新規蛍光プローブを用いた一酸化窒素（NO）の生細胞における作用解析
東京大学大学院菊地

薬学系研究科和也

Nitric Oxide (NO) is produced by a variety of cells and is involved in a broad array of physiological and pathophysiologicalprocesses. It is reported that NO perform in vasodilation, immunoregulation and neurotransmission. However, many proposed
physiological roles of NO were not proved directly by measuring NO. One of the reasons for this is the difficulty of direct, real-time
detection of this gaseous, free radical species. Although several methods of detecting NO, which is unstable and produced at lowconcentration, have been developed, a new method is required which is satisfactory for studies in living cells in terms of selectivity,sensitivity, and experimental feasibility. In order to obtain direct evidence for NO functions in cultured dermatological cells, I
designed and synthesized fluorescent NO indicators to detect NO in living cells as a means to examine the physiological functions ofNO. First, the reactivity of NO was examined in order to find a suitable reaction for selective NO trapping. I found that aromaticamines react with NO in the presence of dioxygen to produce the corresponding triazenes.
We started to investigate the design and synthesis of fluorescent compounds based originally on 2,3-diaminonaphthalene as avicinal diamine. Based on these findings, we designed diaminofluoresceins (DAFs, Figure 1) as indicators for NO. The N-nitrosationof DAFs, yielding the highly green-fluorescent triazole form, offers the advantages of specificity, sensitivity, and a simple protocol forthe direct detection of NO (detection limit: 5 nM). Fluorescence detection with visible light excitation and high sensitivity enabled
the practical assay of NO production in living cells. These dyes were applied to NO detection from cultured macrophages, whichhave inducible NO synthase. The macrophages were cultured in a plate reader wells and the extracellular NO production wasmeasured by their fluorescence intensity. These results were successfully shown to establish the basic fundamental of detectiong
NO from cultured dermatological cells.

１

緒は細胞をすりつぶさないで、生きたまま機能を調べるこ言とができれば多くの情報が得られると考えられる。生体

本研究は一酸化窒素（NO）をターゲットとして、蛍光内分子を標的として生きたままの状態で可視化すること測定で可視化できるプローブを合成し、生きた状態での分は、Ca ２＋を測定する蛍光色素の合成より細胞生理学的研子の作用を明らかにし、生細胞における NO の作用を示す究に広く用いられるようになった１）。この成功の理由は、ことを目的とする。具体的には、まず、一酸化窒素（NO）

従来電極などで局部的に調べていた生理学的現象が、細胞と反応して蛍光特性の変化する蛍光プローブを、分子種のあるいは組織全体として刻々変化する様子が観察でき新し化学反応性に基づいてデザイン・合成する。次に、作成しい情報を得ることが出来るからである。

たプローブを用いて生理活性物質をリアルタイムで画像とさて、NO は 1987 年に EDRF であると報告されて以来２）、して捉えること（バイオイメージング）で、動的作用機序循環系のみならず３）、免疫系や中枢系においても４）、そのの解明を行う。

役割が論じられるようになっている。この発見が 1998 年

細胞生物学研究のゴールの１つは生きている状態におけのノーベル賞受賞対象になったことは記憶に新しいところる分子の働きをその場で明らかにすることである。細胞内である。しかし、その真の活性に関しては未だに議論のあでの情報伝達物質やその物質を認識する分子が単離され、るところで、混沌としているのが現状である。その原因の試験管内での性質が明らかにされるにつれ、次の目標であ一つとして、NO が生理的条件下不安定であり、低濃度でる生理的条件での機能が重要視されるようになってきた。の放出のために測定が困難であることから、生理的に機能具体的には、細胞のどこで、いつ、どれくらい情報伝達物している「生きた」NO の動きを直接捉え、議論すること質が生成し作用するか？

ができないことが挙げられる５〜７）。この状況下、NO の作

情報伝達物質の濃度変化の分布や時間経過が異なるとシグナルの意味が異なるか？

情報用解析に有効な検出法という観点から、特異的な検出に向伝達物質のシグナルが細胞内のある一部に対してのみ向けけた分子デザインが可能な蛍光法に基づくことにした。蛍られるか？

光法に基づく測定法を開発し、バイオイメージングできれ等である。これらの問題点を解決するためにば NO の役割の解明に寄与できると考えた。

Detection and Functional Analysis of
Nitric Oxide on Living Cells Using Novel
Fluorescence Probe（DAN）を用いる NO 2−の測定法が知られていた８）。申請者

Kazuya Kikuchi

らは、NO の反応性を精査したところ、この様なジアミン

Graduate School of PharmaceuticalSciences, The University of Tokyo

で NO をダイレクトに測定できることを見出し、新しい測蛍光法に基づく方法としては、2 , 3—diaminonaphthalene

定法を開発した９）。しかし、DAN をそのまま用いたのでは。
様々な化合物をデザイン・合成しつつ検討した結果、ジア− 36 −

新規蛍光プローブを用いた一酸化窒素（NO）の生細胞における作用解析

ミノフルオレセイン（DAF 類、Fig. １）の開発に至った 10、11）。

２２. １実100 mM）中に 10µM の濃度で DAF—2 を溶かし、100 µMの NO 溶液を各最終濃度になるよう添加した。撹拌後、蛍験光 強 度 が 安 定 し た 後、 各 ス リ ッ ト 幅 2 . 5 nm で 励 起 光ジアミノフルオレセイン（DAF）類の合成（515 nm の蛍光測定）及び蛍光（495 nm の励起光測定）（Fig. １）をスキャンして測定した。

2 , 3—Dimethyl—6—nitroacetanilide （Ⅰ）
25 . 3 g の 2 , 3—Dimethyl—6—nitroaniline を 290 mL の酢酸中、15 mL の無水酢酸を加え、１h 還流する。溶媒溜去後、

２. ３ DAF- 2 の NO Donor による蛍光強度変化の時間経過の測定（Fig. ３）

EtOH から再結晶。
（29 . 3 g、y. 98％）

ナトリウムリン酸緩衝液（pH 7 . 4、100 mM）中に 10µM

3—Acetamido—4—nitrophthalic acid （Ⅱ）の濃度で DAF—2 を溶かし、各濃度の NO 放出生化合物

29 . 2 g の（Ⅰ）を１L の水に懸濁させ、100 g の MgSO 4を加え、還流させ、133 g の KMnO 4 を合計２L の水に懸（NONOate）を添加した。37℃で撹拌後、蛍光強度の時間変化を 495 nm 励起、515 nm 蛍光において測定した。

濁させながら、小分けにして入れる。熱時ブフナー濾過し、濾液に食塩を飽和させ、冷後 HCl で酸性にし析出物を濾取、濾液は AcOEt で抽出し、溶媒を溜去する。
（19 . 6 g、y. 52 ％）２. ４ DAF を用いたマクロファージ（RAW 264 . 7）からの NO の測定

3—Acetamido—4—nitrophthalic anhydride （Ⅲ）

96 穴マイクロプレート上でマクロファージ（RAW 264.7）

0 . 538 g の（Ⅱ）を 10mL の無水酢酸に 80℃で溶かし AcCl

を 10％ FBS、13mM NaHCO3、20mM glucose、70 mg/mL

１mL を加え、２h そのまま撹拌。溶媒を溜去し、少量のbenzylpenicillin、100mg/mL streptomycin を含む DMEM 中 5％

無水 CH ２Cl ２を加え、析出物を濾取。
（0 . 29 g、y. 58％）
3—Amino—4—nitrofluorescein（Ⅳ）（Ⅲ）と２当量の Resorcinol を180℃で溶融し、２h 後 0 . 25 当量の ZnCl 2 を加え、210℃で乾燥固化させる。黒い固まりを砕いた後、0 . 6 N HCl を加え、２h 還流。冷後沈殿物を濾取し、乾燥後、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製。
（y. ５％以上）
3 , 4—Diaminofluorescein（DAF—1）（Ⅳ）を Na2S および NaSH の水溶液中、24h 還流し、冷後 HCl でpH4 にし、沈殿物を濾取。乾燥後、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製。
（y. 76%）必要であれば、硫黄を除くため、2N HCl で再結晶した後、NaOH 水溶液に溶かし、再度 HCl で pH４にし、沈殿物を濾取。
DAF—2、DAF—3 も同様の手順で作成した。

２. ２ DAF—2 の NO による蛍光スペクトルの変化の測定（Fig. ２）ナトリウムリン酸緩衝液（pH 7 . 4、fig. １ 1DAF—1，2，3 の合成スキーム− 37 −

激し、i—NOS を誘導する。16 時間後、２回 Krebs Ringer
Phosphate（KRP） で 洗 い、DAF—2（10mM）、L—Arg（ １mM）
、NOS 阻害剤等を溶かした KRP（200mL/well）に取り替えて更に培養する。２時間後、培養液の上清を蛍光測定用マイクロプレートに取り（180mL/well）、蛍光用マイクロプレー
トリーダーにて蛍光強度を測定した（Ex.485nm —Em.538nm）。

２. ５

血管平滑筋細胞のイメージングの方法

細胞培養：雄性 Wistar ラットの大動脈血管平滑筋細胞を Ross らの方法により摘出し 12）、10％ FBS と抗生物質を含む DME 培地で培養する。底がガラス製のシャーレ（MatTek 社 P 35 G—101）上に移して培養する。実験の前に無血清の DME 培地に取り替え、24 時間培養後、25 U/mL IL—1β、30 ng/mL TNF—α、150 U/mL IFN—γ、12 . 5 mg/mL LPS を培地に加え、細胞を刺激し、さらに12 時間ほど培養する。
実験には 10 〜 20 代の細胞を用いた。
イメージング：それぞれの色素（10 mM）の KRP 溶液（0 . 2％ DMSO 含）に細胞の上清を取り替え、37℃で１時間ほど か け て 色 素 を 負 荷 す る。wash out 後 L—Arg、L—
NMMA を含む KRP に取り替え、DAF—2 誘導体の場合、励起フィルター 490 nm、dichroic mirror 505 nm、バリア
Fig. ２フィルター 515 nm（long pass）の付いた蛍光顕微鏡（オNO 添加による DAF—2 の蛍光スペクトル変化（A）515nm 蛍光測定による励起光変化（B）495nm 励起光変化による蛍光変化

リンパス IX—70）で観察する。なおステージは 37℃に保った。露光時間、撮像間隔は DAF—2 誘導体の場合 132 ms、30 s に設定した。
Charge—coupled device カメラに取り込んだ画像はMCID（Imaging Research 社）で処理、記録した。

３
３. １

結果と考察

NO 検出蛍光プローブ DAF—2 の開発とその化学的性質
申請者はすでに DAN のジアミノ基と NO が特異的に反応してトリアゾール体を生成することを見出したため９）、プローブをさらに最適化し生体サンプルから容易に NO を測定することを目指した。高感度かつ特異的に NO を検出できる蛍光プローブのデザインにあたり着目した点は、
１）生理的な pH 及び温度で水中において NO と速やか
Fig. ３NONOate から生成する NO による蛍光強度変化（A）長寿命型 NOC12（半減期 327min）
による用 依存的時間経過（B）短寿命型 NOC13（半減期 13.7min）
による用 依存的時間経過に反応が進行すること
２）NO との反応により水中において量子収率が大きく増大すること
３）可視光領域に励起光を持ち光照射により細胞内分子の自家蛍光が無視でき光照射により細胞への傷害が小さいこと

CO 2 / 95 ％ air incubator に て 培 養（37 ℃） す る（1 ×の３点である。フルオレセインは 500 nm 付近の長波長に106 cells/well）。
実験の前に無血清の D—MEM に取り替える。24 時間後励起光を持つ。また、水中でも量子収率が減ぜず蛍光強度各種濃度の LPS、IFN—γ を含む DMEM で培養細胞を刺が環境要因によって影響されにくいため広く生物応用が行− 38 −

新規蛍光プローブを用いた一酸化窒素（NO）の生細胞における作用解析

われている。モノアミノフルオレセインは量子収率が小さいことが報告されているが 13）、この理由は電子供与性のアミノ基がフルオレセインのフタル酸部分に入り、キサンテン環とフタル酸部分の両方とも電子供与を行い電子の非局在化が起こりにくいためと考えた。この原理を利用し、ジアミノフルオレセイン（DAF）類を合成すれば量子収率が小さくなり、NO との反応でトリアゾール体を形成してはじめて蛍光強度が強くなることをもくろんだ。これをもとに DAF—1、DAF—2、DAF—3 をデザインし Fig. １に示すスキームで合成した。これら３つの分子ともそれ自身ではほとんど蛍光を持たなかった。
作成した分子のうち DAF—2 は NO との反応で 100 倍もの蛍光増強が確認された。DAF—2 による NO の検出限界は５nM 程度であり、これは DAN に比べ約 30 倍、検出感度が改良されたことになる。NO との反応により、励起波長が 495 nm、蛍光波長が 515 nm（黄緑色）の蛍光が増Fig. ４

強し、前述の可視光励起という目標を達成することができトリアゾール体の蛍光強度への pH の影響た（Fig. ２）。中性のバッファーへの溶解度も良いので、使用濃度の 10 mM で析出することはなく扱いやすい。NO溶液だけではなく、NO を自然分解により生成する分子NONOate を用いた場合でも、蛍光強度が時間を追って容量依存的に増強した（Fig. ３）。
pH 変化における蛍光強度の変化を Fig. ４に示した。
DAF—2 とそのクロル化体である DAF—4 について示したが、pH が６以下になると蛍光強度は大きく減弱する。この原因はフェノール性水酸基の脱プロトン化であると考えられたため、クロル化体の DAF—4 を合成した。DAF—4
ではフェノール性プロトンの pKa が小さくなったが、中性付近での蛍光安定性が低くなった。この原因はトリアゾール環上のプロトンの脱プロトン化によると考えられる。
これらの結果より、細胞系の実験では、中性付近での蛍光強度のより安定な DAF—2 を用いることにした。

３. ２

培養細胞を用いた NO 検出系の確立

生体サンプルとして、培養細胞から生成する NO を測定した。マクロファージの誘導型 NO 合成酵素（i—NOS）の発現量は LPS 及び IFN—γ の濃度に伴い増加することが知られている 14）。i—NOS は一旦誘導されれば酵素自身の発現量が増加するため、c—NOS とは異なり Ca 2 ＋非依存的に NO を産生し続けるので、LPS 及び IFN—γ の濃度依存的に NO 生成量は増加する。そこで、刺激する LPS、IFN—γ 及び細胞数を変化させてマクロファージを一定時間培養後、DAF を添加し、２時間後の蛍光強度を測定した。
なお、マクロファージは D—MEM 中で培養するのが一般的であるが、培地中のフェノールレッドおよび FBS による蛍光の消光を懸念したため DMEM は用いず、DAF を用いる際には KRP 中に溶解して用いた。

Fig. ５ マクロファージを用いた DAF—2 と Griess 反応によるNO 検出の比較（A）DAF—2 を用いたマクロファージ（106cells/well）からのNO 検出。LPS 各濃度による i—NOS 誘導後、L—Arg 刺激２時間後の測定（B）Griess 反応による NO 検出。L—Arg 刺激 48 時間後の培養
土清の測定− 39 −

Fig. ５は IFN—γ を加えない時の蛍光強度の増加率で、細胞数が 106 cells/well と多いものの２時間の培養時間で蛍光強度は LPS 濃度依存的に増加した。吸光度法を利用した既存の NO 2−測定法であるグリース法でも同様の結果（Fig. ５）であったが、感度が低いため９〜 40 時間の培養時間が一般的には要求される 15、16）。両方法を比較して分かるように、DAF を用いることによってより短時間での簡便な手法による NO 測定が可能となった。
更に、この蛍光強度の増加は IFN—γ の添加によって顕著に増加した。マクロファージにおいては LPS と IFN—γを同時に刺激することによって、相乗的に NO 産生能が増大することが知られており 15）、以上の結果はマクロファージが生成する NO を DAF が捉えていることを示している。

３. ３

DAF 誘導体を用いたバイオイメージング

DAF を用いた NO 測定法が確立したので、培養細胞内での NO 産生の検出に応用することにした。そこで細胞に局在化のため、DAF- 2 を誘導化した。
３. ３. １

NO イメージングプローブ（DAF—2 誘導体）のデザイン、合成
細胞膜を透過し、細胞内のエステラーゼにより加水分解を受けるものとして DAF—2 DA の２つのフェノール性水

Fig. ６

DAF—2 誘導体を用いたバイオイメージングの原理

酸基をアセチル化することでデザイン、合成した（Fig. ６）。
Rotman らはフルオレセインのジアセチル体が細胞の中のエステラーゼにより加水分解を受けることを報告しているは蛍光が増加、d では最初は阻害剤が効いていない細胞も17）。アセチル体はフェノール性水酸基及びカルボン酸の負あるが徐々に増加が止まる、e では全く蛍光が増加しない

電荷がなくなっており、脂溶性のため細胞膜を通過する。という結果になり、NO を DAF—2 DA により捕らえてい通過後、エステルの加水分解により再び電荷を生じ、細胞ることが分かる。b では蛍光の増加が阻害されていく様子

質内にとどまる。

が、c では蛍光の増加が NOS の基質の L—Arg の供給により復活する様子が分かる。この様子を Fig. ８に画像とし３. ３. ２

DAF—2 DA を用いた血管平滑筋細胞の産生する NO のイメージングて示す。個々の細胞が NO 産生により、蛍光を生じるようになる経時変化が示された。

DAF—2 DA は非蛍光性であるため、エステルが加水分

DAF—2 が捕らえるのは NO 自身ではなく、酸化した解されない限り蛍光を発しない。これを細胞外に加えるこNO ＋等価体である。このため NO の持つ薬理作用はブロとで、ラット大動脈由来血管平滑筋培養細胞に適用した。

ックしない。この性質は Ca 2 ＋等の他の生理活性物質との血管平滑筋細胞は i—NOS を有することが知られている。

同時変化を調べるときに有利であると考えられる。

細胞に DAF—2 DA を負荷後細胞を観察すると明らかに蛍４

光強度は負荷していない細胞よりも強く、エステラーゼによりエステルが加水分解されていることが分かった。

総括NO の特異的蛍光プローブを作成するために、ジアミノ

Fig. ７a は刺激により NOS を誘導した細胞の上清に１ベンゼン誘導体（DAF 類）をデザイン・合成した。この

mM の L—Arg があるときの蛍光強度の経時変化、b は a

うち DAF—2 は感度、蛍光波長ともに最適であり生体サンの増加している後で上清を１mM の L—NMMA に置換しプルから発生した NO を測定するために有用であった。生たときの経時変化、c はその後、さらに 10 mM の L—Arg

体サンプルとして誘導型 NOS を持つマクロファージを用に 置 換 し た と き の 経 時 変 化、d は １mM の L—Arg にいた結果、細胞外に放出された NO を蛍光強度変化として10 mM の L-NMMA を添加したもの、e は無刺激の細胞の捉えることに成功した。細胞内に細胞無侵襲に加えること上清に１mM の L—Arg を加えたときのものである。a でのできる DAF—2 の誘導体を合成し、細胞内の NO の産生− 40 −

新規蛍光プローブを用いた一酸化窒素（NO）の生細胞における作用解析

a：刺激した細胞の１mM L -Arg を含む培養液下での変化
b：a の後、培養液を１mML-NMMA に置換したときの変化
c：さらに b の後、培養液を 10mML-Arg に置換したときの変化
d：刺激した細胞の１mML-NMMA と１mM LArg を含む培養液下での変化
e：無刺激の細胞１mM L -Arg を含む培養液下での変化＊細線は個々の細胞の蛍光強度を示し、太線はその平均値を示す。

Fig. ７

各条件下における個々の血管平滑筋細胞の蛍光強度変化

Fig. ８

ラット大動脈血管平滑筋細胞が生成する NO の可視化を画像化することに成功しfluorescence properties, J. Biol. Chem., ２６０, 3440 -た。これらの結果は、種々の培養細胞や組織に応用が可能

3450 , 1985 .

であると考えられ、皮膚細胞及び組織の NO 産生機構を明２）Palmer RMJ, Ferrige AG, Moncada S,: Nitric oxide

らかにする上での基盤的研究である。

release accounts for the biological activity ofendothelium-derived relaxing factor, Nature.,（参考文献）

３２７, 524 - 526 , 1987 .

１）Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY,: A new

３）Marletta MA, Yoon PS, Iyengar R, et al.,: Macrophagegeneration of Ca ２＋ indicators with greatly improved

oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate: nitric− 41 −

oxide is an intermediate, Biochemistry, ２７, 8706 - 8711 ,indicators: Diaminofluoresceins, Anal. Chem., ７０,1988 .

2446 - 2453 , 1998 .

4）Bredt DS, Hwang PM, Snyder SH,: Localization of12）Ross R, Glomset J, Kariya B, et al. : A platelet-nitric oxide synthase indicating a neural role for nitric

dependent serum factor that stimulates theoxide, Nature, ３４７, 768 - 770 , 1990 .

proliferation of arterial smooth muscle cells in vitro,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７１, 1207 - 1210 , 1974 .

５）長野哲雄，: NO の検出・測定法 . NO 化学と生物，日本化学会編，: 季刊化学総説，30，学会出版センター，13）M u n k h o l m C , P a r k i n s o n D R , W a l t D R , :Intramolecular fluorescence self-quenching of東京，1996，79 - 86 頁 .

fluoresceinamine, J. Am. Chem. Soc., １１２, 2608 - 2612 ,６）Kikuchi K, Nagano T, Hayakawa H, et al., : Real1990 .

time measurement of nitric oxide production ex vivo
by luminol-H 2 O 2 chemiluminescence method, J. Biol.

14）Lorsbach RB, Murphy WJ, Lowenstein CJ, et al., :Expression of the nitric oxide synthase gene in mouse

Chem., ２６８, 23106 - 23110 , 1993 .
７）Kojima H, Kikuchi K, Hirobe M, et al. : Real-time

macrophages activated for tumor cell killing. Molecularmeasurement of nitric oxide production in rat brain bybasis for the synergy between interferon-gamma andthe combination of luminol-H 2 O 2 chemiluminescence

lipopolysaccharide, J. Biol. Chem., ２６８, 1908 - 1913 ,1993 .

and microdialysis, Neurosci. Lett., ２３３, 157 - 159 ,15）Gross SS, Levi R, : Tetrahydrobiopterin synthesis.

1997 .
８）Misko TP, Schilling RJ, Salvemini D, et al., : A

An absolute requirement for cytokine-induced nitricfluorometric assay for the measurement of nitrite inoxide generation by vascular smooth muscle. J. Biol.

biological samples, Anal. Biochem., ２１４, 11 - 16 , 1993 .

Chem., ２６７, 25722 - 25729 , 1992 .

９）Kojima H, Sakurai K, Kikuchi K, et al., : Development

16）Lewis RS, Tamir S, Tannenbaum SR, et al., : Kineticof a fluorescent indicator for the bioimaging of nitricanalysis of the fate of nitric oxide synthesized byoxide, Biol. Pharm. Bull., ２０, 1229 - 1232 , 1997 .

macrophages in vitro, J. Biol. Chem., ２７０, 29350 29355 , 1995 .

10）Nakatsubo N, Kojima H, Kikuchi K, et al., : Direct
evidence of nitric oxide production from bovine aortic17）Rotman B, Papermaster BW, : Membrane propertiesendothelial cells using new fluorescence indicators:of living mammalian cells as studied by enzymatic

diaminofluoresceins, FEBS Lett., ４２７, 263 - 266 , 1998 .

hydrolysis of fluorogenic esters. Proc. Natl. Acad. Sci.

11）Kojima H, Nakatsubo N, Kikuchi K, et al., : Detection
and imaging of nitric oxide with novel fluorescent− 42 −

USA, ５５, 134 - 141 , 1966 .