博 士 （ 医 学 ） 門 田純

学位論文題 名
Septin rlngaSSemblyrlqulreSCOnCertedaCtionof
polariSOmeCOmponentS， aPAKkinaSeCla4p，● ●andt
heaCtin
CytO
Skeletonin
Sあ CCカ ￠ ケ1刀 穆ツ C￠ S
C￠ 0℃ぴZ
SZロ ピ（出 芽 酵母 の ポラ リ ソ ーム 構 成因子と PAK
キナー ゼC
Ia4pはアクチン細胞骨格と強調してセプチンリング形成を制御する）

学位論文内容の要旨【目的と背景】
細胞の極性形成は 、アクチン細胞骨格の再編 成や様々な極性関連蛋白質の 機能を必要とする非常に複雑な過程である。本研究で用いた出芽酵母Sacchaioi，?
ycescere¥′isiaeは、分子遺伝学的解析が速やかにかつ 明確に行うことができ、細 胞および細胞骨格系の制御を 研究するためには非常に優れたモデル 生物である。出芽酵母は細 胞壁が局所的に伸展した結果 である出芽によって成長し、この出芽 は極性を有する細胞内輸送 によって成り立っている。出 芽開始前には出芽予定位置に向けてア クチン細胞骨格が再編成さ れると同時に、この位置にセ プチンのりングが形成される。
セプチンは酵母か らヒトまで進化的に強く保 存されたGrIP結合蛋白質フん ミリーであり、線維状の構造体を構成 し、細胞質分裂をはじめと するいろいろな生体反応にお いて、多様な蛋白質の働く基盤となる ことが知られている。一方 で、セプチンの異常が細胞癌 化や神経性疾患に関 与 し て い る 可 能 性 が 指 摘 さ れ て お り 、 セ プ チ ン の 制御 機構 の解 明が 期 待さ れて いる 。
出芽酵母において 、アクチンおよびセプチンの再編成にはR
ho type small GTPaseであるCdc42pが 必要 であ る。 GDP̲G'IP交 換反 応促 進 蛋白 質で ある Cdc24pによ り活 性化 さ れた Cdc42pは 、下流のエフェク夕一 にシグナルを伝達して極性 形成を制御する。これまでに アクチンの極性化に重 要 な様 々な Cdc42pの エ フウ クタ ーが 明ら かにされてきたが、どのよ うにしてCdc42pがセプチンリング形成を制御しているのかについては解明されていない。
今 回 、Cdc42pのェ フェ ク ター であ るBnilpとCla4pを欠損した細胞は、 細胞形態及びセプチンリ ン グ形 成が 異常 になり致死性を示すこと を見出した。Bnilpはフォル ミンフんミリーに属し、Bud6p，Spa2p， Pea2pと共にポラルソームと 呼ばれる蛋白質複合体を形成し、芽の先端成長に関 与 する 。ま たBnilpは、分泌小胞の輸送に 重要な役割をするアクチン ケーブルの形成に関与する。一方、Cla4pは、p21‑aciivated kinase (PAK)に属し、細胞質分裂に関与する。生化学的性 質が 異な るこ れ らの 蛋白 質が どの よ うに セプ チン リ ング 形成 に関 与す る のか 検討 した 。
【結 果】

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本研 究では 、高温で Cla4pが分 解され るcla4‑75イ d変異と bnil欠失変 異の二重変異株(bniIAcla4‑75‑川株）を用いて解析した。bnil△cla4‑ガィイ株は、温度感受性増殖を示し、細胞質分裂部位であ るbud neckの 形成や neck filamentの構成分子であるセプチンの局在に異常を示した。セプチンのGFP
融合蛋白質のタイムラプス観察から、bniltlcla4‑75‑td株は、出芽開始時におけるセ プチ ンリン グの初 期形成 に異常 を示し た。し たがって 、Bnilpと Cla4pはセプ チンリ ングの構 造 維 持 で は な くセ プ チ ン リン グ の 初 期形 成 に 重 複し た 機 能 を持 つ こ と が示 唆 さ れ た。
bnil△cla4‑75‑rd株の温度感受性増殖の原因がBNI1のどのドメインに関連するのか検討した。
そ の結 果 、 Bnilpの ア ク チン 重 合に関 連する 機能発 現に必 須のド メイン である FH1及びFH2ドヌイン が必要 である ことが 判った 。した がって 、Cla4p欠損 状態に おける セプチンリング形成にはBnilpのアク チン重 合の機能が必要であると考えられた。また、Bud6p結合ドメインやSpa2p結合ド メイン は高温 下で必 要であ ること が判っ た。これらのドメインはフォルミンの温度感受性増殖 の抑圧 には必 要なか った。 さらに 、ポラ リソー ム構成因 子(BUD6， SPA2，PEA2）の欠失変異とcla4欠失変異との二重変異株は、いずれもbnil△ cla4‑75‑td株と同様の表現型を示した。
したが って、 ポラリ ソーム のintegrityも また、 Cla4p欠損状態におけるセプチンリング形成において重要であると考えられた。
アク チンケ ーブル形 成に異 常を示 すbnil‑116変 異とcla4欠失変異との二重変異株もまたセプ
チンリ ング形 成に異 常を示 した。 さらに アクチ ン重合阻害剤を作用させたcla4欠失変異株や、
アクチ ンケー ブルに 関連し た遺伝 子の変 異とcla4欠失変異との二重変異株もセプチンリングを形 成で きなか った。 したが って、 Cla4p欠損状 態にお けるセ プチン リング 形成に Bnilpに依存したアクチンケーブルが必要であると考えられた。
bniIA cla4‑75‑rd株の温 度感受性 増殖は 、多コ ピーのBEM3
r41‑114とRGA IAl‑632により抑圧された 。BEM3と RGA´はCdc42pのG'IPase
活性促進蛋白質をコードするので、bnil△ cla4‑75‑td株 では 活性型 Cdc42pが蓄 積して いると 考えられ た。ま たbnil欠 失変異 株に活性 型に固 定されたGFP̲Cdc42012Vpを過剰 発現さ せたと き、セ プチンリングに異常が生じたことから、cla4欠失
変 異は 活 性 型 Cdc42pを 蓄 積 さ せる 可 能 性 が高 い と 考 えられ た。し たがっ て、BEM3A1‑114とRGA lAl‑632はcla4欠失変異側の異常を抑圧していると考えられた。
【考察】
本研究 は、出 芽酵母の セプチ ンリン グ形成 におい て、ポ ラルソ ーム構成因子とCla4pが重複した機能 を持ち 、さら にアク チン細 胞骨格 がこの過程に関与する可能性があることを初めて示唆した。 哺乳類 細胞で は、ア クチン 結合蛋 白質であるアニリンを介して、アクチン線維がセブチン線維 の鋳型 になる ことか ら、Bnilpが形成す るアク チン構 造体と ポラリソームが直接的にセプチン リング 形成に 関与す る可能 性が考 えられ る。ま た、Bnilpが 形成するアクチンケーブ
ルは、セプチンリング形成に必要な因子の輸送に使われている可能性も考えられる。一方、Cla4pの機能の 1っとし て、セ プチン を直接 ルン酸 化する ことに よるセ プチンリングの固定化が提唱されてい る。ま た、セ プチン リング の形成 には活 性型Cclc42pと 非活性 型Cdc42pのサイクリングが 必 要 で ある と 提 唱 され て い る 。Cla4pは Cdc42p結合 蛋白質 である Bemlp及びCdc24pと複合体 を 形 成 し、 活 性 型 Cdc42pの ダウン レギュ レーシ ョンに 働くと 報告さ れてお り、Cla4pはC
dc42pの活性を調節することによっても、セプチンルングの形成を制御していると考えられる。
したがっ て、Bnilp依存的 なアク チン構 造体の欠 損と活 性型Cdc42pの異常蓄積が、セプチンを‑ 569ー不安定 にし、 リング 形成の 異常を 引き起こすと考えられる。セプチンの制御の基本ヌカニズムをさら に解析 するこ とは、 セプチ ンの異常による疾患の原因解明の一助になると期待される。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 野 口 昌 幸
副 査 教 授 志 田 壽 利
副 査 教 授 田 中 一 馬

学 位 論 文 題名
Septin ring assembly rlqulreSCOnCertedaCtionof
p01ariSOme
COmponentS， aPAKkinaSeCla4p，
andtheaC
tinC
ytOS
keletonin5
わ CC
カ 口ダ 〇刀 ゑツC￠ SC￠ガ ピぴ 轟轟 弛（ 出 芽 酵母の ポラ リソ ーム 構成因 子と PAKキナ ーゼ C
la4pはアクチン細胞骨格と強調してセプチンリング形成を制御する）

セ プチ ン は酵 母か らヒ トま で 広く 保存 され たフィラ メント形成能を有するGTP結 合蛋白質であり 、細 胞 質分 裂や 小胞輸 送などに関与することが知ら れている。また、セプチン の異常が細胞癌 化や 神 経変 性疾 患に関 与している可能性が指摘され ている。セプチンフィラメ ント形成の基本 的メ カ ニズ ムを 解明す るにあたり、分子遺伝学的解 析が速やかにかつ明確に行 うことができ、 分子 細 胞生 物学 領域で 多くの研究室で用いられてい る出芽酵母をモデル生物と して使用した 。 出芽 酵母 のセ プ チン フィ ラメ ント 形 成に はRho GTPaseで ある Cdc42が 必要 であ る。 活 性化し たCdc42は、 下 流の エフ ェク ター に シグ ナルを伝達 してアクチン細胞骨格再編 成、セプチンリ ング 形 成、 成長 部位へ の小胞の輸送と融合などを制 御して出芽を開始する。エ フェクターに は フォ ルミ ンで あ るBnilや PAKキナ ーゼ であ る Cla4など があ るが 、 これ らの エフ ウク タ ーがど のよ う にし てセ プチン リング形成を制御しているの かについては解明されてい ない。

、

本 研究 にお いて 、 Bnilとaa4を 同時 に欠 損し た 細胞 は、 細胞 形態 及 びセ プチ ンの 局在 が 異常に なり 致 死性 を示 すこ とを 見 出し た。 高温 でaa4が分 解される皿群．耐変異と6川 J欠損変異の二重変異株（みn口 △cZ舛・甜株）を作製し、高温にシフトした後のセプチンの局在を経時的に観察したところ、出芽 開始時におけるセプチンリ ングの形成に異常を示した。したがって、Bni1とaa4は セプ チン リ ング の構 造維 持で は なく セプチン1jングの形成に重複した機能 を持つと考えられた。
Bnilは 幾 つか の機 能ド メイ ン を有 して いる 。 また 、Bni1は Bud6、 Spa2、Pea2と 共にポラリソー ムと 呼 ばれ る蛋 白質 複合 体 を形 成す る。 aa4欠損状 態におけるセプチンリング 形成にどのドメ イン が 必要 か検 討し たと こ ろ、 Bud6結合 ド メイ ンや Spa2結合 ド メインが必要 であった。
さら に各 ポ ラル ソー ム構成 因子とCla4を同時に欠損した 場合もセプチンルング形成 ができなかった 。し た がっ て、 aa4欠損 状態におけるセプチン1」ン グ形成には、ポラリソーム 構成因子が必 要 で あ り 、 さ ら に Bni1が Bud6や Spa2と 相 互 作 用 す る こ と が 重 要 で あ る と 考 え られ た 。
ー 571ーま たBnilの アクチ ン重合に 関わる ドメイ ンがセ プチン 1jング形 成に必要であった。アクチン
重 合阻害 剤を作 用させ たcla4欠損 変異株 や、ア クチン ケーブ ル関連遺伝子の変異にcla4欠損変異 を加え た変異 株もセ プチン リングを 形成で きなか った。 したが って、Cla4欠損状態における
セ プ チ ン リ ン グ 形 成 に は 、 Bnilに よ る ア ク チ ン 重 合 活 性 が 必 要 で あ る と 考 え ら れ た 。
bnildcla4‑td株の 致死性 は、BEM3A1‑114とRGAIAI‑632の 過剰発現により抑圧された。B
EM3と RGA1はCdc42の GTPase活性 促進蛋 白質をコ ードす るので 、6n〃△ cZ群‐耐株では活性型Cdc42が 蓄 積 し てい る と 考 えられ た。また aa4はCdc42に 対する ネガテ ィブフ イード バック 調節が あり 、活性 型Cdc42のダ ウンレ ギュレ ーショ ンに働 くこと が報告 されて いる。6川J欠損 変異株に活 性型に 固定さ れたCdc42を 発現さ せたと ころ、 セプチ ンリン グ形成 に異常が 生じた 。したがっ て 、 c鯏 変 異 は 活 性 型 Cdc42の 異 常 蓄 積 を 引 き 起 こ す 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
本 研 究に よ り 、 Cdc42の エ フェ ク タ ー であ る Bni1の ア クチ ン 重 合 活性 とaa4の キナーゼ 活性 の両方 がセプ チンリ ング形 成に必要 である ことが 明らか となっ た。また、このBni1の作用には 、 Bnilが 、 Bud6や Spa2などの ポラリ ソーム 構成因 子と相 互作用 すること が重要 であっ た。
Bnilが形成す るアク チンケ ーブル は、セ プチン の重合 に必要 な因子の輸送に関与する可能性が考 えられ た。さ らに、 Cdc42の活性 型と不 活性型 問のサ イクリ ングが セプチン リング 形成に必要 である ことが 明らか となり 、aa4がこ のサイ クリン グの調節 に関与 してい る可能 性が示 唆され た。
口 頭発表 におい て、副 査の志 田教授 より哺乳類のセプチンの役割について、またセプチン1」
ン グ 形 成 にお い て Bni1と aa4が1つの 経 路 で 働く 可 能 性 につ い て 質 問が あっ た。続 いて副 査の 田中教 授よル セプチ ンリン グ形成に おける Bni1とCla4そ れぞれ の役割 につい て、ま たCdc4
2の GThse活性 促進蛋白 質によ り6m´△ c轟W． 甜株の致 死性が 抑圧さ れた時 のセプ チンリ ングの状 態につ いて質 問があ った。 最後に主 査の野 口教授 より本 研究で 行った幾っかの実験について技 術的な 側面か ら質問 があっ た。これ らに対 して申 請者は 、自己 の研究結果と文献的知識を基に 誠実に 、概ね 妥当な 回答を 行った。
本 研究は 、セプ チンフ イラメ ント形 成にお ける基本 メカニ ズムの一端を明らかとしたものとし て 高 く 評 価 さ れ 、 今 後 セ プ チ ン 異 常に よ る 病 態の 解 明 に 役立 つ 可 能 性が 期 待 さ れる 。
審 査員一 同は、 これら の成果 を高く 評価し 、大学院 課程に おける研鑽や取得単位なども併せ
申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学位 を 受 ける の に 十分 な 資 格を 有 す るも の と 判定 し た 。

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