フッ素資源の環境持続型循環系構築を目指して
Construction of sustainable recycling system for fluorine resources

─生体触媒を用いたフッ素化反応系の開発─
─ Development of bio-catalytic fluorination ─
東京工業大学・フロンティア創造共同研究センター

助教

岩井 伯隆

NORITAKA IWAI（Assistant Professor）
Tokyo Institute of Technology and Frontier Collaborative Research Center
東京工業大学・大学院生命理工学研究科 教授

北爪 智哉

TOMOYA KITAZUME（Professor）
Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology

1．はじめに化合物循環プロセスの構築を目指している。これまで、フッ素化合物について生物機能を利用して合成・分解す

近年、資源の（とりわけ石油の）枯渇化が現実問題視ることはほとんどなされなかったが、これにはフッ素の独特されるなかで、あらゆる化成品の持続可能な循環系によな性質が障壁となっていたからである。次の章では、フッる物質生産体制の重要性が提起されてきている。簡潔素という物質がもたらす特徴について紹介していこう。に言えば、ゴミとなるものを出さないシステムを作ろうということである。この取り組みは燃料などにも考え方が波2．フッ素及しており、バイオエタノールなどによる植物由来天然資源を利用した燃料生産などが車社会に浸透しつつあるのは、肌身でも感じられることである。

2フッ素は地球上（正確には地殻上）で13番目（クラーク数では、17番目）に多い原子であると言われており、このところで、我々の身の回りには実にたくさんのフッ素化

順位は他のハロゲン原子（塩素、臭素、ヨウ素）と比べて合物が用いられていることをご存知だろうか？フッ素と聞も塩素（クラーク数：11番目）の次に当たり、その量は塩素

くと、一般には歯磨き粉に含まれたり、テフロンなどフラの6分の1程度である1）。しかし、海水中に存在するフッ化イパンのコーティングに用いられていることぐらいしか思

物イオンの濃度は塩化物イオンに比べて1万分の1にも満いつかないかもしれないが、代替フロンなどの冷媒や樹たないし、有機化合物として天然に存在するフッ素化合物

脂、ゴム、塗料、光ファイバー、液晶、半導体、農薬、医はこれまでにたった13種類しか知られていない（図1）2）。

薬品、ガラスなどのコーティング剤として用いられるなどほとんどのフッ素は無機塩として岩石中に含まれており、表実に様々な分野で応用されている。そして、これらほとん舞台には出てこないのである。この理由は何か？ 答えは

ど全ての製品が石油を原料とした炭化水素系化合物とフッ素が水に溶けにくいことに由来する。フッ素の電気陰無機フッ素化合物を原料として有機化学的に製造されて性度は全元素中で最も高く、それゆえに強力な求核剤といるのである。

して振舞う。イオン状態であれば、カルシウムなどと強固にでは、フッ素化合物は環境に配慮された循環型のプロ結合し無機塩となってしまう。また、一方で水に溶けたフセスが構築されているだろうか？ 当然、これらを社会にッ化物イオンは強い溶媒和を引き起こすため、反応性の提供している企業は一定の環境配慮や安全性をクリアし低いイオンとなってしまう。

た上で製造していることは言うまでもないが、クリーンなこのような超安定的な性質は、常に代謝という形で物質循環型プロセスとして完成されたものか？と言えば、それを循環させている生物界においては厄介な性質であり、はまだ不十分な点も多い。

生物からはほとんど利用されずに今日まで来た。我々人類

このような背景から我々は、より安全かつ環境に配慮さは、このフッ素の超安定的性質を利用することで様々な有れたプロセスとして生物由来の酵素機能を利用したフッ素機フッ素化合物を開発し、耐熱性、耐酸性、撥水性など

THE CHEMICAL TIMES 2007 No.3
（通巻205号）

フッ素資源の環境持続型循環系構築を目指しての恩恵を受けてきたのである。しかし、最近になってフッ素間の問題であろう。

化合物のバイオテクノロジーへの展開が注目されつつある。

驚くべきは出発物質が S-アデノシル-L-メチオニン

フッ素化を行う微生物や、有機フッ素化合物を脱フッ素化（SAM）であったことにある。SAMは生体内においては3）する微生物の報告が出てきているのである 。特にここでメチル化の基質として供給され、ゲノムDNAのメチル化な注目したいのはフッ素化を行う酵素の発見である。次章でどに用いられる。DNAのメチル化反応は、生物が自己はフッ素とバイオテクノロジーというこれまでに融合できないと認識をする上で非常に重要な反応であるので、ほとんど思われてきた分野を結びつける大きな一歩として期待され全ての生物がSAMをメチル化の基質として用いているているフッ素化酵素、フルオリナーゼの紹介をしよう。

が、SAMが全く違う使われ方をした例は、恐らくこれが初めてであろう。フルオリナーゼは5'位の炭素をフッ素化することによって、アデノシンのフッ素化誘導体5'-FDA を生成する。この反応機構は、5'位の炭素を中心にして硫黄原子の背面からフッ化物イオンが求核的に攻撃するSN2型の反応であると考えられている。フッ化物イオンはこのとき水分子から脱溶媒和されていることが必要となり、非常に小さな結合ポケットにより、フッ化物イオンは脱溶媒和環境を提供されていることがフルオリナーゼタンパ

図1 天然化合物として見出されている有機フッ素化合物の代表例

ク質のX線結晶構造解析結果より示唆されている。
フルオリナーゼの大きな特徴の一つとして、このフッ化物イオンポケットの大きさが挙げられる。後に下流の引き込み

3．フルオリナーゼの発見

系を強化することで塩素化合物の反応も進行することが有機フッ素化合物が生体の代謝産物として発見された明らかとなったが、結晶構造からの情報では塩化物イオンのは、1940年代のことであるが、無機のフッ化物イオンかの入る大きさとしては不十分であると考えられていた。恐らら直接フッ素化されたものができるという酵素反応が捉え

く誘導適合などの酵素のフレキシビリティーにより塩素化も4）られたのは、つい最近の2004年のことである 。この事多少は可能なのであろうが、その本質がフッ素化にあるこ

実は衝撃的なものであり、これまでのハロゲン化合物の合とは間違いないだろう。いずれにせよ、初めてフッ化物イオ成機構とは全く異なる機構によるフッ素化反応が生体内ンから C-F結合を作ることができる酵素が明らかとなったので起こりうることが証明された。

である。

このフッ素化酵素、フルオリナーゼが見出された微生物
Streptomyces cattleya は、もともと無機のフッ化物イオンを培地に添加することで、モノフルオロ酢酸やモノフルオロトレオニンを生成することで知られていた細菌である5）。この細菌は抗生物質の生産など二次代謝能が豊富なことで知られている放線菌の一種で、フルオリナーゼと名づけられた酵素によってフッ化物イオンからC-F結合を作り、有機フッ素化合物である 5'-フルオロ-5'-デオキシアデノシン（5'-FDA）を作り出すことが明らかとなった（図2）。最終産物として報告されていたモノフルオロ酢酸やモノフルオロトレオニンからは、予想ができない化合物がフッ素化の出発物質であることが明らかとなり、その代謝経路には強い興味が持たれる。残念ながら、この代謝経路はいまだに全容がつかめていないが、明らかとなるのは時

図2 放線菌 S.cattleya 内でのフッ素化反応とフッ素化合物の代謝経路

THE CHEMICAL TIMES 2007 No.3
（通巻205号）

3

4．フルオリナ ーゼの応用と問題点

リナーゼ組換え系に試みた（図3）。GroE タンパク質の過剰発現系によるフルオリナーゼの可溶化は期待したほどのフルオリナーゼが、フッ化物イオンから有機フッ素化合物成果には至らず、不溶性画分から可溶性画分へのタンパを合成することで知られている唯一の生体触媒であるこク質量の大きな移行は認められなかった。しかし興味深いとを述べてきた。従って、この酵素が将来のフッ素化学とことに、その後精製したフルオリナーゼを用いて反応速度バイオテクノロジーを融合する上で、非常に重要な酵素で論的解析を行ったところ、GroE タンパク質の過剰発現系あることは言うまでもなく、当面はフルオリナーゼをどのようで発現させたフルオリナーゼの方が酵素の回転数においてに応用できるかが重要課題であると言えよう。しかし、こ4倍近くの向上が認められたのである7）。この原因ははっきの酵素には少々問題がある。既に酵素の反応速度論的りとは分かっていないが、組換え系のフルオリナーゼは精製定数については、フルオリナーゼの立体構造が明らかにを容易にするためにタンパク質の N 末端側にヒスチジンタされると同時に報告されたが、回転数や基質との親和性グが付加されていることなどから、翻訳後の自然なフォールはそれほど高いものではなく、酵素としての完成度は決しディングでは十分な酵素能力が発揮されず、シャペロン内でて高いとは言えないものであった。実際、我々の研究室

リフォールディングされることによって、より適切な状態へとタでも組換えのフルオリナーゼタンパク質を大腸菌内で発現ンパク質の立体構造が誘導されているのではないかと推測して、精製した後、反応速度論的解析を行ったが、そのしている。詳細な機構は今後の解析が待たれるが、いず反応性は非常に低いものであった。

れにせよシャペロンタンパク質を過剰発現させることにより、そこで、将来的に応用する事を目指した上で、組換えフルオリナーゼ組換え系の反応効率を上げることができた。

系のフルオリナーゼタンパク質の効率を上げる方法が必要であると思われた。また、試験管内での酵素反応は基質の用意や、場合によっては酵素の精製などが必要となり、必ずしも効率的とは言えない。組換え宿主内でフッ素化合物の生成が効率良く行えれば、発酵という形で生産が可能となり、生産性の向上も高く望める。次章からは、組換え系フルオリナーゼタンパク質を応用するための工夫として進めてきたアイデアを紹介しよう。

5．シャペロンタンパク質の導入による高効率化

図3 GroE（GroEL/GroES）
タンパク質によるフルオリナーゼの再生サイクル（フルオリナーゼは六量体を形成してフッ素化を行う。
）

生体の中にはシャペロンといわれるタンパク質が存在し、熱やその他のストレスにより変性・失活したタンパク質を再6．基質供給系の強化生する機構が備わっている。大腸菌においては GroE（GroEL/ES）（Hsp60/Hsp10 ファミリー）、DnaK/DnaJ

次に我々が改善策として注目したのは、基質の供給系（Hsp70/Hsp40 ファミリー）、HtpG（Hsp90 ファミリー）が主である。フルオリナーゼが基質とする化合物は、フッ化物

要シャペロンタンパク質として知られており、その中でもイオンと SAM である。SAM は前述の通り、生体内でのGroE タンパク質は生存に必須な唯一のシャペロンタンパクメチル化の基質として用いられるため、ほとんど全ての生質である。外来のタンパク質を発現させると、タンパク質が物の中で合成される化合物である。しかし、フルオリナー不溶性画分や封入体を形成してしまうことが多く、そのようゼ用の基質として充分に供給されているわけではない。

な場合に GroE タンパク質を強制的に過剰発現すること試験管内でフルオリナーゼ反応を行うには、大過剰の

6）で、問題を解決できることが知られている 。

4

SAM を加えて反応する必要がある。SAM が構造上不そこで我々は、この外来タンパク質の効率的発現に有安定な物質であることに加えて、高価な化合物であること効な手段として知られているGroEタンパク質の導入をフルオを考えると、SAM 合成酵素の共発現が迅速かつ安定的

THE CHEMICAL TIMES 2007 No.3
（通巻205号）

フッ素資源の環境持続型循環系構築を目指してな基質供給を可能にしてくれることが期待された（図4）。

なるフルオリナーゼの N 末端ドメインと C 末端ドメインによっこの基質供給系の共発現による試験管内フルオリナーゼて挟まれる形で構成されており、N 末端ドメイン側のアミノ反応の促進は、残念ながら現在のところ上手くいっていな酸残基によって形成されるフッ化物イオンポケットにフッ化物い。恐らくSAM 合成酵素の不安定性によるものと思われてイオンは収まる。一番コンタクトをとると考えられるのは 158

いるが、幸運なことに生細胞内でのフルオリナーゼ反応の番目のセリンであるが、脱溶媒和環境を形成するために促進にはつながった。すなわち、これまではフルオリナーゼは 、156 番目のフェニルアラニンも重要であると推測される。

組換え大腸菌の培養液にフッ化物イオンのみを添加しても、また、SAM のリボース環と水素結合を介すると思われる生成物であるフッ素化合物（5'-FDA）は検出できなかったが、16 番目のアスパラギン酸も、158 番目のセリン残基であるSAM 合成酵素の共発現によって充分検出が可能な量のヒドロキシル基の方向を規定すると思われ、これらのアミノ生成が可能となったのである。将来的には、試験管内反酸の変換がフッ化物イオンに対する親和性に大きく変化を応の促進にもつなげたいと考えているが、培地にフッ化物イもたらすことが容易に推測できる。現在我々の研究室でオンを添加するだけで、後は培養するのみで 5'-FDA の生は、この推測に従って研究を進めている。

成が可能となったことは、発酵法による有機フッ素化合物の生成を目指す上で非常に画期的な成果である。

酵素が長い年月を掛けて進化してきた賜物であることを考えれば、アミノ酸一置換がもたらす影響は基本的に向上ではなく減衰である。しかし、フッ素化酵素がまだ世の中に多く存在しないものであることを考えると、複数のアミノ酸置換などが面白い効果をもたらす余地があるのではないかと思う。我々もまだ見ぬ完成度の高いフッ化物イオ
ンポケット構造を期待しながら、フルオリナーゼの変異体を設計し、進化型フルオリナーゼの構築を試みている8）。

図4 効率的で安定な基質SAMの供給

7．フルオリナーゼの改変
近年、様々な手法を用いて元となるタンパク質のアミノ酸を変えたり、幾つかの相同的タンパク質配列をシャッフリングすることで、基質特異性を変化させたり反応性を上げる試みがなされてきている。進化工学などとも言われている手法である。フルオリナーゼは SAM に対しては結合定数74μM という高い親和性を示すが、フッ化物イオンに対しては 2 mM と30倍近く、親和性が低い。我々はフルオリナー
ゼの完成度が低い原因（反応性の悪さ）はそこにあるので図5 X線結晶構造解析より明らかとなったフルオリナーゼの基質結合ポケット（フッ化物イオンポケットを形成する3残基を四角で囲った。
）はないかと考えており、フッ化物イオンに対する親和性の向上が、反応の本質的な改善につながるものと考えている。

8．下流代謝経路の魅力

では、どこをどう改善すれば良いのだろうか？この答えは一朝一夕で導けるほど単純なものではないだろう。しかし、フルオリナーゼが発見されてからしばらく、その後の反応タンパク質の立体構造情報が明らかとなり、フッ化物イオン経路は謎に包まれていたが、2006年にフルオリナーゼをコーポケットを構成しているアミノ酸残基はほぼ明らかである（図ドするflA付近の遺伝子が調べられ、次の反応にかかわ5）。図5に示すように、フルオリナーゼの反応場は互いに異（図6）。flB と名づけられたこの遺る酵素が報告された9）THE CHEMICAL TIMES 2007 No.3
（通巻205号）

5

伝子の産物は、5'-FDA を脱アデニン化しリン酸化するヌク

9．最後にレオチドホスファターゼの一種であり、5-フルオロ-3-デオキシ1-リン酸リボース（5-FDRP）
を生成する。興味深いことは、以上で、フッ素化酵素（フルオリナーゼ）の概説と我々

flAを挟んで前後に12 kb（ 11 ORF ）も、フッ素化合物代謝の研究室での応用化への試みを簡単に紹介してきたが、関連遺伝子候補が見つかったにもかかわらず、flB以降の最後にフッ素化学とバイオテクノロジーの今後について述代謝関連遺伝子は一つも見つからなかったことである。フ

べてみたい。

ルオロクラスターと名づけられたこの一連の遺伝子群に含冒頭でも述べたことであるが、フルオリナーゼはフッ素のまれていたものは、フッ素化合物に対する耐性を獲得するバイオテクノロジーを切り開いていく上での第一歩である。

上で重要となったであろうフルオロアセチル-CoA 分解酵素

数少ないとは言え、有機フッ素化合物を利用している生物や、フルオリナーゼ反応の阻害剤となる S-アデノシル-L-ホモは少なからず存在し、これらの生物のほとんどがフッ化物

システイン（SAH）の分解酵素（SAH は SAM の脱メチル化イオンをその原料としているであろう。従って、様々なアイデ合物であり、生体内では容易に生じる）だけで、他にORFアを用いて、より巧妙なスクリーニング系を構築する事で第として見出されたものは輸送系タンパク質やDNA結合タン二、第三のフッ素化酵素も見つかってくるにちがいない。フパク質（転写因子候補）のみであった。恐らく、S. cattleya

ルオリナーゼがこれまでに報告されてきたどのタンパク質とのゲノム上にまだ他のフルオロクラスターが存在し、最終産も類似していなかった（相同性が低かった）ことを考えると、物であるモノフルオロ酢酸やモノフルオロトレオニンまでつな新しいフッ素化酵素がまだまだ地球上には存在していてもがる遺伝子がまとまっているのではないかと期待される。

不思議ではないのである。このようなフッ素をとりまく生物情flBからの下流反応を効率よくスクリーニングする系が構築できれば、第二のクラスター発見につながるのではない報が蓄積されていくことで、フッ素が生体触媒にとって不可能な材料ではない日が訪れることを強く期待している。

かと考えており、我々もスクリーニング系の構築を目指して同時に、我々は作り出したものを元へ戻すことも考えないる。下流代謝経路はフッ素化反応には直接関わらないければならない時代に来ている。有機化学的に、また生反応だが、有機フッ素化合物耐性メカニズムや、有機フッ物化学的に作り出された有機フッ素化合物を再度フッ化物素化合物代謝機構を考える上で非常に重要なヒントを与イオンへと戻すシステムを生物機能により構築することも、えてくれるであろう。これまでにリパーゼのような生体触媒が重要な命題となるであろう。既に、有機フッ素化合物を分フッ素化合物を基質とすることが可能であることが示されて解し、脱フッ素化する微生物の報告があることは最初に述きたが、これらは生体にとって本質的なものではなく、フッ素べた通りである。フッ素資源が生物機能のみで循環できる化合物を生体触媒により利用するための核心的な情報にシステムが構築される日も夢ではないだろう。

はつながりにくい。今後、生体触媒を用いたフッ素化合物循環プロセスの構築を目指す上で、フッ素化合物を本質的に扱う酵素の情報収集は非常に重要であり、フッ素のバイオテクノロジーの発展には欠かせない情報となるであろう。

図6 下流代謝経路

6THE CHEMICAL TIMES 2007 No.3
（通巻205号）

参考文献
1）E.A. Paul, P.M. Huang, Handbook of Environmental
Chemistry, 1980, 1, 69
2）D. O'Hagan, D.B. Harper, J. Fluorine Chem., 1999, 100, 1273）R. Natarajan, R. Azerad, B. Badet, E. Copin, J. FluorineChem., 2005, 126, 4254）C. Dong, F. Huang, H. Deng, C. Schaffrath, J.B. Spencer, D.
O'Hagan, J.H. Naismith, Nature, 2004, 427, 561
5）M. Sanada, T. Miyano, S. Iwadera, J.M. Williamson, B.H.
Arison, J.L. Smith, A.W. Douglas, J.M. Liesch, E. Inamine, J.
Antibiotics, 1986, 39, 259
6）J.G. Thomas, A. Ayling, F. Baneyx, Appl. Biochem.
Biotechnol, 1997, 66, 197
7）N. Iwai, T. Akashi, S. Nakajima, T. Kitazume, To be submitted.
8）中島 聡, 松下 知宏, 岩井 伯隆, 北爪 智哉, 第30回フッ素化学
討論会, 2006.
9）F. Huang, S.F. Haydock, D. Spiteller, T. Mironenko, T-L. Li, D.
O'Hagan, P.F. Leadlay, J.B. Spencer, Chem. & Biol., 2006, 13, 475