角層コルネオデスモゾーム分解過程の免疫電顕的解析

旭川医科大学医学部皮膚科

山 本明 美The epidermal stratum corneum provides a critical permeability barrier between the body and the environment. Ourskin establishes a basket-weave like appearance in the cornified layers. The cells there are attached only at the cell peripheryby corneodesmosomes which are modified desmosomes. These corneodesmosomes spare wide spaces at the central (nonperipheral) area for the lipid layers to form a continuous permeability barrier. To establish this structure while maintaining
steady state thickness of the stratum corneum, degradation process of corneodesmosomes must be under strict control.
Uncontrolled activation of proteases involved in this process could lead to severe skin phenotypes such as those seen inNetherton syndrome, a severe autosomal recessive disease caused by gene mutations in SPINK5 which encodes a proteaseinhibitor LEKTI. Our understanding of the mechanisms which control the degradation of corneodesmosomes is limited.
For example, it is unknown why corneodesmosomes persist only at the cell periphery in fully developed corneocytes. To
explore this, we analyzed the precise distribution of two major components of the extracellular part of corneodesmosomes,
corneodesmosin (CDSN), and desmoglein 1 (DSG1) in normal adult human epidermis. Distributions of corneodesmosomal
components were analyzed using montage pictures of post-embedding immunoelectron microscopy performed on the backskin samples. The upper and lower cell surface of corneocytes from the first to the fifth layers were divided into the central
half and the peripheral half, and colloidal gold particles associated with corneodesmosomes were counted and distribution
densities per membrane length were calculated. Marked decrease in label densities was noted on the central areas of theupper cell surface from the second deepest layer for CDSN and DSG1. Central labeling was virtually lost by the fifth layer,
whereas peripheral labeling densities were relatively high up to the fifth layer. The present study clearly demonstrated
that the degradation of two major corneodesmosomal components, CDNS, and DSG1 is initiated from the central areasof corneocytes soon after the cells move into the cornified layer. This suggests that the molecular basis for the selective
degradation resides in the deepest layer of the stratum corneum.

１．緒

特徴がある。また、微細構造的には細胞内部分ではケラチ言ン線維が付着するアタッチメントプラークが消失し、細胞皮膚の最表層である表皮角層は生体と環境の間の物理的全周に形成される辺縁帯と一体化している。さらに細胞外１）なバリアを形成する 。角層の構造を従来は Elias が提唱

部分は dense midline 構造が失われ、全体的に電子密度のしたレンガとモルタルのモデルによって説明されてきた 。

高い板状の形態を示す。分布様式では、角層下層では細ここでは角層細胞はレンガに、モルタルは細胞間脂質に相胞全周に分布しているが、上層のよく分化した正常の角層当する。つまりかつては、このモルタルにたとえられた細細胞では辺縁部分にしか認められない。このことが顕著に胞間脂質が細胞間の接着をつかさどっているとされていた現れているのが、ホルマリン固定パラフィン包埋標本で観のである。しかし最近では細胞同士の接着は主にコルネ察される角層の網状構造である。すなわちアルコール脱水、

２）

オデスモゾームによっていることが分かってきており

３，４）、キシレン透徹処理中に細胞間に充填されていた脂質は抜け細胞間接着における脂質が占める作用はあったとしてもわてしまうが、辺縁の接着構造であるコルネオデスモゾームずかなものであろうとされている。

は残るため、角層の全体構造が網の目状を呈するのである。

このコルネオデスモゾームとは角化細胞が顆粒細胞から逆に言うと、この辺縁の接着部位に囲まれた中央部分を水角層細胞になるときにデスモゾームが構造変化したもので分バリアをつかさどる層状の細胞間脂質が埋めていることある。その構成成分は顆粒細胞のデスモゾーム構成要素にになる

５，６）

。

加えて、細胞内の層板顆粒から提供されるコルネオデスモ

さて、角層の厚さを一定に保ちながらこの構造をとるたシン（CDSN）が新たに細胞外部分に加わっているというめには、コルネオデスモゾームの分解過程が精密に制御されている必要がある。その制御機構の重要性は、この分解過程が遅延すると老化した皮膚や冬期の乾燥肌にみられる

Immunoelectron microscopic analysisof stratum corneum corneodesmosomal
degradation process
Akemi Ishida-Yamamoto
Department of Dermatology, Asahikawa
Medical College７）ような角層の肥厚をきたし 、逆に異常に亢進すると重篤な魚鱗癬を生じる Netherton 症候群（常染色体劣性遺伝性疾患で、カリクレインなどの角層剥離に働く酵素を阻害する LEKTI をコードする遺伝子 SPINK5 の変異によって生８）じる）をきたすことからも明らかである 。しかしこの制− 45 −

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

御機構の詳細はまだ不明な点が多い。例えばなぜ分化したールとしては 1 次抗体を除いて反応させたものを用いた。

角層細胞では辺縁にのみコルネオデスモゾームが残っているのかその理由は全く知られていない。本研究ではコルネ

2 - 3．画像処理、計測

オデスモゾーム分解過程を明らかにするために、その主た９－13）

免疫電顕写真は倍率 20,000 倍で撮影し、取り込んだ画像る細胞外成分である CDSN とデスモグレイン１（DSG1）を Adobe Photoshop ver. 6.0（Adobe Systems, San Jose,の局在について、免疫電顕法を用いて角層の最深部５層にCA）を用いてモンタージュ写真を合成した。角層細胞のついて検討した。

最深部の１層目から５層目までの細胞のうち、切片上の細２．実胞の幅を Image-Pro Plus ver. 4.0 imaging software（Media験Cybernetics, Silver Spring, MD）によって計測し、10 mm

2 - 1．材料

以上の細胞を解析対象とした。それぞれの細胞の表面を上正 常 ヒ ト 背 部 の 皮 膚 を ２ ％ paraformaldehyde/PBS下にわけ、それぞれの外周の長さを同ソフトを用いて測定

pH 7.4 にて４℃で１時間固定したのち、凍結固定、凍結し、これを中央２分の１と辺縁２分の１にわけて、各領域置 換 し、Lowicryl HM20 樹 脂（Chemische Werke Lowi,

におけるコルネオデスモゾーム上の免疫標識の密度を計測

Waldkraiburg, Germany）に包埋したものを皮膚の垂直方した（図１、２）。各層あたり、６ないし７個の細胞を解析

向に薄切し、包埋後法の免疫電顕用の標本としたした。

14, 15）。すなわち手術材料から得られた皮膚を細切し、氷温の 15％

3．

glycerol/PBS に 1 時間漬けた後、Reichert KF80 凍結固定

結果装置（Leica, Wien, Austria）を用いて―190℃の液体プロパ

角層内のコルネオデスモゾーム上には CDSN、DSG1 とンで固定した。その後、Reichert AFS automatic freeze-もにその標識が認められた（図１）。陰性コントロールでsubstitution system（Leica）を用いて― 60℃のメタノールは標識は認められなかった。角層の深部第 1 層目から 5 層により凍結置換した。Lowicryl 樹脂への置換と紫外線に目までを対象とし、細胞表面を上面、下面に分け、それぞよる重合は製品説明書に従って行った。樹脂に埋め込まれれを中央と辺縁に２分割し、コルネオデスモゾーム上のた皮膚からウルトラミクロトームによって皮膚面に対してCDSN、DSG1 の標識の細胞表面の長さあたりの密度を計垂直方向になるように超薄切片を作成し、Formbar（LADD測した。その結果、両者とも２層目の上面中央部分から顕Research Industries, Williston, VT）の支持膜を張ったニ著に減少しはじめ、5 層目までには殆ど消失することが分ッケルグリッドメッシュにマウントした。

かった（図２、３）。辺縁では両者とも密度の減少はゆるやかであった。

2 - 2．免疫染色4．考

上記の超薄切片を１％ bovine serum albumin（BSA），

察

５％ normal goat serum（NGS），0.1％ fish gelatin/PBS

コルネオデスモソームの分解過程は辺縁部分と中央部分で室温にて 15 分間、前反応させた。その後１％ BSA, １で明らかに異なることが分かり、その複雑な制御機構が示％ NGS, 0.1％ fish gelatin/PBS 中で希釈した次の 1 次抗体

唆された。今回解析した二つのコルネオデスモゾーム成分と４℃で一晩反応させた。免疫電顕に用いた 1 次抗体はの分布密度は、ともに角層 2 層目の上面中央から急速に減CDSN の中央部分に対するウサギポリクローナル抗体

少していき、辺縁では密度の減少はゆるやかであった。

12）（250 倍希釈）および、DSG1 の細胞外ドメインに対するマ

角層細胞間の脂質層による水分バリア機能が適切に発ウスモノクローナル抗体（Dsg-1-P23, Progen Biotechnik

揮されるためには、脂質層が広がるべき部分においてコGmbH, Heidelberg, Germany）（製品原液を薄めず使用）ルネオデスモゾームがタイミングよく消失している必要である。反応後、同希釈液で室温にて５分２回洗浄、１がある。同時に角層の構造も保たれていなくてはならな％ BSA, １ ％ NGS, 0.1 ％ fish gelatin/Tris-HCl buffered

い。コルネオデスモゾームの成分を分解する酵素としてはsaline（pH 8 . 2）にて室温にて５分２回洗浄した。その後、カリクレインファミリーに属する KLK5（stratum corneum

後者にて希釈した次の２次抗体と 37℃、１時間反応させtryptic enzyme）や KLK7（stratum corneum chymotryptic

た。２次抗体は 5-nm gold-conjugated goat anti-rabbit IgGenzyme）などが知られている 。この働きを調節する因（Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK），および子としては、これら剥離酵素の LEKTI をはじめとするイ

5-nm gold-conjugated goat anti-mouse IgG（Amershamンヒビター、相対湿度、硫酸コレステロール、遊離脂肪酸、Bioscience）を 10 倍希釈で使用した。その後、希釈液で５pH、Ca 濃度、酸化などがある分２回洗浄、脱イオン水で５分３回洗浄した。酢酸ウラン

主要なコルネオデスモゾーム成分である CDNS と DSG1 がにて電子染色を施して電子顕微鏡観察した。陰性コントロ角層の２層目という非常に早い段階で細胞表面の中央部分

13）2+− 46 −9, 16–22）。本研究では二つの角層コルネオデスモゾーム分解過程の免疫電顕的解析

図１ CDSN 免疫電顕写真のモンタージュ画像。左上の四角で囲った部位を右下に拡大して示す。コルネオデスモゾームに一致した標識が見られる。

図２ CDSN 分布密度。角層の 1 から 5 層目（C1 から C5）の細胞表面をそれぞれ上の図で示す 4 部分にわけ、CDSNの標識密度を測定した。CDSN の標識は２層目の細胞上面中央部分から減少している。（平均値 ±SEM）

図３ DSG1 分布密度。角層の 1 から 5 層目（C1 から C5）の細胞表面をそれぞれ上の図で示す 4 部分にわけ、DSG1 の標識密度を測定した。DSG1 の標識は２層目の上面中央部分から減少しはじめる。
（平均値 ±SEM）から急速に消失していくことが明らかとなった。このこと胞外成分である CDSN と DSG1 の局在を解析した。CDSN、は角層の深部に、異なるコルネオデスモゾーム構成成分にDSG1 の標識はともに２層目の上面中央部分から減少しは共通する、局在部位に依存性の分解規定因子が内在するこじめた。辺縁では両者とも密度の減少はゆるやかであった。とをうかがわせるものである。

コルネオデスモソーム成分の分解過程が辺縁部分と中央部今回の解析では電顕標本上の断面が幅 10 mm 以上の細胞を対象としたが、免疫電顕標本の角層細胞の最大径は 30分で異なることが分かり、部位特異的な分解制御機構が角層深部に内在することが示唆された。

mm 程度であったので、今後はさらに対象を切片の断面幅20 mm 以上の細胞にしぼって、より細胞の中央断面の状態（参考文献）を明らかにしていく予定である。

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