福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 研 究 報 告 27 (2008)17オオムギ網斑病菌とオオムギ斑葉病菌の rDNA‑IGS 領域の
PCR‑RFLP 解析による識別
菊原賢次*・石井貴明
形態が酷似した近縁種であるオオムギ網斑病菌 Pyrenophora teres とオオムギ斑葉病菌 P. graminea を識別するため，分子遺伝学的手法で解析を行った。国内の西南暖地を中心とした地域から両種の菌株を収集し，rDNA‑IGS 領域を PCRで増幅させ，増幅産物の長さを比較した。P. teres は約 4kbp と約 4.4kbp の 2 つのグループに，P. graminea は約 3.8kbpの 1 つのグループに類別された。これらの増幅産物を 6 塩基認識制限酵素 Apa I，Bgl II，Dra I，EcoR V，Hind III，Sac
I で処理した RFLP パターンは，rDNA‑IGS 領域の増幅産物長で類別されたグループ間で同一であった。4 塩基認識制限
酵素 Alu I で増幅産物を処理した RFLP パターンは，P. teres に属する 2 つのグループと P. graminea に属する 2 つのグループに類別された。以上のように，rDNA‑IGS 領域の RCR‑RFLP 解析は P. teres と P. graminea を識別する有効な手段であった。一方，国外における P. graminea の一部では，本研究の PCR‑RFLP 解析で P. teres と類似するものが存在しており，これらを含めると，PCR 増幅産物を Dra I で処理した RFLP パターンが，両種をより明確に判別することができた。
［キーワード：オオムギ網斑病，オオムギ斑葉病，rDNA‑IGS 領域，PCR‑RFLP 解析］
Distinction between Pyrenophora teres and Pyrenophora graminea based on RFLP analysis of intergenic spacer regionof ribosomal DNA. KIKUHARA Kenji and Takaaki ISHII (Fukuoka Agricultural Research Center, Chikushino, Fukuoka
818-8549, Japan) Bull. Fukuoka Agric. Res. Cent. 27: 17 - 21 (2008)
Intergenic spacer (IGS) region of the ribosomal DNA (rDNA) were amplified from each isolates of Pyrenophora teres and
P. graminea with PCR. The length of the IGS-PCR products in P. teres were classified into two groups, ca. 4kbp or 4.4kbp,
and the length of the IGS-PCR products in P. graminea were ca. 3.8kbp. The RFLP patterns of isolates obtained with the
6-base cutting enzymes Apa I, Bgl II, Dra I, EcoR V, Hind III and Sac I were similar within each group based on the PCR
products length and different among 3 groups. The restriction patterns of IGS-PCR products from isolates of P. teres with the
4-base cutting enzyme Alu I were similar each group and the restriction patterns of IGS-PCR products from isolates of P.
graminea were classified into two groups. Therefore, variability of the rDNA-IGS region could distinguish between P. teres
and P. graminea. On the other hand, the RFLP patterns obtained these restriction enzymes were similar between isolates of P.
graminea in another paper and the group identified by the long IGS-PCR products in P. teres in this investigation. In
consideration of those isolates, the RFLP patterns obtained with Dra I could clearly distinguish between P. teres and P.
graminea.
［Key words: barley net blotch, barley leaf stripe, rDNA-IGS, RFLP analysis］
緒言

Pyrenophora 属菌はイネ科植物に寄生する Drechslera
属菌の完全世代としてよく知られており，世界で十数種が知られ，日本ではオオムギ Hordeum vulgare L.で 3 種，
コムギ Triticum aestivum L.とエンバク Avena sativa L.
に各 1 種が確認されている１１)。オオムギに発生する病害のうち，Pyrenophora teres Drechsler によるオオムギ網斑病と P. graminea Ito and Kuribayashi によるオオムギ
斑葉病は我が国を含む温暖湿潤な地域で重要病害６,１０,１６)である。
オオムギ網斑病は罹病種子や前作のオオムギ残渣が第一次伝染源になり，幼苗に感染する。感染葉上には多量の分生子が形成され，これにより活発に第二次伝染を繰り返し，穂に感染すると罹病種子ができる１７)。オオムギのほとんどが不稔になり，感染葉や茎で形成された胞子斑葉病は種子伝染し，感染した個体は枯死あるいは子実＊ 連絡責任者（病害虫部）

が他の個体の穂に感染すると，罹病種子ができる。両種は同じ種子伝染性病害であるが，防除法が異なり，オオ
ムギ網斑病は種子消毒以外に出穂期の薬剤防除も必要である６,１０)が，オオムギ斑葉病は種子消毒が唯一の防除法である。
種子伝染性病害の防除対策は，健全種子の確保が重要である。特に，オオムギ斑葉病については主要農産物種子法により，生産種子に罹病種子の混入が許されないため，種子生産農家には特に注意すべき病害である。このため，生産現場では健全種子の確保だけでなく罹病種子
における両種の識別が重要である。ブロッター法を改変した菊原９)や松本１２）の方法により，種子上あるいは，種子をのせた培地上に分生子を形成させ，オオムギ網斑病
あるいはオオムギ斑葉病の罹病の有無を判別することは可能であるが，両種が近縁種であるため，分生子の形態
では種の識別ができない。
PCR を含む分子生物学的手法は菌の遺伝的多様性を分析する手法としてよく用いられ，ribosomal DNA(rDNA)領
域は保存性が高い遺伝子と多様性が高い非遺伝子領域を福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 研 究 報 告 27 (2008)

含むため，系統・分類学に良く用いられる。スペーサー
領域の rDNA‑ITS 領域（内部転写スペーサー領域）は種間
で遺伝子の多様性があり，種の識別に用いられ１３,１４,１８)，
リボゾーム反復ユニットを分ける IGS 領域（遺伝子間ス
ペーサー領域）は種内で遺伝子の多様性があることから，
種内の類別に用いられる３,７)。
P. teres と P. graminea の rDNA‑ITS 領域の塩基配列は
1 塩基しか違いがなく１８)，rDNA‑ITS 領域の PCR 増幅産物の制限酵素切断片長多型（RFLP）解析では両種は区別ができなかった８）。これまでに P. graminea では rDNA‑IGS
領域の PCR‑RFLP 解析により，複数の RFLP パターンが確認されているが ５,１５)，P. teres の rDNA‑IGS 領域では
PCR‑RFLP 解析は行われていない。そこで，国内の西南暖地を中心にした地域から両種の菌株を収集し，rDNA‑IGS
領域の PCR‑RFLP 解析を行い，両種の識別の可能性を検討
した。
材料と方法
１

供試菌株
第 1 表に今回使用した P. teres と P. graminea の菌株を示した。これらのうち，筆者が分離した菌株は，以下の方法により分離を行った。すなわち，それぞれの病害について特徴的な病徴を示した罹病葉を各地域から採取
第１表
種／菌株名

し，組織分離法により菌を分離し，V8 ジュース寒天培地（V8 ジュース 200ml，CaCO3 3g，寒天 15g ／ 1L）で 25℃，12 時間 BLB ランプ照射，12 時間暗黒を繰り返す条件で培養し，分生子を形成させ，これを単胞子分離し，菌株として保存した。通常の培養はポテトデキストロース
寒天培地（PDA；ジャガイモ 200g の煎汁，ブドウ糖 20g，
寒天 15g ／ 1L）を用い，長期間培養する場合には素寒天培地を用いた。
２ DNA の抽出法と PCR の条件菌糸を採取する際は，各菌株をポテトデキストロース
液体培地（ジャガイモ 200g の煎汁，ブドウ糖 20g ／ 1L）
で 25 ℃，5 日間培養し，菌糸をガラスウールフィルタで回収した。あるいは，各菌株を PDA 培地で 25 ℃，7 日間培養し，菌糸を白金耳で少量回収した。その後，この菌糸を液体窒素で凍結し，乳鉢で破砕した。全 DNA の抽出は早川４)の方法で行った。rDNA の IGS 領域を増幅するプ
ライマーは CNL12（5'‑CTGAACGCCTCTAAGTC
AG‑3')と CNS1 (5'‑GAGACAAGCATATGACTACTG‑3')を用いた
１５)。PCR は EX Taq DNA polymerase(TaKaRa)キットの説明書に従い 50μl で行った。サーマルサイクラー（ASTEC 製，
PC707）の温度や時間等の条件は最初の熱変性 94 ℃，5分間，熱変性 94 ℃，1 分間，アニーリング 59 ℃，2 分間，伸長反応 72 ℃，5 分間で 35 回繰り返し，最後の伸長反応 72 ℃，10 分間を行った。

供試菌株

宿主

分離地

分離年

分離者・
分譲者

二条オオムギ
二条オオムギ
二条オオムギ
二条オオムギ
二条オオムギ
二条オオムギ六条オオムギ六条オオムギ
不明
不明

福岡県
福岡県
熊本県
熊本県
大分県
鳥取県
千葉県
千葉県
不明
不明

1999
1998
1999
1999
不明
不明
1976
不明
不明
不明

著者
著者
著者
著者
挟間
長谷川
西原
西原
Kurata西原

FUPG9901
Pg kurume 2
FUPG9920
FUPG9910
FUPG9915
FUPG9925
FUPG9930
Tsukuba D5)

二条オオムギ
二条オオムギ
二条オオムギ
二条オオムギ
二条オオムギ
二条オオムギ
二条オオムギ
二条オオムギ

福岡県
福岡県
熊本県
大分県
宮崎県
岡山県
埼玉県
千葉県

1999
1998
1999
1999
1999
1999
1999
不明

IFO75074)

不明

不明

不明

著者
著者
著者
著者
著者
著者
著者
旧畑作病
害研究室
西原

Pyrenophora. teres
FUPT9901
Pt amagi 2
FUPT9906
FUPT9908
pt 1-11)
pt 3-32)
MAFF3054083)
MAFF5110333)
IFO66744)
IFO75084)

18

３ RFLP 解析
制限酵素処理は PCR 産物 1μl，10 ×バッファー 1μl，
制限酵素（Alu I，Apa I，Bgl II，Dra I，EcoR V，Hind III，
Sac I (Boehringer Mannheim)）0.5μl，滅菌蒸留水 7.5μlで 37 ℃，8 時間以上処理した。なお，用いた制限酵素のうち Alu I のみが 4 塩基認識制限酵素で他は 6 塩基認識
制限酵素である。
制限酵素処理断片は 1xTBE バッファーで 1%または 3%のアガロースゲルで電気泳動を行い，エチジウムブロミドで染色した後検出し，解析した。IGS 領域の制限酵素地
図は制限酵素 Apa I，Bgl II，Dra I，EcoR V，Hind III，Sac Iの 2 回処理で作成した。
結P. graminea

1) 大分県農業技術センターより分譲
2) 鳥取県農業試験場より分譲
3) 生物資源機構より分譲
4) 旧発酵研究所より分譲
5) 中央農業総合研究センターより分譲

果

プライマー CNL12 と CNS1 を用いて PCR を行い，IGS 領域を示す DNA 断片がすべての菌株で増幅された(第 1 図a)。P. teres 菌株の増幅産物長は約 4kbp（グループ A（第 1
図 a の A））と 4.4kbp（グループ B（第 1 図 a の B））の 2
つのグループに，P. graminea 菌株の増幅産物長は全て
約 3.8kbp（グループ C（第 1 図 a の C））のグループに類別された。
6 塩基認識制限酵素 Apa I，Bgl II，Dra I，EcoR V，Hind
III，Sac I で PCR‑RFLP 解析を行った。その結果，増幅産物長で類別されるグループ（グループ A，B，C）内は同じパターンを示した。グループ間の比較では，Dra I
処理による RFLP パターンはグループごとに異なった(第1 図 b)。Hind III 処理による RFLP パターンは P. teresのグループ A と B で類似し，P. graminea のグループ C

福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 研 究 報 告 27 (2008)とは異なった(第 1 図 b)。Bgl II 処理では，P. teres のグループ A は切断されたが，グループ B と P. gramineaのグループ C は切断されなかった（データ省略）。Apa I
処理による RFLP パターンは全ての菌株グループで類似

19

し，Eco R V と Sac I も同様であった（データ省略）。6 塩
基認識制限酵素により IGS 領域の制限酵素地図を増幅産物長で類別されるグループごとに作成した(第 2 図，第 2表)。さらに，4 塩基認識制限酵素 Alu I 処理による

Dra I
M

A

B

M

C

A

B

Hind III
C

A

B

C

b

a

第 1 図 P. teres 菌株と P. graminea 菌株の rDNA-IGS 領域の PCR 産物のアガロースゲル電気泳動a) PCR 産物 b) 制限酵素処理（Dra I ， Hind III ）M, 1kb DNA マーカー; A, P.teres:
FUPT9901; B, P.teres: MAFF511033; C, P. graminea: FUPG9901 ，図内の「・」はバンドの位置
を示す。

A

B

C

第 2 図 rDNA-IGS 領域の制限酵素地図A)，B) P. teres ，C) P. graminea

M

a

b

c

d

第3図
P. teres 菌株と P. graminea 菌株の rDNA-IGS
領域の PCR 産物の制限酵素(Alu I)断片の アガロースゲル
電気泳動
M, 1kb DNA マーカー; a, P.teres: FUPT9901; b, P.teres:
MAFF511033; c, P. graminea: FUPG9901; d, P. graminea:
Pgkurume2

福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 研 究 報 告 27 (2008)

PCR‑RFLP 解析を行った。その結果，RFLP パターンは P.
teres のグループ A，B および P. graminea のグループ内
で 2 つのグループに類別された（第３図，第２表）。
増幅産物長や Apa I，EcoR V，Sac I 処理による RFLP パ
ターンは処理産物の分子量が近いため類似し，アガロー
スゲル電気泳動では両種間の区別が困難であった。一方，
Dra I，Hind III，Alu I 処理の RFLP パターンは両種でバンド数が異なり，明確に区別ができた。
第 2 表 Pyrenophora 属菌株の rDNA‑IGS 領域の PCR‑RFLP
パターン
種／菌株名

rDNA-IGS領域のPCR-RFLPパターン
長さと6種類の6塩
基認識制限酵素1)

4塩基認識制限酵素 Alu I

A2)
A
A
A
A
A
B
B
A
B

a
a
a
a
a
a
b
b
a
b

C
C
C
C
C
C
C
C
C

c
d
c
c
c
d
d
d
c

Pyrenophora. teres
FUPT9901
Pt amagi 2
FUPT9906
FUPT9908
pt 1-1
pt 3-3
MAFF305408
MAFF511033
IFO6674
IFO7508
P. graminea
FUPG9901
Pg kurume 2
FUPG9920
FUPG9910
FUPG9915
FUPG9925
FUPG9930
Tsukuba D
IFO7507

1) 6 種類の制限酵素は，Apa I， Bgl I, EcoR V， Dra I， Hind III，
Sac I である
2) 同じアルファベットは同じ多型を示し，第 2 図および第 3 図でのアルファベットの多型を示す。

考察

Jawhar ら５)はシリアの P. graminea の菌株で rDNA‑IGS
領域の RFLP 解析を行った結果，多くの RFLP パターンが見られ，遺伝的変異が大きいことを確認した。その要因
として，突然変異，他の地域からの移入および交雑による組換えの可能性を指摘している。Pecchia ら１５)はイタリア，オーストラリア，チュニジアから分離された P.
graminea の菌株で本研究と同様の rDNA‑IGS 領域の RFLP
解析を行い，菌株ごとに異なる多数のパターンを確認している。このように，オオムギ起源地の近隣諸国においては，P. graminea の遺伝的変異が大きいことが報告されている。一方，本試験で供試した日本産の P. graminea 9菌株は，rDNA‑IGS 領域の RFLP 解析の結果，2 つのグルー

20プに類別され，比較的変異が少なかった。また，その中には Pecchia ら１５)が報告した RFLP パターンと一致するものが含まれていた。日本は，自然状態で病原菌や種子の海外からの移入が少なく，今回供試した菌株の宿主の大半を占める二条オオムギの栽培的歴史も浅いため，P.
graminea の遺伝的変異も少ないと考えられる。このため，国内の西南暖地における P. graminea は限られた遺伝的変異で構成されていると推察される。P. teres 10 菌株の
rDNA‑IGS 領域の PCR‑RFLP 解析により，P. graminea と同様に 2 つのグループに類別され，P. teres も比較的遺伝的変異が少ないと考えられる。国内の西南暖地の両種の遺伝的変異は少なく，本報告の供試菌株を両種に類別できれば，両種を識別する指標として十分と考えられる。
しかしながら，近年の物流状況から，今後，本病の海外からの移入が全くないとは考えられないため，両種の識別には，より多くの菌株を類別できる指標が望ましいと考えられる。
Pecchia ら１５)は P. graminea 6 菌株を rDNA‑IGS 領域のPCR 増幅産物長で約 3820bp と約 4380bp の 2 つのグルー
プに類別し，本研究と同様な制限酵素で PCR‑RFLP 解析を行った。その結果，増幅産物長が約 3820bp のグループは
本研究結果における P. graminea のグループと増幅産物
長および PCR‑RFLP 解析の結果が一致した。一方，増幅産物長が約 4380bp のグループは本研究における P. teresのグループ B と増幅産物長でほぼ一致し，RFLP パターンでも類似していた。西南暖地の菌株を用いた本研究結果
では，両種の識別は増幅産物長の比較や Dra I，Hind III
あるいは Alu I 処理による PCR‑RFLP 解析で可能であった。しかし，本研究で用いた P. teres の一部の菌株では，増幅産物長あるいは Hind III や Alu I 処理による RFLP
パターンが Pecchia ら１５）が報告した P. graminea の解析
結果と類似したことから，P. teres と P. graminea の区別が困難になることも推察される。このため，Dra I 処理による PCR‑RFLP 解析が明確に両種を識別できると考えられた。
P. teres と P. graminea の識別は健全種子生産のため西欧諸国でも重要視され，rDNA‑ITS 領域の 1 塩基の違いを区別できる蛍光物質を利用した Scorpion プライマーによるリアルタイム PCR 法により，両種の識別は可能である１,２)。しかし，この方法では高額なリアルタイム PCR 装置が必要である。一方，本研究結果による識別は従来か
らよく利用されている PCR‑RFLP 法であるため，通常のPCR 装置での識別が可能である。従って，本報告は健全種子を確保するために各県農業試験場や病害虫防除所などの生産現場において利用できる方法として重要な知見
である。
辞

察

本研究実施に当たり，分離菌株を分譲してくださった
大分県農林水産研究センター挟間渉氏，島根県農業技術センター長谷川優氏，中央農業総合研究センター旧畑作
病害研究室に厚く御礼申し上げる。
引用文献

福 岡 県 農 業 総 合 試 験 場 研 究 報 告 27 (2008)

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