113/135 151/153 182/194
紅ほっぺ
250/252 272/299 241/249
220/220213/215 113/135 151/165 194/194
宝交早生
252/252 299/299 237/253
209/232
211/211 115/135 137/165 180/182
美濃娘
252/252 299/299 249/253
220/232
223/223 113/123 151/165 182/194
宮崎
250/252 272/299 249/249
209/217211/223 113/151 143/165 180/180
もういっこ252/252 272/272 239/253
220/232
213/223 113/135 151/151 182/194
八雲
252/252 272/299 237/249
209/220211/211 135/151 153/165 178/180
やよいひめ
252/252 272/272 249/249
220/220213/225 123/135 151/151 182/194
ゆめのか
252/252 272/299 239/253
220/220215/223 135/135 153/165 194/194
麗紅
252/252 293/299 253/280
220/220215/223 113/135 151/153 182/194
Dover
252/252 262/272 239/249
209/228
223/225 113/113 143/153 180/194
注１．AC103：Alu ICA030103，AC109：Alu ICA030109，AC259：Alu ICA030259，RC303：Rsa ICA030303、AG216：Alu IGA030216、HG107：Hae ⅢGA030107、RG115：Rsa IGA030115
注２．すべての品種・系統に共通に検出される190ntのアレルは除く.
25

栃木県農業試験場研究報告 第 87 号

５．簡易検定法の検討

ローカスを増幅するマーカーであり，多型性は高いものの，検迅速に DNA 鑑定を行うために，簡易な DNA 抽出法によるマーカー検出について検討した． Noh et al. (2017) を一部

出アレルの識別が難しく，アレル間の共優性関係も不明であった．

改変したアルカリボイル法について，葉，果実のがく片及び本研究では，開発にあたって，検出アレルの識別がしやす

果肉の各組織ごとに，DNA 抽出条件を検討した．組織のサンいように，各品種において検出アレル数が 4 以下となる条件

プリングは，生検トレパン（φ2mm，kai medical）を用いて行い，でマーカー選抜を行った．また，品種識別だけではなく，8 倍

葉，がく片は直径 2 ㎜のディスク葉を 1 枚，果肉は直径 2 ㎜・体のイチゴでも親子鑑定や現在取り組んでいる種子繁殖育厚さ 7 ㎜程度のサンプル量とした．0.2mL PCR チューブにバ

種における F1 純度検定にも応用できるよう，2 倍体的な挙動

ッファーA（0.1M NaOH, 2％Tween20）70µL とサンプルを入を示す共優性マーカーを選定した．マーカーの独立性につれ，サーマルサイクラーで 95℃・10 分間加熱した後，バッフ

いては，開発当初は確認することができなかった．その後，かァーB（0.1M Tris-HCl（pH8.0）, 2mM EDTA(pH8.0)）70µL を

ずさ DNA 研究所が中心となり，イチゴ品種麗紅の全ゲノムシ加えて抽出液とした．抽出液 10µL に超純水を 40µL を加えーケンスが解読され，データベースサイト Strawberry Gardenて希釈し，鋳型 DNA とした．従来の PCR 反応組成に，終濃が開設されたことにより，イチゴゲノム情報が誰でも使えるよう度が 1mｇ/mL BSA，1％PVP になるように加えて， PCR 増幅になり，マーカーの座乗位置についても確認することができたを実施した場合に，安定した結果を得ることができた．

（第５表）．さらに，今回供試した 161 品種・系統ではすべて

Ⅳ

考察

増幅し，Null 対立遺伝子は確認されなかった．
開発した品種識別技術では，女峰と女峰の培養変異株で

栃木県では，2008 年に栃木県育成 5 品種と国内主要 8ある新女峰はすべてのマーカーで同じアレル型を示し，区別

品種を含む国内外 25 品種・系統について，RAPD-STS 及びすることはできなかった．また，しずちからとその父親である宝AFLP-STS マーカーを用いて識別する技術を開発している

交早生，栃木 31 号とその父親である 05-108-88 は 7 種類中（田﨑ら, 2008a,b）．しかし，2009 年になつおとめ，2011 年に

6 種類のマーカーのアレル型が一致していた． 本研究で開栃木 i27 号が相次いで品種登録出願されたことや，国内各地

発した SSR マーカーは保存性が高い DNA 配列上で作成しで新品種育成が盛んに行われるようになったことから，新品たため，突然変異を識別することはできないマーカーであると種を含む，より広範囲な品種に迅速に対応できる新たな DNA

考えられる．また，しずちからの母親であるしずたからは，宝マーカーを開発する必要性が高まった．

交早生の戻し交配品種であることから，しずちからの DNA のSSR マーカーは信頼度が高く，一般に共優性でアレル数

8 分の 7 は宝交早生由来であると推定できる．同様に，栃木が多いことから品種識別能力も高いため，様々な動植物にお31 号の母親である栃木 23 号と父親である 05-108-88 は，どいて，品種識別や親子鑑定の手法として利用されている．

ちらも片親がとちおとめであり，近親交配を繰り返している．

2005～2007 年に，イチゴ連鎖地図作成のため，とちおとめ
由来の Genomic-SSR マーカー及び EST-SSR マーカーの大以上のことから，上記の品種間では 6 種類のマーカーのアレル型が一致していたと推測された．

量開発を行い（田﨑, 2020），それらのマーカーを，イチゴ炭種苗法に基づく栃木県育成いちご品種の育成者権の保護

疽病耐病性遺伝子領域の QTL 解析に利用した研究実績がを目的として，品種識別を行う場合は，正確性と緊急性が求あったことから（飯村ら, 2012，田﨑, 2020），本研究では，新められるため，DNA 抽出法の簡便化は重要である．対象とな

たなイチゴの品種識別マーカーとして，SSR マーカーを用いる部位は，イチゴ苗の葉，果実のがく片及び果肉で，それらることにした．コムギやアズキのように品種識別に EST-SSR マの組織から短時間で簡易に抽出でき，安定的に PCR 増幅がーカーが利用されている農作物もあるが，田﨑（2020）が開発

可能な検出条件が必要とされる．本研究では，アルカリボイ

したイチゴの SSR マーカーでは，プライマー作成可能な SSR

ル法を用いることで，15 分程度で DNA 抽出が可能となり，安

配列は，Genomic-SSR で 456 個，EST-SSR で 544 個であっ定した PCR 増幅結果が得られる PCR 条件を設定することがたが，とちおとめ及びいちご中間母本農 2 号における多型割できた．

合は，Genomic-SSR の割合が 76.4％に対して，EST-SSR は

イチゴにおいて妥当性試験が実施されている品種識別技

26.7％と低かった．このことは，本研究で選定した品種識別用

術には，独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構

SSR マーカーがすべてゲノム由来であったことと矛盾しない．

（現；国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構，

SSR マーカーによるイチゴの品種識別法は，Shimomura

以下，農研機構）野菜茶業研究所（現；農研機構野菜花き研and Hirashima （2006），Honjo et al.(2011)で報告されてい究部門）が開発した CAPS マーカーを活用した品種識別技

る．これらの SSR マーカーは，少なくとも 3～4 以上の複数の術がある（國久，2010）． シーケンサーのような高額な機器を26

8 倍体イチゴ品種・系統を識別する SSR マーカーの開発と利用必要としないが，多数の制限酵素を準備する必要があり，ま析によるイチゴ炭疽病耐病性遺伝子領域の検索．育た，純度の低い DNA では，結果が安定しないことが知られて種学研究 15: 90-97.

いる．本研究で開発した SSR マーカーを活用した品種識別

飯村一成・田崎公久・中澤佳子・森島正二・生井 潔・天谷

技術は，妥当性試験を実施していないため，税関や裁判の正行（2021）イチゴ栽培種における萎黄病抵抗性 QTL

証拠等へ利用はできないが，育成者権の侵害が疑われる事の検索．育種学研究 23: 101-108.

例における迅速な対応は可能である． また，新品種にもすぐに適用可能であるだけでなく，育種現場での遺伝資源の管理や，種子繁殖育種における F1 純度検定への利用も期待できる技術であると言える．

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