光化学反応によるフリ ー ラジカルの産生と表皮培養細胞に対する影響
Dithranolを例として東京大学医科学研究所

金ケ鏑士

朗

Radical species probably formed during autooxidation of dithranol, 1,8-dihydroxy-9-anthrone, are considered to be responsible for antipsoriatic effect of this drug. By
using spin-trapping ESR spectroscopy, we investigated whether or not radical species,
such as oxygen radical and organic radical, were generated in the presence of dithranol
in organic solvent, in aqueous solution or after incorporation of the drug into ker­
atinocytes. In DMSO, o,-was found to be formed from molecular oxygen with the aid ofdithranol. The reaction was greatly enhanced by near-UV irradiation. In DMSO-PBS
mixture, o,-was also formed but it rapidly converted to·OH. After incubation of thedrug with keratinocytes, organic radical was formed from dithranol. Microsome andmitochondria were found to be responsible for the formation. Although dithranol exhib­
ited cytotoxicity, no indicative of lipid peroxidation was found. Since oxygen radical
scavengers prevent cytotoxic effect of dithranol, at least a part of the cytotoxic effect isdue to oxygen radical species.

1. 緒 言一方 ， ある種の anthraquinone 系化合物には発癌性•発癌 promotor 性のあることが知られてDithranol (1,8 dihydroxy-9-anthrone)はおり 4) ' それらの生理活性にフリ ー ラジカルの関ヒフの増殖性病変である乾癬の治療薬として古く与を示唆するデ ー タが蓄積されつつある 5 > 6 >。

から用いられている I) 。 この化合物は強い還元作

anthraquinone の 一 種である Dithranol には抗用を持ち ， 光や酸素によって容易に酸化されて乾癬作用だけでなく ， 発癌 promotor 作用 ” や突10-anthranyl radical に変化し ，一同時に 重項然変異原性のあることも報告されている 8) 。

酸素あるいはス ー パ ー オキシドアニオンのようなそ こ で本研究で は、 ESR 法に よ っ て ，活性酸素を生ずる。 そしてこれらのラジカルや活Dithranol の酸化過程で生成されるフリ ー ラジカ性酸素が Dithranol の抗乾癬作用の要因であるル種を同定し ， それらのラジカル種の生成に対すと報告されている

2)3l。 しかしながら， これまでる光照射の影響を調べると共に， 培養ケラチノサの報告においては， Dithranol の酸化に際し生イト細胞 を用い ，成される活性酸素種の正確な同定はなされていな

リ ー ラジカルの相関性を検討した。

Dithranol の細胞障害性とフい。 また， 産生されるフリ ー ラジカル種と細胞に対する生理活性との相関性も充分には解明されてしヽなしヽ。
OXYGEN RADICAL FORMATION DURING OXIDATION OF DITHRANOL AND ITS EFFECT ON
KERATINOCYTESShiro Kanegasaki

-67-

2. 実

験に取込ませた 51 Crの放出を指標とした。 96穴のプラスチックプレ ートにケラチノサイト(10り穴）

Dithranol (Sigma製）は 使 用 直前に 暗所 でを移植し， 3日間培養した。 この細胞に 61 Cr­

dimethylsulfoxide CDMSO)に溶解した後 適

sodium chromateを加え37℃ 90分間incubate

当な溶媒で稀釈した。

した。 細胞外の 51 Crを 培養液で洗浄除去した後，Dithranol由来の有機フリ ー ラジカルの生成は直接ESRスペクトルを測定した。

Dithranolを含む培養液で 一 定時間incubateした後 培養液中の放射能と細胞中の放射能を別々活性酸素ラジカル種はDMP0(5,5'-dimethylに測定した。
Dithranolの細胞障害に フリ ー ラジカルが関-pyroline-1-oxide)を用いたスビントラップ
9)

ESR法 により検出した。

与するか否かを調べる実験では ， 上記のごとく細胞内過酸化脂質ラジカルの生成を測定するた

51 Crを取込ませた細胞を各種のフリーラジカル

めには あらかじめ細胞に取り込ませたDHA

スカベンジャ ーないしはスビントラッパ ー 存在下(docosahexaenoic acid)由来の過酸化脂質からでDithranol処理し ， 5 1 cr放出量を比較した。

生じるアルキルラジカルをPOB N(2-(4-pyridyl3. 結果および考察-l-oxide) -1-N-tertbuthylnitrone)でトラッ
プし ， そのESRスペクトルを測定する方法

IO)

をDithranolの自動酸化によるス ー パーオキ

1 .

用いた。

シドラジカルの生成とそれに由来する活性酸

フリ ーラジカル生成に対する光照射の実験には ，キセノンラン プ (Cermax社（米）製 ，LX150-素種の生成300,150W, lOA, 波長範囲300nm-900nm)を使1. 1用した他昼光色蛍光灯も使用した。 対照実験はDithranolをDMSOに溶解した直後に測定し完全に遮光した状態で行った。

DMSO中での反応

たESRスペクトルをFig. laに示す。 スペクト細胞系としては ， マウス皮膚上皮細胞由来のケ

ル に は 02 ーのス ビンアダク ト であ るDMPO­

ラチノサイト (B ALB/MK -2)を用いた。 FBSOOHのシグナルのみが観察された。 スピンアダ

培養液中で4日問培養した細胞をトリプシン処理

クトの生成は， 嫌気的条件下では観察されず光照し， 遠心沈殿したペレットをPBS(-)で洗浄後同射の有無にかかわらず認められた。 反応液を長時溶液に懸濁した。 この細胞懸濁液にDithranol間暗所に放置した場合にはDMPO-OOHのシグを加え ， 添加直後 および一定時間incubateした

後直接並びにスビントラップ剤を加えESRスペクトルを測定した。
Dithranolラジカル生 成に関与する細胞分画の検討に当たっては， 上記の方法で集めたケラチ

二↑へ｀ぃノサイトを等張溶液中で超音波処理した後， 遠心CJ分離法によって mitochondria., microsomeおよ合と同様の方法でESRスペクトルの測定を行った。
Dithranolの細胞障害性は ， ケラチノサイト

V，!OGび cytosolの各分画を採取した。 これらの分画にDithranolを加えて incubateした後， 細胞の場

い-_,_;

F 19. 1 D ithranolのDMSO溶液 にDMPO を 添 加した時に観察されるESRスペクトル
5mM Dithranol溶液に180mM DMPOを添加して測定。 a) DMPO添加直後 ， b)暗所に6時間放置後 ， C)蛍光燈下に6時間放置後。 但し感度を1/20にして測定-68-光化学反応によるフリーラジカルの産生と表皮培養細胞に対する影響

ナルの他に·OHの生産を示唆するDMPO-CH3た(Fig.2d)。反応液に鉄のキレ ー タ ー を加えたの小さなシグナルが見られた(Fig. lb) 。光照射

場合にはDMPO-CHaシグナル強度がやや低下条件下に放置した場合にはDMPO-OOHのシグした。これらの結果から ， Dithranolは水溶液

ナル強度は約10倍近くまで増加し(Fig. le). 光中でも自動酸化されて0 2ーを生成する。しかし， 水照射が0 2 -産生を著しく増強させることを示した。

溶液中ではDMSO 中と異なり， 生成された0 2 -また， 上記DMSO 溶液中では， 以下のDMSO­

は， これから生じたH20 2 とのHa rb er-Weiss

PBS (l:l)混合反応溶液中とは異なり． 長時間光反応あるいは， 反応液中に微量に含まれる鉄を触照射して 放置して もg=2.0の有機ラジカルは観察媒とするFenton 反応によって すみやかに·OHされなかった。この結果は0 2 ーが直接には有機ラに変換されることが示された。

ジカルの生成に関与しないことを示して いる。

反応溶液を長時間暗所に放置した場合にはDMPO-OOHとDMPO-CHaのシグナルが観察

1. 2DMS0-PBS(pH7.4)(1:1)混合液中でのされたのに対して昼色光下で放置した場合には，反応これらのシグナルに加えて g=2.0に有機ラジカルDithranol 溶液を調整した直後のスペクトルが観察された(Fig. 3a)。反応液中にSODを添加をFig. 2a に 示 す 。 こ の 場合主なシグナルはしておくとこのシグナルの強度は増大し(Fig. 3·OH由来と思われるDMPO-CHaのシグナルで，b) ,この他に02―存在を示すDMPO-OOHの小さなDMS0100%の反応液中では反応液を長時間光照シグナルが観察された(Fig. 2a)。反応液中に射することによって 0 2 ー産生量が増加して も有機SODを加えておいた場合にはDMPO-OOHのラジカルは観察されなかったこと(Fig. le)およシグナルは観察されず(Fig2. b),

catalase存在び上記DMSO-PBS 混合反応液中に catalaseを下ではDMPO-C比のシグナル強度は1/4に低加えておくと有機ラジカルの強度が半減したこと下 した(Fig. 2c)。 さ らに 反応液中にSOD とを合わせて考えると， g=2.0 の有機ラジカルのcatalase が あ る と減少し た ( Fig. 3c)。

catalaseを加えた場合には， DMPO-OOHのシグナルもDMPO-CHaのシグナルも現れなかっニニ一乍�l\r-----------旱dJ

Fig.2lOG

DithranolのDMSO-PBS(1:1) 溶液にOM­
POを添加した時に親察されるESRスペクト
ルと活性酸素スカベンジャ ー の影響

5mM Dithranol溶液に180mMDMPOを添加して 測定。 a) 対照；b) 1000U/mi
SOD添加 ， c) 5000U/mU catalase添加d) SODとcatalase添加-69-Fig. 3

Dithrano有l 機ラジカル生成に対する光照射の影響

60mM Dithranol 溶液(DMSO-PBS(1:1))にa)無添加 ， b) 1000U/mi SOD, c)
5000U/ 1111 catalase, d) SODと catalaseをそれぞれ加え ， 蛍光燈下に6時間放置後180mM DMPOを加えて測定。

そこで， このラジカル生成に細胞成分が関与し生成には光が必要であるが 02-は直接関与せず ，て い るか否かを調べる た め に ，H2 切が関与していると考えられた。

mogenateした後遠心分画し ，昼色光下で見られた反応が近紫外部光線によることを確かめるために ， キセノンランプ(300nm

細 胞 を ho­mitochondria,microsome, cytosolおよびcell debrisの分画に以上）を用いて同様の実験を行った。結果はFig.

ついてDithranolを加え， 上記と同様の実験を2の 結 果 と同様で ， 反応液調製直 後 に はま ず行った。結果は， mitochondria, microsomeおDMPO-OOHとDMPO-CHaのシグナルが観察

よびcell debrisの存在下で有機ラジカルが観 察された(Fig. 4a)。この液を暗所に20分放置した

され ，場合のESRスペクトルは， 調製直後のものとほルは観察されなかった。

Cytosolを加えた系ではラジカルのシグナ

とんど変わらない(Fig. 4b)が ， 光照射下20分放置した場合にはDMPO-C止のシグナル強度は

2. 2 ケラチノサイト中で脂質の過酸化反応が1/2に低下し ， 代って g=2.0に有機ラジカルのシ生じるか否かを調べた。Dithranolは水溶液中グナルが観察された。したがって昼色光下で観察で 02 ―, ·OH, H心 2 を生成することが明らかにされたフリ ー ラジカルの生成が近紫外部光線下でなったので， これらの活性酸素種存在下でケラチ生じることが確かめられた(Fig. 4c)。

ノサイト細胞膜において過酸化脂質が産生されるか否かを調べた。このため， あらかじ めDHAをケラチノサイト存在下でのフリ ー

2.

ラジカルの生成とDithranolの細胞障害作用取り込ませたケラチノサイトにDithranolを作用させ ， DHAから過酸化脂質が生成される 時にまず産生されると考えられているアルキルラジカ

2. 1

培養ケラチノサイト細胞にDithranolをルをPOBNでトラップする方法で検討した。 そ加えた反応液を室温で incubateした後DMPOの結果， 対照として二価鉄を加えた反応系ではを加えてESRスペクトルを測定したところ，

POBN の ス ピ ン ア ダク ト が 観 察 さ れ た が ，DMPO-OOHのシグナルもDMPO-C止のシグ

Dithranol添加反応系ではPOBNのスピンアダg=2.0の有機ラジカルのシグ

クトは観察されず ， この条件下では細胞の脂質のナルも観察されず ，過酸化反応が起こっているという証拠は得られなナルのみが観察された。

二'.,�+�臼賛←い―v-t�凸—--二)_�炉

かった。
2. 3

Dithranolの細胞障害性を s1crの放出を指標として調べた。あらかじ め s1crを取り込ませたケラチノサイトにDithranolを加えて incu­
bateし ， そ の間に放出される s1cr量を対照の細胞の値と比較した。 0.5mM Dithranolで4時間"後から有意に s1cr放出の増加が見られ(Fig. 5),

C)

,, .
ーヽ

この濃度でDithranolに細胞障害性のあること

LOG

Fig. 4が確かめられた。

Dithranol 溶液にキセノンランプを照射した
時に親察されるESR スペクトル。
5mM Dithranol 溶液(DMS0-PBS(1:1)) にa) 調製直後 ， b) 20 分間暗所に放置後 ， およびC) 20 分 間キセ ノンランプ照射後 180
mM DMPO を添加して測定。

2. 4

Dithranol細胞障害性に対するフリ ー ラジカルスカベンジャ ー の影響を調べた。2.3と同様の系に 0.5mM Dithranol添 加 直前にSOD,-10-光化学反応によるフリ ー ラジカルの産生と表皮培養細胞に対する影響〇寸

oc*5.0 mM• Q.5 mM
• Q mM3) 水溶液中で Dithranol 自動酸化により生成された 02 ーは H 2 切をへて ・ OH に変換される。

4) H2 切存在下で光を照射すると Dithranol か
0 2 ―, ·OH は検出されず有機ラジカルの生成が観察された。

oz

6) ケラチノサイトにおける有機ラジカルの生成には細胞の mitochondria, microsome 中の酵素の関与が推定された。

oL①see 一① 工 N

ら有機ラジカルが生成される。

5) ケラチノサイト存在下では，

7) Dithranol は 0.5mM, 4 時間処理でケラチノサイトの s1 cr 放出を促進した。

8) Dithranol による s1 cr 放出の促進が SOD にFig. 5hr462

よって低下したことから Dithranol による細胞障害性に 0 2 ーが関与すると考えられる。

（研究実施者 上野郁子， 干徳山）

培養ケラチノサイト細胞からの 51 Cr releaseに対する Dithranol の影響。

引用文献I) Ashton, R. E., Andre, P., Lowe, N. J. andWhitefield, M. J. Am. Acad. Dermatol. �173-192(1983).

catalase, POBN, DMPO 等を加え， Dithranolによる ,1 Cr 放出の促進がこれらのフリーラジカ

2) Bruce, J.M., Kerr, C. W. and Dodd, N. J. F.
J. Chem. soc. Faraday Trans, 1, 埜85-89(1978)

ルスカベンジャ ー の処理によって抑制されるか否かを調べた。 この結果， SOD 処理の場合にのみ約 30% の低下が見られ，

3) Fuchs, J. and Packer, L. J. Invest, Dermatol.
競677-682(1989).

0 2 ―産生が Dithranol の細胞障害性の一部に関与していることが明らかに

4) Uraguchi, K., Saito, M., Noguchi, Y., Taka­hasi, K., Enomoto,M. and Tatsuno, T., FoodCosmet. Toxicol. 拉，193-207(1972).

なった。
以上の結果から ， Dithranol は水溶液中で自動酸化して 0 2 ーを産生し， 近紫外波長の光線はこ

5) Akuzawa, S., Yamaguchi, H., Masuda, T.
and Ueno, Y., Mut. Res. 芦63-69(1992).

速やかに産生されることが明らかになった。 さら6) Ueno, I., Hoshino, M., Maitani, T., Kane­gasaki, S. and Ueno, Y., Free Radical Res.
Com. in pressの 0 2 ―産生を促進すること，

0 2 ーからは ·OH がに ol cr 放出を用いた実験でケラチノサイトは ，低濃度の Dithranol によって傷害され ， その原

7) Boch, F. G. and Burns, R., J. Natl. Cancer
Inst. 迎 ， 393-397(1963).

が関与していることが示された。

8) Gillberg, B. 0., Zetterberg, G. and Swanbeck,G., Nature璽415(1967).

因の一部には Dithranol 存在下で生成される 0 2 -総9) Ueno, I., Kohno, M., Mitsuta, K., Mizuta, Y.
and Kanegasaki, S. J. Biochem. 謳905-910(1989).

括

1) Dithranol は酸素存在下で自動酸化によって 02 ーを生成する。

10) North, J. A., Spector, A. A. and Buettner, G.
R. J. Biol. Chem. 匈 ， 5743-5746(1992)

2) 近紫外部から可視部に至る光線の照射は 0 2 -産生を増大させる。

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