総説

哺乳類 Period の真の機能とは何か
明石 真✉
山口大学 時間学研究所 時間生物学研究室
2017 年 10 月、最初の時計遺伝子としてショウジョウバエの Period（Per）をクローニングした米国の 3 名の研究者へノーベル賞が贈られたことは記憶に新しい。この研究成果から十数年を経て、1997 年にようやく、ショウジョウバエ Per のホモログが哺乳類でクローニングされた。その後、そのコードするタンパク質である Period（PER）の機能解析が急速に進められ、1999 年には、その機能は BMAL1-CLOCK 転写因子複合体の抑制であると早くも結論づけられ、現在もこれが PER の機能だと広く受け入れられている。しかしながら、従来モデルにおいて示される PER の機能では説明できない多くの矛盾が存在している。したがって、クローニングされてから 20 年以上経過した今でも PER の真の機能は不明だと言わざるを得ないが、最近になって新たな機能的側面が分子レベルでわかってきた。すなわち、哺乳類の PER は CRY による転写抑制において緩衝因子として働く側面を持つということが明らかになってきたのである。本稿では、この機能的側面について私たちの研究成果を交えて概説するとともに、この機能の意義についても考察したい。
１．はじめにこれに対し、例えば、MAP キナーゼ（ERK）のアミ

1971 年、ショウジョウバエにおいて概日リズムのノ酸配列を哺乳類とショウジョウバエで比較した場突然変異体が単離され、概日時計が遺伝子による制御合、全長にわたるアミノ酸の同一性が 80%にも及ぶを受けていることが示唆された 1。それから 13 年後ことから考えて、PER の低い同一性は想定外ではなの 1984 年にはその原因遺伝子 Per が同定され、いよいだろうか。このように、配列の類似性が低かったた

いよ概日時計の分子生物学が花開くこととなった

2,3。

めに、従来のクローニング方法では哺乳類の Per の単多くの場合、ショウジョウバエの遺伝子がクローニン離は成功しなかったが、東京大学のグループが開発しグされれば、速やかに哺乳類のオルソログが発見された PCR 法によってようやく同定に至った。簡単に説ることが多い。すなわち、種間で保存された生理機能

明すると、dPER の PAS ドメインに対応するヒトゲを司る遺伝子ならば、遺伝子構造の保存性が高い場合ノム中の塩基配列を Degenerate プライマーによっが多いため、例えば、核酸のハイブリダイゼーションて増幅することで Per に相当する DNA 断片を得るのような物理的相互作用の性質を利用して単離でき方法である。

る。概日時計は種に関わらずほとんどの生物が共通にもつ普遍的生理機能であることから、当時の研究者はほどなくして哺乳類の Per が単離されると心待ちにしたのではないだろうか。

２．従来モデルにおける PER の機能

Per1 遺伝子がクローニングされるとすぐに、これがコードする時計タンパク質である PER1 の機能解

ところが、哺乳類の最初の Per が同定されるまで、析がスタートした。既にショウジョウバエの研究におさらに 13 年後の 1997 年まで待つこととなったのでいて、dPER の過剰発現が内在性の dPer の発現を抑ある 4。意外なことに、ショウジョウバエの dPer と制することが示唆されており、遺伝子産物が自己の転哺乳類の Per1 の構造的類似性は低かった。最もアミ写を抑制するという「ネガティブフィードバックルーノ酸配列の類似性が高かった PAS ドメインにおいてプ」こそが概日時計の分子メカニズムであると考えらも、哺乳類の PER1（本稿ではタンパク質を大文字で、れていた 5。したがって、哺乳類の PER1 についても、核酸は小文字斜体で示すことで区別する）と dPER の同様な機能が期待されるのは当然の流れであろう。ま配列は 41%しか一致しなかったのである。核酸レベず、時計転写因子である BMAL1 と CLOCK のヘテルにおける両者の一致率はずっと低いと想定される。

ロダイマーが認識するエンハンサー配列である E-✉akashima@yamaguchi-u.ac.jp
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box が、Per1 の転写開始点上流において種間で保存

Per1 の機能欠損マウスでは、後にクローニングさされて存在していることが判明した 6 。さらに、れた Per2 の機能欠損マウスと同様、概日リズムの機BMAL1 と CLOCK の過剰発現によって E-box を介能不全が確認されている 11,12。さらに Per1 と Per2した Per1 の転写活性化が確認された。あとは、PER1のダブル機能欠損マウスでは概日リズムはほとんどが、dPER と同様に、Per1 の転写を抑制することが失われる結果となったことから、PER1 や PER2 が概示されば、哺乳類の概日時計においてもネガティブフ日時計において必須の因子であることは間違いないィードバックモデルが証明される。

はずである。しかし、上述の理由から、PER1 や PER2

しかしながら、実際にレポーターアッセイを試みた研究者は数多くいると思うが、PER1 を過剰に発現さが BMAL1 と CLOCK の抑制因子と結論付けることは困難ではないだろうか。

せても Per1 の転写抑制が明確には検出できないのである。私たち自身の実験によると、発現ベクターの量４．転写抑制の緩衝因子としての PERを可能な限り増やして PER1 を細胞内に大量に発現

私たちは、PER1 や PER2 の過剰発現は Per1 に対させても、Per1 の転写抑制は 50%にも至らなかった。

してはわずかな転写抑制効果を示すが、Per2 に対しこれでは、PER1 が転写抑制因子と結論づけるのは難てはむしろ転写を促進することに注目して研究を進しいのではないか。それにも関わらず、少なくとも部めた 13。この際、細胞に導入する PER1 や PER2 の分的には転写を抑制する機能が示されていることか発現ベクター量が少なくても転写活性化が起こり、比ら、PER（以下、PER の表記は PER1 に加え、後に較的少量のベクターでこの活性化は上限に達したこ

クローニングされる PER2 および PER3 を含む）はとから、なんらかの内在性の因子を介して間接的に転BMAL1 と CLOCK に対する抑制因子であるとみな写を活性化していると考えた。つまり、過剰な外因性されるようになり、この考え方は今も広く受け入れらの PER1 や PER2 は内因性の CRY（以下、CRY の表れている。

記は CRY1 および CRY2 の両方を含むものとする）を抑制したと考えたのである。そこで、私たちは、

３．明らかとなった矛盾

CRY1 および CRY2 のダブル欠損マウスの胚性線維

しかし、その後の多くの報告で、PER が単なる転芽細胞を用いてレポーターアッセイを行い、PER2 に写抑制因子であるというモデルは徐々に疑わしいもよる Per2 の転写活性化が起こらなくなることを確認のになる。まず、PER に続いて CRY1 および CRY２した（図１）。

が BMAL1 と CLOCK の転写因子活性を抑制する因子であることが報告され、その抑制作用は PER とは比べものにならないほど強かった。例えば、先ほどのレポーターアッセイの例では、微量の CRY 発現ベクターを細胞に導入するだけで、BMAL1 と CLOCK による Per1 の転写活性化は完全に抑制されることがわ
かった 7。これでは転写抑制因子としての PER の存在意義が霞んでしまう。問題はこれだけではない。
PER が転写抑制因子であれば、その機能欠損によって E-box を介した転写が活性化して Per の mRNA 量は上昇するはずであるが、実際には Per2 の機能欠損マウスにおいて Per1 や Per2 の mRNA 量が顕著に減少することが示された 8。CRY1 および CRY2 については、そのダブル機能欠損マウスにおいて Per1 お
よび Per2 の mRNA 量が恒常的に高く維持されていることが確認されており、転写抑制因子であることはin vivo においても明確である 9。さらに、一部の遺伝子プロモーターを用いたレポーターアッセイにおいて、PER の過剰発現はむしろ転写量を上昇させることが報告された 10。

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図１ PER2 は CRY 依存的に Per2 発現を活性化する胚性線維芽細胞を用いたレポーターアッセイの結果を示す。野生型の細胞では PER2 の過剰発現は転写を活性化するのに対して（左側のグラフ）、Cry ノックアウトマウスの線維芽細胞、すなわち内在性の CRY の非存在下では PER2による転写活性化が全く起こらない（右側のグラフ）。

Vol . 25, No. 1 ( 2019)11次に、NIH3T3 細胞（マウス胚性線維芽細胞）によって以下の実験を行った。まず、既知の通り CRY の過剰発現で Per2 の転写は強力に抑制されるが、PER2を CRY と同時に過剰発現すると CRY が安定化するにもかかわらず、CRY による転写抑制が緩和されることがわかった（図２）。PER2 によって CRY の細胞内局在が変化したために転写抑制が低下した可能性も考えられたが、この緩衝効果は PER2 の核内外局在に依存しないことを、核内外移行シグナル配列を利用した実験で確認している。さらに、CRY との結合領域（PER2 の C 末端の約 200 アミノ酸）を欠失す
ると PER2 は CRY を抑制できなくなり、逆に、このPER2 の C 末端のみを発現させると全長の PER2 よりも強力に CRY を抑制できることもわかった。このことは、全長の PER2 においては C 末端が立体的にマスクされており、翻訳後修飾等によって C 末端が露出すると、CRY への抑制機能が上昇することを示唆している。ところで、内在性の CRY の核内移行はPER1 や PER2 とのダイマー形成に完全に依存する
図２ PER2 は CRY との直接結合によって CRY を抑制している（上）CRY 結合ドメインを欠失した PER2 の模式図を示す。
（下）NIH3T3 細胞を用いたレポーターアッセイの結果を示す。CRY の過剰発現による転写抑制は PER2 の発現によって緩衝されるのに対して（薄いグレーのグラフ）、CRY 結合ドメインを欠いた PER2 ではこれが全く起こらない（濃いグレーのグラフ）。

ことが示されていることから 14、核内における両者の分子数は同等であると想定されるが、この量比を考慮した実験条件においても PER2 は CRY を抑制できることを確認した。
５．PER が CRY を抑制するメカニズム
PER1 や PER2 が CRY を抑制するメカニズムを完全に明らかにするのは難しい。なぜならば、CRY がBMAL1 と CLOCK を抑制するメカニズムも未だ良くわからないからである。現時点では、BMAL1 の転写活性化ドメインにコアクチベーターが結合するのを CRY が同じ部位へ排他的に結合することで阻害している、という報告が有力な証拠を示しているかもしれない 15。私たちは、HEK293 細胞（ヒト胎児腎細胞）で時計タンパク質を人工合成させ、これを精製して EMSA（タンパク質の DNA への結合を電気泳動の移動度で検討するアッセイ）を行ってみたところ、
CRY1 は BMAL1-CLOCK 複合体とともに３量体として E-box に結合することが示された
（図３）。
次に、
CRY1 と PER2 を複合体として精製して実験に利用

図３ PER と結合した CRY は BMAL1-CLOCK-E-box 複合体に結合できない
精製タンパク質を用いた EMSA アッセイの結果を示している。
（レーン２から４）CRY の同複合体への結合が、FLAG 抗体によるスーパーシフトで確認できる。
（レーン５から７）あらかじめ PER2 と結合させた CRY では、複合体への結合が低下している。
（レーン８から１０）PER3 と結合させた CRY
では、この結合低下は起こらない。

したところ、BMAL1-CLOCK 複合体に CRY１が取り込まれにくくなることがわかった。また、C 末端だ
けの PER2 を用いた場合は、全長の PER2 よりもずっと強力に CRY1 のリクルートを抑制した。やはり全長の PER2 では C 末端が立体的にマスクされているのかもしれない。これらの EMSA の実験結果から言えることは、
PER2 は CRY1 が BMAL1-CLOCK に

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アクセスするのを阻止することで、CRY1 による転写抑制を緩衝しているということである。
上記の結果を私たちは論文にまとめてあるジャーナルに投稿したのだが、査読者たちは私たちのデータに興味を示しながらも判断は慎重なものだった。残念ながら、一度完成したモデルに物申すには、相当なデータ量で証明しないと受け入れられないということであろう。ただ、私たちは、これらの現象が in vitroにおけるアーティファクトではなく、PER の真の機能の側面を示唆していると感じていた。その根拠を以下に記す。
６． in vivo データとの整合性
PER2 の機能欠損マウスにおいて Per1 や Per2 の転写量が減少することが示されていることから、

図４ PER3 は CRY を抑制できない
NIH3T3 細胞を用いたレポーターアッセイの結果を示す。
（レーン２から６）PER2 とは異なり、PER3 は Per2 プロモーターを活性化できない。
（レーン７から１２）PER2 とは異なり、PER3 は CRY による転写抑制を緩衝できない。

PER2 が転写に対して正に働くことは in vivo において既に示唆されていたと言える。私たちはさらに invivo との相関を明らかにするために、PER3 に注目して実験を行った。PER3 は、PER1 や PER2 とは異なり、その機能欠損はマウスの概日時計振動に対して大きな影響を及ぼさないことが示されていた 16。しかしながら、従来モデルで示されてきた転写の抑制因子としての機能においては、PER1 や PER2 と同様にPER3 も同等の弱い転写抑制活性を示すことがわかっており 7、PER3 が他の PER と異なっていることを示す機能的理由は何も見つかっていなかった。私た
ちが in vitro で見つけた現象が真実ならば、PER3 において他の PER との違いが見出されるはずである。
実際、私たちのデータは、興味深いことに、PER1 やPER2 で見られた CRY を抑制する機能は、PER3 では存在しないか微弱であることを明確に示した（図４）。したがって、PER3 の機能欠損が及ぼす概日時
計本体への影響が小さいのは、PER3 には CRY を抑制する機能がほとんど無いからである、と解釈できる。

図５ PER2Brdm1 は CRY2 を抑制できない
NIH3T3 細胞を用いたレポーターアッセイの結果を示す。野生型の PER2 が CRY2 による転写抑制を顕著に緩衝するのに対して、変異 PER2（PER2Brdm1）はほとんど緩衝できない。

さらに、上記の EMSA アッセイで検出された、CRYと BMAL1-CLOCK の物理的相互作用の抑制においのプロモーターに対する転写抑制機能を比較したとても、PER3 はほとんど作用を示さなかったのである

ころ、PER2 の野生型も変異体も同様に微弱な転写抑（図３）。

制を示した。ところが、興味深いことに、私たちは、もうひとつ、in vivo との相関を示すデータが得ら

この PER2 変異体が CRY2 に対する阻害機能を顕著れた。これまで、PER2 の部位欠損変異体であるに失っていることを明らかにした（図５）。このこと

PER2brdm1 がなぜ loss of function であるのか、分子は、PER2 による CRY2 の抑制機能が、in vivo の現メカニズムについては何もわかっていなかった 8。

象を良く裏付けていることを示唆している。しかし、

PAS ドメインの一部を含む 87 アミノ残基が欠失してなぜこの変異体 PER2 は CRY1 に対しては依然としいることから、BMAL1 や CLOCK との相互作用におて抑制効果を示すのか、そして、なぜ PAS ドメインいて異常があることが理由であると予想されたが、実近傍領域の欠失でこのような表現系が現れるのか、現験的な証明は何も為されていなかった。そこで、Per1状では説明ができない。

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７．PER と CRY による CLOCK のリン酸化制御
PER1 や PER2 による CRY の機能抑制のメカニズ
ムは、CRY が BMAL1-CLOCK と物理的に結合するのを阻害していることが理由であると説明してきた。
これに加えて、私たちはその後の研究によって、BMAL1 の存在下で起こる CLOCK のリン酸化もこのメカニズムに関与することを示唆するデータを得た 17。まず、私たちはこの CLOCK のリン酸化の役割を知るために、キナーゼ阻害剤ライブラリーを用いた
CLOCK リン酸化阻害剤のスクリーニングを実施し、チロシンキナーゼ阻害剤である Erbstatin analog を見出した。この阻害剤を用いると、BMAL1 の共発現によって起こる CLOCK のリン酸化が部分的に抑制された。この阻害剤の特異性が低いためにキナーゼを特定することは断念したが、約 80 種類の阻害剤の中

図６ PER は CLOCK のリン酸化を保護する
NIH3T3 細胞へ過剰発現させた時計タンパク質をウエスタンブロットにより解析した。
（レーン３）BMAL1 の共発現により CLOCK のリン酸化が起こる。
（レーン４）CRY を発現させると、このリン酸化は強力に抑制される。
（レーン５から８）
PER1 または PER2 の発現によって、CLOCK のリン酸化はCRY から保護される。なお、PER3 ではこの保護作用は全く確認できない。

で唯一明確に CLOCK のリン酸化を抑制したことから、同リン酸化の意義を知るために有力なツールである。
予想通り、この阻害剤で NIH3T3 細胞を処理すると、E-box を介した遺伝子発現が抑制された。すなわ
ち、BMAL1 との共存によって起こる CLOCK のリン酸化は、E-box を介した転写活性化に必要であることが示唆された。一方、この CLOCK のリン酸化は CRYの過剰発現によって顕著に抑制されることから、CRYによる転写抑制のメカニズムは CLOCK のリン酸化の抑制にあることが示唆された。これを支持するように、フラビン結合に必須なアミノ酸に点変異を導入することで転写抑制活性を失った CRY では、CLOCKのリン酸化抑制は起こらなかった。興味深いことに、
この CRY による CLOCK のリン酸化レベルの低下は、PER1 や PER2 の過剰発現によって保護できることがわかった（図６）。そして、やはり PER3 はこの

図７ 立体構造解析から明らかになった時計タンパク質複合体の状態
CRY と BMAL1 の結合面は、CRY と PER および CRY とFBXL3 の結合面とオーバーラップしており、３者の結合は排他的関係にある。TAD とは BMAL1 と転写コアクチベーターの結合ドメインを意味する。CRY は TAD をマスクすることで転写を抑制すると考えられるが、PER が CRY に結合しているとこれが起きなくなる。また、CLOCK には CRY との結合ポケットが存在する。

作用を示さなかった。このように、PER1 や PER2 による CRY の抑制には、CLOCK のリン酸化制御が関た 18。この論文の目玉は、PER2 と CRY1 の結合面に与しているかもしれない。しかしながら、いくつかのは亜鉛結合部位が存在しており、亜鉛の存在量が in

報告によると CLOCK のリン酸化サイトは多数存在

vivo における両者の結合強度に影響を与える点であすることが示唆されており、その部位によって役割がる。また、CRY1 の分解に関わるユビキチンリガーゼ全く異なる可能性がある。今後、CLOCK の活性化にである FBXL3 とは排他的に PER2 は CRY１と結合関わるリン酸化サイトを突き詰めることで、この仮説するという知見は、PER による CRY の安定化のメカの正しさを証明する必要があるだろう。

ニズムを明確に示しておりとても興味深い。さらに、これらに加えて明らかにされたことは、CRY と PER

８．PER の新機能を支持する続報の結合面は、CRY と BMAL1 の結合面とオーバーラ

私たちが PER1 や PER2 による転写抑制緩衝機能ップしているという点である（図７）。これはすなわ

について発表した約３週間後、PER2 の CRY 結合ド

ち、PER が CRY に結合すると CRY は BMAL1 に結メインと CRY1 の photolyase homology region（PHR）

合できないことを示唆しており、私たちが示したの複合体を結晶化して構造解析した報告が発表され

PER1 や PER2 が持つ転写抑制の緩衝機能が構造面

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おいては PER1/2-CRY1/2-BMAL1-CLOCK の４量体として丸ごと E-box から引き離されると主張されている。CRY は BMAL1 との結合面のみならず CLOCKの結合ポケットにも結合することが結晶構造解析の報告で示唆されており 22、PER1 や PER2 によって結合面がマスクされて CRY が BMAL1 と結合できなくても、CRY と CLOCK との結合によって４量体は維持されるのだと考えることができる。私たちのEMSA 実験におけるバッファー環境や電気泳動条件
では、CRY-CLOCK 間の結合が外れたのかもしれな
い。それにしても、時計タンパク質群と E-box の複合体形成状態については、全ての研究報告に対して整合性のあるモデルを考えるのが難しい。実験手法や材料によって様々な報告がある。例えば、PER1/2、CRY1/2、
図８ PER の機能における新たな側面
内在性の CRY は単独では核内移行できない。PER が CRYと結合すると、CRY は FBXL3 による分解から保護され、さらに核内へ移行する。しかし、PER によって CRY と BMAL1の結合面がマスクされているために、ただちに転写抑制は起きないと想定される。この転写抑制の「遅れ」は、概日リズ
ムのような長周期振動を生み出すには不可欠であろう。
PER-CRY 複合体はリン酸化などの翻訳後修飾によって、
BMAL1-CLOCK を抑制できるようになると考えられる。

BMAL1 および CLOCK が複合体として E-box 上にから証明されたと言えるのではないだろうか。そして、れることで翻訳が促進され、内在性の PER2 タンパ

これらの構造的特徴は、同じ年に報告された、PER2ク質量が増加する結果となる。興味深いことに、と CRY2 における同様のタンパク質領域を使用した

PER2 の機能欠損マウスにおいて Per2 の転写量が減複合体の立体構造解析によっても明らかにされてい少するという過去の報告に矛盾せず、このマウスにおる 19。実は、BMAL1 と PER が CRY との結合部位でいては PER2 の増加によって Per2 の転写が促進され競合することはずっと以前に生化学的に示唆されてた。まさに、上述の私たちの実験結果が in vivo の条いたのだが 20、上述の構造解析の研究成果によってこ件下において再現されたのである。そして、おそらくの関係性がさらに明確にされたと言える。

は PER2 の増加が起こした CRY による転写抑制の遅PER2 が CRY による転写抑制を緩衝することは、4-hydroxytamoxifen（4-OHT）によって PER2 が核存在することが、ChIP アッセイによって示唆されている 23。
PER2 が転写促進に働くことは、Per2 の UTR 解析の結果からも明確に示唆されている 24。この報告によると、マウス Per2 の 3’UTR 領域をノックインによって欠失させると、microRNA による標的部位が失われによって、このマウスの行動リズムの周期長は延長を示した。

移行する細胞実験系を用いた研究でも報告されている 21。この実験系においては、PER2-ER（PER2 とエ９．おわりにストロゲン受容体のリガンド結合部位との融合タン

以上のように、PER の機能において従来とは異なパク質）を発現する培養細胞に 4-OHT を添加すると、る側面がわかってきた。すなわち、転写抑制因子 CRY

PER2-ER が直ちに細胞質から核内へ移行する。E-の緩衝因子としての役割である。これにより、従来のbox を介して転写調節される遺伝子は、従来モデル通転写抑制因子としての機能では矛盾していた現象がり、4-OHT を添加するとただちに転写抑制される。

説明できるようになる。例えば、PER2 の欠失によっ

しかしながら、遺伝子の種類によっては、むしろ転写て Per1 や Per2 の転写量が減少するのは、CRY によが促進することが示されたのである。そしてこの転写る転写抑制に歯止めが利かなくなるためであろう。こ促進は CRY の存在に依存していることから、PER2の PER1 や PER2 による CRY の緩衝作用は、概日時

は CRY による転写抑制を緩衝することで転写を促進計の振動を安定に保つために意味があると考えられしたと想定されるのである。上述の私たちの EMSAる（図８）。すなわち、BMAL1 と CLOCK によっての実験では、PER2 の存在下では BMAL1 と CLOCK発現した強力な転写抑制因子である CRY が、即座にの複合体に CRY1 が結合できない結果となっており

BMAL1 と CLOCK による転写を抑制してしまうと、上述の立体構造の報告と整合性があるが、この報告に長周期の遺伝子発現リズムを形成することが難しく

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circadian

味を持つと考えられる。

doi:10.1038/22118 (1999).

しかし、ここで大きな疑問が二つ残る。一つには、
PER1/2-CRY1/2 転写抑制複合体は一時的に不活化し

9.

clock.

Natureなるため、PER1 や PER2 による緩衝効果が重要な意

400,169-173,

Okamura, H. et al. Photic induction of mPer1and mPer2 in Cry-deficient mice lacking aた状態から活性化する必要があるのだが、このメカニ

biological clock. Science 286, 2531-2534 (1999).

ズムが全く不明である。おそらく、CKIε や δ による

10. Kaasik, K. & Lee, C. C. Reciprocal regulation

リン酸化など、PER1/2 や CRY1/2 の翻訳後修飾によof haem biosynthesis and the circadian clock inって転写抑制複合体として活性化すると推察するが、

mammals. Nature 430, 467-471 (2004).

現時点では私たちは明確な証拠を持っていない。もう11. Bae, K. et al. Differential functions of mPer1,一つ、PER1 や PER2 はどのようにして遺伝子特異的mPer2, and mPer3 in the SCN circadian clock.に役割を変えているのか、やはり現時点ではメカニズ

Neuron 30, 525-536 (2001).

ムが全く不明である。E-box の外側にある転写調節領

12. Zheng, B. et al. Nonredundant roles of the域の関与を考える必要があり、この証明は簡単ではな

mPer1 and mPer2 genes in the mammalian

いだろう。

circadian clock. Cell 105, 683-694 (2001).

このように、PER の真の機能が明らかになるにはまだまだ時間を要する。

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