表皮バリア機構に立脚した新規経皮吸収促進法の開発
大阪大学大学院薬学研究科

渡利彰浩

The tight junction (TJ) is responsible for the epithelial barrier function of the skin. A TJ is composed of membraneproteins such as claudins, occludin, and ZO- 1 . It has previously been thought that only the stratum corneum is responsible
for skin barrier function; however, knock-out mouse analysis has shown that claudin- 1 is essential for skin barrier
function. Furthermore, other TJ components including claudin- 4 and occludin also contribute to the skin TJ-barrier.
Homoharringtonine (HHT) is an alkaloid derived from the evergreen tree Cephalotaxus harringtonia. HHT reduces intestinal
epithelial barrier function by inducing a change in the expression and localization of TJ components. However, the effect ofHHT on the skin TJ barrier remains unclear. In the present study, we investigated HHT’s influence on the skin TJ barrier andthe compound’s potential to enhance transdermal absorption. HHT decreased transepithelial membrane electrical resistance(TEER) values and enhanced the paracellular flux of FD- 4 in NHEK cells in a dose-dependent manner. The protein
expression of TJ components such as claudin- 1 , claudin- 4 , and occludin was decreased by HHT in NHEK cells. HTT also
reduced the expression of TJ components that are important for construction of the skin TJ barrier, including claudin- 1 ,claudin- 4 , and occludin. Examination of the transdermal absorption-promoting activity of HHT in vivo showed that theamount of FD-4 absorbed over 24 h of treatment was increased by HHT in a dose-dependent manner. A time-course of FD-4
absorption indicated that HHT increased the amount of FD- 4 absorbed starting after about 6 h of treatment. Analysis using
model dextrans showed that compounds with molecular weights of up to 10 , 000 were absorbed. These findings indicatedthat HHT acts on the epidermal TJ barrier and may serve as a novel transdermal absorption-promoting agent that permits thepassage of high-molecular-weight drugs such as biopharmaceuticals.

1. 緒

た経皮吸収促進法の開発はほとんど行われていないのが現言状である。

昨今の皮膚生理学の進展に伴い、しみやそばかすの要因

当グループはこれまでに、アルカロイドの一種であるや老化に伴うしわなどの生成メカニズムが明らかになって

Homoharringtonine（HHT）が TJ 構成タンパク質である

きており、色素沈着を阻害する物質、抗酸化物質、コラーCLDN の発現低下や局在変化を誘導することで、腸管上皮ゲン合成促進物質などが美白成分やアンチエイジング成分細胞のバリア機能を低下させることを見出している 3）。しとして注目されている。これら有効成分の効果を十分に発かしながら、HHT による表皮 TJ バリア機能制御活性に関揮させるには、皮膚内の作用部位（皮下に存在するメラノしては明らかにされていない。そこで本研究は、HHT にサイトや真皮領域など）まで到達させなければならず、単よる表皮 TJ バリア制御活性の解析、ならびに化粧品有効に皮膚表面に塗布しただけでは目的部位に浸透する割合は成分を見据えた高分子モデル物質の in vivo 経皮吸収活性極めて低い。表皮は大まかに角質層と生きた表皮細胞層かの検証を行うことで、メラノサイトや真皮領域に対して効らなり、生きた表皮細胞層の顆粒層には、隣接する細胞間率的に各種有効成分を送達する経皮吸収促進技術の基盤研に密着結合（タイトジャンクション：TJ）が形成され、TJ究を行った。

により細胞間隙をシールすることで生きた表皮細胞層での2. 方物質透過が制限されている。近年、TJ を構成する膜タン
パク質 claudin（CLDN）が表皮 TJ バリアの中心的な役割を担うことが明らかとなり

1 , 2）法

ヒト表皮細胞であるNormal Human Epidermal Keratinocytes、表皮 TJ バリアを制御するこ（NHEK）細胞を用い、HHTの表皮TJバリア制御活性を検証とによる経皮吸収促進法開発の可能性が提唱されている。

するため、TJ バリア機能を評価する方法として汎用されしかしながら、角層バリアを克服するための技術は多く開ている膜電気抵抗値（transepithelial electrical resistance,発されているのに対し、表皮 TJ バリア制御に焦点を当てTER）の測定、ならびにトレーサー分子の細胞間隙透過性を評価する tracer flux assay を行った。また、HHT の細胞傷害性を評価するため LDH release assay を行った。

Development of transdermal penetration
enhancer by regulating epidermal tightjunction barriers
Akihiro Watari
Graduate School of PharmaceuticalSciences, Osaka University

HHT 作 用 時 の 細 胞 間 接 着 分 子 へ の 影 響 は、Western
Blotting 法により検証した。HHT を作用させた際のマウス皮膚での TJ 構成タンパク質への影響を組織免疫染色法により検証した。

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コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

3. 結にこの際、Top側に添加した 4kDaのFITC‒dextran（FD‒4）

果の Bottom 側への移行量を測定した。Tracer flux assay の3 . 1. Homoharringtonineの上皮バリア制御能の検証

結果、TER assay の結果と相関して、HHT を添加した細HHT の表皮 TJ バリア制御活性を検証するため、膜電気胞群では、Control に比べ細胞間隙透過性の亢進が認めら抵抗値（TER）および細胞間隙透過性の評価を行った。

れた（Fig. 1 b）。また、LDH release assay により、HHTTER assay の結果、HHT を 24 時間作用させた時点での添加時の細胞傷害性を確認したところ、バリア機能低下がTER 値が HHT 濃度依存的に低下していた（Fig. 1 a）
。さら

観察された HHT 濃度においても傷害性は認められなかった（Fig. 1 c）。以上の結果から、HHT は NHEK 細胞において細胞傷害性を示すことなく、TJ バリア減弱作用を示し、細胞間隙透過性を亢進することが明らかとなった。

3 . 2 . HHTによる細胞間接着分子への影響の検証
NHEK 細胞における HHT の TJ バリア抑制能が示された た め、HHT 作 用 時 の 細 胞 間 接 着 分 子 へ の 影 響 をWestern Blotting 法により検証した。腸管バリア機能に関する検討において発現が低下していた CLDN‒ 1、‒ 4、または TJ 構成タンパク質の一つである Occludin（OCLN）、CLDN や OCLN の裏打ちタンパク質である ZO‒ 1、上皮組織における接着装置の一つである Adherens junction の主要構成因子の E‒Cadherin について検討を進めた。その結果、CLDN‒ 1、CLDN‒ 4、OCLN の発現低下が確認された。
一方、ZO‒ 1 や E‒Cadherin の発現低下は確認されなかった（Fig. 2）。以上の結果から、HHT によるバリア機能減弱
Fig. 1a, b NHEK 細胞における HHT の上皮バリア制御活性の検証(a) NHEK 細胞における HHT による膜電気抵抗値の変化(b) NHEK 細胞における HHT による FD-4 の細胞間隙透過性の変化
NHEK 細胞を transwell plate に播種。細胞がコンフルエントに達してから、l.8mM CaCl2 を含む培地に交換し、さらに 2 日間培養。(a) 0, 10, 50, 100nM の HHT を添加 24 時間後の TERを測定。(b) 0, 10, 50, 100nM の HHT 添加 24 時間後、FD-4を Top 側に添加し、1 時間インキュベーション後、Bottom 側の培地中に含まれる FD-4 の濃度を測定。Data are means ± SD
（n=3），*P < 0.05 vs. vehicle treated groups.（Dunnett's test）

Fig. 1c NHEK 細胞における HHT の上皮バリア制御活性の検証(c) LDH release assay
Transwell の Top 側、Bottom 側 に ０ , 10, 50, 100nM のHHT を 添 加。24 時 間 後、 非 処 理 群 の Top 側 を 0.2%
Tween-20 に調節した培地に交換。15 分後、全ウェルの Top側より 1µL を 96-well plate に移し、PBS で 50 倍に 希 釈後、培地中の LDH を検出。

時において、細胞接着分子の中でも TJ 構成因子の発現が低下していることが確認された。

3 . 3 . HHTによるモデル分子の経皮吸収促進活性の評価
表皮細胞を利用した検証により、HHT の上皮バリア制御能が確認されたため、マウス皮膚での HHT による経皮吸収促進活性の評価を行った。まず、異なる濃度の HHTを作用させた際のマウス皮膚から吸収された血漿中蛍光基質濃度を調べた。本検証では HHT による表皮 TJ バリアへ

Fig. 2 HHT 作用時の細胞間接着分子発現への影響
50nM の HHT を 添 加 24 時 間 後、SDS page を 行 い、
CLDN-1、CLDN-4、OCLN、ZO-1、E-Cadherin、㌼-actinの抗体を用いて、Western Blotting 解析を行った。

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表皮バリア機構に立脚した新規経皮吸収促進法の開発の影響を確認するため、除毛 5 日後に Tape–stripping を 8ころ、皮膚障害性は見られず（Fig. 4）、約 2 週間後には再回行うことにより角質層は除いた C 57 BL/ 6 J ♂ 7 週齢マび体毛が生え変わることも確認された（data not shown）。

ウスの皮膚に貼付体を貼付することにより評価を行った。

Tape‒stripping により角質を除去したマウスの皮膚かHHT（0 mM、0 . 1 mM、0 . 5 mM、1 mM）を作用させてら、HHT の作用により 4 kDa のトレーサーの吸収促進活

0 時間から 24 時間までの FD‒ 4 吸収量を比較した結果、性が確認されたことから、次に、HHT によりどの程度の濃度依存的な AUC の増加が確認された（Fig. 3 a）。この際、サイズのトレーサーが吸収促進できるのかについて検証を1 mM の HHT 作用マウスにおいて経時的に血漿中蛍光基行った。モデル分子として分子量 4 , 000、10 , 000、20 , 000

質濃度を測定したところ、Tape‒stripping の影響で貼付直（FD‒ 4、FD‒ 10、FD‒ 20）のトレーサーを用い、1 mM の後の吸収増加も確認されるが、貼付約 6 時間後以降に吸収

HHT に よ る 皮 膚 か ら の 吸 収 量 を 調 べ た。 そ の 結 果、量が上昇することが確認された（Fig. 3 b）
。また、HHT をControl 群と比べて、分子量 10 , 000 までのトレーサー分子作用させて 24 時間後のマウスの皮膚の様子を観察したとが有意に吸収されることが確認された（Fig. 5）。

Fig. 3HHT によるマウス経皮における FD-4 吸収促進活性(a) HHT 濃度別における FD-4 貼付 24 時間の AUC の比較(b) FD-4 貼付 24 時間までの血漿中蛍光基質濃度の推移
除毛 5 日後、Tape-stripping を 8 回行い、20mg/mL FD-4 を貼付体に染み込ませ皮膚に貼付。0, 1,3, 6, 12, 24 時間において血漿中蛍光基質濃度を測定。Data are means ± SE（n=6），*P < 0.05 vs.
vehicle treated groups.（Dunnett's test）

Fig. 4

HHT 作用後の皮膚の状態

除毛 5 日後 Tape-stripping を 8 回施行し、HHT を 24 時間作用させた後のマウスの皮膚の様子。

Fig. 5

HHT による各分子量の蛍光基質の吸収量

除毛 5 日後、Tape-stripping を 8 回行い、貼付体にlmM の HHT を含む薬液を染み込ませ、24 時間作用させた。 各 蛍 光 基 質（FD-4、-10，-20） はそれぞれ20mg/mL 含有。０, 1, 3, 6, 12, 24 時間において蛍光基質濃度を測定し、AUC を算出。Data are means± SE（n=6），*P <0.05 vs. PBS treated groups.
（Student t-test）− 171 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20193 . 4 . HHTによる表皮 TJ 構成タンパク質への影響

600 程度のトレーサー分子を皮下に注入すると、野生型マ

HHT によるマウス表皮組織でのバリア機能低下作用に

ウスでは、細胞間隙を透過したトレーサー分子が TJ の存ついてメカニズムを探るために、HHT を作用させた際の在部分でとどまるのに対し、CLDN‒ 1 KO マウスでは表皮TJ 構成タンパク質への影響を蛍光免疫染色法により検証

TJ バリアが破綻しているため、トレーサー分子が細胞間した。ヒト表皮細胞での Western Blotting 解析による検証

隙を透過し、TJ を超え、角質層まで移動することが報告において発現低下が確認された CLDN‒ 1、CLDN‒ 4 につされている 1）。この報告をうけ、HHT を作用させたマウいて解析を進めた。その結果、CLDN‒ 4 の発現量や局在スの皮膚でのトレーサー分子の透過性を観察した。その結の変化は観察されなかった。一方、CLDN‒ 1 の局在に変果、Control 群と比べて、HHT を作用させたマウスの表皮化は見られなかったが、顆粒層での発現量が低下しているでは、トレーサー分子が TJ を超え角質層付近まで透過しことが確認された（Fig. 6）。以上の結果から、HHT が表皮ている領域が多くみられたことから、TJ バリア領域におバリア機能を低下させるメカニズムとして、CLDN‒ 1 のけるトレーサー分子の透過率が増加していることが確認さ発現量低下が関与することが示唆された。

れた（Fig. 7）。以上の結果から、HHT により CLDN‒ 1 の発現が低下することで、上皮バリア機能が抑制され、上皮3 . 5 . HHTによる経皮透過作用の検証透過性が上昇していることが示唆された。

これまでの上皮バリアに関する研究において、分子量

Fig. ６ HHT による CLDN-1、CLDN-4 への影響
除 毛 5 日 後、Tape-stripping を 8 回 行 い、PBS（10% DMSO） ま た は 1.0 mM（10%DMSO）HHT を 24 時間作用させた。薬液を作用させた箇所の皮膚組織を回収し、凍結切片を作製した。CLDN-1、CLDN-4 の 1 次抗体、２次抗体 Cy®3 を用いて免疫染色を行った。

Fig. 7

HHT による上皮透過性への影響

生後 2日の新生児マウスにTape-strippingを3 回行い、PBS（10% DMSO）または1.0 ｍM（10%DMSO）HHTを 24 時間作用させた。貼付体除去後、10 mg/mL の biotinを含む薬液（1 ｍ M
CaCl 2 含）を 50 µL 皮下に投与し、30 分間インキュベーシヨンした。薬液を作用させた箇所の皮膚組織を回収し、凍結切片を作製した。OCLN の 1 次抗体、２次抗体 FITC（OCLN に対して）、Strepttavidin, Alexa Fluor® 555 conjugate（biotinに対して）を用いて免疫染色を行った。

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表皮バリア機構に立脚した新規経皮吸収促進法の開発

4. 考とにより、体内への吸収量の調整なども可能であると考え察られる。

本研究では、HHT による表皮 TJ バリア制御能を検討す

本研究では HHT の表皮 TJ バリアへの影響を検証するたることで、表皮 TJ の経皮透過における重要性を検証し、め、除毛 5 日後、Tape‒stripping を 8 回行うことにより角

表皮 TJ バリアに焦点を当てた新規経皮吸収促進法開発の質層は除いた皮膚において検証を進めている。今後、より可能性を探るため、in vitro および in vivo における HHT実用的な非侵襲性投与法として応用するためには、角質層の経皮吸収促進活性の検証、また、HHT 作用時の TJ 構成バリア透過を可能にする技術と併用する必要がある。例えタンパクの変動の検証を行った。

ば、透過させたい薬物によって、Azone やエタノールなどヒト表皮細胞である NHEK 細胞を用い、TER assay おの化学的吸収促進、イオントフォレシスやソノフォレシス

よび tracer flux assay を行った結果、HHT 濃度依存的ななどの物理的吸収促進法等 4 , 11 , 12）との最適な組み合わせをTER 値の低下、および細胞間隙透過性が亢進していたこ検証していく必要がある。とから、HHT は表皮 TJ バリア制御活性を示すことが明ら

4. 総かとなった。また、この際、HHT による細胞間接着分子

括へ の 影 響 を Western Blotting 法 に よ り 解 析 し た 結 果、

本研究では、表皮バリア機能の中でも表皮 TJ バリアに

HHT は CLDN‒ 1 をはじめとした TJ 関連分子の発現低下着目し、表皮 TJ の経皮透過における重要性の検証、また、を誘導することが確認されたため、HHT による表皮 TJ バ

HHT による経皮吸収促進活性、および TJ 構成タンパク質

リア機能の低下は TJ 構成タンパク質の変動によるものでへの影響を検証した。本研究で得られた最も重要な知見は、あると考えられる。続いて、角質層を除いたマウス皮膚に

HHT が CLDN‒ 1 の発現量を低下させることにより表皮 TJ

おいて、HHT による経皮吸収促進活性を評価したところ、バリア機能を抑制すること、また、化粧品有効成分の経皮分子量 4 , 000 のモデル分子が皮膚から吸収され、血中にま吸収促進活性を示す可能性が示唆されたことである。本研

で移行することが明らかとなった。この際、分子レベルで究では、TJ 構成タンパク質においてのみ、発現の影響のの影響を検証するため、免疫染色法による解析を行ったと検証を行ったが、今後は、HHT を作用させた際の TJ 構成

こ ろ、HHT を 作 用 さ せ た マ ウ ス の 皮 膚 に お い て、タンパク質以外の分子への影響の検証、また、HHT の分CLDN‒ 1 の 発 現 量 減 少 が み ら れ た。 以 上 の 結 果 よ り、子レベルでの作用機序の解明等さらに詳細な検証を進めてHHT の表皮 TJ バリア制御活性により高分子量の薬物が透いく必要がある。本研究により得られた成果は、皮膚バリ過可能であることが示された。

ア機能において重要な表皮 TJ バリアに関する基礎知識の続いて、HHT による経皮吸収促進が可能な分子量の検蓄積に資するのはもちろんのこと、近年開発が進んでいる証を行ったところ、分子量 10 , 000 までのトレーサー分子

美白成分やアンチエイジング効果を示す機能性ペプチドやの有意な経皮吸収促進活性が確認された。通常、皮膚は分既存の有効成分の皮膚内への効率的な送達法開発に繋がる

子量 600 以下のものであれば通過するとされているが可能性を有し、コスメトロジーの分野に貢献するものと期

4 ‒ 6）、

Tape‒stripping を 行 っ た 皮 膚 で は、HHT に よ り 分 子 量待される。

10 , 000 までのトレーサーの吸収が可能であり、低分子医薬品（分子量 500 以下）やペプチド（分子量 500 ‒ 2 , 000 程（引用文献）度）、またはタンパク質製剤（分子量 10 , 000 ‒ 30 , 000 程度）や、

1）Furuse M. et al., Claudin–based tight junctions are

核酸医薬品（分子量 3 , 000 ‒ 10 , 000 程度）の一部などのバイ

crucial for the mammalian epidermal barrier: a lesson

オ医薬品を経皮吸収促進する活性を有すると考えられる。

from claudin‒1‒deficient mice., J Cell Biol., 1 5 6（6），

経 皮 吸 収 量 の 経 時 的 変 化 を 検 証 し た 結 果、Tape‒1099‒111, 2002.

stripping の影響で貼付後すぐの吸収も見られるが、HHT

2） Nakajima M. et al., Claudin–1 Binder Enhances

を貼付してから 6 時間以降で有意な吸収促進効果がみられEpidermal Permeability in a Human Keratinocyte

たことから、HHT による吸収促進効果が示されるまでにModel., J Pharmacol Exp Ther., 354（3），440‒7, 2015.

は数時間を要することが分かった。この理由として、TJ

3） Watari A. et al., Homoharringtonine increases

構成因子のターンオーバーが関わっていると考えられる。

intestinal epithelial permeability by modulating specific

HHT は、タンパク質翻訳阻害活性をもつことが知られてclaudin isoforms in Caco‒2 cell monolayers., Eur Jいる7 ‒ 10）。HHT が TJ 構成タンパク質の翻訳を阻害し、TJ

Pharm Biopharm., 89:232‒8, 2015.

構成因子の発現低下が認められるまで数時間を要するため、

4）Barry B.W., Novel mechanisms and devices to enable

バリア抑制能を示すまでに約 6 時間かかると考えられる。

successful transdermal drug delivery., Eur J Pharm

今後さらに HHT 作用濃度や作用時間などの検討を行うこSci., 14, 101‒114, 2001.

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