2020年 AJACSオンライン３
11月11日メタゲノム解析(webアプリで解析)
森 宙史, Ph.D.
(Hiroshi Mori)
国立遺伝学研究所
情報研究系
hmori@nig.ac.jp
1

• メタゲノム解析概論• マイクロバイオーム解析の情報解析について

2

微生物 & 微生物群集（細菌群集）• 小さい• 多様• 様々な機能を担う（代謝、宿主の免疫の獲得等）

数%ぐらいの菌しか培養できない3

Metagenomics (since 1998)
Genome analysis against “Microbial community”
to know member compositions and functions““““““““““““““““““““““““2016 DBCLS TogoTV / CC-BY-4.0

Microbiota
sampling

DNA extraction
from microbes

DNA sequencing

Bioinformatics
analysisWhat’s metagenomics?
• Microflora, microbiota, microbial community: 微生物群集
Total collection of microorganisms within a community
Microflora: [Greaves. 1926, 少なくとも]• Metagenome: ある群集の遺伝情報の総体
Total genomic potential of a community[Handelsman et al. 1998, Chem. & Biol.]• Microbiome: マイクロバイオーム
Micro+biome or Microbio + ome?
Microbiota and metagenome in a microbial community

5

amplicon sequencing analysis(アンプリコン解析, 16S rRNA遺伝子のアンプリコン解析)
Pre-analysis (Remove Primer, Chimera etc.)
Sequence clustering or denoising
DNA extraction

PCR amplification

Taxonomic assignment andComparison between samples

0.00.20.40.6

0.81.0DNA Sequencing

TestSample2

2016 DBCLS TogoTV / CC-BY-4.0

SRR061008

SRR061006

SRR061003

SRR061004

SRR095659

SRR094400

Who’s there?

SRR090399

TestSample1

SRR094717

6

16S ribosomal RNA (16S rRNA)・ リボソームの核となるRNAの一つ
・ 全ての細菌が所持
・ 配列間の結合によって高次構造を形成 (保存されているサイトと多様なサイトがモザイク状に存在)・ 系統マーカー遺伝子の代表例
・ 100万本以上の配列がデータベースに登録済み
・ 多くの細菌がゲノム内に複数の遺伝子コピーを所持
・ 全長約1500 base
16S rRNA遺伝子は広範囲の細菌における系統推定を行う上で適した遺伝子
7

Woese et al. 1990, PNASMetagenomic sequencing analysis(メタゲノム解析, ショットガンメタゲノム解析)(メタトランスクリプトーム解析)

Metagenomic reads
Assemble

MEGAHIT,metaSPAdes, etc.

Contig sets

DNA extraction / RNA extraction

Gene finding

Reverse transcription

Prodigal,
MetaGeneMark, etc.

Gene sets

DNA Sequencing

2016 DBCLS TogoTV / CC-BY-4.0

Sequence similarity
searchSample1
Metadata
Sample2
Metadata

Comparative
metagenomics

Who’s there?

BLASTP,DIAMOND,
MMseqs2, etc.

Gene Function abundance
Pathway abundance
Pathway reconstruction
Taxonomic abundance
What are they doing?8

アンプリコン解析もメタゲノム解析も、DNA抽出法が極めて重要
微生物は細胞膜外の構造が多様。胞子形成の有無もDNA抽出効率に影響。

• 微生物群集解析用の代表的なDNA抽出法• 酵素法（Lysozyme, Proteinase, RNase等の組み合わせ)• ビーズ破砕法• フェノールクロロホルム法• アルカリ法• 煮沸法• 短鎖型か長鎖型のシーケンサーを使うかによっても変わる
9• せっかく長く読めるのに、元のDNAがズタズタだと意味が無い環境サンプルからのDNA抽出の難しさ
多様々な夾雑物の存在
阻害物質の• 酵素反応阻害物質
存在量• フミン酸• DNase, RNase, proteinase• DNAの架橋促進物質

FFPE

植物組織 糞便

土壌バイオフィルム
血液微生物コロニー

DNA抽出の難しさ

難ターゲットのDNAが極少量の場合• Host DNA/RNA• 大量のRibosomal RNA• キットや水、試薬中のコンタミDNA

Goffau et al. 2018, Nature Microbiol.
10

自分で条件検討をするのは大変なので、先行研究を参考にすべき

微生物の系統間でのDNA抽出バイアスの評価
あらかじめ細胞の混合量が決まったmock community
をDNA抽出法間の評価に用いる例:
HMP-ATCC mock
ZymoBIOMICS mockhttps://www.zymoresearch.com/collections/zymobiomics-microbial-community-standards/products/zymobiomics-microbial-community-standard

11

アンプリコン解析
利点
・安価かつ少量のDNAから系統組成が得られる
・reference配列に依存しない解析も可能
・マシンパワーは少なくて済み、解析ツールも普及（QIIME2・DADA2等）

欠点
・PCRバイアスの存在
・種以下は分解能に問題あり
・個々の系統が持つ機能が不明

メタゲノム解析
利点
・系統組成と遺伝子機能組成が得られる
・実験によるバイアスが少ない
・優占系統のドラフトゲノムの構築（条件が良ければ可能）

欠点
・reference配列に依存した解析・目的依存で解析手法が変化し、マシンパワーも必要

12マイクロバイオーム解析の情報解析について（アンプリコン解析）

13

アンプリコン解析もメタゲノム解析も、Webブラウザ上やソフトウェア上でのマウスクリックのみでは解析困難
UNIXのスキルや自分のマシンでの解析スキル等が、意義ある結果を得るためにはほぼ必須

14amplicon sequencing analysis(アンプリコン解析, 16S rRNA遺伝子のアンプリコン解析)
Pre-analysis (Remove Primer, Chimera etc.)
Sequence clustering or denoising
DNA extraction

PCR amplification

Taxonomic assignment andComparison between samples

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

DNA Sequencing

TestSample2

2016 DBCLS TogoTV / CC-BY-4.0

SRR061008

SRR061006

SRR061003

SRR061004

SRR095659

SRR094400

Who’s there?

SRR090399

TestSample1

SRR094717

15

Bioinformatics methodology difference of ampliconsequencing before and after NGS
Before NGS: (100-1,000 reads / sample)
multiple alignment & phylogenetic tree based analysis (e.g., UniFrac,DOTUR, ARB, Bellerophon)
Accurate but slow

After NGS: (10,000-100,000 reads / sample)
sequence clustering & sequence similarity search (e.g., CD-HIT,USEARCH/UCLUST/UPARSE, Fast UniFrac, PyNAST, RDP classifier)
Fast but accuracy?
いわゆるOperational taxonomic unit (OTU)クラスタリング
16

OTU clustering problem
例: 16S rRNA遺伝子について、配列類似性97%（種レベル）で配列をクラスタリング• OTUの代表配列• OTUのメンバーの配列• 所属が曖昧な配列

3%

一律の配列類似性でクラスタリングする限り、所属が曖昧な配列が出ることは避けられない。
17

Denoising & Dereplicatione.g., DADA2 (R), Deblur
1. remove sequencing error in reads by model-based approach
2. dereplicate complete match reads to one representative read
3. conduct taxonomic assignment
Denoising & Derep. approachの結果得られた完全マッチクラスタを
Amplicon sequence variant (ASV), Exact sequence variant (ESV),Zero-radius OTU (ZOTU)等と呼んでOTUと区別する

Callahan et al. 2016, Nature Methods.

18amplicon sequencing analysis(アンプリコン解析, 16S rRNA遺伝子のアンプリコン解析)
Pre-analysis (Remove Primer, Chimera etc.)
Sequence clustering or denoising
DNA extraction

PCR amplification

Taxonomic assignment andComparison between samples

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

DNA Sequencing

TestSample2

2016 DBCLS TogoTV / CC-BY-4.0

SRR061008

SRR061006

SRR061003

SRR061004

SRR095659

SRR094400

Who’s there?

SRR090399

TestSample1

SRR094717

19

16S rRNA gene reference DB• SILVA(https://www.arb-silva.de/)Taxonomy: List of Prokaryotic Names withStanding in Nomenclature (LPSN)
License: CC BY
Last update: Aug. 2020

• Greengenes(http://greengenes.secondgenome.com/)
Taxonomy: NCBI Taxonomy (modified)
License: CC BY SA
Last update: Oct. 2013

• RDP
(https://rdp.cme.msu.edu/)
Taxonomy: Bergey's Manual
License: CC BY SA
Last update: Sep. 2016

Balvociute & Huson, 2017, BMC Genomics
20

サンプルごとの系統組成 or ASV組成が得られた後の解析• 組成のグラフ化• 主成分分析• サンプル間の組成の距離計算• 多次元尺度構成法や階層的クラスタリング• 群間の統計的仮説検定• 注目する系統についてのより詳細な解析および検索得られるデータはあくまで相対量であり、絶対量（細胞数）のデータでは無い点に注意が必要
21

https://qiime2.org/

Quantitative Insights Into Microbial Ecology

22

Overview of an example of QIIME2 workflow
https://docs.qiime2.org/2020.8/tutorials/overview/23https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html

24https://www.arb-silva.de/25

16S rRNA gene reference DB• SILVA(https://www.arb-silva.de/)Taxonomy: List of Prokaryotic Names withStanding in Nomenclature (LPSN)
License: CC BY
Last update: Aug. 2020

• Greengenes(http://greengenes.secondgenome.com/)
Taxonomy: NCBI Taxonomy (modified)
License: CC BY SA
Last update: Oct. 2013

• RDP
(https://rdp.cme.msu.edu/)
Taxonomy: Bergey's Manual
License: CC BY SA
Last update: Sep. 2016

Balvociute & Huson, 2017, BMC Genomics
26https://ngs.arb-silva.de/silvangs

27https://ngs.arb-silva.de/silvangs

28https://ngs.arb-silva.de/silvangs

29https://ngs.arb-silva.de/silvangs

30http://vitcomic.org(Mori et al. 2018, BMC Systems Biol.)VITCOMIC2の結果サンプルの属組成が得られる

クラスタリングしないのでメタゲノム解析にも使える全配列のRDPデータベースへの配列類似性検索を行い、Identity ≥ 97%のHitを集計した結果

32

https://microbedb.jp/33

MicrobeDB.jp version 3 data
Data category
Prokaryote genome metadata (from RefSeq)

Number of entry
290,208
genomes

Culture collection strain metadata fromJCM/NBRC (from RDF-Portal)

38,414 strains

Microbiome metadata (from INSDC BioSample)

1,631,611
samples

Microbiome taxonomic composition data
Microbiome functional composition data

96,766 samples
4,784 samples

Version2と比べて、ゲノムは約20倍、メタゲノムは約10倍
Licensed under a Creative Commons 表示4.0国際ライセンス©2020森宙史（国立遺伝学研究所）

Search and compare microbiome samples from soil

35

MeGAP3 (MetaGenome Analysis Pipeline for MicrobeDB.jp ver. 3）36

Latent Environment Allocation (LEA)(Higashi K et al. 2018, PLoS Comp Biol)

Hierarchical Bayesian model ＋
Neural network

Taxonomiccomposition
calculated fromDNA sequence

Naturallanguage data
related toenvironments

MicrobeDB.jp

Visualization of microbialcommunity compositions withenvironment topics

http://leamicrobe.jp/37

http://leamicrobe.jp/38

How to map your metagenome data on LEA

fastq
files

VITCOMIC2（http://vitcomic.org/）

LEA（http://leamicrobe.jp/）~ 6 min. /a sample(100,000sequences)~ 0.5 sec. /a sampleclusterfiles(taxonomiccompositions)

Visualization of your microbialcommunity compositions withenvironment topics
39

マイクロバイオーム解析の情報解析について（メタゲノム解析）

40Metagenomic sequencing analysis(メタゲノム解析, ショットガンメタゲノム解析)(メタトランスクリプトーム解析)

Metagenomic reads
Assemble

MEGAHIT,
metaSPAdes, etc.

Contig sets

DNA extraction / RNA extraction

Gene finding

Reverse transcription

Prodigal,
MetaGeneMark, etc.

Gene sets

DNA Sequencing

2016 DBCLS TogoTV / CC-BY-4.0

Sequence similarity
searchSample1
Metadata
Sample2
Metadata

Comparative
metagenomics

Who’s there?

BLASTP,DIAMOND,
MMseqs2, etc.

Gene Function abundance
Pathway abundance
Pathway reconstruction
Taxonomic abundance
What are they doing?
41Taxonomic assignment strategy?
Coverage ofref.
sequences

Singlecopy ingenomes?

Can analyze
eukaryotes
and virus?

Robustagainst
HGT?

Example oftools

16S rRNAgenes◯××◯

VITCOMIC2,MAPseq

Single copygenes

△

◯×

◯

MAPLE,mOTU2

Unique marker
genes

△

◯×

◯?

MetaPhlAn2

Read mapping△×◯×

BWA-MEM,
Centrifuge

k-mer

△×

◯×

Kraken2,
Mash42

パスウェイデータベース
メタゲノムでは、KEGGのKEGG Orthologyを遺伝子機能の単位として使うことが多い
https://www.genome.jp/kegg/ko.html

ただし、KEGGのアミノ酸配列データとKO IDとの対応関係を手軽に取得するためのKEGG FTPサイトへのアクセスは有料

ある程度遠縁なアミノ酸配列も探せる配列類似性検索ツール
Nature Methods. 2015

Nature Biotech. 2017

Bioinformatics. 2014

Bioinformatics analysis strategy?
Fulllengthgenes

GeneneighborDraftgenomeMinortaxa

HGT

Machinepower

Sensitivity
against ref.
seq.

Assembly◯◯△×◯

highhigh

Assembly+ Binning

◯

◯◯

×

△

highhighReadmapping

×××

◯×

low

low

Readbased CDS

△××

◯

×

middlehigh45

Comparison between projects?
DB名

運営組織

DB URL

公開年

2007

受け付ける
配列データ

主な系統の参照DB

主な遺伝子機能の参照DBリード

SILVA,
Greengenes

SEED, KEGG,
eggNOG

408,442

サンプル数（ 2019年末）

MG-RAST

シカゴ大学, https://www.
USA
mg-rast.org/

IMG/M

JGI, USAhttps://img.jgi 2006
.doe.gov/m/Contig,Scaffold

NCBI
TaxonomyPfam, KEGG,
COG

31,406

MGnifyEBI, EU

https://www.
ebi.ac.uk/metagenomics/

2013

リード

SILVA

Gene
Ontology

215,082

MicrobeDB.jp
version 3

国立遺伝学研究所,
Japan

https://microbedb.jp

2011

リード

RDP, NCBI
Taxonomy

KEGG

1,631,611(96,766)46

https://www.mg-rast.org/

47

https://www.mg-rast.org/mgmain.html?mgpage=search48

https://www.mg-rast.org/mgmain.html?mgpage=overview&metagenome=mgm4902120.349https://www.mg-rast.org/mgmain.html?mgpage=overview&metagenome=mgm4902120.350

https://www.ebi.ac.uk/metagenomics/

51

https://www.ebi.ac.uk/metagenomics/pipelines/4.152https://www.ebi.ac.uk/metagenomics/analyses/MGYA00373091#qc

53

https://www.ebi.ac.uk/metagenomics/analyses/MGYA00373091#taxonomic

54https://www.ebi.ac.uk/metagenomics/analyses/MGYA00373091#functional/go55

Comparison between projects?
DB名

運営組織

DB URL

公開年

2007

受け付ける
配列データ

主な系統の参照DB

主な遺伝子機能の参照DB

リード

SILVA,
Greengenes

SEED, KEGG,
eggNOG

408,442

サンプル数（ 2019年末）

MG-RASTシカゴ大学, https://www.
USA
mg-rast.org/

IMG/M

JGI, USAhttps://img.jgi 2006
.doe.gov/m/Contig,Scaffold

NCBI
TaxonomyPfam, KEGG,
COG

31,406

MGnifyEBI, EU

https://www.
ebi.ac.uk/met
agenomics/

2013

リード

SILVA

Gene
Ontology

215,082

MicrobeDB.jp
version 3

国立遺伝学研究所,
Japan

https://microbedb.jp

2011

リード

RDP, NCBI
Taxonomy

KEGG

1,631,611(96,766)

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