JAIMA Season 2022
機器分析が支える、豊かな暮らしと産業のフロンティア

バイオイメージング・センシング
プラットフォームの開拓

No.16

産業技術総合研究所 健康医工学研究部門 バイオイメージング研究グループ
加藤大、小椋俊彦、鈴木祥夫、山本条太郎、小川昌克

１．はじめにントラスト・低ダメージで観察するためには、電子線を試料に直接照射しなければよい。しかし、生体分子や生体組織、あるいは食品・環境物質

電子線をプローブとして使用する限りは、電子線などの対象物質は、それぞれ多種多様なスケール・の試料への直接照射が必須となる。我々は、こう濃度で存在している。これら対象物質に対して、した矛盾を解決するため、電子線をタングステンより高性能なイメージングやセンシングを達成す薄膜に照射・吸収させ、この電位変化を溶液中のるためには、新たな基盤技術開発が必要となる。

試料を透過させて検出し、試料の誘電率の違いを

産業技術総合研究所 健康医工学研究部門 バイオ

可視化する走査電子誘電率顕微鏡（SE-ADM）のイメージング研究グループでは、新たなイメージ開発を進めてきた 1。この方法では、電子線を試ング・センシングプラットフォームの開拓に向け、料ホルダー上部の窒化シリコン（SiN）薄膜上部

独自性の高い観察・計測のための装置や材料、なタングステン層に照射して吸収させ、薄膜内に局らびに方法論に関する研究開発を進めている。本

所的な電位変化を生じさせる。この電位変化は、稿では、各々のトピックについて解説するととも水溶液中の試料を透過し、下側の測定端子によりに、最近得られた研究成果を紹介する。

検出される。こうした電位変化の透過率は、物質２．走査電子誘電率顕微鏡の開発と溶液中の生物試料やナノ材料の高分解能観察の比誘電率により規定される。水は比誘電率が80と高いため電位変化を良く透過する一方、生物試料や有機材料は、比誘電率が２～３と低く透水溶液中の生物試料やナノ粒子、有機材料等を過が阻害される1。こうした比誘電率に起因する電ナノレベルの分解能で直接観察することは、生物位変化の透過状況を可視化することで、電子線ダ機能の解明やナノ粒子材料の分析に必須である。

メージが無く極めて高いコントラストで水溶液中これまで、10 nm以下の分解能で試料を直接観の試料を直接観察することが可能となった（図１a）。

察する方法として、電子顕微鏡が主に使用されて我々はこれまで、SE-ADMを用いて水溶液中きた。しかし、通常の電子顕微鏡では筐体内部がのバクテリアや細胞、エマルジョン等のさまざま真空となっており、溶液中の生物試料やナノ材料な溶液中の試料の観察を行ってきた。マウス乳がを直接導入し観察することはできない。そのため、ん細胞の観察では、細胞内の核や内膜構造が極試料を溶液のまま封入し、溶液状態を保持したま2。
めてコントラスト良く観察可能であった（図１b）

ま観察が可能な大気圧ホルダーが開発されてきた。

さらに、骨を形成する骨芽細胞が分泌する骨形だが、この観察方法でも、電子線が直接試料に成小胞に関しても細胞内部の形成状態を直接観察照射されるため、電子線ダメージが大きく、さらする事に成功した 3。また、最近では北京の大気に軽元素で構成される生物試料や有機材料の場合より採取された PM2.5の培養細胞への取り込み状はその比重が水の比重と近いため、コントラスト態を直接観察し、細胞内での凝集状態を解析したが極めて低いといった問題点がある。

（図１c）4。

水溶液中のさまざまな試料を電子線により高コ以上のように、我々が開発を進めているSE-JAIMA Season 2022 Spring3

ADMでは、電子線を試料に直接照射しないため、ある。本方法は、生物試料だけでなく水溶液中の電子線ダメージを生じず、極めて高いコントラス

ナノ粒子の形状や分散状態、さらにはエマルショトで細胞の微細構造を直接観察することが可能でンや油中の改質剤等の観察にも応用が可能である。

a）走査電子誘電率顕微鏡（SE-ADM）b）マウス乳がん細胞c）培養細胞内に取り込まれた PM2.5

図１ SE-ADM の模式図（a）と培養細胞の観察結果（b、c）

３．目的のタンパク質・コレステロール等を可視化する合成蛍光プローブデザイン
近年、疾患関連物質に関する研究が目覚ましく

ドーパミンの in vivo イメージングを行い、脳組織におけるドーパミンの動的観察を行うことができた（図２）。

進歩しており、癌、免疫受容体、受精、発生・分化、さらに、哺乳動物細胞の脂質膜のダイナミック感染症、バイオ医薬品開発等において、重要な役挙動についても評価するためにコレステロールに割を果たしていることが明らかとなっている。生着目した。コレステロールは脂質膜に必須な成分

体中に存在する疾患関連マーカー物質は極微量にであり、また情報伝達の調節にも関係している。

しか存在しないため、新たな評価技術の開発が求

コレステロールの細胞内分布は一様でないためめられている。我々は、“バイオセンシング機能輸送系の存在が推定されるが、その全貌は明らかを有する新規機能性材料の創製とそれらを利用しではない。生きた細胞におけるコレステロールのた高機能光化学センサーの構築”というコンセプイメージングは、この輸送系の理解に有益なツートに基づき、特定の生体物質や化学環境に感応しルのひとつである。そのためコレステロールに蛍て光学特性が鋭敏に変化する機能性材料の研究開

光基を化学的に付加したプローブがこれまで複数発を推進している。

開発されたが、コレステロールが局在するはずのこれまでに独自に開発した環境応答性が高い蛍形質膜に局在しない等の問題があった。我々は、光物質と、標的物質（タンパク質、神経伝達物質新たにコレステロールと蛍光基をつなぐ化学構造等）に対して親和性の高い結合部位を併せ持つさを工夫した蛍光プローブ（R-Chol）を開発した 6。

まざまな機能性材料を開発し、検出感度、選択性、培地に添加した R-Chol は細胞へ速やかに取り

分析操作時間、他分析法との比較の観点から性能込まれ、その蛍光が形質膜に顕著に観察された（図評価を行った。

３）。生化学的分析により、
R-Chol はコレステロー

このうち神経伝達物質を選択的に検出するための新規蛍光分子プローブについては、ドーパミン

4おける評価だけでなく、ラットの脳組織におけるルと同様に膜マイクロドメインに集まることが示された。

を高感度かつ高選択的に検出するために、ドーパ化学センサーが、将来の産業、医療、高齢化社

ミン認識部位としてイミノ二酢酸と遷移金属イオ

会、環境問題に対応する技術として発展していくンから成る錯体と蛍光発色団としてシアノピラニ

ためには、新たなる発想に基づく新規機能性材料

ル基を併せ持つ化合物を開発した 5。in vitro にの開発が不可欠であり、化学物質の単なる化学的JAIMA Season 2022 Spring特性を利用するだけでなく、複数の分野間の融合報を解析するためのより高次のプローブが必要でから生まれた新素材と組み合わせ、センシング情あると考えられる。

図２ ドーパミンを検出するための蛍光分子プローブの構造（a）と、蛍光分子プローブでラットの脳組織を染色後、腹側被蓋野を電気刺激した際の蛍光強度の経時変化と分布を表した画像（b）である。これらの利点を生かして、FCS は特に生物学分野の研究で用いられるようになってきた。
FCS では回折限界程度まで集光した励起レーザーとピンホールを用いた共焦点蛍光検出系を用
図３ R-Chol を導入した MDCK 細胞（イヌ腎由来上皮様細胞）の微分干渉像（DIC）と蛍光像（FL）

４．蛍光分子の動態計測手法の開発とその応用研究いる。図４に点線で示す共焦点領域を蛍光標識した分子・粒子がブラウン運動によってランダムに出入りすることによって、検出される蛍光強度が時間的に変動する。この変動の速さを自己相関解析することにより、測定対象のブラウン運動の速当研究グループでは、蛍光計測技術に基づく生さ、すなわち拡散定数を決定でき、その情報を元体分子・微粒子の動態計測技術の開発も進めていに粒子径を決定できる。また FCS では、同時にる。塗料やエマルションのような工業製品の品質粒子濃度の情報も得られる。

管理から、実験室レベルで作成した微粒子の粒子筆者らは、FCS 技術を基盤とした新たな光ファ径評価においては、光散乱計測のひとつである

イバー型 FCS 装置の開発を進めている。通常の動的光散乱法（Dynamic Light Scattering, DLS）

FCS 装置は上述のように一般的な共焦点蛍光検がよく用いられる。しかし、散乱光は試料に含ま出系になっており、ピンホール位置の調整は共焦れるすべての分子・粒子から発せられるため、細点蛍光顕微鏡観察よりもシビアである。そのた胞培養上清や細胞溶解液のような測定対象分子以め、ピンホール位置の調整を日々行う必要があり、外の分子・粒子を多量に含む生物学的試料の測初心者には扱いが難しい装置である。我々が開定には向いていない。一方で、蛍光相関分光法

発した光ファイバー型 FCS（Fiber-Optic Based（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS）

FCS, FB-FCS) は光学系の大部分を光ファイバー

では、あらかじめ測定対象分子に蛍光標識を施しに置き換えることで、調整を一切不要な FCS 装ておくことで、夾雑物を含む試料においても測定置とすることに成功した 8。現在はこの装置を用対象分子のみを特異的に測定できる7。また、生いた生体微粒子の定量・検出に関する研究を進めきた細胞内においても低損傷でそのまま測定可能ている。

JAIMA Season 2022 Spring5また、蛍光分子の並進拡散と同時に回転拡散

ナノカーボン薄膜は、スパッタ条件によりも測定可能な FCS の発展手法である偏光 FCS

sp2/sp3結合比の構造制御ができるため、グラファ（Polarization dependent FCS, Pol-FCS）装置をイト並の高い導電性（電極活性）とダイヤモンド用いた基礎研究も進めている。高分子が高濃度で並の硬度を併せ持った薄膜特性を有する。実際に存在している高分子クラウディング溶液中に緑色（電極ナノカーボン薄膜（sp3=40%）電極の電位窓

蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光体を導入してに安定に電位を印加できる範囲）は、市販のグ

Pol-FCS 計測を行うと、並進拡散は周囲の高分子ラッシーカーボン（GC、sp3=0%）電極より広く、によって阻害されるのに対し、回転拡散は阻害さ酸化側でボロンドープダイヤモンド（sp3≒ 100%）れにくいことがわかった。これは蛍光体が回転半電極に準じる広さを有する。また、ナノカーボン

径程度の領域からの影響しか受けないことから、薄膜の平均表面粗さは 0.1 nmとほぼ原子オーダー

高分子の隙間で比較的自由に回転可能であるためで超平坦であるため、電気化学測定時のノイズ電と考えられた。このことから、回転拡散と並進拡流が極めて低い。

散の比較によって、細胞内を含む高分子クラウナノカーボン薄膜電極の広い電位窓と低いノイディング環境中の高分子の間隙広さや環境の混雑ズ電流の両特性が活かせる測定対象物質としてレベルの評価が可能であると考えられる。この手は、化学的に安定（酸化電位が高い）、あるいは存法を利用して、生細胞内において細胞質の混雑具在濃度が極めて低いため電気化学法では検出が困

合が細胞種や細胞周期に依存して変化している可難である物質が該当し、例えば、ゲノム中に極能性を見出した 9。

微量含まれる 5-hydroxymethylcytosine（5hmC）などの後天的修飾塩基が挙げられる。また、「開発した電極が既存の分析機器とフィッティングできる」ことは産業利用の観点から重要との声を産業界から多くいただいた。
これらの点を実証すべく、5hmCを対象とし、液体クロマトグラフィ（LC）へナノカーボン電極を導入した LC-ECD計測を検討した 11。5hmCは、ヒトやマウスの神経組織において存在が確認

図４ FCS の原理

５．高感度センシングが可能なナノカー
ボン電極材料の創製

ネティックな因子として注目されている。存在割合は１%以下と低いため、より高感度な 5hmC検出技術が必要とされており、これまでにバイサ
ルファイトシークエンシング、抗体、あるいは電気化学測定法は、分子の酸化還元反応の際にLC法をベースとした方法などが報告されている。

流れる電流や電極界面の電位を測定することで、LC法での課題は、5hmCとその原物質であるシト対象物質を検出する手法である。簡便・安価な検シン（C）の極性が近いことに加え、5hmCの濃度出手法として期待される一方、測定できる電位範は極微量であるため、Cとのカラム分離が難しい

囲が狭く微量物質の検出も困難であることから、点である。筆者らは、ナノカーボン電極を用いた測定対象となる物質が限られる点が課題とされて電気化学計測により、5hmC、ならびにCはそれきた。本節では、電気化学法での測定対象の多様ぞれ 1.62、1.74 V（vs. Ag/AgCl、10 mMリン酸化を実現すべく、近年、著者らが開発してきたスバッファー（pH 4.0）中）で酸化されることを確認

パッタ法を用いたナノカーボン薄膜電極についてした。

紹介する10。

6

され、近年神経疾患などの分野においてエピジェJAIMA Season 2022 Spring

この結果から、LC-ECDにおける印加電位を1.6 Vに設定し２種のゲノム DNA（gDNA）試料

謝辞（酵素処理によりモノヌクレオチド単位まで分解

本研究の遂行に当たり、村上伸也先生（大阪大している）を測定したところ、マウス脳由来の学）、金城政孝先生（北海道大学）、丹羽修先生、gDNAでは、大過剰の Cの応答を抑制しながら田中睦生先生（埼玉工業大学）、弊所関係者（岡5hmCの発現を検出できた（検出限界 82.5 fmol）（図田知子博士、鎌田智之博士、栗田僚二博士、小５）。解析の結果、マウス gDNA試料中の５hmC

島直博士、佐々木章博士、山本慎也博士）をは量は 2.2 pmol
（5hmC化率 0.135%に相当）であった。

じめとする多くの共同研究者の皆様に支えてい一方でGC電極では５hmCの検出下限は 50 pmolでただきました。この場をお借りして厚く御礼申あり実試料中の５hmCを計測できなかったことかし上げます。本研究の一部は科学技術振興機構

ら、ナノカーボン電極を搭載した LC-ECD計測の（JST）CREST（JPMJCR19H2）、A-STEP 機 能優位性を示すことができた。

検証フェーズ（JPMJTM19Y0）、科学研究費補助

この他にも、これまで検出が困難であったさまざ金（19H03230、JP19K06591、JP15K06592）、おまな検出対象に合せた電極設計を実現している10。

よび埼玉県産学連携研究開発プロジェクトのご支

今後も電極制御に立脚することで測定対象が拡張援のもとに実施されました。重ねて御礼申し上げされていくことが期待される。

ます。
◉参考文献
1. T. Ogura, Biochem. Biophys. Res. Commun. 459, 521(2015)
2. T. Okada, T. Ogura, Sci. Rep. 6, 29169 (2016)
3. T. Iwayama, T. Okada, T. Ueda, K. Tomita, S.
Matsumoto, M. Takedachi, S. Wakisaka, T. Noda, T.
Ogura, T. Okano, P. Fratzl, T. Ogura, S. Murakami,
Sci. Adv. 5, eaax0672 (2019)
4. T. Okada, T. Iwayama, S. Murakami, M., T. Ogura,

図５ （a）5hmC と C の化学構造、（b）5hmC の LC-ECD 測定。
赤：マウス脳由来 gDNA、黒：ウシ胸腺由来 gDNA

Sci. Rep. 11, 228 (2021)
5. Y. Suzuki, Sens. Actuators B, 239, 383 (2016).
6. Y. Ogawa, M. Tanaka, Anal. Biochem., 492, 49 (2016)

６．まとめ

7. 山本条太郎 , 北村朗 , 金城政孝 , 生物物理 59, 125 (2019)
8. J. Yamamoto, A. Sasaki, Appl. Sci. 11, 6744 (2021)

本稿では、当研究グループで開発するイメージ

9. J. Yamamoto, A. Matsui, F. Gan, M. Oura, R. Ando,

ング・センシング技術ついて解説した。今後、個々

T. Matsuda, J. P. Gong, M. Kinjo, Sci. Rep. 11, 10594の技術の深化と融合により、さまざまな測定対象(2021)へ適用可能な付加価値の高い計測プラットフォー
ムへと発展していくことを期待している。

10.加藤大 , 鎌田智之 , 栗田僚二 , 吉岡恭子 , 芝駿介 , 藏屋英介 , 國武雅司 , 丹羽修 , 分析化学 , 67, 635 (2018)
11 .S. Chaudhari, T. Kamata, N. Kojima, M. Sumimoto, K.
Satyamoorthy, R. Kurita, D. Kato, Sens. Actuators B.,
314, 128092 (2020)

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