メラニン色素合成の解明に向けて〜チロシナーゼ関連タンパク質の金属要求性に関する基盤研究〜
京都大学大学院生命科学研究科

神戸大朋

Melanin biosynthesis requires tyrosinase protein family consisting of tyrosinase (TYR), tyrosinase-related protein 1(TYRP1), and tyrosinase-related protein 2 (TYRP 2). These three proteins show high sequence identify. TYR has oxidase
activity, and possesses two copper ions coordinated at the active center. The Golgi-resident copper transporter ATP7A playsa pivotal role in the coordination of TYR with copper. In contrast, the coordination metals for TYRP1 and TYRP2 have notyet been clarified, although it was suggested that they have a homologous structure to TYR, and thus copper ions would becoordinated at their active site. The crystal structure of TYRP1 was recently reported, which showed that TYRP1 has homologous structure to TYR, as expected. However, it was a surprising result that the coordinated metals at the active center are
not copper ions but zinc ions. Currently, information about the metals coordinated at the active center of TYRP1 and TYRP2is complicated. In this study, we tried to address this unappreciated issue using the gene disruption/re-expression evaluation
strategy. We first confirmed that TYR activation requires ATP7A using the cells deficient in ATP7A gene. We then showedthat two Zn transporter (ZNT) complexes, specifically ZNT5-ZNT6 heterodimers and ZNT7 homodimers, which locate to
the compartments of the early secretory pathway, play essential roles for TYRP1 expression. Moreover, we showed that thecells deficient in both ZNT5 and ZNT7 genes changed the color from black to brown in cell pellets, indicating that both ZNTcomplexes contribute to melanin synthesis. These results provide novel insights into the molecular mechanism underlying
the melanin biosynthesis and TYRP1 expression.

1．緒

ヒト体内のタンパク質の中で亜鉛含有タンパク質は言

10 % 程度、また、銅含有タンパク質は多くても 0 . 5 % 程度

メラニン色素は、メラニン細胞においてメラノソーム中と予想されている 10 , 11）。細胞内におけるこれらのタンパで、チロシンから数段階の酵素反応を経て合成される 1 , 2）。

ク質の生合成や活性発現には、亜鉛や銅が正しく配位されこのメラニン合成に関わる酵素として、チロシナーゼる必要があるため、亜鉛や銅の運搬を担うトランスポータ（TYR）、チロシナーゼ関連タンパク質 1（TYRP 1）、チローは厳密に制御されている 12 , 13）。上述の通り、TYR の活シナーゼ関連タンパク質 2（TYRP 2）の３つが存在する 3 , 4）。

性中心に配位する銅は ATP 7 A により供給されるが 5）、本TYR は、活性中心に銅イオンを配位するタイプ３銅タン

研究では、TYRP 1・2 に亜鉛を供給する亜鉛トランスポパク質であり、そのモノフェノールモノオキシゲナーゼ活ーターが存在すると仮定して解析を実施した。尚、我々の性の発現には、活性中心への銅の配位が不可欠となる。ま

これまでの解析から、亜鉛要求性のエクト型酵素は、亜鉛た、この銅の配位にはトランスゴルジネットワークに局在トランスポーター複合体である ZNT 5 -ZNT 6 ヘテロ二量する銅トランスポーター ATP7A（メンケスタンパク質）が必体と ZNT 7 ホモ二量体が機能することが明らかとなって5）須の役割を果たす 。そのため、ATP 7 A の変異マウスはいるため 14 , 15）、これを指標とし、補因子の観点からメラいずれも斑模様やうすい色を特徴とする被毛を呈する 6 , 7）。

ニン色素生合成の一端を解明することを試みた。

一方、TYRP 1 と TYRP 2 に関しては、TYR と高い相同性２．方を有すること、さらに相同の活性部位を持つと予想される

法。このよう2. 1. 細胞培養、トランスフェクション、亜鉛・銅トランスポーター欠損株の作成な状況下、最近 TYRP 1 の結晶構造解析から、TYRP 1 はヒトメラノーマ細胞である SK-MEL- 2（JCRB 細胞バン

TYR と相同な活性中心を持つものの、配位している金属ク）の培養には 10 % FCS を添加した RPMI 1640（和光純薬ことから、以前よりタイプ 3 銅酵素に分類されており、これまで十分な解析が実施されてこなかった

2 , 3）

は銅ではなく、亜鉛であることが報告された

8 , 9）

工業株式会社）を用いて、5 % CO 2、37 ℃の条件下で 10 cm。

dish にて培養、および継代維持を行った。一方、別のヒトメラノーマ細胞である HMV- Ⅱ（理研 BRC）には RPMI 1640
Studies on the mechanism how melaninbiosynthesis is regulated by metals
Taiho Kambe
Graduate School of Biostudies, Kyoto
University

ではなく、Ham’ s F- 12 buffer（和光純薬工業株式会社）を用いた。亜鉛トランスポーター ZNT 5 および ZNT 7、銅ト ラ ン ス ポ ー タ ー ATP 7 A 欠 損 株 を 樹 立 す る た め に、
pX 330 -B/B ベクターにそれぞれの遺伝子の gRNA を接続したプラスミドを作成した。この作成したプラスミドをブ− 97 −

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ラ ス ト サ イ ジ ン S 耐 性 遺 伝 子 発 現 ベ ク タ ー と 共 に SK-（3 7 5 mM Tris-HCl（pH 6 . 8）、3 0 % Glycerol、6 % SDS、MEL- 2 細胞および HMV-II 細胞に Lipofectamine 2000 を0 . 1 % BPB）を 8 µL 加え、37 ℃で 20 分間インキュベートし使用して導入し、薬剤耐性株を指標にそれぞれのトランスた。Novex WedgeWell 4 - 1 2 % Tris-Glycine Gels

ポーター欠損株（ZNT 5 ZNT 7 二重欠損株と ATP 7 A 単独（Invitrogen）を用い、10 mA、４℃の条件で 3 時間程度、欠損株）を樹立した。また、TYR、TYRP 1、TYRP 2 および、電気泳動を行った。バッファーの置換とゲルの平衡化のたトランスポーターの発現ベクターの導入にもLipofectamine

め、泳動後のゲルを 50 mM phosphate buffer（pH 6 . 0）で2000 を使用した。

室 温 に て 3 時 間 振 と う し た。 平 衡 化 し た ゲ ル は color
formation buffer（1 0 mM phosphate buffer（pH 6 . 8）、1 . 5

2. 2. Western blotting

mM L-DOPA、4 mM MBTH）中において 37 ℃で 1 時間反膜 タ ン パ ク 質 20 µg を 2×SDS sample buffer（375 mM
Tris-HCl（pH 6 . 8）, 3 0 % Glycerol, 6 % SDS, 0 . 5 M DTT,応させた。TYR による L-DOPA 酸化産物である DOPAchrome のバンドの生成を褐色の色素として確認した。

0 . 1 % BPB）に溶解し、37 ℃で 15 分間反応させサンプル溶

３．結液とした。8 % SDS-polyacrylamide gel を用いて電気泳動を行った後、0 . 45 µm PVDF 膜（Immoblion-P）に transfer

果

3. 1. TYR活性はATP7Aによって制御されるした。以下に示した一次抗体にて 4 ℃で一晩抗体反応を行

TYRP 1 の解析を実施するにあたり比較対象となる TYRい、PBS-T で 10 分間の洗浄を 3 回行った後、二次抗体をの銅依存性に関する解析を実施した。CRISPR/Cas 9 を使用

反 応 さ せ た。ImmoblionTM Western Chemiluminescent

して ATP 7 A を欠損させた SK-MEL- 2 細胞株を樹立した。

HRP Substrate（Millipore）を用いて化学発光させ、ImageTYR、TYRP 1、TYRP 2 を一過的に発現させたところ、Quant LAS 500（GE Healthcare Life Science）にて検出しATP 7 A 欠損株および親株のどちらにおいてもメラノソーた。一次抗体には、anti-TYRP 1（1 : 3000 ; Sigma）、anti-ムと思われる小胞への局在が観察された（図１A）。一方、

Rab 2 7 a（1 : 1 0 0 0 ; Cell Signaling technology）、anti-Halo

ザイモグラフィーにおいては、ATP 7 A 欠損株におけるMonoclonal Antibody（1 : 1 0 0 0 ; Promega）、anti-ATP 7 A

TYR 活性を検出することができなかった（図 1 B）。これら（1 : 3000）を使用した。二次抗体には、GE Healthcare 社のの結果から、ATP 7 A 欠損株においては、TYR はアポ型

HRP 標識抗 IgG 抗体（1 : 3000）を使用した。

酵 素 と し て 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た。 一 方、TYRP 1 および TYRP 2 の発現は、野生株と ATP 7 A 欠損

2. 3. 免疫蛍光染色株において差違はみとめられず、両者の発現に ATP 7 A はカバーガラス上で 2 日間培養した SK-MEL- 2 細胞を必要でないことが明らかとなった（Fig. 1 A）。

PBS で洗浄した後、中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業
株 式 会 社 ）に て 固 定 し た。PBS で 3 回 の 洗 浄 後、0 . 1 %3. 2. ZNT5ZNT7二重欠損株ではTYRP1は安定にTriton（Nacalai Tesque）によって透過処理を 15 分間行っ発現できないた後、6 % BSA/PBS 溶液（アルブミン , ウシ血清由来 , フ

次に、SK-MEL- 2 細胞において、亜鉛トランスポータ

ラクション V, pH 7 . 0（和光純薬工業株式会社））でブロッキー ZNT 5 と ZNT 7 を共に欠損させた ZNT 5 ZNT 7 二重欠

ングした後、2 % BSA/PBS 溶液に一次抗体を希釈して 4損 株 を 樹 立 し た。 本 二 重 欠 損 株 に TYR、TYRP 1、℃で一晩抗体反応を行った。PBS で 10 分間の洗浄を 3 回

TYRP 2 を一過的に発現させて Immunoblot 解析を実施し行った後、同様に二次抗体、三次抗体それぞれを室温で 1たところ、TYR と TYRP 2 は野生株と同様に欠損株にお時 間 反 応 さ せ た 後、SlowFade Antifade kit（Molecularいても発現が確認された。一方、TYRP 1 の発現は、欠損Probes）を用いてカバーガラスに封入した。蛍光観察には株においてみとめることができなかった。TYR、TYRP 1、蛍光顕微鏡 FSX 100（Olympus）を使用した。一次抗体には、

TYRP 2 の発現や局在への ZNT 5 と ZNT 7 の影響をさらに

anti-TYR［T 311］
（1 : 1000 ; Santa Cruz Biotechnology）、詳細に解析するため、TYR、TYRP 1、TYRP 2 を野生株

anti-TYRP 1（1 : 1000 ; Sigma）、
anti-TYRP 2［C- 9］（1 : 1000 ;と ZNT 5 ZNT 7 二重欠損株に一過的に発現させ、免疫蛍Santa Cruz Biochemistry）を用いた。二次抗体、三次抗体

光染色によるタンパク質発現と局在解析を行った。TYRには Molecular Probes の Alexa 標識抗 IgG 抗体を使用しと TYRP 2 はメラノソームと思われる小胞への発現が確認た。 核 の 染 色 に は 4 , 6 -diamino- 2 -phenylindole（DAPI）されたが、TYRP 1 は、野生株で観察された発現が欠損株（1 : 1000 ; Abcam）
を用いた。に お い て は 消 失 し て い た（ 図 2）
。 し た が っ て、ZNT 5 ZNT 6 ヘ テ ロ 二 量 体 と ZNT 7 ホ モ 二 量 体 の 発 現 が、

2. 4. ザイモグラフィー

TYRP 1 の安定発現に不可欠であることが示唆された。

調整した膜タンパク質 50 µg に 6 × SDS buffer: DTT（-）− 98 −

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A

B

図１

ATP 7 A欠損SK-MEL- 2細胞に発現させたTYR、TYRP 1、TYRP 2の免疫染色の結果

A. ATP 7A欠損株と野生株において、TYR、TYRP 1、TYRP 2の発現に顕著な変化はみとめられない。
B. ATP 7A欠損株においてはTYRの酵素活性は消失する。TYRの活性はザイモグラフィーによって検出した。

図2ZNT 5 ZNT 7二重欠損SK-MEL- 2細胞に発現させたTYR、TYRP 1、TYRP 2の免疫染色の結果

ZNT 5 ZNT 7二重欠損株においては、野生株で検出されたTYRP 1の発現が完全に消失する。一方、TYRとTYRP 2の発現には変化はみとめられない。

3. ３. TYRP1の発現にはZNT5-ZNT6ヘテロ二量体およびZNT7ホモ二量体が輸送した亜鉛が不可欠である

させた場合には TYRP 1 の発現はみとめられなかった（図TYRP 1 の発現が ZNT 5 と ZNT 7 の輸送する亜鉛に依存活性が必要であることが明らかとなった。また、ZNT 7 おしているのか明らかにするため、亜鉛輸送活性を失った

よび亜鉛輸送活性を持たない ZNT 7 変異体を用いても同様

ZNT 5 変 異 体 を 用 い た 解 析 を 試 み た。ZNT 5 の 属 す るの結果が得られた（結果省略）。

3）。 以 上 の 結 果 よ り、TYRP 1 の 発 現 に は、ZNT 5 とZNT 6 が結合した ZNT 5 -ZNT 6 ヘテロ二量体の亜鉛輸送

ZNT ファミリーには膜貫通領域内に高度に保存された 2。この HD-HD モ

3. 4. HMV-II 細胞のZNT5ZNT7二重欠損株ではメラニン生成が障害される

チーフ内のアミノ酸残基をアラニン（A）に置換した変異体

ZNT 5 -ZNT 6 ヘ テ ロ 二 量 体 と ZNT 7 ホ モ 二 量 体（ 両ZNT 5 H 451 A と ZNT 5 D 599 A は、ZNT 6 と正常にヘテロ二量体

ZNT 複合体）が TYRP 1 の発現に影響を与えたことから、を形成できるが亜鉛結合能を失うため、どちらも亜鉛輸送両 ZNT 複合体のメラニン色素生合成に与える影響を解析

活性をもたない変異体となる 16）。野生株と ZNT 5 ZNT 7した。SK-MEL- 2 細胞は、メラニン生合成ができないメ二重欠損株に TYRP 1 と共に、ZNT 5、ZNT 5 H 451 A またはラノーマ細胞であったため、本解析では、黒色を呈するヒZNT 5 D 599 A を一過的に発現させたところ、野生株においてトメラノーマである HMV-II 細胞を使用した。HMV-II 細は、いずれの ZNT 5 においても TYRP 1 は発現した。これ

胞の ZNT 5 ZNT 7 二重欠損株と野生株のメラニン色素量に対し、欠損株においては ZNT 5 を発現させた場合のみを比較したところ、欠損株の黒色が肉眼で観察できるほどTYRP 1 が検出され、ZNT 5 H 451 A または ZNT 5 D 599 A を発現減少していた（図 4）。このことより、両 ZNT 複合体が輸つのヒスチジン残基（H）と２つのアスパラギン酸残基（D）からなる HD-HD モチーフが存在する

13）− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図3 TYRP 1の発現にはZNT複合体が輸送した亜鉛が不可欠である
ZNT 5 ZNT 7二重欠損株において消失したTYRP 1の発現が、ZNT 5の再発現で回復する。

図4 ZNT 5 ZNT 7二重欠損株ではメラニン生成が障害される
野生株およびZNT 5 ZNT 7二重欠損株の細胞ペレットの写真。

送した亜鉛がメラニン色素生成に重要な役割を果たしていても用いられるタンパク質である。ATP 7 A 欠損細胞にることが示唆された。

TYR を発現させると、TYR の活性は消失するが、TYR タンパク質はメラノソームと予想される細胞内小胞に局在し４．考察とまとめた。今後、この局在がメラノソームであるのかメラノソー

これまで、TYR と TYRP 1 および TYRP 2 の補因子の観ム特異的タンパク質との比較により検討する予定である。

点からの成熟化過程についてはほとんど明らかにされていまた、このアポ型の TYR が正しくメラノソームに輸送さなかったが、本研究では、その分子メカニズムの一端を解れる事実は、亜鉛が配位しないと速やかに分解されると考明 し た。SK-MEL- 2 を 用 い た ATP 7 A お よ び ZNT 5 -えられる TYRP 1 の結果と対比すると非常に興味深い。

ZNT 6 ヘテロ二量体と ZNT 7 ホモ二量体（両 ZNT 複合体）

以前の論文で、TYRP 2 の活性が亜鉛に依存していると欠損株による解析の比較、さらに亜鉛輸送活性を持たない報告されていたため 17）、本解析は当初、ZNT 5 ZNT 7 二ZNT 5 変異体である ZNT 5 H 451 A と ZNT 5 D 599 A を用いた解重欠損株における TYRP 2 の発現に関して解析を進めてい析などから、TYRP 1 は両 ZNT 複合体によって輸送された。しかしながら、TYRP 2 の発現に関しては、欠損株にた亜鉛によって制御されることを示している。これまで、おいて全く変化がみとめられなかった。したがって、上述

TYRP 1 は TYR と同じタイプ 3 銅タンパク質であると考の報告が間違いだった可能性もある。しかしながら、このえられてきたが、本結果は、TYRP 1 の結晶構造で亜鉛が報告を引き続き支持する場合、TYRP 2 への亜鉛供給は、配位していることを報告した論文の内容に呼応する結果と両 ZNT 複合体以外の亜鉛トランスポーターが担っている考えている

8 , 9）と考えられる。細胞外や細胞小器官で機能する亜鉛酵素の。

本 解 析 で は、 主 に SK-MEL- 2 細 胞 を 用 い て TYR、

多くは、両 ZNT 複合体によって亜鉛が輸送されると思わTYRP 1、TYRP 2 の 発 現 解 析 を 実 施 し た。Westernれるため、本結果は非常に興味深い例となり、メラノソー

Blotting において TYRP 1 が特異的に検出されなかった。

ム局在型の亜鉛トランスポーターが存在する可能性も浮上

ZNT 5 ZNT 7 二重欠損株において過剰発現させた TYRP 1する。

でさえ安定に存在できない事実は、細胞内で両 ZNT 複合

これまで、本研究のように金属の中でも特に亜鉛に焦点体が存在しない場合、TYRP 1 の分解が極めて迅速に行わを当て、メラニン生合成との関わりに着眼した研究は、ほれることを示唆する。TYR、TYRP 1、TYRP 2 導入細胞ぼ皆無であった。メラニン生合成は、TYR 酵素群の補酵か ら 調 整 し た RNA を 鋳 型 に し た RT-PCR 解 析 で は、素となる金属の観点からも複雑な活性発現制御機構が存在

TYRP 1 も TYR と TYRP 2 と同様に発現していることが確することが想定される。本研究の解析を進展させ、メラニ認できており（結果省略）、この結果も本仮説を支持する。

ン色素生合成の分子機序の解明に繋げたいと考えている。

今後は、この素早い TYRP 1 の分解機構に関しても解析をその成果は、美白効果を持つ化粧品などの開発に幅広く応進めていく予定である。

用されることが期待される。

TYR、TYRP 1、TYRP 2 はメラノソームマーカーとし− 100 −

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