医療保健学研究

総2号：21-28頁 (2011)ISSN 2185-2227

説Whole mount免疫染色による小脳区画の三次元的可視化
澤田和彦1，落合絵美2
1つくば国際大学医療保健学部理学療法学科，2看護学科―――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――【要旨】小脳では、異なる遺伝子発現パターンを示すプルキンエ細胞群が矢状方向に配列し、独特なストライプ状の区画をつくる。本稿では、この様な小脳区画のwhole mount免疫染色による三次元的可視化について紹介する。whole mount免疫染色のプロトコールは、Sillitoe andHawkes (J Histochem Cytochem 50:235-244, 2002)によって最初に示され、その後、我々が加熱処理による抗原賦活化を適用することでプロトコールを簡略化した(Sawada and Sun, Curr
Neurobiol 1:21-24, 2010)。whole mount免疫染色は、何百枚もの連続組織切片像を三次元構築することなく、zebrin IIやHSP25などによる小脳区画の正常構造の解析や、遺伝子異常などに起因した小脳区画の異常の解析を容易な形で可能にする。(医療保健学研究第2号：21-28頁／2010年11月16日採択)
キーワード： 免疫組織化学，zebrin II，HSP25，Ca2+チャンネル病，rollingマウス，小脳区画―――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
1. 序論状器官で構造タンパクや栄養因子の発現などの解析には用いられるものの、脳や肝臓、腎臓

whole mount 免疫染色は、胚子や胎仔、摘出器官を丸ごと特定の抗原に対する抗体と反などの実質性器官の解析には不向きなのが実状である。

応させ、抗体の認識部位を三次元的に可視化す

脊椎動物の小脳には、矢状方向にストライプる方法である。元来、胚子や胎仔の形態形成お状に配列する区画が存在する。この帯状区画

よび形態形成関連物質の発現動態解析のためは、裂や溝などの解剖学的ランドマークによっに開発された方法で、whole mount in situてその境界線が定められているものではなく、hybridization 法と共に発生学の研究に広く用小脳を構成する神経細胞のひとつであるプルいられている。しかし、胎仔に比べて結合組織キンエ細胞の遺伝子発現パターンの相違(表現が密な成体の器官では、器官表面から数µm し型 phenotype)によって区分される(Hawkes,

か抗体が浸透しないため、血管や腸管などの管1997)。現在では、zebrin II (Aldolase C)を発――――――――――――――――――――

現するプルキンエ細胞と発現しないプルキン

連絡責任者：澤田和彦

エ細胞が交互に配列することでストライプ状〒300-0051 茨城県土浦市真鍋6-8-33の区画をつくることが知られている(Hawkes,

つくば国際大学医療保健学部理学療法学科
TEL: 029-883-6032
FAX: 029-826-6776
e-mail: k-sawada@tius-hs.jp

1997)。この様なzebrin II帯状区画は、登上線維(延髄の下オリーブ核から小脳プルキンエ細胞に投射する“オリーブ小脳路”の神経線維)の22
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投射と密接に関係している(Voogd et al, 2003;③ 3%過酸化水素を含むDentの固定液に室Sugihara and Shinoda, 2004; Sugihara and温で24時間浸し、内因性ペルオキシダー

Quy, 2007; Sawada et al, 2008)。しかし、小ゼを不活性化させる。

脳帯状区画の解析は、たとえば数百枚の組織切片を連続で作製し、その全てでzebrin II免疫染色を行い、写真撮影後にzebrin II免疫陽性プルキンエ細胞群を画像解析装置等を用いて三次元的に構築する(Ozol et al, 1999)など、多大な時間と労力を要した。しかし、Sitolloe and④ 100%メタノール中に室温で60分浸し、脱水する。更にこの工程を二回繰り返す。
⑤ メタノールに浸したまま－80℃の超低温槽に60分間入れ、冷凍する。
⑥ メタノールに浸したまま標本を室温に60分間放置し、解凍する。

Hawkes (2002)により成獣マウス小脳のwhole⑦ ⑤、⑥の工程を更に五回繰り返す。

mount免疫染色法が確立されて以来、小脳の帯⑧ 室温で50%メタノール液に90分、15%メ状区画(Sitolloe and Hawkes, 2002; Terada et

タノール液に90分、リン酸緩衝生理食塩

al, 2004; Sarna et al, 2006)やそれに関連した水(pH. 7.4) (PBS)に90分浸し、親水する。

神経疾患(Sarna et al, 2003; Sawada et al,2010)、オリーブ小脳路(Sawada et al, 2008)の解析などにwhole mount免疫染色が適用され、多くの成果を上げている。本稿では、小脳
帯 状 区 画の 三 次元 的 可視 化 に有 効 な whole
mount免疫染色法の手順と、whole mount免疫⑨ 10mg/ml proteinase K (ケミコン、日本)に室温で5分間反応させる。
⑩ PBSに室温で5分浸し、洗浄する。更にこの工程を二回繰り返す。
⑪ PBSMT(2% ス キ ム ミ ル ク 、 0.1%
Triton-X100をPBSに溶かした液)中に浸染色による小脳の形態的、機能的異常の解析のし、室温で一晩、ブロッキング(一次およ現状について、我々の知見を織り交ぜながら概び二次抗体の非特異的結合のブロック)説する。

を行う。
⑫ 一次抗体をPBSMT‐ DMSO(19:1)液に

2. オリジナル･プロトコール
Sitolloe and Hawkes (2002)によって示された成獣マウスの小脳のwhole mount 免疫染色の手順を以下に示す。whole mount 免疫染色
では通常、4%パラホルムアルデヒド溶液(pH.
7.4)を経心性に灌流した小脳の固定標本を使用する。尚、以下の手順の後固定、内因性パーオキシダーゼの不活性化および脱水に用いているメタノールは、エタノールに代替が可能である(Sawada and Sun, 2010)。
① 実体顕微鏡下で小脳の髄膜を全て取り除く。
② Dentの固定液(メタノール：DMSO = 4：1)中に浸し、室温で24時間、後固定する。

希釈し、標本を浸し、室温で48時間反応させる。
⑬ PBSMTに浸し、室温で2～3時間洗浄する。この工程を更に二回繰り返す。
⑭ 二次抗体をPBSMT‐ DMSO(19:1)液に希釈し、標本を浸し、室温で24時間反応させる。
⑮ PBSMTに浸し、室温で2～3時間洗浄する。この工程を更に一回行う。
⑯ PBT(0.2% ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン 、 0.1%
Triton-X100をPBSに溶かした液)中に浸し、室温で2～3時間洗浄する。
⑰ DAB溶液(0.025% ジアミノベンチジン
四酢酸塩(DAB)(Sigma)、0.015%過酸化水素をPBSに溶かした液)中に室温で4～5分間浸し、発色を行う。

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3. 一次抗体反応前の加熱処理

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確保するために一次抗体反応前に標本の －80℃凍結と常温解凍を各1時間ずつ、5サイクホルマリン固定標本では抗原タンパクにアル以上繰り返して行う(オリジナルプロトコー

ルデヒド架橋が形成され、免疫染色をする場

ル⑤～⑦)。この工程に費やされる時間は単純合、抗原認識部位(epitope)に抗体が到達しにくに計算しても、10時間以上となる。しかし、くなり、染色性が弱くなったり、失われたりす

加熱処理を行うことで、この工程は省略され、ることがある。マイクロウェーヴ照射や加熱処

一次抗体反応前の前処理に費やされる時間は理、オートクレーブ処理などによる抗原賦活化約1時間程度となる(Sawada and Sun, 2010)。

は、アルデヒド架橋を破壊することにより抗原更に、オリジナルプロトコールの凍結･解凍の認識部位を露出させ、免疫染色性を改善する方工程は時間的な拘束だけでなく、－80℃対応法である(Shi et al, 2001)。我々は加熱前処理の超低温槽が必要であり、設備的な制約も受けによる抗体賦活化をwhole mount免疫染色法る。これに対し、加熱処理には90℃まで温めに適用することでSitolloe and Hawkes (2002)ることが可能な恒温槽が必要となるが、これはのプロトコールを一部改変し、簡便で迅速な染超低温槽に比べて断然低コストで小型で持ち色を可能にした(Sawada and Sun, 2010)。以運びが可能なため、設置場所を問わず、また、下にその手順を示す。

メインテナンスもほとんど必要がない。この様に加熱処理抗原賦活化の適用は、設備面でも大(A) 実態顕微鏡下で小脳の髄膜を取り除く。

きな利点があり、超低温槽を持たない小規模研(B) Dentの固定液中に室温で一晩浸し、後究室でのwhole mount免疫染色の実施を可能固定する。にする。

(C) 室温で50%メタノール液に90分、15%メタノール液に90分、PBS (pH. 7.4)に4. 小脳区画の可視化90分浸し、親水する。
(D) AntigenRetrieval
UNIVERSAL(R&DReagentsystem,

zebrin II抗体およびheat shock protein 25

Minneapolis, MN)中で90℃、30分間、(HSP25) 抗 体 を 用 い た 成 獣 マ ウ ス 小 脳 の加熱処理する。

whole mount 免 疫 染 色 像 を 図 1 に 示 し た 。

(E) Antigen Retrieval Reagent 標本を4℃で30分間冷やす。
(F) PBSに室温で5分間浸し、洗浄する。

zebrin II 免 疫 陽 性 反 応 は 、 Sitolloe andHawkes (2002) の 報 告と同 様に 小脳 の前 部
(AZ, anterior zone; 虫部I-VIa小葉、単小葉、(G) オリジナルプロトコールの『⑪ブロッキ係蹄小葉第I脚)ではストライプ状に、中央部ング』以降の工程により、whole mount(CZ, central zone; 虫部VIb-VII小葉、係蹄小免疫染色を進める。

葉第II脚)では一様に、後部(PZ, posterior zone;虫部VII-IXa小葉および正中傍小葉)ではスト

加熱処理による抗原賦活化は、一次および二ライプ状に、小節部(NZ, nodular zone; 虫部

次抗体を少なくとも小脳分子層(厚さ約50 µm)IXb-X小葉、片葉、片葉傍)では一様にみられた。

を浸透してプルキンエ細胞層まで到達させ、オこの様にマウス小脳は、zebrin II陽性プルキン

リジナルプロトコールと遜色のない染色像をエ細胞がストライプ状に配列する部位と一様得ることを可能にしている(Sawada and Sun,に存在する(非ストライプ)部位が吻側から順2010)。また、Sitolloe and Hawkes (2002)のに交互に並んでいることが分かる。更に前部のオリジナルプロトコールでは、抗体の浸透性をzebrin II陽性ストライプは細いのに対し、後部

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図1．whole mount 免疫染色を用いたマウス小脳のzebrin II陽性およびheat shock protein 25 (HSP25)陽性区画。
A．zebrin II抗体を用いてwhole mount 免疫染色をした小脳の背側面。B．HSP25抗体を用いてwhole mount 免疫染色をした小脳の背側面。C．whole mount 免疫染色像を基に作成したzebrin IIおよびHSP25の分布図。zebrin
II発現により小脳は、前部(AZ；ストライプ)、中央部(CZ；非ストライプ)、後部(PZ；ストライプ)ではストライプ状に、小節部(NZ；非ストライプ)に区分される。また、HSP25発現により、zebrin IIによってストライプが形成されない中央部(CZ)および小節部(NZ)がストライプ状に区分される。V：虫部V小葉，VIa：虫部VIa小葉，VIb：
虫部VIb小葉，VII：虫部VII小葉，VIII：虫部VIII小葉，IX：虫部IX小葉，X：虫部X小葉，AZ：前部，CI：係蹄小葉第I脚，CII：係蹄小葉第II脚，CZ：中央部，F：片葉，NZ：小節部，PF：片葉傍，PZ：後部，sim：単小葉．
スケールバー = 1 mmのzebrin II陽性ストライプは太いのが分かる。
HSP25 の whole mount 免 疫 染 色 で は 、Armstrong et al (2000) の 報 告 と 同 様 に 、

5. 病態モデル動物の解析
whole mount免疫染色による病態モデルのzebrin II陽性プルキンエ細胞が一様に存在す

解析については、calbindin D-28k抗体(プルキる中央部および小節部を更に幾つかに区分すンエ細胞のマーカー抗体)を用いたプルキンエるストライプ状の区画が観察された(図1B,C)。

細胞脱落の三次元パターンの解析がlurcherマ

中央部の虫部VIb小葉では5本のHSP25陽性ス

ウスやNiemann-Pick type Cマウスで報告さトライプが左右対称に存在し、小節部では虫部れている(Sitolloe and Hawkes, 2002; Sarna

X小葉には太さの異なる5本のHSP25陽性ストand Hawkes, 2003)。ここでは、rollingマウス

ライプが左右対称に、片葉傍には細い3本のの小脳におけるチロシン水酸化酵素(TH)の異HSP25陽性ストライプが存在した(図1B,C)。

所性発現の三次元パターンを調べた我々の研究について紹介する。

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図2．チロシン水酸化酵素(TH)抗体を用いたrollingマウス(A)と野生型マウス(B)の小脳のwhole mount 免疫染色像とwhole mount 免疫染色像を基に作成したrollingマウスおよび野生型マウス小脳でのTHの分布図(C)。rolling
マウス小脳ではzebrin様のTH陽性ストライプが観察されるが、zebrin IIとは異なり、中央部(CZ)および小節部(NZ)でheat shock protein 25 (HSP25)と相補的なストライプがみられる。野生型マウスでは、TH陽性ストライプは観察されない。V：虫部V小葉，VIa：虫部VIa小葉，VIb：虫部VIb小葉，VII：虫部VII小葉，VIII：虫部VIII小葉，IX：虫部IX小葉，X：虫部X小葉，AZ：前部，CI：係蹄小葉第I脚，CII：係蹄小葉第II脚，CZ：中央部，F：片葉，NZ：小節部，PF：片葉傍，PZ：後部，sim：単小葉．スケールバー = 1 mmrollingマウスは、小脳性運動失調を呈するミキンエ細胞でのTH異所性発現は、細胞内Ca2+ュータントで、8番染色体のtottering遺伝子座濃度の異常を反映していると考えられており(Ca2+ チャンネルα 1Aサブユニット(Cav2.1)遺(Sawada and Fukui, 2001; 福 井 と 澤 田 ，伝子をコード)に変異を持つため、ヒトの家族2003) 、 ま た 、 他 の ミ ュ ー タ ン ト マ ウ ス性片麻痺性偏頭痛(FHM)や反復発作性運動失(dilute-lethal; 10番染色遺体の Myo5a 遺伝子調2型(EA-2)のモデル動物として知られているに変異を持つ)においても運動失調の発症に相(Sawada et al, 2000; 澤田他，2001; Sawada

関してTH異所性発現が観察される(Sawadaand Fukui, 2010a, 2010b)。同遺伝子に変異をet al, 1999a; 1999b)。

持つミュータントとして、totteringやleaner、whole mount免疫染色によりrollingマウス

rocker、wobblyなどが知られている(Sawada

小脳でのTH異所性発現を三次元的に解析してet al, 2000; 澤田他，2001)。我々はrollingマ

みると、組織切片を用いた解析(Sawada et al,

ウスの小脳において、zebrin II様の帯状分布を1999a)と同様に、zebrin II様のストライプ状呈するプルキンエ細胞群でチロシン水酸化酵の発現パターンが観察された(Sawada et al,素(TH)が異所性に発現していることを報告し2010)。しかし、虫部VIbおよびX小葉、片葉傍た(Sawada et al, 1999b; Sawada and Fukui,でzebrin IIとは異なる発現パターンが示され2001; 福井と澤田，2003)。この様な小脳プルた(Sawada et al, 2010)。rollingマウス小脳の26
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TH whole mount免疫染色像を図2に示した。

セロトニンやノルアドレナリンなど特定の神本来、zebrin IIが一様に発現する虫部VIbおよ

経伝達物質をもった投射線維の三次元的走行、びX小葉、片葉傍で、TH陽性プルキンエ細胞及びこれらの異常の解析への適用も可能であのストライプ状の配列が観察された。これらのり、今後の研究の進展が期待される。

小葉でストライプ状に発現することが知られているHSP25(Armstrong et al, 2000)(図1)の発現と比べてみると、TH陽性プルキンエ細胞は、HSP25陽性プルキンエ細胞と交互に配列

参考文献

し て い る こ と が わ か っ た (Sawada et al,

澤田和彦，坂田ひろみ，福井義浩 (2001) Ca2+2010)。また、組織切片を用いたTHとHSP25

チャンネル病マウスにおける小脳の異常の免疫二重染色により、境界線を共有する一部のプルキンエ細胞でこれらの発現が重複するものの、THとHSP25の発現は、ほぼ相補的であ ること が明ら かにな った (Sawada et al,2010)。これらの結果から、rollingマウスの小脳ではzebrin II陽性プルキンエ細胞で起こるTHの異所性発現は、HSP25を生理的に発現している細胞で抑制されていることが示唆された。

6．まとめ
成体器官のwhole mount免疫染色は、一般的には血管や腸管などの特定の管状器官で行われている。whole mount免疫染色の小脳への適用は、zebrin IIやHSP25などの特定の抗原の帯状分布(Sitolloe and Hawkes, 2002; Sarnaet al, 2006)、プルキンエ細胞群に投射する登上線維の分布(Sawada et al, 2008)、ミュータントマウス等でのプルキンエ細胞脱落(Sitolloe and Hawkes, 2002; Sarna andHawkes, 2003) や タ ンパ ク 質の 異 所性発 現(Sawada et al, 2010b)などの研究を大きく進展させてきた。この様な小脳の解析法は、従来、数百枚にも及ぶ連続組織切片を免疫染色し、写真撮影をした後に画像解析装置等を用いて三次元的に構築する方法(Ozol et al., 1999)に比べ、時間的にも労力的にも格段に短縮化され、小脳区画の三次元的解析をより身近なものにした。また、同手法は大脳皮質のバレル構造や、と運動失調．四国医学雑誌 57:218-226.
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Review article

Visualization of spatial organization of cerebellar compartmentationby whole mount immunostaining
Kazuhiko Sawada1, Emi Ochiai2
1Department of Physical Therapy, 2Department of Nursing,

Faculty of Health Science, Tsukuba International University
Abstract
The Purkinje cells of the cerebellar cortex form a complex arrangement of parasagittal stripes
and transverse zones, which are reflected in the diversity of gene expression patterns. This
paper introduces whole mount immunostaining technique, which can visualize spatialorganization of such cerebellar parasagittal compartments. Protocol of whole mountimmunostaining has originally described by Sillitoe and Hawkes (J Histochem Cytochem
50:235-244, 2002), and optimized by pretreatment with heat-induced antigen retrieval in ourprevious study (Sawada and Sun, Curr Neurobiol 1:21-24, 2010). This approach allows for
examination of normal cerebellar topography revealed by cerebellar compartmentation
antigens such as zebrin II and heat shock protein 25, and patterning defects caused bymutations, without 3D reconstruction of immunostained serial sections. [Med Health Sci ResTIU 2: 21-28 / Accepted 16 November 2010]
Keywords: Immunohistochemistry, Zebrin II, HSP25, Ca2+ channelopathy, Rolling mouse,Ataxia, Cerebellar compartmentation