立石科学技術振興財団

助成研究成果集(第26号) 2017

ワンショット共焦点光学顕微鏡による病理組織観察法の創出
One- shot confocal microscopy for histopathological diagnosis
2161024

研究代表者

徳島大学大学院
社会産業理工学研究部

講 師南川丈夫[研究の内容，成果］[研 究 の 目 的]
病理組織診断では，高精細に組織を観察する

1．ワンショット共焦点光学顕微鏡の開発
共焦点光学顕微鏡は，共焦点効果による深さため，光学顕微鏡のボケが出ない程度に病変の極一部 (厚さ 4〜5 μm) を切り出して診断する。 分解能と迷光除去能力を持つことから，広く非その為，切り出した部位が不適切であると，病接触表面形状計測やバイオイメージングで利用変が切片に含まれず，誤診してしまう可能性がされている。共焦点効果を得るためには，光源ある。

ピンホール，サンプル焦点，検出ピンホールがそこで本研究の目的は，病変が確実に含まれそれぞれ結像している必要がある。その為，一るであろう厚い組織であっても，光学顕微鏡の般的には，上記の各焦点が結像関係にある光学ボケがなく，かつ病理組織診断に師匠がないほ系を作製し試料を走査するサンプル走査法，あどの観察速度を有する病理組織観察法の創出をるいはビーム走査光学系を通して試料へ集光し目指す。本研究では，空間情報を光の波長へ変発生した散乱光が同じ光路を通りビーム走査し換する波長／空間次元変換に基づいたワンても元の光路に戻ることを利用したデスキャン

ショット共焦点光学顕微鏡の開発を行った。共システムが用いられてきた。従来，高速なイ焦点光学顕微鏡の有する高い光軸分解能によりメージングを実現するためには，ビーム走査に厚い組織であってもボケがないイメージを取得よるデスキャンシステムが用いられ，ビーム走可能である。また，波長／空間次元変換による

査 に は ガ ル バ ノ ミ ラ ー，ポ リ ゴ ン ミ ラ ー，ワンショットイメージングにより，従来の共焦MEMS ミラー，マイクロレンズアレイといっ点光学顕微鏡に内在した時間分解能の限界を大た機械的走査機構が用いられている。しかし，幅に改善し，病理診断に支障がないほどのイ

これらの機械的走査機構は，振動などの外乱にメージングの高速化が実現可能となる。

弱く，またイメージング速度は機械的走査によ以上から，本研究では病理検査の高精度化にる限界があった。

伴う人間の健康寿命の増進とともに，病気を診そこで本研究では，回折格子を用いた波長／断する病理医の視点に立ったユーザビリティに空間変換によるワンショット共焦点光学顕微鏡基づいた病理観察法を実現し，人間と機械の調の開発を行った。従来のビームスキャン部を波和による医療の進歩を目指す。

長分散素子に変更することで，機械的可動部を排除し，ワンショットで共焦点イメージを取得― 1 ―立石科学技術振興財団

2．基礎特性評価することが可能となる。
図 1 に開発したワンショット共焦点光学顕微開発したワンショット共焦点光学顕微鏡の鏡の概念図を示す。ここで，光軸方向を Z 軸，

基 礎 特 性 評 価 を 行 っ た。図 2 に 試 料 に テ ス

光軸に直交した 2 次元平面を XY 面となるよト チ ャ ー ト (1951 USAF Resolution Target,うな 3 次元座標を定義した。光源には広帯域光Edmund Optics) を用い画像化した結果を示す。

源 (中心波長 : 780 nm，帯域 : 10 nm) を用いた。

Y 軸方向はライン照明 (空間) により画像化

光源から出射された光は，空間フィルタリングしている軸である。即ち，同一波長のラインされた後，シリンドリカルレンズを用いてライビーム内における位置ごとの強度の違いによっンビームに整形した。これは，Y 軸方向のスて画像化されている。一方，X 軸方向は空間／キャンレス化を行っていることとなる。さらに，波長変換により，空間情報が波長に展開するここのラインビームを回折格子 (溝本数 : 1200とにより画像化している軸である。即ち，波長本/mm) に照射することで，X 軸方向には波ごとの強度の違いによって画像化されている。

長で展開され，Y 軸方向には同じ波長が空間以上のことから，図 2a は一見すると一般的な的に広がっている照明光 (Vertical rainbow)

2 次元反射イメージのようであるが，実際にはを 作 り 出 す。こ れ を 対 物 レ ン ズ (倍 率 : ×60,サンプルの情報を反映した vertical rainbow のNA : 0.95) で集光することにより，サンプルライン分光イメージングによって取得された画

上には Vertical rainbow の 2 次元焦点群が生成像である。

される。サンプルの情報を反映した反射・散乱

測定した部位は，グループ 7 の要素 4 (181

光は，同じ光路を逆から辿ることで再び同じ回line pairs/mm)，要素 5 (203 line pairs/mm)，折格子に集光され，空間／波長変換が起こる。

要素 6 (228 line pairs/mm) である。このこと

空間／波長変換によって，空間に展開されていから，視野は 68 μm×156.2 μm であった。また波長の情報は再び重ねあわされ，シングルた，画像は露光時間 2.84 ms，フレームレートビームに戻る。この光は，ビームスプリッタに22.09 fps で 取 得 し た。こ の イ メ ー ジ ン グ は，よってマルチチャネル分光器に導かれる。マル

機械的走査をおこなわずにワンショットで計測

チチャネル分光器の入射スリット上にライン集しているため，各ピクセルの測定タイミングの光された光は，この入射スリットによって共焦同時性が担保されている。

点性を持たされた後にマルチチャネル分光器に

図 2 の断面プロファイルを用い空間分解能のよって分光され，CMOS カメラ (1280×1024評価を行った。その結果，本システムでは Xピクセル) によって検出した。

方向において 1.18 μm，Y 方向において 1.15

図1波長／空間次元変換によるワンショット共焦点光学顕微鏡の概念図

図 2 ワンショット共焦点光学顕微鏡による画像化。(a) ワンショット共焦点画像。(b) Y 軸プロファイル (ライン照明軸方向)。(c) X 軸プロファイル (空間／波長次元変換方向)。

― 2 ―Tateisi Science and Technology Foundationμm の空間分解能を有していることがわかった。
開発したワンショット共焦点光学顕微鏡の空間分解能は，回折理論により考察可能である。
今回，ライン型共焦点光学系を応用していることから，回折限界に基づく X，Y 軸方向の理論的空間分解能 δX，δY はそれぞれ，λNAλδY=0.61NA
δX=0.51となる。ここで，λ は波長，NA は対物レンズの開口数である。回折限界に基づく理論空間分 解 能 は，そ れ ぞ れ δX=0.42 μm，δY=0.5μm である。ただし，X 軸方向の空間情報は波図 3 ワンショット共焦点顕微鏡の光軸分解能評価。(a) Z 軸プロファイル。緑，共焦点スリットを Open 状態で測定したプロファイル (非共焦点光学系)。赤，共焦点スリッ
ト幅を狭めた場合のプロファイル (共焦点光学系)。(b)共焦点光学系における Z=0µm および Z=−12µm 位置でのイメージ。(c) 非共焦点光学系における Z=0µm および Z=−12µm 位置でのイメージ。

長軸に展開されていることから，空間分解能
δX は，使用したマルチチャンネル分光器の波(共焦点光学系)，焦点からのみ信号が得られ，長分解能にも制限される。波長分解能に基づく

Z=−12 μm とした場合は信号が減衰された

理論空間分解能は δX=0.71 μm であった。こ(図 3b)。この時，Z 軸強度プロファイルの半のことから，開発したワンショット共焦点光学

値全幅は 2.41 μm であった (図 3a 赤)。以上の顕微鏡の面内分解能において，X 軸方向に対ことから，開発したワンショット共焦点光学顕してはマルチチャンネル分光器の波長分解能，微鏡は高い Z 軸空間分解能を有していること

Y 軸方向については対物レンズの回折限界にがわかる。この時得られた Z 軸空間分解能は，制限されると考えられる。本実験で実際に得ら通常の病理組織診断で用いられる組織切片厚れた X 軸，Y 軸空間分解能は，理論空間分解3〜5 μm に対して，十分小さい値が得られた。

能に対し，2 倍程度悪い結果となった。この差は，光学系のアライメント，対物レンズ瞳面で3．3 次元形状計測への応用の強度プロファイル等の影響を受けていると考開発したワンショット共焦点光学顕微鏡を 3えられる。このことから，さらなる光学系の改次元形状計測へ応用した。図 4 にチップコンデ

良により，理論空間分解能程度の空間分解能をンサの 3 次元形状計測応用の例を示す。露光時得られると考えられる。

間は 9.15 ms，フレームレート 25 fps で計測し次に，開発したワンショット共焦点顕微鏡のた。また，チップコンデンサ表面を Z=0 μm

Z 軸空間分解能について評価を行った。図 3 にと定義した。Z=0 μm においては，チップコ試料にミラーを用いた場合の結果を示す。対物ンデンサ表面，特に電極部が可視化されているレンズの焦点位置にサンプルがある場合を Z=様子がわかる。Z=−150 μm 位置では，焦点0 μm と定義した。共焦点スリットを Open 状に試料がないため信号が減弱している様子がわ態にした場合，Z 軸強度プロファイルの半値全かる (チップコンデンサ上部)。Z=600 μm で幅は 30μm となった (図 3a 緑，図 3c)。そのは，基板表面が可視化されている様子がわかる。

ため，Z=0 μm (In-focus) の場合と，Z=−12これらを 3 次元再構築することで，チップコンμm (Out-of-focus) の場合で同様の画像が取デンサの 3 次元形状を高い 3 次元空間分解能で得された。一方，共焦点スリットを狭めた場合可視化できていることがわかる。

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図4

電子部品の 3 次元形状計測への応用。(a) 全体像。
(b) チップコンデンサ部。(c) 3 次元形状計測。

図 5 植物細胞観察への応用。(a) 葉の外観図。 (b) 通常の光学顕微鏡像。 (c) 開発したシステムによる共焦点イメージ。

4．植物細胞観察への応用
次に，開発したワンショット共焦点光学顕微鏡を植物細胞観察へ応用した。図 5 にトマトの葉の観察結果を示す。通常の光学顕微鏡像では，深さ方向に積分された画像となっている。
そのため，葉の厚い組織のために，焦点外からのボケた像も重畳し，不鮮明な画像となっている事がわかる。
一方，開発した共焦点光学顕微鏡像では，焦図 6 マウス筋組織観察への応用。(a) 切片化した組織の HE染色像。(b) 青四角部の拡大図。(c) 共焦点スリット
を Open 状態，(d) 共焦点スリットを狭めた状態にした場合のマウス筋組織の観察像。

点面のみの情報が得られるため，植物細胞の形態を高いコントラストで測定できていることが用途である。筋組織を共焦点スリットを Open

わ か る。こ の 時，露 光 時 間 は 29.12 ms，フ状態で観察した場合，深さ方向に積分された画

レームレートは 22.67 fps とし，高速に Z 軸方像となっているため，コントラストが低い (図向に走査しながら観察することで，3 次元形態6c)。の 1 ボリューム毎秒程度でビデオ観察が可能で一方，共焦点スリットを狭め，共焦点を有しあった。このことは，本手法のワンショット画ている状態で観察すると筋細胞の形態を明瞭に像化能と共焦点効果による高い 3 次元分解能を確認できることがわかる。以上のことから，開同時に実現していることで初めて実現される。

発したワンショット共焦点光学顕微鏡を生体組織へ応用可能であることがわかる。今回は原理確認のため切片化した組織を用いたが，今後は5．生体組織観察への応用
最後に，開発したワンショット共焦点光学顕微鏡を生体組織観察へ応用した。図 6 にマウスブロック状の組織を用いることで，本手法の有用性を確認していく。

筋組織の観察結果を示す。筋組織は，複数の筋細胞 (図 6b，円状のピンク色に染色されてい[今後の研究の方向，課題］

る部分) と間質 (図 6b，透明部および線維状のピンク色に染色されている部分) が主な構成― 4 ―本研究では，波長／空間次元変換を援用した

Tateisi Science and Technology Foundation

ワンショット共焦点光学顕微鏡の開発を行い，［成果の発表，論文等］

その基礎特性を明らかにし，および表面形状計

1．宮本周治，長谷栄治，南川丈夫，謝宜達，水谷康弘，

測応用，バイオイメージング応用により本手法

岩田哲郎，安井武史，山本裕紹，“スリット共焦点の有用性を示した。本手法は，高い 3 次元空間と 波 長 / 空 間 変 換 を 用 い た ス キ ャ ン レ ス・フ ル

分解能を持ちながらも，ワンショットで 2 次元フィールド共焦点顕微鏡”，精密工学会誌，82, 7,679-682 (2016).

共焦点画像を取得可能である。その為，高速に

2．Shuji Miyamoto, Eiji Hase, Takeo Minamikawa,

Z 軸方向を走査することで，3 次元イメージのTakeshi Yasui, and Hirotsugu Yamamoto, “Video-

動画観察も可能であることを示した。

rate volume imaging confocal microscope based on

本手法を病理組織切片観察へ応用することで，厚い試料切片を用いた病理組織診断を実現ことが可能である。これにより，病変部の見逃しを防止し，病理組織診断の誤診を防止することがwavelength / space conversion by use of multichannel spectrometer”, Frontier in Optics (FiO)
2016, JTh2A. 128, (Oct. 17-20, 2016, Rochester,USA).
3．宮本周治，長谷栄治，山本裕紹，安井武史，南川丈夫，“波長/空間変換を用いたスキャンレス共焦点可能となる。本研究では，その原理検証を行っレーザー顕微鏡の開発”，レーザー学会学術講演会

たが，今後は実際の病理組織切片観察への応用

第 37 回年次大会，(2017/1/7-9, 徳島大)．

が期待される。そのためには，本手法の多色化が求められる。これは，通常の病理組織切片は多重染色することにより組織の状態を観察しているためである。また，今回示した空間分解能は理論空間分解能には至っていない。そのため，今後はさらなる光学系の改良を行い，実用化に向けて検討を進めていく。

4．宮本周治，長谷栄治，南川丈夫，山本裕紹，安井武史，“波長分散素子を用いたスキャンレス共焦点レーザー顕微鏡の開発”，第 1 回フォトニクス研究会「光の境界を開拓する‼」(2016/12/2-3，沖縄県青年会館).
5．宮本周治，長谷栄治，南川丈夫，山本裕紹，安井武史，“波長/空間変換およびマルチチャネル分光器を用いたワンショット・フルフィールド共焦点光学顕微鏡の開発”，第 39 回日本生体医工学会中国四国支部大会，(2016/10/15，徳島大).

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