エンドファイティックなカビ
Penicillium brocae による汚染米の安全性について

白鳥望美1、滝埜昌彦2、遠藤治3、Phitsanu Tulayakul4、杉浦義紹1、小林直樹1,3、
小西良子1,3（1麻布大院 環境保健、2アジレント・テクノロジー(株）、3麻布大生命・環境科学、4Kasetsart University）

目的

Penicillium brocaeは、これまでコーヒー豆に寄生する昆虫からの分離により登録されたカビである*。コーヒー豆の他、海洋植物からの分離も報告されエンドファイティックなカビであることが知られている。今回、初めて
P. brocaeがタイ米から分離され、本菌が米を汚染する可能性が示唆された。日本人にとって米は主食であり、最も安全性を確保しなければならない食品のひとつである。米のカビによる汚染では黄変米の原因菌であるP. islandicum、P. citreonigrum, P. citrinumによる汚染が知られ、これらが産生するカビ毒が人に有害であることが報告されている。菌が産生する二次代謝産物に関しては、詳細な毒性の報告は少なく、米に汚染した場合の本菌の二次代謝産物の毒性評価はない。そこで、本研究では、P. brocaeによって汚染された米の安全性を明らかにするため、Ames試
験による本菌の二次代謝産物の変異原性評価を行い、汚染米の有害性の有無を調べた。

材料と方法１）試料調製法

タイ米より分離したP. brocae AFS-0006とAFS-0073 菌株の培養抽出物を被験試料とした。供試菌株は米培地で2週間培養しメタノール抽出したものを被験試料とした。これをDMSOに溶解し、米４00mｇ相当の試験原液を調製し、順次希釈してAmes試験に供した。

Ames試験溶液

米培地に菌を接種し、2週間培養メタノールを加え、超音波抽出ろ過後、濃縮乾固

２）Ames試験
Ames試験とは、細菌を用いて突然変異原性を検出する試験であり、DNAや染色体に影響を及ぼす物質を検出することが出来る。今回は、労働安全衛生法の「微生物を用いる変異原性試験」に準拠し行った。供試菌株Salmonella typhimurium TA98、TA100、TA1537およびYG7108、Escherichia
coli WP2/uvrA/pKM101を用い、ラット肝S9 mix添加あるいは無添加の条件下でプレインキュベーション法により下図のように行った。
試料溶液 0.1mL

一夜前培養菌液

菌液
0.1mL

0.1M PBS (or S9mix) 0.5mL

プレインキュベーション(37℃, 20min, 振とう)ソフトアガー
2.0mL

寒天平板培地に重層最少グルコース寒天培地
培養(37℃, 48hr)

コロニー計数
溶媒対照

被験試料３）供試菌株の形態学的特徴と分子系統学的位置づけ
形態学的特徴から 典型的なP. brocaeであり、分子系統学的にもP.brocaeと同じクラスターに属していた。

AFS-0006

AFS-0006
KJ775102 P. brocae
KC773787 P. brocae
AFS-0009
AFS0089
AFS-0073KP329942 P. brocae
100KP329943
P. brocae
71AFS0090
JN625966 P. bilaiae
100 JX091571 P. bilaiae
JN625969 P. herquei
88100 JN625970 P. herquei
AB540176 P. sclerotiorum
96100 JN686384 P. sclerotiorum
KJ767035 P. chermesinum
100 KM088810 P. chermesinum
100 FJ004420 P. lividum
JQ965086 P. lividum
98 EF198564 P. glabrum
100KJ775127 P. glabrum
GQ367499 P. spinulosum
100100 KM089051 P. spinulosum
77GU446644 P. citrinum
100KM491315 P. citrinum
100 EF198621 P. citreonigrum
EF198623 P. citreonigrum
100FJ004428 P. restrictum
100100 KJ775150 P. restrictum
100AY674405 P. digitatum
FJ004403 P. digitatum
99 AY674397 P. italicum
FJ004417 P. italicum
100
96 FJ004405 P. expansum
JQ965099 P. expansum
100 AY674323 P. verrucosum
77FJ004438 P. verrucosum
AY674294 P. viridicatum
100 JX241683 P. viridicatum
100 KC992264 P. funiculosum
KM066165 P. funiculosum
KF984652 P. islandicum
100KF984656 P. islandicum
EF661093 Aspergillus nigerAFS-0073※スケールは10μm0.05

結果まとめ-１
Ames菌株と代謝活性化酵素の有無/被験試料株番号TA100
塩基対置換型

YG7108WP2/uvrA/pKM101

フレームシフト型

TA98

TA1537

変異原比活性（revertants / mg）
AFS-0006

AFS-0073

without S9mix

70

44

with S9mix

74

N

without S9mix

8785

with S9mix

298

308

without S9mix

NN

with S9mix

NN

without S9mix

16

N

with S9mix

17N

without S9mix

NN

with S9mix

13N

AFS-0006

結果まとめ-２塩基対置換型変異—〇—：with S9mix

・・■・・：without S9mix

AFS-0073

Strain :Strain :300

Strain : WP2/uvrA/pKM10300

Revertants / plate

Revertants / plate

Revertants / plate

3001501501500000200400

Dose (mg / plate)

0200400

Dose (mg / plate)

0200400

Dose (mg / plate)結果まとめ-3AFS-0006

フレームシフト型変異AFS-0073—〇—：with S9mix
・・■・・：without S9mix

Strain : TA98

Strain : TA1537

300

Revertants / plate

Revertants / plate300

150150000200400

Dose (mg / plate)

0200400

Dose (mg / plate)

AFS-0006株由来の試験溶液は、
TA100とYG7108において濃度依存的に復帰変異コロニー数の増加が認められた。両者を比べると
YG7108はS9添加で顕著に増加した。また、TA98でも微量の復帰変異コロニー数の増加が認められた。
しかし、TA1537およびWP2/uvrA/pKM101ではほぼ平行で復帰変異コロニー数に変化は認められなかった。
一方で、AFS-0073株由来の試験溶液は、YG7108では同様の傾向が見られたものの、TA100ではS9mix無添加条件下のみで復帰変異コロニー数の増加が認められた。その他の供試菌株には変化が認められなかった。

結論-1• 塩基対置換型の変異原性を検出するAmes菌株のうち、YG7108で両被験物質ともに陽性の結果となった。
• TA100のS9mix添加条件下では違いが見られ、また、フレームシフト型の変異原性を検出するAmes菌株でも被験試料の間に違いが見られたことから産生物質の違いが示唆された。

• 陽性と認められた試験菌株の結果から、塩基のうち－GC－部位に対して変異を起こすことが示唆された。

結論-2• TA100よりもO6－メチルグアニンメチル転移酵素欠損株でアルキル化剤に高感受性を示すYG7108で強い変異原性を示したことから、P. brocaeの二次代謝産物にはアルキル化剤が含まれていることが示唆された。
• S9mix添加条件下でより強い変異原性を示したことから酵素により代謝され変異原性を示す物質が含まれていることが示唆された。

今回、2菌株のP. brocaeの二次代謝産物の試験を行い、両菌株とも変異原性を示す結果となり、本菌が変異原性物質を産生することが示唆された。
以上のことから、P. brocaeが米を汚染する新たな危害真菌の1つとなる可能性が示唆された。