多様な皮膚酸化傷害を制御するガロイル化フラボノイド素材の探索

徳島大学大学院ソシオ・アーツ・アンド・サイエンス研究部

増田俊哉

Potent inhibitory activity of the leaves of Myrica rubra against both chemical and enzymatic (tyrosinase andlipoxygenase) oxidations was found in this project. Constituent analysis of the most active ethyl acetate-soluble part of themethanol extract of the leaves clarified the structures of eight major compounds. The tyrosinase and lipoxygenase inhibitory
activities and DPPH radical scavenging activity of the isolated compounds were measured as indication of inhibition
capacity for the enzymatic and chemical oxidation related to skin injury. The obtained data revealed that enhanced chemicaland enzymatic antioxidant activities of the constituents mainly depended on the galloyl group on the compounds.

１．緒

御特性を化学構造を基盤に解明することにより，多様な皮言

膚酸化傷害に完全に適応できるガロイル化フラボノイドを生体の酸化的傷害は酸素のある限り避けることはできな
いが，その酸化を遅延させるような制御は可能である。と見出し，新しい化粧品素材として構築することを目的として研究を行った。

ころで，皮膚は，人において酸化傷害が顕著に現れるとこ

本研究では，天然素材として，これまでの我々の研究室ろの一つと考えられる。なぜなら皮膚は直接大気中の酸素で取り扱った植物の中から，ガロイルフラボノイド含有がと接し，酸化のトリガーとなる太陽光を浴び，また，環境期待されるヤマモモ葉を対象に実験を行った１－３）。ヤマモ

中の重金属のような酸化開始剤にさらされる機会も多いか

モは，中国原産のバラ科高木であり，その実はフルーツとらである。またそのような化学的原因による酸化以外にもして食される。一方，樹皮は楊梅皮という生薬として知らアラキドン酸の酵素酸化のような各種生体酸化酵素反応もれ、タンニンに富み，止瀉作用や消炎作用があるとされて皮膚にとっては重篤な傷害ともなり得る。なお，皮膚の酸いる４）。このヤマモモは，四国においては，徳島県の県木，化の制御は，酸化傷害が重篤になってから処方される医薬高知県の県花として身近でなじみ深い植物であり，葉部は品以外に，日常において使用される化粧品に予防的な効果健康茶としての民間利用実績も見られる。

を期待することが可能と考えられる。しかしその一方で，

２．実

皮膚の酸化傷害の原因は多様であり，これを完全かつ予防的に制御するには，それぞれに適応する制御剤が多数必要

２・１

験

研究材料になり，現状では実際上完全制御は困難である。ところで，

ヤマモモ（Myrica rubra）は，徳島県小松島市櫛淵町の一連の類似物質が様々な酸化に対する多様な制御能を併せみその農園（仁木博之氏）より枝を入手し，その葉部（1.7持てば，完全制御の可能性を有する製品素材の開発に近づkg）を室温にて，20L のメタノールに 10 日間浸漬した。そけることになると考えられる。そのような目的達成のため，れをろ過し，減圧下で，メタノールを留去したもの（309 ｇ）

本研究ではガロイル化されたフラボノイドに着目する。フをヤマモモ抽出物とした。

ラボノイドは化学的な酸化制御能が強く，また，ある種のフラボノイドにはリポキシゲナーゼのような酸化酵素に対２・２DPPHラジカル消去能の測定 1）する制御能も認められている。さらにガロイル基にも同様

サンプル液 100μL を試験管に取り、4.8 mL のメタノーな制御作用が期待でき，したがって，それらが複合した物

ルを加えた。更に、５mM の DPPH 液を加え、よく攪拌し、質には，必然的に多様な制御能が期待できるからである。

この時を 0 時として 30 分後に 517 nm の吸光度を測定した。

そこで，本研究では，そのようなガロイル化された多数のサンプルをメタノールに置き換えたものをコントロール、フラボノイドをまず身近な天然素材に探索し，更にその制DPPH をメタノールと置き換えたものをブランクとして、測定は３連で行い、下式を用いて活性強度を算出した。
活性強度＝（コントロール Abs）－（サンプル Abs）＋

Chemical Survey for the Galloyl
Flavonoids Exerting Protective Effects
against Various Oxidative Skin Injuries
Toshiya Masuda
Institute of Socio Arts and Sciences,
University of Tokushima（ブランク Abs）

２・３

チロシナーゼ阻害活性の測定３）8×12 の 96 穴マイクロプレートを用いて以下のように条件を設定した。A（3 セル）、B（1 セル）、C（3 セル）、− 74 −多様な皮膚酸化傷害を制御するガロイル化フラボノイド素材の探索

D（1 セル）の計８セルを用いて、A：1/15M リン酸緩衝

クロロホルムを 2 L 流し、更にメタノール濃度を 10％、20液（pH=6.8）120μL、 チ ロ シ ナ ー ゼ 溶 液（355 units/mL）％、30％、40％、50％、70％、100％と上げて、それぞれ40μL 、B：1/15 M リ ン 酸 緩 衝 液（pH=6.8）160μL、C：

2 L ずつカラムに流し分画した。それぞれの分画を減圧下

1/15 M リン酸緩衝液（pH=6.8）80μL 、チロシナーゼ溶液で濃縮乾固し 5 ％溶出部は 11.2 g、10％溶出部は 11.1 g、20（355 units/mL）40μL、2.5 mg/mL 試 料 溶 液 40μL、D：％溶出部は 20.0 g、30％溶出部は 30.0 g、40％溶出部は 13.8

1/15 M リン酸緩衝液（pH=6.8）120μL、2.5 mg/mL 試料溶g、50％溶出部は 13.7 g、70％溶出部は 2.32 g、100％溶出液 40μL をそれぞれ加えて撹拌後、23 ℃で 10 分間静置し部 は 1.36 g を 得 た。 そ の う ち 50 % 溶 出 部（13 g）を ODSた。1/15 M リ ン 酸 緩 衝 液（pH=6.8）に 溶 解 し た 2.5 mM（Cosmosil 140 C18-OPN）カラムクロマトグラフィーに供

L-DOPA 溶液をそれぞれのセルに 40μL 加え、23 ℃で 10し，10 % から 100 % のメタノール―水で溶出した。その分間、波長 475 nm における吸光度を測定した。ポジティ

うち，40 % メタノール溶出サンプル（0.6 g）を分取 HPLC

ブコントロールとしてコウジ酸を用いた。阻害率は以下の［TSK-GEL ODS-80TS（20×250 mm）column（Solvent:１% AcOH in CH3OH-1% AcOH in H2O=9 : 11）］にて精式を用いて算出した。

製し，化合物 1（179 mg）と 5（42 mg）を単離した。30 %阻害率（％）＝〔｛（A－B）－（C－D）｝/（A－B）〕×100

メタノール溶出サンプル（30 g）を再度 ODS のカラムクロ
マトに供し１％酢酸含有メタノール（５% から 100%）で溶

２・４

リポキシゲナーゼ阻害活性の測定出した。その 40 % メタノール溶出サンプル（600 mg）を５）石英セルに 0.1 M（pH ＝ 8.0）トリス塩酸緩衝液を 2.9 mL、Sephadex LH-20 カラム（１% AcOH in CH3OH）に供し，1 mM リノール酸液（in MeOH）を 50μL、サンプル液を

続 い て 分 取 HPLC［TSK-GEL ODS-80TS（20×250 mm）

20μL 加え、ラップで封をし撹拌した。検出器にセットし、column（Solvent : 1 % AcOH in CH 3OH-1% AcOH in25 ℃で 10 分間静置させ、その後、リポキシゲナーゼ液H2O=9 : 11）により 2（161 mg）と 3（49 mg）を得た。５%（13200 units/mL）を 5μL 加え、再びラップで封をし撹拌

メタノール溶出サンプル（55 mg）についても分取 HPLC

後、すみやかに検出器にセットし 234 nm の吸光度を経時（Solvent : CH3CN -１% AcOH in H2O=1 : 3 ）で精製し 6（27分析した。サンプルをメタノールに置き換えたものをコンmg）と 7（17 mg）を単離した。次に最初の ODS カラムのトロールとした。測定は 3 連で行い、下式をもちいて阻害40 % メタノール溶出部（14 g）を再度 ODS のカラムクロマ率を算出した。なお、ポジティブコントロールとしてトに供し １％酢酸含有メタノール（５% から 100%）で溶NDGA メタノール溶液を用いた。阻害率の算出には５分出し，その 30 % メタノール溶出サンプル（520 mg）を分取後の吸光度変化率を用いた。

HPLC（Solvent : CH3CN- 1 % AcOH in H2O=9 : 11）にて精 製 し 1（151mg）, 4（7 mg）と 5（17 mg）を 単 離 し た。

阻害率（％）＝（コントロール ΔAbs －サンプル ΔAbs）／

また，最初のカラムの５% メタノール溶出部（ 1 g）につい（コントロール ΔAbs）×100て も， 再 度 ODS カ ラ ム（30 % methanol containing 1 %AcOH in H2O）と分取 HPLC（Solvent : CH3CN- 1 % AcOH

２・５

ヤマモモ抽出物の分画in H2O=3 : 17）にて精製し 8（7 mg）を得た。

ヤマモモ抽出物 300 g をメタノール２L と蒸留水 220 mL

３．結果および考察に溶かした。これをヘキサン２Ｌで分配し、メタノール分画層とヘキサン分画層を得た。ヘキサン分画層は濃縮・乾固し 26.7 g のヘキサン可溶部を得た。続いて、メタノール

３・１ ヤマモモ抽出物酢酸エチル可溶画分の成分分析と成分の構造解析

分画層を減圧下で濃縮し、メタノールを除去し、更に蒸留

ガロイルフラボノイドの存在が期待されるヤマモモ葉部

水を 2 L 加え、酢酸エチル 2 L、及び１L で計２回分配を行

メタノール抽出物には，我々の研究室におけるスクリーニ

い、酢酸エチル層を減圧下で濃縮・乾固し 64.2 g の酢酸エング実験において，顕著なラジカル消去活性（IC50 6 ㎍ /チル可溶部を得た。次に、水飽和させたブタノール２L でmL）
，チロシナーゼ阻害活性（IC50 0.23 mg/mL），リポキ

水分画層を分配し、それぞれ減圧下で濃縮・乾固し、ブタシゲナーゼ阻害活性（IC50 26 ㎍ /mL）が認められていた。

ノール可溶部を 91.6 g、そして水可溶部を得た。

ラジカル消去活性は，幅広い酸素性ラジカル種（いわゆる活性酸素）の消去能に連動し，常に外気に触れる皮膚にお２・６

ヤマモモカロイルフラボノイド類の単離ける様々な障害を取り除く可能性のあるものである。一方

シリカゲル（Silica gel 60）500g に、ヤマモモ抽出物酢

リポキシゲナーゼは炎症に関わる酵素であり，チロシナー酸エチル可溶部 64 g を 1％酢酸 / クロロホルムと少量のメ

ゼは皮膚のシミ，ソバカスなどの原因となる酸化酵素であタノールで溶かし吸着させた。1 ％酢酸 5 ％メタノール /る。ヤマモモ抽出物が有するこれらの阻害等の活性は，我々− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

がこれまでスクリーニングしてきた沖縄産の薬草類の機能
1, 2）94.7（C8）, 158.4（C9）, 105.8（C10）, 121.8（C1’）, 109.6（C2’。そこで，活性を指標にしてand C6’or C2”’and C6”’）, 146.8（C3’and C5’or C3”’

成分を明らかにすべく溶媒分画を行ったところ，その活性and 5”’）, 137.9（C4’）, 100.4（C1”）, 73.5（C2”）, 70.7（C3”）,

は主に酢酸エチル可溶画分に移行した。酢酸可溶画分が含73.8（C4”）,72.2（C5”）,17.8（C6”）,121.2（C1”’）,110.4（C2”’有する成分をグラジエント HPLC 法を用いて総分析した結and C6”’or C2’and C6’）, 146.4（C3”’and 5”’or C3’and果を図１に示した。この中に活性を有するガロイルフラボ

C5’）, 139.9（C4”’）, 167.5（C7”’）. 3. [a]25D -118º（c 0.1,ノイドが存在すると仮定し，それぞれのピーク物質の単離+CH3OH）; ESI-MS m/z（M+Na）: Calcd for C28H24O16Na:を試みた。結果，実験方法に示したように，8 種の物質の639.0962, Found 639.0974. NMR dH（CD3OD）: 6.20（1H, d,単離に成功した。その物質の機器分析データは以下のとお

J=2.0 Hz, H6）, 6.37（1H, d, J=2.0 Hz, H8）, 7.00（2H, s, H2’りである。

and H6’）, 5.28（1H, d, J=1.9 Hz, H1”）, 4.48（1H, dd, J=3.4に匹敵するものであった

25D

1. [a]+-127º（c 1.0, CH3OH）; ESI-MS m/z（M+Na） :and 1.9 Hz, H2”）, 5.25（1H, dd, J=9.3 and 3.4 Hz, H3”）, 3.67

Calcd for C21H20O12Na: 487.0852, Found: 487.0877. NMR dH（1H, t, J=9.3 Hz, H4”）, 3.72（1H, m, H5”）, 1.00（3H, d, J=5.8（acetone-d6）: 6.24（1H, d, J=2.0 Hz, H6）, 6.45（1H, d, J=2.0Hz, H6”）, 7.17（2H, s, H2”’and H6”’）. 4. [a]25D +13º（c 0.1,Hz, H8）, 7.08（2H, s, H2’and H6’）, 5.44（1H, brs, H1”）,

CH3OH）; NMR dH（acetone-d6）: 6.26（1H, d, J=2.0 Hz, H6）,

4.22（1H, brs, H-2”）, 3.77（1H, dd, J=9.0 and 2.6 Hz, H3”）,

6.51（1H, d, J=2.0 Hz, H8）, 7.50（2H, s, H2’and H6’）, 5.19

3.36（1H, t, J=9.0 Hz, H4”）, 3.52（1H, m, H5”）, 0.92（3H, d,（1H, d, J=7.8 Hz, H1”）, 3.83（1H, dd, J=9.5 and 7.8 Hz, H2”）,

J=6.1 Hz, H6”）. NMR dC（CD3OD）: 159.2（C2）, 136.2（C3）,

3.68-3.58（3H, complex, H3”, H5”, and H6”）, 3.93（1H, brd,

179.4（C4）, 162.9（C5）, 99.7（C6）, 165.6（C7）, 94.6（C8）,J=3.1 Hz, H4”）. NMR dC（CD3OD）: 158.5（C2 or C9）, 136.0

158.3（C9）, 105.7（C10）,121.9（C1’and C6’）, 146.6（C3’and（C3）, 179.4（C4）, 162.9（C5）, 99.8（C6）, 166.0（C7）, 94.7（C8）,C5’）, 137.7（C4’）, 103.4（C1”）, 71.9（C2”）, 72.0（C3”）, 73.2

158.3（C9 or C2）, 103.6（C10）, 121.7（C1’）, 110.0（C2’and（C4”）, 71.8（C5”）, 17.6（C6”）. 2. [a]25D-4º（c 0.5, CH3OH）;

C6’）, 146.4（C3’and C5’）, 138.1（C4’）, 105.6（C1”）, 73.3

ESI-MS m/z（M+Na）: Calcd for C28H24O16Na: 639.0962,（C2”）, 75.1（C3”）, 70.0（C4”）, 77.2（C5”）, 61.9（C6”）. 5.

Found: 639.0984. NMR dH（CD3OD）: 6.19（1H, d, J=2.0 Hz,[a]25D -83º（c 0.1, CH3OH）; ESI-MS m/z（M+Na）+: Calcd forH6）, 6.35（1H, d, J=2.0 Hz, H8）, 6.97（2H, s, H2’and H6’）,

C28H24O17Na: 655.0911, Found 655.0869. NMR dH（acetone-d6）

5.50（1H, d, J=1.5 Hz, H1”）, 5.62（1H, dd, J=3.3 and 1.5 Hz,: 6.20（1H, d, J=2.0 Hz, H6）, 6.43（1H, d, J=2.0 Hz, H8）, 7.22H2”）, 4.03（1H, dd, J=8.5 and 3.3 Hz, H3”）, 3.43-3.45（2H,（2H, s, H2’and H6’）, 5.93（1H, d, J=8.0 Hz, H1”）, 5.50（1H,+complex, H4”and H5”）, 1.03（3H, d, J=5.5 Hz, H6”）, 7.07

9.8 and 8.0 Hz, H2”）, 4.00（1H, dd, J=98 and 3.2 Hz, H3”）,（2H, s, H2”’and H6”’）. NMR dC（CD3OD）: 159.4（C2）,4.08（1H, d, J=3.2 Hz, H4”）, 3.71（3H, complex, H5”and135.6（C3）, 179.3 8C4）, 163.1（C5）, 99.8（C6）, 165.7（C7）,H6”）, 7.40（2H, s, H2”’and H6”’）, NMR dC（CD3OD）:

図 1 HPLC analytical profile of the ethyl acetate-soluble fraction of the methanol
extract of Myrica rubra. Analytical Conditions : Column, TSK-GEL ODS-80TS（4.6×150 mm）; Solvent, A, 0.1％ H3P04 aq., B, CH3CN ; Gradient system, a linear
gradient from 10% of solv. B to 40% of solv. B（40 min）and then 100% of solv. B（50 min）; Flow rate, 1 ml/min ; Detection, 280 nm.

− 76 −

多様な皮膚酸化傷害を制御するガロイル化フラボノイド素材の探索

158.1（C2）, 135.3（C3）, 175.4（C4）, 163.0（C5）, 99.6（C6）,３・２単離物質の活性165.5（C7）, 94.4（C8）, 157.9（C9）, 105.8（10）, 121.9（C1’or

ヤマモモより単離できた 8 種の成分の DPPH ラジカルのC1”’）, 109.8（C2’and C6’or C2”’and C6”’）, 146.3（C3’消去活性，チロシナーゼ阻害活性，リポキシゲナーゼ阻害

and C5’or C3”’and C5”’）, 137.8（C4’or C4”’）, 101.3

活性を測定した。その結果を図３にまとめて示した。

（C1”）, 74.6（C2”）, 73.4（C3”）, 70.5（C4”）, 77.4（C5”）, 62.0

図３A には，各物質５μM における DPPH ラジカルの消（C6”）, 121.6（C1”’or C1’）, 110.6（C2”’and C6”’）, 146.2

去活性を DPPH による 517 nm の吸光度減少度で示した。

（C3”’and C5”’or C3’and C5’）, 139.8（C4”’or C4’）,

化合物８は，活性を示さなかったが，他の物質はこの濃度

25D168.3（C7”’）. 6. [a]+13º（c 0.1, CH3OH）; NMR d（CDH3OD）

でいずれも消去活性を示した。なお，ガロイル基を有する: 4.75（1H, brs, H2）, 4.16（1H, m, H3）, 2.84（1H, dd, J=16.6

２，３，５，７については，そのラジカル消去能が 2 倍程度

and 4.5 Hz, H4a）, 2.72（1H, dd, J=16.6 and 2.9 Hz）, 5.91（1H,高く，ガロイル基の強いラジカル消去効果が表れたといえ

d, J=2.4 Hz, H6）, 5.93（1H, d, J=2.4 Hz, H8）, 6.51（2H, s,る。

25

H2’and H6’）. 7. [a] D -83º（c 0.1, CH3OH）; NMR dH

図３B には，各物質のリポキシゲナーゼ阻害活性を示し（CD3OD）: 4.96（1H, brs, H2）, 5.52（1H, m, H3）, 2.97（1H,た。8 化合物の中では，7 が最も低濃度で活性を示し，そdd, J=17.1 and 4.5 Hz, H4a）, 2.84（1H, dd, J=17.1 and 3.0

れに１と 6 が続いた。一方，４，５，８については，100μM

Hz, H4b）, 5.95（2H, s, H6 and H8）, 6.49（2H, s, H2’andにおいてもほとんど活性を認めなかった。強い活性を示し

H6’）, 6.94（2H, s, H2”and H6”）. 8. NMR dH（CDCl3）: 7.55

た６と７は，いずれもエピガロカテキンであり，7 はさら（2H, m, H2 and H6）, 7.41（3H, m, H3, H4, and H5）, 7.79（1H,にカロイル化されているものである。したがって，エピガd, J=16.1 Hz, H7）, 6.46（1H, d, J=16.1 Hz, H8）.

ロカテキン骨格には，リポキシゲナーゼ活性が存在し，そ詳細は省略するが，以上のデータから，単離した物質の化学構造を解析した結果，1 から 5 は，ミリセチンを母核れがさらにガロイル化されると，その活性が増強することが示唆された。とするフラボノールグリコシドであることが判明し，加え図３C には，チロシナーゼ阻害活性を示した。いずれのて，２，３，５は，予想通りガロイル化されたものであるこ

化合物も 0.1 から 1 mM において，阻害活性を示したが，とがわかった。一方，６，７は，エピガロカテキンである

特に群を抜いて強力なものはなかった。しかしながら，ガことがわかり，加えて，その立体化学は，お茶のカテキンロイル化された２，３，５，７については，ガロイル化されと同じものであることがわかった。なお，７は，6 がさらていないものより低濃度で強い活性を示し，ガロイル基のにガロイル化されたエピガロカテキンガレートであること活性増強効果があるものと思われた。

がわかった。一方で，８は収量的には多かったが，フェノール基のない桂皮酸であることが判明した（図２）。

図２

Chemical structures of the isolated compounds 1-8 from the leaves of Myrica rubra.

− 77 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

図 ３ Chemical and enzymatic antioxidant activity of the isolated compounds 1-8 fromMyrica rubra. Panel A : DPPH radical scavenging activity; Panel B : Lipoxygenase
inhibitory activity; panel C : Tyrosinase inhibitory activity. All data are presented as
mean± S.D. (n=3).

４．総

related activities of ethanol extracts from edible and括

medicinal plants cultivated in Okinawa, Japan. J. Jpn

本研究により，四国地区において身近な植物資源である

Soc. Food Sci. Technol.（in Japanese）, 49, 652-661, 2002.

ヤマモモの葉部に各種のガロイル化フラボノイドの存在を

３）Masuda, T., Fujita, N., Odaka, Y. et al., :Tyrosinase

確認した。さらに，それらのガロイル化フラボノイドが，ラジカ

inhibitory activity of ethanol extracts from medicinalルの消去機能，リポキシゲナーゼやチロシナーゼのようなand edible plants cultivated in Okinawa and

酸化劣化酵素の制御能に優れていることを発見した 6）。な

identification of a at-soluble inhibitor from the leaves

お，今回の結果は，あくまで in vitro の結果であるため，of Nandina domestica., Biosci. Biotechnol. Biochem., 71,2316-2320, 2007.

実際の皮膚における効果は，いまだ定かではない。今後は，ケラチノサイトやメラノサイトのような皮膚由来の培養細胞

４）Inoue, I., Arai, Y., and Nagai, M. : Diarylheptanoids

系や実際の動物を用いた実験系により，単離したガロイル

in the bark of Myrica rubra Sieb. et Zucc., Yakugaku

フラボノイドの効果を検証していくことが必要と思われる。

Zasshi（in Japanese）, 104, 37-41, 1984.
５）Ha, T. J., Nihei, K.-I., and Kubo I., :Lipoxygenase（参考文献）

inhibitory activities of octyl gallate. J. Agric. Food１）M as uda, T . , Yon emori, S . , O y ama, Y . et a l.,

Chem., 52, 3177-3181, 2004.

:Evaluation of the antioxidant activity of environmental

６）Masuda, T., Someya, T. and Fujimoto, A. :Phenolicplants: activity of the leaf extracts from seashore

inhibitors of chemical and enzymatic oxidation inplants. J. Agric. Food Chem., 47, 1749-1754 ,1999.

theleaves of Myrica rubra, Biosci. Biotechnol. Biochem.,２）Masuda, T., Oyama, Y., Inaba, Y. et al., :Antioxidant-− 78 −74, 212-215, 2010.