THECHEMICALTIMES2020 No.2（通巻256号）
ISSN 0285-2446

再生医療関連技術
再生医療における、

02 商業利用に対応したヒト細胞の安定供給
国立成育医療研究センター研究所 副所長

梅澤 明弘

06 化学合成可能な増殖因子代替化合物の開発
東京大学大学院工学系研究科 助教

植木 亮介 他

再生医療製品向け新規ウシ血小板溶解物

12 「NeoSERA 」開発と医療応用®

兵庫医科大学 先端医学研究所 医薬開発研究部門 准教授

山原 研一 他

ヒト間葉系幹細胞用無血清培地：STK®シリーズ
17 （STK®1, STK®2, STK®3）の開発
株式会社ツーセル

研究本部

邵 金昌 他

23 ヒトiPS細胞用培地「ciKIC

TM

iPS medium」の開発

関東化学株式会社 技術・開発本部 生命科学研究所 研究員

渡邉 剛広 他

特集

再生医療関連技術

再生医療における、
商業利用に対応したヒト細胞の安定供給
Business model for stable supply and commercial use of human cells in regenerative medicine

梅 澤 明 弘 Akihiro Umezawa (Deputy Director of the Research Institute)
国立成育医療研究センター研究所 副所長

National Center for Child Health and Development

輸送、品質管理、細胞供給、生物由来原料基準

01

制定

はじめに

厚生労働省告示第375号）
を遵守して実施することが求められ、ドナーへの説明書・同意書に記載すべき内容や組織採取に掛かる実費、社会的にも許容される基準を明確にする必要

再生医療における原料細胞の入手に関し、産業化に向けた事がある。また現状は新規治療法につなげるため再生医療等製業環境の整備は喫緊の課題である。企業にとって再生医療分野品の開発に熱意のある医師や研究者が中心となってヒト同種へ参入するにあたり、ドナーからの寄託が原則となっている国内

体性幹細胞の原料提供されるにとどまり、持続的な再生医療産における細胞原料の安定的な供給が大きな障壁の一つである。

業の発展のためには原料供給を組織的な体制として行うことが再生医療等製品の製造に利用可能なヒト同種体性幹細胞の安定求められる。

的な供給を実現するため、国内医療機関からのヒト細胞原料が供給される工程に係る課題を克服するための体制モデルの構築が重要となる（図１）。医療機関がヒト同種体性幹細胞の原料を提供する場合には、ドナーへのインフォームドコンセントや採取した

02 関連法令について

細胞原料の情報管理などの医療行為以外の作業が発生し、担当

再生医療等製品を製造する企業向けにヒト同種体性幹細胞原する医師にとって負担である。また企業が商用目的に使用する細料を供給するには、「 再生医療等製品の製造管理及び品質管理

胞原料を提供する際には生物由来原料基準（平成15年5月20日の基準に関する省令」（平成26年厚生労働省令第93号、GCTP

制定

省令）を遵守することになる。そのため商用利用可能な細胞原料

厚生労働省告示第210号、最終改正平成26年9月26日

原料流通産業化に向けたモデル
納品書・請求書 送付

材料提供機関組織または細胞評価結果通知発送依頼

・細胞分譲依頼書同意書・業務委託誓約書
・使用機関倫理委員会の承認書

受入細胞の品質評価
無菌試験
細胞数・生細胞率の確認

仲介機関

ドライアイス梱包
宅配便利用

ストックセンター
2週間 保存ラベル同封

・細胞株一時保管依頼書
・ラベル

図1 材料提供期間（国内医療機関）とクライアント（製造販売企業）と仲介機関の関係

2

クライアントTHE CHEMICAL TIMESとは、企業が医薬品医療機器等法（薬機法）に基づいて行う治験書を作成が求められる。細胞が有するゲノムは個人識別符号にや薬事承認を得るための製品の原料（原材料または原材料の元相当することより、それへの対応も必要となる。また、ドナーからになる細胞）を指す。ヒト体性幹細胞とは、平成24年9月7日付けの自発的な提供（贈与）が原則である細胞の入手はヒト由来でな

薬食発0907第3号厚生労働省医薬食品局長通知「ヒト同種体性い医薬品原料等の供給体制とは全く異なり、商用利用を意識し、幹細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保について」
で定義

倫理的、社会的事項を認識し、それらに関してどのように対応すする細胞である。体制モデルとしては、「 国内医療機関」と「仲介るかが重要である
（図２）
。

機関」
の存在により安定供給を実現できる。
「国内医療機関」
はヒト細胞原料の供給に関わる業務を医療機関が主体的に運営する組織体制となり、「仲介機関」
は医療機関を支援し、企業への原料供給を仲介する供給体制を構築する。複数の医療機関のサポー

04 仲介機関の適切性

トを実施できる体制を構築し、細胞製造企業へ原料供給を仲介

再生医療を個々に行う医療（自家移植）から広い対象（他家移する。
「 国内医療機関」と「仲介機関」の連携のもとに、経済産業

植）へ産業化を目指し促進するための課題を明確にする必要が省、厚生労働省およびPMDAの行政・規制当局とも意見交換をある。医薬品医療機器等法の下、再生医療を産業化レベルで活行いつつ、仲介機関が行うべき役割・業務や責任範囲について明性化し、企業等の新規参入を促進するためには、第一に再生医療

確にすることが肝要である。

等製品の原材料となる組織・細胞の確保、管理と安定的な提供が保証される必要がある。原料供給源に関しては、周産期組織や03 法的、倫理的、社会的事項について

手術検体などで医療上必要のなくなった医療廃棄物の利活用が期待されている。一方で、間葉系幹細胞による再生医療は、対象疾患が多岐にわたる上、間葉系幹細胞を採取する組織が様々で「平成29年度AMED間葉系幹細胞の安定供給事業の実現にあり得られる細胞も複数種からなる集団である。そのため、細胞向けた検討委員会報告書」
を参考にした。この報告書に基づき、ソースの体系的な品質評価を行い、付加価値的な原材料供給を①仲介機関の役割の明確化、②情報管理の在り方、③医療機行うことで再生医療製品開発に参入しやすくし、産業化を促進す

関の支援モデルの構築、④使用機関の支援モデルの構築、⑤ドることが肝要である。ヒト同種体性幹細胞を用いた再生医療等

ナーに対する適切な情報提供、⑥仲介機関の役割を担うための製品の研究開発・治療への応用を促進するためには、製造工程の自立的運用ビジネスモデルの構築をわれわれは行うことにした。

入り口の段階にあたる原料・材料（原料等）の安定的な供給が重医療機関は個人情報保護法を遵守し、組織・細胞提供先に識別番

要であり、そのためには原材料の提供元となる医療機関におい号等で匿名化された必要最小限の個人情報、及び細胞の品質とて原材料の提供が如何に行われるかが重要である。国立成育医

安全性に関わる情報を提供する。提供する情報には個人情報保療研究センターでは、成育バイオリソースプロジェクトとして、小護法第二条第三号に規定されている「要配慮個人情報」に該当す

児、産褥婦からの検体提供モデルを構築済みである。それらの細るものが含まれる可能性がある。これらの情報を提供することを胞・組織について、商業利用に関する同意を取得し、品質管理、輸説明・同意文書に記載する。個人の特定につながるような患者情送管理、細胞規格を設定する。医療機関からのヒト体性幹細胞の報については、個人情報管理のコストや情報漏洩のリスクの面か原料を安定的に供給するためには、大学病院や国立高度専門医

ら、可能な限り組織を提供する医療機関から持ち出さずに管理

療研究センターといった公的な組織が非競争的な立場を維持しすべきである。一方、事業者の設定する組織・細胞の受け入れ基

やすく、医療機関と事業者を仲介する機関を担うことがふさわし

準によってはこれらの情報が必要となることも考えられる。医療

いと筆者は考えている。

機関及び組織・細胞提供先においては、医療機関から提供された組織・細胞に付随する暗号化された情報を適切に保管しトレーサ
ビリティを確保するとともに、一連の業務について標準作業手順

05 仲介機関の医療機関に対する役割
仲介機関は原材料提供の医療機関から使用機関である再生医療等製品製造者まで原材料の流通過程における様々な場面

・契約文書の作成・責任範囲の明確化

での役割を行うことが考えられる（図3）。この中には医療機関に・検体の所有権おける提供者への同意取得や検体の取扱いの医療機関に対する支援、使用機関における倫理計画承認の確認や検体搬送・受け

提供機関

仲介機関
無償譲渡

提供先企業

入れ時の支援等使用機関に対する支援が想定され、かつ仲介機関の自律的運営を考慮した場合、受益者負担による運営費の自無償譲渡

立的確保が想定される。医療機関からの組織・細胞の提供におい

所有権：
「贈与」

ては、医療行為以外の様々な作業が発生することから、仲介機関

図2 ドナーからの無償譲渡による細胞の入手はこれら医療機関の作業をサポートすることが想定される。その3

特集

再生医療関連技術

中で、ドナーへの説明や同意取得、医療機関内における調整等にながら、幅広い観点からの検討を行う（図4）。製造販売承認されついては、仲介機関がSite Management Organizationとしてた再生医療等製品の製造を目的とする組織・細胞の採取は生原の機能を有し、Clinical Research Coordinatorの経験のある基第3の1(4)をすべて満たしている必要がある。
ドナーへの組人材を活用することで、医療機関の負担を大幅に減らせると同時

織・細胞提供についての説明・同意取得については、生原基第3に、質の高い運用が可能となる。

の1(4)イに掲げる事項について説明及び同意を取得する。代諾

再生医療等製品の原料として用いるための組織・細胞の品質者への説明・同意取得については、生原基第3の1(4)ウに掲げるとして、生原基に適合していることが必須であり、生原基第3の事項について文書にて説明及び同意を取得することとなってお1(1)では施設、(2)では採取の方法、(3)ではドナースクリーニン

り、代諾者の同意を得た場合には生原基第3の1(4) エにおいてグについての要件が明記されている。その中でも、生原基第3のドナーと代諾者の関係について記録を作成する。また、生原基第1(3)ウに記載のあるウインドウピリオドを勘案した感染症検査の3 の1(4)イ
（ケ）
及びウ
（ケ）
に定めるとおり特許権、著作権、その必要性から、提供者からの同意取得にはこの点を考慮して実施

他の財産権、経済的利益の帰属について明示する必要があり、再する。ただし、状況によっては再検査が不要と判断される場合が

生医療等製品の原料として商用利用されることを明示しつつも、あると想定されるため、レギュラトリーサイエンスの観点から、慎そこから利潤が発生してもドナーのものとならないことをしっか

重に判断する。
ドナーへの説明や同意取得については医療機関

り伝え、十分に理解を得られるよう配慮する。再生医療等製品の内の人材育成や説明内容に関する基準づくりの支援を行ってい原料に関しては生原基第3の1(4)クにあるように、ドナーの組織・く。併せて、仲介機関にて商用利用を目的とした組織・細胞の提細胞提供は無対価であることが原則となっている。
したがって、供に関する適切な倫理審査体制を構築することで、医療機関に

再生医療等製品の原料となる組織・細胞については、組織や細おける倫理審査の負担を軽減する。医療機関において実施する胞そのものに対する対価を生じさせないよう提供を受け、かつ、

倫理審査にて検討が必要な項目を文書化する等の支援を行う。

その入手方法を査察等の際に詳細に開示できるようにしておく。

また、ドナーに対して適切な説明を行うためのスタッフの教育が組織・細胞の提供時のみでなく、その後もドナーの個人情報を管必要となる。文書による同意説明文書の各項目については、治験理・追跡する必要がある場合は、そのことを説明・同意文書に記や臨床研究におけるClinical Research Coordinatorに準じた載する。
ドナーの健康状態について、
組織・細胞提供後のフォロー

知識レベルに加え、商用利用を目的とした提供にあたっては権利アップの必要性やその期間についてもさだめていく。

に関する適切な説明を行う。また、
ホームページを開設し、広く本事業者側にはドナーの情報が追跡できない組織・細胞を用い計画の意義を伝え、再生医療等製品の製造における原材料の患て製品化することで、ドナー由来の疾病の発症に対応できない者（医療機関受診者）
からの提供の重要性を啓蒙する。

等のリスクが生じる可能性がある。一方で、ドナー情報を長期に追跡することは大きなコストがかかり、ドナーの情報が複数の医

A. 細胞仲介事業の運営管理
B. 仲介コーディネート・発注

療機関にまたがることも考えられる。また、細胞は環境要因による影響を受けて状態が変化することから、ドナーの健康状態と

C. 各機関への費用の支払い

採取した組織・細胞の状態は必ずしも一致しない。提供組織・細D. 契約手続き

胞自体に由来するリスクと継代等の作業の中で環境変化により

E. 商用利用のインフォームドコンセント取得支援
F. 倫理委員会対応支援

発生するリスクがあるという点に留意が必要である。提供した組

G. 細胞授受の情報管理
H. 新規組織提供機関の開拓
I.

社会的啓蒙（広報活動）

J. ドナースクリーニング支援
K. 臨床情報の匿名化にかかる支援
L. ドナー再検査にかかる支援
図3 仲介機関の医療機関に対する役割( ア ) ヒト細胞組織原料等の使途( イ ) ヒト細胞組織原料等の提供により予期される危険及び不利益( ウ ) ドナーとなることは任意であること( エ ) 同意の撤回に関する事項( オ ) 提供をしないこと又は同意を撤回することにより不利益な取扱い受けないこと( カ ) ヒト細胞組織原料等の提供に係る費用に関する事項

06 インフ ォームドコンセントについて
手術によって摘出された組織については発生頻度が不定期であるため、安定的な組織入手を望む事業者にとってリスクとなる。健常ドナーからの組織・細胞提供の可能性については、移植に用いる造血幹細胞の適切な提供の推進に関する法律の下、骨髄・末梢血幹細胞提供の枠組みが確立していること等も踏まえ4( キ ) ヒト細胞組織原料等の提供による健康被害対する補償に関する事項( ク ) ドナーの個人情報保護に関する事項( ケ ) 特許権、著作権その他財産権又は経済的利益の帰属に関する事項( コ ) その他ヒト細胞組織原料等を用いる医薬品内容に応じ必要な事項
図4 ドナー本人に対し説明・同意する事項

THE CHEMICAL TIMES
織・細胞に何らかの影響を与えうる問題や事象が発生した場合、提供機関での経費、輸送費については、仲介機関でのコスト算

例えば数年後にドナーが疾病を発症し、それが採取した当時の出、使用機関へのチャージの検討が必要となる。費用積算根拠と組織・細胞に影響を及ぼしている可能性が否定できない場合等なる価格表の作成が必要となる。費用積算根拠は、ケースごとににおいて、当該情報の開示範囲、対応等の適切な体制の構築も異なる可能性がある。医療機関と仲介機関としての自立的な運考慮する必要がある。特に、新生児由来の組織の場合は既往歴用のためにも、適切な費用算定と運用プロセスの明確化は重要が存在しないため、
フォローアップが求められる可能性が高い。

である
（図6）
。

これらのフォローアップ体制の構築についてはどの範囲までが義務であるのか、努力義務の場合はどの範囲まで最低限トレー
サビリティを確保すべきかということについて検討する。再生医療等製品の品質を担保するための情報は長期的に維持管理する必要がある。仲介機関がアクセス可能な情報（臨床情報といった
個人情報）について整理し、長期間の情報追跡を可能とする。

07 仲介機関の製造販売会社に対する役割
細胞品質に関し、生原基第3の1(5)にて、品質及び安全性の確A. 組織提供を依頼（組織の種類・加工の要否・検査内容のリクエスト）

B. 細胞仲介機関への費用の支払い
図6 製造販売企業の役割

09 おわりに保上必要な情報について8項目が定められている。これらの情報

ヒト同種体性幹細胞の原料の供給に係る主な課題である医療を取得し、管理する体制を構築していく。また、再生医療等製品

機関からの原料提供に関わる工程を中心に、課題を克服するたの製造管理及び品質管理の基準に関する省令（以下、GCTP省

めの仕組み作りをわれわれは支援したい。これによりヒト同種体令）
第十一条第二十四号にて、再生医療等製品の原料となる組性幹細胞を用いた再生医療等製品の研究開発を促進する。医療

織・細胞について受入れ時の記録により、当該製品の製品標準書

機関からのヒト同種体性幹細胞原料の供給を促進するため、国に照らして適切なものであることを確認するとともに、その結果

内医療機関からのヒト細胞原料供給に関わる担当医師の負担軽に関する記録を作成し、これを保管することと定められている。

減と商用利用可能な細胞原料の安定的な供給モデル体制を構

当該規定に合致した、供給・管理体制を構築していく（図5）。

築することを目標としている。これにより再生医療等製品を製造する企業は細胞原料の入手の機会増加が見込まれ、再生医療産A. 細胞の単離業の発展につながることが期待される。

B. 細胞の品質検査
C. 細胞・組織の保管
D. 附帯情報の提供
E. 細胞・組織の搬送
図5 再生医療等製品の製造販売企業に対する役割

08 製造販売企業の役割
製造販売企業として、提供機関-仲介機関、仲介機関-使用機
関、仲介機関-ストック機関、仲介機関-輸送機関との契約書、依頼書が必要となる。免責事項及び機密保持契約の適用範囲については機関別に定めるべきである。例えば、
ストックセンターについては、発送先（使用機関名）と物品に対しての機密保持、仲介機関
については凍結細胞についての付随情報、使用機関名、など全体に渡る機密保持が必要となる。また、仲介機関、提供機関、使用機関における情報管理の内容、手順の確認が必要となる。
5

特集

再生医療関連技術

化学合成可能な増殖因子代替化合物の開発
Development of synthetic surrogates of growth factors

植 木 亮 介 Ryosuke Ueki, PhD (Assistant professor)
東京大学大学院工学系研究科 助教

Graduate School of Engineering, The University of Tokyo山 東 信 介 Shinsuke Sando, PhD (Professor)
東京大学大学院工学系研究科 教授

Graduate School of Engineering, The University of Tokyo

増殖因子、アゴニスト、DNAアプタマー

01 はじめに 〜増殖因子の再生医療応用と問題点〜

量体形成を誘起することでMetを活性化させ、肝細胞をはじめとする様々な細胞の増殖・アポトーシス阻害に繋がるシグナル伝達
1)。このようなリガンド結合に伴う受容体の二量
を誘起する
（図１）

細胞の増殖・分化や器官形成を制御するタンパク質として知ら化は、多くの増殖因子に共通の活性化機構である。二量化した受れる増殖因子は、その独特の生理作用から再生医療分野におい

容体は細胞内ドメインのリン酸化を受け、細胞内へのシグナル伝て重要な役割を果たしている。例えば、褥瘡や皮膚潰瘍などの創達を開始する。組換えHGFは、その生理作用から肝炎・肝硬変な

傷治療において増殖因子の組換えタンパク質（例：
トラフェルミ（ALS）
治療への応
どの難治性肝疾患 2)や、筋萎縮性側索硬化症

ン）
が外用薬として利用されている。また、ES細胞やiPS細胞など用が検討されている3)。最近では、HGF遺伝子をコードするプラの多能性幹細胞を体外で培養、あるいは特定の体細胞へ分化誘

スミド「コラテジェン
（ベペルミノゲンペルプラスミド）」が国内初導する際に、培地中に増殖因子を添加して生体内のシグナルをの遺伝子治療薬として条件・期限付き承認を得るなど、再生医療

模倣するアプローチが取られている。今後も再生医療における分野への応用が期待されている。一方で、複雑な構造を持つポリ増殖因子の重要性は高まると考えられるが、マテリアルとしてのペプチドであるHGFは組換えタンパク質生産における高価な製観点から見ると増殖因子は多くの問題点を抱えている。一つに、造コスト、収率の低さ、熱安定性の低さが実用上の問題点となる

組換えタンパク質である増殖因子の製造には生物宿主を用いた

4)発現系が必要であり、一般的に製造コストは非常に高価となる。

が、本節ではHGFの断片ポリペプチドを利用したアプローチにつ

また、糖鎖修飾やジスルフィド結合の形成パターンにばらつきがいて紹介する。

。この問題を解決するべく様々なアプローチが試みられている

生じ得るため、化合物としての均一性を担保するのが難しい。更に、活性の発現に重要なタンパク質の折りたたみ構造は熱的に不安定なことが多く、失活あるいはロット間で活性差が生じる原因となる。上記のように、組換えタンパク質は化学合成品と比べて製造コストや品質管理等の観点でいくつかの問題を抱えている。本稿では、これらの問題を解決するアプローチについて著者
らの研究例を交えつつ紹介したい。

02 肝細胞増殖因子（HGF）

6

図1 肝細胞増殖因子（HGF）による受容体（Met）
二量化を介した細胞活性化

肝臓の再生因子として知られる肝細胞増殖因子（Hepatocyte

HGFはα鎖とβ鎖からなり、α鎖はN、K1、K2、K3、K4 ドメイン

growth factor; HGF）
は、細胞膜上に発現する受容体Metの二から構成されている（図2a）。このうちNとK1ドメインからなる

THE CHEMICAL TIMESNK1 断片は弱いながらもMet活性化能を示すアゴニストとして複数のポリペプチド断片をChemical ligationによって連結す機能することが知られている5)。一方で、NからK2ドメインからなることで合成されている。これらの生理活性を評価した結果、K1

るNK2断片はMet活性化能力を示さない。NK1は結晶構造におドメイン/ストレプトアビジン複合体のみがMet活性化能力を示

いてNドメインとK1ドメイン間のリンカー配列（図2b, 赤）を相互し、K1ドメインが受容体への相互作用に重要であることを示唆

作用界面としたホモ二量体を構成している。一方でNK2単量体している。なお、
この複合体は組換えNK1とほぼ同等の生理活の結晶構造ではこのリンカー配列が構造内部に埋没することで性を示すことが確認されている。ただし、ホモダイマー形成能を

このNドメイ
二量体形成が妨げられていた（図2c, 赤）。つまり、失ったK1ドメインを集積化する目的でストレプトアビジンを利用

ンとK1ドメイン間のリンカー配列の自己集合性が受容体二量化しているため、未だ組換えタンパク質発現系に依存していることを介した活性化に必要であることを強く示唆している。ただし、は注意が必要である。

6)

NK1は受容体の活性化能は示すものの、HGFと同様に発現収量の低さや熱的な不安定性の問題を抱えている上、HGFと比較して受容体活性化能力が低いため、代替物質としての利用価値は低い。

03 DNAアプタマーからなるHGFの合成代替物
我々は、特定の高次構造に折りたたまれ、標的分子に選択的に8)を用いた増殖因子の結合する一本鎖DNA「DNAアプタマー」

代替化合物の開発を進めている。DNAアプタマーは試験管内進化法と呼ばれる手法で取得することが可能である。本手法では
１）
ランダム配列のDNAライブラリを化学合成、
２）
標的分子に結合したDNA配列を単離、３）
PCRによって増幅というサイクルを繰り返すことで、標的結合DNA配列を特定する
（図3）
。一般的に
DNAアプタマーは20-100塩基程度の長さであり、
ホスホロア
ミダイト法と呼ばれる固相合成法によって安価に化学合成可能である。また、DNA高次構造の熱変性は可逆的であり、タンパク
図2 HGFの構造とアゴニスト活性の相関(a) HGF構造の概略図 (b) NK1および (c) NK2の結晶構造（ PDB ID:2QJ2, 3HN4 を元に作図。
青：Nドメイン、緑：K1ドメイン、
橙：K2ドメイン、赤：N-K1ドメイン間配列）

この問題を解決すべく、Cochranらはイーストディスプレイ法

質のように熱的な失活を起こす恐れが低い。
我々は、HGFと競合的にMetに結合する50塩基のDNAアプ
タマー9-10)を5´末端から直列に二分子連結し、アプタマー二量体（ss-0, 図3a）を合成、これがMetの活性化を誘導するアゴニストとして機能することを見出した11)。DNAの相補鎖形成を利によって高収率で発現可能、かつ高熱安定性のNK1変異体を取用してMet結合アプタマーを二量化した検証実験においても、得することに成功している4)。具体的には酵母の細胞表層に発現

アプタマーの二量化に依存した受容体活性化が見られたことかするAga2pタンパク質にerror-prone PCR でランダム変異をらも、受容体二量化を誘導するアプタマーの設計戦略の有効性導入したNK1を融合発現させた。こうして酵母の表層に提示さが示された（lane 4, 図3b）
。このアゴニスト活性を持つアプタ

れたNK1の変異体ライブラリは、FACSによって単離・配列解析

マー二量体は受容体の活性化のみならず、HGF様の生理活性することができる。変異体の中から高い発現量、Metへの高い結を示すことも確認されている。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）

合能を示した変異体を解析したところ、熱安定性の指標である融の増殖試験において、アプタマー添加群はHGF添加群と同様に解温度が20℃近く向上し、組換え発現での収率が40倍向上した

HUVECの増殖を促進した（図3c）。対照実験として、受容体へのNK1変異体の取得に成功している。更に、
この高機能化された結合能を示さないアプタマーの逆配列（ss-0 Rev）
を添加した

NK1変異体の適切な位置にシステイン残基を導入することで、場合には、有意な増殖の促進は見られなかったことから、
アプタ

ジスルフィド結合によってホモ二量体を形成するNK1変異体のマー特異的な受容体への結合および二量化を支持している。

開発を報告している。この戦略により、HGFに匹敵する受容体活

前述のように組換えHGFは肝炎・肝硬変治療薬としての応用性化能力を示しながらも、高い熱安定性と高収率で発現可能なが検討されているが、DNAアプタマーの医薬品応用においては

NK1変異体の開発に成功している。

生体内での安定性が問題となる。一般的に、DNAは血中の分解

一方、発現系に依存しない化学合成によるアプローチも低コス

酵素（ヌクレアーゼ）
により速やかに分解されてしまうため、全身ト化や品質の均質化という観点から非常に重要である。例えば、投与の際には化学修飾による安定化を施すことが望ましい。
しかVicogneらの研究グループでは化学合成とバイオコンジュゲー

し、50%ウシ胎児血清（FBS）
中での評価において、コントロールションによる機能的HGF断片の構築に成功している7)。彼らはビ核酸が１時間ほどでほぼ完全に分解したのに対し、我々の開発しオチン修飾されたHGFのNドメイン、K1ドメインを個別に化学合たアプタマー二量体は24時間後も一部が完全長のまま残存す

成し、
ビオチン/ストレプトアビジン相互作用によって多量化する

このアプタるほどの強い酵素分解耐性を示した12)。検討の結果、戦略を採用している。Nドメイン、K1ドメインは固相合成された

マー二量体の独特の折りたたみ構造によって、酵素分解への耐7

特集

再生医療関連技術

図3 HGF代替化合物として機能するDNAアプタマーの設計と生理作用(a)アプタマー二量体による受容体活性化(b)相補鎖形成を介したアプタマー二量体形成と受容体活性化能の相関(c)ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の増殖試験結果(Adapted with permission from Reference 11.)性が向上していることが判明した。このアプタマーをマウスに尾できる14)。ただし、ヘパリン自体が生物由来の製造原料を用いて静脈投与したところ、肝臓組織におけるMetの活性化が確認さいるため、不純物の混入リスクや脱硫化反応による品質の不均れ、投与されたアプタマーの一部が機能を保ったままの形で肝一性の問題を抱えている。Maynardらは、ヘパリン模倣材料と臓へ移行していることが示唆された。肝炎マウスモデルを用いた

してポリエチレングリコール（PEG）を側鎖に持つメタクリル酸メ

実験においても、アプタマー投与で肝細胞のアポトーシス抑制

チルユニットとスチレンスルホン酸の共重合ポリマー p(SS-co -12)を示唆する結果が得られている 。このように、本アプタマーは

15)。このポリマーをbFGF上のシスPEGMA) を設計した（図4b）

細胞レベル、および個体レベルでの生理活性が確認されており、テイン残基とジスルフィド結合を介して結合して得られた複合

化学合成可能なHGF代替物質としての応用が期待される。

体は、様々な保管環境において安定性が向上していることが示

04

塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）

溶液中で2時間の酸処理、トリプシン存在下で16時間の酵素消化条件において、組換えbFGFがほぼ完全に失活したのに対し、次に、著者らの研究グループでは塩基性線維芽細胞増殖因子

bFGF/ポリマー複合体は生理活性を維持していた。重要なこと（basic fibroblast growth factors; 以下bFGF）
の代替化合

に、
このbFGF/ポリマー複合体は一般的な組換えbFGFと同等物の開発に着手した（図4a）。bFGFのシグナル伝達はヒトES細の生理活性を示したことから、
ポリマー修飾はFGF受容体との相胞・iPS細胞などの多能性幹細胞の未分化状態維持に重要な役互作用やシグナル伝達を阻害しないことが示唆されている。これ割を果たすため、培地の添加物として用いられている。例えば、まで組換えタンパク質へのPEG修飾によって体内動態を改善す2011年Thomsonらは、血清などの夾雑物質を含まず、既知成るアプローチは一般的であったが、この報告ではヘパリン模倣ポ分のみから構成されたiPS細胞培養用培地を報告しているが、こ

リマーよって組換えタンパク質の安定性向上が可能であることの培地に含まれる組換えタンパク質はbFGF、TGF-β、トランスを初めて示している。

フェリン、インスリンのみである13)。先に紹介したHGFとは異な

bFGFの抱える問題点を根本的に解決する方法として、化学合

り、bFGFは大腸菌で簡便に発現可能であるが、そのままの状態成可能で安定な代替化合物の開発はより魅力的である。HGFとでは生理条件下での安定性が低く、Thomsonらの報告による同様、bFGFも部分断片を利用するアプローチがいくつか報告と細胞培養条件で24時間後にはほぼ活性を失う 。そのため、されている。具体的には、bFGFの受容体との相互作用部位であbFGFの安定化剤や、安定な代替化合物の開発は重要な課題でる、
β1, β2, β11-β12 領域に由来するペプチドであるCanofin

ある。

16)
。これらの断片は10アミノ酸などが報告されている（図4a, c）

14)

bFGFは高度に硫酸化された天然多糖であるヘパリンと相互8された。例えば、55˚Cで30分間の熱処理、1%トリフルオロ酢酸

程度のペプチドであるため化学合成可能であるが、残念ながら作用することで安定化することが知られており、保管や使用の際bFGFに匹敵する強い活性を示す断片配列は未だ報告されていにヘパリンと共存させることで活性持続時間を延長することがない。

THE CHEMICAL TIMES
体のFc領域を融合させたタンパク質と混合した。この融合タン

05 bFGF代替アプタマーの開発

パク質はProtein G修飾磁気ビーズに結合するため、磁石を用いて簡便にFGFR1結合配列を単離できる。
６回の選別・増幅過程を繰り返した後にシーケンス解析を行い、いくつかの候補配列を特

我々は、bFGF代替アプタマー開発のため、ヒトES細胞に発現定した。配列の結合活性評価と最小化を行なった結果、FGFR1

し、bFGFと高親和性を示す受容体FGFR1を標的としたDNAに約10 nMの解離定数で結合する38塩基のDNA配列SL38.2

アプタマーの取得を行なった17)。40塩基のランダム配列を含む

を特定した
（図5a）
。

DNAライブラリを合成し、これをFGFR1の細胞外ドメインと抗このアプタマーを受容体を活性化するアゴニストへ変換する

図4 bFGFの安定化、および機能的断片の化学合成を志向したアプローチ(a)bFGF/FGFR1の2:2複合体の結晶構造（PDB ID:1FQ9 を元に作図。緑：FGFR1、灰：bFGF、青：Canofin 1、橙：Canofin 2、赤：Canofin 3）(b)ヘパリン模倣ポリマーp(ss-co-PEGMA)の構造とbFGFへのコンジュゲーション(c)bFGF配列中のCanofin部分。文字色は図４aと対応。

図5 bFGF代替化合物として機能するDNAアプタマーの設計と生理活性(a) FGFR1結合性アプタマーSL38.2の配列と予測二次構造(b)設計したアプタマー二量体の概念図。TDXはX塩基の一本鎖リンカーを介してアプタマーを直列に二分子連結。
DPXはアプタマーをX塩基隔てて20塩基の相補鎖形成で二量化。
(c) FGFR1発現細胞を用いた受容体リン酸化量の評価(d)ヒトiPS細胞を１週間培養した後の未分化マーカー（SSEA4）の発現量比較(Adapted with permission from Reference 17.)9

特集

再生医療関連技術

目的で、数種類のアプタマー二量体を設計した。5’末端から直列想外の結果であった。恐らく、アプタマーの二量化様式によって、に二分子連結した設計や、DNA相補鎖形成を利用して二量体を細胞内シグナル伝達の様式に変化が起きていると考えられる。

形成させる設計を考案した（図5b）。これらの設計はそれぞれ、

TD0添加培地で１週間培養したiPS細胞について、更に評価を二つのアプタマー間の距離・配向性が変化しており、受容体の活行なったところ、細胞が形成するコロニーの形態はbFGF存在下性化に最適な二量化状態をスクリーニングすることができるとで培養した際の形態と類似しており、蛍光標識抗体を使った染色考えた。設計したアプタマー二量体をFGFR1発現細胞に作用さ結果においても、
コロニー全体からSSEA-4の発現が確認された

せ、受容体活性化レベルを評価したところ、いずれの設計でも受（図6）。一方、対照サンプルであるTD0の逆配列（TD0Rev）
を容体リン酸化の上昇が確認された
（図5c）
。特に、
アプタマーを直添加した培地で培養した場合は、bFGF非添加の際と類似した形

列に二分子連結したアプタマー二量体（TD0）が最も高い活性態を示しており、SSEA4の発現も大幅に低下していた。定量PCRを示した。次に、iPS細胞の未分化維持培養へ応用できるか検証

で未分化マーカーの一種であるOCT4の発現量を評価した結するため、これらアプタマー二量体をbFGF不含培地へ添加して果でも同様の傾向が見られた。ただし、今回開発したアプタマー

iPS細胞培養を行なった。培養開始から１週間後にiPS細胞の未分

TD0添加培地で培養を継続した際には、未分化マーカーの緩や化マーカーの一つであるSSEA4の発現量を評価した結果、興味かな発現低下が確認されており、bFGF存在下で培養された細深いことにTD0のみがSSEA4の発現を維持しており、それ以外

胞の状態と必ずしも一致しない可能性が示唆されている。こののアプタマーはbFGF非添加群とほぼ同等のレベルまでSSEA4

原因は未解明ではあるが、アプタマーの再進化による活性向上

発現量が低下していた（図5d）。FGFR発現株を用いた受容体活

や、
シグナル阻害剤との併用などのアプローチによって、bFGF性化の評価では、いずれのアプタマーもアゴニストとして機能し添加培地で培養されたiPS細胞の表現型により近づくことが可能ていたが、TD0のみが未分化マーカーの発現を維持したのは予かもしれない。

図6 ヒトiPS細胞を１週間培養した後の未分化マーカー（SSEA4）の発現。
上から位相差像、核染色（マゼンタ）、未分化マーカー SSEA4（緑）を表す。(Adapted with permission from Reference 17.)

10

THE CHEMICAL TIMES

06 おわりに
本稿では、増殖因子の組換えタンパク質が抱える問題点と、その解決に向けたアプローチについて紹介した。我々の研究グループでは化学合成可能なDNAに着目して増殖因子代替化合物の開発を進めているが、進化工学的手法を利用することで、ペプチドなど他の分子から構成される受容体アゴニストの開発も可能である。例えば、今回紹介したHGFについては東京大学の菅らのグループが独自のスクリーニング系を用いて、Metに結合する特殊環状ペプチドを取得し、アゴニスト化に成功している18)。
これら核酸・ペプチドからなるアゴニストは、その物性や生理活性に応じて、種々の目的への応用が可能であると期待される。
DNAに基づいたアゴニスト設計の利点としては、
ワトソン-クリッ
ク塩基対形成の選択性によって、二次構造を比較的容易に予測可能であることが挙げられる。これにより、目的の構造や特性を示すアゴニストを合理的に設計することができる。実際に我々のグループでは、アプタマー二量体の配列設計によって、受容体の活性化能を制御可能であることを見出した19)。この手法により、天然の増殖因子とは異なる受容体の活性化レベルを人為的に誘導し、細胞機能の精密な制御が可能であることを報告している。
増殖因子が示す再生機能は多面的であり、様々な細胞種の増殖や分化を誘導するため、がん化などの副作用を引き起こすリスクが懸念されている。このようなアゴニスト活性の精密制御は、将来的に安全な再生医療の実現に貢献する分子技術となると期待
される。

参考文献
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12）R. Ueki, S. Uchida, N. Kanda, N. Yamada, A. Ueki, M. Akiyama, K. Toh, H.
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13）G. Chen, D. R. Gulbranson, Z. Hou, J. M. Bolin, V. Ruotti, M. D. Probasco,
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15）T. H. Nguyen, S. H. Kim, C. G. Decker, D. Y. Wong, J. A. Loo, H. D.
Maynard, Nat. Chem. 5, 221-227 (2013).
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17）R. Ueki, S. Atsuta, A. Ueki, J. Hoshiyama, J. Li, Y. Hayashi, S. Sando,
Chem. Commun. 55(18), 2672–2675 (2019).
18）K. Ito, K. Sakai, Y. Suzuki, N. Ozawa, T. Hatta, T. Natsume, K. Matsumoto,H. Suga, Nat. Commun. 6, 6373 (2015).
19）R. Ueki, M. Akiyama, S. Sando, Preprint in ChemRxiv https://doi.
org/10.26434/chemrxiv.9703013.v1 ( 参照 2020-02-10).

11

特集

再生医療関連技術

再生医療製品向け新規ウシ血小板溶解物「NeoSERA®」開発と医療応用
Development and clinical application of a new adult bovine-derived platelet lysate "NeoSERA"
for regenerative medicical products

山 原 研 一 Kenichi Yamahara (Associate Professor)
兵庫医科大学 先端医学研究所 医薬開発研究部門 准教授

Laboratory of Medical Innovation, Institute for Advanced Medical Sciences, Hyogo College of Medicine

浜 田 彰 子 Akiko Hamada (Researcher)

兵庫医科大学 先端医学研究所 医薬開発研究部門 研究員

Laboratory of Medical Innovation, Institute for Advanced Medical Sciences, Hyogo College of Medicine

藤 盛 好 啓 Yoshihiro Fujimori (Professor)

兵庫医科大学 先端医学研究所 医薬開発研究部門 教授

Laboratory of Medical Innovation, Institute for Advanced Medical Sciences, Hyogo College of Medicine

梅 沢 晃 Ko Umezawa (Division Manager)
株式会社ジャパン・バイオメディカル 事業部長
Japan Biomedical Co., Ltd.

須 藤 稔 太 Toshita Sudo (CEO)

株式会社ジャパン・バイオメディカル 代表取締役
Japan Biomedical Co., Ltd.

品質、GMP、日本薬局方、原材料管理

以下、BSE）の発生は、FBSの生産に影響を及ぼした。2001年の

01 はじめに

我が国でのBSE発生報告を契機に、医薬品等の安全性を確保するため、2003年から生物由来原料に対し、細菌やウイルス等の

我々は、新しい再生医療向け原材料として、胎児ウシ血清

安全性確保のための基準（「生物由来原料基準」（平成15年5月（Fetal Bovine Serum：以下、FBS）に代わる、安全性・安定性・20日厚生労働省告示第210号））
が定められることとなった。同

品質を高め、独自開発した国産ウシ血小板溶解物「NeoSERAⓇ」

基準では、医薬品等向けの反すう動物に由来する原材料に関し、を開発している。同時に、NeoSERA を原材料とするヒト羊膜由地理的BSEリスク評価に基づき、原産国が規定された。この結来間葉系幹細胞（以下、羊膜MSC）の製剤化と急性GVHD（移植

果、BSEが発症した我が国は利用可能な原産国ではなくなり、我片対宿主病）
およびクローン病に対する医師主導治験を開始したが国でも一部実施されていた細胞培養用途のウシ血清の製造は

Ⓡ

1,2)
。
（UMIN試験ID UMIN000029945、UMIN000029841）

本稿では、NeoSERAⓇ開発の経緯とその特徴、再生医療を中心とした医療応用の可能性を概説する。

途絶えることとなった3)。
その後、発生経路となる飼料の規制強化等によりBSEの発生は1992年をピークに大幅に減少し、2016年には年間2頭の発生まで減少しており（国際獣疫事務局 World Organisation for

02 NeoSERA の開発経緯Ⓡ

12、
BSEリスクは世界的に大Animal Health：以下、
OIE HPより4））幅に低下している。2013年5月OIEは日本や米国等を新たにBSEの「無視できるリスク国」に指定し、2014年の生物由来原料基準

FBSは、細胞培養技術を用いて製造されるワクチンなどの医の改定（平成26年9月26日厚生労働省告示第375号）
では、反す

薬品及び再生医療等製品向けに、細胞培養用添加剤のスタン

う動物由来原料等の利用可能な原産国を、
OIEの指定するBSEがダードとして汎用されている。
しかし、1980年代後半英国から始「無視できるリスク国」としたことで、現状国産のウシ血清が医薬まった牛海綿状脳症（Bovine spongiform encephalopathy：

品や再生医療等製品の原材料として使用できる状況にある。

THE CHEMICAL TIMES
現在我が国で上市されている再生医療等製品のうち、ジェイ用いることを推奨している。特にMSCについては、
ヒト血小板溶ス、ジャック、
テムセル、ハートシートといった多くの製品で、その解物同様、その増殖性は旺盛であり、5%程度の添加でFBSと同原材料としてFBSを使用している 。この理由は、FBSが細胞培等の増殖を認めることが多い。

5)

養用添加剤のスタンダードであることに加え、細胞培養コストが一方、NeoSERA Ⓡ使用の主な注意点として、以下が挙げられ

無血清培地よりも低額であることも理由と考えられる。
しかしな

るが、詳細はhttps://www.japan-biomedical.jp/how-to-

がら、FBSは不特定多数の胎児ウシの血液抽出物であり、場合に

use-neoseraを参照してほしい。

よっては感染胎児由来のウシ血液の混入もあり得ることから、①①N eoSERA ®は解凍により沈殿物が析出することがあるが、BSE原因であるプリオン混入のリスク、②ロット差、③結果、細胞製品の品質には問題なく、気になるようであれば、遠心や増殖性が劣る、といった、①安全性、②安定性、③品質における問

0.22µmフィルター操作で除去を行う。

題点が以前から指摘されている。また、胎児ウシからという、倫理②FBSからNeoSERAⓇへの変更は、3継代程度の馴化操作が必的に大きな問題のある手法により採取されていることもクロー要である。具体的には、FBSとNeoSERA®の混合比率を3継代ズアップされている6)。

の間に75%：25%→50%：50%→25%：75%と段階的に変化

これらの背景を踏まえ、我々は国産の成牛の血液を加工する

させる方法を推奨している。馴化の際、細胞の増殖が速くなっことにより、FBSの欠点をすべて打ち消す、①安全、②安定、③高た場合であっても継代時の播種密度は大きく変更することな

品質な、医薬品・再生医療等製品向け血清の開発を目指した。ヒく、細胞をよく観察し、適切な継代のタイミングを決めることントとなったのは、増殖因子を豊富に含む、
ヒト血液由来の血小をおすすめしたい。

板溶解物である。ヒト血小板溶解物は、
ヒト細胞、特にMSCの培養用添加剤としての使用が多数報告されている他7)、多くの製品が市販されている8)。そこで我々は、成牛から血小板を抽出し、血を開発し清化処理を施した国産ウシ血小板溶解物「NeoSERAⓇ」

04 NeoSERA の性能Ⓡ（特許第6212723号）、その製造販売を手がける株式会社ジャNeoSERA Ⓡ の主成分である血小板溶解物は、Platelet-

パン・バイオメディカルを立ち上げた（https://www.japan-

derived growth factor（PDGF）、Transforming growthbiomedical.jp）。

factor β（TGF-β）、Insulin-like growth factor-1（IGF-1）、

NeoSERA の安全性は、ジャパン・バイオメディカルの専用

Epidermal growth factor（EGF）
等の増殖因子が豊富に含ま牛舎にて、獣医による定期的な健康確認を受け、管理された

れており9)、細胞培養用添加剤として相応しい。そこで、再生医療

成牛から採取された血液を原料として製造することで、完全な分野で広く検討されているヒトMSCおよびワクチン製造に汎用

トレーサビリティを実現している。また、アメリカ合衆国農務省

されている細胞株について、NeoSERAⓇの性能に関しFBSと比（United States Department of Agriculture：USDA）
規則

較検討した。

Ⓡ

9CFR§113.420および欧州医薬品庁（European Medicines
Agency：EMEA）規則EMEA/CVMP/743/00に従い、ウイ≪ヒトMSCにおけるNeoSERAⓇによる増殖性≫

ルス不活化を含む滅菌を目的に30kGy以上のγ線照射を実ヒト骨髄MSCおよびヒト羊膜MSCにおいて、NeoSERAⓇおよ施しており、生物由来原料基準の規程を満たす安全な細胞培

びFBSをぞれぞれ10%添加したαMEMにて培養し、増殖曲線を養用血清である（平成29年4月17日 医薬品医療機器総合機構作成した。培養7日目の培養写真・増殖曲線を図１に示す。

（Pharmaceuticals and Medical Devices Agency ：以下、PMDA）
再生医療等製品材料適格性確認書取得 薬機審長発第0417002号）。

ヒト骨髄MSCおよびヒト羊膜MSCの培養写真(図1(A)(B))において、FBSおよびNeoSERAⓇで培養した細胞の形態に明確な

また、安定性は、単一プロトコルにて、少数の成牛からの繰り返

差は認めなかった。増殖曲線（図1(C)(D)）の結果から、
ヒト骨髄・

し採血から得られた血小板溶解物をプールした上で分注製造す

羊膜MSCの培養において、NeoSERAⓇはFBSよりも高い増殖性ることにより、ロット間差を最小限にしている。品質に関しても、を有することが示されたことから、細胞製剤化におけるメリットで採血から分注まで閉鎖系（分注のみ安全キャビネットでの操作）

ある、短時間で多くの細胞を得ることが期待される。

にて製造することで無菌性を担保し、常にエンドトキシンは検出感度以下であり、
コンタミネーションによる品質低下は皆無とし≪ワクチン製造用細胞株におけるNeoSERAⓇによる増殖性≫細胞バンクより入手したアフリカミドリザル腎臓由来細胞株ている。

Vero細胞およびヒト胎児肺由来細胞株MRC-5細胞において、

03

NeoSERAⓇを用いた細胞培養Ⓡ
ト）
およびFBSを細胞株のデータシートに基づ
NeoSERA（3ロッ

き推奨される基礎培地に添加し培養を行い、増殖曲線を作成した。培養４あるいは５日目の培養写真・増殖曲線を図2に示す。

NeoSERA の使用に関し、注意すべき点はFBSと大きな差はⓇ

なく、MEM等の基礎培地への添加剤（～10%）
として細胞培養に

VeroおよびMRC-5の培養写真（図2(A)(B)）
において、FBS
13

特集

再生医療関連技術

図１ NeoSERAⓇおよびFBS添加によるヒト骨髄・羊膜MSCにおける増殖性(A)ヒト骨髄MSC培養写真（NeoSERAⓇ、FBS：それぞれ40倍）(B)ヒト羊膜MSC培養写真（NeoSERAⓇ、FBS：それぞれ40倍）(C)ヒト骨髄MSC増殖曲線（片対数）(D)ヒト羊膜MSC増殖曲線（片対数）

図2 NeoSERAⓇおよびFBS添加によるVero・MRC-5における増殖性(A) Vero培養写真（NeoSERAⓇ 3ロット、FBS：それぞれ40倍）(B) MRC-5培養写真（NeoSERAⓇ 3ロット、FBS：それぞれ40倍）(C) Vero増殖曲線（片対数）(D) MRC-5増殖曲線（片対数）およびNeoSERA Ⓡで培養した細胞の形態に明確な差は認めなにおいて、羊膜MSCの静脈内投与が治療効果を示すことを見いかった。増殖曲線（図2(C)(D)）の結果から、3ロットのNeoSERA

だしている13)。

ⓇとFBSとの間に増殖性の差を認めなかった。

我々は、これら急性GVHDおよびクローン病モデルにおける非臨床試験の結果を踏まえ、羊膜MSCの製剤化と急性GVHD・

05

NeoSERAⓇを原材料とした羊膜MSC製剤開発

羊膜MSCの大量培養技術開発に着手した。1つ目の課題として、
羊膜MSCの単離法の確立が必要であった。羊膜は羊水側から

我々はこれまでの基礎的研究において、羊膜MSCが強力なみて、基底膜に裏打ちされる一層の上皮細胞と、その下にある。例えば、急性

細胞外基質層があり、細胞外基質には羊膜1gあたり100万個以

移植片対宿主病（Graft versus host disease：以下、GVHD）

上のMSCが含まれる。そこで、羊膜から羊膜MSCのみを効率的モデルを用いた評価において、
ヒト羊膜MSCの静脈内投与はに採取する方法として、基底膜を壊さない程度に細胞外基質の

急性GVHDの病態を改善することを示し、その理由の１つに羊みを分解できる酵素の配合を決定し、知財化した（図３、特許第膜MSCが有する高いプロスタグランジンE2産生能が考えら

6512759号）。この酵素配合で羊膜を処理することにより、上皮れた 。また、その発症に免疫学的機序が関与する炎症性腸疾患

細胞＋基底膜は残る一方、MSCは酵素液に浮遊した状態となり、については、デキストラン硫酸ナトリウム投与によるモデル動物

メッシュにて簡単に上皮細胞とMSCを分離することが可能とな

免疫・炎症抑制効果を有することを示してきた

10,11)

12)

14

クローン病に対する臨床試験実施をめざし、細胞調製施設でのTHE CHEMICAL TIMES

図3 羊膜MSCの分離

図4 NeoSERAⓇを原材料とした羊膜間葉系幹細胞の製剤化

り、FACSによるソーティングといった特別な操作なしに、遠心機

細胞増殖性に優れたNeoSERAⓇを用いることで、FBSと比較し、のみで簡単に羊膜MSCのみ純化することに成功した。

①ロットチェックが不要、②製造工程が短期化、③大量培養が可

2つ目の課題として、羊膜MSCの大量培養法の確立があった。

能となり、大量製造が容易な製法の確立につながった（図４）。

まず、PMDA薬事戦略相談（現RS戦略相談）にて羊膜MSCの治験製品化に向け、概要書内容、特に原材料に関する相談から始まった。当時は旧薬事法の時代であり、再生医療等製品に対する明確なルールが十分には整備されておらず、更に著者にとって初・クローン病に対する
06 羊膜MSC製剤の急性GVHD
第I/II相医師主導治験と大学発ベンチャーの創業めての経験ばかりで、手探りの状態であった。特に最も苦労した

このような流れの中で、試験名「同種造血幹細胞移植後に発症のは生物由来原料基準である。以前の同基準に関し、前述のごとしたステロイド抵抗性急性移植片対宿主病(急性GVHD)を対象

く、羊膜MSCの原材料であるウシ血清はBSEを考慮し原則オセとしたAM01(羊膜由来間葉系幹細胞)の第I/II相試験」
に関するアニア産に限られること、更に無菌性、特にウイルスに関する規

治験実施計画を確定し、兵庫医科大学病院臨床研究審査委員会

程が明確でなく、どのような資料をそろえれば良いか分からず、の承認（承認番号217851号）
を経て、2017年11月厚生労働大苦労した。結果的に、
このときの努力・知識のお陰で、NeoSERAⓇ

臣に治験届を提出した（UMIN試験ID：UMIN000029945）。まを開発することに成功し、これを原材料とする羊膜MSC製剤のた、同時に計画していたクローン病に対する治験「既存治療で効開発につながった。
とりわけ、製法確立において、ロット差が無く、果不十分の中等症の活動期クローン病患者を対象としたAM01
15

特集

再生医療関連技術（羊膜由来間葉系幹細胞）の第Ⅰ/Ⅱ相試験」
も同年9月に治験届

引用文献を提出するに至った（UMIN試験ID：UMIN000029841）。

1) S. Otagiri S, S. Ohnishi S, A. Miura A, et alH. Hayashi, I. Kumagai, Y.
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mesenchymal stem cells for treatment-resistant moderate Crohn’sdisease: study protocol for a phase I/II, dual-centre, open-label,
uncontrolled, dose-response trial. BMJ Open Gastroenterol 52018;5:,e000206 (2018).

治験の概要であるが、既存の治療に抵抗性の、造血幹細胞移植後の急性GVHD・クローン病患者に対しAM01の静脈内投与を行い、その安全性評価を主たる評価とし、有効性を副次評価することを目的とする。投与方法は、AM01を下記の投与量に従って、急性GVHDは0日目、7日目、14日目、21日目に、クローン病は0日目、7日目のみ点滴で静脈内投与する。
低用量群

1.0×10⁶ 個 /kg：0、7、（14、21）日目

高用量群

4.0×10⁶ 個 /kg：0、7、（14、21）日目

用量は低用量群から開始し、少なくとも3例の低用量群での安全性に関し、独立した組織である効果安全性評価委員会にて確認された後に高用量群へ移行し、高用量群での安全性を確認することとしている。
羊膜MSC AM01を用いた急性GVHD・クローン病に対する
医師主導治験であるが、他家MSCということもあり、治験継続には多額の資金が必要である。そこで、治験の円滑な実施、更には羊膜MSC AM01製剤の製造・研究開発サポートを目的としたベンチャー会社として2018年2月に株式会社シーテックスを立ちあげ、同年4月には兵庫医科大学初・発ベンチャーとしての認定を受けた（https://www.c-tex.jp）。今後、増資による資金を活用し、治験製品AM01の円滑な製造を目指すと共に、急性GVHD・クローン病以外の疾患への応用14)、再生医療等製品として早期の製造販売承認取得を進めていきたい。

07

NeoSERAⓇの今後

細胞培養技術を用いて製造される医薬品・再生医療等製品において、NeoSERAⓇを原材料とすることで、我々の羊膜MSC製剤のように、製品の安全性の強化、培養期間の短縮による低コスト化を実現できるものと考えており、我が国だけでなく世界展開を視野に、積極的な販売展開を行っていきたいと考えている。
現在、NeoSERA のGMP製造化、更には豪州産の製造に取りⓇ組んでおり、近い将来、製品化される予定である。NeoSERAⓇを
FBSの代替品として幅広い研究者・技術者に使用して頂き、我々にフィードバックを頂くことで、よりよい製品になるものと考えており、ご協力頂ければ幸いである。

2) K. Yamahara K, A. Hamada A, T. Soma T, R. Okamoto, M. Okada, S.
Yoshihara, K. Yoshihara, K. Ikegame, H. Tamaki, K. Kaida, T. Inoue, Y.
Ohsugi, H. Nishikawa, H. Hayashi, Y. M. Ito, H. Iijima, S. Ohnishi, D.
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16

THE CHEMICAL TIMES

ヒト間葉系幹細胞用無血清培地：STK®シリーズ（STK®1, STK®2, STK®3）の開発
Development of chemically defined serum-free media: STK® series (STK®1, STK®2, STK®3)
for human mesenchymal stem cell

邵 金 昌 Jinchang Shao (General Manager)
株式会社ツーセル 研究本部 本部長

Head Office of Research & Development, TWOCELLS COMPANY, LIMITED.

長 谷 川 森一 Shinichi Hasegawa (Vice Manager)
株式会社ツーセル 研究本部 副本部長

Head Office of Research & Development, TWOCELLS COMPANY, LIMITED.

加 藤 幸 夫 Yukio Kato (Vice President)
株式会社ツーセル 取締役副社長
TWOCELLS COMPANY, LIMITED.

辻 紘 一 郎 Tsuji Koichiro (President and Chief Executive Officer)
株式会社ツーセル 代表取締役社長
TWOCELLS COMPANY, LIMITED.

Chemically Defined Serum-free Media, Mesenchymal Stem Cell (MSC), Regenerative Medicine

01

はじめに

②血 清 添 加 培 地で培 養したM S C の 安 全 性は担 保できな
い；F B S 添 加 培 地 は 各 種 病 原 体 、例 えば B S E（ B o v i n espongiform encephalopathy）
プリオンやウイルスなど

間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell: 以下MSC）
は、による感染、異種蛋白によるアレルギー、動物型シアル酸産

骨、軟骨、靭帯、筋肉、脂肪など中胚葉由来組織へ分化するのみ

生などのリスクがある。また、患者の自己血清は同種になる

ならず、外胚葉および内胚葉由来組織（神経、肝臓など）へも分ため、FBSより免疫拒絶反応などのリスクが少なく安全だ

化する。
しかもMSCは、成体ドナーの各組織（骨髄、脂肪、滑膜、が、小児や重症患者からの大量採血は困難であるという問

臍帯、歯髄など）から容易に分離できる1-3)。MSCは胚性幹細胞

題もある。

（Embryonic stem cell: 以下ES細胞）より癌化リスクが小さ③血清の成分はMSCに対して最適でない；血清はMSCに特異

く、iPS細胞（induced Pluripotent stem cell）の様な遺伝子レ

的な増殖因子を必ずしも十分に含有するとは限らない。ま

ベルの操作を必要としないため、臨床応用上の安全性が高く、た、血清中にはMSCの増殖を阻害する酵素や未分化性を損

倫理学的問題も少ない細胞である。そのため、近年国内外におなう因子がある。

いて、MSCを用いた細胞移植治療の研究が進められており、骨・関節疾患、循環系疾患、脳卒中、自己免疫疾患、移植片対宿主病

再生医療の移植用MSCの培養に無血清培地を用いると、血清（Graft versus host disease: 以下GVHD）など、すでに多く

ロットチェックが不要；培養期間の短縮；ウイルス、細菌、マイコプの臨床例がある4-6)。一方、従来のMSC培養系には、通常培地にラズマなどの血清由来成分からの感染リスクの減少；効率的に品患者自己血清またはウシ胎児血清（Fetal bovine serum: 以下

質の高い細胞を増幅できるなど、多くの利点が期待できる。

FBS）が添加されているが、血清には下記の３つの問題点がある。

したがって、安全性及び品質の高いMSCを再生医療に提供できるようにするため、無血清培地（完全合成培地）の開発は必要①血清添加培地で培養したMSCの品質は一定しない；血清はである7)。

およそ１万種以上の成分を含むため複雑で、その中には未

本稿では、ヒトMSC用無血清培地：STK ®シリーズ（STK ® 1,

知物質が含まれる。また、血清成分はロットによって性能がの開発経緯及びMSCの無血清培養技術についSTK®2, STK®3）

変化したり、蛋白質分解酵素によって変性したりする。

て概説する。
17

特集

02

再生医療関連技術
ウシ血清由来アルで有効性があった15)。また初期のSTK®2には、初期の無血清培地

ブミンを含有していたが、現在は製造から管理された安全性の高い遺伝子組換えヒト血清アルブミンに置き換えている（図1）。

動物細胞の無血清培養は容易ではない。1980年頃、Gordon

次に、STK®2中の各成分の役割を明らかにするために、同培地か

Satoらは、成長因子を添加した無血清培地を開発した 8)。彼ら

ら成分を一つだけ除去した培地をそれぞれ作製した。STK ®2かの無血清培地は、株化（不死化）
細胞の増殖を支持したが、動物

ら各因子を一つ除去することで、細胞の生存率あるいは増殖率

やヒト組織から分離したプライマリ細胞の増殖を十分に支持が低下した。そして、STK®2中にはMSCの生存に必須である化合しなかった。その後、Denis Gospodarowiczらは、細胞外基質物（インスリンなど）、増殖を促進するのに必要な化合物（FGF-2（Extracellular matrix: 以下ECM）
コート培養皿や血漿リポ蛋など）、未分化性を保つのに欠かせない化合物（TGF-βなど）の必

白質画分を用いて、各種のプライマリ細胞を長期間無血清培養

要性を明らかにした。

。ただしECMや血漿リポ蛋白質画分には、未知物質が含MSCは、様々な組織（骨髄、脂肪、滑膜、歯髄、臍帯組織など）
かまれている。そして、2000年頃から、再生医学の研究が盛んになら分離されている。これらのMSCの多分化能は類似しているが、

した

9-11)

るとともに、MSCを含む幹細胞用の無血清培地の開発が始まっ

滑膜MSCの軟骨分化能や、歯髄MSCの神経分化能は他のMSCた。

と比較して高い。STK®2は、いずれのMSCに対しても、10%FBS
含有培地より高レベルに増殖を促進した16-18)。

ヒト間葉系幹細胞用無血清培地：STK シリーズ
03 （STK
1, STK 2, STK 3）の開発
®

®

®

®

3.1 ヒトMSC継代培養用（大量培養用）無血清培地：STK®2
STK®2は国内初のMSC用無血清培地として2008年に開発された。
我々の目標は、単に無血清で安全であれば良いのではなく、従来法よりも高品質のMSCを効率的に増幅できるような、臨床で有効性を示せる培地を開発することにある。STK®2の開発実
験には、
ヒト腸骨骨髄由来MSCを使用した。我々は、10%FBS含有培地に添加したFibroblast growth factor-2（FGF-2）が骨髄由来MSCの増殖を促進し、軟骨、脂肪、骨への分化能を
12)。現在で高レベルに維持することを報告した（超増幅培養法）

は、FGF-2添加法/超増幅培養法は、全世界で定着している。そこで、STK ®2でもFGF-2を基軸成分とした。通常FGF-2は非常に不安定であるが、無血清培地中では低濃度でも安定であっ

図1 ヒトMSCの長期培養に及ぼす遺伝子組換えヒト血清アルブミンの影響た。おそらく血清中のFGF分解酵素やFGF結合蛋白がないためである。Hepatocyte growth factor（HGF）
はMSC増殖を抑制すると報告されていた13)。またTransforming growth
factor（TGF-β）
は、一般には細胞増殖抑制因子であり分化促

無血清培地: STK®1

進因子でもある。
しかし、これらの因子は、無血清条件下でMSC

全培養プロセスを無血清化するには、初代培養系でも無血の未分化状態を維持しつつ増殖を促進した。さらにVascular

清培養が必要である。
しかし、初代ヒト骨髄MSCの培養系では、

endothelial growth factor（VEGF）、Connective tissue

STK®2培地を用いた培養は細胞の増殖をほとんど促進しなかっgrowth factor（CTGF）などもMSCの増殖を促進した。STK®2

た。特に、細胞の培養皿への接着能が低下した。骨髄から分離直にはこれらの成長因子を組み合わせて添加した。またアルブミン

後のMSCは接着力が弱いため、無血清培地中では増殖しないは、ES細胞などの細胞の生存と増殖に必須でないが 、MSCのが、継代培養系で人工的環境に馴化すれば、STK ®2中でも増殖

生存と増殖には必須であった。各種の脂肪化合物は、低濃度で細できるようになるのかもしれない。一方、血清には接着因子が存

胞増殖を促進し高濃度で抑制したので、それらの組み合わせと在するため、初代、継代に関わらず、MSCの接着と増殖を支持す

濃度を最適化してからSTK 2に加えた。

るものと推察される。いずれにせよ、初代MSCの無血清培養系

14)®

細胞を培養容器に単層で接着させた単層培養系でSTK 2をでは、培養環境への馴化と細胞接着の促進が必要である。これ用いた場合は10%FBS含有培地以上にヒト骨髄MSCの増殖をらのことを考慮しSTK®2中に初代細胞の接着を阻害する成分な

（ハイドロ
促進した
（図1）
。さらにSTK®2はリン酸カルシウム担体

どを除去することで、2010年にMSCの初代培養用無血清培地

キシアパタイト）存在下でもMSCの増殖を促進し、ハイドロキシ

STK®1を開発した。

®

アパタイトを足場とする培養骨の作成においても細胞増殖の面
18

3.2 ヒト初代MSC用（組織より初代細胞樹立培養用）

STK®2はヒト各組織MSCの大量培養をいずれも支持するが、THE CHEMICAL TIMES
それに対して、各組織由来初代MSCのSTK ®1への適応能は多β-グリセロリン
そこで、STK®2から骨分化抑制因子を除去して、様であった。滑膜由来初代MSCはSTK 1中でも最も高レベルの酸、アスコルビン酸を追加したことにより世界初のMSC骨分化増殖を示した。次いで、歯髄由来初代MSCと脂肪由来初代MSC

誘導用無血清培地：STK®3を開発した。STK®3の組成には骨形成

しかが、10%FBS含有培地よりもSTK®1中で活発に増殖した16)。

蛋白質（Bone morphogenetic protein: BMP）などの骨誘導、し、これらの組織と比較して、骨髄由来初代MSCは特に接着能が促進因子を配合していないにも関わらず、従来の血清含有OS-低いため、ドナーによっては骨髄液から分離したMSCは、STK®1

mediumよりも強力にかつ短期間に骨分化を誘導した。これは、存在下で樹立培養できないことがある。

血清中には骨分化を抑制する因子が存在することを示唆してい®

る。
しかも、STK®2で前培養したMSCは、血清含有培地で前培養
3.3 ヒトMSC骨分化誘導用無血清培地: STK®3
骨欠損の治療に自家骨移植がよく用いられているが、骨採取には長期間の疼痛をもたらす。
しかも採取できる骨量は少ない。

（図
した細胞よりもSTK®3添加後により早く相乗的に骨分化した
2）。従来法では、骨分化に3週間から4週間を要するが、STK®3を用いれば1週間に短縮できるので、培養の省力化に役立つ。

したがって大量に作製可能であるMSC由来培養骨への期待は（β社会的に大きい。ところが、従来のMSC用骨分化誘導培地19)

3.4 STK®シリーズ培地の共通成分と追加成分

グリセロリン酸、
アスコルビン酸、デキサメタゾンなど含有:以下

無血清培地の成分は７つのカテゴリー（栄養素、アルブミン、成OS-medium）には10%FBSが含まれているので、前述の全培養

長因子、脂質、低分子化合物、抗酸化剤、その他）に分類可能であ

プロセス無血清化のためにはMSC骨分化誘導用の無血清培地

り、すべての成分は化学的に既知である。STK ®シリーズの全成が求められていた。

分数は65～86個化合物である。STK®シリーズで最も成分数が各種化合物を検討した結果、いくつかの成長因子はMSCの増多いのは、栄養素（無機質を含む）
であり54～60個の化合物から殖を促進する一方で、骨分化を抑制することが明らかになった。

なる。血清中には１万種以上の化合物が存在すると考えられるの

図2 ヒトMSCの骨分化に及ぼす無血清培地の影響：
骨分化誘導培地で培養したMSCの骨分化染色結果 (Alizarin red染色）

19

特集

再生医療関連技術

で、百個以下の化合物で細胞の長期間の生存と増殖を維持できる理由はまだ解明されていない。無血清培地中では、血清中に含まれる細胞内で必要な化合物が合成されるかもしれないし、微安全性が担保できる。
すでに自社開発したMSC
現段階では臨床用STK®シリーズは、由来細胞治療製品の研究開発に活用している。

量分子は最初の持ち込みだけで十分かもしれない。
（60個化合物）
以外に、追加化合物（5
STK®1～3には共通成分～26種類）が配合されている。共通成分は生存を維持し、STK®1
へ の 追 加 成 分は馴 化と接 着 、S T K ® 2 へ の 追 加 成 分は増 殖 、STK®3への追加成分は骨分化を支持する。

04 MSCの無血清培養で使用する酵素液
脂肪、骨膜、歯髄、滑膜組織からMSCを分離、分散するのにコラゲナーゼなどが用いられるが、同酵素の生産過程では血清3.5 臨床用STK®シリーズ（STK®1, STK®2）の開発を使用していない製品を使用すべきである（Collagenase-A,

近年、再生医療の臨床研究の進展や実用化に伴い、「生物由来原animal origin free, Worthington Biochemical Co.など）。

料基準」（厚生労働省告示第210号、
平成15年5月20日）に適合する継代のための細胞剥離剤としては、従来法ではブタやウシ由

原料のみを使用している、
臨床用グレードの培地が求められていた。

来トリプシンが使われているが、ウイルスやプリオンによる感染

我々は前述の研究用のSTK ®シリーズの開発を通じて培ってリスクがあり、動物由来成分フリーでなくなるという問題があきた培地の原料・組成等の開発技術を強みに、PMDAに再生医る。また無血清培地には血清由来の蛋白分解酵素インヒビター

療等製品の材料適格性の相談をした上で、「生物由来原料基準」

が不在のため、動物由来成分が含まれているトリプシンを使用（STK 1,に適合する原料のみを使用した臨床用STK シリーズ

した場合、剥離後に精製トリプシンインヒビターの添加が必要を開発した。研究用STK ®シリーズと比較して、臨床用STK ®2）である（無血清培養ではこれを怠ると細胞が死滅する）。一方、近STK シリーズは、培地の高い性能を保ちながら培養した細胞の年、cGMP（Current Good Manufacturing Practices）
対応

®

®

®

図3 STK®1, STK®2を用いたヒト滑膜MSCの長期連続的な継代培養・大量増殖：10%FBS含有培地との比較

20

THE CHEMICAL TIMESの設備で、動物由来成分を使用せず製造された遺伝子組換え体

MSCを分離して連続的に継代培養した。

トリプシン様酵素（TrypLE™ Select CTS™, Thermo Fisher

Collagenase-A（animal origin free）の処理により組織から

Scientific; TrypZean™ Solution, Sigmaなど）が発売され、
こ

単離した初代滑膜MSCをSTK®1で培養すると、血清含有培地よ

れらは、
ヒトMSCの無血清培養に適用できる。動物由来成分が含り多くの細胞が接着・増殖した。またSTK®1とSTK®2を用いた完まれているトリプシンより純度が高く細胞に優しい。多くの場合、全な無血清の培養条件下で連続的に継代培養（9継代以上）がで洗浄すれば精製トリプシンインヒビターの添加は不要であるが、きた。そして、10%FBS含有培地と比較して、細胞を1万倍まで増

いずれの酵素を用いても細胞剥離後の十分の洗浄は必要であ

幅させる時間が約半分に短縮した（図3）。無血清培地で得られたる。また、無血清培地を用いた細胞継代では、機械的刺激（過度

MSCは、血清含有培地と比較して、細胞集団として均質であり、の撹拌や遠心など）による細胞にダメージを与えてしまうため、同様の細胞表面マーカーを発現した（図4）。また、すべての株で酵素濃度および酵素反応時間を最小にしなければならない。

5継代後も染色体異常がなかった。さらに無血清培養したMSC
は、血清含有培地よりも顕著に高レベルの軟骨、骨、脂肪分化能

STK 1、STK 2を用いた
05 関節疾患治療用他家滑膜MSCの増幅

を示した
（図5）
。

滑膜由来のMSCは、他組織由来MSCと比較して、高い軟骨分業利用が可能な他家移植の安定供給は困難であった。
しかし、化能を有するので、関節疾患治療での細胞ソースとして優れてドナー一人分のヒト滑膜
STK ®シリーズを利用することにより、®

®

従来の血清培養法を用いて増殖したMSCの数は最大でも数十人分程度しか得られないので自家移植は可能であるが、商いる。
しかし、FBSや患者自己血清を用いる従来の培養法では、

組織（湿重量0.5～1g）
から、千人から一万人の関節疾患を治療移植に必要とする数千万ないし億単位の細胞数を確保するのはを増幅することができるようにするための高性能MSC（1013個）ヒト滑膜組織から難しい。そこで、我々はSTK®1とSTK®2を用い、なった。

図4 STK®1, STK®2で増殖したヒト滑膜MSCの表面抗原マーカーの解析：10%FBS含有培地との比較

図5 STK®1, STK®2で培養したヒト滑膜MSCの軟骨・骨・脂肪への分化能：10%FBS含有培地との比較

21

特集

再生医療関連技術

06 MSC用無血清培地が直面している課題
MSC用無血清培地には細胞の増殖性および未分化性を保つため、数種類の遺伝子組換え成長因子を配合している。そのため、血清含有培地より高価になっている。最近のヒトES細胞用の無血清培地では、
これまで必須とされてきたbFGFやTGFβを低分子化合物に置換することができた20)。STK®シリーズについても、将来は遺伝子組換え成長因子などのコストが高い成分を低分子化合物に置換する必要がある。
無血清培地の開発には、培養皿への考慮も必要である。生体内で、幹細胞はニッチに存在するが、ニッチでは、液性因子以外に
ECMや他細胞との接触によりstemness（幹細胞らしさ）が維持される。培地は液性因子、培養皿はECM、フィーダー細胞は他細胞の影響を模倣する。ECMは、細胞の接着、遊走、増殖、分化をしたがって、制御するが21-22)、未知物質を含むことが問題である。
生体内のニッチを再現するには、無血清培地とECMの機能をもつ培養皿との組み合わせが不可欠である。
血清含有培地を使用すれば、血清蛋白が培養皿に付着して、ECMと類似した機能を発揮するのに対して、無血清培地では血清からのECM効果が期待できない。
したがって、無血清培養用の培養皿が必要であり、各社が開発を進めている。従来のプラズマ処置したプラスチック培養皿の表面化学組成は一定でなく、しかも保管中にその化学性状が変化することが問題である。近年、ECMの一部機能が代替できる遺伝子組換えヒトフィブロネクチ
ン、
ビトロネクチンなどが発売されたが、コストが高く患者への経済負担を増加させるため再生医療には今のところ適合しない。
今後、無血清培地と高機能の培養皿の併用が必要となるが、効果とコストのバランスを考慮しなければならない。
また、他家移植法では、移植するMSCの品質が十分管理されていないといけない。所謂MSCには共通分化レパートリーや共参考文献
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Vartak-Sharma, H. Suemori, K. Hasegawa, Nat. Biomed. Eng. 2(3), 173182 (2018).

通の細胞表面抗原が知られているものの、ES細胞のように均

21) Y. Kato, D. Gospodarowicz, J. Cell Biol. 100(2), 486-495 (1985).

質な細胞としてMSCを規定化できていない。我々は、現在各種

22) T. Matsubara, S. Tsutsumi, H. Pan, H. Hiraoka, R. Oda, M. Nishimura,
H. Kawaguchi, K. Nakamura, Y. Kato, Biochem. Biophys. Res. Commun.
313(3), 503-508 (2004).

MSCマーカーの開発にも着手しており、今後MSCの仕様を規定
するのに役立つかもしれない23-25）。

23) H. Kubo, M. Shimizu, Y. Taya, T. Kawamoto, M. Michida, E. Kaneko,
A. Igarashi, M. Nishimura, K. Segoshi, Y. Shimazu, K. Tsuji, T. Aoba, Y.
Kato, Genes Cells 14(3), 407-424 (2009).
24) M. Ishii, C. Koike, A. Igarashi, K. Yamanaka, H. Pan, Y. Higashi, H.
Kawaguchi, M. Sugiyama, N. Kamata, T. Iwata, T. Matsubara, K.
Nakamura, H. Kurihara, K. Tsuji, Y. Kato, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 332(1), 297-303 (2005).
25) A. Igarashi, K. Segoshi, Y. Sakai, H. Pan, M. Kanawa, Y. Higashi,
M. Sugiyama, K. Nakamura, H. Kurihara, S. Yamaguchi, K. Tsuji, T.
Kawamoto, Y. Kato, Tissue Eng. 13(10), 2405-2417 (2007).

22

THE CHEMICAL TIMESヒトiPS細胞用培地「ciKICTM iPS medium」の開発
Development of culture medium for iPS cells “ciKICTM iPS medium”

渡 邉 剛 広 Takehiro Watanabe (Researcher)

関東化学株式会社 技術・開発本部 生命科学研究所 研究員

Life Science Laboratory, Technology and Development Division, Kanto Chemical Co., Inc.

澤 口 智 哉 Tomoya Sawaguchi (Chief Researcher)
関東化学株式会社 技術・開発本部 生命科学研究所 主任研究員

Life Science Laboratory, Technology and Development Division, Kanto Chemical Co., Inc.

再生医療、iPS細胞、培地、未分化な影響を与える培地の重要性は極めて高い。

01 はじめに

本稿では、iPS細胞の発明初期から現在に至るまでの培養方法と培地について概説するとともに、当社が開発したiPS細胞用培地

再生医療は、事故や重篤な疾患によって損傷した体や低下しについて紹介する。
「ciKICTM iPS medium」

た身体機能を、体外で培養した細胞を用いて修復・補完すること
で、従来技術では治療が困難とされていたパーキンソン病や心臓病などの根治も可能にする夢の医療である。再生医療では、1回の治療に10 8～10 11個程度の細胞を必要とするが、体を構成

02 ヒトiPS細胞の培養方法と課題する大部分の細胞は分化および成熟の過程で増殖能力を失っ

ヒトiPS細胞が樹立された当初は、
ヒトES細胞の知見をもとにている。そのため、
まずは自己もしくは他家の体内から増殖能をオンフィーダー培養による未分化維持培養が行われていた。オン有している幹細胞を集め、これを患者に移植する治療が成されフィーダー培養は、マウス胚性線維芽細胞（Murine embryonicてきたが、この方法を適用できる範囲は骨髄移植などの一部にfibroblasts；MEF）などをフィーダー細胞として用いる培養法で限られていた。一方で、1998年にヒト胚性幹細胞（Embryonic

ある。フィーダー細胞は、iPS細胞が接着する足場としての役割を

stem cells；ES細胞）が樹立されたことで1）再生医療の研究が果たすとともに、iPS細胞の維持に必要な液性因子の供給の役割

加速することとなったが、ES細胞の作製には受精卵を用いるとも担っている。
しかしながら、
オンフィーダー培養で増殖させたヒいう倫理的な問題が伴っていた。そのような状況の中、2006

トiPS細胞にはフィーダー細胞（異種細胞）が混入する恐れがあっ年に山中らは、生体から採取した線維芽細胞に4種類の遺伝子たり、ヒトの細胞には通常存在しないN -グリコリルノイラミン酸（Oct-3/4、Klf4、Sox2、c-Myc）を導入することで人工的に幹を含む糖鎖構造がヒト細胞表面に認められたりするなど4）、拒絶細胞を作製することに成功した（人工多能性幹細胞（induced

反応を引き起こすリスクが高まることから、医療応用における安Pluripotent stem cells；iPS細胞）） 。これにより、生命倫理の全性が問題視されている。

2,3）

問題を回避しつつ再生医療に必要な膨大な数の細胞を確保するための道が拓かれた。

このようなオンフィーダー培養が抱える安全性などの懸念を解決すべく、様々な研究機関や企業によってフィーダー細胞をその後、2014年の再生医療等安全性確保法および医薬品医

使用しない培養法（フィーダーフリー培養法）
が開発されてきた。

療機器等法の施行に伴いiPS細胞を用いた複数の臨床研究や治その結果、ビトロネクチンやラミニン511およびラミニン511の験が活性化したことで、再生医療に対する社会の期待は急速に

E8断片（製品名iMatrix-511）などといった細胞外マトリックス

高まったと言える。その期待に応えてiPS細胞を用いた再生医療を用いることで、フィーダー細胞の足場としての役割を代替すを幅広く普及させるためには、iPS細胞に係る研究の深化と研究

フィーダー細胞によってもることに成功している5,6)。これにより、成果を患者に届けるためのバリューチェーンを構築することが必たらされる安全上の懸念を払拭することが可能となった。一方須である。なかでも、細胞の未分化性や増殖性および品質に大きで、これらの細胞外マトリックスには、
フィーダー細胞のような液
23

特集

再生医療関連技術

性因子を供給する働きは無い。そのため、フィーダーフリー培養

酸などとジスルフィド結合を形成した酸化型アルブミンの2種類用培地には、
フィーダー細胞が供給していた液性因子に代わるが存在する。このうち還元型アルブミンは、生体が酸化ストレス

様々な成分を添加する必要がある。具体的には、塩基性線維芽およに曝された際にSH基を利用してヒドロキシラジカル（OH・）

細胞成長因子（basic Fibroblast growth factor；bFGF）やトラを消去することや、過亜硝酸イオン
び次亜塩素酸イオン（OCl－）

ンスフォーミング増殖因子-β（Transforming growth factor；の産生を抑制することが知られている12）。
（ONOO－）さ
TGF-β）
といった増殖因子が比較的高濃度で含まれており 、

このことから、我々は、血清アルブミンがiPS細胞内で生じたらに一部の培地には多量のヒト血清アルブミン（Human serum

ROSを消去することで、細胞の生存性・増殖性維持に関与していalbumin；HSA）
も添加されている。
しかしながら、
これらのタン

るのではないかと推測した。実際に、血清アルブミンを添加して7,8)

パク質成分は、動物由来のものはロット間の品質に差が生じや

いない培地
（Alb
（－）
）
と添加した培地（Alb（＋））
で培養したiPS細すく、その結果として培地の性能に影響を及ぼす恐れがある。

胞のROS量を比較すると、Alb（＋）
において細胞内のROS量がまた、遺伝子組換えタンパク質として供給されているものは、大幅に低下していることが確認できた（図1）。この知見をもとに、動物由来に比べていずれも高価である。アニマルフリーやGMP

細胞内ROS量に着目した抗酸化物質のスクリーニングと添加培（Good Manufacturing Practice）
グレードといった再生医療養試験を行った結果、SH基を有する一部の抗酸化物質がiPS細用途向けの品質を求めることで培地にかかるコストがさらに高ま胞の増殖性を改善することが示唆された（data not shown）。

ることから、再生医療にかかる医療費を押し上げる理由の一つとなっている。
現状のフィーダーフリー培養用培地におけるロット間差やコ
スト面の課題を解決するためには、
タンパク質成分をより安価で品質の安定した合成化合物に置き換えることが有効であると考えられる。その試みのひとつとして、2018年に長谷川らがグリコーゲン合成酵素キナーゼ3（Glycogen synthase kinase 3；GSK3）阻害作用を有する低分子化合物を用いてbFGFとTGF-βを代替する技術を報告している9）。また、我々は血清アルブミンの作用を合成化合物で代替する技術の開発を試み、一定の成果を収めることに成功した。次項では、血清アルブミンの作用とそれを代替する技術の一部を紹介する。

03 血清アルブミンの機能と代替物

図1 血清アルブミンの有無と細胞内ROS量の関係
データは、Alb（－）のROS量を1とした際の相対値（平均値±標準誤差）。
棒グラフ上に位置する括弧内の数字はn数を示す。

血清アルブミンは、主に肝臓で合成される分子量約66,000のタンパク質であり、血清中に存在するタンパク質の約60%を占

3.2. 細胞接着補助作用に着目した代替物の探索めている 。アルブミンは、生体内において、血液の浸透圧の維

我々は、代替物の探索を続ける過程で、血清アルブミンが接持、抗酸化作用、脂肪酸や金属イオンなどの保持・輸送、栄養不足

着細胞の剥離を防ぐ効果を有することに気が付いた。実際に、
Alb時のアミノ酸供給、といった様々な役割を果たしている11）。我々（－）
またはAlb（＋）
を用いて7日間培養した細胞をクリスタルバ

は、
これらの機能の中でも抗酸化作用と、我々が見出した細胞接

イオレットで染色し、培養容器全体を顕微鏡で撮影した写真を図10）

着補助作用に着目し、代替物の探索を試みた。

2に示す。Alb（－）
では、培養容器中央にクリスタルバイオレットで染色された細胞が観察されるが、培養容器の周縁部には細胞

3.1. 抗酸化作用に着目した代替物の探索

24がほとんど認められない。一方で、Alb（＋）
では、培養容器の周縁

活性酸素種（Reactive oxygen species；ROS）
は、主にミト部にも細胞が観察され、細胞が剥離していないことがわかる。培

コンドリアにおける酸化的リン酸化を介したアデノシン5’-三リ

養容器周縁部の細胞が剥がれる原因として、細胞培養時の培地

ン酸産生経路において副産物として生成される。過剰に発生し交換が挙げられる。培地交換は、通常はピペット等を用いて穏やたROSは、細胞のDNAやタンパク質などを酸化することで構造かに行うが、それでも培養容器内の周縁部には培地の流れが生変化を誘発し、それが原因となって細胞活動の低下やアポトー

じ、流れによる剪断力が細胞を培養容器から剥がす原因となりシスを引き起こす。生体内では、上記のようなROSによる傷害を得る。

防ぐために様々な抗酸化物質が働いているが、その一端を担っそこで我々は、血清アルブミンが細胞表面を覆うことで培地交ているのが血清アルブミンである。血清アルブミンには、N末端換時の剪断力を軽減し、細胞の剥離を防いでいるという仮説をから34番目のシステイン残基がチオール基
（SH基）
を有する還

立て、同様の効果が期待される親水性高分子ポリマーの添加培

元型アルブミンと、SH基が酸化される、または他の含硫アミノ養試験を行った。各種ポリマーを添加した培地を用いて7日間培THE CHEMICAL TIMES
養した細胞をクリスタルバイオレットで染色して観察した結果、胞質比と細胞密度を有するiPS細胞に特徴的なコロニーが観察

培養容器周縁部の細胞剥離を防ぐ2種類のポリマー（ポリマー1、された。また、継代に合わせて血球計算盤を使って細胞数を測定

ポリマー2）を見出すことに成功した（図3）。これら2種類のポリし、その結果をもとに4週間にわたる増殖率の推移を記録した。

マーは、安価に合成することが可能なだけではなく、医薬品にもその結果、ciKICTM iPS mediumで培養した細胞は、4週間で約添加される安全性の高い物質であるため、再生医療用途の培地（図5）。これは、対照にした培地と比較して同107倍まで増殖した原料として適していると言える。

程度の増殖性であった。

表1 各培地における培養スケジュール

図2 血清アルブミンの有無が細胞接着に与える影響
写真は、倒立型顕微鏡IX-83（オリンパス）を用いて撮影した
培養容器全体のタイリング画像。

木金

ciKICTM iPS medium

P

○

培地A

P

○

培地B

P

○

土

○

日

○

月

火

水

○

○

○

○

○

○

○

P

P；継代、○；培地交換。
ciKICTM iPS mediumおよび培地Aは7日間おきに継代を行い、培地Bは6日間おきに継代を行った。

図3 各ポリマーが細胞接着に与える影響
写真は、倒立型顕微鏡IX-83（オリンパス）を用いて撮影した
培養容器全体のタイリング画像。

04 ciKIC iPS mediumの性能TM

長谷川らが開発した低分子化合物を用いる未分化維持培地9）に、第3項に記載した血清アルブミン代替物の添加などの改良を加えた培地がciKICTM iPS mediumである。本項では、ciKICTM
iPS mediumの性能について概説する。

図4 各培地におけるiPS細胞の培養所見
写真は、倒立型顕微鏡IX-73（オリンパス）を用いて撮影した位相差像。
C；培地A、D；培地B。
A；オンフィーダー培養、B；ciKICTM iPS medium、

4.1 細胞の形態と増殖性
実験には、SNLフィーダー細胞を用いてオンフィーダー条件下で維持培養したヒトiPS細胞253G1株 13）を使用した。CTK解離
液を用いてフィーダー細胞を除去した後、0.5×TrypLE select/
EDTAを用いてiPS細胞をシングルセル化した。シングルセル化
した細胞をY-27632（Rho結合キナーゼ阻害剤）
を含むciKICTM
iPS mediumに懸濁した後、iMatrix-511でコートした6ウェルプ
レートに50,000 cells/wellで播種した。以降の培地交換および継代は表1に示すスケジュールに従って実施した（継代時の細胞播種数は25,000 cells/well）。また、比較対照に用いた市販のフィーダーフリー培養用培地
（培地A、
培地B）
を用いた実験は、
各メーカーの推奨手順に従って行った。

図5 各培地におけるiPS細胞の増殖率の推移

継代直前に撮影したiPS細胞253G1株の位相差像を図4に示す。いずれの培地においても、丸く明瞭な核を有し、高い核/細25

特集

再生医療関連技術

4.2. 細胞の未分化性（多能性）

tubulin）の免疫蛍光染色を行った。その結果、各マーカーを発現

iPS細胞は分化前（未分化）の状態であり、胎盤の細胞を除く
あらゆる細胞へと分化する能力（多能性）を有している。ciKICTM
iPS mediumで培養した細胞がこのような性質を維持しているする細胞が認められたことから、三胚葉へ分化していることが示
唆された
（図8）
。
以上の結果から、ciKICTM iPS mediumで培養した細胞が未分化性（多能性）を有することが示された。

かどうか検証した。
はじめに、転写因子であるOct-3/4とNanogの免疫蛍光染色を行ったところ、ciKICTM iPS mediumで培養したほとんどの細胞で蛍光が観察され、未分化マーカー陽性細胞であることが示
唆された
（図6）
。次に、
フローサイトメトリーを用いて細胞表面の05 ciKIC iPS mediumの特徴と利点
TM

2種類の糖鎖抗原（TRA-1-60、SSEA-4）の陽性率の測定を行っ

ciKICTM iPS mediumの最大の特徴は、未分化維持や細胞の両マーた。その結果、
ciKICTM iPS mediumで培養した細胞では、生存性・増殖性向上に関わるタンパク質を合成化合物で代替しカー共に95%以上の陽性率を示した（図7）。

た点である。当初の想定通り、安定した品質の培地をよりリーズ

続いて、細胞の多能性を確認するために、胚様体（Embryoid

ナブルな価格で供給することが可能となった。加えて、本培地はbody；EB）
形成を介した三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）への最大で3日間は培地交換を行う必要がないため、休日作業の回避

iPS mediumで継代後7日間培養した（人件費の抑制）や培地使用量の削減といった更なるコスト削減

iPS細胞を0.5×TrypLE select/EDTAでシングルセル化したも期待される。さらに、継代時の細胞の播種方法として操作性に分化を試みた。ciKIC

TM

後、LIPIDURE-CM5206を用いて低接着処理を施した6ウェル

優れたシングルセル播種にも対応しているため、
クランプ
（小さ

プレートに100,000 cells/wellで播種し、同培地を用いて8な細胞塊）播種のような高度な技術を必要としない。これにより、

日間浮遊培養を行うことでEBを作製した。その後、EBをゼラチ

手技間差や実験間差も生じにくくなったことから、増殖させたiPS

iPS medium

細胞の品質の一定化にも寄与するものと期待される。もっとも、から未分化維持成分を除いた培地を用いて12日間の接着培

シングルセル播種自体にも問題点が指摘されているため14）状況養を行った後、内胚葉、中胚葉、外胚葉に特異的なマーカー（αに応じた継代法を選択する必要はあるが、ユーザーに複数の選-fetoprotein；AFP、
α-smooth muscle actin；α-SMA、βIII-

択肢を提示できたことは重要な点であると考えている。

ンコートした6ウェルプレートに移行し、ciKIC

TM

図6 ciKICTM iPS mediumで培養したiPS細胞の免疫蛍光染色像
写真は、倒立型顕微鏡IX-83（オリンパス）を用いて撮影した蛍光画像。
A；Oct-3/4
（緑）
+核
（青）
、B；Nanog
（赤）
+核
（青）
。

図8 ciKICTM iPS mediumで培養したiPS細胞の三胚葉分化
A； 倒立型顕微鏡IX-73（オリンパス）を用いて撮影したEB（浮遊培養8日目）の位相差像。
B-D； 倒立型顕微鏡IX-83（オリンパス）を用いて撮影した蛍光画像であり、

青は核、緑は各マーカー（B；AFP、C；
α-SMA、
D；
βIII-tubulin）
を示す。

図7 ciKICTM iPS mediumで培養したiPS細胞の未分化マーカー陽性率
データは、代表的なヒストグラムと平均値±標準誤差。
グレーのヒストグラムは、unstained controlを示す。

26

THE CHEMICAL TIMES

06 おわりに
ヒトiPS細胞の様々な培養方法と課題について概説した。本稿で紹介したciKICTM iPS mediumは、現在の再生医療が抱える問題の解決に貢献するものであると考えられる。現状の開発品には微量のタンパク質が含まれていており、我々が目指すタンパク質を含まない完全合成培地の構築は未だ道半ばである。今後、残るタンパク質を代替する技術も確立することで、さらなる再生医療の発展とそれがもたらす人々の幸福に寄与していきたい。

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27

キ ー ワ ード 解 説
細胞培養
細胞を生体外で増殖させる方法であり、細胞の種類にあった培地、培養容器および足場材量が必要となる。作業者は、老廃物の除去と栄養供給を目的とした培地交
換と、細胞が増えるスペースを確保するための植え継ぎ（継代）を行う。これらの作業は無菌的に行う必要があるため、クリーンベンチなどの環境設備も必須である。

幹細胞
幹細胞とは、分裂して自身と同じ細胞を作る能力（自己複製能）と、他の細胞に変化
（分化）
する能力
（分化能）
を併せ持つ細胞であり、例としてES細胞やiPS細胞が挙げられる。受精卵などが有する胎盤組織を含めた全ての細胞に分化する能力を全能性（Totipotency）と呼び、胎盤を除く全ての体組織に分化する能力を多能性（Pluripotency）と呼ぶ。

ヒトiPS細胞用 未分化維持培地

ciKIC iPS medium
TM

iPS 細胞の培養に最適なフィーダーフリー用培地
Point

1

低タンパク質アルブミン不含

Point

2

優れた操作性土日(3連休)の培地交換が不要
シングルセルでの継代作業が可能

Point

3

高い増殖支持能と良好な未分化維持能★ 本製品は、京都大学 高等研究院 物質－細胞統合システム拠点 (iCeMS) から技術移転を受けた培地に、関東化学(株)独自の技術を取り入れた製品です。
★ 本製品は試験研究用です。ヒトや動物を対象にした医療や臨床診断の目的には使用しないで下さい。

※無断転載および複製を禁じます。

〒103-0022 東京都中央区日本橋室町2丁目2番1号
室町東三井ビルディング
電話（03）6214-1090 FAX（03）3241-1047HP  http://www.kanto.co.jp/times/

E-mail : chemiti-info@gms.kanto.co.jp  編集責任者：猪瀬真人
2020 年 4 月発行