CUT&Tag-IT R-loop Assay Kit
Catalog No. 53167

日本語簡易プロトコル(Version A3, 2024 年 2 月 2 日版)
最新の英語版プロトコルも必ずご確認ください。
※キットの構成品は、それぞれ保管温度が異なります。商品到着後、適切な温度で保管してください。

キットの構成品と保管温度
本キットには、SPRI ビーズのように凍結させずに 4℃保管する試薬、または、酵素のように-20℃で保管する試薬がそれぞれ下の表のように構成されています。そのため、各構成品は表に示した温度で保管してください。
適切に保管された場合、受領後 6 ヶ月間安定であることを保証します。

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*DNA Purification Wash Buffer は、使用前に 100%エタノール 40 mL を添加し、終濃度 80%エタノールとなるよう調製してください。
**DNA Purification Binding Buffer は、使用前に 100%イソプロパノール 9 mL を添加し、終濃度60%イソプロパノールとなるよう調製してください。

必要なその他の試薬・機器
80% エタノール
100% エタノール
100% イソプロパノール
1X PBS
小型遠心機
ボルテックスミキサー
0.2 mL ストリップチューブ
マグネットバーまたは 0.2 mL チューブ用マグネットラック/スタンド
1.5 mL または 2 mL 微量遠心チューブ（低吸着推奨）
冷却用の氷、アイスペール
Nutator またはオービタルシェーカー
4℃で使用可能な Nutator またはオービタルシェーカー
37℃ ウォーターバス、またはインキュベーター
サーマルサイクラー
イルミナ製シーケンシングシステム

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CUT&Tag-IT R-loop Assay Kit プロトコル
Day 1 細胞への Concanavalin A Beads の結合（約 2 時間）
バッファーの調製
Complete Antibody Buffer は、必要量に応じて Protease Inhibitor Cocktail などを加え、用事調製したものを使用するようにしてください。

細胞の準備（約 10 分）
NOTE: ビーズ、細胞、核、緩衝液等は氷上に置きますが、特に記載のない限り、サンプルの取り扱いは室温で行います。
1.

セルカウントのために、フレッシュな細胞、または凍結していた細胞を 1X PBS でピペッティングにより分散させ、R-loop Assay Kit 反応 1 回につき 200,000～500,000 細胞を分取します。また、凍結していた細胞は、37℃のウォーターバス、またはヒートブロックで素早く解凍してください。

2.

Protease Inhibitor Cocktail を含む Dig-Wash Buffer を調製します。 (１サンプルあたり、2.1 mLの Dig-Wash Buffer に、21 μL の Protease Inhibitor Cocktail を加えます)3.

4℃、600 xg、３分間遠心し、上清を除きます。

4.

Dig-Wash Buffer (with Protease Inhibitor Cocktail) 1 mL を加えて攪拌します。

5.

室温、600 xg、３分間遠心し、上清を除きます。

6.

ステップ 4～5 の工程をもう一度繰り返し、合計 2 回洗浄します。

7.

Dig-Wash Buffer (with Protease Inhibitor Cocktail) 100 μL を加えて攪拌します。

Concanavalin A Beads の調製（約 20～30 分）
8.

Concanavalin A Beads をボルテックスでしっかり撹拌し、ピペッティングでよく混ぜながら、サンプルあたり20 μL を 0.2 mL PCR ストリップチューブに分注します。

9.

1x Binding Buffer 100 μL を加えます。

10. マグネットラック上で Concanavalin A Beads をキャプチャーし、上清を除いたのち、1x Binding Buffer4100 μL を加えて、ピペッティングにより軽く混ぜます。
11. 小型遠心機でスピンダウンさせたのち、マグネットラック上に置き (30 秒～2 分)、上清を除きます。
12. 1x Binding Buffer 10 μL を加えます。
13. ステップ 7 で準備した細胞を加えて混ぜ合わせ、室温、20 – 30 rpm、10 分間、Nutator もしくはオービタルシェーカーで撹拌します。
DNA-RNA Hybrid (Clone S9.6) 抗体との反応（一晩）
14. Nutator もしくはオービタルシェーカーから取り出し、小型遠心機でスピンダウンさせたのち、マグネットラック上に置き (30 秒～2 分)、上清を除きます。
15. 氷冷していた Complete Antibody Buffer 50 μL を加え優しく攪拌し、サンプルを氷上に置きます。
16. サンプルには、DNase/RNase-free water 5 μL を加え、ネガティブコントロールサンプルには、RNaseA
5 μL を加えて、室温、20 – 30 rpm、30 分間、Nutator もしくはオービタルシェーカーで撹拌します。
17. それぞれのサンプルに、DNA-RNA Hybrid (Clone S9.6) 抗体 2 μL を加えて優しくピペッティングで混ぜ合わせます。
18. 4℃、20 – 30 rpm、オーバーナイト、Nutator もしくはオービタルシェーカーで撹拌します。

5Day 2（約 6 時間）
2 次抗体反応
下記の表のように Buffer を調製します。
※各種 Buffer の調製においては、必要量に応じて Protease Inhibitor Cocktail などを加え、用事調製したものを使用するようにしてください。

20. Nutator もしくはオービタルシェーカーからサンプルを取り出し、スピンダウンしてチューブの底に溶液を集めます。マグネットラックなどに置き (30 秒～2 分)、上清を除きます。
21. Complete Dig-Wash Buffer 200 μL を加え、ビーズを攪拌し、マグネットラック上へ戻して (30 秒～2 分)、上清を除きます。
22. ステップ 21 を 2 回繰り返し、合計３回ビーズ/細胞を洗浄します。
23. Rabbit Anti-Mouse Antibody を Complete Dig-Wash Buffer で 100 倍希釈し、それぞれのサンプルへ 100 μL を加えてピペッティングで優しく懸濁します。
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24. 室温、20 – 30 rpm、1 時間、Nutator もしくはオービタルシェーカーで撹拌します。
25. ペレットをピペッティングにより優しく攪拌し、Nutator もしくはオービタルシェーカーへ戻し、さらに室温で 1 時間攪拌します。
26. Nutator もしくはオービタルシェーカーからサンプルを回収し、スピンダウンします。
27. マグネットラックへ置き (30 秒～2 分)、上清を除きます。
28. Complete Dig-Wash Buffer 200 μL を加え、ビーズを優しく攪拌します。
29. ステップ 27～28 をさらに 2 回繰り返し、合計 3 回洗浄します。
CUT&Tag-IT Assembled pA-Tn5 Transposomes との反応（約 1 時間）
30. CUT&Tag Assembled pA-Tn5 Transposomes を Complete Dig-300 Buffer で 1:100 に希釈します。１サンプル当たり 100 μL の Complete Dig-300 Buffer に、1 μL の CUT&Tag
Assembled pA-Tn5 Transposomes を加え、ピペッティングしてよく混ぜます。
31. ステップ 29 で洗浄したサンプルをスピンダウンし、マグネットラックへ置き (30 秒～2 分)、上清を除きます。
32. ステップ 30 で調製した pA-Tn5 Transposomes 溶液を 100 μL ずつ加え、緩やかにピペッティングして混ぜます。
33. 室温、20 – 30 rpm、1 時間、Nutator もしくはオービタルシェーカーで撹拌します。
34. Nutator もしくはオービタルシェーカーからサンプルを回収し、スピンダウンします。
35. マグネットラックへ置き (30 秒～2 分)、上清を除きます。
36. Complete Dig-300 Buffer 200 μL を加え、ビーズを優しく攪拌します。
37. ステップ 35～36 をさらに 2 回繰り返し、合計 3 回洗浄します。
タグメンテーション（約 1 時間）
38. 小型遠心機でスピンダウンし、マグネットラックへ置き(30 秒～2 分)、上清を除きます。
39. Complete Tagmentation Buffer 40 μL を加え、ビーズを優しく攪拌します。
40. 37℃で 1 時間インキュベートします。
DNA 抽出（約 1 時間）
41. タグメンテーション反応を停止させて、DNA 断片を溶出させるため、各サンプルに以下を添加します。
・2.3 μL

0.5M EDTA

・2.8 μL

10% SDS・0.5 μL

10μg/μL Proteinase K

42. 最大速で 2 秒間ボルテックスをかけて攪拌し、小型遠心機でスピンダウンします。
NOTE: このインキュベートの間にビーズが大きな凝集塊となることがあります。
43. 55℃、1 時間インキュベーターで反応させます。 (サーマルサイクラーを使用する場合は、Lid の温度を65℃に設定してください)744. それぞれのウェルに 100 μL の水を加え、細胞やビーズなどの凝集塊が分散するまで、ピペッティングを繰り返します。この時、SDS が入っているため、泡立てないようにサンプル 1 つずつをピペッティングで攪拌することを推奨します。
45. 小型遠心機でスピンダウンし、マグネットラックへ置き (30 秒～2 分)、上清を新しい 1.5 mL または 2m チューブへ移します。
NOTE: 一部のビーズが DNA 溶液中に混入していても、DNA の精製に影響ありません。
46. DNA Purification Binding Buffer (with 60% isopropanol) 750 μL をそれぞれに加え、ピペッティングで攪拌します。溶液の色を確認し、黄色になっていることを確認しますが、紫色やオレンジ色の場合には、3M Sodium Acetate を 8 μL 加えます。

47. サンプルと同数の DNA purification column をコレクションチューブにセットします。
48. これ以降の工程は室温で操作します。各サンプルをカラムに移し、キャップをしたのち、17,000 xg(~14,000 rpm)で 1 分間遠心します。
49. フロースルー溶液を捨てて、カラムをコレクションチューブへ戻します。
NOTE: 初めて使用する際は、DNA Purification Wash Buffer に 40 mL の 100%エタノールを加えてください。（エタノールの終濃度:80%）
50. DNA Purification Wash Buffer 200 μL をカラムに加えてフタを閉じ、17,000 xg (~14,000rpm)で 1 分間遠心します。
51. フロースルー溶液を捨てて、ステップ 50 をもう一度繰り返します。
52. フロースルー溶液を捨ててコレクションチューブへカラムを戻し、残留している DNA Purification Wash
Buffer を捨てるため、さらに 17,000 xg (~14,000 rpm)で 2 分間遠心します。
53. 新しいチューブにカラムを移し、DNA Purification Elution Buffer 22 μL をカラムマトリックスの中心に滴下したのち、フタを閉めて室温で 1 分インキュベートします。
54. 17,000 xg (~14,000 rpm)で 1 分間遠心し、カラムを捨てます。精製した DNA は、以降の PCR による増幅ステップに進むまで-20℃で保存可能です。

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PCR による増幅（約 1 時間）
55. 以下の表で示した試薬類を加えて PCR 反応液を調製します。もし、マルチプレックスでシーケンシングする
場合、それぞれの反応で異なる i5-i7 インデックスの組み合わせになっているか確認します。

56. リッド温度制御付きサーマルサイクラーにより、以下のプログラムを適用して PCR を行います。
(Lid: 105℃設定)
72℃ for 5 minutes
98℃ for 30 seconds
12 cycles of:98℃ for 10 seconds
63℃ for 20 seconds
72℃ for 1 minuteHold at 10℃
57. SPRI ビーズを用いた精製を行います。SPRI Bead Solution 25 μL (PCR 反応液の 0.5 倍量) を加え、ピペッティングで混ぜたのち、室温で 5 分間インキュベートします。
58. マグネットラックにサンプルをセットし (30 秒～2 分)、上清を新しいチューブへ移し、ビーズは破棄します。
59. SPRI Bead Solution 35 μL (PCR 反応液の 0.7 倍量、合計で 1.2 倍量添加している) を加え、室温で 5 分間インキュベートします。
60. マグネットラックにサンプルを置き (30 秒～2 分)、上清を除去し、80% EtOH 200 μL を加えて、2 回洗浄します。
61. 残ったエタノールを揮発させるためにビーズを室温に短時間静置します。ビーズの光沢がくすみのある状態にかわったらマグネットラックから取り出し、DNA Purification Elution Buffer 20 μL を加えて、ピペッティングにて混合し、室温で 1 分間インキュベートします。
62. マグネットラックにチューブを置き (30 秒～2 分)、上清を回収します。このサンプルを用いて、ライブラリの定量、シーケンシングにも使用可能です。

9Index Primers and Sample Sheet Information
Index 1 (i7) Primers
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGG
Index 2 (i5) Primers
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTC

Sequence for Read1 and Read2 adapter trimming: CTGTCTCTTATACACATCT

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References
1. Lin R., et al. (2021) Nucleic Acids Research vol. 50, D303-D315
2. Wnag et al. (2021) Sci.Adv., 7:eabe3516

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トラブルシューティングガイド
問題/疑問

対処方法
ペレットは見えない場合もあります。

核ペレットが見えない

ペレットがチューブのどの位置にあるべきかが分かるように、遠心操作では必ずチューブのキャップの向きを揃えてセットし、注意深く進めてください。

推奨されるシーケンス深度
RNase A 処理したネガティブコントロールでライブラリを作製できますか?

2500 万リードを推奨します。
はい、RNase A 処理したネガティブコントロールを使用してライブラリが作製可能です。RNase A はライブラリの濃度を著しく低下させます。
必ず生細胞を用いてください。

バックグラウンドが高いCountess II のような自動細胞計数法、またはトリパンブルー染色と血球計数装置により、細胞／核が無傷であることを確認してください。
いいえ。タグメンテーションに基づくアッセイにおいて、IgG コントロールは非IgG コントロールを使用すべ常にばらつきが大きく、一貫性がないことを確認しています。そのため、抗きでしょうか?

体のコントロールとしては、DNA-RNA Hybrid (Clone S9.6) 抗体を添加しない方法をお勧めしています。

ミトコンドリア DNA はどの程細胞タイプや細胞の処理方法によって異なりますが、ミトコンドリアにマッピ度観測されますか?

ングされたリード範囲は 36～67%程度でした。

本キットで RNase H では

RNase H 処理では CUT&Tag シグナルが完全に消失せず、消化時間なく RNase A を使っているの延⾧を行っても顕著な効果は得られず、時間がかかることになったためのはなぜですか?

です。

本プロトコルおよび製品に関するご意見やお問合せは、下記までお願いいたします。

アクティブ・モティフ株式会社〒162-0824 東京都新宿区揚場町 2-21
Tel: 03-5225-3638 Fax: 03-5261-8733
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