139L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL17A, PF-BL1A, AR-NE3A, SPring-8 BL41XU, BL44XU

糖非発酵グラム陰性細菌由来
ジペプチジルアミノペプチダーゼ 4 の結晶構造解析
Crystal structure analysis of
Dipeptidyl aminopeptidase IV from
Non-Fermenting Gram-Negative Rods
◯六本木 沙織 1、館岡 千佳 1、鈴木 義之 3、伊藤 康広 3、藤本 真友 1、森澤
さおり 1、飯塚 一平 1、 小笠原 渉 3、田中 信忠 2、阪本 泰光 1、野中 孝昌 1
(1 岩手医大薬、2 昭和大薬、3 長岡技大生物)
ジペプチジルアミノペプチダーゼ（DPP）は、基質ペプチドの N 末端から 2 番
目のアミノ酸を認識してジペプチドを産生する酵素である。糖非発酵グラム陰性細菌（Non-Fermenting Gram-Negative Rods: NFGNR）由来 DPP4 は、アラニン、プロリン、ヒドロキシプロリンに特異性があり、プロリンやヒドロキシプロリン
を含むコラーゲンを主な栄養源とする NFGNR の生育に非常に重要である。
我々は、NFGNR である Pseudoxanthomonas mexicana WO24 由来 DPP4
（PmDAP IV）のアポ体、ペプチドや化合物との複合体の結晶化を行い、モデル分子として多剤耐性菌 Stenotrophomonas maltophilia 由来 DPP4（PDB ID:
2ECF）を用いた分子置換法により PmDAP IV の立体構造を決定した。
我々は、PmDAP IV のアポ体、DPP4 阻害剤複合体、ジペプチド複合体の立体構造をそれぞれ 1.75Å、2.06Å、1.79Åで決定した。また、結晶化条件は同様であるものの、これまで得られた結晶の空間群とは異なる PmDAP IV-ジペ
プチド複合体について 2.40Åでの立体構造決定に成功した。
本研究により得られた PmDAP IV の立体構造と既知のヒト DPP4 の立体構
造比較において、(1)基質ペプチドのプロリンと相互作用するアミノ酸残基が一部異なり、その違いが NFGNR 由来 DPP4 とヒト DPP4 の基質特異性の違いに関与すること、(2)NFGNR 由来 DPP4 は基質結合時にヒト DPP4 では見られな
い構造変化を起こすこと、(3) 基質ペプチド N 末端の認識に重要なアルギニン
残基が、NFGNR 由来 DPP4 とヒト DPP4 で立体構造上ほぼ等価な位置に保存されているものの、そのアルギニン残基を含む二次構造は NFGNR 由来 DPP4
ではαヘリックス、ヒト DPP4 ではループ構造であることが明らかとなった。
これらの知見に基づいて、NFGNR 由来 DPP4 に特異的な阻害剤の探索や設計を進めている。
[1] Ogasawara, W., Tanaka, C. et al. (2005). Protein Expr. Purif. 41, 241-251.
[2] Ogasawara, W., Ogawa, Y. et al. (1996). Biosci. Biotech. Biochem., 60,
2032-2037.

140L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL-1A

低エネルギータンパク質構造解析用ビームライン BL-1A の現状
Current status of the low-energy MX beamline BL-1A
松垣直宏 1、山田悠介 1、原田彩佳 1、平木雅彦 2、千田美紀 1、千田俊哉 1
1
KEK-PF 構造生物学研究センター、2KEK 機械工学センター

Native SAD（Single Anomalous Dispersion）法は、試料中のタンパク質に自然に含まれている軽原子の異常分散シグナルを利用して位相決定を行う結晶
構造解析の手法である。試料への重原子導入を省けることによる解析の高速化、重原子導入自体が困難なタンパク質の構造解析等が期待される。しかし、イオウやリンなど軽原子からの微弱な異常散乱シグナルを精度よく測定する
ことには多くの困難があり、現在においても一般的な位相決定法として普及していない。我々は高輝度の低エネルギーX 線（3.7 - 4.6 keV）が利用できる
KEK-PF BL-1A ビームラインにおいて、検出器までのビーム経路の空気を完
全にヘリウムに置換することで、軽原子からの異常分散シグナルを精度よく測定できるシステムを構築した。
4 keV 以下の低エネルギーX 線を利用する場合、試料結晶からの回折角の増大に伴い高分解能データの取得が困難になる。そこで二台の二次元検出器（Eiger X4M、Dectris Ltd.）をヘリウム環境下で V 字状に配置して測定できるシ
ステムを導入した。12keV 近傍の通常実験と両立できるよう検出器の配置は容易に切り替え可能である。通常配置と V 字状配置で収集した回折データを比較した結果、V 字状配置では高分解能データが観測可能というだけでなく、より高い精度で測定できることが分かった。データの完全性が高分解能側で不足する問題は、ミニカッパ―ゴニオメータと組み合わせることで回避できる。
その他、サンプルチェンジャーのバーコード対応、アニーリングスクリーンの導入などビームラインのアップデートについても合わせて報告する。

141L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A、PF-BL10C、PF-AR NE3A

mGCN5 PCAF-HD の X 線結晶構造解析
Crystal structure of mGCN5 PCAF-HD
日比亮太 1，藤間祥子 1,酒井真志人 2,西條慎也 3, 清水伸隆 3,
松本道宏 4,清水敏之 1
1
東京大学大学院薬学系研究科・2 核内代謝情報研究室・3KEK-PF
4
国立国際医療研究センター研究所○

近年、2 型糖尿病の原因としてグルカゴンの異常分泌が報告されている。分泌されたグルカゴンは細胞内の転写共役因子 PGC-1を活性化し、糖新生系
酵素遺伝子の発現を誘導する。 ヒストンアセチル化酵素として知られる
GCN5 は PGC-1をアセチル化することで活性を制御している。我々は GCN5が 2 型糖尿病を対象とした有望な創薬標的となりうると考え、GCN5 による
PGC-1活性制御機構に注目し、GCN5 の構造機能解明の研究に取り組んでいる。
GCN5 はアミノ酸数 837 からなり、PCAF-HD ドメイン、AT ドメイン、ブロモドメ
インを有する。我々は構造未解明であった PCAF-HD に注目し、結晶構造を1.8Åの分解能で決定した。GCN5 PCAF-HD は結晶中の非対称単位に 2 分子存在していた。(図 a)ゲル濾過クロマトグラフィーと多角度光散乱検出器、X
線 小 角 散 乱 を 融 合 し た SEC-MALS、 SEC-SAXS を 用 い る こ と で 、 GCN5
PCAF-HD が溶液中でモノマーとして存在することを見出した。(図 b)また、アミノ酸配列から予測されなかった Zn フィンガー構造が PCAF-HD に存在することを明らかにした。興味深いことに、本研究で見いだされた Zn フィンガーは過去にあまり例を見ない配位様式をしており、特異な機能があるのではないかと推察される。

a)b)

図(a)結晶構造解析で得られた mGCN5 PCAF-HD。非対称単位内の分子を表示。
(b)SEC-SAXS で決定したダミーアトムモデル。モノマーとの重ね合わせ図

142L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       £®¬± ££¾¼¶½·¹»»¿¾º´À´µ¸¹¹ \CÂČĖõĂČĔćøýĚûÝp=ÙJE
Crystallization and structure determination ofa β-fructofuranosidase from Aspergillus kawachii
+t Ã?At$ ÃS  Ã.n ÃH*- ÃQU ÃM  D,"1[Y&)8Ã WZČĚă÷îïęù²q³ lOmČëđĕĚ©ª¡ ÜÍéèmÞÃÂČĖõĂČĔćøýĚûêÞÏãÃîĆĕĄĚûÃėĉĄĚûÛÚÃJ3lÊČĖõĂĚ
ùØÅèlêOÐèmÊÍé×ÆèÄÌéæÝmÝÜÞÃ
OT2ÝáÛæÑÃÆl eT2ê>ÐèmÊ%ÎÃÓÝJKw`ÜzÊ7ÔéèÄcÝöĖĚčÞÃ£¾¼¶½·¹»»¿¾º´À´µ¸¹¹ \CÝÆl eT2ê>ÐèÂČĖõĂČĔćøýĚûě £º¨¨´¾¶ĜÜa_ÎÃh JEê~ÕÔÝØÐèÄ
²;R³ £º¨¨´¾¶ Ý µ¦¬£ ê ¼§°¡ ´ ÜoáâÌÙØčĔùđăêJjÎÃ"x{ ¤« ¦§¡Iê[Æ× ¬ @i ÜþðėăóøęüöÈåß ª¹¾ üöê}ÍÒÔmÙÎ× £º¨¨´¾¶ ê]XÍÒÔÄ¬¹¬°£ ìòĘĚùÜåèìČíą
ĀíĚõĘĐĂöĔČíĚÜåçkê~ÆÃ¯¦¯­£©§ ØĉęăàØkÍéÔÌÙêbÎÔÄkmÞ!Vsê~ÆÃĈęôęöăĘÿč|N69RÜåçp=ê~ÕÔÄ5āĚüÝÞÃ£®¬± £ ċĚĒĔîę
Ü×~ÕÔÄ
²pGÙv'³  ôêPMÙÎÔBØp=Ê/æéÃguÞ ­¡  ØÃ
p=&^(d Ü  $Ý £º¨¨´¾¶ Ê%ÎÔÄĝrp=JEÝpGÃ¬ @i Ü}üęĊõÙÎ×ÍÒÔþðėăóøęüöÈå
ß ª¹¾ üöÞÃp=Ü%ÒÑL#Î×ÆèÌÙÊ<ÎÔÄÌéÞÃp=ÜyèfÜÈÆ×"x{\CÝčĘĀìĚûØ:ÍéÔäÝÙvÇæ
éÔÄ£º¨¨´¾¶ ÝJÞÃ¬ @i Ý ¢ FÝÂøĚĂÉæ3èÂčĘďĔ
ăēîęÃ¥ @i ÝÂ÷ęăîÿþÃÈåßÃÌéæÝăēîęêÖÛËÁĎĕÿ
õùÉæ3èĕęñĚåçJ3Íé×ÆÔÄT20ØÅèÂčĘďĔăēîę
Ý0ÜÃ4pÙÎ×[ÆÔöĕúĕęÊ%ÐèÌÙÊÉÕÔÄ

143L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF BL-5A

Ⅲ型チオエステラーゼ SAV606 の構造機能解析
Structural analysis oftype III thioesterase SAV606
千菅太一 1、宮永顕正 1、工藤史貴 1、江口正 1
1 東工大理【目的】

Streptomyces avermitilis 由来のⅢ型チオエステラーゼ SAV606 は α,β-不飽和脂肪酸チオエステルであるクロトノイルチオエステル (1) に対し、グリシンのマイケル付加反応とチオエステルの加水分解反応を触媒するユニークな酵素である (図 1)。この二段階反応機構の解明を目的として SAV606 の X 線
結晶構造解析を試みた。

図 1. SAV606 の反応【方法および結果】
SAV606 の組み換えタンパク質は大腸菌にて発現させ、精製酵素を結晶化に用いた。まず、apo 型の結晶構造を分子置換法を用いて分解能 2.4 Å で決定することに成功した。次に、反応機構に関する知見を得るため、基質などとの共結晶化を検討したところ、生成物 (2)との複合体結晶構造を分解能 2.0Åで決定することに成功した。SAV606 は hotdog
fold のモノマーが二量体を形成した double hotdog
fold をとっており、生成物は二量体界面に結合していた (図 2)。現在、活性中心のアミノ酸の部位特異変異体解析を進めている。本発表では、この結果をもとに考察したⅢ型チオエステラーゼ SAV606の反応機構について発表する

図 2. SAV606 の結晶構造

144L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
BL-1A, BL-5A, BL-17A, AR-NW12A, AR-NE3A

タンパク質 X 線結晶構造解析ビームラインにおける全自動測定
Fully automated data collection on macromolecular
crystallography beamlines
山田悠介 1,2、篠田晃 1、平木雅彦 2,3、引田理英 1,2、松垣直宏 1,2、千田俊哉 1,2
1
高エネ機構 物構研 フォトンファクトリー
2
総研大 高エネルギー加速器研究科
3
高エネ機構 共通 機械工学センター
タンパク質 X 線結晶構造解析ビームラインでは回折データ測定の全自動化を進めている。これまで、試料の素性が実験前から良く分かっている創薬研究をターゲットとした全自動測定システムを開発し、主に多量のサンプルからの回
折データ収集を必要とする製薬企業を中心に利用されてきた。しかしながら、一般的なデータ測定には不十分な部分が多く、ビームラインでの回折データ
測定の全自動化を目指すには多くの改良が必要である。とくに結晶試料を X
線照射位置に位置合わせを行うセンタリングの過程において既存の全自動シ
ステムではループ形状のみを認識するループセンタリングと、200μｍ角程度の比較的大きなサイズのビームとを組み合わせることで実現させてきたが、本来は結晶そのものを認識しセンタリングする必要がある。特に結晶に比べて小さなサイズのビームを利用する場合には、このような結晶のセンタリングが必須である。そこで筆者らはループの 3 次元形状認識と X 線センタリングを導入した新たな全自動測定システム（SIROCC）を開発した。
SIROCC ではループの 3 次元形状認識をすることで、市販されている多種多様の形状をしたループのほとんどでループを認識することが可能である。そして、その認識されたループ領域全体を X 線でスキャンして、回折点を多く生じる部分を特定することで結晶位置を特定することが可能である。
SIROCC は現在も開発が続けられている一方で 2016 年秋より一部ユーザーの協力を得てコミッショニングを開始し、2017 年秋を目標に一般ユーザーの実
験にも適応する予定である。

145L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A、PF-BL17A

染色体分配に関与する好熱性真菌 Chaetomium

thermophilum 由来 Separase の構造解析
Structural analysis of Chaetomium thermophilum
Separase involved in chromosome segregation
池田 聡人、西野 達哉
東京理科大学大学院 基礎工学研究科 生物工学専攻

正確な染色体の分配は真核生物の生存に必要不可欠である。染色体の誤分配や異性化は遺伝的不安定性につながり、がんや遺伝病、不妊や流産など細胞や個体の生存に重大な悪影響をもたらす。Separase は姉妹染色分体を接着するコヒーシン複合体を切断するプロテアーゼで、細胞周期中期から後期への移行過程で決定的な役割を担う。Separase の発現や機能の異常は疾患と関連していることから、医学的にも重要である。
Separase の活性は Securin と呼ばれる阻害タンパク質の結合、酵素や基質のリン酸化による翻訳後修飾によっても調整されている。現在のところ、Separase の制御機構や反応機構に関する統一的な見解はなく、生化学的な研究・議論が続いている。そこで、構造生物学的な観点から
Separase の制御及び反応機構を探るため、Separase の X 線結晶構造解析に向けた研究を行った。Separase はすべての真核生物に保存されており 、 タ ン パ ク 質 の 安 定 性 が よ り 高 い 好 熱 性 真 菌 Chaetomium
thermophilum 由来の Separase (ctSeparase)を用いて構造解析を目指した。
ctSeparase は全長で約 240kDa の巨大分子である。N 末端側の約 1600
アミノ酸には armadillo repeat domain、C 末端側の約 600 アミノ酸は
separase protease domain(SPD) が存在する。まず ctSeparase の触媒活性を担う SPD の発現コンストラクトの作製とタンパク質の発現条件を検証した。その結果、大腸菌を用いた組換えタンパク質発現系により生化学的解析や X 線結晶構造解析に十分なタンパク質量を得ることに成功した。精製タンパク質を用いて結晶化条件を検証したところ、結晶を得ることに成功した。今後は、結晶化条件を改善し、PF の BL を利用してX 線結晶構造解析に臨む。

146L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））      ®¨¤«¡£ğĠ ä/Öï ¨¼µÅ¿¶µ·Ã¸ÁºÄ½»¿¹¾Â¿¾ºµ¸ \EĆùĀćĖĉĜāås@áJGCrystallization and structure derermination of a
GH31 dextranase from Flavobacterium johnsoniaeSÊc0UÊQVÊM$
F1'6[Z+.<³t´ oä[ÖïpòKJåb7ä"ÞÌßÖï ¥£²ÇĆĜĂđĜĀäÎÌßÊoOpďóēėĜĝ©ªĞ  äæÊäÈüĘýÿăĜāÐÔðßÌïËÕÏÕãÐíÊ2ÊÈüĘýÿăĜā
%äêùÿĚÿăĜāëÈüĘ÷ěėôĜāãâåpÐ_ÔðïáäÊÌohT7òAÖïpê&Ò_ÔðÊÙðíåJäæzÐ;ÛðïËfåüĘĜĐæq{ ¨¼µÅ¿¶µ·Ã¸ÁºÄ½»¿¹¾Â¿¾ºµ¸ \Eå ©ª ä/ÖïĆùĀćĖĉĜāĝ  ¨»¦¸Æ£Ğådiò~ÜßÎîÊCpæO
T7äÍÊÌohT7òAÖïÓáò?íÏäÕßÌïË æ¨»¦¸Æ£ åk JGò~ÜÛåà#ÖïË
³>R´ ¨»¦¸Æ£ å ·¦­£ ò À§°¢µ ärèéÓáàĐĖĀēĈòJmÕÊ'y{ ¤«¦§Iò[Ìß ­ Blä ªºÂ Ăüò}ÔØÛpáÕß¨»¦¸Æ£ ò_YÔØÛË­º­°£ ôøĚĜĀäìïôďõĊąõĜûĚĒćüĖ
ďõĜäìînò~ÌÊ¯¦¯®£©§ àčěĈçànÔðÛÓáòe
ÕÛËnpæWv3ÊČěúěüĈĚĄĐ|N:=Räìîs@ò~Ü
ÛË 9ĆĜĂåæÊ®¨¤«¡£ ĎĜĔĖöěäß~ÜÛË
³sHáx,´ ¬®¦ á ®§© òPMáÕÛD às@Ð4íðÊjwæ ®àÊs@+`-g ä )å ¨»¦¸Æ£ Ð*!ÕÛË± us@JGåsHÊ¨»¦¸Æ£ å JæÊ­ BlĈĕöěÊÉÈ¢ čęĘÏí8ï(ĈĕöěÊ Ýå ¥ BlĈĕöěå ÝåĈĕöěäìîJ8ÔðßÌÛË
çÛÊ(ĈĕöěòJ8ÖïÉÈ¢ čęĘå  ]aåÉĀćĖěĈá ]aåÉĀćĖěĈå3äÙðÚðöěþĜćÐíðÛË çÛÊå ©ªÈüĘýÿăĜāá"X^7Ð'ÑÒ^ãïäêñí×ÊT75 åôēċL"å&Òæ*ÔðßÌÛË

147L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL17A

紫外線高感受性症候群責任因子 UVSSA VHS ドメインの構造解析
Crystal structure of VHS domain of UV-sensitive
syndrome protein UVSSA
橋本優子 1，松尾和香 1，原幸大 1, 菱木麻美 1，石川吉伸 1，郭朝万 2, 中
沢由華 2, 唐田清伸 2, 荻朋男 2, 橋本博 1
1 静岡県大薬・2 名大環医研【目的】 UVSSA は紫外線高感受性症候群（UVSS）の責任遺伝子であり、光DNA 損傷に対する転写共役ヌクレオチド除去修復機構（TC-NER）に必須なタンパク質である。UVSS は軽微な日光過敏を伴う常染色体劣性の遺伝性皮膚疾患である。日本人の症例から、UVSSA の N 末端に存在する VHS ドメイン内の C32R 変異が UVSS の原因であることがわかっているが、そのメカニズムは明らかになっていない。本研究では UVSSA の立体構造から UVSS の病因を解明することを目指し、UVSSA VHS ドメインの調製、結晶化及び X 線結晶構造解析を行った。
【方法】 N 末端側に His タグを付加させた UVSSA VHS ドメインを、大腸菌を用いて大量発現させ、超音波破砕後、Ni アフィニティー、陽イオン交換、ゲル
濾過カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。精製タンパク質を濃縮し、シッティングドロップ蒸気拡散法にて 20 ℃で結晶化を行った。また、単波長異常
散乱法（SAD 法）による構造解析のため、水銀誘導体結晶を調製した。得られた結晶の回折実験は放射光施設 Photon Factory BL-17A で行った。
【結果及び考察】 結晶化に適した高純度の最終精製品が得られ、X 線結晶構造解析に適した UVSSA VHS ドメインの結晶および重原子誘導体結晶を得ることに成功した。X 線回折実験の結果、ネイティブ結晶で 2.00 Å分解能、重原子誘導体結晶で 2.11 Å分解能の回折データを収集し、SAD 法により立体構造を決定した。UVSSA VHS ドメインは、8 本のα-へリックスからなる典型的な VHS ドメインのフォールドを形成していた。発表では、得られた構造の詳細について議論する。

148L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A, 5A

遊離セリンをリン酸化する酵素 SerK における反応機構
Reaction mechanism of a free serine kinase
藤橋雅宏 1、永田隆平 1、川村弘樹 2、佐藤喬章 2、藤田嵩之 2、跡見晴幸 2、三木邦夫 1
1 京大院理、2 京大院工遊離セリンリン酸化酵素（SerK）は、超好熱性アーキアである Thermococcus
kodakarensis におけるシステイン生合成に関わる。この酵素は、ADP を利用してセリンをリン酸化し、システインの前駆体であるホスフォセリンを生成する。
タンパク質中のセリン残基をリン酸化する酵素はよく知られているが、遊離のセリンをリン酸化する酵素が同定されたのはこれが初めてである。また、SerKは既知のリン酸化酵素とのアミノ酸配列の類似性が低いため、その反応機構は既知のものと異なることが期待される。
我々は、SerK の反応機構を明らかにすることを目指し、野生型と変異型酵素の結晶構造を決定した。SerK の全体構造は 2 つのドメインに分かれており、ドメイン間のくぼみにはセリン結合部位が見つかった（図左）。決定した構造のうち、AMP または ADP との複合体構造はくぼみが開いた構造になっていた。
一方、酵素と生成物（ホスフォセリンと AMP）との三者複合体は閉じた構造になっており、基質との三者複合体も閉じた構造をとると予想される。ドメイン間のくぼみには、触媒残基と考えられる E30 が存在している。この残基をアラニンに置換した変異体では、酵素活性が野生型と比べて大きく減少した。グルタミンに置換した変異体（E30Q）と生成物との三者複合体構造では、Q30 がホス
フォセリンの Oγ原子と相互作用していた（図右）。また、E30Q の開いた構造と閉じた構造の比較から、Q30 は構造が閉じることでホスフォセリンへ近づくことが分かった。これらの結果から、E30 が構造変化に伴ってセリンへ近づいてヒドロキシル基の脱プロトン化を行い、リン酸化反応が始まると予想される。
ホスフォセリン

Q30

図. SerK 変異体 E30Q の全体構造（左）とホスフォセリン結合部位の構造(右)149L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL17A

オリゴペプチド結合タンパク質の X 線結晶構造解析
X ray Crystallographic analysis of the oligopeptide
binding protein
亀井七海 1，横山英志 2，小西佳史郎 1，原幸大 1，石川吉伸 1，松井郁夫 3，
Patrick Forterre4, 橋本博 1
1 静岡県大薬・2 東京理大薬・3 産総研バイオメディカル・4 IGM Univ
Paris-Sud【目的】 ペプチド輸送タンパク質（Opp）は細菌の生体膜に存在する ABC トラ
ンスポーターの一種で、そのサブユニットの一つである OppA はペプチドの細胞外受容体として機能する。真正細菌において、OppA はペプチドをシグナル分子としたクオラムセンシングへの関与が示唆されている。近年、複数の古細菌でウイルス状の膜小胞を形成する現象が報告され、OppA が膜小胞の主要なタンパク質であることが分かった。本研究では、未だ解明されていない古細菌 OppA の構造と機能を明らかにするために、OppA-ペプチド複合体の X 線
結晶構造解析を行った。
【方法】 C 末端側に His タグを付加させた OppA(30-753 残基)に 4 箇所の Met
変異を導入し、大腸菌で Se-Met 置換組換えタンパク質を発現させた。菌体を超音波破砕後、85℃の加熱処理、Ni アフィニティー、陰イオン交換、ゲル濾過
カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。また、塩酸グアニジンを用いて非特異的に結合した内在性ペプチドを除去した。OppA とモデルペプチドである
ブラジキニンをモル比 1:5 で混合し、シッティングドロップ蒸気拡散法にて 20℃
で結晶化を行った。得られた結晶で X 線回折実験を行い、2.4 Å 分解能の回折データを収集し、Se 原子の異常散乱を利用して構造解析を行うことに成功した。
【結果および考察】 OppA の全体構造は、“おにぎり”の様な三角形をしており、25 本のα ヘリックスと 24 本のβ ストランドで構成されていた。OppA は、2 つのドメインから成り、それらによって構成される分子中央部のポケットにペプチドの電子密度が確認出来たが、その形状からブラジキニンとは異なるペプチド
が OppA に結合していると考えられた。本発表では、OppA による多様なペプチド認識に関する討論を行う。

150L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL17A

コンデンシンの制御サブユニットの結晶学的研究
Interaction analysis of ZRANB3 in complex with
PCNA in template switching pathway
清水研一郎 1，原幸大 1，右田智子 1, 鈴木秀造 1，平野達也 2，橋本博 1
1 静岡県大薬・2 理研【目的】 染色体の凝縮は、生物が正常な細胞分裂を行う上で重要な生命現象であり、その異常は細胞のがん化や小頭症などの重篤な遺伝性疾患との関連性が示唆される 1)。コンデンシン I は、分裂期の染色体を構築する主要なタンパク質複合体であり、染色体凝縮において重要な役割を果たす。コンデン
シン I は SMC サブユニット（SMC2、SMC4）と制御サブユニット（CAP-H、
CAP-G、CAP-D2）からなるリング状構造を有するタンパク質複合体であり、姉妹染色分体を取り囲むように結合することで、コンパクトな棒状の高次構造である染色体を形成（凝縮）し、核内に収容する役割を持つ 2,3)。本研究では、コンデンシンと染色体の解離を促進することで、誤った染色体凝縮を防ぐ役割を持つ制御サブユニットに着目し、X 線結晶構造解析を目指した試料調製を行った。
【方法】 ヒト由来組換えタンパク質を大腸菌を用いて大量発現させた。その後、超音波破砕し、アフィニティーカラム、イオン交換カラム、ゲルろ過カラムクロマ
トグラフィーを使用して高純度に精製した。精製タンパク質を用い、シッティン
グドロップ蒸気拡散法にて 20℃で結晶化条件の探索を行った。
【結果と考察】 結晶化スクリーニングにより、いくつかの条件で結晶が得られたので、X 線回折実験を行った。タンパク質結晶であることは確認できたが、X
線結晶構造解析に適した分解能は得られなかった。今後は、構造解析に適した結晶を得るために最適化を行う。
参考文献
1) Martin et al. Genes Dev, 2016
2) Piazza et al. Nature Struct Mol Biol, 2014
3) Kinoshita et al. Dev Cell, 2015

151L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL17A

心不全に関わる転写因子 GATA4 C-terminal Zinc
Finger の結晶構造解析
Crystal Structure of GATA4 C-terminal Zinc Finger,
transcription factor related to heart failure
清水聡史 1、原幸大 1、依光奈津美 1、砂川陽一 1,2,3、刀坂泰史 1,2,3、和田啓道 2、
長谷川浩二 2、橋本博 1、森本達也 1,2,3
1 静岡県立大学大学院 薬食生命科学総合学府
2 京都医療センター 臨床研究センター 展開医療研究部
3 静岡県立総合病院 臨床研究部[目的]心筋細胞肥大や心不全の発症・進展には心臓特異的転写因子 GATA
binding protein 4 (GATA4)が重要な役割を担っている。GATA4 は二つの Zinc
Finger ドメイン(ZF)をもち DNA 上の GATA 配列を特異的に認識する。これまでの研究により、GATA4 のホモ二量体を形成することが転写活性化に重要なプロセスであることを見出した。しかしながら GATA4 の二量体形成メカニズムや
DNA 認識機構は不明である。そのため GATA4 の二量体形成と DNA 認識機
構を解明し、その部位をターゲットとした創薬を目指し、本研究では GATA4 の二量体形成部位を同定し、すでに報告されている DNA 結合に必要な部位の両方を含む部位の X 線回折実験を行った。
[方法]大腸菌にて発現させた GATA4 全長並びにドメイン欠失変異体を用い、GST Pull-down 法及びグルタルアルデヒド化学架橋法を行い、二量体形成部位を同定した。同定した二量体形成部位と DNA 結合部位を含む C 末端側のZF(C-ZF)に GST タグを付加させたタンパク質を大腸菌にて大量発現させた。
得られた菌を溶菌後、GS4B にて Affinity 精製を行い、HRV3C を用い GST タ
グの切断を行った。その後、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラムを用いて精製を行った。その精製したタンパク質を濃縮し、GATA 配列を含む DNA との混
合後 4℃で一晩静置した。この溶液を用いて結晶化スクリーニング、結晶化条
件の最適化を行った。得られた結晶を用いて、Photon Factory BL17A にて X
線回折実験を行い、回折データを取得した。
[結果と考察]GATA4 は C-ZF の 308-326 部位で二量体形成していることがわかった。また結晶化に適した高純度の最終精製品が得られた。さらに結晶化スクリーニングと結晶化条件の最適化をしたところ X 線回折実験に適した結晶を得ることに成功し、X 線回折実験の結果タンパク結晶特有の回折像を得ることができた。今後、データの解析により二量体形成、DNA 認識メカニズムを解明し、その部位をターゲットとした新規心不全治療薬の開発につながると期待
される。

152L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））© © © © © © © Æ¾®ºÂ±¶¹©

Pö¡Ăÿ ÃËÎ²Â²®»¹ÃÆ  ÷©
Ê xvFRN©
Crystal structure of Mad2L2 in complex with CAMP
involved in chromosome segregation_&$ ±Ī0$ ±Ī

I§{ ±Īg. ±ĪC ²Ī_~ ²Ī
TK ±©
±© £-f$Ĩ²© M$¨h©

ádbâ© ÃËÎ²Â² øÞSàõđħěĊó ă28ëÿèóò ¼Ä¹ 5ûÞtHõôõtUö¡êñäÿßÃËÎ²Â² óvëÿđħěĊóêñ »¹ÃÆ ç)éĀîß»¹ÃÆ ĚĔĊĒćħtòøÞHò÷P ÷s %ù÷@ö`/çýĀÞ»¹ÃÆ ç6,nó ÷v÷w;ö7òãÿèóøEýæöõïî ±¬ßêæêÞí÷tõġĉęĐ
ĠûR#cøEýæöõïñäõäßKhkòøÞÃËÎ²Â²®»¹ÃÆ ÷e ^ġĉęĐĠăR]Z(böEëÿèóăd<êÞÃËÎ²Â²®»¹ÃÆ  ÷BÞvFÞÊ xvFRNăïîß©
áDWâ© Ä Jm ö ¿Ñ× đċăéìî ÃËÎ²Â² ó »¹ÃÆ ÷a\qăRoêÞ$ă^äña\éìîß$jiXă ÄÑ ĄĜąęĕąĩÞ¢ĆĈħ=ÞČĥāĉģĠĊĦğėċģĜąĩă^äñpêîßpđħěĊăYyêÞĎĔĕąħċĘĦĔĝV:>Wöñ ²°© ÝòvFďĊĤĩę
ħċăïîß4ýĀîvFă^äñ ÆÐÕØÕÔ© ¾ËÍØÕÖÙ© ºÂ±¶®¹ öñ Ê x!9*¥ăïîßí÷3ÞÃËÎ²Â² ăčĩēĢĖĥóêñĝĦċģĠ Æ¿¹È½Ç ă^äî'z=WöüþRNăïîß©
ávOó}+â© vFöêî¦r1÷Gup ç4ýĀÞvFďĊĤĩęħċóvFL÷GöüïñÞÊ xvFRNöêîÃËÎ²Â²®»¹ÃÆ  ÷vFă4ÿèóö8êîß4ýĀîvF÷l |øÞÀ´²²ÞQ')?ø Ë© ¸©±°µ¯´·ÞÌ©¸©±°µ¯´·ÞÍ©¸©±²¶¯´³©Ú© òãïîßÊ x!
9*¥÷vOÞ ²¯²© Ú ÷!9Ėĩđç4ýĀÞ'z=WöüÿR
Nö8êîß4ýĀîRæýÞ»¹ÃÆ ø ÃËÎ²Â² ÷ÛĎĩėĞĥėÜ¤"öúĀÿüåövêñäÿèóçEýæóõïîßaòøÞ4ýĀîR÷töðäñëÿß©
©
}A[©
±¬ ÀØÕÐ©ÏØ©ËÓ¯©ª©ÉËÔËÒË­©½ÃºÅ©Á¯©«²°±±¬©
©

153L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL5A

セルロース合成酵素 C サブユニットの柔軟なドメインの構造解析
The structure analysis of flexible domain of CeSC
野島慎五 1、藤島あゆみ 1、加藤公児 1,3、田島健次 2、姚閔 1,3
1 北海道大学生命科学院 X 線構造生物学研究室、２ 北海道大学工学研究
院高分子化学研究室、３ 北海道大学理学部高分子
セルロースは地球上に最も多く存在する多糖であり, 高等植物だけでなく藻類・バクテリアの一部・ホヤ類など多種多様な生物種で合成されている. 特に,酢酸菌を代表とするバクテリアが生産するセルロース（バクテリアセルロース，
BC）は高強度・高純度・高保水性といった性質を有しており, 材料工学の分野で注目を浴びている物質である．BC の合成・排出を担っているセルロース合成酵素複合体 TC（Terminal complex）は, 細菌の内膜から外膜に渡って存在する膜タンパク質複合体であり, その構造を解明し, 合成・排出の分子メカニズムに関する知見を得ることは BC 生合成の生産性向上に繋がることが期待される. TC の主要構成成分には, BC の合成・制御に関わる CesA，CesB, 排出に関係するとされている CesD，CesC がある（図 A）. この内, CesC の構造
および機能は解明されていない．CeSC は１次配列から膜貫通ドメインと，34残基のモチーフ構造が繰り返されたテトラトリコペプチドリピート（TPR）ドメインの２つのドメインから構成されていると予測されている．本研究は CeSC の糖鎖排出に関わるメカニズムの解明のために TPR ドメインの構造解析を行った．
TPR ドメインは精製後も経時的に分解する性質があるため，トリプシン限定分
解により安定的な N 末断片（TPR-NTD）を同定し，この断片の結晶から
PF-BL5A にて 3.3 Å の回折データが得られた．さらに，Se-SAD 法で TPR-NTDの構造を決定することに成功した．得られた TPR-NTD の構造では，TPR モチーフの繰り返しの間に，TPR モチーフ A)
B)
BC
に属さない領域が挿入されていた．まC
OM
た非対称単位中に 5 分子の TPR-NTD
CeSC
が含まれており，それらは 3 種類のコ
CeSD
ンフォメーションをとっていた．これらのN
構造を比べることで，非 TPR 領域にあCeSBる 108 番目のロイシンの周辺で構造変
IM
CeSA
L108
化が起きていることが判明した（図 B）．
この TPR ドメインの柔軟性は糖鎖排出
図 A) TC モデル B) TPR ドメイン N 末端の構造に関わる挙動に関わると考えられる．
UDP)glucose154L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））z z z z z z z zåùî÷ûçÞÖäãÆsÒÐ  Ä  ÇOH
f9z
Interaction analysis of ZRANB3 in complex with
PCNA in template switching pathway
内田雅之 1，原幸大 1，田形梨紗 1，菱木麻美 1，石川吉伸 1，横山英志 1,2，
橋本博 1
z w&P`úz 8yQz
¯NM°z åùî÷ûçÞÖäãüýÈdcÇ  .ÆÍÐdct!Óm»ÐV[<\Ã±Ï­DÇ2GrÓqÄº¾  *Ã±Ð®
 È  Æ´·ÐqrÇ Ï-³ÆsÒÐðöãèóÖùáùëÚi
Ã±Ï­ OHxÓºÂ­ ÄW»Ð¸ÄÃ.nÆõÚöûç¹ÑÐ }®ºµº­½ÇhVÅóÙéßòÈ5ÎµÆÅ¿Â²Å²®7Q
SÃÈ­ Ä  ÄÇOHÓ5ÎµÆ»Ð¾ÌÆ­ ïîãèdÇ  XW6;jf9Ä;jÆÁ¶OH
f9Ób¿¾®zz¯3A°z ]^ÓH²Â  ÓkLF¹¼­uÖØù-Ùôò­R
I­K?Ùôò­ÜöCkÙôòÓH²Â  ÓUcº¾®Ucº¾ Ä z ïîãèÓBº­ÝäåÕùÛèøäî_>,0AÃ W6Ób¿¾®)ÎÑ¾W6Ç  X+('æûáÈ­À¶É/$ 4g ¢¦©¦¥z©¦§¬ ÇìûòôÖù  Ãvº­ Y-AÓH² 
ïîãèdÇ  XW6;jf9Ób¿¾®¹ÎÆ­ OHxÆJÓ% º¾  a  Ó]^ÓH²ÂkLF¹¼­  ÔíÕéåÕûUcÓb¿¾®Ucº¾  a  ÓH²Â­îöâ×ù
ÔäàÖÓb²­ Ä  ÄÇOHÓf9º¾®zz¯W:ÊZ#°z  XW6;jf9Ælº¾  dÇ W6Ó)Ð¸ÄÆ*º¾® Y-AÓH²¾;jU"Ób²­dÇT;jÓ@ »Ð¸ÄÆ*º¾®Ë¾­ JÓH²¾îöâ×ùÔäàÖÆÍ¿Â­OHÆpeÅÔñêo=Ó º­ O
HxÓº¾  Ä  ÄÇOHóÙéßòÓ5ÎµÆº¾®zz
Z1Ez} ££z z ©z¤~z{z¤¤ ¡ ~z¦¤z ¤¤~z ~z z|}z
} ª¥~z¢¦¨¤z{z¢ ¥~z¦¤z ¤¤~z ~z  z|}z
}  ¨©¦¥~z © §¨z{z¢ ¤~z ¥ ¨z «~z~zz|}z

155L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
BL-5A/ BL-17A /AR-NE3A

ビタミン D 受容体共有結合型リガンドの創製と結合様式解明
Discovery of ligand covalently binding to vitamin D
receptor and analysis of the binding mode
吉澤麻美 1、堀竜也 1、伊藤俊将 1、山本恵子 11 昭和薬大【目的】共有結合型医薬品には、アスピリン、オメプラゾールなどがあり、薬理活性の持続が特徴である。しかしオフターゲットの問題から、共有結合能を有する化合物は医薬品候補としては避けられる傾向にあり、共有結合型リガン
ドに関する情報は乏しい。創薬ターゲットである核内受容体については、少ないながら共有結合型リガンドが報告されている。それらはいずれもシステインと共有結合している。我々はビタミンＤ受容体（VDR）リガンド開発の一環として、求核性をもつヒスチジンと共有結合するリガンドの創製を行い、それらの結合様式解明を目的とした。
【方法】ヒスチジンとの共役付加反応を期待し、求電子基としてエノンを有する化合物を設計・合成した。VDR との共有結合形成の有無をエレクトロスプレー
イオン化質量分析（ESI-MS）にて測定し、Ｘ線結晶構造解析より結合様式の解明を行った。
【結果・考察】ESI-MS の結果、時間依存的に VDR とリガンド間に共有結合が形成されることが示された。またリガンドの側鎖構造の違いにより、結合の速さに差が観測された。さらに VDR-LBD とリガンド複合体のＸ線結晶構造解析
から、リガンドは His301 と 1,4-共役付加により共有結合を形成していた。また
結晶構造中には非共有結合型のリガンドも存在した。非共有結合型リガンドのエノン部分の配座は安定な s-cis 配座であった。結晶構造から共有結合形
成には s-trans 配座へ変換が必要となり、その駆動力はアミノ酸残基との立体反発であることが示唆された。

156L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-AR NW12A, PF-AR NE3A

ヘムタンパク質シトクローム c’のスピン転移機構
Spin Transition Mechanism of a Heme Protein,
Cytochrome c’
高妻孝光、高階明子、山口峻英、海野昌喜・茨城大院理工
シトクローム c’(Cyt c’)は脱窒菌や好色光合成細菌などのペリプラズ
ムに見出される c 型ヘムタンパク質である。Cyt c’のへム鉄は、異常な電子状態を示し、中性 pH 条件下においては中間スピン状態(S = 3/2)と高スピン状態(S = 5/2)の量子力学的混合状態となっている[1]。吉村らは、脱窒菌 Alcaligenes xylosoxidans 由来の Cyt c’ (AxCyt c’)の EPR スペク
トルより高スピン状態の寄与は、中性条件下においておよそ 89 %であり、pH に依存して、その寄与が変化する事が報告されている[2]。pH 12 以下のアルカリ性 pH 条件下においては、中性条件下から pH が高くなるに連れて高スピンの寄与が高くなる一方で、pH 13 においては S = 1/2 の低スピン状態をとる。本研究では、AxCyt c’の pH に依存したスピン転移機構の検討を、X 線結晶構造解析、MCD スペクトル、CD スペクトル、
ESI-MS スペクトルによって行った。
pH 6.0(1.1 Å分解能)と 10.4(1.48 Å分解能)における X 線
結晶構造解析を行ったところ、HelixC とHelixD の 間 に は 、Ser115 と Asn89 間の水素結合がある。また 、 HelixC に は 、Asp88 と Gln84 間にH2O が架橋水素結合
Figure 1. X 線結晶構造解析より明らかになった AxCyt を形成している。これらの水素結合ネッc’のアルカリ性構造転移
トワークがヘムに結合している HelixD 上の Cys116 にテンションをかけ、ヘムが歪んでいるために、(3/2, 5/2)の Quantum Mechanical Admixture となっていると説明される。アルカリ性になると、Asp88 は Gln84 とが直接水素結合を形成していることが明らかとなったが、これは、Asp88 と Gln84 間を架橋していた
H2O は、負電荷を有する OH-となり、Ap88 のカルボキシル基の負電荷と反発したことに起因する。この結果、Ser115 と Asn89 間の水素結合が切れ、ヘムのテンションが解消され、5/2 の高スピン状態のみになったと解釈できる[3, 4]。
References.
1. R. Weiss, A. Gold, J. Terner, Chem Rev, (2006), 106, 2550.
2. T. Yoshimura, S. Suzuki, H. Iwasaki, M. Masuko, T. Matsubara, Biochem.
Biophys. Acta. (1985), 831, 267.
3. A. Takashina, M. Unno, T. Kohzuma, Chem. Lett., (2015), 44, 268.
4. A. Takashina, M. T. Tiedemann, M. Unno, T. Yamaguchi, M. J. Stillman, T.
Kohzuma, Bull. Chem. Soc. Jpn., (2017), 90, 169. (Selected Paper)

157L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       Uâæùàóøúêç ¡ ÇI}KltF
Structural and functional analysis of human HP1
 j «| L  0V  «r   
 ESa'*'* $`/*^ba TP/*-?« ´×^b8 ,WS  ¡íæ÷Ü÷îåøì÷æÚø È\HTPÂ1Æ)¹Ô¾äøéÜxÂ«gkHÇJ­ÅsÅKlÖ:°¬ÃºÁíæ÷Ü÷îåø37ÆÐÓ (9ÏyÇM5«Goãøç÷ðÙ#ÊÇßêùàøq
Ç.!ÏHn{zÊÇGoÇÅÄ´<·ÑÔÓ¬¡ ÈGoÏ ÇäøéÜxÃ[Uº«Kl»Ó´¼ÇugÈAÅ´&¯¬¡ ëØïõùäøéÜxÈ CcÆÜ÷ñèðÚø« CcÆÜ÷ñàòèùèðÚø´)!º«ÀÇèðÚøÈêøá#Â~i¹ÔÁ¯Ó¬êçÈ¨«©«ªÃ¯°  ÀÇ ¡ éô÷Ý´)!º«¡¨È´×ÃÇ´AÑ³Æ¹ÔÀÀ®Ó¬¡ iäøéÜxÃºÁÈ   ¡ Ï ¢¥¦ ÇÐ°ÅGo
~ (äøéÜx´]ÑÔÁ²Ò«¼ÔÑÇ$xäøéÜxÆÈ ¡§¤§ñåùë´)!»Ó¬¸ÇñåùëÈ ¢ ÃÆ[U»Ó´«¢ %Ç#ÆÐÓiÏwdKIÎ=¹ÔÁ¯Ó¬ D^bÂÈ ¡ Ã$xäøéÜx«QÆ   ¡ Ï ¢¥¦ ÃÇiJ2Ö
T*Y«I}TP*YÆAÑ³Æ»Ó¸ÃÖZYÃºÁ¯Ó¬¸ÔÌÂÆ'mpÖ¿¾h>±äøéÜxXRfÖIeº«¼Ô½ÔÇäøéÜxÖ'
Æw@»Ó¸ÃÆ7º¾¬ÞöÕÏ £6NO+"Û÷õðçõùÖ¿¾tFÆÐÒ ¡ Ã   ¡ É ¢¥¦ ÃÇ[U´_vÂµ¾¬ 4È
¡ Ã   ¡ ÇqiBÖZ;»Ë¶«¡§¤§ ñåùëÖÍ ¡
i#ÖQ+»Ó¬158L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL17A

染色体接着を阻害する PCNA 変異体の構造解析
Structural analysis of PCNA mutant that inhibits thesisiter chromatid cohesion
鈴木麻里子 1，原幸大 1，東寅彦 2, 升方久夫 2，高橋達郎 3，橋本博 1
1 静岡県大薬・2 大阪大理・3 九州大理
【目的】 PCNA（Proliferating Cell Nuclear Antigen）は、ホモ三量体リングを形成するタンパク質であり、DNA 複製や修復、姉妹染色分体の接着などに関与する様々なタンパク質と相互作用することで、これらのタンパク質を DNA 鎖につなぎとめる役割を持つ。本研究では、姉妹染色分体の接着に必須の sororin
タンパク質の DNA 鎖へのリクルート阻害を起こすことで、染色体接着を阻害す
る PCNA(P129E)変異体（PCNAP129E）の X 線結晶構造解析を行った。
【方法】 アフリカツメガエル由来 PCNAP129E(xPCNAP129E)組換えタンパク質を用いて、シッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化条件の探索を行った。スクリーニングで得られた結晶を用いてつくば高エネルギー加速器研究機構放射光施設 Photon Factory ビームライン BL-17A にて X 線回折実験を行った。得
られた回折データを用い、ヒト由来 PCNA（hPCNA）の既知構造をサーチモデ
ルとし、分子置換法により xPCNAP129E の構造解析を行った。
【結果および考察】 構造解析の結果、xPCNAP129E は野生型同様、三量体リング構造をとっていた。そこで、xPCNAP129E の各サブユニット間、または hPCNAと xPCNAP129E とを Cα 原子を用いた構造の重ね合わせを行ったところ、構造のずれを示す Root mean square deviation は 1.0 Å以下となり、変異体と野生型との間で、全体構造に大きな違いは見られなかった。以上の結果から、P129E 変異は PCNA の全体構造には影響を与えないが、129 番目の Proline
が sororin をリクルートするうえで重要な足場となる可能性が考えられる。

159L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       ª¤¡ùýÿõþøòuóûðöîôüþß&]bw
Electron Transfer Pathway of a Blue Copper Protein,
Pseudoazurin
,ÈoMmrÈQf6dRÈ./lÈ%(
n!$R0 &e\)+?
 óûðöîôüþàÈk_pÞÍËÚ[~aÜ_a~
aâß&} ÜÓÚIiÓÚËéÉN;9Þ'Ôé £ÁÇïñþÞà £Ã¿ È©´À È¥·¿È¥·¿  Ï ÓÈJíØ
H|ìÜÙÚÍèÈ
y2È¡Â·°¹«¶¼º±·² ßH|;ìDÔéÑÜÏBçÎÜÝÙ×É¥·¿  K"y ÞàÈ ÞÓÝË ©´À K"Ï'ÓÈ4ËY TìzÓÚ
N;9ß&O<ì8ÓÚËéÉ©´À ìßîú÷Þf>ÔéÑÜÞæè ¡Â·°¹«¶¼º±·² =ßÏ#Ôé®¯É©´À ìjhAîú÷ÛÊé¦¹´È¬°¹ Þf>ÔéÜÈ¡Â·°¹«¶¼º±·² =àÈãä «¶¼º±·² âÜx]Ôé®¯É EZ^ÛàÈN;9y ß ©´À K"ìjhAîú÷ÛÊé ¦¹´È¨´ÁÈ
¬°¹ Þf>Ó× ©´À¡¹· #V ì=ÓÈL)W;uÜ&]
:bwÞÔéZ^ìqÙ×É ©´À¡¹· #V Ü[~aÜß&]:{3àÈS ÛÆ ©¿ ÛÊÙ×ßÞ*ÓÈ©´À¬°¹ ª¡Ä È ©´À¦¹´ ª¡Ä È©´À¨´Áª¡Ä Ûà Æ©¿È Æ ©¿ÈÆ ©¿ ÛÊÙ×É­ ecCH|tFìqÝÙ×Ü
ÑëÈ¥·¿  Ü  UXßîú÷ß
1vàÈS Ü ©´À¦¹´ #VÛàÈÕêÖê  Å Ü Å Û  S Ü ©´À¦¹´ #V ßNèÈĀā îú÷ß ÜN;9;9Íæá` ßH|ß &ßvÏÐÝéÜÈ
&]:{3Ï-ÒÐÝéÑÜÏgÌçÈĀā îú÷ß Ï&]bw5=ÞsÝ7ìG×ÓÚËéåßÜgÌçêéÉ
g@P¤·ÀÄ½°À¾·²¸©¢´À°¹§¹»¼¾µ¢·¼²¶´º
¡±³´¹¶°º·³«¤´À°¹§¢·¼¹¹»¼¾µ£¶´º 

160L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL５A

リジニバチルス菌由来毒素タンパク質 Bin toxin の構造解析
Structural analysis of Bin toxin from Lysinibacillus
sphaericus
松本勇 1，加藤公児 1,2，Panadda Boonserm3, 田中良和 1,2，姚閔 1,2
1 北海道大学生命科学院，2 北海道大学先端生命科学院，
3 Mahidol University, Thailand
真正細菌の一種であるリジニバチルス菌は，毒素タンパク質である Bin
toxin を産生する． Bin toxin は，マラリアやジカ熱を媒介する蚊の幼虫に対してのみ毒性を発揮することから，蚊を抑制する生物殺虫剤としての利用が期待されている．Bin toxin は 前駆体の proBinA と proBinB からな
る二成分性の毒素であり，細菌の体内中に結晶として産生される．細菌から放出された結晶は，幼虫の中腸に達すると，その塩基性条件下において溶解される．続いて，前駆体は宿主酵素による部分切断を受けて，活性型の Bin toxin となる．そして，活性型の BinB が宿主受容体へと結合することによって細胞内へと移行し，最終的に，BinA が中心となり細胞傷害活性を与える．既に，Bin toxin は，細胞膜を破壊する膜孔形成毒素の一種であると考えられているが，細胞傷害活性に関する分子機構の解明には至っていない．
本研究では，proBinA の単量体
Asp342
Asp342構造を分解能 2.7 Å で明らかにし(pH 10)た．得られた構造を，既知の pH 依
Asp342
存的な proBinA•proBinB のヘテロ
(pH 7)
二量体構造と比較した．その結果，
proBinB
Ile141
proBinA の膜孔形成への構造変化に重要だと考えられている
Tyr299(pH 7,10)
Asp342 の側鎖は，pH 7 の配置とはGlu240
Tyr299異なり，pH 10 の配置と同様に反対方向に配置されていた（図）．ま図．構造比較
た興味深いことに，Tyr299 の側鎖の向きに有意な違いが見られた．ヘテロ二量体構造では，Tyr299 は，
proBinB の Ile141 の主鎖と水素結合を形成していたが，本研究の構造では，Glu240 と Asp342 の間に入り込んで弱い水素結合を形成していた．この proBinA の Tyr299 は，ヘテロ二量体ではプロトマー間で水素結合を形成して結晶を安定化させ，また結晶の pH 上昇に伴う溶解の後には，
Glu240 と Asp342 の配置を維持することで，膜孔形成への構造変化に影響していることが示唆された．

161L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））³ ³ ³ ³ ³ ³ ³ ÉÄ·ÁÇ·½À¶³ÁÇ·¹À³

IĉĩĐĒĄĬ Ê·q£{ ÈÐÑÑÏÒÍ·ÎÐ ëª1aï
U da/jP³
Biostructure analysis of insect glutathione
S-transferase Noppera-bo with inhibitor compounds
×s!> ¹ĭ5o.+¡ ºĭX°, ¹ĭ&* ¹ĭ570; »ĭ6¢« »ĭ¨¦#¬ »ĭ ¼ĭ8¬+ ¼ĭ_MJ ºĭf " ºĭ« ¹³´u])ĭd c' ¹ĭ²ăęlĭaUlĭU da ºĭO)ĭYU »ĭO)ĭd p/ ¼µ
IĎĔīāĖġĩĥĬêØûăĈčĎĔīāĖðÔkë(@ï4î¥êØûÕăĈčĎĔīāĖðSa÷RaïĎĔīāĖġĩĥĬëhíû
U ýnãæõÔăĈčĎĔīāĖïdAýª1ãûðc'îâÙëíú<ûÕ³ăĈčĎĔīāĖð®¯gNïĊĪĎĔīĮĩýi`ëâéÔGï£{îøúdAáüûÕăĈčĎĔīāĖdAýCÚ£{ï ¹ èêØûÈÐÑÑÏÒÍ·ÎÐ´ÈÐÎÐµðÔĊĪĎĔīĮĩïDýwãûĉĩĐĒĄĬ Ê·q£{´ÅÊËµêØûÕ ï ÅÊË VîÔÈÐÎÐ ĐĬĝĈð)ýeÙæi
bzëÿĞĀĘĔĀĮąħĤýeÙæyČĎĔĤîøçé2Kî)§yêßûÕóæÔÈÐÎÐ ï£{^=ïTïæõîÔãêîBÖð²?: ÅÊË £{^=ĠīĮğ »¶¼·ÃÈÀÃÂÄ ýeÙæ±vÿēďāČĎĔĤýUx
âéÙûÕåàêBÖðÔ}FÛ ÈÐÎÐ ĐĬĝĈë »¶¼·ÃÈÀÃÂÄ ýeÙéÔ)WaħāğħĨĮïÝù ÈÐÎÐ ª1ýE|âÔHïëíûaýE|âæÕ³BÖðÔO)YUïĊÿaħāğħĨĮîóüû ¿¶¾¸¸ r­ï-aý3îª1E|ýçæÕåï~QÔćāīČĦĂčĦĂĜ
ăÔěĢđħąÔĊėĆÜøñęēĐāČĢąîgNãû ¼³ rï ÈÐÎÐ ïÙäüýöª1ãûGrïaý<æÕ³ZîÔÈÐÎÐ ëª1ï eY9ýJãûæõÔÈÐÎÐ ĐĬĝĈï Ì ~LU PýçæÕåï~QÔćāīČĦĂčĦĂĜăÜøñęēĐāČĢ
ągNï ÈÐÎÐ ĐĬĝĈï~LîAâÔt U ýJùÝîâæÕÈÐÎÐ ð jí ÅÊË ëVî§ U ýnâÔÅÊÆ ~ċāĕÜøñ%~ċāĕÞmáüæÕáùîÔÈÐÎÐ ëª1ëï ï~QøúÔª1ïįèêØûÓăĎĕħčĄĮĩðÔÈÐÎÐ ï%~¢ î~ãûàëÞÝçæÕVîÔòëþìïª1Þ%~ċāĕî~ãûàëÞmáü
æÕb$ÔęēĐāČĢągNï ÈÐÎÐ ëª1aï ïU PÜøñhr©êï ÈÐÎÐ êï ÅÊÆ ~ċāĕë%~ċāĕïÿģĚ¤[%ï\ýôéÙûÕ³

162L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））                            ¨¤¨£ öăĐüýĎąøwà ª¨ q âÏÓîeD0ãC{&X]a©¾¼¿¯¾¿¼­·½¾¿°Áº²®µ¹°µ¹³¸º°±µ¹¶µ¹­½±»¼º¾±µ¹¨£
­¹°ª¨­¹­·º³¯º¸»·±À±½
Ĕ m@+5.  ďV\=ĔēĖ#-Æĕ m #&#&S-&]a_ Ė m #ĆčĎÿóòûĎýĐÉfuÊ ¨£ ä ­­¥ K4ã ©±¼ª´¼ öăĐüßËîÇÔãýĎąøwäT
ßkċĎÕïîÔàßK4ÖÆdiFñ|×îÇÔïæßã]aß « gC{tAâëíÆ¨£ ãöăĐüĂĉôĎâæïî ª¨ e}ãb C{Ñ:ìÐâÕïÞÌîÇ¨£ ãO3àÖÞÆª¨ e} âä"7ãI$Ñ%ÖÞÏíÆª¨ e1é7ãI$ÑÙãææe} â%ÕïÞÌîàÌÍÔààÆ,ôõĎÑ  ÝÖÐ~ ÖáÌÔàÑÐÜÞÌîÇÙãÛèÆéÍ  Ýã,ôõĎãðíâÆI$ê ¨£ ãG!Ñ ª¨ ãċĎ!ñ'(ÕØÆċĎy`ñúĈĐā×
îàhÎìïîÇÙÔßÆ¨£ à ª¨ ÏëåDÈá ª¨ àãq ã
« gC{tAâëíÆª¨ ãċĎy`ECãh*ñoÍÔàñYXàÖÛÇÉ) ÊöăĐüĂĉôĎG!7 ñ#lnß#WRÕØÞcpÖÛ ¨£ ñUÖÛÇe<âä¦¡©§ Æª¨ âäÆ©µ³¸­ ·°¼µ¯´ pã¥¨¨¦¨đ¦¨Ēà ª¨Ä©đ ©ĒÏëå ¥¨¨¨đ¨ĒÆÙãâéª¨ à ¨ ñUÌÛÇ,âä ¥³· ñUÌÞÆ»¡ ä  à ÆM/ä £ã>ßĄĎ÷ĎùĂčþćJâëíe<ÖÛÇæÛÆĊČHÑ ¨£ª¨ė, âáîëÍâ ¨£ NLâòăčùà,ñÎÞÆÙï
ñýĎąøwNLàÖÛÇ« g6) äÆ££¨¤ ß £ ã MßoÌÆ¨´±¹µÀ à ¯ºº¾ ñUÖÞĀĐýtAñoÜÛÇÉeBÊ
tj ĘÅã9sC{  Ýñç  C{ñ2îÔàÑ?ÛÇ
ÙïÚïãC{âÏÓî ¨£ à ª¨ àãeD0ãHzâëíÆ
ª¨ ã  ÝãeD0àráIã%Ñ^vÕïÆÂÆÃÆÄċĎ
ÑZgPã;ây`ÑxÔîàh*ßÒÛÇæÛÆ¨£ª¨¥³ C{âëíÆċĎy`ZãC{ã[ UD0ñh*×îÔàÑ?ÛÇÉh8QÊ¬­¸­³¿¯´µ±¾­·¢¨©º¹²¨¼º¯

163L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL1A、PF-BL17A、PF-BL5A

ニワトリ FANCM-CENP-SX 複合体の X 線結晶構造解析
X-ray structural analysis ofchicken FANCM-CENP-SX complex
伊藤 翔、西野 達哉
東京理科大学大学院 基礎工学研究科 生物工学専攻
真核生物が生命活動を維持するためには、細胞分裂時に染色体が正確に分配されることが極めて重要である。染色体上のセントロメア領域に形成されるキネトコアは染色体と微小管を接着し、正確な染色体分配に必須な役割を果たす。キネトコア形成不全は細胞死や遺伝病を招くことが知られているが、キネトコアの形成機構はいまだ不明な点が多い。キネトコアは層状の巨大タン
パク複合体で、外層は分裂期での微小管との結合、内層はセントロメア領域との結合を担っている。CCAN(構成的セントロメア結合ネットワーク)は内層を構成するキネトコア構成タンパク複合体でこれまでに 16 の因子が同定され細胞周期を通してセントロメアに局在する。CCAN に属する因子のうち CENP-SX と
CENP-TW はヒストンフォールドを有しており CENP-TWSX 複合体を形成する。
CENP-TWSX 複合体は外層のキネトコア構成因子と相互作用しキネトコア構
築に重要な役割を果たすことが示唆されている。一方で、CENP-SX は DNA 二
重鎖修復にかかわる FANCM と複合体を形成することも知られている。CENPSX の２つの作用経路がどのように制御されているかを解明することはキネトコアの形成機構に関する新たな知見につながると考えられる。そこで２つの経路における CENP-SX の DNA 認識機構や構造の違いをみるために、まずは
FANCM-CENP-SX の X 線結晶構造解析を行うこととした。
CENP-S の天然変性領域を除いた FANCM-CENP-SX を精製し、結晶化した
ところ、異なる条件から複数の結晶を得ることができた。PF にて X 線回折デー
タを測定し CENP-SX を探索モデルとして分子置換法を行ったところ FANCMCENP-SX 複合体および CENP-SX 複合体の立体構造を決定することができた。続いて全長 CENP-S を含む FANCM-CENP-SX 複合体を精製し DNA と混合して結晶化を試みた結果、六面体の結晶が得られた。PF にて X 線回折データを測定したところ分解能は 5Å であった。先ほどと同様に分子置換法による立体構造解析を試みたが位相決定に至らなかった。今後はセレノメチオニン置換体を作成して移送決定を行うとともに結晶化条件の最適化を進め立体構造決定を目指す。

164L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-NW12A, NE3A, BL17A

漢方生薬ゴシュユ由来Ⅲ型ポリケタイド合成酵素のX 線結晶構造解析
Crystal  structure  analyses  of  plant  type  III  polyketide  synthases  cloned  from  Evodia  rutaecarpa  松井崇 1、児玉猛 1、只腰哲弘 1、森貴裕 2、  野口博司 3、阿部郁朗 2、森田洋行 1  1
富山大・和漢研、2 東大院・薬、3 静岡県立大・薬  冷え症などで処方される温経湯や当帰四逆加呉茱萸生姜湯に含まれる漢方生薬ゴシュユの基原植物 Evodia rutaecarpa からは、漢方の効能を示す化合物以外にも抗菌作用を示す 2-アルキルキノロン類が多数単離されている。
これらの化合物が持つキノロン骨格は抗生物質等の医薬品や医薬品リード化合物として有用な骨格である。そこで、2-アルキルキノロンの生合成酵素を構
造情報をもとに改変し、生理活性を持つ非天然型キノロン化合物を創出する目的で、はじめに Evodia rutaecarpa の 2-アルキルキノロン生合成に関与すると予想されたⅢポリケタイド合成酵素（PKS）の構造・機能解析を実施した。
Evodia rutaecarpa より得られた 2 つの新規Ⅲ型 PKS であるアルキルジケチ
ド CoA 合成酵素（ADS）と 2-アルキルキノロン合成酵素（AQS）について、ADSは C8 から C12 の脂肪酸 CoA とマロニル CoA を縮合させアルキルジケチド CoAを生成した。また、AQS は非酵素的に加水分解されたアルキルジケチド酸とN-メチルアントラニロイル CoA の反応を触媒して 2-アルキルキノロンを合成することがわかった（図 1）。一方、ADS は他の炭素鎖長の脂肪酸 CoA ではジケ
チド CoA を生産できなかった。また、AQS は N-メチルアントラニロイル CoA とマロニル CoA が縮合したキノリノンを合成できなかった。ADS と ADS 変異体の構造比較から、ADS は活性中心キャビティに特徴的に存在する W332 により活性部位の容積と形状が制限され、C8-C12 脂肪酸 CoA のみジケチド CoA へ変換できる事がわかった。一方、AQS と AQS Y215V 変異体の構造比較から、
Y215 が形成する細い CoA-binding channel のために、AQS は CoA エステルではなくジケチド酸を基質とし、ADS と AQS の共同的な生合成により 2-アルキ
ルキノロンを生産することが明らかとなった。

図 1. ADS と AQS による 2-アルキルキノロンの生合成

165L（生物物理，生物化学（結晶構造解析）） ¢¡¥ðõø ë÷ïåvçóâîàéô÷Ñ¾ÃÝmN·I"T PÒD
The Effect of Aromatic Ring-Water Interactionin Blue Copper Protein, Pseudoazurin
w,20¸Ke5cM¸ 'f¸-.n¸!$o M/ "dW%+;


k\p ¨ª±¯­¯§¦¨³©± ¨´¨¬¯¨¬¦²³©² QCÒçóâîàéô÷Ó¸k\~YÑ¾»Í" ÏÆÍGjÆÍ»Ý¹J86Ò]ÑÓ ©³HÀeÆ¸J86Ò áä÷ÑÈÝ «² ÏÒT PßzÆÍ¸GjSLÏJ86F|Ò&(8Ñ)ÆÍ»Ý¹BUZÎÓ¸ ©³ ßÒÐ» ¬´ Ñe:ÆÊ ©³¬´ Rß qÆ¸F|Ù"X7ÑÖÈDÑÌ»ÍEuÆÊ¹ ©³¬´ Rù° úÒb@Ò@^Ó=>@^ÎºÜ¸[gÓ ¢¸tj µ ÎºËÊ¹¬´ Ñe:ÆÊ  yF|Ó¸ ©³¬´
Òb@ÓiÑû"#ÆÍ¾Ü¸ª¦«®  ÎÓ ©³ ÒºËÊeÑI"Ïh½ÛÞÝ"*1ÀsÅÞÊ¹sÅÞÊI"Ó¸«² ¿Û_  µ ÞÊeÑ#ÆÍ¾Ü «² ÒáòìêøõNÏ3ÂT PÆÍ»ÝÏh½ÛÞÝ¹ª¦«® ÎÓ ²° ¿Û
©³ ÑlÝõø
ñùæáîõøñú
ÀJ86Ñr»¿ÕÅÝÚ¼ÐF|ÏÐËÍ»Ê¹


¥£
¾ÚÔ
©³¬´
RÒJ86yF|©³¬´  RÏV `ÏÒ"X7{1(<Ó ¶  ² ÎºÜ¸Où¶ 
² úÚÜØ}ÂÐËÍ»ÝÄÏÀ?ÆÊ¹ ©³¬´ RÏV `Ò"X7À}ÂÐËÊÒÓ¸ ©³¬´ RÒ À­¤ ÂÐËÊÄÏ¸×Ê¸J86Ñr»¿ÕÅËÍÁÊæáîõøñÀA
Ð"XïèâãáßðöíåÆÊÄÏÑÚÝØÒÏh½ÛÞÝ¹ÄÞÛÒÄÏ¿Û¸ ©³ Ó «² ÏÒ3»T PßzÇÍæáîõøñß&(ÅÉ¸AÐ"X7axÒ49Ñ)ÆÍ»ÝØÒÏh½ÛÞÝ¹

166L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））¤ ¤ ¤ ¤ ¤ ¤ ¤ ¿¸¨µ»«´§¤ ¿¸¨µ»«±´§¤ ¿¸´À¨½·­´¤nio ¿¾¼¹ÏÂ« ÷Ix*ón IFB¤´¤ ÏÐÖÈÍ¤ ÆÄÒÅÐËØÇÒÄÔÈ¤ ÅÌÏÇÌÏÊ¤ ÇÐÎÄÌÏ¤ ÐÉ¤ ¿¾¼¹ÏÂ«¤ ÓÔÈÎ¤ÒÈÊÌÐÏ¤ÎÐÇÕÍÄÔÈÓ¤¾¨ÎÄÏÏÐÓØÍÄÔÌÐÏ¤ÓÌÔÈÓ¤ÐÉ¤Ù¨ÇØÓÔÒÐÊÍØÆÄÏ¤Ec «§¤ {¤  ¬§¤ /Y¤  ¬§¤ z¤ Ml ­§¤ 0¤ # ®§¤ -C¤ M ®§¤ ¨{¤ ) ¬§¤ 5P¤ U) ¯§¤ J¤ e` ¯§¤ K¤ O7 °§¤ ;Y¤  ®§¤ 2
C¤ N ­§¤ Y¤  «§¤ }¤ S' ¬§¤ }¤ £ «¤¤«¬¢ćĘfĩQFfĩFVQ§¤  4,^ĐĨđĪf§¤­ Wsfĩ|#a§¤® h;%ĩ§¤¯ f§¤° H1%ĩV¤ĎďĕħěąĨnđĨĚĊøÛpwyó#3yăqçêĀ ãöýîñmv÷r<õôGÝõVTöàßñõ ãèñßĀÜæ÷p
wyó#3y÷qöøÛÙ¨ĎďĕħċĥĈĨīÙ¨¶¹ĬóùāĀpwy
ö.!éĀČĜģėēĕ÷ ¾¨ğĨęĪď"nóĤĠėĨó÷qâòÞĀæóâĂáîñßĀÜ+ö Ù¨¶¹ ö ¡çāì ¾¨ğĨęĪď"n÷jòÞĀĉčħĪď¥ÃØÍ¦¨ċĦĊħĨ¥¹ÍÆ´¦÷tÿèFâĤĠėĨó÷
c=dXéĀæóâĂáîñßĀÜçþö ÃØÍ¨¹ÍÆ´ tÿèFàýúë÷$óõĀnF6:öĂĀo÷)uâ &8mĎďĕħěąĪ÷ )ó*çāñàÿÛAfkòøë÷ )÷ïòÞĀ¿¾¼¹ÏÂ«¤¥ÑÒÐÔÈÌÏ¤¾¨ÎÄÏÏÐÓÈ¤Ú¨«§¬¨½¨ÄÆÈÔØÍÊÍØÆÐÓÄÎÌÏØÍÔÒÄÏÓÉÈÒÄÓÈ¦öLbèìÜæāûò ¿¾¼¹ÏÂ« ø ¹ÍÆ½´Æ¨Ú«§¬¨¼ÄÏ¨¾¨F6:öĂĀn¡oòÞĀìüÛ¿¾¼¹ÏÂ« ÷Ixó\9ó÷ø?òÞîìÜq@Fáþ ¿¾¼¹ÏÂ« öøï÷ĖĢĆĨ¥ďĔġĖĢĆĨÛ(ĖĢĆĨ¦ă<ïæóă?þáöèìÜ¼ÄÏ¨¾¨ĞĝĒĖó÷FáþÛ(ĖĢĆĨøR*÷ĄĠęă éĀæóøõäÛĞĝĒĖ÷[J8ă èÛ
¹ÍÆ½´Æ¨Ú«§¬ ă ¡éĀæóâ?þáöõîìÜçþöq@FBàýúë÷Fö#ðäIxBă~îìqDÛďĔġĖĢĆĨână òãĀ
æóă?þáöèìÜďĔġĖĢĆĨø Ú qèì ¹ÍÆ½´Æ öRZ8ă<íÛpwòø ¿¾¼¹ÏÂ« ÷oV:QòÞĀ ¹ÍÆ½´Æ¨Ú«§¬¨¼ÄÏ¨¾¨àýúÃØÍ¨¹ÍÆ´ tÿèF÷$F¥¹ÄÍ½´Æ¨Ú«§­¨¹ÍÆ½´Æ¨¤Ú«§®¨¼ÄÏ¥¨°¨ÑËÐÓÑËÐ¦¨¤¾¨¦ăqòãĀæóăgèìÜæ÷_áþ Ù¨¶¹¤öàåĀ ¹ÍÆ½´Æ¨Ú«§¬¨¼ÄÏ¨¾¨ČĆĕ÷ĊĤďđĥĨċIFÛçþö
¿¾¼¹ÏÂ« öýĀ\9_]IFă>èìÜ¤ ¥½©¤ºÕ×ÄÅÄÒÄ¤ÈÔ¤ÄÍ©§¤¿½´Á¤««­¤³¬²ª¨¯¤¥¬ª«°¦¦¤

167L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL5A、MLF-BL3

Glucose isomerase の反応機構解明に向けた中性子結晶構造解析
Neutron crystal structure analysis for elucidation of
the reaction mechanism of glucose isomerase
矢本早紀 1, 小松崎直也 1, 日下勝弘 2, 矢野直峰 2
奥田夏樹 3, 佐々木昭雄 3, 田中伊知朗 2,4
1 茨城大院理工, 2 茨城大フロンティアセンター, 3 (株)V.I.C., 4 茨城大工
Glucose isomerase は、glucose と fructose の互変異性を触媒する金属酵素
タンパク質である。TIM バレル構造を持つホモ 4 量体で、バレルの中心に活性部位がある。糖の互変異性は、開環、異性化、閉環の３段階反応からなる。この反応のうち、異性化反応において glucose の C2 から C1 への水素移動反応が伴うと考えられているが、その詳細な水素移動反応機構は明らかになっていない。そこで今回は、重水バッファーを用いて重水素交換をした glucose
isomerase、金属、glucose の 3 成分複合体結晶を共結晶化し、X 線・中性子結晶構造解析によって反応機構を解明することを目的とした。
Glucose isomerase タ ン パ ク 質 は Hampton Research の HR7-102(Streptomyces rubiginosus 由来) を購入した。結晶化剤に硫酸アンモニウムを用いて、279K で結晶化した。金属 Mg とリガンドとなる glucose はソーキング
によって結晶へ導入し、３成分複合体結晶を準備した。なお、結晶化からソーキングはすべて重水下で行った。室温中性子回折データと室温 X 線回折デー
タはそれぞれ J-PARC MLF BL-03 (iBIX) 、PF-BL5A で測定した。中性子回
折測定のデータ処理は STARGazer、X 線回折測定のデータ処理は HKL2000を使用した。
Glucose isomerase、金属 Mg、糖 glucose の 3 成分複合体結晶(1.1mm3)が得られた。測定の結果、Ｘ線・中性子とも空間群は I 222、a = 97.09Å、b = 99.69Å、c = 102.92Åで、分解能はそれぞれ 1.39Å、2.0Åでデータセットを得た。ＰHENIX を用いた X 線・中性子同時精密化による結晶構造解析を行った。基質の gｌｕｃｏｓｅと２つのＭｇ原子が活性部位に結合しているのが確認できており、
詳細は解析中である。

168L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））      ¡¤éùåîãêûþÓÃÆÞ Asn9 Ô$E
Outer-sphere Effect of Asn9 in Pseudoazurinj  A»./k»&)
l!%R0 'e]*-<éùåîãêûþÕ»i`x^ÓÃÀÎ[}z|c×Ô '  ÐÉÎHhÉÎÀÞÅ»éùåîãêûþÔÛÁÒ 'yëþóètâ6ÐÉÎ»ëþóètÔGwÐHhÐÔXâgÂÞËØÓ»M76vÏÔJ
cdðìíýÿèÓÍÀÎÔFrÅmáßÍÍ¿Þ¼v1»òäõûìî,2K=LÓÛÌÎéùåîãêûþÔM76GwÐ 'O8ÓÍÀÎF
rÉËÐÇà»¥ eLÓÛÌÎ5ÜßËM76GwÃÛÖ 'O
8âqaH]*VÓQÊÞËØÓÕ»ÓW:{ÊÞãöñ}I"Ā¯µ ¹µ ¯µ ¬¶ā$Ó»$Ó(ÊÞ µ² âØÎqaÊ
ÞÇÐÅ~nÏ¿ÞÇÐÅ?ÉË§¨¼ÇÔÛÁÓ*VYoÃÛÖqaH
]*VYoÄÜ»éùåîãêûþÔ$Ó(ÊÞ µ² I"ÔM76
GwÐ 'O8ÔsbHGÔøçïê÷âYÞÇÐÓÛÝ»ëþóètÓÃÆ
Þ$GwÅHhÚN7UQÓÑÔÛÁÓ+ÉÎÀÞÇÐâYÞÇÐÓÍÒ
ÅÞ¼º phÏpDÉËS éùåîãêûþÔ ¥ ed@GwÏÕ»µ²ÕÔ{ÓÊÞ¯µ ÐJcdâBÉ»vÔ ¹µ ÐÙJ'âÉÎJcdâ39ÉÎÀÞÇÐÅ\ÈßÎÀÞĂ§¨¼CZ_ÏÕ µ² â ÔfÏJcdâ39ÉÒ
ÀôæïüãúïþĀ ®¬āÓf;ÉË µ² ®¬ #T â 9É»éùåîãêûþÓÃÆÞ µ²Ô4ÓÍÀÎFrâ  éùåîãêûþÔM76ÃÛÖ µ² 
mÌË¼
uÔGw

½g>P¾§¨£¦©±©­·ª®¯¬¶©°·°°®¬±¢³ª´²§¨£¦©±©­·ª®¯¬¶©°¡¢«¸

169L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       µ¬¨²¤§Í³²¬¨²¢ĚąćğĖĢl ì6)MIëÛçPreparation of sugar-Lysozyme complexes
for neutron structure analysis
3|i 1ÍA0 2,db- 2,]eE 1,2
 y#'. ¡ y#'đĜĞĉüûĄĞĆğ


Ðr Ñ
ĚąćğĖíozìow%ēĒćČÿĚþĞì ´ûĄćěĖęĕĞé ´ûĄćěÿěĀāĕĞììÿĚĀĂČpù?ßönèÒöÎ.K`ëí_×ô;ÞäĚąćğĖØò{ë4\Ý÷çÓöÎÞ×ÞÍĚąćğĖì(OMíBÝ÷çÓêÓØ&ÚÍNÏê4OMØ= Ý÷çÓöÎGfjèíÍ6)MIëóåç*ØF2Ý÷öÍĒĜċď
ğĂĘĞìD[òQn)Ččğc9ùb<gèÙö@6ØR*Ý÷äQQì u7$\ÓçÍ4OMBë1käáöÜéùa`éßöÎï
àíâìXìäðëÍº sIëóö ìLÖóîÚ*Ý÷çÓö6)ĉăċ+ëóõÍpCò!:xìgù}ÔÎ
Ð+Ñ
!+ë\ÓäĚąćğĖí ·¯­³§§²ª¶¯©® hì ®«¹²ĎĝċĚ_ĚąćğĖù \ÞÍlí ´´Ë´ÌË´ÌËÌ¸¾ÈÆ»»½¾ÈÊÂ½ÀÁÈÄÈ¾ÈÆ»ÄÇ¾´§­£é´´Ë´ÌË¸ÆÁ»½¾ÈÊÂ½ÀÁÈÄÈÆÁÄÇ¾ ´§­¢èÒõÍª¾ÉÈÆ» ²»¼ÄÆ»ÈÄÆÁ¾Ç hóõÞäÎĚąćğĖ´§­£´§­¢ìpCv8Híâ÷ã÷ÍėěPè
ĚąćğĖĤlĥ Ĥ ¡ èUÝáÍĚąćğĖZ/ ¢Ã¿Ã²Í´»©Â pCZ/í ¥³Ít~YTĠčċĚýĖġĤ¤³ Å®£¤ÍV/ ¡¦¢± ëçpCv8ù}åäÎº s!:ĊğĆí V ±è µ¬¨²¤§ èW*ÞäÎïäÍ
6)!:ĊğĆíÍÅª £ ìQu>pCù,Vëç °µ§¶© ³²¬¨²¢Á¨¯ºèW*ßö*èÒöÎÐpJÑ
º sMIëóåçĚąćğĖ´§­£´§­¢ì ìS6 ëlØÕçÓöÜéùgßöÜéØèÙäÎqÛçÍ6)ĉăċW*ëÛQĐĈđúù\ÓçpCù}åäéÜøÍmģĦĦëßö'"ìpCù 8ßöÜéØèÙäÎÜìpCù\ÓçÍñêÚ6)ĉăċW*ù}ÔìèÍĔăĆğ^èíâìpJìééñëÍx º sIìpJëæÓçñ^ÞäÓé5ÔÎ

170L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       ¤ ¢ðā÷ítÜÈÍçFxÚM8Ý:8Additivity of the Structure and Properties
in Protein Molecule/0kÂ.~ >Â&)
l"%R1 'e[*-< ðā÷ítÝFxÚM8ÞÂûùñôcÂKacÂAc8YUÊbáéÏæWQÏèØÅçÃh^` 'yðā÷ítîýìôëïþ
āÜÈÅØÂL87w ÙÝA8Ý3ÅY UÝ}p8Ü×ÅØ
Z]ÊnéèØËÕª«ÃîýìôëïþāÞÂ¿» Éå £°¼ ÜiçøĀāó
ÿĂùÜ ¿»Â³»Â£°¼ Ý ½ 'úÝ{ëüõ|êAÐÂ§²º Éå
³» àÙÝöòíÿĂùÜã ½ 'Ü{Ñç ³» J#êAÐØÅçÃ
ÎèàÙÜÂøĀāóÿĂùÝ ³» w Ü( Ñç £°¼ ÊÂîýìôëï
þāÝ 'N9ê6ÐÂîýìôëïþāÝ ¾³¬µ¥²¸¶­³® Ý}Fx8ÞÂ Ýëüõ|Ý ÜäÖØ`dXÜ$ÑçÎÚÊ?åÉÚÛÖØËÕª«Ã£°¼ êjSêAÑçëüõ|Üf;ÑçÚÂL87ÝFxÞ ¾³¬µßÚv\ÑçÃàÕÂöòíÿĂùÝ §²º ÞÂîýìôëïþāÝ|zÜÆùĀóāÝÐèÜÐØÅç ³» J#ÚKacê4:ÐØÅçÊÂ³» ÊùĀóāÐÕN9ÚGÝDêÇç §²º¢¿» ãÂ¾³¬µßÚv\Ñçª«ÃoIXÛFx4:ÝHFêÐçÎÚÞÂAUÛðā÷ítê
:ÑçÎÚÜ+ÑçÚgÇåèÂîýìôëïþāÙqÏèÕO_ÐÕFxv\'Ý:8Ü×ÅØÂBZ]ÙÞÂ£°¼¤²°§²º¢¿» }$V ê :ÐÂFxÚ*X8têEsÐÕÃ ¤¥ ÉåÂ~T!ÙÞ ¾³¬µ !:Ê  ÙÄçÝÜ,ÐÂ£°¼¤²°Â
§²º¢¿» ÙÞÂ¾³¬µ !:ÞÂÓèÔè  Ú  ÙÄÖÕÝÜ,ÐÂ
£°¼¤²°§²º¢¿» ÙÞ  ÚÛÖÕÃÎÝÎÚäæÂă×ÝY UG2ÞÂ
:XÜîýìôëïþāÝM8ê$ÏÒçÎÚÊ?ÐÕÃ¨ ec@FxrCÉåÂ£°¼¤²°§²º¢¿» ÜÈÍç ½¦£°¼ ÝuÞÂ Á ÙÄæÂ¨¦ ÜäÖØ5åèÕ  Áª«äæãmÜÌÛÖØÅçÎÚÊ?ÐÕÃ
ÎÝäÆÜÂă×ÝO_ÐÕFxv\'ÜÞÂ:8ÊÄçÎÚÊâØqÏèÕÃQ ÂÎÝ:8ÝHFÜ×ÅØEsênÖØÅçÃg=P £³¼À¹¬¼º³®´°¼¬µ¡ ·¸º±³¸®²°¶ ¥­¯°µ²¬¶³¯°¼¬µ¡³¸µ ·¸º±²°¶ ¤¬»¼°¼¬µ¡ ·¸º±³¸®²°¶ §©¬¶¬±½®²³°¼¬µ½µµ²°¶¦¸®¡¹· 

171L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））À À À À À À À PF BL-5A

ÿđĄû¬ã¿+pãm~À
Generalization of high-pressure freezing method ofproteins
1c>| 1 ÁÀ ;e? 2 ÁÀ K¢ 1ÀÁÀ  ` 1,3À
.1AÁÀ À 2À .1·}AÁÀ À 3À .1ćĐđāõôþđÿĒÀ

ÀÇ©ÈÀ ÿđĄû¬^ò X ßx4Öï¸ÅY:V­vãÚéâÅ^òÖïL§ÎÉïÆçÚÅÿđĄû¬^òÖïà^±ë0â&çðïk2Îlã^àáîHÕÅ^Î/ðÞÕçËÆÙãÚéÅ
Tò^hsàu%ÕÞÿđĄû¬^òrÖÓàßÅk2òôċďćóýzâÖïÓàÎßÏïÆÀ
ÕÍÕÅTò~ÖïàÿđĄû¬âIºò!æÖÓàÎÉïãßÅ
_°á½ëyEâÕÞëïL§ÎÉïÆçÚÅM2)U5¾~ã1,^òÖï¸Å^±à0±ã1ÏáwEBÍíÅ µÖïÓàÎ¹ÕÊÆÙÓßÅÓðíã'¼ò¨nÖïÚéâÅ¿+d Ĕ200 MPaĕß
^òÖïZpĔ¿+pĕâqÕÚÆÀ
Ç5¾ÈÀ ÿđĄû¬^ò¿+ÖïÚéâÅÊåíÏ²2ąĒĊþđÿĒĔIQBRCĕâªÔðÚ* ADC ¥ã¿+¤ HPC-201 ò~ÊÞ5¾ò£ÜÚÆÓã¤äĉĎ÷ĊùýâìÜÞÅ200M Pa çß]+ÕÞÍíÖïÓàÎ#ßÉïÆç×ÅďĒĈßhsÍí^ò"îÕÅĆđâðÚÆĆđã±âä³Î-é¯çðÞÊïÚéÅâò+âþĀĂÕÞÌÐÓàßÅĆđò+âðÚ¸âÅĆđÎã ßçïÆgâÅ+ò¿+¤âþĀĂÕÅ200 MPa çß+ÕÚÆò0ÖàĆđÎ+±â¡ÛïÆC+âRÕÅ´Y¤òÜÞÅ+±ãăüò´YÖïÆÕÚ^òs Íí"îÕÅ<ÕwEã¿Ê-180ÄãjßW #áčöø¥EM-CPC âÔØÅďĒĈòúČĀĈâÞÞÍí9~7(âðÅsâ3ÖïàÊËS»ò"ÜÚÆÀÇfÈÀ ^ã¡ã'¼ò¶ÑÚéâďĒĈëĆđãXò£ÊÅãQ{òÒÚfÅÂ ēÃãJã1,^~ã+ê~ÊÞÅ
Tòñ×âÅLysozymeÅLysozyme-NAG4 ¦% ÅTEMPOL ò&è LysozymeÅFerritinÅThaumatinÅDAPK ã ^ã¿+âQÕÚÆçÚÅÊÐÝÍã^ßäÅX )U5¾çßQÔØïÓàÎßÏÚÆÀ
Ç«®ÈÀ 5¾âÕÞÐðÚ .1·}Aãe=ODÅb\Å .1
Aã@8NÅ .1ćĐđāõôã[GÅ6oÅFatã$iâP«ÖïÆ

172L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL5A、PF AR-NW12PPARα と γ に対する 17-oxoDHA の共有結合形成
17-oxoDHA forms a covalent bond with PPARα and γ○伊藤 俊将１，江川 大地１，山本 恵子１
1 昭和薬科大学
リピッドセンサーとして考えられている PPARs は核内受容体の一員であり、
α,γ,δ の 3 種のサブタイプがある。そのうち PPARα はフィブラートに代表される
高脂血症治療薬の標的分子であり、PPARγ は TZD と呼ばれる 2 型糖尿病治療薬の標的分子である。
一方、生体内のリガンドは脂肪酸あるいは脂質と考えられており、PPARγや PPARα を活性化する様々な脂肪酸が報告されている。以前、我々は4-oxoDHA をはじめとする電子吸引性基を有する高度不飽和 脂肪酸がPPARγ を活性化し、さらに共有結合を形成することを報告している。
今回我々は、4-oxoDHA とその異性体、17-oxoDHA に関して、oxo 基の位置の違いによる影響を検討する目的で、PPARα,γ,δ のサブタイプの遺伝子転写活性化能と共有結合形成能を比較した。
4-oxoDHA は PPARγ サブタイプのみ活性化したが、17-oxoDHA は
PPARα および γ を活性化するデュアルアゴニストであることが明らかになった。
また、17-oxoDHA は PPARα に対して強い活性化能を示したが PPARγ に対してはパーシャルアゴニスト活性を示した。
ESI-質量分析を行った結果、4-oxoDHA は PPARγ と共有結合したがPPARα とは共有結合を形成しなかった。しかし、17-oxoDHA は PPARα および γ の両サブタイプと共有結合することが判明した。
活 性 化 機 構 を 解 明 す る た め 、 17-oxoDHA/PPARγ 複 合 体 と17-oxoDHA/PPARα 複合体の X-線結晶構造解析を行った。
これまでに脂肪酸/PPARα の共結晶化の例がなく、既知の結晶化条件では 17-oxoDHA/PPARα の共結晶は得られなかった。しかし、co-activator を添加することで、共結晶化に成功した。これにより、初めて脂肪酸/PPARα の複合体の結晶構造を明らかにすることができた。
PPARγ においては 17-oxoDHA は 4-oxoDHA の結合部位である Cys285と共有結合を形成していたが、脂肪酸の配向が一般的なものと反対であったため活性化に重要なヘリックス 12－カルボン酸間の水素結合が欠如していた。
しかしヘリックス 12 は脂肪酸の末端と疎水性相互作用による中程度の安定化を受けていた。そのため、パーシャルアゴニスト活性を示したと考えられる。
一方、PPARα では、17-oxoDHA の共有結合部位は γ には保存されていな
Cys であり、カルボン酸は、ヘリックス 12 と水素結合を形成していた。共有結合する Cys の位置の違いにより、脂肪酸の配向が異なったため、サブタイプ
間でアゴニスト活性に違いが現れたと説明できる。

173L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））{{{{{{{"H2Se }~| ¬¼²¨mCnEbi?{
Structural and biochemical analysis of
Chaetomium thermophilum HP1;O{ \`gtp>LX!%!%w{ U*%TYX{ MI*%(7{ SBMI z+x´®»¨»¶­¼q #QK¦
0¡Ad DEbsh-¦@£´®
»¨»¶­¼_¬¼²¨m 1¾HP1¿´®»¨»¶­¼y_
Ad CnEbsh ¦Vj]9r
HP1  $¤¨»¸±·§¼(CD)¤£·­º³«°¼ H3 ¦kl_£y¨»¸©¹±½±·§¼(CSD)¤£u ,3m¬¼²¨m_£y$a³¼ªyo_¤£W HP1  £Ad Cn0EC
Eb¦i9£&'2 ¢z"H2Se Chaetomium
thermophilum P= HP1 CnEbi?¦f£{ v HP1(CthHP1)CD(CthHP1CD) CSD(CthHP1CSD)¦QK£!ce^5µ¨¬½¦C[_@CthHP1{ CthHP1CDCthHP1CSD ¦!u/£3¤¤_:¦f¥CthHP1CD ¢8)J_:¦/£F1¡_:4¯½¬¦/£._:<¦
6CnG'b_:¦ 3£'£³«°¼m¬¼²¨mR Ni?¦f_j]¦Z Cni?£'£

174L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       ²­©°¨Ì²­©°¥¨ĉ÷čĐē¢ úďĀđ «±¨ ýĐþĀďēĂ«±¨  çs Pæ&àÕu=RPç E
The catalytic mechanism and structure offamily 4 uracil-DNA glycosylase in complex with DNA
X{ĖÌK`ėÌ5zðó,ĘÌ1JoĖĖ 6$*..Ìė aJ*.*.4RPÌĘ aJ*.*.f p.nq «±¨ çĀąĀĒè}øčćæñÞáúďĀđæ)ØÌ®ęªË¨ę´ êç^r_)iç"æåôÍëÜÌ+b>v~hMçĉ÷čĐē© Òñéĉ÷
čĐē« «±¨ ČĐĎďēĂèÌúďĀđïĈČûÿĒăĒåäç}øčćØÜ(&ö2æØáÐáÌÖõòç(&Ô-#Ùôã «±¨ ç=ÔSØáØëÑÍÛçÜíÌ\æ «±¨ ö0DÙôæèÌ«±¨ ÓòúďĀ
đïĈČûÿĒăĒÔ]óåÕ×õô<ÔÏôÍÛÖâAÎèÌ«±¨ çúďĀđçæåúďĀđ «±¨ ýĐþĀďēĂĔµ«®ĕæ[lØÌ+b>v~ ³ÈÁ¾ÃÁÃºÈÆ ÇÃÀÃ¼¹¿¿ hMĉ÷čĐē¢ µ«®ĔÆÇÃµ«®ĕæßÐánq
öíáÐôÍ¶ yxHP NZögÐÜÖõëâçnqâ ÆÇÃµ«® ÒñéúďĀđ çs Pö ¥ Ê  |â EØÜ·¸ÍÛçxOÌ
ÆÇÃµ«® ç Pè ç µ«® ãQæabaÿĒĆùĄăPö:@ØÌúďĀđçQ9î ØáÐôÖãÔEòÓæåÞÜÍëÜÌÖõëâæ
P N×õÜ µ«® ãPöVØÜxOÌÆÇÃµ«® âèÌ«±¨ xæÙô%ĔÁ½È»¿Â½¿ÂÇ½Å»¹Á¹Ç¿ÃÂÁÃÃÄĕæc;kåPÔ3×õÌ«±¨ ãçx G æ è P  )  Ù ô Ö ã Ô C 3 × õ Ü Í Ø Ó Ø Ì ÆÇÃµ«® ç Á½È»¿Â½
¿ÂÇ½Å»¹Á¹Ç¿ÃÂÁÃÃÄ çđēĊPè ¡ øčćT&ãmÕÌÛçtæèaċĐĄ
üāÔßåÔÞáÐáÌedâèÛçP)æßÐá?ÙôÖãÔØÐdYÝÞÜÍÛÖâÌvå ÆÇÃµ«® æñô «±¨ çQ9öEòÓæÙô
ÜíÌÆÇÃµ«®«±¨  çxHæówìÌ¶ y!B0ö0DØÜÍÛçxOÌF78çUâ ¤ Ê  |â PöW/ÙôÖãæ@ØáÐÜÔÌJ78×òæxHL çIöíÜÖãâ Ê  |ëâ×ÚôÖãæ@ØÜÍÛÖâÌJjâèW/ØÜ ÆÇÃµ«®«±¨ çs Pçvã ÆÇÃµ«® çu=æßÐá'ØÜÐÍ ·¸¯¹É¹¿¨½Ç¹Á­¬©³Á½ÇÇ£¦§ ¤¥£ ¤¦  £

175L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
NW12A

高硫化水素産生口腔細菌由来
cysteine (hydroxyl) lyase の立体構造と反応機構
Structure and reaction mechanism of a cysteine(hydroxyl) lyase from a high H2S-producing oral
pathogen○毛塚雄一郎 1、石田哲夫 2、吉田康夫 3、野中孝昌 1
1 岩手医大・薬、2 琉球大・理、3 愛知学院大・歯
硫化水素は口臭の主要な原因物質であり、低濃度においても強い細胞毒性を 示 す た め 、 歯 周 病 を 進 行 さ せ る 一 因 と 考 え ら れ て い る 。 Fusobacterium
nucleatum は、口腔細菌の中でも特に高い硫化水素産生能を有しており、他菌には見られない特有の硫化水素産生酵素（Cysteine (hydroxyl) lyase）を発現する。この酵素は、ピリドキサール 5’-リン酸（PLP）を補因子として持ち、Lシステインの β-置換反応によって硫化水素と L-セリンを生成する（Yoshida etal., Microbiology, 2011）。この置換反応では、基質である L-システインの SH 基が脱離して生じる α-アミノアクリル酸中間体に対して、水分子が付加する過程が必要となるが、水分子の求核性の程度を考慮すれば、この付加反応は通常起こりにくいと考えられる。したがって、この酵素は、水分子を活性化させる仕組みを備えていると推察される。
Cysteine (hydroxyl) lyase は α/β フォールドを持つ 2 つのドメインからなっており、PLP はこれらにより形成されるチャネルの底部で Lys46 とシッフ塩基を形成していた。PLP の近傍には、fold-type II の PLP 依存性酵素群で保存されているアミノ酸残基が見られたことに加え、チャネルの側面には、この酵素に特有の Asp232 が見出された。この残基に対する変異酵素 D232N は、L-システインの β-置換反応に対する活性を消失し、Lシステイン存在下での構造解析によってα-アミノアクリル酸中間体の電子密度を与えた（図 1）。さらに、ラピッドスキャン分光法により得た酵素反応溶液の吸収スペクト
ル変化を解析することによって、Asp232 はβ-置換反応に必須であり、水分子からプロ 図 1 D232N 変異体に結合した α-アミノアク
リル酸中間体トンを引き抜く塩基の役割を果たすことがチャネルの外部から内部方向に投影
明らかとなった。

176L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ÔÏÂËÑÂÈÊ¾ ËÑÂÄÊÁ¾ ËÑÂÄÉÊÁ¾ ÓÎÆÊÁ¾ ¾

Ø `g® eĘzñÿĤğĸĽīĻĠĉÿĐĉ¾
>óĒċ¤ĲĺĠķĴĉ³~¾

ìA¾ :7± ÄļC{¾ O Äļ¨k¾ »8 Åļ¾ *N Åļqc¾ %_ Äļ¾
¾ ´ Åļ {¾ + Ä¾
ľÄ ½ĝĬlgtg ÔÏļÅ o6y)x4Ŀ¾¾ ¬Eŀ g®P2Ĉ1ăñÿ³~Ĉóøĕ¾ Ø `g® eĉ·õĎüĎü½ĎāĄñĕîØ -UĩĽĦĉp<Ćþĉ eĊŀiĦĻĮğªĈ?üĕ 9&tĉ&ĘVĕĤğĸĽīĻĠĆûĄzñēĖĕÿ
Đŀ]ĦĻĮğªĉ`g® eĆĊ}ćĕ]ÿć eTõMĆćĕîþĉÿĐ5÷ĉZ@^£ąĊŀiĦĻĮğªĆ 9&tĆĉ& ĉ`g® eĉÿĐĈŀp<ļ eģĤĨĴĘgûŀĭĜĤĹĽĲħĪą& ĉ`g®Ę eüĕT³~õ¥ďēĖĄñĕî¾¾ ½ĝĬĹĞĽ­,lg Ôßåéåä¾ÏÙÚéåçë ąĊŀ`XģĤĨĴ Ôßåéåä¾ÏÙÚéåçë¾ÊêéåãÙéÜÛ¾ÒåêäéàäÞ¾ÖëèéÜã¾¿ÔÊÒÀĆŀ-U=¼ĩĽĦĳĽĤ ÔÏ¾ÕÜãåéÜ¾ÒåäàéåçàäÞ¾ÖëèéÜã¾¿ÔÕÜÒåÀ¾ ĈĒĕp<ļĩĽĦeģĤĨĴõ°zúĖĄóĔŀĉÿĐ Ø -U=¼1Ę\ûĄñĕîvĉ ÔÕÜÒå ĊŀİĽĴķĜĻĈóñĄp<úĖÿ¾ Ø -UĩĽĦĘØÍÖ Ć ÌÌÔÇ¾æÙÚáÙÞÜ ĉ æåàäéâÜèè óĒċ ÙàãâÜèè Ę āĄwûŀLē
Ėÿ!@HFıęĜĹĘĶĽĢĽĈWąöĕîûôûćõēŀ¢ĉĒòćĤğĸĽīĻĠĈóñĄĊŀ'ĉ²/g®ĵĩĹĘzñÿ9XnĈĒĕ m<ŀg®>ŀóĒċ¶9>F.ĉĈĒĕ 9&t&ĉasĉ<ĊMýėĖĕD ąðĔŀþĉ¯ĉĮĜĲķĜĻĊĤğĸĽīĻĠĘ6jĈB³üĕ3&ĈĊM¸ąðĕî¾¾ ¾ -SïĊ ÔÕÜÒå ĈĒāĄWúĖÿ!@HFıęĜĹôēŀÚéçêäÚÙéÜ
ĘĄ ãåâçÜæ ĈĒĕ9XŀçÜÝãÙÚÈ ĈĒĕ>ŀÚååé ĈĒĕQ
&¹0(«ĉ¶9>F|ĉ#LĘñŀ`;¡Ćg®>ĉ¡ĆĆđĈ¾ Ð×ÒÑ JGąWüĕĲĺĠķĴĘgûÿîùĖĈĒĔŀĩĽĦ"µúĖÿ5[ĉĩĽĦĥħĪĉôēŀįħĪĈ¦Iüĕ&tĉºĆ=¼d ĘuĈ'<üĕùĆõ$Ĉćāÿî¾¾ ¾ cĲĺĠķĴĘzñĄíùĖĎąĈíġĽĤĤĦĩěĆûĄzñÿĦĻĮğªąĊíÅÃ ºĉ 9Ćĉ& g®Ęm<üĕĀøąć÷íįħĪĈ¦Iûćñd đ'hĉğķĜĨĸĚą<üĕùĆą] 9ĉ&RB³ČĉBbõúĖÿîc~ąĊíþĉRfĘ~üĕĆĆđĈíKYüčörĈĂñĄđ©§ûÿñŁ¾

177L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL17A, PF-AR-NE3A, PF-AR-NW12A

改変 HIV-1 逆転写酵素と DNA アプタマー
複合体の結晶解析
Crystal structures of HIV-1 reverse transcriptase
mutants complexed with DNA aptamer
安武義晃 1・田村範子 1・服部真一朗 2・林宏典 2・松田幸樹 2・
前田賢次 2・満屋裕明 2,3
1 産総研・生物プロセス、2 国立国際医療研究センター・研究所、3 National
Cancer Institute, National Institutes of Health
逆転写酵素（RT）は抗ウイルス薬開発において重要な標的タンパク質であり、薬剤結合機構、薬剤耐性機構を詳細に理解するため、また新規薬剤設計を行うために、本酵素の原子分解能での立体構造情報が求められている。
B 型肝炎ウイルス（HBV）は世界全人口の 6％に相当する約 4 億人に持続感染していると推定されており、慢性肝炎から肝硬変、肝細胞癌、肝不全を発症
し、年間 100 万人以上が死亡している。新たな抗 HBV 薬の探索を行うため、これまでに HBV RT の大量発現取得が広く試みられてきたが、著しい不溶性の性質のため、決定的な成果は得られていない。一方、RT の結晶学的研究
はヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）の RT で広く行われており、また HBV RT と
HIV-1 RT の活性部位（薬剤結合部位）はアミノ酸の保存性が見られることから、ポケットの構造は互いに類似していることが推測される。私たちは、HIV-1
RT の活性部位を形成するアミノ酸を HBV RT のアミノ酸に置換した様々な変異体を作成し、その中に抗 HBV 薬であるエンテカビルに対して薬剤感受性を示す HIV-1 RT 変異体を見出すことに成功した。そこで、抗 HBV 薬との複合体
立体構造を解析するため、まず RT 変異体と鋳型 RNA/プライマーDNA 鎖を模して設計された修飾 DNA アプタマーと HIV-1 RT 変異体との複合体結晶化を行った。最初に得られた結晶は、分解能 5.4 Å程度に留まったが、p51 サブユ
ニットの N 末端配列を最適化することで、最大 2.6 Å分解能程度の回折デー
タ取得に成功した。分子置換法による解析の結果、DNA アプタマーに相当す
る明瞭な電子密度が観察され、DNA の 3’末端が RT 分子の活性部位（薬剤結合部位）に位置するように、確からしい方位で結合していることが確認された。

178L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））º º º º º º º ÌËÈ½ÅË¾Áº-&x¥hªc ÔÅÉÑº º
Ĭ±}zÛNd÷Hõ?_ĬºCurrent status, results and future prospects of
IBARAKI Biological Crystal Diffractometer iBIXºYE ¿İ@4¬ ¿İ®A ¿İ¤9Z ¿İ3¹K Àİ
wfUk ¿º¿ 3 ÔÈÎÆīÀÊÄÇÄºÊ½ÍÄÎÆ ĔĪĕĬº^ ¿İ

º ĝĈĒħĬġĘęóM7hªcą<}êĂìüôÛ-ôÿā
Ê½ÍÄÎÆ õx¥Ù&:<¸X¡»ÌËÈ¼ô&x¥hªc ÔÅÉÑ â±īD¡èăìĮÀ¾¾Ã BįÜçõ´ÛğħĒM7uô=Léìr°ĐĠęĠĆ
ĈĞĬ,ĐĪėĨĬĕĬÀ mg)ą±êĂçñôNéìÜÀ¾¿À BCôg)õ¹CâóèăÛg{â ÂÃĭñ·¦ôS(èăÛĕĪğČ¥õhªcõCââāÛbeó<¸â±5èăìÜºº M7hªcöÛp7â ĮÀÚHįðýtéþêäÛÑ cðö*µóġĩęĪõtâðÝĂâÛĕĪğČ¥ô=êĂyJñéïö õýõâQæĀăĂÜºº Ĳı1MąîåêOoñóĂÜºº ĳıp âÝĂáąîåêOoñóĂÜºº ĴıÄÕÒÛÏÓ× ąñêĂn.õ¯õp7õ õq;âðãĂÜºº ĵıT>ĖĤĬđąàóÞt;âðÝĂÜºº À¾¿Â BõüôöÛçăĀõyJąáéìðĳ õġĨĒâĄăìÜëăöÛ1MõtñéïÛ 6sMćĒğĦċĪõĈĢĚ­,õtÛ°BõaqðÝíìĦČĕģ,áĦČėģ,áô=éïÛp7
â8+éóÞçñôÿĂĦČĕģ,õq;Û\ôöÛčę,ØĉĜĬħ,1
Mą"ûĊėĊė|,LlhõR'âÝĂÜùìÛÄÕÒÛÏÓ× ąñêĂćĢĜ­n.õ¯õp7õ Į!ãįõq;ýóèăïÞĂÜºº bðöÛÔÅÉÑ ±õ}zÛt;C!øõāúÛ2ióĥĬď
ĬěĬēô=Léì¢V$§~0õ±ÛM7õyJąáéïIĀăì]¨õNdôîÞï/#êĂÜùìÛFõ ją«Néì ÔÅÉÑ ąÞÛÀ¾¿Ã BC ³õ ¿¾ B²ôòõÿßó£¶ôāû;áąéÛëă
â2äõWõ%øâĂçñą`GéìÞÜºº ùìÛHõ jñéïö©)â ¿ÌÐ «N[ôÛjv¢VĎĈē¿ÖÖÁ õt;âñóĂÿß\óĂCõ!ą PêÜº

179L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
MLF／BL03

飛行時間法により収集されたタンパク質中性子回折デー
タに対するプロファイルフィッティング法の適用	
 Application of profile fitting method to neutron
time-of-flight protein single crystal diffraction data
矢野直峰１、山田太郎１、細谷孝明１,２、大原高志３、田中伊知郎１,２、日下勝弘１
１ 茨大フロンティア、２ 茨大・工、３ 原研・J-PARC センター
茨城県生命物質構造解析装置 iBIX は飛行時間法(TOF)により単結晶の中性子回折データを測定する装置である。回折能の低い蛋白質単結晶の中性子回折データから水素原子やプロトンの構造情報を最大限に引き出すためには、弱い反射の積分強度を高精度に抽出する必要がある。そこ
で、プロファイルフィッティング法を用いた積分強度抽出法の開発を行なった。
	  iBIX はビーム強度を優先し結合型減速材のビームラインに設置されており、得られた中性子回折データの TOF 方向の強度分布は非対称となる。
そこで、iBIX で測定された中性子回折データに対して、既存の非対称な
TOF プロファイル関数を複数検索した結果、粉末結晶用データ処理プロ
グラム GSAS で用いられている指数関数と gauss 関数を畳込んだ関数は強度分布との一致が良く、パラメータ数が５個と少ないため、最も適した関数であると判断した。弱い反射の積分強度をプロファイルフィッティ
ング法により求めるアルゴリズムを考え、プログラムを試作した。蛋白質試料のフルセット回折データに対して、プロファイルフィッティング
法を適用した。summation 法と強度データの Rmerge, Rpim、構造精密化後のR, Rfree を比較したところ、高分解能領域で改善が見られた。標準的な試料であるリボヌクレアーゼ A（リボ核酸を分解する酵素の一種）を例とした場合、Rmerge が最も強度の弱い回折斑点群で 0.375 から 0.280 へと絶対値で 9.5%低下した。
	
  開発した方法は回折データ処理ソフト STARGazer に実装され、iBIXのユーザーが容易に利用出来るようにした。現在、ソフトはマニュアルと共にユーザーに対して配布している。	
 180L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       ®¨¥ª ¤

a|E<_Ó$ÅÊêýóä }SÔo^`Ñ'}
Dynamic nuclear polarization and high-pressure
freezing of protein single crystals for high sensitivityhydrogen detection
6Z9q þ m

rU þ 8m; þ 4( þ x þ Q= þ OW  */k:Ă */:Ă */ôûýíáàèýêÿĂ
 7>/kĂ  /"0fº»D0%J3ÓÀÅÝa|Ô_E<$ÔPbÑÇÏ¸o^`Ā¦¬®āÂ¼Ý¹ÆÔGbßl½ÝÆÑÓÚÜ¸a|ÁÛÔD0MÂT/ÐAYÔ{ ¢ ÑÒÝÑ½¾gÂ¼Ý¹ÆÔHÔ3jÓÕN}SÓøçâúß5Ç¸u+Ā{ ±āÁÎ` cĀ{ ©āÔX ÂCÐ¼Ý¹
VsvÐÕøçâú ±§«®­ª ßùéëÿö}SÓe<Ð5Ç¸¦¬® 3ß½`iÔd2ßÍÊ¹×Ê¸D03Ó$ÅÏ¸/)}SÔ}ÂCÑÒÝÔÐ¸I}ßl½ÉÓ/)}Sß}ÐÃÝ'}ß
ÍÊ¹

º3»
¦¬® ÐÕ¸ñüïù!nùéëÿöÑøçâú ±§«®­ª ß}Sðûìõ±§«®­ª Â µ« ÓÒÝÚ¾òìëbÓÏ}SÇ¸µ´ Ô}SßØÏ  ±¸ © ÔX Ð ¦¬® 3ßÍÊ¹'}ÐÕñüïù!nùéë
ÿöß ±§«®­ª µ«¸µ« ÐæìíáýåðûìõbÓÏ}SÇ¸Â µµ Ô/)Ô}Sß? ¡µµ·Ô'zßl½Ï «®³ ÐI}hÇÐ'}Ç¸®¨¥ª ¤ ÀÚÖ¼½Ì °¯¥ª° ÓÏ{ © Ô
cÐ ² %JÀÚÖ[ßÍÊ¹
º}\»
¦¬® 3Ô}\¸ùéëÿö}SÔ`ÓFÇ¸{ £ ÐT/`iÕ{ ßFÇÊ¹ @ÕX ß,¿Ï¸ÚÜ/ÃÒ`ißBÛÞÝX
ß]ÈÝ¹'}3Ô}\¸{ ¢ÔtiÐ}ÓFÇÊ¹×Ê¸²
%J3ÐÕ{ ¶ ÔÔîÿêÂBÛÞÊ¹ÊËÇ¸úÿõßã÷
ìõÓ¾×Ä&2ÐÃÒ½ÊØÓ ² d2RÓúÿõÂ-ÞÝy¸12Òd2
ÂÐÃÒ½ÙÔÂ.ÁÍÊ¹ @ÕFi ßpKÇÏ~#oÒLÓØ¸ÚÜt3Ó/)}Sß}ÐÃÝPbßtwÈÝ¹

181L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））¥«¢§ª£¤ª§¦£©¡ª£ 4&/Kâðß  Ö\´ÁèÝàÜîËêíãåðÛëîrFProtonation analysis of histidine using 10 Glucose
isomerase neutron coordinate data,a ¯]bB  k$'-¯ k$éíîáØ×Þîßð±ht²
ßîçÚyË3LIÖZr¾ÔÁÏÊ¯Qe&ÑQefË5ÖbÔ»ÇÌ~oÆ³Ô°ÎÁ¯ ËêíãîX7ÖqT¾Ô»ÇÌ¯}eË3
LIÖr>¾Ôµ¶Æ~oÆ³Ô°n;ËêíãîX7ËçßðîÖ9Ä
 ¹¯ÈËÒµÉEÆ¯ÈËêíãîX7ÖÇÔË¸¯¿Ë ÑZ^Ö
rF¾ÔÁÏ¯Ì  ÖA¾ÔßîçÚyËµÂ¯@Ð4&/Kâðß
;¹#¸ÃÁ ¥«¢§ª£¤ª§¦£©¡ª£ &Ë  OÊWVÖ1Å¯êíãåð
ÛëîX7ËrFÖmÃÁ°±rF=R² Ê³Ô  Ë ¥«¢§ª£¤ª§¦£©¡ª£ Ë4&/KâðßÖ\´Å¯u Ë  OËêíãåðÛëîX7¯AY¯S.&ÊÄ´ÅËâðßÖ
vH½Á°MÊ  Ö\´Å¯  O Ë  ¹¾ÔQefË
0¼¯{OËJ&ÖvH½Á°¿Ë2¯ Ë ñ udì
ðàîò·ÒÍ  Ö\´Å¯  OËU%:scÑ ¨ ËudÖ¿ÕÀÕmÃÁ°»ÕÓË5Ö\´Å ¥«¢§ª£¤ª§¦£©¡ª£ Ë  O
ËêíãåðÛëîX7ÊÄ´Ågu`ÉrF·ÒÍi*ÖmÃÁ°±fGïi*²CrFÊ·´Å¯f?E ¨ ¸Ó6¼ÕÔêíãåðÛëîX7ÇÌ_
ÉÔX7Ë  O¹  pÄ¸ÃÁ°»ÕÌ¯  OË+8`É ¨
¹Ë &[!ÊÒÃÅ"½ÁÁÏÇi*½Á°(Ê  ÆÌ¯ËÈËâðßÆÐ Ë ¬¯­ Ë=ÇÐêíãî¾Ô»Ç¹ ¸ÃÁ°¬ ÆÌ  Ë  Ç ­ ÆÌyï)ï &Ë  Ç ® QefÖ½Å´Á°u  Ë  OÖrF½ÁfG¯ Ë  Ì{Ê  Ë  ÉÈËx l¹|:½Å´Ô Êêíãî½¯ Ë  Ñ Ë  ÉÈËN l¹|:½Å´Ô Ìjêíãî¾ÔÇ´µ ¹³Ô»Ç¹ ¸ÃÁ°±wz² k$éíîáØ×ÞîßðË<DPÊÌ¯4&âðßÊ·ºÔêíãåðÛëîrFÆ×äæÙÝÖºÁ°

182L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
PF-BL5A、PF-NE3A、PF-BL17A、PF-NW12A など

CK2α 2 の結晶多形とその構造解析
Crystal structures of CK2α 2 in new crystal forms
露口正人１、仲庭哲津子 2、仲西功 3、木下誉富１
１ 大阪府大院理、２ 大阪大蛋白研、３ 近畿大薬

Casein Kinase 2（CK2）は、数多くの基質のリン酸化を介して様々な細胞プロセスに関与するセリン・スレオニンキナーゼである。CK2 の活性サブタイプとして CK2α 1、CK2α 2 の 2 つのサブタイプが存在する。CK2α 1 は全身で発現しており、異常によってがんをはじめとした様々な疾病の原因となるため、がんなどの疾患の創薬ターゲットである。一方、CK2α 2 は阻害により精巣毒性などの副作用が懸念されるため、オフターゲットとされる。我々はこれまでにCK2α 1 について平均 1.5 Å 分解能で Apo 体及び複合体について多数の結晶構造解析に成功しており、最高分解能 1.06 Å の構造を報告している。
しかしながら、CK2α 2 については、3 Å 程度の分解能の結晶構造しか得られていない。この結晶は針状結晶であり、成長性が悪いことが分解能向上の障害であると考えた。そこで、本研究では、高選択性阻害剤創出を促進する
目的で、新規結晶形の探索を行った。
Apo 体について検討したところ、リザーバーに Polyethylene glycol 4000
(PEG4K) と Lithium Sulfate を含む結晶化条件下で複数の結晶を得た。
PEG4K の濃度と Lithium Sulfate の濃度の変化に応じて粒状結晶、板状結晶、および針状結晶が得られることがわかった。また、同様の結晶化条件下、同じドロップ内でも外見が似ているが空間群が異なる結晶 (P21212, P21,
P212121) が存在することが分かった。当発表においては、空間群が異なる 3つの結晶から得られた、1.89 ～ 2.24 Å分解能での結晶構造について報告
する。

183L
（生物物理，生物化学（結晶構造解析））       PF BL-5A
ØðçÚîÀ/f:Czs?ÍZ5´¸Hj6 Àòhs?
X-ray analysis of Thaumatin crystals grown in heavy
water buffer for the neutron crystal structure
analysis
X'%0ñ¨U]<  m (¨ m åíîÜÏÎ×îÙð
ªgt« RÙîäÔvØðçÚîÁqÎåìÑSÀAO¿r³Ë¸ÙîäÔv
¼¬É¨BÅ»+­RÍ;´¨ÖêcÀ   ÀRÍµÊ©²À+­RÀWQFCÍs9µÊ¸Å¿¨ØðçÚî¯$ ½\ TµÊ½.ÌËÊpÀÎèá~ÀæíÞîP1ÇHÀDÍ/s?¼uÃÊ²½ÍZE½´»­Ê¯¨²À"¼ÁHeÁ¨/½+±\ T´»´Ä­¨ãÛÔÕëÐîß½¾Ê©¶²¼)K/78b¯He¿GÃd  ÀHe¿j6µÊ²½¯¼°ËÂÝðÙÀvÁ°±µÊ©¶²¼="¼ÁHj6À;N¨V¾ÊM!L*¨¦ À>¼¨ØðçÚîf:À ¢ hs?ÝðÙÍGy´»¨/"À`ÝðÙÍ,Ê
²½ÍZY½´¸©ª"«ØðçÚîÁ ¡£¤¥ aÈÉw ´¸ÆÀÍ¶ÀÄÄT­¸©#LM!Àf:k2>Áf:½´»}^~àÞìÐéÑìÐé¨ £¦ ¼#L¨âîÓîÕßíÛæI¼n¹¸© LM! Áf:½´»}^~àÞìÐéÑìÐéÍT­»¨  ¦ ¼#L¨âîÓîÕßíÛæI¼n¹¸©f[¿¶Ë·Ë ¦¦¦¦¦ ÀioJ½3f¼¿ØðÒîÕÍn¹¸©#LM!¨ LM!½Æ¿  ¼ ¢h4Ín¹¸©ªf@ï!«¢ h4Àf@¨#L>Àf:¨ L>À ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Àf:¿º­»4ÝðÙ¯½Ë¸©#L>Àf:¿º­»Ásl §ÀÝðÙ¯½Ë¸À¼s?Í{Å L>ÀÆÀ½Gy´»­°¸­© L>Àf:¿º­»Á¶Ë·Ë&-µÊxH>¨H>¼À
Gy½/¨~/>¼À|­Í_®ÅÊ!¼¬Ê©

184L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
NW-12A, BL-5A

大腸菌酸素センサータンパク質 YddV のリガンド認識機構
Structural basis of globin domain of a heme-based
oxygen sensor enzyme, YddV from Escherichia coli
五十嵐城太郎、松岡有樹
福島医大・医グロビン結合型センサー（GCS）は、ヘムを含むグロビンドメインと酵
素ドメインなどが融合したタンパク質である。YddV は大腸菌に由来する
GCS の 1 つであり、N 末端のグロビンドメインと C 末端のジグアニル酸
シクラーゼが融合している。YddV はヘム鉄が 2 価の状態やヘム鉄 2 価に酸素が結合した状態において、2 分子の GTP から c-di-GMP の合成を触媒する。一方、ヘム鉄 3 価にシアン結合した際にも活性が上昇した。
本研究では、YddV のグロビンドメインのみ（YddV-heme）を大量発現、精製し、結晶構造解析を行った。ミクロシーディングによって得られた結晶は、空間群 P212121（a = 51.6 Å, b = 66.1 Å, c = 83.2 Å）に属した。
YddV-heme の構造は分解能 1.37 Å でヘム鉄を利用した多波長異常分散法（MAD）によって解かれ、非対称単位に 2 分子の YddV-heme が存在した。また、YddV-heme にシアンが結合した YddV-heme の構造も分解
能 1.60 Å で決定した。
YddV-heme の構造は N 末端の Z ヘリックスに加えて 7 つのヘリックス（A〜H、D ヘリックスは欠損）から形成されていた（図 1）。シアンの結合によって C ヘリックスと E ヘリックス間のループ領域に違いが見られた。また、変異体解析より重要性が示唆されていた Tyr43 はシアン結合に伴い、水素結合ができる位置へと移動していた（図 2）。このことから、YddV の酵素活性は Tyr43 と水素結合できるリガンドが結合することで調節されることが示唆された。

図 1：YddV-heme の全体構造

図 2：シアン結合型のヘム近傍構造

185L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
BL−５A, NW-12

イネ顆粒結合型デンプン合成酵素の糖鎖複合体構造解析
Structure analysis of the sugar-complex of rice
granule-bound starch synthase I
藤本瑞、岸根尚美、門間充
農研機構・解析セ顆粒結合型デンプン合成酵素 (GBSS)は、ADP-グルコースのグルコースを
アミロースの非還元末端側にα-1,4 グルコシド結合により付加することにより、デンプンの伸長を司る酵素である。育種学的には、GBSS の欠損による waxy
(ワキシー) と呼ばれる劣性変異遺伝子の表現型がモチ米である。また、
GBSS に欠損ではない変異の入った品種であるミルキークイーンなどの低アミロース米は、ウルチ米よりも粘り強く食味が良いため近年人気品種になっており、GBSS は穀物品種育種上の重要なターゲットとなっている。そこで、イネ
GBSS のデンプン合成機構を詳細に明らかにすることを目指し、構造機能解
析に取り組んでいる。
大腸菌で発現させたイネ GBSS-I の結晶を作製し、高エネルギー加速器研
究機構放射光施設（PF）において X 線回折データを取得した。糖転移酵素ファ
ミリー5 に属する微生物由来のグリコーゲン合成酵素（EcGS）の構造を鋳型として用い、分子置換法により立体構造を決定した。さらに、合成反応機構を解明するため、酵素の基質となる ADP-グルコース、受容体であるマルトオリゴ
糖との複合体の構造解析に取り組んでいる。
イネ GBSS-I の全体構造は EcGS と非常に類似し、N 末、C 末に２つのロス
マンフォールドからなる２ドメイン構造を有していた。ADP-グルコースの複合体構造解析の結果、活性中心は、２つのドメインの間の溝にあることが明らかとなった。一方で活性中心付近には、フレキシブルで観察できないループ領域
があり、この領域がマルトオリゴ糖の結合部位であることが示唆された。また、他の酵素にはこれまで見られていない新規なジスルフィド結合が２つのドメイン間に存在することが明らかとなった。

186L（生物物理，生物化学（結晶構造解析））
MLF-BL03，PF-BL5A

iBIX によるマンガンカタラーゼの中性子回折実験
Neutron Single Crystal Diffraction Experiments ofManganese Catalase using iBIX
山田太郎、矢野直峰、日下勝弘
茨城大学フロンティア応用原子科学研究センター
茨城県生命物質構造解析装置 iBIX はタンパク質および低分子単結晶用の飛行時間型中性子回折装置である．iBIX の装置性能目標の一つは三軸が135 Åを超える単結晶の回折データを取得することである．大きな格子長を持つ結晶の場合，回折斑点が重なることが予想され，ピーク分離技術の開発が必要である．高度好熱菌由来のマンガンカタラーゼの結晶（立方晶系 a =133 Å）の場合，予備回折実験に基づく検討により，飛行時間型中性子回折法の利点と高い結晶対称性を活かして，積分領域が 10%重なっている反射を無視しても，2.0 Å分解能の回折強度データの取得が可能であることがわかっている．今回，中性子構造解析を行うことを目標として，重水溶液中 pD9.6にて重水素化硫安を結晶化剤として大型結晶を育成した． iBIX を使用して約
2.4 Å分解能で全方位の回折データを取得した．これまでの予備実験でも 2
Θが 90°以下の領域にある検出器で回折斑点が重なることが予想されていたが，実際に強度を持つ重なった回折斑点を取得することができた．これにより今後ピーク分離技術開発に必要な実データが得られたことになる．現在，このデータセットについて回折強度積分を行っており，その結果を報告する．
マンガンカタラーゼは活性部位に酸素架橋二核マンガン錯体を有しており，反応状態や酸化状態により架橋酸素のプロトン化状態が異なることが示唆されている．この金属イオン近傍の酸素原子のプロトン化状態を中性子単結晶
構造解析で決定することが目標である．酸性度 pD6.4 及び pD9.6 における X
線結晶構造解析を行ったところ，これまでに報告されている結晶構造と架橋
酸素の状態が異なるものが得られた．pD6.4 結晶では架橋酸素の一つが硫酸イオンに置換されており，提唱されている反応機構の一つの状態と類似していた．一方，pD9.6 結晶では架橋酸素原子が乱れた構造をとっているが，今後，中性子結晶構造解析を行うことにより，新たな構造情報が得られるものと期待する．