コラーゲンの電顕的観察を一筋に伊東多加志
部局系技術支援室

医学技術系第一医学系

概要
私は昭和４５年４月に北大歯学部に技術職員として入職し、口腔解剖学第二講座に所属しました。北大歯学部は新設されたばかりで、学生実習に必要な組織標本の整備等、実習の準備にかなりの時間を割いておりました。一方で、研究の技術的支援業務もあり、電子顕微鏡用試料の作製や観察にも従事しておりました。
数年後、教室の教官が週に 1 回開催していたセミナー（論文の抄読会や実験データの報告など）に加わるよ
うになり、その後コラーゲンの研究との関わりを持つことになりました。コラーゲンは線維性蛋白質で生体の全蛋白質の約 1/3 を占め、結合組織の主要成分ですが、電子顕微鏡で観察すると、線維に 67nm の周期構
造（縞模様）が観察されます。この美しさと線維内コラーゲン分子の配列に興味を持ち、様々な実験を通して線維形成過程を電子顕微鏡で観察しました。昭和５６年４月に主任の星野教授が名古屋大学医学部に転任したのに伴い、私も同行して解剖学第二講座の所属となりました。名古屋大学に転任してからは、コラーゲ
ン分子間の会合状態を電顕的に観察する手段として、グルターアルデヒドによる分子間の架橋固定を行い、次いでコラーゲンの分子地図となるＳＬＳ（segment-long spacing）を形成させる方法を導入しました。以
来、主任教授が平成８年に定年退官するまでコラーゲンの研究を支援して来ましたので、その一端を紹介したいと思います。

In vitro コラーゲン線維形成の分子機序についての電顕的証明
伊東多加志

名古屋大学医学系研究科機能組織学分野

我々は以前、コラーゲン線維形成過程の電顕的観察を行っていたが、その中から今回はコラーゲン線維形
成の分子機序を探る電顕的な仕事についてお話をしたい。随分古い話になりますが、ご容赦ください。

はじめに結合組織から抽出されたコラーゲン分子が in vitro の生理的条件下で native‐type 線維を再生することがよく知られている。native‐type 線維は生体の天然線維と同じく 67nm 周期の横紋構造を示し、線維内で個々の分子が互いに 67nm（D）あるいはその倍数（nD）だけ軸上にずれるように配列されている。線維構造の維持はもちろん、線維形成でさえ最も重要な結合は D ずれ結合であり、4Ｄずれ（＝0.4D end - overlap）結合は線維形成のもっと後の段階でのみ起こると長い間考えられてきた。最近、Silver はレーザ光散乱の研究
から、in vitro 線維形成の初期段階に線状ポリマーが存在すると主張している。そして、コラーゲン線維形成において、4D ずれ結合の線状ダイマーやトリマーの形成が１D ずれ結合の形成に先立って起こるという仮説が提出されている。しかしながら、観察された線状ポリマーが 4D ずれ結合のものであるという確認はされておらず、またポリマーの各々分子の方向も決定されていない。最初に形成された分子集合体を電顕で観察することにも成功していない。我々は、コラーゲン線維形成の最も初期の段階に形成される分子集合体を電子顕微鏡下で直接観察することによってこの仮説を検証した。

方法1）In vitro でのコラーゲン分子の 4Ｄずれ線状ポリマーの形成
架橋阻害剤であるラチロゲンを生前投与したラットの皮膚から 0.5M 酢酸でコラーゲンを抽出し、分別沈殿法によりⅠ型コラーゲンを分離、精製し、凍結乾燥して-20℃で保存した。Interrupted SDS ポリアクリル
アミドゲル電気泳動での同定により、試料はほとんどⅠ型コラーゲンであった。
0.5 M 酢酸に溶解したコラーゲン液（0.1 mg/ml）を 100,000×g で３時間超遠心し、コラーゲンポリマーを除去した後、それぞれ pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 の 5－10 mM 酢酸緩衝液に４℃で 3－4 日間透析した。一定の pH で分子間の結合が起こっても、pH を下げるとモノマー分子に分離されたので、さらに２日間、0.3％グルターアルデヒドを含む同酢酸緩衝液に透析した。酸に不安定な結合を分離させるために 0.5M
酢酸に少なくとも２日間透析し、さらに 0.2％ATP・Na2/0.1M 酢酸に透析した。１滴のサンプルをコロジオ
ン膜でコートしたグリッドに載せ、2％モリブデン酸アンモニウムでネガティブ染色、または 2％リンタング
ステン酸と 1％酢酸ウランでポジティブ染色し、日立 H800 で電顕観察した。
2）4Ｄずれ線状ポリマーの native-type 線維への取り込み
1）では、コラーゲン溶液を pH 4.0－4.5 の酢酸緩衝液に透析したサンプルで 4D ずれ結合を示す Fibrous
SLS が形成されたので、これを 0.14 M NaCl／30 mM リン酸緩衝液（pH 7.4）に透析し、37℃でインキュ
ベーションした。経時的にサンプルを採取し、ネガティブ染色を施した後、電顕で観察した。

結果および考察
コラーゲン溶液を pH3.0－5.5 の酢酸緩衝液に透析して線維を形成しても、一旦 0.5M 酢酸（pH 約 2.3）に透析すると、その後 ATP/0.1M 酢酸に透析してもモノマー分子が横方向に揃って集合した普通の SLS しか観察されなかった。このことから、一定の pH で分子会合体が形成されても、その結合はより低い pH で分離する酸不安定性のものであることが予想された。そこで我々は各々pH の酢酸緩衝液に透析後、さらにグル
ターアルデヒドを含む同緩衝液に透析して分子間の結合を架橋固定させることを試みた。その結果、pH 4.0－4.5 の酢酸緩衝液に透析したサンプルから、SLS の両端が head-to-tail の関係で 0.4D end-overlap した
Fibrous SLS が観察された。このことは、0.5 M 酢酸でモノマーに分散したコラーゲン分子が、pH 4.0－4.5で同じ方向に 4D ずれ結合した線状ダイマーやポリマーを形成したことを示している。
さらに、この架橋固定した 4Ｄずれ線状ポリマーが native-type 線維へと取り込まれるかを確かめるため、
Fibrous SLS を３７℃で 0.14 M NaCl／30 mM リン酸緩衝液（pH7.4）に透析し、経時的にサンプルを採取した。電顕の観察では、4D ずれ（周期）の SLS が緩められた後、透析の４時間以内に D 周期の細い線維構造が現れていた。さらに３７℃でインキュベーションを続けると、4D 周期は完全に消失し、バックグラウン
ドに細いフィラメントと共に、D 周期で極性を持つ線維が形成されていた。in vitro の生理的条件下で形成された 4D ずれ線状ポリマーが、定型的な D 周期横紋パターンを示すコラーゲン線維へと取り込まれることが確かめられた。これらの結果は、4D ずれ線状ポリマーが in vitro 線維形成の最初に形成される分子集合体であるという仮説を実証するものである。

研究・技術支援業績リスト（伊東関係分）

1975.10.31

星野 洸， 伊東多加志

口演：走査電子顕微鏡によるエナメル質の低石灰化部位の観察
抄録：歯科基礎学会誌 17 巻（4 号），p.507

1979.8.28

伊東多加志， 星野 洸

口演：Native type 再生コラ－ゲン線維形成における経時的超微形態変化
第 21 回歯科基礎学会総会
抄録：歯科基礎学会誌 21：補冊，p.264,1979

1981.2.7

伊東多加志， 星野 洸

口演：In vitro 再生コラ－ゲン線維にみられたＤＰＳ- 型線維について
日本電子顕微鏡学会北海道支部学術講演会（札幌、武藤歯科器材）

1982.7.23

伊東多加志， 星野 洸

示説：In vitro におけるコラ－ゲン線維形成過程にみられるＤＰＳ- 型線維について第 14 回日本結合組織学会総会（札幌）
結合組織
抄録：結合組織1983.6.2

14, suppl.,p.66,1982
14(3,4), pp.266-267,1983

星野 洸， 伊東多加志， 小林邦彦

口演：コラ－ゲン線維形成初期における 4D-staggered linear polymers の出現について
日本電子顕微鏡学会（総会） 第 39 回学術講演会（名古屋）
抄録：J.E.M.32(3), p.268,1983
The formation of 4D-staggered linear polymers in the initial phase of collagen
fibrillogenesis.

1983.7.7

星野 洸， 伊東多加志， 小林邦彦

口演：コラ－ゲン線維形成初期過程の分子機構
第 15 回 日本結合組織学会総会（神戸）抄録：結合組織15（3,4 号）, p.114-115 ,1984

The 4D-staggered intermolecular association in type 1. collagen fibrillogenesis
1984.3.17

星野 洸， 伊東多加志， 小林邦彦

口演：コラ－ゲン線維形成における４Ｄずれ分子間結合について－電子顕微鏡的研究－
昭和 58 年度（第 31 回）コラ－ゲン研究会（浜松市，サンビ－チ浜松）
抄録：pp.57-58(59-60),1984
4D-staggered intermolecular association in collagen fibrillogenesis--Electron microscopic studay--1984.4.3

星野 洸， 伊東多加志， 小林邦彦

口演：in vitro におけるコラ－ゲン線維形成初期過程の電顕的観察
抄録：解剖誌 59(4), p.460
Early stages of in vitro collagen fibrillogenesis studied by electron microscopy
1984.10.6

小林邦彦， 星野 洸， 伊東多加志

口演： pH ４付近におけるコラ－ゲン分子集合状態

日本生化学会総会（東大教養部）抄録：生化学

56(8),p.635

1985.7

Kobayashi,K., Ito,T., Hoshino,T.

論文：Electron microscopic demonstration of acid-labile,4D-staggeredintermolecular association of collagen formed in vitro.
Collagen and Related Reserch 5(3):253-260,1985.

1985.3

小林邦彦， 伊東多加志， 星野 洸

口演：In vitro におけるコラ－ゲンの４Ｄずれ分子間結合の形成
昭和 59 年度(32 回) コラ－ゲン研究会（阿蘇）抄録 : p.17(64-65),1985

In vitro formation of 4D-staggered intermolecular association of collagen.

1985.4.3

小林邦彦， 伊東多加志， 星野 洸

口演：コラ－ゲン分子間相互作用の電子顕微鏡的研究
第 90 回日本解剖学会総会 福岡（九大）
抄録：解剖誌 60：p.456

1985.7.5

小林邦彦， 伊東多加志， 星野 洸

示説：コラーゲンの In vitro 線維形成における４Ｄずれ線状ポリマ－の役割
第 17 回 日本結合組織学会総会（京都）
抄録：結合組織1985.5.25

17(4) ; suppl., p.74

（予稿集）pp.380-381

小林邦彦， 伊東多加志， 星野 洸

口演：コラ－ゲン分子間相互作用の電子顕微鏡的解析
日本生化学会中部支部例会（津）， 要旨集（抄録）生化学 57(7) p.658

1986.9Kobayashi,K., Ito,T., Hoshino,T.

論文：Incorporation of in vitro formed 4D-staggered linear polymers of collagen
fibrils.
Collagen Rel. Res. 6:195-201,1986.

1986.4.2

9/26 reprint

小林邦彦， 伊東多加志， 星野 洸

口演：コラゲン分子間相互作用の電子顕微鏡的研究 ２，
第 91 回 日本解剖学会総会（東京，昭和大）

線維形成初期段階

into D-periodic

抄録：解剖誌 61(4), p.454

1986.5.24

小林邦彦， 伊東多加志， 星野 洸

口演：コラ－ゲンＳＬＳ分子束のネガティブ染色像と一次構造の相関
第 46 回 日本生化学会中部支部例会（名古屋）
抄録：プログラム 生化学 58(9) :1241-1242

1986

Kobayashi,K., Ito,T., Hoshino,T.

論文：Correlation between negative staining pattern and hydrophobic residuesof collagen
J.Electron Microsc. 35 (3):272-275,1986

1986.9.1-2

Kobayashi,K., Ito,T., Hoshino,T.

ポスタ－：In vitro formation of 4D-staggered linear polymers of collagen andtheir incorporation into D-periodic fibrils
抄録：

11th ICEM (abstract) Electron Microscopy ,Kyoto,(vol.3.) pp.2395-2396

1986.9.3-4

Kobayashi,K., Ito,T., Hoshino,T.,

ポスタ－：Molecular basis of negative staining - - Direct correlation between negative stained bands and hydrophobic clusters
along segment -long-spacing crystallite of collagen
抄録：

11th ICEM(abstract) Electron Microscopy 1986. Proc. 11th Int. Cong.
on Electron Microscopy (vol. 4.)pp.2703-2704

1987.3.13

伊東多加志， 星野 洸

口演：コラ－ゲン分子間 4D-staggered interaction におけるテロペプタイド除去後の反61 年度（第 34 回）コラ－ゲン研究会（名古屋、愛知会館）
抄録：p.6 (57-58)

The effect of removal of telopeptides on the formation of
4D-staggered interaction of collagen molecules1988.9.23-25

伊東多加志， 藤田芳和， 星野 洸

口演：コラ－ゲン線維形成初期過程におけるテロペプタイドの役割
医学・生物学電子顕微鏡技術研究会 第４回学術講演会（聖マリアンナ医科大学）
研究報告：医学・生物学電子顕微鏡技術研究会会誌 vol.3,No1,p.5,1989

1989.2.17-18

伊東多加志， 藤田芳和， 星野 洸

口演：電顕によるコラ－ゲン分子会合体観察のためのＳＬＳ結晶体の応用
第 11 回 生理学技術研究会（岡崎生理研）
研究報告：生理学技術研究会報告 第 11 号，pp.58-60 (1989)

1989.7.20-22

伊東多加志， 藤田芳和， 星野 洸

応性

示説：In vitro におけるコラ－ゲン線維形成過程の電顕的観察
医学・生物学電子顕微鏡技術研究会 第５回学術講演会（名古屋市立大学 医学部）
研究報告：医学・生物学電子顕微鏡技術研究会会誌 vol.4,No.1,pp.13-15, 1990

1990.3.9

伊東多加志

技術研修会の講演と実技指導：（岡崎生理研技術課）
生理学技術研究会第３回専門部会の技術研修に講師として招かれた。第三専門部会の研修テーマは「生体分子のための顕微鏡技術」で、私は「ネガティブ染色法の原理と実際」について講演し、コラーゲンを材料として実技指導を行った。最後に電子顕微鏡で実際にネガティブ染色像を観察した。
生理学研究所技術課報告 No.5, p.63,66, 1990

1990.7.11-13

伊東多加志， 藤田芳和， 星野 洸

口演：ペプシン限定消化コラ－ゲンによる線維形成能とテロペプタイドの役割
医学・生物学電子顕微鏡技術研究会 第６回学術講演会（京大会館）
研究報告：医学・生物学電子顕微鏡技術研究会会誌 vol.5,No.2, pp.43-44,1991

1991.2.22-23

伊東多加志

口演：1.型コラ－ゲンの調製法（及び interrupted SDS-PAGE による同定法）
第 13 回 生理学技術研究会（岡崎生理研）
研究報告：生理学技術研究会報告 第 13 号 pp.34-37 (1991)

1991.3.1

星野 洸， 伊東多加志， 小林邦彦

総説：コラ－ゲン分子の解剖学
電子顕微鏡（日本電子顕微鏡学会誌） Vol.26,No.1,pp.2-9,1991

1991.7.24

伊東多加志

口演：コラ－ゲン線維形成の分子機構に関する電顕的研究
平成３年度名古屋大学技術職員研修 生物コ－ス「技術発表」

1995.7.27

伊東多加志

口演：金コロイドマーカーを用いた包埋後免疫電顕法（免疫凍結超薄切片法を主体として）平成７年度名古屋大学技術職員研修 生物コ－ス「技術発表」
発表報告：平成７年度名古屋大学技術職員研修「技術発表報告集」, pp.116-123（1995）

1996.2.15

伊東多加志、 田中 稔、 早坂 静

口演及びパネル展示：凍結超薄切片法の技術修得をめざして
第 18 回 生理学技術研究会（岡崎生理研）
研究報告：生理学技術研究会報告 第 1８号, pp.19-22（1996）

2007.3.26

伊東多加志

口演：In vitro コラーゲン線維形成の分子機構についての電顕的証明
第 8 回解剖技術研究・研修会（大阪大学中之島センター）
抄録：第 8 回解剖技術研究・研修会予稿集, pp．7－8（2007）

その他の業績

写真デ－タ提供：（伊東多加志）
コラ－ゲン線維のポジティブ、ネガティブ染色像（電子顕微鏡写真）「口腔生化学」 p.19, 21

早川太郎、須田立雄 著、医歯薬出版、1987

1988.9.23-25
写真デ－タ展示：（伊東多加志）
細菌産生コラゲナ－ゼ消化後のコラ－ゲンＳＬＳ電顕像（写真コンテスト）
医学・生物学電子顕微鏡技術研究会， 第４回学術講演会（聖マリアンナ医科大学）

写真デ－タ提供：（伊東多加志）
草刈古墳３号（千葉県）の人骨化石中のコラ－ゲン線維（電顕像）
ＮＨＫ総合テレビ、特集番組「サイエンスＱ」“日本人のルーツを科学でさぐる”（藤ノ木古墳からの出土品、人骨化石中のコラーゲンの解析）
1989.2.7(火) 22:20～ 放映（国立科学博物館人類研究部長 山口敏、千田アナウンサー）
投稿：（伊東多加志）「技術研究会専門部会に参加して」
岡崎生理研技術課回覧 113 号掲載，1990 年 6 月.

1990.6.18

伊東多加志

講義：
「有機溶剤の分類名並びに、性質と組成」
第３回医学部技術職員セミナ－［第４回医学部技術職員研修のためのプレセミナ－］
報告集原稿：医学部技術職員セミナ－報告集（創刊号） pp.12-22,1992

1991.11/12, 11/29，1992.1/22, 2/5

伊東多加志

講義：
「免疫の基礎」 合計４回
第 10､11､13､14 回医学部技術職員セミナ－（第５回医学部技術職員研修のためのプレセミナー）

報告集原稿：医学部技術職員セミナ－報告集（第２号） pp.23-38,1993

2003.1.20 写真デ－タ提供：（伊東多加志）
コラ－ゲン線維のネガティブ染色像（電子顕微鏡写真）「スタデイ 口腔生化・分子生物学」大井田新一郎著（鶴見大学口腔生化学講座助教授）永末書店、2003.