平成 29 年度 血液医学分野 一般研究助成 研究成果報告書

CD4T 細胞の分化初期段階を制御する転写因⼦の同定
関谷高史
国立国際医療研究センター 免疫制御研究部【研究の背景】
ヘルパーT 細胞（Th）と制御性 T 細胞（Treg）は、それぞれ免疫応答の正の制御、負の制御のエフェクターとして機能する、CD4T 細胞系列に属する細胞サブセットである。Th/Treg の機能のバランスは重要であり、どちらが勝りすぎても様々な疾患の引き金となる。従って、Th と Treg の分化メカニズムの詳細な理解は、免疫疾患の発症メカニズムの解明、ひいては新規治療標的の同定に繋がると期待される。我々の研究グループは先行研究で、Th/Treg 運命決定に機能する重要な転写因子として、「Nr4a ファミリー核内受容体」を見出している 1, 2）。Nr4a ファミリーは Nr4a1, a2, a3 の 3 分子から構成されており、胸腺での Treg の発生分化で必須の役割を担っている。T 細胞特異的に Nr4a ファミリー分子全てを欠損させたトリプルノックアウトマウス（Nr4a-TKO マウス）では、Treg は全く分化しないうえ、Th1 や Th2 タイプのヘルパーT 細胞活性の著明な亢進が起こり、マウスは生後早期に重篤な自己免疫疾患を発症し死亡する。このように、Nr4a は Th/Treg 分化制御で必須の役割を担っており、炎症性疾患の治療標的として大きな期待が持たれる分子である。

【⽬的】

上述の通り、胸腺での Treg の発生分化において Nr4a が必須の役割を担っていることは明らかとされてきたが、様々な未解明な疑問点： ①Nr4a はどのような分子機序で Treg 分化を促進するか ②Treg の分化に寄与する分子イベントの中で、Nr4a に担われるもの、担われないものは、それぞれ何か ③ Nr4a を欠損し、Treg への分化を完了できなかった細胞はどのような運命を辿るかが残されている。これらの疑問点の追求は、炎症性疾患の発症機序や寛容誘導メカニズムなどの理解を深めるのみならず、炎症性疾患の新規治療法の開発につながると期待される。そこで本研究では、胸腺から取得した Treg前駆細胞（Treg precursor cell; preTreg）の解析を中心に、これらの疑問点の解明を試みた。

【⽅法】

マウス胸腺から Nr4a-TKO preTreg, 野生型 preTreg, Treg, non-Treg 細胞を取得し、実験に供した。さらに、それらに加え、Nr4a の誘導標的であり Treg の主要転写因子として知られる Foxp3 を欠損した preTreg（Foxp3-KO preTreg）も取得し、実験に供した。主に以上の細胞を用い ①マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析 ②バイサルファイトシーケンシングによる CpG メチル化解析 ③T 細胞欠損マウスへの移入後の in vivo 解析等の実験を行い、Nr4a の胸腺 Treg 発生分化における役割と分子機序の検討を行った。

【結果】

Nr4a-TKO preTreg, Foxp3-KO preTreg, 野生型 Treg, 野生型 non-Treg のマイクロアレイ解析結果のクラスタリングにより、Treg 分化過程で発現変動する遺伝子を ①Nr4a, Foxp3 両方に依存しないもの ②Nr4a に exclusive に依存するもの ③
Foxp3 に exclusive に依存するもの ④Nr4a と Foxp3 の両方に依存するものに分類した。その結果、Nr4a に exclusive に発現制御を受ける遺伝子として、Treg の主要遺伝子の一つ Eos をコードする Ikzf4 の誘導、Il4, Il21 等の Th2 や Tfh 型のヘルパーT 細胞のサイトカイン遺伝子の抑制が見出された。また、CpG メチル化解析の結果から、Nr4a は Ikzf4 遺伝子座の脱メ

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先進医薬研究振興財団

2018 年度

研究成果報告集

平成 29 年度 血液医学分野 一般研究助成 研究成果報告書

チル化に必須の役割を担っていることが明らかとなった。
Treg は胸腺での発生分化過程において、胸腺樹状細胞や胸腺上皮細胞に提示される自己抗原に対して高い親和性を示したクローンから主に分化する。このことは、Treg への正常な分化を遂げられなかった細胞が生き残り、末梢に遊走すると、自己免疫を引き起こす可能性を孕んでいる。一方、Nr4a-TKO マウスは Foxp3-KO マウスと比較しても寿命の短い重篤な自己免疫疾患を発症することが確認されているため、Nr4a は Treg の誘導以外にも T 細胞で何らかの寛容誘導メカニズムを担っていると推測できる。そこで、Nr4a-TKO preTreg, Foxp3-KO preTreg, 野生型 preTreg を autologous mixed lymphoidreaction（MLR）を用いた in vitro 解析、および T 細胞欠損マウスへの移入による in vivo 解析により検討した。その結果、
autologous MLR では野生型 preTreg, Foxp3 preTreg 共におびただしいアポトーシスを示した一方で、Nr4a-TKO preTregは生存し、自己抗原に反応して増殖することも明らかとなった。また、WT preTreg や Foxp3-KO preTreg では Nr4a1 や Bimの発現の亢進が確認され、アポトーシス誘導に機能していることが示唆された。さらに、野生型 preTreg, Foxp3 preTreg 共に、移入後の T 細胞欠損マウスではアポトーシスが誘導され病原性を示さなかった一方で、Nr4a-TKO preTreg は生存し、様々な臓器で炎症を引き起こすことが確認された。以上の研究成果は Cell Reports 誌で発表を行った 3)。

【考察】

まず、Nr4a に exclusive に誘導または抑制を受ける遺伝子の数はそれぞれ 213 種類と 83 種類であったのに対し、Foxp3と Nr4a の両者に依存せず発現誘導または抑制を受ける遺伝子の数はそれぞれ 730 種類と 776 種類と、多数であった。また、

Foxp3 遺伝子の発現も、Nr4a-TKO preTreg で、量は低いが誘導されることが確認された。Treg 分化において Foxp3 がexclusive に寄与するイベントはそれほど多くは無いことは知られていたが、以上の結果から、Nr4a が exclusive に制御するイベントも一部に留まると推測される。しかし、Eos の発現制御、Th2 や Tfh サイトカイン発現の抑制は Treg の正常な分化に必須であるため、Nr4a の機能は Treg 分化の重要な一翼を担っていることが明らかとなったと言える。
さらに、Nr4a-TKO preTreg は移入後のレシピエントマウスで炎症反応を惹起したが、これは、Treg 前駆細胞から自己免疫性細胞が生じたことを初めて示した例である。Nr4a が Treg 前駆細胞において分化の促進のみならず、分化を完了できなかった細胞にアポトーシスを誘導し、除去する機能も持つことを強く示唆しており、胸腺での中枢性トレランスを担う重要なメカニズムの一つを明らかにしたと言える。

【臨床的意義・臨床への貢献度】
Nr4a ファミリー転写因子は、ヒト・マウスの種間を問わず高度に保存された分子であり、ヒト CD4T 細胞制御でも重要な役割を担っていることが推測される。本研究成果は、自己免疫疾患の発症機序の理解を深めるのみならず、Nr4a を標的とした新規治療薬の開発に重要な指針を与えると期待される。

【参考・引⽤⽂献】
1）

Sekiya, T. et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4+ T cells. Nat
Commun 2011;2, 269.

2）

Sekiya, T. et al. Nr4a receptors are essential for thymic regulatory T cell development and immune homeostasis. NatImmunol 2013;14, 230-237.

3）

Sekiya, T. et al. Nr4a Receptors Regulate Development and Death of Labile Treg Precursors to Prevent Generation ofPathogenic Self-Reactive Cells. Cell Rep 2018;24, 1627-1638 e1626.

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