市販のキットに含まれる STR ローカスの悪性腫瘍組織における変異

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吉本高士

医学系技術支援室 第一医学系形態構造解析班 第二技術

概要
多色蛍光標識プライマーを用いた市販の STR (short tandem repeat) 型判定用マルチプレックスキットが親子鑑定や個人識別に汎用されている。擬父や同胞等が既に死亡している場合、生前医療時に使われた検査試料が親子や血縁関係を調べる鑑定資料として利用することも少なくない。そのような場合、血液型判定用紙に付着している血痕の他に、肝生検などのパラフィン包埋の組織標本が利用されることもあるが、その組織が腫瘍細胞であることも多い。また、血縁関係を調べるばかりではなく、その組織標本が故人に由来するものかどうかの同定を必要とされる場合もある。さらに、腫瘍細胞での STR の不安定性についてはよく知られており、腫瘍細胞マーカーとして利用されているものもある。
本研究では、汎用されている市販のキットに含まれるローカスなど常染色体上の 25 STR ローカス及びＹ染色体上の 14 STR ローカスにおける突然変異の頻度及び動態について、正常組織と腫瘍組織を用いて比較検討した。

1.材料および方法
癌により死亡した患者 11 例から病理解剖時に採取した正常組織及び腫瘍組織 0.04ｇから QIAmp DNA Mini
キットにより DNA を抽出した。2 ng の抽出 DNA を鋳型として、市販の AmpFlSTR Identifiler キット及び Y-PLEXTM
6 キット並びに当講座で作製した３種類のマルチプレックスシステム（FL-6、Quaduraplex、Y-10plex）を用いて PCR 増幅した。各増幅産物を Genetic Analyzer310 を用いて解析し、Genotyper ソフトにより、常染色体 STR 計 25 ローカス、Y 染色体 STR 計 14 ローカス及び性別判定用であるアメロゲニンローカスを型判定した。その型判定結果を Genotyper plot パターン及びピーク高で、正常組織と腫瘍組織で比較した。変異と考えられるアレルが観察された試料を既報のプライマーセットにより増幅し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動・銀染色でアレルを分離した。各アレルを再増幅したものについて Big Dye terminater V.3 を用いて塩基配列決定を行い、どのような変異が生じているかを観察した。

2.結果と考察
表１に示すように、11 例中５例の腫瘍細胞で、アレル数が増加する変異が、FGA ローカスで２例、D7S820、D13S317、D8S1179、CSF1PO、D7S809 及び D14S299 で各１例において観察された。そのうち、アレルが大きくなったと考えられるものは４ローカス、小さくなったと考えられるものは４ローカスであった。これらのアレルについて、塩基配列を調べたところ、その変異は全てリピート数の増減であり、塩基置換やフランキング領域における欠失・挿入は見られなかった。一例として D8S1179 ローカスにおける Genotyper plotのパターンと塩基配列決定したリピート部位のエレクトロフェログラムを図１に示す。このアレル数の増加する変異の発生率は、調べられた常染色体 275 ローカス中で８ローカスであったので、約 2.9％と算出された。また、このアレル数の増減を示す変異は全て常染色体 STR で観察され、Y 染色体上の STR には、全く観察されなかった。このことは、調べられたローカス数が Y 染色体 STR では約半分と少ないものの、染色体の大きさや２倍体ではないことと何だかの関係があるかもしれないことが考えられた。
その他の変異として、正常組織の常染色体 STR でヘテロ接合体と型判定されたローカスにおいて、Genotyper plot 上で、不均衡なピーク高が半数以上のローカスで観察された。このうち、２つのピーク高比が 0.5 以下のものは、STR で 35 ローカス、アメロゲニンローカスで１例観察された（表１参照。各マルチプ
レックスシステムの 1 例を図 2〜3 に示す。
）。また、ピーク高比が 0.1 以下と極端に不均衡なものも５ローカスみられた。これらの中には Genotyper で自動型判定する際に、ヘテロ接合体と判定されないものもあった。
調べられた常染色体 25STR ローカスでヘテロ接合体が 207 観察されたので、その発生率は約 17％、平均ピー
ク高比は 0.268±0.145 であった。従って、本研究により、腫瘍組織の DNA 試料から STR 型判定する際には、アレル数の増加ばかりでなく、ピーク高の極端な不均衡による誤判定にも特に注意する必要があることが示唆された。

Genotyper plot

Allelic ladder

Normal
図２．事例３の D8S1179 ローカスにおける変異Cancer

Electropherogram at the repeat region (YAGA)n

Normal (YAGA)16

Cancer (YAGA)17

図１．事例３の D8S1179 ローカスにおける変異

図３．事例３の D8S1179 ローカスにおける変異表１．本研究で観察された腫瘍組織における異常のまとめ

No.

性別年齢

死因

臓器腫瘍

正常

1

M

47

肺癌

肝臓

血液2M

59

食 道食道癌

3M

102

胃癌

胃4M62

胆 管肝臓癌

アレルの増減ローカス 正常型

変異型

胃D8S1179
D7S820
D13S317

14-16
9-1211-12

14-16-17
9-10-12
11-12-13

肝臓FGA

25-26

18-25-26

大動脈5M74

肝癌

肝臓腎臓

6M56

腎臓

7Ｆ47

肺癌
肺肝 門
肝臓癌

腎臓8M49舌癌

皮膚肝臓9F53

大 腸肝臓癌

肝臓1011ＦM

78

80

Identifiler
FL6
Quaduraplex

不均衡アレル
ローカス ピーク高比
D21S110.0476
CFS1PO0.0856
D18S510.3989
D6S1056
0.0631
D4S26390.4558肝 門
肝臓部 胆 肝臓管癌膵臓膵癌
肝 臓 膵臓(転移)D7S809

29-29

28-29

CFS1POD14S299

11-1230-33

10-11-1230-33-34

FGA

24-25

23-24-25

D16S539vWA
D15S233
D6S1056
D17S1290

0.34820.12060.40400.47390.3277

D21S11
D3S1358
D19S433
D16S539
D18S51
FGA
D20S480
D4S26390.11060.14480.18650.18300.44970.16360.35260.0458

D18S51AMEL
D7S809
D20S480
D9S1118
D4S2639
D21S11
D13S317
D18S51
D5S818
D6S2439
D6S1056
D17S1290
D8S1179

0.26380.38620.36050.34890.26640.36410.16050.19450.10490.04410.47420.35500.10930.2246

CFS1PO0.3980

D6S1056
D9S1118
D17S1290

0.29390.4891
0.4611

参考文献
１）Chung-Yen Pai, Ling-Ling Hsieh, Chun-Wei Tsai, Fu-Shyan Chiou, Chiou-Herr Yang,.: Allelic alterations at the STR
markers in the buccal tissue cell of oral cancer patients and the oral epithelial cell of healthy betel quid-chewers: anevaluation of forensic applicability . F Sci Int, 129: 158-167, 2002.