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THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

62—_5Oct. 2009

DBA/2 系マウスの Legionella pneumophila 肺炎モデルにおける Levoﬂoxacin の治療効果
樫本佳典 1)・黒坂勇一 1)・苅部幸江 1)・魚山里織 1)・
藤川香津子 1)・難波憲司 2)・大谷1)2)剛 1)・山口惠三 3)

第一三共株式会社生物医学第四研究所

Daiichi Sankyo Pharma Development, USA3)

東邦大学医学部微生物・感染症学講座（2009 年 6 月 30 日受付）

ニューキノロン系抗菌薬 Levoﬂoxacin (LVFX) の Legionella pneumophila 肺炎の治療における有用性を基礎的に検討するため，L. pneumophila に対する in vitro ならびに in vivo
抗菌活性を評価した。
本 邦 で 臨 床 か ら 分 離 さ れ た L. pneumophila（ 42 株 ） に 対 す る LVFX の MIC90 は0.03 m g/ml であり， Ciproﬂoxacin および Pazuﬂoxacin と同等で， Telithromycin およびMinocycline よりも高活性であった。
DBA/2 系マウスに L. pneumophila suzuki 株（血清型 1）を点鼻接種し，LVFX を感染翌日から 7 日間経口投与した。LVFX の投与量は，500 mg⫻1/日を経口投与時のヒト血中濃度時間曲線下面積 (AUC) がマウス血清中で達成可能と予測される用量とした。その結果， LVFX は投与翌日から肺内菌数を有意に減少させ，感染 8 日目以降には除菌に至る治療効果を示した。
以上の成績は，Legionella 肺炎の治療における LVFX 500 mg⫻1/日経口投与の有用性を示唆するものと考えられた。

Legionella 属菌は本来土壌菌であり，自然環境施設において 295 人が発症し 7 名が死亡する本邦に広く分布するグラム陰性桿菌である。クーリン

最大の集団感染事例も報告されている 4)。多くのグタワーや循環式温泉などの人工的水利用設備か場合，Legionella 肺炎の起因菌は Legionella pneu-らの分離も多く，エアロゾルを介して感受性宿主

mophila であり，本邦においてはその約 43% が L.

が菌を吸入した場合，肺炎やポンティアック熱をpneumophila 血清型 1 に，その他の血清型を含め発症する。欧米に比較し本邦では Legionella 属菌

ると約 70% が L. pneumophila に起因すると報告さを起因菌とする感染症の発生報告は少ないものれている 5)。の，数年来増加傾向を示し，欧米の発生率に近づ

通性細胞内寄生性である Legionella 属菌によるきつつある。また，散発的な発生事例は例年報告

感染症では，細胞外のみならず食細胞内で増殖すされており 1⬃3)，2002 年には宮崎県の循環式温浴る菌に対しても活性を示す薬剤が必要となる。そOct. 2009

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62—65453 (59)のため，細胞内移行性が良好で，Legionella 属菌を供試した。このうち，L. pneumophila suzuki 株

に対して高い抗菌活性を有するニューキノロン系血清型 1（東邦大学医学部 微生物・感染症学講座やマクロライド系抗菌薬が治療薬として推奨され由来）をマウス肺炎モデルに用いた。

6)ている 。特に，ニューキノロン系抗菌薬の Lev-oﬂoxacin (LVFX) は， Legionella 肺炎に対する高3．薬剤感受性試験

い治療効果が多数報告されている 7⬃9)。それらの最小発育阻止濃度 (MIC) の測定は， Buffered

多くは LVFX 注射剤による治療効果の報告である

starch yeast extract (BSYE) 寒 天 培 地 を 用 い たが，本邦での適応承認は，現在は経口剤のみであSAWATARI らの報告 11) に準じて実施した。すなわる。近年，尿中抗原検出キットなどの迅速診断技

ち ， 菌 株 を Buffered-charcoal yeast extract alpha術の普及により Legionella 肺炎も軽症段階での早(B-CYEa ) 寒天培地（栄研化学）に接種し，37°C期発見が可能となったことから

10)，経口抗菌薬も5% 炭酸ガス濃度条件下で 72 時間培養した後，生6)

理食塩液にて懸濁・希釈し，約 104 CFU/spot の割治療オプションの一つと考えられている 。
今回， LVFX 経口剤の Legionella 肺炎の治療に合で薬剤含有 BSYE 寒天培地に接種した。同条件おける有用性を基礎的に検討することを目的とし下で 96 時間培養後，菌の増殖を阻止した最小のて，本邦で分離された臨床由来の L. pneumophila

薬剤濃度を MIC とした。

に対する LVFX の in vitro 抗菌活性を Legionella 属菌に対して適応を有する既存の抗菌薬と比較する

4．マウス肺炎モデル

とともに，L. pneumophila によるマウス肺炎モデ

動物は DBA/2 系マウス（日本チャールス・リルを用いて，LVFX のヒト血中パラメータ値をマバー），雌性， 7 週齢を用いた。動物の取り扱い

ウス血中でシミュレートした時の治療効果を検討

は，第一三共株式会社「動物実験に関する細則」

した。に準拠して実施した。
接種菌液は，TATEDA ら 12) の方法に準じて調製し材料および方法た。すなわち，保存菌液を Buffered charcoal yeast

extract (BCYE) 寒天培地（日本ベクトン・ディッ1．供試薬剤キンソン）に塗布して 37°C で 3 日間培養し，発Levoﬂoxacin (LVFX), Ciproﬂoxacin (CPFX),

育 し た コ ロ ニ ー を Buffered yeast extract broth

Pazuﬂoxacin (PZFX) および Telithromycin (TEL)(BYEB) に接種した。これを，37°C 5% 炭酸ガスは第一三共株式会社にて合成あるいは製剤から抽濃度条件下で 20 時間振盪培養後，BYEB で 25 倍出し， Minocycline (MINO) はシグマアルドリッに希釈し，同条件下でさらに 18 時間振盪培養しチジャパン株式会社から入手して供試した。いずた。この培養液を 2.5⫻107 CFU/ml となるようにれの薬剤もフリー体換算して使用した。

生理食塩液で希釈して接種菌液とした。この菌液を，ペントバルビタール（ソムノペンチル，共立2．供試菌株商事）の腹腔内投与 (72 mg/kg) により麻酔したマ

薬剤感受性試験には， 1994⬃2003 年に本邦でウスに，40 m L/マウスの割合で点鼻接種した。

臨床分離された Legionella pneumophila 42 株（41株は東邦大学医学部 微生物・感染症学講座由来，5．体内動態

1 株は株式会社ビー・エム・エルより分与された）

DBA/2 系マウス (n⫽4) に， LVFX を 20， 60 お

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よび 100 mg/kg を経口投与し，投与 0.25，0.5，1，62—_5Oct. 2009

液を作製し，これを原液として PB にて適宜希釈

2 ， 4 ， 6 および 8 時間後の血清中薬剤濃度を， し，BCYE 寒天培地に接種して 37°C で 3⬃7 日間
Bacillus subtilis ATCC6633 株を検定菌としたバイ培養した。培養後 BCYE 寒天培地上に発育したコオアッセイ法を用いて測定した。各投与量におけロニー数を計測し，希釈倍率および肺重量を基にるマウス血清中濃度の平均値および標準偏差を算

肺あたりの菌数を算出した。肺内菌数の検出限界

出し，薬物動態解析ソフト SAG-CP（アスメディ

値 は 12⬃14 CFU/Lung (1.08⬃1.15 Log CFU/カ）を用いて台形法および最小二乗法により，体Lung) であった。

内動態パラメータを算出した。

8．統計解析
肺内菌数は各時点毎に，感染対照群と LVFX 投

6．マウス投与量の設定
LVFX の治療効果は血中濃度時間曲線下面積(AUC) に依存すると考えられている

6,13,)

与群の，比較する 2 群で F-検定を実施し，その結。本試験

果が等分散のときは Student の t 検定を，非等分散では薬剤投与後のマウス血清中濃度から算出されのときは Aspin-Welch の t 検定を実施した。検定た体内動態パラメータを基に，LVFX をヒトに 500の有意水準は両側 5% とした。

14)

mg⫻1/日で経口投与した時の AUC と同等の値をマウス血清中で達成が可能と予測される用量を成績推定した。

1．薬剤感受性7．マウス肺炎モデルにおける薬効試験

本邦で臨床分離された L. pneumophila 42 株に

マウス肺感染モデルに， 0.5% Carboxymethyl

対する LVFX の MIC50 および MIC90 はそれぞれcellulose (CMC) に懸濁した LVFX を感染翌日か0.015 および 0.03 m g/ml であり，0.03 m g/ml で全て

ら 1 日 2 回連続 7 日間経口投与した。投与用量はの供試菌株の発育を抑制した。この活性は，上記 6 で設定した用量を用いた。 対照群には，

CPFX および PZFX とほぼ同等であり，TEL およ

0.5%CMC を薬剤投与群と同様に経口投与した。 び MINO よりも高活性であった（表 1）。
感染 1，2，4，8 および 12 日後の肺を無菌的に採薬剤感受性試験に供試した菌株中，in vivo 試験

取し (n⫽5)，このうち副葉に関してはヘマトキシに 供 試 し た L. pneumophila suzuki 株 に 対 す る

リン・エオジン染色標本を作製して病理組織学的LVFX の MIC は 0.015 m g/ml であった。に観察した。その他の肺葉に関しては， 0.033%
リン酸緩衝液 (PB, pH 7.0) を加えてホモジネート
表 1．Legionella pneumophila （42 株）に対する抗菌活性Oct. 2009

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表 2．LVFX 単回経口投与時の体内動態パラメータ

表 3．LVFX の体内動態パラメータを基に設定したマウス投与量2．マウス投与量の設定化を伴う間質性肺炎の像を呈し，その程度は同 4

LVFX をマウスに経口単回投与後，経時的に測日後で最も重度となった。その後病態は徐々に軽定した血清中薬剤濃度から算出した体内動態パラ減するものの同 12 日後においても肺炎は中等度

メータを表 2 に示した。この体内動態パラメータ。これに対し LVFX 投に認められた（図 2，3AB）を基に， LVFX（ 500 mg⫻1/日）を経口投与した

与群では，感染 2 日後に中等度の肺炎像を呈する時のヒト血中 AUC と同等の値をマウス血清中でものの，感染対照群で最も重度となる感染 4 日後再現させる用量を算出し表 3 に示した。すなわち，で既に肺炎は軽度で，肺胞構造もほぼ正常に近い

LVFX の投与量は 80 mg/kg⫻2/日と設定した。

，同 8 日目以降さらに回復像を呈し（図 2，3CD）傾向を示した。

3．マウス肺炎モデルにおける治療効果
DBA/2 系マウスに約 106 CFU の L. pneumophila

考察を点鼻接種した感染対照群の肺内菌数は，感染 4日後まで 106 CFU/Lung レベルで維持し，以後緩Legionella 肺炎は，死亡率の高さから重篤市中やかに減少するものの，感染 8⬃12 日後において肺炎として位置付けられており，適切な抗菌化学も肺あたり 10 ⬃10 CFU のレベルで推移した。

療法が施されなかった場合には，その死亡率はLVFX 投与群の肺内菌数を対照群のそれと比較す10% から 27% へ増悪すると報告されている 15)。そると，感染 2 日後で 1/10 以下， 4 日後で 1/102 以のため，Legionella 肺炎の治療には，確実に薬効543

下， 8 および 12 日後で 1/10 以下に有意に減少しを示す抗菌薬で早期に治療する必要があり，日本(P⬍0.001)，感染 8 日後では 3/5 例で，同 12 日後

呼吸器学会

では 4/5 例で除菌した。

は，キノロン系抗菌薬やマクロライド系抗菌薬が成人市中肺炎診療ガイドライン で感染対照群の肺組織では，感染翌日から肺胞壁推奨されている 6)。本研究においても，臨床分離への好中球を主体とする炎症細胞浸潤，同 2 日後の L. pneumophila に対してキノロン系抗菌薬のから肺胞壁の肥厚，さらに同 4 日後からはマクロLVFX，CPFX および PZFX の MIC90 は 0.03 mg/ml

ファージの浸潤が顕著となるとともに，水腫性変であり，キノロン系抗菌薬が本邦における臨床分456 (62)

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図 1．L. pneumophila 肺炎モデルにおける LVFX の治療効果（肺内菌数）

DBA/2 系マウスを用いた L. pneumophila 肺炎モデルに，LVFX（80 mg/kg⫻2/日）を感染翌日から連続 7 日間経口投与した (n⫽5)。対照群 (Cont) には，調製基材 (0.5%CMC) を薬剤投与群と同様に経口投与した。感染翌日 (Onset) および 2，4，8，12 日後の肺内菌数を測定し，平均値および標準誤差で表した。
***: P⬍0.001。

図 2．L. pneumophila 肺炎モデルにおける LVFX の治療効果（病理所見）

各所見について，軽度を 1，中等度を 2，重度を 3 とし，当該グレードの例数との積を合計し所見のスコアとした。各スコアを時点ごとに累積表示した。
C ：対照群，LV ： LVFX 投与群。

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図 3．L. pneumophila 感染 4 日後の DBA/2NCrj マウス肺の光顕像（HE 染色）

A ：対照群の肺低倍像，B ： A 䊐 部分の高倍像，C ： LVFX 投与群の肺低倍像，D ： C 䊐 部分の高倍像

離菌に対して良好な抗菌活性を保持していること

薬効発現には AUC が関与することが知られていが確認された。

ることから 13)，2009 年 4 月に本邦において新たにLegionella 属菌は通性細胞内寄生菌であり， b -承認された LVFX の新用量・用法である 500 mg⫻

ラクタム系抗菌薬などの細胞内移行性の低い薬剤

1/日を経口投与した時にヒト血中で達成される

では，in vitro で認められる抗菌活性を食細胞内にAUC をマウス血清中で再現させる用量を用いて，寄生している菌に対しては発現することが出来な

Legionella 肺炎モデルにおける治療効果を検討し

16)。このことから，非臨床における抗菌薬のた。その結果，LVFX を投与したマウスにおいて，Legionella 属菌に対する有効性研究では，実験感治療開始翌日から対照群に比較し有意な肺内菌数染動物の重要性は高いと考えられる。の減少が確認された。この早期の治療効果は病理い

本研究では DBA/2 系マウスの L. pneumophila 肺学的にはより顕著であり，病態の進展を感染 4 日炎モデルを供試した。本感染モデルは，A/J 系マ後から阻止することが示され，治療の有用性を示

ウスの感染モデルに比較し感染初期の急激な肺内唆するものと考えられた。

12,17)，より長期に感LVFX は世界的に広く用いられ，多くの国で注染 14 日後まで肺あたり 10 ⬃10 CFU 程度の菌数

射剤と経口剤の両剤型が用いられており，LVFXで推移する遷延型の間質性肺炎病態を呈することによる Legionella 肺炎の治療では，注射剤を用いが報告されている 18)。薬力学的に，キノロン薬のた治療が一般的である。臨床では，LVFX 注射剤

菌数の増加は認められないが
45458 (64)

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はマクロライド系抗菌薬に比較して速やかに薬62—_5Oct. 2009

125: 2135⬃2139, 2004
8)
MYKIETIUK, A.; J. CARRATALÀ , N. FERNÁNDEZ効を発現し早期退院に寄与することが知られていSABÉ , et al.: Clinical outcomes for hospitalる 8,9)。本邦で承認されているのは経口剤のみであized patients with Legionella pneumonia inるが，LVFX 500 mg の静脈内点滴投与時の血漿中
the antigenuria era: the inﬂuence of levoAUC が 48.3 m g · h/ml であるのに対し，経口投与時
ﬂoxacin therapy. Clin. Infect. Dis. 40:14)
794⬃799, 2005のそれは 47.9 m g · h/ml と両投与経路間の血中暴
9) BL Á Z QUEZ GARRIDO, R. M.; F. J. ESPINOSA
露量がほぼ同等であることから，経口投与によっPARRA, L. ALEMANY FRANCÉS, et al.: Antimiても薬効が期待出来るものと推察される。事実，
crobial chemotherapy for Legionnaires dis日本呼吸器学会 成人市中肺炎診療ガイドライン 6)
ease: levoﬂoxacin versus macrolides. Clin.
では，軽症患者に対してはキノロン系やマクロラ
Infect. Dis. 40: 800⬃806, 2005
イド系経口抗菌薬による治療も有効とされており， 10) BENIN, A. L.; R. F. BENSON & R. E. BESSER:
Trends in legionnaires disease, 1980-1998:
Legionella 尿中抗原検出キットなどの迅速診断のdeclining mortality and new patterns of diag普及により感染初期の軽症例の発見が可能である
nosis. Clin. Infect. Dis. 35: 1039⬃1046,
ことから，経口剤による外来治療も重要な治療オ
200211)SAWATARI, K.; N. ITOH, M. NAGASAWA, et al.:プションとして期待される。今回の成績は， LeNew susceptibility testing medium (B-SYE
gionella 肺炎の治療における LVFX 500 mg⫻1/日agar) for Legionella and Legionella-like or経口投与の有用性を示唆するものと考えられた。
ganisms. Chemother. 32: 718⬃723, 1984
12) TATEDA, K.; T. A. MOORE, M. W. NEWSTEAD,
引用文献
et al.: Chemokine-dependent neutrophil re1) 酒井英明，赤井畑美津子，新妻一直，他：乳cruitment in a murine model of Legionella
児院におけるレジオネラ症の集団発生例。感pneumonia: potential role of neutrophils as
染症学雑誌 78: 404⬃410, 2004
immunoregulatory cells. Infect. Immun. 69:2) 中村博幸，柳生久永，岸 厚次，他：レジオ
2017⬃2124, 2001
ネラ肺炎の集団発生事例と臨床症例 1) 集団
13) CRAIG, W. A.: Pharmacokinetic/pharmacody発生事例 (1) 石岡市の事例。化学療法の領域
namic parameters: rationale for antibacterial20: 588⬃591, 2004
dosing of mice and men. Clin. Infect. Dis.
3) 中村博幸, 柳生久永, 岸 厚次, 他：レジオネ
26: 1⬃12, 1998
ラ肺炎の集団発生事例と臨床症例 1) 集団発
14) Package insert of Levaquin, Ortho-McNeil
生事例 (2) 静岡県掛川市の温泉レジャー施設
Pharmaceutical, Inc. 2004の事例。化学療法の領域 20: 592⬃596, 2004
15) FALCO, V.; T. FERNANDEZ de SEVILLA, J. ALE4) 藪内英子，縣 邦雄：日向市の新設温泉施設
GRE, et al.: Legionella pneumophila. A causeを感染源とするレジオネラ症集団発生。感染of severe community-acquired pneumonia.
症学雑誌 78: 90⬃98, 2004
Chest. 100: 1007⬃1011, 1991
5) 布施（都築）閲，舘田一博，山口惠三：尿中 16) HIGA, F.; N. ARAKAKI, M. TATEYAMA, et al.: In
抗原診断：臨床に与えるインパクト。臨床とvitro and in vivo activity of olamuﬂoxacin
微生物 32: 335⬃340, 2005
(HSR-903) against Legionella spp. J. Antimi6) 成人市中肺炎診療ガイドライン, 日本呼吸器crob. Chemother. 52: 920⬃924, 2003
学会, 2005
17) BRIELAND, J.; P. FREEMAN, R. KUNKEL, et al.:7) YU, V. L.; R. N. GREENBERG, N. ZADEIKIS,
Replicative Legionella pneumophila lung inet al.: Levoﬂoxacin efﬁcacy in the treatment
fection in intratracheally inoculated A/Jof community-acquired legionellosis. Chest.
mice. A murine model of human Legion-Oct. 2009

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

naires’ disease. Am. J. Pathol. 145: 1537⬃
1546, 199418) 樫本佳典， 黒坂勇一， 苅部幸江， 他： Le-62—65

459 (65)

gionella pneumophila による DBA/2 系マウス
肺 炎 モ デ ル 。 Jpn. J. Antibiotics 62: 445⬃
451, 2009

Therapeutic efﬁcacy of levoﬂoxacin against a model of replicable
Legionella pneumophila lung infection in DBA/2 mice
YOSHINORI KASHIMOTO1), YUICHI KUROSAKA1), YUKIE KARIBE1),
SAORI UOYAMA1), KATSUKO FUJIKAWA1), KENJI NAMBA2), TSUYOSHI OTANI1)
and KEIZO YAMAGUCHI3)
1)

Daiichi Sankyo Co. Ltd., Biological Research Laboratories IV
2)
Daiichi Sankyo Pharma Development, USA
3)
Depertment of Microbiology and Infectious Disease,Toho University School of Medicine

The in vitro and in vivo antibacterial activities of levoﬂoxacin (LVFX), a quinolone antibacterial,
against clinically isolated Legionella pneumophila were investigated in comparison with those of existing
antimicrobial agents approved for legionnaires disease.
The minimum inhibitory concentrations (MICs) of the agents against 42 strains of L. pneumophila
isolated in Japan were determined using agar dilution methods with buffered starch yeast extract agar.
MIC90 of LVFX was 0.03 m g/ml and this activity was similar to ciproﬂoxacin and pazuﬂoxacin, andhigher than telithromycin and minocycline.
Therapeutic efﬁcacy of LVFX was studied against a pneumonia model induced by intranasal of L.
pneumophila strain suzuki serogoup 1 in DBA/2 mice. Therapeutic doses in mice were selected thatwould closely match human exposure proﬁle, area under the concentration-time curve (AUC) for ahuman oral dose of LVFX at 500 mg once a day. LVFX decreased signiﬁcantly the bacterial burden in thelungs from the next day of commencing treatment.
These results, including in vitro antibacterial activity against clinical isolates and therapeutic efﬁcacy of a humanized dosing regimen, provide good evidence to support the use of LVFX at 500 mg oncea day for treating patient with legionnaires disease.