ツバキ油に含まれるトリテルペンの生合成研究

東京大学大学院薬学系研究科

渋 谷

雅 明

Camellia oil is used as a base material in oil-based cosmetics, and rates high quality oil due to high composition of oleate
glycerides. In addition to fatty acid glycerides, camellia oil contains triterpenes as minor constituents. Although effectivenessof triterpenes in camellia oil is uncovered yet, triterpenes specific for camellia oil likely characterize camellia oil as a goodmaterial in cosmetics, which are seco-triterpenes, camelliol A, B, sasanquol, etc. Biosynthesis of these seco-triterpenes wasunknown. Recent study on Arabidopsis thaliana oxidosqualene cyclase (OSC), however, revealed that seco-triterpenes are
directly biosynthesized by OSC. In order to clarify the biosynthesis of triterpenes in Camellia japonica, cDNA cloning of
OSC from seeds of C. japonica was carried out by homology-based PCR in this study. Presence of eleven OSC homologues(named as cj-01, -02, ---- and -11) was revealed by analysis of the sequence of core DNA fragments. Sequences of three fulllength OSCs (cj-01, 08, 11) were obtained by RACE, although none of the other eight OSCs was unfortunately obtained.
Three full-length OSCs (cj-01, 08, 11) were obtained by PCR, and ligated into yeast expression vector pYES2. Resulting
expression vectors were transferred into ERG7 (lanosterol synthase gene) deficient yeast strain GIL77. After cell lysis andextraction with hexane, extracts were subjected to GC-MS analysis, which revealed that extract from cj-01 transformant
contained b-amyrin as a sole product, that of cj-08 a-amyrin and b-amyrin, and that of cj-11 also a-amyrin and b-amyrin.
Minor products by these three transformants were extensively surveyed, but no trace of camelliol A, B and sasanquol wasdetected. From these result, it is concluded that none of the obtained OSCs (cj-01, 08, 11) in this study was involved in thebiosynthesis of camelliol A, B and sasanquol.

１．緒
1-1

肪酸のグリセライドを含むが、数パーセントの含量でトリ言テルペンを含んでいる。オレイン酸が高含量であることがツバキ油

髪油としての有用性の高さと考えられてきたが、それ以外

ツ バ キ（Camellia japonica） は 日 本 原 産 の 樹 木 で あ る。に微量に含まれるトリテルペンが、ツバキ油の髪油として古事記や万葉集にツバキの記載があり、観賞用として古くの有用性（安定性、吸収性、弾力性の向上など）を高めてから日本人に親しまれてきた。また、ツバキの種子を圧搾いる可能性も十分考えられる。実際、近年の研究から、ツして得られるツバキ油は、毛髪への吸収が優れていること

バキ油やサザンカ油には、β −アミリン（1）、α −アミリや毛髪へ弾力性を与える長所のゆえ、奈良時代の頃から宮ン（2）、ルペオール（3）などの植物界に広く分布するトリ中の女性たちの黒い垂髪を整える髪油として使用され始め、テルペンに加えて、カメリオール A（4）、カメリオール B

その後、大衆にも普及した。化粧品の油性基剤として用い（5）、カメリオール C（6）、サザンクオール（7）などのツられている植物性不乾性油の中でも、植物性油脂としてのバキ油特有のトリテルペンが含まれていることが判明した

安定性や品質の高さを示す指標に用いられるオレイン酸含（引用文献 1）。

量は 85 − 90% であり、オリーブ油（オレイン酸の含有量
文明の導入、さらに、戦後の石油化学技術を基盤とした工

1-3 トリテルペンの生合成、オキシドスクアレン閉環酵素

業製品の汎用は、化粧品にも及び、一時期、ツバキ油へのトリテルペンは植物ステロール生合成の中間体であるオ関心は薄らいでいたが、近年の国民の自然志向、環境問題

キシドスクアレン（8）から分岐して生合成される。トリへの配慮からツバキ油への関心が高まり始めている。

テルペンの骨格はこの分岐反応を触媒する酵素（オキシドは 54 − 83％）を大きく引き離している。明治時代の西洋

スクアレン閉環酵素（oxidosqualene cyclase, OSC）
、ある

1-2

ツバキ油の成分

いは、トリテルペン合成酵素と呼ぶ）によってつくり出さ

ツバキ油、オリーブ油などの植物油は、主成分として脂Studies on the Biosynthesis of Triterpenes
in Camellia Oil
Masaaki Shibuya
Graduate School of Pharmaceutica lSciences, The University of Tokyoれる。これまで β −アミリン合成酵素をはじめとして、複数の高等植物から 20 種を超える OSC がクローニングされている。近年、我々によってシロイヌナズナ（Arabidopsisthaliana）からセコアミリン合成酵素が同定された（引用文献 2）。この酵素は、「OSC は直線状の基質から環構造をつくり出す酵素である。
」というこれまでの概念に反し、開裂反応により一旦構築した環構造を破壊し、新骨格を創出する酵素であった。もし、このような OSC が普遍的に−7−

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

図１

ツバキ油に含まれるトリテルペン

図２

セコトリテルペンの生合成機構

分布するならば、ツバキ油に含まれる開裂型トリテルペン1-4であるカメリオール A、B などは、OSC により直接生合

本研究の目的ツバキのトリテルペンの生合成機構を明らかにできれば、成されるものと考えられる（図 2）。すなわち、ツバキ種生合成酵素遺伝子の高発現、あるいは抑制により、従来の子には、シロイヌナズナ由来のセコアミリン合成酵素と類ものとはトリテルペンの種類と含量が異なったツバキ油を似した反応を触媒する OSC が存在していると考えられる。

調製することが可能となる。本研究においては、ツバキのしかし、これまでツバキの OSC に関する研究はなされて形質転換による品種改良を視野にいれ、ツバキ種子からトいないため、ツバキにおけるトリテルペン生合成機構は全リテルペン合成酵素のクローニングを行う。

く不明である。

−8−

ツバキ油に含まれるトリテルペンの生合成研究

2.
2-1

2-5

実験、結果生成物の同定

GIL77 は、ラノステロール合成酵素が欠損しているためツバキ種子の収穫に、ラノステロール合成酵素の基質となるオキシドスクア

平成 18 年７月に、東京大学本郷キャンパスに植樹されレンを酵母内に蓄積させる。GIL77 内で発現した OSC は、ているツバキから種子を収穫した。種皮を剥皮後、直ちにこの蓄積したオキシドスクアレンと反応し生成物を与える

液体窒素で凍結し、− 80℃にて保存した。

ので、酵母に蓄積する生成物の構造を決定することにより、導入 OSC の機能を同定することができる。

2-2 ツバキ種子から RNA の調製、及び、逆転写反応による cDNA の調製（20 ㎖の培養）を遠心により集菌し、アルカリ添加後加熱凍結保存されていたツバキ種子を、液体窒素を加えなにより容菌した。ヘキサンで抽出し、抽出物を GCMS でがら乳鉢 ･ 乳棒を用いて粉砕した。破砕物からフェノールガラクトース添加で導入遺伝子の発現を誘導した酵母解析した。

クロロフォルム法で Total RNA を調製した。さらに、GEcj-01 は単一生成物を与え、GC の保持時間と MS の開裂

社の RNA purification kit を使用して精製し、mRNA を様式が標品の β −アミリンと完全に一致したことから、生調製した。

成物を β −アミリンと同定した。一方、cj-08 は、複数のこの mRNA を鋳型とし、dT primer と superscript Ⅱ生成物を与えた。GCMS で最も強度の大きかった生成物を用いて逆転写反応を行った。得られた産物を以下のは、GC の保持時間と MS の開裂様式が標品の α −アミリ

PCR の鋳型として用いた。

ンと完全に一致した。また次に強度が強かったものは、同様に標品との比較から β −アミリンと同定した。cj-11 の2-3

Nested PCR による中央部の増幅

生 成 物 は、cj-08 の 生 成 物 と 同 一 で あ っ た。cj-08、 及 び

既知 OSC に保存されているアミノ酸配列に基づいて 10

cj-11 の生成物の組成は、これまで報告のある混合アミリン合成酵素のものと一致していた。

種のオリゴ DNA を合成した。

以上の結果から、cj-01 を β−アミリン合成酵素、cj-08、これらプライマーを組み合わせて上記 cDNA を鋳型にPCR を行なった。PCR 生成物をプラスミドベクターにサ及び cj-11 を混合アミリン合成酵素と同定した。

ブクローニングし、総数 72 個のクローンの塩基配列を決定した。その結果、11 種にグループ分けすることができ、2-5各クローンを CJ-01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11 と命名した。

cj-01, -08, -11 の Minor 成分の検索

本研究においてツバキには少なくても 11 種の OSC クローンが存在することが明らかになった。これまでのところ、3 種の OSC（cj-01：β −アミリン合成酵素、cj-08、及び2-4RACE 法による塩基配列の決定

cj-11：混合アミリン合成酵素）を同定したが、残りの 8 種各クローンについて RACE 法（引用文献 3）による塩の OSC は得られていない。これら得られていない 8 種の基配列の決定を試みた。11 種のうち、8 種については何ら

OSC のいずれかがカメリオール A、及び B などのセコトかの理由により PCR の産物が全く得られなかった。PCRリテルペンを生産する可能性が高いが、ツバキ油に含まれ産物が得られた cj-01, 08, 11 の 3 種のクローンについてるセコトリテルペンの含量はごく微量（引用文献 1）であRACE 法 よ る 塩 基 配 列 の 決 定 を 進 め た。 そ の 結 果、 全るので、cj-01、cj-08、及び cj-11 が、微量ながらカメリオ

ORF の塩基配列を決定することができた。

ール A、及び B を生産する可能性も否定できない。そこで、酵母で発現した cj-01、cj-08、及び cj-11 の生成物の微量成2-4全長クローンの取得、及び酵母での発現分中にカメリオール A、及び B が含まれているかどうか

cj-01, 08, 11 の 3 種のクローンの N 末、及び C 末に対応を調べることにした。

するオリゴ DNA を合成し、それらを用いて PCR を行い、各形質転換酵母を 1L 培養し、同様にアルカリ添加後加３種の OSC の全長クローンの DNA 断片を得た。それら熱により容菌した。ヘキサンで抽出し、生成物を抽出した。

を酵母発現ベクター pYES2（Invitrogen）に組み込んだ。

抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラムで分離し、β −得られたプラスミドをラノステロール合成酵素欠損酵母株

アミリンを major に含むフラクションの前後のフラクシ

GIL77 に導入した。

ョンを GCMS で解析した。カメリオール A、及び B の標

各プラスミドで形質転換した GIL77 を培養し、ガラクトース添加で導入遺伝子の発現を誘導した。

品を入手することが困難であったため、MS の開裂様式の文献値と比較して、カメリオール A、及び B が存在するかどうかを調べた。しかしながら、カメリオール A、及びB に相当するトリテルペンは検出できなかった。以上の結−9−コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

果から、cj-01、cj-08、及び cj-11 はカメリオール A、及び含量は少なく、もしこれら 8 種の中に目的の OSC が含まB の生合成に関与していないことが強く示唆された。

れているとしたならば、そのツバキでの発現量は含量に3.

比例して極めて少ないと予想される。発現量の少なさがまとめと考察

RACE 法による DNA 断片の増幅を困難にしている可能性

ツバキ油に含まれるトリテルペン、特にセコ型トリテルが高いと思われる。本研究期間の後半では、そのようなペンの骨格生成に関与する OSC のクローニングをめざし視点に立ち、微量 RNA を効率的に増幅可能な改良 RACEて、ツバキ種子から OSC のクローニングを行なった。既法（Clontech 社の SMART RACE cDNA 増幅キットなど）

知 OSC に保存されているアミノ酸配列を利用して合成を用いて未クローニングの 8 種の OSC のクローニングをしたプライマーを用いて PCR を行なったところ、11 種試みたが、成功することができなかった。
考えられるクローニング未成功のもう一つの理由として、の OSC クローンの存在が明らかとなった。これらのうち、cj-01, cj-08, cj-11 の３種のクローンについて、RACE 法に種子の収穫時期とカメリオール A、及び B の生合成時期より全長配列の決定に成功した。これら３種の全長クロの相違、あるいは RNA 調製に用いた部位と生合成の場所ーンを PCR により得、酵母酵母発現ベクターに組み込み、との相違が考えられる。種子の収穫時期の変更、葉など種ラノステロール合成酵素欠損酵母株 GIL77 で異種発現さ子以外からの RNA の調製などの試行が必要と思われる。

せた。生成物を GCMS で解析し、cj-01 を β −アミリン合カメリオール A、及び B を生成物として与える OSC の成酵素、cj-08 と cj-11 を混合アミリン合成酵素と同定した。

クローニングの未成功は、「OSC はセコトリテルペンに関cj-01、cj-08、及び cj-11 の酵母における微量生成物を調べ与しないのでは？」という疑念を生じさせる。すなわち、

たが、カメリオール A、及び B に相当するトリテルペン

β −アミリンなどの閉環産物を基質として、その二重結合は検出できず、cj-01、cj-08、及び cj-11 はカメリオール A、にプロトネーションしカルボカチオンを生じさせて反応を及び B の生合成に関与していないと思われる。

進行させる異性化酵素が存在し、その異性化酵素がカメリ

クローニングが成功しなかった８種の OSC の中にカメリオール A、及び B の生合成に関与する OSC が含まれオール A、及び B の生合成に寄与している可能性を考慮する必要性が生じる。

る可能性が高い。ツバキ油のカメリオール A、及び B の図３

本研究と独立して、セコトリテルペンであるヘリアノへリアノールおよびバッカリスオキサイドの生合成− 10 −

ツバキ油に含まれるトリテルペンの生合成研究ール（12）の単離が報告されているヒマワリ（Helianthus

る OSC が存在しているものと思われる。早期にクローニannuus） の 管 状 花、 及 び B 環 開 裂 型 オ レ ア ナ ン 骨 格 のングを成功させ、ツバキの形質転換の足場を築きたいと考

トリテルペンが報告されている Stevia viscida 及び Stevia

えている。

eupatoria（引用文献 4）の同族植物 Stevia rebaudiana の根から、本研究と同様の手法によりセコテルペン合成酵素の（引用文献）クローングを試みた。

１）T. Akihisa, K. Koike, Y. Kimura, et. al., Lipids, 34,

その結果、S. rebaudiana からはバッカリスオキシド合成酵素（引用文献 5）、ヒマワリからはヘリアナール合成酵素のクローニングに成功した。バッカリスオキシド（11）はセコトリテルペンではないが、ヘリアナールは標的としたセコトリテルペンである。ヒマワリ由来ヘリアナール合成酵素は、セコトリテルペンを生成物として与えるシロイ
ヌナズナ由来以外 OSC の初めての例である。このことか1151-1157（1999）．
２）M. Shibuya, T. Xiang, Y. Katsube, et.al., J. Am. Chem.
Soc, 129, 1450-1455（2007）．
３）M.A. Frohman, M.K. Dush, et. al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85, 8998-9002（1988）．
４）L.U.Roman, D.Guerra-Ramirez, et. al. Org. Lett. 6,173-176（2004）．

ら、セコトリテルペンを生成物として与える OSC は、セ

５）M. Shibuya, A. Sagara, et. al., Org. Lett., 10, 5071-5074

コトリテルペン生産植物に存在することが強く示唆され（2008）．

る。ツバキにおいても、セコトリテルペンの生産に関与す− 11 −