栃木農試研報

No.44：49〜54（1996）

Bull．Tochigi

Agr、Exp．Stn．No.44：49〜54（1996）

エステラーゼ酵素多型を利用したニラ交雑個体の選抜
天谷正行

摘要：ニラ育種の効率化を図るため，エステラーゼ同位酵素多型により単為生殖個体と有性生殖個体（F1）の識別を行った，研究結果を要約すると以下のとおりである．

1．ニラの同位酵素多型は酸性側に遍在しており，Fl選抜に適するpIレンジは4〜6であった．

2．酵素多型により推定された交雑率は組合せ毎に異なっており，特に小山在来／大分在来の組合せにおいて約30％が交雑していた。しかし，その逆の組合せでは交雑率は4．4％と低く，単為生殖が母親の性質に強く依存していることが明らかとなった，

3．酵素多型による選抜と従来の圃場での選抜とを比較したところ，圃場選抜は逸脱する株数が多く，選抜株中には誤認した株も含まれていることから，酸素多型選抜の有用性が明らかとなった．

4.ニラの遺伝資源38品種・系統についてエステラーゼ同位酵素多型を調査した結果，8グループに分類することができた．しかし酵素多型は68％が同一のグループに属しておりかなり偏っていることが明らかとなった．

キーワード：ニラ，単為生殖，エステラーゼ，同位酵素多型，等電点電気泳動，等電点（pl）

Selection

crossofhybridplantspopu！ations

ofby

Esterase

Chineseisozymeleek（Allium

polymorphism

tuberosum

fromRottler）

MasayukiAMAGAI

Summary；Rottler）is
orapomixis

fromandapomicts

focusing，The
suitablecrossin

been

Fl

this

Oyama

matemalcrossforandbands

hybridOita

apomixis

involved

alotofChinese

leek

identical

zymogram

pattem。

words：Chinese

isoelectric

toofhybrids

zairaiwasdetected

detectstocksleek，Allium

at

the

observed、Theofapomicts，sowere

Iow

value．However

to

the

the

classified

hybrid．Inbyhightodlscrimlnate

hybrldisozymewasanalyzed

bypoint

andplorderofleafesterase

estimatedhighestselection。According

varieties

Key

wereparticularly

and

on

difficultpopulations，polymorphism

study，Frequency

effectofcrosszairafpopulations

methodconsideredpolymorphic

combinations

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tohavecharacterized

isoelectric

by

the

isoelectricofapproximately30％was

frequency

inthefocusingofhybrids

detectionbytheesterasepolymorphism

of

leaf

intoeightrange

wasby

thewaslsozyme

the

among

cross

was4．4％，difference
avery

isozyme，thirtygroups，however，68％ofthe

tuberosum，apomixis，hybrid，esterase

from4to6wasinphenotypeesteraseisoelectric

crossing

genotypeplantsdifferent

observed

reciprocal

detection

degreevarietiesinusefuleight
showedpolymorphism，

focusing（1996．7，30受理）

49

栃木県農業試験場研究報告第44号

1体であり，これらを識別して排除することがニラ育種の緒言飛躍的な効率化につながるものと考えられる．そこで，栃木県におけるニラ生産は約430haと日本一を誇り，重ニラの育種場面における同位酵素多型による雑種個体選・要な園芸作物として位置づけられている．しかし，現在抜を検討した．1993〜94年度に交配して得られたF1個体の主力品種では抽だいが7月〜8月に生ずるため，このについて，小島らの方法に若干の改良を加えてエステラ時期の出荷調整には労働時間が2倍もかかるという調査

ーゼ同位酵素多型による選抜を行った結果，ニラの単為結果もあり，生産現場からは晩抽だい性品種の育成が強生殖率は母親の形質に影響されることと，従来のニラにく要望されている．このような背景をふまえて，栃木県

比べ単為生殖率が低い（有性生殖率が高い〉系統のある

農業試験場では昭和61年からニラ新品種の開発に取り組ことが明らかになった．また，遺伝資源の材料を調査しんでおりム，平成4年には葉幅が広く草型の旺盛な新品た結果，エステラーゼ酵素多型が8のグループに分類さ種「きぬみどり」の育成に成功した．しかし抽だい性のれたのでここに報告する．

改良には至っておらず現在も品種改良は進められているn

ところである．晩抽性ニラ品種の育成に年限を要するの供試材料及び試験方法

は，一つには有効な遺伝資源の不足をあげることができ

1．供試材料るが，それよりもむしろニラが単為生殖性の高い植物で1）F1個体選抜材料あるという理由によるところが大きい4）．牧草類におい小山在来a，小山在来b（カルス経由再分化個体），ては単為生殖という性質を利用することで，ヘテロシス

小山在来c（カルス経由再分化の固定や安定した種子生産に成功している例があるが8・抽だい株），たいりょう，きぬみどりを交配親とし，当！「，ニラの場合は完全有性生殖個体が見つかっていない

場野菜部の慣行法により交配を行った93，94交雑系のF1ことから交雑育種での積極的な利用には至っておらず，個体を供試した（第1表）．

F1優良個体を選抜し早期に種子増殖するという目的で

2）遺伝資源調査材料利用されているにすぎない。このことは現在の主力な栽

当場で維持する主な遺伝資源38品種・系統を用いた培品種が類似した形質のものばかりになっている要因で個体の中から選抜した（第2表）．

もある．

2．試験方法

さて，植物育種においては遺伝的類縁関係の解明1），

1）供試時期耐病性などの標識選抜9）を効率よく行う目的で同位酵素

93交雑系のF1個体選抜は平成7年5月に2年株を用多型による解析が利用されている．小島らはエステラー

いて行った．また，94交雑系ならびに遺伝資源の調査は

ゼ酵素多型を利用して，ニラの単為生殖率が90％以上で平成8年4〜5月に行った．

あることを明らかにした3・5ナ．この結果に従うなら，圃

2〉等電点電気泳動条件

場に展開された株の90％は母親と同じ遺伝子型を持つ個新葉30㎎を採取し，50酬Tris−Hc1（pH7．5）を100μ加

第1表

エステラーゼ酵素多型によるF1個体選抜結果
94交雑系

93交雑系
交配緯合せ

供試

酵素多型選抜株数

F1株数（％）

圃場選抜F1株数

供試

酵素多型選抜（IEFとの一致株数）

株数

F1株数（％）

小山在来a／たいりょう

285

79（27．7）

17（14）

18（12）

46

8（17、4）1（O）

91・4（4．4）0（0）10（13．3）

4（2）小山在来c／たいりょう

317

97（30．6）

たいりょう／小山在来a113

5（4．4）

3（2）

きぬみどり／小山在来a1374（2．9）

7（1）75

小山在来b／きぬみどり
小山在来c／きぬみどり

58

1（L7）

きぬみどり／たいりょう

67

1（L5）

5（0）

85

0（0．0）

O（0）たいりょう／きぬみどり

868（9．3）

4（2）67

2（3．0）0（0）89

1（1．1）

0（0）

1（L7）

1（0）

36

1（2．8）0（0）2（1）

小山在来bセルフ小山在来cセルフ

たいりょうセルフ50

圃場選抜R株数（IEFとの一致株数）58

エステラーゼ酵素多型を利用したニラ交雑個体の選抜
えたL5麗容のエッペンドルフチューブ内でホモジナイザ

c／たいりょうのF1集団を材料とした等電点電気泳動しー（池田科学社s−205）により磨砕後，遠心（15000rpm×た結果，活性染色により確認されたエステラーゼ酵素の3伽n，5℃）による可溶性タンパク質の分離・抽出を行

多型は陰極側よりも陽極側に認められた．しかし，このい電気泳動用試料とした．泳動はファルマシア製の等電条件では電極付近のバンドが圧縮されてしまい，交雑個点電気泳動装置（MultiphoreH）を使用した．用いたゲル体の選抜には全体像などから推定を余儀なくされる場合の条件は担体として7．5％ポリアクリルアミドゲル，0。3もあった（第1図）．そこで酸性側に等電点を有する蛋％N，N一メチレンビスアクリルアミド，0．075％過硫酸アン白質の分離能を向上させるため，添加する両性電解質のモニウム，両性電解質としてpI5〜8或いは4〜6のpIレンジを4〜6に改変したゲルを作製し，同じ試料を等電点電気泳動した、7．5％（v／v）のキャリアアンフォライン（LKBファルマシア

この結果，p製）を加えたものであった．また，ゲルの大きさは120×I5〜8の条件では確認できなかったた

250×0．2nmlで，一度に52個体の検定が可能なものを使用

いりょうに特有な酸性側のバンドが確認され（第2図中し，試料は一検体あたり15μ4を添加した．電極液は陰矢印〉，F1株の選抜精度が向上した．小島らは単為生

極側に0．2Mヒスチジン，陽極側に40醐D殖程度の推定を行う目的で，pLグルタミン酸

I5〜8において両親のの組み合わせを使用した．泳動時の通電条件は，予備泳エステラーゼ多型に差異を有する交配組合せを用いてい

動に5W，30min，本泳動に5W，30min−10W，30min（全て電る．しかし実際の育種への応用を考慮した場合にはpI

圧一定条件）であった．

5〜8の条件では十分でない場合もあることから，pI3）エステラーゼ酵素の活性染色条件4〜6の条件で選抜を行うことが適当であると考えられ泳動の終了したゲルは蒸留水で軽く表面を洗浄し，た．

Tankslayらの方法lll1に従い直前に調整した染色液（1002．F1交雑個体のエステラーゼ酵素多型による選抜彫／gel）に浸漬し，暗黒条件の室温条件下で10〜15分の活エステラーゼ酵素多型によるF1個体選抜の有用性を性染色を行った．5％酢酸溶液に移して反応を停止し，検討するため，圃場において2年株養成中の集団をスク蒸留水を数回換えてバックグラウンドの除去を行い，出リーニングした．活性染色されたバンドの内，陽極側に現したバンドを解析した．

存在するものについて母親のパターンと異なるもの，明らかに父親由来のバンドを有するもの，あるいは両親と皿結果及び考察は異なるバンドを有するものをF1個体として識別した

1．F1交雑個体選抜条件の検討（第3図）。

F1交雑個体の選抜条件を検討するため，小島らの方その結果，F1個体の出現頻度は0〜3L4％と組合せに法によりp

第2表

Iレンジ5〜8の条件で93交雑系の小山在来

エステラーゼ酵素多型のバンドパターンによる分類
品種・系統名バンド型

大葉南洋

漢中広葉aより差が認められた．特に小山在来（aまたはc）／たいル

ユ化一フl

漢中冬ニラA2

耐寒大葉

漢中冬ニラB

漢中広葉A

食用花ニラ（広巾）キングベルト

東北呼和

満州

津引1号

中国ニラA

キニラA

キニラB

杭州ニラ

岩舟在来

石橋在来

南京791

タイワン

岡山在来A

岡山在来B

漢中冬ニラ西安

漢中冬ニラ西安A

東北小口山形グリーンベルトb

津南青ニラA

津南青ニラBc

漢中冬ニラB2

漢中広葉B

d

モウコ

朝鮮

e

漢中冬ニラA1

成都f

栃交1号（きぬみどり）

g

小山在来

h

たいりょう

中国ニラB

51

栃木県農業試験場研究報告第44号

全L
﹃

趨診

1▼十／

．鍵

齢123（鍵）89、。11、幽斜6・7・8王9￠♂1222324252627282亀・31323334＄覧63勧齢
在り（丸印の個体は交雑個体と推定される個体〉

在り

来よ

来よ

aつ

第1図

aつ小山在来cノたいりょうのF、個体の等電点電気泳動（pl5〜8）によるエステラーゼアイソザイム型

一皇／−←＋のものに限定されていること（第3図）から考えて，小山在来が母親の場合にはF1の識別が困難であり，結果麟としてF1個体の識別を逸脱した個体が存在している危険性が指摘された，撚．．蜘

〈小た④⑥（抽・・⑬⑮・6
山い（丸印の個体は交雑1嶽体と擬される個体〉

在 り
来 よaう

第2図 小山在来c1たいりょうのF1個体の等電点電気泳動（pl4〜6）によるエステラーゼアイソザイム型

酵素多型によるスクリーニングは，①使用する酵素型が両親間で異なっており，②母親の有するバンドが父親に比べて少ないか，③父親が極めてユニークなバンドを有することが望ましいが，交配計画時に酵素多型を考慮した設計を立てない限り，必ずしもこれらの条件が満たされるとは限らない．従って将来的には遺伝子型の差異をも言及できるような，RAPDマーカー2〉による選抜法へと移行することが望ましいと考えられた．

りょうでは3つの集団において約30％の個体がF1であると推定され，小山在来の潜在的な有性生殖率は30％以上であると考えられた。また，94交雑系の小山在来c／たいりょうにおいては15．2％と低い頻度であったが，93交雑系では同一の株で30％が交雑しているという結果が得られていることから，年次問差かあるいは供試個体数が少なかったことが影響したものと考えられた，この逆の交配では93，94交雑系とも4．4％の交雑しか認められなかった．一般的にニラにおける単為生殖は，複相大胞子の形成と偽受精による単為胚発生によって起こるとされてしかし，圃場における特性調査によるF1選抜と酵素多型による選抜とを比較した結果，酵素多型選抜によって得られたF1株数は圧倒的に多く，なおかつ圃場選抜個体は酵素多型選抜結果とはあまり一致しないという結果が得られた（第1表），このことから，本方法をニラの育種現場，特に定植前の苗養成期間中の個体に適用することにより，圃場の利用効率，或いは育種の労力を大幅に省力化することが可能であると思われる．

3．ニラのエステラーゼ酵素多型における多様性について

ニラのエステラーゼ酵素多型における多様性を検討すおり6・7，小山在来が母親の場合にのみ有性生殖頻度がるため，当場で保存している遺伝資源のうち，主要な38高いという結果は，改めて単為生殖性が母親の形質に依品種・系統について等電点電気泳動による分析を行っ存することを示唆している．

た．この結果，供試材料の68％にあたる26品種・系統が一方できぬみどりと小山在来の組合せでは，小山在来bが母親の場合に交雑頻度が高い傾向は認められたが，13．3％とたいりょうの場合に比べて低いものであった．

これは，小山在来はきぬみどりに比べてバンド数が多いことや，きぬみどりのバンドはあまり鮮明なもので無いこと（第4図），さらにF1と識別された個体の呈示するバンドパターンが小山在来のバンドが欠失するタイプ
52ほぼ同一のバンドパターンを有することが明らかとなった（第2表，第4図）．この中には花ニラ品種や中国からの導入品種が多数含まれていた．同時に泳動したpI

マーカーの移動度から換算し，陽極側で多型を示すバンドはpI4．75〜5．1の付近に集中しており，条件検討で述べたように電気泳動時のpIレンジは4〜6程度が適当であることが証明された．また，導入後に形態的変異

エステラーゼ酵素多型を利用したニラ交雑個体の選抜2を生じた品種のうち漢中冬ニラ，漢中広葉，中国ニラは酵素多型パターンまで変化していることがわかった．海木村栄（1995）「きぬみどり」．野菜園芸技術，22（7〉：P．39．

外から導入された品種については遺伝的背景が不明なた

3

小島昭夫，長戸康朗（1989）エステラーゼアイソザ

め，類縁関係についてこれ以上の解析を行うことは不可

イムを利用したニラの単為生殖率の推定．育雑39．

能であるが，特徴的な8の酵素多型パターンは今後の交別2：210−21L配計画に資するものと思われた。

4

Kojima，A

今後はさらに栽培品種についての多様性を検討すると

ofChinese

ともに，DNAマーカーのような精度の高い方法によりa型

inに含まれる多数の品種を識別する条件を確立することが−456．

5必要であると考えられた．

andKawaguchi，T（1989）ApomicticChive（。4〃iμ耀躍68ro5卿nUnpolhnated

Ovule

NatureROTTL，）Detection

Cuhure．Japan

J、Breed、，39：449

小島昭夫，長戸康朗，日向康吉（1991）エステラー

ゼの電気泳動により推定されたニラのアポミクシス
謝辞率．育雑41（1）：73−83．

6

本研究を行うに当たり，野菜部の木村特別研究員をはじ

Koj㎞a，ANagato，Y（1992）Diplosporus

め職員の方々から材料の提供及びニラの特性に関してごdgreeof指導賜りましたことに感謝いたします．

傭6870∫μアn．Sexual

Plant

Reproduction．，5：72−78．

＿and

引用文献
1

Hkai，M．，Kozaki，1．段nd

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and山e

7

fonnation

andsacμ〃2

embryogenesis

andthedegreeofpa質henogenesisiM伽吻魏伽㍑御。SexualPlant

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8analysisandphylogenicrelationshipofcitrus。JapanJ・

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Breed．，36：377−389．

﹁至／←＋・毎轡懸舶剣噸嚥．・
騰椴紹岬

F玉F︐

Apo

Apo

Apo

APo

APo

Apo

ApoF．

たいりょう／小山在来a

小山在来a／たいりょう

Apo

APQ

Ap（》

Apo

F、

小由在来1）／きぬみどり︸至／−←＋鐘．聾醐蓼

APQ

ApQ

F、

Apo

Apo

きぬみどり／たいりょう

幽欝
AP（）

Ap。

F、

Ap・／Ap・小由在来aセルフ

Ap・F、Ap・AI）・

Ap・

たいりょうセルフ

第3図 各交配組合せごとのエステラーゼ酵素多型によるF1個体の識別（図中のF1は交雑個体，Apoは単為生殖個体の意）53栃木県農業試験場研究報告第44号

』㌔、／
畔

駕㌃4』

・ヤナノァ

ドヤ
コア

コド
藩鐵、

←015・10←914・95←pl4・80←訓4．85←gl4』．75

干レa、む』

Cdefgha

第4図 ニラにおけるエステラーゼ酵素多型の多様性※表中のa〜hは第2表のバンド型と同一である
告，第58号．

911

早乙女和彦，吉田久，小林俊一，天谷正行（1990）

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DNApolymorphisms

amplifiedfulas

markers．Nucleic

6535．

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byarbitary

pr㎞ersAcids

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