研究成果報告書（第29回学術研究助成）
2023年

4月9日

公益財団法人 藤原ナチュラルヒストリー振興財団
理 事 長

野 村 茂 樹殿
所属機関名職氏

日本在来種みつばちの会

名 理事名 藤原愛弓

１．研究課題"ニホンミツバチがオオスズメバチの襲撃後に巣の周囲に塗り付ける物質に関する研究:植物等を用いたミツバチの防衛行動の解明に向けて"

２．共同研究者なし

３．研究報告Ⅰ. 研究の目的
オオスズメバチVespa mandarinia japonicaは、秋季にニホンミツバチApis cerana japon
icaのコロニー（以下、群）を集団で攻撃し、時に全滅させる天敵である。ニホンミツバチ
は、オオスズメバチに対する防衛手段を有しており、巣を偵察に来る斥候のオオスズメバチ個体に対して蜂球を形成して熱殺し、その後の壊滅的な集団攻撃を防ぐことが知られている。
しかし熱殺以外の防衛行動については、既存の研究では明らかにされてこなかった。申請者の研究により、オオスズメバチが襲来した直後から、働き蜂がタニソバやイヌコウジュ等、複数の植物種の葉や芽等の植物片を齧り取って大顎で咥えて持ち帰り、巣の入り口周辺へ繰り返し塗りつける行動（以下、塗り付け行動）を盛んに行うことが初めて証明された。
これらの植物種は、オオスズメバチが忌避する成分、もしくはオオスズメバチの餌場マーキングフェロモンの効果を減じる成分を含有しており、働き蜂が周囲に多数生育する植物種の中から選択的に利用している可能性も考えられる。またこの採集行動に伴い、巣の入り口付近でダンス行動が行われることを発見した。働き蜂はこのダンスを用いることで花蜜等と同様、効率的に植物片等の巣の周囲に塗り付けるための物質（以下、塗り付け物質）の採集を行うと考えられ、これらは群れの防衛のために重要な行動であると考えられる。
しかし多数の働き蜂が繰り返し持ち帰る塗り付け物質中に、どのような植物種が含まれるのか、また植物以外にも他の生物分類群が含まれるのか否かは明らかになっていない。そこで本研究では、これらの塗り付け物質を構成する生物相を明らかにすることを目的とした。

Ⅱ. 研究の方法
塗り付け物質に含まれる生物相を調べるため、2021年9月～12月にかけて、岩手県と宮城県（岩手県内2地点と宮城県内2地点の計4地点）で塗り付け物質のサンプル採取を実施した。
サンプル採取を行うための準備として、2021年5月29日に、岩手県一関市内の古蔵に営巣していたニホンミツバチ1群を保護したものを巣箱へ導入し、一関市内の里山地域にある仏教寺院、知勝院の敷地内のミツバチ飼育用の小屋内に設置した。また、2021年6月26月に茨城県の養蜂家から入手したニホンミツバチ3群を同じく小屋内に設置した。その後、実験を行う9月まで、継続的にこれら4群を飼育した。
岩手県一関市では、塗り付け物質の採取を7日間（9月23日、10月3日、10月4日、10月6日、10月9日、10月10日、10月11日）実施し、計0.96gのサンプルを採取した。その後、10月23日に、一関市で飼育していた群のうち、養蜂家から入手した3群を宮城県仙台市青葉区にある宮城学院女子大学の屋上に移動した後、同様に7日間（10月27日、10月28日、10月29日、10月30日、10月31日、11月7日、11月8日）サンプル採取を実施し、計0.81gの塗り付け物質を採取した。なお、これらの移動は同群を異なる地域へ移動した場合、塗り付け物質に含まれる生物種に、地域により差が出るか否かを把握するために実施した。また、上記2地点とは異なる場所で飼育されている群れからサンプルを採取するため、岩手県盛岡市の養蜂家が飼育している1群から9月20日に計0.22g、宮城県仙台市泉区で飼育されている1群から計8日（11月19日、11月20日、11月21日、11月22日、11月30日、12月1日、12月3日、12月4日）、計0.
27gの塗り付け物質を採取した。
サンプル採取は以下のように実施した。働き蜂が塗り付け行動を行う主な場所である巣箱の入り口周囲を、広く覆うように白い片面粘着テープを貼り付け、予め働き蜂により塗り付けられる物質を目視で判別し易いようにした。その後、オオスズメバチを（Fujiwara et al. 2016）の手法に倣って巣箱に接近させ、働き蜂の塗り付け行動を誘発した。その後、働き蜂が持ち帰り、粘着テープの上に塗り付けられた物質を発見次第、ピンセットを用いて採集しサンプル瓶に入れ、クーラーボックスで保存した後、冷凍庫で保存した。なお、塗り付け物質の採取は、ニホンミツバチの外勤活動が不活発になる雨天日を避け、晴天か曇りの日に実施した。
塗り付け物質中に含まれる植物相と、その他の生物分類群の含有の有無を明らかにするため、株式会社生物技研にDNA分析を委託した。具体的には、植物相（gPlant）の他、これまでの観察等から、物質中に含まれる可能性が考えられる菌類相（gITS）、哺乳類相（MiMammal）、昆虫相（gInsect）を対象遺伝子領域とするアンプリコンシーケンス解析を実施した。
なお、一部の塗り付け物質中に、甲殻類の断片様のもの（断片Aとする）が複数確認されたため、その一部についても甲殻類（MiDeca）を対象領域としてアンプリコンシーケンス解析を実施した。なお、これらの解析結果については、データの信頼度を考慮して、リード数が100以上のOTU配列を採用した。

Ⅲ. 研究結果
岩手県、宮城県の計4つの調査地点の分析結果から、植物相については、合計40科57属が検出された。また、岩手県一関市から宮城県仙台市青葉区の大学屋上に移動した3群について、2地域間で検出された植物（科）のOTUの割合を比較した結果、各地域から得られた塗り付け物質から検出された植物は異なっていた（図1）。キク科植物は、全ての群と地点で共通して検出され、特に、岩手県一関市の3群から顕著に多く検出された（図1）。一方でバシ
ョウ科バショウ属は宮城県仙台市泉区の1群のみでしか検出されなかったが、その検出割合は泉区の群の中では最も大きく全体の39％を占めた。
また、菌類相（子実体であるキノコを形成するものを含む担子菌門）については43科67属が検出された。スッポンタケ科スッポンタケ属は全ての群と地点で共通して検出されたが、ツガサルノコシカケ科オオオシロイタケ属のように、岩手県盛岡市の1群のみでしか検出されなかったものもあった。哺乳類相の分析では、25科32属が検出され、全ての群と地点でイヌ科のタヌキが共通して出現した。また、哺乳類とともに鳥類も13科15属が検出され、一部の群からは絶滅危惧ⅠB類（EN）に指定されているクマタカや、カワネズミなどの希少種が検出された。

図1.岩手県一関市の小屋に設置した3群(itinoseki-hive2～4と表記)から塗り付け物質の採取を行った後、宮城県仙台市青葉区の宮城学院女子大学の屋上に同3群（miyagaku-hive2～4と表記）を移動し、一関と同様に塗り付け物質の採取を実施した.2地域間の塗り付け物質から検出された各植物（科）のOTUの割合（％）を示す.

100806040200

キク科

シソ科

マタタビ科

マメ科

タデ科

カタバミ科

アサ科

クスノキ科

ウコギ科

ヤマモモ科

ブナ科

マツ科

モチノキ科

モクレン科

ブドウ科

ツリフネソウ科イネ科

クロウメモドキ科

ヒノキ科

バラ科

イチョウ科

昆虫相は30科34属が検出された。昆虫類については全ての群に共通して利用された種はなかったが、チョウバエ科やショウジョウバエ科のフタオビショウジョウバエは岩手県と宮城県の多くの群れから検出された。
なお、断片Aは、サワガニと100％相同であるとの分析結果が得られ、形態学的観察からも本種であると考えられた(写真1)。

写真1. 岩手県一関市のニホンミツバチ群から採取した塗り付
け物質中から発見された甲殻類と思われる断片 1)～4).
このうち1）については甲殻類（MiDeca）を対象領域としたアンプリコンシーケンス解析に供した.

Ⅳ. 考察
本研究により、ニホンミツバチは営巣場所周辺に生育する多様な植物種を塗り付け物質として利用していることが明らかとなった。また、塗り付け物質中には、植物のみならず、菌類、昆虫類、哺乳類、鳥類、甲殻類など様々な分類群の多様な生物種が含まれることが初めて明らかになった。
一方で、塗り付け物質の採集地域が異なった場合にも、共通して利用する生物種（あるいは科、属）が確認された。例えばタヌキは実験に供した全ての群から検出されていたほか、複数の群れで共通して利用された生物種（あるいは科、属）も多く確認された。そのため、ニホンミツバチの働き蜂は、営巣場所の周囲から無作為に生物を採取してくるのではなく、特定の生物（生体ではなく死体や糞等の可能性もある）に対する選好性を有する可能性が考えられる。
また、一部のニホンミツバチ群のみであるが、絶滅危惧ⅠB類のクマタカや、カワネズミなどの希少種が検出され、塗り付け物質の解析により、目視での生息調査や確認が難しい希少種の把握に寄与できる可能性が示唆された。どの程度地域の絶滅危惧種や希少種の把握が可能であるかを検証するためには、今後調査地点や調査群を増やし、より広い地域を対象にした解析を行っていく必要がある。

Ⅴ. 成果発表
現在、解析結果についての論文を執筆しており、準備が出来次第、国際誌と国内誌への投稿、学会等での成果発表を行う。その他、社会貢献活動の一環として以下の講演会等において本研究の内容の一部について解説を実施したものと、実施予定のものを示す。
1)「ミツバチの生態と養蜂の魅力－ミツバチの生み出す自然の恵みについてー」, 日本薬用植物友の会, 2023年4月2日
2)「ニホンミツバチとそれを取り巻く自然環境について」利府町, 2023年4月22日（発表予定）
3)「在来種ニホンミツバチとその養蜂を支える自然環境」日本ビオトープ協会, 2023年6月23日（発表予定）

Ⅵ. 今後の課題
本研究では、植物以外にも多様な生物群が、塗り付け物質としてニホンミツバチに利用されていることを初めて示したが、これらの物質の採集過程や成分等については明らかになっていない部分も多く、さらなる検証が必要である。また、本研究では把握できなかった、塗り付け物質の構成生物の経時的な変化についても調べていきたいと考えている。分析が完了せず保存しているサンプルもあるため、それらの解析も進めていきたい。
検出種をより増やすために、各調査地域において可能な限り、生息する生物のDNAのローカルデータベースの作成を進めていくことも課題である。