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岡山大学機器No.11
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巻頭言
サービス充実への取り組み
自然生命科学研究支援センター分析計測分野長山田秀徳1

共同利用機器の紹介（11）HPLC‑Chip/QTOF質量分析システム

分析計測分野塩川つぐみ2

共同利用機器の紹介（12）ペプチドシーケンサー

分析計測分野多田宏子6

共同利用機器の紹介（13）生体高分子用X線回折装置

分析計測分野小坂恵9

特別寄稿

第8回自然生命科学研究支援センター分析計測・極低温部門分析計測分野講演会
機器分析によるタンパク質の構造と機能の解析
九州大学大学院植田正11

他大学の機器分析センター（7）九州工業大学機器分析センター

分析計測分野多田宏子13

分析計測部門の装置を利用した研究成果(H19〜H22年）

14

ニュース25

共同利用機器の設置

共同利用機器の利用手順
研修会、講習会の開催

自然生命科学研究支援センター分析計測分野機器管理責任者・監守者名簿主な動き

職員名簿編集後記

機器分析ニュースNo.112011．3●●●●●●●●●●令>●
サービス充実への取り組み

岡山大学自然生命科学研究支援センター
分析計測分野長山田秀徳

前身の機器分析センター設立時のいきさつから、本分野に設置されている機器は各部局から供出いただいているものが殆どです。そのため運用と維持管理は所有部局教員のボランティア的活動に依存しており、共同利用優先のサービスを学内構成員に提供していただくには無理があります。この状況を改善するために、分野で直接管理する機器を増やし、それに技術職員（オペレーター)を配置して､依頼分析やコアユーザーヘの利用指導を行ないたいと常々考えておりました。
しかし、それは容易ではなく、当初開始したサービスは、「化学系研究設備有効活用ネットワーク（現・大学連携研究設備ネットワーク）」に参加し、外部からの元素分析の依頼を受け付けるようにしたこと、高額機器の所在（岡山大学設置機器一覧表）をホームページで公開し、機器の共同利用に対する便宜を図ったことなど、限られたものでした。
そんな中、分析計測・極低温部門に多田宏子准教授が新たに着任され、これを契機に「岡山大学における全学的設備の有効活用と維持管理の方策等について検討を進めよ」という曽良センター長（副学長）の方針が示されました。それに呼応するかのように平成21年度補正予算で相当数の機器が本分野に導入され、分析計測分野が提供するサービスを見直す絶好の機会が訪れました。
そこで先進的取り組みを行っている大学への直接訪問調査、「国立大学法人機器・分析センター会議」を通しての他大学への調査や研究推進産学官連携機構研究推進本部との意見交換等を行い、全学サービス部門として行うべきことの検討を開始しました。その結果、人手と予算の獲得が不可欠であることが明らかになりましたが、人手がなくても新たに実行できるサービスとして、まずは機器の利用説明会の様子をビデオ撮影し、新たな利用希望者がいつでも装置の利用方法を見ることができるようにしました。

しかし「化学系研究設備有効活用ネットワーク」を通して本分野に新たに導入された質量分析装置だけは、全国のユーザーからの依頼分析に応えることを約束した装置ですので、オペレーターを配置しなければどうにもなりません。そのため、大学に技術職員の配置をお願いしていたと
ころ、NMR装置及び質量分析装置のオペレーターとして、特別契約職員（技術職員)1名の配置を実現することができました。
人手は確保したものの、さらには、新規導入機器の保証期間終了後の維持補修費の捻出問題もあります。これも全学的支援が不可欠ですが、皆様のご支持がなければ実現するはずもありません。なにとぞご協力のほどよろしくお願いいたします。
平成23年度は、岡山大学が「第15回国立大学法人機器・分析センター会議」の当番校となっています。その時までに何としても、岡山大学の分析計測分野における共同利用機器の運用、維持管理、サービス等が全国のモデルとなれるようにしておきたいものです。

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HPLC‑Chip/QTOF質量分析システム

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自然生命科学研究支援センター塩川つぐみ

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1概要
精密質量をベースにした構造解析や蛋白質、ペプチド、メタボライトの解析などが可能な「高い分析性能を持ったQ‑TOFシステム」と、微小サンプルの高分離，高感度分析が可能な「チップ方式のナノHPLCシステム(HPLC‑Chipキューブ)」とを組み合わせたLC‑MS/MSシステムである。

2仕様
アジレントテクノロジー社G6520型+G4240型

ポンプ：（ナノ)0.1‑1iiL/min、（キヤピラリ)1‑20uL/min
オートサンプラー：注入量0.01‑40nL、イオン化部:HPLC‑Chip直行型ESI
QTOF部：測定質量範囲m/z25‑m/z20,000(通常3200まで）

精確さ<2ppm(m/z609.2807,lOOpg使用時）
質量分解能:m/z1522で16,000(FVVHM)、ADC式アナライザ：ダイナミックレンジ5桁以上

解析・データベース:MassHunler(Qualitative,Biocomfirm)、Mascot(タンパク質同定),
METLir,i(代謝物）

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HPLC‑Chip/QTOF質量分析システム外観
3原理

質量分析計(Massspectrometer)とは､分子の質量を測定する装置であり、1.試料をイオン化するイオン源(Ionsource)、2.生成されたイオンを質量と電荷の比で分離する分析部(Analyzer)、3.分離されたイオンを検出する検出部(Detector)、4検出されたデータを解析処理するデータ解析システムの42機器分析ニュース
No.II2011.3部から成っている｡本装置には試料導入部としてﾅﾉ‑LCが附属しており、試料中の混合成分を相互分離した後､イオン源に導入する｡イオン源でのイオン化法はエレクトロスプレーイオン化(ESI)法であり、電気伝導性の液体を細管に通し高電圧を印加すると、帯電した均一で微細な液滴として噴霧され､それらの液滴から溶媒を蒸発させることによって試料分子の多価イオンが発生する｡質量分析部では､まず四重極型(Quadrupoi,Q)の4本のロッドを互いに平行に束ね､隣り合うロッドには正負逆電位を与えた空間にイオンを送り込むことで、ある一定の範囲の質量電荷比のイオンだけが安定に振動して通り抜ける。
その後、飛行時間型(TOF)で一定の電圧をかけてイオンを加速し､一定距離の自由空間を検出器に向かって飛行させると､イオンは質量の小さいものから順番に検出器に到着するので､イオンを加速してから到着するまでの時間を測定するとその質量が求められる。四重極とTOFの間には衝突室(Collisioncell)が有り、四重極で選択されたイオンをフラグメント化した後に質量分析できる(msms解析)ので、分子内部の構造情報が得られる．

4装置概略

QuadM

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SFllter(Q1）、 … 1'画1．副nd2

四重極型

TOF型

5用途例
･プロテオーム分析
タンパク質／ペプチドの同定

一一･バイオマーカー研究

一グー

翻訳後修飾解析･低分子化合物同定／定量･精密質量分析･代謝物の同定／定量← 一 一

6実際の測定例＜トリプシン消化BSAの解析＞

トリプシン消化BSAをlOfmol注入してLC‑MSMS分析した。得られたデータから化合物を抽出し、MascotServer解析した結果、score32、配列coverage43%でBSAが同定された。
3

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赤字で示したところが同定された断片

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Mascotserver解析で同定されたCompou
sCore32
coverage43%

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442＜タンパク質同定＞

担子菌シイタケの子実体形成過程における全タンパク質抽出サンプルを二次元電気泳動後、SYPRORuby染色・スポット抽出・ingeldigestion処理の後、LC‑MSMSにて分析し、独自に所有するシイタケのタンパク質アミノ酸配列・cDNA塩基配列を用いたMascotserver解析を行った結果、SIスポット中75スポットのサンプルについてタンパク質が同定された。
（独立行政法人森林総合研究所きのこ研究室特別研究員佐野広明，主任研究員宮崎安将）＜合成ペプチドの質量確認＞

合成ペプチド(Mm(calc)=3162.87)2pmole/^LをダイレクトインジェクシヨンモードでMS分析した。得られたMSスペクトルをデコンボリュートして質量を求めたところ、Mm(obs)=3162.85のペプチドが確認できた（下図)oLC‑MSモードでは、注入量200rmoleでMm(obs)=3162.87のペプチドが確認された。
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カウントvSデコンボリュート質重（amu）＜抗体の分子量測定＞

C8Chipを使用してモノクローナル抗体を分析した。ESIでは多価イオンになるため、分子量の大きい抗体（約150kDa)でも通常モードの測定質量範囲(m/z25‑3200)でm/zピークが検出され、デコンボリュートによって抗体質量が決定された結果、糖鎖構造の異なる分子種が観察された。
<デコンボリュート結果＞

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質量電荷(m/z)

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ナカントVSデコンボリュート質量（amU）

4

機器分析ニュースNo.112011.3＜糖鎖解析＞

糖鎖用のPGCChip(充填剤 :グラファイトカーボン)を使用して、PA化‑GlucoseOligomer(DP=3‑22)をLC‑MS分析した。 この測定条件では、DP=3(583.27)から162の間隔でDP=13までのイオンピークが検出された。
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測定例＞
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新規な構造を有するタンパク質の+スキャン(9,084‑9.698mm 39ｽｷｬﾝ）IIO105SeM.d減算テｺﾝポﾘﾕｰ卜（同位体幅=i3.0）

結晶をX‑線結晶構造解析により構造剛1350389.53を決定する際には､MAD法やs‑sad;;法などが利用される。
今回、我々は鉄硫黄酸化細菌より新0．949872.76

規な構造を有する酵素(4THase)の結0.8

1一SeMet(196.106)‑Met(149.21)

晶化に成功し､これのX‑線結晶構造解06

A516．77＝46.896

516.77／46.,896=11.0個析を試みた｡この際､S‑SAD法によるM解析を行うため、酵素タンパク質内の0．3メチオニンをセレノメチオニン0．2(SeMet)に置換した4THaseを作成し0.1− −I!Vニ ー ー ー ロ ニ ニ

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た。メチオニン栄養要求性大腸菌変異株を宿主としてSeMetを含む合成培地で4THase遺伝子を発現させ、SeMet置換4THaseを得た。このタンパク質のSeMet置換率を求めるため、LC‑QTOFによる質量分析を行った。本酵素は、その遺伝子から推定される一次構造よりII個のメチオニンが含まれることが明らかとなっている。本来の4THaseおよびSeMet置換4THaseをそれぞれLC‑QTOFにより正確な質量を求めた。両者の質量の差およびメチオニン残基とSeMet残基の質量数の差を計算することにより、4THaseに含まれるII個のメチオニン残基が全てSeMet置換されていることが明らかになった。
（自然生命科学研究支援センター分析計測分野金尾忠芳）
7利用方法(2010.02.20現在）
オペレータによるHPLC‑Chip/QTOF依頼分析：
学内料金:10,000円/検体（通常のプロテオーム分析･蛋白質解析）
5,500円/時間（条件検討測定や多検体同時測定用に）
学外利用：受付けておりますので､ご相談下さい。

共同利用（学内のみ）：4,500円/時間（数回トレーニングを受けていただきます｡）
申込み方法：申込書と測定試料情報連絡書に必要事項を記入し、分析計測分野職員室(理･コラボレーションセンター棟21‑204号室)へご持参下さい。

※機械メンテナンスのため、予告なしに業務を中断することがあります｡ご容赦ください。

※詳細は分野ホームページをご確認下さい。http://kikibun1.kikibun.okayama‑u・ac.jp/home.htm
お問い合わせは技術職員塩川（内線8747)(shioka‑t@cc.okayama‑u.ac.jp)
准教授多田（内線8746)(tadahrk@cc.okayarna‑u.ac.jp)

5

回国③図画図，．え少｡｡．叙｡．

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蕊･鐘:母＃共同利用機器の紹介（12）鴬§ペプチドシーケンサー

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自然生命科学研究支援セ ン タ ー 多 田 宏 子

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数pmolレベルのタンパク質（ペプチド）試料について、N末端からのアミノ酸配列を20残基程度まで自動的に決定する装置である。アミノ酸配列は、タンパク質の立 体構造、機能、分子進化等の研究において重要な情報となる。近年可能となった質量分析装置でのアミノ酸配列決定と比較すると、以下の特長を持つ。

蛋白質そのままで､分析する事が可能である。
まったく同じ質量数を有するlieとLeuを識別できる。
Disulfide結合の有無とその位置が､決定できる。
決定された配列の信頼性が非常に高く､確実なアミノ酸配列が決定できる。
特にデータベースに登録されていない蛋白質の同定･アミノ酸配列の確定には有用である。
機器操作とデータ解析が容易である。
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ペプチドシーケンサー外観
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仕様
反応方法：
反応時間：

リアクタ数：
コンバータ制御温度：
試薬溶媒供給方法：
HPLC送液ユニット：

エドマン反応47分／サイクル

1(直径8mm),
室温+10‑70℃，

リアクタ制御温度:室温+10‑60℃
カラム制御淵.度：室温+10‑60℃高純度N2ガス加圧
0.001‑10.000mL/min．

6

検出器：波長範囲190‑700,m