液体クロマトグラフィーの基礎技術（2）Fundamental Techniques of Liquid Chromatography─順相（吸着）クロマトグラフィーについて── About the Normal Phase (Adsorption) Chromatography ─
関東化学株式会社 草加工場 生産技術部

酒井 芳博

YOSHIHIRO SAKAI
Production Technique Dept, Soka Factory, Kanto Chemical Co., Inc.

1．はじめに

５）試料が非極性溶媒に溶ける（極性溶媒に溶けない）
場合。

これまで逆 相クロマトグラフィー（ Reversed Phase

また、最近水系溶離液を使用するNPCが、親水性相

Chromatography：RPC）の基礎技術について説明してきた互 作 用クロマトグラフィー（ Hydrophilic Interaction

が 、今 回 は 順 相クロマトグラフィー（ Normal Phase

１,2）
Chromatography：HILIC）
として注目を浴びているように、Chromatography：NPC）の基礎技術について解説する。

NPCの新たな展開が期待されている。その理由として、以1906年にM.S.Tswettが発表したクロマトグラフィーは、炭下のことが言われている。

酸カルシウムを固定相に、ジエチルエーテルを移動相に使

１）逆相系充填剤ODSの限界が見えてきたこと。

用して葉緑素を分離した実験であったが、これが液体クロ

２）高純度シリカゲルが登場したこと。

マトグラフィーの始まりであり、NPCそのものである。

３）LC／MSに最適な系であること。

以来、約100年を経過し、液体クロマトグラフィーはHPLC

NPCはクロマトグラフィーの原点でもあり、この技術を見直として目覚しい発展を遂げているが、この発展を続けていすことで、液体クロマトグラフィーをより深く理解できるものとるHPLCの技術の中で、最初に登場したNPCは、現在RPC考えている。にその主役の座を奪われている。

本稿では、NPCの中で最も多く使用されている固定相吸着クロマトグラフィーとも呼ばれているNPCは、「シリカ（または充填剤）であるシリカゲルを中心に話しを進めるが、ゲルやアルミナ等の極性の高い固定相を使用し、ヘキサン使用する溶離液により、結果が大きく変わることがあるため、等の極性の低い移動相を使用する」最も古典的な液体ク溶離液についても併せて説明する。

ロマトグラフィーの手法である。
これを試料の溶出の面から見ると、「疎水性の高い試

2．順相クロマトグラフィー用充填剤の種類と特徴料の溶出は早く、親水性の化合物の溶出は遅れる」
ことになり、RPCとは、全く逆の溶出挙動を示すこともよく知られている。
このような特徴を有しているNPCを使用することで良い結果が得られる場合を次に示す。

使用されているが、古来、NPCの固定相には、炭酸カルシウム、アルミナ、活性炭等が使用されていたことはよく知られている。

１）試料の親水性が高くRPCでは保持されない場合。

最近では化学修飾タイプのアミノプロピルシリカゲル充填

２）試料の疎水性が高くRPCでは保持が強すぎる場合。

剤（通称NH2シリカゲル）、シアノプロピルシリカゲル充填剤

３）RPCにおいて十分な分離が得られない場合。

（通称CNシリカゲル）、1,2-ジヒドロキシ-3-プロポキシプロピ

４）試料に位置異性体、立体異性体、ジアステレオマー

ルシリカゲル（通称ジオールシリカゲル）等の充填剤も使用が含まれている場合。

20

NPCに使用される固定相として、シリカゲルが最も多く

THE CHEMICAL TIMES 2008 No.4（通巻210号）されている。

液体クロマトグラフィーの基礎技術（2）それぞれの充填剤の特徴は以下に示すとおりである。

溶出しているが、旧タイプのシリカゲル（金属不純物の含有

１） NH2シリカゲル充填剤は、吸着・分配モードで使用量が多く酸性を示すシリカゲル）では、全く溶出しないことされることが多く、順相固定相として糖の分離に、が示されている。この結果から、シリカゲルを高純度化す

弱イオン交換体としてヌクレオチドの分離に使用さると、配位性が強いといわれている化合物であるカテキンれている。

類の溶出が改善されることが判明した。

２） CNシリカゲル充填剤は、使用する溶離液により順相吸着と逆相分配のモードが使い分けできる。主

この様に、高純度シリカゲル充填剤の用途が大きく広がる可能性が出てきた。にステロイド等の分離に使用されているが、アルキル鎖の異なる第四級アンモニウム塩の分離にも威3．順相クロマトグラフィーの長所と短所力を発揮している。
３）ジオールシリカゲル充填剤もCNシリカゲル充填剤と同様、使用する溶離液により順相吸着と逆相分配のモードが使い分けできる。また、サイズ排除

NPCの長所と短所を表1に示したが、この表の例は、ごく一般的な特徴を記したものである。
表1 順相クロマトグラフィーの長所と短所クロマトグラフィー用の固定相としても使用できることが特徴である。主に、ステロイド、ペプチドの分離に適している。
一方、シリカゲルを原料としたHPLC用充填剤は、高純度シリカゲル（純度99.99％以上）が使用されるようになった

長 所

短 所

①非極性有機溶媒を使用すると、カラムの寿命が長い。

①イオン性化合物は、逆相クロマトグラ
フィーより分離しにくい。

②大量分取用として使用できる。

②溶離液の水分量等により溶出が変化しやすい（コントロールが難しい）。

・充填剤が比較的安価。
・多くの化合物が溶離液の有機溶媒に溶ける。

が、この高純度シリカゲルをNPCに使用すると、良好な結③カラム圧力が低い。

果を得ることがある。その一例を図１に示す。

・粘性の低い溶媒が多く使用される。

③グラジエントが困難。
④順相のカラムの理論段数は、逆相カラムに比べ低い。

・水溶液で分解する試料には有用。

1

また、NPCは極性の高い固定相と極性の低い有機溶媒を移動相に使用することは既に説明したが、その溶離における特徴として、

2①

溶出時間はシリカゲルの比表面積に依存する。

②

官能基（極性基）の数が分離に反映しやすい。

③

分子構造の違いが分離に反映しやすい。

等があげられるが、これらの具体的な例は、第５項で説明する。
a）b）

4．順相（吸着）クロマトグラフィーの分離機構
図1 高純度シリカゲル充填剤と旧来のシリカゲル充填剤の 溶離特性の比較
溶離条件カラム：ａ）Mightysil Si-60（5μm）4.6mmφ×150mmｂ）旧タイプ Si-60(5μｍ) 4mmφ-125mm
溶離液：n-へキサン/酢酸エチル＝37/63
流速：１mL/min.
カラム温度：40℃
検出：UV280nm、0.04AUFS
試料：1：カテキン（１μg）
、2：エピガロカテキン（４μg）

NPCは、古典的な呼び方では、液−固（Liquid-Solid）
クロマトグラフィーである。NPCの分離機構の例として、シリカゲルを固定相にし、アセトフェノンを溶質とした場合の分離モデルを図2に示す。クロマトグラフィーの分離は、移動相中の溶質分子と固定相表面（比表面積、細孔径）との図1は、カテキン類（カテキン、エピガロカテキン）溶出の相互作用によるものであるが、このモデルの場合、溶質でクロマトグラムを示したものであり、高純度シリカゲルを使用あるアセトフェノンは移動相の酢酸エチルとシリカゲル表面

しているMightysil Si-60(5μm)では、良好なピーク形状でへの吸着を競合することで分離が展開される。

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21

エステル類のクロマトグラムを測定した結果を示した。
この結果をみると、比表面積が小さくなるにしたがって、N-ヘキサンフタル酸エステル類の溶出が早くなっていることが示されてアセトフェノン

酢酸エチル

いる。すなわち、比表面積が大きいほどシリカゲル表面と例 溶質：アセトフェノン
移動相溶媒：ｎ-ヘキサン／酢酸エチル
アセトフェノンと酢酸エチルが吸着を競合する。

試料の相互作用が強く、保持時間が長くなり、比表面積が小さくなるとシリカゲル表面と試料の相互作用が弱くなり、保持時間が短くなることが示されている。この様に、シリカゲルカラムを使用するNPCの保持時間は、シリカゲル

図2 シリカゲル表面における分離モデルの比表面積に大きく依存していることがわかる。
5．順相クロマトグラフィーの溶出挙動の特徴

5.2

官能基数の分離への影響

官能基の数が分離に反映する例として、ステロイドホル5.1

溶出時間はシリカゲルの比表面積に依存する

モン（プロゲステロン、テストステロン、ヒドロコルチゾン）のク

シリカゲルを固定相に使用したNPCにおける試料の溶

ロマトグラムを図4ａ）に示すが、NPCの場合は、極性基が出時間は、シリカゲルの比表面積、言い換えるとシラノール最も少ないプロゲステロンから溶出し、極性の高い（極性基の数に依存する。

官能基の数が多い）
ヒドロコルチゾンはシラノールと相互作

シリカゲル表面のシラノール基の構造については、本誌
３）の液体クロマトグラフィーの基礎技術（１） で説明したように、普通3種類のシラノール基が存在している。
シリカゲルの比表面積は、シラノール基の数により決定されるが、比表面積が大きい場合は、シラノール基が多く存用が強く最も遅れて溶出する。
NPCのもう一つの特徴として、既に説明したRPCと比較
すると、溶出順序が逆になるが、その実例を図4ｂ）に示す。
RPCでは、極性の高いヒドロコルチゾンが最初に溶出し、テストステロン、プロゲステロンの順に溶出する。

在することになり、試料の保持も強くなる。また、シリカゲルの比表面積は、シリカゲルの平均細孔経の大きさにも依存し、平均細孔経が小さくなると比表面積は大きくなる。

1：プロゲステロン

2：テストステロン

132a）b）c）

231

図3 シリカゲルの比表面積の違いによるフタル酸エステル類の溶出時間の変化
溶離条件
カラム：4.6mmφ×150mm
充填剤：ａ）Si-60（5μm）
、ｂ）Si-120（5μm）
、ｃ）Si-200（5μm）
溶離液：n-ヘプタン/イソプロピルアルコール＝99/1
流速：1mL/min.
カラム温度：40℃
検出：UV254nm、0.64AUFS
試料：フタル酸ジ-2-エチルヘキシル、フタル酸ジ-n-ブチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジメチル（溶出順）

図３に比表面積の異なる3種類のシリカゲル（Si-60：平均細孔経6nm、比表面積：530m 2/g、Si-120：平均細孔経12nm、比表面積：360m2/g、Si-200：平均細孔経20nm、比表面積：200m 2/g）を充填したカラムを使用し、フタル酸

22THE CHEMICAL TIMES 2008 No.4（通巻210号）a）

3：ヒドロコルチゾンb）

図4 ステロイドホルモンのNPCとRPC
溶離条件
カラム：ａ）Mightysil Si-60（5μm）4.6mmφ×150mmｂ）Mightysil RP-18GP（5μm）4.6mmφ×150mm
溶離液：ａ）n-へキサン/ジエチルエーテル/2-プロパノール＝5/4/1ｂ）アセトニトリル/水＝50/50
流速：1mL/min.
カラム温度：40℃
検出：UV240nm, 0.16AUFS
試料：１：プロゲステロン、
２：テストステロン、
３：ヒドロコルチゾン

液体クロマトグラフィーの基礎技術（2）5.3

分子構造の分離への影響

6．順相クロマトグラフィーにおける注意点

分子構造の違いが分離に影響する例として、シリカゲル
カラムによるスチレンのポリマー（ダイマー、トリマー）のクロ6.1

溶媒の選択マトグラムを、ODSによるクロマトグラフとともに図5に示す。

NPCの溶離液には、非極性溶媒が多用されていること

NPCの場合、図5ａ）のクロマトグラムに示されるように、１．

は既に説明したが、特にこれら非極性溶媒を溶離液としモノマー、２．ダイマー、３．環状トリマー、４．鎖状トリマーて使用して炭化水素類を分離する場合、クロロホルムをの順に溶出されており、分子構造の違いが分離にはっきり添加し溶出時間を調整することが良く行われる。この場現れている。

合、使用するクロロホルムの純度（安定剤の種類）を考慮

これに対して、RPCの場合は、図5ｂ）のクロマトグラムする必要がある。その理由は、クロロホルムには安定剤に示されるように、１．モノマー、２．ダイマー、そして３．トとして、エタノールを添加した試薬（主に試薬特級グレード）

リマー（環状と鎖状の混合ピーク）の順に溶出している。

及び不飽和炭化水素を添加した試薬（HPLCグレード）がトリマーは環状と鎖状が接近して溶出しており、構造の違存在しており、その影響が無視できないからである。

いによる分離はされていない。
この結果を比較すると、分析を考慮した場合は、逆相クロマトグラフィーのほうが分離の状況は良好であるが、分取を考慮した場合は、環状及び鎖状トリマーがはっきり分離されることから、NPCのほうが都合の良い分離を示していることになる。
この様に、クロマトグラフィーを行なう目的にもよるが、シa）

リカゲルカラムを使用したNPCは、興味ある溶出特性を示すことを考慮すると応用範囲が広がるものと考える。
1231423b）
図6 溶媒中の安定剤の違いが順相クロマトグラフィーに与える影響４）a）b）

図5 吸着と逆相クロマトグラフィーによるスチレンポリマーの溶出状況の比較

a）

b）

溶離条件
カラム：Mightysil Si-60（5μm）
4.6mmφ-150mm
溶離液：n-へキサン
流速：1mL/min.
温度：40℃
検出：254nm
試料：スチレンペレット抽出液
20倍濃縮品
1:モノマー
2:ダイマー
3:トリマー（環状）4:トリマー（鎖状）
注入量：20μL

溶離条件
カラム：Mightysil RP-18GP（5μm）
4.6mmφ-150mm
溶離液：A アセトニトリル/水＝60/40
B アセトニトリル＝100
グラジエント：
0 min. A 100%→13min. B100%
温度：40℃
流速：1mL/min
検出：254nm
試料：スチレンペレット抽出液20倍濃縮品
1:モノマー
2:ダイマー
3:トリマー（環状）、（鎖状）
注入量：20μLa）
溶離条件
カラム： LiChroCART 250×φ4mm
LiChrospher Si60（5μm）
溶離液： n-ヘプタン／HLC-SOL クロロホルム＝4／1
流速： 1.0mL/min
圧力： 60kg/cm2
温度： 室温検出： UV254nm
試料： ビフェニル、テニフェル、クアテルフェニル、キンクエフェニルb）
溶離条件
カラム： LiChroCART 250×φ4mm
LiChrospher Si60（5μm）
溶離液： n-ヘプタン／特級 クロロホルム＝4／1
流速： 1.0mL/min
圧力： 60kg/cm2
温度： 室温検出： UV254nm
試料： ビフェニル、テニフェル、クアテルフェニル、キンクエフェニル

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図6は、シリカゲルカラム（Si-60）で芳香族炭化水素類を分離する際、HPLCグレードのクロロホルムと特級グレーが初期理論段数5,500/カラムに再生すると共に、試料の保持時間も初期値に復活したことが報告されている。

ドのクロロホルムを溶離液に使用した場合の影響を示したものである。図6ａ）は、HPLCグレードのクロロホルムを7．親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）使用した例であるが、繰り返し分析を行なっても、芳香族炭化水素類の溶出時間にほとんど変化は見られず、良好

親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）の概念は、な分離を維持している。これに対して、特級グレードのク

1990年にJ.Alpert１）が提唱したが、極性の高い固定相にロロホルムを使用した場合、図6ｂ）に示すように芳香族炭極性の高い溶媒を移動相に使用するNPCの一種である。

化水素類の溶出時間は、回を重ねるごとに速くなり、分

しかしながら、
このHILICモードによるクロマトグラフィーは、析を10回繰り返すと、分離が不能となった。

既に1990年以前から使用されていた方法であり、代表的

これは、特級グレードのクロロホルムにエタノールが安なものとして、アミノプロピルシリカゲル（NH2シリカゲル）カ定剤として使用されていることが原因である。この溶離ラムを使用した糖の分離が、水／アセトニトリルの溶離液液のクロロホルムの割合は20％（v/v）であり、かつ安定で行なわれるのはよく知られた方法である。

剤として添加されているエタノールの量は約0.5％である
が、NPCに極性溶媒が添加されると、この様な溶出異常が発生することがあるため、使用する溶媒の安定剤及び添加する極性溶媒には十分注意する必要がある。
6.2

逆相モードから順相モードへの切替

NPCは、非極性溶媒を使用することが多いが、通常の分析では、逆相モードで極性溶媒を使用していることが多いと考えられる。このように逆相モードで使用した

a）

HPLC装置をNPCモードに切替える場合、シリカゲルカラ
ムを接続する前にポンプ、配管、インジェクター内を逆相モードで使用した極性溶媒と順相モードで使用する非極性溶媒ともに混和する溶媒（2-プロパノール、クロロホルム、テトラヒドロフラン等）で十分洗浄した後、溶離液で同じ洗浄を行い、その後カラムを接続することが必要である。この操作を怠ると、６−１項で説明した事態を招くことになる。
6.3 シリカゲルカラムの再生
シリカゲルカラムは、長時間の使用や長期間のカラムの保存中に溶媒中の水分を吸着し、活性が弱くなり、保持b）

図7 Mightysil Si-60を使用したアミノ酸の分離時間が安定しなくなることがある。
水を吸着して性能が低下したシリカゲルカラムを再生す
るには、単に溶離液を流してカラムの回復を待つという方法もあるが、この方法は時間がかかり確実といえない。
R.A. Bredeweg らは、化学反応を利用しカラムに吸着された水を有効に取り除く方法５）を報告しているが、その方法は、2,2-ジメトキシプロパンをカラムに流し、吸着した水分を除去するものである。この方法では、理論段数が1,200段/カラム（初期理論段数：5,500/カラム）に低下したカラム

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溶離条件：ａ）
カラム Mightysil Si-60（5μm）4.6mmφ×150mm
溶離液：アセトニトリル/水＝75/25
流速：0.5mL/min.
カラム温度：40℃
検出：UV 205nm 、0.02AUFS
試料：タウリンb）
カラム Mightysil Si-60（5μm）2mmφ×150mm
溶離液：アセトニトリル/水＝85/15
流速：0.2mL/min.
温度：室温（26℃）
検出：RI
試料：ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン（溶出順）

液体クロマトグラフィーの基礎技術（2）

図7にシリカゲルカラムSi-60を使用し、水／アセトニトリル
溶離液でアミノ酸を分離した例を示す。図7ａ）は、タウリンをUV検出器で測定した例であるが、タウリンはUV域でのモル吸光係数が小さいため、試料量が少ない場合測定を低波長の205nmとし、検出感度を上げる必要があり、微量分析が困難である。その解決策として検出器の変更が考えられる。
図7ｂ）は、ロイシン等をRI-検出器で測定した例である
が、これらの化合物はODSへの保持が弱いため、逆相カラムでは溶離液を再現性の悪い水100％にしなければならないが、シリカゲルカラムを使用することで、アセトニトリル／水系の溶離液を使用することが可能になる。シリカゲルカ
ラムに水を含有した溶離液を流すことは、カラムの寿命を短くすることが知られているが、同じシリカゲルを充填したプ
レカラムを接続し、溶離液にシリカゲルを飽和させることでカラムの寿命を伸ばすことは可能になると考える。

8．最後に以上、シリカゲルカラムを使用したNPCについて説明をしてきたが、現在はシリカゲル自身の純度が向上してきたことから、従来困難であった化合物の溶出が可能となっており、新たな展開が期待できる。また、最近、NPCにも水系の溶離液を使用し、この溶離液システムをLC/MSに展開する応用が盛んにおこなわれており、今後もその傾向には拍車が掛かるものと考えている。

参考文献
1）A.J.Alpert

J. Chromatogr., 499, 177（1990）

2）中村洋監修 液クロ彪の巻 p54、筑波出版会（2003）
3）酒井芳博THE CHEMICAL TIMES, 205, 13（2007）4）細田誠、酒井芳博

Chromatography, 16, 45（1995）

5）R.A.Bredewe, L.D.Rothman, C.D.Pfeiffer
2061（1979）

Anal. Chem., 51,

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