細胞骨格イメージング

紡錘体微小管の生成メカニズムに関する微細構造学的解析
Ultrastructural Insights into Augmin-Dependent Microtubule Nucleation in the Spindle
釜崎とも子ａ，上原亮太ｂ

Tomoko Kamasaki and Ryota Ueharaａ

名古屋大学大学院理学研究科生命理学専攻細胞内ダイナミクスグループｂ

東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻生命環境科学系

要

旨

紡錘体は染色体を正しく二分するための構造である．機能的な紡錘体は，分裂期に微小管が高度に組織化されることにより形成される．これまでに，紡錘体微小管を生成する微小管形成中心として，中心体と染色体が知られてきた．近年，これらに加えて，紡錘体内部の微小管自身も，紡錘体微小管の生成・増幅に重要であることが分かってきた．このような微小管依存的微小管生成過程で中心的な役割を果たすのが“オーグミン複合体”である．我々はごく最近，ヒト紡錘体を電子線トモグラフィーおよび三次元モデリングにより解析した．その結果，オーグミン依存的な新規微細構造“エンドリンク”を介して微小管の枝分かれが形成されていることを突き止め，紡錘体における微小管依存的微小管生成過程に関する重要な知見を得た．

キーワード：有糸分裂紡錘体，微小管，オーグミン，電子線トモグラフィー，三次元モデリングを司る．非動原体微小管とは，動原体と結合していない微小1.

はじめに管のことである．非動原体微小管のうち，両極方向から伸び細胞分裂は生命を受け継ぎ，維持するために必須の現象でた微小管が紡錘体の中央で重なり合っているものを極間微小ある．紡錘体は主に微小管により構成され，染色体を分配し管と呼び，これは紡錘体の双極性を維持するのに重要である．て細胞を正しく二分する役割を持つ

1,2）．微小管は真核細胞

また，中心体から紡錘体の外部に向かって放射状に伸びていに存在する直径約 25 nm の管状のタンパク質繊維で，そのる星状体微小管は，細胞表層との相互作用を通して，細胞内サブユニットであるチューブリンの重合・脱重合により動的における紡錘体の位置制御に関わっている．これらの基本構に伸長・短縮する．細胞内では，種々の微小管結合タンパク造が，微小管の動態や組織化を制御する様々な因子と共に紡質によって，このような微小管の動態が制御されている．ま錘体を形成している．

た，微小管は方向性のある構造で，チューブリンが付加しや紡錘体は膨大な本数の微小管によって形作られており，ヒすいプラス端と，チューブリンが解離しやすいマイナス端がト紡錘体では数十万本に達すると想像される．これらの微小ある．

管がどこでどのように生成されるか明らかにすることは，紡有糸分裂前中期に入ると，分離した中心体が細胞の両極に錘体の形成メカニズムを理解する上で重要な課題である．こ移動し，双極性の紡錘体が形成される．1882 年，Waltherれまでに，紡錘体微小管は 1）中心体，2）染色体近傍，3）Flemming による著書に，当時の光学顕微鏡観察をもとにし紡錘体内部の 3 種類の微小管形成中心（microtubule organiz-た紡錘体のスケッチが記載されて以来，細胞分裂に関する研ing center; MTOC）から生成され得ることが示されている

究は顕微鏡技術の進歩に牽引されるかたちで発展してきた．

（図 1B）．本稿では，まずこれらの MTOC からの微小管生成

特に透過電子顕微鏡は，これまで 40 年以上の間，紡錘体のについて概説する．次に，その中でも，筆者らが主に研究を基本構造を知る上で重要な貢献を果たしてきた．

行ってきた，紡錘体内部における微小管依存的微小管生成 1,3）

紡錘体は動原体微小管および非動原体微小管と呼ばれるのメカニズムに関してさらに詳細に解説する．最後に，紡錘2 種類の微小管から構成されている（図 1A）．動原体微小管は，体形成の分子基盤を研究する上で微細構造学的解析が貢献し両極に位置する中心体から主に伸長しており，姉妹染色体のた一例として，我々の最新の研究成果を紹介する．

動原体に結合することにより，姉妹染色体の整列および分配ａ〒 466–0822 愛知県名古屋市千種区不老町
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2013 年 6 月 3 日受付
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2.

紡錘体における 3 つの微小管生成経路2.1

中心体依存的微小管生成

中心体は，一対の中心小体をコアとして，その周りを，微小管重合核形成因子である γ-チューブリン複合体を含む中心顕微鏡 Vol. 48, No. 2（2013）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 紡錘体の基本構造（A）中期紡錘体の模式図．紡錘体は動原体微小管（橙色）と非動原体微小管（緑色，黄緑色）から構成される．非動原体微小管のうち，両極方向からの微小管が紡錘体の中央で重なり合っているものを極間微小管（黄緑色）という．中心小体（黄色）をコアに持つ中心体から細胞表層に向かって星状体微小管（桃色）が伸長している．青
色：動原体．（B）紡錘体形成における微小管形成中心（microtubuleorganizing center; MTOC）．3 種類の MTOC である①中心体，②染色体，③紡錘体内部からの微小管生成により，紡錘体が形成・維持される．緑色：微小管，桃色：γ-チューブリン，灰色：中心体と染色体，黄色：紡錘体内部．

図 2 オーグミンをノックダウンした有糸分裂中期のヒト培養細胞コントロール細胞において，γ- チューブリンは中心体および紡錘体内部に見られた．オーグミンを阻害すると紡錘体内部の γ- チューブリンのみが特異的に消失し，紡錘体内部の微小管が劇的に減少した．の分裂酵母，タバコ培養細胞，シロイヌナズナ細胞表層の高解像度生細胞観察によって見出されてきた 5 ～ 7）．これらの細胞では，既存の微小管の側面に重合核形成因子である γチューブリンが局在し，そこから新しい微小管が生成される様子が観察された 5 ～ 7）．また分裂期の動物体細胞では，中心体や染色体近傍以外の紡錘体内部にも γ-チューブリンが局在小体周辺物質が取り囲んだ構造で，細胞周期を通して微小管し，微小管生成が起こっていることから 8），上記の間期細胞生成能を有する．分裂期に入ると，中心体の γ-チューブリンと同様に，微小管依存的微小管生成が行われる可能性が示唆

局在量が増えて，それに伴い微小管生成能が上昇する．一般された（図 1B ③）．しかし，間期細胞の表層に比べて，紡的に，中心小体の周囲には，盛んな微小管生成を反映して，錘体では微小管が密に，かつ複雑に配向するため，蛍光顕微生成された微小管の“根元”に相当するマイナス端が多く見鏡を用いた生細胞観察によって微小管依存的微小管生成を実られる（図 1B ①）2）．長い間，中心体は紡錘体における唯一証することは困難であった．さらに，紡錘体における微小管の MTOC であると考えられてきた．しかし近年，実験的に依存的微小管生成の生理的意義や分子基盤に関しては，全く中心体を除去した場合にも機能的な紡錘体が形成されること明らかにされていなかった．

4）が示され ，中心体以外にも MTOC が存在することが分かってきた．
2.2

染色体依存的微小管生成

中心体を持たないカエル卵母細胞の抽出液を用いた実験系

3. 微小管依存的微小管生成の鍵を握るタンパク質複合体“オーグミン”
3.1 オーグミンの発見を中心に，染色体近傍からの微小管生成（図 1B ②）が紡錘近年，ショウジョウバエ培養細胞を用いた全ゲノム RNAi体形成に寄与することが明らかにされた 2）．染色体を足場にスクリーニングにより，紡錘体における γ-チューブリンの局して活性化する低分子量 G タンパク質やリン酸化酵素が，在化に必要な新規遺伝子 Dgt が発見された 9）．Dgt 遺伝子の種々の微小管結合因子を制御し，染色体近傍で局所的に微小機能を RNAi により阻害すると，γ-チューブリンの中心体へ管の安定化を促すことで，紡錘体形成に必要な微小管が供給の局在は保たれるが，紡錘体内部の局在のみが特異的に消失されると考えられている 2）．

した（図 2）．これに伴って，紡錘体内部の微小管が減少し2.3

微小管依存的微小管生成たため，Dgt 遺伝子は紡錘体内部の微小管生成に寄与するこ

既存の微小管を足場にして新しい微小管を生み出す，微小とが示された．さらに，細胞内において 8 つの Dgt 遺伝子管依存的微小管生成は，蛍光顕微鏡を用いた間期（非分裂期）産物が複合体を形成していることが明らかになり，その新規

特集

紡錘体微小管の生成メカニズムに関する微細構造学的解析

91【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

タンパク質複合体は“オーグミン”と名付けられた 10）．この名称は，オーグミンが紡錘体微小管を増幅する機能を持つことから，ラテン語で“増やす”を意味する “augmenture” に由来している．オーグミンは，動植物で広く保存されたタンパク質複合体である
3.2

11 ～ 13）．

オーグミン依存的微小管生成の紡錘体形成における4. オーグミンの機能解明に向けた微細構造学からのアプ
ローチ
上述のような分子・細胞生物学的解析から，オーグミン依存的な微小管の補填が，機能的な紡錘体形成に重要であることが示され，この微小管生成は微小管の分岐形成を通して行寄与われることが推測された．この仮説を検証するためには，蛍ヒト培養細胞では，RNAi によりオーグミンを阻害すると，光顕微鏡では可視化することが難しいオーグミン依存的微小分裂期の停止や細胞分裂異常といった重い障害が見られ管が，紡錘体内部のどこに，どのように分布しているかを微た 11）．これはオーグミンを介した微小管増幅が，それ以外の細構造レベルで解析する必要がある．そこで我々は，この十MTOC からの微小管生成を強く相補して，正常な紡錘体形数年来，紡錘体を対象とした研究にも応用されている電子線成および細胞分裂に重要な役割を果たしていることを示してトモグラフィーと三次元モデリング 17,18）に注目した．これらいる．の手法により，微小管末端の形態に基づいて決定される細胞動植物細胞に共通して，オーグミンは分裂期前中期から中内の微小管一本一本の方向性や，微小管末端の正確な配置を期にかけて，紡錘体内部の微小管と同様の局在パターンを示明らかにすることができる．しかしこれまで，オーグミンをす．オーグミン複合体のうち，微小管もしくは γ-チューブリ有する生物種の紡錘体に対してこのような解析が行われたこンに結合するサブユニットがそれぞれ同定されていることかとがなかったため，オーグミン依存的に形成される紡錘体内

ら 11,14），オーグミンはそれらのサブユニットを介して既存の部の微細構造は明らかでなかった．

微小管の側面に結合し，γ-チューブリンをリクルートするこ

ごく最近，我々はヒト紡錘体を対象として，広範囲にわたとによって，そこから新しい微小管が生成されると推測される電子線トモグラフィーおよび三次元モデリングを行った 19）

る．さらにこれらの相互作用は，Cdk1 および PLK1 などの（図 3）．未処理（コントロール）もしくはオーグミンを RNAi

分裂期キナーゼによりリン酸化制御されることが明らかにな法によりノックダウンしたヒト培養細胞を加圧凍結・凍結置り，オーグミン依存的微小管形成が細胞内で高度に調節され換固定し，樹脂包埋後，分裂中期の細胞の連続準超薄切片を作ている可能性が示唆された 11,15,16）．

製した．このうち，紡錘体の一部を電子線トモグラフィーにより撮影し，さらに連続切片～ 3 枚分のトモグラムを合体させ

図 3 ヒト紡錘体における微小管マイナス端の配置と微小管の分岐（A）電子線トモグラフィーおよび三次元モデリングにより得られた，中期紡錘体の部分再構築像．微小管の推定マイナス端（中心体側を向いている末端：桃・黄色の点）は紡錘体内部に分布していた（中央）．キャップされたマイナス端を持つ微小管の一部は，近傍の微小管と分岐を形成していた（右）．緑色：微小管，桃色の点：キャップされたマイナス端，黄色の点：中心体側を向いていて且つキャップが無い末端（＝推定マイナス端），白色の点：染色体側を向いている末端（＝推定プラス端），赤色の点：紡錘体微小管の分岐点，青色：染色体の輪郭．中日新聞（2013 年 7 月 20 日朝刊 34 面）より転載．
（B）オーグミ
ン依存的に形成される棒状エンドリンク．トモグラムから抽出した，厚さ 1.4 nm のスライス像（左）とそのトレース像（右）．
（C）オーグミン依存的微小管生成のモデル図．

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顕微鏡 Vol. 48, No. 2（2013）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

ることにより，解析用の画像（～ 4 μm × ～ 6 μm × ～ 0.7 μm）

依存的エンドリンクがオーグミン自身なのか否かを検証するを作製した．これは，紡錘体の約 1.3％のボリュームに相当ことや，エンドリンクを介した微小管増幅過程を明らかにす

解析用の画像に含まれる微小管をトレースし，する．続いて，ることなどが紡錘体における微小管依存的微小管生成過程のまた微小管の末端などの位置を記録することによって三次元理解を大いに助けると考えられる．

モデリングを行い，紡錘体の部分再構築像を作製した．コン
トロール細胞の中期紡錘体において，微小管のマイナス端は中心小体周辺のみならず紡錘体内部にも分布しており（図 3A），紡錘体内部にある微小管のマイナス端は，オーグミン依存的に配置されることを見出した

19）．さらに，γ-チュー

謝辞今回，この原稿を執筆する機会をくださった名古屋大学
理学研究科

生命理学専攻細胞内ダイナミクスグループ

五島剛太教授に感謝いたします．

ブリン複合体によりキャップされたマイナス端のうち約 9％の末端は，その近傍の微小管壁との間に新規結合構造“エンドリンク”を持つことを発見した．エンドリンクの形態は2 種 類 に 分 類 さ れ， 長 さ 約 29 nm の 棒 状 エ ン ド リ ン ク（図 3B）と，キャップされたマイナス端と近傍の微小管壁が直接結合している直接型エンドリンクがあった．これらのエンドリンクで繋がれた紡錘体微小管は～ 20° の角度をなした枝分かれを形成しており，この分岐構造もまたオーグミン依存的に形成されることが明らかになった．これまで細胞骨格繊維の分岐としては，葉状仮足における Arp2/3 とアクチン繊維による～ 70° の分岐 20） や，間期の分裂酵母細胞における～ 180°（逆平行）の分岐 5），タバコ培養細胞の表層における～ 40° の分岐 6）が報告されている．これらの分岐とは異なり，オーグミン依存的に形成される紡錘体微小管の分岐はほぼ平行だった．最近，カエル卵抽出液を用いた試験管内の解析でも，ほぼ平行（～ 20°）に配向した微小管の分岐形成にオーグミンが関与することが示された 21）．この系では，Arp2/3とアクチン繊維による枝分かれと類似して，微小管が樹状に枝分かれし，扇形に広がった微小管構造が形成された．しかし，我々の行った細胞内の解析結果はこれと異なり，一本の母微小管が，ただ一本の娘微小管を持っているケースが大半であった（図 3A 右，B，C）．このことから，娘微小管は次にそこから新たな微小管が重合し始める前に，母微小管から離れることが推測される．以上の解析から，紡錘体内部の微小管は，オーグミン依存的なエンドリンクを介した微小管の分岐形成によって効率よく増幅していることが強く示唆された．また本研究により，微細構造レベルの遺伝子機能解析の重要性や意義を示すことができたものと思われる．
5.

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今後の展望

今後は，精製オーグミンを用いた解析により，オーグミン

特集

紡錘体微小管の生成メカニズムに関する微細構造学的解析

93【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】