ゲノム編集ツール
ガイドRNA調製から変異導入の確認まで

ゲノム編集の実験フロー
ステップ1

s9aC

in vitro 転写でのガイドRNA合成
CUGA®7 gRNA Synthesis Kit・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.2

gRNA

Cas9タンパク質の準備

ステップ2

PAM

Cas9 Nuclease protein NLS (3 µg/µl), (15 µg/µl) ・・・・・・・・・・・ p.3
Cas9 Nickase protein NLS (15 µg/µl) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.3
dCas9 protein NLS (15 µg/µl) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.3

ステップ3

Cas9およびgRNAの細胞導入

ステップ4

変異導入の確認T7 Endonuclease I reaction Mix ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.4
Rapid Indel Detection Kit ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.4【関連製品】Cas9タンパク質の検出
Anti-Cas9 Monoclonal Antibody〒930‐0834 富山市問屋町二丁目7番18号
TEL： 076‐451‐6548 FAX： 076‐451‐6547
URL： https://www.nippongene.com

本社 〒540-8605 大 阪 市 中 央 区 道 修 町 三 丁 目 1 番 2 号 TEL ：06-6203-3741 (代表)東京本店 〒103-0023 東京都中央区日本橋本町二丁目4番1号 TEL ：03-3270-8571 (代表)
フリーダイヤル

0120-052-099

フリーファックス

0120-052-806

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ p.4

in vitro 転写でのガイドRNA合成キット

ライセンス対象製品

CUGA®7 gRNA Synthesis Kit

本キットは、ゲノム編集に必要なガイドRNA（gRNA, sgRNA）等の短鎖RNAを合成・精製するためのキットです。
独自開発した改良型T7 RNA Polymerase（CUGA®7 RNAポリメラーゼ）をin vitro 転写反応に用いることで、目的のガイドRNAを正確かつ大量に調製することができます。
● in vitro 転写でgRNAやsgRNAを正確かつ大量に合成● 転写反応からgRNA精製までの必要試薬を含む＊1● 化学合成gRNAと同等に機能する＜ガイドRNA合成の流れ＞
STEP 1. ガイド RNA 合成用鋳型 dsDNA を用意（キットには含まれません）
Oligo

DNA Extension
dsDNA Template

T7 プロモーター 標的配列

Oligo
scaﬀold テンプレート

DNA Polymerase

STEP 2. CUGA®7 gRNA Synthesis Kit で ガイド RNA を正確かつ大量に合成・精製
DNase I 処理Transcription

カラム精製dsDNA Template

RNA Transcript (sgRNA)CUGA7
RNA Polymerase＜キット構成品＞

Elute sgRNA

標的配列

ガイドRNA合成用試薬
1. CUGA7 Enzyme Solution
2. 5×Transcription Buffer
3. 0.1 M DTT
4. NTP mix
5. DNase I (RNase free)

ガイドRNA精製用試薬
1. gRNA Binding Buffer
2. gRNA Wash Buffer
3. Spin Column
4. ddWater (RNase free)（*1） in vitro 転写反応に必要な鋳型DNAおよび鋳型DNA調製用試薬は本品に含まれておりませんので、別途ご用意いただく必要があります。

＜実験データ＞
実験例１：gRNA合成量の比較

実験例２：電気泳動による比較
１

RNA合成量（µg）

50CUGA®7A社

4030１. CUGA®7２. A社
3％ Agarose 211×TAE
EtBr染色20100２01234

目的以外の転写産物
目的の転写産物

反応時間（hr）

本品及びA社gRNA合成キット(in vitro転写法）
を用いて、37℃で1～4時間の条件でsgRNAの合成を行った。反応後、各社マニュアルに従いgRNAを精製し、合成量を比較した。結果、本品はA社と比べて約3倍のgRNAを合成できた。

2

本品及びA社gRNA合成キットを用いて、37℃で2時間反応させgRNAを合成した。
精製したgRNA（250 ng）をアガロースゲル電気泳動に供した。結果、本品で合成したgRNAは単一のバンドで得られ、正確に合成できていることが分かった。

実験例３：in vitro 切断チェック（化学合成gRNAとの比較）
M １ ２ ３
M：Gene Ladder Fast 2 5 µl
1： Control（基質DNA）
2： 2 pmol Cas9タンパク質*2 ＋ 2 pmol 化学合成 gRNA
3： 2 pmol Cas9タンパク質*2 ＋ 50 ng CUGA®7 gRNA(*2) Cas9 Nuclease protein NLS(Code No.319-08641, 316-08651)

本品で合成したgRNA（single guide RNA：sgRNA）と、化学合成したgRNA(crRNA/tracrRNA)を用いて、標的配列を含むDNA断片をin vitroで切断した。結果、本品で合成したgRNAは化学合成品と同等に機能することが確認できた。

Code No.

製品名

容量

希望納入価格314-08691

CUGACUGA® 7 gRNA Synthesis Kit

50 回用¥54,000

野生型Cas9ヌクレアーゼ ＜高純度・高濃度＞

Cas9 Nuclease protein NLS

ライセンス対象製品

Streptococcus pyogenes 由来のCas9ヌクレアーゼを、組換え大腸菌で発現・精製したものです。核移行シグナル (nuclear localization sequence: NLS) を有しており合成したガイドRNA (gRNA) と組み合わせることでゲノム編集に利用することができます。
● 15 μg/μlの高濃度品をラインナップ！
● 核移行シグナル（NLS）付加● 低エンドトキシン（1 EU/μg 未満）
起 源
酵素 形 状

高濃度品は、グリセロール等の持ち込みを最小限に抑えることができます。

遺伝子組換え大腸菌
10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50％ Glycerol

PAM

genomic DNAsgRNA↓ 二本鎖DNAを切断

図 1. CRISPR/Cas9 の模式図
ガイド RNA と相補的に結合した任意の配列を二本鎖切断し、 DNA 損傷修復機構を利用して遺伝子変異を引き起こします。

Code No.

製品名容量希望納入価格

319-08641

Cas9 Nuclease protein NLS (3 μg/μl)
Cas9 Nuclease protein NLS (15 μg/μl)

75 μg¥23,000

300 μg¥75,000

316-08651

改変型Cas9ニッカーゼ

ライセンス対象製品

Cas9 Nickase protein NLS
野生型 Cas9 Nuclease に変異（D10A) が導入されているため、二本鎖DNAの一本鎖のみを切断しニックを入れる活性を持ちます。CRISPR/Cas9システムのゲノム編集の際は同時に2種類のガイドRNAが必要となり、オフターゲットを抑制することができます。核移行シグナル (NLS) を有します。
● 15 μg/μlの高濃度品！

起 源sgRNA↓

二本鎖DNAの単鎖のみ切断

図 2. 改変型 Cas9 ニッカ―ゼ
標的部位の単鎖のみ切断してニックを挿入します。

● DNAの一本鎖のみを切断

酵素 形 状PAM

genomic DNA

遺伝子組換え大腸菌
10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50％ Glycerol

オフターゲットを抑制

標的配列

一本鎖切断（ニック）は無傷の相補鎖を鋳型として直ちに修復されるため、オフターゲット（非特異的切断により予測していない部位に変異が生じる）が抑制されます（ ① ）。Cas9ニッカーゼによるゲノム編集では、近接した２種類のgRNAをデザインし標的配列の二本鎖を切断します（ ② ）。
修復PAM

PAM

PAM
PAM

① 非標的配列（一本鎖切断）

変異導入② 標的配列（二本鎖切断）

Code No.

製品名容量

希望納入価格317-09161

Cas9 Nickase protein NLS (15 μg/μl)

300 μg¥75,000

不活性型dCas9タンパク質

ライセンス対象製品

dCas9 protein NLS

genomic DNA

sgRNA

Streptococcus pyogenes 由来のCas9 Nuclease の改変体で、Cas9 (D10A,H840A 変異型) 遺伝子を導入した大腸菌で発現させ、精製したタンパク質です。DNA切断活性を持ちません。本品は15 μg/μlの高濃度品で、核移行シグナル(NLS) を有します。
● 15 μg/μlの高濃度品！

● DNA切断活性をもたない起 源
酵素 形 状遺伝子組換え大腸菌
10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50％ Glycerol

Code No.

314-09171

製品名

dCas9 protein NLS (15 μg/μl)

PAM↓ DNA鎖に結合
図 3. 不活性型 Cas9 (dead Cas9; dCas9）
ガイド RNA を介して標的配列に結合することができ、 転写抑制等の研究への応用が期待されます。

容量

希望納入価格300 μg¥75,000

www.nippongene.com

3

ミスマッチ切断酵素 ＜変異導入の確認＞

T7 Endonuclease I reaction Mix
本品は、T7 phage 由来のNuclease とその反応バッファーが一液タイプになったプレミックス試薬です。
本品に含まれるT7 Endonuclease I は、二本鎖DNA のミスマッチを認識し、切断する活性を有しており、ゲノム編集技術を用いた変異導入の確認に利用できます。
＜実験データ＞● T7 Endonuclease I と反応Buﬀerのプレミックス試薬

iPS細胞を用いた切断活性試験 (データ提供：株式会社 特殊免疫研究所)● 大容量バルク供給や特注製造可能

切断活性の高いgRNAを選定するため、エレクトロポレーション法にてgRNAとCas9からなるRNPをiPS細胞に導入し、バルク細胞集団よりゲノムを回収、変異導入解析を行った。

● 二本鎖DNAのミスマッチを認識し切断A社切断酵素
M

標的配列のPCR増幅

123

T7 Endonuclease I reaction MixN/CM

123N/C

IndelIndel{・ 熱変性、再アニーリングしたPCR産物・ T7 Endonuclease I reaction Mix

図1 iPS細胞を標的とした切断活性確認試験

ミスマッチ領域を切断(37℃, 15 分）

M: 100 bp Ladder
1: gRNA 1
2: gRNA 2
3: gRNA 3
N/C: Negative Control (iPS細胞ゲノム)

A社切断酵素では切断できなかった変異導入細胞のゲノムについて、
T7 Endonuclease I reaction Mix で切断確認することができた。

Code No.

製品名

T7 Endonuclease I reaction Mix

313-08801

容量希望納入価格

50 μｌ¥15,000

迅速変異導入検出キット

Rapid Indel Detection Kit

本品は、ゲノム編集技術による変異導入を迅速に確認できるキットです。
本品は、簡易DNA抽出試薬、高正確性PCR酵素、変異(Indel)検出用試薬に使用するT7 Endonuclease I reaction Mixで構成されています＜キット構成品＞
簡易DNA抽出試薬
1. Template Prepper A2. Template Prepper B● 約15分間でDNAを抽出可能

高正確性PCR酵素
1. 2×Go-to PCR Mix● 変異導入クローンのスクリーニングが可能

変異(Indel)検出用試薬
1. T7 Endonuclease I reaction Mix● PCRと電気泳動で簡単に変異の有無を検出可能

Code No.

製品名容量

希望納入価格313-08921

Rapid Indel Detection Kit

50 回用¥30,000【関連製品】 抗Cas9モノクローナル抗体（Cas9タンパク質の検出）
Code No.

製品名容量

希望納入価格310-08431

Anti-Cas9 Monoclonal Antibody

50 μg¥55,000

Cas9タンパク質、T7 Endonuclease I 等について大容量バルクの供給や特注製造も可能です。
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ライセンス対象製品● Cas9 タンパク質（野生型、改変型、不活性型）● ガイドRNA合成キット

Label License (ERS Genomics Limited) はこちら ↑● 本文に収載しております試薬は、試験・研究の目的にのみ使用されるもので、「医薬品」、「食品」、「生活用品」などとして使用できません。
● 希望納入価格には消費税等が含まれておりません。

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