2012. 12. 5

第３回食の安全と健康シンポジウム

複雑な糖鎖の合成
からひもとかれる

生命情報

糖鎖は様々な生命現象に関与する生体分子
糖鎖機能：細胞間の識別、細菌・ウイルス感染、毒糖鎖素の認識と糖鎖、癌と糖鎖・糖鎖と免疫・・・・etc.

糖鎖タンパク質の品質管理
群馬大学大学院工学研究科
応用化学・生物化学専攻
松尾一郎

最近明らかになった
糖タンパク質糖鎖の機能

糖鎖

糖鎖
糖鎖

マッキー生化学よりタンパク質の品質管理機構に糖鎖が関与？
正しいフォールディングを受けたタンパク質のみが機能を持つ

アスパラギン結合型糖鎖の生合成経路は真核生物に共通、しかしその生物学的意義は不明
小胞体ではアスパラギン結合型（高マンノース型）糖鎖が導入される

正しい高次構造（フォールディング）
タンパク質 活性がある

熱
細胞質

小胞体

高次構造が熱で壊れている
活性がなくなっている

１４糖は一塊でタンパク質の上に導入される。

変性

糖鎖の生合成は、ほとんどの真核生物に共通、本質的な役割があると思われていたが、その意義は不明であった。

細胞内にはタンパク質のフォールディングを助けるタンパク質（シャペロン）が存在する

近年、タンパク質の高次構造形成に関与していることが示唆されているその中には糖タンパク質糖鎖を認識するものがある（Calnexin/Calreticulinサイクルでタンパク質の高次構造をつくる）
アスパラギン結合型糖鎖（高マンノース型糖鎖）がこの過程に関わっている（小胞体でタンパク質に導入される糖鎖の役割は明らかになっていない）

ータンパク質が機能発現するために糖鎖は必要 ＝ 生命現象の根幹ー
正しい構造のタンパク質
CNX/CRT

OSTP
P

Glc’ase I

CNX/CRT
cycle

Glc’ase II
G1M9

G3M9

G2M9

目的器官へ輸送cargo
receptors

Glc’ase II

Golgi+
Man’ase I
M9

MLP
EDEM,Htm1p

Glc (D-glucose)
Man (D-mannose)
GlcNAc (N-acetyl-D-glucosamine)

M8B

UGGT

高次構造形成（CNX/CRT-cycle）

不要タンパク質

細胞質分解（ERAD)

polypeptide
mature protein
misfolded protein

Fbs1

糖鎖生合成の不良が原因の疾患が知られている:CDG (congenital Disorders of Glycosylation)

複雑な糖鎖の合成からひもとかれる生命情報

糖鎖がタンパク質の高次構造形成に関与?
小胞体細胞質側で単糖から７糖まで合成、その後小胞体側に反転、１４糖まで合成される。

PNGaseEllgaard, L.; Helenius, A. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4, 181-191 (2003)

糖鎖構造を認識するタンパク質の複雑な連携によってなされる糖鎖ータンパク質の定量的な基質特異性解析や相互作用解析は行われていない

どのようにして生命情報をひもとくのか？
高マンノース型糖鎖はタンパク質の高次構造形成に関与タンパク質の取捨選択、運命を決めている？
高マンノース型糖鎖の品質管理機構への関わりを分子レベルで調べる
糖鎖サンプルを用意して調べればわかる（はず）
糖鎖を化学合成する
合成糖鎖を利用して糖鎖と関連のタンパク質との相互作用を機器分析装置で解析する
定量的データから糖鎖の役割を考える合成化学的アプローチだからこそわかることがある！！

糖鎖構造を認識するタンパク質を解析するために収斂的経路によるアスパラギン結合型糖鎖の合成

ー 収斂的経路を利用して小胞体型糖鎖を系統的に合成するー

2 steps

2 steps

A

4~6 steps

B

C

D

ある程度のブロックに分けて合成後、繋ぎあわせるので効率的

糖タンパク質の高次構造形成に関与するタンパク質の分子レベルでの解析

I. Matsuo, et al., J. Am. Chem. Soc., 2003. 125, 3402-3403.
I. Matsuo and Y. Ito, Carbohydr. Res., 2003, 338, 2163-2168.
I. Matsuo, et al., Tetrahedron Lett., 2005, 46, 4197-4200.
I. Matsuo, et al., Tetrahedron, 2006, 62, 8262-8277.

等温滴定型熱量計（Isothermal titration calorimetry：ITC)を用いた小胞体関連糖鎖とCRTとの相互作用解析

レクチン様分子シャペロン：カルレティキュリ（CRT）

Isothermal titration calorimetry 法

CNX/CRT

MW:46000○ ラベル、固定化する必要が無い！
× 糖鎖およびタンパク質がmgオーダーで必要

Glc’ase II

Lectin like chaperone （ERp57と協調）
Ca2+ binding protein
Cell adhesion
Control of gene expression

CNX/CRTcycle

糖鎖認識に関する研究

Glu’ase II

M9GlcNAc2
Ligand (糖鎖)Glc1M9GlcNAc2＊ A. Vassilakos et al. J. Biochemisty 1998, 37, 3480.
＊ R.G. Spiro et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 11588.
(CRT 固定化カラムを用いた pull down assay)

温度差
熱量変化

G1M3オリゴ糖の結合定数(Ka)は106M-1である＊M. Kapoor et al. J. Biol. Chem. 2003, 278, 6194.
（糖鎖部分構造を用いたITCによる解析)
Reference
Cell

糖鎖の全体構造を用いた定量的解析
糖鎖の認識部位に関する実験データはない

相互作用： 非常に弱い

ー 糖鎖微細構造の違いにより認識能が異なる ー

Ka× 10-6 (M-1)

OC3H7OC3H7OC3H73＊
OC3H72

OC3H7OMe

10

OC3H7G2M9M9

糖鎖の微細な構造の違いがタンパク質品質管理機構を制御している？

？

ERQC
Misfoldedprotein
accumulation
ERStressFolding
diseaseDiabetes

βcells1). Oyadomari, S et al. J. Clin. Invest., 2002, 109, 525-532.

OC3H7
G1M9

非常に弱い

Correlation between
ERQC and folding disease

糖鎖の高次構造の違いが結合に影響している？？
OC3H7Ka =5.26 ×106 M-1

仮説：品質管理機構に関連するタンパク質の活性の差により小胞体の糖鎖構造の違いが生じるのでは？

G1 構造を特異的に認識
分岐部分のマンノース残基が重要
G1M8B に特徴的な結合低下

4タンパク質溶液
SampleCellConditions: 30 M protein (10 mM MOPS, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl, pH 7.4) in a sample cell (volume 1.4181 ml),
300 M oligosaccharide solution at 293K. The oligosaccharide solution was added as 50 injections of 6 M into the sample cell

等温滴定型熱量計(ITC)によるCRTの特異性解析

5Glu’ase II

MicroCal 社製

UGGT

ERp57 (folding sensor)

G1M9糖鎖を認識および分岐部分の構造(B,C-arm）の構造が結合に影響を与える

10 mg~300mg

G1M8B

G1M8C

G1M7

G1M5

G1M4

G1M3

Srinivas, H., Kandiah, E., Gemma, E., Ellgaard, L., Oscarson, S., Helenius, A., Surolia, A., J. Biol. Chem. 278, 6194, 2003.
* Kapoor,M.,“Interactions of Substrate with Calreticulin, an Endoplasmic Reticulum Chaperone”

フォールディング病に糖鎖を介した品質管理機構の痕跡があるか？
糖鎖分子プローブを用いた小胞体関連酵素活性プロファイリング（糖鎖プロファイリング）

糖鎖分子プローブを用いた小胞体関連酵素活性プロファイリング（糖鎖プロファイリング）

糖尿病マウスをモデルとしてラット肝臓小胞体画分の糖タンパク質糖鎖の構造を解析、糖鎖構造の差異はない

PNGase

糖鎖分子プローブをラット肝臓小胞体画分で処理

小胞体ストレス関連タン
パク質
Chaperon
Chaperon
GRP78/Bip
induction
p-IRE1WTGK
WTGK

PA labelingER fraction

糖鎖分子プローブを用いた小胞体関連酵素活性プロファイリング

→ 異なる糖鎖プロファイルを示し
た

糖鎖構造の比較：差は認められない
WT

GK
M8 M9

M8 M9
M6M5

M7M6

G1M9

M7

G1M9

Degradation
OS9β-Actin

WT

WTGKGK

M5

小胞体関連酵素活性の違いにより糖鎖構造プロファイルに差異
小胞体へ糖タンパク質を保持する糖鎖構造

小胞体から排出する糖鎖構造

糖鎖分子プローブを用いた小胞体関連酵素活性プロファイリング
（糖鎖プロファイリング）で疾患に迫れるか？

糖鎖を介した品質管理機構の破綻は何らかの疾患にはつながりそう糖尿病モデルマウスはマンノシダーゼ活性が高い小胞体から排出される糖鎖構造（M8-M5）が積極的に合成されている？

糖鎖プロファイルは、、、、これらの現象を捉える一助になる？
S. Iwamoto, et al., Glycobiology, in press (2013)

研究成果最適展開支援プログラム A-STEP（H23年度）

病原体を除去する分岐型マンノース
結合高機能性綿球の開発

酸化セルロースの調製とマンノース誘導体の導入
糖鎖結合高分子材料

TEMPO/NaBr/NaClO
H2O, r.t., 6h
固体NMRによる酸化セルロースの解析

X線光電子分光分析の結果

EDC/DMF
r.t, 12h群馬大学大学院工学研究科 応用化学・生物化学専攻

糖鎖化学研究室（松尾研究室）

糖鎖をたくさんつくる

糖鎖合成化学を基盤として，糖鎖プローブを創り出し，生化学的な解析を通して糖鎖の機能を理解する。そして糖鎖の機能を生かした機能性材料の開発へと展開する。
謝辞：本研究の一部は、理化学研究所、ERATO-JST主任研究員 伊藤幸成先生
成蹊大学大学院理工学研究科 准教授 戸谷希一郎先生のご協力、ご助言を頂きました。