研究最前線

タンパク質だけで感染する常識外の仮説を実証

プリオン病、ハンチントン病の発症メカニズムに迫る

翻訳直後のプリオン

うし かい めん じょう のう しょう

クロイツフェルト・ヤコブ病やBSE（ 牛 海 綿 状 脳 症 ）で知られるプリオン病は、プリオンというタンパク質の異常により発症する神経変性疾患だ。
プリオン病には細菌やウイルスを介した感染症とは異なり、プリオンだけを感染源とする“タンパク質単独仮説” があり、研究者の間で長年議論されてきた。
理研脳科学総合研究センター タンパク質構造疾患研究チームの田中元雅チームリーダーらは、酵母プリオンを用いて、タンパク質単独仮説を世界で初めて実証。
タンパク質のアミロイド（凝集体）構造の違いがさまざまな症状を引き起こす特異なメカニズムを解明し、治療法の確立していない神経変性疾患の病態解明や治療法開発に役立てようとしている。

社会問題となったプリオン病
神経細胞が死滅し、スポンジのように脳が穴だらけになる

年ノーベル生理学・医学賞）が、プリオン病患者の脳から微プリオン病。長い潜伏期間を経て発病すると、認知障害や妄細な物質を発見。その正体は、253個のアミノ酸からなるタ想といった症状が急速に進行し、やがて体が制御できなくなンパク質で、“プリオン”と名付けられた。
「プルシナー博士は、り1～2年で死に至る恐ろしい病気だ。ヒツジではスクレイ

プリオン病は細菌やウイルスではなく、プリオンという感染ピー、ウシではBSE（通称、狂牛病）、ヒトではクロイツフェ性のタンパク質によって引き起こされるとする“タンパク質ルト・ヤコブ病（Creutzfeldt-Jakob Disease：CJD）など単独仮説”を提唱しました」。この仮説では、“正常型プリオン”が知られている。のほかに、正常型とアミノ酸配列がまったく同じ“異常型プ

1990年代半ばに英国でCJDが集団発生したことを覚えてリオン”があり、病因はこの異常型プリオンにあるとされている人も多いだろう。当時、スクレイピーにかかったヒツジいる（タイトル図）。の脳や肉骨粉を含む飼料を食べたウシがBSEになり、そのウ「タンパク質が正常に機能するには、数珠つなぎになったシを食べたヒトがCJDになることが明らかとなり、種を超えアミノ酸が正しく折り畳まれなければなりません。この折りてプリオン病が感染する恐怖が社会問題にまで発展した。

畳みをフォールディングといいます。異常型プリオンは、折「通常、感染症の病原体は細菌やウイルスなどで、生体にり畳みがうまくいかずにミスフォールドしたもので、帯状の感染した病原体は核酸（DNAやRNA）を複製して自己増殖βシートという構造を多く持ちます。タンパク質単独仮説は、します。ところが、プリオン病では、病原体は細菌やウイル異常型プリオンの構造が鋳型となり、正常型プリオンを異常スではなく、核酸も検出されていません。しかも、同じプリ型の構造に変換し、次第に線維状のアミロイドを形成していオン病であっても、患者さんによって障害が出る脳の部位、くというものです」にく こっ ぷん

進行の速さ、症状などがまるで違うのです（タイトル図）。発タンパク質単独仮説を支持する実験データもいくつか得ら症のメカニズムは解明されておらず、根本的な治療法は今のれてはいるが、タンパク質のみで感染するという医学の常識ところありません」と田中元雅チームリーダー（TL）。に反するこの仮説に対して、世界中の研究者の間で長年議論

タンパク質単独仮説

プリオン病の感染源であり、ほかの因子が関係していないこ

ここで、プリオン病に関するこれまでの研究を紹介してお2こう。1982年、米国のスタンリー・プルシナー博士（1997

RIKEN NEWS October 2011が続いてきた。
「この仮説を実証するには、プリオンのみがとを証明しなければなりません。また、同じアミノ酸配列をプリオン病発症の流れと表現型

プリオン病の病原体は、細菌やウイルスではなく、プリオンという感 染 性 の タン パ ク 質 と 考 えら れ てい る。
DNAの塩基配列が翻訳された直後のプリオンは、アミノ酸が数珠つなぎになったひも状を呈している。それが折り畳まれて（フォールディング）、特有の立体構造となる。何らかの理由で誤った折り畳みになると（ミスフォールディング）、複数のプリオンが重合して線維状正常型プリオン
αヘリックスのアミロイドを形成することがある。このアミロイドの蓄積がプリオン病の発症に関与すると考えられている。
正常型プリオンは、ひもがらせん状になったαへリックスを多く含んだ構造をしており、水に溶けやすい。一方、異常型プリオンは、ひもが帯状に平行に並んだβシートに富む構造をしており、水に溶けにくい、という違いがある。
細胞表現型（酵母）

αヘリックスの多い構造。
水に溶けやすい。

フォール
ディング

アミロイド（凝集体）

疾患表現型（マウスの脳）
発病

異常型プリオン
凝集
4℃

発病

凝集
37℃
ミスフォールディング

凝集

βシートの多い構造。
水に溶けにくい。

発病

βシート持つプリオンから重篤度や疾患部位特異性など、表現型に違いが生じる謎を解明する必要があります」と田中TL。

仮説の実証に成功

入した酵母は白色、37℃で重合したアミロイドを導入した酵
母はピンク色と、異なる色になりました。また感染率も異なり、4℃で重合したアミロイドの方が37℃で重合したものに比べ、より高率にプリオン感染を引き起こしました」。さらに

2004年、田中TLはまず、“酵母プリオン”を使って、プリ重要なことは、この感染実験で現れた表現型（この場合、色）オンのみがプリオン病の感染源であることの証明に挑んだ。

は、導入したアミロイドの量に依存しなかったことだ。
「実験「単細胞の酵母にも、哺乳動物のプリオンと同様の振る舞いに用いたのはアミノ酸配列が同じSup35です。つまり、異なをするタンパク質があり、それを酵母プリオンといいます。

る表現型の出現は、アミロイドの量ではなく、“コンフォメー

私たちは、酵母プリオンの一つ“Sup35”のアミロイドをつションの違い”に由来することが分かりました」

くり、これをプリオン感染していない酵母に直接導入する手法を開発しました。すると、その酵母内の正常型プリオンの100％近くが次々とアミロイド化しました。つまり、プリオンのみで感染したのです」

ハンチントン病にも関わるアミロイド構造
さらに研究を進めていくと、プリオン病だけでなく、同じ神経変性疾患のハンチントン病の発症にもアミロイド構造の次に、同じアミノ酸配列を持つプリオンから異なる表現多様性が関与していることが分かってきた。ハンチントン病型が生じる謎に取り組んだ。田中TLらが着目したのはアミは、不随意運動、認知力低下を伴う疾患で、治療方法が見つロイド構造だ（タイトル図）。
「私たちは、同じアミノ酸配列のかっていない難病だ。

Sup35から異なる“コンフォメーション（同一分子中の各原

まずタンパク質がつくられる過程を簡単に説明しておこ子の立体的な配置）”を持つアミロイドをつくる方法を開発しう。DNAの遺伝子領域の塩基の並び方（塩基配列）は、アました。ポイントは、添加物などを加えずに単に異なる温度ミノ酸のつながり方を指定する暗号になっている。塩基には、でSup35を重合させたこと。4℃と37℃で重合させた二つのアデニン（A）・チミン（T）・グアニン（G）・シトシン（C）

アミロイドを調べ、実際に異なるコンフォメーションになっの4種類があり、塩基が三つ一組みで一つのアミノ酸を指定ていることを確認しました。次に、この二つのアミロイドをする。このアミノ酸が連なってタンパク質がつくられる。

それぞれプリオン感染していない酵母へ直接導入し、感染実「ハンチントン病の原因となるタンパク質“ハンチンチン”験を行いました。その結果、4℃で重合したアミロイドを導の遺伝子領域の一つエキソン1には、C、A、Gの三つ一組み
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プリオン化する仕組みが分かれば、そこから新たな治療戦略や創薬のヒントが得られるはずです。

ドは弱いという、プリオン酵母と同様の結果になりました。
これは露出したポリグルタミンが周辺の正常なタンパク質と相互作用し、それらを巻き込んで凝集することで、正常なタンパク質の機能を失わせるからだと考えられます」

アミロイド構造の形成過程「私を含む多くの研究者は、感染性や毒性の高いアミロイ
ドは“ガチガチに固まった状態”ではないかと、何となくイメージしていました。もちろん、そこには何の根拠もありません。しかし実際には反対で、感染性の高いプリオン、毒性の強いハンチンチンのアミロイドは、むしろ脆弱な構造でした。脆弱なアミロイドは細胞内で細かく分断されます。そして、分断された一つひとつのアミロイド断片がそれぞれに働いて、より感染性が高まることが明らかになっています。では、アミノ酸配列の同じタンパク質からどのように異なるアミロイド構造が生成されるのか。特に、感染性や毒性の高いアミロイド構造が生じるメカニズムを解明すれば、プリオン病、ハンチントン病などアミロイドを原因とする神経変性疾田中元雅 Motomasa Tanaka

和光研究所 脳科学総合研究センター
タンパク質構造疾患研究チーム チームリーダー
たなか・もとまさ。工学博士。京都大学大学院工学研究科修了後、理化学研究所脳科学総合研究センター基礎科学特別研究員。2002年、カリフォルニア大学サンフランシスコ校博士研究員。日本学術振興会海外特別研究員、科学技術振興機構さきがけ研究員を経て、2006年より現職（2011年7月より現在のチーム名に改称）。

患の病態解明や、新たな治療法の開発に近づけます」
そして2010年、田中TLらはSup35を対象に、4℃と37℃におけるアミロイドの形成過程を、理研播磨研究所にある大型放射光施設「SPring-8」を使って詳しく調べた。
「タンパク質溶液にX線を照射し、散乱強度を測定することで、タンパク質の結合状態や構造を調べるX線小角散乱という方法を用いました。その結果、37℃ではSup35は単量体（モノマー）であるのに対し、4℃では複数のモノマーが結合した安定なの繰り返し配列“CAGリピート”があります。CAGはアミ重合体（オリゴマー）を形成していることが分かりました（図ノ酸の一つ、グルタミンを指定し、グルタミンが長くつながっ2）。また、温度を4℃、37℃と繰り返し変えても、それぞれたものをポリグルタミンといいます。ハンチントン病の患者の温度で同じ散乱強度を示したことから、Sup35のオリゴさんでは、CAGリピートが通常よりも多い36個以上繰り返マー形成は温度変化に対して可逆的であることが分かりまし

され、異常に伸長したポリグルタミンがつくられます。このた。さらに、4～9℃で形成したアミロイドはオリゴマーを経異常なポリグルタミンを含むハンチンチンがアミロイドとな由して感染性の高い脆弱な構造になること、10～37℃で形り、発症に関わるのです。しかし、詳細な発症メカニズムは成したアミロイドはオリゴマーを経由せずに感染性の低い堅まだ分かっていません」
2009年、田中TLらは精製したハンチンチンのエキソン1を、酵母プリオンのときと同様に4℃と37℃で凝集させ、アポリグルタミンミロイドを形成させた。
「4℃で凝集させたアミロイドは、β高毒性シートに加え、ひも状構造のループやU字形のループ構造で4℃

ぜい じゃくあるターンを多く含む脆弱な構造で、ポリグルタミンの一部が凝集体の外に露出しています（図1）。一方、37℃で凝集さハンチンチン

ループ、ターンを含む凝集形成せたアミロイドはβシートが多い強固な構造で、ポリグルタミンが凝集体の中に埋もれた構造になります。興味深いこと

アミロイド構造

アミロイド構造37℃に、試験管内で4℃や37℃で凝集させたアミロイドとよく似低毒性た構造を持つアミロイドが、ハンチントン病モデルマウスの脳内でも観察され、脳の中の領域によってアミロイドの構造が違うことも分かりました。さらに、アミロイドの構造の違

図1 アミロイド構造に依存した細胞毒性

いが毒性の強弱をもたらすかどうかを調べたところ、4℃でハンチンチンエキソン1を4℃と37℃で凝集させたところ、4℃で凝集したアミ
ロイドはポリグルタミンが露出した脆弱なアミロイド構造で、より毒性が高いことが分かった。

凝集したアミロイドは毒性が強く、37℃で形成したアミロイ
4βシートに富む

RIKEN NEWS October 2011

非天然相互作用

4℃

脆弱な構造

1〜35 番目のアミノ酸

感染性：高い色：白50〜100 番目の
アミノ酸

オリゴマー

37℃

堅い構造

1〜70 番目のアミノ酸

モノマー
図2 Sup35タンパク質のアミロイド形成過程と酵母プリオン株の表現型

感染性：低い
色：ピンク

アミロイド
4℃では、各モノマーの50～100番目のアミノ酸（黄色）同士が非天然相互作用（緑色の線）により結合し、オリゴマーが形成される。次に、そのオリゴマーが足場となり、モノマーが1～35番目のアミノ酸を介して順次結合していき伸長する。形成されるアミロイ
ド構造は脆弱なため細胞内で分断されやすく、より表現型

多くのアミロイド断片を生じて感染性の高い表現型となる。一方、37℃ではオリゴマーを形成せず、モノマーが1～70番目のアミノ酸を介して順次結合していき伸長する。形成されるアミロイド構造は堅いため分断されにくく、感染性の低い表現型となる。

い構造になることが分かりました。つまり、安定なオリゴマー

リオン病の場合は異常型）である状態は、実は比較的普通にが形成されるか否かが、アミロイドの最終的な構造や表現型起こっている現象で、例えば環境の変化に応じてその都度、を決定する要因になっていたのです」

変換しているのかもしれません。例えば可溶型はスイッチオ

次に、4～9℃でオリゴマー形成に関わるアミノ酸を特定ン、凝集型はオフとして機能していて、何らかの環境変化にするためにSup35の変異体を作製し、どのアミノ酸の変異に適応している。もしも同様のスイッチングをゲノムの変化によってオリゴマーの量が減少するかをX線小角散乱法で調べよって行おうとすれば、どこかに変異が入ってしまうリスクた。その結果、プリオンドメインという123個からなるアミがありますが、タンパク質だけでオン・オフができればそのノ酸配列中の、最初の約100個のアミノ酸が、オリゴマー形リスクを回避できます」と話す田中TLは、プリオンのような、成に関与していることが明らかとなった。

タンパク質の可溶・凝集状態の可逆的なスイッチングを利用「さらに、その中の50～100番目のアミノ酸同士が結合するした細胞機能の発見を目指し、研究をスタートさせている。と、オリゴマー形成が始まることが分かりました（図2）。ほ「もちろん、プリオン病やハンチントン病といった神経変性かの研究グループにより、アミロイド形成に使われるアミノ疾患の病態を解明し、新しい治療戦略や創薬に役立つような酸は、4℃では最初の35個、37℃では最初の70個であること研究も進めていきます」。すでに酵母プリオンでは、感染性が報告されています。これらの結果から、4℃では複数のモノを高める上で重要な役割を果たす“分断タンパク質”が同定

マーがそれぞれの50～100番目のアミノ酸を介して相互作用されている。この分断タンパク質の機能を阻害すると、アミ（非天然相互作用）して、最初にオリゴマーを形成する。次に、ロイドは分断されずに伸びる一方で、その後プリオン化したそのオリゴマーが足場となってモノマーが順次結合していき状態から正常な状態に戻ることが分かっている。この仕組み伸長する。オリゴマーの形成によって、この伸長の際に使わを応用すれば、分断する因子をブロックするという治療につれるアミノ酸が35個と少なくなるために、脆弱なアミロイドながるかもしれない。
「しかし、多くの課題があります。哺乳構造になります。一方、オリゴマーが形成されない37℃では、類に関しては分断タンパク質が見つかっていませんし、タン4℃のときの倍の70個のアミノ酸が結合に参加できるので、パク質だけを用いて高効率でプリオン感染させることも、実安定した堅いアミロイド構造を形成するのです」。脆弱なアミはできていません。哺乳類の場合は、核酸などの補助因子がロイドは細胞内で分断されやすく、より多くのアミロイド断ないと感染性の高いアミロイドはできないのではないかと指片を生じて感染性が高まるのだ。こうして、感染性の高いア摘する研究者もいます。私たちは、酵母プリオンで発見したミロイド構造の生成メカニズムが解明された。

メカニズムをきっかけに、新たな道が切り拓けると信じて研タンパク質によるスイッチング「これまでは病気を引き起こす原因としてのみ見ていたアミロイドですが、最近では生体内で細胞の機能を制御する役割を果たしているのではないかと考えています。タンパク質が可溶型（プリオン病の場合は正常型）である状態と凝集型（プ究を進めています」
（取材・構成／牛島美笛）

関連情報

2010年1月18日プレスリリース「酵母プリオンタンパク質のオリゴマー形成過程が感染強度を決定」
2009年5月26日プレスリリース「タンパク質凝集構造の違いがハンチントン病の発症に関与」

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