洛和会病院医学雑誌

原Vol.22：61−64, 2011著

ラット脂肪組織由来幹細胞の脂肪・骨への分化
関西医科大学覚道奈津子・櫛田形成外科学講座

哲史・鈴木健司・楠本健司

Differentiation of rat adipose-derived stem cells into fat and bone
Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Kansai Medical University

Natsuko Kakudo, Satoshi Kushida, Kenji Suzuki, Kenji Kusumoto【要旨】
脂肪組織中に骨髄間葉系幹細胞と同様の多分化能をもつ体性幹細胞が発見され、これは脂肪組織由来幹細胞（Adipose-derived Stem Cells：ASCs）と呼ばれている。脂肪組織は、形成外科手術の際の余剰組織として低侵襲で採取することは容易であり、ドナーサイトの変形・欠損や採取時の侵襲も非常に少なく行える。
今回我々は、ラット脂肪組織から分離したASCsを分離調整し、脂肪・骨への分化誘導を行った。特別染色により、各誘導へ分化可能であることが証明された。ASCsは脂肪・骨の再生医療において最も有用な細胞源のひとつとなる可能性がある。

【Abstract】
Recently, somatic stem cells with the same pluripotency as bone marrow mesenchymal stem cells were identified
in aspirated adipose tissue. These somatic stem cells are called adipose-derived stem cells (ASCs). Adipose tissue
is a potential alternative to bone marrow as a source of stem cells. Adipose tissue is easily and less invasively
collected as excess tissue during surgery. Collection can be conducted with little donor-side deformity and damage.
Here, we isolated and prepared ASCs from rat adipose tissue and differentiated them into fat and bone. Theirdifferentiation potential was demonstrated by specific staining. Thus, ASCs are potentially useful as a source ofstem cells to regenerate fat and bone.
Key words：脂肪組織由来幹細胞、分化、脂肪、骨、再生医療
Adipose-derived stem cells, differentiation, fat, bone, regenerative medicine【緒言】

床応用を目指し、分離・分化誘導系の基礎的研究を行って近年、吸引された脂肪組織中に骨髄間葉系幹細胞と同様きた。ヒトへの使用の前臨床基礎研究のひとつとして、動の多分化能をもつ体性幹細胞が発見された。これは脂肪組物由来のASCsを分離調製し、同種移植実験でその安全性に織由来幹細胞（Adipose-derived Stem Cells：ASCs）と呼ついて検討を行うことは必要不可欠であるが、これまでにばれ、脂肪組織は骨髄に代替する幹細胞の供給源であるとラットやマウスにおけるASCsの分離調製・分化に関して検考えられている。脂肪組織は、形成外科手術の際の余剰

1）2）討を行った国内報告はほとんど認められない。

組織として低侵襲で採取することは容易で、ドナーサイト

今回我々は、ラット脂肪組織から分離したASCsを分離調の変形・欠損も非常に少なく行える。我々はこのASCsの臨整し、脂肪・骨への分化誘導を行った。特別染色により、− 61 −

原各誘導へ分化可能であることが証明された。ASCsの分離法

著

脂肪細胞への分化誘導
基礎培地に0.5 mM isobutyl-methylxanthine（IBMX）、1と分化誘導実験における臨床的意義について、文献的考察

μM dexamethasone、10 mM insulin、200 mM indomethacin

を含め報告する。

を添加したものを脂肪分化誘導培地とした3）。培地交換は3【材料と方法】

日ごとに行った。サブコンフルエントになったASCsを脂肪実験動物分化誘導培地にて21日間培養し、形態的変化を位相差顕微実験には、Wistar系雄ラット（6週令）6匹を清水実験材鏡にて観察した。

料より購入して用いた。本研究は、関西医科大学の動物実骨細胞への分化誘導

験指針に準じて行われた。

基 礎 培 地 に0.1 μM dexamethasone、50μg ascorbate-2脂肪組織由来幹細胞の分離・培養

phosphate、10 mM b-glycerophosphateを添加したものを骨ラット鼠径部の脂肪組織を採取後、PBS（−）で十分に分化培地とした。培地交換は3日ごとに行い、サブコンフルエ洗浄し、血管、結合組織等を除去後、組織を細分化し、コントになったASCsを骨分化誘導培地にて21日間培養した。

ラゲナーゼタイプⅡ（Sigma, ST Louis）にて40分40℃にて震盪させ、組織を消化した。ダルベッコ改変イーグル培地

グリセロール3-リン酸脱水酵素（GPDH活性）の測定（Dulbecco’s modified Eagle’s medium： DMEM） に 10％

分化誘導3週間後にGPDH活性の測定を行い、基礎培地で

濃 度 の 胎 仔 牛 血 清（fatal bovine serum： FBS）、100U/ml21日間培養したコントロール群と比較した。脂肪培養21日

penicillin G、100 μg/ml streptomycin を添加したものを基礎

目の細胞のGPDH活性を GPDH活性測定キット（TAKARA培地とした。脂肪組織を消化終了後、基礎培地を加えてBIO INC, Shiga, Japan）にて測定した。DNA定量キット（Cell1,300rpm 3分にて遠心処理を行い、下部に沈殿した細胞ペGarage Co., Ltd., Tokyo, Japan）を用いて同一サンプルのレットを新しい基礎培地の入った遠心管に移して攪拌し、DNAを 定 量 し、GPDH活 性 を 補 正 し た。 デ ー タ はMann-洗浄した。この作業を3回繰り返し、十分にコラゲナーゼをWhitneyのU検定を用いて統計学的に評価を行い、p< 0.01を洗浄した。最後に細胞成分を100μmのメッシュでろ過した有意差ありと判定した。

のち、基礎培地にて37℃、5% CO2の条件下で培養を行い、3継代したものをASCsとし、以下の分化誘導実験に用いKossa染色た（図1）。

骨分化誘導を行った、または基礎培地で培養したASCsの 石 灰 化 沈 着 を 染 色 す る た め、Kossa染 色 を 行 っ た。
シャーレ内の培地を吸引し、PBS（−）で2回洗浄後、4%paraformaldehydeにて10分間固定した。その後、5% silver

ASCsの初代培養

nitrate（Sigma, ST Louis）にて室温の暗室で10分間染色し、蒸留水で洗浄後、UVライトを1時間照射した。

ラット脂肪組織遠心分離

成熟脂肪細胞【結果】

初代培養したラット脂肪組織由来ASCsは、線維芽細胞状の形態をしており、基礎培地にて増殖した（図2A）。コン組織を細切コラゲナーゼ処理フルエントになったASCsを脂肪分化誘導培地にて培養をす

ASCs
DMEM+10%FBS

ると，培養7日目より全体の80％程度の細胞の細胞質内に小さい脂肪滴を認め、培養8～21日目になると脂肪滴は徐々に

図1

脂肪組織からASCsを分離する方法増大した（図2B、矢印は脂肪滴を示す）。脂肪滴が大きく− 62 −

ラット脂肪組織由来幹細胞の脂肪・骨への分化なるに従い、細胞の形態は線維芽細胞状より円型に変化し【考た。

察】

脂肪組織由来幹細胞（ASCs）は、美容外科手術のひとつ

骨分化誘導培地にて21日間培養し、Kossa染色を行うと、である脂肪吸引手術より得られた液状脂肪（lipoaspirates）細胞質内に黒色の石灰化沈着が認められた（図2C）。石灰より2001 年に初めて精製された1）。今回我々は、ラット脂化沈着がみられた細胞は全体の40％程度で、骨分化誘導培

肪組織よりASCsを精製したが、既存の報告と同様に、それ地にて培養した細胞すべてではなかった。一方、基礎培地

ぞれの分化誘導培地で培養されたASCsは、脂肪・骨への分で培養したASCsには石灰化沈着が認められなかった。

化が可能であることが明らかになった。

GPDH活性は、脂肪分化の際のマーカーとして汎用され1990年代にラット4） やヒト5） の骨髄中に脂肪、骨、軟骨ている3）。本検討におけるGPDH活性は、コントロール群など中胚葉系細胞に分化可能な、いわゆる間葉系幹細胞が0.0028±0.001（U/mg DNA） に 対 し、 脂 肪 分 化 群0.058±存在することが証明された。この細胞はすでに骨髄障害の0.00921（U/mg DNA）と約20倍の活性を示した。

治療や骨の再生などをターゲットに一部の施設においては

図2A

初代培養におけるラットASCsの位相差顕微鏡像。
線維芽細胞状の形態をしている。

図2C

骨分化誘導後にKossa染色をおこなったASCs。
石灰化沈着が黒色に染色されている（矢印）。

0.08

＊

GPDH（U/mg DNA）

0.070.06
0.050.040.030.020.010

図2B

図3

脂肪分化誘導をおこなったASCs。細胞質内に多数の脂肪滴が認められる（矢印）。

− 63 −

コントロール

脂肪分化

脂肪分化誘導群とコントロール群のGPDH活性。
脂肪分化群が有意に高いGPDH活性を示した。
（＊p < 0.01）

原著

臨床試験が開始されている。しかしながらこの骨髄由来間最も有用な細胞のひとつであり、ASCsも将来骨髄由来幹細葉系幹細胞は、獲得できる細胞数が非常に少なく、そのた胞と並んで臨床応用されていくものと期待している。

め体外培養を施さない限り一度に大量の骨髄採取を必要とする。したがって採取には全身麻酔を要する上、採取後の【参考文献】

疼痛が不可避で、ドナーへの侵襲が大きいことが難点であっ

1）Zuk PA, et al : Multilineage cells from human adipose

た。

tissue : implications for cell-based therapies. Tissue Eng

一方近年、この骨髄由来間葉系幹細胞と同様の性質を有7（2）：211-28, 2001.

する細胞が、骨髄以外の組織にも存在することが示唆さ

2）De Ugarte DA, et al : Comparison of multi-lineage cells、中でもZukら は吸引脂肪組織中に間葉系幹細胞

from human adipose tissue and bone marrow. Cells

れ1）6）7）1）に類似した多能性幹細胞であるASCsを発見した。これらのTissues Organs 174（3）：101-9, 2003.

骨髄・脂肪・真皮・血液などに微量含まれている未成熟の

3）Kakudo N, et al : Fibroblast growth factor-2 stimulates

細胞は体性幹細胞と呼ばれ、ES細胞と比較し一定の種類のadipogenic differentiation of human adipose-derived細胞に分化し、患者自身の細胞を採取するので、拒絶反応

stem cells. Biochem Biophys Res Commun 359（2）：が起きないことが特徴とされている。その中でも脂肪組織

239-44, 2007.

は、形成外科手術の際の余剰組織として採取することが容4）Caplan AI : Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 9（5）易で、局所麻酔下でも採取が可能である。また脂肪組織採：641-50, 1991.

取は骨髄採取に比較して低侵襲で、採取後の疼痛や、ドナー

5）Pittenger MF, et al : Multilineage potential of adult

サイトの変形・欠損も少なく行える。このため、脂肪組織

human mesenchymal stem cells. Science 284（5411）：が再生医療において幹細胞の普遍的な供給源となれば、理143-7, 1999.

想的であると考えられる。

6）Toma JG, et al : Isolation of multipotent adult stem cells

本研究において、脂肪分化は全体の80%程度の細胞におfrom the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol （3 9）：

いて認められたが、骨分化は40％程度にしか認められなかっ778-84, 2001.

た。これは、細胞の採取元が脂肪であるということが関係

7）Lee JY, et al : Clonal isolation of muscle-derived cells

しているのかもしれない。今回はラットASCsを用いて検討

capable of enhancing muscle regeneration and bone

したが、ヒトASCsの場合 と比較し、細胞の形態分化の経

healing. J Cell Biol 150（5）：1085-100, 2000.

3）

過は類似していた。また採取組織の年齢8）、培地の種類9）等

8）de Girolamo L, et al : Human adipose-derived stem

さまざまな要因により増殖・分化の効率が異なるという報cells isolated from young and elderly women : their

告もあり、適切な増殖・分化条件のさらなる探索が必要と

differentiation potential and scaffold interaction during思われる。

in vitro osteoblastic differentiation. Cytotherapy 11（6）：

再生医学に必要な要素として、細胞、足場、増殖因子の3793-803, 2009.

つが重要であり、相互に最良の環境を構築して組織、器官

9）Lund P, et al : Effect of growth media and serumの再生およびその臨床発展型である再生医療が成功に導か

replacements on the proliferation and differentiation ofれると考えられる。我々の研究施設ではこれまでに、ASCs

adipose-derived stem cells. Cytotherapy 11（2）：189-97,の臨床応用化を目指し、増殖因子がASCsに与える影響3）や、2009.

ASCsと足場を用いた3次元骨組織の作成10） を行ってきた。

10）Kakudo N, et al : Bone tissue engineering using human

今後、本研究の内容を発展させ、ヒトへの使用の前臨床基

adipose-derived stem cells and honeycomb collagen

礎研究のひとつとして、ラットASCsを用いた同種移植実験

scaffold. J Biomed Mater Res A 84（1）：191-7, 2008.

を計画している。体性幹細胞は現時点で再生医学において− 64 −