皮膚表皮形成に関わるタンパク質架橋接着反応の分子基盤（高反応性基質配列ペプチドを用いた皮膚型トランスグルタミナーゼの高感度で特異的な活性検出法の確立）
名古屋大学大学院生命農学研究科応用分子生命科学専攻

人 見清 隆Transglutaminase 1 (TGase 1) is an essential enzyme for cornified envelope formation in stratified squamous
epithelia. This enzyme catalyzes the cross-linking of glutamine- and lysine residues in structural proteins in differentiating
keratinocytes. We had used a phage-displayed random peptide library for screening of primary amino acid sequences thatare preferentially selected by human TGase 1. We had identified the most reactive sequence (K5) by evaluation of reactivity
as GST-fused recombinant protein. In this study, we have confirmed that K5 appeared to have high and specific reactivity assubstrate, even in the peptide form. Furthermore, in situ analysis of mouse skin sections using the fluorescence-conjugated
K5 peptide resulted in the detection of TGase 1 activity with high sensitivity. Additionally, we have established a specificassay system using this peptide. In conclusion, we have established in situ and in vitro detection system using substrate
peptide as sensitive and specific detection of endogenous TGase 1 activity in the skin.

１．緒が、トランスグルタミナーゼによる共有結合的な架橋を受言ける。これらの構造物が細胞膜直下に裏打ち構造（cornified

タンパク質架橋化酵素トランスグルタミナーゼは、タンenvelop）として形成される結果、表皮細胞は硬度化が生じ、パク質中のグルタミン残基と異種または同種タンパク質の外部に対し物理的にも化学的にも強力なバリアとして機能リジン残基に、イソペプチド結合形成を触媒する架橋化酵することになる（図１B）。
我 々 は こ れ ま で、 皮 膚 表 皮 に 存 在 す る TGase の う ち、素である。同時にまた、グルタミン残基に一級アミンを取り込ませたり、脱アミド化することでグルタミン酸へと変TGase 1 と TGase 3 の組換えタンパク質を作製して、そ換させたりする場合もある（図１A）。この酵素反応は高の生化学的解析に従事してきた等動物の多くの組織で観察され、植物や下等真核生物、微性な前駆体として合成された後、TGase 1 が in vitro にお生物にも類似の反応様式が見られる事が知られている。高いてカルパインで、TGase 3 がカテプシンによって限定分

等動物においては、これらの酵素の活性発現にはカルシウ解されて活性化されることを明らかにしてきた。

１, ２）。これらの酵素は不活ムイオンが必要であり、カルシウムシグナルに応答して多また一方で、近年我々は、トランスグルタミナーゼが架彩な生理現象に関わっている。トランスグルタミナーゼの橋する基質としては、どのような一次構造（アミノ酸配列）生理的意義は、血液凝固、細胞死、形態形成、細胞外マトがあれば認識されやすいのか、という課題に取り組んできリクスの強化と幅広く、今なお未知の役割が発見される可た（どのグルタミンやリジンでも区別なく架橋重合するの能性もある。トランスグルタミナーゼはヒトにおいてはこではない）。これまで、ファージ提示型ランダムペプチド

れまで８種のアイソザイムの存在が報告されているが、表ライブラリを用いて、各トランスグルタミナーゼのアイソ

皮組織には主に３つのアイソザイム（TGase 1, TGase 3、ザイム（TGase 2 および Factor XIII）が好んで認識する

TGase 5）が存在する。

基質配列（ペプチド）の同定に成功している

皮膚表皮の形成は、表皮深層の未分化な前駆細胞が分化成熟して、角化した表皮細胞として表層に押し出されるこ3, 4）。さらにこのシステムを用いて、同様に表皮の TGase 1 に 対する高反応性ペプチド配列を得ることをめざしていた。とによって達成される。またこの分化過程は、細胞内外の今回のコスメトロジー研究振興財団における研究課題とカルシウム濃度の変化によって支配されている。表皮細して、トランスグルタミナーゼが関わる表皮形成の分子基胞の分化に伴い、細胞内のロリクリン、インボルクリン、盤を確立するという課題で採択を頂いた。この課題の遂行

small proline rich protein（SPR）などの構造タンパク質群を２年間に分けて行い、特に皮膚型トランスグルタミナー

Molecular basis of transglutaminase
reactions in the skin epidermis formation:development of efficient detection
system of transglutaminase 1 activity
using preferred substrate peptide
Kiyotaka Hitomi
Graduate School of BioagriculturalSciences, Nagoya University

ゼに対する高反応性基質配列ペプチドの解析と、これを用いた表皮組織での活性検出システムの構築を目的とした。
昨年度（平成 20 年度）まででペプチドの諸性質の解析と蛍５）光標識ペプチドを用いた検出システムの構築に成功した 。
昨年以降はさらにこれに加えて、化学標識ペプチドを用いた、in vitro での特異的な皮膚表皮架橋酵素のアッセイシ
ステムの開発にも成功したので、ここに報告としてまとめ− 49 −

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

図１

トランスグルタミナーゼの作用様式と表皮における役割たい。今後、表皮（培養）細胞中の活性検出方法の確立や切片を作製した。スライドグラスに貼付した切片を乾燥さ関連病態との関わりを検討していきたいと考えている。

せ、BSA により非特異的な吸着を防止するためのブロッキングを行った後、蛍光標識したペプチドを含むバッファ

２．実験方法ーを添加した。37 度で１時間反応させて、生理食塩水にこれまで我々は、TGase 1 に対する高い反応性を有するより洗浄してから封入・検鏡した。

基質配列を、M13 ファージディスプレイランダムペプチ

このとき、対照実験として、K5 ペプチドのグルタミンドライブラリからスクリーニングしている。そのうちおよ残基をアスパラギン残基に置換した変異ペプチドで同様のそ 15 種類の配列を融合蛋白質として発現精製し、ダンシ実験を並行させた。また、TGase 1 遺伝子欠損マウスの皮ル修飾カダベリン（蛍光標識アミン）の存在下で、TGase膚表皮切片についても行った。

1 に対する反応性の高いものを４つ選んでおり、それぞれイム（TGase 2, TGase 3, Factor XIII）に対する反応性を

２. ３ ビオチン標識ペプチドを用いての新規アッセイ系の開発調べて、特異性の高い配列の１つ、K5（YEQHKLPSSWPF）

我々はこれまでに、フランス CovalAb 社との共同研究について、ペプチドレベルでの反応性、特異性、有用性をで、組織型酵素（TGase 2）について、ELISA 法（タンパ検討した。

ク吸着プレートを用いた酵素発色による免疫反応検出系）について解析を進めた。さらに、TGase 1 以外のアイソザを模した、トランスグルタミナーゼの測定系を TGase 2

２. １６）

ペプチドレベルの反応性評価について開発していた 。これはプレートに、ポリアミン96 穴マイクロタイタープレートを用いる発色方法で行（スペルミン）を共有結合させ、一級アミンを固定したもった。この場合、カゼインをグルタミン残基受容基質としのと、ビオチン標識した高反応性基質配列を用いた検出系て、プレートに固相化した。ここに、ビオチン標識したペで、簡便に高感度で活性検出が可能である。そこで、これプチドを含む溶液に酵素（TGase １）を添加して反応を進を応用して、TGase 1 の高反応性基質ペプチド（K5 ペプ行させた。尚、このとき、TGase 2 に対する高反応性ペプチド）を用いた特異的なアッセイ系構築を実施した 。同チド（T26：HQSYVDPWMLDH）や、変異ペプチド（K5QN：様にポリアミンコートしたプレートに、TGase 1 およびグルタミン残基をアスパラギンに置換したもの）についてK5 ペプチドを混合して反応させ、アビジンパーオキシダも並行させた。反応停止し洗浄後、アビジンパーオキシダーゼを反応させ、発色基質を添加した。

７）ーゼを含むバッファーを反応させた。洗浄後、パーオキシ３．結ダーゼに対する発色基質溶液を添加して発色量を測定した。

果

蛍光標識ペプチドを用いた活性の視覚化

３. 1 選別した高反応性基質配列に相当するペプチドの反応性の評価

野生型および TGase 1 遺伝子欠損マウスから皮膚切片ビオチン標識ペプチド（K5）を、カゼインをグルタミンを取得し、OCT コンパウンドに包埋して、３－４mm 厚で受容基質として、反応を行った。TGase 1 に対する反応を

２. ２− 50 −

皮膚表皮形成に関わるタンパク質架橋接着反応の分子基盤（高反応性基質配列ペプチドを用いた皮膚型トランスグルタミナーゼの高感度で特異的な活性検出法の確立）（K5QN）や T26 は、まったく反応を示さなかった（図２）。

３. ２ 蛍光標識高反応性ペプチドを用いた皮膚表皮における反応の視覚化

なお、図では省略したが、TGase 2, TGase 3, Factor XIII

蛍光（FITC）標識した K5 ペプチドを、皮膚表皮凍結切に対しては、反応性が低いことを確認している。ただし、片に添加して、内在性の TGase 1 活性の検出を試みた（図TGase 2 については、比較的高いペプチド濃度や酵素濃３、図４）。その結果、カルシウム存在下では、K5 ペプチ

度のときには、cross-reactivity が生じることが観察されドについて特異的なシグナルが観察された。キレート存在た。これらの結果により、K5 が TGase 1 に対して、ペプの場合、グルタミン残基を変異させた場合には観察されなチドとしてのレベルでも高く、かつ特異的に基質となるこかった。さらに、図では省略したが TGase 1 遺伝子欠損とが示された。

マウスの皮膚切片の場合では、全くシグナルは観察されな調べた結果、K5 のみが高い反応性を示し、変異ペプチド

図２

選別した高い反応性配列のペプチドレベルでの評価

図３

蛍光標識ペプチドを用いた皮膚表皮内の活性の視覚化（方法）

図４

蛍光標識ペプチドを用いた皮膚表皮内の活性の視覚化（結果）− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

５）

TGase 1 の基質となることが示された。K5 の配列中にはかった 。
ヘマトキシリン＆エオシン染色での結果から、角化層にリジン残基が（グルタミン受容）あり、基質としてどのは活性は検出されず、顆粒層からやや下あたりまでの細胞TGase アイソザイムでも反応する可能性もあったが、特層に見られた。また、TGase 1 は細胞膜直下に局在するが、異的に TGase 1 の良い基質であることが、変異体（QN 変表皮細胞の細胞膜周辺にシグナルが見られ、これまでの知異）の解析で明らかになった。
このペプチドを用いた応用的な解析として、蛍光標識し見とも合致する結果となっている。

たペプチドを作製し、これを用いて皮膚表皮での活性を可

３. ３ ビオチン標識ペプチドを用いた、迅速で高感度な活性検出系の確立視化できた（結果３. ２）。これは、特異的にアイソザイム

図５A に示すように、一級アミン固定化プレートに、トてきた方法よりもさらに正確に酵素の働きを知ることのでランスグルタミナーゼおよび、ビオチン標識した高反応性きる画期的な手法と言える。抗体の場合は、「存在」のみ基質配列ペプチドを混合することによって、反応を進行さであるが、TGase 1 や TGase 3 は限定的分解を受けるとせた。図５B に示すように、TGase 1 に特異的なペプチド活性上昇が起こるので、抗体反応のみでは活性を判断できである K5 を用いた場合、TGase 1 の酵素の存在下で時間ない場合に有効である。基礎的知見に加え、この手法では、依存的にビオチン標識 K5 の取り込みが観察された。同じ

TGase 1 の活性低下による疾病研究にも貢献できる。デようにグルタミン残基を含む、T26 や F11（Factor XIII 高ータは省略するが、この成果より発展したヒト皮膚に関す反応性ペプチド）では反応されなかった。図では省略する

る共同研究を、北海道大学医学部・清水宏教授および秋山が、酵素量およびペプチド濃度依存的にも取り込み量が増真志准教授と行った。その中で、ヒト皮膚表皮、とりわけ大した。

魚鱗鮮患者の皮膚組織での、TGase 1 の発現解析に関しの反応物を検出する方法としては、これまで抗体で行われ8）

４．考ても、有用な検出系として役立つことが判明した 。

察

また結果３. ３に示すように、ペプチドをビオチン標識緒言でも記したように、皮膚形成、特に角化層の表皮細すれば、アッセイが可能なことを示した。予備的な実験結胞でバリア機能を果たす cornified envelop が形成される果として、マウスの皮膚抽出物から、従来のアッセイ系よためには、複数のトランスグルタミナーゼの活性が必須でりもより感度良く、短時間で活性を検出することができた。

ある。なかでも、本課題で対象とした TGase 1 は、
（１）

今後、蛍光ペプチドを用いた可視化の検出系と並行して、ノックアウトマウスで異常な皮膚形成が明らかなこと（２）

皮膚表皮トランスグルタミナーゼの異常なレベル低下の高遺伝子変異によって、重篤な皮膚疾患が生じること、から感度検出に用いられる可能性もある。

最も重要なアイソザイムであると言える。

５．総

我々が近年同定してきた、トランスグルタミナーゼのア括イソザイムに特異的な高反応性基質配列が、ペプチドとしこのようにタンパク質架橋酵素反応を、組織および細胞ても良い基質であれば、様々な用途への展開が可能であるレベルで高感度に検出するシステムを開発することに成功との認識に基づいて、今回の研究課題に臨んだ結果、いくしたので、皮膚表皮における本酵素の分子基盤を確立するつかの有用な成果をあげられた。

ことができたといえる。今後は、皮膚表皮培養系での活性結果の３. 1 に示したように、ペプチドとしても、他の検出と、TGase 1 以外のアイソザイムとの役割分担、おアイソザイムと交差することなく、特異性を有した形でよび架橋重合される基質群の架橋化パターンの解明を行う

図５

ビオチン標識ペプチドを用いた新規な酵素活性測定方法− 52 −

皮膚表皮形成に関わるタンパク質架橋接着反応の分子基盤（高反応性基質配列ペプチドを用いた皮膚型トランスグルタミナーゼの高感度で特異的な活性検出法の確立）ことにより、「どのように皮膚のバリア機能と固さが形成

J. Dermatol. Sci., 32, 95-103, 2003.
３）Sugimura Y. et al. Screening for the preferredされるのか」を明らかにしていきたい。

substrate sequence of transglutaminase using a phage謝辞displayed peptide library. J. Biol. Chem. 281, 17699-17706,

本研究を遂行するにあたり、ご支援を頂いたコスメトロ

2006.

ジー研究振興財団に厚く御礼申し上げます。本研究は名古４）Hitomi K. et al.: Preferred substrate sequences for屋大学大学院生命農学研究科分子細胞制御学研究室で行わtransglutaminase 2: screening using a phage-displayed

れたもので、大学院生として実験に従事されました杉村禎

peptide library. Amino Acids. 36, 619-624, 2009.

昭博士、細野真代氏、北村三矢子氏の多大な努力による成５）Sugimura Y. et al. Identification of preferred substratesequences for transglutaminase 1: development of a novel

果であります。
また、マウスの皮膚切片標本を供与頂いた、兵庫医科大学の山西清文教授に感謝申し上げます。紹介したヒト皮膚peptide that can efficiently detect cross-linking enzyme
activity in the skin. FEBS J. 275, 5667-5677, 2008.

に関する実験は北海道大学医学研究科皮膚科学教室、清水６）Alea, M. P. et al.: Development of an isozyme-specific

宏教授、秋山真志准教授の成果です。また、活性測定系のcolorimetric assay for tissue transglutaminase 2 cross-

開発においては、フランス CovalAb 社との共同研究によlinking assay. Anal. Biochem. 389, 150-156, 2009.
７）Hitomi, K. et al. A specific colorimetric assay forるものです。

measuring of transglutaminase 1 and factor XIII
（参考文献）

activities. Anal. Biochem. 394, 281-283, 2009.

１）Hitomi K.: Transglutaminase in skin epidermis. Eur. J.

８）Akiyama et al.: Transglutaminase1 preferred substratepeptide K5 is an efficient tool in diagnosis of lamellar

Dermatol. 15, 313-319, 2005２）Hitomi K. et al. Analysis of epidermal-typetransglutaminase (TGase 3) in human stratified epithelia
and cultured keratinocytes using monoclonal antibodies.

ichthyosis. Am. J. Pathol. 176, 1592-1599, 2010.
９）人見清隆 タンパク質架橋化酵素の高反応性基質配列の探索と活用 生化学 81, 708-711, 2009.

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