ごあいさつ
この度コスメトロジー研究振興財団として、23 冊目の研究報告書を刊行いたしました。
設立以来 25 年に亘って、化粧品科学及び関連分野に貢献する研究テーマに対し助成活動を滞りなく継続できたことは、多くの関係者の皆様のご理解ご協力によるものと、改めて感謝申し上げる次第でございます。
当財団の助成領域につきましては、医学、化学、薬学、生理学、心理学、文学、社会学など多岐に渡る分野の研究者のお力添えにより、コスメトロジーという分
野が発展してきたといっても過言ではありません。助成させていただいた研究テーマは、新素材設計、ライフサイエンス、化粧心理、文化論など多種多様であり、化粧品学の発展に有用な貢献ができたと考えております。また当財団の活動がその社会貢献の一助になっていることを幸いに思っております。
今回の報告書では、平成 24 ～ 2 5 年度に助成を受けられた方の中から 31 名の方の研究成果を掲載いたしました。
素材、物性に関する分野では、製剤化技術に関わる研究、天然物の新たな有用性に関するテーマが顕著であったと思われます。
生体作用、安全性に関する分野では、皮膚の構成成分に関する基礎的な研究が中心でしたが、昨今再生医療の要として注目されている iPS 技術を用いた研究が目を引きました。
精神、文化に関する分野の研究につきましては、香粧品がもたらす心理的、脳科学的な影響に関する研究であり、大変興味深い内容であったと考えています。
当財団は分野の枠や研究機関の属性などにとらわれることなく、化粧品学の発展のために、優れた研究に対して積極的に助成を行っていきたいと考えております。今後とも、皆さまのますますのご協力とご支援をお願い申し上げます。

平成 27 年 7 月
公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団
理事長

小林

保清

目

次

■ごあいさつ
■研究報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・ 深海生物由来コラーゲンを活用した化粧品基材への応用研究……………………………………………… 4
高知大学農学部 足 立 亨 介

・ 金属イオン配位子修飾ヒアルロン酸の開発と組織浸透性に関する研究 …………………………………… 8
東京大学大学院医学系研究科疾患生命工学センター 伊 藤 大 知・皮膚組織再生を促進するリン酸カルシウム真球粒子の創製 ……………………………………………… 14
国立研究開発法人産業技術総合研究所ナノ材料研究部門 大矢根 綾 子、中 村 真 紀
・球状シリカマイクロ粒子とスメクタイト微結晶の複合技術開発 …………………………………………… 20
信州大学工学部物質工学科 岡 田 友 彦
・ 新規リン酸亜鉛白色顔料の粒子サイズ制御 …………………………………………………………………… 26
京都府立大学大学院生命環境科学研究科 斧 田 宏 明・ 紫外線カットマイクロカプセルの作製 ……………………………………………………………………… 30
横浜国立大学大学院工学研究院 金 井 俊 光・ 加熱加水分解法を用いた紫外線吸収能を有するカルシウムヒドロキシアパタイト粒子の新規調製法の開発とそのキャラクタリゼイション …………………………………………………………… 34
大阪教育大学教育学部 神 鳥 和 彦
・ 両生類皮膚由来機能性生体分子の網羅的探索 ……………………………………………………………… 41
国立研究開発法人産業技術総合研究所健康工学研究部門 茂 里 康
・角度依存性のない構造発色性顔料の調製……………………………………………………………………… 48
名古屋大学大学院工学研究科 竹 岡 敬 和・膜透過性ナノ集合体を封入した固体エマルションの開発 …………………………………………………… 55
山口大学大学院理工学研究科 通 阪 栄 一・神経細胞が分泌する酸化ストレスに対する保護因子の同定 ………………………………………………… 61
同志社大学生命医科学研究科 野 口 範 子、斎 藤 芳 郎
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・ 白髪予防・治療剤の選別に有効な加齢性白髪を自然発症するモデル動物の開発 ………………………… 66
名古屋大学大学院医学系研究科環境労働衛生学 加 藤 昌 志・ 皮膚細胞は独自に女性ホルモンを合成し、それが皮膚細胞の活動を制御している ……………………… 71
東京大学大学院総合文化研究科 川 戸 佳
・海洋性カロテノイドの酸化ストレス応答シグナル Nrf2-ARE シグナルを介した
HO-1 活性化による酸化ストレス軽減 ………………………………………………………………………… 78
国立沖縄工業高等専門学校生物資源工学科 平 良 淳 誠
・ 化粧品成分の安全性評価：CYP 誘導性と肝毒性の in vitro 評価系の構築 ………………………………… 83
鳥取大学染色体工学研究センター染色体医療学研究部門 多 田 政 子
・ 炎症性皮膚疾患におけるアクアポリン９の機能解明 ……………………………………………………… 88
京都大学大学院医学研究科次世代免疫制御を目指す創薬医学融合拠点 竹 馬 真理子

・ IL-33 デコイ受容体による皮膚炎症の制御 …………………………………………………………………… 93
自治医科大学医学部生化学講座病態生化学部門 早 川 盛 禎・ 小胞体における蛋白質の酸化的折畳み異常によるコラーゲン形成障害機構の解明 …………………… 98
山形大学大学院医学系研究科生化学・分子生物学 藤 井 順 逸・ iPS 細胞の造血幹細胞への分化能を応用した先天性皮膚疾患の治療 …………………………………… 105
北海道大学病院皮膚科 藤 田 靖 幸・ 新規な生体親和性化粧品素材ホスファチジル−パンテノールの抗炎症作用と分子機構の解明 ……… 111
北海道大学大学院水産科学研究院 細 川 雅 史
・ 新規経皮導入法による美白ペプチドを用いた高浸透化粧品の開発 ……………………………………… 117
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科細胞生理学 道 上 宏 之
・ 化粧品用無機ナノ材料の遺伝毒性作用の解明 ……………………………………………………………… 123
大阪府立大学理学系研究科生物科学専攻分子細胞遺伝学分野 八 木 孝 司
・ サイトカインによる接触性皮膚炎誘導の制御に関する基盤研究 ………………………………………… 130
東京医科大学医学総合研究所免疫制御研究部門 善 本 隆 之・ クラスリン集合因子 CALM 欠損マウスに見られる、毛や組織の色の薄さの解析
─細胞内物資輸送と体色との関連を探る─ ………………………………………………………………… 134
奈良女子大学大学院人間文化研究科個体機能学講座 渡 邊 利 雄
Ⅲ．精神、文化に関する分野
・ グローバル時代のハラールと化粧に対するモロッコの人々の意識と行動─日常生活における宗教規範と美の実践─ ………………………………………………………………… 140
松蔭大学観光メディア文化学部 川 添 裕 子
・ 嗅覚（芳香）刺激量が与える自律神経機能の経時的変化 …………………………………………………… 148
慶應義塾大学医学部耳鼻咽喉科学教室 神 崎 晶・ 心理・社会的発達と化粧行為の関連の検討──ライフ・ステージによる化粧意識の相違と老年期の化粧 …………………………………………… 155
立命館大学立命館グローバル・イノベーション研究機構 木 戸 彩 恵
・ 抗がん剤による皮膚障害とスキンケアに関する研究 ……………………………………………………… 162
京都薬科大学 臨床薬学教育研究センター 中 村 暢 彦
・ 統計的学習による「似合う」への計算論的アプローチの確立
─個人に似合う髪型の自動提示技術の開発を通して─ …………………………………………………… 167
山梨大学大学院医学工学総合研究部 茅 暁 陽・ 19 ～ 20 世紀にわが国で使用された含鉛おしろいに関する研究 ………………………………………… 173
東京大学大学院新領域創成科学研究科環境システム学専攻 吉 永 淳■国際交流報告
・自己顔に対する意識に関する研究 ─日韓における違い─ ……………………………………………… 179
カリフォルニア矯正歯科 三軒茶屋（元：北海道大学病院咬合系歯科矯正歯科） 日下部 豊 寿■記念講演・第 25 回表彰・贈呈式記念講演「〈香り〉はなぜ脳に効くのか 〜認知症の予防・改善について〜」 ……………………………………… 189
昭和大学医学部教授 塩 田 清 二

■コスメトロジー研究雑感■付……………………………………………………………………………………………… 199

録

事業報告書

……………………………………………………………………………………………………………… 217

平成 26 年度

研究助成を受けられた方々

役員一覧………………………………………………………………………… 219………………………………………………………………………………………………………………… 221

●Ⅰ．素材、物性に関する分野
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
Ⅲ．精神、文化に関する分野●

深海生物由来コラーゲンを活用した化粧品基材への応用研究

高知大学農学部

足立亨介

A partial length cDNA of the Type I procollagen a1 helical was determined using cDNA from muscle of deep see fish
Coryphaenoides yaquinae. The helical region was composed of Gly-X-Y repeats; the conserved triplets within the same
molecule in higher vertebrates. The number Ser residues in the helix were quite high compared to other vertebrates including
fish.
The amino acid composition of purified Type I collagen from Coryphaenoides acrolepis shows also high contents of Ser
residues among other fishes. These facts indicates that Ser is a key amino acid in Type I collagen in deep sea adaptation suchas high pressure, low temperature and etc.

緒が知られる 1）。コラーゲンが化粧品の材料として用いられ言る理由の一つとして、その「保水効果」が挙げられるが、コラーゲンは 40 年以上前から化粧品の配合材料として用いられているコスメ業界には非常になじみ深い成分であ

これはこの水分子を繊維中に封じ込めたハイドロゲルの効
果を利用したものである 1）。

る 1）。本分子は、3 つのサブユニット遺伝子群がトリプル一方で我々は深海に生息する魚類であるシンカイヨロイ

へリックスを構成している。哺乳類、鳥類、爬虫類およびダラ Coryphaenoides yaquinae（生息水深約 6000m）および両生類では 2 本の a1 鎖と 1 本の a2 鎖が（a1）2 a2 の形でイバラヒゲ Coryphaenoides acrolepis（ 生息水深約 1000m）

1）

存在しているが 、魚類ではこの 3 つが全て異なった鎖2）のコラーゲンの特質を生化学的に研究している。本種は深海中で 10−60MPa にも及ぶ圧力、および通年 1 −2 ℃程度（a1a2a3）である種が報告されている（図 1） 。
このⅠ型コラーゲンの各サブユニットの両端には、N 末の低水温に適応して生きているが、これらの環境を直接的

端側には外側からシグナルペプチド、プロペプチドおよびに受けとめているのは表皮・真皮であり、その主要な構成

テロペプチドが、同様に C 末端側にはプロペプチドおよび成分はコラーゲンである。このため深海動物のコラーゲン

テロペプチドが存在するが、シグナルペプチドおよびプロ

はその環境に適応した構造・機能・物性を分子内で進化させペプチドはコラーゲンが成熟する過程で切断されることがていると考えられる。しかしながら、これまでにその構造分かっている。またテロペプチドの間は各サブユニットにと機能は解析された例がなく、詳細は未解明のままである。

おいて［Gly- X- Y］トリプレット構造をとっており、3 残上述のようにコラーゲンを化粧品基材に用いる場合はそ

基ごとにグリシンが 338 回繰り返す一次構造をとることがの「保水効果」が鍵になるが、これまでに用いられている

分かっている（図 1）1, 2）。このアミノ酸XおよびYには、各々素材としては哺乳類由来のもの、ティラピアなど浅海性のプロリンおよびヒドロキシプロリンが存在することが多く、魚類由来のものが中心である 1）。しかしながらこれらの素

これらはイミノ酸とも呼ばれ、コラーゲンの主要構成アミ

材はコラーゲンの分子としての性質が似通っており劇的なノ酸であることが知られている（図 1）。イミノ酸はイミ効果の違いを見ていない。

ノ基とカルボキシル基を持ち、このうちヒドロキシプロリ

そこで本研究ではその生息環境から従来のコラーゲンとンのもつ OH 基がトリプルへリックスを安定化させているは全く異なる物性を有する可能性のある深海魚のⅠ型コラと一般には考えられている

1, 2）。このコラーゲン分子は1/4 ずつずれた形で規則正しく会合し（1/4 ずれ会合モデーゲンのまずは構造に着目し、その cDNA 配列からアミノ酸配列を類推することでその特性を検討する。

ル）、コラーゲン繊維を作り上げている。コラーゲン繊維

試料および方法はさらに重合することによりハイドロゲルを形成すること

シンカイヨロイダラ I 型コラーゲンα1 サブユニットのcDNA 断片配列の決定
試料となるシンカイヨロイダラ（学名：Coryphaenoides
The application of collagen from deep sea
animals to cosmetic vehicle
Kohsuke Adachi
Kochi University

yaquinae、英名：Rattail fish）は、採取後、−80 ℃にて凍結保存した筋肉を用いた。TRIzol（Life Technologies）および NucleoSpin RNA（Takara）にて全 RNA の調製を行い、Rever Tra Ace（TOYOBO） に て 逆 転 写 し た 産 物 を Ex

−4−

深海生物由来コラーゲンを活用した化粧品基材への応用研究

Taq にて PCR で増幅した。PCR に用いたプライマーは 5

pH が中性付近になるまで純水中で透析し、3 回ほど交換

種類の硬骨魚種（タイセイヨウダラ、キンギョ、ゼブラフした。透析後、凍結乾燥機 FD-1（東京理科器械株式会社）ィッシュ、ティラピア、ヒラメ）、のⅠ型コラーゲンの各を用いて凍結乾燥したものを酸可溶性コラーゲン（Acid

塩基配列をマルチプルアラインメントし、保存性が高い部

Soluble Collagen：ASC）とした。全ての操作は 5 ℃で行分をもとに、得られる断片が 50 − 100bp オーララップさった。

せるように設計した。増幅した PCR 断片を Mighty TAcloning Kit（TaKaRa）を用いてライゲーションし、サブク

精製コラーゲンのアミノ酸分析

ローニングし得られたプラスミドを、BigDye Terminator

凍結乾燥したコラーゲン試料 1 mg に蒸留水を 2 ml、濃v3.1 Cycle Sequencing Kit および ABI Prism 3100-Avant

塩酸を 2 ml 添加した後、ソノクリーナー 200D（株式会社Genetic Analyzer（Applied Biosystems）に供し、配列解

カイジョー）中でソニケーションしながら、循環アスピレ

析を行った。

ーター WJ-20（柴田科学株式会社）を用いて 10 分間吸引・脱気した。脱気後、ミニバキュームチューブをドライサー

イバラヒゲ I 型コラーゲンの精製

モユニット DTU-1C（タイテック株式会社）中で 110 ℃，試料となるイバラヒゲ（学名：Coryphaenoides acrolepis、

24 時間インチュベートすることで試料を加水分解した。

英名：Pacific grenadier）は採取後、−50 ℃で保管したもの

放冷した後、試料をナス型フラスコに移し、ロータリーエを用いた。解凍後細切した皮から、コラーゲン以外のタンバポレーター（東京理化器機株式会社）を用いて試料を完

パク質および脂質を除去するために 10 倍量の 0.1M NaOH

全に乾燥させた。そこに、0.02M HCl を 3 ml 添加し、完全を添加し、並列スターラー SRS360YA（アドバンテックに溶解するまで攪拌した後、この溶液をマイクロシリンジ

東洋株式会社）を用いて 1 日間攪拌後、日立冷却遠心機

で 1 ml とり、孔径 0.02 mm のディスポーザブルフィルター

himac CR 21E（株式会社日立製作所）を用いて 10,000×g

ユニット DISMIC-13cp（アドバンテック東洋濾紙株式会

で 10 分間遠心分離するアルカリ処理を 2 回繰り返した。

社）を用いてアミノ酸分析用ガラス瓶に濾過し、これをア

ここで沈殿に 10 倍量の純水を添加し、30 分間攪拌するこ

ミノ酸分析用試料としてアミノ酸分析に供した。

とで沈殿を洗浄後、10,000×g で 10 分間遠心分離した。こ結の純粋による洗浄を上清の pH が中性付近になるまで繰り返した。洗浄後の沈殿に 10 倍量の 0.5M 酢酸を添加し、3日間攪拌後 10,000×g で 10 分間遠心分離し、上清を布で果

シンカイヨロイダラ I 型コラー ゲンα1 サブユ ニット
cDNA 断片配列とそれより類推されるアミノ酸組成

濾過した。この際得られた上清に終濃度 0.9M となるよう得られた 4 つの PCRcDNA 断片を連結することで塩基配

NaCl を添加し、完璧に溶けるまで攪拌後、10,000×g で列 1935bp を決定し、582 残基のアミノ酸配列を推定した。

30 分間遠心分離を行った。その後デカントにより上清を同断片配列は、N 末端側のシグナルペプチド領域、テロペ

除き、沈殿を 10ml の 0.5M 酢酸に完璧に溶解した。これをプチド領域および三重らせん構造の一部を具体的には透析用セルロースチューブ UC30-32-100（三光純薬株式会［Gly-X-Y］のトリプレット構造を 140 組含むことが判明

社）に密封し、0.1M 酢酸中で 2 日間透析（2 回交換）後、した（図 1）。cDNA 配列から予想される同遺伝子のアミ

3 つの異なるサブユニットが 3 重
らせんを構成している。シグナルペプチド、N- プロペプチドおよび C- プロペプチドは、コラーゲ
ンが成熟する過程で切断される領域。Gly-X-Y トリプレットの X お
よび Y の位置には各々 Pro および
Hyp が多く見られる。
図１

魚類Ⅰ型コラーゲン構造の模式図−5−

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

ノ酸組成を同じく配列の明らかになっている他種生物の同ことが明らかになった。

領域と比較し、表 1 に示した。結果、同断片配列において考も他種生物と同じく、Gly がおおよそ 1/3 の割合を占める

察

結果が得られた。また Pro の含有量が他生物よりも低く、本研究ではシンカイヨロイダラのⅠ型コラーゲンの a1

Ser の含有量が多い傾向があった。特に Ser の多さは顕著

サブユニットの断片配列を決定し、それから得られるアミであり、同じ魚類であるゼブラフィッシュ同遺伝子との比ノ酸配列から同遺伝子中に Ser 残基が多く含まれているこ較では約 4.6 倍、ヒト同遺伝子の約 2.8 倍含まれていることを明らかにした。その逆に Pro は表 1 で比較した生物中とが分かった。

最も少ない値を示した（15.5 残基）。緒言で述べたように
本分子には Pro の水酸化された Hyp が含まれると予想されイバラヒゲ皮由来の I 型コラーゲンの精製とそのアミノ酸組成

るが、これは翻訳後修飾であるため、cDNA 配列のコドンからアミノ酸を推測する方法では Hyp の含量は分からな

イバラヒゲの皮 4.8g（湿重量）から、上記の手法にてい。それ故ここでの Pro の量は実際タンパク質における59.5mg の酸可溶性コラーゲン（ASC）を精製することがPro と Hyp の合計と考えるべきである。尚、著者らはⅠ型出来た。表 2 に各試料から精製した ASC のアミノ酸組成

コラーゲンを構成する a2 および 3 鎖においても同様の解を示した。イバラヒゲⅠ型コラーゲンを構成するアミノ酸

析を行っているが、結果が a1 鎖に追従するものであるこは Gly が全体の 1/3 を占め、Pro は 100 アミノ酸残基あたとを付記しておく。

り 7.5、Hyp は 4.8 残基、Ser は 7.3 残基含まれていること

一方で我々はシンカイヨロイダラよりやや浅い水深に生が明らかになった。これまでに精製タンパク質アミノ酸組

息するイバラヒゲよりⅠ型コラーゲンを精製し、そのアミ3−5）と比べても深海魚であるイバラノ酸組成を検討した。その結果、実際のタンパク質を対象

ヒゲで Ser の含量が最も多く、Pro、Hyp 量は最も少ないとしても深海魚Ⅰ型コラーゲンは高い Ser 含量を持つこと

成の報告がある他魚種

表１ シンカイヨロイダラⅠ型コラーゲン α1 サブユニット cDNA 断片配列より類推されるアミノ酸組成−6−

表２ イバラヒゲ精製Ⅰ型コラーゲンのアミノ組成深海生物由来コラーゲンを活用した化粧品基材への応用研究が明らかになった。また同実験では cDNA の解析と異なり、海性の魚類と比べて、Pro および Hyp のイミノ酸含量を減

Hyp の量も実際に測定することが出来る。その結果、Pro

らし、Ser を増やす傾向にあることが明らかになった。今および Hyp 含量はともに他魚種に比して低いという結果

回、検討を行ったコラーゲンが、特有の物性や保湿効果をが得られた（表 3）。これもシンカイヨロイダラの遺伝子示すことが分かれば化粧品基材としての応用も大いに考え

配列から予想される結果に一致する。

ることが出来る。しかしながら、深海魚のコラーゲンの研Pro はそれが水酸化された Hyp とともにはイミノ酸とも

究でネックになるのが、その入手できる量である。バイオ呼ばれる。これらイミノ酸は側鎖がアミノ基と結合して環マスとしての深海生物は莫大なものがあるが、6000m も状になっている故、立体配置座に大きな制限を与える。この深海となるといまだ手軽なアクセス方法は確立されておの制限によってコラーゲンの三重らせんは安定化するともらず、試料としてのコラーゲンをグラム単位で調製するこいえるし、柔軟性を失うとも考えることが出来る。またとは、ティラピアや畜産物のコラーゲンに比べて大きな壁

Hyp 中の水酸基は（議論は分かれるようだが）それの作りになる。コラーゲンは構造が特殊なことや、翻訳後修飾がだす水素結合によって三重らせんを安定化させると考えら必要なこともあって組換えタンパク質の研究は他の分子にれている。今回の解析によって深海魚類であるシンカイヨ

比べ立ち遅れている現状があるが、Pinkas 2011 らによっロイダラ・イバラヒゲⅠ型コラーゲンは陸上生物や他魚種て大腸菌で作出に成功した例もある。また近年は人工遺伝に比してより少量の Pro、Hyp を持ち、より多くの Ser 残子は以前よりも安価で作出できるようになってきた。今回基を有することが、明らかになった。上記の事実に照らし得た内容を基盤にして深海から得たコラーゲンの構造をミ合わせて考えると、イミノ酸の減少によって構成するアミミックした分子を組換えタンパク質にて作り出し、化粧品

ノ酸の立体配置座の制限が減る一方で、Ser を増やすこと

基材としての可能性を探ることも考えてみたい。

で水素結合による三重らせんの安定化を保持していると考（引用文献）

えられる。
上記のことは深海魚 I 型コラーゲン分子の低水温・高水

１）コラーゲンの製造と応用展開 II：

圧の深海環境への適応の結果と考えられる。低水温のみに

谷原正夫監修 , シーエムシー出版

対する魚類タンパク質の適応として酵素の活性中心付近で

２）海洋性コラーゲンを探る：の構造を少ないエネルギーで動かせるように柔軟化させて

３）Nagai T, Izumi M and Ishii M,: Fish scale collagen.

いるとの報告がある。また、高い水圧下への適応として分Preparation and partial characterization. International

子が“柔軟化”するというのは一つの戦略であると考えら

Journal of Food Science and Technology, 39 , 239 – 244 ,れるが、深海魚ミオシンのロッド構造などではその構造を2004 .

コンパクトにして固くしていると考える例もある。

木村茂 ,

五曜書房

４）Shahiri Tabarestani H, Maghsoudlou Y, Motamedzadegan

これらコラーゲン分子の構造の適応がいかに本分子の構A, Sadeghi Mahoonak AR, Rostamzad H,: Study on some造に影響しているのかを検討し、化粧品基材への応用をは

properties of acid-soluble collagens isolated from fish

かることが今後の課題である。

skin and bones of rainbow trout (Onchorhynchus

総mykiss). International Food Research Journal, 19 , 251 -括

257 , 2012 .

本研究において深海魚のⅠ型コラーゲンは陸上動物や浅５）Zhang Y, Liu W, Li G, Shi B, Miao Y, Wu X,: Isolationand partial characterization of pepsin-soluble collagenfrom the skin of grass carp (Ctenopharyngodon idella).

表３ イバラヒゲ精製Ⅰ型コラーゲンの Pro、Hyp、Ser 含量の
他魚種との比較

Food Chemistry, 103 , 906 – 912 , 2007 .
６）Fields PA.; Review: Protein function at thermal
extremes: Balancing stability and flexibility. Comp.
Biochem. Physiol. A 129 , 417 - 431 , 2001 .
７）Morita T,: Comparative sequence analysis of myosin
heavy chain proteins from congeneric shallow- anddeep-living rattail fish (genus Coryphaenoides). The
Journal of Experimental Biology, 211 , 1362 - 1367 , 2008 .
８）Pinkas DM, Ding S, Raines RT, Barron AE,: Tunable,
post-translational hydroxylation of collagen Domains inEscherichia coli. ACS Chem Biol. 6 , 320 - 324 , 2011 .

−7−

金属イオン配位子修飾ヒアルロン酸の開発と組織浸透性に関する研究

東京大学大学院医学系研究科疾患生命工学センター

伊藤大知

Peritoneal metastasis is frequently found at a late stage of stomach and ovarian cancer. Recently intraperitoneal
administration of anticancer drugs such as paclitaxel and cisplatin (CDDP) is expected because relatively high concentrationof the drugs can be administered to disseminated cancer cells. i.p. of paclitaxel is now clinically used as an advanced medical
treatment in Japan. However, the clearance of CDDP is much faster than that of paclitaxel, thus new approach to deliver
CDDP to peritoneal nodules are expected. It is well known that high concentration of hyaluronan exists in peritoneum, thus
hyaluronan (HA) -based drug carrier for CDDP is potentially biocompatible in peritoneum. In addition, the affinitiy between
HA and CD44, which is highly expressed in cancer cells, can be utilized to delivery CDDP to cancer cells selectively.
Therefore, we have developed nanogel composed of iminodiacetic acid-modified HA (HA-IDA) and CDDP. In the present
research, we investigate the targeting effect of the nanogel in vitro using human disseminated stomach cancer cell line,
MKN45P, and human mesothelium cell line, Met-5A. Moreover, we made stomach cancer cell spheroids of MKN74 using
PDMS-bottom plate, then clarified the efficient penetration of the nanogel compared to HA-IDA without CDDP. HA has
excellent water-retention ability, so is utilized widely in cosmetic industry nowdays. The knowledge from the present
research will contribute not only to medical applications but also cosmetic applications.

１．緒言

ヒアルロン酸（HA）は、N －アセチルグルコサミンとグルコン酸が交互に結合した多糖類であり、腹腔液に高濃度で含まれ消化器等の腹腔臓器同士の摩擦を低減する潤滑油的な働きをしていることが知られている。
腹腔内で起こる様々な疾患の中でも、がんの腹膜播種は生命に直結する予後の非常に悪い転移がんである（図１）。
原発胃がんや卵巣がんが臓器漿膜を超えて浸潤し、腹腔内に飛散したがん細胞は腹腔中を拡散し、腹腔内の様々な場
所に転移巣である播種巣を形成する。
期待される治療法の一つが抗がん剤を播種巣近傍に高濃度の抗がん剤を投与可能な腹腔投与であり、タキソールの腹腔投与は先進医療として認められている。一方で、セカンドラインとして期待されるシスプラチン（CDDP）は、

図１

腹膜播種
（a）
とヒアルロン酸（b）

腹腔からのクリアランスが速く、インフュージョンポンプ
を使った持続投与が試みられているが、効果は十分とは言発に成功した（図 2）。難治固形がんでは、DDS 製剤の組い難く、新たな投与法が期待されている。

織浸透性も重要である。そこで本研究では、HA-IDA ／このため我々は、腹腔液に含まれる HA の生体適合性に着目し、HA をドラッグキャリアとした CDDP 送達システ

CDDP ナノゲルあるいは HA-IDA の抗がん特性や播種巣浸透性の検討を行った。

ムの研究を行ってきた。とりわけ CDDP を二座配位する

２．実

イミノ二酢酸を修飾したヒアルロン酸 HA-IDA の合成を行い、HA-IDA と CDDP から成る新たなナノゲル製剤の開験

2. 1. HA-IDA 及び HA-MAの合成
HA 0.5 g（Mw=100kDa） を 100mL の 純 水 に 溶 解 し、Development of new hyaluronan derivatives
modified with metal-ion ligands and theirtissue penetration
Taichi Ito
Center for Disease Biology and Integrative
Medicine
School of Medicine, The University of
Tokyo

EDCI 0.78 g（DMSO3mL ／純水 3 mL 混合液に溶解）を添加し、４時間攪拌を行った。さらにイミノ二酢酸（IDA）
1.2 g と NaOH（1N）10 mL をそれぞれ添加し、一晩撹拌した。
さ ら に 透 析（Spectra/Por MWCO=6000 ～ 8000Da） 膜を用いて純水で透析し、凍結乾燥を行った。重水中にてNMR 測定を行い、修飾率を決定した。

−8−

金属イオン配位子修飾ヒアルロン酸の開発と組織浸透性に関する研究

図２

HA-IDA/CDDP ナノゲルのコンセプト

IDA の代わりにマロン酸（MA）を用いて、同様のス樹立されたもので、高度な転移性を持つ細胞株である。まキームでマロン酸修飾ヒアルロン酸 HA-MA を合成した。

た、腹腔の腹膜・臓器漿膜を覆っている中皮細胞の株化細IDA が CDDP と錯体配位すると 8 員環を形成する一方で、胞である Met-5A（ATCC；CRL-9444）を用いた。
ま ず MKN45P に 対 し て、HA-IDA 及 び CMC-IDA を

MA は 6 員環を形成する。このため MA の方が IDA よりも投与し、その取り込みを共焦点顕微鏡によって観察しキレート形成定数が高いことが予想される。
またHAの代わりにカルボキシメチルセルロース（CMC）

た。さらに HA-IDA/CDDP ナノゲルを調製し、同様に共を用い、CMC-IDA を作製した。CMC は HA と非常に似た

焦点顕微鏡によって観察した。さらに HA-IDA/CDDP ナ

物性を示す一方で、ヒト細胞上の膜レセプターとは相互作

ノ ゲ ル、HA-MA/CDDP ナ ノ ゲ ル、HA/CDDP ナ ノ ゲ ル、

用しない bio-inert な物質であることが知られている。このCMC-IDA/CDDP ナノゲルを作製し、0.1mg/mL の濃度でため物性は類似しつつ、生物学的が異なる HA の対照物質

MKN45P に添加 4 時間後、FACS 測定によって取り込みとして用いられる。

量を比較した。
さらにMKN45PまたはMet-5Aを 24 穴プレートで培養し、引き続き、HA-IDA（または HA, CMC, CMC-IDA）0.20 g
を 15mL 純水に溶解し、EtOH を HA が凝集しないように

ナノゲルを投与後、1 日後に MTT assay によって殺がん

微 量 ず つ 滴 下 し た。 さ ら に 2-chloro-1-methylpyridinium

細胞効果を検証した。

iodide 66 mg を添加した後、Triethylamine 70µL 滴下し、FTSC 4.0 mgを添加して、110℃で 24 時間還流した。最後に、

2. 4. スフィロイド培養とナノゲルの浸透実験

純水／ NaCl 水溶液で透析の後に、凍結乾燥を行って、蛍光測定により修飾率を決定した。

共同研究者である東京大学生産技術研究所・酒井教授の指導の下、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ハニカムマ
イクロウエルシートを既報に従い、ソフトリソグラフィー
1）

2. 2. ナノゲル調製法によって作製した 。良く洗浄したシリコンウエハ上に

HA-IDA 5mg/mL 溶液（母液 A）と CDDP 15mg/mL（母フォトレジスト（SU-8；MicroChem, Newton, MA）をス

液 B）溶液をマイクロチューブ内で混合し、ヒートブロッ

ピンコーティングにより塗布し、フォトマスクを用いて露ク 95 ℃で加熱した。これを 20 分間氷上で冷却し、純水で光後、現像液で処理し、CF3 イオンを利用した反応性イ

透析した後凍結乾燥する事によりナノゲルを作製した。原

オンエッチング（装置：SAMCO, Model RIE-10NR）を行

子吸光によって CDDP 含有量を決定し、ナノゲル PBS 溶

った後に剥離して、モールドを作製した。PDMS と触媒液の粒子径を DLS（動的光散乱）によって測定した。

（Silpot 184, Dow Corning, Tokyo, Japan）を 9：1 で混合+してモールドに流し込み、75 ℃で 2 時間加熱後に剥離して、

2. 3. ナノゲルのがん細胞標的性の検証

酸素プラズマで 10 秒間処理後、親水化コーティングのた

胃がん腹膜播種細胞株である MKN45P は、共同研究者

めに MPC ポリマー（Lipidure-CR1701, Nichiyu）のエタノの東京大学附属病院腫瘍外科・北山准教授によって作製さール溶液に浸漬して、PDMS ハニカムシートを得た。ハニれたものを用いた。MKN45 をヌードマウスに腹腔投与し、

カムシートを、24 穴プレートと同様のフレームの底にセ回収された腹水から培養、再投与を繰り返すことによってットし、酸素透過性 24 穴プレートを作製した（図 3）。

−9−コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

３．結果

3. 1. ナノゲルのキャラクタリゼーション
HA-IDA の IDA 部位のメチレン基、HA のアセチル基のプロトン積分値の比から、修飾率を決定した（図 4 左）。
IDA 修飾率は 40% 程度まで向上可能であり、本研究ではHA-IDA（IDA 修飾率 35%）と HA-MA（MA 修飾率 36%）を用いた。
HA-IDA、HA-MA、及び対照物質としての未修飾の HA
を CDDP と混合し、加熱してナノゲルを得た。未修飾 HAもグルクロン酸のカルボキシル基とキレートすることによってナノゲル化する。DLS 測定によって、PBS 中では HAが 70 mm 程度に対して、ナノゲル化することによって 10〜 20 mm まで粒子径が変化した。またキレート配位子の種類によって粒子径が異なることが示され、ナノゲルサイズ
が HA-MA ＞ HA-IDA ＞ HA となった。CDDP の水への溶
解度はそれほど大きくないため、錯体形成定数が高い MA
図３ 作製した PDMS ハニカム培養プレート（上）と胃がん細胞株：MKN74 を用いて作製したスフィロイド得られた培養プレートは底面素材に PDMS を用いていの CDDP 配位数が一番多く、より疎水化して最も小さい
サイズを取ったものと考えられる。

3. 2. ナノゲルのがん細胞標的性るために、通常のポリスチレンディッシュの 80 倍の酸素

CD44 は HA の 6 糖分を認識すると言われている。このを供給することが可能で、生理活性が高く、細胞密度が高ため HA の CD44 結合能は、化学修飾によって即座に失わいスフィロイドを作製することが可能である。

れるものではないが、HA 主鎖への化学修飾率が増加する

本研究では PDMS ハニカム培養プレートを用いて、胃−62に従って、親和性は低下していくことが知られている。さ

がん細胞株である MKN74 を 5×10 cells/cm で播種し、らに HA を介した CD44 のラフト化促進、あるいは低分

5 日間培養することによって、直径 200 mm 程度のスフィ

子 HA や可溶性 CD44 との競合によるラフト構造の消滅が、ロイドを得た。さらに蛍光標識を行った HA-IDA/CDDP

細胞の活性化や静止期への移行と、密接に関連していると

ナ ノ ゲ ル、 及 び CMC-IDA/CDDP ナ ノ ゲ ル を 0.1mg/mL

言われている。また細胞種により活性化と静止化は刺激の濃度で添加し、10 時間後に共焦点顕微鏡観察によってに対して逆転するケースも報告されている。このため HA-

ナノゲルの浸透速度を評価した。

IDA やナノゲルが確かにがん細胞に取り込まれることを図 4 HA-IDA の 1H NMR（左図）と CDDP と混合・加熱・透析を行って作製した各ナノゲルの動的光散乱により測定した粒子径（右図）− 10 −

金属イオン配位子修飾ヒアルロン酸の開発と組織浸透性に関する研究

CDDP と錯形成をさせて複合化させても、効率的にエンド示すことが重要である。
HA-IDA と CMC-IDA の取り込み共焦点顕微鏡写真を図

サイトーシスされることを示した。

5 に示す。CMC-IDA と比較して、HA-IDA が活発に播種

さらに FACS によって各種ナノゲルの取り込み量を図 7

細胞株に取り込まれていることが観察される。さらに HA-に示す。PBS 中 4 時間後の時点で各ナノゲルは CDDP を

IDA/CDDP ナノゲルの取り込み過程を共焦点顕微鏡で観十分に担持している（data not shown）。まず CD44 発現

察した結果を図 6 に示す。CDDP と錯体配位しナノゲル化

量が高かった播種細胞株 MKN45P で取り込み量が多い一しても、高いエンドサイトーシス効率を示した。すなわ

方で、中皮細胞株 Met-5A では取り込み量が少ない。またち、本研究においては HA に IDA 修飾を施しても、さらに

CMC-IDA/CDDP ナノゲルの取り込み量が一番少ない。
一方で興味深いことに、リガンドポリ
マーとして HA を用いた時より、化学修飾を施した HA-MA、HA-IDA を用いたナノゲルの取り込み効率が高くなった。
この点については、ナノゲルの構造とエンドサイトーシスの機構の関係をより詳細に調べていく必要がある。
以上の結果を踏まえ、MKN45P と Met5A に対してナノゲルを添加し、MTT
assay を行った結果を図 8 に示す。CMCIDA/CDDP ナノゲルは若干毒性が低下
するものの、CDDP とほぼ同様の用量作
用曲線を描く。これに対して HA-IDA/
CDDP ナ ノ ゲ ル と HA-MA/CDDP ナ ノゲルは、播種細胞に対しては遊離 CDDPと同程度かそれ以上の殺細胞効果を発現するのに対し、中皮細胞に対しては非常に低い毒性を示し、がん細胞選択性を発現して著しく副作用を低減できる可能性

図5

図6が示唆された。

HA-IDA 及び CMC-IDA の MKN45P 取り込み効率

ナノゲルの MKN45P 取り込み過程の共焦点顕微鏡観察− 11 −

図7

各ナノゲルの MKN45P 取り込み量の比較コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図8

各ナノゲルの腹膜播種細胞株 MKN45P（左）と中皮細胞株 Met-5A（右）への MTT assay の結果

図9

MKN74 スフィロイド浸透性：HA-IDA（上）及び HA-IDA/CDDP ナノゲル（下）

３．３．胃がん細胞スフィロイドへのナノゲル浸透性度を制御することは決定的に重要である。本研究では、プ

例え in vitro で高い効果を示しても、最終的に in vivo でレート培養を用いた通常の in vitro 実験と動物モデルを用

高い効果を示さなければ意義ある研究とは言えない。腹膜いた in vivo 実験をブリッジするものとして、スフィロイ

播種に対する抗がん剤の腹腔投与で期待することは、腹腔ドを用いたナノゲルの浸透性評価を試みた。

から播種巣への抗がん剤の直接的な浸透による送達である。

実験結果を図 9 に示す。まず HA-IDA のみをスフィロイ

全身循環に移行してから血流を介して播種巣に抗がん剤がド外部から添加した所、10 時間後でもスフィロイド内部送達されるならば、静脈投与と同等の効果しか得られない。

までポリマーが拡散していない。一方で、CDDP とキレー

このために、外部境界から播種巣内部へのナノゲル浸透速

トさせ HA-IDA/CDDP ナノゲル化することによってスフ− 12 −

金属イオン配位子修飾ヒアルロン酸の開発と組織浸透性に関する研究ィロイド中心部までナノゲルが拡散するとともに、プレー

二酢酸は EDTA を丁度半分にしたと考えられる分子であト実験の結果とも良く一致してエンドサイトーシス効率

り、潜在的に生体適合性が高い分子であると考えられる。

も非常に高いことが観察された。これは HA-IDA の CDDP

実際合成した HA-IDA そのものは、繰り返し実験を行っの配位の有無により、サイズや脂溶性が劇的に変化するた

た結果 in vitro と in vivo での毒性は非常に低いことが明らめであると考えられる。

かになった。合成スキームと化学構造の単純さから、将来

４．考

臨床で十分に利用可能な材料となりうる。一方でこのポリ察

マーとシスプラチン（CDDP）から作製したナノゲルの機

ヒアルロン酸に二座配位子であるイミノ二酢酸（IDA）

能は、本研究で明らかにしたように、腹膜播種の腹腔投与

やマロン酸（MA）を修飾したヒアルロン酸誘導体を開発

DDS を実現する上で様々な利点を持っていることが明らし、CDDP とのキレート形成により自発的に組みあがるナかになった。今後は他のがん種への適用検討も有益である

ノゲルの開発を行って、IDA と MA という異なったリガと考える。

ンドを用いることにより、ナノゲルのサイズ等が異なるこ

さらに本研究とコスメトロジー分野への貢献を総括すとを明らかにした。さらにナノゲルはがん細胞に効率的にる。一般に HA の組織浸透性は非常に低く、分子量 1kDa

取り込まれ、遊離 CDDP と同等かそれ以上の抗がん特性以下の HA の角質透過性などが報告されているが、本研究を発揮するのに対して、中皮細胞に対する毒性を劇的に低で用いている 100kDa の HA が組織を浸透していくことは減できることを初めて明らかにした。

ない。しかしイオンとキレートすることによって、組織のさらに一歩踏み込み、高酸素透過性培養プレートを用い間質中を高速拡散することが示唆された。近年、ヒアルロて胃がん細胞スフィロイドを作製することに成功し、スフン酸は保水性を高める化粧品材料として需要が増加していィロイド中でナノゲルの拡散性が劇的に向上することも見る。HA をイオンや疎水性物質と複合化して、分子量が高出した。現在 in vitro の結果に基づき、動物実験の検討を

い HA の回転半径を抑え、ナノサイズ化することにより組開始している。

織浸透性を制御する、と考えれば、本研究は DDS の分野

ヒアルロン酸の CD44 との結合、エンドサイトーシス、
分解、細胞内情報伝達は、まだまだ不明な点が多く生理学に止まらず、広く化粧品の R&D にも応用可能な知見であると考えられる。

的な研究が精力的に行われている。ナノゲルが効率的に

６．謝

エンドサイトーシスされる機構については、ヒアルロン

辞酸分解酵素、エンドサイトーシス阻害剤やオリゴ HA、抗本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりCD44 等を用いた更なる研究の深化が必要である。またナ

ご援助を賜りましたことを感謝申し上げます。ヒアルロン

ノゲルが間質中を拡散する機構についても、FCS 等を用酸をご供与頂いたキッコーマンケミファに感謝致します。

いたより詳細な研究が期待される。

またスフィロイド作製プレートの作製をご指導頂いた東京

５．総大学生産技術研究所・酒井康行教授、腹膜播種細胞株をご括供与頂いた東京大学医学部付属病院・北山丈二准教授に感本研究では、
ヒアルロン酸（HA）にイミノ二酢酸（IDA）

謝致します。最後に、本研究の実験を行ったバイオエンジ

等を修飾した非常に単純な化学合成で作製した HA 誘導体

ニアリング専攻修士課程 2 年平本翔大君、JSPS博士研究員・（HA-IDA）を用いた研究である。EDTA 等はかなりの高太田誠一博士に感謝致します。

濃度を静脈投与しても安全なことがわかっている。イミノ− 13 −

皮膚組織再生を促進するリン酸カルシウム真球粒子の創製

国立研究開発法人産業技術総合研究所ナノ材料研究部門

大矢根

綾 子、中 村真紀

Submicron spheres of calcium phosphate have potential as biocompatible and functional cosmetic materials. In thepresent study, we developed surfactant-free techniques for the synthesis of submicron-sized calcium phosphate-based
spheres. In our techniques, pulsed laser irradiation was applied to dispersions of calcium phosphate integrated with various
light-absorbing agents: ferric (Fe3+) ions, ferrous (Fe2+) ions, and carbon nanopowders.
For the integration of calcium phosphate and ferric/ferrous ions, FeCl 3 or FeCl2 was supplemented to a calcium
phosphate reaction mixture. Pulsed laser irradiation was performed to the reaction mixture during spontaneous precipitationof calcium iron phosphate. After irradiation, submicron- and micron-sized spheres of amorphous calcium iron phosphate
were fabricated. In this process, ferric/ferrous ions integrated in the nano-sized precipitates induced melting andspheroidization of the precipitates via selective laser heating in the reaction mixture. Nucleation-growth process and Ostward
ripening under supersaturated condition might be involved in the sphere growth.
For the integration of calcium phosphate and carbon nanopowders, hydroxyapatite nanopowders as the calcium
phosphate source and carbon nanopowders were mixed using a ball mill. Pulsed laser irradiation was performed to adispersion of the carbon-integrated hydroxyapatite nanopowders in ethanol. After irradiation, submicron spheres ofamorphous calcium phosphate were fabricated. In this process, carbon nanopowders integrated with the hydroxyapatite
nanopowders induced melting, spheroidization, and amorphization of the hydroxyapatite nanopowders via selective laser
heating in the ethanol solvent. The carbon nanopowders were decomposed and/or evaporated during laser irradiation; hence,
there was hardly any carbon remaining in the final spheres.
Our laser fabrication techniques would provide a new way to produce submicron-sized calcium phosphate-based spheres.
The resulting spheres have a potential as biocompatible and functional cosmetic materials.

１．緒

ョン法など）が挙げられる。しかし、化学合成により得ら言れる界面活性剤には、細胞毒性や製造コストなどの課題がリン酸カルシウムはヒトの歯や骨の主要無機成分であり、あった。これに対して最近 Koshizaki らは、界面活性剤を身体に優しい安全・安心素材として、ファンデーション添必要としない簡便・迅速なサブミクロン球状粒子の合成法

加剤などのコスメトロジー素材や、人工骨などの生体材として、液中レーザー溶融法を報告している 1）。液中レー料に応用されている。また、リン酸カルシウムはタンパク

ザー溶融法は、液相中に分散させた不定形ナノ粒子原料に質、抗体、DNA などの生体分子を吸着する特性を有して低エネルギー密度のパルスレーザー光を非集光で照射するいることから、薬剤送達システム（Drug delivery system:

ことで、サブミクロン球状粒子を合成する手法である。こDDS）用担体としての応用も期待されている。本研究では、の手法は、様々な金属や金属酸化物に適用されてきたもの

DDS 機能を有するコスメトロジー素材への応用を目指し、の、レーザー光吸収性に乏しいリン酸カルシウムへの適用

細胞内への取り込みに適したサブミクロン球状構造を有すは困難であった。

るリン酸カルシウムを合成するための技術開発を行った。

そこで我々は、リン酸カルシウムを種々の光吸収剤と複DDS 機能を有するリン酸カルシウムサブミクロン球状粒

合化することによって、液中レーザー溶融によるサブミク

子は、健常な皮膚の美容・保全だけでなく、創傷・皮膚炎・

ロン球状粒子の合成を試みた。リン酸カルシウムと光吸収瘢痕などの治療・予防にも有効な高機能コスメトロジー素剤の複合化手法としては、鉄イオン共沈法およびカーボン材として有用と期待される。

ミリング法の 2 種について検討した。鉄イオン共沈法（2.

従来のリン酸カルシウムサブミクロン球状粒子の合成法

1. 節）においては、光吸収剤として鉄（Ⅲ）イオンおよび鉄としては、界面活性剤を用いる手法（ミセル法、エマルジ（Ⅱ）イオンを用いた。リン酸イオンとカルシウムイオンの混合反応液に鉄（Ⅲ）イオンまたは鉄（Ⅱ）イオンを添加し、*同反応液に低エネルギーのパルスレーザー光を非集光でFabrication of calcium phosphate spheresfor skin tissue repair and regeneration
Ayako Oyane*, Maki Nakamura
Nanomaterials Research Institute, National
Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology（AIST）

照射した。また、カーボンミリング法（2. 2. 節）においては、Li らの報告 2）に倣ってカーボンナノ粒子を光吸収剤として用いた。リン酸カルシウム原料として水酸アパタイトの不定形ナノ粒子原料を用い、光吸収性のカーボンナノ粒子をミリング混合によって複合化した。得られた複合粒子をエ− 14 −

皮膚組織再生を促進するリン酸カルシウム真球粒子の創製

タノール中に分散させ、低エネルギー密度のパルスレーザ

エネルギー密度を 67、133、200 mJ/pulse/cm2（それぞれ 2、ー光を非集光で照射した。

4、6 W/cm2）と変化させた。

以上の 2 つの手法において、反応条件（レーザー光のエ照射後、遠心操作（6000 rpm、10 分）により生成物を回ネルギー密度、照射時間など）を変化させ、得られた生成

収、超純水で洗浄し、試料を得た。得られた試料は更なる物の形態、化学組成、および構造を評価することによって、遠心操作により、大粒径の分画Ｌ（500 rpm、5 分で沈降さ

リン酸カルシウム系サブミクロン球状粒子を得るための基せた分画）、および小粒径の分画Ｓ（分画Ｌを沈降させた後礎的条件を追求した。さらに、反応液中におけるレーザーの上澄液から、さらに 1000 rpm、10 分で沈降させた分画）

光ならびに光吸収剤の役割・相互作用を基礎的に追及し、に分けた。

粒子の生成機構について考察した。

２．実

5）

2. 2. 試料作製［カーボンミリング法］

験

カーボンミリング法における試料作製スキームを図 2 に

2. 1. 試料作製［鉄イオン共沈法］

3, 4）示す。水酸アパタイトの不定形ナノ粒子（1.5 g、一次粒子

鉄イオン共沈法における試料作製スキームを図 1 に示径約 100 nm、太平化学産業株式会社提供）およびカーボン

す。まず、カルシウムイオン水溶液、リン酸イオン水溶

ナノ粒子（0.3 g、粒子径 500 nm 以下、Sigma-Aldrich 製）を液、鉄（Ⅲ）イオン水溶液、および鉄（Ⅱ）イオン水溶液と遊星型ボールミルで 10 分間混合（600 rpm）することによして、それぞれ 200mM CaCl2（ナカライテスク製）水溶

り複合化した。得られた複合粒子（0.005 g）をエタノール（4液、200 mM K2HPO4・3H2O（ナカライテスク製）水溶液、mL）に分散させ、同分散液に攪拌下、2. 1. 項と同じナノ秒

200 mM FeCl3・6H2O（ナカライテスク製）水溶液、およ

パルスレーザー光（30 Hz、355 nm）を非集光で 20 分間照射

び FeCl2・4 H2O（和光純薬工業製）水溶液を、各々の試薬2した。レーザー光のエネルギー密度は 200 mJ/pulse/cm（6を超純水に溶解して調製した。

W/cm2）とした。照射後、遠心操作（6000 rpm、10 分）によ

上記の原料溶液ならびに超純水をガラス製容器内に所定り生成物を回収、超純水で洗浄し、試料を得た。得られたの容量比で添加、混合・攪拌することによって、種々の鉄試料は更なる遠心操作を行い、1000 rpm、10 分で粒子をイオン濃度（Fe（Ⅲ）: 0、1、2、5、7、10mM、Fe（II）: 0、1、沈降させた後の上澄液から、さらに 2000 rpm、10 分で沈

2、5、10、20 mM）を有する反応液（4 mL）を調製した。反降させた粒子を回収した。

応液のカルシウムイオン濃度（16.7mM）およびリン酸イオ
ン濃度（10 mM）は一定とした。なお、原料溶液混合後の反2. 3. 試料評価

応液は直ちに白濁した。

得られた試料（遠心操作後、超純水中に分散）の粒径分布

攪拌下、調製直後の上記反応液にナノ秒パルスレーザー

を、動的光散乱法（DLS: Zetasizer Nano-ZS、Malvern 製）

光（Nd:YAG, Quanta-Ray LAB-150-30, Spectra-Physics 製，により調べた。また、試料の形態、化学組成、ならびに結ビーム径 8mm）を集光せずに、30 分までの種々の時間照晶構造を、電界放射走査型電子顕微鏡（SEM: XL30、
FEI 製）

射した。レーザー光の周波数は 30Hz、波長は 355 nm とし、観察、エネルギー分散型 X 線分光法（EDX、Genesis2000、

図１

鉄イオン共沈法による試料作製スキーム（鉄（Ⅲ）
イオンの例）

図２

カーボンミリング法による試料作製スキーム− 15 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

EDAX 製）、透過型電子顕微鏡（TEM: JEM-2010、JEOL 製）＝ 30 °を中心にブロードなハローが検出された（図 4 下）。

観察、および薄膜 X 線回折法
（XRD: M18X、MAC Science

分画Ｌに得られた粒子についても、同様の EDX スペクト製）により調べた。SEM 観察および EDX においては、試ルおよび XRD パターンが得られた。以上の結果から、分料をシリコン基板上にマウントし、表面にカーボンあるい

画Ｓおよび分画Ｌの球状粒子はいずれも、アモルファスのは金を蒸着した。また、XRD においては CuKa 線を用いた。

鉄含有リン酸カルシウムであると考えられた。
球状粒子の生成過程においては、反応液中の鉄（Ⅲ）
イオ

３．結果と考察

ン濃度、およびレーザー光照射条件（エネルギー密度、照３. 1. 鉄イオン共沈法
3. 1. 1. 光吸収剤として鉄（Ⅲ）
イオンを用いた場合射時間）が重要な要素であると考えられた。そこで、レー3）

ザー光照射条件（200 mJ/pulse/cm2、30 分）を固定し、鉄鉄（Ⅲ）
イオンを光吸収剤として用いて検討を行った。ま（Ⅲ）イオン濃度を変化させて試料を作製した。分画Ｓおよず初めに、鉄（Ⅲ）イオン濃度 5mM、レーザー光のエネ

び分画Ｌの球状粒子生成の有無を SEM 観察により調べた2

ル ギ ー 密 度 200 mJ/pulse/cm 、 照 射 時 間 30 分 の 条 件 下

結果を表 1 に示す。鉄（Ⅲ）イオン濃度 1 mM 以下の反応液で作製された試料について、構造と組成の評価を行った。

からは、リン酸カルシウムの不定形沈殿物のみが生成し、SEM 観察の結果、分画Ｌに得られた試料は、主としてミいずれの分画にも球状粒子は確認されなかった。一方、鉄クロンサイズ（DLS による平均粒子径＝ 800nm）の球状粒（Ⅲ）イオン濃度 2 mM の反応液からは、分画Ｓにサブミク子群であった（図 3 上）
。一方、分画Ｓに得られた試料は、

ロン球状粒子が確認された。反応液の鉄（Ⅲ）イオン濃度をサブミクロンサイズ（DLS による平均粒子径＝ 450 nm）の

5 mM に高めると、分画Ｓのサブミクロン球状粒子（図 3球状粒子群であった（図 3 下）
。以上の結果から、本法によ下）に加え、分画Ｌのミクロン球状粒子（図 3 上）の生成もって、サブミクロンからミクロンサイズの球状粒子を合成認められた。さらに鉄（Ⅲ）イオン濃度を高めていくと、7できることが確認された。

mM では分画Ｓのサブミクロン球状粒子のみが生成し、10分画Ｓの球状粒子の EDX スペクトルを図 4 上に、XRD
パターンを図 4 下に示す。EDX スペクトルでは、試料マ

mM ではいずれの分画にも球状粒子は生成しなくなった。
この理由については、3. 1. 2. 項で考察する。

ウント用のシリコン基板およびカーボン蒸着膜に由来する

次に、鉄（Ⅲ）イオン濃度（5 mM）およびレーザー光照射

ピークの他に、カルシウム、リン、鉄、および酸素のピー

時間（30 分）を固定し、レーザー光のエネルギー密度を変クが検出された（図 4 上）
。XRD パターンでは、回折角 2θ

化させて試料を作製した。SEM 観察の結果（表 2）、レー

図３ 鉄イオン共沈法で得られた分画Ｌ
（上）
と分画Ｓ
（下）
の試
料の SEM 像（［Fe（Ⅲ）］＝ 5 mM、30 分照射）

図４ 鉄イオン共沈法で得られた分画Ｓの球状粒子の EDX スペ
クトル（上）と XRD パターン（下）（
［Fe（Ⅲ）］＝ 5 mM、30 分
照射）− 16 −

皮膚組織再生を促進するリン酸カルシウム真球粒子の創製

ザー光のエネルギー密度 67mJ/pulse/cm2 の条件では、いは調製直後に（レーザー光照射前）、波長 355 nm の紫外光

ずれの分画にも球状粒子は確認されなかった。エネルギー

吸収性（図 5）を示すナノ粒子を自発析出する。この反応液2

密度を高めていくと、133 mJ/pulse/cm の条件では分画
2にパルスレーザー光を照射すると、初期析出ナノ粒子の凝Ｓにサブミクロン球状粒子が、200 mJ/pulse/cm の条件

集体がレーザー光エネルギーを吸収し、加熱溶融されて球では分画Ｓのサブミクロン球状粒子と分画Ｌのミクロン球状液滴となる。球状液滴は、レーザーパルスの間隔におい状粒子の両方が生成するようになった。

て周囲の水溶媒によって急冷され、アモルファス球状構造

続いて、鉄（Ⅲ）イオン濃度（5mM）とレーザー光のエネを保ったまま固化する。以上のような溶融・急冷反応がパ2

ルギー密度（200 mJ/pulse/cm ）を固定し、照射時間を変化

ルスレーザー光照射下で繰り返されるのに並行して、生成させて試料を作製した。SEM 観察の結果
（表 3）
、照射時間

粒子が反応液中のカルシウムイオン、リン酸イオン、鉄イ

10 ～15 分の条件では分画Ｓにサブミクロン球状粒子が確

オン、クラスターを取り込み成長していくことで、サブミ

認され、照射時間 20 ～ 30 分の条件ではさらに分画Ｌのミ

クロンおよびミクロンサイズの鉄含有リン酸カルシウム球

クロン球状粒子も確認された。この結果から、レーザー光状粒子が生成したと考えられる。

の照射開始後 10 分以内にサブミクロン球状粒子が生成し、

4）

20 分以内に一部の粒子がミクロンサイズにまで成長する

3. 1. 2. 光吸収剤として鉄（Ⅱ）イオンを用いた場合と考えられた。

続いて、鉄（Ⅲ）イオンに代えて鉄（Ⅱ）イオンを光吸収

球状粒子の生成過程は以下のように考察される。反応液剤として用い、検討を行った。初めに、鉄（Ⅱ）イオン濃度 5 mM、レーザー光のエネルギー密度 200 mJ/pulse/cm2、

表１ 鉄イオン共沈法における鉄（Ⅲ）
イオン濃度と粒子生成の関係（200mJ/pulse/cm2、30 分照射）

Fe（Ⅲ）
（mM）
粒子生成

0
×

1
×

2
S

5
S+L

7
S

10
×

照射時間 20 分の条件下で試料を作製した。SEM 観察の結果、鉄（Ⅱ）イオンを用いた場合にも、3. 1. 1. と同様、サブミクロンからミクロンサイズの球状粒子を合成できることが確認された（図 6）。また、EDX および XRD の結果から、
分画Ｓおよび分画Ｌの球状粒子はいずれも、アモルファ

× : 球状粒子生成せず
Ｓ : 分画Ｓに球状粒子生成
Ｌ : 分画Ｌに球状粒子生成

スの鉄含有リン酸カルシウムであることも確認された。鉄（Ⅲ）イオンと同様、鉄（Ⅱ）イオンが反応液調製直後に析出するナノ粒子に含有されることで、レーザー光吸収と溶融・

表２ 鉄イオン共沈法におけるレーザー光のエネルギー密度と粒子生成の関係（［Fe（Ⅲ）］＝ 5 mM、30 分照射）

エネルギー密度（mj/pulse/cm2）
粒子生成

67
×

133
S

球状化を促したと考えられる。
続いて、レーザー光のエネルギー密度（200mJ/pulse/

200
S+L

表３ 鉄イオン共沈法におけるレーザー光照射時間と粒子生成の関係（［Fe（Ⅲ）］＝ 5 mM、200 mJ/pulse/cm2）

レーザー時間照射（分） 0
粒子生成
×

5
×

10
S

15
S

20 30
S+L S+L

図５ 鉄イオン共沈法において調製された反応液（［Fe（Ⅲ）］＝5mM）の初期析出ナノ粒子の吸収スペクトル図６ 鉄イオン共沈法により得られた分画Ｌ
（上）
と分画Ｓ
（下）
の試料の SEM 像（［Fe（Ⅱ）］＝ 5 mM、20 分照射）− 17 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015cm2）と照射時間（30 分）を固定し、鉄（Ⅱ）イオン濃度を変3. 2. カーボンミリング法

5）化させて試料を作製した。分画Ｓおよび分画Ｌの球状粒子

カーボンミリング法で作製された試料の SEM 像を図 8

生成の有無を SEM 観察により調べた結果を、鉄（Ⅲ）イオ

上に、EDXスペクトルを図 8 下に示す。SEM観察の結果（図ンの結果（表 1）と合わせて表 4 に示す。鉄（Ⅱ）イオン濃度8 上）、サブミクロンサイズ（100 ～ 400 nm）の球状粒子の2 mM 以上の条件で、分画Ｓにサブミクロン球状粒子の生生成が認められた。EDX スペクトル（図 8 下）では、試料成が認められ、5 mM 以上の条件では、さらに分画Ｌにミマウント用のシリコン基板および金蒸着膜に由来するピー

クロン球状粒子の生成も確認された。また、鉄（Ⅲ）
イオンクの他に、カルシウム、リン、酸素、およびカーボンのピを用いた場合（2 ～ 7 mM）と比較して、鉄（Ⅱ）イオンを用ークが検出された。カーボンのピーク強度は、レーザー光

いた場合（2 ～ 20 mM）には、より広い濃度範囲において球照射前の複合粒子と比較して大幅に減少した。これは、Li状粒子が生成した。この理由の 1 つとして、調製直後の反らも報告しているように 2）、レーザー光照射により複合粒

応液の液性（pH）が考えられる。すなわち、鉄（Ⅲ）イオン

子中のカーボンが昇華あるいは分解したためと考えられの原料試薬 FeCl3・6 H2O が酸性物質であることから、添る。生成したサブミクロン球状粒子の多くは、単一孔構

加濃度の増加により反応液のpHが低下する
（図 7）
。鉄
（Ⅲ）

造（Type A）または多孔構造（Type B）を有していたが、一イオン濃度の高い反応液中では、リン酸鉄およびリン酸カ部、緻密な構造（Type C）を有する粒子も確認された（図 9）。

ルシウムの溶解度が上昇する結果、球状粒子の生成が抑制

透過電子線回折（TED）分析の結果、いずれの粒子もアモされる。一方、鉄（Ⅱ）イオンの原料試薬 FeCl2・4H2O のルファス構造を有していることが明らかになった（図 9 右

酸性度は FeCl3・6 H2O よりも弱いため、添加濃度の増加

上、Type A の例）。

による反応液の pH 低下が抑えられる。その結果、より高粒子の生成機構については、Li らの報告 2）と同様と考え

濃度（～ 20 mM）の鉄（Ⅱ）イオンを添加した場合にも、球られる。すなわち、カーボンナノ粒子がレーザー光エネル状粒子が生成したと考えられる。

ギーを吸収し、それを水酸アパタイトナノ粒子との複合粒以上の結果から、光吸収剤として鉄（Ⅲ）
イオンまたは鉄子に伝えることで、同複合粒子の溶融・球状化を促すと考（Ⅱ）イオンを用いる鉄イオン共沈法により、アモルファス

えられる。この際、大部分のカーボンは昇華あるいは分解の鉄含有リン酸カルシウムからなるサブミクロンおよびミし、球状粒子中にはほとんど残らない。また、溶融液滴中

クロンサイズの球状粒子を合成できることが確認された。

に生じた気泡が、レーザーパルス間隔で急冷・固化される

表４ 鉄イオン共沈法における鉄（Ⅱ）/ 鉄（Ⅲ）
イオン濃度と粒子生成の関係（200mJ/pulse/cm2、30 分照射）

鉄イオン濃度（mM） 0
Fe（Ⅱ）
×
Fe（Ⅲ）
×

1
×
×

2
S
S

5
7 10 20
S+L ー＊ S+L S+L
S+L S
× ー＊

図 7 鉄イオン共沈法において調製された反応液の pH（調製直後、レーザー光照射前）

図８ カーボンミリング法により得られた試料の SEM 像（上）と
EDX スペクトル（下）− 18 −

皮膚組織再生を促進するリン酸カルシウム真球粒子の創製

図９ カーボンミリング法で得られた試料の TEM 像（左上、下）と TED パターン（右上）

際に脱気できた場合には緻密構造が、脱気できずに残存し謝辞本研究は、平成 24 年度コスメトロジー研究振興財団のた場合に孔構造（Type A、Type B）が形成されると推察さ助成を受けて行われたものである。研究の実施にあたってれる。
以上、光吸収剤としてカーボンナノ粒子を用いるカーボ
ンミリング法により、アモルファスリン酸カルシウムのサは、産業技術総合研究所の清水禎樹博士、坂巻育子氏をはじめ、関係各位にご協力を頂いた。

ブミクロン球状粒子を合成できることが確認された。本手法で得られる球状粒子は孔構造を有することから、様々な（引用文献）

薬剤分子の DDS 担体として有用と考えられる。

１）H. Wang, A. Pyatenko, K. Kawaguchi, X. Li, Z.

４．総

Swiatkowska-Warkocka and N. Koshizaki, Angew.

括Chem. Int. Ed., 2010, 49, 6361.

1）

液中レーザー溶融法 を発展させ、リン酸カルシウムに

２）X. Li, Y. Shimizu, A. Pyatenko, H. Wang and N.
Koshizaki, J. Mater. Chem., 2011, 21, 14406.

種々の光吸収剤を複合化することにより、リン酸カルシウ
ム系サブミクロン球状粒子の合成に成功した。光吸収剤の３）M. Nakamura, A. Oyane, I. Sakamaki, Y. Ishikawa,

複合化手法として、鉄イオン共沈法ならびにカーボンミリ

Y. Shimizu, K. Koga, K. Kawaguchi and N. Koshizaki,
RSC Adv., 2014, 4, 38442.

ング法について検討し、それぞれの反応過程を明らかにするとともに、球状粒子を得るための基礎的条件を明らかに

４）M. Nakamura, A. Oyane, I. Sakamaki, Y.Ishikawa, T.

した。得られたリン酸カルシウム系サブミクロン球状粒子

Shimizu and K. Kawaguchi, Phys. Chem. Chem. Phys.,2015, 17, 8836.

は、DDS 担体として適した構造を有することから、治療効果を付加したコスメトロジー素材としての応用が期待さ

５）M. Nakamura, A. Oyane, I. Sakamaki, Y. Shimizu, K.

れる。今後の課題としては、粒子サイズの精密制御、大量合成技術の開発などが挙げられる。

− 19 −

Koga and N. Koshizaki, RSC Adv., 2015, 5, 22620.

球状シリカマイクロ粒子とスメクタイト微結晶の複合技術開発

信州大学工学部物質工学科

岡田友彦

Crystal growth of a layered smectite (a layered silicate) on monodispersed spherical silica particles has been investigated.
Hydrothermal reactions between spherical silica and precursors of smectites (Mg, Li or Al salt) in the presence of urea
resulted in formation of core-shell (silica-smectite) particles. Because of the heterogeneous nucleation, the fine crystallites
were firmly glued on the silica substrate without flaking off the silicate layers from the silica in aqueous media. Cationexchange reactions of the smectites on the hybrids with a long chain alkylammonium ion have been conducted to modify thesurfaces for possible applications as supports of an active ingredient for controlled release.

１．緒言

スメクタイト族粘土鉱物はイオン交換性，膨潤性，熱的化学的安定性などの特徴を有しており，陽イオンの吸着剤としてだけでなく，増粘剤，色素担体として利用されてい1）

る（図 1） 。また，スメクタイトの層間陽イオンを有機陽イオン（例：陽イオン性の界面活性剤など）で交換すると，
有機修飾粘土（例：疎水性のスメクタイト）が得られる

2, 3）

。

この有機修飾粘土へは非イオン性の有機分子が取り込まれることが古くから知られており，最近では薬剤徐放の担体

図１のほかにも，ある特定の有機分子が選択的に吸着できる分
子認識材

4−9）

や高機能な光／電子機能材料

スメクタイト族粘土鉱物の構造

4, 5, 10, 11）への応用についても内外で広く検討されている。スメクタイトのイ討する。この方法の特徴は，シリカマイクロ粒子をスメク

オン交換性を利用すると，ホスト - ゲストの多様な組み合

タイト生成の犠牲鋳型（sacrificial template）として利用する

わせから，多様な機能が発現する興味深い物質系となる。

点にある。すなわち，球状シリカマイクロ粒子をスメクタイ

スメクタイトは天然で豊富に存在する粘土鉱物であるが，トの原料の一部に用い，不均一核生成により球状シリカ表14）

鉄分を含んでいるため精製しても白色度がやや劣る。一面にスメクタイトの微結晶を直接成長させる方法（図 2）

方，化粧品の素材として有用な合成スメクタイトの粒子はであり，一旦剥離したナノシートを layer-by-layer で貼り

ナノメートルオーダーと極めて小さく，水に浸すと剝離し付ける手法とは本質的に異なり，スメクタイトはシリカ粒

やすく皮膚に残存しやすい等ハンドリング性に乏しい。こ

子表面と強固に接着するので，得られるスメクタイト - 球のようにスメクタイトは，天然，合成物ともに粒子形状が状シリカ複合粒子を水に浸しても，スメクタイト成分が剥不規則であり，合成では形状制御が難しい。単結晶合成で落することなくハンドリング性に優れたマイクロ粒子が得は最大で 0.1 mm 程度が限界のサイズでありられると期待できる。複合粒子の応用性を高めるため，本

12）

，しかも比

較的高温，高圧でないと得られない。工業的に量産するに研究では以下の２点を中心に検討した。

は，低温で常圧の合成が望ましく，合成手法が様々提案

Ⅰ）スメクタイトの原料（球状シリカ，金属塩，尿素）を添13）されているが，一般に板状微結晶の集合体として得られる。

加して温めるだけで，シリカ - スメクタイト複合粒子が本研究では，スメクタイト（層状ケイ酸塩の一種）の微結晶得られるか。また種々のサイズの球状シリカを用いてもを球状シリカマイクロ粒子表面に固定する方法について検実現可能か。
Ⅱ）得られる複合粒子には種々のイオン（陽イオン性界面活性剤，色素等）との交換特性があり，粒子表面のスメ

Hybridization of smectite crystallites
with micro-spherical silica particles
Tomohiko Okada
Department of Chemistry and Material
Engineering, Faculty of Engineering,
Shinshu University− 20 −

クタイトが剥落しないか。また，陽イオン性界面活性剤で交換した試料には薬効成分の担持能力があるか。

２．実験方法本研究で取り扱うスメクタイトは，ヘクトライト（理想球状シリカマイクロ粒子とスメクタイト微結晶の複合技術開発

図２

シリカ粒子を犠牲鋳型としたスメクタイト（ヘクトライト）
微結晶の育成 14）

組成：Li （Li
Si8O20（OH）
x
x , Mg6 - x ）4）およびサポナイト（理オン交換容量などの基礎物性に影響を及ぼすので，電荷密想組成：Na x Mg6（Si8 - x Alx ）O20（OH）
4）である。ヘクトラ度の制御は有意義である。ここでは，出発物質の Mg/Li

2++

イトの場合，Mg が低電子価の Li に同形置換されることを表 1 の通りに変化させ，電荷密度の制御を試みた。原料

でシリケート層が負電荷を帯び，この電荷を補償するための単分散球状シリカ粒子には，平均径 1.0 mm のものを用

4+に層間に陽イオンを取り込む。サポナイトでは，Si の一
3+部が Al に同形置換され負電荷を生ずる。一般にサポナイ

いた。
b）単分散球状シリカの粒子径の影響 19）

トの結晶を育成するにはヘクトライトと比べ高温であることを必要とする。

種々のサイズ（平均径：0.2, 0.6, 1.0 mm）のシリカ粒子を原 料 と し て， 仕 込 み 比 LiF：MgCl2：SiO2：Urea=0.21：
0.80：8.0：8.0 として 2. 1. と同様の条件で合成した。

2. 1. ヘクトライト微結晶の固定

これらの試料に対して，メチレンブルー（MB ＋ Cl －）の基本的な方法は次の通りである。LiF，MgCl2 および尿水溶液からの吸着等温線（25 ℃）を測定した。MB ＋ Cl －の素の混合水溶液（80mL）に，所定の粒子径の単分散球状シ

吸着等温線から導かれた飽和吸着量に対し過剰量のジメチ

リカ水懸濁液（20 mL）を加えて撹拌した後，混合物をテフ

ルジステアリルアンモニウムブロミド（2C18N ＋ Br －）を加ロン内筒型密閉容器に移し，一定の速度で回転させながえ，1 日室温にて撹拌ののち水 / エタノール混合溶液にて

ら 100 ℃ 48 時間保持した。容器を急冷した後，遠心分離

繰り返し洗浄することで，2C18N ＋ で交換された単一型のにより沈殿物を回収し，乾燥して試料とした。添加する

層間化合物を得ようとした。

Li および Mg 量を，既報

15）のヘクトライト合成条件（Li：

Mg：Si=1.4：5.3：8.0）と比較して 15% に減じて仕込むこ

2. 2. サポナイト微結晶の固定

20, 21）とで，球状シリカを核，ヘクトライトを殻としたコアシェ

球状シリカ（日本触媒 KE-S100，平均径 1.0 mm）の水懸

ル粒子を得ようとした。また，尿素の加水分解反応を利用

濁液に Al［OCH（CH3）2］3，（CH3COO）
2Mg および尿素を表して，反応中に水酸化物イオンを生成させることで，ヘク

2 の仕込み比で混合した。得られた懸濁液をテフロン内筒

トライトの生成を試みた。

型密閉容器に入れ，175 ℃で 72 時間静置あるいは回転しa）
層表面電荷密度の制御 16−18）た。冷却の後，遠心分離，洗浄，乾燥して試料とした。また，被覆されたヘクトライトの層表面電荷密度は，膨潤やイ

表１

出発物質の化学組成

Sample LiF ：MgCl2 ：Si2O ：Urea
S1
S2
S3
S4

0.21 ： 0.80
0.42 ： 0.69
0.63 ： 0.69
0.84 ： 0.69

： 8.0 ： 8.0： 8.0 ： 8.0： 8.0 ： 8.0： 8.0 ： 8.0

表2

サポナイト

15%

5%

2 C18 2C1N+Br －溶液を試料と反応させ，イオン交換特性を

サポナイト結晶育成における水熱反応方法，原料のモル比および試料名

容器

Al

Mg

Si

Urea

H2O

試料名

静置

0.09

0.45

3.4

0.3

2.5

静置

回転

0.09

0.45

3.4

0.3

2.5

回転

回転

0.09

0.45

3.4

0.045

2.5

尿素減

回転

0.09

0.45

3.4

0.3

0.6

水 0.6

回転

0.09

0.45

3.4

0.3

0.3

水 0.3

回転

0.03

0.15

3.4

0.3

2.5

5%

− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

密なシリカ表面から 20 nm 程度の厚みで低密度な層を形成

評価した。
+

2 C18 2C 1N とイオン交換した疎水性の試料に対して，

し，その表面からシリケート層が成長する様子がみられた。

ヒノキチオールを吸着させた。続いてその試料を n- ヘキ

他方，LiF 添加量の多い場合（S3, S4）では，ヘクトライト

サンに混合し，25 ℃で 1 日静置してヒノキチオールの脱結晶子のサイズが比較的大きく，シリカ粒子の外側の方向

着試験を実施した。この際，市販のスメクタイト（クニピにシリケート層が交わるように成長する様子が見られた。

ア F，およびスメクトン SA：いずれも日本粘土学会参考得られた試料に対する MB ＋ Cl － の吸着等温線は，いず試料）を 2 C18 2C 1N+ で疎水化した試料へも同様にヒノキチ

れも吸着剤─吸着質相互作用が極めて強い H 型であった。

オールを吸着させ，その脱着特性を比較した。

Langmuir 式に回帰して得られた吸着平衡定数（K）および飽和吸着量（qm）を表 3 に示す。合成時に添加する LiF を増

３．結果および考察やすことでqm が増大する結果となった。試料と 2C18N＋ Br－

3. 1. ヘクトライト微結晶の固定との反応により，ヘクトライトの基本面間隔（1.4 nm）が表a）層表面電荷密度の制御

4 に示す値に増大した。これらの値から，2C18N ＋は S1 の

S1 − S4 の XRD パターンには，いずれもヘクトライト

層間では二分子層，S2 および S3 では擬三分子層，S4 でに帰属できる回折ピークが見られた。SEM 像では , いずれはパラフィンタイプで配向していると考えられる。また，も比較的径の揃った球状粒子が観察でき，すべての粒子表

2C18N ＋の吸着量を TG 曲線の 200 − 600 ℃における重量減

面に微細な凹凸が見られた（図 3）。これらの結果から，球少から見積もった結果，表 4 の通りとなった。2C18N ＋ 吸状シリカ表面はヘクトライトで被覆されたことがわかった。

着量と層間での配向との関係 15）を考慮すると，2C18N ＋吸表面の凹凸は，S1 および S2 と比較して，S3 および S4 で着量は，球状シリカの 15% がヘクトライトに変化したこは大きかった。図 4 に試料および原料シリカの TEM 断面とと対応している。いずれの反応でも，表面で育成された像を示す。原料の球状シリカは極めて平滑な球面であるのヘクトライトの微結晶が剥落する様子がみられなかった。

に対し，試料 S1− S4 ではいずれもシリカ粒子表面が削ら

以上より，用いた有機陽イオンは試料のヘクトライト相れている様子がみられた。また，いずれの場合でもヘクトへ選択的に吸着されることがわかった。また，出発物質とライトのシリケート層（1 nm 程度の厚みをもつ層状構造）

して添加する LiF の量を増やすと，シリカ粒子表面上のヘの集合体が見られた。LiF添加量の少ないS1 およびS2 では，クトライトの層表面電荷密度（イオン交換容量）が変化する

図 3 ヘクトライト被覆シリカ粒子（S1-S4）および原料シリカの SEM

図 4 ヘクトライト被覆シリカ粒子（S1-S4）および原料シリカの断面 TEM 像
表 3 試料 S1− S4 への MB 吸着に対するLangmuir 定数

Sample
S1
S2
S3
S4

表 4 試料 S1− S4 に対する 2C18N+ 吸着量および吸着後の基本面間隔

qm
K［10 L/g］ ［mmol/g］
3

5.7
4.3
4.7
2.0

0.12
0.17
0.19
0.23

− 22 −

Sampled（001）［nm］

Amount of 2C18N+［mmol/g］

S1
S2
S3
S4

1.8
2.3
2.2
2.5

0.11
0.16
0.19
0.21

球状シリカマイクロ粒子とスメクタイト微結晶の複合技術開発

ことが明らかとなった。

させると，ほとんどの粒子表面に凹凸が見られた（図 6 中）b）
単分散球状シリカの粒子径の影響ことから，シリカ粒子とアルカリがよく接触してシリカが平均径を 1.0 mm から 0.2 および 0.6 mm とした場合の試料溶解または溶融しながらサポナイトが生成したと考察した。

の電子顕微鏡像を図 5a および 5b にそれぞれ示す。いずれ

試料への 2C182C1N+ の吸着量を TG − DTA 曲線から求めたもシリカ表面からヘクトライトの結晶が成長している様子

結果，“静置”では 0.16 mmol/g，“回転”では 0.15 mmol/が観察された。結晶子サイズは原料シリカの粒子サイズにg であった。反応後の基本面間隔はいずれも 2.2nm であり，依らずほぼ一定であることから，シリカ表面上におけるヘサポナイト層間の 2C18 2C1N+ は擬三分子層で配向している

クトライトの結晶成長には，粒子径よりむしろ原料の濃度と考えられる。この配向をするスメクタイトの陽イオン交＋－が重要であることが示唆された。いずれも 2C18N Br と換容量が 0.7 − 0.8 meq/g clay15）であることを考慮すると，のイオン交換反応が進行し，ヘクトライトの基本面間隔

いずれの試料にもサポナイトが 2 割含まれていると推定で＋（1.4 nm）はいずれも 2C18N が層間で二分子層を形成する

きる。これらのことから，Al と Mg の添加量をサポナイト

1.8 nm であったことから，シリカ球面で成長するヘクトラの生成する条件（Al：Mg：Si ＝ 0.6：3.0：3.4）22）と比べ 15%

イトの層表面電荷密度も，粒子径に関係なく出発原料の濃に減らして水熱反応すると，サポナイトが球状シリカの表度が関係することがわかった。

面で成長することが分かった。
XRD および固体 27Al NMR 分析より，“水 0.6”，“尿素減”

3. 2. サポナイト微結晶の固定および“5%”いずれの条件でもサポナイト様層状ケイ酸塩

サポナイトは構造中に Li+ を含まず，シリケート骨格中4+3+の Si の一部が Al で同形置換することで負電荷を生ずるの結晶が生成した。SEM 観察から，“回転”条件と比べて添加する尿素あるいは Al，Mg 源の量を少なくすると，シ鉱物であることで知られる。試料“静置”および“回転”のリカ表面に凹凸をもつ粒子数が減る傾向にあった。一方，

XRD パターンにはいずれも（060）回折線がみられ，その d“回転”条件と比べ水の添加量を少なくすると，結晶子が小値は 0.152 nm であることから，試料は三八面体型のスメ

さく均一になった。水の量を更に減らすと（“水 0.3”）
，もクタイトを含むことが分かる。固体 Al − MAS NMR スとのシリカ粒子の形状を損ねることなく，シリカ粒子上でペクトルには，60 ppm 付近に四配位の Al に帰属できるシ

サポナイトの微結晶が成長した（図 6 右）。これらのことか

グナルが現れた。試料の ζ 電位は，分散媒の pH に依存せら，添加する水の量のみを減らすとサポナイトの過飽和度

ず−40〜−50 mV であったことから，試料表面は永久電荷が大きくなり，その結果結晶子サイズの小さいサポナイトを帯びていると解釈できる。SEM 観察では，球状シリカが成長すると考えられる。

27

粒子の表面から板状の結晶が成長する様子がみられた。静図 7 に“水 0.3”の断面 TEM 像を示す。この像からサポナ

置で反応させた場合，比較的大きな凹凸をもつ粒子は全イトの微結晶は，シリカ球面から放射状に成長する様子

体の 3 割程であった（図 6 左）
。他方，回転させながら反応がわかる。また，シリケート層の重なりは数枚程度と薄(a)

図５ ヘクトライト被覆シリカ粒子の（a）TEM 像（0.2μm）
および（b）SEM 像（0.6μm）

図 6 サポナイト被覆シリカ粒子：
（左）
“静置”
（中）
“回転”
（右）
“水 0.3”の SEM 像− 23 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図 7 サポナイトで被覆した球状シリカ粒子（試料“水 0.3”）の断面 TEM 像

く、この積層に対してシートのサイズは 0.1 − 0.2 mm であ

図 8 疎水性スメクタイトに吸着されたヒノキチオ
ールの n - ヘキサンへの脱着（25℃）の経時変化

表 5 ヒノキチオールの n - ヘキサンへの脱着結果

り，ヘクトライト微結晶（S1 乃至は S2）と比較すると，ち

試料 ※

a

b

R2

ヘクトライト被覆シリカ

380.00110.994

サポナイト被覆シリカ

0.98

0.53

0.998

2C18 2C1N+ の 吸 着 量 は 0.11 mmol/g で あ っ た。 同 様 の 反スメクトン SA

0.95

1.3

0.989

応を市販のスメクタイト（クニピア F，およびスメクトン

クニピア F

1.0

0.74

0.995

密でなく柔軟な構造であることがわかる。
試料“水 0.3”と 2C18 2C1N+ 塩との反応を実施した結果，

SA）およびヘクトライト被覆シリカ粒子（S1）に対しても行+※いずれも 2C182C1N を吸着させ，疎水化した試料である。

い，得られた疎水化物を n- ヘキサンに分散させた。長鎖アルキルアンモニウムで交換したスメクタイトは，n- ヘキ
サンなどの無極性溶媒で容易に膨潤することが知られていいという特徴が現れた。長鎖アルキルアンモニウムで疎水る。市販のスメクタイトの場合では n- ヘキサンに膨潤し，化してもパラフィン系の有機溶媒で膨潤ないしは剥離しづ体積の増加がみられた。一方，サポナイトおよびヘクト

らいため，化粧品素材としてシリケートの剥落残存がない

ライトで被覆したシリカ粒子（それぞれ試料“水 0.3”および等のハンドリング性に優れ，かつ長時間有効成分を保持・

S1）は膨潤しなかった。図 8 にヒノキチオールを吸着した徐放されると期待される。

試料に対する n- ヘキサンの脱着（25 ℃）の経時変化を示す。

４．総脱着平衡濃度（C0）を規格化し，これを指数関数 C/C0 ＝ a

括（1 − e−bt）;（ただし，t は経過時間［h］，a および b は定数）

Ⅰ）スメクタイトの原料（球状シリカ，金属塩，尿素）を添に回帰した。その結果，表 5 の通り脱着速度を表す b 値は，加して温めるだけで，シリカ - スメクタイト複合粒子が市販のスメクタイトで大きいのに対し，サポナイトで被覆得られる。また種々のサイズの球状シリカを用いても実した粒子ではやや減少し，特にヘクトライトで被覆した場現できる。さらに，原料にLiを使用しない系（サポナイト）

合では著しく小さく，ヒノキチオールの脱着がきわめて遅でも合成可能であることが見いだされた。

いことがわかった。市販のスメクタイトでは，n- ヘキサンⅡ）得られる複合粒子には種々のイオン（陽イオン性界面活に膨潤し層間が著しく拡大したことを反映して，ヒノキチ性剤，色素等）との交換特性があり，溶液中でのこの反オールの脱着が速く，一方の被覆粒子では，n- ヘキサンで応において，粒子表面のスメクタイトは剥落しないこと

層間膨潤していると考えられるが，とくにヘクトライトのがわかった。球状シリカと複合化したスメクタイトの微場合，シリカ球面上でち密に結晶化しているため，市販ス

結晶は，シリカ粒子表面と強固に接着しており，水溶液

メクタイトのような無限膨潤は起こらず，これを反映してでの反応においてもハンドリング性に優れたマイクロ粒

ヒノキチオールの脱着が遅いと解釈できる。

子であると期待できる。また，陽イオン性界面活性剤で以上のように，シリカ球面上のスメクタイトの微結晶は，疎水化したシリカ球面上のスメクタイトは，有機分子

陽イオンおよび有機分子のインターカレーション能を示す（例：ヒノキチオール）を吸着した。シリカ球面上においが，従来のスメクタイトにみられるような無限膨潤はしなて，スメクタイト微結晶をち密に成長させた疎水化粒子− 24 −

球状シリカマイクロ粒子とスメクタイト微結晶の複合技術開発

では，有機分子の無極性溶媒への徐放が著しく遅延する11）Okada T, Watanabe Y, Ogawa M, : Photoregulation

ことがわかった。この方法により得られた疎水性スメク

of adsorption behavior of phenol for azobenzene-clay

タイトは，有機溶媒中でもシリケートはほとんど膨潤・intercalation compounds, J. Mater. Chem., 15, 2005, 987-

剥落しないため，ハンドリング性に優れた徐放剤として

992.
12）Yamada H., Nakazawa H, Ito E, Cooling rate

期待される素材である。

謝dependency of the formation of smectite crystals from辞a high-pressure and high-temperature hydrous melt,
Clays Clay Miner., 43, 693-696, 1995.

本研究は，コスメトロジー研究振興財団の援助を受け遂

13）Kloprogge JT, Komarneni S, Amonette JE, :行されました。ここに記して謝意を表します。

Synthesis of smectite clay minerals: a critical review,（文献）

Clays Clay Miner., 47, 529-554, 1999.

１）日本粘土学会編：粘土ハンドブック（第３版）技報堂 ,14）Okada T, Yoshido S, Miura H, Yamakami T, Sakai T,
Mishima S, : Swellable microsphere of a layered silicate

2009.

produced by using monodispersed silica particles. J.

２）Lagaly G, : Characterization of clays by organic

Phys. Chem. C, 116, 21864 -21869, 2012.

compounds, Clay Miner., 16, 1-21, 1981.
３）岡田友彦，: 層状化合物への吸着量，日本油化学会

15）Ogawa M, Matsutomo T., Okada T, : Preparation

編 : 油脂・脂質・界面活性剤データブック，丸善出版，

of hectorite-like swelling silicate with controlled layer

2012, 376-378 頁 .

charge density, J. Ceram. Soc. Jpn., 116, 1309-1313, 2008.

４）Okada T, Ide Y, Ogawa M, : Organic-Inorganic16）Suzuki A, Yoshido S, Okada T, Mishima S :Hybrids Based on Ultrathin Oxide Layers -Designed

Expandable microsphere of a layered silicate produced

Nanostructures for Molecular Recognition, Chem.-by using monodispersed silica particles, Proc. 1 7

Asian J., 7, 1980-1992, 2012.

International Symposium on Intercalation Compounds５）O k a d a T , S e k i Y , O g a w a M , : D e s i g n e dth(MCIC2013), 46-47, 2013;

Nanostructures of Clay for Controlled Adsorption of17）鈴木飛鳥，ほか 3 名，犠牲鋳型法で単分散球状シリカ

Organic Compounds, J. Nanosci. Nanotechnol., 14, 2135-

微粒子に被覆したヘクトライトの陽イオン交換特性，第2147, 2014.

26 回日本セラミックス協会秋季シンポジウム講演要旨

６）小川誠 , 岡田友彦 , : 吸着剤から検出へ，小川誠監修，
機能性粘土素材の最新動向，シーエムシー出版，2010,

集，2A18, 2013.
18）鈴木飛鳥，ほか 3 名，犠牲鋳型法で合成した層状ケイ193-206 頁 .

酸塩−シリカコアシェル粒子への陽イオン性色素の吸着，

７）小川誠，岡田友彦，: 無機層状化合物を用いた分子認識，

第 32 回固体表面光化学討論会講演要旨集，115, 2013.

笹井亮，高木克彦監修，革新機能材料の開発と応用展開，

19）鈴木飛鳥，ほか 3 名，単分散球状シリカへの層状ケイ

シーエムシー出版，2012, 122-138 頁 .

酸塩による被覆に及ほすシリカ粒子径の影響，第 94 日８）O k a d a T , O g a w a M , : 1 , 1 ’ - D i m e t h y l - 4 , 4 ’-bipyridinium-smectites as a novel adsorbent of phenols

本化学会春季年会講演要旨集，3E5-35, 2014.
20）末吉

舞，ほか 3 名，球状シリカ微粒子と Al 含有層

from water through charge-transfer interactions,状ケイ酸塩との複合化，第 94 日本化学会春季年会講演

Chem. Commun., 2003, 1378-1379.

要旨集，2PA-095, 2014.

９）Okada T, Matsutomo T, Ogawa M, : Nanospace21）末吉舞，ほか 3 名，サポナイト様層状ケイ酸塩と球

engineering in methylviologen modified hectorite-like状シリカ粒子との複合化，第 58 回粘土科学討論会講演

layered silicates with varied layer charge density for

要旨集，B5, 2014.

the adsorbents design, J. Phys. Chem. C, 114, 2010, 539-

22）Kloprogge J T, Breulelaar J, Jansen J B H, Geus J W:

545.

Development of ammonium-saponites from gels with

10）Okada T, Watanabe Y, Ogawa M, : Photocontrol

variable ammonium concentration and water content

of the adsorption behavior of phenol for azobenzene-

at low temperature. Clays Clay Miner., 4 1, 1 0 3-1 1 0,

montmorillonite intercalation compound, Chem.

1993.

Commun., 2004, 320-321.

− 25 −

新規リン酸亜鉛白色顔料の粒子サイズ制御

京都府立大学大学院生命環境科学研究科

斧田宏明

Zinc oxide that has the photocatalytic activity is used as white pigment for cosmetics. A certain degree of sebum on theskin is decomposed by the ultraviolet irradiation in sunlight. Recently, as a white pigment, zinc phosphates were preparedfrom zinc nitrate and phosphoric acid. These zinc phosphates indicated large particles in size for cosmetics. Generally,
the kinds of raw materials in preparation process have influence on the chemical composition and powder properties ofmaterials. Therefore in this work, zinc phosphates were prepared from sodium di-hydrogen phosphate and zinc nitrate,
and from sodium triphosphate and zinc nitrate. Further, the obtained phosphates were treated with ball-mill to obtain small
particles. These zinc phosphates had less photocatalytic activity, therefore, these materials are expected not to decompose thesebum on the skin. Samples treated with ball-mill had smaller particles than un-milled sample.

１．緒

子形状に影響が現れることがある。また、機械的な粉砕処

言理を行うことによる粒子の微細化は一般的によく行われて

現在化粧品用白色顔料として用いられている酸化チタン

いる 8）。そこで本研究では、リン源としてこれまで用いてや酸化亜鉛は光触媒活性を有しており、紫外線を含む日光

いたリン酸に替えてリン酸一ナトリウムあるいはトリリン

1）に当たると皮脂を分解する 。そのため、酸化ケイ素によ酸ナトリウムを用いてリン酸亜鉛白色顔料の作製を試みた。

るコーティングなどが行われているが、光触媒活性は残っ

トリリン酸ナトリウム Na5P3O10 は 3 つのリン酸基が直鎖ており、完全に抑制できていない。肌に塗布した時の危険

状に脱水縮合した縮合リン酸塩である。縮合リン酸塩は縮性については様々な報告があるが、その中には酸化チタン

合していないオルソリン酸塩と異なる物性をもつことがあや酸化亜鉛は皮膚内に取り込まれること、RNA や DNA のるため、本研究においても検討を行った。さらに、得られ一部を分解すること、皮膚がんの要因になることなどの報

たリン酸亜鉛白色顔料についてボールミルを用いて微細化

告がある

2−4）

。これらのことを踏まえ、酸化チタンや酸化

を試みた。

5）

亜鉛の安全性に疑問符がつけられている 。以上の事柄は、

２．実程度の問題はあるが、白色顔料を含んだ化粧品の塗布が危
険性をもっていることを示しており、安全な代替物質が求験

2. 1. リン酸亜鉛白色顔料の作製

められている。そこで、私の研究室では、酸化チタン、酸

硝酸亜鉛水溶液とリン酸二水素一ナトリウム水溶液とを化亜鉛に替わる新規白色顔料として、光触媒活性を持たな

Zn/P ＝ 3/2 となるように混合し、アンモニア水を用いて

いリン酸チタン 6）やリン酸亜鉛 7）白色顔料について検討しpH 5 および 7 に調整した。この Zn/P は Zn（PO
3
4）
2 となる

ている。物性を少し改善するのであれば、試料作製後の改ようにしたものである。得られた沈殿をろ過、乾燥するこ質などによって対応可能であるが、本質的に光触媒活性をとによりリン酸亜鉛試料を得た。また、比較のために pH有しない白色顔料を得るためには、これまで利用されてこ調整を行わない試料も作製したが、その時の pH は 3.0 でなかった化合物を開拓していくことが必要である。リン酸

あった。得られた試料について、X 線回折法（XRD）によ

塩は生体親和性を有しており、水を含有しやすい、保水性

り結晶組成を評価した。さらに試料の一部を硝酸に溶解さも期待できる素材である。これまでリン酸亜鉛の作製を行せ、誘導結合プラズマ法（ICP）を用いて試料中のリンと亜ってきたところ、光触媒活性をもたないが、粒子サイズ

鉛の比を算出した。試料の粒子形状は走査型電子顕微鏡

が 10µm 以上となる粒子を多く含んでいた。一般に、試料（SEM）を用いて評価した。また、粒子サイズは遠心沈降作製時の原料を変化させることにより、生成物の組成や粒式粒度分布測定装置を用いて評価した。メチレンブルー分
解反応を利用して、試料の光触媒活性を評価した。

2. 2. 縮合リン酸塩を用いたリン酸亜鉛白色顔料の作製
Pa r t icle size cont rol of novel zinc
phosphate white pigments
Hiroaki Onoda
Faculty of Life and Environmenta lSciences, Kyoto Prefectural University

トリリン酸ナトリウムはリン酸二水素一ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムを 1：2 の比で混合し、400 ℃で 5 時間加熱することにより合成した。得られたトリリン酸ナト
リウムと硝酸亜鉛水溶液とを Zn/P ＝ 5/6 となるように混− 26 −

新規リン酸亜鉛白色顔料の粒子サイズ制御

合し、アンモニア水を用いて pH 7 に調整した。この Zn/P

用しやすい。

は Zn5（P3O10）2 となるようにしたものである。得られた沈Fig. 2 には pH 5 で作製した試料と酸化亜鉛の紫外可視殿をろ過、乾燥することによりリン酸亜鉛試料を得た。試反射スペクトルを示す。酸化亜鉛は可視領域において高い料は 2. 1. に記述した方法と同様に評価した。

反射率を示すものの、紫外光領域では低い反射率となっている。一方、本研究で作製したリン酸亜鉛白色顔料は、紫2. 3. リン酸亜鉛白色顔料の微細化

外領域でも高い反射率を示していた。このことは紫外線か

2.1. の pH 5 において作製した試料をボールミルにより

ら皮膚をまもるための顔料として非常に有用である。

12, 24, 36, 48 時間処理した。ボールミル処理は、溶媒無し、Fig. 3 にメチレンブルーの分解反応を利用した試料の光

水またはエタノール、乳酸ナトリウム水溶液を粉砕助剤と触媒活性を示す。縦軸は吸光度から評価したメチレンブル

した場合について検討した。乳酸ナトリウム水溶液は、水と 70% 乳酸ナトリウムを体積比で 9：1, 7：3, 5：5 で混合した溶液を用いた。試料は 2. 1. に記述した方法と同様に評価した。

３．結果および考察
3. 1. リン酸亜鉛白色顔料の作製
リン酸二水素一ナトリウムを原料として用い、それぞれの pH において作製した試料の XRD の結果を Fig. 1 に示す。
全ての試料がリン酸亜鉛四水和物 Zn（PO34）
2・4 H2O のピークパターンを示した。また、ICP の結果では全ての試料の Zn/P 比が 1.5 付近であった。このことからも試料の主成分がリン酸亜鉛四水和物であることが確認できた。pH
5 で作製した試料は最もピーク強度が強く、結晶が成長していることが分かる。弱酸性である pH 5 で作製した試料が最も結晶性が良いことは、化粧品用顔料として適している。以前に検討を行ったリン酸チタンはアモルファスとな
り、XRD による結晶組成確認ができなかったことに比べると、リン酸亜鉛は結晶組成確認ができるため工業的に利Fig. 2 UV-Vis reflectance spectra of sample prepared at
pH 5（a）and ZnO（b）．

Fig. 1 XRD patterns of samples prepared at various pH,（a）3,（b）5, and（c）7, ○ ; Zn（PO3
4）
2・4H2O.

Fig. 3 Photocatalytic activity of sample prepared at pH 5,（a）blank,（b）ZnO,（c）sample.

− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

ーの残存率となっており、紫外線照射によって残存率が低た。SEM 像では、トリリン酸を原料とした試料は凝集体

下すると光触媒活性があるということになる。酸化亜鉛をを形成しており、粒度分布では 10 µm 以上の大きな粒子用いた場合ではメチレンブルーの残存率が 70% 近くまでが多く存在していた。紫外可視反射スペクトルを測定する

低下しており光触媒活性を有していることが分かるが、リと、紫外線領域も反射しており、オルソリン酸塩を原料とン酸亜鉛試料では残存率が低下しておらず光触媒活性を有した試料と違いが見られなかった。また、メチレンブルー

していないことが分かる。Fig. 3 では代表的な試料についを用いた光触媒活性の評価において、トリリン酸ナトリウてのみ示しているが、本研究で作製した全ての試料が光触ムを原料とした白色顔料は光触媒活性をもたないことが確

媒活性を有していなかった。このことは肌に塗布して紫外認できた。本項目で扱ったトリリン酸ナトリウムを原料と線に当たっても皮脂を分解しない白色顔料として用いるこ

したリン酸塩白色顔料はその組成評価などにおいて更なるとができることを示している。

検討が必要であり、また、凝集体を形成しやすい性質があることは新規白色顔料として適しておらず、改善方法が求3. 2. 縮合リン酸塩を用いたリン酸亜鉛白色顔料の作製められる。

トリリン酸ナトリウムを原料とした試料は unknown のXRD ピークパターンを示した。これは Zn（P
5
3O10）
2 のデー

3. 3. リン酸亜鉛白色顔料の微細化

タベースが存在しないことによると考えられる。試料を少3. 1. においてリン酸二水素一ナトリウムと硝酸亜鉛を量溶かし、ICP により分析すると、Zn/P 比は 0.83 である原料としたリン酸亜鉛について述べてきたが、粒子サイズ

ことが分かった。この値は理論比である Zn/P ＝ 5/6 と一が大きいという欠点があるため、ボールミルによる粉砕処致しており、調製比通りの試料が得られていると考えられ理を行うことにした。Fig. 4 にボールミルにより処理したFig. 4 SEM images of samples treated for several hours（without milling media）,（a）0,（b）12,（c）24,（d）36, and（e）48 hours.

− 28 −

新規リン酸亜鉛白色顔料の粒子サイズ制御

リン酸亜鉛の SEM 像を示す。ミル処理を行う前の試料で（引用文献）

は大きな板状粒子が観察できる。一方、ミル処理を行った

１）Diebold U., The surface science of titanium dioxide,

試料では粒子が小さくなっており、36 時間処理した試料

Surface Science Report, 48, 53-229 (2003).

では板状粒子がほとんど見られなくなった。粒度分布の結２）Bennat C., Muller-Goymann C. C., Skin penetration

果においても、ミル処理により粒子サイズが小さくなって

and stabilization of formulations containing microfine

いることが確認できた。本研究ではさらに粉砕助剤として

titanium dioxide as physical UV filter, Intern. J.

水やエタノールを用いてミル処理を行った。その結果、水Cosmetic Sci., 22, 271-283 (2000).

を溶媒に用いると、12 時間処理の試料において 10 µm 以３）Hidaka H., Horikishi S., Serpone N., Knowland J., In

下の粒子を多く含むのに対し、エタノールを溶媒とした場

vitro photochemical damage to DNA, RNA and their

合では、10 µm 以下の粒子が少なかった。また、高濃度のbases by an inorganic sunscreen agent on exposure to

乳酸ナトリウム水溶液を粉砕助剤として用いることにより、

UVA and UVB radiation, J. Photochem. Photobiology,

単分散に近い 3 µm 以下の小さな粒子サイズをもつ顔料を得ることができた。

A., 111, 205-213 (1997).
４）Dunford R., Salinaro A., Cai L., Serpone N., Horikoshi

４．総S., Hidaka H., Knowland J., Chemical oxidation and括

DNA damage catalysed by inorganic sunscreen
ingredients, FEBS Letters, 418, 87-90, (1997).

本研究では、硝酸亜鉛とリン酸二水素一ナトリウムおよびトリリン酸ナトリウムを原料としてリン酸亜鉛白色顔料

５）Skocaj M., Filipic M., Petkovic J., Novak S., Titaniumを得た。この白色顔料は、紫外線照射時の光触媒活性をもdioxide in our everyday life; is it safe?, Radiol Oncol,
45, 227-247 (2011).

たず、近紫外領域の光を反射することが分かった。作製時
点の顔料は板状の大きな粒子形状となっていたが、ミル処

６）Onoda H., Yamaguchi T., Influence of ultrasonic

理することにより小さな粒子となることが分かった。さらtreatment on preparation and powder properties ofに、粉砕助剤として、高濃度の乳酸ナトリウム水溶液を用

titanium phosphates, J. Mater. Chem., 2 2 ( 37), 1 9 8 2 619830 (2012).

いることにより、単分散に近い小さな粒子サイズをもつ顔

７）Onoda H., Haruki M., Toyama T., Preparation and

料を得ることができた。

謝

powder properties of zinc phosphates with additives,辞

Ceram. Intern., 40 (2), 3433-3438 (2014).

本研究の遂行に当たりコスメトロジー研究振興財団より

８） Taufiq-Yap Y. H., Goh C. K., Hutchings G. J.,
Dummer N., Bartley J. K., Influence of milling media

ご援助頂きましたことを深く感謝申し上げます。

on the physicochemicals and catalytic properties ofmechanochemical treated vanadium phosphate, Catal.
Lett., 141 (3), 400-407 (2011).

− 29 −

紫外線カットマイクロカプセルの作製

横浜国立大学大学院工学研究院

金井俊光

Protection reagents against ultraviolet lights based on the Bragg reflection at the optical stop band of colloidal photonic
crystals were examined. We found that the colloidal crystals composed of monodisperse polystyrene particles with theparticle diameter of 160 nm could reflect the lights below the wavelength of 400 nm. In addition, we examined a method for
preparation of microcapsules with the colloidal crystal shells by microfluidic techniques.

１．緒

系紫外線吸収剤が対象であり、高い紫外線吸収能力を有し、言かつ分解されにくい新しい物質開発が進められている。し太陽光に含まれる有害な紫外線から身を守るために、サかしながら特に UV-A を防御する安定で安全性の高い有ンスクリーン剤が開発され、使用されている。現在のサン機系紫外線吸収剤の開発は難しく、さらに仮に新物質を開スクリーン剤には、一般的にオクトクリレンに代表される発したとしても、最終的に厚生労働省の認可が下りるには

有機系物質と、酸化チタン、酸化亜鉛などの無機系ナノ粒

少なくとも十数年はかかるといわれており、そのハードル子が含まれており、これらの物質が太陽からの紫外線を主は高いのが現状である。

に吸収することにより防御している。しかしながら有機系

そこで本研究では、これまでほとんど検討されていない

紫外線吸収剤は紫外線を吸収すると同時に分解する性質が反射による紫外線防御方法について検討し、紫外線吸収剤

あり、時間とともに紫外線吸収能力は低下する。さらに有の含有量をできる限り低減させた安心、安全なサンスクリ機系吸収剤はアレルギーを引き起こすことがあり、乳幼児ーン剤の開発を行うことを目的とした。具体的には、従来や敏感肌には適さないことがある。実際、乳幼児向けに有行われているカプセル化技術を発展させ、カプセルのシェ

機系吸収剤を含まない無機系のみのサンスクリーン剤もル部分に紫外線を反射する機能を持たせることを検討する。

市販されてはいるが、SPF（Sun Protection Factor）の値

カプセル表面で自然と起こる光散乱による弱い紫外線カッが小さく、また無機系ナノ粒子は皮膚の油分を吸収する性トの効果はよく知られているが、積極的に紫外線をカット質があるため、肌が乾燥しやすく、やはり乳幼児や敏感肌する機能をカプセルに付与させた報告例はない。本研究でには適さない場合がある。さらに最近、ナノ粒子（粒径 50はシェル材料として我々がこれまで研究を行っているコロ

nm 程度以下）については、人への有害影響を懸念させる

イドフォトニック結晶 の光学ストップバンドで起こるブ研究報告が次々と発表されている。例えば、マウスを用い

ラッグ反射による強い反射を利用することを検討した。コた実験では脳細胞や肝細胞を損傷するなどの報告もなされ

ロイドフォトニック結晶は可視光領域にストップバンドをており、ナノ粒子の使用には不安が残る。

持つように設計するのが一般的であるが、本研究ではより

1）

防御すべき紫外線には、波長域 280 ～ 320 nm の UV-B

小さな粒径のコロイド粒子を用いることにより、紫外光、と波長域 320 ～ 400 nm の UV-A がある。かつてはエネル

特に UV-A 光をカットできる結晶を作製する。これによ

ギーの大きい UV-B の防御が主であったが、近年、UV-A

り紫外線により劣化しにくい安全性の高い紫外線防御材の防御の重要性が指摘されている。波長の長い UV-A はエ開発を行うことを試みた。

ネルギーは小さいものの肌の深部にまで到達でき、長時間

２．実浴び続けると硬く深いしわやたるみができる光老化を誘発する。さらに深刻になると皮膚がんにまで至ることがわか験

2. 1. UV-A 領域（320 ～ 400 nm）に光学ストップバンドを持つコロイド結晶の設計・作製っている。これまでのサンスクリーン剤の開発は主に有機

一般的にこれまでのコロイドフォトニック結晶は、ディスプレイや光通信用デバイスへの応用を目指して、可視光や赤外光領域に光学ストップバンドを持つように設計・作
Preparation of ultraviolet lights protective
microcapsules
Toshimitsu Kanai
Faculty of Eng ineer ing, Yokoha ma
National University

製されている。本研究では、UV-A 領域（320 ～ 400 nm）の
紫外光をカットするため、UV-A 領域に光学ストップバンドを持つコロイド結晶を設計し、実際にコロイド結晶を作製した。コロイド結晶の粒子配列は、最密結晶面が界面− 30 −

紫外線カットマイクロカプセルの作製に対して平行に配列する場合が最もエネルギー的に安定であり、今回、最密結晶面に起因する光学ストップバン
ド波長の計算を行った。図 1 には、ポリスチレン微粒子からなるコロイド結晶について計算した最密結晶面に起因する光学ストップバンド波長の粒子直径依存性を示す。
この図より 320 ～ 400 nm に光学ストップバンドを持つためには、直径 140 ～ 170 nm 程度の粒子を用いる必要がある。そこで、本研究では直径 160 nm のポリスチレン微粒子（ThermoFisher Sci. 製）を用いてコロイド結晶を作製し、紫外線反射特性を評価した。

2. 2. 大きさ 10μm のマイクロカプセル形成用マイクロ流体デバイスの作製
我々はこれまでマイクロ流体デバイスを用いてコロイド結晶をシェルに持つ数百 mm 程度の単分散マイクロカプセ

図１ ポリスチレン粒子からなるコロイド結晶における光学ス
トップバンド波長の粒子直径依存性2）ルの作製に成功している 。本研究では流路の内径を小さくすることにより、大きさ 10 mm 程度の微小な単分散マ
イクロカプセルの作製を試みた。マイクロピペットプラー
やマイクロフォージを用いて、ガラスキャピラリーの内径が 1 ～ 5 mm 程度になるようにテーパー加工し、キャピラ
3）

リーを組み合わせてデバイスを作製した 。

2. 3. 大きさ 10μm のコロイド結晶シェルマイクロカプセ
ルの作製
作製したダブルエマルション形成用マイクロ流体デバイ
スに、各相を流入させ、コロイド結晶をシェルに持つマイクロカプセルの作製を試みた。内側流路からコアとなるシ
リコーンオイルを流入させ、中間流路からシェルとなる

図２ 直径 160 nm のポリスチレン微粒子からなるコロイド結晶の垂直反射スペクトル

直径 160 nm のポリスチレン微粒子の水分散液を流入させデバイスに流入させた。水相‐油相界面を安定化させるた3. 2. 大きさ 10μm のマイクロカプセル形成用マイクロ流体デバイスの作製

め、シェル相と連続相には界面活性剤を添加した。3 液体

マイクロピペットプラーによりガラスキャピラリーを引の流量をシリンジポンプを用いて制御して流入させること

き伸ばし、さらにマイクロフォージを用いて慎重に流路内で、シリコーンオイルコア‐コロイド分散液シェルからな

径を調整した。試行錯誤の結果、3 mm の内径を持つ流路

るマイクロカプセルを作製した。その後、コロイド分散液を作製できるようになった。図 3 にはこのキャピラリーを内の水分を蒸発させることでコロイド結晶化させ、コロイ用いたマイクロ流体デバイスによるドロップ形成過程の写

ド結晶をシェルに持つマイクロカプセルの作製を試みた。

真を示す。分散相、連続相の流速条件を検討することによた。連続相としてシリコーンオイルを用い、外側流路からり最小で直径 5 mm 程度の単分散ドロップが作製できた。

３．結果と考察3. 1. UV-A 領域（320～400 nm）に光学ストップバンドを持つコロイド結晶の設計・作製

3. 3. 大きさ 10μm のコロイド結晶シェルマイクロカプセ
ルの作製

図 2 には、直径 160 nm のポリスチレン微粒子を用いてまずカプセルに内包する油滴の作製を試みた。上述のデ作製したコロイド結晶の垂直反射スペクトルを示す。約

バイスを用いて内側流路からシリコーンオイルを、外側流

370 nm に半値幅約 20 nm の反射ピークが現れ、計算通り

路から界面活性剤（ 2 %、Tween20）を添加した超純水を流のコロイド結晶が得られることを確認した。

入させた。2 液体の流量を調整することにより、油滴の大きさを制御することができた。特に外側流路の流量を上げることで油滴サイズを小さくでき、最終的には図 4 に示す− 31 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図４

マイクロ流体デバイスにより得られた単分散油滴の写真

図３ （a）デバイス内での単分散ドロップ形成過程の写真、（b）得られた単分散ドロップの写真

ように、直径 6 mm、CV 値 6.5% の単分散油滴を得ることができた。
次にシェル部分となるコロイド結晶の作製について検討した。まず直径 160 nm のポリスチレン微粒子の水分散液を超純水で希釈し、0.08 vol% とした。これをマイクロ流

図５ （a）コロイド粒子水分散液の液滴形成過程の写真、（b）乾燥後のコロイド結晶の写真体デバイスの内側流路から流入させ、外側流路から界面活性剤（2 %、DC-749）を添加したシリコーンオイルを流入させた。2 液体の流量を調整することにより、図 5（a）のようの界面活性剤濃度を増加させる必要がある。しかしそれにに直径約 100 mm の水滴が形成できた。その後、水分を蒸よりシェル相の安定性が悪くなり、有効な界面活性剤の種

発させ乾燥することでコロイド結晶化が可能であった。そ類と濃度が決定できなかった。我々は以前、数百 mm 程度の結果、図５（b）に示すように直径 5 mm 程度のコロイド結の単分散マイクロカプセルの作製に成功しているが、今回晶が作製できた。

の実験とは適切な界面活性剤濃度が異なっていると考えら

上述の油滴とコロイド結晶の作製を 1 つのダブルエマル

れ、最適な作製条件を見い出す必要がある。

ション形成用デバイス内で行うことで、油滴コア‐コロイ

以上のように、本研究では直径 160 nm のポリスチレン

ド結晶シェルからなる直径 10 mm 以下の単分散マイクロ

微粒子からなるコロイド結晶により、UV-A 領域の紫外光カプセルの作製を試みた。内側流路からコアとなるシリコをカットできることを示した。また内径 3 mm の流路を持ーンオイルを、中間流路からシェルとなるコロイド水分散

つガラスキャピラリー型デバイスの作製に成功し、直径

液を、外側流路からシリコーンオイルを流入させた。3 液

6 mm、CV 値 6.5% の単分散油滴を作製できることを示し

体の流量を調整することでコア油滴がコロイド液滴に内包た。さらに希釈したコロイド分散液をデバイス内に流動さされたカプセルを形成できた。しかしながら、流路途中でせ、液滴形成後、乾燥によりコロイド結晶化できることをコア油滴がシェルから抜け出てしまい、油滴を内包した安示した。しかしながらコロイド結晶シェル内に油滴を安定定なマイクロカプセルの作製には至らなかった。コア油滴に内包することはできなかった。当初の目的であったコロを安定してカプセル内に閉じ込めるためには、シェル相内

イド結晶をシェルに持つマイクロカプセルの作製には至ら− 32 −

紫外線カットマイクロカプセルの作製なかったが、界面活性剤の選択や濃度調整、またグリセリ

以外の形状の紫外線カット粒子の開発を行いたいと考えてン添加による粘度増加により、油滴を安定化できる可能性いる。

がある。またカプセル形状以外にも球形や板状でも UV-A
カット材料としては機能すると考えられ、今後はこれらの（引用文献）

紫外線カット粒子の開発も行いたいと考えている。

１）Kanai, T., Sawada, T., Toyotama, A., Kitamura, K.:

４．総Air–Pulse–Drive Fabrication of Photonic Crystal Films

括of Colloids with High Spectral Quality, Adv. Funct.
Mater., 15, 25-29, 2005.

サンスクリーン剤は人体に有害な紫外線から身を守るものであるが、そのために人体に悪影響を与える可能性のあ２）Kanai, T., Lee, D., Shum, H. C., Shah, R. K., Weitz,

る物質を用いるのは、本末転倒である。本研究課題は、こD. A.: Gel-Immobilized Colloidal Crystal Shell

れまで開発されていない反射による紫外線防御方法を検討

with Enhanced Thermal Sensitivity at Photonic
Wavelengths, Adv. Mater., 22, 4998-5002, 2010.

した。カプセル化には課題が残ったが、コロイドフォトニ
ック結晶を用いて UV-A 光をカットできることは明らか

３）Kanai, T., Lee, D., Shum, H. C., Weitz, D. A.:になった。そのため、本結晶は UV-A カット材料として

Fabrication of Tunable Spherical Colloidal Crystals

機能すると考えられ、今後は内包物質の安定化やカプセル

Immobilized in Soft Hydrogels, Small, 6, 807-810, 2010.

− 33 −

加熱加水分解法を用いた紫外線吸収能を有するカルシウムヒドロキシアパタイト粒子の新規調製法の開発とそのキャラクタリゼイション
大阪教育大学教育学部

神鳥和彦

Ti and Ce ions doped calcium hydroxyapatite (TiHap and CeHap) particles were produced by aging Ca(OH)2, TiCl4(or CeCl3) and sodium triphosphate (sodium tripolyphosphate, Natpp: Na5P3O10) mixed solution at 100°C for 18 h. The
ellipsoidal secondary particles with ca. 100~150 nm in length composing by aggregation of small ellipsoidal primaryparticles with ca. 20 nm in length were produced at atomic ratio of Ti/(Ca+Ti) [XTi] ≦ 0.2. The in-situ IR spectra of these
TiHap particles exhibited very small bulk OH − band at 3570 cm−1. This result indicated that the TiHap particles were
produced by aggregation mechanism and OH− ions along with c-axis in the poorly crystallized primary particles weredisordered. The diffuse reflectance UV spectra of TiHap particles revealed that these particles have a UV absorption property,
especially produced at XTi=0.1. The morphology of the particles produced with CeCl3 was changed to rod-like with ca.
50~100 nm in width and 100~300 nm in length at 0.1 ≦ XCe ≦ 0.2. Furthermore, particle shape varied to needle-like at 0.4 ≦XCe ≦ 0.8 and finally fine spherical particles with 5~10 nm in diameter were precipitated at XCe=1.0. The XRD patterns of
the particles indicated that highly crystallized pure CeHap particles are produced at XCe ≦ 0.2. On the contrary, the needlelike and very fine spherical particles precipitated at XCe=0.4~1.0 were identified as CePO4. The time resolved TEM and
XRD measurements suggested that the rod-like large CeHap particles are produced by the Ostwald ripening mechanism. The
diffuse reflectance UV measurement indicated that CeHap particles have a UV absorption property, especially produced at
XCe=0.15.

１．緒成を目指した。

言

２．実

我々はこれまでに、単分散コロイド粒子は非常に微細なクラスター粒子が集合して生成する、いわゆる凝集機構に験

今回はドープする元素として Ti ならびに Ce を検討した。

よることを明らかにしてきた 1−2）。そこで、このように微粒子の調製は、Ca2+ と Ti4+ を総量 10 mM、原子比 XTi=Ti/

細な一次粒子の凝集速度をコントロール出来れば、得られ（Ca+Ti）=0 〜 1.0 になるように Ca（OH）2 と TiCl4 を脱炭酸る粒子の形態と大きさを任意にコントロールすることが出

水に溶解し、さらにトリポリリン酸ナトリウム（NaTPP;

来るものと期待される。今回取り上げる無機粒子は金属リ

P3O105−：以下 TPP と略記する）の濃度が 1 mM になるよう

ン酸塩の１つであるリン酸カルシウムで、生体親和性の高に調整した水溶液 20 mL を、テフロンキャップ付き試験管

い物質として古くから知られているカルシウムヒドロキシ中で 100 ℃、18 時間熟成して行った。ここで、Ca（OH）
2

アパタイト（CaHap）である。これは人工骨、人工歯根等

水溶液は使用前にミリポアフィルターでろ過したものを用の他に触媒あるいは吸着剤などに使われているバイオセラ

いた。一方 Ce の場合は、CeCl3 を用いて、XCe=Ce/（Ca+Ce）

ミックスである。近年我々は、Ti や軽ならびに重希土類=0 〜 1.0 の範囲で、その他の条件は Ti と同様にして行った。

元素をドープした CaHap 粒子の調製に成功し、これが強また、反応前後の溶液の pH を室温で測定した。得られた

3−5）

い紫外線吸収能を有することを見出している。しかし、粒子はミリポア水で十分にろ過、洗浄を行い空気中 40 ℃

それらの粒子の合成はオルトリン酸またはオルトリン酸塩

で乾燥した。粒子のキャラクタリゼイションは、TEM、をリン酸源として用いてきたため、反応速度が大変速く、

XRD、TG-DTA、FTIR、N2 および H2O 分子吸着測定から凝集機構による粒子のモルフォロジーを制御する事は出来行った。また粒子ならびに反応溶液中の Ca, Ti, Ce と P のなかった。 今回、縮合リン酸塩の加熱加水分解法を用いて、濃度は ICP−AES によって測定した。

反応速度を制御し形態を制御した Ti や Ce をドープした紫３．結果と考察

外線吸収能を有し生体に優しい CaHap 白色顔料粒子の合3. 1. Ti 添加系について
Preparation and Characterization ofCalcium Hydroxyapatite Particles with
UV Absorption Property From Forced
Hydrolysis Reaction
Kazuhiko Kandori
School of Chemistry, Osaka Universityof Education

Fig. 1 に様々な XTi で得られた粒子の TEM 写真を示した。
XTi=0 では前報 6）と同様に約 20 nm 程度の楕円体形一次粒子が凝集して約 100 nm 程度の楕円体形二次粒子が得られた。XTi の増加とともに、0.2 まで一次、二次粒子の大きさ
は大きく変化しないものの、0.4 以上では大変微細な粒子へと変化した。Fig. 1 中の左下にある数字は、溶液の反応− 34 −

加熱加水分解法を用いた紫外線吸収能を有するカルシウムヒドロキシアパタイト粒子の新規調製法の開発とそのキャラクタリゼイション

Fig. 1 TEM micrographs of the particles produced at various XTi values. The upper and lower values in the picture represent pHvalues before and after the reaction，respectively.

前（上段）と反応後（下段）の溶液の pH である。TPP の加水分解は以下の式（1）、（２）で表されるように、H+ が生成する。
P3O105−＋ 2H2O → 3PO43−＋ 4H+（1）

2P3O105−＋ H2O → 3P2O74−＋ 2H+（2）

したがって、反応後の pH が低下していることから、TPP
は加水分解したものと考えられた。Fig. 2 は、XTi が 0.2までの一次、二次粒子の平均短軸長と長軸長を XTi に対してプロットしたものである。TEM でも見られた様に、
XTi=0.2 まで大きな変化は見られず、一次粒子の凝集体であることが分かった。
Fig. 3（a）には、様々な XTi で得られた粒子の XRD パターンを示した。XTi=0 〜 0.4 では Hap に特有な回折パターンのみが得られているが、XTi=0.4 ではその強度は大変弱くなった。この結果から、XTi=0 〜 0.4 では CaHap の Ca

Fig. 2 Particle and crystallite sizes of the particles produced
at various X Ti values. The particle lengths（ □ . ○ ） andwidths（■，●），respectively. The symbols（□，■）and（○，●）are the results from secondary and primary particles，
respectively. The crystallite sizes from（002）（△）and（300）（▲）faces are also plotted by dotted lines.

原子の一部がTi原子に置換したチタンアパタイト（TiHap）が生成したことが分かった。また、XTi=1.0 ではアナター

で示した。
（002）
、
（300）面はそれぞれ c 軸方向、a, b 軸方

ゼ型の TiO2 の回折パターンが得られているが、その回折向を代表している。この図より、（002）、（300）面から得パターンはブロードで、粒子の結晶性は低いことが示唆さられた結晶子径は一次粒子の長軸長、短軸長と良く一致しれた。この結果は、TEM 写真で粒子が 5 nm 程度の非常にている。このことは、楕円体の TiHap 一次粒子は単結晶

小さなものであることと良く対応している。XTi=0 〜 0.2

であることを意味している。このことから、単結晶の一次で得られた TiHap 粒子について、（002）面と（300）面から粒子が凝集して楕円体の二次粒子となって TiHap 粒子がScherrer の方法で結晶子径を求め、Fig. 2 中に破線（△、▲）生成していることが分かった。

− 35 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Fig. 3 （a）XRD patterns of the particles produced at various XTi values together with those after
treated at 1000℃ for 2h on the particles produced at XTi ＝ 0.4 and 1.0. （b）XRD patterns of theparticles produced at XTi ＝ 0.15 before and after treated at 1000℃ for 2h.

Fig. 4TG-DTA curves of the particles produced at various XTi values.

Fig. 4 には、様々な XTi で得られた粒子の TG−DTA 曲とを示唆している。

線を示した。XTi=0 〜 0.2 の TiHap 粒子では室温から 400℃までの結晶水・結合水の脱離による TG の減量は小さかCa10（PO4）
6（OH）
2 → 3 Ca（PO34）
2 ＋ CaO ＋ H2O

った。また、XTi=0 〜 0.05 では 800 ℃付近から TG に減量と DTA に吸熱ピークが現れていた。一方、XTi=0.1 〜 0.2

すなわち、Fig. 4 の DTA 曲線において 800 ～ 950 ℃で現れでは 950 ℃に TG の減量と DTA に吸熱ピークが見られた。

た吸熱ピークは、H2O の脱離によるものであることが分っFig. 3（b）には、XTi=0.15 で得られた粒子と、さらにそのた。XTi=0.4 〜 1.0 では、粒子の微細化にともなって、400

粒子を 1000 ℃で 2 時間処理した粒子の XRD パターンを℃までの吸着水の脱離にともなう TG の大きな減量と 800示した。非加熱では Hap に由来するパターンのみが見ら℃付近に TiO2 への結晶化にともなう発熱ピークが見られれるが、加熱処理した粒子では、Hap の他に、Ca（PO3
4）
2,

た。Fig. ３（a）には XTi=0.4 と 1.0 で得られた粒子を 1000 ℃

CaO, TiO2 のパターンが現れていた。この結果は、TiHap

で 2 時間処理したもののパターンも示した。このように、の主成分である CaHap において次式の反応が起こったこ

い ず れ も Ti0.936O2, Ca3（PO4）2, TiO2,Ti0.72O2, Ti5O（PO44）
4− 36 −

加熱加水分解法を用いた紫外線吸収能を有するカルシウムヒドロキシアパタイト粒子の新規調製法の開発とそのキャラクタリゼイション

等の結晶相 8）が確認でき、DTA の結果と良く対応した。

に凝集していることを示唆している。SN は XTi ≧ 0.4 で突

Table 1 には、ICP − AES で分析した粒子中の金属元素

然大きく上昇し、XTi=1.0 では 400 m2/g となる。この SN のの濃度をまとめた。Ca と P の濃度はいずれも理論値より増加も、粒子の微細化によるものである。同様な傾向はも小さく、特に P においてその傾向は強く見られた。こSw においても見られた。したがって、Sw/SN 比もほぼ 1 前のことは、P が TPP の加水分解から生成するため、どう後と水分子選択吸着性は見られなかった。

しても低くなっているものと考えられた。また、Ca と P

Fig. 6（a）には XTi=0 〜 0.2 で得られた TiHap 粒子のセル

は XTi の増加とともにいずれも低下していた。これは、Ti

フサポーティング法で測定した in-situ IR スペクトルを示が TPP の加水分解を阻害したためと考えられる。粒子した。XTi=0 には内部 OH －イオンの吸収が 3570 cm−1 に現中の XTi の値は、出発溶液組成のそれよりも大きかった。

れ、3650 cm− 1 にわずかに表面 P − OH の吸収が見られた。

XTi=0.15 で得られた粒子を 1000 ℃で処理した後 TiO2 が生

これらは、石川らが報告している 3659, 3673, 3682 cm−1 に成したことから、非晶質な TiO2 が含まれているため、XTi

現れる表面 P − OH の１つが現れているものと思われる 7）。

の値が高くなったと考えられる。
（Ca+Ti）/P の値も化学量

XTi が増加すると 3570 cm− 1 の吸収は弱くなり、表面 P −論比である 1.67 よりも高い。これは、いずれも TPP の加

OH の吸収は 3674 cm− 1 に現れるようになった。これらの水分解が生じにくいため、粒子内への P の取り込みが少な

結果は、一次粒子が小さく c 軸方向への OH －イオンの配向いからと考えられる。

性が非常に低下するとともに、表面 P − OH の状態も大きFig. 5 には、100 ℃で前処理した粒子の N2 ならびに H2O

く変化していることを表している。XTi ≧ 0.1 のサンプル

分子吸着実験から求めた比表面積（それぞれ SN, Sw と略記

ではわずかに 3737 cm− 1 に表面 Ti − OH の吸収が現れ、Tiする）とその比（Sw/SN）を示した。SN 値は XTi=0 で 80 m2/原子のドーピングが確認できる。

g であり、S=6/Dρ の式で球状粒子の直径 D=20 nm、密度

我々は前報で、TiHap が 600 ℃で熱処理することで、強ρ=3.16 g/cm3 と仮定して算出した S 値 95 m2/g と良く一致い光触媒性を発現するのは、Ti ドープによるトンネル構していた。このことは、一次粒子が二次粒子の中でルーズ造の拡張や電場の変化によって摂動を受けた新たな内部

Table 1 Results of elemental analysis for the TiHap particles
produced at XTi=0 〜 0.2.

Fig. 5 Specific surface area of the particles produced at various XTi values measured by N2（SN）and H2O（Sw）adsorption
experiments and their ratios.

− 37 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Fig. 6 （a）In-situ IR spectra of the TiHap particles produced at XTi=0 〜 0.2 and（b）in-situ IR spectra of
the TiHap particle precipitated at XTi ＝ 0.15 before and after treated at 600℃ for 2h.

OH － イオンが生成するためであると報告した 10）。そこで、その点を明らかにする目的で、XTi=0.05 で得られた粒子を600 ℃で 2 時間熱処理した粒子の in-situ IR スペクトルを測定し、Fig. 6（b）に示した。確かに、前報と同様に 3435
cm−1 に吸収ピークが出現したが、その強度は大変小さい。
これは、一次粒子が小さいため、非加熱粒子においてもす
でに内部 OH － イオンの吸収が小さく、熱処理による効果が現れにくいためと思われる。
さらに、XTi=0 〜 0.2 で得られた TiHap 粒子の紫外線吸収能を調べるため、拡散反射 UV 測定を行った。その結果を Fig. 7 に示した。Ti 原子を全く含まない CaHap（XTi=0）
では全く吸収が見られないが、XTi ≧ 0.05 のサンプルでは、いずれも 240－380 nm に O2−→ Ti4+ の電荷移動による吸収が現れ、特に XTi=0.1 のサンプルでは他の粒子の 2 倍の吸Fig. 7 Diffuse reflectance UV spectra of the TiHap particles
produced at XTi=0 〜 0.2.

収が見られた。また、その吸収端波長からバンドギャップを見積もったところ、3.9−4.1 eV であった。これらのこと

分解したものと考えられた。

から、今回得られた TiHap 粒子の内、XTi=0.1 のサンプル

Fig. 9 には、様々な XCe で得られた粒子の XRD パター

が最も高い紫外線吸収能を有することが分かった。

ンを示した。XCe=0 〜 0.2 では Hap に特有な回折パターン

3. 2. Ce 添加系についてパターンが表れ、その強度は XCe の増加とともに強くシのみが得られているが、XCe=0.4 以上では CePO4 の回折
Fig. 8 に様々な XTi で得られた粒子の TEM 写真を示した。
7）

ャープになった。この結果から、XCe=0 〜 0.2 では CaHapと同様に約 20 nm 程度の楕円体形一次粒の Ca 原子の一部が Ce 原子に置換したセリウムアパタイ

子が凝集して約 100 nm 程度の楕円体形二次粒子が得られト（CeHap）が生成し、XCe=0.4 ～ 1.0 では CePO4 が生成すた。XCe の増加とともに、0.2 まで板状粒子となり大きさもることが分かった。この結果は、TEM 写真で板状粒子が大きくなった。さらに XCe が 0.4 以上では細長い棒状粒子

CeHap、棒状粒子ならびに微細粒子が CePO4 であること

XCe=0 では前報へと変化し、XCe ＝ 1.0 では大変微細な粒子へと変化した。

を示唆している。前回の中間報告でXTi が0.6以上でTiO（ア2

なお、XCe が 0.2 までの大きな板状粒子にも一部 XCe ＝ 1.0

ナターゼ型）が生成したのに対して、今回 CePO4 が生成しで見られる小さな粒子が存在した（図中矢印）。Fig. 8 中にたのは、Ce イオンが 3 価であり、PO43 −イオンと反応し易示した反応後の pH が低下していることから、TPP は加水

いためと考えられる。すなわち、Ti と Ce イオンの価数の− 38 −

加熱加水分解法を用いた紫外線吸収能を有するカルシウムヒドロキシアパタイト粒子の新規調製法の開発とそのキャラクタリゼイション

Fig. 8 TEM micrographs of the particles produced at various XCe values. The upper and lower values
in the picture represent pH values before and after the reaction，respectively.
Table 2 Results of elemental analysis and crystal form of the particles
produced at various XCe values.

Fig. 9 XRD patterns of the particles produced atvarious XCe values.

は、P が TPP の加水分解から生成するため、低くなった

違いが大きく影響したものと考えられる。
Table 2 には、ICP − AES で分析した粒子中の金属元素ものと考えられる。この点は前報の TiHap と全く同様での濃度をまとめた。Ca と P の濃度はいずれも理論値よりある 6）。また、Ca と P は XCe の増加とともにいずれも低下も小さく、特に P においてその傾向は強く見られた。これしていた。これは、Ce が TPP の加水分解を阻害したため− 39 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015と考えられる。粒子中の XCe の値は、出発溶液組成のそれよりも大きかった。
（Ca+Ti）/P の値も化学量論比である
1.67 よりも高い。これは、Ti 添加系と同様に、いずれもTPP の加水分解が生じにくいため、粒子内への P の取り込みが少ないからと考えられる。
Fig. 10 に は XTi=0 〜 1.0 で 得 ら れ た CeHap な ら び に
CePO4 粒子のセルフサポーティング法で測定した in-situ
IR スペクトルを示した。XCe=0 には内部 OH － イオンの吸収が 3570 cm− 1 に現れ、3648 cm−1 にわずかに表面 P −OH の吸収が見られた。これらは、石川らが報告している
3659, 3673, 3682 cm−1 に現れる表面 P−OH の１つが現れているものと思われる 7）。XCe が増加すると 3570 cm−1 の吸収は弱くなり、XCe ≧ 0.6 で生成した CePO4 粒子では消失し、表面 P − OH の吸収が 3637 ～ 3669 cm−1 に現れるようになった。これらの結果は、一次粒子が小さく c 軸方向への OH － イオンの配向性が非常に低下するとともに、表面 P − OH の状態も大きく変化していることを表している。

Fig. 10 In-situ IR spectra of the particles produced atvarious XCe values.

さらに、XCe=0 〜 0.2 で得られた CeHap 粒子の紫外線吸収能を調べるため、拡散反射 UV 測定を行った。その結果をFig. 11 に示した。Ce原子を全く含まないCaHap（XCe=0）では全く吸収が見られないが、XCe ≧ 0.05 のサンプルでは、いずれも 240 － 400nm に O2 − → Ce3+ の電荷移動による吸収が現れ、特に XCe=0.15 のサンプルで最も強い吸収が見られた。また、その吸収端波長からバンドギャップを見積もったところ、3.2 〜 3.3 eV であった。これらのバンド
ギャップは TiHap の 3.9 〜 4.1 eV と比較すると少し低いが、CeHap 粒子もかなり高い紫外線吸収能を有することが分かった。一方、XCe ≧ 0.4 の CePO4 粒子では吸光度は 0.1 以下となり、ほとんど紫外線吸収能が無いことがわかった。

謝

辞本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりご支援いただきましたことを深く感謝申し上げます。

Fig. 11 Diffuse reflectance UV spectra of the particles
produced at various XCe values.

（引用文献）

Surfaces A., 393, 53-59, 2012.

１）Kandori K, in“Surface and Colloid Science, Second５）Yasukawa A, Kandori K, Tanaka H and Goto K,

Edition" Auther Hubbert ed., Taylor & Francis: New

Preparation and structure of calcium hydroxyapatite

York, 2006; 4, pp. 3126 - 3138.

substituted with heavy rare earth ions, Materials
Research Bulletin, 47, 1257-1263, 2012.

２）球状金属リン酸塩粒子のサイズ制御とそのキャラクタ

６）K a n d o r i K , a n d M a t s u i M , P r e p a r a t i o n a n d

リゼイション，色材，72, 301(1999)．
３）W a k a m u r a M , H a s h i m o t o K , W a t a n a b e T ,characterization of calcium hydroxyapatite from

Photocatalysis by calcium hydroxyapatite modified

forced hydrolysis of Ca(OH) 2-Triphosphate-HCl Mixedwith Ti(IV): albumin decomposition and bacterial effect,

Solution, Phosphorus Research Bulletin, 28, 37-44 (2013).

Langmuir 19, 3428-3431, 2003.

７）Ishikawa T, Wakamura M, Kondo S, Surface４）Yasukawa A, Goto K, Tanaka H and Kandori K,

characterization of calcium hydroxylapatite by Fourier

Preparation and structure of calcium hydroxyapatite

Transform Infrared spectroscopy, Langmuir, 5, 1 4 0-

substituted with light rare earth ions, Colloids and144, 1989.

− 40 −

両生類皮膚由来機能性生体分子の網羅的探索

国立研究開発法人産業技術総合研究所健康工学研究部門

茂里康

Twelve novel peptides (Pxt-1 - Pxt-12) were isolated from the skin of Xenopus tropicalis using topological mass
spectrometry analysis. Among them, Pxt-8, Pxt-9, and Pxt-10 were N-terminus of Pxt-1, N-terminus of Pxt-3, andC-terminus of Pxt-11, respectively. The Pxt-3 and Pxt-11 peptides shared significant sequence homologies with magainins
1, 2 and levitide, respectively that were all isolated from X. laevis. Pxt-12 was identical to the X. tropicalis XT-6-likeprecursor previously isolated by ESI-MS/MS. None of the Pxt peptides contained any Cys, Asp, Tyr or Trp, while Ile, Leu
and Lys were frequently found as typical frog-skin peptides. RT-PCR analysis confirmed the gene expressions of Pxt-2,
Pxt-3, Pxt-4, Pxt-5, Pxt-7 and Pxt-11 in X. tropicalis skin. Several ion peaks corresponding to all identified Pxt peptides,
were observed with MALDI-MS analysis of X. tropicalis secretory fluids, collected after in vivo stimulation which suggested
that Pxt peptides were definitely secretory molecules. Circular dichroism studies and the Schiffer-Edmundson helicalwheel projections suggested that Pxt-5, as well as mastoparan, at least, could form a typical amphiphilic a-helix without aphospholipid or a membrane-mimetic solvent. Moreover, Pxt-2 showed growth inhibitory effects on both E. coli (Gramnegative) and S. aureus (Gram-positive), at MIC values of 50 and 9.7 (μg/ml), respectively. Measurements of dynamic lightscattering and the surface tensions of Pxt peptides solutions suggested that both Pxt-2 and Pxt-5 could form associations as
micelles and behave like a general surfactant, affording critical association concentrations (CAC) of 38.1 and 57.3 μM, with
γCAC of 46.9 and 38.3 mN/m.

１．緒

質量分析計（MALDI-MS）や Electrospray イオン化質量分

言

析計（ESI-MS）が登場した。そこで、これら分析機器の応

両生類の代表格であるカエルは乾燥に弱いため、水辺等用を試行錯誤しているうちに、組織切片を用い MALDI-の湿った環境が生息の中心である。産卵場所は多様である

MS を行うと、細胞内分泌顆粒の中に存在しているペプチが、幼生はえら呼吸を行い、水中で生活している。成体にド等の生体成分を分子量プロファイルとして選択的に検なると肺呼吸を開始し、陸上の生活が可能となり、陸上・出できることを見出し、「Topological Mass Spectrometry

水中を行き来しながら生活している。このように陸上及びAnalysis（Direct tissue MALDI–TOF MS）」と命名した 2）。

水中の両方の環境が生息に必要であるが、カエルツボカビ

本手法は質量分析法を駆使し、バイオアッセイや余計な精病をはじめとする感染症等により、近年生息数は激減して製プロセス無しに機能性分子の単離を可能とした。その結いる。

果、希少な動物からの生体分子の単離や不安定な生体成分

一方、生体適応・防御・内分泌系の観点から、カエルはの分析が可能である。

絶好の研究材料として用いられてきた。陸上・水中の異なそこで本申請において、両生類を代表するカエルの皮る生活環境を行き来することから、微生物等の攻撃に曝さ膚 を 用 い て、Topological Mass Spectrometry Analysis

れ易いと考えられる。その様な環境にも関わらず生き続け（Direct tissue MALDI–TOF MS）を駆使し、ペプチド等ていることから、特殊な能力を保持していると考えられの新規生体分子を網羅的に探索することを実施した。

てきた。特にカエルは皮膚の分泌腺や毒腺が多いことから、

２．実

これまで各種機能性分子（抗菌ペプチド等）
が皮膚から単離されてきた。これらの機能性分子は、皮膚組織の破砕、抽出、

2. 1. カエルバイオアッセイ、精製を繰り返し、単離、同定、遺伝子配1）

験

実験に使用したカエル（トノサマガエル、ヌマガエル）に列解読等が行われてきた 。一方 1990 年代になり新たなついては、大阪府池田市、箕面市周辺の田畑で捕獲した。

分析ツールとしてマトリックス支援レーザー脱離イオン化

またアマガエルについては、広島大学両生類研究施設 髙瀬稔先生から供与して頂いた。ネッタイツメガエル（Xenopus
tropicalis）は東京大学・産業技術総合研究所が維持していGlobal exploration of functional biomoleculesfrom amphibian skin
Yasushi Shigeri
National Institute of Advanced Industrial
S c i e n c e a n d Te c h n o l o g y, H e a l t hResearch Institute

る Nigerian 系統を使用した。

2. 2. Topological Mass Spectrometry Analysis（Direct
tissue MALDI–TOF MS）− 41 −

トリス緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水など生化学

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

や組織学の実験でよく使われる緩衝液は、MALDI-MS に解法で分析した。プロテインシークエンサー及び質量分

おいて試料のイオン化を阻害する。一方、質量分析法で析から得られたアミノ酸予想配列データは、データベー

推奨されるギ酸や酢酸溶液を組織切片に応用すると、浸ス検索（http://www.xenbase.org/genomes/blast.do）及び透圧の関係で細胞形態が維持できない。そこで切片調製（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を随時実施して、アミノ法として、生理食塩水による凍結包埋を試みた。摘出し酸配列を確定した。

た皮膚組織（カエル及びオタマジャクシ）を 0.4％食塩水で凍結包埋し、－20 ℃でクリオスタット（CM1850 cryostat,

2. 4. 同定されたペプチドの固相合成

Leica Microsystems, Germany） を 用 い、30 ～ 40 μm の同定されたペプチドの性質解明のため、化学合成する事

厚さの切片を作成した。作成した切片は MALDI-MS 用を試みた。ペプチドの化学合成は Fmoc 固相合成を利用し、サンプルプレートに置き、マトリックス溶液（10 mg/ml

PSSM8 自動ペプチド合成装置（島津製作所）を用いて行っ

CHCA in 50% acetonitrile + 0.1% trifluoroacetic acid）を添た。合成ペプチドの精製は逆相 HPLC（Waters 600）を使加した後、直ちに吸い取った。次にマトリックス溶液を再用し、カラムは 5C18 -AR-II（Cosmosil, nacalai tesque）を度添加し、真空下で素早く結晶化し、MicroflexAI mass

使用し、0.1% trifluoroacetic acid に acetonitrile のグラジ

spectrometer（Bruker Daltonics）を用い、リニア、ポジ

エントを用いて精製を行った。精製品の確認は MALDI-MS

ティブイオンモードで MALDI-MS 測定を行った。

（MicroflexAI mass spectrometer）を用い、マトリックスは（10mg/ml CHCA in 50 % acetonitrile+0.1 % trifluoroacetic

2. 3. ネッタイツメガエル（Xenopus tropicalis）皮膚由来ペプチドのアミノ酸配列決定acid）を使用した。

tissue MALDI–TOF MS）を用いて、得られた分子量を指2. 5. 円二色性分散計（Circular Dichroism, CD）
を用いたペプチドの性質解明

標に、ネッタイツメガエルの皮膚から、抽出、ゲル濾過ク

同定されたペプチドの溶液中での二次構造を測定するた

ロマトグラフィー、HPLC による精製、ESI-MS/MS 解析、めに、日本分光円二色性分散計 J- 820 を用いて測定を行っ

デ ー タ ベ ー ス 検 索（http://www.xenbase.org/genomes/

た。合成ペプチドを 10 mM Tris-HCl（pH 7.2）の緩衝液に

blast.do）、プロテインシークエンサーによるアミノ酸配列

50 μM の濃度に希釈し、光路長が 1 mm の角型石英セルを決定を行った。

用いた。測定条件のバンド幅は 1 nm、レスボンスは 4 sec、

前述の Topological Mass Spectrometry Analysis（Direct

ネッタイツメガエルの皮膚を、
クリオスタット（CM1850 cryostat）

測定範囲は 190 ～ 255 nm、データ取込間隔は 0.5 nm、走を 用 い 10μm に スライスし た 後、50% acetonitrile+0.1%

査速度は 20 nm/min、積算回数は 4 回に固定して測定した。

trifluoroacetic acid 溶液で、4℃、5 時間抽出を行った。そ

測定温度は 10，25，37 度の三つの異なる温度で測定を行の 後 上 清 を、30% acetonitrile +0.1% trifluoroacetic acidった 3）。

溶 液 で 平 衡 化 し た Superdex-30 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ
ィ ー（GE Healthcare, 500×3mm i.d.） で 分 離 し た。500

2. 6. 同定されたペプチドの抗菌及び溶血活性の測定～ 3000Da の 分 子 量 の mid fraction を さ ら に 逆 相 HPLC

Escherchia coli DH5a（グラム陰性）と Staphylococcus（Gilson HPLC system, 東ソー , TSK gel ODS 120T, 5 μm

aureus JCM2151（グラム陽性）を用いて同定されたペプ

particle size, 250×4.6mm i.d.）
で 0.1% trifluoroacetic acid をチドの抗菌活性の測定を行った。まず 5 ml の LB（Luria-

含む acetonitrile のグラジエントを用いて精製を行った。

Bertani ’ s broth）培地で 37℃、15 時間、160 rpm で前培養精製したフラクションは随時、MALDI-MS（MicroflexAIを行った。その後 100 μl の培地溶液を取り、本培養の培地（5mass spectrometer）で分子量の確認を行った。また ESI-ml LB 培地）に植菌した。37℃、2 ～ 3 時間、160 rpm でMS/MS 解析は、HPLC で精製したサンプル、あるいは精培養し、OD610nm が 0.5 付近にまで培養した。その培養液製したサンプルをトリプシン消化した物を使用し、LCQ

を生理食塩水で 100 倍希釈し、その内 50 μl をあらかじめFleet（Thermo Scientific, MA） を 用 い て 行 っ た。LCQ

ペプチドを希釈して 50μl ずつ入れてあった 96 well plate

Fleet には、LC-10 ADVPμ ポンプ（島津製作所）を使用して、に添加して 37℃、24 時間培養した。ペプチドは最終濃度0.05（ml/min） の 流 速 で 50% acetonitrile + 0.1% formic

150 μg/ml の 8 段階の 2 倍希釈、最小濃度 0.6 μg/ml に調acid 溶液でサンプルを負荷した。イオンスプレーの電圧製した。培養後の生菌数はマイクロプレートリーダーを使は 5000V、MS/MS の分析の際の衝突エネルギーは 30V

用し、OD595nm の吸光度で測定した。

で 3 価の前駆イオンの検出のために固定し、ポジティブイ
オンモードで測定を行った。プロテインシークエンサー

ラットの全血に対する同定されたペプチドの溶血活性は、稲垣らの方法に従って行った 4）。

は PPSQ-21（島津製作所）を用い、常法であるエドマン分− 42 −

両生類皮膚由来機能性生体分子の網羅的探索

2. 7. 同定されたペプチドの界面物性測定

7717.5 m/z）、ヌマガエルでは（2174.0, 4998.3 m/z）
、アマ

固相合成したそれぞれのペプチドを約 15mg 測り取り、ガエルでは（1101.9, 1845.8, 2327.2, 3265.9, 4977.7, 6537.4 m/

超純水 15 ml を添加した後、弱く撹拌することにより溶解

z）等の分子イオンピークが検出された。しかしながらいずさせた。次に、この水溶液を適宜希釈することによって、れの国産カエルもゲノム解析が行われておらず、それぞれ各種濃度のペプチド水溶液を得た。各種ペプチド水溶液ののピークのアミノ酸配列を解析するのは困難が予想された。

表面張力は、協和界面科学株式会社製の DropMaster500

そこで、両生類で唯一ゲノム解析が完了しているネッタを用いて、ペンダントドロップ法を用い、25 度で測定した。

イツメガエル（Xenopus tropicalis）（図 1）5）の皮膚を用いてなお、この方法では、キャピラリーに形成させた液滴のTopological Mass Spectrometry Analysis（Direct tissue

形状を解析して、表面張力値を得るが、解析には Young-

MALDI–TOF MS）を実施することにした。
図 2 に示すように、ネッタイツメガエルのオタマジ

Laplace 法を用いた。

３．結

果・4．考

ャクシ（tadpole, stage49 - 51）を用いて Topological Mass察

Spectrometry Analysis（Direct tissue MALDI–TOF MS）

3. 1. ペプチドの配列決定を行っても、有意な分子イオンピークはほとんど検出され大阪府池田市、箕面市周辺の田畑で捕獲したトノサマガ

なかった。

エル、ヌマガエル及び、広島大学両生類研究施設から供一般的にカエルから得られた抗菌ペプチド等の生理活

与して頂いたアマガエルの皮膚組織を用いて Topological性ペプチドは、成体に由来するものである 6）。カエルのMass Spectrometry Analysis（Direct tissue MALDI–

皮膚は幼生（オタマジャクシ）と成体では大きく異なって

TOF MS）を実施した。その結果、トノサマガエルではおり、皮膚腺（顆粒腺）は変態が進まないと形成されない。

（1611.2, 2811.4, 3105.9, 3769.4, 4601.1, 5149.8, 5652.5, 6952.5,

そこで成体のネッタイツメガエルの皮膚組織を使用して、Fig. 1

Xenopus tropicalis

Fig. 2 Direct tissue MALDI–TOF MS spectrum of the hormones fromthe skin in Xenopus tropicalis tadpoles− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Topological Mass Spectrometry Analysis（Direct tissue

Pxt-7 の 6 つの新規ペプチドを同定した。また Topological

MALDI–TOF MS）（リニアー、ポジティブイオンモード）を

Mass Spectrometry Analysis（Direct tissue MALDI–行った。その結果、ネッタイツメガエルでは 1000 ～ 3000

TOF MS）とエドマン分解法を併用し、Pxt-6 の新規ペプ付近の m/z に各種分子イオンピークが検出された（図 3）。

チドを決定した。Pxt-6 についてはデータベース検索でも次に Topological Mass Spectrometry Analysis（Direct

ヒットしないことから、ゲノム解析でも DNA 配列が解読

tissue MALDI–TOF MS）で得られた分子イオンピークをされていない配列であることが示唆された（Table 1）。ま指標に、ネッタイツメガエルの皮膚から、有機溶媒によるた RT-PCR を用いて、各ペプチドの遺伝子発現を検討し抽出、ゲル濾過クロマトグラフィー（Superdex-30）、逆たところ、顕著に皮膚に遺伝子発現が認められた。また

相 HPLC による精製、ESI-MS/MS 解析、データベース検

ネッタイツメガエルは、接触刺激等により粘性かつ泡状索を実施した。その結果、Pxt-1, Pxt-2, Pxt-3, Pxt-4, Pxt-5,の分泌液を出すことが知られている。その分泌液を直接Fig. 3 Direct tissue MALDI–TOF MS spectrum of the hormones from theskin in Xenopus tropicalis adults
Table 1

Sequence, monoisotopicmass, and molecular charges of Pxtpeptides from X. tropicalis skin

− 44 −

両生類皮膚由来機能性生体分子の網羅的探索

Fig. 4MALDI–TOF MS spectrum of Xenopus tropicalis secretory fluids

MALDI–TOF MS で解析したところ、Pxt peptides が同の濃度まで微生物の生育阻害は認められなかった。また様に検出出来た（図 4）。つまり Pxt peptides は何れも分泌Pxt-5 については、培地に添加したところ顕著な沈殿が認されていることが確認できた。

められたことから、抗菌活性の測定は出来なかった。ただし、Pxt-5 は純水や Tris 等の緩衝液には溶解した。一3. 2. 同定されたペプチドの固相合成

方 Pxt-2 の大腸菌及び黄色ブドウ球菌に対する MIC（最同定されたペプチドの固相合成は、Fmoc 固相合成法

小 発 育 阻 止 濃 度 , Minimum Inhibitory Concentration）

を使用した（PSSM8 自動ペプチド合成装置、島津製作所）。

は 50 μg/ml, 9.7μg/ml で あ っ た。 ま た ReversePxt-5 は、

逆 相 HPLC で 精 製 後、MALDI-MS（MicroflexAI mass

150 μg/ml の濃度まで大腸菌に対する生育阻害は認めら

spectrometer）を用いて精製品の確認を行ったところ、ほれなかったが、黄色ブドウ球菌に対する MIC は 150 μg/

ぼ純品であることを確認した。

ml であった。最後に Mastoparan については、大腸菌及び黄色ブドウ球菌に対する MIC はそれぞれ、9.7μg/ml,

3. 3. 同定されたペプチドの 2 次構造解析

19.3 μg/ml であった。またラット血球に関する溶血活性は同定されたペプチド及び、比較のために、Pxt-5 の逆

0.1%（Pxt-1），0.4%（Pxt-2），0.2%（Pxt-3），0.1%（Pxt-4）

配 列 の ReversePxt-5、 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 皮 膚 よ り 単, 10.5%（Pxt-5），0.3%（Pxt-6），0.4%（Pxt-7），0.3%（Pxt-

離された抗菌ペプチドで有名な Magainin 1

7, 8）

及びスズ

11）であった。

メバチ毒素の一種で典型的な両親媒性ペプチドであるMastoparan9）を合成し、均一にまで精製した。これらのペ

3. 5. 同定されたペプチドの界面物性測定

プチドの二次構造解析を詳細に実施するために、円二色性同定されたペプチドの界面物性を測定するために、ペン

分散計 J - 820（日本分光）を用いて測定を行った。その結ダントドロップ法を用い、表面張力の測定を行った。その果 Pxt-2 及び Pxt-5 は両親媒性のアルファーヘリックスを結果、Pxt-2、Pxt-5 及び ReversePxt-5 については、顕著形成することが判明した（data not shown）。

な表面張力の低下が認められ、有力なバイオサーファクタ
ントとして機能することが示唆された（図 5, 6）。

3. 4. 同定されたペプチドの抗菌活性測定

５．総Escherchia coli DH5a（ グ ラ ム 陰 性・ 大 腸 菌 ） と括

Staphylococcus aureus JCM2151（グラム陽性・黄色ブド今回両生類では唯一ゲノム解析されているネッタイツメウ球菌）の微生物を用いて、Pxt-1, Pxt-2, Pxt-3, Pxt-4, Pxt-

ガエル（Xenopus tropicalis）の皮膚を使用して、Topological

5, Pxt-6, Pxt-7, ReversePxt-5, Magainin 1, Mastoparan にMass Spectrometry Analysis（Direct tissue MALDI–TOF

対する抗菌活性を測定した

10, 11）。その結果、Pxt-1, Pxt-

MS）で解析を行った。その結果 7 種類の新規ペプチド

3, Pxt-4, Pxt-6, Pxt-7, Magainin 1 については、150 μg/ml（Pxt1, 2, 3, 4, 5, 6, 11）を発見し、その物理的特性及び生物− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Fig. 5

Surface tension of Pxtpeptides（I）

Fig. 6

Surface tension of Pxtpeptides（II）− 46 −

両生類皮膚由来機能性生体分子の網羅的探索

学的な活性の測定を実施した。特にその界面活性剤として

５）Hellsten U, ほ か 47 名 :The genome of the westernclawed frog Xenopus tropicalis, Science, 328, 633-636,の特性や泡特性からスキンケア素材への可能性が示唆される。今後はどのような組織に発現されているか。またどのような生育時期から機能発現するのか、さらに物理特性を詳細に解析したいと考えている。本成果は文献 12 として印刷中である。

謝2010.
６）岩室祥一：抗菌ペプチドによる先天的生体防御機構と内分泌系の接点を探る , 比較内分泌学 , 35, 71-92, 2009.
７）Zasloff M,:Magainins, a class of antimicrobial peptides
from Xenopus skin: isolation, characterization of two
forms and partial cDNA sequence of a precursor, Proc.

辞本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団に深く感謝します。

Natl. Acad. Sci. USA., 84, 5449-5453, 1987.
８）Zasloff M, Martin B, Chen H,:Antimicrobial activity
of synthetic magainin peptides and several analogues,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 910-913, 1988.

（引用文献）
１）Conlon M, Mechkarska M, King J,:Host-defense
peptides in skin secretions of African clawed frogs(Xenopodinae, Pipidae), Gen. Comp. Endcrinol., 176, 513-

９）Hirai Y, Yasuhara T, Yoshida H, Nakajima T, Fujino
M, Kitada C, Chem. Pharm. Bull., 27, 1942-1944, 1979.
10）日本化学療法学会抗菌薬感受性測定法検討委員会報
告：微量液体希釈による MIC 測定（微量液体希釈法）,

518, 2012.
２）安 田 明 和 , 茂 里 康：Topological Mass Spectrometry
Analysis による翻訳後修飾された脳下垂体ホルモンの分

Chemotherapy., 38, 102-105, 1990.
11）Nat i o n a l c o m m it t e e f o r c l i n i c a l l a b o r at o r y
st a nd a rd s : Met ho d s for d i lut i o n a nt i m i c r obi a l

子多型の新発見 , 生化学 , 84, 582-587, 2012.

susceptibility tests for bacteria that grow aerobically-３）Scholtz JM, Qian H, York EJ, Stewart JM, Baldwin

second edition, tentative standard, NCCLS, Villanova,

RL,:Parameters of helix-coil transition theory foralanine-based peptides of varying chain lengths inwater, Biopolymers, 31, 1463-1470, 1991.

198812）Shigeri Y, Yasuda A, Hagihara Y, Nishi K, Watanabe

４）Inagaki H, Akagi M, Imai H, Taylor R, Kubo
T,:Molecular cloning and biological characterization ofnovel antimicrobial peptides, pilosulin 3 and pilosulin 4,
from a species of the Australian ant genus Myrmecia,
Arch. Biochem. Biophys., 428, 170-178, 2004.

− 47 −K, Imura T, Inagaki H, Haramoto Y, Ito Y, Asashima
M,:Identification of novel peptides from amphibian(Xenopus tropicalis) skin by direct tissue MALDI-MS
analysis, FEBS J, doi: 10.1111/febs.13107, 2014.

角度依存性のない構造発色性顔料の調製

名古屋大学大学院工学研究科

竹岡敬和

We are able to observe a colour due to the interference of light from microstructures composed of different refractive
index materials that is comparable to the visible wavelength of light; such a colour is called a structural colour. Because
structural colour is fadeless and no energy is lost from the colour mechanism, structurally coloured materials are expected to
be used for energy-saving reflective displays and sensors. Previously, however, the word “iridescence” rather than “structural
colour” was used to describe the property of a surface that appears to change colour as the viewing angle or the angle of lightillumination changes. Thus, people who are aware of the concept of the interference colour have a strong impression that all
structurally coloured materials change hues when viewed from different angles, as indicated by the term “iridescence.” Infact, most artificial structurally coloured materials that we and other groups have studied so far change their hue dependingon the viewing and light illumination angles because these structural colours are derived from Bragg reflection. Such angle
dependence presents a barrier for developing displays and sensors using structurally coloured materials. Therefore, my grouphas been working to develop angle-independent structural coloured materials. The latest most notable ones are amorphousarray systems. In this report, I describe the fabrication and the optical nature of the low-angle-dependent structurally
coloured amorphous arrays.

１．緒

後の我々の暮らしが永続的に発展可能で快適になることを言後押しするだろう。そのためには、自然界に豊富に存在し、長期間屋外に貼られたポスターが、色あせた状態になっ

環境負荷性が低い自然調和性に優れた化合物を利用した色ているのを目にした人は多いだろう。このようなポスター

材作りが求められる。申請者は、人や環境に優しい材料かは、紫外線によって分解しやすいイエローやマゼンダの染ら成る、光の波長ほどの微細構造の存在により色を示す構料（有機色素）が使われているため、長い時間を太陽光に晒

造発色性材料が、以上の要求を満たす色材になり得ると考されたことで、それらの染料は元の色合いを失ってしまっ

えて研究に取り組んでいたところ、人や環境への負荷の低たのである。他にも、水分や化学物質の影響を受けて酸い材料から調製した白い微粒子と黒い微粒子を混ぜること

化還元反応を起こして退色する場合もある。それに比べて、で非常に鮮やかな角度依存性のない構造発色を示すことを顔料の中には、耐光性、耐水性、耐薬品性、抗酸化還元性発見した 1）。本研究では、マンドリルやある種のトンボ類などを有するもの（特に無機顔料）が多く、様々な用途に利の表皮で観測される角度依存性のない構造発色が参考にな用されている。しかし、無機顔料は毒性の高い重金属を使ると考え、この構造発色性材料の発色メカニズムの解明に用した化合物からできているものも多いため、化粧品など、取り組んだ。申請者の発見した発色メカニズムが環境や人人に直接触れるような用途には使用できる種類が限定されに優しい新顔料調製のヒントとなり、問題が指摘されていている。染料に関しても、化粧品などへの配合に関して、る従来の色素や顔料に取って代わるものとなればと考えて規制が厳しくなっている。とりわけ、ヨーロッパを中心にいる。

広がる環境に対する配慮から、その他の用途への染料や顔２．実料に使用する材質についても、今後ますます規制が強化されると考えられる。しかし、我々が豊かな生活を送る上で、

験

2. 1. 材料の選定

様々な鮮やかな色を示す退色しない染料や顔料（色材）の存

粒径の揃ったサブミクロンサイズの微粒子としては、こ在は欠かせなくなっている。さらに、低毒性、低環境負荷

れまでに有機高分子からなる系とシリカや酸化チタンなど性を備えた色材が安価に大量に得られるようになれば、今の無機微粒子からなる系を用いている。本研究では、人や環境に優しい材質からなり、安価で大量に調製しやすく、光学的な評価を行いやすいということを条件に微粒子を構成する材料の選定を行った。シリカ微粒子の主成分である

Preparation of angle-independent structural
colored pigments
Yukikazu Takeoka
Department of Molecular Design &Engineering,Nagoya University

SiO2 は、化学的に非常に安定な化合物で、化学実験のガ
ラス器具などに利用されており、また、土壌の主成分としても存在している。さらに、シリカ微粒子の集合体が構造色を示すような粒径 200 nm 以上のサブミクロンサイズな− 48 −

角度依存性のない構造発色性顔料の調製

らば生体への毒性も見られないことから、生体に対してもうことが考えられる。つまり、干渉性散乱を生じることが、非常に安全な材料である。また、屈折率も 1.4 前後で、実彩度の高い構造色を示す上での必要条件であると思われる。

験上の評価も行いやすい。よって、粒径の揃ったサブミク

しかし、干渉による強め合いも相殺も起こらない散乱光も

ロンサイズの微粒子としては、シリカから成る微粒子を主存在し、そのことが可視光全領域に渡って光を散乱してしに利用した。サブミクロンサイズのシリカ微粒子はパウダ

まっている可能性がある。つまり、非干渉性の散乱が、コー状の形態では、可視光を全波長領域に渡って散乱するた

ロイドアモルファス集合体が白く見えることの原因である

め、白い粉である。また、黒色の顔料としては、上の条件と考えている。そこへ、黒色微粒子を添加すると、非干渉と同様にして選定すると、カーボンブラック（CB）、酸化性の散乱を軽減し、干渉性の散乱が強調されるようになる

鉄（Fe3O4）、銀微粒子などが候補としてあげられる。酸化

結果、彩度の高い構造色を示すようになっていると仮定し鉄（Fe3O4）や銀微粒子を用いた場合には、磁性応答性、光て、その発色性メカニズムを明らかにすることに取り組ん

応答性を示す構造発色性材料を開発できる可能性がある。

だ。具体的には、１）アモルファス集合体からなる膜に対紙面の関係上、本稿では CB を用いた結果のみを示す。

して照射する光の角度（θ）と、サンプルから散乱された光を捕らえる検出器の角度（φ）を変えて測定した反射スペク

2. 2. コロイドアモルファス集合体の構築

トルを測定すること、および、２）直線偏光をかけた光を

サブミクロンサイズの微粒子（コロイド微粒子）が短距離

コロイドアモルファス集合体に照射し、散乱した光を様々

秩序を持って集合した状態をコロイドアモルファス集合体

な角度で配した直線偏光フィルターを付与した検出器で捕と呼ぶことにする。このサイズのコロイド微粒子は、比らえることを行った。前者では、照射された光がコロイド

較的秩序だった配列になりやすく、短距離秩序だけでなく、

アモルファス集合体によって、どの方向に最も強く光が散

長距離秩序も有するコロイド結晶となる場合が多い。集合

乱されるのかがわかり、後者からは、コロイドアモルファ

体がアモルファス化することを促進するためには、スプレス集合体からの光の散乱において単一散乱および多重散乱ーによるコロイド微粒子懸濁液の噴霧やスピンコート法にがどれだけ寄与しているのかを知ることができる。

よって、急激な溶媒の蒸発とコロイド微粒子の集合化が達

３．結果と考察

成できるような調製条件が必要と考えている。コロイドア
モルファス集合体の構造を再現良く調製できる方法を選択した。本稿では、スプレー法を利用した結果を示す。

まずは、シリカ微粒子を分散させた懸濁液を調製した。
分散媒には、シリカ微粒子を分散できて、揮発性の高いメ
タノールを選択した。メタノールに分散したシリカ微粒子

2. 3. コロイドアモルファス集合体から観測される彩度の高い発色メカニズムの解明（図 1）と、スプレーのノズルから約 30 cm のところに置いコロイド微粒子が短距離秩序を持って配列すると、そのたガラス板などの上にシリカ微粒子が均一な膜として堆積

秩序の距離や系の平均の屈折率に応じて、各微粒子から散した（図 2a）。利用するシリカ微粒子の粒径に応じて、得乱された光が干渉することで特定の波長領域の光が強め合られた膜の色は異なり、粒径 280 nm の微粒子、360 nm の溶液を、圧縮空気を利用してエアスプレーガンで噴霧する

Figure 1 Schematic illustration of the spray method. Owing to the rapid
evaporation, the silica particles are dried before they reach the canvas,
and an amorphous aggregation state is achieved.

− 49 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

微粒子を用いた場合には、それぞれ、非常に淡い緑色、お体を走査型電子顕微鏡により観察した。図 3a および 3b に、よび、淡い赤色となった。それぞれのシリカ微粒子からな

粒径 360 nm の粒子からなる膜の走査型電子顕微鏡写真をる膜を、積分球を用いて反射スペクトルを測定すると、そ示す。シリカ微粒子が、ラズベリーのような形で様々な大れぞれ、460 nm、610 nm 辺りに p-PBG と見られるピーク

きさに凝集した二次微粒子となっていることが分かった。

がはっきりと観測できた（図 2b）。また、図 2c には、粒径表面の構造を捕らえた電子顕微鏡写真（図 3b）のフーリエ360 nm の微粒子から得られた膜の透過スペクトルの角度

変換像（図 3c）からは、ハローパターンが観測され、粒子依存性を示す。透過スペクトルでも反射スペクトル同様にがアモルファス状に並んでいることが分かる。メタノール

p-PBG が 610 nm 辺りに見られ、かつ、この p-PBG の位置にシリカ微粒子を分散させた溶液をスプレー法によって噴には角度依存性が生じないことがわかった。この角度依存

霧することで生じた液滴は、メタノールの急激な蒸発に伴性がない p-PBG は、シリカ微粒子集合体の短距離秩序のって微粒子が球状の集合体（二次微粒子）を形成し、ガラス存在によるミー共鳴のエバネッセントカップリングが原因

板上に堆積したためと考えられる。この二次微粒子の内部と考えられ、シリカ微粒子がアモルファス集合体を形成しにおけるシリカ微粒子の集合状態を調べるために、超高圧ていることを示している。

電子顕微鏡による三次元画像を撮影し、シリカ微粒子が占有する体積分率を見積もった。

このことを確かめるために、粒径 360 nm の微粒子集合

a

b

c

Figure 2 a, Optical photographs of whitish structural-coloured membranes composed of 280 nm silica
particles and 360 nm silica particles. b, The reflection spectra of the membranes shown in Figure 2aobtained using the integrating sphere measurement. c, The transmission spectra of the membranes
shown in Figure 2a, which were measured at various incident angles relative to the surface of themembranes. Inset: Plots of the position of the dip wavelength (λmin) versus the incident angle, θ.

− 50 −

角度依存性のない構造発色性顔料の調製

以上より、シリカ微粒子がアモルファス集合体を形成

を介して光を照射し、その方向より 10 °の位置に置いた検した結果生じた p-PBG が可視光領域内にあることが原因

出器の手前にも偏光フィルターをおいた。光源側においたで、作製した膜はうっすらとした状態だが色を示している

偏光フィルターと検出器側においた偏光フィルターの偏光と分かった。しかし、図 2b より、p-PBG の領域以外の可方向が平行な場合と、直交する場合に、粒径 280 nm の微

視光も全体的に散乱されていることが分かる。人間の目

粒子のアモルファス集合体から観測される反射スペクトルの網膜中にある 3 種類の錐体細胞は、それぞれ、420 nm、を図 5b に示す。両偏光フィルターの方向が平行な場合に534 nm、564 nm をピークに可視光を検知することがで観測できた反射スペクトルには、CB の有無にかかわらず、き、それぞれが、青色（B）、緑色（G）、赤色（R）に対応す

約 510 nm の位置にピークが見られた。図 2b および 4b のる。我々人間は、これら 3 種類の錐体細胞が検知できる波

反射スペクトルで観測されたピークの位置と少し異なるの長の光量に応じて、光やものが何色に見えるかを判断しは、積分球を用いた場合にはあらゆる方向に散乱された光ている。可視光全体に渡って光を反射するようなものにを捕らえているのに対して、この偏光スペクトルでは一方

対しては、全ての錐体細胞が光を検知してしまう結果、色向に反射された光のみを捕らえているからである。一方、の彩度（saturation）が低下し、白っぽく見えるようになる。

両偏光フィルターの方向が直交した場合には、ピークは見

p-PBG によって反射された光を、色としてより鮮やかに捕られないが、CB を含まない膜は、可視光全体に渡ってほらえられるようにするには、p-PBG の領域以外の光の散乱

ぼ均一に光が散乱されることを示すスペクトルが観測されを抑えなければならない。

た。しかし、CB を加えた膜では、CB を含まない膜で観測

そこで、可視光全領域に渡って光を吸収することができされた光の散乱はほぼ抑制されていることが分かった。両るカーボンブラック（CB、平均粒径 28nm）をシリカ微粒

偏光フィルターの方向が平行な場合に観測されるスペクト

子の集合体中に混入するため、シリカ微粒子のメタノール

ルは、偏光された光が膜によって偏光解消されずに反射さ分散溶液中に CB を分散し、それをスプレーによって噴霧れた成分を観察している。つまり、この膜から観測されるした。図 4a に、CB の含有量を変えて調製した膜の写真を

p-PBG は、膜の表面の構造による単一散乱によって生じて示す。粒径 280 nm の微粒子（上）、360nm 微粒子（下）からいると考えられる。一方、両偏光フィルターの方向が直交なるアモルファス集合体は、CB の量の増加に伴って、よした場合に観測されるスペクトルは、偏光された光が膜内り明確な色が観測できるようになった。図 4b に示した反部の構造によって多重散乱を受けて、偏光解消した光を観射スペクトルからは、CB の量の増加に伴って、p-PBG の測している。よって、可視光の全波長領域において生じ

ピーク強度はさほど変化しないのに対して、可視光領域全ている散乱には、膜内部で生じた光の多重散乱の寄与が大体に渡って見られた散乱が軽減されていることが分かる。

きいと言える。両偏光フィルターの方向が平行な場合、おつまり、p-PBG による光の散乱がより際だった結果、色とよび、直交した場合に観測された反射強度の比を、波長にしても明確に捕らえられるようになったのである 。

対してプロットした結果を図 5c に示す。この結果は、各2）

CB の添加効果を調べるために、図 5a のような方法によ

波長における多重散乱の寄与を表している。CB を含まなって、アモルファス集合体から観測される偏光スペクトルい系においては、p-PBG の位置において、単一散乱が大を測定した。膜面に対して垂直な方向から偏光フィルター

きくなるものの、全体的に多重散乱の寄与が大きい。一Figure 3 a, An SEM image of the membrane composed of 360 nm silica particles. b, A magnified view of
the red-framed region of the SEM image shown in Figure 3a. c, The two-dimensional Fourier power
spectra obtained from the SEM image in Figure 3b.

− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Figure 4 a, Optical photographs showing the colour change in the membranes composed of 280
nm particles with varying amounts of CB and 360 nm silica particles with varying amounts of CB.
b, The reflection spectra of the membranes shown in Figure 4a obtained using the integrating
sphere measurement.

方、CB を添加した系では、多重散乱が抑制され、その結果、に、双方向反射率分布関数BRDF（Bidirectional Reflectance

彩度を上昇させている。短波長領域では、偏光解消された

Distribution Function）の測定を行った（BRDF は入射方向と成分が強くなっているが、これは、微細構造に比べて波長

反射方向の二つの角度の関数として反射率を表したもので、が短くなると、散乱効率が上昇するという、一般的な振る

colorant の標準的な評価方法である）。アモルファス集合

舞いと一致している。

体からなる膜に対して照射する光の角度（θ）と、サンプル

アモルファス集合体の発色特性をより詳しく調べるためから散乱された光を捕らえる検出器の角度（φ）を変えて測− 52 −

角度依存性のない構造発色性顔料の調製

aFigure 5 Polarisation spectra of the structural-coloured membranes. a, A schematic of the instrumental
setup used for obtaining the co-polarisation (p-polarisation) and cross-polarisation (s-polarisation)
spectra. b, The co-polarisation and cross-polarisation reflection spectra of the membranes composedof 280 nm silica particles with/without CB. c, Plots of the ratio of the co-polarisation and crosspolarisation components to the sum of the co-polarisation and cross-polarisation components.

定した反射スペクトルを測定した（図 6a）。そして、様々においては、鏡面反射方向ではなく、後方に強く散乱されな θ、および、φ の組み合わせで測定した反射スペクト

ることを意味する。後方散乱による発色は、波長依存性がルから、p-PBG のピークの位置における反射強度を各 θない、界面での鏡面反射の影響を受けにくいため、発色材− φ に対してプロットした等高線図を図 6b に示す。θ ＝料として好ましい性質であるといえる。自然界の構造色のφ を満たす線上に、強い反射が存在することがわかった。

代表例であるモルフォチョウが、同様な強い後方散乱を持

このことは、アモルファス集合体に照射した光は p-PBGっていることは興味深い。

− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015a

Figure 6 The BRDF of spectra of structural-coloured membranes. a, A schematic of the setup used to obtain the BRDF.
b, Contour map of the reflected intensity versus the θ−φ coordinate at the peak wavelength of the p-PBG for membranes
composed of 280 nm and 360 nm silica particles with 1.7 wt% CB.

謝辞H. Nakamura, Y. Takeoka, ChemPhysChem 2 0 1 0, 1 1,
579-583.

本研究にご助成頂きました公益財団法人コスメトロジー

２）Y. Takeoka, S. Yoshioka, M. Teshima, A. Takano, M.

研究振興財団に深謝申し上げます。

Harun-Ur-Rashid, T. Seki, Scientific Reports 2 0 1 3, 3,（引用文献）

2371.

１）M. Harun-Ur-Rashid, A. Bin Imran, T. Seki, M. Ishii,− 54 −

膜透過性ナノ集合体を封入した固体エマルションの開発

山口大学大学院理工学研究科

通阪

栄一

A transdermal administration on drugs has been limited due to very low permeability of drugs across skin. Especially, it
is generally regarded that hydrophilic macromolecules such as proteins, peptides, and vaccines cannot penetrate across skin.
In this study, a solid emulsion containing membrane permeability nanoassembly was developed for the transdermal deliveryof the protein drugs. The nanoassembly was formed by the complex of surfactant and protein. The usage of a solid fat andgel-vegetable oil as oil phase of the emulsions was examined. Moreover, the surface of oil droplets was coated by the layerby-layer method with polymer electrolyte. These methods made the stability of the emulsion enhance.
In addition, the membrane permeability of protein was evaluated using the artificial epidermal membrane. In this study,
the acceleration of protein transport was largely induced by the compatibility of the nanoassembly with the hydrophobic
epidermal membrane. It is thus possible that the emulsion containing the nanoassembly resulted in the acceleration of proteintransport across the epidermal membrane.

１．緒れるため，角質層の脂質に浸透しやすい微粒子であり，キ言ャリアとしての利用も検討されている 5, 6）。
このように，タンパク質の経皮投与が試みられているが，

近年，動物細胞や微生物を利用して，ペプチドやタンパ
ク質などのバイオ医薬品の製造が活発に行われている。こ体内取り込み量は，注射で投与した場合と比べて極端に低れらバイオ医薬品は，低分子医薬品に比べ効果が大きく副く，また安全性の面で使用が制限されるものもあり，十分作用も少ないため，期待は非常に大きい。これらの分子のな成果は得られていない。

大部分は確実に体内へ導入できる注射により投与されてい我々は，これまでに膜透過性に優れた脂質集合体を開発

るが，患者の苦痛を回避し，患者自身が簡便に投与できる，

した 7−8）。この膜透過性ナノ集合体は，界面活性剤でタン塗る製剤の開発が望まれている。

パク質をコーティングすることで形成され，表面を脂溶性

塗るタンパク質製剤において最大の障壁は，表皮最外層に改質することで，細胞膜との親和性が高くなり，タンパの角質層のバリアーである。角質層は死細胞からなる疎水

ク質の細胞への導入を促進することが確認されている。こ性の高い多層膜であり，外部物質の皮膚浸透において高いの膜透過性ナノ集合体は，調製が簡便，薬物封入率が高い，

バリアー機能を示す。特に，親水性高分子であるタンパク

安定性が高い，タンパク質の大きさ・化学的特性に関係な質は，この疎水性膜の通過が困難である。これまでに，親く封入でき，内封後の活性維持も可能といったタンパク質

水性高分子のタンパク質の吸収性改善を目指して物理的なキャリアに適した特徴を持っており，化粧品への利用価値

方法や化学的手法が検討されている。

も高い技術である。そこで本研究では，このナノ集合体を

例えば，物理的な方法として，マイクロニードルにより油に分散させ乳化した Solid-in-Oil-in-Water（S/O/W）エマ

角質層だけに小孔を開ける手法や，エレクトロポレーショ

ルションをタンパク質のキャリアとして応用し，皮膚透過

ンで脂質に揺らぎを与える，あるいはソノフォレシスでキ性に優れた製剤の開発を目指している。

ャビテーションを与えることで一過性の小孔を形成させる
手法がある

1−3）

塗るタンパク質製剤の開発のために，まず不安定なコロイド粒子であるエマルションを安定化し長期保存可能な皮。

また，化学的な方法としては，角質層に存在する脂質に

膚透過性の高い S/O/W エマルションの調製が不可欠であ作用し薬物の浸透性を向上させる低分子化合物が利用される。本報告では，S/O/W エマルションの安定化のため固4）る 。また，エマルションやリポソームは脂質から形成さ体エマルションの調製法について検討した結果を報告する。
また，S/O/W エマルションの皮膚透過性を確認する前段階として，人工膜をモデルとし，S/O サスペンションを用いたときの膜透過性についても検討を行った。

Development of solid emulsions containing
membrane permeability nanoassembly
Eiichi Toorisaka
Graduate school of science & engineering,
Yamaguchi University

２．実験

2. 1. S/O/Wエマルションの調製− 55 −

ウシ血清アルブミン（BSA）水溶液（10 mL）とショ糖エル

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

カ酸エステル（ER-290）含有ヘキサン溶液（20 mL）をホモ

ンパク質の濃度を，吸光光度計（280 nm），あるいは DC

ジナイザー（ULTRA-TURRAX T25: IKA Labortechnik）

Protein Assay により測定した。

（24000 rpm，2 min） で 高 速 攪 拌 後， 一 晩 凍 結 乾 燥 し（FREEZE DRYER FD-1000: EYELA），界面活性剤 - 薬物

2. 4. 2. 粒子特性評価

集合体を得た。その後，複合体を大豆油（10 mL）と混合し，レーザー回析/散乱式粒度分布測定装置（LA-920 : HORIBA）

超音波発振機を用いて分散させることで，S/O サスペンシを用いての粒度分布測定及び光学顕微鏡を用いての観察をョンを調製した。

行った。

調製した S/O サスペンション（5 mL）と 1 wt% 水溶性
界面活性剤（コール酸ナトリウムと Tween20）含有水溶液

また，エマルション表面電荷の測定のため，ゼータ電位測定を行った。

（10 mL）をホモジナイザー（ULTRA-TURRAX T25: IKA
Labortechnik）（13500 rpm，1 min）で高速攪拌し，S/O/

2. 5. 膜透過性評価

W エマルションを調製した。その後，親水性シラス多孔

2. 5. 1. 評価用パッチの調製

質ガラス膜（SPG）を用いて膜乳化を行うことで，エマルシ
ョンの油滴粒子径の制御を試みた。

5 wt% エチルセルロースのアセトン溶液を調製し，円形（外枠：厚さ 1.0 mm，直径 6.0 mm, 内枠：厚さ 1.0 mm，
直径 4.8 mm）の型に 0.04 mL 滴下し，室温下で乾燥させた。

2. 2. 油相の固体化

次に，3 wt% ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）
を，エ

2. 1. の大豆油の代わりにカカオ脂を用いて同様に調製

チルセルロース層上に 0.1 mL 滴下し，一昼夜凍結乾燥さした S/O/W エマルションを調製した。また，2. 1. と同様

せ HPC 多孔質層をもつパッチを調製した。その後，HPCに S/O サスペンションを調製した後，1 wt% 植物（唐ゴマ）

層に S/O サスペンション 0.02 mL を含浸させ，パッチ製剤

抽出の天然油脂系脂肪酸を油滴のゲル化剤として S/O サを調製した。S/O サスペンションには FITC 修飾インスリ

スペンションに添加し，同様の方法で乳化した S/O/W エン（FITC-Ins）を封入した。脂溶性集合体中の界面活性剤

マルションを調製した。

としては，ショ糖エルカ酸エステル（ER-290），ショ糖オ
レイン酸エステル（O-170），ショ糖ラウリン酸エステル（L-2. 3. 交互積層法による高分子コーティングエマルショ
ンの調製195），ポリグリセリンエルカ酸エステル（ER-60D），ポリグ
リセリンオレイン酸エステル（O-50D）を使用した。

スターラーで攪拌した高分子溶液（10 mL）に，S/O/W
エマルション溶液（ 5 mL）を滴下（1 mL/min）した。滴下後，2. 5. 2. 人工角質層膜を用いた膜透過性評価

そのまま 10 分間攪拌した。高分子溶液としては，カチオ

水平拡散セルを用いて膜透過実験を行った。膜透過性

ン性であるキトサン溶液とアニオン性であるアルギン酸ナの評価には，人工膜（疎水性メンブレンフィルターに 10

トリウム溶液を交互に用いてコーティングを行った（図 1）。

wt% レシチンと 0.5 wt% コレステロールを含むドデカン溶液を含浸させたもの）を用いた。パッチ製剤を人工膜に貼

2. 4. エマルション特性評価

り付け，セル中にリン酸緩衝液を入れ，膜透過実験を行っ

2. 4. 1. 安定性評価

た。このとき，恒温槽（EYELA BATH SB-9，EYELA）を調製した S/O/W エマルション及び粘膜付着性微粒子を用いてセルの温度を 37℃に保った。時間毎に溶液を採取し，4 ℃で静置し，エマルション内へのタンパク質の封入量

FITC-Ins を蛍光分光光度計（VersaFluorTM Fluometer，の経時変化を評価した。封入量は，外水相に漏洩したタ

BIO-RAD）（励起波長 490 nm，蛍光波長 520 nm）で測定した。

図1

交互積層法概念図− 56 −

膜透過性ナノ集合体を封入した固体エマルションの開発た。油相を固めることにより，内部に封入した膜透過性ナ

３．結果と考察

ノ集合体の移動が阻害され，安定性が向上すると考えた。

3. 1. エマルションの粒子径制御

固化する方法として，固体脂であるカカオ脂を利用する

一般に，エマルションの粒子径が細かく均一であるほど，
エマルションは安定化する。また，粒子径を小さく揃える

方法と，天然油脂系脂肪酸をゲル化剤として油滴をゲル化する方法を試みた。

ことで，皮膚との接触面積の向上により，より迅速で効率安定性の結果を図 3 に示す。カカオ脂を用いたときも，的なタンパク質の吸収が望め，また，使用感の向上にも繋ゲル化剤を用いたときも，封入率に減少が見られた。特にがると考えられる。

カカオ脂で，初期の漏洩が多い傾向がみられた。カカオ脂

そこで，膜乳化による粒子径の制御を試みた。図 2 に，を用いた場合，粒子の調製中に固化と融解を繰り返すこと調製した S/O/W エマルションの粒度分布及び光学顕微鏡

により膜透過性ナノ集合体が不安定化したため，より多く写真を示す。ホモジナイザー攪拌後，膜乳化を行うことでのタンパク質が漏洩したと考えられる。

膜の細孔径に沿った粒子径にエマルションを制御できるこ

3. 3. 高分子コーティングエマルションとが確認された。

油滴の固化では充分な安定性が得られなかったことから，

3. 2. 油相の固体化

油滴表面を高分子コーティングすることで固体化すること安定な固体エマルションを得るため，油相の固化を試み

を試みた。

（a）

（b）

（c）

（d）

図 2 S/O/W エマルションの粒度分布及び光学顕微鏡写真（a）粒子径分布（b）ホモジナイザー攪拌後（c）膜乳化後（細孔径 5.1μm）（細孔径 1.0μm）（d）膜乳化後

図3

油種による BSA 封入率の経時的変化− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

アニオン性界面活性剤で S/O/Wエマルションを調製し，そのエマルションをカチオン性高分子の溶液に加えること

0.25 より大きくなると電解質高分子溶液中が大きく増加した。

で，油滴表面を高分子コーティングすることを試みた。さらノニオン性の Tween20 のみのエマルションは，電解質に，エマルション表面に対してカウンターイオンとなるイオン性高分子との相互作用がないため，電解質高分子溶液中でも高分子溶液を，交互に用いることで多層コーティングを試みた。

粒子径に変化がなかったと考えられる。一方でアニオン性のコール酸ナトリウムの割合が大きい場合，カチオン性の3. 3. 1. 水溶性界面活性剤の影響

キトサンと相互作用も大きくなると考えられる。その結果，

交互積層法では，粒子表面と高分子間の静電的相互作用によって，粒子に高分子コーティングを行う。そのため，

エマルション同士の凝集がおき，最終的にエマルションの融合が生じ粒子径が大きく増加したと考えられる。

表面電荷の制御が良好な粒子調製に重要である。そこで，

結果として，エマルション表面の電荷が大きすぎると安はじめにノニオン性界面活性剤である Tween20 とアニオ

定な粒子を調製できず，水溶性界面活性剤として 0.1 wt%

ン性界面活性剤であるコール酸ナトリウムを用い，その割

コール酸ナトリウムと 0.9 wt% Tween20 の条件でエマル合を変化させた場合の粒子特性への影響を検討した
（図4，
5）
。

ション調製を行うと，エマルションの安定性が維持できる

Tween20 のみを用いたエマルションの場合，電解質高ことが確認された。

分子溶液中での粒子径に，ほとんど変化は見られなかった。

続いて，この条件で実際に，電解質高分子がコーティン

また，コール酸ナトリウムの割合が 0.1 の時も，粒子径のグされているか調べるため，エマルションのゼータ電位を変化は少なかった。しかし，コール酸ナトリウムの割合が測定した（図 6）。カチオン性のキトサンとアニオン性のア

図 4 キトサンコーティングエマルションの光学顕微鏡写真（a）条件②（コール酸割合 0.1） （b）
条件③（コール酸割合 0.25）

図5

図6

高分子コーティング後の粒子径変化

高分子コーティングエマルションのゼータ電位変化− 58 −

膜透過性ナノ集合体を封入した固体エマルションの開発

ルギン酸ナトリウムの水溶液にエマルションを交互に浸す

角質層の透過性を向上させることを目指している。ここでことにより，ゼータ電位が大きく変化していることから，は，集合体の効果を確認するためにエマルション中の油相

エマルション表面にそれぞれの高分子がコーティングされ（S/O サスペンション）を用いた疎水膜透過性評価を行った。

ていることがわかる。これらの結果から，この条件で調製

角質層のモデルとして，疎水性メンブレンフィルターに
10 wt% レシチンと 0.5 wt% コレステロールを含むドデカした粒子を以下の検討で用いた。

ン溶液を含浸させた人工膜を用い，S/O サスペンションの3. 3. 2. 安定性評価

膜透過性を評価した。脂質集合体による膜透過性改善効果

高分子コーティングにより，タンパク質の漏洩を防ぐこの確認と，その組成の最適化を行った。

とができるかを検討した（図 7）。コーティングしていない

はじめに脂質集合体の効果を確認した（図 8）。インス

エマルションでは，24 時間後には BSA の封入率は 80% 以リン水溶液，およびインスリンを油に分散させたもので下にまで減少した。一方，高分子をコーティングしたエマは，ほぼ透過しなかった。一方で S/O サスペンションでは，

ルションでは，タンパク質の漏洩は減少した。また，多層膜透過が確認された。脂質集合体が人工膜へ分配すること

コーティングしたエマルションでは，より漏洩を防ぐこと

で膜透過したものと考えられる。疎水性の細胞膜のモデルが可能であり，キトサン - アルギン酸 - キトサンと 3 重にコとして用いた人工膜においてタンパク質の透過が確認できーティングした場合では，24 時間後でも 95% 以上の安定たことから，外部物質の皮膚浸透において高いバリアー機性を示した。

能を示す角質層も脂質集合体を用いることで効果的に透過できる可能性は高いと考えられる。

3. 4. 膜透過性評価

続いて，界面活性剤の種類の影響について検討を行った。

本研究ではタンパク質を界面活性剤でコーティングした結果を図 9 に示す。ER-290 が最も透過性が低く，ER-60D

膜透過性集合体により疎水性バリアとなっている皮膚表面

や O-50D のようなポリグリエステルを用いた脂質集合体

図7

高分子コーティングエマルションの BSA 封入率の経時的変化

図 8 インスリンの膜透過挙動（●）インスリン水溶液，（■）インスリンを分散させた大豆油，（▲）S/O サスペンション

図 9 界面活性剤の影響（●）ER-290，（■）O-170，（▲）L-195，（◆）ER-60D，（▼）O-50D− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015において透過性が向上することが分かった。また，界面活性剤のアルキル鎖を比較すると，アルキル鎖の短い界面活性剤を用いたパッチの場合に透過性が向上することが確認された。したがって，膜透過性を改善する界面活性剤としては，ポリグリエステルでなおかつアルキル鎖長の短いものが適していると考えられる。
続いて，膜透過挙動への界面活性剤濃度の影響を検討した。図 10 に各界面活性剤濃度での 180 分後の透過率を示す。界面活性剤濃度 1 wt% で調製した S/O サスペンショ
ンの場合に著しく膜透過率が低いことが確認された。これ
は，タンパク質の周囲を界面活性剤が十分にコーティング
することが出来なかったためだと考えられる。また，界面活性剤濃度が 5 wt% 以上になると，膜透過率が低下した。

図 10

界面活性剤濃度における透過率の変化（180 min 経過後）

これは，界面活性剤濃度が高くなるにつれて粘性も高くなり，複合体の拡散の妨げになるためだと考えられる。
以上から，S/O サスペンションを用い効率的にタンパク質を皮膚透過させるためには，適した界面活性剤の選択と，安定な脂質集合体の調製が重要であると考えられた。また，透過速度には脂質集合体の拡散が大きく寄与していると考えられた。S/O/W エマルションは，パッチより微粒子化することにより表面積が拡大し，より速やかな拡散が起こ（引用文献）

ると考えられることから，皮膚透過に有利な剤型であると１）Tokumoto S, Higo N, Sugibayashi K, : Effect ofelectroporation and pH on the iontophoretic transdermal

予測される。

４．総

delivery of human insulin.

括２）Wu X-M, Todo H, Sugibayashi K, : Enhancement

本研究では，固体化 S/O/W エマルションの調製法につof skin permeation of high molecular compounds

いて検討を行った。エマルションの固体化により，安定性

by a combination of microneedle pretreatment andの向上を予測したが，油滴の固化という方法では，充分なiontophoersis, J. Control. Release, 118, 189-195, 2007.

安定性が得られず，カカオ脂を用いた場合は，固体化した

３）Paliwal S, Mitragotri S, : Ultrasound-induced cavitation:

場合の方が，安定性が減少するという結果が得られた。調Applications in drug and gene delivery, Expert Opin.

製時のカカオ脂の状態変化が，膜透過性ナノ集合体の不安

Drug Deliv., 3, 713-726, 2006
４）Williams A, Barry B, : Penetration enhancers, Adv.

定要因になったのではないかと推察される。

Drug Deliv. Rev., 64, 128-137, 2012.

エマルション表面を高分子コーティングする方法では，エマルション表面の電荷の制御が，安定した粒子調製のた

５）Kajimoto K, Yamamoto M, et al. : Noninvasive andめに重要であることが確認された。また，多層コーティン

persistent trans follicular drug delivery system using a

グしたエマルションにおいて，安定性の向上も確認された。

combination of liposomes and iontophoresis, Int. j. Pharm.,
403, 57-65, 2011.

また，人工膜を用いた S/O サスペンションの膜透過性について検討した。その結果，脂質集合体にすることでタ６）Korr F, Lademann J, et al. : Follicular transport route-

ンパク質を効果的に膜透過させることができることが確認

Research progress and future perspectives, Eur. J.

された。またタンパク質にコーティングする界面活性剤のPharm. Biopharm., 71, 173-180, 2009.

種類により透過に大きな違いがあること，油相中での集合

７）Toorisaka E, Ono H, et al. : Hypoglycemic effect of

体拡散速度が透過速度に大きく影響することが確認された。

surfactant-coated insulin solubilized in a novel solid-in-

今後は，さらにエマルションのコーティング基材の検討

oil-in-water (S/O/W) emulsion, Int. J. Pharma., 2 5 2, 2 7 1274, 2003.

を行い，安定性に優れ，ハンドリングの良い粒子の開発を目指して検討を続ける予定である。タンパク質の低侵襲投

８）Toorisaka E, Watanabe K, et al., : Intestinal patches

与法としての経皮デリバリー技術の確立を実現したいと考with an immobilized solid-in-oil formulation for oral

える。

protein delivery, Acta Biomater., 8, 653-658, 2012.

− 60 −

神経細胞が分泌する酸化ストレスに対する保護因子の同定

同志社大学生命医科学研究科

野口

範 子、斎 藤芳郎

The protection of neurons from cell death is a vulnerable strategy to prevent neurodegenerative diseases such as
Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease, since neuronal cell death is one of the major events in pathology of these
diseases. PC12D cells are subspecies of PC12 cells which have been used for a variety of neuronal studies. We found that
PC12D cells were resistant against 6-hydroxydopamine (6-OHDA) -induced cell death and that PC12D cell-cultured medium
had abilities to decompose hydrogen peroxide (H2O2). The molecular weight of H2O2 decomposing active compounds wasestimated at about 1,000 Da by gel chromatography analysis. The study using ion exchange resin column showed that thecandidate compounds are not charged. The activity was not abolished by a metal ion chelater, EGTA but siginificantly
suppressed by a polphyrin inhibitor, NaCN. These data suggest that PC12D cells secrete polphyrin-like compounds
possessing H2O2 decomposing activities, by which cells are protected from cell death induced by 6-OHDA.

１．緒間や細胞濃度によって、6-OHDA などによる酸化ストレス

言

刺激に対する耐性が変化することが明らかにされていた

アルツハイマー病やパーキンソン病は代表的な神経変性（未発表）。つまり、PC12D 細胞は酸化ストレス誘導性細疾患として知られ、その名前が示すように神経細胞が変性

胞死に対して抵抗性を示すことがわかっていた。この結果し死滅することが病気の発症に深く関わっている 1, 2）。こから、PC12D 細胞から培養液中に酸化ストレスから神経れらの疾患では、認知機能や運動機能の低下が深刻である細胞を保護する物質が分泌されている可能性が考えられた。

が、加えて患者の表情は硬く乏しくなり、コスメトロジー

本研究は、PC12D 細胞から分泌される神経細胞保護因子の観点からも問題となる。従って、神経細胞死のメカニズの性質を明らかに、その因子を同定することを目的として

ムやそれを防止する方法の開発に関する研究は重要である。

おこなった。

我々は、神経細胞が特異的に産生するオキシステロールの２．実１種である 24S-hydroxycholesterol が、高濃度では細胞死を 3, 4）、低濃度では神経細胞に適応反応を誘導して酸化ス

験

2. 1. PC12 細胞 / PC12D 細胞

トレスに対する抵抗性を獲得させること 5）を示した。1976

実験に用いたラットの副腎髄質由来褐色細胞腫の PC12

年に Green らによって樹立された PC12 細胞は、ラット副

細 胞、 そ の 亜 種 で あ る PC12D 細 胞 は、37 ℃、5% 二 酸 化

腎髄質クロム親和性細胞腫から樹立された細胞株である。

炭 素 の 環 境 下 で 培 養 し た。Dulbecco’s Modified Essential

神経成長因子（NGF）非存在下の培養では副腎髄質クロム

Medium（DMEM）、10 % 非 働 化 Horse Serum（GIBCO）、

親和細胞の形質を示すが、NGF を作用させることにより、5% 非 働 化 Fetal Bovine Serum（Hyclone） と 抗 生 物 質

神経突起を伸長して交感神経細胞様に分化する。そのため、Streptomycin 0.05 mg/ml（GIBCO）
を添加して、実験に用いた。

PC12 細胞は、神経細胞における分化機構の解明や NGF の作用機構解明の研究などに広く用いられている 6）。本研究2. 2. 培養上清の作成 FM、CM 作成

で注目する PC12D 細胞は PC12 細胞の亜種であり、NGF

DMEM に 5 % N2 サプリメント（GIBCO）と 1 % 抗生物やスタウスポリンなどの刺激に素早く反応し神経突起を伸質 0.05 mg/ml を加えた培養液を Fresh Medium（FM）とし長する。また、RNA 合成阻害剤の存在下でも、神経突起た。PC12D 細胞を 10 cm dish に 70 % コンフレントの状態

伸長が誘導されることが知られている細胞である

7, 8）

。先

から 16 時間 FM で培養後、培養液を回収して 1,000 rpm 5行の研究により、PC12D 細胞は細胞を播種してからの時

分 24 ℃で遠心して得た上清を Cultured Medium（CM）とし、使用時まで−80 ℃で保存した。FM とCMは必要に応じて遠心濃縮機を用いて 20 倍まで濃縮し、使用時まで−80℃で保存した。

Identification of neuron-derived protecting
factors against oxidative stress
Noriko Noguchi
Faculty of Life and Medical Sciences,
Doshisha University

2. 3. 細胞死誘導とその評価
細胞死の誘導は 100 〜200 mM の 6 - OHDA あるいは H2O2を用いた。細胞生存率の測定は MTT アッセイ法を用い− 61 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

た。6- OHDA から生成するパラキノン（pQ）の生成は 360

３．結

nm の吸光度測定により求めた。培養液中の H2O2 の濃度はスコポレチン蛍光法を用いて測定した。スコポレチン

果

3. 1. PC12D 細胞の培養液の細胞保護作用が H2O2 存在下で西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）によPC12D を播種し、6 - OHDA 100 mM で刺激をする２時間

り酸化され、蛍光物質が非蛍光物質に変化するため、この前に一旦培養液を FM に交換し、その 10 % 容量の CM を

蛍光強度（励起波長 366 nm、発光波長 460 nm）の減少から添加した。24 時間後に MTT アッセイ法により細胞生存率

H2O2 を測定した。

を測定したところ、CM を添加した細胞は添加しない細胞と比較して生存率が高かった（図１）。次に、6 - OHDA 誘

2. 4. クロマトグラフィーを用いた分泌因子の特性解析

導細胞死に対する CM の防御作用の容量依存性を調べた。

ゲル濾過カラムクロマトグラフィー：PD-10 カラム（GE

6 - OHDA 100 mM または 200 mM で刺激をする２時間前にHealthcare）を用いて、分子量 5,000 以上の物質と 1,000 以

培養液を FM 100 %、FM 50 %/CM 50 %、CM 100 % に下の低分子物質とに分離した。また、分離能が高く高回収交換し、24 時間後に MTT アッセイ法により細胞生存率を率担体である Superdex 30 prep grade（GE Healthcare）

測定した。6 -OHDA 誘導細胞死はいずれの濃度の場合も、を用いて分子量 10,000 以下の分画を行った。

CM の量に依存して抑制された（図２）。

イオン交換樹脂：強酸性陽イオン交換樹脂（交換基：−
SO3−）Hi Trap SP FF（GE Healthcare）および強塩基性3. 2. 6-OHDA 由来の細胞死誘導物質

陰イオン交換樹脂（交換基：−NR3＋）Hi Trap Q FF（GE

6 - OHDAは水溶液中で速やかに分解し、パラキノン（pQ）とスーパーオキサイド（O・2−）を生成し、O・2−は不均化反応

Healthcare）
を用いて分泌因子の荷電性質を調べた。

の結果 H2O2 が生成する。pQ や H2O2 はいずれも細胞死を2. 5. 阻害剤の添加効果誘導する可能性があるため、6 -OHDA からこれらの生成に対する CM の影響を調べた。pQ は 360 nm に吸収波長をEDTA（2Na, 3Na）
（WAKO）を用いた。ポルフィリン阻もつため、この波長の吸光度の経時変化を測定した。pQ

害剤として NaCN（WAKO）
を用いた。

の生成は FM 中と CM 中で差は見られなかった（図 3）。還Cell viability (% control)

鉄をキレートするためにエチレンジアミン四酢酸

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

CM
0%

CM
10 %
図２ PC12D 培養液の細胞死抑制効果
FM100%（FM），
FM50%/CM50%（FMCM），
CM50%（CM）
で培養したときの 6-OHDA による細胞死の抑制効果

図１ PC12D 細胞の生存率に対する CM の添加効果
n=3，**P<0.01, Student t-test

図３ 6-OHDA からの pQ 生成に対する培養液の影響
6-OHDA の分解によって生成する pQ の吸収波長の吸光度をFM，CM，そして GSH を含む FM 中で測定した。

− 62 −

神経細胞が分泌する酸化ストレスに対する保護因子の同定

元型グルタチオン（GSH）は pQ と反応するため吸光度の増考え、ポルフィリンの阻害剤である NaCN を CM に添加し加は著しく抑制された。この結果から CM は 6-OHDA かて H2O2 分解能を調べた。可変量の NaCN を用いて調べたらの pQ の生成には影響を与えないことがわかった。

ところ、5 mM 以上の NaCN によって CM の H2O2 消去活性

次に、FM 中と CM 中で 6 -OHDA から生成する H2O2 濃は抑制されることがわかった（図 5）。

度をスコポレチン法で測定したところ、CM では有意に少４．考なかった。また、既知の濃度の H2O2 を FM および CM に察

添加し、37 ℃ 15 分反応後、H2O2 濃度を測定したところ、PC12D 細胞は、6 -OHDA によって誘導される細胞死に

CM では FM より有意に減少していた（図 4）。この結果よ抵抗性をもつことが先行の研究により示されていたが、本り、CM 中には H2O2 を分解する物質が含まれていること研究により、PC12D 細胞から培養液（CM）中に細胞保護が示唆された。また、6-OHDA による PC12D 細胞の細胞因子が分泌されていることがわかった。培養液中では、死は、カタラーゼの添加によって抑制される結果も（data

6-OHDA から pQ と H2O2 が活性種として生成することがnot shown）、CM 中の保護因子は H2O2 消去によって細胞知られていたが、PC12D 細胞の培養液（CM）は pQ 生成に

死を抑制することを示唆している。

影響を与えないことから、細胞死の抑制は H2O2 の分解によるものと考えられた。実際に CM に添加した H2O2 は速

3. 3. 神経細胞保護因子の分子量と荷電状態

やかに分解された。また、6-OHDA による PC12D 細胞のPD10 と Sephadex 30 prep grade の 2 種類のゲルクロマ

細胞死は、カタラーゼの添加によって抑制されることから、トグラフィーを用いて CM の分画をおこない、H2O2 消去

CM 中の保護因子は H2O2 消去によって細胞死を抑制する能を指標に保護因子の分子量は約 1,000 Da であることを明ことが示唆された。クロマトグラフィーの結果から、CMらかにした（data not shown）。次に、陽イオン交換樹脂お中の保護因子の分子量は約 1,000 Da であることが突き止め

よび陰イオン交換樹脂を用いてクロマトグラフィーを行い、られた。H2O2 の分解には Fe や Cu などの遷移金属の関与

保護因子の荷電状況に依存して吸着することにより H2O2が推測されたが、キレート剤が抑制効果を示さないことや、消去能が失われるか検討したところ、いずれのイオン樹

クロマトグラフィーの結果からもとめられた分子量などか脂を通しても H2O2 消去能には変化がなかった（data not

ら、ポルフィリンが候補物質として考えられた。ポルフィ

shown）。この結果から、保護因子はプラスにもマイナス

リンの活性阻害剤である NaCN を添加すると、CM の H2O2にも帯電していないことが示された。

分解能が抑制されることから、CM 中の活性物質はポルフ
ィリンもしくはポルフィリン様の化合物である可能性が高

3. 4. H2O2 消去能に対する阻害剤の効果い。ポルフィリン錯体の分子量は約 500 Da であるが、配H2O2 の分解には Fe イオンが関与している可能性が考位している金属イオンを介して、ポルフィリン錯体ダイマ

えられたため、Fe イオンをキレートする EGTA 2Na とーを形成する。また、ポルフィリン錯体ダイマーは水溶性

EGTA 3Na を CM に 添 加 し て、H2O2 分 解 能 へ の 影 響 をでカタラーゼ活性をもち、H2O2 と反応することが報告さ調べたが、いずれも分解能を抑制しなかった（data not

れている 10, 11）。以上より、PC12D 細胞の分泌する細胞保shown）。次に、保護因子がポルフィリンである可能性を

護因子は、ポルフィリン様物質であることが示唆された。

図 4 FM と CM の H2O2 消去能の比較
H2O2 もしくは 6-OHDA を FM，CM に添加し，37℃ 15 分
後の H2O2 濃度を測定した。 n=5, **P < 0.01, Student t-test

図５ ポルフィリン阻害剤による CM の H2O2 消去活性抑制
n=10, **P<0.01, Dunnett, compared with 0 mM

− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

謝辞

noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma
cells which respond to nerve growth factor. Proc. Natl.

本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりAcad. Sci. U.S.A., 73, 2424-2428, 1976.

ご援助いただきましたことに深謝いたします。

７）Katoh-Semba R, Kitajima S, Yamazaki Y, Sano
（引用文献）

M, : Neuritic growth from a new subline of PC1 2１）Gomez-Isla T, Hollister R, West H, Mui S, Growdon

pheochromocytoma cells: cyclic AMP mimics theJH, Petersen RC, Parisi JE, Hyman BT, : Neuronal loss

action of nerve growth factor. J. Neurosci. Res., 17, 36-

correlates with but exceeds neurofibrillary tangles in

44, 1987.
８）Sano M, Kitajima S, : Activation of mitogen-activatedAlzheimer’s disease. Ann. Neurol., 41, 17-24, 1997.

protein kinases is not required for the extension of２）Forno LS, : Neuropathology of Parkinson’s disease. J.

neurites from PC12D cells triggered by nerve growth

Neuropathol. Exp. Neurol., 55, 256-272, 1996.

factor. Brain Res., 785, 299-308, 1998.

３）Yamanaka K, Saito Y, Yamamori T, Urano Y,
Noguchi N, : 24S-Hydroxycholesterol induces neuronal９）Miyama A, Saito Y, Yamanaka K, Hayashi K,

cell death through necroptosis, a form of programmed

Hamakubo T, Noguchi N, : Oxidation of DJ-1 induced

necrosis. J. Biol. Chem., 286, 24666-24673, 2011.

by 6-hydroxydopamine decreasing intracellularglutathione. PLoS One., 6, e27883, 2011.

４）Yamanaka K, Urano Y, Takabe W, Saito Y, Noguchi
N, : Induction of apoptosis and necroptosis by 2 4(S)-1 0）Asayama S, Nakajima T, Kawakami H, : New water-hydroxycholesterol is dependent on activity of acyl-

soluble Mn-porphyrin with catalytic activity for

CoA:cholesterol acyltransferase 1, Cell Death Diseases,

superoxide dismutation and peroxynitrite decomposition.

5, e990, 2014.

Metallomics. , 3, 744-748, 2011.

５）Okabe A, Urano Y, Itoh S, Suda N, Kotani R,11）Ohse T, Nagaoka S, Arakawa Y, Kawakami H,

Nishimura Y, Saito Y, Noguchi N, : Adaptive responses

Nakamura K, : Cell death by reactive oxygen species

induced by 2 4S-hydroxycholesterol through liver X

generated from water-soluble cationic metalloporphyrins

receptor pathway reduce 7-ketocholesterol-caused

as superoxide dismutase mimics J. Inorganic Biochem.,

neuronal cell death, Redox Biol., 2, 28-35, 2013.

85, 201-208, 2001.

６）Greene LA, Tischler AS, :Establishment of a

− 64 −

白髪予防・治療剤の選別に有効な加齢性白髪を自然発症する
モデル動物の開発
名古屋大学大学院医学系研究科環境労働衛生学

加藤昌志

Hair graying is a symbol for senescence in humans and one of great cosmetic problems especially for women. Therefore,
development of preventive therapy for hair graying is very important in the field of cosmetology. However, available
preventive therapies for hair graying are very limited at present. Experiments using humans are difficult to develop drugs
for hair graying. Therefore, model mice that mimic the mechanism of hair graying in humans could be strong tools fordevelopment of the preventive therapy. Up to now, more than 10 kinds of model mice for hair graying have been reported.
However, most of the mice are models for premature hair graying with limited life span. In this study, we developed a novel
model mouse for hair graying with long life span. Our macroscopic analysis showed that our model mice progressively
develop hair graying with senescence. Previous microscopic studies showed that loss of follicular melanocyte stem cells isa fundamental cause for hair graying in humans. Therefore, we histologically evaluated follicular melanocyte stem cells in
our model mice. Our melanocyte-targeted reporter transgene analysis showed depletions of follicular melanocyte stem cell
as well as the descendant melanocytes in gray hairs of our model mice. Previous study showed that melanocyte stem cells
divide and produce their descendant melanocytes in every hair cycles to regenerate pigmented hairs. Previous study also
showed that promotion of hair cycles accelerates hair graying. We in this study examined effect of increased hair cycle on
hair graying in our model mice. Hair graying was accelerated by depilation, which is a well-established method to artificiallypromote hair cycles, in our model mice. These results suggest that melanocyte stem cells and descendant melanocytes areassociated with hair graying in our model mice. Our findings suggested that hair graying in our model mice are partiallyresembles hair graying in humans, whereas further analysis to characterize hair graying in our model mice will be needed.
Thus, in this study, we developed a novel model mouse line for hair graying, partially clarified mechanism of hair graying
in the mice with considering the similarity of hair graying in humans and suggest that the mice could be a potential tool todevelop preventive therapy for hair graying.

１．緒

白髪の発症を予防したり、さらに理想的には、既に発症し言てしまった白髪を改善することが、安全にできれば、コス

50 歳の約半数が 50% 程度の白髪を発症すると報告されメトロジー学上、極めて画期的であると言える。しかし、ている 。このように白髪は加齢の象徴であり、特に女性筆者が検索しえた限りでは、科学的根拠に基づいた白髪予にとって、美容上の大きな問題となる。美容上の解決策と防効果のある製品は存在しない可能性が高いと考えられる。

しては白髪染め（ヘアカラー）が、現時点では、最も現実的

白髪予防・治療法の開発においては、ヒトで効果を確認な選択肢である。実際に、日本における白髪関連製品は、するのが最善である。しかし、ヒトの白髪については、①

年間 1,000 億円近い市場となっている。中国、インド、ブ

非常に長い期間かけて進行する、②発症時期や進行速度ラジル等の新興国の経済発展により、美容への関心がさら等、個人差が大きい、③薬物の安全性等の倫理的配慮の必に高まれば、市場規模は、今後増大すると推測できる。し要性、④効果を検討できる薬物の数が限られる、といった

かし、白髪染めは、使用にやや時間がかかるだけでなく、問題もある。ゆえに、ヒトにおいて、薬物や美容関連機器

繰り返して使用することが求められる。白髪染めに関する等の白髪予防・改善の効果を判定することは容易ではない。

アンケートでは、①自分で手間をかけずに染められること、ヒトの白髪発症機構に類似した白髪モデル動物が存在すれ②一度染めたら 2 ～ 3 週間は持続すること、③手の届きにば、外用または内服で有効な白髪予防・治療効果のある薬

くい部分を簡単に染められるブラシが付いていること、が物や食品をスクリーニングすることができる。白髪を自然求められているので、消費者が、より簡便な方法で、長期発症する動物が大型動物であると、飼育場所や飼育費用が間効果の持続する製品を期待していることがわかる。もし、高額になるとともに、管理に関係する人手もかかるので、

1）

マウス等の小動物であることが望ましい。しかし、出生時2）から白髪を発症しているマウス や一時的に白髪を発症す

Establishment of novel animal models forage-related hair graying that are useful todevelop preventive therapies

るマウス は報告されているが、10 ヶ月以上の寿命を持ち、Masashi Kato
D e p a r t m e nt o f O c c up at i o n a l a nd
Environmental Health, Nagoya University
Graduate School of Medicine

ル動物は世界的にも稀である。

3）

ヒトと同じように加齢とともに徐々に白髪が進行するモデ
筆者らは、メラノサイトの分化・増殖・遊走の分子機構
4−6）に焦点をあてた研究を推進している− 66 −。近年では、遺伝子白髪予防・治療剤の選別に有効な加齢性白髪を自然発症するモデル動物の開発

改変技術を用い、新規の白髪を自然発症するマウスを開発

所見を比較した。さらに、HE 染色および LacZ 染色により、している。本モデルマウスでは、2 年以上の寿命を持つ個

病理組織学的に毛疱メラノサイトを検出し、野生型マウス

体も珍しくないので、ヒトと同じように加齢とともに徐々と白髪モデルマウスを比較した。

に白髪を発症するモデル動物であると言える。本研究では、

３.

中間報告での成果をさらに発展させ、白髪モデルマウスを結果用いたより詳細かつ専門的な組織学的解析を通して、ヒト

3. 1. ヒトおよびモデルマウスに発症した白髪の肉眼所見とモデルマウスにおける白髪発症機構の類似性を検証する。

本研究では、ヒトとマウスについて、黒髪と白髪の肉眼

さらに、白髪の予防・治療に有効な薬物のスクリーニング

的特徴を観察した（図 1）。ヒトにおいても、モデルマウス

技術についても、
より現実性の高いロードマップを提供する。

においても、白髪では、メラニンを欠損しているという点

２．実
2. 1. 対で類似性が認められた。本結果より、本モデルマウスにお験

ける白毛の毛疱では、1）毛幹（シャフト）へのメラニン供給

象障害、2）メラノサイトにおけるメラニン産生障害、3）メラ

ヒト、野生型マウス、遺伝子改変マウスである白髪モ

ノサイトの消失、4）メラノサイトの細胞供給源であるメラ

デルマウスを対象とした。尚、メラノサイトを特異的か

ノサイト幹細胞の消失あるいは機能障害のいずれか、あるつ簡便に染色するために、メラノサイト特異抗原である

いは、上記に関する複数の障害を持つ可能性を考えた。

dopachrometautomerase（Dct）のプロモーター下にレポ
ーター遺伝子である lacZ 遺伝子をつないだ Dct/LacZ- トラ

3. 2. モデルマウスにおける加齢性白髪の肉眼所見

7）

ンスジェニックマウス と野生型マウスおよび白髪モデル

本研究では、野生型マウスとモデルマウスについて、加齢と白髪の関係を肉眼で観察した。野生型マウスでは、1

マウスを交配してから解析を行った。

ヶ月齢、3 ヶ月齢、9 ヶ月齢のいずれにおいても、白髪は

2. 2. 形態解析

肉眼的に、ほとんど観察されなかった（図 2A − C）。プレ

加齢性変化を考慮しながら、黒毛と白毛に関する肉眼的パラートを用いた白髪率の解析により、野生型マウスの白

図 1 毛髪の肉眼所見：ヒト（A）および白髪モデルマウス（B）における黒髪と白髪の肉眼所見を示している。黒の矢頭は黒髪を、白の矢頭は白髪を示している。

図 2 マウスにおける加齢性白髪の肉眼所見と白髪率：野生型マウス（A–C）および白髪モデルマウス（D–F）における、月齢と白髪の肉眼所見（A–F）と白髪率（白髪の本数 / カウントした毛髪の総本数）
を示す
（G）
。

− 67 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

髪率は、1 ヶ月齢で 0.0 %、3 ヶ月齢で 1.2 %、9 ヶ月齢でLacZ 陽性細胞（青色に染色される細胞）として染色される。

も 1.7 % 程度であることが分かった。これは、野生型マウ

メラノサイト幹細胞はバルジと呼ばれる毛疱上部に存在し、スにおいて、加齢性白髪の発症は極めて限られているこ

メラノサイトは毛球部に存在する。

8, 9）とを、具体的な数値で示したものである。一方、モデルマ

野生型マウスのバルジ領域では（図 3A）、過去の報告

ウスでは、生後 1 ヶ月の段階で、白髪の割合は 10.9 % でと同様に LacZ 陽性細胞が確認された。本白髪モデルマウあった（図 2G）。肉眼的に見ても野生型マウスに比較してスの黒毛のバルジ領域（図 3B）でも、野生型マウスと同様多いように見える（図 2A, D）。モデルマウスでは、加齢がに LacZ 陽性細胞が観察されるのに対し、モデルマウスの進むにつれて、白髪率が 24.1 %（3 ヶ月）、52.1 %（9 ヶ白毛のバルジ（図 3C）では、LacZ 陽性細胞は観察されなか月）と増加することがわかった（図 2D − G）
。モデルマウった。野生型マウス（図 3D）およびモデルマウス（図 3E）のスの寿命を 30 ヶ月、ヒトの寿命を 80 年（960 ヶ月）と仮定

黒毛の毛球部には、メラニンおよびメラノサイトが存在しし、単純計算すると、マウスの 9 ヶ月は 288 ヶ月（24 年）ていた。一方、モデルマウスの白毛（図 3F）の毛球部ではに相当する。モデルマウスの 9 ヶ月齢の白髪率は 52.1%（図組織学的にもメラニンが欠損しているだけでなく、メラノ

2G）である。ヒトにおいて白髪がほとんどない 25 歳からサイトも消失していた。さらに、少なくとも我々が観察し24 年経過し、約 50 歳を迎えた時、その約半数が 50% 程

た限りでは、バルジ領域に LacZ 陽性細胞が存在しない毛度の白髪を発症することが報告されている ことを考える

根では、毛球部の LacZ 陽性細胞も観察されなかった。こと、本モデルマウスにおける肉眼的白髪発症のダイナミク

れらの結果より、本モデルマウスの白毛では、メラノサイ

スは、ある程度ヒトの加齢性白髪に類似していると提案でト供給源であるメラノサイト幹細胞が何らかの原因で消失

きる。

し、その結果、毛球部へのメラノサイトの供給が停止し、

1）

結果としてメラニンが毛幹へ供給されなくなったと示唆さ3. 3. モデルマウスにおける加齢性白髪の組織所見れる。過去の報告によると、ヒトの白髪でも、メラノサイ

野生型マウスとモデルマウスについて、黒毛と白毛にト幹細胞および毛球部のメラノサイト消失が加齢と共に亢おけるメラノサイトおよびメラノサイト幹細胞の分布を進することが報告されている 。少なくともバルジ領域お調べた（図 3）
。メラノサイトおよびメラノサイト幹細胞はよび毛球部のメラノサイトおよびメラニン産生に関する組

8）

織学的観点においては、モデルマウスにおける白髪発症機
構とヒトの白髪発症機構は類似していると考えられる。

3. 4. 白髪マウスの幹細胞に焦点をあてた白髪化の機序
解析
図 3 より、白髪化の根本原因がメラノサイト幹細胞にある可能性が示唆された。メラノサイト幹細胞は毛周期の回転とともに分裂し、子孫細胞であるメラノサイトを毛母に9）供給することが報告されている 。メラノサイト幹細胞が本白髪モデルマウスにおける白髪化の原因であるならば、毛周期を加速させると白髪化も影響を受けるのではないかと仮説をたてた。本モデルマウスにおいて、脱毛処理により人為的に毛周期を加速させたところ、脱毛部特異的に白髪化が促進された（図 4）。これは、メラノサイト幹細胞が脱毛により影響を受けている可能性を示している。

図 3 マウスにおける加齢性白髪の病理組織所見：9 ヶ月齢の野生型マウスのバルジ領域（A）および同腹の白髪モデルマウ
スの黒毛および白毛のバルジ領域（B と C）の LacZ 染色像を示す。9 ヶ月齢の野生型マウスの毛球部（D）および同腹の白髪モデルマウスの黒毛および白毛の毛球部（E と F）の LacZ
染色像を示す。矢印は、バルジ領域の LacZ 細胞を示す。

図 4 モデルマウスにおける脱毛処理による白髪化の加速：3ヶ月齢のモデルマウスにおける、脱毛処理後の毛色の肉眼所見を示す。脱毛部分に一致して、白髪が発症している。

− 68 −

白髪予防・治療剤の選別に有効な加齢性白髪を自然発症するモデル動物の開発

図 5 白髪予防・治療剤開発の戦略：1 次選別として、①細胞レベルのスクリーニング、
2 次選別として、②モデルマウスを用いた個体レベルでのスクリーニング、3 次選
別として、③ヒトにおける白髪予防・治療効果の確認、といったプロセスによる白髪予防・治療法開発のロードマップを示した。尚、モデルマウスを用いた個体レベ
ルでのスクリーニング（2 次選別）が難しい場合には、ヒトの皮膚を用いた ex vivo 解析等の代用の方法を検討する。

４．考ことは難しい。しかし、ヒトとマウスの相違点を理解した

察

上で、本モデルマウスとヒトで、白髪発症機構の類似点を肉眼的解析により、本モデルマウスに発症する白髪化は、解析することにより、白髪予防・治療に有効な薬物や美容

ヒトの加齢性の白髪と形態的にも白髪発症期間についても関連機器に関するスクリーニング技術を開発するできる可非常に類似していることが示唆された。また、組織学的解能性があるので、コスメトロジー学の発展に貢献できる可析により、モデルマウスの白髪発症機構は、現時点で解明

能性があると考えている。

されているヒトの白髪発症機構と比較して、少なくとも「毛疱メラノサイト幹細胞およびメラノサイトの消滅によるシ

謝ャフトへのメラニン供給の停止」と言う点については、類似していることがわかった。今後、本モデルマウスとヒト

辞

本研究の推進を御支援いただいたコスメトロジー研究振興財団に深く感謝申しあげます。

の白髪発症の分子機構をさらに詳細に比較することにより、①ヒトにおける白髪発症機構に関する新知見、②白髪発症（引用文献）に関与する分子群を特定することにより、将来白髪を発症

１）Keogh EV, Walsh RJ. Rate of greying of human hair.
Nature. 207 (999) : 877-8, 1965.

する確率を予測できるバイオマーカーの開発、が達成できる可能性がある（図 5）。さらに、白髪発症機構の解明を進め、

２）Veis DJ, Sorenson CM, Shutter JR, Korsmeyer SJ.

分子機構を基にした細胞レベルで、白髪の予防・治療に有Bcl-2-deficient mice demonstrate fulminant lymphoid

用な薬物をスクリーニングするシステムを提案後、実際に

apoptosis, polycystic kidneys, and hypopigmented hair.

薬物スクリーニングを実施し、候補薬物をしぼった後に安Cell 22 ; 75 (2) : 229-40, 1993.

全性試験や安定性試験を含めた実用性をヒトで調べること

３）Nishikawa S, Kusakabe M, Yoshinaga K, Ogawa M,

により、白髪の発症を根本から予防・治療できる薬物を提Hayashi S, Kunisada T, Era T, Sakakura T, Nishikawa

案できる可能性がある（図 5）。

S. In utero manipulation of coat color formation by a

５．総monoclonal anti-c-kit antibody: two distinct waves of括

c-kit-dependency during melanocyte development.
EMBO J 10 (8) : 2111-8, 1991.

例えば、成人の毛髪のほとんどは成長期毛である一方、成獣（マウス）の毛は、ほとんどの毛が休止期毛である。こ４）Kato M, Takahashi M, Akhand AA, Liu W, Daiのように、ヒトとマウスが全く同じ機構で白髪を発症する

Y, Shimizu S, Iwamoto T, Suzuki H, Nakashima I.

− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Transgenic mouse model for skin malignant melanoma.

required for the proliferation of melanoblasts in the

Oncogene 17 (14) : 1885-8, 1998.

mouse embryo. Dev Biol 192 (1) : 99-107, 1997.

５）Kato M, Takeda K, Kawamoto Y, Tsuzuki T, Kato

８）Emi K. Nishimura, Scott R. Granter, David E. Fisher.

Y, Ohno T, Hossain K, Iftakhar-E-Khuda I, Ohgami N,

Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte

Isobe K, Takahashi M, Nakashima I. Protective effectstem cell maintenance in the niche. Science 307 : 720-

of hyperpigmented skin on UV-mediated cutaneous

724, 2005.

cancer development. J Invest Dermatol 127 (5) : 1244-

９）Emi K. Nishimura, Siobha´n A. Jordan, Hideo Oshima,
Hisahiro Yoshida, Masatake Osawa, Mariko Moriyama,

9, 2007.
６）Kumasaka MY, Yajima I, Hossain K, Iida M, Tsuzuki

Ian J. Jackson, Yann Barrandonk, Yoshiki Miyachi &T, Ohno T, Takahashi M, Yanagisawa M, Kato M. A

Shin-Ichi Nishikawa. Dominant role of the niche innovel mouse model for de novo Melanoma. Cancer

melanocyte stem-cell fate determination. Nature 4 1 6:

Res 70 (1) : 24-9, 2010.

854-60, 2002.

７）Mackenzie MA, Jordan SA, Budd PS, Jackson IJ.
Activation of the receptor tyrosine kinase Kit is− 70 −

皮膚細胞は独自に女性ホルモンを合成し、それが皮膚細胞の活動を制御している
東京大学大学院総合文化研究科

川戸佳

We analyzed the local estrogen synthesis systems and estrogen receptors in female rat facial skin tissues. RT-PCR
analysis revealed mRNA expressions of representative enzymes and receptors. We compared the skin steroidogenic enzymes/
receptors with those of the brain hippocampus which also has the local estrogen synthesis systems and estrogen receptors. In
the hippocampus, a center for learning and memory, locally synthesized estrogen plays a crucial role in modulating memoryrelated synaptic plasticity. Locally synthesized estrogen could also play a significant role in female facial skin condition in
addition to plasma estrogen.

１．緒言

粧品ののりが良い。エストラジオール受容体も検出してほ女性の顔の肌のつやつや感を保つには、女性ホルモンでかの組織と比較する。最近の化粧品には、肌の状態をよくあるエストラジオール E2 が重要であることは、よく知らするために植物エストロゲンなども（イソフラボンなど）使れている。生理サイクルと顔の肌の状態には密接な関係が用されているが、皮膚細胞がエストラジオールを合成する

あり、エストラジオールは肌の最表層の角層の水分を保持のであれば、その基質 DHEA などを含む、肌にやさしい

し肌の潤いを保つ

1−3）。また、真皮層のコラーゲンやエラ

化粧品なども考案できる。

スチンの合成を促進して、肌のハリを保ち、シワやタルミ

２．実を予防する働きがある。本研究では、顔の皮膚細胞が女性ホルモンを独自に合成し、それが皮膚細胞の活動度維持に験

2. 1. 実験の方針
メスラットを用いて、顔の皮膚組織を用いて、性ホルモ

役立っているという、新しい現象を見出した。
これまの常識では、卵巣が合成して血中に分泌するエンの合成系を解析する。図 1 に示した系があると考え、合ストラジオールとプロゲステロンが皮膚細胞の状態を制成 酵 素 の mRNA を PCR 法 で 検 出 す る。 卵 巣 の 1/200 −御していると思われていた。本研究では、皮膚組織の中に、性ホルモンの合成系の、「コレステロール→［P450scc］→プレグネノロンまたはプロゲステロン→［P450（17a）］→ DHEA またはアンドロステンジオン→［17b-HSD（1, 3），P450arom］→テストステロン、エストロン、エストラジオール」が存在することを見出すことを目指す（図 1）。皮膚細胞が合成する基底量に加えて、血中からくるエストラジ
オールが上乗せされると予測している。
もう 1 つの女性ホルモン、プロゲステロンは皮脂の分泌を促進する。皮脂の分泌が過剰になるとニキビの原因になる。このように、女性ホルモンは肌の状態に大きな影響を与え、例えば、エストラジオールがたくさん分泌される時期、つまり、生理が終わってから排卵までの間は、肌にとっては安定した良い時期で、この時期は肌の調子がよく、化ELocally synthesized steroids in facialskin modulate skin functions
Suguru Kawato
Graduate School of Arts and Sciences,
The University of Tokyo

図 1 本研究において解析した皮膚における女性ホルモン局所
合成経路とその作用経路。川戸研究室の先行研究により、海馬においては、コレステロールから男性ホルモン・女性ホルモンに至る完全な局所合成系が存在し、作用サイトである女
性ホルモン受容体や男性ホルモン受容体が神経細胞に局在することが証明されている 4 − 6）。

− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

1/1000 くらいの mRNA が発現していると予想するが、川いだ。タンパク質を除去したのちに 260 nm の吸光度を測

戸研究室は、この微小量の mRNA の検出が得意である。

定して RNA 濃度を求めた。

それは、2000 年頃から進めている、記憶中枢の脳海馬での局所的な男性・女性ホルモン合成の研究を行う過程で、

2. 4. RT-PCR 法

技術力を磨いたからである。これは primer 設計を熱力学

顔の皮膚や脳の海馬のような局所ステロイド合成系では、の自由エネルギー計算を用いて新たに行い、選択性や結合ステロイド合成酵素や受容体の発現は非常に少ない。内分性を改良して、感度を過去の 1000 倍にした。これによっ泌組織（卵巣・精巣・副腎皮質）と比べて 1/300−1/5000 くて卵巣の 1/200 − 1/1000 くらいの mRNA が発現も検出でらいと微量である。この場合過去の論文のプライマーを使きる。mRNA がこれくらい少なくても、局所の皮膚組織用していては検出できない。新しくプライマーを特別に設内で作用するのであれば、小さな皮膚組織の体積を総血管計しないと、正確な発現量は定量出来ない。熱力学的フリ

体積（ラットで 25 mL）の 1/100 － 1/1000 くらいとすると、

ーエネルギー DG がハイブリダイゼーション部位の平均よ

十分な濃度のエストラジオールが供給できるはずである。

り更に負の値をとるように、コンピュータで計算して設計

ちなみに脳海馬の体積は 0.1 mL くらいで血管体積の 1/250

することで、この問題を解決した 4, 6）。

くらいである。エストラジオールが作用する受容体 ERa,
ERb も解析する。

Total RNA は oligo（dT）プライマーを用いて逆転写反応を行い、一本鎖の cDNA を合成した。反応液（25mL）の質量分析で局所エストラジオール濃度を分析し、血中と比較して、十分な濃度があるのかどうかを検査する。

組成：totalRNA 10mg, 1x RT buffer, 1 mM dNTP mixture,oligo（dT）1 5（Promega）2 mg, RNasin Plus（Promega）
40 U, RTase（Toyobo, Japan）200 U。 こ れ ら を 42 ℃ で

2. 2. 実験動物

60 分反応させ、cDNA を合成し、75 ℃で 15 分間処理して実験動物には、12 週齢のメス Wistar ラットを用いた。

反応を停止させた。cDNA 溶液は 4 U RNase H（Takara

実験動物は室温 25 ℃、照明は午前 8 時に照らし、明暗周

bio, Japan）処理を行い、残った RNA を分解した。得られ期を 12 時間（午前 8 時照明点灯、午後 8 時消灯）の状態でた cDNA 溶液は使用まで－20 ℃に保存する。

飼育した。餌として固形ペレットを与え、実験動物が餌・PCR 反応液（25 mL）の組成：cDNA（toltal RNA 換算

水ともに自由に得られる飼育環境にした。実験はすべて東で 0.1−200 ng）、1x PCR buffer, 0. 2 mM dNTP mixture,

京大学動物実験委員会の承認を得たうえで遂行した。

0. 2 mM プ ラ イ マ ー（forward and reverse）、Blend Taq
polymerase 0.63 U（Toyobo, Japan）。PCR は 3 ス テ ッ プ

2. 3. total RNAの抽出で行い、その増幅プロトコルは 95 ℃、5 分（変性）→［95

ラットを麻酔下で断頭後、顔の皮膚・卵巣・海馬を氷冷℃、30 秒（変性）→ Ta（58 ～ 68）℃、20 秒（アニーリング）

した人工脳脊髄液（pH 7.4, 290 mOsm）
中で取り出し、直ち→ 72 ℃、30 秒（伸長）］× サイクル数→ 72 ℃、5 分（伸長）に液体窒素で凍結した。Total RNA の抽出には SV Totalであった。標的名、プライマー配列、サイクル数、アニー

Isolation System（Promega, USA）を用いた。抽出した

リング温度（Ta）といった条件は表 1 に示した。
PCR 産物を 2 % アガロースゲルで電気泳動して分離し、Total RNA は Recombinant DNase I（RNase-free DNase
I; Takara, Japan）処理を行い、genome DNA の混入を防
表1
Gene
Esr1
Esr2
Cyp19
Hsd17b1
Hsd17b3
Gapdh

Direction

ゲルをエチジウムブロマイドで染色した。紫外線を照射し本研究で用いた PCR の各条件
Product
Ta
Length（bp） （℃）

Primer Sequence（5' to 3'）

Forward GCCGGCTGCGCAAGTGTTACG
Reverse GGAGCGCCAGACCAGACCAATCA
Forward GCAAACCAGGAGGCAGAAAGTAGC
Reverse AAGTGGGCAAGGAGACAGAAAGTAAGTA
Forward CTGATCATGGGCCTCCTCCTG
Reverse CCCACGCTTGCTGCCGAATCT
Forward ACTCCGGGCGTGTGCTGGTGA
Reverse GGCGTGTCTGGATCCCCTGAAACTT
Forward CTCCCCAACCTGCTCCCAAGTCATTT
Reverse AGCAAGGCAGCCACAGGTTTCAGC
Forward TATGACTCTACCCACGGCAAGTTCAA
Reverse ACCACCCTGTTGCTGTAGCCATATTCAT− 72 −cDNA（ng）
卵巣

皮膚

海馬

PCR
cycles

467

68

1

100

100

29

591

60

0.1

100

50

36

276

58

0.1

200

10

40

517

65

1

100

100

30

408

65

1

100

50

38

830

60

10

10

10

23

皮膚細胞は独自に女性ホルモンを合成し、それが皮膚細胞の活動を制御しているて各 PCR 産物のバンドから発する蛍光輝度を Image J で卵巣摘出したメス（OVX）を用いた。

解析し、発現量の定量に用いた。PCR サイクル数を横軸に、同じ個体由来の血漿と海馬を採取し、（1）血漿と（2）
海馬

輝度を縦軸にプロットした増幅曲線を作成し、輝度の対数から抽出・精製した各ステロイドを質量分析の試料とした。

が線形に増加するサイクル数の範囲（指数増幅期）の中から麻酔下で断頭したラットから採取した血液を遠心（1,900

定量の際に用いた PCR のサイクル数を決定した。例えば、

xg、4 ℃、10 分間）して上清の血漿を試験管に分取し、液ERa（Esr1）の場合、指数増幅期は 26～30 サイクルである

体窒素で急速凍結後－30 ℃で保存した。血液の採取と並ので、解析には 29 サイクルで増幅した試料を用いた。

行して 95% O2 / 5 % CO2 混合ガスで十分にバブリングし異なる組織（卵巣・皮膚・海馬）間での標的遺伝子発現た緩衝液中で海馬の摘出を行った。

量 の 比 較 は、 内 部 標 準 遺 伝 子 で あ る glycerol dehyde-3-

海馬 1 対あたり 4mL の緩衝液を加えた。ホモジナイザ

phosphate dehydrogenase（GAPDH）の発現量（バンドのーを用いて氷冷しながら穏やかにホモジナイズし、ホモジ輝度）で標的遺伝子の発現量を割り算して規格化すること

ネートの 2 倍量のステロイド抽出液（ヘキサン : 酢酸エチで行った。GAPDH についても増幅曲線を作成し、23 サイ

ル = 2 : 3 の混合溶液）を加え 10 分間撹拌した後、遠心分クルで増幅した試料を規格化に使用した。

離（2,500 xg、室温、10 分間）して有機層に溶出したステロ
イドを回収した。溶媒を完全に蒸発させ、C18 カラム溶出

2. 5. DNA シークエンス

用溶液（メタノール : DDW = 40 : 60）1mL に再溶し、C18観測した PCR 産物が本当に標的遺伝子産物であるか

Amprep minicolumns（Amersham）を用いて、脂質等のどうかを DNA シークエンスから確認した。電気泳動後

夾雑物を除いた。C18 カラム精製後、HPLC を用いて定量の PCR 産 物 を Wizard SV Gel と PCR Clean-up System

するステロイド毎に分画した。固定相にはシリカゲルの（Promega）を用いてアガロースゲルから抽出し、pGEM-

充填された順相シリカゲルカラム（0.46×15 cm, Cosmosil

T-Easy vectors（Promega）に組み込む。このベクターを

5SL（Nacalai Tesque Inc.））を、移動相にはヘキサン、イBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied

ソプロパノール、酢酸の混合液を用いた。

Biosystems, Foster City, CA, USA） を 用 い て 反 応 さ

E2, E1, T については質量分析器に導入時のイオン化効

せ、蛍光を ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer（Applied

率を高め、検出感度を向上するために誘導体化を行った。

Biosystems）
で測定して DNA 配列を決定した。

E1 と T については picolinoyl 誘導体化を、E2 については
picolinoyl に加えて、pentafluorobenzyl でも誘導体化を行

2. 6. 質量分析 LC-MS/MS による女性ホルモン濃度の測定った。各ステロイド（誘導体）の構造と、LC-MS/MS の衝異なる性周期ステージ（卵胞期 : proestrus、排卵期 :ステロイド（または誘導体化したステロイド）試料をトリ

estrus、黄体期 1 : diestrus 1、黄体期 2 : diestrus 2）のメス、

プルステージ四重極型質量分析計に導入する。第 1 質量分

突部における開裂パターン・m/z 値変化を図 2 に示した。

図 2 本研究において定量したステロイドとその誘導体。各ステロイドは波線の部分で開裂し、娘イオンを生じる。この娘イオンの信号強度から各ステロイドの量を決定した。

− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

析で親イオンが選択されて通過する（例えば、E2 誘導体な産物は 32 ～ 40 サイクル間で指数増幅し 42 サイクルからら m/z ＝ 558）。次に窒素ガスとの衝突により誘導体が開飽和状態に達した。PCR は指数増幅期の 38 サイクルで行裂し、断片化した娘イオン（E2 誘導体なら m/z ＝ 339）がい、卵巣・顔の皮膚・海馬の発現量を比較した（図 3）。皮

第 2 質量分析で検出される。標準溶液を用いて予め作成し膚における 17b-HSD3 の発現量は海馬の 2/3 で、卵巣の約ておいた検量線と、観測された娘イオンの信号強度を比較

1/60 であった。

して、各ステロイドを定量した。

３．結

3. 2. シトクロム P450aromatase（遺伝子は Cyp19）の発現解析

果3. 1. 17β-HSD（type 1, 3）（遺伝子はHsd17b1, Hsd17b3）の発現解析

ストステロン（T）→エストラジオール（E2）の変換を行う酵

17b- ハイドロキシ - ステロイド - 脱水素酵素（17b-HSD）は、素であり、エストラジオール合成において最も重要な酵素

エストロン（E1）→エストラジオール（E2）、DHEA →アン

P450arom は、アンドロステンジオン→エストロン、テである。

ドロステンジオール、アンドロステンジオン→テストステP450arom の PCR 産物量の増幅解析を行った結果、36

ロン（T）への変換、を担う酵素である。ステロイドの 17b～ 42 サイクル間で指数増幅し、44 サイクルから飽和状水酸化反応を行う。女性ステロイドホルモン合成系の中態に達した。PCR は指数増幅期の 40 サイクルで行い、顔で重要な酵素である。14 種存在する 17b-HSD のサブタイの皮膚・海馬・卵巣の発現量を比較した（図 3）。皮膚でのプのうち、17b-HSD type1、type 3 は順方向の代謝を行い、発現量は低く、海馬の 1/50 ～ 1/100 であった。卵巣の約type 2，type 4 は逆方向の代謝を行う。本研究では、テス1/20000 であった。

トステロン・エストラジオールの合成に重要な 17b-HSD

3. 3. ERα，ERβ（遺伝子は Esr1, Esr2）の発現解析（1、3）の発現解析を行った。
17b-HSD1 の PCR 産物量の増幅解析を行った結果、PCR

エストロゲン受容体（ER）は、エストラジオールをリガ

産物は 28 ～ 34 サイクル間で指数増幅し 36 サイクルからンドとする受容体で a 型（ERa）、b 型（ERb）の 2 種類が存飽和状態に達した。PCR は指数増幅期の 30 サイクルで行在している。両者の DNA 結合領域、リガンド結合領域はい、顔の皮膚・海馬・卵巣の発現量を比較した（図 3）。顔類似しているが、N 末端の転写調節領域が異なるため、作の皮膚における 17b-HSD1 の発現量は海馬とは同程度であ用様式が異なっている。

り、卵巣の約 1/100 であった。

ERa（Esr1）の PCR 産物量の増幅解析を行った結果、26

17b-HSD3 の PCR 産物量の増幅解析を行った結果、PCR～ 30 サイクル間で指数増幅し、32 サイクルから飽和状

図 3 メスラットの卵巣・顔の皮膚・海馬におけるステロイド合成酵素と受容体の発現解析。
（左）各遺伝子の cDNA の PCR 産物を電気泳動したゲルイメージ。
（ ）内は解析に用いた PCR のサ
イクル数。卵巣・皮膚・海馬で流した cDNA 濃度は異なるので、規格化した比較は右の表が正しい。（右）卵巣・皮膚・海馬におけるステロイド合成酵素と受容体の発現量の比。Gapdh で規格化したのち、海馬を１として比較した。皮膚は、女性ホルモン前駆体の合成系は海馬と同程度存在するが、女性ホルモンへの変換能は弱そうである。受容体は十分な量発現している。

− 74 −

皮膚細胞は独自に女性ホルモンを合成し、それが皮膚細胞の活動を制御している態に達した。PCR は指数増幅期の 29 サイクルで行い、卵内では Proestrus : 4.3 nM（n ＝ 6）、Estrus : 1.0 nM（n ＝巣・顔の皮膚・海馬の発現量を比較した。皮膚における4）、Diestrus 1 : 0.51 nM（n ＝ 3）、Diestrus 2 : 0.7 nM（nERa の発現量は海馬の 2 倍であり、卵巣の 1/10、であった。

＝ 4）、OVX : 0.7 nM（n ＝ 4）、であった。一方、血漿で比較的多いといえる。

は Proestrus : 0.111 nM（n ＝ 6）、Estrus : 0.017 nM（n ＝ 6）、

ERb の PCR 産物量の増幅解析を行った結果、33 ～ 37

Diestrus 1 : 0.009 nM（n ＝ 5）、Diestrus 2 : 0.029 nM（nサイクル間で指数増幅し、39 サイクルから飽和状態に達＝ 6）、OVX : 0.005 nM（n ＝ 5）であった。これらを 7）かした。PCR は指数増幅期の 36 サイクルで行い、顔の皮膚・ら得られたオスのデータも入れてまとめたものが図 4 であ海馬・卵巣の発現量を比較した。皮膚における Esr2 の発る。海馬内濃度は血漿濃度の 10 ～ 100 倍程度という非常

現量は海馬の 1/4 であり、卵巣の約 1/320 であった。このに高い濃度であった。E2 の血漿濃度は低すぎてグラフのことから、皮膚で発現するエストロゲン受容体のタイプは、スケールでは見えない。

主に Esr1 であることがわかった。

４．考察

3. 4. 海馬と血中におけるエストラジオールとプレグネノ
ロンの濃度

ホルモンの局所合成系・作用系に関わる分子の発現解析を

女性ホルモンの一種であるプレグネノロン PROG は、女行った。川戸研の研究で良くわかってきている、海馬の局性ステロイドの合成における前駆体である。親イオンの所合成系との発現量比較を行い、顔の皮膚における局所合m/z 値は 315、フラグメント化した娘イオンの m/z 値は成系と作用系の意義を考察する。

本研究では、メスラットの顔の皮膚におけるステロイド97.2 であった。PROG 濃度は、海馬内では Proestrus : 55.7
nM（n ＝ 3）、Diestrus 2 : 48.0 nM（n ＝ 4）
、OVX : 24.5

4. 1. 顔の皮膚におけるエストラジオール E2 の局所合成
とその意義

nM
（n＝ 5）であった。一方、血漿ではProestrus : 20.5 nM（n海馬で得られた E2 合成酵素の発現量と E2 局所濃度の＝ 4）、Estrus : 16.7 nM（n ＝ 4）
、Diestrus 1 : 51.6 nM（nデータを用いると、顔の皮膚における E2 合成酵素の発現＝ 3）、Diestrus 2 : 24.1 nM（n ＝ 4）、
OVX : 10.1 nM（n ＝ 5）量のデータから、皮膚の E2 濃度を推定することができる。

であった。これらを川戸研の研究 7）のオスのデータも入れ

その生理的意義も考察する。

nM（n ＝ 4）、Estrus : 40.7 nM（n ＝ 4）
、Diestrus 1 : 87.0てまとめたものが図 4 である。どの群においても、メスの海馬内濃度は血漿の 2 倍程度である。ここで、体積から考4.1.1. 顔の皮膚におけるエストラジオールの前駆体の合成系
メスにおける性ホルモンの局所合成において、主な前駆

えて、血漿濃度は全血中濃度の約 2 倍と考えてよい。
E2 の親イオンの m/z 値は 558、フラグメント化した娘

体は PROG である。血中の PROG 濃度は性周期に伴ってイオンの m/z 値は 339 であった（図 2）。E2 濃度は、海馬

変動し、20 ～ 50 nM と十分な量が供給される。海馬では

図 4 メスラット脳海馬における、性周期ステージにおける PROG, E2 の濃度変動を質量分析により測定したもの。PROG は局所合成系において、E2 をはじめとする性ホルモンの前駆体となる。濃度が海馬 E2 >> 血中 E2 であることから、海馬では血中の E2 は低濃度
過ぎて寄与出来なくて、海馬における E2 はほぼすべて PROG を前駆体として海馬内で局所合成されることがわかる。Pro: 卵胞期、Est: 排卵期、D1 : 黄体期 1、D2 : 黄体期 2。
*p<0.05, **p<0.01。a, b は、オスとメスを比較して有意差（p<0.05) がある 5）。mRNA の発現を比較すると、皮膚においても同様の局所合成が起こっていることが示唆される。

− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

これに海馬自身が合成した PROG が加算されて、そこか

おいて女性ホルモンは、主に ERa を介して生理作用を十ら、エストロン E1 → E2（アンドロステンジオン→テスト

分に発揮していると考えられる。

ステロンも）を合成している。PROG よりも下流の局所合海馬においては、E2 が ERa、ERb を介してシナプス可成された海馬ステロイドの濃度は血中濃度よりもずっと高塑性の変化や樹状突起スパイン（シナプス後部）密度の増加

い。本研究のｍ RNA 発現の結果から、皮膚でも同様の現などを引き起こす 10, 11）。本研究において、顔の皮膚にお象が起きていることが予想される。

ける ERa、ERb の発現量は海馬と同程度であることから、

女性ホルモン合成酵素の途中に位置する 17b-HSD（type1, 3）の皮膚における発現量は、卵巣の 1/100 であるが、ER は、生理作用を引き起こすのに十分な量だけ発現している。

海馬とは同程度であり、局所合成系としては比較的高かっ

５．総た。従って 17b-HSD（type 1, 3）は十分な量の E2 前駆体

括の合成を行っていると推測できる。海馬においては、メス（1）メスラット顔の皮膚において、女性ホルモンの局所合で 2 nM 程度のアンドロステンジオンの産生を見出してい成系が存在することを明らかにした。エストラジオール

る 5, 7−9）ので、皮膚においても E2 前駆体が、やはり、1 ～E2 合成系の酵素、及び、その受容体 ERa、ERb は、脳2 nM 程度の局所濃度を持つことが予想できる。血中のアの海馬と同程度のレベルで発現していた。

ンドロステンジオンの最大値は、高々 0.4 nM であり、局（2）顔の皮膚における E2 局所濃度は、血中とほぼ同程度と所合成系で合成されたアンドロステンジオンが皮膚におけ推測される。これは海馬と血中における E2 濃度の質量

る E2 合成の前駆体となっていると考えられる。

分析結果を用いて、局所合成系 mRNA の発現レベルを

また、17b-HSD（type 1, 3）は、E1 を E2 に変換する経比較して推測した。顔の皮膚で合成される E2 と血中か路も触媒するので、アンドロステンジオンが E1 に変換さら来る E2 が合流して、ERa、ERb に結合して、皮膚のれた場合には、速やかにそれを E2 にしているものと考え状態を改善していることが示唆される。
（3）海馬での局所合成能（mRNA 発現）は性周期によらなかられる。

ったので 5）、顔の皮膚でも局所合成能が一定だと仮定す4. 1. 2. 顔の皮膚におけるエストラジオールの合成系とそると、卵巣からくる PROG と E2 の性周期変動によって、の意義

顔の皮膚での E2 の性周期変動が作り出されるのではな

脳海馬の E2 局所濃度は、卵胞期で最大値 4.3 nM（血漿いか。

は 0.1 nM）
を取り、他は 0.5 ～ 1.0 nM 程度である（この時の血漿濃度は 0.01 nM）。しかし、いずれのステージでも血（References）

漿の E2 の最大濃度 0.1 nM よりも高い値であり、海馬では

１）Ashcroft, G.S., et al., Topical estrogen accelerates

局所合成された E2 が生理作用を担っている。

cutaneous wound healing in aged humans associated

顔の皮膚において、女性ホルモン E2 または E1 を合成

with an altered inflammatory response, in Am J Pathol.

する酵素 P450 aromatase の発現量は海馬と比較して低か

1999: United States. p. 1137-46.

った。その発現量は、海馬の 1/50 程度である。しかし、

２）Dunn, L.B., et al., Does estrogen prevent skin aging?

これだけの発現量があれば、例えば、卵胞期における局所

Results from the First National Health and Nutrition

濃度の推定値は 4.3×1/50 ＝ 0.08 nM となり、血中とほぼ

Examination Survey (NHANES I). Arch Dermatol,

同程度の合成が行われていると推測される。よって、血中1997. 133 (3): p. 339-42.

から供給される E2 に顔の皮膚自身の合成した E2 が上乗

３）Hall, G.K. and T.J. Phillips, Skin and hormone therapy,

せされて、十分な発現量を持つ皮膚 ERa に結合し、顔の皮膚の状態を改善する効果を発揮しているであろう。

in Clin Obstet Gynecol. 2004: United States. p. 437-49.
４）Hojo, Y., et al., Adult male rat hippocampus
synthesizes estradiol from pregnenolone by cytochromes

4. 2. 皮膚におけるエストラジオール E2 の作用系

P45017alpha and P450 aromatase localized in neurons.
Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101 (3): p. 865-70.

女性ホルモン E2 は皮膚水分・コラーゲン合成・ヒア
ルロン酸増加といった生理作用を及ぼし、皮膚の状態を５）Kato, A., et al., Female hippocampal estrogens have

改善する 1 − 3）。この E2 の作用サイトの候補として、ERa、

a significant correlation with cyclic fluctuation of

ERb の二つがある。本研究で、顔の皮膚において女性ホルhippocampal spines. Front Neural Circuits, 2013. 7: p. 149.

モン受容体である ERa は、卵巣の 1/10 という十分に高い

６）Kimoto, T., et al., Semicomprehensive analysis of the

発現量であることが分かった。これに対して、ERb の発現

postnatal age-related changes in the mRNA expression

量は卵巣の約 1/300 であった。このことから、顔の皮膚にof sex steroidogenic enzymes and sex steroid receptors in− 76 −

皮膚細胞は独自に女性ホルモンを合成し、それが皮膚細胞の活動を制御している

the male rat hippocampus. Endocrinology, 2010. 151 (12):discrimination of androgen and estrogen effects on

p. 5795-806.

spinogenesis. Cereb Cortex, 2011. 21 (12): p. 2704-11.

７）Hojo, Y., et al., Comparison between hippocampus-10）Mukai, H., et al., Rapid modulation of long-term

synthesized and circulation-derived sex steroids in the

depression and spinogenesis via synaptic estrogen

hippocampus. Endocrinology, 2009. 150 (11): p. 5106-12.

receptors in hippocampal principal neurons. J
Neurochem, 2007. 100 (4): p. 950-67.

８）Hojo, Y., et al., Hippocampal synthesis of sex steroids
and corticosteroids: essential for modulation of synaptic11）Ooishi, Y., et al., Estradiol rapidly rescues synaptic

plasticity. Front Endocrinol (Lausanne), 2011. 2: p. 43.

transmission from corticosterone-induced suppression９）Mukai, H., et al., Automated analysis of spines fromvia synaptic/extranuclear steroid receptors in theconfocal laser microscopy images: application to the− 77 −

hippocampus. Cereb Cortex, 2012. 22 (4): p. 926-36.

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

海洋性カロテノイドの酸化ストレス応答シグナルNrf 2 -AREシグナルを介した HO- 1活性化による酸化ストレス軽減
国立沖縄工業高等専門学校生物資源工学科

平良

淳誠

Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) binds to antioxidant response element (ARE) induce antioxidant andphase II detoxification enzymes, such as heme oxigenase-1 (HO-1) and glutathione s-transferase under oxidative stress due
to chemicals and exposed to UV-irradiation. Fucoxanthin (FX) and its gastrointestinal metabolite fucoxanthinol (FXOH) aremarine carotenoid from edible brown algae, such as Undaria pinnatifida, Hijikia fusiformis and Sargassum fulvellum. In thisstudy, the activation of compounds on Nrf2-ARE signaling in RAW 264.7 macrophage cells was examined using reporter
assay. The compounds induced in low concentrations (2.5−10 μM) and the western blot analysis showed to Nrf2 transfer into
nuclear, resulted in expression of HO-1 protein due to binding to ARE. Interestingly, apoptotic cells with caspase 3/7 activity
in the presence of the compounds also activated the Nrf2-ARE signaling with HO-1 protein expression, which indicated antiapoptotic activity for cell survival. In addition, the activity of FXOH was higher than that of FX as well as antioxidant action
and anti-inflammatory effects will be bioavailable compound in a biological system.

１．緒

言

皮膚は紫外線や乾燥など、環境ストレスを受けやすい組織である。その環境ストレスの一つに、皮膚内で過剰に生じた活性酸素や窒素ラジカルによる酸化ストレスがある。
皮膚の酸化ストレスは、細胞に障害を与えて生理機能の損
失、皮膚組織の構造変化を引き起こし、皮膚のしみ、シワの要因をつくる。従来の研究では、抗酸化剤による酸化ストレス軽減を目的に行われ、植物抽出エキスやその活性成分による活性酸素消去作用を有する抗酸化剤の化粧品への開発が行われてきた 1−4）。生体には酸化ストレスに対する防御機構として、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼ、チオレドキン等の抗酸化酵素がある。最近の研究
で、Nrf2-Keap1 制御系による環境応答の制御機構転写因図 1 Fucoxanthin（FX）とその代謝体 fucoxanthinol（FXOH）の
化学構造

子 Nrf2 が、酸化ストレスに応答し、抗酸化応答配列（ARE）を介して一群の抗酸化及び薬剤耐性の遺伝子発現を活性化

結果、モズクやワカメなどの褐藻類に含まれる海洋性カする酸化ストレス監視機構として働くことが明らかにな

ロテノイドの Fucoxanthin（FX）とその胃腸管代謝物の5）った 。皮膚においては、UVA による皮膚障害の予防に、

Fucoxanthinol（FXOH）（図 1）7）に Nrf2-ARE シグナルを

Nrf2-Keap1 制御系の応答による Nrf2 が重要な役割を担っ介したヘムオキシゲナーゼ 1（heme oxygenase-1：HO-1）

6）ていることが、明らかとなった 。

の活性化作用による酸化ストレス軽減作用を明らかにした。

本研究では、著者がこれまでの研究で食歴のある安全評価物質の FX は化粧品素材として活用されている。本研

性の高い植物から見出した抗酸化物質について、Nrf2-

究の結果は、今回評価した代謝体 FXOH は FX よりも活性Keap1 制御系を指標に酸化ストレス軽減作用の評価を行が高く作用機序が明確なことから、FXOH または FX とのい、有用な酸化ストレス軽減物質の検索を試みた。その併用による機能性化粧品の開発も期待できることを示唆した。

Marine carotenoid reduces oxidative
stress due to HO- 1 expression throughNrf 2 -ARE signaling
Junsei Taira
Okinawa National College of Technology,
Department of Bioresource Technology

２．実験

2. 1. 細胞培養
RAW264.7 細胞の培養
RAW264.7 細胞は DMEM 培地（10 % 牛胎児血清、500
U/ml ペニシリン、500 µg/ml ストレプトマイシン）で、37− 78 −

海洋性カロテノイドの酸化ストレス応答シグナル Nrf2-ARE シグナルを介した HO-1 活性化による酸化ストレス軽減

量の Caspase-Glo 3/7 Assay kit 試薬（Promega）を添加し℃の CO2 インキュベータ（5 % CO2）で培養した。

て、そのマイクロプレートリーダー（GLOMAX MULTI

2. 2. Nrf2-AREシグナルのレポーターアッセイ

Detection system, Promega）で発光強度を測定した。

RAW264.7 細胞のみ及び試験化合物添加の細胞を、12well のマクロプレート（5×105 cells/ml）で 24 時間培養し2. 6. 統計処理

た。試験化合物は最終濃度が 2.5、5、10µM になるように添加した。培養細胞に FuGENE 6 を用いてプラスミド

実験データは標準偏差 ±SD で示し、有意差は t- 検定で行った。

pGL4.37［luc2P/ARE/Hygro］をトランスフェクションし3．結た。培養 24 時間後に PBS で 2 回洗浄した細胞を 100 µl のlysis バッファーで可溶化した。この可溶化細胞（50 µl）に果

3. 1. Nrf2-AREシグナルのレポーターアッセイ

ルシフェリン（50µl）を添加して、発光強度をマクロプレ

図 2 に、試験化合物存在下での Nrf2-ARE シグナル活性ートリーダーで測定した。また同試料のタンパク定量は試験の結果を示した。FX と FXOH によるシグナル活性が、BCA 法（Thermo Fisher Scientific, Inc., IL）で行い、タン有意に濃度依存で示された。また、FXOH の活性は FX に

パク量当たりの比活性として示した。

比べて高かった。この結果から、両化合物の Nrf2-ARE シ
グナルによる転写因子 Nrf2 による抗酸化酵素群の発現が2. 3. 細胞毒性試験示唆された。

試験化合物の細胞毒性は MTT 法で測定した。レポー
ターアッセイで調製した培養細胞に、0.05% MTT 試薬を

3. 2. Nrf2-AREシグナル活性化に伴うHO-1タンパク発現

500 µl 添加して、CO2 インキュベータで 3 時間培養した。

図 3 に、化合物による Nrf2-ARE シグナル伝達におけ

培養後に上清を完全に取り除き、50µl の DMSO でミトコ

る HO-1 タンパク発現の結果を示した。HO-1 タンパクは、

ンドリアによる MTT 還元物のホルマザンを抽出して、そFX と FXOH 存在下で顕著な発現を示した（図 3A）。このの UV 吸収波長 540nm と対照波長 655nm の吸光度をマイ

タンパク発現量を図 3B に示した。HO-1 タンパクは化合

クロプレートリーダー（model 680XR、BIO-RAD）で測定物の濃度に依存して有意に発現した。これらの結果から、した。細胞生存率は、試験化合未処理の細胞生存 100% に

FX と FXOH は Nrf2-ARE シグナルを活性化させて HO-1

対する各試験化合物処理の細胞生存率を算出した。

タンパク発現をすることで、酸化ストレスを軽減させていることが示された。FX と FXOH の HO-1 タンパク発現は、

2. 4. ウェスタンブロット分析

Nrf2-ARE シグナル活性試験の結果と同様に、FXOH の存

レポーターアッセイと同様に処理した培養細胞は、PBS在下で高かった。

で洗浄後に lysis バッファーで溶解して遠心（13800g、5min）
を 行 い、SDS（ 4 − 12 % SDS-polyacrylamide、Invitrogen）ゲ3. 3. 核内の Nrf2

ルを用いて電気泳を行った。泳動後のゲルはニトロセル

化合物存在下で、Nrf2-ARE シグナルにおける Nrf2 の核ロース膜（iBlot Gel Transfer Mini, Invitrogen）に転写した（iBlot Gel Transfer Device、Invitrogen）。転写膜はimmunodetection system（Invitrogen） を 用 い て マ ニ ュ
アル手順により処理した後に、ウサギポリクロナールのHO-1（Santa Cruz Biotechnology, Inc）及 び Nrf2（Santa
Cruz Biotechnology, Inc）のマウスモノクロナール抗体と、各々反応させて二次抗体処理で検出した各タンパクの質蛍
光強度を、Image Quant LAS 4000（GE Healthcare Life
Sciences）
装置を用いて検出、定量した。

2. 5. カスパーゼ活性試験
カスパーゼ活性は、ルシフェリンをもつ基質 Z-DEVD を添加して ATP 存在下で、室温で反応させる。反応後にルシフェラーゼを添加して活性化カスパーゼ 3/7 で切断された基質から発光する発光強度を測定した。本試験では、レポーターアッセイで調製した培養細胞懸濁液 50µl に、同− 79 −

図 2 FX と FXOH の Nrf2-ARE シグナル活性*control に対する有意差、p<0.01

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

内への移行を調べた。図 3 に、細胞質及び核内の Nrf2 タ

3. 4. 化合物の細胞毒性

ンパク発現とその発現量を示した。細胞質に多く存在する

試験濃度における化合物の細胞毒性の結果を図 5 に示

Nrf2 は、シグナル活性に伴い核内に移動していることがした。10 mM の化合物処理で細胞毒性が認められた。また、示された（図 4A）。また、FXOH が FX に比べて核内に移

両化合物とも、細胞毒性を示した濃度においても Nrf2-

動した Nrf2 タンパク量も多く（図 4B）、この結果は、Nrf2-

ARE シグナルの活性を示した（図 3）。

ARE シグナルにおける活性及び HO-1 タンパク発現の結果とも相関していた。

図 3 Nrf2-ARE シグナル活性化に伴う HO-1 タンパク発現
A：FX と FXOH 存在下での HO-1 タンパク発現
B：A における HO-1 タンパク発現量*control に対する有意差、p<0.05

図 4 FX と FXOH 存在下の転写因子 Nrf2 核内移動
A：FX（10μM）と FXOH（10μM）存在下の転写因子 Nrf2 の核内移動
B：A における Nrf2 の核内タンパク量− 80 −

図 5 Nrf2-ARE シグナルにおける化合物の細胞毒性*control に対する有意差、p<0.01

海洋性カロテノイドの酸化ストレス応答シグナル Nrf2-ARE シグナルを介した HO-1 活性化による酸化ストレス軽減

3. 5. カスパーゼ活性

高濃度化合物存在下の Nrf2-ARE シグナル活性試験で、試験濃度における化合物のカスパーゼの 3 と 7 の同時活

細胞毒性（細胞死）が示された。FX はアポトーシスを誘導性（caspase 3/7 活性）の結果を、図 6 に示した。化合物にすることが報告されている 8−9）。アポトーシスはデスレ

よる細胞死を認めた濃度で、アポトーシスに伴う caspase

セプターとミトコンドリアを介するカスパーゼ（プロテア

3/7 活性の上昇を認めた。従って、化合物による細胞死はーゼ）の活性化（カスパーゼカスケード）に伴い実行される。

アポトーシスによることが判明した。

本研究ではカスパーゼカスケードの下流にあるカスパー

4．考

ゼ 3 と 7 の活性を同時に測定した。結果に示されるように、

察

FX とその代謝体 FXOH で細胞死に相関してカスパーゼ活

ワカメやモズクなどの食用の褐藻類に含まれている海洋性が認められ、化合物によるアポトーシス誘導が明確に示性カロテノイドの FX と FXOH は、最近の研究で抗腫瘍活された。一方で、アポトーシスを誘導した濃度においてによる抗酸化活性も、Nrf2-ARE シグナル活性は上昇し、また HO-1 タンパなどの生理作用が明らかにされている。本研究では海洋性クも発現した。HO-1 タンパクには抗アポトーシス活性がカロテノイドの FX と FXOH による Nrf2-ARE シグナルの報告されている 12）。また、Nrf2 は ARE の Bcl-2 遺伝子発活性が示された。この時に転写因子の Nrf2 が核内に移行

現に伴う Bcl-2 タンパクによるアポトーシスの抑制が報告

し、ARE を活性化させて抗酸化酵素群の一つ HO-1 タンパ

されている 13）。即ち、高濃度の化合物処理はアポトーシ

クを発現することを示した。HO-1 は HO のアイソフォー

スを誘導したが、同時に Nrf2 を活性化させることで、抗ムの一つで、ヘムをビリベルジン、一酸化炭素、遊離鉄にアポトーシス作用による細胞生存のリクルートが行われて分解する酵素である。ビリベルジンは、ビリベルジン・リいることが推察される。今後の研究では、化合物によるアダクターゼにより、ビリルビンに分解される。ビリベルジ

ポトーシス誘導と Nrf2 による抗アポトーシス関連分子のンとビリルビンには強力な抗酸化作用があり、酸化ストレ発現を明らかにしていきたい。これまでの先行研究におけスなどによる細胞傷害を抑制する。FX と FXOH は Nrf2-

る抗酸化活性と抗炎症作用（未発表）の結果と同様に、代謝ARE シグナルを介して HO-1 を発現させてビリベルジンと物 FXOH の活性が FX に比べて高いことから、FX の生体

ビルリビンの抗酸化作用により、酸化ストレスを軽減させにおける活性本体は FXOH であることも示唆された。以ていることが示された。また、ビリベルジンはぺルオキシ

上の結果と考察から、海洋性カロテノイド FX と FXOH のラジカルと反応しビルリビンになることで、脂質過酸化反

酸化ストレス応答シグナル Nrf2-ARE における作用機序を応を抑制している。先行実験では FX と FXOH にはぺルオ

図 7 にまとめた。

性

8−9）

、抗炎症作用10）、ラジカル消去11）

キシラジカル消去活性も明らかにしたが、Nrf2-ARE シグ

５．総ナル伝達の中でも、脂質過酸化反応を制御していることが括推察される。これらの結果から、FX と FXOH には化合物

本研究では、モズクやワカメなどの海藻に含まれる海のもつ抗酸化作用に加えて、Nrf2-Keap1 制御系の調節に

洋性カロテノイドの FX とその代謝物の FXOH が、Nrf2-

よる酸化ストレス軽減作用が明らかになった。

ARE シグナル伝達を介し、転写因子 Nrf2 による抗酸化応

図 6 Nrf2-ARE シグナルにおける化合物の caspase 3/7 活性*control に対する有意差、p<0.01

図 7 海洋性カロテノイド FX と代謝体 FXOH の Nrf2-ARE シグ
ナルを介した抗酸化と抗アポトーシス機構− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

答配列 ARE との結合により抗酸化タンパク HO-1 を発現

2activation in dermal fibroblasts: protective role in

させ、酸化ストレスを軽減させていることを明らかにしUVA-induced apoptosis, J Invest Dermatol, 1 2 4, 8 2 5–た。高濃度の化合物処理は、カスパーゼ 3/7 活性を伴うア

832, 2005.

ポトーシス誘導をしたが、Nrf2-ARE シグナル活性も上昇

７）Sugawara T, Baskaran V, Tsuzuki W, Nagao

した。従って、Nrf2-ARE シグナル活性に伴う HO-1 の発

A,: Brown algae fucoxanthin is hydrolyzed to現による抗アポトーシス活性も示された。また、先行研究

fucoxanthinol during absorption by Caco-2 humanにおける抗酸化活性と抗炎症作用の結果と同様に、代謝物

intestinal cells and mice, J Nutr, 132, 946–951, 2002.

FXOH の活性が FX に比べて高いことから、FX の生体に

８）Hosokawa M, Wanezaki S, Miyaguchi K, Kurihara,
H, Kohono H, Kawabata J, Kawabata J, Odashima S,

おける活性本体は FXOH であることも支持された。

Takahashi K,: Apoptosis-inducing effect of fucoxanthin（引用文献）

on human leukemia cell line HL-6 0, Food Scie Tech
Res, 5, 243-246, 1999.

１）Taira J, Ikemoto T, Yoneya A, Hagi A, Murakami A,
Makino, K,: Essential oil phenyl propanoids. Useful as９）Hosokawa M, Kudo M, Maeda H, Kohno H, Tanaka

・OH scavenger? Free Rad Res Commun, 197-204, 1992.

T, Miyashita K,: Fucoxanthin induces apoptosis and２）Taira J, Ikemoto T, Yoneya A, Hagi A, Murakami

enhances the antiproliferative effect of the PPAR

A, Makino, K,: Hydroxyl radical formation by UV-

γ ligand, troglitazone, on colon cancer cells, Biochim

irradiated epidermal cells, J Biochemistry, 17, 693-695,

Biophys Acta, 1675, 113–119, 2004.
10）Kim KN, Heo SJ, Yoon WJ, Kang SM, Ahn T-H Y,

1992.
３）Taira J, Ikemoto T, Mimura K, Hagi A, Murakami

Jeon Y-J,: Europ J Pharmacol, Fucoxanthin inhibits theA, Makino K,: Effective inhibition of hydroxyl radicals

inflammatory response by suppressing the activation

by hydroxylated biphenyl compounds. Free Rad Res

of NF-κB and MAPKs in lipopolysaccharide-induced

Commun, 71-77, 1993

RAW 264.7 macrophages, 649, 369-375, 2010.

４）Fujita S, Taira J,; Biphenyl compounds are hydroxyl11）Sachindra NM, Sato E, Maeda H, Hosokawa M,

radical scavengers: Their effective inhibition for UV-

Niwano Y, Kohno M, Miyashita K,: Radical scavenging

induced mutation in Salmonella Typhymurium TA102,and singlet oxygen quenching activity of marine

Free Rad Biol Med, 17, 273-277, 1994.

carotenoid fucoxanthin and its metabolites, J Agric
Food Chem, 55, 8516-8522, 2007.

５）Kimura S, Warabi E, Yanagawa T, Ma D, Itoh K,
Ishii Y, Kawachi Y, Ishii T,: Essential role of Nrf212）Busserolles J, Megias J, Terencio MC, AlcarazInt

in keratinocyte protection from UVA by quercetin,

MJ,: Heme oxygenase-1 inhibits apoptosis in Caco-2Biochemical and Biophy Res Commun, 3 8 7, 1 0 9–1 1 4,

cells via activation of Akt pathway, Int J Biochem Cell2009.

Biol, 38, 1510–1517, 2006.

６）Hirota A, Kawachi Y, Itoh K, Nakamura Y, Xu

13）Niture SK, Jaiswal1 AK,: Nrf2 Protein up-regulates

X, Banno T, Takahashi T, Yamamoto M, Otsuka F,:

antiapoptotic protein Bcl-2 and prevents cellular

Ultraviolet A irradiation induces NF-E2-related factor

apoptosis, J Biol Chem, 287, 9873-9886, 2012.

− 82 −

化粧品成分の安全性評価：CYP 誘導性と肝毒性の in vitro 評価系の構築

鳥取大学染色体工学研究センター染色体医療学研究部門

多田

政子

Human adult hepatocytes are required for cell-based assays to evaluate the potential risk of drug-drug interactions
caused by the transcriptional induction of P450 (CYP) enzymes in early-phase drug discovery and development. We createdtransgenic HepaRG cells by replacing the protein-coding regions of human CYP3A4 and CYP3A7 with enhanced green
fluorescent protein (EGFP) and DsRed reporters, respectively, in a bacterial artificial chromosome (BAC) vector that
included whole regulatory elements. In the created BAC-transgenic HepaRG cells, EGFP can be used as a quality assurance
marker for identifying functional hepatocytes derived from DsRed-positive bipotential stem cells in real time without theneed for many time-consuming steps.

2）

１．緒

相同性を示し、抗体を用いて識別することが困難である 。

言

しかし、これらは、酵素反応性や基質特異性、更に発現誘

健康や美容に優れた効果が期待される成分が見つかって導機序が異なっている。よって、CYP3A4 を発現していも、細胞毒性や薬物間相互作用を引き起こす危険性についる成人肝細胞の選択的利用が求められているものの、主なて慎重に精査しなければならない。開発期間の短縮や低コ

ヒト肝癌細胞株は胎児性の遺伝子発現プロファイルを示す

スト化には、それら成分の不都合な特性を可能な限り早いという問題がある。

時期に把握することが重要である。薬物相互作用、いわゆ

本 研 究 で は、 開 発 済 み の 一 体 型 2 色 蛍 光 ベ ク タ ーる「飲み合わせ」の問題は、服用した化合物が薬物代謝酵（CYP3A4G/7R BAC）をヒト肝癌由来細胞株 HepaRG 細素群 P450（CYP）の阻害や発現誘導を引き起こすことに起胞に導入しベクターの作動性を評価した。HepaRG 細胞因する。この反応には種差があるため、ヒト細胞を用いたは、ヒト肝細胞様への分化能を持ち、高い CYP3A4 発現

評価系の確立が望まれる。この実現には、2 つの大きな課を示すようになることが知られている

題が残されている。1 つは、評価に用いる充分な質と量の化したトランスジェニック細胞（CYP3A4G/7R HepaRG）

ヒト肝細胞ソースが確保されていないこと、もう 1 つは短がヒト肝細胞の代替モデル細胞として有用かどうか評価

時間に多検体を評価できるハイコンテンツスクリーニング

し た。 結 果、CYP3A4G/7R HepaRG を 用 い る と、EGFP（HCS）
型の評価系が構築されていないことである。

蛍光が内在性 CYP3A4 発現のインディケーターとなるた

3, 4）。そこで、分

我々は、市販薬の 50 − 60% の代謝を担う成人特異的なめ、HepaRG 細胞の分化状態のモニターや代謝活性の高い

CYP3A4 と胎児肝臓で発現する CYP3A7 を 2 色蛍光で簡細胞を集めることが容易になった。更に、CYP3A4G/7R

便かつ感度よく検出する一体型ベクターを開発した 。こHepaRG に 既 知 の CYP3A4 発 現 誘 導 剤 を 添 加 す る と、のベクターを用いると以下のことが可能になると予想し

EGFP 蛍光量が増加した。よって、CYP3A4G/7R HepaRG

た：① CYP3A7 を発現する肝芽細胞を赤色蛍光（DsRed）で、を用いることで、一度に多数の化合物に関して CYP3A4

CYP3A4 を発現する成人肝細胞を緑色蛍光（EGFP）で同定

発現誘導性をマルチウエルで評価できる HCS 系を構築ですることが可能になる。②成人肝細胞を緑色蛍光に基づいきる可能性が示された。

1）て分取することが可能になる。③ある種の化学物質は核内

２．実受容体のPXRやRXRと結合することでCYP3A4 発現誘導を引き起こすことが知られているが、この CYP3A4 誘導性を

験2. 1. 増殖培養と肝細胞分化

EGFP 蛍光量の増加に基づいて評価することが可能になる。

HepaRG 細胞（Biopredic International）は、710 growth

CYP3A4 と CYP3A7 はタンパク質レベルでは 90% 以上のmedium を用いて 5% CO2、37 ℃で増殖させた。HepaRG 細胞を分化させる場合は、710 growth medium で 2 週間培養

D ua l - color f luore s cent i mag i ng ofdevelopmental shift from foetal hepatic
cells to adult hepatocytes and CYP 3 A4
induction test in human hepatic carcinoma
HepaRG
Masako Tada
Division of Chromosome Engineering &Therapeutics, Chromosome Engineering
Research Center, Tottori University

し、連続的に 720 differentiation medium で 2 週間培養した。

2. 2. トランスジェニック細胞作製
2. 2. 1. loxP-HepaRG 細胞
CYP3A4G/7R BAC ベクター全長を Cre 酵素を介して受容細胞に 1 コピー導入する目的で、loxP サイトを BAC ベ− 83 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

クターに挿入した。次に BAC ベクターを HepaRG 細胞に研究では、BZ-9000 蛍光顕微鏡（Keyence）で画像を取得し、導入するため、loxP アクセプターサイトをもつ HepaRG 細専用の画像解析ソフトで相対的にエリア総蛍光量を比較した。

胞（loxP-HepaRG）を作製した。NotI で切断した loxP サイト

また、自動蛍光画像取得および解析装置であるLEAP cell-

導入用のプラスミドベクターを Lipofectamine LTX（Lifeprocessing workstation（Cyntellect）
およびIncuCyte ZOOMTechnologies）でトランスフェクションした。loxP-HepaRG（Essen BioScience）を適宜用いた。ライブセルイメジングには、プラスミドベクター上のハイグロマイシン薬剤耐性遺は、VivaView FL（LCV-1 0 0）incubator fluorescence

伝子を用いて選択した。ゲノム DNA の PCR 解析や DNA

microscope（OLYMPUS）を用いた。EGFP 陽性細胞は、

FISH 法により、loxP の挿入やその染色体領域を同定した。

FACSAria flow cytometer（BD Biosciences）で解析およ2. 2. 2. CYP3A4G/7R HepaRG 細胞

び分取した。

CYP3A4G/7R BAC は pCAG-Cre ベクターと共に loxP-

３．結

HepaRG に Lipofectamine LTX でトランスフェクション
した。CYP3A4G/7R HepaRG クローンは、プラスミドベ

果

3. 1. CYP3A4G/7R HepaRG 細胞作製

クター上のネオマイシン薬剤耐性遺伝子を用いて選択した。

本研究支援期間の結果は、既に論文発表済みである。よゲノム DNA の PCR 解析や DNA FISH 法により、BAC ベって、図の重複使用を避けるため、詳細データは論文を

クターの挿入やその染色体領域を同定した。

参照して頂きたい 。CYP3A4 と CYP3A7 は、ヒト 7 番

1）

染色体上に並んでいる。この 123 kb を含む BAC クロー

2. 3. CYP3A4 発現誘導

ン RP11-757A13 を、BAC recombineering の 手 法 を 使 っ分化した CYP3A4G/7R HepaRG に 10µM リファンピシて改変した。CYP3A4 のタンパク質コード配列（ORF）をン（RIF）、25 µM デキサメタゾン（DEX）、25µM クロト

EGFP 遺伝子に、CYP3A7 の ORF を DsRed 遺伝子に置換

リマゾール（CLO）、100µM ニフェディピン（NIF）またはした。この CYP3A4G/7R BAC は、CYP3A4 上流 35 kb と

25µM PCN を 24−48 時間添加した。全ての誘導剤に関し

CYP3A7 上流の全て 23 kb の制御領域を含んでいる。また、て、細胞添加状態で 0.1% DMSO になるように DMSO に溶

Cre-loxP システムにより容易に哺乳類細胞へ遺伝子導入で解したストック溶液を調整した。エリア総蛍光量を測定

きるように一カ所の loxP 配列を BAC に挿入した（Fig. 1A）。

した後に RNA を抽出した。これにより、EGFP、DsRed

CYP3A4G/7R BAC を導入する細胞として、予め、loxP

および内在性 CYP3A4 の mRNA 発現量変化と蛍光量変サ イ ト を 一 カ 所 も つ loxP-HepaRG ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク

化 を 比 較 可 能 に し た。cDNA は Superscript III First-

細胞株を取得した（Fig. 1B）。この loxP-HepaRG 細胞に

Strand Synthesis Kid（Life Technologies）
を用いて合成し、は、loxP サ イ ト を も つ あ ら ゆ る 発 現 ベ ク タ ー を Cre 酵

LightCycler 480（Roche Applied Science）を用いて通常素を介して容易に導入することができる。次いで、環の定量性 RT-PCR 法で解析した。

状 の CYP3A4G/7R BAC を Cre 発 現 ベ ク タ ー と 共 に
loxP-HepaRG に 導 入 す る こ と で、 複 数 の CYP3A4G/7R

2. 4. CYP3A4 タンパク質発現解析

HepaRG トランスジェニック細胞クローンを得た。

ウエスタンブロットは、10−20µg の HepaRG 細胞タン
パク質を 25 % LDS sample buffer（NuPAGE）に溶解し、3. 2. CYP3A4G/7R HepaRG 細胞の特性

5 − 20% SDS-polyacrylamide gradient gel（ATTO）を用得られた全ての CYP3A4G/7R HepaRG 細胞クローンは、

いて分離した。Polyvinylidene fluoride membrane にトラ

増殖期には DsRed 蛍光が極めて高い状態であった。これ

ンスファーし、PBS に 3 % スキムミルクを溶解したブロッを分化誘導すると、EGFP 陽性細胞が出現した（Fig. 2）。

キング液を用いて、通常のウエスタンブロット法に従って得られた複数のクローンの中から、分化能が高く EGFP

抗体処理した。シグナルは、ECL Plus Western Blotting

陽性率が高く染色体が安定なクローンを選別した。この

Detection Kit（GE Healthcare） を 用 い て 検 出 し た。 使

基準を満たした C3 クローンを中心に詳細な解析を進めた。

用した一次抗体は以下の通り：anti-CYP3A4/7 antibody

C3 クローンは分化培地で培養すると、DsRed 蛍光が著し（rabbit polyclonal, 1 : 5 0 0 ; Enzo）、anti-EGFP（mouse

く減少した。一方、EGFP の mRNA 発現は、分化開始時

monoclonal, 1 : 200 ; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）、anti-から 2 週間で 7 倍に増加した。また、EGFP 蛍光量は 7-8

ß-actin（mouse monoclonal, 1 : 5,000 ; Abcam）。

倍に増加し、mRNA レベルの増加率を反映していた。

2. 5. 蛍光陽性細胞のライブイメージング、数的評価および蛍光量解析

発現を親株（WT）の HepaRG とウエスタンブロット法で比細胞の蛍光は通常の倒立型蛍光顕微鏡で観察できる。本

ンパク質レベルの CYP3A4 発現に減少していた。これは分化 C3 クローンにおける内在性の CYP3A4 タンパク質較した。WT HepaRG に対して C3 HepaRG は、半分のタ− 84 −

化粧品成分の安全性評価：CYP 誘導性と肝毒性の in vitro 評価系の構築

Figure 1 CYP3A4G/7R HepaRG 細胞の開発とその用途概要
A. CYP3A4G/7R BAC 発現ベクターの概要。
B. loxP-HepaRG 細胞と CYP3A4G/7R HepaRG 細胞の作製手順。
C. CYP3A4G/7R BAC による肝細胞分化モニターの概要。
D. EGFP 蛍光による CYP3A4 発現細胞の濃縮。
E. EGFP 蛍光による CYP3A4 発現誘導性の評価系概要。

Figure 2 CYP3A4G/7R HepaRG 細胞の特性（増殖期）全ての細胞が DsRed 陽性で CYP3A7 発現状態であることを示す。
（分化時）分化細胞の一部が EGFP 陽性の CYP3A4 発現細胞になることを示す。

− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

遺伝子クローニングによる分可能の低下によると考えられ

り RIF で約２倍、DEX で約 2.5 倍に増加し、NIF と CLOる。しかしながら、ウエスタンブロットで全く CYP3A4で約 3 倍に増加した。一方、PCN では、EGFP 蛍光の増発現が確認できない HepG2 細胞に比べ、十分に高い発現加は見られなかった。よって、CYP3A4G/7R HepaRG 細を示した。また、EGFP の発現量はウエスタンブロット法

胞は、細胞を破壊して行う解析を用いずに CYP3A4 誘導

で十分に検出できるレベルであった。CYP3A4 の発現レ性を評価するシステムの構築に寄与できる可能性が高い

ベルの向上は、EGFP 発現の高いトランスジェニック細胞（Fig. 1E）。

クローンの選別や EGFP 陽性細胞の濃縮により更に改善可４．考能と考えられる。

察

機能的な肝臓細胞は、その機能の研究、化学物質の安全3. 3. DsRedとEGFPを用いた肝細胞分化過程の可視化性試験、薬物代謝酵素 P450 誘導性試験および再生医療研分化開始 5 日目の DsRed 陽性細胞と EGFP 陽性細胞が究など広範な領域で需要が高い。CYP 誘導性や代謝産物混在する分化途中の C3 クローンの細胞集団を FACS 解析の解析結果は、評価に用いる「細胞の質」に大きく左右されした。結果、DsRed 陽性細胞と EGFP 陽性細胞に分離でる。しかし、（1）ヒトの初代培養は機能的に低いヘテロなきたが、共に陽性の細胞集団は検出されなかった。このこ集団であり再現性に乏しい、（2）ヒト肝臓癌由来の細胞株とは、CYP3A7 陽性の胎児肝実質細胞である肝芽細胞は、の多くは胎児性の性質をもつ、（3）薬物代謝や CYP 誘導性

CYP3A7 非発現細胞状態を介して CYP3A4 陽性の肝細胞、には種差があるため動物を用いた評価には false negative

CYP3A4 非陽性の肝細胞および胆管上皮細胞に分化するにより生じた薬害が少なからずある、（4）
ヒト iPS 細胞からことを示している。

は未だ機能的で均質な肝臓細胞を得ることが困難であるな

次に、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いてリアルタイム

どの諸問題を抱えている。本研究で用いたヒト肝細胞様に CYP3A4G/7R HepaRG C3 ク ロ ー ン の 分 化 の プ ロ セ

細胞 HepaRG は、増殖状態では肝細胞としての特性を示さ

ス を 観 察 し た。 結 果、 多 く の DsRed 陽 性 細 胞 が 当 初 非ないが、専用の分化培地で 1 − 2 週間培養すると成熟肝細蛍光細胞となり、その中から EGFP 陽性の細胞が出現し胞の特性を示す。定量性 RT-PCR 解析では、HepG2 細胞

た。また、非蛍光細胞の中には、細胞分裂直後に EGFP 陽がヒト成人肝臓の 1 % 程度の CYP3A4 発現量に留まって性となる細胞が存在することが観察されている。よって、いるのに対し、HepaRG 細胞は 120% に達していた。このCYP3A7 を発現していないが増殖能を持つ幹細胞状態をように高い CYP3A4 発現を示す細胞株はかつてなかった。

経て CYP3A4 を発現する成人型肝細胞になる可能性が示

しかし、肝細胞として成熟化していることを見極めるためされた。

には、使い頃を判断できる手軽なマーカーが必要であった。

以上の結果は、CYP3A4G/7R BAC ベクターをヒト ES

CYP3A4G/7R BAC ベクターを導入したトランスジェニッ

細胞や iPS 細胞に導入したトランスジェニック細胞を作製

ク HepaRG 細胞は、赤から緑へ蛍光がシフトするため、細した場合も、内胚葉状態を経て分化状態をモニターできる胞の分化度が簡単に把握できるようになっている。このよ

可能性を示唆している（Fig. 1C）。

うに、HepaRG 細胞の利便性を高めたことで、ヒト肝細胞の初代培養細胞を代替するモデル細胞としての利用が進む

3. 4. FACSによるEGFP 陽性 CYP3A4 発現細胞の濃縮と期待される。

EGFP を指標に CYP3A4 を発現している代謝能の高い

CYP3A4G/7R HepaRG C3 ク ロ ー ン で は、EGFP の 蛍肝細胞を FACS を用いて濃縮できるか検討した。EGFP 陽

光量、EGFP の mRNA および内在性の CYP3A4 の mRNA性細胞と非陽性細胞において内在性の CYP3A4 mRNA 発

発現量の変化に対応が見られた。また、生細胞で連続的現を定量性 RT-PCR 法で調べた結果、分化細胞集団からに観察可能なことから、EGFP は遺伝子発現変動をモニタ

CYP3A4 発現細胞を濃縮できることが示された（Fig. 1D）。

ーできる HCS 対応型の良好なレポーター遺伝子になり得る。一方、ルシフェラーゼやbガラクトシダーゼ等の酵素反応

3. 5. CYP3A4 誘導剤によるEGFP 蛍光量の増加を用いた遺伝子発現レポーターシステムの場合は、基質を4 種類（10 µM RIF、25µM DEX、25µM CLO、100 µM

添加して染色量や発光量を測定する操作が必要である

5 −7）

。

NIF）の既知の CYP3A4 誘導剤で HepaRG C3 クローンを処

ま た、 作 製 し た CYP3A4G/7R HepaRG 細 胞 は、 内 在 性

理し、48 時間後に一定エリアの平均蛍光量を誘導前と比の遺伝子に改変を加えていないため、EGFP 陽性細胞を較した。コントロールとして 0.1% DMSOで処理した。また、

CYP3A4 発現細胞として肝細胞の代わりに使用できる。

CYP3A4 を誘導しないが、マウス Cyp3a11 発現を誘導すこのようなモデル細胞の開発により、再現性と信頼性向上、ることが知られている 25µM PCN で HepaRG C3 クローン

開発期間の短縮と低コスト化、安全性試験に要する実験動を処理した。結果、EGFP 蛍光は、0.1% DMSO 処理群よ物の削減につながると期待できる。

− 86 −

化粧品成分の安全性評価：CYP 誘導性と肝毒性の in vitro 評価系の構築

５．総

e104123, 2014.

括２） Bertilsson G, Berkenstam A, Blomquist P,:

本 研 究 で は、 肝 細 胞 が 成 熟 す る と CYP3A7 か ら

Functionally conserved xenobiotic responsive enhancer

CYP3A4 へ発現がシフトすることを利用して、2 色蛍光in cytochrome P4 5 0 3A7. Biochem Biophys Res
Commun 280: 139-144, 2001.

に基づき（1）肝細胞の分化度のモニター、（2）分化因子の同定、（3）肝細胞の分取、（4）CYP3A4 誘導性評価などが３）Gripon P, Rumin S, Urban S, Le Seyec J, Glaise D, et

可能なヒト肝モデル細胞 HepaRG 細胞を作製した。今後、al.: Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis

HepaRG 細胞の遺伝子発現プロファイルをヒト肝細胞に更B virus. Proc Natl Acad Sci U S A 9 9: 1 5 6 5 5-1 5 6 6 0,
2002.

に近づける工夫を加えることで、汎用化が期待される。また、この細胞は肝細胞の分化過程を促進する培養条件の探４）Antherieu S, Chesne C, Li R, Camus S, Lahoz A,

索に有効である。これにより、ヒト iPS 細胞から機能的な

et al.: Stable expression, activity, and inducibility of

肝細胞を作り出す条件が明らかにできると期待される。結cytochromes P450 in differentiated HepaRG cells. Drug

果、ヒト iPS 細胞を用いた肝臓の「再生医療」の加速化へのMetab Dispos 38: 516-525, 2010.
５）Robertson GR, Field J, Goodwin B, Bierach S, Tran

波及効果も期待できる。

M, et al.: Transgenic mouse models of human CYP3A4

謝辞

gene regulation. Mol Pharmacol 64: 42-50, 2003.

本研究遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりご

６）Tirona RG, Lee W, Leake BF, Lan LB, Cline CB, et al.:The orphan nuclear receptor HNF4alpha determines

支援賜り深く感謝申し上げます。

PXR- and CAR-mediated xenobiotic induction of（参考文献）CYP3A4. Nat Med 9: 220-224, 2003.

１） Tsuji S, Kawamura F, Kubiura M, Hayashi A,７）Zhang W, Purchio AF, Chen K, Wu J, Lu L, et al.:C, Oshimura M,

A transgenic mouse model with a luciferase reporter

Tada M, : Dual-colour fluorescence imaging to monitor

for studying in vivo transcriptional regulation of the

CYP3A4 and CYP3A7 expression in human hepatic

human CYP3A4 gene. Drug Metab Dispos 3 1: 1 0 5 4-

carcinoma HepG2 and HepaRG cells. PLOS ONE, 9(8):1064, 2003.

Ohbayashi T, Kazuki Y, Chesné− 87 −

炎症性皮膚疾患におけるアクアポリン９の機能解明

京都大学大学院医学研究科次世代免疫制御を目指す創薬医学融合拠点

竹馬

真理子

Aquaporins (AQPs, AQP0-12) are membrane water/glycerol channel proteins that participate in various cellular functions
in many cell types. AQP9 is expressed in several immune cells including neutrophils; however, its role in cutaneous immune
response remains unknown. Here we show the involvement of AQP9 in skin allergic inflammation using AQP9 knockout(AQP9-/-) mice and the contact hypersensitivity (CHS) model.
First, AQP9-/- mice showed impairment of CHS responses to hapten (DNFB) compared with wild-type (WT) mice.
Adoptive transfer of AQP9-/- LNs cells into the ears of WT recipients resulted in impaired CHS response, indicating thedefect of sensitization in AQP9-/-. IL-17 production was decreased in AQP9-/- compared with WT LNs cells.
WT mice showed high neutrophil accumulation in LNs at 18 h after DNFB application, but it was abrogated in AQP9-/mice. In accordance, we found the attenuation of AQP9-/- neutrophil migration to LNs after DNFB application. Furthermore,
the neutrophil migration in response to CCR7 ligands was suppressed in AQP9-/- using chemotaxis chambers.
Finally, we found that the administration of neutralizing antibody during the sensitization phase suppressed IL17 production from LNs cells as well as CHS response in WT mice, suggesting the implication of neutrophils for IL-17
production during the development of CHS.
These data suggest that AQP9-expressing neutrophils play an important role in the sensitization phase of CHS throughtheir migration function.

１．緒た表皮細胞や、皮膚に浸潤する多くの免疫細胞（好中球、言

肥満細胞、T 細胞など）に発現していることが示唆されて

水は生命現象にとって必須の物質であり、体内ではみかいるが、その機能はほとんど明らかにされていない。また

け以上にダイナミックな水輸送が行なわれている。この水AQP9 欠損マウスが既に樹立されているが、皮膚の詳細な輸送を支える膜蛋白として発見されたアクアポリン

機能解析は未だ実施されておらず、皮膚外観や組織には顕（AQP）は、現在までに、AQP0 から AQP12 までの 13 の著な異常がないと言及されている 5）。

遺伝子が報告されている。1992 年に AQP1 が発見されて我々は、免疫細胞に発現する AQP9 が、接触皮膚炎、ア以降、AQP の研究は、腎臓、腸管など水の吸収が盛んな

トピー性皮膚炎あるいは乾癬のような免疫異常を伴う炎症臓器を中心に進められてきた。この進展により、近年では、性皮膚疾患の発症に関与している可能性を検討した。

AQP が、水やその他の物質輸送を介して、さらに高次のAQP9 欠損マウスを用い、接触皮膚炎モデル 6）における野生命現象を制御することがわかってきている。

生型マウスとの表現型を比較することで、AQP9 の機能解

我々は皮膚における AQP に着目し、皮膚の構成細胞に明を本研究の目的とした。

発現する AQP 分子の機能を明らかにしてきた。これまで

２．実に、AQP3 欠損マウスおよび AQP3 ノックダウン細胞を主な研究材料に用い、表皮細胞に発現する AQP3 が、細胞

験

2. 1. 接触皮膚炎モデル

遊走および細胞増殖を調節し、創傷治癒、腫瘍形成あるい

AQP9 遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス（AQP9-/-, C57BL/6 genetic

はアトピー性皮膚炎発症に関与していることを明らかにしbackground）は、Rojek 博士（Aarhus University、デンマてきた

1, 2, 3）

。また、T 細胞に発現する AQP3 が、ケモタクーク）から入手し、京都大学動物施設内にて、Hetero 同士

シスを調節することで、接触皮膚炎発症に関与することを交配により繁殖し実験に供した。AQP9-/- および野生型

報告している 4）。

（WT）マウスは、2, 4-dinitrofluorobenzene（DNFB）を腹部

一方 AQP9 は、今までの報告や予備検討から、分化しに塗布し感作した。塗布 5 日後にDNFBを耳介に塗布し（チャレンジ）、24 時間後の耳介浮腫をmicrometer（Mitsutoyo）
により測定した。

Role of Aquaporin- 9 in inflammatory
skin disease
Mariko Chikuma
Center for Innovation in Immunoregulative
Technology and Therapeutics, Kyoto
University Graduate School of Medicine

感作の成立を調べるため、DNFB 塗布 5 日後に、皮膚所属 リ ン パ 節 を 摘 出 し、2, 4-dinitrobenzene sulfonic acid
（DNBS）とともに 3 日間培養し、細胞増殖能（3H サイミジ
ン取り込み）と、培養上清のサイトカイン量（INF-gamma,
IL-17A）を測定した（ELISA kit, e-bioscience）。さらに、− 88 −

炎症性皮膚疾患におけるアクアポリン９の機能解明

DNFB 感作５日後のリンパ節の細胞、およびチャレンジ

好中球での AQP9 免疫染色では、AQP9 が細胞膜と細胞質

24 時間後のリンパ節ならびに皮膚中の細胞を調製し、に局在していることが示された（図 1, right）。
ハプテン（DNFB）誘発による接触皮膚炎反応を、WT お

flow cytometry FACS Fortessa system（Becton Dickinson）

よび AQP9-/- マウスを用い検討した。AQP9-/- マウス皮膚でにより解析した。

は、発症程度を表す耳介浮腫（厚さ）が、WT マウスと比較

2. 2. Adoptive Transfer Experiments

して有意に抑制されていた（図 2, left）。HE組織染色像から、-/-

DNFB 感作 5 日後に、AQP9 および WT マウスの所属

AQP9-/- マウス皮膚では、WT で認められる免疫細胞の浸リンパ節から細胞を調製し、耳介へ皮下投与した。その直潤と表皮肥厚が抑制されていることが示された（図 2, right）。

後、耳介に DNFB を塗布した。翌日の耳介浮腫を測定した。

接触皮膚炎反応惹起時（チャレンジから 24 時間後）に採取した皮膚を用い、FACS 解析あるいは組織解析により、

2. 3. Chemotaxis Assay

皮膚内に浸潤している T 細胞（CD4+, CD8+）、樹状細胞

AQP9-/- および WT マウスの Bone Marrow 細胞から、（MHCII+ CD11C+）、肥満細胞（Toluidine blue 染色）、おPercoll 分画により好中球を調製した。Transwell Chamber

よび好中球（Giemsa 染色）の細胞数を測定した。AQP9-/- 皮（5 µm pore size, Corning Costar）の上部に好中球をアプラ

膚では、CD4+ および CD8+ T 細胞、ならびに好中球の浸潤

イし、下部のケモアトラクタント（CCL19, CCL21, fMLP）

が WT 皮膚と比較して有意に低下していることが示されたへ遊走した細胞数を、FACS により解析した。

（図 3）。

３．結

AQP9-/- マウスで接触皮膚炎の感作が成立しているかを

果検討した。DNFB 塗布 5 日後のリンパ節由来細胞を採取し、

C57BL6 の WT マウスから好中球（Neutrophil）、肥満細++ナイーブマウス（WT, AQP9-/- マウス）の耳介皮内に移入し胞（BMMC）、T 細胞（CD4 , CD8 細胞）、樹状細胞（BMDC）、た（adoptive transfer）。直後に DNFB を塗布し、1 日後におよびマクロファージ（BMM）を採取し、AQP9 遺伝子発

耳介浮腫を測定したところ、AQP9-/- 細胞は WT 細胞と比現量をリアルタイム PCR により測定した。AQP9 は、好較して、有意に耳介浮腫を減少させた（図 4）。この結果は、

中球および肥満細胞で高い発現が確認された（図 1, left）。

AQP9-/- マウスでは接触皮膚炎反応の感作過程の成立が抑図１ C57BL6 マウス由来細胞における AQP9 発現（left；リアルタイム PCR による定量、right；好中球での AQP9 免疫染色）

図２ WT および AQP9-/- マウスにおける接触皮膚炎反応（left；接触皮膚炎反応による耳介浮腫、right；HE 組織染色）− 89 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図３

図4

図5

接触皮膚炎反応惹起時の皮膚内の細胞数（CD4+、CD8+ T 細胞、好中球）

所属リンパ節由来細胞の Adoptive transfer による接触皮膚炎反応

DNFB 塗布 5 日後のリンパ節由来細胞の細胞増殖能（left）、IFN-gamma 産生量（middle）、IL-17 産生量（right）

制されていることを示している。

作不成立の主な原因と考えた。

-/-

AQP9 マウスで確認された接触皮膚炎反応の感作不成

種々の検討から、AQP9-/- マウスにおいて観察される接立の原因を探るため、DNFB 塗布 5 日後のリンパ節由来細触皮膚炎抑制には、好中球が関与していることを見出した。

胞を採取し、DNBS と共に培養し、詳細を解析した。細胞WT マウスでは、DNFB 塗布によりリンパ節内の好中球

内 へ の サ イ ミ ジ ン 取 り 込 み、 お よ び 細 胞 か ら の IFN-数が顕著に増加し、塗布 18 時間後に細胞数がピークにな-/-

gamma 産生量は WT と AQP9 マウス細胞で差はなかった。

ることを見出した（data not shown）。この時、AQP9-/- マ

一方、IL-17 産生は、AQP9-/- 細胞で顕著な減少が認められウスでは、好中球の増加が顕著に抑制されていた（図 6,-/-

た（図 5）。なお、リンパ節内の細胞分布は、WT と AQP9left）。好中球の中和抗体（anti-mouse Ly6G mAb）を投与

マウス細胞で有意な差はなかった（data not shown）。リン

し、好中球を除去した WT マウスでは、DNFB 塗布によるパ節内の細胞、特に CD8+ T 細胞からの IL-17 産生が、接接触皮膚炎反応が抑制された（図 6, middle）。またこれら

7, 8）

。従

のマウス由来のリンパ節細胞では、IL-17 産生が顕著に低って、AQP9 細胞で IL-17 産生低下していることが、感下していた（図 6, right）。さらに、AQP9-/- マウスに、WT

触皮膚炎反応に必須であることが報告されている-/-− 90 −

炎症性皮膚疾患におけるアクアポリン９の機能解明

図 6 好中球の接触皮膚炎への関与
リンパ節の好中球数（left）、好中球除去による接触皮膚炎の抑制（middle）
および IL17 産生量低下（right）

図7

好中球のケモタクシス（left）、F-actin 染色（right）

マウス由来の好中球を移入することで、接触皮膚炎抑制と走を調節していることが認められた。AQP9-/- マウスでは、

IL-17 産生低下が回復した（data not shown）。以上の結果DNFB 塗布により誘発される好中球のリンパ節への浸潤が-/-は、AQP9 マウスでの接触皮膚炎低下は、好中球に原因低下することで、その後に起こる T 細胞の活性化、特にがあることを示唆している。

IL-17 産生の抑制が原因となり感作が成立せず、耳介浮腫

DNFB 塗布後に、AQP9-/- マウスにおいて、リンパ節に局在する好中球数の増加が抑制された要因として、好中球を指標とする接触皮膚炎反応が惹起されなかったと考えられた。

のリンパ節への浸潤 / ホーミングが AQP9 欠損により低下

今後も、接触皮膚炎における好中球の役割を詳細に探索したことが予想された。好中球のリンパ節への浸潤には、するとともに、好中球に発現する AQP9 の機能を明らか

CCR7-CCL19/21 の関与が報告されている 9）。そこで、好にしていく予定である。

中球の CCL19/21 に対する細胞遊走能を、Transwell を用いて検討した。AQP9-/- 好中球では、CCL19 および CCL21（引用文献）への細胞遊走が顕著に低下していた（図 7, left）。また、

１）Hara-Chikuma M & Verkman AS (2008) Aquaporin-3-/-

AQP9 好中球では、CCL19/CCL21 刺激で誘発される細facilitates epidermal cell migration and proliferation

胞の方向性（F-actin 染色）が低下していた（図 7, right）。好during wound healing. J Mol Med (Berl) 86(2): 221-231.

中球に発現する AQP9 が、ケモカイン誘発性の細胞遊走２）Hara-Chikuma M & Verkman AS (2008) Preventionof skin tumorigenesis and impairment of epidermal cellを調節していることが示された。

４．考

proliferation by targeted aquaporin-3 gene disruption.

察

Molecular and cellular biology 28 (1): 326-332.

AQP9 は、皮膚の免疫反応を担う好中球で高い発現が確

３）Nakahigashi K, et al. (2011) Upregulation of aquaporin-3

認され、また接触皮膚炎反応に必須であることが示された。

is involved in keratinocyte proliferation and epidermal

好中球に発現する AQP9 が、ケモカイン誘発性の細胞遊hyperplasia. The Journal of investigative dermatology− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

allergic contact dermatitis. The Journal of investigative

131 (4): 865-873.

dermatology 133 (2): 303-315.

４）Hara-Chikuma M, et al. (2012) Chemokine-dependent T
cell migration requires aquaporin-3-mediated hydrogen７）Nakae S, et al. (2002) Antigen-specific T cell sensitization

peroxide uptake. The Journal of experimental medicine

is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression

209 (10): 1743-1752.

of allergic cellular and humoral responses. Immunity
17 (3): 375-387.

５）Rojek AM, et al. (2007) Defective glycerol metabolism+

in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of８）He D, et al. (2 0 0 6) CD8 IL-1 7-producing T cells are

the National Academy of Sciences of the United States

important in effector functions for the elicitation ofof America 104 (9): 3609-3614.

contact hypersensitivity responses. J Immunol 177 (10):６）Honda T, Egawa G, Grabbe S, & Kabashima K

6852-6858.

(2013) Update of immune events in the murine contact９）Beauvillain C, et al. (2011) CCR7 is involved in the migration

hypersensitivity model: toward the understanding ofof neutrophils to lymph nodes. Blood 117 (4): 1196-1204.

− 92 −

IL- 33デコイ受容体による皮膚炎症の制御

自治医科大学医学部生化学講座病態生化学部門

早川盛禎Interleukin (IL)-33 is a member of the IL-1 cytokine family. Epithelial cells and vascular endothelial cells produce IL33 in the nucleus and release it by stress, injury, or necrosis. IL-33 induces the production of Th2-associated cytokines
via its receptor, ST2L on type 2 innate lymphoid cells, Th2 cells, and mast cells. Therefore, IL-33/ST2L signaling may
contribute to development of allergic diseases such as asthma and atopic dermatitis. The ST2 gene produces a soluble
secreted form, soluble ST2, in addition to a transmembrane form, ST2L, by alternative splicing. Soluble ST2 consists of
only extracellular domain of ST2L. In previous study, we found that soluble ST2 acted as an IL-33 decoy receptor. Soluble
ST2 specifically binds to free IL-33 and inhibits a binding activity of IL-33 for its receptor on target cells. To explore thefunction of soluble ST2 in vivo, we established that a transgenic mouse that constitutively express murine soluble ST2
cDNA under CAG promoter (ST2-Tg mouse). Here, we show that soluble ST2 is a critical repressor for skin inflammation ina murine model of house dust mite (HDM)-induced atopic dermatitis. Skin inflammation of ST2-Tg mice exhibited a lower
development compared to that of wild-type mice. Levels of IL-13, total IgE, and HDM-specific IgE in sera were reduced
in ST2-Tg mice. Furthermore, we examined HDM-specific response of lymph node cells in vitro. Analysis of cytokines inculture supernatants revealed the reduction of IL-4, IL-5, and IL-13 productions in ST2-Tg mice. We also applied ST2-Tg
mice to hapten-induced contact hypersensitivity (CHS) model with fluorescein isothiocyanate (FITC). Migration of skindendritic cells and ear swelling developed normally in ST2-Tg mice. These results suggest that soluble ST2 contributes tosuppressions of skin inflammation and Th2-type immune response in atopic dermatitis. Therefore, soluble ST2 is a potential
therapeutic agent for allergic diseases such as atopic dermatitis.

１．緒するために、分泌型 ST2 を過剰発現するトランスジェニ

言

6）

ックマウス（ST2-Tg マウス）を作製した 。

インターロイキン -33（IL-33）は、上皮細胞や血管内皮本研究では、ST2-Tg マウスを用いて、ハプテン塗布に細胞に発現するサイトカインである 。IL-33 は、自然リ

よる接触皮膚炎モデル、およびダニ抗原塗布によるアト

ンパ球、Th2 細胞、肥満細胞などを活性化し、Th2 サイ

ピー性皮膚炎モデルを作製し、皮膚炎症に対する分泌型

トカインの産生誘導を介して、アレルギー疾患の病態形成

ST2 の作用を中心に検討した。

１）に関与する。アトピー性皮膚炎では、皮膚病変部において

２．実

2）

IL-33 の発現亢進が報告されている 。
IL-33 受容体（別名：ST2L）をコードする ST2 遺伝子の2. 1. マウス

遺伝子産物には、膜貫通受容体型 ST2L の他に、分泌型
3, 4）

ST2 がある験

ST2 トランスジェニック（ST2-Tg）マウスは、CAG プロ。分泌型 ST2 は、IL-33 の結合部位である細モーターにマウス分泌型 ST2 cDNA を挿入したベクター

胞外領域のみを持つ分子で、細胞外に分泌される。我々を用いて作製した 。本研究では、BALB/c 系統にバックは、主に in vitro による検討から、分泌型 ST2 が IL-33 の機クロスしたマウスを使用した。図中では、外因性の分泌能を抑制するデコイ受容体として働くことを発見した 。

型 ST2 cDNA が、ゲノム DNA にヘテロの状態で存在する

分泌型 ST2 は、遊離の IL-33 と特異的に結合し、複合体マウスをトランスジェニック（Tg）、外因性の分泌型 ST25）6）を形成する。この複合体は IL-33 受容体に結合できないた

cDNA がゲノム DNA に挿入されていないマウスを野生型

め、標的細胞は活性化されない。生体内においても、分泌（Wt）として表記した。ST2-Tg マウスの繁殖、成長、免疫型 ST2 は IL-33 デコイ受容体として働くものと予想される。

細胞数などは、野生型マウスと比べて、差は見られなかった。

そこで、我々は生体内における分泌型 ST2 の作用を検討

2. 2. 皮膚樹状細胞の遊走能の評価
マウスの右耳介の表裏に0.5% fluorescein isothiocyanate（FITC）液を 40 ml 塗布し、左耳介の表裏に溶媒液を 40 ml
Regulation of skin inflammation with IL33 decoy receptor
Morisada Hayakawa
Department of Biochemistry, School of
Medicine, Jichi Medical University

塗布した。塗布 24 時間後、右側と左側の顎下リンパ節を そ れ ぞ れ 採 取 し、 細 胞 を 単 離 し た。 細 胞 に 抗 CD16/
CD32 抗体を加えて Fc 受容体をブロックした後、7-aminoactinomycin D（7-AAD）、蛍光標識抗 CD11c 抗体、およ− 93 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015＋

び蛍光標識抗 I-A/I-E 抗体を添加した。その後、フローサ

リンパ節をそれぞれ採取し、FITC 陽性の樹状細胞（FITC

イトメーターにより、FITC 陽性の CD11c I-A/I-E 細胞

CD11c I-A/I-E ）をフローサイトメーターにより検出しを検出した。

た（図 1）。野生型および ST2-Tg マウスともに、左右リン

＋

＋

＋

＋

＋

＋

パ節中の樹状細胞（CD11c I-A/I-E ）の割合に差はなかっ＋

2. 3. 接触皮膚炎モデル＋＋

た（図 1A）。FITC CD11c I-A/I-E 細胞は、FITC 塗布

マウスの腹部の毛をバリカンで刈り、腹部皮膚に 0.5%

した右耳介側のリンパ節にのみ検出された（図 1B）。また、

FITC 液を 200 ml 塗布して感作した。感作 6 日後、両耳のFITC CD11c I-A/I-E 細胞数は、野生型マウスに比べて、耳介の厚さを測定した後、右耳介の表裏に 0.5% FITC 液

ST2-Tg マウスの方が少なかったが、有意差はなかった
（図

＋

＋

＋

を 30 ml 塗布し、左耳介の表裏に溶媒液を 30 ml 塗布した。

1C）。これらの結果から、分泌型 ST2 は、ハプテン感作

その後、経時的に両耳の耳介の厚さを測定した。

期による皮膚樹状細胞の遊走能には影響しないことが明らかになった。

2. 4. アトピー性皮膚炎モデルで処理した。背部皮膚と耳介をテープストリッピングした

3. 2. ハプテン塗布による接触皮膚炎における皮膚炎症の解析

後、50% グリセロール含有生理食塩水に溶解したコナヒョ

ハ プ テ ン に FITC を 用 い て 接 触 皮 膚 炎 モ デ ル を 作 製

ウヒダニ抽出物（HDM）
を 100 ml（2.5 mg/ml）塗布した。コし、皮膚炎症に対する分泌型 ST2 の作用を検討した。まントロールには、50% グリセロール含有生理食塩水 100 ml

ず、除毛した腹部皮膚に FITC を塗布して感作した。感作を反復塗布した。塗布は週に 2 回、8 週間行った。その間、6 日後、両耳の耳介の厚さを測定した後、右耳介に FITC 液、

経時的に耳介の厚さを測定した。最終塗布から 24 時間後左耳介に溶媒液を塗布して炎症を惹起した。その後、経時に背部皮膚、耳介、血清、腋窩リンパ節を採取した。

的に両耳の耳介の厚さを測定し、耳介の腫脹を算出した（図

マウスの背部の毛をバリカンで刈った後、除毛クリーム

耳介および背部皮膚のパラフィン切片を作製し、ヘマト

2）。FITC 刺激による耳介の腫脹のパターンは、野生型おキシリン−エオジン染色した。腋窩リンパ節から単離した

よび ST2-Tg マウスともに、塗布 24 時間後がピークとなり、細胞に HDM を添加し、4 日間培養した後、培養上清を採その後減弱した。また、野生型と ST2-Tg マウスの耳介の取した。血清中、およびリンパ節細胞の培養上清中のサイト

腫脹は同程度であった。これらの結果から、分泌型 ST2 は、カインと免疫グロブリンの濃度を ELISA 法により測定した。

FITC による接触皮膚炎には影響しないことが示唆された。

３．結果

3. 3. アトピー性皮膚炎モデルにおける皮膚病変部の解析

3. 1. 皮膚樹状細胞の遊走能の解析

ダニ抗原によるアトピー性皮膚炎モデルを作製し、皮膚

皮膚樹状細胞の遊走に対する分泌型 ST2 の関与を、炎症に対する分泌型 ST2 の作用を検討した。アレルゲン

FITC を用いて検討した。右耳介に FITC 液、左耳介にはとしてコナヒョウヒダニ抽出物（HDM）を用いて、除毛し対照として溶媒液を塗布した。24 時間経過後、左右の顎下た背部皮膚と左右耳介に 8 週間反復塗布することにより炎症を誘導した。対照群には、HDM 溶媒液である 50% グリ

図１ 表皮樹状細胞の遊走能の解析（A）顎下リンパ節中の樹状細胞（CD11c ＋ I-A/I-E ＋）をフローサイトメーターにより検出した。
（B）FITC 陽性の樹状細胞（FITC ＋ CD11c ＋ I-A/I-E ＋）をフローサイトメーターにより検出した。
（C）顎下リンパ節中の FITC ＋ CD11c ＋ I-A/I-E ＋細胞数を計測した。

− 94 −

IL-33 デコイ受容体による皮膚炎症の制御

セロール含有生理食塩水を塗布した。経時的に耳介の厚さ

生型マウスの背部皮膚は、表皮、真皮、および皮下組織の測定を行い、最終塗布から 24 時間後に背部皮膚、耳介、に肥厚が認められた。ST2-Tg マウスでは、HDM 塗布に血清、腋窩リンパ節を採取した。経時的に耳介の厚さを測より肥厚は生じたが、野生型マウスに比べて減弱していた定した結果、野生型および ST2-Tg マウスともに、HDM（図 3B）。これらの結果から、ST2-Tg マウスの皮膚炎症は、塗布 1 週後から耳介の腫脹が認められたが、ST2-Tg マウ

野生型マウスよりも軽度であることが明らかになった。

スでは、野生型マウスに比べて減弱していた。HDM 塗布
5 週後以降は、野生型と ST2-Tg マウスとの差が顕著になった（図 3A）。耳介の組織像を解析したところ、ST2-Tg

3. 4. ダニ抗原塗布による血清サイトカインおよび血清
IgE の増加マウスでは、野生型マウスに比べて、表皮および皮下組

サイトカインと免疫グロブリンの産生について調べるた

織の肥厚が減弱していた（図 3B）。また、HDM 塗布した野め、各種サイトカイン、総 IgE、および HDM 特異的 IgE

図２ 接触皮膚炎による耳介の腫脹
FITC 液（FITC）または溶媒液（Vehicle）塗布後の耳介の厚さから、塗布前の耳介の厚さを差し引き、その差を腫脹とした。

図３ ダニ抗原反復塗布による皮膚病変部の解析（A）ダニ抗原（HDM）または溶媒液（Vehicle）塗布後の耳介の厚さから、塗布前の耳介の厚さを差し引き、その差を腫脹とした。*, p < 0.05、**, p < 0.01。
（B）耳介および背部皮膚のパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色した。
（上段）
耳介、（下段）背部皮膚。Scale bar=100μm。

− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015の値を ELISA 法により測定した。HDM 塗布群の ST2-Tg

値を ELISA 法により測定した。HDM 塗布群の野生型お

マウスにおける IL-13 値は、野生型マウスに比べて顕著によび ST2-Tg マウス由来リンパ節細胞は、HDM 刺激に応低かった。IL-5 は非常に低濃度であったが、IL-13 と同様じて、IL-4、IL-5、および IL-13 を産生した。しかしながの傾向を示した。また、ST2-Tg マウスにおける総 IgE 値ら、ST2-Tg マウスでは、野生型マウスに比べて、いずれおよび HDM 特異的 IgE 値も、野生型マウスに比べて低かのサイトカインも低値であった。一方、IFN-γ の産生は、った（図 4）。IL-4、IFN-γ、および IL-33 は、HDM 塗布群

HDM 塗布群の ST2-Tg マウス由来のリンパ節細胞の方が、および溶媒液塗布群のいずれにおいても、検出限界以下で野生型マウスに比べて僅かに亢進していた（図 5）。これあった。これらの結果から、ST2-Tg マウスでは、Th2 サらの結果から、ST2-Tg マウスの末梢リンパ組織におけるイトカインや IgE の産生が抑制されていることが明らかに

Th2 型免疫応答は、野生型マウスよりも低下しているこなった。

とが明らかになった。

４．考3. 5. 所属リンパ節におけるサイトカイン産生察腋窩リンパ節から単離した細胞を用いて、ダニ抗原刺本研究では、2 種類の皮膚炎症モデルにより、皮膚炎症

激に応じて産生されるサイトカインを調べた。リンパ節に対する分泌型 ST2 の作用を検討した。FITC 塗布による細胞に HDM または生理食塩水液を添加して 4 日間培養し接触皮膚炎モデルでは、野生型と ST2-Tg マウスにおけるた後、培養上清中の IL-4、IL-5、IL-13、および IFN-γ の

皮膚樹状細胞の遊走能と皮膚炎症に大きな違いは見られな

図４ 血清サイトカインおよび血清 IgE の産生
血清中の IL-13 値、総 IgE 値（Total IgE）、および HDM 特異的 IgE 値（HDM-IgE）を ELISA 法により測定した。
*, p < 0.05、**, p<0.01。

図５ 所属リンパ節由来細胞のサイトカイン産生
溶媒液塗布または HDM 塗布した野生型および ST2-Tg マウス（Wt-Veh、Tg-Veh、Wt-HDM、Tg-HDM）の腋窩リンパ節由来の細胞に生理食塩水（Saline）またはダニ抗原（HDM）を添加し、4 日間培養した後、培養上清を採取した。培養上清中の IL-4、IL-5、IL-13、および IFN-γ の値を ELISA 法により測定した。**，p < 0.01。

− 96 −

IL-33 デコイ受容体による皮膚炎症の制御かった。IL-33 欠損マウスにおける接触皮膚炎の各種症状（引用文献）

も、野生型マウスと差がないことが報告されている 。こ１）Schmitz J, Owyang A, Oldham E, Song Y, Murphyのことから、IL-33 ／ ST2L 系は、接触皮膚炎の発症に関E, McClanahan TK, Zurawski G, Moshrefi M, Qin J,

与しないものと考えられ、分泌型 ST2 の有無も皮膚炎症

Li X, Gorman DM, Bazan JF, and Kastelein RA,:IL-33,に影響しないことが示唆された。

an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1

7）

HDM 反復塗布によるアトピー性皮膚炎モデルでは、

receptor-related protein ST2 and induces T helper

ST2-Tg マウスの皮膚炎症および Th2 型免疫応答は、野生type 2-associated cytokines, Immunity, 2 3, 4 7 9-4 9 0,型マウスに比べて減弱していた。このことから、分泌型

2005.

ST2 は、アトピー性皮膚炎の皮膚炎症を軽減させる作用

２）Pushparaj PN, Tay HK, H’ng SC, Pitman N, Xu D,を持つ可能性が示唆された。ST2-Tg マウスにおける分泌

McKenzie A, Liew FY, Melendez AJ,: The cytokine

型 ST2 は、恒常的に様々な組織で発現しているだけでなく、interleukin-33 mediates anaphylactic shock, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 106, 9773-9778, 2009.

血流を通しても全身に循環している。このため、IL-33の機能が分泌型 ST2 により抑制されるものと考えられた。

３）Yanagisawa K, Takagi T, Tsukamoto T, Tetsuka

しかしながら、ELISA 法では、HDM 刺激した野生型マウT, and Tominaga S,: Presence of a novel primaryスにおいても血清 IL-33 を検出できなかった。今後、このresponse gene ST2L, encoding a product highly similar

モデルマウスの皮膚病変部における IL-33 の発現を調べる

to the interleukin 1 receptor type 1, FEBS Lett., 3 1 8,予定である。

83-87, 1993.

アトピー性皮膚炎患者では、皮膚病変部に IL-33 の発４）Tominaga S,: A putative protein of a growth specific2）

現亢進が認められる 。また、IL-33 トランスジェニック

cDNA from BALB/c-3T3 cells is highly similar to the（IL-33-Tg）マウスを用いた解析において、IL-33 の発現亢

extracellular portion of mouse interleukin 1 receptor,

進により皮膚炎症が誘導されることが示された 。このFEBS Lett., 258, 301-304, 1989.

8）

IL-33-Tg マウスは、表皮特異的に IL-33 を過剰発現してお５）Hayakawa H, Hayakawa M, Kume A, and Tominaga

り、アトピー性皮膚炎と似た皮膚炎症を自然発症する。まS,: Soluble ST2 blocks interleukin-3 3 signaling in

た、Th2 サイトカイン産生能力を持つ２型自然リンパ球

allergic airway inflammation, J. Biol. Chem., 282, 26369-

が皮膚炎症の発症に関与することも示唆された。しかしな

26380, 2007.

がら、IL-33 がどのような機序で細胞外に産生されるのか

６）Ohto-Ozaki H, Kuroiwa K, Mato N, Matsuyamaは分かっていない。IL-33 は、上皮細胞などで発現するが、Y, Hayakawa M, Tamemoto H, Tominaga S,:

その細胞内局在は核である。そのため、アトピー性皮膚炎

Characterization of ST2 transgenic mice with resistanceの患者やモデルマウスでは、搔破行動により表皮細胞が傷

to IL-33, Eur. J. Immunol., 40, 2632-2642, 2010.

つき、細胞外に IL-33 が放出されるものと考えられている。

７）Oboki K, Ohno T, Kajiwara N, Arae K, Morita H,

このように、アトピー性皮膚炎の発症機序にはまだ不明な

Ishii A, Nambu A, Abe T, Kiyonari H, Matsumoto

点は多いが、その発症に IL-33 が関与する可能性は強く示

K, Sudo K, Okumura K, Saito H, Nakae S,: IL-3 3 is唆されている。

a crucial amplifier of innate rather than acquired

５．総

immunity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1 0 7, 1 8 5 8 1-括18586, 2010.

本研究は、ST2-Tg マウスを用いて、分泌型 ST2 がアト

８）Imai Y, Yasuda K, Sakaguchi Y, Haneda T, Mizutani

ピー性皮膚炎に見られる皮膚炎症および Th2 型免疫応答

H, Yoshimoto T, Nakanishi K, Yamanishi K,: Skin-を抑制することを明らかにした。今後、アトピー性皮膚炎

specific expression of IL-3 3 activates group 2 innateの発症機序の解明や治療薬の開発に、分泌型 ST2、すなわ

lymphoid cells and elicits atopic dermatitis-like

ち IL-33 デコイ受容体が寄与することが期待される。

inflammation in mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 110,
13921-13926, 2013.

− 97 −

小胞体における蛋白質の酸化的折畳み異常によるコラーゲン形成障害機構の解明
山形大学大学院医学系研究科生化学・分子生物学

藤井順逸

Vitamin C (ascorbic acid; AsA) is an essential nutritional factor and required for collagen production as well as
antioxidation in human. We have analyzed genetically modified mice regarding Akr1a, which catalyzes a step in the AsA
biosynthesis, and the embryonic fibroblasts derived from the mice (MEFs). The body weight of the knockout (KO) mice
was the same as the wild-type (WT) mice up to ~20 weeks. The KO mice started dying around 10 weeks of age and all
had died within one year under the AsA-deficient diet. However, supplementation of AsA contributed to maintaining bodyweight and extended the life-span of the KO mice. We then used MEFs from WT and human Akr1a-transgenic (Tg) mice
to investigate the potential roles of Akr1a under culture conditions. Tg MEFs showed higher acrolein-reducing activities
than WT MEFs and were more resistant to cytotoxicity. While the administration of ascorbic acid to the cells increased theintracellular levels of ascorbic acid, it had no effect on the resistance to acrolein. Thus, one of the principle roles of Akr1a inprimates is the reductive detoxification of aldehydes, notably acrolein, and protection from its detrimental effects. We also
examined the impact of a deficiency of Akr1a on fibrotic damage caused by unilateral ureteric obstruction in the mice. Even
though Akrla-deficient mice could produce only about 10% of the AsA produced by WT mice, no difference was observed incollagen I synthesis under pathological conditions. The data implied either a low demand for AsA or the presence of anotherelectron donor for collagen I production in the mouse kidney. Application of the genetically modified mice would give us anadvantage in elucidation of in vivo-roles of AsA such as collagen synthesis and anti-oxidation.

１．緒も Prolyl 4-hydorxylase によるプロリンのヒドロキシル化

言反応では、AsA が電子供与体となってコラーゲン形成に関皮膚は、外気や光その他の有害な外的環境に常にさらさわると考えられている。そのため AsA が不足するとコラれているため、様々な影響を受けている。皮膚の創傷によーゲンなどの形成が障害され、壊血病や骨形成異常を来す。

り、護られていた内部組織に障害が及び感染などの危険が霊長類は進化の過程で AsA 合成の最終段階を触媒する

増すため、すみやかな治癒が進行する（図 1）。創傷治癒はGulo 遺伝子に変異を生じたため、ヒトはその合成能を欠

複雑な過程を経るが、その際にコラーゲンなどをはじめとくが、げっ歯類をはじめとする多くの実験動物はグルコーする細胞外基質タンパク質が大量に合成され、創傷部位のスやグリコーゲンを出発材料として AsA を合成できる。

保護とその後のリモデリングなどに働く。

Aldehyde Reductase（遺伝子名 ; Akr1a）はアスコルビン

コラーゲンは身体で最も多いタンパク質であり、その保酸合成反応のうち Gulo とは異なる段階を触媒し、その遺水性や弾力性によって皮膚を若く健康に保つ作用に加え、伝子欠損（Akr1a-KO）によりアスコルビン酸合成能が 10%

多様な生理機能を担っている。例えば心臓や肝臓などの臓程度にまで低下する （図３）。マウスは遺伝子改変技術

器は虚血などによって細胞死が起り失われると、筋線維芽が確立しているため病態モデル動物として頻用されるが、細胞が増殖してコラーゲンをはじめとする基質タンパク質

AsA 欠乏の病態を示さないことから、AsA に関する生理を大量に分泌し、その間隙を埋める（図 2）。このような臓機能の解明を目的とする研究材料には適さない。

1）

器の線維化が緊急対応として機能し、その間に本来の細胞

一般に分泌タンパク質は、粗面小胞体で合成された後に数が回復すれば臓器機能が維持されるが、線維化が進行す

小胞体内でシステイン -SH 基が酸化されてジスルフィド結ると臓器不全に陥る。こうした細胞外基質の形成は、細胞合を形成することで、機能を発揮できる立体構造をとる（図によるタンパク質の合成と分泌反応とも密接に関係する。

4）。PRDX4 は ERO1 とともに新生タンパク質のシステイ

ビタミン C（アスコルビン酸 ; AsA）はその抗酸化能に加ン-SH 基を酸化してジスルフィド結合を導入し、タンパク

えて、いくつかの酵素系で電子供与体として作用する。中で質の酸化的折畳みを行う 。ERO1 欠損マウスと我々が樹2）3）立した PRDX4 欠損マウス を交配して得た ERO1;;PRDX4
Elucidation of malfunction of collagensynthesis caused by defected oxidative
protein folding in endoplasmic reticulum
Junichi Fujii
Yamagata University, Graduate Schoolof Medical Sciences, Department ofBiochemistry and Molecular Biology

二重欠損マウスは、タンパク質の酸化的折畳みが正常に進行しないことが原因となって AsA が消費され、その結4）

果コラーゲン形成障害が起って壊血病になる 。一方、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）の際に起こる線維化は、
5）

PRDX4 欠損により増悪し過剰発現により改善される 。
このように、コラーゲンについては、小胞体における酸化− 98 −

小胞体における蛋白質の酸化的折畳み異常によるコラーゲン形成障害機構の解明

図1

皮膚の創傷治癒過程とコラーゲンをはじめとする基質タンパク質の役割 11）

図 2 臓器線維化の過程で筋線維芽細胞が分化・増殖し、コラーゲンな
どの基質タンパク質を生成する

図3

グルコース・グリコーゲンからの血糖供給と AsA の合成経路− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図 4 コラーゲンの生成には小胞体におけるタンパク質の酸化的折畳みとプロリンのヒドロキシル化が必要

的折畳みに加えて、プロリンがヒドロキシル化された後にした Akr1a-KO マウス（9−10 週齢）群を用いて一側尿管分泌され、細胞外基質としての機能を発揮するようになる。

結紮モデルを作製し、5 日目に腎臓を摘出して腎線維化

本研究では、主に Akr1a 欠損マウスを用いて、コラーに伴うコラーゲン形成と腎障害に及ぼす効果について検ゲンの合成と機能発現における AsA の役割について解明

討 し た。 腎 臓 組 織 切 片 を Elastica-Masson 染 色 し て、 線

するとともに、AsA 合成以外の Akr1a の役割について検維 化 の 程 度 を 評 価 し た。 ま た、 核 酸 の 酸 化 体 で あ る討した。

8-hydorxylguanine（8OH-dG）の抗体を用いた免疫染色を２．実

行い、酸化ストレスの病態への関与について検討した。さ験らに、線維化に関わる筋線維芽細胞のマーカータンパク質

2. 1. Akr1a KOマウスの表現型と個体におけるAsAの作用である a-smooth muscle actin（aSMA）、主要な基質タン

野生型（WT）
・Akr1a- 欠損（Akr1a-KO）
・ヒト Akr1a ト

パク質、オートファジー関連タンパク質、ミトコンドリア

ランスジェニック（hAkr1a- Tg）マウスを AsA 欠乏餌で電子伝達複合体（Ⅰ～Ⅴ）ならびにシトクローム- c の発現

飼育し、AsA 欠乏がマウスの生存に与える影響を調べた。

について、イムノブロット解析を行った。

パク質であるコラーゲンⅠ、抗酸化酵素、小胞体関連タン

また Akr1a-KO マウスに AsA 含有水（1.5 g/L）を与えるこ

３．結とで AsA 欠乏症状への効果を調べ、肝臓・腎臓ならびに果3. 1. Akr1a-KOマウスの表現型と個体におけるAsAの作用

血漿中の AsA を測定した。

2. 2. マウス胚性線維芽細胞（MEF）を用いた解析

Akr1a-KO 雌マウスについては、出生率の著しい低下が

WT・Akr1a-KO・hAkr1a-Tg の妊娠雌マウスの胎仔か認められ、産まれた仔についてもその多くが出生後すぐに

ら MEF を単離し、SV40 large T 抗原を用いて不死化させ死亡した。また、生き残ったマウスも、通常餌での飼育では、て、それぞれの遺伝子型の MEF を樹立した。その MEF

1 年以内にすべて死亡した。そこで AsA（1.5g/L）を飲水

を用いて、AsA 含有量の測定と AsA の合成中間体であるに加えて投与したところ出生率が著しく改善し、死亡する

D-glucuronate の還元活性を測定し、さらに各種アルデヒ

こともほとんどなくなった（図５）。

ド化合物に対する感受性を調べて、MEF における Akr1a

Akr1a-KO 雌マウスにペントバルビタール麻酔を施すとの役割について検討した。特に脂質過酸化の最終産物や環覚醒が遅れたが、AsA を投与することで改善された。こ境毒素として知られるアクロレインの解毒作用に焦点を当の時ペントバルビタールの代謝を行う肝臓の P450 系はてて検討した。

AsA 欠乏の影響を受けておらず、神経系への作用が関係6）する可能性がある 。

2. 3. AsAのコラーゲン形成に果たす役割の検討

マウスの肝臓・腎臓ならびに血漿中の AsA 含有量を測

WT マウス、Akr1a-KO マウス、ならびに AsA を投与定したところ、Akr1a-KO マウスでは AsA 含有量は血漿中− 100 −

小胞体における蛋白質の酸化的折畳み異常によるコラーゲン形成障害機構の解明

図5

Akr1a 欠損マウスは AsA 欠乏により早期に死亡し AsA 摂取により改善する

図6

Akr1a-Tg マウスの線維芽細胞はアクロレインに対して耐性を示す 7）

で数 % にまで低下し、肝臓および腎臓でも約 1 割程度まで極めて低く遺伝子型による違いが認められないことから、低下していた。Akr1a-KO マウスに AsA を投与すること

MEF は AsA をほとんど合成していないことが分かった。

で AsA 含有量が回復し、Akr1a 欠損による影響は救済さ

AsA 合成過程で Akr1a の基質となる D-glucuronate の添加れた。しかし、AsA 水を給水し成獣にまで達した Akr1a-

により AsA 合成量はわずかに増加したが、その量は肝臓KO マウスについて AsA の投与を中止してもその後に死亡などに比べて極めて僅かであった。一方、培地に AsA を率が高くなることはなかった。

添加した場合には、いずれの細胞でも AsA の顕著な増加が認められ、取り込み量には違いは見られなかった。

3. 2. マウス線維芽細胞（MEF）を用いた解析

Akr1a の基質特異性は低く、様々なアルデヒド化合物を

WT・Akr1a-KO・hAkr1a-Tg の 各 マ ウ ス か ら MEF を還元することで広く解毒反応に関わると考えられている。

単離して形態を観察したが、大きな違いを認めなかった。

そこで各種アルデヒド化合物を MEF に添加してその細胞

AsA を含まない通常培地で不死化させた MEF を培養した

毒性について調べたところ、hAkr1a-Tg MEF では脂質過ところ、遺伝子型に関係なく正常に増殖した。それぞれの酸化によって生じるアクロレインの細胞毒性に対する耐細胞抽出液を用いて NADPH 依存性の D-glucuronate 還元性が増していた（図 6）。AsA を添加し細胞内の AsA 含有活性を測定したところ、WT と Akr1a-KO MEF の活性に量を増加させた細胞でもこの傾向は変わらなかったことか

比べて hAkr1a-Tg MEF は高い活性を示した。

ら、アクロレインに対する耐性の獲得には AsA ではなく、この結果は、Akr1a が D-glucuronate 還元に関わっていることを示している。しかし AsA 含有量はどの細胞でもAkr1a によるアルデヒド還元活性が関わっていることが分
7）

かった 。

− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

3. 3. AsAのコラーゲン形成に果たす役割の検討

KO マウスでは顔面皮膚に炎症が自然発症し、それは抗酸

9 −10 週齢では、Akr1a-KO と WT マウスの腎臓の機能化剤の N- アセチルシステインにより著しく遅延されるなに違いは認められなかった。そこで一側尿管結紮モデル

ど、抗酸化物質投与の有効性を明らかにした 。創傷治癒（UUO）を作製して 5 日後に摘出した腎臓の組織学的検討

モデルでは SOD1 欠損により治癒速度が遅延し，加齢のを行なったところ、炎症細胞の浸潤と線維化が認められた

進んだマウスでは顕著になる。その機構を解明するためが、遺伝子型による顕著な違いはなかった。発現タンパに、初代培養 MEF による検討を行ったところ，通常培養

ク質の解析では、筋線維芽細胞への分化を誘導する線維（20% 酸素）下では SOD1-KO MEF は死ぬが、体内の酸素化促進因子である TGFb の発現が亢進していた（図 7）。ま（1 − 2 %）では増殖が停止した。こうした細胞分裂異常にた aSMA、コラーゲンⅠ、PRDX4 の発現についても亢進

細胞周期関連タンパク質の酸化傷害が関わると考えられるが認められた。その一方で、抗酸化酵素の発現については、

10）。このように、in vivo と in vitro では細胞の性質に大きSOD1 と CAT がわずかに低下したのに対して、ミトコン

な違いが認められた。こうした結果を踏まえ、コラーゲン

ドリアに局在する SOD2 と GPX1 については顕著な低下がの形成に密接に関わり、抗酸化力を有する AsA の役割を認められた。尿管結紮による腎障害に小胞体ストレスが関明らかにするために本研究を行った。

9）

与する可能性が示唆されているが、Bip や PDI の発現量は討でも顕著な増加は認められず、オートファジーの関与を

4. 1. Akr1a KOマウスの表現型と個体におけるAsAの作用示す結果は得られなかった。以上、いずれの検討でも遺伝

Akr1a-KO マウスに AsA を投与することで出生率が著し子型による違いはなく、AsA 欠乏の影響を認めなかった。

く回復し、生存率も著しく改善したことから、Akr1a-KO

尿管結紮 5 日後の腎臓について、ミトコンドリア電子伝マウスに見られた表現型の多くは Akr1a 欠損による AsA

達複合体 I ～ V およびシトクローム- c の発現量について調

合成能の低下を反映しているものと考えられた 。 AsA

べたところ、尿管結紮により著しく低下していた。そこでなどの水溶性ビタミンについては、腎臓から尿中に排泄さ

腎線維化にミトコンドリア障害がどのように関わるかを明れるため、過剰症とはならないことが知られており、今回らかにするために、尿管結紮後の異なる時点でこうしたタの検討でも血漿中の AsA は数日で消失した。AsA-KO 雌

ンパク質の発現について評価した。その結果、ミトコンド

マウスでは出生率が著しく低下することから、胚発生過程

リア電子伝達複合体Ⅰ～Ⅴやシトクローム- c の発現低下がでの重要性が確認された。それが胎児に対する効果なのか、

aSMA やコラーゲンⅠの発現に先行して起っていること

それとも母胎に作用して妊娠の維持に必要なのかといったが分った 。

点については引き続き検討を行っている。

僅かに変動しただけであった。また、LC3 抗体を用いた検

8）

４．考

察

8）

4. 2. マウス線維芽細胞（MEF）を用いた解析

当教室は平成 16 年度に本財団より「SOD1 ノックアウト

hAkr1a-Tg マ ウ ス の MEF で は Akr1a を 過 剰 発 現 し てマウスに発症する皮膚炎への活性酸素の関与の解明」の課

いても AsA の含有量に変化がなかったことは、AsA 合成

題で第 14 回研究助成を受けた。その成果として、SOD1-に関わる他の遺伝子の発現が十分でないことを示してお図7

Akr1a-KO による AsA 欠乏は線維化に伴うコラーゲン形成に大きな影響を与えない 8）− 102 −

小胞体における蛋白質の酸化的折畳み異常によるコラーゲン形成障害機構の解明

り、体内での AsA 合成は肝臓などの限られた臓器で行わしてもコラーゲン量に影響を与えないことから、他の分子れるとするこれまでの知見に一致する。肝臓は様々な有害からの電子供与の可能性が示唆された。コラーゲンの形

化合物の解毒に働く臓器であり、Akr1a が肝臓で特に高い

成には、小胞体の中での酸化的折畳みも関係することから、発現を示すことから、AsA 合成の他にアルデヒド化合物

今後は PRDX4-KO との二重欠損マウスについても併せての解毒に働くと考えられている。実際に MEF を用いた検解析することで、コラーゲン形成に関わる因子の相互作用

討では、hAkr1a-Tg MEF がアルデヒドの中でも毒性が高についての解明を目指したい。

いアクロレインに対する耐性を示し、高い解毒作用を有す
7）ることが示唆された 。hAkr1a-Tg MEF では、アクロレ

謝辞インを基質として NADPH による還元活性が高いこともこ

本研究を遂行するに当たり、Akr1a-KO ならびに hAkr1a-の結果と一致する。MEF に AsA を添加して取り込ませてTg マウスを提供くださいました宮田哲博士と、研究を助おいてもアクロレインに対する感受性が変わらないことか成してくださいましたコスメトロジー研究振興財団に心から、AsA はこの解毒作用には寄与しないことが分かった。

ら感謝申し上げます。

このことは、hAkr1a-Tg MEF のアクロレイン耐性には
Akr1a による NADPH 依存性還元活性が直接関係すること（引用文献）を示す。

１）Takahashi M, Miyata S, Fujii J, Inai Y, Ueyama S,
Araki M, Soga T, Fujinawa R, Nishitani C, Ariki S,

4. 3. AsAのコラーゲン形成に果たす役割の検討

Shimizu T, Abe T, Ihara Y, Nishikimi M, Kozutsumi Y,

コラーゲンは身体を構成するタンパク質として最も多く、Taniguchi N, and Kuroki Y. In vivo role of aldehyde

皮膚の保湿性や弾力性の保持など、抗老化にとっても重要

reductase. Bichim Biophys Acta, 1820:1787-1796 (2012)である。AsA はコラーゲンの生成に必要であり，不足す２）Fujii J, Ikeda Y, Kurahashi T, Homma T. Physiological

ると壊血病や骨形成異常を来す

11）。一方で、Gulo 欠損により AsA 合成能を欠くマウスを用いた検討では、骨の発and Pathological Views of Prdx4. Free Radic Biol Med,in press (2015)

育不全を来たし 20 週齢頃から死にはじめるが、皮膚のコ

３）Iuchi Y, Okada F, Tsunoda S, Kibe N, Shirasawa N,

ラーゲンは正常に形成されるといった、これまでの認識を

Ikawa M, Okabe M, Ikeda Y, and Fujii J. Peroxiredoxin

覆す結果が報告されている。このように AsA の作用に関

4 knockout results in elevated spermatogenic cell

する分子機構については、従来の理解とは異なる現象も報

death via oxidative stress. Biochem J, 419:149-58 (2009)
４）Zito E, Hansen HG, Yeo GSH, Fujii J, and Ron D.

告されている。
Akr1a-KO マウスにおいては、野生型マウスの 10% 程度

Endoplasmic reticulum thiol oxidase deficiency leads

しか AsA を合成することができないにもかかわらず、WT

to ascorbic acid depletion and noncanonical scurvy in

マウスと比較して、尿管結紮によって生じるコラーゲンⅠ
8）

mice. Mol Cell, 48:39-51 (2012)の合成量に差を認めなかった 。この結果より、マウスの

５）Nabeshima A, Yamada S, Guo X, Tanimoto A, Wang

腎障害時におけるコラーゲンⅠ合成には微量の AsA しか

KY, Shimajiri S, Kimura S, Tasaki T, Noguchi H,

必要としない、もしくは、プロリルヒドロキシラーゼへのKitada S, Watanabe T, Fujii J, Kohno K, and Sasaguri

別の電子供給体が存在する、可能性が示唆された。ヒト由

Y. Peroxiredoxin 4 Protects Against Nonalcoholic

来の細胞を培養する際の培地には AsA は含まれていない

Steatohepatitis and Type 2 Diabetes in a Nongenetic

場合がほとんどであるが、こうした細胞でもコラーゲンのMouse Model. Antioxid Redox Signal, 1 9:1 9 8 3-1 9 9 8形成が起こることから、後者の可能性が高いと考えられる。

(2013)

プロリルヒドロキシラーゼへの電子の供給に働くレドック

６）Ito J, Otsuki N, Zhang X, Konno K, Kurahashi T,

ス分子としては、細胞内含有量の多いグルタチオンが有力

Takahashi M, Yamato M, Matsuoka Y, Yamada K,

な候補であるため、MEF などを用いた検討により明らか

Miyata S, and Fujii J. Ascorbic acid reverses theにしたい。

prolonged anesthetic action of pentobarbital in Akr1a-

５．総knockout mice. Life Sciences, 98:1-8 (2014)

括７）Kurahashi T, Kwon M, Homma T, Saito Y, Lee

AsA 合成障害のある Akrla-KO マウスを用いて、コラー

J, Takahashi T, Yamada K, Miyata S, and Fujii J.

ゲン合成における AsA の関与について、培養細胞系とマReductive detoxification of acrolein as a potential

ウスを用いて検討を行った。AsA はコラーゲン形成の過role for aldehyde reductase (AKR1A) in mammals.

程でプロリンヒドロキシル化に必要とされているが、欠損

Biochem Biophys Res Commun, 452:136-141 (2014)− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015８）Nishida H, Kurahashi T, Saito Y, Otsuki N, Kwon M,
Ohtake H, Yamakawa M, Yamada K, Miyata S, Tomita

wound healing in SOD1-deficient mice. Mol Cell
Biochem, 341:181-194 (2010)

Y, and Fujii J. Kidney fibrosis is independent of the10）Tsunoda S, Kibe N, Kurahashi T, and Fujii J.

amount of ascorbic acid in mice with unilateral ureteral

Differential responses of SOD1-deficient mouseobstruction. Free Radic Res, 48:1115-1124 (2014)

embryonic fibroblasts to oxygen concentrations. Arch９）Iuchi Y, Roy D, Okada F, Kibe N, Tsunoda S, Suzuki

Biochem Biophys 537:5-11 (2013)

S, Takahashi M, Yokoyama H, Yoshitake J, Kondo S,11）Kurahashi T, and Fujii J. Roles of antioxidativeand Fujii J. Spontaneous skin damage and delayed

enzymes in wound healing. J Dev Biol, 3 : 57-70 (2015)− 104 −iPS 細胞の造血幹細胞への分化能を応用した先天性皮膚疾患の治療

北海道大学病院皮膚科

藤田靖幸

Epidermolysis bullosa (EB) is a group of genodermatoses that cause blister formations from the congenital abnormalityof anchor proteins between the epidermis and the dermis. There have been several strategies for the treatment of EB, and so
far, cell therapies are the most promising approach because of the potential of systemic effects. We have proved that stem
cell therapies, including bone marrow transplantation, hematopoietic stem cell transplantation, can ameliorate the phenotype
and survival prognosis in the junctional EB model mice that lack type XVII collagen (Col17). In this study we explore more
efficient approaches of stem cell therapies for EB, including intramedullary transplantation, mesenchymal stromal/stem cell
infusion, application of induced pluripotent stem cells (iPSCs), and investigate factors in association with transdifferentiationfrom bone marrow-derived stem cells into keratinocytes.

１．緒

的な治療効果を得るために，幹細胞移植の時期および方法

言の最適化検討，皮膚分化因子を併用した造血幹細胞移植，表皮水疱症は，皮膚の表皮 - 真皮境界部を構成する蛋白

骨髄内投与などのより効率の高い投与方法，および安全にに先天的な欠損ないし構造異常が生じることで同部位の脆施行しうる間葉系間質細胞療法や，iPS 細胞を応用した幹弱性を生じ，機械的刺激によって容易に水疱や潰瘍を形成

細胞療法の有用性を検討する．本研究を遂行することによする疾患である．現時点で対症療法以外に確立した治療法

り，難治性疾患である表皮水疱症への新たな治療戦略を立は存在せず，特に重症型では感染症や脱水，二次的な悪性てる上で重要な知見が得られるものと考える．

腫瘍などを生じ，生後数年以内に死亡するものも存在する．

２．実

表皮水疱症などの重症遺伝性皮膚疾患において近年研究されている治療法としては，遺伝子治療，蛋白補充療法お験

2. 1. 分化誘導

よび細胞療法がある．このうち細胞療法は，正常遺伝子をES/iPS 細胞の分化誘導は Kitajima らのプロトコールに有する細胞を患者に投与して欠損蛋白の産生を促す治療法

準じて行った 3）．Lhx2 遺伝子を組み込んだレトロウィル

である．全身性の効果が期待できること，生着により長期

ス ベ ク タ ー を PLAT-E 細 胞 に transfection し， 培 養 後 に間の治療効果が望めること，造血幹細胞移植など現代の医上清を濃縮して Lhx2 レトロウィルス液を調製した．ES/

療レベルで施行可能な治療法があり倫理的障壁が低いこと，

iPS 細胞を OP9 細胞と 10cm ディッシュ内で 5 日間共培養などの利点が考えられる．

し，mesodermal clusters を作製した時点で Lhx2 遺伝子

重症遺伝性皮膚疾患の治療開発に於いては，疾患モデルを形質導入させた．さらに 10 日間OP9 細胞と共培養を続け，マウスの利用が必須である．我々の研究室では近年，新血球系前駆細胞である c-kit+, sca-1+, lineage -population

規表皮水疱症モデルマウスとして，皮膚構成蛋白の 17（KSL 細胞）の出現をフローサイトメトリーにて確認した．

1）型コラーゲン（COL17）欠損マウスの作成に成功した ．
COL17 欠損マウスは従来の表皮水疱症モデルマウスと異2. 2. 細胞移植

なり，成体まで生存する特徴を有しており，各種治療実験

骨髄移植及び造血幹細胞移植として，ドナーとなる成体のモデルとして有用である．そして我々は，COL17 欠損

Col17 欠損マウスに 6Gy 放射線照射を行い骨髄機能を非破

マウスにおいて実際に骨髄移植療法が予後改善および臨床

壊的処置した後に，5×106 個の GFP+ トランスジェニック

症状の改善に寄与することを示した 2）．

マウス由来の骨髄由来細胞ないし 5×103 個の造血幹細胞

本研究は，上記表皮水疱症モデルマウスを用いて，効率を経尾静脈投与した．新生仔マウスに対しては 2.5Gy 放射線照射ののちに，5×106 個の骨髄由来細胞ないし 5×103

Treatment of congenital severe skindisorders with hematopoietic stem cells
obtained from induced pluripotent stem
cells（iPSCs）
Yasuyuki Fujita
Department of Dermatology, Hokkaido
University Hospital

個の造血幹細胞を眼窩静脈叢を経由して静脈投与した．
MSC 療法として，成体 Col17 欠損マウス，COL17 レス
キューマウス（マウス由来 Col17（以下 mCol17）を欠損す
るが、ヒト由来 COL17（以下 hCOL17）を発現することで表皮水疱症発症を回避したマウス 1））および Col17 欠損新生仔マウスの背部に，用手的な水疱形成ないし 4 mm パン− 105 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

チ皮膚メスを用いて全層皮膚欠損を作製した上で，GFP+ト
6

む非血球細胞として GFP+CD45−細胞（ドナー由来）およ

ランスジェニックマウス由来の MSC 1×10 個を経静脈投び GFP−CD45−細胞（レシピエント由来）を各々ソーティ

与，腹腔内投与ないし水疱/創傷周囲への局所投与を行った．

ングした．これら細胞から RNeasy Mini Kit（Qiagen）を

ES/iPS 細胞移植として，ドナーとなる成体 COL17 レス

用いて total RNA を抽出し，Ambion WT Expression Kit

キューマウスおよび Col17 欠損マウスに放射線照射を行っ（Applied Biosystems）を用いて cRNA を増幅・精製した．

た後に，1×104 個の Ly5.1 由来の造血系誘導済み ES/iPS

逆 転 写 反 応 に よ り cDNA を 合 成 し，GeneChip®Mouse細胞を，サポーター細胞として成体 Col17 欠損マウス由来

Gene 1.0 ST Array（Affymetrix）を用いてマイクロアレ

5の全骨髄細胞 5×10 個とともに経静脈投与した．

イプローブとハイブリダイズさせた．GeneChip Scanner

2. 3. COL17 発現解析

（AGCC）を使用してシグナル測定，データを取得し，3000 7G お よ び GeneChip Command Console®Software
骨髄移植・造血幹細胞移植においては，移植 4 週間後に

GeneSpring GX にて解析を行った．

末梢血フローサイトメトリー解析にてドナー血球細胞の生３．結着を確認，背部皮膚に 4 mm パンチ皮膚メスを用いて全層皮膚欠損を作成し，3 週間後に上皮化した部位の皮膚を採取して検討に用いた．MSC 療法においては細胞療法後 3週間で皮膚を採取し，検討した．

果

3. 1. 幹細胞移植の時期および方法の最適化検討
我々は，成体 Col17 欠損表皮水疱症マウスに対して骨髄由来細胞ないし造血幹細胞を経尾静脈移植し，臨床的な上記で得られた皮膚組織は①凍結切片作成後にマウス改善を見いだしている 2）．現実的には表皮水疱症患者は特Col17 モノクローナル抗体（1：2,500, KT4.2）による蛍光抗に重症例では成長前に死亡，ないし有棘細胞癌などの発

体法

③電子顕

症により移植処置が困難になることが予想される．また，④表皮抽出物おCol17 欠損マウスは成体まで成長するものが自然経過では② total RNA 抽出および定性 RT-PCR

微鏡によるヘミデスモソーム構造観察

よびマウス Col17 モノクローナル抗体（KT4.2）を用いた

全体の約 20 ％にとどまり，成長前に死亡する個体が多い．

Western blotting

そのためまず我々は，可能な限り生後早い段階での介入にを施行し，Col17 の発現を検討した．

よる治療可能性を検討した．生後 3 日以内の新生仔 Col17

2. 4. マイクロアレイ解析

欠損マウスに対して経眼窩静脈による骨髄移植を施行した

造血幹細胞移植を行いドナー細胞の生着を確認した

ところ，成体まで成長したマウスは 4/34 匹（11.8 ％）にとCol17 欠損マウスに対して 4 mm パンチ皮膚メスを用いてどまり，皮膚における Col17 発現も免疫染色・RT-PCR・全層皮膚欠損を作成し，3 週間経過して上皮化した皮膚組

Western blotting で確認できなかった（図 1A）．生存した織を採取した．ディスパーゼⅠ（エーディア）を用いて真Col17 欠損マウスの末梢血フローサイトメトリー解析で

皮／表皮を分離し，さらに 0.25 % トリプシンで表皮細胞は，生着したドナー由来の GFP+ 血球細胞の割合は 12.8±2．

を分離させた後，FACS Aria を用いて表皮角化細胞を含2 % に過ぎなかった．また，臨床症状においても生後 28

図 1 Col17 欠損表皮水疱症マウス新生仔に対する造血幹細胞移植（A）Col17 欠損表皮水疱症マウス新生仔に対する造血幹細胞移植療法の治療成績（B, C）新生仔移植療法成功例．
生後 1 ヶ月の時点（B）では正常マウスとほぼ同様の臨床像であり，極めて良好な治療効果が得られたが，生後 2 ヶ月より急激にびらんの形成が強くなった（C）．

− 106 −iPS 細胞の造血幹細胞への分化能を応用した先天性皮膚疾患の治療日の時点ではほぼ正常と同様であったものの，その後 1 ヶ皮膚においても GFP 陽性細胞が観察されなかった（それぞ

月で急激に水疱びらんが多発するようになった（図 1B,C）．

れ n=5）．以上より本実験系においては，骨髄内投与は移この急激な臨床症状の変化の原因として，現病の表皮水疱植方法としてメリットが少なく，妥当性に乏しいことが判症の悪化や，GVHD の発症などが可能性として考えられた．

明した．

新生仔マウスに対する骨髄移植療法が困難であることが確認されたため，次に，GVHD の発症可能性が低く，容3. 2. 皮膚分化関連因子の検索

易に細胞数を得ることが可能である MSC の治療可能性を

我々は過去に，骨髄由来細胞や MSC に発現するケモカ検討した．新生仔 Col17 欠損マウスに対して GFP トラン

インレセプターおよびケモカインによる相互作用が皮膚創

スジェニックマウス由来 MSC の腹腔内投与（n=11）および傷部への細胞動員を促進し，表皮角化細胞を含むドナー由水疱内への皮内投与（n=24）を行ったが，全例で生後 18 日

来皮膚構成細胞の出現を亢進させることを報告している．

以内に死亡し，未治療群との生存率に有意差を認めなかっ

そこでより直接的に，表皮水疱症マウスへの骨髄移植後にた（図 2）．

皮膚に出現するドナー由来およびレシピエント由来の表皮

先天性皮膚疾患においては，白血病など血液悪性疾患

細胞における遺伝子発現の差違を解析し，骨髄由来細胞のにおける造血幹細胞移植とは異なり，造血細胞を完全置

表皮角化細胞への分化関連因子の検索を試みた．Col17 欠換する必要性が高くない．その一方で，Col17 欠損表皮水損マウスに骨髄移植を行い，生着後皮膚から GFP+CD45

疱症マウスへの骨髄移植実験において，造血系細胞の置換−細胞（ドナー由来表皮角化細胞）および GFP−CD45−細率（キメラ率）とドナー由来皮膚構成細胞の出現率との間に胞（レシピエント由来）を各々ソーティングし，マイクロアは正の相関が観察される（data not shown）．そのため，皮レイ解析で mRNA 発現の差違を網羅的に検討した．合計

膚障害をきたさない前処置でかつ，より生着率の高い移

23446 プローブが解析可能であり，そのうち遺伝子発現に植手技が望ましい．また，MSC 移植系においては，尾静

2.0 倍差以上を認めたプローブが 57 同定された．既知の脈投与では投与細胞の 80% が肺にトラップされるとされ，遺伝子でドナー由来角化細胞で発現が亢進しているものとMSC から皮膚構成細胞へ分化させるにあたり効率が相当

して，Mmp13, Cxcl10, Cxcl9 などが検出された（図 3）．

低いことが推測される．これらの背景を勘案して，次に我々は，造血幹細胞・MSC を Col17 欠損表皮水疱症マウ

3. 3. ヒトMSCsの表皮水疱症治療への応用可能性の検討

スへ骨髄内投与する試みを行った．まず，成体 Col17 欠損

我々は過去にマウスにおいて，MSCs が皮膚構成細胞へ

表皮水疱症マウスへ６Gy の放射線前処置の後，GFP+ 骨

分化しうることを示し，MSCs の静脈投与によって表皮水髄細胞を骨髄内移植した．4 週間目における CD45+ 陽性

疱症マウスにおいて欠損蛋白が発現しうることを示した．

細胞の生着キメラ率は 87.9±3.9%（n=5）であり，尾静脈

ヒト MSCs においてはチリのグループで，健常人の兄弟骨投与群の 72.1±5.5%（n=12）と比較して生着率に有意差を髄から採取・培養した MSCs を栄養障害型表皮水疱症患者認めた（p<0.05）．しかし，免疫染色による基底膜部 Col17の病変皮膚に局所注射することで，治療効果を有したといの発現割合に明らかな差を認めなかった．また，GFP 陽

う報告があり，本邦でも MSC 局所投与の臨床試験が開始

性 MSC を成体 Col17 欠損表皮水疱症マウスおよび野生型

されている．そこで，全身的作用に期待するという観点か

C57BL/6 へ骨髄内移植した群においては，移植 4 週間後

ら我々は，ヒト細胞が生着しうる免疫不全 NOG マウスにの時点でドナー GFP 由来の MSC は骨髄内に観察されず，

おいて，ヒト MSC の静脈投与がヒト基底膜蛋白の産生を図 2 Col17 欠損新生仔マウスに対する間葉系間質細胞（MSC）
腹腔投与療法の治
療成績− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

もたらすかを検討した．NOG マウス（n=4）に全層皮膚欠6ではこれらの蛋白発現は確認されなかった．COL7 をはじ損を作製し，直後に尾静脈よりヒト MSC 1×10 cells を投めとした他の皮膚基底膜蛋白の発現は，免疫染色・RT−

与し，上皮化した皮膚を採取して検討したところ，免疫染PCR ともに確認できなかった．

色で MHC classⅠ 陽性細胞が真皮に散見され（図 4A），RT−PCR にても human GAPDH mRNA が検出された．4 匹

3. 4. ES/iPS 細胞による治療の検討

中 2 匹において human COL17，1 匹で human BPAG1 の次に我々は，ES および iPS 細胞の造血系細胞への分mRNA の発現がわずかに確認された（図 4B）が，免疫染色化誘導による造血幹細胞移植の治療可能性を検討した．

図 3 移植後角化細胞のマイクロアレイ解析
移植療法後の表皮水疱症マウス皮膚よりドナー由来（GFP+）/ レシピエント由来（GFP-）の角化細胞を抽出し，遺伝子発現解析を行った．合計 23446 プローブが解析可能であり，そのうち遺伝子発現に 2.0 倍差以上を認めたプローブが 57 同定された．

図 4 NOG マウスに対する MSC 療法の検討（A）ヒト MSC 投与後の NOG マウス皮膚の免疫組織学的検討．正常皮膚（右）では
COL17 が基底膜部に線状に観察され，表皮角化細胞および線維芽細胞等の細胞膜にHLA classI が発現している．ヒト MSC 静脈投与後の NOG マウス皮膚では，真皮に散在性に HLA classI 陽性細胞が観察された．
（B） ヒ ト MSC 投 与 後 の NOG マ ウ ス 皮 膚 の RT-PCR 解 析．4 匹 中 2 匹 に human
COL17, 1 匹で human BPAG1 mRNA の発現が確認された．

− 108 −iPS 細胞の造血幹細胞への分化能を応用した先天性皮膚疾患の治療

Ly5.1 由来の ES 細胞ないし iPS 細胞に Lhx2 遺伝子を導入

我々は，骨髄移植をはじめとした造血幹細胞移植療法が疾し，OP9 細胞と共培養することで血球系前駆細胞（KSL 細患モデルマウスにおいて治療法になり得るという知見を背胞）への分化を確認，さらに血球系細胞への分化を in vitro

景として，より有用な細胞療法の可能性を検討した．

で確認した（図 5A, B）．このようにして得られた細胞を成表皮水疱症に対する骨髄移植療法（造血幹細胞移植療

体 COL17 レスキューマウスに移植したところ，移植後 4法）は，移植された造血幹細胞，あるいは間葉系間質細週間後の時点での末梢血キメラ形成率は ES 細胞移植群で胞やそれらの細胞から分化した前駆細胞等が，何らかの6.32±2.53 %（n=5），
iPS 細胞移植群で 12.2±5.26 %（n=10）

機序により皮膚構成細胞へと変化し，機能性を有する角であった．定性 RT-PCR において計 15 匹中，iPS 細胞由来化細胞として欠損蛋白を補充するという発想を基礎に置

造血幹細胞移植を行った 2 匹，ES 細胞由来造血幹細胞移

く．この角化細胞への変化においては，幹細胞ないし前植を行った 1 匹において mCol17 の発現が確認された（図駆細胞が自身の持つ可塑性を介して角化細胞へ分化する

5C）．しかしながらこれらのマウス皮膚において，免疫染transdifferentiation という考え方と，幹細胞ないし前駆細色でmCol17 の基底膜への線状沈着は確認できなかった（図胞，あるいはマクロファージなどの成熟細胞が角化細胞と5D）．また，電子顕微鏡においてヘミデスモソームの成熟

融合（fusion）することで，既存の角化細胞が欠損蛋白の産化も確認できなかった．

生能を獲得するという二つの機序が考えられる．我々が検４．考討した範囲では，疾患モデルマウスに性別の異なるドナー

察

骨髄細胞を移植した実験系において FISH で角化細胞の X/

表皮水疱症は生下時より全身皮膚に異常をきたし，感染Y 染色体を検討したところ，fusion した細胞は観察されな症や慢性貧血，悪性腫瘍など種々の合併症を併発して予後かった 2）．また，マウス PAM212 細胞をフィーダーとし不良となることも多い重症先天性皮膚疾患である．今回てヒト造血幹細胞を共培養したところ，皮膚基底細胞に特図 5 iPS/ES 細胞の血球系誘導（A）血球分化誘導後の FACS 解析．ES 細胞（左），iPS 細胞（右）ともに造血系前駆細胞（KSL）が同定された．
（B）
さらに OP9 細胞と共培養することで，Giemsa 染色で分葉核を有する好中球を含む成熟血球細胞が多数出現した．
（C）ES および iPS 細胞由来 KSL 細胞を COL17 レスキューマウスに移植したところ，一部のマウスにおいて
mCol17 mRNA の発現が定性 RT-PCR にて確認された．
（D）同移植マウス皮膚を免疫染色したが，mCol17 の基底膜への沈着は確認されなかった．

− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

異的に発現する K14 陽性細胞，すなわちヒト角化細胞へ，と比較して，移植において十分な末梢血キメラ形成を得ら

4）fusion を介さずに分化した ．同様の検討は，ヒト表皮水れていないことが挙げられる．血球誘導の効率的な方法の疱症患者へ造血幹細胞移植を行った例においても示されて検討や，移植細胞数の検討などをさらに重ねていく予定でいる．これらの知見からは少なくとも，造血幹細胞から角ある．

化細胞へ直接分化した経路が存在すると考えられるが，現iPS 細胞の重症先天性皮膚疾患への応用は，正常遺伝子

実的には fusion の経路を介して機能性角化細胞へ変化したを有する iPS 細胞を角化細胞へ分化，表皮シートを作製し細胞も少なからず含まれると考えられる．

それを植皮と同様に貼布する方法や，毛組織およびそれに今回我々は，より効率的な移植時期・方法を目指して新含まれる毛幹細胞・表皮幹細胞へ誘導して病変部皮膚へ移生仔疾患マウスへの骨髄移植・MSC 移植および骨髄内投入する方法などが考慮されるが，我々は重症先天性皮膚疾

与による造血幹細胞移植を検討したが，いずれも通常の成患が全身皮膚を侵すという観点から，全身性の効果が少な体マウスへの conventional な骨髄移植療法と比較して優位

い治療回数で期待できる造血幹細胞移植の可能性を検討し性を見いださなかった．しかしながら，骨髄内投与においている．これら再生医療の分野においては，臨床応用に繋ては移植後 4 週の早期の時点で生着キメラ率が高く，臨床がる安全性・効率を備えた新規治療戦略を考慮し検討を継効果に有意差は無かったものの注目すべき知見であると考続する必要がある．

える．キメラ率の高い個体ほど骨髄細胞由来の皮膚構成細胞の出現割合は高くなる傾向が示唆されており，患者への（参考文献）

臨床応用という観点からは，小児例で施行されている骨髄

１） Nishie W, Sawamura D, Goto M, Ito K, Shibaki

内移植は通常の静脈投与による造血幹細胞移植と比較してA, McMillan JR, Sakai K, Nakamura H, Olasz E,

表皮水疱症の治療においても成績が向上する可能性が示唆

Yancey KB, Akiyama M, Shimizu H. Humanization ofされる．

autoantigen. Nat Med 13:378-383, 2007.

MSC を含む骨髄由来細胞の皮膚への遊走を促進し，皮２）Fujita Y, Abe R, Inokuma D, Sasaki M, Hoshina

膚構成細胞への分化を促進させる因子として，我々はケD, Natsuga K, Nishie W, McMillan JR, Nakamura

モカインの一種である CTACK/CCL27 や SLC/CCL21 のH, Shimizu T, Akiyama M, Sawamura D, Shimizu

可能性を示している 5, 6）．また，Tamai らは MSC の皮膚

H. Bone marrow transplantation restores epidermal

構成細胞への促進因子として HMGB-1 が重要な役割を果

basement membrane protein expression and rescues

たしていると報告している．我々はさらに critical な因子

epidermolysis bullosa model mice. Proc Natl Acad Sciの存在を検討するべく，in vivo において，マイクロアレ

U S A 107: 14345-14350, 2010.

イ法を用いて骨髄由来とドナー由来の角化細胞における３）Kitajima K, Minehata K, Sakimura K, Nakano T,

遺伝子発現パターンを比較したところ，Mmp13, Cxcl10,

Hara T. In vitro generation of HSC-like cells from

Cxcl9 などが検出された．MMP13 は創傷皮膚において血murine ESCs/iPSCs by enforced expression of LIM-

管新生や角化細胞増殖に関わることが知られており，また

homeobox transcription factor Lhx2. Blood 1 1 7:3 7 4 8-

CXCL9/10 は炎症性ケモカインとして生理的意義が検討さ

3758, 2011.

れつつある．表皮水疱症マウスや患者に置ける，これらの４）Fujita Y, Inokuma D, Abe R, Sasaki M, Nakamura因子の関与を今後検討することで，表皮水疱症に対する細H, Shimizu T, Shimizu H. Conversion from human

胞療法に新たな知見が加えられることが期待される．

haematopoietic stem cells to keratinocytes requires

また，造血幹細胞移植においては時に移植細胞数の低下

keratinocyte secretory factors. Clin Exp Dermatol
37:658-664, 2012.

による生着不全や，MHC mismatch による治療困難例が存在するが，iPS 細胞を応用した造血幹細胞移植はこれら

５）Inokuma D, Abe R, Fujita Y, Sasaki M, Shibaki A,の問題点を克服できる可能性がある．本研究ではその端緒

Nakamura H, McMillan JR, Shimizu T, Shimizu H.

として，Lhx2 遺伝子導入を併用した ES/iPS 細胞の血球系

CTACK/CCL2 7 accelerates skin regeneration via

分化誘導を行い，in vitro で造血系前駆細胞（KSL 細胞）おaccumulation of bone marrow derived-keratinocytes.

よび分化血球細胞を確認した．これらの細胞を COL17 レ

Stem Cells 24: 2810-2816, 2006.

スキューマウスに移植したところ，一部のマウスにおいて

６）Sasaki M, Abe R, Fujita Y, Ando S, Inokuma D,

mRNA レベルでの欠損皮膚基底膜蛋白の発現が確認されShimizu H. Mesenchymal stem cells are recruited

たものの，免疫染色や電子顕微鏡レベルでの回復は確認さ

into wounded skin and contribute to wound repair

れなかった．これはいくつかの理由が考えられるが，そのby transdifferentiation into multiple skin cell type. J

１つとして，conventional な骨髄 / 造血幹細胞移植モデル

Immunol. 180: 2581-2587, 2008.

− 110 −

新規な生体親和性化粧品素材ホスファチジル−パンテノールの抗炎症作用と分子機構の解明
北海道大学大学院水産科学研究院

細川雅史

Phosphatidyl-panthenol (P-panthenol) is a novel phospholipid prepared by phospholipase D-mediatedtransphosphatidylation. In this study, we found that P-panthenol suppressed mRNA expression of pro-inflammatory
factors such as IL-6, IL-1b, TNF-a, COX-2 and iNOS in LPS-stimulated macrophages like RAW264.7 cells. In addition,
P-panthenol also down-regulated mRNA expression of pro-inflammatory cytokines in TNF-a stimulated humankeratinocytes, HaCaT cells. The suppressive effects by P-panthenol were stronger than those of free panthenol andphosphatidylcholine used as substrate for P-panthenol synthesis. Inhibition of phosphorylation of p38, ERK and JNK in
MAPK cascade is suggested to be the mechanism of anti-inflammatory effects by P-panthenol.

１．緒したマクロファージによる炎症性因子の過剰産生に対する言抑制機能である。従来の遊離型 panthenol との効果の比較

近年、化粧品には美しく見せることを目的とした従来までの基礎化粧品機能に加え、美しい素肌を維持する美白効を行うとともに、分子機構の解明をはかり、新規化粧品素
材としての有効性を明らかにすることを目的とした。

1）果やアンチエイジング機能が期待されている 。それに伴２．実って、安全性の高い新たなスキンケア化粧品素材の探索や開発が進められている。本研究では、そのような機能性素験

2. 1．細胞培養材として panthenol（ビタミン B5 アルコール）の新規リンマウス由来マクロファージ様細胞 RAW264.7 は大日本

脂質誘導体に注目した。Panthenol は、皮膚組織に対する

住友製薬より購入し、10% FBS 含有 RPMI1640 培地を用

抗炎症作用など優れた機能性

2−4）が知られているが、水溶いて、37 ℃、5% CO2 存在下で培養を行った。ヒト角化細性であることから化粧品素材として利用するには、界面活胞 HaCaT は CLS（Cell Lines Service, ドイツ）から購入し、性剤を用いて脂質中に乳化させ生体親和性を高める必要が10% FBS 含有 DMEM 培地を用いて、37 ℃、5% CO2 存ある。そのような問題を解決し、スキンケアやヘアケアへ

在下で培養を行った。

の 幅 広 い 利 用 が 期 待 で き る 新 素 材 と し て phosphatidylpanthenol（P-panthenol 図 1）の合成を検討してきた。

2. 2．炎症因子の mRNA 発現量の測定

P-panthenol は、生体膜の主要な構成脂質であるリン脂質

RAW264.7 細胞 5×104 cells を RPMI1640 培地 1 ml を用を基本骨格とすることから、生体適合性に優れているばか

いて 24-wellプレートに播種し、24 h前培養した。その後、りでなく両親媒性が付与されるため、水中においてリポソ

P-panthenolまたは遊離型panthenol、大豆phosphatidylcholineーム形成能をもつ。筆者らは、これまでにホスホリパーゼ（SoyPC）をそれぞれ所定の濃度となるように添加し、24h

D を用いたホスファチジル基転移反応により、テルペンア

培養した。なお、試料はエタノール溶液として培地に添加

ルコールやフェノール化合物のリン脂質誘導化法

5, 6）

を開

した。エタノールの終濃度は、培地に対して 0.1 % とし、発しており、その反応系を応用し、反応条件を検討するこ

細胞毒性が見られないことを確認した。次いで、0.1 mg/mlとで高収率での P-panthenol の合成が可能となった。

となるようにリポポリサッカライド（LPS）を添加して炎症

そこで本研究では、P-panthenol の新規化粧品素材としての優れたスキンケア機能を明らかにするため、美白効果

刺激し、6 h の培養後に RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用
いて total RNA を抽出した。

やアンチエイジング効果と密接に関わる抗炎症作用 に着HaCaT 細胞 5×104 cells を DMEM 培地 1 ml を用いて 24-目した。具体的には、皮膚組織を構成する角化細胞や浸潤

well プレートに播種し、24 h 前培養した。その後、上記と7）同様に試料添加し 48 h 培養した。更に 0.1mg/ml の TNF-aを添加して 24 h の培養後に total RNA を抽出した。
抽出した total RNA からcDNA を合成した。炎症因子のAnti-inf lammatory effect of a novel
phospholipid, phosphatidyl-panthenol
Masashi Hosokawa
Faculty of Fisheries Sciences, Hokkaido
University

mRNA 発現量の測定は、定量 PCR 法により行った。なお、
反 応 試 薬 は FastStart Universal Probe Mster（ROX）（Roche） を 使 用 し、TaqMan®Gene Expression Assay（Applied Biosystems Japan Ltd.）を用いて、所望の遺伝子− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図1

ホスファチジル - パンテノール（P-panthenol）
の合成反応

３．結

発現を測定した。

果

3. 1．P-panthenol の活性化マクロファージに対する炎症
因子産生抑制効果

2. 3．炎症性サイトカイン分泌量の測定
RAW264.7 細胞を 2. 2. と同様に培養した後、0.1 mg/ml

新規リン脂質として合成した P-panthenol の抗炎症作用をの LPS を添加して炎症刺激し、更に 24 h の培養後に培地評価するため、マクロファージ様 RAW264.7 細胞に対するを回収した。IL-6 および IL-1b の分泌量の測定は、mouse

炎症因子の産生抑制能を調べた。最初に、P-panthenol の細IL-6 ELISA Kit お よ び IL-1b ELISA Kit（ い ず れ も胞毒性を WST-1 法で調べた結果、終濃度 100 mM においてThermo Scientific）を使用し、添付されたプロトコールに細胞生残率への影響は見られず、毒性の低い脂質であるこ

従って行った。HaCaT 細胞も 2. 2. と同様に培養した後、とを確認した。

0.1 mg/ml の TNF- a を添加して 24 h の培養後に培地を回RAW264.7 細胞培養液に P-panthenol を添加して 24h 培

収 し た。IL- 6 分 泌 量 の 測 定 は、human IL-6 ELISA Kit

養後、LPS を用いて炎症を誘発した結果、炎症性サイトカ（Thermo Scientific）
を使用して行った。

イ ン で あ る IL-1b、TNF-a お よ び 炎 症 関 連 酵 素 で あ る
iNOSおよびCOX-2のmRNA発現量がコントロール群（LPS

2. 4．Western Blotting 法（+））と比較して有意に低下した（図 2）。P-panthenol は、
5

RAW264.7 細胞および HaCaT 細胞 5×10 cells を培地 5

IL-6 の mRNA 発現も抑制したが、同濃度では panthenol に

ml を用いて 6-well プレートに播種し、24h 前培養した。

よる抑制効果は認められず、また SoyPC による抑制効果

次いで、2. 2. と同様に P-panthenol を添加して RAW264.7と 比 較 し て も 強 い 抑 制 傾 向 で あ っ た（ 図 3）
。 更 に、細胞は 24 h 培養した後、0.1mg/ml の LPS を添加して炎症

P-panthenol は、 終 濃 度 25 － 50 mM 以 上 で IL-6 お よ び

刺激を行い、45 min の培養後に細胞を回収した。HaCaT

IL-1bのタンパク質産生量を抑制することが示された（図 4）。

は 48h 培養した後、0.1 mg/ml の TNF-a を添加して 15 min

P-panthenol はビタミン B5 のリン脂質誘導体であるが、培養後に細胞を回収した。その後、細胞タンパク質溶液を

ビタミン B1 のチアミンやビタミン B6 のピリドキシンにつ調製し、SDS-PAGE によるタンパク質分離を行った。電いても PLD を用いてリン脂質誘導体を調製し、活性化マ気泳動したポリアクリルアミドゲルから PVDF メンブラ

クロファージにおける炎症因子の産生抑制能を比較した。

ンにトランスファーした後、一次抗体および二次抗体を用

その結果、終濃度 50mM 処理においてホスファチジル - チ

いて抗原抗体反応を行い、各タンパク質の発現量は、発光

アミンには、弱いながらも IL-6 のｍ RNA 発現を抑制した

検 出 試 薬 は ECL（GE Healthcare） ま た は ImmunoStar

が、 ホ ス フ ァ チ ジ ル - ピ リ ド キ シ ン に は 認 め ら れ ず、（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）を用いて検出を行

P-panthenol の高い抗炎症効果が確認された。

った。タンパク質の発光シグナルの検出は ATTO Cold
CCD Camera System（アトー株式会社）
を用いて行った。

2. 5．統計学的処理

3. 2．P-panthenol の皮膚細胞における炎症因子の産生抑制効果
皮膚組織では、刺激や損傷等によりマクロファージが浸得られた数値は各群で平均値及び標準偏差として示した。

潤し、皮膚表皮細胞と相互作用することによって炎症が進

統計処理は、Dunnett または Tukey の検定を用いて行い、行する。その際、マクロファージから放出される TNF-a

有意水準は P < 0.05、および P<0.01 とした。

などの炎症性サイトカインがメディエーターとして重要な− 112 −

新規な生体親和性化粧品素材ホスファチジル - パンテノールの抗炎症作用と分子機構の解明

（μM）

（μM）
図 2 P-panthenol の活性化マクロファージに対する炎症因子遺伝子の発現抑制** P < 0.01 vs. LPS（+）

図 3 P-panthenol の活性化マクロファージに対する IL-6 mRNA 発現抑制** P < 0.01, * P < 0.01 vs TNF-α（+）††
P < 0.01, † P < 0.05 vs Panthenol

図 4 P-panthenol の活性化マクロファージにおける IL-6 および IL-1β の産生抑制** P < 0.01 vs.LPS（+）− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

役割を担っている。そこで、炎症性サイトカインによる皮め前処理することによって、それら炎症性サイトカインの膚表皮細胞の活性化に対する P-panthenol の抑制効果を明mRNA 発現量の有意な低下が認められた（図 6）。以上の結らかにするため、ヒト角化細胞 HaCaT を TNF-a で刺激し、果は、P-panthenol が皮膚表皮細胞とマクロファージ間のその炎症因子産生に及ぼす影響を評価した。

相互作用を効果的に制御して、炎症の誘導や進展を抑制す

TNF-a 処理により HaCaT では IL-6 の産生が上昇したが、ることを示唆している。

P-panthenol はそのｍ RNA 発現誘導（図 5）およびタンパク
質産生を有意に抑制した。一方、合成反応の基質として用3. 3．P-panthenolによる炎症因子遺伝子の発現抑制機構

いた遊離型の panthenol や SoyPC には終濃度 50 mM 処理に

P-panthenol がマクロファージ様 RAW264.7 細胞およびおいては抑制効果が全く認められなかった。よって、

HaCaT 角化細胞のいずれに対しても炎症因子の産生抑制

TNF-a に よ る HaCaT の 炎 症 誘 導 に 対 す る 抑 制 に は、効果を示したことから、それらの制御機構に関わる情報伝

P-panthenol の構造が重要であることが推察される。

達経路として MAPK 経路への影響を調べた。図 7 に示す

このような角化細胞に対する P-panthenol の炎症因子産

ように、P-panthenol は LPS で刺激した RAW264.7 細胞で生抑制効果は、TNF-a による刺激のみならず認められた。

見られる p38 および ERK のリン酸化を抑制していること

すなわち、RAW264.7 細胞を LPS 処理によって炎症刺激が示された。また、HaCaT 細胞に対しては、p38 に加えすることにより得られた培地を用いて HaCaT 細胞を培養

JNK のリン酸化を抑制し、それらの因子の活性化を制御したところ、IL-6 や TNF-a の mRNA 発現量が増加した。

していることがわかった（図 8）。

これに対し、HaCaT 細胞を P-panthenol を用いてあらかじ

図 5 P-panthenol のヒト皮膚細胞に対する IL-6 mRNA 発現抑制** P < 0.01 vs TNF-a (+)††
P < 0.01, † P < 0.05 vs Panthenol##
P < 0.01, # P < 0.05 vs PC（同濃度間の比較）（μM）
図６ ヒト皮膚細胞のマクロファージ培養液による活性化と P-panthenol による抑制効果** P < 0.01 vs MΦ medium− 114 −

新規な生体親和性化粧品素材ホスファチジル - パンテノールの抗炎症作用と分子機構の解明

図 7 P-panthenol のマクロファージ様 RAW264.7 細胞における MAPK 制御**P < 0.01, *P < 0.05 vs LPS（+）

図 8 P-panthenol のヒト皮膚細胞 HaCat における MAPK 制御**P < 0.01, *P < 0.05 vs LPS（+）− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

４．考

（引用文献）察１）正木

近年、男女を問わず化粧品素材の機能性として「スキン仁編 ,: 機能性化粧品素材の開発 IV, シーエムシ

ー出版 , 2006.

ケア」が注目されている。スキンケア機能の一つとして皮

２）Ebner F, Heller A, Rippke F, Tausch I, : Topical膚老化や皮膚炎に対する抗炎症効果があり、炎症を予防し

use of dexpanthenol in skin disorders, Am. J. Clin.

たり、鎮静化することで健康で美しい肌の維持が期待され

Dermatol. 3, 427-433, 2002.

る。本研究では、新規化粧品素材を開発する目的で、これ３）Wiederholt T, Heise R, Skazik C, Marquardt Y,

ま で に 利 用 が な さ れ て い る panthenol に 着 目 し た。

Joussen S, Erdmann K, Schröder H, Merk HF, Baron

Panthenol は生体内においてビタミン B5 である panthenic

JM,: Calcium pantothenate modulates gene expression

acid に変換されるプロビタミンである。クリームやシャン

in proliferating human dermal fibroblasts, Exp.

プー、育毛剤等に広く利用されており、安全性も高い物質

Dermatol., 18, 969-978, 2009.

といえる。しかし、panthenol は水溶性であるため、組織

４）Bissett DL,: Common cosmeceuticals, Clin Dermatol.,
27, 435-445, 2009.

での滞留性が乏しいことや皮脂バリアを透過しにくいことがあり、応用面での制限が課題である。本研究では、その

５）Yamamoto Y, Hosokawa M, Kurihara H, , Miyashita

ような panthenol をリン脂質誘導化することで生体適合性

K,: Preparation of phosphatidylated terpenes via

や両親媒性を付与し、利用用途を広げるばかりでなく、そphospholipase D-mediated transphosphatidylation, J.

の抗炎症作用が増強することを期待した。

Am. Oil Chem. Soc., 85, 313-320, 2008.

生体内の炎症反応では、組織構成細胞に加え、マクロフ

６）Yamamoto Y, Kurihara H, Miyashita K, Hosokawa

ァージが重要な役割をになう。合成した P-panthenol は、

M,: Synthesis of novel phospholipids that bind

マクロファージ様 RAW264.7 細胞に対し、LPS によってphenylalkanols and hydroquinone via phospholipase

誘導される炎症因子の mRNA 過剰発現を効果的に抑制しD-catalyzed transphosphatidylation, New Biotechnol.,た。その効果は、従来の遊離型 panthenol よりも強く、リ

28, 1-6, 2011.

ン脂質誘導体の優れた機能性を確認した。これらの発現制

７）平尾哲二 ,: 角層サイトカインに着目した皮膚刺激緩和

御機能は、炎症因子の産生に関わる p38 や ERK のリン酸アプローチ , 正木

化抑制を機序として、複数の経路を制御することによる効

シーエムシー出版 , 2006, 72-79 頁 .

果的な作用であることが示唆された。P38 や ERK などの
8, 9）

MAPK カスケードの下流には、NF- k B

10）や AP-1 といっ

仁編 ,: 機能性化粧品素材の開発 IV,８）Pasparakis M, : Role of NF-κB in epithelial biology,
Immunol. Rev., 246, 346-358, 2012.

た転写因子が存在し、炎症因子の mRNA 発現を制御する

９）Tsuruta D,: NF-kappaB links keratinocytes andことから、それらへの影響についても検討することが期待

lymphocytes in the pathogenesis of psoriasis, Recent

される。また、P-panthenol はマクロファージが産生する

Pat. Inflamm. Allergy Drug Discov., 3, 40-48, 2009.

TNF-a によって刺激した角化細胞 HaCaT に対しても、p3810）Zenz R, Eferl R, Scheinecker C, Redlich K, Smolen

や JNK のリン酸化抑制を介して炎症性サイトカインの産

J, Schonthaler HB, Kenner L, Tschachler E, Wagner

生を抑制したことから、皮膚の炎症時にみられる細胞間相EF, : Activator protein 1 (Fos/Jun) functions in

互作用に対しても制御効果を示すものと推察する。

inflammatory bone and skin disease, Arthritis Res.

今後、より詳細な作用機構の解明や効果的な利用形態に

Ther., 10, 201, 2008.

関して更なる研究を重ねたいと考える。

謝

辞本研究にご助成いただきました公益財団法人コスメトロ
ジー研究振興財団に深謝いたします。

− 116 −

新規経皮導入法による美白ペプチドを用いた高浸透化粧品の開発

岡山大学大学院医歯薬学総合研究科細胞生理学

道上宏之

Topical therapy is the most favored form of treatment for whitening against hyper-pigmentation and sunburn.
However, high-molecular-weight, hydrophilic chemicals are difficult to use as transdermal delivery drugs and the use of
topical drugs has been highly limited. We applied 11-arginine peptide (11R), a cell-membrane-permeable peptide, as atransdermal delivery system with a skin delivery enhanser, pyrenbutyrate. We performed intracellular peptide screening formelanogenesis inhibitors with several kinds of tyrosinase inhibitory peptides from natural sources. Next, we performed daily
repetitive topical application of this LILVLLAI peptide found in gliadin protein, a wheat component, for two weeks against
a UV-induced sun-tanning guinea pig model and confirmed significant melanogenesis inhibition in model skin. We showedthat 11R using a transdermal drug delivery system with melanogenesis inhibitory peptide is a very safe and promising
method for applications from cosmetics to the pharmaceutical industry.

１．緒

ン環を有する脂溶性の部分とカルボニル基を有する水溶性

言の部分を合わせ持つ両親媒性の物質である。これを前処置

タンパク質導入法とは、Protein transduction domain

で使用すると、エンドソーム内のタンパク質が効率良く細（PTD）と呼ばれる 10−20 個のアミノ酸からなるペプチド

胞内で拡散することが報告されている 5）。Pyrenebutyrateを融合することによりタンパク質、ペプチド、低分子化合存在下ではエンドソーム内に蓄積することなく、膜透過後、物などの様々な生理活性物質を細胞内に導入し機能させる

速やかに細胞内全体へ導入できる。そのため、エンドソー技術である。タンパク質が直接細胞内に導入されることは、

ム内で機能することなく蓄積していたタンパク質や薬物が、

ヒ ト 免 疫 不 全 ウ ィ ル ス Ⅰ 型（HIV-1） が 発 現 す る Trans-

早期に細胞質に拡散し、より迅速で大きな効果が期待出来

activator of transcription protein（TAT タンパク質）の研究

る 6）。

1）

により明らかになった 。TAT タンパク質の 11 個のアミ

今回、我々の研究では、このタンパク質導入法およびノ酸からなる PTD は細胞膜透過性の性質を有していること

Pyrenebutyrate を、経皮的導入法に応用することとした。

が報告されている。TAT domain（MYGRKKRRERRR）の

まず、皮膚は表皮、真皮及び皮下組織の 3 層構造をとって特徴は、11 個のアミノ酸の内、8 個のアミノ酸がアルギニいる。表皮は表層より角質層、顆粒層、有棘層、基底層かンやリジンなどの塩基性アミノ酸で構成されていることでらなる。メラニンを産生するメラノサイトは、表皮の最下ある。このことから、正電荷を帯びていることが膜透過性層である基底層に存在する。角質層は疎水性であり、外因に重要であることが示唆され、7−11 個の塩基性アミノ酸

性物質に対するバリアの役割を果たしており、経皮的導入からなる数種類の PTD が発見された。そのうち、11 個のにおいても大きな障害となる 7）。

アルギニン（11R）による PTD が導入効率の面から優れてい2）

外用剤を皮膚に適用した時、含有される薬物の主な皮膚ることを我々の研究室の松下らが報告している （Fig. 1）。

透過・吸収の経路は、毛包や汗腺等の付属器官を介する経PTD による細胞内導入では、エンドサイトーシスの一

付属器官ルートと角質層実質を透過する経角質層ルートの種であるマクロピノサイトーシスにより、エンドソームと2 通りが考えられている。付属器官を介した皮膚透過は皮3）いう小胞に包まれた形で細胞内に導入される 。よって、

膚実質を通るより速やかであるが、皮膚表面積に対する付PTD を付加したタンパク質や薬物が細胞内で活性を発揮

属器官の割合は 0.1% 以下である 8）。しかしながら、分子量するには、エンドソームから脱出して細胞膜に移行する、

500Da 以上の物質や極性物質等では、皮膚実質をほとんど

4）

さらなるステップが必要となる 。また、前処置として通過出来ないために毛包等の付属器官に集まると言われてPyrenebutyrate という物質を使用した。これは、ベンゼ

いる 9）。物質が皮膚実質を通る場合は、皮膚透過の最大のバリアである角質層中を拡散する必要がある。角質層を通The development of whitening peptide
with peptide percutaneous drug delivery
systemHiroyuki Michiue
Department of Physiology, Okayama
University Graduate School of Medicine,
Dentistry and Pharmaceutical Sciences

る経路には角質細胞内を通る経細胞ルート（transcellularroute）と細胞間隙を通る細胞間ルート（intracellular route）がある。角質層バリアの克服こそが経皮導入の最大の課題となっている。
現在、薬物の経皮的導入法は物理的促進法と化学的促進法に大別される。物理的促進法としては、例えばイオント− 117 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Fig. 1

Fig. 2
Table 118）

フォレシス 10）やマイクロニードル 11）が挙げられる。イオントフォレシスは、皮膚の離れた 2 点に陽極、陰極をセットし、酸性薬物（負に帯電）では陰極側に、塩基性薬物（正に帯電）では陽極側の基剤に封入する。その後低電圧を負荷させることで、比較的電気抵抗の低い部分である毛嚢や汗腺等の付属器官を介し、角質下の水分に富み電気電導率の高い（電気を通し易い）
表皮・真皮部に電流が流れ、同時に荷電した薬物が電気泳動の要領で表層から皮膚深部へと移動し、経皮吸収される。マイクロニードル法は、角質層（10 ～ 20 mm）のみを通過する針を有する剣山のようなものを皮膚に適用することで、神経に到達させずに角質層に穴を開け、バリア機能を低下させる方法である。
化学的促進法としては、例えば、リポソーム 12）や界面活性剤 13）が挙げられる。リポソームは、リン脂質からなる数十から数百 nm の粒径をもつ微小なカプセルであり、その内部に様々な分子を封入することができると共に、生体適合性や生分解性にも優れていることから、その発見以来、薬物や生理活性物質の理想的な運搬体と考えられている。しかし、薬物の極性、分子量に依存しない経皮的導入
法は確立されていない。
次に、日焼け後の色素沈着やシミ、ソバカスについて説
明 す る。 こ れ ら の 原 因 と な る 紫 外 線 は、UVA（320−れるものとされている 14）。Whitening 効果を得るためのタ

400 nm）、UVB（290−320 nm）、UVC（200− 290 nm）にーゲットとしては、主に三つの機序（Fig. 2）があり、一つ大別される。これらは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺目は、メラニン合成抑制 15）、二つ目は、メラニン排出促

激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚基底層

進 16）、三つ目は、メラノサイト刺激物質抑制である 17）。

に存在するメラノサイトが活性化されメラニン産生が亢進

今回、一つ目のメラニン合成を抑制する機序に焦点を当て、した結果、生じるものと考えられている。また、このメラメラニン合成の律速酵素であるチロシナーゼに着目した。

ニンはメラノサイトの中で生合成される銅含有酵素チロシ

チロシナーゼ活性を抑制するペプチドに関しては、単体アナーゼの働きによって、チロシンから DOPA、DOPA か

ミノ酸及び 8 つ連結したアミノ酸（Table 1）によるチロシ

ら DOPA quinone に変化し、さらに中間体を経て形成さナーゼの活性阻害と結合能が論文において報告されている。

− 118 −

新規経皮導入法による美白ペプチドを用いた高浸透化粧品の開発

さらにその論文において、単体アミノ酸では、バリン、ロ50uL）に塗布し、経時的に観察した。青色は、ヘキストに

イシン、イソロイシンといった疎水性アミノ酸がチロシナー

よる核染色、赤色は、テトラメチルローダミンで蛍光標識

ゼの活性を阻害すると報告している。しかし、これは試験した 11R ペプチドである。観察は、共焦点レーザー顕微管レベルでの報告しかされていない

18）。そこで、我が研鏡（FV300、OLYMPUS）で行った。

究室の手法である、11R を連結させて細胞内へ導入することで検討を行い、細胞レベルでのスクリーニングを行った。

２．実

2. 6. 日焼けモデル動物の作成
日 焼 け モ デ ル と し て 褐 色 モ ル モ ッ ト（Guinea pig,験Weiser-Maples, female, 8w）を採用した。これは、動物の2. 1. ペプチドの作製

中でも体表面積が大きいこと、またヒトと同様のメラニン

今回使用したペプチド18）は、ペプチド合成機を用いてペ形成を行うといった点から褐色モルモットに決定した。脱プチド固相法により作製したもので、近畿大学の研究室に毛したモルモットの背部に、紫外線 UVB 強度測定装置に依頼して合成したものである。本実験には、11R を連結して UV 強度を測定しつつ、UV 照射機により、1 日 1 回紫た候補ペプチドと候補ペプチドのみの両方を使用している。

外線量 0.25J/cm2 を 10 日間照射した。照射面積は一区間2cm×2cm を 4 区間とした。

2. 2. 細胞内スクリーニング
まず、チロシナーゼ抑制効果を有する候補ペプチドに

2. 7. 日焼けモデル動物の治療

11R を連結させて、B16 メラノーマ細胞へ導入し、スクリ

モルモット日焼けモデルに、Propylene glycol にて調整ーニングを行った。実験に用いた B16 メラノーマ細胞は、した 500uM Pyrenebutyrate を前処置で 50uL 塗布した。

マウス悪性黒色腫瘍細胞で、特異的なメラニン産生能を有5 分後、Propylene glycol にて調整した候補ペプチドを各している。1well あたり 1×105 cell を撒き 37 ℃、5% CO2

50 uL、1 日 1 回、14 日間塗布した。その後、デルマパン

下で培養した。一日培養したメラノーマ細胞に希釈した候チ（5 mm、マルホ）を用いて皮膚サンプルを採取した。

補ペプチドを添加した。72 時間後にトリプシンで剥がし、5000 rpm にて 10 分間遠心して細胞を回収した。その後、

2. 8. ヘマトキシリン・エオシン（H.E.）染色

1N 水酸化ナトリウム水溶液、80 ℃、2 時間で細胞を溶解

モルモット皮膚サンプルのパラフィン切片を作製し、カさせ、マルチプレート対応スペクトロフォトメーター（DSラッチヘマトキシリン液を滴下し、5 分間静置した。洗浄し、ファーマバイオメディカル㈱）で吸光度（405nm）を測定し、エ オ シ ン 液 を 滴 下 し、30 秒 間 静 置 し た。 洗 浄 し、

メラニン定量を行った。

DIGITAL SIGHT DS-U1（Nicon）で観察した。

2. 3. WST-1 assay による細胞毒性の有無の検討

2. 9. フォンタナ・マッソン染色

決定したペプチドを用いて、WST-1 試薬を用いて、細モルモット皮膚サンプルのパラフィン切片を作製し、キ胞毒性の有無を検討した。1well あたり、2000cell になる

シレンに 15 分間（58 ℃）、10 分間（RT）浸漬し、100% エタ

ようにメラノーマ細胞をまき、一日培養した。実験には、

ノール、95% エタノール、90% エタノールおよび 70% エ

96 穴プレートを使用した。翌日、希釈した候補ペプチド

タノールを順に各 5 分間滴下した。蒸留水で洗浄し、2.5%を添加し、72 時間培養した。その後、WST-1 試薬を添加し、フォンタナアンモニア銀染色液を滴下し、遮光して 16 時

30 min、60 min 後に、マルチプレート対応スペクトロフォ

間静置した。蒸留水で洗浄し、0.25 % チオ硫酸ナトリウム

トメーター（DS ファーマバイオメディカル㈱）で吸光度水溶液を 1 分間滴下した。蒸留水で洗浄し、ケルンエヒト（450 nm, 690 nm）を測定した。コントロールは DMSO を使

ロート液を 5 分間滴下した。蒸留水で洗浄し、70% エタノ

用した。

ール 90% エタノール 95% エタノール 100% エタノールを
順 に 各 1 分 間 滴 下 し た。 キ シ レ ン を 5 分 間 滴 下 し、

2. 4. 196 ペプチドのAlanine walk の検討

VECTA MOUNTTM に て 封 入 し、DIGITAL SIGHT

決定した 196 ペプチドを用いて、ペプチドの各アミノ酸

DS-U1（Nicon）観察した。

を順番にアラニンに置換する Alanine walk を行った。実３．結験操作は 2. 2. 細胞内スクリーニングと同じである。

果

3. 1. 細胞内スクリーニング
2. 5. モルモットの背部にて 11R の導入の確認

黒いメラノーマ細胞が白くなっている候補ペプチドも数

11R に蛍光標識のテトラメチルローダミンを連結した
2ペプチド（TMR-11R）をモルモットの背部（4 cm 区画、各種類確認することが出来た。さらにメラノーマ細胞を水酸化ナトリウムにて溶解させた後、吸光度測定（405nm）を− 119 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

行ったところ、コントロールより低い値を示したペプチド（Fig. 4）。

は、以下の 8 種類であった。また、50% 以上のメラニン合成阻害を示したのは、196 というスポット番号のペプチド3. 3. モルモットの背部にて 11R の導入の確認であった。この配列は、小麦に存在する Gliadin というタ

6 時間から 48 時間まで経時的に観察したところ、塗布

ンパク質由来のペプチドである（Fig. 3）。

12 時間頃から、表皮基底層にて 11R ペプチドの導入が確認出来た。また、24、48 時間と時間が経過するごとに、

3. 2. WST-1 assay による細胞毒性の有無の検討

真皮にまでペプチドが導入出来ていることが確認出来た

WST-1 assay の結果より、決定したペプチドは、コント（Fig. 5）。

ロールと比較して細胞への毒性はないことを確認した

Fig. 3Fig. 4

Fig. 5− 120 −

新規経皮導入法による美白ペプチドを用いた高浸透化粧品の開発

3. 4. 動物モデルの検討結果

これらに共通する結論が、“チロシナーゼの活性部位に

また、PB および各薬剤によるモルモット日焼けモデル

存在する銅イオンをキレートすることで、チロシナーゼの皮膚サンプルについて、フォンタナ・マッソン染色を行っ活性を阻害している”であった。こちらは、試験管内レベ

た。control、11R + No.10L、No.10L-11R を塗布したサンルの報告はあるが、細胞レベルや動物レベルの応用例はな

プルでは、表層から皮膚基底層までメラニン陽性細胞が多い。その理由は、これらの Whitening ペプチドを皮膚基底数観察されたのに対し、11R-No.10L を塗布したサンプル

膜にある皮膚色素細胞に送達する手段がないためである。

は、他のサンプルと比較して、メラニン陽性細胞が減少しよって、我が研究室の手法である 11R を用いて、細胞レていることを確認した（Fig. 6）。

ベルそして動物レベルにて検討を行い、さらにスクリーニ

次に、フォンタナ・マッソン染色によるメラニン陽性細ングを行った。

胞数を 10 ヶ所の視野で、統計学的に検定したところ、PB

文献の試験管レベルでのスクリーニングの結果と細胞内および 11R-No.10L を塗布した皮膚において、メラニン陽スクリーニングの結果より、メラニン合成抑制効果におい性細胞数の有意な減少が見られた（Fig. 7）。

て異なる結果が得られた。これは、細胞内へ導入する際に４．考

細胞膜通過ペプチド、11R を連結したことで、候補ペプチ

察ドに何らかの立体構造の障害が起きたと考えられる。例え

新たなペプチドをスクリーニングする際に着目したのが、ば、候補ペプチドにマイナスチャージのアミノ酸を含有しはチロシていた場合、11R の強い塩基性を持つアルギニンとの静電

ナーゼの活性部位（Fig. 8）を示したもので、この活性部位を的相互作用により、アミノ酸同士が接着する可能性が示唆阻害する天然素材が報告されている。 例えば、牛乳、小麦、される。決定した 196 ペプチドにおいて、11R を N 末端とチロシナーゼ抑制に関する論文である。下図

19）

はちみつ、絹、ハエといったものが報告されている

Fig. 6

Fig. 718）。

C 末端のそれぞれに連結した場合、N 末端がメラニン合成

フォンタナ・マッソン染色結果

フォンタナ・マッソン染色によるメラニン陽性細胞数の測定結果− 121 −

scale bar： 50μm

Fig. 8

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

Fig. 9抑制効果を示すことも確認している。さらに、褐色モルモットを用いて、日焼けモデル動物を作製し（Fig. 9）、薬剤Novel Transdermal Drug Delivery System, Chem Biol
Drug Des , 80, 639-646, 2012

塗布の検討を行った。その後、H.E. 染色、フォンタナ・マ

９）Jan D. Bos: The 500 Dalton rule for the skin penetrationッソン染色、メラニン陽性細胞数の統計評価を行い、メラof chemical compoundsand drugs, Experimental

ニン陽性細胞の有意な減少効果を認めた。

Dermatology, 9, 165-169, 2000

本研究成果は、The transdermal inhibition of melanogenesis10）Tomasz Ciach : Buccal iontophoresis : an opportunity

by a cell-membrane-permeable peptide delivery system basedfor drug delivery and metabolite monitoring, Drugon poly-arginine. Ookubo N, Michiue H, Kitamatsu M,

Discovery Today, 16, 361-366, 2011

Kamamura M, Nishiki T, Ohmori I, Matsui H, Biomaterials.
2014 May; 35 (15) :4508-16.

11）Shital H : Microneedles : an emerging transdermal
drug delivery system, Journal of Pharmacy andPhamacology, 64, 11-29, 2011

（引用文献）

12）Fang J.Y.: Liposomes as vehicles for enhancing drug１）Shiroh Futaki : Oligoarginine Vectors for Intracellulardelivery via skin routes, Curr Nanosci, 2, 55-70, 2006

Delivery:Design and Cellular-Uptake Mechanisms:13）Simons E.J.: Effect of chemical permeation enhancers

Biopolymers, 84, 241-249, 2006

on nerve blockade, Mol Pharm, 6, 265-273, 2009２）Masayuki Matsushita: A High-Efficiency Protein

14）Juan Carlos Espin : Improvement of a Continuous

Transduction System Demonstrating the Role of PKA

Spectrophotometric Method for Determinig thein Long-Lasting Long-Term Potentiation, The Journal

Monophenolase and Diphenolase Activities ofof Neuroscience, 16, 6000-6007, 2001

Mushroom Polyphenol Oxidase, J. Agric. Food Chem,

３）Jehangir S Wadia : Transducible TAT-HA fusogenic

45, 1084-1090, 1997

peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after

15）Jie Zhang : Wnt5a Inhibits the Proliferation andlipid raft macropinocytosis, nature medicine, 1 0, 3 1 0-

Melanogenesis of Melanocytes, International Journal of

315, 2004

Medical Sciences, 6, 699-706,2013

４）Joliot A : Transduction peptides : from technology tophysiology, Nature Cell Biology, 6, 189-196, 2004

16）Matsuda H : Studies of cuticle drugs from natural
sources.II.Inhibitory veffects of Prunus plants on５）Takeuchi T : Direct and rapid cytosolic delivery using

melanin biosynthesis, Biol Pharm Bull, 10, 1417-20, 1994

cell-penetrating peptides mediated by pyrenebutyrate,17）P.Thanigaimalai, Evaluation of 3,4-dihydroquinazoline-2

ACS Chem Biol, 1, 299-303, 2006(1H)-thiones as inhibitors of a-MSH-induced melanin

６）Gerile Candan:Combining poly-arginine with thehydrophobic counter-anion 4-(1-pyrenyl)-butyric acidfor protein transduction in transdermal delivery,
Biomaterials, 33, 6468-6475, 2012production in melanoma B1 6 cells, Bioorganic &Medicinal Chemistry, 18, 1555-1562, 201018）Marloes Schurink: Novel peptides with tyrosinase
inhibitory activity, ScienceDirect, 28, 485-495, 2007

７）Marek Haftek: Compartmentalization of the human19）Wangsa T. Ismaya: Crystal Structure of Agaricus

stratum corneum by persistent tight junction-likebisporus Mushroom Tyrosinase:Identity of thestructures, Experimental Dermatology, 2 0, 6 1 7-6 2 1,

Tetramer Subunits and Interaction with Tropolone,

2011

Biochemistry, 50, 5477-5486, 2011８）Saman A. Nasrollahi : Cell-penetrating Peptides as a

− 122 −

化粧品用無機ナノ材料の遺伝毒性作用の解明

大阪府立大学理学系研究科生物科学専攻分子細胞遺伝学分野

八木孝司

Titanium dioxide (TiO2) is widely used as an ultraviolet-scattering substance in cosmetics. Here, we investigated effectsof particle sizes and surface modifications of TiO2 NPs on their genotoxicity to human skin fibroblast and keratinocyte
cells with the micronucleus (MN) assay. Induction of DNA strand breaks and reactive oxygen species (ROS) were alsomeasured to elucidate the mechanism of the toxicity. Three types of TiO2 NPs (35 nm and 1000 nm) with different surface
coating (Al(OH)3-coated-, Al(OH)3/C17H35COOH-coated-, and plain-TiO2 NPs) were examined. All TiO2 NPs induced MN
in both cells in a dose-dependent manner. Plain-TiO2 NPs (35 nm) induced more MN, DNA-strand breaks and ROS thanother two coated-TiO2 NPs. Small TiO2 NPs (35 nm, plain) were more genotoxic than large TiO2 NPs (1000 nm, plain). The
ROS production was closely correlated with the cellular uptake of the TiO2 NPs. These results indicate that difference in abalance of the particle size and surface properties of TiO2 NPs affects their cellular uptake, and causes different levels of
genotoxicity.

１．緒って直接皮膚の細胞に接触し、可視光線および近紫外光の言曝露を受ける。

ナノサイズの微小粒子の毒性が懸念されている。これまこのような背景のもと、表面処理の異なる酸化チタンナ

で物質の毒性発現のメカニズムは、物質が生体高分子と相ノ 粒 子（TiO2 NPs） を 皮 膚 由 来 の 2 倍 体 培 養 角 化 細 胞

互作用する化学反応であったが、近年、生体分子との反応（keratinocyte）および線維芽細胞（fibroblast）に曝露し、遺性のない無機物質であっても細胞毒性を持つことが報告さ

伝毒性の有無を小核誘導試験によって調べた。またその毒れ始めた。この毒性は物質の化学組成の他に、大きさと形性メカニズムを明らかにするために DNA 鎖切断と活性酸状に依存する。一般の細胞の大きさは 30 µm 程度であり、素誘導をそれぞれアルカリコメットアッセイと蛍光発光に

1,000 nm 以下の大きさの固体は細胞の貪食作用によってよって検出した。同様の方法で直径 35 nm と 1000 nm の細胞に取り込まれる。たとえば直径約 10 〜 100 nm の銀粒

TiO2 NPs（表面無処理）の遺伝毒性を比較した。これらの子を細胞に曝露すると、銀粒子は容易に細胞に取り込まれ結果、TiO2 NPs の遺伝毒性の強さは、その細胞へ取り込てアポトーシスを起こす。この機構は短波長の可視光（まみ量に比例することが明らかとなった。

たは UVA）との相互作用であることが明らかにされ、活性２．実

酸素分子種が DNA 鎖を切断すると考えられている。また
幅数 nm・長さ約 100 nm の針状の多層カーボンナノチュ

験

2. 1. 材料

ーブは暗所でも活性酸素分子種を介して細胞の DNA 鎖を

TiO2 NPs は、直径 35 nm、結晶構造はルチル型。粒子切断することが知られる。このメカニズムはアスベストの表面処理は Al（OH）3（親水処理）、Al（OH）3/ ステアリン

発癌メカニズムとの共通性で注目されている。

酸（撥水処理）、無処理の 3 種類である。比較対象として表

化粧品には多種類のナノサイズの物質が使用されている。

面無処理の直径 1,000 nm TiO2 NPs も用いた。細胞はヒト

たとえばカオリンは化粧品の基礎的成分、二酸化チタンや健常人皮膚由来 2 倍体の角化細胞 HEKn および線維芽細胞

酸化亜鉛は紫外線防御剤として、マイカは光沢剤として使FJ で、それぞれ Humedia-KG2 および RPMI1640 培地で、用される。さらにそれぞれが副成分によって種々の色彩を

37 ℃、5 ％炭酸ガス条件で培養した。

呈していたり、人工的に着色されたり、表面が親水加工や
撥水加工されたりしている。これらのナノ粒子は化粧によ2. 2. 方法
細胞処理時の TiO2 NPs の性質：培地に懸濁した TiO2 NPs

Genotoxicity of inorganic nanomaterials
used for cosmetics
Takashi Yagi
Laboratory of Molecular and Cellular
Genetics, Department of Biology, Graduate
School of Science, Osaka Prefecture
Universityのゼータ電位を電気泳動光散乱法（レーザードップラー法）、粒子径を動的光散乱法（光子相関法）によって測定した。TiO2 を HEKn 細胞と FJ 細胞に処理し、6 時間後の細胞の状態をレリーフコントラスト顕微鏡で観察した。
小核の誘発：105 個の細胞を 6 cm 培養皿に播種し、上記 3
種類の TiO2 NPs を 0.1、1、10、100 µg/mL の濃度で 6− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

時間処理した。細胞を 42 時間培養後、カルノア固定し、子径 DLS を動的光散乱法（光子相関法）を用いて測定した。

低張処理後スライドグラスに滴下、アクリジンオレンジ

これらの結果を表１にまとめた。

染色し、蛍光顕微鏡で小核を有する細胞の割合を求めた。

TiO2 NPs 処理後の HEKn 細胞と FJ 細胞をレリーフコン

DNA 鎖の切断：10 個の細胞を 6 cm 培養皿に播種し、上トラスト顕微鏡で観察し、その写真を図１に示す。TiO2

記 3 種類の TiO2 NPs を 10 および 100µg/mL の濃度でNPs が発する青い蛍光によって、TiO2 NPs は 35nm- 表面

１時間処理した。細胞を剥離し、アルカリアガロースに無処理＞ 35 nm-Al（OH）3 表面処理＞ 35 nm-Al（OH）3/ ス

包埋後スライドグラスに接着してアルカリ電気泳動した。

テアリン酸表面処理＞ 1000nm- 表面無処理の順に、細胞細胞をサイバーグリーン染色後、蛍光顕微鏡でコメットに多く付着している（または取り込まれている）ことがわか

テールの大きさ（tail DNA）
を測った。

った。

5

活性酸素（ROS）の誘導：105 個の細胞を 6 cm 培養皿に播種し、3 種類の TiO2 NPs を 10 および 100µg/mL の濃度

3. 2. 小核の誘発で１時間処理した。剥離した細胞をH2DCFDAで処理し、角化細胞と線維芽細胞において、無処理でも小核は低頻発生する蛍光をイメージングサイトメーターで測った。

度で発生したが、TiO2 NPs を処理すると濃度に依存してTiO2 NPs の細胞内取込：105 個の細胞を 6 cm 培養皿に播より高頻度に小核を誘発した。図２に誘発された小核の例

種し、3 種類の TiO2 NPs を 10 および 100µg/mL の濃度を示す。表面無処理の 35 nm TiO2 NPs は 35 nm- 表面無処

で１時間処理した。剥離した細胞をフローサイトメータ

理＞ 35 nm-Al（OH）
3 表面処理≥ 35 nm-Al（OH）
3/ ステアーにかけて forward scatter と side scatter を測定し、後リン酸表面処理＞ 1,000 nm- 表面無処理の順に、より高頻者を TiO2 NPs の細胞内取り込み量の指標とした。

度で小核を誘発した（図 3）。

３．結果

3. 3. DNA 鎖の切断（アルカリ性コメットアッセイ）

3. 1. 細胞処理時の TiO2 NPs の性質

アルカリ性コメットアッセイの結果の一例を図 4 に示す。

無血清 Medium 中の TiO2 NPs 懸濁液のゼータ電位と粒表1角化細胞においても線維芽細胞においても、表面処理の異TiO2 NPs の物理的性質

図１ TiO2 NPs（100 µg/mL）処理した HEKn、FJ 細胞のレリーフコントラスト顕微鏡画像。TiO2 NPs が青い蛍光を発している。

− 124 −

化粧品用無機ナノ材料の遺伝毒性作用の解明

図２ TiO2 NPs によって誘発された小核の例。細胞に TiO2 NPs（35 nm-plain, 100 µg/mL）処理した HEKn（左）と FJ（右）細胞

図３ 角化細胞および線維芽細胞における、表面処理の異なる３種類の TiO2 NPs による小核誘発。3 回の独立した観察の平均値 ±SD を表す。* 溶媒対照群と比較して有意差あり（p<0.01）、a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k 異文字間で有意差あり（p<0.01）（Tukey-Kramer 法）。縦軸は観察した細胞 1,000 個あたりの小核保有細胞出現頻度を示す。
CT は溶媒コントロール。 MMC はマイトマイシン C（陽性コントロール）。

図４

アルカリ性コメットアッセイの例。左：角化細胞（HEKn）、右：線維芽細胞（FJ）− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

なる 3 種類の TiO2 NPs は処理濃度に依存してより多くの

3. 4. 活性酸素（ROS）の誘導

DNA切断（tail DNA）を引き起こした。TiO2 NPsは 35 nm- 表

Tali イメージングサイトメーターを用いた細胞内 ROS 誘

面無処理＞ 35 nm-Al（OH）3 表面処理＞ 35 nm-Al（OH）3 /導量測定の一例を図 6 に示す。H2DCFDA が ROS によっステアリン酸表面処理＞ 1,000 nm- 表面無処理の順に、よて酸化され DCFDA となり蛍光を発する。角化細胞およびり多くの DNA 切断を起こした（図 5）。

線 維 芽 細 胞 に お い て、3 種 類 の TiO2 NPs は 10 お よ び

図５ 角化細胞（HEKn）および線維芽細胞（FJ）における、アルカリ性コメットアッセイによって測定した
TiO2NPs による DNA 切断。独立した 3 回の % Tail DNA の平均値 ±SE。* 溶媒対照群と比較して有意差あり（p<0.01）、a, b, c, d, e, f, g, h, i 異文字間で有意差あり（p<0.01）。

図６

角化細胞（HEKn）（左）および線維芽細胞（FJ）（右）における TiO2 NPs100 µg/mL 処理後の ROS 蛍光量− 126 −

化粧品用無機ナノ材料の遺伝毒性作用の解明

100µg/mL 処理によって ROS を誘導することがわかった。

４．考TiO2 NPs は 35 nm- 表面無処理＞ 35 nm-Al（OH）3 表面処
理＞ 35 nm-Al（OH）
3 / ステアリン酸表面処理＞ 1,000 nm-

察酸化チタンナノ粒子（TiO2 NPs）は白色顔料や紫外線散

表面無処理の順に多くの ROS を誘導した（図 7）。

乱剤として日焼け止め等の化粧品に使用されている。また、

3. 5. TiO2 NPs の細胞内取込

粧品もある。本研究では、表面処理の違いと遺伝毒性との無機系・有機系の表面処理を施された TiO2 NPs を含む化
TiO2 NPs を 10 および 100 µg/mL、1 時間処理後、フロ関係を明らかにした。また同時に、表面無処理で直径が異ーサイトメーターを用いて forward scatter と side scatterなる 2 種類の TiO2 NPs の遺伝毒性も比較した。化粧品がを測定した（図 8）。前者は細胞の大きさを反映する。後者

直接皮膚に接触することを考慮し、ヒト皮膚二倍体細胞（線は細胞内に取り込まれた TiO2 NPs の量を反映する。全細維芽細胞および角化細胞）を用いて小核試験を行った。そ

胞数のうち赤の横線より上に分布している細胞の割合は、の結果、Al（OH）
3 表面処理、Al（OH）
3 / ステアリン酸表

100 µg/mL TiO2 、35 nm-Al（OH）3 表面処理、35 nm - Al

面処理、表面無処理の、どの TiO2 NPs（粒子径が 35 nm）（OH）3 / ステアリン酸表面処理、35nm- 表面無処理、1,000も濃度依存的に小核を誘導した。特に表面無処理の粒子に

nm- 表面無処理、溶媒対照の順に、HEKn 細胞では 63.0 ％、よる小核誘発頻度が最も高かった。またアルカリコメット

60.5 ％、90.0 ％、42.6 ％、9.2 ％であり、FJ 細胞では 86.1 ％、アッセイにより、表面無処理の TiO2 NPs が最も DNA 鎖

33.6 ％、91.0 ％、31.2 ％、0.3 ％であった。

切断を誘発することがわかった。さらに、ROS 産生能を、

すなわち、角化細胞および線維芽細胞において、表面無蛍光試薬を用いて調べたところ、表面無処理の TiO ₂ NPs

処理の TiO2 NPs が最も取り込まれ、次いで Al（OH）3 処が最も ROS を誘導した。NPs の小核誘発能、DNA 切断量、理が取り込まれやすく、Al（OH）
3 / ステアリン酸処理は取ROS 産生量と細胞への取り込み量の関係を調べた結果、り込まれにくいことがわかった。表面無処理の 1,000nm

それらに正の相関が見られた（図 9）。

TiO2 NPs が最も取り込まれにくいことがわかった。

以上のことから、TiO2 NPs のヒト皮膚二倍体細胞に対

図７ 角化細胞（HEKn）および線維芽細胞（FJ）における、TiO2 NPs による細胞内 ROS 産生量。独立した 3 回の %Tail DNA の平均値 ±SE。 * 溶媒対照群と比較して有意差あり（p<0.01）、a, b, c, d, e, f, g , h, i, j, k 異文字間で有意差あり（p<0.01）。縦軸はコントロールでの ROS 産生量を１としたときの相対値を示す。

− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

する遺伝毒性の違いは、表面特性による細胞内への取り込すると考えられる。培養液（pH 7）中の TiO2 NPs 粒子のゼ

まれやすさに起因することが示唆された。細胞は培養液中

ータ電位は親水性 NPs で大きいことがわかり、TiO2 NPs

で負荷電していることから、TiO2 NPs の細胞への取り込が凝集していることを示し、顕微鏡観察でもそのことがわ

まれ易さは、粒子の親水性の他に、粒子表面電荷にも依存かった。親水性で凝集性が高い 35 nm NPs は多くの ROS

図８

フローサイトメーターによる TiO2 NPs の細胞内取込量（side scatter）の測定。上：角化細胞（HEKn）、
下：線維芽細胞（FJ）− 128 −

化粧品用無機ナノ材料の遺伝毒性作用の解明を産生し、DNA 損傷および小核を誘導していた。これは1,000 nm NPs は 35 nm NPs と比べて、大きさの点で細胞

TiO2 NPs が凝集することによって、細胞あたりの取り込

膜透過性が低く、遺伝毒性が低いと考えられる。本研究結み量が増え、細胞内 ROS 産生量とそれによる DNA 損傷量

果から導かれる TiO2 NPs の ROS を介した小核誘導のメカが増え、高頻度で小核を誘導すると説明できる。撥水性のニズムを図 10 に示す。

NPs は凝集性が低く、細胞膜透過性も低いと考えられる。

図９（HEKn）、下：線維芽細胞（FJ）
TiO2 NPs の ROS 産生量、DNA 損傷性、小核頻度と細胞への取り込みとの相関。上：角化細胞

図 10

TiO2 NPs による小核誘導のメカニズム− 129 −

サイトカインによる接触性皮膚炎誘導の制御に関する基盤研究東京医科大学医学総合研究所免疫制御研究部門

善本

隆之

In contact hypersensitivity (CHS) induced by haptens such as 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB), CD8+ T cells producing
IL-17 (Tc17) are important effecter cells. Tc17 cells also produce IL-22, which promotes dermal inflammation, and IL27 is an inhibitory cytokine for the differentiation to helper T-17 cells. The present study suggests that IL-22 producedby Tc17 cells is essential for the CHS reaction at the elicitation phase and that IL-27 inhibits it by suppressing the Tc17
differentiation.

１．緒

言

２．実

接触過敏症
（CHS）
は、化粧品や漆によるかぶれなどで炎験

2. 1．IL-22 欠損マウスにおけるCHS 反応の解析症が起こるⅣ型アレルギー疾患で、原因となるアレルゲン

2 日前に背部の皮膚の毛剃りをした野生型および IL-22

は、化粧品や漆などに含まれる特定の化学物質である 1, 2）。

欠損マウスの背部皮膚にハプテンとして DNFB を塗布しこの比較的分子量の小さい化学物質（ハプテン）
は、体内に感作した。5 日後同じハプテンを片方の耳介に、溶媒のみ侵入し皮膚組織の蛋白質と結合し、この修飾蛋白質に対すを反対の耳介に塗布しその厚さを 24、48、72 時間と経時る免疫応答が誘導される。CHS のエフェクター T 細胞と的に測定した。24 時間後には、それぞれの耳介を切除し+し て 以 前 か ら ヘ ル パ ー CD4 T（Th）1 や 細 胞 傷 害 性+

CD8 T（Tc）1 細胞が考えられていたが、最近は、ハプホルマリン固定し、病理組織標本を作製しヘマトキシリン・エオジン（HE）染色し、炎症の程度を比較検討した。

テンが Fluorescein isothiocyanate（FITC）の場合は IL-4の場合は IL-17 を産生する Tc17 細胞が重要なことが明ら

2. 2．IL-22 欠損マウスにおけるDC の所属リンパ節への遊走能の検討かになってきている 3）。IL-22 は、炎症反応により CD4+/

IL-22 の作用機序を調べるため、まず、ハプテンとしてを産生する Th2 細胞が、2,4-Dinitrofluorobenzene（DNFB）+

CD8 T 細胞やナチュラルキラー（NK）/NKT 細胞、g dT蛍光を発するハプテンである Fluorescein isothiocyanate細胞などの免疫細胞より産生され、表皮角化細胞などの非（FITC）で感作後、表皮の DC であるランゲルハンス細胞

免疫細胞に作用し、抗菌ペプチドの発現誘導や角化細胞のが抗原を捕らえ所属リンパ節へ遊走する能力を比較検討し増殖、表皮肥厚を引き起こすサイトカインで、Tc17 細胞かた。感作を直接耳で行うため、野生型および IL-22 欠損マ

らも産生されるが、CHS 反応における役割に関する報告はウスの片方の耳介にハプテンを塗布し、反対の耳介に溶媒

4）

未だない 。一方、
IL-27 は、
マクロファージや樹状細胞（DC）のみを塗布し、24 時間後、それぞれの耳介の所属リンパから産生され、初期の Th1 分化誘導を促進するが、後期の節である顎下リンパ節を取り出した。次に、リンパ節細胞

Th1 分化や Th2 および Th17 分化は抑制するのみならず、の懸濁液を調製し、MHC クラス II と DC に対する抗体でIL-10 を産生する制御性 T 細胞である Tr1 細胞分化を増強

染色し、それぞれのダブルポジティブ細胞中の FITC 陽性

し、炎症性サイトカイン産生も抑制する作用を有する多機細胞の割合を FACS を用いて解析した。

能性サイトカインである

5−7）。そこで、本研究では、IL-22

遺伝子欠損マウスと IL-27 を高発現しているトランスジェ
ニック（Tg）マウスを用いて、CHS 反応における IL-22 の役割とさらに IL-27 の効果について検討を行った。

2. 3．感作した IL-22 欠損マウスの所属リンパ節細胞の再刺激後のサイトカイン産生の検討
次に、IL-22 の Th 分化への影響を調べるため、野生型
および IL-22 欠損マウスの耳介を DNFB で感作 5 日後、所属リンパ節である顎下リンパ節を取り出し、in vitro で同じ

Studies on the regulation of contact
hypersensitivity reaction by cytokines
Takayuki Yoshimoto
Department of Immunoregulation, Instituteof Medica l Science, Tokyo Medica l
University

抗原性を有する水溶性化合物 2,4-dinitrobenzene sulfonate,sodium salt（DNBS）で再刺激し、24、48、72 時間後の培養上清を回収した。その上清中の IL-22、IL-17、IFN- g のサイトカイン量を、それぞれの ELISA により定量した。

− 130 −

サイトカインによる接触性皮膚炎誘導の制御に関する基盤研究2. 4. 惹起時に抗 IL-22 抗体投与の検討

体で刺激 48 時間後の培養上清中の IL-17 や IL-22、IFN-g、

IL-22 の 惹 起 相 で の 役 割 を 調 べ る た め に、 ハ プ テ ン

IL-4 などのサイトカイン産生量を ELISA で測定した。

DNFB で感作した野生型マウスの耳介に DNFB を再塗布

３．結する際、抗 IL-22 抗体を投与し耳介厚を測定した。さらに、惹起 24 時間後それぞれの耳介をホルマリン固定し、病理組織標本を作製し HE 染色を行い、炎症の程度を比較検討

果3. 1. IL-22 欠損マウスにおけるCHS 反応が低下する
ハプテンとして DNFB を用い、野生型マウスおよび
IL-22 欠損マウスの CHS 反応への感受性の違いを検討したした。

ところ、IL-22 欠損マウスでは耳介肥厚が約半分に減弱し

2. 5. 惹起 24 時間後の耳介でのエフェクター分子の発現解析た（図 1）。さらに、感作 24 時間後の病理組織解析より、

ハプテンで惹起 24 時間後のエフェクター分の mRNA 発

潤や表皮の肥厚、浮腫などの炎症症状が軽減していた。こ

現を比較するため、野生型および IL-22 欠損マウスをハプ

れより、IL-22 欠損マウスでは DNFB に対する CHS 反応がテン DNFB で感作 5 日後、片方の耳介を DNFB で、反対低下することがわかった。

野生型マウスに比べて IL-22 欠損マウスではリンパ球に浸の耳介を溶媒だけで塗布し惹起した 24 時間後に、耳介よりRNA を抽出し cDNA を調製し、リアルタイム PCR によりIL-22 およびそのシグナル伝達の下流分子 CXC3 や CCL3、3. 2. IL-22 欠損マウスにおけるDC の所属リンパ節への遊走能には影響ない
IL-22 の作用機序を調べるために、まず耳皮膚にハプテ

S100A7 などの発現を比較検討した。

ンとして FITC を感作後 24 時間後、抗原である FITC を捕2. 6. IL-27Tg マウスでの CHS 反応の解析

らえた DC の所属リンパ節への遊走能を比較すると、IL-22

次に、IL-27 の CHS 反応への影響を調べるため、我々が欠損マウスでも野生型マウスと同様に FITC ＋ MHC クラス

以前に作製した血清アミロイド P 成分のプロモーターの下

II ＋ CD11c ＋ 細胞の所属リンパ節への遊走が見られた。こ流に IL-27 の 2 つのサブユニット EBI3 と p28 をリンカー

れより、IL-22 欠損マウスでは、DC の所属リンパ節へのを挟んで繋いで 1 本鎖 IL-27 を血中に多量に有しているト遊走能には影響がないことが示された。

ランスジェニック（Tg）マウスを用いた 8）。野生型マウス
およびこの IL-27Tg マウスに、上述同様に DNFB をハプテンとして用い感作と惹起を行い、耳介厚を経時的に測定した。また、その際惹起 24 時間後の耳介をホルマリン固定し、3. 3. 感作したIL-22 欠損マウスの所属リンパ節細胞の再刺激後のサイトカイン産生の検討
次に、DNFB で感作後所属リンパ節細胞を in vitro でDNBS で再刺激し、その培養上清中のサイトカイン産生量

病理組織学的解析も同様に行った。

を ELISA で測定した。IL-22 欠損マウスでは、IL-22 産生

2. 7. 感作したIL-27Tg マウスの所属リンパ節の再刺激
後のサイトカイン産生の検討は全く検出されなかったが、IL-17 産生や IFN-γ 産生にはIL-27 の作用機序を調べるため、上述と同様に感作した

マウスは、DNFB に対する T 細胞分化には影響しないこと+

マウスの所属リンパ節細胞から CD8 T 細胞を AutoMACS

有意な差は見られなかった（図 2）。これより、IL-22 欠損が示された。

Pro を用いて精製し、in vitro で抗 CD3 抗体と抗 CD28 抗

図1

IL-22 欠損マウスでは、CHS 反応で耳介厚と炎症反応が低下する− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図2

図3

IL-22 欠損マウスでは、Th17 や Th1 分化には影響しない

IL-27Tg マウスでは、CHS 反応で耳介厚と炎症反応が低下する

3. 4. 惹起時に抗 IL-22 抗体投与によるCHS 反応が低下する

3. 6. IL-27Tg マウスでの CHS 反応の低下
次に、IL-27Tg マウスを用いて IL-27 による CHS 反応へ

DNFB で感作した野生型マウスに惹起直前に抗 IL-22 抗の効果を調べると、IL-27Tg マウスでは野生型マウスに比体を投与し、DNFB で惹起すると、コントロール抗体を投べ耳介の肥厚が顕著に減少し、病理組織学的解析よりリン与したマウスに比べ耳介厚が有意に半減し、さらに病理組

パ球の浸潤や表皮の肥厚、浮腫などが減弱していた（図 3）。

織学的にもリンパ球の浸潤や表皮の肥厚、浮腫などが減弱

これより、IL-27 は CHS 反応を抑制することが抑制するこしていた。これより、IL-22 は、CHS 反応の惹起時に作用とがわかった。

していることが明らかになった。

3. 7. 感作したIL-27Tg マウスの所属リンパ節の再刺激
3. 5. 惹起 24 時間後の耳介でのエフェクター分子の発現解析

IL-27 による CHS 反応の抑制の作用機序を調べるため、

さらに、DNFB で感作・惹起 24 時間後の耳介皮膚での感作した IL-27Tg マウスの所属リンパ節細胞の CD8+T 細

エフェクター分子の発現を調べると、IL-22 欠損マウスで胞を、in vitro で抗 CD3 抗体で刺激した上清中のサイトカ

は IL-22 発現は、ほぼ検出されず、IL-22 シグナルの下流

イン産生を ELISA で調べると、IFN-γ 産生は野生型マウに位置するエフェクター分子である CXCL3 や CCL3 など

スと変わらなかったが、IL-17 や IL-22 産生は顕著に減少のケモカインや、抗菌ペプチドで好中球などの遊走にも関していた。IL-27 は、Tc17 分化を抑制し CHS 反応を阻害

与 す る S100A7 発 現 が 低 下 傾 向 に あ っ た。 こ れ よ り、することが示された。

後のサイトカイン産生の検討

IL-22 欠損マウスでは、惹起時に IL-22 の下流のシグナルが低下していることが示された。

− 132 −

サイトカインによる接触性皮膚炎誘導の制御に関する基盤研究

図 4 IL-22 は惹起相でのエフェクター機構に重要で、IL-27 は Tc17 分化を阻害し CHS 反応抑制する

４．考JF. Effector and regulatory mechanisms in allergic

察contact dermatitis. Allergy, 64, 1699-714, 2009.

以上より、DNFB をハプテンとして用いた CHS 反応に

３）Kish DD, Li X, Fairchild RL. CD8 T cells producing

おいて、IL-22 は感作相である Tc/Th 分化には強くは影響

IL-1 7 and IFN-gamma initiate the innate immune

しないが、惹起相においてケモカインなどのエフェクター

response required for responses to antigen skin

分子の発現を増強し、CHS 反応の誘導に重要な役割を担

challenge. Journal of immunology, 182, 5949-59, 2009.

っていることが明らかになった（図 4）。さらに、IL-27 は、

４）Zheng Y, Danilenko DM, Valdez P, Kasman I,

この DNFB で誘導される CHS 反応において、Tc/Th17 分

Eastham-Anderson J, Wu J, Ouyang W. Interleukin-22,化を阻害し IL-17 や IL-22 産生を低下することで抑制効果

a T(H)1 7 cytokine, mediates IL-2 3-induced dermalを発揮することが示された。IL-27 による阻害効果の作用

inflammation and acanthosis. Nature, 445, 648-51, 2007.

機序としては、IL-27 が CD8+T 細胞中の Tc17 分化に重要

５）Hall AO, Silver JS, Hunter CA. The Immunobiology

な RORgt や RORa などの転写因子発現を低下させている

of IL-27. Adv Immunol, 115, 1-44, 2012.

可能性が考えられる。本研究より、接触過敏症において、

６）Hunter CA, Kastelein R. Interleukin-2 7: balancing

IL-22 発現や機能の阻害剤やその中和抗体、さらに、IL-27

protective and pathological immunity. Immunity, 3 7,投与が治療効果を示す可能性が示唆された。

960-9, 2012.
７）Mizoguchi I, Higuchi K, Mitobe K, Tsunoda R,

謝辞

Mizuguchi J, Yoshimoto T. Interleukin-2 7: Regulation

本研究の遂行にあたり、コスメトロジー研究振興財団よof immune responses and disease development by a

りご支援頂きましたことに心より感謝感謝申し上げます。

pleiotropic cytokine with pro- and anti-inflammatory

また、共同研究者として多大なるご協力を頂いた兵庫医科

properties. In: Yoshimoto T, Yoshimoto T, eds.

大学免疫学・医動物学講座教授・善本知広先生に深謝致し

Cytokine frontiers: Regulation of immune responses in

ます。

health and disease. Springer, 2013; 353-75.
８）Seita J, Asakawa M, Ooehara J, Takayanagi S,（引用文献）

Morita Y, Watanabe N, Fujita K, Kudo M, Mizuguchi

１）Kaplan DH, Igyarto BZ, Gaspari AA. Early immune

J, Ema H, Nakauchi H, Yoshimoto T. Interleukin-2 7

events in the induction of allergic contact dermatitis.

directly induces differentiation in hematopoietic stem

Nat Rev Immunol, 12, 114-24, 2012.

cells. Blood, 111, 1903-12, 2008.

２）Vocanson M, Hennino A, Rozieres A, Poyet G, Nicolas− 133 −

クラスリン集合因子CALM欠損マウスに見られる、毛や組織の色の薄さの解析
─細胞内物資輸送と体色との関連を探る─
奈良女子大学大学院人間文化研究科個体機能学講座

渡邊利雄

CALM is not believed to be an essential component of clathrin-associated endocytosis of transferrin. However, we made
CALM-deficient mouse and found that CALM does indeed appear to be involved in clathrin-mediated membrane traffic.
We also noticed that CALM-deficient mouse showed pale coat color and started a trial to analyze the relationship between
membrane traffic and coat color. As an initial step, we successfully established CALM knock-down melanoma cells for the
analysis.

１．緒言体の各組織は皮膚を含めて様々な色を持っている。メラニンに代表されるように色素は細胞内物流システムで輸送されることにより産生・分配される。この機構に不備が生じると、例えば皮膚におけるシミなどの色素沈着等の現象

図1が起こると考えられる。ということはこの輸送を担う分子の動態を制御する方向での研究を行うことができれば、皮言われていたが、ノックアウトでは CALM 依存性が見ら

膚を健康に保つための新しい研究標的として役立つ可能性

れ、ノックアウトマウスはトランスフェリンによる鉄の取り込が高く、近年この物流システムに関与する因子と色素の輸みの低下により重度の貧血となることを明らかにした 8, 9）。

送との関係が解析され始めている。代表的な成功例はメラ

さらに、大規模遺伝子変異解析から推定されていたが従来ノソーム輸送での低分子量 G タンパク質の Rab の働きであは因果関係が知られていなかった、CALM とアルツハイ

1）

る 。しかし、細胞内の物流システムは Rab のみで成り立マー症との関係など、我々の作製したノックアウトマウス

つのではない。色素を輸送する小胞は小胞形成開始因子

により CALM の新しい知見が蓄積しつつある 10, 11）。

Arf 群や Arf の制御因子の GEF（GTP 交換因子群で小胞形

このような研究を行う中で、我々はクラスリン集合因子

成の活性化因子）や GAP（Arf1 が持つ GTP 加水分解活性

CALM 欠損マウスの体色が薄いことに気が付いた。図 1の活性化因子群で小胞形成の不活性化因子）、被覆のクラの白い星印がホモ欠損マウスで、同腹の兄弟姉妹に比べてスリンやその集合因子の CALM 等々の様々な因子の関与

体色が薄い。その後、成長後の個体の解析から体色のみながあることは判明しているのであるが、これらと色素とのらず、肝臓や心臓等の臓器の色も薄いことを見出している。

関連の解析は遅々として進んでいない

2−7）

本研究は、細胞内物流システムがどのように組織の色と。

我々は、従来から培養細胞でのみ解析されてきたクラス

関係しているのかを、クラスリン集合因子 CALM 欠損マ

リン集合因子の CALM を個体レベルで解析するために世ウスで発見した毛や組織の色の薄さを解析することで明ら界に先駆けてノックアウトマウスを作製し、これを用いたかにしようと試みる、従来にない研究である。我々が作研究から、クラスリン集合因子 CALM は EGF, トランスフ

製した CALM の欠損マウスに見られた新しい知見を基に、ェリン等のクラスリン依存性の小胞輸送に関して従来の報従来知られていない CALM の欠損マウスでの毛や組織の告とは真逆の働きをしていることが明らかになった。即ち、色の薄さを手掛かりとして、現在までに一切の知見がない

従来のドミナントネガティブ体（優性抑制型変異体）
やノッ

クラスリンを被覆として使う細胞内物流機構と毛や組織のクダウウンを用いた研究報告では CALM は関与しないと色との関係を明らかにすることを目的とする。

An analysis on pale coat color found in
CALM-deficient mice −A trial study on
the relationship between membrane trafficand coat color−
Toshio Watanabe
Department of Biological Science, Graduate
School of Humanities and Sciences, Nara
Women’s University

２．実験

2. 1. CALM 欠損マウスの色の薄さは何に由来するのか
明瞭な色素の薄さが観察されるのは、脾臓、骨髄、肝臓、心臓、皮膚、毛であり、そのほかの組織では色の薄さは明瞭ではない。そこで、これらの組織で組織の色を決定する
分子の動態にどのような変化が生じているのかを CALM

− 134 −

クラスリン集合因子 CALM 欠損マウスに見られる、毛や組織の色の薄さの解析

─細胞内物資輸送と体色との関連を探る─

欠損マウスで検討し、標的として扱う分子を決定する。グ

断できる時点までは相当数のホモ欠損体を得ることができ

ロビンやミオグロビンなどの色素タンパク質が最初の解析た。詳しい解析を安定して行うためにこの申請研究に向け対象になると予想している。このような計画を基に実験をて標準系統の C57BL/6 に戻し交配を行ったところ、誕生開始した。

後にホモ欠損体が全く出現しなくなってしまった。また姉
妹交配で維持していたマウスでも同様の現象が観察された。

2. 2. CALM 欠損培養細胞株の樹立と解析

このことは、CALM 欠損の効果に影響を及ぼすマウスの既に作成している CALM 遺伝子破壊マウスの胎児（14遺伝子（いわゆるモディファイヤー）の存在を示唆している。

日胚）から初代培養を行い、胎児の繊維芽細胞（MEF 細胞）

マウス作製に使用した ES 細胞は C57BL/6 と CBA マウ

を得、SV40 ウイルスの不死化遺伝子の T 抗原遺伝子を導スの雑種一代目に由来することから、現在 CBA マウスへ入し、CALM 欠損および野生型の株細胞を樹立した。樹の戻し交配を行っており、誕生するマウスの取得を目指し立した細胞株を用いて、初めに関与が推定される輸送機構ている。なお、我々とは独立に CALM 欠損マウスを作製の解析を、蛍光標識したトランスフェリンや EGF 等、クしたハーバード大のグループも CALM ホモ欠損マウスはラスリン依存性のエンドサイトーシスで取り込まれる分子生まれないとしていることから、我々が遭遇した事態は「あを取り込ませた後に、共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞内へる種のマウスの遺伝背景」によるものだと考えるのは妥当の取り込みに違いが無いかを解析する。マウスの解析からだと判断できる。

予想される色素に関して、その輸送に CALM の有無が効果を与えるか検討する。同様な解析を、メラニン合成細胞として知られる CALM 遺伝子破壊メラノサイトに関しても行う。

3. 2. CALM 欠損培養細胞株の樹立と解析
既に作成している CALM 遺伝子破壊マウスの胎児（14 日胚）から初代培養を行い、胎児の繊維芽細胞（MEF 細胞）を得、SV40 ウイルスの不死化遺伝子の T 抗原遺伝子を導入

2. 3. CALMノックダウンメラニン合成細胞株の樹立

し、CALM 欠損および野生型の株細胞を樹立した。樹立

さて、申請研究の提案を行った際にも CALM 欠損マウした細胞株を用いて、初めに関与が推定される輸送機構のスは離乳期以降にごくわずか存在するだけで、十分な解析

解析を、蛍光標識したトランスフェリンや EGF 等、クラを行うことができないことが問題と考えられた。また、生スリン依存性のエンドサイトーシスで取り込まれる分子を体のメラノサイトの単離培養とメラニン合成の測定はかな

取り込ませた後に、共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞内へのりの熟練を要することから、最初はマウスと平行して培養取り込みに違いが無いかを解析した。その結果、参考文献

細胞を用いたモデル系で実験も行うこととした。そこで、

1 に一部報告したように、従来の定説とは異なり、CALM

扱いやすさの点からメラニンを合成しているメラノーマ細がトランスフェリンの取り込みに重要であることを明らか

胞の B16C2M 細胞をモデル系として、CALM のノックダにした。一方、同じクラスリン依存性で取り込まれる増殖

ウンによるメラニン合成への効果を調べるためにノックダ

因子の EGF の取り込みには影響が見られないことを発見

ウン細胞株の樹立を試み、得た細胞株を用いてメラニン合した。現在、EGF に関しては細胞内への取り込み後の挙成と CALM との関連を解析した。

動に異常がないかを解析している。

2. 4. 新しい個体レベルでの解析系を目指して

3. 3. CALMノックダウン細胞の樹立

CALM 欠損マウスは交配を重ねることにより、生存率

CALM ノックアウト MEF 細胞では、増殖に問題がないの低下が著しいことが判明した。特に C57B/6 の遺伝背景

ことを確認していたので、ノックダウンは sh-RNA 発現ベ

では全く生まれてこないことを新たに見出した。今後の個クター HuSH（ORIGENE）を用いて、「CALM がノックダ

体レベルでの詳しい解析を目指して、新しくコンディショ

ウンされた B16C2M メラノーマ細胞株」を樹立することとナルノックアウトマウスの作製を検討するために標的部位した。

の解析を研究に加えることとした。加えて、発生後期の胚

CALM のノックダウンを目指して、sh-CALM-1 ～ 4 のの検討を行い、CALM と体色との関連を探る手がかりを

以下の配列を用いた。

得ることを試みた。

sh-CALM-1: GCCAGAGCCTGACGGACCGAATCACCGCG

３．結sh-CALM-2: GAGCAAGTTGGAATTGACAGAGGAGATAT果

sh-CALM-3: GAATGATGTAAGTTGGAGTCAACCAGGTG

3. 1. CALM 欠損マウスの色の薄さは何に由来するのか

sh-CALM-4: ATAATGACTGCACCAGCCATCGACATATT

マウス系統の樹立時には、離乳期以降に生存するホモ欠コントロールとして、空のベクターとランダムな配列の損マウスの数が少ないものの誕生後 1 週間ほどの体色が判

SC を導入した。

− 135 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図 2 に示すように、合計 61 個のクローンを得た。

パク質発現の低下が著しいクローン 2-9, 2-10, 3-1 と低下が最初に RT-PCR にて CALM のノックダウンの程度を検見られる 3-17, 3-4、あまり低下が見られない 3-11 のクローンが得られた。

討した。図 2 に示すように sh-CALM-2, 3 で良好なノック

これらのクローンを実験に用いることとし、液体窒素中

ダウンが見られたが、sh-CALM-1, 4 ではあまり効果が見に保存した。

られなかった。これは別の細胞系の BAF3 細胞を用いた場
合も同様の結果を得ていることから（未発表）、CALM の3. 4. CALM タンパク質の低下とメラニン合成との相関性の検討

ノックダウンには sh-CALM-2, 3 の配列が有効であると考えられる。
良好なノックダウン効果が見られた 7 つのクローンに関

スクランブル コントロールを導入した株、sh-CALM-2、して、再度確認実験を RT-PCR にて行った。結果を図 3A

sh-CALM-3 を導入した株、親株、CALM の発現検討の対に示す。

照として我々が作製した CALM KO MEF 細胞と CALM

うち 6 クローンに関してウエスタン法で CALM タンパ

WT MEF 細胞を用いた解析を行った。

ク質の発現を検討した。図 3B に示すように、CALM タン

まず、選んだ細胞株の CALM 発現をウエスタン法で確認した。
図 4 に示すように、向かって左側の B16C2M 細胞の KD
１はスクランブル コントロールを導入した株、KD4 は shCALM-2 を導入した株、KD5 は sh-CALM-3 を導入した株、WT は親株 B16C2M である。ウエスタン法のコントロールとして用いた MEF 細胞では、WT は CALM WT MEF 細胞、
KO は CALM KO MEF 細胞である。KO でバンドが検出されないことから抗体の特異性が確認できる。
sh-CALM-2 を導入した株（KD4）と sh-CALM-3 を導入した株（KD5）では CALM タンパク質の発現が低下していた。
一方で、スクランブル コントロールを導入した株と親株

図2では CALM タンパク質の発現が見られた。検出している

図3

図4− 136 −

クラスリン集合因子 CALM 欠損マウスに見られる、毛や組織の色の薄さの解析

─細胞内物資輸送と体色との関連を探る─

バンドが CALM（2 本のバンド）であることは、CALM

文献 2 で明らかにした CALM の NES（核排出）配列の欠損

WT MEF でバンドが検出され、CALM KO MEF で検出による効果の検討を、樹立した CALM 欠損細胞を用いてされないことから判断できる。また β- アクチンのバンド

変異体でのレスキュー実験を開始している。

から、KD4, KD5 の CALM のバンドが KD1 や WT に対し現在までに、2 種類知られている CALM のアイソフォームのいずれでもトランスフェリンの取り込みが回復するこての薄いことが確認できる。
次に、細胞を沈殿させ沈殿の色を比較した。

とを確認している。現在 NES 変異体の作製を試みようと

図 5 に示したものが結果である。１はスクランブル コ

している。

ントロールを導入した株、2 は sh-CALM-2 を導入した株、尚、現在保有している CALM 欠損マウスは誕生直後に死亡すると推察される。そこで、誕生前の発生最終期の胚

3 は sh-CALM-3 を導入した株である。
この結果と先の CALM タンパク質の発現解析とからは、
CALM の発現が低下している B16 細胞では細胞の色が親での解析ができないかを検討している。
E18.5 日胚を解析したところ、図 7 に示すように CALM
欠損胚では目の黒味が低下している（1, 2, 3 の番号を付し

株の黒から白っぽくなっていることが分かる。
メラニン合成細胞は黒色を呈することから、CALM のたホモ欠損体の目は、黒い色が薄くなっている）ことを見発現量とメラニン合成とに何らかの関連があることが推察出している。今後は、E19.5 日胚と誕生直後の胚（P0）を解できる。

析して、見出した目の色の薄さを手掛かりに、マウス個体

さらに、この色の変化がメラニン合成の低下によるもの
かを、吸光度によるメラニン量の測定を行い検討した（図を用いた CALM と色との関係を解析できないかを検討したい。

6）。１はスクランブル コントロールを導入した株、2 は

４．考

sh-CALM-2 を導入した株、3 は sh-CALM-3 を導入した株である。傾向として、CALM の発現が低下している細胞ではメラニンの含量が低下しているように見える。

察

これまでの研究期間に、予想したもの、予想しなかったものを含めて以下に述べる成果を得ている。
（1）CALM 遺伝子の機能を修飾する遺伝子（モディファイ

3. 5. 新しい個体レベルでの解析系を目指して

アー）の存在を示唆する結果を得た。

申請者が作製した KO マウスでは、発生初期から全身で（2）戻し交配により（1）の仮説の検証を行う準備ができた。

CALM が欠損している状態での解析しかできなかったた（3）CALM 欠損培養細胞株として MEF 細胞株を樹立し、め、前述のように注目しているメラノソームでの解析が困

いくつかの新しい知見を得た。

難になっている。参考文献 2 の白血病との関連や、参考文（4）メラニン合成への CALM の効果の有無を調べるツール

献 4 のアルツハイマー症との関連の解析を行う際にも、同として、CALM がノックダウンされた B16C2M メラノ様の「解析前に個体が死亡してしまう」という問題を抱えてーマ細胞株の樹立に成功した。さらに CALM タンパクいる。より詳しい解析には発生が終了したのちに注目する

質量の低下とメラニン合成量の低下とに相関があること

組織や細胞特異的に CALM を欠損させて解析する必要がを見出した。

ある。そこで、CALM 欠損の効果を解析するために新し（5）メラノサイトレベル、個体レベルでの解析を可能にすく cKO マウスを作製するために設計を行っている。参考ると期待される CALM のコンディショナルノックアウ

図5

図6

図7

− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

トマウス作製に向けた一歩を踏み出した。

G proteins and their regulators: roles in membrane（6）CALM 欠損 E18.5 日胚の解析から、CALM 欠損胚では目の色が薄いことを見出し、マウスを用いた解析の可transport, development and disease, Nat. Rev. Mol. Cell
Biol. 12, 362-375.
３）E. Mizuno-Yamasaki, F. Rivera-Molina, P. Novick.

能性を見出した。

(2 0 1 2) GTPase networks in membrane traffic, Annu.
CALM 欠損マウスが生まれなくなったのは予想外であRev. Biochem. 81, 637-659.

ったが、新しい修飾遺伝子の存在が明らかになり、今後の４）Militello R, Colombo MI. (2 0 1 3) Small GTPases as

解析への期待が持てた点は良かった。このために、当初のregulators of cell division. Commun Integr Biol. 6,計画を若干変更してメラノーマ細胞を用いて CALM がノ

e25460. doi: 10.4161/cib.25460.

ックダウンされた B16C2M メラノーマ細胞株の樹立に成５）Seixas E, Barros M, Seabra MC, Barral DC. (2 0 1 3)

功し、CALM タンパク質量の低下とメラニン合成量の低Rab and Arf proteins in genetic diseases. Traffic. 1 4,
871-85. doi: 10.1111/tra.12072.

下とに相関があることを見出したことは、今後の解析にとり大きな進捗であった。また予想外の障害を乗り越えるべ６）Mizuno-Yamasaki E, Rivera-Molina F, Novick P.

く、将来的に重要になると思われるコンディショナルノッ

(2 0 1 2) GTPase networks in membrane traffic. Annu

クアウトマウス作製へ向けた一歩を踏み出せたことは、研Rev Biochem. 8 1, 6 3 7-5 9. doi: 1 0.1 1 4 6/annurev-

究の進展にとって良かったと思いたい。加えて、CALM

biochem-052810-093700.

欠損 E18.5 日胚の解析から、CALM 欠損胚では目の色が薄７）Donaldson JG, Jackson CL. (2 0 1 1) ARF family G

いことを見出し、マウスを用いた解析の可能性を見出した。

proteins and their regulators: roles in membrane

今後の課題としては、見出した「CALM の発現量が低下

transport, development and disease. Nat Rev Mol Cell

するとメラニン合成が低下する」という相関関係は因果関

Biol. 12, 362-75. doi: 10.1038/nrm3117.

係となり得るのかと言う点がまず解決すべき点である。こ８）M. Suzuki, H. Tanaka, A. Tanimura, K. Tanabe, N.

のために、KD 細胞への CALM 遺伝子導入による CALM

Oe, S. Rai, S. Kon, M. Fukumoto, K. Takei, T. Abe,

発現復帰体でのメラニン合成の回復の有無を検討する予定

I. Matsumura, Y. Kanakura, T. Watanabe. (2 0 1 2)である。さらに、CALM 低下によるメラニン合成低下のThe mouse clathrin assembly protein PICALM is

分子メカニズムを探るために、まずはメラニン合成系酵素

required for erythroid maturation and transferrinの動態を探ることを計画している。加えて、CALM 欠損

internalization. PLoS ONE, 7(2): e3 1 8 5 4. doi:1 0.1 3 7 1/

E18.5 日胚の解析から、CALM 欠損胚では目の色が薄いこjournal.pone.0031854とを手掛かりに解析が行えるかの検討を計画している。

９）鈴 木 麻 衣、 渡 邊 利 雄 (2012) ク ラ ス リ ン 集 合 因 子
CALM はトランスフェリンの取り込みに必要で、欠損謝辞は貧血を引き起こす。－培養細胞研究での定説を覆す－

本財団より受けた助成金が研究の一部を担った参考文献
10, 11 では、Cosmetology Research Foundation よりのサ

細胞工学

31 巻

7 月号

808-809. HOT PRESS

10）M. Suzuki, K. Yamagata, M. Shino, Y. Aikawa,
K. Akashi, T. Watanabe, I. Kitabayashi. (2 0 1 4) The

ポートがあったことを明記した。

nuclear export signal (NES) within CALM is necessary（参考文献）

for CALM-AF1 0-induced leukemia. Cancer Science.

１）M. Ishida, N. Ohbayashi, Y. Maruta, Y. Ebata Y,

105, 315-323.
11）K. Kanatsu, Y. Morohashi, M. Suzuki, T. Watanabe,

Fukuda M. (2012)
Functional involvement of Rab1A in microtubule-T. Tomita, T. Iwatsubo. (2 0 1 4) Decreased CALM

dependent anterograde melanosome transport inexpression modulates Ab4 2 production throughmelanocytes. J Cell Sci. 1 2 5, 5 1 7 7-8 7. doi: 1 0.1 2 4 2/

clathrin-mediated endocytosis of g - secretase. Naturejcs.109314.

Communication DOI: 10.1038/ncomms4386.

２）J.G. Donaldson, C.L. Jackson. (2 0 1 1) ARF family− 138 −

グローバル時代のハラールと化粧に対するモロッコの人々の意識と行動─日常生活における宗教規範と美の実践─
松蔭大学観光メディア文化学部

川添裕子

The purpose of this study is to contribute to the socio-cultural knowledge of cosmetology by exploring the halal-certified
system and Muslim consumers’ perceptions regarding notions of halal and beauty practices in Morocco. The term halal means“lawful” or “allowed” according to Islamic Law. The global halal market has gained a lot of attention because of the universal
rise in the number of Muslims. If a product is marked “halal,” this means that the materials, products, and process facilities ofthe products have been subjected to approved certification systems and that they provide consumers with a guarantee that no
forbidden components are present. All Muslims and non-Muslims who value traceability and high-quality products are expected
to be the new consumers of these products. The data for this study was derived mainly from ethnographic fieldwork researchin 5 Moroccan cities in March 2014, including discussion with about 130 students, a preliminary questionnaire administered to
116 students, and face-to-face interviews with several persons involved in the certification system, as well as scholars.
The Moroccan government established a halal-certified system for foods in July of 2012. Halal-certified cosmetics
and personal care products had no approval system in place at first, but three months after my fieldwork, it was instituted.
Producers and makers who desire a halal logo have to contact IMANOR (Institut Marocain de Normalisation) for aninspection. It can help the procedures in Morocco if the cosmetics in question already have ISO 22716 (Cosmetics Good
Manufacturing Practices) certification or have been approved by such certification institutions as JAKIM (Department ofIslamic Development Malaysia). The government has approved the halal industry as being economically profitable, but
most Moroccan consumers do not know that Morocco has entered this new industry. They believe that “every Moroccan
product is halal,” so they are not worried about halal as long as they are in Morocco. Besides, people care about whether
or not food is halal rather than cosmetics and personal care products, so they use homemade, co-op, and big name brandcosmetics. There are also some people who consider cosmetics “haram (forbidden acts according to Islamic Law)” .
Thus, the reaction toward halal-certified cosmetics is split. Some people regard selling them as an opportunity foreconomic growth or as a chance to start a business. Other people regard halal-certified cosmetics as excessive consumerism,
believing them to be a capitalistic exploitation of religious norms. Companies that emphasize social responsibility can workon this point. An association of women in argan oil producing areas, for example, has attempted to raise awareness aboutsustainable development by promoting such concepts as environmental protection, literacy education, and so on. Now, morethan 200 associations display an awareness of natural resources in their manufacturing processes. Likewise, promoting halalcertified cosmetics and personal care products can be promoted as a form of social responsibility as well.
Halal business can provide an opportunity to deepen mutual understanding between Muslims and non-Muslims, on one
other hand, while running the risk of emphasizing the differences between the two, on the other. At the same time, the gap
between the rich and poor is inherent in it. Nonetheless, halal-certified cosmetics and personal care products are in demand
as a mechanism that ties religious ethics to business ethics even more strongly than organic products and halal-certified food.

１．緒が存在することも珍しくなく、「ISO（国際標準化機構）」

言のような国際規格はない。このように複雑な面もあるが、イスラーム圏の経済成長とムスリム人口増加を背景に、
1）

ムスリム消費者だけでなくトレーサビリティや高品質を求「ハラール（halal）」認証商品が注目されている 。ハラール

める非ムスリム消費者も取り込めるとあって、食品を中心とは、イスラーム法で合法的な、許されたものという意味に様々な分野で新たな市場の形成が期待されている。化粧である。グローバル経済を背景に成立したハラール市場で品・パーソナルケア商品についても東南アジアを中心にハ流通する商品は、材料、加工法、包装、保存、輸送などのラール認証を受けたものが販売されており、コスメトロジ

全行程がイスラーム法に即していると、ハラール認証機関ーとして関連知識と現状を把握しておく必要がある。

から保証されたものである。このハラール認証機関は世界
中に 130 以上ある（2014 年 3 月）
。国内に複数の認証機関

そこで本研究は、イスラーム圏のモロッコ王国を事例に、日常のハラール意識、認証制度としてのハラール、化粧実
践と化粧品原料、ハラール認証の化粧品・パーソナル商品に対する反応について検討した。

Consumers’
Perceptions Regarding Halaland Cosmetics: The Halal- Certified
System in Morocco
Hiroko Kawazoe
Faculty of Tourism, Media, and Cultural
Studies, Shoin University

２．調査・実験
2. 1. 調査対象者
主な調査対象者は、学生（大学、外国語学校）、ハラール
認証制度関係者（モロッコ標準化機構 2）、厚生省医薬局 3）、− 140 −

グローバル時代のハラールと化粧に対するモロッコの人々の意識と行動─日常生活における宗教規範と美の実践─

食品安全局 4）、産業省）、業者（小売店、ハラール認証食品
加工業）
、専門家
（大学、外国語学校、アラブサイエンスリ
サーチセンター）である。

2. 2. 調査方法と環境
図1

2014 年3月 8 日− 3月 30 日、モロッコのラバト、カサブ

ハラールマーク（モロッコ標準化機構の HP より）

ランカ、フェズ、アガディールの五都市で、ディスカッシ
ョン（ 3 国立大学と 2 外国語学校の計 7 クラスの受講者約

3. 1. 2. ハラール認証制度

130 名、中心は 20 代）、インタビュー（認証制度関係者、

ハラール認証制度は、モロッコ標準化機構が中心となり、業者、専門家）、参与観察を行った。なお事前に現地日本諮問委員会、専門家、消費者団体、ウラマー最高評議会 5）、語教師に予備的アンケート実施を依頼した（フランス語版

企業、試験所、そして食品なら食品安全局、化粧品なら厚とアラビア語版を作成、日本語学習者 116 名から回答、本生省医薬局などが横断的に関わる。2012 年 7 月から食品

稿ではフランス語版の 86 名分を集計、中心は 20 代）。調のハラール認証が始まり、調査時点で 16 社が認証を受け査倫理は「日本文化人類学会」倫理綱領を遵守する。

た商品を輸出していた。化粧品については筆者の調査終了

３．結から 3 ヶ月後に認証制度が整った。

果

ハラール認証を望む化粧品メーカーは、モロッコ標準化

3. 1. ハラールと認証制度機構に申請書を提出し、該当商品の材料や添加物、生産過

3. 1. 1. 日常生活のハラール意識

程から流通までがハラールかどうかの審査を受ける。当該

モロッコは国民のほとんどがムスリムということもあり、化粧品が「ISO22716（化粧品優良製造規範）」や、マレーシ

人々の間には「国内産の食品は全てハラール」という認識がアやインドネシアのハラール認証を取っていれば、モロッ

共有されていて、国内にいる限りは気にする必要はないと

コ内でのハラール認証はスムーズにゆくと説明を受けた。

考えられている。グローバルなハラール市場の展開につい

手続き費用は実費に近い印象を受けたが、審査に合格するては、知らなかった人がほとんどで、自分たちの生活にはための設備投資や人件費なども必要になる。さらに 3 年ご

無関係とみなす人もいた。さらに認証制度という形式が、とに更新の審査を受けなければならない。

従来からの人々の消費スタイルには馴染まない面も垣間見

モロッコは化粧品原料に恵まれながらも原産地にとどまってきた。ハラール認証の化粧品・パーソナルケア商品は、えた。あるムスリム女性は以下のように語っている。

イスラーム圏でかつ高品質の天然資源があるモロッコの強モロッコでは、ラベルやマークなんかよりも、昔からみを発揮することができる。関係機関の担当者は、モロッの知り合いや親戚から買ったり、信用できる口コミを頼コブランドへの期待とあわせて、外国企業工場誘致にも積りにする。

極的な姿勢を見せていた。
いち ば

人々は、迷路で有名な市場（スーク）でも、それぞれ馴染

3. 1. 3. 宗教倫理とビジネス倫理の接合

みの店を持っている。同様の意見は他の人からも聞いた。

ハラール認証制度においては商品製造から販売までの全

一方で伝統的な顔がみえる商いは、スーパーの普及やイン過程が書面化され厳密化される。ムスリムが守るべき倫理

ターネットの到来で変化もしてきている。特にネットを駆という側面は、厳格な手続きのみに回収されてしまうのだ

使できる若者は、親の世代より成分といった商品知識にもろうか。
こうした疑問に対して、ベビーフードなどを製造するア詳しい。上記の女性は次のようなことも述べている。

グロフード社は一つの方向性を示している 6）。同社商品は、
私はスーパーでもさっさと買い物をするけれど、子供

モロッコ標準化機構とフランスの「AVS：A Votre Service」

は賞味期限とか裏のラベルを良く見てから買っている。

からハラール食品と認定され、国内および海外 23 ヶ国に輸出されている。興味深いのは、市民活動の一環として収若者たちは、それまでの世代とは異なる生活スタイルを

益の一部を国内の孤児支援に回していることである。共同持っている。その中にはモロッコ産だからといって全てが経営者の一人でフランスからモロッコに移民したフィリッ

ハラールとは限らないと述べる人もいた。ハラール認証商

プ・シャロ氏は次のように述べている。

品は、彼らに高品質商品とムスリムというアイデンティテ
ィを保証するものでもある。

私たちの顧客は裕福な階層だが、その利益の一部を貧しい人たちに還元したい。孤児の支援はその一つ。ここ− 141 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015では婚姻外で子供を出産した場合に母親が一人で育てる（中略）〜私たちを受け入れてくれたこ
ことは難しい。〜の国への恩返しだし、市民として、ムスリムとしての実践だ。
シャロ氏のいうムスリムとしての実践は
「喜捨」
と呼ばれ、
困っている者を助ける、「アッラー（唯一神）」に感謝し、
自分自身や自分の財産を浄める、という意義がある。
ハラールという概念は、ムスリムとして守り行うべき宗教倫理である。現地調査時点ではハラール認証の化粧品・
パーソナルケア商品はまだ出回っていなかったが、アグロ

図 2 コホル（アンチモン表面の粉と他の成分を混ぜたものとされる）

私たちアラブの女性は、他の人たちから毛深いと思わフード社のようにビジネス倫理が発揮されれば単なる付加価値やマーケティングを越える動きになっていくだろう。

れている。嫌だぁ〜。

3. 2. 化粧実践と化粧品資源の活用

一同が笑いに包まれる中で様々な処理法が紹介された。

3. 2. 1. スキンケア、ヘアケア、メイクアップ

眉毛は抜いたりしてはいけないという声もあったが、眉と化粧や身嗜みに関してしばしば引用されるイスラームの眉が繋がるのは嫌がられていた。体毛の処理については、

規範は、イスラームの聖典「クルアーン（コーラン）」とイス

近代化以降の美の観念の変化やジェンダーの多様性からのラーム伝承集成「ハディース」
である。

分析もあるので今後検討を要する 7）。
メイクアップについては、「ハラム（haram：イスラーム

それから女の信仰者にも言っておやり、慎しみぶかく法で禁止された行為）」とみなす人、礼拝前の清めの時に取目を下げて、陰部は大事に守っておき、外部に出ているるという人、メイクしている場合は礼拝自体を遠慮すると部分はしかたがないが、そのほかの美しいところは人にいう人もいて一様ではない。街中でも、化粧をしていない

見せぬよう。胸には蔽いをかぶせるよう。〜後略〜。

女性からしっかりしている女性まで差がある。アンケート

おもて（井筒俊彦訳『コーラン』（中）、光り 31、岩波文庫）

では薄化粧派が三分の二以上だった（図 16）。この結果を自然志向とみることも可能だが、女性の社会進出に伴う現あごひげを伸ばすこと象という見方もある。女性の外出が稀だった時代は派手に（一）イブン・ウマルによると、神の使徒は「口ひげを短化粧して出かけたが、外で働くことが普通になってくるに

く刈り、あごひげは長く伸ばせ」と命じた。

従って薄くなってきたというのである。黒いアバーヤなど（牧野信也訳『ハディース』（V）、衣服 65（一）
、中公文庫）

で目と手足の先以外を覆っている女性に話しを聞く機会はなかったが、不特定の人に顔を見せないからこそ派手な化

これらは信者一人一人が理解力を尽くして読解すること粧も可能だという指摘があった。化粧の中でも、伝統的なを期待するものでもある。したがって人々の認識や実践は

コホル（図 2）は、アイラインやマスカラなどの化粧用だけ

均一ではない。特にイスラーム、アラブ、先住民ベルベル、でなく、眼病予防としての医薬品、邪視から守る魔除けにヨーロッパの文化の影響を色濃く受けてきたモロッコは多用いられてきた。現在は、アイライナー、マスカラ、アイ様である。都市部では、ヴェール（ヒジャーブ）を被っていシャドウ、付けまつげ、まつげ美容液などが広く流通してない女性たちも少なくないし、ヒゲを全部剃っている男性いる。アンケートでも、女性たちのアイメイク用品の利用もいる（図 18）
。人々は、宗教的立場、社会体制、世界情勢、がわかる（図 12）。

職業、男らしさ・女らしさ、流行、セックスアピール、世化粧品・パーソナルケア商品の製造は大まかに、個人の代、体質など、様々な要因を配慮しながら外見を整えてい

手作り、メーカー、協同組合の三つに分けられる。手作り

る。

は、自ら栽培したか市場で購入した材料から作るもので、薄毛や縮毛などヘアケアはヴェールの着用や性別に関わ家族や親しい人たちの間での楽しみになっている。メーカ

りなく、関心が高いことが窺える。またムダ毛も悩みの種

ーは国内化粧品会社よりヨーロッパ系ブランドが目につくになっていることが垣間見える。たとえば訪問先の日本語が、その中にはモロッコ産原料から作られたものもある。

クラスがたまたま女性だけになった時、20 代の女性が次

欧米での生活経験もある 50 代女性は以下のように述べてのような本音を吐いた。

いる。

− 142 −

グローバル時代のハラールと化粧に対するモロッコの人々の意識と行動─日常生活における宗教規範と美の実践─

母の世代は伝統的な化粧品を使っていた。私の世代は若い頃からフランス製やスペイン製を使ってきた。でも自分の国の原料でできていることがわかった。つまり実際はモロッコ製。だから最近はモロッコ製のものに戻ってきている。
自分たちで資源の採取から商品化まで行う協同組合は、
上記のような声に応えるものである。同時に、次項で述べるように資源保護や女性の地位向上まで視野にいれた社会活動となっている。

図 3 ヘンナ（指甲花からできた染料。彩色の他、熱冷ましや魔除けや結婚式などに利用されてきた。日本でもオーガニッ
クの白髪染や消せるタトゥとして販売されている）

伝統的な市場には量り売りの黒石鹸やヘンナ（図 3、17）、
中国産の安価な化粧品類、協同組合製の商品などが所狭しと並んでいる。化粧品店やスーパーマーケットには協同組合製商品の他、世界的化粧品メーカー商品、大手スーパー
マーケットチェーンの自社ブランド製品などが置いてある。
調査に協力してくれた大学生たちはもっぱらスーパーマー
ケットで販売されている商品を購入していて、市場で販売される化粧品・パーソナルケア商品に対しては質に疑念を抱いていた。
3. 2. 2. 化粧品原料活用の光と陰ここでは、モロッコ特産のアルガンオイルを例に化粧品
原料の活用について考えたい 8）。アルガンオイルは、古く

図 4 アガディールにある協同組合製商品を販売する店の実演
コーナー

から先住民ベルベル人が利用してきた。現在は、食用および美容資源として世界的にも有名で、海外の大手化粧品メーカーが化粧品原料として買い付けている。生産者にとっては現金収入になるが、安価で買い取られるので利益率は低い。アルガンの木の絶滅も危惧されていた。このような状況の改善を目的に、1996 年ムハンマド五世大学のシャルーフ教授がアルガンオイルの産地で女性の協同組合による製造をはじめた 9）。協同組合形式の生産は、製品の質向
上や環境保護だけでなく、産地の女性たちの職業研修や識字教育などを実現し、各地に広がっている（図 4、5）。
さて化粧品資源の新しい利用には、陰の面も見えてくる。
天然やオーガニックを全面に出して洒落た容器に詰めれば

図 5 カサブランカの「Maroc Taswiq」では様々な協同組合で作られた商品が購入できる同じ化粧品材料も値段が跳ね上がる。このような高額化粧する人々の反応品に対しては以下のように冷ややかな目もある。

前に述べたように人々の間には「国内産は全てハラール」
10 倍の値段をつけて販売している。店主は儲けに目という認識が共有されている上に、意識するのは食品である。

が眩んでしまったかのようだ。
何、それ？
ハラール認証の化粧品・パーソナルケア商品は宗教倫理に基づくため、こうした反発はオーガニック化粧品より強くなる可能性がある。

ハラール認証の化粧品・パーソナル商品に対しては、まだ流通していなかったこともあるが、大方の人はこう言って首をひねったり、中には吹き出す人もいた。ただしこれ3. 3. ハラール認証の化粧品・パーソナルケア商品に対まで意識してこなかったことへの驚きを表現する女性たち− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

もいた 10）。

は、高品質商品やサービスのために均質化された正確さを追求する。一方モロッコには職人のモノ作りも根強く残っこれまで考えたこともなかったけれど、言われてみれていて、それがモロッコの文化を特徴づけてもいる。世界ば肌に吸収している。特に口紅は口から摂取しているの的な標準化の流れと、従来のモノ作りがどう共存していくも同じこと。どうして今まで気づかなかったのか。

のかという問題もみていく必要がある。
ハラール認証の化粧品・パーソナル商品に対しては、ハ

ネイルは若い女性たちに人気が出始めていたが、メイクラール認証食品には向けられない否定的な意見もあった。

アップ同様、マニキュア自体を良くない
（ハラム）
とみなす
人、清めがきちんとできるように礼拝前に取るという人、肌から吸収されるとはいっても、肉のように口から摂マニキュアをしている時は礼拝を遠慮するなど相違があり、取するのとはレベルが違う。ハラール化粧品は必要ない。

イスラーム法学者などの判断を待っている状態だった。こ
ハラール化粧品は、宗教的というより単なる市場主義

うした状況を反映してか、調査終了後には水の透過性や通気性が良いとうたった商品が中東、ヨーロッパで販売されが生み出した結果。踊らされるのは馬鹿げている。

はじめた。
さて、グローバル市場におけるハラール認証商品の展開、同様の批判的見解は学生や研究者など複数から聞いていモロッコにおける認証制度の進展を知った後の反応は次のる。それまでの価格が数倍から数十倍になれば儲けは多く二つに分かれる。まず肯定的な意見から紹介しよう。

なるが庶民には手が出なくなる。ハラール認証の化粧品・
パーソナルケア商品はハラール産業の申し子のような存在

ハラール認証商品は、モロッコ国内の経済活性化の起であるため、倫理的概念が単に金儲けに利用されるという印象がことさら強くなる。前に紹介したアルガンオイル協

爆剤になりうる。

同組合やアグロフード社のようにビジネス倫理の構築が求
若者人口が多い割に雇用の受け皿となる自国産業が少なめられる。

いために、男女とも上記のように考える人がいた。また現地の日本人日本語教師からは、ハラール産業を契機に日本

3. 4. 予備的アンケート結果

企業が誘致されて教え子の雇用先が広がることを望む声も現地調査に先立ち、ハラールと化粧に関する予備的アン聞かれた。正則アラビア語、モロッコ方言アラビア語、フケートをフランス語とアラビア語で作成し、モロッコ在住

ランス語、英語、スペイン語、日本語など多言語を操るマ

日本語教師を通して日本語学習者に実施してもらった。参ルチリンガルは、日本企業にとっても強みとなりうるだろ

考までに以下に紹介するが、フランス語版とアラビア語版

う。さらに認証制度は、製品だけでなく働き方の質もあげ

で質問肢に若干の相違が生じたため、ここではフランス語

るとの期待も聞かれた。確かにハラール認証などの標準化版（86 名分）の回答結果を抜粋する（図 6 〜 18）。

図6

アンケート対象者の性別（単位：人、以下同）

図7− 144 −

アンケート対象者の年代グローバル時代のハラールと化粧に対するモロッコの人々の意識と行動

図8

─日常生活における宗教規範と美の実践─

図 9 Q.1：次のような状況の時、あなたはハラールを意識しますか（複数回答可）。それとも全く気になりませんか。

アンケート対象者の宗教

図 10 Q.2：次のようなスキンケア用品を使ったことはありますか（複数回答可）。

図 11 Q.3：Q.2 のスキンケア用品を使う理由と目的を次の中から選んでください（複数回答可）。

図 12 Q.4：次のようなメイクアップ用品を使ったことがありますか（複数回答可）。

図 13 Q.5：Q.4 のメイクアップ用品を使う理由と目的は何ですか（複数回答可）。

− 145 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図 14 Q6：あなたが使っているスキンケア用品とメイクアッ
プ用品はどういうところで製造されたものですか。メーカー
名も教えてください（本稿ではメーカー名省略）。

図 15 Q7：外国製スキンケア用品とメイクアップ用品についてどう思いますか。次の中から選んでください。

図 16 Q.8：女性の化粧についてどう思いますか。次の中から選んでください。

図 17 Q.9：ヘンナをすることはありますか。次の中から選んでください。

図 18 Q10：あなたはどのようなヒゲのスタイルが好みですか。
次の中から選んでください。

− 146 −

グローバル時代のハラールと化粧に対するモロッコの人々の意識と行動

４. 考─日常生活における宗教規範と美の実践─

をモロッコ経済の活性化やビジネスチャンスと捉えるもの察である。一方、ハラール化粧品を行き過ぎた資本主義の結

みてきたように、モロッコは食品に続いて化粧品・パー

果と批判的に見る人もいる。ハラール産業の申し子ともい

ソナル商品のハラール認証制度を整えた。ハラール認証をえるハラール認証の化粧品・パーソナル商品には、宗教を望む化粧品メーカーは、モロッコ標準化機構に申請書を提ビジネスに利用する利益至上主義的印象がことさら強くな出し、原材料、添加物、生産から流通までの全過程がハラる。この点で、喜捨として社会貢献活動を行うハラール食ールに適合しているかどうかの審査を受ける。当該化粧品品業者や女性の識字教育活動や職業研修なども目指すアルが既に ISO22716 や、マレーシアやインドネシアのハラー

ガンオイル協同組合の活動は参考になる。ハラール認証のル認証をとっていれば、モロッコでのハラール認証はスム

化粧品・パーソナル商品には輸出促進や新たな消費者発掘ーズに進む。

などの可能性があるが、宗教倫理をビジネス倫理につなげ

こうした制度的な進展は、国内のムスリム消費者にはほとんど知られていなかった。ディスカッションやインタビる仕組みがハラール認証食品やオーガニック化粧品より以上に求められる。

ューでは 、「国内産は全てハラール」という認識が共有されている上に、ハラールかどうかを意識するのは食肉などの食品であって、化粧品・パーソナルケア商品はほとんど「ハラール認証の化粧品・パーソナルケア
１）川添裕子：意識されていなかった。人々は手作り、協同組合製、メー商品」と消費行動（１）、松蔭大学紀要、18 号、123-137、

カー製の化粧品類を利用している（図 14）。中でもスキン2015 他。

ケア用品はモロッコ産の原料から作られたものも人気があ２）Institut Marocain de Normalisation.

った。ヘアケアについては男女ともにかなり関心が高いこ

３）Médicaments et Pharmacies, Ministère de la Santé.

とが窺えた。メイクアップとネイルに関しては、禁止されOffice National de Sécurité Sanitaire des Produits
４）L’

た行為とみなして一切するべきではないという人、きちん

Alimentaires.

と清めができるように礼拝前に取るという人、あるいはメ

５）Le Conseil Supérieur des Oulémas.

イクやマニキュアをしている時は礼拝を遠慮するという人

６）Agro-Food Industrie.

がいて判断は一様ではない。メイク用品はもっぱらメーカ７）Najmabadi,A., Women with Mustaches and Menー製のものが用いられている。都市部ではしっかり化粧しwithout Beards, University of California Press 2005.

ている女性も見かけるが、調査では薄化粧を支持する人が

８）モロッコ南西部大西洋岸の乾燥・半乾燥地域に自生す一番多かった（図 16）。また伝統的な化粧品コホルの影響る樹木の果実から得られる。

もあってか、女性の中にはアイメイクへの関心の高さが窺

９）Zoubida Charrouf 氏。

える（図 12）。目と手足以外を覆う真っ黒いアバーヤの女

10）事前に実施した予備的アンケートでは、ハラールを意

性はお洒落と無縁のようにみえるが、隠れているからこそ識する時として「外国滞在中」「外国食品を摂る時」に加

派手な化粧をすることもできるという指摘もあった。なお

えて「外国製品を使う時」にチェックした回答者がいたが調査終了後に中東、ヨーロッパで水の透過性や酸素通気性（図 9）、回収が遅くなったため、具体的にどういう製品をうたったマニキュアが売り出された。

なのかは確認できなかった。“外国”という言葉への反応、

ハラール市場に対する消費者の反応は大きく二つに分かれる。肯定的な意見は、化粧品を含めたハラール商品全般

アンケート目的（ハラール認証化粧品）に影響された可能性も含めて、次回の現地調査の課題としたい。

− 147 −

嗅覚（芳香）刺激量が与える自律神経機能の経時的変化

慶應義塾大学医学部耳鼻咽喉科学教室

神崎晶

The olfactory epithelium includes the odorant receptors which connects adrenergic nerve fibers. Change occurs in theautonomic function by olfactory stimuli, symptoms appear in the circulatory system, such as a pulse.
However, a strong sense of smell has individual subjective elements and, it is difficult to be evaluated. Therefore, it
is considered that if it is possible to observe a functional change in the autonomic nervous system involuntary, such asparasympathetic and sympathetic, highly accurate diagnosis can be done. It is considered that, it is compared to the responseof Parkinson's disease by knowing the response of the autonomic nervous against odors variety of healthy subjects.
In this study, when it was in healthy subjects sniff the fragrance of the rose-like odor which is generally good smell, theactivity of the autonomic nerves was increased. Further, when it was smell the odor of feces (skatole) like that are generally
malodorous, it was found that the activity of the autonomic nerves is greatly enhanced, and the parasympathetic dominance
yet.

１．緖

変化が生じていることが判明している。一般に良い嗅気と言されるバラ様の嗅気は自律神経の活動を亢進させ、また、嗅覚には解剖学的に自律神経との関連性も報告されてい一般に悪臭とされる糞様の臭気は自律神経の活動を亢進さ1）る 。嗅覚刺激は嗅上皮に存在する嗅細胞の嗅覚受容体をせ、副交感神経を優位に亢進させることが分かった。グレ通じ中枢に情報伝達される。ところが、最近の研究により、ープフルーツの嗅気では交感神経を優位に活発化させる 9）

嗅上皮には嗅覚受容体のみならず、交感神経終末のアドレ

等、自律神経に様々な効果を与えることがすでに判明してナリン受容体や副交感神経終末のムスカリン受容体が存在いる。これらの知見をふまえて、神経疾患を有する患者にすることが分かってきた。そのため健常者において、嗅覚

対して嗅覚刺激を曝露させることで自律神経機能を測定す

刺激によって自律神経の活動を亢進および抑制されることることが臨床的にも有用であることが解明されつつある。

が考えられる。

２．実

一方、パーキンソン病（Parkinson disease）では、一番早期の非運動性の症状として嗅覚障害が見られる。この症状はパーキンソン病の初期段階（early stage of PD）の患者

験《方法》
2. 1. 被験者の自律神経機能の確認の約 90 ％が発現し、また、運動性の障害に先行して生じる。

まず初めに、被験者に自律神経機能に異常があるかどう

そのため、今回様々な香りの試薬を用いて嗅覚刺激を健かを予め把握するため、被験者に脈圧計を付け、起立性低常者に対し行い、その自律神経機能の反応を見る。有意な血圧に陥るかどうかの試験を行った。

反応が見られれば、嗅覚障害がないパーキンソン病の患者

被験者の左上腕にカフを装着し、座位 2 分間→立位 2 分の補助診断にこの検査方法が貢献できると考えられる。

間→座位 1 分間の動作を取ってもらい、座位安静時、立位

また、男女ともに同性用香水では自律神経活動が亢進、

瞬間時、立位安静時、座位瞬間時、座位安静時 2 回目の脈

異性では副交感神経活動が亢進した。また天然のラベンダ圧を測定し、交感神経系、副交感神経系の機能の測定を行ーでは人工のそれより自律神経活動を抑制しえた。

い、被験者の自律神経機能に関して評価を行った。

嗅粘膜には自律神経線維と連絡があることが知られる。

※ 健常者であれば、起立時に瞬間的に血圧が低下し、そ前述した通り、パーキンソン病の自律神経機能とも関連がれに対し、頚動脈洞に存在する圧受容器が反応し延髄にある。そこで、嗅覚機能正常の成人に嗅気を曝露させて自存在する循環中枢に刺激が伝達される。この反応により、律神経機能を測定した。嗅気の提示前後で自律神経機能に交感神経が働き心拍数上昇、および末梢血管の収縮により、血圧が正常に保たれる。そのため、自律神経系統に異常が見られる方は、交感神経の反応低下により血圧をT i m e c o u r s e o f a ut o n o m i c n e r vefunction affected by olfactory（aroma）
stimulation
Sho Kanzaki
Department of Otolaryngology, School of
Medicine, Keio University

保つことができず低血圧となる。

2. 2. 健常者の嗅覚刺激に対する自律神経機能の変化
本題の嗅覚刺激に対する自律神経機能の応答を測定する実験を行った。具体的には、特定の香りがついた試験紙を− 148 −

嗅覚（芳香）刺激量が与える自律神経機能の経時的変化

Fig.2

Fig.1

実験で使用した脈圧計測器

嗅上皮における自律神経の走行

被験者鼻孔約 1 cm 手前に置き嗅覚刺激を与え、予め四肢に装着していた電極により匂いを嗅がせる前（安静時）と匂いを嗅がせた後（嗅覚刺激後）での脈拍の変化を観測した。
脈拍は、交感神経の働きと副交感神経の働きの拮抗によって決定されている。そのため、嗅覚刺激を与えた際に自律神経機能が正常であれば、何らかのレスポンスが生じると

Fig.3

自律神経の活動の大きさと成分分析方法考えられる。また、今回の実験で用いる器具では、自律神経の総合機能の変化の大きさも評価することが出来、どういったように反応したかが分かる。以下が今回の実験に用いた、試料の種類と、具体的な実験行程である。
１. 電極を右手首および左足首に座位の状態で装着し、最初に、安静状態の心拍変動を 4 分間測定した（先ほどの起立性低血圧の実験での動作の影響を取り除くため）。
２. 4 分後、香 1（バラ様の香り）を浸した試験紙を被験者の鼻の前に持っていき 10 秒間匂いを嗅がせ、10 秒後安静にし、その匂いを嗅がせた 10 秒間を含む 30 秒間を、
イベント
「香Ａ」
として心拍数を測定した。
３. 香りイベント測定後、5 分間安静状態を測定した。
（前の香りの after-effect を取り除くため）

Fig.4

自律神経の成分分析方法

４. 安静後、「香 2」を「香 1」同様に、10 秒間嗅がせ、30 秒＊実験条件間測定した。
５. 以後、「香 2」→「安静」→「香 3」というように、3 種類の＊被験者条件

香をすべて嗅がせた。

・正常状態における自律神経機能を測定するため、被験者＊香りの種類
主成分
含有量
溶剤
b-フェニル
日局プロピレ香 1 エチルアル 315.5mg/5ml
ングリコールコール
日局プロピレ香 2 スカトール 39.75mg/5ml
ングリコール
香 3 男性用香水

・実験室は、気温 25 ℃に保った

不明

不明

は実験前日の夜は十分な睡眠を摂取した。

類似した香り《原理》

バラFig. 3 のように、心電図より時間領域解析を用いて自律糞神経全体の活動の大きさの定量化、および、Fig. 4 のよう

形 容しが たいつーんとくる香り副交感神経各々の活動の大きさを分析できるようになってに周波数領域解析により自律神経の成分すなわち交感神経、− 149 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

いる。自律神経の総合的な活動の指標としては CVRR が《結果》挙げられる。なお、心拍の成分を分解すると、超低周波、

具体的な被験者各個人の結果を示す。なお、今回の実験

低周波、高周波の３つに分れ、そのうち、高周波（HF）はでは、19 歳〜 25 歳までの男性 11 名、女性 10 名を対象に副交感神経を、低周波（LH）は副交感神経と交感神経両者実験を行った。それらのデータのうち、匂いを嗅ぐ前後の活動を反映している。そのため、副交感神経の活動の指30 秒で集計し直し、それぞれの平均値をまとめたものが標を HF、交感神経の活動の指標を LH/HF とする。

Table 1 である。

Fig. 5
Table 1

被験者の実際の実験結果

実験値の各平均値（上：匂いを嗅ぐ前 30 秒、下：匂いを嗅いだ後 30 秒）− 150 −

嗅覚（芳香）刺激量が与える自律神経機能の経時的変化

また、各香りについて、匂いを嗅ぐ前と匂いを嗅いだ後での各々の値の変化に対する t- 検定を行った結果が以下の安静状態の心拍変動を測定した（先ほどの起立性低血圧の実験での動作の影響を取り除くため）。
② 4 分後、1 つめの香りを浸した試験紙を被験者の鼻孔前ものである。

にもって行き、10 秒間嗅いでもらう。その 10 秒間を含

2. 3. 男性女性用香水と人工・天然香料の差について

む 30 秒間の心拍数を測定した。

嗅覚刺激に対する自律神経機能の応答を測定する実験を③嗅覚刺激後の疲労をとるため 5 分間安静状態を測定した。

行った。具体的には、特定の香りがついた試験紙を鼻孔か④安静後、「2 つ目の香り」を「1 つ目の香り」同様に、10 秒
間嗅がせ、30 秒間測定した。

ら 1cm の距離で嗅がせる。
安静時と嗅覚刺激後で脈拍の変化を計測した。自律神経⑤後、「2 つ目の香り」→「安静」から、「3 つ目の香り」→「安静」→「4 つ目の香り」の順で刺激を与えた。

の総合機能も含めて評価する。
①極を右手首および左足首に座位の状態で装着し、最初に、

Fig. 6

香 1（バラ様の嗅気）を嗅がせた前後で各値の変化（t- 検定）Fig. 7

香 2（糞様の臭気）を嗅がせた前後で各値の変化（t- 検定）Fig. 8

香 3（男性用香水）を嗅がせた前後で各値の変化（t- 検定）− 151 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

＊自律神経の活動の大きさと成分分析方法＊香りの種類・男性用香水Dolce ＆ Gabbana

自律神経の総合的な活動の指標としては CVRR が挙げ

The One for Men（成られる。なお、心拍の成分を分解すると超低周波、低周波、

分不明）
・女性用香水高周波の 3 つに分かれ、そのうち高周波 HF は副交感神経を、

Jo Malone

・ネクタリンブロッサム＆ハニーコロン（成分不明）

低周波（LH）は副交感神経と交感神経両者の活動を反映し・天然のラベンダー エッセンシャルオイル（花・葉から水ている。
交感神経の活動の指標を LH/HF，副交感神経の活動指

蒸気蒸留したもの）
・人工のラベンダー アロマエッセンス（界面活性剤、香料、標を CCVHF とする。
こ の 周 波 数 解 析 の coefficient of component variance

ハーブ精油）
これを被験者には分からないよう、ランダムに振り当てた。

（CCV）とは、各周波数のゆらぎの係数であり、CVRR と同じように再現性が良い。

＊実験条件
2. 3. 1. 男性用香水と女性用香水の比較

実験室は、気温 25 ℃に保った。

L/H 交感神経活動性 CCV HF −副交感神経活動の指標、＊被験者条件
正常状態における自律神経機能を測定するため以下の条

CVRR 総自律神経活動の指標は男性における男性香水と女件を設定した。

性香水では有意差はなかった。女性においても同様であっ

・被験者は寝不足でない、また眠気はないた。しかし、香水を嗅ぐ前後での変化量の平均をみると下・食後３時間以上経過図になる。

Table 2

− 152 −

嗅覚（芳香）刺激量が与える自律神経機能の経時的変化

変化量の平均値であり、統計学的有意差が認められるものではないが、著しい差が認められる。男性被験者におい副交感神経どちらか優位に傾くことはあまりないものと考えられる。

ては CVRR が男性用香水で大きく変化し、CCVHF はほと

香 2（糞様臭気）に関しては、優位に CCRR と CCVHF のんど変化が無かった。女性用香水では CCVH が高まった。

値に、匂いを嗅いだ後、嗅ぐ前でプラスの変化が見られる

男性被験者は男性用香水を嗅いでも副交感神経活動は変化ことが分かる。おのおの、CCRR は自律神経の総合的な活が無く、総自律神経活動が高まった。女性香水では副交感動、CCVHF は副交感神経の活動を表しており、よって香神経活動が亢進したことを意味する。女性被験者において2（糞様臭気）は自律神経の総合的な活動の亢進および、は、L/H が男性用香水では嗅覚刺激前より低下し CCVHF

交感神経に対する副交感神経の活動が有意に亢進している。

が同性
（女性）
香水より男性香水の方が高まった。女性被験

一般に悪臭とされる糞様臭気においても健常者は、良い嗅者が男性用香水を嗅ぐと副交感神経活動が亢進し、交感神

気（バラ様嗅気）よりも激しく自律神経機能を変化させ、ま経活動は亢進しないことを意味する（Fig. 9）。

た副交感神経機能を有意、すなわち脈拍を遅くする方へ働くことが言える。最後の香３の男性用香水では、特に自律

2. 3. 2. 天然ラベンダーと人工ラベンダーの比較（Fig.10）

神経の活動に変化を与えないことが言える。すなわち、一CVRR、L/H、CCVH の値自体は、有意差がみられなか

般に良い香りとされるバラ様の嗅気では、交感神経・副交感神経どちらかを特に優位に亢進させるのではなく、総合

った（L/H に関してはｐ＝ 0.0734 であった）。
天然と人工の嗅覚刺激前後の変化量をまとめたが、L/H的な自律神経の活動を亢進させることが分かった。また、の変化量の差が認められる。これは天然が人工ラベンダー

一般に悪臭とされる糞様の臭気では副交感神経優位に良いよりも交感神経活動を抑制していることを意味する。

嗅気よりも激しく自律神経の活動を亢進させることが分か

４．考

った。

察

これらのように、香りによって得られる反応が異なった

香１すなわちバラ様の嗅気を発する物質では、P（＜0.05）となりうる値は、CCRR であり、これは自律神経の理由として、各物質の物理構造の違いによるものと考えられる。

総合的な活動の指標である。そのため、一般に良い香りと今回の研究で、自律神経機能亢進の反応が見えた、香１

称されるバラの嗅気では、自律神経機能活動の全体的な亢

の b -フェニルエチルアルコールや香 2 のスカトールは、交進が見られた。また、CCVHF と L/H の値から、交感神経、感神経および副交感神経のリガンドであるアセチルコリン

Fig. 9Fig. 10

男女被験者における平均変化量

Fig. 11 副交感神経受容体のリガンド（アセチルコリン、ムスカリン）

Fig. 13

ラベンダーにおける平均変化量

Fig. 12 交感神経受容体のリガンド（ノルアドレナリン、アドレナリン）

香 1（β- フェニルエチルアルコール）

Fig. 14− 153 −

香 2（スカトール）

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015やムスカリン、アドレナリン等の物質に構造が類似してい3, 4）によると、グレープフルーツの嗅気では交感神経をたため、各受容体に対し親和性があったのではないかと考優位に活発化させる等、他の嗅気も自律神経に様々な効果えられる（Fig. 11 〜 14）。その場合、香２（スカトール）はを与えることが分かってきている。今現在あまり嗅気によよりアセチルコリンやムスカリン等の副交感神経系のリガる自律神経機能の変化・応答に関しての実験・研究・論文

ンドの構造に物理構造特性が類似していると考えられる。

は少ないが、今後自律神経の様々な物質への応答の傾向・

なお、香３の男性用香水の詳細な物質は分からないが、実メカニズムが解明されれば、意図的に自律神経を活発化・

験結果から推定するに自律神経系のリガンドとは構造が類抑制化することができ、また、交感神経 / 副交感神経どち

似しないことが推察される。これらの化学構造に関してのらかを優位にすることも可能となるであろう。また、この証明は、より分子学的な実験を要する。

ような嗅覚刺激を行い、自律神経の応答を見ることで、パ

また、もう１つの可能性として、嗅上皮の自律神経を介ーキンソン病等の、症状の１つに嗅覚障害を伴う疾患のよさない応答がある。香１はバラ様の嗅気であり、これは普りシンプルで客観的な診断検査ができると考えられる。本段私たちが嗅いだことのある匂いであり、習慣的にバラ→来、単なる嗅覚刺激の応答、すなわち匂いの感度の測定で良い匂い→落ち着く気がする→自律神経が応答するという、は、匂いに対しての応答・感じ方に個人差が大きかったが、記憶や慣習を介した自律神経の応答の可能性も考えられる。

自律神経は本人が制御できない automatic な反応であるた

また、香２（糞様臭気）
では普段嗅いだ際に不潔な匂い→記め、主観的なバイアスがより少なく、なおかつ脈拍等の視憶的に気持ち悪くなる or 迷走神経反射→副交感神経応答

覚化しやすい数値変換が行われるので、飛躍的に検査制度（嘔吐中枢）
といった機序で自律神経の活動が活発になったが上昇すると思われる。

とも考えられる。これらを検証するには既述した通り、物（引用文献）

理化学的な実験を必要とする。
引き続いて香料を嗅いだ際の男女差について考察する。
男性は同性香水を嗅いでも交感神経亢進はなく、女性香水

１）Randy A. Hall: Autonomic Modulation of Olfactory
Signaling. Science Signaling 4 (155), p1. (2011).

でリラックスする。女性では同性香水で交感神経が亢進し、

２）Doty, R. L.: Olfactory dysfunction in Parkinson

男性用香水を嗅いで鎮静する。男女ともに同性香水でより

disease. Nat. Rev. Neurol. 8, 329–339 (2012); published

自律神経活動が亢進し、異性用では鎮静する。この反応がonline 15 May 2012.

男女間において何に寄与しているのかは不明であり、今後の課題である。

３）Niijima A, Nagai K: Olfactory stimulation withscent of essential oil of grapefruit affects autonomic

また天然と人工香料の比較検討では、L/H 変化量の差か
ら、天然ラベンダーの方が交感神経活動を抑制していることがわかる。これより、添加物が入っていない、高濃度の香料が効果をより期待できると思われる。

５．総

neurotransmission and blood pressure. Exp Biol Med(Maywood). 2003;228(10):1190-2.
４）Haze S, Sakai K, Gozu Y. Effects of fragrance
inhalation on sympathetic activity in normal adults.
Jpn J Pharmacol. 2002 Nov;90(3):247-53.

括５）Delplanque S, Grandjean D, Chrea C, Aymard L,

今回の実験では、一般に良い嗅気とされるバラ様の嗅気

Cayeux I, Le Calvé B, Velazco MI, Scherer KR, Sander

は自律神経の活動を亢進させ、また、一般に悪臭とされる

D. Emotional processing of odors: evidence for a

糞様の臭気は自律神経の活動を亢進させ、副交感神経を優nonlinear relation between pleasantness and familiarity

位に亢進させることが分かった。また、いくつかの文献（※

evaluations. Chem Senses. 2008 Jun;33(5):469-79.

− 154 −

心理・社会的発達と化粧行為の関連の検討──ライフ・ステージによる化粧意識の相違と老年期の化粧立命館大学立命館グローバル・イノベーション研究機構

木戸彩恵

Psychological research on cosmetic behaviour/consciousness has been conducted primarily within the frameworkof social psychology. However, psychology does not focus sufficiently on the possible transfer of cosmetic behaviour/consciousness to an individual’s specific cohort and age. The purpose of this study was to understand the transformingrole of cosmetic behaviour/consciousness using questionnaire and qualitative research methods. In the first experiment, 90
participants (age range, 20–80 years) were asked to rate daily cosmetic use on a scale and report their cosmetic assumptions,
their identity and gender identity. In the second experiment, 20 participants (age range, 20–70 years) participated in a semistructured interview using the Schedule for the Evaluation of Individual Quality of Life. The data showed that cosmetic
behaviour/consciousness in elderly women does not lead to general beauty consciousness and/or anti-aging consciousness
from the perspective of life-span developmental psychology. Rather, social and common-sense dignity was emphasised. This
attitude is expected to lead to deeper self-understanding and attractiveness due to cosmetic behaviour.

１．緒の意識が段階的に変化していくことが研究されている（た言3）
とえば，阿部，2001）にすぎず，化粧の役割が「質」的に化粧行為の対象は幼少期から老年期まで幅広い年齢に拡変容することについて十分に議論がなされていない。

大する傾向にある。特に老年期の化粧については QOL（生一方で，エイジング概念や老年期の化粧は確実に普及し活の質）の向上などといった目的から一定の成果をあげてている。特に実践的な心理支援やマーケティングの観点かおり，多くのボランティア等が活動を支えている状況があらの介入は枚挙に遑がない。そうした文脈のなかでは，魅る。そうした活動の中では，
「美しさ」
や
「抗齢
（アンチエイ

力の低下や美容・装いに関する関心の低下が単純に問題とジング）」など，実年齢よりも見た目を若く操作することがされ，「ステキ」に元気になることを目指した介入がおこな追及される。

われる。こうした動向のなかで，発達と化粧の連関を巡る活動の学術的根拠の一つとなる，化粧に関する心理学的問題は基礎的な課題といえる。

研究は主に社会心理学分野において進められてきた。たと

生涯発達心理学の第一人者であるエリクソンは，老年期

1）
えば，宇山・鈴木・互（1990）の研究では，実際に化粧をの発達における課題を自我の統合としている。老年期には施した上で，その時の心理的変化が検討されている。宇山

人生のあらゆる心理社会的要素を体制化していくことが課ら（1990）の研究からは，「積極性の上昇」「リラクゼーシ

題になり，自己の内的な特性と向き合うことが求められる

ョン」「対外的な気分の高揚」「対自的な気分の高揚」「安心」

ようになる。つまり，より個別性の観点が強くなる老年期の 5 つの効用があることが明らかになっている。また，山に単に多くの人から若々しく見えることを目指す現在の老2）本（2000） は，「顔の印象と対人的印象」において，外見の年期の化粧の理解そのものを当てはめることが適切でない操作に焦点をあて，外見情報が他者との関係性の初期段階

可能性がある。

に与える影響や，外見的特徴が自他に与える影響をまとめそのため，本研究では生涯発達の視点に基づき，心理・ている。そして，外見を通した印象管理プロセスと管理に

社会的発達と化粧行為の関連の検討をおこなった。その際，対する敏感さ，個人差について議論を展開した。その一方

時間の経過と共に宛先（となる他者や環境システム）との関で，化粧をする個人の年齢やコホートに特徴的な化粧の意

係が変容すること，発達に伴い自身の身体性とそれを表現

識や行為が変容していくという発達心理学的な検討はまだする仕方が変容することを考慮に入れ，20 代から 80 代ま充分ではない。現時点では，年齢段階が上がるに伴い化粧での女性を対象とした質問紙調査と項目自己生成型 QOL
尺度を取り入れたインタビュー調査を実施した。

An examination of socio-cultural development
and cosmetic behaviour/consciousness:
Cosmetic assumptions among different lifestages and cosmetic behavior/consciousness
in elderly women
Ayae Kido
Ritsumeikan Global Innovation Research
Organization, Ritsumeikan University

２．調査

2. 1. 質問紙調査
2. 1. 1. 調査協力者
調査協力者は，20 歳から 86 歳までの女性 90 名（平均年
齢 54.00 歳，標準偏差 25.28 歳であった）。うち，本調査で− 155 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

は，便宜的に 20 代から 40 代までの調査協力者を若年群（342. 2. 2. 調査方法

名，平均年齢 23.61 歳，標準偏差 7.54 歳），50 代以上の調

項目自己生成型 QOL 尺度である SEIQOL-DW（Schedule

査協力者を中高年群（56 名，平均年齢 71.73 歳，標準偏差for the Evaluation of Individual Quality of Life ─ a Direct

10.77 歳）と定義した。

Weighting procedure for Quality of Life Domains）日本語版実施マニュアル（大生・中島，2007 ７））に準じる形式で

2. 1. 2. 調査方法

半構造化インタビューを実施した。

全調査協力者に対し，本研究の趣旨・内容・調査協力者

SEIQOL-DW を用いたインタビュー調査の手続きは，以の権利に関する説明をおこなったうえで，質問紙への回答

下のとおりである。まず，調査協力者が現時点で日常的なを求めた。中高年群の質問紙調査では，郵送にて質問紙をメイクアップをする際に，最も大切だと考えることについ回収する手続きをとった。全体として 120 部を配布したうて領域・項目（Cue）を 5 つ挙げてもらう。このとき調査者

ち，中高年群の質問紙回収率は 46.7 ％であった。

は Cue の定義や具体的な内容を聞き取る。もし Cue を５つ列挙出来ない場合は，マニュアルに付随する項目リストを

2. 1. 3. 質問項目例示する。次に，各 Cue における Level（充足度）をアナ

質問項目は，①日常的に行っているメイクアップに関すログ的視覚尺度（Visual Analog Scale：VAS）を用いて評る項目として，化粧に関する一般的な質問 4 項目（化粧の価してもらう。この際，初めにメイクアップ後の状態につ頻度（選択形式／ 6 段階），濃さ（選択形式／ 4 段階），嗜好いて評価してもらい，次いでメイクアップ前の状態につい性（選択形式／ 5 段階），生活環境（選択形式／ 4 段階））とて 評 価 し て も ら う。 そ し て， 先 ほ ど 挙 げ た 各 Cue の②化粧に対する意識 12 項目（選択形式／ 5 段階）（山田，

Weight（相対的重要度）を，円グラフを使って示す。最後に，

４）を参考とした）を用いた。また，③アイデンティテ

各 Que の Level と Weight を掛け合わせ，SEIQOL の指標

ィに関わる質問項目として，自己の斉一性，一貫した自己（index）を算出する。QOL index は０から 100 の間で算出

感，自己に対する信頼の感覚，自己肯定的な自己受容の感され，数値が高くなるほど QOL が高いと判断される。

2012

5）

覚を表す項目から構成されている藤村（2008） のアイデンティティ尺度７項目（選択形式／ 5 段階）と，性別に対して

2. 2. 3. 分析方法

どの程度のアイデンティティ感覚を持っているのか、そのSEIQOL-DW の QOL index の算出

6）強さについて測定する尺度である佐々木・尾崎（2007） の調査協力者が評価した QOL を SEIQOL-DW のマニュア

ジェンダー・アイデンティティ尺度７項目（選択形式／ 5ルに基づき，QOL index として数値化した。次に QOL に段階）を用いた。

関連する領域として構成された Cue に焦点をあて，年代別に QOL を構成する Cue がどのような領域により構成され

2. 1. 4. 分析方法ているかを検討した。メイクアップ前と後の Cue の Level

調査協力者を便宜的に若年群，中高年群に分け，質問項の違いを比較することで，メイクアップによる QOL の変

目①③については，t 検定を用いて両群の平均の差の比較

容を記述するよう試みた。

の検討をおこなった。質問項目②については，各項目の平KJ 法によるモデル化
調査協力者がメイクアップをする際に重要視する Cue の均を算出した上でグラフ化した。

領域を質的に把握するために，異質のデータや情報を統合

2. 2. インタビュー調査
2. 2. 1. 調査協力者することによって新しい発想とアイデアを生む方法論（川喜田，1970）8）である KJ 法を使用し，データの整理をおこ

インタビュー調査協力者は若年群 13 名（20 代 9 名，30なった。

代 2 名，40 代 2 名），中高年群 7 名（50 代 2 名，60 代 3 名，KJ 法実施にあたっては，調査協力者の Cue から 100（170 代 2 名）の計 20 名であった。質問紙調査時に追跡調査

人につき Cue は 5 つ）のラベルを作成した。年代別のデーへの協力が可能と回答した調査協力者に個別にアポイントタの分散が分かるようにカードを色分けし，KJ 法の手順をとり，個別に 1 度ずつインタビューをおこなった。イン（川喜田，1970）に従い分析を実施した。

タビュー時間は，最短約 1 時間から最長約 4 時間程度であ３．結った。インタビューの実施は，調査協力者が指定した場所
を調査場所として選定し，個別に実施した。いずれのイン

3. 1. 質問紙調査結果

タビューにおいても個人情報の保護管理に了承を得た上で

質問項目①

果

日常的に行っている化粧（メイクアップ）につ録音の許可をとり，許可を得た上で会話内容を IC レコー

いての項目

ダーに録音した。

頻度，濃さ，嗜好性，環境の各項目について，調査協力− 156 −

心理・社会的発達と化粧行為の関連の検討 ──ライフ・ステージによる化粧意識の相違と老年期の化粧者が日常的に行っているメイクアップの統計的差異についメイクアップがあまり好きではないと評価されていた。

て t 検定を用いて検討した。

この結果から，若年女性と中高年女性のメイクアップ頻

メイクアップの頻度

若年群と中高年群のメイクアップの度と環境は同様でありつつも，中高年女性の方がメイク頻度の平均の差が統計的に有意かを確かめるために，有アップは薄く，嗜好性は低くなる傾向があることが明ら

意水準 5 ％で両側検定の t 検定（等分散を仮定しない）をおこなったところ，t（88）=1.05, p=0.30 であり，若年群と中高年群のメイクアップの頻度に差異は認められなかになった。
質問項目②

化粧に対する意識についての項目

化粧に対する意識については，各質問項目の平均を算出した上でグラフ化した（図１）。

かった。
メイクアップの濃さ

若年群と中高年群のメイクアップの全体的な回答傾向として，大きな差は認められなかった

濃さの平均の差が統計的に有意かを確かめるために，有ため，両群の差が 0.5 ポイント以上ある項目のみについて

意水準 5 ％で両側検定の t 検定（等分散を仮定する）をお言及する。中高年群の平均値が若年群の平均値よりも 0.5

こなったところ，t（88）=2.22, p= 0.03 であり，若年群とポイント以上上回っていた項目は，「②化粧をすると心が中高年群のメイクアップの濃さの差異が認められた。

落ち着く（中高年群 3.30，若年群 2.80）」であった。反対に，

メイクアップ嗜好性

若年群と中高年群のメイクアップ嗜

中高年群の平均値が若年群の平均値よりも 0.5 ポイント以

好性の平均の差が統計的に有意かを確かめるために，有上下回っていた項目は「③化粧をすると気持ちが引き締ま

意水準 5 ％で両側検定の t 検定（等分散を仮定する）をおる（中高年群 3.52，若年群 4.17）」，「⑤化粧をして男性からこなったところ，t（88）= 2.02, p= 0.05 であり，若年群

魅力的だと思われたい（中高年群 2.55，若年群 3.34）」であと中高年群のメイクアップの指向性の差異が認められた。

った。

メイクアップ環境

若年群と中高年群のメイクアップ環境

質問項目③

アイデンティティおよびジェンダー・アイデの平均の差が統計的に有意かを確かめるために，有意水

ンティティ尺度項目

準 5 ％で両側検定の t 検定（等分散を仮定する）をおこな

若年群と中高年群のアイデンティティ尺度の平均の差がったところ，t（88）= 0.93, p= 0.35 であり，若年群と中統計的に有意かを確かめるために，有意水準 5 ％で両側検

高年群のメイクアップの環境の差異が認められなかった。

定の t 検定（等分散を仮定する）をおこなったところ，t（78）t 検定の結果，若年群と中高年群のメイクアップの頻= 5.51, p=0.00 であり，若年群と中高年群のアイデンティ

度と環境には，差異が認められなかった。一方で，濃さティ項目回答傾向に強い差異が認められた。同様にジェンと嗜好性については，若年群と中高年群に差異が認めら

ダー・アイデンティティ尺度の平均の差が統計的に有意かれた。具体的には，中高年群のメイクアップはより薄く，を確かめるために，有意水準 5 ％で両側検定の t 検定（等分図１

化粧に対する意識− 157 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

散 を 仮 定 し な い ） を お こ な っ た と こ ろ，t（78）= 3.55,
p=0.00 であり，若年群と中高年群のジェンダー・アイデ

3. 2. 2. KJ 法分析結果
調査協力者がメイクアップをする際に重要視する Cue の領域から，計 100 枚のカードが作成された。これらをカテンティティ項目回答傾向に強い差異が認められた。
いずれの尺度においても，共通して中高年女性が若年女ゴリーとして編成した結果，第 1 段階で 41 カテゴリーと性よりもよりアイデンティティ受容の感覚が強いことを示なり，第 2 段階で 19 カテゴリー，第 3 段階で 11 カテゴリー，

す結果となった。

第 4 段階で 6 カテゴリーとなった。第 4 段階でこれ以上まとめようのない最大カテゴリーになったと判断し，編成は3. 2. インタビュー調査結果

第 4 段階で終了した。なお，第 4 段階で生成したデータの

3. 2. 1. メイクアップによる QOL index の変化

まとまりを「グループ」，第 3 段階で生成したデータのまと

若年群のメイクアップ前の QOL index 値の平均は 27.27

まりを「大カテゴリー」，第 2 段階で生成したデータのまと（SD=13.18），メイクアップ後の QOL index 値の平均はまりを「中カテゴリー」，第 1 段階で生成されたデータのま69.33（SD = 8.23）であった。メイクアップ前に比較し，メとまりを「小カテゴリー」と表現した。以下では，グループ

イクアップ後には平均で 42.06 ポイント QOL 値が上昇しを【】，大カテゴリーを《》で示し，説明を加える。

ていた。これに対して，中高年群のメイクアップ前の第 4 段階で抽出されたグループは【美しく可愛く見える

QOL index 値の平均は 33.55（SD=22.78），メイクアップ

よう顔立ちを補正し，楽しくモチベーションを上げる】【周，

後の QOL index 値の平均は 60.80（SD=20.16）であった。

囲との調和をとり関係性になじむ】，【他人に見せる若々し

メイクアップ前に比較し，メイクアップ後には平均でく新たな顔をつくり，自信と高揚感を高める】，【不快感や27.25 ポイント QOL 値が上昇していた。

負担のない健康的で自然な表情やスタイルをつくる】，【質

若年群と中高年群のメイクアップに関する QOL indexの良い化粧品を使い，肌状態を整えてきちんとした清潔感

値を比較すると，中高年群は若年群に比べてメイクアップのある身だしなみに仕上げる】，【社会的・常識的な品格あ前の QOL 値は 6.28 高く，メイクアップ後の QOL 値は 8.53

る女性らしい魅力】の 6 つであった。

低かった。中高年群のメイクアップ前後の変化は，若年群

これらの結果を図解化したものが図 2 である。図解の縦軸が，個人と関係性を，横軸が幼さと成熟を，右上がりのと比較して，14.81 ポイント小さかった。
なお，QOL index で算出した数値について，母数が少斜め軸が社会的ベースと生理的ベースを，左上がりの斜め
軸が可愛らしい魅力と品格ある魅力をそれぞれ示している。

ないことから統計的検定は実施しなかった。

図2

KJ 法図解− 158 −

心理・社会的発達と化粧行為の関連の検討 ──ライフ・ステージによる化粧意識の相違と老年期の化粧また，メイクアップをする際に重要視する Cue の領域とである。このグループには，全ての年代の調査協力者がして挙げられた語りを KJ 法を用いて整理するにあたり，

Cue を挙げていたが，小カテゴリーの「身だしなみ」にどのようなラベルを付けてまとめたか，どの年齢層の調査

20 代の調査協力者が 5 名 Cue を挙げていたことが特徴

協力者が回答していたかを表 1 にまとめた。なお，カテゴ的であった。

リーによっては下位カテゴリーがそのまま，より大きなカ【社会的・常識的な品格ある女性らしい魅力】 このグルーテゴリーとなっているものもある。以下，それぞれのグル

プは，40 代以上の調査協力者の Cue により編成されてープ毎の内容について説明する。

いた。《節度とマナーを守る品格ある女性としての魅力》【美しく可愛く見えるよう顔立ちを補正し，楽しくモチベ

として TPO を意識すること，《社会的・常識的に恥ずかーションを上げる】 このグループでは，《顔立ちを補正し，しくない自分でいる》ために，社会生活のなかでの仮面，

美しく可愛くみせる》
ことが重視され，《楽しく気分転換

感情を出さないよう，節度を保つためにメイクアップがし，モチベーションを上げる》ものとしてメイクアップ

使用されていることがわかる。

が認識されていた。年代別にみると，20 代から 30 代の４．考調査協力者の Cue から編成されていた。見た目をよりき
れいに可愛らしく見せることで気分転換，モチベーションの向上ができると認識されていた。

察

本研究では，心理・社会的発達と化粧行為の関連を検討することを目的とし，20 代から 80 代の女性を対象とした【周囲との調和をとり関係性になじむ】 このグループは，
20 代の調査協力者の Cue のみから編成されていた。周調査研究を実施した。生涯発達を通じた化粧行為の変容を軸に，以下のようにまとめることができる。

囲との調和をはかること，場所や装いとの調和や風潮が重視されていた。このグループでは，社会的関係性をつくるためのベースとしてメイクアップが捉えられていた。

4. 1. 日常生活におけるメイクアップ
質問紙調査の結果から，日常生活におけるメイクアップ【他人に見せる若々しく新たな顔をつくり，自信と高揚感の頻度や環境についての認識は，若年群も中高年群も大きを高める】 このグループでは，《若々しく新たな自分にな

く変わらないことが明らかになった。しかし，メイクアッる》という自己の更新と，《自信と高揚感をもって外に出プの濃さはやや薄く，メイクアップに対する嗜好性もややるために他人に見せる顔をつくる》という他者に対峙す低いことが明らかになった。また，インタビュー調査におるための顔づくりが重視されていた。メイクアップによけるメイクアップに関する QOL index 値を若年群と中高り，他人に見せる顔をつくりあげ，外出先への心理的ス

年群で比較したところ，中高年群は若年群に比べてメイク

イッチングが行われることが分かる。なお，このグルーアップ前の QOL 値が高く，メイクアップ後の QOL 値は低

プは全ての年代の調査協力者の Cue により編成されていく見積もられていた。中高年群のメイクアップ前後の変化

た。

は，若年群と比較して，より小さいことが明らかになった。

【不快感や負担のない健康的で自然な表情やスタイルをつ

これらを総合して捉えると，年齢を重ねることで，メイ

くる】 このグループは，メイクアップにより自然で健康

クアップに対してより控えめな認識をもつようになること，なイメージをつくり上げることが重視されていた。
《不メイクアップもより薄くなる傾向があることが分かる。

快感を与えない自然な表情やスタイル》に仕上げるという意識と，《肌の負担を抑えつつ，健康的に見えるよう4. 2. メイクアップをする際に重要視するCue の領域

疲れをカバーする》という疲れを見せないようにしよう

インタビュー調査の結果から，女性が自己のプレゼンテとする意識と，メイクアップを通した自分自身のモニターション方略を熟達化させ，「女の子」から「女性」
へと発達

リングが行われているようである。このグループもまたしていく過程を捉えることができた。また，従来的なアン

全ての年代の調査協力者の Cue により編成されていた。

チエイジングの観点から捉えた場合に，老年期になるにつ【質の良い化粧品を使い，肌状態を整えてきちんとした清れ若々しさが重視されるようになると予想されたが，必ず潔感のある身だしなみに仕上げる】 このグループは，《きしもそのような結果にはつながらなかった。本研究の結果

ちんとした清潔感ある身だしなみに仕上げる》ために，からは，どの年齢にも普遍的にアンチエイジングに対する化粧品の品質と機能を使いこなし，肌状態を整える》こ

意識があり，若々しくありたい私という考え方を 20 代女とが重視されていた。全ての年代の調査協力者が Cue を性もが持っていることが明らかになった。

挙げており，化粧品の品質と機能については，香り・値KJ 法による分析の結果は老年期に近づくにつれて，メ段・保湿・日焼け対策が内容として含まれていた。スキ

イクアップが品格ある大人の女性としての魅力を示すため

ンケアを含む化粧により生理的なベースを整え，そしてに行われる行為となるという結論を導いた。

清潔感ある身だしなみに仕上げるという意識があるよう

若年女性にとっては，美しさや可愛らしさを求めるため− 159 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

表1

KJ 法グループ編成の手順と内訳− 160 −

心理・社会的発達と化粧行為の関連の検討 ──ライフ・ステージによる化粧意識の相違と老年期の化粧に自己を補正するメイクアップが重視されるのに対し，老謝

辞

年期には成熟した関係性をつくるためのメイクアップが重本研究遂行にあたり，ご助成頂いた公益財団法人コスメ視される。こうした化粧意識の発達的変容は，質問紙調査

トロジー研究振興財団に心から感謝申し上げます。また，におけるアイデンティティ尺度およびジェンダー・アイデ

調査にご協力下さった立命館大学衣笠総合研究機構客員研ンティティ尺度項目への回答傾向が若年群よりも中高年群究員の石川眞理子氏と立命館大学文学部サトウタツヤ教授

がより受容的であったという結果とも一致する。年齢を重にお礼申し上げます。

ねるにつれ，社会的・常識的な品格ある女性らしい魅力が求められるようになるのは，自我同一性を確立したうえで（引用文献）

心理社会的な自我の統合を目指した自分らしさを求める化

１）宇山侊男，鈴木ゆかり，互恵子，：日本香粧品学会誌，

粧行為がおこなわれているためだと考えられた。

５．総

14, 163-168，1990．
２）山本眞理子，：日本化粧品技術者会誌，34，351 − 358．

括３）阿部恒之，：ストレスと化粧の社会生理心理学，フレ

本研究の結果から，生涯発達の視点から捉えた場合に，老年期女性にとって化粧行為は必ずしも一般的な美しさやグランスジャーナル社，2001．
４）山田雅子，：埼玉女子短期大学紀要，25，111 − 126，

アンチエイジングに関連する意識に結びついていると言えないことが明らかになった。老年期には，むしろ社会的・

2012．
５）藤村和久，：大阪樟蔭女子大学人間科学研究紀要，8，

常識的な品格ある女性らしい魅力を発揮することが重視される。このような意識を重視した上で、化粧をケアに応用

211 − 220，2009．
６）佐々木掌子，尾崎幸謙，：パーソナリティ研究，15，

することは，化粧を介した自己理解の深化と魅力の深化の251-265，2007．

実現につながり，化粧の意義の深い理解にもつながるだろ

７）大生定義・中島孝（監訳）．個人の生活の質評価法

う。

（SEIQOL）生活の質ドメインを直接的に重みづけする方

今後は，本研究から導き出した生涯発達を通した化粧行法（SEIQOL ─ DW）実施マニュアル日本語版（暫定版），

為の変容過程に関する仮説モデルを精緻化していきたい。
そのために，30 代から 50 代の調査協力者を増やし，更なる調査研究をおこないたい。

2007．
８）川喜田二郎，：問題解決学─ KJ 法ワークブック，講談社，1970．

− 161 −

抗がん剤による皮膚障害とスキンケアに関する研究

京都薬科大学 臨床薬学教育研究センター中村暢彦

In the past decade, cetuximab and panitumumab, molecular target drugs, have been widely used in the treatment ofadvanced colorectal cancer. The skin toxicities are seen in from 70% to 90% of patients, and these agents are also strongly
associated with improve of overall survival of patients. For assessment of skin toxicities, Common Terminology Criteria
for Adverse Events (CTCAE) is usually used as a method of grading severity scales for adverse events in cancer therapy.
However, this assessment method is subjective and toxicities are evaluated only by medical staffs. Thus, more objective
evaluation for skin toxicities is required for more precise evaluation of efficacy and safety of cancer chemotherapy bymolecular target agents.
The aim of this study was to evaluate a new method for assessing the conditions and degree of skin toxicity using
photographic images of skin toxic site in patients receiving cetuximab or panitumumab with advanced colorectal cancer.
The assessment procedures using RGB color values obtained from photographic images are developed in combination witha color reference marker, and the method was applied to an objective evaluation for skin toxicities in patients. The timecourse data for the RGB color values as well as the CTCAE grading scores were obtained in a patient. Currently no clear
relationship was detected between these parameters, and further researches are needed to clarify the validity of the present
assessment method.

１．緒療が行われているのが現状である。皮膚症状にあわせた適言

切なスキンケアの方針を立てるためにも、従来の目視によ

分子標的抗がん剤による薬物療法においては、開発当初

る主観的な評価から客観的な評価へとシフトする必要はあには想定されていなかった薬剤特異的な皮膚障害が 70 ～るが、皮膚症状の色彩を数値化して定量的な評価のための1）

90 ％の高い頻度で発現する 。その発現部位は顔から足手段が開発されていない。

の指先まで広範囲に渡り、痤瘡様皮疹と呼ばれるニキビのそこで本研究では、皮膚障害が高頻度に発現するセツキような湿疹や皮膚乾燥、爪の周りが炎症を起こす爪囲炎なシマブあるいはパニツムマブ療法施行中の進行大腸がん患

ど種々の特徴的な症状が発現する

2, 3）。分子標的抗がん剤による皮膚障害は、従来のフルオロウラシルなどの殺細胞者を対象に、抗がん剤の薬物療法による皮膚症状の色彩を数値化し、炎症の状態や程度を点数化することを検討した。

性抗がん剤で発現する骨髄抑制などのような致死的な有害2．方

事象ではないが、患者自身の不快感や日常生活に大きな影響を及ぼすことからその症状のマネージメントが重要であ法

2. 1. 対象患者る。一方で、手術不能な進行・再発大腸がんに使用される適格基準は、20 歳以上のセツキシマブあるいはパニツム

セツキシマブやパニツムマブなどの薬剤では皮膚症状の強マブの薬物治療を受ける進行・再発の大腸がん患者でさが治療効果の指標となる場合があり

4−7）、皮膚症状を軽Eastern Cooperative Oncology Group（ECOG）のPerformance

減しながら治療を継続することが大変重要である。がん薬

Status（PS）が 0 − 2 とした。担当医が 3 ヶ月以上の生存が物療法における有害事象の評価には世界各国で CTCAE

期待できない、または重篤な循環器障害や呼吸器障害など（Common Terminology Criteria for Adverse Events）がの基礎疾患やアレルギー疾患の既往など有するため他の治一般的に使用されているが、皮膚障害の評価は医療スタッ療の影響を排除できない等の理由で被験者として不適切とフの目視による主観的な評価である。そのため異なる医療判断された患者は除外した。

スタッフ間の評価の違いが治療方針に影響を及ぼすなど、基準が不明瞭のため医療現場では個々に工夫した予防、治2. 2. 症例登録
研究分担医師は、選択基準を満たした被験者本人あるいは代諾者から文書による同意を取得後、対象の部位を撮影
し電子媒体に保存した。撮影した画像データは個人識別情

Analysis of the skin toxicity and care inpatients with cancer chemotherapy
Nobuhiko Nakamura
Education and Research Center for ClinicalPharmacy, Kyoto Pharmaceutical University

報管理者へ手渡し、個人識別情報管理者は患者情報の匿名化を行い新たな症例番号を付して情報の保存・管理を行った。

− 162 −

抗がん剤による皮膚障害とスキンケアに関する研究

2. 3 皮膚障害の予防的治療

観 察 距 離 に よ っ て 変 化 し な い と 評 価 さ れ る 輝 度 値 V=

研究分担医師は、皮膚障害に対し「尋常性痤瘡治療ガイ（R+G+B）/3 に変換し、皮膚障害が発現していない薬物治ドライン」に沿って初回投与時から下記の薬剤を投与した。

療開始日の「皮膚障害グレード 0」群と皮膚障害が発生した

ミノマイシン 100mg / 日、ヒルドイドソフト軟膏 50g（手観察日の「皮膚障害グレート 1− 2」群の 2 群間において足）、ロコイドクリーム 5g（顔）、マイザー軟膏 10g（体幹部）。

Wilcoxon 符号付順位和検定を行った。なお統計的な有意水準は 5 % とした。

2. 4. 皮膚障害評価の項目
皮膚障害評価の項目は痤瘡様皮疹、皮膚乾燥、爪囲炎の2. 7. 倫理的配慮

3 つ と し た。 皮 膚 障 害 評 価 は 研 究 分 担 医 師 が Common

本研究のすべての担当者は、「ヘルシンキ宣言」
および「臨

Terminology Criteria for Adverse Events（CTCAE）

床研究に関する倫理指針」を遵守して実施した。研究実施

version 4.0 を用いて評価し（表 1）、グレード評価をカルテに係わる画像試料等を扱う際は、被験者の個人情報とは無に記録した。

関係の番号を付して管理し、被験者の秘密保護に十分配慮した。また、研究結果を公表する際は、被験者を特定でき

2. 5. 撮影方法

る情報を含まないようにした。

画像補正用カラーチャート（CASMATCH ）を撮影部位

研究担当者は、研究協力医療施設の医療倫理審査委員会の周りに置き、デジタルカメラを使用し撮影した。撮影条で承認の得られた同意説明文書を被験者（代諾者が必要な件は先の報告から 2,048×1,536 以上のピクセル JPEG 形式

場合は代諾者を含む）に渡し、文書および口頭による十分で保存とした。自動ホワイトバランス設定、フラッシュはな説明を行い、被験者の自由意思による同意を文書で取得®

使用せず、被写体とカメラの距離は 30 cm に固定した

8, 9）

。

した。

撮影部位は露出度が高くスキンケアが特に必要な顔面、前３．結

胸部、背部の 3 点とした。

果

3. 1. 患者背景
2. 6. 画像解析

本研究の選択基準を満たす患者に対し、研究目的と協力撮影した画像は、CASMATCH® の説明書に従い Adobe

について文書と口頭による十分な説明を行い、同意を得た

Photoshop CS6 を用いて撮影した画像の色調補正を行った。

登録患者は 12 名（男性 7 名・女性 5 名）であった。患者の補正画像から CASMATCH を含まない患部部位を選択範

性別、年齢、身長、体重、体表面積、BMI、観察期間、皮囲とし 50 万ピクセルを抽出した。選択した画像は画像解膚障害について背景を表 2 に示す。

®

析ソフトウェア Image J freeware を用いた解析から RGB

患者の年齢、身長、体重、体表面積、BMI は大腸がん値を算出した。RGB 値の計測結果は、色彩の明るさ感が患者の平均的な数値であった。観察期間中央値は 90.5（30表１皮膚障害のグレード定義

有害事象名

Grade 1

Grade 2

Grade 3

Grade 4

Grade 5痤瘡様皮疹

体表面積の＜10 %を占める紅色 丘 疹および/
また は 膿 疱 で ,そう痒や圧痛の有無は問わない

体表面積の 10 − 30%を占める紅色丘疹および/または膿疱で, そう痒や圧痛の有無は問わない ; 社会心理学的な影響を伴う; 身の回り以外の日常
生活動作の制限体表面積の＞ 30 %を占める
紅色丘疹および/または膿疱
で, そう痒や圧痛の有無は問わない ; 身の回りの日常生活
動作の制限 ; 経口抗菌薬を要する局所の重複感染

紅色丘疹および/または膿疱
が体表面積のどの程度の面積を占めるかによらず, そう痒や圧痛の有無も問わないが, 静注抗菌薬を要する広範
囲の局所の二次感染を伴う;
生命を脅かす死亡

皮膚乾燥

体表面積の＜10 %を占めるが紅斑やそう痒は伴わない

体表面積の 10 − 30%を占め,
紅斑またはそう痒を伴う; 身の回り以外の日常生活動作の制限

体表面積の＞ 30%を占め, そう痒を伴う;身の回りの日常生
活動作の制限──

爪襞の浮腫や紅斑 ; 角質の剥脱

局所的処置を要する; 内服治 外科的処置や抗菌薬の静脈療を要する（例 : 抗菌薬 / 抗真 内投与を要する; 身の回りの日
菌薬 / 抗ウイルス薬）; 疼痛を 常生活動作の制限伴う爪襞の浮腫や紅斑 ; 滲出
液や爪の分離を伴う; 身の回
り以外の日常生活動作の制限

─

─

爪囲炎

− 163 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

− 254）日であった。薬物療法は 4 名がセツキシマブ療法、め観察期間内に 7 時点（1, 33, 54, 68, 82, 96, 110 日目）での8 名がパニツムマブ療法施行であり、これらパニツムマブ

皮膚障害患部の画像を得た。図 1 に画像の例を示す。さら症例の 2 症例は観察期間中に薬物療法に伴うインフュージに研究分担医師のカルテ記録と照合し、経過観察日と皮膚ョンリアクションあるいは皮疹増悪のため中断となった。

障害評価グレードの経時的変化をまとめた結果を、および皮膚障害種別は痤瘡様皮疹が 8 件、皮膚乾燥は 2 件発現し、これらの時点における RBG 値の推移を示す（図 2, 3）。

爪囲炎は認められなかった。皮膚障害の発現部位は患者や薬物治療開始初日の皮膚障害評価はグレード 0 であり、観察時期により異なり、手指や顔面、前胸部、背部などの薬物治療開始 33 〜 54 日目には背部にグレード 1 の皮膚障

局所的な症例から全体的な症例まで認められた。

害が認められた。その後、68 〜 96 日目には皮膚障害評価
はグレード 1-2 となり、110 日目にはグレード 2 の皮膚障

3. 2. 皮膚障害評価グレードおよび RGB 値の関連性

害が認められた。図 2 の色彩の明るさの評価である輝度値

痤瘡様皮疹が 8 件認められた症例の中で、観察期間中には初日から 96 日目までは 122 〜 150 までの値を示しており、背部に皮膚障害評価グレード 0 から 2 まで推移した 1 症例

110 日目のグレード 2 では 100 の値を下回った。図 3 の色が含まれており、この症例において薬物治療開始初日を含の表現法である R 値、G 値、B 値も同様の推移を示した。

表2

患者背景

症例（N=12）
件数
（範囲）
中央値
（範囲）
性別
男性
7
女性
5
年齢（歳）
75.5（49 − 82）
身長（cm）
160.6（140.0 − 170.4）
体重（kg）
52.4（42.2 − 73.9）
体表面積（m2）
1.50（1.24 − 1.75）
BMI
21.7（15.0 − 28.7）
観察期間（日）90.5（30 − 254）
薬物治療
セツキシマブ4
パニツムマブ8
皮膚障害（グレード）痤瘡様皮疹8（1−3）
皮膚乾燥
2（1）
爪囲炎
0

図１

経過観察日と皮膚障害評価グレードの経時的変化− 164 −

抗がん剤による皮膚障害とスキンケアに関する研究「皮膚障害グレード 0」群と「皮膚障害グレード 1-2」群にし、主観的な評価とも同じ傾向であることを示唆するもの

おける輝度値の変化を示す（図 4）。これら皮膚障害の有無である。重篤な皮膚障害の色彩を RGB 値に数値化すること輝度値との関連性について統計学的に有意差（p= 0.81）とは可能であるが、得られたデータの RGB 値は最小値かは認められなかった。

ら最大値までの幅が広く、軽度の皮膚障害の状態や程度を

４．考RGB 値の 256 の値から点数化するのは困難であると考え察られる。このように画像データの解析においては、RGB

今回、観察期間中に背部に皮膚障害評価グレード 0 から

値を単純に用いるのではなくさらなる検討が必要である。

2 まで推移した 1 症例を得た。分子標的抗がん剤による皮分子標的抗がん薬における皮膚障害の発生機序は明確に

膚障害の色彩評価について経時的に調査したデータはなく、は明らかではない。一部、上皮細胞増殖因子（epidermal

１例ではあるが貴重なデータであると考えられる。

growth factor receptor: EGFR）を目標物とする分子標的

患者の皮膚障害部位は正常である薬物治療開始日と比べ抗がん薬では、共通の目標物である EGFR が皮膚組織にもて視覚的に色彩が赤みを帯びており、経過観察日の推移と分布し、増殖や分化に関与するため、角化異常が起こり、共に赤みの程度が濃くなっていた（図 1）。しかし、今回の痤瘡様皮疹が発現するとされている 10）。そのため、EGFR

赤みの程度を客観的に数値化した RGB 値では、皮膚障害阻害薬であるセツキシマブやパニツムマブでは高頻度に皮の有無と RGB 値との関連性が認められなかった。RGB 値

膚障害が発現し、皮膚症状の強さが治療効果の指標となるは 3 つの値が 0 から 255 までの範囲の数値を示すことによことが報告されている 4− 7）。しかし、その皮膚障害の有害

り色彩の表現が可能である。例えば 3 つの値すべてが 0 を

事象評価は目視による主観的な方法を用いており、画像デ

示せば色彩は黒となり、すべてが 255 を示せば白となる。

ータを客観的に評価した報告はされていない。このような今回のデータにおいてグレード 2 の皮膚障害では皮膚障害

客観的評価が確立していない状況の中で、パニツムマブにが発現していないグレード 0 に比べ RGB 値は低い値を示より発現する皮膚症状に対する予防療法の有用性を評価す

図 2 皮膚障害評価グレードおよび輝度値（平均値 ± 範囲）の推移

図 3 皮膚障害評価グレードおよびRed値 Green値、Blue値（平均値 ± 範囲）の推移

図 4 皮膚障害評価グレード 0 およびグレード 1-2 における輝度値の変化
Wilcoxon 符号付順位和検定 , p=0.81− 165 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

る目的で、初回投与の前日から 6 週間スキンケアを継続しal., Dermatologic side effects associated with theた群（予防療法群）と、皮膚障害発現時に担当医の判断によepidermal growth factor receptor inhibitors, J. Am.

りスキンケアを開始した群（対症療法群）との臨床試験が実

Acad. Dermatol., 55, 657-670, 2006.

11）。予防療法群には医療用医薬品の他にサ

２）Van Cutsem E, Challenges in the use of epidermal

ンスクリーンおよび保湿剤が用いられている。グレード 2

growth factor receptor inhibitors in colorectal cancer,

以上の 皮 膚 障 害 は、 予防療法群で 29%、対症療法 群 で

Oncologist, 11, 1010-1017, 2006.

施されている

62% と皮膚障害の発現は予防療法によって対症療法に比３）Heidary N, Naik H, Burgin S, Chemotherapeutic agents

べ半減されており予防的なスキンケアの有用性が明らかと

and the skin: An update, J. Am. Acad. Dermatol., 58, 545570, 2008.

なっている。この結果は、皮膚障害軽減のために抗生物質
内服剤やステロイド外用剤の医療用医薬品の使用だけでは４）Saltz LB, Meropol NJ, Loehrer PJ et al., Phase II trial of

なく、起床時に保湿剤の塗布、外出時にはサンスクリーン

cetuximab in patients with refractory colorectal cancerの塗布の重要性を示唆している。一方で、抗がん剤の薬物

that expresses the epidermal growth factor receptor, J.

療法における皮膚障害は、乳がん患者では他者からその症Clin. Oncol., 22, 1201-1208, 2004.

状が認識できるために患者の苦痛度は口内炎や発熱よりも12）高いと報告されており 、外見の変化を苦痛と感じている
ことが浮き彫りとなった。患者の日常生活において、がん

５） Jonker DJ, O'Callaghan CJ, Karapetis CS et al.,Cetuximab for the treatment of colorectal cancer, N.
Engl. J. Med., 357, 2040-2048, 2007.

薬物療法の治療効果を伴い、かつ他者に認識される皮膚の６）Stintzing S, Kapaun C, Laubender RP et al., Prognostic

露出部分をスキンケアにより皮膚障害の発症予防が可能で

value of cetuximab-related skin toxicity in metastaticあれば予防的スキンケアが推奨されるのは望ましい。現在、colorectal cancer patients and its correlation with

主観的な皮膚障害の評価を用いて臨床試験が先行している

parameters of the epidermal growth factor receptor

が、根本的に患者の症状と苦痛を取り除く為にも皮膚障害

signal transduction pathway: results from a randomizedの客観的な評価法を確立した上で患者に合わせた適切なス

trial of the GERMAN AIO CRC Study Group, Int. J.
Cancer, 132, 236-245, 2013.

キンケアを構築する必要がある。
今後は皮膚症状にあわせた適切なスキンケアの方針を立

７）Van Cutsem E, Peeters M, Siena S et al., Open-label

てるためにも、新しい評価方法へのアプローチを行い色彩phase III trial of panitumumab plus best supportive care

評価の確立が望まれる。

compared with best supportive care alone in patients

５．総with chemotherapy-refractory metastatic colorectal

括cancer, J. Clin. Oncol., 25, 1658-1664, 2007.

本研究では、分子標的抗がん剤による皮膚障害の色彩評

８）Iyatomi H, Oka H, Hagiwara M et al., Computerized

価について調査したデータはなく、大腸がん患者の皮膚症

quantification of psoriasis lesions with colour calibration:状の色彩について経時的なデータが得られた。皮膚症状のpreliminary results, Clin. Exp. Dermatol., 3 4, 8 3 0-8 3 3,

色彩を数値化したが、皮膚障害の有無と色彩の数値には関2009.

連性が認められなかった。炎症の状態や程度を点数化する

９）Iizaka S, Sugama J, Nakagami G et al., Concurrentには、新しい評価方法へのアプローチを行う必要性が示唆

validation and reliability of digital image analysis ofされた。

granulation tissue color for clinical pressure ulcers,
Wound Repair Regen., 19, 455-463, 2011.

謝辞1 0）Lacouture ME, Mechanisms of cutaneous toxicities to

本研究を遂行するにあたり、研究費をご支援頂きました

EGFR inhibitors, Nat. Rev. Cancer, 6, 803-812, 2006.

公益財団法人コスメトロジー研究振興財団に深く御礼申し

11）Lacouture ME, Mitchell EP, Piperdi B et al., Skin toxicity上げます。また、本研究の実施にあたりご協力頂きました

evaluation protocol with panitumumab (STEPP), a phase

大阪赤十字病院の薬剤師、消化器外科医師、外来通院治療

II, open-label, randomized trial evaluating the impact of

センターの看護師の皆さんに対し厚く御礼申し上げます。

a pre-Emptive Skin treatment regimen on skin toxicities

最後に、本研究にご助言とご指導頂きました京都薬科大学

and quality of life in patients with metastatic colorectal

臨床薬学教育研究センター矢野義孝教授に深謝いたします。

cancer, J. Clin. Oncol., 28, 1351-1357, 2010.
12）Nozawa K, Shimizu C, Kakimoto M et al., Quantitative（引用文献）

assessment of appearance changes and related distress１）Agero AL, Dusza SW, Benvenuto-Andrade C etin cancer patients, Psychooncology, 22, 2140-2147, 2013.

− 166 −

統計的学習による「似合う」への計算論的アプローチの確立
─個人に似合う髪型の自動提示技術の開発を通して─
山梨大学大学院医学工学総合研究部

茅暁陽

Hairstyle is one of the most important features people use to characterize one’s appearance. Since whether a hairstyleis suitable or not is relied on the aesthetic sense of human, it is difficult to model the suitability mathematically. We focusedon the fact that the suitable hairstyle is related to one’s face shape. This research proposes a new technique for automatically
retrieving a suitable hairstyle from a collection of hairstyle examples through learning the relationship between face shapes
and suitable hairstyles. Wee first designed the facial feature vector that are relevant to hairstyle. Aesthetic knowledge on faceand hair stylists’ ideas are used to design the facial features. And for producing realistic hairstyle images, we use matting andthin-plate-spine interpolation to improve the synthesis result. The four major contributions of this project can be summarized
as follows: 1. A new framework for retrieving suitable hairstyles through learning the relationship between facial shapes andhairstyles from successful hairstyle examples. 2. The design of a compact feature vector space enabling fast non-parametricsampling in statistical learning. 3. A method of hair-face image composition utilizing modern matting techniques forsynthesizing realistic hairstyle images automatically. 4. An evaluation experiment demonstrating the validity of the feature
vector and the effectiveness of the example-based approach. Experiments have been conducted to investigate how different
features of face shape can influence the results. The effectiveness of the proposed technique was validated through subject
studies.

１．緒

力は入力顔画像にヘアスタイルを合成する形で提示する．

言

5）

6）

Matting や Thin-Plate-Spline 補間技術を利用し，写実的

ヘアスタイルは人の外見を決める上でもっとも重要な要なヘアスタイル画像の呈示が可能である．顔の形状特徴と素の一つであり，ヘアスタイルを変えるだけで人に与えるして，①顔の形や額の高さなど顔の基本形状を表す 6 次元

印象は大きく変わる．本研究では，ノンパラメトリックサのベクトル V1=（v1, v2, v3, v4, v5, v6），②基本形状に加ンプリングに基づく似合うヘアスタイルの自動探索法を提えて顔の魅力度の知覚にもっとも寄与すると言われている

案する．
「似合う」とは感性的な概念であり，その数理目間の距離と顔の幅の比及び鼻の長さと顔の長さの比をモデルを作成することは困難である．提案手法では，ヘア加えた黄金比 を考慮する 10 次元のベクトル V2 =（v1, v2,

スタイルが似合うかどうかを決めるもっとも重要な要因が……, v10），そして，③これらの特徴の平均顔からの差分，

顔の形状特徴であることに着目し，ヘアスタイルの成功例

つまり利用者の顕著な特徴を表す 12 次元のベクトル V3=から顔の形状特徴とヘアスタイルとの関係を学習すること（v1, v2,……, v12）の 3 種類を用いて，それぞれの有効性ににより，利用者の顔に似合うヘアスタイルを得る．図 1 について，評価実験を通して検証を行った．

1−4）

7）

提案システムのフレームワークを示す．システムは大き２．実験・結果

く分けて学習と実行の 2 つの部分から構成される．学習では，ヘアスタイルカタログに掲載されているヘアスタイル

提案手法が似合うヘアスタイルの探索を実現できているを成功例とみなし，顔特徴とその顔に合ったヘアスタイル

かを確かめる被験者実験を行った．利用者本人が判断するのペアを学習データとしてデータベースに格納する．実行

似合うヘアスタイルと，利用者以外が判断する似合うヘア

時は，入力される利用者の顔画像に対し，データベース構

スタイルには違いがあることが予想されたため，自己評価

築のときと同様の方法で顔特徴抽出を行う．そして，平均と他者評価の２種類の評価実験を行った．自己評価の実験

顔と比較し，個人の顔の特徴の強調を行い，顔特徴空間ででは利用者自身を被験者として，提示されたヘアスタイル

距離の近い画像をデータベースから探索し，それと対になについて評価を行った．他者評価の実験では利用者以外のるヘアスタイルを似合うヘアスタイルとして出力する．出

被験者によって，提示される利用者のヘアスタイルの評価を行った．
なお今回の実験では，髪の色による影響を無視するため

A Computational Approach to Hairstyle
Fitting Based on Statistic Leaning
Xiaoyang Mao
Interdisciplinary Graduate School of
Medicine and Engineering, University of
Yamanashiに，カラー画像をグレースケール画像に変換して実験を行った．髪の色も似合うかどうかの判断に重要な影響を与えると考えられるが，個人の好みによるものが大きいこと，
提案手法ではもっとも似合う髪の色に関する考慮がないことから，髪の色については無視して実験を行った．

− 167 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図1

提案システムのフレームワーク

2. 1. データベースの構築
本研究では，ヘアスタイリストが作ったヘアスタイル画
像をデータベースに登録することでシステムを構築する．
登録するヘアスタイルは利用者や利用場面に応じて変更することができる．
我々はまず，髪の量と髪質，髪の長さを属性値として与え，それぞれに対するデータベースを構築した．これは似合うと判断されたヘアスタイルでも，利用者の持つ髪の量，
髪質および髪の長さによって実現できないヘアスタイルが提示されないようにするものである．髪の量，髪質および髪の長さをそれぞれ以下の 3 段階に分けてデータベースを

図2

構築した．

評価用画像セット・髪の量：多い，普通，少ない・髪質：かたい，普通，やわらかいにそれぞれのヘアスタイルについて好みであるかどうかを・髪の長さ：ロング，ミディアム，ショート

答えてもらった．このとき，顔によってヘアスタイルの好これらの属性値は一般的なヘアカタログで利用者への情みが左右されないように，顔にぼかしを加えた画像を提示

報として記載されるものであり，ヘアカタログにこれらのした．顔型はヘアスタイルが似合うかどうかの判断に必要情報の記載があれば，これをそのまま属性値として与えるであると考え，顔の輪郭にはぼかしを加えなかった．

ことができる．画像から自動で判別することができればより多くの画像をデータベースに登録することができるが，撮影環境の違いや解像度の違いなどによって困難であった．

2. 2. 一般向けデータベースでの自己評価実験（特徴ベクトル V1）

本研究では，ヘアカタログに情報があるものについてはそこの実験では「利用者自身に似合うと思うヘアスタイル」のまま属性値として利用し，情報がないものについてはデと「提案システムから提示されるヘアスタイル」が一致してータベース作成時に手動で属性値を与えた．

いるかどうかを調べることを目的とする．被験者は女子大一般向けデータベースはプロのヘアスタイリストが作っ

学生 10 名とした．10 枚を 1 セットとする画像集を 3 セッ

た 84 枚のヘアスタイル画像によって構築した．男性向け

ト用意する．それぞれの画像集には本研究で似合うと判断

データベースでは，まずインターネット上のヘアスタイル

したヘアスタイルの画像 2 枚と無作為に選んだヘアスタイ

画像 283 枚を集めた．属性値は手動で与えた．男性に好ま

ル画像 8 枚が含まれている．被験者は各画像集から自分にれやすいヘアスタイルを選ぶために，15 名の男性被験者

似合うと思う画像を上位 3 枚選択する．図 2 に示すように，− 168 −

統計的学習による「似合う」への計算論的アプローチの確立

─個人に似合う髪型の自動提示技術の開発を通して─

被験者は自分に 1 番目，2 番目，3 番目に似合うと思うヘ

した場合に，一般向けデータベースと比べてよい結果が得アスタイルの画像の番号を順に選択する．10 名の被験者られるかを調べた．被験者は男子大学生 19 名と 20 代男性

が 3 セットの画像集に対して回答を行った，総試行回数は

会社員 6 名，計 25 名とした．2. 3. の実験と同様に，10 枚

30 回となる．

の画像を含む画像集 12 セットを用意した．各画像集には

以下の 3 つのケースについて，回答に有意な偏りがある

提案システムが似合うと判断したヘアスタイル画像が 2 枚かを調べた．

含まれている．被験者は各画像集から似合うと思う画像をケース 1：被験者が 1 番に選んだヘアスタイルは，提案手

上位 3 枚まで選択する．総試行回数は 300 回である．実験
結果を表 5 に示す．

法が似合うと判断するヘアスタイルである．
ケース 2：被験者が 1 番と 2 番に選んだヘアスタイルのうち，

男性向けデータベースの評価では，ケース 1 から 3 まで

少なくとも 1 枚は提案手法が似合うと判断するヘアスタ

すべてで 1 ％有意で帰無仮説を棄却することができた．こイルである．
ケース 3：被験者が 1 番，2 番と 3 番に選んだヘアスタイ
ルのうち，少なくとも 1 枚は提案手法が似合うと判断し

表 1 一般向けデータベースの自己評価実験の結果（**: 1% 有意， *: 5% 有意）選択された回数（10 名 ×3 セット）

割合

ケース 1

4

0.134

ケース 2

16

0.533*

ケース 3

26

0.867**たヘアスタイルである．
画像集に含まれる 10 枚のすべての画像が選ばれる確率は同じであることを帰無仮説として，2 項検定を行った．
結果を表 1 に示す．
30 回の試行に対して，ケース 1 は 4 回，ケース 2 は 16 回，
ケース 3 は 26 回満たされた．ケース 2 は 5 ％有意で，ケース 3 は 1 ％有意で帰無仮説を棄却することができた．つ表 2 一般向けデータベースでの他者評価実
験の結果（**: 1% 有意）

まり，被験者は 2 枚か 3 枚を選ぶときに，少なくとも 1 枚は提案するシステムが似合うと判断するヘアスタイルを選
ぶことがわかった．この結果から，提案するシステムがもっとも似合うとまではいえないまでも，よく似合うヘアス
タイルを探索することができているといえる．

2. 3. 一般向けデータベースでの他者評価実験（特徴ベクトル V1）

選択された回数（13 名 ×12 セット）

割合

34

0.218

ケース 2

80

0.513**

ケース 3

102

0.654**

ケース 1

表 3 一般向けデータベースでの他者評価実
験の結果（男性被験者のみ）選択された回数（6 名 ×12 セット）

割合

ケース 1

12

0.167

ケース 2

30

0.417

ケース 3

40

0.556

この実験では「被験者以外の利用者が似合うと思うヘア
スタイル」と「提案システムから提示されるヘアスタイル」
が一致しているかどうかを調べた．被験者を 13 名の大学生（男性 6 名，女性 7 名）とし，10 枚の画像を 1 セットとする画像集 12 セットを用意した．総試行回数は 156 回である．男女を区別しない実験結果を表 2 に示す．
156 回の試行で，ケース 1 は 34 回，ケース 2 は 80 回，

表 4 一般向けデータベースでの他者評価実験の結果 （女性被験者のみ，**: 1% 有意）選択された回数（7 名 ×12 セット）

割合

ケース 1

32

0.381**

ケース 2

50

0.595**

ケース 3

62

0.738**

ケース 3 は 102 回満たされた．ケース 2 とケース 3 は 1 ％有意で帰無仮説を棄却することができた．
しかし，13 名の被験者の中で男性と女性の評価結果（表3，および表 4）を分けてみると，男性の評価結果は全てで有意差がなく，女性の評価結果では全て有意であることがわかった．このことから，女性のヘアスタイルを判断する
とき，男性と女性で似合うかどうかの判断基準が異なるこ

表 5 男性向けデータベースでの他者評価実
験の結果（**: 1% 有意）とがうかがえる．

選択された回数（12 名 ×3 セット）割合

50

0.347**

2. 4. 男性向けデータベースでの他者評価実験（特徴ベクトル V1）

ケース 1
ケース 2

74

0.514**

男性に好まれるヘアスタイルのみでデータベースを構築

ケース 3

101

0.701**− 169 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015のことにより，利用者に応じたデータベースを構築するこ験と同じ画像集 12 セットを提示し，各画像集から似合うとにより，より似合うヘアスタイルを探索できることが確と思う画像を上位 3 枚まで選択してもらった．総試行回数

かめられた．

は 48 回である．実験結果を表 7 に示す．
実験結果では，ケース 3 についてのみ 5 ％有意で帰無仮2. 5. 順位づけの妥当性の検証（特徴ベクトル①）

説を棄却することができた．この結果は一般人による結果提案手法では顔特徴ベクトル間の距離によって，似合う
ヘアスタイルを選択している．この距離が似合うヘアスタ
イルをよく表現できているかを検証するために，順位相関よりも悪くなったものの，本提案手法で選んだヘアスタイ
ルが被験者に選ばれやすい結果は得られた．
被験者のうち 1 名からは「髪型を細分化してパーツごとに似合うものを選びたい」というコメントを得た．このコを調べた．
実験では，利用者以外の被験者 6 名（いずれも大学生，メントから，ヘアスタイリストは，顔と髪型の全体のバラ

男性 3 名，女性 3 名）に，一般向けデータベースから得ら

ンスのほかに，顔と髪型の各部位ごとのバランスを見ていれる上位 20 枚のヘアスタイル画像を提示した．被験者にることがわかる．本提案手法では，全体のバランスのみには 20 枚の画像を似合うと思う順に選択してもらった．図よって似合うかどうかを判断しており，このことが，ヘア

3 に評価に用いた画像を示す．

スタイリストの結果を一般人の結果よりも悪くしているの実験により求められたスピアマンの順位相関係数 ρ をではないかと考察する．

求め，自由度 18 の t 検定によって評価を行った．結果を表 6 に示す．
被験者 6 人の結果からは，1 名で 1 ％，3 名で 5 ％，2 名

2. 7. 個人特徴の強調及び黄金比の導入に関する評価
実験（V2, V3）

で 10 ％の有意水準で有意に相関が高いことが確かめられこの実験は個人特徴の強調および黄金比の導入した合成

た．男女で比べると，女性でやや順位相関が高かった．こ

結果について提案システムの有効性を検証するための実験の結果から，もっとも似合うヘアスタイルだけでなく，提である．本実験で利用した画像データセットは 4 種類（1：

案手法が与える距離が似合うヘアスタイルをよく表現でき

V2，誇張なし；ているといえる．

2：V2，誇張あり；

3：V3，誇張なし；

4：V3，誇張あり）である．

2. 6. ヘアスタイリストによる他者評価実験（特徴ベクトル V1）

2. 7. 1. システムの有効性
被験者を 20 名の大学生（男性 10 名，女性 10 名）とし，さらに，ヘアスタイリストによる評価実験を行った．被10 枚の画像を 1 セットとするそれぞれの実験用データベ

験者は美容師 4 名（男性 2 名，女性 2 名）とした．2. 3. の実ースからの画像集 48 セット（12 セット×4 種類）を用意した．
総試行回数はそれぞれの画像データセットで 240 回である．
また同様にヘアスタイリスト 10 名（男性 7 名，女性 3 名）を被験者とした実験も行った．総試行回数はそれぞれの画
像データセットで 120 回である．

表6

男性

被験者
ρ

1
+

0.40

表7

図3

順位づけの妥当性検証のための提示画像− 170 −

順位づけに対する順位相関係数（**: 1% 有意，*: 5% 有意，+: 10% 有意）
女性

2

3

4

5

6

0.46*

0.26

0.61**

0.46*

0.37*

ヘアスタイリストによる評価の結果（*: 5% 有意）選択された回数（4 名 ×3 セット）

選択された
割合

ケース 1

13

0.271

ケース 2

22

0.458

ケース 3

31

0.646*

統計的学習による「似合う」への計算論的アプローチの確立

─個人に似合う髪型の自動提示技術の開発を通して─2. 7. 2. 順位づけの妥当性

表 8 に示すように，一般人の結果では，240 回の試行で，
ケース 1 が満たされたのは 53，56，57，60 回であった．

2. 5. の実験と同じように個人特徴を強調し，黄金比の個人特徴を誇張し，黄金比の特徴量も含めて合成した結果

特徴ベクトルを導入し，最適なヘアスタイルをよく表現での方が 5 ％有意である結果になった．ケース 2 とケース 3

きるかを検証するために，順位相関を調べた．

では 5 ％有意である結果となり，誇張した黄金比の特徴量

この実験の被験者は 20 名（大学生，男性 10 名，
女性 10 名）を含めた合成結果の方が選ばれる確率は比較的高いことがである．図 4（a）（b）（c）（d）はそれぞれの評価用画像デ分かった．一方，ヘアスタイリストの評価結果では，総試ータセットを示す．一般向けデータベースから得られる上行回数は 120 回で，ケース１が満たされたのは 15，21，

位 20 枚の似合うヘアスタイル画像を提示した．被験者に16，25 回であった．すべて有意ではない結果となった．

は 20 枚の画像を似合うと思う順に選択してもらった．

一般人の結果より悪いが，個人特徴を誇張し，黄金比の特実験により求められたスピアマンの順位相関係数 ρ を徴量を含めた合成結果の方が良いと分かった．ヘアスタイ

求め，自由度 18 の t 検定によって評価を行った．結果をリストは，2. 6. の実験と同様に顔のパーツごとに似合うも表 9 に示す．相関が高いことが確かめられた．個人特徴をのを選ぶという観点を持っている．一般の人と違い，専門強調し黄金比を含めた特徴ベクトルで最も良い結果が得ら家はそれに関する知識と経験を踏まえて判断しているため，れた．

顔のパーツについての注目度が高いことが分かった．
表8

個人特徴の誇張及び黄金比の導入しシステムの有効性に関する評価実験の結果（*：5% 有意）

割合
被験者

一般人
（20 人）
美容師（10 人）

case

強調なし

強調あり

実験結果

確立

1

53

2

110

3
1

強調なし

実験結果

確立

0.221

56

0.458*

113

154

0.642*

15

0.125

2

44

3

65

（a）V10, 強調なし

実験結果

確立

0.233

57

0.471*

112

160

0.667*

21

0.175

0.367

50

0.542

79

実験結果

確立

0.238

60

0.250*

0.467*

120

0.500*

153

0.638*

165

0.688*

16

0.133

25

0.208

0.417

49

0.408

56

0.467*

0.658*

67

0.558

75

0.625*（b）V10, 強調あり
図4

順位相関係数平均値

一般人（20 人）

ρ（c）V12, 強調なし（d）V12, 強調あり

順位づけの妥当性検証のための提示画像セット

表9

被験者

強調あり

順位づけに対する順位相関係数（**: 1% 有意，*: 5% 有意，+: 10% 有意）
輪郭特徴
（V10）

輪郭特徴＋黄金比特徴
（V12）

実験結果

確立

実験結果

確立

0.51**（３人）

0.58**（2 人）

0.51**（5 人）

0.61**（6 人）

0.41*（12 人） 0.47*（15 人） 0.43*（13 人） 0.49*（13 人）
0.32+（5 人） 0.35+（3 人） 0.34+（2 人） 0.40+（1 人）− 171 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

３．考に焦点を当てて似合うヘアスタイルの探索を行ったが，顔察の各部品の形状や髪の色も似合うかどうかの判断に影響を2. 3. 節で紹介した実験では，男女被験者の評価結果が与えているものと考えられる．さらに，外見を決める上で大きく異なることが分かった．また一部の男性被験者にな服装も重要な要因の一つである．本研究で提案した技術はぜこのヘアスタイルが似合うと思われたか聞いてみると，

個人の特徴を考慮したファッション推奨にも応用できるとロングがすきだからという回答があり，個人の好みが評価考えられる。

結果に大きく影響していることが分かった．男性がよいと評価したヘアスタイルで構築した事例データベースを使用（引用文献）

することで，よい結果が得られた．似合うとは非常に主観

１）Wei Yang, Masahiro Toyoura, Xiaoyang Mao,: Example-的な概念であり，すべての人に適用できるような数理モデ

Based Hairstyle Advisor, International Symposium on

ルを作成することが困難であるが，対象を考慮して適切なComputational Aesthetics (CAe), Poster, 2011-8.

事例データを準備することにより，事例ベースアプローチ

４．総

２）W e i Y a n g , M a s a h i r o T o y o u r a , X i a o y a n g
Mao,:Hairstyle Suggestion Using Statistical Learning,が有効であることを確認することができた．

International Conference on MultiMedia Modeling

括(MMM2012), 2012-1.

本研究では，事例に基づく最適なヘアスタイルの生成技

３）楊 薇 , 豊浦 正広 , 茅 暁陽 , ：例に基づくヘアスタイル術を提案した．ヘアカタログから得られる成功例に基づいアドバイザ , 芸術科学会論文誌 , Vol.11, No.4, pp.195-204て似合うヘアスタイルのデータベースを構築し，顔型を基４）楊 薇 , 豊浦 正広 , 茅 暁陽 , ：顔特徴分析によるヘアスに似合うヘアスタイルを探索した．探索した結果は入力顔画像に対して最新な画像合成手法を用いて合成することで，ユーザに自然なヘアスタイル画像を呈示することができた．
さらに個人特徴を誇張し，黄金比を表す特徴ベクトルを導入することにより，結果をさらに改善させることができた．
今後の課題として，顔型以外の特徴による似合うヘアス
タイルの探索を挙げる．本研究では顔型の一部の特徴のみ

タイルアドバイザ，VCWS2013
５）Wang, M. Cohen, Optimized Color Sampling for
Robust Matting , CVPR, 2007６）BooksteinF.L. (1 9 7 9). Shape Models II: The Thin
Plate Spline. The Palaeontological Association.
７）P.M. PallettLink, K. LeeS. (2010). New "Golden" Ratios
for Facial Beauty. Vision Research 50, 149-154− 172 −

19 ～ 20 世紀にわが国で使用された含鉛おしろいに関する研究

東京大学大学院新領域創成科学研究科環境システム学専攻

吉永淳

Prevalence of non-infectious encephalopathy was high among children in Meiji and Taisho era in Japan. It had turned outthat lead poisoning due to the use of face powder by their caretakers was the cause. In this study seven face powder samples,
manufactured during Meiji era, were analyzed for lead by inductively coupled plasma mass spectrometry to characterize
lead in those historic samples. Four of the 7 samples contained lead at elevated levels (17-55%) and the other one sample
contained at moderate level (0.35%). Lead was not detected in the rest of the samples. Lead isotope ratios (207Pb/206Pb and208
Pb/206Pb) of the leaded face powders indicated that the face powder of those days contained lead either from Japanese orAustralian ores. The lead isotope ratios were consistent with those in human hair of those days suggesting that leaded facepowder was one of major contamination sources of lead of Japanese people of those days.

１．緒る。その後、平井教授の指摘に基づき、1934 年に内務省

言令によって含鉛おしろいの製造・販売が禁止されると、「脳

明治～大正時代のわが国で、小児の
「脳膜炎」
が多数見ら

膜炎」患児数は減少の一途をたどったといわれている。

れたことが記録に残っている。ウイルスや細菌が原因の髄

筆者は、先史時代～近現代までのわが国における人体鉛膜炎は現在でもよく見られる疾患であるが、当時の「脳膜汚染に関する研究を続けている。上記のような鉛脳炎の多炎」には非感染性で、原因がはっきりとしないものが多か発が知られている明治～大正時代というのは、わが国の鉛ったという。

人体汚染史からみてもきわめて特徴的な時代であったと考

この
「脳膜炎」
が、患児の親が使用していた含鉛おしろい

えて、「かもじ」や針山の詰め物として残されていた、この時による鉛中毒であることを、大正 12 年（1923 年）、京都大代の日本人成人女性の頭髪の鉛分析を行った経験がある 3）。

学小児科の平井毓太郎教授が突き止めた。1895 年にそのその結果、この時代の女性の頭髪には、現代の数百倍とい

原因不明の
「脳膜炎」
（当時は
「所謂脳膜炎」と称されていた）う、きわめて高いレベルの鉛が検出され、当時の人々に高が最初に医学的に報告されてから原因解明まで四半世紀といレベルの鉛汚染があったことが裏付けられた。さらに長くかかったのであるが、その間の医学的な経緯について

1930 年代以降の頭髪サンプル中鉛濃度は大きく減少しては、堀口ら 1）及びそれに続く一連の文献に詳しい。

おり、上記の含鉛おしろいの製造・販売禁止の時期とよく鉛を扱う作業現場などにおいて、高いレベルの鉛に長期一致していた。また、一般に鉛の原産国の違いを反映する

間曝露すると、作業者には主に神経系、消化管、腎臓、造鉛安定同位体比を測定すると、明治～大正時代の女性には、血系に毒性があらわれ、貧血や鉛疝痛などの典型的な鉛中日本産とは明らかに異なるきわめて特徴的な同位体比の鉛

毒症状を呈する。神経系への毒性のうち、もっとも重篤なを頭髪中に含有する人が多かったことを見出した。

ものが脳症であり、せん妄、昏睡、痙攣などの症状があら以上のことを背景として、当時使用されていたおしろい

われる。おしろいを多用する歌舞伎役者にもこうした鉛脳の鉛濃度や安定同位体組成と、当時の女性の頭髪中鉛のそ症と考えられる症状が見られたことは、「中村福助の鉛中れとの比較をすることで何らかの新しい情報が得られるか2）

毒事件」等の顛末とともに、「化粧ものがたり」 に詳しくを調べるために、おしろいの鉛分析を行うこととした。

記述されている。成人に比べ小児の鉛の毒性への感受性は２．実高いので、より少ない曝露量で神経系への影響がみられる
可能性があり、明治～大正期の「脳膜炎」には、現在知られているところのこの脳症がかなり含まれていたと考えられ験

2. 1. 分析試料
ポーラ文化研究所よりご提供いただいたおしろい、「都の花」「歌舞伎香」の 2 種類（入手時には含鉛／無鉛不明）及び、ビューティーサイエンス学会高橋雅夫先生よりご提供

Leaded face powder used in 19−20
century in JapanthJun Yoshinaga
Department of Environment Systems,
Graduate School of Frontier Sciences,
University of Tokyo

いただいた、「姿見香」「無類御化粧」（以上含鉛おしろい）、「ちごさくら」「白雪」「御園のつぼみ」（以上『無鉛おしろい』
として販売されていた）の 5 種類、合計 7 種類の明治時代
おしろいを分析試料として用いた。

− 173 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

2. 2. 鉛分析った。一方、「都の花」「歌舞伎香」「姿見香」「無類御化粧」

おしろい試料は、7mL 容のテフロン PFA 製のネジ蓋付の 4 種のおしろいからは 17 ～ 55% という高濃度の鉛が検分解容器（Tuf-tainer vial）に 5 ～ 30 mg を精秤し、超高純出され、いわゆる含鉛おしろいであったことが裏付けられ

度硝酸（多摩化学，川崎）を 1 mL 加えた。分解容器の蓋をた。

締め、しばらく室温放置した後、ステンレス製分解容器に鉛が検出された 5 試料の鉛安定同位体比のうち、「歌舞挿入し、140 ℃，3 時間加熱・加圧分解を行った。分解終

伎香」
「姿見香」
「無類御化粧」の 3 試料はきわめて近い値

了後、冷却してから、精製水を用いて分解容器の内容をポであった。この 3 試料と大きく離れた同位体比を持つのがリプロピレン製ボトルに洗いこみ、50 ～ 100 g として、

「都の花」で、低濃度鉛が検出された「ちごさくら」は「都の試料分解原液を作製した。この原液を適宜 0.14 mol/L 硝花」と他 3 種とのちょうど中間くらいの値であった。

酸で希釈して、鉛分析用試料とした。

４．考

おしろい分解液中の鉛濃度の測定は、10 mg/L 混合標準

察液（XSTC-622, SPEX, USA）を希釈して作製した鉛 1 ng/g

含 鉛 お し ろ い 4 試 料 の う ち、3 試 料 の 207Pb/206Pb はの検量線用標準液を使用して作成した検量線に基づいて行

0.847 で同じであり、208Pb/206Pb が 2.078 ～ 2.091 と非常にった。鉛濃度測定には、誘導結合プラズマ質量分析計

近い値であった（表 1）。これは国内の鉛鉱山から算出する（ICP-MS）（Agilent 7500ce，アジレントテクノロジージ

鉛（207Pb/206Pb=0.844±0.007, 208Pb/206Pb=2093±0.014）と

ャパン，東京）を使用した。測定には 208Pb をモニター同位ほぼ同じ同位体比である。このことから、「歌舞伎香」「姿

体とし、3 ポイント取り込み、各ポイント 100 msec 積分（0.3

見香」「無類御化粧」は国内産鉛を原料とする鉛化合物を含sec 積分／マス）、100 スキャンを 3 回繰り返し測定した。

む も の と 考 え ら れ る。 一 方、「 都 の 花 」 の 207Pb/206Pb、測定して得られた各おしろい試料の分解液中鉛濃度を基にして、鉛濃度を約 5 ng/g になるように再希釈を行い、208

Pb/206Pb は 0.942、2.203 と、他の含鉛おしろい 3 試料とは全く異なる同位体比をもっており、このおしろいに使用

Pb/ Pb， Pb/ Pb を測定した。

されている鉛は国外から輸入されたものであることが明ら

米国National Institute of Standards and Technology（NIST）かである。貿易統計によると、1900 ～ 20 年にわが国に輸同じ ICP-MS を使用して

207

206

208

206

の鉛安定同位体比測定用認証標準物質 NIST SRM 981 を、入されていた鉛の産地は、オーストラリア（43%）
、日本

おしろい試料と同様に 5 ng/g に調製して同位体比測定用（24%）、アメリカ（19%）の順であったという 4）。オーストの装置校正を行った。206Pb，207Pb，208Pb それぞれ 3 ポイ

ラ リ ア の 代 表 的 な 鉛 鉱 山 で あ る Broken Hill の 鉛 のント取り込み、各ポイント 0.33 秒積分とし（1 sec 積分 / マ207

ス）、1000 スキャンに設定し、各試料 5 回測定を行った。

の同位体比はこれと近い。もともと無鉛おしろいとして販

なお鉛同位体比測定の精度は、どちらの比も、変動係数と売されていて、他 4 試料と比較すると 1/100 程度の含有量

しておよそ 0.3% 程度であった。

であった「ちごさくら」中の鉛は、意図的に添加されたもの

３．結

Pb/206Pb は 0.96 であることが知られている 4）。
「都の花」

か、原材料や生産ラインの汚染によって、非意図的に混入果してしまったものかは明確には判断できないが、その同位7 試料の明治時代おしろいの鉛分析結果（濃度および同体比は国産とオーストラリア産のちょうど中間の値であっ位体比）を表 1 にまとめて示した。無鉛おしろいとして販た。意図的な添加であればどちらかの値を取るのではと想売されていたという「ちごさくら」「白雪」「御園のつぼみ」

像されるので、「ちごさくら」中の鉛は、非意図的な混入のの 3 種のうち、「ちごさくら」のみ低いレベルの鉛（0.35%）

結果であったと想像することができる。

が検出されたが、他 2 種からはたしかに鉛が検出されなか

明治～大正時代の女性の頭髪中鉛同位体比 3）と今回測定したおしろい及び国産とオーストラリア産の鉛鉱石のそれとを図 1 にプロットした。図示したように、おしろい、頭髪、

表1

分析したおしろい（明治時代）の鉛濃度および安定同位体比
鉛濃度（％）

都の花
歌舞伎香
姿見香
無類御化粧
ちごさくら
白雪
御園のつぼみ

55
32
28
17
0.35
<0.01
<0.01

207

Pb/206Pb
0.942
0.847
0.847
0.847
0.884
─
─

208

Pb/206Pb
2.203
2.091
2.088
2.078
2.131
─
─

鉛鉱石（日本、オーストラリア）の 207Pb/206Pb、208Pb/206Pb
プロットは直線上にのる。これは鉛の各同位体の親元素（ウ
ラン及びトリウム）の放射壊変の半減期に依存した、鉛の「成長曲線」に沿ったものであるためである。当時の女性の頭髪鉛の同位体比は、日本産の鉛とは大きく異なる同位体比をもっていることはすでに指摘し、当時の環境を汚染していた鉛の同位体比 4）とも異なることから、頭髪中の高いレベルの鉛濃度は環境汚染が原因でないことを議論している 3）。環境汚染でなく、人体のみを汚染するということは、− 174 −

19 ～ 20 世紀にわが国で使用された含鉛おしろいに関する研究

図1

含鉛おしろい、頭髪、鉱石の鉛安定同位体比

生活環境の中で、人々の身近で使用される「もの」からの直7 点中 4 点には鉛が 17 ～ 55%という高濃度で含まれており、接の汚染であろうと推測される。これだけ鉛濃度の高いお含鉛おしろいであることが明らかとなった。2 点に鉛は検しろいが当時家庭内で使用されていたのだとすれば、頭髪出されず、1 点にはおそらく製造過程での非意図的な混入に見いだされた人体鉛汚染の原因として、含鉛おしろいがと考えられる低濃度鉛が検出された。含鉛おしろいの鉛安その有力な候補であると考えるのが自然であろう。

定同位体比は、純国産鉛を含むおしろいと、オーストラリ

当時の女性の頭髪鉛の同位体比は、多くが図 1 の右上方

ア産鉛を含むおしろいがあることを示していた。明治～大向に分布しており、また、分布に多少の幅がある、すなわ

正期の日本人女性の頭髪鉛同位体比についての筆者の既発

ち頭髪中の鉛は産地の異なる複数の鉛の混合物であること

表データと比較すると、当時の女性はオーストラリア産鉛がわかる。このことは、国産鉛を使用したおしろいよりも、を含むおしろいの使用が多かったこと、同じ女性でも複数

オーストラリア産鉛を使用したおしろいへの依存度が高かのおしろいを使用していたことなどが示唆された。

ったこと、しかしおそらく女性たちは一種類のおしろいではなく、複数のブランドのおしろい（日本産鉛のおしろい（文献）とオーストラリア産のもの）を使用していたこと、を示唆

１）堀口俊一，寺本恵子，西尾久英，林千代（2008）
「児科

している。

雑誌」に発表された仮称所謂脳膜炎（鉛毒性脳症）に関す

今回分析した含鉛おしろいでは、国産鉛を原料とするもる研究の足跡 (1) 平井毓太郎による究明まで．労働科学のが 3 点、オーストラリア産鉛を原料とするものが 1 点と、84: 62-71．

たまたま国産ものの方が多かったが、図 1 を見る限り、オ

２）高橋雅夫（1997）化粧ものがたり．雄山閣，東京．

ーストラリア産鉛を原料とするおしろいの方を使用する女

３）M. Matsumoto, J. Yoshinaga (2 0 1 0) Isotope ratios

性の方が多かったものと考えられる。おしろいの原料成分

of lead in Japanese women’s hair of the twentiethの鉛が国産であろうとオーストラリア産であろうと、そのcentury. Environmental Sciences and Pollution

ことはおしろいの品質等とは関係がなかったはずであり、

Research 17: 643-649.

おそらく単純に市場に出回るおしろいの多くがオーストラ４）Y. Hirao, H. Mabuchi, E. Fukuda, H. Tanaka, T.

リア産鉛を使用していたものであったのであろう。このこ

Imamura, H. Todoroki, K. Kimura, E. Matsumotoとは、当時の貿易統計でオーストラリア産鉛がもっとも多(1986) Lead isotope ratios in Tokyo Bay sediments and

く用いられていたこと によっても支持される。

their implications in the lead consumption of Japanese

4）

５．総

industries. Geochemical Journal 20: 1-15.

括

明治時代のおしろい 7 点に含まれる鉛の分析を行った。

− 175 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

自己顔に対する意識に関する研究

─日韓における違い─

カリフォルニア矯正歯科 三軒茶屋（元：北海道大学病院咬合系歯科矯正歯科）

日下部

豊寿

The purpose of this study was to investigate how laypersons are aware of their own faces via a questionnaire between
Japanese and Korean. The selected subjects were Sixty Japanese and 60 Korean females from 18 to 27 years old, who are
students in Dental Hygienist Academy. All subjects are asked to fill out a questionnaire about awareness of their own facial
appearance describing focusing on the visual impression. The Japanese and Koreans are similar anatomically. However, theychose the one that will completely different likes of own face. In addition, Japanese compared to Koreans, had to feel about
the front than profile, and especially for nasolabial. Compare Koreans, Japanese felt a very dissatisfaction for their own
profile.

１．緒

さらには皮膚や脂肪組織なども大きく影響することを踏ま言える必要があることは言うまでもない。これを背景に、歯近年、歯科の中でも矯正治療に対する意識が向上し、虫科矯正治療では側面のレントゲン写真（セファログラム）
か歯の治療だけではなく歯並びや顎の位置がずれているかみら硬軟組織に関わる各種解析を行い、いわゆる「美しい横合わせを治す歯科矯正治療を希望する患者が増加している。

顔」を一つのゴールとして提案している。しかし、（1）
日本

特に、成人になってから矯正治療を希望する患者数は大き

人はそもそも横顔に対する認識が強くないという報告 4）、

1）

く増加している 。歯科矯正治療のゴールは「きれいな歯（2）各種メディアの普及により美しさに対する認識がボー並びを獲得する」という目的のみならず、正しい口腔機能

ダーレスになってきている可能性があること、（3）顔面軟を達成するための「個性正常咬合（正しいかみ合わせ）」を確

組織形態は骨格に大きく左右されること、（4）ほうれい線

立するという目的がある。また、近年ではかみ合わせの善の問題など aging に対する認識が強くなっていること、な

し悪しが健康長寿や体の不具合に深く関連するとも考えらど、従来からある古典的な手法のみで美しさを判断、提案れていることから、医科からも注目を集める部分である。

するには不十分と言わざるを得ない環境に直面している。

一方、歯科矯正治療は歯並びやかみ合わせの改善と同時にこれまでの研究手法では「術者が」あるいは「一般人が」他人

歯と口唇との相互位置も変化することから、口元を中心との側貌に関してどのような印象を持つかというものが主体した顔貌の改善を主訴として治療を期待する患者も少なくであったが、そもそも自分自身が自分の顔をどのように感ない。口元は側貌の美しさを決める上で重要な意味を持つ

じているのか、という視点に欠けるものであった。このよと考えられており、歯科矯正治療では Tweed が「顔面線（横うなことを背景に今回、術者サイドからの retrospective顔）の調和」を治療目標の 1 つに掲げるなど、実際の治療ゴな研究ではなく、「一般人や矯正患者が自分自身の自己顔ールを考える上では側貌（横顔）
形態が歯科矯正学においてに対してどのような意識をもっているのか、また、これがは重要な位置づけにある。この側貌形態の計測には、本人の顔面軟組織形態とどのような関連にあるのか、さら2）

Tweed 分析 や一般的にも有名な Ricketts の Esthetic lineにこれらの個々人がどのような顔貌を好むのか、を明らか（E-line）3）などの軟組織分析がある。顔面は頭蓋骨や顔面にすること」とした。このような目的で、以前当財団の協骨さらには顎骨などの骨組織の上に多種多様の筋肉や脂肪力により、日本人の自己顔に関する意識調査をさせていたがのっており、この上に皮膚組織がのって軟組織を形成しだく機会をもらった。結果、一般人の E-line（横顔から鼻ている。さらに、上下顎骨にある歯槽骨には歯が植立してと顎に接する線）からの平均的な口元の位置は、Ricketts

おり、この位置が口唇の状態を決める大きな要因となる。

の言う好ましいシルエットに近似しているにも関わらず、このため、側貌を考える時にはこれら歯や骨組織や筋肉、自己顔の“横顔の全体印象”や“横顔の輪郭”はやや不満の傾向にあった。また、“口や口元周囲”、“鼻”そして“顎”など
横顔の印象は、やや不満に感じていた。これらから、鼻、唇そして顎から成り立つ E-line が、好みの横顔を理解する

Investigation of Consciousness for Own
Facial Appearance between Japaneseand Korean
Toyohisa Kusakabe
California Orthodontics Sangenjaya

上でとても重要であることを示すと考えた。一方、これらの結果はまた、口唇と E-line の距離と同時に、構成要因や形の間で包括的な関係が、横顔の好みを決定することも示唆する。すなわち自己顔は、口元が後方にあり、好みの横− 179 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

顔も口元が後方にあったが、一般人は自己顔についてやや

お、E-line の設定は鼻尖とオトガイを結ぶ接線とした（Fig.

不満を感じていた。それを受けて、大韓民国は日本に一番

1）。また、計測に際しては、E-line より前方に口唇がある近い国であると同時に、日本人に最も近い民族といわれて場合を「+」、後方にある場合を「−」とした。

いる。そんな隣国でありながら、審美に対する意識は、美側貌写真からは、上下顎の骨の前後的位置関係を調べた。

容外科の普及をみても、日本人より高いことがうかがえる。

レントゲンを使わず、佐藤の方法で軟組織から計算 5）した

そこで今回、日本人と韓国人の間で、自己顔の意識にどの（Fig. 1）。

ような違いがあるか明らかにすることを目的に、研究を行

2. 4. アンケート調査

った。

２．実
2. 1. 対

被験者に対して、以下の自己顔に対する意識に関するア験

ンケート 6）調査を行った（Table 1）。アンケートは 30 項目

象からなるが、内訳は（1）正面顔、横顔、斜め顔の印象、ア

本研究は北海道大学病院倫理委員会とウルサン大学

ウトラインの印象、など顔全体に関する印象からなる 9 項

ASAN 病院倫理委員会の審査を経て行うものである。研目、ならびに（2）目、鼻、口、口元、かみ合わせ、歯、唇、究対象は本研究への同意がえられた 18 歳以上の女性で、あご、えら、などの個々のパーツからなる 15 項目と、横北海道大学病院咬合系歯科にて実習を行った衛生士学校学

顔やほうれい線に関する意識調査の 6 項目とした。これら

生の女性 60 人と、韓国 ASAN 病院矯正歯科（ソウル）にてのアンケートは満足から不満までの 5 段階評価の尺度順位

実習を行った衛生士学校学生の女性 60 人を対象とした（18の形式をとるものである。さらに本アンケートに加えて、

歳から 27 歳）。

（3）我々が所蔵する日本人側貌の平均シルエットを基準にE-line をもとに上下口唇部を一塊にして前後に 2 mm ずつ

2. 2. 顔面写真撮影方法

移動させて作製した 8 枚のシルエットと、同様にオトガイ

被験者顔貌写真を規格化して撮影した。すなわち、頭部部を前後に 2 mm ずつ移動させて作製した 8 枚からなる２固定を左右のイヤーロッドにておこない、被写体、カメラ

種類のシルエットシリーズを作製し、それぞれで「最も好間距離を 1.5m として撮影を行った。カメラは Nikon 社製

ましいもの」を抽出させた（Fig. 2 ）。また、（4）今までに自D40 にて焦点距離 55 ミリのレンズを用いた。さらにパソ分の横顔を写真やビデオ等で意識してみたことがあるか、コン上での計測のため、ルーラーを同じ画面に写すことと化粧の時（髪ではなく）、横顔を意識して見たことがあるか、した。顔面規格写真の撮影は正面、45 度斜位、側面の方

一日に何度くらい鏡をのぞくか、化粧の時に特に注意する

向から行った。撮影条件としては、噛んだ状態（最大咬頭嵌合位）で上下口唇を軽く触れる状態、および歯をみせる

Table 1

笑顔でも行った。

2. 3. 資アンケートの一部

１満足 ２どちらかというと満足 ３どちらともいえない ４どちらかというと不満 ５不満

料

撮影した画像データから等倍に印刷した側面の顔貌写真（以下側貌写真）を作成し資料とした。次に、側貌写真上で各対象の E-line を設定し上下口唇との距離を計測した。なFig. 1 側貌写真上に E-line を設定し、上下口唇との距離および Sn-Ns-Pogs の角度を計測した。

正面顔全体の印象（
斜め顔全体の印象（
横顔全体の印象
（
顔の輪郭
（正面）
（
顔の輪郭
（側面）
（
顔の各部分のバランス（
顔の左右のバランス（
口元全体の印象（
唇全体の印象
（
まゆ
（
まぶた
（
目
（
ひたい
（おでこ）
（
鼻
（
耳
（
ほほ
（
上唇
（
下唇
（
あご
（
えら
（
歯
（
歯並び
（
自分の横顔 は好きですか？ （自分の笑顔 はお好きですか？ （− 180 −

１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
１
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１
１
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１
１

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２

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３
３
３

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４
４
４
４
４

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５
５
５
５

）
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）
）
）
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）
）
）

自己顔に対する意識に関する研究

点はどこか、などの日常生活に関するアンケートを行った。

３．結

一方、これらのアンケートの後に先に撮影した本人の顔貌

─日韓における違い─

果の画像データをタブレット PC（iPad 2, Apple 社）上に描

上下口唇の突出度の平均値（Table 2）と好みのシルエッ

出し、（5）アンケート（1），（2）上で自己顔に対して「満足」

ト（Fig. 3）は、日本人の衛生士学校の学生群も、韓国の衛

もしくは
「不満」
という点数を与えた項目についての具体的

生士学校の学生群も共に平均的なものを選んでいた。これ

内容に関しての聞きとり調査を行った。

は、解剖学的には極めて近似している両群であったが、自

1

2

3

4

5

6

7

8

7

8

a）オトガイ部を一塊にして前後に２mm ずつ移動させたシルエット

1

2

3

4

5

6

b）上下口唇部を一塊にして前後に２mm ずつ移動させたシルエット

Fig. 2

左を向いた横顔のシルエット。赤の矢印は、日本人の平均の横顔を示す。
Table 2 日本人と韓国人の、上下口唇と E-line との距離の平均値、最大値、最小値、中央値。

好ましいシルJaw(K)

25

人数

(人数)

好ましいシルJaw(J)
20
15

25
20
15

10

10

5
0

5
1

2

3

4

5

6

7

0

8
(#)

1

2

5

6

7

8

好ましいシルMouth(K)
人数

(人数)

4

(#)

好ましいシルMouth(J)
16
14
12
10
8
6
4
2
0

3

25
20
15
10
5

1

2

3

4

5

6

7

8
(#)

Fig. 3

0

1

2

3

4

5

日本人（J）と韓国人（K）の、好ましいシルエット− 181 −

6

7

8
(#)

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

己顔に対する好み（Table 3–1 ）は全く異なる傾向を示した。

していた（Table 3–2）。特に、側貌形態は、平均値は比較

また、どちらかというと日本人は韓国人より、横顔を意識的近似していたが（Fig. 4, 5）、極めて不満の程度が高いこ

しないが、正面から見られるほうれい線やその深さを気にとが解った。

Table 3 -1

日本人（Japanese）と韓国人（Korean）のアンケート結果

Table 3 -2

日本人（Japanese）と韓国人（Korean）のアンケート結果− 182 −

自己顔に対する意識に関する研究

４．考Fig. 4

日本人（J）と韓国人（K）の、上下口唇と E-line との距離

Fig. 5

日本人（J）と韓国人（K）の、Sn-Ns-Pogs と ANB の角度

─日韓における違い─

集団は、歯科衛生士学校の学生であること、2. 学生のため

察

ある程度の年齢に集約出来ること、3. 男性に比較して美に両外来ともに、1 年を通して複数の歯科衛生士学校の実対する意識が高いことなど、国の違いだけである程度相似習生が来るため、日本と韓国で同時に平行して実験を行う

した集団のため、データのばらつきが制約されるため被験ことで、研究成果の抽出に時間的な効率化を図ることがで者として適当であると考えた。

きた。そのため、1. 実験の周辺整備、2. 途中経過そして、

これまでの研究は一般集団の個々人や歯科矯正治療を受

3. データがそろったところの 2 回現地に赴き、短期間でける患者がどのように自己顔を認識しているのか、という話し合いをもつことができた。一方、両外来に実習に来て基本的な観点については全く検討しておらず、一般的に「美いる歯科衛生士学校の学生を選択した理由は、1. 両被験者

しい横顔」あるいは「矯正歯科医師が美しいと判断した横− 183 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

顔」といった概念に偏在しているという大きな欠点がある。

向がみられた。これらより、日本人にとっては、横顔の概このような展開は、各個人がもつ顔面形態とこれに対する念が非日常の概念につながり、若干の抵抗感を示すものと意識、さらには aging に対する顔貌の変化とこれに対するも考えられる。

意識の変化といった人間がもつ根源的なものを網羅できな

現在、われわれは、歯科矯正治療を希望する患者と一般集団という異なる２つの集団で自己顔への意識の調査を、

い危険性を有すると考えられる。
本研究ではこれらの点を十分に考慮することで、「各個形態学的な観点を踏まえて行っている。これら 2 群は美に

人が自分の顔を（おそらくは社会に存在するひとりの人間

対する意識が異なり、矯正患者の方で意識が高いという仮として）どのようにとらえているのか」を導き出すことを目説を立てている。今回用いたアンケートは、これら矯正患的とするものであり、個々人の認識の上にいわゆる「歯科者が自己顔についてどのように認識し、良い点や悪い点を矯正治療におけるオーダーメード治療」の展開の可能性がどのように認識しているか、あるいはそれに対してどのよあるという認識である。

うな「執着」をもって対応しているかがわかるものになって

軟 組 織 に 関 わ る 評 価 は い わ ゆ る「attractiveness」 やいる。これらの集計から、自己顔に対する満足の程度の高「preference」といったキーワードに深く関連づけられるたい部分や不満の程度の高い部分が抽出されると予想していめ、評価そのものが困難であり、人種や文化のバックグラる。いわゆるほうれい線については、メディアなどでも露ウンドを考慮する必要もあることから、一般的に研究対象

出頻度は高い。しかしながら、形態学的な裏付けや個人のの抽出には難しい面を有する。これに対してわれわれはこ

好 み ま で 含 め た 検 討 は 皆 無 で あ る。 こ れ ま で 我 々 はれまでにも、「自己顔」に対する「attractiveness」という観

Midfacial Line（横顔における頬の張り出し）の検討を行っ点から軟組織側貌を検討した実績を有し、この部分の研究てきた 7）。矯正治療を希望する患者においてはセファログの有用性と重要性を示唆している 6−8）。さらにわれわれはラムを撮影することから、今後はさらにほうれい線に関す

軟組織の形態は「美しさ」という点のみならず、口唇閉鎖がる調査が可能になると考えられる。

可能かどうかというきわめて機能的な側面と密接に関連することを示唆しており

9, 10）、「機能的な形は優れた形態美

以上より、日韓の間の相違は、形態の問題ではなく、文化的な違いが大きく寄与していると考えられる。

をも有する」ことは人間においても両立しうるというのが５．統着想の発端である。

括結果より、今回用いた被験者の E-line からの平均的な口

今回の研究では、日本人と韓国人との間では、解剖学的元の位置は、Ricketts の言う好ましいシルエットに近似しには極めて近似していたが、自己顔に関する好みは全く異ていた。この値は過去の日本人の報告に比べやや E-line になる傾向を示した。特に側貌に関しては、日本人の方が不対して後方に位置するものである。一方、自己顔の“横顔満の程度が高かった。

の全体印象”や“横顔の輪郭”、“口や口元周囲”、“鼻”そして“オトガイ”など横顔の印象は、やや不満に感じていた。

謝辞

これらの項目は概ね「横顔」
に関するものであることは注視

本研究を実施するにあたりご支援いただきました公益財団すべき点である。
一般集団を用いて行ったわれわれの研究 5）

法人コスメトロジー研究振興財団に深く感謝いたします 12, 13）。

では E-line に対する上下口唇の位置は今回の被験者よりもまた、本研究の遂行にあたり多大なご教授を賜りました北

やや前方にあり一般的な「attractiveness」とはやや乖離し海道大学大学院歯学研究科口腔機能学講座歯科矯正学教室ていたために不満の程度が強いとも考えられた。しかし、准教授

佐藤嘉晃先生に心より御礼申し上げます。

今回の被験者は少なくとも E-line に対する上下口唇の位置
は Ricketts の言う好ましいシルエットに近似していたにも（引用文献）

関わらず不満の程度が強かった。このことは、推察の域を

１）金澤成美、山本隆昭、高田賢二、藤井元太郎、石橋抄

でないものではあるが、日本人は横顔そのものへの抵抗（嫌織、佐藤嘉晃、原口直子、今井徹、中村進治：北海道大悪）があるという見方をすることもできると考えられる。

学歯学部附属病院を受診した矯正患者の過去 15 年間のまた、韓国人に比べると、日本人の方がより不満度が強か

変遷．日矯歯誌 57（2）：92-102（1998）

った。しかし、日本と韓国の女子大生に対する研究におい

２）Tweed, CH : Evolutionary trends in orthodontics,て、1994 年の大坊の報告 11）では日韓ともにあまり変わら

past, present, and future. Am J Orthod 3 9 : 8 1-1 0 8

ないという報告であった。また、これらの被験者において(1953)

は、そもそも「横顔を意識してみることがあるか」「化粧の３）Ricketts, RM : Planning treatment on the basis of

時（髪ではなく）、横顔を意識して見たことがあるか」の問

the facial pattern and an estimate of its growth. Angle

いに対しては「あまり意識していない」という回答を示す傾

Orthod 27 : 14-37 (1957)− 184 −

自己顔に対する意識に関する研究

４）村澤博人 顔と美繊消誌 37:558-564 (1996)

─日韓における違い─

incompetence. Orthodontic Waves 68 : 12-19 (2009)５）佐藤嘉晃 , 角野晃大 , 小原三郎 , 他「軟組織プロファイ

11）Daibou Ikuo, Hiroto Murasawa and Yong-Jin Chou :ルから硬組織の上下顎前後的位置関係を予測する」道矯Attractive faces and affection of beauty-A comparison

誌 38(1):10-16 (2010)

in preferences of feminine facial beauty in Japan and６）佐藤嘉晃、井上則子、大滝尚子
識調査

他 : 顔貌に関する意

Korea. The Japanese Jopurnal of Research on Emotion,

北矯歯誌 26（1）：21-30 (1998)

1(2):101-123 (1994)

７）日下部豊寿 , 佐藤嘉晃 , 岡本亨 , 他「骨格性下顎前突症
患者の側貌の変化－下顎枝矢状分割術と矯正治療との比（本助成金による業績）

較―」日顎変形誌 16(1):1-7 (2006)12）Yoshiaki SATO, Toyohisa KUSAKABE, Junichiro

８）大滝尚子，佐藤嘉晃，梶井貴史 他：

CR 画像側面

頭部 X 線規格写真による Midfacial line の研究

道矯誌，30(1):40-45（2002）

IIDA：Do Japanese laypersons have Attractive
Profile? 4 5th Annual Scientific Congress Korean
Association of Orthodontics, 4th Joint Symposium of９）Handa K, Sato Y, Kaneko T, Yamamoto T, and Iida J

KAO and JOS, November 1-3rd, 2012, Seoul (Korea): A new method to evaluate lip sealing and its clinical13）日下部豊寿，佐藤嘉晃，福島久夢，飯田順一郎：顔貌application, Part 2 : Lip sealing during the daytime andの意識に関する研究―歯科衛生士について―，第 55 回

sleep. Hokkaido J Dent Sci 26 : 83-93 (2005)

北海道矯正歯科学会総会・学術大会，2014 年 6 月 26 日，

10）Leonardo SE, Sato Y, Kaneko T, et al : Differences

札幌

in dento-facial morphology in lip competence and lip− 185 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

●第 25 回表彰・贈呈式記念講演
●

塩田

清二

第25回表彰・贈呈式

記念講演（日本薬学会長井記念ホール・平成26年11月27日）〈香り〉はなぜ脳に効くのか〜認知症の予防・改善について〜
昭和大学医学部 教授

塩田清二

しおだ・せいじ1974年、早稲田大学教育学部生物学研究科を卒業、76年新潟大学大学院医学修士課程修了後、昭和大学医学部第一解剖学教室助手に、83年、昭和大学医学部博士号取得、同年10月、昭和大学医学部第一解剖学講師、97年4月助教授、99年4月から同大学医学部第一解剖学教室主任教授に就任。2001年8月から米国チューレン大学医学部兼任教授に就任、現在に至る。
・専門分野：解剖学、組織学（特に神経細胞死を中心とした基礎及び臨床研究）：メディカルアロマセラピー（特に認知症等の予防医学研究）
・その他：日本解剖学会評議員、日本アロマセラピー学会理事長、他多数歴任

ただいま紹介いただきました昭和大学の塩田と申します。

多いかと思います。ただ、よく考えてみますと、芳香植物

きょうはこのようなすばらしい表彰・贈呈式で記念講演の利用というのは、非常に昔から我々の人類祖先が、お祭をさせていただくという栄誉をいただきまして、まことにりとか、儀礼とか、あるいは最近は美容とか治療、こういありがとうございます。あわせてきょうは、研究助成 32 件、ったところに芳香植物を使って、応用した利用がされてお学術集会支援 1 件の助成の表彰がありましたが、受賞されります。

た先生方ほんとうにおめでとうございます。

例えば、儀礼でいいますと、仏教で仏さんにお参りする

私のきょうの話は、〈香り〉の研究についてですが、ぜひ楽しみながら聞いていただきたいと思います。

とき必ずお線香を立てて香りを出しますけど、これも一種のアロマセラピーなんですね。それから、キリスト教でもきょうも、この第 3 分野で受賞された方で、例えば「ムやはり香りを漂わせますし、イスラムでも同じということ

スリム女性の美と消費」とか「ハラール化粧品の可能性」とで、やはり宗教にはこういった香りがもう離れられないという研究がありますけど、こういったコスメの香りも、一いうか、非常に密接な関係があるということは言われてい種のアンチエイジングにつながりますので、そういったこます。

とも含めまして、お話しさせていただきたいと思います。

そこで、香りに魅了された歴史的な人を挙げてみました。

私どもの研究室をご紹介しますと現在大体 40 名ぐらい

古くはローマ皇帝ネロですね。この方は非常にバラが好き

おり、4 つに分かれて研究しております。先ほど司会者かで、自分の奥さんにもバラの香りをつけたりして、部屋のらご紹介いただきましたが、神経再生、あるいは GPCR リ

中も一面にバラの香りを漂わせていたと言われております。

ガンドで PACAP という神経ペプチドの研究をやっており

クレオパトラも、ご存じのように、バラの香りを使っています。これが最近ドライアイやドライマウスの原因になる

ろいろ男性を魅了したというふうに言われております。そ遺伝子になるのではないかと思い、今こういった予防治療

れから、ハンガリー王妃のエリザベート、この方は、歴史法も考えております。それから、摂食調節は、脳の中でど上非常に有名な王妃というか女性で、ハンガリー帝国を非のようにして我々の食欲がコントロールされているかを研

常に大きくした女性ですけれど、この方も、実はバラが非究中ですが、これもいろんな神経ペプチドを調べながら、常に好きであったと言われていまして、バラのエッセンシ

神経ネットワークを調べているところです。

ャルオイル、精油を使ってご自身のリウマチの治療をして最後にアンチエイジングですが、これはアロマセラピーいたとも言われています。

にもつながります。最近日本でも大分浸透してまいりまし最後はマリー・アントワネットさん。皆さんご存じのよ

た統合医療という研究分野です。今年の 12 月 20 日、21 日、

うに、マリー・アントワネットという方はこのエリザベー

横浜パシフィコで統合医療学会とアロマセラピー学会が同トのところからフランスのルイ 16 世のところに嫁入りし時に開催されます。

たわけですけれど、この方も非常にバラが好きであったと

いろんなところの方々と共同研究させていただきながら、いうことで、自分の肖像画を描くときにもバラを手に持っこの 4 つのテーマで研究を、昭和大学ではもう 35 年ぐらて描いていたり、バラの香りを使ってアロマバスをその当いさせていただいています。

時でもやっていたというふうに言われています。

さて、きょうのお話ですが、まず芳香療法の背景ですが、皆さん方、芳香療法というとアロマセラピーというふうに

このように歴史的人物で有名な人というのは、こういった香りに魅了されていたということが言われています。

なるわけですけど、どういう印象をお持ちでしょうか。何

芳香植物が歴史的に見ていつごろ使われ始めたかというかエステティックとか、サロンとか、そういうイメージがと、古くはエジプト時代と言われています。エジプトでは、− 189 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

紀元前 3000 年とか 4000 年前になると思いますが、ミイ

う人が、精油を使って、医療をさらに応用して功績を上げ

ラづくりをやっていました。ミイラをつくったときに、内ました。この『芳香療法』という、アロマセラピー実践のバ臓を取り出して体は残していますけど、防腐措置をするこ

イブル的な本でありますけど、これをジャン・バルネさんとで腐らないようにするにはどうしたらいいかと、乳香や、が出版をしています。

没薬、ボスウェリアやモツヤクジュという木の樹液、これ

このように、アロマセラピーの認知度というのはフランが抗菌作用があったので、その作用を使って、遺体の周りスをベースにしてどんどん世界中に広がっていったというに塗り込んで、そして遺体が腐らないようにしました。そことになります。

れで現在でもミイラは、大英博物館へ行けばいっぱい並ん

その中でこのアロマセラピーは、ガットフォセのお弟子でいますけど、これが腐らなかったのはこのような、いわさんで、マルグリット・モーリーというオーストリー人のゆる芳香植物の抗菌作用を使っていたということになりま

女性化学者が、フランスのガットフォセのところでアロマす。

セラピーを学び、そしてこれをフランスからイギリスに伝時代が下りましてルネッサンスになりますと、非常に香えます。ご主人がイギリス人だったので、フランスからイ

水がはやりました。エッセンシャルオイルの生産量が増加

ギリスに移住して、そこでアロマセラピーを美容方面に活してきたことで、19 世紀に入りますと、天然の素材のエ用する、そういう技術を発達させて、それが今で言うアロッセンシャルオイルだけでは足りなくなり、合成香料が出

ママッサージということになります。

現しました。また、植物から有効成分を取り出して薬剤とイギリスではアロマセラピーというのは医療というよりして使用されるということが 19 世紀以降起きるようになもむしろマッサージ、エステティックなものにかなり力点りました。

がいったことで、日本では、イギリスで発達したこのアロ

このエッセンシャルオイルの製法ですけれど、これはど
うやってつくるかというと、皆様方ご存じだと思いますが、

マセラピー、マッサージ技法が 1980 年代に入ってきて、それが今までずっと続いてきております。

水蒸気蒸留法というのがあります。これは直接蒸留と間接

アロマセラピーはどういうものかというと、ちょっと定的なものがありますけれど、いずれにしても植物を釜の中義を見ますと、アロマテラピーあるいはアロマセラピーとに入れて、水蒸気を当てる。水蒸気に当てて壊れたものがいいますけど、花とか木、こういった植物に由来する芳香

揮発して、水で冷やしますと、エッセンシャルオイルと蒸成分、これをエッセンシャルオイルといいますが、これを留水、残った水、フラワーウォーター、これが残るわけで使って心身の健康、美容を増進する、そういう技術あるいす。こういう方法はアラビア医学で発達したということで、は行為のことと言われています。また、お香やフレグラン

10 世紀にイブン・シーナーという人がこの水蒸気蒸留を

スのキャンドル、こういったものも、ストレスを解消する

初めて植物で適用して、植物からエッセンシャルオイルをために、リラクゼーション効果を含めて、アロマセラピー

つくりました。これがアロマセラピーの原型であろうと言と言われています。ちなみにお香、香道というのは日本でわれています。

室町時代に発達して、御家流とか志野流とか、そういった

なぜこの水蒸気蒸留がここで使われたかというと、これはいわゆる錬金術ですね。イスラムでは、金とかプラチナ

流派ができまして、現在も香道、香りの「道」と書いていますが、香道は行われています。
5 年ぐらい前に、志野流の香道の全国大会がありまして、とか、いわゆる金属を取り出すために水蒸気蒸留法を使った。そのときに植物を使い、エッセンシャルオイルができ400 人ぐらい集まるんですけど、そこで香りのいわゆる医たと言われています。

学的な応用という話をしたら、「お香にそんな効果あるん

したがって、ここでのアラビア医学ですが、これは十字ですか」とびっくりされました。実際にお香の中で真南蛮軍の遠征でヨーロッパに伝達されることになります。ヨーという香りをかいでみますと、非常にリラクゼーション効

ロッパはその当時、こういう技術がなく、むしろアラビア

果が起きるというのを唾液を調べて成分の解析結果を発表

医学のほうが進んでいたということになります。そしてしました。アロマセラピーの中にお香も入ってきます。

1920 年代の初めに、モーリス・ガットフォセというフラしたがって、アロマセラピーというのは、全体からいいンス人が、実験をやっていたときにやけどを負って、そのますと、まず補完・代替医療の中に入りまして、その中にときにとっさに近くにあったラベンダー精油に手を浸した

植物療法、フィトセラピーというのがあります。これは植ところ傷の治りが非常によかったということです。抗炎症物を使って、それを医療に使うということで、その中にア作用や細胞の再生作用があるというのは最近わかっていま

ロマセラピーが入ってきます。例えば、東洋で言うと漢方すけど、彼はこれを医療に使えるのではないかと考え、研がありますけど、この漢方医学や漢方医療もやはりフィト

究を開始して 1928 年に『Aromatherapy』という本を出版

セラピーなんですね。植物を煎じて、それを人に使うわけいたしました。そして、それをさらにジャン・バルネといですので、それがフィトセラピーということで、西洋で言− 190 −

第 25 回表彰・贈呈式記念講演 「〈香り〉はなぜ脳に効くのか 〜認知症の予防・改善について〜」

うとアロマセラピー、東洋で言うと漢方、そういうふうなで、これを嗅上皮といいます。この上皮は、多列上皮です

ものになるかと思います。

が、嗅細胞といいまして、神経細胞の一種です。それからこのエッセンシャルオイルは、現在では二百数十種類出

いわゆる支持細胞といいまして、これは神経ではない一種ておりますけれど、いろんな症状に対して使われています。

のグリア細胞です。ところが、この 2 つの細胞はどこから気分が落ち込んだうつ状態のときには、クラリセージやカ

来るかというと、この基底にある基底細胞という細胞が分モミール・ローマンを使う、あるいはいらいらして気分が裂をして、この細胞が神経細胞と支持細胞に分化していく

過敏に反応するようなときは、ラベンダーやサイプレスなわけです。これは一種のステムセル（幹細胞）です。ステム

ど鎮静作用のあるようなエッセンシャルオイルをかぐといセルということは自己増殖ができるということになります。

いということで、いろいろ症状に応じて使用するエッセンですから、年をとっても、この細胞がある限り、嗅細胞とシャルオイルというのが盛んに研究されてきております。

か、あるいは支持細胞、こういった上皮がどんどんつくら

エッセンシャルオイルは、自然の、天然の植物由来のもれるということになります。

のですので、非常に多種多様な炭化水素、アルコール、エ

そこで、この嗅細胞の樹状突起に相当するものが外のほ

ステル、いろんなものが入っております。こういうものをう（表面）に出てきます。これを嗅小毛といいまして、1 つ

ガスマス分析するわけですが、そこでこのように値が出ての神経細胞から十数本の枝が分かれて外に出てきます。こきますが、こういう構成成分を含めてケモタイプというふこの嗅小毛の表面に、においの受容体が存在するというこ

うにいいます。ですから、この真正ラベンダーがどういうとがわかってきました。したがって、におい分子がこの嗅成分からできているかということを分析して、それをこう

細胞の表面にある受容体にくっつきますと、この細胞が興いうふうにケモタイプという形で書いております。

奮をして、この情報はこの軸索を伝わって篩骨、篩板とい

ちなみに、この真正ラベンダーの場合でいいますと、主う骨を通って、嗅球という中枢神経のところに伝えられて成分はここにあるモノテルペンアルコールのリナロールと、いきます。ここから先に嗅索を伝わって脳の中に入っていエステル系の酢酸リナリル、これでおよそ 90 ％がこの成

くということになります。

分からできるということになりますが、それ以外に非常にこれはヒトの嗅粘膜の光学顕微鏡ですが、嗅上皮の基底

微量成分がこの中に入っております。ですから、トータルにあるこの細胞、これがいわゆるステムセルに相当します。

でこの真正ラベンダーという香りができているわけで、そこの細胞が分裂していきますと、上に上がっていきまして、の辺がいわゆる西洋医学的なものと違って、主成分はこれ

嗅細胞とか支持細胞になっていきます。この表面に薄く毛ですから、リナロールをやればラベンダーの作用が出ますが見えると思いますけれども、これが実は嗅小毛という、というわけでもないんですね。やはり混合したもので初め嗅細胞がつくる突起の毛に相当します。

て我々はラベンダーというものを感じているということにこの場所を電子顕微鏡でもっと詳しく見ますと、この一本一本が嗅細胞の突起になります。この嗅細胞の突起は、なります。
それで、エッセンシャルオイルをかぐと、気体として揮表面でちょっと膨らみを持っていまして、これを嗅小胞と発しますので、後で詳しくお話ししますが、鼻から入って、いいます。ここから、実は十数本の毛がここに出てきます。

嗅神経を伝わって脳の中に情報が入ってきます。最終的にこの表面にいろいろありますが、この毛の表面ににおいのいろんな標的臓器に働き、内分泌、自律神経、免疫、ある受容体というのが存在いたします。

いは高次脳機能、いろんなところに影響が出てきます。まこの受容体を発見したのはだれかといいますと、ここにた一方、吸入したエッセンシャルオイルが肺に入りますと、ありますように、リチャード・アクセルとリンダ・バック

肺胞から血液に入って体循環をする。経皮投与で皮膚にマルという 2 人です。この 2 人が、におい分子に結合するレッサージをしますと、ここから血液に入って体循環をする。

セプターを発見いたしました。ここからにおいの科学的な経口投与しましても腸管から吸収されて最終的に末梢臓器研究が始まったと言われています。

に運ばれていく、ですから、エッセンシャルオイルは実際

この 2 人は何をやったかといいますと、実はマウスを使に吸ったり、あるいはつけたりすると、いろんな形で体のいまして、受容体の遺伝子が約 1,000 種類あるということ中に入っていくということになります。

を 1991 年に発表いたしました。ちなみに受容体の遺伝子

これから、
〈香り〉
が脳に一体どういう影響をするかといの数は全遺伝子の約 3 ％です。ということで、非常に大きなグループをつくっております。しかもこれはいわゆるう、そういったところの話をさせていただきます。
香りはどこで感じるかといいますと、この嗅覚器とあり

GPCR と呼ばれる、G タンパク質結合体の受容体です。まあ、

ますが、この鼻の中の上の奥のところに、においの部分と我々人間やネズミもそうですけど、およそ遺伝子は 3 万といいまして嗅部という場所があります。ここに実は嗅神経いうふうに言われていますが、そういったうちの 1,000 個という神経が来ております。この部分を拡大したのが右図もあるということは、においにかかわる遺伝子が我々の体− 191 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

にとって非常に重要であるということになります。ちなみ

濃度をどんどん上げていきますと、非常に発火頻度が上がに我々の嗅覚の受容体遺伝子は幾つかというと、約 350 でってくるということがわかっています。細胞内記録法によす。つまり我々人間は、においについてはマウスなどの動って嗅細胞のにおい応答というのが濃度依存性であるとい物に比べると 3 分の 1 ぐらいの遺伝子ということで、におうことも証明されております。

いについて見ると、私たちの機能はネズミより退化していということで、嗅覚系の神経回路の概略としては、においを感受する嗅細胞というのがにおいをキャッチしますと、るということになります。
ただ、それでもいろいろ遺伝子の組み合わせになります

軸索が脳の中に入っていって、嗅球の糸球体と呼ばれるとから、私たちは数万種類の香りをかぎ分けると言われていころに神経が終末します。そうすると、次の、2 次ニューます。遺伝子がたった 350 でどうやってそんな何万種類のロンにこれがシナプスという形で情報が伝達され、それが香りをかぎ分けられるのか、というのは次のところの話に嗅皮質に入り、さらに 3 次ニューロンにシナプスで転換さ入っていきますと大体ご理解いただけると思います。

れていくことで、香りの化学的な情報が電気的な情報に変彼らは結局この嗅細胞のところにあるにおいの受容体、

わって、それが脳の中に入っていくということになります。

遺伝子をクローニングして、そして、そのにおいによってこれは東大の森先生の図を借用したんですけど、科学雑

この細胞が興奮して、それが糸球体と呼ばれる嗅球のとこ

誌『サイエンス』にレビューで書かれていますが、実はこのろにその情報が伝えられるというところまで見つけたんで香りを感じる細胞というのは、先ほど言った嗅球の糸球体す。ここから先のことはまだ良くわかっておりません。

に軸索が投射されますが、ランダムにいくわけではなく、嗅覚系の受容体ですが、OR、odorant receptor といい

ある特定のにおいはある特定の糸球体にいくということがますので、におい受容体というふうに言っています。これわかってきました。つまり、これは糸球体のところににおは先ほどの毛の表面にある膜のところに、膜を 7 回貫通す

いの番地があるということです。ですから、あるにおいがる GPCR です。これがにおい受容体の基本です。ただ、こ来ますと、ある特定の糸球体のところにいく。においに 1

こに VNR とか VR とありますが、これはフェロモンの受

丁目 1 番目という、こういう番地が振ってあるということ容体です。これを見るとわかりますように、フェロモンのがわかってきたということです。

受容体もにおい受容体もほぼ同じような、非常によく似た

ここから先はどうなるかというのは、まだ残念ながらよ

構図をしております。ただ我々人間の場合には、残念ながくわかっておりません。まだ研究中ということなんです。

らフェロモンは存在しないということが言われていますの

これはなかなか難しいところがあります。

で、ネズミにあるかどうかということですけど、我々はこところで、嗅球から入ってきた情報は、外側嗅索を経てのにおい受容体でにおい分子が来て、それが結合すること

脳のいろんなところに投射されていきます。それがさらにによってにおいを感じるということになります。

扁桃体や海馬や視床も経ますけれど、こういったところをこのリチャード・アクセルとリンダ・バックルさんは、通って最終的に前頭葉の眼窩回のところに入っていきます。

91 年にこういう構図を発表いたしました。これはにおい

我々はここでにおいの情報を最終的に集めて、連合して、受容体部位のアミノ酸配列で、膜を 7 回貫通しまして、N

そしてそのにおいに対するリアクションというのを起こす

末端が細胞外、C 末端が細胞内にあり、これが G 蛋白と結わけです。ですから、これが気持ちいいとか、悪いとか、合するということも明らかになっています。

あるいはこの香りをかぐとおなかがすいたとか、そうする

実際ににおいはどのように受容されるかというと、におと、おなかがすいたので、今度はちょっと食べ物を食べよ

い分子がやってきますと、先ほどの嗅神経細胞の膜のとこ

うとか、そういう意思のほうにいくわけです。いろんな形

ろににおい分子特異的なレセプターがあります。そうする

で情報が脳の中に入って、それが集まっていくということと、におい分子がくっつきますと、これは特異性があるわになります。

けですけど、1 つのレセプターは 1 つのにおい分子としか私たちは、functional MRI を用いた香りの研究というのくっつかないと言われておりますが、そうしますと、細胞をもう 10 年以上前から行っております。ご存じのように、側にある G 蛋白が活性化して、それがアデニル酸シクラー

この fMRI というのは、核磁気共鳴を利用して、脳や脊髄ゼという酵素によって ATP から cAMP ができる。このの活動に関連した血流の動態反応を視覚化します。神経細cAMP がこういったナトリウムチャネルにくっつきますと、胞の活動を直接見るわけではなくて、ある領域の脳の中の外からナトリウムが入ってきて、この細胞の膜の脱分極と血流が非常に高まっているということを測定することがでいうのが起きる。それによって嗅細胞は興奮をするというきます。ですから、当然ある場所の神経細胞が活性化してことになります。

いれば脳血流は上がるわけですので、逆に脳血流が上がっ

実際にイソアミルアセテートやカンファーといった香りているところは神経細胞が興奮しているということがわか

分子を受容体に反応させて、嗅細胞の膜電位をはかると、ります。それを画像化することで、生きた状態で脳の活動− 192 −

第 25 回表彰・贈呈式記念講演 「〈香り〉はなぜ脳に効くのか 〜認知症の予防・改善について〜」

我々は、各種におい刺激に対する脳の応答性を調べ、脳を見ることができるわけです。
例えばこれはヒトの脳ですけれど、前頭葉は活性化してのどういう場所がどういう香りで活性化するのか、あるいおりますけれど、こういうふうな形で、あるにおいをかがは不活性化するのかを調べてきました。全部はお話しできせてもいいですし、あるいは何か物を食べてもいいですし、ませんが、例えば、この LHA と呼ばれるここは摂食センあるいはそれを考えてもいいわけですけど、脳が動いてい

ター、あるいは覚醒センターと呼ばれています。視床下部るときに必ず血流は上がるわけですから、こういったとこ

では外側領域というのがありますが、その場所は、いわゆ

ろを見ると、逆に、ある香りをかがしたときに脳のどういる我々がおなかがすいたときに非常に活動が高まる場所なう場所が興奮するかというのがわかるわけです。

んです。食欲の、摂食センターと呼ばれています。ですか

それで私たちは、味の素の中央研究所の動物専用のら、そこにジンジャー、あるいはティートリーとかの香り

MRI を使って香りをやろうということで、8 種類ぐらい異をかがせますと、私たちはおなかがすいた状態で非常に物なる香りを使いまして――これはエッセンシャルオイルでを食べたくなります。それから、ペパーミントといいましす。そしてコントロールとして基準臭を使って、そしてそて、この香りをかぐと、LHA、外側視床下部は興奮します。

れをネズミ、ラットにかがせて、それで撮像するというこ

ここがいわゆる覚醒センターです。
最近の研究でわかってきましたのは、外側視床下部のとを行ないました。
例えばこれ、olfactory bulb ですけど、ちょっとぼやっ

LHA にはオレキシンというニューロンがありまして、ことしていますけど、これはラットの MRI の画像です。このニューロンが、こういった香り刺激をすると、非常に覚

ういうふうに 5 つぐらいに脳を分けていって、どういう場

醒作用があるニューロンですので、興奮すると考えられる。

所が香りで興奮するかということを調べていきました。

ですから、興奮するということは神経活動が高まるわけで、

例えば、真正ラベンダーをかがせますと、この嗅球のとしかもオレキシンというのは、覚醒作用もあるとともに食ころで、外側のところは血流が低下します。ところが腹側欲を亢進する作用があります。ですから、我々は、まあ、のところは脳血流が上がってきます。背側部は変化しない。

動物でも同じですけど、物を食べるというときは覚醒状態ですから、ある特定の香りをかがせると、脳のある特定のなんです。覚醒状態にあって物を食べるという行動にいく

場所が興奮するということ、あるいは抑制されるというこわけです。ですから、例えば皆さん方、もう経験あると思とがわかってきました。

いますけど、非常に眠いときというのは食欲がなくなるん

プチグレンという精油をかがせますと、今度は外側のほです。我々よりももっと動物のほうがはっきりしているわ

うと腹側の領域が両方このように脳血流が低下して、神経

けなんですけど、動物は、食欲を亢進させるというときは細胞の活動が低下するということもわかってきました。

必ず外側視床下部が活性化して、そして食欲を増進させて、さらに脳の後ろのほう、前脳、forebrain のところを見物を取りにいくという、そういう行動にいくわけです。

ていって、いろんなところを分けて、それぞれの場所でのところで、この VMH と呼ばれる満腹センターですが、脳血流を見ていきますと、これはレモンという柑橘系の香

残念ながら、満腹センターを興奮させるにおいというのは、りをかがせます。それで前脳のレベルで調べていきます。

いろいろ調べましたが、なかなかないんですね。ですから、

例えば、運動皮質とか体性感覚皮質はこういった変化があ

私どもは、VMH と呼ばれる満腹センターを興奮させる香りません。しかし、前脳の内側部や腹側部、この領域、こりを今探しております。それができれば、いわゆる抗肥満

ちらがコントロールの香りでこちらがレモンをかがせますのダイエットに効く香りというのはできると思います。こと、この領域、こちらでは赤くなっていますけどこちらはれを化粧品に練り込めば、化粧品を塗りながらおなかがいグリーンになっています。つまり、内側とか腹側領域の血っぱいになって、ダイエットになります。ダイエット化粧流が低下するということがわかりました。

品というのもできるんじゃないかというようなことも考えこの場所はどういう場所かと調べていきますと、これはています。

解剖生理学的な、昔からいろんな研究の蓄積がありまして、

ちょっとそれは話が飛びますけど、そういうことで、嗅この場所の神経細胞がずっと後ろの脳幹部のところに投射細胞で感受された情報は、嗅球を伝わって脳の中に入ってして、それが交感神経を抑制する場所であるということがいく。ですから、最終的には眼窩皮質のところにいくといわかっています。

うことになります。

そういうことで、この内側領域、腹側領域の神経細胞が、先ほど言いましたように、こういう食物の情報、嗅覚と血流が落ちるということはここが神経活動が低下するので、か視覚の情報は、目から入って、それが情動認知系とか運したがって、逆に脳幹部のほうで神経活動が高まる。こう動系を動かし、さらに視床下部を介して末梢の自律神経系

いうふうな神経のリレー、こういったエビデンスがとれても動かします。ですから、こういう香りとか視覚というのきたということが分かりました。

は、私たちの脳のいろんな場所を使いながら摂食行動とか− 193 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

代謝調節など、自律神経活動をやっているということにな状というのが出てきます。夜行性徘徊とか、暴力を振るうります。

とか、あるいは過食をするとか、幻想を抱く、せん妄を抱さて、これから本題になります。認知症ですが、現在世

く、睡眠障害、意欲低下、抑うつ状態、こういうものがど

界の認知症患者さんは非常に増えております。3,560 万人

んどん周辺症状として出てくるので、そういう認知症の患とここに書いてありますけど、今はもっと多いのかもしれ者さんをテイクケアするのは非常に大変だということになません。特に高所得国よりも低・中所得――これ、発展途

ると思います。

上国と言っていいと思うんですが――ここで非常に認知症

認知症の原因疾患ですけど、アルツハイマー病は大体の人口が増えているということが今後非常に大きな問題に45 ％から 50 ％にもなっております。昔は、脳血管痴呆となると思います。

いいまして、脳血管が詰まって、脳梗塞が起きて、それで日本における認知症の患者さんは、2015 年、およそ認知症が起きるというケースが多かったんですけど、最近

250 万人で、その数は大体 65 歳以上に占める割合 7.6 ％。

は欧米型のタイプ、アルツハイマー型の痴呆というのが増

これがどんどん先にいきますと、その認知症の数は増え、えております。

しかもパーセンテージは上がってまいります。ですから、

このアルツハイマー型の痴呆の特徴は、年をとるに連れ少なくとも10％以上が認知症になるということになります。

てそのパーセンテージが上がってくるということです。大

この認知症ですけど、加齢か物忘れかということで言い体 65 歳から 70 歳とか、これぐらいだと 10 ％レベルです

ますと、ちょっと違いがあります。単なる物忘れというの

けど、80 歳から 90 歳ぐらいになると、20 ％を超えます。

は、体験の一部を思い出せないわけですけど、認知症の場ですから、65 歳ぐらいだと大体 10 人に 1 人なんですけど、合は全体を忘れてしまう。新しいことを覚えられない。自80 歳、90 歳になってきますと、4 人とか 3 人に 1 人が認覚に乏しい。だから自分は心配していないんですね。
「私知症ということになります。しかもそれがアルツハイマー

は大丈夫です」と言う人ほど危ないという、そういうこと

病ということになります。
アルツハイマー病の特徴は、側頭葉の萎縮が特徴で、こなんですね。
それから、注意したい変化ですが、いろんな変化が出てれを見るとわかりますが、この側頭葉の神経細胞が死んでおります。日時、曜日がわからなくなるとか、好きなこと、しまいますのでだんだん萎縮します。それとともに、これ趣味をやらなくなってしまう、それから怒りっぽくなるとはポジトロンエミッショントモグラフィー（PET）で、持いうケースもあります。大体認知症の人の共通しているとってきた絵ですけど、正常の人は、前頭葉とか側頭葉が働ころというのは、面倒くさいと言うんですね。何かやっていていますが、アルツハイマーになってしまいますと、こくださいと言うと、「いや、私、面倒くさいからやりません。

ういうふうにブルーになって、神経細胞は働かないんです

面倒くさいから私やりたくない」と、こうなると、認知症ね。こういうのはアルツハイマー型認知症の特徴というこはもうかなり進んでいるといってよいでしょう。ですから、とになります。

自分でもし何か心当たりがあったら、ちょっと考えないと

現在この認知症の治療薬というのはアリセプト、ガラン

いけないですけど、面倒くさいということが非常にキーワ

タミン、メマンチン、3 種類出ております。しかし、いずードになると思います。

れも対症療法でして、根本治療にはなっておりません。で女性の主婦の場合ですと、同じ料理が出てくるんですね。

すからこれ、飲んだとしても、認知症が治るわけじゃなく

きのう食べたものがまたきょうも出てくる。それからあとて、認知症の発症をおくらせることができるという、根本は、同じ食材を常に買い込み、冷蔵庫がいっぱいになって的な治療じゃないんですね。ここが非常に大きい問題だとおります。皆さん方、あまり冷蔵庫をあけたことないかもいうことになっています。

しれませんけど、たまには冷蔵庫をあけてみたほうがいい

それで我々は、認知症に対してアロマセラピーがどういと思います。そうすると、同じ食材がいっぱい入っている

うふうな効果があるかと、特に中核症状、物忘れ、この認んですね。私も時々チェックしているんですけど、「何で知機能をアロマセラピーで改善できるということがわかっ同じもの買うの？」と言って。
「よくわかりません」と。「認てきましたので、それを使えば有効な治療ができるのでは知症、始まりじゃないですか？」なんて言うと怒られるん

ないかと考えました。特に高度な認知症の患者さんでも効ですけど、あとは、食材でないものを冷蔵庫にしまい込ん果があるということがわかってきました。

でいるんですね。冷蔵庫をあけると花が出てきたりするわ

これは ADAS（エイダス）といいまして、スコアなんでけです。こういうことも注意したい変化ということになり

すけど、認知機能の障害の重症度と嗅覚障害を見たものでます。

す。縦軸は嗅覚の認知度です。ですから、においに対して中核症状ということで言いますと、いわゆる認知機能が非常に反応性が悪い人はスコアが下になりまして、におい

中核症状なんですが、それ以外に、周りにいろんな周辺症をかぎ分けられる人はこういうふうに 10 点というふうに− 194 −

第 25 回表彰・贈呈式記念講演 「〈香り〉はなぜ脳に効くのか 〜認知症の予防・改善について〜」に少ないので、この中に芳香植物を入れまして、低温で、なります。
これで見ていきますと、ADAS スコアで見ると、認知

大体 40 度ぐらいで、真空状態で、7 ～ 8 時間やりますと、機能が非常に悪くなるとこの値が上がってきます。ですか

50 キロぐらいのものを入れると、ここに水と精油が一緒

ら、それに連れて嗅覚障害が起きるということがわかりまに出てきます。この装置ですね。この中に入れてやります

す。ですから、嗅覚障害と認知機能の重症度というのは非と、ここに回収するものが出てきます。最後は、この残査

常に相関性があるということがわかってきました。これはは、真空でやりますので、パウダーとして出てきます。と今年論文に出しておりますが、さらに、嗅覚障害の相関でいうことで非常に熱に弱い成分を自然に近い状態で抽出が見て、血液中のタウ蛋白、あるいは β アミロイドですが、できる。それから、ほかに溶媒とか使いませんので、芳香こういったものは認知症、特にアルツハイマーになると増水（セルエキストラクト）の抽出ができます。

えてきますけど、この値が上がってきますと嗅覚の障害がそれで我々は、いろんな日本独自の植物を使って、低温真空法で抽出しています。最近では、例えばサクラですね、

起きてくるということがよくわかります。
そういうことで、実際に正常の人とアルツハイマー病のヤエザクラからこの低温真空で初めて細胞水というのを抽患者さんを比べると、においに対する障害、重症度が非常出することができました。今までサクラをいろいろやったに違うということがわかります。ですから、においの、い人がいましたけど、だれも成功していなかったんです。こわゆるきき分けができなくなるということが認知症とかなの技術を使うと、低温真空で、サクラの、いわゆる細胞水、りリンクしているということになるわけです。

セルエキストラクトがとれたことで、これをかがせてみる

これは私どもの教室の神保博士が研究して発表したんですけれど、アルツハイマー病の患者さんに、アロマセラピと、結構リラクゼーション効果があるということもわかりました。

ーを実際に行ってみたデータです。これがコントロール、

さて、それで、こういったレモングラスですけど、これ

まあ、これはにおいをかがせない状態ですけど、ここからをかがせてヒトで実験しました。およそ 30 名ぐらいの、

アロマセラピーを約 1 カ月間、毎日、昼間に交感神経を刺

老健施設に入っていらっしゃる人たちに、毎日 2 時間です

激する香り、夜に、寝る前に、ラベンダーとかリラクゼー

けど、レモングラスをディフューザーでかいでいただいて、ションする香りをかがせて、28 日、約 1 カ月やります。

それを 8 週間、16 週間と、こういうふうにずっとやって

GBS スケールで測定すると非常に認知度が上がってまいおります。そうしますと、においによって精神症状はよくります。ところが、これをやめてしまいますと、また悪くなります。それより最もおもしろいのは、不眠状態の改善

なってしまうということになります。

で、非常に夜眠れるようになったという、そういうことがこれはアルツハイマー病の患者さんの初期から後期にかわかりました。

けて、70 人から 80 人の患者さんで実施しました。次に高

また、知的機能の改善については、先ほど言いましたよ

度のアルツハイマー病の患者さんだけ選んでみましても、

うに、いわゆる物忘れ。これをやっていきますと、8 週間

やはり同じように、このアロマセラピーをやっていきます

で既に有意によくなってきたことで、さらに 16 週間やりと非常に ADAS のスコアが低くなって、認知機能が上がますと、知的機能の改善が起きてきたことから、現在老健ってくるということがわかりました。さらに、アルツハイ

施設でレモングラスウォーターをかいでいただいて、認知マー病以外に、例えば血管性の脳痴呆とかありますけれど、症の治療も行っております。

こういう患者さんにもアロマセラピーをやると、非常に認その過程で、なぜレモングラスをかぐと認知機能がよく知度がよくなるということがわかりました。そしてまたこなるのか。そのエビデンスを明らかにしようと考え、れをやめてしまいますと、悪い方向にいくということにな

NIRS（ニールズ）といいまして、近赤外光を使ったスペク

りました。

トロスコピーを実施しました。脳の外側にヘルメットをかそういうことで、芳香療法をやりますと、認知症患者のぶせまして、ここに近赤外光が出る電極をつけます。ここ

認知機能障害、物忘れなどを非常によくするという、効果から近赤外光を出して、そして脳の中でヘモグロビンがど的であるというデータが出まして、これを我々は論文にしういうふうになっているかをスペクトロスコピーではかるております。

ことによって、それで脳の血流をはかることができます。

最近私たちは、レモングラスというものに着目して、こfMRI とはちょっと違いますけれど、例えばエッセンシャ

れと認知症の改善ということで研究しております。一般的

ルオイルをかがせて NIRS で見ると、これはレモングラス

な方法でつくった精油とか芳香水というのは、水蒸気蒸留

をかがせますと、大脳の、前脳ですけど、大脳皮質の前頭でやりますと物が壊れてしまいます。我々は低温真空抽出

葉の内側が非常に活性化します。ところが、ミルラ（myrrh）

技術法というものをつくりまして、これは非常に低温で、やペッパー（pepper）をかがせますと、こういった前頭葉

かつ真空状態で抽出していきますので、物の壊れ方が非常の内側はあまり血流量が変化しません。血流が増えないん− 195 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015はどういうタイプがお好きですか」と言うと、「年上の女だ」

ですね。逆に側頭葉とかが増えてきます。
ということで、エッセンシャルオイルをかがせた場合に、と言うんですね。111 歳のときですから、年上の女ってなぜレモングラスをかがせると認知機能がよくなるかとい

120 歳とかになっちゃって、こんな人いないわけですね。

うことをこういった NIRS イメージで証明することができ

まあ、これを承知で言っているわけで、つまり、それだけるようになりました。現在いろんなエッセンシャルオイル

この人は頭がやわらかいということですよね。だから、を使って、この NIRS イメージで、特に大脳皮質、前頭葉

111 歳のときでこういうふうな受け答えができたというこのところを調べています。

とは、やっぱり認知症ではないということを逆に証明して認知症をはじめとして脳の関連する疾患に芳香療法は非いると思います。

常に治療効果を持つこと、特に高度な認知症患者さんにもそういう意味で、我々も、酒と女というのはなかなか難

一定の効果があるということがわかりました。それで我々しいので、香りで何とかできないかというふうに考えていは、認知症の治療においても、従来の薬物療法とあわせてるわけです。

使うと非常に有望な認知症治療の選択肢になるのではない

最後になりました。この研究は我々のところの教室の教室員とさっきここに出しました、ヒューマンライフケア横かと考えています。
65 歳以上の人口 3,186 万人ということで、4 人に 1 人。

浜といいまして、ここは戸田中央病院グループの中のケア

現在日本は世界一の長寿立国と言われております。しかしのシステム、老人介護のところなんですけど、そこで我々、ながら、この人生最後の 10 年間、平均寿命と健康寿命に実際に今、このアロマセラピーで、レモングラスをかいで10 年ギャップがあります。ですから、長生きしたといっいただいて、認知症の人たちに、予防・改善ということでても、最後 10 年間は寝たきりで過ごさなきゃいけないとやっております。たまたまこの前、レモングラスが一たんいうことになっていますから、いかに健康で長生きできる

切れてしまって、供給が途絶えたんですね。そうしたら、かということを我々は考えないといけないのではないかと

ケアマネジャーの人が、芳香療法をやっている人たちが急考えています。そういう意味で、こういった芳香療法を使に元気がなくなって、食欲がなくなっちゃいましたと。そうということは、認知症の予防と改善にもつながりますのれで、どうしましょうと言うから、またやってくださいとで、この人生最後の 10 年間、元気で過ごしたいなと考え言って、芳香療法をまたやり始めたら、今度は元気になっています。

て、食欲が出て、みんな残さないで食べるようになりまし

最後の話ですが、ギネスブックで、泉重千代さんという

たというふうに言っていました。

方、皆さんご存じだと思いますけど、120 歳と 237 日生きた、ですから、そういう香りというのも、QOL を上げるの男性で世界トップですね。この人が 111 歳のときに、女性に非常に重要な働きをしているのではないか、ということ

レポーターの取材を受けました。レポーターが「長寿の秘

です。

訣は何か」
と言うと、
「酒と女だ」と言うんですね。
「お酒はご清聴どうもありがとうございました。

何か」と言うと、「黒糖の焼酎を薄めて飲む」。
「では、女性− 196 −―― 了 ――

コスメトロジー研究雑感

平成 24 年度

研究助成

深海生物とコスメトロジー
足立亨介（のっけから私事で恐縮ですが）学生時代より理系人間、水産物は多種多様で、かつ水温や水圧といったパラメータ

体育会出身でアカデミアに進んだ私はコスメ業界とはこれに分子の特性が左右されます。代替品として水産物に着目まで全く無縁に生きてきました。また今回の研究対象分子したことはあっても、この点に着目して、コラーゲンを扱

はコラーゲンでしたが、これも特に専門でもなく、現職にっている人はまだまだ少ないのが現状です。

赴任時にちょっとした縁があって研究をはじめることにな

今回、私はその多様な水産物の中でもとりわけ特殊な深ったまでです。コラーゲンは細胞と細胞の間隙でそれをつ海生物のコラーゲンを化粧品基材としての活用を見出す可

なぎとめるはたらきをしますが、これまた偶然にも私とコ能性を探る研究をさせていただきました。研究例が少ない

スメ業界という全く無関係な両者もつないでくれたようにこともあってまだまだ先は長いと言わざるを得ないのです

思います。

が、「低温」「高圧」の深海環境に適応し、少なくとも陸上

コラーゲンは元々牛を中心とした畜産物を主原料として生物と異なる構造を有していることは分かりました。何ら

きましたが、周知のとおり 2001 年に BSE の問題が起きてかの形でこの構造から分子としての特性を探っていきたいから種々の海洋生物から抽出されたコラーゲンが「マリンと考えています。今後、私自身が「お寒い」状況にさらさ

コラーゲン」として市場に出回るようになりました。名前

れようと、周りから妙な「プレッシャー」をかけられようと、からしてイメージもよく、主原料が畜産物から水産物に置うまく適応しコスメ業界に少しでも貢献出来れば幸いです。

き換わるのに大きな混乱もなかったように感じています。

この度はコスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択してしかしながら畜産物は種類が非常に限られているのに対し、いただき本当にありがとうございました。
（高知大学農学部）

平成 24 年度

研究助成

Department of Cosmetology ?
伊藤大知

化学工学が専門である筆者と、化粧品は専門性の相性はの化粧品マーケットは 2013 年度で 2 兆 3000 億円程度（株良いかと思う。粉体工学、混合、撹拌、分散、膜分離、液液式会社富士経済の調査結果）。日本の医療用医薬品の生産

抽出、イオン交換と、講義や研究にて使う単位操作は、化粧

高は 2010 年度で、6 兆 8000 億円程度（厚生労働省「薬事工品のファウンデーションや乳液などの開発や生産に、直接

業生産動態統計調査」平成 22 年度）であるそうだから、市的に役立っているのであろう。また研究にて扱う生体適合場としても十分なボリュームのある産業である。そして経性材料は化粧品素材としてオーバーラップする範囲が広い。

済成長が著しいアジア各国や、これから成長するアフリカ

ところで、今回の研究助成を頂いて最も感銘を受けたの諸国など、経済成長に伴い確実にマーケットが大きくなる

は、素材や安全性に関する研究にとどまらず、精神・文化地域がある。

に関する分野の研究課題が多数選ばれていることだった。

そんなことを考えると、市場の大きさや発展性、研究の化粧品は、コミュニケーションの手段であり、科学的合理学際性などから、化粧品学科、Department of Cosmetology

性では推し測れない文化的合理性に根差す趣向の違いが色というのが、大学にほとんど存在しないのは不思議である。

濃く反映されるであろう。そういう意味で、文理境界領域

特に女子学生にとって化粧品メーカーは就職で人気であるの研究として、コスメトロジーの面白さを感じたし、今後し。しかし専門の縦割りにとらわれない柔軟さが、コスメの海外マーケットの展開は、グローバルな文化差を考慮しトロジーの発展の源なのか、と。門外漢だった筆者にとっながら研究も産業も発達していくのだろうから、本助成のて、視野が広がり、これからコスメトロジーに関わる手がユニークさと先見性に感銘を受けた。

かりを与えてくれた、これが小生にとって本助成の最も大数字に関して厳密に精査しているわけではないが、国内きな収穫だった。

− 199 −

（東京大学大学院医学系研究科）

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

平成 24 年度

研究助成

私とコスメトロジー素材
大矢根綾子

この度の研究助成により、「皮膚組織再生を促進するリ療効果を示し、かつ肌に優しいコスメトロジー素材を作り

ン酸カルシウム真球粒子の創製」に関する研究を発展させたいとの考えを持つに至りました。今回の助成研究で私たることができました。手厚いご支援を頂きましたことに、ちは、薬剤担体として有用なサブミクロンサイズの球状粒

心より感謝申し上げます。

子を、生体親和性・安全性に優れたリン酸カルシウム（骨私が治療効果を併せ示すコスメトロジー素材に興味を持や歯の無機質と同じ成分）から簡便に合成する技術を開発ったのは、今から十数年前のことです。顔中にできるニキしました。この技術は、治療効果を付加した高機能コスメ

ビに悩まされ、様々な化粧品・スキンケア製品を試したもトロジー素材の新しい製造技術としての可能性を秘めていのの一向に改善せず、皮膚科を受診しました。抗菌薬を含ると考えています。未だ解決すべき課題は残っていますが、む塗り薬が処方されたのですが、その時の注意点が、「フ

今後も、安全・安心・高機能なコスメトロジー素材に関わァンデーション等は併用しないように」とのこと。思わずる技術開発を通じて、国民健康福祉の向上に貢献できるよ「えっ !?」と聞き返してしまったことを覚えています。年頃

う努力していきたいと考えています。

の女性として（当時は）、治療をとるか、化粧をとるかの二最後に、本研究課題の実施において中心的役割を果たし者択一に迷いました。結局、使用上の注意を守らずにファて下さった産業技術総合研究所の中村真紀博士および坂巻

ンデーションを併用してしまったのですが、その為か、症

育子氏に、誌面をお借りして感謝の意を表します。
（産業技術総合研究所ナノ材料研究部門）

状は改善しませんでした。この経験をきっかけに、高い治

平成 24 年度

研究助成

粘土鉱物とコスメトロジー素材
岡田

粘土鉱物は，「千の用途のある素材」ともいわれるように，

友彦

業研究のテーマを設定しこれを説明する際に，ある程度実比較的安価であることから，化粧品素材としては勿論のこ用性を絡めないと，なかなか学生の推進力とはなりにくいと，様々な分野で利用されています。ある化粧品会社さんようです。化粧品応用で，乳液でこれを○○に使う，あるの基礎研究部門の方から，本助成期間中にとある雑誌の総いはファンデーションで△△で使うには，などとすると，説執筆を依頼されました。未だに粘土科学は，化粧品の基動機付けが明確になるためか，研究の意義の理解を促すに礎研究でも貢献できることがあるのだと改めて実感させらは有効なようです。また，化粧品応用を意識したテーマは，れた次第です。

使用実績があることを考え，その素性を理解しているであ

粘土とは，水を含むと粘性をもつ土の総称です。スメク

ろう女子学生が担当するのですが，当の私自身は商品の特タイトと呼ばれる一群の層状粘土鉱物は，水中で膨潤する

徴や使い心地云々まで細かいところを知る由もありません。

性質があり，水に分散するとシリケート層（約 1 nm）
が剥

よって，その学生にいろいろ訊くのですが，事情を知らな

離し安定な懸濁液になる，と数多くの教科書や総説，解説

い他の学生にとってはその様子が奇異に映るようです。

などに書かれています。ところが，研究者ゆえに「へそ曲

このように少々恥ずかしい思いもしましたが，今回助成がり」な性格のせいでしょうか，長くそのように理解され，金をいただいた機会に，化粧品素材設計の理屈や合理性な受け入れられていることとは違ったことをしてみよう，とどを垣間みることができました。また，化粧品開発には芸思ったのです。すなわち，粘土鉱物のようにインターカレ

術性や流行も必要なようで，理屈だけではないその奥深さーション能はあっても，シリケート層が膨潤・剝離しないも少しですが知ることができました。何かの機会にさらなような「モノ」をつくれないか？という発想から，本助成金

るご教示を賜りますと幸いです。末筆ながら，本研究を進の申請につながっています。サイエンスの視点から明らかめるにあたりコスメトロジー研究振興財団からの助成に心にしようとした（している）
主旨はこれだけですが，昨今卒から御礼申し上げます。

− 200 −

（信州大学工学部物質工学科）

コスメトロジー研究雑感

平成 25 年度

研究助成

新規白色顔料の可能性を探って斧田宏明

この度はコスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択

タンやリン酸亜鉛が新規白色顔料として可能性があるのでして頂き、心より感謝致します。私の研究室では、化粧品はないかと研究を進めております。予想通り、リン酸チタ

や日焼け止めに用いられる白色顔料として、新規材料を提ンやリン酸亜鉛には光触媒活性がなく、凝集しにくいとい

案する研究を行っております。現在白色顔料として用いらう性質もあり、なめらかな塗布が可能であるということがれている酸化チタンや酸化亜鉛は光触媒活性をもっており、分かりました。しかしながら、欠点として生成する粒子が紫外線に当たることにより有機物を分解する性質をもって酸化物に比べて大きいということがあります。そこで今回おります。私が学位を取得して最初に勤めた研究室では、の研究ではミル処理を行うことにより微細化を検討するこ

一部の学生が酸化チタン薄膜の光触媒活性を高める研究をとを行いました。また、化粧品に関するテーマは身近な材行っておりました。このような光触媒活性のあるものを肌料開発ということで学生や大学職員からも高評価を頂いてに塗布していることに疑問をもちつつ、研究室を主宰する

おります。近年は大学も外に向けてアピールしなければな立場になったときに新たなテーマとして検討することにしらなくなっており、分かりやすく身近であることは重要とました。大学院時代にリン酸塩の触媒活性を検討しておりのことです。今後は、このリン酸塩白色顔料の実用化を目ましたが、非常に弱いということが分かっており、リン酸

指して一歩ずつ進めていきたいと考えております。
（京都府立大学大学院生命環境科学研究科）

塩は生体材料としても用いられておりますので、リン酸チ

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
金井俊光

この度は、コスメトロジー研究振興財団研究助成に採択

方向性がはっきりしてきました。また本研究により少なくして頂きまして、誠にありがとうございました。今回申請

ともコロイドフォトニック結晶の光学ストップバンドを利致しました研究課題は、安全・安心なサンスクリーン剤を用することにより UV-A 領域を充分防御できることが明ら開発するものであり、これまで一般的な吸収による紫外線

かとなりました。私の中ではこれだけでも価値ある成果と防御方法ではなく、反射による新しい防御方法を検討した思っており、今後の可能性が広がったと思っております。

チャレンジングな提案をさせて頂きました。サンスクリー

具体的にはカプセル形状のみならず、より簡単に形成できン剤は肌に直接塗布するものですので、より安全性の高いる球形や板状のコロイド結晶でも紫外線防御が期待できる

安心な材料でなければなりません。紫外線を反射することと考えられ、これらの形状制御も今後行っていきたいと考で、サンスクリーン剤自体も劣化しない方法を検討しまし

えております。より安全性の高い安心なサンスクリーン

た。研究過程で想定外の課題も発生し試行錯誤の連続でし剤を開発すべく、研究を続けていきたいと思っております。

た。残念ながら提案当初の目標であったカプセル化までは本研究にご支援頂きました貴財団に改めてお礼申し上げま

完了しませんでしたが、課題が明確になり、今後の研究のす。

− 201 −

（横浜国立大学大学院工学研究院機能の創生部門）

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

平成 24 年度

研究助成

研究雑感

神鳥

和彦

筆者らはこれまでに、単分散コロイド粒子は非常に微細出しています。しかし、それらの粒子の合成はオルトリン

なクラスター粒子が集合して生成する、いわゆる凝集機構

酸またはオルトリン酸塩をリン酸源として用いてきたため、によることを明らかにしてきました。そこで、このように反応速度が大変速く、凝集機構による粒子のモルフォロジ

微細な一次粒子の凝集速度をコントロール出来れば、得らーを制御することは出来ませんでした。

れる粒子の形態と大きさを任意にコントロールすることが今回貴財団の研究助成金を頂くことで、縮合リン酸塩（ト出来るものと期待し、今回の貴財団の研究助成金を申請い

リポリリン酸ナトリウム）の加熱加水分解法を用いて反応たしました。

速度を制御し Ti ならびに Ce イオンをドープした紫外線吸

今回私が取り上げた無機粒子は金属リン酸塩の１つで収能を有した CaHap 白色顔料粒子の合成することに始めあるリン酸カルシウムで、生体親和性の高い物質としてて成功しました。今後はこれまでの研究をさらに発展させ

古くから知られているカルシウムヒドロキシアパタイトて、さらに異なる縮合リン酸塩を用いて、新規な物性を有（CaHap）です。これは人工骨、人工歯根等の他に触媒あする CaHap 系白色顔料粒子の合成を検討してゆく所存でるいは吸着剤などに使われているバイオセラミックスです。

す。

筆者ら、これまでに共沈法を用いて作成した Ti や軽ならびに重希土類元素をドープした CaHap 粒子が強い紫外線

最後に、今回の研究にあたり研究助成を頂いたコスメト
ロジー研究振興財団に深謝申し上げます。
（大阪教育大学）

吸収能を有することを見出し、光触媒効果があることも見平成 24 年度

研究助成

コスメトロジー研究雑感
茂里康

この度は研究助成に採択して頂き、誠にありがとうござ

私の研究スタンスとしては、いろいろ異なる分野の一線いました。本研究を思いついたのは、最近はやりの韓国の研究者と交流・議論を実施し、自分の興味に合致したい

コスメからです。カタツムリクリーム等の韓国コスメがろいろな知識を系統的にまず蓄積する様に心がけています。

流行するなら、何とか日本オリジナルな生物でコスメがその様な情報や知識はすぐに活かせない事が多いですが、出来ないか、と思いついた次第です。まずどこにでも居今回の様に思わぬところで成果に結びつく場合もあります。

そうなトノサマガエルやヌマガエル、少し貴重なツチガ

最近特に思うのは、若手の研究者が精力的に人間交流やエル等を調べましたが、うまくいきませんでした。そこ

情報収集をしないということです。もちろんインターネッ

で、私の知人のバージニア大学の中山卓哉先生、カエル

ト等の検索を利用して情報収集をされていますが、face-の発生研究で著名な浅島誠先生のアドバイスを頂き、両

to-face の議論や少しアルコールを嗜んでの交流の場は、非生類で唯一ドラフトゲノム解析が終了しているネッタイツ

常に貴重です。また積極的に海外に渡航されずに国内でじメガエル（Xenopus tropicalis）を用いて、Topological Mass

っとされている方も見受けられます。これもゆとり教育のSpectrometry Analysis（Direct tissue MALDI–TOF MS）

弊害でしょうか。応用嗜好も一段落ついて、根本的な基礎という、我々が開発した方法を駆使しました。その結果、回帰も重要ではないでしょうか。
（産業技術総合研究所健康工学研究部門）

あれよ、あれよと順調に研究が進展した次第です。

− 202 −

コスメトロジー研究雑感

平成 25 年度

研究助成

白い微粒子と黒い微粒子から得られる角度依存性のない構造発色性顔料の調製
竹岡

敬和

この度は本研究を進めるにあたり、研究費を援助して頂のためには、これらの微粒子が周期性や長距離秩序を有すいたコスメトロジー研究振興財団に心より感謝致します。

る集合状態ではなく、短距離秩序のみを有する集合体にす

現在、進めている研究は、白い微粒子と黒い微粒子を混ることで、従来の顔料同様に角度依存性のない発色性を示

ぜて様々な色を示す材料を作るという内容です。白い微粒

すようになります。すぐに役立つ物は、まだ得られていま

子や黒い微粒子は、環境に安全で安価な材料から得られる

せんが、角度依存性のない様々な色を示す色材が得られる物が沢山ありますので、これらを用いれば様々な色の顔料

ことを確認しております。コスメトロジー研究振興財団かを作り出すことが可能になります。現在利用されている高らの援助によって、素晴らしい発展に結びつけられるよう

価、もしくは、毒性の高い顔料などに置き換わる顔料を、になったと言えるように努力します。
（名古屋大学大学院工学研究科）

我々の方法で作れるようにすることが一つの目標です。そ平成 24 年度

研究助成

コスメトロジー研究雑感
通阪栄一

この度はコスメトロジー研究振興財団より研究助成の援

塗る，飲む，吸う製剤の開発が期待されています。私はこ助をいただきましたこと，深く感謝申しあげます。本研究

れまで，バイオ医薬品の経口投与技術の開発を目指し検討

助成によりバイオ医薬品の低侵襲性経皮投与技術の開発にを行ってきましたが，本助成ではその技術を経皮投与へついて検討致しました。近年，バイオテクノロジーの発展応用しました。経口投与では腸上皮細胞層，経皮投与ではに伴い活発に開発されているタンパク質性薬物などのバ

角質層がバイオ医薬品の吸収におけるバリアとなりますが，

イオ医薬品は，低分子薬物に比べ特異的にターゲット部位

どちらも疎水膜により親水性高分子の透過が阻止されるこへ結合できるために効果が高い反面，体内での安定性が低とが原因です。つまり，吸収を促進させるためには疎水膜いものが多いといった欠点があります。また，それらは親への親和性を向上させることがポイントとなります。私は水性の高分子であるために，腸や皮膚からの吸収性が低く，界面活性剤との複合化技術でこの課題に取り組んでいます。

注射で投与されているのが現状です。しかし，注射投与は

今後は，この疎水膜の透過メカニズムを明らかにし，効率

どうしても患者の苦痛を伴う上，アレルギー反応を引き的輸送を実現できる製剤開発を行いたいと考えています。
（山口大学大学院理工学研究科）

起こすこともあり，患者自身で負担なく簡単に投与できる，

平成 24 年度

雑

野口

研究助成

感

範子

本研究は、神経細胞に関する研究によく使われる PC12ていた研究者から、その原因を突き止めてほしいという相細胞の亜種である PC12D 細胞が、成長因子に速やかに反談から始まった。しかも、PC12D が培養液中にその原因

応して神経突起を伸長したり、酸化ストレスに対する耐性物質を分泌していると考えられるデータを見せられた。細を示すなど、要するに元気のいい細胞であることに気づい

胞自身が酸化ストレスに抵抗する物質を産生そして分泌− 203 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

し、生育しやすい環境を自ら作り出しているというのだか

らく遷移金属が含まれているはずであるが、それを決定す

ら非常におもしろいと思った。そして、すぐにこの酸化ス

ることもできなかった。もう少しというところまで来ていトレス抵抗物質の同定に着手した。この物質が H2O2 を分ると思われるので大変悔しい思いでいる。神経細胞が元気

解・消去する活性をもつことは早くにわかった。数種類のであることはコスメトロジーにおいても重要なことである。

クロマトグラフィーを駆使しておおよその分子量を決定し、また、コスメトロジーに直接関係する細胞にも細胞自身の荷電状態も明らかにした。様々な阻害剤を用いた活性抑制

抵抗性を上げるだけではなく、酸化ストレスに対抗できる実験の結果もあわせて、細胞保護因子はポルフィリン様の物質を分泌し、周囲の細胞も保護する性質を獲得した細物質で、ペルオキシダーゼではなくカタラーゼ様の活性に胞が存在する可能性が高い。今後は保護因子の同定に加え、より H2O2 を消去することを突き止めた。しかし、本研究細胞の保護因子分泌を亢進させる方法の開発が進むことが期間にこの保護因子の同定には至らなかった。また、おそ期待される。

（同志社大学生命医科学研究科）

平成 24 年度

研究助成

安心・安全な化粧品を開発するための健康リスク評価技術加藤昌志

大変残念なことであるが、近年化粧品による健康被害が一つとして、安全性試験の「感度」が十分ではないと考えら

社会的に大きな注目を集めている。これらの化粧品は現行れる。特に、今回の白斑被害は美白剤使用者全体の 2 ％程の試験で安全性を確認された後に商品化されている。それ度であることを考えると、技術革新により、より高感度でにもかかわらず、健康被害が発生している現状は、「現行

化粧品の健康リスクを評価できる技術を開発する必要があの安全性試験では化粧品の健康リスク評価技術に問題がある。
一方、化粧品の開発に実験動物を用いることが、難しくる可能性」
を示している。
美白剤を例にとって考えると、健康被害が公表された後なりつつある。ヒトを用いた安全性試験には、倫理的に多も売り上げは増加している。さらに、今回問題となった美くの制約があるので、in vitro 実験系をはじめとする種々

白剤以外にも 10 種類以上の化粧品が白斑を誘導する可能の代替技術の開発が進められている。しかし、動物実験と性があり、現在調査を進めているとの報告もある。こうしいう個体における化粧品の健康リスク評価の過程を経ずに、た現状は、美容関連製品による健康被害が、今後も拡大す

ヒトにおける化粧品の安全性を担保することは容易ではなる可能性があることを示している。安全性の高い化粧品をいとも考えられる。美白剤により白斑を発症した患者さん

供給するために、新しい化粧品の健康リスク評価システム

が 2 万人近くにのぼっている現状を考えると、少なくともの構築が必要であると考えられる。

環境労働衛生学を専攻する研究者の立場としては、化粧品

従来の安全性試験では、細胞を用いた in vitro 実験系に加え、齧歯類等を用いた動物実験によっても安全性を評価の安全性評価には、動物を用いた健康リスク評価を継続する方法もあるのではないかとも感じられる。
（名古屋大学医学系研究科環境労働衛生学）している。それでもなお、健康被害が発生している原因の平成 24 年度

研究助成

皮膚細胞は独自に女性ホルモンを合成し、それが皮膚細胞の活動を制御している
川戸
今年で東大を定年退官になるので、今は引っ越しの準備佳
先日お叱りの電話を頂いた。

でてんやわんやである。私の頭の中もてんやわんやである。

というわけで、今慌てて書いているわけであるが、東大最後の院生達の学位論文審査もあるし、最終講義の準備の教授生活最後の年にコスメトロジーに関わる研究ができもある…。いつしか、この雑感を書くことを忘れてしまい、

たのは楽しかった。これまでずっと、脳の記憶中枢の海馬− 204 −

コスメトロジー研究雑感

での性ホルモン合成と神経シナプスの活性化という研究をを果たしているのではないかという研究が活発になってきしてきたが、皮膚にも性ホルモンの合成系が存在することているので、その助けになるはず。4 月からの新しい大学

を今回の研究で証明できて、性ホルモンの局所合成系は脳でも、面白い研究ができることを期待しつつ、筆を置く。

に限らず、色々な組織に（筋肉や骨にも）存在する普遍的な（東京大学大学院総合文化研究科）

系なのだという実感が湧いてきた。最近、卵巣や精巣以外（現・順天堂大学医学部泌尿器科学）の器官でも、女性・男性ホルモンの局所分泌が重要な役割

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジーに基づく化粧品開発平良淳誠

私は以前に化粧品研究開発に従事し、医薬部外品などのましたが、まだ他にもいくつかの機能性の高い物質も探索開発を行った経験があります。本校では、コスメトロジー

できることが、今回の研究を通してわかってきました。研のほんの一部ではありますが皮膚の生理と美白剤や保湿剤

究時間が限られていることもあり、まだ化粧品への実用化などの役割などの内容を授業に取り入れています。皮膚はの部分では基礎と応用の両方の面で至らないのが現状であからだの中で最大組織であり、他の臓器とは異なる様々なりますので、今後の研究で少しでも進展させたいと考えて生理作用をもっていることなど、一人でも多くの学生が皮います。最近、問題になった薬用美白剤の件もありますの膚に興味をもてるように、心がけて授業を行っています。

で、単に機能性の追求のみではなく、物質の持つ副作用も私は、化粧品は単に美的追求のみの産物ではなく、機能性考慮しなければいけないと強く感じています。今回の研究をもっていること、そして国内の化粧品会社における研究

助成は、皮膚に活用できる安全で機能性の高い物質の探索

成果の積み重ねが、皮膚科学の推進に大きく貢献してきたを進める良い機会になりました。これを機会に、よりコスと思っています。

メトロジーに基づく化粧品へ応用できる研究課題にも積極研究課題では、化粧品に活用できる素材や物質を提供で的に取り組んでいきたいと思っています。この度の研究のきるように、酸化ストレス応答シグナル Nrf2-ARE に対す機会を与えて頂いたコスメトロジー研究振興財団並びに関る作用機序を明確にした活性評価を進めました。報告書に係者各位には、この誌面を借りて深謝いたします。
（国立沖縄工業高等専門学校生物資源工学科）も示しましたようにモズクやワカメなどの褐藻類に含まれる海洋性カロテノイドの有用性の高いことを明らかにでき

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
多田政子「美しさは内面から」と言われます。その人の生き方や表ん。その意味で、沢山の成分の濃度依存的な細胞毒性を調情、健康状態などが姿に映し出されます。そのため、健康べることが今後大事になると考えられ、ヒトモデル細胞のだけでなく美しさを手に入れるために「体にいい」といわれ需要は増えてくると考えられます。本研究で開発したヒトる機能食品が求められ、市場にあふれています。一種類の肝細胞モデル細胞を開発段階に留めることなく、製品化に容量は記されているものの、他の食品も合わせて総合的により広く利用して頂くことで、生活の安全性を高めること

どれだけの量を摂取するかは、子供を含む一般の人の見識に貢献したいと思っています。末尾になりましたが、コスに託されています。
「過ぎたるは及ばざるが如し」といいま

メトロジー研究の益々の発展をお祈り申し上げます。

すが、単一成分のとり過ぎには気をつけなければなりませ− 205 −

（鳥取大学染色体工学研究センター）

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

平成 24 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
竹馬

真理子

皮膚の研究をしている過程で浮かんだ「歳をとると、なアレルギー疾患やガンなどの治療を見据えて、未だ解明し

ぜ皮膚にしわができるのか？」「肌のみずみずしさを決め

きれていないアクアポリンの機能を研究し続けていきたいている遺伝子があるのではないか…？」 そんな単純なと思っております。

疑問が、当時全く研究されていなかった「皮膚のアクアポ最後になりましたが、本研究を進めるにあたり、コスメ

リン」研究をはじめたきっかけでした。その後の研究から、トロジー研究振興財団よりご支援いただきましたことに、

アクアポリンが、皮膚細胞の水分状態 / 代謝を調節してい心より感謝申し上げます。

るだけではなく、細胞増殖や細胞遊走を司る重要な遺伝子（京都大学大学院医学研究科
次世代免疫制御を目指す創薬医学融合拠点）であることを明らかにしてきました。これからも、皮膚・

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
早川研究助成の応募時、３つの分野「素材、物性」、「生体作用、

盛禎

もう一つのきっかけは、海外留学です。免疫細胞の細胞安全性」、「精神、文化」を見て、多角的な研究助成だなと内シグナル伝達を研究できるところを探していましたが、思いました。皮膚科学専門の研究者だけでなく、他分野の偶然にも、皮膚科学専門の研究所に属する研究室に採用さ研究者にも門戸が開かれているのは大変有り難いことです。

れました。皮膚組織の写真もほとんど見たことがない素人

私の専門は生化学ですが、二つのきっかけから、皮膚科学

が、その道のプロ集団に入ったことで苦労はありました。

の研究に携わるようになりました。

しかし、新鮮さもあり、帰国後は自分の研究テーマにも皮

一つ目は、今回の研究テーマにもあるインターロイキン-33（IL-33）とその受容体です。私の所属する研究室は、後膚科学を取り入れようと考えていました。それを実現させてくれたのが、今回の研究助成でした。

に IL-33 受容体として知られる遺伝子をクローニングしま

貴財団の分野の枠にとらわれない取り組みは、皮膚科学した。長年、オーファン受容体でしたが、2005 年に IL-33の発展になくてはならないと思います。その研究成果が、が同定され、細胞内シグナル伝達など機能面が明らかにな

将来、皮膚のケアや治療を必要とする方々に役立つものにりました。2010 年には、IL-33 刺激に応じて大量に Th2 サ

なればと期待します。私もその一助となるように研究を続

イトカインを産生する 2 型自然リンパ球が発見されました。

けていきたいと思います。最後になりますが、本研究をごこれらの研究成果により、気管支喘息やアトピー性皮膚支援頂きましたコスメトロジー研究振興財団に心より御礼炎の病態形成に IL-33 が関与することが分かってきました。

申し上げます。

同時に、私の研究分野も生化学に留まらず、免疫学や皮膚科学へと広がっていきました。

− 206 −

（自治医科大学医学部生化学講座病態生化学部門）

コスメトロジー研究雑感

平成 24 年度

研究助成

コスメトロジーと酸化ストレス藤井

順逸

それまで対象としていた研究領域から、活性酸素・酸化

ただきましたが、平成 16 年の時は Superoxide Dismutase

ストレスの研究領域に移って 25 年になりますが、関連領

1（SOD1）に関する研究にご助成いただきました。ビタミ

域ではその間に一酸化窒素の発見や一酸化炭素・硫化水

ン C は古くから知られる食品成分のため研究し尽くされて素の生理作用の解明と、多くの出来事がありました。急速いる感があり、新規性が問われる競争的資金はなかなか獲に進む生命科学の進展に合わせて、活性酸素の理解も着実得できない状況です。そうした中でコスメトロジー研究振に進んでいます。研究をはじめた頃は、酸化ストレスは未興財団からご支援いただけたことで、ビタミン C とコラーだ専門の研究者だけが使う専門用語に過ぎなかったようにゲンに関する研究を進めることができました。SOD1 欠損

思いますが、今では研究者だけではなく、一般の方が普通とビタミン C 欠乏については、少しは関係するかと思いなに使う用語となりつつあります。ことに健康食品やサプリがらも別のテーマとして取り組んで来ましたが、最近になメントの宣伝文句でお目にかかる機会が多く、医学の領域ってビタミン C がスーパーオキシドの消去に重要であるとでもよく耳にするようになりました。しかし、残念ながら、いった結果を得つつあります。未だ確証がないため、今回

前者では効果のしくみがよく分かっていない場合に、後者の報告書には記載できませんが、現在検証を進めていますでも病因が分からない時に、とりあえず酸化ストレスを抑ので近いうちに公表できればと思っています。スーパーオ

える、酸化ストレスが原因といったように便利に使用されキシドとビタミン C の両課題にご支援いただいたコスメトていることが多いように思います。

ロジー研究振興財団には、心から感謝申し上げます。
（山形大学大学院医学系研究科生化学・分子生物学）

この度の研究ではビタミン C を主にした課題でご助成い平成 24 年度

研究助成

表皮水疱症の臨床から研究、そして臨床へ藤田靖幸

私がコスメトロジー研究振興財団に採択された研究テーます。私よりはるかに若い方が、全身の潰瘍に苦悶し、皮マは、表皮水疱症という患者数が少ないながらも大変な経膚癌を発症していく姿をみて、この疾患に取り組むこと過をたどる疾患について、何とかして良い方向に向かわせが physician-scientist としての皮膚科医の責務の一つであることは出来ないかというものです。表皮水疱症は、皮膚ると考えました。幸いなことに疾患マウスにおいて造血幹の強度形成に関わる複数の構造蛋白のうち、どれか 1 つに細胞移植が有効であることを報告することができ、その知でも異常や欠損があると、全身の皮膚がもろくなり、少し見も踏まえて海外では実際に患者さんに対して治療が始まの刺激で全身に水疱や潰瘍を作ってしまう先天性の疾患でりつつありますが、今回はそれをさらに進めて iPS 細胞なす。皮膚科という診療科全体をみても最も重篤な経過をたどで治療をすることが出来ないかを検討いたしました。残どるものであり、患者さんやご家族のみならず医療関係者

念ながら思い通りの結果を得られるまでの状況には至らず、ですらも、出口の見えない処置や合併症に絶望しかねない

今後のさらなる精進や条件検討が必要でありますが、いつ状況です。

か研究成果が再び臨床に還元される日を夢見て、引き続き私が表皮水疱症、それも治療をターゲットに研究するき邁進したい所存です。貴財団から援助を受けて研究を進めっかけになったのは、大学を卒業して医師として働き始めることができ大変光栄でした。この場を借りまして、心よた初日に、病棟で担当になったのが表皮水疱症の患者さん

り御礼申し上げます。

であったことであると、今になって振り返ると実感いたし− 207 −

（北海道大学病院皮膚科）

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
細川雅史

この度、コスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択語が多く見られることに気づきました。コスメトロジー研

頂き、誠に有難うございました。私のこれまでの研究は、究が、男女や世代を問わず多くの人々に関心のある分野で水産化学、食品栄養学、脂質化学を専門としており、皮膚あることを改めて実感した次第です。

や化粧品に関連した業績が全くないにもかかわらず、ご支

今回助成いただいた研究内容は、従来から化粧品素材等

援頂きましたことを大変うれしく光栄に思っております。

で利用されてきたパンテノールの高機能化をはかることを

贈呈式には、分野の異なる先生方に混じって出席させて頂目的とした内容で、これまで私が行ってきた研究とは全くき、記念講演では慶応義塾大学医学部の天谷先生の非常に異なるものです。皮膚組織を構成する細胞が次々に新しいインパクトのある研究内容を拝聴する機会をもつことがでものに新陳代謝されることにあやかって、私自身の研究分

きましたことに重ねてお礼申し上げます。

野にも新しい視点を取り入れる機会にできればと思う次第

研究を進めるにあたって購入した実験書では、これまでです。新しい分野の先生方と出会うことができたことに感の研究内容と比較して、その手法や原理に大きな違いは見謝するとともに、社会に少しでも役立つ研究成果を得るこられないのですが、タイトルに
「育毛」
、
「ニキビ」
、
「日焼け」、とができるよう頑張りたいと思っております。
（北海道大学大学院水産科学研究院）「美白」
といった私生活で気にしてきた単語が散見され、研究者としての興味というよりは、一般人として気になる用平成 24 年度

雑

道上

研究助成

感

宏之

公益財団法人コスメトロジー研究振興財団第 23 回（平成に成功しました。これは、美白剤ができたという、単なる

24 年度）研究助成を頂き、とても光栄に思います。私の主結果というよりは、ペプチドを使って、水溶性分子や高分

たる研究分野は、悪性脳腫瘍の治療研究です。医学部を子など様々な生理活性物質を導入できる一つのシステム

卒業し、脳神経外科医として臨床に携わると同時に、悪を証明する一助になると考えられます。この研究は、私と性脳腫瘍の恐ろしさに、治すことができない無力さを痛

修士課程に在籍した一人の女性研究者が中心となり研究を感し、研究を始めました。それと同時に、Drug Delivery

続け、Biomaterials という雑誌にアクセプトされる結果をSystem の素晴らしさに目覚め、痛い思いをする注射より、出してくれました。一歩、一歩ですが、経皮導入という分脳腫瘍が塗って治るなら多くの方が笑顔になると思い、研野において、公益財団法人コスメトロジー研究振興財団よ究しています。これまでに、ペプチドを使った経皮的導入

り頂きました研究助成のおかげで進むことができていると、システムの開発や毛母細胞の細胞周期を促進させて育毛剤

胸を張って、他の研究者、応援してくださる方にご報告でを開発など、の研究を行ってきましたが、今回、皮膚メラ

きると思います。この度は、大変お世話になりました。

ノサイトのチロシナーゼ活性を阻害するペプチドをスクリーニングし、ペプチドを使って経皮導入し効果を得ること− 208 −

（岡山大学大学院医歯薬学総合研究科細胞生理学）

コスメトロジー研究雑感

平成 24 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
八木孝司

いま大阪のミナミ、道頓堀界隈を歩いていると、韓国語メントが意外で驚いた。韓国女性は自国の化粧品を信用しや中国語が飛び交い、まるでソウルの繁華街、明洞にいるておらず、日本製の化粧品を使う。日本人女性が韓国の化のかと錯覚しそうになる。私がソウルの東国大学の外国粧品を買って帰る理由がわからないという内容だった。

人特別教授となって丸 3 年が経ち、ソウル通いはこれまで

昨年 12 月の中央日報によれば、韓国人が訪れた外国の20 回にも及んでいる。3 年前の明洞は日本からの女性観光

トップは日本だった。また、日本で行きたい町のトップは客で満ちあふれ、あちこちの店から日本語で呼び込みがか大阪であった。いつの間にか旅行者の流れが逆転していた。

かった。しかし日本でも韓国でも政権が代わり、政治的・韓国の女性観光客に人気の日本のおみやげは何かをネット

経済的関係が悪化するや否や、明洞の日本人観光客が激減

で検索してみると、S 社の化粧品がトップ３にランクされした。

ていた。なるほど、日本と韓国の女性は互いに他国の化粧当時、明洞での日本人女性観光客のおみやげ第一位は韓品が優れていると思っているらしい。

国製化粧品であった。私が東国大学の環境科学の科目で、このたび貴財団から、紫外線防御剤として使われるナノ

紫外線の人体影響について授業をしたとき、日焼けや皮膚材料の安全性に関する研究に助成していただき、深く感謝

がんが生じるメカニズムから、紫外線防御化粧品まで話を申し上げる。私どもの研究がこれらの女性に、安全で信頼進めた。私も家内から韓国 M 社の BB クリームをおみやげできる化粧品を提供する一助となれば幸いである。
（大阪府立大学理学系研究科）に買って帰ることを頼まれていると話した。
授業終了後のアンケートを読んで、１人の女子学生のコ

平成 24 年度

研究助成

感作性物質の評価
善本

隆之

皮膚表皮の表層にある角層は、外界に対するバリア機能作性試験が行われてきた。ところが、近年、動物実験に対を担い、その中の主要な蛋白質であるフィラグリンは、角して、動物を使用しない実験方法への代替（Replacement）、

層の水分保持やバリア機能に重要な蛋白質である。近年、

実験動物数の削減（Reduction）、実験方法の改良により実このフィラグリンの遺伝子変異が、アトピー性皮膚炎の発

験動物の苦痛の軽減（Refinement）の 3R の原則が作られ、症の原因の一つであることが明らかになった。さらに、従これらの安全性試験において動物を使わない in vitro 代替

来、即時型の食物アレルギーの発症機序として食べること

評価法の開発が急務となっている。この代替評価法の一つで感作される、すなわち、消化管での感作が主であると考として、3 次元の皮膚角化細胞培養系を用いた実験系など

えられていたが、最近、経皮感作による食物アレルギーのが開発されているが、さらに呼吸器と皮膚感作性も見分け発症の可能性が注目を集めている。特に、茶のしずく石鹸

る評価法の必要性も迫られている。

の問題は、食物アレルギー発症における経皮感作の重要性

我々は、今回サイトカインによる接触性皮膚炎誘導の制を証明する大規模な疫学的結果となった。つまり、石鹸や御に関して研究を行ったが、今後このような in vitro の新化粧品の中に含まれる食物由来蛋白質が皮膚を通過し感作

しい感作性評価法の開発も検討していきたいと考えている。

される場合もあり、さらに、低分子化学物質がハプテンと最後になりましたが、今回研究助成金の支援を頂き、改めして感作し、再度の接触により I 型呼吸器および IV 型皮膚てコスメトロジー研究振興財団に心より御礼申し上げます。

アレルギー反応を誘導する場合もある。それ故、これらの（東京医科大学医学総合研究所免疫制御研究部門）

危険性を除くため、これまでマウスなどの動物を用いた感− 209 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

平成 24 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
渡邊利雄

右も左もわからず研究費も設備もなく、隠居しろとまですことができ現在も育成を継続している。その一方で、（3）言われながらの独立でした。研究費を申請しても、「女子に関しては、本学で単離された遺伝子のノックアウトマウ

大でそのような研究が行えるとは思えない」との理由で不スが、培養細胞での解析から期待された表現型を一切示さ採択になることもあり、建前とは異なり現実はかなり厳しずにまったく解析が進まず苦戦中で、かつ理学部に受け入いものでした。

れられるような女子大らしいテーマも裏付けとなる研究費

そうは言いうものの、女子大学で自分のラボを立ち上げの欠如等の理由によりなかなか進まなかったが、幸いにもるにあたって３つの目標を立てました。
（1）女子大でも世本申請研究が採択されたことにより、本申請研究内容が学界と伍す研究成果を発表する。
（2）女性研究者の育成を行生のテーマたり得ることが判明し、今後の目標達成に向けう。（3）女子大らしい研究を行う。

た成果を得ることができた。

それから 9 年、最初の 5 年は論文公表できるだけの成果

昨今、大学からの研究経費の大幅削減と競争的研究資金が出ずに、海外のラボとの競争があり苦しかったです。現の獲得競争の激化により、小規模女子大での研究への支援

在も互いに抜きつ抜かれつと苦労は続いているものの（1）が細るなか、よくぞ支援していただいたものだと感謝してに関しては論文発表等の業績（本学学生が著者の公表論文おります。本申請研究で得た成果をさらに発展させ、公表

数は９編）も増え、小胞輸送研究や癌研究で対外的に一応できる成果へと発展させることを次のラボの目標とさせての認知を得るところまでは来られた。また、ラボに来てく

いただきます。今回のご支援、本当にありがとうございまれる学生に恵まれたおかげで、（2）に関しては産業界と研した。
（奈良女子大学大学院人間文化研究科個体機能学講座）

究の世界の両方で卒業生が活躍しており、一応の成果を出

平成 25 年度

研究助成

ハラールと化粧品 ─モロッコから
川添

裕子「サウジアラビアやドバイではなく、モロッコですか？」

ガイドブックには、モロッコの魅力として美容、ハンマ

第 26 回表彰・贈呈式（平成 25 年 11 月 28 日）会場で複数のーム（浴場）、アラビア書道、ミントティー、お香、寄木細参加者から質問された。モロッコを調査地に選んだ理由は、工などが掲載されている。どれも日本人には目新しくかつ日本で人気が出始めたアルガンオイルの産地だったことに親しみを感じるものである。これらはもっぱら政治経済外

加えて、ハラール市場への参入がそれほど早くない分、新の領域とみなされがちだが、化粧品類は古くから各地の交

たな商品流通による人々の認識や社会の変化をみることが易品として取引されてきたし、銭湯やサウナは社交の場とできると思ったからである。

しても利用されてきた。身体装飾はホモサピエンスの特徴

モロッコには、アルガンオイルをはじめ豊かな化粧品原の一つである。ハラール認証の化粧品・パーソナルケア商料がある。中には家伝の手作り化粧品を楽しむ人もいる。

品市場が今後大きく展開するかどうかは未知数だが、コミ女性たちとはメイクアップやネイルや脱毛の話でも随分ュニケーション、経済活性、ビジネス倫理の発動などの可盛り上がった。一方男性たちは年齢が上がる程「外見は気能性もみえてきた。化粧に着目することで、モロッコと日にしない」と言う人の割合が高くなる。とはいえヘアスタ

本の関係にも原産地と消費地だけではない新しい繋がり方

イルやヒゲは念入りに整えられているし、「毎晩こっそりも見出せるかもしれない。そんなことを考えながら研究を

手作り育毛剤をつけているお父さん」も少なくないらしい。

続けている。

男女ともにヘアケア製品の需要は相当ありそうだ。

− 210 −

（松蔭大学観光メディア文化学部）

コスメトロジー研究雑感

平成 24 年度

研究助成

嗅覚と精神・生活神崎晶

今回貴財団から研究費を賜りましてありがとうございまに同性異性用の香料をかがせてみたところ、興味深いこした。お陰様で、この研究費を通じて、嗅覚と社会生活、とに男女とも異性香水でリラックスしていることがわかり

精神・神経について以前よりも考える機会をいただくことました。感覚的にはわかりやすい結果ですが、この反応がができました。嗅覚障害で来院される患者さんの多くの方

男女間において何に寄与しているのかは不明であり、今後

は生活がつまらなくなった、と嘆かれます。視覚聴覚と比の課題です。また、人工と天然香料で自律神経の反応が異較すると注目されにくい領域ですが、嗅覚を使う職業をさなることもわかりました。こちらの解明も今後の課題です。

れていなくても困っている方、失望されている方は多いの

なお、この研究は慶応義塾大学医学部学生である西田梨紗です。そこで、嗅覚障害がどれだけ辛いものかを測定するさんの尽力で行われたものであり、非常に興味深いものでため、QOL を調査しました。臨床的に最も予後の悪い「頭ある。若い世代には嗅覚はますます重要になっており、嗅部外傷後」に伴う嗅覚障害は QOL も非常に悪い結果でした。

覚障害に興味をもつ学生も多い。

次に、嗅粘膜の受容体には自律神経受容体が関与すること

嗅覚障害に関する病態、それに伴う精神への影響などにで、自律神経との関連を解析しました。良い香り、悪臭そついて今後もっと研究がさかんになると期待しています。

れぞれをかがせたところ、交感あるいは副交感いずれかが（慶應義塾大学医学部耳鼻咽喉科）

興奮するのですが、一定の傾向はありません。さらに男女

平成 24 年度

研究助成

「かわいい」から「品格」へ
木戸

彩恵

本研究課題の予備調査のために「大学で研究員をしてい難しいかもしれないと素データや調査協力者の反応を見なます。メイクアップに関する研究をしているので、差し支がら考えていました。しかし、データと向き合い、研究のえなければ、お話を伺わせて頂けませんか。
」と、街頭で年

全体像を捉え直したときに、自己と他者の媒介として化粧配の女性にお声がけし、何度かお話を伺わせて頂きました。

が表面的な「かわいい」から「品格」へと生涯を通して変容す

この時には、怪訝な目で見られ、多くの方に警戒されてしることに気づきました。これは、私にとっては大きな発見まいました。おそらく、化粧品のセールスやエステの勧誘であり、女性の生涯発達と化粧を関連づけながら考えるたのたぐいと勘違いされてしまったのでしょう。また、本調めの土台となる視点を頂くことができたと、とても嬉しく査をお願いした年配女性にも何人かネガティブな反応をさ感じました。

れることや、「年をとると、化粧は関係なくなるの。」とい女性にとって化粧は身体化された行為であるからこそLife（生命・生活・人生）に関わる重要なテーマとなります。

う感想を頂くこともありました。
一方で、別の調査協力者の方々から、調査に参加するこ

私自身、ライフワークとして化粧を通して女性の生き方のとで、「自分自身を振り返るよい機会になりました。」とい研究に携わって参りたいと考えておりますが、化粧心理学

う感想や、「普段「女性」としてということを考えなくなっの研究ではこれまで予算を頂くことができずに苦心して参ているなと改めて感じました。
」という省察的な感想を頂くりました。末筆となりましたが、貴財団から初めて助成いこともありました。

ただくことで、関心をもつ研究を実現させることができま

これまでに私自身が行ってきた女子大学生を対象とした研究とは違い、壮年期以降の化粧に対する価値観は解釈がした。ご支援に心からの感謝を申し上げます。
（立命館大学立命館グローバル・イノベーション研究機構）− 211 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

平成 24 年度

研究助成

コスメトロジーとがん薬物治療中村暢彦

コスメトロジーの世界は美しく華やかなイメージです。

まで全身に出てきます。薬物投与を中止することもできま

化粧品などの商品の広告にはイメージキャラクターとしてすが、副作用の皮疹が治療効果とも関連しており、原則と今を時めく話題の若い女優さんが起用されています。一方、して治療を継続します。患者さんは薬物療法によって変化

がんは内閣府の 20 歳以上に実施された「がん対策に関するした外見に悩んでおり、顔や手足に出る皮膚の障害は生活世論調査」で「こわい病気と思う」人の割合が 76.7% に上がの質にも影響を与えます。この副作用の皮疹を抑えるにはっています。その理由は「死に至る場合があるから」を挙げ

スキンケアが大切ですが、各施設で独自のスキンケアが実た人が最も多く 75.1% でした。子どもたちを対象にした別施されているのが現状です。このような中、私はがん薬物のアンケートでも同様の数字であり「抗がん剤で毛が抜け療法のスキンケアに関してコスメトロジーの研究に寄与でる病気」といったイメージでした。これはテレビの影響がきればと願っています。

大きいのかも知れませんが、よいイメージではありません。

2025 年には 65 歳以上の高齢者の占める割合が 30 ％をがん薬物療法の研究者はしのぎを削って生命予後が改善

超え、女性でも 2 人に 1 人ががんになる時代です。誰でもできる薬物の開発に取り組んでいます。その結果、最近で最後まで美しく華やかでいたいものです。コスメトロジー

は「分子標的薬」と呼ばれるがん細胞を標的とする薬剤がは化粧品を中心として時代とともに発展し続け、がんスキ

臨床では広く使用されています。しかし、肺や大腸がんにンケアの広告のイメージキャラクターには今を時めく年を使用される代表的な分子標的薬には皮膚に副作用が 70 〜

重ねた女優さんが起用されているのではないでしょうか。

90% と出やすく、ニキビのような「皮疹」が頭の先から足（京都薬科大学臨床薬学教育研究センター）

平成 24 年度

研究助成

情報技術とコスメトロジー
茅暁陽

まず，研究助成をくださったコスメトロジー研究振興財

話題を呼んでいます．今回の研究ではユーザ自身がデータ

団に心より感謝申し上げます．この助成により，私自身の入力またはシミュレーションを行うことなく，システム側

これまでの研究分野を大きく拡げることができたと思いまがユーザの顔画像から特徴を自動抽出し，「似合う」
ヘアス

す．

タイルを推薦するものです．しかし，評価実験においても私は画像処理と統計学習技術を利用して，個人の顔に似再確認されました通り，「似合う」は主観的かつ感性的な概合うヘアスタイルを推薦する研究を行いました．メイクや念ですので，経験やジェンダーによっても大きく異なりま

ヘアをはじめ，美容は個人に似合ってこそ，その人をよりす．本研究では「似合う」を直接定量的に扱うことをせずに，美しくみせることができます．皮膚や髪への影響を考えれヘアスタイルと個人の特徴との関係を過去の成功事例からば，メイクやヘアカラーリングは何度も試すことはできま学習するアプローチを試みました．このような統計学習アせん．また，髪は一度切ってしまうと，すぐには元に戻り

プローチはまさに今ビッグデータブームの主役でもありまません．したがって，事前に自分に最も似合うものを特定す．また，今回のアプローチにおいて特に重要なのは特徴できるような情報技術があれば，その用途はたいへん大きベクトルの設計であるため，視線装置を用いてユーザの感

いと考えます．肌の性質など，本人のデータや好みを入力性を特徴設計に反映させる検討も行いました．その効果的すれば，化粧に関するアドバイスを呈示してくれるようなな利用は今後の課題として残されています．

エクスパートシステムは従来から利用されていますが，近データの蓄積と流通が益々進むにつれて，今後のコスメ

年は画像処理や CG 技術を利用して化粧やヘアスタイルをトロジーにおける情報技術の活用になお一層大きな期待をビジュアルにシミュレーションできる情報技術も開発され，寄せたいと思います．
（山梨大学大学院医学工学総合研究部）− 212 −

コスメトロジー研究雑感

平成 25 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
吉永淳「コスメトロジー研究報告」を拝見すると、コスメトロジ

わが国で使用されていたおしろいに含まれる鉛に関する理ー研究振興財団の助成金には、動物実験や in vitro 系を活

化学的な分析を主とするもので、わが国の化粧品使用の歴用した、いわゆる医学生物学系の分子レベルの研究が多く史にかかわる「文科系」的な研究を「理科系」的な手法で行お採択されているようです。そのなかで筆者の申請研究「19うというものでした。コスメトロジー研究振興財団の懐の～ 20 世紀にわが国で使用された含鉛おしろいに関する研深さに敬服するとともに深く感謝申し上げます。

究」はやや趣が異なるものでしたが、幸いにも採択されて（東京大学大学院新領域創成科学研究科環境システム学専攻）

研究を進めることができました。この研究は、明治時代に

平成 26 年度

学術集会支援助成

第１回 アジアオレオサイエンス会議を終えて宮下第１回アジアオレオサイエンス会議（1st Asian Conference

和夫

エンスの重要性と、本会の役割を強く期待するものでした。

on Oleo Science:ACOS2014）は、平成 26 年 9 月 8 日から同外国人参加者の多くは、9 月 11 日に帰国する予定でし

9 月 10 日までの 3 日間、札幌市のロイトン札幌において、たが、当日は北海道ではこれまで例のない大雨となり、参宮下和夫実行委員長のもと開催されました。本会議への参加者の帰りの足が大変心配されました。しかし、外国の方

加者は 300 名を超え、そのうち海外からの参加者は、アジからは、帰りの便には間に合わなかったけれども、千歳のアを中心に 14 カ国 100 名以上となりました。ACOS2014

航空カウンターの方の“信じられないような”親切な対応ででの口頭発表は基調講演 2 題などを含め 112 題、ポスター

何とか無事帰国できたとのメイルも届いております。また、発表は 92 題にのぼりました。また、ビジネスミーティン

ホテルスタッフやエキスカーションを企画してくれた札幌

グ（9 月 8 日）
、懇親会（9 月 10 日）やエキスカーション（9市のボランティアの方々への感謝のメイル、札幌から函館

月 10 日）などにも多数の参加者がありました。ビジネスミ

経由でバンコクに戻った方からは、切符の購入から列車

ーティングでは、パーム油などの主な油糧作物はアジア諸への案内までしてくれた見知らぬ日本人への感謝の言葉が国が主産地であり、これらの原料は、食用の他、石鹸・洗ありました。国際会議が単に、関連の研究交流に留まらず、剤や化粧品といった製品の重要な素材となっていること、国際親善にも貢献できることを知りました。

我が国はパーム油など多くの油脂資源をアジア諸国から輸最後になりましたが、本会議の開催にあたり、コスメト

入していることなどの共通認識のもと、有意義な議論を行

ロジー研究振興財団より助成金の支援をいただけましたこ

うことができました。特に、外国の方からは、ACOS の今とに心より感謝申し上げる次第です。

後の発展を望む声が多く聞かれました。その内容は、研究（第１回アジアオレオサイエンス会議実行委員長

交流に留まるだけでなく、日本企業とのコラボレーションなど多岐にわたるものであり、アジアにおけるオレオサイ− 213 −

北海道大学大学院水産科学研究院）

●
事業報告（平成 26 年度）
役員●

事業報告書

事業報告書（自平成 26 年 4 月 1 日

至平成 27 年 3 月 31 日）《研究助成関連》
2014

5

7

公募開始

全国 550 の大学、病院、研究機関等へ公募要領及び推薦書を送付、関連学術雑誌７誌、当財団 HP 他３機関 HP に掲載
7
8
公募締切り
応募総数125件
7/15 〜 8/22
各選考委員による個別審査
9
1
選考委員会
（第２分科会） 生体作用、安全性に関する分野の選考
9
4
選考委員会
（第３分科会） 精神、文化に関する分野の選考
9
5
選考委員会
（第１分科会） 素材、物性に関する分野の選考
9 25
本選考委員会
各分科会の結果を総合的に判断して研究助成32課題を選考
11 27
理事会
本選考委員会より答申、助成課題決定
第25回 表彰・贈呈式
研究助成対象32課題の代表者へ、表彰状、助成金目録等を授与
記念講演
演題：『〈香り〉はなぜ脳に効くのか』〜認知症の予防・改善について〜
講演者：塩田清二 先生 昭和大学医学部 教授
12 12
助成金交付
採択課題に対し研究助成金を交付 総額2,800万円《国際交流助成関連》
2015

1

5

審査
助成金交付

応募課題の審査
国際交流助成金の交付無し《学術集会支援助成関連》
2014

5
6

26
10

審査
助成金交付

応募課題の審査
学術集会支援助成金の交付

平成25年度事業報告及び収支決算報告の承認、補欠評議員候補者の選
出、任期満了に伴う選考委員及び理事、監事候補者の選出、株主としての議決権行使、報告事項
代表理事（理事長及び副理事長）及び業務執行理事（専務理事）の互
選、事務局長の選任、常勤役員報酬の承認
平成26年度（第25回）研究助成者等の承認、平成27年度事業計画及び予算案の承認、報告事項

50万円《理事会関連》
2014

5

29

第一回通常理事会

620

臨時（書面）理事会

1127

第二回通常理事会《評議員会関連》
2014

6

13

第一回定時評議員会

8
12

18
5

評議員報告（書面）
評議員報告（書面）

平成25年度事業報告及び収支決算報告の承認、補欠評議員の選任、任期満了に伴う理事、監事の選出、評議員１名の辞任願いの承認、評議員会長の互選
上野芳夫評議員逝去、後任の選任無し（定員数を満たしているため）第二回通常理事会議決事項、第25回表彰･贈呈式− 217 −

コスメトロジー研究報告Vol.23, 2015

《その他》
１）報告書発行
2014
5
1
9
1

中間報告集
完了報告集

２）情報公開（当財団HP）
2014
3 13
事業計画及び収支予算
4
4
公募要領
6 16
事業報告及び収支決算
6 30
役員の変更
9
1
研究報告の要旨
12
1
研究助成者及び課題名

研究業績 中間報告集 第23号
コスメトロジー研究報告 2014 vol.22

平成26年度事業計画及び収支予算書
2014年度「コスメトロジー研究」公募要領
平成25年度事業報告書及び収支決算報告書
理事、監事任期満了改選に伴う新役員
コスメトロジー研究報告 2014 vol.22 掲載課題の要旨
平成26年度研究助成者名及び研究課題名− 218 −

事業報告書平成 26 年度 助成を受けられた方々

１）研究助成（32 課題）
第 1 分野：素材、物性に関する分野（９課題）
氏

名

飯島

志行

江島

所

属

職位

研究課題

横浜国立大学大学院
環境情報研究院

講師

カチオン性高分子の部分的疎水化と化粧品原料微粒子の油中分散安定化剤への応用広貴

東京大学生産技術研究所

助教

天然を超える抗酸化＆抗菌活性の発現をめざしたポリフェノール模
倣高分子の精密重合杉本幸子

広島大学大学院
医歯薬保健学研究院

講師

アーユルヴェータ生薬および熱帯植物からのアンチエイジングを志向した抗糖化および美肌薬の創薬研究

出口

茂

松岡

秀樹

京都大学大学院
工学研究科高分子化学専攻

准教授

外部刺激による高分子ミセルの特異的形成／崩壊制御とその物質輸送系への応用三浦佳子

九州大学大学院
工学研究院化学工学部門

教授

高分子ナノゲル粒子の短距離秩序に基づく色彩の研究

道信

剛志

東京工業大学大学院理工学研究科准教授
有機・高分子物質専攻

水溶性フラーレンの設計とそれらを用いた抗酸化作用に関する研究

安永

秀計

京都工芸繊維大学大学院
工芸科学研究科
バイオベースマテリアル学部門

准教授

バイオベースマテリアルを用いた人体により安全な染毛法の開発

山路稔

群馬大学学術研究院
分子科学部門准教授

抗炎症効果のあるUVサンスクリーン分子の開発と基礎物性の研究

独）海洋研究開発機構
センター ナノ乳化におけるトップダウンプロセスとボトムアッププロセスの海洋生命理工学研究開発センター長
比較第２分野：生体作用、安全性に関する分野（15 課題）
氏

名池ノ内 順一

所

属

職位

研究課題

九州大学大学院理学研究院
生物科学部門

准教授

タイトジャンクションの形成を促進するシグナル伝達経路の解明

岩脇

隆夫

群馬大学
先端科学研究指導者育成ユニット

講師

酸化ストレスの生体分子イメージングから迫る対紫外線スキンケア
分子の新規探索と機能評価

大沢匡毅

岐阜大学大学院医学系研究科
生命機能分子設計分野

教授

皮膚角化層形成にともなう上皮細胞のダイナミズムを制御する分子
メカニズム

大津

浩

東北大学大学院工学研究科
応用量子医工学分野

教授

慢性皮膚炎モデルにおける HDC 遺伝子レポーターマウスを用いたヒスタミン産生細胞の同定

岡野純子

滋賀医科大学医学部医学科
解剖学講座生体機能形態学部門

准教授

レチノイン酸の皮膚内濃度モニタリングと新規アンチエイジング分子の同定への応用尾上誠良

静岡県立大学薬学部
薬物動態学分野

教授

光線過敏症リスク予測方法の確立と国際協調活動の戦略的推進菊地和也

大阪大学大学院工学研究科教授

炎症時における細胞動態と酵素活性を in vivo で可視化する機能性
MRI プローブ佐々木教授・ 新規ナノ粒子を用いた皮内 siRNA デリバリーによる皮膚の恒常性
薬剤部長 維持均

長崎大学病院薬剤部

住吉秀明

東海大学医学部再生医療科学講師

創傷をより綺麗に修復させる皮膚再生促進薬の開発

平修

福井県立大学生物資源学部

准教授

経皮吸収物質の体内動態のイメージング質量分析による解析− 219 −

コスメトロジー研究報告Vol.23, 2015

氏

名

谷崎

英昭

中台 枝里子
原

俊太郎

所

属

職位

研究課題

京都大学大学院
医学研究科皮膚科

助教

皮膚バリア機能障害を伴う皮膚疾患を対象としたラマン分光装置を用いた角層天然保湿因子の解析

大阪市立大学複合先端研究機構/大学院生活科学研究科

特任准教授

極長鎖脂肪酸含有セラミドの表皮バリア形成における機能と分子機構の解明

昭和大学薬学部教授

皮膚疾患におけるプロスタグランジン最終合成酵素群の機能解析

松﨑伸介

大阪大学大学院 連合小児発達学
研究科 こころの発達神経科学講座 分子生物遺伝学領域

准教授

創傷治癒機構における小胞体ストレス応答の関与

水品

善之

神戸学院大学大学院
食品薬品総合科学研究科

准教授

紫外線ダメージ抑制作用を有する熱帯植物の探索と作用メカニズムの解析

第３分野：精神、文化に関する分野（8 課題）
氏

名

東

照二

大川 真由子
荻

あや子

熊崎

博一

髙坂

康雅

佐々木 一郎

職位

研究課題

立命館大学言語教育情報研究科

所

属

教授

「香り」の社会言語学：人はどのように「香り」の言語化を行うのか？

早稲田大学人間科学学術院

助教

ムスリム女性の「美」と消費
能性

岡山県立大学
保健福祉学部看護学科

准教授

患者や家族と看護者の化粧に対する認識の比較に関する研究

─中東におけるハラール化粧品の可

福井大学 子どものこころの発達
特命助教 自閉症スペクトラム症の香料過敏についての調査
研究センター
和光大学
現代人間学部心理教育学科

准教授

自我発達からみた女子青年における容姿・容貌に対する劣等感への化粧効果の認識に関する発達心理学的研究

同志社大学商学部

准教授

消費者ニーズの変化と化粧品チャネルに関する研究准教授

女性の美における訴求表現に関する研究

助教

化粧がもたらす自己の価値および社会行動における価値の変化－ 行動学的検討

広瀬英史

静岡文化芸術大学
文化政策学部国際文化学科

藤原寿理

福島県立医科大学医学部
システム神経科学講座

３）学術集会支援助成（１件）
実施責任者

宮下

和夫

所

属

北海道大学大学院
水産科学研究院

職位

教授

集会名

及び

内容

第１回アジアオレオサイエンス会議
平成26年9月8日～ 9月10日（ロイトン札幌にて）
目的：油脂（脂質）に関わる学際領域を網羅しているオレオサイエ
ンスの啓蒙と発展及び関連企業の発展− 220 −

事業報告書役

員
平成 27 年７月１日現在

理事長

小林

保清

株式会社コーセー

名誉会長

副理事長

小林

一俊

株式会社コーセー

代表取締役社長

専務理事

土子

利明

元株式会社コーセー

理

事

宇佐美昭次

早稲田大学

理

事

関根

茂

日光ケミカルズ株式会社

理

事

二木

鋭雄

東京大学

理

事

西川

武二

慶應義塾大学

理

事

廣部

雅昭

東京大学

理

事

野呂

影勇

早稲田大学

理

事

山㟢

幹夫

元新潟薬科大学

監

事

小田倉正典

公認会計士

監

事

村上

實

弁護士

評議員会長

内藤

昇

株式会社コーセー

評議員

伊藤

正俊

評議員

齊藤

勲

元厚生省大臣官房審議官

評議員

仙名

保

慶應義塾大学

評議員

中村

陽子

評議員

西岡

清

評議員

花輪

隆昭

元昭和館

評議員

原田

敬之

東京女子医科大学

評議員

宮㟢

榮三

東京工業大学

東邦大学

常勤監査役

名誉教授
代表取締役社長

名誉教授
名誉教授

名誉教授
名誉教授
学長

常務取締役

名誉教授
名誉教授

元厚生省医薬安全局安全対策課安全対策企画官
東京医科歯科大学

名誉教授

館長
名誉教授

名誉教授

− 221 −

＊本財団についてのお問い合わせは下記にお願いいたします。

公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団〒 104 — 0032

東京都中央区八丁堀三丁目 11 番８号
ニチト八丁堀ビル五階
電話 03（3206）7721

コスメトロジー研究報告

Vol.23／2015

非売品

2015年９月１日発行

編集責任者
発
行
制

作

印

刷

土子 利明
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