2020

令和 2 年度

金沢医科大学
共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書

令和 4 年 10 月

金沢医科大学はじめに

令和 2 年度金沢医科大学共同研究・奨励研究の成果報告書を発刊しましたのでお手元にお届けいたします。
本学では，平成 15 年度から若手研究者の育成を目的とした奨励研究や，
学部，
大学院，総合医学研究所，他大学等との有機的連携を目指す共同研究を展開することで本学研究の活性化を進めております。平成 19 年度からは，看護学部が設置されたことに伴い，医学領域と看護学領域に分けて募集しています。また，奨励研究にスタートアップの枠を設けるなど研究の多様化にも対応しており，
令和 2 年度にはライフイベントにより研究活動を中断した研究者への支援として，リスタートの枠を新設いたしました。
令和 2 年度は，医学領域に 30 件（共同研究 9 件，奨励研究 21 件）の申請があり，10 件（共同研究 2 件，奨励研究 8 件）を採択いたしました。本書はこれらの研究の成果をまとめたものであります。
今後，これらの研究で得られた研究成果を，社会に還元するとともに本学の研究基盤がより一層充実することを期待します。
最後に，本報告書の取りまとめの労をとられた研究業績評価委員会，研究推進課並びに関係各位に感謝します。

令和 4 年 10 月
金沢医科大学
学長

宮澤

克人

目

次

はじめに

令和 2 年度 共同研究成果報告書[医学領域]
C2020-1. 脂肪幹細胞経鼻自家移植による嗅覚再生医療の基盤研究
志賀英明
C2020-2.

･････

1

血液細胞分化モデルの解明と急性骨髄性白血病の新規治療法の開発
･････

4

令和 2 年度 奨励研究成果報告書[医学領域]
S2020-1.
石灰化を起こした血管における可溶性グアニル酸シクラーゼヘム鉄の酸化還元状態について
田 和 正 志 ･････

8

小内伸幸

S2020-2.

血管形成を制御する mRNA 選択的ポリ A 付加機構の解明
池田崇之

S2020-3.

義大

･････

13

･････

15

核白内障に対する環境温度および眼球深部温度がおよぼす影響
武田

S2020-5.

10

シングルセル解析を用いた糖尿病腎線維化プロセスの解明
林

S2020-4.

･････

峻DNA 損傷依存性コラーゲン VI 分泌に着目した結節性糸球体硬化の新規機序の解明藤井S2020-6.

愛

18

･････

20

･････

22

尿細管の二重鎖 DNA 損傷が，移植腎機能発現に及ぼす影響の解明
岡田圭一郎

S2020-7.

･････

スフィンゴミエリン合成酵素阻害による脂肪肝が増悪させる
大腸癌肝転移の抑制
藤田純

S2020-8.

DNA 損傷応答タンパク質 53BP1 がアポトーシス細胞に対する自己免疫応答を抑制するメカニズムの解明
砂谷優実

･････

24

令和 2 年度

共同研究成果報告書

医学領域

C2020-1～2

１．研究課題名：脂肪幹細胞経鼻自家移植による嗅覚再生医療の基盤研究（研究番号 C2020-1）
２．キーワード：１）嗅覚障害 (olfactory impairment)２）脂肪由来間葉系幹細胞 (adipose-derived mesenchymal stem cells)３）神経栄養因子 (neurotrophic factor)
４）経鼻投与 (nasally administration)５）嗅上皮 (olfactory epithelium)
３．研究代表者：志賀 英明・医学部・准教授・耳鼻咽喉科学
研究分担者：三輪 高喜・医学部・教授・耳鼻咽喉科学
石垣

靖人・総合医学研究所・教授・生命科学研究領域

八田稔久・医学部・教授・解剖学 I硎

澄仁・総合医学研究所・講師・先端医療研究領域

瀧淳一・金沢大学・医薬保健研究域医学系・協力研究員・核医学

４．研 究 目 的
嗅覚障害の原因疾患として感冒（上気道炎）の頻度が高く（日本鼻科学会編. 嗅覚障害診
療ガイドライン 2017），新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) 患者でも 8 割に嗅覚障害を認めている (Lechien et al. Eur Arch Otorhinolaryngol, 2020)。嗅覚障害患者の増加に伴い火災の察知の遅れによる重大事故が多発する危険性が危惧されるが，感冒後嗅覚障害の治療法は確
立していない。以上より嗅覚障害の画期的治療法の開発が早急に望まれている。嗅細胞の分化成熟や軸索伸長には，神経栄養因子が不可欠であるが，神経栄養因子製剤の長期投与はがん化リスクもあり実用化されていない。一方，脂肪幹細胞は多種の神経栄養因子を分泌することで知られる (Sadat et al. BBRC 2007)。脂肪幹細胞の自家移植療法における重要な懸念の一つは，経静脈投与では肺塞栓症のリスクと神経栄養因子の分泌量に個人差があると予想されることである。そこで本研究では，嗅覚障害治療における脂肪幹細胞経鼻自家移植療法の実現可能性を明らかとするため，健常ボランティアの脂肪組織から調整した脂肪幹細胞の，嗅粘膜障害マウスへの経鼻移植実験による前臨床試験を行うことを目的とした。
５．研 究 計 画
メチマゾール投与嗅上皮障害マウスにおいて，GFP トランスジェニックマウス大腿脂肪由来幹細胞（GFP マウス脂肪幹細胞，Cyagen Biosciences, CA, USA）の生理食塩水懸濁液を経鼻投与後の酪酸臭に対する忌避行動観察（嗅覚忌避行動観察）と嗅上皮再生状態の免疫組織化
学染色による組織学的解析を行った。また ELISA 解析による神経栄養因子（NGF：神経成長因子，BDNF：脳由来神経栄養因子，IGF-1：インスリン様成長因子-1 および IL-15/IL-15 レセ
プター複合体）の濃度を GFP マウス脂肪幹細胞上清と細胞調整液 ADSC-1 とで比較した。細
胞調整液では basic-FGF（塩基性繊維芽細胞増殖因子）濃度も ELISA で解析した。さらにメ－ 1 －チマゾール投与嗅上皮障害マウスに対する健常ボランティア脂肪幹細胞経鼻投与による嗅覚
忌避行動観察を行った。上記の実験全般について研究分担者の三輪と石垣の指導のもと，研究責任者の志賀などが行った。免疫組織化学染色は総合医学研究所のサポートを受けた。実験方法について研究分担者の八田，硎および瀧に助言を受けた。
６．研 究 成 果
GFP マウス脂肪幹細胞の経鼻投与 24 時間後ではマウス鼻腔内に GFP 発現細胞の集団を認めたが，嗅上皮には GFP 発現細胞は認めなかった。幹細胞経鼻投与３日後にはマウス鼻腔内の GFP 発現細胞は消失していた。幹細胞経鼻投与 14 日後で生食点鼻群と比較して GFP マウ
ス脂肪幹細胞投与群では嗅覚忌避行動の回復促進と嗅上皮における成熟嗅細胞の増加が認められた。さらには経鼻投与 24 時間後の嗅上皮において NGF の発現を脂肪幹細胞投与群の嗅上皮で認めた。一方で BDNF の発現増加は認めなかった。GFP マウス脂肪幹細胞経鼻投与 24
時間後のマウス鼻腔における GFP 陽性細胞の周囲に NGF 発現を認めた。
GFP マウス脂肪幹細胞上清の ELISA 解析では NGF の発現を認めたほか，BDNF 発現もわずかに認めた。IGF-1 および IL-15/IL-15 レセプター複合体の発現は細胞上清には認めず，細胞調整液には解析対象の 4 因子すべての発現を認めなかった。また細胞調整液には高濃度のbasic-FGF 発現を認めた。
4 名分の健常ボランティア脂肪幹細胞をそれぞれメチマゾール投与嗅上皮障害マウスに経鼻投与して嗅覚忌避行動を観察したところ，1 名の健常ボランティア脂肪幹細胞が嗅覚再生効果をもたらしたのに対し，1 名が軽度改善効果を認め 2 名が生食群と同様のレベルであった。
GFP マウス脂肪幹細胞または健常ボランティア脂肪幹細胞の経鼻投与後から還流固定・解剖までの期間で呼吸不全に至ったマウスは認めなかった。
７．研究の考察・反省
以上より嗅上皮傷害モデルマウスにおいて脂肪幹細胞の経鼻移植による嗅上皮再生と嗅覚
忌避行動の回復促進作用が明らかとなった。また，嗅上皮再生機序として脂肪幹細胞から分泌される神経栄養因子の関与が示唆された。さらには経鼻移植後 3 日以内に移植幹細胞が消失することが明らかとなり，移植細胞が長期に残存する可能性は低いと考えられた。また本研究の結果から脂肪幹細胞の経鼻移植により肺塞栓症のリスクを回避できると考えられた。
細胞調整液の ADSC-1 にはウシ胎児血清が含有しており，過去の論文で局所投与による嗅上皮再生促進作用が示されている basic-FGF が高濃度で発現していたため，脂肪幹細胞上清投与実験は今回行わなかった。また本研究において脂肪幹細胞投与の際には十分に細胞を洗浄後に生理食塩水に懸濁してマウスへ経鼻投与したので，細胞調整液自体の影響の可能性は低いと考えられる。
本研究の結果から脂肪幹細胞から分泌された NGF が嗅上皮再生に関わっている可能性が示され，これまで嗅細胞の分化成熟に NGF が関与しているとの過去の知見があらためて確－ 2 －認された意義は大きいと考える。また健常ボランティア脂肪幹細胞の嗅上皮再生効果には個人差が認められ，将来自家脂肪幹細胞移植療法を展望するうえで，嗅上皮再生効果を予測可
能な脂肪幹細胞分泌因子の探索が課題として残った。高い嗅上皮再生効果を有する健常ボラ
ンティア脂肪幹細胞のある特定の分泌因子発現を siRNA で抑制することで，嗅上皮再生効果も低下するのか今後の研究で明らかとしたい。
以上より，本研究で示された脂肪幹細胞経鼻移植の安全性と有効性を基礎に，数年以内には欧州で嗅覚障害の標準的治療となっている嗅覚刺激療法への上乗せ効果を検証する，嗅覚障害患者を対象とした脂肪幹細胞自家移植による臨床研究への展開が期待できる結果であった。
本研究結果の一部は以下の学会報告を行ったほか，英文論文として投稿中である。
国際学会（一般演題）：
Ishikura T, Shiga H, Nakamura Y, Kanitani T, Ishigaki Y, Miwa T. Treatment with nasally administeredadipose-derived stem cells from GFP transgenic mice in olfactory impaired mice. The 20th Asian
Research Symposium in Rhinology Online, September 24-25, 2021.
全国学会（一般演題）：
石倉友子, 志賀英明, 熊井理美, 三輪高喜: 脂肪幹細胞経鼻移植の前臨床試験, 第 59 回日本
鼻科学会総会, 東京, 2020.10.
優秀演題賞受賞 会議録：
石倉友子, 志賀英明, 中村有香, 蟹谷貴子, 石垣靖人, 三輪高喜. 嗅上皮傷害マウスにおける
脂肪幹細胞経鼻移植の検討. 耳鼻咽喉科ニューロサイエンス
８．研 究 発 表
現在，投稿中である。

－ 3 －35; 52-53, 2022.

１．研究課題名：血液細胞分化モデルの解明と急性骨髄性白血病の新規治療法の開発（研究番号C2020-2）
２．キーワード：１）単球 (monocyte)２）顆粒球 (granulocyte)３）細胞分化 (cell differentiation)４）造血幹細胞 (hematopoietic stem cell)５）血液前駆細胞 (hematopoietic progenitor cell)
３．研究代表者：小内 伸幸・医学部・教授・免疫学
研究分担者：齋藤 史路・医学部・助教・免疫学
松葉慎太郎・医学部・助教・免疫学
樗木 俊聡・東京医科歯科大学難治疾患研究所・教授・生体防御学分野
金山 剛士・東京医科歯科大学難治疾患研究所・助教・生体防御学分野
４．研 究 目 的
造血幹細胞は自己複製能と多分化能を備え，生涯に渡って全ての血液細胞を作り出している。現在広く受け入れられている血液細胞分化モデルは造血幹細胞を頂点とし，その下流に多能性前駆細胞が存在し，さらに共通骨髄球系前駆細胞 (common myeloid progenitor: CMP)と共通リンパ球系前駆細胞 (common lymphoid) が存在する二分岐階層性モデルである。このモデルでは骨髄球-赤血球系細胞分化とリンパ球系細胞分化が最初の分岐点とする。しかし最近のシングルセルを用いた遺伝子発現解析結果から多分化能を持つ共通骨髄球系前駆細胞が存在しない可能性が示唆された。この CMP の存在は二分岐階層性モデルの基盤となる前駆細胞であり，
同細胞が存在しないとなると正しいモデルを提唱する必要がある。こうした中，申請者は血液細胞分化の最初の分岐点の指標となる新規細胞表面マーカーCLEC12A を同定した。この CLEC12A は造血幹細胞には発現せずに多能性前駆細胞から発現し，多能性前駆細胞が CLEC12A 陽性と陰性に分かれることを見出している。
本研究では，この CLEC12A+多能性前駆細胞と CLEC12A-多能性前駆細胞の分化能を検討し，真の血液細胞分化経路解明を目指す。
５．研 究 計 画
本研究では CLEC12A 陽性，CLEC12A 陰性の多能性前駆細胞 (multi-potent progenitor: MPP)
や CLEC12A 陽性 CMP，CLEC12A 陰性 CMP の in vitro 及び in vivo における多分化能の検討を行う。またこれら血液前駆細胞から RNA を抽出して定量的 PCR によって各血液細胞の分化系譜決定因子発現量を解析する。さらに CLEC12A 遺伝子の下流に cre を組み込んだ新規細胞運命追跡実験システムを構築し，CLEC12A＋前駆細胞由来の娘細胞の，また定常状態の造血にどの程度貢献しているか解析を行い，真の血液細胞分化モデルの解明を目的とする。

－ 4 －(1) CLEC12A+MPP 及び CLEC12A-MPP の in vitro 及び in vivo における分化能の検討
マウス骨髄細胞を PE-Cy5 標識された系列 (lineage: Lin) マーカー抗体カクテルと Cy5 マイ
クロビーズを用いて造血幹細胞と血液前駆細胞が濃縮された Lin-細胞分画を粗精製する。その後 c-kit, Sca-1, CD48, CD150, CD135, CLEC12A 抗体にて染色し，MPP を純化し，in vitro コ
ロニー形成能実験を行い，in vitro における分化能を検討する。また，CAG-EGFP マウスの骨髄から CLEC12A+MPP 及び CLEC12A-MPP を純化し，致死量の放射線を照射した B6・SJL マ
ウスに移植し，経時的に末梢血を採血し，in vivo における分化能を検討する。
(2) CLEC12A+CMP 及び CLEC12A-CMP の分化能の検討
マウス骨髄細胞から上記の方法と同様に Lin -細胞分画を粗精製し，CD117, Sca-1, CD34,
FcγRII/III, CLEC12 抗体にて染色し，CLEC12A+CMP と CLEC12A-CMP を純化し，in vitro コ
ロニー形成能実験及びサイトカインを用いた培養システムを用いて各系列細胞への分化能を検討する。
(3) 定量的 PCR による分化系譜決定因子発現の解析純化した CLEC12A+MPP，CLEC12A-MPP，CLEC12A+CMP と CLEC12A-CMP から RNA を抽出し，逆転写反応を行い，Sybr green を用いた定量的 PCR 方法によって分化系譜決定因子の遺伝子発現を解析する。
(4) CLEC12A の発現特性を活かした細胞運命追跡実験による CLEC12A+前駆細胞の分化能と自然状態における造血への貢献度の検討
CLEC12A 遺伝子の exon6 の 3’領域に P2A-cre 遺伝子を挿入した construction を作製する。
その後，crispr-cas9 技術を用いた同 construction を受精卵にマイクロインジェクションによって導入し，CLEC12A-cre 遺伝子改変マウスを作製する。このマウスを Rosa26-flox-stop-flox-EYFP
レポーターマウスと交配し，CLEC12A-cre/Rosa26-LSL-EYFP マウスを作製する。その後，末梢血を採血し，各系列細胞中の EYFP 発現をフローサイトメーターによって解析する。
６．研 究 成 果
(1) CLEC12A+多能性前駆細胞の同定
これまで多能性前駆細胞は赤血球系細胞に分化バイアスがかかった MPP2，骨髄球系細胞に分化バイアスがかかった MPP3，さらにリンパ球系細胞分化にバイアスがかかった MMP4が同定されていた。そこで，今回，CLEC12A を発現する新規前駆細胞を同定するために，
造血幹細胞，多能性前駆細胞を含む Lin-Sca-1+c-kit+細胞分画を 14 種類の抗体によって多重染
色し，tSNE 解析を行った結果，従来の MPP3 中に新規 CLEC12A+MPP3 細胞を同定した。
(2) CLEC12A+MPP 細胞の分化能の検討
新たに同定した CLEC12A+MPP3 の分化能を検討するために，MPP2，従来の MPP3，
CLCEC12A+MPP，CLEC12A-MPP3，MPP4 を純化し，in vitro コロニー形成実験を行った。この結果，従来の MPP3 では 25%が混合コロニー，15%が赤血球系コロニー，60%が単球，顆粒球から構成される骨髄球系コロニーを形成した。一方で，CLEC12A+MPP3 は骨髄球系コロ
ニーのみ形成し，赤血球及び混合コロニーは全く形成しなかった。これとは逆に－ 5 －CLEC12A-MPP3 は 75%が赤血球系コロニーを形成した。また，MPP4 は従来の報告と同様に骨髄球系コロニーのみを形成した。このように CLEC12A を用いることで従来の MPP3 から骨髄球系細胞分化能が分離可能であることが明らかになった。
さらに，これら MPP の in vivo における分化能を検討するため，CAG-EGFP マウスの骨髄から純化した各前駆細胞 1x104 個を致死量の放射線を照射した B6・SJL マウスに移植した。
移植後，各マウスから継時的に末梢血を採血し，FCM 解析によって各系列細胞中の EGFP 陽性率を解析することによって分化能を評価した。
CLEC12A+MPP3 は in vivo において主に顆粒球，単球に分化し，B 細胞への分化能は僅かに示したが，赤血球への分化能は全く示さなかった。MPP2 と CLEC12A-MPP3 は主に赤血球へと分化し，骨髄球系細胞と B 細胞への分化能も示した。一方で，MPP4 は骨髄球系細胞とB 細胞への分化能を示した。これらの結果から，CLEC12A を用いると MPP 中から赤血球系
細胞分化能を明確に分離可能であることが明らかになった。
(3) CLEC12A を発現する共通骨髄球系前駆細胞(CMP)の分化能の検討
共 通 骨 髄 球 系 前 駆 細 胞 (CMP) を CLEC12A と マ ク ロ フ ァ ー ジ 刺 激 因 子 (macrophagestimulating factor: M-CSF) の 受 容 体 で あ る CD115 で 染 色 す る と CLEC12A-CD115- ，
CLEC12A+CD115-，CLEC12A+CD115+ CMP の 3 つの亜群に分かれることが明らかになった。
そこでこれら３つの亜群のコロニー形成能を検討した。驚くべきことに，
CLEC12A-CD115-CMP は赤血球コロニーのみ，CLEC12A+CD115- CMP は顆粒球と単球に，
CLEC12A+CD115+CMP は単球のコロニーのみ形成した。また，樹状細胞への分化能を検討したところ，CLEC12A+CD115-CMP と CLEC12A+CD115+CMP は樹状細胞への分化能を示したが，CLEC12A-CD115-CMP は同細胞の分化能は全く示さなかった。従来，CMP は多能性を有する前駆細胞を含むと考えられていたが，CLEC12A と CD115 を用いると赤血球系前駆細胞
で あ る CLEC12A-CD115-CMP と 骨 髄 球 系 前 駆 細 胞 で あ る CLEC12A+CD115-CMP と
CLEC12A+CD115+CMP に分離可能であることが明らかになった。
(4) 分化系譜決定因子の発現解析
これまでの結果から，CLEC12A を用いると赤血球系細胞分化能と他系列分化能を分離あることが明らかになってきた。そこで CLEC12A-CD115-，CLEC12A+CD115-，CLEC12A+CD115+
CMP の 3 つの亜群から RNA を抽出し，cDNA を合成して定量的 PCR によって分化系譜決定因子の発現を検討した。この結果，CLEC12A-CD115-CMP では赤血球系細胞分化に必須転写因子 GATA1 と GATA2 の発現が強く，顆粒球/単球分化に必須な転写因子 PU.1，CEBPa，Irf8の発現が非常に低かった。一方で，CLEC12A+CD115-CMP と CLEC12A+CD115+ CMP は
CLEC12A-CD115-CMP とは逆に PU.1，CEBPa，Irf8 の発現が高く，GATA1 と GATA2 の発現が低かった。特に CLEC12A+CD115-CMP では顆粒球分化に重要な CEBPa の発現が高く，
CLEC12A+CD115+ CMP では単球と樹状細胞分化に必須な Irf8 の発現が高い結果であった。このように分化系譜決定転写因子発現レベルでも CLEC12A-CD115-CMP，CLEC12A+CD115-CMPと CLEC12A+CD115+CMP 分化能との相関があった。
(5) CLEC12A の発現特性を活かした細胞運命追跡実験による CLEC12A+前駆細胞の分化能の検討－ 6 －自 然 状 態 に お け る CLEC12A+MPP の 由 来 の 娘 細 胞 を 検 討 す る た め ，CLEC12A-cre/Rosa26-LSL-EYFP マウスを作製した。このマウスの末梢血を生後 5 週目から経時的に採血し，各系列細胞中の EYFP 陽性率をフローサイトメトリーによって解析した。この結果，驚くべきことに単球，顆粒球，樹状細胞，B 細胞の 95%以上が EYFP 陽性となった。
また，T 細胞は 77%，NK 細胞は 53%が EYFP 陽性であった。一方で，赤血球と血小板は EYFPが 0%であった。CLEC12A+MPP は赤血球と血小板以外の全ての血液細胞へと分化し，特に単球，顆粒球，樹状細胞，B 細胞はほとんど CLEC12A+MPP から由来することが明らかとなった。
７．研究の考察・反省
近年，CMP を用いたシングルセル RNA-sequencing の結果から，CMP 中には赤血球系細胞と骨髄球系細胞（単球，顆粒球と樹状細胞）へ分化可能な多能性細胞が含まれない可能性が示唆されている。
本研究で我々は CLEC12A と CD115 を用いると CMP が CLEC12A-CD115-，
CLEC12A+CD115-，CLEC12A+CD115+CMP の亜群に分かれることが明らかになった。さらに
こ れ ら 亜 群 の 分 化 能 を 検 討 し た 結 果 ， CLEC12A-CD115-CMP が 赤 血 球 系 前 駆 細 胞 ，CLEC12A+CD115-CMP が顆粒球/単球前駆細胞，CLEC12A+CD115+CMP は単球/樹状細胞前駆細胞と CMP が 3 つの異なる前駆細胞から形成されていることが明らかになり，やはり我々の実験結果から，CMP 中には多能性細胞が含まれないことが明確になった。また，我々はCMP の上流に位置する MPP 中に CLEC12A+MPP を見出した。この CLEC12A+MPP は優れた骨髄球系細胞への分化能を有し，赤血球系細胞への分化能がほとんどないことが in vitro 及び
in vivo における解析結果から明らかになった。また CLEC12A の発現特性を活かした細胞運命追跡実験結果から，CLEC12A+MPP は骨髄球系細胞，リンパ球系細胞へとは分化したが，赤血球と巨核球には全く分化しなかった。これらの結果は，CLEC12A+MPP が骨髄球系細胞とリンパ球系細胞の分化起源であることと，血液細胞分化経路において最初の分岐点が骨髄球系細胞-リンパ球系細胞と赤血球系細胞であることを示唆し，これまでのドグマを書き換える重要な研究結果である。
また，本研究課題では CLEC12A を発現する急性白血病幹細胞のがん幹細胞性を明らかにし，新たな治療標的を発見することを目的としていたが，これは今後の研究課題である。
８．研 究 発 表
現在，投稿中である。

－ 7 －

令和 2 年度

奨励研究成果報告書

医学領域

S2020-1～8

１．研究課題名：石灰化を起こした血管における可溶性グアニル酸シクラーゼヘム鉄の酸化還元状態について（研究番号 S2020-1）
２．キーワード：１）可溶性グアニル酸シクラーゼ (soluble guanylate cyclase)
２）酸化還元状態 (redox state)３）一酸化窒素 (nitric oxide)４）血管石灰化 (vascular calcification)５）腹部大動脈 (abdominal aorta)
３．研究者氏名：田和 正志・医学部・講師・薬理学（採択時）
４．研 究 目 的
全身臓器である血管の石灰化は加齢，糖尿病および慢性腎不全などに伴い形成される病態であり，心血管疾患の独立した危険因子として問題視されている。石灰化を起こした血管では一酸化窒素（NO）の生物学的利用能低下をきたしており，これが血管の柔軟性や弾力性の低下，ひいては心血管疾患発症の原因となると考えられている。NO は可溶性グアニル酸シクラーゼ（sGC）を活性化することにより様々な作用を惹起するが，NO が活性化できる sGC
は還元型（ヘム鉄が 2 価）のみであり，酸化型（ヘム鉄が 3 価）やアポ（ヘムが脱離）を活性化することはできない。本研究の目的は，石灰化を起こした血管における sGC ヘム鉄の酸化還元状態およびその病態生理学的意義を明らかにすることである。
５．研 究 計 画
血管石灰化を起こすことが知られているビタミン D 過剰症モデル動物を用いて検討した。
ラットの皮下にコレカルシフェロール（200000 IU/kg）を単回皮下投与し，7 あるいは 14 日
後に腹部大動脈を摘出した。なお，コレカルシフェロールの溶媒であるリン酸緩衝生理食塩
水を皮下投与したラットの腹部大動脈を対照とした。石灰化の有無や程度を調べるため，単離した腹部大動脈から組織標本を作製し，コッサ染色を実施した。また，sGC ヘム鉄の酸化還元状態を類推するため，NO 供与薬（還元型 sGC アゴニスト）および sGC 活性化薬（酸化型およびアポ sGC アゴニスト）に対する腹部大動脈の反応性を観察した。
６．研 究 成 果
コレカルシフェロール投与 7 日後の腹部大動脈にはコッサ染色で黒褐色に染まるカルシウ
ム沈着が認められた。NO 供与薬による弛緩反応は対照動物の腹部大動脈とモデル動物の腹部大動脈で変わらなかったが，sGC 活性化による弛緩反応はモデル動物で増強した。コレカ
ルシフェロール投与 14 日後には石灰化の程度は進行しており，また，対照と比較して，NO供与薬の応答性は減弱に転じ，sGC 活性化薬の応答性は差がなくなった。

－ 8 －７．研究の考察・反省
血管石灰化を起こした早期の段階では，酸化型/アポ sGC が増えている可能性が考えられる。ただし，石灰化が進行すると sGC は減少するのかもしれない。証拠はまだ不十分ではあるが，sGC ヘム鉄の酸化還元状態は血管石灰化の発生・進行とともに変化していくと類推される。今後は，sGC の発現量について評価する必要がある。また，臨床的意義を付加するた
めに，NO 供与薬や sGC 活性化薬の投与が血管石灰化の進行を抑止するのか否かについても明らかにする予定である。
８．研 究 発 表
なし

－ 9 －

１．研究課題名：血管形成を制御する mRNA 選択的ポリ A 付加機構の解明（研究番号 S2020-2）
２．キーワード：１）mRNA 選択的ポリ A 付加 (alternative polyadenylation, APA)
２）可溶型 Flt-1 (soluble Flt-1)
３）アルギニンメチル化 (arginine methylation)４）アルギニンメチル化酵素 (PRMT)
５）低酸素 (hypoxia)
３．研究者氏名：池田 崇之・医学部・准教授・生化学Ⅱ
４．研 究 目 的
正常な血管新生制御の破綻は，糖尿病網膜症，癌，炎症性疾患などの発症・進展と大きく関連している。血管の恒常性は，血管内皮増殖因子 (VEGF) に代表される血管新生を促進す
る因子と，可溶型 Flt-1 のような血管新生を抑制する因子のバランスで保たれていると考えられている。可溶型 Flt-1 は，VEGF 受容体 (Flt-1) の細胞外部分のみの可溶型のタンパク質
で，細胞外で VEGF をトラップする強力な内因性の血管新生抑制因子として知られている。
Flt-1 は一回膜貫通型受容体（膜型）であるが，可溶型 Flt-1 は膜型 Flt-1 と同じ遺伝子からmRNA レベルでの制御（mRNA 選択的ポリ A 付加，APA）によって産生されていることが明らかとなっている。しかしながら，どのような刺激で，どのようなメカニズムで制御されているかは全く不明であった。池田はこれまでの研究で，低酸素刺激により可溶型 Flt-1 産生が低下すること，
またその低下には RNA 結合タンパク質である hnRNP D が関与していること，
さらにタンパク質のアルギニンメチル化が関与していることを明らかにしてきた (Ikeda et al.
Biochem. J., 436, 399-407, 2011; Ikeda et al. Mol. Cell. Biochem., 413, 155-164, 2016; Ikeda et al. Int.
J. Mol. Sci., 21, 6460, 2020)。そこで，これまでの研究を発展させ，タンパク質のメチル化を介した低酸素応答という全く新しいシグナル伝達経路を明らかにすることが本研究の目的である。
５．研 究 計 画
(1) アルギニンメチル化酵素が APA を制御することを明らかにする
アルギニンメチル化酵素 (PRMTs) が Flt-1 の発現を制御することを明らかにするために，
PRMTs ノックダウン血管内皮細胞で Flt-1 の mRNA 量を解析する。
(2) hnRNP D メチル化が Flt-1 pre-mRNA との結合に関与することを明らかにする
アルギニン残基に変異を導入した Flag-hnRNP D を血管内皮細胞に発現させて RNA 免疫沈降を行い，メチル化が Flt-1 pre-mRNA との結合に与える影響を解析する。また，hnRNP D とFlt-1 pre-mRNA との結合におけるメチル化酵素阻害剤の影響を検討する。

－ 10 －

６．研 究 成 果
アルギニンメチル化酵素 PRMT1，PRMT2，PRMT3，PRMT5 をそれぞれノックダウンした
ヒト微小血管内皮細胞から RNA を抽出し，可溶型 Flt-1 と膜型 Flt-1 の発現を解析した。
PRMT1 と PRMT3 ノックダウンでは可溶型 Flt-1 の発現に差は見られなかった。PRMT2 とPRMT5 ノックダウンでは，可溶型 Flt-1 の発現が増加することが明らかとなった。
低酸素刺激 (1% O2) は可溶型 Flt-1 産生を減少させることから，PRMTs が低酸素による可溶型 Flt-１産生制御に関与しているかどうかを明らかにするために，低酸素刺激下でのノッ
クダウンの影響を検討した。すべての PRMTs ノックダウンで，通常酸素濃度に比べて低酸素濃度で可溶型 Flt-1 の産生が減少したことから，低酸素刺激による可溶型 Flt-1 産生制御には
PRMTs は関与していないことが示唆された。
hnRNP D メチル化と Flt-1 pre-mRNA との結合の関連を調べるため，アルギニン残基に変異を導入した Flag-hnRNP D を血管内皮細胞に発現させて RNA 免疫沈降を行った。hnRNP D にはアルギニン残基が 3 ヶ所あり (R272，R282，R365)，それぞれをアラニンに変異させたもの(R272A，R282A，R365A)，3 ヶ所すべてをアラニンに変異させたもの (R272,282,365A) を用いて，共沈する Flt-1 pre-mRNA 量を比較した。野生型の hnRNP D に対して，R282A と R365A
は約 4 割まで，R272,282,365A では 1 割まで結合 RNA 量が減少した。さらに，hnRNP D とFlt-1 pre-mRNA との結合におけるメチル化酵素阻害剤 (MTA) の影響を検討した。野生型の
hnRNP D では，MTA を処理すると 3 割程度まで結合する Flt-1 pre-mRNA が減少した。
R272,282,365A は野生型に比して結合する Flt-1 pre-mRNA は少ないが，この結合は MTA の影響は受けなかった。したがって，hnRNP D がメチル化されることが Flt-1 pre-mRNA との結合に重要であることが示唆された。
７．研究の考察・反省本研究では，低酸素刺激による Flt-1 産生制御がタンパク質のアルギニンメチル化を介していることを明らかにするために，メチル基転移酵素と可溶型 Flt-1 産生との関連を検討した。アルギニンメチル化酵素 (PRMTs) のうち，RNA 結合タンパク質と相互作用がある，あるいは RNA スプライシングと関係があることが報告されている PRMT1，PRMT2，PRMT3，
PRMT5 について，ノックダウンにより Flt-1 産生を解析したところ，PRMT2 と PRMT5 では
可溶型 Flt-1 の発現が増加した。しかしながら，通常酸素濃度と低酸素濃度を比較すると，ノックダウンでも低酸素濃度で可溶型 Flt-1 産生が低下し，低酸素濃度ではコントロールに比べてノックダウンで増加した。これらの結果から，PRMT2 と PRMT5 は Flt-1 の産生に関与している可能性はあるが，低酸素刺激によって可溶型 Flt-1 産生が制御される経路とは別の経路であることが示唆された。したがって，今回調べた PRMTs については Flt-1 産生制御には関与していないことが示された。今後は，他の PRMTs や PRMTs 以外のタンパク質メチル化酵素の関与を検討したいと考えている。
これまでに Flt-1 pre-mRNA に結合する候補タンパク質として hnRNP D を同定し，hnRNP Dの 272 番目のアルギニン残基が Flt-1 発現制御に関与している可能性を示してきた。実際に－ 11 －

hnRNP D が Flt-1 pre-mRNA と結合するかどうかは RNA 免疫沈降で確認された。アルギ
ニン残基のメチル化と Flt-1 pre-mRNA との結合の関係を解析すると，変異 hnRNP D では
Flt-1 pre-mRNA との結合が落ちていることから，アルギニン残基が結合に重要であることは明らかである。また，メチル化酵素阻害剤を処理すると，可溶型 Flt-1 産生が増加し，
hnRNP D との結合が減少することから，タンパク質のメチル化が hnRNP D と Flt-1 pre-mRNAの結合を介して可溶型 Flt-1 の産生を制御していると考えられる。しかしながら，低酸素刺激で hnRNP D のアルギニンメチル化を検出できていないので，hnRNP D 自体がメチル化によって制御されているかどうかは未だに不明である。今後，抗メチル化アルギニン抗体などを用いて，hnRNP D のメチル化を検証していく予定である。
８．研 究 発 表
該当なし

－ 12 －

１．研究課題名：シングルセル解析を用いた糖尿病腎線維化プロセスの解明（研究番号 S2020-3）
２．キーワード：１）糖尿病腎症 (diabetic nephropathy)
２）シングルセル解析 (single-cell analysis)
３）腎線維化 (renal fibrosis)
３．研究者氏名：林義大・医学部・助教・糖尿病・内分泌内科学

４．研 究 目 的
糖尿病腎症は，慢性腎臓病の主たる原因疾患である。腎臓の線維化は慢性腎臓病の進行過程において共通の機序であり，細胞外基質の産生に重要な役割を果たすと考えられている筋
線維芽細胞の由来に関してはこれまで複数の報告があるもののいまだに議論が繰り広げられている。この理由として腎臓は血管内皮・尿細管上皮を始めとして多くの細胞から構成されていることが挙げられる。実際に我々は糖尿病腎において内皮細胞－間葉細胞分化 (EndMT)および上皮細胞－間葉系細胞分化 (EMT) が腎線維化に重要な役割を演じていることを報告しているが，その詳細なメカニズムは未だに不明なことも多い。シングルセル解析は腎臓の様に多数の細胞腫が存在する臓器において，細胞同士がどの様に相互作用を及ぼし環境に反応するかに関して，組織を細胞レベルで理解することを可能にする技術である。腎線維化を来しやすい 2 型糖尿病ラットおよびマウスを用いて，複数の腎線維化ステージでのシングル
セル解析を行い，線維化におけるシグナルを同定する。
５．研 究 計 画
① Wistar fatty rat の腎にてシングルセル解析を行い，糖尿病状態の腎構成細胞で誘導されるシグナルを同定する。Wistar fatty rat 及び対照群として Wistar lean rat に通常食を投与し，24 週及び 30 週齢で屠殺。gentleMACS Dissociators を用いて腎から単細胞懸濁液を調製，セルカウン
ターを使用し細胞の viability を確認する。Chromium コントローラーを用いてシングルセルレ
ベルで遺伝子発現解析を行い，筋線維芽細胞活性化の中心となる細胞シグナル変異を同定する。
② C57BLKS db/db の腎にてシングルセル解析を行い，糖尿病状態の腎構成細胞で誘導されるシ
グナルおよび表現系の違いを生じる原因を同定する。通常食をコントロール (db/m) および 2型糖尿病 (db/db) マウスに与え，8 週齢，16 週齢，24 週齢で屠殺。①と同様にシングルセル
解析を行い，細胞シグナル変異を同定する。
６．研 究 成 果
Wistar fatty rat を用いた研究については，単細胞懸濁液を調製する段階で細胞の単離が困難であった。
腎線維化が影響している可能性も考慮し 20 週齢に変更して行ったが同様の結果であったことから実験を終了した。実験②の 8 週齢における db/db および db/m の単細胞懸濁液－ 13 －

の調整は終了し，16 週および 24 週齢の単細胞懸濁液を現在作成中である。すべての週齢の単細胞懸濁液を調製後，シングルセル解析を行う予定としている。
７．研究の考察・反省
ラット腎でのシングルセル解析については報告がなく挑戦的な研究であったが，Wistar
fatty rat の単細胞懸濁液の調整についてはラット専用の酵素がなく，miltenyi biotec 社に確認
しヒト用の酵素を用いた。条件を変更しながら調整を行ったが結果的に単細胞懸濁液の調整は失敗した。ラットの実験については早期に終了をすべきであった。
８．研 究 発 表なし

－ 14 －

１．研究課題名：核白内障に対する環境温度および眼球深部温度がおよぼす影響（研究番号
S2020-4）
２．キーワード：１）不死化ヒト水晶体上皮細胞株 (immortalized human lens epithelial cell clone)２）核白内障 (nuclear cataract：NUC)
３）環境温度 (environmental temperature)４）水晶体温度 (crystalline lens temperature)５）コンピューターシミュレーション (computer simulation)
３．研究者氏名：武田 峻・金沢医科大学病院・医員・眼科
４．研 究 目 的
世界保健機関 (World Health Organization：WHO) によると，2020 年の失明原因の第一位は白内障であり，外科的手術が困難な発展途上国においては未だに失明に至る患者が極めて多い眼疾患とされている。水晶体混濁は，クリスタリン蛋白質が凝集して起こる多因子性プロセスが関与しており，水晶体の混濁部位により皮質白内障 (cortical cataract：COR)，核白内障(nuclear cataract：NUC)，後囊下白内障 (posterior subcapsular cataract：PSC)，Retrodots およびWaterclefts などに分類される。特に加齢とともに徐々に進行する NUC は，早期から高次収差，前方散乱光，後方散乱光が増加して視力障害を生じることから，加齢白内障の中でも重要な白内障のカテゴリーとされている。NUC 発症リスクとしては，加齢，喫煙，高血圧，紫外線，長眼軸，酸化ストレス，遺伝的素因および過酸化脂質などのさまざまな要因が報告されている。
我々は熱帯・亜熱帯地域における WHO 分類 NUC グレード 1 の有病率が温帯・亜寒帯地域に比べて有意に高値であることを示し，高温環境も NUC 発症のリスクになる可能性があることを報告した。また NUC の多い熱帯・亜熱帯地域では，周囲の紫外線 (UV) 強度も強い。これまでの研究にて，水晶体周囲温度の上昇には環境温度に加え，深部温度の上昇も関与していることが知られている。また熱帯地域在住民では温帯地域在住民に比べ深部温度が高いこと，高齢者では高熱環境での深部温度の調整機能が低下していることが報告されている。
このように，高温環境に長期間さらされることが NUC 発症のリスクになることが疫学研究により示唆されているが，高温による NUC 発症の詳細なメカニズムについては未だ明らかにされていない。そこで環境温度の上昇が NUC 発症のリスクとなる可能性を仮定し，本研究を施行した。
５．研 究 計 画
本研究では，環境温度と水晶体温度の関係を in silico でコンピューターシミュレーションを行い，評価した。また，熱帯と温帯の住民の水晶体温度で水晶体嚢に存在するヒト水晶体－ 15 －

上皮細胞 (lens epithelial cell：LEC) を用いて，異なる温度が水晶体に及ぼす影響を in vitro で検討した。
① ヒト水晶体推定温度は，若年成人と高齢者（>65 歳）の被験者を対象とし，日本人男性の平均的な解剖学的数値人体モデルを用いて，環境温度（周囲温度）と深部温度 （ヒト体内深部温度）をもとにシミュレーションした。
② 不死化ヒト水晶体上皮細胞株（immortalized human lens epithelial cell line clone NY2：iHLECNY2 細胞）を新規作製した。この iHLEC-NY2 は，遺伝子配列を一部改変した SV40 Large T
antigen（不死化遺伝子）を Jump-In Gateway Expression System を用いて phiC31 Integrase プラ
スミドに搭載して，遺伝子導入を行った。この遺伝子導入手法を用いることで，初代培養の
LEC が元来有している既知の遺伝子配列を壊すことなく，不死化遺伝子を特異的に導入した
iHLEC-NY2 細胞株を作製することができた。
６．研 究 成 果
① コンピューターシミュレーションでは，水晶体推定温度は温帯に比べて熱帯地域で高くなり，環境温度が 19.0℃，35.0℃の場合，水晶体推定温度はそれぞれ 35.0℃，37.5℃となることがわかった。
② 新たに調製した iHLEC-NY2 細胞を 35.0℃と 37.5℃で培養したところ，35.0℃に比べ 37.5℃
では細胞増殖活性が高くなり，αA-crystalline の遺伝子および蛋白質の発現量が増加した。
また白内障水晶体で検出されるアミロイドβ1-40 の蛋白質および遺伝子の発現も 37.5℃で増加した。
７．研究の考察・反省
水晶体推定温度は，眼球の周囲温度に応じて 35〜37.5℃と推定されているが，周囲温度が30℃を超えると，水晶体推定温度は年齢によって異なり，加齢とともに高くなる。これは高齢者では，皮膚の熱感受性が低下し，発汗量が減少することで体温が高くなるからである。
したがって，水晶体推定温度は経年変化により影響を受ける可能性があると推測される。
生体内において非常にゆるやかに増殖する LEC の増殖活性が高くなるということは，長期的に考えると水晶体組織幹細胞の減少と LEC の老化が促進され，クリスタリン蛋白質の変性・異性化などが起こり，水晶体内の恒常性が崩れやすくなることが考えられる。実際にア
ミロイドβ1-40 の遺伝子および蛋白質も 37.5℃で増加していた。したがって，今回の結果は
環境温度の上昇が，我々の疫学研究で観察された NUC 発症要因の一つであること，およびLEC と水晶体の老化は温度が高いほど縦断的に進行する可能性があることが示唆された。
本研究の限界として環境温度との比較ができなかった点が挙げられる。今後，熱帯・亜熱帯地域での調査，検体採取および測定回数を増やした体温測定を行い，より客観性のあるデータを用いて NUC 発症と体温の関連性について更に検討する必要がある。

－ 16 －

８．研 究 発 表Naoki Yamamoto, Shun Takeda, Natsuko Hatsusaka, Noriko Hiramatsu, Noriaki Nagai, Saori Deguchi,
Yosuke Nakazawa, Takumi Takata, Sachiko Kodera, Akimasa Hirata, Eri Kubo, Hiroshi Sasaki.
Effect of a lens protein in low-temperature culture of novel immortalized human lens epithelial cells(iHLEC-NY2). Cells 2020; 9: 2670.

－ 17 －

１．研究課題名：DNA 損傷依存性コラーゲン VI 分泌に着目した結節性糸球体硬化の新規機序の解明（研究番号 S2020-5）
２．キーワード：１）二重鎖 DNA 損傷 (double strand DNA breaks)２）VI 型膠原線維 (collagen type VI)３）結節性病変 (nodular glomerulosclerosis)
３．研究者氏名：藤井 愛・医学部・助教・腎臓内科学
４．研 究 目 的
当研究室では移植後年数の経過によって，移植腎糸球体係蹄内皮細胞（CD34 陽性）の DNA
損傷数と，糸球体における VI 型膠原線維量が増加し，不可逆的な糸球体の線維化が生じる事を報告してきた。糸球体における Ⅵ型膠原繊維の沈着は，糖尿病性腎症の特徴的で診断的価値の高い病理変化である結節性病変の主要な構成成分である。また，結節性病変は尿細管
間質障害の進行とも相関し，強い腎予後予測因子である。本研究では，各種腎疾患における糸球体内二重鎖 DNA 障害とⅥ型膠原繊維の蓄積との関連を検討する事を目的とした。また，
未だ不明である糸球体係蹄内皮細胞からの VI 型膠原線維の分泌機序を明らかとし，糸球体線維化抑制の可能性を検討する事を併せて目的とした。
５．研 究 計 画
1) 培養ヒト糸球体内皮細胞 (Human renal glomerular endothelial cells; HRGECs) による VI 型膠原線維分泌に関する細胞内シグナル伝達経路の解析を検討するため，DNA 損傷誘発剤マイトマイシン C (MMC) ならびに Camptothecin (CPT)，Neocarzinostatin (NCS) といった代謝拮
抗薬を用い，DNA 損傷を誘発した。また細胞質に貯蔵されている VI 型膠原線維の細胞外分泌を誘導するというシグナル伝達機構の全容を明らかにすることとした。まず DNA 損傷後の修復に中心的な役割を果たす 3 つのキナーゼ (ATM，ATR，DNA-PK) のうち Homologous
recombination 経路にある ATM と ATR に着目し，それに対する特異的な阻害剤を用いて検討した。さらにⅥ型膠原繊維の細胞外分泌の機序に細胞内輸送蛋白である Annexin A2(ANXA2) の関与について検討するため siRNA による ANXA2 発現制御を行なった。その後
DNA 修復機構である ATR と ANXA2 との間に VI 型膠原線維の分泌を誘導するというシグナル伝達への相互関係を明らかにする計画を立案した。
2) 2016 年から 2019 年に当院で施行した腎生検症例を対象とし，慢性腎臓病患者における DNA
損傷数とⅥ型膠原繊維の増加についてヒト検体を用いて検討した。結節性病変を有する 14例（糖尿病 5 例，腎硬化症 3 例，移植腎 6 例）
，疾患背景を考慮して選択した結節を有さない 16 例（糖尿病 3 例，腎硬化症 3 例，移植腎 5 例，コントロール群 5 例）を解析に用いた。
DNA 障害マーカーであるリン酸化ヒストン H2AX (γ-H2AX) およびⅥ型膠原繊維は免疫蛍光抗体法により同定し，画像解析ソフトにより定量化した。

－ 18 －

６．研 究 成 果1) In vitro における検討結果
DNA 損傷誘発剤 MMC での培養ヒト糸球体係蹄内皮細胞からのⅥ型膠原繊維分泌は，DNA
修復関連キナーゼの 1 つである ATR に対する阻害剤 (VE-821) により抑制された。また ATR
優位の DNA 修復が生じやすいとされる CPT 処理細胞では，MMC 処理細胞同様Ⅵ型膠原繊
維分泌が惹起されたのに対し，別の DNA 損傷関連キナーゼ ATM 優位の DNA 修復が生じやすいとされる NCS 処理細胞ではⅥ型膠原繊維分泌はコントロール群と同程度であった(Control vs. CPT p<0.05，Control vs. NCS p>0.05)。以上の実験結果より，DNA 損傷後のⅥ型膠原繊維分泌は ATR 依存性であることが示された。つぎに細胞内輸送蛋白である ANXA2 を
siRNA にて発現制御したところ DNA 損傷誘発後のⅥ型膠原繊維の分泌は低下した。さらに
ATR および ANXA2 のⅥ型膠原繊維分泌に対する相互作用に関する検討では ATR 阻害剤投与
および ANXA2siRNA の併用処理においてもそれぞれの単独処理と CⅥ型膠原繊維陽性細胞の割合に差はなかった。
以上の結果から，DNA 修復関連キナーゼ ATR と細胞内輸送蛋白 ANXA2 はⅥ型膠原繊維
分泌に関して相互に作用している可能性が示された。
2) ヒト検体での検討結果
糸球体におけるγ-H2AX 陽性率 (β：0.539，t = 2.668，p = 0.014) および尿タンパク/クレ
アチニン比 (β：-0.494，t = -2.184，p = 0.039) は，Ⅵ型膠原繊維陽性率に対する独立した関連因子であることが多変量回帰により示された。また結節性病変を有する群では，γ-H2AXと糸球体内Ⅵ型膠原繊維は正相関した (r = 0.642，p = 0.017)。
７．研究の考察・反省
In vitro の検討において，糸球体内皮細胞二重鎖 DNA 障害後のⅥ型膠原繊維分泌には DNA
修復関連キナーゼ ATR および細胞内輸送蛋白 ANXA2 が相互に重複して関与している事が示された。また今回のヒト検体における検討において，糸球体内皮細胞の二重鎖 DNA 障害とⅥ型膠原繊維蓄積が各種腎疾患においても存在し，相互に連関していることが確認された。
今後はⅥ型膠原繊維蓄積の意義についての検討ならびに動物モデルを用いⅥ型膠原繊維の分泌抑制効果について検討していきたい。
８．研 究 発 表
該当なし

－ 19 －

１．研究課題名：尿細管の二重鎖 DNA 損傷が，移植腎機能発現に及ぼす影響の解明（研究番号
S2020-6）
２．キーワード：１）DNA 二本鎖切断 (double strand breaks)２）移植腎機能発現遅延 (delayed graft function: DGF)
３）虚血再灌流障害 (ischemia reperfusion injury)４）リン酸化 H2AX (γ-H2AX)
３．研究者氏名：岡田 圭一郎・医学部・助教・腎臓内科学
４．研 究 目 的
本邦において，慢性腎臓病症例は 1300 万人と推定されている。また，透析症例も年々増加
し，現在 33 万人を超えた状況である。透析技術の進歩により透析症例の生命予後は延びてきているが，腎移植症例の方が優れている。また，透析症例に比べて，移植症例は生活の質も高く，社会復帰率も高い。従って，腎移植医療は，患者個人だけでなく，社会的にも重要である。しかし，提供腎に限りがあり，腎移植は，本邦では年間 2 千例にも満たない状況である。そこで，より良い腎移植医療が求められている。そのため，移植腎の生着率を低下させる原因となる拒絶反応や感染症などを予防すると共に，現在も良い解決手段の無い，早期の腎機能障害の改善が喫緊の課題である。近年，腎移植，特に献腎移植における移植腎機能発現遅延 (DGF; Delayed Graft Function) や移植後無機能腎 (PNF; Primary Non Function) が問題となっている。これまで様々な研究で，移植腎機能発現遅延 (DGF) は移植腎の予後や拒絶反応など長期的な有害事象と関連すると報告されている [AJKD 2013 62:150-158]。したがって，確実かつ早期に移植腎機能発現遅延 (DGF) を診断し治療介入することで，移植腎の生着率上昇および合併症の予防が期待できる。現在多くの施設で，ドナー腎の 0 時間あるいは
1 時間の腎生検を施行し，動脈硬化や腎硬化などの長期的な腎障害の程度や，持ち込み腎炎の有無などを評価している。しかし，移植に伴う急性期の組織ダメージを評価する有効な方法が無い。本研究は，その組織障害の要因の一つとして DNA 損傷に着目し，DNA 二重鎖切断が，移植腎機能発現遅延 (DGF) の発症と重症度を予測するマーカーとなるか否かを明らかにするものである。移植後生検において尿細管の DNA 二重鎖切断と移植腎機能発現との関連について調査したものは報告されておらず，これを解明することで移植患者の予後に重要な結果をもたらすことができると考える。
５．研 究 計 画
本研究では，γ-H2AX 染色という DNA 二重鎖切断を鋭敏に検出する方法を用いている。移植後 1 時間の腎生検標本を用いて γ-H2AX 染色を行うと，高率に尿細管上皮細胞に DNA 二
本鎖切断が発生することを 2018 年に報告した。この γ-H2AX 陽性 DNA 二本鎖切断尿細管上皮細胞出現と，組織障害や腎予後との関連を，移植腎機能発現遅延の視点で検討する。さら－ 20 －

には，当教室でこれまで行ってきた低酸素ストレスや，虚血再還流モデルといった細胞実験
および動物モデルを用いて，尿細管上皮細胞および内皮細胞における DNA 二本鎖切断が，炎症や組織障害に与える影響を検討する。
６．研 究 成 果
生体腎移植では，0 時間および 1 時間後の γ-H2AX 陽性率は，有意に低下していた。また，生体腎移植と献腎移植の 1 時間後の γ-H2AX 陽性率に有意差を認め，生体腎移植より献腎移植では移植後 1 時間で，移植腎の尿細管障害を強く認める結果となった。移植後 0 時間
生検の γ-H2AX 陽性率と 0 時間と 1 時間における γ-H2AX の陽性率の差である⊿γ-H2AX は，生体腎，献腎移植例ともに負の相関を示した。一方，移植後 1 時間生検の γ-H2AX 陽性率とその変化率は，献腎移植例において正相関を示すとともに移植腎機能発現遅延 (DGF) お
よび移植後無機能腎 (PNF) では，その変化率が増加傾向を示した。多変量解析では，DGF
や PNF などの腎予後の grade を 5 段階で評価した場合に，γ-H2AX の変化率と donor の血清
クレアチニン値との関連が強いことが示された。また，移植腎 donor の血清クレアチニン
値と，⊿γ-H2AX は，より重度の腎機能発現遅延を認めた症例および PNF 症例に対する有用な予測因子であり，DGF を予測できる可能性が示唆された。
７．研究の考察・反省本研究を通して，生体腎移植に比して献腎移植，特に DGF および PNF では，移植後の二本鎖 DNA 障害に示される尿細管障害が進行し，その機能発現がより遷延している可能性が示された。現在，虚血再灌流モデルマウスを作成し，マウス腎組織を採取し，γ-H2AX による染色を開始している。従来の抗体を用いると，非特異的反応によって γ-H2AX の定量化が困難となっており，今後は，動物種の異なる別の抗体を用いることによって対応する。また，培養細胞に対する低酸素ストレスや虚血再灌流マウスモデルを用いた尿細管上皮細胞や内皮細胞における遺伝子，蛋白質発現を網羅的に調べることで，DNA 二重鎖切断発生に伴って生じる炎症プロセスの発現あるいは進展機序を解明することを今後の検討課題とする。
８．研 究 発 表
特になし

－ 21 －

１．研究課題名：スフィンゴミエリン合成酵素阻害による脂肪肝が増悪させる大腸癌肝転移の抑制（研究番号 S2020-7）
２．キーワード：１）スフィンゴミエリン (sphingomyelin)
２）非アルコール性脂肪性肝疾患 (non-alcoholic fatty liver disease)
３）大腸癌肝転移 (colon cancer liver metastasis)
３．研究者氏名：藤田 純・医学部・助教・一般・消化器外科学（採択時）
４．研 究 目 的
大腸癌において最も頻度の高い転移臓器は肝臓であり，転移性肝癌は大腸癌の予後の規定因子の一つである。そのような中，現在は食生活の欧米化などに伴い，大腸癌罹患患者は増加の一途をたどっており，また非アルコール性脂肪性肝疾患 (non-alcoholic fatty liverdisease; NAFLD) の肥満と関連する患者も急激に増加している。一方，我々は，細胞形質膜の主成分であるスフィンゴミエリン (SM) を合成する酵素である SMS2 遺伝子欠損マウス
において，高脂肪食による糖尿病モデルの病態が抑制されること，炎症性大腸癌モデルの大腸発癌が減少すること，さらにはリンパ腫の肝転移モデルの転移が抑制されることを見出している。本研究の目的は，ヒト大腸癌患者の臨床データを解析し NAFLD が大腸癌の肝転移因子になるか否かを確認し，更には食餌性肥満マウスにおける大腸癌肝転移モデルを作成，
SMS 阻害よる抑制が起こるか否かを検討することで，最終的に大腸癌予後改善に貢献する抗癌剤開発への応用を目指すことを目的とする。
５．研 究 計 画
1) ヒト臨床データの解析として，2007 年 1 月～2015 年 12 月に当院での手術加療で大腸切除術を施行された大腸癌患者を対象とし，術前検査の後方視的調査により NAFLD fibrosis
score (NFS) を算出，大腸癌術後肝転移との関連について後方視的な臨床研究を生存率含めて行う。更には転移性肝癌に対して肝切除を施行された患者の病理標本から背景肝のNAFLD の程度と術前の NFS や脾臓体積との関連を検討する。
2) 食餌性脂肪肝及び大腸癌肝転移モデルマウスの解析として，食餌性脂肪肝及び大腸癌肝転移
モデルマウスにおける野生型と SMS2 欠損マウスの比較を，4 週齢の野生型と SMS2 欠損マ
ウスをそれぞれ 2 群に通常食と高脂肪食をそれぞれ与え，全 4 群における肝転移の数，大きさを比較する。さらに食餌性脂肪肝及び大腸癌肝転移モデルマウスにおける SMS 阻害剤の効果として，通常食＋溶媒，通常食＋SMS 阻害剤，高脂肪食＋溶媒，高脂肪食＋SMS 阻害剤のこの 4 群における肝転移の数，大きさを比較する。
６．研 究 成 果
ヒト臨床データでは NFS により算出された脂肪肝群が大腸癌根治切除後の肝転移再発にお－ 22 －

ける独立した危険因子であった。また肝外転移再発は 2 群間で有意差は認めなかったことも，
さらに裏付けとなる。マウスモデルに関しては，野生型マウスの通常食と高脂肪食の 2 群で実験を進めているが，大きな有意差もなく SMS2 欠損マウスを今後は使用し，実験遂行を予定している段階である。
７．研究の考察・反省
大腸癌の予後因子としては従来から悪性腫瘍側の因子のみの考察がなされていたが，今回は NAFLD が大腸癌術後の肝転移再発における危険因子として宿主側の因子がありえることが示唆された。肝臓の微小環境変化が転移促進因子でもあると考える。反省点としては SMS2欠損マウスでの実験遂行が予定より遅れていることでもあるが，今後の研究で SMS 阻害剤投与によって脂肪肝における大腸癌転移の増強を抑制できれば，SMS が大腸癌転移阻害の分子標的となりえる創造的研究と考察する。
８．研 究 発 表
該当なし

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１．研究課題名：DNA 損傷応答タンパク質 53BP1 がアポトーシス細胞に対する自己免疫応答を抑制するメカニズムの解明（研究番号 S2020-8）
２．キーワード：１）アポトーシス (apoptosis)
３．研究者氏名：砂谷 優実・医学部・講師・生化学Ⅰ
４．研 究 目 的
DNA 損傷修復タンパク質として知られる 53BP1 は，放射線等により生じた DNA 二本鎖切断部位のヒストンと結合することで，DNA 二本鎖切断部位に速やかに集積し，相同組換えによる修復を抑え，非相同末端再結合修復を促進する。一方，放射線により致命的な損傷を受けた細胞はアポトーシスに陥る。アポトーシス細胞の細胞膜表層には，アポトーシスのごく初期から断片化されたクロマチンが露出してくるが，その露出の分子メカニズムは不明である。研究者は，①53BP1 がカスパーゼ依存性に切断されること，②切断後に残存する 53BP1C
末断片がアポトーシス細胞表層に露出すること，③53BP1 がアポトーシス細胞表層へのクロマチン露出に関与していることを見出した。本研究は，アポトーシスにおける 53BP1 の役割を明らかにすることを目的とした。
５．研 究 計 画
新型コロナウイルス感染症蔓延の影響で，動物実験施設の使用に制限が加えられたため，当初 53BP1 欠損細胞として使用する予定であった 53BP1 ノックアウトマウスのリンパ球が使用できなかった。そこで，以前より使用しアポトーシスの誘導およびクロマチン露出の検出の方法を確立しているヒト T リンパ球由来白血病細胞株 Jurkat 細胞を用いて，53BP1 がどのようにしてアポトーシス細胞表層へのクロマチン露出に関与するのか，そのメカニズムについて調べた。
A. クロマチン露出，53BP1 露出は DNA 断片化依存性か？
アポトーシス細胞でのヌクレオソーム単位の DNA 切断において中心的な役割を果たすヌ
クレアーゼは Caspase-activated DNase (CAD)である。そこで，CAD 欠損細胞を作製し，アポ
トーシス時の DNA 切断を抑制することでクロマチンおよび 53BP1 の露出が減少するか否かを検証した。まず，CAD を，CRISPR/Cas9 を用いて欠損させた Jurkat 細胞株を樹立した。次に，CAD 欠損細胞では，スタウロスポリンでアポトーシスを誘導しても，ゲノム DNA の断片化が全く見られないことをアガロースゲル電気泳動法で確認した。
B. 53BP1 結合タンパク質 X がクロマチン露出，53BP1 露出に関与するか？
研究者の所属研究室では以前に，カスパーゼでの切断後に残存する 53BP1C 末断片に含まれる 53BP1 の領域に結合するタンパク質 X を免疫沈降法と質量分析法で見出していた。そこ－ 24 －

で研究者は，このタンパク質 X に着目し，タンパク質 X がクロマチンおよび 53BP1 の露出を調節する因子なのではないかと予想し，検証することとした。そのために CRISPR/Cas9 を用いてタンパク質 X 欠損 Jurkat 細胞株を樹立した。
６．研 究 成 果
A. クロマチン露出，53BP1 露出は DNA 断片化依存性か？
CAD 欠損細胞をスタウロスポリンで処理すると，アポトーシスの指標であるホスファチジ
ルセリンの露出が野生型細胞と同程度に検出されたことから，CAD 欠損細胞はアポトーシス
時に生じる DNA 断片化以前の細胞内変化の進行は正常であることを確認した。しかし CAD
欠損細胞では，アポトーシス誘導後の細胞膜表層へのクロマチンの露出がほとんど見られな
くなることがわかった。アポトーシス細胞における細胞膜表層へのクロマチンの露出には，
CAD 依存性の DNA 切断が必要であることが明らかになった。
一方，53BP1 の露出は，CAD 欠損細胞でも完全には抑制されなかったことから，53BP1 のアポトーシス細胞表層への露出は部分的に DNA 断片化依存性であることが示された。
B. 53BP1 結合タンパク質 X がクロマチン露出，53BP1 露出に関与するか？
タンパク質 X 欠損細胞では，アポトーシス誘導後の細胞表層へのクロマチン露出が減少した。露出したクロマチンの内訳を解析すると，53BP1 陽性のクロマチンが特に減少していたことが判明した。この結果から，53BP1 結合タンパク質 X は 53BP1 およびクロマチンの両方の露出に関与する因子であることが示唆された。
次に，クロマチンおよび 53BP1 露出制御に関わるタンパク質 X の機能領域を明らかにしようと考えた。そこで，タンパク質 X 欠損細胞にタンパク質 X 機能変異体を導入する実験系の確立を試みた。しかし，タンパク質 X 欠損細胞では，増殖能，アポトーシス刺激，および遺伝子導入ストレスに対する感受性が野生型細胞とは異なっており，タンパク質 X 変異体を戻した細胞株を樹立することが困難であった。
７．研究の考察・反省
これまでの研究から，53BP1 のアポトーシスにおける役割として，細胞表層へのクロマチ
ンの露出を予想していた。
本研究により，53BP1 を介したクロマチン露出メカニズムとして，
53BP1 は CAD によるヌクレオソーム単位の DNA 切断依存性にアポトーシス細胞表層に露出することが考えられた。また，53BP1 およびクロマチン露出を制御する因子として，53BP1
結合タンパク質 X の存在が示唆された。
しかしながら，タンパク質 X の欠損は細胞への悪影響が大きくタンパク質 X の機能解析がうまく遂行できなかった。今後，タンパク質 X の機能解析の代替手段として，タンパク質 X
機能変異体を野生型細胞にノックインした Jurkat 細胞株を作製し，タンパク質 X の機能解析を続行する予定である。

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８．研 究 発 表
該当なし－ 26 －

2020

令和 2 年度金沢医科大学共同研究成果報告書
奨励研究成果報告書編 集発行所

令和 4 年 10 月発行
研究業績評価委員会
金沢医科大学出版局
石川県河北郡内灘町大学 1 丁目 1 番地

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