生物資源ゲノム解析拠点ニュースレター

CONTENTS
巻頭言............................................................................................................................................................... 2

生物資源ゲノム解析拠点ニュースレター............................................................................................... 3
生物資源ゲノム解析センターの運用実績...................................................................................................... 5
共同利用・共同研究拠点「生物資源ゲノム解析拠点」
生物資源ゲノム解析拠点 研究報告会......................................................................................................... 6
平成 30 年度 研究発表実績......................................................................................................................... 8
平成 30 年度 共同利用・共同研究拠点採択課題一覧............................................................................. 10
単細胞紅藻における従属栄養応答時の遺伝子発現解析とその比較..................................................... 11
半数体ゲノムのマルチプレックスシーケンシング− FST を指標とした性拮抗遺伝子の探索−....... 12
哺乳類雄性生殖細胞における減数分裂期移行に伴うクロマチン動態解析.......................................... 13
シンジュサンとエリサンを用いた遺伝学開拓のための高精度ゲノム情報整備〜休眠遺伝子の探索を嚆矢として〜..... 14
葉緑体分化を決定する光合成装置形成のオン・オフ制御機構............................................................. 15
栄養繁殖性雑草防除の分子基盤開発にむけたトランスクリプトーム解析.......................................... 16

東京農業大学

生物資源ゲノム解析拠点研究報告会

要旨集............................................ 17

NGRC ニュースレター......................................................................................................................... 79
平成 30 年度 学内公募一覧....................................................................................................................... 81
肥満モデルマウスの腸内細菌叢解析....................................................................................................... 83
in vivo/in vitro 双方からの膵臓再生メカニズムの解明........................................................................ 84
高質な胚生産のための培養環境の構築に関する研究............................................................................ 86
豚肉熟成に関与する細菌フローラの解析................................................................................................ 87
生後早期の子豚の便微生物叢の継時的変化、ならびに飼料中の抗菌性物質による影響の解析....... 89
ニホンカワウソ剥製標本からのメタゲノム解析.................................................................................... 91
食餌性マグネシウム欠乏はマウス海馬ニューロンの形態に影響を与えずに海馬依存性記憶の障害を導く..... 93
卵母細胞の発生支持能を制御する因子の解析........................................................................................ 95
オオムギとトマトの根端の高 pH に対する応答の比較......................................................................... 97
シアノバクテリアの複製開始メカニズムの多様性................................................................................ 99
16S rRNA メタゲノム解析を適用した熟成チーズの細菌相解析..................................................... 101
生分解性プラスチックの環境への影響評価......................................................................................... 103
PMA-PCR 法を用いた浄水場処理工程水の細菌相解析...................................................................... 105
研究発表実績............................................................................................................................................... 107

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農学分野の研究拠点形成
平成 20 年度に文部科学省私立大学戦略的研究基盤形成支援事業の採択をうけ、生物資源ゲノム解析センターが設置され 10 年以上が経ちます。平成 25 年度からは、第 2 期の戦略事業に加え、特色ある共同利用・共同研究拠点事業の認定も受け、本センターの規模を拡大することができました。センター設置時には、まだ国内への導入が始まったばかりの Genome Analyzer II を導入しましたが、当時のスタッフは装置をまずは正常に動かすということに多くエネルギーを費やしていました。その後、シーケンサーも改良され、当センターでも新型装置を順次導入をしました。それは単に新型が登場したからという理由だけではなく、NGS を利用した解析を行いたいという研究者も時間とともに増え続けてきたことによります。本センターでは一貫してショートリードタイプと呼ばれるシーケンサーを導入してきましたが、生物機能の解析という点からはセンターとしての役割を果たして来られたのではないかと自負するところです。たとえば生物資源ゲノム解析拠点として 6 年間にわたり採択された共同研究課題は、北海道から沖縄まで、国公私立大学、法人研究機関などの約 50 機関に所
属する研究者代表者によるのべ約 230 件に、扱う生物も微生物を別にしても約 130 種にのぼります。
また、その成果も国際的な雑誌に発表されるなどにより、拠点の中間審査では S 評価をいただきました。また学内的にもセンター発足時の在来牛、酒米のゲノム解析からウズラ、また本学のトレード
マークともいえるダイコンのゲノム解析など、農学分野のゲノム解析拠点としての機能を果たしてきたと考えます。
このような中で、リードデータが次々と生産される一方、ボトルネックとなるのがデータ解析になります。本ゲノムセンターでは、国内外の研究者が公開しているソフトウェアを利用しつつも、学生を含めできるだけ多くの研究者が自ら解析を行いやすい環境作りの一つとして、市販の GUI で操作可能なソフトウェアも導入し、特にモデル生物の解析では効果的に利用されています。しかし一般的に言われるようにバイオインフォマティクスを専門とする研究者の重要性がますます増す一方で、この点は本センターでもまだ足りていない部分でもあります。今日、民間の受託サービスが普及するな
かで、NGS を研究に用いるというハードルはかなり低くなってきたと思います。多様な生物を研究対象とする農学分野には追い風の環境ですが、まだ誰もが気軽に利用し成果を発表できるという状況ではないようにも思います。そのようななかで今後も、まだ残されたハードルを少しでもさげるべ
く、本センターの活動を続けていきたいと考えております。皆様のご協力とご支援を賜れば幸いです。
生物資源ゲノム解析センター
センター長

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矢嶋俊介

生物資源ゲノム解析拠点
ニュースレター
東京農業大学生物資源ゲノム解析センター
2019 年 3 月号

生物資源ゲノム解析拠点ニュースレター

共同利用・共同研究拠点「生物資源ゲノム解析拠点」

生物資源ゲノム解析センターの運用実績
東京農業大学生物資源ゲノム解析センターは、文部科学省の認定による生物資源ゲノム解析拠点の運用を開始してから 6 年、今年度で最終年度を迎えました。本拠点は、学外の研究者との共同研究を通じて、我が国の農学分野を中心とする新たな研究領域の開拓を図ることを目指し、現在ではNGS の呼称で幅広く知られるようになった高速 DNA シーケンサーを利用した遺伝情報解析を推進しています。
当センターには、Illumina 社の高速 DNA シーケンサーが設置されており、ライブラリー調製からシーケンサーのオペレーション、データ解析までを一貫して行える研究員が常勤しています。各研究員は、それぞれ専門分野を中心に微生物から高等な動植物まで多岐にわたる生物種を対象に、さらに最近ではゲノムやトランスクリプトームのほかにエピゲノムやメタゲノムなど解析目的の幅も広がり、様々な研究課題に対応できる体制となっています。
平成 30 年度も、これまで通り多くの研究者の方々から農学分野において重要な生物を対象とした様々な研究課題が申請され、例年に比べると今年度の採択課題数は縮小されましたが、採択件数は初
年度から累積すると 230 件を超えました（図 1）。今年度の採択課題の対象生物種は、これまでと同様に動物、植物、微生物が全て含まれました。また、解析手法別にまとめると、今年度は主にトランスクリプトーム解析と全ゲノム解析を目的とした研究課題が対象となりました（図 2）。
この 6 年間で本拠点を運用するために、当センターでは HiSeq2500 の導入や研究員の増員、解析
サーバーの拡充やメモリ増設、解析ソフトウェアの導入など、十分な共同研究に取り組める環境が整備されました。さらに、一昨年度に包括連携協定を締結した国立遺伝学研究所との共同による遺伝情報解析の実施、セミナーやシンポジウムの開催など、幅広く研究者同士の交流を深め、NGS 解析に携わる研究者ネットワークの構築にも貢献することができたと言えます。

図1

共同利用・共同研究課題件数（累積）図2

今年度の共同研究課題における解析手法（生物資源ゲノム解析センター

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田中啓介）

生物資源ゲノム解析拠点ニュースレター

生物資源ゲノム解析拠点 研究報告会
東京農業大学生物資源ゲノム解析センターが、これまで 6 年間にわたり実施してきた生物資源ゲ
ノム解析拠点の締め括りとして、平成 31 年 2 月 15 日に東京農業大学世田谷キャンパスにて研究報告会を開催しました。この報告会の開催にあたり、これまでに当センターの解析拠点を利用して頂いた方々に口頭発表とポスター発表をお願いしました。また、基調講演として情報・システム研究機構
データサイエンス共同利用基盤施設長の藤山秋佐夫先生をお招きして、「大規模ゲノム解読技術が拓く農・生物学データ中心科学の展開とオープンサイエンスへの展望」と題してご講演を頂きました。
報告会当日は、時折雪のちらつく寒い日となりましたが学内外で約 120 名のご参加を頂くことができました。
はじめに、口頭発表では 5 名の演者によって研究成果を発表して頂きました。対象生物種は、コ
ムギ、トンボ、イネ、ヒラタチャタテ、海水由来の環境サンプルと多岐にわたり、NGS 解析の内容
ではトランスクリプトーム解析やメタゲノム解析が中心となりました。そして、会場からは分野問わず、参加された多くの方々から質問・議論が交わされました。

岡本昌憲先生二橋 亮先生鳥羽太陽先生（宇都宮大学）（産業技術総合研究所）（東北大学）

石橋 宰先生長井 敏先生（大阪府立大学）（中央水産研究所）

ポスター会場6

生物資源ゲノム解析拠点ニュースレター

藤山秋佐夫先生（データサイエンス共同利用基盤施設）

続いて、ポスター発表では 42 課題のポスターを掲示して頂きました。会場では動物・植物・微生物と多様な生物種に対して、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、エピゲノミクス、メタゲノミク
スとあらゆるオミクス解析が対象となり、議論が交わされていました。また、大学院生や若手研究者の交流も盛んに行われていました。
その後会場を移し、藤山秋佐夫先生にご講演を頂きました。講演では、ライフサイエンス研究における生命情報分野の位置付けと変遷、NGS 解析に基づいた研究の成功例や失敗例、今後の農学における生命情報学の展望に関することが中心的な内容でした。そのような歴史的・学術的に大きなス
ケールの内容に対して、会場からは今後の生命情報学における中核的な質問・議論が交わされました。
今回の報告会では、当センターの解析拠点を利用した研究者の発表の場となったことに加え、農学の中でも様々な分野で活躍する研究者間の情報共有やコミュニティの強化・創成を図ることもできたと考えます。さらに、どの発表者からも、当センターに対する謝辞や必要性を述べて頂き、このこと
は当解析拠点が 6 年にわたり掲げてきました「我が国の農学分野を中心とする新たな研究領域の開拓を図ることを目指す」という活動に対する一つの応えであり、解析拠点の利用者側と運用者側の双方で実りある 1 日になりました。
NGS の普及に伴い、様々な分野の研究においてブレークスルーが巻き起こされてきた経緯から、現在では NGS が一般的なツールとなりつつあります。そのような中で、生命科学と情報学との横断的つながりはますます強固になってきています。そのような点から、本報告会が少しでも NGS 解析に携わる研究者ネットワークの構築に役立てば幸いです。最後になりますが、本報告会の開催に際してご協力頂きました関係者の皆様にこの場を持って深くお礼を申し上げます。
（生物資源ゲノム解析センター

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田中啓介）

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平成 30 年度 研究発表実績〇論文発表● Kawai K, Kanesaki Y, Yoshikawa H, Hirasawa T.
Identification of metabolic engineering targets for improving glycerol assimilation ability of
Saccharomyces cerevisiae based on adaptive laboratory evolution and transcriptome analysis.
J Biosci Bioeng. (2019) in press● Shinkawa H, Kajikawa M, Nomura Y, Ogura M, Sawaragi Y, Yamano T, Nakagami H,
Sugiyama N, Ishihama Y, Kanesaki Y, Yoshikawa H, Fukuzawa H.
Algal protein kinase, triacylglycerol accumulation regulator1, modulates cell viability andgametogenesis in carbon/nitrogen imbalanced conditions.
Plant Cell Physiol. (2019) in press● Fukuda T, Doi K, Donai K, Takahashi K, Kobayashi H, Hirano T, Nishimori K, Yasue H.
Global transcriptome analysis of pig induced pluripotent stem cells derived from six and four
reprogramming factors.
Sci Data. (2019) 6: 190034.
● Futahashi R, Yamahama Y, Kawaguchi M, Mori N, Ishii D, Okude G, Hirai Y, Kawahara-Miki R,
Yoshitake K, Yajima S, Hariyama T, Fukatsu T.
Molecular basis of wax-based color change and UV reflection in dragonflies.
eLife. (2019) 8: e43045.
● Mega R, Abe F, Kim JS, Tsuboi Y, Tanaka K, Kobayashi H, Sakata Y, Hanada K, Tsujimoto H,
Kikuchi J, Cutler SR, Okamoto M.
Tuning water-use efficiency and drought tolerance in wheat using abscisic acid receptors.
Nat Plants. (2019) 5: 153-159.
● Toriba T, Tokunaga H, Shiga T, Nie F, Naramoto S, Honda E, Tanaka K, Taji T, Itoh JI,
Kyozuka J.
BLADE-ON-PETIOLE genes temporally and developmentally regulate the sheath to blade ratio ofrice leaves.
Nat Commun. (2019) 10: 619.
● Yokoyama E, Torii Y, Shigemura H, Ishige T, Yanagimoto K, Uematsu K, Ando N, Murakami S.
Isolation of Salmonella enterica serovar Agona strains and their similarities to strains derived
from a clone caused a serovar shift in broilers.
J Infect Chemother. (2019) 25: 71-74.
● Enoki S, Hamaguchi Y, Suzuki S, Fujisawa H, Hattori T, Arita K, Yamaguchi C, Mikami M,
Nagasaka S, Tanaka K.
Physiological characterization of leaf and internode after bud break in Japanese indigenous
Koshu grape by comparative RNA sequencing analysis.
PLOS ONE. (2018) 13: e0194807.
● Kobayashi-Kirschvink KJ, Nakaoka H, Oda A, Kamei KF, Nosho K, Fukushima H, Kanesaki Y,
Yajima S, Masaki H, Ohta K, Wakamoto Y.
Linear regression links transcriptomic data and cellular Raman spectra.
Cell Syst. (2018) 7: 104-117.e4.
● Nishihara K, Kato D, Suzuki Y, Kim D, Nakano M, Yajima Y, Haga S, Nakano M, Ishizaki H,

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生物資源ゲノム解析拠点ニュースレター
Kawahara-Miki R, Kono T, Katoh K, Roh SG.
Comparative transcriptome analysis of rumen papillae in suckling and weaned Japanese Black
calves using RNA sequencing.
J Anim Sci. (2018) 96: 2226-2237.
● Nosho K, Fukushima H, Asai T, Nishio M, Takamaru R, Kobayashi-Kirschvink KJ, Ogawa T,
Hidaka M, Masaki H.
cAMP-CRP acts as a key regulator for the viable but non-culturable state in Escherichia coli.
Microbiology. (2018) 164: 410-419.
● Nosho K, Yasuhara K, Ikehata Y, Mii T, Ishige T, Yajima S, Hidaka M, Ogawa T, Masaki H.
Isolation of colonization-defective Escherichia coli mutants reveals critical requirement for fatty
acids in bacterial colony formation.
Microbiology. (2018) 164: 1122-1132.
● Shimmori Y, Kanesaki Y, Nozawa M, Yoshikawa H, Ehira S.
Transcriptional activation of glycogen catabolism and the oxidative pentose phosphate pathway
by NrrA facilitates cell survival under nitrogen starvation in the cyanobacterium Synechococcus
sp. strain PCC 7002.
Plant Cell Physiol. (2018) 59: 1225-1233.
● Shinde H, Tanaka K, Dudhate A, Tsugama D, Mine Y, Kamiya T, Gupta SK, Liu S, Takano T.
Comparative de novo transcriptomic profiling of the salinity stress responsiveness in contrasting
pearl millet lines.
Environ Exper Bot. (2018) 155: 619-627.
● Suzuki HC, Ozaki K, Makino T, Uchiyama H, Yajima S, Kawata M.
Evolution of gustatory receptor gene family provides insights into adaptation to diverse hostplants in nymphalid butterflies.
Genome Biol Evol. (2018) 10: 1351-1362.
● Toyotome T, Hamada S, Yamaguchi S, Hiroki Takahashi H, Kondoh D, Takino M, Kanesaki Y,
Kamei K.
Comparative genome analysis of Aspergillus flavus clinically isolated in Japan.
DNA Res. (2018) 26: 95-103.
● Yokoi K, Uchiyama H, Wakamiya T, Yoshiyama M, Takahashi J, Nomura T, Furukawa T,
Yajima S, Kimura K.
The draft genome sequence of Japanese honey bee, Apis cerana japonica (Hymenoptera:
Apidae)EUR J ENTOMOL. (2018) 115: 650-657.

9生物資源ゲノム解析拠点ニュースレター

平成 30 年度
共同利用・共同研究拠点採択課題一覧
1.

兼崎友（静岡大学）「単細胞紅藻における従属栄養応答時の遺伝子発現解析とその比較」
2.

小山喬（東京大学）「半数体ゲノムのマルチプレックスシーケンシング− FST を指標とした性拮抗遺伝子の探索−」
3.

前澤創（麻布大学）「哺乳類雄性生殖細胞における減数分裂期移行に伴うクロマチン動態解析」
4.

木内隆史（東京大学）「シンジュサンとエリサンを用いた遺伝学開拓のための高精度ゲノム情報整備～休眠遺伝子の探索を嚆矢として～」
5.

増田建（東京大学）「葉緑体分化を決定する光合成装置形成のオン・オフ制御機構」
6.

吉田明希子（横浜市立大学）「栄養繁殖性雑草防除の分子基盤開発にむけたトランスクリプトーム解析」〈課題番号順〉

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単細胞紅藻における従属栄養応答時の遺伝子発現解析とその比較
紅藻は海苔などに代表される真核藻類の一群である。紅藻の中で最も原始的な単細胞紅藻イデユコ
ゴメ綱はシアニディオシゾン、シアニジウム、ガルデリアの 3 属からなり、紅藻と言いながら緑色をしている。これら 3 属はいずれも高温、強酸性の非常に類似した環境中に棲息するが、細胞の形
態、ゲノム配列の特徴、分裂様式、栄養的分類など、多くの点で異なっている。例えば、シゾンは特殊な培養条件を除けば光独立栄養性であるが、ガルデリアはグルコースなど約 50 種類の外来糖を資化する従属栄養増殖が可能である。特にガルデリアは培養条件により葉緑体の可逆的な分化・脱分化が観測できる珍しい生物種である。真核植物の進化系統樹において紅藻は灰色藻類に次いで根元に近い枝から分岐する生物群であり、このような葉緑体の分化・脱分化機構の獲得はガルデリアが真核植物の中で最初であった可能性も考えられる。同じイデユコゴメ綱のシゾンやシアニジウムには見られないこのような性質を、ガルデリアが突然獲得したのか、それともまだ観測されていないだけでシゾンやシアニジウムにも同様の機構があるのか、という疑問は未だ解明されていない。本共同研究によりガルデリアの従属栄養応答時の遺伝子発現変動を調べることで、光合成関連遺伝子や糖トランスポーター遺伝子などの転写産物量の変動を検出することができた。

兼崎友（静岡大学グリーン科学技術研究所）

共同研究先：渡辺智（生命科学部）

田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）

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半数体ゲノムのマルチプレックスシーケンシング− FST を指標とした性拮抗遺伝子の探索−
有胎盤哺乳類の性染色体のような、形態が異なる（異形化した）性染色体は、元々は常染色体と同様に形態的差異の無い染色体対を形成していたが、X-Y（Z-W）間の組換え抑制が発端となり、異形化したと考えられている（図 1）。この組換え抑制は、性決定遺伝子と性拮抗遺伝子の連鎖関係が選択されることによって起こると考えられている（図 1b）が、異形化の引き金となった性拮抗遺伝子を十分な説得力を伴って示した例は、これまでのところ報告されていない。その最大の理由は、組換
え抑制が始まる直前と直後の性染色体を持つ、理想的なモデル生物群が見つかっていないことにある。
我々が性決定遺伝子を同定したブリ属魚類は、近縁種間でゲノム配列類似性が高い一方で、性決定遺伝子周辺で組換えが強く抑制されている種（ブリ；図 1b の状態）と抑制されていない種（カンパチ；図 1a の状態）が存在する。また、性染色体上の全ての SNP 座についてフェージング可能ならば、性拮抗遺伝子は X-Y（Z-W）間の FST 値を指標に同定できると考えられているが、信頼性の高いフェージング情報はトリオ解析などを行わなければならず、現在のところコスト・技術面で難易度が高い。一方、ブリ類は ZW 型性決定機構のため、不活化精子により半数体 Z 胚、W 胚が作出でき、フェージングの問題も回避できる。我々の知る限り、ブリ属は性染色体の組換え抑制を研究するのに最適な材料である。
そこで本研究では、半数体ブリ胚を用いて Z/W 染色体を分離し、リシーケンシング・集団遺伝解
析に付し、性拮抗遺伝子の分子実体を明らかにすることを目指す。

図1

性染色体の進化モデル

図の各縦棒は性染色体を表しており、左から右に向かって進化の時間軸が進む。背景が灰色の部分が組換
え抑制領域を指している（Wright et al., 2016 を改変）

小山
車喬（東京大学大学院農学生命科学研究科附属水産実験所）

菊池遥介（東京大学大学院農学生命科学研究科附属水産実験所）
潔（東京大学大学院農学生命科学研究科附属水産実験所）

共同研究先：小林久人（生物資源ゲノム解析センター）
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哺乳類雄性生殖細胞における減数分裂期移行に伴うクロマチン動態解析
生殖細胞は生命の連続性を担う唯一の細胞である。生殖細胞は細胞分裂を繰り返して細胞数を増やすが、ある時期が来ると減数分裂を起こし、やがて精子もしくは卵子に分化する。生殖細胞特有の現象である減数分裂は、種の多様性を生み出すと共に、配偶子形成に不可欠なプロセスである。マウス
精子形成期では、減数分裂期へ移行する際に、数千もの遺伝子発現が変化し、体細胞型の遺伝子発現から生殖細胞特有の遺伝子発現へと切り替わる。この変化は、生殖細胞特異的なエピゲノム変化及びクロマチン構造変化によってもたらされるが、詳細な分子機構は不明である 。
また、有性生殖を行う生物は精子と卵子の受精という共通の戦略を有するが、種を越えた受精は行われない。つまり、生殖細胞分化は生物種間で共通の現象であるにも関わらず、関与する分子の種特異性は高い。実際に、生殖細胞の分化制御を担う遺伝子の一部は種特異的な進化を遂げており、マウス - ヒト間では、生殖細胞の発生に必須の遺伝子や、その機能及び発現する順序も異なっている。減数分裂期への移行の際にも、種特異的なエピゲノム変化やクロマチン構造変化が生じると考えられているが、未だ不明な点が多く残されている。
本研究では、哺乳類雄性生殖細胞の減数分裂期への移行及び進行に伴う、段階的なエピゲノム変化
及びクロマチン構造変化を明らかにすることを目的とした（図）。さらに、モデル動物としてマウス
及びブタを用いて比較解析を行うことにより、生物種間の共通性及び特異性の解明を目指した。これまでに、マウス及びブタの減数分裂期の細胞を用いた RNA-seq 及び ATAC-seq データの取得が完了している。今後解析を進め、各段階で生じるクロマチン構造変化を明らかにすることによって、遺伝
子発現変化や相同組換えのクロマチンレベルでの制御機構を解明する。将来的に、本研究で見出されたクロマチン構造変化を人為的に調節することにより、減数分裂期への移行や進行を制御する発生工学への応用が期待される。

図1

マウス精子形成期の分化段階

減数分裂期への移行と進行に伴うクロマチン構造及びエピゲノム変化を明らかにすることによって減数分裂の開始・進行の分子機構を解明する。本研究では、精子細胞とパキテン期（Pac.）精母細胞の間の、プレレプトテン期（pre-Lep.）、レプトテン期（Lep.）、ザイゴテン期（Zyg.）精母細胞を解析対象
とする。

前澤

創 （麻布大学獣医学部）

共同研究先：小林久人（生物資源ゲノム解析センター）

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シンジュサンとエリサンを用いた遺伝学開拓のための高精度ゲノム情報整備〜休眠遺伝子の探索を嚆矢として〜
ヤママユガ科に属する大型鱗翅目昆虫であるシンジュサン（Samia cynthia pryeri）とエリサン（Samia ricini）は、遺伝学の研究材料として潜在的な魅力を秘めている。両種は形態的に非常に類似しているが（図 1）、体色、食性、休眠性、繭の色など、それぞれの種に特徴的な形質を有している。
両種は正逆ともに交配ができ、妊性のある雑種が得られる。そのため、形質が分離したエリサンとシンジュサンの交雑後代において順遺伝学的な解析を行うことができる。しかしながら、シンジュサン
は蛹で休眠する一方、エリサンは完全非休眠性の昆虫であり、研究材料として扱いづらいところがある。私たちはエリサンにおいてゲノム編集技術をすでに確立しており（Lee et al., 2018, PLoSOne）、もし休眠性を意のままに操作できるようになれば、両種の遺伝学材料としての価値を飛躍的に高めることができる。
シンジュサンの休眠性は Z 染色体上にある遺伝子に強い影響を受け、優性的に遺伝することがわ
かっている。私たちはエリサンとシンジュサンの F1 に休眠性を維持しながらエリサンの雌を 3 回戻し交雑することで、理論的にはゲノムの 90% 以上がエリサン型に置き換わりながらも休眠する BC3個体を得た。本研究では、これら 4 個体の全ゲノムシークエンスを行い、すでに解読済みのエリサ
ンゲノムにマッピングすることで、シンジュサン型の配列が残っているゲノム領域を SNPs 情報により特定した。その結果、休眠性に強く関与するゲノム領域を Z 染色体上に同定することができた。
今後は、その領域に含まれる 16 個の候補遺伝子から休眠性に関与する責任遺伝子を絞り込む予定である。
遺伝学の研究対象としては、その多彩な形質が魅力ではあるが、ヤママユガ科昆虫は紡績原料用や食用としても利用されている農学的にも重要な資源昆虫である。今まで形質に直結する責任遺伝子が順遺伝学的に単離された例はないが、本研究の成果を契機として、応用的に重要な形質に関与する遺伝子を探究しようとする意欲が高まることを期待している。

図1

シンジュサンとエリサンの 5 齢幼虫

木内隆史（東京大学大学院農学生命科学研究科）
李
嶋田

允求（東京大学大学院農学生命科学研究科）
透（東京大学大学院農学生命科学研究科）

共同研究先：長島孝行（農学部）
内山博允（生物資源ゲノム解析センター）
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葉緑体分化を決定する光合成装置形成のオン・オフ制御機構
八百屋に並ぶ大根の根は光が当たっているのになぜ緑色にならないのか？またなぜ発芽初期の芽は次第に緑色になるのか？一見とても単純な問いに見えます。根や初期胚では葉緑体発達が抑制されているからですが、どのようなメカニズムによってそれが成されているか、実のところ未だ正確には分かっていません。葉緑体分化を決定する光合成装置形成のオン・オフ制御機構が分子レベルで未だ明らかになっていないためです。
私たちはこれまでに葉緑体分化において、複数の転写制御因子が共同して光合成装置形成に関わる遺伝子群を協調的に転写調節することを明らかにしてきました。実際、20 以上の核コード光合成遺伝子が共発現しており、これらのプロモーター領域には共通したシス配列が保存されていることを見出しています。光合成装置形成を調節する転写制御因子として、光シグナル下流の bZIP 型転写因子
HY5 とサイトカイニンおよびオーキシンシグナルの下流にある GARP 型転写因子 GLK（GLK1 及び GLK2）が機能していることを明らかにしました。また近年、サイトカイニンシグナルの下流に位置する GATA 型転写因子（GNC、GNL）が光合成装置形成をオンにすることが示されました。
GLK1/2 と GNC/GNL は共通する光合成遺伝子および異なる遺伝子の制御に関与していると考えられていますが、その詳細は明らかではありません。これらを明らかにする上では、それぞれの転写因子により制御される遺伝子を包括的に調べることが必要です。本研究では、GLK1/2 および GNC/
GNL により制御される遺伝子を明らかにするために RNAseq 解析を行い、その詳細な制御機構に迫ることを目的としました。このようなメカニズムの解明は、葉緑体分化および光合成装置形成の制御機構を明らかにする上で重要なだけでなく、植物に新たな光合成組織を創出する技術にも繋がり、将来における農学的な応用にも発展させることが期待できると考えています。

複数の転写制御因子群による光合成装置形成のオン・オフ制御のモデル図

増田建（東京大学大学院総合文化研究科）

共同研究先：渡辺智（生命科学部）

田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）

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生物資源ゲノム解析拠点ニュースレター

栄養繁殖性雑草防除の分子基盤開発にむけた
トランスクリプトーム解析
農業生産性を向上させるには収量増加や病害虫駆除だけでなく、農地内や農地周囲の雑草防除による栽培技術の向上も重要な課題である。特に、環境に適応したクローンにより次々に増殖していく栄
養繁殖性を有する雑草は、増殖速度が速くその防除が非常に難しい。本研究では、栄養繁殖性雑草モ
デルとして水田雑草のウキクサに着目した。ウキクサは、水田雑草の中でも、増殖速度が著しく速く、ひとたび増殖してしまうと防除が困難になる。その一方で、ウキクサは増殖速度が速い上に、個体も小さく扱いやすいため、水質浄化などのバイオレメディエーションの研究材料として昨今注目されているほか、古くから日本国内の研究機関において花芽分化に関する研究も行われてきた。ウキク
サは栄養繁殖と生殖繁殖の両方を行いながら増殖する（図 1.）ものの、それぞれの成長様式に関して形態学的・分子遺伝学的知見が極めて限られており、花芽分化の決定因子であるフロリゲンをコードする遺伝子も未同定である。
本採択課題では、ウキクサを材料として、栄養器官（葉・茎）により増殖する栄養繁殖ステージと生殖器官（花・種子）により増殖する生殖繁殖ステージを材料として、de novo RNA シーケンスによる比較トランスクリプトーム解析を行った。トランスクリプトーム解析によって、栄養繁殖と生殖繁殖をおこなうそれぞれの器官（葉・茎・花）形成に関与するメリステム関連遺伝子やフロリゲンをコードする遺伝子を同定した。今後はこれら本研究で得られた成果を活用し、ウキクサの繁殖機構の詳細を解明することにより、環境に応じて栄養繁殖または生殖繁殖と、繁殖方法を切り替えて旺盛に繁殖し続ける雑草の防除に向けた研究基盤の整備につなげたい。

図 1．ウキクサの生活環

吉田明希子（横浜市立大学
辻寛之（横浜市立大学

木原生物学研究所）
木原生物学研究所）

共同研究先：小林久人（生物資源ゲノム解析センター）
田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）

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平成 30 年度
1．山根

拓実（応用生物科学部

学内公募一覧

食品安全健康学科）「メタボリックシンドロームによる皮膚機能の脆弱化メカニズムの解明」
2．野本康二（生命科学部

分子微生物学科）「生後早期の子豚の腸内フローラの継時的変化に及ぼす抗菌性物質の影響の解析およびプロバイ
オティクスによる抗菌剤の代替の可能性の検討」
3．田﨑啓介（農学部農学科）「花弁のアントシアニン着色を制御する光応答経路の解明」
4．田中尚人（生命科学部

分子微生物学科）「有用菌株の機能性遺伝子探索とその発現ネットワーク解析」
5．田中

尚人（生命科学部

分子微生物学科）「菌株保存室保有の有用菌株ドラフトゲノム配列決定とデータベース化」
6．田中尚人（生命科学部

分子微生物学科）「生分解性プラスチックの河川微生物フローラへの影響」
7．岩田尚孝（農学部

動物科学科）「卵子の発育を支持する卵胞液中の miRNA」
8．志波優（生命科学部

分子微生物学科）「マウスの乳酸菌摂取による腸内フローラへの影響」
9．志波優（生命科学部

分子微生物学科）「ヤムイモに棲息する窒素固定細菌のメタゲノム解析」
10．渡辺智（応用生物科学部

バイオサイエンス学科）「シアノバクテリアゲノムに刻まれた起源的 DNA 複製開始機構の解析」
11．樋口恭子（応用生物科学部

農芸化学科）「野生植物ヨシの根におけるイオン輸送体遺伝子 variant の発現パターン」
12．岩槻健（応用生物科学部

食品安全健康学科）「霊長類オルガノイドを用いた味覚・消化感覚の解析」「遺伝子改変マウスを用いた膵臓再生メカニズムの解析」
13．三井裕樹（農学部

生物資源開発学科）「ダイコンの遅咲き性をもたらすエピジェネティック変異の解明」
14．笠原浩司（生命科学部

分子微生物学科）「出芽酵母リボソームタンパク質遺伝子群の新規転写制御機構の解明」
15．煙山紀子（応用生物科学部

食品安全健康学科）「肝臓における IL-21 の病態生理学的意義に関する解析」「非アルコール性脂肪性肝炎におけるラカンカ抽出物の影響に関する解析」
16．藤本尚志（応用生物科学部

醸造科学科）「EMA-PCR 法を用いた浄水場処理工程水の細菌相解析」

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17．川崎

信治（生命科学部

分子微生物学科）「微生物の環境ストレス耐性機構と感受性機構に関する研究」「花と昆虫に共生する微生物叢のメタゲノム解析」
18．石川森夫（応用生物科学部

醸造科学科）「16S rRNA メタゲノム解析を適応した熟成チーズの細菌相解析」
19．千葉櫻拓（応用生物科学部

バイオサイエンス学科）「ヒト染色体複製開始領域におけるサイクリン A と Mcm7 の相互作用解析」
20．朝井計（応用生物科学部

バイオサイエンス学科）「細胞における転写翻訳装置の新規機能と増殖停止期の生存戦略ならびに実験進化と合成生物」
21．新村洋一（生命科学部

分子微生物学科）「摂取栄養源によるラット腸内菌叢解析」
22．新村洋一（生命科学部

分子微生物学科）「鉄欠乏時にキュウリ（Cucumis sativus）で生成される新規ビタミン B2 誘導体（4′-ketoriboflavin）の生成機構の解析」
23．梶川

揚申（応用生物科学部

農芸化学科）「運動性 Lactobacillus 属細菌がもつ運動性関連遺伝子群の多様性解析」
24．遠藤

明仁（生物産業学部

食香粧化学科）「豚肉熟成に関与する細菌フローラの解析」
25．遠藤

明仁（生物産業学部

食香粧化学科）「Lactobacillus helveticus の比較ゲノム解析」
26．小塩海平（国際食料情報学部

国際農業開発学科）「trans-2-Hexenal 処理が茶葉の GABA（γアミノ酪酸）含量に及ぼす影響」
27．尾畑

やよい（応用生物科学部

バイオサイエンス学科）「卵母細胞の発生支持能を制御する因子の解析」
28．福島

穂高（応用生物科学部

バイオサイエンス学科）「マルチスケール精神病態の同定を目的としたトランスクリプトーム網羅的解析」
29．志波優（生命科学部

分子微生物学科）「CRISPR-Cas9 を用いたゲノム編集のオフターゲット配列の解析」
30．小林朋子（農学部

動物科学科）「牛白血病発症における遺伝子異常の検出および牛白血病ウイルス感染、発症指標の開発」
31．太治

輝昭（生命科学部

バイオサイエンス学科）「HafA1 導入トマトにおける下流遺伝子の探索」
32．松本隆（生命科学部

バイオサイエンス学科）「植物工場栽培に適したダイコン品種のゲノム編集育種に向けた基盤構築」
33．和久大介（農学部

バイセラピー学科）「ニホンカワウソ剥製標本からのメタゲノム解析」
34．太治

輝昭（応用生物科学部

バイオサイエンス学科）「シロイヌナズナの野生型および変異株のリシークエンス」

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肥満モデルマウスの腸内細菌叢解析
酒粕から分離した Lactobacillus paracasei K71（以下 K71 株）は、これまでに加熱死菌体摂取によるアトピー性皮膚炎の緩和作用、および唾液中の分泌型イムノグロブリン A（SIgA）の増加作用が報告されており、脂質代謝への影響について本学の農芸化学科・栄養生化学研究室で解析が進められている。本研究では、遺伝性肥満マウス（ob/ob マウス）を用いて、K71 株摂取による腸内細菌叢への影響を明らかにすることを目的とした。
実 験 に は 5 週 齢 の 雄 性 C57BL6/J マ ウ ス と ob/ob マ ウ ス を 用 い た。AIN-93G 飼 料 で 飼 育 し た
C57BL6/J マウス（野生型群）と ob/ob マウス（ob-AIN 群）、AIN-93G 飼料に K71 株を添加した飼料で飼育した ob/ob マウス（ob-K71 群）の 3 群（各群 8 匹）を 90 日飼育した。飼育 90 日目の自然排便された糞便試料を採取し、採取し -80℃で保存した。糞便試料から DNA を抽出し、16S rRNA
遺伝子（V3-V4 領域）をバーコードタグ付きプライマーで増幅し、MiSeq システムを用いてメタ
16S 解析を行った。
その結果、種の豊富さを示すα - 多様性はいずれも群間で有意な差は見られなかった。一方、試料間での菌叢構造（β - 多様性）は群間で有意に異なっていた（図 1）。続いて、ob-AIN 群と ob-K71
群の比較において組成比が有意に変化している細菌を科レベルで探索したところ、ob-K71 群で有意な増加が見られたのは Bacteroidetes 門（B 門）Rikenellaceae 科であった。一方、ob-K71 群で有意な減少が見られた科は、B 門 Prevotellaceae 科、Firmicutes 門 Peptostreptococcaceae 科、Proteobacteria 門
Alcaligenaceae 科、Verrucomicrobia 門 Verrucomicrobiaceae 科であった。これら ob-K71 群で有意な増加および減少した科の多くは、2 型糖尿（T2D）や非アルコール性脂肪肝炎（NASH）との関連が報告されている。以上のことから、K71 株摂取は腸内細菌叢に影響を与え、T2D や NASH で報告のある
腸内細菌群に影響を与えることが明らかとなった。本研究は本学の農芸化学科・栄養生化学研究室との共同研究であり、論文が日本乳酸菌学会誌 29(3), 152-157, 2018 に掲載された。

図1

試料間での菌叢構造（β - 多様性）

志波 優（生命科学部
藤田信之（生命科学部
田中尚人（生命科学部

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分子微生物学科）
分子微生物学科）
分子微生物学科）

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in vivo/in vitro 双方からの膵臓再生メカニズムの解明
膵臓は、消化酵素を産生し十二指腸に放出する外分泌組織と、インスリンやグルカゴンなどの血糖コントロールに関与する様々なホルモンを産生する内分泌組織から構成されている。その中で、β細胞は血糖値の変化を感知してインスリンの分泌量を調節することによって、全身の血糖恒常性の維持に重要な役割を果たしている。β細胞が十分に機能しなくなり、最終的に数が減少することで糖尿病が引き起こされる。糖尿病の治療は対症療法が中心であり、膵島移植などの試みはあるものの、ドナー不足などの観点から十分な根治的治療法の確立には至っていない。そのため、β細胞を新たに産生できれば糖尿病患者数の増加を抑制することができるとして期待されている。
β細胞を作出するにあたって、新たなβ細胞がどのように再生するのか、そのメカニズムを明らかにすることは重要な課題である。しかし、通常状態において膵臓は再生能が低く、再生の様子を観察
す る こ と は 困 難 で あ る。 と こ ろ が、 膵 管 の 一 部 を 縛 り 炎 症 を 故 意 に 引 き 起 こ す（partial duct
ligation：PDL）と、細胞の新生が盛んに起こり膵臓の再生が観察できる。そこで我々は、膵臓内分泌前駆細胞において一過的に発現する転写因子 Neurogenin3（Ngn3）の遺伝子のプロモーター制御
下に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現させた遺伝子改変マウス（Ngn3-GFP マウス）を用いてPDL を試みた。過去の文献に従い PDL を実施したものの、膵管は非常に細く透明かつ腺房細胞に覆われているため、実体顕微鏡下であっても観察できず、手術は困難を伴った。この問題を克服する
ため、膵管の走行を観察できる方法の確立が第一に必要であると考えた。我々は様々な蛍光物質の中から、胆管の可視化に用いられる蛍光胆汁酸 Cholyl-lysyl-fluorescein（CLF）を利用することで胆管とつながる膵管も可視化できると考えた（図 1A）。麻酔下のマウスに CLF（350 µg/kg 体重）を尾静脈注射し、10 分後に蛍光実体顕微鏡下にて膵臓の観察を行った。その結果、全身に循環した試薬は胆管を通り十二指腸へと排出されたが一部胆管から分枝する膵管へと流入する様子が観察され（図1B、C）、生存下における簡便な新規膵管可視化方法が確立できたと判断した（Nakajima et al.
Tissue Eng Part C: Methods, 2018）。
膵管可視化方法にて可視化した膵管のうち、膵尾部に向かう膵管を結紮した（図 2A, B）。手術 7日目で回収した膵臓サンプルより、膵尾部の自己消化による腺房細胞の死滅および膵管の再構築を観察した（図 2B-E）。さらに興味深いことに膵管結紮によって内分泌前駆細胞である GFP 陽性細胞が膵管の周囲に出現することを確認した（図 2G）。このことで、in vitro において膵管から Ngn3 を発現する内分泌前駆細胞が出現する可能性が示唆された。そこで、より直接的にこのことを証明するために我々は Ngn3-GFP マウスの膵管をオルガノイド培養に供し、膵管由来の細胞から GFP が出現するかを観察した。培養を開始して 2 日後、膵管の切断箇所から細胞の増殖が認められた。培養 3 日
目には直径 1 mm ほどの球体が形成されたことから、オルガノイドが作製できたと判断した。その後、オルガノイド培養 7 日目に膵管オルガノイド上に GFP 蛍光を呈する Ngn3 陽性細胞の出現が観察され、膵管上皮細胞から内分泌前駆細胞が出現したことが証明された（図 2G）。さらに、作製 11 日後のオルガノイドから抽出した mRNA を用いたトランスクリプトーム解析により、Isl1、NeuroD、Insm1 など、内分泌細胞へ分化する際に発現する転写因子が Ngn3 の発現と相関して上昇することを
確認した。
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以上より、膵管上皮細胞には内分泌細胞に分化する能力があることが確定的となった。同オルガノ
イド培養系は、成熟した内分泌細胞の産生に適していると考えられるため、分化効率を高めるための培養条件を見出すための培養プラットフォームになると考える。現在、Ngn3 陽性細胞群を最終分化させ、機能する内分泌細胞を作出することを目指している。

図1

CLF による膵管の可視化

蛍光胆汁酸である CLF を尾静脈投与後（A）、開腹し膵管が染色されるかを実体顕微鏡で観察したもの（B, C）。

図 2 膵管結紮とその後の膵臓再生
CLF 標識後の膵管と膵管結紮場所（リボン、A）。膵管結紮後 7 日目の膵臓（C）と未施術の膵臓（B）。膵管部分結紮により膵臓はダメージを受けた後、再構築されることが膵管マーカーである CK19 により分かる（E）。膵管結紮後 7 日目の膵管の周囲には Ngn3-GFP シグナル陽性の細胞が観察された（G）。一方、未施術の膵臓（F）では GFP 陽性シグナルは全く観察されな
かった。

岩槻

健（応用生物科学部

中嶋ちえみ（農学研究科

食品安全健康学科）
食品栄養学専攻）田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）

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高質な胚生産のための培養環境の構築に関する研究
卵巣では卵子発育に伴い卵胞が形成され、その中で卵子発育が行われ、これを支える環境として卵胞液がある。卵胞液中には非常に多くの生理活性物質が含まれている。卵子の成熟培地に卵胞液を添加すると卵子の能力を向上させることは古くから知られており、さらに卵胞液の性状は卵胞の状態や個体の状態によっても変わる。
ウシをモデルに若齢や加齢個体の卵巣から卵胞液を回収し、これを初期胞状卵胞卵子の体外発育培
地や胞状卵胞卵子の成熟培地に添加すると、加齢由来の卵胞液は、体外発育卵子や成熟卵子の質を低下させる。ブタでは、卵胞中の顆粒層細胞数が個体によって大きく異なりこれは内包される卵子の発生能力と高い相関がある。そこで顆粒層細胞の多い個体の卵胞液と少ない個体の卵胞液をそれぞれ初期胞状卵胞卵子の体外発育培地や卵胞卵子の体外成熟培地に添加すると、顆粒層細胞が多い卵胞液が卵子の質を改善した。この効果の分子背景を調べるため、顆粒層細胞が多い卵胞と少ない卵胞から回収した顆粒層細胞を用いて RNAseq を行い発現が異なる遺伝子を検出し、これらを用いて IPA 解析
よる上流因子の推測を行うと E2、EGF、VEGF など卵胞発育に必要な因子と miRNA が見つかった。
卵胞液はエキソソームの形で miRNA を含んでいる。エキソソーム除去卵胞液と非除去卵胞液を作成し、ブタの初期胞状卵胞卵子の体外培養や胞状卵胞卵子の成熟培養に用いると非除去卵胞液は卵子発育や発生能力を改善し、除去卵胞液はこれを低下させた。そこで卵子発育を支える miRNA を同定するために、大 - 小卵胞や、顆粒層細胞が多いまたは少ない卵胞の顆粒層細胞で発現に差がある遺伝子群を RNAseq によって同定しさらに上流因子としての miRNA を推測した。さらに卵胞液中のエキ
ソソーム内 miRNA の smallRNAseq を行い高濃度で含まれる miRNA を見つけ、前述の miRNA と照合することで卵胞の質や発育に必要な候補 miRNA を推定した。これらの miRNA は、エキソソーム
除去と非除去の卵胞液で培養した顆粒層細胞の RNAseq と IPA 解析から推測した上流因子とも重複していた。
候補 miRNA の mimic を卵子の体外発育や成熟培地に添加する実験を行うと、卵子の体外発育や卵子の体外成熟後の発生能力を有意に改善する miRNA が見つかった。これらの miRNA が作用する分子背景は明らかではない。しかし、先の RNAseq の結果から卵胞発育には顆粒層細胞の HIF1VEGF や解糖系の活性化が必要であることを我々は見つけている。そこで、今回、卵胞発育効果が認められた miRNA を検討すると、顆粒層細胞の解糖系の活性を有意に促進するものがあることが分かった。これまではホルモン等の効果を明らかにして培地に添加することにより、培養条件の改善を行ってきたが、miRNA も卵子の質に非常に大きなインパクトを持っていることが分かり、さらに高質な卵子を得る条件として、または高質な卵子のマーカーとして利用できると考えている。
岩田尚孝（農学部

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畜産学科）

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豚肉熟成に関与する細菌フローラの解析
熟成肉は、と殺後の解硬、熟成を経た食肉をさらに一定の期間貯蔵して熟成した食肉で、熟成方法にはドライエイジング（DA）またはウェットエイジング（WA）と呼ばれる方法が用いられる。DAは熟成中に食肉の水分を除去しながら熟成する方法で、DA の際に熟成庫内および食肉表面中に微生物を存在させる場合や送風機を使用して食肉に風をあてる場合もあり、肉熟成に広く用いられる手法である。この DA により、肉は香り、柔軟性、うま味といった嗜好性が向上するため、近年では大きな注目を集めている。このような DA 中の肉質の変化には、内在性のプロテアーゼだけでなく、微生物由来のプロテアーゼも大きく関与していると考えられている一方で、どのような微生物が関与しているのかはほとんど研究されていない。そこで我々は豚肉 DA 中の微生物フローラの解析を培養法及びメタゲノム解析により行った。また、培養法により得られた分離株は、プロテアーゼ及びリパーゼ活性の確認を行った。
本研究では、豚 3 頭分の枝肉を研究に用いた。熟成は 1-2 度に保たれた低温貯蔵庫にて 40 日間行
い、熟成前（0 日目）、熟成中期（20 日目）、熟成終了後（40 日目）の 3 点で肉表面を削ぎ落とし、
実験試料とした。まず水分活性の測定を行ったところ、熟成前から中期にかけて低下したものの、中期から後期にかけては水分活性の変動は見られなかった。この熟成中、一般細菌数の大きな変動は見られなかったが、乳酸菌数は減少し、酵母数は増加した。分離株を同定すると、熟成前には広範なPseudomonas 属細菌の他、Staphylococcus 属細菌、Acinetobacter 属細菌、Enterococcus 属細菌が分離されたが、熟成が進むにつれて菌種の多様性は減少し、熟成後期には数種の Pseudomonas と共に
Staphylococcus 属細菌が多く見られた。酵母は Debaryomyces 属及び Candida 属が分離された。これら
分離株はほぼ全てがリパーゼ活性を持っていた一方で、プロテアーゼ活性は細菌からのみ検出された。
次にメタゲノム解析を行ったところ、熟成中期に有意な細菌多様性の増加がみられたが、この多様性は熟成後期には有意に減少した。主成分分析の結果から、熟成前には似たような細菌構成であっても、熟成が進むに従い、サンプル間にバラつきが大きいことが明らかとなった。属レベルの解析では、熟成前には相対比 35-70% であった Pseudomonas 属細菌が熟成中期には 5-40% 程度にまで減少
し、 代 わ っ て Sphingomonas 属 や Staphylococcus 属 な ど の 相 対 比 が 向 上 し た。 熟 成 後 期 に は 再 び
Pseudomonas の相対比が向上したが、サンプルによっては Staphylococcus 属が 50% 以上の相対比を占めるなど、サンプル間でのバラつきが見られた。
今回の研究により、豚肉 DA 中の細菌フローラが明らかとなった。Pseudomonas 属は肉表面に頻繁に見出される細菌であり、食肉衛生管理指標の一つにもなっている。この Pseudomonas 属は熟成前及び熟成後半から見いだされる主要な細菌で、プロテアーゼ、リパーゼ活性も有していることから、豚肉 DA の重要な細菌であると考えられた。一方で、熟成中期には Pseudomonas が一時的に減少し、他の細菌の相対比が増加することから、他の細菌の関与も考えられた。今後は、今回見いだされた微生物が DA 中の肉質の形成にどのように関与するのかを明らかにすることで、熟成肉の肉質向上メカニ
ズムの解明に繋げていきたいと考えている。

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熟成前及び熟成後の豚肉

メタゲノムデータの主成分分析(Weighted UniFrac)

遠藤明仁 （生物産業学部

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食香粧化学科）

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生後早期の子豚の便微生物叢の継時的変化、ならびに飼料中の抗菌性物質による影響の解析
畜産領域において、幼若期における飼料への抗菌性物質の添加が通常化している。これは、生後間もない時期の下痢や感染症を予防することにより家畜の健全な生育を図る（生産性を高める）ことを目的としている。一方、飼料への抗菌性物質の添加より家畜（家禽）の常在細菌が薬剤に耐性化して環境に拡散することにより、ヒトにも水平伝播することが懸念される。そのため近年、畜産農家に対する抗菌性物質の適正使用に関する指導や、食品安全委員会による耐性菌の発生リスクの調査結果に基づく抗菌性飼料添加物のリスク管理措置などが実施されている。これに対し、抗菌性飼料添加が家畜の成長過程における腸内フローラに及ぼす影響については、その詳細は未だ不明である。この理由
として、極めて多様で複雑な腸内フローラの精度の高い解析方法が確立されていなかったことが考えられる。
本研究は、抗菌性飼料添加が豚の成長期における腸内フローラの構築に与える影響を、分子生物学的手法（16SrRNA を対象とする網羅的な DNA 配列の解析）により明らかにすることを目的とする。
特に、生後早期から哺乳期以降の子豚の飼料への抗菌性物質の添加が、子豚の腸内フローラに与える影響を継時的に調べる。同時に、腸内フローラの機能的側面として、腸内有機酸濃度を定量的に測定する。腸内フローラの構造および機能の解析の結果と臨床的なマーカー（体重変化、臨床症状、血液生化学マーカー）との相関を明らかにする。この結果から、抗菌剤による子豚の腸内フローラや腸内環境形成のゆがみを明らかにするとともに、特定の微生物因子と子豚の成長の関連を探ることにより、抗菌剤に依存しない健常な腸内フローラの構築（例えば乳酸菌などのプロバイオティクス）による子豚の健康管理法の確立のための基盤となる情報を得る。
H29 年 6 月より開始した研究では、農大富士農場で誕生した異なる 3 系統の母親より誕生した、同腹の子豚（5-11 例 / 母豚：抗菌剤含有飼料で飼育）について、生後 1 週目より開始して生後 20 週

哺乳中の対象豚（MYB ｘ D 種、富士農場豚舎内）

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令まで経時的に採取された新鮮便の解析を実施した。その結果、16S rRNA 遺伝子を標的とする
Miseq 解析の結果、子豚の便中フローラは離乳期を挟んで有意に変化することを示唆する結果を得た。
便中の有機酸濃度についても同様の成長に伴う変化が認められた。引き続き、H30 年度においては、
抗菌性物質を全く含まない飼料で飼育された子豚の便フローラの成長に伴う変化を解析中である。今後は、抗菌性物質の有無による仔豚便フローラおよび腸内環境の変化の差異を明らかにするとともに、末梢血中の生化学検査項目など臨床検査結果との相関解析を実施することにより、子豚の健全な成長に関与する腸内フローラ（環境）因子を明らかにしていきたい。
野本康二（生命科学部

分子微生物学科）

新村洋一（生命科学部

分子微生物学科）

野口龍生（農学部

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富士農場）

笠原浩司（生命科学部

分子微生物学科）

細田浩司（生命科学部

分子微生物学科）

志波優（生命科学部

分子微生物学科）

黒澤

亮（農学部

動物科学科）

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ニホンカワウソ剥製標本からのメタゲノム解析
ニホンカワウソはかつて日本列島の離島を除く広い地域に生息していたが狩猟圧などにより個体数を減らし、1979 年に高知県の新荘川で目撃されたのを最後に確からしい情報がなくなった。その後、2012 年には環境省が絶滅を宣言した。しかし、2017 年に長崎県対馬市で琉球大学のグループが設置したセンサーカメラにカワウソが映りこみ（図 1）、日本全国にニュースが流れた。
しかし、絶滅したニホンカワウソの分類学的位置づけはいまだ明らかではない。ニホンカワウソの分類は Gray による 1867 年の研究にまで遡り、Gray は北海道函館産の亜成獣 2 個体の頭骨を測定し、大陸のユーラシアカワウソ Lutra lutra とは異なる Lutronectes whiteleyi と分類した。その後、国立科学博物館の今泉吉典博士が Lutronectes を Lutra の異名（シノニム）とし、さらにユーラシアカワ
ウソの亜種として Lutra lutra whiteleyi と分類した。更にその後、今泉博士と当時東京農業大学の吉行瑞子博士が本州と四国のニホンカワウソも計測・分類し、本州以南の個体群を Lutra nippon とした。このように、学術上はニホンカワウソと言っても、ユーラシアカワウソの亜種（北海道個体群）と日本固有種（本州以南個体群）が含まれる。しかし、全世界の生物絶滅リスク評価を行っている国
際自然保護連合は、データ不足を理由に独立種 L. nippon とする分類を採用しておらず、L. lutra として扱っている。さらには環境省が発表しているレッドリストでは北海道個体群こそ L. l. whiteleyiとされているが、本州以南個体群が L. l. nippon とされている。このように、ニホンカワウソの分類は混乱しており、議論が続いている。
これまで本研究グループは、神奈川県産と高知県産のニホンカワウソ標本から DNA を抽出し、MiSeq で解析を行った。この結果、ヒトや細菌のリードが多数含まれながらも、両サンプルからミ
トコンドリア DNA 全長配列を決定した。このように、剥製標本の DNA 解析はコンタミネーションがつきものであり、メタゲノム解析になる。大陸の L. lutra と系統解析を行った結果、神奈川県産は中国のユーラシアカワウソ系統に近縁と示され、高知県産はユーラシアカワウソと姉妹群となる独自系統と示された。この結果は、本州以南の個体群を L. nippon とした先行研究の結果と異なる。さらに分岐年代推定を行ったところ、高知県産の祖先は約 127 万年前に分岐したことが示されたが、この分岐年代から別種とするか別亜種とするかは研究者によって意見が分かれるものとなった。一方で、神奈川県産は最も近縁な中国の集団と約 10 万年前に分岐したとされ、ユーラシアカワウソと判断するに十分な結果となった。これらの結果は、今泉博士と吉行博士の独立種とする結果とは異なる。しかし、神奈川県産が採取された地域は遠洋漁業が盛んな地域で、人為的に持ち込まれた個体の可能性もある。すなわち、ニホンカワウソの解析個体を増やし、各系統が実際に生息していたのか判断する必要がある。
2017 年に発見された長崎県対馬市のカワウソでは、採取された糞を環境省の事業として解析し、ミトコンドリア DNA の配列を決定している。決定した部分配列を用いて系統解析をしたところ、韓国やサハリンのユーラシアカワウソと同系統という結果となった（図 2）。対馬は、大陸種ベンガル
ヤマネコの 1 亜種である Prionailurus bengalensis euptilurus のうち、対馬に分布している個体群がツシマヤマネコと呼ばれているように、大陸種が多く生息している。つまり、今回の結果は自然史を考えても、不自然ではない。その一方で、今泉博士と吉行博士がまとめたように「本州以南」すべての個体群が L. nippon（もしくは高知県系統）ではないことを、神奈川県産とは異なる結果で示した。
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上記のように、ニホンカワウソの系統分類学的位置づけはいまだ明らかではない。神奈川県産の系統が実在したか明らかにするためには、本州の解析個体数を増やす必要がある。また、四国と本州間で交雑の有無を調べる必要があるが、ミトコンドリア DNA は母系のみを示すため、核 DNA の配列を調べる必要がある。現在、北海道・本州・四国の解析個体数を増やし解析中であり、結果が待ち望
まれる。

図 1.

対馬でセンサーカメラに写り込んだカワウソ。健康そうに見える。（提供 : 琉球大学動物生態学研究室）

図 2.

ニホンカワウソとユーラシアカワウソの系統樹。ミトコンドリア DNA の部分配列に基づいた系統樹。対馬の個体は「カワウソ（対馬）」と示している。（提供：環境省）

和久大介（農学部
瀬川高弘（山梨大学

バイオセラピー学科）

米澤隆弘（農学部

医学部）
動物科学科）

佐々木浩（筑紫女学園大学
佐々木剛（農学部

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現代社会学部）

生物資源開発学科）

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食餌性マグネシウム欠乏はマウス海馬ニューロンの形態に影響を与えずに海馬依存性記憶の障害を導く
マグネシウム（Mg2+）は、生物学的機能を維持するための必須ミネラルです。脳における Mg2+の 1 つの主要な作用は、N −メチル− d −アスパラギン酸（NMDA）型グルタミン酸受容体の電位依存性遮断を調節することであり、これはシナプス可塑性にとって極めて重要です。従って、Mg2+
は学習・記憶、シナプス可塑性において重要な役割を果たすことが示されています。しかし、学習・記憶に及ぼす食餌性 Mg2+ 欠乏症（MgD）の影響、および記憶能力に寄与するニューロンの形態は詳
細には調べられていません。そこで本研究では、MgD マウスの海馬依存性の記憶と海馬ニューロンの形態を解析しました。
まず恐怖条件づけ文脈学習課題を用いて恐怖記憶を評価しました。この課題では、マウスは文脈（条件刺激）とフットショック（電気ショック）による恐怖（非条件刺激）との関連を学習し、海馬依存性の嫌悪記憶を形成します。マウスに 1 回のフットショック（0.4 mA、2 秒間）を与え、この24 時間後に、マウスが恐怖を感じた時に示す、すくみ反応を示した時間の長さを指標に恐怖記憶を評価しました。その結果、MgD マウスは恐怖条件づけ記憶の形成に障害を示すことが示唆されました。次にモリス水迷路課題を用いて空間記憶を評価しました。この課題では、マウスはプールの周りに配置された空間的手がかりを用いて、プール内の隠されたプラットホームに到達することで空間学習を行います。マウスに 7 日間、1 日当たり 2 回の試行を行った結果、MgD マウスは正常な空間学習を示しましたが、空間記憶を形成することができず、MgD により空間記憶の形成に障害を示すことが示唆されました。最後に、社会的認知記憶課題を用いて社会記憶を評価しました。この課題では、マウスは海馬依存性の非嫌悪記憶を形成します。具体的には、記憶能力を測る成体マウスと同性の幼若マウス（3 ～ 6 週齢）を 24 時間の間隔を空けてケージに 3 分間入れ、成体マウスが幼若マウ
スに鼻先を接触させた時間の長さを測定し、1 回目と 2 回目の接触時間の長さを比較して社会記憶を評価します。その結果、MgD マウスは社会記憶の形成に障害を示すことが示唆されました。以上より、MgD マウスは異なる 3 種類の海馬依存性記憶の欠損を示すことが示唆されました。一方、他の行動課題を用いた解析から、MgD マウスの扁桃体及び島皮質依存性記憶は正常であり、行動活性及び不安様行動も正常であることが示唆されました。
これまでに樹状突起形態の異常は、認知、情動及び記憶の異常を特徴とする神経障害と相関することが示唆されていることから、MgD マウスに観察された海馬依存性記憶障害は MgD による海馬
ニューロンの異常な樹状突起棘形態が原因である可能性が考えられました。そこで MgD マウスのニューロン形態を解析しましたが、予想に反し、MgD マウスの海馬ニューロンの形態に異常は観察されませんでした。以上の結果をまとめると、MgD が海馬ニューロンの樹状突起棘の密度および形態に影響を及ぼすことなく海馬依存性記憶の欠損を誘発することが示唆されました (Serita et al.,2019)。
重要なことに、我々の以前の研究では、食事性ビタミン B1（チアミン）欠乏が海馬依存性記憶形成を損なうだけでなく、海馬ニューロンの樹状突起棘の密度も減少させることを示しました（Inabaet al., 2016）。対照的に、MgD マウスでは海馬依存性記憶の障害を示しましたが海馬の樹状突起棘密度および形態に異常は観察されなかったことから、MgD によって誘発される海馬依存性記憶の欠損
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は樹状突起の異常密度および形態と相関しないことを示しました。従って、必須栄養素の欠乏によって引き起こされる栄養失調は、単に樹状突起棘密度と形態の変化を通じて記憶能力を損なうわけではないと考えられます。 そのため、MgD が海馬依存性記憶の形成を損なうメカニズムを理解するためには、さらなる研究が必要と考えています。現在、MgD マウス海馬サンプルを用いたトランスクリ
プトーム解析を進めており、今後、必須栄養素と脳機能の関係性が明らかになることが期待されます。

MgD 群のテストにおけるすくみ反応を示した時間の長さは対照群よりも有意に短かった（左図）。MgD マウスの海馬 CA1
領域のニューロン形態に異常は観察されなかった（右図）。

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福島穂高（生命科学部

バイオサイエンス学科）

喜田

バイオサイエンス学科）

聡（生命科学部

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卵母細胞の発生支持能を制御する因子の解析
卵母細胞は受精や発生に不可欠な因子をその成長過程で細胞質に蓄積し、全能性を獲得するが、全ての卵母細胞がこの能力を有しているとは限らず、特に、体外で成長・成熟した卵母細胞の発生能は顕著に低い。しかし、卵母細胞の発生支持能を制御するメカニズムの全容は明らかでない。そこで本研究では、体内および体外培養由来マウス卵母細胞のトランスクリプトの差分から発生を制御する因子を同定することを最終目標とし、今年度は、マウス 2 細胞期胚のシングルセル RNA-seq 解析の実
験系の確立を目指しそのデータ精度を考察した。
本研究では、QIAseq FX Single Cell RNA Library Kit を用いてそれぞれの単一胚からライブラリーを構築した。このキットでは、RNA から逆転写された cDNA をライゲーションし増幅するため（MDA 法）、従来の PCR を介した方法（SMARTer 法）と比較して、各 cDNA の増幅にバイアスが生じにくいメリットがある。一方で、RNA-seq 解析には多数のキメラ分子（2 遺伝子以上の cDNAが合体したもの）が供試されることになる。ここまでの解析で、シークエンスリード 75 塩基のうち、6 塩基までのミスマッチを許容した場合、総リード数のうち 33% しかエキソンにマップされなかった（n=39）。そのため、トランスクリプトーム解析に必要なリード数を得るためには 3 倍のリード数を解読する必要性が示唆された。次に、体内で成長・成熟した卵母細胞の体外受精で得られた 2 細胞期胚の 1 胚ずつから RNA-seq 解析を行ったもの（n=9）と 2 細胞期胚 20 胚から RNA-seq 解析を行ったもの（n=3）を比較した。マウスにおいてこれらの 2 細胞期胚は 90% 程度が個体発生能を有することから、この RNA-seq 解析での差は発生に影響を及ぼさず、方法論によって生じた差である可能性が高い。これらのサンプルを比較すると、1 胚由来ライブラリー間での相関は R=0.82~0.85 とな
り、20 胚由来ライブラリー間での相関は R=0.9~0.91 となった。1 胚由来ライブラリーではバリエー
ションが大きく検出された。さらに、Moderate t-test (P<0.05) Benjamini-Hochberg FDR 法で 1 胚由来ライブラリーと 20 胚由来ライブラリーで有意に差次的発現をしていると見なされた遺伝子の総数
は、649 遺伝子あった。しかし、1 サンプル以上で RPM ＞ 5 という条件でフィルタリングすると、有意に差次的発現をしていると見なされたもの総数は、52 遺伝子まで縮小した（図 1）。このことから、RPM>5 で解析することで、発生に影響しない差分を大きく除外できると考えられた。最後に、体外で成長・成熟した卵母細胞の体外受精で得られた 2 細胞期胚の 1 胚ずつから RNA-seq 解析を行った（n=4）。その結果、階層的クラスタリング解析では、体内由来胚（n=9）と体外培養由来胚（n=4）は別のクラスターに属することが示された（図 2）。1 サンプル以上で RPM ＞ 5 という条件でフィルタリングし、両者間において有意に発現差が認められる遺伝子を解析した結果、821 遺伝子が抽出され、体内と体外で成長・成熟した卵に由来する胚では、決定的に差異があると考えられた。次年度以降、さらに解析胚数を増やし、差次的発現遺伝子から胚発生を制御する遺伝子を追究したい。

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図 1 マウス 2 細胞期胚における各遺伝子の発現量を示す散布図
横軸が 20 胚由来ライブラリー。縦軸が 1 胚由来ライブラリー。単位は log2 RPM。
1 サンプル以上で RPM ＞ 5 の遺伝子がプロットされており、赤い点がそれぞれのライブラリー間で有意に差次的発現を呈する遺伝子。

図 2 体内（in vivo）および体外（in vitro）で成長・成熟した卵母細胞の体外受精で得られた 2 細胞期胚の階層的クラスタリング

尾畑やよい（生命科学部

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バイオサイエンス学科）

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オオムギとトマトの根端の高 pH に対する応答の比較
多くの植物は根圏が pH5 から 7 ぐらいで最も良く生育する。この条件では多くの必須元素の溶解性が高いこと、また植物の膜輸送はプロトン濃度勾配によって駆動されるものが多いことと、細胞の伸長成長は酸成長理論に依存しているため細胞外が微酸性であることが好ましいからである。しかし、アルカリ塩類が集積することにより土壌 pH がアルカリ性になっている地域も世界には広く存在するにもかかわらず、根圏が高 pH であることに対する植物の応答は十分に研究されているとは言えない。これまで、高 pH では必須遷移金属の溶解性が低下し植物にとって吸収しにくくなること、アンモニアガスが発生し根に障害を与えること、などもっぱら要素障害の面から研究がなされてきた。
これに対し当研究室では、高 pH による生育障害は、必須遷移金属の欠乏に先立って根の伸長阻害、と い う 形 で 現 れ る こ と を 見 出 し た（Kobayashi et al. 2010 Soil Science and Plant Nutrition v56
p407-411）。そこで様々な植物で高 pH による根伸長阻害を比較したところ、一般的な作物の中ではオオムギの根伸長が高 pH に対して耐性を示すことが分かった。そこで、高 pH でも根伸長が維持される植物としてオオムギ、高 pH で根伸長が阻害される植物としてトマトを選び、このような違いをもたらす要因を明らかにする研究を開始した。
まず根細胞からの酸放出能力をオオムギとトマトで比較したが、高 pH で栽培したトマト根はむしろオオムギより高い酸放出能力を示した。そこで次に根端分裂組織に着目したところ、オオムギ根端
では高 pH で細胞の分裂・分化が促進されるが、トマト根端では抑制されることが分かった（Higuchi
et al. 2017 Plant, Cell & Environment v40 p1609-1617）。さらに地上部を切除するとオオムギ根もトマト根と同様に高 pH で伸長が阻害されること、トマトを高 pH 水耕液に移すと地上部の成長も速やかに抑制されることから、植物は根で高 pH を感知すると、その情報を全身に伝え全身で応答していることが予想される。しかし、このような制御経路を既知のシグナル伝達経路に当てはめて作業仮説を立てることは難しいと考え、トランスクリプトーム解析を行って、高 pH に対するオオムギとトマ
トの異なる応答機構を明らかにすることを目指した。
pH6 の水耕液で栽培した本葉が 4 ～ 6 枚のオオムギとトマトを、Good バッファーで pH を 6 もし
くは 8 に固定した水耕液に移植し、8 時間後と 72 時間後に根端 1 mm を採取した。全 RNA を抽出し生物資源ゲノム解析センターにてトランスクリプトーム解析を実施した。、栽培は 3 回行い、3 反復の試料を用意したが、解析の結果、1 反復は質的に他の 2 反復と大きく異なると判断されたので、発現変動が大きかった遺伝子の抽出や GO エンリッチメントは 2 反復のデータで行った。
図のように 8 時間で発現変動した遺伝子は少なかったが、トマトの方がより早い段階からトランスクリプトームが変化していることが分かった。発現変動した遺伝子の推定される機能はオオムギとトマトで大きく異なっていた。トマトで発現が上昇もしくは低下したものには細胞壁関連の遺伝子が多かった、一方オオムギでは、転写・翻訳やタンパク質の分解に関する遺伝子が多かった。現在はいくつかの遺伝子について個別に PCR で発現量の変動を確認しているところで、これらが、根が伸長する・しないこととどのように関連付けられるのか、今後検討を進める。今回は根端に絞って解析を行ったが、ここで抽出されてきた遺伝子が根端だけでなく伸長領域や成熟領域でも発現変動するのかどうか、についても調べる必要がある。

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樋口恭子（応用生物科学部

農芸化学科）

田中啓介（生物資源ゲノム解析センター）
西田

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翔（広島大学大学院

生物圏科学研究科）

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シアノバクテリアの複製開始メカニズムの多様性
シアノバクテリアは地球上で最初に酸素を発生する光合成を始めた生物であり、海水、淡水、陸上、または他生物との共生状態など多様な自然環境に棲息しています。中には食用の種も多数います
し、一方、水中に大発生して水質汚染を引き起こす種も存在するなど、環境問題や農業・水産業とも密接に関わる生物です。1996 年に全生物で 4 番目に全ゲノム情報が解読されたシネコシスティスという種をはじめ、多くのシアノバクテリアが光合成やバイオマス生産などの研究分野で用いられています。私たちは、次世代シーケンサー（NGS）が登場した初期の頃から、シアノバクテリアのゲノ
ム解析を通じて農学分野の貢献を進めてきました。
細胞が増えるためには、あらかじめゲノムを「複製」、「分配」した後に「分裂」する必要があります。多くの生物は、この一連の現象を厳密にコントロールすることで、細胞あたりのゲノム数を 1セットに維持しています。一方で、世の中には細胞あたり複数セットのゲノムを持つ生物も見つかっています。シアノバクテリアもその一種です。しかし、シアノバクテリアの複数セットのゲノムがどのように「複製」しているのかはわかっていませんでした。私たちは NGS を用いてシネココッカスというシアノバクテリアのゲノム複製について研究を進め、複数コピーゲノムの複製開始領域や、ゲノム間の複製の非同調性を明らかにしました（Watanabe et al., Mol. Microbiol., 2012, Watanabe etal., PLoS One, 2015）。
ゲノム複製を開始するには二本鎖 DNA を一時的に解く必要があります。この反応を触媒するタン
パク質 DnaA は多くのバクテリアで必須です。しかし、シネココッカスについて DnaA の欠失を試みた結果、完全に欠損した株を作出することができました。詳しく調べてみると、DnaA がなくなった
シネココッカスは代わりにプラスミドと呼ばれる DNA 配列をゲノムに取り込んで、プラスミドの複製装置を使ってゲノムを増幅することが明らかとなりました（Ohbayashi et al., ISME J., 2015）。
私たちは現在、シネココッカスで見つかった「プラスミドによる複製開始機構」が他のシアノバク
テリアも存在するかどうか、調べています。シアノバクテリアは多種多様な生物群であり、その中には DnaA が 必 須 で は な い 種 や 最 初 か ら
DnaA を持たない種も見つかります。特に冒頭に紹介したシネコシスティスはゲノム配列決定から 20 年以上経った今でも複製開始機構はわかっていません。シネコシス
ティスは 20 コピー以上のゲノムに加えて、
40 kbp 以上の巨大なプラスミドを 4 つ持っており、DnaA を容易に欠損することができます。また、これまでの解析から 4 つの巨大プラスミドがゲノムに取り込まれていることを示す結果を得ることができました。シネコシスティスがゲノム複製に 4つの巨大プラスミドを利用しているのではないかと考え、研究を進めています。

図99

シアノバクテリアに見出された複製開始機構の多様性

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植物細胞の細胞小器官である葉緑体は独自の DNA を持ち、シアノバクテリアと共通の祖先から発生したと言われています。葉緑体も DnaA に相当するタンパク質はもっておらず、シアノバクテリアで見つかった DnaA に依存しないゲノム複製は植物の葉緑体にも共通した現象であると考えています。今後の研究にご期待ください！
渡辺智（生命科学部

兼崎友（静岡大学大林龍胆（東京大学

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バイオサイエンス学科）
グリーン科学研究所）
理学部）

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16S rRNA メタゲノム解析を適用した熟成チーズの細菌相解析
チーズの製造には、凝乳酵素の活性化、汚染菌の抑制、呈味成分や香気成分の生成を目的として、所謂スターター乳酸菌が人為的に添加される。一方で、熟成工程を有するナチュラルチーズではこれ
ら以外の乳酸菌（非スターター乳酸菌）や乳酸菌以外の多様な細菌が熟成中に自然発生的に増殖することが知られている。しかし、チーズはその原産国や種類、製法が多様であるが故、チーズの品質と熟成時の細菌相の相関については不明な点が多く残されている。我々はこれまでに熟成チーズ中の非スターター乳酸菌の菌相解析を培養法で行い、チーズからの分離報告例のない好塩性・好アルカリ性の乳酸菌群が一部の熟成チーズの主要な乳酸菌相を構成することを明らかにしている。しかし、これらの乳酸菌は一般的な乳酸菌の分離条件では全く分離されないため、本研究では、培養に依存しない
16S rRNA メタゲノム解析を適用することで、これら乳酸菌の熟成チーズ中の占有率や細菌相の全体像を明らかにすることとした。白カビ熟成チーズおよび細菌熟成チーズ計 5 点の表皮および内部
より DNA を抽出し n=3 で解析に供した。得られた結果から、すべてのチーズにおいて占有率が 0.5%
未満の OTU を除外し、階層的クラスタリングに供したところ、白カビ熟成チーズは種類の違いに依らず、類似した OTU の構成を示した一方、細菌熟成チーズではそれぞれに特有の構成を示した（図1）。また、乳酸菌相に着目すると、スターター乳酸菌である Lactococcus 属の OTU の占有率はいず
れのチーズでも高かったが、その他のスターター乳酸菌および非スターター乳酸菌（Leuconostoc,
Lactobacillus, Enterococcus） と 好 塩 性・ 好 ア ル カ リ 性 の 非 ス タ ー タ ー 乳 酸 菌（Marinilactibacillus,
Alkalibacterium, Vagococcus）の占有率が逆相関の関係にあることが示された（図 1）。さらに、各チーズの有機酸分析を行い、得られたプロファイルと細菌相解析結果との間で Spearman の相関分析を行ったところ、スターター乳酸菌および非スターター乳酸菌が OTU リード数の上位を占める場合と好塩性・好アルカリ乳酸菌および海洋細菌が上位を占める場合では、有機酸組成のプロファイルが大きく異なり、逆相関の関係にあることが示された（図 2）。現在、香気成分や糖類、アミノ酸のプロ
ファイルを用いた解析も行っており、本研究により、チーズに存在する細菌相とそれらがどのように

図1

各種チーズ細菌相の階層的クラスタリング

図2

各種チーズの有機酸組成プロファイルと細菌相間の Spearman の相関分析

101

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チーズの熟成に寄与しているのかについて、より明確な知見が得られるものと考えている。
石川森夫（応用生物科学部

醸造科学科）

鈴木敏弘（応用生物科学部

醸造科学科）

志波

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優（生命科学部

分子微生物学科）

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生分解性プラスチックの環境への影響評価
プラスチックはヒトの生活に欠かせない物質だが、現在ヒトにより生産され使用されている石油由
来プラスチックはヒトにより地球規模であらゆるところに廃棄されている。しかし、このプラスチッ
クは自然の物質循環の一員ではないために、分解はほとんど物理的な力によってのみ行われ、その結果、細かく断片化されただけの状態になる。この断片化により生じたマイクロプラスチックは特に河川や海洋環境へ流出することにより生体内に蓄積して生命に何かしら影響を与える可能性があるなどと言われ始め、プラスチックを環境問題の 1 つとしてヒトが問題意識を持ち始めている。
この問題解決のため、近年では生分解性プラスチックの研究が盛んに行われている。生分解性プラ
スチックは微生物が分解し自然的副産物のみが生じるプラスチックであり、プラスチックを自然の物
質循環の一員として考えることができる。実用化の面では石油由来プラスチックに比べると強度や柔軟性などの物理的な性質はまだ及ばないものの今後の開発研究により実用化が期待できる。本学でもH29 から革新的技術研究（学部長主導型プロジェクト）により実用性のある生分解性プラスチックの開発が行われている。このプロジェクトではその先も見据え、実際に生分解性プラスチックが廃棄されたと仮定したときの環境への影響についての研究もテーマの 1 つである。生分解性プラスチックの分解は微生物やその産生する酵素の作用により進行するが、分解過程で生じる様々な物質によりヒトの望まない微生物を増強する、また、有害な物質が生じるなど二次的な環境悪化をもたらす可能性 も あ る。 そ こ で 生 分 解 性 プ ラ ス チ ッ ク の 環 境 へ の 影 響 に 関 す る 研 究 テ ー マ で は、poly-3hydroxybutyrate [P(3HB)] を生分解性プラスチックのモデル物質として用い、P(3HB) を水環境に暴露してから分解が進行する（図 1）時の微生物叢の変化を調査し、生分解性プラスチックが環境に及ぼす影響について微生物学的に評価することを目的としている。
本研究では試料に国内の河川水や本学の池を用い、P(3HB) 暴露の有無が各試料の微生物叢に影響するかメタゲノム解析によって評価する。池に暴露している様子が図 2 である。メタゲノム解析の試料調製のため、メンブランフィルターを用いて試料から吸引濾過によって集菌し、DNA 抽出した
後に MiSeq による 16S メタ解析を行っている。現在、P(3HB) 暴露による水環境の微生物叢の挙動が明らかになりつつある。

図1

水環境に暴露して分解された P(3HB) の写真

103

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図2

池への P(3HB) 暴露試験の様子

ネットに P(3HB) と石を入れたもの（左上）を池に沈めた。

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田中尚人（生命科学部

分子微生物学科）

志波優（生命科学部

分子微生物学科）

藤田信之（生命科学部

分子微生物学科）

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PMA-PCR 法を用いた浄水場処理工程水の細菌相解析
浄水処理のコストや、衛生管理の観点から、処理工程における微生物の挙動を把握することは重要である。これまで、16S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンシングを用いて、浄水場処理工程水の微生物相を解析してきた。その結果、各処理工程水は真正細菌の占める割合が高く、また、沈澱処理水とろ過水間で、微生物相が大きく変化することが明らかになった。そこで本研究では浄水場における細菌の挙動を明らかにするため、各処理工程水の細菌相について PMA-PCR 法を用いて生菌と死菌を識別して評価した。PMA（Propidium monoazide）は死菌の DNA に結合し遺伝子増幅を阻害する試薬である。供試試料として、相模湖を取水源とする川崎市上下水道局長沢浄水場の原水、沈澱処理
水、ろ過水を用いた。調査は 2018 年 8 月、9 月に行った。PMA 処理には PMAxxTM（Biotium 社）
を用い、集菌後のフィルターに添加し、暗所で反応後、光照射したのち、DNeasy PowerSoil Kit（QIAGEN 社）を用いて DNA 抽出を行った。また、集菌後に PMA 処理をせず、DNA 抽出を行ったものを対照系として比較を行った。DNA 抽出物と、16S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域をターゲットとしたプライマーセットを用いて PCR 増幅した。シーケンスは MiSeq（Illumina 社）を用いて行い、シーケンスデータの解析は QIIME2 で行った。
原水において PMA 処理の有無による微生物相の違いは、8 月、9 月ともに、綱レベルでも属レベ
ルでもみられなかった（図 1）。沈澱処理水では、両方の月で違いがみられ、PMA 処理にともないBetaproteobacteria 綱（Limnohabitans 属、Polynucleobacter 属 ）、Cytophagia 綱（Pseudarcicella 属 ）、
Sphingobacteriia 綱（Sediminibacterium 属）の割合が減少し、Alphaproteobacteria 綱（Sphingomonas
属、Methylocystis 属、Methylobacterium 属 ）、Gammaproteobacteria 綱（Methyloparacoccus 属、Methylobacter 属）の割合が増加した。なお、8 月は Cytophagia 綱の割合に大きな変化はなかったが、Pseudarcicella 属の割合の減少と、Spirosoma 属の割合の増加がみられた。ろ過水では、8 月は綱レベルで特徴的な違いはみられなかったが、PMA 処理にともない Spirosoma 属と、Alphaproteobacteria 綱内

図 1 各試料の PMA 処理の有無における微生物相（綱レベル）（G 原水、T 沈澱処理水、R ろ過水、- PMA 処理なし、＋ PMA 処理あり）

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NGRC ニュースレター

における Methylobacterium 属の割合の減少と、Phreatobacter 属の割合の増加がみられた。9 月は PMA
処理にともない Betaproteobacteria 綱（Limnohabitans 属、Polynucleobacter 属）、Cytophagia 綱（Pseudarcicella 属）、Sphingobacteriia 綱（Sediminibacterium 属）の割合が減少し、Alphaproteobacteria 綱（Sphingomonas 属、Methylocystis 属、Phreatobacter 属）の割合が増加した。PMA 処理の有無における微生物相から評価した結果、沈澱処理水における主要な生菌は、Sphingomonas 属、Methylocystis 属、Methylobacterium 属であると考えられた。ろ過水における主要な生菌は、Sphingomonas 属、Methylocystis 属であると考えられた。これらは、沈澱処理水から流入したものと考えられた。以上の結果から PMA-PCR 法により浄水場処理工程水中の生菌の挙動を評価できることが示唆された。
藤本尚志（応用生物科学部
志波106

優（生命科学部

醸造科学科）

分子微生物学科）

NGRC ニュースレター＝研究発表実績＝〇論文発表● Itaya M, Nagasaku M, Shimada T, Ohtani N, Shiwa Y, Yoshikawa H, Kaneko S, Tomita M,
Sato M.
Stable and efficient delivery of DNA to Bacillus subtilis (natto) using pLS20 conjugationaltransfer plasmids.
FEMS Microbiol Lett. (2019) in press.
● Yamagata K, Nagai K, Miyamoto H, Anzai M, Kato H, Miyamoto K, Kurosaka S, Azuma R,
Kolodeznikov II, Protopopov AV, Plotnikov VV, Kobayashi H, Kawahara-Miki R, Kono T,
Uchida M, Shibata Y, Handa T, Kimura H, Hosoi Y, Mitani T, Matsumoto K, Iritani A.
Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualizedby live-cell imaging.
Sci Rep. (2019) in press.
● Ohki K, Kanesaki Y, Suzuki N, Okajima M, Kaneko T, Yoshikawa S.
Physiological properties and genetic analysis related to exopolysaccharide (EPS) productionin the fresh-water unicellular cyanobacterium Aphanothece sacrum (Suizenji Nori).
J Gen Appl Microbiol. (2018) in press● Jahan A, Komatsu K, Wakida-Sekiya M, Hiraide M, Tanaka K, Ohtake R, Umezawa T,
Toriyama T, Shinozawa A, Yotsui I, Sakata Y, Takezawa D.
Archetypal roles of an abscisic acid receptor in drought and sugar responses in liverworts.
Plant Physiol. (2019) 179: 317-328.
● Kawabata Y, Kamio A, Jincho Y, Sakashita A, Takashima T, Kobayashi H, Matsui Y,
Kono T.
Sex-specific histone modifications in mouse fetal and neonatal germ cells.
Epigenomics. (2019) online first.
● Serita T, Miyahara M, Tanimizu T, Takahashi S, Oishi S, Nagayoshi T, Tsuji R, Inoue H,
Uehara M, Kida S.
Dietary magnesium deficiency impairs hippocampus-dependent memories without changes
in the spine density and morphology of hippocampal neurons in mice.
Brain Res Bull. (2019) 144: 149-157.
● Shinozawa A, Otake R, Takezawa D, Umezawa T, Komatsu K, Tanaka K, Amagai A,
Ishikawa S, Hara Y, Kamisugi Y, Cuming AC, Hori K, Ohta H, Takahashi F, Shinozaki K,
Hayashi T, Taji T, Sakata Y.
SnRK2 protein kinases represent an ancient system in plants for adaptation to a terrestrial
environment.
Commun Biol. (2019) 2: 30.
● Brind'Amour J, Kobayashi H, Richard Albert J, Shirane K, Sakashita A, Kamio A, Bogutz
A, Koike T, Karimi MM, Lefebvre L, Kono T, Lorincz MC.
LTR retrotransposons transcribed in oocytes drive species-specific and heritable changes
in DNA methylation.
Nat Commun. (2018) 9: 3331.
● Chiba M, Itabashi T, Hirai K, Sakamoto M, Ohkuma M, Ishige T, Kawasaki S.
Lactobacillus metriopterae sp. nov., a novel lactic acid bacterium isolated from the gut ofgrasshopper Metrioptera engelhardti.
Int J Syst Evol Microbiol. (2018) 68: 1484-1489.

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● Endo A, Maeno S, Tanizawa Y, Kneifel W, Arita M, Dicks L, Salminen S.
Fructophilic lactic acid bacteria, a unique group of fructose-fermenting microbes.
Appl Environ Microbiol (2018) 84: e01290-18.
● Endo A, Sasaki F, Maeno S, Kanesaki Y, Hamaguchi Y, Torres GA, Tomita S, Nakagawa J.
In vitro and in silico characterisation of Lactobacillus paraplantarum D2-1, a starter culture
for soymilk fermentation.
Int J Food Sci Nutr (2018) 69: 857-869.
● Funane K, Tanaka Y, Hosaka T, Murakami K, Miyazaki T, Shiwa Y, Gibu S, Inaoka T,
Kasahara K, Fujita N, Yoshikawa H, Hiraga Y, Ochi K.
Combined drug resistance mutations substantially enhance enzyme production in
Paenibacillus agaridevorans.
J Bacteriol. (2018) 200: e00188.
● Inoue-Sakamoto K, Nazifi E, Tsuji C, Asano T, Nishiuchi T, Matsugo S, Ishihara K,
Kanesaki Y, Yoshikawa H, Sakamoto T.
Characterization of mycosporine-like amino acids in the cyanobacterium Nostoc
verrucosum.
J Gen Appl Microbiol. (2018) 64: 203-211.
● Ito K, Takagi K, Matsushima Y, Iwasaki A, Tanaka N, Kanesaki Y, Martin-Laurent MartinLaurent FF, Igimi S.
Identification of the novel hcbB operon catalyzing the dechlorination of pentachlorophenol
in the Gram-positive bacterium Nocardioides sp. strain PD653.
J Pestic Sci. (2018) 43: 124-131.
● Jaroensanti-Tanaka N, Miyazaki S, Hosoi A, Tanaka K, Ito S, Iuchi S, Nakano T,
Kobayashi M, Nakajima M, Asami T.
The chemical NJ15 affects hypocotyl elongation and shoot gravitropism via cutinpolymerization.
Biosci Biotechnol Biochem. (2018) 82: 1770-1779.
● Kansaku K, Munakata Y, Itami N, Shirasuna K, Kuwayama T, Iwata H.
Mitochondrial dysfunction in cumulus-oocyte complexes increases cell-free mitochondrial
DNA.
J Reprod Dev. (2018) 64: 261-266.
● Kimata S, Mochizuki D, Satoh J, Kitano K, Kanesaki Y, Takeda K, Abe A, Kawasaki S,
Niimura Y.
Intracellular free flavin and its associated enzymes participate in oxygen and ironmetabolism in Amphibacillus xylanus lacking a respiratory chain.
FEBS Open Bio. (2018) 8: 947-961.
● Matsuura A, Ishima T, Fujita Y, Iwayama Y, Hasegawa S, Kawahara-Miki R, Maekawa M,
Toyoshima M, Ushida Y, Suganuma H, Kida S, Yoshikawa T, Iyo M, Hashimoto K.
Dietary glucoraphanin prevents the onset of psychosis in the adult offspring after maternal
immune activation.
Sci Rep. (2018) 8 :2158.
● Miyazaki S, Hara M, Ito S, Tanaka K, Asami T, Hayashi KI, Kawaide H, Nakajima M.
An ancestral gibberellin in a moss Physcomitrella patens.
Mol Plant. (2018) 11: 1097-1100.
● Mochizuki K, Hayashi Y, Sekinaka T, Otsuka K, Ito-Matsuoka Y, Kobayashi H, Oki S,
Takehara A, Kono T, Osumi N, Matsui Y.
Repression of somatic genes by selective recruitment of HDAC3 by BLIMP1 is essential for

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NGRC ニュースレター
mouse primordial germ cell fate determination.
Cell Rep. (2018) 24: 2682-2693.e6.
● Mochizuki K, Tando Y, Sekinaka T, Otsuka K, Hayashi Y, Kobayashi H, Kamio A, ItoMatsuoka Y, Takehara A, Kono T, Osumi N, Matsui Y.
SETDB1 is essential for mouse primordial germ cell fate determination by ensuring BMP
signaling.
Development. (2018) 145: dev164160.
● Motomura K, Sano K, Watanabe S, Kanbara A, Gamal Nasser AH, Ikeda T, Ishida T,
Funabashi H, Kuroda A, Hirota R.
Synthetic Phosphorus Metabolic Pathway for Biosafety and Contamination Management of
Cyanobacterial Cultivation.
ACS Synthetic Biology (2018) 7: 2189-2198.
● Munakata Y, Ueda M, Kawahara-Miki R, Kansaku K, Itami N, Shirasuna K, Kuwayama T,
Iwata H.
Follicular factors determining granulosa cell number and developmental competence of
porcine oocytes.
J Assist Reprod Genet. (2018) 35:1809-1819.
● Murakami S, Kobayashi T, Sekigawa Y, Torii Y, Kanesaki Y, Ishige T, Yokoyama E,
Ishiwata H, Hamada M, Tamura T.
Actinomyces denticolens as a causative agent of actinomycosis in animals.
J Vet Med Sci. (2018) 80: 1650-1656.
● Nagamori I, Kobayashi H, Nishimura T, Yamagishi R, Katahira J, Kuramochi-Miyagawa S,
Kono T, Nakano T.
Relationship between PIWIL4-mediated H3K4me2 demethylation and piRNA-dependent DNA
methylation.
Cell Rep. (2018) 25: 350-356.
● Nakajima C, Kamimoto K, Miyajima K, Matsumoto M, Okazaki Y, Kobayashi-Hattori K,
Shimizu M, Yamane T, Oishi Y, Iwatsuki K.
A method for identifying mouse pancreatic ducts.
Tissue Engineering Part C Methods. (2018) 24: 480-485.
● Sano M, Seno K, Munakata Y, Kawahara-Miki R, Takahashi H, Iwata H. Kuwayama T,
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Three-dimensional culture system enhances anti-inflammatory characteristics in humantrophoblast cells.
J Reprod Immunol. (2018) 130: 41.
● Seno K, Munakata Y, Sano M, Kawahara-Miki R, Takahashi H, Ohkuchi A, Iwata H,
Kuwayama T, Shirasuna K.
Aggregation of human trophoblast cells into three-dimensional culture system enhances
anti-inflammatory characteristics through cytoskeleton regulation.
Int J Mol Sci. (2018) 19: 2322.
● Uchiyama H, Komatsu KI, Nakata A, Sato K, Mihara Y, Takaguri A, Nagashima T,
Wakame K.
Global liver gene expression analysis on a murine hepatic steatosis model treated withmulberry (Morus alba L.) leaf powder.
Anticancer Res. (2018) 38: 4305-4311.
● Yamamoto K, Shiwa Y, Ishige T, Sakamoto H, Tanaka K, Uchino M, Tanaka N, Oguri S,
Saitoh H, Tsushima S.

109

NGRC ニュースレター
Bacterial diversity associated with the rhizosphere and endosphere of two halophytes:
Glaux maritima and Salicornia europaea.
Front Microbiol. (2018) 9: 2878.
●志波優，伊藤さとみ，松本雄宇，鈴木司，石毛太一郎，熊谷武久，藤田信之，山本祐司，田中尚人
肥満モデルマウスにおける Lactobacillus paracasei K71 加熱死菌体摂取による腸内細菌叢および脂質代謝への影響日本乳酸菌学会誌 (2018) 29: 152-157.

その他● Tanaka K, Ohtake R, Yoshida S, Shinohara T.
Microsatellite capture sequencing. In: Genotyping.
IntechOpen. (2018): 13-30.
＝マスメディア＝2018 年 4 月
田中啓介研究員の飛散花粉の解析について、以下のテレビで紹介されました。
TBS テレビ
2018 年 8 月
岩槻健先生の膵管を蛍光色素で可視化について、以下の新聞で紹介されました。
日本経済産業新聞2018 年 9 月
松林尚志先生のボルネオ島の熱帯雨林で現地スタッフと取り組む野生動物の研究・保全活動について、以下のテレビで紹介されました。
NHK ワールド JAPAN2018 年 9 月
渡辺智先生の亜リン酸を用いた組換え藻類の封じ込め技術開発について、以下の新聞で紹介されました。
中国新聞、日経バイテク ON LINE
＝受賞＝
2018 年
2018 年 BBB 論文賞受賞
Watanabe S, Ozawa H, Kato H, Nimura-Matsune K, Hirayama T, Kudo F, Eguchi T, Kakinuma K,
Yoshikawa H.
Carbon-free production of 2-deoxy-scyllo-inosose (DOI) in cyanobacterium Synechococcus
elongatus PCC 7942.
2018 年
The 7th International GIGAKU Conference in Nagaoka (IGCN2018) Poster Award
Tanaka K, Ohtake R, Yoshida S, Shinohara T.
Microsatellite capture sequencing as a massive simple sequence repeat (SSR) detection
approach for DNA marker development and polymorphic analysis.
2019 年
2019 年度農芸化学奨励賞
渡辺智
シアノバクテリアから見出された増殖機構・環境適応機構の可塑性と有用物質生産への展開

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