THECHEMICAL
TIMES
2022 No.4（通巻266号）
ISSN 0285-2446

細胞アッセイ

02 ヒト皮膚三次元モデル作製の留意点と展望
近畿大学 薬学総合研究所 先端バイオ医薬研究室 准教授（PI） 森山 博由
近畿大学 薬学総合研究所 アンチエイジングセンター 客員准教授 森山 麻里子

09

コラーゲンビトリゲル®を用いた新規肝細胞培養系における薬物動態研究
エーザイ株式会社 ＤＨＢＬ メディスン開発
バイオファーマシューティカル・アセスメント機能ユニット
グローバル薬物動態研究部 マネージャー 渡 隆爾

15 ヒト肺モデル：肺特有の構造・機能をin vitroで再現する
HiLung株式会社 代表取締役

20

山本 佑樹

血管網との共培養に着目した
Microphysiological systems (MPS)の開発
京都大学大学院 工学系研究科マイクロエンジニアリング専攻 教授

26

横川 隆司

新規in vitro細胞アッセイとしてのMicrophysiological Systems（生体模倣システム）- MPSの開発を色々な面から眺めてみる
崇城大学大学院 工学研究科 応用生命科学専攻 教授

石田 誠一

ヒト皮膚三次元モデル作製の留意点と展望Key notes and prospects for the methodology
of preparing on three-dimensional models of human skin

森 山 博由近畿大学 薬学総合研究所 先端バイオ医薬研究室 准教授（PI）

森 山 麻里子

近畿大学 薬学総合研究所 アンチエイジングセンター 客員准教授

Hiroyuki MORIYAMAMariko MORIYAMA

評価モデル

Pharmaceutical Research and Technology Institute,
Laboratory of Advanced Biomedicinal Products, KINDAI UNIVERSITY (Associate Professor (Principal Investigator))Pharmaceutical Research and Technology Institute,
Anti-aging center, KINDAI UNIVERSITY (Visiting Associate Professor)

皮膚構成細胞

はじめに

間葉系幹細胞01

皮膚組織

ヒト三次元構成皮膚組織

野（ヘルスケア産業製品化）、ナノ粒子等の先端分析評価のための材料工学としての人工皮膚、次世代型アンドロイドなどの人工
皮膚、生体センサーとしてのセンシング皮膚の開発（先端工学科

本稿では、ヒト皮膚の構造とヒト皮膚科学研究の現状を概説し、学応用化）など、皮膚の恒常性を解明する科学的成果が多分にそれらの知見からヒト皮膚三次元モデルを構築する際に重要な寄与している派生分野をあげれば枚挙に暇がない。さらに近年

3要素を提案する。筆者がどのようにしてそれら3要素を選択しヒ

では、内閣府より提唱されている我が国が目指す未来社会像たト皮膚評価モデルを構築したか、科学的知見の礎となった論文

るSociety 5.0という社会モデル（https://www8.cao.go.jp/

を踏まえ解説する。また現在研究中である新規ヒト皮膚三次元

cstp/society5_0/）が唱道されている。それはサイバー空間

モデルの内容を紹介しつつ、
ヒト皮膚科学の基礎・応用研究の展（仮想空間）とフィジカル空間（現実空間）
を高度に融合させたシ

望について述べる。

ステムにより、経済発展と社会的課題の解決を両立する、人間中
心の理想空間社会である。このSociety 5.0の未来社会では、時間や空間の隔たりを埋めるために、高精度かつ評価・診断に必須

02

なバイオモデルも重要なキーツールとして位置づけられている。

皮膚は基底層から角質層へと常にターンオーバーを繰り返す

背景・期待に積極的に貢献すべきヒト皮膚科学研究の実状とい

表皮組織層と、それを支持している真皮層からなる最大の臓器

えば、細胞レベルや遺伝子組換えマウス動物モデルに依る研究である。さらに、皮膚に隣接した下部組織である脂肪組織およびが主体であり、
ヒト皮膚組織を用いる多様な研究との連携もしく

感覚器、機能的細胞種とも連携している。さらに、
ヒト皮膚は多は移行へと転じたいものの、進捗に乏しい状態が続いている。背様な細胞・器官と連携することで、
ヒト外表として物理的・生理学

景には、動物実験倫理等に準じる側面からも動物を用いた生体的機能を保っている。例えば、細菌やウイルスなどの侵入を防ぐ

実験が規制され続けていることも大きい。これは肝要な生命科

ランゲルハンス細胞などの免疫系の細胞、または有害な紫外線

学研究倫理であり無論に否定の余地はないが、皮膚科学研究の

ヒト皮膚の構造と科学研究の現状

つまり、ここでも先鋭的な人工的ヒト皮膚およびそれを用いた評価モデルの存在が重要視されている。
しかしながら、このようなへの防御能を有するメラノサイトなど、
これら機能的細胞との連推進には実質的な足かせとなっている側面もみせる。だがなによ

携は生体防御のフロントラインとして日々、皮膚の恒常性維持にり、適切な研究素材（使えるヒト人工皮膚）の開発状態が律速と貢献している（図1）。ゆえに、皮膚の生理学的な機能や体内側かなっていること、
これが問題の中心に位置し続けていることに目らの水分蒸散を防ぐなどといった物理学的な機能などの安定的を背けてはいけない。この潮流は、とりわけ産学の研究開発環境な維持・いわゆる恒常性の理解は、生命医科学分野において重の閉塞を醸し出す傾向まで生じている現状からも、決して看過で要な課題のひとつとなっている。実際、多くの病原体に対抗するきない。つまりは「機能的な研究開発基材としてのヒト皮膚三次皮膚感染防御能に関する創薬・臨床開発分野（生命医科学的実元評価モデルの不在」
こそが、
上述の諸問題の解決を阻む大きな用化）や、健常な皮膚から心身のQOL（Quality of Life;生活お壁なのである。そこでこの障壁を打破する一助たるべく、
ヒト皮膚よび人生の質）を高めるためのサプリメントや香粧品の開発分

三次元評価モデル作製の在り方や作製における留意点を整理し、

2

THE CHEMICAL TIMES
科学的な観点をベースとした述懐的考察と提言を進めたい。

織層や真皮組織層の構成要素について、必要条件を満たす最低限の項目を精査・選別することが有効である。つまり、
ヒト皮膚モデルを構築するうえで重要な3要素をどのように構成し、目的にあった評価系に資する研究素材としてヒト皮膚評価モデルに落とし込むかが鍵となる。

細胞の種類・ソースの選択

04

購入可能な初代細胞、および株化された細胞ソースとして、
ヒト表皮細胞 [human primary epidermal keratinocytes

図1 簡素化したヒト皮膚の基本構造(HPEK)]やヒト線維芽細胞 [human dermal fibroblasts(HNDF)]、またはヒト間葉系幹細胞（一般なヒト脂肪由来幹細評価系に適切な
ヒト皮膚評価モデルの構成要素

03胞）[adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells(hASCs)]などが存在する1, 2)。これは使用する細胞の選択性を拡げるうえでもたいへん有用である。我々の研究室では、ヒト皮膚に近い条件を必要とするデータ取得および評価が必須なため、

ヒト皮膚評価モデルを構築する際には、細胞の種類・ソース、細市販の初代細胞および、適切な倫理下において共同研究機関か胞の位置・配置、組織（層）
間の連絡という、少なくとも3点の要素ら供与いただいているヒト由来初代細胞の種々を目的に応じてが重要となる。これらの要素の選択を執り決める際には、必要十選択または複合して用いている。実際、これらの細胞種の特性に分にして最低限なことは何であるか、それらを意識しつつ、研究

ついては、その科学的な理解を深める興味深い知見が得られて従事者や評価者が求める内容を正確に反映するような要素を峻いる。

別する必要がある。そのための一助として、
ヒト皮膚組織を図1

筆者らはヒト真皮から正確に分取したHNDFとヒト皮下組織かのように皮膚層・皮下組織層までの層組織連絡体としてのエッセら正確に分取したhASCsを用い、これら細胞のおもだった細胞ンスを抽出し、必要最低限にシンプルな構造として捉えることが表面マーカーを調べたところ、そのプロファイルに際立った差異有用である。これには、
ヒト皮膚評価モデルを構成する、表皮組

3)。また、両者の間葉系幹は生じていないことが分かった（図2a）

図2 ヒト線維芽細胞(HNDF)とヒト脂肪由来幹細胞(hASCs)の性状細胞表面マーカーの比較(a) フローサイトメトリー法による細胞表面マーカーの比較 (b) HNDFとhASCsの分化能特性の評価 adipocytes: 脂肪細胞, osteocytes：骨細胞。Oil-Red O染色：脂肪細胞の含有する油滴の染色（＝分化した脂肪細胞）。Alizarin Red 染色：骨分化細胞に沈着したカルシウムの染色（=骨細胞）。写真は分化像を示している。グラフは全ての細胞から抽出した染色物の吸光度を示し(ただし、dif = 分化誘導処理あり、undif = 分化誘導処理なしの状態を表す）、複数回の独立した実験から得られた統計学的データであることを示す。** P <0.01。スケールバー：200 µm。

3

特集

細胞アッセイ細胞への分化能については、分化能を携えた細胞集団の様相に（層）間の連絡を考慮することは必須の要件である。これらの著しい差異が生じるものの、両者には少なくとも分化能を示す

利用を熟考するうえで、HNDFまたはhASCsにおける上皮層へ集団の存在が確認された（図2b）。これらの結果は、従来のマーの影響を探索する必要がある。そこで、HNDFまたはhASCsを

カー分類法のみによるHNDFとhASCsの分別は難しいことに加評価対象細胞とした種々の共培養系を試行し、これら細胞の位

3)

え、興味深いことに、一般的にHNDFは分化能を有さないと考え

置・配置が表皮の発達に及ぼす影響を評価する系を構築した（図られているが、実際にはHNDFにも多分化能を示す細胞が一定

3）。このとき、評価対象細胞の特性を評価する共培養系はおも数含まれていることを示す。つまり、真皮層のHNDFには、真皮層に2つの系に分かれる。ひとつはオプションリング
（関東化学株と密に隣接する脂肪組織にあるhASCsに極めて類似した性状を式会社製）
をキーツールとした両面培養系 (Double sided co-

もつ集団が存在しえることを想起させる。これらの結果は、未同

culture) であり、もうひとつは培養インサートをツールとした共定の真皮線維幹細胞の存在や、未同定のヒト脂肪由来幹細胞の培養系 (Separate culture) である。前者のオプションリングを亜集団が線維芽細胞様細胞へ遷移する可能性なども示唆してお活用した両面培養系では、インサート外の底面に評価対象細胞

り、皮膚組織（皮膚・皮下組織）の新規細胞や機能の発見につながを、
インサート内の底面にヒト表皮細胞(HPEK)を播種し、膜を境ることが期待される。これらの考察を背景に、筆者らは、現状までに細胞（層）間を可能な限り密接させた共培養系である点がポイに理解できうる皮膚・皮下組織を構成する細胞の性状を精査し、

ントである
（図3a）
。後者の共培養系では、培養プレート底面に評

ヒト皮膚三次元モデル作製の主要細胞ソースとしてHNDFおよ

価対象細胞を、セルカルチャーインサート内にHPEKを播種した

びhASCsに注視し、それらの皮膚組織層における局在や性状が共培養系であり、それぞれの層間の距離を保った培養系である

皮膚バリアのフロントラインである表皮層にどのような影響を及

点がポイントである（図3b,c）。本評価系は、これらの空間的に解

ぼすかについて検証した。

釈を分けられる基礎的な2つの評価系に加え、両面培養時におけるセルカルチャーインサート底面の基材（以下、セパレータ基材）

細胞の位置・配置と組織
（層）
間の連絡

05

として、
コラーゲンのみで膜が形成された関東化学株式会社製4)（以下、コラーゲンビトリゲル®膜）と、のad-MED ビトリゲル®2

ポリカーボネート(PC)膜の2種類のセパレータ基材を用いること、共培養時はポリエチレンテレフタレート(PET)膜を加えた3種

ヒト皮膚三次元モデル作製においては、これを形作る細胞の類のセパレータ基材を用いることにより、細胞（層）の足場や接着位置や配置、
またそれらを考慮して構成される組織と、他の組織性などの性状をも考慮できるパラメータを加えた多角的な培養

図3 共培養系の概略図（a）
両面培養系 (Double sided co-culture) では、
オプションリング（関東化学株式会社製）
を使用してヒト線維芽細胞の裏面に播種し、ヒト表皮細胞 (HPEK)をインサー(HNDF)またはヒト脂肪由来幹細胞 (hASCs)をad-MED ビトリゲル®2（関東化学株式会社製）
トの内側に播種した。
（b、c）
共培養系 (Separate culture)では、hASCまたはHNDFのいずれかを12ウェル培養プレートに播種した。
（b）
接着性
アッセイでは、hASC/HNDFを播種してから24時間後にHEPKを培養インサートに播種した。
（c）
ヒト人工表皮の再構成、増殖アッセイでは、HPEKを培養インサートに播種し、24時間インキュベートした。次に、インサートをhASC/HNDFが播種された12ウェル培養プレートに配置した。

4

THE CHEMICAL TIMES
実験系となっている。以上の特色を有した共培養系(両面培養とその結果、コントロール群となる、HPEKのみを各種セルカル共培養)およびセパレータ基材の違い(コラーゲンビトリゲル®膜

チャーインサートへ播種しそこから作製された再構成表皮につとPET膜、PC膜)を組み合わせた培養系において、HNDFおよび

いて、HE(Hematoxylin Eosin)染色にて表皮組織の構成を比hASCs の有する皮膚組織層における局在や性状の評価を行っ較解析したところ、各種のセパレータ基材（コラーゲンビトリゲた。このとき、それらの作用を評価する対象細胞としてHPEKをの違いに顕著な差はなく、全て健常
ル ®膜、PET膜およびPC膜）

選択した。当然ながら、表皮構成細胞であるHPEKは、皮膚の中な再構成表皮の組織層の構造が観察された（図4：ControlのHEで最もターンオーバーに富み、分化成熟を繰り返す皮膚の最外染色パネル群）。ただし、コラーゲンビトリゲル®膜を用いた再構

表組織体として恒常性のゲートキーパーを担っているため、ヒト

成表皮については、他のものと比べ、やや整然とした表皮組織

皮膚生体内で起こる様々な要因の影響を最もセンシティブに感層（図1）の構造が観察される傾向にあった（図4）。この点は、
ヒ

受する細胞集団である。そのため、本実験系の評価対象細胞としト皮膚三次元モデル作製における生体の摸倣膜の選択性の観てHPEKは最も至適かつ、その影響の度合いを測るセンシング細点に興味深い考察を与える。さらに、両面培養系（図4:Double-

胞として適切な素材なのである。実験系では、
コンディションをSided実験データの各カラム）
または共培養系（図4:Separate

整えて精確に維持したHPEKを、
セパレータ基材上に精確な密度

実験データの各カラム）
で示した、HNDFまたはhASCsとの共培を計算して播種し、そこに評価対象細胞とともに培養する環境に

養実験において、
コラーゲンビトリゲル®膜上で培養されたHPEK

暴露させ、各条件が均等となるよう精緻な培養実験を行った（図からなる再構成表皮にのみ、controlに比べ、より厚く豊潤に、さ

3）。その後、それぞれの実験系に暴露され得られた評価対象細らに表皮組織も整然と形成されていることが観察された（図4：胞であるHPEK（層）
は、さらに気相−液相培養法にてヒト人工表

各HE染色像のカラム）。そのうえ、
コラーゲンビトリゲル®膜を用皮の再構成物（以下、再構成表皮）に分化成熟させ、それを詳細いて両面培養を行った再構成表皮の基底層において、増殖マーに解析することも加え、HNDFおよびhASCsの有する皮膚組織

カーであるp63の免疫蛍光染色を実施したところ、コントロール層に与える影響について、生体皮膚組織の構築作用に近似したと比較してp63陽性細胞の数はHNDFまたはhASCsのいずれに系にて総合的に評価した。

おいても増加していた（図4: Double-Sided実験データのp63

図4：コラーゲンビトリゲル® (関東化学株式会社製ad-MED Vitrigel® 2:Vitrigel®)、
ポリエチレンテレフタレート (PET)、
およびポリカーボネート (PC)インサートを用いた共培養系で再構成されたヒト人工表皮の比較 インサート表面にヒト表皮細胞 (HPEK)を配置し、ヒト線維芽細胞 (HNDF)またはヒト脂肪由来幹細胞 (hASCs)をインサート裏面に配置した両面培養 (Double-sided)、もしくは培養プレート底面での共培養 (Separate)にて14日間培養した。HPEKのみ（共培養なし）から再構成されたヒト人工表皮を対照とした。これらヒト人工表皮について、ヘマトキシリンおよびエオシン（HE）
染色による組織評価、ならびにp63（緑色）に対する免疫染色による組織評価を行った。グラフは、複数回の独立した実験から得られた統計学的データ、および皮膚の表皮全体の厚さの平均±SD値をマイクロメートル単位で表す。** P <0.01、*P<0.05。スケールバー：50 µm。

5

特集

細胞アッセイ

免疫染色カラム）。これらのデータは、HNDFもしくはhASCsをいているため、さらなる改善と改良が求められる。その指針のひ播種したコラーゲンビトリゲル®膜との両面培養組織と融合した

とつに、
ヒト脂肪由来幹細胞(hASCs)の活用がある。先述のとお

HPEK、ならびにコラーゲンビトリゲル®膜に隣接したHPEKは、生り、一部のhASCs亜集団の性状はHNDFと類似しつつ、HNDF体の作用に近似した正の影響が与えられ得る可能性があること

中にも終末分化が可能な間葉系幹細胞が混入していることかを示している。つまりは、コラーゲンビトリゲル 膜とHPEKの隣ら、HNDFの中にもhASCsが存在しているものと考えられる（図

接の条件は、
コラーゲンビトリゲル®膜内の貫通孔の構造をも加2）。実際、真皮にもhASCsが局在しているとの報告もある6, 7)。こ味すると、近接する皮膚組織構成細胞（HNDFもしくはhASCs）
・

れらの事実は、真皮層ならびに皮下組織の相互作用を取り込む

その細胞群を包含する組織間の作用に重要な働きを担うこと、

うえで、有効な論拠のひとつと考えられる。さらに、hASCsはさ

®

ならびに、
これらの細胞のいずれからでも放出されている因子

まざまな増殖因子を分泌しており、皮膚のハリや弾力に必須であの作用を受け入れるにも有用であることを示している。これに対るコラーゲンを、自発的に産生する能力も有する8)。事実、図3、4

し、PET膜またはPC膜インサートを用いた共培養ではHPEKに際の実験結果からも、hASCsにはHNDFに劣らない、再構成表皮だった影響が観察されなかったため、共培養や両面培養の影響

豊潤化の作用が備わっていることが伺える。実際、この性質を応が十分には活かされていないことが示唆される結果となった。

用しTrottierらは、より分化誘導を行った脂肪細胞を真皮代替品

これらの知見は、
ヒト皮膚評価モデルを構築するうえで、ヒト皮として使用し、
ヒト皮膚三次元組織の作製にも成功している9)。さ膚組織を構成する細胞の性状およびその配置や状態、ならびにらに筆者らがこれまでに開発した、低酸素培養法により生体内環組織(層)間連絡の理解を深めるたいへん重要な知見である。今よ境に近似した状況において作製したhASCsを用いることで10)、回、共培養系を構築する際に用いたセルカルチャーインサート

り実質的な真皮層および皮下組織の構築も可能となる。この方は、細胞の接着性や浸潤性などを測る器材として活用出来るこ法は現在もアップデートを重ねており、現状ではよりコラーゲンとは広く知られている。その一方で各種のセルカルチャーイン

産生能を亢進するhASCsの亜集団も分取・維持もしくは作製がサートを用いた共培養・両面培養システムは、種々の細胞を評可能である。このようなhASCsの亜集団、HNDF、およびそれぞ価するのみならず細胞間での情報連絡を評価する系としても有れの細胞から産生されるコラーゲンをヒト皮膚三次元モデルの効に活用できるものと考える。とりわけ今回取り扱ったコラーゲ

原料とした「細胞の組織内での自己再構成を誘発する疑似真皮

ンビトリゲル 膜は、細胞が分泌する液性因子や細胞が産生する

層の作製」
は、
より実質的なヒト皮膚モデルの作成のためにたい

Extracellular matrix(ECM)に類する素材として考えられるた

へん有用な概念のひとつと考えられる。さらに、密性結合組織で®

め、これに隣接する細胞もしくは組織間の性質や性状を、おそら

ある真皮の環境のうち、
コラーゲンやエラスチンおよび基質等

くより生体にミミック（生体に近しい状態に組織科学的に近似均の結合性や配座も、できる限り生体に近しい状態で付設すること整化）するための至適な器材のひとつとして有効と考えられる。

が望ましい。この観点については、後述するプリンティング技法などを用いた物理的な配座方法の検討や、組織包埋前の化学的06

人工真皮層の作製事例

現在までのヒト皮膚評価モデルを俯瞰すると、生体内の真皮層を大雑把に摸倣したヒト皮膚三次元評価モデルは未成熟な状態であり、実用的なレベルでの表皮-真皮層の相互作用の探索や評価系構築のためにもより成熟したモデルの登場が待たれる状況

架橋処理による部分的なECM体を形成することが有効に思われる。

ヒト初代皮膚構成細胞の特性を最大限に利用したヒト皮膚三次元モデル開発の試み

07

筆者らもこれまでにヒト脂肪由来幹細胞(hASCs)を真皮代替にある。先例では、
これまでにコラーゲンゲルで包埋したヒト線

品、hASCsより分化誘導した脂肪細胞を皮下組織代替品とした維芽細胞(HNDF)を疑似真皮層とし、その表面で気相-液相培養

ヒト皮膚三次元モデルのプロトタイプを作製している。このヒト

したヒト表皮細胞(HPEK)を疑似表皮層として構築した形態のヒ

皮膚3次元モデルに向かうまでの過程で、再構築した表皮層の厚ト皮膚三次元組織が報告され、利用も始まっている 。確かに、本

みの制御や豊潤化などが誘導できるようになるなど、成果やノウ

5)法はシンプルな構造体としての疑似人工真皮層を有し、これまでハウも蓄積されてきている。基本的にhASCsは、多数の終末分より人工皮膚組織を長く維持できるなど画期的なものである。

化細胞（種）への分化能を有することに加え、様々な成長因子や本稿でも述べてきたように、
ヒト皮膚組織の構成要素をシンプル

サイトカイン、細胞外小胞（EVs: Extracellular Vesicles）
をもに分解・再構成して理解し、疑似真皮層を整然と作製することが分泌していることから、
ヒト皮膚三次元モデルにおいて血管や免評価系の組織構築ではとても重要な要因となる。その意味合い

疫細胞などの導入を誘引するなど、広義のtrophic効果
（組織修

において、
この疑似真皮層の作製は一定のブレークスルーを得復、健常化、保護作用）も期待できる。我々の研究室でも検証をたものと捉えられる。
しかしながら、
コラーゲンゲルで構成され重ねているところではあるが、hASCsのパラクライン効果によった環境内にHNDFをどのように配置すべきか、疑似真皮層内のてヒト皮膚3次元モデルプロトタイプを構成する細胞（層）
への

HNDFの自由度や疑似真皮層下部からの影響などの要因を欠血管誘導作用も一部観察されている。
しかしながらこれまでのプ

6

THE CHEMICAL TIMES
ロトタイプは、本稿で述べてきた「細胞の種類・ソース、細胞の位配座といった自己再構成を促せるように計算・配置された数理的

置・配置、組織（層）間の連絡」
を再現性良く満たす状態には届いなCADデザインモデルから創出された画期的なシステムとなっておらず、技術的にいくつかのハードルが存在していた。
とりわけ

ている
（未発表データ、特許出願準備中）。この新タイプのヒト皮「細胞の位置・配置の制御」
は際だった問題であった。この問題

膚三次元モデルは、表皮層、真皮層、皮下組織を携えたモデルでを解決するため、近年に活用の幅が広がっている3Dバイオプリ

あることから、
これまでのモデルよりヒト生体の皮膚に近似したンティング技術の活用を検討した。

組織体である点が長所である。また、
このヒト皮膚三次元モデル

開発段階であるため、作製工程の詳細説明は割愛させていただのキーとなる構成細胞に予め時間空間的な自由度を与えること

くが、筆者らがヒト皮膚三次元モデル開発の技術革新を図っていで、本来の細胞性状を拘束しない、いわゆるエンドジーナスな細るシステムの概略を示す（図5）。本稿で示してきたヒト初代皮膚胞の挙動を観察・評価することが可能な面でも非常に興味深い、細胞や、ヒト皮下組織に含まれるいわゆるhASCs、
および、
さらに

全く稀有な新世代のヒト皮膚三次元モデルといえよう。一方で、

hASCsより高解像度の幹細胞亜集団（ヒト脂肪由来間葉系間質

精度の高い再現性等、いくつかの課題も抱えている。現在、それ細胞の純種により近似した細胞集団）、ならびにそれらの産生すを解決する科学的なアイディアを試行錯誤し、徐々に開発の懸念る生体因子を主たる素材（種類や量もバイオプリンティング用イ

や構築時間軸等の律速も解消され始めてきている。この概念をンクの配合成分としてもたいへん有用）を選択している。

有した三次元モデルは二次元モデルでは図りし得ない有用性をもつことが期待できる。

さらに、前項で示したコラーゲンビトリゲル 膜ならびにオプショ®

例えば、皮膚のバリア機能や水分保持量などについて評価研

ンリング（いずれも関東化学株式会社製）
を技術として活用した究を行うためには、
ケラチノサイトなどを用いた二次元培養系で両面培養システム、ならびに生体由来ECMを適切に配合したバは、生体に近似したデータは得られにくい。二次元培養系から得

イオインク（含：模擬的な間充組織液としての用途）等の新規素材たデータの有用性を確認するためにも、より生体に近似したヒトの開発、かつこれらを統合してアッセンブルできる3Dバイオプ

皮膚三次元モデルは非常に有用である。さらに、美白機能成分のリンティング技術を統合して、「細胞の種類・ソース、細胞の位置・評価系として、
このヒト皮膚三次元モデルに機能性細胞体の一種

配置、組織
（層）
間の連絡」
の概念を反映したヒト皮膚三次元モデであるメラノサイトを表皮層へ組み込むことにより、実際の皮膚ルの作製・醸成段階に入っている。ここから作出されるヒト皮膚のようにメラニン色素を持ったヒト皮膚三次元モデルを作製でき

三次元モデルは、一部の細胞（群）
は分化誘導を行う必要がある

る可能性がある。実際、我々の研究室において、hASCsを神経堤が、ほとんどは細胞の分化の有する分化方向性や能動的移動・細胞へ分化させたのちメラノサイトへと比較的短時間にて分化

図5 ヒト初代皮膚構成細胞種を用いたヒト皮膚三次元モデルの開発スキーム

7

特集

細胞アッセイ

誘導を完了できる新しいメラノサイト作製プロトコルの開発にもあれば、本稿で示した内容物が一助となることを期待する。今後成功している（特許出願準備中）。この方法によりヒト皮膚の組織も歩み続ければ近い将来、実用化のステージへとあがり序論で学的種類別および個人単位でのメラノサイトの作製も可能とな述べたような多分野において、裾野広く有効活用されることを期る。このように、特異的なヒト皮膚三次元モデルを精確に活用す待している。

ることにより、動物実験の3Rs(Reduction:削減、Refinement:
苦痛軽減、Replacement:代替法利用)遵守の全てに通底する

参考文献

Replacementに与する、
まさに実験動物に頼らない、
ヒト皮膚科

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学における新領域vivo研究の推進が為し得られるものと感じる。
その先、または併行して可能な実用化研究の面からも、
このヒト
皮膚三次元モデルは、精度の高い解析に適する、より効果的な薬剤の創製やドラッグリポジショニング・スクリーニングは勿論のこと、機能性香粧品の開発や安全性・安定性評価にも革新を与えるものと思われる。

おわりに08

本項の冒頭において機能的な皮膚評価のみならず、皮膚科学
および皮膚科学関連分野の進展を阻害している、「機能的な研究
開発基材としてのヒト皮膚三次元モデルの不在」という問題が生じていることを記した。この問題を根本的に解決すべく、筆者らがどのようにして、ヒト皮膚モデルを構築しているかを示した。ヒ
ト皮膚評価モデルを構築する上で、皮膚構成細胞の種類やソースの理解と選択、選択した皮膚構成細胞の組織内における局在・
位置・配置、細胞間または組織（層）間の連絡という3要素を、どのように理解し目的にあった評価系に資する「ヒト皮膚三次元評価モデルの作製につなげるか」について論じてきた。そのためには、シンプルな評価系から理解し、そこから得た知見を高次元のモデルへと連結させていくことの重要性を示した。さらに従来の方法に捉われず、その時々において利用可能な既存技術や製品を、積極的に評価モデルへと取り込んでいくことの有効性も実証した。そのうえヒト皮膚評価モデルの機能性をあげるために、機能性細胞等をヒト皮膚三次元モデルへ組み込むといった、評価
目的にかなったヒト皮膚三次元評価モデルへアップデートする有用性も提案した。このような試みはすべて、皮膚科学・幹細胞生物学の基礎的な積み重ねから論理的に思考試作されうるものであり、その結果のフィードバックこそが「ヒト皮膚三次元評価モデ
ル作製の展望」となる。例えば、筆者らが探求をつづける「真のヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の同定とそのオントロジー
（存在
論）
」
や
「皮膚に存在する幹細胞の同定」など、未到の研究領域にアクセスする真摯な基礎研究から徐々に紡ぎ出される事実は、
常にヒト皮膚三次元評価モデル作製に応用されている。この未同定な細胞を明らかにし、皮膚・皮下組織の構築にフィードバッ
クすることは実に象徴的な例証に思える。日進月歩で進捗する皮膚科学や幹細胞に係る研究成果は枚挙に暇がない。これらをより統合的に理解すると同時に、それら独自の観点や切り口から「新次元のヒト皮膚評価モデルの創製」を期待する。
しかしながらその時間を切り取った時点で、目的に対し有効に機能するので

8

10. 森山 博由 , 森山 麻里子 , 早川 堯夫 , 松山 晃文 , 脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法 . 特許 第 6209377 号 , 優先日 20120711.

コラーゲンビトリゲル を用いた
新規肝細胞培養系における薬物動態研究®

Drug metabolism and pharmacokinetics researchin novel hepatocyte culture system using collagen vitrigel® membrane

渡 隆爾
Ryuji WATARI

エーザイ株式会社 ＤＨＢＬ メディスン開発バイオファーマシューティカル・
アセスメント機能ユニット グローバル薬物動態研究部 マネージャー

Global Drug Metabolism and Pharmacokinetics Biopharmaceutical Assessments (BA) Core Function Unit (CFU),
Medicine Development, DHBL, Eisai Co., Ltd. (Manager)

コラーゲンビトリゲル®

細胞培養法

薬物動態

01

ヒトにおける薬理効果や毒性発現に対する予測精度は低い。従っ

本稿では、創薬研究における薬物動態の役割を示し、動態研究

正確に予測できる新たな評価法を構築し、可能な限りリスクの少における肝細胞培養技術と評価法の変遷を辿る。これらを踏まない開発候補品を選出できれば、成功確率の向上とともに、臨床

えて、関東化学株式会社より販売されているad-MED ビトリゲ

研究の効率的な進行に貢献できる。

ル ®を用いた新規肝細胞培養法の構築、及び肝代謝に関わる代

医薬品開発において、薬物動態研究は、探索研究から、臨床研

謝酵素であるシトクロムP450（CYP）の活性評価について述べ

究、承認申請まで幅広いステージに関わっている。同時に、薬理る。さらに、CYPの典型基質を用いたヒト肝クリアランス(CL)のや安全性研究をサポートする大切な役割も担っている。薬理効予測を実施し、実際のヒト臨床値との比較にも言及する。

果や毒性の発現は、投与された薬物の全身暴露や薬効・毒性発

はじめにの不足や予期せぬ毒性発現である。
しかし、従来の評価方法ではて、非臨床段階（探索研究）
でヒトにおける薬理効果や安全性を現組織への移行が大きく関わっている。そのため、薬物動態研究

02

医薬品開発における薬物動態の役割において重要なことは、探索研究の段階において、最終候補医
薬品のヒトでの安全性領域を保ち、かつ、有効薬効用量を正確に予測・提案することにある。さらに、最終開発候補品を決定する段階では、
ヒトPK予測に加え、薬理効果や安全性を予測する

医薬品開発は、低分子化合物の場合、成功確率が約4%であり、

PK/PD（Pharmacokinetics/Pharmacodynamics）
及びTK/

一つの医薬品を開発する期間として約13年、研究開発費用としTD（Toxicokinetics/Toxicodynamics）の実施が重要である。

て約2,000億円がかかるといわれている 。従って、医薬品開発

PK/PD及びTK/TDは、ヒト投与量を基に規定される。ゆえに、薬の成功確率を向上させ、開発期間の短縮並びに開発費を低減す

理効果や毒性の発現の予測には、
ヒトPK予測の精度が肝となる。

ることは、製薬企業として極めて重要な課題である。また、医薬品

このヒトPK予測の精度を向上させるための取り組みの一つが、の開発中止や市場撤退も、製薬会社として回避すべき事象であ

薬物代謝の中心臓器である肝臓を扱う肝代謝研究である。

1)

り、薬を望む患者様の期待に応えるためにもできる限りの対策を

筆者らは、肝代謝研究に必要な肝細胞培養法の検討を行い、薬講じることが必要である。

物動態評価に適した培養法の研究を推進した。

過去の医薬品開発の歴史を振り返ると、1990年代は薬物動態（DMPK：Drug Metabolism and Pharmacokinetics）
が原
因で開発中止となる医薬品候補化合物が、全体の約40%を占めていた2)が、2000年代以降は約10％以下に減少した3)。これは、肝細胞や肝ミクロソームなどのヒト生体試料が使用できるように肝細胞培養技術の変遷

03

なり、薬物動態研究の進展とともにヒトにおける動態予測を主と薬物動態研究では、医薬品候補化合物の生体内における肝CLしたトランスレーショナル/リバーストランスレーショナル研究のの予測や、代謝酵素誘導性及び細胞毒性を評価するin vitro評推進が寄与したと考えられる。一方で、安全性および薬理効果に価モデルとして肝細胞が利用されている。
しかしながら、従来のついては依然として開発中止の原因として多くを占めており、そ

単純なin vitro評価法においては、薬物代謝酵素として最も重要。つまり、現なCYP活性が培養中に低下してしまう上、細胞は播種後数日しか在の医薬品開発で特に大きな障害となっているのは、薬理活性

培養できない。そのため単純な培養法では、生体における肝臓のの比率は過去と比較しても大きく変動していない

2, 3)

9

特集

細胞アッセイ

生理学的機能を再現することは困難であった。医薬品候補化合雑であることから、Relay法と同様に探索研究段階で多くの医薬物のヒト肝CLや肝毒性をより正確に予測するには、生体内の肝品候補化合物を評価するスクリーニング手法としては不向きで臓に匹敵する肝機能を維持した新しい肝細胞培養法を構築するあるといえる。使用場面としては、数種類の医薬品候補化合物の必要がある。そこで筆者らは、従来法よりも優れた培養法の開発

中から1品に絞る後期の段階において、活用することが想定されを目指した。

る。

細胞培養法の開発を考える上で重要な項目は3つある。それは、①培養基材（培養システム）、②細胞、そして③培地である。本

3.4 スフェロイド培養

項においては、特に、培養基材に焦点を当て、肝細胞培養法の変コラーゲンコーティングしたプレートに単純に細胞を播種する2遷を辿る。

次元平面培養では、複雑な立体構造を有する生体組織を模倣することはできない。そのため、細胞同士を集合させることによっ

3.1 従来の培養基材(システム)て、3次元細胞塊を形成するスフェロイド培養が提案された9)。ス

従来の培養法では、市販のコラーゲンコーティング済みプレート

フェロイド培養では、細胞同士が自発的に凝集することで、細胞（培養基材）
を用いるのが一般的であるが、そうした簡便な方法

間相互作用が高まり、細胞機能の向上が期待されるとともに、立では代謝活性が数日間までしか維持ができない4)。そのため、代体的な組織を構築することで生体環境に近づけることができる

謝活性を長期に渡り維持する培養基材(システム)の開発が進めと考えられた。ただし、細胞凝集塊は自律的なものではなく、単純られている。以下に、肝代謝評価で開発されてきた手法に関してな集合体であるため、細胞塊の大きさが一定以上を超えると、細簡単に述べる。

胞塊内部の細胞まで、酸素や栄養素の供給ができず、壊死してしまうという問題がある。こうした課題を解決するため、Cell-able®

3.2 Relay法(東洋合成工業株式会社)のような、細胞塊の大きさを一定以内

肝細胞を用いた代謝活性評価法では、凍結肝細胞を使用するに制御するプレートを開発して、細胞塊の品質を安定させることのが一般的であり、凍結融解直後の浮遊細胞(Suspension)をで代謝活性を維持する手法もある10)。また、代謝活性評価に限ら用いて、各化合物のCLを算出する。
しかし、足場のない、細胞間ず、スフェロイド培養を毒性評価に適用した事例も報告されてい接着の少ない浮遊状態では、4時間程度しか代謝活性が維持さスフェロイド培養には、線維芽細胞のような足場を作る11)。なお、れないことが知られている4)。そのため、肝細胞を4時間毎に交換

るフィーダー細胞の存在を必要とする。フィーダー細胞は、細胞して化合物のCLを算出するRelay法がPfizer社により開発されの接着に必要な、細胞外マトリックスの供給など、細胞機能に必た5)。本手法により、代謝活性を長時間維持しないと評価できな

要な足場を提供する。一方で、フィーダー細胞による代謝活性やい代謝安定性の高い低CL型化合物の評価が可能となった。一方

毒性評価への影響を考慮する必要があり、フィーダー細胞を必で、高価な凍結肝細胞あるいは新鮮肝細胞を大量に投入し、4時要としないスフェロイド培養法も提案されてきた12)。

間毎に細胞を交換しなければならないため、人的及び物的コスト

このように、2次元培養法や3次元培養法の取り組みも活発化しが大きいという欠点がある。

ているが、薬物動態研究の観点として、3次元培養法の代謝活性のレベルはsuspensionを使った従来法と比べて低く、
ヒト肝CL

3.3共培養システム

予測評価モデルとしては課題も多い。

3.1から3.2項で見てきた培養法は、肝臓組織における実質細胞としての肝細胞に焦点を当てている。本来、肝臓組織は、実質細3.4 オルガノイド胞である肝細胞と非実質細胞である星細胞・クッパー細胞・血管

スフェロイドのような、自発的な細胞凝集を用いた3次元培養

内皮系細胞によって構成された臓器である。生体肝臓組織を模法をさらに発展させた形として、
より自律的に、複数の細胞種を倣するには、実質細胞だけではなく、非実質細胞の存在も忘れて伴って小器官(ミニ臓器)を形成する手法をとっているのが、オルはならない要素である。近年、実質細胞以外の細胞とともに培養

ガノイドである。オルガノイド形成の際に使用する細胞種に関しを行う共培養法が多く研究されており、線維芽細胞との共培養ては、Embryonic Stem cell (ES細胞：胚性幹細胞)、induced

やHμREL法 が開発され、長期培養

Pluripotent Stem cell (iPS細胞：人工多能性幹細胞)のよう法として、Hepato-pac法

6,7)

8)

及び肝機能向上が認められるとともに、肝CL評価法として注目に幹細胞を主な細胞源としているものが多い。肝臓に関してされている。Hepato-pac法に関しては、培養プレートにマイク

は、iPS細胞から分化させた肝細胞と、endothelial cell
（内皮

ロパターニング手法を施すことで、細胞接着の場を制御するとい細胞）としてヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein

う培養基材側の工夫もなされている 。

Endothelial Cells：HUVEC）、mesenchymal cells
（間葉系幹

ただし、
これら共培養法は肝細胞以外の細胞による影響を加味

細胞）の3種類を組み合わせた肝オルガノイドが報告されている

6)。幹細胞による自律的な組織構築が可能となり、創薬利用にもする必要があり、得られた結果に対する非実質細胞や線維芽細13)胞の寄与に注意を要する。また、Hepato-pac法のようなマイク

期待されている14)。一方で、肝オルガノイドは薬理評価や毒性評

ロパターニング手法を取り入れた培養基材は、現在日本での入価に利用することが多く、薬物動態評価に適応している例は少な手が困難である。更に、共培養法は評価コストが高く、操作が複いのが現状である。

10

THE CHEMICAL TIMES
3.5 Microphysiological system（MPS）

な2次元培養で肝機能の向上及び長期培養を実現することが、従来のin vitroモデルは単一細胞かつ静置培養を基本とする閉創薬研究の観点から活用しやすいと判断した。本素材は、関東

鎖系であり、生体における血流要素や多種多様な細胞・組織・臓として、Transwell ®
化学株式会社より「ad-MED ビトリゲル ®」器が存在する生体の複雑な環境を模倣していない。生体の模倣(Corning社)のような細胞培養用インサートとして販売されていを狙う上では、各臓器を個別に考えるだけでは不十分であり、臓る（図1）。本研究では、12ウェルプレート用のビトリゲル®を使用

器同士の連結による応答、さらには全身への連関を考慮する必して評価を実施した。

要がある。そうした中で、Microphysiological system（MPS：生体模倣システム）と呼ばれる新しい培養システムが考案され、生4.2 細胞：PXB-cells®

体に近い環境を再現しようとする試みがなされている。中でも肝コラーゲンビトリゲル ® の先行研究として、株化細胞である

MPSに関しては、肝機能の再現を目指すおおよその指標も提示

HepG2細胞を用いて、代謝活性や肝機能の指標であるアルブ

しかし、MPSは主に安全性・薬理効果での研究がされている 。

しかし初代肝細ミン分泌及び尿素合成能が向上した例がある18)。

主流であり、
オルガノイド研究と同様に薬物動態評価としての研胞を用いた実績はなかったため、本研究ではヒト初代肝細胞を用究報告は少ない。

いて検討することにした。肝細胞は、凍結ヒト肝細胞が一般的に

このように、様々な培養システム（培養基材）
が提案、研究されて利用されているが、高コスト、ロット間差の大きさ、使用個数・期

きているが、薬物動態評価での活用には多くの課題が存在し、探間の制限といった障壁がある。評価系構築の際には、再現性の観索研究において真に創薬活用できる簡便な培養システム
（培養

点から、
ロット間差の大きい細胞源を扱うことはデータ解釈の上基材）の開発が必要である。

で問題となる可能性が高い。そこで我々は、ヒト肝細胞を移植し15)より単離した新鮮ヒト
たヒト肝置換キメラマウス（PXB-mouse®）

コラーゲンビトリゲル®による新規培養法の開発

04

ヒトの薬
肝細胞であるPXB-cells®に注目した。PXB-mouse®は、
物動態の予測において高い予測性を示す有望なモデル動物19,20)
として近年認知度が上がっている。キメラマウスより単離した肝細胞は、一つのロットを安定的に数年に渡って使用することがで

前項では主に、培養基材に焦点を当てて、培養法の変遷を辿っ

き、低コストかつ、新鮮肝細胞の持つ良好な接着性・再現性・代謝たが、培養基材以外の細胞・培地も重要な要素である。これら3能を実現したヒト肝細胞の代替品として使用が期待される。

つの要素を適切に選択し、条件を設定していくことがより良い培養法構築の要である。我々は、培養基材：コラーゲンビトリゲル®、

4.3 培地：dHCGM

細胞：PXB-cells 、培地：dHCGMを基礎とする新規肝細胞培

本来培地は、購入する細胞ごとに最適化された推奨培地が存在

養法の開発を行った。以下に、決定した3つの要素に関して、紹介し、各メーカーにより多種の製品が販売されている。ところが、各を行う。

メーカー独自に開発された培地は、培地組成が開示されていな®

16)

いため、培地成分の何が良いのか、改善する部分はどこにあるの
4.1 培養基材：コラーゲンビトリゲル

かを把握しにくい点が、ユーザー側として悩ましい部分である。

コラーゲンビトリゲル は、竹澤俊明グループ長（国立研究開新たな培養法の開発を行う際には、培地組成が明らかなものを

発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 生物機能利用研究部

使用したいという意図があったため、培地の検討を行う上では、門）
が開発された新規培養基材である17)。コラーゲンビトリゲル

培地組成の開示にこだわり、研究を進めた。その結果、最終的に、®

を選んだ理由として、本培養基材は、生体内の結合組織に匹敵

PXB-cells®を販売している株式会社フェニックスバイオから入手する高密度コラーゲン線維網で構成されており、生体内を擬似できるdHCGM培地に決定した。本培地は、DMEMを基本培地的に模倣した環境を提供できると期待したからである。また、共として組成成分が公開されており16, 21)、PXB-cells®の培養に用い培養法や3次元培養も捨てがたい方法であったが、まずは簡便る標準的な培地として販売されている。

®

®

A

B

4.4 ビトリゲル®培養法による肝機能評価
上記の細胞培養法構築のための3要素を基に、コラーゲンビト
リゲル®膜、並びにコラーゲンを塗布した従来のプレートにPXBcells®を播種し、3週間の長期培養を行い、CYP代謝活性及び肝特異的機能を比較した。その結果、肝臓で主要な5つのCYP分子種（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6及びCYP3A）の代謝活性が、従来法では培養開始後10日以降に減少するのに対し、ビトリゲル®培養法では、培養14日～17日目で代謝活性の向図1 A環状ナイロン膜の支持体付きコラーゲンビトリゲル®薄膜（提供：関東化学株式会社）、B ad-MED ビトリゲル®膜チャンバーの製品

22)。
上が認められ、高い活性を維持することを見出した
（図2）

また、
ビトリゲル®培養法では培養14日目において、肝機能の

11

特集

細胞アッセイ

図2 ビトリゲル®培養法及び従来法におけるCYP典型基質化合物での代謝活性評価22)

指標であるアルブミン分泌能や尿素合成能が従来法と比較して

23)

。さらに、
ビトリゲル®培養法によりCYP代謝活性の向上と維持増加することが確認された。

を実現したことから、従来法ではCLを求めることが困難であった

上 記 の 結 果 から、コラー ゲンビトリゲ ル ®とP X B - c e l l s ® 、

warfarinやtolbutamideといった低CL化合物のCL値の予測もdHCGMを組み合わせたビトリゲル 培養法を構築し、従来法と可能であった。

比べてCYP代謝能を含む肝機能を長期に賦活化することが可能

一方、5倍以上の過大評価又は過小評価となった化合物は、となった。

alprazolam、diclofenac及びglimepirideの3化合物であった®

(表1)。DiclofenacとglimepirideはPXB-cells®への結合やコビトリゲル®培養法におけるヒト肝クリアランス予測への応用

05

かつ両化合
ラーゲンビトリゲル®膜への非特異的吸着も疑われ、物ともに血漿タンパク結合率が非常に高く（fu,p=0.005以下）、
非結合型化合物濃度が低くなるため、ビトリゲル®培養法では過小評価になったと推察される。なお、本研究ではコラーゲンビト

PXB-cells を使用したビトリゲル 培養法では、播種後2週間付

リゲル®膜への非特異的吸着やPXB-cells®への結合は評価して近で代謝活性のピークがあることがわかったため、播種後2週いないが、Hepato-pac法でも同様の現象が確認されている7)。

®

®

間目にCYP典型基質22化合物の代謝評価を実施した。さらに、

こうしたタンパク結合率が高い化合物は、過小評価となる危惧がヒト臨床で得られたCL値
ビトリゲル®培養法で算出したCL値と、ある。そのため、代謝評価を実施する際に、アッセイ培地中に分を比較し、本培養法の予測精度を検証した。その結果、評価化合泌されるアルブミンを考慮して、
アルブミンへの結合率を補正す

物の約80%が3倍以内の予測精度と高い予測性を示した（図3）

ることにより予測精度が向上した例も報告されている24)。ビトリ

12

THE CHEMICAL TIMES

図3 ビトリゲル®培養法によるCYP典型基質化合物の肝CL予測23)

表1 ビトリゲル®培養法による各CYP典型基質化合物の肝CL及びヒト臨床値23)ゲル®培養法では、培養後2週間でアルブミン分泌量も増加しているため、アルブミンへの結合率の補正処理を行う必要性が高おわりにいと考える。

06

以上、コラーゲンビトリゲル ®膜チャンバーとPXB-cells ®を用

本稿では、
薬物動態におけるヒト予測の意義を説明し、薬物動態いたビトリゲル 培養法は、CYP基質、特に低CL型化合物のヒト評価のための肝細胞培養法に関する変遷を、培養基材(培養シス

肝CLを精度良く予測できる培養システムであることが明らかにテム)を中心に辿った。そして、培養基材としてコラーゲンビトリなった。ただし、
タンパク結合率が高い化合物への適応には課題

ゲル®、細胞としてPXB-cells®、培地としてdHCGMを組み合わせがあり、そうした課題を踏まえた上で評価系を活用することが重た新規肝細胞培養法を提案し、ヒト肝CL予測精度の高い評価モ要である。今回、新たに構築したビトリゲル 培養法は、探索研究

デルを構築した（図4）。

段階の創薬活動において精力的に活用していく。

今後は、培養基材の改良として、MPSとの組み合わせや、長期間®

®

に渡って高い代謝活性能の維持ができる利点を活かし、安全性

13

特集

細胞アッセイ

図4 ヒト肝CL予測精度の高いビトリゲル®評価モデル23)

評価への応用も検討している。
以上、探索研究から臨床へと繋ぐ創薬研究を支援する評価系の一つとして、今後もビトリゲル®を用いた薬物動態研究を進めて
いきたい。
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ヒト肺モデル：肺特有の構造・機能を
in vitroで再現する
Human lung models: reconstructing structures and functions in vitro

山 本 佑樹Yamamoto Yuki

HiLung株式会社 代表取締役
HiLung Inc. (CEO)

呼吸器

iPS細胞

ヒト肺モデル01

を果たしているのは、肺を構成する特徴的な機能を有した細胞

近年、パンデミックを来たし世界の仕組みを変えてしまった、新これらの細胞群が複雑な相互関係を構築することで告1)もあり、型コロナウイルス感染症(COVID-19)をはじめとする病原体は恒常性を維持していると考えられる。

はじめに群である。シングルセル解析などのオミックス技術が進歩した現
在、ヒト肺には最低でも58種類もの細胞種が存在するという報勿論、たばこ煙や排ガス・PM2.5などの環境公害物質、花粉・黄このように肺は“精密機械”のようであり、一般に再生能力の低

砂などのアレルゲンとなりうる物質は、呼吸器疾患の原因あるい臓器にも関わらず、常に外気に晒され体外の多種多様な刺激

いは悪化要因となり得る。複雑で高度な機能を有する肺を高精に曝露されていることが大きな特徴である。このため肺において度に模倣したヒト肺モデルは乏しかったが、近年の発生学及び幹は多種多様の難治性疾患が発生し一部は致死的である。

細胞生物学の急速な進展により、臓器形成や組織再生におけるメカニズム解明やその制御に関する理解が進んだ。その結果、組織幹細胞や前駆細胞などを適切な条件下で培養することにより、呼吸器細胞の特異的性質を維持しつつ培養したり、複雑な細胞構成や三次元組織構造を再現したりすることが可能になって呼吸器疾患モデルの現状と問題点

03

きた。またこれらのヒト肺モデルは生体工学などの異分野技術

前述のような背景をもとに、呼吸器疾患における医薬品ニーズとの融合によって、さらに精緻化することも可能になっており、は極めて大きいにも関わらず、医薬品の開発成功率は他の疾患

Microphysiological System (MPS)や生体模倣システムと総領域に比べて低いとされている。中でも、医薬品開発において初称され、高いヒト外挿性の実現が期待されている。本稿では肺のめてヒトでの薬効が確認される、第二相試験での成功率の低さ

概略を踏まえた上で呼吸器疾患モデルの問題点を紹介し、こうが目立つ。すなわち前臨床で行われた培養細胞や動物モデルをしたヒト肺モデルの進展について最近の知見を含めて紹介した

用いて取得されたデータが、“ヒト”の臨床試験結果を正確に予い。

測できていないことを示唆する。特に、動物モデルとヒト呼吸器疾患病態との乖離は、近年の研究進展によって数多く指摘され肺の構造と機能02ている。例えば、嚢胞性線維症という遺伝性疾患はCaucasianを中心に多くの保因者がみられ、呼吸器病変が致死的となる難病が存在する。この難病は細胞膜を介した塩素イオン輸送に関わるCFTR遺伝子 (cystic fibrosis transmembrane

肺は生命維持に必須の機能であるガス交換の場として極めて

conductance regulator) の変異によって引き起こされるが、複雑精緻な構造と機能を有する臓器であり、空気の通り道であCFTR遺伝子を欠失させたマウスにおいては特に大きな変化はる気道とガス交換の場である肺胞に大別することができる。構造見られない2)。また遺伝性疾患以外でも同様であり直近の例を挙としては気管から始まり枝分かれを繰り返して末梢気管支へ至げると、新型コロナウイルスは通常マウス肺においては効率的なり、その先端に嚢胞状の構造物である肺胞が存在する。ヒトの肺感染が成立しない3)。このような乖離の要因として重要と考えら

では肺胞が約3億個存在し、延べ表面積は70m2に達するとされれるのは、ヒト肺と動物肺との差異である。まず前提として、魚類ており、この広大な表面積は効率的なガス交換を可能にしていなどは一部を除いて肺が存在しておらず、心臓や肝臓などの主る。このような複雑な構造・機能を維持する上で最も重要な役割

要臓器を比べても、
そもそも進化レベルで決定的な違いがある。

15

特集

細胞アッセイ

さらに哺乳類という枠組みに限っても、動物モデルとして最も汎な非臨床薬効データになったことが知られている。CFTRは塩素用されるマウス肺では、ヒト肺と比較して構成する細胞種が異な

イオンチャネルの機能を有するため、
イオンチャネル機能が評価ることや、呼吸細気管支のような解剖学的に疾患発生母地として可能なUssing chamber法を用いて評価を行ったところ、VX-など大きな種差が存在する。
重要な構造が存在しない 、

770は良好な機能改善作用を示した6)。その後ivacaftorの成功

4)

このように動物モデルの限界が指摘される中で、疾患研究や創を皮切りにVertex社はCFTR modulatorを連続的に上市させ薬においてヒト外挿性の高い“ヒト肺モデル”
に対する関心が高ているが、このin vitro機能評価系と臨床試験のアウトカム(1秒

まっている。従来は、ヒト肺細胞モデルとしてA549などの腫瘍細量の改善)が良く相関することが知られており、in vitroヒト呼吸胞株が用いられてきたが、このような細胞では呼吸器上皮細胞と器疾患モデルの成功事例と言える。こうした遺伝性疾患以外にしての特徴的なマーカー発現や機能が消失しているなど、外挿も、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの罹患率が高性を考えるうえで問題点が多かった。またヒト肺から単離した初い疾患においても、ALI培養を用いた疾患モデル作成の有用性

代培養細胞も重要な細胞ソースではあるが、通常の平面的な培は知られている。例えばGrasらは、重症および中等症喘息患者養方法では短期間のうちに呼吸器細胞特異的な性質を失ってしから得た気管支上皮細胞をALI培養で分化させたのち、それらのまうといった問題が指摘されてきた 。

フェノタイプを比較したところ、重症患者由来ALI培養において

5)

ムチンやIL-8の産生増加といった臨床に合致する所見を得るこ

気面-液面境界培養(air-liquid interface, ALI)

04とが出来た7)。またGohyらはCOPD患者とコントロールの肺検体サンプルを解析比較するとともに、そのサンプルに由来する細胞を用いてALI培養を行ったところ、繊毛上皮細胞が減少し粘液産生細胞が増加するといったCOPD患者における特徴的な細気面-液面境界培養は、培養ウェル内にセルカルチャーインサー

胞分化傾向を再現することが出来たとしている8)。

ト(以下、インサート)と呼ばれる宙づり状の物質透過性培養器

細胞の管腔側が空気に曝露されるという、生理学的に整合性の材を配置することにより、上層に細胞を播種して空気に曝露さ高いALI培養の特徴が最大限に活きる実験は、
たばこ煙や病原体せるとともに、下層に加えた培地がインサート膜の穴を通してなど外気を通じて肺に取り込まれる物質の影響評価や疾患病態

上層の細胞に供給される仕組みとなっている(図1)。空気に細胞研究である。ALI培養におけるたばこ煙曝露実験は、たばこ煙のが曝露される状態が生理的である呼吸器領域においては、特に毒性評価や喫煙と極めて関連が深い疾患であるCOPDの疾患

気管・気管支上皮細胞の培養において最も標準的な方法としてモデル作成など多数の報告があり、その有用性が広く知られて使用されている。ヒト気管・気管支から採取された細胞を本培養

いる9)。GindeleらはALI培養した気管支上皮細胞にたばこ煙を系に播種して数週間培養することにより、基底細胞や繊毛上皮

間欠的に曝露させると、上皮バリア機能障害や繊毛運動低下が細胞、杯細胞などの粘液産生細胞などが、いわゆる偽重層構造起きたことに加え、トランスクリプトーム解析を行うと気道上皮(pseudostratified layer)を呈する生体の気道上皮を近似した細胞の分化傾向に異常が惹起されることを示した10)。また呼吸器

構造体を再現することが可能になる。また呼吸器疾患患者からウイルス感染症研究においても本培養系は有用なツールのため採取した気道上皮細胞を用いることにより、疾患病態研究や創薬多数の報告事例があり、新型コロナウイルス感染症のパンデミッにも応用されている。本培養系が創薬においてヒト外挿性の高クを契機に改めて注目が集まっている。本稿でも触れる通り、inいモデルとして重要な役割を果たした代表的事例の1つに、嚢胞vitroのヒト肺モデルについては、近年の幹細胞生物学の急速な性線維症におけるCFTR modulator(嚢胞性繊維症治療剤)と呼発展に伴ってオルガノイド培養が脚光を浴びるようになっていた

ばれるクラスの薬剤開発が挙げられる。本症において病因となっが、パンデミックに伴う新型コロナウイルス研究の際にその弱点ているCFTR機能異常を標的とする最初の上市薬はivacaftor

もクローズアップされた。すなわち一般的な呼吸器オルガノイド(VX-770)であるが、患者由来気道上皮細胞を用いてALI培養をの作製手法では、多くの場合細胞管腔側が三次元培養体の閉鎖行った薬効評価試験結果は、本剤が臨床試験に進むうえで重要された内腔側に位置するため、管腔側から感染する新型コロナウ

図1 気面-液面境界培養

イルスにおいては生理的なモデルを作製することが難しいのでウイルス感染実験を容易かつヒト病態とのある11, 12)。その結果、整合性をもって行えるALI培養が創薬・病態研究モデルとして頻用されることとなった13)。中でもALI培養が大きな役割を果たしたのは、最初の緊急使用許可に至ったレムデシビルの非臨床薬効試験である。本剤は従来コロナウイルス感染症に汎用されていたVeroE6細胞感染モデルでは、新型コロナウイルスに対する薬効は弱かったが、ALI培養を用いた気道上皮細胞の感染モデル
においてより高い薬効を確認することが出来14)、臨床開発に進む
後押しになったと推察される。
今までに述べてきた通り、ALI培養は呼吸器の生理学的特徴に

16

THE CHEMICAL TIMES
合致する部分の多い手法であり比較的古くから行われている

いたマウス由来Ⅱ型肺胞上皮細胞をマウス由来肺線維芽細胞とが、COVID-19パンデミック対応を含めて現在もヒト肺モデルとの共培養オルガノイドとして形成することにより、初めて長期にして最も汎用されている。また本系は上皮細胞を中心に行われ培養するとともにⅠ型上皮細胞への分化能などを確認した21)。同ヒているが、近年では線維芽細胞との共培養を行う手法15)など、研究は、これまで重要視されながらも困難であったヒト肺胞領域

ト肺モデルの複雑化に向けた試みによって更なる発展が期待さ

および関連する疾患研究の端緒となった、重要なマイルストンとれる。

位置付けられる。その翌年、京都大学のGotohらの研究グルー
プが、
ヒトiPS細胞から分化誘導した肺前駆細胞と線維芽細胞と05

オルガノイドの共培養オルガノイドを形成することにより、困難であったⅡ型肺胞上皮細胞の分化誘導に成功した22)。呼吸器領域では腸管などと異なり、初代培養細胞採取に高い侵襲性を伴うこともあり、特にヒトiPS細胞を用いたオルガノイド形成研究や創薬研究応用がオルガノイドとは、一般に臓器特有の三次元構造や複雑な構成

盛んに行われるようになった。例えば、ChenらはヒトiPS細胞から細胞をin vitroで再現した培養体であり(図2)、癌細胞などの疾

肺の三次元枝分かれ構造を再現したオルガノイドを作製し、ウイ患組織再現も含めた比較的広い範囲で用いられる用語となって

ルス感染実験や疾患特異的iPS細胞を用いた肺線維症モデル作

いる。オルガノイドの起源をどこに置くかは諸説あるが、本系を製が可能であることを報告した23)。またKorogiらは疾患iPS細胞

構築する上で細胞ソースとして欠かせない幹細胞に関する研究から作成した肺胞オルガノイドを用いて、遺伝性肺線維症の病態進展が、現在の“オルガノイド”の急速な普及に寄与したと考える形成に肺サーファクタントの分泌異常が関与している可能性をと、日本人を筆頭著者とする二つの研究が極めて重要であったこ

示した24)。本研究ではライブセルイメージングを用いてサーファ

とは明らかである。一つは、2008年にEirakuらが報告したES細クタント分泌に関わる細胞小器官の動態を可視化したり、遺伝性胞を用いた大脳組織の構築に関わる論文で、幹細胞がもつ“自己

肺線維症の原因遺伝子をCRISPR/CAS9を用いて修復しフェノ

16)

組織化”
という能力を実証した 。もう一つは、2009年にSatoら

タイプが正常化することを示したりするなど、
iPS細胞由来オルガ

が報告したLgr5陽性小腸幹細胞を用いた腸管オルガノイド形成

ノイド技術やイメージング技術、遺伝子改変技術の組み合わせに関わる論文で、ニッチ環境の再現による幹細胞制御で生体にが病態研究に大変有用であることを示した。またオルガノイド培

類似した三次元培養体を作製できることを明らかにした 。さら養を用いて、iPS細胞由来肺胞上皮細胞を長期間にわたり増殖さに、2007年にTakahashiらが樹立したヒトiPS細胞 が広く利用

オせることなども可能になった25, 26)。気道上皮細胞においても、できるようになると、オルガノイド技術と組み合わせてヒトの臓

ルガノイド培養を行うことによってより成熟した機能的な繊毛上器形成を再現可能なツールとして様々な領域で応用されるよう皮細胞を分化することができるようになるなど27)、iPS細胞から成になった。またTakebeらが血管構造を持つオルガノイド形成に熟した呼吸器細胞を分化・維持する方法として、
オルガノイドの有より生体模倣性を高めるために多系統の細胞成功したように 、用性に関する多くの報告がなされている。一方、患者検体等から種を共培養する試みも進んでいる。

分離した初代培養細胞を用いたオルガノイド作製については、先呼吸器のオルガノイドも他臓器と同じく、発生学や幹細胞生物

述の通り細胞採取自体に伴う侵襲性の問題や安定した細胞増殖学の知見の上に発展してきた。2009年にRockらは、気道上皮細が難しかったこともあり、汎用的な手法は限られていた。
しかしマ胞において基底細胞が組織幹細胞の役割を持つことをマウスのウスなどの実験動物を用いた幹細胞ニッチの研究などから、呼実験などを通して証明し、表面抗原を用いて分離した基底細胞

吸器細胞系譜の制御に関わる因子などが同定された結果、分離を三次元培養することにより、繊毛上皮細胞や粘液分泌細胞なした組織幹細胞を用いて効率的にオルガノイドを作製すること

ど実際の気管・気管支構成細胞への分化や構造を模倣することが可能になってきた。Katsuraらはヒト肺から分離したⅡ型肺胞上

17)

18)

19)

ができることを示した 。この論文を発表したHoganらの研究グ

皮細胞を、線維芽細胞との共培養系を用いずに複数の成長因子

ループは、2013年に従来in vitroでの培養維持が困難とされてや化合物を添加した培養液だけで肺胞様の三次元構造を形成さ

20)

図2 オルガノイド培養

せ、増殖・分化させることに成功した28)。またこのモデルを用いて新型コロナウイルス感染モデルを作製することにも成功した。さらに初代培養気道上皮細胞からオルガノイドを作製し、より長期間にわたって拡大培養したり、嚢胞性線維症や呼吸器ウイルス感
染モデルへ応用したりすることも可能となった29)。
このように呼吸器オルガノイドは、iPS細胞あるいは初代培養組
織幹細胞などを用いた臓器形成、組織再生メカニズム等の研究から呼吸器疾患の病態研究まで、幅広い応用展開が行われている。こうした取り組みの中から、今までの培養系では困難であった新規メカニズムや創薬ターゲットの同定など、実際の患者治療につながる知見が得られることが期待されている。

17

特集

細胞アッセイ

Organ-on-a-chip

06

細胞を気道オルガノイドに分化させ、嚢胞性線維症の病態再現や治療薬評価が可能であったと報告している33)。また遺伝性肺線維症を来す、Hermansky-Pudlak症候群患者から樹立したiPS

幹細胞が持つ自己組織化能を活用したオルガノイドと異なり、細胞を用いた疾患モデリングも報告されている24, 34)。さらに、先マイクロ流路系などの工学的な技術を応用した生体環境を模倣

述のorgan-on-a-chipの技術と組み合わせて気道繊毛上皮細する試みの一つとして、Organ-on-a-chipと呼ばれるデバイス

胞の分化や原発性線毛機能不全症の疾患モデル形成を行った技術がある。本系の最大の特徴は、収縮伸展やフローなどの生報告もある35)。こうした遺伝性疾患に加えて、肺胞オルガノイドに

体臓器におけるメカニカルな刺激(以下、メカニカルストレス)を、

薬剤障害を加えることにより肺線維症モデルを作成したり36)(図in vitroで再現可能にしたところにある。常に呼吸に合わせた収3)、iPS細胞由来気道上皮細胞を用いて新型コロナウイルス感染

縮伸展を繰り返し、気流や血流などのフローも含めた多様なメカモデルを作製し薬効を評価したり37)することが可能になってニカルストレスがかかる臓器である肺は、本系において格好の研いる。

究ターゲットとなってきた。実際、organ-on-a-chipの概念が初めて世に示されたHuhらの論文は、lung-on-a-chipとしてメカニ

図3 iPS細胞由来肺胞オルガノイドを用いた線維症モデル

カルストレスに対する生体の反応を再現するものであった30)。その後、本論文の責任著者であるIngberの研究グループからは、肺を含む様々な臓器に関するchipが作製され、病態モデル作製などに応用されている。さらにこれらの知見をもとに設立された
Emulate社が、本系の実用化に成功し、現在創薬研究などに広く用いられている。また最初の論文から10年が経ちより肺の生体模倣性を高めるために、chipを構成するメンブレンなどをより生体に近いものにした第二世代とも言うべきlung-on-a-chipも登場してきた。Zamprognoらは、従来organ-on-a-chipに多用されていたPDMS膜ではなく、エラスチンとコラーゲンの合成膜で構成されたlung-on-a-chipを開発し、メカニカルストレッチなどを再現することに成功した31)。これらの系は呼吸器疾患の病態研
究や創薬応用だけでなく、気流の再現を活用したPM2.5の吸入
物質毒性研究にも応用されている32)。

またiPS細胞を用いたヒト肺モデルの展開として、スループット

Organ-on-a-chipの問題点は、chipに搭載する細胞ソースやの高い創薬アッセイへの応用や将来的な再生医療への応用が期搭載された細胞の性質・機能維持が不十分であったと考えられる

待される。双方を実現するためには、細胞量産系の開発が必要でが、前項でも述べた幹細胞生物学的知見の蓄積とiPS細胞などをあるが、IkeoらはiPS細胞由来肺前駆細胞をファイバー状に培養含めた細胞ソースの多様化により、より安定かつ複雑な生体環境する方法により、安定的に拡大培養できることを報告した38)。さらを模倣することができるようになると考える。またこれらのchipに、iPS細胞由来肺前駆細胞をマウスに移植することにより、初めは、例えばliver-on-a-chipやkidney-on-a-chipと連結することて肺胞領域への生着に成功した。呼吸器領域でのiPS細胞の応で、多臓器間の相互作用などを再現することが可能になると考用は他臓器に比べ遅れてきたが、将来の創薬あるいは再生医療

えられており、いわゆるbody-on-a-chipの概念実現が期待さへの応用へ向けた研究が着実に進んでいる。

れる。

iPS細胞由来ヒト肺モデル

07

まとめ

08

肺は機能的にも構造的にもin vitroモデルを形成することは困オルガノイドに関する項でも述べたように、
ヒトiPS細胞は元来難と考えられていた。
しかしiPS細胞や組織幹細胞などを中心と採取にハードルがあった初代呼吸器細胞に代わる、ヒト肺モデル

した幹細胞生物学の進展と、組織・生体工学を加えた様々な解析の細胞ソースとして有望視されている。特に気道や肺胞上皮細技術を組み合わせることにより、生体模倣性の高いヒト肺モデル

胞の分化誘導方法確立に伴い、これらの細胞を種々の呼吸器疾を作製することが可能になってきた。新型コロナウイルスのパン患モデルに応用する研究が盛んになっている。またiPS細胞は血デミックに伴い世界中で行われているメカニズム研究や創薬の液などの検体から樹立が可能なため、臨床検体の入手が比較的現場において、
これらヒト肺モデルが当たり前のように使用され困難な遺伝性希少疾患の研究において大きな威力を発揮していており、病態理解や薬剤開発を行う上で欠かせないツールとなっる。例えばMcCauleyらは、嚢胞性線維症患者から樹立したiPSた。今回のパンデミックを契機に、
ヒト肺モデルの生体模倣性向

18

THE CHEMICAL TIMES
上や実用化がさらに加速していくと考えられる。例えば将来的には”clinical trial in a dish”のような、臨床試験機能を置き換えることや個別化医療を実現するツールとして、あるいは再生医療

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19血管網との共培養に着目した
Microphysiological systems (MPS)の開発
Development of microphysiological systems (MPS)
focusing on co-culturing blood vessels

横 川 隆司Ryuji Yokokawa

京都大学大学院 工学系研究科マイクロエンジニアリング専攻 教授
Department of Micro Engineering, Kyoto University (Professor)

Microphysiological systems (MPS)

01

はじめに

マイクロ流体デバイス

マイクロ・ナノ加工技術

μTASは、有機・無Lab-on-a-Chipとも呼ばれるようになった 3)。
機化学においてベンチトップで実施される溶液輸送、混合、反応、ろ過、検出などの複数の操作をワンチップ上に統合しようという

マイクロ流体デバイス内に臓器細胞を培養した生体模倣システ

考え方であり、マイクロ流体デバイス（チップ）
はフォトリソグラ

ム、すなわちMicrophysiological systems (MPS)によりヒト

フィを中心とした半導体プロセスによって作製される。半導体プ

臓器の機能を再現するという概念が広く知られるようになった。

ロセスを用いて電気・機械的な機構を作製するMicro Electro

以前は、臓器細胞を培養することに力点を置いて、より直接的にMechanical Systems（MEMS）の隆盛に続きμTASの研究分Organ-on-a-Chipと呼ばれていた。これらの細胞培養技術は、野が広がった。初期のμTASでは、
アミノ酸4)や核酸5)の分離検出

従来の培養皿を用いた場合よりも生体内の臓器機能を適切に表

チップが多く報告されており、これを細胞生物学に応用しようと現することができる。そのため創薬支援ツールとしての利用が期いう流れはごく自然に進んできた。例えば、マイクロパターンを待されるようになり、生理学的な機能計測に着目してMPSという用いて細胞を配置する技術は1994年に報告されており6)、マイ

呼称が一般的に使われるようになった。近年、創薬におけるMPS

クロチャネル（流路）の中での細胞培養は2001年に報告されての位置付けについて論じた総説は多く発表されており、創薬応用

マイクロスケールにおける細胞培養では、細胞いる7)。その後も、。

間相互作用や細胞への物理化学的な刺激を制御しやすいことか

本稿では、MPSを工学的なシステム創成と捉えて、そのマイクら、様々な細胞アッセイが報告された。2010年頃までのオンチッ

ロ加工技術に立脚したアプローチを概説する。まず、Organ-on-

プ細胞アッセイについては、総説が多く発表されている8)。

a-Chip以前のマイクロ流体デバイスと細胞アッセイの融合研究

最初のOrgan-on-a-Chipとして、Lung-on-a-Chipが2010からMPSへの展開、およびMPS研究を支えてきた研究プロジェ

年に報告された9)。上記のオンチップ細胞アッセイとの違いは、クトについて述べる。次に、ヒト臓器の構造において特徴的な血Lung-on-a-Chipが肺胞上皮細胞と血管内皮細胞の共培養に管構造と実組織の界面を設計するという着想に基づいて、具体より上皮・内皮組織の界面を再現しただけでなく、その細胞極性的なMPSの例を紹介する。セルカルチャーインサートのように界を規定しそれに依存したアッセイを実証した点である（図1a）。

に関する議論はそちらに譲る

1, 2)

面を平面的に再構成する二次元MPS、スフェロイドやオルガノイ

MEMSやμTASに比べるとマイクロ加工技術に求められる技術

ドなど三次元組織の培養のための血管網を有する三次元MPS

レベルは高くないものの、複数の生細胞を扱うための技術課題について近年の研究例を紹介する。最後に、MPS研究においては広範にわたる。つまり、チップの材料選定、細胞外基質（ECM）

アカデミアが有する課題と今後の期待について述べる。

コーティング、培地最適化により細胞培養系を設計しなければならないこと、培養皿に比べはるかに少数の細胞から分子生物学

02

Organ-on-a-ChipからMicrophysiological systems (MPS)へ的な評価をしなければならないことから、求められる技術分野が格段に広がった。この点が、学術的に多くの分野の研究者の興味を引き、Lung-on-a-Chipが高く評価されることとなった所以である。この成果を皮切りに、腸、腎、血液脳関門
（BBB）
など様々

マイクロ流体デバイスあるいはマイクロ加工技術と細胞培養な臓器モデルが次々に開発された。ここで述べるまでもなく、創技術の融合は、1990年代前半から報告され始めた。これには、薬における有効性と安全性の向上という喫緊の課題や、Organ-

A. ManzらによるMicro Total Analysis Systems（μTAS、マ

on-a-Chipによる候補医薬品評価のコスト削減や開発期間短縮

イクロタス）の概念の提唱が大きな貢献を果たしており、後になどのニーズの高まりが背景にある。

20

THE CHEMICAL TIMES(a) 上皮細胞

培養液

(b)

(c)

多孔質膜
血管内皮細胞

培養液

RP

TE

C

C

VE

HU

明視野観察
真空吸引用チャネル(d)

200 µm膜下側の血管内皮細胞(e)

HUVECs (RFP)

真空吸引により多孔質膜を伸展し引っ張り刺激を付与

100 µm膜下側の血管内皮細胞
真空吸引

HUVECs (CD31)

膜上側の上皮細胞

RPTECs (ZO1)

図1 二次元MPSの構成 a) 多孔質膜の上側に上皮細胞、下側に血管内皮細胞を培養する。左右のチャネルは真空吸引することにより、多孔質膜を伸展し引っ張り刺激を付与する。b) 流路内培養した近位尿細管上皮細胞（RPTEC）と血管内皮細胞（RFP-labeled
HUVEC）の明視野像。c) RFP-labeled HUVECの蛍光像。d) HUVECのCD31免疫染色像。e) RPTECのZO-1免疫染色像。

Lung-on-a-Chipモデルを基盤に、米国では即座にheart-

広く定義されており、半導体プロセスに限らず射出成型や3Dプ

lung tissue chipを用いた薬剤の安全性と有効性を評価する

リンタを用いたチップも含まれる。この定義は、創薬において従National Institute of Health (NIH)のプロジェクトが開始さ

来の培養皿を用いた細胞培養実験や動物実験に代わる医薬品

れた（https://ncats.nih.gov/tissuechip/about）。これは、あの評価方法が非常に強く求められていることを反映しており、こ

くまでレギュラトリーサイエンスプログラムの一環として開始さの目的に合致するあらゆるアプローチを取るという研究者の強れたが、それ以降も関連の研究プロジェクトが広がり、2016年

いメッセージである。このような経緯から、本稿においてもこれの世界経済フォーラムにおいてOrgan-on-a-ChipがTop 10

以降はMPSと呼ぶこととする。

Emerging Technologiesとして取り上げられるに至った。このアカデミアにおける研究分野の形成を受けて、MPSの実用頃になると、各論文誌における特集号やメディアへの露出によ化に向けた企業の動きも活発になった。その一つとして、多くり、特に創薬支援技術としての位置づけが注目され、広く認知さの製薬企業が参画するThe International Consortium forれるようになった。さらに、単一臓器の微小環境の再現に留まら

Innovation and Quality in Pharmaceutical Development

ず、三次元アッセイとの融合や複数臓器との連関を評価すること(IQ Consortium)が、2018年にIQ MPS Affiliateを設立した

で、ヒト臓器に対する外挿性を高める取り組みが広がっている。

（https://www.iqmps.org/）。MPSの社会実装に向けた課

アカデ ミアに お け る 研 究 として 、米 国 で は 2 0 1 2 年 から

題、特にcontext of use (COU)に沿ったチップ作製から細胞

NIH、Defense Advanced Research Projects Agency

アッセイまでのパッケージを規制当局に受け入れてもらうことが(DARPA)、Food and Drug Administration (FDA)の共同

重要な課題であると位置付けて活動している。IQ MPS Affiliate

プロジェクトを17名の主たる研究者が牽引する形で、ヒト臓器では、MPSが「薬物の有効性と安全性に関する独自の洞察をもを網羅的にオンチップ化する取り組みが始まった。2014年からたらし、現在創薬や薬剤開発に用いられているin vitroモデルには第2フェーズとして複数のOrgan-on-a-Chipを接続すること

比べ、in vivoにおけるヒト臓器や組織の生理的機能を予測できによる多臓器モデルが開発された。2017年までの5年間で約る可能性のある革新的なモデルである」と期待を寄せている。

160億円の大型プロジェクトとなり、新たな学術研究分野の形成

IQ Consortiumでは、実用化に向けた議論を企業間の議論としに貢献した。また、このプロジェクト推進の過程において、FDAて留めるのではなく、学術論文誌に掲載することでアカデミアにが微小環境における組織や臓器の生理機能を再現する技術を新たなMPS開発の期待を寄せたり、規制当局にMPSを用いた標

Microphysiological systems (MPS)と定義したことが重要

準化や基準化を促したりする情報発信により、産官学の連携を促である（https://www.fda.gov/science-research/about-

している。一方、参画企業は、それぞれがMPSを活用した研究成

science-research-fda/advancing-alternative-methods-

果を独自に発表している。つまり、コンソーシアムとして規制当

fda）。MPSは、Organ-on-a-ChipやTissue Chipも含むものと局に働きかけたり情報共有したりする活動と、各企業内での活動

21

特集

細胞アッセイが両輪となってMPSの実用化が進められている。これらの活動

定量的に加えながら、出力としての細胞の動態もリアルタイム

は年次報告書に纏められているのでご参照頂きたい（https://で観察し評価ができる。それを実証したのが前述のLung-on-a-www.iqmps.org/annual-report）。

Chipであり、上側の流路に上皮細胞、下側の流路に血管内皮細2010年代後半のMPS開発について、米国の動きを例に紹介し9)。本稿では、Lung-on-a-Chipの詳細胞を培養している（図1a）てきた。この間、学術的な成果として多くの論文が発表されたこな解説は拙稿に譲り12)、その後の二次元MPSの展開について述と、初期から複数の学術分野の融合とレギュラトリーサイエンス

べる。

からのアプローチを盛り込んだこと、NIHのNational Center

例えば、血液脳関門モデル（BBB）
では、下側の流路にヒト脳微for Advancing Translational Sciences (NCATS)が産学連

小血管内皮細胞、上側の流路にペリサイト、ニューロン、アストロ

携によりMPSコミュニティの拡張を図ったことなどが特筆すべ

サイトなどを共培養した系が用いられ、血管網との共培養を可能き点である。一般的には、学術研究分野の形成後、実用化の道筋にしている。BBBにおける最重要課題は、新規候補化合物の脳内が見え始めるとアカデミアにおける研究は下火になることが多移行性の適切な評価であり、MPSを用いることで細胞のアピカ

い。
しかし、NCATSを中心に新規MPS開発のための3D tissue

ル側とベーサル側のそれぞれに独立してアクセスを行い、一方chip、Tissue chip in space、Immune Chipなど新たなプロから他方への分子輸送を評価することが必須である。分子量依

グラムによりMPSを活用した学術研究が広がっており、創薬応

存的なバリア機能、P-gp等による適切な薬剤排出機能を再現す用に限らず基礎生物学分野との連携により、学術的な深みも追ることが重要である。市販のヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、

及する取り組みがアカデミアの研究者を引きつけている 。欧州

マウス脳微小血管内皮細胞（bEnd.3）、
さらにラット神経膠腫細10)では、Horizon 2020 Future and Emerging Technologies

胞（C6）等を用いたデバイス開発の例は非常に多く報告されてOpen projectとして、Organ-on-Chip In Development

おり、経上皮電気抵抗（TEER）
計測システムを搭載したバリア機(ORCHID)が2017年から実施されEuropean Organ-on-

能のモニタリング技術も重要である。近年の例では、患者由来

Chip Society (EUROoCS)が設立された 。我が国においてのiPS細胞から内皮細胞、ニューロン、
アストロサイトを誘導しても2017年からAMED-MPS事業が開始され、肝臓、小腸、腎臓、BBBを作製し、トランスポーターの欠損やバリア機能の低下を

BBBのMPS開発が進んでおり、2022年からは第2フェーズに再現したり、薬剤の透過性予測を精度良く実施したりした例があ入った。産官学の連携により国産のMPSが活用されるよう、筆者

る13)。また、せん断応力刺激によるバリア機能の向上を評価し、らも微力ながら貢献したい。また、近年の日米欧のMPSコミュニ

擬似的な三次元環境においてアストロサイトを培養することでティを繋ぐ役割として、2022年に第1回のMPS World Summit

炎症マーカーの上昇を抑えたモデルになること、high densityが開催され、2023年はベルリン、2024年はシアトルでの開催がlipoprotein（HDL）を模倣したナノ粒子の透過や蓄積の評価が決まっている（https://mpsworldsummit.com/）。MPSに関す

報告されている14)。いずれも、MPSを用いて構成したBBBが遺伝る国際会議としての位置づけであり、今後はアジア各国からの貢子やタンパク質のレベルからin vivoの発現パターンを反映して献も必要である。

いるかの評価、得られたBBBのバリア機能や物質の脳内移行性11)の評価まで網羅的に実施されている。つまり、2015年頃までは二次元MPS：
セルカルチャーインサートからの発展

03

BBBの細胞構成や構造に着目したMPS開発が主眼であったが、近年ではマイクロ流体デバイスの最適化から始めて、動物実験も活用した臓器らしさの評価や機能の再現までを実証することが求められている。

ヒトの臓器は三次元であるから、in vitroアッセイも三次元のス

二次元MPSでは、BBBに限らず、腸、肝、腎などにおいても上記

フェロイドが優れている、と言う見方がある。一方で、臓器を微のような研究開発の流れが示されている。筆者らも、上側の流路

視的に見れば、各要素単位は二次元と見なすことができ、そのに近位尿細管上皮細胞、下側の流路に血管内皮細胞を培養した要素単位の集まりが三次元の臓器を形成していると考えること

血管網との共培養系を用いて、腎近位尿細管モデルを開発してもできる。MPSによりヒト臓器機能をまるごと再現するのではな

きた（図1b-e）。マイクロ流体デバイスの開発をベースに初代培く、その一部を抽出して再現性良くかつ定量的に評価することが養細胞や株化細胞を用いて、小腸であれば吸収、肝臓であればMPS開発の主眼であるとすれば、二次元MPSという考え方は非代謝・排泄、腎臓であれば再吸収を実証することが第一歩であっ常に理に適ったものである。

た。これらのMPSについても、近年はヒトiPS細胞を用いて高機上皮組織とそれを支える基底膜は、従来のセルカルチャーイン

能化すること、疾患特異的ヒトiPS細胞を用いて個別化医療を目サートを用いることにより良く再現されてきた。チャンバー上下

指したMPSをゲノミクスやプロテオミクスと融合して実証するこを仕切る多孔質膜のポアサイズを選択することで、薬物輸送、血とが主流となっている。また、腸肝循環に留まらず、多臓器連結モ

管新生、腫瘍の転移や浸潤などを評価できるが、これをマイクロデルを用いることや、PK/PDの数値モデルとの融合によりヒトへ

流体デバイス内に構成することでどのような利点があるだろうの外挿性を目指す方向が重要である15)。Lung-on-a-Chipから始か。極微量の培地や試薬を用いた生化学的な刺激、細胞培養時

まったMPSは、
アカデミアにおいて求められる研究の分野が広がのせん断応力刺激、基底膜に対する引っ張り刺激などの入力をり、求められるデータの質も高まることで、新たなMPS開発の方22

THE CHEMICAL TIMES
向性が示されている。

た製品が販売されており、平面培養の場合よりも薬物代謝酵素

以上の経緯から、近年のMPS研究は、システム設計からプロトやトランスポーターの発現が高いことが知られている。
しかし、

コル開発と細胞アッセイまで実証するために、非常に広範な知

その多くは初代培養細胞や株化細胞を用いることで品質管理を識と長い時間を要する。このため、マイクロ流体デバイスやそれ行っており、短期的な細胞機能の評価に留まっている。そこで、を支える流体システムの開発、およびそれを用いた基本的な細長期的なスフェロイド評価を実施するために、
マイクロ流体デバ

胞アッセイについては大学発ベンチャーに依存している研究がイスを用いた灌流技術、酸素供給、局所刺激応答アッセイなどが多い。例えば、Lung-on-a-Chipを開発したハーバード大学発の統合されてきた。つまり、
スフェロイド技術は、学術研究におけるEmulate（https://www.emulatebio.com/）
はその代表であ

ニーズから様々なオンチップ技術と融合されることにより、MPS

ドイツのTissUse（https://www.tissuse.com/en/）、オ
り 、のひとつとして捉えられるようになってきた。

ランダのMimetas（https://www.mimetas.com/en/）
など

近年では、
オルガノイド研究の発展が目覚ましく、
マイクロ流体も基盤技術をアカデミアに提供して、連携先の研究者がMPSをデバイスと融合する取り組みが広がっている。
これは、
オルガノイ

用いた学術的に重要な成果を発表している。これらのベンチャー

ドを構成する複数の細胞やECMによる細胞ニッチ、液性因子の16)

企業は、複数の製薬企業と包括的な研究契約によりMPSの創薬

濃度勾配、血流や間質流による細胞へのせん断応力などをマイ応用を進める一方、アカデミアにも基盤技術を提供して新たな

クロ流体デバイスにより定量的に規定できることが理由である。

MPSを開発する二方向にビジネスを展開している。近年は、次項

例えば、
オルガノイドアレイをチップ内で大量かつ並列に作製しの三次元MPSについてもベンチャー企業が同様の取り組みを進

成長因子の濃度勾配を与えれば、オルガノイドの分化誘導条件

めることで、産学間の知識や人材の良い循環が広がっている。

を大量かつ一括に評価できる17)。また、各種モルフォゲンの濃度勾配を規定すると、ヒト臓器の発生におけるパターン形成を模倣

三次元MPS：生体の発生に倣うできることから基礎生物学におけるマイクロ流体デバイスの利

04

用が広がっている（図2a）。オルガノイド技術についても、発生生物学的なニーズからオンチップ技術との融合に至った研究例が多く、今後も臓器発生における細胞ニッチを規定するための技

二次元MPSでは、実質細胞と血管内皮細胞の界面を微視的に術としての位置づけが重要である。既にオルガノイド創薬は多く再現するに留まり、複数種類の細胞の共培養や細胞密度の高いの製薬企業が着手しているところであり、Organ-on-a-Chipが環境までは再現できない。これを実現するため、細胞凝集塊であ

MPSの1つとして活用されるようになることを期待したい。

るスフェロイドを用いた毒性試験や薬物動態試験が広く行われスフェロイドやオルガノイド技術に加え、細胞や高分子材料のており、長年にわたる細胞選定やアッセイ技術の蓄積がある。ス

3Dプリンティング技術、細胞シートを積層するバイオエンジニア

フェロイドの大量並列作製に用いるプレートと細胞をキットにしリング的な三次元化技術などを含め、三次元の細胞培養モデル

(a)

(b)
iPS 細胞PDMSピラースフェロイド導入口
500 µm

チップへの細胞播種(c)

スフェロイド、オルガノイド
アレイ作製

血管床

除去可能な薄膜

スフェロイド・オルガノイド

濃度勾配、せん断応力刺激の付与

遺伝子解析
機能解析
毒性試験
形態評価
血管床形成チップ

血管網内の流れ図2 三次元MPSの構成 a) スフェロイド、
オルガノイドアレイの製作と、濃度勾配やせん断応力刺激の付与。b) 血管新生による三次元組織と血管網の接続。c) 血管床を用いたスフェロイド、
オルガノイドの共培養チップ。

23

特集

細胞アッセイが確立してきた。これらをそのまま細胞アッセイに用いることも

05

おわりに

できるが、細胞塊内部は酸素や養分不足により壊死してしまい、
長期アッセイには向かない。そこで、三次元モデル内部の細胞に酸素や養分を供給し、経血管的な薬剤投与実験をするために血MPSに必要なMEMSやμTASといった要素技術の研究・開発は管網を融合する試みが広がっている。チップ内に血管網を作製す

我が国がトップランナーでありながら、
なぜMPSについては欧米

る技術は、
ヒト肺線維芽細胞（hLF）
からの液性因子とHUVECの諸国に先を越されてしまったのかを工学的視点から考察して結自己組織化能を活用して作製され、我々は血管新生能を活用しびとしたい。我が国においては、日の丸半導体がトップを走ったてスフェロイド内に血管網を構築した（図2b）。近年では、スフェ

1980年代を受けてMEMSが広がり、その後MEMSを活用したロイドが十分な血管新生因子を有しない場合にも、血管網構造

μTASが広まったため、これらの分野における日本の基礎から応と共培養できるような血管床デバイスを開発した。この技術を用研究の層は厚い。一方、Organ-on-a-ChipやMPSは、MEMS

用いると、灌流可能な血管床の上にスフェロイドやオルガノイド

やμTAS以上に複数の学術分野が連携した融合分野の研究であを培養し、その内部まで血管網を導入して灌流することもできる

り、
この分野における我が国のプレゼンス向上が今後さらに望（図2c） 。通常のシャーレを用いた培養ではhLFの液性因子はまれる状況である。この要因のひとつは、複数の研究費配分機関

拡散してしまうが、チップ上で濃度勾配を維持することによってが研究目的や対象ごとに分かれており、MPSが必要とする基礎

血管新生や脈管形成を誘導している。つまり、チップがあるからから応用かつ複数分野を幅広くかつシームレスに繋いでサポー

こそ実現可能な血管網を有する三次元MPSが実現できたのでトする体制がなかったことである。また、我が国特有の研究者育ある。

成制度がMPS研究に適応していないことも挙げられる。つまり、三次元の血管網を用いた共培養の例として、骨や筋組織に対す

大学学部教育では学科のカリキュラムにより特定の学問分野をるがん細胞の転移モデル、骨組織モデル、血液脳関門モデルな深めることが重視されており、大学院においてもバイオエンジニ

どが報告されている。筆者らは、乳ガン細胞MCF-7を用いたス

アリング専攻など分野横断型の専攻、あるいは分野横断型の履

フェロイドに対する薬剤投与実験 、胞巣状軟部肉腫モデルにお修が認められている専攻に所属していなければ、MPSに必要なける血管壁透過性の変化などを実証している18)。

学問領域を履修することは難しい。1990年代からDepartment

今後は、二次元MPSと同様に、疾患特異的ヒトiPS細胞を用いた

of Biomedical Engineering（BME）が設立されて学部レベル

病態モデルを展開することで、三次元化技術を利用したMPSのでも医工融合教育が進んだ欧米諸国や、それに追随して2000

18)

19)

活用が広がるものと期待される 。培養皿における培養から始年代にBMEが設立されたアジア諸国と比べると、我が国のMPS

まり、二次元MPS、三次元MPS、多臓器連結モデルへと展開してに必要な融合領域の人材育成は遅れている。このような現状に

ヒト臓器との相関を求める方向と、細胞アッセイのスループット

対し、AMED-MPS事業が開始されたことにより、国家プロジェクを上げる方向は相反するものがある（図3）。本稿で紹介した例はト主導で大学院生の視野が融合領域に広がってきたことは歓迎

16)

MPSのごく一部であるが、このトレードオフを考慮しながらCOU

したい。例えば、AMED-MPS事業には機械系の研究者が多く参に応じたMPSが今後多く開発され、創薬の現場において活用さ画しており、学生がMPSを機械工学における研究テーマの1つとれることを期待したい。

して捉え始めたことは重要である。さらに、国内の大学にも医工融合教育を目指した大学院が増えたことにより、大学院を目指す
学部生にもMPSが将来の研究テーマとして視野に入り始めていることを実感している。今後、各分野の垣根を越えた学部・大学

ヒト臓器との相関
二次元静置培養

MPS を用いた三次元静置培養
二次元灌流培養
スフェロイド オルガノイド

MPS を用いた三次元灌流培養

mimetas.com

emulatebio.com

アッセイのスループット
図3 従来の細胞アッセイ法とMPSの位置づけ

24

MPS を用いた複数臓器の統合培養

THE CHEMICAL TIMES
院教育を通して研究者の裾野が広がることで、我が国がマイクロ・ナノ加工技術やヒトiPS細胞技術の強みを活かしたMPSを開発し、当該分野における主導的な役割を果たすことを期待したい。
謝辞
本研究の推進にあたり、AMED-MPS事業（課題番号JA17
be0304205）、次世代がん医療加速化研究事業（P-PROMO
TE、課題番号JP22ama221206）、文部科学省「ナノテクノロ
ジープラットフォーム」
事業（課題番号：JPMXP09F19KT0107）、
立石科学技術振興財団の支援を受けました。
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25

新規in vitro細胞アッセイとしてのMicrophysiological Systems（ 生体模倣システム）- MPSの開発を色々な面から眺めてみる
Microphysiological Systems as a Novel In Vitro Cell Assay Looking at the Development of MPS from Various Perspectives

石 田 誠一Seiichi Ishida

崇城大学大学院 工学研究科 応用生命科学専攻 教授

Division of Applied Life Science, Graduate School of Engineering, Sojo University (Professor)

Microphysiological systems (MPS)

序

01

MPSとは

02

本稿では、新規in vitro細胞アッセイとして近年学会や専門

ヒトの組織/臓器から細胞を単離し実験室で培養すること、つま誌で目にする機会が増えているMPS（ Microphysiologicalり試験管内（in vitro）
においてヒト組織/臓器を模倣しようとい

Systems：生体模倣システム）について論じる。MPSの定義や、使う試みは古くから行われており、HeLa細胞が樹立された1950

用目的から求められる機能、模倣の対象とする臓器/組織による年代から現在まで連綿として試みられている。人工臓器やバイオMPSの構成要件、規制側から見たMPSの位置づけなどについリアクターのような大がかりな培養装置は別として、長らくは培て、それぞれにまつわる異なる視点からの議論を対比させて扱う

養ディッシュの中で細胞を平面的に培養するだけにとどまっていことで、MPS開発の将来展開を考えてみたい。MPSについては、た。
しかし培養器への微細加工技術が進展したことや、初代培養

近年多くの総説が出ており、筆者が参加したAMED-MPSプロ細胞の維持培養法やES細胞、iPS細胞に代表される幹細胞分化

ジェクトの概要も含め、そちらも参考にされたい。

1, 2, 3, 4, 5)

誘導法の開発が進むにつれて、さまざまな培養器と細胞資源が利用できるようになり、近年多様な細胞培養手法が提供されるよ
うになってきた。それらをスループット性と生体機能の反映度か

図1 in vitro培養系の分類

26

THE CHEMICAL TIMES
ら分類すると図１のようになろう。スループット性は従来からの平が期待値であろう。一方で、MPSを利用する業界によって、当然面培養がやはり優れているが、生体機能を模倣するという点ではながらCoUが異なる点は注意を要する。筆者が今まで関わって限界がある。それらを両立させるために、生体を構成する複数のきた分野を例に挙げると、化学物質の分野と医薬品分野では、細胞を共培養する系や膜透過性を再現するセルカルチャーイン

CoUが異なっている印象である。

サートの系などが開発されてきた。また、幹細胞からの分化誘導

まず化学物質の分野では、
ヒト健康影響評価の代替法の開発

技術が開発されたことにより、組織分化の系譜をなぞることで三が大きな課題となっている。そのため従来の実験動物で行って次元的なミニ組織をin vitroで構築する、
オルガノイドの形成もいた評価項目に対して、いかにMPSというin vitro細胞アッセイ可能になってきている。このような培養を行うことで、生体機能

が当てはまるかが、注目される点であろう。化学物質の分野におを高度に模倣することが可能になってきた 。以上は、生物学的ける動物実験の代替においては、MPSは従来から用いられていな側面からのin vitro細胞培養の生体模倣を目指す技術である。

る試験法の延長線上に位置づけられると考える。すなわち、化学

一方で、生体の中で見られる血流のような力学的効果を培養に物質による有害事象をAOP（Adverse Outcome Pathway：有取り入れて生体模倣を目指す、灌流培養も考えられている（灌流

害性発現経路）に沿って解析した際、そこに含まれるkey event

培養に対し、従来の培地が循環しない培養を静置培養と呼ぶ）。

(遺伝子やタンパク、免疫系に生じる事象)の評価に有効な試験系

元々、灌流培養はバイオリアクターによる細胞の大量培養や人がMPS開発に期待されるところではなかろうか。もともとAOP

工臓器で検討されてきた技術であった。ところが微細加工技術

が一連の有害事象をkey eventという細胞内の応答に還元してを用いることにより、灌流培養はチップサイズでも可能になったいく考え方であるため、MPSに求められる性能も細胞全体より、6)ため、ごく普通のインキュベーターがあれば灌流培養を行えるよ

注目する遺伝子やタンパク、免疫系など、細胞内で起こる個々のうになってきた。細胞の培養面で培地を灌流することで流れの効反応をいかに的確に評価できるかが、考慮する点になると考え果を取り込むための培養器が構成の基本である。その一方でそる。一種、組織や臓器、それを構成する細胞、というブラックボッ

れらの培養器を複数連結させることにより、複数の組織もしくはクスから、有害事象を惹起する分子生物学の反応を理解してい臓器間の連携を模倣することも可能である。従来これらは、それくリバースエンジニアリングに似た視点からの開発が求められぞれ単組織/臓器チップ（organ-on-a-chip）、
多組織/臓器チップているともいえる。ただし、AOPによる有害事象の理解が進むこ（organs-on-a-chip）と呼ばれているものである（図1）。

とで、次のステップはkey event同士を繋いでいくこと、さらに

そもそもMPSとは何であろうか。近年、MPSの開発が進む中、は、複数のAOPの連関を見る方向がみえてくる。Key event一

米国食品医薬品局（FDA）
から「生体模倣システム
（MPS）
は、
ヒ

つを再現するのが単組織/臓器チップであるとすれば、今後、そトや動物由来の特定の組織や器官の機能的特徴をin vitroでモ

れらをいかに連結していくか、言い換えれば、多組織/臓器チップ

デル化するために、その機能や病態に重要な生理学的側面を模に組み上げていくかが論点になってくると思われる。現在、IATA

倣した微小環境に細胞を曝露することによって、マイクロスケー（Integrated Approaches to Testing and Assessment：

ルの細胞培養プラットフォームを提供するもの。」という定義がさまざまな情報（in vitro, in silicoなど）を統合して有害事象の提唱され、MPSの守備範囲が広範囲に拡がったように感じる。一

評価をする手法）構築の一環として、化学物質の体内動態をdry

方で、Pfizer社のグループからは、「Complex in vitro Models

simulatorの一種であるin silicoで予測するために各機関にお(CVM)」という概念で従来からある培養ディッシュを用いた平いて議論されているが、MPSがwet simulatorとして用いられ面培養を除く培養系すべてがMPSである、という主張がされてるようになる日が来るかもしれない 。

おり、欧米の製薬企業が中心となり活動するIQコンソーシアムの次に医薬品分野におけるMPSへの期待は、開発品の体内動態

MPS分科会ではこの理解が一般的になっているようである。
しかを考慮した毒性評価や安全性評価、薬効評価である。これらの中し、このような細胞培養技術を広範囲に包含する定義では、論点でも特に、従来の手法では評価が難しかった項目（アンメットニーがぼやけるため、本稿ではMPSを「組織臓器内の血液の流れをズ）を解決するための、新規細胞アッセイとしてMPSが期待され

in vitroで模倣し、血流が細胞に及ぼす力学的影響と共に、細胞ているであろう。医薬品の開発においては、化合物
（開発品）
を投

の栄養素や代謝老廃物、または薬剤などの物質移動の影響をin

与後、血流により体内に分布して組織/臓器に取り込まれ、どこで

vitroで解明できる新規の灌流培養装置」という観点で扱ってみどのような効果を示すかを細胞全体で評価することが望まれる。

たい。

特に、今まで細胞アッセイでは難しかった薬効や毒性の判別、分

7)

6)

8)

子機構解析ができる細胞アッセイ系は“アンメットニーズ”に応え

MPSに期待されているもの

03

るものとして期待が高い。この場合、化合物が標的とする細胞応
答だけでなく、化合物の細胞内への取り込みや細胞内での代謝、標的以外の細胞応答を含めた評価系である必要がある。そのため医薬品開発の場におけるMPS開発においては、組織/臓器らしでは、MPSにより何を解明することが期待されているのであろ

い応答（我々はこれを「臓器らしさ」と呼んでいる）を評価できる、うか。
「新規」の培養装置という点において、従来の培養法では難in vitro評価系が期待されているようである。

しかった細胞アッセイ系としての使途（Context of Use：CoU）

27

特集

細胞アッセイMPSに求められる性能と特徴

04の接着（タイトジャンクション）が維持されていることは重要である。一方、実質組織・臓器では、化学物質への応答を惹起するさま
ざまな分子機構が細胞に備わっていることは重要である。また上MPSに求められる性能と特長を説明するためには、まず物質が記に加えて、化学物質を細胞内に取り込む機構が必要になる場

どのように体内へ取り込まれてどのように代謝され排泄されるか合もある（例えば肝実質細胞における物質の取り込み機構）。

を知る必要がある。そこで体外から取り込まれた物質が体内を巡

MPSはこれらの組織が有する機能を、in vitroで再構成しやすり、体外へと排泄される主な経路をまとめた様子を図２に示す。

いようにさまざまな工夫がなされており、従来の培養器とは区物質が体外から体内に取り込まれるためには、肺や小腸などの細別される利点である。代表的な例を、図３にまとめた。バリア組織

胞膜を透過する必要があり、細胞膜を透過した物質は血流に乗っ

MPSは、従来からあるセルカルチャーインサート培養器を発展さて全身へ行き渡る。小腸から吸収された物質は門脈に乗り肝臓せたものが基本である。例えば、A)では培地の流れが培養下面に入る。肝臓は、小腸門脈や肝動脈血内の物質を処理し、体内でに限られるが、B)では細胞培養面の上下で培地の流れを持たせ利用できる分子に変換するか、不要なものは体外に排泄されやることにより、細胞を透過する前と後で物質（培地）のやり取りがすい分子に変換したのち、全身の血流に戻す。一部の物質は胆容易になっている。以上の二つのバリア組織MPSは、細胞を透過

汁とともに小腸へ戻り、糞便中に排泄される。また全身を巡る物

性のある孔の空いた膜（トラックエッチング膜）の上に播種してい質のうち、不要な物質は腎臓から尿中に排泄される。末梢に運ばるため、細胞が形成する膜における上下の透過率は膜自身の開れた物質は組織/臓器に分布する。この物質の体内の動きと組織

孔率によって制限を受ける。その一方で、C)のバリア組織MPSは/臓器の関係を物質の視点からまとめると、表１のようになる。すトラックエッチング膜よりも開口率の高いECM(Extracellular

なわち、物質の取り込みや排泄の際に通過する小腸や血管のよMatrix：細胞外基質)の界面に沿って細胞が膜を形成するため、うな組織（バリア組織）と、組織/臓器に取り込まれた物質を利用

物質交換の効率が高いのが特徴である。またD)の実質組織する実質細胞からなる組織（実質組織・臓器）の2種類に分けられ

MPSは培地を灌流させることにより、流れによる刺激を細胞に与る。それぞれの組織における機能の特徴を見てみよう。まずバリえることが可能となっている（後述）。

ア組織では、物質透過の方向性が重要である。例えば、小腸粘膜
上皮では腸管の管腔から血管へ、血管では血管内から組織/臓器へ、という物質の流れを保つために物質の取り込みと排泄が極性を持って行われることが必須である。このような極性を持つた
めには、それに関わる分子機構（例えばトランスポーター）が配向性をもつことや、細胞間隙からの漏れを防ぐために細胞―細胞培地灌流の効果

05

冒頭でMPSの定義を議論した際、本稿でのMPSに付与されている機能として、「血流が細胞に及ぼす力学的影響」と「細胞の栄
養素や代謝老廃物、または薬剤などの物質移動の影響」を挙げた。ここでは、培地を灌流する効果について触れてみたい。
培地を灌流することができるのはMPSの特徴であるが、培地（液体）に流れを持たせることで引き起こされる現象として、剪
断応力と層流が挙げられる。MPSの培養器内における細胞の上面に培地が流れる際、培地は粘性のある液体であるため、培地と接する面にある細胞へ力を及ぼす（剪断応力）。このような剪断
応力の影響は、生体内では血流と血管内皮の間でよく知られており、血流による剪断応力によって内皮細胞が流れ方向に配向
し、物質の透過性や生理活性物質の生産能に対して影響を及ぼすことが報告されている。このような灌流がもたらす剪断応力の効果は従来の静置培養では期待できず、MPSがin vitroで再現できる特有の効果と言える9)。もう一つ、培地の灌流を行えること
により再現することが期待される生体環境の模倣として、肝類洞構造に見られるゾネーションがある。肝臓の類洞は、門脈から中心静脈に向かって肝実質細胞が一列に並び、その間を門脈からの血液が流れている。門脈側からは肝動脈も流れ込んでおり、酸素や栄養に富んだ環境にある。一方で、中心静脈側へ向かうにつれて酸素は肝実質細胞に消費され、肝実質細胞からの老廃物や代謝産物が増えてくる。その結果、門脈側に位置する肝実質細胞

図2 体内における化合物の流れ

28と中心静脈側の肝実質細胞では環境が異なっており、実際、糖代THE CHEMICAL TIMES
謝（糖新生、解糖）
をはじめとする細胞機能に差異が生じている。

き、MPSの解釈が冒頭のように拡げられたように感じる。
しかし、また肝実質細胞に対する化合物の応答も類洞の位置により異な最近になり、単組織/臓器の培養系が技術的に成熟し始めると、り、例えば四塩化炭素の毒性は中心静脈周辺に認められるというまた、多組織/臓器を連結させるMPSの開発が活発化する兆しことが知られている。そこで実質組織MPSのように閉じられた空が見えてきた。多組織/臓器を連結させる方法は色々と試行さ間で液体をゆっくり流すと、乱流を生じず流れに沿って規則正しれているが、基本は図４に示すような、単組織/臓器チップを複数

く流れる状態（この状態を「層流」という）を作ることができる。こ流路で連結したものである。先に行われたMPS World Summit

れを応用すると、上述した肝ゾネーションをin vitroで再現でき、（https://mpsworldsummit.com/）
でも、複数の組織/臓器肝障害の詳細な解析が可能になると期待される 。

を連結させたorgans-on-a-chipの報告が多く見られた11)。た10)

だ、
ここで注意しなければならないのは、「高機能の単組織/臓器
チップを単純に連結させれば多組織/臓器チップが作れる」
とい

06

うほど、
ことは単純でない。それぞれの単組織/臓器チップでは冒頭でMPSの定義を議論した際に気づいた読者もいるかもし地に含まれる因子が培養を阻害するといった事象が懸念される。

れないが、FDAの定義やPfizer社の提唱するCVMは、どちらも実際、筆者の経験でも、２つの組織/臓器チップを連結すること

単一の組織/臓器を想定して議論しているように思われる。元々、で、それぞれの機能が落ちてしまう、ということは経験している。

MPSは人体を模倣する培養系としてコンセプトが提案され、多この点は、培養条件や培養器の工夫だけでは解決が難しく、多組

組織/臓器を同時に培養する培養系の構築が目標であったが、

織/臓器チップに適した培地の開発が待たれるところである。

単組織/臓器チップ（organ-on-a-chip）から
多組織/臓器チップ（organs-on-a-chip）へ培養の至適条件が異なっているため、単純に単組織/臓器チップを連結し培地を循環させると、ほかのチップから流入してくる培構成する単組織/臓器の機能再現に注力する時代がしばらく続
表1 臓器/組織のタイプ

臓器／組織のタイプ（対応するMPS)

臓器／組織

バリア組織（バリア組織MPS）

小腸
肺
腎臓
血管
血液脳関門

実質組織・臓器（実質組織・臓器MPS）

肝臓
心臓
筋肉

図3 バリア組織MPSと実質組織MPS

29

特集

細胞アッセイ07が異なっても、系統を指定することで実験結果にかなりの再現性

今までの議論では、MPSという新規培養法について論じてきた

物動態や毒性試験においては、同様の状況が期待されると思わ

培養器か細胞かが担保されている。MPSで同様の試験を行う際は、細胞株として維持が可能な細胞を用いることが望まれる。医薬品分野でも、薬が、実際のところMPSは培養器と細胞からなる細胞培養プラットれる。その点において細胞の規格化と維持が重要である一方で、フォームである。MPSの特徴である、培地の灌流を行うためには

薬物動態では人種差があることは広く知られている。このような培養器の道具立てが重要なのは言うまでもないが、培養器のみ場合、人種差を反映するMPSを揃えることができれば、薬物動態で期待される「臓器らしさ」が構築できるわけではない。例えば、の評価に有用と考えられる。さらに個別化医療に至っては、患者

iPS細胞を分化誘導して得られる臓器細胞は幼若な細胞までのごとの特性を反映したMPSの構築が求められるようになってく

分化にとどまっているのが現状である。肝実質細胞でも、化合物る。またMPSを疾患の解析に応用することも当然ながら行われの代謝活性が「肝臓らしさ」
にとって重要な項目となっているが、ている。このような評価系においては、培養器は再現性のある培iPS細胞由来肝実質細胞をMPSに搭載しても、期待する活性値は養環境を提供することが重要であり、細胞は患者個人の細胞や得られておらず、
やはり細胞自体が高機能であることも重要であ疾患モデルとなる細胞を用いることが必要になる。このような場る。その反面で、培地の灌流が可能でも、細胞培養面が通常の細合、患者個人や特定の疾患から樹立されたiPS細胞を目的とする

胞培養ディッシュやセルカルチャーインサートと同じ、という培養臓器に分化誘導することが重要な技術要素となると考えられる。

器も散見される。このような培養器では、細胞の培養環境を構築するために、複数細胞の共培養により培養ニッチの再構築を試みている例も多いが、培養手技が複雑化する点を考慮すると必ずしも好ましくないように見受けられる。一方で、今日ではさまざま

MPS開発の流れ

な三次元細胞培養基材が広く手に入る。特に日本はこの分野に09おいて多くの強みを持っている5)。今後、日本が得意とする三次

最後に、今後の期待が大きいMPSの開発について、
日米欧の公元培養基材を搭載したMPSが開発されてくることを期待したい。

的な開発の状況を簡単にまとめておきたい。
MPSがin vitroで生体を模倣する技術ということで、バイオの技術としては珍しく、当初は表2と表3で示すように、
アメリカよりも欧州での開発が先行していた。現在は、それぞれで独自のコンソーシアムが活発に活動している。それぞれの活動については、表４に挙げるURLを参照していただきたい。日本では、2017年より、経済産業省がバックアップしてAMED-MPSプロジェクトが行われた。現在、同プロジェクトの二期目がスタートしたところである。また、厚生労働省のバックアップによるAMED事業もこの4月からスタートしている
（表４）
。

おわりに

10

本稿では、MPSの新規in vitro細胞アッセイとしての開発を俯瞰的に論じてきた。個別の開発例は総説 1, 2, 3, 4, 5)を当たってい図4 単組織/臓器 MPSと組織/臓器結合型 MPS

ただきたいが、まだまだ開発途上の技術であり、多くの論文は個別化医療、疾患モデルとMPS

08

Proof of Conceptの域を出ていないものが多い。その一方で、最近の話題としては、Sanofi社がHEPEROS社のHuman-on-aChip®を用いて得られたデータを、FDAが臨床試験の承認資料として認めたという事例12)もある。この事例のようにMPSが実用

CoUを議論した際、MPSを適用する分野によっては、CoUが大化の域に入ってきている例も報告され始めている。MPSの捉え

きく異なることを論じた。ここでは、CoUによりMPSの用い方が方に統一された見解がなくとも、
新規in vitro細胞アッセイとして異なってくることを搭載する細胞の背景から論じてみたい。

の技術開発は日々進歩している。本邦でも、厚生労働省や経済産

化学物質の分野では、
ヒト健康影響評価のlegacy dataは実験業省がバックアップするAMEDプロジェクトがスタートしており、動物を用いた病理試料である。ここでは、遺伝的バックグランド

MPSの実用化に日本が立ち後れないように進むことを期待してがコントロールされた実験動物が使われており、たとえ実験施設いる。

30

THE CHEMICAL TIMES
表2 米国における公的機関の活動

年

組織

2010

IQコンソーシアム

活動

2012

DARPA

MPSプログラム開始→ 2019年終了

2012

NCATS

Tissue Chip Programを設立

2017

FDA

2018

IQコンソーシアム

Affiliated GroupとしてIQ MPS設立

2020

IQコンソーシアム

Lab on a Chip誌でMPS特集を発刊

2020

FDA

Alternative Methods Working Group (WG)を組織

2021

FDA

Alternative Methods WGが “Advancing New Alternative Methodologies at FDA”を公表

IQコンソーシアム設立“FDA‘s Predictive Toxicology Roadmap”を公表(毒性予測の新技術としてMPSが筆頭)

表３ 欧州における公的機関の活動

年

組織

活動

2011

KNAW

Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen (KNAW, オランダ王立芸術科学アカデミー)が資金提供してCrossing BordersのプログラムでOoCの開発に着手

2015

hDMT

オランダで欧州の産学官連携コンソーシアムである
Human Organ and Disease Model Technologies (hDMT)設立 (欧州初のOoCコンソーシアム)

2017

ORCHID2014年から開始されたHorizon 2020の中でOrgan-on-Chip In Development (ORCHID)のプロジェクトが開始→ 2019年終了

2018EUROoCSORCHIDの活動の一環として、European Organ-on-Chip Society (EUROoCS)が設立

2020

Moore4Medical

電子医療機器のイノベーション促進のため、企業を中心としたコンソーシアムが設立

表４ 公的活動組織の資料入手先

地域

米国

組織

URL

DARPA

https://www.darpa.mil/attachments/MPS_Layout_Final.pdf

NCATS

https://ncats.nih.gov/tissuechip/projects

FDA

https://www.fda.gov/media/109634/download

FDA

https://www.fda.gov/media/144891/download

IQ コンソーシアム
IQ MPS Affiliate

欧州https://www.iqmps.org/

hDMT

https://www.hdmt.technology/

hDMT

https://digitaalpubliceren.com/hdmt/18283/

EUROoCS

https://euroocs.eu/about-us/

Moore4Medical

https://moore4medical.eu/

Moore4Medical

https://www.dos4ever.com/M4M/WP2.pdf

AMED-MPS Project日本

https://iqconsortium.org/

http://www.scetra.or.jp/business/

AMED「再生医療・遺伝子治療の産業化に向けた基盤技術開発事業」 https://www.amed.go.jp/koubo/13/01/1301C_00018.html
AMED「医薬品等規制調和・評価研究事業」

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キ ー ワ ード 解 説
in vitro
試験管などの培養器内において生体組織を用いて人工的に生体を模倣した環境のこと。生体内での環境であるin vivoと比較して使用されることが多い。

MPS(Microphysiological Systems)：生体模倣システム
in vivoに近い環境をマイクロスケールで再現するin vitro培養系のこと。
しかし近年ではMPSの解釈や定義が拡大、変更されており、
マイクロスケールでないinvitro培養系もMPSとして説明されている場合がある。詳細は本誌の横川教授と石田教授が解説されているのでそちらを参照頂きたい。

ビトリゲル®
農業生物資源研究所(現：農業・食品産業技術総合研究機構 生物機能利用研究部門)の竹澤グループ長らが開発した、ハイドロゲルをガラス化および再水和することで作製した素材。このうち、コラーゲンゲルから作製したものをコラーゲンビトリゲル®と言い、再生医療用材料、薬物送達システムの担体、および、三次元培養に適した細胞培養担体としての応用研究が進展している。

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2
3

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は、国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構による登録商標です。
ad-MEDビトリゲル は、農林水産省「アグリ・ヘルス実用化研究促進プロジェクト(ビトリゲル )」の支援を受けて、
国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構と共同で開発されました。

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編集責任者：湯浅 隆秀
2022 年 10 月発行