CLC Genomics Workbench
ハンズオントレーニング
変異解析編

株式会社キアゲングローバルイフォマティクス ソリューション＆サポート
アプライドアドバンストゲノミクス

Sample to Insight1

Genomics Workbench で可能な解析

新規生物種

変異解析

ChIP-seqRNA-seqsmall RNA

インポート

インポート

インポート

インポート

インポート

Quality check

Quality check

Quality check

Quality check

タグの抽出

De Novo
アッセンブリ

マッピング

マッピング

RNA-seq

miRBase
ダウンロードBLAST検索

変異検出

ピーク検出

RPKM計算アノテーション付け

フィルタリング

ピーク精査

群間比較

既知のmiRNAとそれ以外の分類

Sample to Insight2

データ管理
データロケーション•

Genomics Workbench ではデータ保存の階層のトップをLocationと呼びます。

•

デフォルトのLocationはCLC_Dataが作成されていますが、左の図のようにLocationは追加可能です。

•

Location の新規追加は、Navigation Area 左上のアイコンから作成可能です。シークエンスデー
タはサイズが大きいため、容量が大きいディス
クへLocationを作成することをお勧めします。

Location
FolderLocation 作成
Folder 作成•

また解析が一通り終了し、バックアップや外付けのディスクへ移動する場合は、このLocation
単位での移動をお願いします。

Sample to Insight3

今日のデータ
データインポート
今日は、変異解析用データと、発現差解析用データを使います。それぞれzip形式で圧縮されていますが、圧縮された状態のまま、以下のImport > Standard Import よりインポートしてください。

Sample to Insight4

変異解析フロー
全体の流れ
インポート
QC、トリミング
マッピング
マッピング補正
変異解析
アノテーション
フィルタリング

Sample to Insight
Title, Location, Date

5

CLC Genomics Workbench
データインポート

Sample to Insight6

データインポート
リードデータインポート

次世代シークエンサー以外のファイル
アノテーションファイルのインポート
SAM/BAMインポート*

シークエンサーデータインポート

SAM/BAMファイルは、マッピング後のデータにおいて利用される一般的なフォーマットです。

Sample to Insight7

データインポート
リードデータインポート：イルミナ•
General options：共通のオプション• Paired reads: ペアかどうか• Discard reads names: リード名を捨てるかどうか（捨てないことをお勧め）• Discard quality scores: クオリティスコ
アを捨てるかどうか（捨てないことをお勧め）

リードファイルの選択

Paired options：ペアのオプション• Paired-end: ペアエンドかどうか• Mate-pair: メイトペアかどうかペアを選んだ場合はリード長を含めた距離を入力。

古いバージョンのIlluminaのソフトウェアで処理されたデータの場合は、バージョンを指定。
Sample to Insight8

データインポート
リードデータインポート：イルミナ

Result handling：結果の扱い方• Open: インポート後開く• Save: インポートして保存• Into separate folders: データごとにフォルダを作成するかどうか。複数ファイルをインポートする場合は、チェックを入れておくことで、デー
タごとにフォルダが作成され、管理が容易になります。

Sample to Insight9

データインポート
リードデータインポート：Ion Torrent• リードファイルの選択
General options：共通のオプション• Paired reads: ペアかどうか• Discard reads names: リード名を捨てるかどうか（捨てないことをお勧め）• Discard quality scores: クオリティスコ
アを捨てるかどうか（捨てないことをお勧め）

Ion Torrent オプション: .sffファイルでのインポートの場合、Clippingされた情報を使うかどうか、選択できる。

• Fastqかsffを選択可能

Paired options：ペアのオプション• Paired-end: ペアエンドかどうか• Mate-pair: メイトペアかどうかペアを選んだ場合はリード長を含めた距離を入力。

Sample to Insight10

データインポート
リードデータインポート：Ion Torrent

Result handling：結果の扱い方• Open: インポート後開く• Save: インポートして保存• Into separate folders: データごとにフォルダを作成するかどうか。
複数ファイルをインポートする場
合は、チェックを入れておくこと
で、データごとにフォルダが作成され、管理が容易になります。

Sample to Insight11

データインポート
リードデータインポート：Ion Torrent (Unmapped BAMファイル) ※注意
Ion Torrentのシークエンサーデータを処理するTorrent Suitでは、バージョン3.0以降、デフォル
トでは、fastqファイルやsffファイルが作成されず、Unmapped BAM ファイルが作成されます。
Unmapped BAM ファイルは、Import > Standard Import よりインポートいただくことで、fastq
ファイルをインポートした場合と同じようにインポートが可能です。

リードデータとしてインポートされます。
マッピングデータとしてインポートされます。

Sample to Insight12

データインポート
ゲノムインポート
ゲノムデータは、よく知られているモデル動物についてはのDownload Genome よりインポー
トできます。

Sample to Insight13

データインポート
ゲノム配列の入手方法•

Download 機能を用いる

または•

Download サイトからダウンロードしたファイルをインポートする

Sample to Insight14

データインポート
ゲノムインポート• Download genome sequence: 新規にゲノムをダウンロードする場合。
• Use exsting genome sequence track: すでに
ダウンロードしたゲノムにアノテーションを追加する場合。以下のようにトラックのフォーマットになっているゲノムを選択。

• ドロップダウンリストから生物種を選択。

Sample to Insight15

データインポート
ゲノムインポート• 希望するアノテーションにチェックを入れる。ゲノム配列をダウンロードする
ときは、Sequences にもチェックを入れる。
• 選択した生物種により、表示されるアノテーションの種類は異なります。
Sample to Insight16

データインポート

NCBIで検索してインポート

または• NCBI のサイトに検索をかけて、直接ゲノム配列をダウンロードすることができます
Sample to Insight17

データインポート
Search for Sequences at NCBI

• 検索のキーワードを入れて、Start search をクリックします• 目的の配列を選択して、Download and Save で配列をダウンロードできます
Sample to Insight18

データインポート
アノテーションインポート•

Download Genome 以外にも、アノテーションファイルをインポート可能です。

•

アノテーションとして取り込めるファイルは以下のフォーマットです。

•

アノテーションファイルをインポートする際には、対象となるゲノム配列がすでにインポー
トされ、Trackのフォーマットになっていることが前提です。
•
•
•
•
•
•
•

VCF
GFF/GTF/GVF
BED
WiggleComplete Genomics Var file
UCSC Variation table damp
COSMIC variation database※変異のデータについても、アノテーションとして自分の変異へアノテーションとして情報の追加や比較ができるため、アノテーションのインポート可能フォーマットに含めています。

Sample to Insight19

データインポート
アノテーションインポート
アノテーションのインポートは、Import > Tracks より行います。

Sample to Insight20

データインポート
トラックインポート

インポートするファイルのタイプを選択

インポートするファイルを選択対象とする参照配列（ゲノム配列）を選択。あらかじめインポートされている必要があります。
Sample to Insight21

データフォーマット編
スタンドアロンフォーマットとトラックフォーマット

Sample to Insight22

スタンドアロンフォーマット
スタンドアロンフォーマットでは、1つのデータに配列情報、アノテーションがセットになっています。

Sample to Insight23

トラックフォーマット
トラックフォーマットでは、リードやゲノム配列、アノテーションがばらばらのファイルになっており、好きに組み合わせて表示が可能です。

Sample to Insight24

トラックリスト
複数のトラックを組み合わせてTrack list を作ることで好きなビューを作成できます。

Sample to Insight25

フォーマットとアイコン表示
スタンドアロンフォーマット
染色体のセットやリード配列など配列のセット
染色体1本など１つの配列
リードマッピング

トラックフォーマット

青いヒストグラムが目印
ゲノムTrack

アノテーションTrack

変異Track
リード（マッピング）Track

解析によって必要とするフォーマットが異なります。
スタンドアロン⇔トラックの変換は自由に行えます。
Sample to Insight26

フォーマットの変換
トラックフォーマットからスタンドアロンフォーマット、またスタンドアロンフォーマットからトラックフォーマットへは、 Toolbox > Track tools の中のツールを使って変換可能です。

•

スタンドアロンフォーマットからトラックへの変換。

•

トラックからスタンドアロンフォーマットへの変換。

Sample to Insight27

フォーマットの変換
トラックフォーマットからスタンドアロンフォーマット、またスタンドア
ロンフォーマットからトラックフォーマットへは、 Toolbox > Track toolsの中のツールを使って変換可能です。

•

スタンドアロンフォーマットからトラックへの変換。

•

トラックからスタンドアロンフォーマットへの変換。

スタンドアロンフォーマットへ変換する場合、スタンドア
ロン内に含めるアノテーショントラックを含めて変換するようにしてください。
Sample to Insight28

フォーマットの変換

スタンドアロンフォーマットへ変換する場合、スタンドアロン内に含める
アノテーショントラックを含めて変換するようにしてください。

•

スタンドアロンフォーマットでは、Setting Panel のAnnotation Type からどういったアノテーションが付属しているか確認できます。

Sample to Insight29

クオリティチェックとトリミング

Sample to Insight30

クオリティチェックとトリミング

Quality Report作成: Create Sequencing QC Report•

インポートしたリードのクオリティがどのぐらいか、その後のトリミングや、PCR
Duplicate の状況などを確認するためにレポートを作成。

トリミング: Trim Sequences•

アダプターの除去、クオリティスコアによる除去、長さを指定した除去などを選択・組み
合わせてトリミング。

上記処理の後に再度Quality Reportを作成すると処理前と処理後でのリードのクオリティを比較でき、便利です。

Sample to Insight31

クオリティトリミング：原理
クオリティスコア
シークエンサーから出てきたリードは、各塩基ごとにエラーの確率の値を持っている。
Genomics Workbench へインポートされた時点で、Phred Score に変換されるようになっています。Pred Score は、塩基のエラー確率のLogを取り、-10をかけてスコア化したものです。値が大きくなるほど精度が高いことをあらわしています。

Phred Score

Error の確率

Base call の精度

10
20
30
40
50
60

1/10
1/100
1/1,000
1/10,000
1/100,000
1/1,000,000

90%
99%
99.9%
99.99%
99.999%99.9999%

Sample to Insight32

QCレポート作成：Create Sequencing QC Report•••

Navigation Areaから使用するリードデータを選択。
Toolboxから NGS Core Tools > Create Sequencing QC Report
を選択、ダブルクリック。
ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。

Sample to Insight33

QCレポート作成：Create Sequencing QC Report• Quality analysis: クオリティスコアに関する解析。
• Over-representations analysis: 過度に現れているような塩基配列などの解析。

• Create graphical report: グラフィカルなレポート
作成。
• Create supplementary report: 数値のレポート作成。
• Create duplicated sequence list: 重複のあった配列のリスト作成。

Sample to Insight34

QCレポート作成：Create Sequencing QC Report

Sample to Insight35

トリミング原理
3種類のトリミング

アダプター除去• あらかじめ登録されているアダプターの除去• 新規で独自の配列を登録することも可能

クオリティトリミング• Quality Score を使い、Quality の低い配列が連続するようになる箇所からカット• 正確に読めていない塩基をいくつ許容するか長さによる除去• 塩基数を指定して、5末端、3末端をカット• Quality Scoreでカット後、短くなりすぎた配列をカット

Sample to Insight36

クオリティトリミング：原理
クオリティスコア

Trimming ではQuality Score を使い、累積のQuality Score がある一定の値より大きいものが続いた場合に、その箇所を取り除く、という処理を行います。
具体的には以下：
1. Phred Score をp値へ変換

2. Trimming 中に設定するパラメータ（Limit）とp値の差を計算
3. 差の累積和を計算。このとき、0以下の値は0とする
4. Trimming後のリード開始点は累積和がはじめて0以上になった点。Trimming後のリード終了点は累積和が最大の点

Sample to Insight37

クオリティトリミング：原理
原理
G
C
C
C
A
T
G
T
T
C
G
A
T
G
C
4
8 15 30 32 23 10 31 31 20 15 11 10 1090.40 0.16 0.03 0.00 0.00 0.01 0.10 0.00 0.00 0.01 0.03 0.08 0.10 0.10 0.13
-0.35 -0.11 0.02 0.05 0.05 0.04 -0.05 0.05 0.05 0.04 0.02 -0.03 -0.05 -0.05 -0.08
0.00 0.00 0.02 0.07 0.12 0.16 0.11 0.16 0.21 0.25 0.27 0.24 0.19 0.14 0.06

リード配列

Phred score
p値
Limit - p値 (D)(D)の累積和

Limit = 0.05の場合スタート点：
累積和が0より大きくなった塩基終了点：
累積和が最大を示す塩基

Phred score の棒グラフ
40
20
0
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

グラフより、ある程度クオリティが高くなった場所からリードを使い、クオリティが連続して悪くなっている箇所からリードをトリムしていることがわかる。
※途中、1塩基のみクオリティが低いような場合は、必ずしもトリムされない。これはできるだけリードを長く保とうとするため。
Sample to Insight38
38

トリミング• Navigation Areaから使用するデータを選択。
• Toolboxから Trim Sequences を選択、ダブルクリック。
• ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。

Sample to Insight39

トリミング
クオリティトリミング• Trim using quality scores ：トリミ
ングに使用するLimitパラメータを決定• Trim ambiguous nucleotides：N表示される塩基について、最大何塩基まで保持させるか。

• 今回はアダプターは設定なし。

Sample to Insight40

トリミング長さによるトリミング••

5末、3末の塩基数を指定してカットする
Quality Scoreによるトリミングであまりに短いリードの除去など長さによるトリミング

Sample to Insight41

トリミング結果
結果•

トリミング後は、トリムされたリードと、レポートを作成した場合は、そのレポートが作成されます。

•

トリミング結果のデータはファイル名の後にtrimmed という名前が付いています。ファイル
内容はインポート後のデータ同様に、配列と、クオリティスコアを含んだファイルとなっています。

Sample to Insight42

トリミングレポート
結果

Sample to Insight

43

QCレポート 再作成による比較
エクササイズ•

トリミング後のデータでレポートを作成してみましょう！

BeforeAfter

Sample to Insight44

アダプタートリミング：アダプターの指定
File > New > Trim Adapter List

• Name:アダプターの名前• Sequcence: アダプターの配列• Strand• アダプターが見つかった場合のアクションの指定• Alignment scores costs: ミス
マッチとギャップに対するペナ
ルティのコスト• Match thresholds: internal または end のマッチに対する
criteria
Sample to Insight4545

マッピングSample to Insight46

マッピング原理
2つのステップ
1. ローカルアライメント
参照配列と似ている場所を探す

2. フィルタリング
どの程度参照配列と一致しているリードをその後の解析に残すか

Sample to Insight47

マッピング原理
マッピング原理
スコアリング
最適なマップ場所をLocal Alignmentで探索
Match = 1, Mismatch cost = 2

リード配列（20bp）が全て一致した場合

CGTATCAATCGATTACGCTATGAATG||||||||||||||||||||ATCAATCGATTACGCTATGA

アライメントスコア = 20

Sample to Insight48

マッピング原理
マッピング原理
スコアリングCGTATCAATCGATTACGCTATGAATG|||||||||||||||||||TTCAATCGATTACGCTATGACGTATCAATCGATTACGCTATGAATG|||||| ||||||||||||TTCAATCAATTACGCTATGACGTATCAATCGATTACGCTATGAATG|||||| ||| |||||||TTCAATCAATTGCGCTATGC

アライメントスコア = 19

アライメントスコア = 16

アライメントスコア = 10

Sample to Insight49

マッピング原理
フィルタリング
最も高いアライメントスコアにマップされたリードのうち、どの程度参照配列と類似している
リードをその後の解析に残すのかを決定します。

Sample to Insight50

マッピング原理
Linear gap とAffine gap
Linear gap cost の場合（Deletionコストが３の場合）

A

GenomeAATTCGCGCGGCATTCGCGCC
AAATCG----GCATTCGCGCC

Read

50 match
B

50 + 6 + 4 x (-3) + 11 = 55
AATTCGCGCGGCATTCGCGCC
AAATCG----GCATTCGCGCC
50 + 6 = 56

Affine Gap costを使った場合 （Gap open = 6, Gap extend = 1）C

AATTCGCGCGGCATTCGCGCC
AAATCG----GCATTCGCGCC
50 + 6 + (-6) + 4 x (-1) + 11 = 57

これまでのマッピングでは、Aのように本来マッピングすべきような場合でも、リードの末端部分をア
ライメントしない（Bのブルーの箇所）場合のほうが、アライメントスコアが高くなるため、大きな挿入や欠失がうまくマップできていないことがありました。アフィンGapコストの場合、このような問題を防ぐことができます。またGapを開くときのコスト（Open）と延長するときのコスト（Extend）が別に設定できることで、より細かくコントロールが可能になる場合があります。
Sample to Insight51

マッピング原理
フィルタリング原理
Length FractionとSimilarity パラメータを使って、どの程度アライメントされたリードを、マッピングされたものとして保持するか、決定します。
Length Fraction とSimilarity は２つのパラメータの組み合わせで使用されます。
Length fraction: フィルターをかける際に、考慮する長さ
Similarity: Length Fraction で指定した長さのうち、どの程度類似しているものを残すか。
リード長：100 bp

デフォルトのLength Fraction, 0.5
100 bp x 0.5 = 50 bp,
デフォルトのSimilarity 0.8 50bp x 0.8 = 40
50塩基中40塩基が完全一致していることがフィルタリングの条件となる
Reference

Sample to Insight52

マッピング原理
２つのパラメータを使う理由
Reference– リードの一部は似ているけれども、大きな挿入や、欠失によりリードの一部が参照配列と一致しない可能性がある場合– トリミングが完全にできなかったクオリティの低い配列が末端部にある場合（Length Fraction を小さくすることで、リードの一部に限定してアライメントの類似度を設定できる）

Reference– 参照配列とほぼ一致するが、所々、１塩基の変異があると想定される場合

Sample to Insight53

マッピング• Navigation Areaから使用するデータを選択。
• Toolboxから NGS Core Tools > Map Reads to Reference を選択、ダブルク
リック。
• ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。
Sample to Insight54

マッピング• Reference:使用する参照配列を選択。
• Reference masking
Exclude annotated：あるアノテーションを除外したい場合。
Include annotated only: あるアノテー
ションのみ含みたい場合。

• Referenceに使用するデータを選択。

Sample to Insight55

Mapping parameters: Linear Gap cost

Mismatch の penalty
Insertion/deletion のpenalty (Linear)

Filter の parameter

Sample to Insight56

Mapping parameters: Affine gap cost

Insertion/deletion のpenalty (Affine)Insertion, Deletion 開始時点でカウントされるコスト（Insertion/Deletion open cost）とInsertion, Deletionが1塩基長くなる際に増えるコスト（Insertion/Deletion extended cost）
Sample to Insight57

マッピング

•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

•
•

•

Mismatch cost：アライメントにマッチしないものがあった
場合のコストInsertion cost：アライメントに挿入がある場合のコスト
Deletion cost:アライメントに欠失がある場合のコスト
Insertion open cost: 挿入を開始する場合のコスト
Insertion extend cost: 挿入を延長する場合のコスト
Deletion open cost: 欠失を開始する場合のコスト
Deletion extend cost: 欠失を延長する場合のコスト
Length fraction：リードの長さのどの程度がマッピングされているべきか。
Similarity :どの程度類似しているべきか。
Global alignment:
Global alignment を行うかどうか。チェックが外れている場
合はLocal alignmentを実行。
Color space alignment:カラースペースのデータかどうか、その場合にカラーによるエラー補正を行うかどうか。
Auto-detect paired distances: 自動でペアの距離を決めるかどうか。
Non-specific match handling：同一スコアでマップされる箇所がある場合の対処。

Sample to Insight58

マッピング••••Create reads track: 結果をトラックとして作成する場合。
Create stand-alone read mappings：結果をstand-aloneフォーマット（参照配列、リードマッピング、アノテーショ
ンが一つになったファイル）で作成するか。
Create report:マッピング結果のレポー
ト作成。
Collect un-mapped reads:マップされなかったリードをリストとして作成するかどうか（リスト化することにより、De Novoなど、別の解析へ利用可能）

Sample to Insight59

マッピング：結果
結果のトラック

トラック

選択ツール
拡大ツール
スライドズーム
縮小して全体表示ボタン
Tool バーSample to Insight60

マッピング：結果• 背景に色が付いている箇所は、参照配列と異なる箇所です。

• 緑色のリードは、センス鎖にマップされたリード、赤色のリードはアンチセンス鎖へマップされた
リードになります。青色のリード
は、ペアとして認識されている
リードです。

• 色がうすくなっている箇所
はマッピングされていません⇒カバレッジの計算にも考慮されていません。

Sample to Insight61

マッピング：レポート
基本の Report は「Summary Report」という名前で保存されています。

Sample to Insight62

マッピング：Track list の作成
参照配列の追加
リードマッピングの結果に参照配列を追加しましょう。

Sample to Insight63

マッピング：Track list の作成•••

マッピングに使用したゲノムを選択。
ゲノム（参照配列）のアイコンがのような場合、Track Tools >Convert to Track を使って、変換を行ってください。

•

追加されたゲノムトラックと遺伝子トラック

ドラッグアンドドロップで簡単に位置を変更できます。

Sample to Insight64

Local Realignment

Sample to Insight65

Local Realignment
原理
マッピングのプロセスでは、各リードがもっとも高いアライメントスコア（参照配列との一致度を示すスコア）を示す場所にマッピングをしています。しかしながら、時には近傍のリードのマッピングの状況から、最も高いアライメントスコアではなくとも、もっともらしいマッピ
ング結果が考えられる場合があります。

たとえば上記例では、GCCGは左横にずれることで、他のリードのマッピングとも一致し
もっともらしいマッピングになると考えられます。マッピングの段階では、各々のリードのア
ライメントスコアのみを考えているため、このような状況が発生します。
さらにこの状況で変異やInsertion、Deletionの検出を行うと、正しく検出できないものも発生します。特にInsertionやDeletionが影響をうけると考えられています。
Sample to Insight66

Local Realignment
原理•

Local Realignment では、このような状況を修正するため、マッピングを部分的にやり直します。この際、通常のマッピングの段階とは異なり、他のリードのマッピング状況を考慮す
るため、先ほどのマッピングは以下のように変化します。

•

先ほどのマッピングよりも、こちらの方がもっともらしい結果であることが直感的に分かります。

Sample to Insight67

Local Realignment•

Toolbox > NGS Core Tools >Local Realignment•

2種類のLocal Realignmentsがあります。さらにGuided にNo forceとForceの2種類があります。
– Non guided– Guided• No force• Force

Sample to Insight68Local Realignment
Guided Local Realignment

ガイドとなるような変異（InsertionやDeletion）の情報をあらかじめ与えておくことで、その領域のInsertion、Deletionを考慮してリアライメントを行う。
• ガイドとなる変異情報がない場合、Local Realignment では、少なくとも1本のリードがInsertionやDeletionを支持している必要がある。このような場合、ガイドとなる変異情報を与えることで、InsertionやDeletion を効率的に検出できるようになる。
••

Guided Local Realignment が有効な例

Sample to Insight69

Local Realignment 実行方法

• Navigation Areaから使用するマッピングデータを選択。
• Toolboxから NGS Core Tools > Local Realignment を選択、ダブルクリック。
• ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。
Sample to Insight70

Local Realignment 実行方法•

Realign unaligned ends: マッピングの際にマップされなかった末端（soft clipping）
をLocal Realignment の際に利用するかどうか。アダプターの一部のようなものが残っていない限り、ここはチェックを入れる。

•

Guidance-variant settings：ガイダンスあり、なしの設定
Guidance-variant track: ガイダンスに使用するトラックを選択。
Force realignment to guidance-variants:
ここにチェックを入れることで、より積極的にRealignmentを行える。

•

Sample to Insight71

Local Realignment 実行方法•

Output options アウトプットの選択
Create reads track: トラックフォーマットでの作成。
Create stand-alone read mappings: スタン
ドアロンフォーマットでの作成。
Output track of realigned regions:
Realignmentされた個所をトラックとして保存するかどうか。確認に便利。

•

Result handling
Open: 実行後すぐに開く。
Save: 実行後一旦保存。

•

Log handling
Make log: ログを作成するかどうか。

Sample to Insight72

Local Realignment：結果•

結果はマッピングのファイルとして作成され、名前の最後に locally realigned として作成されます。
– スタンドアロンフォーマットで作成した場合– トラックフォーマットで作成した場合•

この後、通常と同じ方法で変異やInsertion, Deletion の検出を行います。

Sample to Insight

73

変異検出

Sample to Insight74

SNV検出3種類の variant detection tools
Basic Variant Detection ：クオリティと、バリアントの見られる頻度からバリアントのサイト
を検出(version 7.5以前のQuality-Based Variant Detection)
Fixed Ploidy Variant Detection：確率モデルを使い、バリアントのサイトを検出(version 7.5以前のProbabilistic Variant Detection)
Low Frequency Variant Detection：低頻度で見られるバリアントの検出ツール。倍数性を指定しないでバリアントの検出が行える。
使い分け：
バリアントの見られる頻度が、その領域において15％以下のような場合は、Basic Variant
Detection, それよりも多い場合は、Fixed Ploidy Variant Detection をご利用ください。バリアントの見られる頻度が低い場合や、倍数性を指定できない場合などは、Low Frequency Variant
Detection をご利用ください。

Sample to Insight75

フィルター：General Filter
共通フィルター

Reference masking
Ignore positions with coverage above：カバレッジが指定した数字以上のバリアントについてリストに含めないRestrict calling to target regions：バリアントを検出したい領域の指定（アノテーショントラックで指定）
Read filters• Ignore broken pairs：ペアエンドのリードでペアと認識されなかったリードをバリアント検出の計算に含めるかどうか• Ignore non-specific matches：「Reads」を選択す
ると、non-specificなマッチのリードを計算に含めなくなり、「Regions」を選択すると、1本でもnon-specificなリードが含まれる場合、その領域のバリアントを検出しません。
• Minimum read length：Ignore broken pairとIgnore
non-specific regions が指定された場合、このフィルターの対象となる最小のリードの長さの設定が必要です。これは非常に短いリードは、その短さからnon-specificになる可能性があるためです。

Sample to Insight76フィルター：General Filter
共通フィルター

Coverage and count filters• Minimum coverage：最小カバレッジ• Minimum count：バリアントを支持するリードの最低
カウント数• Minimum frequency (%)：最小頻度

Sample to Insight77フィルター：Noise Filters
共通フィルター•

Quality filter
Base quality filter:塩基のクオリティに関するフィルター
Neighborhood radius：クオリティフィルターの対象とする横方向の塩基数（奇数）Minimum central quality：縦方向の数（リード数）
Minimum neighborhood quality：Neighborhood
radiusで指定した範囲の最低クオリティ（Phredscore）

78
Sample to Insight78フィルター：Noise Filters
共通フィルター•

Direction and position filters：リードの方向（ForwardとReverse）とポジションを使ったフィルター
Read direction filter：どちらか一方の方向のリードが多数見られる場合にそれを排除（ただし、アンプリ
コンには適していません）。
Relative read direction filter：リードの方向が一方のみに偏りすぎていないか、全体のForwardとReverseのバランスを見て統計検定を行う。Significanceで閾値を入力。
Read position filter：システマティックなエラーを取り除くために用いるツールでハイブリダイゼーションを行った場合のデータに有効。リードを5つのセグ
メントに分割し、バリアントの見られるポジションの５つのセグメントに分割されたリードの分布が全体のそれと似ているかどうか検定を行う。
Significanceで閾値を入力。＊詳細は後述
79

Sample to Insight79フィルター：Noise Filters
共通フィルター•Technology specific filters
Remove pyro-error variants：ホモポリマー領域
に対するエラーの除去
In homopolymer regions with minimum
length：指定した長さのホモポリマー領域のInDelを取り除く。
With frequency below：指定した頻度以下のものについてのみフィルターを適用。

80
Sample to Insight80Base quality filter
フィルター例•

Base quality filter 適用例：マッピングしたリードをクオリティで表示。
クオリティの低いリードがマップされている箇所がバリアントのリストからはずされます。

Sample to Insight81

Read direction
フィルター例•

Read direction filter 適用例：リードの色は緑（Forward）、赤（Reverse）、黄色（nonspecific）を示しており、緑のリードが大部分のバリアントをサポートしていることがわかる。こういったアンバランスな箇所で検出されたバリアントが取り除かれる。

Sample to Insight82

Read position filter
原理•

もしリードが理想的な均一なカバレッジであれば、検出されるバリアントをサポートする塩基のリード
中の位置は、さまざまになるはずです。

•

これを使い、リードをForward、Reverseの向きを考慮して、それぞれ5分割、計10個の領域に分断し、変異が見つかった箇所がリードのどの領域に属するか、それらの分布が全体と大きく差がないかを検定していますSample to Insight83

Read position filter
フィルター例•

Read position filter 適用例：バリアン
トをサポートしているリードがリードの同じ位置で検出されているため、このバリアントはRead position filter により除去されます。

Sample to Insight84Basic Variant Detection

変異検出ツールでは、フィルターの条件をクリアした場合に variant をコールしますSample to Insight85Basic Variant Detection•••

Navigation Areaからマッピングデータを選択。
Toolboxから Resequencing Analysis > Variant Detectors > Basic
Variant Detection を選択、ダブルクリック。
ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。

Sample to Insight86Basic Variant Detection•

Ploidy: 参照配列の倍数性

Sample to Insight87Basic Variant Detection

Reference masking• Ignore positions with coverage above：
カバレッジが指定した数字以上のバリ
アントについてリストに含めない• Restrict calling to target regions：バリ
アントを検出したい領域の指定（アノテーショントラックで指定）

Sample to Insight88Basic Variant Detection

Read filters• Ignore broken pairs：ペアエンドのリードでペアと認識されなかったリードをバリアント検出の計算に含めるかどうか• Ignore non-specific matches：「Reads」を選択すると、non-specificなマッチのリードを計算に含めなくな
り、「Regions」を選択すると、1本でもnon-specificなリードが含まれる場
合、その領域のバリアントを検出しません。
• Minimum read length：Ignore broken
pairとIgnore non-specific regions が指定された場合、このフィルターの対象となる最小のリードの長さの設定が必要です。これは非常に短いリードは、
その短さからnon-specificになる可能性があるためです。
Sample to Insight89Basic Variant Detection

Coverage and count filters
Minimum coverage：最小カバレッジ
Minimum count：バリアントを支持する
リードの最低カウント数
Minimum frequency (%)：最小頻度

Sample to Insight90

Basic Variant Detection

Quality filter• Base quality filter:塩基のクオリティに関するフィルター• Neighborhood radius：クオリティ
フィルターの対象とする横方向の塩基数（奇数）• Minimum central quality：縦方向の数（リード数）• Minimum neighborhood quality：
Neighborhood radiusで指定した範囲の最低クオリティ（Phredscore）

Sample to Insight91
91

Basic Variant Detection

Direction and position filters：• Read direction filter：どちらか一方の方向のリードが多数見られる場合にそれを排除（ただし、アンプリコンには適していません）。
• Relative read direction filter：リードの方向が一方のみに偏りすぎていないか、全体のForwardとReverseのバランスを見て統計検定を行う。Significanceで閾値を入力。
• Read position filter：システマティック
なエラーを取り除くために用いるツー
ルでハイブリダイゼーションを行った
場合のデータに有効。リードを5つのセグメントに分割し、バリアントの見られるポジションの５つのセグメントに分割されたリードの分布が全体のそれと似ているかどうか検定を行う。
Significanceで閾値を入力。

Sample to Insight92
92

Basic Variant Detection

Technology specific filters• Remove pyro-error variants：ホモポリ
マー領域に対するエラーの除去• In homopolymer regions withminimum length：指定した長さのホモポリマー領域のInDelを取り除く。
• With frequency below：指定した頻度以下のものについてのみフィ
ルターを適用。

Sample to Insight93
93

Basic Variant Detection••

Create track: トラックの作成
Create annotated table: アノテーション付のテーブルの作成

Sample to Insight94Basic Variant Detection
結果•

結果はデフォルトではトラックフォーマットになっています。

•

左下のテーブルアイコンをクリックするとテーブルに代わります。

Sample to Insight95

Basic Variant Detection：結果

•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

•
•

Count: クオリティのフィルターをパスしたリードの数
Coverage: クオリティのフィルターをパスしたリードの数
Frequency: バリアントが見られた頻度
Probability: バリアントのアレルの事後確率（そのアレルが尤もであるとする確率。高い方がより確度が高いという事。）
Forward reads: その領域に見られたForwardリードの数
Reverse reads:その領域に見られたReverseリードの数
Forward/reverse: Forward/Total reads または Reverse/Total reads のうち小さい方の値。ForwardとReverseが同じなら、0.5となる。
Average quality: 該当する領域の平均リードクオリティ。
# unique start positions:バリアントコールに使われたリードのうちスタートポ
ジションにあるリードの数# unique end positions:バリアントコールに使われたリードのうち最後の箇所にあるリードの数
BaseQRankSum:クオリティスコアについて、参照配列と同じアレルとバア
リアントのアレルについてマンホイットニーU検定を行い計算されたZスコア。これが高いほど参照配列の塩基とバリアントの塩基に差がある。
Hyper-alleic：想定されるアレルよりも頻度が高いかどうか
Homopolymer：ホモポリマー領域かどうか

Sample to Insight96Basic Variant Detection
トラックリストの作成

Sample to Insight97

Basic Variant Detection
トラックリスト作成•••

Navigation Areaからマッピングデータとバリアントの結果を選択。
Toolboxから ResequTrack Tools > Create Track List を選択、ダブルクリック。
ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。

Sample to Insight98Basic Variant Detection
トラックリストの作成•

バリアントのトラックの名前のところでダブルクリック•

テーブルが現れます。テーブルの行と、マッピングのビューアは対応しているので、テーブルで指定したポジ
ションに自動的にビューアが移動します。

Sample to Insight99

Fixed Ploidy Variant Detection
Probabilistic Variant Detection•

確率モデル（Bayes model）を使ったバリアント検出
Reference

A

?
A
A
T
T
C

? : Site type (ex) A/A, A/T, A/C... ?

与えられるリードから、そのポジションのSite Typeを推定
Reference と推定したSite typeが異なる場合、バリアントとして結果返す。

Sample to Insight100

Fixed Ploidy Variant Detection

P(A)
A

P(B
B
)

P(A∩B)A∩B

P ( A  B ) = P ( B | A) P ( A)
P( A  B ) = P( A | B ) P( B )P ( B | A) P ( A) = P ( A | B ) P( B )ベイズの定理

事後確率
Posterior

P ( B | A) =P( A | B ) P( B )
P( A)

事前確率
Prior
尤度
Likelihood

Sample to Insight101

Fixed Ploidy Variant Detection

Reference

A

?
A
A
T
T
C

? : Site type (ex) A/A, A/T, A/C... ?

S : Site type
R : Reads

P( R | S ) P( S )P( S | R ) =P( R )
P( R | S )P( S ): Error Modelを使って推定: Genome Modelを使って推定Sample to Insight102

Fixed Ploidy Variant Detection
Genome Model

Reference がAのとき、Readの大部分はAになると仮定し、初期の確率を以下のように設定し、EMアルゴリズムを使ってそれぞれの確率を推定する。
EMアルゴリズム（Expectation Maximization algorithm）は、得られたデータから推定したい現象が観察できない場合に、その確率を推定する、一般的な統計の手法。
Site Type
A/A
A/C
A/G
A/T
T/C
T/G
T/T
G/C
C/C
G/G
G/A/C/T/-

Initial Probability
0.2475
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
0.24750.001
0.24750.2475
0.001
0.001
0.001
0.001

Sample to Insight103

Fixed Ploidy Variant Detection
Error Model– リードに含まれるエラーを考慮するため、尤度のところにエラーを考慮した確率を推定する。初期値を以下のように設定し、EMアルゴリズムにて確率を推定する。

Reference

A

C

G

T

-

A

0.90

0.025

0.025

0.025

0.025

C

0.025

0.90

0.025

0.025

0.025

G

0.025

0.025

0.90

0.025

0.025

T

0.025

0.025

0.025

0.90

0.025

-

0.025

0.025

0.025

0.025

0.90

Reads

Sample to Insight104

Fixed Ploidy Variant Detection•••

Navigation Areaからマッピングデータを選択。
Toolboxから Resequencing Analysis > Variant Detectors > Fixed Ploidy
Variant Detection を選択、ダブルクリック。
ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。

Sample to Insight105

Fixed Ploidy Variant Detection

Ploidy：参照配列の倍数性• Required variant probability：バリアン
トが参照配列と異なる確率（想定で入力）。この値を低くすると、検出されるバリアントが多くなります。

Sample to Insight106

Fixed Ploidy Variant Detection

Reference masking• Ignore positions with coverage above：
カバレッジが指定した数字以上のバリ
アントについてリストに含めない• Restrict calling to target regions：バリ
アントを検出したい領域の指定（アノテーショントラックで指定）

Sample to Insight107

Fixed Ploidy Variant Detection

Read filters• Ignore broken pairs：ペアエンドのリードでペアと認識されなかったリードをバリアント検出の計算に含めるかどうか• Ignore non-specific matches：「Reads」を選択すると、non-specificなマッチのリードを計算に含めなくな
り、「Regions」を選択すると、1本でもnon-specificなリードが含まれる場
合、その領域のバリアントを検出しません。
• Minimum read length：Ignore broken
pairとIgnore non-specific regions が指定された場合、このフィルターの対象となる最小のリードの長さの設定が必要です。これは非常に短いリードは、
その短さからnon-specificになる可能性があるためです。
Sample to Insight108

Fixed Ploidy Variant Detection

Coverage and count filters
Minimum coverage：最小カバレッジ
Minimum count：バリアントを支持する
リードの最低カウント数
Minimum frequency (%)：最小頻度

Sample to Insight109

Fixed Ploidy Variant Detection

Quality filter• Base quality filter:塩基のクオリティに関するフィルター• Neighborhood radius：クオリティ
フィルターの対象とする横方向の塩基数（奇数）• Minimum central quality：縦方向の数（リード数）• Minimum neighborhood quality：
Neighborhood radiusで指定した範囲の最低クオリティ（Phredscore）

Sample to Insight

110
110

Fixed Ploidy Variant Detection

Direction and position filters：• Read direction filter：どちらか一方の方向のリードが多数見られる場合にそれを排除（ただし、アンプリコンには適していません）。
• Relative read direction filter：リードの方向が一方のみに偏りすぎていないか、全体のForwardとReverseのバランスを見て統計検定を行う。Significanceで閾値を入力。
• Read position filter：システマティック
なエラーを取り除くために用いるツー
ルでハイブリダイゼーションを行った
場合のデータに有効。リードを5つのセグメントに分割し、バリアントの見られるポジションの５つのセグメントに分割されたリードの分布が全体のそれと似ているかどうか検定を行う。
Significanceで閾値を入力。

Sample to Insight

111
111

Fixed Ploidy Variant Detection

Technology specific filters• Remove pyro-error variants：ホモポリ
マー領域に対するエラーの除去• In homopolymer regions withminimum length：指定した長さのホモポリマー領域のInDelを取り除く。
• With frequency below：指定した頻度以下のものについてのみフィ
ルターを適用。

Sample to Insight112

Fixed Ploidy Variant Detection••

Create track: トラックの作成
Create annotated table: アノテーション付のテーブルの作成

Sample to Insight113

Fixed Ploidy Variant Detection：ビューの見方

Sample to Insight114

Fixed Ploidy Variant Detection：結果

•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

•
•

Count: クオリティのフィルターをパスしたリードの数
Coverage: クオリティのフィルターをパスしたリードの数
Frequency: バリアントが見られた頻度
Probability: バリアントのアレルの事後確率（そのアレルが尤もであるとする確率。高い方がより確度が高いという事。）
Forward reads: その領域に見られたForwardリードの数
Reverse reads:その領域に見られたReverseリードの数
Forward/reverse: Forward/Total reads または Reverse/Total reads のうち小さい方の値。ForwardとReverseが同じなら、0.5となる。
Average quality: 該当する領域の平均リードクオリティ。
# unique start positions:バリアントコールに使われたリードのうちスタートポ
ジションにあるリードの数# unique end positions:バリアントコールに使われたリードのうち最後の箇所にあるリードの数
BaseQRankSum:クオリティスコアについて、参照配列と同じアレルとバア
リアントのアレルについてマンホイットニーU検定を行い計算されたZスコア。これが高いほど参照配列の塩基とバリアントの塩基に差がある。
Hyper-alleic：想定されるアレルよりも頻度が高いかどうか
Homopolymer：ホモポリマー領域かどうか

Sample to Insight115

Low Frequency Variant Detection• Low frequency Variant Detection では、倍数性を仮定せず、対象となる領域が、シーケンスエラーなのか、そうではない（=バリアント）なのかを検定しています。
• Error モデルについては、Fixed Ploidy Variant Detection にて採用したエラーモデルを使い、計算し、尤度比検定を行っています。

Sample to Insight116

Low Frequency Variant Detection•••

Navigation Areaからマッピングデータを選択。
Toolboxから Resequencing Analysis > Variant Detectors > Low
Frequency Variant Detection を選択、ダブルクリック。
ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。

Sample to Insight117

Low Frequency Variant Detection•

Required significance :シーケンスエラーかどうか、検定の際の閾値

Sample to Insight118

Low Frequency Variant Detection

Reference masking• Ignore positions with coverage above：
カバレッジが指定した数字以上のバリ
アントについてリストに含めない• Restrict calling to target regions：バリ
アントを検出したい領域の指定（アノテーショントラックで指定）

Sample to Insight119Low Frequency Variant Detection

Read filters• Ignore broken pairs：ペアエンドのリードでペアと認識されなかったリードをバリアント検出の計算に含めるかどうか• Ignore non-specific matches：「Reads」を選択すると、non-specificなマッチのリードを計算に含めなくな
り、「Regions」を選択すると、1本でもnon-specificなリードが含まれる場
合、その領域のバリアントを検出しません。
• Minimum read length：Ignore broken
pairとIgnore non-specific regions が指定された場合、このフィルターの対象となる最小のリードの長さの設定が必要です。これは非常に短いリードは、
その短さからnon-specificになる可能性があるためです。
Sample to Insight120

Low Frequency Variant Detection

Coverage and count filters
Minimum coverage：最小カバレッジ
Minimum count：バリアントを支持する
リードの最低カウント数
Minimum frequency (%)：最小頻度

Sample to Insight121

Low Frequency Variant Detection

Quality filter• Base quality filter:塩基のクオリティに関するフィルター• Neighborhood radius：クオリティ
フィルターの対象とする横方向の塩基数（奇数）• Minimum central quality：縦方向の数（リード数）• Minimum neighborhood quality：
Neighborhood radiusで指定した範囲の最低クオリティ（Phredscore）

Sample to Insight

122
122

Low Frequency Variant Detection

Direction and position filters：• Read direction filter：どちらか一方の方向のリードが多数見られる場合にそれを排除（ただし、アンプリコンには適していません）。
• Relative read direction filter：リードの方向が一方のみに偏りすぎていないか、全体のForwardとReverseのバランスを見て統計検定を行う。Significanceで閾値を入力。
• Read position filter：システマティック
なエラーを取り除くために用いるツー
ルでハイブリダイゼーションを行った
場合のデータに有効。リードを5つのセグメントに分割し、バリアントの見られるポジションの５つのセグメントに分割されたリードの分布が全体のそれと似ているかどうか検定を行う。
Significanceで閾値を入力。

Sample to Insight

123
123

Low Frequency Variant Detection

Technology specific filters• Remove pyro-error variants：ホモポリ
マー領域に対するエラーの除去• In homopolymer regions withminimum length：指定した長さのホモポリマー領域のInDelを取り除く。
• With frequency below：指定した頻度以下のものについてのみフィ
ルターを適用。

Sample to Insight

124
124

Low Frequency Variant Detection••

Create track: トラックの作成
Create annotated table: アノテーション付のテーブルの作成

Sample to Insight125

Low Frequency Variant Detection：結果

•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

•
•

Count: クオリティのフィルターをパスしたリードの数
Coverage: クオリティのフィルターをパスしたリードの数
Frequency: バリアントが見られた頻度
Probability: バリアントのアレルの事後確率（そのアレルが尤もであるとする確率。高い方がより確度が高いという事。）
Forward reads: その領域に見られたForwardリードの数
Reverse reads:その領域に見られたReverseリードの数
Forward/reverse: Forward/Total reads または Reverse/Total reads のうち小さい方の値。ForwardとReverseが同じなら、0.5となる。
Average quality: 該当する領域の平均リードクオリティ。
# unique start positions:バリアントコールに使われたリードのうちスタートポ
ジションにあるリードの数# unique end positions:バリアントコールに使われたリードのうち最後の箇所にあるリードの数
BaseQRankSum:クオリティスコアについて、参照配列と同じアレルとバア
リアントのアレルについてマンホイットニーU検定を行い計算されたZスコア。
これが高いほど参照配列の塩基とバリアントの塩基に差がある。
Hyper-alleic：想定されるアレルよりも頻度が高いかどうか
Homopolymer：ホモポリマー領域かどうか

Sample to Insight126挿入、欠失と構造変異解析

Sample to Insight127

InDels and Structural Variants••

Quality Based Variant Detection やProbabilistic Variant Detection では変異やInDelを検出できました。
しかしながら大きなInDelの検出や構造変異については、上記ツールでの検出は難しい場合があります。

＜••••

アルゴリズムにとっては、大きなInsertionやDeletionを受け入れるよりは、Unaligned endとするほうがスコアを大きくできるからです。
InDel and Structural Variants ツールでは、このUnaligned end に着目して、大きなInDelや構造変異を見つけます。
Unaligned end が別の領域に十分な量マップすることができれば、そこまでの距離のInsertionやDeletion、構造変異と考えられます。
注意：このツールでは、同一染色体内の構造変異のみが検出可能です。

Sample to Insight128

InDels and Structural Variants•••

Navigation Areaからマップするデータを選択。
Toolboxから InDels and Structural Variantsを選択、ダブルクリック。
ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。

Sample to Insight129

InDels and Structural Variants

•

•

•

P-value threshold: 得られた coverage 数において、生じたunaligned end の数が得られる
確率がこの p-valueより少ない場合、breakpoint を生成する。
Maximum number of mismatches: align された部分の mismatch がこの数以下のもののみカウントする。
Filter variants: ここで指定した数より少ないリードにしかサポートされていない breakpoint は除く。

Sample to Insight130

InDels and Structural Variants•

Output について設定する。

Sample to Insight131InDels and Structural Variants

Sample to Insight132

リシーケンシング解析：その他の機能

•

•
•
•

•

•

Annotate from Known Variants : known
variants とオーバーラップする variants にアノテーション付けする
Filter against Known variants : known
variants と比較してフィルタリングする
Annotate with Exon Numbers : exon の番号をアノテーションに追加する
Annotate with Flanking Sequences :reference の隣接する塩基とともにアノテーション付けする
Filter Marginal Variant Calls : Variant
frequency, Forward/reverse balance,
Average base quality などの条件でフィルタリングする
Filter Reference Variants : reference allele
variants をフィルタリングする

Sample to Insight133リシーケンシング解析：その他の機能

•

•

•

•

•

Compare Sample Variant Tracks: 2つのvariant track を比較して、共通する、または、異なる variant を出力する (Ver6.5で追加)。
Compare Variants within Group : グループの中で common variants を検索する。
Frequency を % で指定できる。
Fisher Exact Test : Case-control study で、case に有意に存在する variants を検出する。
Trio Analysis : 子供と両親のデータを用いてtrio 解析を行う。Variants が親に由来するのか、de novo なのかをレポートする。
Filter against Control Reads : Control に存在する variant をフィルタリングする。

Sample to Insight134リシーケンシング解析：その他の機能

•

•
•

•

GO Enrichment Analysis : 検出された variantsが含まれる遺伝子にどのような Gene Ontologyと関連するものが多いのかを解析する。
Amino Acid Changes : variants に、アミノ酸置換に関するアノテーション付けを行う。
Annotate with Conservation Score : 異なる種におけるアミノ酸の保存の程度に関する情報をア
ノテーション付けする。保存の度合いが高いほど、機能的に重要であると期待される。
Predict Splice Site Effect : variants の splicesite に対する影響を予測する。

Sample to Insight135アミノ酸置換の解析

Sample to Insight136アミノ酸置換の解析••

Resequencing Analysis – Amino Acid Changes を選択
Variant データを選択

Sample to Insight137アミノ酸置換の解析•

CDS の track を選択•

mRNAのtrackを選択•

ゲノム配列のtrackを選択•

Filter synonymous: アミノ酸が変化する variant のみをアノテーション付けするときにチェックする
Filter CDS regions with no variants:
variantが無い領域をフィルターする
Genetic code: 解析しているゲノムで該当するものを選択する••

Sample to Insight138アミノ酸置換の解析
Variant Track

Sample to Insight139アミノ酸置換の解析•

アミノ酸置換に関する情報がテーブルに追加されました

Sample to Insight140アミノ酸置換の解析
Amino Acid Track

Sample to Insight141

変異のフィルタリング

Sample to Insight142既知の variants の filter：Filter against Known Variants•••

Navigation Areaから変異トラック(アミノ酸置換を調べたもの)を選択。
Toolboxから Resequencing Analysis > Annotate and Filter Variants > Filter
against Known Variants を選択、ダブルクリック。
ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。

Sample to Insight143既知の variants の filter：Filter against Known Variants•••

Known variants track:比較したい変異トラックを選択。
Auto join: 隣り合わせの変異について、フィルターをかける
際に一つの変異として扱うかどうか。
Filter Option
Matchを残す：アレルまで完全に一致しているものを残す。
Overlapを残す：オーバーラップがあるものを残す。
Not matchを残す：完全に一致しなかったものを残す。

•

SNPのトラックを選択。

Sample to Insight144

既知の variants の filter：Filter against Known Variants

Sample to Insight145既知の variants の filter：Filter against Known Variants
トラックで表示

•
•

dbSNP

共通しなかったもの

Sample to Insight146

遺伝子のアノテーション

Sample to Insight147

アノテーション付け：Annotate with Overlap Information•••

Navigation Areaから変異トラック(フィルタリングしたもの)を選択。
Toolboxから Track tools > Annotate and Filter > Annotate with Overlap
Information を選択、ダブルクリック。
ウィザードが起動し、選択したデータが選ばれていることを確認。

Sample to Insight148

アノテーション付け：Annotate with Overlap Information•

Gene の track を選択。

Sample to Insight149

アノテーション付け：Annotate with Overlap Information

Sample to Insight150

３D構造解析

Sample to Insight151

3D構造解析：Link variants to 3D Protein Structure

Download 3D Protin Structure Database:
Resequencing Analysis > Functional Consequencesの中に含まれるこのツールでは、PDBに登録されているアミノ酸配列のデータベースをダウンロードします。この
後のLink Variant to 3D Protein Structure で必要となります。

Link Variants to 3D Protein Structure:
ダウンロードしたアミノ酸配列に対して、変異の検出か
らアミノ酸置換させた配列を使いBLAST検索をかけます。

Sample to Insight152

3D構造解析：Link variants to 3D Protein Structure

Sample to Insight153

3D構造解析：Link variants to 3D Protein Structure

Sample to Insight154お疲れ様でした。

Sample to Insight155