ペプチドによる微小管の構造安定化への基盤技術の開発
鳥取大学

工学部 化学バイオ系学科
准教授 稲葉 央
2022年3月8日
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微小管とは・チューブ型構造
・細胞機能に重要な役割
・分子デバイスの材料として注目

骨格 (強度)運動形成・解離

持続長 5000 mm(剛直性の指標)

アクチン：13.5 mm
中間径フィラメント：0.5 mm

wehi.edu.au

Cellular Visions

細胞分裂

神経軸索
精子の運動形成解離2微小管の応用・チューブ型構造
・細胞機能に重要な役割
・分子デバイスの材料として注目

抗がん剤開発材料応用

タキソール（パクリタキセル）

微小管内部のポケットに結合し、安定化することで抗がん剤として働く
解離

A. Kakugo et al.,Nat. Commun., 2018, 9, 453

微小管の運動を利用した輸送システムやマイクロデバイス

高コストや副作用のため、微小管を安定化できる代替品が求められている内部の利用はない。加えて微小管自体の不安定性が材料として利用する上で課題
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微小管安定化の従来技術と問題点

薬剤 (タキサン系)
タキソール

微小管内部のポケットに結合して安定化する分子→抗がん剤および微小管安定化剤として汎用的に利用される。

課題：合成の困難さ、低い水溶性、毒性など「微小管内部にものを入れる」「微小管の安定化」の技術ほぼなし↓タキサン系薬剤に変わる微小管安定化剤が必要

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微小管内部に結合するペプチドの開発
R1R2R3R4N
繰り返し
配列

Tau由来ペプチド (TP)CGGGKKHVPGGGSVQIVYKPVDL

Tau

Taxolと同じ内部ポケットに結合

C

微小管内部への結合
TMR
Sba

TPGTP or
GTP analog
重合10 mm

チューブリン

Chem. Eur. J., 2018, 24, 14958
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Tau由来ペプチドの特徴

Tau由来ペプチド (TP)CGGGKKHVPGGGSVQIVYKPVDL

・様々な分子に連結可能・合成が容易・配列改変可能・高い水溶性 (~ mM)
・細胞毒性なし
・微小管内部に結合するため外部に結合するタンパク質の機能を損なわない

Zhang Lab

微小管外部結合タンパク質 (MAPs)

微小管の機能に必須
モーター 形成促進

固定化

連結TPを元に微小管構造を安定化できれば、生体応用・材料応用におけるタキサン系とは異なる新しい技術となる
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本技術の特徴・従来技術との比較
共通
・タキソールに比べ合成が容易で製造コストが低い
・様々なタンパク質を内包可能、それにより微小管の構造、安定性を調整できる・ペプチド配列を変えることで、微小管への結合の強さを調整できる

抗がん剤開発・従来のタキソール骨格（高コストや副作用）に依存した設計から脱却した新しい設計
・ペプチド配列最適化により副作用の軽減や抗がん活性の調整が可能
・ペプチドのみでの細胞内の微小管への結合は確認済み（ACS Omega, 2019）

材料応用
・安定な微小管として利用可能

・長さや剛直性、運動性が変化した微小管を提供（これまでにない「用途に応じた微小管」）
・内包したタンパク質の輸送・放出が可能（外部への結合に比べ微小管機能を阻害しない）
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TPの微小管安定化効果
重合

タキソール

脱重合

微小管形成解析10 mM TP
1 mM GTP
4 mM
Tubulin

37°C

濁度上昇

Optical density at 350 nm

タキソール：微小管内部に結合して安定化

タキソール

0.250.25

タキソール

0.200.200.150.15

TP 4°C

0.100.10

1N 1C 2C バッファ0.05
0.0500002020404060608080

Time / min

TPは微小管形成を促進（安定化）するがタキソールほどの効果はない
8微小管内部への分子導入
金ナノ粒子

蛍光タンパク質

磁性ナノ粒子

金ナノ粒子

磁場の方向に応じて配列

Chem. Eur. J., 2018, 24, 14958,
Chem. Lett., 2022, in press

Chem. Commun., 2019, 55, 9072

環状ペプチドNano Lett., 2020, 20, 5251

細胞内への結合微小管安定化
Polym. J., 2020, 52, 1143

ACS Omega, 2019, 4, 11245

Bull. Chem. Soc. Jpn., 2021, 94, 2100 (Account)9タンパク質内包による微小管の安定化①
再構成によりGFPのC末端に導入

TP

微小管への結合解析

内部への結合は抗GFP抗体の結合解析により評価

微小管

TP-GFP

GFP

GFP内包微小管

10 mm

TP-GFP内包微小管

全長1.7倍微小管形成解析

通常の微小管持続長（剛直性の指標）

4.0倍×100 speed

20 mm

運動速度
1.2倍

20 mm

Optical density at 350 nm

キネシン基板上における構造・運動解析

10 mm

Taxol

0.150.15

4°C

Taxolと同程度
微小管を安定化

TP-GFP
0.100.10

TP-GFP110.05
0.0500

None002020404060608080

Time / min

・TPを用いることでGFPの微小管への内包を達成・GFP内包により微小管の全長・剛直性・運動速度・安定性が増大➡︎天然のタンパク質内包微小管の機能を人工的に模倣
Chem. Commun., 2019, 55, 9072; 特願2020-028653
10タンパク質内包による微小管の安定化②4.1 nm

TP
Azami-Green(AG)四量体蛍光タンパク質

微小管形成解析より顕著な安定化

微小管超構造体形成
アスター構造

ダブレット

分岐

TP-AG
Taxol
TP-GFP
None
AG
TP-mAG(monomer)

20 mm

50 nm

50 nm

TPを用いたAGの内包および微小管外部への結合により、微小管の顕著な安定化および超構造体（アスター・ダブレット・分岐など）形成を確認
bioRxiv, 2022 (DOI: https://doi.org/10.1101/2022.01.27.476107)
11環状ペプチドによる微小管の安定化
分子力場計算

TMR

TCP3

TP

水中チューブリン
結合時

TCPn (n = 1, 3)
Kd = 0.97 mM (n = 3)

Kd = 6.0 mM

RMSD: 1.70–1.94 Å(3.45–3.71 Å for TP)

TMR-C(G)nKKHVPGGGSVQIVYKPVDLC

濁度測定による微小管形成解析
Taxol

DOD at 350 nm

0.100.10

微小管の安定化

TCP34°C

TP

微小管

0.080.08

TCP3

TCP30.060.06

微小管の形成促進・解離抑制

TCP10.040.04

TPNone0.020.02

凝集体

微小管安定化

10 mm

10 mm0000

20204040

Time / min

60608080

一般的に不安定なGTP微小管を安定に形成

・TPの環化によりチューブリンに強く結合（TPの6倍）
・環状ペプチドによる不安定なGTP型微小管の安定化
Polym. J., 2020, 52, 114312磁性ナノ粒子内包による微小管の配列化
HYPTLPLGSSTYGGGKKHVPGGGSVQIVYKPVDL

CoPtナノ粒子

TP

CoPt結合ペプチド
GMPCPPPolymerization1)

Co(CH3COO)2(NH4)2PtCl42)NaBH4

磁性ナノ粒子内包微小管

ペプチド内包磁場による配列化

弱い磁場 (0.37 T) で配列化

− Magnetic field+ Magnetic field2)

透過型電子顕微鏡像

10 mm

S

6060

配向度
400.08配向度
400.71微小管の数

一部連続してCoPtナノ粒子が配列化

微小管の数

50 nm

10 mm

θN

200–50050

微小管の角度 / degree

×20 speed

200–50050

運動中の磁場の印加により運動方向制御

微小管の角度 / degree

・微小管内部における磁性CoPtナノ粒子合成
100× speed
・運動性を保持したまま磁場配列化（磁場なしと比べ9倍の配向度）➡︎磁場に応答して運動方向が変化する磁性微小管の構築
Nano Lett., 2020, 20, 5251

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細胞内微小管への結合
細胞内微小管への結合解析

10 mM TP–TMR, 6 h

HepG2細胞への取り込みと細胞内微小管への結合
取り込みの温度依存性
TP–TMR/Hoechst 33342

37°C

10 mm

10 mM TP–TMR, 3 h

TP–TMR/Hoechst 33342

4°C

10 mm

4°Cで取り込み抑制⇨エンドサイトーシス

エンドサイトーシスによる取り込みと脱離により細胞内微小管に結合
ACS Omega, 2019, 4, 11245
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想定される用途（生体応用）
抗がん剤としての利用 微小管の形成や解離を阻害→細胞分裂を抑制

微小管の解離を阻害

微小管・微小管安定化による抗がん剤はタキソールのみ→微小管を標的とした抗がん剤開発の新たな設計指針を示す

細胞内微小管へのタンパク質内包

細胞の構造・分化などの性質の改変

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想定される用途（材料応用）
モータータンパク質の運動➡️アクティブマターとしての応用

外部表面
天然：モータータンパク質
非天然：アミノ酸への修飾

+ATP

内部空間
キネシン

天然：
非天然：

?

微小管内部への分子導入は未開拓 ➡︎ 内包による構造・機能制御
サイズ・形状運動性

安定性・微小管を作るための試薬は市販されている（Cytoskeleton, Inc.）が、これまでそのまま使われており、微小管自体の性質を変える手法は報告例がなかった→微小管を安定化し、その性質を自在に変えることができる新しい手法
・微小管への分子内包、輸送、放出の技術はなかった→本技術により可能となる。デバイスやドラッグデリバリーへの応用
16実用化に向けた課題と今後の計画
生体応用
・細胞内への取り込み量の増加、細胞内の微小管への効率的な結合が必要→細胞透過ペプチドの融合、ペプチドの配列スクリーニング

材料応用
・内包物が微小管にどのような影響を与えるか予測が難しい。

→モデル計算による解析、様々なタンパク質や金属ナノ粒子を内包してその影響を評価
・内包物の放出挙動が不明→放出される条件の探索および最適化
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企業への期待
生体応用
・細胞内への分子輸送技術、および細胞への影響（細胞死、形態、運動等）を評価できる系を持つ企業との共同研究を希望（サンプル提供可能）

材料応用
・内包物（一次元的に配列化することで機能発現が期待できる分子、輸送や放出を目指す分子）の提案・提供を希望

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：タンパク質を内包した人工微小管• 出願番号：特願2020-028653• 公開番号：特開2021-134144
• 出願人
：鳥取大学
• 発明者
：稲葉央、松浦和則、山本昂久、岩崎崇、角五彰

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お問い合わせ先
国立大学法人鳥取大学
研究推進機構ＴＥＬ 0857‐31‐5546
ＦＡＸ 0857‐31‐5571
e-mail sangakucd＠ml.cjrd.tottori-u.ac.jp20