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液体クロマトグラフィーの基礎技術（1）Fundamental Techniques of Liquid Chromatography─逆相クロマトグラフィーとカラムの選び方 その2── How to select the appropriate column for your reversed phase chromatography (II) ─
関東化学株式会社 草加工場 生産技術部

酒井 芳博

YOSHIHIRO SAKAI
Production Technique Dept, Soka Factory, Kanto Chemical Co., Inc.

5．逆相系カラムの選択に関して

べたが、平均細孔径10nmのシリカゲルから合成された炭化水素含有量20%の一反応性ODSシリカゲルの溶出挙

5-3-1

試験―Ⅰ 疎水性及び立体選択性試験

2）平均細孔径の違いによる溶離挙動の違い
充填剤において平均細孔径は、試料の溶出時間を左右する重要な因子である。
Mightysil RP-18GPシリーズの充填剤は、平均細孔径12nmのシリカゲルを採用していることは前稿（205号）に述動との比較を図7に示した。
同じ溶離条件を用いた場合、平均細孔径が12nmの充填剤（図7ａ）では、最後に溶出するトリフェニレンは14分強だが、平均細孔径10nmのODSシリカゲル充填剤（図7ｂ）では17分強と3分ほど保持時間が長く、全ての試料に対して保持力が強く現れるのである。
3-1）炭化水素量の違いによる溶離挙動の変化
ODSシリカゲル充填剤の溶離、特に溶出時間に関係するファクターとして、炭化水素量があげられる。
これまで、溶出時間に影響を与える因子としてODS基のファンクショナリティー、原料シリカゲルの細孔径について述べてきたが、炭化水素量も逆相クロマトグラフィーでは重要な因子の一つである。
炭化水素量は、ODS化する際に使用するシリカゲルの比表面積に依存することから、同じ比表面積のシリカゲルを使用する限り大きな変化は望めない。したがって、炭化水素量を制御するにはシリカゲルの比表面積を変えることが一般的である。一方、C18（ODS基）を中心にして、アルキル鎖の長さの異なるアルキルシリル化剤を用いて炭化水素量を調整することも行なわれている。
炭化水素量の異なる充填剤Mightysil RP-18GP（L）

図7 平均細孔径の異なるODSシリカゲルを使用した試験―Ⅰのクロマトグラムａ）
平均細孔径 12nm 炭化水素量20%のODSシリカゲル充填剤ｂ）
平均細孔径 10nm 炭化水素量20%のODSシリカゲル充填剤
溶離条件
カラム：4.6mmΦ×150mm
溶離液：メタノール／水＝80／20
流速：1ml／min.
カラム温度：40℃
検出：UV254nm, 0.16AUFS
試料：①ウラシル、②カフェイン、③フェノール、④n-ブチルベンゼン、⑤o-ターフェニル、⑥n-アミルベンゼン、⑦トリフェニレン（溶出順）（炭化水素量15％）、（M）（炭化水素量20％）、及び（H）（炭化水素量23％）のクロマトグラムを図8に示した。当然ながら、炭化水素含有量の高い（H）タイプの充填剤の溶出時間が最も長くなっている。特に炭化水素量15％と炭化水素量23％の結果を比較した場合、明らかに溶出時間に差が認められる。

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（通巻206号）

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図8 炭化水素量の違いによる溶出時間の違い（試験―Ⅰ）
カラム：4.6mmΦ×150mmａ）
Mightysil RP-18GP（L）（5μm）（炭化水素量：15％）ｂ）
Mightysil RP-18GP（M）（5μm）（炭化水素量：20％）ｃ）
Mightysil RP-18GP（N）（5μm）（炭化水素量：23％）
溶離条件及び試料は図7と同じ

図10 Mightysil RP-8GP（5μm）とMightysil RP-18GP（L）（5μｍ）の比較（試験―Ⅰ）
カラム： ａ）Mightysil RP-8GP（5μm）
4.6mmΦ×150ｂ）Mightysil RP-18GP（L）（5μm）
4.6mmΦ×150
溶離条件及び試料は図7と同じ

水素量の違い以上に溶離特性が大きく異なることがある。
このように、炭素鎖の違いは溶出挙動を大きく変化さ3-2）アルキル鎖のちがいによる溶出挙動
ベンゼン、ナフタレン、アントラセンの三種類の試料を用せることがあるので、単に溶出時間の調節のためだけにＣ8カラムを選択するには充分注意を払う必要がある。

いたクロマトグラムを比較して図9に示した。Mightysil
RP-8GP（5μm）（ 炭化水素量：13％）は、Mightysil RP-5-3-2

試験−Ⅱ エンドキャッピング試験

18GP（5μm）（ 炭化水素量：20％）と比較すると、三番目

溶離試験−Ⅱは、中性溶離液におけるプロカインアミド、に溶出するアントラセンの溶出時間がRP-8では4分半程

アセチルプロカインアミドの溶離挙動からエンドキャッピング度となっており、かなり保持時間が短くなることが分かる。の達成度を確認するものである。同じくピリジン/フェノール試験も良く知られている試験方法であるので後述する。
最近では、より塩基度の強い化合物を試料として使用し、さらにpHの高い（中性から弱塩基性）溶離液を用いる試験方法がよく採用されている。その理由として、残存シラノールは、pHが高くなるにつれ解離が進み、塩基性化合物との不可逆的な二次相互作用が強く現れるためである。したがってpHの高い溶離液においても塩基性化合物がシャープなピーク形状を示す充填剤は、良好にエンドキャッピングされていることになる。
このような特性をふまえ、Mightysil RP-18GPではエンド

図9 C18とC8の溶出時間の比較
a）
Mightysil RP-8GP（5μm）
、b）
Mightysil RP-18GP（5μm）
溶離条件
カラム：4.6mmΦ×150mm
溶離液：アセトニトリル／水＝75／25
流速：1ml／min.
カラム温度：40℃
検出：UV254nm, 0.16AUFS
試料：ベンゼン、ナフタレン、アントラセン
（溶出順）

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キャッピングの評価用の試料としてプロカインアミドを採用している。そのクロマトグラムを図11ａ）に示す。
二番目に溶出するピークが、プロカインアミドである。対象性の良いクロマトグラムが得られており、塩基性化合物と不可逆的な二次相互作用がない充填剤であることがわかる。

一方、Mightysil RP-8GP（5μm）（炭化水素量：13％）

一方、エンドキャッピングが不充分であると、図11ｂ）には、Mightysil RP-18GP（5μm）（L）（炭化水素量 15％）示すようにテーリングしたクロマトグラムになることが特徴に比べ極端に炭化水素量が少ないわけではないにもかである。ここで使 用した O D Sシリカゲル 充 填 剤は 、かわらず、溶離条件によっては、図10に示すように、炭化Mightysil RP-18GPを合成する途中の中間体であり、エTHE CHEMICAL TIMES 2007 No.4
（通巻206号）

液体クロマトグラフィーの基礎技術（1）ンドキャッピングが不充分な充填剤を用いた。二番目に用できるようになってきたが、反面旧タイプの充填剤を使用溶出しているプロカインアミドのピークはテーリングが大きした充填カラムも依然流通しているので、カラムの選択にく、不可逆的な二次相互作用が強いことを示している。

は注意が必要である。

図11 エンドキャッピングの評価（試験―Ⅱ）
溶離条件
カラム：4.6mmΦ×150mm、ａ）
Mightysil RP-18GP（5μm）ｂ）
エンドキャッピング不良充填剤
溶離液：メタノール／pH7.6 20mMりん酸緩衝液＝40／60
流速：0.5ml/min.
カラム温度：40℃
検出：UV254nm, 0.16AUFS、
試料：ウラシル、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド（溶出順）

図12 エンドキャッピングの評価（ピリジン/フェノール試験）
溶離条件
カラム：ａ）
Mightysil RP-18GP（5μm）
4.6mmΦ×150mmｂ）
エンドキャッピング不良充填剤（5μm）
4.6mmΦ×150mm
溶離液：アセトニトリル／水＝30／70
流速：0.5ml/min.
カラム温度：40℃
検出：UV254nm, 0.16AUFS
試料：ピリジン、フェノール（溶出順）

5-3-3

試験−Ⅳ 配位化合物試験

配位化合物との不可逆的な二次相互作用の評価は、プロカインアミドを使用した塩基性化合物の試験は、オキシン銅を使用するMightysil RP-18GPシリーズは、pH7.6の緩衝液とアセトニトリルの混合液を溶離液に使用

高純度シリカゲル（純度99．99％以上）を原料に使用してする試験であるが、簡易的にはアセトニトリルと水の混合いることに加え、エンドキャッピングも完全に行われている

液を溶離液に、ピリジンとフェノールを試料にしたピリジン/ため配位化合物の溶出は良好である。

フェノール試験と呼ばれている方法もよく利用されている。
この試験で得られたクロマトグラムを図12に示す。図12

図13ａ）にMightysil RP-18GP（5μm）
を使用した配位化合物試験−Ⅳのクロマトグラムを示す。

ａ）は、Mightysil RP-18GP（5μｍ）の結果で、同ｂ）は、オキシン銅は、配位化合物の代表として充填剤の性エンドキャッピング不良の充填剤（図11ｂ）と同じカラムによ能評価物質として使用されるが、測定に際しては、オキる結果である。

シン（8-ヒドロキシキノリン）として測定されるので、その配前者では、ピリジン（最初に溶出しているピーク）はピークテーリングも小さくシャープなピークを示し、これに対して、後者のピリジンのクロマトグラムでは、テーリングが大きく、ピーク幅も広くなっている。

位性のみならず、塩基性であることも考慮する必要がある。
現在、配位化合物の溶出挙動の改善の為には高純度シリカゲルを充填剤の原料に使用することが最善の策

また、エンドキャッピングが悪い場合、二次相互作用がと考えられているが、たとえ高純度シリカゲルを原料とし強くなるため、塩基性化合物の溶出時間が遅れることもてもエンドキャッピングが不十分であれば、同時に溶出一般的に生じる現象である。

不良を引き起こすため、この二つの因子を適切に制御

この様に、シリカゲルを基材とした逆相充填剤は、残存シラノールの影響が強く現れることから、エンドキャッピングは絶対的に必要なプロセスとなっている。
高純度シリカゲルを原料とするODSシリカゲル充填剤では、ほとんど、塩基性化合物の溶出に関して問題なく使することが不可欠となる。この様子を図13b）に示す。
興味深いオキシン銅の測定例を次に示すので参考にされたい。オキシン銅は、ゴルフ場農薬として公共水域等で監視されている有害物質の一つである。
その代表例が、環境省法15）及び上水試験法16）である。

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キャッピングが 充 分 行なわれていることも重 要となり、Mightysil RP-18PAのように、溶出が保証されているカラムも選択肢の一つとなろう。17）

図13 配位化合物のクロマトグラム（試験―Ⅳ）
溶離条件
カラム：ａ）Mightysil RP-18GP（5μm）
4.6mmΦ×150mmｂ）
エンドキャッピング不良充填剤 4.6mmΦ×150mm
溶離液：アセトニトリル/20mM りん酸＝5/95
流速：1.0ml/min.
カラム温度：40℃
検出：UV250nm, a）
0.16AUFS, b）
0.08AUFS
試料：ウラシル、オキシン銅、カフェイン（溶出順）

これらの試験方法では、オキシン銅を測定する溶離液のｐＨは、環境省法がpH3.3、上水試験法がpH3.5と規定されている他、その定量下限も5ngとなっている。

図15 Mightysil RP-18PAによるオキシン銅の溶離挙動
溶離条件
カラム：Mightysil RP-18PA（5μm）4.6mmΦ×150mm
溶離液：50mmol/l りん酸緩衝液（pH3.5）/AcCN=60/40
流速：1ml/min.
カラム温度：40℃
検出：UV230nm
試料：オキシン銅 1ppm溶液、 注入量： 5μl

この条件下でオキシン銅を測定すると一般的なODSシ
リカゲル充填剤では、図14に示す様に、ピークを確認

6．親水性ODSシリカゲル充填剤（3.3分付近）することはできるが、定量性のないクロマトグ
ラムを得ることになる。

ODSシリカゲル充填剤は、水100％の溶離液を使用する場合、時間の経過と共に試料の保持が弱くなることが良く知られている。この現象は、「撥水現象」と呼ばれ充填剤表面のODS基がワックス化することで生じる現象であると考えられていた。最近、これは充填剤表面の細孔から水が抜けることにより生じる現象18）であると報告あり議論の的となっている。
いずれにしても、試料の保持が弱くなることはHPLC分

図14 上水試験法の溶離液（pH3.5）を使用した場合のオキシン銅（20ng）の溶離挙動
溶離条件
カラム：市販品ODSシリカゲルカラム（5μm）
4.6mmΦ×150mm
溶離液：50mmol/l りん酸緩衝液（pH3.5）/AcCN=60/40
流速：1ml/min.
カラム温度：40℃
検出：UV230nm、
試料：オキシン銅 1ppm溶液, 20μｌ

析上好ましいことではない。このため誕生したのが水100％溶離液を使用しても保持が変化しない親水性ODSシリカゲル充填剤Mightysil RP-18GP Aquaである。
Mightysil RP-18GP Aquaの特徴を説明する前に、一般のODSシリカゲル充填剤カラムが引き起こす保持の低下について述べる。

このクロマトグラムでは、オキシン銅を20ng注入したが、ODSシリカゲル充填剤は、一般に有機溶媒と水、もしこの状態では、定量下限である5ngの注入量ではピーク

くは緩衝液の混合液を溶離液として使用される。しかしを確認することは困難である。

極性物質である核酸やアミノ酸等を分析する際は、有機

これに対し、充分なエンドキャッピングを施した充填剤を溶媒の割合が増えるとその保持が弱くなることから、水使用すると、注入量が定量下限の5ngであってもシャープリッチな系の溶離液で分析される。しかしながら、水分なピークを示し、上水試験法に対応が可能となる（図15）。

比率が高い溶離液では、図16に示すように短時間（連続この様に、オキシン銅の微量分析では、高純度シリカ

送液15時間後）のうちに保持時間が低下し、再現性をゲルベースの充填剤を使用するのみならず、さらにエンド16

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（通巻206号）失ってしまう。

液体クロマトグラフィーの基礎技術（1）

これに対して、Mightysil RP-18GP Aquaは、図17に示7．最後にすように、保持はほとんど変わらず良好な再現性を与えている。このように、Mightysil RP-18GP Aquaは、核酸以上、逆相充填剤であるODSシリカゲル充填剤の基等の極性化合物も誘導体化やイオンペアを考える必要も本的な特徴を説明してきたが、逆相カラムの選択にあたなく、直接分析することが可能であると共に、ODSシリカり、この解説がお役に立てば幸いである。

ゲル充填剤としての一般的な特性も他のMightysil RP18GPシリーズと同じであることから、より広範囲に応用が可能なカラムといえよう。

参考文献
1）Lloyd R.Snyder,Joseph J.Kirkland,Joseph L.Glajch,"PRACTICAL HPLC METHOD DEVELOPMENT" 2ndEDITION, JOHN WILEY & SONS INC
2）日本分析化学会関東支部編, 改訂2版
マトグラフィーハンドブック ,丸善（2000）

高速液体クロ3）中村洋監修, 液クロ虎の巻 ,p54,筑波出版会（2003）
4）Y.Ohtsu, Y.Shiojima, Y.Okuyama, J.Koyama,
K.Nakamura, K.Kimata, N.Tanaka, J.Chromatogr.,
481,147（1989）
5）細田誠、酒井芳博, Chromatography, 17, 39（1996）
6）酒井芳博, THE CHEMICAL TIMES 171, 17（1999）
図16 水リッチな溶離液使用開始直後と15時間後のクロマトグラムの比較
溶離条件
カラム：Mightysil RP-18GP（4.6mmΦ×150mm）ａ）
使用開始直後、ｂ）
ａ）を測定した15時間後のクロマトグラム
溶離液：5mM KH2PO4
流速：0.5 ml/min.
カラム温度：40℃
検出：UV254nm、試料：ＣＭＰ、ＵＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ、ＡＭＰ（溶出順）

7）US Patent No. US6713033 B2
8）C.H.Lochmueller, D.B.Marshall, Analitica Chimica Acta,
142,63（1982）
9）K.Jinno,S.Shimura,N.Tanaka,J.C.Fetze,R.Biggs,
Chromatographia, 27, 285（1989）10）N.Nagae, Y.Hatano, D.Ishii, Chromatography, 14, 45R（1993）
11）特許第2611545号
12）酒井芳博、浜川大爾、太田鈴枝, 第2回LCテクノプラザ）
講演要旨集、BP2 51（1997）13）槍田孝、井原俊英、堀本能之、野村明, 第4回LCテクノ）
プラザ講演要旨集、BP2 36（1999）
14）K.Kimata, K.Iwaguchi, S.Onishi,K.Jinno, R.Eksteen,
K.Hosoya.M.Arai, N.Tanaka, J.Chromatogr.Sci., 721, 27（1989）
15）上水試験方法（2001年版）日本水道協会

図17 水リッチな溶離液使用開始直後と15時間後のクロマトグラムの比較
溶離条件
カラム：Mightysil RP-18GP Aqua（5μm）
（4.6mmΦ×150mm）ａ）
使用開始直後、ｂ）
ａ）を測定した15時間後のクロマトグラム
溶離液：5mM KH2PO4
流速：0.5 ml/min.
カラム温度：40℃
検出：UV254nm
試料：ＣＭＰ、ＵＭＰ、ＧＭＰ、ＩＭＰ、ＡＭＰ（溶出順）

16）環境省環境管理局水環境部土壌環境課「ゴルフ場で使用される農薬による水質汚濁の防止に関わる暫定指導指針」（2001）
17）竹田津研、深井伸彦、澤田豊、酒井芳博, 第8回LCテ
クノプラザ講演要旨集、GO1（2003）
18）長江徳和、榎並敏行, 分析化学, 49, 887（2000）

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