141L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
BL-1A/BL-5A/BL-17A/AR-NW12A/AR-NE3A

構造生物ビームライン試料交換システムの現状
Current Status of Sample Exchange System at
Structural Biology Beamlines
平木雅彦 1,2、山田悠介 2,3、松垣直宏 2,3、千田俊哉 2,3
1
KEK 機械工学センター、2 総研大、3KEK 構造生物学研究センター
フォトンファクトリーの構造生物ビームライン BL-1A、BL-5A、BL-17A、
AR-NW12A、AR-NE3A には、ビームタイムの効率的利用、リモート実験、全自動実験を目的として、試料交換システムが設置されている。本発表ではこれらの試料交換システムおよび、BL-1A 下流に設置されている実験前準備のためのキャビン（Cabin01）に設置したオフライン試料交換システムの現状について述べる。
BL-1A は低エネルギー実験を効率的に行うために、試料回転軸や検出器をヘリウムチャンバー内に設置している。そのためヘリウムチャンバー側面の開口部から試料を交換できる新たな試料交換システム PAM-HC を開発し、2014 年からユーザー運転に供している。2015 年夏期シャットダウン中にキャリ
ブレーション法を見直し、安定運転を実現した。
BL-17A ではビームラインの大改造に伴い、試料交換システムの配置の検討を行い、新しいビームラインに合うように改造を行った。
Cabin01 には、オフラインの試料交換システムを準備した。ビームタイム前に試料の準備に用いられる他、液体窒素を使った試料交換システムのテスト
実験、ソフトウェア開発等にも用いている。
全試料交換システムに共通した点としては、トング乾燥時間を短縮するた
めに新たな乾燥システムの開発を進めており、乾燥途中の水滴を吹き飛ばす装置を実装中である。
本研究の一部は、文部科学省、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、
国立研究開発法人日本医療研究開発機構の創薬等ライフサイエンス研究支
援基盤事業（創薬等支援技術基盤プラットフォーム事業）の支援により行われ
た。

142L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF BL-17A

構造生物学ビームライン BL-17A の高度化
Upgrade of a macromolecular crystallography
beamline, BL-17A
山田悠介 1)、松岡亜依 1)、小山篤 1)、平木雅彦 2)、松垣直宏 1)、千田俊哉 1)
1)
高エネ機構・物構研・フォトンファクトリー
2)
高エネ機構・共通基盤・機械工学センター
BL-17A は高エネ機構フォトンファクトリー初のマイクロビームが利用可能な
構造生物学ビームラインとして平成 18 年からユーザー利用が開始されてきた。
しかしながら構造解析の対象はより複雑で結晶化が困難なものへとシフトしており、より小さなＸ線ビームが求められる最近の構造生物学研究においてその競争力の低下は否めず、ユーザーからも更なる高輝度化が求められ、平成
26 年度にビームラインの高度化を実施した。高度化は、(1)第二集光装置の追加などの光学系レイアウト変更による試料位置のビームの更なる微小化、(2)より安定かつ多機能な回折計の導入、(3)大型ピクセルアレイ型検出器の導入、という 3 つの項目を中心に行った。高度化作業完了後、平成 27 年 5 月
からの 1 か月間のコミッショニングを経て、平成 27 年 6 月からユーザー利用を開始した。
光学系の高度化の結果、試料位置のビームサイズをこれまでの 250 x 50
μm2 から 80 x 16 μm2 まで縮小することが出来た。鉛直方向のビームサイズ
はレイトレースシミュレーションで得られた 8 μm に比べて 2 倍の大きさである
が、これは二結晶分光器をはじめとする光学系、および回折計の振動の影響であると考えられる。仮想光源スリットでビーム成形を行うことで試料位置のビームサイズをさらに縮小することが可能であり、2015 年 12 月の時点では水平
方向は 40～20 μm の間の任意のサイズをユーザーが選択できるようにしている。鉛直方向については長時間のビーム位置のドリフトが原因で 16 μm 以
下のサイズに変更することが出来なかった。このドリフトの問題については仮
想光源位置でのビーム位置フィードバックを実施することで解消することが出来ると考えている。
新規回折計の導入により、クライオループを用いた通常の回折実験の他、結晶化プレートを用いて結晶化ドロップ中の結晶に直接 X 線を照射し回折データを取得することが可能となった。多くのユーザーは与えられたビームタイ
ムの中で、クライオループによる実験と結晶化プレートによる実験を交互に行うことが想定されるため、この実験の切り替えがソフトウェアにより制御できるようになっている。2015 年 10 月より、結晶化プレートを用いた回折実験のユーザー利用を開始した。

143L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF／BL1A, BL5A, BL17A, PF-AR/NE3A, NW12A

歯周病菌由来 DPP11 の構造生物学的研究
Structure and function of PgDPP11.
六本木沙織 1、鈴木義之 2、田仲広明 3、伊中浩治 4、太田和敬 5、山田貢 5、小笠原渉 2、田中信忠 6、野中孝昌 1、阪本泰光 1 1 岩手医大薬、2 長岡技大工、
3 コンフォーカルサイエンス、4 丸和栄養食品、5 JAXA、6 昭和大薬
【背景】 歯周病は、人類最大の感染症であり成人の８割が感染しているとされる。歯周病は、死に至る疾患ではないが歯の主な喪失原因であり、歯の喪
失は、高齢者の第一の死因とされる肺炎を引き起こす一因ともなっている。歯周病の原因菌である Porphyromonas gingivalis は、糖や炭水化物ではなくタン
パク質やペプチドを栄養源とする糖非発酵性グラム陰性細菌(NFGNR)である。
これら、NFGNR の内膜は、アミノ酸単体ではなく、ジペプチドを選択的にと輸送するため、ペリプラズムでジペプチドを産生するジペプチジルペプチダーゼ(DPP)が、その増殖や生育に重要である。微生物 DPP は、Clan SC S9 と ClanPA S46 の二つのファミリーに分類され、Clan PA S46 ファミリーの DPP は微生物のみに存在する。Clan PA S46 ファミリーに属する歯周病菌由来 DPP11 は歯周病菌における主要な酸性アミノ酸ジペプチド産生酵素で、歯周病菌の増殖だけでなく、細胞障害性単鎖脂肪酸の産生にも関与する 1。本研究では、微生物 DPP の構造生物学的研究を通じて NFGNR のペプチド代謝機構の解明とその応用を目指している。
【方法】歯周病原菌 P. gingivalis 由来 DPP11(PgDPP11)の大量発現系の構築と精製、微小重力下での結晶化、放射光施設での X 線回折データ収集、構造解析を行った。また、DPP11 と同様に Clan PA S46 ファミリーに属する DAP BIIに関して、DPP11 化変異体 DAP BII(G675R)と基質との複合体の X 線結晶構
造解析を行った。
【結果および考察】我々は PgDPP11 の結晶構造を 1.66Å 分解能で決定した。
PgDPP11 は DAP BII と同様に、触媒三残基を含むダブルβバレルドメインと、Clan PA S46 ファミリーの酵素に特有のαへリカルドメインを有していた。また、
PgDPP11 S1 ポケットの Arg673 が基質の酸性アミノ酸を認識することが示唆された 2。現在、得られた構造情報に基づいたインシリコスクリーニングと化合物
スクリーニングによる DPP11 阻害剤の探索を進めている。歯周病の治療には他の菌にも作用する抗菌薬が使われているが、特異的でない抗菌薬の使用は多剤耐性菌の出現を早め、抗菌薬の寿命を短くする恐れがある。DPP11 をはじめとする S46 ファミリーの DPP に特異的な阻害剤は、結果として歯周病菌や NFGNR に特異的な抗菌薬の開発に結びつく可能性がある。
1.
Ohara-Nemoto, Y. et al., J. Biol. Chem. 286, 38115-38127, 20112.
Sakamoto, Y. et al., Sci. Rep. 4, 4977, 2014 Sci. Rep., 5, 11151

144L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））¥©¡¤

z;1u_y# ìïáÛçöÎpHP}
Crystal structure of supermolecule hemocyanin
MFEøs

(øtø[r&ø2 U15 YVÍÊÆÈnÎCÏvÌY QPÉ·ØùÜÝÌËÎ| VÔÝçÌËÎj{VÉÏìïáÛçöÊ¸¹%Jãöéßy¼ÃÎ<ÚBÆÈ¸Øù| VÎìïáÛçöÏø3 ¼mD ª§­D ª§­ ÍÓ!Ðz;1Ìu_y# É·×ø¾ÙÏX4ÁØIÓ1½¸u_yÎÇ
É·Øù| VÎìïáÛçöÏø3 m ¡°§­ Î ¨µ²®´¯³²­±¬²¯´¨¬
¼ £ Ç~pÀÅm °§­ Îàêñçäæ¼OWÍ  3#ÀÅ;1u_y# É·ØùìïáÛçöÏÃÎ1½¿ÚY»ÀÈèëåöÎÞðóÛ
3Ôø^xTÊÀÈZ¿ÙÈ¸Ø¼ø;1É·Ø¾ÊÔ7GÍàêñ
çäæÑÊwÁØÊ¸¹?y»ÖøpH¼*É·×ø¾ÙÒÉÏÍ
3>ÍÕ×ÃÎP}¼wN¿ÙÈ½ÅùKcgÉÏøâôîÜÝ\LìïáÛçöÎpHP}Ú ¶ ÎwqÉS6ÁØ¾ÊÍ@ÀÅùIo`Í £ R-ø£ Î ¦µ« ßòâã÷ø¡ iAÎl Î 3P}ÚS6ÀÅùFÖ»ÍÌÆÅP}ÏøhWÎ0.,Êø¡ ÇÎ,ÍÕ×P@¿ÙÈ¸Åù0.,Ïø Îëõæí÷¼ §¡ Î:e?É#ÀÅøa= ¶ø¿ ¢¶ Îh+ÎP}ÚÀÈ¸Åù¡ ÇÎ,ÍÏÃÙÄÙø Î ¨¬ ¼%ÒÙÈ¸Åùëõæí÷ÚP@ÁØ £ fÎ ¨¬ Ï¸ÂÙÓ ÀÅP}ÚJÀÈº×ø¨¬ $/¼  ):eÍ#ÀÅ ¨¬ 
¼P} ÊÌÆÈø£ª§­ Î P}¼Pk¿ÙÈ¸ÅùÒÅøl ¼ëõæí÷$/Î]Í9ÀÈ¸Å¾Ê»Öøëõæí÷Îb ZÍ8ÁØ"q?¼d'¿ÙÅù

145L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））      «²¢©ª¡ ´¸§ªĆùāĐöæÏÔòďĉøÿĒQu5 çP#eStructural basis of ubiquitin-like translational
modification in bacteria
 Fd ¥É'z 0 ¥É%M fS ¥É fS ¦É b z §É)  §Ę % `Éę atj |#eÉĚ % n` ďĉøÿĒèhOrxæGcæ,"Ùò/þĒćùâĖRcþĒćùã
IsÙòÕãâRcþĒćùçĖ7Ė­´ª
8ĖĈýăĒþ
Ēćùç Ė+çüúąĐĒúåäQÊåTyõNÜÙėEĖ
O`]æíďĉøÿĒQç/þĒćùÑ,"ÙòÕãÑiðóáÏñĖÛó
ðèÿöčĒîĎĐĊĂĒ~qåäçkõë]õ`<ÙòĖkõBÙòkĄąēã×á ôóáÌòėÛóðç3åg :ÐðĖhO`]çďĉøÿĒpèO`]çkBpÐð×áÒÜçâè
åÌÐãvÎðóáÒÜ¹¥ºė  ·ÆÁ¢Ä¾¿ÁÅÂ¿¼¿À½ ÃÇÀÄ¾»Ã½ « ·ÄÅ« è(\hVr{ 
Ñ?àďĉøÿĒQç/þĒćùâĖÄ¶´ª çk9çÜìçkĄąēþĒćùâËòė×Ð×2Ė·ÄÅ« çTyèÛóçêåðÚĖkq·ÄÅª ãf@Isõ4<×ĖÛçqZ:õ=Ùò_Ñ$ÖóÜ¹¦ºėÕóèĆùāĐöâìáĖkBãu5 çEæÙò
Ty:çďĉøÿĒQþĒćùç,"õFðÐæ×Ü$âĖÛóðçcå:õf@}Ôò>æåßÜė ×Ð×ĖÕç ¦ àç9ÑäçïÍæàçqâ7ÖóáÌòçÐæà
ÌáèJÝFðÐæåßáÌåÌė råTPõFÙòÜìæĖlÜÞè
·ÄÅª¢·ÄÅ« w çsHPõ ¦£¨ÈçyæáX-×Üė6ðóÜ
PâèĖ·ÄÅ« çđēċ^ç ¬ KnÑ ·ÄÅª çZ: æ[Ó1×éóĖÛçækm9çW#ãu5 çþēûĀăW#EÑ,"×áÌÜėÕçsNÐðĖ·ÄÅ« ç ¬ Knç^;õ×áĖęàç9õØZ: â*Ùò9TPÑA!ÖóÜė!"#$!"#$

!"#%-"#''0!"#'''!()*+,-"#$%.

!"#$%!"#&!"#$%%!"#$%&12!"#$%%12!"#'''
-"#$%.12-"#''012-"#''/

!"#"$"%&"!"#$%&-"#''/!"#$%&'()*+((,*-./0-12230-'()*$"!1#4'565-7/0-12"10-+,-

146L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
NW12A

Fusobacterium nucleatum 由来
硫化水素産生酵素の立体構造と反応機構
Structure and reaction mechanism of H2S-producing
enzyme from Fusobacterium nucleatum○毛塚雄一郎 1、吉田康夫 2、野中孝昌 1
1 岩手医大・薬、2 愛知学院大・歯
硫化水素をはじめとする揮発性硫化物は口臭の主要な原因物質であると同時に、低濃度においても強い細胞毒性を持ち、歯周病を進行させる一因でもある。歯周病原細菌として知られる Fusobacterium nucleatum は高い硫化水
素産生能を有し、これまでに 4 種類の硫化水素産生酵素遺伝子が同定されている。この中で、硫化水素産生酵素 Fn1055 は 2 番目に硫化水素産生への寄与が高く、L-システインから L-セリンを生成する反応を触媒する過程で硫化水素を産生する（Suwabe et al., Microbiology, 2011）。一般に、細菌や植物においては L-セリンを出発物質として L-システインが 2 段階の反応を経て合成されることから、Fn1055 はこの細菌に特有のアミノ酸生合成に関与する重要な酵素であると考えられる。
Fn1055 の大量発現は大腸菌を宿主として行い、3 段階のクロマトグラフィー
により高純度に精製した。この酵素を用いて広範囲におよぶ結晶化条件のス
クリーニングを行ったにも関わらず、良質な結晶を得ることができなかった。しかし、リジンの ε-アミノ基を化学的にジメチル化した酵素を調製し（Rayment,
Methods Enzymol., 1997）、再度スクリーングを試みたところ、非修飾の酵素よりも良好な回折を与える結晶を得ることができた。得られた結晶からビームラ
イン NW12A において、結晶交換ロボットを使って効率的に回折強度データを収集し、分子置換法により 2.1 Å 分解能で結晶構造を決定した。
Fn1055 は α/β フォールドを持つ 2 つのドメインからなっており、補因子である
ピリドキサール 5ʼ-リン酸はこれらの作るクレフトの底部で Lys46 と共有結合を形成していた。また、反応中間体複合体の構造解析の結果、中間体の形成によりクレフトが閉じることが示唆された。類縁酵素（システイン合成酵素、アミノ酸配列のアイデンティ: 32%）との構造比較により、クレフトの一部を形成するループのアミノ酸残基の違いが各酵素の基質特異性に寄与していることが考えられた。Fn1055 において、このループ上に位置する Asp232 は触媒反応に必須であり、L-システインの β 脱離反応で塩基としての役割を果たすことが分か
った。

147L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））         

SepCysE possesses non-specific tRNA binding domain
1

1

1

1

!Meirong Chen , Yuto Nakazawa , Yume Kubo , Nozomi Asano , Koji Kato
1,2

1,2

Yoshikazu Tanaka , Min Yao
1
Graduated School of Life Science, Hokkaido University
2
Faculty of Advanced Life Science

1,2,

A series of tRNAs are made in cell to serve as adaptors relating the aminoacid to genetic code of mRNA. The errorless recognition and attachment ofamino acids to tRNAs are performed by a family of enzymes designated asaminoacyl-tRNA synthetases(aaRS). Normally, aaRS can directly ligates aminoacid to the cognate tRNA to produce aa-tRNA. However, there are exceptions
for Glutamine, Asparagine and Cysteine in some organisms, in which enzymes
with different functions assembling to form complex are necessary for aa-tRNA
synthesis. And of interest, recent research discovered a huge complex namedtranssulfursome takes charge of cysteine-tRNACys synthesis in Methanogenic
Archaea.
Transsulfursome consists of three protein components, O-phosphoseryl-tRNA
synthetase(SepRS), Cys-tRNACys Sep-tRNA:Cys-tRNA synthase(SepCysS), and
SepRS/SepCysS pathway enhancer(SepCysE) which functions as a bridge toconnect SepRS and SepCysS. Firstly SepRS ligates O-phosphoserine(Sep) totRNACys, and then the formed Sep-tRNACys is transferred to SepCysS where it isconverted into Cys-tRNACys. This two-step pathway is the sole source forcysteine insertion into protein and cysteine biosynthesis in such organisms.
Previous research indicated that the N-terminal domain(NTD) of SepCysE isessential for assembly of transsulfursome, and crystal structural analysis of
SepCysS-SepCysE_NTD suggested the formation of a dimer of heterodimer.
While the structure and function of SepCysE_NTD are elaborated
comprehensively, little is known about C-terminal domain(CTD) of SepCysE,
and how tRNACys is transferred from SepRS to SepCysS remains unclear.
In current research, we performed binding assay of SepCysE_CTD with
tRNACys by Native-PAGE and ITC. The strong binding affinity was observed.
Whether SepCysE_CTD specifically binds tRNACys was further investigated.
Surprisingly, the binding affinities of other tRNAs are almost at the same level
as tRNACys, suggesting SepCysE_CTD can be characterized as a tRNA binding
domain. Given the non-specific binding of SepCyse_CTD on tRNACys, therecognition of transsulfursome on tRNACys may mainly depend on SepRS and
SepCysS during aminoacylation and the second step reaction, respectively.

148L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF BL-1A、PF BL-17A、PF-AR NW12A など

ファミリー4 ウラシル DNA グリコシラーゼと DNA の複合体構造解析
Structure analysis of family 4 uracil-DNA
glycosylase in complex with DNA
河合聡人 1、中村照也 2、山縣ゆり子 2、宮本秀一 11 崇城大学薬学部、2 熊本大学大学院生命科学研究部
DNA 中のシトシンは脱アミノ化によってウラシルに変化し、G：C→A：T への点突然変異の原因になる。シトシンの脱アミノ化は温度上昇に伴い、その発生頻度が高くなる。さらに好熱性古細菌由来のファミリーB およびファミリーD
DNA ポリメラーゼでは、ウラシルやヒポキサンチンなどの脱アミノ化した塩基を厳密に認識していて、これらの塩基が存在すると DNA の複製反応が停止してしまう。ウラシル DNA グリコシラーゼ（UDG）は、DNA 中に存在するウラシルを認識し、塩基と糖の間にある N グリコシド結合の加水分解反応を触媒すること
で、DNA 中からウラシルを取り除く酵素である。UDG は、様々な生物種でその存在が確認されていて、これまでの研究で明らかになった構造的な特徴や基質特異性の違いにより、ファミリー1〜6 に分類されている。中でもファミリー4に属する UDG は、好熱性古細菌や好熱性細菌といった高温環境下に適応した生物種のゲノムにコードされていて、その活性は、1 本鎖、2 本鎖 DNA に関係なく DNA 中に存在するウラシルを認識し、除去する。我々は、好熱性古細菌 Sulfolobus tokodaii 由来ファミリー4 UDG（stoUDG）について研究を進め、X
線結晶構造解析法により 1.7 Å 分解能で単体およびウラシル複合体の立体構造を解明した[1]。そして、全体構造は他の UDG と同様にα/β/αサンドイッ
チ構造を形成し、ウラシルの認識様式も他の UDG と類似していることを明らかにした。また、これまでに構造解析された UDG と構造を比較した結果、
stoUDG では、DNA 結合に関与する領域（leucine intercalation loop）に特徴的な構造が観察された。そこで、詳細な stoUDG による DNA の認識様式を明らかにするため、stoUDG-DNA 複合体の共結晶化に取り組み、PF BL-1A でのX 線回折実験の結果、2.6 Å 分解能で複合体構造を決定することに成功した。
本発表では決定した stoUDG-DNA 複合体の立体構造、ならびに現在得られている立体構造から推察した stoUDG の酵素触媒機構について報告する。
[1] Kawai A. et al., FEBS lett., 589, 2675-2682, 2015

149L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））             £ \EíýďĕĄăòúĄēĆęüÙĄėĈĕIzÙuG£·²²«°µ¶´·©¶·´«³¬¯µ³±§°¶³ª«¸¶´§²§µ« ¬´³±     £c/  ¼}S  ¼.P  ¼tQ U ¼K$  Fy0'Ę7[Z*-> ¾jv¿íýďĕĄăòúĄēĆęüĚ¡ěÚõĕöęúÆ»iÕÓ×
ÆÒÑ&fÄâÛðĔ÷fØ,ËÔ¼{DeÅãîòý"Ø [Ë¼fíýďĕĄęú°© »°©èZ9ÍåNu~hÕÀå½¡ Ú¥¹ ăęþĎęúØâä¼fwNu~hČêĐĔęØÊæ
ÔÁåÆ¼ ØÊæå×~hÚ»ñēôĄùÿęüà»ëûĀĕñēôĄøĐćÿęüÕÀå½áÃØ ¡ Ù#wW]8ÖIzÙaØnÆ<Ñæå½
¡ ÙZ"ÛäñėąÖÙs ÙIzÅã ¡ ØÚW5_×IzèËÔÁåÉÖÆÅÒÑ½W5ÙÓØĄėĈĕIzÆÀå½ÉÙĄėĈĕÚ
¡ ÙT86ØÅÂâÂØ)!Ë¼ĔñėąiBÙÞØXæ¼N(è&ÈéÕÁÑ½ÉÙĄėĈĕÆXæåÖÇØ¼ëĐĉJ#Ø'Ç×öėČïđ
ęùĒė%ÆxÉå½ ¼ÉÙĄėĈĕ39Øçä¼'ÇÈöėČïđęù
Ēė%èxÉÍ  Øb`ËÑ½ÉÙ  èëēćėØl=ËÑ%] è rË¼ĜkiCIzuGèqÁ¼ÐÙIzèuAËÑ½
¾@RÖiH¿¡¦ ^X[čēúĐąè rË¼¯µ¶§­ pþėċôwÖËÔ   Õ^XÊÏÑ½¢¯¢£ ëñĖęúØâäëČìćĂìęô
ĖďĄõēČìęèqÒÑ4¼£®´³±¨¯² YèËÑ½¯µ¶§­ è ËÑ 
èĊėóėõąĖāčoM;?RØâäiCÊÏ¼íýďĕĄęúèýęòė
õ4¼Ĝk :21V+Ø[ÁÑ½¡íýďĕĄęúè"ÖË¼(l=RØâä íýďĕĄęús ÙIzè ºÙumÕO+ËÑ½
IzuGÙiH¼íýďĕĄęúÚZ"ÖÌâÂØ¼T8| Ö ¡
@Ø  (ÎÓiËÔÁåÉÖÆÅÒÑ½ËÅË¼íýďĕĄęúÆT8| Øi4ßëĐĉJ#ÙöėČïđęùĒė%ÆxÉãÎ¼ĄėĈĕÚ
ÌÑÝÝØ×ÒÔÁÑ½ÝÑ¼ ÕÚ¼¤£ ÖLÜ~hT8Æg  Ù Ø ÍåÉÖÆÅÒÔÁå½áÃØ ¡¦ ÙT8 ØÚÉÙĄė
ĈĕIzÆËÔÄä¼ÉÙĄėĈĕIzÚ ¡ ÙT8ØËÔÁåÉÖ
ÆdÊæÑ½

150L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A

アーキア由来ユビキチンの結晶構造解析
Crystal structure of archaeal ubiquitin
藤橋雅宏 1，橘高瑞奈 2，金井保 2，跡見晴幸 2，三木邦夫 1
1
京大院理・2 京大院工ユビキチンは、真核生物において標的蛋白質を修飾 (ユビキチン化・ポリユ
ビキチン化) し、蛋白質分解系をはじめとした様々なシステムに関わることが知られている。このシステムには、ユビキチンそのものと、ユビキチン化に関わる酵素である、E1, E2, E3 などが含まれることが知られている。
原核生物においてもユビキチン様の蛋白質は見つかっている。例えば ThiSや MoaD と呼ばれる原核生物由来のユビキチン様蛋白質は、硫黄化合物の代謝に関わることが知られている。ThiS や MoaD による硫黄化合物の代謝には E1 様の蛋白質も関わるが、E2 や E3 に相当する因子は見つかっていない。
また好塩性アーキア由来 SAMP や好熱菌由来 TtuB は、E1 ホモログを介して標的蛋白質を修飾する。これらのケースにおいても E2 や E3 に相当する因子は見つかっていない。
我々は最近好熱性アーキアである Caldiarchaeum subterraneum のメタゲ
ノムより、ユビキチン様蛋白質の遺伝子(CsUbl)を見いだした。この遺伝子の周辺には E1, E2, E3 ホモログの遺伝子が存在し、オペロンが形成されていた。
C. subterraneum の培養条件は今だに不明であるため、これらの蛋白質の生
体内での動態は不明であるが、大腸菌を用いて組換え蛋白質として発現させると、試験管内において E1 のユビキチン化、E2 の E1 を経由したユビキチン化が起こることを確認している。ポリユビキチン化はユビキチンのリシン残基(または N 末アミノ基)を介して起こることが知られているが、一次構造だけでは立体構造上のリシン残基の配置はわからない。そこで CsUbl の結晶構造解析に取り組んだ。
様々な結晶化条件を試したが、太さ 10 μm 程度の針状晶しか得ることができなかった。PF-BL1A において X 線回折実験を行ったところ、2.78 Å 分解能の回折データを得た。このデータは pseudo merohedral twin の性質を持っていた。位相決定は赤痢アメーバ由来ユビキチンをモデル分子とした分子置換によって行い、refmac による twin refinement によって Rfree = 25.1%にまで構造を精密化した。CsUbl のリシン残基の立体構造上での位置は、真核生物ユビキチンとはあまり一致しないことがわかった。

151L（生物物理，生物化学（結晶構造解析）） ¥ ¥ ¥ ¥ ¥ ¥ ª²¦±­©ª¥@(     nT\Nuîÿôæ®¯§©§ª ÑIZV¥
Crystal structure of CcGH131A, a function-unknown
protein, from a basidiomycete Coprinopsis cinerea

WG+ §º'2K §ºm{% §ºmSi §ºw4r ¨ºvm ¨¥
Ye ©ºm ©º3F( ¨º`b §º^!¢ §¥ ¥¥§U5$*$*¡¥ *6¥ <lk*0C¥¨
U$*$*¡¥ *k}*x}¥ kfRD}*0C¥©
U5$*$*¡¥ *6¥ j"df}*0C¥¥¥ ´µ¥ |ÑçýĀöÍÒº@(¤ÑÅÉMRQÐtqÅºåòèxÑúïýÍ¼Ú@(¥      n T î ÿ ô æ ®¯§©§ª ÑZÎ\ÑxÞÊÌ½Ú»®¯§©§ª ÒăËÑñùàÿÀ
Ø?Ùº¬ O ÐñùàÿÞAËÃÎÀØºPÑóàâ÷ê\ZÐ¿½Ì ØÀÑÂÞÖËîÿôæÍ¼ÚÎ ¾ØÛÚ»PîÿôæÁ1ÆÚ ®¯§©§ õßøüĀÐ¿½ÌÒº¸¦çýãÿa>ÞJÆÚîÿôæÑ)Á ÄÛÌ½ÚÁº®¯§©§ª Ògo>ÁHÍ¼ÙºEÏ\ÞAËÍ¼ÚÃÎÁL:ÄÛÚ»¥¥ ÃÛÔÍÐ ®¯§©§ª ÑñùàÿÞ]&ÄÇÉîÿôæā®¯§©§ª¹¬«°ĂÑIÞ½º®¯§©§ª¹¬«° Ò¸¦ìüĀþĀýõ
áĀýñÞJÆÚZÍ¼ÚÃÎÁÀÊÉ»ÄØÐºçüëþĀýĄ(Áa>;Î=ÝÛÚ ÐÅÌ½É»PxÍÒ ®¯§©§ª ÑZ\s ÞHØÀÐÆÚÉÕºIZV¿×Óc,Ð×ÚÐ/ÆÚg
o>Ñ ÞÊÉ»¥¥´XÎ .µ  ®¯§©§ª¹¬«° ÐË½Ìº~Ð/ÆÚðüöðõßÿ
Ñ87#ÞB[ÎÅÉc,ÞÊÉ»ÈÑXº¸¦çýãÿÐ/ÆÚ<Ò¼ÔÙÏ½ÑÐ/ÅºåéûÿÐ/ÅÌ$ÂÏ87#ÞzÆÃÎ
ÁÀÊÉ»ÈÃÍºåéþðüâĀêÞüäÿñÎÅÌIÐíĀåÿçÞ½º
IZVÞÊÉÎÃÜº ÍÒ¼ÚÁåéþĀêÐs9ÆÚÑ£(-7Á ³·¶ą§ ÐØÛÉ»ÔÉºPîÿôæÞ_     ÍphÄÇÁÅÉÖÑÐË½ÌIZVÞ½º Ñ ÞyÆÚÃÎÁÍÂÉ»¥¥152L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL5A, PF-AR NW12A

アサ由来ポリケタイド閉環酵素の X 線結晶構造解析
Structure determination of polyketide cyclase from
Cannavis sativa.
松井崇 1、楊新美 1、児玉猛 1、周暁希 1、森貴裕 2、
野口裕司 3、阿部郁朗 2、森田洋行 11
富山大・和漢研、2 東大院・薬、3 静岡県立大・薬
大麻由来 olivetolic acid cyclase (OAC) は、アサ Cannabis sativa のテトラヒドロカンナビノイドのポリケタイド骨格の生合成において、Ⅲ型ポリケタイド合成酵素 (PKS) であるテトラケタイド合成酵素 (TKS) が生産するヘキサノイ
ルテトラケタイド CoA 中間体を基質として C2-C7 アルドール閉環反応によりオリベトール酸 (OA) へと変換する植物で唯一同定されたポリケタイド閉環酵素である (図 1）。中間体を生成するⅢ型 PKS は広範な構造の CoA チオ
エステルを基質とし、多様な骨格の酵素反応中間体の生成を経て非天然型
芳香族化合物を生産できる。したがって、OAC の基質特異性を拡張し多様な骨格構造を持つ基質を変換できれば、これまで以上に多様な化合物群の創製が期待される。本目的のためには OAC の基質認識機構の解明が必須であり、OAC の結晶構造を解析した。
その結果、OAC および OAC-OA 複合体構造をそれぞれ 1.32、1.70 Å の分解能で解析することに成功した。OAC は各サブユニットに cavity を形成する植物ならびに細菌の dimeric α+β barrel (DABB) タンパク質と高い構造相同性を示した。また、OAC-OA 複合体構造から、この cavity 内に存在する疎水性 tunnel にヘキサノイル基が結合することが明らかとなった。さらに、cavityに存在する残基に対して変異導入し酵素活性を測定した結果、この cavity の入口に存在する Tyr72、His78 が OA の閉環触媒残基である事が示唆された。
これまで、OAC は植物で唯一同定されたポリケタイド閉環酵素であったが、本研究で解明された触媒残基 Tyr72、His78 と触媒残基と相互作用し活性に関与する His5、Tyr27、Asp96 は DABB ファミリーに属する植物ストレス応答性タンパク質 POP3 ファミリーにおいて良く保存されており、POP3 ファミリ
ーも OAC 様のポリケタイド閉環酵素である可能性が示唆された。今後、これらの DABB タンパク質を同定・機能解析と各酵素の比較解析により、多様な
非天然化合物ライブラリーの構築に応用可能となる事が期待される。

図 1. OA の生合成経路

153L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-AR NW12A

ソホロオリゴ糖に特異的な ABC トランスポーター基質
結合タンパク質の熱力学的解析と立体構造
Thermodynamic analysis and crystal structure of asolute-binding protein of ABC transporter specificfor sophorooligosaccharides
阿部 紘一 1, 中島 将博 2, 砂川 直輝 1, 石田 卓也 1, 五十嵐 圭日子 1, 鮫島正浩 1, 宮永 顕正 3, 中井 博之 4, 田口 速男 2, 荒川 孝俊 1, 伏信 進矢 1
1 東大院農生科, 2 東理大院理工, 3 東工大院理工, 4 新潟大農
β-1,2-グルカンはグルコースがβ-1,2-結合で重合した多糖であり、自然界
では一部のグラム陰性菌が産生する環状糖として主に知られているが、その分解代謝系には不明な部分が多い。近年、我々は Listeria innocua において
β-1,2-グルカンの代謝に関与すると思われる遺伝子クラスターを発見した 1。
そのクラスター内には 3 糖以上のソホロオリゴ糖（β-1,2-グルコオリゴ糖）を、無機リン酸を使って特異的に分解する 1,2-β-オリゴグルカンホスホリラーゼ（OGP）、2 糖のソホロースを好んで分解するβ-グルコシダーゼがコードされている。また、同クラスター内には推定 ABC トランスポーターの構成成分である基質結合タンパク質（LiSBP）および膜貫通タンパク質がそれぞれコードされていることから、L. innocua はこのトランスポーターを介してβ-1,2-グルカンまたはソホロオリゴ糖を取り込んでいると思われる。しかし、L. innocua はβ-1,2グルカンでの生育例がないことから、ソホロオリゴ糖を取り込んでいるのではないかと推測されるが、LiSBP とソホロオリゴ糖との相互作用を調べた例はな
く、その立体構造も未知である。そこで本研究では LiSBP の熱力学的相互作
用解析および X 線結晶構造解析を行った。
等温滴定熱量測定（ITC）を行った結果、LiSBP は 3 糖以上のソホロオリゴ糖に 104〜106 M-1 のオーダーで特異的に結合することが明らかとなった。この結果は OGP が 3 糖以上のソホロオリゴ糖を分解することと対応している。
さらに、LiSBP の結晶を用い KEK PF-AR NW12A において X 線回折実験を行った結果、分解能 2.2 Å でリガンドフリー状態の構造決定に成功した。LiSBPの全体構造は、他の基質結合タンパク質で見られる二つの球状ドメインから構成されており、これらのドメインで挟み込むようにしてソホロオリゴ糖を結合するのではないかと思われる。また、他の構造既知のタンパク質との比較から、今回得られた構造は Open 型であることが示唆された。
LiSBP の全体構造
1. Nakajima, et al., PLoS One 9, e92353

154L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-AR NE3A、AR NW12A

Caulobacter crescentus 由来アミノレブリン酸合成酵素のグリシン複合体の結晶構造
Crystal Structure of Aminolevulinic acid synthase
complexed with Glycine
from Caulobacter crescentus
主馬野祐希 1、生城浩子 2、矢野貴人 2、神谷信夫 3,1、宮原郁子 11 大阪市大・院理、2 大阪医大・生化学、3 大阪市大・OCARINA
アミノレブリン酸合成酵素(ALAS)は、グリシンとスクシニル CoA よりアミノレ
ブリン酸を合成する反応を触媒する、ピリドキサール-5’-リン酸(PLP)依存性の酵素である。ALAS が触媒するこの反応は、ヘム生合成における律速段階である。また、ヒトにおいては、赤芽球細胞で特異的に発現する ALAS-2 の変異が X 連鎖性鉄芽球性貧血の原因となる。これまでに、Rhodobacter
capsulatus 由来 ALAS の結晶構造が報告されているが、基質との二元複合
体は分解能が低く、電子密度が不明瞭であった。我々の研究グループでは、ALAS の反応機構を構造学的な立場から明らかにすることを目的として、
Caulobacter crescentus 由来 ALAS(cALAS)の三元複合体の X 線結晶構造解析を達成することを目標に研究を行っている。

培養・精製した cALAS の結晶化スクリーニングを行ったところ、良好な単結晶を得ることができ、PF-AR NW12A において 1.35 Å という高分解能でのデータ収集に成功し、cALAS の結晶構造を初めて明らかにした。PLP は、
Lys248 とシッフ塩基を形成し、Internal Aldimine の状態で存在していた。PLPのピリジン環は Asp214 の側鎖と N1 の水素結合、His142 のスタッキング、
2 と O3 の水素結合によって活性部位に固定されていた。また、His217 の Nεリン酸基は複数のアミノ酸残基や水分子との水素結合によって固定されていた。
また、グリシンとの共結晶も行った。スクリーニングの結果、単結晶を得ることができ、PF-AR NE3A において 1.77 Å 分解能でのデータ収集に試行し、グリシン複合体の構造も明らかにした。PLP はグリシンとシッフ塩基結合を形成し、そのカルボキシル基を PLP ピリジン環に対して垂直に配向し His142 と水素結合を行っていた。これは同じサブクラスに属するセリンパルミトイル基転移酵素においても見られる構造で、スクシニル CoA が結合するまで、反応が進行しないように制御するための機構であると推定される。

155L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       ³¬ ©¯¥¨jVXùčĂó@(uMTÝÖâÝĈöñĊ(Ý0ÚÕÝ 
Doping of radical molecules and its evaluation for
Dynamic Nuclear Polarization Neutron protein
structure analysis
1S5 k ¡Ďi nN ¢Ē£Ď4i 7 ¤Ď+$ y ¤¡ }%'g6Ē¢ }%'6Ē£ }%'ĄČčüíì÷čùďĒ¤ 39'gÆvÇ
@(#F*ÜËÏç[tÝWA8"ÝK]ÚÒØÄjVX
Đª±³đÍÈçÅÐÝC]ëhÉçÐÚÜäæÄ[tÌåÝl.jÛHÍ<RÝs ¦ ÚÛæÄÑåÜ[tÝááÙãāûóôĈïčÿÍ ÉÚÉÊdÍÈçÅÐÝDÝ*fÜÞJuMÜĈöñĊë0Óç>ÍÈæÄÕÝZeÞùčĂóÝ[t (IēĈöñĊIĔ¡ē¡ ÙÈçÅPprÙÞ ¶«°³²¯ ëĉøúďĆuMÜc8Ù0ÒÄ«µ´ *!ß · wuMYTë~ÉÄùčĂóuMÝĈöñĊ(IÝ)ÚĈöñĊÜä
ç(YàÝ:ë ÒÖÅÆ*ÇùčĂóÞ µ½»¿¸¨¾ºÁ½¹¼ qäæÒÖĉøúďĆëhÉc8Þ ¡¥£ ¿»¿¯ÄuMÞ&ĀþĉïĆ ¢¥¶«°³²¯ ¢ ¿°Äxb^Þ¥  ¿° ĀþĉïĆ À­ ¤¥Ä_8 ¢§£ ®ÄuMÞąîóČāûú]ëhÉ
ØuMë~×ÖÅ=åèÖuMë · wTho|òćăĈĉÜ/ÒÄ«µ´ *ÜhÉÖÅáÖÄðúċčôĉõďĊ £ ÂÂëEuÚÒØhÉØmuÒÄ³¬ ©¯¥¨ ÜØ ¡ ® Ý _Ù · w#F!ßTë~×ÖÅÆuUĎz-Ç«µ´ *ÝuUäæÄ¶«°³²¯ c8Ü.ÓçĈöñĊ(IÚĉøúďĆ(IÝZë\âÖÚÐéÄZjÎèÉÛZ Í=åèÄâØ «µ´ *Üä×ØùčĂóuMÝĈöñĊÝ)jÛWÜBÒÖÅÐèÜä
æÄĉøúďĆÜËÏçjVXë~ÊÖâÝ>Q ëaÖÓuMQ
ÍLÒÖÅÐÝQ ëaÖÓ ¶«°³²¯ c8ÝĉøúďĆuMÝ · w#F
ë~ÉÄ{ ¡¢ ÃÝýďùÍ=åèÖÅYTÝuUÄ¶«°³²¯ ÝãÝÚ?ÒÎ(,8Þ`ÑèÔÄ¶«°³²¯ ÞĉøúďĆÚÞkGl hÒÛÉãÝÚ?êèçÅ;Ý2OÚÒØÞÄ*ÜjVXë~ÉÄ[t(ÝXeë`)Óç)ÙÈçÅ

156L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL17A

HIV-1 逆転写酵素 Q151M 変異体の構造解析
Structure of the HIV-1 reverse transcriptase Q151M mutant
中村彰良、田村範子、安武義晃
産総研、生物プロセス研究部門

B 型肝炎ウイルスの逆転写酵素 (HBV pol)は抗 HBV 薬開発において重要な標的タンパク質であり、効率的な薬剤設計のためにも立体構造情報の活用が期待されている。しかし、HBV pol は生体外では不溶性かつ不安定であることからサンプル調製が困難であり、立体構造解析は難航している。
テノフォビルやラミブジンなどの一部の核酸系逆転写酵素阻害剤は、HBV
pol と HIV-1 の逆転写酵素 (HIV-1 RT)の両方に阻害活性を示すことが報告されている。また、HBV pol と HIV-1 RT の配列比較から、活性部位を形成する
アミノ酸残基は両者で高く保存されていることが明らかになっている。このことから、HBV pol と HIV-1 RT の活性部位構造および反応機構は類似していると予想されている。しかし、活性部位の配列比較では 1 残基の違いがあり、
HIV-1 RT の Gln151 に相当する残基は HBV pol では Met で保存されている。
興味深いことに、この Gln151 が Met に置換された HIV-1 変異体(Q151M 変異体)は多剤耐性を示すことが報告されている。しかし、多剤耐性を示す Q151M
変異体に対して、HBV pol 阻害剤であるテノフォビルおよびラミブジンは変わらず阻害活性を示すことが明らかになっている。以上の活性部位の類似性および薬剤感受性の共通性から、HIV-1 RT Q151M 変異体の活性部位構造は
HBV pol の活性部位構造を反映していると考えられる。
我々は、HIV-1 RT Q151M 変異体の立体構造を 2.6 Å 分解能で決定することに成功した。Q151M 変異体の全体構造はこれまでに報告されている HIV-1
RT の閉構造と同じであったが、活性部位を形成する β2–β3 シートに構造変化が見られた。この β2–β3 シートには置換した Met151 が存在しており、Metの疎水性側鎖によってこの構造変化が引き起こされたと考えられる。さらに、
Q151M 変異体とこれまでに報告されている HIV-1 RT 阻害剤複合体との活性部位構造の比較から、Q151M 変異により阻害剤との水素結合ネットワークが変化することによって、薬剤耐性や HIV-1 RT と HBV pol の薬剤感受性の違いが生じていることが示唆された。

157L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       ©¦¤§¢£ ©¦£ª¨¥¡£ íĉ÷æ ÎqHÍ´¹ÜTSÎ7ÎL
Analysis of the influence of precipitantson the protein crystallization
v; «D «$ «m\ «Nc «G<Q  x.y«  *~(.y®a`¯íĉ÷æ Î X rqHOLßz²Éa`íĉ÷æ ÎqH¶:É°Ü¶«qHKÎ@pÏ½Ð½Ð&ß²¬ÂÎ%Î 1 ÇÊ½È«ÚÝÄKÉÎÕqH¶L¿ÜY]¶FÚµÉÌ±»Ê¶?ºÚÝÜ¬=­ÏzeiÍ´±Èíĉ÷æ ÎqHOÍ´¹Üjt¶«qHÎÍ[±ÚÝÜTSÎhÍ.·¸ 0¿Ü»Êß½Ä¬Â»ÉJeiÉÏ«qHÍ´¹ÜTSÎ8ÎFÌÚÑÍíĉ÷æ qHPOÎFß×Ä¬®EUĊqM¯íĉ÷æ Ê½È«áĉùĆãĉéâáĆëÎ>ÇüąÿĄċì}Î PA èúĂôïñÎ N Iko 200 R+(PAN)ß[±Ä¬PAN Îq
HKß@p½«3 ÇÎ^ÌÜKÉíĉ÷æ qHß9Ü»Ê¶É·«ÂÝÃÝÍÇ±ÈOLßzÆÄ¬[±ÄTSÏÂÝÃÝfàĉĀôâ
þ«däąâþóñąâþ«PEG 8000 É°Ü¬ÂÝÃÝÎjtÏÍ
P41212, P41212, C2 É°ÆÄ¬!¾jtÊÌÆÄ 2 ÇÎTSÍÏ«íĉ÷æ Í4½ Î [¶°ÜÊB3¼ÝÜ¬QÍ PAN ÎqHOßØÊÍ«öĉåĉçòĈïûÎTSV6ßX¿ÜÙ²ÍTSÎ/ßíĉ÷æ
Î#'ÍĄĉîþÍ_Z¼ÁÄĀðĆß 3 ÇÎTSÂÝÃÝÍÇ±È 2 ÇÀÇ Û«ÂÝÃÝ 100 óõg(PEG ß"ÖĀðĆÎÕ 200 óõg)Î/
1êýāćċêăĉßzÆÄ¬ÂÎqM«3 ÇÈÎTSÍÇ±È«TS
/Ïíĉ÷æ Î#ÛÍlE`Í5¿ÜÎÉÏÌ¸«W2ÎE Í.·¸ÆÈ0)¿Ü»Ê¶ÆÄ¬fàĉĀôâþÊdäąâþóñąâþ
ÎKÉÏ«íĉ÷æ {Î²ÅTS¶ÆÈ5¿Ü Ï«qH
Í´±Èíĉ÷æ /Ë²½¶A½È±Ì± ÍÒÓw½Ä¬ÂÎÄ×«»ÝÚ 2 ÇÎTSÏíĉ÷æ /Ë²½ÎA½²Ü ß2¿ÜÙ²ÍÏÄÚ·«jtß2½È±ÜÊu³ÚÝÜ¬PEG ÎKÉÏÍ«TS¶ÆÈ5¿Ü Ï«qHÍ´¹Üíĉ÷æ /Ë²½ÎA ÍÒÓw½Ä¬ÂÎÄ×«PEG Îq ¿Üíĉ÷æ {Î ¶ÂÎÔÔíĉ÷æ Ë²½ÎA Î|ÊÌÛ«jtß2½È±ÜÊu³ÚÝÜ¬»Î, «íĉ÷æ -PEG b [¶íĉ÷æ -íĉ÷æ b [Ís·CÞÜ»ÊÉ«nÎãĉñĈøċ¶-½Èíĉ÷æ qHÎÍÌÜÊB3É·Ü¬158L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL5A, PF-BL17A

黄色ブドウ球菌由来-hemolysin の分子機構の解明
Molecular mechanism of staphylococcal
-hemolysin
菅原宇希 1，山下大智 1，加藤公児 1,2，金子淳 3，神尾好是 4，田中良和 1,2，姚閔 1,2
1 北大院・生命科学，2 北大院・先端生命，3 東北大院・農，4 尚絅学院大院内感染の原因菌として知られる黄色ブドウ球菌は，様々な膜孔形成毒素を分泌し，宿主の血球細胞を破壊する．-ヘモリジン（-HL）は膜孔形成毒素の一つであり，−バレル型の膜孔を形成して赤血球を破壊する．-HL は可溶性の単量体として分泌されるが，赤血球の膜上で会合し，大きな構造変化を経て prepore と呼ばれる中間体構造を形成した後，膜孔を形成する．膜孔形成機構の理解に向け，各段階の結晶構造解析が試みられてきたが，
-HL は膜孔へと会合しやすく，これまで，膜孔の構造のみしか決定されていなかった．そこで本研究では，過去の報告をもとに，安定な単量体およびprepore を形成する変異体を取得し（H35A 変異体および W179A/R200A 二重変異体），これらの結晶構造解析により-HL の一連の動的な構造変化を明らかにした．
予想された通り，H35A 変異体の結晶構造は単量体であり，膜貫通領域を形成する stem 領域が折り畳まれていた（図 A,B）．また，N 末端に存在する疎水性残基が Cap ドメインと疎水性コアを形成する事で，N 末端ラッチは湾曲し た 構 造 を 形 成 し て い た ．
W179A/R200A 二重変異体の構造は膜孔と酷似していたが，膜貫通領域のフレキシビリティーが著しく高い点で異なっていた（図 C,D）．また，N 末端ラッチの疎水性残基は，隣接する分子と疎水性コアを形成して，会合構造を安定化していた．これらの構造解析の結果をもとに，N 末端ラッチの疎水性を利用した，-HL の動的な膜孔形成機構が提案された．
（）本研究により解明された-HL 単量体の構造．
（B）既知の 7 量体膜孔
構造中のプロトマーの構造．
（C）本研究により解明された-HL の preporeの構造．
（D）prepore の-バレルにおける B-factor 図（C の四角部分の拡大図）．※色の濃さ，リボンの太さは温度因子の高さを表す．

159L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））   PF BL-5A=TJ?R"¥qÊ!Î-°³
The study of thaumatin of sweetness and structureWA 1©Z`® 1.2
1 ¼uy|2 ¼uyHQRB32<R>T·Â  ¥q>RG7Æ=TJ?R#¾2HN6l§"¡"!À
g.wv">RG7Æ,'¥q1:M´"kVh"U" ¥q1p-¥q!Í¿0.2KFÌ#¦¤|«Ñ +-²0 - ¥q"ª£#Å"&&-.&"°³#Á"Ï!>R
G7Æ"É!f¶i)¶ji À &2KFÌ­\b¨&-&pH " ¥q!Í¿ 2KFÌ"*
Ð1m-" (Äµ!Ã. pH 1x-!*-n¥q!Í¿ 2KFÌ"ÊÈ1½ 
f¶i1x "Ð1È-1]r"Ñ"¬«Ñ
 =TJ?R#:8J2ODN@?±*,Çe("1"&&¨¶º_#¶jiË¯ÌECN4L6N4
L1¨MES-NaOH pH 6.5 :@B3R8DQ@I½KEK-PF BL-5A ! a 100 K !Ó¸r1½
f¶i!#5?PR8N9TO8N<QTO;7QT;PEG4000 " 4 1¨¶S¹
¥q!¢!Í¿-Â0.- Arg82  Lys67 1 pH
4.5,6.5,7.0 "_Xsz&# occupancy 1..È/wv!É%Y}~! -do À+.f¶i!;7QT;1c¨("#;7QT;#[À ¥q!Í¿ 2KFÌ­\b¨8N<QTO# 4 hzÀ
5?PR8N9TO# 2 hzÀ  ]r"ÑÒ
" 1.1 "ÒhÁ»+.&¥q!Í¿ 2KFÌ"­\b¨#PEG4000 1c¨("#PEG4000 #À2KFÌ"­\b¨#^!$¶ji¨Ë¯ÌECN4L6N4L#.."f¶i"_ 2hz{t

160L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））

 u u u u u u u yu

Q -Lysozyme a  Æ t  b [ ò V 9 i b 5High resolution X-ray crystallography study ofsugar-Lysozyme complexes}u \%$o }xu G L2 }x~u u&xu ~u \ ãéêÝÓÒØêÚìxu

u­Uc®çÙÛìåÇK;S]ÆSZÑ9+ºÏQqÑ=bºÏlRÂ¯Î«&8IÅÇH³Í-¸¾çÙÛìå´rË^Å*F·
ÐÁ°Ï¬¸³¸«çÙÛìåÆ=b:9«QÃÆJ FÅÀ°ÁÇb
0·ÐÁ°Ä°j´°¬¼¶Â3MPÂÇ«QyçÙÛìåa Ñtb[ÂÆòVT19ib5Ñ_°«¢¡ çÙÛìåÑÉ _MPÆQyç
ÙÛìåa ÞìÚÃ<h¸«QÆ#Æ·Ð/ËDÅ=Ñ¸¾ÚêâÖfÃÆJ FÑ7dºÏ¬uuu­ ! s / > ®   F ° ¾ Q Ç x©xª©xª©ªy¥£¥§¥¡¥¥£¡¤uvvwwÃ x©xª©y£¥§¥¡¥£¡¤uvvwwÂ¯Î«¦¥£u¡£¥¡£¤OÌÎg¸¾¬vvwwÃvvwwÆT1Y+4Ç¼Ð½Ð«æè<ÂçÙÛìåðQñ}ð}z~ Â@·»«çÙÛìåC(Ç |xu|u{« T1
C(Ç |z«|zu«Ç¹4Â«W`B?îkmàßçÕåïð|z||uu ¢u z«A(ð~ u «T1/>ðäÔÖéáÜÛ>ÂT1Y+Ñ_¿¾¬
?Ç×çØéìè |u íÑF°Á«yu y Å²°Á A }||u Â  V,!sÑ_°«~||| ÑF°ÁÞìÚE¸« ¦«¡¡¥ ÑF°
Á9ib5Ñ_¿¾¬uu­T6ëX"®ÞìÚEëb5ÆT6«3MPÂÆvwyçÙÛìåÂT1
Y+¸¾çÙÛìåÆb[Ç }z|u ¨Â¯¿¾¬È¾«vwyçÙÛìåÂ
T1Y+Ñ¸¾çÙÛìåÆb[Ç }z|u ¨Â¯Î«y£ Ç }z}u í«~|z}u íÃ°± _MPÞìÚÃ<h¸ÁÊ«p'Åtb[ÄÞìÚÑ)Ï¶Ã´Âµ¾¬¼Ð½Ðvw«vw ´çÙÛìåÅ#·Ð¾¶Ã´NeÂµ«È¾¶ÐÈÂÅÇNe·ÐÁ°Ä°=Ñ¸¾QyçÙÛìåÆnÆ=RT´a.Ne·Ð¾¬u
u
u

161L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））~ ÁÉËÉËb«¶1JF¬s;
Structural study on the reaction mechanism of
a free serine kinase
NX- 1mI( 1RH 2+C/H 2
zq<. 2A" 1
1 !U2 !,ma 2

$k«­¬VS`«­ªT?¬vd{'¶ ®$k¬¿ÀÃ»ËV3d{­]Lck²]EVS¬±¬©­Yª¤§¶>|y#Q2$k
Thermococcus kodakarensis ¬¿  1. ¿ÀÃ»ËV3«§ SerK ÀÃ»ËV3« ¸¶9r¬~ t%¶1ÁÉËÉËb SerK q¥¤¡SerK ­ ADP '[«~¬ÁÉË
¹ÉË¿ÀÃ»Ë¬ ¨¶ÇÀÆ¼ÁÉË¹V3¶Í 1ÎBb­°§)·¡~¬ÁÉË¹ÉË¶b¨µÂËÅ¾x¬ÁÉËÌÀÊ½ÄËM¹ÉË¶b©­Yª¶±¬¨¶¯¡·¬:^¬ÉËb©±K2¹_ª¡°9r¬
1JF¹6¥©@0¨¶
4­°«SerK ¬ AMP p ¬F}¹ 1.65 Å si¨O)¡¬F}´
AMP ¬ÉË|¬ 4 ¥¬2MÍE4,
E30, E36, D69Î¬£*ª©± 1 ¥t%M¢©h´·¡·´¬ 4 M¹··ºÈÄË«g8¶©E30A © D69A ¬Y ¨­P2l ¤¡¨1\¬F}¹7³©·´¬ Y ¹
W§ÁÉË© ADP ©¬e=¹n¤¡¬eDD69A ¬e=­ X f¬5iF}O)«­j´ª¤¡E30A ¬e=F}­ 2.0 Å si¨O)¨¡¬F}¨­xe «V3S¨¶ÇÀÆ  2. SerK-E30A ¬ F}¼ÁÉË© AMP e§¡Í 2ÎZo ©xe ¬G&¨­·´¬F}«¦§ SerK ¬1JF«¥§wu¶162L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A

真菌由来ｔＲＮＡリガーゼ(Trl1)のリガーゼドメインの機能・構造解析
Structure analysis of ligase domain of fungal tRNA ligase
村井綱二１，加藤公児１，２，姚閔１，２
１ 北海道大学生命科学院，２ 北海道大学先端生命科学研究院
生命活動に必須なタンパク質合成はリボソームによって行われる．
tRNA は細胞内で mRNA 上のコドンに対応するアミノ酸をリボソームへと運搬するアダプター分子として機能している．DNA から転写された
tRNA が機能を有する tRNA になるためには，様々な成熟化過程を経ることが必須である．一部の tRNA 前駆体には余分な配列であるイントロンが含まれており，そのままではアミノ酸を運搬できない．tRNA が成熟化するためにはヌクレアーゼがイントロンを切除した後，残った２つの必要な配列であるエキソンがつながれる必要がある．この反応は tRNA スプラ
イシング反応と呼ばれており，多くの生物では２つの酵素（CPDase，キナーゼ）により末端の修飾が行われた後，tRNA リガーゼがエキソン同士をつなぐ．一方で，真菌由来 tRNA リガーゼ（Trl1）は３つのドメインの働きにより，たった一つの酵素でこの一連の反応を触媒している．現在，多くの真核生物のゲノム解析が完了しているにも関わらず，Trl1 とホモロジーを持つ遺伝子は哺乳類のゲノム中からは発見されていない．そのため，Trl1 は有用な抗真菌薬となる可能性が示唆されているが，この反応機構の詳細は不明である．
本研究では，Aspergillus oryzae 由来
Trl1 のリガーゼドメインの構造を分解
能 1.9Åで明らかにした．得られた構造
では、活性部位の Lys117 に、発現に用いた大腸菌由来の AMP が結合しており、この AMP の認識に 7 つの残基が関わっていることが明らかとなった（Fig1）．既に構造が決定されている
Trl1 のホモログタンパク質 T4 RNA リ
ガーゼ Rnl1 の構造と比較した結果、塩基の認識が異なっていることがわかっ
Fig 1. AMP の認識た．そこで、基質認識に関する知見を得るために， NTP を用いた基質特異性の解析を行うことで、Trl1 の特有の基質認識機構の足掛かりをつかんだ。また，活性部位周辺の残基の変異
体の活性測定からも Rnl1 とは異なる結果が得られており，Trl1 が特有の反応機構や tRNA の認識機構を持つタンパク質であることが示唆された．

163L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL5A、PF-NE3A、PF-BL17A など

CK2 サブタイプ間で異なる hematein の相互作用様式の解明
Structural insight into binding of hematein to CK2
catalytic subunits
露口正人１、平澤明２、仲庭哲津子 3、櫻井淳史 4、仲西功 4、木下誉富１
１ 大阪府大院理、２ 京大院薬、３ 大阪大蛋白研、４ 近畿大薬

Casein Kinase 2（CK2）は 100 種以上もの基質のリン酸化を介して様々な細胞プロセスに関与するセリン・スレオニンキナーゼである。CK2 の活性サブユ
ニットとして CK21、CK22 の 2 つのサブタイプが存在する。CK21 は広く発現しており、がんなどの疾患の創薬ターゲットとされている。一方、CK22は精巣で特異的に発現しており、その阻害により精巣毒性などの副作用が懸念されるため、オフターゲットとされている。したがって、副作用を抑えるためには高選択性 CK21 阻害剤の創成が望まれる。2 つの立体構造は非常によく似ており、選択性を高めるための構造知見は得られていない。
CK2 阻害剤 hematein は CK21、CK22 に対する阻害活性は同程度であるが、CK21 に対しては ATP 非拮抗型阻害型、CK22 には ATP 拮抗型阻害型と、それぞれ異なる様式で作用する。この差異には何らかの構造的要因があると予想される。
そこで、本研究では、CK21、CK22 について hematein との複合体構造を解析した。CK21 は PF/NE3A で、CK22 は SPring-8/BL44XU で X 線
回折データを測定した。HKL2000 で回折イメージの積分及びスケーリングを行ったところ、CK21 は 1.91Å、CK22 は 3.09Å 分解能のデータが得られた。空間群は CK21 は P212121、CK22 は P1 である。初期位相は、既知の CK21 (3WAR) あるいは CK22 (3OFM) の構造を鋳型として molrep を使った分子置換法により決定した。精密化は DSmodeling/CNX、Coot/Refmac5 などのプログラムを用いて行った。CK21 は Rwork = 22.6% /Rfree = 25.6%、CK22 は Rwork = 24.8% / Rfree = 33.0%となっている。hematein は
共に ATP 結合サイトに結合していたが、その結合様式には明らかな違いが見られた。CK21 については、His160 の側鎖が大きく反転して hematein と相互作用していた。CK22 では His161 (CK21 の His160 に相当) の側鎖
は ATP 結合サイトと逆側を向いており、hematein との相互作用は全く見られなかった。このことから、CK21 に対する hematein の阻害様式は His160の側鎖の反転が重要であると結論される。

164L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））なし

タンパク質結晶化条件の高速スクリーニングのための画像処理による沈殿検出
Precipitation Detection with Image Processing for
Fast Screening of Crystallization Conditions ofProtein江並和宏 1，平木雅彦 1，千田美紀 1，千田俊哉 1
1 高エネルギー加速器研究機構
タンパク質結晶を効率よく生成するための手法として，「すぐ見る法」がある．
「すぐ見る法」は，結晶化直後のドロップを観察するスクリーニング手法である．
タンパク質溶液と結晶化試薬の混合時，下図のようにドロップ中に一旦沈殿が生じ，結晶化試薬の拡散に従い沈殿が減少していく現象が見られる事があるため、これを観察することで結晶化の可能性を推測し，効率良くスクリーニ
ングを進めることができる．
現状は人間が沈殿の発生・変化を観察し，結晶化可能性を判定しているが，この判定を機械的に可能にすれば，専門家を要しない自動判定や，溶液作成
及び判定の並列化による高速化が可能になる．そこで，機械的な結晶化期待値判定によるスクリーニングを目指す．
このためには，沈殿が生じてから消えていく過程の沈殿量の数値化が要求される．そこで，時間差のある 3 枚の画像の差分から沈殿を検出する手法を提案し，溶液混合時の映像から沈殿部分を抽出できることを示した．
沈殿
沈殿
沈殿量

混合前

最大沈殿時

沈殿減少時

溶液混合
時間

タンパク質の結晶化時の映像と沈殿変化の数値化グラフ

差分による沈殿検出

165L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））                            ³«§¯¦¦¶³ ØôîKÑê ¦¶³ ékßä
ÿČěąĆęďāĤģĦĥìJOµÉÇÊºÉÊÇ¸ÂºÅÃÆ¸ÇÀÈÅÄÅ½É¿¼ÁÀÄ¸È¼ÆÇÅÉ¼ÀÄ©¦³® ¹ÅÊÄ»ÉÅ¦¶³¸Ä»Ë¸ÇÀÅÊÈ¦¶³¸Ä¸ÂÅ¾Ê¼È
F,8/  Ě[aBğĞġğ r!&.ÏĠ r!&)&)X.)bec ġ r!&đĘęĈüûĄęĆěÒlzÓ©¦³® í ¨¸¨¸° R7 ì µ¼Ç¶¿Ç ÿČěąèÔ÷ÐÝìĆęďāíYèpĖęÞø÷ÝéèR7ßÏjnMúà÷ÝéÚùÙåçÕ
÷ÐÝøðèìJ)]beèVgàïÛUíÏ¦¶³ k"ëí%<ìP'Ú(ßçØöÏûČĘĂk4èë(ßäPPì<Úâìððk ë(ÞøçÕ÷ÝéèÔ÷ÐâìäñÏ¦¶³ PyóĖęd6ìþęĊĘĐěòñäþčėĀěì;ú~}à÷äñìĕĉėë ßçÕ÷Ð· mëô÷Pi'9$ëØÜ÷+ó#
ì_ ZK0ëßçìaxíÏÿČěąâìòììĖę#dLJ
ì|jìy@ó ©¦³® ì+ì\ëò2fæòìéC3Þø÷ÐâÝè
DbeèíÏ©¦³® é ¦¶³ Øôî ¦¶³ w ì · mkAJyGútÕÏâøãøì ¦¶³ k ë`^ßäJOútÖÝéú^]éßäÐÒ*ÓÿČěąċĔýęN#< ¡¡ú&qsè&\WÞáçhvßä ©¦³® úZßäÐkAëí±­µ²Ï¦¶³ ûČĘĂëíÏµÀ¾Ã¸ ¦Â»ÇÀº¿ vì¦°³³Ä³Ĝ¦±³ĝé ¦¶³ÎµĜ¦¬µĝØôî ¦¶³Ï-ëí °¾¨Â úZÕçÏ
£® ìEèĎęĀęĂċĘćĒQëôökAßäÐkAíÏ¦ÆÅ Ï©¦³®¦¶³Ï©¦³®¦±³°¾Ï©¦³®¦¬µ°¾Ï©¦³®¦¶³°¾Ïâøãø Æ­ é ¢ ì  EètåäÐðäÏĕėOÚ ©¦³®¤ûČĘĂĢ-¥¤¤ëê÷ôÖë ©¦³® TSëûČĘĂé-ú×çÏâøúĆęďāTSéßäÐ· m:*í ®ª®³« ¦´§¯¦ ëçtÕÏ³¿¼ÄÀÌ é ºÅÅÉ ú ZßçĉěĆyGútåäÐÒkHÓ
 y o  Í ì ©¦³®¦¶³ ´½Ç¼¼¤¡¢ Ï  Í ì ©¦³®¦¶³°¾
´½Ç¼¼¤ Ï Íì ©¦³®¦¬µ°¾ ´½Ç¼¼¤£¡ìJÚ=äë5õøäÐâøãøìJëØÜ÷ĤģĦĥéûČĘĂéì_ ZìOó ¦ÆÅ éìPì ì>ìÕëæÕçÏI{útåäÐ|jê~}í1?ìēăĆ
ě\uëçtÖÐ

166L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A、PF-AR-NW12

アーキア由来新規キチナーゼの結晶構造
Crystal structures of a novel type of chitinase fromarchaea○西谷優一 1、堀内あゆみ 2、金井 保 2,3、跡見晴幸 2,3、三木邦夫 1,3
1 京大院理、2 京大院工、3 CREST
超好熱性アーキア Themococcus chitonophagus は、キチンを唯一の炭素源とする培地より単離された菌である。このような培地で生育できる超好熱菌の報告例はこれまでになく、本菌の高いキチン分解・資化能の解明を目指して、本菌のゲノム解析が行われた。その結果、新規キチナーゼの可能性がある
Tc-ChiD 遺伝子が見つかった。Tc-ChiD は N 末端にシグナル配列を持ち、それに続いて超好熱性アーキア T. kodakarensis 由来キチナーゼのキチン結合ド
メイン（ChBD）と相同性のある領域を二つ持つ。一方、C 末端ドメインには既知
糖質分解酵素との配列相同性が見られず、GH18-type キチナーゼで保存されている DXDXE モチーフすら存在しない。本研究では、Tc-ChiD の X 線結晶構造解析を行い、新規キチナーゼの全体構造ならびに反応機構を明らかにすることを目的とした。
全長タンパクの大量発現は困難であったため、推定キチナーゼドメインのみを有する Tc-ChiD(ΔBD)を作製したところ、大量発現可能でかつ活性を有するサンプルを得ることができた。このサンプルを用いて結晶化を行い、基質非結合型ならびに基質結合型構造を決定した。またその際、結晶化の温度を 20˚Cから 35˚C に上げることで、20˚C の時とは形状の異なる結晶を得ることができ、分解能を 2.65 Å から 1.95 Å まで向上させることができた。現在は、全長タンパ
クの大量発現・結晶化にも取り組んでいる。
明らかになった Tc-ChiD(ΔBD)は、アミノ酸配列からでは予想できなかった三
つ目の ChBD3 と、活性ドメインの二つから構成されていた。構造が類似した酵素との比較から、Tc-ChiD は約 100 残基からなる本酵素特有の C 末領域を有することが分かり、それが ChBD3 の固定に重要な役割をしていることが分かった。また、活性ドメインに基質の結合を確認し、反応に関わる残基を予想した。これらの構造情報を元に、生化学的解析も行った。発表では、Tc-ChiD の反応機構とキチン鎖結合について議論したい。

167L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A、PF-BL５A、PF-AR-NE3A[NiFe]ヒドロゲナーゼ成熟化に関わるアーキア由来
HybD の X 線結晶構造解析
Crystal structure of a [NiFe] hydrogenase maturation
protease HybD from Thermococcus kodakarensis
KOD1
権 成鶴 1、西谷優一 1、渡部 聡 2、金井 保 3,4、跡見晴幸 3,4、三木邦夫 1,4
1 京大院理、2 東北大多元研、3 京大院工、4 CREST[NiFe]ヒドロゲナーゼは、水素の酸化還元反応を触媒する酵素である。この酵素は、大サブユニットと小サブユニットから成り、大サブユニットの活性部位には Ni と Fe が組み込まれている。この金属クラスターの形成には、成熟化と呼ばれる翻訳後修飾のプロセスを必要とする。成熟化の最終段階において、
HybD または HycI の成熟化プロテアーゼは、大サブユニットの C 末端残基の切断を行う。Ni イオンが成熟化プロテアーゼの基質認識及び切断に重要であることが分かっているが、このプロセスに関しての詳細はまだ不明である。本
研究では、この基質認識及び切断機構を理解するために、好熱性アーキア
Thermococcus kodakarensis KOD1 由来 HybD（TkHybD）の X 線結晶構造解析を行った。
TkHybD を大腸菌により大量発現した後、陰イオン交換クロマトグラフィーと疏水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製し、結晶化試料を調製した。結晶は Polyethylene glycol 6000 を沈殿剤とする条件で得られ、ミクロシーディング法により結晶の質を改良した。PF beamlineなどを使用して最終的に 1.8 Å 分解能の回折データを収集し、分子置換法により 結 晶 構 造 を 決 定 し た 。 解 析 の 結 果 、 大 腸 菌 由 来 HybD や HycI 、 ま た
Peptidyl-tRNA ヒドロラーゼと同様に、TkHybD には金属認識及び触媒作用に必要であると思われる残基(Asp16, Asp57, His89)が保存されていることが分かった。さらに、我々はリガンド結合部位を予測するプログラムを用いて、これらの残基が Ni イオンの結合部位を形成する可能性が高いことを示した。現在は、TkHybD の構造に基づいて、TkHybD と[NiFe]ヒドロゲナーゼ大サブユニットとの複合体の結晶化実験を行っている。

168L（生物物理，生物化学（結晶構造解析）） § § § § § § ¼»¸©¶»«®§ Æ¶¹Ã§Æ¶¹Ã òo×ÜĆċøċ÷þĈčýOæ§
À½¸ D/'I3¥§
TOF Neutron Diffraction Experiments ofManganese Catalase using IBIX
9p- ¬Čwu: ¬ČL? ¬Č0M ¬ČpxR ¬Č,¦C ­§¬ ),1ĄĊċÿõôy}üċþč¨§­§º©¾µ¿· üċþč§)vn%h[V Æ¶¹Ã çþċĂùČQ]/OæO
D/[VòÎÕâòtså º©¾µ¿·§¼»¸ æăčćĈöċ ¶»©«® åÖñÜ¤NĎÀ½¸ď(D/'IáÌðđÆ¶¹Ã çăčć@>òAðÜ
ëå"(aSòD/cå o×àÍðđÕæÜë'IdÒ À½¸ K#
å=ÒðiDòQ×àÍðđ,ÓäOY/òQÙðúċąĉåÐÍàçĐ¡ï"Î'IdÒ~K#æêäîÚĐNK#áäð DÒÌðđÕæ
íÎä+"Đ'Idæ¢|_rÒBâäðđÕÎ×Üj^òéÏĐHËç;G ­³ <>éáåĒßæY/Ò ¬®°§ Ê éáæþċĂùOæD/[VòÎÕâòt\â×àÍðđ'ĐÿûāĀčþòAðÜëĐ¦>.g 
 qUæĆċøċ÷þĈčýæOæ À½¸ D/'
I3¥òÞÜđÕæOç Ä Ò ¬®­§ Ê æKOĎ~ ­¬®ďå8Ù
ðđÁª§Áª§¶ÄÉÆÈÆÈ îæ*$òå×àĆċøċ÷þĈčýæOòÞÜđ®« !æZ&òQÙð Æ¶¹Ã òoÍàĐFæOK åßÍàĐ& ®««§ÇÂ æĂĉûD/ăčćò ¯¬ Nf5×Üđ o×ÜD/`ç ­ª°©±ª°§ Ê áÌðđP7£ Å Ò ­ª²§ Ê {>æ À½¸ 'IòAÜđA
îñÜĀčþÑî6U[VÒ ÑãÎÑòJÙðÜëĐ­ª«§Ê 
éáæ'Idæ|mòÞàĐ¡ï"Î5æäïæ{>òX×ÜđÛæWĐ æZ&Ď­!§´§°«©²° >ďæÎÝĐäð DÒÌð5
æ"Ò,ÓÔäðìæÒÌðÕâÑÞÜđÕñå4× > â¦ æZ&áçèâóãäïÒnØäÍÕâÒÑÞÜđkíÔ À½¸ D/'
I3¥òÎÜëåçĐäÞÜ5æ¢|_ærÒBáÌðđĆ
ċøċ÷þĈčýæ+"ĐOæ4zDÒ¦ÔĐäÞÜ'Idòe×àìĐ ä@>ĀčþÒæ'ITáAðÕâÒáÓðĐ§ ÕæÜë ­ª«§ Ê æD/O[VåBä'IĀčþÒl3säb2NáAáÌðâEÖñðđ

169L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A、PFAR-NE3A、PFAR-NW12A

時分割 X 線結晶構造解析による
酸化ヌクレオチド加水分解酵素の反応機構の解明
Reaction mechanism of oxdative nucleotidehydrolase
平田啓介、中村照也、吉川紘平、池鯉鮒麻美、池水信二、山縣ゆり子
熊本大院薬生命活動で生じる活性酸素種は DNA、RNA、さらにはその前駆体であるヌク
レオチドに酸化損傷を与える。その中でもグアニンの 8 位が酸化を受けた 8オキソグアニン（8-oxoG）は、生成頻度が高く、シトシンのみならずアデニンとも同程度に塩基対を形成できるため、8-oxo-dGTP が DNA 複製時に新生鎖へ取り込まれると突然変異を誘発する。ヒト由来 MutT ホモログは Mg2+または
Mn2+の存在下で 8-oxo-dGTP を 8-oxo-dGMP へ加水分解することで DNA 鎖への取り込みを阻害し、8-oxoG に起因する突然変異の防御系の一つとして機能している。
これまでに我々は、X 線結晶構造解析および時分割 X 線結晶構造解析により MutT ファミリータンパク質の基質認識機構および反応機構の解明を行ってきた。今回、低温トラップ法を用いた時分割 X 線結晶構造解析により、ヒト由来
MutT ホモログの加水分解反応過程を追跡した。8-oxo-dGTP の複合体結晶に Mg2+または Mn2+を含む溶液に浸漬させて結晶内反応を開始させた後、反応時間毎に 100K の N2 ガスで急速凍結して反応を停止させ、反応開始から終了までのそれぞれの中間体構造の解析を行った。本発表では、反応中間体構造から明らかになったヒト由来 MutT ホモログの加水分解反応機構について報告する。また、これまでに我々が明らかにした大腸菌 MutT の反応機構と比較、検討したので報告する。

170L（生物物理，生物化学（結晶構造解析）） Ï Ï Ï Ï Ï Ï áàÝÒÚàÓÖÏ

ª2,»wÁ³s­¤ iBIX -ą l¾Ĉ ³s-IBARAKI biological crystal diffractometer iBIX
-current status and recent results-hM ÔĿE;Å ÔĿÈF ÔĿ º>i ÔĿ:$ÎU ÕĿuaz ÔĿÏÈH ÖĿ n ÔÏÔª2: ëÝäÛïÕßÙÜÙÏßÒãÙäÛ ħļĩľïÖ r :9ÏÏ Î=Ĉ"¡kW=.\ćđĔwÁ³sĉï¨ć ³¦Ć è £ĬľĩĄĉ±ö/ÊĆ|$=ĐĴĻĭļZćĂòăïè £.
\ĬľĩąĈ®ĆćđēïIĈÎòY4ėQĔúąöĄ÷ĔðĄ!ė#ĎĔ|Đ=¬ËĈ|$=Ĉ¶ ĆY4ĉÎ=Ĉ=·¹Đ?%V{w³ićCüăÇ¯Ć°ėóĔúąöoPĄ
÷ĔðİěĥĹľĴĪĭĆW=wÁ³sėAýĔĀĎćïª2ćđēßÒãÙäÛ Ĉ »î,?AÍg´ÐáàÝÑćª2, »wÁ³s­¤ÐëÚÞèÑöÉĽL´ûĕĀðëÚÞè ĉ ÕÓÓØ G ÔÕ mõĒª2:?ĈÃ¼¢]ĽĈďąÿĈėÉ<üïÕÓÔÕ GIćv-ĈÎIöĆûĕïĩļığ
»µdċĈptö&¦ąĆāĀðÕÓÔÖ GIõĒĉïÀ-ĈÔáç ċĈ6Nć(ĖþăïyµdģěĦ ÔììÖ Ĉ@ö&¦ąĆĔúąė
^üïĬľĩIĈ)ĽķľĤľĮľĦċĈCVėąüĀïĨĳĭĜĝ
ęôđĊµd+½5­¤ĈÉėÂĎăòĔðÏ
Ï NIĬľĩĈIė)ýĔĀĎćĉïv-ć±ûĕĔ Úíéêê%DĈ ¤ėBćýĔT¯öñĔðúĕėAýĔĀĎćï"¡kĈÚíéêê %Dė@ýĔúąćđĔv-JyĈB@ė«āĀðv- ÖÓ'ăĈJyąĢĮĞĶľĩĈĞĳħĪĭ²ö}čēï%D ¤ėýĔĀĎćT¯Ć æÚ «ĈIö)üï^bùĈIĐQĒĕĔt=@b
ĈIö)üĀðûĒćïĬľĩĨĳĭĜĝęĈġļĵľįļĭĄñĔćĂòăĈeĀĆfėÉüĀðÚíéêê %DĈOė¥[üïÌ3OėlÄýĔfą åâÝ f)ćCüăĴĻĳĘěĹĳĚĪīĚļĠ
ėÄVüĀĄñĔðúĕćđēĬľĩIïć%DĈ§IĈ)ė0āĀðķľĤľöđēòjò5ė_ýĔĀĎć@RĽĬľĩĨĳĭĈķľĤĲĸīĚľ)Ĉ`©ďÂĎăòĔðčĀï9xĆķľĤľĮľĦćCVýĔĀĎïµdĈ8Æq ė7ûþĔ­¤ąüăïıĹĥĺľĤľD­¤ĽÎ­¤ĽK ­¤ĽX­¤ĈÉė«āăòĔð1ïķľĤľAÍćýĔČø´¤Ľ¸cĄñēïÕÓÔ× GIoĈķľĤľÉ<ė^üăòĔðÏÏ p¬Ąĉ¿üĀl¾ĈÉ~ćóăïëÚÞè ćđēW=wÁ³sĈSėõüăQĒĕĀ³sćĂòăď4*ýĔðÏ171L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL5A、AR-NE3A

蛋白質脱イミノ化酵素 PAD1 の構造と結晶化条件の改良
Overall structures of PAD1 andimprovement of the crystal
永井杏奈 1,4、眞下隆太朗 1,4、西條慎也 2、清水伸隆 2、
高原英成 3,4、海野昌喜 1,4(1.茨大院理工、2.高エネ研、3.茨大農、4.茨大 iFRC)
蛋白質脱イミノ化酵素 peptidylarginine deiminase （PAD）は、Ca2+存在下で、蛋白質中のアルギニン残基をシトルリンに変換する酵素である。哺乳類には
PAD1-PAD6 の 5 種類のアイソザイムが存在する。我々は、毛髪内に多量発現する S100A3 タンパク質 (S100A3) がシトルリン化を受けていることを見出したことから、毛髪内で起こるシトルリン化反応に興味を持った。毛髪にはPAD1, PAD2, PAD3 の 3 種類が存在している。毛髪キューティクル細胞内に多量に存在する PAD3 は S100A3 の Arg51 を特異的にシトルリン化する。この翻訳後修飾により、ホモ二量体で存在する S100A3 は四量体に構造変化し、Ca2+,
Zn2+との親和性が上がることから、PAD3 による S100A3Arg51 の特異的シトルリン化は、Ca2+, Zn2+の恒常性維持に関わる重要な反応であることが明らかになってきた。一方、in vitro で PAD1, PAD2 は S100A3 の 4 つすべてのアルギ
ニン （Arg3, Arg22, Arg51, Arg77） をシトルリン化し、PAD3 とは異なる基質特異性を持つ。本研究の最終目的は、PAD1, PAD2 と PAD3 の基質認識の相違
を構造生物学的に解明することである。
当研究室では、PAD1 の結晶化を Ca2+存在下で行い、X 線結晶構造回折実
験から 3.7 Åの分解能を得られた。PAD1 結晶の構造解析から、非対称単位
中に 2 分子存在していること、活性部位に隣の細長い N 末端が入り込む構造であることが明らかになった。しかし、その 2 分子の配置が PAD2 や構造既知である PAD4 二量体構造とは明らかに異なる構造であった。これらの構造が結晶内分子パッキングによる人工的なものである可能性を考慮して、溶液中での構造を決定するために、X 線小角散乱 (SAXS) 実験を行い、溶液中の構造を解析した。X 線小角散乱による溶液構造解析において、PAD1 は、細長い棒状の形状を示し、単量体であることが明らかになったが、基質認識の違い
は全体構造のみでは解明できないと判断し、原子レベルの解析が必要となった。
PAD１の高分解能構造解析を目指し、結晶化条件の改良を行ったところ、PF の AR-NE3A で、3.2 Åの分解能に相当する回折データを得ることに成功した。また、阻害剤を用いて共結晶化を行い、阻害剤結合型の構造の解明を試みている。本シンポジウムでは PAD1 の構造についてと、高分解能化を目指した結晶化条件の検討・改良の状況について議論する。

172L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       ·°¡­´¤¬Ê¨¬Ê¤ª¬Êµ»Ĕĕ¬Êµ¯¦J~KXSäìïąăĎďćĄčþēýå    
*ZXSTime-resolved crystallograhy of the reaction
mechanism of nitrile hydratase
2I ¤Ê0F ¤ ¥Êw ¦ÊYPa ¤Ê 4 ¦Ê > ¤Ê  
kq\F ¤
¤ R3)ĒĒ3Ê¥ xq)ĒĒ3,cÊ¦ #!1)ĒĒl
~KXSá<ĈĐüûòČąþēØïÕâæXSå åßá
ÍïË@ÌæÊąăĎďćĄčþēýµ±¼Æ¾òQGä<ZXåJ~KXSäî}óáÎï ¤ ¥Ëµ±¼Æ¾ æôöĎďôċĄëąøÿđôċĄå3
Vnoä5ÓpÖðïoVsäMê?×Û|áÍïË×Ñ×ÊßåòÔÛúûāõđ +ò$èçÛæøĆďă âÎÏWéà
hrã`=;òêßÕâÑíÊÚå*ZXæOÜIíÑäãÞàÎãÎË
PuzáæÊ& µ±¼Æ¾ åJ~KXSäìîÊ< å~
KXòIíÑä×Û ¦Ë<6òn&å £¢¥çá ÖÙÛ !¸¨©³ (r òąăĐúďá`=&ä×ÛêåòLAá~K×Ê'â×àÄ¿È¼ÀÃÂ¿ÇÅ¿À¾ òb×ÊyÌåJf/ò×à µ¶ òÖÙà|<òñÙÛÍâÊ~äìÞà<ò[ÖÙÊ~KXò_-×ÛËÚå~TÊµ¶ åä ÞàÊ'Ċ÷ĀăäîçðàÎÛ'Ò|ä~"×Ê<J ¨£ å~KáæÊ'åąăĎďe|ät8Øï+.6äæúûāõđåß "®ÉÆ¤¤§¡¹¶± å|+ÒN~"×àÐîÊnogáÍï Ä¿È¼À¼Á¿½¾ äWéà ÛXò9?×àÎÛËØ
ãñÝÊ'Òå{ ©  7ä~"×Û:Ê"®ÉÆ¤¤§¡¹¶± å|Ò'åąăĎďe|ä^UED×àmiå< ò9?ØïÕâÒvÖ
ðÛËÚÕáÊ¤«¶ čĉď×Û]á*<òÖÙà °º²¸ áS×Û~TÊ*ùõöďä "®ÉÆ¤¤§¡¹¶± å ¶ +Òd*å]+âCÖðïÕâ
òIíÑä×ÛËå~TÑíÊ"®ÉÆ¤¤§¡¹¶± Ò'ò^UEDØïH
*ČĂďòB%×ÛËFj(1) K. Hashimoto, H. Suzuki, K. Taniguchi, T. Noguchi, M. Yohda, M. Odaka, J.
Biol. Chem. 2008, 283, 36617–36623.
(2) Y. Yamanaka, K. Hashimoto, A. Ohtaki, K. Noguchi, M. Yohda, M. Odaka, J.
Biol. Inorg. Chem. 2010, 15, 655-665.
(3) Y. Yamanaka, Y. Kato, K. Hashimoto, K. Iida, K. Nagasawa, H. Nakayama, N.
Dohmae, K. Noguchi, T. Noguchi, M. Yohda, M. Odaka, Angew. Chem. Int.
Ed. 2015, 54, 10763-10767.

173L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-NW12A

ブルー銅タンパク質 Met16Gly 変異体の構造と電子移動反応
Structure and electron transfer reaction of blue
copper protein Met16Gly pseudoazurin mutant
玉置彩緒理、大下宏美、山口峻英、海野昌喜、高妻孝光
茨城大院・理工

脱窒菌 Achromobacter cycloclastes 由来のシュウドアズリン(PAz)は、脱窒過程において亜硝酸還元酵素(NiR)、亜酸化窒素還元酵素への電子供与体として機能している。第二配位圏には Met16 残基が位置し、活性中心の銅イオンに配位する His81 との相互作用を通して、機能発現と活性中心構造の安定性に寄与していることが知られている[1]。本研究では、Met16 をアミノ酸側鎖が水素原子である Gly に置換した Met16Gly 変異体を作製し、弱い相互作用の変化が構造や電子移動反応に及ぼす効果について検討した。
Met16Gly の電子吸収スペクトルを測定したところ、453 nm と 593 nm に吸収極大を与えた。453 nm と 593 nm の吸光度比は A453 / A593＝0.47 であり、Wild
Type (A454 / A594＝0.46)とほぼ同じ値であることから、活性中心の構造は Wild
Type と同様の構造を有しているものと考えられた。Met16Gly の酸化還元電位は、313 mV vs. NHE であり、Wild Type (260 mV vs. NHE)よりも 53 mV 高い酸
化還元電位を有することが明らかとなった。電気化学的に得られた Met16Glyと NiR との電子移動反応速度定数は 5.76×103 M-1 s-1 であり、Wild Type (1.42×105 M-1 s-1)よりも約 25 倍遅くなることが判明した。このことは、Met16Gly の酸化還元電位が 53 mV 高いこと、および、Gly 残基を導入したことによって活性中心近傍での弱い相互作用に変化が生じたことによるものと考えられる。
酸化型 Met16Gly（pH 7.5）の結晶について X 線結晶構造解析を行ったところ、活性中心の構造は酸化型 Wild Type（pH 7.5）と同様の構造をとっていたが、Gly に置換した 16 位周辺の構造は、2 分子のうち chain A では Met16 側鎖の位置に水分子と考えられる電子密度が見られ、chain B では Lys10 から Glu19のループ構造がディスオーダーしている構造をとっていることが明らかとなった。このことから、Gly 残基の導入によりオープンスペースが与えられると、ループ構造が変化しやすくなるが、Met16 側鎖の位置に水分子が存在すること
で His81 との間で新たな相互作用が生じ、ループ構造が安定化すると示唆された。
[1] R. F. Abdelhamid, Y. Obara, Y. Uchida, T. Kohzuma, D. M. Dooley, D. E.
Brown, H. Hori, J. Biol. Inorg. Chem. 2007, 12, 165-173.

174L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A

2 台の二次元検出器を用いた高角回折 X 線データ収集環境
High-angle diffraction data collection environment using two
area detectors
松垣直宏 1、山田悠介 1、Dorothee C. Liebschner1、平木雅彦 2、千田美紀 1、
千田俊哉 1
1 KEK-PF 構造生物学研究センター、2 KEK 機械工学センター

低エネルギーX 線を利用した軽原子 SAD（単波長異常分散）法は、試料中のタンパク質に自然に含まれている軽原子の異常分散シグナルを利用して位相決定を行う結晶構造解析の手法である。試料への重原子導入を省けることによる解析の高速化だけでなく、重原子導入自体が困難なタンパク質の構造解析等が期待される。しかし、イオウやリンなど軽原子からの微弱な異常散乱シ
グナルを精度よく測定することには多くの困難があり、現在においても一般的な位相決定法として普及していない。
軽原子からより大きな異常分散シグナルを得るには、より低エネルギーの X
線を使用するのが一般的に有利である。しかし回折データ収集においては、
試料そのものや大気による X 線の吸収、回折角の増大による検出器側の制約等の問題がよりシビアになり、精度の高いデータ収集を困難にしている。
PF-BL1A では、一般的な構造生物学ビームラインがカバーできない 4keV 近
傍の X 線を用いると同時に上記問題を克服すべく、データ収集・解析法の開発を進めている。高角の回折 X 線を精度よく測定するため、二台の二次元検出器をヘリウムチャンバー中で V 字状に配置しデータ収集するシステムを開発中である。2015 年 6 月の予備実験では 2θが 90 度近傍までカバーされた状態でデータ収集を行い、データ統計が妥当なこと、軽原子 SAD 法による位相決定が可能であることが示された。2015 年度冬の停止期間に 2 台の検出器の角度をそれぞれ 0～30 度まで独立に変更できる新型の検出器架台のイ
ンストールを行い、通常配置及び V 字状配置でのデータ収集を切り替えて実験ができるシステムを構築予定である。2－3 月のビームタイムでテスト実験を経た後に来年度からのユーザーオープンを目指したい。

175L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF BL-1A, 17A

MR-SAD を用いた転写因子の結晶構造解析
Structural study of a bacterial transcription factor by
MR-SAD
秋山友了 1、山田悠介 2、矢嶋俊介 1
1
東京農業大学バイオサイエンス学科、2KEK-構造生物学研究センター[背景] ヒドラジドは一般式 R1C(=O)NR2NR3R4 で表される化合物である。原料のヒドラジンやカルボン酸は安価で入手が簡単であり、合成も容易であるため、医薬品、農薬、染料、塗料など工業的に広く用いられている。しかし、天然にはわずかにしか知られておらず、その代謝メカニズムについて詳細は不明である。近年、ヒドラジドを単一の炭素源として生育可能な細菌、Microbacterium sp.HM58-2 株が土壌から単離され、ヒドラジド分解酵素
hydrazidase が同定された(1)。この酵素遺伝子はグルコースを炭素源とした培地では発現が抑えられるのに対し、ヒドラジドを炭素源とした培地において発現が誘導され、その制御は IclR 型の転写因子によることが予想された。そこで、ヒドラジド代謝機構を明らかにするために、IclR の立体構造解析に着手した。
[方法･結果] IclR は約２５０残基からなり、すでに大腸菌、Rodococcus,
Thermotoga 等由来の結晶構造が明らかとなっていた。そこで、常法に従い、
Microbacterium 由 来 IclR (mi-IclR) を 大 腸 菌 を 用 い て 大 量 発 現 さ せ 、Ni-affinity カラムにより精製を行った。ハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶を得たが、非常にもろく回折データ収集が困難であったため、カウンターデ
ィフュージョン法を用いることで、再現性良く良質な結晶を得ることに成功した。
PDB 上の IclR は、お互いのアミノ酸配列 identity は 18~21%であるが、基質結合と DNA 結合ドメインが短いα-ヘリックスでつながれた共通構造を取っている。mi-IclR のアミノ酸配列も同様の identity であるため、得られたデータか
らドメインごとに Molrep, Phaser で分子置換を試みたが解が得られなかった。
そこで、MoRDa を使用したところ、非対称単位中に基質結合ドメインが７分子の解が得られ、そのうち２分子が正しい解であると考えられた。BL-1A を利用
し波長 2.7 Å で S-SAD 用回折データ（分解能 3Å）を収集した。XDS package
により integration, scaling を行い、CCP4 suite の CRANK2 に MoRDa の解を用いて、MR-SAD を行った(2)。その結果、非対称単位中にある４分子（ホモ２量体ｘ２）のモデリングがすべて自動で得られたので報告する。
参考文献(1) Oinuma, et al., (2015) J. bacterial. 197, 1115-1124.
(2) Senda, et al., (2015) 日本結晶学会要旨集, p50.

176L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF BL-5A

タンパク質単結晶の高圧凍結法の最適化
Optimization of high pressure freezing method ofsingle crystal of protein
岳 文雪１、飛田 雅之２、田中 伊知朗２３
1 茨城大院理工、2 茨城大工、3 茨城大フロンティア
大形生体高分子単結晶凍結は、中性子回折技術において水素検出感度向上を目的とした核偏極中性子回折実験において重要なものである。通常のタンパク質単結晶の凍結は、不凍液を用いて育成した単結晶を短時間で冷却することで、水をアモルファスのまま、氷の結晶を生じさせずに、結晶を壊さな
いまま低温にする方法である。この方法は、放射光 X 線源で用いる小さい結晶には適しているが、中性子用の比較的大型単結晶には、不向きである。大抵の場合、中性子実験用の大型単結晶は、何個も用意できないことも多く（通常は 1-2 個）、失敗が許されない。なので、大形たんぱく質結晶の凍結法の検討が必要になっている。
2005 年米国コーネル大 Kim らのグループによって開発された約 200MPa まで高圧環境での凍結法が大型単結晶に適用できるのではないかと注目した。
大型結晶が凍結できるような圧力管（内径 6.35mm 以上）やピン（約 3mm ループ付）を特別に追加した仕様の高圧凍結装置 HPC-201(米国 ADC Inc)の市販
1 号機を発注し、2014 年 3 月に設置することができた。
高圧凍結の手順は：①結晶をループで掬う、②ループを凍結ピンに乗せる、③凍結ピンを圧力管にセットする、④凍結ピンごとに加圧する（200ＭＰa まで）、
⑤常圧に戻る、⑥凍結管を開放する、⑦結晶をループステージに移動する、⑧結晶を液体窒素の中に保存する。
従来の瞬間凍結の手順と違うのは、手順④から手順⑧までの作業について、結晶と結晶を触る設備が全部 100Ｋに保持しなければならない。実際に高圧凍結装置を使って高圧凍結実験を行ったところ、最初は予想外に、凍結がほとんどできませんでした。調べてみると、ループ、凍結ピン、圧力管、開放道
具、ループステージについて、それぞれ不具合があった。また、凍結後の結晶の取り出しについても大きなトルクを必要とし、結晶に損傷を与える可能性があることも分かった。それに対して、ループ、凍結ピン、圧力管、開放道具、ループステージの改良をそれぞれ行うことにした。何回も改良したうえ、凍結の成功率が最初の１０％以下から、ほぼ１００％に上がった。
結果として、抗凍結剤と結晶保護剤を使わず、最大体積が 0.8×0.8×0.8 ㎜
3 のリゾチームたんぱく質を凍結した。水をアモルファスのまま、氷の結晶を生じさせずに、凍結できた。以下Ｘ線のディフラクションを見ると、高圧凍結した結晶が瞬間凍結した結晶より、氷のバックグランドが完全に低かった。

177L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF BL-5A

鉄貯蔵タンパク質アポフェリチンへ
Fe2+イオンを導入したときの結晶学的研究
Crystallographic studies of iron storage protein
Apoferritin introduction by Fe2+ ions
矢本早紀 1, 田中伊知朗 1,2
1 茨城大工, 2 茨城大フロンティアセンター【緒言】アポフェリチンは空洞を持つ球状の 24 量体の鉄貯蔵タンパク質である。
分子の大きさは、外径約 130Å、内径約 80Åで、24 量体は F432 という空間群
で 非 常 に 高 い 対 称 性 を も っ て 構 成 さ れ て い る 。 空 洞 内 に は 鉄 を ferrichydroxyphosphatemicelles という形で最大 4500 個貯蔵することができ、生体内で鉄の保存・放出に関与している。アポフェリチンの結晶には Cd2+イオンが配位していることがわかっている。そこで本研究では、Ｘ線回折測定の直前に
Fe2+イオンを結晶に導入することで、Fe2+イオンの結晶構造への取り込み及び、Cd2+イオンに対する影響を調べ、アポフェリチンへの Fe2+イオン導入の効果を結晶学的に考察することを目的とした。
【実験】アポフェリチンタンパク質はウマ脾臓由来の Sigma-Aldrich 製(A3641)を購入した。結晶化溶液は、沈殿剤に Ammonium Sulfate、添加剤として
Cadmium Sulfate、Sodium Azide を用い、293K の条件下で、ハンギングドロッ
プ法によって結晶化した。X 線回折実験は茨城県つくば市にある KEK-PF
BL-5A にて低温 100K で行った。結晶への Fe2+イオンの導入は、測定直前に結晶を硫酸鉄(Ⅱ)水溶液にソーキングすることで試みた。抗凍結剤には
ethylene glycol を用いた。データ処理は HKL2000、構造解析は Phenix、cootを使用した。
【結果】X 線回折実験の結果、分解能はアポフェリチン結晶で 1.75Å、鉄導入を試みた結晶は 2.20Åであった。ソーキングによる結晶の損傷は見られなかった。
分子間結合に関与する Asp80 と Gln82 におけるカドミウムの電子密度分布は楕円体で、異方性温度因子を決定することができた。解析の結果、両構造の比較により、Fe2+イオンの導入を試みた結晶ではアポ体のカドミウムに相当
する電子密度が少し拡がっており、ピーク値が減少した。これは、Cd2+イオン
が Fe2+イオンに置き換わった可能性があると考えられる。詳細な議論は当日
ポスター発表で行う。

178L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF AR-NW12A/BL-5A

多数のヨウ素イオンが配位したリゾチームタンパク質の X 線
構造解析
X-ray structure analysis of lysozyme protein
coordinated by many iodine ions
小林政義 1・田中伊知朗 2, 3
１ 茨城大院理工、２ 茨城大工、３ 茨城大フロンティアセンター【緒言】ヨウ素が体内に取り込まれると、甲状腺に集まり、甲状腺ホルモンが作られる。一方でヨウ素がタンパク質に多く配位することが結晶学的に知られている。本研究では、リゾチームに NaI を加えることで良質な単結晶を作製し、X 線解析を行うことで、ヨウ素のタンパク質中における詳細な配位の様子に関する情報を得ることを目的とした。これにより、ヨウ素の代謝に関するモデル系を構築できる可能性がある。
【実験】リゾチームは Sigma-Aldrich 社より購入したものを用いた。結晶育成条
件は、タンパク質濃度：10-90mg/ml リゾチーム、結晶化濃度：0.5%～5.0%
Sodium Iodide(NaI)、緩衝液：0.050M NaOAc（酢酸/酢酸ナトリウム）pH=4.5、温度 293K、結晶化法：ハンギングドロップ法で結晶化実験を行い、約 0.5mm3の結晶が得られ、KEK-PF AR-NW12A および BL-5A において低温 100K にて X 線回折および解析を行った。
【結果・考察】X 線回折実験を行った結果、NaI 濃度 0.5%（分解能：1.46Å、
Rfree：19.81%）、2.0%（分解能：1.00Å、Rfree：20.52%）、3.0%（分解能：1.20Å、
Rfree：20.41%）、4.0%（分解能：1.52Å、Rfree：20.59%）の 4 条件において解析することが成功し、単斜晶系リゾチームであることが確認できた。ヨウ素が多数配位したデータとしては、非常に高分解能として解析が成功した。これらの結果を、それ自身と、ヨウ素が配位した室温の単斜晶データ[1]および正方晶データ[2]から、ヨウ素が結合する場所と結合様式に関して、測定温度、濃度、晶系、非等方性温度因子の 4 つの観点からそれぞれの依存性を比較したところ、多くの同一性や相違点を見つけることができた。さらに、ヨウ素の有無による構造の変化、結晶パッキングに関与するヨウ素といった情報を得ることができた。詳細は当日、ポスターにて議論する。
参考文献：[1] M. C. Vaney, et al., Acta Cryst, D57, 2001, 929-940[2] K. Takeda, et al., J. Appl. Cryst. 37, 2004, 925-933

179L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））Á½±º¿¶¹°¯ Á½¹Â±À¼´¹°¯ Á½¹Â±ÀÃ²³¹¯

C0 S[YÞ ÐÖĄĐĔ¢¤ ÁÄÅ¹
.u ¾¸·» ß/) S WßL¯
Search for the conditions for obtaining the large
crystals of a bilin reductase PcyA mutant I86D forthe neutron crystal structure analysis
9$ ²°¯ f§Q% ³°´°¯ V7^ µ°¯ #r$ ¶°¯ z6D ·¯
1. */2:2£, 2. */2/2ªn:2y}{, 3. */2ĆēĔüîíBq0{2y}ùĔúĕ, 4. t/22£, 5. 5
8/2üĀĎíýďûóM][, 6. /©/2/2ª:2y}{
PcyA àüýďąēĕđßĄĐĔßØÚÉéĄĐĈđ÷Ĕ IX!
ĖBVėìĆðĒþñöĔ1wÞ¢ÓÆGåBÚ¦Ý>ìIËĆîõöíāĄĐĔĖPCBėìGÔéÇPcyA à BV ß D oĄĀđ+ÛA oĄĀđ+ì£ kuwÞ¬;~ÙÙ¢ÔékAwÝ¤ÚÉéÇUy}ÚàÆBV Û¦ÝíČā¥ Asp105 ßÞ Ôé Ile86 ìíøăďòĔ¥ÞNÓÖ PcyA .u I86D (I86D)ßclFìÔéÇI86D Û BV ß ĖI86D-BVėß!øĉóýđà§p)
PcyA Û BV ß ĖWT-BVėÛaÓÙ 730nm ß!<Í/ÎÏ-/ÓÙÊÖÇÕß!àÆ_«xßBÚ PcyA Þæ×Ù BV ÞćēýĔÍÒêÖ BVHĘsXÚÉéÛMiÒêÙÊéÇÕÑÚ I86D-BV
SßC0 S[YÌç@éc0ß E,Þæ×ĘÙÆBVH ß[ÛćēýĔþÿĕßRìxKÔÇ
=NÓÖ/Ú I86D ¡ 0ìvmÆI86D úĔăóìÓÖ?ÆI86D-BV  ß SWìZÆT ÓÙ/) S ìxKÓÙÊéÇĂĔòĔôþēûćbJOeåöûüîĔôþēûćbJOeÆĊúĔYeÝÜß\ÈÝ SPeìäÖÇãÖÆgåd`ßj<å|­ÆpH ÝÜßWìZÓÙÊ×ÖÇ@çêÖSìqÊÙ h X &H3®Æ4h X &H3®ìÊÆh<'0ÝÜÌç SCßìÓÖÇßÛÑëàÆT¨Í 1.3mm âÜß
I86D-BV  ß Sß ÞGÓÙÊéÇUöĔċ÷ïčÚàÆ
I86D-BV  ß/) SáßèäÛÆm(@çêÙÊé S
ÞØÊÙ,"ÓÖÊÇ

180L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF BL-5A, BL-17A

ブタ肝臓由来シトクロム b5 可溶性ドメインの高分解能結晶構造
High-resolution crystal structures of solubilized
domain of porcine cytochrome b5
平野 優 1、木村 成伸 2、玉田 太郎 1
1 原子力機構量子ビーム、2 茨城大学工学部
哺乳類のミクロソームに存在するシトクロム b5 は、様々な電子伝達パートナーとの間で電子伝達反応を行うことが知られている。シトクロム b5 は、約 134
アミノ酸残基からなるヘム結合タンパク質であり、N 末端側は小胞体膜の細胞質側に存在するヘム結合領域で、C 末端側で小胞体膜に結合している。本研
究では、ブタ肝臓由来シトクロム b5 の N 末端側 94 残基のヘム結合領域について、2 つの結晶化条件で酸化還元状態の計 4 種の結晶を作成し、X 線結晶構造解析を実施した。回折実験は PF BL5A と BL17A において行い、4 種の結晶全てについて 1 Å 分解能を超えるデータセット（0.76-0.95 Å）を取得した。高分解能構造解析の結果、いくつかのアミノ酸残基で水素原子の電子密度を観測することができた。また、高分解能構造を用い酸化還元状態の比較を行ったところ、ヘムの酸化還元状態調節に重要だと考えられる構造の特徴をとらえることができた。まず、原子間結合距離、角度の制約をはずした立体構造精密化を行った結果、ヘムのプロピオン酸基におけるプロトン化状態が、ヘムの酸化還元状態の調節に関わっている可能性が示唆された。また、ヘム鉄配位子の構造については、酸化還元状態間で有意な差を観測することはできなかったため、ヘム鉄配位子の構造変化は大きく制限されていることが明らかとなった。一方、ヘム鉄の軸配位子 His68 の周辺においては、水素結合ネットワー
クの構造変化が観測された。そのため、His68 周辺の水素結合ネットワークの構造変化がヘムの酸化還元状態調節に関わっていると予想された。

181L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））

Photoactive Yellow Protein におけるアルギニン 52 の精密構造解析
Structural Detailed Analysis of Arginine52 in
Photoactive Yellow Protein
米澤健人１、清水伸隆 2、山崎洋一１、片岡幹雄 1、上久保裕生 1
１ 奈良先端大・物質、2 KEK-PF
アルギニン残基の pKa は約 13.8 であり、この値はアミノ酸残基の中で最も高い. そのため蛋白質内部のような疎水環境でも、アルギニンが電気的に中性状態を取ることは難しいと考えられている. 我々は X 線・中性子結晶構造解析を用いることで、光受容蛋白質（Photoactive Yellow Protein, PYP）の暗状態において、蛋白質表面近傍に位置するアルギニンが電気的中性状態をとることを示唆してきた. しかしながら、結晶構造解析に一般的に用いられているソフ
トウェアには電気的中性状態のアルギニンのトポロジーやパラメータが提供されていないため、先の構造解析ではプロトン化したアルギニンのトポロジーとパラメータを使用した. プロトン化したグアニジノ基は Cζ-Nε並びに Cζ-Nη1,2の間で共鳴構造をとり、Cζを中心に対称的な結合を有する. 一方で、電気的中性状態のグアニジノ基では、Cζ-Nε並びに Cζ-Nη1,2 の間で単結合と 2 重結合が明確に区別される構造となる. 本研究では、Arg52 の詳細な構造を高分
解能 X 線結晶構造解析(0.84Å)と中性子結晶構造解析によって決定することを目的とした. 高分解能 X 線結晶構造解析の結果から Arg52 のグアニジノ基の電子密度は非対称性を示し、Cζ-Nη1 のπ電子に由来すると考えられる電子密度が観測され、Cζ-Nη1 が 2 重結合性を示すことが明らかとなった. 高分解
能 X 線結晶構造で決定したグアニジノ基の C, N の位置を元に中性子結晶構
造解析を行い、グアニジノ基の水素原子の精密化を行った. その結果、2 重結合を形成している Nη1 ではプロトン１原子のみ核密度が観測された．一方、単結合と考えられる Cζ-Nη1 の窒素原子では 2 つのプロトンに由来する各密度が観測されたことに加え、Nη２周りにおけるプロトンの核密度は、グアニジノ基の平面構造に対して外れた所に位置していることが明らかになった. この結果
は、Nη２が sp3 混成軌道によって説明できることを意味している. 以上の結果
から、PYP の Arg52 は蛋白質表面近傍に存在しているにもかかわらず電気的に中性状態をとっていることが明らかとなった. ポスター発表では、赤外吸収
分光と DFT 計算の結果も示し、溶液状態でのアルギニンのプロトン化状態についても議論する．

182L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））          

 multi-step soaking J · À ÃÒÞ×Ìye<¸y¸4
Use of multiple cryoprotectants to improve diffraction quality fromprotein crystals
Uh_ DQ V%9 ^ , ?5> UàOFY B SfY ÏÞÏÖÓÈß
 |&´¹*$´y¸-¢e<´¡°³¾3ÔßÒ¸¦j¶;·¶°³§¯ª¥ª tj·¶Ã\·e<F~¥Á)ÁÄÃ.¦¬Ã¯½y¸n¢e<Æ)Ã¯½¸1J·#¬Ã +¹¢ÒÞ×Ìy
¸e<· ¬Ã2q¹@/N´¡Ã¯½wpx·Ã¨µ¦¢¦d·²¢³ ¸ 7MÆu ¬Ã¨µ´{}·e<¸yÆ4¬Ã¨µ¦j·¶Ã0¸ÍÜßÙ´¹G¶ÒÞ×Ìy¸ X ge<F~tCÆp£´Pl¸e<¸1JÆWª!zª³§¯AWr´¹e<¸yÆ4¬Ã¯½·Wª¯s6¸ÌÚÉÊÙÝÓÌÒÞÕÆH´T
¢Ã multi-step soaking J·±¢³aª¯¢(1)
 ØÝÛo¸W¦ÇÒÞ×Ìy CagA e<¸"K´L ª¯¿rX¶ÌÚÉÊÙÝÓÌÒÞÕ´¡ÃÍÛÐÝßÜÆT¢¯·¹ 7 Å t
j¸3ª¥R«¶¥°¯ª¥ª` 20 ]¸ÌÚÉÊÙÝÓÌÒÞÕ¸¥Á CagA e<·ª¯ÌÚÉÊÙÝÓÌÒÞÕÆº ªH´c¼Å­³T¢¯eE=bX·¹ 3.1 Å tj»´ÔßÒ¦4©ÄSAD J·ÀÃF~I Æp£¨µ¦´§¯(2)»¯kyËÖßÑ¸ PI5P4K! ·±
¢³¹(
4 Å
tj¸ÔßÒª¥¬Ã¨µ¦´§¶¥°¯¦multi-step soaking JÆT¬Ã¨µ·ÀÂ=´ 2.1 Å tj¸ÔßÒÆ¬Ã¨µ¦´§¯®¸eEGTP µ ATP ¸eG'¸¢Æ:Z·[¬¨µ¦´§ PI5P4K! ¦ GTP ÐÞÎß´¡Ã¨µÆv:¬Ã·m°¯(3)
¨¸8J¹¸ÒÞ×Ìye<¸yÆ4¬Ã¯½·¾T´§Ãµi¤³¢ÃReference
1. M. Senda et al. Crystal growth & Design in press.
2. T. Hayashi et al. (2012) Cell Host & Microbe. 12, 20-33.
3. K. Sumita et al. (2016) Molecular Cell 61, 1-12.

183L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL5A、BL17A、NW12A

N-アセチルヘキソサミン 1-キナーゼのX 線結晶構造解析と機能改変
X-ray crystal structural analysis and changing
substrate specificity of N-acetylhexosamine 1-kinase
佐藤真与 1、荒川孝俊 1、西本完 2、北岡本光 2、伏信進矢 1
1 東大院・農、2 農研機構・食総研
ビフィズス菌はヒトの健康に有益な善玉菌として知られ、宿主や他細菌が利用しにくい難消化性の糖質である、ヒトミルクオリゴ糖やヒト消化管粘膜のムチン糖鎖などを利用して生育する。それに対応してビフィズス菌が保持する独特な糖代謝機構の 1 つが GNB/LNB 経路であり、本研究の対象である N-アセチ
ルヘキソサミン 1-キナーゼ（NahK）は、この経路中で主に N-アセチルグルコ
サミン（GlcNAc）または N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）の 1 位α-ヒドロキ
シ基の ATP によるリン酸化を触媒する他、基質特異性が広く様々な糖 1-リン酸を生成できる。本研究では NahK を活用したオリゴ糖合成を目指し、X 線結晶構造解析と機能改変を行った。
【NahK の X 線結晶構造解析】
結晶化、Se-SAD 法による位相決定により、基質フリー、ATP、ADP 複合体（open 構造）、GlcNAc、GalNAc 複合体（closed 構造）の 5 種の立体構造を決定し（図）、基質結合に伴う大きな open-close 構造変化の様子を明らかにした。変異体の詳細な活性測定により、触媒反応に関わる残基を同定し、ATP に結合した 2 つのMg2+の重要性を示した。以上から、NahK が既存の糖キナーゼとは性質が異なり、プロテインキナーゼから進化をしてきた酵素であることを見出し、キナーゼの分子進化に関する新たな知見を得た(Sato, et.al., BBA, 2015)。 （図）NahK の全体構造【NahK の機能改変】
NahK により生成する糖 1-リン酸のうち、α-マンノース 1-リン酸は、β-マン
ノシドに作用する反転型ホスホリラーゼ（糖質加水分解酵素ファミリー130）の逆反応により各種β-マンノオリゴ糖を合成する際の基質となる。しかし NahKの Man に対する活性は本来の基質である GlcNAc の約 1/13 と、実用化には不十分であったため、NahK の基質特異性を GlcNAc から Man へシフトさせる
ような機能改変を目指した。60 種以上の変異体を作製した結果、Man に対す
る kcat が上昇し、触媒効率が野生型の約 15 倍上昇した I146K/F149Y と、Manに対する Km が低下し、触媒効率が約 30 倍上昇した I146Y/F149Y、2 種の実用化の見込まれる改変酵素が得られた。

184L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））t t t }wt t {t        t  y t   x  6 ¸ U Ú Ì Þ  k N    ¸  RP17g_3t
Structural analysis of demethylase, LigM from
Sphingobium sp. SYK-6.
{w|

B' } 2G} .W{w| B {yttt 7g@?t |yt QIt ?c7gJ! }yt n$,ZJ!!t @?Mt   tytx ´ ¡)@?¹ÕÞ×&<£Ào¨Â¯)@?³f%¸@?´¹¥¦DµÁ5r]9*Ä-°² Áf%¸@?¤q»Á½¸¹q»ÀÂ«Vs/?³Á  *¸ÝËÒàÄ_©²ÇÓÞÉáÄ(² Áx 6¸  ¹  *ÝËÒàa# ³ÁÔÒÝàl¾ }xxÚÌÞÈÝÍÊlÄc´ªÁUÚÌÞkN´©²HÀÂ² Á ¹UÚÌÞ¸\kN´©²ÎÏÜÖÐßXlt uvt ÄAªÁ§´³t ~x }x Ä@+©>N ã±Ä { bOd¶ ªÁ´S¢ÀÂ² Á©£© x 6¸@?¸ { b´¹c¤¦Dµ°² Á§´£Àx ¹]µÇÓÞÉá=³ÁÝËÒàa# ?Ä { b¶A³¥Á¿¡¶h©¯´S¢ÀÂ¯­§³x 6¸h¸iKÄ0À£¶ªÁ¯¼¶ RP17g_3;ÄA©²  ¸P17gÄ:"©ØÛßËkN¸L 7gÄ8eªÁ§´³hFµH^Ä(ÁÄ`C©¯ttt} º t{ ÄA©ÅÙcP\kNPcÅÑßËâ\kNP¸P17gÄ­Â®Â {y~twt{yztwt{yztwt{y~t ¸_T³:"ªÁ§´¤³¥¯­Â®Â¸7gÄ ³m·Ã¬ÄP4c¾\kN¤P©¯§´¶¿ÁpYµ 7
g¸¹^ÀÂµ£°¯©£©ØÛßËkN¸7g´8e©¯P
4t  xx ÐÚÆà¸j¸7g¤¥¦D°² ¯¹ ¸P17g_3¸P4´ØÛßËkN´¸7g¸8eP4ÄE[ª
Át

185L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））

 ± ± ± ± ± ÊÂµÀÇ·¿èÊÂµÀÇ·¼¿±± ±    ±ßÝ¶±ÌÏÆµ» XnU ÍäÝÔ±ÅÅ± ĔĘĝĢįĜĕĴı±ĜĕĖěĚĤĴĞ± ÁÔßÐ± ă Î O[W±±ÊáÞØÕØÒÑàØÜÛ´±ÒÞäßàÑÙÙØåÑàØÜÛ±ÑÛÓ±ÎµÞÑä±ßàÞáÒàáÞÔ±ÓÔàÔÞÚØÛÑàØÜÛ±ÜÕ±Ñ±àäÝÔ±ÅÅ±ÔãàÞÑÓØÜÙ±ÓØÜãäÖÔÛÑßÔ±ÁÔßÐ±ÓÔÞØâÔÓ±ÕÞÜÚ±    ±ßÝ¶±ÌÏÆµ»±çV_1 ·èSs! ¸èI" ¸èm& ·´¹±·± v,è¸± ¨5Cw2,2è¹± °ĔĦvĳf[w2vzB±± ÁÔßÐ Ąc>;Ăă¬ĩī¦ĐĊý àäÝÔÅÅ ĔĘĝĢįĜĕĴıĜĕĖ
ěĚĤĴĞÿè    ±ßÝ±ÌÏÆµ» Xă Ăîìþ ¹µµÚÔà×äÙÖÑÙÙÑàÔ±²¹ÈÃ¿³ă¯j©=Đ-øĎ£}ÿëĎéÌÏÆµ» XĄİęĥĲnUă /¯M#fĐ÷þkøĎõĀð āXÿèõă ĄõďĆÿĂqĂWöďþñûéõăÿ§ĀāĎ¯jă©=ĐEí£}Ąi(ĆÿĂ ÁÔßÐĳÇØÖ¿ÀĳÁÔßÀ ăĵy®ð«öďþîčè
ùďúďăoāĎ*go>Đl÷þJăĐFýõĀĂċčĔĦıėĴ ăYĀāĎ¯j©=Đt÷þìĎéAêĄõďĆÿă
vzĂîìþèÇØÖ¿À îċą ÁÔßÀ ăO[Đ`3÷ûðèÁÔßÐ ĂýìþĄQuÿëüûéRvzÿĄèÁÔßÐ ă~ā{[Đ:ĎõĀĂċčèõď
Čĵy®ă£}ă*go>ăìĂýìþKûāuĐ:ĎõĀĐPqārqĀ÷èÁÔßÐ ăpiĳ|LaăP îċąOèÎ O[WĐüûé±± ÁÔßÐ Ąc>;Ă¦Đ<ĀøĎðèõăyĂ4øĎ£}Ą¤}ĂċĎ¤Đôþ¦ð«øĎõĀðuČďþìĎéùăûĉ'Ą ÁÔßÐ ă|ĂøĎNªĐZdČ÷è|9øóĂ.^T Ăx÷þOĐüûé:ČďûOĄ ÊÂµÀÇ·¿ îċą ÀÇ·¼¿ ÿ Î 'DġĴğĐe3÷èt`3Ą ÊÂµÀÇ·¿ ăĩİēīĠĮĲĨĴÿb¨ ·¶¾æÿe3÷û'DġĴğĐlìþ ÉÑàØâÔµÌ¿Á aĂċčüûéĆûèõõÿ:Čďû[ĐĭġıĀ÷û/ GaĂċčèPqĂ ·¶½ºæÿă[`3Ă@÷ûé±± ÁÔßÐ Ą ÇØÖ¿ÀĳÁÔßÀ ăc>;Đ%ĈģĬĒĲĀċò û[ĐFüþîčèùă Ë¶È¶Ì¶Á¶Ąùďúď ·¶¾æîċą ¸¶¼æÿëüûéĆûèc>;ÿ¥4Ā¢ øĎ]*Ą ÄØßµÄØßµÃÙá ÿèđĪħ¤¢$\Ă¬7Ăċò0öďþìûé÷ï÷c>¡ ăĂt8øĎ¡ÿĄ ÁÔßÐ ăćĂ0(øĎ­)ð+Ă6ñðčc>¡ Đ©ôHýh?Ăëüûé9è':Čďāïü
û*µ#[Đ`3÷èöČāĎWĐĉþìò3ÿëĎé±186L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））}  }àÙÊÓæ¼|$`@EtjC}
High-Pressure Protein Crystallography of Ubiquitin
IJ03íëoTîëNu íëî}í(ÏæËåÕåæëî(w1gSn½$»-¯¶ëjyçÁÍæÚÉÝèÏáæ&¸§µ³F¥º8]ÆX±ì­¨§µ³8]¼'¬½gSn¸"¼H)¸¼U Q»p!¯¶§Ä¸c©ÃÅ¶§Äì b`@EtjCL·½ëgSn)eq¼\ Et»©¶ëgSn)izÁ)¼HH¼EtÀK+±Ä­¸«d·¦Äì²­·9¥½ÒÈßÞæÖÇæÙäÐäéê¸<.
¼VMv  bÆ Q¯³gSn`@¼|$EtjCÆhµ¶§Äì}AW[·½ëØÕàÙÊÓæ`@ÆQ§¶ë¢} ¢ £ ¼Ñæ×Ën`@EtjCQÙèÜâÈæ }  ¸ë¦§´ÏæËåÕåæÐæÑè¼/(*ÙèÜâÈæ   ·2$ªÃ }  Z5¾·¼F¥º$B· ;ÔèÑÆx¯ëGrÆhµ³ìØÕàÙÊÓæ`@Æ  l=,»ÎæÛãæÌ¯ë2$ç,O¼B¼À¸·ëMv }¤ ¼VMv¼ bÆQ§¶ÔèÑxÆh§ë²¼7`@Æ$¯ë2$·P.¯³^:¸°^:»5  bÆP.¯ÔèÑxÆhµ³ì²¼`Dë$¼%
» µ¶   Á ¡~º¹¼ ;ÔèÑ¼ak«{f»±Ä­¸«?Ãª¸ºµ³é#íêì­Å½»àÙÊÓæs¼H)«$»Âµ¶Y4®Å³­¸»ÂÄ¸c©¶§Äé#îêì6>½EtÆ¿¶m_ÆR
i±Äì}
}
}
\=9
}
\ 
}
}
}
}
=9DT
 DT
}}}
8[Y'%")=9DTW9DT
}ESY!)$ R0;(&)XF0;
8ZY=9#*!W9#*!ESY}
IPJY19QG3
-=9,7A#*!2U?XLC194K@/> M
H<Y .VO5+Y
NF6FB:1Y

187L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A, PF-BL17A, PF-BL5A

3 メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素(３MST)による阻害剤認識の構造基盤
Structural basis for inhibitor recognition by 3MST
諏訪内悠介，藤間 祥子, 島本一史，長野哲雄，花岡健二郎,
王超，内山真伸, 清水敏之
東大院薬硫化水素の生理機能についての研究は近年精力的になされている。硫化水素産生経路の一
つに、Cys から 3-メルカプトピルビン酸(3MP)を経て硫化水素を産生する経路があり、3MP から
図 1 3MST の 関 与 する硫 化 水 素 産 生 反 応の硫化水素の生成には 3-メル
カプトピルビン酸硫黄転移酵素(3MST)が関与している。3MST は 3MP の硫黄をシアニドやチオールに転移させる酵素であり、チオールに転移させる場合、生成したペルスルフィドが他のチオールと非酵素的に反応して硫化水素が産生される(図 1)。3MST の機能解析には選択的な阻害剤の開発がのぞまれているが、これまで 3MP 類似阻害剤(α-ケトグルタル酸 2(AKG)、2-メルカプトプ
ロピオン酸 3(2MPA)と知られている化合物は阻害効果も弱く、選択性も低い。
近年、東京大学大学院薬学系研究科薬品代謝化学教室によって、(現)東京大学創薬機構の化合物ライブラリーの中から、3MST に選択的阻害作用を持
つ物質 A、B(阻害剤 A、B)が見出された。阻害剤 A、B はともに、芳香環-カル
ボニル-硫黄-4-ピリミドンの共通骨格を持つ。本研究では、既存の 3MP 類似阻害剤と新規 3MST 阻害剤それぞれの 3MST との複合体の結晶構造を明らかにし、それぞれの阻害剤の阻害機構を解明することを目的とし研究とした。
m3MST を用いて、1〜2Å という高分解能で阻害剤との複合体構造を決定した。得られた構造と生化学的解析から、新規阻害剤は３MST の一段階目の反応生成物に対して特異的に結合することを明らかにした。また
分子起動計算を行い、反応中間体である Cys-SS と新規阻害剤
が強い安定化エネルギーを持
つ相互作用を形成することを明らかとした。得られ知見はより親和性の高い特異的な 3MST 阻 図 2 新 規 3MST 阻 害 に対 する認 識 様 式
害剤の設計に貢献出来ると考えている。