１．委 託 事 業 名 ：多段階式硝化反応を用いた食品加工廃棄物からの植物栽培用液肥製造システムの開発

２．委託事業者名：

委託団体： 株式会社アイエイアイ
連携大学： 静岡大学工学部化学バイオ工学科教授

二又 裕之、助教

田代 陽介

３．研究成果概要：【はじめに】
慣行栽培に用いられる化学合成肥料は、無機肥料であり、直接植物に吸収される為、定量的な栽培管理が可能である。一方で有機栽培に用いられる堆肥や油粕、米ぬか等の有機質肥料は、土壌微生物の活動によって無機化された後、植物に吸収される。このように有機栽培は、微生物の活動に依存しており、それ故に安定的な作物生産が難しい。しかし慣行栽培で用いられる化学合成肥料は、天然鉱物や化石燃料を使用して製造されており、地球資源の保全を考慮すると、定量的な栽培管理が可能な有機質由来の液肥の開発が望まれる。
【現状】
魚の煮汁の有機態窒素から安定して硝酸イオンを製造する「多段階式硝化反応システム」の開発に取り組んでいる。本システムは、有機態窒素から硝酸イオンまでの無機化過程に複数の異なる微生物群が関与する為、微生物群別にリアクターを設け、連続して反応を行うものである。県内食品加工工場から生じる魚の煮汁は、有機態窒素を多く含んでいる事から、原料として使用している。また併せてトマト水耕栽培の液肥として利用する栽培技術の開発にも取り組んでいる。（特願 2015-143431）【目的】
本事業では、トマト周年生産に向けた「多段階式硝化システム」の製作と有機質由来の液肥製造、そして本システムにて硝化を担う微生物群集（種類)の構造と機能について解析・理解することを目的とする。
【研究結果および成果】１．多段階式硝化システム試作機
魚煮汁を微生物群によって安定的に肥料化するシステムを試作した（図１）。本システムの特徴として、従属栄養細菌群によって有機物からアンモニウムイオンまで変換するアンモニア化リアクターと硝化細菌群によってアンモニウムイオンを硝酸イオンに変換する硝化リアクターで構成されている。各反応に専用のリアクターを設ける事で、製造管理を単純化し、かつ反応を担う微生物の菌叢変化の抑制を図っている。また各リアク
ターは、土壌由来の従属栄養細菌群、硝化細菌群をそれぞれ固定した担体が入っており、それらの活動に影響－1－＜図１. 多段階式硝化システム＞

を与える溶存酸素や pH、温度を制御する仕様となっている（図２）。特に溶存酸素、pH については、酸素濃縮機および pH 調整機を導入する事で安定した制御を行う事が出来ている。また作業マニュアルをもとに一般主婦のパート社員が作業を行っており、簡単に操作できる仕様となっている。

＜図２．システム概要＞

２．硝化液製造マニュアルの構築
１）リアクター管理条件
次に上記の多段階式硝化システム試作機を用いて硝化液製造マニュアルの作成を行った。各アクターの条件を表 1 に示すとおりに設定し、マニュアルの作成を行った。

＜表 1．各リアクターの管理条件＞
項目

アンモニア化リアクター

硝酸化リアクター

温度

25±5℃

25±5℃

撹拌回転数

330 rpm390 rpm

溶存酸素濃度担体量（かさ体積）
液量
優位菌叢
反応液移送基準値 pH
反応時間

4mg/L以上

4mg/L以上

液量に対して30%(v/v)

液量に対して40%(v/v)

約220L

約340L

従属栄養細菌

硝化細菌

8.55.5

24時間24時間２）アンモニア化リアクター
アンモニア化リアクターに煮汁を水量 100L に対し、200g を添加して（500 倍希釈）、アンモニア化を試みた。その結果、24 時間以内に煮汁に含まれる有機態窒素が全てアンモニア化された。生産性を高める為、さらに高濃度である 333 倍、250 倍希釈液のアンモニア化を順次試み、現在 250 倍希釈液（有機態窒素量 約 52g/100L）までアンモニア化に成功している（図３）。
３）硝化リアクター
硝化リアクターにアンモニア化リアクターで製造したアンモニア化液を給液し、硝化液の製造（硝化）を試みた。その結果、24 時間以内にアンモニア態窒素が消失し、硝酸態窒素が生成された。アンモニア態窒素から硝酸態窒素への収率は約 50%である。
また硝化リアクターでは、通常、反応を担う硝化細菌によって pH が低下し、反応が遅延または停止する現象が生じるが、速やかに硝化させる為、アルカリ性の植物灰抽出液（パ－2－ームヤシ灰抽出液）を用いた pH の最適管理方法を構築した。これにより現在、煮汁 250倍希釈液で製造したアンモニア化液 100L（アンモニア態窒素 約 52g）を安定して硝化する事に成功している（図４）。なおパームヤシ灰は、有機 JAS 認証の天然物を使用している。

＜図３.

アンモニア化反応＞＜図４. 硝化反応＞※0h は添加したアンモニア態窒素量４）メンテナンス
開発試験を進める中でリアクター内の汚泥蓄積による通水性の低下や各種センサーへのバイオフィルム付着による制御異常が発生した。システムの安定性を長期的に維持する為、清掃等のメンテナンス方法を検討し、簡単に行える作業マニュアルを作成した。特にアンモニア化リアクターは汚泥の発生量が多くトラブルが発生したが、汚泥の除去作業を開始してから汚泥蓄積によるトラブル発生は見られていない。
３．微生物の解析
本システムの各リアクターの反応を担う微生物群集構造を時系列で解析するため、静岡大学実験室内において小規模のリアクターを構築した。使用したリアクターの容積は 5 L、魚煮汁および担体量の割合は実機と同等とした。
アンモニア化リアクターは、約１日から３日間で約 12 mM の NH4+-N を生産し、その変換効率は約 75%を示した。一方で、生成速度は 4 mM day-1 から 10 mM day-1 と変動し、変換活性は未だ安定していないことが示された。一方、硝化リアクターでは１回目の運転が終了したところであり、10 mM の NH4+-N が約 20 日間で消費され、最大で約 3 mM のNO2--N を経て、約 0.7 mM の NO3--N へと変換された。今後、集積培養を進めることで、実機レベルの硝化能力を達成できると予想される。
上記リアクターにおける微生物群集構造を、16S rRNA 遺伝子を標的にした変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）法を用いて解析した（図５）。同時に、実機リアクターの微生物群集構造と比較を行った。その結果、アンモニア化リアクターでは複数の優占微生物群によって構成されていた。これら優占微生物群には変遷が見られ、また、担体表面に形成されたバイオフィルムと培養液中の優占微生物群は多少異なっていた。また、実機の微生物群集構造と比較し、－3－＜図５. 微生物群集構造解析＞

同一の優占微生物および異なるものが観察され、リアクターサイズおよび馴養期間の差によるものと推察された。硝化リアクターでは、NH4+-N から NO2--N および NO2--N からNO3--N への初期と後期の３サンプルを用いて解析した。その結果、微生物群集構造の変化が確認され、微生物間で役割を分担していることが推察された。
４．液肥の窒素肥料成分
今回試作した液肥製造システムで製造した液肥を静岡県工業技術研究所へ分析を依頼した。その結果、硝酸イオン濃度 1,100mg/L（硝酸態窒素換算 249mg/L）、全窒素濃度 251mg/Lであった。硝酸イオンの窒素換算値と全窒素の値が同じであった為、液肥に含まれる窒素成分は高純度の硝酸イオンである事が確認された。
５．トマト栽培
現在、有機液肥の評価を目的としたトマト水耕栽培を行っている。本システムで製造した液肥をトマトに与え、生育や収量等のデータを継続的に取得している。
（図６）。

＜図６. 栽培試験の様子＞【まとめ】
魚煮汁から安定的に液肥を製造する「多段階式硝化反応システム」試作機を制作し、液肥製造マニュアルを構築した。本システムは、硝酸態窒素濃度 200mg/L 以上の液肥を安定的に製造する事が可能である。また、微生物群集構造解析を行い、各リアクターの微生物は、複数の優占微生物群により構成され、微生物間で役割を分担している事が推察された。
【今後】
本事業で開発した液肥製造技術をトマト生産施設へ導入し、化学合成肥料を使用しないトマト生産実証の計画を進める。さらに、本システムを用い、トマト以外の作物（イチゴなど）栽培に適した液肥製造技術の研究開発を進める。また、静岡大学工学部に引き続き協力頂き、微生物の菌叢、分離、クローンライブラリー、機能遺伝子の解析を進め、微生物群集の構造と機能を解明し、本システムの製品化を行う予定である。
【謝辞】
本事業を進めるにあたり、添加有機物の全窒素検査や本開発リアクターで培養している微生物の経時的菌叢解析を行って頂くと共に、多大なるご指導、ご助言を賜りました静岡県工業技術研究所及び沼津工業技術支援センターの皆様に誠意を表わすとともに厚く御礼申し上げます。

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