交換型マイクロ流路チップ・セルソーターを中心としたアプリケーション集
マイクロ流路チップを採用したフローサイトメーターを中心に、エマルジョンの封入やシングルセル分注を組み合わせることで、従来のフローサイトメーターでは実現できなかったアプリケーションをご紹介いたします。

On-chip Sort
交換型マイクロ流路チップ・セルソーター

On-chip Droplet Generator
細胞/細菌や遺伝子のシングル封入されたエマルジョンを大量作製

On-chip SPiS
簡単・確実にシングルセルをウェルプレートに分注（ハイブリドーマ、ゲノム編集細胞など）※製造元：株式会社 オンチップ・バイオテクノロジーズ

アプリケーション■ダメージフリー セルソーティング
培養・形態変化の評価
遺伝子変化の評価■大型細胞の分離
スフェロイド原生生物

Application Reports of On-chip■レアセル ソーティング
Circulating tumor cells
ネガティブソーティング■シングルセル培養
ゲノム編集細胞の選抜■微生物叢からの分離
大腸菌（エマルジョン・ハイドロゲルボール）
テトラヒメナ（エマルジョン）
土壌微生物（エマルジョン）

01

ダメージフリー
培養・形態変化の評価■ ラット胎児の脳海馬より回収した神経細胞による比較

胎児ラット海馬から細胞を調整し、ソーティング無し、従来のセル・ソーターで分取したもの、On-chip Sortを用いて分取し、7日間培養を行った。

■ HeLa細胞と抹消血好酸球による比較

ソーティング後のHeLa細胞の増殖曲線。
横軸は播種後の日数、縦軸は細胞数。写真は3日目に撮影したもの

末梢血好酸球のソーティング後サイトスピンで標本化したときの形態。左がOn-chip Sort後、右が従来のソーティング後

On-chip Sortを用いてソーティングした細胞は、各細胞特有の形態を保っており、細胞増殖に及ぼす影響を最小限にして分取可能であった。

Application Reports of On-chip02

ダメージフリー
遺伝子変化の評価■ Caco-2細胞とHeLa細胞による評価
On-chip Sort

Conventional Sorter

0.25%

変化のない遺伝子の割合

1.24%

1.23%

5.86%

（図左・中）赤・緑の点はコントロール（ソート無し）のものと比較して大きく遺伝子発現量が変化したものを表す（数字は全データに対する割合）。
（図右）各プロパティ(apoptosis, cell adhesion, cell cycle, etc)で分類されている生データをすべて統合したデータのうち、発現量の変化（ソートした細胞のシグナル強度/ソートしていない細胞のシグナル強度）をヒストグラ

Apoptosis

アポトーシスConventional Sorter

On-chip Sort

Conventional Sorter

On-chip Sort

Conventional Sorter

On-chip Sort

Conventional Sorter

On-chip Sort

ムとして、HeLa、Caco-2でプロットした結果。

reactive_oxygen
活性酸素

Proliferation
細胞増殖

Cell cycle
細胞周期

Transcription factor
転写因子

Oxidative stress
酸化ストレス

主に差が認められる分類ごとの解析。
左がソーティングなしと比較したOn-chip Sort。右がソーティングなしと比較したConventional Sorter。黒が差がなし。緑が低下。赤が上昇。

遺伝子発現パターンから、細胞増殖、細胞周期、アポトーシスでの変化は見られており、増殖曲線が異なる現象を補足するデータであった。
また、転写因子にも影響を与えていることから、ソーティング後の2次解析の解釈にも影響する可能性が示唆された。
On-chip Sortによるソーティングは、細胞の遺伝子発現に与える影響が少ないことが示唆された。
マイクロアレイ解析協力：株式会社セルイノベーター受託研究部

Application Reports of On-chip

安田様、萩原様、九州大学

田代康介先生03

大型細胞の分離
スフェロイド■ 癌幹細胞スフェロイド・ソーティング後の薬剤感受性試験
不均一なスフェロイド

Before均一なサイズで高精度な薬効評価

After Sorting

Single cell dispence

150µm

On-chip Sortの150 µm流路ソーティングチップにより一定サイズのスフェロイドをソーティングし、On-chip SPiSによりスフェロイドをひとつずつ分注することで精度の高い薬剤スクリーニングが可能であった。

Collaboration with Mitchel Cancer Institute, USA

原生生物■ シロアリ体内に生息する腸内原生生物のソーティング
Sample : イエシロアリの腸内原生生物※1

After Sorting※3Before※2

シロアリ腸内に寄生する原生生物は、通常のセルソーターではサイズが大きすぎることや、浸透圧によって破裂してしまうことで分取が困難である。

On-chip Sortの150 µm流路ソーティングチップおよび適切なシース液を用いることで原生生物をソーティングすることが可能であった。

※1
※2、3

Application Reports of On-chip

wikipediaより検索ワード「シロアリ」参照
理化学研究所 雪先生より 画像提供
04

レアセル ソーティング
Circulating tumor cells■ サンプル数個／mL中のレアセルを濃縮●CTC
100,000,000個 10個●白血球Sort

回収

廃棄

1回目ソーティング後
処理時間：18min●白血球100,000個

回収●CTC9個

●CTC●白血球8個1,000個SortSort

廃棄

廃棄

2回目ソーティング後
処理時間：15min全量繰り返しソーティングで純度が向上（3回 48分）

3回目ソーティング後
処理時間：15min●白血球 数個●CTC 7-8個

ダメージフリーのソーティングを繰り返すことによりCirculating tumor cellsなどの超レア細胞の解析分離が可能であった。

ネガティブソーティング■ iPS未分化細胞の除去
浮遊系培養細胞 10^8個に対して、iPS細胞 10^4個のスパイク試験→廃液に対して4回の繰り返しソーティングにより、残存iPS細胞は0個となった。

サンプル
濃度：>10^8個ml

処理後

蛍光信号強度FL3

処理前

蛍光信号強度FL2

繰り返し処理による細胞数の変化

ネガティブソーティングを繰り返すことにより、存在比率が低い細胞の除去に対して有効であった。
京都大学ウイルス再生研と共同研究成果(NEDO)

Application Reports of On-chip05

シングルセル培養
ゲノム編集細胞の選抜■ 薬剤セレクションが不要となるノックアウト細胞株樹立
CRISPR/Cas Systemを用いてトラスフェクションした細胞をOn-chip SPiSにて分注した。

Transfection
細胞培養

72hr
・ crRNA + tracrRNA・ Cas9発現HEK293

生着した細胞Complex

増殖後細胞株（2weeks）

Plate N0.
Plate N0.
Plate N0.
Plate N0.
Total

撒いた 生着した
ウェル数 ウェル数

2週間後に十分に増殖したウェル数

151218226734.9％

76962814.6％

48484848192

割合（％）

2 週 間 後 細 胞 が 十 分 に 増 殖したウェル の み
ddPCR (droplet digital PCR)で目的物のノックアウトを確認した。28ウェル中3ウェルでノックアウトを確認した。
本確認方法では目的配列プローブを使用してddPCRをかけて増加してこないものをノックアウトしたと判断している。
下の緑のドットが Reference ( BCHDKA )、上の青のドットがターゲットのプローブを使用したときの結果である。

トランスフェクション後に薬剤セレクション不要でノックアウト細胞株を樹立できることがわかった。
しかし生着および増殖してくるウェル数が減少することから、シングルセル培養のような少数細胞培養からの細胞増殖は培養条件の最適化が課題としてあることもわかった。
国内のお客様による実験事例

Application Reports of On-chip

06

微生物叢からの分離■ 微生物叢サンプルを用いた、エマルジョン封入から単離まで実施

1. 細菌のエマルジョンへの封入

細菌を希釈

On-chip Droplet Generator

増殖した細菌の検出とエマルジョンのソーティング

2. エマルジョン中の細菌培養とソーティング

On-chip Sort

3. 細菌封入エマルジョンの一個分注

増殖した細菌の検出とエマルジョンのソーティング

エマルジョン内での培養

ソーティング後の細菌封入したエマルジョンを1 個ずつマルチウエルプレートに分注

On-chip SPiS■ GFP発現大腸菌の封入と培養（ミネラルオイル）

封入直後

0hour

20hour■ ハイドロゲルボール（大腸菌）

試薬
E.Coli expressing GFP in PBS +Km(approx. 1 cell in 1 droplet)
大腸菌濃度は 1x106 個 /ml に調整
Mineral oil; Span80 4.5%,
Triton X-100 0.4%
Droplet Generator;
sample/7.3kPa, sheath/9.5kPa→ about 40µM

※1
■ テトラヒメナの封入と培養（フッ素系オイル）

封入直後

0day

3day

試薬
Tetrahymena in AB + penicillin(approximately 1 cell in 1 droplet)
原生生物濃度は 1x105/mL に調整
Pico-Surf(tm) 1 (2% (w/w) in Novec(tm) 7500)
Droplet Generator; sample/7.0kPa,sheath/11.0kPa → about 120µM

エマルジョンに微生物を封入することで単離・培養が可能であった。
ハイドロゲルボールとすることで外部から培地や物質を取り込むことも可能と思われる。
※１：サンプル提供：筑波大学

Application Reports of On-chip

中野先生
07

微生物叢からの分離■ 土壌微生物のエマルジョン培養コレクション

2018年度戦略的イノベーション創造プログラム スマートバイオ産業・農業基盤技術の成果
長岡技術科学大学

小笠原 渉教授

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