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蛍光標識アミノ酸の部位特異的導入によるタンパク質構造変化のFRET解析

Author(s)芳坂, 貴弘Citation

科学研究費補助金研究成果報告書: 1‑6

Issue Date

2010‑04‑10

TypeResearch Paper

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publisher

URL

http://hdl.handle.net/10119/9039

RightsDescription

研究種目：基盤研究（Ｂ）, 研究期間：2007〜2009,
課題番号：19370063, 研究者番号：30263619, 研究分
野：生物学, 科研費の分科・細目：生物科学・生物物
理学Japan Advanced Institute of Science and Technology

様式 C-19
科学研究費補助金研究成果報告書
平成 22 年 4 月 10 日現在
研究種目：基盤研究（Ｂ）
研究期間：2007～2009
課題番号：19370063
研究課題名（和文） 蛍光標識アミノ酸の部位特異的導入によるタンパク質構造変化の FRET
解析研究課題名（英文） FRET analysis of protein structural changes by site-specificincorporation of fluorescent nonnatural amino acids
研究代表者
芳坂 貴弘（HOHSAKA TAKAHIRO）
北陸先端科学技術大学院大学・マテリアルサイエンス研究科・教授
研究者番号：30263619

研究成果の概要（和文）：本研究では、これまで開発してきた 4 塩基コドンなどを用いたタンパク質の部位特異的二重蛍光標識法をさらに発展させることで、タンパク質の立体構造やその変化を FRET により解析する手法の確立を行なった。実際に、マルトース結合タンパク質などについて基質結合に伴う立体構造変化の FRET を用いた検出や、二重標識に有用な N 末端特異的な非天然アミノ酸誘導体の導入法、高効率アンバーサプレッサーtRNA の開発などを達成した。
研究成果の概要（英文）：In this study, FRET analysis of protein structures and structuralchanges were investigated through site-specific incorporation of fluorescent nonnaturalamino acids in response to expanded genetic codes. Detection of structural changes ofmaltose-binding protein upon ligand-binding by FRET, N-terminal specific incorporationof nonnatural amino acid derivatives, and screening of highly active amber suppressor
tRNAs were achieved.
交付決定額（金額単位：円）2007 年度
2008 年度
2009 年度
年度
年度
総 計

直接経費
7,500,000
3,400,000
3,400,000

間接経費
2,250,000
1,020,000
1,020,000

14,300,000

4,290,000

合計
9,750,000
4,420,000
4,420,000

18,590,000

研究分野：生物学
科研費の分科・細目：生物科学・生物物理学
キーワード：蛋白質，非天然アミノ酸，生物物理，無細胞翻訳系，蛍光共鳴エネルギー移動，４塩基コドン
１．研究開始当初の背景
近年、X 線結晶構造解析などによりタンパク質の静的な立体構造に関する知識と理解は大幅に進んでいる。その一方で、タンパク質は生体内では構造変化を伴いながら、他のタンパク質や生体分子と相互作用して機能していると考えられており、そのようなタンパク質の構造変化を計測することのできる手法は必要不可欠である。
研究代表者らは、これまで開発してきた 4塩基コドンを用いた非天然アミノ酸導入技術を利用することで、タンパク質中の指定した 2 ヶ所の位置へ定量的に蛍光標識アミノ酸を導入しておき、FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)によりタンパク質の立体構造変化を検出する手法を開発した。この手法では、4 塩

基コドン CGGG と GGGU（または UAG）を導入した遺伝子と、それらのコドンに相補的なアンチコドンを持ち 2 種類の蛍光標識アミノ酸を付加した tRNA を合成し、これらを無細胞翻訳系に加えることにより、4 塩基コドンなどで指定した位置に蛍光基を導入することができる。
この際、生命科学分野で広く使用されている可視光領域に蛍光を発する分子構造の大きな蛍光基を持つアミノ酸は、リボソームなどの翻訳系に基質として許容されないという問題があった。研究代表者らは非天然アミノ酸に対する翻訳系の基質選択性(p-置換フェニルアラニン誘導体が基質として好まれる)を明らかにした上で、翻訳系に許容されるようにパラ位に蛍光基を結合させたフェニルアラニン誘導体を設計・合成し、これらがタンパク質へ効率良く導入できることを明らかにしている。
FRET によるタンパク質の立体構造解析法
自体は国内外で以前より行なわれており研究報告も多いが、これまでは特定の 2 ヶ所のみを定量的に二重蛍光標識することが困難だったために、厳密な解析はできなかった。
研究代表者らが独自に開発した 4 塩基コドンによる二重蛍光標識法は、この困難を打ち破り、タンパク質構造変化の FRET による解析法を格段に発展させる契機となると期待される。
２．研究の目的
本研究では、研究代表者らが独自に開発した部位特異的二重蛍光標識技術を利用したタンパク質の立体構造変化の FRET 解析法を発展させ、その有用性をさらに高めることを目的とする。そのために、基質の結合によるタンパク質の構造変化について注目し、それを FRET により解析することを試みた。さらにその FRET 効率の変化から蛍光基間の距離情報を得て、立体構造データとの相関について評価するとともに、二重蛍光標識タンパク質をタンパク質間相互作用やリン酸化などのプローブとして利用することの可能性についても検討することを目指した。
具体的には、まずマルトース結合タンパク質をモデルとして取り上げて、マルトースの結合に伴なう立体構造の変化を FRET により解析することを試みた。マルトース結合タンパク質の構造変化(結合前後の構造は X 線結晶構造解析により決定されている)は比較的小さいが、蛍光基を適切な位置へ導入することでそのような小さな構造変化も検出できるかどうかについて検証した。さらに立体構
造データ上での距離変化と FRET 効率変化の定量的な関係を評価することも試みた。
また、タンパク質の二重標識に有用な N 末
端特異的な非天然アミノ酸誘導体の導入法や、高効率なアンバーサプレッサーtRNA の開発なども合わせて実施した。
３．研究の方法(1)マルトース結合タンパク質の基質結合に伴う構造変化の FRET を用いた分析
モデルタンパク質としてマルトース結合タンパク質を使用し、まず 4 塩基コドン
CGGG を 15 ヶ所のチロシン部位に導入した遺伝子を作製した。これらの変異遺伝子のmRNA を、蛍光標識アミノ酸 BODIPY FL-アミノフェニルアラニンを結合させ 4 塩基のアンチコドンを持つ tRNA とともに、大腸菌由来無細胞翻訳系へ加え、蛍光標識タンパク質の合成を行なった。遺伝子の C 末端に付加しておいた HisTag を利用して精製した後、マルトースの添加による蛍光スペクトル変化を測定した。蛍光強度の変化した導入部位については、トリプトファンによる蛍光消光の影響を調べるために、蛍光基の近傍のトリプトファンをそれぞれフェニルアラニンに置換して、蛍光消光に直接関与するトリプトファン残基を同定した。
続いて、4 塩基コドンを用いて Tyr210 部位に BODIPY558 を導入しつつ、終止コドンUAG を用いて N 末端部分に BODIPYFL を導入した二重蛍光標識 MBP を合成した（図 1）。
その蛍光スペクトル変化を測定して、マルトースの結合に伴う２つの蛍光強度比の変化を評価した。

図 1 拡張遺伝暗号を用いたタンパク質の部位特異的二重蛍光標識法
同様の手法により、シアル酸結合レクチンについても、糖基質の結合に伴う基質結合部位近傍のトリプトファンによる蛍光消光の変化、および、二重蛍光標識による蛍光強度比の変化の測定を行なった。
(2) タンパク質 N 末端への非天然アミノ酸誘導体の導入
続いて、蛍光標識アミノ酸の導入をタンパ
ク質 N 末端特異的に行なうために、開始コドンに対して蛍光標識アミノ酸および蛍光標
識非 α アミノ酸の導入を検討した。ストレプ
トアビジンおよびマルトース結合タンパク
質の開始コドンを本来は終止コドンであるUAG に置換しておき、一方で、大腸菌開始
tRNA のアンチコドンを CUA に置換して、蛍光標識された非天然アミノ酸、α 置換アミノ酸、非 α アミノ酸を結合させた。無細胞翻訳系における翻訳生成物を分析することで、開始コドンによるタンパク質 N 末端への蛍光基の導入を評価した。
(3) 蛍光基の位置揺らぎを抑制した二重蛍光標識法の開発
リンカーを含まない蛍光標識アミノ酸のＮ末端への導入と、リンカーを含まない非蛍光性 FRET アクセプターとなる非天然アミノ酸の内部部位への導入を行なった。これにより、アミノ酸主鎖と蛍光基との間にリンカーを含まず、蛍光基の位置の揺らぎが生じないようにした。実際にマルトース結合タンパク質について、Ｎ末端と種々の内部部位を二重標識して、蛍光スペクトル測定および蛍光寿命測定により、FRET 効率とドナーアクセプター間距離の算出を試みた。
(4) 非天然アミノ酸導入用 tRNA のスクリー
ニング
リン酸化アミノ酸などの導入効率の低い非天然アミノ酸を効率良く導入するために、終止コドン UAG を用いて非天然アミノ酸を効率良く導入できるアンバーサプレッサーtRNA の開発を行なった。まず、様々な生物種由来の tRNA を合成して、蛍光標識アミノ酸を結合させ、タンパク質への導入を電気泳動により評価した。また、蛍光検出をより簡便に行なうために、緑色蛍光タンパク質 GFPに BODIPY558 標識アミノ酸を導入する系を利用して、アンバーサプレッサーtRNA の翻訳活性をリアルタイム検出可能な手法を新たに開発した。
４．研究成果(1)マルトース結合タンパク質の基質結合に伴う構造変化の FRET を用いた分析
MBP の 15 ヶ所のチロシン部位に蛍光標識アミノ酸 BODIPYFL-アミノフェニルアラニンを導入して、基質結合に伴う蛍光変化を測定したところ、Tyr210 と Tyr242 に導入した場合には、マルトースの結合に伴って蛍光強度が大きく増加することが見い出された。これはマルトース非存在下では BODIPYFL が近傍のトリプトファンにより消光されているが、マルトースの結合による構造変化によってトリプトファンの位置が変化して、消光が起こらなくなったためだと考えられた。そこで、基質結合部位近傍の 4 つのトリプトフ
ァンをそれぞれフェニルアラニンに置換したところ、Tyr210 に蛍光基を導入した場合はTrp340 が、Tyr242 の場合は Trp232 がそれぞれ主に消光変化を引き起こしていることが確認された。
続 い て 、 Tyr210 ま た は Tyr242 に
BODIPY558-アミノフェニルアラニンを導入しつつ、N 末端領域に BODIPY558 の FRETドナーとなる BODIPYFL を導入することで、蛍光強度比の大きな変化が観察できた（図 2）。
これは、BODIPYFL から BODIPY558 へのFRET が 起 き る と と も に 、 Tyr210 ま た は
Tyr242 での BODIPY558 の蛍光消光の変化が起こり、その結果、蛍光強度比が大きく変化したと解釈できた。

図 2 マルトース結合タンパク質の基質結合に伴う蛍光変化
この原理の一般性と応用可能性を評価するために、同様に基質結合部位近傍にトリプトファンを有するシアル酸結合レクチン（ミミズ由来レクチン変異体）について、BODIPY標識アミノ酸の導入と基質結合に伴う蛍光変化を測定した。その結果、基質結合部位近傍に BODIPY 標識アミノ酸を導入することで、基質の結合に伴い蛍光の大きな増加が観察された。また、別の部位に FRET ペアとなる蛍光基を導入することで、基質結合に伴う蛍光強度比の変化を検出することもできた。
これらの蛍光分析方法は、特定の基質の結合を蛍光で高感度に検出できるとともに、蛍光レシオイメージングも可能にすることから、様々な応用が期待される。
(2) タンパク質 N 末端への非天然アミノ酸誘導体の導入
上記の二重蛍光標識の際には、タンパク質の立体構造に大きな影響を与えないようにするために、一方の蛍光基を N 末端領域に導入している。このような N 末端への導入を効率的に行なうために、開始コドンに対して非天然アミノ酸誘導体を導入する手法を開発した。ただし通常の開始コドン AUG を用いた場合には、メチオニンと競合するため、本来は終止コドンであるアンバーコドン UAGを拡張開始コドンとして使用した。これまでに、翻訳開始過程ではαアミノ基は必ずしも必要ないことが確認されていることから、その基質選択性を明らかにするために、種々の鎖長を有するアミノカルボン酸に蛍光基を結合させて、N 末端への導入効率を評価した。
その結果、アルキル鎖長や蛍光基の種類がその導入効率に大きく影響することが明らかとなった。また、蛍光標識アミノ酸のαアミノ基にビオチンなどの別の標識分子を結合させて、N 末端に導入することも可能であった（図 3）。

図 3 非天然アミノ酸誘導体のタンパク質 N
末端への導入法
さらに、開始 UAG コドンを用いた N 末端への導入と、伸長 UAG コドンを用いた内部部位への非天然アミノ酸の導入は、互いに独立して起こることも確認した。この手法を実際に上記の二重蛍光標識 MBP の合成に応用して、従来の 4 塩基コドンなどを用いた場合と同様の蛍光変化を示す二重蛍光標識 MBPが合成できることも示した。
(3) 蛍光基の位置揺らぎを抑制した二重標識法の開発
上記の研究により、蛍光標識アミノ酸の導入が、タンパク質の構造やその変化の解析に有用であることを実証したが、FRET によって 2 残基間距離を算出する場合には、蛍光基とアミノ酸主鎖の間にリンカーが存在するために、蛍光基の位置が揺らいでしまい、正確に測定できないという問題があった。そこで、リンカーを含まない蛍光標識アミノ酸（N-RhodamineGreen-アラニン）とその非蛍光性 FRET アクセプターとなる非天然アミノ酸（NBD-アミノフェニルアラニン）を設計・合成した。これらは、開始および伸長 UAG コドンを用いた二重導入法を用いてマルトー
ス結合タンパク質の N 末端および内部部位へ導入した。

図 4 リンカーを含まない標識アミノ酸のタンパク質への導入
得られた二重標識 MBP について、蛍光スペクトル測定および蛍光寿命測定を行ない、FRET 効率および 2 残基間距離の算出を行なった。その結果、蛍光減衰曲線を通常の多成分解析した場合は複数の成分に分離され、見かけ上は FRET による短寿命成分の他に、ほとんど FRET を起こしていない長寿命成分が現れることがわかった。そこで、2 残基間距離に分布があると仮定して解析したところ、やや広い距離分布を有することが推測された。これについては、今後も最適な解析が行なえるよう、引き続き検討する予定である。
(4) 非天然アミノ酸導入用 tRNA のスクリー
ニング
蛍光標識アミノ酸 BODIPYFL-アミノフェニルアラニンを用いて、スクリーニングを行なった結果、マイコプラズマの Trp tRNA 変異体が非常に高い導入効率を示すことが見い出された。ただし、スクリーニングの過程
では蛍光標識アミノ酸を導入したタンパク質を電気泳動して蛍光イメージを取得する必要があり、大量の tRNA のスクリーニングを行なうためには、より簡便な検出法が必要であった。そこで、緑色蛍光タンパク質（GFP）の N 末端領域に BODIPY558-アミノフェニルアラニンを導入して、GFP から BODIPY558への FRET をリアルタイム測定することで、簡便に蛍光標識アミノ酸の導入を評価できる手法を確立した。

図 5 非天然アミノ酸導入用アンバーサプレ
ッサーtRNA の新規スクリーニング方法
実際に 20 種類程度の tRNA についてスクリーニングを行なったところ、既に得られていたマイコプラズマ由来の tRNA と同程度の活性を持つ tRNA を取得することができた。今後、スクリーニングのスケールアップを行なうことで、さらに高い活性を持つ tRNA の取得が可能になるとともに、そのような tRNAを用いることで、導入効率の低いリン酸化アミノ酸なども効率よく導入できるようになると期待される。

５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）

in a cell-free translation system, Biochem.
Biophys. Res. Commun., 2008, 374, 304-308.
査読有〔雑誌論文〕（計 8 件）
1. Masanori Miura, Norihito Muranaka,
RyojiAbe,
Takahiro
Hohsaka,
Incorporation of fluorescent-labeled
non-α-amino carboxylic acids into theN-terminus of proteins in response toamber initiation codon, Bull. Chem. Soc.
Jpn., 2010, 83, 546-553. 査読有
2. Ryoji Abe, Kaori Shiraga, Shogo Ebisu,
HiroakiTakagi,Takahiro
Hohsaka,
Incorporation of fluorescent non-naturalamino acids into N-terminal tag ofproteins in cell-free translation and its
dependence on position and neighboringcodons, J. Biosci. Bioeng., 2010, 110,
32-38. 査読有
3. Tadayoshi Egusa, Kaori Shiraga, Takuya
Chiba, Yasunori Tokuda, Issei Iijima,
Takahiro Hohsaka, Incorporation ofnon-natural amino acids with two labelinggroups into the N-terminus of proteins,Bull. Chem. Soc. Jpn., 2010, 83, 176-181.
査読有
4. Naoki Shozen, Issei Iijima, Takahiro
Hohsaka, Site-specific incorporation of
PEGylated amino acids into proteins using
nonnatural amino acid mutagenesis, Bioorg.
Med. Chem. Lett., 2009, 19, 4909-4911. 査
読有
5. Issei Iijima, Takahiro Hohsaka,
Position-specificincorporationof
fluorescent non-natural amino acids into
maltose-binding protein for detection ofligand binding by FRET and fluorescencequenching,
ChemBioChem,2009,10,999-1006. 査読有6. Takayoshi Watanabe, Yoichi Miyata,
Ryoji Abe, Norihito Muranaka, Takahiro
Hohsaka, N-Terminal specific fluorescencelabelingofproteinsthroughincorporation of fluorescent hydroxy acidandsubsequentester
cleavage,
ChemBioChem, 2008, 9, 1235-1242. 査読有7. Takayoshi Watanabe, Norihito Muranaka,
Takahiro
Hohsaka,
Four-basecodon-mediated saturation mutagenesis ina cell-free translation system, J. Biosci.
Bioeng., 2008, 105, 211-215. 査読有
8. Hikaru Taira, Yosuke Matsushita, Kenji
Kojima, Kaori Shiraga, Takahiro Hohsaka,Comprehensive
screeningofambersuppressor
tRNAs
suitablefor
incorporation of non-natural amino acids〔学会発表〕（計 39 件）1. 芳坂貴弘，非天然アミノ酸導入技術のタ
ンパク質の構造機能解析への応用，第 12 回
生命化学研究会，2010.1.8，あわら市
2. 東 周作、飯島一生、三浦将典、芳坂貴弘、
新規蛍光標識非天然アミノ酸の導入によるタンパク質立体構造の精密な FRET 解析の検討 、 第 32 回 日 本 分 子 生 物 学 会 年 会 、2009.12.11、横浜
3. Issei Iijima, Takahiro Hohsaka,
Screening of amber suppressor tRNAs
suitable to introduce nonnatural aminoacids into proteins by real-timemonitoring of cell-free translation, The6th International Symposium on Nucleic
Acids Chemistry, 2009.9.29, 高山
4. 芳坂 貴弘，非天然アミノ酸導入技術を利用したタンパク質の部位特異的蛍光標識とFRET 解析への応用，第 9 回日本蛋白質科学会
年会，2009.5.22，熊本
5. 飯島一生、芳坂貴弘、非天然アミノ酸の二重導入によるタンパク質構造変化の FRET
分 析 、 日 本 生 物 物 理 学 会 第 46 回 年 会 、2008.12.5、福岡
6. 江草忠義、飯島一生、芳坂貴弘、非天然アミノ酸導入技術を利用した二重蛍光標識タンパク質の合成と FRET 分析への応用、第 3回バイオ関連化学合同シンポジウム、
2008.9.20、横浜
7. 飯島一生・芳坂貴弘，蛍光標識アミノ酸の導入によるタンパク質機能の蛍光分析，日本生物物理学会第４５回年会，2007.12.21，
横浜
8. 芳坂貴弘，拡張遺伝暗号を用いたタンパ
ク質のピンポイント蛍光標識法の開発，第７回日本蛋白質科学会年会，2007.5.24，仙台
他 31 件〔図書〕（計 2 件）
1. 人工タンパク質の合成と応用、芳坂貴弘、超分子サイエンス＆テクノロジー(国武豊喜監修)、pp890-895、エヌティーエス、2009.
2. 非天然型アミノ酸を含むタンパク質、芳坂貴弘、トコトンやさしいタンパク質の本(東京工業大学生命理工学研究科編)、
pp112-113、日刊工業新聞社、2007.
〔その他〕
ホームページ等
http://www.jaist.ac.jp/ms/labs/hohsaka/

６．研究組織(1)研究代表者
芳坂 貴弘（HOHSAKA TAKAHIRO）
北陸先端科学技術大学院大学・マテリアル
サイエンス研究科・教授
研究者番号：30263619(2)研究分担者（）
研究者番号：(3)連携研究者（）
研究者番号：