学位論文内容の要旨
博士の専攻分野の名称

博士（医 学）

氏 名

寺下 勝巳

学 位 論 文 題 名
肝内胆管癌における上皮間葉転換に関する分子の発現と臨床病理学的研究(Studies on EMT-related molecules in intrahepatic cholangiocarcinoma.)【背景と目的】肝内胆管癌 (Intrahepatic cholangiocarcinoma :ICC) は胆管の二次分枝及びその末梢の胆管上皮から発生する悪性腫瘍と定義されている。肝原発癌の中で肝細胞癌に次いで二番目に多く、本邦では約10%程度と比較的稀であるが、国際的にも肝内胆管癌の発症は増加を辿っている。有効的な治療は外科的切除であるが、手術根治後も高頻度に再発転移を来し、予後不良な癌腫の一つである。肝内またはリンパ節、他臓器へ高頻度に転移再発し、これらが予後規定因子となる場合が多いにも関わらず、その分子機構は不明
で更に切除不能例の肝内胆管癌症例に対して有効な化学療法は確立されていない。肝内胆管癌の転移再発、癌の進展に関与する分子機構を解明することは、いまだ予後不良な肝内胆管癌における有効的な治療の開発や新たなbiomarkerの同定に導く重要な課題である。
Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT :上皮間葉転換) は上皮細胞が間葉系様細胞に形態変化する現象であり、初期胚発生、器官形成過程で必須の現象であると考えられている。一方、EMTの獲得が細胞運動性の亢進や細胞外基質の変化をもたらすことから、癌細胞の浸潤、転移に関する重要な機序として近年注目されている。徐々にEMTを誘導するいくつかの転写因子は同定され、そのうちの一つにZEB1が挙げられる。ZEB1の重要な特徴として
E-cadherinの喪失があり、様々な経路でEMTに関わるkey moleculeと考えられている。EMT 関連分子の発現が、多臓器癌の予後、浸潤、転移能に関する臨床病理学的因子と相関することが多数報告されており、更に肝内胆管癌においてもEMT関連分子の高発現が予後と相関することが報告されている。しかし、EMT関連分子の肝内胆管癌における症例数は比較的少なく、EMTのmaster moleculeであるZEB1についての報告はない。本研究は、肝内胆管癌の悪性度進展、転移再発の機構としてEMTに注目し、肝内胆管癌におけるにおけるZEB1を始めとしたEMT関連分子 (E-cadherin, vimentin, claudin1, CD44) について網羅的に免疫組織学的染色を行い、肝内胆管癌におけるにおけるEMTの臨床病理学的意義を明らかにする事を目的とした。
【対象と方法】
1996 年から 2012 年に北海道大学病院（以下当院）、他 4 施設で切除された肝内胆管癌 102症例とした。適格基準は病理学的に典型的に肝内胆管細胞癌で腺癌と診断され、臨床病理学的に術後経過を確認された症例を検討材料とした。除外基準として、術前に抗癌剤や放射線治療を施行していない症例は除外とした。観察期間の中央値は 35 か月(3-170 か月)であった。EMT 関連マーカー抗体として，EMT 誘導転写因子である ZEB1，Claudin-1 の 2 種類，上皮系マーカーの E-cadherin，間葉系マーカーの vimentin、幹細胞マーカーの CD44、計 5種類の抗体で検討を行った。免疫組織化学染色は FFPE ブロックより作製した wholesection を用い、その選択は病変部の辺縁で非病変部を共に含むもので、免疫組織化学染色を施行した。鏡検は患者臨床情報を確認せず、病理専門医 2 名と共に評価した。腫瘍細胞の免疫組織染色については強度と比率を評価した。
強度は 4 つのスケール(0: 陰性，1+: 弱陽性，2+: 中陽性, 3+: 強陽性) で分類し、各々の強度が切片内の病変部においてどれくらいの割合を占めるか、p 0, p 1, p 2, p 3 (px: 強度 X の病変部の比率(%) p0 +p1 + p2 +p3

= 100 , 0≦p 0, p 1, p 2, p 3 ≦100) を評価する。Total score は次の計算式で t = p0 × 0 + p 1 × 1 + p 2 × 2 + p 3 × 3 で、計算した。ZEB1 の免疫組織染色について非癌部の血管内皮細胞を internal control とした 15。同様に E-cadherin は非癌部の肝細胞の細胞膜、Vimentin は非癌部の肝細胞の細胞質、Claudin-1 は非癌部胆管上皮、CD44 は非癌部門脈域のリンパ球とした。
【結果】肝内胆管癌の腫瘍部における ZEB1, E-cadherin, Vimentin, Claudin-1, CD44 の発現は、症例全体の 46.1%, 43.1%, 44.1%, 75.5%，14.7%に認めた。癌細胞の核膜に発現する ZEB1 であるが、score の中央値は 40 (0-170)、E-cadherin の score 中央値は 140 (0-300)、
Claudin-1 は 80 (0-260)、Vimentin は 0(0-300)、CD44 は 0(0-270)であった。この中央値を cut-off として、それぞれの EMT 分子の発現の差異により、全症例を高発現群(high group)、低発現群(low group)の 2 群に群別した。
ZEB1 と EMT 関連分子の発現の相関性について、ZEB1 の発現は E-cadherin と逆相関(p=0.004)、Vimentin と同相関(p=0.022)を示した。Claudin-1 と CD44 の発現に有意な相関を認めなかった。
EMT 関連分子の発現と臨床病理学的因子の関連について、ZEB1 の高発現は TNM 分類の進行癌 Stage IV (p=0.037)、低分化型腺癌 (p=0.017)、リンパ節転移 (p=0.024)、門脈浸潤(p=0.037)のある症例で多く認めた。E-cadherin では相関性のある因子を認めなかったが、vimentin の高発現症例では腫瘍径が大きく(p=0.007)、門脈腫瘍栓を有する傾向(p=0.027)を認めた。CD44 の高発現症例では肝内転移(p=0.045)、遠隔転移(p=0.045)を有する症例で関連を認めた。Claudin-1 の高発現症例では TNM 分類の進行癌 Stage IV (p=0.027)、リンパ節転移陽性症例(p=0.024)で関連を認めた。
EMT 関連分子の発現の差異に基づいた肝内胆管癌患者の術後生存期間について、ZEB1 高発現群、低発現群の術後 3 年生存率はそれぞれ 33.5%、64.9%であり、ZEB1 の高発現群は有意に予後不良であった(p=0.027)。E-cadherin について高発現群は予後が良好であり(p=0.041)、高発現群、低発現群の術後 3 年生存率はそれぞれ 58.8%、39.1%であった。
Vimentinでは高発現群は予後不良で(p=0.049)、高発現群、低発現群の術後 3 年生存率はそれぞれ39.8%、57.3%であった。Claudin-1 については、有意差はつかないものの高発現群は比較的予後良好の傾向があった。CD44 について高発現群は予後不良で(p=0.015)、高発現群、低発現群の術後 3 年生存率はそれぞれ 32.7%、54.2%であった。
肝内胆管癌における重要な予後因子について単変量、多変量解析を用いて検討した。まずログランク検定で単変量解析をしたところ臨床病理学的因子から性別、年齢、腫瘍個数、腫瘍径、分化度、リンパ節転移症例、門脈浸潤陽性症例、肝内転移症例、肝静脈浸潤陽性症例で有意に予後不良因子として抽出され、今回検討した分子についても、ZEB1 高発現+CD44 高発現症例、E-cadherin 低発現症例、vimentin 高発現症例は、同様に予後不良の因子として抽出された。抽出された因子から多変量解析を行ったところ、性別(Hazard ratio
2.082, 95% CI; 1.063-4.075 P=0.032)、分化度(Hazard ratio 2.133, 95% CI; 1.129-4.031P=0.022)、リンパ節転移(Hazard ratio 1.974, 95% CI; 1.058-3.681 P=0.048)、肝内転移(Hazard ratio 2.570, 95% CI; 1.009-6.545 P=0.048)、ZEB1 高発現+CD44 高発現群(Hazardratio 2.200, 95% CI; 1.077-4.492 P=0.030)が術後生存期間に特に寄与する因子として抽出された。
【考察】
肝内胆管癌における ZEB1 の発現が EMT 関連分子である Vimentin の発現と同相関、E-cadherin の発現と逆相関を呈し、腫瘍の悪性度を示す臨床病理組織学的因子と相関し、肝内胆管癌における重要な marker である事を示した。更に ZEB1+CD44 が肝内胆管癌術後患者の予後を予測する 独立した指標となることを明らかにした。
【総括および結論】これらの結果は、肝内胆管癌術後患者において、術後サーベイランスの観点から有用な情報となりうる．また、今回の結果は、肝内胆管癌の新たな分子標的治療の開発や症例層別化の発展 にも寄与する可能性を秘めており、今後さらなる検討が必要と考えられた。