2023年10月2日(月)京都工芸繊維大学 教授着任講演会

京都工芸繊維大学
分子化学系 生物創成学研究室
黒田 浩一

独自の知見とバイオ研究ツールを基に有用生物 を 新 た に デ ザ イ ン･創成します。

生体分子の網羅的定量解析により、生命現象を分子レベルで理解することを目指します。

国内外の大学、企業と連携して社会実装を進め、環境･エネルギー･食糧問題など地球規模の課題解決につなげます。

細胞を改変し、創成するための新たなバイオ研究ツール･戦略を開発します。

有用微生物の創成によるスマートセルインダストリーの実現
未利用資源

有用微生物のデザイン・創成
細胞表層工学

ストレス耐性強化

代謝工学･合成生物学

バイオ燃料などの有用物質を生産
A

B

C

新規バイオ研究
ツールの開発と応用

DE

藻類

環境に優しい究極のバイオプロダクションを目指す

細胞表層工学の確立とその応用
細胞表層工学とは …
EnzymeReceptor
Antibody

Functional protein
細胞Antigen

Cell recognition factor

細胞表層工学
VaccineCell adhesion

応用例

Molecularrecognition

Biosensor
Signaltransduction

Immobilizedbiocatalyst

Change ofcell function

Bioconversion
Bioremediation

細胞表層に輸送・局在化されるタンパク質の分子情報を活用し、有用機能をもつタンパク質を細胞膜の外側や細胞壁に集積させ、細胞表層へ新機能を付与する

酵母細胞表層の構造
N, O-Glycosylated proteins (a-Agglutinin, Flo1p, Sed1p…..)

O-Glycosylated proteins(Cwp1p, Tip1p, Tir1p…..)
b-1,6-Glucan
b-1,3-Glucan
ChitinN-Glycosidic chain
O-Glycosidic chain
Periplasmic proteins
Plasma membrane

酵母細胞表層提示システム
酵母α-アグルチニンのドメイン構造

細胞表層提示のための分子デザイン

酵母への細胞表層提示標的タンパク質
Yeast cell

細胞壁結合ドメイン
Kuroda et al. Biotechnol Lett (2011)
Kuroda et al. Methods Mol Biol (2014)

細胞表層工学による蛍光タンパク質EGFPの細胞表層提示【細胞表層工学】細胞表層に輸送・局在化されるタンパク質の分子情報を活用し、有用機能をもつタンパク質を細胞膜の外側や細胞壁に集積させ、細胞表層へ新機能を付与
機能性外来タンパク質

アーミング
酵母

5μm

千手観音像 (Arming Buddha)

酵母細胞表層提示システムにより、１細胞あたり105-106分子を提示することが可能

バイオツールとしての有用性 ～新規機能性タンパク質の創成～
1. Intracellular expression system

2. Extracellular secretion system

3. Molecular display system

環境浄化・資源回収への応用① (His)6の細胞表層提示
Cu2+, Ni2+, Cd2+の吸着･回収② メタロチオネインの細胞表層提示
Cd2+の吸着･回収③ ModEの細胞表層提示MoO42-の吸着･回収④ ModE変異体の細胞表層提示
WO42-の選択的吸着･回収⑤ NikR変異体の細胞表層提示
UO22+の吸着･回収

バイオによる金属吸着・回収の新たな戦略を開拓
メタルバイオテクノロジー
Kuroda et al. Curr Opin Biotechnol (2011)
Kuroda et al. Appl Microbiol Biotechnol (2010)

藻類バイオリファイナリー
排他的経済水域: 4,470,000 km2（世界第6位）
海藻養殖が可能な漁場が沿岸に豊富に存在

Ecklonia kurome（クロメ）

緑藻（2.9%）紅藻（17.1%）

褐藻（68.6%）【褐藻の利点】✓ 養殖技術が確立している✓ 養殖可能な海域が広い✓ 生育速度が速い✓ 難分解性のリグニンを含まない高機能細胞触媒を構築して褐藻を原料とした有用物質生産を実現！

褐藻(クロメ)を構成する成分とその用途
その他の成分セルロース (7.3%)
ヘミセルロース (6.1%)

フコース (2.3%)

キシランなどアルギン酸 (23.5%)

灰分 (25.8%)

養殖クロメ

タンパク質 (7.1%)
マンニトール (11.3%)脂質（1.4%）フロロタンニン類 (3.0%)

ラミナラン (1.1%)

市場価格：25,000円（kg）

アーミング酵母によるエネルギー生産抽出物を直接利用

海洋細菌 Saccharophagus degradans
S. degradans

S. degradansの全ゲノム [2]http://genome.jgipsf.org/micde/micde.home.html➢ アメリカ チェサピーク湾の大量死したジャイアントケルプから単離された細菌 [1]➢ 全ゲノム解読がされている [2]。
➢ アルギン酸, セルロース, ヘミセルロース, ペクチン, ラミナランなどの様々な多糖類を分解・資化することができる。
➢ しかし, アルギン酸資化機構の詳細はわかっていない。
[1] G Andrykovitch, I Marx, Appl Environ Microbiol, 54, 3-4 (1988)[2] RM Weiner et al., PLoS Genet, 4, e1000087 (2008)

生体高分子の網羅的解析
セントラルドグマの各レベルで細胞中の全生体分子を対象として定量解析

フェノーム・生命現象を俯瞰的視野から理解・仮説ベースの戦略では到達できない
予想外の知見、新たな発見につなげる

メタボローム

全代謝物を定量解析。メタボローム解析、メタボロミクス

タンパク質

プロテオーム全タンパク質を定量解析。プロテオーム解析、プロテオミクス

RNA

トランスク
リプトーム

全RNAを定量解析。トランスクリプトーム解析、トランスクリプトミクス

ゲノム

全ゲノム配列を解読する配列解析。ゲノム解析、ゲノミクス

表現型

代謝物

DNA

各種表現型

比較プロテオーム解析結果を基にした資化機構予測
S. degradans全遺伝子（4007）➢ LC-MS/MSによる比較プロテオーム解析

同定タンパク質（987）➢ 主成分分析➢ Volcano plots
アルギン酸特異的に生産されたタンパク質を選抜（23）➢ LipoP, SignalPによるタンパク質局在予測➢ 大腸菌発現系によるタンパク質機能評価
アルギン酸資化機構を予測
Takagi et al. Marine Biotechnol , 18: 15-23 (2016)

アルギン酸からエタノールを生産するアーミング酵母
アルギン酸・マンニトールからのエタノール生産を実現【 出芽酵母 AM1株 】
マンニトール2% アルギン酸、4% マンニトールを含む
YPAM培地 (pH 6.0 and 37 oC)

オリゴアルギン酸
Step 2アルギン酸

エンド型・エキソ型アルギン酸リアーゼの共提示

Saccharophagus
degradans由来
Alg7A (エンド型)
Alg7K (エキソ型)

Step 4
Step 3アルギン酸・マンニトール濃度
Alginate and mannitol (g/L)(g/L)

Step 14520Alginate
アルギン酸
Mannitol
マンニトール
エタノール
Ethanol

403530251020155105000

藻類バイオリファイナリーに向けた細胞分子育種

15Ethanol (g/L) (g/L)
エタノール生産量

単糖(DEH)50

100150

培養時間 (h)200mean±SEM, n=3エタノールを生産
Takagi et al. Appl Microbiol Biotechnol , 101: 6627-6636 (2017)

大型藻類CO2固定の加速により地球環境の回復と物質生産を両立
Blue gold の時代を拓く

O2
H2O

化成品原料・
生分解性プラス
チック
機能性
食品素材

大気
N2
CO2

大型藻類
（陸上植物と比べて約10倍のCO2吸収量）• CO2固定能の強化
優良株選抜育種
ゲノム編集株作製

人工代謝経路による変換• 藻場の拡大• 固定したCO2の有効活用

固定したCO2の有効活用

生物学的固定の強化

潜在能力を拡張
有用微生物の合成生物学的育種
O2
H2O

CO2

自然プロセスの加速

アミノ酸
低エネルギー
プロセス
N2

有機物

CO2

酸素フリーN2大型藻類の育種
優良種の選抜
ゲノム編集

バイオリファイナリーにおけるジレンマ
原料

微生物細胞

代謝工学
合成生物学有用物質

しかし、下記の場合・反応条件 (pH, 温度など)が特殊・生産物自体が毒性を示す
生産性を高めたい反面、細胞機能が低下細胞自体の耐性を高めておくことが重要

有用物質

網羅的解析と転写因子の改変による細胞制御 －ストレス耐性工学－
変異を導入

転写因子

1種の変異にて複数遺伝子の発現を同時に制御

網羅的定量解析・mRNA・タンパク質
ゲノム解析

DA

ストレス耐性向上の原因因子を同定

B
C
核

各種ストレスに対する耐性向上
有機溶媒
酸･アルカリ重金属

個々の遺伝子の過剰発現や破壊とは異なる効率的細胞分子育種
熱

アルコール

Satomura et al. Curr Environ Eng (2014)
Kuroda et al. J Biosci Bioeng (2017)

アルコールの細胞毒性
酵母 Saccharomyces cerevisiae
・エタノール生産能に優れた微生物
・エタノール耐性が高い (8%が限度)
・炭素数が2つ増えたイソブタノールでは1.4%が限度
エタノール

イソブタノール

エタノールとは全く異なる阻害機構が予想されるものの…
イソブタノールが毒性を発揮する機構：分かっていない
イソブタノール耐性を大きく向上させた例：無いイソブタノール感受性株・耐性株の網羅的探索
酵母非必須遺伝子破壊株ライブラリー in 96-well plate

SC培地にて前培養 in 96-well plate
2種類のSC培地に植菌＆培養 in 96-well plate

OD600 の測定およびTolerance factorの計算
イソブタノール含有培地 (B)でのOD600 / 通常の培地 (A)でのOD600耐性株(gln3Δ株)を発見

イソブタノール感受性株・耐性株を同定

GLN3 遺伝子の破壊によるイソブタノール生産能の増大
分岐鎖アルコール耐性酵母gln3Δ株においてイソブタノール生合成経路の酵素を過剰発現4.9倍コントロール

イソブタノール生合成経路の酵素を過剰発現

分岐鎖アルコール耐性の強化により、イソブタノール生産量の大幅な向上(4.9倍)を実現➞ 細胞自体の耐性を高めておくことが生産性を増大させる上で有効な戦略

イソブタノールによる新たな生育阻害機構の発見と耐性向上
酵母野生株

分岐鎖アルコール耐性酵母gln3Δ株
網羅的解析を起点とした基礎研究

独自の知見を基にイソブタノール生産量の増大に成功(約5倍): 促進: 抑制MIT・Stephanopoulos教授、MITホワイトヘッド研究所・Fink教授、プリンストン大学・Avalos助教との国際共同研究を主導

野 生 株 ：窒素源が豊富に存在するにも関わらず、イソブタノールにより窒素飢餓ストレス応答が強制的に引き起こされる

gln3Δ株：イソブタノールによる窒素飢餓ストレス応答は起こらない

・日本農芸化学会2021年度大会トピックス賞
・Kuroda et al. Cell Systems (2019)