ＯＴＥＣ
Vol. 24 (2019)，35 〜 40

海洋深層水からの放線菌の分離と抗癌物質の生産

海洋深層水からの放線菌の分離と抗癌物質の生産
今田千秋＊1, 梁 太熙＊1, 山田勝久＊2, 周 韜＊3, 春成 円十朗＊3, 五十嵐 康弘＊3, 池上康之＊4
Isolation of actinomycetes from deep-sea water and production of anticancer substance
Chiaki IMADA＊1, Taehui YANG＊1, Katsuhisa YAMADA＊2, Thoa SCHU*3,Enjuro HARUNARI*3, Yasuhiro IGARASHI*3, Yasuyuki IKEGAMI＊4
Tokyo University of Marine Science and Technology 4-5-7, Konan, Minato-ku, Tokyo 108-8477, Japan*2
DHC Corporation 2-8-21 Minami-azabu, Minato-ku, Tokyo 106-0047, Japan*3Toyama Prefectural University 5180 Kurokawa , Imizu-shi , Toyama 939-0398 , Japan*4Institute of Ocean Energy University of Saga 1-Honjo machi, Saga-shi, Saga, 840-8502, Japan*1

Abstract
Various actinomycete strains were isolated from deep-sea water (DSW) and surface seawater (SSW) in Izu-Akazawa
in Shizuoka Prefecture and Kume-Jima in Okinawa Prefecture, and anticancer activities of culture supernatant of these strains
were tested. Out of 252 isolates, 16 positive strains were obtained. Among them, one strain named as strain AKA32, isolatedfrom Izu-Akazawa DSW had constant high anticancer activity and was selected for further studies. Taxonomical
characterization of strain AKA 32 and 3 type strains (Nonomurea asiatica, N. indica, and N. muscoviences) was performed.
The strain showed close resemblance with N. indica by 16S rDNA analysis (98.5%, 1,435bp). However, all the type strains
had no anticancer activity. When the strain was cultivated in a liquid medium at 30℃ for 7 days with shaking, the anticancer
substances were produced in the culture broth. The active substances were purified from the broth and three active
compounds were isolated by extraction using n-butanol, followed by silica gel column and ODS column chromatographies,and high-performance liquid chromatography. The chemical structure of a novel compound which we named as“akazamicin” was very similar to that of “madurahydroxylactone” whereas the other two compounds were identical with Nformylanthranilic-acid and actinofuranone C, respectively by mass and NMR analysis. The cytotoxicity of akazamicin
against B-16 cells was much higher than those of other two compounds.
Key words : deep-sea water, actinomycete, cancer cell, anticancer substance

1. 緒

言

微生物由来の抗生物質や抗癌剤などの生理活性物質は人間生活の向上に大きく貢献してきたことは周知の事実である. 微生物の中でも放線菌というグラム陽性細菌は主に陸地の土壌から分離される微生物であり, 各種抗生物質や酵素阻害剤および癌治療薬の生産者として知られてきた. 従来これらの活性物質は陸土壌由来の微生物からの探索が主であったが, 近年新規活性物質の発見頻度が著しく減少してきたことから, 新たな微生物の探索源として, 海洋環境が俄かに注目されるようになってきた. しかし, これまで微生物の分離源は海洋表層水（SSW）,沿岸の海底堆積物や海洋生物などがほとんどであり, 水深 200m を超える深度の海洋深層水 (DSW) はその対象からはずれていた. この理由として, DSW は SSW と比較して微生物数が極めて少ないことが考えられる（今田2012）．そこで, 分子遺伝学的手法を用いて日本各地の DSW および SSW の微生物群集構造の解析を行った結果,
DSW には SSW に見られない独自の微生物群集構造が存在し, 新たな有用微生物探索源として期待が持てることが判明した (Terahara et al. 2016）. DSW の微生物は低温, 高水圧, 低有機物濃度の極限環境に適応していることから, 他の環境では見られない特異な微生物が生息していることは明らかであり（矢田ら, 2003）, このような微生物は特異な代謝系を用いて, 新規生理活性物質を生産している可能性が考えられる．そこで本研究では, この放線菌に着目し, DSW から分離を行い, 得られた有望株が生産する抗癌物質の諸性状を調べることを目的とした.
原稿受付 2019 年 8 月 5 日*1
東京海洋大学学術研究院 （〒108-8477 東京都港区港南 4-5-7）
Email of corresponding author: imada@kaiyodai.ac.jp

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今田 千秋，梁 太熙，山田 勝久，周 韜，春成 円十朗，五十嵐 康弘，池上 康之2．試料および方法
2-1. DSW からの放線菌の分離と有望株の選択
第 14 回海洋エネルギーシンポジウム 2017（2017 年 9 月 21 日）において報告した日本各地の DSW および SSWの微生物群集構造解析結果より, 新種を含む未同定種の多かった伊豆赤沢および久米島に着目し, 以下の方法により微生物の分離を行った.
伊豆赤沢は, 図１に示す DSW の懸濁物の濾過に用いる使用済みのバッグ状フィルター (孔径約 0.5μm) を入手し（2015 年 10 月 30 日, 12 月 28 日）, フィルターの底部を無菌的に 3 ㎝画に切り取った. なお, SSW は DSW取水設備の直上水２L を採集した.
一方久米島は, 佐賀大学久米島サテライトにある海洋温度差発電装置で発電に使用後の DSW（2015 年 6 月 25日, 8 月 30 日, 2016 年 1 月 14 日, 5 月 16 日）を微生物の分離に用いた. この DSW 約 2 トンを逆洗濾過器内に装着されている 8 つの中空糸膜フィルター (孔径 0.1μm, 井戸水濾過装置 TC-12J, 株式会社十字屋) を用いて約3,000 倍に濾過濃縮した. この濃縮物をさらに孔径 0.2μm のヌクレポアフィルターで濾過濃縮し、最終的に約 5 万倍の DSW 濃縮懸濁液を得た。なお, SSW はサテライト付近から採集(２L)した.
これら 伊豆赤沢バッグ状フィルター, SSW サンプルおよび久米島 DSW 濃縮懸濁液, SSW サンプルをそれぞれ滅菌 DSW で適宜希釈した後, その希釈液 0.1ml を放線菌の分離に汎用されている ISP-No.4 培地および HV寒天培地に塗抹したのち, 27℃において 4 週間静置培養した. 培養後, 生じたコロニーの中から肉眼で放線菌と判断されたコロニーを釣菌し, 分離株として保存した.

Fig. 1. Filtration equipment of DSW in Izu-AkazawaA: The water tanks of the filtration equipment containing bag filters used for the isolation of DSW microorganisms
B: Inside of the tanks where 5 bag filters are installed
C: The bag filer (Nagoya Filter Co. Japan. Type CB x 400M: 180φ x 800mm)
2-2. 分離放線菌株の抗癌活性評価
これらの分離株を液体培養後, 遠心分離した上清について, B16 マウスメラノーマ細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより入手, 以下：B16 細胞）を用いた MTT 還元法（山田ら, 2007）により癌細胞に対する毒性を評価した. 得られた有望株について, さらにヒト皮膚由来線維芽細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより入手, 以下：NB1 細胞）を用いて正常細胞に対する毒性も調べた．なお本研究では，正常細胞に対するよりも癌細胞に対する毒性が特異的に高いことを抗癌活性、その抗癌活性を示す物質を抗癌物質と呼称する．本研究において, 特に高い抗癌活性を示した株について, 16S rRNA 遺伝子解析による種の同定を行った. さらにその培養液から目標化合物を単離・精製して化学構造を解析した. また, これらの化合物について B16 細胞, Caco-2細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより入手, ヒト結腸癌由来）および Hep-G2 細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより入手, 肝臓癌由来）を用いて抗癌活性をそれぞれ調べた.
3. 結果および考察
3-1. 伊豆赤沢および久米島 DSW および SSW の放線菌有望株同定および抗癌活性海洋深層水からの放線菌の分離と抗癌物質の生産

伊豆赤沢 DSW より 131 株および SSW より 37 株, また久米島 DSW より 67 株および SSW より 17 株の合計252 株の放線菌を得た. これらすべての分離株について B16 細胞に対する毒性を調べた結果、表 1 に示すように
伊豆赤沢 DSW から 7 株および SSW から 1 株, また久米島 DSW から 4 株および SSW から 4 株の合計 16 株の有望株が得られた. これらの有望株について, 16S rRNA 遺伝子解析により同定を行った結果, Streptomyces 属の放線菌が最も多かった. 本研究では, 伊豆赤沢由来の AKA32 株と命名した株が最も安定に抗癌活性が見られたことから, 分類学的諸性状を明らかにするとともに有効物質を培養液から単離・精製し, 化学構造を解析するとともに抗癌活性を評価した.

3-2. AKA32 株の同定
本株について, 常法により 16S rDNA の塩基配列を解析した結果, 本株は放線菌 Nonomuraea indica DRQ-2 と98.5% (1,435bp) の相同性を示した(Saitou and Nei, 1987). この N. indica DRQ-2 はこれまで鉱山の石灰岩からの分離報告があるが, 抗癌物質の生産性については知られておらず, 海洋環境からの分離例も皆無である(Syed et al.,2015）. 次に本株の近縁種（標準菌株）3 株を入手し, 本株との培養性状および生理・生化学的性状の比較を行った (表 2). その結果, これら３株の標準菌株には抗癌活性が全く認めらなかった. また各種培地におけるAKA32 株と標準菌株との生育程度の比較では, AKA32 株, N.asiatica A299 株および N.indica DRQ-2 株が 10-45℃間で生育が見られた反面, N.muscovyenesis FMN03 株は 15-40℃間での生育を示した. 同じく生育 pH 範囲試験でも AKA32 株, N.asiatica A299 株および N. indica DRQ-2 株は pH 6-9 間で生育を示した反面, N.muscovyenesis
FMN03 株は pH 7 のみで生育を示した. NaCl 耐性では AKA32 株, N.asiatica A299 株および N. indica DRQ-2 株はいずれも NaCl 3% まで生育を示したが, N.muscovyenesis FMN03 株は NaCl 1% までしか生育しなかった. 上記生育温度, 生育 pH 範囲および NaCl 耐性から, AKA32 株, N.asiatica A299 株および N. indica DRQ-2 株は互いに類似した生理・生化学的性状を有していると考えられたが, 残りの N.muscovyenesis FMN03 株は性状が異なっていると判断された. 次に炭素源の利用試験では AKA32 株および N.asiatica A299 株は 8 種類全ての炭素源を含む培地で生育を示したが, N. indica DRQ-2 株および N.muscovyenesis FMN03 株は L-arabinose および D-fructose で生育が見られなかった（表 3）. また,アミノ酸の利用試験では AKA32 株が L-methionine, D-alanine および L-isoleucine を除く 7 種類のアミノ酸を利用したことに対し, N.asiatica A299 株は L-methionine, D-alanine, L-isoleucine, valine および L-tyrosine を除く 5 種類のアミノ酸を, また N. indica DRQ-2 株は L-methionine, L-isoleucine および valine を除く7 種類のアミノ酸を, さらに N.muscovyenesis FMN03 株はいずれのアミノ酸も利用することが出来なかった（表4）. 以上のように, AKA32 株はこれら 3 つの標準菌株と炭素源の利用性およびアミノ酸の利用性が異なっていることから, 新種の放線菌の可能性が示唆され, 今後さらなる性状試験を実施する必要があると思われた.

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3-3．本菌の培養液からの抗癌物質の単離・精製 (Yang et al., 2019).
本菌をあらかじめ V22 液体培地 (soluble starch 1%, glucose 0.5%, Bacto-yeast extract 0.2%, Bacto-tryptone 0.5%,K2HPO4 0.1%, MgSO4・7H2O 0.005%, CaCO3 0.3%) 100ml 中で 6 日間前培養した（30℃）. 前培養後, その全量をA16M (glucose 2%, Pharmamedia 1%) 液体培地 2L に接種したのち, 7 日間回転振盪（30℃）培養した. 培養後，nブタノール 2L をこれに直接添加したのち,１時間回転振盪し, 二層に分配したのち, 得られた有機層を回収し,エバポレーターで濃縮乾固した．この乾固物をクロロホルムとメタノール (1:1) に溶解させたのち, シリカゲルカラム（10cm x 50cm）を用いて, クロロホルムとメタノールで段階溶出した後, 得られた活性画分を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に展開し，目的物質を確認した. この目的物質を含む画分をエバポレーターで濃縮後,ODS 中圧カラム（5cm x 40cm）を用いて, 0.1%ギ酸水溶液とメタノールで段階溶出した. 各 ODS 画分中からHPLC 分析によって目的物質を確認した後, エバポレーターで濃縮乾固した. 得られた濃縮物をさらに ODS カラム（I.D.x250 mm, COSMOSIL 5C18-AR-II Packed, Nacalai Tesque）を装着した HPLC により, 単一の化合物になるまで精製した. 精製された各化合物は１H および 13C NMR（Bruker AVANCE 500 spectrometer, Bruker Biospin K. K.,
Yokohama, Japan）を用いて化学構造を解析した．その結果, 1 つの新規物質（akazamicin と命名）及び 2 つの既知物質 N-formylanthranilic-acid (Jiaolin et al., 2016) ，actinofuranone C (Um, et al., 2013) がそれぞれ得られた.
3-4．Akazamicin の諸性
図 2 に akazamicin の化学構造を示した(Yang et al., 2019). 本物質は madurahydroxylactone（Kim et al., 2017)と類似した構造を有していた. akazamicin は分子量 491.1 （C26H20NO9）の赤色粉末であり, メタノール溶媒中では,243, 292, 319,および 476nm に極大吸収を示した.

OHOOH

HOOH OCO2H
NH2OFig. 2. Chemical structure of novel compound named as “akazamicin”
3-5．各種癌細胞に対する細胞毒性
表 5 にこれら３つの物質の各種癌細胞に対する細胞毒性を示した. この表から明らかなように, これらの３つの化合物は各種癌細胞に対して特異的な毒性を示し, 特に akazamicin は B16 メラノーマ細胞に強い細胞毒性を示した.
Table 5. Cytotoxicity of three compounds against various tumor cell types

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今田 千秋，梁 太熙，山田 勝久，周 韜，春成 円十朗，五十嵐 康弘，池上 康之

本研究では伊豆赤沢 DSW 由来の抗癌物質生産放線菌の諸性状について明らかにしたものであるが, 久米島由来の DSW からもいくつの有望株が取得されているため, 今後これらの株についても詳細に諸性状を調べたいと考えている. このように, DSW からの有用微生物探索研究はようやく緒に就いたばかりであり, 今後益々有用性の高い生理活性物質が続々と単離され, 諸産業に応用されることを祈念したい．
文献
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Terahara, T., K. Yamada, J. Nakayama, Y. Igarashi, T. Kobayashi and C. Imada. Bacterial community structure of deep-sea
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矢田修一・大場雅行・榎本恵一 室戸海洋深層水中の細菌種の分析. 海洋深層水研究, 4, (2003), pp. 47-56.
山田勝久・今田千秋・土屋孝弘・宮本勝城・辻坊 裕・小林武志・濱田（佐藤）奈保子 海洋環境より分離された糸状菌培養液の美白素材への応用研究. 日本化粧品技術者会誌, 41, (2007), pp. 254-261.
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