実施例

3

K562細胞の解析 (Shin-RamDA-seq®と他社試薬の⽐較)

レッジを⽐較した結果、Shin-RamDA-seq Kitの⽅が⾼い検出転写産物・遺伝⼦数を⽰し、カバレッジにおいても®

▼ライブラリー調製を⾏いました。イルミナ社 MiSeq ®を⽤いてNGS解析を⾏い、検出転写産物数・遺伝⼦、カバ▼

Shin-RamDA-seq ® Kitおよび他社対応Total RNA-seq試薬を⽤い、1細胞に平均化したヒト由来K562細胞からRT-RamDA®法による NGS解析用ライブラリー調製キット

Shin-RamDA-seq® Kitの⽅が偏りのない結果が得られました。
検出転写産物・遺伝⼦数(TPM>0)

検出遺伝⼦の⽐較

35,00028,62530,00025,0004145

19,02520,00015,0008551894
他社試薬®

Shin-RamDA-seq Kit

10,00068095726390
他社試薬®

Shin-RamDA-seq Kit

5,0000®

Shin-RamDA-seq Kit

TPM>0.1

他社Total RNA-seq試薬

TPM>1

カバレッジの⽐較
Number of Genes(RSEM)®

Shin-RamDA-seq Kit + Human NSR Primer

Coverage (Normalized)

12,692

12,000

9,811

10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
01.2
10.8
0.6
0.40.20®

Shin-RamDA-seq Kit

他社Total RNA-seq試薬品

他社Total RNA-seq試薬

1.4

Coverage (Normalized)

14,000020406080100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)

名2
1.8
1.6
1.4
1.2
10.80.60.40.200Code No.

価格(税別)

24回⽤

RML-101T\ 158,000

96回⽤

RML-101\ 568,000

NSR Primer Set for human

96回⽤

NSR-101\ 27,000NSR Primer Set for mouse

96回⽤

NSR-102\ 27,000

24回⽤

RMD-101T\ 130,000

96回⽤

RMD-101\ 438,000

1,152回⽤

RMD-301\ 14,000

GenNext Shin-RamDA-seq Single Cell Stranded Kit®

GenNext RamDA-seq Single Cell Kit®

RamDA Cell Lysis Kit *3®

*2*1/&8Single Cell Stranded Kit

20406080
100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)包装®

GenNext®
Shin-RamDA-seq®

Number of Transcripts(RSEM)*1 ライブラリー調製試薬を含みます。*2 ライブラリー調製試薬は含んでおりません。
*3 Code No. RMD-101, 101Tに含まれる細胞溶解試薬の⼤包装タイプです。RML-101, 101Tとの互換性はありません※ RT-RamDA®、RamDA-seq®、Shin-RamDA-seq®は理化学研究所の登録商標です。
その他の本資料に記載している会社名および商品名・ロゴマークなどは、各社の商号、商標または登録商標です。

シングルセルや微量RNAに対応
1〜100細胞または10pg〜1ng total RNAからcDNAの調製が可能です

FFPE由来の分解RNAやPolyAをもたないTotal RNAの解析が可能
non-poly(A)RNA (lncRNA, pre-mRNA, circRNAなど)や分解したRNAにも使⽤できますRNA全⻑をカバーした解析が可能
⻑鎖RNAやスプライシングバリアントが正確に解析できます

保存温度︓-20℃

⽅向性情報を維持しより正確な解析が可能 N E W
アンチセンスやオーバーラップ遺伝⼦を明確に⾒つけることができます◆ 既存法に比べ、検出遺伝子数アップ！
◆ ライブラリー調製試薬内包のため、cDNA合成からライブラリー構築までをトータルサポート
toyobo公式x2024.10.01 THS24166

シーケンス法であり、random primer(あるいはNSR primer*)を使⽤するため、poly(A)配列以外からもcDNA合成を⾏うことができ、non-poly(A) RNAも検出可能です。また、これらのprimerがRNAのさまざまな場所に結合しcDNA合成が開始されるため、RNA全⻑からシーケンスリードを得ることができます。

遺伝⼦数、平均カバレッジ、マッピング率、rRNA率、ストランド解析率について解析しました。 RNA-Seqにはイルミナ社 MiSeq® を使⽤しました。
Shin-RamDA-seq® Kitでは⾼いストランド解析率を⽰し、RNAの⽅向性情報が維持されました。またShin-RamDAseq® Kitでは試薬組成を最適化したことで、RamDA-seq® KitよりもrRNA率が低く、検出遺伝⼦数はRamDA-seq®
Kitより優れた結果が得られました。またNSR Primerを⽤いることでrRNA率を下げ、より検出遺伝⼦数を増やすことができました。

Shin-RamDA-seq® 法 (Stranded High-Sensitivity Random Displacement Ampliﬁcation sequencing)

検出転写産物・遺伝⼦数(TPM>0)

カバレッジ

Number of Transcripts (RSEM)

は、RamDA-seq®を改良したもので、RamDA-seq®の特⻑にくわえ、⽅向性情報の維持が可能になりました。

RamDA-seq® Kit (random primer)

30,00024,46225,000＊NSR Primerとは、Not so random primerの略で、18S、28S RNA遺伝⼦に完全にマッチする配列を計算上除外したrandom primerのこと

20,000です。random primerの代わりにNSR Primerを⽤いることで、rRNAからのcDNA合成を抑制できます。

18,87625,865

20,48315,000poly(A) RNA

RT-RamDA

原 理

1. RT primer annealing

5ʼAA

Random primer

2. cDNA synthesis

cDNA

3ʼ 5ʼ

TTTTTTTTRNA

Oligo-dT primer

RNase H minus
RTaseAAAAAAA AT T AAAAAA
TTTTTTAA

3. Random cDNA cleavage
in RNA-DNA hybrid

TT

RNA

Random primer

12,000TT

Shin-RamDA-seq® Kit

11,397

12,115

12,03912,575AAA
T T AAAA
TTT
TTT

T4 gene 32 protein

3,000

T TTTTT0

Amplified cDNAs

Amplified cDNAs

RamDA-seq® Kit

Shin-RamDA-seq® Kit
NSR primer

対して遺伝⼦⻑が1,000bpとなるように補正した後、各サンプルの総リード数をすべて100万に揃えた数値

RamDA-seq® Kit

Shin-RamDA-seq® Kit[Code No. RMD-101]*1[Code No. RML-101]*2

細胞溶解または RNA 希釈

細胞溶解または RNA 希釈

熱変性反応

熱変性反応

1.5min.

実施例

0210.80.6
0.4
0.2
020406080
100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)0Shin-RamDA-seq® Kit (NSR primer)

1.4

1.4

1.2

1.2

10.8
0.6
0.4
0.2
020406080
100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)RamDA-seq Kit(NSR primer)
Shin-RamDA-seq® Kit(random primer)®

Shin-RamDA-seq Kit(NSR primer)®

20406080100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)

10.80.60.4
0.20020406080
100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)マッピング率rRNA率

ストランド解析率89.72%

35.52%-90.92%22.20%-91.54%28.57%

97.24%

90.50%

11.47%

96.94%

Shin-RamDA-seq® Kitを⽤いたリードカバレッジ

平均化したヒト⽩⾎病細胞株K562細胞1細胞分からライブラリーを調製してRNA-seq解析を⾏い、Millefy*を5min.

ゲノム除去反応

ゲノム /rRNA 除去反応

5min.

1h10min.

cDNA 合成および増幅反応

cDNA 合成および増幅反応

1h10min.

1h25min.

2nd 鎖合成反応

2nd 鎖合成反応

1h25min.

Puriﬁcation

Puriﬁcation

Nextera 反応

断片化・アダプター付加反応Puriﬁcation & QC

Puriﬁcation

Sequence

ライブラリーエンリッチメント

⽤いてカバレッジを確認しました。Shin-RamDA-seq® Kitを使⽤したシングルセル解析で、20kb程度の⻑さを持つ
NEAT1_2 全⻑のカバレッジが確認でき、NEAT1_1、NEAT1_2 のアイソフォームを解析できました。また⽅向性情報が維持されており、逆向きに転写されることが知られているMRRF とRBM18 においても明確な解析が可能でした。
＊Millefy︓１細胞RNAシーケンスのリードカバレッジの細胞間変動（細胞ごとのばらつき）を可視化するソフトウェア。

NEAT1_2
NEAT1_1
Forward

1-2dayReversePuriﬁcation

ForwardSequence

Reverse＊１ 本試薬の他に、磁性ビーズ : Agencourt® AMPure® XP試薬 (ベックマンコールター社) および ライブラリー調製試薬 : Nextera® XT DNA Sample Preparation Kit、Index Kit (イルミナ社) が必要です。
＊20.2

RamDA-seq Kit(random primer)*TPM（Transcripts Per Million ）︓各転写産物のリードカウントに

1-2day0.4®

random primer

1.5min.

0.66,000

T4 gene 32 protein

ワークフロー

0.8

09,000

DNase ITTRamDA-seq® Kit

15,000A AAAA

TTTT

1.2

1

Shin-RamDA-seq® Kit (random primer)

Number of Genes (RSEM)

RNase H minus
RTase

DNase I

4. Strand displacement
ampliﬁcation

0A

DNAcDNA

1.2

5,000

3ʼ

A A AAA

1.4

010,000

non-poly(A) RNA

RamDA-seq® Kit (NSR primer)

1.4
Coverage (Normalized)

RamDA-seq® (Random Displacement Ampliﬁcation sequencing) は、RT-RamDA 法を応⽤したRNA

1細胞に平均化したマウス由来NIH3T3細胞からライブラリー調製を⾏い、RNA-Seq 解析に供し、検出転写産物・Coverage (Normalized)利⽤した新規cDNA増幅⽅法です。

NIH3T3細胞の解析 (Shin-RamDA-seq® KitとRamDA-seq® Kitの⽐較)

Coverage (Normalized)

した「Reverse Transcription with Random Displacement Ampliﬁcation」の略で、逆転写酵素の鎖置換活性を1Coverage (Normalized)

RT-RamDA® 法は理化学研究所 ⽣命機能科学研究センター バイオインフォマティクス研究開発チームが開発

実施例

本試薬の他に、磁性ビーズ : Agencourt® AMPure® XP試薬 (ベックマンコールター社) および アダプター : IDT for Illumina® TruSeq® DNA UD Indexes v2 (イルミナ社) などが必要です。

MRRF
RBM18

シーケンス法であり、random primer(あるいはNSR primer*)を使⽤するため、poly(A)配列以外からもcDNA合成を⾏うことができ、non-poly(A) RNAも検出可能です。また、これらのprimerがRNAのさまざまな場所に結合しcDNA合成が開始されるため、RNA全⻑からシーケンスリードを得ることができます。

遺伝⼦数、平均カバレッジ、マッピング率、rRNA率、ストランド解析率について解析しました。 RNA-Seqにはイルミナ社 MiSeq® を使⽤しました。
Shin-RamDA-seq® Kitでは⾼いストランド解析率を⽰し、RNAの⽅向性情報が維持されました。またShin-RamDAseq® Kitでは試薬組成を最適化したことで、RamDA-seq® KitよりもrRNA率が低く、検出遺伝⼦数はRamDA-seq®
Kitより優れた結果が得られました。またNSR Primerを⽤いることでrRNA率を下げ、より検出遺伝⼦数を増やすことができました。

Shin-RamDA-seq® 法 (Stranded High-Sensitivity Random Displacement Ampliﬁcation sequencing)

検出転写産物・遺伝⼦数(TPM>0)

カバレッジ

Number of Transcripts (RSEM)

は、RamDA-seq®を改良したもので、RamDA-seq®の特⻑にくわえ、⽅向性情報の維持が可能になりました。

RamDA-seq® Kit (random primer)

30,00024,46225,000＊NSR Primerとは、Not so random primerの略で、18S、28S RNA遺伝⼦に完全にマッチする配列を計算上除外したrandom primerのこと

20,000です。random primerの代わりにNSR Primerを⽤いることで、rRNAからのcDNA合成を抑制できます。

18,87625,865

20,48315,000poly(A) RNA

RT-RamDA

原 理

1. RT primer annealing

5ʼAA

Random primer

2. cDNA synthesis

cDNA

3ʼ 5ʼ

TTTTTTTTRNA

Oligo-dT primer

RNase H minus
RTaseAAAAAAA AT T AAAAAA
TTTTTTAA

3. Random cDNA cleavage
in RNA-DNA hybrid

TT

RNA

Random primer

12,000TT

Shin-RamDA-seq® Kit

11,397

12,115

12,03912,575AAA
T T AAAA
TTT
TTT

T4 gene 32 protein

3,000

T TTTTT0

Amplified cDNAs

Amplified cDNAs

RamDA-seq® Kit

Shin-RamDA-seq® Kit
NSR primer

対して遺伝⼦⻑が1,000bpとなるように補正した後、各サンプルの総リード数をすべて100万に揃えた数値

RamDA-seq® Kit

Shin-RamDA-seq® Kit[Code No. RMD-101]*1[Code No. RML-101]*2

細胞溶解または RNA 希釈

細胞溶解または RNA 希釈

熱変性反応

熱変性反応

1.5min.

実施例

0210.80.6
0.4
0.2
020406080
100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)0Shin-RamDA-seq® Kit (NSR primer)

1.4

1.4

1.2

1.2

10.8
0.6
0.4
0.2
020406080
100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)RamDA-seq Kit(NSR primer)
Shin-RamDA-seq® Kit(random primer)®

Shin-RamDA-seq Kit(NSR primer)®

20406080100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)

10.80.60.4
0.20020406080
100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)マッピング率rRNA率

ストランド解析率89.72%

35.52%-90.92%22.20%-91.54%28.57%

97.24%

90.50%

11.47%

96.94%

Shin-RamDA-seq® Kitを⽤いたリードカバレッジ

平均化したヒト⽩⾎病細胞株K562細胞1細胞分からライブラリーを調製してRNA-seq解析を⾏い、Millefy*を5min.

ゲノム除去反応

ゲノム /rRNA 除去反応

5min.

1h10min.

cDNA 合成および増幅反応

cDNA 合成および増幅反応

1h10min.

1h25min.

2nd 鎖合成反応

2nd 鎖合成反応

1h25min.

Puriﬁcation

Puriﬁcation

Nextera 反応

断片化・アダプター付加反応Puriﬁcation & QC

Puriﬁcation

Sequence

ライブラリーエンリッチメント

⽤いてカバレッジを確認しました。Shin-RamDA-seq® Kitを使⽤したシングルセル解析で、20kb程度の⻑さを持つ
NEAT1_2 全⻑のカバレッジが確認でき、NEAT1_1、NEAT1_2 のアイソフォームを解析できました。また⽅向性情報が維持されており、逆向きに転写されることが知られているMRRF とRBM18 においても明確な解析が可能でした。
＊Millefy︓１細胞RNAシーケンスのリードカバレッジの細胞間変動（細胞ごとのばらつき）を可視化するソフトウェア。

NEAT1_2
NEAT1_1
Forward

1-2dayReversePuriﬁcation

ForwardSequence

Reverse＊１ 本試薬の他に、磁性ビーズ : Agencourt® AMPure® XP試薬 (ベックマンコールター社) および ライブラリー調製試薬 : Nextera® XT DNA Sample Preparation Kit、Index Kit (イルミナ社) が必要です。
＊20.2

RamDA-seq Kit(random primer)*TPM（Transcripts Per Million ）︓各転写産物のリードカウントに

1-2day0.4®

random primer

1.5min.

0.66,000

T4 gene 32 protein

ワークフロー

0.8

09,000

DNase ITTRamDA-seq® Kit

15,000A AAAA

TTTT

1.2

1

Shin-RamDA-seq® Kit (random primer)

Number of Genes (RSEM)

RNase H minus
RTase

DNase I

4. Strand displacement
ampliﬁcation

0A

DNAcDNA

1.2

5,000

3ʼ

A A AAA

1.4

010,000

non-poly(A) RNA

RamDA-seq® Kit (NSR primer)

1.4
Coverage (Normalized)

RamDA-seq® (Random Displacement Ampliﬁcation sequencing) は、RT-RamDA 法を応⽤したRNA

1細胞に平均化したマウス由来NIH3T3細胞からライブラリー調製を⾏い、RNA-Seq 解析に供し、検出転写産物・Coverage (Normalized)利⽤した新規cDNA増幅⽅法です。

NIH3T3細胞の解析 (Shin-RamDA-seq® KitとRamDA-seq® Kitの⽐較)

Coverage (Normalized)

した「Reverse Transcription with Random Displacement Ampliﬁcation」の略で、逆転写酵素の鎖置換活性を1Coverage (Normalized)

RT-RamDA® 法は理化学研究所 ⽣命機能科学研究センター バイオインフォマティクス研究開発チームが開発

実施例

本試薬の他に、磁性ビーズ : Agencourt® AMPure® XP試薬 (ベックマンコールター社) および アダプター : IDT for Illumina® TruSeq® DNA UD Indexes v2 (イルミナ社) などが必要です。

MRRF
RBM18

実施例

3K562細胞の解析 (Shin-RamDA-seq®と他社試薬の⽐較)

レッジを⽐較した結果、Shin-RamDA-seq Kitの⽅が⾼い検出転写産物・遺伝⼦数を⽰し、カバレッジにおいても®

▼ライブラリー調製を⾏いました。イルミナ社 MiSeq ®を⽤いてNGS解析を⾏い、検出転写産物数・遺伝⼦、カバ▼Shin-RamDA-seq ® Kitおよび他社対応Total RNA-seq試薬を⽤い、1細胞に平均化したヒト由来K562細胞からRT-RamDA®法による NGS解析用ライブラリー調製キット

Shin-RamDA-seq® Kitの⽅が偏りのない結果が得られました。
検出転写産物・遺伝⼦数(TPM>0)

検出遺伝⼦の⽐較

35,00028,62530,00025,0004145

19,02520,00015,0008551894
他社試薬®

Shin-RamDA-seq Kit

10,00068095726390
他社試薬®

Shin-RamDA-seq Kit

5,0000®

Shin-RamDA-seq Kit

TPM>0.1

他社Total RNA-seq試薬

TPM>1

カバレッジの⽐較
Number of Genes(RSEM)®

Shin-RamDA-seq Kit + Human NSR Primer

Coverage (Normalized)

12,692

12,000

9,811

10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
01.2
10.8
0.6
0.40.20®

Shin-RamDA-seq Kit

他社Total RNA-seq試薬品

他社Total RNA-seq試薬

1.4

Coverage (Normalized)

14,000020
406080100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)

名21.8
1.6
1.41.210.8
0.60.40.200Code No.

価格(税別)

24回⽤

RML-101T\ 158,000

96回⽤

RML-101\ 568,000

NSR Primer Set for human

96回⽤

NSR-101\ 27,000NSR Primer Set for mouse

96回⽤

NSR-102\ 27,000

24回⽤

RMD-101T\ 130,000

96回⽤

RMD-101\ 438,000

1,152回⽤

RMD-301\ 14,000

GenNext Shin-RamDA-seq Single Cell Stranded Kit®

GenNext RamDA-seq Single Cell Kit®

RamDA Cell Lysis Kit *3®

*2*1/&8Single Cell Stranded Kit

20406080
100
Normalized Position Along Transcript (5ʼ to 3ʼ)包装®

GenNext®
Shin-RamDA-seq®

Number of Transcripts(RSEM)*1 ライブラリー調製試薬を含みます。*2 ライブラリー調製試薬は含んでおりません。
*3 Code No. RMD-101, 101Tに含まれる細胞溶解試薬の⼤包装タイプです。RML-101, 101Tとの互換性はありません※ RT-RamDA®、RamDA-seq®、Shin-RamDA-seq®は理化学研究所の登録商標です。
その他の本資料に記載している会社名および商品名・ロゴマークなどは、各社の商号、商標または登録商標です。

シングルセルや微量RNAに対応
1〜100細胞または10pg〜1ng total RNAからcDNAの調製が可能です

FFPE由来の分解RNAやPolyAをもたないTotal RNAの解析が可能
non-poly(A)RNA (lncRNA, pre-mRNA, circRNAなど)や分解したRNAにも使⽤できますRNA全⻑をカバーした解析が可能
⻑鎖RNAやスプライシングバリアントが正確に解析できます

保存温度︓-20℃

⽅向性情報を維持しより正確な解析が可能 N E W
アンチセンスやオーバーラップ遺伝⼦を明確に⾒つけることができます◆ 既存法に比べ、検出遺伝子数アップ！
◆ ライブラリー調製試薬内包のため、cDNA合成からライブラリー構築までをトータルサポート
toyobo公式x2024.10.01 THS24166