ナノ粒子曝露が真皮中の線維芽細胞に与える影響の定量的リアルタイム解析
物質・材料研究機構 国際ナノアーキテクトニクス研究拠点

柴弘 太

Recently, the effect of nanoparticles on living things has attracted much attention because of the increasing opportunities
to use the nanoparticles in such areas as environmental purification, biology, medicine, cosmetology, and so on. As
nanotechnology advances, the nanoparticles with desired properties have become available. On the other hand, nanoparticleinduced toxicity has been reported. Therefore, it is important to quantitatively understand risks of the nanoparticles before
using them, though the effect of the nanoparticles, especially in the case of an uptake through skins, is still not yet unclear. In
this study, we synthesize monodispersed titania-based nanoparticles with controlled size (70-500 nm) as a model material toinvestigate the nanoparticle effect. In addition, a characterization system for such effect is developed using a membrane-typesurface stress sensor (MSS), which can detect surface stress applying on its surface with high sensitivity and in real-time.
Taking advantage of the photoactivatable cell-culturing substrate reported before (J. Nakanish et al., J. Am. Chem. Soc. 129,6694-6695 (2007).), we demonstrate that cell-culturing only on top of the MSS is possible.

１．緒言

２．実

近年、トイレタリー・化粧品分野において、例えば「白2 .1

験

試薬

金ナノコロイド」などの名称で、ナノ粒子の利用が一般にモデル粒子として、チタニアをベースとしたハイブリッ認知される機会が増加している。PM 2 . 5 問題の深刻化をド粒子を合成するため、チタニウムテトライソプロポキシ一つのきっかけに、ナノ粒子が生体に及ぼす影響にも関心ド（TTIP）、イソプロピルアルコール（IPA）、オクタデシが集まりつつあることからも、ナノ粒子が引き起こす効果ルアミン（ODA）を用いた。の定量的な評価と、摂取可能量に関する指標確立は喫緊の課題と言える。現在のところ、経口や経鼻によるナノ粒子摂取に関する研究が着実な進展を見せる一方、経皮に着目した研究は少ないのが現状である 1−3）。

2.2モデル粒子の合成

サイズの揃ったチタニア− ODA ハイブリッド粒子の作
製には、マイクロリアクタを組み込んだフロー式の合成系

そこで本研究では、経皮によるナノ粒子曝露の影響を定6−8）を利用した（図１）。

量評価するための第一歩として、モデル粒子の合成に加え、粒子合成手順の一例を以下に示す。TTIP（0 . 595 mL）

これら粒子が真皮中の線維芽細胞に与える影響を調べるたの IPA（12.26 g）溶液（溶液 A）と、IPA（12.65g）水（0.100 mL）めの測定系を構築した。検出部として、表面に生じる応力をリアルタイムに精密測定可能な、膜型表面応力センサー（MSS）を 用 い 4）、 こ の 表 面 上 で の 細 胞 培 養 を 試 み た。
MSS の検出限界はおよそ 0 . 2 mN/m であり、細胞が膜表面で集合的に振動した場合に生じる応力がおよそ２mN/mであることから 5）、検出は原理的に可能であると考える。
細胞の挙動を MSS により確実に検出するため、膜表面に位置選択的に細胞を培養するための条件も検討した。

Real-time and quantitative analysis of
the effect of nanoparticles on fibroblasts
in the dermis
Kota Shiba
WPI Center for Materials Nanoarchitectonics（MANA），National Institute for Materials
Science（NIMS）

図 1 マイクロリアクタを利用した核形成・粒子成長分離型合成システムの概要。マイクロリアクタチップ内で核形成が起こり、形成した核が別の原料溶液中へ吐出され、そこで粒子成長が起こる。動的光散乱測定の結果、マイクロリアクタ内での核形成が示唆された− 106 −

ナノ粒子曝露が真皮中の線維芽細胞に与える影響の定量的リアルタイム解析

溶液（溶液 B）を、シリンジポンプを用いて流速 20 mL・−1・ナノ粒子のサイズが揃っているmin で送液し、Y 字型の混合部を有する PTFE 製マイク

・ナノ粒子の形状が揃っている

ロリアクタ内で混合した。混合液を別途調製しておいた・ナノ粒子のサイズを制御できるODA（0 . 0684 g）を含む IPA（49 . 32 g）水（0 . 300 mL）溶以上が求められる。筆者はこれまで、チタニア、シリカを液（溶液 C）へ吐出し、溶液 A および B の全量を吐出するはじめとする種々の酸化物系ハイブリッドナノ粒子の合成

までの約 40 秒間、撹拌を続けた。室温で 24 時間静置したに従事し、単分散粒子合成についてのノウハウを確立して後、吸引濾過あるいは遠心分離による固液分離、IPA によきた。その概要を図１に示す。本手法は、マイクロメートる洗浄、60 ℃で一晩の乾燥過程を経て、試料粉末を得た。

ルサイズの微小な空間を化学反応に利用可能な、いわゆる「マイクロリアクタ」を組み込んだフロー式の合成法であ2.3

MSSチップの作製り、大きく２つの段階から構成される。それは、マイクロMSS チップは、既報にしたがい、SOI 基板を利用して一4）般的な半導体プロセスにより作製されたものを用いた 。

リアクタ内での原料の１次混合と、１次混合後の反応液をさらに別の原料と混合することによる２次混合である。チ
タニア系粒子の合成には、原料として TTIP を用いること2.4

MSSチップ上への光応答表面の作製が多く、この加水分解・縮重合反応により、粒子の形成・MSS チップ上への位置選択的な細胞培養は、図２に示
9）成長を誘起する。しかし、TTIP の加水分解はきわめて短すような光応答表面を利用した方法により行った 。光照時間に進行することが知られており、一つの容器に順次原射によって脱離する官能基を備えたシランカップリング剤料を加えて、閉鎖系で反応させるようなバッチ合成では、によって、シリコン製の MSS の表面を被覆し、蛍光顕微局所的に反応が進行してしまい、結果として多分散粒子が鏡を用いて局所的に UV 光を照射する。その後、細胞吸着形成するという問題が生じやすい。これを回避するための剤を適用することで、任意の位置に細胞を配置することが方法として、加水分解に必要な水をごく少量ずつ加えるこ可能になる。とにより（多くの場合、TTIP：水のモル比が１：３程度）、反応をゆっくり進行させることが有効とされてきたが、こ2.5

細胞培養の場合は未反応の原料が残存しやすく、収率の低下が問題MSS 表面への培養可能性を探る予備的な検討を行う目となる。そこで本手法においては、１次混合時の TTIP：的で、まずは一般に広く使用されている HeLa 細胞を用い水のモル比を１：３程度とし、ここで粒子の「核」のみをた。培地は RPMI- 1640 を用い、37 ℃、５%CO 2 下で培養し形成させることを試みた。動的光散乱測定により、１次混た。

合直後の反応液中にはおよそ２～３nm 程度の微細な粒子が存在しており、核の形成に成功したことが示唆された。

３．結果および考察
3.1

次いで、この核を含む反応液を、ODA および１次混合時単分散チタニア − ODA ハイブリッド粒子の合成と比較して多量の水を含む原料液と２次混合することで、ナノ粒子曝露が細胞に与える影響を定量的に調べるため粒子の成長を期待した。その結果、図１右下の SEM に示の前提条件として、図 2 光応答表面を利用した細胞配置・操作技術の模式図。光照射によって脱離するニトロベンジル基を備えた NPE-TCSP などのシランカップリング剤によって、表面応力センサーのシリコン表面を被覆する。これを BSA などで被覆し、細胞の吸着を阻害する表面を作製する（a）。蛍光顕微鏡を用いて、局所的に紫外光を照射することで、ニトロベンジル基を脱離させた後（b）、細胞吸着剤である Fibronectin などを被覆することで、任意の位置に細胞を配置し、さらにその成長を誘導することが可能になる（c）。
（d）
生きた細胞の配置・誘導の例− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

すようなサイズの揃った粒子を得ることができた。核形成相互作用（凝集）して、球状粒子を形成している可能性がと粒子成長の過程を分離することが、単分散粒子を得る上ある。水の量が少なければ、個々の粒子は大きく成長できできわめて重要であることは古くから指摘されているが 、るはずであり、これらのことは実験結果と一致している。

合成条件をランダムに振るなどして最適条件を探していく

アルキルアミンを用いたチタニア−アルキルアミン複合体以外、具体的な指針は得られていなかった。本手法を用い形成に関する以前の報告において、アルキルアミン中のアることで、１次混合で核を作りさえすれば、２次混合以降ミノ基と、チタニア表面の水酸基が水素結合により相互作の反応環境を工夫することにより、最終生成物のサイズを用することが指摘されており 11）、本系においても、同様の調整できる可能性が示された。

現象が起こっているものとみられる。水 /IPA モル比を調10）

次に、サイズ制御の可能性を明らかにするため、２次混節することにより、チタニア− ODA 粒子のサイズは 70 nm

合時の条件を検討した。２次混合前の段階では、未反応の～ 500 nm 程度の範囲で制御可能であることが分かった。

TTIP が存在していると考えられるため、まずは原料を完他の実験パラメータに関しても検討を進めており、予備実全に消費することに焦点を絞り、２次混合時の水 /IPA モ

験の結果、既に 10 nm 程度から 1200 nm 程度までの広い範ル比の影響を検討した。その結果、水 /IPA モル比を大き囲でサイズ制御できること見出している。今後、結果をまくしていくことにより、段階的にサイズの小さな粒子が生とめて報告する予定である。

成することが分かった（図３）。Ti ベースの収率は、いずれの場合も 90 % 以上であった。ODA を添加せずに合成し3.2

MSS の構造と基本性能た場合、不定形の凝集粒子が得られたこと、Ti ベースでMSS は、「ナノメカニカルセンサー」4 , 12 , 13）と呼ばれる計算した収率が約 50 % 程度であったことも考慮すると、タイプのセンサーの一種であり、代表的なカンチレバー型粒子の成長機構には疎水性相互作用が関係していると考えのセンサーを構造最適化することで、性能の飛躍的向上にられる。つまり、ODA はアルキル鎖を外側に向けてチタ成功したものである 4）。これは、センサーチップに埋め込ニア粒子と相互作用しており、反応系に存在する水の量がまれているピエゾ抵抗を用いた読み取り方法に基づくセン増えるほど、最表面が疎水的なチタニア− ODA は、表面サーであり、図４にその基本的構造を図示した。MSS は「カエネルギーを小さくするために周囲のチタニア− ODA とンチレバー」構造と異なり、４つのピエゾ抵抗「検出ビー

図3

溶液 C 中の水 /IPA モル比を変えて合成したチタニア − ODA 粒子の SEM 像とサイズ分布− 108 −

ナノ粒子曝露が真皮中の線維芽細胞に与える影響の定量的リアルタイム解析

ム」によって支持された「吸着メンブレン」から成り、そ・導電性液体中でも安定な動作が可能（1 ヶ月以上の安定な測定を確認済み）

れら４つのピエゾ抵抗が完全ホイートストンブリッジを構成する。吸着メンブレン上に表面応力が印加されることに・センサー内の完全ホイートストンブリッジ構成により熱ドリフトが少ない

よって生じるメンブレンの変形が、増幅された一軸性の応力としてピエゾ抵抗ビームに効率的に変換される。プロトMSS のプロトタイプ（1 G - MSS）は、１cm×１cm のシリタイプ MSS の評価実験によって、標準のピエゾ抵抗カンコンチップ上に８つのメンブレンが一次元に配列した構造チレバーの 20 倍以上の感度が得られることが明らかになを 有 す る。1 G - MSS の 最 小 検 出 可 能 表 面 応 力 は 0 . 2 ～り、光学的読み出しカンチレバーセンサーと同等の感度が0 . 3 mN/m であり、これまでに報告された細胞牽引力が２実証された。このセンサーは、本研究を遂行するにあたっ

mN/m 程度であることから 5）、さらなる感度の向上が必要て、以下のような様々な長所を有する。

であった。そのため、シリコンの特性や微細加工技術を踏・超高感度（吸着メンブレン上のサブナノメートルの変形も検出可能）まえた最適化を各構成要素に適用することで、感度向上を試みた。構造最適化を行う上で、チップサイズが大きくな・光学系が不要（細胞による屈折率変化の影響が無い）ると、測定チャンバーも大きくする必要があり、より多く・高濃度・不透明溶媒（細胞培養環境）中で測定可能の試料が必要になるだけでなく、チップ上の各メンブレン・静的な測定のため、液体によるダンピングの問題が無において、試料や培養条件の不均一化が懸念される。そのいため、チップサイズを小さく保つために、３× ３の合計９チャンネルの二次元配列 MSS（2 G - MSS）チップを作製した（図５⒜）。さらに、各 MSS チャンネルの感度を向上させるために、以下の通り、各構成要素の最適化を行った
14）。
1）検出ビームと吸着メンブレンの両方の厚みを薄く（3 . 2 µm → 2 . 5 µm）2）ピエゾ抵抗部分の保護膜を薄く（CVD SiO 2 650 nm +LPCVD Si 3 N 4 100 nm → 熱酸化 SiO 2 80 nm + LPCVD80 nm）
3）ピエゾ抵抗部のホウ素ドープを浅く（〜 500 nm →〜300 nm）
4）ピエゾ抵抗部の負の領域を排除（電流と応力の方向を

図4MSS の構造と電気配線の模式図

図 5 （a）2G-MSS チップの写真。MSS センサー素子が 3×3 の合計 9 個、二次元配列されている。下部は 0.5mm ピッチの電極であり、これを標準の 0.5 mm ピッチコネクタに差し込むことで、ワイヤーボンディングなどをすることなく、すぐに測定が開始できる。
（b）2G-MSS、1G-MSS、およびピエゾ抵抗カンチレバーからのシグナル。2G-MSS は、1G-MSS、ピエゾ抵抗カンチレバーと比べて大幅に感度が向上していることが確認できる。poly（sodium 4-styrenesulfonate）（PSS）をインクジェットにより 1µm 被覆し、100 mL/min で水蒸気を含む窒素ガスと純窒素ガスを 3 分間ずつ曝露− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014のメンブレンにのみ細胞が培養されている様子が確認でき考慮して最適化）
これらの構造最適化の効果を、有限要素解析によって確る。これにより、MSS チップに光応答表面を適用するこ認したところ、1 G - MSS チップと比較して、約 2 . 8 倍の感とによって、任意のメンブレン上にのみ細胞を配置するこ度向上が見込めることが明らかになった。これらの最適化とが可能であることが実証された。

を行った 2 G - MSS チップの感度を実験的に検証してみた

４．総ところ、1 G - MSS の約４倍のシグナルを示した（図 5 ⒝）。

括

これはピエゾ抵抗「カンチレバー」センサーと比較して、マイクロリアクタを組み込んだフロー式の合成装置を用

約 100 倍の感度であり、一般的に使用されている光（レーいて、オクタデシルアミン存在下、チタニウムテトライソザー）読み取り型のカンチレバーセンサーと比較しても、プロポキシドの加水分解・縮重合反応を行うことにより、数倍高い感度を有していることが確認された 14）。

サイズの揃った真球状のチタニア−オクタデシルアミンハ
イブリッド粒子を得た。粒子形成反応の開始に必要な水に3 . 3 光応答表面作製技術を利用したMSSチップ上への HeLa 細胞の位置選択的培養着目し、合成時の水 / イソプロピルアルコールのモル比を光応答表面修飾 MSS チップは、以下の手順で作製した。

った粒子を得られることが分かった。また、表面に生じる

まず、MSS チップ上の９つのメンブレンの表面を、末端応力変化を高感度かつリアルタイムに測定可能な膜型表面変えることにより、70 nm から 500 nm の範囲でサイズの揃に活性エステルを有する光分解性シランカップリング剤

応力センサー上に、HeLa 細胞を培養する条件を検討した。

（TMS- 2 NP-NHS）によって修飾し、アミノポリエチレン

紫外光照射により分解するシランカップリング剤を用いてグリコール（PEG、分子量 12 , 000）と反応させた。その後、表面修飾し、その上に細胞の吸着を抑制するアミノポリエいくつかのメンブレンにのみ蛍光顕微鏡を用いて紫外光をチレングリコールを反応させた後、センサー表面にのみ紫照射し、シランカップリング剤の分解に伴って PEG を除外光照射することでポリエチレングリコールを除去した。

去することにより、細胞吸着メンブレンを作製した。他のこれにより、位置選択的な細胞培養が可能であることを実

メンブレンは PEG で被覆されているため、細胞の吸着が証した。今後はセンサーによる測定と、顕微鏡による直接抑制される。ここに HeLa 細胞を播種し、24 時間培養した観察が可能な測定システムを構築することにより、ナノ粒後、正立顕微鏡を用いて観察した結果を図６に示す。特定子が細胞に与える影響に関して、詳細な検討を進めていく予定である。

図 6 光応答表面修飾 2G-MSS チップ上に成長した細胞の顕微鏡写真。（b）（d）（e）（f）は紫外光を照射し、PEG を除去した細胞吸着メンブレンであり、（a）と（c）
は、PEG 被覆されているメンブレンである。細胞吸着メンブレンにのみ細胞が吸着していることが確認できる− 110 −

ナノ粒子曝露が真皮中の線維芽細胞に与える影響の定量的リアルタイム解析

謝辞through Microfluidic Approach, Ind. Eng. Chem. Res.,MSS チップを用いた実験全般は、物質・材料研究機構

49 , 8180 - 8183 , 2010 .の吉川元起博士の協力を得て行いました。また、光応答表

８）Shiba K, Onaka K, Ogawa M, : Preparation of mono-

面を利用した位置選択的な細胞培養は、物質・材料研究機

dispersed titanium dioxide-octadecylamine hybrid

構の中西淳博士の協力を得て行いました。ご多忙中にもか

spherical particles in the submicron size range, RSC

かわらず、快くお力添え下さったお二方に、心より感謝申Adv., 2 , 1343 - 1349 , 2012 .
９）Nakanishi J, Kikuchi Y, Inoue S, Yamaguchi K,

し上げます。

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− 111 −