顕微ラマン分光法を用いた皮膚角質層の評価法
および透過性スクリーニング法の構築
明治薬科大学藤井美 佳、深 水啓朗

In this study, lipid structural change was monitored using Raman spectroscopy during heat treatment, along with theimpact of lipid states on the structural and physical properties during the preparation process of the intercellular lipidmodel (MODEL) in stratum corneum. Moreover we demonstrated the availability of the MODEL for an evaluation ofskin permeation mechanisms for skin permeation enhancers. The lipid states in preparation process was monitored byvaluable temperature (VT) -Raman spectroscopy and differential scanning calorimetry. The Raman spectra were analyzed
by perturbation correlation two-dimensional correlation spectra. The microstructure of MODELs prepared different
temperatures and the structural changes of MODELs after application of skin permeation enhancers (vesicle and micellesolution) were detected by small angle X-ray scattering and powder X-ray diffraction measurements. The microstructuresof the MODEL changed depending on the melting of lipid ingredients in the preparation process. It was recognized that VTRaman spectroscopy is a useful and attractive tool for the sensitive monitoring of lipid state changes and lipid melting. Theseresults suggested that monitoring lipid structural changes during the heating step is important to precisely prepare target
MODEL. The MODEL structure changed after application of skin permeation enhancers. Especially the vesicle solution that
promote skin permeation of low molecular weight compounds rather than micelle solution, was made the model structure
disorder. It is expected that the MODEL would apply for the elucidation of skin permeation mechanisms.

1. 緒びコレステロール（CHOL）を構成脂質とした MODEL 3 , 4）に言ついて，調製過程における脂質の構造変化をラマン分光法

皮膚の最外層に存在する角層は，生体内への病原体・異でモニターし，調製温度が及ぼす MODEL 構造への影響を物の侵入抑制および生体内からの水分蒸散抑制における重調べた．また，経皮吸収促進剤の適応による MODEL の構要な役割を担っている．特に角層細胞間脂質は低分子化合造変化を観察し，皮膚透過性評価における MODEL の有用物の経皮吸収における主な経路となることが知られてお性を検証した．

り，化合物の経皮吸収メカニズムの解明には，化合物と細2. 方胞間脂質の相互作用評価が重要である．しかしながらヒト
角層は，採取する部位，被験者の年齢，性別および人種に

2 . 1. 材法

料

よる構造および組成のばらつきが大きく，由来の異なる角CER として（2 S, 3 R）
-2（- 2 -Hydroxyhexadecanoyl）amino

層検体間での評価結果を単純に比較することが難しい．まoctadecane- 1 , 3 -diol（Takasago International Corporation,

た 2009 年以降，EU において動物実験を実施した化粧品Tokyo, Japan）を使用した．PA（PALMAC 98 - 16）およびの販売が禁止され，化粧品開発においては動物皮膚の使用

CHOL は，Acidchem International Sdn Bhd（Penang,も難しい状況にある．このような背景から，ヒトおよび動Malaysia）
およびFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

物の角層細胞間脂質の代替として，構造や組成の偏差が少（Osaka, Japan）からそれぞれ購入して使用した．

ない細胞間脂質モデル（MODEL）が注目されており，様々経皮吸収促進剤として，イソステアリルグリセリルエ

な MODEL が開発されている 1 , 2）．MODEL の組成や調製ーテル（Penetol Ⓡ GE-IS, Kao, Tokyo, Japan, 以下 , GE-IS）

条件の違いは，その構造および物性に大きく影響するため，およびポリオキシエチレン（60）硬化ひまし油（HCO- 60 ,

望ましい構造またはプロファイルを示す MODEL をデザイ

Nikko Chemicals, Tokyo, Japan, 以下 , HCO- 60）を用いた．

ンするためには，調製過程における構成脂質の構造変化を2 . 2 . 細胞間脂質モデル（MODEL）の調製詳細に理解することが重要と考えられる．
本検討では，セラミド（CER），パルミチン酸（PA）およ

まず CER/CHOL/PA（42：15：43 , w/w）の物理混合物を調製した．これらの物理混合物をクロロホルム／メタノール溶液（2：1）に溶解後，ガラスConstruction of evaluation method
for human stratum corneum andscreening method for percutaneousadsorption by Raman spectroscopy

プレートに滴下した．32 ℃で溶媒を揮発させ，Mika Y. Fujii, Toshiro Fukami

製した．同様に MODEL 120 は，LM を 120 ℃

Meiji Pharmaceutical University

で 30 min 加熱した後，室温まで冷却して調製− 47 −脂質膜（LM）を得た．MODEL 80 は，LM を 80℃で 30 min 加熱した後，室温まで冷却して調コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019（λ=1.5418Å）
で真空下にて測定した．Repeat distance（d）
は，した．

d=2 π/qより算出した（q：散乱ベクトル）．

2 . 3 . 脂質膜（LM）および MODELの物性評価

2 . 4 . 経皮吸収促進剤によるMODEL 構造の変化

2 . 3. 1. 示差走査熱量計（DSC）
示差走査熱量計（DSC）はMettler Toledo DSC 1（Mettler

経皮吸収促進剤には，5 wt% GE-IS / 5 wt% HCO-60 にToledo International Inc.）を用いた．LM を 20 ℃から 80 ℃

よるベシクル溶液，5 wt% HCO- 60 によるミセル溶液を用または 120 ℃まで，5 ℃/min（40 mL/min., N 2 環境下）の速い，溶媒にはそれぞれ 50 mM クエン酸緩衝液を使用した．

度で昇温する過程の熱量変化を測定した．

MODEL（10 .5 mg）に，各溶液を 20 µL滴下し，室温で 24h

2 . 3 . 2. 温度可変顕微ラマンスペクトル測定

静置後，SAXSで測定した．

温度可変顕微ラマンスペクトル測定は，顕微ラマン分光装3 . 結果および考察置（Work StationTM, Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor,UK）を用いた．ヒートステージ上に LM をセットし，20 ℃

3 . 1. 調製過程におけるLM 中脂質構造のダイナミク
スから 120 ℃まで昇温した．昇温速度は 10 ℃/min とし，10ラマン分光法は脂質炭化水素鎖の C-C 結合や CH 2 結合

℃毎に 2min間保持した後にラマンスペクトルを測定した．

等，対称性の高い振動モードの検出を得意とし，ラマンスラマン分光装置は，照射レーザー波長 785nm，積算回数

ペクトルの変化から炭化水素鎖の周辺環境の変化を検出で3 回，露光時間 30s，測定範囲 300-3500cm- 1，100 倍の対きる．加熱過程における LM の構造変化をより詳細に調べ物レンズを用いて測定した．得られたラマンスペクトルは，るために，20 ℃から 120 ℃まで LM の温度を変化させ，そ2 Dshige version 1. 3 を使用して，摂動相関二次元相関スペの過程をラマン分光法でモニターし，PC 2 D で解析した．

クトル（PC2D）を得た．各温度のラマンスペクトルは，ガPC 2 D は，摂動に対するスペクトル変化を捉えることが可MI, USA）
および 10083（Linkam Scientific Instruments Ltd.,-1

ラス基板に由来する 1698. 6 cm のピーク強度が一定になる能であり，スペクトル強度の変曲点を把握するのに有効でように規格化した．

ある 5）．

2 . 3 . 3. 粉末Ｘ線回折（PXRD）

昇温過程における LM 中脂質のラマンスペクトル変化おPXRD は，MiniFlex 6 0 0（Rigaku Corporation, Tokyo,よび熱挙動を Figure 1 に示す．DSC 曲線では，58 . 6 ℃のJapan）を使用した．2θ側測定範囲 2 -28 °，ステップサイズ

吸熱に続いて，71 . 2 ℃および 81 . 4 ℃の吸熱ピークが認め

0 .02 °
，スピード 4 °/min，X 線出力 管電圧 40kV，管電流られた．ラマンスペクトルでは，脂質炭化水素鎖の C-C15 mA，線源 Cu-Kα（λ= 1. 5418Å）で測定した．

伸縮振動に由来する 1061 cm- 1 あるいは 1128 cm- 1 のピー

2 . 3 . 4. 小角 X線散乱（SAXS）

ク強度が 70 - 80 ℃で低下した．これらのピークは，脂質SAXS は，SAXS space（Anton paar，Graz，Austraria）

炭化水素鎖の運動性を示していることから 6），DSC 曲線でを使用した．露光時間 1min，積算回数 4 回，線源 Cu-Kα

認められた 81 . 4 ℃の吸熱ピークはゲル－液晶相転移を示

Figure 1

昇温過程における LM の PC2D スペクトル− 48 −a）
および DSC 曲線 b）

顕微ラマン分光法を用いた皮膚角質層の評価法および透過性スクリーニング法の構築していると考えられる．また，2852 cm- 1 の CH 2 対称伸縮-1

LM, MODEL 80および MODEL120のPXRDおよび SAXS

振動のピーク強度は 70 - 80 ℃，2888 cm の CH 2 逆対称伸パ タ ー ン を Figure 2 に 示 す．LM お よ び MODEL 80 の縮振動のピーク強度は 70 ℃で急激に低下することが明ら

PXRD パターンから，直方晶および六方晶を示す約 21 . 5 °おかとなった，これらのピークは細胞間脂質の充填構造のよび 23 . 8 °の回折ピークが認められた．またこれらの充7）

情報を反映することが知られており ，DSC 曲線で認めら填構造に加え，約 19 . 6 °，23 . 5 °および 24 . 6 °に回折ピーれた 71 . 2 ℃の吸熱ピークは，充填構造の変化に起因するクが認められたことから，複数の複格子構造が混在するとと推察される．一方，DSC 曲線で吸熱ピークが観察され考えられる．一方，MODEL 120 ではこれらのピークは消た 58 . 6 ℃では，ラマンスペクトルに大きな変化は認めら失し，直方晶および六方晶のみが認められた．LM およびれなかった．このピークは構成脂質単独の吸熱ピークとはMODEL 80 の SAXS パターンでは，4 . 32 - 4 . 38 nm の d 値一致しないことから（data not shown），共晶の構造変化にを有する構造（ⅰ）および，3.60nmのd値を有する構造（PA）よる吸熱ピークと考えられる．また，ラマンスペクトルのが観察された．PA の単斜晶は約 3 . 60 nm の d 値を有する

ピーク強度は 90 ℃付近で一定となることが明らかとなり，ことから 8），当構造は PA が単独で形成する結晶によると約 90 ℃で LM が完全に融解したと考えられる．

考えられる．ヒト角層では，CER：脂肪酸：CHOL はお
よそ当モル比で存在することから 9），当 MODEL は PA の3 . 2 . MODELの周期構造解析配合量が多いことが分かる．つまり，過剰に存在する PAラマンスペクトル（Figure 1）の結果から，調製温度の違が単独で結晶構造を構築したと考えられる．一方，構造ⅰ

いによって MODEL 形成までに経験する構造変化が異なる

は CER，PA および CHOL の共晶によるピークと推察されことが示唆された．そこで 80 ℃または 120 ℃で得られた

る．MODEL 120 では 4 . 60 nm（Ⅰ），4 . 00 nm（Ⅱ）および各 MODEL について，ラマン分光法では得ることができな3 . 60 nm（PA）の d 値を有する構造が認められた．3 . 6 nm

いより長距離の周期構造を PXRD および SAXS を用いては，PA の結晶由来と推察され，PA 結晶は調製温度に因評価した．

らず，当 MODEL 中に存在することが明らかとなった．構

Figure 2 LM（a), MODEL 80（b）および MODEL 120（c）の PXRD およびSAXS パターン
（HEX：六方晶，ORTH：直方晶，PA：パルミチン酸の結晶）− 49 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

造ⅠおよびⅡは CER，PA および CHOL の共晶による構造

ピークトップを Table 1 に示す．と考えられるが，特に構造Ⅰの構造は CER のヘアピン構

当研究で使用したベシクル溶液はミセル溶液と比較し造による結晶であると推察される（CER ヘアピン構造の分て，低分子化合物の皮膚透過量を 1 . 5 - 3 倍向上させるこ

子長：約 2 . 1 - 2 . 3 nm）．以上の結果より MODEL の構造はとが明らかとなっている（data not shown）．Table 1 より，調製温度によって異なり，特に共晶構造および充填構造は50 mM クエン酸緩衝液適応後の MODEL は，4 . 48，3 . 98，MODEL 80 と MODEL 120 で大きく異なることが分かっ

3 . 58 および 2 . 26 nm の d 値を有しているが，ベシクル溶

た．Figure 1 より，調製過程において構成脂質は 90 ℃以液の適応により，Second peak（3 . 98 nm 付近）が消失し上で完全に融解することが明らかとなっており，調製過程た．ミセル溶液においてもピーク強度は減少したが，そのの脂質の融解状態が MODEL 構造に影響すると推察され構造は完全には消失しないことが明らかとなった（Figureる．ヒト角層細胞間脂質の充填構造は六方晶と直方晶から3）．また PXRD 測定の結果から，ベシクル溶液を適応し成ると考えられている

10）．そこで，六方晶および直方晶

たMODELの広角側に，ハローパターンが認められ（Figureを充填構造として有していると考えられる MODEL 120 を3），MODEL が非晶質化したことが示唆された．これより，使用し，経皮吸収促進剤の適応によるモデルの構造変化を細胞間脂質の構造が一部乱されたことが，ベシクル溶液に評価した．

よる低分子化合物の皮膚透過性促進作用の機序の一つであると考えられる．

3 . 3 . 経皮吸収促進剤によるMODEL 構造の変化

4. 総

ベシクル溶液，ミセル溶液および 50 mM クエン酸緩衝液を適応した MODEL の SAXS patterns を二次微分したTable 1

本研究では先ず，調製過程における MODEL 構成脂質の各製剤を適応した MODEL 120 の d 値（nm)50 mM citricacid buﬀerVesicle

First peak

4.48

4.51

4.48

Second Peak

3.98

‑3.96

Third Peak

3.58

3.59

3.57

Forth peak

2.26

2.25

2.27

MicellEach data was gained by second derivative of SAXS patterns（Figure 3).

Figure 3各溶液を適応した MODEL の SAXS および PXRD パターン− 50 −

括

顕微ラマン分光法を用いた皮膚角質層の評価法および透過性スクリーニング法の構築

状態変化を温度可変ラマン分光法でモニターし，調製温度（引用文献）が及ぼす MODEL 構造への影響を調べた．調製過程で LM

1） D. Groen, et al., Langmuir, 26, 4168-4175（2010）．

を完全に融解することで，ヒト角層細胞間脂質に類似した

2） A.P. Ramos, M. Lafleur, Langmuir, 31, 11621-11629

充填構造を有する MODEL を調製できることが明らかと（2015）．

なった．加熱過程における LM の構造変化を分子レベルで

3） H. Watanabe, et al., Chem. Pharm. Bull., 5 8（3），312-317（2010）．

理解することは，適切な MODEL を調製するうえで必要不可欠であり，温度可変ラマン分光法はその構造変化を in

4） X, Wang, et al., Coll. Surf. B, 78, 92-100（2010）．

situ モニタリングできる有効なツールであることが示され

5） M. Thomas, H. H. Richardson, Vib. Spectrosc. 24, 137146（2000）．

た．次に，当 MODEL に経皮吸収促進剤であるベシクルおよびミセル溶液を適応し，MODEL の構造変化を評価した．

6） A. N. C. Anigbogu, et al., Int. J. Pharm., 1 2 5, 2 6 5282（1995）．

低分子化合物の皮膚透過性を亢進させる，ベシクル溶液を適応すると，MODEL の構造が一部消失し，非晶質化する

7） R. Koynova, M. Caffrey, Biochim. Biophys. Acta,．
1255, 213-236（1995）

ことが示唆された．経皮吸収促進剤が MODEL に与える影響については，更に詳細な検証が必要とされるものの，本8） X, Wang, et al., Coll. Surf. B, 78, 92-100（2010）．

MODEL は経皮吸収促進剤等の浸透促進メカニズムの解明

9） A. Weerheim, M. Ponec, Arch. Derm. Res., 292, 191199（2001）．に応用が期待される．

10）S. Ramakrishman, et al., Mater. Res. Soc. Symp.
Proc. EXS-A H 6 . 2 . 1（2004）.
．

− 51 −