紫外線曝露による皮膚老化・発癌においてミトコンドリア関連分子が果たす役割を解明する
北海道大学大学院医学研究院皮膚科学教室

柳輝希

Mitochondria exerts a central function in various cellular responses, and repeats fusion and division to change theirmorphology. In recent years, a group of GTP hydrolases involved with fusion and division of mitochondria has been
identified. Mitofusin (Mfn) 1 , Mfn 2 , and OPA 1 are involved in the process of fusion, and DRP 1 (Dynamin Related
Protein 1 ) is involved in the division process. Although it has been reported that DRP 1 is essential for maintaining the cell
division of malignant tumors such as malignant melanoma, the molecular function in ultraviolet-related carcinogenesisof keratinocytes is unknown. Herein we conducted experiments using clinical specimens and cultured cells to analyze
the function of DRP 1 in skin aging, UV-related skin disorders and cutaneous squamous cell carcinoma (SCC). We
investigated cell proliferation, cell cycle, mitochondrial morphology, and MAPK signaling pathway using cutaneous SCC
A 431 and DJM 1 cells that were transfected with shRNA vectors targeting Drp 1 . The Drp 1 gene-knockdown SCC cells
showed lower cell proliferation than scramble control cells, as assessed by direct cell counting and clonogenic assays.
DNA content analysis showed Drp 1 knockdown to cause G 2 /M arrest. Morphologically, the depletion of Drp 1 resulted
in an elongated,hyper-fused mitochondrial network. The MEK inhibitor PD 325901 suppressed cell proliferation, as
well as inhibiting the phosphorylation of ERK 1 / 2 and Drp 1 (Ser 616 ). Also, PD 325901 caused the dysregulation of themitochondrial network. In tumor xenografts of DJM 1 cells, the knockdown of Drp 1 suppressed tumor growth in vivo, andclinically, the expression levels of Drp 1 were higher in cutaneous SCCs than in normal epidermis, and correlated positively
with the advanced clinical stages. Our findings suggest that the mitochondrial division-related molecule “DRP 1 ” may
become a new biomarker in cutaneous SCC as well as a novel therapeutic target.

1. 緒

言

ミトコンドリアは、酸素呼吸により細胞内のエネルギーをつくりだすオルガネラであり、さまざまな細胞応答において中心的な機能を発揮している。またミトコンドリアは活発に融合と分裂を繰り返し、その形態を変化させている。近年、ミトコンドリアの融合と分裂に機能する GTP
加水分解酵素群が同定された。融合には Mitofusin（Mfn）
1、Mfn 2、OPA 1、 分 裂 に は DRP 1（Dynamin Related

図 1 ミトコンドリアは融合と分裂を繰り返している。DRP1 は分裂を制御する。

Protein 1）
が関与する（図 1）1）。また、DRP 1 が悪性黒色腫などの悪性腫瘍の細胞分裂維持に必須であることが報告された 2）。しかしながら、紫外線発癌や紫外線老化におけるこれらの分子の機能は不明である。本研究では、紫外線発

紫外線、慢性的な炎症、機械的刺激、ウイルス、放射線な癌および皮膚老化（特に紫外線による光老化・皮膚障害）にどが関与する。なかでも、紫外線の関与は大きく、本邦でおけるミトコンドリア分裂関連分子 DRP 1 の機能についも SCC の 6 割が日光露光部に発生し、ますます SCC の発て、各種実験を行った。

生数が増加することが予想されている。SCC は、日光角高齢化のすすむ現代、皮膚癌の頻度は増加の一途をた化症、Bowen 病、熱傷瘢痕、慢性膿皮症などの先行病変どっている。有棘細胞癌（Squamous cell carcinoma、以下の上に発生し、はじめのうちは小丘疹～結節として生じる

SCC と略す）は表皮由来の皮膚癌の一種であり、その発生が、増大すると腫瘤や難治性の潰瘍などを形成するように率は高齢化とともに近年増加している。SCC の発生にはなる。さらに巨大になると、しばしばカリフラワー状と形容され、表面が乳頭状の腫瘤性病変を呈する。また、角質や痂皮、あるいは壊死組織などを付着し、細菌の二次感染

Functions for mitochondrial moleculesin skin aging and tumorigenesisを来たして、悪臭を伴うものも多く、患者の QOL（Quality

Teruki Yanagi

表皮と連続した異型細胞が、個細胞角化や細胞の配列の乱Department of Dermatology, Faculty of
Med ici ne a nd Graduate s cho ol of
medicine, Hokkaido Universityof Life）を大幅に損ねることも多い。病理組織学的には、れ、核異型・細胞分裂・癌真珠などを形成しながら増殖する。未分化になるほど、角化傾向が少なくなり、浸潤・増− 161 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

殖能も強く、一般的には予後が悪くなる。SCC は、低悪

24 時間インキュベートして準備した。24 時間後に蛍光顕性度のうちは、外科的切除で根治が期待できるが、転移を微鏡で green fluorescent protein（以下 GFP と略す）がど伴うような進行例になると、化学療法にしばしば抵抗性をのくらいの割合で入っているかを視認し、トランスフェクシ

示し、治療に難渋することも少なくない。リンパ節転移を

ョン効率を確認した。また、A431、DJM1 細胞を 6cmディッ認める症例においては、リンパ節郭清を根治的に行うこシュに 30 ％コンフルエントになるように播種しておき、24ともあり、外科的切除以外には放射線療法や化学療法など

時間 37 ℃でインキュベートした。293FT細胞から得られたの集学的治療が行われる。近年では、Epidermal growth

ウイルス上清は、45µmフィルタを通して回収した。播種しfactor receptor 阻害剤や種々の免疫チェックポイント阻害ておいた A 431、DJM 1 細胞にウイルス上清を 1 mL ずつ薬を用いた治験などが試みられている。しかしながら、進添加し、puromycin（最終濃度 1 µg/mL）を培地に加えて行期の SCC においては、治療の選択肢は未だ限定的であり、培養し、ウイルス産生細胞株を樹立した。以後、培養液にさらなる治療の研究開発が望まれている。

は puromycin を添加してセレクションをかけて培養した。

2. 方

法

2 . 1. 皮膚有棘細胞癌腫瘍部におけるDRP1 の発現解析（免疫染色）2 . 3 . DRP1ノックダウン時の、ミトコンドリア形態の観察
MitotrackerRedFM（Invitrogen）と BZ‒ 9000（キーエ北海道大学皮膚科にて治療歴のある皮膚有棘細胞癌 30

ンス社）にて、ミトコンドリア形態の観察を行った。ミト

例について、抗 DRP 1 抗体（BD 611133）を用いて、免疫コンドリアの形態は Mito Tracker Red（ThermoFisher）

染色を行った。ホルマリン（Wako）固定パラフィン切片をを用いて、蛍光染色を行い観察した。観察細胞を PBS で

4 µm の厚さで切り出して、免疫染色を施行した。同一観

十分に洗浄した後、Mito Tracker Red を 1 µL 添加し、37

察者（筆者）によりスコアリングは行い、別視野で少なく℃ で 30 分 静 置 し た。 そ の 後、Phenol red の 入 っ て い な

とも 3 回それぞれ 100 個の細胞をランダムに選択して評価

い DMEM（Life Technology）を添加した。観察顕微鏡にした。免疫染色スコアは、proportional score（免疫強度；

は、BIOREVO BZ‒ 9000（KEYENCE） お よ び Fluoview

0 なし，1 0 ‒ 25 %，2 25 ‒ 50 ％，3 50 ‒ 75 %，4 > 75 %）、FV 10 i（Olympus）を使用した。ミトコンドリアの形態は、

intensity score（染色強度；0 なし，1 弱陽性，2 中等度陽性，

ミトコンドリア 1 つあたりの面積で評価した。ミトコン

3 強陽性）の 2 つのパラメータの和で算出した。

ドリアの面積は、画像解析ソフト Image J（developed byWayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda,

2 . 2 . RNA干渉を用いた DRP1ノックダウンによる
皮膚有棘細胞癌株の表現型観察

MD; available at http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html）を用いて導出し、定量化した。

ヒト有棘細胞癌株 A 431 細胞、DJM 1 細胞、シグマ社
pLKO‒shRNA システムを用いてノックダウン実験を実施

2 . 4 . DRP1 活性化機構の解明した。継続的な Drp 1 のノックダウンには、レンチウイル

MEK 阻害剤（PD 325901）を 0 , 0 . 5 , 1 , 5 , 10 , 50 µM のスを用いた short‒hairpin RNA（以下 shRNA と略す）を

濃 度 で 添 加 し、RIPA Buffer に て 細 胞 内 タ ン パ ク を 抽使用した。細胞のセレクションは puromycin により行っ

出し、SDS‒PAGE・免疫ブロット法を実施した。Drp 1、た。20 ％コンフルエントになるようにあらかじめ 293 FT

MEK 阻害剤として Mdivi‒ 1（Santa Cruz Biotechnology）

細胞（Invitrogen, R 700 ‒ 07）を播種しておき、24 時間 37

お よ び N‒difluoro‒ 2 ‒benzamede（ 以 下 PD 325901 と 表℃ で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後、20 µmol の shRNA vector

記，Cayman Chemical）を使用した。Mdivi‒ 1 は分子量が（pLKO‒ 4 2 3 , 4 2 6 , 1 0 9 7 , scrambled–puromycin, 1 µg/

353 . 22 であり、まず 5 mg を DMSO 1 . 416 mL に溶かして

mL）3 µL と DNAmix（pLP 1 , pLP 2 , pVSVG,

各 1 µg/

10 mM の濃度になるように調整した。本剤を使用していmL）9 µL をそれぞれ 1 mL の Opti–MEM で溶解し、さらる論文では、10 ‒ 50 µM の濃度で投与しているため、さらに Polyethylenimine（以下 PEI と略す）15 µL を加えてよに希釈して各濃度の Mdivi‒ 1 を調整した。また PD 325901

く混合し、室温で 15 分静置した。この混合液を、準備しは分子量が 482 . 2 であり、5 mg を DMSO 1 . 037 mL に溶かた 293 FT 細胞に添加し、24 時間 37 ℃でインキュベート

して 10mMの濃度になるよう調整した。本剤は 10 ‒ 100 µM

した。トランスフェクション効率を確認するため、コンで使用されており、これを希釈して各濃度の調整を行っトロールとして enhanced green fluorescent protein（以た。阻害剤の添加については、40 ‒ 50 % コンフルエントに

下 EGFP と略す）で標識したプラスミドの pcDNA 3 ‒EGFP

なるように対象細胞を 10 cm または 6 cm シャーレに播種（1 µg/mL）3 µL と、PEI 15 µL を 1 mL の Opti‒MEM に混しておき、対象濃度の 1000 倍に調整した Mdivi‒ 1 および合し、室温で 15 分静置した混合液を 293 FT 細胞に添加し、PD 325901 を 10 cm シャーレでは 10 µL、6 cm シャーレで− 162 −

紫外線曝露による皮膚老化・発癌においてミトコンドリア関連分子が果たす役割を解明する

は 5 µL それぞれ添加した。コントロール群では DMSO を

2 . 9. ウエスタンブロット

投与した（最終 DMSO 濃度が 0 . 1 % になるように調整）。

2 . 9 . 1. ライセートの回収
Lysed buffer に は、RIPA buffer（50 mM Tris pH 7 . 5 ,2 . 5 . DRP1 阻害剤による皮膚有棘細胞癌治療

1 5 0 mM NaCl, NP 4 0 1 %, sodium deoxycholate 0 . 5 %,DRP 1 阻害剤（Midivi‒ 1 , Santa Cruz）を使用して有棘細胞癌株への治療実験を実施した。

SDS 0 . 1 %, NaF, final concentration 1 nM, NaV 3 O 4 , final
concentration 10 µM，Roche）を使用した。対象細胞を PBS
で 2 回洗浄した後、RIPA buffer を添加し、氷上で 30 分静2 . 6 . ATP 活性測定法を用いたCell viability assay

置した。次に、セルスクレーパーを用いて各ウェルの表面対象となる細胞の細胞数を Cell counter（TC 10 TM，を擦過し、融解液をすべて 2 mL のエッペンチューブに回Bio‒Rad）で測定した後、96 ウェルプレートに 5000 ‒ 10000

収した。4 ℃、15000 rpm で 20 分遠心した後、上清を回収

個／ 100 µL・ウェルになるように細胞を播種した。このして別のエッペンチューブに移し、NuPAGE LDS Sample

とき、熱による物理的刺激を避けるため、播種したウェ

Buffer（lithium dodecyl sulfate, pH 8 . 4 , Invitrogen）、

ルの外側のウェルにも PBS を 100 µL ずつ分注・静置し

NuPAGE Sample Reducing Agent（500 mM dithiothreitol

た。48 時間 37 ℃でインキュベートした後、Cell titer glo

at a ready‒to‒use 10 x concentration, Invitrogen）を加え

solution を各ウェルに 100 µL ずつ加えてピペッティング

混和し、ライセートを回収した。

でよく混濁し、室温で遮光しながらさらに 15 分インキュ2 . 9 . 2 . 電気泳動、転写、ブロッキングベートした。各ウェルの混合液を観察用の white 96 well

回収したライセートは、70 ℃で 10 分間ボイルしてヒート

plate に そ れ ぞ れ 移 し 換 え た 後、 吸 光 度 を Spectra Max

ブレイクした後、マーカーとともに SDS‒PAGE 5 ‒ 10 % Gel

Paradigm（Molecular Devices）
を用いてそれぞれ測定した。 （Invitrogen）にセットした。バッファーには MOPS SDS
Running Buffer（# 1908733，Life Technology） を 使 用

2 . 7. 細胞増殖アッセイ

し、電気泳動を行った。その後、iBLOT 2（Invitrogen）
5

細胞を 6 cmディッシュに 1 . 0×10 個ずつ播種し、37 ℃でイ

で polivinylidene difluoride membranes（Invitrogen）

ンキュベートした。1、3、5、7 日後にPBS で洗浄し、750 µLに転写した。転写したメンブレンは、5 % スキムミルクの 0 . 25 % Trypsin‒EDTA（Thermo Fisher Scientific）を（Wako）溶解 1 xTBS‒T（20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0 . 1 %それぞれ加えて、6 分間 37 ℃で静置して細胞をディッシ

Tween 20）に浸し、室温で揺らしながら 60 分間ブロッキ

ュから剥がし、細胞の計測を行った。

ングを行った。

Dead cell ratio の測定においては、死細胞を含む上清2 . 9 . 3 . 1 次抗体、2 次抗体による酵素抗体反応

培養液を一度ファルコンチューブに集めておき、0 . 25 %上述の抗 Drp 1 抗体（mouse, # 611113 , BD Transduction

Trypsin‒EDTA で細胞を剥がしたあとで、集めておいた

Lab）、抗 Drp1Ser616 抗体（rabbit, #611738, Cell Signaling

培養液で再懸濁を行った（HPEKp の細胞株においては，上Technology）、抗ERK1/2 抗体（rabbit, #4695, Cell Signaling

清 の CnT‒PR を 一 度 回 収 し、Trypsin‒EDTA の 反 応 をTechnology）、 抗 ERK1/2 リ ン 酸 化 抗 体（rabbit, #9191,

10 %FBS 添加 PBS でアンインキュベートし、遠心して上Cell Signaling Technology）、 抗 CDK1 抗（mouse, # 610037 ,清を吸引した後、避けておいた CnT–PR で再懸濁した）。

BD Biosciences）、 抗 CDK 2 抗 体（mouse, # 610145 , BD

その後、細胞数を測定し、「dead cell ratio ＝（全細胞数－

Transduction Lab）
、 抗 phospho–histone H 3 抗 体（rabbit,

生細胞数）/（全細胞数）× 100」
として導出した。

# 3377 , Cell Signaling Technology）、抗 ㌼ ‒actin 抗体（mouse,#A 5441 , Sigma）を 1 次抗体として使用し、4 ℃で揺らし

2 . 8 . コロニー増殖アッセイながら、抗原抗体反応行った。1 xTBS‒T で 20 分 3 回洗35 mm の 6 ウェルプレートに、対象細胞を 5 . 0 ×102 個

浄した後、HRP 標識ウマ抗マウス IgG 抗体および HRP 標

ずつ播種し、14 日間 37 ℃で静置した。培地は 7 日目に 1

識抗ラビット IgG 抗体（Cell Signaling Technology）を二度交換した。PBS で 2 回洗浄した後、70 % エタノールを次抗体として 60 分間室温で抗原抗体反応させた。再度

各ウェルに 1.5mLずつ添加して30 分間室温で静置し固定した。

1 xTBS‒T 3 回洗浄した後、Image Quant LAS 4000（GEエタノールをすべて除去し、
0 . 5 % crystal violet dye（100 mL

Healthcare）で撮像した。

あ た り、0 . 5 g crystal violet を 25 ml メ タ ノ ー ル お よ び
75 mL の滅菌水に溶解して精製）を各ウェルに 1 . 5 mL ずつ

2 . 10 . 細胞周期解析

添加し、30 分室温で静置しコロニーの染色を行った。水道細 胞 周 期 は propidium iodide DNA staining を 行 い、

水で洗浄し、直接目視によりコロニー数を計測した。コロ

fluorescence–activated cell sorting（以下、FACS と略す）

ニーは最低 50 個以上の細胞数があるものを有意とみなした。

により解析した。PI solution（Wako）は PBS 1000 µL あた− 163 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

り TritonX‒ 100 1 µL、RNAseA 20 µL、PI 20 µL をそれぞ

分量のホルマリンで固定した後、パラフィン切片を作成

れ添加して調製した。対象細胞は 10 cm ディッシュで培し、Hematoxylin and Eosin（HE）染色により病理組織学

養し、PBS で洗浄した後、1 mL の 0 . 25 % trypsin‒EDTA

的解析を行った。また免疫染色として、Ki– 67 染色およびを加え、37 ℃で 6 分間インキュベートした。血清培地を

TUNEL 染色を行った。免疫染色の評価には、100 か所あ

9 mL 添加して懸濁し、ファルコンチューブに全量を回収たりの陽性細胞を異なる視野で 5 回カウントし、その平均

して 1000 rpm，室温で 3 分間遠心した。上清をアスピレ

値を免疫染色陽性細胞率として算出した。

ーション後、PBS 5 mL で再懸濁した後、1000 rpm，室温

なお、侵襲を伴う処置については、麻酔下に施行した。

で 3 分間再遠心し、上清をすべて除去した。70 % エタノー

麻酔はイソフルレン（Abbi）による吸入麻酔と、抱水クロ

ル 5 mL を添加し、サンプルを固定し 4 ℃に静置した。次に、ラール（Wako）の腹腔内投与（300 mg/kg）を併用した。まサンプルを 1000 rpm，室温で 3 分間遠心した。エタノー

た、鎮静剤として術後 3 日間はアスピリン（Wako）の経口

ルを除去し、さらに PBS で 2 度洗浄した。次に PI solution

投与（150 mg/kg）を行った。

をそれぞれ 500 µL ずつ添加し、37 ℃で 15 分インキュベー

3. 結トした。FACS には、AriaIII（BD Biosciences）を使用し、

果縦軸に細胞数を、横軸に Phycoerythrin（PE）を設定した

3 . 1 . DRP 1 は皮膚有棘細胞癌部で高発現している状態で、サンプル数を 10000 カウントし、ヒストグラム

51 検体（紫外線発癌が疑われる「露光部」の皮膚有棘細胞を描出した。

癌 Squamous cell carcinoma: SCC および正常皮膚）を用いた免疫染色を行ったところ、これらの腫瘍部分においてミ

2 . 11. In vivo 異種移植モデル（Xenograft）

トコンドリア分裂因子である DRP 1 の発現が亢進していた

5 週齢、メスの BALB/cAJcl‒nu/nu（CLEA）を用いて（図 2）。

実験を行った。マウスは北海道大学医学部の動物実験施設
にて管理され、搬入されたマウスは少なくとも 5 日間当施

3 . 2 . DRP1ノックダウンは有棘細胞癌の増殖を抑制する設で飼育し、環境に適応したことを確認して実験に用いた。

皮膚有棘細胞癌細胞 A 431 細胞、DJM 1 細胞において尚、本研究の動物実験申請については、ヘルシンキ宣言にRNAi 法（shRNA）を用いた DRP 1 遺伝子発現ノックダウン

基づき、当院動物実験承認機関で審査承認済である。移植を実施した。2・3 種類の塩基配列にて DRP 1 のノックダする細胞株は、scrambled shRNA/shRNA# 3 をトランスウンを行ったところ、蛋白レベルで 90 ％以上のノックダ

フェクションした DJM 1 細胞を選択した。移植部位 1 か

ウン効率を認めた（図 3）。これらの細胞について、細胞増6所あたり 5 × 10 個の細胞を使用した。対象細胞は PBS で洗浄後、0 . 25 %Trypsin‒EDTA を加えて 37 ℃で 6 分間静置し、DMEM を 9 cc 加えて懸濁した。その後、懸濁液を全てファルコンチューブに回収し、1000 rpm で室温で 3分間遠心させ、上清を全て吸引し、PBS で再懸濁した。細
胞の個数を測定し、1 箇所あたり少なくとも 5 × 106 個の細胞数になるように PBS を加えてトータル 200 µL に調整した。この混合液を 1 cc の注射器（27 G 針）に吸引し、氷上で保存した。これらを速やかにヌードマウスの両側側腹部に皮内注射して異種移植し、Xenograft を作成した。その後、経時的に腫瘍の動態を観察した。

図2

Drp 1 阻 害 剤 添 加 の 実 験 に お い て は、 腫 瘍 の 長 径 が皮膚有棘細胞癌では DRP1 発現が亢進している。

5 ‒ 7 mm に な っ た 時 点 で、1 . 75 mg の Mdivi‒ 1（Santa
Cruz Biotechnology）を DMSO 25 µL に溶解したものを、腫瘍に直接局所注射した。コントロール群には、25 µL のDMSO を投与した。術後、腫瘍の長径・短径を 1 日おきに測定し、腫瘍の容積を“（1 / 2）×（長径）×（短径）2 ”で近似して導出した。移植後 15 日目に頚椎脱臼法によりマウスを安楽殺し、ピンセットと眼科用曲尖を用いて、生着していた皮下の腫瘍を周囲の軟部組織から剥離しながら摘出した後、腫瘍の重量を測定した。摘出した腫瘍組織は、十図 3 皮膚有棘細胞癌細胞株 A431 および DJM1 細胞に対して、
DRP1 ノックダウンを行った（J Dermatol Sci, 88; 298–307,2017）。

− 164 −

紫外線曝露による皮膚老化・発癌においてミトコンドリア関連分子が果たす役割を解明する

殖能をセルカウントにて評価したところ、DRP 1 ノックダの抑制が認められた（図 5）。次に、DRP 1 阻害剤（Mdivi‒ 1 ,ウン群は、コントロールに比べて有意に増殖能が抑制され

0 ‒ 100 µM）を添加したところ、濃度依存性に細胞増殖がた（図 4）。さらにノックダウン細胞の Clononic assay を行抑制された（Cell viability assay, Clonogenic assay, 図 6）。

ったところ、同様に DRP 1 ノックダウン細胞にて細胞増殖

次に、細胞増殖抑制機序を解明するため FACS を用いた

図 4 DRP1 ノックダウン細胞は細胞増殖が抑制される（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017）。

図5

DRP1 ノックダウン細胞株を用いた Clonogenic assay（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017 を改変）。

図 6 有棘細胞癌株に対する Mdivi–1 を用いた DRP1 阻害実験
88; 298–307, 2017）。

Midivi–1 投与によって細胞増殖が抑制された（J Dermatol Sci,

− 165 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

細胞周期解析を実施したところ（DNA contents analysis）、

ミトコンドリアが観察された（図 8）。以上より、DRP 1 が

DRP 1 のノックダウン細胞では、G 2 /M 期の細胞の割合が

皮膚有棘細胞癌においても G 2 /M 期のミトコンドリアの多くなっており、さらに phospho histone H 3 の発現レベ分裂に関与しており、DRP 1 の欠損あるいは阻害によってルから、G 2 期における細胞周期の停止と考えられた（図 7）。

分裂不全となることが示唆された。

3 . 3 . Drp1の欠損は、長いミトコンドリアネットワーク
を誘導する

3 . 4 . MAPK 経路によりDrp1 は活性化する
DRP 1 は増殖シグナルの一つである MAPK 経路を介しMitotracker（Thermo Fisher Scientific）
をもちいてミトて活性化するという既報告がある 2）。そこで、私たちも皮コンドリアの形態学的評価を実施した。その結果、DRP 1

膚有棘細胞癌において MAPK 経路について観察したとこのノックダウン細胞および DRP 1 阻害剤を加えた細胞でろ、経路の上流に位置する MEK 阻害剤を添加すると、そは、コントロールに比べて長いネットワーク構造を呈したの下流にある ERK と同調して DRP 1 のリン酸化 Ser 616 が

図7

DRP1 ノックダウンによって、G2/M 期での細胞周期の停止が認められる（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017 を改変）。

図8

DRP1 ノックダウンによってミトコンドリア形態が変化する（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017）。

− 166 −

紫外線曝露による皮膚老化・発癌においてミトコンドリア関連分子が果たす役割を解明する阻害された。この結果から、DRP 1 は MAPK 経路を介し

ろ、DRP 1 の KD 群では、有意に細胞の増殖が抑制された。

て活性化されることが解明された（図 9）。

同様に、DRP 1 阻害剤を腫瘍内に局所注射した、腫瘍の動態を観察したところ、DRP 1 阻害剤添加により、腫瘍の増3 . 5 . 異種皮下移植モデルにおいて有棘細胞癌の細胞増殖は Drp1 欠損により抑制される

殖が抑制された（図 10 ‒ 12）。

4 . 考察・まとめ

ヌードマウスの皮下に皮膚有棘細胞癌 DJM 1 細胞を投与して異種移植を行い、腫瘍の動態について観察したとこ

本研究では、皮膚有棘細胞癌では、他の癌種でも報告されているように、DRP 1 は細胞の増殖、細胞周期、ミトコ
ンドリアの分裂などを調整していることが分かり、有棘細胞癌の新規治療ターゲット分子の候補となりうる可能性が示唆された（図 13）3）。
肺癌、転移性乳癌、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、膵臓癌、および黒色腫を含むいくつかの癌の細胞において、DRP 1の高発現または活性化の更新が観察されている。例えば、
Rehman らは、DRP 1 の喪失は肺癌細胞増殖の減少および自発的アポトーシスの増加をもたらすことを報告した 4）。

図 9 MEK 阻害剤によって DRP1 のリン酸化が抑制される（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017）を改変。

図 11 DRP1 ノックダウン腫瘍細胞は生体内でも細胞増殖が抑制された（ 腫瘍体 積）（J Dermatol Sci, 88; 298–
307, 2017）。

図 10 異種皮下移植後の組織抽出物を用いた、免疫ブロット法（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017）

図 12 DRP1 ノックダウン腫瘍細胞は生体内でも細胞増殖が抑制された（腫瘍重量）（J Dermatol Sci, 88; 298–307, 2017）。

図 13 皮 膚 有 棘 細 胞 癌における DRP1 の 機 能（模 式 図 ）（JDermatol Sci, 88; 298–307, 2017 から改変）− 167 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

また、Inoue‒Yamaguchi らは、DRP1 の消失が結腸癌におけ5）るアポトーシスを増加させることを示した 。皮膚科領域
においては、リン酸化された Drp 1 S 616 は BRAFV 600 E
メラノーマの発生率と相関し、DRP1 の阻害はBRAFV 600 E
6）メラノーマ細胞の生存を抑制することが報告されている 。

（引用文献）
1） Koshiba T, Detmer SA, Kaiser JT, Chen H,
McCaffery JM, Chan DC: Structural
basis of mitochondrial tethering by mitofusin complexes.
Science 305: 858‒862, 2004.

さらに、DRP 1 活性化機構としては、2 つの独立した研究

2） Kashatus JA, Nascimento A, Myers LJ, Sher A,

グループが、Ras‒MAPK シグナル伝達が DRP 1 活性を調

Byrne FL, Hoehn KL, Counter CM, Kashatus DF:

4）

節することを報告した 。皮膚有棘細胞癌では、EGFR は

Erk2 phosphorylation of Drp1 promotes mitochondrial

過剰発現しており、予後不良と相関する 。EGFR は、

fission and MAPK‒driven tumor growth. Mol Cell 57:

Ras‒MAPK の主な活性化因子の 1 つとしても知られてお537‒551, 2015.

7）

り、EGFR‒Ras‒MAPK シグナル伝達は、皮膚有棘細胞癌

3） Kitamura S, Yanagi T, Imafuku K, Hata H, Abe R,

における DRP 1 活性化を調節するための重要な経路である

Shimizu H: Drp1 regulates mitochondrial morphology

可能性が高い。

and cell proliferation in cutaneous squamous cell

ミトコンドリア分裂は、細胞周期停止およびアポトー

carcinoma. J Dermatol Sci 88: 298‒307, 2017.

シスを促進する機構に関連している 。細胞周期において、

4） Rehman J, Zhang HJ, Toth PT, Zhang Y, Marsboom

Drp 1 Ser 616 は主に S 期初期にリン酸化され、ミトコンド

G, Hong Z, Salgia R, Husain AN, Wietholt C, Archer SL:

リア分裂促進に至り、細胞を G 2 /M に移行させる。報告

Inhibition of mitochondrial fission prevents cell cycle

では、DRP 1 の喪失がミトコンドリアの過剰融合を誘導し、

progression in lung cancer. FASEB J 2 6: 2 1 7 5‒2 1 8 6,

8）ATM 依存性の G 2 /M 停止およびアポトーシスを引き起こ2012.

すとされている。今回の私たちのデータは、これまでの研

5） Inoue‒Yamauchi, A. and Oda, H. Depletion of

究結果と一致しており、皮膚腫瘍においても同様の細胞機

mitochondrial fission factor DRP1 causes increased

構があることが考えられた。

apoptosis in human colon cancer cells. Biochem

DRP 1 はまた、いくつかの悪性腫瘍における予後因子とBiophys Res Commun 421: 81‒85, 2012.

なる可能性がある。Chiang らは、DRP 1 の核発現が肺腺

6） Wieder, SY, Serasinghe MN, Sung JC, Choi DC,

癌の不良予後と相関することを報告している 9）。我々の研Birge, MB, Yao JL, Bernstein E, Celebi JT, Chipuk JE:

究では、DRP 1 の発現レベルは、皮膚有棘細胞癌の病期のActivation of the mitochondrial fragmentation protein

進行と相関していた。 DRP 1 の免疫染色スコアと分化度

DRP1 correlates with BRAF（V6 0 0E）melanoma. Jとの間に相関関係に有意差はなかったが、相関の負の傾向

Invest Dermatol 135: 2544‒2547, 2015.

は P= 0 . 08 として示された。DRP 1 の発現レベルも、有棘7） Cañueto J, Cardeñoso E, García JL, Santos-Briz Á,

細胞癌において、低分化病変よりも分化した病変の方が低Castellanos-Martín A, Fernández‒López E, Blanco

かった。

Gómez A, Pérez‒Losada J, Román‒Curto C: Epidermal

私たちは、DRP 1 が皮膚有棘細胞癌における「細胞増殖・

growth factor receptor expression is associated with

アポトーシス・細胞周期」の重要な分子であることを示しpoor outcome in cutaneous squamous cell carcinoma.

た。今後、DRP 1 の正常皮膚組織における解析を進めたい

Br J Dermatol 176: 1279‒1287, 2017.
8） Zhao J, Zhang J, Yu M, Xie Y, Huang Y, Wolff DW,と考えている。

Abel PW, Tu Y: Mitochondrial dynamics regulates
謝

辞migration and invasion of breast cancer cells.

本研究はコスメトロジー研究振興財団の助成を得て実施いたしました。深く感謝いたします。

Oncogene. 32: 4814‒4824, 2013.
9） Chiang YY, Chen SL, Hsiao YT, Huang CH, Lin TY,
Chiang IP, Hsu WH, Chow KC: Nuclear expression of
dynamin‒related protein 1 in lung adenocarcinomas.
Mod.Pathol 22: 1139‒1150, 2009.

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