ChIP-IT Express

ChIP-IT® Express（商品番号 53008）
日本語簡易プロトコール

使用上の注意事項
本プロトコールは ChIP-IT Express（カタログ番号 53008）の英語版製品マニュアル（ver. F5）中のChIP 実験プロトコール部分を中心に作成したものです。ChIP 実験プロトコール以外の箇所は英語版製品マニュアル（ver.

F5）をご参照ください。英語版製品マニュアルは弊社

HPをご参照ください。（2020．8．19 改訂）-1Active MotifChIP-IT Express

クロマチン免疫沈降実験の概要
クロマチン免疫沈降（ChIP）はタンパク質－DNA 相互作用を研究するための強力な実験手法です。
この方法では、 無傷生細胞（Intact living Cell）をホルムアルデヒド（Formaldehyde）で固定することによって、タンパク質と DNA が架橋され、 タンパク質－DNA の相互作用が維持されます。次に、 超音波破砕または酵素処理により DNA を短く均一な長さに断片化し、 目的の DNA 結合タンパク質に対する特異的な抗体を用いてタンパク質－DNA 複合体を免疫沈降します。免疫沈降の後、 脱架橋し、Proteinase K 処理によりタンパク質を除去し、 DNA を回収します。その後回収された DNA を解析することによって、 目的のタンパク質が結合していた DNA を同定します。
ChIP アッセイ（ChIP Assay）はクロマチン生物学や転写制御の研究において極めて有用です。なぜなら、特定の DNA 領域にどのようなクロマチンタンパク質や転写因子が存在するのか、またヒストンにどのような修飾があるのかを決定できるからです。タンパク質－DNA 相互作用が保存されるため、ChIP アッセイの結果には染色体を取り巻く周囲の環境、染色体のトポロジー、細胞内の調節タンパク質の影響が反映されます。

ChIP-IT Express Kit の流れ-2Active MotifChIP-IT Express

ChIP-IT Express キット操作手順
本キット構成品以外に必要となる試薬や器具について英語版製品マニュアルで事前に確認してください。（英語版製品マニュアル 8 ページ参照）

A. 細胞の固定
以下のプロトコールでは、15 cm 培養ディッシュ 1 枚分の細胞（細胞数：約 1.5×107 個）を使用します。
（サンプル量が異なる場合には、英語版製品マニュアル Appendix-Section D を参考に、反応スケールを調節します。）以下のプロトコールには、細胞株や実験条件に応じて最適化されたクロマチン断片化条件が必要です。断片化条件の最適化が終わっていないときは、クロマチン断片化の条件検討を先に行う必要があります。その際は、クロマチン断片化条件検討方法（英語版製品マニュアル
Appendix-Section A-C）を参照してください。この条件検討には培養ディッシュ 3 枚分の細胞が必要です。この量の細胞を使用すると、複数の断片化条件を試すことができ、適切な条件を決定できます。条
件検討によって得られた条件を以下のプロトコール中で使用してください。

クロマチン断片化のヒント
1. ChIP 実験には、通常 200～1500 bp のサイズに断片化したクロマチンを使用します。
2. 一般的に、断片化の効率は、断片化処理時の液量を小さくすること、または V 底のチューブを使用することによって向上します。
3. クロマチン試料が気泡によって乳化（emulsified）すると断片化の効率は低下します。これを回避するには、超音波の強度をより低くする、強度を徐々に強くするという方法があります。もし、クロマチン試料が乳化した場合には、断片化処理を中断し、サンプルを小型遠心機で 4℃、8,000 rpm で 8 分間遠心してサンプルから空気を抜きます。
4. クロマチンが加熱変性するのを防ぐために、断片化処理は可能な限り氷上で実施し、超音波処理は断続的に行います（例えば、20 秒ソニケーション、氷上もしくは水上で 30 秒インキュベート、再び20 秒ソニケーションと繰り返す）。
5. プローブ型超音波破砕機を使用して断片化を行う場合には、プローブの先端を常に同じ高さ（チューブの底から約 5 mm）に維持することで、再現性の高い実験が可能です。

注意事項
以下の過程で使用する試薬の中には、予め protease inhibitors（PIC）や PMSF を添加する必要があります。そのためクロマチンの調製を始める前に、これらの試薬を解凍し（およそ室温で 30 分）、各バッファーを使用する直前に添加します。

-3Active MotifChIP-IT Express
1. 15 cm プレートで 70～80%の細胞密度で細胞を培養する。
↓2. 細胞を回収する直前に、以下の溶液を調整する。
a Fixation Solution: 0.54 ml の 37％ホルムアルデヒドを 20 ml の最小培地に添加し、よく撹拌する。その後室温に置く。
b 1x PBS solution: 2.33 ml の 10×PBS を 21 ml の滅菌水に添加し、氷上に置く。
c Glycine Stop-Fix Solution: 1 ml の 10×Glycine Buffer、1 ml の 10×PBS、8 ml の滅菌水を混合し、よく撹拌する。その後室温に置く。
d Cell Scraping Solution: 0.6 ml の 10×PBS を 5.4 ml の滅菌水で混合し、氷上に置く。
↓3. 培地を捨て、20 ml の Fixation Solution をそれぞれのプレートに加える。室温で 10 分間振とうしながらインキュベートする。
↓
4. Fixation Solution を捨て、10 ml の氷冷した 1×PBS でプレートを洗浄する。5 秒間プレートを振り動かした後、PBS を捨てる。
↓
5. 10 ml の Glycine Stop-Fix Solution を加え、固定反応を止める。プレートを回すようにして、全体に溶液を行き渡らせた後、5 分間室温で振とうする。
↓
6. Glycine Stop-Fix Solution を除去し、10 ml の氷冷した 1×PBS を加え、5 秒間振とうする。その後 PBS を捨てる。
↓
7. 30 µl の 100 mM PMSF を Cell Scraping Solution に加える。 5 ml の氷冷した Cell Scraping
Solution をプレートに加え、細胞を擦り取る（scrape）。1 ml のピペットを使い 15 ml のコニカルチューブに細胞を移す。
↓
8. 4℃、2,500 rpm で 10 分間遠心し、細胞を沈殿させる。
↓9. 上清を除去する。
※固定した細胞を冷凍保存することが可能。その際は 1 µl の 100 mM PMSF と 1 µl の PIC を加え、-80℃で保存する。

ソニケーションによるクロマチン断片化
1. （細胞を冷凍保存していた場合）細胞ペレットを氷上で解凍する。1 ml の氷冷した Lysis Buffer に 5µl の PIC と 5 µl の PMSF を添加し、細胞を再懸濁する。氷上で 30 分インキュベートする。

-4Active MotifChIP-IT Express↓
2. 細胞を氷冷したダウンス型ホモジェナイザー（※1）に移し、10 回ペストルを動かし、細胞を破砕する。顕微鏡を使い、細胞の破砕具合と核が細胞外に放出されていることを確認する。
↓
3. 細胞を 1.7 ml のチューブに移し、4℃、10 分、5,000 rpm にて遠心する。
↓
4. 上清を除去し、1.75 µl の PIC および 1.75 µl の PMSF を添加した 350 µl の Shearing Buffer に再懸濁し、氷上に静置する。
↓
5. ソニケーター（※2）を用いて DNA を断片化する（この条件は事前検討で最適化しておく、英語版製品マニュアル Appendix A-C 参照）。
↓
6. 4℃、10 分、15,000 rpm にて遠心する。上清を新しい 1.7 ml チューブへ移す（クロマチンは上清に含まれている）。このサンプルから 50 µl を使って、DNA 切断効率や濃度の定量を行う。残りは、すぐに次の実験に使用するか、-80℃で保存する。

クロマチン免疫沈降
B. 免疫沈降
1. （クロマチンを冷凍保存している場合）クロマチンを氷上で解凍する。このうち 10 µl をチューブに分取し（”Input DNA” : ChIP 実験後の PCR 解析用のコントロールとして使用）、4℃で保存する。6 時間以内に使用できない場合には、-20℃で保存すること。
↓
2. ChIP 反応液を以下の表に従って、1.7 ml チューブか PCR チューブに作成する。抗体は反応液に最後に加えること。
クロマ チンが60 ul以下の場合（ 1反応あたり）

クロマ チンが60 ulより多い場合（ 1反応あたり）

Protein G Magnetic Beads

25 ul

25 ul

ChIP Buffer 110 ul

20 ul

Sheared Chromatin (7-25 ug)

20-60 ul

61-100 ul

Protease Inhibitor Cocktail (PIC)

1 ul

2 ul

総量が100 ulになるように調整

総量が200 ulになるように調整

Antibody (最後に加える)

1-3 ug

1-3 ugTotal Volume

100 ul200 ul

試薬dH2 O↓

-5Active MotifChIP-IT Express
3. チューブにふたをして、ローテーターを使い 4℃で 4 時間インキュベートする（このステップはオーバーナイトで行うと、感度が上昇する）。
↓4. 軽く遠心して、溶液を容器の底に集める。
↓5. チューブを磁気スタンドに設置し、ビーズをチューブの側面に集める。
↓
6. 上清を除去する。
.

C. 磁気ビーズの洗浄
1.7 ml チューブ使用時
1. 800 µl の ChIP Buffer 1 で１回洗浄する。
↓
2. 800 µl の ChIP Buffer 2 で 2 回洗浄する。
↓
3. 洗浄後、ビーズを乱さないように可能な限り上清を除去する。
8 連 PCR チューブ使用時
1.

200 µl の ChIP Buffer1 で 3 回洗浄する。

↓
2.

200 µl の ChIP Buffer2 で 2 回洗浄する。

↓3.

洗浄後、ビーズを乱さないように可能な限り上清を除去する。

D. クロマチンの溶出と脱架橋および Proteinase K 処理
1. 洗浄したビーズを 50 µl の Elution Buffer AM2 に再懸濁する。
↓2. ローテーターを使い、室温で 15 分インキュベートする。
↓3. 軽く遠心し、溶液を容器の底に集める。
↓
4. 50 µl の Reverse Cross-linking Buffer を加え、ピペッティングして撹拌する。チューブを磁気スタンドに設置し、磁気ビーズを集める。

-6Active MotifChIP-IT Express↓
5. 上清にクロマチンが含まれているので、上清を新しいチューブに回収する。
↓
6. 10 µl の Input DNA（凍結している場合は氷上で解凍する）に、88 µl の ChIP Buffer2 と 2 µl の 5 MNaCl を加える。
↓
7. 95℃で 15 分、ChIP サンプルと Input DNA サンプルをインキュベートする。
↓
8. チューブが室温に戻った後に、軽く遠心して溶液を容器の底に集める。2 µl の Proteinase K を加える。
↓
9. チューブにふたをして、よく混和した後、37℃で 1 時間インキュベートする。インキュベート中に、Proteinase K Stop Solution を室温に置いておく。
↓10. チューブを室温に戻した後に、2 µl の Proteinase K Stop Solution を加える。軽く遠心して、溶液を容器の底に集める。Proteinase K Stop Solution 処理後の DNA はすぐに PCR（英語版製品マニュアル Protocol-PCR Analysis 以降を参照）に用いるか、-20℃で保存する。
※リアルタイムPCRをする場合は、DNAの精製が必要です。アクティブ・モティフのChromatin IP
DNA Purification Kit（商品コード 58002）の使用を推奨します（英語版製品マニ ュアル18ページ参照） 。

-7Active MotifChIP-IT Express（※1）ダウンス型ホモジェナイザー
ダウンス型ホモジェナイザーと隙間の狭いペストルを使用してください（Dounce homogenizer with thetight-fitting pestle（アクティブ・モティフ商品コード 40401 & 40415））。 超音波によるクロマチン断片化処理の前に、ホモジェナイザーで細胞を処理することを強く推奨します。ダウンス型ホモジェナイザーの使用は、ChIP 実験を成功させる可能性を大幅に向上させます。

（※2）超音波破砕機
アクティブ・モティフではプローブ型の超音波破砕機の使用を推奨します。弊社では EpiShear™
Sonicator with a 1/8” probe （カタログ番号 53051）および EpiShear™ Cooled Sonication Platform（カタログ番号 53080）を取扱っています。

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アクティブ・モティフ株式会社〒162-0824 東京都新宿区揚場町 2-21
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