上原記念生命科学財団研究報告集, 29 (2015)

197. 局所酸素濃度上昇による癌新規治療法の開発

長谷川巧実* 神戸大学 医学部附属病院
歯科口腔外科Key words：炭酸ガス，活性酸素，扁平上皮癌

緒

言

抗癌剤投与による抗悪性腫瘍効果は，活性酸素 (ROS: Reactive Oxygen Speacies) が関与することが示されている 1)．
しかし，癌組織では酸素供給が不十分であり，低酸素状態では腫瘍の悪性化が増し，ROS の発生も不十分であることが知られている．近年われわれは，局所的炭酸ガス投与装置を開発し，血管拡張作用と Bohr 効果により，筋肉内の局所の酸素供給を増やすことを証明した 2)．また，これを癌組織に応用し，癌組織内の低酸素環境を改善し，細胞内ミトコンドリア量の増加によるミトコンドリア経路のアポトーシスを活性化することにより，抗腫瘍効果を証明した 3)．しかし，局所の低酸素環境改善と ROS の関係については不明である．そこで本研究の目的は，癌組織に対して局所的炭酸ガス投与装置を応用し，シスプラチン (CDDP: cisplatin) との併用効果を確認するとともに，局所の酸素供給を増やすことで効率的に ROS を増加させ，抗癌剤の効果促進と副作用抑制を観察し，新たな知見を得て口腔癌の新規治療法を開発することである．

方法

in vitro で，ヒト口腔扁平上皮癌由来細胞 (HSC-3) を培養後，サブコンフルエントになった時点で，CDDP 9.6μl/mlを投与し，24 時間作用させた．その後，細胞を回収し RNA およびタンパクの回収を行った．CDDP 非投与群をControl 群とした．すでに報告済みである局所炭酸ガス投与によるミトコンドリア経路のアポトーシスの活性化がCDDP 単独投与により生じているかどうかの確認のため，同経路関連因子である peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma coactivator-1 alpha (PGC-1α) および mitochondrial transcription factor A (TFAM) について Real
time PCR 法にて解析した．また，CDDP 投与による ROS 産生量を FACS および蛍光免疫染色にて解析した．in vivoで，HSC-3 (2×106 cell) を Nude Mouse 背部に皮下移植し，移植 14 日目より局所的炭酸ガス投与を週２回（投与時間20 分間）経皮的に行い，25 日間ののちに評価した．投与方法は，われわれがすでに報告した方法（図 1）で行った 3) ．
同様に移植 14 日目より CDDP 4 mg/kg を Mouse 腹腔内に投与し，CDDP 投与群とした．最終的に，Control 群（CDDP･CO2 非投与），CO2 投与群（CDDP 非投与），CDDP 投与群（CO2 非投与），併用群（CO2 ＋ CDDP 投与）の４群とした．腫瘍の体積を V=（最大径）×（最小径）2×π/6 で求め，比較検討した．また副作用の評価として，Mouse
体重の測定を行った．最終評価日に，腫瘍を採取し RNA の回収を行った．in vitro での実験と同様に，PGC-1α および TFAM について Real time PCR 法で解析した．in vivo では，さらに転移関連因子の検討を行うため，癌の増殖･浸潤に深く関わる因子である vascular endothelial growth factor (VEGF)，matrix metalloproteinase (MMP) 2，MMP9について Real time PCR 法で解析した．

*現所属：神戸大学 大学院医学研究科 外科系講座 口腔外科学分野
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図 1． 局所的炭酸ガス投与方法（文献 3 より改変）．
局所的炭酸ガス投与を週２回（投与時間 20 分間）経皮的に行った．

結果CDDP 単独投与により，ミトコンドリア経路のアポトーシス関連因子である PGC-1α および TFAM は有意な変化を示さなかった（図 2A）．FACS 解析では，データのばらつきが大きく，Control 群と CDDP 投与群において，ROS発現に明らかな差はなかった（図 2B）．蛍光免疫染色では，CDDP 投与群において，Control 群に比較して ROS 産生の増大や細胞死が確認できた（図 2C）．

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図 2． in vitro における CDDP 単独投与による PGC-1α, TFAM, ROS の変化．
A) in vitro における CDDP 単独投与による PGC-1α および TFAM の変化．Control 群，CDDP 群において有意な差はなかった (Mann-Whitney U test)．B) in vitro における CDDP 単独投与による ROS の変化（FACS; 横軸apoptotic cell, 縦軸 ROS activity）．Control 群と CDDP 投与群において，ROS 発現に明らかな差はなかった．
C) in vitro における CDDP 単独投与による ROS の変化．CDDP 投与群において，Control 群に比較して ROS 産生の増大や細胞死が確認できた． Scale bar: 100μm
腫瘍体積の結果は，Control 群に比較して，CO2 投与群，CDDP 投与群，併用群で有意に腫瘍増大抑制効果を認めた（図 3A）．しかし，CO2 投与群，CDDP 投与群に比較して，併用群では若干の併用効果は認めるものの，有意な腫瘍増大抑制効果は認めなかった．一方，体重変化については，CDDP 投与群，併用群で若干の減少が認められたが，有意な差はなく，重篤な合併症はいずれの群においても生じなかった（図 3B）．

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図 3． in vivo における腫瘍体積と体重の変化．
A) in vivo における腫瘍体積の変化．Control 群に比較して，CO2 投与群，CDDP 投与群，併用群で有意に腫瘍増大抑制効果を認めた (Kruskal Wallis test & Scheffe test). B) in vivo における体重変化．各群において有意な差はなく，重篤な合併症はいずれの群においても生じなかった (Kruskal Wallis test & Scheffe test).
ミトコンドリア経路のアポトーシス関連因子である PGC-1α および TFAM は，Control 群に比較して，CO2 投与群で有意に増加したが，CO2 投与群と併用群の間には有意な差はなかった（図 4A）．また VEGF，MMP2，MMP9 については，Control 群に比較して，他の 3 群では低下する傾向にあったが有意な差はなかった（図 4B）．

図 4． in vivo における PGC-1α，TFAM，VEGF，MMP2，MMP9 の変化．
A) in vivo における PGC-1α および TFAM の変化．Control 群に比較して，CO2 投与群で有意に増加したが，CO2 投与群と併用群の間には有意な差はなかった (Kruskal Wallis test & Scheffe test)．B) in vivo におけるVEGF，MMP2，MMP9 の変化．Control 群に比較して，他の３群では低下する傾向にあったが有意な差はなかった (Kruskal Wallis test & Scheffe test)．

考察

抗癌剤投与による抗悪性腫瘍効果には，ROS が関与することが示されている 1) ．しかし，癌組織では酸素供給が不十分であり，低酸素状態では腫瘍の悪性化が増し，ROS の発生も不十分であることが知られている．一方，近年われわれは，局所的炭酸ガス投与装置を開発し，癌組織に応用することで，癌組織内の低酸素環境を改善し，細胞内ミトコンドリア量の増加によるミトコンドリア経路のアポトーシスを活性化することにより，抗腫瘍効果を証明した 3) ．しかし，扁平上皮癌に対する主要な抗癌剤である CDDP との併用効果や，炭酸ガス投与による局所の低酸素環境改善と4

ROS の関係については不明であった． 本研究結果から，明らかな併用効果は確認できなかったものの，局所的炭酸ガス投与が，既存の CDDP に替わる新規治療法となりえる可能性が示唆された．この技術を応用することで，CDDP 投与量の低下につながれば，患者にとって大きな福音をもたらす．また副作用の軽減という腫瘍の治療において，非常に大きなインパクトを与えることが予測される．
局所的炭酸ガス投与はすでにわれわれが報告しているように PGC-1α，TFAM を介したミトコンドリア経路のアポトーシスの活性化による抗腫瘍効果が主であるのに対して，CDDP は既知のとおり DNA 複製阻害を含めた細胞毒性作用が主である．本研究においては，この 2 つの治療法が抗腫瘍効果を発揮する経路が違うことが，局所的炭酸ガス投与と CDDP の明らかな併用効果が確認できなかった理由として考えられる．しかし，有意な差はなかったものの，in vivoの実験での腫瘍体積や VEGF，MMP2，MMP9 は CO2･CDDP 併用群で減少傾向であり，今後投与方法や投与期間などを再考し，併用効果をさらに検討していきたい．また，CDDP 投与による ROS 産生量の FACS での解析結果はばらつきが大きく，明らかな傾向を確認できなかったが，蛍光免疫染色では ROS 産生量の増加を確認できており，今後，別の測定方法をさらに検討していきたい．

共同研究者
本研究の共同研究者は，神戸大学医学部附属病院歯科口腔外科の武田大介医員である．本研究の指導者は，神戸大学大学院医学研究科外科系講座口腔外科学分野の古森孝英教授である．

文献1） Casares, C., Ramírez-Camacho, R., Trinidad, A., Roldán, A., Jorge, E. & García-Berrocal, J. R. : Reactive
oxygen species in apoptosis induced by cisplatin: review of physiopathological mechanisms in animalmodels. Eur. Arch. Otorhinolaryngol., 269 : 2455-2459, 2012.
2） Oe, K., Ueha, T., Sakai, Y., Niikura, T., Lee, S. Y., Koh, A., Hasegawa, T., Tanaka, M., Miwa, M. & Kurosaka,
M. : The effect of transcutaneous application of carbon dioxide (CO2) on skeletal muscle. Biochem. Biophys.
Res. Commun., 407 : 148-152, 2011.
3） Takeda, D., Hasegawa, T., Ueha, T., Imai, Y., Sakakibara, A., Minoda, M., Kawamoto, T., Minamikawa, T.,
Shibuya, Y., Akisue, T., Sakai, Y., Kurosaka, M. & Komori, T. : Transcutaneous carbon dioxide induces
mitochondrial apoptosis and suppresses metastasis of oral squamous cell carcinoma in vivo. PLoS One. 9 :e100530, 2014.

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