ヒトはいかにして化粧品にかぶれるのか
一次刺激性皮膚炎を伴わない接触皮膚炎モデルの作成
東北大学大学院医学系研究科皮膚科学講座

相場

節也

To investigate the role of platelets in the process of sensitization of allergic contact dermatitis, we first examinedthat hapten stimulates CD40 ligand release from platelets in vitro. When platelets obtained from healthy volunteers were
stimulated with a representative hapten, DNCB and one of danger signals, ATP, they significantly released CD40L in adose-dependent fashion. Next, we examined using DNA microarray how ATP, which is released from platelets by various
stimuli, e.g., thrombin, collagen, von Willebrandfactor, ADP, vasopressin, platelet-activating factor, and Ca 2+ ionophores
affects immune response by keratinocytes. We identified several immune-related genes whose expression is augmented
in ATP-stimulated human keratinocytes by DNA microarray. The statistical analysis of the microarray data revealed that,besides IL-6, the expression of several novel genes such as IL-20, CXCL1-3, and ATF3 was significantly augmented
in ATP-stimulated keratinocytes. These data were validated by quantitative real-time RT-PCR. We also confirmed theaugmented production of IL-6, IL-20, CXCL1 by ELISA and that of ATF3 by Western blotting. These studies characterized(1) production of IL-6 and IL-20, (2) chemotaxis for neutrophils via CXCL1-3, and (3) ATF3 activation as possible rolesof ATP-stimulated keratinocytes. Finally, we demonstrated the presence of extracellular ATP in the sensitization phase ofallergic contact dermatitis in vivo by using agarose beads coupled with lucifearase. These studies suggest that platelets may
play a crucial role in sensitization of allergic contact dermatitis and that platelets may surrogate the role of irritant dermatitis
in sensitization.

１．緒ることを報告した。CD40L は、以前から活性化Ｔ細胞に言発現することがよく知られていた分子であるが、近年、活化粧品開発においては、化粧品による接触皮膚炎をいか

性 化 さ れ た 血 小 板 が CD40L を 放 出 す る こ と、 ま た、に防止するかは永遠のテーマであり、したがって、アレル

CD40L のノックアウトマウスで抗体産生などの免疫反応

ギー性接触皮膚炎のメカニズムの解明は、化粧品の安全性が著明に抑制されること、さらには、このマウスに CD40を担保するうえで不可欠な課題である。現在、接触皮膚炎

Ｌを有するマウス由来の活性化血小板を移入するのみで免は、実験動物を用いた多くの研究により、感作相と惹起相

疫反応を回復させることができるなどの報告が相次いだ 2）。

に分けられること、そして、感作相における強い一次刺激

血小板が、様々な機械的、化学的刺激により活性化する性皮膚炎の存在が惹起相における免疫反応の誘導に必須でことを考えると、ヒトにおける接触皮膚炎の成立にも血小あることが明らかにされている。しかし、ヒトの接触皮膚板が何らかの役割をはたしている可能性が推測される。ま炎においては、患者のほとんどは、発症前に、このようなた、血小板が種々の刺激により細胞外に放出する CD40L

強力な一次刺激性皮膚炎の存在を自覚していない。また、や ATP は、樹状細胞の CD40 や ATP 受容体に作用して樹現実的に、一次刺激性皮膚炎を惹起するような化粧品が市状細胞を活性化させることが知られている。そこで、本研

場に広く流通することも考えにくい。これらの事実は、ヒ究 に お い て は、 血 小 板 を ハ プ テ ン に て 刺 激 し た 際 にトの接触皮膚炎の感作過程においては、マウス接触皮膚炎

CD40L が遊離されるか否か、また、細胞外の ATP が表皮モデルとは全くことなった機序が存在していることを示唆

角化細胞にどのような影響を与えるかを検討した。最後に、しているように思われる。

ハプテン塗布によりマウス皮膚において ATP が実際に遊

近年、ノックアウトマウスを用いて接触皮膚炎の解析が離されるか否かも検証した。

多数試みられ、接触皮膚炎感作に必要な分子が次々と明ら

２．実験方法かにされてきている。そのなかで、Moodycliffe ら 1）は、
マウス接触皮膚炎感作には、CD40L の存在が不可欠であ

１）血小板の分離
健常人ボランティアよりヘパリン採血した末梢血を素早
く等量の PBS で稀釈し 22 ℃、800 g ５分間遠心することにより濃縮された血小板を含む分画を作成した。それを１%

How do cosmetics sensitize humans?
Analysis of a possible role of platelets.
Setsuya Aiba
Department of Dermatology, Tohoku
University Graduate School of Medicine

FCS を含む PBS で洗浄後 10％ FCS 添加 RPMI-1640 培地に浮遊させ以下の実験に用いた。

− 108 −

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一次刺激性皮膚炎を伴わない接触皮膚炎モデルの作成

２）血小板からの CD40L 放出
血小板からの CD40L の放出は、種々の濃度の異なった化学物質で 24 時間刺激後に培養上清を回収し、上清中のCD40L を市販の CD40L に対する ELISA kit を用いて定量した。

３）ヒト表皮細胞培養及び培養条件
ヒト正常表皮細胞 NHEKs は Kurabo（Osaka, Japan）より購入した新生児包皮細胞を使用した。NHEKs の培養は75 cm2 フ ラ ス コ を 用 い、 表 皮 角 化 細 胞 増 殖 用 培 地（HuMedia-KG2 ; Kurabo）を用いて５% CO2、37 ℃飽和水
蒸気圧下で行った。実験には第三継代の細胞を使用した。

７）ELISA

また、実験を行うにあたり、HuMedia-KG2 に含まれるハ

細胞上清中のサイトカインの定量（IL-6、IL-20 およびイドロコーチゾンは NHEKs における免疫修飾活性に影響

CXCL1）は、市販の ELISA kit を用いてメーカーから供与を与えることが知られていることから、これを避けるためされたプロトコールに基づき行った。

に実験を行う 24 時間前にハイドロコーチゾンのみを除い

８）タンパク質調製とウエスタンブロット解析

た HuMedia-KG2 に置換した。

NHEKs を 1 mM バナジウム酸塩（Wako Pure Chemical４）RNA 抽出

Industries, Osaka, Japan）を含む氷冷 phosphate buffered

培養細胞からの Total RNA の分離および抽出は RNeasy

saline（PBS）にて二回洗浄後、細胞可溶化液（0.5 M Tris-

Mini kit（Qiagen, Santa Clarita, CA）を用いて行った。操HCl pH 6.8）、10 % SDS、20 % グリセロール、1× プロテ

作手順についてはメーカーから供与されたプロトコールに

ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー カ ク テ ル（Complete, Mini; Roche,

従い、抽出した Total RNA は OD260 により定量した。また、

Basel, Switzerland）、0.2 % ブロモフェノールブルー）を

Total RNAはRNA6000 Nano KitおよびAgilent 2100 bioanalyzer

添加し、スクレイパーにて細胞を可溶化した。その後、（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いて、純度

BCA protein assay（Thermo Scientific, Rockford, IL）をならびに RNA Integrity Number（RIN）の測定を行った。

用いてタンパク量を定量した。調製したタンパク質を 10−20 % ポリアクリルアミドゲル（ATTO, Tokyo, Japan）

５）DNA マイクロアレイ解析にて泳動し、次に、polyvinylidene difluoride（PVDF）膜DNA マイクロアレイは一色法を用いて、以下のようにに 転 写 し た。Western blotting は、 一 次 抗 体 に phospho-

行った。なお、DNA マイクロアレイに用いる Total RNA

tyr705-STAT3 antibody、total STAT3 antibody（Cellは、コントロールまたは ATP（100 mM）刺激 1 時間後のS i g n a l i n g T e c h n o l o g y ）、 A n t i - A T F 3 （ A T L A S ,ものを使用した。また、抽出・精製した Total RNA を用

Stockholm, Sweden）、およびAnti-b-Actin（mouse）（Sigma-

いた二本鎖 cDNA 合成および Cyanine-3（Cy3）標識 cRNA

Aldrich）抗体、２次抗体にAnti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody

合成には Cyanine-3 using Quick Kit（Agilent Technologies）

ま た は Anti-mouse HRP-linked Antibody（Cell Signalingを使用した。DNA マイクロアレイは常法にのっとりマイTechnology）を用い基質に LumiGLOR chemiluminescent

クロアレイスライド（44K Whole Human Genome*; Agilent

reagent（Cell Signaling Technology）を加えて化学発光に

technologies）を用いて行った。また、データの解析は、て検出した。

GeneSpring GX 7.3.1（Agilent technologies）を用いて行い、さらに結果の生物学的解釈には、Gene Ontology（http://
www.geneontology.org/）を用いた。

９）統計解析
DNA マイクロアレイを除く各実験で得られたデータは、
mean±S.E.M. で表した。また、二群間の統計解析に基づ

６）定量 RT-PCR

く差異は、Student’ s t-test（両側）によって決定した。二DNA マイクロアレイの結果は、定量的 real-time PCR に群間以上、すなわち多群間における統計解析における差異
は、Dunnet’ s multiple comparison test によって決定した。

より確認した。
以下に使用した各プライマーおよび TaqMan probe を

また、P<0.05 は統計学的に有意であると見なした。

示す。

− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 201110）in vivo ATP imaging

ら未刺激対照と比較して明らかに有意な CD40L の放出が細胞外に放出された ATP を in vivo で確認する目的で、認められた。

私たちは Eluc ルシフェラーゼをアガロースに固相化した

CD40L による樹状細胞の活性化は、IL-12 の産生増加とビーズを作成した。これをあらかじめルシフェフェリンをT 細胞刺激活性の増強効果を伴っており接触皮膚炎の誘導

腹腔内投与したマウス皮下に投与することにより投与部位に重要な役割を果たしていることが推測される 3）。

周 囲 に 存 在 す る ATP を IVIS 100（Zenogen）を 用 い て

２）DNA マイクロアレイを用いた ATP 処理 NHEKs における遺伝子変動解析

imaging することが可能となった。

３．結果と考察

次に、細胞外 ATP の皮膚免疫における役割の解明を目

１）血小板からの CD40L の放出的として、ATP（100 mM）で１時間刺激、または未処理

血 小 板 を １×108/ml に 浮 遊 し、 そ れ に 10 mM, 30 mM,の NHEKs における DNA マイクロアレイ解析を行った。

100 mM の DNCB、100 mM, 300 mM, 1000 mM の NiCl 2 、なお、発現変動の認められた遺伝子の絞り込みは、図２に100 mM, 300 mM, 1000 mM の ATP を加えて 24 時間培養し、示したストラテジーにて行った。

培養上清中の CD40L の存在を ELISA にて検討した。その

まず、同じ実験を 3 回繰り返し行い、mRNA 発現量の平結果、図１のように DNCB と ATP 刺激において血小板か

均値が未処理群と比較して 2 倍以上増加した遺伝子 336 個

図１

図２

ハプテン、ATP 刺激血小板からの CD40L の放出

ATP 処理 NHEKs で変動する遺伝子の同定アルゴリズム− 110 −

ヒトはいかにして化粧品にかぶれるのか

一次刺激性皮膚炎を伴わない接触皮膚炎モデルの作成

を 選 択 し た。 次 に、 こ れ ら に 対 し て Paired Student’ sなど、免疫応答に関与する遺伝子が ATP 刺激により上昇

t-test を行い、有意差（P<0.05）の認められた遺伝子 67 個することが判明した（表２）。そればかりか、これらの GOを抽出した。一方、３回の実験全てに共通して未処理群のterm に含まれる遺伝子として、既に報告のある IL-6 をは2 倍以上発現が増加した遺伝子 44 個を抽出し、これらと先じ め 4, 5）、 新 た に IL-20、CXCL1、CXCL2、CXCL3、の 67 個のうち、共通する遺伝子 35 個を抽出した。３回いGTP binding protein overexpressed in skeletal muscle

ずれの実験においても２倍以上発現が増加し、かつ有意差（GEM）、ならびにV-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene（P<0.05）の認められた合計 35 個の遺伝子リストを Table

homologue（V-fos）などの免疫応答因子が誘導されること

1 に ま と め た。 こ れ ら 35 個 の 遺 伝 子 に つ き、Geneを見出した（表３）。

Ontology（GO）データベース（http://www.geneontology.

さらに、同定された35 個の遺伝子群の中に、cAMP responseorg/）を用いて、遺伝子の機能を分類した。各 GO term に

element binding protein（CREB）/ATF ファミリーに属おいて選定された遺伝子は、Fischer’ s exact test によるする ATF3 が認められた。本遺伝子は、Table 2 において統計解析を行って有意差（P<0.05）の認められたもの、すは GO: 50794、50789、31323、19219、6350 に 含 ま れ、 幅

なわち、各 GO term に分類される遺伝子群の存在が偶然広い機能を有する転写活性因子の一つであり、ストレスにではないと判断されたものとした。

応答して誘導されることが広く知られている 6, 7）。2007 年、

その結果、inflammatory response（GO: 6954）、immuneGilchrist ら 8）によるシステム生物学的手法を用いた解析に

response（GO: 6955）および defense response（GO: 6952）

より、本転写因子は Toll 様受容体４（TLR4）を介して活表１

ATP 刺激表皮細胞で変動した遺伝子リスト− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

表２

ATP 刺激表皮細胞で発現が変動した遺伝子の Gene Ontology 解析

表３

ATP 刺激 NHEKs で優位に発現が増加した免疫関連遺伝子（ohara H, et al. J. Dermatol. Sci., 58 : 143-151, 2010）− 112 −

ヒトはいかにして化粧品にかぶれるのか

一次刺激性皮膚炎を伴わない接触皮膚炎モデルの作成性化したマウスマクロファージにおいて、Rel（NF-κB

動員作用を有しており、細胞や組織に傷害や炎症が起こるの構成因子）と共に IL-6 および IL-12p40 のプロモーター領と産生される。血管内の白血球は、細胞表面に発現する膜域に結合することにより、これらの転写を抑制することが７回貫通 G タンパク共役型受容体である CXCR2 を介して明らかにされた。この報告以来、TLR を介した免疫応答

ケモカイン産生部位に集まり、血管内皮細胞層に接着する。

に対する ATF3 の機能解析が進展し、本転写因子が TLR

次に、血管内皮細胞の間を通り抜け、血管外へと遊走したを介した免疫応答において負の調節因子として振舞うこと

後、傷や炎症部位に到達して抗原を攻撃することにより、9, 10）。表皮細胞

創傷治癒や免疫応答に重要な役割を果たす。さらに、血管、本受容体を内皮細胞にも CXCR2 が発現しており、本受容体を介した介したサイトカインやケモカインの産生は、生体防御反応

血管新生が報告されている 15, 16）。一方、GEM と V-fos は免において重要な役割を担っているものと思われる。これら

疫応答因子に分類されているものの、これらは様々なシグのことから、ATF3 は、表皮細胞における TLR4 を介するナル伝達に関与しており、かつ非常に多くの機能を発揮す

シグナルに対して同様に機能することが推察されたため、るため、本研究における解析対象として取り扱わないこと

今後、本転写因子を免疫応答因子の一つとして扱うこととと し た。 以 上 の よ う に、 今 回、IL-6、IL-20、CXCL1、した。

CXCL2、CXCL3 および ATF3 に着目し、研究を進めるこは、疑いようのないものになってきているには TLR2 および TLR4 が発現しており

11, 12）

また、今回 ATP 刺激により新たに発現が見出されたととした。

IL-20 は、mRNA レベルで皮膚や気管に低レベルで発現していることが判っており、その機能として IL-20 を過剰発現させたトランスジェニックマウスは、表皮形成の異常に

２）DNA マイクロアレイ解析の mRNA およびタンパクレベルでの検証より、出生後数日のうちに死に至るなどの現象から、皮膚

次に、同定された ATP により誘導される IL-6、IL-20、の形態形成やその維持に重要な役割を担っていることが明CXCL1、CXCL2、CXCL3 および ATF3 の mRNA 発現変らかとなっている 13）。また、本サイトカインは TNF-a な

動を TaqMan probe を用いた定量 RT-PCR 法により確認しどの産生による免疫応答の惹起、さらには IL-6 と同様にチた。また、その際に発現の経時変化についても検討を加え

ロ シ ン キ ナ ー ゼ で あ る Janus kinase（JAK）を 介 し たた。すなわち ATP（100 mM）刺激後 0、0.5、1、1.5、2、3、6、

STAT3 のリン酸化により表皮増殖を促し、創傷治癒や皮12、24 時間における mRNA の発現を解析したところ、い13, 14）。一ずれの免疫応答因子も ATP 刺激 30 分後において有意に発方、CXCL1、CXCL2 および CXCL3 はそれぞれ白血球の現誘導された。この変化は約１時間後に最大となり、２時

膚の恒常性維持に貢献しているものと考えられる

図３ DNA マイクロアレイ解析結果の quantitative real-time RT-PCR による検証
NHEKs were treated with 100μM of ATP for different time periods. Total RNA was extracted at the indicated times and IL-6, IL20, CXCL1, CXCL2, CXCL3 and ATF3 mRNA were examined by quantitative real-time RT-PCR. The mRNA expression by ATPstimulated NHEKs was normalized using that of GAPDH. The ratio was demonstrated by the normalized mRNA expression by
ATP-stimulated NHEKs divided by that of control cells (time 0). The data represent the mean±S.E.M. (n=3). *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 indicate a statistically significant difference in comparison to cells that were time 0.

− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

間後以降は時間の経過に伴って減弱した（図３）。本検討

４A, B）。このことから、細胞外 ATP によるシグナルは、

結果は、DNA マイクロアレイの結果を裏付けるものとな

刺激開始後約 1 時間で ATF3 のタンパク質合成レベルに達った。

することが明らかとなった。

同様に、タンパクレベルでの検証も試みた。図４に結果

ATF3 は、様々なストレスによって誘導される転写因子を示したが、IL-6 および IL-20 において時間依存的な産生であり、細胞周期や細胞保護、またはアポトーシスなどのの亢進が認められた。さらに、IL-20 は ATP 刺激後 6 時間

多くの細胞内イベントに関与している 6, 7）。そればかりか、以降に産生されるのに対し、IL-6 は 1 時間以降に産生が認

最 近、TLR2/6 ヘ テ ロ 二 量 体、TLR3、TLR4、TLR5、められ、早い段階で産生されることが明らかとなった（図TLR7 および TLR9 などの TLR シグナルを介する炎症反応

４A, B）。また、CXCL1 は未処理群においても時間依存的において、負の調節因子として機能する可能性が示唆されな産生が認められ、ATP 刺激による mRNA の誘導にも関た 8−10）。NHEKs に お い て は TLR2 お よ び TLR4 が 発 現 しわらず、その産生において有意な差は認められなかった（図ており 11, 12）、細胞外 ATP により誘導される ATF3 は、免４C）。

疫応答を抑制することも考えられることから、ヒト表皮にまた、データーは示さないが、これらのタンパク産生増
加は、ATP の容量に依存していた。

おける本転写因子の機能に興味が持たれる。
以上の結果は、血小板が様々な刺激により活性化され引き続き、ATP 刺激が発現亢進することが初めて明ら

ATP を放出することを考慮すると 17）、血小板の活性化が、かとなった ATF3 のタンパク質レベルにおける発現のタ

ATP 放出を介して皮膚免疫に多大な影響を及ぼす可能性

イミングを精査するため、その発現変動を経時的に追跡すを示唆している。我々も ATP がプテンによる直接刺激とることとした。ATP 刺激後、0、0.5、1、2、4、8、12、24

協調して樹状細胞の活性化を亢進させることを報告してい時間における ATF3 の発現解析を行ったところ、ATF3 のるが 18）、それに加えて、ATP が表皮細胞やその他皮膚構発現は、ATP 刺激１時間から４時間後に亢進し、以降、成細胞に作用して IL-6 などの産生を介して樹状細胞の活時間の経過とともに徐々に減弱する傾向が認められた（図性化に影響を与えることが明らかとなった。

図４ DNA マイクロアレイ解析のタンパクレベルでの検証
NHEKs were cultured in the presence or absence of 100μM of ATP for indicated time periods. After culture,IL-6 (A), IL-20(B) and CXCL1(C) in the culture supernatant were measured by ELISA. Results are expressedas picograms/ml and represent the mean±S.E.M. (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 indicate astatistically significant difference in comparison to cells that were non-treated (Control).

− 114 −

ヒトはいかにして化粧品にかぶれるのか

４）ハプテン刺激による皮膚からの ATP 放出

一次刺激性皮膚炎を伴わない接触皮膚炎モデルの作成

ゼにより検出した。その結果、ハプテン塗布１時間で皮膚未感作マウス皮膚にハプテンを塗布し、経時的に塗布部における細胞外 ATP が検出できた。

位皮膚における細胞外 ATP の存在を固相化ルシフェラー

図５ 細胞外 ATP による ATP3 タンパクの誘導
NHEKs were stimulated with 100μM of ATP for indicated time periods. (A) A representative western blottingfrom three independent experiments is shown. (B) The ATF3/
β-actin ratios were determined as fold increase
compared with control (time 0). The intensity of the corresponding ATF3 bands was analyzed using
densitometry. The data are the mean ± S.E.M. (n=3). *P<0.05 indicates a statistically significant differencein comparison to cells that were time 0.

（A）

（B）

図６

ハプテン刺激皮膚における細胞外 ATP の検出（A）未処理 （B）DNCB 塗布１時間後− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

４．結

(2005).

語８）Gilchrist M., Thorsson V., Li B., Rust G.A., et al.

今回の研究により、ハプテンおよび ATP 刺激により血Systems biology approaches identify ATF3 as a

小板から CD40L が放出されることが明らかになった。まnegative regulator of Toll-like receptor 4. Nature, 441,

た、血小板から種々の刺激で放出される ATP により表皮細胞から免疫反応に関与するサイトカイン、ケモカインが173-178 (2006).
９）Khuua H.C., Barrozo M.R,, Hai T., et al.

Activating

放出されることも明らかとなった。また、実際に、ハプテtranscription factor 3 (ATF3) represses the expression

ン塗布皮膚には、細胞外に ATP が存在していることも証

of CCL4 in murine macrophages. Mol. Immunol., 44,

明した。種々の刺激で活性化する血小板が、接触皮膚炎感
作過程における樹状細胞活性化に関与していることが示唆

1598-1605 (2007).
10）Whitmore M.M., Iparraguirre A., Kubelka L., et al.
Negative regulation of TLR-signaling pathways byされた。

activating transcription factor-3. J. Immunol., 179, 3622（文献）3630 (2007).

１）Moodyclliffe A.M., Shreedhar V., Ullrich S.E., et11）K a w a i K . , S h i m u r a H . , M i n a g a w a M . , e t a l .

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499 (2009)− 116 −