ヘパリン導入コラーゲンからなる G/O エマルションの開発
九州大学大学院工学研究院化学工学部門

井嶋博之

Heparin-collagen conjugate using heparin having affinity for various growth factors was prepared. Furthermore, a gelin-oil (G/O) emulsion consists of this conjugate was developed. This G/O emulsion was able to immobilize various growth
factors including bFGF. In addition, this G/O showed good permeability to the skin. Furthermore, activation of the cultured
dermis model was suggested in the application test of bFGF-containing G/O. From the above, the effectiveness of the G/O emulsion as a novel skin care technology having good skin permeability, stabilization of the active ingredient and its
sustained release property was expected.

１．緒言

シワやたるみ、シミや黒ずみ、ニキビ、ニキビ跡、髪のダメージ・抜け毛などのトラブルは誰にでも起こる問題であり、精神衛生的観点からもこれら問題を解決することは重要である。近年、増殖因子が注目されており、上皮細胞増殖因子（EGF）や線維芽細胞増殖因子（FGF）などが配合された美容液が市販されている。しかしながら、増殖因子は不安定であり容易に失活するため、その安定性の向上が不可欠である。さらに、皮膚は優れたバリア性を有するため分子量数万の各種増殖因子の皮膚透過性は極めて低い。

Fig. 1 Image of activation of skin by G/O emulsion

これに対してタンパク質薬物を Solid-in-Oil 化することで疎水性表面の直径数百 nm の微粒子が作製でき、劇的な皮膚浸透性の向上が報告されている 1 - 2）。

ア技術を創出することを目的とした（Fig. 1）。

一方、ヘパリン導入コラーゲンは肝臓 3 - 8）、血管 5 - 6）, 9）、２．方神経組織 10）に対する再生医療用基材としての有効性が実法

傍において自発的にゲル化し、高い生体親和性を示す。さ2 . 1. ヘパリン導入コラーゲンゲルへの増殖因子固定化と安定性評価

らに本基材は EGF、FGF、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、水溶性カルボジイミド塩酸塩（EDC）および N- ヒドロキ

肝細胞増殖因子（HGF）などの各種増殖因子と高い親和性シスクシンイミド（NHS）を用いてコラーゲンゲルにヘパを有しており、自発的にそれら増殖因子を固体化保持できリンを導入した。作製したヘパリン導入コラーゲンゲルにる 4 - 10）。これにより、増殖因子の失活が阻害され、その細塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を固定化し、ELISA 法証されてきた。本基材は生体内コラーゲンと同様に中性近、かつ徐放性がによりゲル内の bFGF 量を評価した。また、ヘパリン導入ことにより、効果的な皮膚の活性化が期待

コラーゲンゲルに bFGF を固定化して 1 日間インキュベー

胞活性化効果を長期間良好に維持でき付与される

5 - 6）

9 - 10）

ションした後、ELISA 法によりゲル内の bFGF 量を評価される。
そこで本研究では、上記ヘパリン導入コラーゲンのナノした。

ゲルからなるエマルションを開発し、従来にないスキンケ

2 . 2 . G/Oエマルションの開発
ゼラチン溶液の水相と、ショ糖エルカ酸エステル（ER290）を溶解したシクロヘキサンの油相を混合し、超音波
Development of G/O emulsion consists ofheparin-collagen conjugate
Hiroyuki Ijima
Dept. of Chemical Engineering, Graduate
School, Kyushu University

ホモジナイザーを用いて乳化させた。ゲル化後油相を置換し、ミリスチン酸イソプロピル（IPM）に再分散させることで G/O を調製した。G/O 調製時の界面活性剤濃度、水相と油相の体積比、ゼラチン濃度について最適化を行った後、−4−ヘパリン導入コラーゲンからなる G/O エマルションの開発

ヘパリン導入ゼラチン溶液を水相に用いた G/O 調製を試

3．結果と考察みた。G/O の粒径分布は動的光散乱法（DLS）により測定し評価した。

3 . 1. ヘパリン導入コラーゲンゲルへの増殖因子固定化と安定性評価

2 . 3 . G/Oエマルションの皮膚浸透性評価

果、有意に多くの bFGF が固定化されていることが確認さた。また、G/O 内水相のゲル化を動的粘弾性測定によりヘパリン導入コラーゲンゲル内の bFGF 量を評価した結強化緑色蛍光タンパク質 EGFP を含むゼラチン溶液の水れた。その固定化効率は約 71 % であった。また、ヘパリ相 1 mL と、IPM（ER- 290：50 mg/mL）の油相 2 mL を用ン導入コラーゲンゲルに固定化した bFGF は、溶液中のいて EGFP 含有 G/O を調製した。拡散セルにマウスの背bFGF と比較してその活性を良好に維持していることが期

中皮膚を挟み、PBS を皮膚下面がさらされる程度まで加え待された（Fig. 2）。これは bFGF が分子構造の比較的安定た。EGFP 含有 G/O を皮膚上面に添加し、インキュベータなヘパリンに結合し、立体構造が安定化したためだと考えー内で 1 日間静置した。その後、皮膚断面の凍結切片を作られる。

製して蛍光観察を行った。

2 . 4 . 培養真皮モデルを用いた bFGF 固定化 G/O の有効性評価

3 . 2 . G/Oエマルションの開発
ナノゲル粒子を IPM に再分散させたところ、均一に分散させることができ、G/O の形成が示唆された。G/O 調

1 % コラーゲン溶液と 20 % FBS 添加 2 倍濃縮 DMEM製時の組成について最適化を行った結果、界面活性剤濃度を 1：1 で混合した溶液にマウス線維芽細胞（L 929 細胞）を50 mg/mL、水相と油相の体積比 1：2、ゼラチン濃度 5 %5懸濁し（6 . 7×10 cells/mL）、37 ℃下でゲル化させることの条件において、粒子径が小さい G/O が得られた。こので培養真皮モデルを作製した。この培養真皮モデル表面に条件下において、ヘパリン導入ゼラチン溶液を水相に用いbFGF 固 定 化 G/O エ マ ル シ ョ ン を 塗 布 し 培 養 し た。て G/O を調製したところ、平均粒径が 293 nm の G/O が得

Hoechst を用いた DNA を定量により、培養真皮モデル内られた（Fig. 3（A））。これより皮膚浸透可能なサイズの G/の細胞増殖を評価した。

O 作製が示唆された。また、IPM 中に分散した G/O エマ

Fig. 2 Immobilized bFGF in heparin-collagen conjugate gelevaluated by ELISA; n = 3 . Bars represent S.D.

Fig. 3 Characteristics of G/O emulsion. (A) Size distribution of G/O emulsion evaluated withDLS; n = 3 . (B) Phase-contrast microscopic observation of G/O emulsion. Bar indicates
1 µm.

−5−コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

ルションは安定であり、経時的粒径変化は観察されなかっ形成が示唆された。EGFP 含有 G/O の皮膚浸透試験の結果、た。さらに、G/O 粒子の動的粘弾性測定を行った結果、同EGFP の皮膚浸透が示唆された。さらに、bFGF 含有 G/O様に作製した W/O エマルションと比較して硬いことが分の塗布試験において培養真皮モデル活性化が示唆された。

かった。これより、G/O 内水相のゲル化が期待された。

以上より、皮膚浸透性と有効成分の安定化および徐放性を有する新規スキンケア技術としての G/O エマルションの有3 . 3 . G/Oエマルションの皮膚浸透性評価効性が期待された。

EGFP 含有 G/O の皮膚浸透試験を行った後、皮膚断面の蛍光観察を行った。EGFP の皮膚浸透性は見られなかった

謝

辞が、G/O 化することにより EGFP の皮膚内部への浸透が示

G/O エマルション作製および評価に尽力いただいた長された（Fig. 4）。また、G/O 調製時に EGFP の活性は失わ

尾征哉氏（九州大学）、山本惠美子氏（九州大学）に心よりおれておらず、皮膚浸透後も活性を維持していることが示さ

礼申し上げます。また、基材評価にご協力いただいた後藤れた。

雅宏教授（九州大学）、三浦佳子教授（九州大学）、小野文靖准教授（九州大学）に感謝申し上げます。

3 . 4 . 培養真皮モデルを用いた bFGF 固定化 G/O の有効性評価
増殖因子不含培地と比較して bFGF 含有培地の増殖促進

本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コスメトロジー研究振興財団よりご援助いただきましたことに深く感謝申し上げます。

効果は観察されなかった。これは bFGF の安定性の乏しさに起因するものである。また、bFGF 固定化 W/O エマル（引用文献）

ションにより培養初期において細胞増殖促進効果が見られ

1） Wakabayashi, R., Sakuragi, M., Kozaka, S., Tahara,

たものの、その効果は持続できなかった。一方、bFGF 固Y., Kamiya, N., Goto, M.. Solid-in-Oil peptide

定化 G/O エマルションにおいては他の条件と比較して有nanocarriers for transcutaneous cancer vaccine

意な細胞増殖効果が確認され、少なくとも培養 7 日間そのdelivery against melanoma, Mol. Pharm., 1 5, 9 5 5-9 6 1,
2018.

効果が持続した。よって、G/O エマルションによる培養

2） Tahara, Y., Honda, S., Kamiya, N., Piao, H., Hirata, A.,

真皮モデルの活性化が期待された。

４．総

Hayakawa, E., Fujii, T., Goto, M., A solid-in-oil

括nanodispersion for transcutaneous protein delivery, J.
Control. Release, 131, 14-18, 2008.

ヘパリン導入コラーゲンゲルに増殖因子を固定化させる
ことで、増殖因子の活性維持が確認された。また、内水相

3） Ye, J., Shirakigawa, N., Ijima, H., Hybrid organoids

がヘパリン導入ゼラチンゲルである G/O（粒径約 293 nm）

consisting of extracellular matrix gel particles andFig. 4 In vitro evaluation on skin permeability of G/O emulsion using mouse skin. Bars indicate 200 µm.

−6−ヘパリン導入コラーゲンからなる G/O エマルションの開発

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