立石科学技術振興財団

助成研究成果集(第30号) 2021

［ 研究助成 (B) ］

エピゲノム情報を基にした機械学習によるヒト iPS 細胞の肝細胞分化効率予測システム構築のための基礎研究
Study of a prediction system for hepatocyte differenciation efficiency of human iPSCs
by machine learning based on epigenome information
2191901

研究代表者

宮崎大学

農学部

教授

西野光一郎するツールとして iPS 細胞は有用である。

[研 究 の 目 的]しかし，同一の親細胞を使用し，同一の作成
本研究は，ヒト人工多能性幹細胞 (induced方法で樹立し，同一の培養条件で得られたヒト

pluripotent stem cell：iPS 細胞) のロット間にiPS 細胞であっても，細胞ロット間によって分おける特性の違いを機械学習により識別し，肝化能力に違いが存在する。再生医療を目的にヒ細胞分化効率を予測するシステム構築のためのト iPS 細胞から様々な細胞への分化誘導系が研基礎研究である。ヒト iPS 細胞は再生医療にお究開発されているが，ヒト iPS 細胞ロット間のける切り札であるが，樹立されたロット間には分化能力の違い (分化指向性) は，再生医療を明確な特性の違いが存在する。その特性は，細実用化する上で大きな障害となっている (図

胞分化効率の差として顕著に現れ，ヒト iPS 細1)。

胞の実用化の大きな壁となっている。本研究でこのヒト iPS 細胞の肝細胞分化誘導においては，細胞内バイオデータと機械学習技術を融合分化指向性が存在するのかを検討した。十分にすることで，未分化状態の iPS 細胞から肝細胞細胞数を確保したヒト iPS 細胞をアクチビンへの分化効率を予測するシステムを開発する。

A，Wnt3a，HGF 等を添加した RPMI/B27 培

多数の未分化ヒト iPS 細胞から網羅的 DNA メ

地で培養し，内胚葉へ分化誘導し，その後，オチル化情報と，肝細胞への分化効率を取得し，ンコスタチンやデキサメタゾン等を含む 2 種類

教師あり学習を行うことで，精度の高い学習モデルの構築を行う。
[研究の内容，成果］
肝疾患による年間死亡数は 17 万人を超えており，死因では常に 10 位以内に入る (令和元年度厚生労働省「人口動態統計の概況」)。肝疾患の発生メカニズムを詳細に解明することは肝疾患の克服に向けての大きな課題である。肝細胞を in vitro で再現し，そのメカニズムを解明
― 1 ―

図1

iPS 細胞株間の分化指向性がにもたらす問題

立石科学技術振興財団の肝細胞分化培地で培養することで肝細胞を誘導した。
分化誘導培養後，細胞を固定し，肝幹細胞のマーカーである AFP に対する抗 AFP 抗体で免疫化学染色を施した。フローサイトメーターを用いて染色細胞を解析し，分化効率 (AFP陽性細胞の割合) を測定した。研究期間を通して合計 18 株のヒト iPS 細胞について肝細胞分化誘導実験を行い，検証したところ，その分化誘導効率に大きな違いが存在することが明らか

図3となった。18 株の内，明確な低分化効率株 6

iPS 細胞株間の DNA メチル化クラスタリング
解析と肝細胞分化効率

図 3 の結果で明らかなように教師なし学習で株および高分化効率株 6 株の合計 12 株を以降ある階層的クラスタリング解析による分類では，の実験に用いた (図 2)。

ヒト iPS 細胞の肝細胞分化効率を予測することは不可能である。また，未分化ヒト iPS 細胞における肝細胞への分化指向性を制御する因子は同定されていない。これらの結果は，ヒト iPS細胞の分化指向性は単一の遺伝子発現に依存する単純なものではなく，細胞内の分子間ネットワーク，つまり遺伝子発現やエピジェネティクス制御のネットワークにより規定されていることを示唆している。よって，iPS 細胞ロット間の肝細胞分化における分化指向性を解析し，肝細胞分化を制御するには，細胞から得られる網羅的データを包括的に解析，検定，評価する事が必要となる。
ヒト iPS 細胞の肝細胞への分化指向性を包括
図2

iPS 細胞株間の肝細胞分化効率の比較的に正確に理解するためには，肝細胞への分化上記のヒト iPS 細胞 12 株について，大量に効率の実測値の収集，様々な網羅的データの蓄増やした未分化ヒト iPS 細胞を回収し，ゲノム積とそれらを総合的に解析する方法が必要であDNA を抽出後，バイサルファイト反応を施し，る。この解析を実現する手段として，人工知能

Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip(AI) 技 術 が 有 効 で あ る。AI 技 術 と バ イ オを用いて DNA メチル化プロファイルを得た。

ビックデータを活用することで，株間の差を分Infinium MethylationEPIC BeadChip は，ヒト子レベルで理解し，且つ分化効率に影響を及ぼ

ゲノム DNA 上の 85 万箇所以上の CpG 部位のす分子ネットワークの解析が可能であり，それメチル化率を測定できるアレイシステムである。

らを応用して株間の分化指向性を可視化するこ得られた網羅的 DNA メチル化データを用いてとで肝分化のメカニズムをより詳細に解明でき

階層的クラスタリング解析を行った。階層的クる。

ラスタリング解析の結果と図 1 の肝細胞分化効率の結果を合わせた結果が図 3 である。

そこで本研究では，細胞内バイオデータと機械学習技術を融合することで，未分化状態の― 2 ―Tateisi Science and Technology Foundation

ゲノム DNA 抽出に用い，残りの未分化ヒト
iPS 細胞は肝細胞分化実験に供した。抽出した
ゲノム DNA は，バイサルファイト反応を施し，
Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChipを用いて DNA メチル化プロファイルを得た。
1 検体につき 85 万箇所以上の CpG 部位のメチル化率を取得した。同時に DNA メチル化情報を取得した同一 iPS 細胞株を用いて肝細胞への分化誘導実験を実施し，肝分化効率の実測値を図4測定した。具体的には，肝幹細胞への分化誘導網羅的バイオデータと機械学習の融合による細胞特性判別システムの創出を行い，肝幹細胞のマーカーである AFP の蛍光抗体を用いて免疫細胞染色を行った。

iPS 細胞から肝細胞への分化効率を予測するシ前述と同様に十分に細胞数を確保したヒトステムの開発を試みた。未分化ヒト iPS 細胞かiPS 細胞をアクチビン A，Wnt3a，HGF 等をら網羅的 DNA メチル化情報と肝細胞への分化添加した RPMI/B27 培地で培養し，内胚葉へ効率実測値を取得し，教師あり学習を行うこと分化誘導し，その後，オンコスタチンやデキサで，学習モデルの構築を行った (図 4)。

メタゾン等を含む 2 種類の肝細胞分化培地で培本研究における成否は，学習モデルを構築す養することで肝細胞を誘導した。分化誘導培養るための良質な学習データをいかに多く確保で後，細胞を固定し，抗 AFP 抗体で免疫化学染きるかにかかっている。本件で定義する良質な色を施した。フローサイトメーターを用いて染学習データとは，すなわち質を保証された iPS色細胞を解析し，分化効率を測定した。これら細胞から得られた DNA メチル化データであの実験によって，ヒト iPS 細胞 12 株について，り，同一 iPS 細胞株を分化誘導して得られる

各未分化 iPS 細胞の DNA メチル化情報と，そ分化効率の実測値データである。培養環境やれに対応する肝細胞分化効率のデータの取得を継代数でその性質が変動するヒト iPS 細胞にお行った。複数のヒト iPS 細胞から，同一培養条

いては，良質な学習データを得るためには，ヒ件での分化誘導実験によって一貫した分化効率

ト iPS 細胞の培養，回収，分化誘導実験を同一評価データとそれに完全対応する網羅的 DNA条件にして行わなければならない。それらを踏メチル化データのセットはほとんど報告がなく，まえ，良質な学習データを得るためのヒト iPS非常に貴重なものである。ヒト iPS 細胞から分細胞培養に多くの時間を費やした。十分なゲノ化誘導実験までを一貫して行うことで，細胞ム DNA を得るために，ヒト iPS 細胞株 12 株

ロット間の性質の差異を正確に評価し，解析すをそれぞれ培養，増殖し，十分な細胞数を得るることが可能なデータセットを取得したことは，ことができた。ヒト iPS 細胞の培養は，マウス

本研究の特色であり，利点である。

胎児由来線維芽細胞 (MEF) をフィーダー細網羅的 DNA メチル化情報を入力データとし胞として，Knockout-DMEM, 代替血清であるて，機械学習技術を用いるための基盤設定，各Knockout-Serum Replacement (KSR) と繊維種ハイパーパラメータの設定，データマイニン

芽細胞増殖因子 FGF-2 (basic FGF) を添加しグ，学習手順の設定など最適な学習手順の構築

た Knockout-DMEM をベースとした培地を使及び学習モデルのバリデーション法の検討を用した。

行った。生命科学では検体数の制限があり，数大量に増やした未分化ヒト iPS 細胞の一部は万の iPS 細胞ロットとその分子データを揃え，― 3 ―立石科学技術振興財団

分化誘導実験を行うことは現実的には不可能で解析シーンでは，特徴量数に対してその 100 倍ある。

以上のサンプル数を用いることが一般的であり，そこで，本研究ではニューラルネットワーク

本研究のように特徴量数が圧倒的に多い場合にと比較して少ないサンプル数にも対応可能な線は，過学習による問題があり，機械学習は不向形分類器による機械学習を検討した。未分化ヒきとされる。

ト iPS 細胞の DNA メチル化データ (入力デー

しかし，画像データとは異なり細胞内分子タ) とそれぞれの株に対応する肝細胞分化効率

データを用いた機械学習の応用を考えた場合，の実測値データ (教師データ) のセットを用い特にヒト iPS 細胞の様な特殊なサンプルにおいて，学習モデルの構築を行った。線形分類器のては，サンプル数よりデータの特徴量数が多く

Platform はオンライン機械学習向け分散処理ならざるを得ない。近年，次世代シークエン

フ レ ー ム ワ ー ク：Jubatus (http : //jubat. us/

サー解析やマイクロアレイ技術が一般化し，生ja/) を用い，アルゴリズム AROW による多命科学研究者は網羅的なバイオデータを取得で値分類と二値分類を検討した。教師データのラきるようになった。これら膨大なバイオデータ

ベルの組み合わせと Regularization weight お(1 サンプルに対して膨大な特徴量を含む) のよび epoch 数の組み合わせによる学習モデル

解析に機械学習技術を応用することで，これまを 16,000 ほど作成し，学習モデルを評価した。

で明らかにできなかった生命現象を解き明かす学 習 モ デ ル の 評 価 は，Leave-one-out cross-ことが期待でき，それ故，網羅的バイオデータvalidation を行い，F-score の比較検証によりの機械学習手法の開発は必要である。本研究で行った。その結果，肝細胞分化効率 20% 以下

は，12 サンプルを使用し，85 万箇所の DNAを低分化群，80% 以上を高分化群の 2 ラベル

メチル化データを用いて学習モデルを作成し，として二値分類の学習を行った群の成績が良く，肝細胞分化予測モデルの基盤技術を構築するがその内 F-score の高いもの上位 3 つの条件をできた。サンプル数がまだ少ないためモデルの

図 5 に示す。Regularization weight : 1.0，200-

精度は十分ではないが，今後，より精度の高いepoch 設定の学習モデルが最も評価値が高いも機械学習法の検討を行い，機械学習技術の生命のとなった。

科学分野への積極的な応用を進めていく。精度

regularization weight
epoch

1.02200.9190の高い肝細胞分化予測モデル構築に向けては，

1.1180ヒト iPS 細胞サンプルデータの追加は必須であり，追加学習を進め，学習モデルから抽出した

F-ScoreTest sample
Learning sample

0.727
0.947

0.677
0.925

0.665
0.897

要素解析を通して肝分化効率に影響を及ぼすゲ

Accuracy
Test sample
Learning sample

0.667
0.947

0.667
0.924

0.583
0.894の解明へ繋げていきたい。

図5

ノム領域の抽出を行い，肝細胞分化メカニズム学習モデルの評価[成果の発表，論文等］[ 1 ] Nishino K, Takasawa K, Okamura K, Arai Y,[今後の研究の方向，課題］

Sekiya A, Akutsu H, Umezawa A. Identification ofan epigenetic signature in human induced pluri-

本研究では，12 サンプルを使用し，1 サンプ
ル に つ き 85 万 箇 所 の DNA メ チ ル 化 デ ー タ(85 万の特徴量数) を用いて学習モデルの構築を試みた。近年の機械学習によるビッグデータ― 4 ―potent stem cells using a linear machine learningmodel. Human Cell. 34(1) : 99-110. 2021.