cAMPシグナルを標的にしたヒアルロン酸産生制御メカニズムの研究

横浜市立大学大学院医学研究科

石川義 弘、横 山詩子

Hyaluronic acid is a kind of mucopolysaccharide and exists abundantly as extracellular matrix in skin, article, lens andother organs. Skin folding as seen with aging is shown to be related to a decrease in the content of hyaluronic acid in skin.
Supplemental uptake of hyaluronic acid and addition to cosmetic ointment as well as direct skin injection of hyaluronic aciditself have been commonly employed. Further, in the treatment of article inflammation or lens injury, hyaluronic acid hasbeen used widely in medicine. It has been known that stimulation of G protein-coupled receptors is necessary to produce
hyaluronic acid, leading to increased cell migration or proliferation. However, the exact molecular mechanism of thissignal transduction in cells has remained undetermined. We have investigated the molecular mechanisms of hyaluronic acidproduction through cAMP signal in our laboratory. We have demonstrated that the activation of cAMP signal is essential andresulting increase in hyaluronic acid synthase enzyme expression follows. Because cAMP is produced by adenylyl cyclase,a membrane-bound enzyme that is activated by Gs protein, leading to the conversion of ATP to cAMP, it is necessary toinvestigate the molecular mechanisms of adenylyl cyclase activation that leads to increased hyaluronic acid production.
Adenylyl cyclase enzyme has many isoforms, from type I to IX, which show distinct tissue distribution and biochemicalproperties. Because the hyaluronic acid production has been best demonstrated in vascular smooth muscle cells in ourlaboratory, we examined adenylyl cyclase isoforms that are responsible for hyaluronic acid production. We also examinedthe effect of stimulating these adenylyl cyclase isoforms in an isoform-specific manner using forskolin derivatives that haveincreased specificity to these isoforms. We also examined the effect of overexpressing adenylyl cyclase isoforms in thesecells to explore changes in intracellular cell signaling as well as changes in hyaluronic acid production. Accordingly, we
found that specific isoforms of adenylyl cyclase are more responsible for hyaluronic acid production and thus cell migration
thereafter, and that these isoforms play an important role in not only hyaluronic acid production, but regulating vascularfunction such as vasodilatation or endothelial thickening. Our results have indicated that it is important to understand therole of each adenylyl cyclase to regulate hyaluronic acid production. Pharmacological stimulation of a specific isoform of
adenylyl cyclase may enable us to enhance the production of hyaluronic acid specifically. Development of such specificstimulator of adenylyl cyclase may be used in the treatment of conditions where decrease in hyaluronic content is involved.
Indeed, our results have suggested that such strategy is pharmacologically feasible.

１．緒はその細胞内シグナルの制御は独立して行われているのか言は不明であった。

ヒアルロン酸はムコ多糖の一種であり、皮膚をはじめと我々の研究室では、G 蛋白共役型ホルモンによる cAMPして関節や硝子体などにおける細胞外器質として豊富に存シグナルの分子メカニズムを長年にわたって研究してきた在する。加齢に伴う皮膚のたるみやシワではヒアルロン酸が、最近の成果によればヒアルロン酸の産生制御には含有量の低下が関与しており、近年では健康補助食品としcAMP シグナルの活性化が必要であり、平滑筋細胞や繊維ての摂取や、化粧品の添加物としての使用、さらには美顔芽細胞においてヒアルロン酸産生酵素の一つである Has2術としてのヒアルロン酸注入が行われている。これ以外にの転写レベルでの亢進が重要な役割を果たしていることがも関節炎や角結膜上皮障害における治療など、幅広く医療わかった 1）。さらに cAMP シグナルの標的酵素として、従に利用されている。ヒアルロン酸の産生に G 蛋白共役型の来考えられていたプロテインキナーゼ A 以外に、Epac とホルモン刺激が関与することは以前より知られていたが、呼ばれる G 蛋白質調節因子が細胞遊走の調節に重要な役割その詳細なメカニズムは不明であった。G 蛋白共役型のホを果たしており、プロテインキナーゼ A と Epac に機能分ルモン刺激によってヒアルロン酸産生の亢進とともに、細担が存在することがわかってきた 2, 3）。このことは、ヒア胞増殖や遊走が亢進することが報告されてきたが、これらルロン酸産生と細胞遊走の制御メカニズムが異なる可能性の細胞機能を特異的に制御することが可能なのか、あるいを示唆する。
本申請では、G 蛋白共役型ホルモンによるアデニル酸シ*クラーゼの活性化が引き起こす cAMP シグナルがヒアルロン酸産生を如何に制御するかを検討し、血管平滑筋細胞
Regulation of hyaluronic acid production
via cAMP signal
Yoshihiro Ishikawa*, Utako YokoyamaYokohama City University Graduate
School of Medicineを含めて細胞外器質の産生を特異的に制御する酵素サブタイプを含めた検討をおこなった。さらに特定のアデニル酸シクラーゼサブタイプの制御剤が、将来的な薬物開発の対象となりうるかについて検討した。

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２．実

イルスを作製した。作成に当たっては AdenoX adenovirus験construction kit（Clontech, Tokyo, Japan）を用いた。6 型

HAS 発現の定量

アデニル酸シクラーゼを発現するアデノウイルスにおいてトータル RNA はプールされたラット組織から抽出した。
cDNA の合成および RT-PCR は過去の文献に記載された方は、サイトメガロウイルスプロモーターを用いた。作成に当たっては homologous recombination method を用いた。

法を用いた。PCR 増幅に用いたプライマーの塩基配列はラットのものを用い、遺伝子バンクからの配列を元に合成

cAMP 産生能の検討した。定量的な RTPCR 反応においては、それぞれのテン細胞を 24 穴プレートにおいて培養し、24 時間の血清無プレートは少なくとも３回の定量を行い、再現性を検討し添加条件のあとに cAMP 産生を定量した。定量に当たった。それぞれの遺伝子の定量に当たっては GAPDH をコンては事前に 0.2 mM IBMXを添加し 20 分間の preincubation

トロールとして用いた。GAPDH の定量に当たっては、市をおこなった後に、各試薬を加えてさらに 10 分間 incubate

販のキットである TaqMan Rodent GAPDH control reagent

し た。 産 生 反 応 は 培 養 液 を 除 去 し、400 µl の ice-coldkit（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いた。

trichloroacetic acid（7.5 %）を各穴に加えて終了させた。
サンプルは10 µl acetyc anhydride, 20 µl triethylamine（Sigma）

細胞培養を加えてアセチル化させた。これらのサンプルを 50 µl 取

Wister ラットの血管平滑筋細胞を初代培養して使用しり 出 し、12,000 cpm 125I-cAMP（Perkin Elmer, Waltham, MA）た。ラット胎生期 21 日を中心に採取した。組織片は切り

50 µl ウサギ血清 anti-cAMP 抗体（diluted 1 : 3000, Millipore,

刻まれ、800 µl の collagenase/dispase enzyme mixture をBillerica, MA）と４度の条件で一晩 incubation をおこなっ添加し、37 度にて 15 分間の消化をおこなった。細胞浮遊た。50 µl ヤギ抗ウサギ抗体（magnetic bead coated, QIAGEN,

液を遠心し、培養液を 4collagenase mixture II に変えてさTokyo）を 加 え て 室 温 条 件 化 で 揺 ら し な が ら １ 時 間ら に 37 度 に お い て 12 分 間 お こ な っ た。 細 胞 浮 遊 液 はincubate し た。Bound from free の 分 離 に お い て は、

growth media mixture に 移 さ れ、35 ｍ ｍ の Poly-L-Lysin

Millipore フィルターを用いておこなった。残存した放射皿を用いて培養を行った。培養期待は 5% CO2 の条件であ能活性を測定し、標準曲線と対比することにより cAMPり、37 度にて施行した。細胞はそれぞれ 4 − 6 回の継代培産生量の定量をおこなった。cAMP 産生量は蛋白濃度で補養中に使用し、alpha-smooth muscle actin の発現が 99％正した。

以上に見られることを確認して使用した。

PKA 活性
ヒアルロン酸の定量

PKA 活性はアッセイキットを用いて測定した（StressGen

ヒアルロン酸は細胞培養液中に放出された量を定量した。
牛軟骨から抽出されたヒアルロン酸結合蛋白をラテックス

Biotechnologies, Ann Arbor, MI）。測定法の詳細は製造者のプロトコールに従った。にラベルし、凝集を指標として定量することで行った

３．結（LPIA Ace, Fujirebio Inc, Tokyo）。ヒアルロン酸の定量は duplicate で 製 造 者 の プ ロ ト コ ー ル に 基 づ い て 行 い、

PGE-EP4 シグナルによるヒアルロン酸産生の制御

Hitachi 7070 analysis system（Hitachi, Tokyo）を用いて800nm における吸光度分析をおこなった。

果

我々はヒアルロン酸の産生能力を、これまでに検討してきた血管平滑筋細胞を用いて調べた。これまでの研究結果から、動脈管などから採取された血管平滑筋細胞におけるsiRNA 実験

ヒアルロン酸産生能力が高いことがわかっている。プロス

二重鎖 siRNA をアデニル酸シクラーゼ２、５、および 6

タグランジン刺激によって、ヒアルロン酸産生が亢進する型の塩基配列から特定部分を選択しておこなった。コント

ことは従来の結果からも示唆されているが、はたしてどのロールには QIAGEN にて作製されたものを用いた。製造

ようなサブタイプによる産生が最も強いのかを検討した。

者 の 推 奨 す る プ ロ ト コ ー ル に 基 づ い て、siRNA（300PGE1, PGE2, および EP4 アゴニストである ONO-AE1-329pmol）、Lipofectamin RNAiMAX（Invitrogen, San Diego,を用いて刺激したところ、容量依存性にヒアルロン酸産生CA）を用いた。

が増加した。最終的な増加は 48 時間後の定量において判断した。PGE1 刺激によるヒアルロン酸の産生は EP4 アン

アデノウイルス実験タゴニストである ONO-AE3-208 によって阻害された。一ラット 2 型アデニル酸シクラーゼ全長 cDNA をシャトル

方で EP1 および EP3 に対する拮抗剤を使用しても抑制はベクターに組み込んで、同サブタイプを発現するアデノウ見られていなかった。これらの結果から EP4 による刺激− 92 −cAMP シグナルを標的にしたヒアルロン酸産生制御メカニズムの研究を培養し、刺激をおこなった。4、24、２日、4 日間におがヒアルロン酸の産生を引き起こすことが推測された。

けるヒアルロン酸の産生を比較したところ、時間依存性にcAMP 産生を介したヒアルロン酸産生の制御ヒアルロン酸産生が増加することがわかった。さらに EP4

上記の結果から、ヒアルロン酸産生において EP4 の刺アゴニストによるヒアルロン酸産生は、PKA の選択的阻激が重要であることが推測された。そこで、EP4 の選択的害によって抑制されたことから、EP4 刺激が cAMP の産な刺激剤である ONO-AE1-329 を用いて、血管平滑筋を刺生を上昇させ、PKA シグナルを賦活化することによって激し、用量依存性と時間依存性を検討することにより、ヒアルロン酸産生を上昇させるメカニズムが確認された。

ONO-AE1-329 によるヒアルロン酸産生効果を確認することとした（図１）。容量依存的な EP4 アゴニストによるヒヒアルロン酸産生の分子メカニズムアルロン酸産生の検討として、血管平滑筋細胞を培養条件ヒアルロン酸の産生に当たっては、これまでに３種類の下で EP4 の選択的なアゴニストである ONO-AE1-329 を 48ヒアルロン酸産生酵素の存在が知られている。そこで、時間に渡って添加し、ヒアルロン酸の産生を比較した。培EP4 を介したシグナル系において、どのサブタイプが関与養液中に浸出するヒアルロン酸を凝集法を用いて定量した。

しているのかを検討した。検討に当たっては、制御メカニいずれも容量依存性にヒアルロン酸産生が増加しているこズムとしてもっとも基本的な転写調節レベルでの制御が想とがわかった。さらに、時間依存的な EP4 アゴニストに定されたため、まずは RT-PCR を用いて、ｍ RNA の定量よるヒアルロン酸産生を検討した。上記と同様に EP4 アをおこなった。HAS1,HAS2, HAS3 の三つのサブタイプにゴニストである ONO-AE1-329 を用いて、血管平滑筋細胞特異的なプライマーを用いて RT-PCR による、それぞれの定 量 を お こ な っ た。EP4 選 択 的 な 刺 激 剤 で あ る ONOAE1-329 を 10− 6 M の濃度において、血管平滑筋を刺激した後に RNA を抽出し、選択的なプライマーを用いて定量を お こ な っ た と こ ろ、HAS1 お よ び HAS3 に 比 較 し て、HAS ２発現の圧倒的な増加が観察された（図２）。さらにこの結果を確認するために、時間依存的な HAS2 ｍ RNA
発 現 量 の 変 化 で 観 察 し た。ONO-AE1-329,−6

PDGF-BB のそれぞれを、10

図１．EP4 アゴニストによるヒアルロン酸産生制御
A. 容量依存的な EP4 アゴニストによるヒアルロン酸産生。
血管平滑筋細胞を培養条件下で EP4 の選択的なアゴニストである ONO-AE1-329 を 48 時間に渡って添加し、ヒアルロン酸の産生を比較した。培養液中に浸出するヒアルロン酸を凝集法を用いて定量した。いずれも容量依存性にヒアルロン酸産生が増加している。
B. 時間依存的な EP4 アゴニストによるヒアルロン酸産生。
EP4 アゴニストである ONO-AE1-329 を用いて、血管平滑筋細胞を培養し、刺激をおこなった。4、24、２日、4 日間におけるヒアルロン酸の産生を比較した。

TGF ｂ、M, 10ng/ml, 10ng/ml の濃図２．EP4 アゴニストによるヒアルロン酸産生酵素発現の変化
A. RT-PCR に よって ヒ ア ル ロ ン 酸 産 生 酵 素 の サ ブタイ プ（HAS1,HAS2, HAS3）のｍ RNA 発現を定量した。EP4 選択的な刺激剤である ONO-AE1-329 を 10−６M の濃度において、血管平滑筋を刺激した後に RNA を抽出し、選択的なプライマーを用いて定量をおこなった。HAS1 および HAS3 に比較して、HAS ２発現の圧倒的な増加が観察された。
B. 時間依存的な HAS2 ｍ RNA 発現量の変化で観察した。ONOAE1-329, TGFb、PDGF-BB のそれぞれを、10−６M, 10 ng/ml, 10 ng/ml の濃度で刺激し、HAS2 の発現を RT-PCR において定量した。いずれも時間依存的に発 現を増加させたが、ONO-AE1-329 による増加効果が最も強力であった。

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度で刺激し、HAS ２の発現を RT-PCR において定量した。

４．考

い ず れ も 時 間 依 存 的 に 発 現 を 増 加 さ せ た が、ONO-察AE1-329 による増加効果が最も強力であることがわかった。

ヒアルロン酸は細胞外器質として様々な作用を持つこと

以上の結果から、ヒアルロン酸産生増強の分子メカニズが知られているが、その発現調節は十分わかっていない。

ムとして、EP4 刺激を介して PKA の活性化がおこり、こ我々は少なくとも血管平滑筋細胞によるヒアルロン酸産生れによる HAS2 の選択的な転写促進がおこり、最終的に血には EP4 刺激が重要な役割をはたし、EP4 によるアデニル管平滑筋細胞におけるヒアルロン酸分泌が促進されるメカ酸シクラーゼの活性化およびヒアルロン酸産生酵素の転写ニズムが想定された。

刺激を介して、ヒアルロン酸の産生が上昇することを示した。

平滑筋におけるアデニル酸シクラーゼサブタイプの発現

これまでの実験で得られた結果で重要と考えられること

EP4 刺激は G 蛋白質共役型受容体の活性化をへて、Gsは、これらの刺激が細胞内シグナル系をへて発揮されるが、蛋白質の活性化、および引き続くアデニル酸シクラーゼの関与する酵素サブタイプが特定されたことである。受容体活性化を経て cAMP 産生を引き起こす。この下流に存在レベルでは EP4 が主要な役割を果たし、その下流にあるする PKA 刺激が HAS ２の転写促進因子として働くことがアデニル酸シクラーゼのサブタイプに関しては 6 型サブタわかった。しかるに血管平滑筋には多数のアデニル酸シクイプが重要な役割をになっている。さらに大切なことはヒラーゼサブタイプが発現している。我々は特定のアデニルアルロン酸産生酵素サブタイプであり、3 種のサブタイプ酸シクラーゼサブタイプがこのプロセスに重要な役割を果の中でも 2 型のみが EP4 刺激によって転写活性が増強され、たす仮説をたてた。そこで定量的な RT-PCR 法を用いて、ヒアルロン酸産生を亢進させることがわかった。これらのどのアデニル酸シクラーゼサブタイプが血管平滑筋細胞に結果から、ヒアルロン酸産生の分子メカニズムとして、高多く発現するかを検討した。

度に分化した特定のサブタイプを通じたシグナル伝達系がRT-PCR の結果から、平滑筋細胞には１および 8 型を除細胞内で構築されている可能性がしめされた。

くすべてのサブタイプの発現が検出された。この中ではと細胞内には多数の酵素が存在し、その酵素サブタイプにくに２および 6 型の発現がおおいことがわかった。そこでは複数存在することが知られている。シグナル伝達の過程

２および 6 型のそれぞれの関与を検討するために、siRNAにおいては、異なったサブタイプが相補的に作用し、同じの手法を用いて、それぞれのアデニル酸シクラーゼサブタような結果を生む場合と、それぞれのサブタイプが異なっイプの欠損実験をおこなった。いずれのサブタイプの欠損た機能を担っている場合がある。PGE 刺激によるヒアルにおいても PGE １を介した cAMP 産生能は顕著な低下をロン酸産生に関しては後者の可能性が考えられる。EP4、示した。このことから両サブタイプは、いずれも PGE1 刺アデニル酸シクラーゼ 6 型、およびヒアルロン酸産生酵素激の下流に存在することが推測された。そこでこれらのサ2 型のそれぞれが機能的に共役していることがわかったが、ブタイプによるヒアルロン酸産生を比較したところ、6 型その共役を可能とするメカニズムは不明である。いわゆるサブタイプの欠損時においてヒアルロン酸産生能が低下す

カベオリンなどのスカフォールド蛋白質などを通じて、特るが、2 型ないし 5 型の欠損時にはそのような産生低下は定のサブタイプ蛋白が重合している可能性も考えられる。

みられないことがわかった。

そのような検討に当たっては免疫沈降法や細胞における免さらにアデノウイルスをもちいて、2 型および 6 型サブ疫染色法を用いた検討が必要であると考えられ、今後の検タイプの過大発現をおこしたところ、2 型サブタイプの過討課題である。また、今回の研究結果から、特定のアデニ大発現においてはヒアルロン酸産生は上昇しなかったが、ル酸シクラーゼサブタイプを制御する活性薬理物質が、ヒ6 型サブタイプの過大発現によってヒアルロン酸産生が顕

アルロン酸欠乏組織などにおけるヒアルロン酸産生促進に著に増加することがわかった。以上の結果から、血管平滑応用できる可能性が示された。皮膚科学や整形外科分野を筋細胞に発現する多数のアデニル酸シクラーゼサブタイプ含めて、今後どのような分野において活用できるのかを検の中でも、6 型サブタイプが EP4 刺激によるヒアルロン酸討する必要がある。

産生に重要な役割を果たしていることが想定された。
さらに２型および６型に選択的な刺激薬を用いた実験か（引用文献）

らは、アデノウイルスによるアデニル酸シクラーゼ蛋白発１）Yokoyama U, Minamisawa S, Hong Q, Segi-Nishida

現と同等の効果が、アデニル 酸シクラーゼ選択的刺激薬

E, Ghatak S, Iwasaki S, Iwamoto M, Misra S, Tamura

によって得られることがわかった。このことは、アデノウ

K, Hori H, Yokota S, Tool BP, Sugimoto Y, andイルスを使うことなく、薬理学的な手法を用いることによIshikawa Y: Chronic activation of the prostaglandin

り、ヒアルロン酸産生を制御できる可能性を示唆する。

receptor EP4 promotes hyaluronan-mediated− 94 −

cAMP シグナルを標的にしたヒアルロン酸産生制御メカニズムの研究

neointimal formation in the ductus arteriosus. J. Clin.
Invest. 116; 3026-3034, 2006３）Yokoyama U, Minamisawa S, Quan H, Akaike T,Suzuki S, Jin M, Jiao Q, Watanabe M, Otsu K, Iwasaki

２）Ulucan C, Wang X, Baljinnyam E, Bai Y-Z, Okumura

S, Nishimaki S, Sato M, and Ishikawa Y: PGE2-S, Sato M, Minamisawa S, Hirotani S, and Ishikawa Y:

activated Epac promotes neointimal cushin formation

Developmental changes in gene expression of Epacof the rat ductus arteriosus by a process distinct fromand its upregulation in myocardial hypertrophy. Am.

that of PKA. J. Biol. Chem. 283; 28702-28709, 2008

J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 293; H1662-72, 2007

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