R esearch
生物の代謝フローを可視化する!
高感度! 分子内Stable Isotope Probing法の開発と応用
水・物質循環部門

力石

嘉人／滝沢侑子

安定同位体の存在量で物質の移動を見たい
同位体物質循環分野では、非生物と生物（無機物と有機物）、生物 A と生物 B（捕食や共生、図１）、もしくは、１つの生物の中にある有機分子 A と有機分子 B（生合成や代謝）などといった、様々なスケールにおける物質と物質のつながりを、水素・炭素・窒素などの元素が持つ「安定同位体の存在量の変化」を用いて見ています。

図２ 水素、炭素、窒素の安定同位体の平均存在量「安定同位体」とは、同一の原子番号を持ち（＝陽子の数が同じ）、中性子の数が異なる原子のうち、放射性崩壊を起こさない原子のことです（図２）。例えば、水げてみましょう。我々動物は、「餌を食べて、消化し、素には、質量数１の水素（ H）と質量数２の重水素（ H）養分を吸収し、その養分に含まれているグルタミン酸（アがあり、炭素には、質量数 12 の炭素（ C）と質量数ミノ酸の一種）を分解して、エネルギーを得る」という13 の炭素（ C）があります。おそらく多くの方が、高代謝系を持っています。この時、養分に含まれているグ校や大学で「同位体」を知り、「同位体は、陽子数と電ルタミン酸が、約 50% 分解された場合、分解されずに子の配置が等しいため、物理・化学的性質が全く同じで残ったグルタミン酸が持つ 15N の量は、分解される前とある」と学んでいると思います。しかし、本当は、質量比べて、ほんの僅か、+0.0015% 分だけ上昇するのです。の小さい同位体は、質量の大きい同位体に比べて、極僅

私たちは、このような存在量の“超”微小なスケールのかですが、確実に反応しやすいために、質量の異なる同変化を精密に測ることによって、「何の物質が、どのよ位体は、様々な反応や現象において、常に異なる挙動をうな経路を通り、どのくらい反応したのか」を見ていま示します。そのため、地球上に存在する様々な物質の安す。

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定同位体の存在量には多様性が生まれ、図２に示される

なお、有機分子が持つ安定同位体の存在量を、どのように存在量の表記には、必ず「平均」という言葉をつような機器を用いて測定するのかは、研究室のホームけます。

ペ ー ジ（http://www.lowtem.hokudai.ac.jp/isophysiol/

では「安定同位体の存在量」は、どのくらいのスケールで変化しうるものでしょうか？具体的な例をひとつ挙

products/cn6/pg172.html）に掲載していますので、そちらも読んで頂けると嬉しいです。

図１ 研究室で飼育しているハゼとエビ。自然界では、このハゼとエビのように、異種の動物間の共生関係がしばしば見られます。これらの「共生」はどのようなメカニズムで成立しているのでしょうか？また、そこには、どのようなエネルギーの効率化（獲得、貯蓄、消費のバランスの最適化、価値交換）があるのでしょうか？

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RESEARCHStable Isotope Probing 法とはつい先ほど、安定同位体の存在量の「超微小なスケールの変化」を精密に測ることによって、研究対象とする物質の反応経路と、その反応量を評価していると述べました。しかし、自然界でおこる安定同位体の存在量の変化には、現在の我々の技術力をもってしても捉えることができない「更に小さいスケールでの変化を持つ事象」がたくさん存在します。そこで登場するのが、「StableIsotope Probing 法」です。Stable Isotope Probing 法とは、試料（生物そのものや、土壌などの環境試料）に、安定同位体の存在量を「人為的」に大きく変化させた基

図３

分子内 Stable Isotope Probing 法の概念図

質（＝原料）を与え、その「人為的」な存在量を追跡すをしているのか（＝どうやって生きているのか）を、正ることで、生体内で「どのような反応が起きているのか」、確に知ることが可能になります。

もしくは「その環境にどのような生物がいるのか」など

具体的な例を一つあげましょう。図３に示すように、を知るための技術です。これを用いることで、その「た生体内で、アセチル -CoA 分子からグルタミン酸分子をくさんの事象」を研究することができるようになります。

作る経路として、A、B、C の 3 つが考えられるとします。

この「Stable Isotope Probing 法」を用いたおそらくそのような場合に、アセチル -CoA のカルボニル基の炭最も有名な例が、ピロリ菌の検査です。ピロリ菌は、我々素（図３の赤●）の 13C 量を人為的に変化させ、新たに人間の胃に感染し、胃炎や、胃・十二指腸潰瘍をもたら合成されたグルタミン酸の分子構造の中の「どの炭素のす菌です。彼らは強酸性の胃の中で生育するため、胃の13中にある尿素を、アンモニアと二酸化炭素に分解し、そグルタミン酸の合成経路 A、B、C のうち、どの経路がの生産したアンモニアを用いて胃酸を中和していると考働いているのかを明確に知ることができるのです。

C 量が変化しているのか」を追跡することができれば、えられています。すなわち、ピロリ菌の感染の有無（もしかし、この「分子内 Stable Isotope Probing 法」は、しくは、除去の成否）は、「 C 量を人為的に大きく変開発当初から、非常に大きな問題を抱えていました。そ化させた尿素」を経口投与し、ピロリ菌による尿素分解

れは、安定同位体の「人為的」な存在量の測定に用いる「核13の生成物として「人為的な C 量を持つ二酸化炭素」が磁気共鳴（NMR）」の感度がとても低いことです（図４）。

発生するかどうか、を測定することで調べることができ例えば、多くの大学や研究機関で一般的に使用されているのです。

る NMR を用いて測定する場合、13C 量が 50% 以上の有13機分子を mg 〜 g スケールで用意する必要がありますが、“分子内”Stable Isotope Probing 法とはこの条件を満たす試料を用意することは、現実的には（おStable Isotope Probing 法では、反応基質の「全体」の金と労力の面で）非常に難しいという課題がありました。

安定同位体の存在量を変化させていたのに対し、「分子内このような背景から、新たな「高感度な測定技術」が強Stable Isotope Probing 法」は、反応の基質となる有機分く求められていました。

子の「特定の部位の元素のみ」の安定同位体の存在量を人為的に変化させ、その「人為的」な存在量を、有機分子の分子構造の中の「１つ１つの元素のレベル」で追跡できる、2000 年頃から注目を集めている技術です。この「分子内 Stable Isotope Probing 法」を用いると、生物の生合成・代謝における物質の流れ（＝フロー）や、有機分子の生物間の移動を極めて正確に評価することができ、その結果として、生物や生物群が、与えられた環境で何図４

分子内 Stable Isotope Probing 法の感度

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RESEARCH“高感度”分子内 Stable Isotope Probing 法の開発

GC-MS の質量分析情報を与えればよいことになります（式２）。

そこで我々は、従来よりも少ない試料量で、短時間で、安く、正確に測定できるという「夢の技術」の開発を目[ 精密質量 ] − [GC-MS の質量分析情報 ]指し、一般的なガスクロマトグラフ−質量分析計（GC-= [ 安定同位体の存在量 ]（式２）MS）に、GERSTEL 社が販売する MassWorks というソフトウェアを組み合わせて利用することで、（1）研究対象の有機分子を高純度で得る

また、MS 部で生じたフラグメントイオンをうまく使（2）ng 〜 µg オーダーの試料量で測定する

えば、理想的には、有機分子を構成する 1 つ 1 つの元（3）1 〜 99% の広い範囲の C 量を測定する

素の安定同位体の存在量を計算することも可能になりまの３課題の根本的な解決を試みました（図５）。GC-MS

す。実際に 13C 量が既知のアミノ酸の標準物質を用いては、ガスクロマトグラフ（GC）部で、混合物から研究検証したところ、20ng 〜 20µg という少ない試料量で、対象の有機分子をクロマトグラフィーで分離し、質量分13析計（MS）部で、分子をイオン化し、分子イオンとその炭素の 13C 量を求めることができる、ということがわのフラグメントイオンの m/z を測定することで、有機かりました。

13C 量にして 1 〜 2% の誤差で、アミノ酸に含まれる個々分子の構造を決定する装置です。そして MassWorks は、式１に示すように、GC-MS で得られた質量の情報と、安定同位体の平均存在量を使って、研究対象の有機分子応用研究：始原的微生物が持つ TCA 回路の機能と役割を調べる開発した「高感度分子内 Stable Isotope Probing 法」の精密質量を計算するソフトウェアです。の応用先として、1 つ研究を紹介したいと思います。こ[GC-MS の質量分析情報 ] + [ 安定同位体の平均存在量 ]の研究は、始原的な系統（＝地球上に最初に生まれた= [ 精密質量 ]生命に近い系統）に属する水素酸化硫黄還元好熱細菌（式１）Thermosulfidibacter takaii の TCA 回路（別名：クエン酸回路）が「可逆的」であり、回路の回転方向（機能とこの式１を用いて、研究対象である有機分子の「安定役割）が利用可能な炭素源に対応して柔軟に変化できる同位体の存在量」を得るためには、既知の精密質量に、ことを証明したもので、2018 年の 2 月にサイエンス誌（Nunoura et al., 2018, Science 359.
559-563）に、布浦拓郎博士（海洋研究開発機構・主任研究員）、跡見晴幸教授（京都大学）と力石他の共同研究として掲載されました（詳細は論文を読んで頂けると嬉しいです）。
我々人間を含む全ての好気性動物のミトコンドリアが持つ「酸化型 TCA 回路」
は、食事から得た有機分子を分解し、生じたアセチル -CoA を、完全に水と二酸化炭素に分解するとともに、有機分子が持つエネルギーを取り出す回路です。一方で、生物界全体を見渡すと「TCA 回路」と称されるものの中には、「酸化型」な

図５4GC-MS と MassWorks を組み合わせた高感度分子内 Stable Isotope Probing 法の仕組み

もののみならず、嫌気性細菌が持つ「分RESEARCH岐型」や、二酸化炭素を固定して有機分子を生成する「還なお、この研究は、約 100 細胞 /ml 程度しか増えないT.

元型」（逆 TCA 回路ともよばれる）もの、一部が欠損

takaii について、数〜数十 ml の培養液を用いて、実施する「不完全型」や「バイパス型」など、基本的には同したものであり、わずか数十 ng の有機分子があれば、じような酵素群で動き、同じような反応系であるにも関1 〜 2% の誤差で有機分子の個々の炭素の 13C 量を測定わらず、その反応の経路や、回転の向きには多様性があできる（図４）、という「高感度分子内 Stable Isotopeることが知られています。

Probing 法」のデモンストレーションという点でも、重この「TCA 回路がどのような向きで動いていたのか」

要な研究になりました。

を、とくに始原的な系統に属する微生物について調べる
ことは、「原始生命が、無機物から有機物を作れる独立今後の展望栄養生物であったか？有機物を利用して生きる従属栄養

前述したように「Stable Isotope Probing 法」は、現在生物であったか？」という、長きにわたり議論されてきの我々の技術力では、「自然界でおこる安定同位体の存在た疑問の解決に貢献できます。たとえば、初期の生命が量の極々微小の変化」を捉えることができない多くの事

従属栄養生物として誕生した場合、炭素や他の元素を固象に関して、安定同位体の存在量を「人為的に」大きく定する者が存在しないので、彼らは一方的に消費するばコントロールした基質を試料（生物そのものや、土壌なかりで、すぐに絶滅してしまうでしょう。一方で、生命どの環境試料）に与え、その「人為的な存在量」を追跡は有機物プールの中から生まれたとされる仮説がありまする技術です。すなわち、この技術を用いる時には、必ず、すが、もしそうだとするならば、有機物が有り余ってい飼育や培養実験が必要になります。また、自然界ではある状態の中で、新たに有機物を生産する独立栄養型生物り得ない濃度の「重い同位体」やそれが含まれる有機物が果たして生まれるのか？という疑問が残ります。

を、環境に散布することは、その環境に少なくないダ

そこで、我々は、始原的な系統に属する T. takaii が、メージを与えます。そこで、我々は原点に返り、自然界どのような TCA 回路を持っているのかを理解するためから採取した試料を用いて、「自然界でおこる安定同位体に、 C 量を変化させた CO2、酢酸、コハク酸などを用の存在量の極々微小の変化」の痕跡を、「Stable Isotope

いて培養し、生合成されたアミノ酸の１つ１つの炭素のProbing 法」を使わずに、なんとか有機分子に含まれる13C 量を測定しました。その結果、１つ１つの原子のレベルで、見たい、見られるようにし13（1）独立栄養での培養条件（CO2 の添加）においては、還元的 TCA 回路が機能するたい！と思い、現在は新たな研究手法の開発と、その応用研究に取り組んでいます（図４）。近い将来、皆さんに（2）酢酸、コハク酸のどちらか 1 つを添加すると、分良い報告ができることを楽しみにしています。

岐型の TCA 回路が機能する（3）酢酸、コハク酸の両方を添加すると、酸化的 TCA 回路が機能するということを明らかにできました（図 6）。そしてこの発見は、始原的な系統に属する生命が、「独立栄養的に、無機物から有機物を作れる機能」を持つと同時に、「従属 栄 養 的 に、 有 機 物 か ら エ ネ ルギーを獲得できる機能」を、柔軟に使い分けられる「混合栄養生物」であった、と考えうる世界で初めての重要な証拠になりました。

図６ 各種の培養条件における Thermosulfidibacter takaii の TCA 回路のふるまい 赤矢印が還元的 TCA回路の向き，青矢印が酸化的 TCA 回路の向き

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