転移因子を用いたアントンアニン色素生合成遺伝子とその発現調節因子遺伝子の解析
東京理科大学基礎工学部

飯田滋

Although transposable controlling elements are believed to exist in virtually everyorganism, they have been isolated from only a few plants and have been characterized at
genetic and molecular level in only two plants, maize (Zea mays) and snapdragon(Antirrhinum majus). Their ability to transpose, affect gene expression and promote
DNA rearrangements causes genetic instability. We have identified and isolated a newtransposable controlling element, Tpnl (Transposon Pharbitis nil one), from a line ofJapanese morning glory (Pharbitis nil) bearing variegated flowers. The 6.4 kb trans­posable element was inserted in the gene for dehydroflavonol-4-reductase (DFR), oneof the genes involving anthocyanin pigment biosynthesis. Its terminal inverted repeats
and the number of target duplications indicate that it belongs to the family of the maizetransposable element Suppressor-mutator/Enhancer (SpmlEn). Cosegregation dataof the variegated flower phenotype and the DFR gene carrying Tpnl indicate that themutable phenotype is due to excision of Tpnl from the DFR gene. Sequences homolo­gous to Tpnl are present in multiple copies in the genome of Japanese morning glory.

現するアントシアニン色素生合成系遺伝子などの1. 緒 言発現を調節して絞り模様（キメラ斑）を生じさせる因子として見い出され、その後、種々の生物種

キメラとは本来、頭が獅子、胴が山羊、尾が龍のゲノム上に散在されていることが明らかにされの ギリシャ神話の怪獣で、生物学上は複数の遺伝た。 トランスポゾンによる花の絞り模様形成に関的に異なる細胞群よりなる個体のことである。 植する分子遺伝学的研究はそのほとんどがキンギョ

物キメラは種々の原因により生ずるが、トランスソウで行われているだけである。 我々は平賀源内

ポゾンの転移に伴う体細胞変異によっても生じる。

が記述した絞りアサガオのアントシアニン色素生

一

トランスポゾンとは染色体上を転移し得る 定の合成系遺伝子中より 6.4kb のトランスポゾン Tpn

塩基配列をもつ遺伝的因子で、挿入・転移・脱離I を単離し、この Tpnl が花弁の器官形成時に転• 欠失など種々の DNA 再編成を引き起こし、 ま移することが絞り模様の形成に直接関与しているた遺伝子発現の調節に様々な影響を与え、遺伝的ことを明らかにしたので I . 2) 、その結果をここ不安定性の一因となっている因子でもある。 トラで述べる。

ンスポゾンの存在は最初トウモロコシの穀粒で発Molecular analysis of a tran_sposable control­ling element affecting ex ·essionof a gene for anthocyanin biosy­
thesis.
Shigeru Iida
Department of Biological Scienceand Technology,
Science University of Tokyo2. 実 禁絞り花アサガオ a ー炉の系統として“時雨絞り" KK/SSB-3 と KK/SSB-、4 を、野生型“全”色花 アサガオとして KK/ZSh.-2 を用いた。
植物ゲノム Dl\JA は CTAB法制限酵素による解笈-119-3)により分離し、DNA 断片の入ファ ー ジベ

より古典遺伝学的解析が行われている 9 . 10) 。 すクタ ー およびプラスミドベクタ ー ヘのクロ ー ン化、DNA塩基配列の決定などは既存の方法 4 , 5 lに準なわち、アントシアニン色素生合成に関与する遺じて行った。 また、 DNAプロプとして用いた

伝子のA-3に変異が起こったために、花弁細胞

アントシアニン色素生合成系の遺伝子は1.5kbの中で色素が生成されなくなり白色となるはずが、ー

6)

ペチュニアDFR-A遺伝子のcDNA 、 1.3kb

花弁形成時に体細胞復帰変異を起して、色素が生のキンギョソウのCandi遺伝子cDNA1) および合成されるようになり、花弁の一群の細胞が有色2.2kbのトウモロコシBzl遺伝子のゲノミックとなったことが白色地に有色の絞り模様の形成機)

DNA断片 8 である。

構である。 白色の細胞群と有色の細胞群は体細胞変異により遺伝的に異なるので、このような絞り3. 結

果模様はキメラ斑とも呼ばれる。 花弁形成の早い時期に変異により白色から有色となった細胞はより

図1の白色地に有色の絞り模様のアサガオは、遺伝学的には“雀斑（そばかす/flecked)"、 園“”“

多く細胞分裂するので有色の細胞群の数も多くなり、 当然有色セクタ ー も大きくなる。 それ故、絞染り花の有色のセクタ ー の大きさは体細胞変異の時”

め分け と呼ばれる系統で、平賀源内の『物類品期を、 またセクタ ー の数は体細胞変異の頻度を表隙』(1762)の牽牛子・和名アサガホの項の黒す。

芸上は絞り模様により時雨絞り

もしくは“時雨絞り”のように小さな有色スポットが白江南花•和名シボリアサガホに記載されている

たくさんある絞り花は花弁形成の後期に高頻度でアサガオと同じ系統と考えられている。 この雀斑

変異が起こり、系統のアサガオに関しては、1930年代に今井になセクタ ー のある花は低頻度の変異が早い時期に“”染め分け のような小数の大き起こったためと考えられる。
この体細胞変異の起こる茎頂や花茎頂の分裂組織はアサガオなど双子葉植物の場合は、LI·L
II·Lillの3層に分けられる 11) 。 花の中にはLI由来の表皮細胞でのみ色素発現が見られるものも多いが、アサガオの場合はLI·LII·L皿由
来のいずれの細胞においてもアントシアニン色素が生合成される。 そこで今井は雀斑アサガオを用いて表皮下のLII由来細胞が変異により有色となった花を自殖すると3対lの割合で有色花と絞り花の次世代アサガオが生ずることなどから生殖細胞はL II由来であることを明らかにした 10) 。
なお、アントシアニン色素の発現による絞り模様
F ig.1

Pigmentation Phenotypes of Pharbitis
Lines.
(A), FullypigmentedlineKK/ZSK-2.
(B) , (E) and (F)、Variegated line
KK/SSB-3.
(C) and (D) , Variegated line KK/
SSB-4.
(G) and (H) , Germinal revertantderived from KK/SSB-3.

-120-は雀斑系統のアサガオでは花ばかりでなく、葉や茎でも観察され（図1)、アサガオの場合、 茎の色素発現はLII由来の細胞でのみ起こることも知られている。 この雀斑の絞り模様を司るアントシアニン色素生合成系の易変性(mutable)遺伝子a — 炉は連鎖地図の第V染色体上にマップされている。 この易変性遺伝子a ー別は野生型（有色転移因子を用いたアントシアニン色素生合成遺伝子とその発現調節因子遺伝子の解析花）の遺伝子A-3に対し、劣性で、しかもa-3 1としてサザン法により検討した（図3)。 その結からA-3になった生殖細胞復帰変異体が2-5%果、絞り花アサガオDFR遺伝子領域中には6.4位の頻度で得られることも知られている

9kbのDNA配列が挿入されていることが明らか, IO l 0

図lのような白色地に有色のキメラ斑は図2にとなった。 このDFR遺伝子傾域を、全色花と絞示したアントシアニン色素生合成経路のアントシり花アサガオの各ゲノムよりクロ ー ニングして、アニジン ー3ー グルコシドまでの段階の生合成に関

そのDNA配列の挿入領域の構造解析を行ったと与する遺伝子か、もしくは、その転写調節因子遺伝子が易変性になっている場合が多い I 2 l。 そこ

ころ、絞り花アサガオDFRの第3エクソンの約でこの絞り花の白色地部分の色素分析をしたとこ挿入されていた。 その末端繰り返し配列やDFRろ、フラボノー

ルが検出できたのでフラボノーlObp上流のイントロン内に6.4kbのDNA配列がル遺伝子内の挿入部位で認められた3bpの標的重複の段階までは生合成されていると考えられた。 すなどの構造上の特徴から、トウモロコシ Spml

なわち、 図2のCHS、CHI、およびF3H遺伝子

A37 873 8llw
�

↓(kb)

(kb)

—Flavone

�18.6
�12.2
�8.9

�Flavonolv>

Dihydroflavonol[>↓ FJHv>

Flavanone[>N-Chalcone

↓ CHI

Bglll

BamHItA

↓ CHS

DFR｀

3 Malonyl-CoA + p-Coumaroyl-CoA

DFR

Leucoanthocyanidin(Candi)↓↓

Anthocyanidin↓ UFGT(Bzl)

Anthocyanin

BCandiやこれらの発現を制御する転写調節因子遺伝子は

EcoRY

UFGT
Oral

゜

A Simplified Pathway for Anthocyanin
Biosynthesis.

Fig.2

N

正常であって絞り模様の形成には関与していない?;>'St>27』に、 図lの絞り花と野生型有色花アサガオより

�t ••により易変性となっているか否かを検討するため

.
9,

心｀

UFGTの遺伝子が未知のトランスポゾンの挿入(kb)＇・ぶ，”ン｀と思われ る。 そ こ でそ の先のDFR 、 AS 、<">

N?;

r--.

>

マ>

(kb)

•15.0

各々ゲノムDNAを抽出し、各遺伝了つ構造を、既に単離されているペチュニアDFR-A遵伝子
cDNA、キンギョソウのAS遺伝子であるCandi

F ig.3遺伝子のcDNA、およびトウモロコシのUFGT遺伝子であるBzl遺伝子のコー ド領域をプロ ー プ-121-

DNA Gel Blot Analysis of the Pharbit1s
DFR Region inA-3anda-3'Lines.
V4 indicates the variegated line KK/SSB-4; V3, the variegated line KK/SSB-3;
W2, the wiId type KK/ZSK-2.

( +＋）

uooこl+)
Hoou9A＞ここ ）竺 DO）

Tpnl (Transposon Pharbitis nil One) と命
2l
名したI, 0
この新たに単離された転移因子Tpnlについて、I+ )＋I J )[り最初に分離されたトランスポゾンということで(J14> 類縁の新しいトランスポゾンであることが明らかとなったので、アサガオ(P. nil)よ(J1 a.

( ＋En

(kb)

その構造と機能の解析を行うために全塩基配列のには28bpの逆繰り返し配列を、また、両末端近傍領域の各々0.8kbお よび1.0kbにわたり、Spm/En類縁因子に見られる、転移酵素 の結合部位と考えられる構造を有していた。 これは今まFig.5で知られているSpm/Enファミリ ー のトランスポゾンの中で最も複雑な構造であった。
アサガオゲノム中にはペチュニアのDFR遺伝子 6) と相同性のあるDFR-A,B, Cの3種類の遺伝子が存在する（図 4)。 そこで、 Tpnlの挿入しニTpn/--.

•→DFR・AFig.4

DFR B... -·......
DFR・C

The Structures of the DFR Region in thePharbitis A-3 and a-3 1 Lines.

37 873 811<< <決定を行った。 この Tpnlは6412bpで、両末端

DNA Gel Blot Analysis of theDFR Genein the a-3 1 Lines and their Germinal
Reverta n ts.
Genomic DNAs were cleaved with Bgl II
and hybridized with the petunia DFR
cDNA probe. W (+/+) indicates thewild type line ( homozygous); V (f/f), the variegated I ine (homozygous) ;GR (+/f), a germina I revertant (het­erozygous) ; OGR (fl f), a variegatedoffspring (homozygous) of a germinal
revertant; OGR (+/f), a solidly colored
offspring (heterozygous) of a germina I
revertant ; OGR (+/+), a solidly col­ored offspring (homozygous) of a ger­minal revertant.ていて発現され ないが、花弁形成中にTpnlがていたDFR-B遺伝子が絞り模様を形成させる

DFR遺伝子より転移・脱離する体細胞変異に易変性遺伝子のa-3 1 の本体であり、 その野生型

よって、 DFR遺伝子が再活性化されることが絞であるA-3遺伝子が花弁や葉、 茎な どの色素生り花（キメラ斑）形成の分子機構であることが明合成に関与するDFR遺伝子であるか否かを検討らかとなった。 なお、 Tpnlの挿入によるDFRするために、a —炉の生殖細胞復帰変異体を得て-B遺伝子不活性化の 分子機構と して は、Tpnl

さらにその自殖後代における有色花と絞り花アサ内のタ ー ミネ ー タ ー により転写が終結することやガオのDFR-B遺伝子内にTpnlが挿入されていスプライシングが正常に起こらないことなどが考るか否かをサザン法により検討した。 その結果、えられる。 また、この花弁などで機能しているア

有色花アサガオは全て2対のDFR-B遺伝子のうサガオDFR-B遺伝子は6つ のエキソンと5つのち少なくとも一方はTpnlが転移・脱離していたが、全ての絞り花アサガオの2対のDFR-B遺伝イントロンから構成されていることも明らかとなった。

子はともにTpnlの挿入されたホモの状態であっ

なお、 アサガオゲノム上にはTpnlに相同性のた（図5)。 それ故、 Tpnlの挿入されたDFR­配列が多コビ ー 存在する。 図6から明らかなようB遺伝子が易変性遺伝子a-3 1 の本体であり、に、 野生型の全色花アサガオに比べて雀斑系統のTpnlの挿入したDFR-B遺伝子は不活性化され絞り花アサガオゲノム中にはTpnl類縁の配列が-122-

転移因子を用いたアントシアニン色紫生合成遺伝子とその発現調節因子遺伝子の解析

N3<",＞ぐヽi..,r＞(kb)r'"',3,＞cDNAとなって転移するレトロトランスポゾン

寸＞が存在する。 これらのうち、主に前者が転移に伴うDNA再編成などによって植物遺伝子の発現を調節し、キメラ斑を形成させることが知られてい23る。 高等植物のトランスポゾンによる遺伝子発現

9.46.6の調節機構の分子遺伝学的解析は、そのはとんどかトウモロコシとキンギョソウで行われており、4.4

DNA型トランスポゾンにより調節される遺伝子としてアントシアニン色素生合成系遺伝子群がよ2.3

く研究されている。 事実、図2のアントシアニン

2.0

色素生合成系遺伝子やその転写調節因子遺伝子の中にはトランスポゾンを用いた遺伝子タッギング法により同定・単離されたものも多い。 トランス
ポゾンの中で転移に必要な活性な転移酵素の遺伝子を持ち自ら転移できる因子を自律性因子、内部のみ転移できる因子を非自律性因子という。 我々は平賀源内が記述した絞りアサガオのアントシア

Probe B

Probe A
Fig.6

自律性因子より活性な転移酵素が供給されたとき

コ

ビnl

尼三］欠失変異体などで転移酵素遺伝子に欠損があり、Probe B

Probe Aニ ン 色 素 生 合 成 系 の DFR-B 遺 伝 子 中 よ り 、Presence of Tpn!-related Elements 1nthePharbitis Genome
The genomic DNAs were cleaved with
Bgl II and hybridized with the probes Aor Bas indicated. V4 indicates the var1e­
gated line KK/SSB-4; V3、the variegat­
ed line KK/SSB-3 ; W2, the wild type
KK/ZSK-2.

Spm/En類縁の6.4kbのトランスポゾンTpnlを単離し、このTpnlが花弁の器官形成時に転移することか絞り模様の形成に直接関与していることを明らかにした。 このTpnlは6412bpであって、その構造上の特徴から考えて、自律性因子であるよりも自律性因子の内部欠損型の非自律性因子でより多く存在する。

ある可能性が高い。 もしもそうであるならば、アまた、他の植物のトランスポゾンの場合と同様サガオゲノム中に存在する自律性因子の作用によに、各々のアサガオゲノム中にはTpnlの末端領り、TpnlはDFR-B遺伝子より転移・脱離する域に相同性のある配列の方が内部領域の配列よりと考えられる。

もよりコビ ー 数が多いことも明らかとなった。

高等植物のトランスポゾンは転移因子としての側面から転移に伴う遺伝的組換え機構の解明や調4. 考 察節因子として植物遺伝子の発現調節機構の解明に貢献してきたのみならず、トランスポゾンタッギ

トランスポゾンは遺伝子 発現を制御する調節ングによる有用遺伝子の単離やトランスポゾンベ

因 子として最初にト ウモロコシで見い出されクタ ー による有用遺伝子の導入、さらには遺伝子た I 3. I 4) 。 高等植物ゲノムには脱離と再挿入に発現制御のための生物学的スイッチなど植物バイより転移するDNA型トランスポゾンと、転移中オテクノロジ ー にも利用され始めた。 ここに述べ

間体と し て 生じたRNAか逆転写 酵 素 に よ りたアサガオのトランスポゾンTpnlやその類縁因-123-

子の解析 も遺伝子発現機構の解析のみならず、 植6) Beld, M., Martin, C., Huits, H., Stuitje, A.R.

物バイオテクノロジ ー にも貢献できる可能性もあand Gerats, A.G.M. C 1989) . Flavonoid syn­ろう 。 事実、 アサガオには 20 種以上の花色、 葉

thesis in Petunia hybrida : partial characteri­

色、 さらには花や葉の形態に関して、 トランスポ

zation of dihydroflavonol-4-reductase genes.

ゾ ンが関与すると考えられる易変性 (muta­

Plant Mo!. Biol., 13, 491-502.

ble) 変異体が知られている。

これらの中には

7) Martin, C., Prescott, A., Mackay, S. Bartlett,Tpnl 類縁因子の関与するものもあると思われ、J. and Vrijlandt, E. (1991) . Control of an­

トランスポゾンタッギングにより未知の有用遺伝

thocyanin biosynthesis in flowers of Antir­

子をアサガオから単離することもできそうである。

rhinum majus. Plant J., 1, 37-49.
8) Fedoroff, N.V., Frutek, D.B. and Nelson, 0.

文献E. (1984) . Cloning of the bronze locus in the1) 飯田滋 (1994). 絞り花アサガオから分離された
トランスポゾンによる遺伝子発現の調節 ，ファルmaize by a simple and generalizable proce­duce using the transposable controlling ele­ment Activator (Ac) . Proc. Natl. Acad.

マシア30, 481-455.
2 ) Inagaki, Y., Hisatomi, Y., Suzuki, T., Kasa­
hara, K. and Iida, S. (1994) . Isolation of an
Suppressor-mutator /Enhancer-liketrans­

Sci. USA, 81, 3825-3829.
9) Imai, Y. (1931) . Analysis of flower colour m
Pharbitis nil. J. Genet., 24, 203-224.

posable element, Tpnl, from Japanese morn­10) Imai, Y. (1934) . On the mutable genes ofing glory bearing variegated flowers. Plant

Pharbitis, with special reference to their bear­

Cell, 6, 375-383.

mg on the mechanism of bud-variation. J.

3 ) Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980) .
Rapid isolation of high molecular weightplant DNA. Nucleic Acids Res., 8, 4321-4325.

Coll. Agric. Imp. Univ. Tokyo, 12, 479-523.
11) Tilney-Bassett, R. A. E. ( 1986 ) . Plant
chimeras (London : Edward Arnold)4 ) Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.

12) Dooner, H.K., Robbins, T.P. and Jorgensen,(1989) . Molecular Cloning : A Laboratory

R.A. ( 1991 ) . Genetic and developmental

Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor, New

control of anthocyanin biosynthesis. Annu.

York:

Cold Spring Harbor

Laboratory

Rev. Genet., 25, 173-199.
13) Fedoroff, N. V. (1989) . Maize TransposablePress) .
5) Shimamoto, K., Miyazaki, C., Hashimoto,

Elements. In Mobile DNA, D.E. Berg and M.

H., Izawa, T., ltoh, K., Terada, R., Inagaki,

M. Howe, eds (Washington, DC: American

Y. and Iida, S. (1993) . Trans-activation

Society for Microbiology) , pp. 375-411.

and stable integration of the maize transpos­

14) Gierl, A. and Saedler, H. C 1992) . Plant­

able·element Ds cotransfected with the Ac

transposable elements and gene tagging.

transposase gene in transgenic rice plants.

Plant Mo!. Biol., 19, 39-49.

Mol. Gen. Genet., 239, 354-360.

-124-