非線形光学現象を利用した
真皮コラーゲン分布 in vivo 可視化法の開発
大阪大学大学院基礎工学研究科

荒 木勉

Second-harmonic-generation (SHG) microscopy has been applied to observe collagen fiber structure in porcine dermis.
Collagen fiber structure in the samples is clearly visualized as high contrast SHG images using a sample-scanning SHG
microscope based on a transmission configuration equipped with a mode-locked Ti:sapphire laser. From comparison of
the SHG images between the transmission detection mode and reflection one, we have confirmed that the reflection-mode
SHG imaging is also applicable to observation of the collagen fiber structure in the porcine dermis. In order to apply theSHG measurement to human skin, we have used a mode-locked Cr:forsterite laser with a long wavelength and compared its
imaging characteristics with that of the Ti: sapphire laser-based microscope for the measurement of dermal collagen fiber.
The results indicate that the applicability of the Cr:forsterite laser-based SHG microscope for in vivo imaging of human skin.

１．緒が提案されているが、真皮コラーゲンの詳細な構造分布測

言

定ついてはほとんど報告されていない。またレーザー光の真皮は皮膚の張り・弾性・水分保有の機能に深く関与しヒト皮膚への影響についての検討も皆無である。そこで本ており、その主成分はコラーゲンである。したがって、皮研究では、はじめにブタ真皮コラーゲンの詳細な構造分布

膚の形態的及び機能的特性を決定する上でコラーゲンが重測定を行い、その結果をもとにヒト皮膚測定への応用の可要な役割を果たしているといえる。日常生活においても化能性について考察する。

粧過や過度の日照によって光老化が引きおこされるなど皮２．実

膚は様々な刺激にさらされており、これら刺激によって真験皮性状は変化すると思われる。このような真皮コラーゲン

コラーゲンの基本構造はトロポコラーゲン（コラーゲンの構造異常や構造的変化を観察することは、皮膚性状を探分子）であり、これが規則的に順次集合して階層的に太くるだけでなく皮膚疾患に関する情報を得る上でもきわめてなっていく。トロポコラーゲンは光波長オーダーで非中心重要と考えられることから、真皮コラーゲンの変化を迅速対称性構造をとり、２次の非線形光学特性を有している。にモニターするための診断技術が皮膚科学の分野で強くそのため、非常に高い瞬時ピークパワーを有するフェムト望まれている。そこで我々はこれまで生体計測ではほとん秒パルスレーザー光をコラーゲンに照射すると、非位相整ど用いられることの無かった非線形光学現象と超高速光技合型 SHG 発生過程を介して 、SHG 光が特異的に発生す術を積極的に導入することで、真皮コラーゲン分布の inる。特にコラーゲンは真皮のみに局在しているので SHGvivo 可視化を試みる。

光を用いることにより真皮コラーゲン構造の選択的計測が-15５）フェムト秒（10 秒）オーダーの超短パルスレーザー光可能になる。また、その後方散乱光を検出することで表皮を生体組織に照射すると、光電場とコラーゲン分子の非線越しに生体 SHG 光を取得し、in situ 観察が可能となる。

形相互作用によって、入射レーザー光の半波長（あるい図１に実験装置を示す。光源にはモード同期チタン・サは２倍の周波数）の光が第２高調波発生光（生体 SHG 光）

ファイアレーザー（Ti:S レーザー、中心波長 800nm、パとして発生する 。皮膚組織の場合、コラーゲンは真皮のルス幅 100fs、繰り返し周波数 80MHz）を用いた。レーザ

みに豊富に含まれ（含有量 70％）、表皮および皮下組織にービームは、ガルバノミラー（GM）とリレーレンズ光学はほとんど含まれないことに注目すると、真皮コラーゲン系（RL1, RL2）を経た後、対物レンズ（OL）でサンプルの分布情報を特異的に抽出する手段として、生体 SHG 光照射することにより生体 SHG 光（中心波長 400nm）を発が有効であると考えられる 。これまでにも、生体 SHG生させる。反射配置計測とするため、生体 SHG 光の後方光を用いた皮膚疾病診断

散乱成分を同じ対物レンズで集光し、ハーモニックセパ

１）

２）

３）

や真皮コラーゲン配向計測

４）Visualization of in vivo dermal collagenfiber distribution by non-linear opticaleffectレータ（HS, 反射波長 400nm）と青色透過フィルター（F,透過波長 =300-500nm）で抽出した後、光電子増倍管（PMT）で検出を行う。なお、基本は反射光学配置であるが、透過Tsutomu Araki型の光学配置へも随時転換できるようにしている。さらにGraduate School of Engineering Science,
Osaka University, Machikaneyama ,Toyonaka, Osaka 560-8531

自動ステージによるサンプル走査あるいはガルバノミラーによるビーム走査を用いて、SHG イメージング計測を行った。本システムの面内分解能と深さ分解能はそれぞれ− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009の変化しないステージスキャンにより切片サンプルの透過 SHG イメージングを行った。ここでは、真皮上層（乳頭層付近）、真皮中層（網状層上部）及び真皮下層（網状層下部）をそれぞれ測定した。得られた
SHG イ メ ー ジ（400µm×400µm）を図２に示す。この結果を見るとコラーゲン線維分布が高コントラストな SHG イメージとして可視化できていることが分かる。特に真皮上層部では、非常にキメの細かいコラーゲン線維が密に分布している様子が
図１ 実験装M：ミラー、ND：減光フィルター、BF：ブルーパスフィルター、HS：ハーモニックセ
パレーター、GM：ガルバノミラー、L：レンズ、RL：リレーレンズ、OL：対物レンズ、
PM：光電子増倍管分かる。これらの像を HE 染色光顕像と比較し考察した。図２⒜で表皮が真皮に落ち込んだ表皮突起部分は、表皮がコラーゲンを含有していないため、SHG 光の全く検出されない丸い領域として現われている。真皮中層部では、比較的太1.5µm と 14µm である。
サンプルには、様々な動物の中で比較的ヒト皮膚に類似いコラーゲン線維が直交方向にゆるやかに交叉した網状分した構造を有する市販ブタ皮膚（Yucatan Micropig、米布が部分的に確認できた。しかし真皮下層部では、網状の国チャールズ・リバー社）の背中部分を用いた。採取されコラーゲン線維分布は確認できなかった。また、真皮各層た皮膚組織は表皮剥離後 OCT コンパウンド（サクラファで SHG イメージを比較すると、乳頭層と網状層ではコラインテックジャパン社）で包埋された後、液体窒素で凍結ーゲン線維分布の相違が確認できたが、網状層上部と下部され保存される。このような凍結豚真皮組織ブロック（厚では明確な相違は確認できなかった。

さ 3 ㎜）を解凍しサンプルとして用いた。透過型光学系でin vivo 計測への拡張を考慮した場合、反射配置が現実

測定する場合、凍結皮膚組織ブロックをミクロトームによ的であるが、信号強度が小さくなり SN 比の劣化が懸念さって皮膚表面と平行方向に連続スライスすることにより、れる。そこで実用性を検討するため、反射配置に光学系を各皮膚深さでの切片サンプル（厚さ 16µm）を作成した。

アレンジし、豚真皮組織ブロックの深さ分解 SHG イメー

３.
3. １

ジング計測を行った。ここでは皮膚の非接触リモート計測

結果と考察という観点からドライの対物レンズを用い、入射レーザー組織切片の SHG イメージング

パワーを 30mW に固定して測定を行った。さらに in vivo

組織の詳細を知るため、はじめに空間的、時間的に焦点（a）計測を目指す点から、測定時間の短縮は必須であり、今回（b）
図２

ブタ皮膚切片試料の SHG 画像（画像サイズ： 400µm× 400µm）⒜真皮上層、⒝真皮中層、⒞真皮下層− 96 −（c）

非線形光学現象を利用した真皮コラーゲン分布 in vivo 可視化法の開発

3．2長波長レーザーによる測定深度の向上

以上実施した測定においては 800nm のレーザーを用い、400nm の青色 SHG 光を得ていた。このような青色光は生体内多重散乱を受けやすい波長帯に位置しており、散乱0µm20µm40µmによる信号減衰が測定可能深度を制限している。したが60µmって 150µm より深部の画像は極めて不明瞭であった。一般に多重散乱効果は波長の 4 乗に反比例するため、レーザー波長を長波長化することで得られる赤色 SHG 光が測定可能深度の向上に有効である。このような点を踏まえて波80µm

100µm120µm

長 800nm の Ti:S レーザーの代わりに、フェムト秒モード140µm

図３ 豚真皮ブロック試料の反射 SHG 画像（画像サイズ：100µm×100µm）

同期クロム・フォルステライトレーザー（Cr:F レーザー、中心波長 1250nm）と油浸対物レンズを用いたシステムを使用し、両レーザーの測定能を比較した。ここでは豚皮をの測定はビームスキャンモードで計測を行った。図３は各測定資料として、表面から 50µm ごとに深さ 350µm まで測定深度（20µm 毎）で得られた SHG イメージ（100µmの SHG 画像を取得した。レーザーパワーは試料面上でい×100µm）を示している。反射配置における測定 SN 比のずれも 40mW に設定した。1 画面にあたりの試料の大き低下によりイメージが若干ぼけているが、オプティカル・さは 400×400µm であり、1 画面あたりの取得時間を 10セクショニングされた SHG イメージが連続的に変化して秒にした。図４に測定結果を示す。この図からも明らかないる様子が確認できる。しかしながら、実際の応用計測をように Cr:F レーザーを使用することで 300µm まで鮮明な考慮した場合、現在の測定可能深度ではまだ十分とは言え画像が得られており、レーザーの長波長化の有効性が確認ない。

できた。

図４ 深さ方向に 20µm ステップで分解した豚真皮ブロックの反射 SHG 画像（画像サイズ ：100µm×100µm）.

− 97 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

図６ Ti:S レーザーと Cr:F レーザーによる SHG 画像の比較⑵
深さ 140µm における豚真皮ブロックの反射 SHG 画像（画像サイズ：200µm×200µm）.Ti:S レーザーによる画像（a：10 秒で取得、b：1 秒で取得）、Cr:F レーザーによる画像（c：10 秒で取得、d：1 秒で取得）

７）

3．3 ヒトを対象とする in vivo

幼魚に成長したとする報告 、150mW の光をハムスター測定への可能性の口腔部へ 3 時間照射しても細胞の壊死は観測されないとヒトに対する測定で必要なことは安全性の確保と迅速性した報告

８）などがある。我々が提唱する装置では Cr:F レである。Cr:F レーザーを用いた計測では 1 画面あたり 10ーザー照射光を 40mW に設定し、照射時間も 10 秒程度で秒を要しており、数画面の取得には 1 分程度必要となる。

あるため、測定時における被験者への光照射エネルギーは体動の影響をなくするにはさらなる時間短縮が望まれるが、上記報告例における場合に比べて格段に小さい。したがっそれに伴う SN 比の劣化が懸念される。そこで実用性を検て皮膚へのダメージは無視できると思われる。

討するため、200µm×200µm の画面を 1 秒で取得し、10４.

秒で取得したものと比較した。この結果を図５に示すが、1 秒の取得時間でも SN 比の大きな劣化はなく、実用性に問題はないことを確認した。

総括

本報告では、生体 SHG イメージングが真皮コラーゲン分布を抽出する手段として有効であることを示した。高コ

次に、Cr:F レーザー光が皮膚へ及ぼすダメージにつントラスト・高空間分解な透過型 SHG イメージをもとに、

い て 検 討 す る。Cr:F レ ー ザ ー 光 に 関 し て こ れ ま で に、真皮各層の切片サンプルにおけるコラーゲン線維の詳細な120mW の光をタマネギ切片の細胞壁に 10 分間照射しても2 次元分布が調査できた。また、反射型深さ分解 SHG イ細胞壁の破壊は認められなかったとする報告 、100mWメージングによってコラーゲン線維分布のオプティカル・の光をゼブラフィッシュの胚へ 12 時間照射しても正常なセクショニング像が得られ、本法が 3 次元的コラーゲン構６）− 98 −

非線形光学現象を利用した真皮コラーゲン分布 in vivo 可視化法の開発

造の in vivo 計測に有効な手法であることを確認した。こof collagen orientation in human dermis by two-のような計測手法を利用することにより基礎研究だけでなdimensional second-harmonic-generation polarimetry, J.

く、臨床応用にも耐えうる真皮コラーゲン診断法が可能とBiomed. Opt., 9, 259-264, 2004.
５）B. M. Kim, J. Eichler, and L. B. Da Silva: Frequency

なり、様々な皮膚科学分野への応用が期待できる。

doubling of ultrashort laser pulses in biological tissues,

謝辞Appl. Opt., 38, 7145-7150, 1999.

本研究に対して助成を賜ったコスメトロジー研究振興財

６）I.-H. Chen, S.-W. Chu, C.-K. Sun, P.-C. Cheng, and B.-L.
Lin: Wavelength dependent damage in biological multi-団に深く感謝いたします。

photon confocal microscopy: a micro-spectroscopic（参考文献）

comparison between femtosecond Ti:sapphire and１）S. Roth and I. Freund: Optical second-harmonic

Cr:forsterite laser sources, Opt. Quantum. Electron, 34,

scattering in rat-tail tendon, Biopolymers 20,1271-1290,1251-1266, 2002.
７）S.-W. Chu, S.-Y. Chen, T.-H. Tsai, T.-M. Liu, C.-Y. Lin,

1981.
２）伊藤誠啓，安井武史，荒木勉，山下豊信，國澤直美，

H.-J. Tsai, and C.-K. Sun, In vivo developmental biology

高橋元次：SHG（第２高調波発生光）顕微鏡を用いた真study using noninvasive multi-harmonic generation
microscopy, Opt. Express, 11, 3093-3099, 2003.

皮コラーゲン線維分布の観察、光学、１ 35-40, 2007.
３）
K. König and I. Riemann: High-resolution multiphoton

８）S.-P. Tai, W.-J. Lee, D.-B. Shieh, P.-C. Wu, H.-Y. Huang,tomography of human skin with subcellular spatial

C.-H. Yu, and C.-K. Sun: In vivo optical biopsy ofresolution and picosecond time resolution, J. Biomed.

hamster oral cavity with epi-third-harmonic-generation

Opt., 8, 432-439, 2003.

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４）T. Yasui, Y. Tohno, and T. Araki: Characterization− 99 −