メラノソーム膜に局在する OCA4 型アルビノ原因遺伝子 MATP を標的としたメラニン合成阻害剤の開発
名古屋市立大学大学院薬学研究科

保嶋智也

Melanin is produced from tyrosine by tyrosinase localized in melanosomes in melanocytes present at the cutaneousepithelium. There are also many reports indicating that various amino acid-related compounds other than tyrosine areinvolved in controlling melanin synthesis. Based on these, it may be likely that transport of amino acid-related compounds
for the supply or elimination at the melanosomal membrane by a transporter is involved in melanin synthesis as the ratedetermining step. Solute Carrier (SLC) 45 A 2 , which has been identified as a causative gene for Oculocutaneous Albinism
Type 4 (OCA 4 ), is for a transporter that operates for translocation of small molecules across biological membranes. It isalso notable that the OCA 4 patients are present at a quite high frequency among the Japanese. Thus, the designated genetic
polymorphism of SLC 45 A 2 has already been indicated to be linked to a major type of OCA, but the mechanism behind thatremains to be elucidated. We, therefore, attempted to investigate into that possibility and successfully identified putrescine,
an amino acid-related compound as a substrate of SLC 45 A 2 . Putrescine has been reported to suppresses melanin
synthesis by inhibiting tyrosinase. Based on these, it would be possible to hypothesize that melanin synthesis is impaired in
OCA 4 patients because of its extensive accumulation into melanosomes due to the dysfunction of SLC 45 A 2 . Therefore,
elucidation of the function of SLC 45 A 2 and its role in the synthesis of melanin in relation to OCA 4 should be of great help
in the development of melanin synthesis inhibitor.

1. 緒

高水溶性（低脂溶性）である等の物理化学的な性質から、メ言

ラノソーム膜をはじめとする生体膜（脂質膜）を透過する過現代の日本においては、多くの女性が肌を白く保とうと程においては、その分配を要する単純拡散機構の寄与は小する傾向があり、美白を目的とした化粧品・医薬部外品等

さく、トランスポーター（膜内在性輸送タンパク質）によが多く販売されている。しかしながら、それら化粧品・医る担体介在的な機構が関与していると考えられている。

薬部外品等に配合される有効成分は、メラニン合成酵素でそこで、メラノソーム膜に局在しアミノ酸関連化合物あるチロシナーゼの阻害を標的としているものがほとんどを輸送するトランスポーター群の候補遺伝子を探索し、であり、それ以外の分子標的については、ほとんど明らか

Membrane‒Associated Transporter Protein（MATP）にとなっていないのが現状である。肌の黒色化は、主にメラ着 目 し た。MATP は OCA 4 型 ア ル ビ ノ の 原 因遺 伝 子 とニン合成の亢進によるが、そのメラニンはチロシンを原して発見され 1）、特に日本人のアルビノ罹患者に最も多料として皮膚上皮細胞のメラノソーム内に局在するチロシくみられる型の一つであることが報告されている 2）。近ナーゼにより産生される。メラニンはその物理化学的性質

年、MATP がメラノソーム内 pH の調整を行い、それによとして水や有機溶媒に不溶で安定な化合物であるため、一ってチロシナーゼの活性を制御しているとの報告がされ度生成されると除去されにくい特徴を有するが、その中でた 3）。このことから、Bin らのグループは MATP が H+ をも特に安定性の高い亜メラニンの生成にはシステインが関輸送基質にしていると考察しているが、明確なデータを与していることが知られている。また、細胞増殖に不可欠示せておらず H+ が輸送基質であるか現在のところ断定さな化合物と知られているポリアミンが、メラニン合成を制れていない。MATP は solute carrier 45（SLC 45）family

御しているとの報告がある。このように、メラニン合成のに属しており、proton‒associated sugar transporter であ律速段階としてメラノソーム内へのチロシンやシステイン、る SLC 45 A 1 と高い相同性を有している 4）。このことから、ポリアミン等のアミノ酸関連物質の供給過程が関与していMATP は糖類を輸送基質とすることが予想されたが、こる可能性が極めて高いと考えられる。アミノ酸関連物質はれまでの申請者の検討からそれらを輸送基質としないことが分かっている。また、MATP は有機物（糖類）を輸送す
る SLC 45 A 1 と高い相同性を有することから、無機物であDevelopment of melanin synthesis
inhibitor targeting MATP localized inmelanosomal membrane
Tomoya Yasujima
Graduate School of PharmaceuticalSciences, Nagoya City University

る H+ を本来の輸送基質にすることは考え難い。以上のような研究現状より、本研究では、MATP の機能解明を行い、メラニン合成阻害の有望な標的分子になりうるかを検証した。

− 155 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

2. 方ligation mix（NIPPON GENE, Japan）を用いてライゲーショ法

ンし、ヒートショック（42 ℃、1 min）によって大腸菌（DH 5 α）

2 . 1. ヒトMATP（hMATP）のクローニングに導入した。その大腸菌を、ampicillinを添加した LB プレhMATP（accession no, NP_ 057264 . 3）の cDNA は、ヒートに播き、37 ℃で一晩培養した後、プレート上のコロニー

ト皮膚の total RNA 試料より RT‒PCR によってクローニンを採取した。そこからプラスミド DNAを抽出し、制限酵素グをした。1 µg の total RNA を用い、オリゴ dT プライマ

処理後、電気泳動を行うことによりインサート部分を確認しーと逆転写酵素 ReverTra Ace（TOYOBO, Japan）によった。予想された長さのインサート部分が確認されたコロニーて cDNA 試料を得た。hMATP の cDNA は GenBank に登から得られたプラスミドの配列は、自動シークエンサー ABI

録されている配列より open reading flame 領域が増幅され

PRISM 3100
（Applied Biosysytems, U. S. A.）により確認し、るよう設計したプライマーを用い、KOD plus polymerase

目的とする部分の塩基配列に変異があることを確認した。

（TOYOBO, Japan）を使用して PCR を行った。得られた
3100（Applied Biosysytems, U.S.A.）にて確認した。発2 . 3 . hMATPとその各種変異体の一過性発現系細胞

現ベクターである pCI‒neo vector（Promega, U.S.A）に

実 験 に は、 イ ヌ 腎 由 来 MDCK Ⅱ 細 胞 を 用 い た。

hMATP の cDNA を 組 み 込 ん で、hMATP プ ラ ス ミ ド

MDCKII 細胞は継代に際し、ビュルケルチュルク盤を用いを 作 成 し た。 ま た、 そ の 際 に N 末 端 に FLAG sequenceて細胞数を計測した後、3×105 cells/ml となるように調製（DYKDDDDK）が付与されるように組み込んだ。

し、24 well プレートに 500 µl/well ずつ播種した。その約

hMATP の cDNA 配列は自動シークエンサー ABI PRISM

1 時間後、導入試薬として 3 µg/well の polyethyleneimine

2 . 2 . hMATP の各種変異体の作製（Polyscience, U. S. A.）を用いて、各プラスミド（hMATP

各種変異体を作製するにあたり、pCI‒neo vector に組みとその各種変異体）を導入した。その後、36 ‒ 48 時間の培込んだ FLAG‒hMATP を鋳型とし、所定の変異が導入さ養によって、一過性にそれぞれのタンパクを発現させ、コれるよう設計したプライマーを用い（Table 1）、PrimeSTAR

ンフルエントに達した状態のものを実験に用いた。また、

Max DNA Polymerase を使用し PCRを行った。得られた対照として pCI‒neo vector のみを導入した mock 細胞をPCR 産物を 37 ℃で 1 時間のDpnI（TOYOBO, Japan）処理作成した。細胞培養培地として、10 % fetal bovine serum、後、T4 Polynucleotide Kinase（TOYOBO, Japan）、2 ×

1 % penicillin/streptomycin を 含 む Dulbecco’ s modified

Table 1

各種 hMATP 変異体作製のためのプライマー配列− 156 −

メラノソーム膜に局在する OCA4 型アルビノ原因遺伝子 MATP を標的としたメラニン合成阻害剤の開発Eagle’ s medium を使用し、37 ºC、95 % air ‒ 5 % CO 2 インを要する場合には、ANOVA の後に Dunnet's test を用いた。

キュベーター内で培養した。

3. 結2 . 4 . 取り込み実験

果取り込 み 実 験 用緩 衝 液として、10mM HEPES を加えた

3 . 1. MATP のメラノソーム膜局在シグナル配列の探索

Hanks’ solution（136 . 7 mM NaCl, 5 . 36 mM KCl, 0 . 952 mM

現在までに MATP の輸送基質は同定されておらず、

CaCl 2 , 0 . 812 mM MgSO 4 , 0 . 441 mM KH 2 PO 4 , 0 . 385 mM

MATP の機能変動に起因する OCA 4 型アルビニズム発

Na 2 HPO 4 , 25 mM D‒glucose）
または、10 mM HEPES を加症の機構については不明なままである。前述したように、

え た Mannitol buffer（5 . 37 mM K‒gluconate, 273 . 4 mM

MATP の輸送基質としてアミノ酸関連物質が予想される

Mannitol, 0 . 4 4 1 mM KH 2 PO 4 , 0 . 8 1 2 mM MgSO 4 ,ため、それら化合物が MATP の輸送基質となるか検証を

0 . 952 mM Ca‒gluconate, 0 . 385 mM K 2 HPO 4 , 25 mM D‒行う必要があるが、MATP はメラノソーム膜に局在するglucose）を用い、2 M の NaOH を用いて pH 7 . 4 に調整しため、細胞外に暴露された検討対象化合物を輸送することた。この緩衝液中に［3 H］tyrosine（5 nM）または［3 H］ができない。細胞内小器官に局在するトランスポーターの

putrescine（2 nM）
を加え、取り込み試験液とした。

生体膜透過の検討には、ジキトニンをはじめとした界面活取り込み実験に際して、まず、well 中の培地を吸い取性剤で細胞表面を処理することにより細胞膜透過性を上昇

り、37 ºC の Hanks’ solution（1 ml）を加えて 5 分間プレイさせ、検討対象化合物を細胞質内へ移行させ評価する方法

ンキュベーションした。その後、取り込み試験液（250 µl）が一般に用いられている。しかし、界面活性剤処理の条件を加え、取り込みを開始させた。所定の時間経過後、氷冷設定が難しく、再現性や安定性に問題がある。そこで、メした Hanks’ solution（stop solution, 1 ml）を加えることにラノソーム膜に局在させる移行シグナルに着目した。膜貫より反応を停止させ、stop solution（2 ml）で細胞を 2 回洗通タンパクの細胞内ドメインに D/ExxxLL や Yxxφ、KxK浄した。続いて、0 . 5 % SDS を含む 0 . 2 M NaOH を 500 µl（x：任意のアミノ酸、φ：疎水性アミノ酸）の配列を有す加え、細胞を可溶化させ、カウンティングバイアルに回収

るとメラノソーム膜やライソソーム膜に局在することがした。そこに液体シンチレーションカクテル 2 ml を加え、知られている 5 , 6）。そこで、MATP のアミノ酸配列を解析

液体シンチレーションカウンター（LSC‒ 5100 , Aloka Co.,

すると、細胞内に複数の YxxL、KxK 配列を有しているこTokyo, Japan）により放射能活性を測定することで取り込とが確認された。また、その配列は種間の保存性が高くむ量を評価した。

MATP のメラノソーム膜への局在制御に関わっている可能性が強く示唆された（Fig. 1）。よって、この配列を Sxxφ、

2 . 5 . データ解析

AxA に変換することでシグナルを除去し、メラノソーム

2 . 5 . 1 . 取り込みデータ解析

膜に発現する MATP を強制的に細胞膜へ移行させること細胞への薬物の取り込み量は以下の式を用いて算出した。
smctv

で輸送基質の検討を行うこととした。

3 . 2 . hMATPとその各種変異体によるtyrosine 輸

ここで、Uptake は取り込み量（pmol/mg protein）、As は送能の解析

サンプルの放射能（dpm/well）、Act は取り込み試験液の放メラニンは、メラノソーム内のチロシナーゼの働きに射能（dpm/µl）、Av は細胞のタンパク量（mg protein/well）、より、アミノ酸の一種である tyrosine を原料に合成される。

Cm は取り込み試験液の基質濃度（µM）
である。

そのため、メラノソーム内へのメラニン供給経路は、生体取り込み量（Uptake）を取り込み時間（t, min）で割ることにおけるメラニン合成において、律速段階になっていると考えられる。アミノ酸は一般的に高水溶性（低脂溶性）であにより、取り込み速度（V, pmol/min/well）を求めた。

るため、その物理化学的な性質から、脂質膜で構成される生体膜を透過する過程においては、細胞膜（脂質膜）への分
2 . 5 . 2 . 統計処理配を要する単純拡散機構の寄与は小さい。そのため、トラ

MDCKII 細胞における 1 回の実験のデータは、同時に調ンスポーター（膜内在性輸送タンパク質）による担体介在製した細胞の 2 サンプル（well）における実験値として得た。

的な機構の関与が古くから示唆されており、現在までに多実験回ごとに細胞を調製して、複数回の実験を行い、合計くのアミノ酸トランスポーターの分子実体が明らかになのサンプル数を例数（n）とした。ってきた 7）。メラノソーム膜においても例外ではなく、アデータは、原則として平均値±標準誤差として示した。

ミノ酸などの高水溶性化合物の膜透過過程には、トラン2 群間の比較には、Student's t–test を用いた。多重比較スポーターが重要な役割を担っていると考えられる。メ− 157 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Fig. 1

MATP の種間の相同性とメラノソーム膜局在シグナル配列− 158 −メラノソーム膜に局在する OCA4 型アルビノ原因遺伝子 MATP を標的としたメラニン合成阻害剤の開発

ラノソーム膜におけるチロシン輸送には、トランスポー8）によりメラノソーム内からのポリアミン排出が停止し、メターの関与を示唆する報告はあるが 、その分子実体のラニン合成能不全が惹起されている可能性が考えられる。

同定には至っていない。そこで、MATP がこの過程を担ポリアミンはポリカチオン構造を有することから高水溶う分子実体であるとの仮説をたて、MATP とその各種変性であるため、その生体膜透過にはトランスポーターが異体による tyrosine 輸送能の解析を行った（Fig. 2）。その必要であると考えられている。そこで、MATP の Y 317 S

結果、Y 317 S 変異体においてわずかながら tyrosine 輸送変異体を用いて、ポリアミンの一種である putrescine 輸量の増加傾向がみられた。このことから、Y 317 S 変異体送能の解析を行った（Fig. 3）。その結果、ナトリウムイオは MATP のメラノソーム膜局在シグナルが除去され細胞ン、塩化物イオンを除去した条件では（mannitol buffer）、膜に局在し、tyrosine 活性を有していることが示唆された。

mock 細胞と比較して Y 317 S 変異体における putrescine 輸

ただ、その活性は非常に弱いことから、他に良好な輸送基送量は有意に上昇した（約 3 倍）。このことから、MATP質が存在していることが考えられたため、Y 317 S 変異体はメラノソームからポリアミンを排出し、チロシナーゼのを用いて、他の輸送基質の探索を進めた。

活性の維持に重要な役割を担っている可能性が示唆された。

4. 考

3. 3. hMATPとその各種変異体によるputrescine
輸送能の解析
細胞の増殖等、生理機能の維持に重要であるポリアミンは、チロシナーゼ活性を抑制しメラニン合成を減少させるとの報告がある

9 , 10）。MATP の遺伝子多型による機能不全

Fig. 2Fig. 3察

本 研 究 に お い て、hMATP の ア ミ ノ 酸 配 列 の 中 のY317

XXL 320 がメラノソーム膜局在に重要である可能性が示唆された。また、Y 317 S の変異体は細胞膜に局在し、細胞膜輸送に基づいた簡便で再現性の高い機能評価系のhMATP とその各種変異体による tyrosine 輸送能の解析

hMATP とその変異体（Y317S）
による putresine 輸送能の解析− 159 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Y, Tada J, Kikuchi N, Takata M, Takamori K,Kishibe M, Tanaka M, Miyamura Y, Ito S, Tomita Y.
Oculocutaneous albinism type 4 is one of the mostcommon types of albinism in Japan. Am J Hum Genet,
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Membrane–Associated Transporter Protein（MATP）
Regulates Melanosomal pH and Influences Tyrosinase
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N, Miura M. Past‒A, a novel proton‒associated sugartransporter, regulates glucose homeostasis in the brain.
Fig. 4

J Neurosci, 22, 9160‒9165（2002）．

メラニン合成に係る MATP の寄与

5） Dietrich J, Kastrup J, Nielsen BL, Odum N, Geisler
C. Regulation and function of the CD3gamma DxxxLL確立に成功した。MATP は tyrosine 輸送能を有していた

motif: a binding site for adaptor protein‒1 and adaptor

が、その活性は弱く、生体における役割においては重要で

protein‒2 in vitro. J Cell Biol, 138, 271‒281（1997）．

はないことが示唆された。一方、ポリアミンの一種であ6） Guarnieri FG, Arterburn LM, Penno MB, Cha Y,る putrescine の輸送活性が認められた。MATP の遺伝子

August JT. The motif Tyr‒X‒X‒hydrophobic residue

多型による機能不全は、メラニン合成能が欠損しアルビ

mediates lysosomal membrane targeting of lysosome‒

ノを発症するため、MATP がメラニン合成酵素であるチassociated membrane protein 1. J Biol Chem, 2 6 8,

ロシナーゼの活性低下に寄与するポリアミンをメラノソ

1941–1946（1993）．

ーム外に排出している可能性が示唆された（Fig. 4）。よっ7） Fotiadis D, Kanai Y, Palacín M. The SLC3 and SLC7て、MATP の阻害剤はメラノソーム内にポリアミンを蓄

families of amino acid transporters. Mol Aspects Med,積させることに貢献し、チロシナーゼ活性を抑制する可能

34, 139‒158（2013）．

性が示唆された。この知見は、MATP の輸送機能及び分8） Gahl WA, Potterf B, Durham–Pierre D, Brilliant MH,

子特性の解明を進展させ、MATP の機能変動に起因する

Hearing VJ. Melanosomal tyrosine transport in normal

OCA 4 型アルビニズム発症の機構の解明、また、その阻and pink–eyed dilution murine melanocytes. Piment

害剤がメラニン合成阻害の有望な化合物の開発に役立つ情

Cell Res, 8, 229‒233（1995）．
9） Käpyaho K, Jänne J. Stimulation of melanotic

報の提供につながるものと期待される。

expression in murine melanoma cells exposed to（引用文献）

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