博 士 （ 医 学 ） 吉 川 泰 永学位論文題名NovelvariationsandlossofheterozygosityofBRCA
2identified inadog with mammary tumors（イヌ乳腺腫瘍において認められた癌抑制遺伝子B
RC
A2の新規変異とヘテロ接合性の消失）

学位論文内容の要旨【背景】
最近 の統計に よると 、日本人女性の部位別癌罹患率で乳癌は第1位であり、極めて重要な癌 に位置づ けられて いる。 また、日 本人女 性の19人に 1
人 は一生の うちに乳癌に罹患する と報告さ れており 、年々 増加傾向 にある 。癌抑制 遺伝子 であるBR
CA2は、その変異が乳 癌の発症 と強く相 関して いる。変 異BR
CA2をもつ人 が一生 のうちに 乳癌に罹患する確率 は60‑85％ になる と報告されており、乳癌を研究する上で重要な位置を占めている。
BRCA2の変異に より癌 化した細 胞では 、他の癌 抑制遺伝 子と同 様に両方 のアリルに変異が 生じてい ると考え られて いる。変 異BR
CA2をもつ個 体にお いて、癌 化していなぃ細胞では変異型および正常型アリルからなるへテロ接合体であるが、癌化した細胞では組換えや欠失などにより正常型アリルが消失して変異型アリルのみが残り、ホモまたはヘミ接合体 となる。 このよう な変化 をへテロ 接合性 の消失(Lossof heterozygosityLOH)と呼ぶ が 、 変 異 BRCA2に よ る 遺 伝 性 乳 癌 に お い て こ の LOHが 多 数 報 告 さ れ て い る 。
BRCA2は 300
0個 以 上の ア ミ ノ酸 か ら なる 巨大 分子で、 D
NA損傷 修復に 関与する 。DNA
損傷 修復系の ひとっで ある相 同組換え 修復に おいて、 R
AD51
タ ンパク質 が中心的な役割を 果た す こ と が知 ら れ てい る が 、BRCA
2は そ の中 央 に 存在 す る 8っの B
RC repeatsとC
末 端 に 存 在 す る RAD51結 合 領 域 を 介 し て RAD51に 結 合 す る 。 そ し て 、 RAD51を DNA損傷部位にりクルートすることで、DNAの安定化に寄与する。
現 在 、 変 異BRCA
2に よ る乳 癌 の モデ ル 動物 として 10系統以上 の遺伝 子改変マ ウスが作出されているが、胎生致死である報告や乳腺腫瘍以外の腫瘍発症頻度が高いという報告が多く、乳癌発症のモデル動物としてこれらは不十分であると考えられる。そこで我々は、他の 動物種で 変異BR
CA2による 乳癌発症 の新規 モデルを 確立し ようと考 え、乳腺腫瘍の発症 頻度が極 めて高い イヌに 注目した 。イヌ の乳腺腫 瘍とBR
CA2の変異 との関係は不明
であ るが、我 々はイヌ 乳腺腫 瘍におい てもBR
CA2の変異 が関係 している と考えた。そこ
で 、イ ヌ に お いて 腫 瘍 発症 に 関 係す る BR
CA2の変 異 を 発見 し 、 イ ヌが 変異BR
CA2による乳癌発症の新規モデル動物になり得るか検証した。
【材料と方法】
イヌの乳腺腫瘍発症例、あるいは非発症例由来の血液およぴ乳腺腫瘍組織は、北海道大学および岩手大学の附属動物病院から提供を受けた。
イヌ 乳腺腫瘍 におい てB
RC
A2の 腫瘍発 症に関係する変異を発見するために、BRCA2の翻訳領 域全長の 塩基配列 を調べ ることを 考えた 。しかし、BRC
A2の翻訳領域全長は約10kbp‑175―と非常に長いので、全症例について塩基配列を調べることは費用と時間がかかりすぎると判断 し、塩 基配列を 調べる 前にLOH
解析を利用したスクリーニングを行うことにした。イヌ
BRC
A2の遺 伝子領域 には、 LOH
解析 に適し た多型マ ーカー が存在し なかった ので、4種類のマーカーを新規に確立し、これを使用してLOH解析を行った。
血 液 およ び 乳 腺腫 瘍組 織から得 られた ゲノムDN
Aおよ びcDN
Aの塩基 配列を DNA
シー クエ ン サ ー によ り 解 析し た。また 、乳腺 腫瘍組織 におけ る鰡〇42のmRNAの発現 量をSYBRgreenを用いたりアルタイムPCRにより測定した。
【結果】
硼〇42
遺伝 子のイ ントロン に存在す る3種類のマ イクロ サテライ ト配列を 利用して新規 の多型 マーカー を確立 した。ま た、以 前報告し たエキソン27に存在する挿入・欠失多型 マーカ ーの検出 方法を 改善した 。この 4種類 の多型マ ーカー について 11個体の アリル型 を調べ たところ 、いず れのマーカーでもへテロ接合体の頻度が高いことが判明し、4種類 す べ ての マ ー カー の アリル 型がホモ 接合体で ある個体 は見っから なかった 。
乳 腺 腫瘍 発 症 イヌ 3例 にお い て 、こ の 4種類 の 多型 マーカー を利用し たLO
H解析を行っ た 。 そ の 結 果 、 硼 D他 遺 伝子 領 域 にお い て LO
Hを 示 す1例 を 発見 し た 。こ の 検 体の乳 腺腫瘍 組織では 両方の アリルで 硼〇他 が発現し ていることがわかった。乳腺腫瘍組織で 発 現 し てい る 齠 〇他 の 翻 訳領 域 全 長の 塩 基 配列 を調べ たところ 、BRCA2の機能ド メ
イ ンをコ ードする 領域に 4種類 のミスセ ンス変 異、1種類の 挿入・欠 失変異、 1種 類のサイ レント変異を発見した。これらの変異のうち、正常組織ではへテロ接合体であり腫瘍組織 ではホ モ接合体 となっ た変異は 、BRCrepeat3のア ミノ酸配列を変化させるミスセンス変異（K1435R）であった。
次に、LOHを示し た検体 の乳腺腫 瘍細胞 において 、組換 えまたは 欠失のど ちらの変異が 起 こ っ た の か を 調 べ る た めに 、 血 液と 乳 腺 腫 瘍組 織 の ゲノ ム DN
Aか ら BRCrepeat3を 含む領域をクローニングしてシークエンス解析を行った。その結果、この検体では組換えによりLOHを示したことがわかった。
【考察】
イヌBR
eA
2の遺伝 子領域で 確立した 新規多 型マーカ ーは、 ヘテロ接 合性の 頻度が高いことからLOH解 析に 適 し てお り 、 実際 に 、 乳腺 腫 瘍 症例 に お け るLOHの発 見 に利用できたことから有用なマーカーであると言える。
LOHを 示 し た検 体 の 乳腺 腫 瘍 組織 で 発 現し て い た鰡 eA2には 腫 瘍 発症 と 関係 する変異 が存在 していた はずで ある。ゆ えに、 この検体 で発見した4種類のミスセンス変異と1種 類の挿入・欠失変異の中には、腫瘍発症と関係する変異が含まれると予想される。特にBRCrepeat3の ア ミノ 酸配 列を変 化させる ミスセン ス変異 （K1435R）は 、正常組 織ではヘ テロ接合体であったが腫瘍組織ではホモ接合体になっており、この検体で乳腺腫瘍の発症 と 関 係 す る 変 異 で あ る 可 能性 が 高 い。 こ の BR
Crepeat3
は RAD51を 結合 す る ドメ イン であり 、K1435
Rの変 異はこれ らの結 合に影響 を与える可能性が考えられた。ヒト乳癌患 者において同定されたものの発癌に対する影響がわかっていなぃミスセンス変異がデー
タ ベ ー ス に多 数 報 告さ れ て いる 。 そ れら の 中 にイ ヌ の K
1435Rと 対 応 する ヒ トの変異（ K1440R） が あ る 。 ヒ ト に お い て も BRCrepeat3の ア ミ ノ酸 配 列 を変 化 さ せる 変 異（ K1440R） は 腫 瘍 発 症 に 関 係 す る 変 異 で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。
【結論】イ ヌ 齠〇 42遺伝 子 領 域に お い て多 型 マ ーカ ー を利 用したLO
H解析法 を確立 し、乳腺腫 瘍 組 織 でLOHを示 す 例 を初 め て 発見 し た 。こ の LO
Hを 示 す 検体 か ら 乳腺 腫 瘍発症と関 係する可能性のある変異を特定した。変異のひとっはヒト乳癌患者において発癌に対する 影響がわかっていなぃミスセンス変異と同様の変異であり、ヒトにおいてもこの変異は― 176―

腫瘍発症に関係する変異である可能性が考えられた。以上のことからイヌは変異BR
CA
2に よ る 乳 癌 発 症 の 新 規 モ デ ル 動 物 に な る 可 能 性 が 考え ら れ た 。

― 177―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 渡 辺 雅 彦
副 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 岩 永 敏 彦

学位論文題名Novel variations and loss of heterozygosity of BRCA2
identifiedina
dogwith mammary tumors（イヌ乳腺腫瘍において認められた癌抑制遺伝子BRCA2の新規変異とヘテロ接合性の消失）

癌 抑 制 遺伝子 であるBR
CA2は、 その変異 が乳癌の 発症と 強く相関 してい る。BR
CA2はDNA損 傷 修復 系 の ひと っ で あ る相 同 組換 え修復に おいて 、R
AD51をDNA
損 傷部位に りクル ート す ること で、DNAの安定 化に寄 与する。 変異BRCA2による 遺伝性 乳癌にお いてこのへテロ接合性の消失(Lossofheterozygosity,LOH)が多数報告されている。申請者は、
マウス 以外の 動物種で変異BR
C
A2による乳癌発症の新規モデルを確立しようと考え、乳腺腫 瘍の 発 症頻度 が極め て高いイ ヌにお いてBR
CA2の変異 を発見し 、イヌ が変異BR
CA2による乳癌発症の新規モデル動物になり得るかを検証した。
研究で は、BR
CA2遺伝子 のイン トロンに 存在する3種類のマイクロサテライト配列を利用して新規の多型マーカーを確立した。また、以前報告したエキソン2
7に存在する挿入・決失多 型マー カーの検 出法を 改善した 。乳腺腫瘍発症イヌ3例において、この4種類の多型 マー カ ー を利 用 し たLOH解 析を 行 い 、BRCA
2遺 伝 子領 域 に 韜い てLO
Hを示す 1例を 発見した 。この 検体の乳 腺腫瘍 では欠失 ではなく 組換え によりLOHを示 し、両方のアリルでBRCA2が 発現 している ことがわ かった 。乳腺腫 瘍組織 で発現し ている BRC
A2
では 、機能ドメ インを コードする領域に4種類のミスセンス変異、1種類の挿入・欠失変異、1種類のサイレント変異を発見した。これらの変異のうち、正常組織ではへテロ接合体であり腫瘍組織 ではホ モ接合体となった変異は、BRCrepeat
3のアミノ酸配列を変化させるミスセンス変異(
K1435R)であった。
イヌBRC
A2の遺 伝子領域で確立した新規多型マーカーは、ヘテロ接合性の頻度が高いこと から LOH解析 に適し ており、 実際に 、乳腺腫 瘍症例 における LOHの発 見に利 用できた
ことか ら有用 なマーカーであると言える。R
AD51を結合するドメインのアミノ酸配列を変化させ るミス センス変 異(K1435R)は、 正常組織ではへテロ接合体であったが腫瘍組織ではホモ接合体になっており、乳腺腫瘍の発症と関係する変異である可能性が高い。ヒト乳癌患者 のミス センス変 異の中 にこれと 同じ変異(K1440R)があることから、ヒトにおいてもこの変異は腫瘍発症に関係する変異である可能性が考えられた。以上のことからイヌは、
変 異 BRCA2に よ る 乳 癌 発 症 の 新 規 モ デ ル 動 物 に な る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。
論 文 審 査 と 平 行し て 公 開発 表 は 、平 成 21年2月 2日午 後 4時30分 より 医 学 部臨 床 大一 178―

講堂において行われた（出席者26名）。申請者はスライドを用いながら約18分にわたって学位論文の発表を行った。その後、畠山教授より、くD実験にはどのような系統（品種）のイヌを用いていたのか、また遺伝的背景は均一であるのか、◎Mammaliantwohybrid
以外の結合性実験は行っているのか、◎BR
C
A2はどのくらい下等な動物から存在する遺伝子なの か、につ いて質 問があっ た。次 いで、主 査（渡辺 ）より、くDB
RC
A
2はDN
A
修復に関与する遺伝子であるが、どのような機序で乳腺腫瘍の発症に関与するのか、◎B
R
CA
2には核へRAD
51を運 ぶ以外 の機能が あると 考えるの か、◎ 核に移行するタンパクとしては巨大であると思われるがその点支障はないか、＠イヌが新規モデルになる可能性とは具体的にどういうことか。モデル動物というには不十分であると考えられなぃか、などにっいて質問があった。最後に、岩永教授より、◎乳腺の状態によってBRC
A2の発現に変化は認められるのか、◎モデルマウスが胎生致死に陥る時期とその原因はわかっているのか、について質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は自身の研究成果を元に、過去の文献
およぴ未発表所見を加えて、おおむね適切に回答した。
この論文は、イヌが変異BRCA2による乳癌発症の新規モデル動物になる可能性を示した
点で高く評価され、今後の乳癌発症の機序を解明することに貢献するものとして期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ申請者 が博士 （医学） の学位 を受ける のに充分 な資格 を有する ものと 判定した。

― 179ー