微細藻類が生産するアスタキサンチンを水溶化するタンパク質の化粧品素材としての開発
東京農業大学生命科学部分子微生物学科
東京農業大学応用生物科学部バイオサイエンス学科

川﨑信治

Under extreme environmental conditions such as desiccation and high salinity combined with high light irradiation, it
is difficult for higher plants to survive because light energy, in combination with oxygen, leads to the generation of reactive
oxygen species (ROS) under water stress conditions. However, microalgae are found to thrive under such conditions. A
microalga, strain Ki- 4 was previously isolated from asphalt in midsummer, and a novel water-soluble astaxanthin binding
protein, named AstaP, was identified from this microalga. This protein is heat-stable and possesses singlet oxygen-quenchingactivity in water. AstaP is thought to enable the microalga to survive under the extreme photooxidative stress conditions. Our
aim is to develop AstaP as a novel functional molecule, which can be produced at high yields, to enable lipid-soluble organic
astaxanthin to function in water. In this study, we have been working on developing a system to obtain large amounts of thehighly purified AstaP by engineering the cultivation systems of strain Ki- 4 . In addition, we are determining the possibilityof using AstaP as a cosmetic product to protect human cells from the toxic effects of sun light and ROS.

1. 緒あった。微細藻類 Ki-4 株はヘマトコッカス藻と同じ緑藻言綱に属する微細藻類で、AstaP は本藻類が光酸化ストレス

植物は強光が付随する環境ストレス下では、活性酸素のを感知した際に細胞内で大量に生産される（図 2）。AstaP生成を伴う光酸化ストレスを発生し枯死にいたる。申請者
らは一般の植物が生存しえない砂漠環境などの極限環境から微細藻類の探索を行い、70株ほどの真核微細藻類を単離・保有している。これら極限環境から単離した藻類は、淡水性でありながら強い乾燥耐性や耐塩性を示し、強光照射下でかつ水分が 0 ％の環境でも数ヵ月間生存するなど強い環境ストレス抵抗性を示すことから、シングルセルを強光毒性から防御するための優れた生命代謝系の存在が推定された。
強光下の真夏のアスファルトから単離した微細藻類 Ki-4株は、強光が付随する環境ストレス（強光＋乾燥や塩スト

図 1 大学前の真夏のアスファルトから単離したKi-4 株の顕微鏡写真レス）に遭遇すると細胞液を赤く変色して生存する（図 1）。
この赤色に着目して研究をすすめた結果、植物界で初めての発見となるアスタキサンチンを結合する水溶性タンパク質の精製に成功し、AstaP と命名した 1）（図 2）。アスタキ
サンチンはカロテノイドの中でも特に優れた抗酸化力をもつ脂溶性のカロテノイドであり、エビやカニの甲羅、フラミンゴの羽などに含まれる脂溶性のカロテノイドで、化粧品や機能性食品に広く利用されている。また植物界におけるアスタキサンチンは、真核の微細藻類ヘマトコッカス藻などが細胞内に油滴として蓄積することが知られるのみでDevelopment of a novel microa lga laqueous astaxanthin binding protein foruse in cosmetic products
Shinji Kawasaki
Tokyo University of Agriculture

図2
A. Ki-4 株を寒天培地上で培養し、強光 + 乾燥ストレスを付与した際の形態変化
B. Ki-4 株の液体による大量培養とストレス付与後の色彩変化
C. 精製後に純水に溶けたアスタキサンチン結合タンパク質（AstaP）−8−

微細藻類が生産するアスタキサンチンを水溶化するタンパク質の化粧品素材としての開発はアスタキサンチンを純水に溶かす水溶化能力があり、その開発に着手した。の水溶特性と 1 重項酸素消去活性は 100 ℃・1 時間の処理後も安定であった。そこで本研究では AstaP を脂溶性アス

2. 3. 細胞アッセイ系の確立

タキサンチンの効力を水溶液中で発揮し、かつ大量生産がAstaP は脂溶性のアスタキサンチンの効力を水溶液中で可能な新奇な機能性素材として認識し、化粧品分野での有発揮することが可能な抗酸化物質としてのユニークな機能効的な利用法の可能性を探ることを目的とする。

性が期待される。そこで水溶液中での活性酸素消去能力の2. 実評価、ならびに 1 重項酸素消去剤としての能力の評価と安験定性に関する試験を行った。AstaP は新規な機能性素材で2. 1. 大量生産法の確立あることから、化粧品素材への応用は各種の安全性試験を水溶性のアスタキサンチン結合タンパク質（AstaP）の商クリアする必要がある。その第一歩として、培養細胞を用業利用には、まず本品の大量生産系の確立が前提条件とないた試験を実施した。細胞を用いた毒性試験はアスタキサる。そこで微細藻類の大量培養系の確立に着手した。まずンチンの抗酸化能力を評価した過去の論文を参考にして実は大量培養に向けた培地成分の確立を行った。培地には糖施した。専門家の指導の下で細胞培養系の立ち上げを行い、源など有機物を含まない無機塩類をベースとした安価なその後にアスタキサンチンの機能性評価に関する論文を参

無機培地を採用し、完全な独立栄養（CO2 と光のみの供給考にして、マウス胎児由来の線維芽細胞である NIH3T3 細で生育）にて良好な生育を可能とする培地組成を検討した。

胞を用いて評価を行った。

次に光酸化ストレス付与に応じて発現する AstaP の最適な

3. 結誘導条件を決定するために、光強度や CO2 濃度、塩濃度、培養温度などの光酸化ストレス付与条件と、さらなる発現果

3. 1. AstaP の大量生産法の確立

量の向上を目指して鉄濃度の影響を調査した。また上記で培地成分に関する正確な情報を得るために、無菌環境下確立した培養条件を用いて、非閉鎖系での屋外培養槽によで Ki-4 藻の培養を行い、CO2 の濃度、ならびに光条件のる大量培養試験を実施した（図 3）。

検討を行った。その結果、培養開始後 4 日目で 3 × 106 個/ml（培地）の増殖を可能とする藻細胞培養系の確立に成2. 2. 大量精製法の確立功した。アスタキサンチン生産用に培養されている微細藻

AstaP の商業利用には、AstaP を容易に、かつ高純度に類ヘマトコッカス藻で報告されている細胞増殖速度は 105

精製する技術が必要となる。AstaP は細胞内で最も高い等個 /ml のオーダーであることから 2，3）、細胞の数として評電点（pI=10.5）をもつことから、本性質を上手く利用する価すると約 10 倍の増殖速度に相当する結果を得た。確立

ことにより他の細胞内タンパク質との容易な分別精製が可した大量培養系にて AstaP の生産効率の向上を試験した。

能になることが推定された。そこで前項 2. 1. で実施した

その結果、AstaP は光酸化ストレス下（強光＋塩ストレス

屋外大量培養法で生産した微細藻類から、AstaP の大量精や乾燥ストレス下）で速やかに遺伝子発現を開始し、スト製法の確立を試みた。まず安価でかつ容易な精製系の確立

レス開始後 2 日目には、細胞内で最も大量に蓄積するタンを目的として、イオン交換樹脂の検討と、効率的な精製法パク質になることがプロテオーム解析の結果から判明した

図３
A. 非閉鎖系培養の様子
B. 本研究で最適化した培養法による Ki-4 株の生育。○：CO2 通気培養。●：Air 通気培養
C. 光酸化ストレスを付与後の藻体から抽出した水溶性画分−9−

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

（図 4）。そこで CO2 濃度や光の強度、さらには Fe イオン

3. 2. 抗酸化活性の評価法の確立の濃度を変化させ、AstaP 発現との相関性に関して解析を過去の研究において、AstaP は１重項酸素を水溶液中で行った。その結果、最適な通気 CO2 濃度の条件を決定し消去する活性に優れ、AstaP 0.2µM（アスタキサンチン換た（図 3）。またヘマトコッカス藻において Fe 添加による算）は標準化合物である NaN3（アジ化ナトリウム）1mMアスタキサンチン合成量の上昇が報告されていたことからに相当する強い活性を示すことを報告した 1）。本活性は同様に添加したところ、AstaP 発現量の向上が観察された。

100 ℃で 1 時間のボイル後も失活しない耐熱性がある。現しかし Fe 未添加のものと比べて生産量が 1.2 倍程度高いの

在は精製した AstaP を用いて、1 重項酸素消去活性と共に、みであり、その後の生産プロセスにおける Fe の混入リス様々な酸化基質に対する抗酸化活性について解析を行ってクもあることから、以後の実験は全て Fe 未添加条件で行いる。能力の比較に関しては可溶性の抗酸化剤であるアンうこととした。次に、上述で開発した大量培養系を用いてトシアニンやフラボノイド類、ビタミン類、グルタチオンな生産した AstaP の効率的な精製法の開発を行った。AstaPどの水溶性化合物を用いて、抗酸化活性や各種安定性（光、は高い等電点を有することから、陽イオン吸着カラムに使熱、放置）について比較した。その結果、興味深い結果が用するバッファー組成について検討した。その結果、他の得られたことから、現在は商業利用に向けた総合的な観点タンパク質が吸着しない高アルカリのバッファーを使用しからの評価を継続し、論文化を目指してデータを精査してた場合でも陽イオン交換カラムに吸着することが判明したいる。

ため、カラム 1 本の使用のみで AstaP 溶出画分をほぼ完全AstaP は新規な機能性素材であることから、細胞や生体に精製できる系の確率に成功した（図５）。現在は AstaP のへの影響は不明である。上記の解析において in vitro の系質量より高分子領域に存在する微量の夾雑タンパク質を完で得られた AstaP の活性を応用的に評価するためにも、細全に除去するための溶出塩濃度のグラジェントの条件を検胞培養系の確立と、AstaP 共存下における細胞への影響を討している。また本精製は安価なイオン交換樹脂を用いた解析する必要がある。そこで細胞培養系の確立を行った。

場合でも可能であったことから、精製法の低コスト化と簡過去にアスタキサンチンの細胞への機能性を評価した論便化に目途がついた。

文 4）を参考にして、ラット胎児由来の線維芽細胞（NIH3T3

図4A. AstaP 遺伝子の発現。光酸化ストレス付与から 2 時間後に発現誘導が観察された
B. AstaP タンパク質の発現。光酸化ストレス付与 48h 後（右）に大量発現が観察された

図5
A. AstaP タンパク質精製の様子
B. 精製タンパク質の SDS-PAGE。カラムクロマトグラフィー前（細胞粗抽出液、左）と後（右）。カラム 1 本で高純度の精製が可能となった− 10 −

微細藻類が生産するアスタキサンチンを水溶化するタンパク質の化粧品素材としての開発細胞）の培養系の確立を行った。NIH3T3 細胞は理化学研

いた安全性評価を実施したい。また AstaP の機能性は、ア究所のストック株を使用し、DMEM 培地に細胞を接種し、スタキサンチンの代表的な機能性である 1 重項酸素消去活5.0% CO2 インキュベータで数日間培養したところ、良好性の他にも、眼精疲労抑制や免疫賦活、脳梗塞など、新規に生育した。純水に溶けた濃縮 AstaP を添加して NIH3T3な効果が続々と報告されている。これらの研究には全て脂細胞の生育への影響を観察したところ、これまでに終濃度溶性のアスタキサンチンが用いられていることから、純水15µM までの AstaP（OD484nm=1.5 に相当、濃いオレンに可溶な AstaP の利用性は未知の可能性を秘めている。今ジ色になる）を添加した条件下で細胞生育への負の影響は後は培養細胞の評価系を用いて、脂溶性のアスタキサンチ観察されなかった。本研究で細胞培養系と添加実験に関すンがもつ機能性が水溶液中でも実現可能かどうかを解析し、る評価系を確立できたことから、今後は AstaP 共存下で細AstaP がもつ可能性を評価していきたい。

胞への紫外線照射の影響や活性酸素発生剤の影響などを観察し、細胞保護効果の有無を観察し、さらなる応用研究を謝辞本研究の実施にご助成いただきました公益財団法人コス進める方針である。

4. 考

メトロジー研究振興財団に深謝いたします。

察

本研究では微細藻類由来の水溶性アスタキサンチン結合（引用文献）

タンパク質の化粧品素材への応用に関して研究を行った。

1） S. Kawasaki, K. Mizuguchi, M. Sato, T. Kono and H.

応用研究に着手する際に必要不可欠となる大量生産系の確Shimizu. A novel astaxanthin binding photooxidative

立を目的として、屋外培養に向けたパイロットスタディを

stress inducible aqueous carotenoprotein from行った。開発した開放培養系での AstaP の生産量を総括

a eukaryotic microalga isolated from asphalt in

すると、パイロットスタディでは約 2 週間の期間でヒトのmidsummer. Plant Cell Physiol. 54, 1027-1040, 2013.

目で判別される充分なオレンジ色（OD485nm=0.5）の水溶

2） M. Harker, A.J. Tsavalos, and A.J. Young. Factors

液 50 ml を約 30 本得られる藻体が 10 L の培地から得られResponsible for Astaxanthin Formation in theた。この生産量を基準としてスケール UP が容易な直径 3Chlorophyte Haematococcus Pluvialis. Bioresourceｍの培養槽で行う場合は約 500 本（収率 50 ％として）、やTechnology 55, 207-214, 1996.

や中規模の直径 10 ｍの培養槽で行う場合は約 5,000 本（収3） I. Suh, H. Joo, C. Lee. A novel double-layered

率 30 ％として）の生産が可能と試算した。以上を総括する

photobioreactor for simultaneous Haematococcusと、供給面については商業化に必要な諸条件をクリアできpluvialis cell growth and astaxanthin accumulation. J.

る感触を得た。

Biotechnol. 125, 540-546, 2006.

一方、化粧品素材への利用には、機能性だけでなく安全4） S. Hama, S. Uenishi, A. Yamada, T. Ohgita, H.

性を評価する必要がある。細胞への影響を評価したとこ

Tsuchiya, E. Yamashita, and K. Kogure. Scavenging ofろ、充分なオレンジ色の水溶液では、少なくとも NIH3T3

Hydroxyl Radicals in Aqueous Solution by Astaxanthin

細胞の増殖に負の影響を与えないことが判明した。今後は、

Encapsulated in Liposomes. Biol. Pharmaceu. Bull. 3 5,

様々な種類の動物細胞を用いてさらに高濃度の AstaP を用

2238-2242, 2012.

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