膜透過性ナノ集合体を封入した固体エマルションの開発

山口大学大学院理工学研究科

通阪

栄一

A transdermal administration on drugs has been limited due to very low permeability of drugs across skin. Especially, it
is generally regarded that hydrophilic macromolecules such as proteins, peptides, and vaccines cannot penetrate across skin.
In this study, a solid emulsion containing membrane permeability nanoassembly was developed for the transdermal deliveryof the protein drugs. The nanoassembly was formed by the complex of surfactant and protein. The usage of a solid fat andgel-vegetable oil as oil phase of the emulsions was examined. Moreover, the surface of oil droplets was coated by the layerby-layer method with polymer electrolyte. These methods made the stability of the emulsion enhance.
In addition, the membrane permeability of protein was evaluated using the artificial epidermal membrane. In this study,
the acceleration of protein transport was largely induced by the compatibility of the nanoassembly with the hydrophobic
epidermal membrane. It is thus possible that the emulsion containing the nanoassembly resulted in the acceleration of proteintransport across the epidermal membrane.

１．緒れるため，角質層の脂質に浸透しやすい微粒子であり，キ言ャリアとしての利用も検討されている 5, 6）。
このように，タンパク質の経皮投与が試みられているが，近年，動物細胞や微生物を利用して，ペプチドやタンパク質などのバイオ医薬品の製造が活発に行われている。こ体内取り込み量は，注射で投与した場合と比べて極端に低れらバイオ医薬品は，低分子医薬品に比べ効果が大きく副く，また安全性の面で使用が制限されるものもあり，十分作用も少ないため，期待は非常に大きい。これらの分子のな成果は得られていない。

大部分は確実に体内へ導入できる注射により投与されてい我々は，これまでに膜透過性に優れた脂質集合体を開発るが，患者の苦痛を回避し，患者自身が簡便に投与できる，した 7−8）。この膜透過性ナノ集合体は，界面活性剤でタン塗る製剤の開発が望まれている。

パク質をコーティングすることで形成され，表面を脂溶性塗るタンパク質製剤において最大の障壁は，表皮最外層に改質することで，細胞膜との親和性が高くなり，タンパの角質層のバリアーである。角質層は死細胞からなる疎水ク質の細胞への導入を促進することが確認されている。こ性の高い多層膜であり，外部物質の皮膚浸透において高いの膜透過性ナノ集合体は，調製が簡便，薬物封入率が高い，バリアー機能を示す。特に，親水性高分子であるタンパク安定性が高い，タンパク質の大きさ・化学的特性に関係な質は，この疎水性膜の通過が困難である。これまでに，親く封入でき，内封後の活性維持も可能といったタンパク質水性高分子のタンパク質の吸収性改善を目指して物理的なキャリアに適した特徴を持っており，化粧品への利用価値方法や化学的手法が検討されている。

も高い技術である。そこで本研究では，このナノ集合体を例えば，物理的な方法として，マイクロニードルにより油に分散させ乳化した Solid-in-Oil-in-Water（S/O/W）エマ角質層だけに小孔を開ける手法や，エレクトロポレーショルションをタンパク質のキャリアとして応用し，皮膚透過ンで脂質に揺らぎを与える，あるいはソノフォレシスでキ性に優れた製剤の開発を目指している。

ャビテーションを与えることで一過性の小孔を形成させる手法がある

1−3）

塗るタンパク質製剤の開発のために，まず不安定なコロイド粒子であるエマルションを安定化し長期保存可能な皮。

また，化学的な方法としては，角質層に存在する脂質に膚透過性の高い S/O/W エマルションの調製が不可欠であ作用し薬物の浸透性を向上させる低分子化合物が利用される。本報告では，S/O/W エマルションの安定化のため固4）る 。また，エマルションやリポソームは脂質から形成さ体エマルションの調製法について検討した結果を報告する。
また，S/O/W エマルションの皮膚透過性を確認する前段階として，人工膜をモデルとし，S/O サスペンションを用いたときの膜透過性についても検討を行った。

Development of solid emulsions containing
membrane permeability nanoassembly
Eiichi Toorisaka
Graduate school of science & engineering,
Yamaguchi University

２．実験

2. 1. S/O/Wエマルションの調製− 55 −

ウシ血清アルブミン（BSA）水溶液（10 mL）とショ糖エル

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

カ酸エステル（ER-290）含有ヘキサン溶液（20 mL）をホモンパク質の濃度を，吸光光度計（280 nm），あるいは DCジナイザー（ULTRA-TURRAX T25: IKA Labortechnik）

Protein Assay により測定した。

（24000 rpm，2 min） で 高 速 攪 拌 後， 一 晩 凍 結 乾 燥 し（FREEZE DRYER FD-1000: EYELA），界面活性剤 - 薬物

2. 4. 2. 粒子特性評価集合体を得た。その後，複合体を大豆油（10 mL）と混合し，レーザー回析/散乱式粒度分布測定装置（LA-920 : HORIBA）

超音波発振機を用いて分散させることで，S/O サスペンシを用いての粒度分布測定及び光学顕微鏡を用いての観察をョンを調製した。

行った。

調製した S/O サスペンション（5 mL）と 1 wt% 水溶性界面活性剤（コール酸ナトリウムと Tween20）含有水溶液

また，エマルション表面電荷の測定のため，ゼータ電位測定を行った。

（10 mL）をホモジナイザー（ULTRA-TURRAX T25: IKALabortechnik）（13500 rpm，1 min）で高速攪拌し，S/O/

2. 5. 膜透過性評価

W エマルションを調製した。その後，親水性シラス多孔

2. 5. 1. 評価用パッチの調製質ガラス膜（SPG）を用いて膜乳化を行うことで，エマルションの油滴粒子径の制御を試みた。

5 wt% エチルセルロースのアセトン溶液を調製し，円形（外枠：厚さ 1.0 mm，直径 6.0 mm, 内枠：厚さ 1.0 mm，直径 4.8 mm）の型に 0.04 mL 滴下し，室温下で乾燥させた。

2. 2. 油相の固体化

次に，3 wt% ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）を，エ2. 1. の大豆油の代わりにカカオ脂を用いて同様に調製

チルセルロース層上に 0.1 mL 滴下し，一昼夜凍結乾燥さした S/O/W エマルションを調製した。また，2. 1. と同様

せ HPC 多孔質層をもつパッチを調製した。その後，HPCに S/O サスペンションを調製した後，1 wt% 植物（唐ゴマ）

層に S/O サスペンション 0.02 mL を含浸させ，パッチ製剤抽出の天然油脂系脂肪酸を油滴のゲル化剤として S/O サを調製した。S/O サスペンションには FITC 修飾インスリスペンションに添加し，同様の方法で乳化した S/O/W エン（FITC-Ins）を封入した。脂溶性集合体中の界面活性剤マルションを調製した。

としては，ショ糖エルカ酸エステル（ER-290），ショ糖オレイン酸エステル（O-170），ショ糖ラウリン酸エステル（L-2. 3. 交互積層法による高分子コーティングエマルショ
ンの調製195），ポリグリセリンエルカ酸エステル（ER-60D），ポリグリセリンオレイン酸エステル（O-50D）を使用した。

スターラーで攪拌した高分子溶液（10 mL）に，S/O/Wエマルション溶液（ 5 mL）を滴下（1 mL/min）した。滴下後，2. 5. 2. 人工角質層膜を用いた膜透過性評価

そのまま 10 分間攪拌した。高分子溶液としては，カチオ水平拡散セルを用いて膜透過実験を行った。膜透過性ン性であるキトサン溶液とアニオン性であるアルギン酸ナの評価には，人工膜（疎水性メンブレンフィルターに 10トリウム溶液を交互に用いてコーティングを行った（図 1）。

wt% レシチンと 0.5 wt% コレステロールを含むドデカン溶液を含浸させたもの）を用いた。パッチ製剤を人工膜に貼

2. 4. エマルション特性評価

り付け，セル中にリン酸緩衝液を入れ，膜透過実験を行っ

2. 4. 1. 安定性評価

た。このとき，恒温槽（EYELA BATH SB-9，EYELA）を調製した S/O/W エマルション及び粘膜付着性微粒子を用いてセルの温度を 37℃に保った。時間毎に溶液を採取し，4 ℃で静置し，エマルション内へのタンパク質の封入量

FITC-Ins を蛍光分光光度計（VersaFluorTM Fluometer，の経時変化を評価した。封入量は，外水相に漏洩したタBIO-RAD）（励起波長 490 nm，蛍光波長 520 nm）で測定した。

図1

交互積層法概念図− 56 −

膜透過性ナノ集合体を封入した固体エマルションの開発た。油相を固めることにより，内部に封入した膜透過性ナ

３．結果と考察

ノ集合体の移動が阻害され，安定性が向上すると考えた。

3. 1. エマルションの粒子径制御固化する方法として，固体脂であるカカオ脂を利用する

一般に，エマルションの粒子径が細かく均一であるほど，エマルションは安定化する。また，粒子径を小さく揃える

方法と，天然油脂系脂肪酸をゲル化剤として油滴をゲル化する方法を試みた。

ことで，皮膚との接触面積の向上により，より迅速で効率安定性の結果を図 3 に示す。カカオ脂を用いたときも，的なタンパク質の吸収が望め，また，使用感の向上にも繋ゲル化剤を用いたときも，封入率に減少が見られた。特にがると考えられる。

カカオ脂で，初期の漏洩が多い傾向がみられた。カカオ脂

そこで，膜乳化による粒子径の制御を試みた。図 2 に，を用いた場合，粒子の調製中に固化と融解を繰り返すこと調製した S/O/W エマルションの粒度分布及び光学顕微鏡により膜透過性ナノ集合体が不安定化したため，より多く写真を示す。ホモジナイザー攪拌後，膜乳化を行うことでのタンパク質が漏洩したと考えられる。

膜の細孔径に沿った粒子径にエマルションを制御できるこ

3. 3. 高分子コーティングエマルションとが確認された。

油滴の固化では充分な安定性が得られなかったことから，

3. 2. 油相の固体化

油滴表面を高分子コーティングすることで固体化すること安定な固体エマルションを得るため，油相の固化を試みを試みた。

（a）

（b）

（c）

（d）

図 2 S/O/W エマルションの粒度分布及び光学顕微鏡写真（a）粒子径分布（b）
ホモジナイザー攪拌後（c）膜乳化後（細孔径 5.1μm）（d）膜乳化後（細孔径 1.0μm）

図3

油種による BSA 封入率の経時的変化− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

アニオン性界面活性剤で S/O/Wエマルションを調製し，そのエマルションをカチオン性高分子の溶液に加えること0.25 より大きくなると電解質高分子溶液中が大きく増加した。

で，油滴表面を高分子コーティングすることを試みた。さらノニオン性の Tween20 のみのエマルションは，電解質に，エマルション表面に対してカウンターイオンとなるイオン性高分子との相互作用がないため，電解質高分子溶液中でも高分子溶液を，交互に用いることで多層コーティングを試みた。

粒子径に変化がなかったと考えられる。一方でアニオン性のコール酸ナトリウムの割合が大きい場合，カチオン性の3. 3. 1. 水溶性界面活性剤の影響キトサンと相互作用も大きくなると考えられる。その結果，交互積層法では，粒子表面と高分子間の静電的相互作用によって，粒子に高分子コーティングを行う。そのため，エマルション同士の凝集がおき，最終的にエマルションの融合が生じ粒子径が大きく増加したと考えられる。

表面電荷の制御が良好な粒子調製に重要である。そこで，

結果として，エマルション表面の電荷が大きすぎると安はじめにノニオン性界面活性剤である Tween20 とアニオ定な粒子を調製できず，水溶性界面活性剤として 0.1 wt%ン性界面活性剤であるコール酸ナトリウムを用い，その割コール酸ナトリウムと 0.9 wt% Tween20 の条件でエマル合を変化させた場合の粒子特性への影響を検討した（図4，5）。

ション調製を行うと，エマルションの安定性が維持できるTween20 のみを用いたエマルションの場合，電解質高ことが確認された。

分子溶液中での粒子径に，ほとんど変化は見られなかった。

続いて，この条件で実際に，電解質高分子がコーティン

また，コール酸ナトリウムの割合が 0.1 の時も，粒子径のグされているか調べるため，エマルションのゼータ電位を変化は少なかった。しかし，コール酸ナトリウムの割合が測定した（図 6）。カチオン性のキトサンとアニオン性のア

図 4 キトサンコーティングエマルションの光学顕微鏡写真（a）条件②（コール酸割合 0.1） （b）
条件③（コール酸割合 0.25）

図5

図6

高分子コーティング後の粒子径変化

高分子コーティングエマルションのゼータ電位変化− 58 −

膜透過性ナノ集合体を封入した固体エマルションの開発

ルギン酸ナトリウムの水溶液にエマルションを交互に浸す角質層の透過性を向上させることを目指している。ここでことにより，ゼータ電位が大きく変化していることから，は，集合体の効果を確認するためにエマルション中の油相エマルション表面にそれぞれの高分子がコーティングされ（S/O サスペンション）を用いた疎水膜透過性評価を行った。ていることがわかる。これらの結果から，この条件で調製角質層のモデルとして，疎水性メンブレンフィルターに10 wt% レシチンと 0.5 wt% コレステロールを含むドデカした粒子を以下の検討で用いた。

ン溶液を含浸させた人工膜を用い，S/O サスペンションの3. 3. 2. 安定性評価

膜透過性を評価した。脂質集合体による膜透過性改善効果

高分子コーティングにより，タンパク質の漏洩を防ぐこの確認と，その組成の最適化を行った。とができるかを検討した（図 7）。コーティングしていないはじめに脂質集合体の効果を確認した（図 8）。インス

エマルションでは，24 時間後には BSA の封入率は 80% 以リン水溶液，およびインスリンを油に分散させたもので下にまで減少した。一方，高分子をコーティングしたエマは，ほぼ透過しなかった。一方で S/O サスペンションでは，ルションでは，タンパク質の漏洩は減少した。また，多層膜透過が確認された。脂質集合体が人工膜へ分配することコーティングしたエマルションでは，より漏洩を防ぐことで膜透過したものと考えられる。疎水性の細胞膜のモデルが可能であり，キトサン - アルギン酸 - キトサンと 3 重にコとして用いた人工膜においてタンパク質の透過が確認できーティングした場合では，24 時間後でも 95% 以上の安定たことから，外部物質の皮膚浸透において高いバリアー機性を示した。

能を示す角質層も脂質集合体を用いることで効果的に透過できる可能性は高いと考えられる。

3. 4. 膜透過性評価

続いて，界面活性剤の種類の影響について検討を行った。

本研究ではタンパク質を界面活性剤でコーティングした結果を図 9 に示す。ER-290 が最も透過性が低く，ER-60D

膜透過性集合体により疎水性バリアとなっている皮膚表面や O-50D のようなポリグリエステルを用いた脂質集合体

図7

高分子コーティングエマルションの BSA 封入率の経時的変化

図 8 インスリンの膜透過挙動（●）インスリン水溶液，（■）インスリンを分散させた大豆油，（▲）S/O サスペンション

図 9 界面活性剤の影響（●）ER-290，（■）O-170，（▲）L-195，（◆）ER-60D，（▼）O-50D− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015において透過性が向上することが分かった。また，界面活性剤のアルキル鎖を比較すると，アルキル鎖の短い界面活性剤を用いたパッチの場合に透過性が向上することが確認された。したがって，膜透過性を改善する界面活性剤としては，ポリグリエステルでなおかつアルキル鎖長の短いものが適していると考えられる。
続いて，膜透過挙動への界面活性剤濃度の影響を検討した。図 10 に各界面活性剤濃度での 180 分後の透過率を示す。界面活性剤濃度 1 wt% で調製した S/O サスペンションの場合に著しく膜透過率が低いことが確認された。これは，タンパク質の周囲を界面活性剤が十分にコーティングすることが出来なかったためだと考えられる。また，界面活性剤濃度が 5 wt% 以上になると，膜透過率が低下した。

図 10

界面活性剤濃度における透過率の変化（180 min 経過後）

これは，界面活性剤濃度が高くなるにつれて粘性も高くなり，複合体の拡散の妨げになるためだと考えられる。
以上から，S/O サスペンションを用い効率的にタンパク質を皮膚透過させるためには，適した界面活性剤の選択と，安定な脂質集合体の調製が重要であると考えられた。また，透過速度には脂質集合体の拡散が大きく寄与していると考えられた。S/O/W エマルションは，パッチより微粒子化することにより表面積が拡大し，より速やかな拡散が起こ（引用文献）

ると考えられることから，皮膚透過に有利な剤型であると１）Tokumoto S, Higo N, Sugibayashi K, : Effect ofelectroporation and pH on the iontophoretic transdermal

予測される。

４．総

delivery of human insulin.

括２）Wu X-M, Todo H, Sugibayashi K, : Enhancement

本研究では，固体化 S/O/W エマルションの調製法につof skin permeation of high molecular compounds

いて検討を行った。エマルションの固体化により，安定性by a combination of microneedle pretreatment andの向上を予測したが，油滴の固化という方法では，充分なiontophoersis, J. Control. Release, 118, 189-195, 2007.

安定性が得られず，カカオ脂を用いた場合は，固体化した

３）Paliwal S, Mitragotri S, : Ultrasound-induced cavitation:場合の方が，安定性が減少するという結果が得られた。調Applications in drug and gene delivery, Expert Opin.

製時のカカオ脂の状態変化が，膜透過性ナノ集合体の不安

Drug Deliv., 3, 713-726, 2006
４）Williams A, Barry B, : Penetration enhancers, Adv.

定要因になったのではないかと推察される。

Drug Deliv. Rev., 64, 128-137, 2012.

エマルション表面を高分子コーティングする方法では，エマルション表面の電荷の制御が，安定した粒子調製のた５）Kajimoto K, Yamamoto M, et al. : Noninvasive andめに重要であることが確認された。また，多層コーティン

persistent trans follicular drug delivery system using a

グしたエマルションにおいて，安定性の向上も確認された。

combination of liposomes and iontophoresis, Int. j. Pharm.,
403, 57-65, 2011.

また，人工膜を用いた S/O サスペンションの膜透過性について検討した。その結果，脂質集合体にすることでタ６）Korr F, Lademann J, et al. : Follicular transport route-

ンパク質を効果的に膜透過させることができることが確認

Research progress and future perspectives, Eur. J.

された。またタンパク質にコーティングする界面活性剤のPharm. Biopharm., 71, 173-180, 2009.

種類により透過に大きな違いがあること，油相中での集合

７）Toorisaka E, Ono H, et al. : Hypoglycemic effect of

体拡散速度が透過速度に大きく影響することが確認された。

surfactant-coated insulin solubilized in a novel solid-in-

今後は，さらにエマルションのコーティング基材の検討

oil-in-water (S/O/W) emulsion, Int. J. Pharma., 2 5 2, 2 7 1274, 2003.

を行い，安定性に優れ，ハンドリングの良い粒子の開発を目指して検討を続ける予定である。タンパク質の低侵襲投

８）Toorisaka E, Watanabe K, et al., : Intestinal patches

与法としての経皮デリバリー技術の確立を実現したいと考with an immobilized solid-in-oil formulation for oralえる。

protein delivery, Acta Biomater., 8, 653-658, 2012.

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