新しい DDS 剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発
東京理科大学生命科学研究所

片岡一

則Supramolecular structures, such as lipoproteins and viruses, occur in vivo as natu­
ral carner systems. In mimicking such vehicles, we have been studying micelle-form­
ing polymeric drugs as a novel type of drug carrier. Polymeric micelles based on ABblock copolymers of polyethylene oxide ( PEO ) and poly-b-benzyl-L-aspartate(PBLA) were prepared. Such polymeric micelles are expected to physically incorpo­
rate drugs. AB block copolymers were synthesized using amino-terminated PEO to ini­
tiate the polymerizaいon of /3一 benzyI-L-aspartate-N-carboxyanhydride ( BLA­NCA) . The composition and molecular weights of the block copolymers were estab­lished by 1 H-NMR. Micellar solutions of PEO-PBLA block copolymer were character­ized by dynamic light scattering. Fluorescence probe techniques were used to study thepolymeric micelles. From changes in the fluorescent intensity and shifts in the excita­tion spectrum of pyrene upon micellization, critical micelle concentrations (CMC) ofPEO-PBLA block copolymers were obtained. The vibrational structure of monomer
pyrene fluorescence was altered in PEO-PBLA micellar solutions consistent with low
polarity within the PBLA core. In PEO-PBLA micellar solutions, 1,3- (1,1'­dipyrenyl)-propane intramolecular eximer emission, relative to monomer emission
was very small ; this indicated very low mobility of PBLA segments within the micellar
core. Further evidence for the limited motion of PBLA segments in the micellar core wasobtained by'H NMR. This limited motion of the PBLA segments in the micellar core isin contrast to low molecular weight surfactants which commonly show a higher degreeof motion within their cores. The ability of PEO-PBLA micelles to solubilize hydropho­
bic molecules was studies by UV and fluorescence spectroscopy using pyrene. Enhanced
solubility of pyrene was determined with increasing concentrations of PEO-PBLA.
Then, potential of entrapping Adriamycin ( ADR) within micelles based on PEO­PBLA block copolymers was investigated. The loading process involved bringing ADR
and PEO-PBLA into an aqueous milieu from N,N-dimethylformamide (DMF )through a simple dialysis procedure. Evidence for the physical entrapment of ADR with­in the micelles was derived from fluorescence spectroscopy, where considerable quench­
ing of fluorescence was observed for ADR associated with the micelles. In addition,quenching experiments, using a water-soluble quencher (iodide (「））, showed that―the fluorescence of ADR, present in micellar solutions, was largely uneffected by I ,whereas the fluorescence of free ADR was readily quenched. As a result of the entrap­
ment of ADR within the polymeric micelles, the drug slightly binds serum albumin as
evidenced by gel permeation chromatography (GPC). In contrast, free ADR readilybinds serum albumin in aqueous solutions. The finding suggests that ADR is stably en­
trapped within PEO-PBLA micelles. The ADR imbued within the micelles is expected
to display markedly dissimilar pharmacokinetics relative to free ADR.

Design of Polymeric Micelles for Novel Carn 一ers in Drug Delivery Systems
Kazunori Kataoka

1. 緒言

近年、経皮あるいは経粘膜的に、 薬物等の生理Research Institure forBiosciences
Science University of Tokyo

活性物質を体内に制御されたモ ー ドで供給する薬物送達システム(DDS)の研究が国内外で大きな注目を集めている-10-I)。 このようなシステムは、

新しい DDS 剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発

体内で作用する薬物のみならず、皮膚角質層などの体表部位に作用する生理活性物質や香料成分の制御放出の実現を通じてコスメトロジ 一 分野においても大きな貢献をなすことが期待される。 薬物等を制御されたモ ー ドで供給するためには、薬物を安定に保持し、また、必要に応じて制御放出される機能を有する担体システムの設計が重要な課

micelle formation

題である。 本研究では、親水性連鎖と疎水性連鎖

ゎ紐、紐とからなるプロック共重合体が、水溶液中で疎水N\J咋わ性連鎖を内核、親水性連鎖を外殻とする安定な多chemically bound drug

分子会合体（高分子ミセル）を形成することに着F ig.1

目し、その内核を薬物のミクロ ・ リザ ー バ ー としDrug loading of polymeric miceIlesて利用する新規薬物担体システムの構築を行った。

2. 実 験

このような高分子ミセルには、 〔1〕難溶性物質の包接化による溶解性向上、 〔2〕凍結乾燥状態あるいは溶液状態での優れた安定性、 〔3〕内核PEO-PBLAプロックコポリマ ー はFig.2にからの薬物制御放出、 〔4〕外殻表面への生体組示すように、 B ー ベンジル ー L ー アスパルテ ー トー

織親和性分子あるい は剌激応答分子（インテリN ー カルボン酸無水物(BLA-BCA)を片末端ジェント化）の連結、等の様々な利点が期待され、に一級アミノ基を有するポリエチレンオキサイド

DDS用の新剤型 として高い 有用性が見込ま れを開始剤として、重合 することによって合成しる2- 4) 0

た 5) 。 この際、PEOとPELAの分子量を種々変本研究の目的を達成せしめるためのプロック共えたプロックコポリマ ー を合成した。 これを水溶

f�0J

液中に溶解し、PEO-PBLAミセルを得た。

重合体としては、 〔 1 〕ミセルの外殻を形成する親水性のセグメントとミセルの内核としてミクロ環境を形成するセグメントの 2 種類の役割分担の明確なセグメントを有すること、 〔 2〕薬物等をrn『心十導入可能な官能基を有すること、 〔3〕良好な生匹.J(,―.

.ll.LtJdK:i1.f.EfU.JJ.L;1

体適合性を有すること、という3つ の特色を備え
Fig.2

たポリエチレンオキシド／ポリアミノ酸プロック共重合体に着目した。 第1年度においては疎水性『心rn

Synthesis of micelle- forming AB block
copolymers based on PEO and poly(amino acids)

プロックとしてポリ(/3 ー ベンジル ー L ー アスパ
PEO-PBLAミセルの特性解析については、

ルテ ー ト）(PBLA)を選び、種々連鎖長を変えたPEO-PBLAプロックコポリマ

ーを合成し、蛍光プロ ー プ法により行い、蛍光プロ ー プとしてそのミセル形成能と疎水性モデル薬物（ビレン）ビレン(Py)を使用したの取り込み能(Fig.I参照）を評価した。 また、

クコポリマ

第 2年度においては、実際の薬物として疎水性制ー6)。 水溶液中のプロッの濃度変化に伴うPyモノマ ー の光強度変化、および励起スペクトルシフトより、分ガン剤アドリアマイシン(ADR)の導入を行い、

子 量 の異なる各PEO-PBLAプロックコポリ

高分子ミセル型ドラッグとしての有用性について

マ ー につきCMC を測定した。 その際、Pyモノ検討した。

マ ー の蛍光スペクトルの第 ービー ク、第三ピ ー ク-11-比CI /III)より、ミセル内のミクロ極性を調べ

次に、ピレンの蛍光挙動からこれらブロック共た。また、ミセル内核 PBLAセグメントの運動重合体ミセルの臨界ミセル濃度(CMC)を評価

性について、蛍光プロ ー ブとして1、3 ー ビス(1した。異なる濃度のプロック共重合体共存下におービレニル）プロパンCP3CP )を使用して検討けるピレンの蛍光スペクトルならびに励起スペクした。すなわち、 P3CP のエキサイマ ービー

トルをそれぞれFig.3 とFig.4に示す。ブロックク、

モノマ ー ビー ク強度比Cle/Im)より、 PEO­

Em= 390 nm

PBLAミセルのミセル内核のミクロ粘性を解析し、 ミセル内 PBLAセグメントの運動性を評価

PEO-PilLA (mg/ml)
1.
0.5
2.

3.

した。さらに、 PEO-PBLAミセルヘの疎水性
マ ー 形成、および Pyモノマ ー の蛍光スペクトルのI/皿比変化の導入量依存より導入を確認し、種々の導入法について検討を行った。
ミセル中へのADR導入は以下のように行った。
ADR塩酸塩を DMF下に少量のトリエチルアミンを入れて溶解し、さらにそこに PEO-PBLA

4. 10
5. 50
6. 1007. 5008. 1000(snun ,i.1u.1l!
q.1u)AJ!
SUaJU!

プロ ー プの可溶化については、 PyのエキサイI5

プロックコポリマ ー を溶かした。一晩暗所で撹拌の後、溶液をO.lM酢酸バッファ ー (pH5.5)に対して透析し、引き続いて蒸留水で透析を行い、ミセルを得た。 ミセル中に捕捉されたADRの量は485nmの吸光度より算定した。

3. 結果と考察

300
Fig.3

340
320
wavelength (nm)360

Excitation spectra of pyrene in PEO­PBLA aqueous solutions.
Sample is 5-10. The Concentration ofpyrene is 6.0xe-1 M.

共重合体の濃度上昇に伴って赤色シフトが認めら
3. 1

ブロック共重合体ミセルの調製とモデル薬れる。特に、ピレンの(O、 0)バンドに由来す物（ピレン）の導入る334nmのビー クがミセルに取り込まれること

PEO-PBLAブロックコポリマ ー は、 PEOとによって339nmにシフトしていることがわかる。

PBLA鎖の分子量を種々変えたものについて合この励起スペクトルにおける334nmとのビー ク成を行った。 PBLA中のBLAユニット数が20比からCMCを見積ることが可能である ” 。また、以下で PEOセグメントの分子量が5000以上の試

ビレンの蛍光強度は周囲の極性に依存するため、料は水溶性を示した。また、いずれの試料も水溶蛍光強度変化からもCMCを決定することができ液中でミセルを形成することが動的光散乱測定よる 8) 。Fig.5 には、蛍光強度及び339nmと334り明らかとなった。平均粒径は約20nm程度であnmの強度変化比をブロック共重合体濃度に対しる。重量平均分布より少量の二次凝集体と考えらてプロットした結果を示す。図より、約5-lOmg/れる粒子が平均粒径100nm程度に観察された。

1の範囲で蛍光強度あるいはビー ク強度比が急激

一方、5-10について静的光散乱よりミセル分子に変化しており、CMCがこの濃度領域にあるこ6

量を算定すると、2. 8 X 10 と求められた。これより、会合数はおよそ400となる。但し、この値とが明らかである。
また、ビレンの蛍光スペクトルにおいて、その振動微細構造はピレンの置かれている局所極性にには、二次凝集体の寄与も含まれている。

-12-

新しい DDS 剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発

1.9

PEO-PBLA (mg/ml)
1.
0.5

●口S

10so

6. 1007. 5008. 1000

1.5
1.
4_- - --

園じ�
；

6．
1

(S}!U n iC.1e .1}!q .
rn ) A l!SU ;}lU !

5.

IIIII

3.

4.

171．

2.

1.8・。▲Ex== 339 nm..

'�4Fig.6.

� ..
'-]-3-2log (coucentration).

�!!四l
Ire出lllC
lolrrcnc
hcnzyl alcohol
chloruforn,
ethyl acetate
dioxnnc
water

皿
0.58
I.OS
1.24
1.25
1.37
I.SO
1.87

'0I/ill vibrational band ratio of pyrene as afunction of logarithm PEO-PBLA con­centration. The concentration is ex­pressed in units of mg/mR.

／皿比は水溶液中のビレン（約1.87)と同程度の高い値を示すが、 CMCを境にその値は小さく

420
400
wavelength (nm)380360なり約1.45程度の値となる。 これは、 プロック

440

共重合体のミセル形成に伴ってビレンがミセル内核に取り込まれたものと考えられる。 アスパラギン酸ユニットの保護基であるベンジルアルコ ー ル

Fluorescence spectra of pyrene in PEO­PBLA aqueous solutions.
Sample is 5-10. The concentration ofpyrene is 6.0xe-1 M.

中では、 ピレンのI/皿比は1.24であり、 ミセ9敏感であることが知られている(Ham効果） )。

PBLA骨格のアミド構造の寄与や内核と外殻界

Fig.4

ル中の値の方がやや大きい。 このことについては、面に位置するビレンの寄与等が考えられる。 以上

そこでバンドI ((0、 O)バンド）とバンド皿CC o 、 2)バンド）の比(I /Ill比）を取り、 プの結果より、 プロック共重合体ミセル内核に疎水ロック共重合体濃度に対してプロットした結果を性物質を非共有結合的に導入することが可能であり、 さらに低いCMC値からは、 この ミセル形態

Fig.6に示す。 CMC以下の領域においては、●．

▲．

ロ•-1log (concentration)

゜

Fig.5

-3

っ＿log (concentration)

0 .0_4ロ亀-1口●-2。

-3ロ

50ci�

▲01▲

4口 ●

0004gug S;JJO llU (C lO )

。

51000
8000
6(n c ) h 1!SU ,l)U !

2000(P C E [6£ £ ) O !JIU A l!SU .JlU !

．
．

0000ー"'2.0

The total fluorescent intensity of monomer emission and the intensity ratio (339/334) from theexcitation spectra of pyrene versus logarithm PEO-PBLA.
-13一が熱力学的に極めて安定であることが示された。
Ex= 333 nm
3.2

ミセル内核の粘性評価

薬物を安定に内核に保持するためには、内核が局所の粘性が高ければ薬物の局所拡散が妨げられ、外部へのリリー スが抑制されるからである。そこ
゜で、ミセル内核の局所粘性をヒ レンダイマ ー (P3CP)(Fig.7参照）のエキサイマー

発光強度から見積もることとした。P3CPは粘性の低い環境下では分子内回転が容易な為、顕著なエキサイ三5さs）
u
9一(二lw．
,A11旦u(固体状態であることが望ましい。すなわち、内核,(b)。このエキサイマー

発光強度はミクロ枯性。

るIO)

FIuorescence spectra of 1,3- ( 1, 1'ーdipyrenyl) propane in PEO-PBLA andSOS micellar solutions. Samples are 1220 at a concentration of0.10 mg/m2 and
SOS at a concentration of 3.0 mg/m 2 .
The concentration of 1 3 (1 1dipyrenyl) propane is 2 .0xe-7M.

Structure of 1,3- (1,1'-dipyrenyl )propane (P3CP)

マ ー 発光を480nm付近に示すことが知られてい

]「 60

Fig.7

nnFig.8500
450wavelength (nm)。

..o�360

加温処理、超音波処理効果により、水中でのビレンの溶解度(6.0xe-1M)の500倍を溶解可能でーあることが示された。この疎水性薬物モデルとし発光強度Cle)とモノマ ー 発光強度(Im)の比てのピレンの導入測定から、導入法を工夫するこの上昇とともに低下することから、エキサイマ・。

(le/Im)よりP3CP周囲のミクロ粘性を評価

3.0e-4することができる11) 。Fig.8 に例を示したが、heatsonication

4e―0するビークがミセル形成後は極端に小さくまたプ゜

れているものと考えられる。このことは、別途、・。

41―e0．

UJI\U;J;Jに内核に保持された物質の動きも大幅に束縛さ1H-NMRにおいてフェニル環のプロトンに由来．

)なった。すなわち、プロック共重合体ミセル内核
では、高分子鎖の運動性がかなり低く、そのため(Zれず、le/Im値も極 め て低 い ことが明らか と．
2中ではP3CPエキサイマ 一 発光はほとんど認めら゜

SDSミセルに比して、プロック共重合体ミセル．

゜

O.Oe+O+ロー ドになることからも支持された。

1020

PEO-PBLA (mg/ml)

次にピレンのミセル内への導入を促進する目的
で、通常の撹拌での導入の他に加温処理、超音波処 理 の 効 果を調べた 。Fig.9より 、 導 入量はPEO-PBLAの濃度に依存することが示され、-14-Fig.9

The solubilization of pyrene in PEO­PBLA micellar solutions. The loading ofpyrene was faci Iitated by heating at 80℃,sonication. Pyrene has a solubility inwater of 6.0xe -7 M.

新しい DDS 剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発とにより、 疎水性物質の導入量をかなり増加することが可能であり、 PEO-PBLA プロックコポ
リマー の薬物担体としての有用性が期待された。
3.3 ブロック共重合体ミセル中へのアドリアマ
5 q,osqc(ne)83イシン(AOR)の導入と安定性の評価
ビレンでの結果をふまえ、 実際の薬物としてADRの取り込みを行った。導入法は、 実験の項に詳述したように有機溶媒(DM下）から緩衝液への透析平衡法である。 ミセル中に取り込まれないフリ ー のADRは限外口過により除去した。
この方法により、 ミセル重量に対して10%の割5合でADRを導入可能であることがミセルの吸光度測定より明らかとなった。また、動的光散乱よりADR内包ミセルの直径は約35nmと求められた。この値は、 ADRを内包しない場合に比して若干大きめの値となっている。ADR内包ミセル

1015elution volume (ml)Fig.10 Stability of PEO-PBLA micelles after
incubation with albumin (10 mg/mU inPBS、0.1, pH7.4) , onalyzed by gel per­meation chromatograms (GPC) . The
concentration of ADR is 10 mg/mU.

は凍結乾燥保存が可能であり、 再溶解後もミセル次にミセル内に保存されたADRの安定性をゲ
ルロ過クロマトグラフィー逗u1aou8 SOJOnIJ
Sua1)Al!
q.ra
1m11
<.
旦 un ,（直径に変化のないことが確認された。
(GPC) により評価し た 。 結果をFig.10に示す。Fig.10は、 PBS中に保存したミセルのGPC であるが、 排除限界に単分散のミセルビー クが認められる。この試料をlOmg/叫濃度のアルプミン溶液中に共存させた時の時間経過を あわせてFig.10に示す。 5時

ー・・ (t= 0)

PF,;Q-Pl;lしA/AO�

•二·: ;:: 闘闊h}
二 二 i に閤間経過後もミセルピ ー クの強度に変化は認められず、 その安定性が確認された。なお、 ウサギ血清を用いて評価した場合にも同様の結果が得られている。また、 ミセル内包ADRについては内部遮蔽効果による著しい消光が認められた。時間経過とともにわずかな蛍光強度の増加が観察されたが、500

550600650700wavelength (nm)Fig.11 Fluorescence emission spectra of ADR
and PEO-PBLA/ADR micelles in PBS
buffer (0.10M, pH7.4). The concentra­tion of ADR is 10 mg/mg.

その程度 は極めて小さく、 内 核 に 保 持 され たADRは、 少なくともPBS中ではほとんど外部に放出されないことが判明した(Fig.11)。

ような疎水的ミクロ環境には浸透しにくいはずである。したがって、 ADRがミセル内核に確かにさらに蛍光の消光剤であるヨウ素イオンによる保持されていればヨウ素イオンにより消光しにく

ADR蛍光の消光度合を調べることからADRのいことになる。 その評価は(1) 式に示すStern

ミセル内存在状態を評価した。 ョウ素イオンは負-Volmer の式で行われる。

荷電を有しかつ水和しているため、 ミセル内核の-15-

Fo/F=l+Ksv [r-]ここで Fと Fo は、核に疎水性薬物を内包可能であることが明らかと(1)―

I 存在下あるいは非存在下でのADR蛍光強度、 Ksvは消光定数でありこの値 が 大 き い程、 消光されやす い こ ととなる。

'ダ定であることが示された。 このプロック共重合体

ミセルは凍結乾燥状態での保存も可能であり製剤8上の利点も大きい。 内核に保持し得る薬物としては、 アドリアマイシン以外に消炎剤インドメタシ

゜6

J oJ

゜ンも適用可能であることも予備的に確認している。

4

内包薬物の選択が広く、 優れた安定性を有する本n~゜゜2

プロック共重合体ミセルは、 薬物や香料等のキャリア ー として、 薬学ならびに化粧品分野において0.2広範な応用が今後期待できるものと考えられる。
0.4
l- (M]

0.60.8

文 献

F ig.12 Stern-Volmer plots for ADR 1ncorpo­
rated into PEO-PBLA micelles in PBSbuffer (0.1M, pH7.4) . The concentra­
tionofADR is5mg/mD.
比してミセル内包ADRではKsvの値が極めて小さいことがわかる。 Ksvは正確には、 消光速度定数(kq)と蛍光寿命（てo)の積であらわされる。

外部に拡散することなく安定に存在できることがマイシンはI - ! こよる消光を受けず化学的にも 安ADR : Ksv = 17.3

10と異なり固体状態であるため、 保持された薬物は特徴である。 事実、 ミセルに保持されたアドリアFig.12に結果を示すように、 フリ ー のADRに12なった。 ミセル内核は、 通常の界面活性剤ミセルてoはフリ ー ADRと比べてミセル内包ADRでは同程度かあるいはむしろ小さい値を示すことが別途、 蛍光寿命の測定から明らかとなっている。 したがって、 ミセル内包ADRで観測された小さいKsv値は、 消光速度定数kqが小さいことに由来するためと結論される。 すなわち、

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C 1993)5) M. Yokoyama, S. Inoue, K. Kataoka, N. Yui,

ADRはミセル内核に安定に保持される結果、ーI との衝突頻度が下がり、 消光されにくいものと考えられる。 この結果は、 ミセル内包ADRが化学的に安定であることとも一 致するものである。

T. Okano, Y. Sakurai, Makromol. Chem. 追L
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以上の結果より、 PEO-PBLAプロック共重合体は水溶液系でミセルを形成し、 また、 その内-16-

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