栃木農 試研報 No59：45〜54 (2007)
Bull.Tochigi Agr.Exp.Stn.No59.：45〜
54の主要形(2007) 質DNAマーカ ーの開発 ・評価と育 種利用上 の問題点
ビ ール大麦ビール大麦の主要形質DNAマーカーの開発・評価と育種利用上の問題点
長嶺敬・天谷正行・池田達哉1)・大関美香・春山直人・加藤常夫2)・五月女敏範
摘要：ビール大麦育種の効率化を目的として，麦芽品質や農業特性に大きな影響を及ぼす５種類の遺伝子について，DNAマーカーを開発あるいは既報マーカーの有用性について検討した．ビールの香味安定性，泡持ち性に関わるリポキシゲナーゼ（Lox-1）に関してはCAPSマーカー及びミスマッ
チプライマー法に遺伝子型判別法を開発した．また，麦芽蛋白質分解に関わるセリンプロテアーゼ（Cxp1），縞萎縮病抵抗性（rym5），うどんこ病抵抗性（mlo），凍霜害の回避に有用な秋播性（Vrn-H2）については，外国品種を用いた研究報告のあるDNAマーカーについて，日本品種への適用性を評価した．これらのマーカーの有用性や日本品種のもつ遺伝子型変異を解析するとともに，マーカーを適用することが出来ない品種を明らかにし，育種利用上の問題点を明らかにした．

キ−ワ−ド：DNAマーカー，ビール大麦，育種，リポキシゲナーゼ, 縞萎縮病抵抗性

Development and Evaluation of DNA Markers for Japanese Malting
Barley Breeding
Takashi NAGAMINE, Masayuki AMAGAI, Tatsuya M. IKEDA, Mika OOZEKI, Naoto HARUYAMA,
Tsuneo KATO and Toshinori SOUTOME
Summary：DNA markers were developed for selecting lipoxygenase-deficient lines and published DNA
markers were evaluated for four breeding characters to develop an efficient system for malting barley
breeding. For the efficient selection of lipoxygenase-deficient lines which are effective to keep beer flavor
and form stability, cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) and genotype-specific PCR markers
were developed. DNA markers for serine protease activity (Cxp1), barley yellow mosaic virus resistance(rym5), powdery mildew resistance (mlo) and winter habit (Vrn-H2) were evaluated. Based on the analysisof the genotype variation among Japanese cultivars, we found that the usability of the markers for rym5,
mlo, and Vrn-H2 has limitation in Japanese malting barley breeding.

Key words：DNA marker, malting barley, breeding, lipoxygenase, barley yellow mosaic virus resistance1)近畿中国四国農業研究センター，2)現 農政部経営技術課(2007.7.31受理)

45

栃木県農 業試験場 研究報告

Ⅰ

緒

言

第59号

本稿で報告するDNAマーカーはリポキシゲナーゼについては今回新たに開発したものであるが，他形質につ近年の作物ゲノム研究の進展は著しく，ビール大麦にいてはすべて海外の品種を用いた研究で報告されたマー

おいてもDNAマーカーを利用した育種の効率化が可能カーである．これらのマーカーを育種素材の遺伝的背景になっている．DNAマーカーを利用した育種体系を構がかなり異なる日本での育種に利用するためには事前に築するには，１）重要な育種形質を選抜できること，

その有用性や育種素材の違いによる限界などを評価する

２）選抜ミスが少ないこと，すなわち遺伝子本体または必要がある．本研究ではこのようなマーカー自体を評価

強い連鎖を持つマーカーであること，３）DNA抽出のするとともに，日本のビール大麦の遺伝的変異について手間を考慮すれば，出来るだけ多くの形質についてマーの検討を行った．

カーを揃えて選抜を実施すること，が望ましいと考えられる．
本研究ではビール大麦育種において重要かつ上記の条件をみたす５形質（①原麦リポキシゲナーゼ欠損特性，②セリンプロテアーゼ活性，③縞萎縮病抵抗性，④うど
んこ病抵抗性，⑤秋播性）に関するDNAマーカーについて検討した．
①原麦リポキシゲナーゼ欠損特性は，ビールの鮮度維持（香味安定性）や泡持ち性の改良に，極めて大きい効
果を示し 3,4) ，ビール大麦の飛躍的な高品質化に有用な特性である．当研究室で作出した原麦リポキシゲナーゼ
欠損突然変異系統である大系LM１がもつ変異型Lox-1遺伝子の育種への活用が急務となっている15)．
②セリンプロテアーゼは麦芽タンパク質の分解に関与しており，低活性型遺伝子を導入することにより，スカ
イゴールデンなどで問題となっている麦芽タンパク質の過剰分解特性の改善が期待される形質である．
③縞萎縮病抵抗性はウイルス汚染の広がる栃木県でのビール大麦生産に欠くことの出来ない特性であり，複数の抵抗性遺伝子が知られている 20,12) ．最近，栃木県北部で見つかった新たなウイルス系統に対しては，本研究での対象抵抗性遺伝子rym5 と最近の育成品種の持つ抵抗性遺伝子rym3 との相補作用で抵抗性が発現すると見られており，その重要性が増している．
④うどんこ病抵抗性は多収で整粒歩合の高い品種の育成には不可欠の条件であり，数多くの抵抗性遺伝子が報告されている 9,6) ．欧州ではうどんこ病菌レースの変化による「抵抗性品種の罹病化」が生じており，新たな抵抗性遺伝子の利用や抵抗性遺伝子の集積が重要な育種課
題となっている．本研究で対象とした抵抗性遺伝子mlo
は抵抗性崩壊がおこりにくい有望な遺伝子と考えられて
おり8,17)，抵抗性遺伝子源の多様化が必要な日本のビール大麦育種にも特に有用な遺伝子である．
⑤秋播性は凍霜害の回避，早播き適性の向上などのために有効な特性であり，「秋播性早生」ビール大麦の育成は長年の課題となっている26,19,7)．

46

Ⅱ

試験方法

１．材料及び方法
１）材料
DNAマーカーの開発や評価には遺伝子型が既知の品種・系統を用いた．また，栃木分場で育成した品種・系
統など主要な日本のビール大麦品種について，各DNA
マーカーによる分析を行い，遺伝的変異を分析した．
なお，リポキシゲナーゼのDNAマーカー開発には，
大系LM1や一般品種の他，（大系LM1×サチホゴールデ
ン）のF1種子やF3種子なども用いた．
２）DNA抽出法
大麦種子からのDNA抽出はIkedaら 6) の方法で行った．
すなわち，大麦種子の胚１個をルータードリルで削りだした粉（5mg程度）あるいは5mm角の葉片を1.5mlチューブにいれ，DNA抽出液（100ｍM Tris-HCl (pH 8.0),50mM EDTA, 500mM NaCl, 1.25% SDS) 500μlを加えて混和した後，65℃処理を15分間行う．ついで，5M 酢酸カリウム液 160μlを加えて氷上10分間静置した後，遠心分離（12500rpm×5分）によって得られる上清 500
μlを別のチューブに移し，イソプロパノール330μlと混和後，氷上に5分間静置する．遠心分離（12500rpm×5分）後，上清を捨て，70%エタノール 500μlを加えて，遠心分離（12500rpm×5分）を再度行う．上清を捨てて，室温で10〜15分間乾燥させた後，RNase(6.7μg/ml)を含むTE緩衝液（10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA）
50μlに溶解して，10分間の65℃処理を行い，DNA抽出
サンプルとした．

３）PCRによるDNA増幅及び制限酵素処理
PCRの反応液組成は滅菌イオン交換水 12μl，PCR緩衝液（組成）1.5μl，dNTPs（デオキシリボヌクレオチ
ド3リン酸混合液各2mM) 1.5μl，フォワードプライマ
ー，リバースプライマー（100pmol/μl, インビトロジ
ェン社に依頼合成)各0.08μl，DNAポリメラーゼ0.15

ビ ール大麦 の主要形 質DNAマーカ ーの開発 ・評価と育 種利用上 の問題点

unit（0.06μl，Blend Taq，TOYOBO社)，鋳型DNA 30

ースが多いことを利用して，目的遺伝子の1塩基多型をng（1μl）とした．

検出する方法で，イネのいもち病抵抗性遺伝子の検出2)

サーマルサイクラーはMycycler（バイオラッド社）を用い，各種プライマーの塩基配列およびPCR反応条件はなどで利用されている．
この方法を用いて，正常型と大系LM1型のLox-1 遺伝
子塩基配列を考慮したミスマッチ塩基を導入したプライ

第１表に示した．
CAPSマーカーにおける制限酵素処理は後述のとおり

マーを設計し，遺伝子型特異的なPCR増幅を試みた（第２図）．大系LM1型遺伝子の特異的増幅を目的とするである．
PCR産物あるいはCAPS産物は1.8％アガロースゲルでLOX48.3プライマーセットあるいは正常型遺伝子の特100V，20〜30分間電気泳動し，エチジウムブロマイド

異的増幅を目的とするLOX50プライマーセットを用いで染色した後，紫外線照射下で写真撮影した．ただし，て第１表の条件で，PCRを行った．第２図に示したとお低分子バンド(100bp以下)の差異を検討したLox-1遺伝子

り，いずれのプライマーの増幅を目的とする遺伝子に対のCAPS解析においては20%アクリルアミドゲル(9cm幅

しては1塩基のみがミスマッチを持ち，増幅したくない

×7cm高)で100V，2.5時間の電気泳動を行った．

対立遺伝子については２塩基のミスマッチを持つように設計されている．

(1）原麦リポキシゲナーゼ遺伝子 Lox-1

LM1型特異的プライマー

原麦リポキシゲナーゼ欠損突然変異系統である大系

正常型特異的プライマー ATCAAGGCCATCAAGC

LM1のLox-1 遺伝子にある１塩基置換（第1図) 15) を検出するように，増幅プライマーを設計し，CAPS法あるいはミスマッチプライマー法によるLox-1 遺伝子型の判別
を試みた．

+1

ｴｸｿﾝ1

ｴｸｿﾝ2

ｴｸｿﾝ3

ｴｸｿﾝ4

ｴｸｿﾝ5

ｴｸｿﾝ6

ｴｸｿﾝ7

(183bp）(296bp）(645bp）(108bp） (311bp）(264bp）(769bp）

ｲﾝﾄﾛﾝ1

ｲﾝﾄﾛﾝ2(542bp） (634bp）*

ｲﾝﾄﾛﾝ3 ｲﾝﾄﾛﾝ4 ｲﾝﾄﾛﾝ5

ｲﾝﾄﾛﾝ6(106bp） (132bp） (79bp）(83bp）+4162

ATCAAGGCCATCATGT(正常型塩基配列）(LM1の塩基配列)×△
ATCAAGGCCATCACGCATCAAGGCCATCACGT

第２図

特異的増幅プライマーとLox‑1塩基配列のミスマッチ構造×△

共通ミスマッチ塩基遺伝子型に依存したミスマッチ／対合塩基

実験材料にはサチホゴールデン／大系LM1のF3種子から，あらかじめリポキシゲナーゼ活性評価の色素退色法(+2005)Karl (塩基配列）： GCC ATC ACG CAG GGC ATC(ｱﾐﾉ酸配列）
大系LM1 (塩基配列）

Ala

Thr

Gln

Gly

Ile

テロ，正常型ホモ各10粒を実験に用いた．

： GCC ATC ACG TAG GGC ATC(ｱﾐﾉ酸配列）

第１図

Ile15) により，Lox-1 遺伝子型判定をしたＬＭ１型ホモ，ヘ

Ala

Ile

Thr

stop Gly

Ile

大系LM1のLox‑1遺伝子の変異(大関ら2007)15)(2) セリンプロテアーゼ

Cxp1

麦芽タンパク質の分解に関与するセリンプロテアー
ゼのｍRNAの発現量の多寡に関わるeQTLであることがPotokinaら 18) に よ っ て 報 告 さ れ て い る CAPS（ Cleaved

ａ．CAPS法

Amplified Polymorphic Sequences）マーカー Te945を用第1表に示したプライマー（940LOX），PCR反応条件
により得られたPCR反応液15μlに制限酵素BsaAI １unit

いて，日本品種の遺伝子型変異の解析を行った．
PCRは第１表に示したプライマー，条件で行った．

（New England BioLabs社）と添付の反応緩衝液2μlを添PCR産物（15μl）に制限酵素 FastDigest BseGI加し，37℃8時間の反応を行い，アクリルアミド電気泳（Fermentas社）と添付の反応緩衝液2μlを37℃3時間の動に供した．

反応を行い，アクリルアミド電気泳動に供した．

ｂ．ミスマッチプライマー法「ミスマッチプライマー法」とは20塩基程度の増幅プ(3) 縞萎縮病抵抗性

0.1μl

rym5

海外品種を用いた研究により，オオムギ縞萎縮病抵抗末端にミスマッチ塩基を１塩基だけ導入性遺伝子rym5と0.034cMで連鎖することが，Pellioら 16)

した場合にはPCRによる増幅が起こるが，増幅プライマ

によって報告されているAFLP多型由来のSTSマーカーE

ーの３'末端に加えて，３末端から３塩基目にさらに

31/M41（の有用性を評価した．材料には，ウイルス汚もう一つミスマッチを導入した場合には増幅できないケ

染圃場での抵抗性反応からrym5 遺伝子型が既知の品種

ライマーの347

栃木県農 業試験場 研究報告

第59号

・系統などを用いた実験を行った．PCRは第1表に示し(5)秋播性た条件により行った．

Vrn-H2mlo

播性に関わるVrn-H2 遺伝子のSTSマーカーとして，

うどんこ病抵抗性に関わるmlo遺伝子５'上流域（−2.

Szucsら 22) が報告したZCCT-Ha/bマーカーの有用性を評3kb)の挿入／欠失変異（In/del変異）を検出するTacconi

価するために，秋播性を有するMaris Otterなどの標準品

ら23)のom2マーカーの有用性を評価するために，日本品

種や日本品種を用いて，第1表の条件で実験を行った．

(4) うどんこ病抵抗性種や既知のmlo抵抗性遺伝子を有する品種Chariot (mlo-11)，Alexis (mlo-9)などを用いて実験を行った．PCRは第1表に示した条件により行った．

第１表

遺伝子型判別に用いたプライマーの塩基配列及びPCR条件
マーカーあるいはプライマー Ｆプライマー塩基配列
セット名

目的形質

Ｒプライマー塩基配列

ＰＣＲ温度条件

マーカーの原報

リポキシゲナーゼ欠損特性
940LOX
Lox-1 (CAPS)GCAACGGAGGGAGTAA CGATGGCTTGGACCAA 94℃4分-（94℃30秒-53℃45秒-72℃45秒）×
40回-72℃5分
AACA
TTAC

なし

リポキシゲナーゼ欠損特性
Lox-1 (LM1型特異的増幅） LOX48.3

ATCAAGGCCATCATGTCGATGGCTTGGACCAA 94℃4分-（94℃30秒-47℃45秒-72℃45秒）×
40回-72℃5分
TTACなし

リポキシゲナーゼ欠損特性
Lox-1 (正常型特異的増幅） LOX50ATCAAGGCCATCAAGCCGATGGCTTGGACCAA 94℃4分-（94℃30秒-47℃45秒-72℃45秒）×
40回-72℃5分
TTACなし

セリンプロテアーゼ

Tｅ945

GTCGTGCCACGGAAAT AACACCACTGGCAACT 94℃4分-（94℃30秒-60℃30秒-72℃30秒）×
35回-72℃5分
TACT
TCCT

Potonika et al. (2006)18)

縞萎縮病抵抗性 ｒｙｍ5

E31/M41GAGTCGTCACAACGTA GTGGCTGTAAATAGGC 94℃4分-（94℃30秒-60℃30秒-72℃30秒）×
35回-72℃5分
CCTTGCTAAGGCC

Pellio et al . (2005)16)

うどんこ病抵抗性mlo

om2

TAGCAATCACGGTCAC CCGCAAGGCTGCTATG 94℃4分-（94℃30秒-65℃50秒-72℃1分）×35
回-72℃5分
GTCAACAAAAGGG

Tacconi et al . (2006)23)

秋播性 Vrn-H2

ZCCT-Ha/b CCTAGTTAAAACATAT GATCGTTGCGTTGCTA 35回-72℃5分

Cxp1

94℃4分-（94℃30秒-55℃30秒-72℃45秒）×

ATCCATAGAGC

Ⅲ

ATAGTG

結果及び考察Szucs et al . (2006)22)

により，Lox-1 遺伝子型に応じた多型が見られた(第３図)．正常型遺伝子を持つ系統では３本のバンド（102，

１．リポキシゲナーゼ遺伝子 Lox‑1 の遺伝子型判別
リポキシゲナーゼは脂質酸化に関わる酵素で，その作用により麦芽中に生じた過酸化脂質はビールの鮮度低下（老化臭）の原因物質であるトランスノネナールなどを生成する．そのためリポキシゲナーゼ活性を製麦法 25）
や仕込み法 27） の改良や，大麦の育種 3,4,15,1) によって抑制する研究がなされている ．
大系LM1は米国品種Karlが原品種の突然変異変異系統であり，農業特性が劣るため実用品種としての利用価値は低い15)．そのため，大系LM1がもつリポキシゲナーゼ
活性欠損型Lox-1 遺伝子を実用性の高い有用母本に導入，選抜することが求められている．
以下，大系LM1型Lox-1 遺伝子の選抜を目的とした２種類のＤＮＡマーカーの検討結果を記す．

１）CAPSマーカー
PCRによって得られる940bpの増幅産物はBsaAI処理

48

328，510bp）がみられ，大系LM1型遺伝子を持つ系統では102bpバンドが消失し，代わりに71bp，31bpのバンドがみられた．正常型／大系LM1型のヘテロ個体（＝大系LM1×サチホゴールデンのF1）では両方の遺伝子に対応したバンドが検出できた．すなわち，CAPS法によれば，育種目的の大系LM1型Lox-1 遺伝子をホモで持つ系統の選抜や連続戻し交雑中のヘテロ個体の選抜ができることが明らかとなった．
すなわち，本法による遺伝子型の判定はおもに102bp
バンド，71bpバンドの有無を目安として判断することになるが，いずれも分子量が小さいため，アガロースゲル
では誤判定が生じやすく，低分子域分解能の優れるアク
リルアミドゲルを用いて判定することが望ましいと考えられた．

ビ ール大麦 の主要形 質DNAマーカ ーの開発 ・評価と育 種利用上 の問題点

２．セリンプロテアーゼ Cxp1遺伝子型の判別
最近の育成品種であるスカイゴールデンなどでは，麦芽タンパク質が過度に分解しやすい特性があり，その育
102bp

71bp

種的改善が強く求められている．麦芽タンパク質の過剰分解には，１）麦芽プロテアーゼ活性が高いこと，２）

31bp
しゅんれい

スカイゴールデン

第３図

サチホゴールデン

大
系
Ｌ
Ｍ
１

原麦β−グルカンが低いこと，などが関わっている 13）．
(大系
LM1
×
ｻﾁﾎｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ)
F1

CAPS法によるLox‑1遺伝子型の判別

麦芽品質に悪影響を与えずに，麦芽タンパク質の過剰分解を抑制するには，プロテアーゼ活性をやや抑制することが望ましいと考えられている．セリンプロテアーゼは麦芽に含まれる諸種のプロテアーゼの一つであり，その発現量を低下させることができれば，麦芽タンパク質の過剰分解特性を改善できる可能性がある．Potonikaらの報告18)によるセリンプロテアーゼのeQTLマーカーTe945
は ，セ リン プロ テアー ゼ遺 伝子 Cxp1 内 の１ 塩基 多型２）ミスマッチプライマー法（SNP）を検出するマーカーであるが，セリンプロテア

大系LM1型遺伝子特異的増幅プライマー（LOX48.3）

ーゼｍRNAの発現量の多寡と関係することが明らかと及び正常型遺伝子特異的増幅用プライマー（LOX50）

なっている．そこで，Te945に関する日本の大麦品種・のいずれにおいても，遺伝子型に対応した目的増幅産物

系統の遺伝的変異について分析した．

（555bp）が得られた（第４図）．非特異的増幅バンド

その結果，ビール用品種では供試したすべての品種・も見られたが，本法によって目的遺伝子の有無が判定で系統がセリンプロテアーゼｍRNA高発現型であるタイ

きた．ただし，ホモ／ヘテロについては，1種類のマープⅠ（増幅産物長196bp）であった(第４図，第２表)．

カーのみでは判定できないので，目的に応じてプライマ

食用品種では皮麦，裸麦ともに低発現型のタイプⅡ（増ーを使い分ける必要があると考えられた．例えば，連続幅産物長291bp）のほうが多かった．

戻し交雑による大系LM-1型Lox-1 遺伝子の導入には大系

今後のビール大麦育種では低発現型のタイプⅡ遺伝子

LM1型特異的増幅プライマーを用いて，555bpバンドのを導入することにより，過剰な麦芽タンパク質分解を抑得られる個体選抜を行う．また，大系LM1型のホモ固定制した系統が効率的に選抜できる可能性がある．

系統（＝LOX欠損系統）の選抜には正常型特異的プラ

ただし，本マーカーはeQTLマーカーであるため，実イマーを用いて，555bpバンドの得られない系統を選抜際のプロテアーゼ活性との関係，さらに麦芽タンパク質する．

分解程度との関係について評価する必要がある．タイプ
正常型特異的プラ
イマーによる増幅555ｂｐ

Ⅱ遺伝子を持つ木石港３やAlexisは栃木分場では頻繁に育種利用してきた品種であるので，これまでの育成中断
系統の中にはタイプⅡ遺伝子をもつ系統もあると思われ，それらの再発掘，データ利用も含めて今後の研究が重要

LM1型特異的プラ
イマーによる増幅

である．

555ｂｐ

ＬＭ１型
ホモ

第４図

ヘテロ

正常型
ホモ

ミスマッチプライマー法によるLox‑1遺伝子
型の判別

49

栃木県農 業試験場 研究報告

291ｂｐ
196ｂｐ

諸形質のDNAマーカー分析により判定した主要品種・系統の遺伝子型

セリンプロ 縞萎縮病 うどんこ病
秋播性
テアーゼ
抵抗性
抵抗性
Vrn-H2
Cxp１
ｒym5
mlo
Te945マー E31/M41 om2マー ZCCT-Ha/b
カー
マーカー
カー
マーカー
1)

Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
5)
ND
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ

セリンプロテアーゼCxp1遺伝子型の品種
間差異

タイプⅠ（高発現型）＝196bpバンドをもつタイプⅡ（低発現型）＝291bpバンドをもつファイバースノウ

木石港３

イチバンボシスカイゴールデン

ｱｻｶｺﾞｰﾙﾄﾞ
ｱｽﾞﾏｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ
おうみゆたか
関東二条29号
きぬか二条
きぬゆたか
きぬ二条12号
ｺﾞｰﾙﾃﾞﾝﾒﾛﾝ
こまき二条
さきたま二条ｻﾁﾎｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ
さつきばれ
ｽｶｲｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ
ｼﾊﾞﾘｰ
大系HO4
ﾀﾞｲｾﾝｺﾞｰﾙﾄﾞ
つゆしらず
とね二条
なす二条
ﾆｼﾉｺﾞｰﾙﾄﾞ
ﾆｭｰｺﾞｰﾙﾃﾞﾝにらさき二条はるな二条
ほうしゅん
ﾐｶﾓｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ
ﾐｻﾄｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ
ﾐﾊﾙｺﾞｰﾙﾄﾞ
ﾐﾎｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ
みょうぎ二条ﾔｼｵｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ
ﾔﾁﾎｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ
関東二条34号
九州二条16号
新田二条19号
新田二条20号
新田二条21号
中間母本農1号
栃系216
栃木ｺﾞｰﾙﾃﾞﾝﾒﾛﾝ
ほしまさり

しゅんれい

あかぎ二条

ミカモゴールデン

品種・系統名

あまぎ二条

はるな二条

ＡＬＥＸＩＳＰＲＯＣＴＯＲＢＯＬＩＶＩＡ

ＭＯＲＥＸ

第２表

第５図

第59号

-2)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

3)

Del
Ｉｎ
Del
Ｉｎ
ND
Del
Ｉｎ
Ｉｎ
Ｉｎ
Ｉｎ
Ｉｎ
Del
Ｉｎ
Del
Ｉｎ
Del
Del
Del
Ｉｎ
Ｉｎ
Del
Del
Ｉｎ
Del
Ｉｎ
Del
Del
Del
Ｉｎ
Ｉｎ
Ｉｎ
Del
Del
Ｉｎ
Ｉｎ
Del
Del
Del
Del
Del
Ｉｎ

4)

春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
春播型
ND
春播型
春播型

特性

品種・系統名セリンプロ 縞萎縮病 うどんこ病
秋播性
抵抗性
抵抗性
テアーゼ
Vrn-H2
Cxp１
ｒym5
mlo
Te945マー E31/M41 om2マー ZCCT-Ha/b
カー
マーカー
カー
マーカー

ビール用

りょうふう

Ⅰ

ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
ビール用
北海道品種

北育33号
北育39号
大系LM1
大系HG12
大系HG13
大系HG32
大系HG33
大系HH12大系HH27
大系HH43
大系HH8
大系HK69大系HM102
AlexisChariot
Maris Otter
Morex
Optic
Otis
Proctor
木石港3
ｶｼﾏﾑｷﾞ
ﾌｧｲﾊﾞｰｽﾉｳ
べんけいむぎ関東皮78号
関東皮82号
西海皮60号
東山皮100号
東山皮101号
東山皮102号
東北皮37号
東北皮38号
北陸皮35号
北陸皮38号
ﾆｼﾉﾎｼ
ｲﾁﾊﾞﾝﾎﾞｼ
ﾏﾝﾈﾝﾎﾞｼ
御堀裸3号
四国裸103号
赤神力

Ⅰ
Ⅰ
ND
ND
ND
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Ⅱ
Ⅱ
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Ⅰ
Ⅱ
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Ⅱ
Ⅱ
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Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅱ
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Ⅱ
Ⅱ

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特性

Ｉ
ｎ

春播型

北海道品種

Ｉ
ｎ
Ｉ
ｎ
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In
In
ND
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Ｉ
ｎ
Ｉ
ｎ
Ｉ
ｎ
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ｎ
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ｎ
Ｉ
ｎ
Ｉ
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Del
Ｉ
ｎ
Ｉ
ｎ
Ｉ
ｎ
Ｉ
ｎ
Del
ND
Ｉ
ｎ
ND

春播型
春播型
春播型
秋播型
秋播型
秋播型
秋播型
秋播型
秋播型
秋播型
秋播型
秋播型
秋播型
春播型
春播型
秋播型
春播型
春播型
春播型
春播型
秋播型
ND
秋播型
秋播型
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
春播型
秋播型
秋播型
ND
春播型
ND

北海道品種
北海道品種
Karl突然変異
秋播性中間母本
秋播性中間母本
秋播性中間母本
秋播性中間母本
秋播性中間母本
秋播性中間母本
秋播性中間母本
秋播性中間母本
秋播性中間母本
秋播性中間母本
mlo-9 品種
mlo-11 品種
秋播性品種
外国品種
外国品種
外国品種
外国品種
外国品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用六条品種
食用皮麦
裸麦
裸麦
裸麦
裸麦
裸麦

１） Cxp1遺伝子型： I … タイプⅠ（高発現型）; Ⅱ … タイプⅡ（低発現型）
２） rym5遺伝子型 ：＋ … rym5を有する; − … rym5をもたない; （＋）… 誤判定品種（rym5をもたない品種であるがバンド検出）３） mlo遺伝子型 ： In … 挿入型(1000bpバンド); Del…欠失型（750bpバンド）
４） Vrn-H2遺伝子型： 関東二条29号、ヤチホゴールデンは播性Ⅲの秋播性をもつが、マーカー判定は春播型（本文参照）
５） ＮＤ…供試せず

50ビ ール大麦 の主要形 質DNAマーカ ーの開発 ・評価と育 種利用上 の問題点

３．縞萎縮病抵抗性遺伝子rym5の遺伝子型判別の集団中ではrym5遺伝子型と連鎖が保たれているが，縞萎縮病抵抗性遺伝子rym5 はミサトゴールデン，ミ裸麦や外国品種などでは連鎖していないケースが多いマ

カモゴールデンやタカホゴールデンの縞萎縮病抵抗性品

ーカーであると考えられた．今後，rym5 遺伝子につい種がもつ抵抗性遺伝子である．rym5 を有する系統は縞ては他のSNPマーカーなどの検討により，より汎用性の萎縮病Ⅰ型ウイルスには抵抗性だが，Ⅲ型ウイルスに対高いDNAマーカーを選択・利用する必要があろう．

しては罹病するため 20,12) ，Ⅲ型ウイルス汚染地帯が大ただし，rym5 遺伝子はビール大麦育種のなかでも重きくなった栃木県ではⅢ型，Ⅰ型の両ウイルス系統に抵要性が高く，早急に選抜開始する必要がある．現在の育抗性を示すrym3 遺伝子がおもに育種利用されている．

種状況においては，日本のビール大麦品種からrym5 を

しかし最近，栃木県北部で見つかった新たな縞萎縮病ウ

導入しようとする交配組合せがほとんどである．したがイルスレースに対しては抵抗性遺伝子がrym3 あるいはって，E31/M41マーカーの利用が可能と判断される組合

rym5 を単独で有する品種・系統は罹病し，rym3 とrym5

せが大半であり，汎用性の高いDNAマーカーの開発まを併せもつ品種・系統(スカイゴールデン，栃系331なでの当面の間は，本マーカーでの選抜を進めることが望ど)のみが抵抗性を示すことからrym5 の重要性が再認識

ましいと思われる．

未発表）．

一般に病害抵抗性育種においては，抵抗性遺伝子の集そこで，rym5 と強く連鎖することが報告されている

積(ピラミディング)が有効な手法であることが知られてSTSマーカーE31/M41を栃木分場での育種に利用するたいる．縞萎縮病はビール大麦生産に対して過去に壊滅的めに，マーカーの評価を行った．rym5 遺伝子型が既知な影響を与えた経緯もある重要病害であるため，栃木県の品種・系統を用いて評価した結果，日本のビール大麦

北部の新ウイルス系統や今後見つかるであろうウイルス

品種・系統では450bpバンドの有無とrym5 遺伝子型が完系統への育種的対応が不可欠である．栃木分場のⅢ型ウ

全に一致し，抵抗性品種のみに450bpバンドが現れた

イルス汚染圃場でのrym3選抜とE31/M41マーカーあるい（第６図，第２表）．

は今後開発されると思われる汎用性の高いマーカーを用されてきた（加藤らいたrym5 選抜を併用することにより，rym3 とrym5 を併せ持つ系統の選抜が今後の育種においては重要である．
約450ｂｐなす二条

ＰＲＯＣＴＯＲＡＬＥＸＩＳ

ＭＯＲＥＸ

はるな二条

あまぎ二条

しゅんれい

ミサトゴールデン

ミカモゴールデン

スカイゴールデン

木石港３

４．うどんこ病抵抗性遺伝子mloの遺伝子型判別
ミカモゴールデン，あまぎ二条，はるな二条など古い品種の多くがうどんこ病抵抗性をもたないが，タカホゴ
ールデン以降の新しい育成品種はほとんどが抵抗性をもつ．ただし，日本品種が持つうどんこ病抵抗性はタカホ

第６図

縞萎縮抵抗性遺伝子rym5に連鎖する
E31/M41マーカーに関する品種間差異

rym5を有する品種:木石港３､ｽｶｲｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ､ﾐｶﾓｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ､
ﾐｻﾄｺﾞｰﾙﾃﾞﾝ､しゅんれい

ゴールデンの系譜上のMonaやミハルゴールドの系譜上のSpartanに由来するMla9 やMlkなど少数の抵抗性遺伝子に依存している 11,28) ．うどんこ病は数多くの抵抗性遺伝子が報告されているが9)，うどんこ病菌レースの変化

しかし，MorexやChariotなど一部の外国品種や，裸麦品種などにはrym5を持たないにもかかわらず，450bpバに伴う「抵抗性の崩壊」が欧州では問題となっており，抵抗性遺伝子源の拡大が重要課題となっている．

ンドが見られ，誤判定が生じることが分かった(第２表

本項でとりあげるMlo座のうどんこ病抵抗性遺伝子にの網掛け品種）．近中四農研大麦研究チームでの実験でついては抵抗性機作が他の抵抗性遺伝子と異なり，すべも，E31/M41マーカーについては，裸麦品種ではrym5遺ての菌系に対して抵抗性を示し，抵抗性の崩壊が見られ伝子型と対応がとれないとのことである（近中四農研・ていないことから，持続性の高い抵抗性遺伝子として期

柳澤貴司氏私信）．また，Strackeら 21) はrym5 遺伝子

近傍領域の132kbの中にSNPsなど90種類程度の変異を報告している．
これらのことから，E31/M41マーカーは変異に富んだ
rym5遺伝子近傍領域の変異検出マーカーであり，遺伝的変異がごく限られている日本のビール大麦品種・系統待されている8,17)．
そこで，本項ではTacconiら 17)が開発したmlo遺伝子５'
上流域（−2.3kb)のIn/Del変異を検出するom2マーカー
を栃木分場での育種に利用するための評価を行った．
Mlo座の抵抗性遺伝子をもつ外国品種Alexis (遺伝子：mlo-9 ),Chariot(mlo-11 )はいずれも高分子バンド51

栃木県農 業試験場 研究報告

第59号

（1000bp）をもつIn型であったが，うどんこ病抵抗性をして，出穂は比較的早い「秋播型早生」の育成が求めら持たないあまぎ二条，ミカモゴールデンなど一部の日本

れている．

品種にもIn型の品種が見られた（第７図，第２表）．一大麦の播性(低温要求性)にはVrn-H1 座（旧称：Sh2 座，方，スガイゴールデンやサチホゴールデンなど最近の品

座乗染色体 5HL），Vrn-H2 座（Sh座，4HL），Vrn-H3種・系統の多くでは抵抗性外国品種とは異なる低分子量座（Sh3 座，1HL）の３遺伝子座が関わっており，秋播

バンド（Del型，1000bpバンド）がみられた．

性となるのはvrn-H1 ，Vrn-H2，vrn-H3 の組合せの場合に限られる24）．

1000ｂｐ（In型）
750ｂｐ (Del型）

本項ではこのうち，Vrn-H2 遺伝子について解析を行った．Vrn-H2 座のSTSマーカーZCCT-Ha/bについて，秋

ミカモゴールデン

あまぎ二条

サチホゴールデン

スカイゴールデン

ＣＨＡＲＩＯＴＡＬＥＸＩＳ

播性程度が既知の主要品種や栃木分場育成系統を材料として，日本品種に対するマーカーの適合性を評価した．
その結果，秋播性Vrn-H2 遺伝子を持つ標準品種Maris
Otterと同様の350bpバンドが，栃木分場で育成した秋播性系統である大系HG32，大系HM102や，六条品種マン
ネンボシ，ファイバースノウなどの秋播性品種・系統で第７図みられた（第８図，第２表）．しかし，栃木分場で育成

うどんこ病抵抗性mlo遺伝子型と連鎖するom2マーカーに関する品種間差異

し，これまで秋播性を有すると考えてきたヤチホゴール

mlo遺伝子を有する品種はALEXIS､CHARIOTのみ。

デン，関東二条29号（いずれも播性はⅢ）ではバンドが検出されず，春播型Vrn-H2 遺伝子を有すると判断されMlo遺伝子領域あるいはその近傍では多数のSNPsやIn/た（第８図）．この原因としては，１）大系HG32など

Del変異が報告されている 23) ．日本のビール大麦品種・の秋播性程度（Ⅳ以上）に比べると，ヤチホゴールデン系統の系譜上にはmlo遺伝子をもつ抵抗性品種はほとんなどの秋播性程度は低いことから，本来は春播型の遺伝

どない．Alexisなどmlo遺伝子を有する外国品種と同じIn子型であるにもかかわらず感光性，純粋早晩性などの影型に分類された日本品種の多くはうどんこ病罹病性であ響も受ける圃場での播性検定試験において，秋播性と誤り，mlo遺伝子をもたないことは明らかである．すなわ

判定された可能性，２）ヤチホゴールデンなどの秋播性

ち，om2マーカーに関する日本品種の多型はMlo遺伝子

遺伝子が本マーカーでは検出できない可能性，が考えら

領域の多様性に起因するものであり，いずれのタイプとれた．

もに日本品種ではmlo遺伝子とは連鎖していない．

すなわち，本マーカーではヤチホゴールデンタイプをしたがって，rym5遺伝子に対するE31/M41マーカーと選抜することはできないが，栃木分場で秋播性早生遺伝

同様，mlo遺伝子に対するom2マーカーの利用は限定的

子源として，交配利用している品種・系統の多くが検出とならざるを得ない．すなわち，om2マーカーを用いて可能であった．秋播性の選抜は圃場での選抜には多くのはAlexisやChariotのmlo遺伝子を導入しようとする場合，労力がかかるため，DNAマーカー選抜が今後特に重要交配母本とする日本品種はDel型のものに限られる．Inになると思われる．

型の母本に対して，DNAマーカーによりmlo遺伝子を導なお，今後十分な検討が必要であるが，Vrn-H1 座に入するには，om2マーカーとは異なる抵抗性品種のみを関するDNAマーカーを用いた予備実験の結果では日本グループ化するマーカーの開発が必要であると考えられのビール大麦品種・系統では秋播型遺伝子をもっている

た．ただし，先述の通り，交配母本として頻用されるサものが多いと思われた（未発表）．Vrn-H3 座について

チホゴールデンなど最近の優良育成品種の多くはDel型

は，春播性遺伝子を持っているのはエチオピア在来種なであり，In型母本用のマーカーは相対的には必要性が低

ど特殊なものに限られるため 24） ，日本品種の育種ではい．

当面は意識する必要はないと考えられる．

５．播性遺伝子 Vrn‑H2 の遺伝子型判別
ビール大麦では一般に早生品種ほど茎立期が早く，早春の低温による幼穂の凍霜害を受けやすい26,19,7) ．そのため，秋播性（低温要求性）を導入して，茎立期を遅く

52

ビ ール大麦 の主要形 質DNAマーカ ーの開発 ・評価と育 種利用上 の問題点

謝辞
本研究の一部は農林水産省指定試験事業，プロジェク
ト研究「低コストで質のよい加工・業務用農産物の安定
約350ｂｐ

関東二条２９号

ヤチホゴールデン

スカイゴールデン

ミカモゴールデン

ファイバースノウ

マンテンボシ大系ＨＭ１０２

大系ＨＧ３２ＭＡＲＩＳ ＯＴＴＥＲ

第８図

供給技術の開発」および農林水産研究高度化事業「極低ポリフェノール大麦を利用した機能性食材の新規用途開発」により実施したものである．研究材料の養成，分析には大塚孝，田中良張，荒川秀樹の諸氏に協力いただいた．ここに記して感謝の意を表する．

播性に関わるVrn-H2遺伝子型の品種間差異

引用文献
６．今後の課題
上述のように，今回供試したrym5 ，mlo，Vrn-H2 に関

1. Douma, A.C., Doderer, A., Cameron-Mills, V.,
Skadhauge, B., Bech L.M., Schmitt, N., Heistek,

わるDNAマーカーは外国品種での研究をもとに開発さJ. C. and Van Mechelin, J. R. (2002)

れたマーカーであるために，日本品種や一部の外国品種

Low-lipoxygenase 1 barley. International Patent Treaty

では適用できない事例が見られた．今後，適用できない

Publication W02002/053721.

ケースが少ない（汎用性が高い）マーカーの開発が望ま

2. 林敬子・橋本憲明・太源正明・芦川育夫 (2002)アレれる．しかし，現在の栃木分場でのビール大麦育種におル特異的PCRマーカーをもちいたSNPs検出の安定性．

いて，今回のマーカーで選抜できないケースは限定的で育種学研究4(別2)：265.

ある．圃場選抜の難しい形質もあり，DNAマーカーを早期に利用する必要がある．

3. Hirota, N., Kaneko, T., Kuroda, K., Kaneda, H.,
Takashio, M., Ito, K. and

Takeda, K. (2005)

DNAマーカーを効率的に育種利用するためには煩雑

Characterization of lipoxygenase-1 null mutants in

なDNA抽出法の簡略化や，さらに多くの形質に関わる

barley. Theor. Appl. Genet. 111:1580-1584.

DNAマーカーの開発・評価が望まれる．重要性や開発

4. Hirota, N., Kuroda, K., Takoi, K., Kaneko, T.,

実現性が高いDNAマーカーとしては以下の形質が考え

Kaneda, H., Yoshida, I., H., Takashio, M., Ito,

られる．１）ビールの低温混濁や食用麦の炊飯後褐変のK. and

原因物質であるポリフェノール含量を著しく低下させる

of malted lipoxygenase-1 null barley and effect on the

効果のあるプロアントシアニジンフリー遺伝子ant28 や，flavor stability of beer. Cereal. Chem. 83:250-254.

２）縞萎縮病抵抗性遺伝子としてもっとも利用頻度が高

Takeda, K. (2006）Brewing performance

5. 日浦運治・部田英雄(1957)

いrym3 ，３）西日本で汚染が拡大しているマイルドモる研究

ザイク病に対する抵抗性を発揮する抵抗性遺伝子rym1，

連鎖．農学研究45:14-48.

第12報

オオムギの耐病性に関す

ウドンコ病に対する抵抗性遺伝子の４）プロアントシアニジンフリー系統の共通の問題であ6. Ikeda, T.M., Nagamine, T., Fukuoka, H. andる穂発芽耐性14)を改良するための休眠性，などである．

Yano, H. (2002）Characterization of new low

今後もますますゲノム情報開発は進み，新たな情報を

molecular-weight glutenin subunit genes in wheat.

育種に生かす努力を続ける必要がある．圃場での農業特

Theor. Appl. Genet. 104:680-687.

性の選抜，製麦による麦芽品質分析と，DNAマーカー

7. 稲垣正典・増田澄夫 (1984) オオムギにおける節間伸による選抜，といった育種３要素への研究資源（労力，

長期の品種間差異について．育雑．34:191-196.

研究費など）の配分の最適化が重要な課題となる．育種

8. Jorgensen,J. H. (1984) Durability

材料・集団のレベル，選抜対象形質に対するDNAマー

powdery

カーの効果，研究員人数などによって，最適配分は変化

Vortr.Pflanzenzuchtg.6:22-31.

する．状況に応じて，柔軟かつ大胆に配分変更していく
ことが，優良品種の効率的育成には不可欠である．

mildew

resistance

genes

of

the

ml-o

in

barley.

9. Jorgensen,J. H. (1993) Cordinator's report: Disease
and pest resistant genes. Barley Genetics Newsletter 22:
110-131.

53栃木県農 業試験場 研究報告

第59号

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エステラーゼアイソザイム同位酵素遺伝子

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