生物物理 44（6）, 000-000（2004）

原子間力顕微鏡−ナノバイオロジーへの架け橋−

特集
京都大学大学院生命科学研究科

小堀俊郎, 横川雅俊, 竹安邦夫

Atomic Force Microscopy（AFM）plays important roles in nanobiology. We here review therecent development and application of AFM technology from the technical point of view. In
the visualization mode, AFM produces not only static images at lower time-resolution in theseconds to minutes, but also motion images at higher time-resolution in the milliseconds.
Furthermore, AFM combined with fluorescent techniques can now address varieties of biological questions from genes to proteins and from proteins to cells. In the force mode, the tip
directly interacts with the molecules of interests to measure the inter- and/or intra-molecular physical properties.
atomic force microscopy / nanoimaging / single molecular dynamics / mechanical sensor / nanofabrication

Split photodiodeLaser diode1．はじめにOpical lever method
laser

個々の生体物質のダイナミクスをナノスケールで見ることができれば, 生命現象の理解はどれほど進むだ
ろうか. そうした壮大な夢を現実のものとする可能性

Cantileverを秘めたツールの1 つが原子間力顕微鏡（atomic forcePCmicroscopy ；AFM）1）である. 当初, 表面画像化技術とSubstrateして開発されたAFM も, 近年ではその活躍の場を広げ,
Sample stage力学・化学センサとして, そしてナノハンドリングマ
シンとして, 幅広い利用が可能となってきている

Feedback controller2）-4）

.

Fig.1

そこで本稿では, AFM の動作原理を概説し, AFM のナノバイオロジーへの応用について述べる.

2．AFM の動作原理
AFM は, おもに以下の4 つの構成要素からなる. ①探針を先端にもつカンチレバー, ②3 次元的に試料ステー

Principle of AFM. When AFM scans a sample on thestage, location of the tip is controlled by the feedback
loop such that the force between the tip and the sample
stays constant. Cantilever deflection corresponds tothe surface shape of the sample. The sample heightis measured by the optical lever method, which detects
angular displacement of the laser beam from the backof the cantilever.

ジの位置を制御する駆動機構（ピエゾ素子）, ③カンチレバーのたわみ・振動の検出機構, ④検出信号に対しワールス引力が働き, さらに原子結合距離程度まで近試料ステージの位置を制御するフィードバック回路

接すると斥力が強く働く. この探針−試料間の相互作（Fig.1）.

用により, 柔らかい板バネであるカンチレバーのたわ

AFM は微小な探針を試料表面に近接させた際に生じみ, あるいは振動状態に変化が生じる. この変化をカンる力学的相互作用の分布を画像化する顕微鏡である.

チレバー背面に照射したレーザーの反射光を通して,探針と試料との間にはレナード-ジョーンズ型のポテン位置センサーである 2 分割フォトダイオードに当ててシャルで近似される力学的相互作用が存在する. 探針検出する（光てこ方式, Fig.1）.

を試料遠方より近づけていった際, 最初にファン デル
Atomic Force Microscopy, Passport to Nanobiology
Toshiro KOBORI, Masatoshi YOKOKAWA and Kunio TAKEYASU
Graduate School of Biostudies, Kyoto University1原子間力顕微鏡−ナノバイオロジーへの架け橋−するタンパク質複合体である, RFC 複合体や PCNA 複3．AFM による画像化

合体のサブユニット構造を解析することに成功した 6）.

3.1 画像化モード

このようにCNT 探針による画像化は, 分子量が巨大で画像化モードにはコンタクトモード, タッピングモー

結晶化の困難なタンパク質複合体の構造を観察する手ド, およびノンコンタクトモードがあるが, 生命科学で段として有用である.

はタッピングモードが主流である（Fig.2）. タッピング

3.3 時間分解能への挑戦−液中高速AFM の開発−

モードでは, カンチレバーを共振周波数付近において生体試料の溶液中AFM 観察は, その試料のもつ本来振動させるが, その振幅は探針と試料の接触により減の構造や相互作用を可視化できる点で重要な技術であ衰する. この振幅が一定となるようにステージの高さる. しかしながら, 既存の AFM では走査速度が遅いたに対してフィードバックをかけながら試料表面を水平め, 生きた生体試料の静止像は観察できても, 分子レベ走査すれば, ステージの上下変位を各水平位置におけルのダイナミックな反応や構造変化は直接観察できなる高さとすることによって, 走査範囲全体の表面形状かった. タッピングモードでは各ピクセル当たり少なが画像化される. この方法では, 試料と探針との横方向

くとも 1 回以上カンチレバーが振動しなくてはならなの接触を少なくできるため, 探針や試料の損傷を抑えいが, 一般的な液中測定用カンチレバーの溶液中でのられるという利点がある.

共振周波数は10 kHz 程度と低く, 高速化の大きな制約

3.2 水平分解能の向上−カーボンナノチューブのの1 つであった.

利用−

この制約はカンチレバーを通常より小さくする（長AFM の表面観察における水平方向の分解能は, 探針さ9 µm, 幅2 µm, 厚さ140 nm）ことで解決され, 板バネの先端径に大きく依存する. したがって, その分解能のとしての柔らかさを損なうことなく, 溶液中で600 kHz向上には, 先端曲率半径や頂角のより小さな探針の利という非常に高い共振周波数を獲得することに成功し用が必要となる. 通常の画像化ではシリコン製の探針た 7）. さらに, スキャナーなどの装置面の改良や新しいを用いるが, 水平分解能を上げるために先端曲率半径光てこ法の導入などにより, 溶液中の試料をリアルタが約2 nm で機械的強度にも優れるカーボンナノチューイムで観察することに成功した（Fig.3）7）. これによりブ（CNT）を先端に付着させた探針を用いて画像化す

タンパク質の構造変化や存在位置の変化といった, 分る技術が確立された 5）. 筆者らの研究室では CNT 探針を用いることにより, DNA ポリメラーゼの機能を補助
（a）

（b）
1

250 nm

1.5 µm
Fig.2340 ms

80 ms

160 ms

240 ms

320 ms

400 ms

480 ms

560 ms640 ms

500 nm（d）（c）

2

10 µm

Fig.3

Examples of the tapping mode imaging.（a）Circular
plasmid DNA（pBluescript KS（−）, 3.0 kb, 2 × 2µm2）.（b）In vitro reconstituted chromatin（1.5 × 1.5µm2）.（c）Human metaphase chromosome（6.2 ×6.2 µm2）.（d）Yeast cells（40 × 40 µm2）.

2Real time observation of myosin V molecule insolution by fast AFM7）. Dynamics of myosin V is directly
observed by the fast AFM in solution. Arrows 1, 2, and3 indicate the head/neck region, the long tail, and theglobular tail end, respectively. Scan area is 240 × 240nm 2 , and the frame rate is 12.5 frame / sec （80msec/frame）.

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物理

Vol.44 No.6（2004）

子間反応に伴うダイナミクスを 1 分子レベルで直接観ズにのみ依存するため, 場合によっては通常の蛍光顕察することが可能となった.

微鏡よりも高い分解能を発揮する. 実際, 光学顕微鏡で3.4 蛍光と表面構造のハイブリッドイメージング

は 1 点として観察される染色体上のテロメアシグナル

蛍光観察技術とAFM とを組み合わせたハイブリッドが, 100-200 nm を隔てた 2 点に分離されて観察されたイメージング法も開発されている. 従来の倒立型蛍光顕（Fig.4c）10）. このようにSNOM/AFM により蛍光シグナ

微鏡のステージ上にAFM のスキャナを搭載し, ガラスルを高い光学分解能で解析することが可能になったが,基板上に展開した試料を上方（AFM）と下方（蛍光顕こうした画像を定常的に取得するには技術的に克服す微鏡）の 2 方向から同時に観察する（Fig.4a）. 蛍光顕べき問題が残されている.

微鏡に全反射蛍光観察システムを組み込んでおけば,4．力学測定

1 分子単位で基板上の蛍光分子を捉えることができる 8）.
SNOM/AFM（scanning near-field optical microscope/

AFM は画像化だけでなく, 探針−試料間の相互作用atomic force microscope）を利用する方法もある 9）.

を解析するツールとしても用いられる. 力学測定では,

SNOM/AFM は探針先端に発生させた近接場光で試料探針を垂直方向に移動させ, 探針を試料に押し付けたを励起して蛍光像を取得する一方, AFM と同様に表面（引き離した）際のカンチレバーのたわみを検出する形状も取得できるプローブ顕微鏡である. 近接場光の（Fig.5）11）. このたわみの大きさとカンチレバーのバネ発生方法から開口型と散乱型の2 種類に大別されるが,定数から, 試料（カンチレバー）にかかる力の大きさが生命科学には開口型が適している. この装置では, AFM計算できる. 一般的なAFM では, およそ0.01-100 nN 程のカンチレバーと探針の代わりに先鋭化した光ファイ度, この機能に特化したAFM であれば0.1 pN オーダー

バーをプローブとして用いる（Fig.4b）. 光ファイバーの力の測定が可能である.

プローブの先端部には光源波長よりも小さな開口（直生体物質の力学測定には大きく分けて2 種類ある. 1 つ径50-100 nm）が設けてあり, そこからにじみ出る近接は単一分子の力学測定である. 対象分子を基板表面に場光を利用して試料の局所領域を光励起する.

吸着させた後, 探針を基板表面に接触させることによって探針側にも結合させ, カンチレバーを引き離すこ

SNOM/AFM の光学分解能は開口径および試料のサイとにより（試料の）延伸特性を評価する方法である. こ（a）Apertureless SNOM
Metal probeの方法は筋肉タンパク質の力学測定によって一般的に（b）Aperture SNOMLight source

Optical fiber probe
Aperture

Evanescent field

Near field

Light source

Topographic image Fluorescent image
Fig.4

Distance（c）AFM/SNOM image

Merge image

Combination of AFM and other fluorescent techniques.
（a）AFM combined with fluorescent microscope.（b）Aperture SNOM/AFM. The evanescent light excites
fluorescent molecules in the limited area just below theaperture.（c）SNOM/AFM image of the telomericregion of a barley chromosome. Topography andfluorescent signals of the telomeric repeat can beobtained simultaneously. These images are provided
by the courtesy of Dr. Ohtani, National Food ResearchInstitute.

ForceFig.5

3Single molecule force measurements. Mechanicalproperties of single molecule can be measured by theforce mode AFM. The force can be calculated from thespring constant and deflection of the cantilever.

原子間力顕微鏡−ナノバイオロジーへの架け橋−
ディップペンナノリソグラフィーも可能になってきた.

なったと言えるだろう. 筋肉はアクチン, ミオシンあるいはタイチンなどの筋肉タンパク質が力を発生するこさらにマニピュレーターとしての機能を大幅に向上とによって伸び縮みするが, 実際にピコニュートンレさせる探針（ナノピンセット）が開発され 20）, 実用段階

ベルの力が発生していることが力学測定により明らかに入っている 21）. ナノピンセットはシリコン探針の先にされた. このほか, DNA 鎖の力学特性やタンパク

端に 2 本のカーボンナノチューブを平行に取り付けた質の折り畳み機構の解析に力学測定を適用する例が多もので, 電圧の印加および解除により2 本のナノチュー12）

く見られるが, クロマチンを延伸することによってフブ先端の間隔を制御できる. このときの 握力 は用途ォールディング過程を解明する試みも行われている 13）.に応じて変更できるため, AFM を用いた精緻なマニピ

今後はさらに高次な構造体である染色体や細胞核でのュレーションが今後一般的になっていくと期待される.

研究へと進んで行くだろう.

6．おわりにもう1 つは, 2 分子間に働く相互作用力の解析である.
たとえば, リガンド−受容体間の相互作用を解析する

生体機能は, 種々の生体物質の分子構造, 物性, 化学的場合, 探針に結合させたリガンドを基板上に吸着させ性質, 細胞内での空間配置と動き, ほかの生体物質とのた受容体と相互作用させた後, カンチレバーを引き上相互作用, などに強く依存しており, 時々刻々と状態をげることによって作用する力を測定できる. このとき変化させている. AFM は, そのような細胞内での複雑な探針によって引き起こされる, 押しつぶしや引き延ば状況の一端を, 単一分子レベル, 単一細胞レベルで画像しといった受容体の変形を避けるために非圧縮法が提化するとともに, 個々の生体物質がもつ力学物性の定, 今後の分子間力学測定法の標準にな量化, さらには人為的なナノマニピュレーションも可案されており14）るだろう. 最近では, 表面形状と相互作用力との同時測能とし, 分子生物学や生化学による分子集団の解析で定が可能な装置も市販されている. 分子間力学測定のは得られない情報をもたらした点で, 非常に優位性の概要は別に記した 15）ので, そちらを参照されたい.

高い研究ツールとなった. もっとも, その特異性ゆえに当然ながら分子内あるいは分子間の相互作用だけで結果の解釈には慎重を期すべきであることも忘れてはなく, 細胞レベルでの力学特性を測定することもできならないが, 他方で既存の方法論との整合性を取るこる. フォースカーブを生細胞全体にわたってピクセルとにより新たな真実が浮かび上がってくることも間違ごとに測定したところ, 弾性率分布は一様ではなくアいないだろう. 今後は, 同一試料からさまざまな情報をクチンフィラメントの分布と対応することが明らかに得るために, 各カンチレバーに異なる機能を付与したマ. さらにフォースモジュレーション法の適用

ルチカンチレバーアレイをもつAFM システムの実用化により, 時間分解能の向上だけでなく, 試料の粘性係数も期待される. このシステムにより, ゲノムの直接的ななった16）の定量化が可能になり, 細胞にかかる張力や硬さが細改変, 膜タンパク質の回収, 細胞小器官の移植なども当胞運動に影響することが示されている 17）.

たり前のように行われる時が来るかもしれない. このように, 現在は, 生体物質のダイナミクスをナノメートル,5．マニピュレーターとしてのAFMミリ秒, ピコニュートンレベルで追求するナノバイオロ

AFM をマニピュレーターとして用いる試みもある.

ジー 22）によって, 生命の本質を理解する新たな扉が開生細胞に探針を突き刺しmRNA を探針先端に付着させけ放たれた時代だと言っても過言ではなさそうだ.て遺伝子発現の分布を可視化すると, 細胞集団は均一

文 献

ではなく発現状態がほかとは異なる細胞が存在する

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生物

物

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