Nuclear Extract Kit
核タンパク質抽出キット（商品コード40010 & 40410）

⽇本語版プロトコール

使⽤上の注意事項
この⽇本語プロトコールはNuclear Extract Kit（商品コード40010 & 40410）の英語版製品プロ
トコール (Version D5) に基づいて作製しました。本プロトコール使⽤時には、英語版プロトコール
も併せてご参照ください。英語版プロトコールの最新版は弊社ウェブサイトよりダウンロードが可能
です (http://www.activemotif.jp/catalog/100)。
注）Phosphatase Inhibitorの変更に伴い、添加量に変更がございます。必ずご確認ください。

アクティブ・モティフ株式会社〒162-0824 東京都新宿区揚場町2-21
TEL: 03-5225-3638 FAX: 03-5261-8733

www.activemotif.com

Nuclear Extract Kit

改訂履歴
改定⽇
2022年5⽉

改定内容【 重 要 】 構 成 品 の Phosphatase Inhibitors (Part#102146) は 、 100x Phosphatase
Inhibitors (Part#105840) に変更となりました。構成品の変更に伴い、抽出プロトコール
における添加量にも変更がございますので、プロトコール（細胞/組織からの核/細胞質/全細胞抽出）のバッファー調製表を参照し、添加量を決定してください。また、最新版の英語版プロトコールも併せてご参照ください。

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Nuclear Extract Kit

⽬次
はじめに···················································································································· 3
キットの性能と利点······································································································ 4
Nuclear Extract Kitについて ························································································· 5
キット内容と保存⽅法 ··································································································· 6
キット構成品の他に必要な試薬類 ····················································································· 6
追加で必要となる可能性のあるもの ·················································································· 6
バッファーの調製と推奨事項··························································································· 7
Protocol I: 接着細胞・浮遊細胞 ····················································································· 8A 細胞サンプルからの核抽出物調製 ················································································· 8
B 細胞サンプルからの全細胞抽出物調製 ··········································································· 9
Protocol II: 新鮮な組織と冷凍組織 ··············································································· 11
A 組織サンプルからの核抽出物調製 ··············································································· 11
B 組織サンプルからの全細胞抽出物調製 ········································································· 13

Appendix
Section A ブラッドフォード法によるタンパク質定量⽤の希釈例 ··········································· 14
Section B トラブルシューティング ················································································ 15-2-

Nuclear Extract Kit

はじめに
Nuclear Extract Kitは、細胞または組織サンプルから核抽出物、全細胞抽出物、細胞質抽出物を調製するためのキットです。細胞質または核画分内の活性を維持したタンパク質を簡便に迅速かつ、効率的に取得することができます。このキットで回収したタンパク質は、様々な実験 (ゲルシフトアッセイ (EMSA)、DNAフットプ
リンティング、ウエスタンブロット) に使⽤可能です。また、精製した核タンパク質は酵素活性アッセイや結合実験などに供与することができます。アクティブ・モティフの TransAM®アッセイキットで転写因⼦の活性を調べる際には、Nuclear Extract Kitで細胞抽出物を調製することが推奨されています。
本キットには、8.8×106個の細胞 (HeLa細胞が100 mm組織培養⽫に広がった状態に相当する) からの核分
画抽出を100回または400回実施するための試薬が含まれています。
Nuclear Extract Kitは、様々な細胞や組織から核、細胞質または全細胞分画の調製ができるよう設計されています。また、サンプルの保存については、新鮮または凍結どちらの状態からも抽出が可能です。核抽出物の調製に際しては、脱リン酸化酵素阻害剤を添加した氷冷PBSで細胞を回収します。これは、タンパク質への余計な修飾 (タンパク質の発現、分解、脱リン酸化など) を抑える⽬的があります。次に、それらを低張液バッフ
ァーに再懸濁し、細胞膜を膨張させ壊れやすくします。界⾯活性剤の添加によって、細胞質のタンパク質が上清に漏出します。細胞質分画を回収した後に、核を溶出して、タンパク質分解酵素阻害剤を添加した界⾯活性剤を含まないバッファーで核タンパク質を可溶化します。
全細胞抽出物を調製するには、脱リン酸化酵素阻害剤⼊りのPBSで細胞を回収し、溶解バッファーで細胞を溶解します。遠⼼によって、細胞残滓と可溶化したタンパク質を分離します。
組織からの抽出を⾏う際には、サンプルを細かく裁断し、ダウンス型ホモジェナイザーを使って破砕すること
で、単⼀細胞懸濁液にします。その後、遠⼼によって、細胞残滓と可溶化したタンパク質を分離します。
細胞抽出物のタンパク質濃度は、アクティブ・モティフのProStain Protein Quantification Kit (商品コード
15001) やブラッドフォード法によって定量することが可能です。BCA法につきましては、希釈により抽出液が希薄になり、タンパク質濃度が標準曲線の範囲内に収まらなくなるため、お勧めできません。
アクティブ・モティフでは、様々な細胞や組織に由来する核、全細胞および細胞質抽出物50種類以上を製品として提供しています (https://www.activemotif.com/catalog/751)。

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Nuclear Extract Kit

キットの性能と利点
Nuclear Extract Kitは研究⽤試薬です。診断検査には使⽤できません。

アッセイ時間︓2時間

タンパク質の抽出量︓細胞質抽出液︓8.8×106個の細胞から〜0.5 - 1 mg (〜1 - 2 mg/ml)
核抽出液︓8.8×106個の細胞から〜0.15 - 0.25 mg (〜3 - 5 mg/ml)
全細胞抽出液︓8.8×106個の細胞から〜1.2 - 2.4 mg (〜4 - 8 mg/ml)(注意︓コンフルエントに培養したHeLa細胞の例)

アッセイの適合性︓
TransAM®、EMSA、DNAフットプリンティング、ウエスタンブロッティング、核タンパク質の予備精製、タ
ンパク質アッセイなどのサンプル調製に使⽤できます。
抽出可能な活性化転写因⼦には、NFκB、AP-1、CREB、p53、HIF-1、STAT、Sp1、NFAT、MyoD、NF-YA、
C/EBPおよびPPARγなどがあります。抽出に成功した細胞には、HeLa細胞、WI-38細胞、COS-7細胞、PC12細胞、Jurkat細胞、RINm5F細胞など多数あります。抽出には新鮮または凍結した細胞、組織サンプルのいずれも使⽤可能です。

経時変化研究について︓
エフェクター分⼦を異なる時点で加えて経時的変化をみる実験には、細胞溶出やサンプル処理を同時に⾏って、操作をサンプル間で⼀致させることを推奨します。

-4-Nuclear Extract Kit

Nuclear Extract Kitについて

Figure 1︓核抽出物および細胞抽出物の特異的抽出
TransAM® NFκB p50 Kit (商品コード41096または41596) を⽤い、刺激処理有り/無しのHeLa細胞からNuclear
Extract Kitで単離した核分画および細胞質分画について、使⽤量を変化させた時のNFκBの活性を調べた。

Figure 2: 細胞抽出物中の特異的タンパク質のウエスタンブロット
細胞分画の効率を分析するため、Nuclear Extract Kitを⽤い̜HeLa細胞の核分画、細胞質分画、全細胞分画を調製した。20 μgの細胞質分画 (Cy)、核分画 (Nu)、全細胞抽出物 (WC)、核ペレット (NP) を4-20%のSDS- PAGEゲル
で電気泳動した。ゲルを1:1000で希釈した各タンパク質特異的な⼀次抗体を使⽤したウエスタンブロッティングで検出した。
使⽤した⼀次抗体︓alpha Tubulin mAb (商品コード39528); COX IV mAb; GAPDH mAb; Lamin A/C mAb (商品コード39288); Pan-Cadherin mAb; RNA pol II mAb (商品コード 39097)。RNA pol IIが核ペレットに確認されているが、これはRNA pol IIが核⾻格やクロマチンと結合することが理由である。オプションとして、界⾯活性剤
を核ペレットに添加すると、核⾻格タンパク質やRNA pol IIのようなクロマチン結合タンパク質がより可溶化しやす
くなる。

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Nuclear Extract Kit

キット内容と保存⽅法
未使⽤のキットは、­20℃で保管できます。使⽤後はそれぞれの試薬類を下記に⽰す温度で保管してください。
容量
構成品

100回分/400回分

保管温度/ 安定性

Lysis Buffer AM1

10 ml / 50 ml

4℃で６ヶ⽉

1M Dithiothreitol (DTT)

100 μl / 500 μl-20℃で1年

Protease Inhibitor Cocktail

100 μl / 500 μl-20℃で1年

100 ml / 4X 100 ml

4℃で６ヶ⽉

8 ml / 4X 8 ml

-20℃で６ヶ⽉

50 ml / 4X 50 ml

4℃で６ヶ⽉

3 ml / 4X 3ml

4℃で1年

10X PBS
100X Phosphatase Inhibitors
10X Hypotonic Buffer
Detergent

キット構成品の他に必要な試薬類
・ 5 mlおよび10 mlピペット
・ ピペッター・ セルスクレーパー
・ 15 mlコニカルチューブ
・ 微量遠⼼チューブ・ 冷却遠⼼機・ シェーカー・ 蒸留⽔

追加で必要となる可能性のあるもの
ダウンス型ホモジェナイザー (容量2 ml)
最初のサンプル量を減らすために太いペッスル (looser, A, 隙間 0.12 mm)、最終的なホモジェナイズには細いペッスル (Tighter, B, 隙間 0.06 mm) を使⽤します。接着細胞や浮遊細胞の処理には隙間の⼩さい (B)ペッスルが必要です。⼀⽅、新鮮または凍結組織の調製には⼤きい (A) ペッスルと⼩さい (B) ペッスルが必
要になります。アクティブ・モティフのダウンスホモジェナイザーは商品コード40401および40415です。

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Nuclear Extract Kit

プロトコール
バッファーの調製と推奨事項【重要】Phosphatase Inhibitors (Part#102146) は、100x Phosphatase Inhibitors (Part#105840) に変更となりました。必ず、プロトコール (細胞/組織からの核/細胞質/全細胞抽出) のバッファー調製表を参照
し、添加量を決定してください。
PBS/Phosphatase Inhibitor溶液の調製
PBS/Phosphatase Inhibitor溶液は、透明で⻩⾊い液体です。プロトコール (細胞/組織からの核/細胞質/全細胞抽出) を参照し、抽出操作に必要なPBS/Phosphatase Inhibitor溶液の液量を決定してください。例えば、
100 mmディッシュ1枚の細胞から核タンパク質を回収する場合には、以下の⼿順でPBS/Phosphatase
Inhibitor溶液8 mlを調製してください︓10X PBSを0.8 mlと蒸留⽔を7.12 ml混合し、100X Phosphatase
Inhibitorを80 μl添加します。Phosphatase Inhibitorは希釈後24時間経過すると活性が失われるため、
PBS/Phosphatase Inhibitor溶液は調製した⽇に使⽤してください。残った溶液を同⽇に使⽤しない場合は廃棄してください。
1X Hypotonic Bufferの調製
プロトコール (細胞/組織からの核/細胞質/全細胞抽出) を参照し、抽出操作に必要な1X Hypotonic Bufferの液量を決定してください。例えば、100 mmディッシュ1枚の細胞から核タンパク質を抽出する場合には、以下に⽰す⼿順で1X Hypotonic Buffer 500 μlを調製してください︓10X Hypotonic Buffer 50 μlと蒸留⽔
450 μlを混合します。残った1X Hypotonic Bufferは4℃で1週間保存できます。
10 mM DTTの調製
Nuclear Extract Kitには、1 M DTTが付属しています。Complete Lysis Bufferを調製するために、まず1 M
DTTを希釈して10 mM DTTを調製してください。ただし、組織からの核および細胞質抽出には1 M DTTを使⽤します (組織からの核抽出プロトコールP11参照)。10 mM DTTを作製するには、蒸留⽔で1 M DTTを100倍希釈してください (例︓蒸留⽔99 μlに1M DTT 1 μlを加える)。DTTは⾮常に不安定な物質なので、10 mM
DTTは必ず使⽤前に⽤時調製し、凍結融解して何度も使⽤することは避けてください。
Complete Lysis Bufferの調製
注意︓Lysis Buffer AM1には、Phosphatase Inhibitorが含まれていますが、Protease Inhibitorは含まれていません。Phosphatase Inhibitorが含まれているとLysis Buffer AM1は⻩⾊に発⾊します。
プロトコール (細胞/組織からの核/細胞質/全細胞抽出) を参照し、抽出操作に必要なComplete Lysis Bufferの液量を決定してください。例えば、100 mmディッシュ1枚の細胞から核タンパク質を抽出する場合には、以下に⽰す⼿順でComplete Lysis Buffer 50 μlを調製してください︓Lysis Buffer AM1 44.5 μlに10 mM
DTT 5 μlを添加し、さらにProtease Inhibitor Cocktail 0.5 μlを添加します。Protease Inhibitor Cocktailの中には希釈後24時間経過すると活性が失われるものがあります。このため、 Complete Lysis Bufferは調製
後すぐに細胞溶解に使⽤してください。残った溶液を同⽇に使⽤しない場合は廃棄してください。
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Nuclear Extract Kit

Protocol I: 接着細胞・浮遊細胞
A. 細胞からの核抽出物調製
以下のプロトコールでは約8.8x106個の細胞 (HeLa細胞の100 mm培養プレートでコンフルに培養した細胞数に相当) を使⽤することを想定しています。PBS/Phosphatase Inhibitors、Hypotonic Buffer、Complete
Lysis Bufferを、バッファー調製表に従って調製してください。サイズの異なる培養プレートで培養した細胞を使⽤する場合には、バッファー調製表に従って、調製する液量を調節してください。アッセイ開始まで、バッファーおよびチューブは氷上に置いておきます。

細胞からの核抽出時のバッファー調製表(細胞3.2 x 106個)(細胞8.8 x 106個)

100 mmプレート

150 mmプレート

10X PBS
蒸留⽔
100X Phosphatase Inhibitors
総必要量400 μl3560 μl40 μl4000 μl

800 μl7120 μl
80 μl8000 μl

1600 μl
14240 μl
160 μl16000 μl

1X Hypotonic Buffer

10X Hypotonic Buffer
蒸留⽔
総必要量

25 μl
225 μl250 μl50 μl450 μl500 μl100 μl900 μl1000 μl

Complete Lysis Buffer

10mM DTT
Lysis Buffer AM1
Protease Inhibitor Cocktail
総必要量2.50 μl22.25 μl0.25 μl
25.00 μl

5.0 μl44.5 μl
0.5 μl50.0 μl

10 μl
89 μl
1 μl
100 μl*(オプション) Detergent

総必要量1.25 μl

2.5 μl5 μl

調製する試薬

組成

PBS/Phosphatase Inhibitors

60 mmプレート(細胞2 x 107個)*Step3-1において核ペレットにDetergentを添加すると、タンパク質、特に膜やクロマチンに強く結合しているタンパク質がより可溶化しやすくなります。

Step 1 細胞の回収
1. ディッシュから培地を吸引除去し、氷冷したPBS/Phosphatase Inhibitors 5 mlで洗浄する。溶液を吸引除去し、氷冷したPBS/Phosphatase Inhibitors 3 mlを加える。浮遊細胞の場合は、ペレット化した細胞を氷冷したPBS/Phosphatase Inhibitors 3 mlで洗浄し、3.へ進む。
2. セルスクレーパー⽤いてディッシュから細胞を丁寧に剥がし、冷却した15 mlのコニカルチューブに移す。
注意︓細胞を剥がすためにトリプシンを使⽤すると、意図していないシグナル伝達経路が活性化してしま
う恐れがあります。
3. 予め4℃に冷却した遠⼼機を⽤いて細胞懸濁液を200 xgで5分間遠⼼する。
4. 上清を捨てる。細胞ペレットは氷上に置く。

Step 2 細胞質画分の回収
注意︓細胞溶解前後 (ステップ1と2) で、位相差顕微鏡を⽤いて細胞の様⼦を観察し、細胞溶解の効率と核の放出を忘れずに確認してください。無傷の細胞は、暗く⾒える核を明るく⾒える細胞質が取り囲んでいるように⾒えるはずです。
1. 1X Hypotonic Buffer 500 μlを加え、細胞を数回上下にピペッティングして慎重に再懸濁し、冷却した微-8-Nuclear Extract Kit
量遠⼼チューブに移す。氷上で15分間反応させる。
2. Detergent 25 μl (チャートのオプションとは別) を添加し、最⾼速度で10秒間ボルテックスする。
3. 少量のサンプルを顕微鏡下で観察して、細胞溶解効率と核の放出を検証する。この段階で細胞が⼗分に溶解していなければ、氷冷しておいたダウンス型ホモジェナイザーと隙間の狭い (B) ペッスルを使って、細胞を追加で破砕する (Appendix Bのトラブルシューティングを参照)。
注意︓細胞を⼗分に溶解するまで、次の遠⼼ステップには進まないでください。
4. 予め4℃に冷却した微量遠⼼機を⽤いて懸濁液を14,000 xgで30秒間遠⼼する。
5. 上清（細胞質画分）を冷却した微量遠⼼チューブに移す。上清は使⽤するまで-80℃で保存する。ペレットは核画分の回収に使⽤する。
オプション︓ウエスタンブロットでの分画効率の検証のために、上清（細胞質画分）を保管しておくことをお勧めします。

Step 3 核画分の回収
1. 核ペレットにComplete Lysis Buffer 50 μlを加え、ピペッティングして再懸濁する。
オプション︓膜結合性の核タンパク質の可溶化を促進するため、2.5 μlのDetergentを添加する。⾮常に粘性の⾼いペレットが形成され、完全には再懸濁できないことがある。その場合、ダウンス型ホモジェナイ
ザーを使⽤することもできる (Appendix Section Bのトラブルシューティングを参照)。最後に最⾼速度で10秒間ボルテックスする。
2. シェーカーを150 rpmにセットし、試料を氷上で30分間反応させる。
3. 最⾼速度で30秒間ボルテックスする。予め4℃に冷却した微量遠⼼機を⽤いて14,000 xgで10分間遠⼼後、
上清（核画分）を冷却した微量遠⼼チューブに移す。
オプション︓上清（核分画）を保存しておくと、ウエスタンブロットによる分画効率の決定に使⽤できます。
4. ⼩分けにして-80℃で保存する。凍結融解の繰り返しは避けること。
注意︓ある種の界⾯活性剤やPMSFは、ブラッドフォード法によるタンパク質定量に影響を与える場合があります。このため、試料を1:50または1:250に希釈してください。サンプルと同じ倍率で希釈した
Complete Lysis Bufferをブランクとして使⽤してください。プレートリーダー型の分光光度計で595 nmの吸光度を測定してください (Appendix Section Aのサンプル希釈例を参照してください)。または、アクティブ・モティフのProStain Protein Quantification Kit (商品コード15001) を使⽤してください。このキットを使⽤すると、⾼感度かつサンプル中の物質による影響を受けにくいタンパク質定量が可能です。
BCA法は、希釈により抽出液が希薄になり、タンパク質濃度が標準曲線の範囲内に収まらなくなるため、お勧めできません。

B. 細胞サンプルからの全細胞抽出物調製
以下のプロトコールでは約8.8×106個の細胞 (HeLa細胞の100 mm培養プレートでコンフルに培養した細胞数に相当) を使⽤することを想定しています。PBS/Phosphatase Inhibitors、Complete Lysis Bufferを、バッファー調製の章に従って調製してください。サイズの異なる培養プレートで培養した細胞を使⽤する場合には、バッファー調製表に従って、調製する量を調節してください。アッセイ開始まで、バッファーおよびチューブは氷上に置いておきます。
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Nuclear Extract Kit細胞からの全細胞抽出時のバッファー調製表

60 mmプレート
100 mmプレート 150 mmプレート（細胞3.2 x 106個） （細胞8.8 x 106個） （細胞2 x 107個）

調製する試薬

組成

PBS/Phosphatase Inhibitors

10X PBS400 μl800 μl1600 μl

蒸留⽔3560 μl

7120 μl

14240 μl

40 μl

80 μl

160 μl100X Phosphatase Inhibitors
総必要量
Complete Lysis Buffer

4000 μl

8000 μl

16000 μl

10mM DTT

10 μl

30 μl

90 μl

Lysis Buffer AM1

89 μl

267 μl

801 μlProtease Inhibitor Cocktail

1 μl

3 μl

9 μl

100 μl300 μl900 μl

総必要量

Step 1 細胞の回収
1. ディッシュから培地を吸引除去し、氷冷したPBS/Phosphatase Inhibitors 5 mlで洗浄する。溶液を吸引除去し、氷冷したPBS/Phosphatase Inhibitors 3 mlを加える。浮遊細胞の場合は、ペレット化した細胞を氷冷したPBS/Phosphatase Inhibitors 3 mlで洗浄し、3.へ進む。
2. セルスクレーパーを⽤いてディッシュから細胞を丁寧に剥がし、冷却した15 mlのコニカルチューブに移す。
3. 予め4℃に冷却した遠⼼機を⽤いて細胞懸濁液を200 xgで5分間遠⼼する。
4. 上清を捨てる。細胞ペレットは氷上に置く。

Step 2 細胞の溶解
1. Complete Lysis Buffer 300 μlを加え、細胞を数回ピペッティングして懸濁する。
2. 懸濁液をシーソー式シェイカー (rocking platform) で150 rpm、10~30分振とうしながらインキュベー
トする。少量を顕微鏡で観察し、細胞が効率的に溶解しているかを確認しながら、インキュベーションの時間を決定する。この段階で細胞が⼗分に溶解しなかった場合には、氷冷したダウンス型ホモジェナイザ
ーと隙間の狭い (B) ペッスルを使って、細胞を破砕する (Appendix Section Bのトラブルシューティン
グを参照)。
注意︓細胞が⼗分に溶解するまで、次の遠⼼のステップには進まないでください。
3. 最⾼速度で、30秒間ボルテックスを使い振とうする。その後4℃にあらかじめ冷却した微量遠⼼機で14,000 xgで20分間遠⼼する。その後、上清（全細胞抽出物）を冷却しておいたマイクロチューブに移す。
4. ⼩分けにして-80℃で保存する。凍結融解の繰り返しは避けること。
オプション︓上清を保存しておくと、ウエスタンブロットによる分画効率の決定に使⽤できます。
注意︓ある種の界⾯活性剤やPMSFは、ブラッドフォード法によるタンパク質定量に影響を与える場合があります。このため、試料を1:50または1:250に希釈してください。サンプルと同じ倍率で希釈した
Complete Lysis Bufferをブランクとして使⽤してください。プレートリーダー型の分光光度計で595 nmの吸光度を測定してください (Appendix Section Aのサンプル希釈例を参照してください)。または、アクティブ・モティフのProStain Protein Quantification Kit (商品コード15001) を使⽤してください。このキットを使⽤すると、⾼感度かつサンプル中の物質による影響を受けにくいタンパク質定量が可能です。
BCA法は、希釈により抽出液が希薄になり、タンパク質濃度が標準曲線の範囲内に収まらなくなるため、お勧めできません。
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Nuclear Extract Kit

Protocol II: 新鮮な組織と冷凍組織
A. 組織サンプルからの核抽出物調製
核抽出物の調製には、新鮮な組織サンプルの使⽤が推奨されます。凍結した組織サンプルがある場合には、全細胞抽出 (P.13参照) を⾏うことをお勧めします。核分画の抽出に凍結組織を使っても、質の良い核抽出物を調製できると予想されますが、その収量は少なくなります。サンプルは常に氷上に置くようにしてください。
すべてのステップは氷上または4℃で⾏い、事前に冷却したバッファーと器具を使⽤します。⼀般的に、1mgの組織には、2x105個の細胞が存在すると概算されますが、プロトコールに従って実験を始める前に、組織サンプル中に含まれる細胞数を正確に定量しておくことを強くお奨めします。
注意︓Complete Lysis Buffer には、1 M DTTを1:100で希釈した10 mM DTTを使⽤してください。

組織からの核抽出時のバッファー調製表
調製する試薬
1X Hypotonic Buffer(組織のホモジェナイズ⽤）

1X Hypotonic Buffer(細胞質分画⽤)
Complete Lysis Buffer*(オプション) Detergent

組成
10X Hypotonic Buffer
Protease Inhibitor Cocktail
100X Phosphatase Inhibitors
蒸留⽔
1 M DTT
Detergent
総必要量
10X Hypotonic Buffer
蒸留⽔
総必要量10 mM DTT
Lysis Buffer AM1
Protease Inhibitor Cocktail
総必要量
総必要量

組織 1 g
400 μl40 μl
40 μl
3512 μl
4 μl
4 μl
4000 μl
50 μl
450 μl500 μl
5.0 μl44.5 μl
0.5 μl50 μl
2.5 μl組織 100 mg
40.0 μl
4.0 μl4.0 μl351.2 μl
0.4 μl
0.4 μl400.0 μl
5 μl
45 μl
50 μl
0.50 μl4.45 μl0.05 μl
5.00 μl0.5 – 1.0 μl

組織 50 mg
20.0 μl
2.0 μl
2.0 μl175.6 μl
0.2 μl
0.2 μl200.0 μl
2.5 μl22.5 μl25.0 μl0.250 μl2.225 μl0.025 μl2.500 μl0.5 – 1.0 μl*Step3-1において核ペレットにDetergentを添加すると、タンパク質、特に膜やクロマチンに強く結合しているタンパク質がより可溶化しやすくなります。
チャートはサンプル量に応じた必要量の⽬安です。ピペットで秤量できる液量で調製してください。

注意︓試薬の液量は組織の種類に応じて最適化する必要がある場合があります。
Step 1 組織のホモジェナイズ処理
1. 組織サンプルを調製する間は、組織の鮮度を保つため迅速に作業する。
2. 1 gの組織を使⽤する場合、単⼀細胞の懸濁液にするため、まず組織を⼩さく加⼯する。
新鮮組織の場合︓清潔な剃⼑またはメスで組織を刻み、組織を1-3 mm3の⼩⽚にする。組織を低温で維持するため、冷却したセラミック製の乳鉢の中でこの作業を⾏う (乳鉢の底部を液体窒素に沈めておくと、乳鉢を冷却できる)。予め冷却しておいた清潔なダウンス型ホモジェナイザーに組織⽚を集め、隙間が広い(A) ペッスルで処理する。
凍結組織の場合︓必要な量の凍結組織を乳鉢と乳棒を使って分取する。乳鉢の底部は液体窒素に浸し、乳鉢の中にも液体窒素を少量注ぎ、その中で作業を⾏う。液体窒素で冷却した乳棒を使⽤することもできる。

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Nuclear Extract Kit
3. 以下で例⽰するプロトコールでは、1 gの凍結組織を使⽤している。前⾴のチャートに従い、組織量に応じて使⽤する試薬量を調節する。DTT、Detergent、phosphatase、proteaseを添加した1X Hypotonic
Bufferを組織1 g当たり3 ml加え、ダウンスホモジェナイザーと隙間の広い (A) ペッスルを使って氷上でホモジェナイズする。ペッスルを約20回上下に動かして、組織を破砕する。顕微鏡下で細胞が単⼀細胞に分離されていることを確認する。必要であれば単⼀細胞の懸濁液になるまで操作を続ける。
4. 15分氷上でインキュベートする。
5. 4℃で850 xg、10分間遠⼼する。上清をあらかじめ冷却しておいた微量遠⼼チューブに移す。
オプション︓上清を⼀部分取し保存しておくと、ウエスタンブロットによる分画効率の決定に使⽤できます。
6. この時点で組織はホモジネートされ単⼀細胞の懸濁液になっているが、可溶化はしていないため Step 2に進む。この際、100 mmディッシュ (8.8 x 106個の細胞) 1枚分の細胞サンプルとみなして作業を⾏う。

Step 2 細胞質画分の回収
1. 1X Hypotonic Buffer 500 μlを加え、細胞を数回上下にピペッティングして慎重に再懸濁し、冷却した微量遠⼼チューブに移す。氷上で15分間反応させる。
2. Detergent 25 μl (チャートのオプションとは別) を添加し、最⾼速度で10秒間ボルテックスする。
3. 少量のサンプルを顕微鏡下で観察して、細胞溶解効率と核の放出を検証する。この段階で細胞が⼗分に溶解していなければ、氷冷しておいたダウンス型ホモジェナイザーと隙間の狭い (B) ペッスルを使って、細胞を追加で破砕する (Appendix Bのトラブルシューティングを参照)。
注意︓細胞を⼗分に溶解するまで、次の遠⼼ステップには進まないでください。
4. 予め4℃に冷却した微量遠⼼機を⽤いて懸濁液を14,000 xg で30秒間遠⼼する。
5. 上清（細胞質画分）を冷却した微量遠⼼チューブに移す。上清は使⽤するまで-80℃で保存する。ペレットは核画分の回収に使⽤する。
オプション︓ウエスタンブロットによる分画効率の検証のために、上清（細胞質画分）を保管しておくことをお勧めします。

Step 3 核画分の回収
1. 核ペレットにComplete Lysis Buffer 50 μlを加え、ピペッティングして再懸濁する。
オプション︓膜結合性の核タンパク質の可溶化を促進するため、2.5 μlのDetergentを添加する。⾮常に粘性の⾼いペレットが形成され、完全には再懸濁できないことがある。その場合、ダウンス型ホモジェナイ
ザーを使⽤することもできる (Appendix Section Bのトラブルシューティングを参照)。最後に最⾼速度で10秒間ボルテックスする。
2. シェーカーを150 rpmにセットし、試料を氷上で30分間反応させる。
3. 最⾼速度で30秒間ボルテックスする。予め4℃に冷却した微量遠⼼機を⽤いて14,000 xgで10分間遠⼼後、
上清（核画分）を冷却した微量遠⼼チューブに移す。
オプション︓上清（核分画）を保存しておくと、ウエスタンブロットによる分画効率の決定に使⽤できます。
4. ⼩分けにして-80℃で保存する。凍結融解の繰り返しは避けること。
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B. 組織サンプルからの全細胞抽出物調製
組織からの全細胞抽出時のバッファー調製表
調製する試薬Complete Lysis Buffer

組成10mM DTT

組織 1 g4 μl

組織 100 mg
0.4 μl組織 50 mg
0.2 μl

Lysis Buffer AM1

3916 μl391.6 μl195.8 μl

40 μl

4.0 μl

2.0 μlProtease Inhibitor Cocktail
100X Phosphatase Inhibitors
総必要量

40 μl

4.0 μl

2.0 μl4000 μl400.0 μl200.0 μl

チャートはサンプル量に応じた必要量の⽬安です。ピペットで秤量できる液量で調製してください。

注意︓試薬の体積は組織の種類に応じて最適化する必要がある場合があります。
1. 1 gの組織を使⽤する場合、清潔な剃⼑で組織を刻み、1~3 mm3の⼩⽚にする。冷却した15 mlコ⼆カル
チューブに組織⽚を移す。
2. 氷冷したComplete Lysis Bufferを組織1 g当たり3 ml加え、ダウンスホモジェナイザーまたはポリトロン
ホモジェナイザーを使い、氷上でホモジェナイズを⾏う。全操作を通じて温度を4℃に保つ。ホモジェナ
イズ後、氷上で30分間インキュベートする。
注意︓凍結組織は⾮常に薄くスライスすると、バッファーで溶解することができます。ホモジェナイザー
機器を使⽤する場合、組織⽚が⼩さく破砕されるまでは低速度でホモジェナイズし、その後最⾼速度で4560秒間ホモジェナイズします。過剰な熱または気泡が発⽣しないように注意してください。
3. 冷却した微量遠⼼チューブに移し、4℃で10,000 xg、10分間遠⼼する。
4. 上清を氷冷した新しい微量遠⼼チューブに移し、再び遠⼼する。⼀つのチューブに上清をまとめる。この上清は全細胞溶解物である。透明な細胞溶解物を回収するために、⻑時間の遠⼼が必要になる場合がある。
5. ⼩分けにして-80℃で保存する。凍結融解の繰り返しは避ける。
オプション︓上清を⼀部分取し保存しておくと、ウエスタンブロットでの分画効率の決定に使⽤できます。
注意︓ある種の界⾯活性剤やPMSFは、ブラッドフォード法によるタンパク質定量に影響を与える場合があります。このため、試料を1:50または1:250に希釈してください。サンプルと同じ倍率で希釈した
Complete Lysis Bufferをブランクとして使⽤してください。プレートリーダー型の分光光度計で595 nmの吸光度を測定してください (Appendix Section Aのサンプル希釈例を参照してください)。または、アクティブ・モティフのProStain Protein Quantification Kit（商品コード15001）を使⽤してください。このキットを使⽤すると、⾼感度かつサンプル中の物質による影響を受けにくいタンパク質定量が可能です。
BCA法は、希釈により抽出液が希薄になり、タンパク質濃度が標準曲線の範囲内に収まらなくなるため、お勧めできません。

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Appendix Section A
ブラッドフォード法によるタンパク質定量⽤の希釈例
ブラッドフォード法でタンパク質定量を⾏う際のサンプル希釈例を⽰します。
1. ブラッドフォード法を⽤いてタンパク質濃度を測定するために、検量線⽤のBSAストックを⽤事調製する(以下のプロトコールでは5 mg/mlのBSAストック溶液を使⽤する)。
注意︓Complete Lysis Buffer に含まれるDTTおよびprotease inhibitorsは、タンパク質濃度の定量の前に希釈しておく必要があります。つまり、希釈系列を作成する前に、DTTとprotease inhibitorsをLysis
buffer に添加しておくことが重要です。
2. アッセイ⽤にComplete Lysis Bufferを希釈する。希釈例は1:50または1:250です。ブランクウェルと標
準ウェルの必要数を決定し、サンプル希釈⽤に1:50または1:250で希釈したLysis Bufferを必要数準備する。その際、希釈には⽔を使⽤する。１ウェルあたりの体積は、ご⾃⾝で⽤意したブラッドフォード法のプロトコールに従うこと。
希釈例
Lysis buffer 1:50希釈ストック → 30 μlのComplete Lysis Bufferと1470 μlの⽔
Lysis buffer 1:250希釈ストック → 6 μlのComplete Lysis Bufferと1494 μlの⽔

3. 5 mg/mlのBSAストック10 μlを990 μlのComplete Lysis Bufferに加えて、50 μg/mlのBSA溶液を調製する。次に、0.5 mlのComplete Lysis Bufferを4つのチューブに⼊れる。50 μg/mlのBSA溶液を使⽤して、以下に⽰すように希釈系列を作成する。以下の例で作成したBSA標準サンプルの濃度はそれぞれ50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mlとなる (注意︓ここで⽰した標準サンプル濃度はあくまで実験例であり、濃度の範囲をより広く設定することも可能です)。詳細については、使⽤するブラッドフォード法の試薬のプロトコールを参照すること。希釈系列作成時には、よくサンプルを混和してから分注する。また、ブランクと測定サンプルを忘れずに準備すること。50 μg/mlが最も濃い標準であり、ブランクは0.0 μg/ml(Complete Lysis Buffer のみ) となる。
サンプル調製例︓
10 ulのBSA溶液 (5 mg/ml) と0.99 mlのComplete Lysis Buffer希釈ストック → 50 μg/ml
そのうち0.5 mlを0.5 mlのComplete Lysis Buffer希釈ストックへ → 25 μg/ml
そのうち0.5 mlを0.5 mlのComplete Lysis Buffer希釈ストックへ → 12.5 μg/ml
そのうち0.5 mlを0.5 mlのComplete Lysis Buffer希釈ストックへ → 6.25 μg/ml
そのうち0.5 mlを0.5 mlのComplete Lysis Buffer希釈ストックへ → 3.125 μg/ml
ブランク＝Complete Lysis Buffer希釈ストックのみ
標準サンプル＝BSA 溶液をComplete Lysis Bufferと希釈ストックで希釈測定サンプル＝サンプル1 μlを49 μl (1:50) または249 μl (1:250) の⽔で希釈
4. 各ブラッドフォード法の試薬プロトコールに従って、吸光光度計を⽤い595 nmの吸光度を測定する。
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Appendix Section B
トラブルシューティング
問題点

考えられる原因

推奨の解決策使⽤した抽出⽤試薬の量が、細胞数 バッファー調製⽤の表に従って、バッファー量を適切な量にに対して適切でない
細胞質分画のタンパ
ク質濃度が低い調整する。

細胞ペレットの細胞膜が破壊されていない (細胞サンプルの核抽出物調製プロトコールA Step 2-1)

くピペッティングする。Deterget添加後、顕微鏡を使って破砕具合を確認する。不⼗分であれば、微調整⽤ (B) ペッスルとダウンスホモジェナイザーを使って破砕する。

スタート時の細胞数もしくはLysis
Bufferの量が正しくない

細胞ペレットを破砕するため、Hypotonic buffer中でやさしLysis Bufferの量を減らす、または細胞数を増やす。

細胞数に対して、抽出⽤試薬の体積 バッファー調製表に従って、バッファー量を適切な量に調整が適切でない核分画のタンパク質
濃度が低い

する。
顕微鏡下でサンプルを観察する。細胞からの核抽出物の調製

核の破壊後に、核タンパク質が失わ プロトコールA Step 2-2, 2-3において、ボルテックスの処れ、細胞質画分に移⾏した

理時間を短縮し、遠⼼の強度と時間を減らす。核が放出されたのを確認したら、インキュベーションをやめる。

核ペレットが⼗分分離していない(細 確実に核を溶解するため、しっかりボルテックスする。核が胞からの核画分抽出プロトコールA 可溶化しにくい場合には、ダウンス型ホモジェナイザーを使
Step 3-1)⽤する。

この抽出⽅法が使⽤できない細胞種 細胞の膨潤と溶解の条件および試薬を、この細胞種に対してであった最適にする必要がある。
この場合、核タンパク質が細胞質画分に⾒られる。

細胞質分画と核分画過剰に溶解が進んでいた

Hypotonic Bufferでのインキュベート時間を減らす。凍結サ
ンプルの場合には、凍結融解の過程で、核が溶解し、核タンパク質が細胞質画分に混⼊することがある。

のどちらかのタンパ
ク質収量が、少な

この場合、細胞質のタンパク質が核分画に⾒られる。

い、または全くない

Detergentを加えた後、細胞を顕微鏡下で観察し、細胞が遊溶解が不⼗分であった離していることを確認する。これは、溶解が⼗分⾏われていることを⽰している。あるいは、完全に細胞を破壊するために、冷却したダウンスホモジェナイザーと微調整⽤ペストル(B) を使⽤して、10ストロークする。

タンパク質の分画状
況が不⼗分である

細胞質分画の分離が不完全である

Lysis Bufferを加える前に、沈殿している核ペレットから、確実に細胞質分画を取り除く。

タンパク質の活性が作業中はサンプルを低温に維持し続ける。作業時間を最⼩限

弱い、または全くな 回収したタンパク質が分解しているに抑え、⼩分けした試料はすぐに冷凍する。プロテアーゼをい

増量する、または別のプロテアーゼを使⽤する。

核ペレットの粘性が⾼く、再懸濁できな 核ペレットの分離が不完全である
い

確実に核を溶解させるため、⼗分にボルテックスをする。核ペレットが可溶化しにくい場合には、ダウンス型ホモジェ

ナイザーを使⽤する。細胞種によっては、核が粘性の⾼いペレットになるが、⼗分な核抽出物が得られる。
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