立石科学技術振興財団

助成研究成果集(第29号) 2020

［ 研究助成 (A) ］

シークエンシングと機械学習が駆動する細胞フェノタイピング技術にむけてToward multi- modal cell phenotyping for networked biophotonics
2181005

研究代表者

東京大学
先端科学技術研究センター准教授

太田禎生

かを見るためにパワフルなのが，光イメージン[研究の目的]グ技術です。光イメージング技術の長所は，壊細胞は部品や設計図が分かっていても，働くしてしまっては機能しないブラックボックスの仕組みまだまだ分からない，膜に包まれた直径応答を，迅速かつ安価に調べられる点にありま10 µm オーダーの微小構造体です。そしてフェす。どんなに細かく要素を計測できるように

ノタイプ (表現型) とは，ジェノタイプ (遺伝なっても，(細胞が計算機内で完全に再現でも子型) と環境因子の関わり合いの結果として観されない限り)，こうして非破壊に問いかけな察できる特徴セットであり，フェノタイピングければ，人の仮説は検証するのは容易ではないはこれを調べていく研究と捉えています。もうためです。一方で，光イメージングが，塩基配少し噛み砕けば，細胞の設計図たる遺伝子型を列のような分子レベルの解像度と特異度を得る

知った上で，細胞に色々と問いかけてみてそのには，まだ時間がかかりそうです。

応答を観察し，中で何が起きているのか，ある

このように，細胞を壊して要素を調べる分子いは如何に求めた応答が得られるか，私たちはフェノタイプ解析と，細胞を壊さずに総体とし理解を目指していると言うことと考えています。て観る光イメージングは一長一短で，いずれも問いかけ方は，例えば薬を与えてみたり，環が欠かせない技術です。今後は，この仕組みの境を変えて飼ってみたり，様々です。それではわからないブラックボックスを様々な角度から応答は何を見るのでしょう。まず細胞内のある計測し，データを紡いで理解していく方向性が時点で構成分子の有無を，細胞を壊して網羅的ますます重要になってくると考えられます。しに検出する分子フェノタイプ解析は，分子的なかし従来法において，この分子フェノタイピン機序の説明を支持する上で，非常にパワフルなグと非破壊イメージング技術を融合し，データアプローチです。近年，1 細胞毎の個性を高解の価値を活かしきるのは容易ではありませんで像度に調べるシングル解析分野が興隆していました。そこで私たちはこれを可能にすべく，イすが，その中心は次世代シークエンシング技術

メージング技術とシークエンシング技術を繋ぎによる遺伝子発現解析は，この分子解析に含ま合わせることで，機械学習の力をフルに引き出れます。分子のレベルの解像度で，細胞の中のす技術基盤を目指しています。その基盤内の 1構成要素を定量的に測れるようになった技術のつの重要な構成技術である高速三次元フローイ

進歩には，本当に凄まじいものがあります。一メージング技術を，立石財団のサポートを頂き方，構成分子が構造的にいかに機能しているのながら実現を目指してきたので，ここに報告し― 1 ―立石科学技術振興財団

ループットなイメージング法を開発してきまします。

た。
[研究の内容，成果]
2．単一対物レンズ光シート顕微鏡の仕組み
図 1(a) に示すのは，本研究開発で構築した，1．3D イメージング技術背景
細胞は三次元の構造物ですので，その構造を改変 APOM 式の光流体ライトシート 3D 顕微評価する上で，細胞の三次元 (3D) イメージ鏡システムです。この系ではまず，サンプルにングは非常に有用です。しかし一般的に，カメ面した対物レンズとは離れた地点で，サンプルラの二次元 (2D) 素子に結像する 2D イメーの光学像を同一なレンズを用いて結びます。そジング手法と比べると，奥行き方向の空間情報こに例えば 45 度に傾斜した鏡を配置しておくを取得するために時間がかかってしまいます。と，鏡での反射により対物レンズ光軸に平行なそのため，細胞 3D イメージングのハイスルー

縦平面を光軸直交平面にひっくり返す事ができ，プット化は容易ではありませんでした。そこでその結果，光軸に垂直に配置する通常のカメラ

私 た ち が 採 用 し た の が，Axial-plane opticalで縦平面画像を撮像する事ができます[1]。こmicroscopy (APOM) と呼ばれる技術です[1]。の光学系により，深さ方向に広がる平面の撮像APOM は，対物レンズの縦面 (光軸に平行なを，スキャンすることなく実現することができ面) を直接カメラに結像する光学顕微鏡法であます。本研究では，縦平面ではなく傾斜した平り，光シートで対物レンズ上のサンプルを励起面を，オリジナル APOM よりも傾斜させた鏡し，光シートを通り過ぎる細胞の 2D 切断面をにより同様の仕組みを用いて，直接カメラに結連続的に取得することができます。言い換えれ像しました。これにより，収差に由来して生じば，サンプルを対物レンズ光軸に直交する方向る画像の歪みを減らし，傾斜した鏡からの反射に動かすだけで 3D 画像を取得でき，高速で連してくる光信号の収率を高めています。そして続的に大量の 3D 細胞画像を撮像できるようにこの系に，カメラ結像面と一致するように光なるという仕組みです。私たちは本研究においシート照明を導入し，単一対物 (サンプルに対て，この高速 3D イメージング系を改変し，マしている) レンズの上で，対象がシートを横切イクロ流路を組み合わせ，流れる細胞のハイスるように動かすと，対象の 2D 断面が連続的に(a) 光学系模式図，(b)-(d) 二次元切断像，(e) 三次元再構成像

図1

開発した単一対物レンズライトシート顕微鏡と，細胞蛍光三次元イメージング― 2 ―Tateisi Science and Technology Foundation

取得され，3D ライトシート蛍光顕微鏡として蛍光染色 (LIVE / DEAD Fixable Green Dead機能することとなります。実験上においては，Cell Stain) を施した MIA PaCa-2 細胞をゲル対象である細胞は電動ステージ上に載せて光学中に固定し，このゲルを電動ステージを用いて系の光軸に垂直に移動するか，マイクロ流路中0.5 mm 毎 秒 の 速 度 で 光 軸 に 垂 直 に 移 動 し，にサンプルを流すことにより，連続的に 2D 画sCMOS カメラ (scientific Complementary met-像を計測し，そこから細胞の 3D 画像を再構築al-oxide-semiconductor camera) を 880 フレーしています。

ム毎秒のフレームレートで用いて，光切断面を連続イメージングしました。図 2(a) に示すのは切断面の蛍光画像であり，z 方向は深さ方向

3．高速 3D イメージング実証
3D イメージング実証においては，まず膜をの情報を持っています。そのため，深さ方向に蛍光染色した細胞を準備しました。k562 細胞重なっている細胞も，空間的に別々に見分ける(直径約 15 µm，CellMask Green Plasma Mem-ことができています。この連続光切断イメージ

brane Stain 染色) を載せたサンプルを電動スングを 1136 ミリ秒行って，合計 2791 細胞を撮テージで光軸に垂直に移動させることで 2D 断像し，図 2(b) のように三次元画像を再構築し面画像を連続に取得し (図 1b〜1e)，この画像ました。検出スループットにして，2457 細胞

スタックから 3D 画像を計算機内で再構築しま毎秒と換算されます。

した。細胞膜をイメージングできている結果か

そして，この新しい顕微鏡を用い，PDMSら，この光シート顕微鏡が，深さ方向にスキャ(ポリジメチルキサン) とガラスで作られたマンすることなく，深さ方向の解像能力を有するイクロ流路デバイスを流れる細胞の 3D イメーことが実証されています。

ジングの実証に進みました。蛍光染色された本技術の長所は，深さ方向にスキャンする必MIA PaCa-2 細胞を流路に送液し，光シートを要が無いため，他の手法よりも高速に三次元イ通り抜けていく切断面像を連続的に撮像し (図メージングできる点です。また二次元イメージ

2(c))，細胞を高速に 3D イメージングするこ

ングと比べると，深度方向に重なり合っているとができています (図 2(d))。お見せしている細胞を空間的に識別できるという強みもありま

データでは，52 細胞毎秒相当のスループットす。これらを実証するために広視野での細胞集で細胞が 3D イメージングされています。現在，団の撮像を行いました。この実験では，死細胞さらに遥かに多くの細胞を，同時に流して撮像

図2

開発した単一対物レンズライトシート顕微鏡によるハイスループット撮像― 3 ―立石科学技術振興財団

することができる流体技術を導入することによ

グ解析の進展に，大きく貢献していけると考えり，スループットは大幅に増加 (1000 細胞毎ています。

秒以上) してきています。また，イメージングの多色化も進展しています。

[成果の発表，論文等]
おかげさまで投稿論文に関しては，現在執筆中です。

4．まとめと今後の展開

以下には，学会発表を記載します。

以上のように，APOM 光学系を改変した単一対物レンズの光シート顕微鏡を構築しました。
そして，最終的にはマイクロ流路技術と組み合わせることにより，ハイスループットな 3D 光

[1]ference on. Miniaturized Systems for Chemistry andLife Sciences (µTAS 2019), 2019.

流体イメージング技術を開発・実証しました。
本研究期間内においては実現に至りませんでしたが，この高解像な細胞情報計測技術を，今後はシークエンシング技術と融合していきます。
この融合システムの実証を通し，未だブラックボックスである細胞の網羅的なフェノタイピン― 4 ―Masashi Ugawa, Sadao Ota, High-throughput

optofluidic 3D imaging, The 23rd International Con-[参 考 文 献][1]

T. Li, S. Ota, J. Kim, Z. J. Wong, Y. Wang, X. Yin,and X. Zhang, “Axial Plane Optical Microscopy,”
Scientific Reports, 4, 7253, 2014.