病原体検出マニュアル
サル痘ウイルス第2版
令和 4 年 8 ⽉

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⽬次
１．

概説

２．

検体の採取と保存

３．

検体の処理等3-1.検体処理時の防護3-2.検体の処理

４．

病原学的検査4-1.リアルタイム PCR
4-2.ウイルス分離
4-3.電⼦顕微鏡法によるオルソポックスウイルス感染症の検査（参考検査）

５．

ポックスウイルス感染症の診断基準

６．

連絡先

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１． 概説サル痘はポックスウイルス科オルソポックスウイルス属に分類されるサル痘ウイルスによる感染症である。オルソポックスウイルス属には痘そうウイルス、⽜痘ウイルス、ワクシニアウイ
ルス も分類されている。いずれも DNA をゲノムとしてもつ。サル痘ウイルスは遺伝⼦系統でコンゴ盆地型と⻄アフリカ型に分けられ、前者の⽅が重症化しやすい。
サル痘ウイルスは 1958 年にワクチン製造⽤のサルのコロニーで痘そう様症状を⽰す疾患が発⽣した際に初めて認識されこの名前が付けられたが、⾃然宿主はサルではなくアフリカのリス等の齧⻭類ではないかと考えられている。ヒトのサル痘は 1970 年に初めて（現）コンゴ⺠主共和国で認識され、これまで主にアフリカ中央部および⻄部の諸国で発⽣している。2003 年以降、欧⽶等で散発的に発⽣が認められるがアフリカの発⽣地域からの輸⼊事例（動物を介する場合もある）である。サル痘は感染動物や感染者との接触、あるいはそれらに由来する⾶沫物や⾎液、体液に汚染されたもの（寝具等）との接触等で伝播する。輸⼊事例からの⼆次感染も⽣じうるが、これまではヒトからヒトへの感染は稀であり感染の連鎖はすぐに途絶えると考えられていた。しかし 2022 年 5 ⽉以降、欧⽶を中⼼に輸⼊事例や輸⼊事例からの⼆次感染ではないと考えられる症例が短期間に数百⼈以上報告され、ヒトからヒトへの感染は想定されていた以上に⽣じやすい可能性が指摘されている。遺伝⼦系統では⻄アフリカ型に分けられる。
サル痘の潜伏期間は 5-21 ⽇（多くは 7-14 ⽇）である。発熱、頭痛、筋⾁痛、背痛、リンパ節腫脹等で発症し、その後発疹する。発疹は通常全⾝性で、顔⾯から始まり全⾝に広がる。発疹は⽔疱、膿疱、痂⽪とほぼ同調して変化し脱落する（痂⽪にも感染性ウイルスが含まれる）。2 週から 4 週で病気が進⾏する。致命率は約 10%以下とされ、⼦供、妊婦、免疫不全の状態にある者では致命率は⾼まる。痘そうと類似点は多いが、重症度や致命率はサル痘では低く、またリンパ節腫脹は通常痘そうでは⾒られない。2022 年 5 ⽉以降の欧⽶を中⼼とした発⽣では死亡事例はこれまでと⽐べ⾮常に少なく、また発疹が⽣殖器等に限られるケースが多く認められている。
サル痘の発疹のような所⾒はオルソポックスウイルス属の他の複数のウイルスやバリセロウイルス属の⽔痘帯状疱疹ウイルス（ゲノムは DNA）の感染などでも認められ、迅速な鑑別のため病原学的検査（遺伝⼦検査）ではこれら複数を標的としたものを並⾏して調べることが勧められる。場合によっては国⽴感染症研究所へ相談あるいは精密検査の依頼をすべきである。⽔痘帯状疱疹ウイルスによる発疹の所⾒はポックスウイルスによるものと明らかに異なる部分があり、むしろ⽔痘が強く疑われる場合には⽔痘の病原体検出マニュアルを参照されたい。
なお、オルソポックスウイルス属のウイルスの抗原性は似通っているため、サル痘の実験室診断を⾎清学的に⾏なうことは現時点では困難である。また、発痘部位の検索に関して、以前は免疫組織化学法あるいは電⼦顕微鏡法も検査法として挙げられていたが、網羅的スクリーニングが可能である⼀⽅で特異性には⽋き、技術と経験を要するため、これらの⽅法は参考検査の位置付けである。免疫組織化学法や電⼦顕微鏡法による検査で陽性の場合はオルソポックスウイル
ス感染症との診断にとどめる。

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２． 検体の採取と保存
サル痘の実験室診断（病原学的検査）には⽔疱、膿疱、痂⽪等の⽪膚病変（発痘部位）が最も適する。⽪膚病変は病期（潜伏期及び前駆期 → 丘疹期及び紅斑期 → ⽔疱期 → 膿疱期 → 痂⽪期 → 回復期）により性状が変化していき、⽔・膿疱の⽪（上蓋）、⽔・膿疱内容物、⽔・膿疱内部のスワブ、痂⽪が検査に適している。咽頭等の粘膜スワブ、尿、⾎液、精液からもウイルスが検出された事例が知られている。また、ウイルス検査以外の診療⽬的で⽪膚病変の⽣検が実施された場合、ホルマリン固定パラフィン包埋検体を⽤いた検査も可能である。その場合の検査については、国⽴感染症研究所 感染病理部に問い合わせること。実験室診断のための具体的な採材の材料や⽅法、その保存⽅法については表 1 と図 1 を参照のこと。
表１. 検査に使⽤する検体優先順位

分類

⽪膚病変

１・ ２箇所以上の⽪膚病変から採取。
・ 同じ種類の検体は 1つのチューブに混合しても構わないが、異なる種類の検体を混合しない。
・ 適切な検体採取が実施されたかどうかの判断のため、検体採取前の病変部の⾁眼写真と検体採取時の⼿技の詳細について検体送付時に添付することが望ましい。

粘膜病変
２・ 肛⾨管粘膜、直腸粘膜、陰部粘膜、⼝腔粘膜等の粘膜疹や潰瘍病変部から採取。

⾮病変部・ ⽪膚・粘膜病変に⽐べ３て検出感度は低下す
るが、サル痘ウイルスが検出されればサル痘と診断可能

検体種

⽔疱液・膿疱液

病変部スワブ（⽔疱・膿疱内部）

採取⽅法

保管⽅法

⽣理⾷塩⽔（もしくは PBS）を0.1〜0.2ml ⼊れた注射針(26Ｇ)付きの１ml の注射器を疱膜から挿⼊して、2〜3 回ポンピングして内容液を採取。

滅菌スクリューキャップチ
ューブ（2ml 以下）等に内容液を⼊れて密栓。冷蔵保管。

病変内部のウイルスをスワブに吸着させるために病変内部を強く擦り、内容液・浸出液をスワブに吸着させる。

スワブをウイルス輸送⽤培地(Viral TransportMedium, VTM)に浸して密封。冷蔵保管。
スワブを溶液に浸さず密封しドライスワブのまま冷蔵保管でも良い。
滅菌プラスチックチューブに⼊れ密栓。冷蔵保管。

痂⽪

ピンセットを⽤いて痂⽪を採取

⽔疱蓋・膿疱上蓋

ピンセットと先の丸い鋏を⽤いて⽔疱・膿疱の上蓋を剥がして採取滅菌プラスチックチューブに⼊れ密栓。冷蔵保管。

⽪膚⽣検検体ウイルス検査以外の診断⽬的で⽪膚病変の病理組織検査が実施された場合は、当該検体を病原体検査に使⽤することが可能

常法に則り、ホルマリン固定パラフィン包埋し、常温保管。

病変部スワブ

病変部のウイルスをスワブに吸着させるために病変内部を強く擦り、内容液・浸出液をスワブに吸着させる。

スワブを VTM に浸して密封。冷蔵保管。
スワブを溶液に浸さず密封しドライスワブのまま冷蔵保管でも良い。

組織⽣検検体ウイルス検査以外の診断⽬的で粘膜病変の病理組織検査が実施された場合は、当該検体を病原体検査に使⽤することが可能

常法に則り、ホルマリン固定パラフィン包埋し、常温保管。

（可能であれば採取）

咽頭スワブ、⿐腔ス
ワブ、その他⾮病変

常法に則り採取部の粘膜スワブ
尿、精液、⾎液常法に則り採取

4 / 19スワブを VTM に浸して密封。冷蔵保管。
スワブを溶液に浸さず密封しドライスワブのまま冷蔵保管でも良い。
尿、精液は滅菌プラスチッ
クチューブに⼊れ密栓。⾎液は EDTA 管に採取。冷蔵保管。

【検体採取時の注意事項】
全ての検体について、採取時には、標準予防策に加えて、⾶沫やエアロゾル感染の予防をする。
具体的には、⻑袖ガウン、⼿袋、眼の防護具および N95 マスクを含む個⼈防護具を適切に着⽤し実施すること。状況に応じて、靴カバーやキャップの着⽤も考慮する。検体採取には原則ディスポーザブルの器具を⽤いる。使⽤後の器具は汚染を広げないように適切に廃棄⼜は処理する。また、検体採取を⾏った診察室等は、リネン類の交換を含め、接触⾯の清拭などの清掃を⾏う。清掃担当する者も適切な個⼈防護具の着⽤は必須である。
採取後の検体輸送に際しては、検体送付の担当者は必ず検査機関の担当者と打ち合わせること。検体は、原則、基本三重梱包を⾏ない、公⽤⾞・社⽤⾞等の⾃動⾞または、カテゴリーBに分類される臨床検体等の取扱い可能な輸送業者を利⽤して送付する。また、⾶⾏機、電⾞、バス、タクシーなどの公共交通機関を利⽤して輸送する場合は、航空法および各公共交通機関の約款等ルールを遵守する。なお、核酸抽出液についてはカテゴリーB に分類される臨床検体としての取り扱いは不要となるので、基本三重梱包を⽬安に適切に梱包する。
＊カテゴリーB に分類される臨床検体等の梱包・運搬時の注意事項等は「2019-nCoV (新型コロナウイルス)感染を疑う患者の検体採取・輸送マニュアル(2021 年 3 ⽉ 19 ⽇更新版)」を参照のこと。
図 1 検査検体を採取する⽪膚病変

5 / 19検査に使⽤する⽪膚病変● ⽔疱・膿疱

蓋
感染細胞
底● 痂⽪感染細胞が中に閉じ込められている治癒過程でここから剥げ落ちる

6 / 19図 ２ ⽪膚検体の採取⽅法

局所の⽪膚病変別の検体の採取⽅法❶ ⽔疱が保たれている場合

⽔疱内容液を注射器で吸引して採取する➋ ⽔疱が⾃壊している場合❸ 痂⽪となっている場合

⽔疱内容液及び⾃壊組織をスワブで拭い、スワブごとｽｸﾘｭｰｷｬｯﾌﾟﾁｭｰﾌﾞに⼊れる

痂⽪を採取するスクリューキャップの2ml チューブに⼊れる
この⽅法が最もウイルスを検出しやすいことが予想される

⽔疱を切開した場合もこの⽅法を⽤いることができる

7 / 19スクリューキャップのプラスチックチューブに痂⽪を⼊れる

３． 検体の処理等
3-1. 検体処理時の防護検体処理は BSL2 にて⾏ない、更に個⼈防護具を強化して⾏なうことが望まれる（特に痘そうワクチンを受けていない者が作業を⾏なう場合には強く推奨される）。検体は安全キャビネット内で取扱い、操作中は標準的な個⼈防護具に加えタイベックスーツまたは⻑袖ガウン（⽔を通さない/通しにくい背⾯開き型）、⼿袋（2 重）、マスク（サージカルマスクで良い）、キャップ、そして⽬の防護具を着⽤すること等が望まれる。

3-2.検体の処理
3-2-1.⽔疱（膿疱）内容物の場合
3-2-1-1.内容物全量をスクリューキャップ付きの 1.5mL チューブ、⼜はそれと同等のチューブに移動させる。ここに適量の PBS（⽣理⾷塩⽔でも可、量は 500µL 等）を添加しピペットなどを⽤いて混合する。その後 2000 x g で三分間遠⼼した後上清を各種検査（PCR 検査、ウイルス分離、電顕等）に供する。ペレットおよび上清の残余はディープフリーザーで保存する。
3-2-3.⽔疱（膿疱）内容物スワブの場合
3-2-3-1.適量の PBS（⽣理⾷塩⽔でも可、量は 500µL 等）が⼊った 1.5mL チューブにスワブを⼊れ、付着物を浮遊させる。その後 2000 x g で三分間遠⼼した後上清を各種検査（PCR 検査、ウイルス分離、電顕等）に供する。ペレットおよび上清の残余はディープフリーザーで保存する。
3-2-4.⽔疱、膿疱、痂⽪の場合
3-2-4-1.⽔疱、膿疱、痂⽪を適量の PBS（⽣理⾷塩⽔でも可、量は 500µL 等）で適度にほぐす。例
えばバイオマッシャーII（写真参照）を⽤いる場合、添付の撹拌棒を⽤い 10 回程度⼿動で擦るようにしてほぐす。組織⽚が完全には崩れないことが多いが構わない。ホモジナイザー等の機器を⽤いるとエアロゾルを発⽣する可能性があるので⽤いないこと。

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バイオマッシャーII

3-2-4-3. 2000 x g で三分間遠⼼した後上清を各種検査（PCR 検査、ウイルス分離、電顕等）に供する。ペレット（組織⽚）および上清の残余はディープフリーザーで保存する。
3-2-4-4. 検体処理に使⽤した機材の消毒
サル痘ウイルスはエンベロープを有し、⼀般的な消毒法であるアルコール（消毒⽤アルコール）、0.5％次亜塩素酸ナトリウム、ホルマリン、紫外線、オートクレーブによって、容易に不活化される。
検体処理時に使⽤した機材の消毒を適切に⾏い、処理後の検体から⽣じた廃棄物、使い捨てのものはオートクレーブバッグに回収後オートクレーブ処理をする。

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4． 病原学的検査
4-1.リアルタイム PCR
本病原学的検査は⼆種類のリアルタイム PCR で⾏う。1 つはオルソポックスウイルス属ウイルス全般（サル痘ウイルス、⽜痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ラクダ痘ウイルス、ヤギ痘ウイルス、痘そうウイルス）の A3L 遺伝⼦または H2R 遺伝⼦をターゲット領域とする SYBR Green法を⽤いた系（4-1-3 参照）、もう⼀つは 2 ⾊の蛍光プローブを⽤いたサル痘ウイルスの F3L 遺伝⼦（FAM による検出）と⽔痘帯状疱疹ウイルスの ORF38 遺伝⼦（VIC による検出）をターゲット領域とするマルチプレックス系（4-1-4 参照）である。⼆種類のリアルタイム PCR 両⽅の検査結果を元に判定を⾏うが、これらは反応条件が異なるため 2 台の機器で並⾏して、あるいは個別に⾏なう必要がある。
4-1-1.必要な試薬や機器（同等品で代替可）
核酸抽出キット（Roche High Pure Viral Nucleic Acid Kit 、Qiagen QIAamp DNA Mini Kit 等）、分⼦⽣物学⽤エタノール、分⼦⽣物学⽤ DW、PCR ⽤チューブ、PCR キット（QuantiTect Probe
PCR Kit 等）、TE（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0）、リアルタイム PCR 装置、プライマー（下記参照）、マイクロピペット
4-1-2. 検体からの核酸抽出
検体の処理については 3-2 を参照。必要液量を核酸抽出に供する。核酸抽出キットのマニュアルに従い、検体中の核酸を抽出する。特に⽪膚病変が検体の場合は吸光度計などで濃度測定を⾏い、抽出液中に核酸が存在することを確認する。精製した核酸を直ちにリアルタイム PCR に供しない場合は-80℃で保管する。
4-1-3.オルソポックスウイルス属ウイルス全般の A3L 遺伝⼦または H2R 遺伝⼦をターゲット領域とするリアルタイム PCR（SYBR Green 法）
4-1-3-1. プライマーミックスの作製
後述の PCR 反応液を作製する際に使⽤する 10x プライマーミックスを作製する。ここでは 100reaction 分の調製を⽰す。
適宜調製量を増減しても良い。
直ちに使⽤しない場合は-80℃で保管する。
年単位での保管が可能である。
A3L
プライマー原液 (全て 50µM)

液量（µL）PCR 反応液中の終濃度（µM）

A3L f212.50.25

A3L r312.50.25

H2O225

合計

250
10 / 190.25 eachH2R
プライマー原液 (全て 50µM)

液量（µL）PCR 反応液中の終濃度（µM）

H2R f312.50.25

H2R r112.50.25

H2O225

合計

2500.25 each

4-1-3-2. Standard DNA 希釈列の準備
4-1-3-2-1. Standard DNA 希 釈 列 ( 陽 性 コ ン ト ロ ー ル DNA 希 釈 列 ) 、 Non-Template Control（Nuclease-free water）を氷上に⽤意する。
4-1-3-2-2. 配布する Standard DNA（共通スタンダード。サル痘、⽔痘帯状疱疹ウイルス⽤スタンダードと同じものである）は痘そうウイルス A3L 遺伝⼦と H2R 遺伝⼦の配列からなる Standard DNAを 3µL 中に 105 コピー含む。従って Standard DNA 原液 10µL を 90µL の TE で希釈すると溶液 3µL中に 104 コピーDNA が存在することになる。同様に Standard DNA 10µL を 90µL の TE で希釈する操作を繰り返す。これにより、Standard DNA 希釈列を作製する（3µL 中に 101 コピー含む溶液まで作製する。104 から 101 まで）。リアルタイム PCR では、この 104 から 101 コピーまでを鋳型として使⽤する。
作製した 104 から 101 コピーの希釈列については冷蔵保存(-80℃保存が望ましい)であれば 1 週間使⽤が可能である。
4-1-3-3. リアルタイム PCR 反応液の準備
リアルタイム PCR 反応液を調製する。QuantiTect SYBR Green PCR Kit を⽤いる場合を⽰す（1 サンプルあたり、必要な本数分＋α で⽤意）。
A3L 遺伝⼦と H2R 遺伝⼦は、反応液の液量や PCR サイクルは同じだが別々の反応系で検出するた
め、実際にはそれぞれ別のチューブに⽤意することになる。
2x QuantiTect SYBR PCR Mix

12.5µL10x プライマーミックス

2.5µL

H2O7µL

Total

22µL

0.2 ml PCR ⽤チューブに 22µL ずつ反応液を⼊れる。
4-1-3-4. Standard DNA、Non Template Control、検体の添加
4-1-3-2 で作製した Standard DNA、Non Template Control（ Nuclease-free water）、または検体 3µLをリアルタイム PCR 反応液に加える（計 25µL）。
4-1-3-5. PCR チューブにフタをする。
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4-1-3-6 ウェルの壁についている反応液をスピンダウンし、サーマルサイクラーにセットする。
4-1-3-7. リアルタイム PCR 装置の設定下記の条件設定後ランを開始する。
任意で 45 サイクルの PCR 反応後に Tm 値を求めるためのプログラムを挿⼊しても良い。
サンプル、スタンダードの Tm 値を求めることはプライマーダイマーなどの⾮特異的な PCR 産物を識別する⼀助となる。
Temp

Time

Step

95℃

15 min PCR initial activation

95℃

15 sec53℃

30 sec72℃

30 secstep cycling total 45 cycles
40℃

30 secCooling

4-1-3-8. 結果の解釈について
40 サイクル以内に Standard DNA の 102 コピーのシグナルの⽴ち上がりが確認されれば本検出系は成⽴しているとみなす。A3L 遺伝⼦と H2R 遺伝⼦のどちらもシグナルの⽴ち上がりが認められた場合に陽性と判断する。 ⽚⽅のみシグナルが確認された場合は国⽴感染症研究所ウイルス第⼀部へ連絡する。
参考 プライマー配列、Standard DNA の配列
リアルタイム PCR のターゲット領域とプライマーの配列
Target gene
A3L

H2R

プライマー名Sequence (5'-3')A3L f2TTGTAACGATGATGATGCGG

A3L r3CGAATGCCATAGAATAAATATCCTTGG

H2R f3

CGGTTAACGATTGGAAATCATTAACGG

H2R r1

CCTCGCCTAATAGCTTGCG

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Standard DNA 溶液中には以下の⼆種類の配列を持つ DNA 断⽚が含まれている。プライマー領域を下線で⽰す。
Standard DNA

Sequence (5'-3')TTGTAACGATGATGATGCGGTAGATCCCCATCTAATGAAGATTATTCATACTGGATGCTCTCAAGTTATGACAGATGAGGAACAGATATTGGCTA3L (278 bp)

TCTATTTTGTCTATAGTTGGATTTAGACCTACGTTGGTTTCTGTGGCTAGACCTATAAACGGCATCAGTTACGATATGAAACTTCAGGCGGCACCATACATAGTTGTTAATCCTATGAAGATGATCACAACATCCGACAGTCCGATTTCTATCAATTCCAAGGATATTTATTCTATGGCATTCGCGGTTAACGATTGGAAATCATTAACGGATAGCAAAACAAAATTAGAA

H2R (178 bp)

AGTGATAGAGGTAAACTTCTAGCCGCTGGTAAGGATGATATATTCGACTTCAAATGTGTGGATTTCGGCGCCTATTTTATAGCTATGCGATTGGATAAGAAAACATATCTGCCGCAAGCTATTAGGCGAGG

4-1-4. サル痘ウイルスの F3L 遺伝⼦（FAM による検出）と⽔痘帯状疱疹ウイルスの ORF38 遺伝⼦（VIC による検出）をターゲット領域とするリアルタイム PCR（マルチプレックス系）
4-1-4-1．プライマー・プローブミックスの作製
後述の PCR 反応液を作製する際に使⽤する 25x プライマー・プローブミックスを作製する。ここでは 100 reaction 分の調製を⽰す。適宜調製量を増減しても良い。直ちに使⽤しない場合は-80℃で保管する。年単位での保管が可能である。
プライマー/プローブ原液液量（µL）

PCR 反応液中の終濃度（µM）

MPXV F3L upper

100.2

MPXV F3L lower

100.2

VZV ORF38 upper

100.2

VZV ORF38 lower

100.2

MPXV F3L probe (FAM)

100.2

VZV ORF38 probe (VIC)

100.2

H2O40

合計100(全て 50µM)

0.2 each

4-1-4-2. Standard DNA 希釈列の準備
4-1-4-2-1. Standard DNA 希 釈 列 ( 陽 性 コ ン ト ロ ー ル DNA 希 釈 列 ) 、 Non-Template Control（Nuclease-free water）を氷上に⽤意する。

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4-1-4-2-2. 配布する Standard DNA （共通スタンダード。オルソポックスウイルス属ウイルス全般⽤スタンダードと同じものである）はサル痘ウイルス、⽔痘帯状疱疹ウイルスの Standard を 3µL 中に 105 コピー含む。従って Standard DNA 原液 10µL を 90µL の TE で希釈すると溶液 3µL 中に 104コピー存在することになる。
同様に Standard DNA 10µL を 90µL の TE で希釈する操作を繰り返す。
これにより、Standard DNA 希釈列を作製する（3µL 中に 101 コピー含む溶液まで作製する。104 から 101 まで）。リアルタイム PCR では、この 104 から 101 コピーまでを鋳型として使⽤する。
作製した 104 から 101 コピーの希釈列については冷蔵保存(-80℃保存が望ましい)であれば 1 週間使⽤が可能である。
4-1-4-3. リアルタイム PCR 反応液の準備
リアルタイム PCR 反応液を調製する。QuantiTect Probe PCR Kit を⽤いる場合を⽰す（1 サンプルあたり、必要な本数分＋α で⽤意）。
2x QuantiTect probe PCR Mix

12.5µL

25x プライマー・プローブミックス

1.0µL

H2O

8.5µL

Total

22µL

0.2 ml PCR ⽤チューブに 22µL ずつ反応液を⼊れる。
4-1-4-4. Standard DNA、Non Template Control、検体の添加
5-4-2.で作製した Standard DNA、Non Template Control（H2O）、または検体 3µL をリアルタイム
PCR 反応液に加える（計 25µL）。
4-1-4-5.PCR チューブにフタをする。
4-1-4-6.ウェルの壁についている反応液をスピンダウンし、サーマルサイクラーにセットする。
4-1-4-7. リアルタイム PCR 装置の設定下記の条件設定後ランを開始する
Temp

Time

Step

95℃

10 min PCR initial activation

95℃

15 sec63℃

60 secstep cycling total 45 cycles
40℃

30 secCooling

4-1-4-8.結果の解釈について
40 サイクル以内に Standard DNA の 102 コピーのシグナルの⽴ち上がりが確認されれば本検出系は成⽴しているとみなす。その時、検体については 40 サイクル以降にシグナルが⽴ち上がっても陽性
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と判断する。サル痘ウイルス DNA は FAM による蛍光、⽔痘帯状疱疹ウイルス DNA は VIC による蛍光が検出される。 FAM のシグナル増幅が認められた場合にはサル痘ウイルス陽性と判断する。
VIC のシグナル増幅が認められた場合には⽔痘帯状疱疹ウイルス陽性の可能性が⾼いため、国⽴感染症研究所ウイルス第⼀部第四室（ヘルペス担当）へ連絡し陽性と⾒做すかの判断を確認する（本法は⽔痘の病原体検出マニュアルと⽅法が異なっており確認を要するため）。
なお、オルソポックスウイルス属 PCR（4-1-3）が陽性、サル痘・⽔痘帯状疱疹 PCR（4-1-4）が陰性の場合には、サル痘以外のオルソポックスウイルスの可能性があるため、国⽴感染症研究所ウイルス第⼀部第⼀室へ連絡する。
参考 プライマー・プローブ配列 Standard DNA の配列
サル痘 F3L と⽔痘 ORF38 を検出するリアルタイム PCR のターゲット領域とプライマー/プローブの配列
Target geneサル痘 F3L

⽔痘 ORF38

プライマー/プローブ

Sequence (5'-3')名
MPXV F3L upper

CATCTATTATAGCATCAGCATCAGAMPXV F3L lower

GATACTCCTCCTCGTTGGTCTACMPXV F3L probe

FAM-TGTAGGCCGTGTATCAGCATCCATT-MGB

VZV ORF38 upper

AAACCGCACATGATAACGCVZV ORF38 lower

GATTAGGACCATCCCCCGVZV ORF38 probe

VIC-ACAATGAGTAGTGGCTTTATGGCGAG-MGB

Standard DNA 溶液中には以下の⼆種類の配列を持つ DNA 断⽚が含まれている。プライマー領域は下線、プローブ領域は⼩⽂字で⽰す。
Standard DNA

Sequence (5'-3')サル痘ウイルス GATCCATCTATTATAGCATCAGCATCAGAATCtgtaggccgtgtatcagcatccatt
F3L (79 bp)
⽔痘ウイルス
ORF38 (89 bp)

GTCGTAGACCAACGAGGAGGAGTATCTCGAGATCTAAATATAACCTCGTCCGCAAAAAAAACCGCACATGATAACGC
GCGGATACaatgagtagtggctttatGGCGAGGATCCCAAATGTCCATTACCCGGGGGATGGTCCTAATCTTCGA

4-2.ウイルス分離
4-2-1. T25 フラスコにサル痘ウイルス感受性細胞（Vero 細胞、VeroE6 細胞、LLC-MK2 細胞、BSC40 細胞等）を subconfluent にしたものを⽤意する。
4-2-2.培養上清を DMEM に FCS を 2%加えた培地（DMEM-2FCS）5mL と置換する。培地としては抗⽣物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）や抗真菌剤（アムホテリシン B）等が添加されたも15 / 19

のを推奨する。
4-2-3. 3-2（検体の処理）で得られたウイルス分離⽤の材料（100µL など）を 4-2-2 の培養細胞に添加し、1-3 時間程度培養する。バクテリア等のコンタミネーションを低減させるため、ウイルス分離⽤の材料をあらかじめ遠⼼（10000g, 10 分等）し、その上清を細胞に添加しても良い。
4-2-4.上清を除き、５ｍL の DMEM-2FCS あるいは PBS で 2 回程度細胞を洗浄する。
4-2-5. ５ｍL の DMEM-2FCS 存在下で細胞を最⼤ 7 ⽇間培養する。
4-2-6.細胞変性効果が認められた場合あるいは 7 ⽇間培養した後、培養上清の⼀部より 4-1（リアルタイム PCR）で⽰した⽅法でサル痘ウイルスの遺伝⼦の存在の有無を調べる。
4-3.電⼦顕微鏡法によるオルソポックスウイルス感染症の検査（参考検査）
4-3-1.必要な試薬・器具等
マイクロチューブ、ペレットミキサー、マイクロピペット、ピペットチップ、チップ捨て、蒸留⽔、
phosphate buffer (pH7.2, 0.01M)、固定液（2.5%GA 1%PFA in 0.1MPB）、濾紙（⼩⽚）、プラステ
ィックディッシュ、ピンセット、適当な⼤きさに切ったパラフィルム
安全キャビネット、遠⼼機、透過型電⼦顕微鏡）
4-3-2.グリッドの準備
200-400 メッシュのグリッド：コロジオン+カーボン膜処理済み、使⽤時にイオンスパッタ装置による親⽔化処理を⾏う
4-3-3.染⾊液の準備
2% sodium phosphotungstate(pH7.0)：DW20ml にリンタングステン酸 1g を溶かし、0.1N KOH30mlをゆっくり加え濾過して使⽤。あるいは酢酸ウランを使⽤してもよい。
4-3-4.検体の準備
ウイルス分離材料⽤に作製した乳剤上清の⼀部（0.05 mL 程度）を使⽤する（例：マイクロチューブ中で検査材料と phosphate buffer の乳剤を作製する。径 5mm のポックに対して 0.3-0.5ml）。不活化を⽬的として固定液（例：2.5%GA 2%PFA in 0.1MPB）を等量混合する。室温放置 15 分以上。い
ずれも安全キャビネット内で実施する。
4-3-5.染⾊⼿順（いずれも安全キャビネット内で実施する）
4-3-5-1. 固定済みのサンプルを 5,000 rpm, 1 分以上遠⼼し、材料の上清を採取する（サンプルによっては上清を２−８倍希釈し、標本を作製した⽅がよい。サンプルによって適宜⼯夫する）。
4-3-5-2. パラフィルムに材料上清、蒸留⽔、染⾊液（PTH あるいは酢酸ウラン）、蒸留⽔の順番で各 10-30 µL の⽔滴を準備する。
4-3-5-3. 材料上清の⽔滴に親⽔化処理済みグリッドを裏返しに置き、20-30 秒以上放置する。
4-3-5-4. ピンセットでグリッドを⽀持し、濾紙で余分な液を吸⽔する。
4-3-5-5. 次に蒸留⽔の⽔滴にグリッドを裏返しに乗せ、すぐに余分な⽔を吸い取る。
（この過程でエンベロープウイルスはエンベロープが壊れ、染⾊液が内部にはいり内部構造が明確になる。
）
4-3-5-6. 続いて染⾊液の⽔滴に 10-20 秒インキュベートする。過染に注意すること。
4-3-5-7. ピンセットでグリッドを⽀持し濾紙で余分な液を吸⽔する。
4-3-5-8. 10 分間 UV 照射(254nm)し殺菌処理を施す。表・裏いずれも 10 分間照射する。
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4-3-5-9. グリッドが乾燥したら透過電⼦顕微鏡で観察を⾏う。
4-3-6.評価⽅法
ウイルス粒⼦はリンタングステン酸によりネガティブに染⾊され、250-300nm の⼤型の粒⼦として観察される。オルソポックスウイルスは増殖ステージによって形態が異なり（M 型、C 型）、エンベ
ロープで覆われている場合と壊れている場合がある。特異性には⽋けるため、オルソポックスウイ
ルス粒⼦が検出された場合はオルソポックスウイルス感染症との診断にとどめる。パラポックスウ
イルスやヘルペスウイルスなどと鑑別が可能である。ただし、同じポックスウイルス科の伝染性軟属腫（⽔いぼ）との鑑別は困難である。
参考⽂献 https://www.cdc.gov/smallpox/pdfs/negative-stain.pdf

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5． サル痘の診断基準
次のいずれかが満たされた場合、サル痘と診断する。
・PCR 法によるサル痘ウイルスの遺伝⼦の検出・分離・同定によるサル痘ウイルスの検出
いずれの場合もより精密な検査を⾏なうため国⽴感染症研究所ウイルス第⼀部第⼀室へ連絡する。
なお、電⼦顕微鏡法による検査ではオルソポックスウイルス感染症との診断にとどめる。

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6． 連絡先国⽴感染症研究所ウイルス第⼀部第⼀室
TEL: 042-561-0771（代表）
国⽴感染症研究所感染病理部
TEL: 03-5285-1111（代表）
国⽴感染症研究所ウイルス第⼀部第四室
TEL: 03-5285-1111（代表）

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