酵母 Cryptococcus humicola UJ1 における D‑アスパラギン酸酸化酵素の生理機能解析
環境生物化学研究室 角一 大樹
k 指導教官 山田 良平，解良 芳夫，高橋 祥司
1. はじめにD‑アスパラギン酸酸化酵素（DDO, EC 1.4.3.1）は、D‑アスパラギン酸（D‑Asp）や D‑グルタミン酸（D‑Glu）などの酸性 D‑アミノ酸の酸化的脱アミノ反応を触媒する酵素であり、酵母からヒトに至る多くの真核生物に存在していることが知られている。現在までに、いくつかの生物種由来の DDO の酵素学的諸特性が詳細に解析され、哺乳動物においてその生理機能に関する研究が進行中である。しかし、真核微生物における DDO の生理機能に関する報告はない。
我々は DDO を多量に生産する酵母 Cryptococcus
humicola UJ1 を単離し、微生物由来としては初めて完全精製した C.humicola UJ1 の DDO（ChDDO）について、その酵素学的諸特性を明らかにしてきた。また、C.humicola UJ1 は D‑Asp を唯一の窒素源として生育させた時に ChDDO を生産し、他の D, L‑アミノ酸では明らかな生産はみられなかったことから、ChDDO は D‑Asp を窒素源として生育に利用する役割を担っていることが示唆された。しかし、ChDDO の発現条件のより詳細な解析はなされておらず、また、
ChDDO 遺伝子破壊株が得られていなかったこともあり、その生理機能は完全には明らかとされていない。
本研究では、C.humicola UJ1 の ChDDO 遺伝子破壊株（ddoΔ）を構築し、その生育特性を解析するとともに ChDDO の発現条件を詳細に解析することにより、本酵母における本酵素の生理機能を明らかにすることを目的としている。

ルコース、D‑Asp、D‑Glu、D‑アラニン（D‑Ala）の 1 M溶液をろ過滅菌（孔径 0.2‑µm）して使用時に無菌的に必要量を培地に添加した。培養は 30℃の好気的条件下で振とう培養により行い、生育は波長 600 nmでの吸光度（OD 600）を測定した。
2‑2. ChDDO 遺伝子の破壊と確認
ddoΔ株の作製のために、in vitro で ChDDO 遺伝子
内に選択マーカーとして C.humicola UJ1 のオロチジン‑5’‑リン酸脱炭酸酵素遺伝子（ChURA3 遺伝子）を挿入した ChDDO 遺伝子破壊ベクター pSKdDU を構築した（図 1）。そして、C.humicola UM3 を制限酵素KpnⅠと HindⅢで消化した ChDDO 遺伝子破壊ベクターにより形質転換した。酵母の形質転換は、電気穿孔法により行った。
形質転換体における ChDDO 遺伝子破壊の確認は、制限酵素 PvuⅡで消化した形質転換体ゲノム DNA について、ChDDO 遺伝子と ChURA3 遺伝子に対するサザンブロット解析により行った。

2. 材料と方法
2‑1. 実験に用いた酵母と培地組成、実験に用いた酵母と培地組成、培養方法
酵母と培地組成、培養方法
C.humicola UJ1 は 、 野 生 株 と し て 用 い た 。
C.humicola UJ1 の Chura3 株である C.humicola UM3は、ddoΔ株を作製するための宿主として用いた。
酵母菌株は、YPD 培地（1% yeast extract (w/v), 2%polypeptone (w/v), 2% glucose (w/v)）或いは SD培地（0.67% yeast nitrogen base (w/v), 2% glucose(w/v)）で培養した。平板培地は、2% (w/v)の寒天の添加により作製した。また、 C.humicola UJ1 とddoΔ株の生育特性を比較するために、Wickerham の酵母用合成培地を基本として必要に応じて窒素源と炭素源を変えた完全合成培地を作製した。窒素源と炭素源は、pH 7.0 に調製した塩化アンモニウム、グ

図 1 ChDDO 遺伝子破壊ベクター pSKdDU のプラスミド地図
2‑3. 無細胞抽出液の調製と DDO 活性の測定
活性の測定
酵母細胞は、ガラスビーズ（直径 0.45‑0.5 mm）を含む破砕バッファー（50 mM KPi, 2 mM EDTA, pH 7.0）に懸濁して 1 分間のボルテックスと氷上での 1 分間の冷却を 10 回繰り返すことで破砕した。そして、遠心分離（15,000 x g, 20 分間, 4℃）して回収した
上清を無細胞抽出液とした。
1

3. 結果と考察
3‑1. Ch
ChDDO
DDO 遺伝子の破壊と確認
遺伝子の破壊と確認
C.humicola UJ1 における ChDDO の生理機能を解析
ChDDO 遺伝子を破壊した ddoΔ株は重要するために、な役割を担う。
図 1 に示すように構築した ChDDO 遺伝子破壊ベク
ター pSKdDU は、ChDDO 遺伝子と ChURA3 遺伝子をそれぞれ制限酵素処理したのち、互いの DNA 末端を平滑化して連結しているために ChURA3 遺伝子の挿入される方向が異なることが予想される。この pSKdDUにより大腸菌 DH5α を形質転換したところ、いくつかの大腸菌形質転換体が得られた。得られた大腸菌
形質転換体から無作為に 16 個のコロニーを選択してプラスミドを回収したのち、制限酵素 SalⅠ消化によるアガローズゲル電気泳動解析を行った。その結果、ChDDO 遺伝子の 5 から 3 方向に対して逆方向に ChURA3 遺伝子（図 1, 3 ‑5 ChURA3）が挿入された pSKdDU11 と、ChDDO 遺伝子の 5 から 3 方向に対して同方向に ChURA3 遺伝子（図 1, 5 ‑3 ChURA3）が挿入された pSKdDU12 および pSKdDU13 と名付けた
ChDDO 遺伝子破壊ベクターを確認した（data notshown）。なお、ddoΔ株作製のために C.humicola UM3へ導入する ChDDO 遺伝子破壊ベクターは、ChDDO 遺伝子と ChURA3 遺伝子の連続した発現の可能性を避けるため pSKdDU11 を用いた。

DDO の活性測定は、無細胞抽出液と 50 mM KPi バッファー(pH 7.5), 20 µM FAD と 20 mM D‑Asp を含む混合液において、基質である D‑Asp から酵素反応により生じるオキサロ酢酸を 2,4‑ジニトロフェニルヒドラジン（2,4‑DNPH）と反応させて生じたヒドラゾンの吸光を波長 445 nm で測定して決定した。DDO
活性の 1 U は、1 分間に 1 µmol の D‑Asp を消費する酵素量として定義した。
2‑4. タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度の測定は、フェノール試薬とタンパク質（チロシン、トリプトファン）が結合する際の吸光の変化を測定する Lowry らの方法により行った。
2‑5. 酸性 D‑アミノ酸の毒性
ddoΔ
アミノ酸の毒性との毒性と ddo
Δ株の生育
SD 培地で OD 600 が 1.5〜2.0 になるまで生育させた C.humicola UJ1 と ddoΔ株を酵母細胞数が 10,000、1,000、100、10 となるように、それぞれ異なるアミノ酸を添加した SD 平板培地に接種して、30℃で 24時間の培養を行った。SD 平板培地に添加するアミノ酸は、D‑Asp, D‑Glu, L‑Asp, L‑Glu を用いた。
異なるアミノ酸を含む SD 平板培地は、pH 7.0 に調整した必要量の SD 培地に 1 M D‑Asp 溶液、1 M D‑Glu溶液、1 M L‑Asp 溶液、1 M L‑Glu 溶液を無菌的に最終濃度が 50 mM、100 mM、200 mM となるように添加して作製した。
A.

PvuⅡ

PvuⅡ
3.8 kbp

親株 C.humicola UM3

ChDDO
ChDDO プローブ

ddoΔ株

ChURA3 プローブ
ChURA3
6.3 kbpB.
M : DNA サイズマーカー
1 : C.humicola UM3
2 : UM3 形質転換体 No.1
3 : UM3 形質転換体 No.2
4 : UM3 形質転換体 No.3
5 : UM3 形質転換体 No.4
6 : UM3 形質転換体 No.5

図 2 制限酵素 PvuⅡ 消化による UM3 形質転換体のゲノム DNA のサザンブロット解析2

C. humicola UM3 を制限酵素 KpnⅠと HindⅢ消化した pSKdDU11 で形質転換したところ、いくつかの UM3形質転換体が得られた。得られた UM3 形質転換体か
ら無作為に 5 個のコロニーを選択して、それぞれ UM3株形質転換体 No.1 から No.5 と名付けて、そのゲノム DNA 上の ChDDO 遺伝子の形態をサザンブロット解析により確認した（図 2）。
C.humicola UM3 のゲノム DNA を制限酵素 PvuⅡで消化すると、ChDDO 遺伝子を含む約 3.8 kbp のゲノム DNA 断片が得られる。一方、ddoΔ株では ChDDO
遺伝子内に挿入された ChURA3 遺伝子を含む約 6.3kbp のゲノム DNA 断片が得られる（図 2‑A）。
図 2‑B から、ChDDO 遺伝子に対するサザンブロット
解析は、UM3 形質転換体 No.3 において ChDDO 遺伝子破壊株に特異的な約 6.3 kbp 程度のバンドを検出した。 一方、ChURA3 遺伝子に対するサザン解析は、
ChDDO 遺伝子の場合と同様に UM3 形質転換体 No.3 において約 6.3 kbp 程度のバンドを検出した。また、
UM3 形質転換体 No.3 のゲノム DNA 中の Chura3 遺伝子が、コントロールとした C. humicola UM3 の Chura3遺伝子のバンドと同じ位置に検出された。
また、UM3 形質転換体 No.3 は D‑Asp を唯一の窒素源とした平板培地で生育しなかったこと（data notshown）と液体培地で ChDDO を誘導したときの DDO活性が測定されなかったこと（data not shown）から、ChDDO の機能不全が確認されたため、サザン解析の結果とあわせて UM3 形質転換体 No.3 を ddoΔ株と決定した。
3‑2. C.humicola UJ1 と ddo
ddoΔ
Δ株の生育特性の比較の生育特性の比較
現在までに、C.humicola UJ1 は D‑Asp を唯一の窒素源としたときに、ChDDO を大量に生産することが明らかとされている。しかしながら、D‑Asp を唯一の炭素源もしくは窒素および炭素源としたときのC.humicola UJ1 における ChDDO の発現は明らかとされていない。また、D‑Asp が本酵素のみで代謝されているのかについても明らかとされていない。そのため、窒素源や炭素源の違いによる C.humicola UJ1と ddoΔ株の生育特性を比較して（図 3）、ChDDO 遺伝子破壊の影響について考察した。
窒素源の違いによる生育特性の比較は、D‑Asp、D‑Glu、D‑Ala をそれぞれ唯一の窒素源として最終濃度が 10 mM になるように添加した完全合成培地（炭素源はグルコースを最終濃度 55.5 mM 添加）で行った。
炭素源による生育特性については、D‑Asp を最終濃度が 83.25 mM になるように添加した完全合成培地（窒素源は塩化アンモニウムを最終濃度10 mM 添加）

D‑Asp/Glucose

生育（OD600）

生育（OD600）

NH4Cl/Glucose

NH4Cl/D‑Asp

D‑Asp/D‑Asp

生育（OD600）

時間（h）

生育（OD600）

時間（h）

D‑Glu/Glucose

D‑Ala/Glucose

生育（OD600）時間（h）

生育（OD600）

時間（h）

時間（h）

時間（h）

図 3 様々な窒素源と炭素源での C.humicola UJ1 とddoΔ株の生育

C. humicola UJ1（●）, ddoΔ株（△）
で行った。このときの D‑Asp の最終濃度は、コントロールとした 55.5 mM のグルコースの炭素数と等しい。また、窒素源と炭素源の両方については、D‑Aspを最終濃度93.25 mM 添加した完全合成培地で行った。
D‑Asp を窒素源（D‑Asp/Glucose 培地）としたとき、炭素源（NH4Cl/D‑Asp 培地）、窒素および炭素源（D‑Asp/D‑Asp 培地）としたとき、いずれにおいても C.humicola UJ1 は生育したが ddoΔ株は生育しなかった。このことから、ChDDO は D‑Asp を窒素源や炭素源として別々に、もしくは同時に代謝出来る唯一の酵素であることが明らかとされた。
窒素源を D‑Glu（D‑Glu/Glucose 培地）や D‑Ala（D‑Ala/Glucose 培地）としたとき、C.humicola UJ1と ddoΔ株は共に生育した。しかし、窒素源が D‑Glu3

3‑4 酸性 D‑アミノ酸の毒性とddoΔアミノ酸の毒性とddoΔ株の生存可能性のとき、ddoΔ株の生育は C.humicola UJ1 よりも劣っていた。このことは、ChDDO 遺伝子破壊によるD‑Glu 代謝への何らかの影響を示唆する。
D‑Glu
事実、を唯一の窒素源としたときの C.humicola UJ1 とddoΔ 株の DDO 活性を測定したところ、僅かにC.humicola UJ1 で ddoΔ株には見られない DDO 活性を確認した（data not shown）。
ChDDOの発現解析
3‑3. C.humicola UJ1 における Ch
DDO の発現解析
窒素源炭素源（30 mM）（30 mM）

C.humicola UJ1SDddoΔ株
SD+200 mM D‑Asp

C.humicola UJ1ddoΔ株

DDO 比活性（U/mg）
00.5

1.01.5SD+200 mM D‑Glu

C.humicola UJ1ddoΔ株
104

図 5103102

10 cells

酸性 D‑アミノ酸を含む SD 平板培地でのC.humicola UJ1 と ddoΔ株の生育

ChDDO の発現は、他の窒素源や炭素源に影響されることなく D‑Asp の存在に依存することから、ChDDOは D‑Asp を生体異物として分解する役割を担うことが示唆された。そのため、D‑Asp の他に利用可能な窒素源と炭素源の共存下で、 C.humicola UJ1 とddoΔ株の生育を比較することにより D‑Asp による生育阻害の影響を検討した（図 5）。
D‑Asp の添加は、C.humicola UJ1 の生育に影響は与えなかったが、ddoΔ株の生育は著しく阻害した。そして、ddoΔ株の生育阻害は D‑Asp の濃度に依存して大きくなった（data not shown）。また、D‑Asp と同じ酸性 D‑アミノ酸の D‑Glu の添加は、
C.humicola UJ1と ddoΔ株の生育を阻害した。しかし、D‑Glu の濃度に関係なく同様に生育した C.humicola UJ1 に対して、ddoΔ株は D‑Glu の濃度に依存して生育が阻害された（data not shown）。このことは、D‑Glu の分解にChDDO が関与している可能性を示唆している。
以上のように、D‑Asp や D‑Glu は ddoΔ株の生育を阻害することから、C.humicola UJ1 の ChDDO は、D‑Asp や D‑Glu を分解する解毒酵素としても機能していることが示唆された。

図 4 様々な窒素源と炭素源の組み合わせにおける
C.humicola UJ1 の DDO 活性

C.humicola UJ1 における DDO の発現条件のより詳細な解析を行うために、図 4 に示す窒素源と炭素源の組み合わせにおける DDO 活性について検討した。
DDO 活性は、D‑Asp の存在下（図 4, d, i, m, q‑s）においてのみ検出され、塩化アンモニウムやグルコース（図4, c）、他の D, L‑アミノ酸の存在下（図 4,e‑g, j‑l, n‑p）では意味のある DDO 活性は検出されなかった。また、窒素源もしくは炭素源のない状況（図 4, a, b, h）で DDO 活性は検出されなかった。
以上のことから、C.humicola UJ1 における ChDDOの発現は、D‑Asp の存在に依存して誘導され、他の窒素源や炭素源により誘導されないことが明らかとなった。また、他の窒素源や炭素源との共存下においても誘導されることが示唆された。そして、ChDDOの発現は窒素源もしくは炭素源異化抑制作用のような発現調節機構を受けないことが示唆された。

4. まとめC.humicola UJ1 の ChDDO は、D‑Asp を代謝して生育に利用するために必須な酵素であることが明らかとなった。そして、本酵素の発現は D‑Asp の存在に依存的であり、他の窒素源や炭素源との共存下でも誘導発現された。
また、本酵素は酸性 D‑アミノ酸を分解する解毒酵素としても機能していることが示唆された。

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