187M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））

PF-BL10C

アリの感覚子に発現する「化学感覚タンパク質」のリガンド結合に伴う構造変化

The structural changes induced by ligand binding of
the chemosensory protein found in the sensillum ofCamponotus japonicus.
温都日格 1・李興１・平井光博 2・北條賢 3・尾崎まみこ 3・岩佐達郎 1,4（1 室蘭工大・工学専攻、2 群馬大学・理工学府、3 神戸大学理学研究科生物学専攻，4 室蘭工大環境科学
・防災研究センター）【研究⽬的】オオクロアリ（Camponotus japonicus）の感覚⼦に発現す
る「化学感覚タンパク質」（chemosensory protein; CSP）は多くの昆⾍
種の化学感覚器に存在する親油性物質結合タンパク質の⼀種類であり、化学分⼦を受容体まで輸送していると考えられている。CjapCSPs は⽔溶性低分⼦蛋⽩質で、4 個のシステイン残基を⼀定の位置に持ち、4-5 本のα ヘリックスで構成されている。疎⽔性の炭化⽔素と結合でき、親⽔的環境に炭化⽔素を溶かし込むことができる。オオクロアリで網羅的発現解析の結果 12 種類の CjapCSPs が⾒出された。最初に感覚⼦で⾒つかった CjapCSP1 はアリの巣仲間と敵との区別に関係するフェロモン分⼦を運ぶと考えられている。この作⽤機構を、CjapCSP1 のリガンド結合に伴う構造変化の視点から解明することを⽬的として研究を⾏っている。
【試料調製】CjapCSP1 の 遺伝⼦を発現ベクターに導⼊し、⼤腸菌
BL21(DE3)で⼤量発現、精製した。散乱測定前に，紫外吸収、蛍光測定（Trp 残基近傍の情報）、CD 測定（タンパク質の⼆次構造情報）を⾏った。
【散乱測定・結果】SAXS、WAXS 測定には BL10C を利⽤した。カメラ
⻑と波⻑を変えて測定を⾏った（1.35 Å, 28.9 cm；1.7Å, 203.7 cm）。溶媒の pH を変化させ，リガンドとの結合・⾮結合状態での構造変化を検討した。また，研究対象である CjapCSP1 の⽴体構造は決定されていない
ため，フォールド推定ソフト Phyre2 を使⽤し，溶液散乱シュミレーショ
ンソフト CRYSOL により実験散乱データとの⽐較を⾏った。

188M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））
PF-小角散乱ビームライン/ PF-BL-6A

胆汁酸混合ミセルの形態変化におけるコレステロールの影響
Effect of cholesterol on morphologic change in bile salt
based mixed micelles
相澤秀樹 1、小竹（奈良）英一 2、市川創作 3
1 摂南大薬、2 農研機構食品研究部門、3 筑波大生環系

医薬品もしくはサプリメントに含まれる脂溶性有効成分は一般に油脂に溶解した状態で存在しており、胆汁酸によって油脂とともに乳化された後、胆汁酸混合ミセルに可溶化され、腸で吸収される。このように胆汁酸混合ミセルは、脂溶性有効成分の可溶化と吸収に大きな役割を果たしている。胆汁酸混合ミセルの構造を明らかにし、胆汁酸混合ミセルの組成、構造、腸への脂溶性有
効成分の吸収性との関係を議論することは、脂溶性有効成分の体内吸収を制御する技術の開発に有用な基礎的知見となる。
我々は、緑黄色野菜に多く含まれるβ-カロテンは、脂溶性の食品機能成分であり、ヒト腸管モデルである Caco-2 細胞を用いてβ-カロテンの腸への吸収
性とそのミセル構造を明らかにした。混合ミセルは胆汁酸、モノオレイン、オレ
イン酸を一定の割合で混合し、さらに 1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（MPPC）、あるいは 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）のどちらかを異なった割合で加えて調製した。このような混合ミセルでは、MPPC あるいは POPC の割合によりβ-カロテンの Caco-2 細胞への取り込み量が異なっており、また MPPC の割合により球形ミセルから楕円体
ミセルへ変化していき、POPC の割合により球形ミセルから楕円体ミセル、そして円柱ミセルへと変化していったことを明らかにした[1-2]。本研究では、本来の胆汁酸混合ミセルの成分の一つであるコレステロールを、これら組成の異なる
混合ミセルに添加し、フォトンファクトリー BL-６A に設置されている小角 X 線装置を用いて測定し散乱曲線を得た。その散乱曲線に幾何学構造モデルに基づく理論散乱曲線をあわせることで、これら組成の異なる混合ミセルの大きさと形状を求めた。その結果、コレステロールの有無にかかわらず、混合ミセ
ル中の MPPC の割合により球形ミセルから楕円体ミセルへ変化していき、
POPC の割合により球形ミセルから楕円体ミセル、そして円柱ミセルへと変化していった。コレステロールは、ミセルの変化過程には影響を与えなかったが、ミセルの大きさに若干の影響を与えた。
[1] T. Sugawara, M. Kushiro, H. Zhang, E. Nara, H. Ono, A. Nagao, J. Nutr., 131(11), 2921 (2001).
[2] H. Aizawa, S. Ichikawa, A. Nagao, Photon Factory Activity Report 2013#31(2014) B

189M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））¨ ¨ ¨ ¨ ¨ ¨ ¨ Á»­·¾°¯¸¨{öĀăĎĞĔĊ45

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Structural study of the stabilization of protein
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190M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））

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SAXS analysis of SHP2 in complex with the EPIYA
segment of Helicobacter pylori CagA
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BL-6A/10C

高濃度コレステロールは薬剤クロルゾキサゾンのリン脂質膜への結合を阻害する
High concentration cholesterol’s inhibition of the bindingof chlorzoxazone to phospholipid bilayers
山田安由美 1、清水伸隆 2、引間孝明 3、高田昌樹 3,4、小林俊秀 5、高橋 浩 1,3,5
1 群馬大、2 KEK-PF、3 理研播磨、4 東北大、5 理研和光
筋弛緩作用を持つ薬剤クロルゾキサゾン（CZX）を、はじめとして多くの薬剤
は、小胞体膜に存在する膜タンパク質シトクロム P450(CYP)で酸化され親水性が高まることで、尿とともに体外に排出されるようになる。
この CYP による薬剤代謝プロセスに関して、分子動力学的研究［1］なされている。その研究では、部分構造しか解かれていないが、CYP の結晶構
造解析の原子座標データを基礎にし、リン脂質膜に CYP を埋め込み、水相にイブプロフェン等の薬剤を入れた系での各分子の動きをシミュレーションしている。結論として、次の描像が提案された。(1)薬剤は、まずリン脂質膜に結合し膜の疎水性内部に入り込み、その後、(2)リン脂質膜の疎水性内部に口が開いている CYP のチャンネルを介して、薬剤は CYP の疎水性領域の内側にある触媒部位へ運ばれ、(3)酸化作用を受けた後、先とは別のチャンネ
ルを通って薬剤は細胞質側に放出される。
この研究を受けて、我々は、CZX のリン脂質膜へ結合および侵入が、コレ
ステロール(Chol)を添加することで、どう変化するかを実験的に調べることを行った。その動機は主に２つあって、上記の研究ではコレステロールの存在が無視されていることと、CYP が主に存在する小胞体膜は、他の細胞内小器官と比較すると、Chol 含有量が少ないという特徴を持つことに興味があるからである。実験手法としては、熱測定、分光法、および、放射光 X 線回折を使用した。リン脂質としては、代表的なホスファイジルコリン(PC)を使用した。
結果、分子動力学計算が示唆したように、CZX は確かに PC 膜の内部に侵入した。しかし、Chol 濃度の増減に応じて、その結合・侵入の度合いは 2 相的に変化した。小胞体膜程度の 10mol%の低濃度で、リン脂質膜の CZX の取り込み量は最大に達し、その後は、Chol 量が増加するにしたがって減少した。形質膜程度の 30-50mol%の高濃度では、Chol は CZX のリン脂質膜への結合を阻害した。この結果から、Chol 濃度に応じて、CZX の生体膜への侵入が制御され、それが効率良く CYP が存在する小胞体へ薬剤を導くことに役立っているとの仮説を提唱した [2]。
[1] K. Berka et al., J. Phys. Chem. A, 115 (2011)11248–11255.
[2] A. Yamada et al., Biochemistry, 55 (2016) 3888–3898.

192M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））

ＢＬ６Ａ

低強度の遠心性収縮は反復してもサルコメア構造に分子レベルでほとんど影響を与えない
Repetitive low-intensity eccentric contraction has
little effect on sarcomere structure
at a molecular level.
平野和宏1、中原直哉1、山内秀樹1、平塚理恵2、山口眞紀1、竹森重1
１ 東京慈恵会医科大学医学部分子生理学
２ 東京慈恵会医科大学自然科学生物研【目的】遠心性収縮（ECC）は、収縮する骨格筋が外力に負けて伸長される収縮様式である。興味深いことに ECC は高強度で筋を損傷し、低〜中強度で筋を強化・肥大させるという。 我々は X 線回折法を用い、中等度強度（75Hz の電気刺激で収縮を誘発）の ECC がミオシン層線強度を顕著に低下させ、筋の結晶構造（サルコメア）の分子レベルでの明らかな劣化を起こすことを報告した。本研究では、低強度 ECC が筋の結晶構造に与える効果を評価した。
【方法】麻酔下にて 8 週齢の F344 雄ラットに血流供給下で神経を介して足底筋を電気刺激した。300 ミリ秒の持続的収縮を、以下の条件で 3 秒に 1 回の間隔で 10 回誘発した；100Hz 等尺性収縮（ISO）、50Hz ECC、75Hz ECC。また、総収縮負荷の影響を評価するために、50Hz ECC を 30 回連続で誘発（50Hz
ECC×30）する条件を設けた。
【結果】力-時間積分（N・s/cm2 ）として評価された全体の収縮負荷は、50Hz
ECC <ISO = 75Hz ECC <50Hz ECC×30 であった。収縮負荷の 1 時間後に評価された等尺性最大張力は、ISO = 50Hz ECC <50Hz ECC×30 <75Hz ECC であった。ミオシン層線強度は、75Hz ECC では殆ど観察されなかったが、ISO、
50Hz ECC、および 50Hz ECC×30 では収縮負荷を与えない対照群と同等の強度であった。
【結論】ミオシン層線によって表されるサルコメアの劣化は、発生する力の大きさに大きく依存し、総収縮負荷にはよらない。したがって、リハビリテーションに
おいては、反復性の低強度運動をさせることが、サルコメアを劣化させることなく筋力を増強する上で適していることが示唆された。
【ＣＯＩ】申告すべきものなし。

193M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））
PF-BL10C

抗貧血薬候補鉄配位ウシラクトフェリンの pH 依存による会合機構
pH-dependent assembly mechanism of multiferricion-bovine lactoferrin: A new antianemic material
松村義隆 1、山口智大 1、清野翔平 1、川上浩 2、田之倉優 3、小島正樹 1
1
東京薬科大学、2 共立女子大学、3 東京大学

Previously, we prepared soluble bovine lactoferrin (bLf) in the presence of 70
mol ferric ions (70FeLf). In the present study, we have measured the 70FeLf at
pH 1-6 by small angle X-ray scattering (SAXS). The results indicated that
70FeLf takes a globular shape. Besides, it is indicated that 70FeLf has many bLf
monomers at investigated pH range. The number of bLf monomer in 70FeLf
showed pH-dependent. These results suggest that following: (1)Multiferric-bound-bLf may maintain physicochemically a stable conformationin both stomach and digestive tract. (2) The number of bLf monomer inmultiferric-bound-bLf might be correlated with internal conformational change
of bLf or apparent pKa of bicarbonate ion. Multiferric-bound-bLf may be usefulfor antianemic materials.

194M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））µº«®­¶¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦µÎÄÀÏÐ¦ÐÑÊÌÎ¦ÈÇËÀÏÄ dG#_[íS¦
Insight into the activation mechanism of Brk
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The Software Development for Serial BioSAXS data
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[2] M. V. Petoukhov et al. J. Appl. Cryst. 45, 342-350 (2012).

196M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））
BL-6A

超好熱アーキア Sulfolobus tokodaii 由来アルコール脱水素
酵素の熱活性化に伴う構造変化の解明
Elucidation of the structural changes in heat
activation of alcohol dehydrogenase from a
hyperthermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii
郷田秀一郎 梶山晃成 永野結花 内田拓郎 海野英昭 畠山智充
長崎大学大学院・工学研究科
超好熱アーキア Sulfolobus tokodaii 由来アルコール脱水素(StADH)は、大腸菌を宿主に用いて生産されると活性が低い状態で得られ、加熱によって活性が上昇する。StADH の酵素活性測定を、基質に ethanol、補酵素に NAD を用いて行ったところ、比活性は加熱することによって 0.28 U/mg から 1.31 U/mg
へと約 5 倍上昇した。また、ミカエリス定数（Km）を算出すると、基質に対するKm 値に大きな違いは見られなかったものの、補酵素に対する Km 値は加熱によって減少が見られ、補酵素と酵素の親和性が高くなると考えられた。大腸菌で生産された低活性 StADH を 90℃で加熱し、構造及び酵素活性の経時変化を測定した。構造の変化は X 線小角散乱測定で行い、その結果、分子の回転半径であるギニエ半径は 15 秒加熱することによって活性型ほどのサイズに変化したが、酵素活性は 45 秒ほど加熱することによって最大値を示した。このことから StADH の熱活性化は、分子全体の構造が変化した後で、微細な構造変化が起こることによって完全な酵素活性を示すと考えられた。非加熱状態の StADH の原子レベルでの構造解析を目指して結晶化を行い、いくつかの条
件で結晶化に成功し、構造を解析した。その結果、酵素活性には亜鉛が必要であり、他の菌由来ではタンパク質 1 分子あたり 2 分子の亜鉛が見られているが、不活性型酵素ではそのうちの一つがマグネシウムとなっていた。マグネシ
ウムは補酵素の近傍に位置しており、このことが酵素活性に影響を与えたと考えられた。

197M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））

PF-BL10C

ÍÏÂÉÑÒÅÏÆÔÐ5*±¡¾ÈÒÌÄ78
 d²O 6eio
Structural study of protein stabilizing action in
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198M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））
BL10C

高速重イオン照射による SiO2 ガラス中欠陥構造の
SAXS 評価
SAXS Observations of Defect Structure in SiO2 glass
by Swift Heavy Ions
○吉岡 聰 1，鶴田幸之介 1，安田和弘 1，松村 晶 1，石川法人 2
1 九州大学 工，2 原子力研究機構
高速重イオンをセラミックス材料に照射すると，材料中に高密度の電子励起が付与されイオントラックと呼ばれるナノメートルサイズの柱状欠陥が形成される．このような微細構造変化は，例えば原子炉材料の性能劣化を把握するために重要であり，定量的な評価が求められている．ケイ酸（SiO2 ）ガラス
は，非晶質中に生成するイオントラックの構造理解を目的とした数多くの研究がある．本研究では，SiO2 ガラス基板に対して高速重イオンを照射し，イオン
トラック構造を小角 X 線散乱（SAXS）法により調べた．
高速重イオン照射は日本原子力研究開発機構（JAEA）のタンデム加速器
を用い，ビーム方向に対して基板面が垂直となるよう試料を配置して実験した．
イオン種およびエネルギーは 200 MeV Xe，100 MeV Kr イオンとした．
SAXS 測定はカメラ長 2 m，波長 1.5 Å に設定し，2 次元検出器（PILATUS
300K-W）で散乱パターンを観察した．
図 1 に 200 MeV Xe イオンを 3×1011 まで照射した試料の 2D イメージを示
す．イオン照射の方向と平行に X 線を入射した場合の散乱像が(a)であり，試料基板面を X 線ビーム方向に対して 1，2，4，6，10°傾斜したそれぞれの場合の散乱像を(b)〜(f)に示している．（a）では、同心円状の散乱パターンが得ら
れ，イオントラック径のサイズを反映している．一方，(b)〜(f)では，イオントラッ
クの長さと径のアスペクト比が大きいことに起因して，細いストリークが出現し，傾斜角の増加に伴ってその変化は顕著である．

図 1. イオン照射した SiO2 試料を傾斜した場合の 2 次元検出器上の小角散乱パターン。

199M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））

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200M（生物物理，生物化学（小角散乱等，L以外））
BL-6A

リン脂質/コレステロール/水系で得られる
巨大分子集合体の相構造に及ぼす
長鎖アルキルアミンおよび長鎖脂肪酸添加の影響
Effect of addition of long-chain alkylamines and fatty acids on
the phase structure of giant lipid assemblies formed inphospholipid/cholesterol/water systems
黒岩崇 1、家才子翔平 1、端山琢人 1、市川創作 2、金澤昭彦 1
１ 都市大院工、２ 筑波大生命環境
リン脂質やコレステロールをはじめとする生体脂質は、水溶液中で様々な分子集合体を形成することが知られている。本研究グループでは、リン脂質とコレステロールを主成分とする脂質混合物が水溶液中で大きさが数 mm に達する巨大な分子集合体を形成することを見出している。これまでの研究で、温度、pH、脂質混合物の組成などの様々な条件により、巨大分子集合体の形状が著しく変化することがわかっている。この形状の変化は、分子集合体内部の脂質分子の配向状態の変化を反映していると考えられる。本研究では、少量の長鎖アルキルアミンおよび脂肪酸類の添加が、この巨大分子集合体の相構造にどのような影響を及ぼすかについて、小角/広角 X 線散乱測定(SAXS/WAXS)により検討した。
卵黄由来ホスファチジルコリン(EPC)、コレステロール(Chol)に種々の長鎖アルキルアミンまたは脂肪酸を加えた脂質混合物を n-ヘキサンに溶解し、脂質溶液を作製した。この脂質溶液を NaCl 水溶液または pH 4～11 に調整した緩衝液上に静かに積層し、約 24 時間静置してヘキサンを蒸発除去することで水相中に球状または膜状の巨大分子集合体を得た。
EPC、Chol およびステアリルアミンからなる脂質混合物を用いた場合、弱酸性～中性付近の pH では球状、アルカリ性（pH>10）では膜状の巨大分子集合体が得られた。これに対し、EPC、Chol およびステアリン酸かならる脂質混合物を用いた場合、弱酸性～中性付近の pH で膜状、弱アルカリ性～アルカリ性の pH で球状の巨大分子集合体が得られた。SAXS 測定の結果、ステアリルアミンおよびステアリン酸のいずれを添加した場合においても、球状の分子集合体は温度に依存してそれぞれ cubic-lamellar 相転移を示し、膜状の分子集合体は hexagonal-lamellar 相転移を示すことがわかった。これらの結果は、pH により添加成分の親水基サイズが変化することで、脂質分子の充填状態に影響を及ぼしたものと考察した。