心身科学 第 10 巻第 1 号（85 90）（2018）

フィブロネクチン基質におけるエンビジンタンパク質による細胞の接着伸展の亢進市原啓子＊１）

エンビジンは細胞表面の１型膜貫通型糖タンパク質で、タンパク質の構造的な特徴から免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。エンビジンは、モノカルボン酸輸送体２タンパク質（MCT ２）の協働因子と考えられているが、機能に関しては不明な点が多い。本論文では、エンビジンの生理機能を明らかにする目的で、エンビジンの cDNA に myc タグと His タグを連結した発現ベクターを作成し、ヒト培養細胞である HEK293T 細胞で強制発現させた。
エンビジン遺伝子を細胞に導入し、48 時間後にウェスタンブロット解析を行なったところ、エンビジンタンパク質は抗エンビジン抗体および抗ペンタ His 抗体によって検出できた。細胞接着アッセイは、ベクターのみを導入した HEK-293T 細胞 (HEK) をコントロールとし、エンビジン発現ベクター導入によりエンビジンタンパク質を発現する HEK-293T 細胞 (HEK-Em) を使って行なった。フィブ
ロネクチンをコートした基質上に細胞を２時間まき込み、接着細胞および伸展細胞の数を計測した。
接着細胞数に対する伸展細胞数は、HEK-Em は HEK の２倍となった。この結果から、エンビジンは細胞接着において基質への接着だけでなく細胞の伸展につながるシグナル伝達に関与する可能性が示唆された。
キーワード：エンビジン、細胞接着、伸展、フィブロネクチン

表面タンパク質と複合体を形成し細胞の機能をI. はじめに

調 節 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る。International
Mouse Phenotyping Consortium database（www.

エンビジンは、村松らのグループによって 1990 年

mousephenotype.org/）６ ） では、エンビジンノックアに同定された細胞表面の １ 回膜貫通型糖タンパク質

ウトマウスはホモ接合体が誕生するものの、心臓や肝である １ ）。タンパク質の構造的な特徴からイムノグロ臓で形態異常が発生すると記載されている。しかしなブリン（Ig）スーパーファミリーに分類され、ほ乳類

がら、エンビジンがこのような異常をひきおこす仕組から魚類までの脊椎動物で遺伝子が同定されている。

みについては解明されておらず、依然としてエンビジマウスでは発生初期に発現が高く、カルシウムイオンンの生体内での作用機序については不明な点が多い。

２）、エ

本研究では、エンビジンの機能を明らかにする目的

ンビジンとファミリーを形成するベイシジンと共にモで、マウスエンビジン組換えタンパク質をヒト培養細ノカルボン酸トランスポーター MCT と複合体を形成胞において強制発現させる系を作成した。さらに、エすること ３ ） が報告されている。近年、肝臓での幹細ンビジンを発現させた細胞を用い、フィブロネクチン依存的に細胞の基質への接着が亢進すること４）、膵臓がんにおをコートした基質上での細胞の接着と伸展に対する効いては発現の上昇、上皮ー間充織の転移に関係するこ果を調べた。その結果、エンビジン発現細胞では、伸胞のニッチ分子として機能することと５）が 報 告 さ れ、 細 胞 表 面 に お い て 他 の 細 胞

展細胞数がコントロールと比較して ２ 倍になること＊ 1 ）愛知学院大学心身科学部健康栄養学科（連絡先） 〒 470-0195 愛知県日進市岩崎町阿良池 12 E-mail：kichi@dpc.agu.ac.jp― 85 ―

市原啓子

がわかった。エンビジンが細胞接着において基質への添 加 し た 可 溶 化 バ ッ フ ァ ー（0.6% CHAPS, 0.1%

接着だけでなく細胞の伸展につながるシグナル伝達に

sodium deoxycholate, 10mM Hepes -NaOH pH 7.2、関与する可能性が示唆された。

150mM NaCl）を加え、4 ℃で 30 分間振とうしてタンパク質の抽出を行った。スクレーパーで可溶化物を 集 め、15000rpm、4 ℃ で 10 分 間 遠 心 し 上 清 を 得た。この上清に含まれるタンパク質を、SDS- ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離し、PVDF 膜（Immobilon-P, Millipore） に 転 写 し た ７ ）。

II．材料と方法

ポンソー染色でタンパク質の転写像を確認した後、５ ％スキムミルクを含む TBS-T バッファー（20 mM

１ ．発現ベクターの作成
マ ウ ス エ ン ビ ジ ン（GenBank, NM̲010330） のTris-Cl pH 7.4、150 mM NaCl、0.1 % Tween20）でcDNA を鋳型とし、 ２ つのプライマー、EmbF07Hdブロッキングし、抗 Penta-His 抗体（ 1 :1000、マウ

5 '-AAAGCTTGCCATGCGCTCGCACACTGGCCTG

スモノクローン抗体、Qiagen）または抗エンビジン

A- 3 ' お よ び EmbR999Xb 5 '-TCGATTTCTAGACTA抗体 Em51（ウサギポリクローン抗体、自作）８ ） と反TCTGCAGAGTCAGTTTTTC- 3 ' で PCR 反 応 を 行 っ応させた。TBS-T で洗浄後、二次抗体として HRP 標た。増幅した DNA 断片をアガロースゲルで精製し、識抗マウス IgG 抗体（ 1 :6000, ヤギポリクローン抗制限酵素 Hind III と Xba I 処理をおこなった。この体、Jackson ImmunoResarch） ま た は HRP 標 識 抗

断 片 を Hind III と Xba I と で 切 断 し た pcDNA3.1-

ウサギ IgG 抗体（ 1 :6000, ヤギポリクローン抗体、myc-His ベクター（Invitrogen）にライゲーションをJackson ImmunoResarch）と反応させた。洗浄後、行い、大腸菌を形質転換し、エンビジン発現ベクター

ECL Prime（GE ヘルスケア）と反応させ、得られたpEmbMycHis を得た。発現ベクターの cDNA および

化学発光のシグナルをライトキャプチャー II（ATTO）

cDNA とベクターの連結部分は、DNA シーケンサーで検出した。

ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer（Applied４．細胞接着アッセイBiosystems）で塩基配列を確認した。さらに、発現基質となるヒト血漿フィブロネクチン ９ ）は PBS でベクターを産生する大腸菌を大量培養し、プラスミド希釈し、マルチウェルプレート（Falcon 1147, BD

精製カラム（Qiagen）で純度の高いプラスミド DNA

Biosciences 社）の各ウェル（ ２ cm２）に 0.40ml 入れ、を得た。

２ 時間室温で放置した。滅菌水で各ウェルを ３ 回洗２．細胞培養とトランスフェクション浄した後、1 % ウシ血清アルブミンを含む PBS で、30ヒト培養細胞 HEK293T 細胞株は、poly-D-Lysine

分間 37℃でブロッキングした。細胞をトリプシン - 1（PDL, Sigma-Aldrich）をコートした培養皿を用い、mM EDTA 処理で解離し、ダイズトリプシンインヒ

10% ウ シ 胎 児 血 清 を 含 む Dulbecco's Modiﬁed

ビターを含む DMEM で洗浄した後、DMEM に懸濁Eagle's Medium（DMEM）で継代した。プラスミドした。 １ ウェルあたり ３ 105 個でまきこみ、37℃、DNA の細胞へのトランスフェクションは、PDL コー

5 % CO2 で ２ 時間培養した 10）。PBS で洗浄し、未接6トした 60 mm 径培養皿に 1.0 x10 細胞を播種し、リ着の細胞をウェルから除いた後、4 % 中性緩衝ホルマ

ポ フ ェ ク ト ア ミ ン 2000（Thermo Fisher Scientiﬁc）

リンで細胞を固定した。また各ウェルをランダムにを用いて行った。トランスフェクションの 48 時間後

５ 箇所以上写真撮影し、接着細胞の数と伸展細胞のにウェスタンブロットでエンビジンタンパク質の発現数をカウントした。接着細胞数に対する伸展細胞の割を調べた。細胞接着アッセイには、トランスフェクショ合を求め、得られた平均値に有為な差があるかどうかン後 72 時間の細胞を用いた。

を student の t 検定で調べた。

3. ウェスタンブロッティング

III．結果トランスフェクトした細胞をリン酸緩衝塩液（PBS）で洗浄後、プロテアーゼインヒビターミックス（1.0mM AEBSF、0.80μM Aprotinin、15μM

１．HEK293T 細胞におけるマウスエンビジンタンパ

E - 6 4 、2 0 μM L e u p e p t i n h e m i s u l f a t e 、5 0 μM
Bestatin、10μM Pepstatin A、Nacalai tesque）を― 86 ―ク質の発現
マ ウ ス エ ン ビ ジ ン cDNA を 組 み 込 ん だ 発 現 ベ クエンビジンによる細胞伸展の亢進

ターを、HEK293T 細胞にトランスフェクションし、クチンの濃度が 0.5 と 1.0 の時それぞれ 8.1% と 12.0

48 時間後に細胞を可溶化し、ウェスタンブロッティ% だった。一方、エンビジン発現細胞（HEK-Em）でングを行った（図 １ ）。抗エンビジン抗体（anti-Emb）

は、伸展した細胞の割合は、フィブロネクチンの濃度を用いた結果から、HEK293T 細胞は、内在性のエンが 0.5 と 1.0 の時でそれぞれ 19.2 % と 23.8 % だった。

ビジンがわずかに発現しているが、トランスフェク（図 ２ B）
。エンビジンを発現させた細胞では、同じ濃ションした細胞での組換えエンビジンの発現量が非常度のフィブロネクチン基質上で、0.5 でも 1.0 でも、約に大きいことがわかった。また、組換えタンパク質に２ 倍の細胞で突起の伸展が起こったことがわかった。

はヒスチジンタグが付加されているため、抗 Penta-

この伸展細胞の割合に関して、t 検定をおこなったとHis タグ抗体（anti-His）で検出することができた。

ころ p ＜ 0.01 で有意な差が認められた。

内在性のエンビジンと同様、組換えエンビジンは 66

IV．考察

kDa のバンドとして認められた。
２．エンビジン発現細胞における細胞接着の亢進トランスフェクションした 72 時間後に細胞を解離

本研究の結果、エンビジンを強制発現させた細胞でし、フィブロネクチンを 0.5μg/ml または 1.0μg/ml

は、接着面のフィブロネクチン基質に対して接着伸展でコーティングした基質上にまきこみ、 ２ 時間培養する細胞の数が有意に増加していることが明らかとした（図 ２ A）
。フィブロネクチンの濃度が高いほど、なった。HEK293T 細胞のエンビジンタンパク質の産接着する細胞の数が多くなった。また、接着し突起を生量はわずかである。したがって、フィブロネクチン伸展させた細胞数も増加していた。接着した細胞数

基質への接着や伸展の効果は、エンビジンを強制発現および突起を伸ばした伸展細胞の数を数え、接着したさせたことによると考えられる。
細胞がフィブロネクチン基質に結合する際の受容体コントロールの HEK293T 細胞（HEK）では、接着はインテグリンである 11）12）。エンビジンのファミリーした細胞のうち、伸展した細胞の割合は、フィブロネタンパク質であるベイシジンは、細胞膜表面でインテKHE

KHEKHE

HEKEm

Em細胞における突起伸展細胞の割合を調べた（図 ２ B）。

N'D

Emb
DQWL(PE

図1

DQWL+LVHEK293T 細胞におけるエンビジンタンパク質の強制発現HEK293T（HEK）細胞にマウスエンビジン発現ベクターをトランスフェクトし、エンビジンタンパク質を発現する細胞（HEK-Em）を作成 し た。抗 エ ン ビ ジ ン 抗 体（anti-Emb）お よ び 抗 penta-His 抗 体（anti-His）でウェスタンブロットを行ったところ、エンビジンタンパク質（矢印）を検出することができた。

― 87 ―

市原

グリンと複合体を形成することでインテグリンの作13）

啓子

テグリンと協働して、接着後の細胞内への情報伝達に。また、マウス L関与する可能性を示唆するものである。エンビジンの細胞においてエンビジンを強制発現させるとフィブロ機能として、細胞膜上でインテグリンとその複合体とネクチン基質への接着が亢進することが報告されてい協働して伸展を促進する可能性や、エンビジンの細胞

る ２ ）。しかしながら、エンビジンの突起の伸展に対す内部位に何らかのタンパク質が結合してインテグリンる効果については記述がない。本研究では、エンビジを活性化する可能性などが考えられる。エンビジンをンの発現が接着の亢進のみならず、伸展も亢進すると介した細胞の伸展について、より詳細な細胞内情報伝いうことを明らかにした。これは、エンビジンがイン達の仕組みの解明が求められる。

用を補助することが知られている$+(.

+(.(P)150+m% 
伸展した細胞の割合(%)

)1

図２+(. +(.(P0.5 +g/ml+(. +(.(P1.0 +g/ml

エンビジン発現細胞のフィブロネクチン（FN）基質への接着

A. コントロール細胞（HEK）とエンビジン発現細胞（HEK-Em）を FN をコーティングした基質上で２時間培養し、位相差顕微鏡で観察した。B. 接着した細胞と接着伸展した細胞の数を調べ、接着細胞数に対して突起をもち伸展している細胞の割合を調べた。同じ FN の濃度では、エンビジン発現細胞の方で、伸展細胞の割合が大きくなることがわかった。* は、p<0.01 で有意差があることを示す。

― 88 ―

エンビジンによる細胞伸展の亢進

phenotyping data.

謝辞７ ）Ichihara-Tanaka K, Oohira A, Rumsby M, Muramatsu T.
（2006）J Biol Chem. 281 , 30857­64. Neuroglycan C is aDNA シーケンサーの使用に際して、愛知学院大学

novel midkine receptor involved in process elongation of

歯学部吉村文信教授の協力と支援をうけたことに深く

oligodendroglial precursor-like cells.

謝意を表します。

８ ）市原啓子（2014）心身科学 6 :119­124. ブレビバチルス発
現系によるエンビジン組換えタンパク質の発現と精製

文献９ ）Ichihara-Tanaka K, Titani K, Sekiguchi K.（1995）J Cell
Sci. 108 : 907-915. Role of the carboxyl-terminal Fib 2１）Huang RP, Ozawa M, Kadomatsu K, Muramatsu T.（1990）
Differentiation. 45 , 76­83. Developmentally regulated
expression of embigin, a member of the immunoglobulin

domain in ﬁbronectin matrix assembly.
10）Maeda T, Oyama R, Ichihara-Tanaka K, Kimizuka F,Kato I, Titani K, Sekiguchi K.（1989）J. Biol Chem 264 :superfamily found in embryonal carcinoma cells.
２）Huang RP, Ozawa M, Kadomatsu K, Muramatsu T.

15165­68. A Novel Cell AdhesiveProtein Engineered by（1993）Dev Biol. 155 , 307­14. Embigin, a member of theimmunoglobulin superfamily expressed in embryonic cells,

Insertionof the Arg-Gly-Asp-Ser Tetrapeptide.
11）Geiger B and Yamada K（2011）Cold Spring Harb Perspect
Biol 2011: 3 : a005033. Molecular Architecture andenhances cell-substratum adhesion.
３）Wilson MC, Meredith D, Fox JE, Manoharan C, Davies

function of matrix adhesions.

AJ, Halestrap AP.（2005）J Biol Chem. 280 , 27213­

12）Huttenlocher A, Horwitz A.（2011）Cold Spring Harb

21. Basigin（CD147）is the target for organomercurial

Perspect Biol 2011: 3 : a005074. Integrins in cell

inhibition of monocarboxylate transporter isoforms 1

migration.

and 4: the ancillary protein for the insensitive MCT 2 is13）Muramatsu T.（2016）J Biochem 159 :481­490. Basigin

EMBIGIN（gp70）.

（CD147）, a multifunctional transmembrane glycoprotein

４ ）Silberstein L, Goncalves KA, Kharchenko PV, Turcottewith various binding partners.

R, Kfoury Y, Mercier F, Baryawno N, Severe N, BachandJ, Spence JA, Papazian A, Lee D, Chitteti BR, Srour EF,
Hoggatt J, Tate T, Celso CL, Ono N, Nutt S, Heino J,
Sipila K, Shioda T, Osawa M, Lin CP, Hu GF, Scadden
DT.（2016）Cell Stem Cell 19 : 530­543. Proximity-Based
Differential Single-Cell Analysis of the Niche to Identify
Stem/Progenitor Cell Regulators.
５）Jung DE, Kim JM, Kim C, Song SY.（2016）Mol Carcing

55 : 633-45. Embigin is overexpressed in pancreatic ductal
adenocarcinoma and regulates cell motility throughepithelial to mesenchymal transition via the TGF-betapathway.
６）Koscielny G, Yaikhom G, Iyer V, Meehan TF, Morgan H,
Atienza-Herrero J, Blake A, Chen CK, Easty R, Di Fenza
A, Fiegel T, Griﬁths M, Horne A, Karp NA, Kurbatova N,Mason JC, Matthews P, Oakley DJ, Qazi A, Regnart J,Retha A, Santos LA, Sneddon DJ, Warren J, Westerberg
H, Wilson RJ, Melvin DG, Smedley D, Brown SD, Flicek
P, Skarnes WC, Mallon AM, Parkinson H.（2014）NucleicAcids Res. 42 （Database issue）: D802­809. TheInternational Mouse Phenotyping Consortium Web Portal,a unified point of access for knockout mice and related― 89 ―（平成 29 年 12 月 26 日受理）

Journal of the Institute for Psychological and Physical Science, Vol. 10, No. 1 , 85 90, 2018

Cell attachment and elongation on the ﬁbronectin substratum are enforcedby the embigin expression.
Keiko ICHIHARA-TANAKA

Abstract
Embigin is a cell surface transmembrane protein, which is classiﬁed as the immunoglobulin
superfamily. Embigin is thought to be the cofactor of monocarboxylate transporter 2 , but its
function is not fully understood yet. In this paper, to study the physiological roles of embigin,
the expression vector containing mouse embigin cDNA with myc and His tag sequences wasconstructed, and introduced into the human HEK293T cells.
Embigin protein was successfully expressed at 48 hours after the transfection, and detectedby the western blotting with either anti-embigin antibody or anti-penta-His antibody. Then cellattachment assay was performed using control HEK293T (HEK) cells and the transiently embigin
expressing HEK293T (HEK-Em) cells. After two hours incubation on the fibronectin coating
substrate, both HEK and HEK-Em cells were attached and elongated. I counted the number ofattached cells and the elongated cells, and calculated the ratio of the munbers of elongated cells
to the number of the attached cells. The ratios on the ﬁbronectin substrata were approximately
2 times higher at HEK-Em cells than HEK cells. This result shows that expression of embigin
protein enhance both cell attachment and elongation.
Keywords：embigin, cell attachment, elongation, ﬁbronectin― 90 ―