Wnt シグナルを標的とした育毛促進作用をもつ天然成分の探索

千葉大学大学院薬学研究院

大 槻崇

Wnt signaling maintains hair inducing activity including regeneration of hair follicle. On the basis of our screening
program targeting activation of TCF/b-catenin transcriptional activity, a plant extract of Excoecaria indica was selected
as a positive sample. Activity-guided fractionations led to the isolation of a-sapinine (1) as active compound. Also, two
flavonoid glycosides, myricetin 3-O-b-D-galactopyranoside (2) and myricetin 3-O-a-L-rhamnopyranoside (3) were isolated
from Erythrophleum succirubrum as active compounds. Compound 1 led to more than 20-fold increase in TCF/b-catenintranscriptional activity at 1.4 or 2.9 μM．

１．緒言

２． 実

古来より加齢に伴う男性型脱毛が多くの男性を悩ませてきたが，最近では脱毛の発症メカニズムについても分子レ

2・1験

TCF/b-catenin 転写誘導活性試験

対数増殖期にある 293T/STF 細胞3）を 96 穴白色平底マ
4ベルで解明されてきている．退縮に向かう分子機構につイクロプレートに各ウェル中 200µL あたり 3×10 cells

いてはアポトーシスによるものであることが明確になっの密度で細胞を播種し，10%FBS 含有 D-MEM 培地中でてきたが，休止していた毛包の発毛段階へのスイッチング

24 時間培養した．培地の除去後，種々の濃度の試料（植に関しては，以前から指摘されていた男性ホルモン ( アン物エキス，分画後の画分，単離した化合物）を含有すドロゲン ) の関与に加え，最近では，毛包上皮幹細胞の存る 200µL の培地を添加し 24 時間培養した．その後培地在，この幹細胞にシグナルを送る毛乳頭細胞の重要性，及を取り除き，PBS で細胞を１回洗浄後，細胞溶解剤 Cell

びこれら 2 種の細胞間に作用する分泌性のシグナル因子のCulture Lysis Reagent（プロメガ社製）を 20µL 加え 30

関与することがトランスジェニックマウスやコンディショ分間振とうした．その後プレートと発光基質液（発光基ナルノックアウトの研究で明らかになりつつある．ま質 Luciferase Assay Substrate ＋緩衝液 Luciferase Assay

た，動物の発生過程で，体軸形成や陥入運動など形づくり

Buffer, ともにプロメガ社製）をマイクロプレートルミノの基盤となる初期の重要なプロセスから，その後の種々のメーター（サーモ社製ルミノスキャンアセント）へセット

組織・器官の形成に関与する Wnt シグナル伝達経路の活しルシフェラーゼ活性を測定した．なお，試料添加時のル性化（b-catenin/LEF/Tcf タンパクの複合体形成→複合体シフェラーゼ遺伝子の発現量（化学発光量）を指標として，の TCF 結合領域への結合それに伴う転写活性化）が，毛TCF/b-catenin 転写誘導活性を評価した． 293T/STF 細

包形成，毛髪生成に重要な役割を果たしていることが明胞は，John hopkins 大学の Jeremy Nathans 教授よりごらかにされている．当研究室では，最近，Wnt シグナル恵与頂いた．

1, 2）

伝達経路における最下流の TCF/LEF 転写因子の転写活性を評価するレポーターアッセイを確立した．本研究では，

2・2

スクリーニング検体

Wnt シグナルを活性化する天然物（小分子化合物）を探

スクリーニングは，当研究室で独自に採集，構築したタ索し，見出した活性成分の中から，有効な育毛促進作用をイ，インドネシア，バングラデシュ産の植物エキス群を対有する化合物を発見し，育毛剤原材料としての利用に貢献

象とし，良好な活性を示す検体を選別する．

することを目的とする．

2・3

Excoecaria indica からの活性成分の探索

Excoecaria indica の葉部（42 g）をメタノールで室温にSearch for natural product for promoting
hair growth based on Wnt signaling
Takashi Ohtsuki
Graduate School of Pharmaceutica lSciences, Chiba Universityて 24 時間抽出した．その後，ホモジナイズし，遠心分離及び濾過により抽出液を濾別した．残渣にメタノールを加えて再抽出し，これらの抽出液を併せて減圧濃縮し，抽出物（16 g）を得た．次に，この抽出物についてヘキサン，酢酸エチル，ブタノールを用い溶媒分配を行い，ヘキサン可溶部（0.7 g）, 酢酸エチル可溶部（3.9 g）, ブタノール可溶部（3.3 g）, 水可溶部（3.9 g）をそれぞれ得た．ヘキサ− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009ン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（分離用心分離及び濾過により抽出液を濾別した．残渣にメタノ

担体：Silica gel PSQ100（28 ㎜ ×260 ㎜）；移動相：クロールを加えて再抽出し，これらの抽出液を併せて減圧濃縮ロホルム / メタノール）に付し Fr．1A ～ 1R を得た． 次

し，抽出物 56 g を得た．この抽出物のうち 37 g をヘキサに，Fr．1E（53.6 ㎎）についてゲルろ過カラムクロマト

ン，酢酸エチル及びブタノールで溶媒分配を行い，ヘキグラフィー（分離用担体：Sephadex LH-20（20 ㎜ ×550

サン可溶部（10.9 g），酢酸エチル可溶部（4.3 g），ブタノ㎜）；移動相：メタノール）に付し Fr．2A ～ 2O を得た．

ール可溶部（9.3 g），水可溶部（13.4 g）をそれぞれ得た．

次に Fr. 2D について，逆相 HPLC（カラム：CAPCELL

ブタノール可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー

PAK ACR C18（4.6 ㎜ ×250 ㎜）；移動相：75% メタノール；（分離用担体：Silica gel PSQ100B（44 ㎜ ×600 ㎜）；移動

流速 , 1.0 mL/min；検出 UV（254 nm））による精製を行相：クロロホルム / メタノール）に付し Fr.1A ～ 1I を得た．

い化合物 1（1.4 ㎎）を単離した．

このうち Fr．1E について逆相 HPLC（カラム：Mightysil
RP-18（10 ㎜ ×250 ㎜）；移動相：35% メタノール；流速：

2・4 Erythrophleum succirubrum か ら の 活 性 成 分の探索

2.0 mL/min；検出：UV（254 nm）and RI）による分画をErythrophleum succirubrum の葉部 330 g をメタノールで2E について，C30 カラムを用いた逆相 HPLC（カラム：

室温にて 24 時間静置した．その後，ホモジナイズし，遠Develosil C30 UG5（8 ㎜ ×250 ㎜）；移動相：45％メタノ行い，Fr.2A-2F を得た．得られた画分のうち Fr.2C 及びFig.1 Isolation chart of Excoecaria indica− 34 −

Wnt シグナルを標的とした育毛促進作用をもつ天然成分の探索

Fig.2 Isolation chart of Erythrophleum succirubrumール；流速： 1.5 mL/min；検出：UV（254 nm）and RI）

succirubrum（マメ科）より転写活性を上昇させる化合物を行い，Fr.2C からは化合物 2（6.1 ㎎）を，Fr.2E からはを単離したので併せて報告する．

化合物 3（9.3 ㎎）をそれぞれ単離した．

3・2３．結果及び考察
3・1

Excoecaria indica からの活性成分の探索

Excoecaria indica の葉部より得られたメタノール抽出物

スクリーニングの TCF/b-catenin 転写活性について検討を行ったところ，

当研究室の天然物資源ライブラリー（天然抽出物）の25µg/mL で未処理群と比較して 9.5 倍 TCF/b-catenin 転う ち， 植 物 エ キ ス 250 種 に つ い て ス ク リ ー ニ ン グ を 行

写活性を上昇させることが判明した．次に，本抽出物につったところ，2 種に TCF/b-catenin 転写活性を上昇させいてヘキサン，酢酸エチル，ブタノールを用い溶媒分配ることが判明した．このうち，強い活性が認められたを行い，各可溶部をそれぞれ得た．得られた各可溶部のExcoecaria indica（トウダイグサ科）を試料として選択しTCF/b-catenin 転写活性について検討を行ったところ，ヘ活性成分の探索を行った．また，本スクリーニングにてキサン可溶部，酢酸エチル可溶部，ブタノール可溶部に活TCF/b-catenin 転写阻害作用を示した植物 Erythrophleum性が認められた．そこで，ヘキサン可溶部について分画を− 35 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

ラフィーに付し Fr.1A ～ 1R を得た．得られた画分のうち3・3 Erythrophleum succirubrum か ら の 活 性 成 分の探索

Fr．1E, 1F, 1H, 1K, 1L, 及び 1M に TCF/b-catenin 転写活Erythrophleum 属の植物は西アフリカ，アーストライア性の上昇が認められた．単離量並びに TLC 分析の結果をやフィリピンなどに広く分布しており，葉部，種子に強い考えあわせ，Fr.1E を次の分画の対象とした．そこでまず，毒性を示し，子供や家畜を致死させた報告が多数ある．マ

Fr.1E（53.6 ㎎）について , Sephadex LH-20 カラムクロマ

メ科植物 Erythrophleum succirubrum はタイでは「Saat」とトグラフィーを行い Fr．2A ～ 2O を得た．主成分が Fr．の慣用名で知られ，その葉部，種子の急性毒性作用，心2C 及び 2D に移行したことが TLC 分析より明らかになっ

臓停止及び神経筋遮断作用が報告されている ．これまたため，この 2 つの画分について，逆相 HPLC による精でに Erythrophleum 属の成分研究に関しては，アルカロイ製を行い化合物 1（1.4 ㎎）を単離した．

ド類化合物の cassaine, cassaidine, acetyl cassaidine の単行った．ヘキサン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグ

化合物 1 は，各種スペクトル分析及び文献値

４）との比較より，a-sapinine と同定した．

５）

６）

離 報 告 例 が あ る ． な お，Erythrophleum succirubrum のメタノールエキスは，上記のスクリーニングにおいてTCF/b-catenin 転写阻害活性を示したものの，本植物に化 合 物 1: a-sapinine. White solid; C30H37NO7, MW: 523.

ついて詳細な成分解析を行ったところ，驚くことに TCF/[a] = -63.6 (c 0.4, CHCl3); EIMS m/z 523 [M ], H NMRb-catenin の転写を活性化する成分の単離に至ったので報[measured at 600 MHz, CDCl3)]: d 7.08 (s, H-1), 2.80 (m,告する．

26
D+1H-4), 3.45 (brd, J=15.6, H-5), 5.14 (brs, H-7), 2.02 (m, H-8), 3.52

Erythrophleum succirubrum の葉部 330g をメタノールで(m, H-10), 1.87 (m, H-11), 5.72 (d, J=10.2, H-12), 0.83 (d, J=4.8,抽出し抽出物 56g を得た．このうち 37g をヘキサン，酢H-14), 1.17 (s, H-16), 1.33 (s, H-17), 1.12 (d, J=6.0, H-18), 1.80

酸エチル及びブタノールで溶媒分配を行い，各可溶部を(s, H-19), 3.91 (d, J=12.0, H-20), 4.01 (d, J=12.0, H-20), 6.70

それぞれ得た．得られた各可溶部のうちブタノール可溶(d, J=9.0, H-3’), 7.42 (t, J=7.2, H-4’), 6.61 (t, J=7.2, H-5’),部を選択し以下の分画を行った．まず，本可溶部につい7.88 (d, J=7.8, H-6’), 2.92 (d, J=4.8, NH-CH3), 2.08 (s, CO-てシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い Fr.1A ～CH3), C NMR [measured at 150 MHz, CDCl3]: d 156.1 (C-1I を得た．このうち，Fr.1E について逆相 HPLC による分1), 137.1 (C-2), 214.3 (C-3), 49.6 (C-4), 25.1 (C-5), 143.4 (C-6),

画を行い，Fr.2A-2F を得た．得られた画分のうち Fr.2C

126.4 (C-7), 40.7 (C-8), 78.1 (C-9), 47.4 (C-10), 43.5 (C-11), 74.9

及び 2E について，C30 カラムを用いた逆相 HPLC を行い，(C-12), 65.3 (C-13), 37.1 (C-14), 25.2 (C-15), 24.1 (C-16), 16.5

Fr.2C からは化合物 2 を（6.1 ㎎），Fr.2E からは化合物 3(C-17), 11.8 (C-18), 10.4 (C-19), 69.3 (C-20), 173.5 (C-21), 169.1（9.3 ㎎）をそれぞれ単離した． 単離した化合物 2 及び 3(C-22), 152.3 (C-1’), 110.8 (C-2’), 110.8 (C-3’), 134.9 (C-4’),

は， H NMR スペクトルにおいて特徴的なシグナルとし114.3 (C-5’), 134.9 (C-6’), 29.5 (NH-CH3), 21.2 (CO-CH3).て，6-8 ppm 付近でフラボノイド骨格由来するシグナル並

131Fig.3 TCF/b-catenin transcriptional activity of each soluble fractions of Excoecaria indica− 36 −

Wnt シグナルを標的とした育毛促進作用をもつ天然成分の探索

びに 3-5 ppm 付近に一分子の糖に由来するシグナルが観2’’), 72.1 (C-3’’), 73.4 (C-4’’), 72.0 (C-5’’), 17.7 (C-6’’).

測されたことより，2 及び 3 はフラボノイド配糖体と推定された．各種スペクトル分析及び文献値との比較より，23・4は myricetin 3-O-b-D-galactopyranoside

単離した 3 種の化合物について TCF/b-catenin 転写活3-O-a-L-rhamnopyranoside８）７），3 は myricetin

単離した化合物の TCF/b-catenin 転写活性性について検討を行った．その結果，a-sapinine（1）は，と同定した．

293T/STF 細 胞 の 生 存 率 を 維 持 し な が ら 1.4 µM で 22.5
化 合 物 2: Myricetin 3-O-b-D-galactopyranoside. Yellow倍（Viability: 86%），2.9 µM で 46.6 倍（Viability: 88%）

powder; C21H20O3, MW: 480.; FABMS m/z 481 [M+H] , Hと比較的低濃度で顕著に TCF/b-catenin の転写を活性化

NMR [measured at 500 MHz, CD3OD)]: d 6.19 (d, J=2.0,することが判明した．また，フラボノイド配糖体である

H-6), 6.39 (d, J=2.0, H-8), 7.37 (s, H-2’and H-6’), 5.18 (d,myricetin 3-O-b-D-galactopyranoside（2） 及 び myricetin

J=8.0, H-1’’), 3.82 (dd, J=8.0 and 9.0, H-2’’), 3.56-3.59

3-O-a-L-rhamnopyranoside（3） は，293T/STF 細 胞 の 生(overlapped, H-3’’), 3.86 (brd, J=3.0, H-4’’), 3.49 (brt,存率を維持しながら 50 µM 及び 100 µM で TCF/b-catenin

J=6.5, H-5’’), 3.65 (dd, J=6.5 and 11.5, H-6’’), and 3.56-の転写を活性化することが判明した．

+

3.59 (overlapped, H-6’’),131

C NMR [measured at 125

４． 結

MHz, CD3OD]: d 158.7 (C-2), 136.0 (C-3), 179.4 (C-4), 163.0

語(C-5), 99.9 (C-6), 166.1 (C-7), 94.7 (C-8), 158.4 (C-9), 105.6 (C-Wnt シグナルと毛髪生成に関しては 2007 年 5 月に成10), 121.7 (C-1’), 110.0 (C-2’), 146.3 (C-3’), 138.1 (C-4’),体における毛包形成と Wnt シグナル経路の関与につい

146.3 (C-5’), 110.0 (C-6’), 105.6 (C-1’’), 73.3 (C-2’’), 75.1て Nature 誌(C-3’’), 70.1 (C-4’’), 77.2 (C-5’’), 62.0 (C-6’’).

告されている９）で報告されるなど，その新知見が多く報10）．一方，小分子を用いたアプローチで
11）は，Wnt シグナルを活性化させる化合物として，QS1112）

12）

や化 合 物 3: Myricetin 3-O-a-L-rhamnopyranoside. Yellow

SB-216763

powder; C21H20O3, MW: 464.; FABMS m/z 465 [M+H] , Hシグナルに作用する小分子を育毛作用に結びつけた研究はNMR [measured at 500 MHz, CD3OD)]: d 6.19 (d, J=2.1,あまり知られていないH-6), 6.35 (d, J=2.1, H-8), 6.94 (s, H-2’and H-6’), 5.31 (d,に，有効な育毛促進作用を有する化合物を発見を目指し，

J=1.5, H-1’’), 4.21 (dd, J=1.5 and 3.2, H-2’’), 3.78 (dd,当研究室保有の植物エキス 250 種について TCF/b-catenin

J=3.2 and 9.5, H-3’’), 3.33 (t, J=9.5, H-4’’), 3.51 (dq, J=6.1

転写活性を指標としたスクリーニングを行った．その+113, SB-415286などが報告されているが，Wnt13）．本研究では，上記の知見を基

and 9.5, H-5’’), 0.95 (d, J=6.1, H-6’’), C NMR [measured

結果，活性が認められた Excoecaria indica より a-sapinine

at 125 MHz, CD3OD]: d 159.4 (C-2), 136.3 (C-3), 179.7 (C-を，Erythrophleum succirubrum よ り myricetin 3-O-b-D-4), 163.2 (C-5), 99.8 (C-6), 165.9 (C-7), 94.7 (C-8), 158.5 (C-9),

galactopyranoside 及 び myricetin 3-O-a-L-rhamnopyranoside

105.9 (C-10), 122.0 (C-1’), 109.6 (C-2’), 146.9 (C-3’), 137.9の単離に成功した．今後，特に Excoecaria indica の活性画(C-4’), 146.9 (C-5’), 109.6 (C-6’), 103.6 (C-1’’), 71.9 (C-分について，更に成分探索を行い，得られた活性成分の化

Fig.4 Chemical structure of compounds 1-3− 37 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

Fig.5 TCF/ b -catenin transcriptional activity ofValues are mean±S.D. (n=3)
compound 1

Fig.6 TCF/b-catenin transcriptional activity of compound 2 and 3

Values are mean±S.D. (n=3)

Phytochemistry 1971, 10, 2793-2797.

学構造を明らかにする予定である．また，得られた活性成分について，種々の生化学的手法（Western blotting 法な７）Foo, L.Y.; Lu, Y; Molan, A.L. et al., Phytochemistry
2000, 54, 539-548.

ど）を用いてその作用機構の詳細な解析を行い，有望な作用を示した成分について，in vivo 実験等により育毛作用に

８）Chung, S.; Kim, Y.; Takaya, Y. et al., J. Agric. Food
Chem. 2004, 52, 4664-4668.

関する有用性を評価し，育毛剤原材料としての利用を検討していきたい．

９）Ito, M.; Yang, Z.; Andl, T. et al., Nature 2007, 447, 316-（引用文献）

10）Gerard M. J. Beaudoin III, G. M. J.; Sisk, J. M.;

320.
１）岸本治郎 , 日本農芸化学会誌 2003, 77, 566-569.

Coulombe, P. A. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2005, 102,２）岸本治郎 , 実験医学 2000, 18, 1817-1820.

14653-14658.

３）Xu, Q.; Wang, Y.; Dabdoub, A. et al., 2004, 116, 883-11）Zhang, Q.; Major, M.B.; Takanashi, S. et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 2007, 102, 7444-7448.

895.
４）Chumkaew, P.; Karalai, C.; Ponglimanont, C. et al, J.

12）Coghlan, M.P.; Culbert, A.A.; Cross, D.AE. et al.,Chem. boil., 2000, 7, 794-803.

Nat. Prod. 2003, 66, 540-543.
５）Sattayasai, J.; Sattayasai, N.; Laupattarakasem, P. et13）河﨑綾，鳥居宏右，西沢幸二

年会講演要旨集al., J. Sci. Coc. Thailand 1983, 9, 47-52.
６）Griffin, W.J.; Phippard, J.H.; Culvenor, C. C. J.et al.,

− 38 −

2007, 2, 117．

他，日本薬学会第 127