Enabling Epigenetics Research

日本語マニュアル
(Version B12, 2024年9月13日版)
最新の英語版プロトコルも必ずご確認ください。

※キットの構成品は、それぞれ保管温度が異なります。商品到着後、適切な温度で保管してください。

Revision

変更年月

変更内容

B12July, 2024

英語版B8以降の全ての更新に対応。
5ページの誤字・脱字を修正

B12 Rev. 2

September, 2024

1. (誤) 15 mL ⇨ (正) 1.5 mL
6. (誤) ATAC Lysisbuffer ⇨ (正) ATAC Lysis Buffer目次

概要 ............................................................................................................ 1
キットの構成品と保管温度 .............................................................................. 2
その他の必要な試薬・機器 ............................................................................ 3
ATAC-Seq Kitのプロトコル ........................................................................... 4
組織サンプルの調製 .................................................................................... 4
細胞サンプルの調製 .................................................................................... 5
タグメンテーション反応と精製 ...................................................................... 6
Tagmented DNAのPCRによる増幅 .................................................................. 7
Index PrimerおよびSample Sheet情報 ........................................................ 9
References ...............................................................................................10トラブルシューティングガイド .......................................................................11
FAQ .........................................................................................................12
関連製品 ....................................................................................................14テクニカルサポート......................................................................................15

概要ATAC-Seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin via Sequencing）法は、2013年に初めて導入されました1。ATAC-Seqは、オープンクロマチン領域の同定を可能とするエピジェネティックな状態の簡便なアッセイです。このアッセイでは、無傷の核を高活性型Tn5トランスポゼース変異体により処理します。この変異体は、「タグメンテーション」と呼ばれるプロセスにより、標的DNAをNGS用アダプターでタグ付けすると同時にDNAを断片化することができます2。
ATAC-Seqは、そのスピード、シンプルさ、感度、幅広いサンプルタイプへの適用性から、一般的に使用されるエピジェネティックスのアッセイとなっており、より詳細なエピジェネティックな解析への入り口として役立ちます。ATAC-Seq Kitには、1反応につき20～30 mgの組織または50,000～100,000細胞から、16種類のユニークなIllumina®シーケンサー対応のATAC-Seqライブラリー作製に必要な試薬が含まれています。
ATAC-Seqの利点
オープンクロマチン領域のエピジェネティックプロファイルを評価可能
次世代シーケンサーに対応したサンプルを数時間で得ることが可能
シンプルで迅速な3ステッププロトコール

製品
ATAC-Seq Kit

反応回数Catalog No.

16 回

53150

|

1キットの構成品と保管温度
このキットには、16サンプル分のATAC-Seqライブラリー作製に十分な試薬が含まれています。このキットの試薬には複数の保存温度がありますが、キットは2つの温度で出荷されます。-20℃で保存する試薬の入った箱と、4℃または室温で保存する構成品の入った箱がありますが、受領後は以下の保管条件にしたがってそれぞれ保管してください。適切に保管いただければ、すべての試薬は受領日から6ヶ月間安定であることを保証いたします。
試薬等容量

保管温度※

※RT：室温|2

その他の必要な試薬・機器
100%エタノール
脱イオン水
0.4%トリパンブルー溶液
マイクロピペットおよび対応するチップ
マイクロチューブ用遠心機
スイング式遠心機
1.5 mL マイクロチューブ
300 µL PCR チューブ(200 µLでも可)棒磁石(ネオジム製の強力なものを推奨)
以下は組織サンプルの場合
40 µm セルストレーナー：Corning社(Falcon®), Cat. NO. 352340を推奨
カミソリ刃
5 cm ペトリ皿
15 mL 遠心チューブ
氷冷 PBS
ダウンス型ホモジナイザー：アクティブ・モティフ製 Cat. No. 40401を推奨|

3

ATAC-Seq Kitのプロトコル
Note:

以下のプロトコルは20-30 mgの組織、または50,000～100,000細胞の使用を前提に最適化されています。

組織サンプルの調製
20-30 mgの組織の処理を想定しています。アッセイには新鮮な組織、または瞬間凍結して-80℃に保管した組織を使用できます。
※ 実験を始める前に、SPRI beadsを4℃の冷蔵庫から取り出して室温に戻してください。
1.

サンプルごとにラベルした5 cmのペトリ皿を氷上に置き、サンプル名を記入し、5 mLのPBSを入れた15 mLチューブを氷上に用意する。

2.

各サンプルを対応するペトリ皿に取り出し、カミソリ刃を用いて細断した後、1 ml のピペットとステップ1で用意した氷冷PBSを用いて15 ml チューブに移す(目詰まりを防ぐため、チップ先端はあらかじめ適当な大きさに切って広げてください)。

3.

500 x gで5分間、15 mLチューブを遠心する(4°C)。

4.

上清のPBSを除き、1 mLのATAC Lysis Buffer を加える。

5.

先端を切って穴を大きくした1 mLチップを使い、各サンプルを1 mLのダウンス型ホモジナイザーに移して、氷冷しながらペッスルをゆっくりと30回抜き差しする(アクティブ・モティフのホモジナイザー(Cat. No. 40401)を使用の場合、隙間の狭いペッスルを推奨します)。

6.

ホモジナイズしたサンプルは、40 μmのセルストレーナーを用いて夾雑物を取り除き、1.5 mL のマイクロチューブに回収する。そこから細胞の計数用に10 μLを別の1.5 mLチューブに分取する。

7.

ステップ6で分取した10 μLの細胞懸濁液に、0.4%トリパンブルーを10 μL加え、核が青く染まった細胞のみを計数する(染まっていない細胞は数えないでください)。

8.

回収した細胞(核)を転倒混和し、50,000～100,000個を等量ずつ新しいチューブに移す。

9.

500 x gで5分間、15 mLチューブを遠心する(4°C)。この間に、以下のTagmentation MasterMixを用意する。
Tagmentation Master Mix (1サンプルあたり)
試薬

容量10. 上清を除き、速やかに「タグメンテーション反応と精製」の工程(6ページ)に進む。

|

4細胞サンプルの調製
50,000 – 100,000個の新鮮な細胞、または細胞保存液を用いて凍結された細胞を使用できます。細胞は、80％以上(90%以上が理想)の⽣存率を有していることが必要です。凍結保存された細胞は、氷晶形成と、その後の細胞損傷を防ぐように調製された培地を用い、緩慢凍結することを推奨します。
※ 実験を始める前に、SPRI beadsを4℃の冷蔵庫から取り出して室温に戻してください。
1.

細胞を計数し、50,000-100,000細胞を1.5 mLの遠心チューブに用意する。

2.

500 x gで5分間(4°C)、1.5 mLチューブを遠心する。この時、ペレットが集まる向きがわかるようにしてから遠心する。 ペレットが見えない場合は、1,000 x gで5分間(4°C)の遠心を加する。

3.

ピペットで上清を除去し、100 μL の氷冷したPBS を加える(ピペッティングしたり、ペレットを崩したりしないでください)。500 x gで5分間(4℃)遠心して細胞を回収する。

4.

ペレットが崩れないよう慎重に上清を除き、 100 μLのATAC Lysis Bufferを加えて細胞を懸濁する。

5.

懸濁したサンプルを氷上のPCRチューブに移したら、ただちに500 x gで10分間(4℃)遠心する。
この間に以下のTagmentation Master Mix を用意する。
Tagmentation Master Mix (1サンプルあたり)
試薬

6.

容量

ペレットが崩れないよう慎重に上清を除き(注意：ペレットを崩さずに余分なATAC Lysis Bufferを除くことは⾮常に重要な作業です)、速やかに「タグメンテーション反応と精製」の工程(6ページ)に進む。

|5タグメンテーション反応と精製
1.

各サンプルに50 µLのTagmentation Master Mixを加える(氷上にする必要はありません)。必要に応じてマルチチャネルピペッターを用いて、細胞を懸濁する。

2.

800 rpmで撹拌しながら37℃で30分間インキュベートする。

3.

タグメンテーション反応後、ただちにサンプルを新しい1.5 mLチューブに移し替える。

4.

250 µLのDNA Purification Binding Bufferと5 µLの3 M Sodium Acetateをそれぞれのサンプルに加える。

5.

もし、サンプルの色が明るい黄色以外の色だった場合、1度に5 µLずつ３ M Sodium Acetateを加えて正しい色になるよう調整する(図1を参照)。

図 1: pHに依存した溶液の色。

DNA Purification Binding BufferはpH指示薬を含むため、色からpHが推定できます。サンプルは、pHが7.5未満であることを示す明るい黄色(左のチューブ)の時のみ、カラムにアプライしてください。pHが7.5以上では、DNAがカラムに結合しません。
6.

ピペッティングにより、よく撹拌する。

7.

番号などでDNA Purification Columnをラベルし、付属のcollection tubeに戻す。

8.

各サンプルを対応するDNA Purification Columnに加え、17,000 x g (14,000 rpm)で1分間遠心する。

9.

Collection tube内のフロースルーを捨て、再度カラムを取り付ける。

注意：

初めて使用するキットの場合、次のステップに進む前に、DNA Purification Wash Bufferに40 mLの100%エタノールを加えてください(終濃度80%)。短期間にキットを使い切る予定がない場合は用時調製することをお奨めします(例：2.4 mLのDNA Purification Wash
Bufferに9.6 mLの100％エタノールを加える)。

10. 750 µLのWash Bufferをカラムに加えてキャップを閉める。
11. 17,000 x g (14,000 rpm)で1分間遠心する。

|

612. Collection tube内のフロースルーを捨て、再度カラムを取り付ける。
13. カラムのキャップを開けて17,000 x g (14,000 rpm)で2分間遠心し、カラムに残ったWashBufferを除去する。
14. サンプル名をラベルした新しい遠心チューブにカラムをセットする。
15. 35 μl のDNA Purification Elution Bufferをカラム中央のフィルターに滴下し、キャップを閉じて１分間、室温に静置する。
16. 7,000 x g (14,000 rpm)で1分間遠心する。
17. カラムを捨てたらDNAの精製が完了。
18. 精製されたDNA は-20℃で保管するか、次の「Tagmented DNAのPCRによる増幅」のステップに進む。

Tagmented DNAのPCRによる増幅
Note:

KAPA Real-Time Library Amplification Kit などを使用する場合、最初の72℃の伸⻑反応ス
テップは必須です。

1.

以下に示す順序で各成分を添加し、PCRの準備をする。1つのフローセルでシーケンスするためにライブラリーをマルチプレックス化する場合は、サンプルごとに固有のi5/i7インデックスとなるよう組み合わること。
各サンプルは、PCR増幅において1つのi7 Indexed Primerと1つのi5 Indexed Primerの組み合わせを必要とします。固有のi7/i5プライマーの組み合わせは4 x 4 = 16通りあり、最大16サンプルをマルチプレックスとすることができます。これらのIndexed Primerは、Illumina社のNexteraアダプ
ターに基づいています。
1 反応につきi7 Indexed Primerおよびi5 Indexed Primerを1種類ずつ使用：
i7 Indexed Primer

Reagents

i5 Indexed Primer

容量|72.

ヒートリッドのあるサーマルサイクラーを用いて以下のプログラムを用いてPCRを行う：
72°C 5 minutes
98°C for 30 seconds
10 cycles of: 98°C for 10 seconds, 63°C for 30 seconds, 72°C for 1 minuteHold at 10°C.

3.

以下では、60 µLのSPRI Beads溶液(サンプル量の 1.2倍)で精製し、20 µLのDNA Purification
Elution Bufferで溶出する。1サンプルあたり400µLの80%エタノールを用意する(用時調製)：
A. 室温に戻したSPRI Beads溶液をよく混ぜ、60 μL (サンプルの1.2倍)をPCR後の反応液に加える。
B. ボルテックスして撹拌し、室温に5分間静置してDNAをビーズに吸着させる。
C. チューブの底に棒磁石を当て、ビーズを回収する。
D. 溶液が透明になったら、磁石を当てたままピペットを用いて上清を除去する。
E. 磁石をサンプルに当てたまま、各サンプルに180 µLの80%エタノールを加える(撹拌しない)。
F. 室温で30秒間静置する。
G. サンプルに磁石を当てたまま上清を除去する。
H. ステップE-Gを繰り返し、2回目のエタノール洗浄を行う。
I. チューブの蓋を開け、残存するエタノールを蒸発させてビーズ表面のつやが曇ったら(2～5分間)、次のステップへ進む。
J. 磁石から離したチューブに、20 μLのDNA Purification Elution Bufferを加える。
K. キャップを閉めてボルテックスして懸濁する。
L. サンプルを室温で5分間静置する。
M. チューブに磁石を当ててビーズを回収する。
N. ビーズが磁石に集まり上清が透明になったら、上清を新しいチューブに移す。

4.

この段階で、ライブラリーの定量とシーケンシングの準備完了となるので、NGSライブラリー用の定量キット(例えばKAPA Biosystems, Cat. No. KR0405など)を用いて定量する。
PCR増幅したライブラリーはBioanalyzerやTapeStationあるいは同等の装置を用いてサイズ分布を評価することが可能です。

|8

Index PrimerおよびSample Sheet情報

i7 Index

i5 Index

i5 Indexi7 Sequence

Sample Sheeti5 Sequence

Sample Sheet (NovaSeq
v1.0 Reagent Kits,MiSeq, HiSeq 2000/2500)

i5 Sequence

Sample Sheet (NovaSeq
v1.5 Reagent Kits, iSeq,
MiniSeq, NextSeq,HiSeq 3000/4000)

Read 1およびRead 2のアダプタートリミングに使用する配列: CTGTCTCTTATACACATCT.

|

9

References
1.

Buenrostro, J. D., et al. (2013) Nat. Methods 10: 1213-1218.

2.

Adley, A., et al. (2010) Genome Biol. 11.

3.

Corces, M. R., et al. (2017) Nat. Methods 14: 959-962.

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トラブルシューティングガイド
トラブルの内容考えられる原因推奨される対応

シーケンスデータのバックグラウンドが高い。

細胞の⽣存率が原因の可能性があります。アポトーシ
スした細胞が細胞外に放出するDNAは、核内に密集したクロマチンDNAよりもTn5がアクセスしやすいた
め、バックグラウンドシグナルが高くなります。

オプションとして細胞をDNase Iで処理すると、結果が改善される場合があります。しかし、この処理は、酵素処理中も⽣存可能で酵素を除去可能な細胞の場合のみ実行可能です3。

ライブラリーができない。

プロトコール全体を通してサンプルのロスは起こり得ます。特に少量の細胞を扱う場合、ペレットが見えにくいか、見えない場合があります。

遠心後の細胞ペレットがどこにあるかわかるように、遠心する際はチューブの向きを決めてください。数マイクロリットルの上清が残るLysis Bufferの除去のとき以外、すべての遠心後のステップでは、ペレットと反対側からピペッティングしてください。

互換性のないPCR増幅のプログラムが使用されている可能性があります。

ATAC-Seqライブラリーの増幅では、変性前の最初の72℃伸⻑ステップが必須です。これは、Tn5によりアダプターが挿入されていないDNA鎖の末端では、PCR酵素の結合に必要なDNA配列が欠損しているためです。この欠損を埋めてインデックスプライマーのアンカーサイトを作るために伸⻑が必要となります。もし、誤った条件でPCRを行ってしまった場合、回復することはできません。

|11FAQ
質問

回答

このキットは、オリジナルの論文のプロトコルと同じですか？

このキットは、オリジナルの論文(Buenrostro et al., 2013, Nat Methods.)、およびCorces et al., 2017, Nat Methods.の組み合わせに基づいており、より確実で効率的なアッセイとするためにバッファーを最適化しています。

このキットに含まれるリコンビ
ナントTn5酵素の供給元はどこですか？

本キットに含まれるリコンビナントTn5酵素は、弊社が独自にでクローニングし、発現・精製を行い、品質テストを行った高活性型の変異体です。この酵素を用いて構築されたトランスポゾームには、次世代シーケンサー用アダプターがあらかじめロードされているため、最適化やその他の準備を必要とせずに、そのまま使用できます。

反応1回あたりの最少の細胞数または組織量は？

50,000細胞または組織20 mgです。

凍結した組織や細胞は使用できますか？

はい。ただし、⽣存率を維持するため、サンプルは良好な状態で保存する必要があります。特に細胞は、凍結による氷晶形成とその後の損傷から保護することの可能な培地を用いて、適切な速さで凍結して保存する必要があります(緩慢凍結法を推奨)。組織は-80℃で瞬間凍結してください。

後でATAC-Seqで使用するために、核を凍結保存することはできますか？

はい、後の使用に備えて抽出した核は-80℃で凍結保存してください。1度のサンプル調製で限られた量の細胞しか得られない場合も、プールすることでアッセイが可能となります(可能ならば、上記の細胞の状態で凍結保存することを推奨します)。

FACSでソーティングした細胞は使用できますか？

可能ですが、FACSソーティングの過程で細胞が損傷する可能性があります。良好な
ATAC-Seqライブラリーを得るには、細胞(特に核)が無傷であることが重要です。

組織サンプル用の40 μmメッシ
ュのストレーナーにお奨めの製品はありますか？

はい。Falcon® 40 μmセルストレーナー(Corning社 Cat. No. 352340)を推奨します。

DNase処理はすべてのサンプルに推奨されますか？

DNase処理は、(死細胞の)ミトコンドリアDNAの除去目的や、サンプル中に死細胞が15％以上含まれる場合など、特定の状況において有効です。そのため、処理後も細胞が十分に⽣存可能で、酵素の影響を受けない場合のみ推奨します。接着細胞などで15％以上の死細胞が⽣じる場合は、細胞の剥離にトリプシンなど細胞傷害性の高い酵素を使用せずに、より細胞にダメージの少ない剥離剤の使用をご検討ください。

サーモミキサーを持っていませんが、このキットは使えますか？

サーモミキサーの使用を推奨しますが、弊社においてサーモミキサーを使用せずに、ヒートリッド付きのサーマルサイクラーを用いたタグメンテーション反応(37℃)の検証を行い、問題ないことを確認しています。

マスターミックスや酵素を含むすべての試薬やキット構成品は解凍して室温で調製できますか？

Assembled TransposomesとQ5 DNA Polymeraseにはグリセロールが含まれており、解凍の必要はありませんので氷上に置いてご使用ください。他の構成品は室温で溶解して使用可能です。また、次回以降の反応のために再度、凍結融解することが可能ですので、16の反応すべてを同時に行う必要はありません。

|12

質問

回答

最終的なライブラリーのサイズはどのくらいになると予想されますか？また、フラグメントアナライザーでライブラリーのトレースはどのように表示されますか？

ライブラリー断片の⻑さは約250bpから1000bpで、約150bp周期のピークが見られます。具体的なトレースの例は、以下のキットのwebページのFAQ、およびライブラリーの良し悪しについて記述した弊社ブログをご参照ください。

サンプルあたりどのくらいのシーケンスリードが必要ですか？

通常、ペアエンドの3,000万リードで十分ですが、最低でも2,000万リードは必要です。リード数はサンプルのゲノムサイズとATAC-Seqアッセイの目的によって異なります。サンプルのゲノムサイズが⾮常に大きい場合や、より高度な解析が必要な場合は、より多くのシーケンスリードが必要になることがあります。

このATAC-Seq Kitを使用して16サンプル以上をマルチプレックスできますか？

このATAC-Seq Kitには、16サンプル分の4x4種のDual Indexが含まれています。キット内のインデックス付きプライマーは、N701～N704およびN501～N504に対応す
るIllumina Nexteraプライマーと同一です。16種類を超えるマルチプレックスが必要な場合は、Nextera™-Compatible Multiplex Primers (96 plex) (Cat.No.53155)をご利用いただくと、最大96種類のマルチプレックスが可能です。このプライマーセッ
トは、当社のキットでそのまま使用できるように25 µMの濃度で提供されています。
キットに含まれるものと同じ濃度(25 µM)の他のIllumina Nexteraプライマーをご購入いただいて組み合わせることもできます。

このATAC-Seq Kitを使用した論文はあります？

2024年7月現在、Natureなどのトップジャーナルを含む、70報以上の学術論文において使用されています。文献リストは以下からご参照ください。

⚫ https://www.activemotif.com/catalog/1301/atac-seq-kit#faqs⚫ https://www.activemotif.com/blog-library-qc

https://view-awesome-table.com/-LiEheTlJUWN7ZR9oXqH/view?filterS=53150|13

関連製品
⚫

ATAC-Seq Spike-In Control (Cat. No. 53154)
クロマチン修飾に関連する酵素の阻害効果など、修飾変化がゲノム全体にわたり起こる場合、サンプル間の違いを同定することは⾮常に困難です。さらに、サンプル量の測定が不正確であったり、処理中の手技にばらつきがあったりすると、サンプル間のデータにもばらつきが⽣じます。このような場合、現在利用可能なバイオインフォマティクスに基づく正規化手法を、データセット間の正規化に適用することはできません。このため、サンプル量や手技の偏りとばらつきを補正するには、すべてのサンプルに既知の標準物質を添加(“spikein”)することが必要です。このSpike-In Controlを使用することにより、バイオインフォマティクス過程でサンプル間のばらつきが補正可能になり、データ間の真の違いを明らかにすることができます。

⚫

Fixed Cell ATAC-Seq Kit (Cat. No. 53151)
バイオセーフティレベルの高い感染性のサンプルなども、ホルムアルデヒド固定を行うことにより、固定後の作業を一般的な実験室で行うことが可能になります。また、発⽣過程のタイムコースなど、培養中のエピジェネティックな状態を可能な限り維持したままサンプル調製したい場合、インキュベータから取り出してすぐに固定することにより、サンプル間のばらつきを最小限に抑えることが可能です。

⚫

Recombinant Tn5 Transposase proteins (Cat. No. 81286 & 81284)
ATAC-Seq Kitに含まれるTn5にも使用されているリコンビナントタンパク質ですが、NGSアダプターのunloadedバージョンです。ご自身でお好みのアダプターをロードすることが可能です。容量違いの2製品があります。

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Pre-indexed Assembled Tn5 Transposomes (Cat. No. 53152)
ATAC-Seqアッセイのハイスループット化に対応するため、8ウェルごとに切り離せる96ウェルプレートを用いた自由度の高いフォーマットになっています。各ウェルには、固有のi5およびi7インデックスを含むアダプ
ターをロードしたトランスポソームが分注されているため、ATAC-Seq Kitにおいて手間のかかるプライマーの分注操作や組み合わせ確認などが省略でき、多数のATAC-Seq反応を簡単に行えます。ATAC-Seq Buffer
Set (Cat. No. 53153)と合わせてご利用ください。

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テクニカルサポート
サポートが必要な場合は、下記のアクティブ・モチーフ・テクニカル・サービスまで電話または電子メール

China日本Europe

North America

でお問い合わせください。

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