集合して生体に作用する有機分子の設計と合成および機能評価東京大学大学院

薬学系研究科分子薬学専攻 薬化学教室

大 和 田智彦

A synthetic method was developed for synthesizing α,α--disubstituted glycines bearing a large hydrophobic ring
(more than 15-membered ring) based on ring-closing metathesis. Ring-closing metathesis reactions of the dialkenylated
malonate precursors turned out to proceed efficiently, particularly when long methylene chains adequately tether bothterminal olefin groups. Surprisingly, the amino groups of the α,α-disubstituted glycines bearing a large hydrophobic
ring are inert to conventional protective reactions (e.g., N-Boc-protection: Boc2O/DMAP/CH2Cl2; N-Z-protection: Z-Cl(benzyloxycarbonyl chloride)/DMAP/CH2Cl2). The Curtius rearrangement of the carboxylic acid functionality ofthe malonate derivatives, obtained after the ring-closing metathesis, to an amine functionality can be catalyzed bydiphenylphosphoryl azide (DPPA), but unexpectedly, only the intermediate isocyanates can be isolated, even in thepresence of alcohols such as benzyl alcohol. Thus, the corresponding isocyanates were isolated in high yields when
this Curtius rearrangement was carried out in an aprotic solvent (benzene). The resultant isocyanate was treatedwith 9-fluorenylmethanol in a high boiling point solvent such as toluene under reflux to give the N-Fmoc-protectedaminomalonate derivatives in high yield. These hydrophobic amino acids can be incorporated into a peptide by Fmocsolid phase peptide synthesis using the acid fluoride activation method. In a 17-amino-acid peptide sequence known totake a monomeric α-helix structure, the replacement of two alanines with two new hydrophobic amino acids bearing acyclic 18-membered ring enhanced the stability of the helical structure. Assembly to hexamers was also suggested by
the results of sedimentation equilibrium studies in the presence of 100 mM NaCl.

１．緒言Aib（α-aminoisobutyric acid）などの C α,α - 二置換グリ
シン誘導体は β -bend、310 もしくは α ヘリックス構造をとり2118

やすく，またこれらの構造を安定化させることが知られてい15る。なかでも、C α のジ置換基をシクロアルカンとしたものは
H2N

1-aminocycloalkane-1-carboxylic acid 残基（Acnc）として知られ、Toniolo らを中心に現在までに Ac3c（３員環）-Ac12c

1

ゴマー中への挿入ペプチドの構造特性が調査されている１）。

CO2H2２．実

一方、天然に存在する疎水性アミノ酸、特にアルキン、イソロイシンなどで、アルキル炭素数も１〜４とそH2NH2N

CO2H3Figure 1（12 員環）の合成および数残基のホモオリゴマーもしくはオリル側鎖をもつアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシ

CO2H

験

2．1 大きな疎水性領域を持つ α,α- 二置換グリシン誘導体の合成法の疎水性の違いが比較的小さい。疎水性領域を大きく変

今まで Toniolo らによって報告され構造解析がされた化させたアミノ酸の機能は不明である。さらに、長いペ

Acnc の合成法は Strecker 反応を用いたものがほとんどでプチド鎖に C α, α - 二置換グリシン誘導体を導入した際のある１）。しかし、この合成法では無保護のアミノ酸を合成単独ペプチド構造および自己組織化構造への効果は未知してから NH2 および CO2H に保護基を導入する必要があである。このような考えのもとに、本研究者は新規疎水る。環が小さい場合はあまり問題にならないが、環が大き性 α,α- 二置換グリシン誘導体 1, 2, 3 を設計し、その自己くなった場合、無保護のアミノ酸の溶解性の低さ、立体障組織化構造への効果を調査した（Figure １）。

害が問題となり保護基を導入することが困難になってくる

Design, synthesis and functions of selfassembled biomolecules.

事が予想される。そこで本研究者はマロン酸誘導体を出発物質とし、Grubbs 触媒を用いた Ring Closing Metathesis

Tomohiko Ohwada（ROM）による環形成の後 Curtius 転位反応を行うこと

Graduate School of Pharmaceutical
Sciences The University of Tokyo

すなわち、マロン酸誘導体４をジアルケニル化後（6）、閉で大環状アミノ酸誘導体の合成を計画した（Scheme １）。
環オレフィンメタセシス反応を用いて環化を行い（7）、それに続く Curtius 転位反応を経て（9）アミノ酸誘導体 12− 52 −

集合して生体に作用する有機分子の設計と合成および機能評価

HHabm

X YX45mcn

YXmnYX6Y
7Reagents a,b and c are shown in Scheme 2Scheme 1

HHa4cnHO2C CO2t Bu
ring size = 21 8A 83%
ring size = 18 8B 82 %ring size = 15 8C 88 %emcn

R1O2C CO2t Bumnfmn

O C N CO2t Bu

R2HN CO2t Bu

9A 83%
9B 82 %
9C 88 %

10A 96 %10B 98 %10C 93 %n

R1O2C CO2t Bu

6c : m=n=9 84 %6m: m=6,n=9 86 %6h : m=n=6 64 %5c: m=9 68 %5h: m=6 67 %R1=Bnmm

R1O2C CO2t Bu

R1O2C CO2 Budbmt

7c 84%
7m 92 %
7h 72 %g, hmn

R2HN COX
X=OH11A
11B
11C

X=F

12A 96 %12B 98 %12C 93 %R2=Fmoc
a: CH2=CH(CH2)m Br, NaH, DMSO, rt

b: CH2=CH(CH2)nBr, NaH, DMSO, rtc: (PCy3)2Cl2Ru=CHPh, CH2Cl2, reflux d: H2, Pd/C,AcOEt e: DPPA, Et3N, benzene, reflux
f: 9-fluorenylmethanol, toluene, reflux g: TFA, CH2Cl2, rt

h: DAST, CH2Cl2,rt

Scheme 22．1．3を得る合成法を計画した（Scheme ２）
。

2．1．1

ジエン 6 の合成Z-Acnc-F18 の合成（合成経路の探索研究）

21,18,15 員環をもったアミノ酸誘導体の N-Z（benzyloxy

マロン酸エステルからは Curtius 転位反応により α アミcarbonyl）- 酸フッ化物の合成を t-butylbenzyl malonate

ノ酸を、ニトリル化合物からは還元により β アミノ酸を（4c）を用いての合成を行った（Scheme ２）。Pd/C を用合成できると考え、基質としてマロン酸ジエステル、シアいて７のオレフィンを接触還元すると同時にベンジルエステル

ノ酢酸エチル、マロノニトリルを用いた。これらの基質４をカルボン酸としてモノエステル８を得た。得られた８に対しに塩基存在下、alkenyl bromide を付加させることでジエDPPA（diphenylphosphoryl azide）を用いた Curtius 転位

ン６を得た。反応の副生成物を避けるため、一気にジアル反応を検討した。アルコール存在下でカルボン酸を DPPA とケニル化する方法ではなく、モノアルケニル体５を経てか反応させると通常はイソシアネートを経由してアルコールがらジアルケニル化する方法を用い、比較的高収率で６を得反応して一気にウレタン誘導体を与えるが（Table １）３）、α のた。

二置換基のアルキル鎖が大きくなるとアルコール共存下でも2．1．2

閉環メタセシス反応（ROM）

イソシアネートが単離されることが判明した（Table 1）。そこ

市販の第一世代の Grubbs 触媒を用いて、様々な置換基、でモノエステル８を非プロトン性溶媒（ベンゼン）中 DPPAアルキル鎖をもつジエン６の閉環メタセシス反応を行ったと加熱環 流下反応させると、イソシアネート９が収率良く（Scheme ２） 。その結果、置換基とアルキル鎖の長さに得ることが出来た。イソシアネート９をベンジルアルコール２）より反応の効率が異なることがわかった。特に、ニトリル

中 neat で加熱することで Z - 保護アミノ酸エステルを得た

置換基を持つ化合物や一方の炭素鎖が短い場合（n=2）の（Table 1）。この反応スキームは N-Fmoc 保護体の合成に収率は低かったが，それ以外では比較的高い収率で環化体も適用した。一方，別法で得たアミノ基を塩化メチレン溶液７が得られた。反応によっては分子間で反応が進行したダ中触媒量の DMAP（N,N-dimethylaminopyridine）存在下イマーも得られた。環化した７のオレフィンの E/Z 比をN-benzyloxycarbonyl chloride（Ｚ -Cl）で N-Z 化や DMAP

13CNMR の積分値から見積もったところ、E 体が優先的に存在下塩化メチレン溶液中 B oc2 O で処理し，N-B oc 化を試得られていることがわかった。

みても反応せず，先の合成法の有効性が判明した。

− 53 −

Table 1R2

R1HO2C

CO1Et
R1R1PhCH2OH
reflu xR2HN

a n-propyln-propylundecylb udecylundecylc octyl
2-membered ringd1-membered ringe2．1．4R2DPPA, Et3N

R1R2N

CO2Et+CO2Et

O CZ
time
68 %0%
0%0%
0%

47 hr
20 hr
20 hr
26 hr
15 hr

Fmoc-Ac20c-F の合成

trace
82 %
82 %
47 %
68 %

ックス性が増大する可能性が考えられ、また、α へリック

Fmoc 固 相 合 成 法 を 用 い て ペ プ チ ド を 伸 長 す る た

ス性が変化しないとしても、安定性に大きな違いがみられめ、N-Fmoc 保護のアミノ酸を合成した（Scheme ２）。

る可能性があり，疎水性アミノ酸の評価方法として適当で21,18,15 員環をもった benzylt-butyl malonate（4c）をあると考えたからである。

Pd/C を用いて接触還元してモノエステル体８とし、得なお、ペプチド合成は N-Fmoc と酸フルオライドを用られた８に対し、DPPA を用いた Curtius 転位反応を行い Rink amide resin を用いた固相合成法によって行った。

い、イソシアネート９とした。９をトルエン中、高濃度のAc-AE3AAAKEAA10AKEAAAKA-NH29-fluorenylmethanol と加熱還流することで N-Fmoc アミ

Ac-AE（2,C18）AAKEAA（2,C18）KEAAAKA-NH2 peptide IIノ酸 t-butyl エステル 10 とし、10 を TFA で処理するこAc-AEAAAKEAA（2,C18）KEAAAKA-NH2peptide IIとによりカルボン酸 11 とした。11 を DAST（diethylamino）

Ac-AE（2,C18）AAKEAAAKEAAAKA-NH2peptide IV

peptide I（native）

sulfur trifluoride）を用いて酸フッ化物とし目的物 12 が（A=Ala, E=Glutamic acid, K=Lysine）得られた。ここで得られた酸フッ化物はカラムクロマトグ

水溶液中の CD 測定から大きな疎水性領域を持つ α,α-ラフィーで分離精製可能である。

二置換グリシン誘導体を一つまたは二つアラニンの代わりに置換したアミド鎖は Baldwin の原形と同じく α- ヘリク

２．２ 大きな疎水性領域を持つ α,α- 二置換グリシン誘導体の置換による α ヘリックス構造への効果ッスを取ることが分かった（Figure ２（A））。すなわち、2．2．1（peptide I）より増強されていた。peptideII では大きな疎疎水性アミノ酸の評価２を二つ置換基した peptide II の α ヘリシティーは原形

通常ペプチドは水溶液中では、水との水素結合が優先水性領域を持つ α,α- 二置換グリシン誘導体がヘリックスし、ペプチドは規則構造は取らない。TFE（tetrafluoro

鎖に沿って重なるように位置を選定している。一方１つ置ethananol）などの疎水性有機溶媒の共存化で分子内水素換した peptideIII もしくは Peptide IV では α ヘリシティ結合を形成し α ヘリックスなどの自己組織化構造を形成

ーは原形（peptide I）より減弱している。さらに温度上することが知られている。そのため α ヘリックス構造は昇によるヘリックス構造の減少速度から２を二つ置換基し分子間や分子内で会合しその疎水性ゆえに安定化される。

た peptide II はヘリックス構造の安定化の亢進が観測され一方、Baldwin らは Ac-（N）Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-た（Figure ２（B））。

Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Ala（CO）NH2

また，peptide II は塩濃度増加（10mM->100mM）により（peptide I）の配列をもつペプチドが水溶液中で会合する

CD 曲線から α ヘリシティーの増加が観測された（データ省略）。

ことなく単独で α へリックスをとることを報告していると塩基性アミノ酸の Lys（+）の塩橋（salt bridge）が存

２．３ 大きな疎水性領域コアを持つ α ヘリックスペプチドの自己集合構造在し α ヘリックスを安定化すると考えられている。本研

peptideII の 40000 回転（一分間当たり）における遠心究者はこのペプチドの疎水性アミノ酸である Ala を１つ沈降実験を行ったところ５）、100mM の塩濃度でテトラマまたは２つ新規疎水性アミノ酸２（12B）に置換したものーを形成することが分かった。特にモノマー⇔テトラマーを合成し，CD スペクトルを用いて大きな疎水性領域を持間の直接的な会合現象であり、途中にダイマーやトリマー

つ α,α- 二置換グリシン誘導体の α へリックス構造への効は存在しない。ペプチド鎖は大きな疎水性コアによって会果を調査した。大きい疎水場を持つアミノ酸を導入するこ合し、ヘリックスバンドル間水素結合の関与も考えられる。とで塩橋による固定化が壊れ α へリックス性が減少する

ペプチド鎖同士は双曲子モーメントをうち消すアンチパラ可能性と，疎水場を中心に集合体をつくることで α へリレル構造を取ると推測している。

。このペプチドはらせんに沿って酸性アミノ酸の Glu（-）

４）− 54 −

集合して生体に作用する有機分子の設計と合成および機能評価

AB
1 .201[θ] 222 / [θ ini ]222

[θ] (deg·cm 2 /dmol )5000- 5000

IVIII
20000

I

0 .60 .4

IIIIVI0 .2II-2II0 .802 00220240

2 60

0

Wavelength (nm )102030405060

Te mperat ure (°C)

Figure 2とが明らかとなった。導入効率などの改善点は残こるもの

３．結果と考察の、今後、これらのアミノ酸を導入したペプチドの性質を本研究において本研究者は新規疎水性アミノ酸 1, 2, 3

詳細に検討し、本研究で示した疎水性コアによる水溶液中を得るため、マロン酸誘導体４をジアルケニル化後（6）、でのヘリックスペプチドの自己集合組織化の一般性の調査

閉環オレフィンメタセシス反応を用いて環化を行い（7）、を行うことは今後の重要な課題である６）。従来にない新しそれに続く Curtius 転位反応を経てアミノ酸誘導体 11 をい構造とそれに由来する生体機能を持ったペプチドの創製得る、という合成法を計画し、N-Fmoc 化されたアミノ酸を目指したいと考えている。

11 を得ることに成功した。大環状疎水基を持つアミノ酸において無保護のアミンを Z 化することができず、カル

本研究は、小嶋大輔修士、京都大学化学研究所

黄檗達

ボン酸も無保護の場合には有機溶媒に不溶であることなど

人博士、二木史朗博士、杉浦幸雄教授、大阪大学大学院薬から推測すると、Strecker 合成を用いてアミンを保護し学研究科た 1, 2, 3 を合成するのは非常に困難であると考えられる。

ンター山口健太郎博士との共同研究である。

西義則博士、小林祐次教授、千葉大学分析セ

本合成法は Strecker 合成と異なり、無保護のアミノ酸を保護する過程がなく、合成の各段階において比較的高収率１） a) A.Moretto, F.Formaggio, M.Crisma, C.Toniolo,で目的物を得られる。また、最初のジアルケニル化に用い

M.Saviano, R.Iacovino, R.M.Vitale and E.Benedetti,

るアルキル基の長さを変えることにより、様々な大きさのJ.Pept.Res., 57, 307 (2001). b) M.Saviano, R.Iacovino,環をもつアミノ酸誘導体を得ることができる。さらに、安V.manchise, E.Benedetti, G.M.Bonora, M.Gatos, L.Graci,

定に単離できるイソシアネート９と反応させるアルコール

F.Formaggio, M.Crisma and C.Toniolo, Biopolymers, 53,

を変えることにより、アミンの保護基も選択できるなど、200 (2000).

様々な利点を有する。今後、この合成法を用いて様々な大２） a) R.H.Grubbs and S.Chang, Tetrahedron, 54, 4413

きさの環や原子種を持つ新規疎水性アミノ酸を合成する予(1998) b) T.A.Kirkland and R.H.Grubbs, J.Org.Chem., 62,

定である。

7310 (1997).

本合成法の key step である閉環オレフィンメタセシス反

３） T. Shioiri; K. Ninomiya; S. Yamada, J. Am. Chem.

応を様々な基質６を用いて調査した結果、置換基とアルキ

Soc. , 94, 6203-6205 (1972). b) K. Ninomiya; T. Shioiri; S.

ル鎖の長さにより反応の効率が異なることがわかった。ニYamada, Tetrahedron, 30, 2151-2157 (1974).

トリル置換基を持つ化合物や、一方の炭素鎖が短い場合の４） S.Marqusee and R.L.Baldwin, Proc.Natl.Acad.Sci., 84,

収率が低かったが、それ以外では比較的高収率で環化体７8898 (1987).

が得られ、反応によっては分子間で反応が進行したダイマ

５） M. Doi; Y. Nishi; S. Uchiyama; Y. Nishiuchi; T.

ーも得られた。この結果から、反応には置換基のかさ高さ

Nakazawa; T. Ohkubo; Y. Kobayashi, J. Am. Chem.

による立体的な影響，触媒と置換基のキレーションによる収率の変化など様々な要因が関与していると考えられる。

Soc., 125, 9922-9923 (2003).
６） T. Ohwada,; D. Kojima; T. Kiwada; S. Futaki;
Y. Sugiura; K. Yamaguchi; Y. Nishi, Y. Kobayashi,

まとめ

Chemistry-A European Journal, 10, 617-626 (2004).

本研究により、高次構造をとり得るような長さのペプチ
ドに 1, 2, 3 などの大環状疎水性アミノ酸を導入できるこ− 55 −