栃木農試研報

No．46：29−35（1997）

BullTochigiAgr．Exp．Stn

No．46：29−35（1997）

RAPDマーカーによるニラ品種の識別
天谷正行
摘要：ニラ育種への利用を目的とし，RAPDマーカーによる品種識別条件を確立した．38のニラ

遺伝資源の葉身からCTAB法により抽出したtDNAに対し，34種の合成プライマーを用いてPCRを行った．この結果，22種のプライマーから236個のRAPDマーカーが得られた．このうち19種のプライマーから得られた181個のRAPDマーカーを用いてクラスター分析を行ったところ，エステラーゼ多型分析では識別できなかった26品種を識別することができた．また，この同一のエステラーゼ多型を持ったグループのうち24品種は2つのクラスターを形成することが明らかになった．不抽だい性品種である大分在来と小山在来は非常に類似していることが明らかになった．

キーワード：ニラ，PCR，RAPD，品種識別

Discriminationof

ChineseChive（AlliumbyRAPD

amplifiedpolymorphicChive（A〃加規飯わ6アos麗醒SPR．）cultivars

andutilize

bladeofRAPD

theanalysis

each

cultivars

amplifiedpolymorphic

polymerase

chain

Using

these

RAPD

clusterzairai，wereclosely（random

amplifiedCTABthemarker，it

Allalysis
relatedeachobserved

showedthatotherand

DNA

the

two
weretoapplied

relationship

to380fbetweencultivars

extracted

fromwereused

for

RAPD

analysis236

in22primers

outof34used

obtained

discriminate36cultivars
zymogram

pattemlandraces，Oita−zairai

notwithanother

ROTTL，PCR（polymerase

leafforfrom19primers．

nonboltingDNA），Cultivar

thewereidentical

relatedChineseDNA

fragments

possible

showedaand34primers

genomic

wasdefinewasprogram。Genomic

wereChive，Allium．fuberosum

polymorphic

tomethods

fragments
withorder

breeding

which26cultivars

isozyme．The

words：ChinesethebyDNA

reacti（》nspolymorphism，lnKeyforAMAGAIDNA（RAPD）analysis

lnSPR。）Cultivars

Markers

MasayukiSummary：Random

fuberosum

bolting

chainfrom

theofesterase

andOyama−

cukivars。

reaction），RAPD

Discrimination（1997．7．31受理）

29栃木県農業試験場研究報告第46号

1緒言

な判定が迅速かつ客観的に行えるようになったことである．加

現在我が国におけるニラの主力品種のほとんどが集団からのえて，DMを対象としたことで環境に影響されない結果を得る選抜育種法によって育成されているが，この理由はニラが高度ことができることも上げられる．また，任意に合成されたプラに単為生殖を行う形質を持つことによる劉．このため，近年のイマー（a【bitary品種は草型ヤ特性の類似したものが多く，新たな遺伝子の導入で，あたかも無選抜状態にある形質を比較するような効果力碍

をはかる上では限界があった．

られるため，ニラのように遺伝的背景の全くわかっていないも栃木県農業試験場では昭和61年よりニラの交配育種に取りpr㎞er）を利用して遺伝子増幅を行うことのを対象にしても客観的な判新を下すことができる．

組んでおり，平成4年に「きぬみどり」を育成した6｝．しかし，これらのことから，本研究では当場の有するニラ遺伝資源の交雑率力弛の作物に比べてかなり低く，しかもF1実生集団中にうち特に海外等から導入された品種を榊こ用いて，R物法に単為生殖個体が混在した状態で選抜を行わなければならないな

よる品種識刃1掬よび，その類縁的関係の推定の可能陛についてど，育種法には改良すべき問題があった．そこで我々はF1交雑検討した．

個体を効率よく選抜する手法として，エステラーゼ酵素の多型lI材料及び方法を利用し，酵素多型の異なる両親間であれは選抜効率をあげられることを明らかにした．また38の遺伝資源、についてエステラ

1．供試械料ーゼ酵素の多型を調査したところ，8の異なる酵素多型の存在1986年より収集し，当場の慣行法により野菜部圃場で栽培さが認められた．しかし，最も主要なタイプには全鉢の68％が集れたニラ遺伝資源38品種（第1表〉の葉身を材料とした．各品中して含まれていることがわかり，交雑育種への利用の点から種とも交配母本として選抜保存された代表株から1996年8月〜

は，より精度の高い品種の識別法を確立する必要性力沸鏑され9月にかけて採取した．

た2）．

1990年にwillia皿sら171によって提唱された脚D（Rand㎝
細plifiedPolymr画icDNA）法による遺伝子分析は，現在まで

2．高分子蝋の抽出方法
まず高分子切Mの抽出条件を検討するため，遺伝資源のうちに様々な植物の品種識別4，5・10｝，親子鑑別15，16），Fl純度検定11）な主要な4品種（グリーンベルト：佃，小山在来：OZ，大分在来：どに幅広く利用されている．本方法の優れている点は，それま㏄，きぬみどり：Kin）より採取した葉身約2gを液体窒素を用では育種に長年携わったエキスパートのみに可能であったよう

いて乳鉢で粉砕し，様々な植物で用いられている㎜法1胴を第1表供試品種

漢中広葉A
漢中広葉B
東北小口山形
津南青ニラA
津南青ニラB

耐寒大葉
津引1号（中国）
年花ニラ

岡山在来A
30

2AB2
B F
ABOA
B Fl S
A HH
BZ
F
FG
OnT
OAi
KTSKKKKTKK

品種名グリーンベルト
小山在来大分在来
きぬみどり成都漢中冬ニラA1
漢中冬ニラA2
漢中冬ニラB1漢中冬ニラB2
朝鮮

略号

導入先（導入年度）

品種名

略号
OKB

導入先（導入年度）
岡山市（s61）
台湾（東北種s60）
台湾（東北種s61）

武蔵野種苗（s59）岡山在来B

石橋町（上古山s60）

黄ニラA
黄ニラB

KNA

中国ニラA
中国ニラB

TNA

日本タネ（s60）

TNB
KFS

日本タネ（s60）

KFSA
NK791
TW

日本タネ（s60）

大分市（s63）
栃木農試育成（h4）中国（南京大s61）
日本タネ（s60）
日本タネ（s60）

漢中冬ニラ西安系
漢中冬ニラ西安A

日本タネ（s60）

南京791

日本タネ（s60）
群馬園試（s60）

台湾

日本タネ（s60）
日本タネ（s60）

山形自生（s63）

南京大（s61）南京大（s61）
渡辺採種（s61）

南京大（s61）
台湾（千葉大s61）
岡山市（s61）

KNB

IWZ
岩舟在来
ISZ
石橋在来
Hu呼和浩特食用花ニラ（広巾） SHMS
満州KN
抗州ニラ
KB
キングベルト
MKモウコ
NN
ネギニラ
TR
たいりょう

日本タネ（s60）

南京大（s61）
群馬園試（s60）

岩舟自生（s61）
石橋町（上古山s60）
東北大（内モンゴルs63）

武蔵野種苗（s63）
群馬園試（s60）

中国（抗州市H2）
前川種苗（s62）
福島農試（s61）

栃木農試育成（h5）渡辺採種（s61）

RAPDマーカーによるニラ品種の識別
若干改変した方法により抽出を行った（第1図）．また，多糖類の除去を目的として同4品種の葉身約0．1gをNucleocon

第2表PCR反応溶液組成

成画ytopure（Scotlab社）DM抽出キットにより抽出を行い，㏄脇法との比較を行った．得られた各D甑溶液を吸光度分析（日本

10XPCRbuffer
dMPI虹x（2．5州）
Taq

分光：UvI班℃一660）により定量し（Abs260），さらに皿IPid−2（コスモバイオ社）によりアガロースゲル電気泳動（0．5％／0．5×1BE㎞ffer，100Vconst）を行い，エチジウムブロマイドで染色し，写真撮影して分子量を推定した．また，エチジウムブロマイド染色による輝度から，濃度既知のDNA討料との比較により

容量分

enzy皿e（5unit／μ1）

templateDNA（50〜100㎎／μ1）

primerDNA（7．8μM）

total

終濃度

2．5μ1

1×

2．0μ1

0．2副

2．0μ1

1u

1．0μ1

50〜100㎎

1．6μ1

0．5

25．0μ1

volu皿e葉身組織（2g）

占r液体窒素収量を推定した．

3．遺伝子増幅（PCR）条1牛Taq55。C、40min，40rpmで混和

polymeraseぱ宝酒造，プライマーはニッポンジーン12mer（M，2，3，4シリーズ48種）および，オペロン1伽r（OPAシリ

室温、20minーズ20種）の68種類を単独で使用し，反応溶液を最終容量252800rpmμ1となるように調製した（第2表）。1孤装置はPDC−100−96V＋hotbometαロResearch社）を使用し，，8連チューブでP㎝反応を行い（第2図），珊pid−2によりアガロースゲル電気泳

x20minsup動（1．5％／0．5XTBE㎞ffer／100Vconst）を行い，エチジウム

室温、10minブロマイドで染色後写真撮影して増幅多型を検出した．試験は2800rpm

すべて2反復で行い，結果が異なった場合は再度行い再現性をx30min確認した．

suplrCTABppt（等量創4．品極哉別および統計解析

供試全品種のDNAを調製し，主要品種間で明確な増幅バンドの認められたプライマー34種（ニッポンジーン：キ
07，08，09，11，21，23，24，25，27，28，29，30，31，32，41，42，43，44，妬，ppt↓二TEN（2ml）

550C、20min

娼，51，52，61，62，63，65，670P㎜N：OPA刈2，05，06，α1，10，12，14）を単独で用いてPCRを行った．このときのDNAの抽出方法は㏄B法で行い，pmの条1嘱よ先に検討を行った方法に従った・反応

isopropylalchol（2ml）ppt

液はフォーラックサブマリン泳動漕（日本エイドー社畑一1㎝8）

70％EtOHによりアガロース電気泳動（1．5％アガロース／0．5X

100％EtOH

TBE／150V

幅多型を検出した．各増幅バンドは分子量ごとにRAPDマーカー

TE（500μ1）

RRNase処理として同定し，マーカーの存在，非存在をそれぞれ1，0と表（10mg／mlを3μ1，37。C，30min）（10し，解析ソフトsystntver5．1．2formaρintosh（appleco，LTD）

った．

nei帥bormethod

Oこよりクラスター分析を行

2

室温で風乾（4〜6hrs）室const）を行い，エチジウムブロマイドで染色後写真撮影して増を用いてnearestxtDNA

出

第1図ニラ葉身からの高分子DNA抽出方法

31

栃木県農業試験場研究報告第46号

950C3min

↓（kb）

930C

lmin

↓

400C

lmin

40cycle
23．1

↓

720C

9．42min↓

720C

6．65min

第2図PCR反応条件
第3図CTAB法により抽出したニラ全DNA
M：λ一Hlnd 1
1：GB 2：：OZ 3：0T

1結果

4＝Kin

㏄紹法によって得られたD甑の分子量は約40kb以上と推定され，収量も各品種とも葉身1gあたり約200μg程度であった

M（第3表，第3図）．…回のpmに必要な鋳型D甑量は0．5μ1234（kbgなので，400回以上の供試量力碍られたことになる．また，ニラは多糖類の含量が高くpmに影響する可能陛があったため，抽出の過程でsilica−borate担体により多糖類の除去を行える

23．

Nucleoconphytopurekitlこよる抽出を行ったところ，㏄脇法﹁ノ6た，㎜法から得られたDMに比べて高分子領域のスメアな産46と同様な分子量のDMを抽出することができた（第4図）．ま9．4

物が少ないという特徴があった．また，この市販kitは操作に要する時間が㏄畑法に比べて1／3程度で済むことがわかったが，反面高価なため多量のサンプルを扱うには適さないと考えられた．

この2つの方法によって抽出したDNAを鋳型とし，68種類のプライマーを用いて㎜を行ったところ，48種類のプライマー

第4図nucleoconkitにより抽出したニラ全DNA
M＝λ一EcoRl＋λ一Hindにおいて増幅バンドが檎出された．懸念されていた糖の混入に

1＝GB2：0Z

310T

I

4＝Kin

よる多型像の差は認められなかったため，㏄B法によるD甑抽出の有用性が確認された．増幅バンドが検出されなかったプライマーの内訳は，増幅がほとんど認められなかったものが14種（ル21，23，26，27，28，47，49，50，64，66，69，70，71，72），非特異的な増幅が多くバンドが不鮮明なプライマーが4種（Ar68，0Pル
05，09，13），主要品種間で多型の認められなかったプライマーが2種（ArO1，0PM5）であった．このうち増幅が認められなかったプライマーグルーフは，A−50以外は㏄含量が42％以下のグ

32

第3表CTAB法により抽出したニラtDNAの収量および分子サイズ
品種名葉身重（9）収量（μ9）μ9／9サイズ（kb：GB

1．839021742＜OZ

2．772726942＜OT

2．653520638＜Kin

2．046723442＜RAPDマーカーによるニラ品種の識別

IV考察
第4表品種識別に用いたプライマーと検出されたRAPDマーカー数
pri皿ersize

Resource

No．

（皿er）

A−0712A−08〃

A−29／ノA−30
A−31
A−42〃〃〃RAPD数

サイズ（b）ったことがその最大の理由であろうと、思われる．この点に関し

640−740〃

8520−1780て，脚Dマーカーは無選抜な形質を比較することと同義であり，／ノ

7700・一1400

全く類縁関係のわかっていない集団を客観的に把握するには最〃〃〃9350−1380
9430−1200も有効な手段である．また遺伝的類縁関係を論じる場合に問題

450−1550

11350−1980

A−44

〃

A−46
A−48
A−51
A−52
A−61
A略2A−65

〃
〃〃〃
〃〃
〃

A−67

〃

14480−1800

100peron9430−1580〃

1］L

OPA−10

ノノ

10

ノノ

OPA−07

6！ノ！ノが無かったのは，交配によって遺伝的変異の拡大をしてこなか

3nippongene

A−43

OPA−02

これまでにニラについて遺伝的な背景について言及した報告

370−11309410−1080〃〃〃〃

16400−175013810−16001（1275−1050

9590−17509510−2250
6〃12450−1350

なのがニラ品種の固定度についてであるが，ほとんどの品種が未固定であろうと考えられる．実際にいくつかのF1集団を脚Dマーカーでスクリーニングしたところ，分離するマーカーの存在を確認している（未発表）．しかしこれは交配したごく…部の個体についてであり，ほとんどの後代実生は高度な単為生殖によって同一の遺伝子型が保存されていくので，固定種としての扱い力河能である．またDNAマーカーは表現型とは異なり，たとえ分離しても後代へは必ず伝わる（消失するものも当然あ520−1750430−1800

る）ものなので，交配親株が保存される限り普遍的な意味を持つものである．以上のような理由で，今回の一連の結果は鯉Dによりニラ種内にも遺伝的多様陛力椿在ループであり，適切なアニーリング温度は供言規牛の400Cよりしていることを明らかにした最初の報告であり，今後育種を進も低いものであった．反対に非特異的なバンドが多く増幅しためるうえで大きな意義を持つものであると考える．

グルーフはアニーリング温度が高いグループであった．

本言鵡飾府った鯉D分析とクラスター分析から得られた品種

これらの予備試験の結果から，判引に良好な脚Dを検出した間の遺伝的距離を表す系統図により，先に報告したエステラー

34種のプライマー（試験方法参照）を用いて，ニラ38品種（うゼ酵素多型分析の結果，最もメジャーな型に属する品種のほとち1品種はネギとニラの種間雑種）に対するPα｛を行ったとこ

んどは（第6図中のグレーの網掛け）同一のグループを形成しろ，22種のプライマーにおいて236個の甜凹マーカーを確認すており，中で2つのクラスターを形成していることが明らかとることができた．この段階では1つのプライマーから得られたなった．このことは，本手法による品種類縁関係の推定の正当マーカーは平均すると約10本であったが，不魚糊なものも含ま性を示唆するものである．また，このグループには栽培品種でれていた．また，プライマーによって品種間で大きく異なるマあるグリーンベルトやその系統であるキングベルトが含まれてーカーカ鴇られたものもあれば，ほとんど差の認められなかっおり，現在の日本における主力品種もこのグループに多く含またプライマーもあった（第5図a，b）．尾崎ら131はRAPD法にれてくるものと推察された．これらとは異なる位置に属する台よるウメの親子鑑別の報告において，再現注の高いRAPDマーカ

湾と漢中冬ニラ西安については，エステラーゼ分析に供試した

ー分子量としては0．3〜2．2kbpの範囲にあるものを利用するこ株と今回遺伝資源母本として保存した株の遺伝子型が異なってとが望ましいと指摘している．そこで，得られたマーカーのういた可能性もある．大分在来と小山在来はRAPDマーカーではほちこの範囲内にあるものを検索したところ，プライマーとして19とんど多型が認められず，極めて類似したあるいは同」のもの種，mPDマーカーとして181個が選抜されたので（第4表），であることが示唆された．この2品種は草型も極めて類似してこの結果からクラスター分析を行い系統図の作製を試みた．こおり，株元のアントシアニン色素の出方に若二Fの違いがある程の結果，遺伝資源は多様性に富んでおり，小山在来と大分在来度しか区別性は無かった．この品種の最大の特徴は自然状態でを除けばR畑Dマーカーを組み合わせることでほとんどの品種では抽だいしない点であり，このため現地でも株分けによって維識別力河能であると考えられた（第6図）．

持されていたものである．地理的な距離を考えるとどうして大33

栃木県農業試験場研究報告第46号
（bp）

（bp）

レーン

MφX174−Hae

1353＿
1078＿

1 GB
2 0Z
3 0T
4 Kin
5 ST
6 KFA
78 KFB2TS1353＼
1078＿8721
603／310／281／872／6031
310／281／910KHB
MKll TKO
12 TAA
13 TAB

14TO

15

TB1

16

HN

171819202122230KA
KNB
TNB
TNAKFSKHAKNA

24NK79璽

b．A−43プライマーによるRAPDa．A−41プライマーによるRAPD

第5図RAPDマーカーによるニラの品種間差異

1．O

遺伝的距離
轍灘

辮麟灘灘欝 韓灘灘灘繊覇㎜Dマーカーから推定されたニラ遺伝資源の遺伝的距離

DISTANCE METRIC IS1−PEARSON CORRELATION COEFF【CIENTSINGLE LINKAGE METHOD（NEAREST NEIGHBOUR）
SAMPLE＝37，RAPD

marker＝181（19phmers）の品種は同一のエステラーゼ酵素多型を持つグループ
34縫

津南青ニラB
津南青ニラA

灘雛灘麟

繋繋難義鐘

灘羅葬麟羅灘馨鐵灘

第6図

漢中冬ニラB2

轍雛灘

中国ニラB
蒙古

朝鮮
灘難鐵灘
漢中広葉B
漢中冬ニラA101RAPDマーカーによるニラ品種の識別
分市と小山市なのかはわからないが，人為的に導入されたことClassificationof

he曲ceous

Peony

cultiva齢byrandoma皿は間違いないであろう．これについては国内で不抽だい性の在Plifie（ipo1脚帥icD甑（脚D）analysis：J．斑州．Soc．Hort．

来種をさらに収集することで，導入の経路を明らかにすること

Sci．，65（4）：843−849ができる可能性があるものと思われる．また，たいりょうや成6．木村栄（1995）「きぬみどり」：野菜園芸技i術，22（7）：39

都，漢中冬ニラA1などがむぬg㎜囲種としては遺伝的に離れた

7．Kojima，AandNagato，YandHinata，K（1991）Degreeof姻

品種であることがわかった．きぬみどりについては，蒙古×た皿ixisinchinesechive（沼11i囲む伽㎜）estimatα1byes

いりょうという交配で育成された経過が麦）ることからたいりょ

teraseiso聯analysis：Japan．J．Breed．，41＝73−83

うに近い品種として位置づけられた．小島ら（1994）9｝は一連の単

8．Kojim，AandNagato，Y（1992）Pseu6㎏amus㎝bryogenesis

為生殖に関する報告の中で，滋11i囲．漉m3㎜と㎜㎜力溶

andthe易に交雑を起こすことを指摘している．この2つの種について

exualPlant

は現在のところ開花期間や花被の長さで区別をしているに過ぎdegree

島私信）と考えられており，今後㎜㎜種についての試験をative

たような一定の傾向は今回の遺伝資源材料の間1こは認められな今後は以上の結果をふまえ，RAPDマーカーを利用したF1個体の早期選抜法の確立を行い，両親力沫固定である場合に有効な㎞1k法を用いて育種上有用な形質に連鎖したDNAマーカーの検plants（iet㏄ted

inChinesechive，af㏄ult

ap㎝ict：Breedi㎎Science．44：143−149

10．木村鉄也，小曽納雅則，伴義之（1997）品種識別に有効なプ

ライマーの選抜：育雑47（別1）：131
11．Matsuura，S．，Saito，A

rapid

かった．

in、411i吻オ吻㎜㎜S9．Koji㎜，へ，Kozono，T．，Nagato，YandHinata，K．（1994）Non−parthenogenetic

えられる．その他に導入先や抽だい期，草丈等の特性と関連しparthenogenesis

Reprod血ction．，5：78−85

ないが，雑種が遺伝資源の中に混入している可能性は高い（小行うことで，更に詳細な遺伝的関係を明らかにできるものと考ofchecki㎎of

and

seed

Fujita，Y（1994）An

purity畑RFLP

aP【）roachanalysis

offor

nucl

earD甑inF1肋ridofCuc曲r（伽皿fs誠f㎜L．）：J．
理州．蹴．Hort．翫i．，63（2）：379−383
12．Murray，M．G．an（iTh（澗【）son，W．F（1980）Rapi（iisolationofhi帥mo1㏄ularwei帥tplantD甑：：Nuc．AcidRes．，8（19）：43

索を行う予定である．

21−4325

V謝辞

13．

本報告をまとめるにあたり，農材添産省野菜茶業試験場ユリ

Ozaki，T．，Shimada，T．，Nakanishi，T．，Yamamoto，JandYoshida，M．（1995）鯉D｛malysisforparentagedeteminationin

科作物膚種研究室小島昭夫室長より貴重な助言を頂いた．また，Pr㎜us㎜eSieb．etZucc：」．狸州．㎞．Hort．Sci．，64（2）：

栃木農試野菜部科寸部長，丹羽技師，普及教育課室井専技より

235−242

ニラ遺伝資源材料及び特陛調査結果等の協力を頂いた．ここに

14．島本功，佐々木卓治（1995）植物の㎜実験プロトコール：

秀潤社

記して厚く感謝の意を表するものである．

15．丁紬iro，Y．，Oy㎝a，T．，lw㎝to，Y．，NωaandMiyazaki，S（1VI引用文献

995）ldentificationofmate㎜1an（1parentαlplantsofA

1．天谷正行・大橋一夫・木村栄・ノ』栗尚iF・小島昭夫（1995）

ネギとニラの種間雑種植物の育成．栃木農研報（43）：87−94

2．天谷正行（1996）エステラーゼ酵素多型を利用したニラ交雑個体の選抜：栃木農研報，44号：（inと栽培

ArakibyRFLP

analysisofchloroPIast

DNA：J．」畑畑．恥c．Hort．Sci．，63（4）：819−824

16．寺本さゆり，村上（嘉納）ゆり子，保里昌彦，神山清文（1び親子鑑定：園学雑63巻（1）：17−21
17．Williams，J．G．K．，A．R．KUbelik，K，J．Livak，」．A．Rafalskiの基本：施設園芸，39（5）：64−68

4．藤本卓矢，山岸博（1996）鯉D分析による

wakegi994）D甑フィンガープリント法によるニホンナシの品種およprillti㎎）

3．天谷正行（1997）ネギニラ「なかみどり」の品種特性

llium

スグキデのカブ品種との類縁関係の解析：園学雑65巻（3）：609−614
5．Hosoki，T．，Nagおato，T．，Ki㎜m，DandNish㎞oto，K（1997）

dS．V．Ti㎎ey（1990）D甑polymΦhisms

yprimers

areusefhl

asgenetic

a珊plifiedby

anaゴbitarmarkers：Nuc．Aci（1Res．，18（22）：6531−653535