創傷治癒における細胞外マトリックスの一つである
バーシカンの関与、RNAiによる検討
長崎大学病院皮膚科アレルギー科

冨 田

元

Traumatic injury leaves disfiguring scar and pigmentation, which provide significant reduction of QOL. Adequate skinwound healing leads to beautiful scar. Therefore, there is a need for a better treatment approach. Skin wound healing is acomplex biological event as a result of the interplay of epidermis and dermis. Formed good dermis wound bed performs
an essential function for epidermal cell migration and re-epithelization. Although, extracellular matrix existing dermis
has relations with cell adhesion, cell migration, cell differentiation, and cell proliferation, little is known about a role ofextracellular matrix in wound healing. To clarify a role of extracellular matrix in wound healing, we investigated mouse
fibroblast cell using suppression of versican, which is a hyaluronan-binding, extracellular chondroitin sulfate proteoglycan.
The levels of versican expression were measured over time after mouse cutaneous wounding. On day 4 and 5, mRNAlevel of versican were significantly increased in day 4 and 5 relative to day 1 to 3. By contrast, mRNA level of versican weresignificantly decreased in day 6 and 7. Therefore, versican may regulate the wound healing process.
The mRNA expression of Srpx2, Ccl6, and Smoc2 was increased in versican suppressed mouse embryonic fibroblast.
Previous reports showed that these factors regulated the inflammatory cell infiltration and angiogenesis. These results suggestthat versican may regulate the wound healing through Srpx2, Ccl6 and Smoc2.
Blockade of versican changed the various factors in mouse embryonic fibroblast. These effects of versican blockade may
occur in this wound study on day 1 to 3, 6, and 7. Taken together, it is possible that versican regulate the wound healing by
the Srpx2, Ccl6 and Smoc2 at some stated periods.

１．緒で炎症期となり、好中球、マクロファージ、リンパ球など言が創部に浸潤してくる。これら炎症細胞は侵入病原体を除外傷などで損傷された皮膚は難治な場合に醜い瘢痕や色去するのみならず、サイトカインや細胞成長因子を放出す素沈着を残し、著しく QOL を低下させる。そのため、瘢ることによって、表皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞を痕や色素沈着が少なく美しく治るような適切な治療が常に活性化させ、次に続く増殖期を誘導する。増殖期では、表求められている。皮膚潰瘍の治療には真皮側、表皮側の両皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞などが増殖し、その結方の再生が必要であり、良好な真皮側のウンドベッド（創果再上皮化、肉芽組織の形成が起こる。その後に、いった床）形成が表皮細胞の遊走、再上皮化の前提条件である。

ん生じた瘢痕組織などを正常の組織構築に置き換える再構

この真皮側のウンドベッド形成には新生血管や線維芽細胞築期という、比較的長く続く過程が生じる。の増殖が必須の条件となっている。今回、それらの細胞間今回、バーシカンが創傷治癒の過程において経時的な発に存在する皮膚細胞外マトリックスに焦点をあてた。皮膚

現の変化をとることが示され、創傷治癒過程のそれぞれの細胞外マトリックスは、細胞の接着、分化、増殖などに深時期によって異なった役割を果たしている可能性があるこく関わっていることが知られているが、創傷治癒におけるとが示唆された。線維芽細胞におけるバーシカンの発現を個々の成分の役割は未だ解明されていない点が多い。本研調節することで、創傷治癒におけるバーシカンの詳細な役究はこれまで注目されてこなかったグリコサミノグリカン割を検討することを本研究の目的とした。

（コンドロイチン硫酸）を糖鎖に持つバーシカンの創傷治

２．実癒における役割をさぐる。
創傷治癒の過程は大きく分けて 4 つの過程から成ると考2 .1

験

マウスの創傷皮膚におけるバーシカンの発現えられている。最初の過程は血液凝固期であり、創ができマウスの背部皮膚にメスを用いて長径２cm の全層性のると血小板・フィブリンが凝集し、まず創部を塞ぐ。次い皮膚潰瘍を作成し、テガダーム ®にて創を被覆した。創傷の２mm マージンで創部の皮膚を採取し、全 RNA を単離

Study t he ext racel lu la r mat r i x ,especia l ly versica n involvement ofwound healing by use of RNAi
Hajime Tomita
D ep a r t ment o f D e r m at o l og y, a ndA l lerg o l og y, Na g a s a k i Un iver s it y
Hospital

した。RNA を cDNA に逆転写し、バーシカンの転写産物を Glyceraldehyde 3 -phosphate dehydrogenase（GAPDH）の PCR 産物と比較することで相対発現量を算出した。以上の RT-PCR 法をもちいて創作生後の１日目から７日目までのマウス創傷部皮膚におけるバーシカンの発現を検討した。

− 130 −

創傷治癒における細胞外マトリックスの一つであるバーシカンの関与、RNAi による検討

2 . 2 RT-PCRを用いたマウス胚線維芽細胞（MEF）のsmall interfering RNA（siRNA）導入によるバーシカ変化を網羅的に観察した。

2.5

ン産生抑制の確認
胎生 10 日のマウスより皮膚線維芽細胞を摘出し、MEFTMを培養する。Lipofectamin

バーシカンの抑制によって変化した分子の検討

マイクロアレイにて変化を起こしていた分子に対して実RNAiMAX®を用いて MEF

際に MEF で変化がおきているかを RT-PCR を用いて確認にバーシカンの siRNA を導入した。その５日後、７日後、した。サンプルとしてはバーシカンの siRNA を導入した

10 日後、14 日後の MEF から全 RNA を抽出し、RT- PCR をMEF を用い、導入後７日目のサンプルを用いた。コント

用いてバーシカンの発現を検討した。コントロールとしてロールとしてはネガティブ siRNA を導入した MEF のメデ

ネガティブ siRNA を同様の方法で導入した MEF を用いた。

ィウムを用いた。また、siRNA 導入の３日目、５日目にそまた、siRNA 導入の３日目、５日目にそれぞれメディウムれぞれメディウムの変更を行った。の変更を行った。

３．結果

2 . 3 ドットブロットを用いたMEFの siRNA 導入によるバーシカン産生抑制の確認

3 .1 経時的に変化するマウス創傷皮膚のバーシカンの発現（図１）siRNA 導入７日目のメディウムを用い、バーシカンがタ創作成の１−３日目ではバーシカンの発現は認められなンパクレベルにおいても抑制されているかを確認した。採かった。しかしながら創作成４−５日目でバーシカンは過取したメディウム 4 µl をメンブレンに滴下し、バーシカン剰に発現した。しかしながら、創作成６−７日目ではバーの抗 IgG 抗体及び蛍光抗体を用いてバーシカンの発現を確

シカンの発現は４−５日目と比較して著明に抑えられた。

認した。コントロールとしてはネガティブ siRNA を導入

創傷治癒の過程の一部でバーシカンが著明に発現し、そのした MEF のメディウムを用いた。また、siRNA 導入の３後に抑制されていることが示された。

日目、５日目にそれぞれメディウムの変更を行った。

2.4

3 . 2 siRNA 導入によるバーシカン産生の経時的変化（図２）

DNAマイクロアレイ

MEF にバーシカンの siRNA を導入して７日後の MEF サ

MEF にバーシカンの siRNA を導入することによってンプルとネガティブ siRNA を導入した MEF サンプルそれMEF のバーシカン産生の変化を確認した。導入５日目、ぞれの DNA を抽出し、マイクロアレイを用いて DNA の７日目ではネガティブコントロールと比較して、著明にバ

図１

図２

経時的に変化するマウス創傷皮膚のバーシカンの発現

リアルタイム RT-PCR によるバーシカン発現の変化− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014ーシカンの産生は減少していた。siRNA 導入 14 日目にはに何らかの役割を担っている可能性が高いと考える。本研

ネガティブコントロールとほぼ変わらない結果となった。

究では創傷作成後２−３日で上皮化することから、５日目は創傷治癒における増殖期から再構築期であり、その時期3 . 3 タンパクレベルにおけるバーシカン発現の確認（図３）にバーシカンが発現していることが示唆される。またそのMEF にバーシカンの siRNA 導入の後７日目において、MEF のバーシカンを抑制する実験では、本研究の創傷治メディウム中のバーシカンの発現は著明に減少していた。

癒過程において６−７日目の状態を観察することができた

タンパクレベルでも siRNA 導入によってバーシカンの産可能性がある。

後バーシカンの発現が低下していることから、今回のMEF の バ ー シ カ ン を 抑 制 す る と Srpx 2 が 上 昇 し た。

生が抑制されていることが確認された。

Srpx 2 は細胞外マトリックス蛋白の一つであり、セレクチ

3 . 4 バーシカンが抑制されることで変化した細胞外マトリックスやサイトカイン（図４）ンファミリーとともに働くことによって血管新生と血管内マイクロアレイを用いて MEF のバーシカンを抑制したーシカンの抑制により Srpx 2 が上昇することで、血管新生際に、上昇した３つの因子を実際に RT- PCR を用いて評価の促進、血管内皮細胞の遊走を介して創傷治癒を調節してした。バーシカンのsiRNAを導入した７日目のMEFにおいいるのかもしれない。

皮細胞の遊走を調節していることが報告されている 1）。バて、コントロールと比較してSushi repeat- containing protein,同様の実験で MEF のバーシカンを抑制した際に Ccl 6 がX-linked 2（Srpx 2）と CC Chemokine Ligand- 6（Ccl 6）、上昇した。Ccl 6 はマクロファージや CD 4 陽性リンパ球、Secreted modular calcium-binding protein-2（Smoc2）の発現好酸球の遊走因子である事が知られている。また、Ccl 6がネガティブコントロールと比較して有意に上昇していた。

はマクロファージの遊走を促すことで創傷治癒を促進する

４．考ことが報告されている 2）。実際の創傷治癒ではどの時期に察働いているのかは不明であるが、バーシカンが抑制されたマウス皮膚創傷治癒の過程において、バーシカンが一過性に発現し、その後に抑制されていることから、創傷治癒

図３

図４状態では Ccl 6 を介して創傷治癒を促進していることが予想された。

ドットブロットによるバーシカン発現の確認

MEF のバーシカンを抑制した際の Srpx2、Ccl6、Smoc2 の発現− 132 −

創傷治癒における細胞外マトリックスの一つであるバーシカンの関与、RNAi による検討

同様に、MEF のバーシカンを抑制した際に Smoc 2 が上昇した。Smoc 2 は細胞外マトリックスの１つであり、腫カンの細胞に働きかける役割をさらに検討する必要があると考えた。

瘍の新生や創傷時の組織の修復に関与している事が知られ５．総ている。具体的には Smoc 2 は血管新生やケラチノサイトの遊走などを促進することが報告されている 3 , 4）。バーシ括

創傷治癒は様々な過程を経ているため非常に複雑であり、カンが抑制されると Smoc 2 の経路も介して創傷治癒を促バーシカンが経時的に発現、抑制されていることは非常に進することが予想された。

興味深い。特に肉芽形成を反映する増殖期に過剰発現し、バーシカンを抑制することでこれら３つの因子が上昇しその後に抑制されていることは意味があると考えられた。

た。それぞれが創傷治癒を調節することが報告されており、今後は実際に血管新生、炎症細胞遊走、線維芽細胞や表皮これらの因子を介してバーシカンは創傷治癒を調節してい細胞の遊走に与える変化を in vitro にて検討していくことる可能性がある。よって in vivo でバーシカンを抑制するとなる。さらに、マウスを用いた in vivo の創傷治癒過程ことが出来た場合は創傷治癒に何らかの変化が起こることにおいてバーシカンを RNAi 法にて抑制した際の創傷治癒が予想された。

過程の変化を検討し、さらに Srpx 2 や Ccl 6、Smoc 2 の発本研究では正常の創傷治癒においてバーシカンが発現す現の変化を検討する必要性があると考える。これらの結果る時期は４−５日目と限られていたことがわかった。バーからバーシカンが創傷治癒に与える影響を検討していく。

シカンの抑制実験が実際に本研究の創傷治癒における１−また、マイクロアレイ法にて変化があったサイトカインや３日目、６−７日目を反映しているかどうかは確かめてお細胞外マトリックスに関しても in vitro、in vivo それぞれらず、in vivo での定量が今後必要であると考えた。

にて発現の検討を行い、バーシカンの線維芽細胞、マウス

創傷治癒過程において一過性に発現するバーシカンにはの皮膚に与える影響を詳細に検討していく必要がある。

創傷治癒を調節する役割があることが予想された。受傷１−３日目ではバーシカンが抑制されており、Srpx 2 や Ccl 6、 （引用文献）
Smoc 2 などが発現し、炎症細胞の浸潤や血管新生を促進

１）Miljkovic-Licina M, Hammel P, Garrido-Urbani S et

して、肉芽の形成を促進している可能性がある。さらに言al. Sushi repeat protein X-linked 2 , a novel mediator of

えば、これまでの報告で肉芽組織には過剰にバーシカンがangiogenesis. FASEB J 2009 ; 23 : 4105 - 16 .

5）

発現していることが知られており 、受傷４−５日目では２）Kaesler S, Regenbogen J, Durka S et al. The healing

形成された肉芽を反映してバーシカンが上昇していると思skin wound: a novel site of action of the chemokine

われる。受傷６日目以降ではバーシカンの発現は再度抑制

C 10 . Cytokine 2002 ; 17 : 157 - 63 .

されており、再度 Srpx 2 と Ccl 6、Smoc 2 が上昇している

３）Maier S, Paulsson M, Hartmann U. The widely

事が予想される。よって受傷６日目以降は肉芽組織が減少

expressed extracellular matrix protein SMOC- 2する再構築期である可能性が高い。

promotes keratinocyte attachment and migration.

MEF に対して RNAi 法を用いることでバーシカンを抑Experimental cell research 2008 ; 314 : 2477 - 87 .

制すると非常に様々な変化を起こしていることが示唆され

４）Rocnik EF, Liu P, Sato K et al. The novel SPARC

た。MEF から発現するバーシカンを抑制することで MEF

family member SMOC-2 potentiates angiogenic growthの周囲の環境が変化し、Srpx 2 や Smoc 2 などの細胞外マfactor activity. The Journal of biological chemistry

トリックス、Ccl 6 などのサイトカインに影響を及ぼして2006 ; 281 : 22855 - 64 .

いた。その詳細なメカニズムは不明であり、今後のさらな

５）Hakkinen L, Westermarck J, Kahari VM et al.

る検討が必要であると考える。マイクロアレイ法にて変化

Human granulation-tissue fibroblasts show enhanced

した因子は Srpx 2 と Ccl 6、Smoc 2 以外にも多数変化した

proteoglycan gene expression and altered response to

ものが認められ、他の分子においても検討を行い、バーシ

TGF-beta 1 . J Dent Res 1996 ; 75 : 1767 - 78 .

− 133 −