クラスリン集合因子CALM欠損マウスに見られる、毛や組織の色の薄さの解析
─細胞内物資輸送と体色との関連を探る─
奈良女子大学大学院人間文化研究科個体機能学講座

渡邊利雄

CALM is not believed to be an essential component of clathrin-associated endocytosis of transferrin. However, we made
CALM-deficient mouse and found that CALM does indeed appear to be involved in clathrin-mediated membrane traffic.
We also noticed that CALM-deficient mouse showed pale coat color and started a trial to analyze the relationship between
membrane traffic and coat color. As an initial step, we successfully established CALM knock-down melanoma cells for theanalysis.

１．緒

言体の各組織は皮膚を含めて様々な色を持っている。メラニンに代表されるように色素は細胞内物流システムで輸送されることにより産生・分配される。この機構に不備が生じると、例えば皮膚におけるシミなどの色素沈着等の現象

図1が起こると考えられる。ということはこの輸送を担う分子の動態を制御する方向での研究を行うことができれば、皮言われていたが、ノックアウトでは CALM 依存性が見ら

膚を健康に保つための新しい研究標的として役立つ可能性

れ、ノックアウトマウスはトランスフェリンによる鉄の取り込が高く、近年この物流システムに関与する因子と色素の輸みの低下により重度の貧血となることを明らかにした 8, 9）。

送との関係が解析され始めている。代表的な成功例はメラ

さらに、大規模遺伝子変異解析から推定されていたが従来ノソーム輸送での低分子量 G タンパク質の Rab の働きであは因果関係が知られていなかった、CALM とアルツハイ

1）

る 。しかし、細胞内の物流システムは Rab のみで成り立マー症との関係など、我々の作製したノックアウトマウスつのではない。色素を輸送する小胞は小胞形成開始因子

により CALM の新しい知見が蓄積しつつある 10, 11）。

Arf 群や Arf の制御因子の GEF（GTP 交換因子群で小胞形

このような研究を行う中で、我々はクラスリン集合因子成の活性化因子）や GAP（Arf1 が持つ GTP 加水分解活性CALM 欠損マウスの体色が薄いことに気が付いた。図 1の活性化因子群で小胞形成の不活性化因子）、被覆のクラの白い星印がホモ欠損マウスで、同腹の兄弟姉妹に比べてスリンやその集合因子の CALM 等々の様々な因子の関与体色が薄い。その後、成長後の個体の解析から体色のみながあることは判明しているのであるが、これらと色素とのらず、肝臓や心臓等の臓器の色も薄いことを見出している。

関連の解析は遅々として進んでいない2−7）

本研究は、細胞内物流システムがどのように組織の色と。

我々は、従来から培養細胞でのみ解析されてきたクラス関係しているのかを、クラスリン集合因子 CALM 欠損マリン集合因子の CALM を個体レベルで解析するために世ウスで発見した毛や組織の色の薄さを解析することで明ら界に先駆けてノックアウトマウスを作製し、これを用いたかにしようと試みる、従来にない研究である。我々が作研究から、クラスリン集合因子 CALM は EGF, トランスフ

製した CALM の欠損マウスに見られた新しい知見を基に、ェリン等のクラスリン依存性の小胞輸送に関して従来の報従来知られていない CALM の欠損マウスでの毛や組織の告とは真逆の働きをしていることが明らかになった。即ち、色の薄さを手掛かりとして、現在までに一切の知見がない従来のドミナントネガティブ体（優性抑制型変異体）やノックラスリンを被覆として使う細胞内物流機構と毛や組織のクダウウンを用いた研究報告では CALM は関与しないと色との関係を明らかにすることを目的とする。

An analysis on pale coat color found in
CALM-deficient mice −A trial study on
the relationship between membrane trafficand coat color−
Toshio Watanabe
Department of Biological Science, Graduate
School of Humanities and Sciences, Nara
Women’s University

２．実験

2. 1. CALM 欠損マウスの色の薄さは何に由来するのか
明瞭な色素の薄さが観察されるのは、脾臓、骨髄、肝臓、心臓、皮膚、毛であり、そのほかの組織では色の薄さは明瞭ではない。そこで、これらの組織で組織の色を決定する分子の動態にどのような変化が生じているのかを CALM

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クラスリン集合因子 CALM 欠損マウスに見られる、毛や組織の色の薄さの解析

─細胞内物資輸送と体色との関連を探る─

欠損マウスで検討し、標的として扱う分子を決定する。グ

断できる時点までは相当数のホモ欠損体を得ることができロビンやミオグロビンなどの色素タンパク質が最初の解析た。詳しい解析を安定して行うためにこの申請研究に向け対象になると予想している。このような計画を基に実験をて標準系統の C57BL/6 に戻し交配を行ったところ、誕生開始した。

後にホモ欠損体が全く出現しなくなってしまった。また姉妹交配で維持していたマウスでも同様の現象が観察された。

2. 2. CALM 欠損培養細胞株の樹立と解析

このことは、CALM 欠損の効果に影響を及ぼすマウスの既に作成している CALM 遺伝子破壊マウスの胎児（14遺伝子（いわゆるモディファイヤー）の存在を示唆している。

日胚）から初代培養を行い、胎児の繊維芽細胞（MEF 細胞）マウス作製に使用した ES 細胞は C57BL/6 と CBA マウを得、SV40 ウイルスの不死化遺伝子の T 抗原遺伝子を導スの雑種一代目に由来することから、現在 CBA マウスへ入し、CALM 欠損および野生型の株細胞を樹立した。樹の戻し交配を行っており、誕生するマウスの取得を目指し立した細胞株を用いて、初めに関与が推定される輸送機構ている。なお、我々とは独立に CALM 欠損マウスを作製の解析を、蛍光標識したトランスフェリンや EGF 等、クしたハーバード大のグループも CALM ホモ欠損マウスはラスリン依存性のエンドサイトーシスで取り込まれる分子生まれないとしていることから、我々が遭遇した事態は「あを取り込ませた後に、共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞内へる種のマウスの遺伝背景」によるものだと考えるのは妥当の取り込みに違いが無いかを解析する。マウスの解析からだと判断できる。

予想される色素に関して、その輸送に CALM の有無が効果を与えるか検討する。同様な解析を、メラニン合成細胞として知られる CALM 遺伝子破壊メラノサイトに関しても行う。

3. 2. CALM 欠損培養細胞株の樹立と解析
既に作成している CALM 遺伝子破壊マウスの胎児（14 日胚）から初代培養を行い、胎児の繊維芽細胞（MEF 細胞）を得、SV40 ウイルスの不死化遺伝子の T 抗原遺伝子を導入

2. 3. CALMノックダウンメラニン合成細胞株の樹立

し、CALM 欠損および野生型の株細胞を樹立した。樹立

さて、申請研究の提案を行った際にも CALM 欠損マウした細胞株を用いて、初めに関与が推定される輸送機構のスは離乳期以降にごくわずか存在するだけで、十分な解析解析を、蛍光標識したトランスフェリンや EGF 等、クラを行うことができないことが問題と考えられた。また、生スリン依存性のエンドサイトーシスで取り込まれる分子を体のメラノサイトの単離培養とメラニン合成の測定はかな

取り込ませた後に、共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞内へのりの熟練を要することから、最初はマウスと平行して培養取り込みに違いが無いかを解析した。その結果、参考文献

細胞を用いたモデル系で実験も行うこととした。そこで、

1 に一部報告したように、従来の定説とは異なり、CALM扱いやすさの点からメラニンを合成しているメラノーマ細がトランスフェリンの取り込みに重要であることを明らか

胞の B16C2M 細胞をモデル系として、CALM のノックダにした。一方、同じクラスリン依存性で取り込まれる増殖ウンによるメラニン合成への効果を調べるためにノックダ

因子の EGF の取り込みには影響が見られないことを発見

ウン細胞株の樹立を試み、得た細胞株を用いてメラニン合した。現在、EGF に関しては細胞内への取り込み後の挙成と CALM との関連を解析した。

動に異常がないかを解析している。

2. 4. 新しい個体レベルでの解析系を目指して

3. 3. CALMノックダウン細胞の樹立

CALM 欠損マウスは交配を重ねることにより、生存率CALM ノックアウト MEF 細胞では、増殖に問題がないの低下が著しいことが判明した。特に C57B/6 の遺伝背景ことを確認していたので、ノックダウンは sh-RNA 発現ベ

では全く生まれてこないことを新たに見出した。今後の個クター HuSH（ORIGENE）を用いて、「CALM がノックダ体レベルでの詳しい解析を目指して、新しくコンディショウンされた B16C2M メラノーマ細胞株」を樹立することとナルノックアウトマウスの作製を検討するために標的部位した。の解析を研究に加えることとした。加えて、発生後期の胚

CALM のノックダウンを目指して、sh-CALM-1 ～ 4 のの検討を行い、CALM と体色との関連を探る手がかりを以下の配列を用いた。

得ることを試みた。

sh-CALM-1: GCCAGAGCCTGACGGACCGAATCACCGCG

３．結sh-CALM-2: GAGCAAGTTGGAATTGACAGAGGAGATAT果

sh-CALM-3: GAATGATGTAAGTTGGAGTCAACCAGGTG

3. 1. CALM 欠損マウスの色の薄さは何に由来するのか

sh-CALM-4: ATAATGACTGCACCAGCCATCGACATATT

マウス系統の樹立時には、離乳期以降に生存するホモ欠コントロールとして、空のベクターとランダムな配列の損マウスの数が少ないものの誕生後 1 週間ほどの体色が判SC を導入した。

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コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図 2 に示すように、合計 61 個のクローンを得た。

パク質発現の低下が著しいクローン 2-9, 2-10, 3-1 と低下が最初に RT-PCR にて CALM のノックダウンの程度を検見られる 3-17, 3-4、あまり低下が見られない 3-11 のクローンが得られた。

討した。図 2 に示すように sh-CALM-2, 3 で良好なノックこれらのクローンを実験に用いることとし、液体窒素中ダウンが見られたが、sh-CALM-1, 4 ではあまり効果が見に保存した。

られなかった。これは別の細胞系の BAF3 細胞を用いた場合も同様の結果を得ていることから（未発表）、CALM の3. 4. CALM タンパク質の低下とメラニン合成との相関性の検討

ノックダウンには sh-CALM-2, 3 の配列が有効であると考えられる。
良好なノックダウン効果が見られた 7 つのクローンに関

スクランブル コントロールを導入した株、sh-CALM-2、して、再度確認実験を RT-PCR にて行った。結果を図 3A

sh-CALM-3 を導入した株、親株、CALM の発現検討の対に示す。

照として我々が作製した CALM KO MEF 細胞と CALM

うち 6 クローンに関してウエスタン法で CALM タンパ

WT MEF 細胞を用いた解析を行った。

ク質の発現を検討した。図 3B に示すように、CALM タン

まず、選んだ細胞株の CALM 発現をウエスタン法で確認した。
図 4 に示すように、向かって左側の B16C2M 細胞の KD
１はスクランブル コントロールを導入した株、KD4 は shCALM-2 を導入した株、KD5 は sh-CALM-3 を導入した株、WT は親株 B16C2M である。ウエスタン法のコントロールとして用いた MEF 細胞では、WT は CALM WT MEF 細胞、
KO は CALM KO MEF 細胞である。KO でバンドが検出されないことから抗体の特異性が確認できる。
sh-CALM-2 を導入した株（KD4）と sh-CALM-3 を導入した株（KD5）では CALM タンパク質の発現が低下していた。
一方で、スクランブル コントロールを導入した株と親株

図2では CALM タンパク質の発現が見られた。検出している

図3

図4− 136 −クラスリン集合因子 CALM 欠損マウスに見られる、毛や組織の色の薄さの解析

─細胞内物資輸送と体色との関連を探る─

バンドが CALM（2 本のバンド）であることは、CALM

文献 2 で明らかにした CALM の NES（核排出）配列の欠損

WT MEF でバンドが検出され、CALM KO MEF で検出による効果の検討を、樹立した CALM 欠損細胞を用いてされないことから判断できる。また β- アクチンのバンド変異体でのレスキュー実験を開始している。

から、KD4, KD5 の CALM のバンドが KD1 や WT に対し現在までに、2 種類知られている CALM のアイソフォームのいずれでもトランスフェリンの取り込みが回復するこての薄いことが確認できる。
次に、細胞を沈殿させ沈殿の色を比較した。とを確認している。現在 NES 変異体の作製を試みようと

図 5 に示したものが結果である。１はスクランブル コしている。

ントロールを導入した株、2 は sh-CALM-2 を導入した株、尚、現在保有している CALM 欠損マウスは誕生直後に死亡すると推察される。そこで、誕生前の発生最終期の胚

3 は sh-CALM-3 を導入した株である。
この結果と先の CALM タンパク質の発現解析とからは、
CALM の発現が低下している B16 細胞では細胞の色が親での解析ができないかを検討している。
E18.5 日胚を解析したところ、図 7 に示すように CALM欠損胚では目の黒味が低下している（1, 2, 3 の番号を付し株の黒から白っぽくなっていることが分かる。
メラニン合成細胞は黒色を呈することから、CALM のたホモ欠損体の目は、黒い色が薄くなっている）ことを見発現量とメラニン合成とに何らかの関連があることが推察出している。今後は、E19.5 日胚と誕生直後の胚（P0）を解できる。

析して、見出した目の色の薄さを手掛かりに、マウス個体さらに、この色の変化がメラニン合成の低下によるものかを、吸光度によるメラニン量の測定を行い検討した（図を用いた CALM と色との関係を解析できないかを検討したい。

6）。１はスクランブル コントロールを導入した株、2 は４．考

sh-CALM-2 を導入した株、3 は sh-CALM-3 を導入した株である。傾向として、CALM の発現が低下している細胞ではメラニンの含量が低下しているように見える。

察

これまでの研究期間に、予想したもの、予想しなかったものを含めて以下に述べる成果を得ている。
（1）CALM 遺伝子の機能を修飾する遺伝子（モディファイ

3. 5. 新しい個体レベルでの解析系を目指してアー）の存在を示唆する結果を得た。

申請者が作製した KO マウスでは、発生初期から全身で（2）戻し交配により（1）の仮説の検証を行う準備ができた。

CALM が欠損している状態での解析しかできなかったた（3）CALM 欠損培養細胞株として MEF 細胞株を樹立し、め、前述のように注目しているメラノソームでの解析が困いくつかの新しい知見を得た。

難になっている。参考文献 2 の白血病との関連や、参考文（4）メラニン合成への CALM の効果の有無を調べるツール

献 4 のアルツハイマー症との関連の解析を行う際にも、同として、CALM がノックダウンされた B16C2M メラノ様の「解析前に個体が死亡してしまう」という問題を抱えてーマ細胞株の樹立に成功した。さらに CALM タンパクいる。より詳しい解析には発生が終了したのちに注目する質量の低下とメラニン合成量の低下とに相関があること

組織や細胞特異的に CALM を欠損させて解析する必要がを見出した。

ある。そこで、CALM 欠損の効果を解析するために新し（5）メラノサイトレベル、個体レベルでの解析を可能にすく cKO マウスを作製するために設計を行っている。参考ると期待される CALM のコンディショナルノックアウ

図5図6

図7− 137 −コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

トマウス作製に向けた一歩を踏み出した。

G proteins and their regulators: roles in membrane（6）CALM 欠損 E18.5 日胚の解析から、CALM 欠損胚では目の色が薄いことを見出し、マウスを用いた解析の可能性を見出した。

transport, development and disease, Nat. Rev. Mol. Cell
Biol. 12, 362-375.
３）E. Mizuno-Yamasaki, F. Rivera-Molina, P. Novick.
(2 0 1 2) GTPase networks in membrane traffic, Annu.

CALM 欠損マウスが生まれなくなったのは予想外であRev. Biochem. 81, 637-659.

ったが、新しい修飾遺伝子の存在が明らかになり、今後の４）Militello R, Colombo MI. (2 0 1 3) Small GTPases as

解析への期待が持てた点は良かった。このために、当初のregulators of cell division. Commun Integr Biol. 6,計画を若干変更してメラノーマ細胞を用いて CALM がノe25460. doi: 10.4161/cib.25460.

ックダウンされた B16C2M メラノーマ細胞株の樹立に成５）Seixas E, Barros M, Seabra MC, Barral DC. (2 0 1 3)

功し、CALM タンパク質量の低下とメラニン合成量の低Rab and Arf proteins in genetic diseases. Traffic. 1 4,871-85. doi: 10.1111/tra.12072.

下とに相関があることを見出したことは、今後の解析にとり大きな進捗であった。また予想外の障害を乗り越えるべ６）Mizuno-Yamasaki E, Rivera-Molina F, Novick P.

く、将来的に重要になると思われるコンディショナルノッ(2 0 1 2) GTPase networks in membrane traffic. Annu

クアウトマウス作製へ向けた一歩を踏み出せたことは、研Rev Biochem. 8 1, 6 3 7-5 9. doi: 1 0.1 1 4 6/annurev-

究の進展にとって良かったと思いたい。加えて、CALM

biochem-052810-093700.

欠損 E18.5 日胚の解析から、CALM 欠損胚では目の色が薄７）Donaldson JG, Jackson CL. (2 0 1 1) ARF family Gいことを見出し、マウスを用いた解析の可能性を見出した。

proteins and their regulators: roles in membrane

今後の課題としては、見出した「CALM の発現量が低下

transport, development and disease. Nat Rev Mol Cell

するとメラニン合成が低下する」という相関関係は因果関

Biol. 12, 362-75. doi: 10.1038/nrm3117.

係となり得るのかと言う点がまず解決すべき点である。こ８）M. Suzuki, H. Tanaka, A. Tanimura, K. Tanabe, N.のために、KD 細胞への CALM 遺伝子導入による CALM

Oe, S. Rai, S. Kon, M. Fukumoto, K. Takei, T. Abe,

発現復帰体でのメラニン合成の回復の有無を検討する予定

I. Matsumura, Y. Kanakura, T. Watanabe. (2 0 1 2)である。さらに、CALM 低下によるメラニン合成低下のThe mouse clathrin assembly protein PICALM is

分子メカニズムを探るために、まずはメラニン合成系酵素

required for erythroid maturation and transferrinの動態を探ることを計画している。加えて、CALM 欠損internalization. PLoS ONE, 7(2): e3 1 8 5 4. doi:1 0.1 3 7 1/

E18.5 日胚の解析から、CALM 欠損胚では目の色が薄いこjournal.pone.0031854とを手掛かりに解析が行えるかの検討を計画している。

９）鈴 木 麻 衣、 渡 邊 利 雄 (2012) ク ラ ス リ ン 集 合 因 子
CALM はトランスフェリンの取り込みに必要で、欠損謝辞は貧血を引き起こす。－培養細胞研究での定説を覆す－

本財団より受けた助成金が研究の一部を担った参考文献
10, 11 では、Cosmetology Research Foundation よりのサ

細胞工学

31 巻

7 月号

808-809. HOT PRESS

10）M. Suzuki, K. Yamagata, M. Shino, Y. Aikawa,
K. Akashi, T. Watanabe, I. Kitabayashi. (2 0 1 4) The

ポートがあったことを明記した。

nuclear export signal (NES) within CALM is necessary（参考文献）

for CALM-AF1 0-induced leukemia. Cancer Science.

１）M. Ishida, N. Ohbayashi, Y. Maruta, Y. Ebata Y,105, 315-323.
11）K. Kanatsu, Y. Morohashi, M. Suzuki, T. Watanabe,Fukuda M. (2012)
Functional involvement of Rab1A in microtubule-T. Tomita, T. Iwatsubo. (2 0 1 4) Decreased CALM

dependent anterograde melanosome transport inexpression modulates Ab4 2 production throughmelanocytes. J Cell Sci. 1 2 5, 5 1 7 7-8 7. doi: 1 0.1 2 4 2/

clathrin-mediated endocytosis of g - secretase. Naturejcs.109314.

Communication DOI: 10.1038/ncomms4386.

２）J.G. Donaldson, C.L. Jackson. (2 0 1 1) ARF family− 138 −