アスパラギン酸プロテア ー ゼ類の蛋白工学的改変によるケラチナ ー ゼの開発
束京大学大学院理学系研究科井上史

英An aspartic proteinases, proctase B from Aspergillus niger var. macrosporus, was preparedby two types of heterologous systems, i.e., an expression- in vitro refolding system using
Escheガchia coli and an expression-secretion system using Bacillus brevis. Both of the systems gave
potentially active proproctase B, which was converted into the mature form under acidic
conditions (pH ;;, 5) by autoprocessing. The completely processed form had almost the same
properties with native proctase B although their N-termini were different from each other. TheB. brevis expression system yielded proproctase B corresponding to 50 mg of active proctase B
per one liter of culture. The replacement of Arg6 or Lys7 in the prosequence with glutamine
increased the yield up to 120 mg. These expression systems, especially the B. brevissystem, enable
us to alter the properties of proctase B by site-directed mutagenesis and to study the relationships
between the structure and substrate specificity of proctase B to increase the activities toward
keratin and collagen.

1緒

言

蛋白質を消化する機能を持たない、ケラチンを分解するプロテア ー ゼはケラチナ ー ゼと総称されるが、ケラチナ ー ゼに関する研究は少ない。

皮府は身体を被覆することにより、体内の諸器官が外部から種々の刺激や傷害を受けることを防

皮府感染を起こす菌として Candida 属が知られ御する。 表皮の最も外側にあって、この重要な役るが、これらは菌体外にアスパラギン酸プロテア割を担っている角質層は化粧品学においても非常ーに重要な身体組織である、角質層を構成する成分

ゼはケラチンや コ ラ ー ゲンを分解する活性を持つとして主要なものはケラチンと呼ばれる蛋白質でことが報告されている。 アスパラギン酸プロテアある。 ケラチンは不溶性であり、かつ種々の要因ーに対して抵抗性が強く、このことにより身体の最おいてもペプシン、レニン、カテプシンD•E等、生外層の構成成分としての重要な役割を果たすと考理機能の異なる他数の分子種が存在している。 こゼを分泌する。 このアスパラギン酸プロテア ーゼは、真核生物に広く存在しており、哺乳類にえられる。 しかし 方では、このような性質のたれらは構造や触媒機構において共通性を持っておめにケラチンは生化学的には非常に扱いにくい蛋

り、同 一の起源から進化したと考えられる。 我々

白質であり、研究は進んでいない。 蛋白質を分解が本研 究 で 用 い る糸状菌 Aspergillus niger var.

一macrosporus が分泌するアスパラギン酸プロテアする酵素プロテア ー ゼは、これまでに多くの生物ー種から非常に多数の分子種が単離され研究されてれているが，きているが、そのほとんどは、身体の強靭な組織“を構成するケラチンや コ ラ ー ゲンなどの 固いゼ（プロクタ ー ゼB) 1 . 2) は消化薬として用いら
コ ラ ー ゲンを分解する コ ラゲナーゼ活性を持つことが知られている l)”0

プロテア ゼかケラチンや コ ラ ー ゲン等を分解ー

Study on the relationship between structure

するための必要条件は何であるのか、あるプロテand karatinase activity of aspartic

ア ー ゼを改変してこのような蛋白質に対する活性proteinases.

を高めるためにはどうすれば良いのか。 このようHideshi Inoueな点を明らかにし、ケラチン分解活性を持った新規な酵素を蛋白工学的に創生することは皮屑科学

The University of Tokyo

や化粧品学の基礎研究・応用に役立つと思われる。

-24-

アスパラギン俄プロテア ー ゼ類の蛋白工学的改変によるケラチナ ー ゼの開発

リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に対し透析した。

また、 ケラチン含有組織を蛋白質資源として有効利用することにも応用されることが期待される。

2·2

そこ で本研究では、 種々のアスパラギン酸プロテ

アッセイ

ゼ活性

蛋白質分解活性は、 pH2 ( リン酸ナトリウム）を付与または増強することを目的とし、 アスパラで酸変性したヘモグロビンを基質として用いて行ギン酸プロテア ー ゼの大量発現系を構築し、 部位った 5) 。

アーゼを改変することにより、 ケラチ ナー特異的変異を行うことにより発現量の向上を行っ
2·3 Bacillus brevisによる発現系の構築た。

ヒト・ ペプシノ ー ゲンA、 ヒト・ カテプシンE、2実及び A. niger var. macrosporus 由来プロクタ ー ゼ験B のc DN A の プ ロ 体 部 分 を コ ー ド する領域を2·1

polymerase chain reaction 法により増幅し、 発大腸菌による発現系の構築
ゲンA、ヒト・カテプシンE、及び、現ベクターpNU211R2 L5 6) に組み込んだ。 これを

A. niger var. macrosporus由来プロクタ ー ゼBのB. brevis HPD3 1株に導入し、 PY-1培地中 で培養しcDNAのプロ体部分をコ ードする領域をpolymeraseた ” 。 以下に、プロクタ ー ゼBについて行った手順

chain reaction法により増幅し、 それぞれT7プロを述べる。 培養上清を集め、 60- 80%硫安で沈殿ヒト・ペプシノ ーに組みする画分を集め、 プロプロクタ ー ゼBの部分精込み、 大腸菌BL2 l (DE3 )に導入した。 発現に用製試料とした。 また、 培養上清に塩酸を加えていたプラスミドが各プロテア ー ゼ前駆体を正しくp H2 . 2 とし、 3 7℃で10 分処理した後、遠じヽしてモコーー

ターを持つ発現ベクター4)

p AR211 3

ド していることを、 DNAシ ー クエンシングにより確認した。 クローン化した形質導入株を沈殿物を除き、60%飽和硫安で沈殿させた画分をプロクタ ー ゼBの部分精製試料とした。

M9ZB培地で培養し、 イソプロピルチオガラクトピラノシドを加えることにより発現を誘導した。 培

2·4

部位特異的変異変異をデザインした合成オリゴDNAを用いて、養後、 集菌した菌体をリゾチ ー ム処理、 超音波破ゼKunke lの方法 8) によりプロクターゼBcDNAに変Bにおける実験手順を記す 。 溶菌 後遠心して封異を導入した。 発現に使ったプ ラスミドは変異が入体を沈殿させ、 8 M尿素、lOOrnM 2

正しく導入され ていることをDNAシ ー クエンシ

砕処理により溶菌した。 以下にプロプロクターー

メルカプ

トエ タ ノ ー ルを含むトリ ス ー 塩酸バッファ ー(pH8)で変性 プロプロクターングにより確認した。

ゼBを抽出した。 透析

3

して変性剤と還元剤を取り除くことによりリフォー

果ルディングを行った。 遠心して上清をとり、

DE52 カラムに吸着させた。

3·L 大腸菌による発現
ヒト・ ペプシノ ー ゲンA 、 ヒト・カテプシンE、

0-0. 5M NaCl の直線濃度勾配によりプロプロクター結ゼBを溶出し、 潜在活性をもつフラクションを及びA.n屯er var. macrosporus由来プロクタ ー ゼBの集めた。

cDNAのプロ体部分をコ ー ドする領域をそれぞれT7

次にPhar-macia LKBのSuperose6 HRカラムを用い

プロモ ー タ ー を持つ発現ベクタ ー に組み込み、 大てゲル濾過を行い、 さらに20mMトリエタノ ー ルア

腸菌BL2l(DE3)による発現を行った。 その結果、

ミン緩衝液(pH7. 3)に対し透析した後MonoQカラ

プロクタ ー ゼBにおいて、 完全長のプロ体 蛋白ムに吸着させ、0 -lM NaCl濃度勾配により溶出質が大量に(1リットル培養液中200mg以上）発現した。 潜在活性を持つフラクションを集め、lOrnMした。 ただし、 発現したプロプロクタ ー ゼBの-52 -大部分は、 不溶性の封入体を形成しており、 活性発現し たプロプロクタ ー ゼBは、 ヘモグロビンを持たなかった。 そこで、 大腸菌を溶 菌後、 遠心を用いたアッセイにより、 1リットル培養液あ分 離 に よ り封入体を分離し、 8M 尿素と100mたり約 50mgのプロクタ ー ゼ B活性に相当するとM2 ー メルカプトエタ ノ ー ルにより可溶化する画見積もられた。(Fig. 1)

分を集め、 透析して尿素と2 ー メルカプトエタノ ー
3·3 組み換え発現により得たプロクタ ー ゼBとルを取り除くことによりリフォ ー ルディングを行

天然プロクタ ー ゼBとの比較った。 その結果、 酸性条件Fにおいて変性ヘモグロビンを基質に用いたアッセイにより酸性プロテ大腸菌で発現して精製したプロプロクターゼB、ア ー ゼの活性が認められた。 このプロプロクタ ー

B. brevis から得られたプロプロクタ ー ゼ B 、 いずれゼ B は、 DE52 、 Superose HR 、 MonoQによるカラも酸性条件下で、 SDS-PAGE上で天然のプロクタ

ムクロマトクラフィ ー により精製され、 SDS-PAGEゼBと等しい移動度を示す活性型成熟体に変換し、上で単 一 のバンドになった。 この完全精製物の収他のプロテア ー ゼ活性を必要とせすに、 自己触媒量は1リットルの培養液から1 mgであった。 一方、的にプロセッシングすることが明らかになった。

ヒト ・ ベプシノ ー ゲン A は完全長の 蛋白質を発得られる成熟 型プロクタ ー ゼBは天然のも のと現させることが出来なかった。

等しい比活性や性質(pH依存性等、Fig. 2)を持ち、3·2

B. brevis による分泌発現系の構築

ー100

B. brevis は菌体外に大量の蛋白質を分泌 するこ80

要蛋白質のシグナルベプチドと種々アスパラギン

20

現を行った。 その結果、 ベプシノ ー ゲンA の発40酸プロテア ー ゼのプロ体との融合蛋白質の分泌発60[l!
A!
P U 0A!IB10l!とが知られている。 そこで、 B. brevis の 菌体外主―ー―

現量はた いへん少な く 、 またプロカテプシンE3の発現は全く検出できなか ったが 、プロプロクpH

タ ー ゼBについては潜在活性の発現が見られた。

--0- Proclasc B●Recombinant proproctuse B゜―- ― - ―05('!
O
877 70Hd

Fig.2プロクタ ー ゼBと組み換えプロプロクタ ー ゼBの活性のpH依存性
正しい高次構造を持ったプロクタ ー ゼBが得ら

600

゜
。

500

200
100-·210

セッシング部位は異なっており、 組み換え体のN 端はいずれの発現系を用いた場合も 天然のものより2残基長かった。

Activity (U/1)
OD660

3Culture day4゜。

——--0-すなわちプロ体から成熟体を 精製するときのプロ0990 0(1/n)Al!
＞lp<4300れたと考えられた。 しかしながら、 N端の配列、このことはA. n 屯er var. macrosporusにはプロプ

5ーロクタ ー ゼBが自己触媒的に活性化した後に さらにN端の2残基を切断するプロテア ー ゼが存在することを意味する。 ただし、 このことは組み換え発現系を用いてプロクタ ー ゼBの機能改変を行Fig. 1 8. brevis によるブロプロクタ ー ゼB分泌発現の経時変化

うことにおいては全く影響がない。

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アスパラギン俄プロテア ー ゼ類の蛍白工学的改変によ←るケラチナ ー ゼの開発

2010ANB
PGA
PCE

4030

APAPTRKGFTINQIARPANKTRTINLPGMYARSLAKFGGTVPQSVKEAA' '= ====IMYKVPLIRKKSLRRTLSERGLLKDFLKKHNLNPARKYFPQWEAPTL..,... ·: ,,,,''",. '===QGSLHRVPLRRHPSLKKKLRARSQLSEFWKSHNLDMIQFTES====.....,....
Fig.3ブロ配列の比較
ANS: A. niger var. macrosporus proctase B PGA: Human pepsinogen A
PCE: Human procathepsin E 二重下線：塩碁性アミノ酸残茎

3·44プロ配列の改変による発現量の向上

考察

ベプシノ ー ゲンAとプロカテプシンEはプロ配列のN端近傍に塩基性アミノ酸残基が多数存在しプロクタ ー ゼBの発現系を大腸菌及びB. brevisをているのに対し、 プロクタ ー ゼBでは塩基性残用いて構築した。 特に B. brevisによる分泌発現系基が比較的少ない (Fig, 3) ことから、 N端近傍のの方がいくつかの点で大腸菌による系に比べてす塩基性残基の存在が分泌発現において不利な要因ぐれていると考えられる。 すなわち、第 一に、となる可能性が考えられた。 そこで、 プロクタ

B. brevisによる発現系ではリフォ ー ルディングのゼBプロ配列の6位のアルギニン残基と7位の処理をすることなく潜在活性型のプロ体を大量にーリジン残基をそれそれグルタミンに変換した変異発現できる。 第二に、 B. brevis の系では菌体外に体(R6Q及びK7Q変異体）を部位特異的変異法によプロプロクタ ー ゼBを分泌するのでB. brevis由来のり作製した。 その結果、いずれの変異体において蛋白質の混入が少ない。 第三に、活性型プロクタも発現最が上昇し、R6Q変異体ではlリットル培養ーゼBの収星がB. brevisの系の方が多い。 発現量はゼBのプロ配列N端近傍の塩基性残基を減らす ことに発現が見られた(Table 1)。 これらのプロ体は野より増加したが、このことは他のアスパラギン酸

生型プロ体と同様に酸性条件下で自己触媒的に速プロテア ー ゼにも応用できるものと考えられる。

液あたり120mgの潜在活性型プロプロクタやかに活性型成熟体に変換した。

一ー方、16、22、すなわち、 プロプロクタ ー ゼBよりもヒト ・ ペ32位のアルギニン、20、36、46位のリジンは、いプシノ ー ゲンAやヒト ・ カテプシンEの方がプロ配ずれをクルタミンあるいはアスパラギンに変換し列N端近傍が塩基性残基に富んでおり、このことても発現量の増大が見られなかった。

が B. brevis による分泌発現に不利である可能性が考えられる。 今後検討の余地がある課題である。
第四に、 B. brevis が活性型アスパラギン酸プロテ

Tab I e I 8. brevisによるブロプロクターゼBの発現部位特異的変異による発現岳の増大

ア ー ゼを菌体外に生成することは、種々の変異体の活性の測定を簡便にし、 目的とする基質（ケラチン）を含んだ寒天培地を用いることにより、一Proproctase BMedium

Amounts of ANB

度に大巌の変異体のスクリ ー ニングを行うことが可能であると考えられる。 また、栄養源をケラチ

Wild type
R6Q
K7Q
R6Q

『5 PY
5'PY
5'PY
5'PY + 0.3% glycine

ンに制限することによってケラチナ ー ゼ活性発現

50mg
90mg
80mg
120 mg菌の選択も可能かもしれない。 また、プロクタ ーゼBのコラ ー ゲ ン 分解活性を増強する研究も同様に行うことが可能である。

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5

総括

A. niger var. macrosporus由来プロクタ ー ゼBを大腸菌及びB. brevis を用いて発現し、活性型酵素を得た。 特にB.brevis の系ではプロ配列を改変することにより、1リットルの培養により120mgの活性型酵素を分泌発現させることに成功した。 このことは他のアスパラギン酸プロテア ー ゼ類を発現させる上でも重要な指針を提供すると思われる。
また、この活性型酵素の菌体外高発現系を利用することにより、改変酵素の作製と検索を容易に行うことが可能となった。
引用文献
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