メラニン合成酵素を輸送する Rab32 および Rab38 の不活性化因子 GAP の色素細胞における機能解析
筑波大学医学医療系生理化学

大林典彦

Rab 32 and Rab 38 (Rab 32 /Rab 38 ) have been proposed as regulating the trafficking of melanogenic enzymes, including
tyrosinase and tyrosinase-related protein 1 (Tyrp 1 ), to melanosomes in melanocytes. Rab 32 /Rab 38 are known to function
as switch molecules that cycle between a GDP-bound inactive form and a GTP-bound active form; the cycle is thought tobe regulated by an activating enzyme, guanine nucleotide exchange factor (GEF), and an inactivating enzyme, GTPaseactivating protein (GAP), which stimulates the GTPase activity of Rab 32 /Rab 38 . Although BLOC- 3 has already been
identified as a Rab 32 /Rab 38 -specific GEF that regulates the trafficking of tyrosinase and Tyrp 1 , physiological GAP for
Rab 32 /Rab 38 in melanocytes has never been identified, and it has remained unclear whether Rab 32 /Rab 38 are involvedin the trafficking of dopachrome tautomerase (Dct), another melanogenic enzyme, in melanocytes. In this study, weinvestigated RUTBC 1 , which was originally characterized as a Rab 9 -binding protein and GAP for Rab 32 and Rab 33 B in
vitro, and the results demonstrated that RUTBC 1 functions as a physiological GAP for Rab 32 /Rab 38 in the trafficking of
all three melanogenic enzymes in melanocytes. The results of this study also demonstrated the involvement of Rab 9 A in theregulation of the RUTBC 1 localization and in the trafficking of all three melanogenic enzymes. We discovered that either
excess activation or inactivation of Rab 32 /Rab 38 achieved by manipulating RUTBC 1 inhibits the trafficking of all threemelanogenic enzymes. These results collectively indicate that proper spatiotemporal regulation of Rab 32 /Rab 38 is essential
for the normal trafficking of all three melanogenic enzymes in melanocytes.

1. 緒

方で、色素細胞において実際に Rab32/Rab38 を不活性化言する GAP（GTPase-activating factor）については謎に包メラニン合成酵素は色素細胞において生合成された後、まれており、Rab32/Rab38 の調節機構については十分にトランスゴルジ網からエンドソームを経てメラノソームは理解されていなかった。そこで、本研究では in vitro でに輸送される。そして、輸送されたメラニン合成酵素のRab32 と Rab33B（Rab38 とは異なるアイソフォーム）に働きによりメラノソームでメラニンが産生・貯留される。

対して GAP 活性を有することが報告された Run and TBC

このメラニン合成酵素の輸送過程に異常をきたす疾患のdomain-containing 1 分子（RUTBC1、SGSM2 としても知1 つとして、白皮症を呈するヘルマンスキー・パドラッられる）に着目し 4）、色素細胞における RUTBC1 の機能をク症候群（HPS）が知られている。HPS 様の病態を呈する解析し、メラニン合成酵素輸送における Rab32/Rab38 のモデル動物はいくつかが報告されているが、その中でも、制御機構を精緻に理解することを目的とした。

chocolate マウスや ruby ラットは Rab38 が責任遺伝子である 1）。Rab は低分子量 G タンパク質の 1 つで、GTP 結合型の活性化体と GDP 結合型の不活性化体をサイクルするこ

2. 方法

2. 1. 試薬類とで、その機能を発揮する。Rab38 は一次構造が類似しRab32、Rab38、チロシナーゼ、Tyrp1、Dct に対する抗た Rab32 と冗長的にメラニン合成酵素のメラノソームへ体は、精製した各タンパク質あるいはペプチドをウサギの輸送を調節している 2）。近年、HPS の原因因子の 1 つでに免疫することにより得た。活性化型 Rab32 / Rab38 に特ある biogenesis of lysosome-related organelles complex-3

異的に結合する VPS9-ankyrin repeat protein（Varp）の（BLOC-3）と呼ばれる HPS1 と HPS4 分子から構成される単離は既に行っており、これを用いた 5）。ヒト RUTBC1複合体が、Rab32 および Rab38（以下、Rab32/Rab38）のcDNA は、かずさ DNA 研究所（千葉、日本）より得た。マGEF（Guanine nucleotide exchange factor）として機能し、ウス RUTBC1 に対する２種類の siRNA は、ニッポンジー

3）

Rab32/Rab38 を活性化することが報告されている 。一Functional analysis of a GAP for Rab 32 /Rab 38 that regulate melanogenic enzymes
trafficking in melanocytes
Norihiko Ohbayashi
Department of Physiological Chemistry,Faculty of Medicine, University ofTsukuba

ン（富山、日本）より得た。

2. 2. 細胞蛍光免疫染色
マウス由来の色素細胞株 melan-a 細胞は、Dorothy C.
Bennett 教授から提供された。各種発現ベクターや siRNAは、Lipofectamine 2000（Invitrogen） を 用 い て melan-a細胞に導入した。染色された細胞を共焦点蛍光顕微鏡（FluoView 1000-D、オリンパス、東京、日本）により観察− 68 −

メラニン合成酵素を輸送する Rab32 および Rab38 の不活性化因子 GAP の色素細胞における機能解析した。共焦点顕微鏡で無作為に 20 細胞ずつ蛍光シグナル

在性 Rab32 / Rab38 の活性化レベルを評価した。

を取得し、MetaMorph ソフトウェア（Molecular Devices、3. 結Sunnyvale、CA）で定量した。 ダネット検定またはスチューデント t 検定を用いて統計解析を行い、p 値 <0.05 を統果

3. 1. RUTBC1 はメラニン合成酵素の輸送に関わる計学的に有意とみなした。

RUTBC1 の機能を解析するため、RUTBC1 を色素細胞に過剰発現させたところ、チロシナーゼ、Tyrp1、Dct すべて

2. 3. 共免疫沈降とプルダウンアッセイのメラニン合成酵素のメラノソームへの輸送が阻害され、それLipofectamine-LTX Plus（Invitrogen） を 用 い て T7-らの色素細胞における発現が大幅に低下した（図 2）。Rab32

GST-Varp または T7-GST 発現プラスミドを COS-7 細胞にとRab38 がともに不活性化したときに、これらメラニン合成導入した。可溶化バッファー（50mM HEPES-KOH pH7.2、酵素の輸送が阻害されることから 2）、RUTBC1 が色素細胞150mM NaCl、1mM MgCl2、1 ％ Triton X-100、 プ ロ テ

内で Rab32/Rab38 に対するGAPとして機能する可能性が示

アーゼ阻害剤（Roche））を用いて細胞を溶解し、細胞溶解

唆された。

物をグルタチオンセファロースビーズと共に 4 ℃で 2 時間インキュベートした。ビーズを洗浄バッファー（50mM
HEPES-KOH pH7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、0.2 ％Triton X-100）
で 3 回洗浄し、Varp ビーズを調製した。次に、
T7-RUTBC1 野生型（WT）/ R803A および FLAG-Rab32 /Rab38 を共発現した COS-7 細胞抽出物と Varp ビーズを反応させ、FLAG-Rab32 / Rab38 の活性化レベルを定量した。
T7-Varp 発現プラスミドをトランスフェクションした
COS-7 細胞抽出物を可溶化バッファーで溶解し、抗 T7 タグ抗体結合アガロースビーズと 4 ℃で 2 時間反応させた。
ビーズを洗浄バッファーで 3 回洗浄し、次いで RUTBC1
ノックダウン melan-a 細胞の可溶化物と共に 4 ℃で 2 時間インキュベートした。そして、ビーズに結合した内在性Rab32 / Rab38 タンパク質をイムノブロットで定量し、内図 １ 本 研 究 で 用 い た ヒ ト RUTBC1 お よ び そ の 変 異 体（RUTBC1-N、RUTBC1-C、および R803A 変異体）の模式図。
RUTBC1 は、Rab9 結合活性を有する N 末端 RUN ドメイン（薄灰色のボックス）および、in vitro で Rab32 および Rab33Bに対して GAP 活性を示す C 末端 TBC ドメイン（暗灰色のボックス）を有している。

図２ 色素細胞におけるメラニン合成酵素のメラノソーム局在に対するRUTBC1 の過剰発現の影響。
上図は、
T7-RUTBC1、T7-RUTBC1（R803A）、そしてコントロールとして T7-GFPを発現する色素細胞の画像を示す。Melan-a 細胞に T7 タグを付加した各タンパク質発現プラスミドをトランスフェクションし、チロシナーゼ、Tyrp1、Dctに対する抗体で染色した。 T7 タグタンパク質を発現する細胞は、破線で示されている。スケー
ルバー：20 µm。
下図は、上図で示されたチロシナーゼ / Tyrp1/ Dctシグナルを定量化したグラフである。バーは 20 細胞におけるシグナルの平均値を示している。

− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

3. 2. RUTBC1のTBCドメインはメラニン合成酵素の輸送に関わるが、TBCドメイン以外もメラニン合成酵いて活性化型 Rab32/Rab38 をプルダウンした。その結果、
RUTBC1（R803A）変異体は Rab32/Rab38 を不活性化で素の輸送に必要である

きないのに対し、RUTBC1 分子は顕著に Rab32/Rab38 をメラニン合成酵素の輸送阻害が RUTBC1 における TBC不活性化することを明らかにした（図４）。

ドメインの GAP 活性によるものかどうかを確認するため

一方、色素細胞から RUTBC1 をノックダウンし、そのに、N 末端側の RUN ドメインを欠いた RUTBC1-C および細胞可溶化液を用いて同様にして活性化型 Rab32 / Rab38

TBC ドメインの活性中心に点変異を導入した RUTBC1-Cを定量したところ、細胞内の Rab32 / Rab38 の発現量自体（R803A）を作製した（図 1）。RUTBC1-C の発現により、チは変化が認められないものの、活性化型 Rab32/Rab38 のロシナーゼ、Tyrp1、Dct すべてのメラニン合成酵素のメ量がコントロールに比べて顕著に増加することを見出した

ラノソームへの輸送を阻害されたが、RUTBC1-C（R803A）（図５）。さらに細胞免疫染色により、RUTBC1 ノックダの発現ではほとんど影響が認められなかった（図 3）。これウン色素細胞では、メラノソーム上の Rab32/Rab38 シグ

らの結果から、RUTBC1-C によるメラニン合成酵素の阻ナルがより増強する結果を得た（図５）。これは RUTBC1

害は、RUTBC1 の基質となる Rab の強制的な不活性化にノックダウン色素細胞において Rab32/Rab38 が過剰に活よる可能性が高いと考えられた。しかしながら、予期せぬ性化され、メラノソーム膜に持続的に局在することを示唆ことに、全長の RUTBC1（R803A）変異体を過剰発現させしている。ても、すべてのメラニン合成酵素のメラノソームへの輸送

3. 4. Rab32 とRab38 の過剰な活性化は、メラニン合成酵素の輸送を阻害するの阻害が観察されたことから（図 2）、TBC ドメインによるGAP 活性に依存しない、すなわち RUTBC1 の N 末端側のRab32/Rab38 はメラニン合成酵素輸送を促進すること作用によって仲介される何らかの分子メカニズムの存在がが知られており 2）、RUTBC1 ノックダウン色素細胞にお想定された。

いて Rab32/Rab38 が活性化したことから、RUTBC1 ノッ

3. 3. RUTBC1はRab32 とRab38 に対してGAP活性を有する

クダウン色素細胞ではメラニン合成酵素輸送が促進される

RUTBC1 による Rab の不活性化機構を明らかにするた色素細胞を用いてメラニン合成酵素の細胞内局在や発現量め、Rab32/Rab38 を RUTBC1 あるいは RUTBC1（R803A）を評価したところ、メラニン合成酵素輸送が顕著に抑制さ変異体と共発現させ、その細胞抽出液より Varp 分子を用れるという全く相反する結果を得るに至った（図６）。

ものと予想した。しかしながら、RUTBC1 ノックダウン

図2− 70 −

図 3 RUTBC1 の C 末 端 TBC ド
メインの GAP 活性は、色素細胞におけるチロシナーゼ / Tyrp1 /Dct 輸送に関与する。
T7-GFP、T7-RUTBC1-C、 また は T7-RUTBC1-C（R803A）を発現する色素細胞の画像を示す。Melan-a 細 胞 に T7 タ グ を付加した各タンパク質発現プラ
スミドをトランスフェクションし、チロシナーゼ、Tyrp1、Dctに 対 す る 抗 体 で 染 色 し た。T7
タグタンパク質を発現する細胞は、破線で示されている。下図は、上図で示されたチロシナーゼ /Tyrp1 / Dct シグナルを定量化したグラフである。バーは、20 細胞シグナルの平均値を示している。

メラニン合成酵素を輸送する Rab32 および Rab38 の不活性化因子 GAP の色素細胞における機能解析

図 4 RUTBC1 は、細 胞 内 で Rab32 お よ び
Rab38 の両方を不活性化する。
T7-GFP、T7-RUTBC1 または T7-RUTBC1（R803A） と と も に FLAG-Rab32 あ る い は
FLAG-Rab38 を発現する COS-7 細胞を可溶化し、Rab32/Rab38 エフェクターである Varpを結合したグルタチオンセファロースビーズを用いて活性化型 Rab32 および Rab38 をプルダウンした。

図 5 RUTBC1 ノックダウンは、Rab32 / Rab38 のメラノソーム発現を増加させる。
抗 Rab32 抗体（左上図）または
抗 Rab38 抗体（右上図）で染色され た RUTBC1 ノ ッ ク ダ ウ ン 色
素細胞の典型的な画像およびそれらに対応する明視野画像を示す。挿入図は、ボックス領域の拡大図を示す。メラノソームにおける Rab32 / Rab38 陽性シグナルは、コントロール siRNA 処
理色素細胞においてメラノソーム（Mel、擬似赤色）と共局在しており、そのシグナルは RUTBC1
ノックダウン色素細胞において明らかに増加した。
（下図）T7GFP または T7-Varp と結合した
抗 T7 タグ抗体結合アガロースビーズを、RUTBC1 ノックダウン色素細胞の可溶化液とともにインキュベートした。免疫沈降した T7-GFP または T7-Varp および共免疫沈降した内在性 Rab32 /Rab38 が、示された抗体によるウェスタンブロットにより検出された。

− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

3. 5. Rab9Aはメラニン合成酵素の輸送に関与するはしばしばメラノソームにおいて共局在した（図 7）。単独

GAP 活性を欠損した全長 RUTBC1（R803A）変異体のの発現では RUTBC1 の大部分は細胞質全体に散らばった過剰発現の結果として、メラニン合成酵素の輸送が阻害ことから（図 7）、RUTBC1 のメラノソームにおける局在は、された分子基盤の解明を試みた。C 末端側の RUTBC1-C

Rab9A によって仲介されると考えられた。興味深いこと（R803A）変異体は阻害活性を示さなかったことから、に、Rab9A と RUTBC1 を共発現した色素細胞では、メラRUN ドメインを含む RUTBC1 の N 末端側領域が、メラニニン合成酵素輸送が顕著に阻害されるのに対し、Rab9Aン合成酵素の輸送に付加的な機能を果たしている可能性がと RUTBC1（R803A）変異体を共発現した色素細胞では、考えられた。興味深いことに、RUTBC1 は Rab9 エフェク

メラニン合成酵素の輸送に異常は認められなかった（図 7）。

ターとして同定されており （図 1）、RUTBC1 の N 末端最後に、BLOC-3 のサブユニットである HPS4 もまた側領域は Rab9 結合に重要な役割を果たすことが報告されRab9 のエフェクター分子であることから 6）、Rab9A とている。色素細胞では、Rab9A アイソフォームのみを発RUTBC1 との機能関係を解析するため、HPS4 に焦点を現し、Rab9B アイソフォームを発現しないことから（デー当てて解析を行った。これまでの報告に一致するように、

タ未掲載）、RUTBC1 と共に Rab9A を色素細胞に発現さHPS4 と Rab9A の結合、および、RUTBC1 と Rab9A の結せた。その結果、Rab9A および RUTBC1（WT / R803A）合を確認した（図８）。次いで、競合実験を行うことにより、

4）

図 6 色素細胞における RUTBC1 のノックダウン
は、3 つのメラニン合成酵素すべての発現を減少させる。
RUTBC1 ノックダウンは、Rab32 / Rab38 の発現を変化させることなく、色素細胞における3 つのメラニン合成酵素（チロシナーゼ、Tyrp1、Dct）全ての発現を強く抑制した。右図は 3 つのメラニン合成酵素それぞれに対する抗体を用いて染色された RUTBC1 ノックダウン色素細胞の画像を示す。破線は細胞膜を示す。

図 7 Rab9A はチロシナーゼのメラノソームへの適切な輸送に関与している。
T7-RUTBC1 ま た は T7-RUTBC1（R803A）と FLAG-Rab9A を共発現する色素細胞の画像を示す。抗 T7 抗体、抗 FLAG 抗体、抗チロシナーゼ抗体を用いて細胞を染色し、対応する明視野（BF）画像を示す。赤色あるいは白色の
破 線 は、T7-RUTBC1（WT / R803A）
ま た は FLAG-Rab9A を 発 現 す る 細 胞を示す。挿入図は、ボックス領域の拡 大 図 を 示 す。T7-RUTBC1 + FLAGRab9A を発現する色素細胞ではチロシナーゼシグナルが減少したが、T7RUTBC1（R803A）+ FLAG-Rab9A を発現する色素細胞では減少しなかったことに留意されたい。

− 72 −

メラニン合成酵素を輸送する Rab32 および Rab38 の不活性化因子 GAP の色素細胞における機能解析

次に、RUTBC1 の過剰発現およびノックダウンによりメラニン合成酵素の輸送が阻害されたことから、メラニン合成酵素輸送には Rab32/Rab38 の適切な活性化・不活性化のサイクル（すなわち GTP-GDP サイクル）が必要であると考えられた。
予期しなかった別の発見として、全長 RUTBC1 の GAP活性変異体である RUTBC1（R803A）の過剰発現もまた、野生型 RUTBC1 の過剰発現と同じく、メラニン合成酵素すべての輸送異常を引き起こしたことがあげられる。C 末端の RUTBC1-C（R803A）変異体は全く効果がなかったことから、RUTBC1 の N 末端領域の重要性が示唆された。
RUTBC1 の N 末 端 領 域 は、Rab9 と 相 互 作 用 す る ため、RUTBC1（R803A）変異体による阻害効果は、色素細胞における内在性 Rab9A を捕捉することにより、内在性
図8

RUTBC1 は HPS4 と競合して Rab9Aと結合する。
HA-HPS4 またはT7-RUTBC1 と共にFLAG-Rab9Aを発現した COS-7 細胞溶解液を、抗 FLAG タグ抗体結合アガロースビーズで免疫沈降させ、FLAG ビーズに結合したタンパク質を示された抗体を用いてイムノブロットした結果を示す。

Rab9A と内在性 RUTBC1 の相互作用を抑制した可能性が考えられる。RUTBC1（R803A）変異体を Rab9A と共に過剰発現した際には、メラニン合成酵素の輸送阻害は認められなかったという結果は、この可能性を裏づけていると考えられる。さらに本研究では、RUTBC1 が Rab9Aと BLOC-3 のサブユニットである HPS4 との相互作用を阻

RUTBC1 が HPS4 と Rab9A 間の結合を阻害することを見害することを示した。したがって、RUTBC1 過剰発現は、出した（図８）。これらの結果は、RUTBC1 が少なくともRab32/Rab38 の GAP 活性を促進することによる直接的な2 つの作用、すなわち① TBC ドメインを介する Rab32/阻害、さらに、Rab9A と BLOC-3 の相互作用を阻害するこRab38 の 直 接 的 な 不 活 性 化 能、 ② Rab9A と BLOC-3 かとにより Rab32/Rab38 の活性化を間接的に阻害する、とら構成される複合体形成を阻害することによる間接的ないうモデルを提唱するに至った 7）。

Rab32/Rab38 の不活性化能を有していることを示してい5. 総る。

4. 考

括

本研究では、Rab9 結合タンパク質である RUTBC1 が察

Rab32/Rab38 を不活性化することにより色素細胞におけ

RUTBC1 は Rab32 および Rab33B に対して GAP 活性をる 3 つのメラニン合成酵素の輸送を抑制すること、また、有すること、そして in vitro では Rab38 に対して約 10 倍

RUTBC1 ノックダウンにより、メラニン合成酵素の輸送低い GAP 活性を有することが報告されていたが、その生が抑制されることを明らかにした。これらの発見により、理機能については不明であった。本研究では、RUTBC1

メラノソームへのメラニン合成酵素の輸送が正常に行われがメラニン合成酵素のメラノソームへの輸送に重要なるためには、Rab32/Rab38 の適切な GTP-GDP サイクルがRab32/Rab38 の生理学的な GAP であることを裏づけるい必要であることが示唆された。

くつかの研究成果を得ることができた。まず、RUTBC1-C

Rab32/Rab38 の活性化レベルを制御することは、メラ末端の TBC ドメインを色素細胞に発現させるとメラニノソームの成熟（暗色化）の制御につながるため、Rab32/ン合成酵素の輸送が阻害されるのに対し、その変異体

Rab38 の活性化制御は重要な創薬のターゲットと考える

RUTBC-1（R803A）を発現させても何ら影響が認められことができる。しかし、低分子量 G タンパク質には化合物なかった。第二に、RUTBC1 ノックダウン色素細胞では、が相互作用できるポケットが極めて少なく、低分子量 G タ

メラノソーム上の Rab32/Rab38 シグナルの増強が観察さンパク質自身をターゲットとした新薬の開発は非常に困難れた。第三に、生化学的手法により RUTBC1 が活性化型であると考えられている。本研究成果をふまえ、Rab32/Rab32 および活性化型 Rab38 の量を劇的に減少させ、一Rab38 と RUTBC1 の相互作用を阻害するような化合物の方で RUTBC1 ノックダウン色素細胞では活性化型 Rab32

開発は、メラニン合成酵素のメラノソームへの輸送を調節および活性化型 Rab38 量の増加が観察された。これらのできる可能性が考えられる。本アプローチは、アルブチン知見から、RUTBC1 が色素細胞における Rab32/Rab38 のをはじめとするメラニン合成酵素自身の活性化制御をター機能的な GAP であると結論づけた。

ゲットとする既存のアプローチとは異なっている点に特色− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018があり、メラニン産生を多面的な角度から制御することは、

Raposo G, Seabra MC: Rab38 and Rab32 control post-

今後のコスメトロジー研究の発展に不可欠であると考えら

Golgi trafficking of melanogenic enzymes, J. Cell Biol.,れる。

175, 271‒281, 2006.
5） Nottingham RM, Ganley IG, Barr FA, Lambright（引用文献）

DG, Pfeffer SR: RUTBC1 protein, a Rab9A effector
that activates GTP hydrolysis by Rab3 2 and Rab3 3B

1） Oiso N, Riddle SR, Serikawa T, Kuramoto T, Spritz

proteins, J. Biol. Chem., 23, 33213‒33222, 2011.

RA: The rat Ruby（R）locus is Rab3 8: identicalmutations in Fawn-hooded and Tester-Moriyama rats

6） Kloer DP, Rojas R, Ivan V, Moriyama K, van Vlijmenderived from an ancestral Long Evans rat sub-strain,T, Murthy N, Ghirlando R, van der Sluijs P, Hurley JH,Mamm. Genome, 15, 307‒314, 2004.

Bonifacino JS, Assembly of the biogenesis of lysosome-2） Gerondopoulos A, Langemeyer L, Liang JR, Linford

related organelles complex-3（BLOC-3）and its

A, Barr FA: BLOC-3 mutated in Hermansky-Pudlak

interaction with Rab9, J. Biol. Chem., 285, 7794‒7804,

syndrome is a Rab32/38 guanine nucleotide exchange

2010.
7） Marubashi S, Shimada H, Fukuda M, Ohbayashi N:factor, Curr. Biol., 20, 2135‒2139, 2012.
3） Tamura K, Ohbayashi N, Maruta Y, Kanno E, Itoh T,

RUTBC1 Functions as a GTPase-activating Protein

Fukuda M: Varp is a novel Rab3 2/3 8-binding protein

for Rab3 2/3 8 and Regulates Melanogenic Enzymethat regulates Tyrp1 trafficking in melanocytes, Mol.

Trafficking in Melanocytes, J. Biol. Chem., 2 9 1,Biol. Cell, 20, 2900 ‒2908, 2009.

1427‒1440, 2016.

4） Wasmeier C, Romao M, Plowright L, Bennett DC,− 74 −