Blockmer を中間体とするオリゴヌクレオチドの合成®

Synthesis of Oligonucleotides Using Blockmer® as an Intermediate

片 岡 正典Masanori Kataoka

株式会社ナティアス 代表取締役、
国立大学法人 神戸大学大学院 科学技術イノベーション研究科（客員教授）

Chief Executive Officer, NATiAS Inc.
Graduate School of Science, Technology and Innovation, Kobe University(Research Visiting Professor)

oligonucleotide APIs

chemical synthesis

block elongation

01

はじめに

COVID-19の感染拡大による社会の変化により核酸の重要性が大きく増している。mRNAワクチンは最も有効なワクチンとして、real-timePCRやLamp法による遺伝子検査は信頼性の高い感染診断法として、ヌクレオチドアナログ薬はウィルス性疾患に対する最も効果の高い治療薬として、COVID-19の感染拡大の抑制に貢献し、with/postコロナ社会においても引き続き核酸の需要が伸びると予想されている。

図1 構築単位（アミダイトモノマー）

ところで、mRNAのような数千塩基長の長鎖核酸の場合は酵素法で合成されるが、数十から百塩基程度のオリゴヌクレオチドは化学合成法で合成される。オリゴヌクレオチドは、核酸医薬品やPCR用プライマー/プローブ、コンパニオン薬、ゲノム編集用

Blockmer®の開発

guide RNA、核酸系アジュバントなどその応用範囲が広く、大き02

オリゴヌクレオチドの製造上の課題は以下の通りであり、製造産な市場を形成している。
オリゴヌクレオチドの化学合成においては、
ヌクレオシド 3’-ホス業におけるQCDS（品質、コスト、納期、スケーラビリティ）全てにホロアミダイトモノマーと呼ばれるモノヌクレオチドをビルディンおいて顕在化している4)。

グブロックとして、任意の配列を自動合成装置に入力することで合成される。モノヌクレオチドをビルディングブロックとする合成（1）
多段階合成による多様な不純物の蓄積と不完全な除去法は1976年にLetsinger博士によるホスファイト法の発表 に端（2）
原料・反応剤・溶媒の過剰使用、大量の廃棄物を発し、1981年にCaruthers博士がホスホロアミダイト法2)に発（3）バッチスケールの限界

1)展させ、1984年にKöster博士がホスホロアミダイト原料の保護基をDMTr基、2-シアノエチル基、アシル基とすることで再現性

上記問題を解決するための手段として複数のモノヌクレオチド

ビルディングブロックの構造良く核酸を合成できることを示し 、が連結したものを原料/中間体とする手法がある。ペプチド合成が固定された（図1）。現在では3’、5’両末端への官能基の導入においてはセグメント縮合法として知られ、核酸製造においてはや核酸塩基部やリボース部の化学修飾にも対応したホスホロア

Khoranaらによる初期のオリゴヌクレオチド合成において採用さミダイトモノマーが市販されており、複雑な構造のオリゴヌクレ

しかし、煩雑な操作と低い収率によりほとんど実用化れていた5)。

オチドの合成も可能となっている。に至らず、前述のように現在ではモノヌクレオチドを構築単位としかし、オリゴヌクレオチドの用途の拡大によりこれまで利用されする合成法でほとんどのオリゴヌクレオチドが合成されている。てきたオリゴヌクレオチド合成法の課題が顕在化し、核酸市場のオリゴヌクレオチド合成において実用化されている数量体ヌク発展におけるボトルネックとなっている。本稿ではナティアスのオコドンにレオチド中間体としては、三量体の構築単位が知られ6)、リゴヌクレオチド合成技術開発の取り組みについて紹介したい。

対応した29種の三量体中間体とその混合物が市販されている

3)

2

THE CHEMICAL TIMES（図2）。
リン酸部の保護基をクロロフェニル基とすることで化学的に安定な三量体を完成させているが煩雑な操作の問題は完全に解決しておらず、ホスホロアミダイトモノマーと比べて非常に高価なため、使用者としては大量に購入することが難しい。

図4 ナティアス社から市販されるBlockmer®原料

CE-Blockmer®の固相法での利用

03®
®
2-シアノエチルホスファイト型のBlockmer（CE-Blockmer）

図2 コドンに対応した三量体原料

は固相法を採用する自動合成装置の利用を想定して開発された。リン酸部の保護基として広く利用される2-シアノエチル基は、前述の通りリン酸エステル中では容易に遊離し、三量体の同様に、二量体中間体の市販が始まっているが、製造工程が煩

0.05 mol/Lアセトニトリル溶液での半減期は約1日であること雑であり、2-シアノエチル保護基は5価のリン酸エステルの中でから自動合成装置での使用は制限される。一方、ナティアスの不安定なことから、オリゴヌクレオチドの原料として求められる純

CE-Blockmer®はより安定なホスファイトを採用し、0.05 mol/度98%の二量体中間体は入手が困難であり、提供される配列もL アセトニトリル溶液での半減期は約7日であることから、百量体限定される（図3）。オリゴヌクレオチドの内製を目的とした数量を越える中鎖オリゴヌクレオチド合成など、長時間を要する合成

体ヌクレオチド中間体の論文もあるが7)、いずれも不安定な2-シや合成スケジュールの変更など柔軟に対応できる10)。アモルファ

アノエチルホスフェート構造に基づいて設計されるため、煩雑なス状態の三量体CE-Blockmer®は–30 ℃で2年以上酸化/分解操作と純度の問題が解決していない。

することなく保管できる。二量体、三量体の天然型リボヌクレオシド（DNA, RNA）のほか、種々の修飾ヌクレオシド（2’-OMe、2'OMOE、2'-F、LNA）の供給が可能となっている。
CE-Blockmer ®の合成は核酸塩基がアシル基で保護された5’-O-DMTrヌクレオシドを原料とし、リン酸化剤により系中でホスホロアミダイトモノマーに変換した後、系中で3’-O-アシルヌクレオチド11)と反応させることによりヌクレオチド二量体を得る。
弱塩基性条件下でアシル基を除去した後、再生された3’-水酸基をリン酸化剤によりホスホロアミダイトとし、同様の操作を繰り返すことにより三〜五量体のホスホロアミダイトに変換する。

図3 2-シアノエチルホスフェート型⼆量体原料

必要に応じて順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーをおこな（図5）。5’-水酸基のい、純度98%以上のCE-Blockmer®を得る
保護基をシリル系保護基とした原料を使用することで、5’-水酸

一方で、ナティアスが製造する数量体ヌクレオチド中間体は基を鎖長伸長前に再生可能となる。これによって得られる5’-OH

Blockmer ®という商品名で2-8量体が数百mgから数百gまで

Blockmer®とCE-Blockmer®と反応させることにより四〜十量様々なスケールで販売されている8, 9)。Blockmer®は化学的に安体のCE-Blockmer®を合成することも可能である。全工程を液定な構造を有しており、主に固相合成での利用を想定したリン酸相中でおこない、都度順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー

部が三価の亜リン酸エステルで構成される2-シアノエチルホスファイト型、主に液相合成での利用を想定してアリル保護基を採用するアリルホスフェート型、立体制御されたホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチド合成の原料となる光学活性型や加熱によって除去される熱除去型まで、用途に応じてBlockmer®の構造を選択できる（図4）。

図5 CE-Blockmer®原料3

特集

核酸医薬を使用して精製する。ホスホロアミダイト化したBlockmer®の精長によって異なり、二量体はホスホロアミダイトモノマーと同程製においては関東化学社等から市販されている低金属シリカゲ度であるが、三量体は長時間を要する。縮合生成物の構造はホルを使用することで、ホスホロアミダイトBlockmer の純度はスホロアミダイトモノマーを用いる場合と等価であることから、向上する。CE-Blockmer の製造プロセスは日東電工社や塩野キャッピング、酸化/硫化、脱トリチル化は条件を変更する必要はフィネス社と協力して最適化し、通算収率は大きく向上した（図ないが、三量体を使用して数百mg以上のスケールで合成をおこ

6）12)。dGGGのように固相法で合成が困難な配列についてもなう場合は酸化/硫化工程を2回実施するとより安定した結果がBlockmer は純度よく得られ、複数の修飾ヌクレオシドが含まれ得られる（図8）。脱保護工程も条件を変更する必要は無い。ていても、問題なく製造できる。8種について製造経験があり、各三量体CE-Blockmer®を使用した予備的な固相合成試験にお®

®

®

。
Blockmer®間で製造条件の調整は必要なかった（図7）

いて、製造が困難とされるポリA配列のオリゴヌクレオチドを標的自動合成装置でCE-Blockmer®を使用する際の縮合条件は鎖として実施した。日本テクノサービス社の協力の下におこなった

図6 CE-Blockmer®合成経路

図7 修飾ヌクレオシド含有CE-Blockmer®原料4

図8 Blockmer®を使⽤する鎖⻑伸⻑サイクル

THE CHEMICAL TIMES
本試験では縮合時間をホスホロアミダイトモノマーと同じメソッドで実施したことから、縮合収率は低いものの、目的鎖長から3の倍数分短い不純物のみが確認された（図9）。

図11 Blockmer®原料で合成したオリゴヌクレオチドの簡易精製

図9 CE-Blockmer®のみで鎖⻑伸⻑するオリゴヌクレオチドの固相合成

CE-Blockmer®を固相合成に使用する最も効率的な方法として、目的鎖長から使用するBlockmer ®の鎖長を引いた鎖長までホスホロアミダイトモノマーを使って鎖長伸長し、最終工程にBlockmer ®を使用して目的鎖長まで伸長することを提案した
い。この方法では本質的にn-1およびn-2の短鎖不純物の生成を抑制し、精製負荷を下げることができる。例えば、二十量体合成において、十七量体までをモノマー原料、最終工程に三量体Blockmer®を使用することで 目的鎖長のオリゴヌクレオチドが得られる（図10）。

図12 精製オリゴヌクレオチドの純度⽐較できる10, 13)。二量体を原料とすることで鎖長伸長サイクル数が100超から半分の約50に削減できることから合成上のリスクが低減する。五量体を原料とすれば約20サイクルとなり、二十量体合成と同等の工程で百量体を越えるオリゴヌクレオチドの合成が可能となるが、準備すべきBlockmer®数が著しく増加するため、不特定の配列を並列合成するような用途では現実的ではない。ナティアスでは固定された配列の数種のオリゴヌクレオチドを大量に製造する際に限定して実施している。また、合成された百量体のHPLC において、メインピーク中のMS 分析で短鎖不純物はほとんど含まれていないことが明らかとなり、Blockmer®
図10 Blockmer®原料を使⽤するオリゴヌクレオチドの固相合成の有効性が示された（図13）。

この方法で合成した硫化オリゴヌクレオチド二十一量体の精製
例を示す
（図11）
。このサンプルは合成後に固相抽出で簡易精製をしたものであるが、簡易精製でも十分に純度の高いオリゴヌクレオチドが得られることがわかる。核酸医薬品で汎用される硫化されたオリゴヌクレオチド二十四量体のBlockmer®使用合成品と市販のHPLC精製品を比較したところ、Blockmer®使用合成品
では短鎖不純物はほとんど存在しないのに対し（図12上）、市販のHPLC精製品はn-1,n-2鎖長の短鎖不純物をはじめとする多くの不純物が混在する（図12下）。
また、RNA 合成用の二量体リバース型CE-Blockmer®を使用

図13 百量体オリゴヌクレオチドの純度⽐較することで、百量体を越える鎖長であっても純度良く得ることが5

特集

核酸医薬AL-Blockmer®の液相法での利用

04

オリゴヌクレオチドの化学合成において、製造コストとスケーラビリティを改善するための方策として液相法の採用が直接的でしかし、二十量体合成においては100工程をあると考えられる4)。
越える多段階となり、操作が煩雑となる液相合成の課題も強調される。1993年にBonora博士によってポリエチレングリコールを可溶化担体とする効率的液相合成法が発表され14)、液相法の煩雑性を低減することが可能となった。この方法では片末端がメ

図15 フルオラスタグ化AL-Blockmer®

チル基でキャップされたポリエチレンオキシドコハク酸モノエステルをヌクレオシドの3’に結合させ、ホスホロアミダイトモノマーを原料に鎖長伸長する（図14）。合成過程でヌクレオチド中間体は反応溶媒に溶解しており、各工程で沈殿化あるいはゲル濾過により中間体を精製することで煩雑性を緩和しているが、操作性の大きな改善には繋がらなかった。その後東京農工大の千葉博士がポリ脂質系担体を開発するなど、様々な可溶化担体が開発されてきたが15)、未だ製造コストと生産性の大きな改善に至っていない4)。
図16 フルオラスタグを導⼊した⼋量体AL-Blockmer®の順相シリカゲル精製で保護された5’-O-DMTrヌクレオシドを原料とし、リン酸化剤により系中でホスホロアミダイトモノマーに変換した後、系中で図14 ポリエチレングリコールを結合させたヌクレオシド

3’-O-アシルヌクレオチドと反応させることによりヌクレオチド二量体を得て、位置選択的な脱保護をおこない、同様の操作を繰り

可溶性担体はオリゴヌクレオチド合成のコスト問題を解決する返すことにより四量体、八量体AL-Blockmer®を得る。必要に応ための1つの手段として一定の効果を示したが、製造上の諸問じて順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーをおこない、5’末題を解決するためには多面的なアプローチが必須である。筆者

端あるいは3’末端にFtagやシリル系保護基、DMTr基などが導は1997年に八量体のオリゴヌクレオチドの液相合成を発表して入されたAL-Blockmer®を95%以上の純度で得ることができる

いる16)。テトラゾール活性化剤を触媒量使用してリン酸部がアリ（図17）。

ル保護された八量体中間体を合成し、これらがジクロロメタンｰアセトニトリル溶液に可溶であることを示した。リン酸部がアリル保護された八量体Blockmer®が液相で合成可能であり、順相シリカゲルで精製可能であることを知識として保有しており、従来はモノマー原料に導入されていた可溶化担体を保護八量体に導入し、これを基点に鎖長伸長することを計画した。可溶化担体
候補を安価な市販品を中心にスクリーニングした結果、フルオラスケミストリーで利用される炭素数6-8のポリフッ化アルキル
アルコール（Ftag、図15）が最適であり、これを導入した八量体
Blockmer の有機溶媒に対する高い溶解性とシリカゲル薄層ク

図17 フルオラスタグを導⼊した⼋量体AL-Blockmer®のHPLC図®

ロマトグラフィーでスメアすることなく検出されることが明らか
液相法の優位点の一つとして反応のモニタリングが挙げられとなった（図16）。
はCEアリル保護されたヌクレオチド中間体（AL-Blockmer ）る。固相法では固体に担持されたヌクレオチド中間体の生成過

Blockmer と異なり5価のリン酸型がより安定である 。AL-程を正確にモニタリングすることは困難である一方、液相法ではBlockmer®は有機溶媒中で極めて安定であることから、有機溶

LC-MS等を利用して簡便に反応溶液の経時変化を追うことが可媒中に長時間滞留する必要がある液相合成において有用であ能である。

る。合成はCE-Blockmer と同様のプロセスで実施可能であり、ナティアスでは、AMEDの支援を受けて、24量体のオリゴヌク四量体、八量体はより簡便に合成できる。核酸塩基がアシル基

レオチドCpG ODN 2006の1kg製造試験を実施した。3’末端®

®

17)

®

6

THE CHEMICAL TIMESにFtagが導入された八量体AL-Blockmer®を基点にホスホロアロー合成の運用を進めている。十量体Blockmer ®の安定製造

ミダイト八量体AL-Blockmer を用いて2回鎖長伸長をおこなうが可能となったいま、フロー合成技術への展開は容易に想像ことで、CpG ODN 2006を簡便な操作で得ることができた。原

できるであろう。5’末端にFtagが導入された3’-ホスホロアミ料コストは固相法の10分の1以下であり、AL-Blockmer を原料末端にFtagが導入された十量体
ダイト十量体Blockmer ®と3’とする液相Block-elongation Systemの高いコスト/エナジー

Blockmer®の混合液と活性化剤溶液を送液/混合することで縮パフォーマンスが示された（図18）。純度に関しては向上の余地合反応をおこない、流路に脱保護液を注入することにより二十量を残しており、ナティアスでは液相法の改良を継続研究している。

体オリゴヌクレオチドを得る生産機を整備した。バッチスケール®

®

100kg超のGMP準拠製造施設として2023年秋からの商用生産を計画している。モニタリングには質量分析検出器と31P NMR今後の展開05を採用しているが、NIRやUV-VIS、ラマン分光等の導入も予定する。この製造工程で得られる粗生成物溶液はさらにインラインで連続精製、ダイアフィルトレーションを経てスプレードライヤにナティアスのBlockmer を原料とするオリゴヌクレオチド合成よる粉末化によって完全封じ込めされた連続生産装置となる（図が、固相法と液相法のいずれにおいても有効で、合成されるオリ19）。この連続生産装置の開発は中小企業庁の支援を受けてアゴヌクレオチドの品質向上と製造コスト削減に大きく寄与するこカデミアと共同で進めている。オイル化したBlockmer®による無とが実証された。

溶媒鎖長伸長法やエステル交換型鎖長伸長反応も知財化を進®

残す課題は2点。適用鎖長の限界に関して、Ftagを核酸塩基にめており、近い将来、オリゴヌクレオチドの連続生産がナティアス導入した八量体Blockmer®を用いて液相、固相における合成鎖によって実現すると確信する。

長の限界を確認したところ、固相合成においては240量体、液相合成においては128量体まで合成可能であることが明らかとなった。さらに長鎖オリゴヌクレオチドの合成に向けては固相担体の開発とオリゴヌクレオチド中間体の有機溶媒に対する溶解性の改善が必要となる。
スケーラビリティの課題に対しては、液相法を発展させたフ図18 製造法⽐較

図19 フロー式核酸連続⽣産装置概略

7特集

核酸医薬

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