化粧品成分の安全性評価：CYP 誘導性と肝毒性の in vitro 評価系の構築

鳥取大学染色体工学研究センター染色体医療学研究部門

多田政子

Human adult hepatocytes are required for cell-based assays to evaluate the potential risk of drug-drug interactions
caused by the transcriptional induction of P450 (CYP) enzymes in early-phase drug discovery and development. We createdtransgenic HepaRG cells by replacing the protein-coding regions of human CYP3A4 and CYP3A7 with enhanced green
fluorescent protein (EGFP) and DsRed reporters, respectively, in a bacterial artificial chromosome (BAC) vector that
included whole regulatory elements. In the created BAC-transgenic HepaRG cells, EGFP can be used as a quality assurance
marker for identifying functional hepatocytes derived from DsRed-positive bipotential stem cells in real time without theneed for many time-consuming steps.

2）

１．緒

相同性を示し、抗体を用いて識別することが困難である 。

言

しかし、これらは、酵素反応性や基質特異性、更に発現誘健康や美容に優れた効果が期待される成分が見つかって導機序が異なっている。よって、CYP3A4 を発現していも、細胞毒性や薬物間相互作用を引き起こす危険性についる成人肝細胞の選択的利用が求められているものの、主なて慎重に精査しなければならない。開発期間の短縮や低コヒト肝癌細胞株は胎児性の遺伝子発現プロファイルを示す

スト化には、それら成分の不都合な特性を可能な限り早いという問題がある。

時期に把握することが重要である。薬物相互作用、いわゆ

本 研 究 で は、 開 発 済 み の 一 体 型 2 色 蛍 光 ベ ク タ ーる「飲み合わせ」の問題は、服用した化合物が薬物代謝酵（CYP3A4G/7R BAC）をヒト肝癌由来細胞株 HepaRG 細素群 P450（CYP）の阻害や発現誘導を引き起こすことに起胞に導入しベクターの作動性を評価した。HepaRG 細胞因する。この反応には種差があるため、ヒト細胞を用いたは、ヒト肝細胞様への分化能を持ち、高い CYP3A4 発現評価系の確立が望まれる。この実現には、2 つの大きな課を示すようになることが知られている題が残されている。1 つは、評価に用いる充分な質と量の化したトランスジェニック細胞（CYP3A4G/7R HepaRG）ヒト肝細胞ソースが確保されていないこと、もう 1 つは短がヒト肝細胞の代替モデル細胞として有用かどうか評価時間に多検体を評価できるハイコンテンツスクリーニング

し た。 結 果、CYP3A4G/7R HepaRG を 用 い る と、EGFP（HCS）型の評価系が構築されていないことである。

蛍光が内在性 CYP3A4 発現のインディケーターとなるた3, 4）。そこで、分

我々は、市販薬の 50 − 60% の代謝を担う成人特異的なめ、HepaRG 細胞の分化状態のモニターや代謝活性の高い

CYP3A4 と胎児肝臓で発現する CYP3A7 を 2 色蛍光で簡細胞を集めることが容易になった。更に、CYP3A4G/7R

便かつ感度よく検出する一体型ベクターを開発した 。こHepaRG に 既 知 の CYP3A4 発 現 誘 導 剤 を 添 加 す る と、のベクターを用いると以下のことが可能になると予想し

EGFP 蛍光量が増加した。よって、CYP3A4G/7R HepaRG

た：① CYP3A7 を発現する肝芽細胞を赤色蛍光（DsRed）で、を用いることで、一度に多数の化合物に関して CYP3A4

CYP3A4 を発現する成人肝細胞を緑色蛍光（EGFP）で同定

発現誘導性をマルチウエルで評価できる HCS 系を構築ですることが可能になる。②成人肝細胞を緑色蛍光に基づいきる可能性が示された。

1）て分取することが可能になる。③ある種の化学物質は核内

２．実受容体のPXRやRXRと結合することでCYP3A4 発現誘導を引き起こすことが知られているが、この CYP3A4 誘導性を

験2. 1. 増殖培養と肝細胞分化EGFP 蛍光量の増加に基づいて評価することが可能になる。

HepaRG 細胞（Biopredic International）は、710 growth

CYP3A4 と CYP3A7 はタンパク質レベルでは 90% 以上のmedium を用いて 5% CO2、37 ℃で増殖させた。HepaRG 細胞を分化させる場合は、710 growth medium で 2 週間培養

D ua l - color f luore s cent i mag i ng ofdevelopmental shift from foetal hepaticcells to adult hepatocytes and CYP 3 A4induction test in human hepatic carcinoma
HepaRG
Masako Tada
Division of Chromosome Engineering &Therapeutics, Chromosome Engineering
Research Center, Tottori University

し、連続的に 720 differentiation medium で 2 週間培養した。

2. 2. トランスジェニック細胞作製
2. 2. 1. loxP-HepaRG 細胞
CYP3A4G/7R BAC ベクター全長を Cre 酵素を介して受容細胞に 1 コピー導入する目的で、loxP サイトを BAC ベ− 83 −

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クターに挿入した。次に BAC ベクターを HepaRG 細胞に研究では、BZ-9000 蛍光顕微鏡（Keyence）で画像を取得し、導入するため、loxP アクセプターサイトをもつ HepaRG 細専用の画像解析ソフトで相対的にエリア総蛍光量を比較した。

胞（loxP-HepaRG）を作製した。NotI で切断した loxP サイト

また、自動蛍光画像取得および解析装置であるLEAP cell-

導入用のプラスミドベクターを Lipofectamine LTX（Lifeprocessing workstation（Cyntellect）およびIncuCyte ZOOMTechnologies）でトランスフェクションした。loxP-HepaRG（Essen BioScience）を適宜用いた。ライブセルイメジングには、プラスミドベクター上のハイグロマイシン薬剤耐性遺は、VivaView FL（LCV-1 0 0）incubator fluorescence

伝子を用いて選択した。ゲノム DNA の PCR 解析や DNAmicroscope（OLYMPUS）を用いた。EGFP 陽性細胞は、FISH 法により、loxP の挿入やその染色体領域を同定した。

FACSAria flow cytometer（BD Biosciences）で解析およ2. 2. 2. CYP3A4G/7R HepaRG 細胞び分取した。

CYP3A4G/7R BAC は pCAG-Cre ベクターと共に loxP-

３．結HepaRG に Lipofectamine LTX でトランスフェクションした。CYP3A4G/7R HepaRG クローンは、プラスミドベ

果

3. 1. CYP3A4G/7R HepaRG 細胞作製

クター上のネオマイシン薬剤耐性遺伝子を用いて選択した。

本研究支援期間の結果は、既に論文発表済みである。よゲノム DNA の PCR 解析や DNA FISH 法により、BAC ベって、図の重複使用を避けるため、詳細データは論文をクターの挿入やその染色体領域を同定した。

参照して頂きたい 。CYP3A4 と CYP3A7 は、ヒト 7 番1）

染色体上に並んでいる。この 123 kb を含む BAC クロー

2. 3. CYP3A4 発現誘導

ン RP11-757A13 を、BAC recombineering の 手 法 を 使 っ分化した CYP3A4G/7R HepaRG に 10µM リファンピシて改変した。CYP3A4 のタンパク質コード配列（ORF）をン（RIF）、25 µM デキサメタゾン（DEX）、25µM クロト

EGFP 遺伝子に、CYP3A7 の ORF を DsRed 遺伝子に置換

リマゾール（CLO）、100µM ニフェディピン（NIF）またはした。この CYP3A4G/7R BAC は、CYP3A4 上流 35 kb と25µM PCN を 24−48 時間添加した。全ての誘導剤に関し

CYP3A7 上流の全て 23 kb の制御領域を含んでいる。また、て、細胞添加状態で 0.1% DMSO になるように DMSO に溶

Cre-loxP システムにより容易に哺乳類細胞へ遺伝子導入で解したストック溶液を調整した。エリア総蛍光量を測定

きるように一カ所の loxP 配列を BAC に挿入した（Fig. 1A）。

した後に RNA を抽出した。これにより、EGFP、DsRed

CYP3A4G/7R BAC を導入する細胞として、予め、loxP

および内在性 CYP3A4 の mRNA 発現量変化と蛍光量変サ イ ト を 一 カ 所 も つ loxP-HepaRG ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク

化 を 比 較 可 能 に し た。cDNA は Superscript III First-細胞株を取得した（Fig. 1B）。この loxP-HepaRG 細胞にStrand Synthesis Kid（Life Technologies）を用いて合成し、は、loxP サ イ ト を も つ あ ら ゆ る 発 現 ベ ク タ ー を Cre 酵

LightCycler 480（Roche Applied Science）を用いて通常素を介して容易に導入することができる。次いで、環の定量性 RT-PCR 法で解析した。

状 の CYP3A4G/7R BAC を Cre 発 現 ベ ク タ ー と 共 にloxP-HepaRG に 導 入 す る こ と で、 複 数 の CYP3A4G/7R

2. 4. CYP3A4 タンパク質発現解析

HepaRG トランスジェニック細胞クローンを得た。

ウエスタンブロットは、10−20µg の HepaRG 細胞タン
パク質を 25 % LDS sample buffer（NuPAGE）に溶解し、3. 2. CYP3A4G/7R HepaRG 細胞の特性

5 − 20% SDS-polyacrylamide gradient gel（ATTO）を用得られた全ての CYP3A4G/7R HepaRG 細胞クローンは、いて分離した。Polyvinylidene fluoride membrane にトラ

増殖期には DsRed 蛍光が極めて高い状態であった。これ

ンスファーし、PBS に 3 % スキムミルクを溶解したブロッを分化誘導すると、EGFP 陽性細胞が出現した（Fig. 2）。

キング液を用いて、通常のウエスタンブロット法に従って得られた複数のクローンの中から、分化能が高く EGFP抗体処理した。シグナルは、ECL Plus Western Blotting

陽性率が高く染色体が安定なクローンを選別した。この

Detection Kit（GE Healthcare） を 用 い て 検 出 し た。 使

基準を満たした C3 クローンを中心に詳細な解析を進めた。

用した一次抗体は以下の通り：anti-CYP3A4/7 antibody

C3 クローンは分化培地で培養すると、DsRed 蛍光が著し（rabbit polyclonal, 1 : 5 0 0 ; Enzo）、anti-EGFP（mouseく減少した。一方、EGFP の mRNA 発現は、分化開始時

monoclonal, 1 : 200 ; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）、anti-から 2 週間で 7 倍に増加した。また、EGFP 蛍光量は 7-8

ß-actin（mouse monoclonal, 1 : 5,000 ; Abcam）。

倍に増加し、mRNA レベルの増加率を反映していた。

2. 5. 蛍光陽性細胞のライブイメージング、数的評価および蛍光量解析

発現を親株（WT）の HepaRG とウエスタンブロット法で比細胞の蛍光は通常の倒立型蛍光顕微鏡で観察できる。本ンパク質レベルの CYP3A4 発現に減少していた。これは分化 C3 クローンにおける内在性の CYP3A4 タンパク質較した。WT HepaRG に対して C3 HepaRG は、半分のタ− 84 −

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Figure 1 CYP3A4G/7R HepaRG 細胞の開発とその用途概要
A. CYP3A4G/7R BAC 発現ベクターの概要。
B. loxP-HepaRG 細胞と CYP3A4G/7R HepaRG 細胞の作製手順。
C. CYP3A4G/7R BAC による肝細胞分化モニターの概要。
D. EGFP 蛍光による CYP3A4 発現細胞の濃縮。
E. EGFP 蛍光による CYP3A4 発現誘導性の評価系概要。

Figure 2 CYP3A4G/7R HepaRG 細胞の特性（増殖期）全ての細胞が DsRed 陽性で CYP3A7 発現状態であることを示す。
（分化時）分化細胞の一部が EGFP 陽性の CYP3A4 発現細胞になることを示す。

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遺伝子クローニングによる分可能の低下によると考えられ

り RIF で約２倍、DEX で約 2.5 倍に増加し、NIF と CLOる。しかしながら、ウエスタンブロットで全く CYP3A4で約 3 倍に増加した。一方、PCN では、EGFP 蛍光の増発現が確認できない HepG2 細胞に比べ、十分に高い発現加は見られなかった。よって、CYP3A4G/7R HepaRG 細を示した。また、EGFP の発現量はウエスタンブロット法

胞は、細胞を破壊して行う解析を用いずに CYP3A4 誘導で十分に検出できるレベルであった。CYP3A4 の発現レ性を評価するシステムの構築に寄与できる可能性が高い

ベルの向上は、EGFP 発現の高いトランスジェニック細胞（Fig. 1E）。

クローンの選別や EGFP 陽性細胞の濃縮により更に改善可

４．考能と考えられる。

察

機能的な肝臓細胞は、その機能の研究、化学物質の安全3. 3. DsRedとEGFPを用いた肝細胞分化過程の可視化性試験、薬物代謝酵素 P450 誘導性試験および再生医療研分化開始 5 日目の DsRed 陽性細胞と EGFP 陽性細胞が究など広範な領域で需要が高い。CYP 誘導性や代謝産物混在する分化途中の C3 クローンの細胞集団を FACS 解析の解析結果は、評価に用いる「細胞の質」に大きく左右されした。結果、DsRed 陽性細胞と EGFP 陽性細胞に分離でる。しかし、（1）ヒトの初代培養は機能的に低いヘテロなきたが、共に陽性の細胞集団は検出されなかった。このこ集団であり再現性に乏しい、（2）ヒト肝臓癌由来の細胞株とは、CYP3A7 陽性の胎児肝実質細胞である肝芽細胞は、の多くは胎児性の性質をもつ、（3）薬物代謝や CYP 誘導性

CYP3A7 非発現細胞状態を介して CYP3A4 陽性の肝細胞、には種差があるため動物を用いた評価には false negative

CYP3A4 非陽性の肝細胞および胆管上皮細胞に分化するにより生じた薬害が少なからずある、（4）
ヒト iPS 細胞からことを示している。

は未だ機能的で均質な肝臓細胞を得ることが困難であるな

次に、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムどの諸問題を抱えている。本研究で用いたヒト肝細胞様に CYP3A4G/7R HepaRG C3 ク ロ ー ン の 分 化 の プ ロ セ細胞 HepaRG は、増殖状態では肝細胞としての特性を示さ

ス を 観 察 し た。 結 果、 多 く の DsRed 陽 性 細 胞 が 当 初 非ないが、専用の分化培地で 1 − 2 週間培養すると成熟肝細蛍光細胞となり、その中から EGFP 陽性の細胞が出現し胞の特性を示す。定量性 RT-PCR 解析では、HepG2 細胞た。また、非蛍光細胞の中には、細胞分裂直後に EGFP 陽がヒト成人肝臓の 1 % 程度の CYP3A4 発現量に留まって性となる細胞が存在することが観察されている。よって、いるのに対し、HepaRG 細胞は 120% に達していた。このCYP3A7 を発現していないが増殖能を持つ幹細胞状態をように高い CYP3A4 発現を示す細胞株はかつてなかった。

経て CYP3A4 を発現する成人型肝細胞になる可能性が示

しかし、肝細胞として成熟化していることを見極めるためされた。には、使い頃を判断できる手軽なマーカーが必要であった。

以上の結果は、CYP3A4G/7R BAC ベクターをヒト ES

CYP3A4G/7R BAC ベクターを導入したトランスジェニッ細胞や iPS 細胞に導入したトランスジェニック細胞を作製

ク HepaRG 細胞は、赤から緑へ蛍光がシフトするため、細した場合も、内胚葉状態を経て分化状態をモニターできる胞の分化度が簡単に把握できるようになっている。このよ可能性を示唆している（Fig. 1C）。

うに、HepaRG 細胞の利便性を高めたことで、ヒト肝細胞の初代培養細胞を代替するモデル細胞としての利用が進む

3. 4. FACSによるEGFP 陽性 CYP3A4 発現細胞の濃縮と期待される。

EGFP を指標に CYP3A4 を発現している代謝能の高い

CYP3A4G/7R HepaRG C3 ク ロ ー ン で は、EGFP の 蛍肝細胞を FACS を用いて濃縮できるか検討した。EGFP 陽

光量、EGFP の mRNA および内在性の CYP3A4 の mRNA性細胞と非陽性細胞において内在性の CYP3A4 mRNA 発発現量の変化に対応が見られた。また、生細胞で連続的現を定量性 RT-PCR 法で調べた結果、分化細胞集団からに観察可能なことから、EGFP は遺伝子発現変動をモニタ

CYP3A4 発現細胞を濃縮できることが示された（Fig. 1D）。

ーできる HCS 対応型の良好なレポーター遺伝子になり得る。一方、ルシフェラーゼやbガラクトシダーゼ等の酵素反応

3. 5. CYP3A4 誘導剤によるEGFP 蛍光量の増加を用いた遺伝子発現レポーターシステムの場合は、基質を4 種類（10 µM RIF、25µM DEX、25µM CLO、100 µM添加して染色量や発光量を測定する操作が必要である

5 −7）

。

NIF）の既知の CYP3A4 誘導剤で HepaRG C3 クローンを処

ま た、 作 製 し た CYP3A4G/7R HepaRG 細 胞 は、 内 在 性理し、48 時間後に一定エリアの平均蛍光量を誘導前と比の遺伝子に改変を加えていないため、EGFP 陽性細胞を較した。コントロールとして 0.1% DMSOで処理した。また、

CYP3A4 発現細胞として肝細胞の代わりに使用できる。

CYP3A4 を誘導しないが、マウス Cyp3a11 発現を誘導すこのようなモデル細胞の開発により、再現性と信頼性向上、ることが知られている 25µM PCN で HepaRG C3 クローン

開発期間の短縮と低コスト化、安全性試験に要する実験動を処理した。結果、EGFP 蛍光は、0.1% DMSO 処理群よ物の削減につながると期待できる。

− 86 −

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５．総e104123, 2014.

括２） Bertilsson G, Berkenstam A, Blomquist P,:

本 研 究 で は、 肝 細 胞 が 成 熟 す る と CYP3A7 か ら

Functionally conserved xenobiotic responsive enhancer

CYP3A4 へ発現がシフトすることを利用して、2 色蛍光in cytochrome P4 5 0 3A7. Biochem Biophys Res
Commun 280: 139-144, 2001.に基づき（1）肝細胞の分化度のモニター、（2）分化因子の同定、（3）肝細胞の分取、（4）CYP3A4 誘導性評価などが３）Gripon P, Rumin S, Urban S, Le Seyec J, Glaise D, et

可能なヒト肝モデル細胞 HepaRG 細胞を作製した。今後、al.: Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis

HepaRG 細胞の遺伝子発現プロファイルをヒト肝細胞に更B virus. Proc Natl Acad Sci U S A 9 9: 1 5 6 5 5-1 5 6 6 0,
2002.に近づける工夫を加えることで、汎用化が期待される。また、この細胞は肝細胞の分化過程を促進する培養条件の探４）Antherieu S, Chesne C, Li R, Camus S, Lahoz A,索に有効である。これにより、ヒト iPS 細胞から機能的なet al.: Stable expression, activity, and inducibility of

肝細胞を作り出す条件が明らかにできると期待される。結cytochromes P450 in differentiated HepaRG cells. Drug

果、ヒト iPS 細胞を用いた肝臓の「再生医療」の加速化へのMetab Dispos 38: 516-525, 2010.
５）Robertson GR, Field J, Goodwin B, Bierach S, Tran

波及効果も期待できる。

M, et al.: Transgenic mouse models of human CYP3A4

謝辞gene regulation. Mol Pharmacol 64: 42-50, 2003.

本研究遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりご６）Tirona RG, Lee W, Leake BF, Lan LB, Cline CB, et al.:The orphan nuclear receptor HNF4alpha determines

支援賜り深く感謝申し上げます。

PXR- and CAR-mediated xenobiotic induction of（参考文献）

CYP3A4. Nat Med 9: 220-224, 2003.

１） Tsuji S, Kawamura F, Kubiura M, Hayashi A,７）Zhang W, Purchio AF, Chen K, Wu J, Lu L, et al.:C, Oshimura M,

A transgenic mouse model with a luciferase reporter

Tada M, : Dual-colour fluorescence imaging to monitor

for studying in vivo transcriptional regulation of theCYP3A4 and CYP3A7 expression in human hepatic

human CYP3A4 gene. Drug Metab Dispos 3 1: 1 0 5 4-carcinoma HepG2 and HepaRG cells. PLOS ONE, 9(8):1064, 2003.

Ohbayashi T, Kazuki Y, Chesné− 87 −