高等真核細胞を用いた組換え体
タンパク質の産生向上を可能にする
スタビロンタグの開発
日本大学

生物資源科学部 応用生物科学科准教授
舛廣 善和
令和 ２ 年１０月１３日

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従来技術とその問題点
タンパク質の産生向上に繋がるタンパク質の安定化や分解耐性を目的とした“ タグ ”はこ
れまでにはない。
検出や精製面で評価を得ているタグシステムには、Flagタグシステム等があるが、免疫沈降法や免疫染色法によるタンパク質間相互作用の解析などでは２種以上の極めて特異性の高いモノクローナル抗体が必要である（ポリクローナル抗体は動物愛護の観点から好ましくない）。
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従来技術とその問題点
タグ種名

タグ配列

抗体

Flag

DYKDDDDK
人工配列

M2

非常に特異性が高い

9E10

タグを繰り返した方が結合が強い（6xMycなど）

Myc

EQKLISEEDL

特徴・問題点前後の配列に影響される
HA

YPYDVPDYA

4B2、6B3など多数いい抗体を選ぶ必要がある※昨今、高親和性のタグ、モノクローナル抗体のコマーシャルが多くなってきている
3新技術発見の背景
E2F-1

DP-1 スタビロン

DP-1

転写因子DP-1 （ E2Fファミリーと-EDDEEDDDFNENDEDD

A ヘテロダイマーを形成し細胞周期を制御 ）DP-1 WT1

新規発見のアイソフォーム

102127

192318410a.a.

αβΔC364
ΔC395

B＋ −＋ −＋ −＋ −＋b

RT-PCR

MG132 −βαFlag-DP-1 WTc

WB:Flag(M2)d

WB:GAPDH

a12345678910

Flag-DP-1
GAPDH

C末が欠けると発現が見られない！C末の16アミノ酸がDP-1タン
パク質の安定化に重要であった
Masuhiro Y. et al
Biochem Biophys Res Commun. 2010
397(2):345-9. doi: 10.1016/j.bbrc.2010.05.127.
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タンパク質の安定化領域（スタビロン）／不安定化領域（デグロン）
このような欠失変異体作製時、本来のタンパク質の発現が悪くなったり良くなったりすることがあります！

ΔC

ΔN

不安定化
分解促進

WT

WT
ΔN
ΔC

Factor X

安定化
分解阻害

スタビロン

デグロン
ウエスタン解析（例）5スタビロンとデグロンのメカニズムは？
Ub
E3 ユビキチン Ub
リガーゼ
Ub
P Ub
WT S K

分解促進

デグロン
比較的よく解析PESTモチーフが有名
ユビキチン化リジン（K）
Phospho-デグロン（S/T）など

プロテアソーム？
Factor X

安定化
分解阻害

スタビロン
メカニズムはあまり知られていない
6タンパク質を安定化するには
P
WT S

デグロンの欠失、変異 ΔN

Ub
K

Factor X

S➡A K➡R

変異デグロンの除去もしくは変異導入という方法があるが、これはデグロンが判明しているタンパク質にのみ適応。
さらに、欠失や変異で機能が変わることも！

スタビロン
融合

SK

S

K

融合はどのタンパク質にもトライできる！汎用性高い！
分子内部への融合も有効！（全てに効く保証はないが）7

iPS
Flag-TRIP6
Flag-Stabilon-TRIP6
Flag-TRIP6-Stabilon

Flag-Stabilon-Dkk1∆NSS

安定化みられない

Flag-Dkk1∆NSS

核タンパク質Flag-p53-Stabilon

Target Protein

Flag-Stabilon-p53

Stabilon

Flag-p53

安定化した

Flag-PCBD1
Flag-PCBD1-Stabilon

Flag-NFYC-Stabilon

Flag-NFYC

Flag-Foxp3
Flag-Foxp3-Stabilon

Target Protein

Flag-RARα-Stabilon

Flag

Flag-Stabilon-RARα

Target Protein

Flag-RARα

Flag

Flag-Stabilon-Sox2
Flag-Sox2-Stabilon

Flag-Sox2

Flag Stabilon

Flag-Glis1-Stabilon

Flag-Stabilon-Glis1

Flag-Glis1

DP-1スタビロンは多くのタンパク質を安定化する
主に細胞質局在タンパク質（一部両局在タンパク質）

安定化み安定化した られない

WB;Flag(M2)WB;β-Actin
白血球 Treg

上記コンストラクトをHEK293細胞（ヒト胎児腎由来培養細胞）にトランスフェクトし、24時間後に全抽出液を作製。等量をアプライし左記抗体を用い、ウエスタンブロットで検出
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DP-1スタビロンはプロテアソームによるタンパク質分解を防ぐ
シクロヘキシミド pulse chase assay
Flag

Sox2

CHX(50µg/ml；hours)

Sox2

Stabilon

Flag-Sox2-Stabilon

Flag-Sox2

HEK293 Stable
MG132(10µM)

Flag- - - - - + + + + + - - - - - + + + + +026 10 24 02

6 10 24 02

6 10 24 02

6 10 24

WB:Flag(M2)

早期分解

ほとんど分解されない

WB:β-actin
1234567スタビロン

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

プロテアソーム

9想定される用途（１） 発現プラスミドのタグとして（発現向上・分解耐性・特異的検出 / 精製用）
発現プラスミドMCS

Stabilon
pStabilon-C1,C2,C3

製品リスト

Target Protein

Stabilon

resin
溶出ペプチドMCS

Stabilon
pStabilon-N1,N2,N3

免疫染色

Stabilon
Stabilon

Target Protein

resin 免疫沈降精製

ウエスタン解析# 発現プラスミド# 検出用抗体（HRP融合, 蛍光ラベル等）# 抗体レジン# 溶出ペプチド（２） 有用タンパク質の大量産生に
6xHis

医療用タンパク質
精製用タグ（ワクチン、バイオ医薬品）
研究用酵素、生理活性タンパク質、CPP
基剤、洗剤（酵素等）
膜透過性タグ

有用タンパク質Stabilon

有用タンパク質Stabilon※細胞内の機能調節が可能

CHO細胞、HEK細胞
植物細胞、昆虫細胞、大量産生可能な動植物、酵母などで発現（３） 変性状態タンパク質のリフォールディング時の再凝集防止に（大腸菌等で封入体誘導時に）変性
封入体

尿素やグアニジン塩酸

巻き戻し

Ni
精製

透析

可溶化する；アグリゲーション防止
His-tag
Stabilon※ 塩基性タンパク質は透析時再凝集し易いが、スタビロン融合で等電点が低下し（酸性寄りになる）可溶化する。
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人工配列（多くの生物種の内因性タンパク質に存在しない配列）へ
番号
No.0

配列
EDDEEDDDFNENDEDD(ヒト DP-1 395-410a.a.)

No.1
DFNDNEDEDEFNDNED
No.2
EFNDNDDEEDFNDNED
No.3
DEEDDEEEFNDNENEE
No.5
DEEDDEEEDEDEE
No.6EEDEFNENDEDEDDED
No.7
EEDEEDEDEDDED
No.8
EFNDNEFNDNDDEEDFNDNED
No.4
DEEDDEEEFNDNEDEE
No.9
EFNDNDEEDDEEEFNDNEDEE
No.10 EFNDNEFNDNDEEDDEEEFNDNEDEE

タグ用に設計した新規配列（Blastで検索し非存在を確認）
いくつかのタンパク質のN末、C末に融合し、発現向上度を調べたところ、No.4, 9, 10が好成績！
その中でもNo.9が好成績！

No.4

No.10

No.9

No.9ペプチドを抗原にモノクローナル抗体作製

E;グルタミン酸、 D;アスパラギン酸、 F；フェニルアラニン、 N；アスパラギン
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hSox2
hSox2

A BC

DE F

ABCDEF9 10 09 10 0Stabilon-0hRARαNo.9-Stabilon

hRARαNo.10-Stabilon

hRARαStabilon-0

Stなし

hRARα

Stなし

A FlagB FlagC Flag
D FlagE FlagF Flagマーカー

ELISA法でスクリーニングしたモノクローナル抗体のうちcl-24は全抽出液から単一バンドで検出可能な抗体だった

CMVプロモーター
Stなし

Stなし

哺乳動物細胞発現プラスミド

0WB;Flag(M2)

HEK293細胞へトランスフェクト
↓全抽出液でウエスタン解析

0WB;cl-24※No.10-StabilonはNo.9-Stabilonと同じ配列を含んでいます12モノクローナル抗体cl-24は免疫沈降,免疫染色が可能
免疫沈降精製

重鎖＊＊IP;cl-23
IP;cl-24IP;Flag

IP;cl-23IP;cl-24IP;Flag※cl-23はcl-24と同じ抗体です

Lysate

Cl-24

Cl-24Flag(M2)

Alexa594

No9-Stabilon

RARα＊IP;ProGのみFlag

免疫染色

No9-Stabilon

FlaghRARα
核内因子＊

軽鎖WB;Flag(M2)CBB染色

Alexa594検出と微分干渉の重ね合わせ
13モノクローナル抗体cl-24は植物やカイコタンパク質との交差性が低い

WB;

トマト（果実）シャインマスカット（果実）

Flag

Flag

cl-24(-) (+) (-) (+)

cl-24(-) (+) (-) (+)

カイコ（成虫体液）

コセンダン
グサ（葉）
Flag

cl-24

Flag

(-) (+) (-) (+)

cl-24(-) (+) (-) (+)(-)は各抽出液総タンパク質量5µg、(+)には各抽出液に加え下記の精製組換え体20ngがアプライされている
6xHis

Flag

Stabilon No9

hOct4

S19

TAT

NLS
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新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術にはなかった、タンパク質の安定化、分解耐性による発現向上にはじめて成功した。
• 極めて特異的な検出および精製が可能なモノクローナル抗体の開発に成功した。
• 本技術の適用により、有用タンパク質の増産が期待できるため、生産コストが大幅に削減されることが期待される。

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想定される用途• 本技術の特徴を生かすためには、種々の生物種（動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母など）の発現系のタグに適用することで、高機能有用タンパク質の大量産生系開発へのメリットが大きいと考えられる。
• ワクチンやバイオ医薬品などの高度修飾タンパク質の大量産生、ゲノム編集や遺伝子治療時の長寿命タンパク質の開発に期待される。
• 上記以外に、酸性アミノ酸が多い点に着目すると、大腸菌発現系での可溶性発現や、封入体タンパク質の尿素・グアニジン塩酸変性可溶化後の透析による巻き戻し時の可溶化度向上にも期待される。
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実用化に向けた課題• 現在、スタビロンモチーフとその抗体についてはウエスタンブロットや免疫沈降、免疫染色での特異的検出が可能なところまで開発済み。エピトープ部位も確認済みである。しかし、溶出ペプチドの開発が未解決である。
• 今後、溶出ペプチドについて設計を行い（エピトープのみや、その繰り返しなど）、実験データを取得し、免疫沈降精製に適用していく場合の条件設定を行っていく。
• 実用化に向けて、植物や昆虫細胞、酵母まで応用可能か（安定化能を発揮するか）を検討する必要あり。
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企業への期待• 未解決のカイコ個体内での安定化に関しては、遺伝子組み換えカイコ技術により克服できると考えている。
• 未解決の植物細胞での安定化については、効率のよい遺伝子導入法やゲノム編集、膜透過性組換え体タンパク質技術により克服できると考えている。
• タグ、モノクローナル抗体（検出、精製用）の技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、ゲノム編集や発現系で組換え体タンパク質を開発中の企業、バイオ医薬品分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：抗体又はその抗原結合フラグメント、抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸、ベクター、形質転換体、及び、スタビロン改変体検出キット• 出願番号• 出願人• 発明者：特願2020-150003
：日本大学
：舛廣善和
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お問い合わせ先
日本大学 産官学連携知財センター(NUBIC)
日本大学 研究推進部 知財課
ＴＥＬ：０３－５２７５－８１３９
ＦＡＸ：０３－５２７５－８３２８e-mail：ｎｕｂｉｃ＠ｎｉｈｏｎ－ｕ.ａｃ.ｊｐ

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