細胞増殖因子および接着分子による皮膚硬化制御に関する分子生物学的研究
獨協医科大学山

蔭

皮膚科

明生

Purposes: We investigated how to control skin sclerosis and softness. Systemic scleroderma is a model for scleroticor aging skin. We indicated that TGF-β, PDGF-AA and PDGF α receptor interaction might play an importantrole in skin sclerosis. Recently, it has been clear that many of the proteoglycans behave as modulators of growth
factors binding in scleroderma and normal fibroblasts. We examine the role of proteoglycans for binding to growth
factors on scleroderma fibroblasts in this paper. The hyaluronate receptor（CD44）molecule is a multifunctional
cell surface protein involved in T cell activation, monocyte cytokine release, fibroblast locomotion, and lymphocyte
binding to high endothelial venules. There is protein kinase C -like kinase domain in intracellular portion of CD44,
and intra-molecular serine/threonine residue may be phospholylated to mediate signal transduction. Materials andmethods: Effects of heparitinase digestion on TGF-β and bFGF binding to their receptors were studied in vitro
using ligand binding assay, 3H-thymidine uptake and affinity lavel in scleroderma and control fibroblasts. To study
the roles of CD44 molecules play in systemic sclerosis（SSc）, we measured expression and phospholylation of CD44
in lymphocytes and fibroblasts from SSc patients and healthy controls, using immunoprecipitation method with 32P
and anti-CD44 antibody. Results: TGF-β binds to 200-300kD betaglycan（type III receptor of TGF-β, type I andII receptor in scleroderma fibroblasts more than in control fibroblasts. After heparitinase digestion betaglycan isdegraded to 110kD core protein of betaglycan and TGF-β does not bind to type I nor II receptor. bFGF binds to130kD receptor in scleroderma fibroblasts more than in control fibroblasts. After digestion bFGF bind to no receptor.
CD44 was expressed and phospholylated on many lymphocytes and fibroblasts. Furthermore, lymphocytes fromSSc patients contained more CD44 or more phospholylated than cells from healthy control. Immunohistochemically,
CD44 was expressed on the cells. Conclusions: Obtained data suggest that heparan sulfate proteoglycans are growth
factor receptors and affect storage, release and protection against degradation of growth factors. It was suggested
that multifunctionality of TGF-β express through heparan sulfate proteoglycans. In the pathogenesis of SSc, CD44
may play an important role in control of cell locomotion, cell adhesion, cell proliferation, and synthesis of extracellularmatrix component.

発現さらにはシグナル伝達機構などの働きを解明

１ 緒 言

し、線維化を様々な段階で抑制することを目指し

皮膚の柔らかさ・硬さは主に真皮結合組織、す（TGF
た。すなわち transforming growth factor−β

なわち膠原線維・弾力繊維・ムコ多糖等の量的お− β）や basic fibroblast growth factor（bFGF）の１）、２）。

レセプターであるヘパラン硫酸プロテオグリカン

臨床的に皮膚硬化を来す強皮症や軟化を示すエーの役割や CD44 の作用を検討して、in vitro で皮ラース＝ダンロス症候群などの疾患で皮膚結合織

膚線維芽細胞の作用をコントロールすることによ代謝異常が認められ、これらの病態は種々の増り、皮膚の柔軟性保持ひいては皮膚老化抑制の方殖因子や接着分子の作用によって制御されてい法を探った。

よび質的状態を反映していると考えられるる３）−８）。そこで我々は、汎発性強皮症患者と健２ 実 験

常人の皮膚を比較対照して検討することで、増殖因子や接着分子の産生およびそれらのレセプター
Molecular biological study on thecontrol of skin sclerosis by growth
factors and adhesion molecule
Akio Yamakage
Department of Dermatology,
Dokkyo University School of Medicine

２. １ 材 料
汎発性鞏皮症患者前腕伸側硬化部皮膚および健常人対照の同部非硬化皮膚より生検により採取し培養した真皮線維芽細胞、患者および健常人から分離したリンパ球浮遊液及び培養線維芽細胞培養
上清を用いて以下の実験を行なった。

− 86 −

細胞増殖因子および接着分子による皮膚硬化制御に関する分子生物学的研究

２. ２

３

H− TdR uptakeを認めた。一方、PSS では TGF− β 添加群と無１ng/mL TGF− β および１ng/mL basic FGFを加え、heparitinase 添加群と無添加群で培養線添加群とで増殖活性は不変で、heparitinase 消化により上昇する傾向を認めた（図１）。

３維芽細胞の増殖活性を H− TdR の uptake を測定
４）、９）することにより、検討した。

健常人由来線維芽細胞では basic FGF 添加群では無添加群に比して増殖活性は２倍以上上昇する傾向があり、heparitinase 消化では不変。一方、

２. ３ receptor binding assayPSS では basic FGF 添加群では無添加群に比してリガンドとレセプターの結合を receptor binding
assay により測定し、レセプター数と親和性を算定した

増殖活性は２倍に上昇する傾向があり、heparitinase消化により低下する傾向を認めた（図２）
。

10）

。
３. ２ heparitinase 消化による receptor binding

２. ４ immunoprecipitation 法

heparitinase 消化前後の TGF− β receptor 数はすでにコラーゲン・ムコ多糖産生を促進することが知られている TGF− β、basic FGF のレセプ

健常人でも PSS でもやや減少し、親和性はやや増加した（図３）。

ター発現と、リガンドとレセプターの結合様式に与えるヘパラン硫酸プロテオグリカンの影響をヘパリチナーゼによりレセプターとしてのヘパラン硫酸プロテオグリカンを切断することで検討した。
さらに、TGF− β、FGF などの成長因子が細胞表面上のプロテオグリカンを含むレセプターにどれだけ結合するかを receptor binding assay およびアフィニティラベルにより測定した。
細胞膜表面に存在する接着分子 CD44 はヒアルロン酸・コラーゲン・ヘパラン硫酸・ヘパリンをリガンドとして、リン酸化シグナルを発信しリンパ球の増殖、活性化を促進するので、汎発性鞏

図１ 健常人由来および PSS 由来培養線維芽細胞における heparitinase 消化（＋）および未消化（−）条
件下での TGF− β 添加による増殖活性皮症患者より分離したリンパ球浮遊液中にヒアルロン酸を加え、32 P ラベル後抗 CD44 モノクローナル抗体を用いた Immunoprecipitation 法によりCD44 を分離し、SDS− PAGE 後 autoradiographyを施行し、tyrosine kinase のリン酸化を指標としてリン酸化シグナルを測定した 11）。

３ 結 果３. １ 培養線維芽細胞の増殖活性
健常人由来線維芽細胞では TGF − β 添加群では無添加群に比して増殖活性は低下する傾向があり、heparitinase 消化によりさらに低下する傾向

図２ heparitinase 消化（＋）および未消化（−）条件
下での bFGF 添加による増殖活性− 87 −

heparitinase 消化前後の basic FGF receptor 数65Kd）および type Ⅱ（MW 同 95Kd）の TGF− βは健常人でも PSS でもやや増加し、親和性もやreceptor に結合していた 125 I− TGF− β は、そのや増加した（図４）。

まま残った（図５）。
heparitinase 消 化 に よ り、heparan sulfate

３. ３ heparitinase 消化による TGF − β およびproteoglycan の proteoglycan 部分に結合していた

bFGF binding site の変動

125

heparitinase 消 化 に よ り、heparan sulfateし得なくなった（図６）。

− basic FGF は、結合部位を失ったため、結合proteoglycan（betaglycan、TGF− β receptor typeⅢ、MW 300Kd 前後）に結合していた 125 I− TGF−

３. ４ ヒアルロン酸添加培養によるＣＤ 44 のリ

β は、GAG 鎖が消化されて残った、TGF− β 結ン酸化合部位を有する core protein（MW 100 〜 130Kd）

汎発性鞏皮症より分離した末梢血リンパ球でに結合して存在するようになった。また type Iは、健常人に比してヒアルロン酸添加培養群で（MW125I− TGF− β monomer との結合体として

図３ heparitinase 消化前後の TGF− βreceptor 数

CD44 のリン酸化をより強く認めた（図７）。

図５ heparitinase 消化による TGF− βbindingsite の変動

図６ heparitinase 消化による bFGF bindingsite の変動

図７ 汎発性鞏皮症より分離した末梢血リンパ球では、健常人に比してヒアルロン酸添加培養群で CD44 のリン酸化をより強く認めた

図４ heparitinase 消化前後の basic FGF receptor 数− 88 −

細胞増殖因子および接着分子による皮膚硬化制御に関する分子生物学的研究

ックスを構築し、デコリンはⅠ型コラーゲンや

４ 考 察

TGF− β に結合する。

近年、種々のコア蛋白とグリコサミノグリカ

ベータグリカンはヘパラン硫酸およびコンドロン（GAG）側鎖からなるプロテオグリカンの構造

イチン硫酸に富む GAG 鎖をもち、分子量 300Kdと機能が明かになりつつある。例えば、コア蛋白（非還元下〜 600Kd）前後のプロテオグリカンで、と GAG 鎖の種類によって軟骨のアグリカン、線TGF− β タイプⅢレセプターとも呼ばれ、100 〜維芽細胞のバーシカン、結合組織のデコリン、基130Kd のコア蛋白部分に TGF− β 結合部位を有底膜のパールカンなどが知られている。アグリカする（図８）。ベータグリカンそのものにはシグナンやバーシカンはヒアルロン酸と結合してマトリル伝達機能は認められていないが、TGF− β を貯

図８ ベータグリカンの仮想的機能（山口佑：実験医学 10：1859, 1992 より）①ベータグリカンは TGF-β をシグナリングレゼプター（タイプⅠあるいはタイプⅡレセプター）に提示する。ベータグリカンの存在により、シグナリングレセプターへのTGF-β の結合が促進される。②ベータグリカンの一部は遊離型となり、TGF-β を細胞外マトリックッスに貯蔵する。③遊離のベータグリカンがレセプターに TGF-β を提示する可能性。

− 89 −

蔵ないし保存する働きやタイプⅠおよびタイプⅡ

では bFGF と結合し得、ヘパリチナーゼ消化によレセプターへの TGF − β の提示ないし結合促進

り結合できなくなる点で、線維芽細胞の性状に相作用などが知られている12）− 16）。

違はなかった。

今回の実験で、PSS 患者前腕伸側硬化部皮膚由

リンパ球及び線維芽細胞表面 CD44 は、ヒアル来および健常人対照の同部非硬化皮膚由来真皮培

ロン酸と結合し、protein kinase C 類似の kinase

養線維芽細胞に対する TGF − β の作用およびプのリン酸化および CD44 分子内 serine/threonine

ロテオグリカンの役割がより明かになった。

残基のリン酸化を来たすことによりシグナルを発

basic FGF は細胞表面のヘパラン硫酸プロテオ信し、細胞の接着機能・増殖能・結合織成分合成グリカンあるいはフリーの可溶性ヘパリンないし能などを制御している可能性がある（図 10）27）− 29）。

ヘパリン様分子に結合し、ある種の構造変化を遂

特に汎発性鞏皮症では CD44 を介してリンパ球及げた状態でのみ高親和性レセプターに結合し得る

び線維芽細胞の誘導、増殖、ムコ多糖・コラーゲ17）− 26）（図９）。PSS 線維芽細胞においても健常人対照線維芽細胞においてもヘパリチナーゼ無添加ン合成の亢進などが行なわれていることが示唆された。

図９ An Induced-Fit Model for Heparin-Dependent High Affinity Receptor Binding of bFGF
（Yayon A et all:Cell 64:841,1991 より）
bFGF can bind to its hight affinity receptor only when bound to either cell surface HSPGs
or to free, soluble heparin or heparin-like mokecules. Both free and cell surface immobilized
heparin-like molecles can interchangeably confer a stable, receptor-compatible conformational change upon bFGF. Hep, heparin; R, recepter.

− 90 −

細胞増殖因子および接着分子による皮膚硬化制御に関する分子生物学的研究

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図 10 CD44 分子の構造（反町典子ら：実験医学12:2190,1994 より）
N 末端側に軟骨プロテオグリカンのコアプテインあるいはリンクプロテインに相同性のあるドメインが存在し、この部分でヒアルロン酸に結合すると考えられている。細胞膜直上部にコンドロイチン硫酸が付加する部分がある。

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