日本語マニュアル(Version A6, 2024 年 8 月 14 日版)
最新の英語版プロトコルも必ずご確認ください。

※キットの構成品は、それぞれ保管温度が異なります。商品到着後、適切な温度で保管してください。

Copyright 2023 Active Motif, Inc変更年月

A3

2023年10月

A4

2023年12月

A5

2024年5月

変更内容•0.1 M CaCl2の保管温度範囲を更新。

•

9ページ目のステップ3について、SPRIの容量を1.1から1.2に修正。

•

4ページ目のDNA Binding BufferをDNA Purification Binding Bufferに修正。

•

英語版A5までの全ての更新に対応し、表紙更新・目次追加。

•

概要(1ページ目)を追加。

•

3ページ目の誤字を修正。

•

9ページ目のステップ1について、『追加の』を『異なる』に表現を修正。

•9ページ目のステップ3について、SPRIビーズとサンプルの比を1.5Xから1.6Xに修正。

A6

2024年8月•3ページ目のライブラリー調製キットにアクティブ・モティフの製品を追加。

•

3ページ目のインデックスプライマーにアクティブ・モティフの製品を追加。

•8ページ目のステップ26の記述内容をより詳細に修正。

•NGSライブラリー調製のためのオプションにアクティブ・モティフの製品を追加。

•※「関連製品」および「テクニカルサポート」のページを追加

変更内容欄のページ数は、当該 Revision のページです。本 Revision (A6)とはページ数が異なる場合がありますのでご注意ください。

activemotif.com

目次
概要 ..................................................................................................... 1
キットの構成品と保管温度 ......................................................................... 2
必要なその他の試薬・機器 ............................................................................... 3

ChIC/CUT&RUN Assay プロトコル .......................................................... 4
バッファーの調製 ........................................................................................... 4
1 日目（約３時間） ........................................................................................ 52 日目（約 5 時間） ....................................................................................... 7(オプション) NGS Library の調製(約 3 時間) ― アクティブ・モティフの DNA Library
Prep Kit for Illumina®を使用する場合................................................................ 9(オプション) NGS Library の調製(約 3 時間) ― NEB 社の NEBNext® Ultra™ II for
DNA Library Prep Kit for Illumina®を使用する場合 ............................................ 10

References ........................................................................................ 12
トラブルシューティングガイド ................................................................. 13
関連製品.............................................................................................. 14
テクニカルサポート ............................................................................... 15

概要CUT&RUN（Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease）は、様々なクロマチン関連タンパク質とその修飾のゲノムワイドな分布を調べるために用いられるエピジェネティックな手法です 1。
CUT&RUN は、抗体を用いてクロマチン関連マークやタンパク質を標的とする点において、クロマチン免疫沈降法（ChIP）と類似していますが、ChIP よりもサンプル量が少なく、シーケンス深度も浅く済みます 1-3。
CUT&RUN では、インタクトな細胞内でクロマチンに結合した目的のタンパク質を抗体でタグ付けさせます。次に、マイクロコッカル・ヌクレアーゼ(MNase)を用いて、目的のタンパク質の結合部位において DNA を特異的に切断します。MNase は Protein AG と融合しており、Protein AG の部位が目的のタンパク質と結合した抗体に結合します。次に、MNase は Ca2+の添加によって活性化され、DNA は断片化されて、上清に移行します。放出された断片を精製し、NGS によりシーケンスした後、参照ゲノムにマッピングしてタンパク質の結合部位を決定します。
ChIP-Seq と比較して CUT&RUN が優れている点は、サンプルの超音波処理を必要としない簡便なプ
ロトコール、少ない細胞数 (ヒストン修飾ではわずか 5,000 個、一部の転写因子では 25,000 個)から高信頼性データが得られること、および浅いシーケンス深度(高信頼性マークではわずか 2,000,000リード、転写因子では平均 25,000,000 リード)で実行できることです 3。
CUT&RUNは、ChIPよりも高感度で特異的、かつ少ない細胞数で行えるため、転写因子やヒストン修飾などのクロマチン関連タンパク質の結合パターンをゲノムワイドに同定するのに理想的であり、クロマチン関連タンパク質を研究するための有用な手法です。クロマチン関連タンパク質は、遺伝子発現、DNA複製、DNA修復、細胞分化など様々な細胞内プロセスの制御に重要な役割を果たしており、このようなタンパク質の結合パターンを解明することは、クロマチン関連タンパク質の機能解析に不可欠です。これらのタンパク質の結合パターンを理解することにより、これらの細胞プロセスがどのように制御されているかについての知見が得られます。
製品

反応回数

Catalog No.

キットの構成品と保管温度
各構成品は以下の温度で保管してください。適切に保管された場合、受領後 6 ヶ月間安定であることを保証します。

試薬等

容量

保管温度※

※RT: 室温*DNA Purification Wash Buffer は、使用前に 100%エタノール 40 mL を添加し、終濃度 80%エタノールとなるよう調製してください。
**DNA Purification Binding Buffer は、使用前に 100%イソプロパノール 9 mL を添加し、終濃度60%イソプロパノールとなるよう調製してください。

必要なその他の試薬・機器
標的タンパク質に対する抗体
100%エタノール
100%イソプロパノール
微量遠心機
ボルテックスミキサー
マグネットバーまたは 0.2mL チューブ用マグネットラック/スタンド
1.5 – 2 mL 微量遠心チューブ
冷却用の氷、アイスペール
Nutator または旋回シェーカー
4℃で使用可能な Nutator または旋回シェーカー
NGS ライブラリー調製キット
アクティブ・モティフの DNA Library Prep Kit for Illumina® (Cat. No. 53220)、または NEB社の NEBNext® Ultra™ II for DNA library Preparation (E7645/E7103)※ライブラリー調製に必要なその他の試薬・機器については、本マニュアルと使用するライブラリーキットのマニュアルをご確認ください。
インデックスプライマー
アクティブ・モティフの Dual Index Primers Set 1 for Illumina® (Cat. No. 53221) / DualIndex Primers Set 2 for Illumina® (Cat. No. 53222)、または NEB 社の NEBNext® Multiplex
Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) (Cat. No. E7335S) / NEBNext® Multiplex Oligos
for Illumina (Index Primers Set 2) (Cat. No. E7500S)

ChIC/CUT&RUN Assay プロトコル
バッファーの調製
DNA Purification Binding Buffer: DNA Purification Binding Buffer のボトルに、100%イソプロパノールを 9 mL 添加する (最終濃度 60%)。4℃で 6 ヶ月保存可能。

DNA Purification Wash Buffer: DNA Purification Wash Buffer のボトルに、100%エタノールを 40 mL 添加する (最終濃度 80%)。4℃で 6 ヶ月保存可能。

Stop Solution: Stop Solution に、Glycogen 11 μL と RNase A 22 μL を添加する。4℃で 6 ヶ月保存可能。1 反応あたり 40 μL を使用する。

以下のバッファーは、反応数に応じて用時調製してください。
バッファー名構成品

1反応8反応24反応

保存条件*Complete Nuclei Isolation Buffer: 1 サンプルあたり 100 µL が必要となります。
Nuclei Isolation Buffer のボトル (2.7 mL) に 1 M Spermidine を 1.4 µL 添加する (調製後 4℃で 6ヶ月保管可能)。 使用時に、1 mL あたり 10 µL の 100X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) を添加する (Step 13)。

1 日目（約３時間）
Concanavalin A Beads の準備（20 - 30 分）
NOTE: 緩衝液等は氷上に置きますが、特に記載のない限り、サンプルの取り扱いは室温で行います。
1.

Concanavalin A Beads が入ったチューブをボルテックスなどにより懸濁する。

2.

キット付属の 0.2 mL ストリップチューブに、沈殿しないように混ぜながら Concanavalin ABeads を 10 μL ずつ分注する。

3.

マグネットラック/スタンドに置く。

4.

ビーズが集まったら、上清を除く。

5.

マグネットラック/スタンドからチューブを外し、1x6.

ピペッティングによりビーズを穏やかに懸濁させる。

7.

チューブを再びマグネットラック/スタンドに置き、ビーズを集め、上清を除く。

8.

5～7 の操作をもう一度繰り返す (合計 2 回の洗浄)。

9.

上清を除いたチューブに 1x Binding Buffer を 10 μL 加えて、使用するまで氷上で保管する。

Binding Buffer を 100 μL 加える。

細胞の準備（約 10 分）
10. 新鮮な細胞、もしくは緩慢凍結した細胞 5,000-500,000 個を用意する(接着細胞の場合は、細胞の剥離・分散に TrypLE Express の使用を推奨)。緩慢凍結した細胞は、37℃のウォーターバスまたはヒートブロックで解凍させる。
11. 室温、600 x g、３分間遠心する。
12. 上清を除く。

核の調製（推奨オプション）（約 15 分）13. 1 反応あたり 100 μL の Complete Nuclei Isolation Buffer を用意する (Nuclei Isolation
Buffer 1 mL + Protease Inhibitor Cocktail 10 μL+ 1M Spermidine 0.5 μL)。
NOTE: Nuclei Isolation Buffer のボトルに 1M Spermidine を 1.4 μL 添加し、4℃で６ヶ月保存することが可能です。使用前に Protease Inhibitor を添加してご利用ください(4 ページの『バッファーの調製』をご参照ください)。

14. 12 で回収した細胞に 100 μL の Nuclei Isolation Buffer を加え、ピペッティングまたは指先で軽くチューブをタッピングして穏やかに、かつ完全に再懸濁する。細胞は最大 500,000 個で、細胞数が少ない場合でも液量を変更する必要はない。
15. 細胞を氷上で 10 分間静置する。
16. 室温、600 x g、３分間遠心する。
17. 上清を除く。

細胞/核の洗浄（約 30 分）18. 沈殿した細胞もしくは核に、Complete Dig-Wash Buffer を 100 μL 加え、ピペッティングや指先で軽くチューブをタッピングして穏やかにかつ完全に再懸濁する。
19. 室温、600 x g、３分間遠心する。
20. 上清を除く。
21. 18 - 20 のステップをもう一度繰り返す (合計 2 回)。
NOTE: 細胞数が少なくペレットが見えない場合には、2 回目の洗浄ステップを省略可。
22. Complete Dig-Wash Buffer を 100 μL 加え、ピペッティングや指先で軽くチューブをタッピングして穏やかにかつ完全に再懸濁する。
23. 懸濁したサンプルを、Concanavalin A Beads の入ったチューブに移す。
24. ピペッティングで穏やかに撹拌する。
25. 室温で 10 分間静置する。
26. マグネットラック/スタンドに置く。
27. 上清を除く。
28. Antibody Buffer を 50 μL 加える。

抗体の結合（オーバーナイト）
29. 抗体 1 μg もしくは 1 μL を各サンプルに加える。
NOTE: コントロール実験として、添付の H3K4me3 抗体と Negative Control IgG, Rabbit を加えたサンプルも一緒に行うことを推奨。
30. ピペッティングで穏やかに懸濁する。
31. チューブのキャップがしっかり閉まっていることを確認し、ビーズがフタの溝などに詰まらないように Nutator や旋回シェーカーで 4℃、20 - 30 rpm、一晩撹拌する。

2 日目（約 5 時間）
細胞/核の洗浄（約 10 分）
1.

軽く遠心して液体を集めた後、室温でマグネットラック/スタンドに置く。

2.

上清を除く。

3.

Cell Permeabilization Buffer を 200 μL、沈殿が崩れないよう静かに加える。

4.

上清を除く。

5.

3～4 のステップを繰り返す(合計 2 回)。

ChIC/CUT&RUN pAG-MNase の結合(約 20 分)
6.

Cell Permeabilization Buffer を 50 μL 加える。

7.

ChIC/CUT&RUN pAG-MNase を 2.5 μL 加える。

8.

マグネットラック/スタンドからチューブを取り出し、ピペッティングでビーズを穏やかに懸濁させる。

9.

室温で 10 分間静置する。

10. マグネットラック/スタンドに置く。
11. 上清を除く。
12. 200 μL の Cell Permeabilization Buffer を沈殿が崩れないよう静かに加える。
13. 上清を除く。
14. 12～13 のステップを繰り返す (合計 2 回)。
15. Cell Permeabilization Buffer を 50 μL 加える。
16. 次のステップに進む前に、氷上で 2 分間静置しサンプルを冷やす。

クロマチンの断片化（約 3 時間）
17. 各サンプルに 0.1 M CaCl2 を 1 μL 加える。
18. ピペッティングでビーズを穏やかに懸濁させ、氷上に静置する。
19. 4℃、20～30 rpm の速度で、2 時間、Nutator もしくは旋回シェーカーで撹拌する。
20. 撹拌装置から取り出し、氷上に静置する。
21. 軽く遠心した後、Stop Solution を 40 μL 加える。
22. ピペッティングで穏やかに混ぜる。
23. サーマルサイクラーなどを使って 37℃で 10 分間温める (リッド温度 65℃)。このステップで、断片化されたクロマチンが溶液中に遊離する。
24. マグネットラック/スタンドに 30 秒以上静置する。

ChIC/CUT&RUN DNA の単離と精製 (約 45 分)
25. ビースが決して混入しないよう丁寧に、上清を新しい 1.5 mL の遠心チューブに移す。
NOTE: 次のステップでビーズや細胞が混入しないよう、上清を移したチューブをマグネットラック/スタンドに置くことを推奨。
26. (イソプロパノール添加済みの) DNA Purification Binding Buffer 450 μL を加える。もし、DNAPurification Binding Buffer の色が明るい黄色以外（紫色またはオレンジ色）に変わったら、3 M
Sodium Acetate を 5 μL 加える。
新しいキットの使用時には、DNA Purification Binding Buffer のボトルに終濃度 60%になるよう 100%イソプロパノール加えてください。
27. ボルテックスでよく混ぜ、室温で 1 分間静置する。
28. サンプルを DNA Purification Columns SF に移す。
29. 16,000 x g、1 分間遠心する。
30. フロースルーを捨てる。
31. カラムに DNA Purification Wash Buffer を 200 μL 加える。
32. 最大速度 (16,000 x g)、1 分間遠心する。
33. 31～32 を繰り返す (合計 2 回)。
34. フロースルーを捨てる。
35. 最大速度 (16,000 x g) で 1 分間遠心し、バッファーを完全に除く。
36. カラムを新しい Collection Tube に入れ替える (フタを除去した 1.5 mL 遠心チューブなど)。
37. 55 μL の DNA Purification Elution Buffer をカラムに加える。
38. 室温で 1 分間静置する。
39. 最大速度 (16,000 x g) で 1 分間遠心する。
40. 溶出した ChIC/CUT&RUN DNA を新しいチューブに移す。以上で NGS Library Preparation (次ページ)の準備が完了。すぐに NGS Library Preparation に進まない場合には、-80℃で保存する(最大 1 週間保存可能)。

(オプション) NGS Library の調製(約 3 時間) ― アクティブ・モティフのDNA Library Prep Kit for Illumina®を使用する場合
1.

アクティブ・モティフの DNA Library Prep Kit for Illumina® (Cat. No. 53220)のマニュアルにしたがう。NGS ライブラリー1 つの調製に対し、ChIC/CUT&RUN Assay Kit で得たサンプル溶出液を 39 µL 使用。
マニュアル：https://www.activemotif.com/documents/2292.pdf※ 上記のライブラリーキットの使用には別途 Dual Index Primers Set 1 for Illumina® (Cat. No.
53221)または Dual Index Primers Set 2 for Illumina® (Cat. No. 53222)が必要です。

(オプション) NGS Library の調製(約 3 時間) ― NEB 社の NEBNext®
Ultra™ II for DNA Library Prep Kit for Illumina®を使用する場合
1.

NEBNext® Ultra™ II for DNA Library Prep for Illumina®のマニュアルに記載された手順に、下記のステップを追加すること。

重要！ 概ね NEBNext® Ultra™ II for DNA Library Prep Kit の手順に沿っていますが、いくつか異なるステップがあります。また、NEBNext Multiplex Oligos for Illumina®も必要です。
2.

アダプターを 1:25 の濃度(0.6 µM)に希釈する。NEBNext® Ultra™ II for DNA library Prep Kitfor Illumina®の Step 2.1 参照。

3.

Step 3 の SPRI bead cleanup のステップでは、double-sided cleanup を行う。0.4X bead/sample ratio に続いて、1.6X bead/sample ratio で精製する。具体的には、まずサンプル容量に対して 0.4 倍量の SPRI beads を加える(3A.2)。その後、上清に 1.2 倍量の SPRI beads を加えて精製する(3A.6)。
※NEB キットのマニュアル Step 3A.1 から 3A.9 を実行します。Step 3B は実行しないでください。

Note:

サンプルの粘性が高いと、予想量からずれる可能性があります。サンプル量は SPRI cleanupの前に測定してください。

4.

Step 3A.10 2 回の洗浄後、チューブを軽く遠心してマグネットに戻し、エタノールを確実に除く。

5.

Step 3A.12 溶出は、17 μL の DNA Purification Elution Buffer で行う。

6.

Step 4 にしたがい、12 サイクルの PCR で CUT&RUN ライブラリーを増幅する。
※使用する Multiplex Oligos Primer Set の説明書にしたがってください。

7.

PCR 増幅後、double-sided SPRI bead cleanup を行う。0.4X bead/sample ratio に続けて、1.2X bead/sample ratio で精製する。
A.

50 μL の PCR 産物に対して 20 μL の SPRI beads を加える(0.4x)。ピペッティング 10 回程度で混ぜる。

B.

室温で 5 分間静置する。

C.

マグネットラック/スタンドにセットし、5 分間静置する。

D. 上清を新しいチューブに移す。ビーズは廃棄する。
E.

上清に 40 μL の SPRI beads を加える (1.2X: 50 × (1.2 – 0.4) = 40)。10 回程度ピペッ
ティングして混ぜる。

F.

室温で 5 分間静置した後、マグネットラック/スタンドにセットし、5 分間静置する。

G. 上清を除く。
H. チューブをマグネットラック/スタンドに置いたまま、80%エタノールを 200 μL 静かに加えて洗浄する。
I.

上清を除く。

J.

7H – 7I を繰り返す (合計 2 回)。

K.

P10 ピペットを使って、残存するエタノールを確実に取り除く。室温で 5 分程度乾燥させる(輝いているビーズがつや消しになるほどの過剰な乾燥はさけること)。

L.

チューブをマグネットラック/スタンドから取り外し、DNA purification Elution Buffer を22 μL 加える。

M. 室温で 1 分間静置する。
N. マグネットラック/スタンドにセットし、室温で 5 分間静置する。
O. 上清を新しいチューブに回収する(約 20 μL)。Illumina プラットフォームでシーケンシングするまで-20℃で保存する。

References

トラブルシューティングガイド
問題/疑問

対処方法
ペレットは見えない場合もあります。

核ペレットが見えない

ペレットがチューブのどの位置にあるべきかが分かるように、遠心操作では必ずチューブのキャップの向きを揃えてセットし、注意深く進めてください。

推奨されるシーケンス深度

標的分子が転写因子の場合は、2500 万リードを推奨します。ヒストン
修飾の中には 200 万リードまで下げることが可能な場合があります。

標的分子が転写因子の場

50 万個の細胞を用いて、CUT&RUN 検証済み抗体を使用することを合に必要な細胞数推奨します。
必ず生細胞を用いてください。

バックグラウンドが高いCountess II のような自動細胞計数法、またはトリパンブルー染色と血球計数装置により、細胞／核が無傷であることを確認してください。

ネガティブコントロールでライ

はい、ネガティブコントロール IgG を使用してライブラリーが作製可能でブラリーを作製できますか？

す。

SPRI ビーズがペレットにならない、または時間がかかるマグネットバーを使い、SPRI ビーズをチューブの上部に向かってペレット化することから始め、徐々にチューブの下部に向かって移動させます。その後、チューブをマグネットラック/スタンドの上に置きます。

関連製品
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CUT&RUN Spike-In Control (Cat. No. 53183)
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DNA Library Prep Kit for Illumina® (Cat. No. 53220)
DNA Library Prep Kit for Illumina®は、アクティブ・モティフの ChIC/CUT&RUN Assay Kit などで得られた dsDNA テンプレート用に最適化されているため、効率的なライブラリー調製が可能です。また、 DNA Library Prep Kit には 48 反応分のライブラリー調製試薬と DNA 精製・サイズセレクションを行うための SPRI 磁性ビーズ試薬が含まれています。

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Dual Index Primers Set 1 (Cat. No. 53221) / Dual Index Primers Set 2 (Cat. No.
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各インデックスプライマーセットは互いに異なる配列を有し、Illumina シーケンサーシステムのフローセルでそれぞれ最大 48 反応までのマルチプレックスが可能なため、合わせて最大 96 反応までのマルチプレックスが可能です。

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