2024年8月30日版

残留農薬分析
動物用医薬品分析
カビ毒分析

STQ法ガイドブック2024
Solid Phase Extraction Technique with QuEChERS method

はじめに：アイスティサイエンスとSTQ法について
STQ法：Solid Phase Extraction Technique with QuEChERS method

アイスティサイエンスは残留農薬分析においてSTQ法を提案し、「簡単・速い・安い」だけではなく「高精製・自動化」と「安定分析の持続」をテーマとしています。

・STQ法は国内約100か所の導入実績（一部工程の採用も含む）
・提案開始より約10年の実績による安定運用
・STQ法ユーザーの内、半数が前処理装置をご導入され自動化を実現
・主な導入先：農水省、地方衛生研究所、保健所、登録検査機関、受託検査機関、

食品飲料メーカー、農業団体、生協、食品輸入商社、大学など
・当社およびユーザー様による学会発表や論文投稿多数
・ISO17025認定も複数あり
認定書試験法欄に「STQ」の文言記載実績も
・某技能試験で最も多い参加率の手法（次いで厚労省通知一斉試験法）
・AOACに論文掲載
・個別分析法への応用も提案

3

目次

1, STQ法の概要

・・・72, 試料の調製 予冷式ドライアイス凍結粉砕法

・・・9

3, 抽出

・・・13

【参考】一斉試験法(通知試験法)抽出手順例

4, 精製

・・・19

・・・29

1）概要

・・・30

2）全自動固相抽出装置による精製

・・・35（1）STQ-GC-B法(自動)・・・36（2）STQ-GC-B法の精製・・・38（3）STQ-LC法(自動)・・・46（4）STQ-LC法の精製・・・48

3）手動法による精製

・・・49（1）STQ-GC-B法(手動)・・・50（2）STQ-LC法(手動)・・・52

5, STQ法の応用例

・・・55

1）残留農薬（1）STQ-GC-B法アレンジ法
①大豆

・・・56

②アルコール飲料

・・・57③オリーブオイル・・・58④畜水産物(脂質の多い試料)

・・・59（2）個別分析法①グリホサート・グルホシネート

・・・60②ジチオカルバメート系農薬

・・・64③TPN・キャプタン・カプタホール・ホルペット・・・68④ネオニコチノイド

・・・70

4

目次
目次
2）動物用医薬品（1）一斉分析・・・74（2）マラカイトグリーン

・・・763）カビ毒 アフラトキシン

・・・784）その他 メラミン・・・805）【参考】STQ-GC‐A法・・・82

6, 異常回収率の原因と対策

・・・85

1）異常回収率・・・862）多段階添加回収試験

・・・87

3）精製後添加の異常回収率

・・・884）GC-MS測定におけるマトリックス効果

・・・90

5）抽出工程での損失

・・・946）精製工程での損失

・・・96

7, 補足資料-1 固相抽出の基礎

・・・97

1）固相カートリッジの基本的な使い方

・・・98

2）Smart-SPEの種類

・・・99

3）主な固相カートリッジの使い方

・・・100(1)無極性カラム C18

・・・100(2)イオン交換カラム・・・106(3)グラファイトカーボンカラム

・・・1168, 補足資料-2 GC-MSの検量線

・・・1191）検量線の作成方法

・・・1202）定量方法の種類

・・・1239, 製品紹介・・・1251）全自動固相抽出装置 ST-L400

・・・1262）GC用大量注入口装置 LVI-S250

・・・127

5

目次
目次
10,

製品カタログ・・・129

凍結粉砕キット・・・130

抽出操作

・・・131

全自動固相抽出装置

・・・132

STQ法 前処理キット

・・・132

精製操作

・・・133

固相カートリッジ・・・134

ガイドブック中の下記マークは弊社HPの掲載の有無を示しています。本ガイドブックと合わせてご活用ください。
試料ごとの豊富なアプリケーションノート
日本食品衛生学会・農薬残留分析研究会など学会で発表した資料
アイスティサイエンス独自の技術(登録なしでご覧いただけます)

凍結粉砕や抽出や精製などのポイントをビデオで説明※お断り■本ガイドブックで紹介する分析法は一例であり必ずしも分析結果を保証するものではありません。またSTQ法
は日々改良しており、予告なく変更する場合があります。予めご了承ください。
■本ガイドブックではわかりやすさ重視するため一部科学的でない表現や誇張した表現をしている場合がありますがご了承ください。

6

1, STQ法の概要

7

1,STQ法の概要

STQ法の概要

STQ法：Solid Phase Extraction Technique with QuEChERS method〇 STQ法は、操作性と高精製を両立した残留農薬分析法です。
残留農薬分析、特に多成分を一斉に対象とする場合は、操作性と精製のバランスが重要となります。例えば、簡便でも精製が不足していると測定装置の汚染や誤定量につながります。一方、精製に重きを置き過ぎると、煩雑さが増し時間も要することになります。STQ法は、抽出・精製・測定・解析のトータルバランスを考慮し設計されています。
抽出はQuEChERS法を参考とし、精製には固相カートリッジを使用しています。QuEChERS法は、欧州ではEN法、米国ではAOACに掲載されている国際的にも標準的な分析方法として広まっていますが、精製にバルク固相（粉状固相）で分散精製を行っているため、精製度の低さが心配との声が多く聞かれます。そこで、STQ法では操作性のよい
QuEChERS法の抽出法のみを参考とし、精製には固相カートリッジを採用しています。
また固相カートリッジは数十mgという少量充填のSmart-SPEを開発しました。その他の機能として、ストレート構造による通液・通気がスムーズで、簡単に連結可能な性能を持っています。
精製操作は、独自の試験管ラック（前処理キット）で操作性を追求した手動法と、全自動固相抽出装置（STL400）による自動法をご提案し、状況に応じてお選びいただけます。
STQ法のもう一つの特徴として、溶媒濃縮を行わないことによる省力化があります。ただ、これにより、測定装置の感度が必要となります。そこで、GC-MS測定においては、大量注入装置LVI-S250による高感度測定を提案しております。

QuEChERS抽出①試料細切、凍結粉砕②抽出、振とう塩析

STQ法前処理キット③遠心分離

全自動固相抽出装置

精製

ST-L400
測定
GC-MS＋大量注入
LC-MS/MS測定
8

LVI-S250

2, 試料の調製
予冷式ドライアイス凍結粉砕法

9２,予冷式ドライアイス凍結粉砕法
概要〇残留農薬分析は試料の均一性が重要です。
食品分析に共通する重要事項の一つに「試料の均一性」があげられます。残留農薬分析も例外ではありません。食品に残留している農薬が偏在または点在している場合、均一性の悪さは定量性の悪さに直結します。同じ試料を分取しても、分析のたびに定量値が異なると基準値判定が難しくなります。例えば、果実などを通常粉砕した場合、果皮と果汁が分離し均一な試料の分取が困難な場合があります。また農薬は物性により、残留しやすい部位が異なること
からも均一化が必要です。
近年分析装置の高感度化に伴い、分析試料の少量化が進んでおり試料均一化の重要性が増しています。そこで、ア
イスティサイエンスは「予冷式ドライアイス凍結粉砕法」を提案しています。この手法を用いることで、試料が粉末となり均一性が増します。その他にも低温粉砕により試料中の酵素活性を抑制できるというメリットがあります。酵
素は食品を切断した瞬間に断面で活性化し、夾雑成分を発生させたり農薬を分解するという分析への悪影響があります。夾雑成分の例として、ネギ類における硫黄化合物があげられます。

均一性が増すと、分析に用いる試料の減量も可能となり、分析のコンパクト化、省力化にもつながります。

凍結粉砕と凍結乾燥の違い■凍結粉砕：試料中の水分も含めて凍結→粉砕(低温脆性を利用)します。
急速冷凍

水分は残したまま

粉砕■凍結乾燥：試料を凍結しそこから減圧乾燥させます。
急速冷凍

水分昇華(真空乾燥)

粉砕

予冷式ドライアイス凍結粉砕のメリット■パウダー状にまで粉砕可能なため均一性が向上■すじや繊維質が多い試料もパウダー状に粉砕■パウダー状のため試料採取が容易■均一性に伴う分析のコンパクト化及び省力化■ドライアイスによるかさ増しで少量試料の粉砕も可能■水分と固形物が均一化された状態のため、秤量誤差が低減■凍結により酵素活性を抑制し、夾雑成分の増加を抑えることにより、キャプタン、クロロタロニルなどの農薬の分解を抑制【凍結粉砕による酵素の活性抑制】①①

常温粉砕に比べドライアイス凍結粉砕の方が妨害ピーク（特に硫黄化合物）
が小さく、バックグラウンドも抑えら②

れる傾向があります。
硫黄化合物

②
常温粉砕

PEG

PEG

PEG

PEG

PEG

PEG※
凍結粉砕

※PEG：ポリエチレングリコール
疑似マトリックス(p.92参照)

タマネギを常温粉砕または凍結粉砕しSTQ法にて分析した時のそれぞれのクロマトグラム（TIC）
10

２,予冷式ドライアイス凍結粉砕法【粉砕試料の冷凍保管】
常温粉砕した試料を冷凍保管した場合、試料全体が塊となって凍結されます。再分析するときは解凍してから秤量しますがその際試料の水分と固形物が分離してしまい秤量誤差が懸念されます。
一方凍結粉砕の場合は凍結粉末状のまま冷凍保管することができるので再分析する際も試料が均一化された状態で秤量することができます。

粉砕例【ブドウの常温粉砕と凍結粉砕の比較】
常温粉砕では果皮と果肉の硬さが異なるので果皮が細かく粉

凍結粉砕

常温粉砕

砕できません。一方凍結粉砕では果皮もパウダー状に粉砕されるため試料が均一になります。

常温粉砕

凍結粉砕

ブドウ果皮の粉砕方法の比較
常温粉砕では大きな果皮が残っていますが、凍結粉
砕では細かく粉砕されています。

【その他の試料】
凍結粉砕をすることで試料が均一化され、常温粉砕での問題点が解決されます。
試料

常温粉砕の問題点

常温粉砕

凍結粉砕

粉砕後水分と固形物に分離

キュウリ

しやすく秤量するときは試料をよくかき混ぜて均一化させながら採取する必要があります。

表皮と果肉の粉砕度合が異パイナップルなり秤量するときは試料をよくかき混ぜて均一化させながら採取する必要があります。

団子状になり混和性が悪い

ささみ

ためかき混ぜて均一化させながら試料を採取する必要があります。

粉砕時の発熱により試料かゴマ

ら油が出てくるためペースト状からそぼろ状になり、試料を均一の採取するのが難しくなります。

参考文献：佐々野ら,「少量試料サンプリングのためのドライアイス凍結粉砕の検討」,第106日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.115

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2,予冷式ドライアイス凍結粉砕法
手順
ほうれんそうの場合①

留意点● 注意：ドライアイスは急激に昇華するため、ふた等にガ

試料は重量を量り予め5cm幅にカットしておく。

ス排気穴が必要です。危険ですので密閉容器での操作は②

ウダー状）しておく。
③

お控え願います。

板状またはペレット状のドライアイスの場合は予め粉砕（パ●はドライアイスで十分冷却します。

①のカットした試料を予冷容器(ビニール袋)に均等になるよ

常温のまま使用すると試料がシャーベット状になってうに入れる。

④

試料、粉砕機、薬さじ(試料秤量時使用のものを含む)器具に付着し操作性が悪化します。

③の試料に試料と同量のドライアイスを上から均等に振りかけて加え、約３分間放置する。

● ドライアイスが揮発したかどうかの目安
・試料温度が-20℃程度になっている(ドライアイスは-79℃で気化します)⑤⑥④の試料とドライアイスを予冷容器(ビニール袋)ごと振り、・重量変化がない

試料全体を凍結させて予冷する。

・体積変化がない

粉砕機にドライアイス100 gを入れ15秒程粉砕しながら容器を冷却する。（粉砕機の予冷）⑦⑤の予冷した試料と残存ドライアイスを⑥のドライアイスが入っている粉砕機に入れて、試料を凍結粉砕する。

工程概要

試料細切

予冷した試料とドライア
イスを粉砕

試料の予冷（試料とパウダー状ドライアイスを混合）

ドライアイスが昇華後も試料はパウダー状のまま※ 凍 結 粉 砕 に つ い て は 「 予 冷 式 ド ラ イ ア イ ス 凍 結 粉 砕 法 ガ イ ド ブ ッ ク (http://www.aisti.co.jp/wp/wpcontent/uploads/2022/10/touketsuguidebook.pdf」もご参照ください。
PowerPoint プレゼンテーション (aisti.co.jp)
参考文献：佐々野ら,「少量試料サンプリングのためのドライアイス凍結粉砕の検討」,第106日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.115

12

3, 抽出

13

3,抽出
概要
STQ法の抽出はQuEChERS法を参考とした抽出法です。この方法では簡便・迅速に多成分の農薬を抽出することができます。

【QuEChERS法抽出のメリット】■

抽出時に液液分配と塩析を同時にできる■

クエン酸塩によりpHの緩衝作用を利用できる■

使い捨て容器を使用するため分液ロートなどガラス器具が不要

抽出の
ポイント

液液分配と塩析効果により農薬をアセトニトリル層①ACN層へ移行させ水溶性成分を除去します。

②試料層①ACN層：農薬③水層②試料層③水層(除去部)：糖等の水溶性の夾雑成分

試料層が厚い場合は傾けても混ざりません。

遠心分離後

抽出フロー
抽出フロー解説・留意点※用語 ACN：アセトニトリル
NaCl：塩化ナトリウムMgSO4(無水)：無水硫酸マグネシウム
試料採取 10 g❶ 穀類 ・ 豆類 5 g

その他難試料 1～2 g
茶、香辛料等の難試料は試料を減量します。その場合は希釈倍率が高くなるため測定感度にもご注意願います。

…❶
添加 標準溶液(添加回収試験の場合)…❷❷

添加溶液は試料量の1/20以下になるようにします。
また標準溶液の溶媒はACNに溶解するものをご使用ください。
添 加 後 は 30 分 程 度 放 置 す る こ と を 推 奨 し ま す(p.15(2)参照) 。

❸

試料の水分含量が80％未満の場合は水を添加します。水添加には2つの目的があります。
①液液分配時の水分量を調整する。
試料の水分含量と合わせて10 g相当となるように添加します。
②溶媒を試料に浸透させ農薬を抽出しやすくする。
乾燥試料では水添加後試料全体に水を十分に浸透、膨潤させるため約15分放置します。
水添加の詳細はp.15(1)をご覧ください。

❹

4種類の塩を以下の目的で添加します。
①NaCl：塩析効果
②クエン酸3Na2水和物
緩衝作用(pH調整)③クエン酸水素2Na1.5水和物④MgSO4(無水)：塩析効果タンパク質変性により試料層を形成していると考えられます。

❺

大豆など遠心分離後に試料層が厚く上層が少なくなる場合は、セラミックホモジナイザーを2個入れて振とうします(p.56参照)。

❻

NaClとクエン酸2種を十分溶解してからMgSO4(無水)を添加します。溶解が不十分だと緩衝作用が不十分になったりMgSO4(無水)が固まって正しい分配ができない場合があります。

添加 水 (10－試料の含水量) mL…❸

添加 ACN 10 ｍL
ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分
添加 NaCl 1 g
添加 クエン酸3Na2水和物 1 g

添加 クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5 g…❹…❺
振とう溶解 10秒…❻
添加 MgSO4(無水) 4 g

振とう 1分

…❼遠心分離 3,500 rpm, 5分抽出液(ACN層)❼
分取して精製工程へ激しく振とうし混和させるため手操作を推奨します。
振とう機を使用する場合は、チューブ内で試料が撹拌されていることをご確認願います。

…❽
❽
14

試料層が薄い場合は傾けた際に、層が崩れる場合があるのでピペット等で上層を分取します。

3,抽出
補足・参考資料(1)水添加試料の水分含量が80％未満の場合は水を添加します。水添加には2つの目的があります。
①液液分配時の水分量を調整する。
水は試料中の水分量も含め約10 gになるように調整します。これはあとで添加する塩類が水10 mLに対する量に設定しているためです。(液液分配での塩析効果で塩が飽和になるように添加します。)
従って試料の含水比率が小さいもの(水分含量80 ％未満)については試料秤量後に水を添加する必要があります注1) 。
各試料の水添加例については下記「水添加量の目安」をご覧ください。また試料中の水分量は「日本食品成分表(書籍)」や文部科学省のWebサイト（食品成分データベースhttps://fooddb.mext.go.jp/index.pl）が参考となります。

②溶媒を試料に浸透させ農薬を抽出しやすくする。
穀類、豆類、茶など乾燥した試料では抽出溶媒が組織内に浸透しにくいため、予め水で試料を膨潤させることで溶媒が組織内に浸透しやすくなり、農薬が抽出されやすくなります注2) 。
水添加量の目安
試料
果実・野菜
例)ほうれんそう水分（％）

試料秤量（g）

添加水量（mL)

＞80

10

0

備考

92.4

10

0

25~80

10

Ｘ

71.7

10

3

穀類・豆類

15未満

５

10

例)玄米

15未満

5

10

抹茶

15未満

1～2

10

夾雑が多いため試料減量

香辛料

15未満

1～2

10

夾雑が多いため試料減量

オリーブオイル

15未満

1～2

10

抽出時、油に分配するため試料減量

15未満

5

10

40未満

5

X

15.4

5

9.23

果実・野菜

例)えだまめはちみつ
ドライフルーツ

注3)例)乾燥いちご
注1)

X=10 g－試料10 g中の水分量

X=5 mL＋(5 gー試料5 g中の水分量)
5 mL+(5 g－5 g×15.4/100)=9.23 mL

水添加後は薬さじで混合するか、またはPPチューブに蓋をして振とうし、試料とよく混合させます。試料が完全に湿っていることをご確認願います。

注2)

穀類・豆類・茶など乾燥試料は水添加・混合後約15分放置し、試料を膨潤させます。

注3)

水は粉砕時に添加することもできます。その場合、秤量は試料の重量が5 gになるよう秤量します。

(2)標準溶液の添加
抽出溶媒がアセトニトリルのため添加用標準溶液もこれに溶解する溶媒である必要があり、アセトニトリルやアセトンをお勧めします。ヘキサンなど溶解しにくいものは、抽出溶媒と分離し回収率が悪化する原因となります。また添加する溶液量は試料の1/20以下をお勧めします。溶媒の体積が増えると抽出液が希釈され定量値に影響を与えます。

【標準溶液添加時の注意点】①添加する標準溶液はできるだけ少量にとどめ、試料量の1/20以下になるようにする。
②標準溶液を添加後はよく混和し、30分程度放置した後に抽出操作を行う。
③添加する標準溶液はできるだけヘキサン溶媒を含まないようにする。
参考文献：1)日本農薬学会「残留農薬分析知っておきたい問答あれこれ」 改訂4版 20182)坂ら,「玄米および小麦試料の残留農薬分析における抽出時の水浸漬効果」,日本農薬学会誌 31 (4),pp.431-434(2006)

15

3,抽出
(3)pH調整
柑橘類(レモン)などpH3未満の酸性試料では、抽出前に5 mol/L水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH6～7程度に調整が必要な場合があります。酸性試料ではホモジナイズ後に添加する2種類のクエン酸ナトリウムによる緩衝作用の効果が得られない場合があるためです。
【pH調整手順の概略】
pH調整用試料の秤量 → pH調整 → 添加量の確定 → 試験用試料の秤量 → 農薬添加(添加回収試験の場合) → pH調整

【pH調整方法】①5 mol/L水酸化ナトリウム水溶液作製：水酸化ナトリウム20 gを超純水100 mLに溶解する。
※作製量は適宜調整願います。
②試験する試料とは別にpH調整用の試料を用意する。
③5 mol/L水酸化ナトリウム水溶液を100 μLずつ添加する。その都度薬さじで試料とよく混合し、pH試験紙でpHを確認する。
④ pH6～7になるまで③を繰り返えし、 5 mol/L水酸化ナトリウム水溶液の必要量を決める。
⑤試験用の試料を秤量後、農薬を添加しよく混合する(添加回収試験の場合)。
※農薬とアルカリ溶液が直接接触すると農薬が分解する可能性があるためです。
⑥⑤に④の量の5 mol/L水酸化ナトリウムを添加してよく混合してから試験を開始する。

(4)抽出法のアレンジ
試料によっては抽出法をアレンジすることにより抽出効率や定量性を高めることができます。大豆などで効果が見られます。
①15mL抽出法
抽出時のアセトニトリル量を15mLに増やすことで抽出効率を高めることができます。
試料採取 10 g (穀類5 g)(添加 水 10 mL 穀類の場合)
添加 ACN 15 mL

ACN添加量を増加

ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分
添加 NaCl 1 g
添加 クエン酸3Na2水和物 1 g
添加 クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5 g
振とう溶解 15秒
添加 MgSO4(無水) 4 g
振とう 1分

遠心分離 3,500 rpm, 5分※ACN：アセトニトリル
NaCl：塩化ナトリウムMgSO4(無水)：無水硫酸マグネシウム

ACN層
16

3,抽出
②繰り返し抽出定容法
抽出を2回繰り返して得られた抽出液を合算・定容することで抽出効率とともに定量性も高めることができます。

【操作手順】
抽出塩析→遠心分離→アセトニトリル層をメスフラスコに分取（アセトニトリル層①）→残留物にアセト
ニトリル再添加→振とう抽出→遠心分離→アセトニトリル層②→アセトニトリル層①に合わせ定容

試料採取 10 g (穀類5 g)(添加 水 10 mL 穀類の場合)
添加 ACN 10 mL
繰り返し抽出

ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分
添加 NaCl 1 g

添加 ACN (定容量-ACN層①量) mL

添加 クエン酸3Na2水和物 1 g
添加 クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5 g

振とう

1分

振とう溶解 15秒
添加 MgSO4(無水) 4 g

遠心分離 3,500 rpm, 5分

振とう 1分
遠心分離 3,500 rpm, 5分

ACN層①

ACN層②

残留物(試料層・水層）※ACN：アセトニトリル
NaCl：塩化ナトリウムMgSO4(無水)：無水硫酸マグネシウム①②合算
定容：ACNで調整

残留物(試料層・水層)

定容

参考文献：
1)http://www.quechers.com
2)Masahiro Okihashi, Food 1 (2007) pp.101-110
3)佐々野ら, 「作物中残留農薬の 迅速一斉分析法-GC/MS編-」,第94回日本食品衛生学会学術講演会 講演要旨集p.33, B-74)谷澤ら, 「LC/MS/MSを用い た残留農薬の多成分迅速一斉分析法の 検討」,第95回日本食品衛生学会学術講演会講 演要旨集 p.39, A-21
5)佐々野ら, 「GC/MS大量注入を 用いた食品中残留農薬の迅速一斉分析 法の評価」,第95回日本食品衛生学会学術講演会講 演要旨集 p.40, A-22
6)Michelangelo Anastassiades et al., J. AOAC Int., 86, pp.412-431(2003)
7)佐々野ら, 「STQ法における繰り返し抽出定容法の検討」,第105回日本食品衛生学会学術講演会講 演要旨集
8)小西ら, 「STQ法(残留農薬一斉分析法)における抽出溶媒量の検討,第113回日本食品衛生学会学術講演会講 演要旨集 p.51, A-17

17

18

3,抽出 【参考】一斉試験法(通知試験法)抽出手順例 (202403 ver.)

一斉試験法(通知試験法)
抽出手順例【該当試験法】
GC/MSによる農薬等の一斉試験法 (農産物)
LC/MSによる農薬等の一斉試験法Ⅰ(農産物)

LC/MSによる農薬等の一斉試験法Ⅱ (農産物)19

3,抽出 【参考】一斉試験法(通知試験法)抽出手順例 (202403 ver.)
1,抽出フロー

抽出フロー
試料秤量

（←水

果実、野菜
：20.0g
穀類、豆類及び種実類：10.0g
茶及びホップ：5.00g
20mL※穀類、豆類及び種実類、茶及びホップの場合）（水を添加した場合30分間放置※ GC/MSによる農薬等の一斉試験法、LC/MSによる農薬等の一斉試験法Ⅱでは15分間放置)← アセトニトリル 50mL

ホモジナイズ 1min：1 回目

吸引ろ過：１回目

残留物← アセトニトリル 20mL
ろ液①
ホモジナイズ 1min :２回目

吸引ろ過：2回目

ろ液②混合

定容：100 mL

アセトニトリルで調整

20

3,抽出 【参考】一斉試験法(通知試験法)抽出手順例 (202403 ver.)2,使用する器具・試薬
使用する器具・試薬【吸引ろ過】※写真は一例です。

・吸引鍾

漏斗

・漏斗(ブフナー型)
・三角フラスコ等(廃液受け・適切な容量のもの)

吸引鍾・100ｍL短型メスフラスコ(抽出液受け)

100ｍL短型
メスフラスコ
三角フラスコ等
廃液受け・ろ紙(5A)・吸引ポンプ(コックがあれば便利)
アスピレーターでも可・薬さじ・セライトNo.545(富士フィルム和光純薬 )・水吸引ポンプとコック【抽出】・ジェネレーターなどホモジナイズ抽出する装置
・容器

使い捨て容器でも可・ピンセット・メスシリンダー・50 ｍL遠沈管(1本：溶媒入れ)
・アセトニトリル
・駒込ピペット
50mL遠沈管

ジェネレーター①②③＜容器の例＞①ホモジナイザーカップ②アズワン アイボーイ PP広口びん 250ｍL③AGCテクノグラス・IWAKI 遠沈管 100ｍL 2355-100シリーズ※②③は使い捨て容器
21

3,抽出 【参考】一斉試験法(通知試験法)抽出手順例 (202403 ver.)3,準備(1) 吸引ろ過の準備
漏斗①吸引鍾の中に廃液受け用の三角フラスコ等を入れ、上に漏斗とろ紙(５A)をセットする。

ろ紙(5A)

三角フラスコ等②吸引しながら少量の水を注ぎろ紙を漏斗に密着させる。
(流出液は廃棄)③漏斗にセライトを適量（④で厚さ1cm程度になる量）入れる。

④水（セライトが完全に浸る程度）を加えた後、吸引する。
（流出液は廃棄）※水を加えた後、吸引するとセライトが平らになる。
約１㎝⑤吸引が終わったら吸引鍾の中の三角フラスコ等を100ｍLメスフ
ラスコに交換する。

100ｍLメスフラスコ

22

3,抽出 【参考】一斉試験法(通知試験法)抽出手順例 (202403 ver.)(2) 抽出溶媒の準備
各工程で使用する下記①～③の溶媒はすべて100ｍLメスフラスコに回収する。

①１回目の抽出溶媒：アセトニトリル

50ｍL②２回目の抽出溶媒：アセトニトリル

20ｍL

１回目抽出後の刃の洗浄および２回目の抽出溶媒として使用③器具洗い込み溶媒：アセトニトリル

適宜23

3,抽出 【参考】一斉試験法(通知試験法)抽出手順例 (202403 ver.)4,抽出・吸引ろ過【果実・野菜の場合】(1) 試料秤量と抽出溶媒の添加①試料を容器に秤量する。
果実、野菜：20.0g②１回目の抽出溶媒アセトニトリル50ｍLを容器に入れる。

(2) 抽出・ホモジナイズ・・・１回目①約10,000rpmで１分間ホモジナイズする。

②（必要に応じて）ピンセットで刃の間の試料を回収する。

③アセトニトリル20ｍLを遠沈管に入れホモジナイザーの刃を洗浄する。
※洗浄後のアセトニトリルは2回目の抽出溶媒として使用するので
捨てない。

24

3,抽出 【参考】一斉試験法(通知試験法)抽出手順例 (202403 ver.)(3) 吸引ろ過・・・１回目①ホモジナイズした試料と抽出液を漏斗に流し込み吸引ろ過する。
※試料によっては泡立ってメスフラスコから吹きこぼれる場合があるので注意する。
泡立った場合は速やかに吸引を停止し、しばらく静置後に再開する。コックがついている場合はコックの開閉でも調整可能。

②セライトの上の残留物を薬さじで容器に回収する。
※このときできるだけセライトが入らないようにする。

③薬さじに付着した試料も（ピンセット等を用いて）容器に回収する。

25

3,抽出 【参考】一斉試験法(通知試験法)抽出手順例 (202403 ver.)(4) 抽出・ホモジナイズ・・・2回目①１回目の吸引ろ過(4,(3)②③)で残留物を回収した容器に、１回目抽出後の刃を洗浄した洗液（4,(2)③）を入れる (赤枠)。

4,(3)②③で残留物を回収した容器

4,(2)③１回目の抽出・ホモジナイズで刃を洗浄した洗液※空になった遠沈管はこのあと4,(4)④で使用するので捨てない②約10,000rpmで１分間ホモジナイズする。

③（必要に応じて）ピンセットで刃に付着している試料を回収する。

④空になった4,(4)①の遠沈管にアセトニトリル約10mLを入れ、２回目抽出後の刃(4,(4)③)を洗浄する (赤枠)。

遠沈管にアセトニトリル約10mLを入れる

２回目抽出後の刃を洗浄

4,(4)①の遠沈管※この洗浄液は4,(5)②で吸引ろ過するので捨てない26

3,抽出 【参考】一斉試験法(通知試験法)抽出手順例 (202403 ver.)(5) 吸引ろ過・・・2回目①ホモジナイズした試料と抽出液を漏斗に流し込み吸引ろ過する。

②遠沈管の刃の洗浄液(4,(4)④)も漏斗に流し込み吸引ろ過する。
4,(4)④の液③少量のアセトニトリルで使用した器具（容器、ピンセット、漏斗などの内側）を洗いこみ、洗液を吸引ろ過する。
※ろ液が100mLを超えないようにメスフラスコ内の液量を見ながら行う。

標線

容器

ピンセット
(使用した場合)

漏斗吸引ろ過が終わった状態(写真は茶色だが実際は緑色)(6) 定容アセトニトリルで100mLに定容する。
※吸引ろ過が終わった直後は溶液の温度が下がっているため、常温に戻ってからアセトニトリルで定容する。

参考文献：
1)厚生労働省：一斉試験法(通知試験法) https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/kenkou_iryou/shokuhin/zanryu/zanryu3/siken.html
2)志田(齋藤)ら, 「GC-MS/MSを用いた残留農薬一斉試験法の簡便化の検討～通知一斉試験法の精製方法の改良～」,第119回日本食品衛生学会学術講演会 講演要旨集p.84, P-14

27

28

4, 精製
1）概要
2）全自動固相抽出装置による精製（1）STQ-GC-B法（2）STQ-GC-B法の精製（3）STQ-LC法（4）STQ-LC法の精製
3）手動法による精製（1）STQ-GC-B法（2）STQ-LC法

29

1）概要

30

4,1)概要
精製の概要
固相抽出による精製には固相を粉状のまま使用する「バルク固相」と「固相カートリッジ」として使用する方法があります。これらは固相と試料の相互作用の原理が異なるため精製効果にも違いが見られます。STQ法ではより精製効果の高い「固相カートリッジ」を使用します。

（1）分散SPEと固相カートリッジの精製効果の違い
同じ固相(充填剤)でも粉状のままバルク固相として使用する分散SPEと、固相カートリッジとして使用する場合では精製効果が異なります。分散SPEでは、固相の粒子と液相中の化合物（農薬や夾雑成分）の接触により、その親和性に応じて固相あるいは液相に「分配」されますが農薬と夾雑成分は分離されません。一方、固相カートリッジではカラム性能が得られ、固相と液相の相互作用が最大限に活かされ分画・分離が可能となり農薬と夾雑成分が分離されます。
測定での分離カラムと同様の理論です。
分配型-固相抽出法と分配分離型-固相抽出法のイメージ《QuEChERS法》《STQ法》

分配型-固相抽出法（分散SPE）

分配分離型-固相抽出法（固相カートリッジ）
液相

液相
固相

液相
固相

夾雑成分
1000

農薬
10

夾雑成分

農薬

200
800

8
2

固相
夾雑成分：1000

農薬：10

夾雑成分が液相に、農薬が固相に分配されたまま液相に分配された農薬が液相とともに移動し夾雑成分と分離

試料中に農薬が10、夾雑成分が1000あると仮定します。それを分散SPEで振とうにより分配すると分配後の液相にも夾雑成分が分配されており、固相にも農薬が一部分配されています。従ってこの液相を測定すると200の夾雑成分が存在し、農薬は10のうち2が固相に分配されたため8しか回収されないことになります。

一方固相カートリッジでは夾雑成分は通液により固相と液相の間で分配されながら固相をゆっくり進み、農薬は固相と液相の間で分配されながら液相とともに移動するため、農薬が固相から溶出したところで通液を止めることで農薬と夾雑成分が分離され、溶出液には農薬が10回収されます。

【実試料における精製効果の比較例】
固相カートリッジ
高沸点化合物が除去されている（C18→グラファイトカーボン＋PSA）

分散SPEでは高沸点夾雑成分が残っていま
すが同じ種類の充填剤でも固相カートリッジとして使用した場合はこれらの夾雑成分が除去されています。

分散SPE（グラファイトカーボン＋PSA＋C18＋MgSO4）

高沸点化合物が残っている

ほうれんそうにおける分散SPEと固相カートリッジの違い

314,1)概要(2)STQ法の特長
固相カートリッジを用いたSTQ法の精製操作は、全自動固相抽出装置（ST-L400）による自動法と、独自の試験管ラック（前処理キット）で操作性を追求した手動法をご提案しており状況に応じてお選びいただけます。
精製には「GC-B法」と「LC法」があり、対象農薬により精製法を分けています。これによりGC法の場合は高極性夾雑成分を、LC法の場合は低極性
夾雑成分を除去することができるためより精製効果を高めることができます。

全自動固相抽出装置 ST-L400

両方法とも充填量が数十mgと少ない固相カートリッジ「Smart-SPE」を用いて精製を行います。またSTQ法では省力化のためエバポレーターによる濃縮操作はありません。そのため前処理後の試料は希釈されていますが、
GC-MS測定においてはGC用大量注入口装置LVI-S250を使用し、大量注入を行うことで感度を確保しています。

前処理キット

GC-B法●精製効果が高く加工食品にも対応

GC-B法

GC法

●精製固相の追加や溶出溶媒の変更が可能

LC法
Methamidofos
Acephate
Monocrotofos
CarbarilDichlorvos
Dimethoate
・・●アセフェート、メタミドホスなどの高極性農薬は対象外(LC法で対応)●操作時間は約30分/4検体

Methamidofos
Acephate
Monocrotofos
CarbarilDichlorvos
Dimethoate・・(コンディショニング等準備時間は除く)※「【参考】STQ-GC-A法」はp.82をご覧ください。

GC-MS
GC-MS

LC-MS/MS

GC対象農薬(300成分)

LC法

GC対象農薬(350成分)●通知一斉試験法Ⅰ法・Ⅱ法の同時分析が可能

低極性から高極性まで農薬と夾雑成分が対象に

GC対象農薬に絞ること
で高極性夾雑成分を除去

LC対象農薬(200成分)
LC対象農薬に絞ることで低極性夾雑成分を除去※Ⅱ法は酸性農薬対象●操作時間は約15分/4検体

高極性農薬はLC-MS/MSへ(コンディショニング等準備時間は除く)

高極性農薬をLC-MS/MSで測定することで、最適な前処理条件で分析が可能となる！

(3)STQ法で使用する主な固相

GC‐B法
固相

LC法

目的

C18-50対象試料

無極性夾雑物の除去

すべて

目的物質の保持すべて

有機酸等イオン性夾雑物の除去

すべて

平面構造夾雑物の除去

色素を多く含む試料、柑橘類など

SI-30

カフェインの除去

茶などカフェインを多く含む試料

SAX-30脂肪酸の除去穀類など脂肪酸を多く含む試料

C18‐50(自動）PBX‐10(手動)PSA-30
GCK-20

注2)

注1)

固相

目的

対象試料

C18-50無極性夾雑物の除去

すべて

C18-30無極性夾雑物の除去

すべて

PSA-30有機酸等イオン性夾雑物の除去

すべて

注1)PBX：ポリマー系表面修飾ポリスチレンジビニルベンゼン親水性/疎水性バランス充填剤
注2)本ガイドブックで紹介しているグラファイトカーボンにはGCKとGCSがあります。これらは製品名称の違いであり、使用目的及び性能は同等です。現在はGCKの販売となっております。

324,1)概要
用語の定義

本ガイドブックでは精製フローにおける用語を以下のように定めています。ご了承ください。

●負荷[通液]：

試料溶液中の夾雑成分を固相に保持させ、目的物質は固相から流出させる。流出液は回収する。

●負荷[保持]：試料溶液中の目的物質を固相に保持させ、夾雑成分は固相から流出させる。流出液は廃棄する。

●通液：

溶媒を固相に通液し負荷[通液]で固相に残った目的物質を流出させる。流出液は回収する。

●洗浄：

溶媒または水を固相に通液し、夾雑成分を固相から流出させる。流出液は廃棄する。

●溶出：

溶媒を固相に通液し、固相に保持していた目的物質を溶出させる。溶出液は回収する。

■目的物質を固相に保持させ、夾雑成分を洗浄後、目的物質を溶出する場合
1. 負荷[保持]

2. 洗浄

3. 溶出

試料溶液が入っていた試験管を溶媒

溶媒または水

試料●洗液：
溶媒などで洗い込んだ溶液。

固相
洗液
流出液
廃棄

溶出液
回収

流出液
廃棄

■夾雑成分を固相に保持させ、目的物質を回収する場合
1. 負荷[通液]

2. 通液

試料

溶媒
目的物質

固相
流出液
回収

夾雑成分

流出液
回収

その他、以下の略号を使用しています。

●ACN： アセトニトリル●NaCl： 塩化ナトリウム●MｇSO4(無水）： 無水硫酸マグネシウム●PEG：

ポリエチレングリコール

334,1)概要
STQ法で使用する試薬の調製方法（１）GC-B法⚫10%（w/w）塩化ナトリウム水溶液：塩化ナトリウム50 gを超純水に溶解し500 mLとする。
⚫アセトニトリル-水（9/1）混液：アセトニトリルと水を体積比9:1で混合⚫アセトン‐ヘキサン (15/85)混液：アセトンとヘキサンを体積比15:85で混合⚫0.1%ポリエチレングリコール300（PEG300）＋1 ppmフェナントレンd体/アセトン：①PEG300を1 g、1000 ppmフェナントレンd体/アセトン溶液1 mLを100 mLメスフラスコに分取し、アセトンで100 mLに定容②①をアセトンで10倍希釈（２）LC法⚫2%ギ酸含有アセトニトリル (用時調製)：ギ酸2 mLをアセトニトリルに溶解し100 mLしたもの。
⚫アセトニトリル-水（8/2）混液：アセトニトリルと水を体積比8:2で混合（３）LC法検量線作成用混合溶媒（用時調製）● アセトニトリル、2%ギ酸含有アセトニトリル、アセトニトリル‐水（8/2）、水を体積比で1:1:1:1で混合したもの※酸性農薬が分析対象外の場合は2%ギ酸含有アセトニトリルではなくアセトニトリルを使用します。
※LC-MS/MS測定では測定液組成が感度やピーク形状に影響するため標準液はサンプルと同じ組成液での調製を推奨しています。

（４）標準溶液調製方法※検量線用混合標準溶液濃度は一例です。状況により適宜変更可能です。

≪GC用≫

≪LC用≫

●混合標準溶液 2 ppm（抽出前添加用）＜標準原液が20 ppmの場合＞
10 mLのメスフラスコに各標準原液を1 mLずつ採取し、アセトン注1)で10 mLに定容する。

●混合標準溶液 2 ppm（抽出前添加用）＜標準原液が20 ppmの場合＞
10 mLのメスフラスコに各標準原液を1 mLずつ採取し、アセトニトリル注3)で10 mLに定容する。

●混合標準溶液 0.1 ppm（検量線作成用中間溶液・用時調製)
1 mLのメス試験管に上記混合標準溶液2 ppmを50 μL採取し、アセトンで1 mLに定容する。

●混合標準溶液 0.1 ppm（検量線作成用・用時調製)
1 mLのメス試験管に上記混合標準溶液2 ppmを50 μL採取し、LC法標準溶液希釈液注4)で1 mLに定容する。

●各濃度の検量線用混合標準溶液(用時調製)＜2.5 ppb＞
2 mLのメス試験管に混合標準溶液0.1 ppm/アセトンを
50 μL、0.1%PEG300＋1 ppmフェナントレンd体/アセトンを40 μL採取し、アセトン-ヘキサン混液注2)で2 mLに定容する。

●各濃度の検量線用混合標準溶液(用時調製)＜1.25 ppb＞
2 mLのメス試験管に混合標準溶液0.1 ppmを25 μL採取
し、検量線作成用混合溶媒注4)で2 mLに定容する。
＜2.5 ppb＞
2 mLのメス試験管に混合標準溶液0.1 ppmを50 μL採取
し、検量線作成用混合溶媒注4)で2 mLに定容する。

＜5 ppb＞
1 mLのメス試験管に混合標準溶液0.1 ppm/アセトンを
50 μL、0.1%PEG300＋1 ppmフェナントレンd体/アセトンを20 μL採取し、アセトン-ヘキサン混液で1 mLに定容する。

＜3.75 ppb＞
2 mLのメス試験管に混合標準溶液0.1 ppmを75 μL採取
し、検量線作成用混合溶媒注4)で2 mLに定容する。

＜7.5 ppb＞
1 mLのメス試験管に混合標準溶液0.1 ppm/アセトンを
75 μL、0.1%PEG300＋1 ppmフェナントレンd体/アセトンを20 μL採取し、アセトン-ヘキサン混液で1 mLに定容する。

注1）抽出前添加用混合標準溶液は、抽出溶媒（アセトニトリ
ル）に溶解する溶媒を用いて希釈します。
例：ヘキサンが多く含まれると抽出溶媒（アセトニトリ
ル）と分離し、低極性農薬が回収されにくくなります。

注3）抽出前添加用混合標準溶液は、抽出溶媒（アセトニトリ
ル）に溶解する溶媒を用いて希釈します。
注4）前処理の最終試験溶液と同じ溶媒を使用します。
調製方法は上記「(3)LC法検量線作成用混合溶媒」をご覧ください。

注2）溶媒（アセトン-ヘキサン）は前処理の最終試験溶液と同じ溶媒を使用します。

34

2）全自動固相抽出装置による精製

全自動固相抽出装置 ST-L400

354,2)(1)STQ-GC-B法 (自動) (202405 ver.）4,2)(1) STQ- GC-B法 (自動)①エバポレーターによる濃縮操作なし

前処理の
ポイント

GC対象農薬を全自動固相抽出装置(ST-L400)を使用して精製します。

②精製固相の追加と溶出溶媒の変更が可能③1検体の処理時間約15分

精製フロー【ST-L400の工程】

全自動固相抽出装置ST-L400

目的物質(農薬など)
夾雑成分(1)試料負荷

コンディショニング
アセトン
ACN-水(9/1)②ACN‐水(9/1)①抽出液(ACN層)

Smart-SPE C18-50㎎：精製
サンプル
ループ

負荷[通液] 抽出液(ACN層) 0.5 mL 分取③10%NaCl水溶液

洗液 ACN-水(9/1) 0.5 mL

C18-50 mg：精製

シリンジポンプ
Mノズル

…❶❷*

流出液
添加 10%NaCl水溶液 約23 mL

Smart-SPE C18-50㎎：保持シリンジポンプ 農薬

コンディショニング
アセトン
水

…❷

C18-50 mg：保持除去物質
・高極性夾雑成分
・糖類
・水など(2)固相乾燥
洗浄 水 1.3 mL
固相乾燥(窒素ガス) 2分

…❶

除去物質
・無～低極性夾雑成分
・クロロフィル
・高級脂肪酸エステル類
・高級アルコール類
・ステロール類など

④窒素ガス

…❸

コンディショニング
アセトン
アセトン-ヘキサン(15/85)

ボンベ

Smart-SPE C18-50㎎…❹

Smart-SPE PSA-30㎎：精製

農薬

溶出 アセトン-ヘキサン(15/85) 1 mL(3)溶出C18-50 mg…❸⑤アセトン‐ヘキサン(15/85)

溶出液
添加 0.1%PEG300‐1ppmフェナントレンd体
混合アセトン溶液 20 μL…❺

定容：1 mL アセトン-ヘキサン(15/85)で調整

C18-50 mg
シリンジポンプ…❹

PSA-30 mg 精製
除去物質
・イオン性夾雑成分
・高級脂肪酸・色素など…❻

測定：GC-MS (大量注入25μL)* 特許第4780109号

農薬

精製固相の追加
B法では試料に含まれる夾雑成分に応じて精製固相を追加したり溶出溶媒を変更することができます。
ただし、固相を追加して精製効果が向上すると一部農薬の回収率が低下する可能性があります。目的物質の回収率は事前にご確認願います。

●脂肪酸が多い試料の場合(例：古い玄米)SAX-30 mg＋PSA-30 mg 溶出 アセトン-ヘキサン（15/85）1 mL※アセトン比を下げることで精製効果は高まりますが、農薬によっては十分に回収されない場合があります。
●カフェインが多い試料の場合(例：茶)SI-30 mg＋PSA-30 mg 溶出 アセトン-ヘキサン（20/80）1 mL ※SI=シリカゲル※アセトン比を20%以下にすることでカフェインの除去効果が高まります。
●色素やフラボノイドが多い試料の場合(例：柑橘類)
GCK-20 mg＋PSA-30 mg 溶出 トルエン-アセトン-ヘキサン（５/10/85）1 mL※GCK＝グラファイトカーボン
キノメチオネート
N
S※トルエンを使用してもキノメチオネートのように回収率が低い平面構造の
O
CHS
農薬がありますのでご注意願います。
N3364,2)(1)STQ-GC-B法 (自動) (202405 ver.）
前処理フロー解説・留意点

測定条件
条件例1

❶ (1)試料負荷負荷した試料(抽出液)はC18-50㎎(上)に無~低極性夾
雑成分が保持され目的物質である農薬は通過します。

❷

PTV 注入口 LVI-S250(AiSTI Science)
インサート
スパイラル（胃袋型）インサート
注入口温度
70℃(0.16 min)-120 ℃/min-240 ℃50 ℃/min-290 ℃(26 min)

C18-50㎎(上)からの流出液に10％NaCl水溶液を添加し、ACNの濃度が低くなった状態(約4％)でC18-50㎎

GC Nexis GC-2030 (島津製作所)
注入モード
LVI-S250 大量注入法 スプリット
制御モード
カラム流量
カラム流量
1.2 mL/min
線速度
40 cm/s
パージ流量
3.0 mL/min
スプリット比50
スプリットレス時間 4 min
カラム
VF-5ms, 0.25 mm i.d. X 30 m, df;0.25 µm
オーブン温度60℃(4 min)-25 ℃/min-125 ℃ -10 ℃/min310 ℃(8 min)
インターフェース温度
290 ℃(下)に通液します。C18-50㎎(下)では農薬がC18-50㎎に保持され高極性夾雑成分はそのまま通過して除去されます。
このとき高極性農薬のアセフェートやメタミドホスは
C18-50㎎に保持されませんのでLC法で対応します。

❸ (2)固相乾燥
C18-50㎎に残った水分を窒素乾燥により除去し、溶出液に水が混入しないようにします。

❹ (3)溶出MS GCMS-TQ8040 NX(島津製作所)
イオン源温度
260 ℃
測定モード
MRM

C18-50㎎から保持した農薬を溶出します。そのとき
C18-50㎎の下にPSA等の固相を連結することで高級脂
肪酸や色素などのイオン性夾雑成分を除去します。
溶出時には夾雑成分の種類に応じて固相を追加したり溶出溶媒を変更することでより精製効果を高めることができます。(p.36「精製固相の追加」、pp.38-44参照)

❺

❻

条件例2
PTV 注入口 LVI-S250(AiSTI Science)
インサート
スパイラル（胃袋型）インサート
注入口温度
70 ℃(0.27 min)-120 ℃/min-240 ℃50 ℃/min-290℃(40 min)

これは大量注入(25μL)する場合の添加量です。注入
量が異なる場合はGCに注入するPEGの絶対量が500 ng、
フェナントレンd体が0.5 ngになるように添加量を変更します。
※フェナントレンd体は測定時の感度変動確認のために添加しています。定量値補正には使用していない
ため添加は必須ではありません。

GC 7890B (Agilent Technologies)
注入方式
LVI-S250 溶媒ベントモード
ベント圧力
70 kPaベントフロー
150 mL/min
ベント時間
0.27min
パージ時間
4 min
パージフロー
50mL/min
カラム流量
コンスタントフロー, 1.1 mL/min
カラム
VF-5ms, 0.25 mm i.d. X 30 m, df;0.25 µm
オーブン温度60 ℃(4 min)-25 ℃/min-150 ℃-3 ℃/min200 ℃-8 ℃/min-310 ℃(5 min)
MSDトランスファーライン温度
290 ℃

標準溶液は試料溶液と同じ溶媒組成にすることを推奨します。

※極性・無極性といった表現は相対的なものです。

MS Agilent 7000C (Agilent Technologies)
イオン源温度
280 ℃
測定モード
MRM

自動前処理装置によるアプリケーションデータはこちらから自動前処理装置の動画はこちらから（Youtube）

374,2)(2)STQ-GC-B法の精製
4,2)(2) STQ- GC-B法の精製
STQ-GC-B法における夾雑成分除去の概念【GC-B法の概要】①液液分配：
無~低極性物質は上層（アセトニトリル層）に、塩類・糖類などの高極性成分
は下層（水層）に移行し、それぞれを分離します。
※トリグリセリドなど無極性夾雑成分は油層として分離することができます。

試料秤量

ホモジナイズ振とう②C18精製：油やクロロフィル（緑色）などの無～低極性成分をC18に保持し除去します。

遠心分離
ACN層
Smart-SPE C18：精製

Smart-SPE C18orPBX注1)2)：保持③C18orPBXに農薬を保持：通液させる溶媒の極性を高めることで、固相に農薬を保持します。

④極性成分の除去：

高極性夾雑成分はC18orPBXに保持されず除去されます。
流出液廃棄

⑤精製：

固相乾燥(吸引)

通常はPSAにより高級脂肪酸などイオン性夾雑成分を吸着除去します。
試料によりPSAのみで除去できない場合は夾雑成分に応じて最適な固相

Smart-SPE C18orPBX
Smart-SPE GCKorSAXorSI：精製
Smart-SPE PSA：精製を追加します。
GCK：平面構造夾雑成分の除去
SAX：陰イオン夾雑成分の除去
SI ：カフェインの除去
PSA（追加）：陰イオン夾雑成分の除去
注1) PBX：ポリマー系表面修飾ポリスチレンジビニルベンゼン親水性/疎水性バランス充填剤

定容注2) 全自動固相抽出装置使用の場合はC18を、手動の場合はPBXを使用します。

C18とPBXの使い分け
上記フローの③におけるC18とPBXの使用目的は同じでどちらも農薬の保持になります。この工程では約12 mLの液を通液します
が水の比率が高いためシリカ系のC18に手動で通液すると圧力がかかり操作性が落ちます。そこでポリマー系のPBXを用いて操作性を高めています。

【夾雑成分の除去の概念図】

疎水性（無極性）

親水性（極性）
液液分配
水 糖 高
溶 類 極
性
性
夾
夾
雑
雑
成
成
分
分

C18orPBX注1)2)農薬保持
極性夾雑成分

GCK精製
平面構造夾雑成分
・フラボノイド

無~低極性夾雑成分・クロロフィル

・水溶性の高い
植物成分

C18精製

対象農薬

・高級脂肪酸エステル
・高級アルコール・糖類

・ステロール類

・カフェイン 注3)
イオン性夾雑成分
・遊離高級脂肪酸・色素

PSA,SAX精製
注1)PBX：ポリマー系表面修飾ポリスチレンジビニルベンゼン親水性/疎水性バランス充填剤
注2)全自動固相抽出装置使用の場合はC18を、手動の場合はPBXを使用します。
注3)自動化ではC18にほとんど保持されず流出して除去されます。

38

液液分配
ト
リ
グ
リ
セ
リ
ド
（
脂
肪
）

無
極
性
夾
雑
成
分

4,2)(2)STQ-GC-B法の精製
GC-B法の精製について

GC-B法

GC-B法では試料に含まれている夾雑成分に精製工程の愛略

応じて、精製固相を追加したり通液溶媒を変固相A：精製更することにより精製効果を高めることができます。 詳細 はp.38「4,2)(2)STQ-GC-B法

負荷[通液] 抽出液(ACN層)の精製」をご覧ください。

通液 ACN-水

ただし、固相を追加して精製効果が向上すると流出液

一部農薬の回収率が低下する可能性があります。目

添加 10％(w/w)NaCl水溶液

的物質の回収率は事前にご確認されますようお願い

固相B：保持します。

洗浄 水
固相乾燥(吸引)
固相B
固相C：精製
溶出

精製溶媒

定容

【試料別の精製の例】
試料
穀類・豆類・果実・野菜

固相A

固相B

固相C

C18-50

C18-50PSA

精製溶媒
アセトン‐ヘキサン

コメント
基本フロー

（15/85）アセトン‐ヘキサン

しょうが、大葉、香辛料、加工食品など

C18-50

C18-50PSA（10/90）アセトン‐ヘキサン

極性農薬の回収率が低下（5/95）

する可能性ありトルエン‐アセトン‐ヘキサン 平面構造の農薬を対象と
GCK+PSA
柑橘類、色素の多い試料

C18-50

C18-50
SAX+PSA（5/10/85）

する場合

アセトン‐ヘキサン

平面構造の農薬を対象と（15/85）しない場合

アセトン‐ヘキサン（15/85）トルエン‐アセトン‐ヘキサン 平面構造の農薬を対象と緑茶などカフェインを多く含
む試料

手動の場合

C18-50同上

C18-50

GCK+SI+PSA

PBX-10注1)注2)（5/20/75）

する場合

アセトン‐ヘキサン

平面構造の農薬を対象と（20/80）

しない場合

同上

同上

注1) PBX：ポリマー系表面修飾ポリスチレンジビニルベンゼン親水性/疎水性バランス充填剤
注2) 全自動固相抽出装置使用の場合はC18を、手動の場合はPBXを使用します。

弊 社 で は W e b サ イ ト ( http://www.aisti.co.jp/appli/)に 「 残 留 農 薬 基 礎 デ ー タ 」 と し て 一 部 の 農 薬 に つ い て 精 製 固 相 と 精
製 溶 媒 の 種 類 に よ る 回 収 率 を 掲 載 し て い ま す の で こ ち ら も ご 覧 く だ さ い。 な お こ れ ら の デ ー タ は 一 例 で あ り 必 ず し も 分 析
結 果 を 保 証 す る も の で は あ り ま せ ん。 回 収 率 は 事 前 に ご 確 認 さ れ ま す よ う お 願 い し ま す 。

394,2)(2)STQ-GC-B法の精製
固相と溶出溶媒による精製効果
精製に使用する固相と溶出溶媒の種類及び比率により精製効果は異なります 。ここでは固相と溶出溶媒の組合せによる精製効果の比較をご紹介します。但し、これらの組合せにより農薬の回収率も変動しますのでご注意願います。

PSAと溶出溶媒による精製効果
PSAは陰イオン交換と極性の相互作用を併せ持つ固相です 。溶出溶媒のアセトン -ヘキサンの比率により精製効果が異なります。下図はほうれん草の例です。アセトンの比率を下げることでPSAによる脂肪酸の除去効果が高くなります。但しアセトン-ヘキサンの比率により農薬の回収率が変動する場合がありますのでご注意願います(下記「PSAと溶出溶媒による回収率(抜粋)」参照)。
①②

PSA-30mg
アセトン-ヘキサン (1/1)

PSA-Si-CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2
N-プロピルエチレンジアミン
一次相互作用：極性・陰イオン交換① Hexadecanoic acid

(3/7)

O

(1/4)

OH

② Linolenic acid
(15/85)

最適溶媒比
O

P

P

P

P

P

標準試料

P

OH

P：ポリエチレングリコール
R.T. (min:sec)

ほ う れ ん 草 に お け る PS A と 溶 出 溶 媒 （ ア セ ト ン - ヘ キ サ ン ） に よ る S C A N ト ー タ ル イ オ ン ク ロ マ ト グ ラ ム の 比 較
PS A と 溶 出 溶 媒 に よ る 回 収 率 ( 抜 粋 )試料：ほうれんそう
添加濃度：試料中0.05ppm(抽出後添加)回収率の全データはHPの「食品中残留農薬分析における固相抽出法を用いた自動前処理装置の開発-第3法-」をご覧くだ
さ い (http://www.aisti.co.jp/common/pdf/ss10001p.pdf) 。 な お こ れ ら の デ ー タ は 一 例 で あ り 必 ず し も 分 析 結 果 を保証するものではありません。回収率は事前にご確認されますようお願いします。
参考文献：佐々野ら,「食品中残留農薬分析における固相抽出法を用いた自動前処理装置の開発-第3報‐」,第100日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.52

404,2)(2)STQ-GC-B法の精製
シリカゲル（SI）と溶出溶媒による精製効果
S I は カ フ ェ イ ン な ど 極 性 夾 雑 成 分 を 除 去 し ま す 。 下 図 は 抹 茶 の 例 で す 。 G CS ( グ ラ フ ァ イ ト カ ー ボ ン ) で 除
去できなかっ たカフェイ ン が SIでは除 去できて いま す 。さらにアセ トンの比率 を下げることで SIに よる カ
フェインの除去効果が高くなります。但しアセトン-ヘキサンの比率により農薬の回収率が変動する場合がありますのでご注意願います(下記「SI＋PSAと溶出溶媒による回収率(抜粋)」参照)。
O① Cafeine

SI
①

N

N

-Si-OH
活性シリカゲル
一次相互作用：極性O

N

N

他法 GCS-20mg+PSA-30mg
トルエン-ACN (1/3)①

PSA-30㎎
アセトン‐ヘキサン(1/4)

本法 SI-30mg+PSA-30mg
アセトン-ヘキサン (1/1)
SI-30㎎＋PSA-30㎎
アセトン‐ヘキサン(1/4)

(3/7)

(1/4)

最適溶媒比
緑茶におけるSIのカフェイン除去効果

R.T. (min:sec)

SIを使用することで同じ溶媒比でもカフェインの除去効果が見られる抹茶のSI+PSAと溶出溶媒アセトン-ヘキサンによるSCANトータルイオンクロマトグラムの比較

S I ＋ PS A と 溶 出 溶 媒 に よ る 回 収 率 ( 抜 粋 )試料：抹茶
添加濃度：試料中0.05ppm(抽出後添加)回収率の全データはHPの「食品中残留農薬分析における固相抽出法を用いた自動前処理装置の開発-第3法-」をご覧くだ
さ い (http://www.aisti.co.jp/common/pdf/ss10001p.pdf) 。 な お こ れ ら の デ ー タ は 一 例 で あ り 必 ず し も 分 析 結 果 を保証するものではありません。回収率は事前にご確認されますようお願いします。

参考文献：佐々野ら,「食品中残留農薬分析における固相抽出法を用いた自動前処理装置の開発-第3報‐」,第100日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.52

414,2)(2)STQ-GC-B法の精製
SAXと溶出溶媒による精製効果
SAXは陰イオン夾雑成分を除去する一方でオレンジでは下図のように2-ヘキサデカノイルグリセロールやフラボノイド類の除去にも効果があります。アセトンの比率を下げることでSAXによる2-ヘキサデカノイル
グリセロールやフラボノイド類の除去効果が高くなります 。但しアセトン-ヘキサンの比率により農薬の回収率が変動する場合がありますのでご注意願います (下記「SAX＋PSAと溶出溶媒による回収率(抜粋)」参照)。
SAX-30mg+PSA-30mg
アセトン-ヘキサン (1/1)

②

SAX

①

-Si-CH2CH2CH2N⊕-(CH3)3
トリメチルアミノプロピル
一次相互作用：陰イオン交換(3/7)① 2-Hexadecanoyl glycerol
OH

(1/4)

O
O

HO

(15/85)最適溶媒比② フラボノイド類
O

O

(1/9)

O
O

O
O

O

R.T. (min:sec)

オ レ ン ジ に お け る S A X +PS A と 溶 出 溶 媒 （ ア セ ト ン ‐ ヘ キ サ ン ） に よ る S C A N ト ー タ ル イ オ ン ク ロ マ ト グ ラ ム の 比 較

S A X ＋ PS A と 溶 出 溶 媒 に よ る 回 収 率 ( 抜 粋 )試料：オレンジ
添加濃度：試料中0.05ppm(抽出後添加)回収率の全データはHPの「食品中残留農薬分析における固相抽出法を用いた自動前処理装置の開発-第3法-」をご覧くだ
さ い (http://www.aisti.co.jp/common/pdf/ss10001p.pdf) 。 な お こ れ ら の デ ー タ は 一 例 で あ り 必 ず し も 分 析 結 果 を保証するものではありません。回収率は事前にご確認されますようお願いします。
参考文献：佐々野ら,「食品中残留農薬分析における固相抽出法を用いた自動前処理装置の開発-第3報‐」,第100日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.52

424,2)(2)STQ-GC-B法の精製
グラファイトカーボン（GCS）と溶出溶媒による精製効果
G CS は 色 素 ( ク ロ ロ フ ィ ル ) や フ ラ ボ ノ イ ド 類 と い っ た 平 面 構 造 の 夾 雑 成 分 を 除 去 し ま す 。 下 図 は オ レ ン ジの 例 で す 。 P S A の み で は 除 去 で き な か っ た フ ラ ボ ノ イ ド 類 の 除 去 に 効 果 が あ り ま す。 但 し 、 平 面 構 造 の 目 的物質(農薬)も保持されるのでご注意願います 。その場合は溶出溶媒にトルエンを使用します 。トルエンの比率を下げることで精製効果は高くなります。対象農薬がアセトン-ヘキサンのみで溶出される場合はトルエンは不要です。トルエン‐アセトン-ヘキサンの比率により農薬の回収率が変動する場合がありますのでご注
意願います(下記「GCS＋PSAと溶出溶媒による回収率 (抜粋)」参照)。

GCS①

PSA-30mg
アセトン-ヘキサン(15/85)

グラファイトカーボン
一次相互作用：平面構造、無極性※GCSとGCKは製品名の違いであり、ともにグラファイトカーボンです。
現在はGCKのみの販売となっております。

GCS-20mg+PSA-30mg
トルエン-アセトン-ヘキサン(15/15/70)① フラボノイド類
GCS-20mg+PSA-30mg
トルエン-アセトン-ヘキサン(10/15/75)

O

O

O
O

O
O

GCS-20mg+PSA-30mg
トルエン-アセトン-ヘキサン(0/15/85)

O

R.T. (min:sec)

オ レ ン ジ に お け る G C S + PS A と 溶 出 溶 媒 （ ア セ ト ン ‐ ヘ キ サ ン ） に よ る S C A N ト ー タ ル イ オ ン ク ロ マ ト グ ラ ム の 比 較

G C S ＋ PS A と 溶 出 溶 媒 に よ る 回 収 率( 抜 粋 )試料：ほうれんそう
添加濃度：試料中0.05ppm(抽出後添加)回収率の全データはHPの「食品中残留農薬分析における固相抽出法を用いた自動前処理装置の開発-第3法-」をご覧くだ
さ い (http://www.aisti.co.jp/common/pdf/ss10001p.pdf) 。 な お こ れ ら の デ ー タ は 一 例 で あ り 必 ず し も 分 析 結 果 を保証するものではありません。回収率は事前にご確認されますようお願いします。
参考文献：佐々野ら,「食品中残留農薬分析における固相抽出法を用いた自動前処理装置の開発-第3報‐」,第100日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.52

434,2)(2)STQ-GC-B法の精製
参考：しょうがにおける固相と溶出溶媒の精製効果
ここではしょうがにおける固相と溶出溶媒及び比率の違いによる精製効果の比較をご紹介します 。下図は生姜でPSA またはSAX+PSAの固相を用いた場合のトータルイオンクロマトグラム (TIC)の比較です。SAXを追加することや溶出溶媒のアセトンの比率を下げることで精製効果が高まります。但し使用する固相と溶出溶媒及び比率により農薬の回収率が変動する場合がありますのでご注意願います。

A

①

PSA
アセトン-ヘキサン (3/7)②① ② Gingerol

B

PSA-30mg+PSA-30mg(15/85)C

SAX-30mg+PSA-30mg(15/85)D

PSA-30mg+PSA-30mg
(1/9)

E

SAX-30mg+PSA-30mg
(1/9)

F

PSA-30mg(5/95)

O

OH

HO
O

R.T. (min:sec)

しょうがの各固相と溶出溶媒アセトン‐ヘキサンによるSCANトータルイオンクロマトグラムの比較
精製効果はTICだけでなく、定量イオンクロマトグラムでも見られます 。下図はしょうがにおけるメフェ
ンピルジエチルとイプロジオンの定量イオンクロマトグラムです。精製が不十分な場合はピークが後ろにずれます(A)。またBとC、EとFではTICでは大きな違いは見られませんが定量イオンクロマトグラムでは PSA
のみのB及びFではピークが後ろにずれる傾向がみられることからSAXを使用した方が精製効果が高まることがわかります。

Mefenpyr-diethyl

標準試料
A

PSA(3/7)

B

PSA+PSA(15/85)

C

SAX+PSA(15/85)

D

PSA+PSA(1/9)

E

SAX+PSA(1/9)

F

PSA(5/95)

Mefenpyrdiethyl

R.T. (min:sec)

Iprodione

R.T. (min:sec)

しょうがにおける各固相と溶出溶媒アセトン‐ヘキサンによる定量イオンクロマトグラム比較

参考文献：佐々野ら,「食品中残留農薬分析における固相抽出法を用いた自動前処理装置の開発-第3報‐」,第100日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.52

44

45

4,2)(3)STQ-LC法 (自動) (201809 ver.）4,2)(3) STQ-LC法 (自動)①エバポレーターによる濃縮操作なし

前処理の
ポイント

LC対象農薬を全自動固相抽出装置(ST-L400)を使用して精②通知一斉試験法Ⅰ法、Ⅱ法を同時分析③1検体の処理時間約１0分

製します。

精製フロー

【ST-L400の工程】

全自動固相抽出装置ST-L400

目的物質(農薬など)
夾雑成分(1)試料負荷
コンディショニング
ACN②2%ギ酸含有ACN①抽出液(ACN層)

Smart-SPE C18-50㎎：精製

C18-50 mg：精製

Smart-SPE PSA-30㎎：精製

コンディショニング
ACN-水(8/2)

除去物質
・無～低極性夾雑成分
・クロロフィル
・高級脂肪酸エステル類
・高級アルコール類
・ステロール類など

サンプル
ループ
シリンジポンプ…❶③水

PSA-30 mg：精製

負荷[通液] 抽出液(ACN層) 0.5 mL 分取Mノズル

洗液 2 %ギ酸含有ACN 0.5 mL…❷

シリンジポンプ

農薬
流出液

添加 水 0.5 ｍL

…❶

…❷

除去物質
・イオン性夾雑成分
・高級脂肪酸・色素など

C18-30 mg：精製

…❸

除去物質
・低極性夾雑成分
・クロロフィル
・高級脂肪酸エステル類
・高級アルコール類
・ステロール類など

農薬
コンディショニング
ACN
水

…❸
(2)通液

Smart-SPE C18-30㎎：精製④ACN‐水(8/2)

通液 ACN-水(8/2) 0.5 mL…❹

C18-30 mg：精製
シリンジポンプ

定容：2 mL 水で調整…❺

測定：LC-MS/MS

農薬

自動前処理装置によるアプリケーションデータはこちらから自動前処理装置の動画はこちらから（Youtube）

46

…❹

除去物質
・低極性夾雑成分
・クロロフィル
・高級脂肪酸エステル類
・高級アルコール類
・ステロール類など

4,2)(3)STQ-LC法 (自動) (201809 ver.）
前処理フロー解説・留意点

測定条件例❶ (1)試料負荷❷❸

C18-50㎎で油やクロロフィル（緑色）などの無～低極性夾雑成分、PSA-30㎎で高級脂肪酸などのイオン性
夾雑成分が吸着除去され、農薬は通過し試験管に回収されます。

LC UHPLC(Nexera X2) (島津製作所)

このとき酸性農薬はPSAに保持されるため2％ギ酸含
有ACNを流すことでPSAに保持されたそれらの農薬をPSAから溶出させます。(下記「2%ギ酸含有ACNとACNの回収率比較」参照)

流速
グラジエント

分析カラム
移動相

カラム温度
注入量

酸性農薬を対象としない場合は、ギ酸は不要です。ア
セトニトリルのみを使用します。
2％ギ酸含有アセトニトリルはギ酸が揮発し濃度が低下すると酸性農薬が溶出不十分になり回収率が低下する
ため用時調製します。

Shim-pack FC-ODS,
内径2.0 mm x 長さ150 mm, 粒径3 μm
A液：0.5 ｍM 酢酸アンモニウム水溶液
B液：0.5 ｍM 酢酸アンモニウムメタノール溶液
0.2 mL/min
B Conc. 15%(0 min)-40%(1-3.5 min)50%(6 min)-55%(8 min)95%(17.5-30min)-15%(30.01-40 min)
40 ℃
2 µL(+40 µL水 共注入)

MS LCMS-8045 (島津製作所)
イオン化モード
ESI positive and negative

C18-50㎎＋PSA-30㎎からの流出液に水を添加し、ACNの濃度を下げた状態(約70％)でC18-30㎎に通液します。ACN濃度を下げてC18-30㎎に通液することでC18-50㎎では除去できなかった低極性夾雑成分を除去します。
このように2個のC18を使用して無～低極性の夾雑成分を除去することでLC-MS/MSで使用する分析カラム(ODS) へ の 負 担 を 軽 減 し ま す 。 詳 細 は p.48
「4,2)(4)STQ-LC法の精製」をご覧ください。

❹ (2)通液
C18-30㎎にACN-水(8/2)を通液することで一部ここに残っていた農薬を溶出します。

❺

LC-MS/MS測定では測定溶液の組成が感度やピーク
形状に影響するため標準溶液はサンプルと同じ組成での測定をお勧めします。
※極性・無極性といった表現は相対的なものです。

2%ギ酸含有ACNとACNの回収率比較(デコポン)
pKaが3～4付近で、官能基に-COOHをもつような酸性農薬
は、中性状態では解離してマイナスに帯電しているため、プラスに帯電したPSAに保持されます。溶出の際には2%ギ酸
ACNを用いて酸性状態にすることで酸性農薬を非解離にしてPSAから溶出します。一方ACNを用いた場合は酸性農薬は解離状態のままなのでPSAから溶出されず回収率が低下します。
Si-CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2

CH3
O
Cl

CH

＋

CO2H

＋

PSA

ｐKa
農薬名
Cloprop
Dichlorprop
Gibberellin
Imazaquin
MCPA
MCPB
Mecoprop
Naptalam

クロプロップ（農薬）

3.00
4.0
3.8
3.07
4.84
3.78
4.6

ギ酸アセトニトリル
ｐH3
回収率（％）
80
77
102
78
78
84
80
68

アセトニトリル
ｐH7
回収率（％）
15
24
4
9
12
17
18
15

pp.106-115「7,3)(2)イオン交換カラム」も併せてご覧ください。

参考文献：谷澤ら,「LC/MS/MSを用いた作物中残留農薬の迅速一斉分析法の検討」,第93日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.46
谷澤ら,「作物中残留農薬の迅速一斉分析法 –LC/MS/MS編– 」,第94日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.46

474,2)(4)STQ-LC法の精製
4,2)(4) STQ-LC 法の精製
C18精製におけるLC分析カラムの負担軽減
LCの測定カラムはODS(=C18)がよく使われています。一般的なグラジエント分析では1回のインジェクションの都度、最後に洗浄目的として一定時間溶媒比率を90％以上にし、無～低極性夾雑成分を分析カラムから溶出、除去する必要があります。
STQ-LC法では、これらの夾雑成分を除去することで、測定カラムにこれらの夾雑成分が入らないようにしています。これにより、洗浄時間が不要となり、測定時間の短縮を図ることができます。

【2個のC18による無~低極性夾雑成分の除去】

試料：ほうれんそう
ステロール類Smart-SPE C18-50

1つ目(C18-50)は抽出
液(ACN)で通液し、無極性の夾雑成分が保持されます。

脂肪酸エステル類
高級アルコール類

Smart-SPE PSA-30
C18精製無高

100%ACN

Smart-SPE C18-30

80%ACN/水

2 つ 目 (C18-30) は
ACN-水(8/2)で通液するため溶液の極性が高くなります。そのため1つ目で保持されなかった無～低極性の夾
雑成分が2つ目のC18に保持されるようになります。

67%ACN/水50%ACN/水 低

ＡＣN濃度による精製効果違い
C18による除去成分＜
80%ACN/水100%ACN●無～低極性夾雑成分●クロロフィル
●高級脂肪酸エステル類●高級アルコール類●ステロール類など【LC測定カラムにおける無極性夾雑成分除去のイメージ】
前処理で固相C18を用いない場合
ACN：水（5:95）

グラジエント分析

ACN：水（95:5）

ACN：水
（4:1）

夾雑成分

（極性）

（無極性）

無極性
夾雑成分

前処理で固相C18による精製をした場合
夾雑成分

（極性）

LCで使用されている分離
カラムは「ODS」で、固相C18と同じ充填剤なので、予め固相C18で精製することでLCカラムへの負荷を低減します。

メリット

C18ミニカラムによる精製効果

48● LCカラムの劣化を防ぐ● ピーク形状の維持● 分析時間の短縮

ACN濃度3）手動法による精製

STQ法前処理キット

494,3)(1)STQ-GC-B法 (手動) (201809 ver.）①エバポレーターによる濃縮操作なし

4,3)(1) STQ-GC-B法 (手動)

前処理の
ポイント

GC対象農薬を手動で精製します。農薬を保持する際には通液圧力を考慮しポリマー系のPBXを使用します。

②精製固相の追加と溶出溶媒の変更が可能③操作時間は約30分/4検体(コンディショニング等準備時間は除く)

前処理フロー
前処理フロー解説・留意点…❶

コンディショニング
アセトン 2 mL(洗浄、出し切る)
ACN-水(9/1) 2 mL
(活性化、出し切らない)

Smart-SPE C18-50㎎：精製

負荷[通液] 抽出液(ACN層) 0.5 mL 分取
通液 ACN-水(9/1) 0.4 mL
流出液

…❷*

添加 水 1.5 mL
試験溶液①

…❸

Smart-SPE PBX-10㎎：保持コンディショニング
アセトンｰヘキサン(15/85) 2 mL
(洗浄、出し切る)
アセトン 2 mL(洗浄、出し切る)
水 2 mL(活性化、出し切らない)❶ 固相活性化のコンディショニングについて
シリカ系充填剤は、シリカ細孔が溶媒で十分満たされた状態を保つために固相活性化の溶液は出し切らずに少し残します。
❷ 流出液に水を添加しACN濃度を約35％に下げた試験
溶液①をPBXに負荷します。この段階では低極性農薬
がPBXに保持され、中～高極性農薬は流出し試験管に回収されます。
❸ PBXはポリマー系の表面修飾ポリスチレンジビニルベ
ンゼン親水性/疎水性バランス充填剤の固相です。手動での通液操作を円滑にするためにC18ではなくポリマー系を使用します(p.38、p.51参照)❹

負荷[保持] 試験溶液①流出液
添加 10%NaCl水溶液 10 mL

…❹

試験溶液②

はPBX-10㎎に保持されませんのでLC法で対応します。

Smart-SPE PBX-10㎎：再保持❺

PBX-10㎎に残った水分が溶出液（GC-MS測定液）に混入しないように固相を乾燥(吸引)します。カート
リッジやマニホールドに連結するためのアダプターに付着している水滴もふき取ります。

❻

PBX-10㎎から保持した目的物質を溶出します。そのときPBX-10㎎の下にPSA等の固相を連結することで高級脂肪酸などのイオン性夾雑成分を除去します。
溶出時には夾雑成分の種類に応じて固相を追加したり溶出溶媒を変更することでより精製効果を高めることができます。(下記「精製固相の追加」、pp.38-44参照)❼

これはGC-MSに大量注入(25μL)する場合の添加量です。注入量が異なる場合はGCに注入するPEGの絶対量が500 ng、フェナントレンd体が0.5 ngになるように添加量を変更してします。※フェナントレンd体は測定時の感度変動確認のために添加しています。定量値補正には使用していないため添加は必須ではありません。

❽
測定条件はp.37参照

標準溶液は試料溶液と同じ溶媒組成にすることを推奨します。

* 特許第4780109号※極性・無極性といった表現は相対的なものです。

負荷[保持] 試験溶液②
洗浄 水 2 mL……❺

固相乾燥(吸引) 3分

Smart-SPE PBX-10㎎
Smart-SPE PSA-30㎎：精製

流出液に10％NaCl水溶液を添加してACN濃度を約7％に下げ、且つ塩析効果を持たせた試験溶液②を試験
溶液①を負荷したのと同じPBXに負荷します。それにより試験溶液①で保持できなかった中～高極性農薬を再保持させます。一度にACN濃度を下げると低極性農薬がリザーバー等に吸着するため2回にわけてACN濃度を変えて負荷します。
このとき高極性農薬のアセフェートやメタミドホス

コンディショニング
アセトン 2 mL(洗浄、出し切る)
アセトン-ヘキサン(15/85) 2 mL
(活性化、出し切らない)…❻

溶出 アセトン-ヘキサン(15/85) 1 mL
溶出液
添加 0.1%PEG300‐1ppmフェナントレンd体
混合アセトン溶液 20 μL
定容：1 mL アセトン-ヘキサン(15/85)で調整

測定：GC-MS (大量注入25 μL注入)…❼…❽

精製固相の追加
B法では試料に含まれる夾雑成分に応じて精製固相を追加したり溶出溶媒を変更することができます。
ただし、固相を追加して精製効果が向上すると一部農薬の回収率が低下する可能性があります。目的物質の回収率は事前にご確認願います。

●脂肪酸が多い試料の場合(例：古い玄米)SAX-30 mg＋PSA-30 mg 溶出 アセトン-ヘキサン（15/85）1 mL※アセトン比を下げることで精製効果は高まりますが、農薬によっては十分に回収されない場合があります。
●カフェインが多い試料の場合(例：茶)SI-30 mg＋PSA-30 mg 溶出 アセトン-ヘキサン（20/80）1 mL ※SI=シリカゲル※アセトン比を20%以下にすることでカフェインの除去効果が高まります。
●色素やフラボノイドが多い試料の場合(例：柑橘類)
GCK-20 mg＋PSA-30 mg 溶出 トルエン-アセトン-ヘキサン（５/10/85）1 mL※GCK＝グラファイトカーボン
キノメチオネート
N
S※トルエンを使用してもキノメチオネートのように回収率が低い平面構造の
O
CH
S
N
農薬がありますのでご注意願います。
3*特許第4780109号

50

4,3)(1)STQ-GC-B法 (手動) (201809 ver.）
操作方法の解説

目的物質(農薬など)
夾雑成分

C18で無～低極性の夾雑成分を除去して農薬はスルーさせます。

① C18で精製
抽出液0.5 mLをC18へ負荷

リザーバー(小)C18

流出液を試験管(小)に回収試験管(小)

農薬②PBXへ農薬を保持（2段階保持）【保持1回目】
試料を水で希釈後、PBXに通水し低極性農薬を保持させます。

【保持1回目】

リザーバー(小)①の流出液に水を加えてACN濃度を約35%にしてPBXに通液流出液を試験管(大)に回収

除去物質
・無～低極性夾雑成分
・クロロフィル
・高級脂肪酸エステル類
・高級アルコール類
・ステロール類など

PBX

同じPBX

低極性農薬を保持試験管(大)【保持2回目】
流出液にNaCl水溶液を添加後、再びPBXに通液し、中～高極性農薬を再保持させます。

【保持2回目】
保持1回目の流出液にNaCl水溶液
を加えてACN濃度を約7%とし再度PBXに通液する。

リザーバー(大)低極性～高極性まで幅広い農薬を同じカラムに保持

2回目の保持はリザーバー(大)に変
更し、吸引マニホールドを使用

除去物質
・高極性夾雑成分
・糖類
・水など

流出液は廃棄B法ではアセフェートやメタミドホスなど高極性農薬はPBXに保持されませんのでLC法で対応します③固相乾燥(吸引)固相の中に水分が残っていると、溶出溶媒と分離し結果に影響を与える場合があるのでので吸引マニホールドで吸引し固相を乾燥する。

PBX：ポリマー系の表面修飾ポリスチレンジビニルベンゼン親水性/疎水性バランス充填剤の固相で、ここでは農薬を保持させるために使用します。

ガラスリザーバー
アセトンによるリザーバーからの不純物の溶出を防ぐため

固相乾燥(吸引)前に固相やアダプタの水分をキムワイプや綿棒で取り除く。
固相はリザーバーを外して固相乾燥(吸引)する。

PSAでは高級脂肪酸や色素等を除去し、農薬はスルーさせます。

④溶出＆PSAで精製

PBX

PBXの下にPSAを連結させ、アセトン-ヘキサン(15/85) 1 mLで溶出

PSA

除去物質
・イオン性夾雑成分
・高級脂肪酸
・色素など
メス試験管

農薬

51

4,3)(2)STQ-LC法 (手動) (201809 ver.）4,3)(2) STQ-LC法 (手動)

前処理の
ポイント

LC対象農薬を手動で精製します。

①エバポレーターによる濃縮操作なし②通知一斉試験法Ⅰ法、Ⅱ法を同時分析③操作時間は約１5分/４検体(コンディショニング等準備時間は除く)

前処理フロー
前処理フロー解説・留意点…❶

コンディショニング
ACN 2 mL(洗浄・活性化、出し切る)❶

本来シリカ系充填剤の場合はシリカ細孔が溶媒で十分満たされた状態を保つために固相活性化の溶液は出し切らずに少し残しますが、メス試験管に回収した流出液が2 mLを超えないようにするため、ここでは固相活性化に用いた溶液を出し切ります。
コンディショニング後は固相が乾燥しないように速やかに溶液を負荷します。

❷

C18-50㎎で油やクロロフィル（緑色）などの、無～低極性夾雑成分、PSA-30㎎で高級脂肪酸などのイオン性夾雑成分が吸着除去され、農薬は通過し試験管に回収されます。

Smart-SPE C18-50㎎：精製
コンディショニング
ACN-水(8/2) 2 mL (洗浄、出し切る)

Smart-SPE PSA-30㎎：精製

負荷[通液] 抽出液(ACN層) 0.5 mL 分取

通液 2 %ギ酸含有ACN 0.5 mL

…❷

…❸

流出液

添加 水 0.5 ｍL

このとき酸性農薬はPSAに保持されるため2％ギ酸含
有ACNを通液することでPSAから溶出させます。(p.53「2%ギ酸含有ACNとACNの回収率比較」参照)

…❹

試験溶液①

❸

Smart-SPE C18-30㎎：精製

コンディショニング
ACN 2 mL(洗浄、出し切る)
ACN-水(8/2) 2 mL
(活性化、出し切る)❹

負荷[通液] 試験溶液①

通液 洗液 ACN-水(8/2) 0.5 mL

定容：2 mL 水で調整…❺…❻

LC-MS/MS
測定条件はp.47をご覧ください

酸性農薬を対象としない場合は、ギ酸は不要です。ア
セトニトリルのみを使用します。
2％ギ酸含有アセトニトリルはギ酸が揮発し濃度が低下すると酸性農薬が溶出不十分になり回収率が低下する
ため用時調製します。

C18-50㎎＋PSA-30 mgからの流出液に水を添加し、ACNの濃度を下げた状態(約70％)でC18-30㎎に通液します。 ACN濃度を下げてC18-30㎎に通液することでC18-50㎎では除去できなかった低極性夾雑成分を除去します。
このように2個のC18を使用して無～低極性の夾雑成分を除去することでLC-MS/MSで使用する分析カラム(ODS) へ の 負 担 を 軽 減 し ま す 。 詳 細 は p.48
「4,2)(4)STQ-LC法の精製」をご覧ください。

❺

試験溶液①負荷後のC18-30㎎にACN-水(8/2)を通液することで一部ここに残っていた農薬を溶出します。

❻

LC-MS/MS測定では測定溶液の組成が感度やピーク
形状に影響するため標準溶液はサンプルと同じ組成での測定をお勧めします。
※極性・無極性といった表現は相対的なものです。

【コンディショニングについて】

手動法によるC18‐50とPSAのコンディショニングは両者を連結し下記手順で行っても構いません。ポイントはPSAに先に
ACN-水(8/2) を流すことです。
コンディショニング
ACN-水(8/2) 2 mL
(洗浄、出し切る)
ACN 2 mL(活性化、出し切る)

Smart-SPE C18-50㎎：精製
Smart-SPE PSA-30㎎：精製

524,3)(2)STQ-LC法 (手動) (201809 ver.）
操作方法の解説

目的物質(農薬など)
夾雑成分①C18＋PSAで精製
抽出液0.5 mLをC18＋PSAへ負荷

C18で無～低極性の夾雑成分、PSAで脂肪酸などを除去し、農薬はスルーさせます。しかし、一部の酸性農薬はPSAに保持されます。
除去物質
・無～低極性夾雑成分
・クロロフィル
・高級脂肪酸エステル類
・高級アルコール類
・ステロール類など流出液を試験管(小)に回収

除去物質
・イオン性夾雑成分
・高級脂肪酸・色素など

C18-50②C18＋PSAから農薬を溶出

PSA

一部の酸性農薬が保持される2%ギ酸ACNを
C18+PSAへ通液し、C18＋PSA

試験管(小)

から農薬を溶出農薬
PSAに保持された酸性農薬は酸性の2%ギ酸含有ACNを通液する
ことにより酸性農薬を非解離状態にし、PSAから溶出させます。
（下図参照）

流出液を試験管(小)に回収③C18で再度精製
水を0.5 mL添加し、試料中の試料中の溶媒濃度を約70%に下げてC18に通液することで最初のC18で除去できなかった低極性夾雑成分を除去します。またC18から溶出していなかった農薬も溶出します。

溶媒濃度を約70%に下げる。

除去物質
・低極性夾雑成分
・クロロフィル
・高級脂肪酸エステル類
・高級アルコール類
・ステロール類など

C18-30C18へ通液
メス試験管

農薬
流出液をメス試験管に回収

2%ギ酸含有ACNとACNの回収率比較(デコポン)
pKaが3～4付近で、官能基に-COOHをもつような酸性農薬
は、中性状態では解離してマイナスに帯電しているため、プラスに帯電したPSAに保持されます。溶出の際には2%ギ酸
ACNを用いて酸性状態にすることで酸性農薬を非解離にしてPSAから溶出します。一方ACNを用いた場合は酸性農薬は解離状態のままなのでPSAから溶出されず回収率が低下します。
Si-CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2

CH3
O
Cl

CH

＋

CO2H

＋

PSA

ｐKa
農薬名
Cloprop
Dichlorprop
Gibberellin
Imazaquin
MCPA
MCPB
Mecoprop
Naptalam

クロプロップ（農薬）

3.00
4.0
3.8
3.07
4.84
3.78
4.6

ギ酸アセトニトリル
ｐH3
回収率（％）
80
77
102
78
78
84
80
68

アセトニトリル
ｐH7
回収率（％）
15
24
4
9
12
17
18
15

pp.106-115「7,3)(2)イオン交換カラム」も併せてご覧ください。

参考文献：谷澤ら,「LC/MS/MSを用いた作物中残留農薬の迅速一斉分析法の検討」,第93日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.46
谷澤ら,「作物中残留農薬の迅速一斉分析法 –LC/MS/MS編– 」,第94日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.46

53

54

5. STQ法の応用例
1）残留農薬（1）STQ-GC-B法アレンジ法①大豆②アルコール飲料③オリーブオイル④畜水産物(脂質の多い試料)（2）個別分析法①グリホサート・グルホシネート②ジチオカルバメート系農薬③TPN・キャプタン・カプタホール・ホルペット④ネオニコチノイド
2）動物用医薬品（1）一斉分析（2）マラカイトグリーン
3）カビ毒

アフラトキシン

4）その他

メラミン

5）【参考】STQ-GC‐A法

555,1)(1)①STQ-GC-B法アレンジ法 大豆(202010ver.)5,1)(1)① 大豆
前処理の
ポイント

大豆では遠心分離後のアセトニトリル層が少量になる場合があります。十分なアセトニトリル層を確保し、定量性と抽出効率を高めるために繰り返し抽出定容法を行います。

前処理フロー①セラミックホモジナイザーの使用②振とう時間の延長③遠心分離前の静置④繰り返し抽出定容法

前処理フロー解説・留意点

試料採取 5 g…❶❶

添加 水 10 mL
添加 ACN 10 mL
ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分

セラミックホモジナイザー 2個
添加 NaCl 1 g…❷

試料を斜めにして水を入れると混合しやすくなります。また水添加後は遠沈管を逆さにして遠沈管の底にあった試料を蓋側に落とし水とよく混合します。

添加 クエン酸3Na2水和物 1 g
添加 クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5 g
振とう溶解 15秒
添加 MgSO4(無水) 4 g

水…❸
静置 5分 …❹

混和

激しく振とう 2分

繰り返し抽出遠心分離 3,500 rpm, 5分
残留物(試料層・水層）

ACN層①

試料を斜めにして水を入れる❷

試料と塩類がよく混合するようにセラミックホ
モジナイザーを2個入れます。

❸

大豆は混ざりにくいので2分間激しく振とうします。
このとき試料が遠沈管内で動いていることをご確認願います。

❹

振とう後は発熱します。常温に戻るまで5分間そのま
ま放置してから遠心分離します。

添加 ACN (定容量-ACN層①量) mL
振とう

…❺

1分

底の試料を逆さにして底の試料を落として混ぜる

遠心分離 3,500 rpm, 5分
ACN層②

①②合算

定容：15 mL ACNで調整抽出液(ACN層)
抽出液(ACN層) 1.5 mL 分取
添加 ACN 0.5 mL試験溶液 2 mL
全自動固相抽出装置ST-L400

Smart-SPE C18-50㎎：精製❷❸❹の操作によりACN層を増やすことができます。

コンディショニング
アセトン
ACN-水(9/1)

負荷[通液] 試験溶液 0.5 mL 分取
洗液 ACN-水(9/1) 0.4 mL
流出液
添加 10%NaCl水溶液 約12 mL
コンディショニング
アセトン
水
Smart-SPE C18-50㎎：保持

洗浄 水 1 mL❺

本法では15 mLに定容しますので、例えばACN層①の量が6 mLの場合2回目の抽出にはACNを(15-6=9) mL
添加します。

❻

これは大量注入(25μL)する場合の添加量です。注入
量が異なる場合はGCに注入するPEGの絶対量が500 ng、
フェナントレンd体が0.5 ngになるように添加量を変更します。
※フェナントレンd体は測定時の感度変動確認のために添加しています。定量値補正には使用していないため添加は必須ではありません。

❼

標準溶液は試料溶液と同じ溶媒組成にすることを推奨します。

固相乾燥(窒素ガス) 2分
Smart-SPE C18-50㎎
Smart-SPE PSA-30㎎：精製

コンディショニング
アセトン
アセトン-ヘキサン(15/85)

溶出 アセトン-ヘキサン(15/85) 1 mL
溶出液
添加 0.1%PEG300‐1ppmフェナントレンd体
混合アセトン溶液 20 μL…❻…❼

定容：1 mL アセトン-ヘキサン(15/85)で調整

参考文献：佐々野ら,「STQ法における繰り返し抽出定容法の検討」,第105回日本食品衛生学会学術講演会要旨集

測定：GC-MS (25 µL大量注入)
565,1)(1)②STQ-GC-B法アレンジ法 アルコール飲料(202010ver.)5,1)(1)② アルコール飲料
ワインや日本酒などにはアルコール(エタノール)が含まれて

前処理の
ポイント

います。通常通りアセトニトリル10 mLで抽出を行った場合、遠心後のアセトニトリル層にエタノールが移行することで10繰り返し抽出定容法

mLを超え、希釈されてしまいます。そこで本法では繰り返し抽出定容法をご紹介します。

前処理フロー …❶

前処理フロー解説・留意点

試料採取 10 g❶

添加 ACN 10 mL
混和
添加 NaCl 1 g

アルコール飲料では直接固相に負荷して精製した
場合、一部の低極性農薬が低回収率となります。これは試料の極性が高いため容器等に吸着した可能性が考えられます。そのためACN抽出を行いました。

添加 クエン酸3Na2水和物 1 g
日本酒における前処理の違いによる回収率の比較例

添加 クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5 g

試料を直接固相に負荷

繰り返し抽出定容法

回収率(％)

回収率(％)

エトフェンプロックス

31

82

6.9

テフルトリン

37

84

6.4

プロチオホス

41

84

5.7

成分名

振とう溶解 10秒
添加 MgSO4(無水) 4 g
振とう 1分
遠心分離 3,500 rpm, 5分

logPow

繰り返し抽出❷残留物(試料層・水層）

ACN層①

添加 ACN(定容量- ACN層①量) mL
振とう

…❷

1分

ACN抽出を行ったところ試料に含まれるエタノールの影響により添加量の10 mLを超えてしまいます。そこで遠心分離後の残留物に再度ACNを添加し、繰り返
し抽出を行い20 mLに定容します。

遠心分離 3,500 rpm, 5分
ACN層②

①②合算

定容：20 mL ACNで調整
約12.5 mL

約10 mL※

抽出液(ACN層)
全自動固相抽出装置ST-L400

Smart-SPE C18-30㎎：精製

コンディショニング
アセトン
ACN-水(9/1)

ACN層①

…❸

負荷[通液] 抽出液(ACN層) 0.5 mL 分取
洗液 ACN-水(9/1) 0.4 mL❸

アルコール飲料では低極性夾雑成分が少ないため
C18-30 mgを使用します。

❹

これは大量注入(25μL)する場合の添加量です。注入
量が異なる場合はGCに注入するPEGの絶対量が500 ng、
フェナントレンd体が0.5 ngになるように添加量を変更します。
※フェナントレンd体は測定時の感度変動確認のために添加しています。定量値補正には使用していないため添加は必須ではありません。

流出液
添加 10%NaCl水溶液 約12 mL
コンディショニング
アセトン
水
Smart-SPE C18-50㎎：保持

洗浄 水 1 mL
固相乾燥(窒素ガス) 2分
Smart-SPE C18-50㎎
Smart-SPE PSA-30㎎：精製

ACN層②※ACN層①を分取した残りと2回目の抽出で添加した7.5 mLの合計

コンディショニング
アセトン
アセトン-ヘキサン(15/85)❺

溶出 アセトン-ヘキサン(15/85) 1 mL

標準溶液は試料溶液と同じ溶媒組成にすることを推奨
します。

溶出液
添加 0.1%PEG300‐1ppmフェナントレンd体
混合アセトン溶液 20 μL

参考文献：島ら,「加工食品中残留農薬のSTQ法による分析適合性の検討」,
第43回農薬残留分析研究会講演要旨集pp.173-182…❹
定容：1 mL アセトン-ヘキサン(15/85)で調整 …❺
測定：GC-MS (25 µL大量注入)575,1)(1)③STQ-GC-B法アレンジ法 オリーブオイル(202010ver.)5,1)(1)③ オリーブオイル
オリーブオイルは一価の不飽和脂肪酸であるオレイン酸を

前処理の
ポイント

多く含む油脂であり、抽出・精製においてその除去が課題となります。本法では遠心分離及び冷凍、溶出溶媒比の変更によりオレイン酸を除去します。…❶

前処理フロー①抽出効率向上のため試料採量を少なくする②遠心分離と冷凍により油層を分離③アセトン比率を下げてPSAから溶出

前処理フロー解説・留意点

試料採取 2 g❶

添加 ACN 10 mL
手で振とう

オレイン酸は動物性脂肪や植物油に多く含まれている一価の不飽和脂肪酸です。
オレイン酸

添加 水 10 mL

❷

手で振とう
添加 NaCl 1 g

遠心分離後、試料を冷凍することで油層が固まり、分離しやすくなります。

添加 クエン酸3Na2水和物 1 g
添加 クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5 g
振とう溶解 10秒
添加 MgSO4(無水) 4 g
油層

振とう 1分遠心分離後

冷凍後

遠心分離 3,500 rpm, 5分
冷凍(-20℃,90分)❸…❷

アセトンの比率を下げることでPSAによるモノオレインの除去効果が高くなります。
PSAにおける溶出溶媒による精製効果の比較

抽出液(ACN層)
モノオレイン

全自動固相抽出装置ST-L400

Smart-SPE C18-50㎎：精製

コンディショニング
アセトン
ACN-水(9/1)

負荷[通液] 抽出液(ACN層) 0.5 mL 分取
洗液 ACN-水(9/1) 0.4 mL(15/85)

流出液
添加 10%(w/w)NaCl水溶液 約12 mL
コンディショニング
アセトン
水
Smart-SPE C18-50㎎：保持(10/90)

洗浄 水 1 mL
固相乾燥(窒素ガス) 2分
Smart-SPE C18-50㎎

Smart-SPE PSA-30㎎：精製❹

これは大量注入(25μL)する場合の添加量です。注入
量が異なる場合はGCに注入するPEGの絶対量が500 ng、
フェナントレンd体が0.5 ngになるように添加量を変更します。
※フェナントレンd体は測定時の感度変動確認のために添加しています。定量値補正には使用していないため添加は必須ではありません。

❺

標準溶液は試料溶液と同じ溶媒組成にすることを推奨します。

コンディショニング
アセトン
アセトン-ヘキサン(10/90)

溶出 アセトン-ヘキサン(10/90) 1 mL…❸

溶出液
添加 0.1%PEG300‐1ppmフェナントレンd体
混合アセトン溶液 20 μL…❹
定容：1 mL アセトン-ヘキサン(10/90)で調整 …❺

参考文献：佐々野ら,「自動前処理装置を用いたオリーブオイル中の残留農薬迅速一斉分析法の検討」,第104日本食品衛生学会学術講演会
要旨集p.98

GC-MS測定 (25 µL大量注入)585,1)(1)④STQ-GCB法アレンジ法 畜水産物(脂質の多い試料) (202010ver.)5,1)(1)④ 畜水産物(脂質の多い試料)
畜水産物など脂肪を多く含む試料ではアセトニトリルに脂

前処理の
ポイント

肪が溶解しないためアセトンを用いて農薬の抽出を行います。
また遠心分離により脂肪層を分離し、その後の冷凍固化によ①アセトンによる抽出②遠心分離・冷凍による脂肪の除去

りその大部分を除去します。

前処理フロー

前処理フロー解説・留意点

試料採取 10 g
添加 水(10-試料の含水量) mL
添加 アセトン 10 mL❶

試料の水分含量が80％未満の場合は水を添加します 。
水は試料の水分と合わせて水が10 g相当となるように添加します(p.15(1)参照)。

❷

脂肪を多く含む畜水産物では脂肪を溶解しその中の農薬を抽出するために抽出溶媒にアセトンを使用します。
下図は脂肪がアセトンに溶解することを確認するため牛脂をアセトンまたはアセトニトリルに溶解し比較したものです。牛脂にアセトンを添加すると全体が白濁して混和しますが、アセトニトリルでは遠沈管(PPチューブ)の表面に脂肪が付着して混和されません。

…❶…❷

ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分
添加 NaCl 1 g
添加 クエン酸3Na2水和物 1 g
添加 クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5 g
振とう溶解 10秒
添加 MgSO4(無水) 4 g

振とう 1分牛脂
遠心分離 3,500 rpm, 5分
冷凍(-20℃,60分)…❸

左）アセトン 右）アセトニトリル
抽出溶媒を加えて振とうした牛脂❸抽出液(アセトン層)

全自動固相抽出装置ST-L400

Smart-SPE C18-50㎎：精製

コンディショニング
アセトン
ACN-水(9/1)

遠心分離によりアセトン層と試料層の間に脂肪層が分離されます。それを冷凍することで脂肪を固化させ大部分の脂肪を取り除くことができます。
【物性】
アセトン

負荷[通液] 抽出液(アセトン層) 0.5 mL 分取

比重：0.79
融点：-94℃

洗液 ACN-水(9/1) 0.4 mL
脂肪層

脂肪酸
パルミチン酸試料層

比重：0.85

アセトン層

流出液
添加 10%(W/W)NaCl水溶液 約12 mL

Smart-SPE C18-50㎎：保持

水層

コンディショニング
アセトン
水

遠心分離後
冷凍後
牛肉 ミンチ

洗浄 水 1 mL
固相乾燥(窒素ガス) 2分
Smart-SPE C18-50㎎
Smart-SPE PSA-30㎎：精製

融点：63℃
オレイン酸

コンディショニング
アセトン
アセトン-ヘキサン(10/90)

溶出 アセトン-ヘキサン(10/90) 1 mL

比重：0.89
融点：13℃❹

これは大量注入(25μL)する場合の添加量です。注入
量が異なる場合はGCに注入するPEGの絶対量が500 ng、
フェナントレンd体が0.5 ngになるように添加量を変更します。

❺

標準溶液は試料溶液と同じ溶媒組成にすることを推奨
します。

参考文献：
1)根本了,「食品中残留農薬公示試験法の進歩」
食品衛生学雑誌,Vol.51, N0.6, pp.349-359 (2010）2)佐々野ら,「畜産物中残留農薬の迅速一斉分析法の検討 －GC/MS編－」
第101回日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.31
3)谷澤ら,「畜産物中残留農薬の迅速一斉分析法の検討 －LC/MS/MS編－」
第101回日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.32
4)佐々野ら,「畜水産物中の残留農薬の迅速一斉分析法の検討 －GC/MS編－」
第102回日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.42
5)小西ら,「畜水産物中の残留農薬の迅速一斉分析法の検討 －LC/MS/MS編－」
第102回日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.41

溶出液
添加 0.1%PEG300‐1ppmフェナントレンd体
混合アセトン溶液 20 μL…❹…❺

定容：1 mL アセトン-ヘキサン(10/90)で調整
GC-MS測定 (25 µL大量注入)595,1)(2)①個別分析法 グリホサート・グルホシネート(202010ver.)5,1)(2)① グリホサート・グルホシネート

化合物情報

グリホサート、グルホシネートは非常に水溶性が高く水抽【グリホサート】

出を行います。そのため固相抽出の際に目詰まりが生じる場

OH

MF： C3H8NO5P
MW:169.1
LogPow： ＜-3.2(pH2-5，20℃)
pKa：5.77±0.03、2.18±0.02(20±0.2℃)

合があります。そこで本法では抽出時に除タンパクを行い固相抽出での操作性を向上させました。また測定には陰イオン交換分析カラムを用いることで前処理で誘導体化をせず操作

O

P
OH

NH
O
HO

を簡便にしています。
【グルホシネート】

前処理フロー

通常試料

OH

グルホシネートアンモニウム塩
O

MF： C5H15N2O4P

試料採取 1～10 g (野菜・果実 10 g、大豆 2 g)

添加 水 (25－試料の含水量) mL

LogPow： ＜0.1(pH7、22℃)

…❷

＋

P

NH2

CH3

MW:198.2

…❶

NH4

O
HO

グルホシネート
MF： C5H12NO4P

振とう抽出 10分

MW:181.1

添加 ACN 約25 ｍL

pKa：pKa1＜2、pKa2：2.9、pKa3：9.8…❸★ 全量が50 mLになるように調整

前処理フロー解説・留意点

振とう 1分

❶ 大豆などタンパク質を多く含む試料は試料中のタンパク質量が1 g
静置 5分

…❹

以下になるように採取量を調整します。 (p.63参照)
小麦粉、食パン、小豆などデンプンを多く含む試料はp.61「デンプンを多く含む試料」をご覧ください。

遠心分離 3,500 rpm, 5分
抽出上澄液
抽出上澄液 0.5 mL 分取
添加 水 1.5 mL❷

試料の含水量と合わせて25mLになるように水を添加します。

❸

ACNを添加することにより、タンパク質を変性させ、遠心分離により沈殿させて除去します。

…❺

試験溶液 2 mL (抽出上澄液：水＝1:3)
除タンパク後の試料(ほうれんそう)

全自動固相抽出装置ST-L400

Smart-SPE PBX-10㎎：精製❹
コンディショニング
アセトン
メタノール-水(1/9)

タンパク質の変性を促すため必ず5分静置願います。

❺

水を添加することでACNの比率を下げ、PBXへの低極性夾
雑成分の吸着を促進させます。

❻

Smart-SPE SCX-30㎎：精製

ギ酸水を添加し、溶出液のpHを中性～酸性にします。

Smart-SPE PSA-50㎎：保持

測定条件

負荷[保持] 試験溶液 1 mL 分取

LC UHPLC(Nexera X2) (島津製作所)
分析カラム
TSKgel SuperIC-AP, 4.6 mm I.D. x 7.5 cm
移動相
A液：0.1 ｍM ギ酸アンモニウム水溶液
B液：0.5 % ギ酸水溶液
流速0.8 mL/min
グラジエントB Conc. 5%(0.5 min)-98%(2-11 min)5%(12-14 min)
カラム温度
40 ℃
注入量
5 µL

洗浄 メタノール-水(1/9) 1.5 mL

Smart-SPE PSA-50㎎
溶出 0.14%アンモニア水 0.9 mL
溶出液
添加 5%ギ酸-水 30 μL…❻

MS LCMS-8045 (島津製作所)
イオン化モード： ESI positive

定容：1 mL 水で調整

測定：LC-MS/MS
605,1)(2)①個別分析法 グリホサート・グルホシネート(202010ver.)①アセトニトリルによる除タンパク
前処理のポイント②誘導体化なし③PSAとの相互作用による精製④NaOHの添加（デンプンを含む試料の場合）

前処理フロー※デンプンを多く含む試料
試料採取 1～2 g

前処理フロー解説・留意点…❶❶ 小麦粉などデンプンを多く含む試料は試料中のデンプン量が1 g 以

添加 水 25 mL

下になるように採取量を調整します。例えば小麦粉の場合は1 g、食パンの場合は2 g採取します(p.63参照)。

手で振とう 1分
添加 1 mol/L NaOH水溶液 50 μL

❸

…❷

❷

NaOH水溶液を添加しアルカリ性にすることで農薬のデンプンへの吸着を防ぎます。

振とう抽出 10分
添加 ACN 約25 ｍL…❸

ACNを添加することにより、タンパク質を変性させ、遠心分離により沈殿させて除去します。

★ 全量が50 mLになるように調整
振とう 1分

静置 5分

❹

…❹

❺
遠心分離 3,500 rpm, 5分❻

タンパク質の変性を促すため必ず5分静置願います。

水を添加することでACNの比率を下げ、PBXへの低極性夾
雑成分の吸着を促進させます。

試料採取量が1 gの場合は2 mL分取、2 gの場合は1 mL分取して固相に負荷します。

抽出上澄液

抽出上澄液 0.75 mL 分取
添加 水 2.25 mL❼…❺

試験溶液 3 mL (抽出上澄液：水＝1:3)

LC-MS/MSのリン酸コーティング

全自動固相抽出装置ST-L400

Smart-SPE PBX-10㎎：精製

グリホサートのようなリン酸化合物の配管への吸着を抑制します。

コンディショニング
アセトン
メタノール-水(1/9)

カラムの代わりにユニオンを接続し、イオン化部からプロー
ブとエレクトロードを引き抜いた状態で、プローブの先端まで
２ ％ リ ン 酸 を 0.05 mL/min で
12時間通液します。
弊社では約半年程度効果が持続することを確認しています。また他の農薬分析への影響は見られませんでした。

Smart-SPE SCX-30㎎：精製
Smart-SPE PSA-50㎎：保持
負荷[保持] 試験溶液 2 mL 分取

ギ酸水を添加し、溶出液のpHを中性～酸性にします。

…❻

洗浄 メタノール-水(1/9) 1.5 mL

リン酸コーティングなし

グリホサートSmart-SPE PSA-50㎎
リン酸コーティングあり

溶出 0.14%アンモニア水 0.9 mL※装置によってはリン酸コーテ
ィングの必要がない場合もあります。まずはコーティングなしの状態でピーク形状をご確認願
います。

溶出液

添加 5%ギ酸-水 30 μL
定容：1 mL 水で調整…❼

グリホサート

参考文献：石渡智 ホクレン農業協同組合連合会,「残留農薬モニタリング
検査の取り組みと高感度LC/MS/MSの活用法の紹介」(2013)

LC-MS/MS615,1)(2)①個別分析法 グリホサート・グルホシネート(202010ver.)タンパク質の除去効果
水抽出した抽出液に同量のアセトニトリルを添加して5分間静置したところ、変性したタンパク質が析出してきました。これを遠心分離したところ変性したタンパク質が沈殿しました。

変性した
タンパク質

タンパク質を変性させるため、アセトニトリルを添加してから5分間静置するのが重要です。
①水抽出液
3mL分取

②アセトニトリル3 mL
添加後５分間静置③遠心分離後抽出時のｐH
140
120

をしない場合はグリホサートの回収率が低下します。抽出時に100回収率（%）

小麦粉などデンプンを多く含む試料では抽出工程でpH調整
酸性(塩酸で調整)またはアルカリ性(NaOHで調整)にpHを調整したところアルカリ性での回収率が改善されました。

80
60
40
20
0

pH3

pH4

pH6

pH8.5

pH9.5

■グリホサート ■グルホシネート
抽出時のpH調整と回収率の関係

精製のポイント②メタノール－水(1/9)③0.14％アンモニア‐水①試験溶液1 mL

サンプルループ

PBX-10 精製：
低極性夾雑成分の除去

シリンジポンプ

PSA-50シリンジポンプ

SCX-30 精製：
陽イオン性夾雑成分の除去
Mノズル

溶出液

④目的物質溶出PSA-50 保持：目的物質
目的物質(農薬など)
夾雑成分

流出液：非イオン親水性夾雑成分

環境がアルカリ性の場合

環境が中性の場合
PSA

Si-CH2CH2CH2＋
NHCH2CH2＋
NH2

⊖

O

O

P

-

OH

O

NH

グリホサート

O

O
O

-

⊖

-

⊖

Si-CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2

⊖

O

O

P

-

OH

P

O

NH

グリホサート

NH2
O
O

-

⊖

環境が中性の場合、PSAはプラスに帯電しており、マイナスに帯電しているグリホサート、グルホシネー
トを保持します。

O

O
O

CH3

グルホシネート

PSA

-

-

⊖

P

NH2

②メタノール-水(1/9)で固相を洗浄します。

CH3⊖①試料液1 mL負荷
PBX-10：低極性夾雑成分を除去します。
SCX-30：陽イオン性夾雑成分を除去します。
PSA-30：グリホサート・グルホシネートを保時します。

O

グルホシネートO-⊖

環境がアルカリ性の場合、PSAは帯電していないため、マイナスに帯電しているグリホサート、グルホシ
ネートはPSAから溶出されます。

62③④0.14％アンモニア水による溶出
アルカリ性の0.14％アンモニア水によりPSAを
非解離状態にしてグリホサート・グルホシネート
をPSAから溶出します。

5,1)(2)①個別分析法 グリホサート・グルホシネート(202010ver.)
参考資料(1) 大豆や小麦粉の前処理について
タンパク質を多く含む試料(例：大豆)やデンプンを多く含む試料(例：小麦粉)では抽出時にグリホサート、グルホシネートがそれらに吸着して回収率が低下することがあります。そこで試料の採取量を減らして前処理を行います。
さらに小麦粉のようにデンプンを多く含む場合は抽出工程でグリホサート、グルホシネートがデンプンへ分配され、抽出効率が低下すると考えられます。そこで抽出時にNaOH水溶液を添加してアルカリ性にすることでこれらが抽出液に分配されるようにします。

【対応前処理フロー】
分析時には試料の成分を調べてから分析法を選択します。
・タンパク質を多く含む試料(例：大豆)：前処理フロー：p.60 「通常試料」
・デンプンを多く含む試料(例：小麦粉)：前処理フロー：p.61「デンプンを多く含む試料」【試料採取量の目安】
タンパク質を多く含む試料、デンプンを多く含む試料ともに試料中のタンパク質またはデンプン量が1 g以下になるように調整します。

抽出溶液中成分含有量の計算表
ほうれん草

大豆

小麦粉

食パン

あずき

水分

92.4

12.4

14.0

39.2

14.2

タンパク質

2.2

33.8

8.3

8.9

20.8

デンプン

0.0

0.6

72.7

38.9

41.7

脂質

0.4

19.7

1.5

4.1

2.0

試料採取量

10.0

2.0

1.0

2.0

2.0

水分

9.24

0.25

0.14

0.78

0.28

タンパク質

0.22

0.68

0.08

0.18

0.42

デンプン

0.00

0.01

0.73

0.78

0.83

脂質

0.04

0.39

0.02

0.08

0.04

25

25

24

25

可食部100g中含有量, g

抽出液中含有量, g

添加する水の量, mL

16

日本食品標準成分表2015年版（七訂）から引用(2) 穀類と豆類のタンパク質とデンプン量の比較■イネ科作物の種子：穀類
食品名

穀類（イネ科）ではデンプンが多く含まれています。
食品成分量（可食部100g中の量：g）
水分

トウモロコシ

14

米(玄米）
小麦

■マメ科作物の種子：豆類
食品名タンパク デンプン

生物の分類

脂質

科

属

9

63

5

イネ科

トウモロコシ属

15

7

70

3

イネ科

イネ属

12

11

56

3

イネ科

小麦属

豆類ではタンパク質とデンプンが多く含まれていますが大豆と落花生はデンプンを含んでいません。
食品成分量（可食部100g中の量：g）
水分タンパク デンプン

生物の分類

脂質

科

属
ダイズ属

大豆

12

34

1

20

マメ科

あずき

14

21

42

2

マメ科

ササゲ属

いんげんまめ

15

22

35

2

マメ科

インゲンマメ属

ソラマメ

13

26

32

2

マメ科

ソラマメ属

エンドウ豆

13

22

37

2

マメ科

エンドウ属

落花生

6

25

4

47

マメ科

ラッカセイ属参考文献：
1)小西ら アイスティサイエンス, 「グリホサートおよびグルホシネートの分析の自動化の検討」,第36回農薬残留分析研究会講演要旨集pp.119-124
2)石渡智 ホクレン農業協同組合連合会,「残留農薬モニタリング検査の取り組みと高感度LC/MS/MSの活用法の紹介」（2013）
3)天川映子 東京都健康安全研究センター, 「食品中に混入されたグリホサートおよびグルホシネートの迅速分析」,東京都健康安全研究センター年報
Ann.Rep.Tokyo Metr. Inst.P.H.,57,pp.235-238,2006
4)永富康司 アサヒグループホールディングス株式会社, 「グリホサートとグルホシネートおよび代謝物のLC/MS/MS一斉分析法の開発」,第35回農薬残留分析研
究会講演要旨集pp.92-97
5)宮本紫織 愛媛県立衛生環境研究所, 「LC/ICP/MSによる水道水中における有機リン系農薬の分析法の開発」,平成23年度愛媛衛研年報14，pp.10-14
6)佐々野ら アイスティサイエンス, 「グリホサートおよびグルホシネートの分析の自動化の検討－第2報－」,第42回農薬残留分析研究会講演要旨集pp.117-124

635,1)(2)②個別分析法 ジチオカルバメート系農薬 (202010ver.)5,1)(2)② ジチオカルバメート系農薬
ジチオカルバメート系農薬は水にも有機溶媒にも溶けないため、エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物(EDTA)を用いたシステイン-エチレンジアミン四酢酸溶液(以下システイン-EDTA溶液)に溶解することでナトリウム塩の形にして水に溶けるようにして抽出します。その後ヨウ化メチルを用いてメチル化物を生成し有機溶媒に溶けるようにします。
しかし通知法におけるこれらの操作は煩雑なため本法ではホクレン農業協同組合連合会様が開発した迅速分析法をもとにGC-MS
で測定するための精製工程を追加しました。

化合物情報
ジチオカルバメート系農薬からは3種類のメチル化物が生じます。
【ジチオカルバメート系農薬の種類】【メチル化物】
S(CH3)2 N-C-S-CH3

SS(CH3)2N-C-S
ジラム

2

CH2NH-C-S

Zn

CH2NH-C-S
ジネブ

S(CH3)2N-C-S
ニッケルビス

2S

S

CH2NH-C-S

フェルバム

3

Fe

Mn

S

CH2NH-C-S

S(CH3)2N-C-S

S
マンコゼブ

S-C-N(CH3)2

チラム

n

S

CH2NH-C-S

Zn S-C-N(CH3)2

CH2NH-C-S

Zn S-C-N(CH3)2

S

メチル化物

ジラム
ニッケルビス(ジチオカルバメート)

S

DMDC

フェルバム

CH2 NH-C-S-CH3

チラム

CH2 NH-C-S-CH3S

S
CH2NH-C-S

Zn

プロピネブ

S
マンネブ

S

S

S-C-NHCH2 -CH-HN-C-S

S

Ni

CH2NH-C-S(CH3)2N-C-S

CH3

成分名

ジメチル
ジチオカルバミン酸メチル
DMDC

Zn

ジネブ

S

エチレン
ビス ジチオカルバミン酸メチル
EBDC

S

EBDC

マンネブ
マンコゼブ
プロピネブ

PBDC

ポリカーバメート

DMDC＋EBDC

S

ポリカーバメート
MnxZnyx

CH3-CH2 NH-C-S-CH3
CH2 NH-C-S-CH3
S
プロピレン
ビス ジチオカルバミン酸メチル
PBDC

誘導体化の原理
マンネブの誘導体化の例を示します。
システイン-EDTA溶液で抽出することでマンネブ内の金属(Mn)がEDTAに取り込まれて水に溶けやすいナトリウム塩になります。
続いてヨウ化メチルによりS-にメチル基が結合してメチル化物が生成されます。

SCH2NH-C-S
CH2NH-C-S

S

S
システイン-EDTA溶液

Mn

S

マ ン ネ ブ の 金 属 (Mn)がEDTAに取り込まれてナトリウム塩になります。

CH2NH-C-S- Na＋CH2NH-C-S- Na＋S

S-にメチル基が結合し、メチル化物を生成します。

CH2NH-C-S

CH3CH2NH-C-S

CH3

S

EBDC

マンネブ
水にも有機溶媒にも溶けない

ヨウ化メチル

水に溶ける！

64

有機溶媒に溶ける！！

5,1)(2)②個別分析法

ジチオカルバメート系農薬 (202010ver.)①QuEChERS法を参考とした抽出②抽出時におけるメチル化③GC-B法の応用

前処理の
ポイント
前処理フロー【粉砕】

試料 100 g + システイン-EDTA溶液１） 100 g…❶

前処理フロー解説・留意点❶

試料採取 20 g (試料 10ｇ相当)
添加 6mol/L塩酸２） 700 µL程度 (pH6.5に調整)…❷

玄米など乾燥試料でシステイン-EDTA溶液を添加せずに粉砕した試料は、秤量後に試料の水分含量を合わせて
10 g相当になるように水を添加します。その後システイ
ン-EDTA溶液を10 g添加します。

振とう 10秒
添加 ヨウ化メチル 60 µL

試料は同量のシステイン-EDTA溶液を添加して粉砕したものを使用します。

…❸

激しく振とう 30秒

水 約10 g(試料の水分含有量＋添加)＋システインEDTA溶液 10 g

振とう 10分
添加 ACN 10 ｍL❷

分析用とは別に試料を20 g秤量し、6 mol/L塩酸を700µLを目安に添加してpH6.5に調整するのに必要な塩酸の量を決めます。その量を分析用試料に添加します。
EDTAが金属を取り込むのに適したｐHに調整します。

❸

ヨウ化メチルは添加しただけでは図1のようにシステイ
ン-EDTA溶液と分離します。添加後は手で激しく振とう
し(図2)、ヨウ化メチルを均一に分散させます。その後振とう機で振とうします。

振とう抽出 5分

添加 NaCl 4 g
振とう溶解 10秒…❹

添加 MgSO4(無水) 6 g
振とう 1分ヨウ化メチル

遠心分離 3,500 rpm, 5分抽出液(ACN層)

全自動固相抽出装置ST-L400

Smart-SPE C18-50㎎：精製

図1

コンディショニング
アセトン
ACN-水(8/2)

負荷[通液] 抽出液(ACN層) 0.5 mL 分取
洗液 ACN-水(8/2) 0.4 mL

…❺

流出液

添加 10%NaCl水溶液 約12 mL

Smart-SPE C18-50㎎：保持コンディショニング
アセトン
水

❹

NaClを十分に溶解させてからMgSO4(無水)を添加します。溶解が不十分な場合はMgSO4(無水)の塩析効果が不十分になる場合があります。

❺

メチル化物が全量溶出する溶媒比としてACN-水(8/2)
を流します。

❻

柑橘類の場合はPSAにGCK（グラファイトカーボン）を追加して使用します。GCKは柑橘類のフラボノイド類を除去します。

【柑橘類の場合】
C18
＋
GCK
＋
PSA

GCK
＋
PSA

洗浄 水 1 mL
固相乾燥(窒素ガス) 2分
Smart-SPE C18-50㎎
Smart-SPE PSA-30㎎：精製

図2…❻

コンディショニング
GCK(上)＋PSA(下)コンディショニング
アセトン
アセトン-ヘキサン(3/7)

溶出 アセトン-ヘキサン(3/7) 1 mL

添加 0.1%PEG200‐1ppmフェナントレンd体
混合アセトン溶液 20 μL
定容：1 mL アセトン-ヘキサン(3/7)で調整❼

メチル化物が全量溶出する溶媒比としてアセトン-ヘキ
サン(3/7)で溶出します。

❽

これは大量注入(25μL)する場合の添加量です。注入量が異なる場合はGCに注入するPEGの絶対量が500 ng、
フェナントレンd体が0.5 ngになるように添加量を変更します。※フェナントレンd体は必須ではありません。
またジチオカルバメートではPEG300とm/zと重なるため
PEG200を使用します。

❾

標準溶液は試料溶液と同じ溶媒組成にすることを推奨し
ます。

…❼

溶出液

…❽

…❾

測定：GC-MS 大量注入25μL

溶出時
C18(上)＋GCK(中)＋PSA(下)1),2)の試薬調製方法はp.66をご覧ください。
655,1)(2)②個別分析法

ジチオカルバメート系農薬 (202010ver.)

試薬調製方法

測定条件例

1)システインｰEDTA溶液(システイン‐エチレンジアミン四酢酸溶液)※1000 mL作製の場合①Lシステイン塩酸塩一水和物50 gを約800 mLの水に溶かします。
②エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム水和物

PTV 注入口 LVI-S250(AiSTI Science)
インサート
スパイラル（胃袋型）インサート
注入口温度
70℃(0.27min)-120℃/min-240℃-50℃/min290℃(14min)(以下EDTA)50 gを入れます。
＊この状態ではEDTAは溶解しません。
＊EDTAの秤量には樹脂製のスプーンをご使用願います。
③水酸化ナトリウム(NaOH)約28 gを入れます。
＊水温が上がり始めます。
④EDTAが溶けたら12 mol/LNaOH※で約pH9.4まで調整します。
⑤溶液の温度が室温相当に下がるのを待ち、pH9.6に調整します。
＊溶液の温度が高いとpHが安定しないので室温に戻ってからpH9.6に調整します。
⑦メスシリンダーに移して水で1000 mLにメスアップします。

GC 7890B (Agilent Technologies)
注入法
スプリットレス
スプリットレス時間 4 min
スプリット流量50 mL/min
ガス制御
コンスタントフロー, 1.1ml/min
カラム
VF-5ms, 0.25mm i.d. X 30m, df;0.25µm
オーブン温度60℃(4min)-10℃/min-125℃-30℃/min320℃(4min)
ｲﾝﾀｰﾌｪｰｽ温度 290℃
MS Agilent 7000C (Agilent Technologies)
MS メソッド
SCAN※12 mol/L 水酸化ナトリウム水溶液(20 mLの場合)
約15 mLの水に水酸化ナトリウム4.8 gを添加し、よく攪拌した

後20 mLに定容します。調製液はガラス以外の容器に入れます。
調製の際は必ず水に水酸化ナトリウムを入れます。水酸化ナトリ
ウムに水を入れると危険です。
2)６ mol/L 塩酸

35％塩酸と水を1:1で混合します。調製の際は必ず水に塩酸を入れます。塩酸に水を入れると発熱し危険です。

665,1)(2)②個別分析法

ジチオカルバメート系農薬 (202010ver.)

参考資料【EDTAとは】
EDTA ：エチレンジアミン四酢酸(ethylendiaminetetraacetic acid)
通常はジナトリウム塩である「エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物(EDTA/２Na/2H/2H2O)」のことを指します。

HOOC-CH2

NCH2CH2N

NaOOC-CH2

CH2-COOH

HOOC-CH2

CH2-COONa-OOC-CH

NCH2CH2N

2

CH2-COOH＋ 2Na+

CH2-COO-

白色粉末で、非潮解性、水に溶けやすい【ジチカルバメート農薬の抽出にEDTAを使う理由】
EDTAの性質

EDTAはアルカリ金属を除く多くの金属イオンと非常に安定な錯塩をつくる性質があり、そのEDTA錯塩は水によく溶けます。
このようにEDTAが金属を取り込んだ形を「錯体(キレート)」と言います。キ
レートとははさみを意味するギリシャ語です。金属イオンが有機試薬で包み込まれたような状態がカニがはさみでエサを捕らえた格好に似てるいるためこのように呼ばれます。

ジチカルバメートは水にも有機溶媒にも溶けないためEDTA溶液(正確にはシステイン-EDTA溶液)に溶かします。そうすることでEDTAがジチカルバメートの金属を取り込みジチオカルバメート系農薬が水に溶けるようになります。

ジネブ

S

CH2NH-C-S

CH2NH-C-SS
Zn＋ システイン‐EDTA

Zn

溶液

S

＋

CH2NH-C-SCH2NH-C-SS

水にも有機溶媒にも溶けない

金属(Zn)が外れて水に溶ける！

このようにEDTAが金属を取り込むには最適なpH領域があり、ジチオカルバメート系農薬の場合はpH6.5となります。

pHとの関係pHが低くなりH+の濃度が高くなると、EDTAと結合していた金属イオンM＋がH+によって押し出され、EDTA錯塩の解離が起こる。
溶液のpHが次第に高くなると金属イオンは水酸化物となって沈殿してくる傾向があり、pHの上昇に従って生成した水酸化物の安定度がEDTA錯塩の安定度より高くなってくると、EDTA錯塩は分解して金属の水酸化物が沈殿する。
※ EDTA錯塩が安定なのは一定のpH領域に限られており、そのpH領域は金属イオンの種類によって異なる。
引用文献：上野景平:“EDTAの使い方”,分析化学, 8巻, pp.207-214（1959）

参考文献：
1)石渡智、関口博史,「農産物中ジチオカルバメート系農薬の迅速分析法の検討」,第110回日本食品衛生学会講演要旨集p.63(2015)2)石渡智、関口博史,「農産物中ジチオカルバメート系農薬の迅速分析法の検討(第ニ法)」,第111回日本食品衛生学会講演要旨集p.63(2016)3)S.Ishiwata,S.Imai,「Simplified Method for the Determination of Dithiocarbamates in Agricultural Profucts by LC/MS/MS」,12th European Pesticide Residue
Workshop,Programme & Book of Abstracts,pp.130-131(2018)4)安藤ら,「ジチオカルバメート迅速スクリーニング法の開発」,第41回農薬残留分析研究会講演要旨集pp.221～226

675,1)(2)③個別分析法

TPN・キャプタン・カプタホール・ホルペット(202012ver.)5,1)(2)③ TPN・キャプタン・カプタホール・ホルペット

化合物情報

TPN(クロロタロニル)、キャプタン、カプタホール、ホル【TPN(Chlorothalonil)】

ペットは試料粉砕時に分解するため、通知個別法ではリン酸

MF： C8Cl4N2
MW:265.9
LogPow：2.9(25℃)

添加を、QuEChERS法では凍結状態 1),2) で分解を防いでいます。またキャベツなど硫黄化合物の夾雑成分を含む試料では

Cl
CN

Cl
Cl

精製時のPSAがTPN消失の要因のとなる可能性も報告されてO【キャプタン】

います3)。本法ではこれらの状況を考慮した方法です。

MF： C9H8Cl3NO2S
MW:300.6
LogPow：2.8(25℃)

前処理フロー
予冷式ドライアイス凍結粉砕

CN
Cl

…❶

【カプタホール】
MF： C10H9Cl4NO2S
MW:349.1
LogPow：3.8

試料採取 10 g…❷(冷凍(-20℃, 30分)(添加回収試験の場合)) …❸
添加 標準溶液(添加回収試験の場合)

MF： C9H4Cl3NO2S
MW:296.6
LogPow：3.1

ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分
添加 NaCl 1 g

OO
N SCCl2CHCl2
O

O【ホルペット】

添加 ACN 10 mL

N SCCl3

N SCCl3
O

前処理フロー解説・留意点

添加 クエン酸3Na2水和物 1 g
添加 クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5 g❶

凍結粉砕により試料の酵素活性化を抑制し、夾雑成分の増加を抑え、TPN等の分解を抑制します。

❷

添加回収試験の場合、対象農薬の分解を防ぐため標準溶液は１％ギ酸含有混合標準溶液を添加します。

❸

添加回収試験の場合、添加後は試料が室温に戻り、酵素が活性化しないよう-20℃で静置し、含浸します。

振とう溶解 10秒
添加 MgSO4(無水) 4 g
振とう 1分
遠心分離 3,500 rpm, 5分抽出液(ACN層)
全自動固相抽出装置ST-L400

Smart-SPE C18-50㎎：精製

コンディショニング
アセトン
ACN-水(9/1)❹

キャベツやタマネギのように硫黄化合物の夾雑成分を含む
試料ではPSAを使用した場合、TPNの回収率が低下します。
そのような試料の場合はAXi3-20㎎を使用することにより回収率が向上します(p.69参照)。

負荷[通液] 抽出液(ACN層) 0.5 mL 分取
洗液 ACN-水(9/1) 0.4 mL
流出液※AXi3-20㎎：表面修飾ポリスチレンジビニルベンゼンミッ
クスモード強陰イオン交換充填剤

添加 10%(w/w)NaCl水溶液 約12 mL
コンディショニング
アセトン
水
Smart-SPE C18-50㎎：保持❺対象農薬を溶出させるためアセトン-ヘキサン(1/3)を使用します。

洗浄 水 1 mL
固相乾燥(窒素ガス) 2分
Smart-SPE C18-50㎎

コンディショニング
アセトン
アセトン-ヘキサン(1/3)…❹

Smart-SPE PSA-30㎎ or AXi3-20㎎：精製…❺❻

PEGを使用した場合、注入口で気化する温度が高くなり対象成分が分解する懸念があるため、本法ではPEGは使用しません(p.69参照) 。

溶出 アセトン-ヘキサン(1/3) 1 mL❼

標準溶液は試料溶液と同じ溶媒組成にすることを推奨しま
す。

溶出液

…❻
定容：1 mL アセトン-ヘキサン(1/3)で調整…❼

GC-MS測定 (25 µL大量注入)685,1)(2)③個別分析法

TPN・キャプタン・カプタホール・ホルペット
個別分析法 グリホサート・グルホシネート(202010ver.)(202012ver.)①予冷式ドライアイス凍結粉砕
前処理のポイント ②キャベツ等硫黄化合物の夾雑成分を含む試料でのAXi3-20による精製③アセトン‐ヘキサン(1/3)による溶出④ギ酸含有標準溶液の添加 (添加回収試験の場合)

常温粉砕と凍結粉砕
常温粉砕に対し、凍結粉砕した試料では回収率が向上する傾向がみられます。

回収率(％)
150

TPN

CaptanFolpetCaptafol100

また添加回収試験では「ギ酸含有混合標
準溶液」を添加することでキャプタン、ホ50

ルペット、カプタホールの回収率が向上しました。TPNについては下の「PSAとAX

0
ギ酸無 ギ酸無 ギ酸有 ギ酸無 ギ酸無 ギ酸有 ギ酸無 ギ酸無 ギ酸有 ギ酸無 ギ酸無 ギ酸有の回収率」も併せてご覧ください。

常温

凍結

常温

トマト

凍結

常温

キュウリ

凍結
大根

凍結
キャベツ

添加濃度：試料中100ppb
精製固相：PSA
溶出溶媒：アセトン-ヘキサン(1/3)

PSAとAXの回収率
タマネギなど特に硫黄化合物の夾雑成分

常温

回収率（％）
150
TPN

CaptanFolpetCaptafol

AX

AX

AX

を 含 む 試 料 に お い て AX※(Smart-SPE
AXi3-20mg)を使用することでTPNの回収100

率が向上しました。
※AX：表面修飾ポリスチレンジビニルベンゼン
ミックスモード強陰イオン交換充填剤

50

0
PSA

AX

玉ねぎ

PSA

白ネギ

PSA

キャベツ

PSA

大根

PSA

AX

キュウリ

PSA

PSA

レタス ほうれん草

添加濃度：試料中100ppb(ギ酸含有)
試料：凍結粉砕試料
溶出溶媒：アセトン-ヘキサン(1/3)

疑似マトリックスPEGの影響
PEGを共注入した場合、ピーク面積値の

ピーク
面積比

減少が若干みられました。PEG共注入によ100

り、注入口で気化する温度が高くなるため

TPN

CaptanFolpetCaptafol

混合標準溶液・濃度：50ppb
・アセトン-ヘキサン（1/3）

共注入物質
・ギ酸：1%
・PEG：200ppmに分解することが懸念されますので本法ではPEGは使用していません。
50

注入口条件
・注入量：25 µL
・注入口温度70℃-120℃/min-240℃-50℃/min-280℃（26min）

0

PEG
参考文献：
PEG無
ギ酸
PEG
ギ酸＋PEG
無ギ酸1)M.Anastassiades; www.quechers.com
2)斎藤ら,「ドライアイス添加均質化操作を加えた食品中残留農薬一斉分析」,第98日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.49
3)永井雄太郎、「QuEChERSを見直してみよう」,日本農薬学会誌,37(4),pp.362-371(2012)4)佐々野ら,「ドライアイス凍結粉砕法とSTQ法を用いたTPN、キャプタン、カプタホール、ホルペットの分析法の検討」,第114日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.34
695,1)(2)④個別分析法 ネオニコチノイド(202012ver.)5,1)(2)④ ネオニコチノイド
ネオニコチノイド農薬(殺虫剤)は各国で使用されていますが、ミツバチにおいて蜂群崩壊症候群の一因とされているため、近年ではEUなど諸外国で一部使用規制が進んでいます。しかし日本では使用規制がなされていないため分析の需要が多い農薬です。

ここではSTQ-LC法をネオニコチノイド系農薬に最適化した分析法を紹介します。

化合物情報

ブテノライド系殺虫剤

ネオニコチノイド系殺虫剤

アセタミプリド
MF：C10H11ClN4
MW:222.7
Cl
LogPow：0.8

H3C

N

N
CH3
N

イミダクロプリド
MF：C9H10ClN5O2
Cl
MW:255.7
LogPow：0.57

クロチアニジン
MF：C6H8ClN5O2S
Cl
MW:249.7
LogPow：0.7

N

NH
O
N

+

N

N

-

O
N

H3C
NH

S

O

-

+

NH

N

N

N

O

チアクロプリド
MF：C10H9ClN4S
MW:252.7
LogPow：1.26

フルピラジクロン
MF：C12H11ClF2N2O2
MW:288.7
LogPow：1.2

N

Cl
N

N

S

チアクロプリドアミド(チアクロプリド代謝物)
MF：C10H11ClN4OS
MW:270.7
Cl
LogPow：-

ニテンビラムMF：C11H15ClN4O2
MW:270.7
Cl
LogPow：-0.64

F
F

O
N

Cl

O
N

O
N
N

NH2

スルホキシミン系殺虫剤

SN

スルホキサフロル
MF：C10H10F3N3OS
MW:277.3
LogPow：0.8
H

F

N

H3C

N

N

S
O

F

CH3

F

O
+

H3C

N

N

N

O

-

NH
H3C

フェニルピラゾール系殺虫剤
ジノテフラン
MF：C7H14N4O3
MW:202.2
LogPow：-0.55

チアメトキサム
MF：C8H10ClN5O3S
MW:291.7
LogPow：-0.13

O

NH

NH
CH3

O

+

N

N

O

O
+

N
N
S
Cl
N

N

O
N

O

-

CH3

CPF
(ニテンビラム代謝物)
MF：C9H11ClN2O2
MW:198.7
LogPow：-

CPMF(ニテンビラム代謝物)
MF：C10H14ClN3
Cl
MW:211.7
LogPow：-

CH3
O
N
Cl
N

H3C

N
N

N

70

CH3

エチプロール
MF：C13H9Cl2F3N4OS
MW:397.2
LogPow：2.9

フィプロニル
MF：C12H4Cl2F6N4OS
MW:437.2
LogPow：4.0

NH2

Cl

O
CH3

S

F
F

N
N

F

N

Cl

Cl

NH2

O
F

S

F
F

F

N

F
N

F
Cl

N

5,1)(2)④個別分析法 ネオニコチノイド (202012ver.)①STQ-LC法の応用②Smart-SPE PBXを使用③アセトニトリル-水（2/1）による低極性夾雑成分の除去効果UP

前処理の
ポイント

前処理フロー 通常試料
試料採取 10 g…❶

前処理フロー解説・留意点

添加 水 (10ー試料の含水量) mL…❷❶

穀類 ・ 豆類 5 g その他難試料 1～2 g❷

試料の水分含量が80％未満の場合は水を添加します。水
は試料の水分と合わせて水が10 g相当となるように添加します(p.15(1)参照)。

添加 ACN 10 ｍL
ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分
添加 NaCl 1 g

試料採取量と水添加量の例
試料採取量

試料の水分含量

水添加量

（ｇ）

(％)

（ｍL)

ハチミツ

5

17.6

10

玄米

5

14.9

10

大豆

5

12.4

10

ほうれん草

10

92.4

－

添加 クエン酸3Na2水和物 1 g

分析試料

添加 クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5 g
振とう溶解 10秒
添加 MgSO4(無水) 4 g

出典：日本食品標準成分表（2015年版（七訂）振とう 1分
遠心分離 3,500 rpm, 5分抽出液(ACN層)❸

ハチミツは遠心分離後の試料層が薄く、アセトニトリル
抽出液層と水層が混ざりやすいので注意が必要です。

❹

STQ-LC法ではC18を使用していますが、ネオニコチノ
イド系農薬ではポリマー系親水性/疎水線バランス充填剤
であるPBXに変更します。それはC18では対象成分の一つであるCPMFがC18に吸着しその溶出に酸性溶媒が必要になるからです。酸性溶媒で溶出するとC18の下に連結したPSAで保持していたイオン性夾雑成分も一緒に溶出されてしまい精製効果が下がります。
CPMFはPBXには吸着されないため酸性溶媒での溶出が必
要なく、PSAからイオン性夾雑成分を溶出することなく対象成分を回収することができます。

❺

PBXに通液するACN-水の比率はACNの比率が低いほど低極性夾雑成分の除去効果が高まります。ここでは対象成分が溶出されるACN比率にすることで低極性夾雑成分の除去効果を高めています。

…❸

全自動固相抽出装置ST-L400
コンディショニング
ACN-水(2/1)

Smart-SPE PBX-20㎎：精製…❹

コンディショニング
ACN-水(2/1)

Smart-SPE PSA-30㎎：精製

負荷[精製] 抽出液(ACN層) 0.5 mL 分取
洗液 ACN-水(2/1) 0.5 mL

…❺

流出液

添加 水 0.5 mL
Smart-SPE PBX-20㎎：精製

コンディショニング
ACN-水(2/1)
水通液 ACN-水(2/1) 0.5 mL

…❺

流出液

定容：2 mL 水で調整

715,1)(2)④個別分析法 ネオニコチノイド (202012ver.)①STQ-LC法の応用②Smart-SPE PBXを使用③アセトニトリル-水（2/1）による低極性夾雑成分の除去効果UP④固相負荷前の希釈によるカテキン類の除去

前処理の
ポイント

前処理フロー 茶
前処理フロー解説・留意点…❶

試料採取 2 g❶❷

添加 水 10 mL
添加 ACN 10 ｍL
ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分
添加 NaCl 1 g

茶は難試料に相当するため採取量は2 gとします。
マトリックスを低減するため固相負荷前に抽出液(ACN層)を水で10倍希釈します。これによりカテキン類を除去
し、イオン化阻害を低減します。
※カフェインおよびエピカテキンは完全には除去できません。
エピカテキン

30000000

25000000

エピカテキンガレート

カフェイン
エピガロカテキンガレート

20000000

添加 クエン酸3Na・2H2O １ g

エピガロカテキン
カテキン類?

15000000

10000000

50000000
1.020000000

添加 クエン酸2Na・1.5H2O 0.5ｇ

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0

14.0

15.0

16.0

13.0

14.0

15.0

16.0

15000000

エピカテキン

12500000

18.0

19.0

min

カフェイン

10000000

振とう溶解 10秒

7500000
5000000※比較のため拡大

2500000
0
1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

17.0

18.0

19.0

min

茶抽出液のTICクロマトグラム比較（上：試料0. 033 g相当, 下：試料0. 01 g相当）

添加 MgSO4(無水) 4 g
振とう 1分

❸LC法ではC18を使用していますが、ネオニコチノイド系農薬ではポリマー系親水性/疎水線バランス充填剤であるPBXに変更します。それはC18では対象成分の一つであるCPMFが吸着しその溶出には酸性溶媒が必要になるからです。その際C18の下に連結したPSAに保持したイオン性夾雑成分も一緒に溶出されてしまいます。しかしCPMFはPBXには吸着されないため酸性溶媒での溶出も必要なく、その下に連結しているPSAに保持したイオン性夾雑成分を溶出することなく対象成分を回収することができます。

❹

PBXに通液するACN-水の比率はACNの比率が低いほど低極性夾雑成分の除去効果が高まります。ここでは対象成分が溶出されるACN比率にすることで低極性夾雑成分の除去効果を高めています。

遠心分離 3,500 rpm, 5分抽出液(ACN層)

抽出液(ACN層) 1 mL 分取

17.0

17500000…❷

添加 水 9 mL試験溶液 10 mL (抽出液：水＝1:9)

全自動固相抽出装置ST-L400

測定条件

コンディショニング
ACN-水(2/1)
Smart-SPE PBX-20㎎：精製…❸

Smart-SPE PSA-30㎎：精製

LC UHPLC(Nexera X2)
分析カラム ： Shim-pack FC-ODS,

コンディショニング
ACN-水(2/1)

2 mm I.D. x 150 mm, 3µm

負荷[精製] 試験溶液 0.5 mL 分取
洗液 ACN-水(2/1) 0.5 mL

移動相： A液：0.1% ギ酸+0.5 mM 酢酸アンモニウム水溶液

流速：0.2 mL/min

B液：0.5 mM 酢酸アンモニウム含有メタノール…❹

グラジエント : B Conc. 5%(0-1 min)-99%(15-20 min)-

流出液

5%(20-30 min)
添加 水 0.5 mL

Smart-SPE PBX-20㎎：精製

コンディショニング
ACN-水(2/1)
水通液 ACN-水(2/1) 0.5 mL

カラム温度

：40 ℃

注入量

：2 µL

MS LCMS-8045
イオン化モード： ESI positive and negative…❹※検量線用標準溶液の調製

流出液

LC-MS/MS測定では測定溶液組成が感度やピーク形状に影響する
ため標準溶液はサンプルと同じ組成溶液での調製を推奨します。

定容：2 mL 水で調整

725,1)(2)④個別分析法 ネオニコチノイド (202012ver.)
移動相のpH
ネオニコチノイド系農薬の測定には酸性の移動相を使用します。移動相にギ酸を添加することでCPMFのピーク形状が改善されます。また測定開始時（インジェクション時）の移動相組成をB液比率5%と溶媒比率を下げておくことで全ての成分で良好なピーク形状が得られます。
B.conc5%のクロマトグラム例
中性移動相 A：0.5mM酢酸アンモニウム水溶液
B：0.5mM酢酸アンモニウム含有メタノール

測定開始時の移動相組成をB Conc.5%にすることで保持時間の早い成分のピーク形状が改善されます。

1750000
1500000
1250000
1000000

CPMF

750000500000(RT：6.2)

2500000
1.0

600000 214.00>128.00(+)
214.00>101.00(+)
500000400000300000

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0

14.0

15.0

16.0

17.0

18.0

19.0

min

2000001000001750000

酸性移動相 A：0.1%ギ酸+0.5mM酢酸アンモニウム水溶液
B：0.5mM酢酸アンモニウム含有メタノール

06.01500000

ジノテフラン

1250000(RT：6.8)

5000007.0

203.15>114.15(+)
203.15>87.00(+)
203.15>73.10(+)
203.15>100.20(+)

1000000
750000250000

CPMF

500000250000
0
1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0

14.0

15.0

16.0

17.0

18.0

19.0

20.0

0

min

6.0

7.0

グラジエント : B Conc.5%(0-1 min)-99%(15-20 min)-5%(20-30 min)

精製のポイント①抽出液(ACN層)0.5 mL(通常試料）
試験溶液0.5 mL(茶)②ACN-水(2/1)④ACN-水(2/1)
サンプルループ
シリンジポンプ

PBX-20(上) 精製：
低極性夾雑成分の除去
PBX-20(下) 精製：
低極性夾雑成分の除去

PSA-30 精製：
脂肪酸、イオン性夾雑成分の除去③水シリンジポンプ
Mﾉｽﾞﾙ

シリンジポンプ

PBX-20(下) 精製：
低極性夾雑成分の除去⑤目的物質(ネオニコチノイド系農薬)⑤目的物質(ネオニコチノイド系農薬)①抽出液(ACN層)(茶の場合は試験溶液)0.5 mLを負荷
PBX-20：低極性夾雑成分を除去します。
PSA-30：脂肪酸等陰イオン夾雑成分を除去します。

⑤目的物質(ネオニコチノイド系農薬)②ACN-水(2/1)0.5 mLを通液
PBX-20(上)から目的物質(ネオニコチノイド系農薬)を溶出します。

目的物質(農薬など)
夾雑成分

参考文献：
1)小西ら,「STQ法におけるハチミツ中ネオニコチノイド分析への応用」,第37回農薬残留分析研究会講演要旨集，pp.119-126③水を添加
水添加により試料液のACN比率を下げてPBX-20に負荷することで①で除去できなかった低極性夾雑成分を除去します。

2) 佐々野ら,「少量試料サンプリングのためのドライアイス凍結粉砕の検討」,第106日

本食品衛生学会学術講演会要旨集p.115
3)平井ら,「QuECHERS法を用いた蜂蜜および玄米中ネオニコチノイド系農薬等の一斉分析法の検討」,福井県衛生環境研究センター年報第14巻，pp.32-39
4)小西ら,「STQ法を応用したネオニコチノイド分析法の検討」第43回農薬残留分析研究
会講演要旨集，pp.163-172

73④⑤ ACN-水(2/1)0.5 mLを通液②で回収されなかった目的物質(ネオニコチノイド系農薬)は試験管に回収します。PBX-20(下)から溶出しま
す。

5,2)(1)動物用医薬品 一斉分析 (201809 ver.）5,2)(1) 動物用医薬品一斉分析

化合物情報

動物用医薬品には様々な物性の成分があり、それらを一斉分【サルファ剤】
ベンゼンスルホンアミド基を基本骨格にもつ化合物

析するのは容易ではありません。本法ではアセトニトリル(中性)とギ酸アセトニトリル(酸性)の2種類の溶媒で繰り返し抽出

LogPow＜2の成分が多数を行い、その抽出液を合わせることで一斉分析(サルファ剤、キ

基本骨格例)スルファチアゾール
MF：C9H9N3O2S2
MW:255.3
LogPow：0.1

ノロン剤、その他)を可能としています。
(対象成分の詳細:https://www.aisti.co.jp/common/pdf/as191001.pdf)

前処理フロー【キノロン剤】
4-キノロンを基本骨格にもつ化合物

試料採取 5 g

LogPow＜2の成分が多数

添加 水 (5－試料中水分量) mL

例)オキソリン酸
MF：C13H11NO5
MW:261.2
LogPow：-0.2

添加 ACN 10 mL
ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分…❶

添加 NaCl 0.5 g

基本骨格

振とう溶解 10秒
添加 MgSO4(無水) 2 g

前処理フロー解説・留意点

振とう 1分

❶ACN：水(試料中水分量含む)の比率を1:1→2:1に変更することでキノロン剤の回収率が向上しました。それに伴いNaCl及びMgSO4(無水)の添加量を減らしています。
また1回目の抽出は中性(ACN)、2回目の抽出は酸性(ギ酸含有ACN)状態を保つためクエン酸は添加しません。

❷

1回目はACN(中性)、2回目はギ酸含有ACN(酸性)で繰り返し抽出を行います。

遠心分離 3,500 rpm, 5分
ACN層①

残留物(試料層・水層）
添加 5%ギ酸含有ACN 10 mL…❷

ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分
遠心分離 3,500 rpm, 5分❸

5％ギ酸含有ACN層②①②合算

酸性のギ酸含有ACN-水を使用することでキノロン剤をPSAから溶出します。

定容：20 mL ACNで調整

測定条件例
抽出液(ACN層)
LC UHPLC(Nexera X2)

全自動固相抽出装置ST-L400

分析カラム ：YMC-Triart C18,
2.1 mm I.D. x 150 mmL.,3 μm

コンディショニング
ACN

移動相： A液：0.1 ％ ギ酸水溶液

流速：0.2 mL/min

Smart-SPE C18-50㎎：精製

Smart-SPE PSA-30㎎：精製

B液：0.1 ％ ギ酸ACN溶液
コンディショニング
ACN-水(8/2)

グラジエント : B Conc. 1%(0 min)-15%(1 min)40%(6 min)-100%(10-15 min)-

負荷[通液] 抽出液(ACN層) 1 mL 分取
洗液 2%ギ酸含有ACNｰ水(8/2) 0.5 mL

1%(15.01-18 min)

…❸

流出液

カラム温度

：40 ℃

注入量

：5 µL(+10 µL水 共注入)

MS LCMS-8045

添加 水 0.5 ｍL
Smart-SPE C18-30㎎：精製

イオン化モード： ESI positive and negative

コンディショニング
ACN
水※検量線用標準溶液の調製
LC-MS/MS測定では測定溶液組成が感度やピーク形状に影響する
ため標準溶液はサンプルと同じ組成溶液での調製を推奨します。

定容：2 mL 水で調整
LC-MS/MS

参考文献：1)小西ら,「STQ法を用いた動物用医薬品一斉分析への応用の検討」,第108回日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.47
2)島ら,「STQ法とLC/MS/MSを組み合わせた食肉中の動物用医薬品高速一斉分析(前処理編)」,第114日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.124
3)島ら,「STQ法とLC/MS/MSを組み合わせた動物用医薬品高速一斉分析(第2報)」,第115日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.110

745,2)(1)動物用医薬品

一斉分析 (201809 ver.）①アセトニトリル(中性)とギ酸アセトニトリル(酸性)による繰り返し抽出

前処理の
ポイント

②繰り返し抽出液を合わせることによる一斉分析③繰り返し抽出液の混合定容

繰り返し抽出定容法
分取
ACNを添加ホモジナイズ

溶液は中性
キノロン剤は解離

遠心

キノロン剤は水層に移行

試料層

試料

サルファ剤・他
キノロン剤

キノロン剤以外は
アセトニトリ層に移行

水層

分取

5 %ギ酸含有ACNを添加ホモジナイズ

溶液は酸性
キノロン剤は非解離

キノロン剤はACN層に移行

遠心

合算
全成分を回収

サルファ剤

キノロン剤

H

環境が酸性の場合非解離状態とな
りキノロン剤は有機層(ACN層)へ添加回収率(％）

環境が中性の場合解離状態となりキノロン剤は水層へ添加回収率(％）＋

キノロン剤の解離・非解離状態(例：オキソリン酸)
ギ酸含有濃度(％)

ギ酸含有濃度(％)

4-キノロンを基本骨格にもつ化合物でその骨格の中に‐COOH基をもつため、環境が中性の場合は解離状態となり水層に移動します。環境が酸性の場合は非解離となり有機層(ACN層)に移動します。

Sulfathiazole

Sulfanilamide

Sulfapyridine

Oxolinic acid

Marbofloxacin

Miloxacin

抽出時のギ酸濃度の違いによる回収率の比較例(鶏ささみ)

サルファ剤ではギ酸を添加すると回収率が低下するためギ酸濃度０％を、キノロン剤では安定した回収率を得られるようギ酸濃度５％を選択しました。

精製のポイント②2%ギ酸含有ACN-水(8/2)①抽出液(ACN層)1 mL①抽出液(ACN層)1 mLを負荷
C18-50：低極性夾雑成分を除去します。
PSA-30：脂肪酸や陰イオン性夾雑成分を除去します。
キノロン剤は保持されると考えられます。

サンプルループ

C18-50 精製：
低極性夾雑成分の除去

シリンジポンプ③水Mノズル

シリンジポンプ

PSA-30 精製：
脂肪酸、陰イオン性夾雑成分の除去③水を添加
水添加により試料液のACN比率を下げてC18-30に負荷することで①で除去できなかった低極性夾雑成分を除去します。

C18-30 精製：
低極性夾雑成分の除去④目的物質(キノロン剤)

目的物質(農薬など)
夾雑成分②2%ギ酸含有ACN-水(8/2)0.5 mLを通液
酸性溶液を通液することでキノロン剤を非解離状態に保ちます。

④目的物質を試験管に回収します。
④目的物質

PSAについてはpp.106-115「7,3)(2)イオン交換カラム」も併せてご覧ください。
755,2)(2)動物用医薬品

マラカイトグリーン (202010ver.)5,1)(2) マラカイトグリーン

化合物情報

マラカイトグリーンは水カビなどの治療薬として観賞魚に使【マラカイトグリーン：MG】

用されますが、食用の養殖魚への使用は禁止されています。マ

MF：C23H25N2
MW:329.47
pKa:5.06
水に可溶

ラカイトグリーンは光分解性があり、分析には迅速性が求められます。

前処理フロー【ロイコマラカイトグリーン：LMG】

試料採取 10 g

MF：C23H26N2
MW:330.48
pKa :5.46
水に可溶

添加 クエン酸・リン酸緩衝液(pH3)1) 4 mL
添加 ACN 10 mL

前処理フロー解説・留意点

ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分
添加 NaCl 1 g❶ クエン酸・リン酸緩衝液(pH3)で抽出するのでクエン酸は添加しません。

…❶

振とう溶解 10秒
添加 MgSO4(無水) 4 g❷

振とう 1分冷凍することで脂肪を固化し脱脂します。
（写真はうなぎ蒲焼）

遠心分離 3,500 rpm, 5分
冷凍により固化
冷凍(－20℃：60分）…❷

抽出液(ACN層)
全自動固相抽出装置ST-L400

Smart-SPE C18-30㎎：精製

1)クエン酸・リン酸緩衝液(pH3)調製方法①クエン酸63 gを水に溶解し1 Lに定容します。
②リン酸二ナトリウム215 ｇを水に溶解し1 Lに定容します。
③①に②を加えpH3に調整します。

コンディショニング
アセトン
ACN

Smart-SPE SCX-30㎎：保持
負荷[保持] 抽出液(ACN層) 1 mL 分取
洗浄 ACN 1 mL

測定条件例
LC Prominence (島津製作所)
分析カラム Atlantis T3, 2.1 mm I.D. x 150 mml.,3µm
移動相A液：0.1 %ギ酸水溶液
B液：アセトニトリル
流速0.2 mL/min
グラジエント B Conc. 5%(0-3 min)-95%(10-15 min)5%(15-20 min)
カラム温度
40 ℃
注入量
10 µL

Smart-SPE SCX-30㎎
溶出 28％アンモニア水-ACN(1/9) 0.9 mL

定容：1 mL 水で調整
測定：LC-MS/MSMS API3200 (エービー・サイエックス)
イオン化モード ESI positive

参考文献： 小西ら,「LC/MS/MSを用いたうなぎ中マラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの迅速分析法の検討」,第103食品衛生学会学術講演会要旨集p.45

765,2)(2)動物用医薬品

前処理の
ポイント

マラカイトグリーン (202010ver.)①C18-30での低極性夾雑成分の除去②アンモニア水(アルカリ性)によるSCXからの溶出

精製のポイント②ACN1 mL

③28％アンモニア水-ACN(1/9)1 mL①抽出液(ACN層)(pH3)1 mL

サンプルループ

C18-30 精製：
低極性夾雑成分の除去

シリンジポンプ

シリンジポンプ

Mﾉｽﾞﾙ

SCX-30 保持：
MG、LMG④目的物質(MG、LMG)

流出液：高極性・中極性夾雑成分の除去
低極性夾雑成分の除去

目的物質(農薬など)
夾雑成分

SCX(Strong Cation Exchange)
常にマイナスに帯電作用：強陽イオン交換

O OS
O

pKa：-6.5

強イオン交換カラムはpHに関わらず常に帯電状態です。

環境が酸性の場合
SCX

SCX-30MG

H Si
3スルホニルベンゼン

環境がアルカリ性の場合
SCX

MG①抽出液(ACN層)(pH3)1 mLを負荷
C18-30：低極性夾雑成分を除去します。
SCX-30：MGとLMGは保持されます。
ACN層抽出は酸性のためMG,LMGは解離状態となりSCXに保持されます。
このとき高極性及び中極性夾雑成分は流出液とともに除去されます。

②ACN1 mLを洗浄
ACNは中性のためSCXに保持されたMG、LMGは保持されたままで低極性夾雑成分を洗浄により排出し除去します。

③④28％アンモニア水-ACN(1/9)による溶出
アルカリ性の溶液で溶出することでMG、LMGは非解離状態となり、SCXから溶出されます。

環 境 が 酸 性 の 場 合 、 MG 、
LMGはプラスに帯電し解離状態になり、SCXも帯電状態である
ためMG、LMGはSCXに保持されます。

環 境が アル カ リ性 の場 合 、MG、LMGは帯電せず非解離状態になり、SCXから脱着して溶出されます。

SCXについてはpp.106-115「7,3)(2)イオン交換カラム」も併せてご覧ください。

775,3)カビ毒

アフラトキシン (202010 ver.)5,3) アフラトキシン

化合物情報

アフラトキシン (以下AFs)とはアスペルギルス ・フラバス(Aspergillus flavus：コウジカビの一種)などから生成されるカ【アフラトキシンB1 (AF B1)】

ビ毒の総称で、中でもAFB1は天然物で最も強力な発がん性物質の一つとして知られています。厚生労働省の『総アフラトキシ

Bグループは五員環

MF：C17H12O6
MW:321.3
logPow：1.23(推定値)

ンの試験法』ではB1、B2、G1、G2が対象となっています。

前処理フロー【アフラトキシンB2 (AF B2)】

試料採取 50 g

MF：C17H14O6
MW:314.3
logPow：1.45(推定値)

添加 ACNｰ水(9/1) 200 mL
ホモジナイズ 8,000 rpm, 5分…❶

静置【アフラトキシンG1 (AF G1)】

抽出液

MF：C17H12O7
MW:328.3
logPow：0.50(推定値)

抽出液 5 mL 分取
添加 水 5 mL

遠心分離 3,500 rpm, 5分

Gグループは六員環…❷…❸【アフラトキシンG2】
MF：C17H14O7
MW:330.3
logPow：0.71(推定値)

試験溶液 10 mL
全自動固相抽出装置ST-L400

Smart-SPE C18-50㎎：精製

コンディショニング
アセトン
ACN-水(1/1)

前処理フロー解説・留意点❶

本法ではプロセスホモジナイザーを用いてホモジナイズしました。
アフラトキシンなどカビ毒汚染はロット内に局在化しているためサン
プリングご誤差を低減する目的で試料の採取量を多くします。

負荷[通液] 試験溶液 1 mL 分取
洗液 ACN-水(1/1) 0.2 mL

流出液
添加 水 12 mL

Smart-SPE C18-50㎎：保持コンディショニング
アセトン
水プロセスホモジナイザー❷ 水を添加し、ACN濃度を下げて(約45％ACN-水)C18に保持させます。

洗浄 水 3 mL
固相乾燥(窒素ガス) 10秒…❹❸ 遠心分離により固形物を沈殿させます。

Smart-SPE C18-50㎎
Smart-SPE SCX-30㎎：精製

コンディショニング
アセトン
ACN

Smart-SPE PSA-30㎎：精製

遠心分離後❹ ここでの窒素ガスは固相の乾燥目的ではなく、装置内

溶出 ACN 1 mL

で固相が移動する際に固相の先端から液滴が落ちるのを防ぐためなので10秒にしています。

定容：2 mL 水で調整
測定：LC-MS/MS

78

5,3)
カビ毒
アフラトキシン(202010ver.)カビ毒
アフラトキシン
(201910ver.)①C18-50負荷[通液]による低極性夾雑成分の除去

前処理の
ポイント

②C18-50 [保持]による高極性夾雑成分の除去③SCX-30、PSA-30によるイオン性夾雑成分の除去

精製のポイント②ACN-水(1/1)④ACN①試験溶液1 mL

サンプルループ

C18-50(上) 精製：
低極性夾雑成分の除去

シリンジポンプ③水

C18-50(下)シリンジポンプ

SCX-30 精製：
陽イオン夾雑成分の除去

Mﾉｽﾞﾙ

PSA-30 精製：
脂肪酸等陰イオン夾雑成分の除去

C18-50(下) 保持：
AFs

シリンジポンプ⑤目的物質(AFs)

流出液：高極性夾雑成分の除去

目的物質(農薬など)
夾雑成分①試験溶液1 mLを負荷
C18-50(上)：ACN濃度約45％で負荷し、低極性夾雑
成分を除去します。
②ACN-水(1/1)0.2 mLを通液
C18-50(上)から目的物質(AFs)を溶出します。

精製固相の検討
イオン性夾雑成分の除去を目的として追加精製の固相を検討しました。
その結果SCX+PSAで良好な回収率が得られました。

120
AF B1

AF B2

AF G1

③水を添加
水添加によりACN濃度を約4％にしてC18-50(下)に負荷します。ここで目的物質はC18-50(下)に保持され、高極性夾雑成分は流出し除去されます。

AF G2

100

④⑤ACNによる溶出
C18-50の下にSCXとPSAを連結することでイオン性夾
雑成分を除去しながら目的物質を溶出します。

回収率(%)

80
60
40

測定条件例

20
0
PSA

SCX+PSASAXLC UHPLC(Nexera X2) (島津製作所)
分析カラム
Shim-pack FC-ODS,
2.0 mm I.D. x 150 mmL.,3 μm
移動相
A液：10 mM酢酸アンモニウム水溶液
B液：メタノール
流速
0.2 mL/min
グラジエントB Conc. 40%(0-2 min)-60%(10 min)90%(12-14 min)-40%(14.1-15min)
カラム温度
40 ℃
注入量
10 µL

SCX+SAX

陽イオン交換、陰イオン交換カラムにおける回収率の比較(アーモンド抽出液に標準溶液を添加して評価)

MS LCMS-8045 (島津製作所)
イオン化モード ESI positive
参考文献： 小西ら,「自動前処理装置によるアフラトキシン(B1,B2,G1,G2)分析法の開発」,第115食品衛生学会学術講演会要旨集p.142

795,4)その他

メラミン (201809ver.)5,4) メラミン

化合物情報

メラミンは、主にメラミン樹脂の原料として使用されるほか、【メラミン（2,4,6-トリアミノ-1,3,5-トリアジン）】

ラミネート、接着剤など様々な工業製品に利用されています。

NH2

MF：C3H6N6
N
N
MW:126.12
logPow：-1.37、-1.14
H2N
N
NH2
解離定数：5.00（25℃）、5.16（20℃）

しかし、2007年に中国製ペットフード、2008年に中国製乳幼児用調製粉乳にメラミンが不正に混入され、メラミンが原因と思われる健康被害が多数報告されました。

前処理フロー
牛乳

固形物(チョコレート、クッキーなど)
試料採取 5 g

試料採取 5 g

添加 ACN 10 mL…❶

添加 ACN-水(1/1) 25 mL
振とう 1分

振とう 1分

遠心分離 3,500 rpm, 5分

遠心分離 3,500 rpm, 5分

抽出上澄液

抽出上澄液

抽出上澄液 0.2 mL 分取

抽出上澄液 1.5 mL 分取
添加 水 0.5 mL…❷

添加 ACN-水(1/1) 1.8 mL…❸試験溶液 2 mL試験溶液 2 mL
全自動固相抽出装置
Smart-SPE C18-30㎎：精製

全自動固相抽出装置

コンディショニング
アセトン
ACN

Smart-SPE C18-30㎎：精製

Smart-SPE PSA-30㎎：精製

コンディショニング
アセトン
ACN

Smart-SPE PSA-30㎎：精製

負荷[通液] 試験溶液 1 mL 分取負荷[通液] 試験溶液 1 mL 分取

洗液 ACN-水(1/1) 1 mL

洗液 ACN-水(1/1) 1 mL

流出液

流出液
添加 0.1 mol/L HCl 2 ｍL

Smart-SPE SCX-30㎎：保持

添加 0.1 mol/L HCl 2 ｍL
コンディショニング
アセトン
ACN

Smart-SPE SCX-30㎎：保持

Smart-SPE SCX-30㎎

Smart-SPE SCX-30㎎

固相乾燥(窒素ガス) 20秒

固相乾燥(窒素ガス) 20秒
溶出 28%アンモニア水-メタノール(5/95) 0.9 mL

溶出 28%アンモニア水-メタノール(5/95) 0.9 mL

定容：1 mL メタノールで調整

定容：1 mL メタノールで調整
分取 0.1 mL

コンディショニング
アセトン
ACN

…❸

測定：LC-MS/MS

定容：1 mL メタノールで調整
測定：LC-MS/MS

805,4)その他

メラミン (201809ver.)①アセトニトリル抽出による除タンパク(牛乳の場合)

前処理の
ポイント

②C18-30による低極性夾雑成分の除去③SCX-30、PSA-30によるイオン性夾雑成分の除去

前処理フロー解説・留意点

❶

測定条件例

牛乳では抽出溶媒をACN‐水とした場合、遠心しても白濁するだけで分離しないため(写真左)、ACNに変更しました。
抽出溶媒をACNに変更することで、牛乳中のタンパク質が変性・凝固し、遠心分離による除タンパクが可能になりました(写真右)。

抽出溶媒
ACN‐水

LC Prominence (島津製作所)
分析カラム
TSK-GEL AMIDE-80,
2.0 mm I.D. x 150 mml
移動相A液：0.1 %ギ酸水+2mMギ酸アンモニウム水溶液
B液：ACN
流速
0.3 mL/min
グラジエントB Conc. 95%(0 min)-90%(1 min)60%(2-4 min)-56％(6min)10%(7-12min)-90%(12.1-17min)
カラム温度
40℃
注入量
5 µL

抽出溶媒
ACN

❷

水を添加し、ACN濃度を下げてC18-30に負荷すること
で低極性夾雑成分を除去します。

❸

測定濃度が検量線の直線性の範囲内に入るようにするた
め希釈します。本法の測定条件では0.1～10ppbの間で直線性が確認されました。

MS API3200 (エービー・サイエックス)
イオン化モード ESI positive

精製のポイント②ACN-水(1/1)④28％アンモニア水-メタノール(5/95)①試験溶液1 mL

サンプルループ
シリンジポンプ③0.1 mol/L HCl

C18-50(上) 精製：
低極性夾雑成分の除去

シリンジポンプ

SCX-30

PSA-30 精製：
脂肪酸等陰イオン夾雑成分の除去⑤目的物質(メラミン)
シリンジポンプ

SCX-30 保持：メラミン①試験溶液1 mLを負荷
C18-50：低極性夾雑成分を除去します。

目的物質(農薬など)
夾雑成分

PSA-30：脂肪酸等陰イオン夾雑成分を除去します。

SCX(Strong Cation Exchange)

強イオン交換カラムはpHに関わらず常に帯電状態です。

O OS
O
H Si

スルホニルベンゼン

3

環境が酸性の場合

環境がアルカリ性の場合

常にマイナスに帯電
SCX

H Si

NH2 メラミンN

3

プラスに帯電 H2N

O OS
O

NH2
N

H Si

N
N

③0.1 mol/L HClを添加
HClを添加して試験溶液を酸性にした状態でSCXに通液します。酸性条件下(pH＜3)ではメラミンはプラスに帯電するためSCXに保持されます。

常にマイナスに帯電
SCX

O OS
O

②ACN-水(1/1)1 mLを通液
C18-50から目的物質(メラミン)を溶出します。

常にマイナスに帯電作用：強陽イオン交換
pKa：-6.5

N

メラミン

3

H2N
NH2

環境が酸性の場合、メラミンはプラスに帯電し、SCXも帯電状態であるためメラミンはSCXに保持されます。

N

NH2

帯電されない環境がアルカリ性の場合、メラミン帯
電されないのでSCXから溶出されます。

参考文献： 小西ら,「メラミン分析法の自動化の検討」,第107食品衛生学会学術講演会要旨集p.49

81④⑤28％アンモニア水-メタノールによる溶出
アルカリ性溶液を通液することでメラミンは帯電されずSCXから溶出されます。

SCX に つ い て は pp.106-115 「 7,3)(2) イ オ ン 交 換 カ ラム」も併せてご覧ください。

5,5)【参考】STQ-GC A法 (201809 ver.)5,5) STQ-GC A法
STQ-GC A法は通知試験法（一斉試験法）をスケールダウンした方法になります。
比較的広い極性の農薬を対象とできますが、その分精製効果が不十分となる傾向があり、先に記載したGC-B法がお勧めですが、参考としての掲載となります。LC-MS/MSを保有していない場合、極性農薬の分析に有効です。

前処理フロー
前処理フロー解説・留意点…❶

コンディショニング
アセトン 2 mL(洗浄、出し切る)
ACN 2 mL(活性化、出し切らない)

Smart-SPE C18-50㎎：精製❶

固相活性化のコンディショニングについて
シリカ系充填剤の場合はシリカ細孔が溶媒で十分満たされた状態を保つために固相活性化の溶液は出し切
らずに少し残します。

❷

GCKを上に、PSAを下になるよう連結します。下に選択性の高い固相を用いることで精製効果を高めるよ
うにします。

❸

リザーバーにMgSO4(無水)を入れ、そこに試験溶液①を負荷して試験溶液①の水分を脱水します。
MgSO4(無水)の量が少ないと脱水が不十分となり精製効果が低下します。

❹

GC-MSで測定するためアセトン‐ヘキサン混液に転
溶します。

❺

これは大量注入(25μL)する場合の添加量です。注入
量が異なる場合はGCに注入するPEGの絶対量が500 ng、
フェナントレンd体が0.5 ngになるように添加量を変更します。
※フェナントレンd体は測定時の感度変動確認のために添加しています。定量値補正には使用していないため添加は必須ではありません。

❻

標準溶液は試料溶液と同じ溶媒組成にすることを推奨します。

❼

定容量を変更して濃縮することも可能です。その場
合はPEG及びフェナントレンd体の添加量が❺になるよ
うに調製します。

負荷[通液] 抽出液(ACN層) 1 mL 分取
通液 ACN 0.2 mL
流出液
添加 トルエン 0.4 mL
試験溶液①Smart-SPE GCK-20㎎：精製
Smart-SPE PSA-30㎎：精製

コンディショニング
アセトン 2 mL(洗浄、出し切る)
ACNｰトルエン(3/1) 2 mL…❷

添加 MgSO4(無水) 0.3 g…❸

負荷[通液] 試験溶液①
脱水
通液 洗液 ACN-トルエン(3/1) 0.6 mL
流出液

濃縮、溶媒除去
添加 アセトン-ヘキサン(15/85) 1 mL…❹

添加 0.1%PEG300‐1ppmフェナントレンd体
混合アセトン溶液 40 μL

定容：2 mL アセトン-ヘキサン(15/85)で調整

…❺

…❻❼

測定：GC-MS

GCK(グラファイトカーボン)の機能
グラファイトカーボンは平面構造であるため、試料に含まれる平面構造をもったフラボノイド類やクロロフィル等の物質を吸着します。

グラファイトフラボノイド類

クロロフィルa

グラファイトカーボンカラムについてはpp.116-117「7,3)(3)グラファイトカーボンカラム」も併せてご覧ください。

825,5)【参考】STQ-GC A法 (201809 ver.)
前処理の
ポイント

比較的幅の広い極性に対応可能で、アセフェート、メタミドホス等の高極性農薬も分析可能だが、精製効果は不十分となる傾向。

操作方法の解説

目的物質(農薬など)
夾雑成分

C18で無～低極性の夾雑成分を除去して農薬はスルーさせます。

① C18で精製

抽出液 1 mLをC18へ負荷。

流出液を試験管(小)に回収

除去物質
・無～低極性夾雑成分
・クロロフィル
・高級脂肪酸エステル類
・高級アルコール類
・ステロール類など

C18

試験管

農薬

② 脱水＆GCK+PSAで精製

MgSO4(無水) 0.3 g

GCKで色素など平面構造のもの、PSAで高級脂肪酸や色素などを除去し、農薬はスルーさせます。
ただしGCKでは平面構造をもった農薬もGCKに保持されるためACN‐トルエンで溶出します。

MgSO4(無水)を通液前にリザーバーに直接投入
リザーバーにMgSO4(無水)を直接投入し矢印のように回転させて試料溶液とMgSO4(無水)をよく攪拌する。

MgSO4(無水) （脱水剤）
GCK

それにより試料溶液中のごく微量の水分を脱水しGCK＋PSAにおける精製効果をUPさせる。

PSA

除去物質

除去物質
・イオン性夾雑成分
・高級脂肪酸
・色素など
メス試験管

農薬

83

色素、フラボノイド類

84

6, 異常回収率の原因と対策
1）異常回収率
2）多段階添加回収試験
3）精製後添加の異常回収率
4）GC-MS測定におけるマトリックス効果
5）抽出工程での損失
6) 精製工程での損失

えっー！！
なんで？？

85

6,1)異常回収率6,1) 異常回収率
回収率が20％(低い)とか200％(異常に高い)になったことありませんか？

試験法の評価の一つとして添加回収試験があります。その添加回収率(以下回収率)が100％であれば工程での損失がなく試験法として問題ありません 注1) 。しかし回収率が20％と低かったり200％といったように異常に高くなったりしたことはありませんか？ここで

えっー！！
なんで？？

はこのような異常回収率 注2) となった場合の原因と対策例を紹介します 注3)。
注1)厚生労働省の妥当性評価ガイドラインでは真度(回収率)の目
標値は70～120％となっていますが本ガイドブックでは損失のない場合の回収率は便宜上100％とします。
注2)本ガイドブックでは低回収率と異常高回収率を合わせて「異常回収率」と表現します。
注3)測定機器の不具合は除きます。

【異常回収率改善の手順】
異常回収率になった場合はまず多段階添加回収試験を行いどの工程に原因があるかを調べます 。次にその箇所に応じた対策を行い状況の改善をはかります。

ちゃんと操
作したのに
なあ

どこでロス
したのか
な？

異常回収率
低回収率はな
んとなくわかるけど回収率200％ってどういうこと？

多段階添加回収試験

原因箇所の特定
まずは
多段階添加回収試験をやってみよう！！

対策

改善

参考文献：厚生労働省：医薬食品局食品安全部発第1115001号：食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドラインについて866,2)多段階添加回収試験
6,2)多段階添加回収試験(1)多段階添加回収試験とは多段階添加回収試験とは前処理工程内の複数の段階で目的物質を添加し、その回収率の差から目的物質の挙動を推測する試験法です。本ガイドブックでは『抽出前』、『抽出後』、『精製後』の3段階で標準溶液を添加し、それぞれの段階の回収率を比較・評価する方法を提案しています。これによりどの工程に問題があったかを推測することができ、それに応じた対策を講じることで結果を改善することができます。

(2)多段階添加回収試験の手順①下記A.、B.、C.の各段階で標準溶液を添加した試料とD.標準試料を調製し測定します。
A. 抽出前添加：いわゆる通常の添加回収試験で、試料秤量後に標準溶液を添加します。
B. 抽出後添加：固相抽出を行う前に抽出液に標準溶液を添加します。

C. 精製後添加：測定前に前処理が終わった試験溶液に標準溶液を添加します。
D. 溶媒調製標準試料：溶媒に溶解した標準溶液で検量線として使用します。

②D.標準試料を検量線としてA.抽出前添加、B.抽出後添加、C.精製後添加の回収率を求めます。

・AとBで回収率に差がある場合は抽出でのロスが考えられます。
・BとCで回収率に差がある場合は精製でのロスが考えられます。
・Cの回収率は理論的には100％になるはずですが200％や数10％など異常回収率になる場合
は測定時のマトリックス(夾雑成分)による問題が考えられます。

試料秤量

抽出

A.抽出前添加測定

精製

B.抽出後添加C.精製後添加D.溶媒調製標準試料【回収率比較】
A＜Bの場合【回収率比較】
B＜Cの場合Cが異常回収率の場合抽出で損失！

精製で損失！

測定で問題あり！

p.94へ

p.96へ

p.88へ

よしっ！
原因箇所がわかったぞ！！

例えばCが異常低回収率(20％)の場合、抽出・精製工程で損失がなくてもA、Bの回収率も異常回収率(20％)となります。

876,3)精製後添加の異常回収率6,3) 精製後添加の異常回収率
精製後添加の回収率は添加後の工程がないので理論的には100％になるはずです。しかし実際には抽出や精製工程に問題がなくとも200％を超える異常高回収率や数10％の異常低回収率となる

精製後添加でも回収率が100％じゃないことがあるんだ…

場合があります。このような現象はマトリックス効果といわれます。ここではマトリックス効果に起因すると考えられる精製後添加における異常回収率の対応例を紹介します。
例えば・・・

試料秤量

抽出

A.抽出前添加精製

B.抽出後添加測定

C.精製後添加回収率200％

回収率がor100％じゃない！！

回収率20％

マトリックス効果とは

GC-MS、LC-MS/MS等の測定時にマトリックスにより目的成分のピーク形状、感度、保持時間が変動する現象のことです。精製後添加の回収率(マトリックスを含む添加試料/溶媒調製標準試料*100)で評価します。

(1)GC-MSにおける対策例
GC-MSでは200％を超えるような異常高回収率となる傾向が多く見られます。考えられる主な原因の一つは標準試料のGC-MSの活性点への吸着です。例えば検量線に使用する溶媒調製標準試料がGC-MSの活性点に吸着し、ピーク面積が減少すると添加試
料面積への相対値が小さくなりその結果として異常高回収率になります。対策としては疑似マトリックス(PEG)の使用や起爆注入
注1)により活性点をコーティングして標準試料が活性点に吸着しないようにします。疑似マトリックス(PEG)の使用ついてはp.91

でさらに詳しく説明します。異常回収率のもう一つの原因はマトリックスが多いことによる測定への影響です。マトリックスの影
響で注入時に農薬が分解する場合は低回収率となる場合もあります。以下に対策例と優先順位を記載します。
優先順位
1

2
3
4
5
6

考えられる原因

対策

標準試料が活性点に吸着され面積値が減

疑似マトリックス(PEG)の使用

少して相対的に回収率が高くなる「6,4)GC‐MS測定におけるマトリックス効果(p.80)」参照

標準試料が活性点に吸着され面積値が減

起爆注入注1) の実施

少して相対的に回収率が高くなる

注2)

装置に注入されるマトリックスが多く測精製後の最終試験溶液を希釈定に影響を与える(測定前に希釈:測定液のマトリックスを減らす)
注2)

固相に負荷するマトリックスが多く精製

抽出液の希釈が不十分(固相負荷前に希釈:固相に負荷するマトリックスを減らす)

精製が不十分でマトリックスが十分に除精製方法の変更

去できていない(固相や溶出溶媒の変更)
採取量の減量マトリックスが多く精製が不十分(抽出工程からマトリックスを減らす)

注1)起爆注入とはマトリックスを含む試料溶液を先に測定し、そのあとに溶媒(マトリックスなし)に溶解している標準試料を測することをいいます。最初に測定した試料のマトリックスによりGC-MSの活性点をコーティングし標準試料が活性点に吸着するのを抑制します。
注2)同じ希釈倍率でも固相負荷前に抽出液を希釈する方が最終試験溶液を希釈するより精製効果は高くなります。

886,3)精製後添加の異常回収率(2)LC-MS/MSにおける対策例
LC-MS/MSでは20％や50％といった異常低回収率となる傾向が多く見られます。このような現象はイオン化阻害(抑制)と呼ばれます。また異常高回収率を生じるイオン化促進という現象もあります。両者ともに装置に注入されるマトリックスが多い場合に生じます。以下に対策例と優先順位をマトリックスを減らすのがポイ
ントなんだね！

記載します。装置に注入するマトリックスの量を低減するのが基本ですが

それでも改善しない場合はマトリックス検量線注1)を使用します。マトリッ
クス検量線についてはp.123「8,2)定量方法の種類」をご覧ください。

優先順位
1

2
3
4
5

考えられる原因

対策
・精製後の最終試験溶液を希釈注2)

装置に注入されるマトリックスが多く測(測定前に希釈:測定液のマトリックスを減らす)

定に影響を与える・ 注入量を減らす
注2)

固相に負荷するマトリックスが多く精製が不十分

抽出液の希釈(固相負荷前に希釈:固相に負荷するマトリックスを減らす)

精製が不十分でマトリックスが十分に除精製方法の変更

去できていない(固相や溶出溶媒の変更)
採取量の減量マトリックスが多く精製が不十分(抽出工程からマトリックスを減らす)

マトリックスが多く、上記1～4でも改善

マトリックス検量線の使用しない

注1)マトリックス検量線とは試料ブランク測定液で希釈した標準物質を測定し作成した検量線です。試料溶液と標準試料のマトリックスの影響を相殺できます(p.123参照)。
注2)同じ希釈倍率でも固相負荷前に抽出液を希釈する方が最終試験溶液を希釈するより精製効果は高くなります。

へえー
同じ希釈でも固相負荷前に希釈する方がきれいになるんだ。

参考文献：日本農薬学会「残留農薬分析知っておきたい問答あれこれ」

改訂4版

2018

89

6,4)GC-MS測定におけるマトリックス効果
6,4) GC-MS測定におけるマトリックス効果
6,3)(1)で述べたようにGC-MS測定では200％など異常高回収率が生じる場合があります。その原因の一つとして標準試料のインサートやカラム、イオン源等に存在する活性（吸着）点への吸着があります。この現象はマトリックス効果と呼ばれます。ここではマトリックス効果の概要とその対策である疑似マトリックス(PEG)の使用について説明します。

(1) マトリックス効果の概要①異常高回収率を引き起こすマトリックス効果のイメージ標準試料では活性点を通過する際、その一部が活性点に吸着されることで検出器までの到達量が減少します。しかし、マトリックスを含む試料では、マトリックスが活性点に吸着するため、添加した標準試料は活性点に吸着されず、減量せずに検出器まで到達します。その結果、減量した標準試料で添加回収率を算出することになり100％を超えるという状況となります。
マトリックスを含んだ標準試料（添加回収試験）

標準試料
標準試料

活性点

マトリックス

10

10

マトリックスが活性点を
コーティング検出される標準試料は活性点の影響を受けない。

10

一部が活性点に吸着55検出される標準試料は減少している。（10→5）

標準試料を100%として計算するため、添加回収率が200%となる。

②検量線におけるマトリックス効果の影響
活性点に吸着する物質量は一定と考えられています。つまり、低濃度ほど吸着の影響が大きいことになり、検量線を作成した場
合、二次曲線となります。二次曲線の検量線を無理やり直線としてしまうと定量値に大きな誤差が生じます。これでは、抽出、精製で本来良好な回収率が得られていたとしても、計算上で異常定量値となります。特に点数の少ない検量線では誤算出の可能性が高まります。
60,000高濃度の標準試料
50,00040,000ピーク面積値

955

活性点の影響：小(100→95)

30,000

定量面積値

20,000

校正検量線から得られた濃度値

10,000低濃度の標準試料
5

5

0
0

200

直線検量線から得られた濃度値

活性点の影響：大(10→5)

400

600

800

1000

濃度 (ppb)

低濃度程、活性点の影響を受けやすくなる。
低濃度域での検量線が2次曲線になるのは
こういうことだったんだね！

【実際の検量線の例】
10000

1400

y=93.641x・484.71
2
Ｒ ＝0.9975

9000
8000

1200

7000

1000

6000

800

5000

600

4000
3000

低濃度域を拡大

2000

400
200

→

A点

1000

0

0
0

20

40

60
80
濃度 (ppb)

100

120

5

0

90

検量線がＹ切片を切っている。
1510
濃度 (ppb)

20

25

6,4)GC-MS測定におけるマトリックス効果(2)対策 疑似マトリックス(PEG)の使用：PEG共注入法[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ]標準試料にポリエチレングリコール300(PEG)を添加することで

TIC
PEG:

72826288

PEG

PEG

PEGが疑似マトリックスとして活性点をコーティングし、標準試料

-

0

PEG

6.0E+07

PEG

PEGの活性点への吸着を低減します。
4.0E+07

PEGはほとんどの農薬の保持時間をカバーしており、またそのフラグメントイオンは主に100以下のため目的物質(農薬)のマススペ

2.0E+07

PEG

PEG

クトルと重なりにくいといった利点があります。

0.0E+00
R.T-->
10:0015:0020:0025:0030:0035:00

PEG300のTICクロマトグラム①PEG使用による異常高回収率改善のイメージ
PEG共注入を行わない場合

マトリックスを含んだ標準試料（添加回収試験）

標準試料

標準試料

活性点

標準試料

10

マトリックス

10

マトリックスが活性点を
コーティング一部が活性点に吸着検出される標準試料は活性点の影響を受けない。

1055

検出器にすべての添加した標準試料が到達（10→10）

検出器に到達する標準試料が減少（10→5）

標準試料を100%として計算するため、添加回収率が200%となる。
PEG共注入を行う場合
標準試料
標準試料

マトリックスを含んだ標準試料（添加回収試験）
PEG
マトリックス
活性点

10

PEGが活性点をコーティング

PEGが活性点をコーティング

10

PEGが活性点をコーティングするため、標準試料は活性点の影響を受けにくい。

PEGが活性点をコーティングするため、マトリックスの吸着による活性点の増大を防げる。

②参考：農薬標準溶液測定における問題点
クロルピリホスの単品標準混合溶液と混合標準溶液の比較

GC-MSで同濃度の単品の標準溶液と混測定条件合の標準溶液を測定した場合で面積値が異なる場合があります。これは単品の標準溶液の方がより活性点への吸着を起こしやす
いためと考えられます。この場合も単品の

面積値

1 単品標準溶液(クロルピリホスのみ)

995,061

2 混合標準溶液32(クロルピリホス含む)

1,518,705

3 混合標準溶液34(クロルピリホス含まない)＋クロルピリホス

1,335,686

4 単品標準溶液(クロルピリホスのみ)＋PEG300

1,294,356

5 混合標準溶液32(クロルピリホス含む)＋PEG300

1,669,142

6 混合標準溶液34(クロルピリホス含まない)＋クロルピリホス＋PEG300

1,719,705

標準溶液にPEGを添加し、共注入を行うことで農薬の活性点への吸着が低減され、よ・1の面積値が最も小さくテーリングを起こしている。

り正確な定量値に近づけることができると・2と3の面積値はほぼ同じで1よりもピーク形状が改善し、面積値も増加した。

考えられます。

・PEG添加によりピーク形状が改善し、面積値も増加した(4,5,6)。

916,4)GC-MS測定におけるマトリックス効果(3)PEG共注入による効果
標準試料だけでなく最終試験溶液(測定液)にもPEGを添加することでマトリックスによる活性点の増大をPEGのコーティングにより防ぐことができます。
PEG共注入メリット■

マトリックスによる異常回収率の低減

■

感度向上

■

ピーク形状の改善(PEGが活性点をコーティングし目的物質が吸着されないため)■カラム劣化の防止(PEGが活性点をコーティングするためマトリックスが活性点に吸着せず汚れとして残らないため)(一部の農薬ではネガティブ効果となります)■ PEG共注入検量線法による検量線の直線性の向上
標準試料に疑似マトリックスとしてPEGを添加し検量線を作成する手法です。マトリックス検量線の問題点である試料に残留する農薬の影響を受けません。(p.123参照)【PEG共注入によるクロマトグラムの比較例】

ネガティブ効果

ポジティブ効果
PEG有

PEG有

PEG有

PEG有

PEG無

PEG無

PEG無

PEG無

ﾎｽﾁｱｾﾞｰﾄ

ﾄﾘｼｸﾗｿﾞｰﾙ

PEG有

PEG有

PEG無

PEG無

ｴﾃﾞｨﾌｪﾝﾎｽ

ｲｿｷｻﾁｵﾝ

ｲﾌﾟﾛｼﾞｵﾝ

PEG有

PEG有

PEG無

ﾋﾟﾗｸﾛﾎｽ

PEG無ｱｸﾘﾅﾄﾘﾝ

ｲﾐﾍﾞﾝｺﾅｿﾞｰﾙ(4) PEG共注入の方法
共注入に使用するPEGは必ずPEG300を使用します。PEG400以上は高沸点のPEGが分離カラムに残る可能性があり、分離カラムの極性を変えてしまう恐れがあります。
PEGは絶対量が500 ngになるようにGCに注入します。500 ngより少ないと効果が薄く、多すぎると吸着を引き起こし悪影響が生じる可能性があります。注入量により測定液へ添加するPEGの濃度と量が異なりますのでご注意願います。

①PEG300の調製方法
a)１％(w/v)PEGアセトン溶液
PEG300を1g秤量しアセトンで100 mLに定容します。
b)0.1％(w/v)PEGアセトン溶液a) １％(w/v)PEGアセトン溶液を10倍希釈します。
10倍希釈の例： a) １％(w/v)PEGアセトン溶液1 mL分取し、アセトンで10 mLに定容【PEGの添加例】
最終試験液の定容量最終試験液へのPEGの添加濃度と添加量

GCへの注入量

濃度

添加量

注入絶対量

1 mL

1 µL

１ ％(w/v)PEG

50 µL

500 ng

1 mL

2 µL

１ ％(w/v)PEG

25 μL

500 ng0.1 ％(w/v)PEG

20 μL

500 ng

1 mL

25 µL(LVI大量注入)926,4)GC-MS測定におけるマトリックス効果②PEG300の使用上の注意点■

PEG300を使用する。

■

GCに注入する絶対量を500 ngにする。

■

LVI-S250使用の大量注入の場合は最高温度を290℃に、スプリットレス注入の場合は注入口温度を270℃に設定する。

■

GCの昇温最高温度を310℃5分以上保持とし、高沸点のPEGを分離カラムに残さない。

■

最高使用温度の高いカラムを推奨■

GCのインターフェース温度を290℃に設定し、高沸点のPEGをインターフェースに残さない。

オーブン温度
最高温度310℃（5分以上）
試料による汚れが懸念される場合は320℃に設定

注入口条件

但し液相がはがれやすくなるので要注意

LVI-S250大量注入口：最高温度を290℃に設定
スプリットレス注入口の場合は270℃に設定

インタｰフェｰス温度
290℃以上イオン化室温度

プレカラム注1)

260℃以上不活性化処理カラム
0.25 mm×0.5 M
高沸点化合物
テーリング防止のため)

分離カラム
高温条件に対して耐久性のある
分離カラムを選択

ポストカラム注2)
不活性化処理カラム0.25 mm×0.5 M
高沸点化合物による汚れの吸着防止のため

注1),2)【プレカラムとポストカラム】❶プレカラム大量注入口装置LVI-S250使用時は分離カラムの注入口側にプレカラムの装着を標準仕様としています。大量注入口ではインサートからカラムへの導入に時間がかかるためプレカラムを装着することで昇温開始前の分析カラムの先端に試料を濃縮させてから昇温を開始し分離が始まるようにします(試料がカラムに導入されるまでオーブンは初期温度のままに設定しておきます)。これ
によりピーク形状や高沸点化合物の感度を良好にします。
❷ポストカラム
STQ法では検出器側にポストカラムをつけることを推奨しています。インターフェース部分はカラムオーブン最高温度より低く設定されているため、インターフェース付近では高沸点化合物がカラム内に汚れとして吸着される可能性があるためポストカラムを装着することによりその汚れを防ぎます。ポストカラムはプレカラムと同じものをご使用できます。
❸分離カラムとの接続
分離カラムとプレカラムとポストカラムの接続にはガラス製のプレスフィットコネクタを用います。
プレカラム及びポストカラム※プレカラム/ポストカラム共に
約0.5 mにカットして使用します。

【ジーエルサイエンス製】
不活性シリカキャピラリーチューブ
内径0.250 mm 外径0.350 mm 長さ10 m（CatalogNo.1010‐36322）【アイスティサイエンス製】

プレスフィットコネクタ

プレスフィットⅠ型 0.25‐0.25 mm
10個入り（型番：GB‐5010‐501）

参考文献：1)Tameo OKUMURA, Journal of Environmental Chemistry, N0.5(3), pp.575-583 (1995）
2)佐々野ら,「作物中残留農薬の迅速一斉分析法 －GC/MS編－」,第94回日本食品衛生学会学術講演会要旨集p.33
3)佐々野ら,「GC/MSを用いた食品中残留農薬分析における検量線に関する検討」,第31回農薬残留分析研究会要旨集pp.217-222

936,5)抽出工程での損失
6,5)抽出工程での損失
抽出前添加の回収率が抽出後添加の回収率より低い場合は抽出工程での損失が考えられます。抽出前添加は試料秤量後に標準試料を添加しますが、用いる試料が変性していたり、粉砕時の酵素の影響などで添加した標準溶液が分解し回収率が低下する場合があります。そこで粉砕時における対策例もあわせて紹介します。

例えば・・・

試料秤量

抽出

精製

A.抽出前添加測定

B.抽出後添加＜回収率40％

C.精製後添加回収率100％抽出工程で60％の損失！！
粉砕や試料の保管にも注意しないといけないんだなあ(1)粉砕(試料調製)における対策例
粉砕(試料調製)が回収率に影響を与える原因には①均一不足による偏りから生じる結果のばらつき、②粉砕時の分解、③吸着、④凍結・解凍の繰り返しによる試料の変性などが考えられます。凍結粉砕は試料の均一化、分解・変性を抑制するためこれらの対策として有用です。

凍結粉砕のメリットについてはp.10「2,予冷式ドライアイス凍結粉砕法」をご覧ください。

原因
①

均一不足

試料の偏り

②

分解

加水分解

症状

対策例

ばらつき

凍結粉砕、ミル、超遠心粉砕、ふるいなど

酵素
低回収率

熱分解
③
④

吸着
凍結・解凍の
繰り返し

物性特性

低回収率
ばらつき

変性

低回収率

94

酸・アルカリ添加、凍結粉砕、発熱防止、
温度調整などガラスや金属への吸着防止剤添加など
凍結粉砕、小分け凍結保管

6,5)抽出工程での損失(2)抽出における対策
抽出工程では回収率に影響を与える原因として下記の①～⑦が考えられます。いずれの工程も重要ですがポイントは液液分配時の水と塩の比率(塩が飽和していること)と、塩類を十分に振とう溶解することです。特に⑥ではまず3種類の塩を添加し、十分に振とう溶解(⑦)してからMgSO4(無水)を添加することで試薬の溶解不足を解決し、液液分配で塩の役割を発揮することができます。
(p.14参照)①

試料採取 10 g

添加 標準溶液(添加回収試験の場合)
添加 水 (10－試料の含水量) mL
添加 ACN 10 ｍL

ホモジナイズ 13,000 rpm, 1分②③

振とうが大事なんだね。
抽出って奥が深いなあ…

④⑤

添加 NaCl 1 g
添加 クエン酸3Na2水和物 1 g
添加 クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5 g

振とう溶解 10秒⑥⑦
添加 MgSO4(無水) 4 g

振とう 1分⑦

遠心分離 3,500 rpm, 5分抽出液(ACN層)

①
②

③

原因

症状

対策例

ばらつき

ばらつき

均一化

添加量が多い希釈される(定量値に影響を与える)

低回収率

濃い濃度での少量添加

溶媒にヘキサンが含まれている抽出溶媒(ACN)と分離する

低回収率

溶媒変更

水添加後の膨潤時間が長い

農薬の分解

低回収率

時間調整

低回収率

水分含量の確認

採取量が少ない(1g採取など)

溶媒との混和不十分
水の添加量不足

液液分配時の水と塩の比率が変わってしまう
pH調整不十分

増量④

抽出液量の不足

抽出力不足

低回収率

複数回抽出
(p.16~17参照)

⑤

抽出方法

⑥

試薬添加ミス⑦

振とうが不十分

抽出力不足
pH調整不十分塩析効果不十分

低回収率

ホモジナイズ

低回収率

計量スプーンの使用

試薬溶解不足低回収率

pH調整不十分塩析効果不十分95

MgSO4(無水)添加前後の振とうの強化6,6)精製工程での損失
6,6)精製工程での損失 B.抽出後添加回収率＜C.精製後添加回収率
抽出後添加の回収率が精製後添加の回収率より低い場合は精製工程での損失が考えられます。
例えば・・・

試料秤量

抽出

A.抽出前添加精製

測定

B.抽出後添加C.精製後添加＜回収率30％

回収率100％

精製でのロスは固相から出て来てないのかなあ？
保持されずに流れていった可能性もあるなあ。

精製工程で70％の損失！！

(1)精製における対策例
精製工程で損失する原因としては農薬が固相に保持されていない、または固相から溶出していないことが考えられます。
原因

対応例
負荷溶液の溶媒の種類や比率を変更する

固相への保持が不十分
保持力の強い固相を使用する固相からの溶出が不十分

溶出溶媒の種類や比率を変更する

溶媒比率にはこんな背景があったんだね。

(2)【参考】STQ法で使用する溶媒比率の精製効果
STQ法で使用する固相に通液する溶媒の比率による精製効果を下記に示します。農薬を効果的に保持または溶出させるには適切な溶媒比率があります。但し、農薬と性質の近い夾雑成分も同様の挙動を示すため農薬の回収率と精製効果のバランスを見ながら溶媒比率を設定する必要があります(pp.40-44、
p.48参照)。
主な相互作用

主な用途

通液溶媒

溶媒比率による精製効果
・ACN比率が無極性例)C18

無・低極性夾雑の除去
クロロフィル

低い→脂質除去効果大、低極性農薬の回収率が低下
ACN－水(ｼﾗﾌﾙｵﾌｪﾝ、ｴﾄﾌｪﾝﾌﾟﾛｯｸｽ)

コレステロールなど

高い→低極性農薬回収向上、夾雑物の溶出の増加(脂質、ｸﾛﾛﾌｨﾙの溶出)・ACN比率が高い→極性農薬が溶出、固相に保持されない

無極性
例)C18

農薬保持

PBX

低い→極性農薬は固相に保持される
ACN－水

しかし有機溶媒の農薬が溶解している状態で水を添加して急激にACN比率を下げると低極性農薬がリザーバーなどに吸着し回収率が低下する
・アセトン比が極性
陰イオン交換例)PSA

ｱｾﾄﾝ‐ﾍｷｻﾝ混液

低い→高極性農薬の回収率低下 (ﾌﾙﾘﾄﾞﾝ、ﾌﾟﾛﾊﾟﾆｱﾙなど)

脂肪酸除去

高い→脂肪酸溶出の可能性

イオン性夾雑物除去

・ギ酸濃度がギ酸含有ACN

低い→酸性農薬の回収率が低下 (ｸﾛﾌﾟﾛｯﾌﾟ、ﾅﾌﾟﾀﾗﾑなど)
高い→酸性夾雑の溶出

平面構造
例)GCK

・トルエン比が平面構造夾雑除去

ﾄﾙｴﾝ‐ｱｾﾄﾝ‐ﾍｷｻﾝ

低い→平面構造農薬の回収率低下
高い→平面構造夾雑物の溶出96

7, 補足資料-1
固相抽出の基礎
1）固相カートリッジの基本的な使い方
2）Smart-SPEの種類
3）主な固相カートリッジの使い方（1）無極性カラム C18（2）イオン交換カラム（3）グラファイトカーボンカラム

イオン交換

LogPow

pKa

コンディ
ショニング

？

極性/無極性保持/溶出
いつもやってる固相抽出だけど説明してって言われたらちょっと自信がないなあ。

977,1)固相カートリッジの基本的な使い方
7,1）固相カートリッジの基本的な使い方
固相カートリッジはまずコンディショニングを行い充填剤の官能基を活性化させてから試料を負荷します。試料の負荷には「通過型」と「保持型」の使い方があります。

(1)コンディショニング
コンディショニングとは使用前の固相カートリッジに溶媒を通液して充填剤を濡らし官能基を活性化させることです。基本的な流れは溶媒を通液して固相を洗浄したあと試料溶液と同じ組成の溶媒を通液して固相を活性化させます。コンディショニング後は活性化状態を保つため通液した液を少し残し固相を乾燥させないようにします。
①溶媒を通液して固相を洗浄します。
②試料溶液と同じ組成のものを通液し活性化します。
③乾燥させないよう液を引ききらずに少し残します。
① 洗浄

知っておこう！
C18などシリカゲル担体の固相では充填② 活性化③乾燥させない
試料溶液と同じ組成

溶媒溶液

固相を洗浄します。

固相を濡らし官能基を活性化させます。

ため細孔内部まで液で満たす必要があります。しかし水はいきなり細孔内部まで入り込めまないので最初に溶媒を流して細孔内活性化部まで液を満たし官能基を活性化させます。

活性化した固相を乾燥させないため溶液を少し残します。

グなしあるいは乾燥しても使用可能なもの

活性化

洗浄

固相

剤の細孔内部にある官能基を活性化させる

ポリマー系充填剤ではコンディショニン
もあります。

(2)試料負荷：通過型①試料を負荷して夾雑成分を固相カートリッジに保持させ目的物質を通過させます。
②溶媒を通液して固相カートリッジに残っていた目的物質を回収します。
① 負荷[通液]

② 通液

試料
溶媒
固相

目的物質
夾雑成分

夾雑成分は固相カート
リッジに保持されます。
目的物質は通過します。
(回収)

固相カートリッジに残っていた目的物質を回収します。

(3)試料負荷：保持型①試料を負荷して目的物質を固相カートリッジに保持させ、夾雑成分を通過させます。
②保持させたあと溶媒や水を通液し、固相カートリッジを洗浄します。
このとき目的物質は固相カートリッジに保持されたままで夾雑成分が通過します。
③溶媒を通液し、目的物質を固相カートリッジから溶出して回収します。
④保持型では目的物質を固相カートリッジで濃縮することができます。
① 負荷[保持]

② 洗浄

試料

固相

③ 溶出

溶媒または水

目的物質は固相に保持されたまま目的物質は固相カート
リッジに保持されます。

夾雑成分は通過します(廃棄)。

溶媒①で残存または保持されていた夾雑成分を洗い流します(廃棄)。

98

目的物質が溶出されます(回収)。

7,2)Smart-SPEの種類
7,2） Smart-SPEの種類
Smart-SPEシリーズには以下の種類があります。このうちSTQ法で使用する主な固相カートリッジについてその使い方を
pp.100-117で説明します。

分類

シ

名称

官能基

構造

一次相互作用

C18

オクタデシル

無極性

油脂などの低極性物質の除去（保持）

SI

シリカゲル

極性

カフェインの除去

FL

フロリジル

PSA

N‐プロピルエチレンジアミン

NH2アミノプロピル

SAX

トリメチルアミノプロピル

SCX

ベンゼンスルホニルプロピル

GCK

グラファイトカーボン

PBX

表面修飾ポリスチレンジビニルベンゼン 親水性/疎水性バランス充填剤

極性

ケイ酸マグネシウム

リ
カ
系

特徴

極性・陰イオン交換、脂肪酸など‐COOH基をもつような

pKa10.1、10.9

酸性物質や極性物質の保持

極性・陰イオン交換、脂肪酸など‐COOH基をもつようなpKa9.8

酸性物質や極性物質の保持

強陰イオン交換、脂肪酸など‐COOH基をもつようなpKaなし常に解離

酸性物質や極性物質の保持

無極性・強陽イオン交換、

マラカイトグリーンなど‐N+を

pKa非常に低い持つような塩基性物質の保持に有効

カー
ボ

色素など平面構造の化合物の

平面構造

保持に有効

ン
系
ポ
リ
マ

無極性+極性ー

極性～無極性までの幅広い化合物の保持に有効

系【参考資料：固相充填剤と有機溶媒の極性】
固相

有機溶媒

分子式

n‐ヘキサン

CH3（CH)3

0.013ｇ/L(20℃）

69

トルエン

C6H5CH3

0.47ｇ/L（20℃）

111

ベンゼン

C6H6

1.8ｇ/L（15℃）

80

クロロホルムCHC138ｇ/L（20℃）

61

ジクロロメタン

CHC1213ｇ/L（20℃）

40

酢酸エチル

CH3COOC2H5

83ｇ/L（20℃）

77

アセトン

CH3COCH3

可溶

57

PSA

アセトニトリル

CH3CN

可溶

82

NH2

メタノール

CH3OH

可溶

65

水

H2O

－

100

C18

極性
低

PBX

SI

高

99

水への溶解度

沸点（℃）

7,3)主な固相カートリッジの使い方
7,3)(1)無極性カラム C18

この章ではわかりやすさを重視し科学的でない表現や誇張した表現をしている場合がありますがご了承ください。

無極性カラムの代表的なものにC18があります。C18はシリカゲル担体に官能基としてオクタデシル基(C18H37)がついた固相で、その炭素数の多さから疎水性が強く無極性相互作用を示します。

Si
オクタデシル基C18H37①無極性相互作用とは本題に入る前に・・・

極性、無極性とは水と油のどちらに溶けやすいかを表したものです。
極性が低い

無極性

水に溶けるか油に溶けるかって考えるとわかりやすいね。

・・・ 油にしかとけない

低極性

・・・

中極性

・・・ 水、油のどちらにも溶ける

高極性
極性が高い

≒ 疎水性

≒ 親水性

(極性)

油に溶けやすい・・・ 水に溶けやすい(水にしか溶けない)※わかりやすくするため誇張した表現にしています。

また物質の極性、無極性の程度を示すものとして疎水性の指標である「logPow」があります。logPowはC18を使用する上で重要な要素の一つです。詳細はp.103「7,3)(1)④無極性の指標

LogPow」をご覧ください。

無極性相互作用とは無極性の物質同士が分子間力の一つであるファンデルワールス力によって引き合うことです。C18の官能基であるオクタデシル基はC18H37と炭素数が多く無極性です。ここに油など無極性の物質がくると似た者同士が引き合い油がC18に保持されます。この作用は特に極性の高い環境下でその効力を発揮します。

無極性相互作用のイメージ

無極性相互作用とは無極性の似た者同士がくっつく

油
ファンデルワールス力
シリカゲル
無極性カラムC18

オクタデシル基

無極性の似た者同士

担体
官能基：オクタデシル基

拡大Si

油：ステアリン酸

ファンデルワールス力

オクタデシル基
ファンデルワールス力100

油7,3)主な固相カートリッジの使い方②無極性カラム固相は目的物質及び夾雑成分のどちらとも相互作用しますが、ここではわかりやすくするため固相と目的物質との相互作用として説明しています。

C18の使い方【負荷・保持】試料(下記イメージでは水)を負荷すると目的物質は液相と固相を行ったり来たりしながら固相と液相への存在比が一定の値に近づいていきます。これを分配といいます。行ったり来たりする中で目的物質は自分と似たC18と一緒にいる方が居心地がよいため
C18での滞在時間が長くなります。一方液相に移動した目的物質は液相と性質が違うため居心地があまりよくなく滞在時間が短くなりまた固相と行ったり来たりして・・・というのを繰り返し目的物質は固相に保持されます。
この工程は負荷する溶液の極性が高ければ高いほど効果的に行われます。液相の極性が高くなるほど無極性である目的物質は液相よりも固相の方が居心地がよく固相の滞在時間が長くなるからです。

【溶出】
固相にアセトニトリルを流すと保持されていた目的物質はまた固相と液相の間で行ったり来たりを繰り返します。今度は固相よりも液相の方が居心地がよいので液相での滞在時間が長くなり液相とともに移動して溶出されます。
このように無極性固相では液相の極性を変えることがポイントです。

無極性カラム C18の使い方のイメージ

液相

水※

負荷

保持

無極性カラムC18

無極性カラム
C18

溶出

液相

ACN

無極性カラムC18

行ったり来たり行ったり来たり

目的物質

行ったり来たりしながら目的
物質は居心地のよい固相に滞在する時間が長くなる。

目的物質が固相に保持された状態

へぇー
物質って液相と固相の間を行ったり来たりしてるんだ

行ったり来たりしながら目的物質は今度はアセトニトリルの方が居心地がよくなりそち
らに滞在する時間が長くなり溶出される。

溶出するときは液相の極性を変えよう！

※ここでは無極性相互作用をわかりやすくするため最も効果が表れる水を負荷した場合を例にしています。

C18は無極性だし、目的物質も極性は決まってるから液相の極性によって目的物
質は固相の方にいくか液相の方にいくか
居心地のよい方を選んでるんだね。

1017,3)主な固相カートリッジの使い方③ STQ法におけるC18の使い方
STQ-GC-B法とLC法におけるC18の使い方をみてみましょう。流す溶液の極性により目的物質を通過させたり保持させたりしています。

GC-B法(自動)フロー p.36より抜粋

LC法(自動)フロー p.46より抜粋

Smart-SPE C18-50㎎：精製

Smart-SPE C18-50㎎：精製
Smart-SPE PSA-30㎎：精製

負荷[通液] 抽出液(ACN層)

負荷[通液] 抽出液(ACN層)

C18にACNを流す↓
プラスアルファPlusα解説❶

洗液 ACN-水(9/1)
流出液

C18にACNを流す

農薬

無極性夾雑成分

ACNといる方が居心地がよい↓
ACNとともに流れていくC18といる
方が居心地がよい↓
C18に保持される↓

通液 2 %ギ酸含有ACN
流出液
添加 水

農薬

無極性夾雑成分

ACNといる方が居心地がよい↓
ACNとともに流れていくC18といる
方が居心地がよい↓
C18に保持される

添加 10%NaCl水溶液
Smart-SPE C18-30㎎：精製

Smart-SPE C18-50㎎：保持
洗浄 水
以下省略

流出液にNaCl水溶液を加えてC18に流すプラスアルファPlusα解説❷

通液 ACN-水(8/2)

・水添加により極性が高くなる
・NaClによる塩析効果↓
農薬はC18といる方が居心地がよい↓
C18に保持以下省略

プラスアルファプラスアルファPlusα解説❷

Plusα解説❶

C18-50 ㎎

ACN-水(9/1)のように水が入るとACNに比べ液相の極性が少し高くなりま解説①と同様にACN-水(8/2)の場合も水が入るのでACNす。農薬は水が少し入ってもACN-水(9/1) の方が居心地がよいので液相と液相の極性が高くなります。農薬は水が入っていても油B

一緒に流れていきます。

ACN-水(8/2) の方が居心地がよいので液相と一緒に流C18

しかし油の中には液相がACNなら一緒にいて居心地がよいと思っていても10％水が入るとC18の方が居心地がよいと思うものがあります。このように水の比率

ACN-水
(9/1)

農薬

れていきます。一方水の比率が高くなるとC18と一緒にいる方を好む夾雑成分が増えていきます。
油Aは先に使用したC18-50 ㎎で保持されましたが油を高くすることで少しでも多くの油をC18に保持して除去することができます。

油A

C18-30 ㎎

油 Bは そ のと き はACNと 一 緒に い る 方が 居心 地 がよ農薬かったのでACNとともに流れてきました。しかしACN水(8/2)ではC18と一緒にいる方が居心地がよくなるた
めC18-30 ㎎に保持され除去することができます(p.38

参照)。

102

ACN-水
(8/2)

農薬

油B

7,3)主な固相カートリッジの使い方④無極性の指標

LogPow

物質の疎水性を表す指標として「オクタノール/水分配係数 Pow」があります。固相抽出では目的物質、液相、固相の相対的な極性の関係により無極性相互作用の挙動が変わるためこの係数は重要な要素の一つです。
本題に入る前に・・・

オクタノールとは炭素数8の脂肪族一価アルコールの総称で、 「オクタノール/水分配係数」にはこの中の1-オクタノー
ルが利用されます。オクタノールはアルコールの仲間ですが水には溶けません。
【1-オクタノール】
オクタノールは水に溶けないから油みたいなもの
だね。

MF：C8H18O
MW:130.2
水への溶解度：溶けない※以下便宜上1-オクタノールを「オクタノール」と表記します。

LogPowとは？

オクタノール/水分配係数(Octanol Water Partition Coefficient ：Pow)とはオクタノールと水の2つの溶媒層中にある物質を加えて平衡状態になったときのオクタノール層の濃度と水層の濃度比を表したものです。一般的には対数を用いて「LogPow」で表
します。
対数表記

オクタノール中濃度(Co)

LogPow = Log10=Pow

水中濃度(Cw)

物質添加

行ったり来たり

オクタノール中濃度(Co)
水中濃度(Cw)

平衡状態

オクタノール層Co(オクタノール中の濃度)Cw

水層(水中の濃度)【LogPowの見方】

LogPowを見れば水と油のどっちに溶けやすいか目安になるね。

LogPowは値が大きいと水に溶けにくく、小さいと水に溶けやすいことを示します。
LogPowの値が「1」大きくなると水よりもオクタノールに10倍多く溶けていることを示します。
※極性の分類は目安です。

オクタノール中濃度が１オクタノール中濃度が1000

水中濃度が10の場合

水中濃度が1の場合

水中濃度が1の場合(水に多く溶けている)(オクタノールに水の千倍溶けている)(オクタノールに水の100万倍溶けている)

Pow =

Co
Cw

=

1
10

= 10-1

LogPow =Log1010-1 =-1
高極性

Pow =

Co

Cw

=

103
= 103
1

オクタノール中濃度が1000000

Pow =

Co
Cw

=

106
= 106
1

LogPow =Log10103 =3

LogPow =Log10106 =6

中極性

低極性

C18を使うときはLogPowを調べておこう!

1037,3)主な固相カートリッジの使い方【参考：農薬のLogPow】
下記に農薬のLogPowの一例を示します。STQ法では農薬の極性に応じてGCB法とLC法で対応しています。LogPowの大きい農薬
は低極性で水に溶けにくいためGC-MSで測定することを前提にGC-B法で前処理します。一方LogPowの小さい農薬は水に溶けやすい
ためLC-MS/MSで測定することを前提にLC法で前処理します(p.32参照)。このようにLogPowに応じた前処理を行うことでGC-B法では下図のAの高極性物質を、LC法では下図Bの低極性物質を除去し、精製効果を高めることができます。
ちなみにグリホサートのようにLogPowが-3と小さいような農薬は非常に極性が高く一斉分析には不向きであり個別分析をする必要があります(p.60参照)。

高極性

低極性

logPow

小

-4

-2

-3

logPow
-1

0

1

2

3

4

A 高極性物質-0.89 -0.8

グ
リ
ホ
サ
ー
ト

ア
セ
フ
ェ
ー
ト

メ
タ
ミ
ド
ホ
ス

6

7

8

GC-B法
LC法

-3.2

5

B 低極性物質1.9 2.63

3.29

7.05

8.2

ジ
ク
ロ
ル
ボ
ス

ト
リ
チ
コ
ナ
ゾ
ー
ル

エ
ト
フ
ェ
ン
プ
ロ
ッ
ク
ス

シ
ラ
フ
ル
オ
フ
ェ
ン

ジ
メ
ト
モ
ル
フ

104

大

7,3)主な固相カートリッジの使い方⑤保持容量
固相には相互作用する物質の量を最大限に保持できる量「保持容量」があり、C18では固相重量の約５％とされています。適切な固相抽出を行うには保持容量を超えないように試料を負荷する必要があります。固相は目的物質と夾雑成分の区別はできないため夾
雑成分の一部も保持される場合があります。夾雑成分が多い試料ではオーバーフローしないよう充填量を考慮することが大切です。

イオン交換カラムの保持容量についてはp.115をご覧ください。

もう持てないよ！！

特に食品の分析では目的物質に比べて夾雑成分が多いからね。
こんなことにならないよ
うに充填量を考慮しておくことも大事だね。

1057,3)主な固相カートリッジの使い方
7,3)(2)イオン交換カラム

この章ではわかりやすさを重視し科学的でない表現や誇張した表現をしている場合がありますがご了承ください。

イオン交換カラムとはプラスまたはマイナスに帯電した官能基を持つ固相です。官能基の種類により陰イオン交換カラムと陽イオン交換カラ
ムがあります。
プラスに帯電≒ 陽イオン
マイナスに帯電 ≒ 陰イオン
解離 ≒ 帯電 ≒ イオン化

似たような意味で使ってるかな。

①イオン交換カラムの相互作用とは
イオン交換相互作用とは官能基のイオンが試料中の別のイオンに置き換わることですが、この章では帯電した官能基と試料中の帯電した物質が電気的な力で引き付け合うこととして説明します。
■陰イオン交換カラム：官能基がプラスに帯電していてカラムの名称の陰/陽は官能
基じゃなくて保持する物質のイオンの陰/陽のことだか
ら気を付けてね！

マイナスに帯電した物質を保持する■陽イオン交換カラム：官能基がマイナスに帯電していてプラスに帯電した物質を保持する【陰イオン交換カラム】
陰イオン交換カラムにはプラスに帯電した官能基がついています。ここにマイナスに帯電した物質がくるとプラスとマイナスの電気的引き合いで固相に保持されます。

イメージを強陰イオン交換カラムであるSAX(Strong Anion Exchange)を例に説明します。
SAXの官能基であるトリメチルアミノプロピルには第四級アミンがありpHに左右されず常にプラスに帯電しています(p.108参照)。
そこに脂肪酸のようにマイナスに帯電した物質がくると電気的に引き合い固相に保持されます。

陰イオン交換カラム(SAX)でのイメージ

陰イオン交換カラムで起こっていること+と−でくっつくのはイメージが湧きやすいね。

＋に帯電した官能基に−に帯電した物質がくっつく

脂肪酸－

電気的引き合い
シリカゲル
陰イオン交換
カラム
SAX

担体

官能基

＋

官能基：トリメチルアミノプロピル＋

Si

解離した脂肪酸

CH2CH2CH2N-(CH3)3

RCOO電気的引き合い

拡大
官能基

＋

電気的引き合い
脂肪酸

－

106

－

7,3)主な固相カートリッジの使い方【陽イオン交換カラム】
陽イオン交換カラムにはマイナスに帯電した官能基がついています。ここにプラスに帯電した物質がくるとプラスとマイナスの電気的引き合いで固相に保持されます。

イメージを陽イオン交換カラムであるSCX(Strong Cation Exchange))を例に説明します。
SCXの官能基であるプロピルベンゼンスルホニルには帯電したス
SCXには無極性相互作用もありますがここではイオン交

ルホ基(SO3－)がありこの部分がマイナスに帯電しています。そこに換作用に着目して説明します。

マラカイトグリーンのようなプラスに帯電した物質がくると電気的に引き合い固相に保持されます。

陽イオン交換カラム(SCX)でのイメージ

陽イオン交換カラムも陰イオ
ン交換カラムと同じだね。+と−でくっつくのはイメージが湧きやすいよ。

陽イオン交換カラムで起こっていること− に帯電した官能基に＋に帯電した物質がくっつく

MG：マラカイトグリーン
電気的引き合いシリカゲル

陽イオン交換
カラム
SCX

担体

官能基

－

MG

＋

官能基：プロピルベンゼンスルホニル

Si
拡大

CH2CH2CH2

SO3

－
-

帯電したMG＋
H＋

電気的引き合い官能基－

電気的引き合い

MG

＋

107

＋

7,3)主な固相カートリッジの使い方②イオン交換カラムの使い方
イオン交換カラムの相互作用が起こるためには先述したように固相の官能基と目的物質の両者が帯電している必要があります。
陰イオン交換カラム：固相はプラスに、目的物質をマイナスに帯電陽イオン交換カラム：固相はマイナスに、目的物質をプラスに帯電
官能基や目的物質を帯電させるにはそれらのpKaに基づき通液する溶液のpHを調整する必要があります。pKaはイオン交換カ
ラムを使用する際の重要な要素の一つです。詳細は以下の「本題に入る前に・・・①」とp.113「7,3)③解離の指標

酸解離常数

Ka」をご覧ください。

本題に入る前に・・・①

イオン交換カラムには陰イオン交換カラムと陽イオン交換カラムがあり、さらに官能基の種類により強イオン交換カラムと弱イ
オン交換カラムに分けられます。強イオン交換カラムはpKaがなくpHに関係なく常に解離しています。一方弱イオン交換カラムはpHによって解離/非解離の状態が変わります。

強陰イオン交換カラム ・・・pKaなし、pHに関係なく常に解離
陰イオン交換カラム
弱陰イオン交換カラム ・・・pKaあり、pHにより解離/非解離の状態が変わる
イオン交換カラム
強陽イオン交換カラム ・・・pKaなし、pHに関係なく常に解離
陽イオン交換カラム
弱陽イオン交換カラム ・・・pKaあり、pHにより解離/非解離の状態が変わる

固相や目的物質が帯電する/しない(≒解離/非解離)は液相のpHに関係します。そこで重要になるのが「pKa」です。pKaは約半分が解離しているpHを示します(p.113参照)。
ここではまず固相の解離/非解離についてみてみましょう。

強イオン交換カラム 例)SAX、SCX
1

７

14

pH

常に解離

弱陰イオン交換カラム 例)NH2 pKa9.8 NH2の詳細はp.109「本題に入る前に・・・②」をご覧ください。
1

7.8

9.8

11.8

pH

ほぼ100％解離

108

50％解離

ほぼ100％非解離

147,3)主な固相カートリッジの使い方

本題に入る前に・・・②

次に弱陰イオン交換カラムであるNH2(アミノプロピル)と脂肪酸(R-COOH)を例に固相と目的物質の解離/非解離の関係をみてみましょう。
NH2の官能基であるアミノプロピルのpKaは9.8でありpH9.8では約50％のアミノプロピルが解離しプラスに帯電しています。一方脂肪酸のpKaを4.8とするとpH4.8では約50％の脂肪酸が解離しマイナスに帯電しています。脂肪酸をNH2に保持させるには両者ともほぼ全てを解離状態にする必要があります。pKaの値からpHが「2」変更されるとほぼ解離またはほぼ非解離の状態になります(p.113参照)。
この例ではNH2のpKaは9.8ですからそこからpHを2低くし7.8にするとほぼ100％解離状態になります。脂肪酸のpKaは4.8ですからそこからpHを2高くし6.8になるとほぼ100％解離状態になります。つまり液相のpHを6.8～7.8に調整すると
NH2も脂肪酸もほぼ100％解離した状態になり相互作用により脂肪酸がNH2に保持されます。

1

脂肪酸のpKa
4.8

2.8

6.8

7.8

NH2のpKa
9.8

11.8

14

pH

R-COOH
非解離

R-COOH
50%解離

両者ほぼ100%解離
固相に保持

NH2
50%解離

NH2
非解離

脂肪酸：R-COOH
pKa = 4.8 (pH4.8で50%解離）

R-COOHー＋

R-COO ＋ H

脂肪酸のマイナスとNH2のプラスが引き合う
ように両者をほぼ解離状態にする＋

弱陰イオン交換作用
固相：NH2（アミノプロピル）
pKa=9.8（pH9.8で50%解離）-Si-CH2CH2CH2NH3-Si-CH2CH2CH2NH2

反対に液相のpHを2.8以下に調整すると脂肪酸は非解離状態になりNH2から溶出されます。また液相のpHを11.8以上に調整した場合はNH2が非解離状態になり脂肪酸は溶出されます。pKaをもつ弱イオン交換カラムの場合は目的物質または固相のどちらかを非解離状態にすることで目的物質を溶出します。

1

2.8

脂肪酸のpKa
4.8

6.8

7.8

NH2のpKa
9.8

11.8

14

pH

脂肪酸ほぼ
100%非解離
溶出R-COOH
非解離

R-COOH50%解離

ほぼ100%解離NH250%解離

R-COOH

NH2
非解離

NH2ほぼ
100%非解離
溶出-Si-CH2CH2CH2NH2

イオン交換カラムを使うときはpKaを調べておこう!

1097,3)主な固相カートリッジの使い方
固相は目的物質及び夾雑成分のどちらとも相互作用しますが、ここではわかりやすくするため固相と目的物質との相互作用として説明しています。

❶陰イオン交換カラム使い方
プラスに帯電している固相にマイナスに帯電させた目的物質を通液します。

【イメージ】
例えば目的物質を酸性物質とすると中性溶液中では解離してマイナスに帯電しています。この状態で負荷すると目的物質が固相に保持されます。次に酸性の溶液を通液すると酸性物質は非解離状態になり帯電しなくなるため固相から離れ溶出されます。
イオン交換カラムではこのように液相のpHを変更することがポイントです。

陰イオン交換カラムの使い方のイメージ (目的物質が酸性物質の場合）

保持

溶出

中性の溶液を流す
酸性物質解離→帯電

プラス‐マイナスの相互作用で固相とくっつく

酸性の溶液を流す
液相 酸性物質非解離→帯電しない

陰イオン交換カラム

陰イオン交換カラム

陰イオン交換
カラム

＋

－＋

＋

－

＋

－＋

＋

－

＋

－＋

＋

負荷
液相

中性
－

マイナスに帯電した目的物質がプラスに帯電している固相に引き付けられる。

目的物質が陰イオン交換カ
ラムに保持された状態

酸性

目的物質

＋

官能基

目的物質が非解離になり帯電しないので固相から離れる。

溶出するときは液相のpHを変えよう！

1107,3)主な固相カートリッジの使い方【STQ法における陰イオン交換カラムの使い方】
STQ-LC法における弱陰イオン交換カラムPSAの使い方をみてみましょう。流す溶液のpHを変更「することで目的物質を保持させたり溶出させたりしています。
＜PSA(Primary-Secondary Amine)＞
作用：弱陰イオン交換
pKa：10.1、10.9＜酸性物質＞
脂肪酸（夾雑成分）：pKa4.8※弱陰イオン交換カラムはpHにより帯電状態が変わります。LC法の条
件では常に帯電状態です。

LC法(自動)フロー p.46より

4-CPA（農薬)： pKa3.56

R-COO-+ H+
OCH2CO2H

Cl【保持】 PSAは主に脂肪酸除去目的で使用します。
抽出液(中性:正確には若干酸性より)を流す↓

Smart-SPE C18-50㎎：精製

脂肪酸は解離してマイナスに、PSAは解離してプラスに帯電↓

Smart-SPE PSA-30㎎：精製

脂肪酸はPSAに吸着(保持)しかし4-CPAのような酸性農薬も同様に解離してPSAに保持されます。

PSA

負荷[通液] 抽出液(ACN層)

Si-CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2＋＋

R-COO− + H+−

OCH2CO
H
＋H＋
OCH
2COO
2

Cl
Cl

4-CPA（農薬 pKa:3.56）

脂肪酸（夾雑成分 pKa:4.8）

洗液 2 %ギ酸含有ACN(pH2)【溶出】
酸性溶媒(2％ギ酸含有ACN)を流す↓

流出液

４‐CPAは非解離になり帯電しなくなる↓

添加 水

4-CPAはPSAから溶出

PSA

Smart-SPE C18-30㎎：精製

Si-CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2＋

通液 ACN-水＋R-COOH

定容

脂肪酸（夾雑成分 pKa:4.8）

OCH2CO
H
OCH
2COOH
2

Cl
Cl

4-CPA（農薬 pKa:3.56）【参考：グリホサート・グルホシネートにおけるPSAの使い方】
グリホサート・グルホシネート分析では溶出時にこれらの農薬を非解離にするのではなくPSAを非解離にしています。
(p.62参照)。
GLY：グリホサート【保持】グリホサート・グルホシネート(自動)フロー p.60より

GLU：グルホシネート

抽出液(中性)を流す↓

Smart-SPE PBX-10㎎：精製

GLY・GLUは解離してマイナスに、PSAは解離してプラスに帯電↓

Smart-SPE SCX-30㎎：精製

GLY・GLUはPSAに吸着(保持)Smart-SPE PSA-50㎎：保持【溶出】負荷[保持] 試験溶液

アルカリ性溶液(0.14％アンモニア水)を流す↓

洗浄 メタノール-水(1/9)

PSAは非解離になり帯電しなくなる↓
GLY・GLUはPSAから溶出

Smart-SPE PSA-50㎎

PSA pKa：10.1、10.9

非解離になる

Si-CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2

溶出 0.14%アンモニア水

⊖ O

溶出液

O

-

O

P
OH

O

NH
O
O

定容

111

⊖
NH2

CH3

GLY

添加 5%ギ酸-水

-

P

-

⊖

GLU

O
O

-

⊖

7,3)主な固相カートリッジの使い方❷陽イオン交換カラム使い方
マイナスに帯電している固相にプラスに帯電させた目的物質を通液します。

固相は目的物質及び夾雑成分のどちらとも相互作用しますが、ここではわかりやすくするため固相と目的物質との相互作用として説明しています。

【イメージ】
例えば目的物質を塩基性物質とすると酸性溶液中では解離してプラスに帯電しています。この状態で負荷すると目的物質が固相に保持されます。次にアルカリ性の溶液を通液すると塩基性物質は非解離状態になり帯電しなくなるため固相から離れ溶出されます。陰イオン交換カラムのときと同様にこのように液相のpHを変更することがポイントです。

陽イオン交換カラムの使い方のイメージ (目的物質が塩基性物質の場合）
負荷
液相

溶出

保持

アルカリ性の溶液を流す

中性の溶液を流す
塩基性物質解離→帯電

プラス‐マイナスの相互作用で固相とくっつく

液相 塩基性物質非解離→帯電しない

陽イオン交
換カラム

陽イオン交
換カラム

陽イオン交
換カラム

中性

アルカリ性

＋

－

＋－

－

＋

－

＋－

－

＋

－

＋－

－

プラスに帯電した目的物質がマイナスに帯電している固相に引き付けられる。

目的物質

－

官能基

目的物質が非解離になり帯電しないので固相から離れる。

目的物質が陽イオン交換カ
ラムに保持された状態

溶出するときは液相のpHを変えよう！

【STQ法における陽イオン交換カラムの使い方】
マラカイトグリーン分析法における強陽イオン交換カラムSCXの使い方をみてみましょう。流す液のpHを変更することで目的物質を保持させたり溶出させたりしています。

＜SCX (Strong Cation Exchange)＞
作用：強陽イオン交換

抽出液(酸性)を流す↓
MGは解離してプラスに、SCXは常に解離状態でマイナスに帯電＜塩基性物質＞↓

マラカイトグリーン（以下MG）：pKa5.06

MGはSCXに吸着(保持)マラカイトグリーンフロー p.76より抜粋

SCX

Smart-SPE C18-30㎎：精製

O OS
O

−

pKa：-6.5【保持】※強イオン交換カラムはpHに関わらず常に帯電状態です。

＋

H

H 3Si

Smart-SPE SCX-30㎎：保持MG(pKa5.06)

負荷[保持] 抽出液(ACN層：酸性)【溶出】
アルカリ性溶媒(28％アンモニア水-ACN)を流す

洗浄 ACN↓
MGは非解離になり帯電しなくなる↓

MGはSCXから溶出SCX
溶出 28％アンモニア水-ACN

O OS
O

−

Smart-SPE SCX-30㎎

H 3Si

定容

MG(pKa5.06)

112＋7,3)主な固相カートリッジの使い方③解離の指標酸解離常数Ka

酸の解離を表す指標として「酸解離常数

Ka」があります。一般的には対数を用いて「pKa」で表されます。イオン交換カラムを使用する上で解離状態は重要な要素の一つですので詳しくみていきましょう。
本題に入る前に・・・❶酸には強酸と弱酸があり、解離の状態によって酸の強さが決まります。
【強酸】

水溶液中で完全に解離しています。

AH

A− ＋

AH：非解離状態の酸【弱酸】 水溶液中で解離しているものと非解離のものが存在し、常に行ったり来たりして平衡状態を保っています。

H＋

A− ：解離状態

AH

H＋：水素イオン

A− ＋H＋❷pHのおさらいpHとは「水素イオン指数」のことで水素イオン濃度の逆数の対数で表わされます。

pH =ーLog10 [H+]pKaとは？

酸解離常数(Ka)とは酸の解離のしやすさを表したものです。
Kaは水溶液中で酸が解離して水素イオンを放出したときの水素イオン濃度[H＋]、解離状態の酸濃度[A-]、非解離状態の濃度[AH]を用いて下記の式で表され、一定条件下では常数となります。
Kaはそのままでは桁数が多くわかりにくいため一般的には対数を用いて「pKa」で表します。

酸解離常数 Ka＝

対数表記

[A-][H+]pKa = -Log10 Ka[AH]

またpKaとpHは以下のような関係にあります。

Ka＝[A-][H+][AH]

両辺のLogをとります。

Log10 Ka =Log10[A-][H+][AH]

右辺を分けます。

Log10 Ka =Log10 [H+] ＋

これに pKa = -Log10 Ka

Log10

[A-]
[AH]

と pH = -Log10 [H＋] を当てはめます。

pH = pKa ＋

Log10

[A-]

[AH]

ちょっと難しいけど[A-]と[AH]が等しいとpH=pKaになるのはわかったよ！

ここで[A-]と[AH]が等しいとき[A-]/[AH]＝1でありLog10 [A-]/[AH]=0となります。つまりAHが50％解離している状態では

pH＝pKaとなります。

1137,3)主な固相カートリッジの使い方【pKaの見方】❶pKaの値
pKaは値が小さいほど強い酸であることを示します。
pKaが小さい→Kaが大きい→[A-][H+]が大きい→解離しているものが多い→強い酸

pKa = -Log10 Ka =Log10[A-][H+]
[AH]

大きい

小さい

大きい

❷解離/非解離の状態変化
pKaと同じpHでは約半分(50％)が解離している状態であることはp.108、p.113で説明しました。しかしpHが異なると解離の割合は変化します。 pHの値が1異なると解離しているものと非解離のものの割合が10倍変わります。2異なると100倍変わるためほぼ100％解離または非解離の状態にするにはpHの値をpKaから2以上変えることが必要です。

例えばある酸AHのpKaを4と仮定します。pH4ではAHは半分が解離しています。

AH

A− ＋

H＋

pHが6になるとH＋の濃度が少なくなるため平衡は右に動きAHが減って解離状態のA-とH＋ が増えます。

AH

A− ＋

H＋

一方pHが2になるとH＋の濃度が多くなるため平衡左に動きA-とH＋ が減って非解離状態のAHが増えます。

AH

A− ＋

pKaから2離れたpH
でほぼ100%非解離
2

pH

AH

解離
非解離

A− ＋ H ＋

99

99％が非解離AH

解離/非解離の割合が100倍変化

pKaから2離れたpH
でほぼ100%解離

AHのpKa
4

3

0.99

H＋

9
90

90％が非解離56

A− ＋ H ＋50

解離/非解離の50

割合が10倍変化

50％が解離pHが1変わるとこんなに解離/非解離の割合が変わるんだね。これでなぜ2以上離すかもわかったよ！

114

解離/非解離の割合が10倍変化

AH

90
9

解離/非解離の割合が100倍変化

90％が解離A− ＋ H ＋99
0.99
99％が解離pKaからpHを2以上離しておくと安心だね。

7,3)主な固相カートリッジの使い方④イオン交換カラムの保持容量
イオン交換カラムにも保持容量(p.105参照)がありイオン交換容量と固相の充填量から計算することができます。

イオン交換容量とは？

イオン交換容量とはイオン交換カラムの官能基のイオンが交換できる試料中の一価イオンの量のことですがここではイオン交換
カラムが保持できるイオンの量として考えます。固相ではイオン交換容量は充填剤1gあたりのイオン交換容量として「meq/g」(meqの読み方：ミリ・イクイバレント、メック)で表されます。「meq/g」は固相の種類や製品ごとに決まっています。

イオン交換カラムに最大限保持できる理論値は以下のように計算することができます。

理論上保持できる最大量(㎎) = 分子量× イオン交換容量(meq/g)

× 充填量(g)【計算例】
下記の場合の理論値を計算してみましょう。
・保持させたい物質の分子量：300
・イオン交換容量：0.8meq/g
・充填量：500㎎
理論上保持できる最大量 (mg)

= 300 × 0.8(meq/g) × 0.5(g) = 120 (mg)

このイオン交換カラムではこの物質を理論上最大120 ㎎保持することができます。

【補足】meqとは？

meq(milli equivalent：ミリ・イクイバレント)とは電解質の量を表す単位で下記の計算式で求められます。

meq= 物質量(mmol) × イオンの価数

イオン交換容量はメーカーによっても違うし、同じメーカーでも製品(ブランド)
によっても違うよ！

1157,3)主な固相カートリッジの使い方
7,3)(3)グラファイトカーボンカラム※

この章ではわかりやすさを重視し科学的でない表現や誇張した表現をしている場合がありますがご了承ください。

グラファイトカーボンカラムの充填剤は炭素が平面的に並んだ構造になっています。
※本ガイドブックで紹介しているグラファイトカーボンにはGCKとGCSがあります。これらは製品名称の違いであり、使用目的及び性能は同等です。現在はGCKのみの販売となっています。

①グラファイトカーボンカラムと平面構造物質の相互作用
グラファイトカーボンカラムでは同じく平面構造を持つ化合物がグラファイトカーボンの平面構造の中に入り込み吸着(保持)され、立体構造のものは素通りします。従って緑色野菜のクロロフィルや柑橘類のフラボノイド類などの平面構造の夾雑成分の除去に効果があります。ただし平面構造の目的物質も同様に吸着(保持)されるため注意が必要です。吸着された目的物質を溶出するにはトルエンを使用します。

グラファイトカーボンカラムの使い方のイメージ

液相

負荷

グラファイトカーボンカラムでは平面構造の似た者同士がくっつく

グラファイトカーボン
カラム

拡大
フラボノイド類（夾雑成分）
平面構造化合物
立体構造化合物

平面構造の化合物はグラ
ファイトカーボンの間に入り込んで保持され、立体構造の化合物は素通りする。

液相

クロロフィルa (夾雑成分)
グラファイトカーボンに保持される平面構造の化合物の例

溶出
グラファイトカーボン
カラム

平面構造の目的物質を溶出するときはトルエンを使おう！

トルエン

トルエン

トルエンを使うと目的物質だけでなく折角捕まえた夾雑成分も出てきちゃうから注意してね。詳しくは次のページを見てね！

トルエンを流すことで平面構造の化合物はグラファイ
トカーボンから溶出される。

1167,3)主な固相カートリッジの使い方②グラファイトカーボンカラムの精製効果
下記はオレンジのGC-MSのSCANクロマトグラムです。グラファイトカーボンカラムを使用することでフラボノイド類が除去されていることがわかります。このとき平面構造の農薬もグラファイトカーボンカラムに保持されてしまいますのでこれらを溶出するにはトルエンを使用します。但しトルエンの比率が高くなると保持されていたフラボノイド類も溶出されてくるので精製効果が低くなります。トルエンを使用する場合はその比率を目的物質が回収できる必要最小量にするのがポイントです。

オレンジを用いたGC+PSAミニカートリッジと溶出溶媒によるSCANクロマトグラム比較

フラボノイド類

PSA-30 mg
アセトン-ヘキサン(15/85)

O

O

O
O

O
O

O

グラファイトカーボン使ってないとこんなにフラボノイド
残ってるの！ベースラインが上がったままだよ！

GCS-20 mg+PSA-30 mg
トルエン-アセトン-ヘキサン(15/15/70)

トルエンの比率が増える
ことでフラボノイド類の溶出量が増えます。

GCS-20 mg+PSA-30 mg
トルエン-アセトン-ヘキサン(10/15/75)

グラファイトカーボンカラムを使用することでフラボノイド類はほとんど検出されていません。

GCS-20 mg+PSA-30 mg
アセトン-ヘキサン(15/85)

R.T. (min:sec)

目的物質が回収されてなくてト
ルエンで溶出するときは目的物質が溶出する最低量のトルエンにしてできるだけ夾雑成分が出てこないようにしよう！

アセトン‐ヘキサンで溶出したらフラボノイド類はほとんど検出されていないね。
もしアセトン‐ヘキサンで目的物質が十分回収されているならあえてトルエンを流す必要はない
よ。その方がきれいだし装置への負担も軽減されるしね。

【参考：溶出溶媒比率による回収率の比較】
グラファイトカーボンカラムに保持された農薬はトルエンの比率を上げて溶出することで回収率も向上します。しかしその場
合夾雑成分も溶出してきますので注意が必要です。
溶出溶媒
化合物名

イソプロカルブ

トルエン‐アセトン‐ヘキサン比率(20/15/65)(15/15/70)

20%

15%

(10/15/75)

CH(CH3)2(0/15/85)

トルエン比率キノキシフェン
Cl

CH3NHCO2

10%

Cl

0%

イソプロカルブ

89.2

89.7

61.9

31.8

キノキシフェン

94.2

93.0

95.9

59.5

シニドンエチル

100.2

92.9

88.2

37.7

プロパクロール

100.3

98.8

71.0

41.3

プロパニル

101.1

101.2

92.7

60.9

O

COCH2Cl
N

Cl
Cl

O

CH(CH3)2

CH C
CO2CH2CH3

プロパニル
NHCOCH2CH3

Cl

詳細は「残留農薬基礎データ

GCS+PSAミニカラムと溶出溶媒による回収率」参照

http://www.aisti.co.jp/common/pdf/kn1305.pdf

117N

プロパクロール

シニドンエチル
N

O

Cl

F

7,3)主な固相カートリッジの使い方
まとめ【これだけ知っておこう！固相の使い方】■C18

これを知っておくとフローがわかりやすくなるよ！

キーワード：LogPow、低極性、高極性
試料を溶媒と水を混ぜて流すと保持されるものと流出するものがある

試料を水100％で流すと保持される※

試料を溶媒100％で流すと流出する※※わかりやすくするため誇張した表現をしています。

溶媒と水の比率で農薬(または夾雑物)をC18に保持させたり流出させたりする■イオン交換カラム

キーワード：ｐKa、解離・非解離

陰イオン交換カラムの場合保持させるときは目的物質もカラムも両方解離させる

液相

中性
－
－
－

溶出させるときは目的物質またはカラムのどちらかを非解離にする

負荷

保持

陰イオン
交換カラム

陰イオン
交換カラム

＋

－＋

＋

＋

－＋

＋

＋

－＋

＋

液相

酸性

溶出
陰イオン
交換カラム

解離・非解離のカギを握るのはpH■グラファイトカーボン

キーワード：平面構造、トルエン

平面構造のものが保持される

平面構造の農薬を溶出するときはトルエンを使う

試料

トルエン

トルエンは目的物質が溶出する最小量にする(夾雑成分の溶出を低減するため)

118

目的物質
＋

官能基

8, 補足資料-2
GC-MSの検量線
1）検量線の作成方法
2）定量方法の種類

直線

標準添加法

面積(or高さ)

対数
内部標準法

二次曲線

絶対検量線法

濃度

検量線っていろいろあるんだよね。何がどう違うんだったけ？

119

どれ使えばいいのかなあ・・・

8,1)検量線の作成方法
8,1)検量線の作成方法
定量値を求めるのに重要な検量線ですがその作成方法や種類により定量値が大きく異なる場合があります。ここではより正確な定量値を導き出すためにGC-MS測定における検量線について説明します。
標準試料をGC-MSで測定する際、その一部が活性点に吸着され検出量が減少することがあります(p.90参照)。この現象は特に低濃度域で顕著であり、その結果検量線の直線性が乏しく、その検量線から算出された定量値は理論値と大きく異なります。その場合は検量線の作成方法 (線の引き方)を変更することでより正確な定量値を算出することができます。検量線の作成方法には直線、重み付き直線、二次曲線、対数などがあります。

(1)検量線の作成例
下図は農薬(ピリブチカルブ)の標準試料（7濃度)の測定データから作成した検量線です。
直線で作成した場合、低濃度域での実測値と検量線のずれが大きくなっており、定量値も理論値と大きく異なっています。
直線

検量線からの定量値

拡大

濃度

定量値

（回収率%）

200ppb203.81101.9

100ppb

94.71

94.7

50ppb

45.37

90.7

20ppb

18.44

92.2

10ppb

10.99

109.9

5ppb

7.67

153.5

2ppb

6.02

301.0

理論値2ppbに対して定量値6ppb
3倍も増加！

同じデータを重み付き直線、二次曲線、対数などで検量線を作成すると実測値と検量線のずれは直線の場合とは異なり、対数の場合は理論値との差が最も小さくなります。このように検量線の作成方法により定量値が異なりますので目的に応じた濃度域での検量線を作成し定量することが重要です。
重み付き直線二次曲線

対数
一般財団法人残留農薬研究所坂様からのご助言

濃度

定量値

(回収率%）

濃度

定量値（回収率%）

濃度

定量値（回収率%）

200ppb245.03122.5

200ppb199.8599.9

200ppb201.14

100.6

100ppb111.09111.1

100ppb100.95100.9

100ppb

101.13

101.1

50ppb

50.52

101.0

50ppb

49.28

98.6

50ppb

50.73

101.5

20ppb

17.46

87.3

20ppb

18.46

92.3

20ppb

19.61

98.0

10ppb

8.31

83.1

10ppb

9.52

95.2

10ppb

9.74

97.4

5ppb

4.24

84.7

5ppb

5.49

109.8

5ppb

4.84

96.9

2ppb

2.21

110.3

2ppb

3.46

173.1

2ppb

2.09

104.7

120

8,1)検量線の作成方法

対数検量線への表記＊JAあいち経済連永井様からのご助言

二次曲線で得られる式は
y=ax^2・・・式1
式1の両辺を対数変換するとlog(y)=log(a)+2log(x)・・・式2
そこでlog(y)=Y、log(x)=X、log(a)=Aと置き換えると
Y=2X+A・・・式3となり一次直線になります。

濃度
10
20
50
100
200
500
1000

面積
10
20
50
100
200
500
1,000

濃度
10
20
50
100
200
500
1000

1000
800
600
400
200

0
0

500

1000000
面積
100 800000
400
2,500 600000
10,000 400000
40,000250,000 200000
1,000,000
0

1000

0

500

1000

10

100

1000

1000000

1000

100000
10000

100

1000
10

100
10

100

1000

両対数検量線にすると二次曲線も直線になる！

1218,1)検量線の作成方法(2)実際のデータによる各検量線
実際の測定データから異なる検量線を作成しました。対数検量線が最も良好な相関係数が得られます。
濃度(ppb)
面積A

542,917

10
95,921

20
219,28750
694,737

重み付き直線

直線

面
積

面
積

200
3,664,586

二次曲線

相関係数= 0.99793

相関係数= 0.99793

100
1,602,024

対数

相関係数= 0.99992

相関係数= 0.99997

面積

濃度(ppb)面積

濃度(ppb)濃度(ppb)濃度(ppb)

対数検量線の相関係数が一番良好！

また対数検量線の場合、どの濃度においても面積Aに対して同じ比率での差で認識できます。

実測値
計算値
計算値

濃度(ppb)
面積A
A×1.2
A×0.7

5
42,91751,50030,042

10
95,921
115,105
67,145直線4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
5000000R² = 0.9959

100

50
100
200
694,737 1,602,024 3,664,586
833,684 1,922,429 4,397,503
486,316 1,121,417 2,565,210

二次曲線

y = 18641x - 142858

0

20
219,287
263,144
153,501

200

300

4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
5000000

対数3000000

300000y = 22.473x2 + 14092x - 49621
R² = 0.9998

0

100

122

200

30000
300

5

50

8,2)定量方法の種類
8,2) 定量方法の種類①絶対検量線法(外部標準法)
面積(or高さ)

既知濃度の標準試料を測定して検量線を作成します。

標準試料の面積(or高さ)
未知試料の面積(or高さ)

標準試料の 濃度
濃度

未知試料の
濃度

②絶対検量線法-マトリックス検量線
標準物質をサンプルブランク測定液で希釈したものを測定し検量線を作成します。

マトリックスの影響を相殺して定量することができますが、試料に測定対象成分が含まれていないことが前提になります。またマ
トリックス検量線用に別途測定液を作製する必要があります。

③絶対検量線法-PEG共注入検量線法(p.92参照)
標準試料に疑似マトリックスとしてポリエチレングリコール(PEG)を添加したものを測定し検量線を作成します。マトリックス
検量線のように検液に測定対象成分が含まれる懸念はありません。また検量線用に検液を調製する必要もありません。

④内部標準法
標準試料と試料に内部標準物質を添加したものを測定し、対対象物質とISの比

象物質と内部標準物質の比から検量線を作成します。対象物質
標準試料の対象物質とISの比と内部標準物質の比を用いて検量線から未知試料の濃度を算出します。

IS：内部標準物質
未知試料の対象物質とISの比

測定対象物質と内部標準物質との物性の違いなどからその補正に関して問題視されることもありますが、前処理工程や測定

未知試料の
濃度

による影響を相殺する手段として有効です。

標準試料の 濃度濃度

⑤標準添加法
未知試料と未知試料に既知濃度の標準試料を添加したものを測面積(または高さ)定し、その差を利用して定量値を求めます。
「すべての検体について未知試料と添加試料を測定する必要があ

標準試料の面積(or高さ)る」、「添加した標準試料の濃度よりも極端に高い濃度の農薬を

未知試料の面積(or高さ)

検出した場合に誤差が大きくなり、正確な濃度が求められない」などの理由により採用が難しい面もありますが、マトリックスの影響を除去して測定する手段としては有用であると報告されてい未知試料に含まれる濃度(絶対値)

ます。
定量方法

絶対検量線

絶対検量線

絶対検量線

標準試料の
添加量

内部標準法

添加量

標準添加法

マトリックス検量線 PEG共注入検量線法
標準試料

標準試料or＋PEG

マトリックス

無

無

有

無

濃度

濃度

濃度

濃度

添加量

面積or高さ面積or高さ面積or高さ溶液

標準試料

マトリックス

内部標準物質

無

検量線の軸

123

対象物質と内部標準物
質の比

マトリックス

面積or高さ124

9, 製品紹介
1）全自動固相抽出装置 ST-L400
2) GC用大量注入口装置 LVI-S250

1259,1)全自動固相抽出装置 ST-L4009,1)全自動固相抽出装置 ST-L400(1)全自動固相抽出装置

ST-L400とは固相抽出による精製操作に必要な「コンディショニング」、「試料負荷」、「洗浄」、「溶出」の工程をすべて自動で行う装置です。
STQ法をはじめオリジナルの精製方法にも対応可能です。

(2)自動化のメリット
時間の有効活用をはじめとし、ボタンひとつで誰でも同じ精製操作を行うことができるため分析者の人的ばらつきを抑制できる、装置内の操作による溶媒暴露も軽減などが挙げられます。

1. 時間の有効活用
2. 引き継ぎ労力の軽減

全自動固相抽出装置 ST-L400

3. 人的ばらつきの縮小
4. 労働衛生環境改善(溶媒暴露軽減等)
5. メソッドファイルの共有(遠隔ラボ間)(3)ST-L400の特徴
残留農薬一斉分析メソッドであるSTQ法（GC-B法3種、LC法）が搭載されているほか、オリジナルメソッドも作成可能です。最大
20検体まで連続処理を行うことができ、その操作もタッチパネルにより簡単に行うことができます。
溶媒の使用量も少なく、ガラス器具もメス試験管1本のみのため分析後の片付けも時間短縮が図れます。

1. 残留農薬一斉分析メソッドSTQ法(GC-B法、LC法)の搭載
2. オリジナルメソッドの作成が可能
3. 最大20検体の連続処理
4. 容易なメンテナンス
5. タッチパネルによる操作の簡便化
6. 使用ガラス器具はメス試験管1本のみ(4)ST-L400の操作手順①専用のサンプルバイアルに抽出液を分取し、試験管とともにセットします。
②使用する固相カートリッジをセットします。
③必要な溶媒を配管にセットします。
④シーケンスを作成し、実行ボタンを押します。

①サンプルバイアルと試験管をセット②固相カートリッジをセット③溶媒を準備126④シーケンスの作成・実行

9,2)GC用大量注入口装置 LVI-S250
9,2)GC用大量注入口装置 LVI-S250(1)GC用大量注入口装置

LVI-S250とは

エアーヒーター
ホットエアーによる放熱のため冷却も速い

LVI-S250はスパイラル(胃袋型)インサートを搭載したGC用大量セプタム

注入口装置です。この独自のインサート形状により最大200 µLまで

セプタムパージ

注入が可能となり感度向上を図ることができます。STQ法は少量サ

Oリング

ンプリングに始まりエバポレーターによる濃縮操作のないスケール
キャリアガス

ダウンした前処理方法ですがLVI-S250を用いることで感度を確保しています。

スプリットパージ(2)LVI-S250の特長

スパイラル(胃袋型)インサート

1. 大幅な感度向上による低濃度試料の高感度分析

試料を液体状態でインサート内に保持することができ、インサート内で試料の濃縮が自由自在

グラファイトフェラル

2. 試料の少量化や濃縮操作の省略による前処理の迅速化
3. 試料を液体状態でインサートに保持し、ここで濃縮が可能
4. 低温度でカラムに導入できるため熱に弱い物質にもキャピラリーカラム

LVI-S250の構造対応可能
5. インサート内での誘導体化が可能(3)LVI-S250の原理

①試料注入

②試料濃縮

③目的物質導入④夾雑成分除去①試料を注入し、液体状態のままスパイラルイン
サート内に保持します。このときインサート内で試料溶媒が突沸しないように注入口温度を試
料溶媒の沸点より低めに設定しておきます。
②スプリットモードで揮発した溶媒を排出し、インサート内で試料を濃縮します。
③スプリットレスモードで注入口温度を上げ、目的物質を分離カラムに導入します。
④スプリットモードでインサートを焼き出しします。

目的物質

インサート

キャピラリーカラム①
・試料を注入・インサート内に保持

溶媒排出(スプリットモード)

目的物質導入焼き出し(スプリットレスモード) (スプリットモード)②③
・注入口温度を上げる
・目的物質導入・溶媒蒸気を排出・インサート内で濃縮試料を注入して濃縮している間は注入口温度を溶媒の沸点より低い状態に設定します。濃縮後は注入温度を上げて目的物質をカラムに導入していきます。カラムオーブン温度は目的物質をカラムへ導入し終えるまで低い温度を維持します。
これによりカラム先端部で目的物質を再濃縮させます。その後は通常の分析条件に従ってカラムオーブンの温度を上げて
いきます。

温度

約4分かかります。

注入口温度

高

カラムオーブン温度

試料の溶媒の沸点
低右はアセトン‐ヘキサン(15/85)を25 μLの注入した場合の例です。注入から濃縮まで約0.3分※ 、カラムへの導入までに④
夾雑成分除去注入

0.3
4
スプリット スプリット スプリット
レス
濃縮
導入
分析

※GCの機種により異なる場合があります。

LVI-S250の原理と注入口及びGC条件の概念図(4)注入量の違いによるクロマトグラムの比較
同じ試料を2 µL注入した場合と100 µL注入した場合のク
ロマトグラムの比較です。2 μL注入ではピークがノイズと重なり定性・定量が困難ですが100 µL注入では定性・定量が容易に行えます。このように微量分析において感度が足りない場合に大量注入を用いることで感度向上が図れ、データの信頼性も高くなります。

注入量の違いによるクロマトグラムの比較
127

時間

夾雑成分

128

10, 製品カタログ
凍結粉砕キット
抽出操作
全自動固相抽出装置
STQ法

前処理キット

精製操作
固相カートリッジ※お断り■製品の仕様・外観・構造等は、改善のため予告なく変更する場合があります。
■価格は2024年5月1日現在のもです。今後予告なく変更する場合があります。
予めご了承ください。
価格表
https://www.aisti.co.jp/price■お見積り、お問合せはこちらからお願いします。
見積もり お問合せ
https://www.aisti.co.jp/contact

129

7，製品紹介

凍結粉砕キット

凍結粉砕機 フレステント FST-4000

型番

製品名

単位

入数

税抜定価

SA-8010-004

凍結粉砕機 フレステント FST‐4000（本体、容器、蓋、カッター）式

1

248,000

SA-8010-006

凍結粉砕機 フレステントFST‐4000用 容器

個

※１
1

35,000SA-8010-007

凍結粉砕機 フレステント FST‐4000用 蓋個

118,000SA-8010-005

凍結粉砕機 フレステント FST‐4000用 カッター個

1

18,000SA-8010-011

凍結粉砕機 フレステント FST‐4000用 断熱マット(3個入り)

個

3

5,000

SA-8010-010

凍結粉砕機 フレステント FST‐4000用 蓋パッキン(3個入り)

個

3

5,000

凍結粉砕機フレステント FST-4000
容器

凍結粉砕機フレステント FST-4000
蓋

凍結粉砕機フレステント FST-4000
カッター

型番SC-4010-151
内訳

ドライアイス凍結粉砕用備品（一式）

製品名

凍結粉砕機フレステント FST-4000
蓋パッキン

単位

入数

税抜定価

ドライアイス凍結粉砕用備品（一式）

式

1

5,600

スコップ（ドライアイス用）

個

1

予冷容器

個

1

試料採取用スプーン

本

5

試料取り出し用スプーン

本

5

単位

入数

税抜定価

台

1

130,000

型番
SC-4010-101

凍結粉砕機フレステント FST-4000
断熱マット

製品名
スノー状ドライアイス製造装置

スノー状ドライアイス製造装置

130

抽出操作
型番

製品名

単位

入数

税抜定価

SB-7011-101

塩化ナトリウム(残農グレード) 1g用(関東)

本

1

7,800

SB-7011-102

塩化ナトリウム(残農グレード) 1g用(和光)

本

1

7,800

SB-7033-101

クエン酸3Na・2水和物 1g用(関東)

本

1

7,800

SB-7033-102

クエン酸3Na・2水和物 1g用(和光)

本

1

7,800

SB-7099-100

クエン酸水素2Na・1.5水和物 0.5g用(特注製品)

本

1

9,000

SB-7022-201

無水硫酸マグネシウム 2g用(関東)

本

1

7,800

SB-7022-402

無水硫酸マグネシウム 4g用(和光)

本

1

7,800

SB-7022-031

無水硫酸マグネシウム 0.3g用(関東)

本

1

7,800

SB-7000-941【セット内容】塩化ナトリウム 1g、クエン酸3Na・2水和物 1g、クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5g (特式

425,800式

425,800

単位

入数

税抜定価

計量スプーン

QuEChERS法用 計量スプーン4本セット(関東)
注製品)、無水硫酸マグネシウム 2g(2回計量)

SB-7000-942

注製品)、無水硫酸マグネシウム 4g

型番

抽出用ジェネレータセット（IKA製）

製品名

SE-4010-030

抽出用ジェネレータセット（IKA製）

式

1

お問い合わせ下さい

SE-4010-025

ジェネレーター本体

台

1

お問い合わせ下さい

SE-4010-026

ジェネレータ用シャフト

本

1

お問い合わせ下さい

SE-4010-027

ジェネレータ用スタンド

台

1

お問い合わせ下さい

SE-4010-029

ジェネレータ用クランプ個

1

お問い合わせ下さい

単位

入数

税抜定価

袋

100

10,300型番

製品名

SB-3010-009

遠沈管 PP製 50mL 100本入

QuEChERS法用 計量スプーン4本セット(和光)【セット内容】塩化ナトリウム 1g、クエン酸3Na・2水和物 1g、クエン酸水素2Na1.5水和物 0.5g (特遠沈管 PP製 50mL 100本入

QuEChERS法用スプーン4本セット

131全自動固相抽出装置

製品名
全自動固相抽出装置

ST‐L400

L300・Ｌ400用スクリューバイアル(褐色・4mL) 100本入り

単位

入数

税抜定価

式

1

8,900,000

箱

100

5,500

STQ法 前処理キット(税抜定価)

キット内容

STQ‐GC A法STQ‐GC B法

STQ‐LC法

前処理キット

前処理キット

前処理キットSS-5020-011

SS-5020-002

SS-5020-003

単位

入数¥148,300¥182,700¥159,600

遠沈管 PP製 50ｍL 100本入

袋1

残留農薬分析用試験管ラック

台

1

●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●

●
●
●
●
●
●
●

押し出しポンプ（小・青）

4本入

パック

1

●
●
●

押し出しポンプ（中・緑）

4本入

パック

1

―

袋

2

個

1

袋

1

●
●
●

Smart‐SPE用アダプタ

6個入

固相カートリッジ脱着器
ディスポーザブルPPリザーバー（小）50本入PPリザーバー（大）

20本入

袋

1

―

ガラス製リザーバー

10本入

袋

1

―

20ｍL 10本入

袋

1―

溶液押し出し器
試験管（大）

10本入

袋

1

―

試験管（小）

100本入

袋

1

袋

1

●
●

メス試験管 1&2mL 共栓付

10本入

132

―
―
―
―

●
●

精製操作
型番
SA-2010-005

製品名

単位

入数

税抜定価

備考

台

1

39,500

A&B&LC法

製品名

単位

入数

税抜定価

備考

残留農薬分析用試験管ラック

型番
残留農薬分析用試験管ラック

SB-4010-002

押し出しポンプ(小・青)

4本入

ﾊﾟｯｸ

4

11,300

A＆B＆LC法

SB-4010-004

押し出しポンプ(中・緑)

4本入

ﾊﾟｯｸ

4

11,300

A＆B＆LC法

製品名

単位

入数

税抜定価

備考

個

1

13,000

A&B&LC法

単位

入数

税抜定価

備考

型番
右下：押し出しポンプ（小・青）
左上：押し出しポンプ（中・緑）

SA-2030-005

固相カートリッジ脱着器

型番

固相カートリッジ脱着器

ディスポーザブルPPリザーバー（小）製品名

SB-6011-005

ディスポーザブルPPリザーバー（小）セット 500本入

袋

500

14,000

A&B&LC法

SB-3020-011

PPリザーバー(大)

袋

20

4,800

B法

SB-3020-015

ガラス製リザーバー 10本入箱

1010,000B法

SB-3020-013

溶液押し出し器 20mL 10本入

袋

10

1,500

B法

単位

入数

税抜定価

備考

20本入

型番

製品名

SB-3010-003

試験管(大)

10本入

箱

10

13,200B法

SB-3010-001

試験管(小)

100本入

箱

100

6,800

A&B&LC法

SB-3011-021

メス試験管 1&2mL 共栓付

袋

1035,000

A&B＆LC法

10本入

PPリザーバー（大）ガラス製リザーバー

溶液押し出し器 20mL

試験管（大）

型番

吸引マニホールドキット 20ポート

右上：Smart-SPE用アダプタ
真中：ストップコックPTFE

メス試験管1mL&2mL共栓付試験管（小）

製品名

キット内容

単位

入数

税抜定価

式

1

お問い合わせ下さい

SS-5110-002

吸引マニホールドキット 20ポート

SB-5110-002

吸引マニホールド本体 20ポート式

1

お問い合わせ下さい

SB-5110-003

ストップコックPTFE 10個入袋

2

お問い合わせ下さい

SA-2020-002

Smart‐SPE用アダプタ 10個入袋

2

12,000SB-5110-004

ダイヤフラム真空ポンプ(スイッチ付)

台

1

48,000SB-5110-005

吸引ろ過瓶

個

1

10,600SB-5110-006

吸引ホース一式

式

1

7,300

SB-5110-007

廃液受け 20ポート

型番SA-2020-003

Smart‐SPE用アダプタ

個

1

5,000

製品名

単位

入数

税抜定価

備考

6個入

袋

6

9,000

A＆B&LC法

133

固相カートリッジ●シリカゲル系カラム
型番

製品名

単位

入数

税抜定価

備考

SA-1110-030

Smart-SPE C18-30

箱100

39,000

LC&MG法SA-1110-050

Smart-SPE C18-50

箱100

39,800

A&B&LC法SA-1120-030

Smart-SPE PSA-30

箱100

39,800

A&B&LC法SA-1120-040

Smart-SPE PSA-40

箱100

41,800―

SA-1120-050

Smart-SPE PSA-50

箱100

43,800

GS法

SA-1160-030

Smart-SPE SI-30

箱100

39,800

B法

SA-1122-030

Smart-SPE SAX-30

箱100

39,800

B法

SA-1122-050

Smart-SPE SAX-50

箱100

41,800―

SA-1121-030

Smart-SPE NH2-30

箱100

39,800

B法

SA-1123-030

Smart-SPE SCX-30

箱100

39,800

MG法＆GS法

単位

入数

税抜定価

備考

●ポリマー系カラム
型番

製品名

SA-1260-010

Smart-SPE PBX-10

箱100

39,800

B法＆GS法SA-1260-020

Smart-SPE PBX-20

箱100

45,000

ー

単位

入数

税抜定価

備考

箱

100

39,800

A&B法

単位

入数

税抜定価

備考

箱

90

39,800―●その他
型番SA-1351-020

製品名
Smart-SPE GCK-20●3種セレクト
型番SA-1900-333

製品名
Smart‐SPE 3種セレクト※3種×30個となります。ご希望の固相の種類をご指定願います。

固相カートリッジ

134アイスティサイエンスホームページのご案内- WWW.aisti.co.jp -試料ごとの豊富なアプリケーション
ノート

株式会社

日本食品衛生学会・農薬残留分析研究会など学会で発表した資料

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