口腔粘膜歯肉由来 iPS 細胞を用いた口腔化粧品の安全性評価の確立

東北大学大学院歯学研究科分子・再生歯科補綴学分野

江 草宏

The aim of this project is to develop bioengineered safety evaluation tools for oral care reagents using patient-derived
stem cells, which mimics structure and function of oral mucosa and tongue in vitro. We first generated iPS cells fromhuman gingival fibroblasts via transduction of Oct3/4, Sox2, Klf4 without using c-Myc oncogene. By this method, gingival
fibroblasts demonstrated a higher reprogramming efficiency than the skin fibroblasts, which have been conventionally usedfor the generation of iPS cells. We also generated dendritic cells from mouse iPS cells which showed antigen-presenting cellfunction. To fabricate tongue structure in vitro, we applied cyclic strain to mouse bone marrow-derived mesenchymal stem
cells. We found that application of cyclic strain greatly enhances the skeletal myogenesis of these stem cells with an alignedstructure. These findings would be important step toward the further application of these methods to apply development ofsafety evaluation tools for oral care reagents.

１．緒がある。

言

また，味覚器である舌は口腔内で外来刺激を繊細に感じ

近年，国民の歯や口腔内への関心の高まりに伴い，雑誌とる。特に口腔乾燥症（ドライマウス）の患者では，一般やインターネット上では口臭予防や歯を白くする効能を謳的な洗口液であってもこれに含まれるアルコール等の刺激った歯磨材やデンタルリンス（洗口液）などの商品が数多によって舌痛症を引き起こすため，舌に対する口腔化粧品く販売されている。これら商品の多くは，植物エキスなどの刺激を試験管内で評価するシステムは有用と思われる。

を配合して他の商品と区別化を図っているが，薬事法のもしかしながら，舌を構成している主な細胞は，細胞増殖能と医薬部外品の承認を得るには時間とコストがかかるため，力が乏しい骨格筋細胞や味蕾細胞であるため，必要な数の“口腔化粧品”として販売されている実態がある。このよ細胞を用意することは困難である。

うな状況下，口腔内に用いる化粧品や医薬品材料の安全性

これに応えるべく，近年では生物の巧妙な機能と構造をを，動物や健常者由来の細胞を用いるだけでなく，アレル基にして工業技術を創り出す生物工学（Bioengineering）

ギーなどの疾患を有している患者の細胞を用いて確実に評の研究が急速に進展している。また，複雑な構造をもつ粘価する技術の開発は重要な課題である。

膜や舌を試験管内で構築するためには，iPS 細胞や間葉系

口腔粘膜は免疫応答が活発に起こる軟組織である。その幹細胞のように発生学的により未分化な幹細胞を用いるこ

ため，本来ならば口腔化粧品の安全性評価は，個人に由来とが有用である 1）。iPS 細胞は，体細胞に数個の遺伝子をする口腔粘膜細胞を用いることが望ましい。口腔粘膜は，導入することでその記憶を初期化した人工多能性幹細胞で粘膜の最表層を覆う上皮層および線維芽細胞や樹状細胞，あり，将来的な組織工学の幹細胞源として大いに期待されT 細胞などを含む粘膜固有層から構成されており，これらている。我々は，歯科治療の過程で切除される機会の多いの細胞が外来刺激に対する免疫応答を担当している。した組織である，口腔粘膜歯肉の細胞を用いることで容易にがって，試験管内で口腔化粧品に対する口腔粘膜の応答をiPS 細胞が樹立可能であることを見出しており 2），この細再現するためには，患者由来の上皮細胞，線維芽細胞ある胞が歯科医学研究や歯科医療技術に有用なツールになり得

いは樹状細胞などの免疫を制御する細胞を用意する必要がるものと期待している 3）。

ある。特に，患者個人の細胞から抗原提示細胞として機能一方，骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）は，骨芽細胞，する樹状細胞を作製する技術は，口腔化粧品などの材料に軟骨細胞，脂肪細胞，筋細胞，神経細胞等様々な組織細胞対する粘膜の免疫応答の個人差に重要な知見を導く可能性に分化することが可能である。BMSC は，患者の骨髄液から比較的容易に採取でき，患者への侵襲も少ないため，現実的な組織再生の幹細胞源として期待されている 4）。しかDevelopment of safety evaluation tools
for oral care reagents using gingivaderived iPS cells

しながら，通常の培養条件では幹細胞を成熟した組織細胞

Hiroshi Egusa
Division of Molecular and Regenerative
Prost hodont ics , Tohoku University
Graduate School of Dentistry

因子や足場の要素に加えて，細胞配向や外的刺激などの生に分化誘導することは容易ではないため，近年では，成長体内における擬似環境を用いて，幹細胞を目的の組織細胞に確実に誘導する技術が注目されている 5 , 6）。

− 78 −

口腔粘膜歯肉由来 iPS 細胞を用いた口腔化粧品の安全性評価の確立

これらを背景に，本研究課題では，歯肉から採取した線た後，培地を交換し OVA を除去した。その後，樹状細胞維芽細胞から作製した iPS 細胞を，口腔粘膜を構成する細様細胞を OVA 特異的な OT-II マウス由来の CD 4 + T 細胞胞（上皮細胞，線維芽細胞，樹状細胞など）に分化誘導で（FACSAriaTM にて分離）と共に３日間培養し，細胞増殖きれば，個人由来の培養口腔粘膜として口腔化粧品などのを評価した。

安全性評価に用いることが可能ではないかと考えた。また，さらに，作製した iPS 細胞由来樹状細胞様細胞による抗BMSC から舌組織の細胞を誘導するために，骨格筋の特異原特異的な抗体産生の誘導を評価するため，iPS 細胞由来な細胞配向を試験管内で再現する方法に着目した。本研究

樹状細胞様細胞を雄性 C 57 BL/ 6 マウスの腹腔内に１週間の目的は，歯肉由来 iPS 細胞あるいは BMSC を用いて試験毎に３回注射した。さらに１週間後に OVA を経鼻投与し，管内で口腔粘膜あるいは舌を構成する細胞を作り出し，患その２週間後に血清および唾液中の抗体価を測定した。

者個人の体質を反映した細胞培養システムを構築し，口腔化粧品が口腔粘膜や舌に及ぼし得る為害作用を評価する技

2 . 3 BMSCを用いた骨格筋細胞への分化誘導技術の開発術に繋げることである。

２．実
2 .1

C 57 BL/ 6 マウスの大腿骨内腔より取り出した骨髄細胞から BMSC を分離培養し，単一細胞株を樹立する目的で

験

長期継代培養による自然不死化を誘導した。この不死化細患者歯肉を用いたiPS 細胞の樹立

胞からシリンダー法および限界希釈法を用いた細胞クロー

これまでに我々は，山中４因子（Oct 3 / 4，Sox 2，Klf 4，ニングによって単一細胞株を作製した。これらの細胞株のc-Myc）7）を用いた初期化効率は，マウス歯肉線維芽細胞

中で，著明な骨，軟骨および脂肪細胞への分化能が確認さの方が皮膚線維芽細胞よりも 7 倍以上高いことを明らかにれた多分化能細胞株を実験に使用した。BMSC の骨格筋分2）している 。ただし，これら初期化因子に含まれる c-Myc化誘導には，Muguruma ら 11）の報告にある培地を用いた。

は癌遺伝子であるため，これを用いずに iPS 細胞を作製す細胞に反復伸展刺激を与えるための細胞伸展装置を，カ8）ることが望ましい 。そこで，本研究課題ではヒト歯肉組スタムメイドで作製した。この細胞伸展装置では，細胞培織を用い，山中４因子から c-Myc を除いた３因子を導入す地中に設置されたシリコンシートの両端がクランプで挟まることで iPS 細胞の樹立を試みた。

れている。片方のクランプは固定され，もう一方のクラン歯科治療の過程で切除された患者歯肉由来の線維芽細胞

プが付属のモーターによって一軸方向に牽引を繰り返すこに，pMXs レ ト ロ ウ イ ル ス ベ ク タ ー を 用 い て Oct 3 / 4，とにより，シリコンシート上に播種した細胞に対して周期

Sox 2，Klf 4 遺 伝 子 を 導 入 し，mitomycin C で 処 理 し た的伸展刺激が加えられる構造になっている。シリコンシー

SNL フィーダー細胞上に播種した。形成された胚性幹細ト上に BMSC を播種し，骨格筋分化誘導培地中にて 10 %，胞（ES 細胞）様コロニーをクローニングし，その ES 細胞

0 . 17 Hz（10 回 / 1 分）の周期的伸展刺激を与え，骨格筋分様の性質を，RT-PCR 解析およびテラトーマ形成実験にて化を骨格筋細胞分化に特異的な遺伝子発現（RT-PCR 法）評価した。また，ヒト皮膚線維芽細胞を用いて同様の初期および蛋白質発現（免疫染色法）について検討した。

化誘導を行い，歯肉線維芽細胞の初期化効率と比較検討し３．結た。初期化効率の評価では，初期化誘導 50 ～ 60 日目に未分化 iPS 細胞のマーカーのひとつであるアルカリフォスファターゼ（ALP）について染色を行い，ALP 陽性の ES 細果

3 .1 c-Myc 癌遺伝子の導入を伴わないヒト歯肉由来iPS 細胞の樹立胞様コロニーの数から初期化効率を算出した。

患者歯肉から樹立したヒト歯肉線維芽細胞を，Oct 3 / 4，
Sox 2，Klf 4 の 3 因子の導入によって初期化を誘導した結果，歯肉由来 iPS 細胞から樹状細胞への分化誘導

誘導 50 日後に ES 細胞様のコロニーが出現した（図 1 -A）。

マウス ES 細胞から樹状細胞に分化誘導した報告 9 , 10）をこれらのコロニーから樹立した３つの iPS 細胞クローン株

参考に，iPS 細胞から樹状細胞への分化誘導を試みた。実は，いずれも ES 細胞のマーカー遺伝子である，NANOG，

験には，我々がこれまでに，マウス歯肉線維芽細胞から癌OCT 3 / 4，REX 1，SOX 2，TERT を ES 細胞と同程度に発2.2遺伝子 c-Myc を用いずに樹立した iPS 細胞 を用いた。誘現していた（図 1 -B）。テラトーマ形成実験の結果，樹立し導実験では，iPS 細胞を OP 9 細胞フィーダーと共培養し，た iPS 細胞株はマウス精巣に移植した 10 週間後に著明な腫CM-CSF を加えた。また，より成熟した樹状細胞様細胞を瘍形成を示し，腫瘍内部には神経組織（外胚葉由来），軟骨，得るために，TNF- α，IL- 4 および anti CD 40 を加えた。

筋肉，脂肪組織（中胚葉由来）および腸管上皮様組織（内2）歯肉由来 iPS 細胞から得られた樹状細胞様細胞が抗原提胚葉由来）の存在を認めた。以上の結果から，樹立した示能を示すか否かを検討する目的で，iPS 細胞由来樹状細iPS 細胞は三胚葉に由来する様々な細胞組織に分化するこ

胞様細胞に卵白アルブミン（OVA）を添加して一晩培養しとが可能な多能性幹細胞であることが示された（図 1 - C）。

− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

また，３名の患者から採取したヒト歯肉線維芽細胞およ群 は，OVA 非 添 加 群（ コ ン ト ロ ー ル 群 ）と 比 較 し て，びヒト皮膚線維芽細胞を用いて初期化効率の検討を行った

OVA 特異的 T 細胞受容体遺伝子導入マウスとして知られ結果，ヒト歯肉線維芽細胞は Oct 3 / 4，Sox 2，Klf 4 の３因ている OT-II マウス由来の CD 4 +T 細胞の数を増加させた子を導入した 60 日後に約 0 . 02 − 0 . 07 % の初期化効率を示（図 2 -B）。さらに，OVA を添加した iPS 細胞由来樹状細胞したのに対して，ヒト皮膚線維芽細胞は ES 細胞様のコロ様細胞をマウス腹腔内に投与することで，血清および唾液ニーを形成しなかった（図 1 -A）。

中における抗原特異的な抗体産生が著明に亢進した。

3.2

3 . 3 反復伸展刺激が BMSC の骨格筋細胞分化に及ぼす影響

iPS 細胞から樹状細胞への分化誘導

iPS 細胞を OP 9 細胞フィーダーと共培養し，CM-CSF を加えた結果，位相差顕微鏡下にて多くの樹状細胞特有の形3.3.1

細胞配向態を示す細胞を認めた。また，FACS 解析の結果，これらカスタムメイドの細胞伸展装置（図 3 -A）を用いて周期の iPS 細胞由来樹状細胞様細胞には，樹状細胞に特異的な的伸展環境下でマウス BMSC を 48 時間培養した結果，細細胞表面マーカー（CD 11 c 陽性）の発現を認めた（図 2 -A）。

胞および細胞骨格であるアクチン線維は伸展方向に対してiPS 細胞由来樹状細胞様細胞に OVA を添加した共培養並行に一様に配向した（図 3 -B）。一方，静的培養細胞では，

図１ c-Myc 導入を伴わないヒト歯肉線維芽細胞由来 iPS 細胞の樹立
A：初期化誘導 60 日後の ALP 染色像
B：RT-PCR 解析（GAPDG：内在性コントロール）
C：テラトーマ形成実験（HE 染色像）

図２ iPS 細胞から樹状細胞への分化誘導
A：樹状細胞マーカー（CD11c）陽性細胞の検出（FACS 解析）
B：抗原（OVA）提示後の iPS 細胞由来樹状細胞による OVA 特異的 CD4+ T 細胞の増殖− 80 −

口腔粘膜歯肉由来 iPS 細胞を用いた口腔化粧品の安全性評価の確立

細胞およびアクチン線維の配向は観察されなかった。また，

小胞体ストレスに関連する Glucose-regulated protein 78

周期的伸展刺激は BMSC を配向させる一方でその増殖を（BIP/GRP 78）の遺伝子発現を経時的に促進した（図 4 -A）。

抑制し，骨格筋細胞が成熟する過程の細胞融合に必要な細リアルタイム RT-PCR の結果，周期的伸展を与えて培養し胞同士の緊密な接触を促した。

た 5 および 7 日後における Myf 5 および MRF 4 の遺伝子発3.3.2

現は，静的培養の場合と比較して有意に増加していること

骨格筋分化

RT-PCR 解析の結果，周期的伸展刺激は骨格筋細胞分化が確認された（図 4 -B）。に特異的な遺伝子である Myf 5，myogenin，MRF 4 の発

また，周期的伸展刺激を 5 日間与えて培養した BMSC は，現を促進した。周期的伸展を与えて培養した BMSC は，細胞が融合した多核の骨格筋細胞様の像を示した（図 4 - C）。

平滑筋に特異的な遺伝子である myocaldin は発現しなかっ静的および周期的伸展培養５日後の細胞を，骨格筋関連タた。また，他の平滑筋マーカー遺伝子である a smooth

ンパク質 myogenin および myosin で免疫蛍光染色した結muscle actin（a - SMA）の発現は，周期的伸展培養によっ果，周期的伸展を与えた細胞は，静的に培養した細胞と比て低下した。一方，周期的伸展刺激は Tension-induced /較して，これらのタンパク質を強く発現している像が観察

inhibited proteins - 1（TIP 1）遺 伝 子 の 発 現 を 促 進 し，された（図 4 - D）。

TIP 3 遺伝子の発現を抑制した。また，周期的伸展刺激は

図３

反復伸展刺激が BMSC の細胞配向に及ぼす影響 12）

A：細胞伸展装置
B：伸展刺激 48 時間後の BMSC（左図：位相差顕微鏡像，右図：ファロイジン染色像）

図４ 反復伸展刺激が BMSC の骨格筋細胞分化に及ぼす影響 12）
A：RT-PCR 解析（static：静的培養。strain：伸展刺激培養）
B：リアルタイム RT-PCR 解析（*P<0.05，**P<0.01: ANOVA）
C：伸展刺激５日後（位相差顕微鏡像）
D：伸展刺激５日後（myosin 免疫蛍光染色像）− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014４．考用できる可能性に着目し，周期的伸展刺激が BMSC に及察ぼす影響を検討した。その結果，10 %，0 . 17 Hz の周期的iPS 細胞を口腔化粧品の安全性評価ツールに応用するた

伸展刺激は，マウス BMSC を伸展方向に配向し，骨格筋めには，iPS 細胞の資源となる組織の採取が容易で，患者特異的遺伝子およびタンパク質の発現を促すことにより骨にとって安全・低侵襲でなければならない。また，iPS 細格筋分化を促進することが明らかとなった。また，周期的胞を効率よく作製するためには，その資源となる組織の細伸展刺激による BMSC の骨格筋分化促進作用には，細胞胞は初期化されやすい性質を有していることが望ましい。

配向による細胞間の緊密な接触および機械的刺激に誘発さ歯肉は歯科治療の過程で切除される機会の多い組織であり，れた TIP 1 / 3 あるいは小胞体ストレス関連遺伝子などが関切除による創傷は良好な治癒経過をたどる。本研究によっ与している可能性が示唆された 12）。本研究で明らかとなって，従来 iPS 細胞作製に用いられている皮膚線維芽細胞でた周期的伸展刺激の骨格筋分化誘導作用は，これまで困難

は Oct 3 / 4，Sox 2，Klf 4 のみによる初期化誘導は困難であであった BMSC の効率的な骨格筋分化誘導を可能とするるが，ヒト歯肉線維芽細胞を用いることで癌遺伝子 c-Myc新たな技術として，組織工学に貢献することが期待される。

を用いないでも iPS 細胞の樹立が可能であることが示唆さ５．総れた。歯肉線維芽細胞は皮膚線維芽細胞と比較してテロメ

括ラーゼ活性に関与する Tert 遺伝子を高発現している 2）。しこの度のコスメトロジー研究の成果として，ヒト歯肉線たがって，歯肉線維芽細胞が初期化され易い一因として，維芽細胞を用いることで，癌遺伝子 c-Myc を用いずに iPS内在性の Tert の発現が関与している可能性が考えられる。

細胞を容易に樹立することが可能であることを明らかにし臨床現場で日常的に切除して捨てられている歯肉は，優れた。今後，この技術を基盤にして患者由来 iPS 細胞を用いた iPS 細胞の資源であり，将来の医療や薬剤の安全性評価た口腔粘膜および舌の構築を目指す予定である。また，マに利用される可能性のある魅力的な組織と言えるであろう。

ウス歯肉由来 iPS 細胞から抗原提示能を有する樹状細胞を樹状細胞は，口腔粘膜を含む様々な組織に常在する白血誘導することに成功した。今後は，ヒト iPS 細胞を用いて球の一種であり，抗原タンパク質を T 細胞に提示する機能同様の樹状細胞を作製し，口腔化粧品の生体安全性評価にをもつ細胞である。樹状細胞は，外来抗原に対する獲得免応用したいと考えている。さらに，周期的伸展刺激を用い疫応答を開始させるだけでなく，自己に対する免疫応答をて生体内の環境を模倣することにより，BMSC から効率的抑制する免疫学的自己寛容の維持，あるいは過剰な免疫応に骨格筋細胞を作製することが可能であることを明らかに

答を抑制する上でも重要な役割を果たしていると考えられした 12）。今後は，この技術を用いて，三次元的な骨格筋配10）ている 。したがって，口腔粘膜に存在する樹状細胞が，向細胞の積層化を試みると共に，患者由来 iPS 細胞を用い口腔化粧品などに対するアレルギー反応に関与している可ても同様の誘導が可能か否かを検討したい。本研究成果が，能性は否定できないため，患者由来の樹状細胞を用いて口将来的には患者個人から作製した培養口腔粘膜，樹状細胞腔化粧品に対する応答を評価することには意義があると思あるいは舌組織を用いて，口腔化粧品などに対する患者個われる。しかしながら，成熟した樹状細胞は増殖能をもた人の寛容性を評価するシステムの構築に繋がり，コスメトないため，患者から十分な数の樹状細胞を得ることは困難

ロジー研究の発展の一助となることを期待する。

である。iPS 細胞は自己複製能を有するため，多能性を保ったまま無限に増殖させることが可能である。したがって，

謝辞

無限に増殖できる iPS 細胞を材料として樹状細胞を作製す

本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりることが可能になれば，必要な数の患者由来の樹状細胞をご援助いただきましたことを深く感謝申し上げます。また，作製できるようになる。本研究において，マウス歯肉由来共同研究者として多大なる御協力を頂いた大阪大学大学院

iPS 細胞から抗原提示能を有する樹状細胞を誘導できるこ

歯学研究科・予防歯科学教室の関根伸一先生に深甚の謝意とが明らかとなった。今後，抗原提示細胞として機能するを表します。

樹状細胞を患者由来 iPS 細胞から作製することで，口腔化粧品などに対する患者特有の免疫応答の評価に重要な知見（引用文献）が導かれることが期待される。

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生体内の骨格筋組織は伸展，弛緩を繰返しており，組織内

２）Egusa H, Okita K, Kayashima H, Yu G, Fukuyasuの細胞はそれによる力を受けている。本研究では，試験管

S, Saeki M, Matsumoto T, Yamanaka S, Yatani H,:

内における周期的伸展刺激が骨格筋細胞への分化誘導に応Gingival fibroblasts as a promising source of induced− 82 −

口腔粘膜歯肉由来 iPS 細胞を用いた口腔化粧品の安全性評価の確立

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