博 士（ 生命 科学 ）大藪巨樹
学位論 文題名
Insight into the Epitope Structure ofAnti R/IUCl/KL− 6Monoclonal Antibody（抗MUCl/KLー6
モ ノクローナル抗体のエピトープ構造の解明）

学位論文内容の要旨
夕ンバク質は、糖鎖付加、リン酸化、メチル化、硫酸化などの翻訳後修飾を受けて成熟した機能を持つことが多い。ゲノム情報からアミノ酸配列情報をもとにして、夕ンパク質の機能解明を目指したプロテオーム解析が隆盛を極めている。しかしながら、アミノ酸配列に依存するタンパク質の機能解明のみでは不十分であることから、近年では翻訳後修飾におけるタンバク質の機能解析が注目されている。翻訳後修飾の中でも、最も複雑な過程である糖鎖修飾に関しては未だ不明な点が多いが、最近の質量分析機器の進歩とともにグライコーム研究が盛んに行われおり、糖鎖の生物機能解析が徐々に進みつっある。糖鎖研
究には、1）糖鎖遺伝子解析、2）糖鎖合成技術、3冫糖鎖解析技術の開発が必須であるが、これらの研究からバイオマーカーとして糖鎖と疾患との関連性が注目されるようになってきた。糖鎖機能の特徴は、種特異的であり細胞特異的である場合が多く、また細胞の分化段階特異的である。これらの特徴を反映して、癌、免疫、感染症、再生医療、生殖医療などに対する研究が精力的に行われている。一方で、80年代にモノク口ーナル抗体技術の発達とともに、盛んに癌細胞に対する特異的抗体の作製が行われてきたが、獲得された特異的抗 体の 多く は、 癌化に伴う糖鎖変化を 認識するものである。これらの中には、CEA、
CA19‑9やSialylTn抗原などの糖鎖構造の変化の違いに基づいた腫瘍マーカーとして臨床応用されているが、臨床の場だけでなく抗原糖鎖と疾患の関連性の解明を目指して糖鎖の解析や組織分布を行うツールとしても用いられている。これらの診断マーカーとして使用される抗体は、ムチンなどの〇結合型糖鎖をもつ糖夕ンバク質を抗原として認識する場合が多い。一般的に〇結合型糖鎖の分析は困難とされ、疾患に関連する糖鎖変化の解析が盛んに行われているが、疾患に関連する糖鎖構造の変化を化学構造レベルで解明された例は少ない。この原因として、〇結合型の糖鎖は複雑な糖鎖の組み合わせに加えて、結合様式も多岐にわたることやN結合型糖鎖の分析に用いられる糖鎖とタンバク質を切断する汎用性の高い方法がないことが挙げられる。著者が所属する西村研究室では化学反応と酵素反応を組み合わせた効率的な糖ベプチド合成技術を確立していることから、今回、その技術を応用して糖鎖構造やその置換位置の規定さ れた200種以上の糖ベプチドライブラリーを合成・評価して、疾患特異的なMU
C1抗体のエ ピトープ構造解析を行った。夕ーゲットの抗体は診断薬K
L‑6エイテスト＠として問質性肺炎の診断マーカーとして臨床の場で使用されている。最近でも、種々の癌に対する診断マーカーとしての応用や治療や予後マーカーなどの可能性を示唆する興味ある知見が数多く報告されている。本抗体の認識するェピト
ープの化学構造レベルでの詳細については不明であった。まず、ムチンの基本構造である− 97−

corel，core2，cor
e3，core6などの糖鎖構造を有する糖アミノ酸によるべプチド合成と種々の糖転移酵素によ るケモェンザイマテイックな糖鎖伸長反応を組み合わせることにより多様性 の高 い糖ベプチドライプラリーを構築した。最初にピオチ ン化M
UC1糖ベプチドライプ
ラ リ ー を 用 い て 抗 MUCl/KL‑6抗 体 と の 反 応 性 を ELISAに よ り 評 価 し た 。 MUC1配 列 上の Asp‑Thr‑ArgのThrに2，3‑SialylTやdi sialylTの糖鎖を置 換した糖ベプチドに強い抗体反応が確認された。一方、Asp‑Tlu‑Arg
以外の位置の2，3‑Sialyl
T置換体には抗体反応性が 認め られ なか った こと から 、 抗MUCl/KL‑6抗体との認識に は糖鎖とべプチド部分の両方が重要である ことが示唆された。次に正常部位と腫瘍部位との違いを識別する鍵となる
Ser/Thrに結 合し てい るGal
NAc6位へ の糖 鎖付 加に つい て検 証し た。 競合 的ELIS
Aに より 2， 3− SialylT体 と core2か ら 誘 導 可 能 な GalNAcの 6位 へ G
lcNAc、 LacNAc、 Sialyl
LacN
Acを付加した糖ペプチドとKL‑6抗体との親和性を比較し た。結果、いずれの糖鎖構造も同等の親和 性が認められたので、本抗体は正常と癌を識別する鍵と考えるGa
lNAcの6位からの分岐構 造を認識しないことが明らかになった。また、抗KL‑6抗体の最小エピトープ 構 造 を 明 ら かに する ために 、糖 ベプ チドス キャ ンニ ング を適応 して 、Pro‑Asp‑
Thr‑Arg‑P・ro‑
Ala‑ProのThr残基に2，3‑SialylTの導入された構造が最小エピトープ構造であるこ とを明らかにした。一方、エピトープ構造を含む高密度に糖鎖が付加した
MUC1
糖 ベプ チド の抗 体と の親 和 性を 評価 した 。立 体的 に嵩 高い6糖構造の5ケ所に付加したべプチドは 、大幅に親和性が低下したことから、エピトープ近傍の糖鎖置換の環境が抗体との認識に も影響することが示唆された。以上、糖ベプチドライブラリーを利用することにより、抗 K
L‑6抗体の認識するエピトープ構造を解明できたので、本ライプラリーは〇 結合 型糖鎖を解析する強カなツールであることを実証する ことが出来た。さらにM
UC1の機能解析を進 めるために、血清中に存在する糖夕ンバクのモデルとしてタンデムリピー
ト MU
C1糖ペプチド合成法を検討した。一般的に分子量の大き な糖ベプチドを合成するべプチド連結方法はチオエステル法やnativec
hemicalligation法が知られている。様々な糖鎖を有するべプ チドライプラリー構築には不向きであることから、これを解決する合成法としてべプチド フラグメントを固相合成する方法を選定した。糖鎖の置換するSer/
Thr
以外のアミノ酸配 列を3つの分けたフラグメン トと糖アミノ酸を組み合わせたタンデムリピー ト糖 ベプチドの構築を目指した。HBTU等を縮合剤として用 いるべプチド固相合成の一般的な反応条件 におしゝては、ベプチドフラグメントを縮合させる際にC末端側のアミノ酸の顕著な異性化 が確認された。種々の反応条件を検討した結果、反応溶媒にCH2Cl2を用いて 縮合 剤に DIC、 反応 活性 剤と して HO
OBtによ る条 件で 異性 化がほぼ低減できることを見出した。続い て、本合成法の有用性を実証することとKL‑6抗体の反応性を確認するために、エピトープ 構造を2箇所に設定して、そ れ以外の位置は任意の糖鎖で置換した77残基
夕ンデムリピー ト体の合成を行った。その結果、高分解能質量分析で目的の糖ベプチドの生 成を 確認 する と共 に、 HPLC分 析で シン グル ピー クの 目的 物を得た。さらにはM
arfey法によるアミノ 酸のラセミ化検定で異性化が殆ど認められないことから、本合成法の有用性 を示 すことが出来た。次にK
L‑6抗体の反応性を確認するた めに、合成した77残基糖ベプ チド に糖転移酵素で処理してシアル酸を6力所伸長させ、酵素処理の前後2種類の糖ベプチドに対して K
L‑6診断キットを用いて評価した結果、シアル酸を伸長させた糖ペプチドに 診断 キットの陽性検体である天然のMUC1糖夕ンパクと同等 の反応が確認された。血清中に存在するKL‑6抗原に近いモデル糖ペプチドとして、診断キットに検出される原理を確認できた。
最後に、本アプ 口ーチによる成果は、K
L‑6抗体のェピトープ構造の解析に留まらず、糖鎖抗体の診断性を 議論するうえで重要な知見を得た。これらの手法や知見は抗体医薬や癌ワ― 98 ‑

クチンなどの医薬品創製に繋がる研究成果と考える。

― 99―

学位論 文審査の要旨
主査教 授西村 紳一郎
誠副査教 授出村教授
芳副査教 授綾部 時
幸
副査教 授菅原 一 次
副査准
門出 健

学位論文題名InsightintotheEp
itopeStructureof
Anti MUC17KL−6rvIonoclonal Antibody（抗MUCl/K
L―6
モノクローナル抗体のエピトープ構造の解明）

近年，糖鎖構造の変化と疾患との関連性に関する免疫学的な研究が盛んに行われている。
しかし、その多くは、生化学的な手法による糖鎖分析によるものが多く、構造変化と疾患との関連性を化学構造レベルで解明した例は少ない。糖鎖の複雑さとその合成の難易度ゆえに精密な有機合成を応用した網羅的な解析の実施が難しいためであり、現状これに適した合成法の開発が待たれている状況にある。
本論文は，このような難易度の高い糖鎖合成に関して、有機と酵素反応を組み合わせて精密に化学構造の規定された糖ベプチドライブラりを構築した。これら化合物を用いた評価系により網羅的なスクリーニングを実施して、診断薬として臨床応用されている抗体に関する認識する構造について詳細な解析した。糖鎖構造と疾患との関連性を明らかにする有益な知
見 を 得 るこ と を 目的 と し たも の で 、 糖鎖 生 物 学上 極 め て意 義 の 大き い も ので あ る。
本 論文は 、診断薬 として応 用されている抗MUCl/K
L‑6抗体の認識構造を極めて精密に化学構造レベルでの解析を行った。その内容としては、著者が所属する西村研究室では化学反応と酵素反応を組み合わせた効率的な糖ベプチド合成技術を確立していることから、今回、そ の技術を 応用し て糖鎖構 造やそ の置換位置の規定された200種以上の糖ベプチドライブ
ラ1」ー を合成 ・評価し て、疾 患特異的なMU
C1抗体のエピトープ構造解析を行った。夕ーゲ ットの抗体は診断薬KL‑6エイテスト＠として問質性肺炎の診断マーカーとして臨床の場で使用されている。最近でも、種々の癌に対する診断マーカーとしての応用や治療や予後マーカーなどの可能性を示唆する興味ある知見が数多く報告されている。本抗体の認識するエピトープの化学構造レベルでの詳細については不明であった。まず、ムチンの基本構造であるcorel，core2，core3，core6などの糖鎖構造を有する糖アミノ酸によるべプチド合成と種々の 糖転移酵素によるケモエンザイマテイックな糖鎖伸長反応を組み合わせることにより多様 性の高い 糖ベプ チドライ プラリ ーを構築 した。 最初にピ オチン化MUC1
糖ベプチドライブ ラ リ ーを 用 い て抗 MUCl/KL‑
6抗 体 との 反 応 性を ELI
SAに より 評 価 した 。 MUC
1配 列上のAsp‑Thr‑ArgのThrに2，3‑
SialylTやdisialyl
Tの糖鎖 を置換 した糖ベ プチド に強い抗体反応が確認された。一方、Asp・Thr・Arg以外の位置の2，3．SialylT置換体には抗体反応性ー 100−が 認 め ら れ な か っ た こ と か ら 、 抗 MUCl/KL‑6抗 体 と の 認 識 に は 糖 鎖 と べ プ チ ド 部 分 の 両 方が重 要で ある こと が示 唆さ れた。次に正常部位と腫瘍 部位との違いを識別する鍵となるSer/Thrに 結 合 し て い る GalNA． c6位 へ の 糖 鎖 付 加 に つ い て 検 証 し た 。 競 合 的 ELISAに よ り
2， 3． SialylT体 と core2か ら 誘 導 可 能 な GalNA℃ の 6位 ヘ GlcNAc、 LacNAc、 SialylLacNAc
を 付 加 し た 糖 ベ プ チ ド と KL． 6抗 体 と の 親 和性 を比 較し た。 結 果、 いず れの 糖 鎖構 造も 同等の 親 和 性 が 認 め ら れ た の で 、 本 抗 体 は 正 常 と 癌 を 識 別 す る 鍵 と 考 え る GalNAcの 6位 か ら の分 岐 構 造 を 認 識 し な い こ と が 明 ら か に な っ た。 ま た、 抗KL・6抗体 の最 小エ ピ トー プ構 造を明らかにするために、糖ベ プチドスキャンニングを適応して、Pro，Asp‐Th・Aピg・Pr0．Ala・Pr0の Thr残 基 に 2， 3・ SialylTの導 入さ れた 構 造が 最小 エピ トー プ 構造 であ るこ と を明 らか にした 。 一 方 、 エ ピ ト ー プ 構 造 を 含 む 高 密 度 に 糖 鎖 が 付 加 し た MUC1糖 ベ プ チ ド の 抗 体 と の 親和 性 を 評 価 し た 。 立 体 的 に 嵩 高 い 6糖 構 造 の 5ケ 所 に 付 加 し た ぺ プ チド は、 大 幅に 親和 性が低 下 し た こ と か ら、 エ ピト ープ 近傍 の糖 鎖 置換 の環 境が 抗体 と の認 識に も影 響 する こと が示
唆 さ れ た 。 以 上 、 糖 ベ プ チ ド ラ イ プ ラ リ ー を利 用 する こと によ り、 抗 KL・ 6抗 体の 認識 する
エ ピ ト ー プ 構 造 を 解 明 で き た の で 、 本 ラ イ ブ ラ り は O結 合 型 糖 鎖 を 解 析 す る 強 カ な ツ ー ル
で あ る こ と を 実 証 す る こ と が 出 来 た 。 さ ら に MUC1の 機 能 解 析 を 進 め る た め に 、 血 清 中 に存 在 す る 糖 夕 ン バ ク の モ デ ル と し て タ ン デ ム リ ピ ー ト MUC1糖 ベ プ チド 合成 法 を検 討し た。
一般 的に 分子 量の 大き な糖 ベプ チド を合 成す るべ プ チド 連結 方法 はチ オエ ステ ル法やnativechemica11igation法 が 知 ら れ て い る 。 様 々 な 糖 鎖 を 有 す る べプ チド ラ イブ ラリ ー構
築 に は 不 向 き で ある こ とか ら、 これ を解 決 する 合成 法と して べ プチ ドフ ラグ メ ン卜 を固 相合
成 す る 方 法 を 選 定 し た 。 糖 鎖 の 置 換 す る Ser/Th以 外 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 3つ の 分 け た フ ラ グ
メ ン ト と 糖 ア ミ ノ 酸 を 組 み 合 わ せ た タ ン デ ム リ ピ ー ト 糖 ペ プ チ ド の構 築を 目 指し た。 HBTU等 を 縮 合 剤 と し て用 い るべ プチ ド固 相合 成 の一 般的 な反 応条 件 にお いて は、 ベ プチ ドフ ラグメ ン ト を 縮 合 さ せ る 際 に C末 端 側 の ア ミ ノ 酸の 顕著 な異 性化 が 確認 され た。 種 々の 反応 条件を 検 討 し た 結 果 、 反 応 溶 媒 に CH2C12を 用 い て 縮 合 剤 に DIC、 反 応 活 性 剤 と し て HOOBtに
よ る 条 件 で 異 性 化が ほ ぼ低 減で きる こと を 見出 した 。続 いて 、 本合 成法 の有 用 性を 実証 する
こ と と KL・ 6抗 体 の 反 応 性 を 確 認 す る た め に 、 エ ピ ト ー プ 構 造 を 2箇所 に設 定 して 、そ れ以外 の 位 置 は 任 意 の 糖 鎖 で 置 換 し た 77残 基 夕 ン デ ム リ ピ ー ト 体 の 合 成を 行っ た 。そ の結 果、高 分 解 能 質 量 分 析 で 目 的 の 糖 ベ プ チ ド の 生 成 を 確 認 す る と 共 に 、 HPLC分析 で シン グル ピー
ク の 目 的 物 を 得 た 。 さ ら に は Marfey法 に よ る ア ミ ノ 酸 の ラ セ ミ 化 検定 で異 性 化が 殆ど 認め
ら れ な い こ と か ら 、 本 合 成 法 の 有 用 性 を 示 すこ と が出 来た 。次 にKL・ 6抗体 の 反応 性を 確認す る た め に 、 合 成 し た 77残 基 糖 ペ プ チ ド に 糖 転 移 酵 素 で 処 理 し て シ ア ル 酸 を 6力 所 伸 長 させ 、 酵 素 処 理 の 前 後 2種 類 の 糖 ベ プ チ ド に 対 し て KL・ 6診 断 キ ッ ト を用 いて 評 価し た結 果、シ ア ル 酸 を 伸 長 さ せ た 糖 ベ プ チ ド に 診 断 キ ッ ト の 陽 性 検 体 で あ る 天 然 の MUC1糖 夕 ン バ クと 同 等 の 反 応 が 確 認 さ れ た 。 血 清 中 に 存 在 する KL．6抗 原に 近 いモ デル 糖ベ プ チド とし て、診断キットに検出される原 理を確認できた。
こ れ を 要 す る に， 著 者は ，臨 床の 場で 応 用さ れて いる 診断 性 の抗 体に つい て 、認 識構 造を
詳 細 に 解 析 し た 手法 は 糖鎖 生物 学に おい て も貢 献の 大き いと こ ろで あり 、疾 患 発症 に伴 う糖鎖 構 造 の 関 連 性 を化 学 構造 レベ ル明 らか に した 数少 ない 成功 例 のー つで ある 。 得ら れた 知見は、 疾患の 診断 性の みな らず治療薬の創製に結びっくところ大なるものがある。
よっ て著 者 は， 北海 道大 学博 士 （生 命科 学） の 学位 を授 与さ れる資格あるもの と認める。

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