太賜光紫外線誘発DNA損傷とヒト細胞における修復金沢大学薬学部階堂

修

We analyzed the induction and repair of various kinds of DNA damage in human cells
exposed to a solar UV-simulator, by means of an enzyme-linked immunosorbent assay or animmunoslot blot conjugated with enhanced chemiluminescence (ISB-ECL) system. When we
irradiated normal human cells with up to 1!)1/ m・ of UVC (germicidal lamps, predominantly
254nm), we could detect the induction of both cyclobutane thymine dimers (TT-dimers) and(6-4) photoproducts (64Ps) in their cellular DNA in dose-dependent manners. Normal humancells completely excised 64ps by 8hr after the exposure, whereas the cells excised only 50% of
initial amount of TT-dimers by 24hr. On the other hand, the xeroderma pigmentosum cells
beloging to complementation group A (XPA) could not excise both TT-dimers and 64ps.
We succeeded to detect the induction of the Dewar isomers of (6-4) photoproducts in humancells exposed to a solar UV-simulator (Oriel) by using a monoclonal antibody DEM -1 specificfor Dewer photoproducts (Dewer-P) in DNA. Normal human cells excised Dewer-P from their
DNA faster than TT-dimers, but slower than (6-4) photoproducts. However XPA cells defectivein DNA repair could not excise any kinds of DNA damage at all.

1序 論

長の紫外線のDNAへの効果とともに、混在する他の波長の紫外線による複合効果をも併せ考慮する必太陽光紫外線は295nm�400皿の波長の長波長紫要があることになる。 これまでヒト細胞への紫外外線を含むが、そこに含まれるUVB (295�320nm)線の効果を調べるのに、専ら254nmの単一波長に近とUVA(320�400nm)は、様々な人体影響、例えばい紫外線を特異的に放射する殺菌燈が用いられて免疫能の低下や皮贋がんの発生をもたらすことかきたが、得られた効果は太陽光紫外線の効果を近知られている。 太陽光紫外線は前述の様に極めて似するものですら無いことが明らかである。 従っ

広範囲なスペクトルを有する長波長紫外線であるて、太陽光紫外線の生物・人体影響を解析する場ため、そこに含まれるUVBがDNAに様々な損像を誘合には、太陽光紫外線に特徴的な損像を指標とし起すること、およびUVAが誘起された損傷の一つて研究をおこなうべきと思われる。

である(6-4)photoprciductを光異性化する l. 2) と紫外線の照射によって種々の損儀か DNAに誘発いう特徴かある。 即ち、太陽光紫外線の生物学的されるが、前述の様に損傷の種類とその生成量は影継を調べる場合には、そこにふくまれる各種波波長依存的である。図 — lに代表的な損傷の構造式を示した。254nmの紫外線照射 (UVC)によって、DNA中の隣合ったthymineが cyclobutane thymine

DNA damege and its repair in human cells
exposed to solar light

dimer (TT-dimer)と (6-4)photoproduct (64P)に変換されるが、Dewar photoproduct (Dewar-P)

Osamu Nikaidoは生成されない。 一方、320nm付近の紫外線が照Division of Radiation Biology,
Faculty of Pharmaceutical Sciences

射されると、64PがDewar-Pに光異性化されるので、Kanazawa University

太陽光紫外線などの長波長紫外線によって生成さ-74-

太腸光紫外線誘発DNA損傷とヒト細胞における修復cH
゜
人ー／zzー〈中の紫外線をシミュレ ートする照射装置 (Oriel社

3゜81192型）、並びに太陽光紫外線そのものを紫外線源として実験に用いた。 シミュレ ート照射装置のーo�'�

゜

示した。

゜

。I

CH3

TT Dewar photoproduct—Solar simulator (Oriel)

紅証

図 ー l. 紫外線で誘発される thymine を含む各種の捐傷

Action spectra of a solar simulator (Oriel)

55aoue1pe,,
1a>11e1a1:1T(6-4)T photoproduct

照射する紫外・可視域のスペクトル分布を図 ー 2にThymine

5 店戸；ICyclobutane thymine dimer52。

⑬れるのは主として TT-dimerとDewar-P となる。

350450550650750

Wavelenghth (nm)

これま で我々は、紫外線によって誘発されるDNA損傷を特異的に分別検出するモノクロ ー ナル抗体

図 — 2. 太陽光紫外線シュミレ ー ト照射装醤から照射される紫外・可視域のスペクトル分布の樹立を行って、ヒト細胞の損傷修復動態や修復の機構について解析してきた。 本研究では、太陽光紫外線で特異的に誘発されるDewar-P のヒト細胞での生成と修復の動態を解析することを目的とした。

紫外線の線量率は、 uvc の場合東京工学のトプコンUV-radiometer で、 太陽光紫外線シミュ

2

レ ー ト照射装置に よる照射の際には、 Mecam社

実験(Scotland) の ultraviolet digital radiometer(360nm) で測定した。 紫外線照射直後、 あるい

2. 1細胞は 一 定時間37℃でインキュベ ート 後、細胞を取りヒト細胞として GUN-2M(ヒト皮膚由来正常2倍体出し DNA を抽出した。

細胞）、WI38VA13 (ヒト胎児肺由来SV40形質転換細胞）とHeLa S3 (ヒト子宮頚がん由来細胞）を用

2. 3

各種細胞の太陽光紫外線感受性の検討いた。 またA相補性群に属する色素性乾皮症患者

100�200 個の各種の細胞を直径10cmのシャ ー レ由来細胞 (XP lEH, XP20SSV) を用いた。 全ての細に播種した後、 6時間インキュペ ートした。 つい胞はダルベッコ変法 MEM培地に10% の濃度に仔牛で氷冷PBS(-) で細胞を洗浄し、氷冷浴下太陽光紫胎児血清を加えた培養液によって、37℃の co 臼

外線シミュレ ート照射装置で照射を行った。 照射ンキュベータ内で培養された。

後加温した培養液を再び加え、37℃で2週間インキュベ ートした。 シャ ー レ上に形成されたコロニ

2. 2

紫外線照射

ー数から生存率曲線を求めた。

各種の細胞10 叶固を直径 lOcrnのプラスチックシ
ャ ー レに培養して 2 日後、細胞をlOrnlの氷冷PBS(-)
で2 回洗浄し、細胞の乾燥を防ぐため厚さ lrnrnの石英ガラスをシャ ー

2.4

損傷の検出

紫外線を照射後、一定時間インキュベ ートされレ上面にかぶせ、氷冷下で種々た細胞から DNA を抽出し、DNA 中に残存する各種損の紫外線を照射した、 主として 254nrn の紫外線傷をモノクロ ー ナル抗体を用いて免疫化学的に定(UVC) を照射する殺菌燈（東芝 GL-15) 、 太陽光量検出した。

-75-

2.4. 1

正常ヒト由来GUM-2M、 ヒト由来の無限増殖するDNA抽出。細胞を PBS(-)で洗浄

Wl38V A 13細胞、 子宮頚がん由来HeLaS3細胞では、後、 E D T A と SD Sを含む細胞溶解液で処理し、共に太陽光紫外線に対する感受性に大きな違いは水野等の方法によった3〉トした。

無い結果が得られたが、色素性乾皮症A相補性群

つ いでphenol/ ch 1 oroforrn: i soarny !alcoholに属するXPl EH細胞は、 太陽光紫外線に対し高い

proteinase Kで一晩37℃でインキニペー( P/CIA)でDNAを抽出した。抽出されたDNA 標品を感愛性を示した。この結果は uvcを照射した際のトした後、再XP 1 EH細胞の高感受性と矛盾しない（未発表）。

RNa s e で 37℃、1時間インキュベーびP/CIA処理によりDNAを抽出し、ethanol沈殿後、PBS(-)に溶解した。

uvcを照射されたヒト細胞におけるDNA損傷

3. 2の修復

2. 4. 2

図 —4にuvcを照射された正常ヒト、XPA群細胞にモノクロ ー ナル抗体

本実験にはTT-dimerを認識するTDM-1 3> 。TDM-24)

4)

おけるTT-dimerと64Pの修復動態を調べた結果をとDe war-Pを示した。XPA (XP20SSV) 細胞は両損楊の除去修復を用いた（各種抗体の認識能力を示さない。正常ヒト細胞は64Pを6-12時間するエピト ー プについては図 ー1を参照のこと）。

以内に完全に除去するが、TT-dimerは24時間を経抗体、64Pを認識する64M-2抗体

認識するDEM-1抗体

2)

過しても約40-50%か除去されるに過ぎないこと
2. 4. 3

紫外線損傷検出法が明らかである。なおつけ加えるならば、10J/m 2のuvc照射ではDewar-Pは全く生成されない。

各種のモノクロ ー ナル抗体を用いた酵素標識免疫抗体法(Enzyme-L inked Immunosorbent Assaychemiluminescence(ISB-EC L)を適用した方法で損傷を検出した。

果。

結33. 1

20008060 8 20 01 1一ー一sans6u1pu1q,qy8du O U80Je1111: ELI SA) 5 〉 とimmunos lo t blotにen hanced

12182406121824

Repair lime (hr)

太隔光紫外線を照射されたヒト細胞の感受性の検討

図 —4. UVCIOJ/m'を照射された各種のヒト細胞における損侶の修復動態（左図はTDM-1抗体で検出された
TT-dimer, 右図は64Pを示す）

太陽光紫外線シミュレ ー ト照射装置を用いて細3. 3胞の感受性を検討した結果を図 —3に示した。

るDNA損傷の誘発

1000

太陽光紫外線シミュレ ー ト照射装置で各種のヒGUN-2M
Wl38VA13HelaS3XP-1EH1哀）一m>lこns゜0ー.01

太隔光紫外線を照射されたヒト細胞におけ卜細胞を照射し、その直後にDNAを抽出して各種の損俄を測定した結果を図 ー 5に示した。 左右両図の縦軸は異なっていることに注意されたい。なお、損儀の生成量をUVC(殺菌燈紫外線）等量で示した。
TDM-2抗体で測定されたTT-dimer に比較し、64M-2

O

102030

Solar Dose (kJ/m 2)40

図 — 3. シュミレ ー タ ー 照射装貸で照射された各種ヒト細胞の生存率曲線

抗体で検出された64Pは生成量が低いことが明らかである。 その理由はシミュレ ー ト照射装置によって生成された64Pが光異性化されてDewar-Pに変化したことによる。 事実、生成量は低いながら-76-人船光紫外線誘発DNA損侶とヒト細胞における條役

4〇△●-―

も右に掲けた図からも明らかなようにDewar-Pの考察生成が認められる。
これまでの細胞を用いた多くの研究か UVC( 殺35 2 9 6 3
1 1(E lr)••op::,,>n＂

点こ81菌燈）を紫外線線源として用いたものであり、太陽光紫外線、もしくはシミュレ ー ト照射装置によ心 60 80 100

る長波長紫外線照射の効果を調べた実験は数える程しか無いのが現実である。 我々がこれまで報告し、また本報告で明らかになったように、太陽光
紫外線は、広範囲にわたる各種の波長の紫外線を含み、その複合効果が現われることから、太陽光図—5. 太隔光紫外線シミュレート照射装醤で照射されたヒ卜細胞における種々の損傷の誘発（左図はTT-dimerと64Pを、 右図はDewar-Pの誘発動態を示す）

3.4

紫外線の生物・人体影響を uvcを用いた実験から推定することは出来ないという結論が導かれる。
本報告では、Dewar-Pの正常ヒト細胞における修復動態を解析した。 一方、 修復能の欠損を示す

太陽光紫外線シミュレ ー ト照射装置で照射

XPA群細胞は何れの損傷をも除去できない結果がされたヒト細胞におけるDNA損傷の修復得られた（未発表）。

照射後、横軸に示した時間インキュベートした

Dewar-Pは太陽光紫外線の照射によった生成さ細胞よりDNAを抽出し、 残存する損傷量を測定れる64Pか、同時に太陽光紫外線に含まれる320nmしたところ、 uvcで得られた結果と同様に64Pの除の波長によって効率よく光異性化されることに去はTT-dimer のそれより早いことが分かった

よって生じる。 今後は太陽光紫外線に照射された（図 ー6)。 一方、Dewar-Pの除去動態を見ると、正常ヒト細胞では24時間の間に約70%を除去する能

ヒト皮附組織で、TT-dimerやDewar-Pがどの様に生成・除去されるかを明らかにする予定である 6)

力があることが分かった。
以上の結果から、正常ヒト細胞におけるDewar­5

Pの除去は TT-dimerより早く、64Pより遅いという結果が得られた。

総0括

近年のオゾン層の減少に伴い、これまで我々が経験したことの無い短波長紫外線が地表上に到達

GUN-2M Cell

細胞遺伝子に誘発される様々な DNA損傷であることは疑いを容れない。 短 波 長 紫 外 線の増加はTT-dimerと64Pを生成し、64PはさらにDewar-Pに効率よく変換されることから、その修復動態を

一〇05ー6u1u1ewa 』a6mEep O文°

し、皮府がんの多発する可能性が示唆されている。
皮府がんの原因の 一つは、太陽光紫外線によって

゜゜解析することが重要である。 本研究の結果から
Dewar- Pの除去はTT-dimerと同様に遅滞すること(6-4)photoproduct126
Time after irradiation (hr)が明らかになったが、その変異原性についての詳細な研究が今後必要となると考える。 また、 コス24

メトロジ ー の観点から見ると、 UVBのみならず UVAをも効率的に防護する製剤を開発することが急務となるであろう。

図—6. 正常ヒト細胞における各種損イgの修復-77-6謝study with 64M-l antibody specific for(6-4) phot oproducts",Mutation Res. DNA

辞R�拉ir., 254 175-184 (1991)
4) Mori T.. M.Nakane, T. Hattori, T. Matsunaga.

我々は長年にわたって太陽光紫外線生物学研究の樹立を訴えてきたが、 今回コスメト

ロジ ー財団

M . Ihara and 0 . Nikaido, "simultaneousから研究助成を受けたことにより、 その碁礎を築

establishment of monoclonal antibodies

く研究を完成させることが出来た。 深く感謝すると共に貴財団の今後の発展を祈るものである。

specific for either cyclobutane pyrimidine
dimer or (6-4) photoproduct from the same

引用文献

m o u s e immunized with u ltra violet
irradiated-DNA", Photochem. Photo杭ol., 541) Taylor J. -S. and M.P. Cohrs, "DNA, light andDewar pyrimidone: the structure andbiological significance of Tp T 3", ]. Am.
Chem. Soc., 109 2834-2835 (1987)
2) Matsunaga T., Y. Hatakeyama. M. Ohta. T.Mori.

225-232 (1991)
5) Matsunaga, T., T. Mori and 0.Nikaido. "Basesequence specificity of a monoclonaa n t i b o d y binding t o ( 6-4) p h o t o­and 0.Nikaid o , " E stablishment andproducts", Mutation Res., 2 3 5 187-194 Cl 990)

characterization of a monoclonal antibody

6) Chadwick C.A., C. S.Potten, O .Nikaido,
T.Matsunaga, A. R. Young, "The detection ofrecognizing the Dewar isomers of (6-4)
p h o t oproducts", Photochem. Photobiol., 57

cy c l o b u t a n e thy mine dimer s , 6-4
photolesions and the Dewar photoisomer in

934-940 (1993)
3) Miz uno T., T . Matsunaga, M. Ihara and0.Nikaido, "Establis血ent of a monoclonalsections of UV-irradiated human skinu sing sp ecific antibodies.and th edem onstration of dep th p enetration

antibody recognizing cyclobutane-type
thymine di田 ers in DNA: a comparativeeffects", Photochem. Photobiol., in press.

-78-