JAIMA Season 2022
機器分析が支える、豊かな暮らしと産業のフロンティア

MSイメージングによる機器分析
イメージング質量顕微鏡で身の回りの物質を探る

No.18

株式会社島津製作所 分析計測事業部 ライフサイエンス事業統括部 MS ビジネスユニット
緒方是嗣

１. はじめに察された「もの」の中身を知るための質量分析計として、顕微鏡画像に対応した、高解像度の質量分析法は、目的の化合物をイオン化し、質量MSイメージング画像装置である。この iMScope

電荷比（m/z）により分離されたイオンを検出する

TRIO の後継機として、飛行時間型質量分析計ことにより、その化合物の構造等を調べる分析方（Q-TOF MS：LCMS-9030）と組み合わせたイメー法である。このイオン化をマトリックス支援レー

ジング質量顕微鏡 iMScope QTは開発された 4）。こ

ザー脱離イオン化法（MALDI）により行う装置がの装置は、LCMS-9030に取り付けることで、顕MALDI-MSであり、微生物同定や質量分析イメー

微鏡による光学イメージと高精度・高解像度のジング（Mass Spectrometry Imaging：（MSI）法な質量分析イメージを融合できるイオン源をもつどを応用例として、使用用途が広がっている 1)。

MALDI-Q-TOF型質量分析計として使用できるMSI法は、一般的にはサンプルを MALDIなど（図１）。Q-TOF型質量分析計 LCMS-9030の高いで直接イオン化し、次にこれを飛行時間型質量分質量精度と分解能により、iMScope QTでイオン析計（TOF-MS）で質量分離し分析するという原化された物質は、精度の高いイメージングデータ理に基づき、生体組織の切片上において、数千～を取得できる。

数万点におよぶ質量分析データの膨大な情報から

iMScope QTには、40倍の対物レンズによ任意の分子情報のみを選択的に解析し、分布強度る 1 μm以下の高解像度画像を取得できる顕微鏡を画像化するものである。この技術を利用したイと、最小 5μmから約 200μmまでビーム径を可変メージング質量顕微鏡（iMScopeTM）は、分布情に設定できる UVレーザ（Nd : YAGレーザ、波長報の画像化において、精密な光学画像を顕微鏡に355nm･周波数 20kHz）が搭載されている。MSIより取得することで、まさに二次元レベルでの詳法により、分子の分布を解明する際に形態学的な細な質量分析を可能にするものである。この手法特徴と関連づけて観察する場合には，できる限りによりペプチド、脂質など生体組織上で位置情報空間分解能が高いことが望まれる。

を保持したまま解析することが可能になり、医学分野では病態解析や薬物動態、農学分野では農a）b）

薬の浸透・蓄積、有用物質の分布解析などへの応用として利用されている 2,3)。本稿では iMScope
QTを中心に、MSI全般に利用できる前処理シス
テム、ソフトウェアについて紹介する。

２ . イメージング質量顕微鏡の開発と周辺機器
２−１．イメージング質量顕微鏡 iMScopeiMScope TRIO（2013年発売）は、顕微鏡で観4

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図 1. iMScopeQT 概観 4）a) iMScope QT b)LCMS-9030

高空間分解能の実現には、レーザー径の微小従来のハンドスプレーの課題であった作業者の技化（5μm）に加え、マトリックスの微細結晶化な量や噴霧時の周辺環境の条件ばらつきを解消するどが必要である。さらに顕微鏡による位置合わせことを目指しているが、２段階蒸着のための後処とレーザーを正確にその位置に照射するステー理に使用することで、空間分解能と感度の両立にジ制御の高精度化もあわせて必要な技術となる。

有用であることが示された。
この２段階蒸着法は、CCDカメラでの位置合わせや光学画像を別に撮蒸着のみでは検出できない化合物の測定の際に、像するシステムと異なり、iMScopeではシステム的高い空間分解能を維持したままでのイメージングに統合された分析手順によるイメージング画像とを実現する 7)。

光学画像の重ね合わせでは、人の手を介することマウスの肝臓サンプルを用い GSSG（酸化型グがないため、恣意的な要素が入らず、正確である。

ルタチオン）、HemeBを標的とした 5μｍでの高顕微鏡観察からそのまま測定するため、大気圧空間分解能測定での解析により、高い位置精度とMALDIを採用しているが、測定中にサンプルの感度の両立を実証した例を示す。マウス肝臓の状態が変わりにくいという利点もある。一般に高切片のうち、辺縁部を含む領域と、血管部位を質量分解能や高空間分解能での測定では、総分析含む部位について、9-AA（9-amino acridine : 9-ア

時間は長くなるため、サンプルは長く装置内に留ミノアクリジン）をスライドグラス表面上に膜まることとなり、真空下に晒され、測定中にマト厚 1.0μmになるように iMLayerで塗布したのちリックスの減少を体験することもある。質量分析

iMLayer AEROにより重層しイメージングした。

装置としては、非常に高い質量分解能の有する装スライドグラスを専用ホルダにセットし、撮像置も複数存在しているが、MSイメージングにおから前処理、測定まで実施することで、GSSGが肝いては、総分析時間やメンテナンスに必要な時間

臓組織から滲みだすことなく検出することを光学など、質量分解能などと異なる直接仕様から見え画像との重ね合わせにより正確に確認することがにくい特徴にも注意が必要であり、目的によってできた（図２ a-2）。スプレー法では、100-150μm程使い分けも必要であろう5)。

度のわずかなサンプル外への滲みが発生しているa）b）

iMScope発売以来、装置性能以外の要望も多く（図２ b-2）が、通常の分析では、イメージング画
4）いただいている。MALDIでイオン化しない物質像に合わせて画像の重ね合わせを実施することがa) iMScope QT b)LCMS-9030への対応や再現性、定量性への不安といった点多いため、この誤りに気が付かないことが多い。

に対して、新規マトリックスの開発 6)や誘導体化、塗布方法の改良 7)、解析方法の開発などもあわせ、

図 1.

a-1)

iMScopeQT 概観

a-2)

MSIに対するトータルソリューションの提供を目指し、複数の周辺装置、ソフトを開発してきたので、これをあわせて紹介したい。
２ − ２ ．前 処 理 装 置 i M L a y e r / i M L a y e rAEROb-1)b-2)

MALDI-MSイメージングを行うためのサン
プル前処理の装置として、iMLayerと iMLayer
AEROは、それぞれ蒸着、溶液噴霧と異なる原理で目的を実現するために開発された。iMLayerは膜厚測定により、iMLayer AEROは雰囲気制御と塗布条件の固定化により、それぞれ前処理の再現性を担保している。特に、iMLayer AEROは、

図２ マトリックス塗布条件の違いによるGSSG イメージング結果a-1) b-1): 光学画像 a-2):2 段階蒸着法 b-2):e スプレー-2): m/z 426 スケールバー :100 μ m

JAIMA Season 2022 Autumn5また肝臓内の血管部分では HemeBを検出している（図３）。切片上の HemeBは、本来血管内は２−３．解析ソフトウェア IMAGEREVEALMS

均質もしくは血管壁に近い分布を示すはずである

MSIデータの解析は、ユーザー層の増加と分析が、スプレーで塗布している場合、シグナル強度のスループットや精度の向上に伴うデータ量の増のばらつきが大きくなっている。一方、２段階蒸加や潜在的な情報の網羅的解析への要求から、簡着ではスプレー法とは異なりマトリックス結晶核単な手順で質量分析イメージデータの解析を行うがあらかじめ形成されているため、この結晶形成ことができ、大きなデータサイズに対応することのばらつきが小さく、均質性の高いデータが得らが求められている。また、受託分析会社や共同利れている。この利点は、高解像度イメージング用施設でのイメージングデータの取得も増えてきデータの取得時に特に影響が大きいと考えられる。

たため、複数の装置を利用した解析も想定される。

多少結晶形成にばらつきがあっても、レーザー径そういったユーザー層の用途の広がりにより、でが大きい場合にはその影響はわかりにくかったが、きるだけ同じプラットフォームでの解析の要求もマトリックス塗布状態の再現性が高く、微細な結高く、ソフトウェアに対する要求が高まっている。

晶が形成される２段階蒸着法では、シグナル強度のMSイメージングの画像解析に絞ったとしても、ばらつきを小さくする効果が大きいと予想される。

複数の多変量解析機能に加え、興味領域（RegionOf Interest : ROI ）間の比較などを、時間や手a間をかけることなく、多様な観点から解析したいといった要望がある。これらの要望に対して、他社質量分析装置でも利用可能な汎用のイメージン
グ解析ソフトウェア IMAGEREVEAL MSを提供している。このソフトウェアでは、基本統計量bcや p値（t-test, u-test，ANOVA）に加え、多変量解析やクラスタ解析を行うことで、ROI間の差やROI内部の分布の特徴をより効率的に解析できる機能（差異解析、画像解析）が使用できる。参照
画像とMSイメージの位置合わせや、画像の並行図３ マトリックス塗布条件の違いによるHemeB イメージング結果
a : マトリックス塗布前光学画 b : 2 段階蒸着法 c: スプレー

移動、回転、拡大縮小などは、連続切片での染色
画像との重ね合わせ、マトリックス塗布や真空雰囲気によるサンプルの収縮に対応した非線形（位もともと MALDI分析ではウェルごとに測定置毎に異なる変異の変形が行われる）の画像レジした場合のシグナル強度のばらつきは、50-200％ストレーションも、イメージング画像の表示には（もしくはそれ以上）あり、定量性を論じること有用な機能である。

が難しいと考えられていた。しかしながら、適切な前処理を行ったうえで、高い空間分解能とある３.MSIの課題と今後の発展に向けた要望

程度の画素数のイメージングデータを用いれば、MSIの課題は高感度化とイオン化可能な物質のLC -MSのデータと比較しても± 20%程度の誤差拡大であった。しかし、マトリックスの塗布方法に収まると予想されるため、前処理がより重要にについて、蒸着後にマトリックス溶液を塗布するなる。

ことで従来法に比べ 10-40倍検出感度が上がったとの報告 7)もあり、その課題も改善されつつある。
また、イオン化が困難な化合物を組織切片上で誘導体化することで検出する報告もある 8)。

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感度面の不満は、高い質量分解能でシグナル /物質の分布状況を可視化する MSI法は、研究ノイズ（S/N）を向上させることで目的化合物の者自身だけでなく、その物質を使用する人にとっシグナルを分離することにより改善される。
また、て、よりアピールするものとなる。CTスキャン

高分子の検出が困難である点は、真空下でのイオ画像のような３D化による立体的な MSI表示や、ン化により改善される部分も多い。ただし、一般皮膚や毛髪への浸透といった特定部位での物質のに高質量分解能の測定が可能な装置は真空下でイ可視化は、今後もっとポピュラーなものになる。

オン化するものが多いため、サンプルは長く装置

今後、MSイメージング画像を広告などで目にす内に留まることとなり、真空下に長時間晒され、る機会も多くなる。今後、最も日常に溶け込んだ、マトリックスが測定中に減少する場合もある。高質量分析のアプリケーションの一つになるかもし

質量分解能装置は、導入や運用コストに加え、測れない。

定自体の難易度も高くなりがちで、用途によって一方、現在広く利用されている臨床分野での応はイメージングを専門とする受託施設を利用する用では、他のモダリティと連携することで情報の方が有利になるとも予想される。一方で、探索的多元化を進め、より深い知見が得られるようにな研究といった分野では、ユーザーの経験をあまりることが想定される。多次元の情報を統合する選ばない直感的に使用できる装置は、前処理からAI技術も組み合わせることで、将来的な創薬や測定、解析までを、より手軽に実施できるシステ診断技術の開発につながると信じている。そのたムとして整備されているべきであろう。顕微鏡をめには、高分解能化・高感度化に加え、使いやすベースとした iMScopeシリーズは、顕微鏡画像

いＭＳIシステムを提供し、さまざまな分野でこのから直感的な測定が可能な装置であり、前処理か技術がよりポピュラーなものとして使われること

ら解析ソフトウェアを含め、トータルで新規のを期待している。

ユーザー層へ提供できるシステムであるが、まだまだ認知度が低い。スライドグラス上に準備され５. 謝辞たわずか 10μm厚の生体切片から得られうる、他質量顕微鏡の開発は、独立行政法人科学技術振の情報と組み合わせて、さらに情報量を上げてい興機構（ JST）の先端計測分析技術 ･機器開発プロ

くことが、本システムのより広い普及のための要グラム「プロトタイプ実証･実用化タイプ」の支援件であると考える。生体から得られる情報の利用を受けて行われ、学校法人慶應義塾大学医学部については、遺伝子、たんぱく、代謝物、脂質な末松誠教授、国立大学法人浜松医科大学医学部

どの物質ベースにとどまっているところを、より瀬藤光利教授らとの共同研究を通じて、共同研究広げていくことが必要である。

者からはさまざまな貴重なアドバイスをいただきました。ソフトウェアについては、先端融合医療

４.MS イメージング分析法の今後の展開について

レドックスナビ研究拠点 国立大学法人九州大学

MSIによる薬物動態解析や代謝物研究は、従来した。その後の開発に関しても、多くの共同研究行われているラジオアイソトープ（RI ）ラベルの者の皆様のご助言ご協力をいただきました。関係

イメージングや LC - MS（/MS）
での分析法と比べ、者の皆様に対し、ここに深く謝意を表します。との共同研究によって得られた成果を製品化しま

前処理の簡便さ、微細な空間での分布情報、さらに体内の代謝物の変動など、得られる情報の豊富さから非常に有効な手段である5）と期待されている。もとより本手法の応用範囲は、創薬に限らずさまざまな分野に適用可能な技術として、注目を集めている 9,10,11）。

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7◉参考文献
1） Caprioli RM, Farmer TB, Gile J.Anal Chem 69 4751
～ 60 （1997）
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N, Nakamura S, Yuki D, Sugiura Y,Zaima N, GotoInoue N, Hayasaka T, Shimomura Y, Setou M. PLoS
ONE 6 e26721（2011）3） Kubo A,Ohmura M,Wakui M,Harada T,KajiharaS,Ogawa K,Suemizu H,Nakamura M, Setou M &Makoto Suematsu M Anal Bioanal Chem 400 1895～ 1904（2011）4） 緒方是嗣 , 竹下建悟 , 寺島健太 , 山本卓志 , 脇華菜 , 笠松郷志 , 原田高宏 . 島津評論 , 77,69 ～ 78（2020）
5） Schulz S, Becker M, Groseclose MR, Schadt S, andHopf C. Current Opinion in Biotechnology. 55, 51 〜59.（2019）6） Kim YH, Fujimura Y, Sasaki M, Yang X, Yukihira D,
Miura D, Unno Y, Ogata K, Nakajima H, Yamashita
S, Nakahara K, Murata M, Lin IC, Wariishi H,Yamada K, Tachibana H, Agric. Food Chem., 62,9279 ～ 9285（2014）7） Shimma S, Takashima Y, Hashimoto J, Tamura K,and Hamada A. J. Mass. Spectrom.48,1285 ～ 1290
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8） Thomas A, Charbonneau JL, Fournaise E, andChaurand.: Anal. Chem.., 84、2048 〜 2054.（2012）9） Liu W, Nie H, Liang D, Bai Y and Liu H. Talanta.
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Appl. and Envirol. Microbiol. 84 e02791-17（2018）11）Matsumoto T, Kushida H, Matsushita S, Oyama Y,Suda T, Watanabe J, Kase Y & Setou M. Sci. Rep. 7,44098;（2017）8JAIMA Season 2022 Autumn