皮膚ケラチノサイトの水・グリセリンチャネル AQP3（アクアポリン３）の脂溶性ビタミンによる発現調節明治薬科大学病態生理学教室

石 橋賢 一The skin is constantly exposed to external physical and chemical toxins to protect the interior and eventually to keep thehomeostasis. This barrier mechanism will be enhanced by moisturizing the skin, which is partially conducted by glycerol,an ancient ingredient of cosmetics. The uptake of glycerol into the keratinocyte is mainly conducted by AQP3, a member ofaquaglyceroporins also including AQP7, 9, and 10. Recent analyses of AQP3-null mice showed that the absence of AQP3 not
only decreases the water content of the skin but also inhibits the development of skin cancer through the glycerol transport.
Therefore, glycerol will be beneficial to moisten the skin and promote its regeneration while it will be harmful to stimulate
the growth of skin cancers. Since the glycerol transport is regulated by the amount of AQP3 expression in the keratinocyte,
the regulation of AQP3 expression should be examined to predict the clinical outcome of the application of cosmetics. Since
we examined the effects of glycerol and vitamin A on AQP3 expression in keratinocarcinoma previously, here we tested
the effects of vitamin E and D on the expression of AQP3 in a human normal epidermal keratinocyte cell line (PHK16-0b).
Both lipophilic vitamins and lower concentration of glycerol significantly stimulated AQP3 expression examined by RT-PCR
technique while higher concentration of glycerol inhibited its expression. It will be more efficient to develop a screening
system to examine the effect of cosmetic ingredients on AQP3 expression in the keratinocyte in culture to predict theirpotential benefits and harms to the skin.

１．緒になるので、AQP-11 が細胞分化、増殖にかかわっており、

言

4）

他のアクアポリンでも同様の役割がある可能性がある 。

われわれの体には 13 種類の水チャネルが発現してい興味深いことに、最近 Verkman のグループは、AQP3る。水チャネルは水を選択的に通す古典的なアクアポリン

ノックアウトマウスに皮膚癌が増殖しにくいことを発見し、（AQP0. 1. 2. 4. 5. 6. 8）と、水以外にもグリセロールや尿グリセリンの補充で増殖するようになることを報告してい素も通す aquaglyceroporin（AQP3, 7, 9, 10）と、さらにはる 。これは AQP3 の発現をへらすことが皮膚癌の治療に水を通す細胞内オルガネラに存在する AQP11, 12 の３つのなると同時に、AQP3 の増加は癌の増殖を促進するというサブグループにわけられている 。

諸刃の剣になる可能性を示している。さらに、グリセリン

1）

皮膚の角質層には水・グリセリンチャネルであるアクアポリン 3（AQP3）が多く発現している。AQP3 は角質層の3）の輸送が関与していることから、グリセリンが皮膚癌の増殖を促進する危険性も示唆している。

グリセリンと水の量を調整しており、皮膚の保湿にとってグリセリンは古来ひろく皮膚に直接投与する基剤としても重要な役割をはたしていることが AQP3 ノックアウト

使われているので、その安全性について検証することは重マウスの解析からあきらかになった 。

要である。とくに化粧品は連日長期に使用されるので問題2）

さらに 2005 年に Alan Verkman らによって、血管内皮となる。だだ、これまでグリセリンによる有害事象は長期において AQP1 がないと細胞運動が遅くなって血管新生が的には報告されておらず、今回のノックアウトマウスの知遅延することが示されて、アクアポリンの新たな役割が注見が、ヒトにも適用できるかどうかはにわかには判定しが目されるようになった。皮膚や角膜にある AQP3 も、組織たい。

3）

再生に重要な役割をしていることが示されている 。現在

われわれはこれまで AQP3 をはじめヒト、マウスのアのところ細胞運動にアクアポリンが促進的にかかわっていクアポリンを７つあらたにクローニングしてきた（AQP3,ると考えられているが、組織の修復が促進されることから7-12） 。さらに、皮膚の AQP3 についてもビタミン A に細胞増殖にもかかわっている可能性もある。アクアポリン

よって増加することをあきらかにしてきた 。またケラ-11（AQP-11）のノックアウトマウスでは多発性のう胞腎チノサイトの腫瘍細胞（keratinocarcinoma）での内因性

1）

5）

AQP3 が、ソルビトールによっても増加することもあきら
The regulation of aquaglyceroporin
AQP3 by lipophilic vitamins in skinkeratinocytes
Kenichi Ishibashi, M.D.
Meiji Pharmaceutical University,
School of Pharmacy, Department ofPathophysiogy5）

かにしてきた 。
一方、皮膚の細かい傷のすみやかな修復は、きめの細かい美的肌を保つために必須である。AQP3 によってそれが促進されている可能性があり、AQP3 の発現を調節する物質を発見することは、将来的に化粧品の開発のシードを提供する。これは、老化による皮膚のダメージからの修復に− 78 −

皮膚ケラチノサイトの水・グリセリンチャネル AQP3（アクアポリン３）の脂溶性ビタミンによる発現調節も関与している可能性もある。さらに、医療の現場においに増加した（1.5 〜 1.8 倍）。0.001%（0.14 mM）グリセローても、圧迫潰瘍（床ずれ、褥瘡）など難治性の傷の治療にルの添加では、コントロールと変わらない発現量であった。

もつながりうる重要な知見を提供すると考えられる。

一方、0.1%（14 mM）グリセロールの添加では、コント

ビタミン A が紫外線から皮膚を保護する機構の一部に、ロールの 0.8 倍に減少し、１%（137 mM）グリセロールのAQP3 の増加による皮膚再生の活性化もありうる。また添加では、コントロールの 1/10 にさらに減少した。10%

皮膚圧迫潰瘍の治療において、ユーパスタのような高尿（1.37 M）グリセロールの添加では、細胞がはがれてしま素軟膏が使われて効果をあげているが、この機構の一部っため検討できなかった。以上より、高濃度のグリセローにも AQP3 の誘導がありうる。このような研究によって、

ルは、ケラチノサイトには毒性がある可能性が示唆された。

AQP3 をバイオマーカーとして新薬を開発できる可能性が

ただ、少量のグリセロールで AQP3 の発現が刺激されるが、ある。もっとも、AQP3 を高度に誘導すると皮膚癌が発生中等量では抑制されるという結果は、中等度濃度のグリセしやすい環境では、皮膚癌の増殖を促進してしまう可能性

ロールには毒性よりもネガティブフィードバックによる制があるので注意が必要である。

御作用がある可能性がある。

そこで、癌細胞ではなく培養正常ヒト皮膚ケラチノサイ

以前、われわれは別の細胞で 50, 100, 200 mM のグリセトを用いて、軟膏薬としてよく用いられ、AQP3 の発現をロールでは、24 時間後の AQP3 蛋白の発現に影響しなか調節する可能性のある、脂溶性ビタミンである、ビタミンったという結果を得ている 。これは浸透圧によると考えＥとＤについて検討したので報告する。

られるソルビトール 200 mM で、AQP3 の発現が２倍に増２．実5）加するという結果とは違っており、グリセロールに浸透圧

験とは異なる特異的な細胞作用が存在することを示唆してい文献５に順じて、培養細胞を用いて実験をおこなった。
簡単に述べると、正常ヒト皮膚ケラチノサイト（NHEK）
６）る。今後、時間経過やタンパク量の発現も含めて検討する必要がある。

（PHK16-0b 細胞） を 12 ウェルプレートに 40000 細胞播き、一方、カルシトリオール（活性型ビタミン D）の添加に翌日約 60％コンフルエントに増殖したことを確認後、ビよる AQP3 の RNA 発現量の変化をみてみると、添加濃度タミン類あるいはグリセロールをそれぞれ添加して培養に依存して増加し、1×10 M の濃度で 1.5 倍に増加した。

した。PHK16-0b 細胞の培養は、KGM-2 Bullet Kit を用い、さらに、酢酸トコフェロール（ビタミンE）添加（2×10 M）に培地交換は１日おきに行った。細胞の継代および使用時

よっても、AQP3 の発現量の同程度の増加が見られた。このプレートへの播き替えは、HEPES 緩衝液（HEPES 濃度れに対して、トコフェロールのみでは、添加濃度を変えて30 mmol/L 添加した生理食塩水）で洗浄したのち、トリプも AQP3 の RNA 発現量および形態の変化は全く生じなか

シン /EDTA 液（HEPES 緩衝液にトリプシン濃度 0.025%、った。さらに、トコフェロール添加後の培養が 12 時間後、EDTA 濃度 0.01% 添加）を加え、細胞がフラスコ面から丸24 時間後でも、共に AQP3 の発現量に変化は認められなみをおびるのを確認後、フラスコ面を軽くたたいてフラかった。これは、トコフェロール単体ではバイオアベイラスコから剥離させ、トリプシン中和液（HEPES 緩衝液にビリティーに問題がある可能性があるので、今後検討されFBS10% 添加）を加えて細胞を回収した。

なければならない。

ビタミン類はカルシトリオール（ビタミンD；1×10-8-10-10〜1×-4-8-10以上より、正常ヒト皮膚ケラチノサイト PHK16-0b 細胞〜1×10 M）、において、少量グリセロール、カルシトリオール、酢酸ト〜2×10 M）、コフェロールの添加により、AQP3mRNA の発現量が増加

グリセロールは 0.001 〜 10％を最終濃度になるよう用いた。

することがあきらかになった。以前我々はケラチノカルチ

各ビタミンあるいはグリセロール添加 12 時間あるいは 24ノーマ細胞において、ビタミン A 添加による AQP3 の発現時間後、細胞を回収して、トータル RNA を精製（RNeasy変化を認められなかったが 、今回正常ヒト表皮ケラチノ

Mini Kit, QIAGEN）し、RT-PCR を行い、各ビタミンあるサイト（NHEK）を用いることで、より正常に近い反応をいはグリセロール添加によるヒト AQP3 の発現変化を検討検討できたのではないかと考えられる。

10 M）、 トコフェロール
（ ビタミンE；1×10酢酸トコフェロール（ビタミンE 酢酸塩；2×10-10-65）

した。コントロールは上記添加ビタミン類なし、あるいは今回もちいた脂溶性ビタミンは皮膚疾患によく用いられ最終濃度 0. 1% エタノールを添加したケラチノサイトを用るものなので、AQP3 発現調節にどのように関与するかにいた。

興味がもたれる。以前のわれわれの検討でも 、脂溶性物

5）

質の溶解に用いる DMSO だけで、AQP3 の発現が増加す３．結果と考察ることを認めており、vehicle の影響には細心の注意を払

0.01%（1.4 mM）グリセロールの添加による 12 時間と 24う必要がある。今回は、エタノールを vehicle にもちいて時間後の AQP3 の発現量は、コントロールに比較し明らかおり、エタノールそのものだけでは、AQP3 の発現に影響− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010をしないのを確認しているが、実際の化粧品などでは混合（参考文献）物が多いので、それらの影響も考慮する必要がある。

１）Ishibashi K, Hara S, and Kondo S.: Aquaporin water
channels in mammals.

今後、これらの培養細胞での知見が、皮膚組織においClin Exp Nephrol.13, 107-117,

2009.ても認められるかを検証していく必要がある。さらには、
AQP3 の発現を定量化するより簡便な方法を開発すること

２）Hara-Chikuma M, and Verkman AS. : Aquaporin-3

で、もっと多くの化学物質を効率よくスクリーニングする

functions as a glycerol transporter in mammalian skin.

ことが可能になる。自動化も含めたスクリーニング系の開Biol Cell. 97, 479–486, 2005.

発は、より効果的で安全な化粧品の開発にもつなげられる可能性があるので重要である。

３）Hara-Chikuma M, and Verkman AS. : Prevention ofskin tumorigenesis and impairment of epidermal cell

3）

proliferation by targeted aquaporin-3 gene disruption.

一方、マウスでみられたような 、皮膚癌をグリセリン

Mol Cell Biol. 28, 326–332, 2008.

が促進する可能性があるので、ケラトカルチノーマ細胞における AQP3 の発現制御が、正常皮膚ケラチノサイトと同

４）Morishita Y, Matsuzaki T, Hara-Chikuma M, et al, :様であるのかどうかも検討していく必要がある。ケラトカ

Disruption of aquaporin-11 produces polycystic kidneys

ルチノーマ細胞の AQP3 を減少させるが、正常皮膚ケラチ

following vacuolization of the proximal tubule. Mol Cell

ノサイトの AQP3 の発現を増加させる物質を同定することBiol. 25, 7770–7779, 2005.

が、より安全な化粧品の開発には望まれると考えられるか

５）Nakakoshi M, Morishita Y, Usui K, et al,: Identificationof a keratinocarcinoma cell line expressing AQP3. Biology

らである。

of the Cell. 98, 95-100, 2006.
謝辞

６）Ishibashi Y, Sugita T, Nishikawa A.: Cytokine secretion

本研究に対して、重ねてご支援いただいたコスメトロジ

profile of human keratinocytes exposed to Malassezia
yeasts. FEMS Immunol Med Microbiol. 48, 400-409, 2006.

ー財団に感謝いたします。

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