酵母由来の機能性糖脂質（バイオサーファクタント）の構造及び機能の拡充に関する研究
独立行政法人産業技術総合研究所

福岡

環境化学技術研究部門

徳馬

Biosurfactants (BS) are functional amphiphilic compounds produced by a variety of microorganisms. They show uniqueproperties (e.g. mild production conditions, multifunctionality, higher biocompatibility and environmental compatibility)
compared to chemically synthesized counterparts. BS have thus been receiving increasing attention as environmentallyadvanced surfactants. Mannosylerythritol lipids (MELs), which are amphiphilic glycolipids abundantly produced by yeasts
from vegetable oils, are one of the most promising BS because of their excellent surface-active properties and versatilebiochemical actions. However, the structural variety of MELs hitherto discovered still remains limited; this makes the broad
range of their applications difficult. We thus have continuously developed new types of MELs with different structures andfunctions.
In this study, we have newly prepared MEL-D, which has no acetyl groups in the hydrophilic sugar moiety, and new
diastereomers having the carbohydrate configuration different from the conventional MELs. These novel MEL homologs
show specific self-assembling properties and biological actions. Based on their unique properties, they would be expected toapply to pharmaceutical and cosmetic fields.

１．緒

された。さらに医薬、化粧品分野をはじめ、幅広い用途へ言の応用を目指した技術開発が活発に進められている 5）。

バイオサーファクタント（BS）は、微生物が糖質や植物MEL には、マンノース上の置換基（アセチル基）の結合油などの再生可能資源から作り出す両親媒性物質であるが、数、結合位置の異なる同族体（MEL-A、-B、-C；図 1）をはその高い生体適合性や生分解性に加え、汎用の合成界面活

じめ、脂肪酸鎖の組成の異なるものなど、これまで数種の性剤に比べ極少量（1/100 ～ 1/1000）で優れた効果を発揮同族体が確認されている 6）が、僅かな構造の違いで物性がするなど、「持続可能な社会の構築・発展」に向けて、「環劇的に変化するというユニークな特性が報告されている 7）。

境適合性」と「高性能」を両立した「環境先進型の界面活したがって、新規構造の同族体を開発し、構造種のバラエ性剤」として期待されている。

ティを拡張してその物性比較を行うことは、MEL の用途

マンノシルエリスリトールリピッド（MEL、図 1）は、の飛躍的な拡大に繋がるものと期待される 6）。本研究では、ある種の酵母によって生産される親水基が糖鎖からなる微生物プロセスと化学・酵素合成プロセスを組み合わせて、−6

BS の一種である。MEL は、極めて低濃度（10 M）で高糖鎖上の置換基や糖鎖の立体構造の異なる新規 MEL 誘導

い界面活性（表面・界面張力低下能など）を示すばかりで体を製造することで、医薬、化粧品用途を指向した MEL

なく、幅広い濃度（0 ～ 90 wt%）、温度範囲で、単一成分同族体の製品ラインナップの拡充を狙った。また、各化合で特異な液晶（スポンジ、キュービック、ラメラなど）を物間で物性比較を行うことで構造 - 機能相関の解明を進め、形成し、様々な生理活性（抗微生物活性、抗腫瘍活性、抗目的の用途に対応したテーラーメイド的な MEL 同族体の体結合能など）を有する。また、商業生産に対応可能なレ提供を目指した。

ベル（>100 g/L）まで生産収率が向上しており、既知の２．実BS（数十種類）の中では、最も実用化の可能性が高いとされ、その研究開発が注目されている 1）。最近では、優れた液晶形成能を利用した液晶乳化技術 2）や、皮膚や毛髪に対験

本 研 究 で は、 従 来 技 術 で は 得 ら れ な か っ た 2 種 類 のMEL 同族体を新たに開発し、その物性評価を進めた。

する高い保湿効果 3）4）などが見出されたことを契機に、まずは化粧品素材（高機能保湿剤）として MEL 製品化が達成

Expansion of structure and function ofyeast glycolipid biosurfactants
Tokuma Fukuoka
Research Institute for Innovation in
Sustainable Chemistry, National Instituteof Advanced Industrial Science andTechnology（AIST）

2. 1. 糖鎖の立体構造が反転した MEL『GL』の開発と従来型との機能比較
酵母の一種 Pseudozyma crassa が、従来の MEL とは糖鎖の立体構造が異なる MEL 同族体（GL：図２）を生産することを見出した 8）。オレイン酸を原料として該酵母を培養することで GL を生産し、培養液から酢酸エチルで抽出後、カラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製した。
精製サンプルについて、既存の MEL と界面物性の比較を− 58 −

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図１

マンノシルエリスリトールリピッドの生産スキームと構造例

図2

GL の構造式

図4

図3

MEL-D の構造式

MEL-D（D- 体、L- 体）の構造式

プラズモン共鳴法（SPR）により MEL 同族体（自己組織化

2. 3. 糖鎖の立体構造が反転した MEL-D の合成と物性比較

膜）と抗体タンパク（免疫グロブリン G；IgG）との結合親出発原料に、MEL 及び上述の反転型 MEL を選び、それ和性を調べた。さらに、医薬・化粧品などへの応用を考慮ぞれからアセチル基を加水分解して糖鎖の立体構造が反転して、酵素（リパーゼ）反応に対するこれらの MEL 同族体した MEL-D（D- 体、L- 体；図４）を調製した。得られたの添加効果を検証した。

MEL-D 間で表面張力低下能や会合体形成挙動を比較した。

行ったほか、糖鎖の分子認識能の評価の一環として、表面

３．結

2. 2. アセチル基を持たない新規 MEL『MEL-D』の開発

果にアセチル基のみを加水分解することで、糖鎖上にアセチ

3. 1. 反転型 MEL（GL）の開発と従来型 MEL との機能比較

ル基を有さない MEL-D（図３）の合成を行った。生成物

P. crassa が生産する糖脂質（GL）は、詳細な構造解析のはカラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製し、各種結果、従来の MEL に対してエリスリトールの結合向きがNMR（1H、13C、1H-1H COSY、HMQC、HMBC） 測 定、逆転した、糖鎖のキラリティーの異なる新しいタイプの分子量測定（MALDI-TOF/MS）、脂肪酸組成分析（GC-MS）

MEL 同族体であることが見出された。また、2 本結合してなどにより構造を同定した。精製サンプルについて、各種いる脂肪酸の一方が極端に短い擬一鎖型糖脂質であること機器分析（ウィルヘルミー法、光学顕微鏡観察、光散乱法、も確認されており、親水基、疎水基ともに従来型とは組成

X 線構造解析など）により、得られた MEL-D の界面物性が大きく異なるという特徴があった（図２）。

触媒にリパーゼを用い、既存の MEL 同族体から選択的について評価し、従来の MEL 同族体と比較した。

主成分であるジアセチル型の GL-A について、ウィルへ− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

ルミー法により表面張力低下能を評価した。GL-A の室温

ゼ B に対しては、MEL のみが顕著な阻害効果を示した。

での臨界会合体形成濃度（CAC）、及びその時の表面張力

さらに、生体内での脂肪分解モデルとしてよく利用される−6（γCAC）は、それぞれ 5.2×10

M、26.5 mN/m であり、従豚膵臓由来リパーゼに対しては、GL のみが大きな阻害効

来の MEL-A（CAC = 2.7×10[M]、γCAC = 28.4 [mN/m]）に果を示した 10）。

−6対して CAC が上昇する一方で γCAC を低下させるといった特徴が見られた。また、GL は水との二成分系での相挙動

3. 2.

新規 MEL 同族体（MEL-D）の開発が従来の MEL と大きく異なる様子も観察された。以上のマンノースの６位のみにアセチル基を有する MEL-B（酵結果より、分子構造の違いが自己集合挙動や水親和性に大母により量産可能 11））を出発物に選び、触媒に固定化リパきな影響を与えることが示唆された。

ーゼ（Novozym435）を用いて、90 % エタノール中、大気下、これまでの報告から、従来型 MEL は、抗体タンパク（IgG）
9）50℃で１週間撹拌することで、既存の MEL よりも高極性に対して強い結合親和性を示すことが分かっている 。その糖脂質がほぼ定量的に得られた。NMR 測定の結果、アこで、MEL と GL から自己組織化膜を作製し、SPR を用いセチル基由来のピークが消失し、６位のプロトン由来のピて抗体との相互作用を比較検討した。その結果、興味深いークが高磁場側にシフトしていることが確認された。また、ことに GL は IgG に対して全く結合性を示さなかった（図分子量測定の結果、出発物からアセチル基の式量 42 分だ５）。両者の結合特性の違いは、糖鎖（エリスリトール部分）け分子量が減少したこと、脂肪酸組成分析の結果、反応前の立体構造の違いに起因していることが推定された。

後で脂肪酸組成に変化がなかったことなどから、本反応に続いて、リパーゼによるエステル加水分解反応に対するMEL および GL の添加効果を検討した。その結果、MEL、よって選択的に６位のアセチル基のみが加水分解されて、目的の MEL-D が得られたことが確認された。
精製した MEL-D を用いて、表面張力低下能を評価した。

GL とも、酵素種の違いに応じて、大きな反応促進、あるい は 反 応 阻 害 効 果 を 示 す こ と が 分 か っ た。 細 菌

室温における MEL-D の CAC = 1.2×10− 5 [M]、及び γCAC（Pseudomonas sp.）由来のリパーゼに対しては、両者とも= 24.6 [mN/m] であり、従来の MEL と同様の優れた表面反応を大きく促進させ、特に GL は非添加系と比べて反応張力低下能を示すことが確認された。また、出発物（CAC速度を 11 倍以上と大幅に促進した。一方、有機合成にお= 3.1×10− 6 [M]、γCAC = 26.1 [mN/m]）に対して、CAC がいて汎用される酵母菌（Candida antarctica）由来のリパー上昇するなど、アセチル基の除去により親水性の向上が見られた。
続いて、水中における MEL-D の分子集合体形成挙動について調べた。MEL-D 水溶液の光学顕微鏡観察の結果、
MEL-D は CAC 値以上の濃度で容易にベシクル状の構造体を形成することが分かった。さらに、各濃度の MEL-D 水溶液を調製し、小角 X 線散乱測定（SAXS）などを用いて相挙動を解析した結果、全濃度領域にわたって二分子膜構造から成るラメラ相を形成することが確認された（図６）。
また、原料であるモノアセチル体の MEL-B（>60 wt%）と比較して、より低濃度（>50 wt%）までラメラ相単相領域

図5が拡大し、さらにラメラ相の層間距離も拡張するなど、アSPR センサーグラム

図6MEL-D の二成分系相図− 60 −

酵母由来の機能性糖脂質（バイオサーファクタント）の構造及び機能の拡充に関する研究

セチル基の脱離により MEL 分子の水親和性や保水力が向た。続いて、デカン中でも同様の検討を行った結果、D-12）体では逆ミセル、L- 体では逆ベシクルを形成することが分

一方、MEL-D は、有機溶媒中においても単独で自己集かった（図 8）。以上のように、エリスリトールの立体配置合体を形成することが新たに見出された。顕微鏡観察など

は、MEL の会合体形成挙動を大きく変化させることが示から、これがベシクル（逆ベシクル）であることが示されされた。

上していることが示唆された 。

た（図７）。溶媒種について検討した結果、直鎖状炭化水

４．考

素類をはじめ、環状炭化水素類、スクアラン、スクアレン、シリコーンオイルなどでも逆ベシクルの形成が確認された。

察

反転型 MEL は、最近新しく見出された新型 MEL であるが、 今 回 検 討 を 進 め た P. crassa 由 来 の MEL8） と、P.

3. 3. 糖鎖の立体構造が反転した MEL-D の合成と物性比較13）

tsukubaensis が生産する MEL-B11）の二例しか今のところ見つかっていない。糖鎖のキラリティーの違いは生理活性に２種類のMEL生産菌（Ustilago scitaminea 、Pseudozyma

強く影響すると予想されるため、医薬・化粧品分野への応tsukubaensis11））を用いることで、エリスリトールの立体配用を目指す上で、その物性データの蓄積は極めて重要であ

置の異なる MEL-B（D- 体、L- 体）がそれぞれ得られる。

る。

これらを原料とし、上述と同様の方法で２種類の MEL-D本研究で、これらの比較検討が初めて行われ、構成要素を合成した。なお、D- 体が従来の MEL と同じエリスリトが同じ糖脂質でも、糖骨格や脂肪酸組成に差異があれば、ールの立体配置であり、L- 体が反転型に当たる。3. 2. で得界面物性、生理活性ともに大きく影響することが検証された MEL-D は反転型であり、L- 体に当たる。

た。特に、今回 MEL 同族体にリパーゼ活性の阻害効果が−6[M]、γCAC= 25.7 [mN/見出されたことで、生体内での脂質分解が鍵となる「肥満m] であり、L- 体の方が高い CAC 値を示した。これは 3. 1.

防止」や「皮膚炎、肌荒れ改善」など、新しい医薬・化粧の GL-A の場合と同じ傾向であった。以上の結果より、エ品用途への可能性が示唆された。

D- 体 の MEL-D の CAC=7.1×10

リスリトールの立体配置は、MEL の界面活性に大きく影

MEL-D は、これまで微生物生産物中からはその存在が確認されていなかったが、本研究では既存の MEL から選響を及ぼすことが示された。
次に、各サンプルの水中での自己集合挙動を検討した。

択的にアセチル基のみを加水分解する酵素法の利用により、両者とも容易にベシクルを形成したが、L- 体の方が D- 体初めて大量取得に成功した。これまで MEL には、アセチよりも粒子径の大きなベシクルを形成することが確認されル基を２個有する MEL-A と、１個有する MEL-B、-C との

図7

図8

MEL-D が形成する逆ベシクル

MEL-D の自己集合挙動（10 wt%、デカン中）− 61 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

間で、ただ一つのアセチル基の有無により物性が劇的に変化するという興味深い特徴が報告されていた

４）T. Morita, M. Kitagawa, S. Yamamoto, et al., :Glycolipid biosurfactants, mannosylerythritol lipids,

1）7）。したがって、今回新たにアセチル基を有さない MEL-D が得られ、repair the damaged hair, J. Oleo Sci., 59, 267-272 (2010).

物性評価が行われたことは、MEL の構造 - 機能相関の解明

５）福岡徳馬 , 森田友岳 , 井村知弘 , ほか 2 名 , : 微生物由来の高機能界面活性剤（バイオサーファクタント）の用途を進め、用途拡大を目指す上で極めて重要である。

開発 , フレグランスジャーナル , 37(8), 33-40 (2009).

実際に、MEL-D は全濃度範囲にわたって優れたラメラ形成能を有することが確認された。これまで、同じくラメ

６）福岡徳馬 , : 微生物由来の機能性脂質（バイオサーファラ形成能に優れる MEL-B には、セラミド様の優れた肌荒クタント）の構造および機能の拡充に関する研究 , オレ

3）

れ改善効果が見出されており 、化粧品素材として製品化されている 5）。MEL-D は、その製品ラインナップを拡充

オサイエンス , 9(4), 127-133 (2009).
７）T. Imura, N. Ohta, K. Inoue, et al., : Naturally
engineered glycolipid biosurfactants leading toする新素材としての可能性を秘めている。

distinctive self-assembled structures, Chem. Eur. J., 12,

さらに、L- 体の MEL-D には、油性物質中で「逆ベシクル」

2434-2440 (2006).

を形成するという新しい機能が見出された。逆ベシクルは、有機溶媒中で形成する新しい分子集合体であり、マイクロ８）T. Fukuoka, M. Kawamura, T. Morita, et al., : A

カプセル化、有用物質の放出制御、特異な反応場などへのbasidiomycetous yeast, Pseudozyma crassa, produces

14）

応用が期待されている 。逆ベシクルを形成する素材に関novel diastereomers of conventional mannosylerythritol

する報告例は極めて少なく、特に今回のように様々な油性

lipids as glycolipid biosurfactants, Carbohyd. Res., 343,

物 質 中 で、 単 一 成 分 で 逆 ベ シ ク ル を 形 成 す る 素 材 は、

2947-2955 (2008).

MEL-D が初めての報告となる。これらの特性を活用して、

９）T. Imura, S. Ito, R. Azumi, et al., : Monolayer

乳液、クリームなど油系での MEL の応用が期待される。

assembled from a glycolipid biosurfactant from

以上のように、新規構造の MEL 同族体の開発を通じて、Pseudozyma (Candida) antarctica serve as a high-

特異な分子構造に起因するユニークな特徴を明らかにし、affinity ligand system for immunoglobulin G and M,
Biotechnol. Lett., 29, 865-870 (2007).

新しい機能利用の可能性を示すことができた。本研究から得られた知見は、BS の新たな用途展開、普及の促進に貢10）特開 2010-248186

献するものである。

11）T. Fukuoka, T. Morita, M. Konishi, et al., : A
basidiomycetous yeast, Pseudozyma tsukubaensis,（引用文献）

efficiently produces a glycolipid biosurfactant;

１）D. Kitamoto, T. Morita, T. Fukuoka, et al., : Self-identification as a new diastereomer of conventional

assembling properties of glycolipid biosurfactants

mannosylerythritol lipid-B, Carbohyd. Res., 343, 555-560(2008).

and their potential applications, Curr. Opin. Colloid

12）T. Fukuoka, T. Yanagihara, T. Imura, wt al., :Interfac. Sci., 14, 315-328 (2009).
２）W. Worakitkanchanakul, T. Imura, T. Fukuoka, et al.,Enzymatic synthesis of a novel glycolipid biosurfactant,: Phase behavior of ternary mannosylerythritol lipid /mannosylerythritol lipid-D, and its aqueous phasebehavior, Carbohyd. Res., 346, 266-271 (2011).

water / oil systems, Colloid Surf. B-Biointerfaces, 68,13）T. Morita, Y. Ishibashi, T. Fukuoka, et al., : Production

207-212 (2009).
３）T. Morita, M. Kitagawa, M. Suzuki, et al., : A yeastof glycolipid biosurfactants, mannosylerythritol lipids,glycolipid biosurfactant, mannosylerythritol lipid,

by a smut fungus, Ustilago scitaminea NBRC 32730,

shows potential moisturizing activity toward cultured

Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 788-792 (2009).

human skin cells: The recovery effect of MEL-A on the14）H. Kunieda, K. Nakamura, D. F. Evans, : Formation

SDS-damaged human skin cells, J. Oleo Sci., 58, 639-642

of reversed vesicles, J. Am. Chem. Soc., 113, 1051-1052(2009).

(1991).

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