®

ChIP-IT Express Enzymatic
Magnetic Chromatin
Immunoprecipitation Kit&
Enzymatic Shearing Kit（商品コード53009 & 53035）

日本語版プロトコール

使用上の注意事項
この日本語プロトコールは ChIP-IT® Express Enzymatic（商品コード 53009）
および ChIP-IT Express Enzymatic
Shearing kit（商品コード 53035）の英語版製品マニュアル（ver.F5）をもとに作製しました。英語版製品マニ
ュアルは弊社ウェブサイトをご参照ください（https://www.activemotif.jp/documents/1719.pdf）。

（2020.8.19 改訂）

アクティブ・モティフ株式会社〒162-0824 東京都新宿区揚場町 2-21
TEL: 03-5225-3638 FAX:03-5261-8733
www.activemotif.jp

ChIP-IT® Express Enzymatic

目次
クロマチン免疫沈降実験の概要····························································3
ChIP-IT® Express Enzymatic の操作方法··················································4
参考文献················································································4
ChIP-IT® Express Enzymatic の利点·························································5
関連製品の紹介··········································································6
キットの内容物と保存条件································································9
ChIP-IT® Express Enzymatic（商品コード 53009）········································9
ChIP-IT® Express Enzymatic Shearing（商品コード 53035）·······························10キットに含まれていない試薬と器具·······················································11
ChIP-IT® Express Enzymatic の実験デザイン···············································12
プロトコール： 断片化クロマチンの調製···················································13
A. 細胞の固定とクロマチン断片化·····················································13
プロトコール：クロマチン免疫沈降························································16
B. 免疫沈降·········································································16
C. 磁気ビーズの洗浄·································································17
D. クロマチンの溶出、脱架橋、Proteinase K 処理········································17
プロトコール：PCR による解析···························································18
E. エンドポイント PCR·······························································18
F. リアルタイム PCR·································································21
Appendix-補足説明······································································25
Section A.クロマチン断片化条件検討のための細胞固定···································25
Section B. 酵素によるクロマチン断片化の条件検討······································26
Section C. DNA の洗浄とクロマチン断片化効率の評価···································27
Section D. クロマチン調製時のスケールアップ／ダウン··································29
Section E. 磁気ビーズと磁石（マグネットバー）の使用法································30
Section F. トラブルシューティング····················································33
Section G. 関連製品リスト····························································36-2-ChIP-IT® Express Enzymatic

クロマチン免疫沈降実験の概要
クロマチン免疫沈降（ChIP）はタンパク質－DNA 相互作用を研究するための強力な実験手法です 1,2。
この実験手法では、 無傷生細胞（Intact living Cell）をホルムアルデヒド（Formaldehyde）で固定することによって、タンパク質と DNA を架橋し、タンパク質－DNA の相互作用を維持します。次に、超音波破砕または酵素処理により DNA を短く均一な長さに断片化し、目的の DNA 結合タンパク質に対する特異的な抗体を用いてタンパク質－DNA 複合体を免疫沈降します。免疫沈降の後、脱架橋し、Proteinase K 処理によりタンパク質を除去して DNA を回収します。その後回収された DNA を解析することによって、目的のタンパク質に結合していた DNA を同定します（4 ページ図 1 参照）。
ChIP アッセイ（ChIP Assay）はクロマチン生物学や転写制御の研究において極めて有用です。なぜなら、特定の DNA 領域にどのようなクロマチンタンパク質や転写因子が存在するのか、またヒスト
ンがどのように修飾されているのかを決定できるからです。ChIP アッセイではタンパク質－DNA 相
互作用が保存されるため、その解析結果は染色体のトポロジーや細胞内の調節タンパク質の影響を反映します 3,4,5。
ChIP 法は、技術的な要求が厳しい実験手法です。DNA 結合状態かつ固定された対象のタンパク質を認識する高品質の抗体、抗体－タンパク質複合体を効率よく沈降させるための試薬（プロテイン A やG の結合したビーズが良く使用される）が必要です。さらに、非特異的な濃縮とタンパク質の分解を最小限に抑えるために、ChIP 用に最適化したバッファー、阻害剤カクテル、ブロッキング試薬も必要とされます。
アクティブ・モティフの ChIP-IT® Express Enzymatic キット（商品コード 53009）には、 タンパク質－DNA 間相互作用を迅速かつ正確に解析するために必要な試薬一式が含まれています。ChIP-IT®
Express Enzymatic キットではプロテイン G 磁気ビーズで免疫沈降を行うことで、 ChIP アッセイのプロトコールは簡潔なものとなりました。また、従来のプロトコールを見直し、所要時間の短縮や不要箇所の削除を行いました。この結果、本キットを用いることにより迅速かつ効率的な ChIP アッセ
イが可能です。
ChIP-IT® Express Enzymatic キットには 25 回分の免疫沈降試薬に加え、断片化クロマチン調製を 10
回と断片化の条件検討を 2 回実施するのに十分な量のクロマチン断片化試薬が含まれています。より多くのクロマチンを断片化する必要がある場合は、 断片化試薬のみが含まれる ChIP-IT® Express
Enzymatic Shearing Kit をご利用ください。本キットの関連製品についての情報は弊社ウェブサイト
（http://www.activemotif.jp/chipitdocs）をご参照ください。

製品名

反応回数

商品コード

®

25 rxns

53009®

10 rxns53035®

25 rxns

53014

ChIP-IT Express Enzymatic
ChIP-IT Express Enzymatic Shearing Kit
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads-3-

ChIP-IT® Express Enzymatic

ChIP-IT® Express Enzymatic の操作方法

図 1: ChIP-IT® Express Enzymatic を用いたクロマチン免疫沈降の概略図
ChIP-IT® Express Enzymatic では細胞をホルムアルデヒドで固定し、タンパク質／DNA を架橋する。酵素処理によりクロマチンを断片化する。断片化したクロマチンを、目的の DNA 結合タンパク質に対する抗体と反応させ、抗体と結合したタンパク質／DNA 複合体を Protein G をコートした磁気ビーズを用いて免疫沈降する。免
疫沈降後、クロマチンを溶出、脱架橋し、目的のタンパク質に結合していた DNA 断片を PCR により解析する。

参考文献
1. Solomon、M.J. et al. (1988) Cell 53(6): 937-47.
2. Solomon、M.J. and Varshavsky A. (1985) PNAS USA 82(19): 6470-4.
3. Kuo、M.H. and Allis、C.D. (1999) Methods 19(3): 425-33.
4. Weinman、A.S. and Farnham、P.J. (2002) Methods 26: 37-47.
5. Caretti、G. et al. (2003) J Biological Chem. 278: 30435-30440.

-4-

ChIP-IT® Express Enzymatic

ChIP-IT® Express Enzymatic の利点
迅速かつ効率的な ChIP アッセイのためのコンプリートキット
・簡便なプロトコールにより、所要時間を劇的に減少させます。
・多試料の ChIP アッセイを同時に行うことも可能です。
・マルチチャンネル型のピペッティングにも対応可能です。
ChIP-IT® Express Enzymatic キットには、簡便なクロマチン免疫沈降実験用の試薬とプロトコールが含まれています。これらのキットを用いてクロマチンの調製、クロマチン断片化条件の最適化、免疫沈降を行うことができます。
ChIP-IT® Express Enzymatic キットには 25 回分の免疫沈降試薬に加え、断片化クロマチン調製を 10
回と断片化の条件検討を 2 回実施するのに十分な量のクロマチン断片化試薬が含まれています。プロ
テイン G でコートされた磁気ビーズは、すぐに使用可能な状態で提供されています。
このビーズは IgGに対する結合容量が高く、非特異的結合が小さいという特長があります。そのため、この磁気ビーズを用いるとアガロースビーズよりも洗浄回数が少なくて済み、免疫沈降を行う前にクロマチンを事前に精製しておく必要もありません。さらなる利点として、回収に遠心操作が必要な標準的なアガロー
スビーズと比べて、磁気ビーズはより短時間で回収することができます。さらに、磁石スタンド（およびキット添付の磁石）はビーズをチューブの側面に集めるように設計されているため、ビーズを乱すことなくバッファーを簡単に取り除くことができます。そのため、マルチチャンネルピペッターを
磁気ビーズの洗浄に用いることもできます。このような特色によって、所要時間が劇的に短縮され、再現性が高い実験が可能となりました。キット添付のシリコン処理済みマイクロチューブにより洗浄ステップが単純化され、プロテイン G ビーズのロスが抑えられます。他のステップのプロトコールも最適化されています。
特別な Elution Buffer と Reverse Cross-linking Buffer を併せて使用することで、所要時間が短縮されて実験操作が減り、精製過程で起こりうる DNA のロスが小さくなりました。
こうした改善により所要時間が大幅に減少しただけでなく、8、16 または 24 サンプルの並列 ChIP アッセイを同時に行うことが簡便になりました。これは、時間と労力がかかる従来の ChIP アッセイでは不可能なことでした。アクティブ・モティフ社の ChIP-IT® Express HT（商品コード 53018）を用いると、最大 96 サンプルのハイスループット ChIP アッセイを同時に行うことができます。

2 種類のクロマチン断片化法- ChIP-IT® Express（ソニケーション）と ChIP-IT® Express
Enzymatic（酵素）ChIP-IT® Express Kit にはクロマチン調製のための試薬 10 回分と、断片化条件検討用の試薬 2 回分が含まれています。このキットのプロトコールに従うと、各クロマチン試料の調製には 15cm の組織培
養ディッシュ 1 枚分の細胞を用い、そこから調製したクロマチンを用いると最大で、6 回の免疫沈降反応を行うことができます（1 回の免疫沈降反応とは、1 つのクロマチン試料を 1 つの抗体と反応さ-5-ChIP-IT® Express Enzymatic

せることを意味します）。クロマチン調製のプロトコールは、細胞数に応じてスケールアップやスケ
ールダウンをすることができます（本プロトコールの補足説明 Section D（28 ページ）参照）。ソニ
ケーションによる試料調製を追加で行いたい場合は、別売の ChIP-IT® Express Shearing Kit をご利用ください。
ChIP-IT® Express Enzymatic キットは ChIP-IT® Express キットに似ていますが、 超音波に代わって酵素切断法でクロマチンを断片化に適した試薬に加えて、Enzymatic Shearing Cocktail と Digestion
Buffer を使用します。酵素によるクロマチン断片化は時間と温度のみに依存するため、ソニケーショ
ンによる断片化で問題となる超音波の強度のばらつきや、クロマチンの乳化を回避できます。この理
由で、酵素切断法はシンプルなだけでなく、断片化条件の最適化や再現性の高い断片化処理をより簡単に行うことができ、ChIP 実験の結果も改善されることが期待されます。

関連製品の紹介
下記製品については、アクティブ・モティフ社のウェブサイトをご覧頂くか、本プロトコールのSection G（35 ページ）参照してください。
・ChIP-IT® Control Kit
適切なコントロールを置くことで、ChIP 実験の解釈やトラブルシューティングがより簡単になります。ヒト、マウス、ラットに対応した ChIP-IT® Control Kit を用意しています。この便利なキットには、ポジティブおよびネガティブコントロール用抗体と動物種特異的な PCR 用のポジティブコント
ロールプライマーが含まれています。このキットは ChIP 実験における抗体の評価に非常に役に立ちます。
・ChIP Control qPCR primer sets
ChIP Control qPCR primer sets も有用性の高い製品です。一般的な多くの ChIP ターゲットに対して、ポジティブおよびネガティブコントロールとして使用することができ、ChIP 反応の成否を確認する
ことができます。アクティブ・モティフ社のプライマーセットを使うことで、研究対象の遺伝子や種特異的なプライマーを設計、合成して、それを評価する時間と労力を大幅に削減することが期待されます。
・Ready-to-ChIP Chromatin
アクティブ・モティフ社の Ready-to-ChIP Chromatin は、時間削減のためのもう一つの有用な試薬です。これらの高品質のクロマチンサンプルは、様々な細胞種（HeLa, Hep G2、K-562 および NIH/3T3）に由来しています。このクロマチンは超音波処理によって断片化済みのため、すぐに ChIP 実験に供与することができます。
・ChIP-IT® Express Enzymatic Shearing Kit
ChIP-IT® Express Enzymatic キットで調製可能な断片化クロマチンよりも多くの断片化クロマチンが必要な場合には、ChIP-IT® Express Enzymatic Shearing Kit を別に使用することができます。
-6-

ChIP-IT® Express Enzymatic・Bridging Antibody for Mouse IgG
プロテイン G への結合力が強くないアイソタイプのマウス抗体を ChIP に使用する場合には、
Bridging
Antibody for Mouse IgG の使用をおすすめします。この抗体はプロテイン G ビーズとマウス一次抗体へ特異性が高く結合します。この抗体は、マウス抗体の免疫的複合体の捕捉効率を最大化し、マウス
一次抗体を使った ChIP や IP 実験の結果を改善します。
・Antibodies for ChIP
ChIP 実験の困難な点の一つに、DNA 結合状態かつホルムアルデヒド固定状態のターゲットタンパク質を認識する抗体を確保することが挙げられます。ウエスタンブロットや他の用途で使用できる抗体
が、ChIP ではうまく機能しないことがあります。このような理由から、アクティブ・モティフ社では ChIP 実験で使用可能な抗体のラインアップを強化しています。最新のアクティブ・モティフ社のChIP 用抗体については、www.activemotif.jp を参照してください。
・ChIP-IT® High Senstivity
細胞内の量が少ない転写因子の研究や、特異性があまり良くない抗体で実験をする場合、また限られた少量のサンプルからChIPを行う場合には、アクティブ・モティフ社のChIP-IT® High Sensitivityキッ
トが理想的なChIPキットと言えます。このキットはより高い感度でChIP実験を行えるため、上記のような障害を乗り越えることができます。ChIP-IT® High SensitivityキットはChIP-IT® qPCR Analysis
Kitと一緒に使うことができます。このキットは、qPCR解析をより簡便にし、複数種のサンプルや異なる実験間でのデータの標準化を容易にします。
・ChIP-IT® Express HT
ChIP-IT® Express HTキットは、多くのChIP実験を同時に行う必要のあるユーザー向けに設計されています。磁気ビーズを使用するChIP-IT® Expressキットの手法を96ウェルプレートでChIPができるよ
うに改変した試薬とプロトコールが採用されています。
・Re-ChIP-IT®
二つのエピジェネティックマークやクロマチン結合タンパク質が、単一のクロマチンサンプル中で同じ場所に存在することを立証するためには、連続的なChIP実験が必要となり、ChIP済みサンプルを異なる抗体を用いて再度ChIP実験を行います。連続してのChIP実験は複雑なプロセスを経るため、アクティブ・モティフ社ではRe-ChIP-IT®キットを提供しています。このキットでは、ChIP-IT® Expressを発展させた手法によって、連続的なChIP実験を簡単に行うことができます。
・ChIP-IT® ChIP-Seq
ChIPと次世代シークエンサーを使ったゲノムワイド解析を組み合わせる（ChIP-Seq）ことを計画しているユーザーには、ChIP-IT® ChIP-Seqキットをおすすめします。このキットには、高性能なChIP
用試薬、効率化されたプロトコール、有効なコントロールが採用されており、次世代シークエンシン
サー解析を目的としたChIPによる濃縮、ChIP反応の有効性の判定、次世代シークエンス用のライブ-7-

ChIP-IT® Express Enzymatic

ラリ調製を行うことができます。
・ChIP-IT® FFPE
臨床サンプルから得られる遡及的かつ有用なデータを役立てるため、ChIP-IT® FFPE Kitを開発しました。このキットではホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）された組織ブロックと病理スライドをサンプルとして使用することができます。

-8-

ChIP-IT® Express Enzymatic

キットの内容物と保存条件
ChIP-IT® Express Enzymatic（商品コード 53009）
構成品はそれぞれ、以下の表に示された温度で保管してください。

試薬名

容量

保存温度/有効期間

Rnase A (10 µg/µl)

40 µl-20℃/ 6ヵ月

5M NaCl

200 µl-20℃/ 6ヵ月

100 mM PMSF

475 µl-20℃/ 6ヵ月

Proteinase K (0.5 µg/µl)

250 µl-20℃/ 6ヵ月

Proteinase K Stop Solution

150 µl-20℃/ 6ヵ月

2 x 100 µl-20℃/ 6ヵ月

1X Lysis buffer

16 ml-20℃/ 6ヵ月

10X Glycine

33 ml-20℃/ 6ヵ月

10X PBS

120 ml-20℃/ 6ヵ月

Elution Buffer AM2

1.6 ml-20℃/ 6ヵ月

Reverse Cross-linking Buffer

1.6 ml-20℃/ 6ヵ月

ChIP Buffer 1

70 ml-20℃/ 6ヵ月

ChIP Buffer 2

70 ml-20℃/ 6ヵ月

Digestion Buffer

11 ml-20℃/ 6ヵ月

Enzymatic Shearing Cocktail

6 µl-20℃/ 6ヵ月

0.5 M EDTA

280 µl-20℃/ 6ヵ月

Protein G Magnetic Beads*

650 µl

4℃/ 6ヵ月

Siliconized 1.7 ml microcentrifuge tubes

25

室温

Bar Magnet

1

室温Mini Glue Dots

1 sheet

室温Protease Inhibitor Cocktail (PIC)* Protein G Magnetic Beads はドライアイス保存で出荷致しますが、一旦融解したら再凍結は避けてください。融解後は 4℃で保管してください。

-9-ChIP-IT® Express Enzymatic

ChIP-IT® Express Enzymatic Shearing Kit（商品コード 53035）
この構成品リストはChIP-IT® Express Enzymatic Shearing Kit単体用です。このキットには、断片化
関連試薬のみが含まれています。ChIP-IT® Express Enzymaticキット用の構成品リストは8ページにあります。構成品はそれぞれ、以下の表に示された温度で保管してください。

試薬名

容量

保存温度/有効期間

Rnase A (10 µg/µl)

40 µl-20℃/ 6ヵ月

5M NaCl

200 µl-20℃/ 6ヵ月

100 mM PMSF

475 µl-20℃/ 6ヵ月

Proteinase K (0.5 µg/µl)

250 µl-20℃/ 6ヵ月

Proteinase K Stop Solution

150 µl-20℃/ 6ヵ月

2 x 100 µl-20℃/ 6ヵ月

1X Lysis buffer

16 ml-20℃/ 6ヵ月

10X Glycine

33 ml-20℃/ 6ヵ月

10X PBS

120 ml-20℃/ 6ヵ月

Digestion Buffer

11 ml-20℃/ 6ヵ月

Enzymatic Shearing Cocktail

6 µl-20℃/ 6ヵ月

0.5 M EDTA

280 µl-20℃/ 6ヵ月

Protease Inhibitor Cocktail (PIC)-10-

ChIP-IT® Express Enzymatic

キットに含まれていない試薬と器具
・ ChIP アッセイで使用できることが確認済みの任意のタンパク質に対する抗体
・ Dounce 型ホモジェナイザーとクリアランスの小さなタイプのペッスル（例：アクティブ・モティ
フ Dounce Homogenizer: 商品コード 40401 または 40415）：ホモジェナイザーの使用は、ソニケーションによるクロマチン断片化に推奨致しますが、酵素処理によるクロマチン断片化には必須です。ホモジェナイズを行うことで、ChIP アッセイが成功する確率が格段に上昇します。
・ 磁石スタンド：添付の棒磁石を用いて磁石スタンドをご自身で組み立てるか（Appendix-Section E（29 ページ）参照）、市販のスタンドを用いることもできます（例: Promega の MagneSphere®
Technology 12 本立て磁気分離スタンド）。
・ 37%ホルムアルデヒド（ホルマリン）：重合を防ぐため 10~15％のメタノールが添加されているもの。パラフォルムアルデヒドは推奨しません。
・ 位相差顕微鏡および血球計算盤
・ 50％グリセロール（dH2O で希釈したもの）
・ pH 8.0 TE 飽和フェノール／クロロホルム（1:1）：DNA 精製用、分子生物学グレード
・ 3M 酢酸ナトリウム、pH5.2（吸光度測定やゲル電気泳動による濃度チェックの前に行う Input DNA
や断片化 DNA の精製用）
・ 100%エタノール
・ 70%エタノール
・ DNase フリー水（Input DNA の精製用）
・ 培養ディッシュのためのシェーカー
・ 4℃で稼働させるマイクロチューブ用ローテーター（例: Barnstead/Thermolyne の Labquake）
・ 卓上遠心機（4℃設定が可能なもの）とマイクロチューブ
・ DNA 量の測定のための分光光度計
・ ピペッターとチップ（フィルター付きチップを推奨）
・ アガロースゲル電気泳動装置・ 無血清最小培地
・ セルスクレーパー（ラバーポリスマン）
その他オプション・ 8 穴 PCR ストリップチューブ（例: Thermo Fisher 商品コード AB-0451）
・ シリコン処理された 1.7 ml チューブ（例：アクティブ・モティフ
・ Chromatin IP DNA Purification Kit（例：アクティブ・モティフ-11-

商品コード：58036）

商品コード：58002）

ChIP-IT® Express Enzymatic

ChIP-IT® Express Enzymatic の実験デザイン
プロトコール全体をよく読んでから実験を始めてください。
考慮すべき点細胞の培養とクロマチンの調製 – 実験を始める前にどの程度のクロマチン量が必要になるかを計算し、免疫沈降反応を何回行うかを決定してください。その際、コントロールについても反応回数として計算に入れてください。また、任意の化合物や培養条件が DNA-転写因子間相互作用に及ぼす影響を解析する場合は、未処理の細胞をコントロールとして用意してください。
プロテイン G 磁気ビーズ – キット付属の磁気ビーズはすぐにご使用頂けます。ビーズのブロッキング
や事前の洗浄は必要ありません。ビーズを混合する場合、静かにチューブを回して混ぜてください。ただしビーズはすぐに沈殿するので、使用直前にピペッティングしてください。ビーズはドライアイス保
存でお届けしますが、一度融解したら再凍結は避けて、4℃で保管してください。ChIP-IT® Protein G
Magnetic Beads は別売しています(商品コード 53014)。
ChIP 用抗体 – ChIP アッセイでは、DNA や他のタンパク質と複合体を維持しつつ、固定された非変性状態の目的タンパク質を認識できる抗体を用いる必要があります。他の用途でよく働く抗体が ChIP アッセイでは働かないということはよくあります。そのため、ChIP アッセイでの使用が確認されていない抗体で ChIP アッセイを行う際には、適切なポジティブコントロール（例：RNA pol II 抗体、商品コード39097）およびネガティブコントロール（マウスモノクローナル抗体やウサギポリクローナル抗体など）をおき、その抗体と調製したクロマチンが ChIP に適しているかを確認する必要があります。このような場合のために、アクティブ・モティフ社ではヒト、マウスおよびラット用の ChIP-IT® Control Kit を販売しています。これらのキットにはポジティブコントロールとネガティブコントロールの抗体、PCR プ
ライマー、PCR バッファー、ローディングダイが含まれています（本プロトコールの補足説明の Section
G 参照）。
シリコン処理済みチューブ – ChIP 反応を行う際には、キット内のシリコン処理された 1.7ml マイクロチューブまたは 8 ウェル PCR ストリップチューブを使用してください（これらをクロマチンの調製やインプット DNA の単離に使用すると、チューブの数が不足します）。
棒磁石 – キット内に含まれる棒磁石はシリコン処理された 1.7 ml マイクロチューブおよび 8 ウェル
PCR ストリップチューブのどちらのフォーマットにも対応しています（詳細は本プロトコールの補足説
明 Section

E（29 ページ）参照）。市販の側面吸引型の磁石スタンド（例：Promega 社の MagneSphere®

Technology12 本立て磁気分離スタンド-1.7 ml マイクロチューブフォーマット）
もご利用いただけます。

-12-

ChIP-IT® Express Enzymatic

溶液の十分な懸濁 - PMSF や Proteinase K Stop Solution は室温で溶かし、完全に溶解させてください（約 30 分間かかります）。穏やかに撹拌し、使用前に軽く遠心してください。
抗体量 – 一般的に最良の結果を得るには 1〜3 µg の抗体を用います。しかし最適な条件は、抗体の特異性やクロマチンの質によって異なるので、より多くの量の抗体が必要になることも予想されます。
安全に関する注意 – ホルムアルデヒドと PMSF は非常に毒性の高い化合物です。適切な安全策（例
えば安全眼鏡、手袋、白衣の着用）を用いてください。また、ホルムアルデヒドは吸い込むと危険なので、安全キャビネットの中でのみ使用してください。サンプル細胞に感染性因子が含まれている可能性がある場合、ソニケーションによるクロマチン断片化は安全キャビネットの中で行ってください。

プロトコール： 断片化クロマチンの調製
A. 細胞固定とクロマチン断片化
以下のプロトコールでは、15 cm 培養ディッシュ 1 枚分の細胞（細胞数：約 1.5×107 個）を使用します（サンプル量が異なる場合には、補足説明 Section D を参考に、反応スケールを調節します）。以
下のプロトコールには、細胞株や実験条件に応じて最適化されたクロマチン断片化条件が必要です。
断片化条件の最適化が終わっていないときは、クロマチン断片化の条件検討を先に行う必要があります。その際は、クロマチン断片化条件検討方法（補足説明 Section A～C を参照してください。この
条件検討には培養ディッシュ 3 枚分の細胞が必要です。この細胞量は、複数の断片化条件の比較や、適切な条件の決定が十分行える量です。条件検討によって得られた実験条件を以下のプロトコール中で使用してください。
クロマチン断片化のヒント
酵素によるクロマチン断片化において最も重要なことは、細胞を効率よく破砕しておき、酵素がクロマチンと反応できるようにすることです。このため、ダウンス型ホモジェナイザーと隙間の狭いペッスルを使用して、核を壊すことなく細胞膜を物理的に破壊することを強く推奨します。細胞膜の破砕が効率的に行われているか顕微鏡を用いて検証します。破砕しにくい細胞の場合には、ホモジェナイズによる細胞破砕の回数を増やすこと、固定時間を 5 分に短縮することも有効です。そして、細胞が-13-

ChIP-IT® Express Enzymatic

完全に破砕された後に酵素カクテルを加えることが大切です。
酵素カクテル中の DNA 切断酵素は DNA 配列非依存的に DNA を切断します。酵素はヌクレオソームの間などの、接近しやすい領域を切断する傾向があります。したがって、酵素切断産物には DNA 断
片サイズに特徴があります。すなわち~150 bp（ヌクレオソーム 1 個）、~300 bp（ヌクレオソーム 2個）、~450 bp（ヌクレオソーム 3 個）といったパターンとなります。酵素カクテルを入れる前に細胞が良く破砕されていることを確認すれば、酵素処理は断片化クロマチンを調製する非常に優れた手法
だと言えます。一度、細胞種に応じて細胞破砕の条件と酵素処理の時間を最適化すれば、いつでも再現性の高い結果を得ることができます。
ChIP-Seq のように非常に短い DNA 断片が要求される解析手法の前処理に本キットは最適です。次世代シーケンサーでの解析には 100～200 bp 程に小さく断片化された DNA が必要です。この点において、酵素による断片化は超音波を使用する方法に比べて、短い DNA 断片を簡単に調製できます。単純に酵素反応時間を長くするだけで、より短い DNA 断片を得ことができます（15～30 分の範囲）。
重要：以下で使用するバッファーのいくつかは、PMSF と protease inhibitors（PIC）の添加が必要です。クロマチン調製を開始する前（例：室温で 30 分）にこれらの試薬を解凍し、使用する直前にバッファーに添加してください。
1.

15 cm プレートに細胞を 70－80％の培養密度で培養する。

2.

細胞の準備が整ったら、以下の溶液を用事調製する。
a.

Fixation Solution: 0.54 ml の 37％ホルムアルデヒドを 20 ml の細胞培養培地に加え、よく混合する。その後室温に置く。

b.

1×PBS Solution: 2.33 ml の 10×PBS を 21 ml の滅菌水に添加し、混合する。氷上に静置
しておく。

c.

Glycine Stop-Fix Solution: 1 ml の 10×Glycine Buffer、1 ml の 10×PBS、8 ml の滅菌水をよく混合し、室温に置く。

d.
3.

Cell Scraping Solution: 0.6 ml の 10×PBS を 5.4 ml の滅菌水に混合し、氷上に置く。

細胞培養用培地を捨て、20 ml の Fixation Solution を各プレートに添加する。振とうしながら 10
分間室温でインキュベートする。
重要：標準プロトコールでは、断片化に先立ってクロマチンを 10 分間固定します。これらは代表的な固定条件なので、抗体とクロマチンの組み合わせによっては、固定時間を短くした方が良い場合があります。

4.

Fixation Solution を除去し、10 ml の氷冷した 1×PBS を加え、5 秒間プレートを揺り動かす。その後 PBS を捨てる。

5.

10 ml の Glycine Stop-Fix Solution を加え、固定反応を停止させる。溶液が全体に行き渡るようにした後、5 分間プレートを揺り動かす。

6.

Glycine Stop-Fix Solution を除去し、10 ml の氷冷した 1×PBS を添加する。5 秒間プレートを揺-14-

ChIP-IT® Express Enzymatic

り動かし、PBS を捨てる。
7.

使用する直前に、30 μl の 100 mM PMSF を Cell Scraping Solution に加える。5 ml の氷冷した
Cell Scraping Solution をプレートに添加し、細胞をこすり取る。1 ml のピペットを用いて、細胞を 15 ml のコニカルチューブへ移す。

8.

4℃で 2,500 rpm、10 分間遠心して、細胞を沈殿させる。

9.

上清を捨てる。この段階で細胞を冷凍保存することが可能。その場合は 1μl の 100 mM PMSF と1 μl の PIC を添加し、-80℃で保存する。

酵素によるクロマチン断片化
この章では酵素切断法によるクロマチンの単離と断片化について記載しています。
1. （必要であれば、細胞ペレットを氷上で解凍し）5 μl の PIC と 5 μl の PMSF を添加した 1 ml の氷冷した Lysis Buffer に細胞を再懸濁する。やさしくピペッティングと短時間ボルテックスをして、再懸濁する。その後氷上で 30 分インキュベートする。
インキュベーション中に、Enzymatic Shearing Cocktail（200 U/ml）を調製する。組成は以下の表に従い、必要反応分だけ作成する。Enzymatic Shearing Cocktail は 4℃で 1～2 週間安定的に保存可能である。

試薬名

1～2反応

3～5反応

6～10反応Stock Enzymatic Shearing Cocktail (2 x 10 U/ml)

0.5 µl

1.0 µl

2.0 µl

50% glycerol

49.5 µl

99 µl

198 µl4

2. 氷冷したダウンス型ホモジェナイザーに細胞を移し、10 回ペッスルを動かして、核を抽出する。
細胞の破砕物を顕微鏡下で観察し、核が放出されているかを確認する。
細胞溶解の観察：細胞の溶解を確認するために、ダウンス型ホモジェナイザーから細胞溶解物を10 μl 取り、位相差顕微鏡と血球計算盤を使用して検鏡し、核が細胞外に放出していることを確
かめてください。細胞溶解ステップ前後で細胞を検鏡すると、細胞と核の識別を比較的容易に行うことができます。無傷の細胞は中心部に黒い領域（核）があり、核は色の薄い細胞質に囲まれています。溶解した細胞では、核は非対称形の破片に囲まれた黒いドット状に見えます。細胞が溶解していなければ、氷上でさらに 10 回ペッスルを操作するか、または細胞が溶解されるまでホモジェナイズを行ってください。
3. 破砕した細胞を 1.7 ml のチューブに移し、4℃で 10 分間 5,000 rpm (2,400RCF)で遠心し、核を沈殿させる。
4. 上清を捨て、
核ペレットを 1.75 μl の PIC と 1.75 μl の PMSF を添加した 350 μl の Digestion bufferに再懸濁し、37℃で 5 分間インキュベートする。
5. 17 μl の用事調製した Enzymatic Shearing Cocktail (200 U/ml)を添加し、ボルテックスしてよく混合する。
6. 37℃でインキュベーションする。時間は細胞によって異なるので、事前に最適化しておく（2 分-15-ChIP-IT® Express Enzymatic

おきにボルテックスすることで、切断効率が上昇する）。
7. 7 μl の氷冷した 0.5 M の EDTA を加え、氷上で 10 分間静置し、酵素反応を停止させる。
8. 4℃で 10 分間 15,000 rpm で遠心する。上清に断片化したクロマチンが含まれている。50 μl を切断効率と濃度測定に使用する。残りはすぐに次のステップに使用するか-80℃で保存する。
重要：上記で分取した50 μlのサンプルはDNAの精製プロトコール（本プロトコールの補足説明
Section C参照）に従って処理し、DNAの濃度測定とクロマチン断片化を確認するのに使用します。ChIP反応系を構築する際にはDNAの濃度が必要です。

プロトコール：クロマチン免疫沈降
B．免疫沈降1. クロマチンが凍結している場合は、氷上で解凍する。10 μl をチューブに移す。これは“Input DNA”とし、ChIP 後の PCR 解析に使用する。6 時間以内に使用できる場合は 4℃、それ以上の場合には-20℃で保存しておく。
2. 以下の表に従い、ChIP 反応液を調製する。シリコン処理した 1.7 ml チューブか PCR チューブを使用する。抗体は必ず最後に反応液に加えること。
表 1
クロマチンが60 ul以下の場合（1反応あたり）

クロマチンが60 ulより多い場合（1反応あたり）

Protein G Magnetic Beads

25 µl

25 µl

ChIP Buffer 1

10 µl

20 µl

Sheared Chromatin (7-25 µg)※20-60 µl61-100 µl

Protease Inhibitor Cocktail (PIC)

1 µl

2 µl

総量が100 ulになるように調製総量が200 ulになるように調製

Antibody (最後に加える)

1-3 µg1-3 µgTotal Volume

100 µl200 µl

試薬

dH2 O※重要：ChIP 後の実験によっては、クロマチン量を 1～50 μg で実施することも可能。
3. チューブのふたをして、回転式ローテーターで 4℃、4 時間インキュベートする（オーバーナイト
でインキュベーションすることで感度が上昇する）。
4. 軽く遠心し、溶液をチューブの底に集める。
5. チューブを磁気スタンドに設置し、磁気ビーズを側面に集める。
6. 上清を捨てる。

-16-

ChIP-IT® Express Enzymatic

C．磁気ビーズの洗浄
重要：ビーズを乾燥させないでください。バッファーの除去と次のバッファーの添加は1分以内に行ってください。ビーズの洗浄法に関しては、本プロトコールの補足説明Section Eにも記載があります。
1.7 ml チューブ使用時
1. 800 μl の ChIP Buffer 1 で 1 回洗浄する。
2. 800 μl の ChIP Buffer 2 で 2 回洗浄する。
3. 洗浄後、ビーズを乱さないように、可能な限り上清を除去する。
8 連 PCR チューブ使用時
1. 200 μl の ChIP Buffer 1 で 3 回洗浄する。
2. 200 μl の ChIP Buffer 2 で 2 回洗浄する。
3. 洗浄後、ビーズを乱さないように、可能な限り上清を除去する。

D.

クロマチンの溶出、脱架橋、Proteinase K 処理

1. 洗浄したビーズを 50 μl の Elution Buffer AM2 に再懸濁する。
2. 回転式ローテーターを使い、室温で 15 分インキュベートする。
3. 軽く遠心し、溶液を容器の底に集める。
4. 50 μl の Reverse Cross-linking Buffer を加え、ピペッティングして撹拌する。チューブを磁気スタンドに設置し、磁気ビーズを集める。
5. クロマチンが含まれている上清を新しいチューブに回収する。
6. Step B-1 で分取しておいた 10 μl の Input DNA（凍結している場合は氷上で解凍する）に、88 μlの ChIP Buffer 2 と 2 μl の 5 M NaCl を加え、体積を 100 μl に調製する。これらは Input DNAにだけ加えること。
7. 95℃で 15 分、ChIP サンプルと Input DNA サンプルをインキュベートする。
重要：より大きな、壁の厚いチューブを使用するのであれば、65℃で 2.5 時間インキュベートしてください。また、よりタンパク質成分の多いサンプルではさらに長くインキュベートする必要があるかもしれません。サンプルはこのステップ終了時点で-20℃保存することが可能です。
8. チューブが室温に戻った後、軽く遠心して溶液を容器の底に集める。2 μl の Proteinase K を加える。
9. チューブの蓋をして、よく混和した後、37℃で 1 時間インキュベートする。インキュベート中に、Proteinase K Stop Solution を 30 分から 1 時間室温に置く。
10. チューブを室温に戻したのち、2 μl の Proteinase K Stop Solution を加える。軽く遠心して、溶液を容器の底に集める。Proteinase K Stop Solution 処理後の DNA は、すぐに PCR 解析（プロトコ ール PCR による解析参照）に用いるか、-20℃にて保存する。※リアルタイム PCR をする際は DNA 精製が必要です（21 ページ参照）。
-17-

ChIP-IT® Express Enzymatic

プロトコール： PCRによる解析
E. エンドポイント PCR
以下のプロトコールは ChIP で回収した DNA を適切に PCR で解析するための指標について記載しています。異なる ChIP 実験から得られた DNA 量の信頼できる比較を行うためには、エンドポイント
PCR は線形増幅期の間に停止させなければなりません。この増幅期間はサンプルや PCR プライマー
によって変わるため、適切な PCR サイクルの回数を定めることが必要です。リアルタイム PCR を用いれば、それぞれのサンプルの線形増殖期が開始するサイクル数を表す Ct 値を求めることができます。これらの利点があるため、可能であればリアルタイム PCR を使用することをお勧めします。
PCR は 4 つのテンプレート DNA を用いて行ってください。
ポジティブコントロール抗体（例 RNA pol
II）とネガティブコントロール抗体（例 Negative control IgG）を使って行われた ChIP から得られた
DNA、Input DNA および実験用の抗体を使った ChIP 実験から得られた DNA の 4 種類です。PCR 試
薬にコンタミがないことを示すため、水だけのコントロールも用意するのがよいでしょう。
プライマーの設計
プ ラ イ マ ー ペ ア は PCR 用 の プ ロ グ ラ ム を 使 っ て （ 例 the UCSC Genome Browser ；http://genome.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）、ゲノム DNA 中の単一の箇所を増幅することを確認してください。理想的には増幅サイズが、150～400 bp になるようにプライマーを設計します。PCR プ
ライマーの設計用プログラムの使用は、良いプライマー選択の手助けとなります。
注意：PCR は非常に鋭敏なので、汚染を防ぐために最大限の注意を払う必要があります。実験用手袋を着用し、フィルター付きのチップを使用することが推奨されます。
PCR の準備と反応
以下の参考プロトコールでは、PCR を 2 つの異なる PCR カクテルを使って行っています。
それぞれ、ポジティブコントロールまたはネガティブコントロール PCR プライマーが含まれています。もし、アクティブ・モティフの ChIP-IT® Control Kit のポジティブコントロール抗体を使用しているのであれば、その抗体由来の ChIP DNA に対しては、ポジティブコントロールプライマーだけを使用してください。アクティブ・モティフのポジティブコントロール抗体はゲノム中の多くの箇所に結合するよ
うに選択されているため、このポジティブコントロールに対するネガティブコントロールプライマーを設計することは現実的ではないからです。他の抗体を使った ChIP 実験を分析する場合には、その抗体に適切なポジティブコントロールプライマーとネガティブコントロールプライマーの両方を設計することが可能です。
1.

サーマルサイクラーのプログラムを入力する。最初の熱変性ステップは 94℃ 3 分、続いて 94℃
20 秒、59℃ 30 秒、72℃ 30 秒のサイクルを 30～36 回繰り返す。最後に 10℃の hold ステップ-18-

ChIP-IT® Express Enzymaticを行います。それぞれの PCR 反応液の総量は 25 µl にする。PCR の条件検討には、サイクル数
36 回から始めるのが良い。状況に応じてサイクル数を最適化する必要がある。
2.

重要：Input DNA を 10 倍に希釈する。20 µl の Input DNA に 180 µl の滅菌水を加える。

3.

以下の表のように各 PCR チューブをラベルし、テンプレート DNA とコントロール用の水を各チューブに加える。その際、PCR チューブは氷上に置いて作業する。PCR カクテルは次のステッ
プで加える。
使用するテンプレートDNA（各 5 µl）

使用するPCRカクテル（各20 µl）

1

ポジティブコントロール抗体でChIPしたDNA

Positive PCR cocktail

2

ネガティブコントロールIgG抗体でChIPしたDNA

Positive PCR cocktail

3

Input DNA（10倍希釈物）

Positive PCR cocktail

4

目的の抗体でChIPしたDNA

Positive PCR cocktail

5

H2 O（DNA無し）

Positive PCR cocktail

6

ポジティブコントロール抗体でChIPしたDNA

Negative PCR cocktail

7

ネガティブコントロールIgG抗体でChIPしたDNA

Negative PCR cocktail

8

Input DNA（10倍希釈物）

Negative PCR cocktail

9

目的の抗体でChIPしたDNA

Negative PCR cocktail

10

H2 O（DNA無し）

Negative PCR cocktail

番号4.

以下の表に従い、ポジティブ PCR カクテルとネガティブ PCR カクテルを氷上で調製する。最初に滅菌水を加え、最後に Taq polymerase を加える。よく反応液を混和して、氷上に置き、PCR
サイクルの開始まで PCR 反応が開始するのを防止する。上記のように、アクティブ・モティフの ChIP-IT Control Kits では、ポジティブコントロール抗体およびネガティブコントロール抗体とポジティブコントロールプライマーのみが提供されている。実験用の抗体については、可能であればポジティブコントロールとネガティブコントロールのプライマーセットを設計し、それらが使用できるか試しておくことを推奨する。
Positive control cocktail
試薬

1反応分

5反応分

DEPC H2 O

12.3 µl61.5 µl

Positive Forward primer (5 pmol/µl)

2.0 µl

10 µl

Positive Reverse primer (5 pmol/µl)

2.0 µl10 µl

dNTP mixture (5 mM each dNTP)

1.0 µl

5.0 µl

10X PCR Buffer

2.5 µl12.5 µlTaq (5 U/µl)

0.2 µl

1.0 µlTotal volume （テンプレートを含まない）

20 µl

100 µl

1反応分

5反応分

12.3 µl61.5 µl

Negative Forward primer (5 pmol/µl)

2.0 µl

10 µl

Negative Reverse primer (5 pmol/µl)

2.0 µl10 µl

dNTP mixture (5 mM each dNTP)

1.0 µl

5.0 µl

10X PCR Buffer

2.5 µl12.5 µlTaq (5 U/µl)

0.2 µl

1.0 µlTotal volume （テンプレートを含まない）

20 µl

100 µlNegative control cocktail
試薬
DEPC H2 O-19-

ChIP-IT® Express Enzymatic

5.

適切な PCR カクテル 20 µl を、ステップ３で調製した氷上の 5 µl の PCR テンプレートに加える。
ピペッティングで反応液を撹拌した後に、PCR チューブの蓋を閉める。反応液がチューブの底にあることを確かめる。

6.

PCR チューブをサーマルサイクラーにセットし、Step1 に従って PCR プログラムを開始する。
終了後、チューブを取り出して、氷上に置く。

7.

PCR 反応物は、以下のプロトコールに従って直ちに解析を続けるか-20℃で保管する。

PCR 反応物の解析
1.

3％アガロースゲルで～8 µl の PCR 産物を電気泳動する。追加で電気泳動をする必要がある場合には、残りの PCR サンプルを保存しておく。アガロースゲルの作成時には、2.5 mm のコームを
使用する。

2.

ヒト GAPDH ポジティブコントロールプライマーから得られる PCR 増幅産物のサイズは 166 bp、同様に EF1α プライマーからは 233 bp、ラットアクチンプライマーでは 223 bp となる。50 bp
または 100 bp のラダーマーカーを使用する。PCR 産物とプライマーやプライマーダイマーが分離されるまで泳動を行う。ゲルを染色して、観察する。

図2: HeLa細胞を１%ホルムアルデヒドで10分間固定し、超音波処理（パルス5回）によって断片化クロマチンを調製した。
ChIPには750,000個または100,000個の細胞から得られたクロマチンを使用して、Negative control IgG抗体とRNA pol II抗体
で免疫沈降を実施した。以上のChIPで得られたDNAをサンプルとし、GPADHポジティブコントロールプライマーを使った®

36回サイクルのPCRで分析した（これらの抗体およびプライマーはChIP-IT Control Kit– Humanに含まれている。マウス用とラット用キットもある）。10 µlのPCR産物を1％ アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後にUVを当て可視化した。GAPDHプライマーとRNA pol II抗体によって単離されたDNAのPCR反応の方が、ネガティブコント
ロールIgGで単離したDNAに比べて、多くのPCR産物を生成した。これらの結果から、RNA pol II抗体で行われたChIPによってGAPDHプロモーターDNAが濃縮され、IgG抗体を使ったChIPでは濃縮が起こらないことが示されている。

-20-

ChIP-IT® Express Enzymatic

F. リアルタイム PCR
免疫沈降したクロマチンを最終的に溶出、脱架橋と Proteinase K 処理したあと、ChIP で得られた DNAを洗浄してから下流のアプリケーションに使用すべきです。リアルタイム PCR の際には、アクティ
ブ・モティフの Chromatin IP DNA Purification Kit（商品コード 58002）を使用することを推奨します。
このキットのカラム精製では液量 50 µl で溶出し、そのうち 2 µl を 1 回の PCR 反応に使用します。
これは 25 回分の PCR 反応に十分な量です。また、市販されている SYBR Green を採用した PCR キ
ットとリアルタイム PCR 用のサーマルサイクラーを使ってください。
A. プライマー設計
・ 準備したプライマーセットを PCR 用のプログラムを使って分析してください（例 UCSC
Genome Browser；http://genome.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）。PCR で実績のあるプライマ
ーセットでも、リアルタイム PCR では使えない可能性があることを注意してください。
・ プライマーダイマーをとる可能性のあるプライマーは避けてください。プライマーダイマー
は SYBR Green に結合するので、正しい定量を妨げる可能性があります。プライマーセットの自己相補性や２次構造を Primer 3（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）
でテストすることができます。
・ 理想的には、リアルタイム PCR には増幅サイズが 50～150 bp になるようにプライマーを設計してください。
・ プライマーの 3’末端の C/G の連続は避けてください。
・ プライマーセット間の Tm の差は 3℃以内にしてください。
B. Fold Enrichment を正確に決めるための標準曲線の生成
注意：このステップは必須ではありませんが、この後行う解析の多くの計算が標準曲線を基にして行われます。
1. プライマーセットの効率をテストするため、そのプライマーセットと濃度既知の Input DNA
で triplicate の qPCR を行って標準曲線を作成する。たとえば、0.005 ng、0.05 ng、0.5 ng、
5 ng、50 ng のような 10 倍の段階希釈系列で 3 から 5 サンプルの qPCR を行う。
2. 標準となる上記の Input DNA の希釈系列サンプルと並列して、ChIP サンプルと IgG サンプルの qPCR を行う。プライマーセットごとに異なる増幅プロファイルを示すので、それぞれのCt 値から線形回帰プロットを作成する。ほとんどのリアルタイム PCR 用のサーマルサイクラ
ーには自動で標準曲線を作る機能があるため、この作業が不要の場合がある。
3. Ct(Threshold Cycle)はシグナルがバックグラウンドの閾値レベルを超えるサイクル数を示している。
4. 希釈系列の DNA 量の対数を横軸に Ct 値を縦軸にして、標準曲線をプロットする。

-21-

ChIP-IT® Express Enzymatic

標準曲線の傾きを使用して、Fold Enrichment を計算する方法が 2 つあります。一つ目の方法でほとんどの状況に対応できますが、二つ目の方法も良く使用されています。
Method 1
この方法では、(a)ChIP および IgG サンプルの DNA 量を求めて、(b)IgG サンプルに対する ChIP サン
プルの Fold Enrichment を計算する。
X = DNA の量
Y = Ct 値
M = 標準曲線の傾き
B = X＝1 の時の Ct 値（y 切片に相当、Figure 3 では 27.46 サイクル）
ChIP Ct = 22.77 サイクル（Figure 3 より）
IgG Ct = 30.22 サイクル（Figure 3 より）(a) Y = M(log X) + B or log(x) = (Y - B) ÷ M(b) Fold Enrichment = ChIP DNA 量 ÷ IgG DNA 量
Figure 3 のデータを使って、以下のように計算を行う。
既知の値である傾き、y 切片、ChIP Ct 値および IgG Ct 値を用いて X を求める。
(a) log(X) = (Y – B) ÷ M
i.e.: log(DNA 量) = (Ct – y 切片)

÷傾きChIP サンプルの場合、log(X) = (22.77 – 27.463) ÷ -3.508 なので X = 21.767 ng
IgG サンプルの場合、log(X) = (30.22 – 27.463) ÷ -3.508 なので X = 0.1637 ng(b) (a)で算出した DNA 量を使って Fold Enrichment を求める
27.767 ng ÷ 0.1637 ng = 133 (Fold Enrichment)
Method 2
2 番目の方法では濃縮率(enrichment)を IgG サンプルと ChIP サンプルの増幅効率の比として産出する。
プライマーの増幅効率は標準曲線の傾きと以下の公式を使って計算することができる。
% Efficiency = [10(-1/slope) - 1] ×100%
Figure 3 では傾き= -3.508 なので、% Efficiency = [10(-1/slope) - 1] ×100% = [10(-1/-3.508) - 1] ×100%% Efficiency = [1.928 - 1] ×100% = 0.928 × 100%
% Efficiency = 92.8%
理想的な効率は 100%±10%（例 90-110%、傾きが-3.32 のとき 100% Efficiency となる）となる。この例においては、プライマーセットの効率は許容範囲内に収まっている。このため、このプライマーの増幅効率を使用して、ChIP サンプルと IgG サンプルの増幅効率を決定することができる。
-22-

ChIP-IT® Express Enzymatic

AE = 増幅効率(amplification efficiency) = 10(-1/slope)
Fd = 希釈係数(dilution factor)（i.e. Fd = 1）(a) %ChIP = AE(Input Ct – ChIP Ct)×(Fd)(100)(b) %IgG = AE(Input Ct – IgG Ct)×(Fd)(100)(c) Fold Enrichment = %ChIP + %IgG
Figure 3 からの数値を使い、以下のように計算を行う。
slope(傾き) = -3.508 (Figure 3 より)
AE = 10(-1/slope) = 10(-1/-3.508) = 1.928
Input Ct = 21.36 サイクル（ChIP サンプルに最も近い Input DNA スタンダードの値を使用する。Figure
3 では、50 ng Input DNA の Ct 値に相当する）
ChIP Ct = 22.77 サイクル(Figure 3 より)
IgG Ct = 30.22 サイクル(Figure 3 より)(a) %ChIP = (1.928(21.36-22.77))×(1)(100)%ChIP = (1.928(-1.41))×(1)(100)%ChIP = 39.62%(b)%IgG = (1.928(21.36-30.22))×(1)(100)%IgG = (1.928(-8.86))×(1)(100)%IgG = 0.3%(c) 計算した増幅効率(AE)を使って Fold Enrichment を求める
39.62% ÷ 0.3% = 132 (Fold Enrichment)-23-

ChIP-IT® Express Enzymatic

Figure 3: Input DNAの10倍希釈系列から作製された標準曲線
GAPDHに対するプライマーを用いてChIPサンプルおよびIgGサンプルと同時に、Input DNAの5つの10倍希釈系列をトリプ
リケートでqPCRを行った。それぞれのInput DNAの量に相当するCt値をプロットし、標準曲線を作成した。その傾きとy切片の値はCt値と併せて、Fold Enrichmentの算出に使用した。

Figure 4: RNA pol II抗体とネガティブコントロールIgGを使ったChIP実験におけるGAPDHプロモーターDNAの濃縮率
HeLa細胞を1%ホルムアルデヒドで10分間固定して、超音波断片化法（パルス5回）によってクロマチンを調製した。750,000個の細胞から調製したクロマチンとネガティブコントロールIgG抗体およびRNA pol II抗体（商品コード39037）を用いて、®
ChIP-IT ExpressでChIPを行った。それぞれのChIP反応物から精製したDNAとGAPDH遺伝子に対するプライマーペア使用

して、リアルタイムPCRを行った（これらの抗体とプライマーセットはChIP-IT® Control Kit – Human （商品コード53010）に含まれている）。これらの結果から、RNA pol II抗体で行われたChIPによってGAPDHプロモーターDNAが濃縮され、IgG抗体を使ったChIPでは濃縮されないことが示されている。

-24-

ChIP-IT® Express Enzymatic

Appendix

補足説明

クロマチン断片化条件の最適化
クロマチン断片化の条件は細胞種、そしてときには細胞の培養条件や特定経路の誘導処理によって大きく変わります。しかし、ある細胞種で断片化条件がいったん最適化されれば、その後は再現性のよい結果が得られるのが普通です。そのため、ある細胞株から初めてクロマチンを調製する際には、以下のプロトコールを用いて最適な断片化条件を決定することをお勧めします。それ以降の実験は最適化された条件のみで行うことになるので、より少ない細胞数で実験を行うことができます。

Section A.クロマチン断片化条件検討のための細胞固定実験を始める前に本キットの実験デザインの章（11ページ参照）を読んでください。～350 µlのクロマチンが調製されますが、そのうち200 µlを断片化効率の解析に使用します。マニュアル通りにPIC
やPMSFをfixation bufferおよびdigestion bufferに加えているのであれば、未使用の～150 µlのクロマチンは断片化条件検討の間は冷凍で保存できます。その後この保存したクロマチンを解凍し、最適化
した条件に従って断片化して、ChIPに使用します。一度最適な断片化条件を確立し、ChIPを実行す
る準備が整うまでは、条件の最適化中にPICやPMSFを使用すると断片化処理やChIPの反応回数が減ってしまうことがあります。
注意：以下で用いるバッファーの多くには PMSF と PIC を加える必要があります。これらの試薬は実験を開始する前に溶解し、使用直前にバッファーに加えてください。断片化条件を決定する目的（断片化したクロマチンを保存しない）にのみ、以下の実験を行うのであれば、 PIC と PMSF を加える
必要はありません。これらの試薬は他の ChIP アッセイで使用するために節約することができます。
1.

細胞を 15 cm ディッシュ 3 枚に 70〜80%程度の細胞密度で培養する。必要に応じて、興味ある経路を活性化するような処理を施す。

2.

細胞を回収する準備ができたら、以下のバッファーを用事調製する。以下で示す体積は15 cmプ
レート１枚に適した量(およそ細胞1.5 x 107 個)になっている。:
a.

Fixation Solution：37%ホルムアルデヒド 0.54ml を細胞培地 20ml に加えてよく混ぜる。室温

に置く。
b.

1X PBS：10X PBS 2.33 ml を dH2O 21 ml に加えてよく混ぜ、氷上に置く。

c.

Glycine Stop-Fix Solution：10X Glycine Buffer 1 ml、10X PBS 1 ml、dH2O 8 ml をよく混ぜ、室温に置く。
d.
3.

Cell Scraping Solution：10X PBS 0.6 ml をdH2O 5.4 mlに加えて混ぜ、氷上に置く。

ディッシュの培地を除き、Fixation Solution 20 ml を各ディッシュに加える。室温で 10 分、シェーカーの上で反応させる。
注意： この標準プロトコールでは、断片化の前のクロマチン固定時間は 10 分。これは標準的な固定時間であるため、抗体とクロマチンの組み合わせによってはより短時間の固定の方がよい場-25-

ChIP-IT® Express Enzymatic

合がある。
4.

Fixation Solution を除き、氷冷した 1X PBS 10 ml を加えて 5 秒間ディッシュを揺らした後、PBS
を除く。

5.

Glycine Stop-Fix Solution 10 ml を加えて固定反応を停止させる。ディッシュを回すようにして全体に液を行き渡らせ、その後室温において 5 分間シェーカー上で振とうする。

6.

Glycine Stop-Fix Solutionを除き、氷冷1X PBS 10 mlを加えて5秒間ディッシュを揺らした後、PBS
を除く。

7.

使用する直前に、30 µlの100 mM PMSFをCell Scraping Solutionに加える。氷冷したCell Scraping
Solution 5 mlを各ディッシュに加えて、細胞をラバーポリスマンで剥がす。ディッシュを傾けて保持し、細胞をはがしてディッシュの下の隅に集め、1 mlピペットを用いて細胞を氷上の15 ml
チューブに移す。

8.

細胞全量を 4℃で 10 分間、2,500 rpm（720RCF）で遠心し、ペレットダウンする。

9.

上清を除く。この時点でペレットを凍結保存することもできる。ペレットを凍結する場合は、100mM PMSF 1 µlとPIC 1 µlを加えて-80℃で保存する。

Section B. 酵素によるクロマチン断片化の条件検討
始めに12ページのクロマチン断片化のヒントを読んでください。～350 µlのクロマチンが調製されますが、そこから200 µlを断片化効率の解析に使用します。
1.

（必要に応じて）ペレットを溶かし、PMSF 5µl と PIC 5µl を加えた氷冷 Lysis Buffer 1 ml を加える。やさしくピペッティングとボルテックスを短時間行って、細胞を懸濁します。氷上で 30 分反応させる。 この間に、添付されている Enzymatic Shearing Cocktail（2X104 U/ml）を 50%グ
リセロール（キットに含まれません）で 100 倍に希釈し、使用濃度の Enzymatic Shearing Cocktail（200 U/ml）を調製する。200 U/ml の溶液は以下のステップ 5 で用いる。この溶液は 4℃で 1～
2 週間安定。
試薬名

1～2反応

3～5反応

6～10反応Stock Enzymatic Shearing Cocktail (2 x 10 U/ml)

0.5 µl

1.0 µl

2.0 µl

50% glycerol

49.5 µl

99 µl

198 µl42.

氷冷したダウンス型ホモジェナイザーに細胞を移し、氷上でペッスルをゆっくり10往復させることにより、核の放出を促す。
細胞溶解の観察：確実に細胞を溶解するため、細胞溶解液10 µlをダウンス型ホモジェナイザーから取り、血球計算盤を使用し、位相差顕微鏡下で核が放出されていることを確認する。細胞溶解ステップの前後で細胞を観察しておくと、細胞と核の違いを視認しやすくなる。無傷の細胞は中心部が暗く（核）、その周りを明るい領域（細胞質）が囲んでいるように見える。溶解した細胞
では、核は非対称の破片に囲まれたドットの様に見える。細胞が溶解していない場合は、さらに10回（または十分溶解するまで）ダウンス型ホモジェナイザーで処理する。

-26-

ChIP-IT® Express Enzymatic

3.

細胞を1.7 mlマイクロチューブに移し、4℃で10分、5,000 rpm（2,400 RCF）で遠心し、核をペレットダウンする。

4.

注意深く上清を取り除いて捨てる。核のペレットを Digestion Buffer 350 ml（PMSF 1.75 µl と PIC
1.75 µl）で懸濁する。これを 37℃で 5 分間インキュベートする。

5.

Digestion Buffer中のクロマチンを4本の新しいマイクロチューブに50 µlずつ分注し、チューブを37℃で2分間反応させる。残りのクロマチンは-80℃で凍結保存する(適切な断片化条件を決定した後、このクロマチン7.5 µlのworking stock Enzymeを使い、Step 6の通りに断片化をすることも
可能)。

6.

以下のように 4 つの反応を行って、酵素を用いた断片化条件を検討する。低めの強度にセットしたボルテックスで反応液を混ぜる。切断効率を上げるために、インキュベーション中は約 2 分ごとにボルテックスで簡単に撹拌する。
a.

クロマチン 50 µl に dH2O 2.5 µl を加え、37℃で 10 分反応させる。

b.

クロマチン 50 µl に使用濃度の酵素 2.5 µl を加え、37℃で 5 分反応させる。

c.

クロマチン 50 µl に使用濃度の酵素 2.5 µl を加え、37℃で 10 分反応させる。

d.

クロマチン 50 µl に使用濃度の酵素 2.5 µl を加え、37℃で 15 分反応させる。

7.

氷冷した 0.5 M EDTA 1 µl を各チューブに加えて反応を停止させ、氷上で 10 分冷却する。

8.

断片化されたクロマチン試料を4℃で10分、15,000 rpm（18,000 RCF）で遠心し、上清を回収する。この断片化クロマチンは-80℃で保存することができる。また、Section Cにただちに進んで脱架橋後クロマチンを精製し、ゲル解析を行うこともでる。

Section C. DNAの洗浄とクロマチン断片化効率の評価
1.

（必要に応じて）断片化されたクロマチン試料 50 µl を溶かす。

2.

各チューブに dH2O 150 µl と 5M NaCl 10 µl を加える。

3.

ウォーターバスかサーマルサイクラーで試料を65℃で4時間からオーバーナイトの範囲で加熱し、脱架橋する。ウォーターバスを用いる場合は蓋が開かないよう注意する。

4.

各試料に RNase A 1 µl を加え、37℃で 15 分間反応させる。

5.

各試料に Proteinase K 10 µl を加え、42℃で 1.5 時間反応させる。
分光光度計で DNA 濃度を測定する場合には、先に DNA を洗浄する必要がある。反応液に多量に含まれているタンパク質がカラムを詰まらせる恐れがあるため、カラム精製は推奨しない。そのため、DNA はフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿で精製する。以下に方法を記載する。
a.

試料に TE 飽和 1:1 phenol/chloroform pH 8 を 200 µl 加え、ボルテックスでよく撹拌した後、微量遠心機を用いて 5 分間、最大速度で遠心する。

b.

上層を新しいチューブに移し、そこに 3 M 酢酸ナトリウム（pH5.2）20 µl と 100%エタノー
ル 500 µl を加える。ボルテックスしてよく撹拌した後、-80℃に少なくとも 1 時間置く。または-20℃で一晩放置することもできる。
-27-

ChIP-IT® Express Enzymaticc.

遠心機を用いて 4℃で 10 分間、最大速度で遠心する。

d.

ペレットに触らないよう注意して、上清を取り除く。

e.

70%エタノール 500 µl をペレットに加え、4℃で 5 分間、最大速度で遠心する。

f.

ペレットに触らないよう注意して、上清を取り除きます。ペレットを乾燥させる。

g.

ペレットを dH2O 30 µl で溶解し、分光光度計を用いて 260 nm における吸光度を測定し、DNA濃度を決定する（1.0 A260 = 50 µg/ml）。

この DNA 濃度から、断片化クロマチンサンプルの濃度を計算することができる。以下は任意ではあるが、実施することを推奨する。複数のクロマチンサンプル（処理群と非処理群等）を使って ChIP を実施する場合、DNA 濃度をもとにして各 ChIP 反応に供与する初期 DNA 量（7~25 µgを推奨）を等しく調製することができる。これにより、各 IP 反応に等量のクロマチンが使用されていることを保証し、各サンプル間の相対的な変化が比較可能になる。
6.

ロード量が多すぎたり少なすぎたりすることを避けるため、二つの異なる量の各断片化試料を、ゲルにロードすることを推奨する。試料 16 µl に 6X Loading Buffer 4 µl を加え、各試料 5 µl および 10 µl を 1% TAE アガロースゲルにロードする。100 V で 45 分から 1 時間、ゲルの下端 3/4 にローディングダイが到達するまで泳動する。

7.

酵素による断片化の最適条件では、以下図 5 のレーン 4 のように 200〜1500 bp のラダー状のス
メアとなる。

8.

PICとPMSFを最適化実験中にも使用していた場合、Step B-5で冷凍保存した残りのクロマチンを最適な条件に従って断片化できる。切断時の溶液量は、Section BのStep 6に示された量の比例計算で算出します。例えば、150 µlの未切断クロマチンには7.5 µlのworking stock Enzymeが必要となる。上記で定めた反応時間に従って、37℃でインキュベートする。氷冷した0.5 M EDTAを3 µlで反応を停止する。10分間冷蔵した後、15,000 rpm (18,000 RCF)で4℃10分間遠心する。回収した上清は直ちにChIP反応に使用するか、－80℃で1年程度保存することも可能。
Figure 5: 酵素処理によるクロマチン断片化 (ChIP-IT® Express Enzymatic)
HeLa 細胞を 1% ホルムアルデヒドを用いて 10 分間固定し、クロマチンを得た後、キットプロトコールに従ってクロマチンを断片化した。断片化したクロマチンおよび非断片化クロマチン試料は脱架橋、Proteinase K 処理、フェノール／クロロホル
ム抽出、エタノール沈殿後、1%アガロースゲルで電気泳動した。ChIP アッセイに最適なのは、200 -1,500 bp に断片化されたクロマチンである。
レーン 1: 100 -1,000bp DNA ラダーマーカー
レーン 2: 断片化していない HeLa 細胞の DNA
レーン 3 HeLa 細胞の DNA を 5 分間の酵素処理で断片化（断片化不足）
レーン 4: HeLa 細胞の DNA を 10 分間の酵素処理で断片化（最適）
レーン 5: HeLa 細胞の DNA を 15 分間の酵素処理で断片化（過剰な断片化）-28-

ChIP-IT® Express Enzymatic

Section D. クロマチン調製時のスケールアップ／ダウン
アクティブ・モティフ社の標準的なクロマチン調製プロトコールでは 15 cm ディッシュ 1 枚分（細胞約 1.5×107 個）を使用して、6 回分の ChIP に十分なクロマチンが得られます。弊社のプロトコールを元にバッファーのスケールを変更することで、異なる細胞数で実験を行うこともできます。以下の説明に従って、使用する細胞数に適したバッファー量で実験を行ってください。
・ Lysis buffer 量が 500 µl 以下または 2 ml 以上になるサンプルの場合は、細胞溶解やホモジェナイズのステップに支障があります。そのままの量での実験は推奨されません。
・ 複数のサンプル間で ChIP の結果を比較しようとしている場合には、それらのサンプルに同じ処理を行ってください。誘導／非誘導にかかわらず、同じ培養ディッシュで同じ密度になるまで細胞を培養します。その後、等量のバッファーを使い、等しい断片化条件で処理します。こうすることで、調製したクロマチンは、細胞数やゲノムサンプル量で同等であり、DNA の切断効率などの点でも同じであるという確証が得られます。クロマチン調製後に DNA を定量し（上記の DNA Clean Up
プロトコールに従う）、個々の ChIP アッセイに同じ質量のクロマチンを使用します。
・ ヒト細胞（2n）には6.6 pgのDNAが含まれています。この値は、実験サンプルの細胞数が既知の場
合、クロマチン調製時のDNA量の見積もりに使うことができます。アクティブ・モティフでは、クロマチン断片化におけるDNAの収量をおよそ60-70％と見積もっています。また、この値は細胞や組織の種類に依存しています。
1 well of a
24- well plate

10 c m plate

15 c m plate3 x 15 c m plates

細胞数1300000.66 x 107

1.5 x 107

4.5 x 107

（組織の質量）(-)（-）（～75 mg)(～225 mg)

Fixation Solution

2ml

10 ml

20 ml

60ml (20 ml/plate)

Glycine Stop-Fix

1ml

5 ml

10 ml

30ml (10 ml/plate)

1 X PBS

2×1ml

2×5 ml2×10 ml

2×30ml (2×10 ml/plate)

Cell Scraping

500μl +

1 ml +

5 ml +

Solution + PMSF

2.5μl PMSF

5μl PMSF

30μl PMSF

Lysis Buffer +200μl + 1μl PIC +500μl + 2.5μl PIC+

1ml + 5μl PIC+

3 ml+15μl PIC+

PIC + PMSF

1μl PMSF

2.5μl PMSF

5μl PMSF

15μl PMSF

50μl +

175μl +

350μl +

1000μl +0.25μl PIC

0.875μl PIC

1.75μl PIC

5μl PIC

0.25μl PMSF

0.875μl PMSF

1.75μl PMSF

5μl PMSF

2.5μl

8μl

17μl

50μl

1μl

3.5μl

7μl

20μl

Digestion Buffer +PIC + PMSF
Enzymatic Shearing
Cocktail, diluted
0.5 M EDTA

-29-

15ml +90μl PMSF
(5ml +30μl PMSF)
Pool the 3 plates

ChIP-IT® Express Enzymatic

Section E. 磁気ビーズと磁石（マグネットバー）の使用法
・ 磁石は付属のチューブ内に保管してください。
・ 金属の物体や表面の近くで作業する場合は注意してください。固定されていない磁石は、非常に速い速度で移動して、近くの金属面に張り付くことがあります。これが原因で、磁石が壊れることがあります。
・ 添付の Mini Glue Dot を用いて磁石を空のピペットチップケースに固定し、PCR ストリップチューブやマイクロチューブ用の磁石スタンドを作製してください。
・ 磁石が平らな金属面に張り付いた場合は、磁石をずらして金属表面の端から外してください。磁石の一端を金属から引きはがそうとすると磁石が壊れることがあります。
注意：付属のネオジム棒磁石は非常に強力ですが、不適切に取り扱うと簡単に壊れます。
8 穴 PCR ストリップ用磁石スタンドの作製：
注意：標準的な 96 穴サーマルサイクラーとともに使用するチューブとしては、8 穴の PCR ストリップ（例:Thermo Fisher の AB-0451）をお勧めします。
1.

空のチップケース（200 µl チップ）の穴に PCR ストリップチューブを置き、チューブに直に接するように磁石を置く。このようにして、Glue Dot を用いて磁石をチップケースに固定する際の磁石の位置決めを行う。2 つの Glue Dot の片側のテープをはがし、次ページの写真のように Glue
Dot を磁石に貼りつける（粘着面を磁石側にする）。

2.

Glue Dot のもう一方のテープをはがし、磁石が PCR チューブに接するように磁石をチップケー
スに固定する。これで磁石スタンドが完成します。
注意: 磁石スタンドの操作に慣れてから、最初の実験を行ってください。8 穴 PCR ストリップチ
ューブの 1 つに ChIP Buffer 1 100 µl と磁気ビーズ 5 µl を加え、これを組み立てた磁石スタンドとともに使用して、ビーズと磁石の操作に慣れてください。チューブが磁石のすぐ横に置かれているとビーズの再懸濁が困難なので、懸濁を行う際にはチューブを磁石スタンドから離すことをお勧めします。

洗浄は下記のように行います：a.

下の写真のように、磁石に接するようにチューブをスタンドに置き、ビーズをチューブの側面に
集める。
-30-

ChIP-IT® Express Enzymaticb.

200 µl のピペットマンか 200 µl の 8 チャンネルペピットマンを用いて上清を除く。

c.

ストリップチューブを磁石に隣接していない位置にずらす。

d.

Wash Buffer を加え、ピペッティングによりビーズを充分に懸濁する。ピペッティングの後、ビーズがピペットチップの中になるべく残らないようにする。

e.

a から d のステップを繰り返し、任意の回数の洗浄を行う。

8 穴 PCR ストリップチューブの遠心：
8 穴 PCR ストリップチューブを利用する場合、キャップの内側の液体とビーズをチューブの底に集めるために、遠心が必要になります。これは、マイクロタイタープレート用のアダプターをセットした遠心機を用いて行います。標準的な 96 穴プレートをアダプター上に置き、そこにチューブをセッ
トしてください。ローターの反対側の 96 穴プレートアダプターにも適切な重さのマイクロタイター
プレートとチューブをセットし、バランスをとります。プレートを軽く遠心し、ローターの速度が1,000 g に達したら止めます。
1.7 ml マイクロチューブ用磁石スタンドの作製：
1.

2 つの Glue Dot の片側のテープをはがす。

2.

2 本の 1.7 ml マイクロチューブを空のチップケース（1000 µl）の穴に置き、チューブにじかに接するように磁石を置く。このようにして、Glue Dot を用いて磁石をチップケースに固定する際の磁石の位置決めを行う。

3.

前ページ写真のように Glue Dot を磁石に貼り付ける（はがした面が磁石に接するようにする）。

4.

Glue Dot のもう一方のテープをはがし、磁石をチップケースに固定する。これで磁石スタンドが完成する。
注意：一般的な市販の磁石スタンドと比較すると、このチューブスタンドでは 1.7 ml マイクロチ-31-

ChIP-IT® Express Enzymatic

ューブがしっかりとは保持されませんが、以下の洗浄プロトコールに従って操作すれば問題はありません。チューブは一度に 1 本ずつ取り扱い、磁石に近付ける時以外はチューブを標準的なラックに置いてください。
洗浄は 1 本ずつ、以下の説明に従って行ってください：1.

チューブを標準的な 1.7ml マイクロチューブラックに置き、蓋を開ける。

2.

組み立てた磁石スタンドに、蓋の開いたチューブを置く。チューブの底を磁石に対して下の写真のように近づけてからチューブをゆっくり穴に差すことで、ビーズをより短時間で集めることができる。この操作によってチューブの側面にビーズが集められる。

3.

ビーズが完全に集まったら、1,000 µl のピペットマンを用いて上清を除去する。チューブをラックに挿したままでも、取り出した状態でもバッファーを取り除くことができる。磁石からチューブを離しても、ビーズはチューブの側面に保持される。

4.

チューブを標準的なマイクロチューブラックに戻し、Wash Buffer 800 µl を加え、ピペッティン
グによりビーズを充分に懸濁する。

5.

2 から 4 のステップを繰り返し、任意の回数の洗浄を行う。最後の洗浄の後、残った Wash Bufferを 200 µl のピペットマンで取り除く。

-32-

ChIP-IT® Express Enzymatic

Section F. トラブルシューティング
問題/疑問

推奨

プロトコールはどこで中断できるか？

次の4つのステップで中断できます。以下の温度でサンプルを保存してください。
・サンプルをホルムアルデヒド固定して遠心し、細胞ペレット化した時点。サンプル保存
温度：-80℃
・クロマチン断片化後、サンプル保存温度：-80℃
・脱架橋後、サンプル保存温度：-20℃
・DNA洗浄後、サンプル保存温度：-20℃
核が放出されていない可能性があります。酵素による断片化時には、ダウンス型ホモ
ジェナイザーの使用は非常に重要です（超音波による断片化の場合にも強く推奨されます）。隙間の狭いダウンス型ホモジェナイザーを使用してください。プロトコールに記載したように、破砕後は細胞の溶解を顕微鏡を用いて確認してください。一般的に、細胞が溶解すればするほど、断片化クロマチンの収量は多くなります。

断片化クロマチンの収量 固定時間を短縮してください。固定しすぎた細胞は細胞破砕や断片化が難しくなることがあります。過剰な固定処理によって、架橋による巨大な凝集物を形成されるおそれがが悪いあります。これを効率的な断片化に悪影響を及ぼします。ホルムアルデヒド固定ステップ
におけるインキュベート時間を5分に短縮してください。
Fixation Solution調製時に新鮮なホルムアルデヒドを使用してください。
バッファー量が、サンプルサイズに比例して適切にスケールアップ／ダウンされていな
い。Appendix-Section Dの表に従って、クロマチン断片化時の反応スケールを調節してください。
多量のクロマチンを含むサンプルの場合には、脱架橋時間を延長する必要があります（4時間からオーバーナイト）。
精製時にDNAを失っています。フェノールは必ずpH 8.0のTEバッファーで飽和させてお電気泳動でクロマチンの きます。pHの低い溶液ではDNAが分解されてしまいます。断片化処理後のサンプルに断片化効率が確認しにく は多量のタンパク質が含まれており、これがカラムに詰まる恐れがあるため、DNAのカい
ラム精製は推奨しません。
断片化後の分子量が大きすぎます。酵素切断時間を延長して、再度断片化を行ってください。また、断片化処理中は必ず2分おきに、サンプルをボルテックスで撹拌してください。
～100-200bpに１つバンドが見えるが、その見え方は切断時間の異なるレーンでも変化しない。細胞の溶解が不完全だったため、酵素がクロマチンを十分に分解できなかったことを示唆しています。マニュアルに従って、サンプルをダウンス型ホモジェナイザーで処理して下さい。酵素切断時間を増加しても、この問題は解決されないでしょう。
DNAが存在していない。未切断DNAサンプルのレーンでは普通の現象です。この場合、非常に広範囲にDNAサイズが分散しているため、DNAが存在していてもゲル上では確認できません。切断済みサンプルのレーンでDNAが見えない場合は、サンプルが非常に少ない（ゲルで検出するのに不十分な量）か、精製の過程でDNAが失われたことを示唆します。
電気泳動をしても、ラダー 低分子量のスメアがみられる。切断時間が長すぎるか、Enzymatic Shearing Cocktail
状のバンドを見ることがの希釈が適切でないと考えられます。
できない
スメアがウェルから続いている。脱架橋が不十分です。タンパク質とDNAが依然として架橋されており、DNAがゲルの中を適切に泳動されなかったため、多くのDNAがウェルに留まったと考えれます。また、精製過程でDNAが失われてしまった可能性もあります。
ゲルの下部に広いバンドやスメアが見られる。キット付属のRNaseを使用したRNAの分解が不十分です。
特異的なバンドが見られず、切断時間に依存してサイズが小さくなるスメアが見られる。
これはDNAの分解を示唆しています。（特に、組織サンプルの場合）サンプル処理をもっと迅速に行います。マニュアルの指示に従って、サンプルが氷上に置かれていることと適正な量のproteinase inhibitorが添加されていることを確認してください。

-33-

ChIP-IT® Express Enzymatic
問題/疑問

推奨

細胞が溶解しない細胞種によっては、溶解と酵素による断片化に耐性があります。その場合には、超音波による断片化法に切り替えてください。

これは推奨できません。サンプルを小スケールのChIP反応（それぞれ200 ul）分割して、大容量のクロマチンをChIP後のサンプルをひとつにまとめる方が、大スケールのChIP反応を1回実施するより使ってChIPを実施したい
効率が良いです。捕捉効率が悪いため、単一の大スケールのChIPは避けてください。
クロマチンが少なすぎます。一般的に通常のChIP（ヒストンのように非常に豊富に存在するものがターゲット）には、7～10 ugのクロマチンを使用することを推奨します。中程度の量がある転写因子には、7～25 ugのクロマチンが推奨されます。非常に量が少ない
転写因子には、最大量である50 ugのクロマチンを各IP反応に供与することが推奨されます。小スケールのChIPの場合、クロマチンの量が1 ug程度の量になることがあります。この際、クロマチン量は転写因子の存在量や抗体の特異性に応じて、適切に調整する必要があります。適量のクロマチンがサンプルごとに確実に供与され、各ChIP反応に等量のクロマチンを使用するために、断片化したクロマチンサンプルの濃度は忘れずに測定するようにしてください。
ChIP実験で使用できない抗体である。抗体が固定されたタンパク質を効率的に認識していません。この理由は固定によってエピトープが破壊されているためか、または、より大きな複合体となりエピトープが覆い隠されているためと考えられます。CｈIPで使用可
能な抗体を補助するために、同じ生物種由来のRNA pol II抗体のようなポジティブコント
ロール抗体とネガティブコントロール用IgG抗体を使用すると非常に便利です。また、
PCRのタイプに応じてワークすることを確認したプライマーを使用することも有効です。

ターゲットに対する抗体を使用しても濃縮がよくな 抗体の特異性が低い。ChIP反応時のインキュベーション時間を増やします。回転型ローテーターで4℃オーバーナイトでインキュベーションしてください。
い／濃縮がされない
protein Gに対する抗体の特異性が弱い。モノクローナル抗体ごとに、protein Gに対する結合の特異性が違っており、それらはpHに依存しています。適切なpHはイムノグロブリ
ンのタイプによって異なります。結合の特性が弱～中程度の抗体の場合には、protein
Gによる捕捉効率を、アクティブ・モティフ社のBridging Antibody （カタログ番号53017）を使用することによって、劇的に改善することが可能です。この抗体はウサギ由来の抗マウス抗体で、マウス免疫グロブリンの全サブクラスを認識します。使用するマウスIgGの結合特異性がprotein AやGに対して弱い／中程度の場合には、Bridging Antibodyを使うことで、バックグラウンドの上昇を抑えつつ、ビーズによる抗体の捕捉効率を改善することが期待できます。
PCRに問題があります。リアルタイムPCRに使用するDNAは、増幅の前に精製しなけ
ればなりません。
プライマーに問題があります。プライマーの種特異性を確認してください。場合によっては、プライマーを再設計する必要があるかもしれません。エンドポイントPCRで使用できるプライマーがリアルタイムPCRで使用できるとは限りません。
もっと多くのPCR産物をロードしてください。また、ウェルのサイズを小さくしたアガロース
正しいサイズのPCR産物 ゲルを使用してください。PCR反応は対数増幅期に停止させているため、PCR産物がが見られるが、収量がと 最大限に増幅される通常のPCRに比べ、PCR産物の収量が少なくなることに注意してても少ない（薄く見える） ください。PCRサイクル数を増やすことも可能です。
注意：正しいサイズのPCR産物の下部にプライマー2量体が見えることがあります。
PCRの前に、マニュアルに記載してある通りにInput DNAを10倍希釈してください。
Input DNAサンプルにおいて、PCR産物のバンド Protease Kの活性が、完全に阻害されていないかもしれません。Protease K Stopがない（しかし、ChIPサン Solutionを30分間温めて室温に戻し、さらに短くボルテックスして完全に溶解させます。
プルのPCRでは正しいサ その後、プロトコールに従って、2 ulを加えインキュベートしてください。
イズのPCR産物がある）
PCRの前に、DNA精製用のカラムでInput DNAを精製することで改善されることがありま
す。

-34-

ChIP-IT® Express Enzymatic
問題/疑問

推奨

ChIPサンプルにおいて、 ChIP実験に使用するクロマチンの量または抗体の量を増やしてください、またはその両PCR産物が見られない 方を増やしてください。
（しかし、Input DNAには正しいサイズの増幅産物
違う抗体を使ってください。
が見られる）
リアルタイムPCRで、
PCR産物が見られない

リアルタイムPCRを実施する前に、DNAを精製してください。リアルタイムPCRの前には、アクティブ・モティフ社のChromatin IP DNA Purification Kit（カタログ番号58002）の使用を推奨します。そのカラムを使用した場合、溶出量は50 ulとなります。そこから2 ulを各PCR反応に使用します。これは、25回のPCR反応に相当する量となります。

バックグラウンドが高い

クロマチンが十分に切断されていません。DNA断片化時には、隣接するクロマチン配列に由来したバックグラウンドを排除するのに十分な短さにまでDNAを切断すべきですが、同時にターゲットとする増幅部位がそのまま維持される長さを確保する必要があります。断片化サイズは200～1,500 bpを推奨します。DNA断片が大きすぎる場合には、バックグラウンドが大きくなります。酵素切断の時間を増加することを考えてください。断片化効率を調べるために、断片のサイズをアガロースゲルで調べてください。
抗体の問題です。ChIP反応において、クロマチン量に対して抗体が多すぎるのかもれしません。過剰量の抗体を使用すると、非特異的結合が多くなることにより、バックグラウ
ンドが高くなります。
テンプレートDNAが過剰です。PCR反応での、DNA量を減らしてください。
洗浄を増やしてください。多くの場合、このマニュアルの洗浄プロトコールで問題ありま
せんが、バックグランドが高い、またはより強い条件で洗浄を行う場合には、いくつかの方法があります。
1．洗浄ステップで、ChIP Buffer 1と（または）ChIP Buffer 2を加えた後、バッファーを取り除く前に数分間サンプルを優しく撹拌する。
2．洗浄回数を増やす。このキットには、1サンプルあたり、2回分追加洗浄を行うのに十分なChIP Buffer 1が含まれている。ChIP Buffer 2は1回分の追加洗浄ができる液量を提供している。
3．高塩濃度のバッファーを使って、2回追加洗浄を行う。高塩濃度のバッファー組成は、
20 mM Tris-Cl、1 mM EDTA、0.1%SDS、1% Triton X-100、500 mM NaCl(pH 7.4)
（キットには含まれない）。この追加洗浄は、ChIP Buffer 1での洗浄後に実施する。その後は、プロトコールに従ってChIP Buffer 2で洗浄を行う。
磁気ビーズへの非特異的吸着をブロックする。キット付属の磁気ビーズはほとんどの
ChIP実験の場合には、そのまま使用できるようになっています。ChIP済みDNAをクローニングする場合や他のアプリケーションにおいて特別なブロッキングが必要とされる抗体を使用する場合のような、非特異的結合に対して非常に敏感なアプリケーションの際においては、ブロッキング試薬をChIP反応液に加える必要があるかもしれません。
ブロッキング試薬の組成： 2.5 ug/ul BSA（Sigma； カタログ番号4503）に加え、1.25
ug/ul tRNA（Sigma；カタログ番号R3629）または2.5 ug/ul Salmon sperm DNA（Sigma；カタログ番号A-7888)のどちらかを直接ChIP反応液に加えます。表示している
濃度はそれぞれの終濃度です。これらの量は初期検討の値として最適ですが、必要であれば量を増やすこともできます。

-35-

ChIP-IT® Express Enzymatic

Section G. 関連製品リスト
包装
25 rxns
25 rxns
10 rxns
10 rxns
16 rxns
10 rxns
10 libraries
16 rxns
5 rxns96 rxns
25 rxns
25 rxns
50 rxns
110 V
1 platform
25 rxns
30 rxns
25 tubes
5 rxns
5 rxns
5 rxns
5 rxns
5 rxns
5 rxns
10 rxns
10 rxns
10 rxns
10 rxns
500 µg
1 ml
15 ml

ChIP-IT Kits
ChIP-IT Express
ChIP-IT Express Enzymatic
ChIP-IT Express Shearing Kit
ChIP-IT Express Enzymatic Shearing Kit
ChIP-IT High Sensitivity
ChIP-IT qPCR Analysis Kit
ChIP-IT ChIP-Seq
ChIP-IT FFPE
ChIP-IT FFPE Chromatin Preparation Kit
ChIP-IT Express HT
Re-ChIP-IT
RNA ChIP-IT
Chromatin IP DNA Purification Kit
EpiShear Probe Sonicator
EpiShear Cooled Sonication Platform, 1.5 ml
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads
Protein G Agarose Columns
Siliconized Tubes, 1.7 ml
ChIP-IT Control qPCR Kit - Human
ChIP-IT Control qPCR Kit - Mouse
ChIP-IT Control qPCR Kit - Rat
ChIP-IT Control Kit - Human
ChIP-IT Control Kit - Mouse
ChIP-IT Control Kit - Rat
Ready-to-ChIP HeLa Chromatin
Ready-to-ChIP Hep G2 Chromatin
Ready-to-ChIP K-562 Chromatin
Ready-to-ChIP NIH/3T3 Chromatin
Bridging Antibody for Mouse IgG
Dounce Homogenizer
Dounce Homogenizer

商品コード
53008
53009
53032
53035
53040
53029
53041
53045
53030
53018
53016
53024
58002
53051
53080
53014
53039
53036
53026
53027
53028
53010
53011
53012
53015
53019
53020
53021
53017
40401
40415

Recombinant Methylated, Acetylated and Phosphorylated Histone Proteins
最新のリコンビナントヒストン製品リストはウェブサイトをご覧ください（ www.activemotif.com/chipabs ）Whole Genome Amplification
GenoMatrix Whole Genome Amplification Kit

包装
1 kit

商品コード
58001

Modified Histones Assays
Modified Histone Peptide Array

包装
1 array

商品コード
13001

-36-

ChIP-IT® Express Enzymatic
Histone ELISAsHistone H3 monomethyl Lys4 ELISA
Histone H3 dimethyl Lys4 ELISA
Histone H3 trimethyl Lys4 ELISA
Histone H3 acetyl Lys9 ELISA
Histone H3 dimethyl Lys9 ELISA
Histone H3 trimethyl Lys9 ELISA
Histone H3 monomethyl Lys27 ELISA
Histone H3 trimethyl Lys27 ELISA
Histone H3 acetyl Lys14 ELISA
Histone H3 acetyl Lys27 ELISA
Histone H3 phospho Ser10 ELISA
Hisotne H3 phospho Ser28 ELISA
Total Histone H3 ELISA

包装
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns

商品コード
53101
53112
53113
53113
53108
53109
53104
53106
53115
53116
53111
53100
53110

Histone Acetyltransferase and Deacetylase Activity
HAT Assay Kit (Fluorescent)
Recombinat p300 protein, catalytic domain
Recombinat GCN5 protein, active
HDAC Assay Kit (Fluorescent)HDAC Assay Kit (Colorimetric)

包装
1 x 96 rxns
5 µg
5 µg
1 x 96 rxns
1 x 96 rxns

商品コード
56100
31205
31204
56200
56210

本プロトコールおよび製品に関するご意見やお問合せは下記までお願い致します。

アクティブ・モティフ株式会社〒162-0824 東京都新宿区揚場町 2-21
Tel： 03-5225-3638 Fax： 03-5261-8733
e-mail： japantech@activemotif.com
http://www.activemotif.jp-37-