コラゲナーゼ抑制作用をもつ天然物の探索
千葉大学大学院

薬学研究院

石正橋

己In order to maintain the elasticity of the skin it is important to prevent reduction of collagen with collagen decomposition
enzyme (collagenase). Search and development of a compound with collagenase inhibitory activity is therefore one effective
method for aging prevention of the skin. During our studies on search for new biologically active natural products from
unexploited tropical plants, marine algae, and nudibranchs, here we investigated a search for collagenase-inhibitory
substances from natural resources. As a result of our screening program against collagenase inhibitory activity using
extracts of 92 medicinal tropical plants, 100 marine algae, and 27 nudibranchs, we selected 7 plants, 6 algae, and 3 nudibranchs
as active samples. The leaves of Melastoma polyanthum (Melastomataceae), collected in Thailand, were extracted methanol,and the methanol extract was successively partitioned with ethyl acetate and water. The ethyl acetate soluble fraction,
which was found to be active against collagenase inhibitory test, was subjected to repeated chromatographies on silica gelcolumn and reverse-phase HPLC to isolate four flavonoids, kaempferol 2,4-di-O-(trans-p-coumaroyl)-β-D-galactopyranoside,
3-O-kaempferol 2-cis-p-coumaryl-6-trans-p-coumaryl-β-D-galactopyranoside, 3-O-kaempferol 2-trans-p-coumaryl-6-cis-pcoumaryl-β-D-galactopyranoside, and 3-O-kaempferol 6-galloyl-β-D-galactopyranoside, and these compounds exhibitedcollagenase inhibitory activity. From a brown alga Ishige okamurai (Ishigeaceae), collected at Boso Peninsula, a phlorotannin,
diphlorethohydroxycarmalol, was first isolated as a naturally occurring form and was fully characterized here, while fromanother brown alga Undaria pinnatifida (Phaeophyceae), two sterols, 24-methylenecholesterol and fucosterol, were isolated.
From a nudibranch Pleurobranchus hirasei (Pleurobranchidae) collected also at Boso Peninsula, a sterol peroxide, 5,8α-epidioxy5α-cholest-6-en-3β-ol, was obtained and identified on the basis of spectral data. While extracts of these algae and nudibranchs
showed collagenase inhibitory activity, isolated sterols did not show the inhibitory activity and active components of these
extracts have not been isolated yet.

１．緒することを第一の目的とする．

言

一方，コラーゲンは，いわゆる細胞外マトリックスの一種

皮膚は表皮と真皮から構成されており，中でも，表皮のである．ここ十数年程の細胞生物学，分子生物学の飛躍的内側で皮膚の構造の大部分を占める真皮が，皮膚の弾力性な進歩により，細胞間の接着あるいは細胞内外でのシグナやハリを保つ役割を担っている．真皮の約 9 割は膠原線維

ル伝達等多様な生物現象において，細胞外マトリックスがからなり，その主要成分はコラーゲンである．シワやタルきわめて重要な役割を果たしていることが次第に明らかと

ミ，シミなどの皮膚の老化現象は，この真皮の主要成分でなり，今後，最も注目される分子の一つとも考えられていあるコラーゲンの減少・変性に起因することが多いと考える．従って，細胞外マトリックス分解酵素（別名，マトリられる．従って，皮膚の弾力性やハリを保つためには，コックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ））の一つとして位置ラーゲンの減少を防ぐことが重要であり，また一方，コラ付けられるコラゲナーゼの作用を抑制する低分子化合物をーゲンの分解はコラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ）によ発見できれば，コスメトロジーへの貢献はもちろんであるって引き起こされる．以上のことから，コラゲナーゼの作が，それに加えて，コラーゲンが関わる多様な生理現象の用を抑制することは皮膚の老化防止のための一つの有効な分子機構の解明等に寄与することも大いに期待される．

方法であると考えられる．従って，コラーゲンを分解するコラゲナーゼ群には，4 種の MMP（すなわち，MMP-1,コラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ）を抑制する作用をもMMP-8, MMP-13, および MMP18）が属することが知られつ化合物の探索および開発が強くのぞまれる．
本研究では，ている．これまでに MMP 阻害物質の天然物からの探索にコラゲナーゼ抑制作用を示す低分子化合物を，とくに天然関しては，伏谷，清木らによるマトリックスプロテアーゼ物を素材として探索し，皮膚老化防止に役立つ物質を発見（＝コラゲナーゼ）阻害剤を海綿動物から探索したという

Search for Natural Products with
Collagenase Inhibitory Activity
Masami Ishibashi
Chiba University報告はあるものの，まだそれほど研究例は多くない．合成化合物に関しても MMP 阻害作用を示すいくつかのペプチド性合成化合物が知られているものの，コラゲナーゼに特異的に結合する有効な低分子化合物の開発のためにさらに異なったタイプの基本構造をもつ低分子リード化合物の出現がのぞまれている．

− 31 −

２．実
2. １.

験

スクリーニング

実験試料として，熱帯薬用植物 92 種，千葉県房総半島産海藻 100 種，千葉県房総半島産ウミウシ 27 種を用いて，コラゲナーゼ阻害作用に関するスクリーニングを行った．
コラゲナーゼ阻害活性試験は，96 穴プレートを用い，次のような方法で行った．
①サンプル溶液（1% MeOH 水溶液）を 1 穴あたり 50 L分注する．
②酵素溶液（10 g/mL, pH7.4, 50 mM Tris-HCl 溶液）を 1穴あたり 100 L 分注する．
③ 37℃にて，10 分間プレインキュベーション後，基質溶液（5 M, pH7.4, 50 mM Tris-HCl 溶液）を 50 L 分注する．
④ 37℃にて，60 分間インキュベーション後，励起波長320nm，検出波長 405nm で測定する．
⑤ 60 分間の MOCAc 遊離量をコントロール（サンプル 0μg/mL）と比較し，MOCAc 遊離率とする．遊離率が低いほど酵素が阻害されている［遊離率（%）＝ 100 −阻害率（%）］．

ち，まず，ノボタン科 Melastoma polyanthum の成分研究を行った．

ここで，基質としては，MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2pr

今回入手した Melastoma polyanthum の葉のメタノー（Dnp）-Ala-Arg-NH2（MOCAc :（7-Methoxycoumarin-4-ル抽出物 6.9 g を用いて，まず，溶媒分配により，酢酸yl）acetyl , Dnp : Nε-（2,4-Dinitrophenyl））を用いる．まエチル可溶部 1.94g，ブタノール可溶部 2.07g，水可溶部

た，Phosphoramidon（N-（α-Rhamnopyranosyloxyhydroxy2.7g を得た．各画分のコラゲナーゼ抑制活性は 100 g/mLphosphinyl)-Leucyl-Tryptophan）を陽性対照として用いた．

で，各々，15.6，38.0，および 33.9％であった．従ってまスクリーニングの結果，熱帯薬用植物７種，海藻６種，ず，最も顕著な活性が認められた酢酸エチル可溶部についウミウシ３種を活性サンプルとして選別した（表１）．て，シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル系およびクロロホルム／メタノール系）を行っ

２. ２.

活性成分の分離・精製た後，最も顕著な活性を示したフラクションを最終的に

2. 1. で選別した活性サンプルをメタノールで抽出し，続逆相 HPLC（Develosil RPAQUEOUS-AR-5, 10×250 mm;

いて溶媒分画により数種の画分に分配した．得られた画分

70% MeOH; UV 220 nm）にて精製し，4 種のフラボノイについて、各種分離用担体を用いたカラムクロマトグラフ

ド配 糖体 MP1 〜 MP4 を各 々 19.5，3.0，1.0， および 1.1

ィーを行い，化学成分を単離した．

mg 単離した．MP1 〜 MP4 は各種スペクトルデータの文献値１）との比較により，3-O-kaempferol 2,4-di-O-(trans-p-２. ３.

単離された成分の化学構造の決定

coumaroyl)-β-D-galactopyranoside，3-O-kaempferol 2-cis-

2. 2. で分離された成分に対して，核磁気共鳴法や高分解

p-coumaryl-6-trans-p-coumaryl-β-D-galactopyranoside,

能質量分析法などの最新の各種機器分析法を駆使すること

3-O-kaempferol 2-trans-p-coumaryl-6-cis-p-coumaryl-β-D-により，化学構造の解明を行った．

galactopyranoside, および 3-O-kaempferol 6-galloyl-β-Dgalactopyranoside と同定した（図１）．これらのうち，

２. ４.

単離された成分の生物活性の測定

MP2 と MP3 は新規化合物であった．

2. 2. で分離された成分に対して、コラゲナーゼ抑制活性

MP1 〜 MP4 の他にも，同抽出物から 4 種以上の類縁化に関する再測定を行った．以下，これらの実験の結果につ合物を単離しており，それらの化学構造の決定について検いて，その概要を記す．

討している．

３．結
３. １.

単離した MP1 〜 MP4 についてコラゲナーゼ抑制活性果を調べたところ，MP1 に最も強い活性が認められた（表植物成分の研究

２）．しかしながら，MP1 〜 MP4 だけでは粗抽出物の活コラゲナーゼ抑制活性を示した熱帯薬用植物７種のう性の強さを説明できなかった．

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コラゲナーゼ抑制作用をもつ天然物の探索

３. ２.
２. １.

海藻成分の研究で選別した海藻６種のうち，まず，褐藻 Ishigeokamurae および Undaria pinnatifida の成分研究を行った．
房総半島・天津小湊町で採取した褐藻 Ishige okamurae（湿重 280 g）のメタノール抽出物 21.7 g に対して，ヘキサンと 90％メタノールで溶媒分配を行った．90％メタノール可溶部（17.8 g）について，ダイヤイオン HP-20 によるカラムクロマトグラフィーを行って色素を除去した後，シリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返し行い （[ i）
2.0 ×18 cm, クロロホルム／メタノール（5:2）;（ii）1.5×22cm, クロロホルム／メタノール／水（16:8:1）]，最終的にセファデックス LH-20 カラム（1.0×38cm, メタノール）にて精製し，1 種のフロロタンニン IO1 を 153 mg 単離した．
IO1 は褐色非晶質固体として得られ，高分解能マススペク
トルにより分子式 C24H16O13 をもつことが分かった（m/z512.0589, Δ -0.2 mmu）
．各種スペクトルデータの解析の結果，IO1 は以前，褐藻 Carpophyllum maschalocarpumより分離されていた diphlorethohydroxycarmalol ２）と同定した（図２）．ただし，diphlorethohydroxycarmalol は以前はノナアセタート体として単離され，ヒドロキシ型では単離された報告はなかったため，今回詳細にスペクトルデータの帰属を行った（表３）．
一方，同様に房総半島・天津小湊町で採取した褐藻
Undaria pinnatifida のメタノール抽出物 36.8 g を用いて，まず，溶媒分配により，酢酸エチル可溶部 2.6 g，ブタノ− 33 −ール可溶部 1.7 g，水可溶部 30.9 g を得た．各画分のコ性を調べたが，活性が認められなかった．

ラゲナーゼ抑制活性は 100μg/mL において，各々，42.8,４．考93.8，および 100％であった．従って酢酸エチル可溶部に察本活性が集約したため，酢酸エチル可溶部について，シ

熱帯薬用植物，海藻，ウミウシを材料として，コラゲリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エナーゼ抑制成分の探索を行った．これまでのところ，活チル系およびクロロホルム／メタノール系）を行った後，性成分として，ノボタン科植物 Melastoma polyanthum

ダイヤイオン HP-20 カラムにて色素を除去し，最終的から 3-O-kaempferol 2,4-di-O-(trans-p-coumaroyl)-β-D-に逆相 HPLC（Develosil ODS HG-5, 20 x 250 mm; 100%galactopyranoside（MP1）を得た．同時に，MP1 に関連

MeOH; UV 220 nm）にて精製し，2 種のステロール UP1する構造をもつ新規化合物を単離した．一方，他の材料か

お よ び UP2 を 各 々 1.2 お よ び 1.3mg 単 離 し た．UP1 おらは現在のところ，明確な活性成分の単離には至っていなよび UP2 は各種スペクトルデータの解析の結果，各々い．これまでのスクリーニングの結果を概観すると，植物

24-methylenecholesterol および fucosterol と同定した（図に含まれるタンニン類等，高極性のフェノール系化合物に３）．単離した UP1 および UP2 についてコラゲナーゼ抑はコラゲナーゼ阻害活性を有する可能性が高いことが示唆

制活性を調べたところ，これらの化合物には活性が認めらされた．さらに研究を継続して，当研究室内でこれまでにれなかった．

構築した未開拓天然物材料ライブラリーを素材として，総合的かつ系統的な材料の確保およびスクリーニングを行え

３. ２.
２. １.

ウミウシ成分の研究

ば，新しいタイプのコラゲナーゼ抑制物質の発見が可能でで選別したウミウシ 3 種のうち，まず，カメノあると考えられる．

コフシエラガイ Pleurobranchus hirasei の成分研究を行っ謝た．
房総半島・天津小湊町で採取したカメノコフシエラガイ
Pleurobranchus hirasei（湿重 25.7g）のメタノール抽出物

辞本研究を遂行するに当たり，ご支援をいただきましたコス
メトロジー研究振興財団に感謝申し上げます．

0.97 g に対して，酢酸エチルと水で溶媒分配を行った．コラゲナーゼ抑制活性が認められた酢酸エチル可溶部につ（文献）いて，シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い（1.0１） Romussi G, Bignardi G, Pizza C, De Tommasi N,:×35 cm, ヘキサン／酢酸エチル系），つづいて逆相 HPLC

Constituents of Cupuliferae. XIII. New and revised（Develosil RPAQUEOUS-AR-5, 10×250 mm; 70% MeOH;

structures of acylated flavonoids from Quercus suber

UV 220 nm）にて精製し，１種のステロールパーオキシ

L., Archiv der Pharmazie, 324, 519-524, 1991.

ド PH1 を 0.5 mg 単離した．PH1 は各種スペクトルデータ

２） L i S M , G l o m b i t z a K W , : C a r m a l o l s a n dの解析の結果，5,8α-epidioxy-5α-cholest-6-en-3β-ol と同定

phlorethofuhalols from the brown alga Carpophyllum

した（図４）．単離した PH1 についてコラゲナーゼ抑制活

maschalocarpum, Phytochemistry, 30, 3417-3421, 1991.

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