Photon Factory Activity Report 2017 #35 (2018)

BL-1A, BL-17A / 2014G556

オーバラッピングダイヌクレオソームの構造解析
Structural analysis of the overlapping dinucleosome
有村泰宏 、 胡桃坂仁志
東京大学、定量生命科学研究所、〒113-0032, 東京都文京区弥生 1-1-1
Yasuhiro ARIMURA and Hitoshi KURUMIZAKA
Institute for Quantitative Biosciences, The University of Tokyo, 1-1-1 Yayoi, Bunkyo-ku,
Tokyo 113-0032, Japan.
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本研究において、H2A、H2B が 3 分子ずつと、H3、H4 が 4 分子ずつからなるヒストンの 14 量体の周りにDNA が巻きついた、オーバーラッピングダイヌクレオソームと呼ばれる特殊なヌクレオソームの立体構造を、3.14Å の分解能で X 線結晶構造解析によって明らかにした。本研究によって、主要のヌクレオソーム（ヒストン 8 量体に DNA が巻きついたヌクレオソーム）とは異なる特殊なヌクレオソームの原子分解能での立体構造を初めて明らかにした。
1 はじめに真核生物のゲノム DNA には様々なタンパク質やRNA が結合し、クロマチン構造を形成している。
クロマチンの基本構成単位は、ヌクレオソームと呼ばれる DNA とヒストンタンパク質の複合体である。
細胞内の大多数のヌクレオソームは、4 種のヒストン（H2A、H2B、H3、H4）各 2 分子ずつで構成されるヒストン 8 量体の周りに DNA が 1.7 回転巻きついたオクタソームと呼ばれる構造体である[1]。本研究においては、オーバーラッピングダイヌクレオソームと呼ばれる特殊なヌクレオソームの立体構造を、
X 線結晶構造解析によって明らかにした。オーバー
ラッピングダイヌクレオソームは H2A、H2B が 3分子ずつと、H3、H4 が 4 分子ずつからなるヒストンの 14 量体の周りに DNA が巻きついた構造体である。遺伝子発現調節などに伴って、プロモーターや遺伝子コード領域のヌクレオソームの形成位置が変化する際にヌクレオソーム同士が衝突することで、オーバーラッピングダイヌクレオソームが形成されることが、試験管で再構成したヌクレオソームを用いた生化学的解析によって示唆されていた[2], [3]。
本研究では、試験管内でオーバーラッピングダイヌクレオソームを再構成し、X 線結晶構造解析によって、3.14 Åの分解能でその立体構造を明らかにした (図 1)。この成果は Science 誌に掲載された (成果1)。
2 実験
オーバーラッピングダイヌクレオソームを試験管内で再構成するために、250 塩基対の DNA を調製した。さらに、ヒトの各種ヒストンタンパク質（H2A、H2B、H3、H4）をリコンビナントタンパク質として精製した。精製したヒストンを用いて、4種のヒストン（H2A、H2B、H3、H4）各 2 分子ずつを含むヒストン 8 量体を再構成した。これらのDNA とヒストンとを高塩濃度下で混合し、徐々に塩濃度を低下させることで、試験管内でオーバーラッピングダイヌクレオソームを再構成した。再構成したオーバーラッピングダイヌクレオソームを、分取用電気泳動装置を用いて、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。精製したオーバーラッピングダイヌクレオソームをハンギングドロップ蒸気拡散法によって結晶化した。結晶化においては、結晶化ロボット DropSetter NT8(Formulatrix) を用いて、70 µL のレザーバー溶液(100mM potassium bromide, 100 mM potassium thiocyanate,
50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 1.5% PGA-LM30, 12% PEG
400 に対して、0.1 µL のオーバーラッピングダイヌクレオソーム溶液と 0.1 µL のレザーバー溶液の混合液を蒸気拡散によって、20℃において数日から数週間、平衡化した。結晶の観察には、自動結晶観察装置 RockImager182 (Formulatrix) を用いた。得られた結晶をクライオプロテクタント溶液に浸潤し、液体窒素で凍結し、Uni-puck に装填して photon factoryの BL-1A および BL-17A に持ち込み、クライオプロテクタント溶液の最適化を行い、X 線回折データを取得した。
HKL2000 を用いて 3.14 Å の分解能でスケーリングを行った。位相決定は Molrep を用いて分子置換法によって行い、サーチモデルには、146 塩基対のDNA を含むヌクレオソーム構造（PDB ID:3AFA）、および既知のヌクレオソーム構造をもとに作成したヘキサソームのモデル構造の２つを用いた。分子置換法によって得られた初期構造について、phenix、coot を用いて精密化を行なった。その結果、3.14 Åの分解能で、オーバーラッピングダイヌクレオソー
ムの立体構造を決定した。
3 結果および考察
今回決定したオーバーラッピングダイヌクレオソームの立体構造から、オーバーラッピングダイヌク
レオソームは、オクタソーム（ヒストン 8 量体にDNA が巻きついた構造体）とヘキサソーム（ヒストン 6 量体に DNA が巻きついた構造体）の 2 つのユニットが連結することで、ヒストン 14 量体の周りに DNA が約 3 回転巻きついた構造を形成していることが明らかになった。

Photon Factory Activity Report 2017 #35 (2018)

また、オーバーラッピングダイヌクレオソームは、H2A、H2B を 3 分子ずつと、H3、H4 を 4 分子ずつ含む複合体であり、ヌクレオソーム二つ分のヒストン含有量 (H2A、H2B、H3、H4 が 4 分子ずつ)に比べて、H2A と H2B が１分子ずつ少ない。そのためオーバーラッピングダイヌクレオソームが形成される際には、2 つのヌクレオソームのうち、片方のヌクレオソームから、H2A と H2B が１分子ずつ解離すると考えられた。今回決定した立体構造から、オーバーラッピングダイヌクレオソーム中のヘキサソームユニットは、オクタソームユニットと接する面の H2A と H2B を欠失していた。オーバーラッピン
グダイヌクレオソームが形成される際には、2 つのヌ ク レ オ ソ ー ム の 向 き 合 う 面 か ら 、 H2A お よ び
H2B が解離すると考えられた。
さらに、ヘキサソームユニットとオクタソームユニットの間に形成される相互作用に着目すると、ヘキサソームユニット中の H3 の Lys56 および Thr80
がオクタソームユニット中の DNA と、オクタソー
ムユニット中の H2A の Asn68 と Arg71 および H2Bの Lys108、Ser112、Lys116 がヘキサソームユニッ
ト中の DNA と近接しており、相互作用することが考えられた。これらのアミノ酸を酸性アミノ酸に置換することで、DNA との相互作用を失わせるような変異体を設計して、X 線小角散乱によって解析したところ、オーバーラッピングダイヌクレオソームの形成効率には影響がなかったものの、通常のオーバーラッピングダイヌクレオソームよりも回転半径が大きくなることが、X 線小角散乱解析によって明らかになった。そのため、これらのアミノ酸は、オーバーラッピングダイヌクレオソームの形成には必須ではないものの、その構造を安定に保つために必要であることが考えられた。
4 まとめヌクレオソームはゲノム DNA 上に数珠状に形成されており、クロマチンリモデリング因子によって、プロモーターや遺伝子コード領域のヌクレオソームの形成位置が変化させられる際に、ヌクレオソーム同士が衝突し、オーバーラッピングダイヌクレオソームと呼ばれる特殊なヌクレオソーム構造が形成される場合があることが示唆されていた。
本研究では、試験管内でオーバーラッピングダイヌクレオソームを再構成し、X 線結晶構造解析によって、3.14 Åの分解能でその立体構造を明らかにした。この構造中では、ヒストン 6 量体に DNA が巻きついたヘキサソームと、ヒストンの 8 量体にDNA が巻きついたオクタソームが重なり合い、ヒストン 14 量体に DNA が左巻きに 3 回転巻きついた特殊な立体構造を形成していた。
本研究によって、通常のヌクレオソーム（ヒストン 8 量体に DNA が巻きついたヌクレオソーム）とは異なる特殊なヌクレオソームの原子分解能での立体構造が世界で初めて明らかになった。

ゲノム解析の結果、このオーバーラッピングダイヌクレオソームが転写開始点の近傍に形成されていることが示唆された。今後、オーバーラッピングダイヌクレオソームの機能について明らかにしていきたい。
謝辞
X 線回折データの収集にあたり、ご協力いただいた PF のスタッフの方々に深くお礼申し上げます。
参考文献[1] K. Luger et al., Nature 389, 251-260 (1997).
[2] M. Engeholm et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 151158 (2009).
[3] N. P. Ulyanova and G. R. Schnitzler, Mol. Cell. Biol.
25, 11156–11170 (2005).
成果[1] D. Kato et al., Science 356, 205-208 (2017).
* kurumizaka@iam.u-tokyo.ac.jp

オクタソームオーバーラッピング
ダイヌクレオソーム

図1 オクタソームと、オーバーラッピング
ダイヌクレオソームの立体構造