ミルクオリゴ糖（乳中少糖）の比較生化学（X）
Comparative Biochemistry of Milk Oligosaccharides (X)─化学構造的特徴とその利用性── Characteristics on the Chemical Structure and Their Application ─
国立大学法人 東北大学大学院農学研究科 教 授 農学博士

齋藤 忠夫

TADAO SAITO Dr. Agric.
Graduate School of Agricultural Science, TOHOKU University
国立大学法人 帯広畜産大学大学院畜産学研究科 教 授 農学博士

浦島匡

TADASU URASHIMA Dr. Agric.
Graduate School of Food Hygiene, OBIHIRO University of Agriculture and Veterinary Medicine

元末端にN-アセチルラクトサミンを含むものを除いては、ラ1．はじめにクト系列かネオラクト系列の糖脂質糖鎖構造に分類され哺乳動物は、その名の通り仔に対して自ら乳（ミルク）ていた。ところが、最近Uemuraらによりバンドウイルカ初を分泌して与える。泌乳初期に限定されて生合成・分泌乳に発見されたミルクオリゴ糖の化学構造は、ヒトなどでされる乳は、とくに「初乳（colostrum）」と呼ばれ、常乳は脳神経系に局在するガングリオ系列スフィンゴ糖脂質（normal milk）とは区別される。初乳は常乳と比較して成のGM2の糖鎖構造と同一であるという大きな知見が含ま分的に大きく異なり、多量の免疫抗体（immunoglobulin,れていた10）。本稿では、その構造決定にあたって威力をIg）に加えて、ラクトース（乳糖）以外に多種多様な「ミル発揮したHSQCによる二次元核磁気共鳴スペクトル法クオリゴ糖（milk oligosaccharides, MO）」と呼ばれる特殊（NMR）の解釈を中心に、イルカという陸棲動物とは異なっな糖質（炭水化物）が含まれている。

た海獣類の乳中に存在するミルクオリゴ糖の存在意義と

1）

2）

3）
,8）

これまでに著者らは、ヒト 、ウシ 、ウマ
4）

6）

7）

3）
,5）、ヒツジ、重要性について考察してみたい。

9）

ヤギ 、イヌ 、カモノハシ およびツキノワグマ の乳に含まれるミルクオリゴ糖の化学構造解析を行い、乳中での2．バンドウイルカミルクオリゴ糖の分離精製存在意義について比較考察してきた。人乳（ヒトミルク）には、これまでに100種類以上のミルクオリゴ糖が全泌乳期
1）

2

バンドウイルカ（Tursiops truncatus）の初乳は、神戸市に亘って存在することが知られている 。しかし、ウシなどの須磨水族館で1999年6月に出産した個体より分娩後2幾つかの哺乳動物種においては、泌乳初期の非常に短日目に得られた。その15 mLを常法に従い、4倍量のクロい期間に分泌される初乳に限定されて含まれるミルクオリロホルム/メタノール混液（2:1, v/v）で振とう抽出し、メタノー

ゴ糖は、その生物の初期成長に特別に必要な成分であル可溶性画分をBio Gel P-2によるゲルろ過、DEAE-ることが考えられる。ミルクオリゴ糖には、乳仔腸管内のSephadex A-50による陰イオン交換クロマトグラフィーでの脱有用細菌であるビフィズス菌に対する特異的増殖活性塩の後、TSK-gel Amido-80カラムによる順相高速液体ク（ビフィズス因子）、有害微生物の排除や毒素の中和作用

ロマトグラフィー（HPLC、移動相：50%および80%アセトニなどの感染防御活性（感染防御因子）などの機能が推定

トリル/15 mMリン酸緩衝液を用い、80%から50%までのアされているが、その存在意義を巡る全貌はいまだ解明さセトニトリルの直線濃度勾配溶出）によって各オリゴ糖を分れていない。

離・精製した。

ヒトや各種の哺乳動物のミルクオリゴ糖には、動物組織バンドウイルカ初乳より抽出した糖質画分のBio Gel P-2の上皮、内皮、神経などの細胞表層に存在するスフィンゴクロマトグラムを図1に示した。peak 1およびpeak2をあわ糖脂質に結合している糖鎖と化学構造的に同一のものがせた画分のDEAE-Sephadex A-50による陰イオン交換ク存在している。従来報告されてきたミルクオリゴ糖は、還ロマトグラフィーとBio Gel P-2によるゲルろ過によりTt1およTHE CHEMICAL TIMES 2006 No.3
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びTt2を得た。その後Amido-80によるHPLCによりTt1-4、また、化学シフト値δ1.927、δ2.657およびδ2.030には、Tt2-2、2-3、2-4を調製した。また、Tt3からはAmido-Neu5AcのH-3アクシャル、H-3エクアトリアルおよびN-アセチ80HPLC（移動相：50%および80%アセトニトリル/イオン交換

ル基に相当するシアル酸に特徴的な3つのシグナル群が認

水、80%から50%までのアセトニトリルの直線濃度勾配溶められた。しかし、H-3アクシャルシグナルは3'-SLの同位出）
によりTt3-8を単離精製することができた。

置の化学シフト値（δ1.800）
よりも著しく低磁場シフトし、一方H-3エクアトリアルシグナルは同オリゴ糖の化学シフト値（δ2.757）
よりも著しく高磁場（右側）シフトしていた。N-アセチル基由来のδ2.013の化学シフトは、シアル酸以外にN-アセチルヘキソサミン残基（HexNAc）の存在を示し、アノメリックプロトン領域のδ4.732のアノマーシグナルは、この残基がβ-配向性で隣接残基に結合していることを示していた。δ4.119の化学シフトは、置換によって通常よりも低磁場シフトしたシグナルと考えられるが、2.9 Hzの結合定数（ガラクトースのH-3、H-4間の結合定数に相当する）の値から、このシグナルはGalβ4残基のH-4残基に由来し、こ図1 バンドウイルカ初乳より抽出した糖質画分のゲルろ過溶出曲線
全糖質画分のゲルろ過は、以下の条件で行った。
充填剤：Bio Gel P-2 (Extra Fine)
カラム ：2.6 X 100 cm
移動層：蒸留水（流速は15 mL/h）
分画 ：5mL/本
検出 ：中性糖はフェノールー硫酸法（−）
シアル酸は過ヨウ素酸-レゾルシノール法（…◆…）の位置がβ-配向性のN-アセチルヘキソサミン残基によって置換を受けている可能性が示唆された。

3．1H-NMRおよび 1H-13C HSQCによるミル
クオリゴ糖Tt1-4の構造決定
HPLCによって分離されたミルクオリゴ糖：Tt1-4のプロトン（1H）-NMR解析により得られたスペクトラムを図2に示した。オリゴ糖還元末端のグルコース（D-Glc）のC-1に結合するα-およびβ-アノマープロトン（δ5.219,δ4.665）が観察された。また、N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）がラクトース単位に結合した酸性3糖である3'-シアリルラクトー
ス［Neu5Ac（α2-3）Gal（β1-4）Glc, 3'-SL］のGalβ4H-1アノマープロトンと同様のδ 4.529のシグナルが観察された。
またδ4.151のダブレットダブレットの特徴的なシグナルの存在は、3位が置換を受けたGalβ4残基のH-3シグナルに由来するものと考えられた。以上より、このミルクオリゴ

図2 バ ンドウイル カ 初 乳からの シアル 酸 を 含 む 酸 性ミル クオリゴ 糖：
Tt1-4のプロトン（1H）-核磁気共鳴スペクトル法（NMR）で得られたスペクト
ラムと主要シグナルの帰属
スペクトラムはD 2 Oを溶媒とし、内部標準物質にアセトンを使用した。
測定は、JEOL EPC-400 FT NMRスペクトロメーターを使用して、500MHzの磁場下、室温で実施した。

糖は置換を受けた3'-SLユニットを含んでいることが強く同オリゴ 糖の詳細な構造解析は、1 H- 13 C HSQCス示唆された。
しかしながら、Galβ4残基のH-3シグナルであるδ4.151のペクトルの解析により行った。ミルクオリゴ 糖：Tt1-4の化学シフト値は、3'-SLの同残基の化学シフト値（δ4.115）

1

H- 13 C HSQCスペクトラムを図３に示した。 13Cシグナ

よりもかなり低磁場（左側）にシフトしており、Galβ4の周辺ルの中でδ76.65はδ4.151の 1Hシグナルと相関しているの位置がさらに他の糖質により置換を受けている可能性をで、Galβ4残基のC-3に帰属された。これは3'-SLの同位示唆していた。

置の化学シフト値（δ78.15）
よりも若干高磁場側にシフトし

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3ている。δ79.82の 13Cシグナルはδ4.119の 1Hシグナルと相糖の3'-SL単位に帰属されないシグナル（δ177.49, 105.41,関しているので、Galβ4残基のC-4に帰属される。このシ77.36, 73.66, 70.40, 54.97および25.24）
も、遊離のβ-グナルは、3'-SLの同位置の化学シフト値（δ70.17）よりもGalNAcの13Cシグナルとの比較から帰属された。

大きく低磁場シフトしている。13C-NMRにおいて、置換をこの残基のC-3 ~ C-6の化学シフト値およびアセチル基受けた位置のシグナルは受けていない同位置のシグナル（CH3CO）の同値は、β-GalNAcの対応する化学シフト値よりも大きく低磁場シフトし、その隣接位置のシグナルはとよく一致している。δ105.41の化学シフト値はグリコシド未置換の糖の対応する位置のシグナルよりも若干高磁場結合のため、β-GalNAcのC-1（δ98.08）よりも低磁場シフシフトするというNMRの経験則がある。

トしているが、δ54.97の化学シフト値はβ-GalNAcのC-2（δ56.42）
よりもC-1位のグリコシド結合の影響により若干高磁場シフトしている。これらの考察から、このオリゴ糖のHexNAc残基はβ-結合したN-アセチルガラクトサミン（β-GalNAc）と決定された。もしこの残基がβ-GlcNAcであれば、C-2シグナルはGlcNAc（β1-6）Gal（β1-4）Glcのβ-GlcNAcの 13C-NMRで観察されたδ58.2011）に近い位置にあらわれることが予想されるからである。
表1以上のような1H-13C HSQCの解析により、同糖の完全図3 ミルクオリゴ糖：Tt1-4の1H-13C HSQCスペクトラム（a）アノマー領域における1H-13C-相関共鳴シグナル（b）δ3.0〜4.4の一次元 1H-NMRスペクトラム領域における1H-13C-相関共鳴シグナル

化学構造は、GalNAcが3'-SLのGal部位に結合した
GalNAc（β1-4）［Neu5Ac（α2-3）］Gal（β1-4）Glc（GM24糖）と決定された。またMALDI-TOF/MSによる質量分析
では、m/z 875.31のピークが検出され、これはM+K+イオ

以上の解釈により、このオリゴ糖のGalβ4残基の4位が4ンの質量値と良く一致していた。

β結合HexNAcで置換を受けていることが証明された。

これは、構造決定に1H-NMRならびに1H-13C HSQCのこのオリゴ糖に含まれる3'-SL単位の各シグナルは、3'-SLシグナル解析が見事に実施されたモデルケースと考えられの同位置のシグナルとの比較から表1のように帰属される。その他のミルクオリゴ糖のTt2-2、Tt2-3およびTt3-8は、た。ここでδ76.65の 13CシフトはGalβ4残基のC-5に帰属

標準糖との1H-NMRのシグナルパターンの一致から、それされるが、3'-SLの同位置のシグナル（δ77.84）
よりも若干

ぞれ3'-SL、 Neu5Ac（α2-6）Gal（β1-4）Glc（6'-SL）および高磁場シフトしており、ここでも置換位置の隣接位置につGal（α1-4）Gal（β1-4）Glc（グロボトリオース, Gb33糖）と同いての13C-NMRの経験則に当てはまっていた。同オリゴ定された。

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4．GM24糖および Gb33糖発見の意義

よって、ミルクオリゴ糖には種による多様性が予想以上に拡がっていることが再確認された。

構造決定されたオリゴ糖の中で、GM24糖とグロボトリ

これまでの著者らの一連の研究では、ヒツジ初乳中にオースはとくに注目される。GM 24糖と同一の構造をもつ

抗ウィルス活性の期待される3'-シアリルラクトースラクトンの糖鎖を結合したスフィンゴ糖脂質GM2は、ヒトやラットでは発見や5）、イヌ乳中に網膜や脳の発達に重要な無機硫酸

主に脳神経系に局在するGM1｛Gal（β1-3）GalNAc（β1-基の供与体としての硫酸化ラクトース（ラクトース-3'-O-硫4）［Neu5Ac（α2-3）］Gal（β1-4）Glc-Cer｝の合成中間産酸）の発見6）、ウマ初乳中の新規なN-アセチルラクトサミン物である。GM1やGM2は、ガングリオ系列の糖脂質としてα1-二リン酸8）の発見およびクマ乳中にヒトには見出され分類されている。同4糖が遊離のオリゴ糖として、哺乳動ないABH抗原構造を有するオリゴ糖群の発見などの例

物の乳中に発見されたのは本研究が初めてである。

を紹介した9）。さらに、著者らのミルクオリゴ糖研究に関し前述したように多くのミルクオリゴ糖は、ラクト-N-テトラオース（Gal（β1-3）GlcNAc（β1-3）Gal（β1-4）Glc）、ラクト-ては、原著論文を概説した総説があるので13）-23）、興味のある方はさらに参考にしていただきたい。

N-ネオテトラオース（Gal（β1-4）GlcNAc（β1-3）Gal（β1-4）

今後、さらに新たなミルクオリゴ糖の発見などにより、泌

Glc）、ラクト-N-ヘキサオース（Gal（β1-3）GlcNAc（β1-3）

乳初期に限って乳中に出現するミルクオリゴ糖の存在意［Gal（β1-4）GlcNAc（β1-6）］Gal（β1-4）Glc）
あるいは ラ義が次第に明らかにされてくることが期待される。

クト-N-ネオヘキサオース（Gal（β1-4）GlcNAc（β1-3）［Gal（β1-4）GlcNAc（β1-6）］Gal（β1-4）Glc）
をコア骨格として参考文献

1）

おり 、哺乳動物細胞表層に存在するラクト系列、ネオラクト系列のスフィンゴ糖脂質糖鎖と構造的に近い。ラクト系

1）齋藤忠夫, 浦島 匡, The Chemical Times, No. 154, 13-21（1994）.
2）齋藤忠夫, 浦島 匡, The Chemical Times, No. 165, 15-20（1997）.

列やネオラクト系列の糖脂質は、上皮系や内皮系の細胞

3）齋藤忠夫, 浦島 匡, The Chemical Times, No. 167, 3-9（1998）.

表層にあることから、一般的にはミルクオリゴ糖は上皮や

4）齋藤忠夫, 浦島 匡, The Chemical Times, No. 173, 2-8（1999）.

内皮の糖鎖合成系と同一の生合成系によって合成され

5）齋藤忠夫, 浦島 匡, The Chemical Times, No. 175, 3-8（2000）.

ると考えられる。それに対しガングリオ系列の糖脂質は6）齋藤忠夫, 浦島 匡, The Chemical Times, No. 176, 18-21（2000）.

神経系に多い。バンドウイルカの初乳にGM24糖が発見

7）齋藤忠夫, 浦島 匡, The Chemical Times, No. 177, 11-16（2000）.

されたことは、バンドウイルカのミルクオリゴ糖生合成系は、ラットやヒトにおける神経系の糖鎖合成系に類似していることが示唆される。すでに、クマのミルクオリゴ糖にはヒトのABO式血液型抗原に類似しているものが含まれることを示したが 9）、ミルクオリゴ糖は哺乳動物種により極めて固有の生合成系を反映することが再確認された。
また、グロボトリオースが遊離ミルクオリゴ糖として発見されたのも意義深い。これまで、ウシ、ヤギ、ヒツジ、クマ、ハナグマなどの広範囲な種にGal（α1-3）Gal（β1-4）Glc（イソグロボトリオース）は発見されているが2）,3）,4）,9）、グロボ

8）齋藤忠夫, 浦島 匡, The Chemical Times, No. 183, 20-24（2002）.
9）齋藤忠夫, 浦島 匡, The Chemical Times, No. 184, 2-6（2002）.
10）Uemura,Y., S. Asakuma, T. Nakamura, I. Arai, M. Taki, T.
Urashima, Biochim. Biophys. Acta, 1725, 290-297（2005）.
11）Urashima, T., W.A. Bubb, T. Saito, M. Messer, Y. Tsuji, Y.
Taneda., Carbohydr. Res., 262, 173-184（1994）.
12）Newburg, D.S., S. Ashkenazi, T.G. Cleary, J. Infect. Dis., 166,832-836（1992）.
13）浦島 匡, 齋藤忠夫, 化学と生物, 31, 80-82（1993）.
14）Messer, M., 浦島 匡, 化学と生物, 33, 816-824（1995）.
15）浦島 匡, 中村正, 齋藤忠夫, Milk Science, 46, 211-220（1997）.
16）齋藤忠夫, 浦島 匡, 化学と生物, 37, 401-403（1999）.

トリオースは見出されなかった。グロボトリオースを結合し17）浦島 匡, 齋藤忠夫, バイオサイエンスとインダストリー, 57, 619620（1999）.

たスフィンゴ糖脂質（Gb3）は上皮系細胞表層にあり、その

18）齋藤忠夫, 浦島 匡, 中村 正, 畜産の研究, 53, 1155-1160（1999）.

糖鎖部分は病原性大腸菌0-157H7の生産するベロ毒素19）齋藤忠夫, Milk Science, 48, 199-205（1999）.のレセプターである12）。バンドウイルカの初乳に遊離のグロ

20）齋藤忠夫, 浦島 匡, 中村 正,シープジャパン, 33, 11-13（2000）.

ボトリオースが発見されたことは、同毒素が乳仔腸管の上皮に付着するのを防ぐ可溶性レセプターアナログとして機能している可能性を示唆するものである。これらの発見に

21）齋藤忠夫, 浦島 匡, 化学と生物, 38, 447-451（2000）.
22）齋藤忠夫, 乳業技術（創立50周年記念号）, 50, 38-57（2000）.
23）浦島 匡, 齋藤忠夫, 中村
195-202（2000）.

正, 荒井威吉, Milk Science, 49,

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