学位論文
tRNA 修飾酵素 アーケオシン tRNA グアニン
トランスグリコシラーゼの機能･構造解析

平成 14 年 12 月博士（理学）申請
東京大学大学院理学系研究科
生物化学専攻石谷 隆一郎

目次
第１章

序論

1

1.1

RNA 修飾の意義 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 1

1.2

RNA 修飾酵素と RNA の構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 2

1.3

tRNA 修飾酵素 ArcTGT による tRNA 認識 ．．．．．．．．．．．．．．． 4

1.4

塩基交換反応 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 6

1.5

本研究の概要 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 8

第2章

1.5.1

第 2 章の概要 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 8

1.5.2

第 3 章の概要 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 8

1.5.3

第 4 章の概要 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 8

1.5.4

第 5 章の概要 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 8

1.5.5

第 6 章の概要 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 9

超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来
ArcTGT の X 線結晶構造解析

2.1

11

材料と方法 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 11
2.1.1

ArcTGT の構造解析 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 11

2.1.1.1

組み換え蛋白質の大量調製 ．．．．．．．．．．．．．．．．．． 11

2.1.1.2

動的光散乱の測定 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 12

2.1.1.3

結晶化 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 12

2.1.1.4

セレノメチオニン標識蛋白質の大量調製と結晶化 ．．．．．．．． 12

2.1.1.5

X 線回折像の測定 (B 型結晶 ) ．．．．．．．．．．．．．．．．． 13

2.1.1.6

X 線回折像の測定 (C 型結晶 ) ．．．．．．．．．．．．．．．．． 13

2.1.1.7

回折データの処理 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 13

2.1.1.8重原子同型置換体の探索 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 13

2.1.1.9

分子置換法による位相決定の試み ．．．．．．．．．．．．．．． 13

2.1.1.10

MAD 法による位相決定 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 13

2.1.1.11

ArcTGT 原子モデルの構築 ．．．．．．．．．．．．．．．．．． 14

2.1.1.12

ArcTGT モデルの精密化 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 14

2.1.2

ArcTGT とリガンド（グアニン等）との複合体の構造解析 ．．．．．．． 14

2.1.2.1

複合体結晶の調製 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 14

2.1.2.2

回折像の測定と回折データ処理 ．．．．．．．．．．．．．．．． 15

2.1.2.3

分子置換法による位相決定とモデルの精密化 ．．．．．．．．．． 15

i

■ 目次

2.2

結果と考察 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 16

2.2.1

組み換え蛋白質の大量調製 ．．．．．．．．．．．．．．．．．． 16

2.2.1.2

動的光散乱の測定 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 17

2.2.1.3

結晶化と回折像の測定 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 17

2.2.1.4

データセットの測定と処理 (C 型結晶 ) ．．．．．．．．．．．．． 20

2.2.1.5重原子同型置換体の探索 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 20

2.2.1.6

分子置換法による位相決定の試み ．．．．．．．．．．．．．．． 20

2.2.1.7

セレノメチオニン標識蛋白質の大量調製 ．．．．．．．．．．．． 20

2.2.1.8

セレノメチオニン標識蛋白質の結晶化 ．．．．．．．．．．．．． 21

2.2.1.9

セレノメチオニン標識結晶の回折像測定とデータ処理 ．．．．．． 21

2.2.1.10

MAD 法による位相決定 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 21

2.2.1.10原子モデルの構築と精密化 ．．．．．．．．．．．．．．．．．． 26

2.2.2

第3章

ArcTGT の構造解析 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 16

2.2.1.1

ArcTGT とリガンドとの複合体の構造解析 ．．．．．．．．．．．．．． 26

2.2.2.1

複合体結晶の回折像測定とデータ処理 ．．．．．．．．．．．．． 26

2.2.2.2

複合体のモデル構築と精密化 ．．．．．．．．．．．．．．．．． 26

ArcTGT 単独 , リガンドとの複合体の結晶構造

27

3.1

材料と方法 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 27

3.2

結果と考察 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 27
3.2.1

ArcTGT の結晶構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 27

3.2.1.1

全体構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 27

3.2.1.2

亜鉛結合サイト ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 27

3.2.1.3

ArcTGT の二量体化 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 27

3.2.1.4

触媒ドメインの構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 28

3.2.1.5

QueTGT の構造との比較 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 28

3.2.1.6ドメイン C3 の構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 30

3.2.1.7ドメイン C1，C2 の構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 31

3.2.1.8

他の古細菌ではドメイン C2 ･ C3 を欠く ArcTGT が存在する ．．． 31

3.2.2

ArcTGT ･リガンド複合体の結晶構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．． 35

3.2.2.1

リガンド・フリー型 ArcTGT と3.2.2.2

グアニンと preQ0 の認識様式 ．．．．．．．．．．．．．．．．． 35

グアニン，preQ0 結合型 ArcTGT の比較 ．．．．．．．．．．．． 35

第4章
4.1

ii

3.2.2.3

QueTGT による preQ1 認識との比較 ．．．．．．．．．．．．．． 37

3.2.2.4

グアノシン，デオキシグアノシン類似体との複合体の構造 ．．．． 38

P. horikoshii 由来 ArcTGT ･ tRNA 複合体の X 線結晶構造解析

39

材料と方法 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 39
4.1.1

tRNA T7 転写産物の大量調製 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 39

4.1.2

ArcTGT・tRNA 複合体の調製 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 39

4.1.3

複合体状態での動的光散乱の測定，native PAGE，ゲルろ過 ．．．．．． 40

4.1.4

ArcTGT・tRNA 複合体の結晶化 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 40

目次 ■

4.2

第5章
5.1

4.1.5

ArcTGT・tRNA 共結晶の回折像測定 ．．．．．．．．．．．．．．．．． 40

4.1.6

回折データの処理 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 40

4.1.7

分子置換法による位相決定 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 40

4.1.8

tRNA モデルの構築と精密化 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 40

結果と考察 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 41
4.2.1

tRNA T7 転写産物の調製と精製 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 41

4.2.2

ArcTGT・tRNA 複合体の調製 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 41

4.2.3

ArcTGT・tRNA 複合体の結晶化スクリーニングと結晶化条件最適化 ．．． 41

4.2.4

ArcTGT・tRNAVal 複合体の回折像測定 ．．．．．．．．．．．．．．．． 45

4.2.5

分子置換法による位相決定 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 45

4.2.6

tRNA モデルの構築とモデルの精密化 ．．．．．．．．．．．．．．．． 45

ArcTGT による tRNA の認識機構

49

材料と方法 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 49
5.1.1

ArcTGT 変異体の調製 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 49

5.1.2

tRNAVal 変異体の調製．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 49

5.1.3

グアニン交換反応の活性測定 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 49

5.3.1

ArcTGT・tRNA 複合体の全体構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．．． 51

5.2

結果 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 51

5.3

考察 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 51
5.2.1

各変異体の活性測定 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 51

5.2.2

ミニ･マイクロヘリックスの活性測定 ．．．．．．．．．．．．．．．． 51

5.3.2

ArcTGT に結合した tRNA の構造変化 ．．．．．．．．．．．．．．．．． 52

5.3.3

C 末端ドメインによるアクセプター・ステムの認識 ．．．．．．．．．． 55

5.3.3.1

ドメイン C3（PUA ドメイン）による認識 ．．．．．．．．．．． 55

5.3.3.2

ドメイン C2 による認識 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 58

5.3.4

5.3.4.1

D アーム前半 U8 から U13 の認識 ．．．．．．．．．．．．．．． 59

5.3.4.2

G15 とその前後の残基の認識 ．．．．．．．．．．．．．．．．． 60

5.3.4.3

ArcTGT はいかにして tRNA 15 位を探し当てているか ．．．．．． 61

5.3.4.4

ArcTGT による認識に必要な RNA の最小構造 ．．．．．．．．．． 61

5.3.5

第6章
6.1

高次構造の壊れた D アームの認識 ．．．．．．．．．．．．．．．．．． 59

触媒サイトの構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 62

5.3.5.1

Phe99 の役割 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 62

5.3.5.2

Asp249 の役割 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 62

総合討論

65

塩基交換反応の触媒機構 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 65

iii

■ 目次

6.2

6.3

6.1.1

Asp249 の役割 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 65

6.1.2

Asp95 の役割 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 65

6.2.1

QueTGT による tRNA 認識との比較 ．．．．．．．．．．．．．．．．． 69

ArcTGT による tRNA 認識と他の酵素･ RNA 相互作用の比較 ．．．．．． 69
6.2.2

SnoRNP 複合体による基質 RNA 認識との対比 ．．．．．．．．．．．．． 69

6.2.3

構造変化による修飾導入は RNA 以外の系にありうるか？ ．．．．．．． 70

オルタナティブ型 tRNA の意義 ．．．．．．．．．．．．．．．．．． 71
6.3.1

tRNA 修飾酵素の超分子複合体 “modiﬁcosome” ．．．．．．．．．．．． 71

6.3.2 Ψ 55 修飾酵素 TruB との比較 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 72
6.3.3 RNA シャペロンとしての ArcTGT ．．．．．．．．．．．．．．．．．． 72

6.4

オルタナティブ型 tRNA とミトコンドリア tRNA の対比 ．．．．．．． 73

Appendix. A

iv

75

A.1

アミノ酸の略号 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 75

A.2

核酸の略号 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 75

A.3

その他の略号 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 76

A.4

備考 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 77

Appendix. B
謝辞

記号･略号及び備考

参考文献

79
83

目次 ■

v

図表目次
第１章

序論
図 1-1
図 1-2

構造安定化に寄与しうる修飾塩基の例 ．．．．．．．．．．．．．． 2
シュードウリジンによる構造安定化 ．．．．．．．．．．．．．．． 2

図 1-3
図 1-4

rRNA と塩基修飾サイト ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 3

図 1-5
図 1-6

TruB・RNA 複合体の結晶構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．． 3
アーケオシンの生合成経路 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 4

図 1-7
図 1-8

ArcTGT と他の相同性を有する酵素のドメイン構成 ．．．．．．．． 5

図 1-9
表 1-1

第2章

tRNA のコア構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 3

キューオシンの生合成経路 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 5
塩基交換反応に対して提唱されている反応機構 ．．．．．．．．．． 6
ArcTGT に関して過去に行われた tRNA の変異体解析の結果 ．．．． 4

超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来
ArcTGT の X 線結晶構造解析
図 2-1
図 2-2

本研究で使用したデオキシグアノシン類似体の構造式 ．．．．．．．14

図 2-3
図 2-4

大腸菌で大量発現させた ArcTGT の精製 ．．．．．．．．．．．．．16
リガンド･フリー ArcTGT の結晶の写真 ．．．．．．．．．．．．．17

図 2-5
図 2-6

B 型結晶の回折像 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18

図 2-7
図 2-8

セレノメチオニン化した酵素と native 酵素の質量分析 ．．．．．．．20
X 線蛍光スペクトルの測定 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21

図 2-9
図 2-10異常分散差フーリエマップ ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23
ArcTGT の実験的位相マップ ．．．．．．．．．．．．．．．．．．23

図 2-11
図 2-12リガンド･フリー ArcTGT のラマチャンドランプロット ．．．．．．24
C 型結晶のパッキングの様子 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．25

図 2-13

リガンド・フリー ArcTGT の主鏁の温度因子分布 ．．．．．．．．．25
ArcTGT の精製に使用した緩衝液の一覧 ．．．．．．．．．．．．．12
リガンド･フリー ArcTGT の結晶化条件 ．．．．．．．．．．．．．18

表 2-1
表 2-2
表 2-3
表 2-4
表 2-5
表 2-6

本研究で使用した結晶構造精密化手順 ．．．．．．．．．．．．．．13

C 型結晶の回折像 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18

B, C 型結晶の回折像統計値 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．19
結晶中の異常散乱原子の位置 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．22
Sharp による位相計算の統計値 ．．．．．．．．．．．．．．．．．22
リガンド･フリー ArcTGT と各リガンドとの複合体の構造精密化統計値 ．．．．．．．．．．．．24

表 2-7

第3章

ArcTGT 単独 , リガンドとの複合体の結晶構造
図 3-1
図 3-2

vi

各リガンドとの複合体の回折像統計値 ．．．．．．．．．．．．．．26

リガンド･フリー ArcTGT の結晶構造 ．．．．．．．．．．．．．．28
ArcTGT のドメイン構成 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29

図表目次 ■

図 3-3
図 3-4

触媒ドメインの比較 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29
ArcTGT と QueTGT の分子表面，表面電荷の比較 ．．．．．．．．．30

図 3-5
図 3-6

TGT ファミリーの触媒ドメインの配列アラインメント ．．．．．．31
ArcTGT のドメイン C2，C3 とCbf5p Ψ合成酵素の PUA ドメインの配列アラインメント ．．．．．．32

図 3-7
図 3-8
図 3-9
図 3-10

TruB Ψ合成酵素の C 末端ドメインとの比較 ．．．．．．．．．．．33
ArcTGT の系統樹 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．33
リガンド・フリー，グアニン，
preQ0 との複合体それぞれにおける触媒サイトの構造 ．．．．．．．34
ArcTGT の触媒ドメインとQueTGT のクリスタルコンタクトの比較 ．．．．．．．．．．．．．35

第4章

図 3-11
図 3-12

ArcTGT のリガンド認識と , QueTGT のリガンド認識の比較 ．．．．36
ArcTGT によるリガンドの認識（その２）．．．．．．．．．．．．．37

表 3-1

二量体化に関わっている原子の組とその距離 ．．．．．．．．．．．28

P. horikoshii 由来 ArcTGT ･ tRNA 複合体の X 線結晶構造解析
図 4-1
図 4-2
図 4-3
図 4-4
図 4-5
図 4-6
図 4-7

第5章

試験管内転写反応で調製した tRNA の精製 ．．．．．．．．．．．．41
ArcTGT と tRNA によるゲルシフト･アッセイ ．．．．．．．．．．．41
ArcTGT・tRNA 複合体の結晶 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．42
ArcTGT・tRNA 複合体 B2 型結晶の回折像 ．．．．．．．．．．．．43
複合体結晶構造の電子密度 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．44
複合体 ArcTGT のラマチャンドランプロット ．．．．．．．．．．．45

図 4-8

複合体 ArcTGT 主鎖の温度因子分布 ．．．．．．．．．．．．．．．46
複合体構造中の tRNA 主鎖の温度因子分布 ．．．．．．．．．．．．46

図 4-9
表 4-1

複合体結晶のクリスタルパッキング ．．．．．．．．．．．．．．．47
tRNA の試験管内転写反応に使用した反応液組成 ．．．．．．．．．40

表 4-2
表 4-3

ArcTGT・tRNA 複合体の結晶化条件 ．．．．．．．．．．．．．．．42

表 4-4
表 4-5

分子置換により得られた解 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．44
ArcTGT ･ tRNA 複合体モデルの精密化統計値 ．．．．．．．．．．．44

ArcTGT ･ tRNA 複合体結晶の回折像統計値 ．．．．．．．．．．．43

ArcTGT による tRNA の認識機構
図 5-1
図 5-2
図 5-3
図 5-4
図 5-5
図 5-6
図 5-7
図 5-8
図 5-9
図 5-10
図 5-11
図 5-12
図 5-13tRNA 変異体の 2 次構造模式図 ．．．．．．．．．．．．．．．．．50
本研究で使用したマイクロヘリックス・ミニヘリックス ．．．．．．50
ArcTGT ･ tRNA 複合体の結晶構造 ．．．．．．．．．．．．．．．．52
通常型とオルタナティブ型 tRNA の高次構造の比較 ．．．．．．．．53
通常型とオルタナティブ型 tRNA の二次構造の比較 ．．．．．．．．53
通常型とオルタナティブ型 tRNA のコア構造の比較 ．．．．．．．．54
ArcTGT と tRNA の相互作用の模式図 ．．．．．．．．．．．．．．55
tRNA のアンチコドン･アームと ArcTGT の相互作用 ．．．．．．．．56
ArcTGT C 末端ドメインによる tRNA アクセプター・ステムの認識 ．56
ArcTGT C 末端ドメインによる tRNA 認識（その２）．．．．．．．．57
2+

通常型 tRNA の D アームの付け根に配位した Mg イオン ．．．．．58
飛び出した D アームの認識 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．59
A14 と U16 の認識 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．60

図 5-14
表 5-1

ArcTGT・tRNA 複合体における触媒サイトの構造 ．．．．．．．．．62
変異体作成に用いた DNA プライマー ．．．．．．．．．．．．．．50

表 5-2

酵素活性測定の結果 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．51
vii

■ 図表目次

第6章

総合討論
図 6-1

viii

図 6-2

ArcTGT・tRNA 複合体と , DNA 修復酵素
AlkA・DNA 複合体構造の触媒サイトの比較 ．．．．．．．．．．．66
Asp95 の向きの比較 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．67

図 6-3
図 6-4

塩基交換反応・第一段階目の反応機構 ．．．．．．．．．．．．．．68
ArcTGT，QueTGT の RNA 結合ポケットの比較 ．．．．．．．．．．69

図 6-5
図 6-6

SnoRNA による基質 RNA 認識 ．．．．．．．．．．．．．．．．．70
TruB によるオルタナティブ型 tRNA 認識の可能性 ．．．．．．．．．71

図 6-7

オルタナティブ型 tRNA とミトコンドリア tRNA の構造 ．．．．．．73

第１章

序論

1.1 RNA 修飾の意義
RNA は遺伝情報を伝達できる側面と，化学反応

報とアミノ酸を対応付ける役割を果たす tRNA や，蛋を触媒できる側面を持つ生体髙分子である（Altman,

白質を合成する反応を触媒する rRNA，mRNA の転写

1990; Cech, 1990）．その為，現存する生物界（DNA・

後プロセシングを行うスプライソソームなどが挙げらProtein world）が完成する進化の段階に，RNA 主体で成れる．これらの分子では，RNA が修飾というストラテ

り立つ生物界（RNA world）が存在したのではないか

ジーを取ることで，蛋白質にひけをとらない，十分にという仮説が立てられている．しかしながら，RNA は

効率的な触媒・機能分子として働くことができるよう遺伝情報の伝達・触媒分子としての性能，両者ともにになったと考えられる．

modification

現存の DNA・Protein world に比べて劣っている点が多例えば，アダプター分子として働く tRNA には特い．例えば，RNA は 2′ 位の OH 基がホスホジエステ

異的な分子間相互作用が必須であるが，4 種類しか構

ル結合の切断を促進してしまう為，DNA に比べて化成要素がない RNA だけでは，多くの特異的な相互作

学的に不安定で分解されやすい．一方，触媒機能の用を作り出すのは困難である．その為，tRNA のアン

面では，RNA は蛋白質に比べて構造が柔軟な為，効率

チコドン部位には多種の修 飾塩基が存在し，分子間的に反応を触媒するのが困難である．また，RNA は蛋相互作用をよりバラエティに富んだものにしている白質に比べて構成要素が 4 種類と少なく，分子間の相と考えられる（Björk et al., 1999; Giegé et al., 1998; Marck

互作用も蛋白質に比べて貧弱なものとなり，これも& Grosjean, 2002; Yokoyama & Nishimura, 1995）． さ ら

RNA の構造を不安定にしている．

に，リボソームやスプライソソーム等に多く見られる

modified nucleoside

RNA world 仮説では，RNA には以上のような問題点

修飾塩基シュードウリジン（Ψ；図 1-1，2 ページ，パがある為，遺伝情報に関しては（一部のウイルスなど

ネル A）は，水分子を結合して RNA の構造を強固にを除いて）DNA にその役割を譲ったものと考えられし，さらに塩基間のスタッキングを強めるという役割ている．一方，触媒・機能分子としての役割は，そを果たしていると考えられている（図 1-2，2 ページ）の殆どを蛋白質に移行したわけであるが，転写・翻（Auﬃnger & Westhof, 1998; Charette & Gray, 2000）．また，

訳系には未だに RNA が触媒・機能分子としての役割

Ψ と同様に多く見られる修飾の一つである 2′-O- メチを担っている部分が多く存在している．例えば遺伝情ル化（図 1-1，2 ページ，パネル B）も，RNA の構造を
1

第 1 章 ̶ 序論

A

B

O

HO
HN

(Base)

NH

O

C

O
OH

図 1-1 構造安定化に寄与しうる修飾塩基の例(A) シュードウリジン（Ψ），(B) 2′-O-メチル化，(C) 1-メチルグアノ
1
7
2
シン（m G），(D) 7-メチルグアノシン（m G），(E) N -メチルグアノシン
2222，(F) N ,N -ジメチルグアノシン（m 2G），(G) 5-メチルシチジン
（m G）
5
4
1
，(I) 1-メチルアデノシン（m A）．修（m C），(H) 4-チオウリジン（s U）

O

飾により，元の塩基から変化した部分を赤色で示した．(B) 以外は，共通であるリボース部分を省略した．

CH3

C

D

O
CH3

N

N+

N

N

N

E

N

NH2

N

F

O
N

NH

N

N

N

NH2

O
N

O–

H3C

CH3

N

NH

Η2Ο

NH

N

N

54

CH3

CH3

Ψ55
G

H

NH2

I

S

H3C
N

N

N

CH3

N

NH

O

NH

O

N

N

N

図 1-2 シュードウリジンによる構造安定化
シュードウリジンは，図のように特異的に水分子と水素結合を形成し，RNA の構造安定化に寄与していると考えられている
Phe（Auﬃnger & Westhof, 1998）．図では，酵母 tRNA における Ψ55と水分子の水素結合を例として挙げた．

安定化する役割があると推測されている（Davis, 1998;

効率的にペプチド転移反応を触媒できるようにしていKawai et al., 1992）．実際，現在明らかにされているリると考えられている．一方，tRNA の L 字型構造の中ボソームの構造と rRNA の修飾サイトを対応付けると， 央部分（コア；図 1-4，3 ページ）を形成する D アーム，
リボソーム中央の触媒サイト付近に修飾が集中していバリアブル・ループ，TΨC ループには多種多様の修飾る（図 1-3，3 ページ；Decatur & Fournier, 2002）．すな

塩基が見出されており（Sprinzl et al., 1998），tRNA の L

わち，これらの rRNA の修飾は RNA の構造を補強し，字型構造を補強していると考えられる．

1.2 RNA 修飾酵素と RNA の構造
構造を補強していると考えられるタイプの RNA 修

結合し，修飾を行っているとは考えにくい．RNA 修

飾は RNA の折畳みの内部に存在し，互いに複雑な

飾酵素は，修飾サイトが露出するように構造変化を起

t e r t i a r yinteraction

髙次構造的相互作用を形成している．

こした RNA に結合し，修飾を導入している可能性が例 え ば， リ ボ ソ ー ム の 髙 次 構 造 か ら（Ban et al.,髙い．rRNA のような巨大な構造を持つ RNA の場合は，2000; Wimberly et al., 2000），rRNA の 修 飾 サ イ ト の 殆

多種の RNA ヘリカーゼがその生合成に重要であるこどが構造の内部に存在していることが明らかになっとが知られており（Luking et al., 1998），RNA 修飾酵素

た（図 1-3，3 ページ；Decatur & Fournier, 2002）．また，

はヘリカーゼにより巻き戻された状態の RNA に結合tRNA のコア構造に見られる多種の修飾塩基も，そして修飾を導入していると推定される．一方，tRNAの多くが tRNA の折り畳みに埋もれて存在しているのような小さな構造においてはそのようなヘリカーゼ（図 1-4，3 ページ）．これらの修飾は，いずれも RNAは知られておらず，多くの tRNA 修飾酵素は ATP の

modification enzyme

修飾酵素が触媒する化学反応により導入されるが，こようなエネルギー源を使用せずに修飾を行うことがのように大半の修飾サイトは RNA の構造に埋もれて出 来 る（Garcia & Goodenough-Lashua, 1998）． そ の 為，いる為，修飾酵素が完成した状態の rRNA や tRNA にtRNA 修飾酵素は正規の L 字型構造から何らかの構造

2

1.2

RNA 修飾酵素と RNA の構造

変化を起こし修飾サイトが露出した tRNA を結合して， tRNA の部分構造のみからなる基質では，このような修飾していると推測される．さらに，このようにして
canonical

単純な残基のフリップでアクセスできたわけである

コアの部分に修飾が導入された tRNA は，正規の L 字が，一方で，通常の tRNA では Ψ55 は D ループ上の型構造のみを安定に取り，再び構造変化することのな

Gm18 と塩基対を作り髙次的な相互作用を形成していいよう補強されると考えられる．

る（図 1-4，3 ページ）．その為，tRNA の D ループは，

最近，tRNA の 55 位に Ψ を導入する，シュードウリ

TruB と tRNA が結合した状態では何らかの構造変化

ジン合成酵素 TruB と TΨC ステム・ループからなるを起こしている筈である．しかしながら，上記の結RNA との複合体の結晶構造が報告されている（Hoang

晶構造では基質が TΨC アーム部分のみである為，他& Ferré-D’Amaré, 2001）． そ れ に よ る と，TruB は 通 常の部分がどのような構造変化を起こすかは解明できな

ループの内側を向いている U55 の塩基をフリップさ

かった．さらには，D アームやバリアブル・ループ上

せて，TruB の触媒サイトに結合させることが明らかにある修飾サイトの中には，コアの内部に埋もれて，になった（図 1-5，3 ページ）
．ステム・ループという

上記のような単純な塩基のフリップだけではアクセスできないサイトが多数存在する（s U8, m G9, m G10, Ψ
4

1

2

13, m1A22, m22G26, m7G46, m5C48 など；図 1-1，2 ペー
ジに各々の構造式を，図 1-4，3 ページに導入されるサ
Peptidyl transferase
centerイトを示す）．すなわち，これらの修飾塩基は，tRNAが何らかの構造変化を起こして修飾酵素により認識され修飾が導入されている，という可能性が強く示唆されるのである．

Modificationsites

50S rRNA
図 1-3 rRNA と塩基修飾サイト
50S rRNA の結晶構造（Ban et al., 2000 ）に，大腸菌 50S rRNA

TSL-RNAの修飾サイトをマッピングしたもの．青色が修飾サイト，赤色が触媒サイトを示している．

TΨC arm
Gm18 Ψ55

acceptor stem

U55
D arm

G15

core region

anticodon arm
図 1-4 tRNA のコア構造
様々な生物種にわたって広く修飾されている残基を矢印で示した．また，アーケオシンが導入される 15 位も示した．

TruB
図 1-5 TruB・RNA 複合体の結晶構造
tRNA の 55 位 U を シ ュ ー ド ウ リ ジ ン 化 す る TruB と TΨCstem-loop RNA（TSL-RNA）との複合体の結晶構造（Hoang & Ferr
é-D’Amaré, 2001）．U55 を赤色で示した．U55 を含む，かぎ括弧で示した 3 ヌクレオチドが通常の TΨC ループの構造と異なり，ループの外側へフリップしている．

3

第 1 章 ̶ 序論

1.3 tRNA 修飾酵素 ArcTGT による tRNA 認識a r c h a e o s i n earchaea

修飾塩基ア ーケオシン（図 1-6，4 ページ）は古 細菌

も効率よく認識される．また，15 位の G が厳密に認tRNA の 15 位に見出される修飾塩基であり（Edmonds

識されているという以外は，tRNA 上の他の塩基配列

et al., 1991; Gregson et al., 1993; McCloskey et al., 2001），に殆ど特異性がないことがわかっている．このように細胞内のほぼ全ての tRNA に存在する（Gupta, 1984;

塩基配列に殆ど特異性がないにもかかわらず，15 位のSprinzl et al., 1998）．tRNA D ループ上の 15 位はバリア

G のみ非常に厳密に認識されており，例えば 14 位やブル・ループ上の 48 位と塩基対をつくり，さらに T

16 位が G であっても，誤ってその部分に修飾が導入

ΨC ループ上の 59 位にスタックしている（図 1-4）．そされるということはない．以上のことから，ArcTGTの為，アーケオシンはこの相互作用を強化して，tRNAは，構造変化した tRNA の 15 位を位置特異的にかつ，の D ループ，バリアブル・ループ，TΨC ループをつ

配列非特異的に認識していると考えられる．しかしなぎとめる楔のような役割をしていると推測される．

ながら，配列情報を用いずに ArcTGT がどのようにし

アーケオシン tRNA グアニントランスグリコシラーて tRNA の 15 位を探し当てているのかは不明である．

ゼ（ArcTGT）は，アーケオシンの生合成にかかわる本研究の ArcTGT・tRNA 複合体の構造解析から，以上

tRNA 修飾酵素である（Watanabe et al., 1997）．図 1-6（4の tRNA 認識のメカニズムを含め，tRNA 修飾酵素がページ）に示すように，ArcTGT はアーケオシン前駆

構造変化した tRNA をどのように認識し修飾している

体の preQ0 塩基を tRNA 上 15 位に導入する（Watanabe

かを解明することができると考えられる．

position specificet al., 1997）．さらに，tRNA に導入された preQ0 にアンモニアが付加することでアーケオシンが完成する（Watanabe et al., 1997; 最後の preQ0 をアーケオシンに

表 1-1

ArcTGT に関して過去に行われた tRNA の変異体解析の結果
Watanabe et al.（2000）による結果を簡単にまとめたもの．

変換するステップに関しては，どのような酵素がかかわっているかは不明である）．tRNA 15 位は L 字型

tRNA 変異体のタイプのコアの中心部分に深く埋もれており（図 1-4）
，単純TΨC ステムを壊す○

アンチコドン・ステムを壊す○

D ステムを壊す○

アクセプター・ステムを壊す×

G15 を A，C，U に変異

×

G15 以外の 1 塩基置換○

15 位を G 以外に，14 位を G に変異（G15 を 14 位にシフト）×

15 位を G 以外に，16 位を G に変異（G15 を 16 位にシフト）×

な塩基のフリップだけで酵素がアクセスできるとは考えにくい．ArcTGT は何らかの構造変化を起こした
tRNA を認識し，修飾していると考えられる．ArcTGTによる tRNA 認識に関しては，表 1-1（4 ページ）に示
すように，tRNA の変異体解析による生化学的な研究が 詳 細 に 行 わ れ て い る（Watanabe et al., 2000）． そ の結果によると，正規の L 字型の構造は必要ではなく，髙次構造の一部が形成できないような tRNA 変異体で

N

O
P

14
N

OH

O

N

O

N

O

NH2

P

NH

OH

O

N

N

O

O-

P

O
O

N

O-

P

P

N

ArcTGT
O

O
P

N

O

NH2

archaeosine
O

OH
O-

P

N

O

O

16
O

OH
O-

NH

N

O

16
OH

O-

C
OH

O-

O

O

16
O

NH2

P

OH

O

O

O

O

preQ0

OH

O

O

O

G15
O

???

O-

O

NH2

H2 N

O

14

C

O

NH

O-

N
O

C

O

14
O

N

N
O

O

活性（○：あり，×：なし）

O

P

OH
O-

図 1-6 アーケオシンの生合成経路
tRNA 上の 15 位グアニンが ArcTGT により preQ0 に交換され，さらに未解明の反応ステップを経てアーケオシンになる．PreQ0 がどのようにして合成されているかも解明されていない．

4

1.3

図 1-7

ArcTGT と他の相同性を有する酵素のドメイン構成ArcTGT と，さらに同じ TGT ファミリーに属する QueTGT，rRNA/snRNA の Ψ 化にかかわる snoRNP 複合体の触媒コンポーネントである
Cbf5p/dyskerin のドメイン構成を，それぞれ示した．また，バクテリア QueTGT の結晶構造（Romier et al., 1996a）を右上に示した．

tRNA 修飾酵素 ArcTGT による tRNA 認識

N

QueTGTC

Zn

Catalytic domain

Z. mobilis QueTGT
N

ArcTGT

Cbf5p/dyskerin

N

C

Zn

PUA

Ψ synthase

PUA

Catalytic domain

C

HO

HO

U

U
O

O

33
O
O

P

+

O

33
N

OH

O

NH

O–

O

N

O

N

O

NH2

P

U
H3 N

O

CH2

O

N

O

N

O

O

O

OH
O–

P

U

O

O

U

O

P

O

OH
O–

P

U
O

QueTGT
O

P

35
O

OH
O

–

NH

queuosine
O

O

O

N

O

35
OH

–

NH

N

O

O

O

35
O

OH
O–

OH
O–

P
O

O

NH2

P

C

preQ1

G34
O

O

NH

O–

O

H 2C

33

C

OH

NH2+

O

O

P

OH
O–

図 1-8 キューオシンの生合成経路
真正細菌におけるキューオシンの生合成経路を簡単に示した．tRNA アンチコドンループ上の 34 位グアニンが QueTGT により
preQ1 に交換され，さらに数ステップの反応によりシクロペンテンジオール環が付加されて Q となる．PreQ1 がどのように合成されているかは解明されていない．一方，髙等真核生物は Q の合成経路を持たず，栄養素として外部から取り入れた Q を QueTGT が
直接 34 位の G と交換すると考えられている（Katze et al., 1984）．

ArcTGT の一次構造は，図 1-7（5 ページ）に示すよ

uridine synthase/Archaeosine TGT）ドメインという配列

うに，N 末端側の領域と，C 末端側の機能未知の領域

モチーフを含んでいる（図 1-7，5 ページ；Aravind &からなっている．N 末端側の領域は，近縁の酵素でKoonin, 1999）．PUA ドメインの構造・機能はともにあるキューオシン TGT（QueTGT）全長と相同性が髙未知であるが，他の RNA 修飾酵素にも見出される為，い（Romier et al., 1997）．QueTGT は， 図 1-8（5 ペ ー

RNA 認識に関わっているのではないかと推測されてジ）に示すように，tRNA アンチコドン・ループ 34 位

いる．特に ArcTGT の PUA ドメインは，眞核生物にq u e u o s i n eに，修飾塩基キ ューオシンを導入する反応に関わっ

おいて rRNA，snRNA のシュードウリジン化に関わって い る（Nishimura, 1979）． す な わ ち， 眞 核 生 物 のている snoRNP 複合体の構成要素，Cbf5p/dyskerin（Kiss,

QueTGT は Q 塩基を直接 tRNA に導入するが，眞正2001）の PUA ドメインに類似している（図 1-7）．これ

細菌の QueTGT は前駆体である preQ1 塩基を tRNA にらのことから，ArcTGT の（PUA ドメインを含む）C 末導入する（Nishimura, 1979）．眞正細菌の QueTGT は

端領域は，RNA 認識に関わっていると推測される．
o r t h o l o g u e

その生化学的な解析が進んでおり（Björk, 1995），酵さらに，Cbf5p のヒトの相 同分子種である dyskerin

素単独あるいは preQ1 との複合体の結晶構造も解明さは，遺伝病，先 天性角化異常症（DC）の原因遺伝子れている（Romier et al., 1996a）．このように，QueTGTであるといわれている（Heiss et al., 1998; Lafontaine etと ArcTGT の触媒する反応が類似している点や，上記

al., 1998）． こ の，DC は dyskerin を コ ー ド す る 遺 伝のような配列の類似性から，ArcTGT の N 末端領域は

子 DKC1 のミスセンス変異により引き起こされる．

触媒ドメインであると考えられている（Romier et al.,

DC の家系において最も頻繁に見つかっている変異

1997; Watanabe et al., 1997）．

は A353V のアミノ酸置換であることが報告されてdyskeratosis congenita

一 方，ArcTGT の C 末 端 側 領 域 は， 眞 核 生 物， 古細菌の RNA 修飾酵素に広く見られる，PUA（Pseudo-

おり（Knight et al., 1999），興味深いことに，Ala353 はdyskerin の PUA ドメイン上の残基である．
5

第 1 章 ̶ 序論

A

B

C

O
XH
NH

N

N

N

H+

O

NH2

N

N
H

NH2

H

NH2

O

O

O

H

OH

N

O

O
O

NH

X–

NH

N

O

O

N

X–

N

O

O

O

O

O

O

OH

H

OH

O

OH

Asp

D
X–

O
O

O

E

OH

F

N

G
O

C

C

NH

X–
N

N

N

O

C

N

XH
NH2

H

O

O

O

H

C

O

C

XH

C

NH

NH
O

O

N

N

N

NH2

N

O

O

NH2

O
O

O

H

O

H
O

O

O

O

H
O

O

O

O

O

図 1-9 塩基交換反応に対して提唱されている反応機構(A) 酵素に tRNA が結合し，触媒サイトに G15 が結合する．(B) 酵素側の残基により G15 の塩基がプロトン化される．(C) その結果，N-グリコシド結合が開裂し，オキソカルベニウム・カチオン（遷移状態）が生じる．さらに，カチオンを酵素の Asp 残基が求核攻撃する．(D) 新たな O-グリコシド結合が生じ，グアニンが脱離する．(E) PreQ0 が触媒サイトに取り込まれ，酵素側の残基により
N9 が脱プロトン化する．一方で，不安定な酵素との O-グリコシド結合が開裂し，再びオキソカルベニウム・カチオン（遷移状態）が生じる．(F) PreQ0 の N9 がカチオンを求核攻撃する．(G) PreQ0 との間に N-グリコシド結合が再生し，反応が完了する．

1.4 塩基交換反応
ArcTGT と QueTGT は，tRNA のポリヌクレオチド

al., 1997）． さ ら に， 眞 正 細 菌 Zymomonas mobilis 由 来

鎖上で N-グリコシド結合を開裂・再生させ，核酸のQueTGT の結晶構造（Romier et al., 1996a）や生化学的塩基の部分のみを交換するという，特徴的な反応機な解析（Romier et al., 1996b）から，ArcTGT，QueTGT 両

構 で tRNA を 修 飾 す る．ArcTGT は G15 の グ ア ニ ン

者に共通の塩基交換反応は以下のように進行すると推，一と preQ0 を入れ替え（図 1-6; Watanabe et al., 1997）

測されている（図 1-9，6 ページ）．

方，QueTGT は G34 のグアニンと preQ1 を入れ替える

1.

N-グリコシド結合が開裂し，グアニンが遊離
o

x

o

c

a

r

b

e

n

i

u

m

ことで修飾を導入している（図 1-8; Nishimura, 1979）．

する．リボースはオ キソカルベニウム・カチ

N-グリコシド結合を切断する酵素には，DNA の除去

オン遷移状態となる．
catalytic nucleophile

修復に関わる DNA グリコシラーゼなど（Cunningham,2.

1997; Krokan et al., 1997）があり，また，同一の塩基に対して N-グリコシド結合を開裂・再生させる酵素にtRNA のリボースの C1′ を求核攻撃する．
3.

はシュードウリジン合成酵素（Gu et al., 1999）がある
が，塩基を全く別のものに入れ替えてしまうという反4.

6

基 質 ポ ケ ッ ト か ら グ ア ニ ン が 遊 離 し，preQ0（QueTGT の場合は preQ1）が取り込まれる．

5.

TGT 両者の酵素の類似性や，反応と基質の類似性か
ら，ほぼ同じ機構であると推測される（Watanabe et

酵素と tRNA の間に新しい O-グリコシド結合が生成する．

応は他の酵素には見られないものである．
塩 基 交 換 の 反 応 機 構 に 関 し て は，ArcTGT と Que-

求 核触媒として働く，保存された Asp 残基がO-グリコシド結合が開裂し，リボースは再び
オキソカルベニウム・カチオン遷移状態となる．

6.

PreQ0 の N9 がリボースの C1′ を求核攻撃する．

1.4

7.

N-グリコシド結合が再生して反応が完了する．

ただし，上記の過程で確認されているのは，酵素と塩基交換反応残基が必要であるが，QueTGT の結晶構造からは不明である．

intermediatetRNA の共有結合した，(3) でできる反応中間体が存在･ (5), (6) のうち，どちらが先に起こるのか．(5) だとする（Romier et al., 1996b）という点と，活性サイト付

SN1 的であり，(6) だと SN2 的に求核置換反応が進近に Asp 残基がある（Romier et al., 1996a）という点のむことになる．また，どちらの様式で進むにしてみである．さらに，上記の反応機構には以下に挙げるも，新たに取り込まれた塩基の 9 位が脱プロトン

ような疑問点が残る．

化していなければ求核置換反応は進み得ない．塩･ 結晶構造から上述の反応機構で出てくる求核触基性残基が塩基からプロトンを引き抜く必要があ

媒 残 基 は Z. mobilis QueTGT の Asp102（P. horikoshii

る．1 段階目の求核置換反応で酸触媒として働い

ArcTGT で は Asp95）で あ る と 推 測 さ れ て い る

た残基がここで塩基触媒として働いている可能性（Romier et al., 1996b）．Z. mobilis QueTGT の結晶構が髙いが，QueTGT の結晶構造からは不明である．

造では Asp のカルボキシル基が塩基（あるいはリボースがくるであろうと推測される向き）と逆方

上 記 の 疑 問 点 は，ArcTGT の 結 晶 構 造， あ る い は向に向いているが（図 3-11，36 ページ，パネル C）

ArcTGT と基質（グアニン，preQ0，tRNA を含む）との（Romier et al., 1996a），本当に求核残基なのか．

複合体の結晶構造を解明することで明らかにできる可･ (1), (2) のうち，どちらが先に起こるのか．(1) だと能性がある．

nucleophilic substitution

SN1 的であり，(2) だと SN2 的に求 核置換反応が進むことになる．(1) であると考えると，N-グリコシドを開裂させるように塩基をプロトン化する酸性7

第 1 章 ̶ 序論

1.5 本研究の概要
本研究では，まず，ArcTGT による基質認識と塩基溶液中での動的光散乱の結果からも二量体化が示さ

交換反応の解明を目的とし，X 線結晶構造解析法によれた．N 末端領域の触媒サイトと，C 末端ドメインのり超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来 ArcTGT の仮説的な tRNA 認識サイトの配向から，二量体化によ

構造決定を行い，さらにグアニン，preQ0，グアノシ

る tRNA 認識が示唆された．次に，リガンド・フリー

ン，デオキシグアノシン類似体それぞれとの複合体のの構造では，触媒サイト付近の残基 97–106 が disorder

構造を決定した．次に，上述の RNA 修飾酵素によるしていたが，リガンドが結合することで構造変化してRNA 認識と RNA の構造変化を解明することを目的と

α へリックスを形成することが判明した．また，グアVal

し，ArcTGT と tRNA 複合体の結晶構造を決定した．

ニン複合体と preQ0 複合体の構造を比較することで，さらに，得られた結晶構造に基づいて ArcTGT 及び

ArcTGT が異なるリガンドを同様に認識する機構を解Val

tRNA 変異体を作成し，活性測定を行った．

明した．さらに QueTGT ･ preQ1 複合体の構造と比較することで，ArcTGT と QueTGT のリガンド認識の違い

1.5.1 第 2 章の概要が何に起因するかを明らかにした．次に，上記のリガ

第 2 章 で は， 超 好 熱 性 古 細 菌 P. horikoshii 由 来

ンドとの複合体に加え，さらにグアノシン，デオキシ

ArcTGT の大量調製から構造決定に至るまでを詳述し

グアノシン類似体との複合体の構造とも比較することた．以下に概略を述べる．まず，東京で，従来求核触媒残基であると考えられてきた Asp95

理業大学・生命学研究科・岡田研究室からいただいた P. horikoshii

ArcTGT の発現系を用いて，ArcTGT の大量調製・精製の系を確立した．さらに酵素単独の結晶化スクリーニの塩基交換反応における役割について議論した．

1.5.3 第 4 章の概要

ングを行った結果，最終的に分解能 2.0 Å 程度まで回

第 4 章 で は，ArcTGT と tRNA 複 合 体 の 結 晶 か ら，折する結晶が得られた．また，酵素のセレノメチオニ

構造解析に至るまでを詳述した．以下に概略を述べ

ン置換体を用いた MAD 法による構造決定を行った．

Valる．まず，P. horikoshii tRNA (UAC) の T7 RNA ポリメラー

酵素単独の結晶構造は最終的に分解能 2.2 Å で決定しゼによる大量転写系を構築し，結晶化に適した純度にた．一方，酵素単独の結晶に様々なリガンドを浸潤さ精製した．次に ArcTGT と tRNA 複合体の結晶化スせることで，リガンドとの複合体の結晶構造を決定しクリーニングを行い，いくつかの条件下で結晶化に成た．構造決定は酵素単独の構造をモデルとして用いた

功した．さらに結晶化条件を改善することで，分解分子置換法によって行った．最終的には，グアニンと能 3.3 Å までの回折データを収集することができた．

の複合体を 2.3 Å，preQ0 との複合体を 2.5 Å，グアノシ

ArcTGT 単独の結晶構造をモデルとした分子置換法にンとの複合体を 2.8 Å，デオキシグアノシン類似体とのより位相決定を行い，最終的には分解能 3.3 Å で複合複合体を 2.8 Å の分解能でそれぞれ決定した．

体の結晶構造を決定した．

1.5.2 第 3 章の概要

1.5.4 第 5 章の概要

Val

第 3 章では，第 2 章で決定した酵素単独あるいは第 5 章では，第 4 章の結果に基づき，「tRNA 修飾

リガンドとの複合体の構造から，「C 末端ドメインの酵素による構造変化を起こした tRNA 認識の機構」，

構造」，「リガンドの認識機構」，「塩基交換の反応機「配列非特異的かつ位置特異的な tRNA 認識機構」に構」について議論した．構造未知であった PUA ドメ

ついて議論した．さらに，得られた結晶構造に基づいインを含む C 末端領域は 3 つのドメインから構成さて酵素と tRNA の変異体をデザインし，それらの活性れており，β シートに富む構造をとっていることが明測定を行った．第 5 章では，その方法について述べ，らかになった．β シート上には多くの塩基性残基が存さらに結果についての考察を行った．

在して分子表面に正電荷のパッチを形成しており，C

ArcTGT は二量体化することにより tRNA を認識し末端ドメインによる tRNA 認識が示唆された．一方，ており，ArcTGT に結合した tRNA は大きく構造変化

ArcTGT は結晶構造中で緊密な二量体を形成しており， を起こしていた．その構造変化は，単に変性してしま81.5うのではなく，修飾の標的部分が露出するよう tRNA

本研究の概要位の（一本鎖になった RNA の）バックボーンを一つの二次構造が組み変わっていることが明らかになった． 一つ認識し，ポリヌクレオチド鎖の長さを測ることで，
すなわち，この ArcTGT に結合した tRNA は，正規の正確に G15 位を触媒サイトに位置づけていた．

L 字型 tRNA とは異なった新たなコア構造を持つ，「オ

次に，tRNA との複合体における ArcTGT の触媒サ

ルタナティブ」な L 字型構造をとっていた．このオルイトの構造から，保存された Asp249 残基が求核触媒

タナティブ型 tRNA では，D アームの構造が完全に破残基である可能性を示した．変異体の活性測定の結果壊され U8 位から U22 位が tRNA 本体から飛び出し，や，他の類似の反応を触媒する酵素の触媒サイトの構

そのうち U8 位から U17 位は ArcTGT に認識されてい造などからも，Asp249 残基が求核触媒残基である可能る．一方，正規の tRNA では D アームを中心にコア性が強く示唆された．

構造が構成されているが，オルタナティブ型 tRNA では，元 D ステムの一部とバリアブル･ループにより新
たなステム構造「DV ステム」が形成され，新たなコア構造の中心を形成していた．

1.5.5 第 6 章の概要
第 6 章では，ArcTGT・tRNA 複合体の構造だけでな
く，ArcTGT と小分子リガンドとの複合体の構造解析

さらに，ArcTGT による，配列非特異的かつ位置特の結果も併せた上で，「塩基交換反応の触媒機構」，

異的な tRNA の 15 位の認識は，tRNA のバックボーン「tRNA 修飾酵素による tRNA の認識機構」について総の糖と燐酸を 1 残基ずつ厳密に認識することで達成さ合的に議論した．またさらに，本研究で解明された

れていることを突き止めた．ArcTGT の PUA ドメイ

tRNA 認識機構が，他の系における酵素による RNA

ンを含む C 末端ドメインは tRNA のアクセプター･ス

認識の構造生物学的な基盤となる可能性等に関してもテムの燐酸バックボーンを正確に認識し，飛び出した

議論した．

D アームの付け根の部分 U8 位を酵素に対して正確に□位置づけていた．さらに ArcTGT は，U8 位から A14

9

超好熱性古細菌 Pyrococcus
horikoshii 由来 ArcTGT のX 線結晶構造解析

第2章

本章では，超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来 ArcTGT の精製と結晶化，X 線結晶構造解析について述べる．さらに，ArcTGT とリガンドであるグアニン，preQ0，グアノシン，
デオキシグアノシン類似体，それぞれとの複合体の構造解析についても述べた．

Pyrococcus horikoshii は，最髙生育温度が 104℃、至適生育温度が 98℃と髙く、生育には酸素の代わりに硫黄を必要とする嫌気性の古細菌である．その為本細菌由来の酵素は非常に耐熱性が髙く，機能･構造解析に有利であると考えられる．1998 年に，独立行政法人・
製品評価技術基盤機構により全ゲノム解析が完了している．

2.1 材料と方法
2.1.1 ArcTGT の構造解析
2.1.1.1

組み換え蛋白質の大量調製

P. horikoshii 由来 ArcTGT の native 組み換え体は，当
初，東

大・生命理

・岡田研究室から精製サンプル

ArcTGT を含む粗抽出液を疎水性クロマトグラフィーにより精製した．緩衝液 B（表 2-1，12 ページ）で平衡化した Butyl TOYOPEARL（東洋曹達業）を加え，更に溶液の硫酸アンモニウム濃度が 1.0 M になるように
3.0 M 硫酸アンモニウム溶液を加えた．この ArcTGTを頂いて結晶化していたが，最終的には発現系を頂き， が吸着した Butyl TOYOPEARL 樹脂をカラムに充塡し，独自に培養・精製を行った．以下にその方法を述べる． 緩衝液 B から緩衝液 C（表 2-1）への直線濃度勾配でP. horikoshii 由 来 ArcTGT の 発 現 系 は，ArcTGT 遺 伝

目的蛋白質を溶出した．以上の疎水性クロマトグラ

子（1749 bp, 582 aa）を pET3a ベ ク タ ー（Novagen）に

フィーで分離したサンプルを透析法により緩衝液 D

NdeI，BamHI サイトでつないだものである（Watanabe（表 2-1）に緩衝液交換した上で，陽イオン交換カラム

et al., 2000）．この発現プラスミドを大腸菌株

Uno S（BIO-RAD）により精製した．溶出は緩衝液 D*

BL21(DE3)TIR（大腸菌株 BL21(DE3) に Arg と Ile のマ

から E（表 2-1）への直線濃度勾配により行った．こイナーコドン AGR と AUA に対応した tRNA 遺伝子の時点で得られた ArcTGT 準精製サンプルを 50% グを導入したもの）に導入し，終濃度 50 μg/ml のアンピ

リセロールを含む緩衝液 A*（表 2-1）に溶解し，–20°C

シリンを含む LB 培地で 37°C にて培養し，波長 600

にて保存した．

nm における濁度が 0.1 になった時点で培養温度を 20°結晶化の際には，上記の ArcTGT 準精製サンプルをC に下げ，さらに 24 時間培養した．遠心（4,000 g，15

疎水性カラム PhenylSuperose（Amersham Biosciences）に分）により集菌した後，培養に使用した培地の 3% 体より精製した．サンプルに 800 mM になるように硫積の緩衝液 A（表 2-1，12 ページ）に懸濁し，超音波で酸アンモニウムを添加してカラムにチャージし，緩菌体を破砕した．遠心（12,000 g，50 分）により不溶性

衝液 F から G（表 2-1）への直線濃度勾配により溶出画分を除いた後，上清を 40 分間 80°C に加熱して大腸した．ArcTGT を含む画分を限外濾過装置 Centriprep

菌由来の蛋白質を熱変性させ，さらに遠心（12,000 g，

YM-30（Millipore）で濃縮し，緩衝液 A**（表 2-1）への50 分）により変性蛋白質を除去した．次に，得られた

緩衝液交換を行った．緩衝液交換は，ゲル濾過カラム
11

第 2 章 ̶ 超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来 ArcTGT の X 線結晶構造解析
表 2-1

ArcTGT の精製に使用した緩衝液の一覧
還元剤

その他

A

50 mM Tris HCl
pH 7.5

緩衝剤

500 mM NaCl
200 mM MgCl2

10 mM DTT

1 mM PMSF

A*

20 mM Tris HCl
pH 7.5400 mM NaCl
5 mM MgCl2

10 mM 2-ME

A**

10 mM Tris HCl
pH 7.5400 mM NaCl
5 mM MgCl2

10 mM 2-ME

50 mM Tris HCl
pH 7.5300 mM NaCl
5 mM MgCl2
1 M (NH4) 2SO4

1 mM DTT

0.1 mM PMSF

50 mM Tris HCl
pH 7.55 mM MgCl2

1 mM DTT

0.1 mM PMSF

100 mM 燐酸ナトリウム 200 mM NaCl
pH 6.55 mM MgCl2

1 mM DTT

0.1 mM PMSF

D

100 mM 燐酸ナトリウム 50 mM NaCl
pH 6.55 mM MgCl2

10 mM 2-MED*

100 mM 燐酸ナトリウム 2 M NaCl
pH 6.55 mM MgCl2

10 mM 2-ME

E

20 mM Tris HCl
pH 7.5300 mM NaCl
5 mM MgCl2
0.8 M (NH4) 2SO4

10 mM 2-ME

F

20 mM Tris HCl
pH 7.5300 mM NaCl
5 mM MgCl2

10 mM 2-ME

G

B

C

塩類

Superdex200（Amersham Biosciences）により行った．最を満たした細胞培養用 24 穴プレート（Corning）上に，

終精製サンプルの蛋白質濃度は波長 280 nm における真空グリースを用いてはり付け封止した．スクリーニ

吸光度により決定した．

ングには CrystalScreen, CrystalScreen II, Natrix（Hampton
Research）を用いた．

2.1.1.2

動的光散乱の測定

さらに，沈殿剤の濃度勾配，緩衝液の pH，結晶化

最終精製サンプルが結晶化に適するかどうか調べ

温度などを変化させて結晶化条件の改良を試みた．まる為に動的光散乱の測定を行った．測定には DynaPro

た，添加剤のスクリーニングによる結晶化条件の改MS（Protein Solutions）を用いた．サンプル濃度は 2 g/l

良も試みた．添加剤としては，AdditiveScreen I，II，III，になるよう調製し，測定前に 0.1 μm Anodisc13 グラ

CrystalScreen，CrystalScreen II（Hampton Research）を 用

スフィルター（Whatman）により濾過した．得られたいた．

データはプログラム DYNAMICS（Protein Solutions）を用いて解析した．

2.1.1.4

セレノメチオニン標識蛋白質の大量調製と結晶化

2.1.1.3

結晶化

ArcTGT 発 現 用 ベ ク タ ー を B834(DE3)CodonPlus 株

上記の緩衝液 A**（表 2-1）に溶解した最終精製サン（メチオニン要求性株 B834(DE3) に Ile，Arg，Leu のマ

プルを限外濾過装置 Centriprep YM-10（Millipore）で濃イナーコドンに対応する tRNA 遺伝子を導入したも縮した後，0.1μm Ultrafree-MC ﬁlter（Millipore）により不の）に導入し，50 μg/ml アンピシリン，25 μg/ml セレノ

溶物を除き，紫外吸光度から濃度を 11 g/l にあわせ，メチオニンを含む LeMaster 培地を用い 37°C にて培養

結晶化用サンプルとした．結晶化条件のスクリーニ

し，波長 600 nm における濁度が 0.6 になった時点でングは 20°C でハンギングドロップ蒸気拡散法により1 mM IPTG により発現を誘導しさらに 8 時間培養し行った．具体的には，結晶化用サンプル 1 μl とスクた．精製方法等は 2.1.1.1 節（11 ページ）に準じたが，リーニング用沈殿剤 1 μl をシリコン化したスライド

セレノメチオニン置換体の酵素が酸化され易いことをグラス上で混合し，500 μl のスクリーニング用沈殿剤

考慮し，常に還元剤として 10 mM DTT を添加した．

12

2.1 材料と方法

た．実験室系における回折実験は B 型結晶と同様のModel building

方法で行った．放射光施設での X 線回折像の測定は，SPring-8 BL44XU にて波長 0.9 Å の X 線を用いて行っ

Rigid-body refinement

た．回折 X 線の検出には PX210 CCD（Oxford）を使用した．一方，セレノメチオニン置換体結晶の XAFS 測Energy minimization

定と回折実験は SPring-8 BL41XU にて行った．回折 X
Restrained, individual B-factor refinement

線の検出には marCCD165（Mar Research）を使用した．
回 折 デ ー タ は， 波 長 0.97392 Å（High-energy remote），
0.98203 Å（Low-energy remote），0.97916 Å（Peak），

Simulated annealing refinement (3000 K)

0.97931 Å（Edge）それぞれ 4 波長の X 線に対して収集した．

Restrained, individual B-factor refinement

manual revision(WA, WB optimization)

2.1.1.7

回折データの処理

HKL2000 package（Otwinowski & Minor, 1997）に 含

Energy minimization/
B-factor refinement

まれる Denzo により指数付けとデンシトメトリーを

図 2-1 本研究で使用した結晶構造精密化手順
灰色で示した部分は，構造計算の最終段階に行った手順を示している．

クションを行って各指数に対する回折強度を求めた．

行い，同 Scalepack によりスケーリング，データリダ
さ ら に CCP4 program suite（CCP4, 1994）に 含 ま れ る
scalepack2mtz により ASCII 形式の回折強度データを精製したサンプルの質量分析を理化学研究所・生体分

mtz 形式に変換し，同 truncate により構造因子への変子解析室に依頼した．結晶化条件の最適化は主に沈殿換を行った．その他 mtz 形式の構造因子データの操作剤の濃度勾配変化により行った．

には cad や mtzutils 等（CCP4, 1994）を用いた．

2.1.1.5

2.1.1.8

X 線回折像の測定 (B 型結晶 )重原子同型置換体の探索

B 型結晶（図 2-4，17 ページ，パネル E）の回折像測

C 型結晶に対し，重原子同型置換（MIR）法による定は全て低温（100 K）で行った．結晶をハーベスト溶

位相決定の為の重原子誘導体結晶の調製を試みた．ス

液でハーベストした後，マウスピペットにより徐々に

クリーニングには Hg, Pt, Au, Pd, Ir, Tl の化合物を用い髙濃度の抗凍結剤（グリセロール）を含む溶液に移した．重原子誘導体結晶は，重原子化合物を含むハーベた．最終的に結晶をクライオループで掬い，100 K のスト溶液中で，結晶に重原子化合物を浸潤させること

窒素クライオストリームで瞬時に冷却した．実験室で行った．ある時間浸潤後，2.1.1.6 節（13 ページ）の系における X 線回折像の測定は，回転対陽極型 X 線

方法と同様の方法で，透析により抗凍結剤を含む溶液発生装置 UltraX18（理学電機）とイメージングプレーに置換してから回折像を測定した．

ト X 線検出装置 RaxisIV（理学電機）を用いて行った．
また，シンクロトロン放射光を用いた回折実験は，

2.1.1.9

分子置換法による位相決定の試み

SPring-8 BL45PX にて波長 1.070 Å の X 線を用いて行っC 型 結 晶 で 測 定 し た 回 折 デ ー タ に 対 し， 分 子 置

た．回折 X 線の検出には同様に RaxisIV を使用した．

換法による位相決定を試みた．ArcTGT の N 末端は
QueTGT の全長と配列類似性が髙い．モデルとしては，

2.1.1.6

X 線回折像の測定 (C 型結晶 )C 型結晶（図 2-4，パネル G）の測定は，B 型結晶のZ. mobilis QueTGT の結晶構造を用いた．分子置換には CCP4 の AMoRe（Navaza, 1994）を使用した．

測定と同様の方法で行った．ただし，こちらの結晶は
ハーベストや抗凍結剤に対して安定であったので，モ2.1.1.10 MAD 法による位相決定

ザイク性の低下を期待して溶媒の抗凍結剤への置換は

まず，2.1.1.6 節（13 ページ）の方法により測定した，透析法により行った．透析には Spectra/Por Membrane

セレノメチオニン置換体 C 型結晶（図 2-4，パネル

M.W.C.O. 50 kDa（Spectrum Laboratories）のものを用いH）のピーク波長（0.97916 Å）のデータに対して，異常13

第 2 章 ̶ 超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来 ArcTGT の X 線結晶構造解析

分散パターソン解析による異常散乱原子の位置決定を試みた．プログラムとしては CCP4 の rsps（Knight,O2000）を用いた．一方で，直接法のプログラムである
N

SnB（Weeks & Miller, 1999）を用いた異常散乱原子の位

NH

置決定も試みた．この場合，規格化構造因子の計算には drear（Blessing & Smith, 1999）を用いた．さらに SnB

N

HO
H2
C

の計算では，使用する反射の数，triplet invariant の数，
試行毎の SnB サイクル数はそれぞれ，求める重原子
サイト数の 30 倍，300 倍，2 倍とした．各 SnB サイク

H

H

OH

H

H

ル に お け る 位 相 の 精 密 化 は parameter-shift method で

N

NH2

H

行った．また，初期位相としては，重原子サイトをランダムに配置したモデルを使用した．全体で 1000 回

図 2-2

本研究で使用したデオキシグアノシン類似体の構造式試行を行った上で，最も Rmin 値の小さい結果を解とした．

2.1.1.12 ArcTGT モデルの精密化

次に，MAD 法による位相計算・精密化は，CCP4 の

原 子 モ デ ル の 精 密 化 に は Crystallography & NMR

mlphare あるいは sharp（de La Fortelle & Bricogne, 1997）

System（CNS; Brunger et al., 1998）を使用した．精密化を使用し，3.2 Å 分解能の反射までに対して行った．位に お け る cross validation に は， 全 反 射 の 10% を 使 用

相 の 改 良 に は，CCP4 の dm と solomon（Abrahams &した．具体的には，図 2-1（13 ページ）のように，剛Leslie, 1996) を使用した．具体的には，まず晶系と格体精密化，エネルギー極小化，焼き鈍し法，procheck

子長，ArcTGT の分子量から推定される結晶の溶媒含（Laskowski et al., 1993）を用いたモデルの検証，O を用

量を用いて，dm あるいは solomon による溶媒平滑化といたモデルの修正を交互に行った．エネルギー極小化，

ヒストグラムマッチング（dm のみ）を行った．次に，

捻れ角 MD で使用する力場としては，Engh&Huber の得られた電子密度に Z. mobilis QueTGT のモデルを重パラメータ（Engh & Huber, 1991）から引力を無視したね合わせたところ，ArcTGT が非対称単位中に 2 分子もの使用した．初期の精密化サイクルにおいては，非存在することが確認された為，重ね合わせたモデルか–1–1
対称単位中の蛋白質主鎖に対して 300 kcal mol Å のら NCS 行列を計算し，dm による電子密度平均化，溶NCS restraint をかけた．R 因子がある程度下がったと媒平滑化，ヒストグラムマッチングによる位相改良をころで，native 結晶のデータに対して CCP4 の AMoRe

行った．NCS 行列の計算には CCP4 の lsqkab を，平を用いて分子置換を行った．これはセレノメチオニン

均化マスクの生成には同 ncsmask を使用した．Dm の置換体結晶と native 結晶が非同型であった為である．

計算は 6 Å からサイクルごとに分解能を上げる方法をさらに，native 結晶の反射に対して同様に CNS と O をとり，サイクルは 200 回行った．次に QueTGT には用いてモデルの精密化を行った．この時点で，水分子存在しない C 末端ドメインの大体の主鎖トレースをのモデルも構築した．水分子のモデル構築は CNS に行い，C 末端ドメインに対する NCS 行列を計算した．

より自動的に行った（water_pick.inp を使用）
．水分子トレースには O（Jones et al., 1991）を使用した．さらに， の自動判別には，|Fo|–|Fc| 電子密度マップ中のピークの同様にして dm による電子密度平均化を含めた位相改髙さ（3σ 以上），蛋白質原子との距離（2.2–3.5 Å）だけ

良と，3.2 Å から 2.8 Å への位相拡張を行った．

でなく，水素結合の可・不可も判別の基準にした．

2.1.1.11 ArcTGT 原子モデルの構築

2.1.2 ArcTGT とリガンド（グアニン等）との複合体の構造解析

原子モデルの構築には O（Jones et al., 1991）を使用した．N 末端側のドメインは，主鎖のトポロジーが Z.
mobilis QueTGT とほぼ同じであった為これを参考にし

2.1.2.1

複合体結晶の調製

リガンドのうち，preQ0（図 1-6，4 ページ）は東大・つつ行った．C 末端ドメインは類似の構造が知られて生命理いない為ゼロからモデルの構築を行った．

シン類似体（図 2-2，14 ページ）は，東京医科歯科大・
生体材料

14

・岡田研究室から頂いた．デオキシグアノ学研究所の杉山 弘 先生から頂いた．これ

2.1 材料と方法

はデオキシグアノシンの O4′ 原子がメチレン基（CH2）

1.0 Å の X 線を用い，marCCD165 を使用して測定した．

に置き換わったものである．リガンドとの複合体の収集したデータの処理は，2.1.1.7 節（13 ページ）に準結晶の調製は，すべて結晶に基質を浸潤させることでずる方法で行った．

行った．結晶をハーベストし，透析により抗凍結剤入り沈殿剤溶液に置換したのち，基質溶液を加えて 24

2.1.2.3

分子置換法による位相決定とモデルの精密化

時間以上静置して浸潤させた．各基質の浸潤条件に各複合体の位相決定は，CCP4 の AMoRe を用いて，おける終濃度は，それぞれグアニン 3.0 mM，preQ0 2.5分子置換法により行った．分子置換のモデルとして

mM，グアノシン 15 mM，デオキシグアノシン類似体

は，2.1.1.12 節（14 ペ ー ジ ）で 決 定 し た ArcTGT 単 独

1.7 mM である．

の結晶構造を使用した．さらに，各モデルの精密化
は CNS で行った．方法は 2.1.1.12 節に準ずる．CNS

2.1.2.2

回折像の測定と回折データ処理で使用するグアニン，グアノシンのパラメータはグ

回 折 像 の 測 定 は 全 て 低 温 条 件（100 K），2.1.1.5 節

アニル酸のものから借用した．PreQ0 のパラメータは（13 ページ）に準ずる方法で行った．グアニンとの複xplo2d により分子座標から生成したものを使用した．

合 体，preQ0 と の 複 合 体 は，SPring-8 BL45PX に て， 波

デオキシグアノシン類似体の電子密度にはデオキシグ

長 1.020 Å の X 線を用い，RaxisV（理学電機）を使用しアノシンをモデルとして置いて精密化を行った．

て測定した．グアノシンとの複合体，デオキシグアノ
シン類似体との複合体は，SPring-8 BL41XU にて波長

15

kDa

M

at
he

so

ni

ca

tre

tio

n

at
m

en

t

第 2 章 ̶ 超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来 ArcTGT の X 線結晶構造解析

M

M

M

M

66
45
36
29
24

Butyl TOYOPEARL

図 2-3

UnoS

PhenylSuperose

Superdex200

大腸菌で大量発現させた ArcTGT の精製

2.2 結果と考察
熱処理上清を低イオン濃度の緩衝液に対して透析す

2.2.1 ArcTGT の構造解析
2.2.1.1

ると ArcTGT がかなり沈殿する為，イオン強度を下げ

組み換え蛋白質の大量調製る必要のない疎水性カラムを先に行うことにした．ま当 初，P. horikoshii ArcTGT の 大 腸 菌 に お け る 発 現た，はじめの陰イオン交換カラムでは，大腸菌由来の量はかなり少なかった．古細菌と真正細菌のコドン

夾雑物が ArcTGT と殆ど同時に溶出する為，精製効果

使用頻度の違いが原因であると考え，Arg, Ile に対応が低いと考えて行わなかった．

するマイナーコドンに対応する tRNA を共発現する

次に，疎水性カラムではかなり夾雑物が除かれた．

BL21(DE3)TIR での発現を試した．その結果，ArcTGT

ただ，元の手順では硫安の初期濃度を 1.6 M にしていの発現量が飛躍的に増加したが，菌破砕後に ArcTGTた為 ArcTGT が一部沈殿していたようだった．その為，が殆ど不溶化して沈殿し，最終的な収量はそれほど

ArcTGT が十分に結合する限界の 1.0 M に変更した．

増加しなかった．不溶化の原因としては，好熱性古

しかし，それでも熱処理上清に硫安を加えてカラムに細菌由来の ArcTGT 自体が大腸菌内で正しく折り畳み

チャージすると，途中で徐々に凝集しカラムが詰まっにくいことが考えられた為，発現誘導をかけるタイてしまった．熱処理上清に硫安を加えると同時に平衡

ミングや IPTG の濃度，培養温度の調整，発現誘導後化した樹脂も加え，よく混ぜた上でカラムに充填する

エタノールを加える（シャペロンの発現の誘導），なことで凝集を起こさせずに樹脂に吸着させることがでどを試みたがいずれの場合も改善が見られなかった．

きた．

ArcTGT は，誘導をかけない場合でも発現がかなり漏

次に，陽イオン交換カラムでは殆どの夾雑物が除か洩することがわかっていた．その為，グルコースをれた．ただし，前段階の溶出画分をイオン交換樹脂

加えて漏洩を抑えることを試みたが，殆ど効果があに吸着させる為に低イオン濃度にすると，ArcTGT がらわれなかった．ところが一方，発現誘導をかけず沈殿してしまうことが分かった．これを防ぐ為に樹脂に発現させたほうが，可溶化量が増加することが判に吸着できる最髙の塩濃度を緩衝液の pH を振って検明した．また，培養温度をある程度菌が増えたところ

討したところ，pH 6.5 の条件（緩衝液 D*，表 2-1，12（OD600=0.1）で 20°C 程度にすると，さらに可溶化量がページ）で沈殿せずにカラムにチャージできることが増加した．また，菌破砕時の緩衝液にマグネシウムイ

分かった．

オンを多く加えると可溶化量が少々増加した．
精 製 方 法 に 関 し て は， 東

この段階で十分に純度の髙いサンプルが得られたの大・ 岡 田 研 で あ る 程で，ハイドロキシアパタイトカラムは使用せずに結晶

度 確 立 し て い た が（Watanabe et al., 2000），途中での化に用いた（図 2-3，16 ページ）．ただし，グリセロー

ArcTGT の沈殿が多く収量が悪かった為，さらなる改

ルストックにした後時間がたつと結晶が出にくくなっ善を試みた．初めの精製法は，熱処理，陰イオン交換

たので，さらに疎水性カラムとゲル濾過カラムを使用

カラム，疎水性カラム，陽イオン交換カラム，ハイド

して精製した．

ロキシアパタイトカラムの順であった．
16

2.2 結果と考察

A

B

C

~100 μm~100 μm

D~100 μm

E~100 μm

F~100 μm

G

H~100 μm~100 μm~100 μm

図 2-4 リガンド･フリー ArcTGT の結晶の写真(A) A 型結晶，(B) A′ 型結晶，(C) A″ 型結晶，(D) B 型結晶，(E) 最適化後の B 型結晶，(F) C 型結晶，(G) 最適化後の C 型結晶，(H) セ
レノメチオニン化 ArcTGT の C 型結晶．写真中に線で大まかな寸法を示した．

当初は培養液 8 l から 1 mg 程度しか ArcTGT が得られなかったが，この方法で，最終的に 50 mg 程度得ることができた（図 2-3，16 ページ）．

2.2.1.3

結晶化と回折像の測定

温度 20°C における結晶化スクリーニングの結果，
燐酸ナトリウム・カリウムを沈殿剤とした条件において，板状結晶（A 型，図 2-4，17 ページ，パネル A）を

2.2.1.2

動的光散乱の測定得ることができた．この他に硫酸アンモニウムや燐サンプルが結晶化に適する状態であるかどうか調

酸二水素アンモニウムを沈殿剤とした条件でも良く似べる為，光散乱を測定したところ Cp/Rh=23.7% と単分た結晶が得られた．また，硫酸リチウムを沈殿剤とし散であることが分かった．また，分子量が約 124 kDa

た条件では，非常に細い針状結晶が得られた（図 2-4・

（Rh=4.67 nm）と見積もられたことから，溶液中で 2 量

表 2-1，12 ページ）．

体化していることが示唆された．一方，髙温（60°C）

板状結晶のほうが有望そうであったので，燐酸ナト

で測定したところ，分子量の見積もりもが約 131 kDa

リウム・カリウムの条件で得られた A 型結晶の改善（Rh=4.77 nm）となり同様に二量体化していることが示を試みた．添加物スクリーニングの結果，ベンズアミ

唆された．

ジン塩酸塩を 2% 加えることで板状の厚みが増すこと
17

第 2 章 ̶ 超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来 ArcTGT の X 線結晶構造解析

表 2-2

リガンド･フリー ArcTGT の結晶化条件
緩衝剤

沈殿剤

0.1 M Na HEPES (pH7.5)

0.8 M KH2PO4
0.8 M NaH2PO4A′ 型

0.1 M Na Acetate (pH4.6)

2.0 M (NH4)2SO4A″ 型

50 mM Na Cacodylate (pH 6.5)

1.3 M Li2SO4

0.1 M Na HEPES (pH7.5)

0.8 M KH2PO4
0.8 M NaH2PO4

0.1 M Na HEPES (pH7.5)

0.8 M KH2PO4
0.8 M NaH2PO4

A型

B型
C型

塩

添加剤

10 mM Mg Acetate
2% ベンズアミジン塩酸塩
0.84 M Na Acetate

2% ベンズアミジン塩酸塩

図 2-5 B 型結晶の回折像
SPring-8 BL45PX にて，波長 1.070 Å，カメラ
距離 420 mm，振動角 3.0° で測定．X 線検出装置として RaxisIV（理学電機）を使用．右上は枠内を拡大したもの．

~2.0Å
図 2-6 C 型結晶の回折像
SPring-8 BL44XU にて，波長 0.900 Å，カメラ距離 215 mm，振動角 1.0° で測定．X 線検出装置として PX210 CCD (Oxford) を使用．
点線は 2.0 Å 分解能を示す．左上は枠内を拡大したもの．

が判明した（B 型結晶 ; 図 2-4，パネル D）．さらに結相分離を起こし使用できなかった．12.5% グリセロー

晶化条件の改善を試みたところ，酢酸ナトリウムやイルを加えた条件で凍結しないことが分かったが，このソプロパノールを加えると，かなり厚みのある板状結

条件では結晶が急激に溶けてしまった．さらに塩濃度晶になることが分かった（図 2-4，パネル E）．

を上げて結晶を溶けないようにする必要があったが，B 型結晶の回折像を実験室系の装置で測定したとこ

KH2PO4 の溶解度が低い上に，グリセロールの影響でろ，室温では殆ど回折しないことがわかった．抗凍結塩の溶解度が下がる為不可能であった．（エチレング剤としては，MPD や PEG400 等は髙イオン強度によりリコールでも同様の結果であった．）

18

2.2 結果と考察

B 型結晶

C 型結晶 (native)

1.070

0.900

Wavelength (Å)

Wavelength (Å)

Resolution (Å)

50–3.8

3.94–3.8

50–2.2

2.24–2.2

Total reﬂections

65,812

̶

530,165

̶Unique reﬂections

29,493

̶

88,967

̶

Redundancy

2.2

̶

6.0

̶

Completeness (%)

74.9

65.8

95.3

93.0

I/σ (I )

5.8

1.9

34.0

7.1

Rsym (%)

17.3

40.0

9.2

25.6

C 型結晶 (SeM, High)

C 型結晶 (SeM, Low)

C 型結晶 (SeM, Peak)

C 型結晶 (SeM, Edge)

0.97392

0.98203

0.979160.97931

Resolution (Å)

50–3.2

Total reﬂections

383,965

̶

381,037̶

383,410̶

385,326

̶

Unique reﬂections

31,670̶

31,757

̶

31,708

̶

31,624

̶

Redundancy

12.1

̶

12.0

̶

12.2

̶

12.1

̶

Completeness (%)

99.8

99.9

99.8

99.8

99.8

99.9

99.8

99.9

I > 3σ (I ) (%)

91.3

74.5

88.2

67.0

90.7

73.2

92.1

76.1

Rsym (%)

8.7

19.5

8.9

23.5

8.4

20.2

9.2

18.7

表 2-3

3.26–3.2

50–3.2

3.26–3.2

50–3.2

3.26–3.2

50–3.2

3.26–3.2

B, C 型結晶の回折像統計値

NaH2PO4 の溶解度が髙いことに着目し，カリウム⁄ を置換したところで結晶が板状から針状に変化す

塩を全てナトリウム塩に置き換え，さらに全塩濃度

ることがわかった（C 型；図 2-4，17 ページ，パネルを 3.2 M に上げたところ，12.5% グリセロール存在下F・表 2-2，18 ページ）．さらに結晶化を 4°C で行うこでも結晶がかなり安定に存在することが判明した．ことで針状から最大 100 μm×100 μm×500 μm 程度の柱状こで，酸性の二水素塩を多量に加えている為 pH が下結晶が得られた（図 2-4，パネル G）．

がっている可能性があったが，実際測定したところ，C 型結晶に関して抗凍結剤の検討を行ったところ，

3.5 とかなり低くなっていた．塩基性で溶解度の髙い

15% グリセロールの存在下で結晶が安定に存在しかK2HPO4 を加えて結晶化条件と同じ pH 4.5 に合わせた

つ凍結しないことが分かった．この条件下で結晶はところ，殆ど溶けなくなることが判明した．

かなり安定で，数日置いても結晶に変化は見られな以上の条件で，B 型結晶は，実験室系の測定におかった．実験室系で測定を行ったところ，最髙で 3 Å

いて 4 Å 程度まで回折することが分かった．さらに程度まで回折することが分かった．さらに SPring-8

SPring-8 BL45PX で測定を行ったところ，3 Å 以上の回

BL44XU での測定では，最髙で 2.0 Å 程度まで回折す

折像が得られた．しかしながら，結晶軸のある一方向ることが分かった．しかしながら，X 線による損傷がに対し非常にモザイク性が髙く（図 2-5，18 ページ），

大きく，5 秒露光 1.0° 振りの測定条件下では，30° 程度

指数付けが困難であった．データ処理の結果，晶系はで分解能が 3 Å まで落ちてしまうことがわかった．照

単斜晶系，空間群 C 2 に属し，格子定数は a =139.8 Å,

射する X 線を弱くすることも考えられたが，他のビー

b =227.7 Å, c =133.2 Å, β =117.8° であることが分かった．

ムラインでの測定で照射 X 線が弱いと到達分解能がモザイク性が髙く正確に回折強度の積分が行えない

3 Å 以下まで下がることがわかっていた為，行わな

為か，多くの反射がスケーリングの段階で棄却され，かった．結晶が長いことを利用し，X 線があたる部分

completeness が非常に悪くなった（表 2-3，19 ページ）．

をずらしつつ測定することで，2.2 Å の分解能を保ち以上の事から B 型結晶は構造解析には不適と判断

かつ 100° 分のデータを収集することができた．

し，さらに結晶化条件の改善を試みた．沈殿剤である燐酸塩を徐々に酢酸ナトリウムに置換したところ，
19

第 2 章 ̶ 超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来 ArcTGT の X 線結晶構造解析

66464

100

67327

100

Relative Abundance

67212
90

90

80

80

70

70

66764

67737

66591
69519
60

60

66669

67850
66838
65098
50

65972

66252

65849
65937

50

66943
67017

66030
66189

69258

67114

40

67188 40

30

30

Native2.2.1.4

68716
69385

図 2-7

セレノメチオニン化した酵素と native 酵
素の質量分析
開始コドンに由来するメチオニンが失われているとして計算した native 酵素の分子量は 66463.9 Da，セレノメチオニン化酵素の分子量は 67214.2 Da であり，それぞれ図中のピーク 66464 と，67212 に対応していると考えられる．セレノメチオニン化酵素
での最も大きいピーク 67327 が何に由来するものか
は不明．

SeMet

データセットの測定と処理 (C 型結晶 )為，ハーベスト溶液中の燐酸イオンを他の沈殿剤に置C 型 結 晶 は 空 間 群 P41212 あ る い は P43212 に 属 し，換することを試みた．PEG 等では結晶が溶けてしま

格子定数 a=b=99.28 Å，c=363.74 Å であった．結晶のモうが，硫酸塩ではほぼ元の条件と同程度に安定である

ザイク性も全体にわたり 0.7–0.8° 程度と，良いとはいことが判明した．この条件で K2PtCl4 を浸潤させたとえないまでも構造解析に問題ない程度であることがころ，長時間では褐色に着色した．ただ，沈殿剤置換

分かった．回折像と回折データの統計値を図 2-6（18の為か，結晶に損傷がおこり回折点が流れたようになページ），表 2-3（19 ページ）に示す．

ることがあった．さらに条件を詰めて測定することで，一方，結晶の 4 回螺旋軸は結晶の外形の長い方向と良い重原子置換体が得られた可能性があるが，この時一致している為，普通にマウントすると螺旋軸がスピ

点で MAD 法による位相決定に成功した為，重原子置

ンドル方向に向く為，容易に completeness の髙いデー

換体の探索を中止した．

タが収集できたようである．また，同様の理由で長い軸が振動方向と垂直になる為，モザイク性が髙めにも2.2.1.6

分子置換法による位相決定の試み

関わらず回折像が重なることが殆どなかった．データ

AMoRe を用いた分子置換の結果，使用する反射のは 1° 振りで測定したが，2° 振りでも問題なく測定でき分解能上限を変える等して，P41212，P43212 ともに試したと考えられる．

たが，解は得られなかった．

C 型結晶は非対称単位あたり 2 分子の ArcTGT を含
3

P. horikoshii ArcTGT の N 末 端 領 域 と，Z. mobilis

むと考えると溶媒含量 64%（VM=3.4 Å /Da）となり妥

QueTGT 全長の配列の類似性は，356 残基中 26% 同一当である．これは光散乱の ArcTGT が 2 量体化していであり，ほぼ折り畳みは同一であると類推される．しるという結果と符合する．

かしながら，ArcTGT は C 末端に 226 残基もの独自の領域を持っており，これが原因で，分子置換法では解

2.2.1.5重原子同型置換体の探索が得られなかったものと考えられる．

2.1.1.8 節（13 ページ）で示したさまざまな重原子化合物に対してスクリーニングを行ったが，非同型にな

2.2.1.7

セレノメチオニン標識蛋白質の大量調製るものと，重原子が浸潤しないものしか得られなかっ発現に関しては，native 蛋白質と異なり，37°C で培

た．ハーベスト溶液に髙濃度の燐酸イオンを含む為，養し誘導をかけても非常によく可溶化した．原因は不ランタノイド・アクチノイドの重原子化合物は試すこ明である．（ちなみに，この結果に基づいて native 蛋とができなかった．

白質も LeMaster 培地で培養したが，特に可溶化量はさらには，髙濃度の燐酸イオンが重原子の蛋白質への特異的な結合を阻害している可能性も考えられた20増えなかった．
）

2.2 結果と考察

A

B
Peak

Anomalous scattering factors

RemoteH

Measured fluorescence

2.0

1.0

0

RemoteL–5

RemoteLE (Peak) = 12.662 keV
f " max = 4.12 e

RemoteH

E (Edge) = 12.659 keV
f ' min = –9.31 e
Edge
12.55

12.6

12.65

12.7

12.75

12.8

12.85

12600

12650

X-ray energy (keV)

12700

12750

12800

X-ray energy (eV)

図 2-8 X 線蛍光スペクトルの測定(A) セレノメチオニン化した結晶の X 線蛍光スペクトルと，(B) それから計算した Se 原子構造因子の異常散乱項 f ′と f ″ の値．

精製は native 蛋白質と同様に行ったが（2.1.1.1 節，
11 ページ参照），疎水性カラムでは native 蛋白質よりむ．その為，非対称単位あたり 16 個あるいは 32 個の異常散乱原子を含むと予想された．

よく吸着する傾向にあった．他のカラムでの挙動はまず，peak 波長のデータセットに対し，異常分散パ

native のものと同様であった．精製後，セレノメチオ

ターソン函数を計算し rsps による解釈を試みたが，異ニンへの置換率を確認する為，質量分析を理研・生体

常散乱原子が多すぎるせいか，解釈できる解は得られ

分子解析室に依頼したところ，ほぼ完全に置換されてなかった．その為，直接法プログラム SnB による異いることが確認された（図 2-7，20 ページ）．

常散乱原子の位置決定を試みた．まず，結晶の空間群を P41212 であると仮定し，非対称単位あたり ArcTGT

セレノメチオニン標識蛋白質の結晶化

1 分子と 2 分子の場合を仮定して，それぞれについNative 蛋白質と同じ条件で結晶化したところ，小さて乱数の seed を変えて数回計算を行った．その結果，な結晶がたくさん出て native と同程度の大きさまで成どの解においても，ピークの上位 12 個程度は（対称長しなかった．その為，セレノメチオニン化結晶用に性により許される併進を考慮したうえで）同じ解が出

さらなる条件の最適化を行った．その結果，沈殿剤濃ることが確認できた．また，各 SnB 試行毎の Rmin 値

度を低くすることで 100 μm×100 μm×500 μm 程度の測に関するヒストグラムでは，ピークが二つ現れる形の定に適した大きさの結晶を得ることができた（図 2-4，分布になり，正しい解が得られていることが示唆され

17 ページ，パネル H）．

た．（正しい解が得られている場合，2 峰型分布になり，

2.2.1.8

Rmin の大きい方の集合は誤った解で小さい方の集合が2.2.1.9

セレノメチオニン標識結晶の回折像測定とデータ処理

正しい解である．）
上記で得られた解を用いて，mlphare による重原子C 型 セ レ ノ メ チ オ ニ ン 標 識 結 晶 は，native と 同 様

サイトの精密化と位相計算を行った．重原子サイト数に 空 間 群 P 41212 あ る い は P 43212 に 属 し， 格 子 定 数を徐々に増やしながら計算を行い，計算の結果占有率

a=b=100.15 Å，c=363.64 Å であった．XAFS 測定の結果

が 0 あるいはそれ以下になるものは誤ったサイトと考を図 2-8（21 ページ）に，回折データの統計値を表 2-3

えて除去した．最終的には，分解能 3.5 Å までの反射（19 ページ）に示す．

と，14 個の重原子サイトを用いて位相計算を行った．
さらに dm を用いた溶媒平滑化による位相の改善を試

2.2.1.10 MAD 法による位相決定

みた．この時点では非対称単位あたりの分子数がはっ

P. horikoshii ArcTGT は開始コドンに由来するメチオ

きりしていなかったので，1 分子と 2 分子の場合を考ニンを除けば，1 分子あたり 16 のメチオニン残基を含

えて溶媒含量を振って計算を行った．しかしながら，解釈できる電子密度は得られなかった．同じ重原子サ21

第 2 章 ̶ 超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来 ArcTGT の X 線結晶構造解析
表 2-4 結晶中の異常散乱原子の位置2
位相計算に使用した 22 個の Se サイトの sharp による精密化後の分率座標，占有率，温度因子（Å ）．「実体」はセレ
ン原子がどのセレノメチオニン残基に属していたかを示している．
番号

精密化後の分率座標

1(0.5677, 0.1624, 0.9264)

占有率
0.7187

温度因子44.6802

B566

実体

2

(0.7776, 0.6846, 0.9217)

0.857646.8701B263

3(0.7314, 0.7980, 0.9124)

0.576949.7624B55

4(0.9027, 0.9035, 0.9451)

0.782145.3095

A55

5(0.0313, 0.8648, 0.9687)

0.924551.2306A37

6(0.8686, 0.5756, 0.8848)

0.693138.9236B243

7(0.8856, 0.9506, 0.9010)

0.837343.0158

A295

8(0.0833, 0.6942, 0.9550)

0.585139.2081A243

9(0.6093, 0.7532, 0.9081)

0.597264.0533B45

10(0.6196, 0.0119, 0.8885)

0.437837.6326B218

11(0.1482, 0.6437, 0.9736)

0.676258.5663

A218

12(0.7136, 0.7958, 0.9563)

0.644752.4317B295

13(0.7164, 0.6839, 0.8820)

0.916351.3496B37

14(0.6205, 0.0031, 0.9836)

0.635636.5410A566

15(0.9915, 0.8373, 0.9282)

0.923346.1532

A263

16(0.8190, 0.1922, 0.9966)

0.536341.4118A187

17(0.9851, ̶, 0.9529)

0.603550.4731A45

18(0.8384, 0.6148, 0.9032)

0.0027

197.9318̶19(0.9322, 0.6454, 0.9160)

0.0900169.7108̶20(0.6941, 0.0973, 0.8882)

0.0017̶̶

21(0.2665, 0.4353, 0.9041)

0.052045.1575̶

22(0.8099, 0.7749, 0.9345)

0.22357.2700亜鉛

表 2-5 Sharp による位相計算の統計値
位相計算を行った分解能範囲（50.0–3.2 Å）における統計値を示した．Iso は isomorphous，Ano は anomalous，Cen は
centric，Acen は acentric の略．
Peak
Iso

Edge
Ano

Iso

High-energy remote
Ano

Iso

Ano

Low-energy remote
Iso

Ano

Phasing power (Cen)

1.604

̶

̶

̶

1.653

̶

1.520

̶

Phasing power (Acen)

2.400

3.064

̶

2.482

2.500

2.445

2.235

0.8165Rcullis (Cen)

0.6552̶̶̶

0.5896

̶

0.6706̶Rcullis (Acen)

0.63800.6016

̶

0.73130.55460.72940.6451

0.9825イトに対して sharp と solomon を用いて位相計算・溶22 ページ）のサイトまで含めて計算を行うことができ媒平滑化を行ったが，同様に解釈できる電子密度は得た．3.2 Å までの分解能で計算した統計値を（表 2-5，

られなかった．

22 ページ）に示す．図 2-9，23 ページに，φo を用いて空間群が誤っている可能性を考え，P43212 と仮定しpeak 波長のデータに対して計算した異常分散フーリて SnB による異常散乱原子の位置決定から計算をやエマップと，最終的に得られた ArcTGT モデルにおり直したところ，前回よりもピークの髙い解が得られけるセレン原子の位置を示す．また，位相改良前のた（ただし，解の座標は前回と鏡像になっている点を|Fo|，φo を用いて計算したフーリエマップを，図 2-10

除いて同じものが得られた）．また，mlphare での重原

（23 ページ）パネル A に示す．さらに dm を使用して子サイトの精密化でも，前回よりも多い 22 個（表 2-4， 溶媒平滑化を行ったところ，溶媒領域と蛋白質領域が22

2.2 結果と考察

Zn

図 2-9 異常分散差フーリエマップ
ピーク波長（0.97916 Å; 緑，4σ レベルで表示），低エネ
ルギー側リモート波長（0.98203 Å; 青，4σ レベルで表示）における異常分散差フーリエマップ．各波長におけるDo( = |Fo+| – |Fo–|) と，MAD 法による位相計算の結果得られた φo を用いて計算．低エネルギー側リモート波長ではセレン原子構造因子の異常分散項の虚数成分 f ″ は亜鉛に比べて小さい為，亜鉛原子のピークの方が強くなる．

AB

図 2-10 ArcTGT の実験的位相マップ
全てステレオ図．(A) MAD 法により決定した位相とピーク波長における構造因子 Fo を用いて計算したフーリエマップ（1.1σ レベルで表示）．(B) さらに
溶媒平滑化，電子密度平均化により位相改善を行った結果得られた電子密度マップ（1.1σ レベルで表示）．両者とも，
酵素をチューブモデルで，セレノメチ
オニン残基をボールスティックモデル
で示した．

23

第 2 章 ̶ 超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来 ArcTGT の X 線結晶構造解析

表 2-6

リガンド･フリー ArcTGT と各リガンドとの複合体の構造精密化統計値

Resolution (Å)

NativeGuanine

preQ0

Guanosine

dG-analog

50–2.250–2.350–2.550–2.850–2.8

Number ofReﬂections

91,13882,09363,19346,31647,060Protein atoms

9,304

9,304

9,304

9,304

9,304

Ligand atoms

0

11

13

22

38

Ions

4

4

4

4

4

295

184

142

76

96

Bond length (Å)

0.00634

0.00669

0.00730

0.00687

0.00714

Bond angles (Å)

1.28

1.33

1.37

1.32

1.37

Impropers (°)

0.857

0.872

0.916

0.87

0.90

Most favored (%)

90.7

90.7

87.1

86.1

87.7

Additionally allowed (%)

9.0

8.5

12.3

13.0

11.8

Generously allowed (%)

0.3

0.7

0.6

0.8

0.5

Rwork (%)

22.7

22.9

23.1

19.1

19.2

Rfree (%)

26.1

27.1

27.8

24.7

24.7

σA coordinate error (Å)

0.27

0.47

0.67

0.5

0.36

Water atoms
R.m.s.d.

Ramachandran plotA (Subunit A)

B (Subunit B)

180

180

135

135 b

90

90

B

~b
b
~b
~l

l
ASN 475 (A)

l

45

45

L

ψ (˚)

ψ (˚)

a
0

~a

-45

-45
-90

A

0

-90

ARG 470 (A)ARG 470 (B)-135 ~b

-135

~p
b

p
~b

-180

-135

-90

-45

0

45

90

135

180

-180

-135

-90

φ (˚)

Glycine residues

0

45

90

135

φ (˚)

Other residues

Glycine residues

Other residues

Most favoured regions
91.0%
Additional allowed regions 8.6%
Generously allowed regions 0.4%
Disallowed regions
0.0%

Most favoured regions
90.4%
Additional allowed regions 9.4%
Generously allowed regions 0.2%
Disallowed regions
0.0%

100.0%

100.0%

図 2-11 リガンド･フリー ArcTGT のラマチャンドランプロット(A) サブユニット A の，(B) サブユニット B のラマチャンドランプロット．

24

-45

180

2.2 結果と考察

ZYO

図 2-12 C 型結晶のパッキングの様子
単位方を枠で，X，Y，Z 軸を矢印で示した．また，単位胞中の 8 つの結晶学的対称単位内の 2 分子をそれぞれ異なる色で示した．

X

A

Catalytic domain

100

C1

C2

C3 (PUA)

α5

B-factor (Å²)

80

β18β19hairpin

60
40
20
0

0

100

200

300

400

500

600

Residue number

B

Catalytic domain

100

C1

C3 (PUA)
β18β19hairpin

α580

B-factor (Å²)

C2

60
40
20
0

0

100

200

300

400

500

600

Residue number

図 2-13 リガンド・フリー ArcTGT の主鎖の温度因子分布
パネル A はサブユニット A の，B はサブユニット B のグラフを，また，グラフの上に対応する構造を模式図で示した．Disorder しているヘリックス α5 の部分が相対的に髙い温度因子を示している．しかし，温度因子の精密化において，WB（温度因子の restraint に関する項の重み因子）を精密化しなかった為，周囲の低い温度因子に影響されて絶対的にはそれほど髙い値にはなっていない．また，
クリスタルコンタクトの違いにより，サブユニット B，特に C 末端ドメインの温度因子が髙くなっている．

明確に分かれた電子密度が得られ，α ヘリックスを見もっており良い電子密度が得られると考え，最終的に出すことができた．次に，同じサイトに対して sharp

は sharp による結果を用いた．）2 つの QueTGT のモデと solomon を用いて位相計算・溶媒平滑化を行い，得ルから NCS 行列とマスクを計算し，dm を用いて電子られた電子密度に対して Z. mobilis QueTGT のモデル

密度平均化による位相改善を行った．さらに，その結を重ね合わせたところ，非対称単位あたり 2 分子存在果得られた電子密度を用いて，C 末端ドメインの大ますることが確認できた．（mlphare よりも sharp の方がかな主鎖のトレースを行った．この C 末端ドメイン

非同型性による誤差や最尤推定法の尤度を正確に見積のポリアラニンモデルを用いて NCS 行列とマスクを25

第 2 章 ̶ 超好熱性古細菌 Pyrococcus horikoshii 由来 ArcTGT の X 線結晶構造解析

表 2-7

各リガンドとの複合体の回折像統計値
Guanine

preQ0

GuanosinedG analog

1.020

1.020

0.900

1.000

Wavelength (Å)
Resolution (Å)

50–2.3

2.34–2.3

50-2.5

2.54–2.5

50–2.850–2.850–2.82.9–2.8

Total reﬂections

567,949̶

282,730

̶

466,918

̶

588,077

̶

Unique reﬂections

82,107

̶63,242

̶

46,419̶

47,239̶

Redundancy

6.9

̶

4.4

̶

10.0

̶

12.4

̶

Completeness (%)

98.4

96.7

96.0

92.3

99.2

97.0

98.7

89.4

I/σ (I )

19.6

3.78

8.69

2.14

20.4

2.56

33.3

4.58

Rsym (%)

10.7

38.2

8.4

20.2

11.1

29.7

6.1

19.9

計算し，ArcTGT 全体に対して電子密度平均化を行っ悪くなっているが，結晶自体の大きさが原因と考えらた．同時に，2.8 Å までの反射に対して位相拡張を行っれる．一方グアノシン，デオキシグアノシン類似体のたところ，十分にトレース可能な電子密度が得られた結晶は分解能が他のものに比べてかなり悪くなってい（図 2-10，23 ページ，パネル B）．

るが，これはビームタイム等の都合上，検出装置面積が狭い CCD で測定せざるをえなかった為である．

2.2.1.10 原子モデルの構築と精密化
主 鏁， 側 鏁 の ト レ ー ス の 結 果，N 末 端 の 6 残 基

2.2.2.2

複合体のモデル構築と精密化と 97–106 番 残 基 以 外 は モ デ ル を お く こ と が で きまず，preQ0 との複合体のモデル精密化を基質をモ

た． モ デ ル の 精 密 化 は， 最 終 的 に native 結 晶 のデルに含めずに行った．2|Fo|–|Fc| 電子密度図を見た

2.2 Å 分解能までの反射を用いて行った．その結果，ところ，(α/β)8 バレル構造の中心部分に preQ0 と思し

Rwork=22.7%，Rfree=26.1% まで精密化することができた．

き電子密度を見出すことができた（図 3-9，34 ページ，

モデル精密化に関する統計値を表 2-6（24 ページ）に，

パネル C）．さらに，disorder していた 97–106 番残基

Ramachandran プロットを図 2-11（24 ページ）に示す．

も電子密度中に見出され，α ヘリックスを形成してまた，結晶中の各分子のパッキングの様子を図 2-12いた（図 3-9，パネル C）．最終的に preQ0 のモデルを（25 ページ）に，温度因子の分布を図 2-13（25 ペー

含めて精密化を行ったところ，Rwork=23.1%，Rfree=27.8%ジ）に示した．決定した ArcTGT の座標は Protein Dataとなった．他の基質との複合体においても，同様に，

Bank に登録した（PDB ID: 1IQ8）．

preQ0 と同じ位置に基質の電子密度が見出された（図2.2.2 ArcTGT とリガンドとの複合体の構造解析

体のモデル精密化に関する統計値をまとめて表 2-6（24複合体結晶の回折像測定とデータ処理ページ）に示す．決定した ArcTGT・グアニン複合体，リガンドを浸潤させた結晶は，いずれもリガンド・

ArcTGT・preQ0 複合体の座標は Protein Data Bank に登

2.2.2.1

フリーの結晶とほぼ同じ格子定数であった．各複合体の回折データの統計値を表 2-7（26 ページ）に示す．
どの結晶もリガンド・フリーの結晶に比べて分解能が

26

3-9，パネル B・図 3-12，37 ページ）．各基質との複合録した（PDB ID: 1IT7, 1IT8）．
□

第3章

ArcTGT 単独 , リガンドとの複合体の結晶構造

本章では，
P. horikoshii ArcTGT 単独の結晶構造に基づいて，二量体化の様式や，未知であった C 末端ドメインの構造と機能について述べる．さらに，リガンドとの複合体の結晶構造に基づいて，リガンド認識の機構や，塩基交換反応の機構について述べる．

3.2.1.2

3.1 材料と方法

亜鉛結合サイト

ArcTGT は触媒ドメインに亜鉛イオンを結合していた（図 3-2）．この金属イオンが亜鉛イオンであるこ

結晶構造の解析（構造の比較・図の作成等）には，Oとは，波長 0.98203 Å で測定した回折データを用いて（Jones et al., 1991），DINO（Philippsen, 2002），自作の結計算した異常分散フーリエマップにより確認できる

晶構造可視化ソフト Que（Ishitani, 2002）を使用した． （図 2-9，23 ページ）
．この亜鉛結合サイトは QueTGT
分子間の接触面積は CCP4 の areaimol を使用して算出に も 共 通 し て 存 在 し て お り， そ の モ チ ー フ 配列 はした．蛋白質の一次構造の比較には，blastp（Altschul et

CXCX2CXnH であるが，このような亜鉛結合モチーフ

al., 1990）と CLUSTAL_X（Thompson et al., 1997）を 使

は現在のところ TGT ファミリー以外には見出されて用した．

いない．QueTGT においてこの亜鉛イオンと触媒作用の関連が詳細に研究されているが（Garcia et al., 1996）

3.2 結果と考察

その結果によると，亜鉛イオンは直接塩基交換反応に関与しているわけではなく，酵素の構造形成に重要で3.2.1 ArcTGT の結晶構造
3.2.1.1

全体構造

ArcTGT の 全 体 構 造 を 図 3-1（28 ペ ー ジ ）に 示 す．

あることが示唆されていた．ArcTGT においても，亜鉛結合サイトが触媒サイトから離れていることから，
この亜鉛結合サイトは，QueTGT の場合と同様に酵素の構造形成に重要であると考えられる．

ArcTGT は，N 末端側の触媒ドメインと C 末端側の C
末端ドメインからなっている．触媒ドメインは独特の3.2.1.3

ArcTGT の二量体化

モチーフを含む亜鉛結合サイトを有している．一方，

ArcTGT は，結晶の非対称単位あたり 2 分子含まれC 末端ドメインは他の生物種の ArcTGT との配列比較ており，お互いの分子は上記の亜鉛結合サイトと C1や立体構造から，3 つのドメイン（C1, C2, C3）に分けドメインを介して密に接している（図 3-1）．二量体化ることが出来る．ArcTGT の二次構造とドメイン構成の結果生じる分子間の接触面積は約 2,200 Å 平方であを図 3-2（29 ページ）に模式的に示した．

る．二量体化に関わっている蛋白残基間の相互作用と2

その距離を表 3-1（28 ページ）に示した．溶液中での光散乱の結果（17 ページ）なども考慮すると，この相27

第 3 章 ̶ ArcTGT 単独 , リガンドとの複合体の結晶構造
表 3-1 二量体化に関わっている原子の組とその距離
リガンド・フリー ArcTGT 結晶構造中において，非対称単位に存在する 2 つの ArcTGT 分子において，お互いの相互作用に関わっているとみなされる原子の組とその距離（3 Å 以下）を示した．

A
Catalytic domain

Mg2+

Domain C3

A サブユニット側

DomainC2

Glu32
Glu266

Zn2+

Lys269Asp275

DomainC2

B

Catalytic domain

Arg330

Arg 335
Arg 337
Lys 341
Ile371
Glu 421

DomainC1

DomainC1

N

Ala422
Glu 423

3.2.1.4

ε2

O

ζ

N

O

ε1

ε

N

ε1

O

η1

N

η1

N

ζ

N

O
O

ε2

O
O

B サブユニット側
Tyr 276
Glu 334
Glu 325
Gln 321

ηOγ

Glu334

Domain C3

N

Ser280Gln321

Catalytic domain

ζO

Lys317

Domain C3O

ε2

Tyr276Glu314

Mg2+

O

ε1

O
O

ε1
ε2
e1

O

ε1

距離 ( Å )
2.66
2.43
2.78
2.83

Glu 32O

2.75

Glu 314

Oε2

2.94

γ

Ser 280

O

2.62

Phe277O

2.87

Asp 275

N

2.81

Arg 337O

Glu 266

ε2

O

ε1

2.72
2.59

Glu 334

O

2.99

Ile 371

O

2.84

Ala 422

O

2.64

Arg 337
His339Lys 341ε1O

ηLys 347

η1

N
N
N
N

ε2
ζ
ζ

2.83
2.89
2.62
2.85

触媒ドメインの構造

ArcTGT の N 末端側に位置する触媒ドメインの構造
は，QueTGT 全 長 の 構 造 と よ く 似 て お り，(α/β)8 バ レ
ル構造を主体とした構造からなっている（図 3-3，29

Catalytic domain
Domain C3
図 3-1 リガンド･フリー ArcTGT の結晶構造
一つのサブユニットを茶色・緑色で，もう一つサブユニッ
トを紫色，ピンク色で示した．(A) は分子の Zn 結合サイト側
から，(B) はその逆側から見た図．

ページ）．亜鉛結合サイトはこの (α/β)8 バレルの 8 番
目の β シートと α ヘリックスの間に挿入されている．
また，TGT の (α/β)8 バレルは，バレルの底にあたる部分に，蓋をするように β シートが存在している点が特徴的である（図 3-3）．(α/β)8 バレルを持つ多くの酵互作用はクリスタルコンタクトによるものではなく，素（糖鎖分解に関わるグリコシラーゼ等）にはこのよ

生体内でも二量体を形成していると考えられる．

うな蓋は存在しない．

一 方 で，QueTGT も 多 量 体 化 が 示 唆 さ れ て い る（Garcia et al., 1993）が，Z. mobilis QueTGT の 結 晶 構 造

3.2.1.5

QueTGT の構造との比較

では非対称単位あたり 1 分子しか見出されなかった

ArcTGT の触媒ドメインと QueTGT は二次構造のト（Romier et al., 1996a）．Romier らは結晶学的な対称分子ポロジーはほぼ同じであるが，分子表面に位置するとの相互作用を指して二量体化の可能性を議論していアミノ酸側鎖に大きな違いが見られる．その結果，図る．この Romier らが提唱している二量体化の様式も3-4（30 ページ）のように，表面電荷の分布は全く異亜鉛結合サイトを介しているが，ArcTGT の二量体化なったものになっている．QueTGT は亜鉛結合サイト

は C1 ドメインも介しており，これとは全く異なったの付近に比較的大きな正電荷のパッチを有しており，ものになっている（図 3-1）．

さ ら に， こ の 部 分 に QueTGT 間 の み で 保 存 さ れ た

28

3.2.1

Open end of
the barrel

A

ArcTGT の結晶構造

B
Catalytic domain

α9

ytic
in

Zincbinding site

β9

β10

α11

β8

α7

β12

β13

NH2

β1

β3

β11

β2

α12

Zi
bindi

α8

α10

β7
α6

α14
α13
β6
α15

β4

β5

α5

α16

nd of
rrel

α4

α17

α2

α1

α3

Domain C1
α18

β14

β15
β16

β17

COOH

α22
α20

β23

β27

β26

β25

β22

β24

α21

β21

β20

β19

β18

3

α19

Domain C2
Domain C2

α23

Domain C3 (PUA domain)

図 3-2 ArcTGT のドメイン構成(A) ArcTGT のドメイン構成と (B) 二次構造模式図．(A)，(B) ともに，触媒ドメインは黄色で，ドメイン C1 は明るい緑色で，ドメイン C2 は水色で，ドメイン C3 は青色で示した．

A

helix α9B
α55

QueTGTspecific β-sheet
B-factor
2

20
70
100 (Å )図 3-3 触媒ドメインの比較
リガンド・フリー ArcTGT の触媒ドメイン (A) と，同じくリガンド・フリー QueTGT (B) の構造の比較．触媒サイトに蓋をするヘリックス α5 については，リボンモデルだけでなく側鎖もスティックモデルで示し，温度因子に対応させて色を表示した．ArcTGTと QueTGT で構造が異なっている部分を矢印で示した．

Arg 残基が存在し，tRNA アンチコドン・ループの燐酸に特有の C 末端ドメイン上に大きな正電荷のパッチ

バックボーンを結合する部分ではないかと推測されてが存在している．

い る（Romier et al., 1997）． 一 方 で，ArcTGT の 亜 鉛 結

ArcTGT の触媒ドメインと QueTGT の構造は，上記合サイトは正電荷を帯びてはいるものの，その範囲はの表面電荷の違い以外にも幾つかの相違点が見られ

QueTGT に比してかなり縮小しており，逆に，ArcTGTる．まず，QueTGT はヘリックス α5 と α6 の間に逆平29

第 3 章 ̶ ArcTGT 単独 , リガンドとの複合体の結晶構造

A

B

Subunit B

K579

K576
Positivelycharged patches

578
Zinc-binding site

Positivelycharged patch

Zinc-binding site

Catalytic domain

Catalytic site
Catalytic site
Subunit A

図 3-4 ArcTGT と QueTGT の分子表面 , 表面電荷の比較(A) ArcTGT，(B) QueTGT をそれぞれ表面モデルで示した．電荷は，–10 kT/e から 10 kT/e の範囲を赤から青色で示した．また，比較しやすいように ArcTGT の触媒ドメインを線で囲んだ．

行 β シートを有しており，髙次構造上ではバレル構造

1998），rRNA や snRNA のシュードウリジン化を行うの側面に貼り付くような形で存在している（図 3-3，29

RNA 修飾酵素である．この遺伝子のヒトの相同分子

ページ；図 3-5，31 ページ）
．この β シートが QueTGT

種である dyskerin は，先天性角化異常症と呼ばれるヒでどのような役割を果たしているかは不明である．

トの遺伝病の原因遺伝子であることが分かっている

QueTGT にのみ存在することから tRNA 認識に関わっ（Heiss et al., 1998）．Cbf5p, dyskerin の PUA ドメインとているとも考えられるが，Romier らが提唱している

ArcTGT の PUA ドメインは幾つかの保存された塩基

QueTGT と tRNA のドッキングモデルではこの部分性残基を有しており（Lys576，Arg578，Lys579），これらは tRNA と接触していない（Romier et al., 1996a）．次にの残基は ArcTGT の C 末端ドメイン上に大きな塩基

ArcTGT のヘリックス α9 は QueTGT には存在しない性パッチを構成している（図 3-4，30 ページ）．一方で，（図 3-5）．3.2.2.3 節（37 ページ）で述べるように，こ構造上の類似性をみると，ArcTGT の PUA ドメインの α ヘリックスが，ArcTGT と QueTGT の基質認識のは真正細菌の tRNA シュードウリジン合成酵素 TruB

違いに関連しているようである．さらに，ArcTGT は（Hoang & Ferré-D’Amaré, 2001）の C 末端ドメインとあ触媒ドメインの末尾に付加的にヘリックス α16 と α17る程度の類似性を持っており，二次構造のトポロジーを有しているが（図 3-5），これは ArcTGT の触媒ドメが似ている．しかし一方で，PUA ドメインにはループ

インと C 末端ドメインをつなげる役割を果たしていやへリックス α23 の挿入があるなど，異なる点も多い

ると考えられる．

（図 3-7，33 ページ）．TruB と RNA 複合体の結晶構造から，この TruB の C 末端ドメインは tRNA のアクセ

3.2.1.6ドメイン C3 の構造

ArcTGT の C 末端ドメインのうち，C1 と C2 は既知の他の蛋白質と配列上，構造上ともに相同性がある

プター・ステムの燐酸バックボーンを認識することが分かっている．ArcTGT の核酸認識に関する議論は5.3.3 節（55 ページ）で行った．

ものは存在しないが，C3 は真核生物，古細菌の RNA

さらに，ドメイン C3 には金属イオンらしき電子

修 飾 酵 素 に 広 く 存 在 す る「PUA ド メ イ ン 」（Aravind

密度が見られた（図 3-1，28 ページ）．Ala528，Val531，& Koonin, 1999）と相同性がある（図 3-6，32 ページ）．

Met566，Ile567 の主鎖のカルボニル基，水分子がこのPUA ドメインは，ArcTGT 以外にはシュードウリジン

電子密度ピークに対して正八面体状に配位しており，合成酵素などに見出されており（PUA は Pseudouridine

配位数などからマグネシウムイオンの可能性が髙いとsynthase/Archaeosine TGT の 略 ），RNA 認 識・ 結 合 に 関思われる．分子モデルではマグネシウムイオンを置い連したドメインであることが推測されている．そのて精密化を行った．

中でも，酵母 Cbf5p は snoRNP 複合体のコンポーネン
トのひとつであり（Lafontaine et al., 1998; Watkins et al.,30

3.2.1

A

10
PyrHo
PyrAb
PyrFu
MetJa
MetTh
TheAc
TheVo
FerAc
ZymMo
RicPr
EscCo
ShiFl
SalEn
HaeIn
VibCh
BacSu

20

30

40

50

60

ArcTGT の結晶構造

7080

MSRGDKMLK
FEIKARDGAGRIGKLEVNG
KKIETPAIMPVVNPKQMVVEPKELEKMGFEIIITNSYIIYKDEELRRKALELGIHRM
MSRGDKMLKFEVKARDGAGRIGKLEVNG
KKIETPAIMPVVNPKQLIVEPKELEKMGFDIIITNSYIIYKDRELREKALEVGIHKLMSRGDSMLRFEIKDRDAAGRIGKLEVNG
KKIETPAIMPVVNPKQLIVEPKELKRMGFDIIITNSYIIYKDKKLREKALEKGIHRLMT
FEIKHRDAMGRIGILNINGKKIETPTIMPVIHPNPKKQIVSMDLINKL ADVIIT TYITYKTKHLREIAEEKGIHKLISRGNTLLMTLWEDFMFEIKSKDGLGRTGILKTEHGTVRTPALMPVIHP
GKQTIDVKGPGAEIVITNAYIIYRNPELRERALSDGVHRLMKIEERDGLARIAKFETPHGPIETPTVLPVINPNIMNITPQEMKPLGLQGIITNSYIILRTPELRERALREGLHSLMEIRERDGLARIARFDTPH
GTIETPTVLPVINPNIMDITPEEMKKYGVHGVITNSYIILRNDRLREEAEKYGVHSLMQMFFREGLARIGKFSTPH
GDIETPTVMPVINPNLNFLTKEELKSIGVQAVITNSYIIKRTASLEQDALKHGVHRLMVEATAQETDRPRFSFSIAAREGKARTGTIEMKRGVIRTPAFMPVGTAA TVKALKPETVRATGADIILGNTYHLMLRPGAERIAKLGGLHSFMSKFSFTIHSHYKKARSGVITTAHGEIRTPAFMPVGTRG AVKAMLTEAVVETGADILLGNTYHLMLQPSAERIAYLGGLHKFMKFELDTTDGRARRGRLVFDRGVVETPCFMPVGTYG TVKGMTPEEVEATGAQIILGNTFHLWLRPGQEIMKLHGDLHDFMKFELDTTDGRARRGRLVFDRGVVETPCFMPVGTYG TVKGMTPEEVEATGAQIILGNTFHLWLRPGQEIMKLHGDLHDFMKFELDTTDGRARRGRLVFDRGVVETPAFMPVGTYG TVKGMTPEEVEATGAQIILGNTFHLWLRPGQEIMKLHGDLHDFMKYELDKTSGNARRGRLVFERPQGTFSVETPAFMPVGTYG TVKGMTPEEVRATGAEILLGNTFHLWLRPGQEVMRKHGDLHDF
MKLKFELKKKNGNARRGQLIFERGTVQTPAFMPVGTYG TVKGMTPEEVKETGAQILLGNTFHLWLRPGQEVMKMHGDLHDF
MAEQPIRYEFIKECKQTGARLGKVHTPH
GSFETPVFMPVGTLA TVKTMSPEELKAMDAGIILSNTYHLWLRPGQDIVKEAGGLHKF

β1

β2

β3

β4

α1

β5

130

140

α2

α3

α4

D95
90
PyrHo
PyrAb
PyrFu
MetJa
MetTh
TheAc
TheVo
FerAc
ZymMo
RicPr
EscCo
ShiFl
SalEn
HaeIn
VibCh
BacSu

100

110

120

150

160

LDYNGIIEVDSGSFQLMKYGSIEVSNREIIEFQHRIGVDIGTFLDIPTPPDAPREQAVKELEITLSRAREAEEIKE
LGYDGIIEVDSGSFQLMRYGNVD
VSNREIVEFQHRIGVDIGTFLDIPTPPDAPKEKAMEDLKITLERAREAEEIKELDYDGIIEVDSGSFQLMRYGKVEVTNREIVEFQHKIGVDIGTFLDIPTPPDAPREKAEQDLKITLERAKEAESIKQIGFDKVIVTDSGSFQLGVYGDVEVEPLEIIEFQERIGVDVGTILDIPTPPDVDRERAEKELEETLKRAKASIELKEERG
IDFDGPIMTDSGSFQLSEYGDIE
VENPEIIRFQDEIGTDIGTSLDIPTPPGVSHRRAIEEVEVTLERARESIEYRER
IGYDGPIMTDSGTFQSYVYGSIEFNNREVVDFQRRIGSDISTILDVFTTPGTPKPEAEKAVIETYNRMLEVNDEEG
IGYDGPVMTDSGTFQSYVYGSVEFNNRQVVEFQKTIGSDILTILDIFTTPSSSRQEVENAITETYRRMLEVNDAGG
INFDGPIMTDSGTFQSYVYGDIEYGNKEIVQFQKDIGSDIITILDIFTKPQDSYEQAKAAVYETSRRLQEVNTPDSMGWDRPILTDSGGYQVMSLSSLTKQSEEGVTFKSHLDGSRHMLSPERSIEIQHLLGSDIVMAFDECTPYPATPSRAASSMERSMRWAKRSRDAFDSRKMNWDKPILTDSGGFQVMSLSKLCKITEEGVSFRSHINGNKYMLTPEYSTEIQYLLGSTITMALDECTPYPSTFEKAKTSMHLTTRWANRSRDAFVKRMQWKGPILTDSGGFQVFSLGDIRKITEQGVHFRNPINGDPIFLDPEKSMEIQYDLGSDIVMIFDECTPYPADWDYAKRSMEMSLRWAKRSRERFDSLG
MQWKGPILTDSGGFQVFSLGDIRKITEQGVHFRNPINGDPIFLDPEKSMEIQYDLGSDIVMIFDECTPYPADWDYAKRSMEMSLRWAKRSRERFDSLG
MQWKGPILTDSGGFQVFSLGDIRKITEQGVHFRNPINGDPIFLDPEKSMEIQYDLGSDIVMIFDECTPYPADWDYAKRSMEMSLRWAKRSRDRFDSLG
MQWHRPILTDSGGFQVFSLGKLRKITEEGVKFQNPINGERIFLSPEKSMEIQYDLGSDIVMIFDECTPYPATFDYAKKSMEMSLRWAKRSRDRFDELG
MNWQGPILTDSGGFQVFSLGDIRKITEEGVHFRNPVNGDKIFMDAEKSMEIQKDLGSDIVMIFDECTPYPATHDEAKKSMEMSLRWAKRSRDHFDKLEMNWDRAILTDSGGFQVFSLSKFRNIEEEGVHFRNHLNGDKLFLSPEKAMEIQNALGSDIMMAFDECPPYPAEYDYMKRSVERTSRWAERCLNAHNRQ

β6

α5

α6

QueTGT-specific β sheet

β7

α7

D249
170
PyrHo
PyrAb
PyrFu
MetJa
MetTh
TheAc
TheVo
FerAc
ZymMo
RicPr
EscCo
ShiFl
SalEn
HaeIn
VibCh
BacSu

180

190

200

210

220

230

240

250

IPMNATIQGSTYTDLRRYAARRLSSMNFEIHPIGGVVPLLESYRFRDVVDIVISSKMALRPDRPVHLFGAGHPIVFALAVAMGVDLFDSASYA
IAMNAAIQGSTYTDLRRYAARRLSSMNFEIHPIGGVVPLLEAYRFREVVDIVISSKMALRPDRPVHLFGAGHPMVFALAVAMGVDLFDSASYA
IPMNATVQGSTYLDLRKLAARKLSEMNFEIHPIGAVVPLLESYRFKDVVDIVIASKMGLRPDRPVHLFGAGHPMVFALAVAMGVDLFDSASYAFKLLLNGTVQGSTYLDLRQKSAKEMAKLGFDIYPIGAVVPLMEQYRYRDVAEIIINSKMYLPTNKPVHLFGCGHPMFFALAVALGCDLFDSAAYAMMLNAVVQGSTHPDLRRYCASRLAELPVELHPIGAVVPLMESYRYRELVDAVLSSVSELPPSRPRHLMGAGHPMLFALAVSMGCDLFDSAAYIIIAGPVQGGVYPDLRQKSAELMNSTNAGYHPIGGVVPLLETYDYSTLVDIIINSKINLSFNKPVHLFGGGHPMFFAFSVYLGVDLFDSASYIMIAGPIQGGIYPDLRKRSAELMNSTNASYLPIGGVVPLLESYEYDKLVDIILNSKLNVSFGKPIHLFGGGHPMFFAFAVYLGVDLFDSASYVIIAGPIQGSIYPDLRRESARLMSEASYLPIGGVVPLLESYRYSDLVNIIINSKLNSDFSKPVHLFGGGHPMFFAFSVLLGVDIFDSASYIEQAENAALFGIQQGSVFENLRQQSADALAEIGFDGYAVGGLAVGEGQDEMFRVLDFSVPMLPDDKPHYLMGVGKPDDIVGAVERGIDMFDCVLPTEGYAQFGIIQGSVYKELREQSVKDLVKCDFEGYAIGGLAVGEGQELMFRVLDYVPDFLPQNKPRYLMGVGKPSDIIGAVSRGIDMFDCVIPTNKNALFGIIQGSVYEDLRDISVKGLVDIGFDGYAVGGLAVGEPKADMHRILEHVCPQIPADKPRYLMGVGKPEDLVEGVRRGIDMFDCVMPTNKNALFGIIQGSIYEDLRDISVKGLVDIGFDGYAVGGLAVGEPKADMHRILEHVCPQIPADKPRYLMGVGKPEDLVEGVRRGIDMFDCVMPTNKNALFGIIQGSVYEDLRDISVKGLVEIGFDGYAVGGLAVGEPKADMHRILEHVCPQIPADKPRYLMGVGKPEDLVEGVRRGIDMFDCVMPTNKNALFGIIQGGVFEELRKVSLEGLVNIGFDGYAVGGLAVGEPKEDMHRILEYICPQIPADKPRYLMGVGKPEDLVEGVRRGIDMFDCVMPTNPNNLFGIVQGGVYEDLRDVSVKGLTEIGFDGYAVGGLAVGEPKEDMHRVLEHTCPQLPEDKPRYLMGVGKPEDLVEGVRRGIDMFDCVMPTDEQGLFGIVQGGEYEDLRTQSAKDLISLDFPGYAIGGLSVGEPKDVMNRVLEFTTPLLPKDKPRYLMGVGSPDALIDGAIRGVDMFDCVLPT

β8

α8

β9

α9

α10

β10

α11

β11

ArcTGT-specific
α helix
Zn Zn Zn
260
PyrHo
PyrAb
PyrFu
MetJa
MetTh
TheAc
TheVo
FerAc
ZymMo
RicPr
EscCo
ShiFl
SalEn
HaeIn
VibCh
BacSu

270

280

Zn
290

300

310

320

330

LYAKDDRYMTPEGTKRLDELDYFPCSCPVCSKYTPQELREMPKEERTRLLALHNLWVIKEEIKRVKQAIKEGELWRLVDERARSHLYAKDDRYLTPEGTKRLDELEYFPCSCPVCSRYTPQELREMPKEERARLLAIHNLWVIKEEIERIKQAIREGELWRLVDERARSHLYAKDDRYLTPQGTKRLEELEYFSCSCPVCSKYTPQELREMPKEEREKLLALHNLWVIREEINRVKQAIKEGELWRLVDERARAHLYAKDDRYLTERGTLHLEEIKDLKAFPCSCPVCSSYTPKELASLNKKERER
LLAEHNLYVTFEEINRIKQAIRDGSLWELVEERVRCH
LYAEDDRLLSTEGTYKLENLQEMPCSCSVCTDYTPSELMGMDREERRN
LIAEHNLHVSFAEIRKVRQAIHDGNLMELVEERCRAHKYAKDDRLIYPDGTRDLARITELPQWSPLYDRYTVKEIRDLDKERRSLEIARHNLKAIFMEISEIKERIYEEGLAQYVAQKARSHKYAKDDRLIYPDGTRDLARIIEIPEWSPLFDKYTVKELKELPKEQRSVELSRHNLKAIFMEISEIRERIYEESMDQYLAQKAKSHKYAKDNRVLYTEGTRNLKEIRDFPEWSPLFNKYSPVELIKADEKTRLKLLSLHNLKAIFNEITEIKERIYENTLYQYVEEKSMAH
RSGRNGQAFTWDGPINIRNARFSEDLKPLDSECHCAVCQKWSRAYIHHLIRAGEILGAMLMTEHNIAFYQQLMQKIRDSISEGRFSQFAQDFRARYRSGRNGQAFTKYGTVNIRNSKYADDKEPLEHDCKCPACTNYTKAYLHHLVRIREILGPMLMTWHNLTYFQNLMSRIRTYIKLGKDFDFVHRNARNGHLFVTDGVVKIRNAKYKSDTGPLDPECDCYTCRNYSRAYLHHLDRCNEILGARLNTIHNLRYYQRLMAGLRKAIEEGKLESFVTDFYQRQRNARNGHLFVTDGVVKIRNAKYKSDTGPLDPECDCYTCRNYSRAYLHHLDRCNEILGARLNTIHNLRYYQRLMAGLRKAIEEGKLESFVTDFYQRQRNARNGHLFVTDGVVKIRNAKHKSDISPLDAECDCYTCRNYSRAYLHHLDRCNEILGARLNTIHNLRYYQRLMAGLRKAIEEGKLESFVTEFYQRQRNARNGHLFVTDGIVKIRNAKYRDDTSPLDPECDCYTCKNYTKAYLYHLDKCGEILGARLNTIHNLRYYQRLMAEIRQAIEDDRFDDFVVEFYARMRNARNGHLFVTGGVIKIRNAAHKTDTTPLDPHCDCYTCKNYSKSYLHHLDRCNEILGARLNTIHNLRYYQRLMESIRKAIDEDRFDQFVAEFYARRRIARNGTVFTAEGRLNMKNAKFERDFRPIDEECDCYTCKNYTRAYIRHLIRCNETFGLRLTTYHNLHFLLHLMEQVRQAIREDRLGDFREEFFERY

α12

β12

β13

α13′

α13

α14

α15

図 3-5 TGT ファミリーの触媒ドメインの配列アラインメント(A) ArcTGT の触媒ドメインと QueTGT の配列アラインメント．ArcTGT に関しては，Pyrococcus horikoshii（PyrHo），Pyrococcus abyssi（PyrAb），Pyrococcus furiosus（PyrFu），Methanocaldococcus jannaschii（MetJa），Methanothermobacter thermautotrophicus（MetTh），Thermoplasma
acidophilum（TheAc），Thermoplasma volcanium（TheVo），Ferroplasma acidarmanus（FerAc）の配列を示した．真正細菌由来 QueTGT に関して は，Zymomonas mobilis（ZymMo），Rickettsia prowazekii（RicPr），Escherichia coli（EscCo），Shigella ﬂexneri（ShiFl），Salmonella enterica（SalEn），
Haemophilus inﬂuenzae（HaeIn），Vibrio cholerae（VibCh），Bacillus subtilis（BasSu）の配列を示した．また，配列の上に P. horikoshii における残基番号を，配列の下に P. horikoshii における二次構造を模式的に示した．（32 ページに続く）

3.2.1.7ドメイン C1，C2 の構造の構造では，挿入がある部分に相当する 430 番付近のドメイン C2 は，4 本の逆平行 β シートとそれを裏

残基は温度因子が非常に髙くなっている（図 2-13，25

打ちする 2 つの α ヘリックスからなっている．β シー

ページ）．この部分は C2，C3 と触媒ドメインを接続す

ト 上 に は 保 存 さ れ た 塩 基 性 残 基（Lys465，Arg470，

るのが主な役割である為か，進化の過程で大きく変化

Arg483）が存在しており，上述のドメイン C3 の保存していると推測される．

された塩基性残基とともに，C 末端ドメイン上に大きな塩基性パッチを形成している（図 3-4，30 ページ）．
一方，ドメイン C1（とくに C 末端側）は ArcTGT

3.2.1.8

他 の 古 細 菌 で は ド メ イ ン C2 ･ C3 を 欠 く
ArcTGT が存在する

間でも保存性が低く，好熱性メタン古細菌類では長いP. horikoshii ArcTGT と他の古細菌由来の ArcTGT の挿入配列が見られる（図 3-6，32 ページ）．P. horikoshii

配列比較を blastp や CLUSTAL_X を用いて行ったとこ31

第 3 章 ̶ ArcTGT 単独 , リガンドとの複合体の結晶構造
340

350

360

370

380

390

ALFKISNESLRWPVVRRAKER
AKS
INE
PyrHo P K L Y S A Y K R L L E H Y T F L E E F E P I T K K S
PyrAb P K L Y S A Y K R L L D H Y T F L E E F E P V T K K S
AVFKISHESLRWPLVRRARER
AER
VNS
PyrFu P K L Y A A Y K R L L E Y Y H Y L E E Y E P I T K K S
AFFKISEESLKWPIARRAKER
AEK
VKA
MetJa P K L L E A Y R V V R K Y I D Y I E K F D P V T K K S
AFFYTGIESMFRPEVLRHKKR
LKRLRYEKVYITTVSSSIEKPYHEHLN
VVET
MetTh P R L L E G Y R R M S E Y L D L I E K F E P R S K R S
AFFYTGPESLGRVEVHRHLKR
VKEHLGERLALVAPSRRPYSSSLPARIGGFSSLRPQSGG
TheAc P S L M K A Y S R I M S Y S N I L E K Y E D L S K K T
AYFFYDSFSTRNPYVSRINRFTESYLSSNKKDTYAFTYRAWNPGYTNSEFVRDVYQK
TheVo P S L L K A Y V K V M Q Y S K M L E K Y Q D L F K K A
AYFFYDSFSTKNTYVARLEKFTSKYLTSKKKETYVFSRKDWLPGYTNLNFVRDVYER
FerAc P A L Y R A Y L E M L D H N
LEPFWNISLKSPLYFFNSSTYKNTFIKRLVKFTEDYISNGKK TVLVSYRQWRHGFPVSDDILRSYETHalSP1 P S T L D G Y R A L L D H S D Q L E A S D P A S K D
AFFYTGAGSARRPEVHRHHQRLDRLDVDGDDVLLTEG
D
SNHR
HalVo P A M L D G Y R A L L A H V D Q L E R E D P A S K G
AFFYASNESAHRPEVARHHARMDRLTAEG HVLLTEGGVP
SGDD
MetAc P K L L D G L K R L Y T H S A W L E Q F D P A T K G
TYFYCGPESSFRPEVLRFEKRLDRFSLEG SAIIRTAPVKGEKDMetMa P K L L D G L K R L Y T H S A W L E Q F D P A T K G
TYFYCGPESASRPEVLRFGKRLERFSIEG SAIIRTSPVKGEKDMetBa P K L L D G L K K L Y T H S S W L E Q L D P A T K G
TFFYCGPESSSRPEILRFGKRLDRFSLQG SVIIRTGSVKGEKDMetKa P R A W A G M V E L A R R G G E L E R W C P A V K R S
VFVCD EVSKGRPELRLYRRRLRDRFGELSGRKVVKGISRPYAEIV
EWLE
ArcFu P N M L A G W R Q V K H Y W E L L E K A D P K M K R
KFLYTGIDSLYRPAVRRHVKAIKNVELPE EVLVSTD
FG
SulSo P A V Y S A F K R L M K Y K D Y L E K F D P R I R G D P K G L F L F D G N S L H R P E I I R H S
RFLERYIQKKDKISIYCYDKAISDTAYDFKEKIREKIADRN
SulTo P A V Y S A F K K I L K Y K D Y L E K Y D P R V K G N I R G I F L F D L K S L N R P E I V R H Y
NFLDRINKNNDKAIIICEKRENILKKVKNNE
AerPe P S T A R V M A R M R R Y I D A L E K G S A R G R G V V R G V R A Y G L E S L S N P R L S R F S S D A A R L V E A M A E K W G G G K A V L K P L D P K
PEPGQCESMVGG
PyrAe P T L Y R F L R S L G R Y K R L I E E Y D P E T H P E T H G L F F Y Q D T A E S R P E P H R H W S
RTANLYTPSKVAIVIRAGEKPYNKSWEYRYLKSLVGD

α16

α17

400

410

β14

420

α18

430

PyrHo R F G E L V E H P I F G R V S R Y L S L T Y P F A Q S E A E D D F K I E K P T
PyrAb K F G D L V E H P I F G K V T K Y L T L T Y P F A Q S E A E D E F S I E K P T
PyrFu K F P E S I P H P I F G E I P K Y L S L T Y P F A Q S E S E E D F Q I E K P T
MetJa D V D I L I K D P V F G F I P Y Y I D T V Y P L S Q H E I P E L F D Y E K E I N K R F V D E F I D W L K K K I G E D N I L D I M T Y N Y Y I N Y F S A N K K
MetTh P W R V V V V D L P F G I I P L E L D Q V Y P L A Q S D A P G I M D L D G E E F L R G L V R D L M D G D A I V D D A L C S E L G I E L P Y K Y M G E V E T
TheAc I D C N A L I S W S G T F V P A E L E N T Y P I E Q T V S S G F E PDPDFSRAKDLIAPFRVDMYKGEKFEGEQV
TheVo T E C N A L I P W S G I M V P A E L E N T Y P I E Q T V S S G L E P
DPDVSAISESISPFDIRVYKGESVDSDKI
FerAc T D Y N F L I E W N D I F I P M E L E N T Y P V S Q M V P S G V L D K I Y R D D Y I A W L K S I N N D I S F Y D P S I T G S E K I
HalSP1 Y D E S W N V L P P F G P Y P S A L A T T Y P L T A E T P
ARMDRAGYEAAAEGVCRLAEAN PDTAFT LAHDDWPESALEAVPQRVSLYN
AVRGE
HalVo F D A T W R V V P P F G P F P R S L S E T Y P L T A E V P
ERLDRDAYEQAARGVSRLVEEN PDAAFT LAHDDWPESALARVPESVELESLSAVSERL
MetAc Y D R V L T F K A P F G S F P A E M E E V Y P F N A E V P
KFPDYETLSTALSNTLKLMELN PGAEFTFICEKEFEHPLIEEIGKKAKLVYR AAWKKE
MetMa Y D R I L T F K A P F G T F P A E M E E V Y P F N A E V P
KFPDYEALSTSLSNTIKLMDLN PGAEFTFICEKEFQHPLIEEIGKKAKLVYR EAWKKEMetBa Y D Q I L T F K A P F G A F P V E M E E V Y P F N A E V P
KFPDYESLNTALSNTLKLIDLN PEAEFTFICEEEFKHPLIEEIRKRAKLVYR KDWKKE
MetKa P W E L A F A D E W L G V V P G E L S W S Y P C H C L V E P
SGDDE GEDRRRGEEGRRR
ArcFu I Y A N I Y L R P V F G P V P A E M L E T Y P A G H A E I P E E D V V E E E A L K A A S E A L M E L M N S H P E K R F K V Y V S K V W M K H L Q N L P P N G E L N V L S
SulSo E S D V F I A V P F F G L I P L E I S D S Y P L S Q F E I P N E I D E D V I D D M K T K I I SFLRRNNYQKVELINCEKLGLHIDSISTSS
SulTo N V D I Y L F N P F Y G L I P I N L I E V Y P Y F Q T E Y P E E I D E D V L R Y I E S K I V EFVRSKGYTKIDFIGCEKYLSHINSIGAFFS
AerPe G E W I L F Y Q P F L G V F P V E A C G A Y P S L Q I D Y P Q E G L P A E V I G D L A S K I A S T V S I L R G R G F T V R L E Y C G K V E W Q A R A V E A L K T A A A G D L P T V E A C G
PyrAe R A H V L F Y D P V F G L V P E E V A E I Y P L S Q N E A E G E
SEAARAFAYEWLNNYDVILLYRVDLPMLSKKVIPLRSLDDVLHYI

β15

β16

β17

（31 ペ ー ジ か ら 続 く ）(B) ArcTGT の 触 媒 ド メ イ ン と C1 ド メ イ ン の 配 列 ア ラ イ ン メ ン ト．(A) に 挙 げ た 生 物 種 に 加 え，Halobacterium sp. NRC-1（HalSP1），Haloferax volcanii（ HalVo），Methanosarcina acetivorans（MetAc），Methanosarcina mazei（ MetMa），
Methanosarcina barkeri（MetBa），Methanopyrus kandleri（MetKa），Archaeoglobus fulgidus（ArcFu），Sulfolobus solfataricus（SulSo），Sulfolobus tokodaii（SulTo），Aeropyrum pernix（AerPe），Pyrobaculum aerophilum（PyrAe）の配列も示した．(B) で追加したこれらの古細菌由来の ArcTGT は，
ドメイン C2，C3 を欠いており，α2β2 サブユニット構成になっていると推測される（ 3.2.1.8 節，31 ページ参照）．また，ドメイン C2，
C3 を有する α2 サブユニット構成の ArcTGT でも，ドメイン C1 と C2 の間（425–435 のループの部分）に長い挿入配列を持つものがあることがわかる．(A)，(B) ともに配列アラインメントには CLUSTAL_X(Thompson et al., 1997) を用いた．

420

430

440

450

460

β18β19 hairpin 470

480

490

500

SEAEDDFKIEKPTKEDAIKYVMAIAEYQFGEGASRAFDDAKVELSKT G M P R Q V K V N G K R L A T V R A D D G L L T L G I E G A K R L H R V L P Y P PyrHo
NYFSANKKINADALRIRKMLQYQYGFDIIDDELMNKIKVVRSKTT G R L R Q V L D E N G E I L F S V R S N D N L L I P S E K G A K L L W K K I P F P MetJa
KYMGEVETTVDDLDRVRMVADYQFGMGAGELLFTDDVRIERSRNT G K I R H I Y A G D E L I C T M R A S D G L L V L G A E G A V R L H K G T D Y P MetThESVDSDKIRSFDLEKIRTIADYQFGYGIGKDFFKDDVRIFKSKT G R I R G V F D K G N K L I A T L R N D G F F T L T F H G A T L L Y N V S K S P TheVo
EKFEGEQVRSFNLNKIRMVADYQFGSGVGRMIFRDDVRINVSKT G R I R G I L S K E G R Q I A T M R N D G F F T L T Y Y G A S L I H S Q L K P P TheAc
TGSEKIRNYSHSKINEVFHLQFKA
RKNLFVNSDKIIKSKAT G H I R N I K R G E K I I A T M R N D G F L T L S I Y G G K L L N D M L D F P FerAc
MNNDTERLARVRMIADYQFGKGIGKELFPDGSTFQLSR
T K R V R Q V L H S G K R M A T A R A K D G F F T L S I E G A S I V H R L L P E K MetBa*
MNSNVERLSRVRMIADYQFGKGTGKELFPEGSTFQLSR
T K R V R Q V F H S G K R I A T A R A K D G F F T L S I E G A A V V H R L L P G K MetAc*
MNCNVERLSRVRMIADYQFGKGTGKELFPEGSTFQLSR
T K R V R Q V L H S G K R I A T A R A K D G F F T L S I E G A S V I H K L L S G K MetMa*
MSRYVEIVRGILAYQFGREAADAMLDGEVKVRVRRG R P R E V F V D G K R L C T V R A S D G L V S L A P E G A R R L H A A T E P P MetKa*
M Q D A G I P A L R T V A A Y Q Y G A A A G R A L F P E D K P H H V Q R S S T G R P Q Q I H R D D G A R L V S V G L D G R L T L G P A G G Q R L I D A L E H P HalNRC1*M F N L T K P L K A Q K D E I N Y L R Y I A M Y Q F S S K V A S C L F P E D S T F F I Q R S L T T N R I R N I L T E D K R L F L V L R A Q D N L F S I T E I S G Q I I K N C T S P P SulTo*

α19

α20

β18

β19

β20

β21

α21

Domain C2510

Cbf5p/dyskerin

520

530

540

550

560

570

580

RMRVVVNKEAEPFARKGKDVFAKFVIFADPGIRPYDEVLVVNENDELLATGQALLSGREMIVFQYGRAVKVRKGVEKYRVVVNKEAEEFAREGRNVFAKFVIDCDEELRPYEEVLVVNEDDELLAYGTTILNGIELREFNYGLAVKVRGGLKINKAWRVAVNEESEPFARKGKSVFAKFIIDCDNNIRANDEVLIVNADDELLATGKALLCAEEMMDLNHGQAVKTRKGGFNLRVFVKNESAEYNAKGYSVFFKFILDADPDIIAKNETLVVNENGELVAVGKATVSGKELREYSDGIAVKIHEGRDQSAKAMRVTVSKESAEYNAKGYSVFFKFILGSDENIIAKNDVLVVDEDDVLAAVGKAMVSGRELREYTEGIAVKVHEGRDQSEKASRVIVTDDSGEFNSQGYNVFFKFVEDCDREIIAGNDVMVTSASGDLYAVGHATVSGKEMGFYRNGIAVKVHEGINKLKLRVVISEEAAPFVEKGKTAFIKHVVEIDPELRAGEEVLVTDETNRLLATGQLLLSPAEVLALNSGAAVDVRVGVASKKEKRLRVAVSEDAAPFVEAGKTAFAKHVIEIDPELRAGEEVLVTDKADRLLATGQLLLSPAEILALDSGAAVDVRTGIASKKKGKLRVVVSDDAAPFVEAGKTAFAKHVIDIDPELRAGEEVLITDKNDRLLATGQLLLSPAEIRDLDSGAAVDVRAGIASKEHRVVCADEWVEAVRRGRDLFCEYALRGWEELRPGDECLVVSEDDELLAVGKMRLSGWEVEYFEHGVAVRVRRGLRARVVVGDESEPFVRDGKNVFAKFVTDVDDDARQGDELAVVHEDGRLLAVGRAELDAASMRDFETGMAVSVRAGVPATDASFRFIIKNEVASFIREGRNAFCKFVINSDPSIRAGDEVLVVDEQDNLLAVGRAKVSGEEVKQYKRGLAVIVKRGIKNVYQD
KRLVMKDSAVNAICYGAKIMLPGVLRYEDGIEVNQEIVVITTKGEAICMAIALMTTAVISTCDHGIVAKIKRVIMEKRLVMKDSAVNAICYGAKIMLPGLLRYEDGIEVNQEIVVITTKGEAICMAIALMTTAVISTCDHGIVAKIKRVIMEKRIIMKDSSVNAVCYGAKITLPGVLRYEDGIEIDQEIVICTTKGEAICLAIALMTTATMASCDHGVVAKIKRVIMEKRVVVKDSCINAICYGAKILIPGILRYDDDIEVGKEIVIMSTKGEAICIAIAQMNTSTIASVDHGVVAKSKRVIMEKRIVVKDSAVNAVCYGAKLMIPGLLRYEEGIELYDEIVLITTKGEAIAVAIAQMSTVDLASCDHGVVASVKRCIMEKRIVVKDSAVNAICYGAKLMIPGLLRYEAGIEVNEEIVLITTKGEAIAVGIAQMSTVELSTCDHGVVAKVKRCIME

β22

α22

β23

β24

β25

β26

α23

PyrHo
MetJa
MetTh
TheVo
TheAc
FerAc
MetBa*
MetAc*
MetMa*
MetKa*HalNRC1*
SulTo*
human
mouse
DroMe
CaeEl
yeast
SchPo

Cbf5p/dyskerin

PyrHo
MetJa
MetTh
TheVo
TheAc
FerAc
MetBa*
MetAc*
MetMa*
MetKa*HalNRC1*
SulTo*
human
mouse
DroMe
CaeEl
yeast
SchPo

β27

Domain C3 (PUA domain)
図 3-6 ArcTGT のドメイン C2，C3 と Cbf5p Ψ合成酵素の PUA ドメインの配列アラインメント
配 列 ア ラ イ ン メ ン ト に は CLUSTAL_X(Thompson et al., 1997) を 用 い た．ArcTGT に 関 し て は，Pyrococcus horikoshii（PyrHo），
Methanocaldococcus jannaschii（MetJa），Methanothermobacter thermautotrophicus（MetTh），Thermoplasma volcanium（TheVo），Thermoplasma
acidophilum（TheAc），Ferroplasma acidarmanus（FerAc）のドメイン C2，C3 の配列を示した．ドメイン C2，C3 だけの独立した ORF が存在すると推定される古細菌に関しては，Methanosarcina barkeri（MetBa），Methanosarcina acetivorans（MetAc），Methanosarcina mazei（MetMa），
Methanopyrus kandleri（MetKa），Halobacterium sp. NRC-1（HalNRC1），Sulfolobus tokodaii（SulTo）の配列を示した．また，Cbf5p/dyskerin に関しては，human，mouse，Drosophila melanogaster（DroMe），Caenorhabditis elegans（CaeEl），出芽酵母（yeast），Schizosaccharomyces pombe（SchPo）のものを示した．さらに，配列の上に P. horikoshii における残基番号を，下には二次構造の模式図を示した．

32

3.2.1

ArcTGT の結晶構造

ろ，一部の古細菌ではドメイン C2 と C3 を欠いていものが，進化の過程で融合して α2 二量体構成になっる事が明らかになった．さらにドメイン C2 と C3 のたのではないかと推測される．TGT ファミリーのバみの配列を用いて blastp 検索を行ったところ，これレル構造が全ての生物種に存在するが，C 末端ドメイ

らの C 末端ドメインを欠く ArcTGT をもつ生物種にン（あるいは β サブユニット）に存在する PUA ドメイ

限り，ドメイン C2 と C3 のみの配列からなると思わンが真核・古細菌にしか存在しないことから，かな

れる短い ORF が検出された（図 3-6，32 ページ）
．以り古い時期から存在したであろう QueTGT に C1 ドメ

上のことから，C 末端ドメインを欠く ArcTGT を持つインが付加して α サブユニットが出来，一方では PUA

古細菌においては，ArcTGT は全体として α2β2 四量体ドメインに C2 ドメインが付加して β サブユニットが（α=触 媒 ド メ イ ン+ド メ イ ン C1，β =ド メ イ ン C2+C3）

出来て ArcTGT が完成し，一部ではさらに進化して αを形成して機能している可能性が髙いと考えられる．

と β サブユニットが融合した ArcTGT が出来上がった

最初に ArcTGT が発見された好塩性古細菌 Haloferaxのではないだろうか．一方，現在配列がわかっていvolcanii の ArcTGT は，ドメイン C2C3 を欠いているタる ArcTGT の系統樹を作成すると図 3-8（33 ページ）イプに属している．β サブユニットは分子量が 16 kDaのようになった．これからは，α2 型 ArcTGT には 2 グ

程度と α サブユニット（56.3 kDa）に比べてかなり小さ

ループあり，上述のような融合がそれぞれのグルー

い為，H. volcanii ArcTGT のクローニング（Watanabe etプに対して個別に起こった可能性が示唆される．こal., 1997）において見出すことができなかったのであの，Thermoplasma acidophilum 等を含む，別系統の α2 型

ろ う． さ ら に， こ の C2C3 を 欠 く H. volcanii ArcTGT

ArcTGT は，亜鉛結合モチーフを含まない等（図 3-5，

発現ベクターに組み込み，組み換え体の調製を試みた

31 ページ），他の TGT とは殊更異なった特徴を示し

ところ，殆どが不溶性画分に沈殿してしまったらしいている．

（行木博士私信）．ArcTGT が正しく折り畳むには，ド

ところで，この例のように，ある生物種では 1 つのメイン C2，C3 からなる β サブユニットが必要なのでORF にコードされている酵素が，他の生物種では分はないかと推測される．

かれた ORF になっている例は幾つか挙げられる．例

このように一部の古細菌で C2，C3 ドメインが分離

Leu
えば，tRNA にロイシンを結合させるロイシル tRNA

した ORF になっているということから，P. horikoshii の合成酵素（LeuRS）は，通常 1 つのポリペプチド鎖か

ArcTGT も，元来このように α2β2 四量体構成であったらなるが，真正細菌 Aquifex aeolicus 由来の酵素は ORF

MetMa (30°C)
MetBa (30°C)

α22

HalSP1 (37°C) α β
2 2Euryarchaeota

MetAc (37°C)

COOH

HalVo (37°C)
ArcFu (85°C)
MetKa (98°C)
MetTh (65°C)

β27

β23

MetJa (80°C)
PyrFu (97°C)

α2

β26

PyrHo (98°C)
PyrAb (98°C)
FerAc (35°C)
TheAc (55°C)

AerPe (90°C)
SulSo (70°C)
SulTo (75°C)

α23

図 3-7 TruB Ψ合成酵素の C 末端ドメインとの比較
ArcTGT のドメイン C3（PUA ドメイン）を水色で，TruB Ψ 合成酵素の C 末端ドメインを半透明のピンク色で示した．また，
ArcTGT については，二次構造の名称も示した．重ねあわせには lsqkab (CCP program suite) を使用した．

α2β2

Crenarchaeota

β25

β24

α2

TheVo (60°C)
PyrAe (98°C)

図 3-8 ArcTGT の系統樹
α2β2 サブユニット構成になっていると推測される ArcTGT に関しては，α サブユニット（触媒ドメイン＋ドメイン C1）を用いた．α2，α2β2 サブユニット構成の ArcTGT を異なる色で囲って示した．系統樹の作成には CLUSTAL_X(Thompson et al., 1997)を使用した．生物種の略称は図 3-5（31 ページ）に準ずる．また，
生物種名の横に生育温度を示した．

33

第 3 章 ̶ ArcTGT 単独 , リガンドとの複合体の結晶構造

B-factor
20

70

100 (Å2)AB

C

図 3-9 リガンド・フリー , グアニン , preQ0 との複合体それぞれにおける触媒サイトの構造
全てステレオ図．(A) はリガンドフリー，(B) はグアニンとの複合体，(C) は preQ0 との複合体の構造．残基 94–110 とリガンドをス
2
ティックモデルで，それ以外はリボンモデルで表示した．スティックモデルの部分に関しては，温度因子に対応して，青（20 Å ），2
2
赤（70 Å ）から黄色（100 Å ）で表示した．またそれぞれの構造について，残基 94–110 とリガンドをオミットして計算した 2|Fo|–|Fc|
焼き鈍しオミットマップを暗緑色で示した．

が二つに分かれていることが報告されている（Goudaの境界で起こっているが，好熱性メタン古細菌類では

et al., 2002）．A. aeolicus は起源が古い真正細菌であるとこの部分に長い挿入配列があり，生物種間で大きく異いわれており，その為，LeuRS は元々ヘテロ二量体をなっている部分である，という点で共通している（図形成していて，進化の過程で単量体の酵素になったと

3-5，31 ページあるいは，図 3-6，32 ページ）．

推測されている（Gouda et al., 2002）．A. aeolicus LeuRSの分断は “Leucyl-speciﬁc insertion domain” と呼ばれる，異なる生物種間で配列の変化が大きいサイトで起こっている．一方で，ArcTGT の分断もドメイン C1 と C2
34

3.2.2

A

Arc TGT ･リガンド複合体の結晶構造

B
additional
β sheetα5α5

図 3-10 ArcTGT の触媒ドメインと QueTGT のクリスタルコンタクトの比較
両者とも酵素の主鎖をリボンモデルで，結晶中に存在する周囲の分子を表面モデルで示した．(A) ArcTGT に関しては，触媒サイトに蓋をするへリックス α5 を赤色で示した．へリックス α5 と周囲の残基が全くクリスタルコンタクトに関わっていないことが分かる．一方，(B) QueTGT に関しては，へリックス α5 に直接接続している QueTGT に特有の additional β sheet（図 3-5，31 ページ，パネル A）上の残基がクリスタルコンタクトに関わっており，それらの残基を CPK モデルで示した．

3.2.2 ArcTGT ･リガンド複合体の結晶構造
3.2.2.1の若干の変化はあるものの，disorder して見えなくなるということはないようである．QueTGT の結晶構造は

リ ガ ン ド・ フ リ ー 型 ArcTGT と グ ア ニ ン，

ArcTGT に比べて溶媒含量が低く，ヘリックス α5 に接

preQ0 結合型 ArcTGT の比較続している QueTGT 固有の β シート（図 3-5，31 ペー

リガンド・フリー型の結晶構造では触媒サイト付ジ）等で結晶学的対称分子と密に接触している（図近 の 残 基 97–106 が disorder し て い た が（2.2.1.11 節，

3-10，35 ページ）
．これらの接触が，ArcTGT で見られ

26 ページ参照），グアニンとの複合体の構造では 97–

たような構造変化を妨げている可能性が髙い．

106 の主鎖が order し，ヘリックス α5 として電子密度中に見出された．しかし側鎖はかなり disorder して殆

3.2.2.2

グアニンと preQ0 の認識様式

ど見えなかった（図 3-9，34 ページ）
．一方，preQ0 とのグアニンと preQ0 の構造は 7 位の置換基を除き同じ複合体でも同様に，97–106 の主鎖が order し電子密度である．両者の共通部分は ArcTGT によりそれぞれ中に見出された．さらに側鎖も order し，特に Phe99

同様に認識されていた．すなわち，N1，N2 が Asp130と Met102 の側鎖がはっきりと見られた．この構造変の O ，O と 水 素 結 合 し，O6 が Gln169，Gly196 と 水化は，基質塩基と Ser96，Ser98 の側鎖の水素結合と，素結合している（図 3-11，36 ページ）．さらに，Asp95

Phe99，Met102 の疎水的な相互作用により引き起こさの O ，O が グ ア ニ ン の N2，N3 と そ れ ぞ れ 水 素 結

れているようである（図 3-9）．

合している（図 3-11）．中性 pH におけるグアニンの構造変化を起こすヘリックス α5 は，触媒ドメイン

δ1

δ1

δ2

δ2

N2 はプロトン化しており，N3 はプロトン化していなのバレル構造の入り口部分に蓋のように存在している． い．一方，中性 pH でアスパラギン酸のカルボキシル
触媒サイトにリガンドがない状態ではヘリックス α5基は電離している．その為，この結晶構造のようにが動きやすくなり，触媒サイトにリガンドが取り込

Asp95 の Oδ2 と N3 が水素結合できる距離に存在する

まれやすくなっていると考えられる．一方，リガンドには（図 3-11），少なくとも間にプロトンが取り込まが触媒サイトに取り込まれた状態では，ヘリックス α5

れている必要性があるだろう．

が触媒サイトに蓋をすることで，水分子等により求核

一方 preQ0 との複合体では，preQ0 に特異的な 7 位置換反応が阻害されないように保護しているのではなの シ ア ノ 基 は Val198 の 主 鎖 の ア ミ ノ 基 と 水 素 結 合

いかと考えられる（図 3-9）．

できる距離にある（図 3-11）．生体髙分子の結晶構造

ところで，この構造変化を起こすヘリックス α5 はでシアノ基が水素結合を形成している例は他に見ら

QueTGT に も 存 在 す る が，QueTGT で は リ ガ ン ド あ

れないが，シアノ基の窒素原子は孤立電子対を持つ

り・なしのどちらの場合でも ArcTGT のような構造変為，水素結合の受容体として働くことは十分考えられ化は起こっていない（Romier et al., 1996a）．温度因子

る．一方，グアニンとの複合体では，7 位は水分子を35

第 3 章 ̶ ArcTGT 単独 , リガンドとの複合体の結晶構造

A

Arg177

Arg177B

Arg177

Arg177

C

Arg211

Arg211

D

preQ0/preQ1

preQ0/preQ1

図 3-11 ArcTGT のリガンド認識と , QueTGT のリガンド認識の比較
全てステレオ図．(A) は ArcTGT とグアニン，(B) は ArcTGT と preQ0 との複合体の，(C) は QueTGT と preQ1 との複合体の構造．
酵素側の構造はリボンモデルで示した．また，リガンド認識にかかわる酵素側の側鎖をスティックモデルで表示した．リガンド
はボールスティックモデルで表示した．(D) は ArcTGT・preQ0 複合体と QueTGT・preQ1 複合体の構造比較．両者の酵素側の主鎖を，lsqkab (CCP4 program suite) を用いて最小二乗法で重ね合わせて表示した．QueTGT・preQ1 複合体の座標は，EMBL ハイデルベルグ硏
究所の Dietrich Suck 博士より頂いた．

36

3.2.2A

Gly196

Gln169Gly196

Asp130

Asp95

B

Gly196

Arc TGT ･リガンド複合体の結晶構造
Gln169

Asp130

Asp95

Gln169Gly196

Asp130

Asp95

Gln169

Asp130Asp95

図 3-12 ArcTGT によるリガンドの認識（その２）全てステレオ図．(A) がグアノシンとの複合体，(B) がデオキシグアノシン類似体との複合体．すべて図 3-11（36 ページ）と同じ向きから表示した．また，リガンドをオミットした，|Fo|–|Fc| 焼き鈍しオミットマップ（A は 6σ レベル，B は 4σ レベル）を暗青色で示した．

介して Val198 の主鎖のアミノ基と水素結合していた

Z. mobilis QueTGT とその基質である preQ1 との複合

（図 3-11）．すなわち，preQ0 の 7 位の置換基の代わり体の結晶構造が報告されている（Romier et al., 1996a）に水分子が位置している．

が，preQ1 とグアニンは 7 位の置換基を除き構造が同さらにリガンドの芳香環は Phe99 と Phe229 の芳香

じであり，この共通部分に関しては，QueTGT による

34 ペー
環に挟まれるようにスタックしている（図 3-9，

preQ1 認識と ArcTGT によるグアニン・preQ0 認識はほジ）．このような疎水的な環境中に上記の水素結合がぼ同じであった（図 3-11，36 ページ）
．ただ，QueTGT

存在することからも，リガンドの認識が非常に強固かでは，求核触媒と考えられている Asp102（ArcTGT のつ厳密なものであることが推定される．ArcTGT は，

Asp95 に相当）の側鎖が回転し，塩基と逆方向に向い

このように，異なる基質の共通部分を厳密に認識するている（図 3-11）．さらに，QueTGT では基質ポケット

ことで，グアニンと preQ0 を同様に認識することが出

内に水分子が入り込み，Asp 残基の代わりに基質と水来るのだろう．

素結合している（図 3-11）．ArcTGT と QueTGT は同様の機構で反応を触媒していると考えられているが，QueTGT による preQ1 認識との比較

触媒残基と考えられている Asp 残基になぜこのような

1.3 節（4 ペ ー ジ ）で も 述 べ た よ う に，ArcTGT と構造の違いがあるのかは不明である．本論文では，6.1

3.2.2.3

QueTGT は同様の反応を触媒すると考えられているが， 節（65 ページ）において，Asp95 の役割と他の残基が使用する基質が異なっている．すなわち，QueTGT は求核触媒である可能性を再検討した．

グアニン，preQ1，preQ0 ともに基質とするが，ArcTGT

一方，preQ1 に特異的な 7 位のアミノメチル基は，は グ ア ニ ン，preQ0 の み 基 質 と す る（Watanabe et al.,Leu231（ArcTGT の Val197 に相当）の主鎖のカルボニ

1997）
．

ル基と水素結合している（図 3-11，36 ページ，パネル
37

第 3 章 ̶ ArcTGT 単独 , リガンドとの複合体の結晶構造

C）．ArcTGT と QueTGT の基質ポケットを重ね合わせた図 3-11（パネル D）からもわかるように，ArcTGT

3.2.2.4

グアノシン，デオキシグアノシン類似体との複合体の構造と QueTGT では，基質ポケット 7 位の置換基を収納

ArcTGT と グ ア ノ シ ン の 複 合 体 の 結 晶 構 造 で は，する部分の構造が大きく異なっている．すなわち，

2|Fo|–|Fc| 電子密度マップ中にグアニン部分の電子密度

ArcTGT では主鎖のアミノ基が基質の方を向いているは見られたが，リボース部分は全く見出すことが出来のに対し，QueTGT では主鎖がフリップして，カルボなかった（図 3-12，37 ページ，パネル A）．リボース部

ニル基が基質の方を向いている．これは，ArcTGT の分の温度因子が髙い為に disorder して見えていない可

基質ポケットは負に分極した preQ0 の 7 位のシアノ基能性と，塩基交換反応の第一段階目が SN1 的に進行しを認識するようにできているが，QueTGT の基質ポて N-グリコシド結合が切断され，リボースがなくなっ

ケットは正に帯電した preQ1 の 7 位のアミノメチル基てしまっている可能性が考えられた．

を認識するようにできている為だろう．さらに，こ一方，デオキシグアノシンの類似体との複合体での主鎖の構造の違いは，ArcTGT に特異的に存在するは，グアニンだけでなくリボース類似体に相当すると

ヘリックス α9（198–202）によるものと考えられる（図思われる電子密度が見出された（図 3-12，パネル B）．

3-5，31 ページ）．ArcTGT では，この挿入されたヘリッ

このリボース類似体では，4′ 位の酸素がメチル基に変クスの為，Val198（QueTGT の Ala232 に相当）が基質

わっている為（図 2-2，14 ページ），求核置換反応の遷側に押し下げられ，その結果 Val198・Val197 間のペプ移状態であるオキソカルベニウム・カチオンを生じる

チド結合の向きが QueTGT と逆になっている．

ことが出来ず，結果として N-グリコシド結合が切断

ArcTGT が preQ1 を結合しないという実験結果は，されなくなっている．一方，それ以外の性質はグアノ

上記のモデルでよく説明できる．一方，QueTGT はシンとほぼ変わらない（QueTGT で塩基交換反応は標

preQ0，preQ1 ともに基質とすることができるが，これ的サイトの残基がデオキシ体でも反応が進むことが確は以下のように説明できる．すなわち，QueTGT の 7

認されている為（Nonekowski et al., 2002），2′ 位の違い

位ポケットはヘリックス α9（198–202）に相当する部分の影響はないと考えられる）．この類似体でリボースがないだけ ArcTGT に比べて広くなっている（図 3-11， の電子密度が見られたということは，グアノシンとのパネル D）．QueTGT の基質ポケットに preQ0 が入っ

複合体において disorder の為リボースが見えなかった

た場合，preQ0 のシアノ基と QueTGT のポケットに面という可能性は排除できる．すなわち，塩基交換反応

しているカルボニル基との間に電荷の反撥が起こる可の第一段階目が途中まで進行した結果，N-グリコシド能性があるが，ポケットが広くなっている分距離が離結合が切断された可能性が髙い．

れる為問題なく結合できるのであろう．

38□

P. horikoshii 由来 ArcTGT ･ tRNA複合体の X 線結晶構造解析

第4章

序論 1.2 節（2 ページ）でも述べたように，tRNA 修飾酵素には，通常の L 字型に折りた
たんだ tRNA の髙次構造に埋もれているサイトに修飾を導入するものが存在するが，これらの酵素は何らかの構造変化を起こした tRNA を認識している可能性が髙い．ArcTGT は
そのような修飾酵素のひとつであり，髙次構造に埋もれた tRNA の D ループ上 15 位にどのようにして修飾を導入しているかは不明であった．一方，過去の生化学的な実験から，
ArcTGT の tRNA 認識には正しい L 字型をした tRNA は必要でなく，塩基配列の特異性は 15位の G 以外ないにもかかわらず，tRNA 上の 15 位を厳密に認識できるということがわかっていた（Watanabe et al. , 2000）．これらの tRNA 認識の機構を解明することを目的とし，P.

horikoshii 由来 ArcTGT・tRNAVal 複合体の結晶構造解析を行った．本章では，tRNA の調製から，ArcTGT・tRNA 複合体の結晶化，X 線結晶構造解析についてまで述べた．

4.1 材料と方法
4.1.1 tRNA T7 転写産物の大量調製
Val

ラーゼによる転写反応を行った．尿素変性 PAGE で生成物を確認した後，7 M 尿素変性 10% PAGE（19:1）で

P. horikoshii 由 来 tRNA (UAC) 遺 伝 子 は， 独 立 行 政 法

生成物を全て泳動し，ゲルから切り出して精製した．

人・製品評価技術基盤機構が解読した P. horikoshii ゲノ

切り出した tRNA を含むゲルを約 50 ml の精製水で抽ム配列を参考に，ゲノムから PCR 法を用いてクロー出した（37°C，24 時間）．さらに，脱尿素と濃縮のたニングした．クローニングした遺伝子は，上流に T7めに抽出した溶液をイオン交換カラム RESOURCE Q

プロモーター，下流に制限酵素 Mva I の認識サイト（Amersham Biosciences）にかけて塩濃度勾配で溶出しを付加し，pUC119 上に導入した．この鋳型プラスミ

た．溶出した tRNA を含む画分は，エタノール沈殿にドを大腸菌株 DH5α に導入して大量培養を行い，得よりさらに濃縮した．最終生成物は緩衝液 A**（表 2-1，られた菌体からアルカリ法でプラスミドを抽出した．

12 ページ）に溶解し，–20°C に保存した．精製 tRNA

プラスミド DNA をさらに CsCl 濃度勾配遠心法で精の濃度は紫外光の吸光度により，1 OD260=44 mg/l とし製し，制限酵素 Mva I で処理して T7 転写反応の鋳型て測定した．

DNA とした．本来，3′-CCA 末端を揃える為の Mva I
処理は，CCA 末端にアミノ酸を結合させるアミノアシ4.1.2 ArcTGT・tRNA 複合体の調製

ル tRNA 合成酵素の基質 tRNA を調製する場合に良くArcTGT の 調 製 は 2.1.1.1 節（11 ペ ー ジ ）と 同 じ 方用いられる方法であり，G15 を修飾する酵素には不要法で行った．4.1.1 節（39 ページ）で得られた tRNA とである．しかし結晶化の上で末端の非一様性が悪影響

ArcTGT をモル比が 1:1 になるように混合した．ここを及ぼすことが憂慮されたので，なるべく一様な転写

で，混合するときの ArcTGT 濃度，緩衝液の塩濃度，産物を得るために上記のような方法を取った．

pH を変化させ，安定に可溶化しかつ単分散になる条

上述の手順で得られた鋳型 DNA を用いて，表 4-1（40 ページ）の組成により 37°C，3 時間 T7 RNA ポリメ

件を探索した．複合体サンプルの濃縮には M.W.C.O.
10,000 の Vivaspin500（Viva science）を使用した．

39

第 4 章 ̶ P. horikoshii 由来 ArcTGT ･ tRNA 複合体の X 線結晶構造解析
表 4-1

tRNA の試験管内転写反応に使用した反応液組成

4.1.5 ArcTGT・tRNA 共結晶の回折像測定
成分

濃度

HEPES・カリウム（pH 8.1）

80 mM

まず抗凍結条件の探索をおこない，はじめから極低塩化カリウム40 mM

温条件下で測定を行った．測定は，実験室系の回折計

塩化マグネシウム

24 mMと，シンクロトロン放射光（SPring-8 BL41XU）両方で

GMP

31 mM

行った．なお，BL41XU における測定では，窒素ガス

スペルミジン

2 mMを用いたクライオ装置（100 K）以外に，ヘリウムガス

1,4- ジチオスレイトール

16 mMを用いたクライオ装置（30 K）も使用した．X 線検出

ATP，CTP，GTP，UTP

各 4 mM

牛血清アルブミン

20 mg/ml

RNase inhibitor（SIN-101, 東洋紡）

0.2 mg/ml

T7 RNA ポリメラーゼ

約 10 mg/ml

鋳型プラスミド

50 mg/ml

装置は，marCCD165 (Mar Research）を使用した．

4.1.6 回折データの処理
2.1.1.7 節（13 ペ ー ジ ）と 同 様 に，HKL2000 package（Otwinowski & Minor, 1997）に含まれる denzo により指数付けとデンシトメトリーをおこない，同 scalepack

4.1.3 複合体状態での動的光散乱の測定，native
PAGE，ゲルろ過
4.1.2 節（39 ページ）で調製した複合体溶液の動的によりスケーリング，データリダクションを行って各指数に対する回折強度を求めた．

4.1.7 分子置換法による位相決定

光散乱の測定を行った．測定には DynaPro MS（Protein

複 合 体 の 位 相 決 定 は，CCP4 の MolRep（Vagin &Solutions）を用いた．サンプル濃度は ArcTGT の濃度

Teplyakov, 1997）を用いて，分子置換法により行った．

が 3 g/l になるよう調製し，測定前に 0.1 μm Ultrafree-

分子置換のモデルとしては，2.1.1.12 節（14 ページ）で

MC ﬁlter（Millipore）により濾過した．得られたデータ決定した ArcTGT 単独の結晶構造を 2 量体化した状態

はプログラム DYNAMICS（Protein Solutions）を用いてのまま使用した．
（複合体でも 2 量体化していること解析した．また，4.1.2 節で調製した複合体溶液を非変が予想されたため，モデルとしては 2 量体化した状態

性（native）PAGE で泳動する，あるいはゲル濾過クロの ArcTGT を用いた）．モデルの精密化は CNS で行っマトグラフィーにかけることで，一様な分子量の状態

た．具体的な方法は 2.1.1.12 節（14 ページ）に準ずる．

で存在しているかどうか確認した．ゲル濾過クロマト
グラフィーには Superdex200（Amersham Biosciences）を使用した．

4.1.4 ArcTGT・tRNA 複合体の結晶化

4.1.8 tRNA モデルの構築と精密化
原 子 モ デ ル の 構 築 に は O（Jones et al., 1991）と 一
部 Que（Ishitani, 2002）を使用した．tRNA の構造で通常の tRNA と同じ構造をしていた部分に関しては，T.

4.1.2 節 ，4.1.3 節で最適化した条件の複合体サンプ

thermophilus GluRS・tRNAGlu 複 合 体（Sekine et al., 2001）

ルを用いて，結晶化スクリーニングを行った．結晶の構造を参考にモデル構築を行った．構築したモデ

化スクリーニングの方法は 2.1.1.3 節（12 ページ）と同ルの精密化には CNS（Brünger et al., 1998）を使用した．

様の方法で，ArcTGT 濃度 3 g/l，20°C の条件で行った．

精密化に用いる構造因子の分解能範囲は，回折デー

さらに，スクリーニングで得られた予備的な結晶を，タの統計値と，さらに Wilson プロット等を参考に決2.1.1.3 節と同様の方法で最適化した．また，得られた定した．回折データの統計値に関しては，空間群や結晶を溶かし，尿素変性 PAGE で泳動した後，臭化エ

redundancy に左右される Rsym 値より，I/σ (I ) を重視してチジウムと CBB 両者で染色することで複合体結晶で分解能の上界を決定した．具体的な方法は 2.1.1.12 節

あることを確認した．

（14 ページ）に準ずる．

40

結果と考察

N

N

tR

tR

A

A+
Ar
c

TG

T

4.2

ArcTGT-tRNAcomplextRNA dimer ?

PAGEpurification

T7 transcriptiontRNA monomer

RESOURCE Q

図 4-1 試験管内転写反応で調製した tRNA の精製(A) T7 反応後と，(B) ゲル精製後 RESOURCE Q にかけた溶出画分．

図 4-2 ArcTGT と tRNA によるゲルシフト･アッセイtRNA 転写物のみと，ArcTGT ･ tRNA 複合体を非変性条件下の 10% PAGE（0.5× TBE）で泳動したもの．

4.2 結果と考察
次に，非変性下の条件でおこなった PAGE では，複4.2.1 tRNA T7 転写産物の調製と精製合体のものと考えられるバンドが見られた（図 4-2，

5.0 ml スケールの溶液で T7 転写反応を行い，精製

41 ページ）．バンドがはっきりと現れていることかを行った．最終的には 5.2 mg の精製されたサンプル

ら，一様な複合体を形成しており結晶化に適した状を得ることができた（図 4-1，39 ページ）．

態であると考えられる．一方，ゲル濾過クロマトグラ
フィーの結果では，複合体のものと思われるピークが4.2.2 ArcTGT・tRNA 複合体の調製

ArcTGT のピークより少々大きい分子量の画分に見らVal

ま ず，ArcTGT と tRNA を ArcTGT 4.4 g/l，tRNAれた．

1.8 g/l になるように，100 mM 燐酸ナトリウム緩衝液

更に，上述の方法で調製した複合体溶液の動的光（pH 6.5）NaCl 300 mM の 条 件 下 で 混 合 し た と こ ろ，

散乱測定を行った．4°C で調製したサンプルを一度 70

瞬時に白沈が生じた．この白沈は溶液を 75°C に加温°C に加熱し，急冷，徐冷（20 分），徐冷（100 分）のすると溶解したが，室温下では再び徐々に沈殿してし

3 通りの方法で 25°C に戻して測定した．その結果，まった．濃縮したもの同士を混合すると沈殿する可能

20 分かけて徐冷したサンプルで，推定分子量 170 kDa

性があると考え，両者とも 1.0 g/l 以下程度にしてか（Rh=5.3 nm），Cp/Rh=21.7% となり，単分散になること

ら混合し，複合体の状態で濃縮することを試みた．こが 判 明 し た． 一 方， 急 冷， 徐 冷（100 分 ）と も Cp/Rhの場合は，ArcTGT の濃度が 10 g/l に達するまで濃縮~40%，推定分子量 200 kDa 以上と，多分散になる傾しても沈殿は生じなかったが，4°C に数十分ほど置く

向があることがわかった．20 分かけて徐冷した場合と白沈が生じた．この白沈は 37°C に加温すれば溶解の推定分子量は，ArcTGT 2 量体に tRNA が二つ結合ししたが，再び 4°C に置くと沈殿してしまった．塩濃度， た分子量に近い．
pH に問題があると考えられたため，それぞれを振って小容量で濃縮を試みたところ，100 mM 燐酸ナトリ
ウム緩衝液 pH 7.5 で NaCl 濃度が 400 mM 以上あれば，4°C で ArcTGT 数十 g/l まで濃縮しても，全く沈殿しないことが分かった．

4.2.3 ArcTGT・tRNA 複合体の結晶化スクリーニ
ングと結晶化条件最適化
まず，4.2.2 節にあるように一度沈殿したサンプル
で無理にスクリーニングを行ったが，複合体の結晶
41

第 4 章 ̶ P. horikoshii 由来 ArcTGT ･ tRNA 複合体の X 線結晶構造解析

表 4-2

ArcTGT・tRNA 複合体の結晶化条件
緩衝剤

沈殿剤

A1 型

0.1 M ADA (pH6.5)

12% PEG4000

100 mM Li2SO4

2% 2-propanol

A2 型

0.1 M ADA (pH6.5)

12% PEG4000

200 mM NaH2PO4

2% 2-propanol

A3 型

0.1 M ADA (pH6.5)

12% PEG4000

200 mM NaH2PO4

2% 2-propanol
0.3% sucrose

B1 型

0.1 M Na Citrate (pH 5.6)

1 M NH4H2PO4

B2 型

0.1 M Na Citrate (pH 5.6)

1 M NH4H2PO4

0.3% xylitol

B3 型

0.1 M Na Citrate (pH 5.6)

1 M NH4H2PO4

0.3% xylitol
0.1% agarose

C型

0.1 M Na Acetate (pH 4.6)

2 M Na Formate

A (type A1)

塩

B (type A2)~100 μm~100 μm

D (type B1)

E (type B1)

添加剤

C (type A3)~50 μmF (type B2)~30 μm~30 μm~100 μm

G (type B3)
H (type C)

I (type C)~100 μm~100 μm~100 μm

図 4-3 ArcTGT・tRNA 複合体の結晶(A) A1 型結晶，(B) A2 型結晶，(C) A3 型結晶，(D) スクリーニング時の B1 型結晶，(E) 最適化後の B1 型結晶，(F) 最適化後の B2 型結晶，(G) B3 型結晶，(H) スクリーニング時の C 型結晶，(I) 最適化後の C 型結晶．図中におおよその寸法を示した．

は得られなかった．次に 4.2.2 節の手順を経て，沈殿燐酸アンモニウムを沈殿剤とした条件（表 4-2; B1 型）

しないように ArcTGT と tRNA を混合して調製したサで微小な六面体状の結晶（図 4-3; パネル D）が得られンプルを用いてスクリーニングを行ったところ，2 週

た．また，蟻酸ナトリウムを沈殿剤とした条件（表間ほどで 12% PEG4000 を沈殿剤とした条件（表 4-2，

4-2; C 型）でも針状結晶（図 4-3; パネル H）が得られた．

42 ページ，A1 型）で沈殿の中から針状結晶（図 4-3，42

まず，PEG4000 を沈殿剤として得られた結晶の最適ページ，パネル A）が得られた．さらに 1 ヶ月ほどで化を，pH，沈殿剤濃度の変化，添加剤としての塩の種

42

4.2

結果と考察

図 4-4 ArcTGT・tRNA 複合体 B2 型結晶の回折像
SPring-8 BL41XU に て 波 長 1.0 Å の X 線 を 用 い， カ メ ラ 距 離 250 mm， 振 り 角 1.0° で 測 定．X 線 検 出 装 置 は，marCCD165 (MarResearch) を使用．左図は，右図の枠内 (~3.3 Å) を拡大した図．
表 4-3 ArcTGT ･ tRNA 複合体結晶の回折像統計値

類・濃度の変化などで試みた結果，塩を 100 mM 硫

Wavelength (Å)

1.000

酸リチウムから 200 mM 燐酸二水素ナトリウムに変えResolution (Å)

ることで結晶が少し太く成長することが分かった（図Total reﬂections

334,265~ 23,500

4-3，表 4-2，A2 型）．さらに添加剤のスクリーニング

Unique reﬂections

41,0494,055を行ったところ，0.3% 蔗糖の存在下で棒状結晶になる

Redundancy

8.1

~ 5.8

ことが分かった（図 4-3，表 4-2，A3 型）．しかし，こCompleteness (%)

99.7

99.8

の結晶は再現性が悪かったためこれ以上最適化するのI/σ (I )

16.7

2.31

が困難であった．

Rsym (%)

9.9

48.7

50–3.3

3.42–3.3

蟻酸ナトリウムを沈殿剤として得られた結晶の最適化を，pH と沈殿剤濃度の変化，添加剤のスクリー度の結晶が得られることが分かった．これらの添加剤

ニングにより試みたところ，pH を 4.6（酢酸ナトリウが多量の種結晶の生成を抑えることで，大きな結晶がム）から 5.6（クエン酸ナトリウム）に変えることで結出やすくなるようである．また，この条件で得られる晶が出やすくなることが分かった．しかし，長期的結晶は，成長中に種結晶が重力の影響によりドロップに見ると pH 4.6 の方が大きな結晶に成長した．また，界面に落下し，界面上で結晶が成長するため（図 4-3

ArcTGT 濃度 12 g/l にした条件で，結晶が太くなるこ

パネル F では立方体に見えるが）全方向に結晶が成長とが分かった（図 4-3，パネル I）．ただ，現在のとこ

しないことが分かった．また，界面で成長した板状結ろ回折像の測定を行えるほど良い結晶が得られるには晶は分解能やモザイク性が悪い傾向にあった．そのた

いたっていない．

め，アガロースを加えてドロップ中のシードの移動を燐酸アンモニウムを沈殿剤として得られた結晶の最抑制し，結晶化を試みたところ，0.1% アガロースを加適化を，他の結晶と同様に行ったところ，スクリーニえるという条件で正六面体状の結晶を得ることができ

ングでは 1 ヶ月あまりかかったのに対し，サンプル濃た（図 4-3，B3 型）．しかしながら，B2 型の最も良かっ度を 7.0 g/l にすることで，3 日で結晶化した．しかし，た結晶に比べて格段に分解能が良くなるというような微小結晶が非常に多く出てしまうことが分かった．添

効果は得られなかった．さらに添加剤濃度などを変化加剤スクリーニングの結果，燐酸アンモニウムの濃させて最適化を試みたが，これ以上良い結晶は現在の度を 1.0 M にして，かつ 0.3% キシリトールを加える

ところ得られていない．

ことで最大 100 mm × 100 mm × 100 mm 程度に成長す一方，4.2.2 節（41 ページ）で 70°C に一度加熱してることが分かった（図 4-3，表 4-2，B2 型）．また，0.3%から徐冷したほうが光散乱の結果は良くなっていた

エタノールやイソプロパノールを加えた条件でも同程ので，PEG4000 と燐酸アンモニウムを沈殿剤とした43

第 4 章 ̶ P. horikoshii 由来 ArcTGT ･ tRNA 複合体の X 線結晶構造解析
表 4-4 分子置換により得られた解
MolRep による分子置換により得られた解（オイラー角と分率座標）， 表 4-5相関係数と R 因子などを示した．
(A) 回転関数の解
順位
1

ArcTGT ･ tRNA 複合体モデルの精密化統計値
Resolution (Å)

50.0–3.3

Number of

α

β

31.57

γ

78.47

Rf

Rf /σ

99.02

5

2.388×10

5

Reﬂections used

41,391

7.42

Protein atoms

9,286

6.75

RNA atoms

3,163

2

37.76

85.85

11.15

2.172×10

3

37.04

90.00

333.001.587×105

4.93

Ions

6

4

82.23

90.00

187.851.572×105

4.88

Water atoms

41

5

56.80

85.08

214.111.481×105

4.60

R.m.s.d.

(B) 回転関数（順位１）の解に対する並進関数の解

Bond length (Å)

0.0119Dens /σR -facCorr

Bond angles (Å)

1.56

0.269

37.20

0.459

0.496

Impropers (°)

1.49

0.318

0.126

14.99

0.521

0.349

Ramachandran plot

0.651

0.37

14.63

0.516

0.358

順位

X

Y

Z

1

0.522

0.985

2

0.189

3

0.855

(C) 回転関数（順位２）の解に対する並進関数の解
Dens /σR -fac

Corr

0.155

34.53

0.474

0.466

0.967

0.442

14.55

0.530

0.331

0.299

0.297

14.11

0.531

0.333

順位

X

Y

Z

1

0.294

0.634

2

0.961

3

0.626

Most favored (%)

82.1

Additionally allowed (%)

17.5

Generously allowed (%)

0.2

Rwork (%)

22.5

Rfree (%)

28.8

σA coordinate error (Å)

0.72

A

6

6

B
protruded D arm

acceptor stem

protruded D arm

acceptor stem

図 4-5 複合体結晶構造の電子密度
すべてステレオ図．(A) tRNA 分子中，D ステム，バリアブル・ループの一部と，アンチコドンアーム全て（G23 から C49）をオ．オミットした残基をボールスティックモデルで，それミットして計算した |Fo|–|Fc| 焼き鈍しオミットマップ（2.6σ レベルで表示）以外の部分をチューブモデルで表示した．酵素側の構造はリボンモデルで示した．(B) tRNA 分子中，アクセプター･ステムと，飛び出した D アーム（G1 から U17，C66 から A76）をオミットして計算した |Fo|–|Fc| 焼き鈍しオミットマップ（2.7σ レベルで表示）．
オミットした残基をボールスティックモデルで表示した．酵素側の構造はリボンモデルで示した．

44

4.2

A (Subunit A)
180

B (Subunit B)180

ALA 555 (A)

B

~b
b

135 b

B

~b
b

135 b

~b

~b
~l

~l

90

90

l

45

l

45

L

L

a

ψ (˚)

a

ψ (˚)

結果と考察

A

0

~a

-45

A

0

~a

-45

LYS 433 (A)ILE 493 (B)ILE 493 (A)

-90

-90

ASN 475 (A)-135 ~b-135 ~b~pb

ASN 475 (B)

~p
b

p

p
~b

~b

-180

-135

-90

-45

0

45

90

135

180

-180

-135

φ (˚)

Glycine residues

-90

-45

0

45

90

135

180

φ (˚)

Other residues

Glycine residues

Other residues

Most favoured regions
82.5%
Additional allowed regions 16.7%
Generously allowed regions 0.4%
Disallowed regions
0.4%

Most favoured regions
82.1%
Additional allowed regions 17.5%
Generously allowed regions 0.2%
Disallowed regions
0.2%

100.0%

100.0%

図 4-6 複合体 ArcTGT のラマチャンドランプロット(A) 複合体構造中の ArcTGT サブユニット A と，(B) サブユニット B のラマチャンドランプロット．

条件で，同様に一度徐冷した上で結晶化を試みた．

ムガスを用いたクライオストリーム（30 K）で測定を

PEG4000 を沈殿剤とした条件では，結晶とともに現行ったところ，最後（90 フレーム）まで，3.3 Å 程度のれる沈殿の量が減少した．しかし結晶が大きくなるよ

回折像が得られた．データ処理を行った結果，空間群

うな効果はなかった．一方，燐酸アンモニウムを沈殿

R 32， 単 位 胞 が a=b=230.840 Å，c=269.271 Å（α=β=90°，剤とした条件では，徐冷すると全く結晶が出なくなる

γ=120°）であることがわかった．回折像を 図 4-4（43ことが分かった．

ページ）に，回折データの統計値を 表 4-3（43 ページ）

4.2.4 ArcTGT・tRNAVal 複合体の回折像測定
燐酸ナトリウムを沈殿剤として得られた B2 型結晶（図 4-3）について，極低温条件下での測定のため，に示す．

4.2.5 分子置換法による位相決定
分子置換による位相決定を試みたところ，回転関数，

抗凍結剤の検討を行ったところ，25% グリセロール

並進関数ともに明瞭な解が得られた（表 4-4，44 ペーが適していることがわかった．大きさが 50 mm 程度

ジ）．得られた解をさらに CNS を用いた剛体精密化，に成長したものを実験室系，シンクロトロン放射光エネルギー最小化，温度因子精密化で精密化し，σA 重（SPring-8 BL41XU）で測定したが，両者とも全く回折み付けされた 2|Fo|–|Fc| 電子密度を計算させたところ，像が得られなかった．さらに大きさが 100 μm 程度に蛋白質部分の電子密度が見出された．また，C 末端ドなったものを実験室系の回折計で数十 Å 程度の回折

メインの付近や，2 量体インターフェイスの付近など像が得られた．Denzo で指数付けを行ったところ，結に tRNA の電子密度が見出された．

晶系が菱面体晶系の可能性が髙いと推測された．さらにシンクロトロン放射光（SPring-8 BL41XU）で測定

4.2.6 tRNA モデルの構築とモデルの精密化を行ったところ，3.3 Å 分解能までの回折像を測定する

電子密度から明らかに tRNA の二重らせん部分と分ことができた．ただ，100 K での測定では 5 秒露光 1

Glu
かるところに対しては，GluRS・tRNA 複合体（Sekine° 振りで 20 フレーム程度測定した段階で，X 線による

et al., 2001）のモデルから tRNA の部分だけを借用してダメージのため分解能が低下することが判明した．露

電子密度に当てはめた．また，TΨC アームに関して

光時間を短くする，X 線の強度を減衰させるなどの方は電子密度から通常の tRNA と同様の構造を取ってい法も試みたが，分解能が低下してしまうため，ヘリウ

ることが確認できたため，上記のモデルから部分を45

第 4 章 ̶ P. horikoshii 由来 ArcTGT ･ tRNA 複合体の X 線結晶構造解析

A

Catalytic domain

150

C1

C2

C3 (PUA)

B-factor (Å²)

120
90
60
30
0

0

100

200

300

400

500

600

Residue number

B

Catalytic domain

150

C1

C2

C3 (PUA)

B-factor (Å²)

120
90
60
30
0

0

100

200

300

400

600

500

Residue number
図 4-7 複合体 ArcTGT 主鎖の温度因子分布(A) はサブユニット A の，(B) はサブユニット B のグラフを，また，グラフの上に対応するドメインを模式図で示した．

A

Single-stranded region (loop)
acceptor

B-factor (Å²)

200

D arm

D arm

anticodon
anticodon VD
VD anticodon

Double-stranded region (stem)
CCA

TΨC

TΨC

TΨC

acceptor

150

100

50

0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Residue numberB

acceptor

B-factor (Å²)

200

D arm

D arm

anticodon
VD anticodon
anticodon VD

CCA
TΨC

TΨC

TΨC

acceptor

150

100

50

0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Residue number
図 4-8 複合体構造中の tRNA 主鎖の温度因子分布(A) は tRNA-I の，(B) は tRNA-II のグラフを，また，グラフの上に対応する構造を模式図で示した．tRNA-I は -II に比べてクリス
タルコンタクトにより安定化されて，その結果，全体的に低い温度因子になっている．

46

4.2

結果と考察

A

B

tR

tRNA-I

図 4-9 複合体結晶のクリスタルパッキング(A) 単位胞中の結晶学的な対称分子 18 個をすべて表示した（ステレオ図）．単位方を黄色で，ArcTGT を薄黄色のリボンモデルで，tRNA を緑色のリボンモデルで表示した．三方晶系は六方軸と菱面体軸，2 通りの取り方があるが，この図では六方軸を表示している．
(B) 非対称単位中 2 分子ある tRNA のうち，より温度因子の低かった tRNA-I は，図のように飛び出した D アーム（18–20a 位）の部
分が結晶学的対称分子と塩基対を形成していた．結晶学的な 2 回軸を中心に示した．

借用して電子密度に当てはめた．アクセプター・ス

呼ぶ）に関しては，D アームの G18 から U22 が最後まテム，TΨC アーム，アンチコドンステムの一部のモで disorder して解釈することができなかった．最終的デルを置いた段階で CNS によりモデルの精密化（剛には Rwork=22.5%（Rfree=28.8%）までモデルを精密化で体精密化・エネルギー最小化・温度因子精密化）をきた（表 4-5，44 ページ）．モデル精密化後の電子密度

行い，σA 重み付けされた 2|Fo|–|Fc| 電子密度を見たとを 図 4-5（44 ページ）に示す．また，複合体結晶構造

ころ，モデルを置いた部分の電子密度が改善される

中の ArcTGT のラマチャンドラン・プロットを 図 4-6だけでなく，tRNA の電子密度が不明瞭であった部分（45 ページ）に，酵素・tRNA それぞれの主鎖の温度因にも，解釈できる電子密度が見出されるようになっ子分布を 図 4-7（46 ページ），図 4-8（46 ページ）に，た．さらに tRNA モデルを構築し，CNS による精密化

クリスタルコンタクトの様子を 図 4-9（47 ページ）にを行うことを繰り返したところ，B サブユニットの触示す．ArcTGT・tRNA 複合体の分子モデルと構造因子

媒ドメインに結合した tRNA（tRNA-I と呼ぶ）に関し

は，Protein Data Bank に登録した（PDB ID: 1J2B）．

ては，全てモデルをおくことができた．一方，A サブ□

ユニットの触媒ドメインに結合した tRNA（tRNA-II と

47

第5章

ArcTGT による tRNA の認識機構

本章では，第 4 章で解明した ArcTGT ･ tRNA 複合体の結晶構造に基づき，本研究ではじめて明らかになった「tRNA 修飾酵素による構造変化を起こした tRNA 認識の機構」，「配列非特異的かつ位置特異的な tRNA 認識機構」について議論した．また，構造解析の結果に基づいてデザインした酵素・tRNA の変異体解析を行い，その結果について考察した．

5.1 材料と方法
5.1.1 ArcTGT 変異体の調製

5.1.2 tRNAVal 変異体の調製

酵 素 の 一 残 基 変 異 体（D95N，D249N）は Quick-tRNA 変 異 体 は 図 5-1（49 ペ ー ジ ）に 示 し た も のChange site-directed mutagenesis kit（Stratagene）により作を，ミニヘリックス・マイクロヘリックス RNA は成した．また，酵素の残基欠失変異体 ∆(463-466) は，

図 5-2（50 ページ）に示したものを使用した．これら

欠失させる残基の前後の部分に貼り付くプライマーのうち，変異サイトが一部分だけの tRNA（1GGU）はを作成し，遺伝子の部分とプラスミドを併せて一周

QuickChange site-directed mutagenesis kit（Stratagene） に

PCR で増幅させ，得られた断片を T4 DNA キナーゼ

より作成した．一方，変異サイトが複数部分にまたがで燐酸化したうえで T4 DNA リガーゼでセルフライ

るものは，tRNA の前半部分と後半部分に対応する一ゲーションさせて作成した．使用した DNA プライ

本鎖 DNA を合成し，PCR 反応で二本鎖化させ，そのマーを 表 5-1（50 ページ）に示す．

まま T7 転写反応の鋳型として使用した．T7 転写反作成した変異体遺伝子の乗った発現プラスミドを大応の結果得られた tRNA は，4.1.1 節（39 ページ）と同腸菌株 BL21(DE3)TIR に導入することで組換え蛋白質様の方法で精製した上で濃度測定を行い，活性測定にを発現させた．方法は 2.1.1.1 節（11 ページ）と同様で用いた．ミニヘリックス・マイクロヘリックス RNA

ある．発現した蛋白質を熱処理により精製し，活性測は，米 Dharmacon 社から購入したものを使用した．

定を行った．活性測定の結果，全く活性がなかった変異体に関しては，それ以上の精製は行わなかった．一

5.1.3 グアニン交換反応の活性測定

方，活性がわずかながら検出された ∆(463-466) 変異体

TGT はグアニンと修飾塩基だけでなく，グアニンに関しては，正確に酵素濃度を測定して活性測定条件

同士も入れ替える活性を持つ．塩基交換反応の活性を合わせる必要があると考え，2.1.1.1 節と同様のカラ測定は，ArcTGT により tRNA 上の G15 がどれだけラ

ムクロマトグラフィーによる方法で精製して濃度測定

ベル体のグアニンと置換されたかを定量することでを行い，活性測定を行った．また，変異体酵素が正し測定した．反応は 45°C 或いは 70°C の恒温水槽で行っ

く折り畳んでいることを動的光散乱の測定により確認た．反応液の組成は，50 mM Tris·Cl 緩衝液（pH 7.5），

した．

5 mM 塩化マグネシウム，400 mM 塩化ナトリウム，2049

第 5 章 ̶ ArcTGT による tRNA の認識機構

変異体作成に用いた DNA プライマー
方向

D95N

D249N

∆(463-466)

1GGU

DSTBL1DSTBL2塩基配列 (5′ → 3′)F

TATAACGGAATAATAGAGGTGAATTCTGGGTCATTTCAGCTCR

GAGCTGAAATGACCCAGAATTCACCTCTATTATTCCGTTATAF

GGTGTTGATCTTTTTAATTCAGCTAGCTATGCACTG

R

CAGTGCATAGCTAGCTGAATTAAAAAGATCAACACCFGGGATGCCCAGACAAGTTAAAGTTAACGG

R

TTCGACTTTAGCATCATCAAAAGCTCTCF

ATGTAATACGACTCACTATAGGTGGGCCCGTGGTCTAGTTGGTR

ACCAACTAGACCACGGGCCCACCTATAGTGAGTCGTATTACATFCGGGATCCATGTAATACGACTCACTATAGGGCCCGTGCCGGAGTTGGTCACCGGGCCGCCCTTACGAGGC

R

CCCAAGCTTCCTGGTGGGCCCGCGGGGATTCGAACCCCGGTCCTCCGCCTCGTAAGGGCGGCCCGGTGACFCGGGATCCATGTAATACGACTCACTATAGGGCCCGTGGTCTAGTTGGTCATGACGCCGCCCTTACGAGGC

R

CCCAAGCTTCCTGGTGGGCCCGCGGGGATTCGAACCCCGCTTTCCGCCTCGTAAGGGCGGCGTCATGACC

A 1GGUB DSTBL1

76

76

-

-

-

A
G-C
G-C
U-A
1G - CG-C
G - C 70
C-G
C-G
59
G G C C C-G
66
8 G-C
U AA
15
U
GCCCC
G
U
G
G
U
A
49
CGGGG
U C U G 10
G
U UC
C
G
U
U C AU G A C G
GA26
C -G AGC -G
C C G G G -C
30 C - G 40
C -G
C A
U
G
UAC

-

A
G-C
G-C
U-A
1G - CG-C
G - C 70
C-G
C-G
C-G
59
66
8 G-C
U AA
15
U
GCCCC
G
U
G
G
U
A
49
CGGGG
U C U G 10
G
U UC
C
G
U
U C AU G A C G
G26
C -G AG
C -G
G -C
30 C - G 40
C -G
C A
U
G
UAC
35

C DSTBL2

76

A
G-C
G-C
U-A
1G - CG-C
G - C 70
C-G
C-G
C-G
59
66
8 G-C
U AA
15
U
GCCCC
G
U
G
G
U
A
49
CGGGG
U C U G 10
G
U UC
C
G
U
G
U C AU G A C G
GA26
C -G AGA
C -G
G -C
30 C - G 40
C -G
C A
U
G
UAC
-

変異体

-

表 5-1

35

35

図 5-1 tRNA 変異体の 2 次構造模式図tRNA 変異体，1GGU (A)，DSTBL1 (B)，DSTBL2 (C)，それぞれの 2 次構造模式図．

UU GA

GU
U C U G 10

1
ACCA
G-C
G-C
G-C
C - G 70
C-G
C-G
G-C

B

1
ACCA
G-C
G-C
G-C
C - G 70
C-G
60
C-G
A
G
C
U
G
A
GCCCC
UU A
GU
G
U C U G 10
CGGGG
U UC

-

A

図 5-2

本研究で使用したマイクロヘリックス・ミニヘリックス
本研究で使用した (A) マイクロヘリックス RNA と，(B) ミニヘリックス
RNA の 2 次構造模式図を示した．

μM 8-[14C] グアニン（53 mCi/mmol; Moravek）とした．

を除いた．更に，100% エタノールで 2 回洗って水分反応は，酵素の添加によって開始し，10% のトリクロを除き乾燥させた後，非水系シンチレーションカクテ

ロ酢酸（TCA）を染み込ませて乾燥させた 3MM ペー

ルに浸し，シンチレーションカウンターで計測した．

パーに反応液を移すことによって停止させた．反応液

tRNA の 変 異 体 1GGU，DSTBL1，DSTBL2 と， 酵 素 のを浸潤させた 3MM ペーパーを 10% TCA 溶液で 1 回，

変異体 ∆(463-466) に関しては同じ条件で 2 度活性測定

更に 5% TCA 溶液で 2 回洗浄して，未反応のグアニンを行い，反応初速度の平均値と標準偏差を求めた．

50

5.2

結果

表 5-2 酵素活性測定の結果
括弧の中に標準偏差を示した．
SubstratetRNA

enzymeWild type

V 0 (cpm/min)
45 ℃

V 0 ratio (%)

70 ℃

45 ℃

70 ℃

Intact160 (4.5)250 (2.0)

100

100

1GGU

6.6 (0.15)

190 (11)

4.3

75

DSTBL16.1 (0.45)

160 (0.52)

3.9

66

DSTBL235 (2.2)

200 (9.2)

23

81

Minihelix

90

̶

58

̶

Microhelix

140

̶

90

̶

Intactn.d.

66 (0.72)

0

26

D95N

̶

n.d.

̶

0

D249N

̶

n.d.

̶

0

∆(463-466)

5.2 結果5.2.1 各変異体の活性測定
まず野生型の酵素と tRNA で活性測定を行い，酵素反応の速度論的定数（KM，kcat）の測定を試みたが，基質濃度を予測される KM 付近にすると誤差に比して十分な放射線のカウント数（CPM）を測定することがで

度 45°C においては酵素 300 nM，tRNA 基質 80 mM で，
温度 70°C においては酵素 100 nM，tRNA 基質 80 mMで測定を行った．表 5-2（51 ページ）にそれぞれの酵
素･ tRNA 変異体の酵素活性測定の結果を示す．

5.2.2 ミニ･マイクロヘリックスの活性測定

きず，正確に KM，kcat を測定することができなかった．

図 5-2（50 ページ）のミニヘリックス･マイクロヘ

これは，使用したグアニンのラベル体が 8 位のみラベ

リックス RNA の酵素活性の測定は，tRNA での活性ルしたものであった為 1 分子当たりの放射活性が低く， 測定と同様に，温度 45°C，酵素 300 nM，RNA 基質 80
誤差に比べて十分なカウント数を得ることができな

mM で行った．その結果，マイクロヘリックス RNA

かったことが原因であると考えられる．その為，渡辺では野生型 tRNA と比べてほぼ同じ程度の活性がある

らの論文（Watanabe et al., 2000）ではグアニンの炭素原ことが分かった．一方ミニヘリックス RNA では活性子全てにラベルが入ったものを用いているが，そのよはあるものの，マイクロヘリックス RNA に比べるとうなラベル体は現在入手不可能であった．

低くなった．これは，マイクロヘリックスの方が，配以上の問題点の為，酵素活性は，十分に活性がありかつ反応が飽和に達しないよう条件を選び，反応の列が長く GC 含量も多い為，予期しない二次構造を取ってしまう為と考えられる．

初速度をもって測定することにした．具体的には，温5.3 考察5.3.1 ArcTGT・tRNA 複合体の全体構造

ち，ArcTGT の 2 つのサブユニットを架橋するように
tRNA が結合している（図 5-3，52 ページ）
．二量体化

ArcTGT・tRNA 複合体の結晶構造は，非対称単位

した ArcTGT の両サブユニットの構造は殆ど同じで当たりに ArcTGT 2 分子（A サブユニット，B サブユ

あった．同様に，二量体化した ArcTGT の両側に結合

ニ ッ ト ）と tRNA 2 分 子（tRNA-I，tRNA-II）を 含 ん でした各 tRNA-I，tRNA-II 分子も殆ど同じ構造を取っている．酵素単独の構造解析の結果や，複合体の動的いた．ただ，tRNA-I 側の温度因子がより低く，電子密

光 散 乱 の 結 果 か ら 予 測 さ れ た よ う に，ArcTGT は 二

度がより明瞭に見える為，以下の議論では tRNA-I 側

量体化した上で，2 分子の tRNA を認識していた．即のみについて議論する．
51

第 5 章 ̶ ArcTGT による tRNA の認識機構

A

subunit A

subunit A
C-terminal
domains

catalytic
domaincatalytic
domainC-terminal
domains

subunit B

subunit A

subunit A
catalytic
domainC-terminal
domains

catalytic
domainC-terminal
domains

C-terminal
domains

catalytic
domaincatalytic
domainC-terminal
domains

subunit B

B

C-terminal
domains

catalytic
domainC-terminal
domains

catalytic
domainsubunit B

subunit B

図 5-3 ArcTGT ･ tRNA 複合体の結晶構造
全てステレオ図．(B) は (A) から 180° 回転して，裏側から見た図．

複合体結晶中の ArcTGT の構造は，リガンド・フら C12）は酵素によって認識されている（5.3.4 節，59

リー状態の ArcTGT と，触媒サイト付近の残基を除き， ページに後述）．一方，その相手側の残基（G23 から
殆ど同じ構造を取っていた．即ち，二量体化の様式もC25）は，バリアブル･ループ（G46 から C48）と塩基殆ど同じである．一方 ArcTGT に結合した tRNA には， 対をつくり，ステム構造を形成していた（以降「DV通常の L 字型構造の tRNA に比して，非常に大きな構ステム」と呼ぶ；図 5-6，54 ページ；図 5-5，53 ページ）．

造変化が見られた（図 5-4，53 ページ）．

この構造変化した tRNA の新たなコア構造は，DV ス

5.3.2 ArcTGT に結合した tRNA の構造変化

テムを中心に構成されている．DV ステムはアンチコ
ドンステムの上側に存在しており，両者は連続したArcTGT に 結 合 し た tRNA は，D ア ー ム の 殆 ど がステム構造を形成しているが，その間に塩基対が壊れtRNA 本体から飛び出している（図 5-4，53 ページ）．

た領域が存在している（インターナルループ領域；図通常の L 字型 tRNA では，D アームがコアの形成に重5-5，図 5-6）．このインターナルループ領域は，塩基要な役割を果たしている．その為，D アームが tRNA対が作れないものの塩基同士が向き合ってスタックし本体から飛び出しているこの tRNA では，新たなコアており，不安定なステム構造を形成しているように見構造が形成されていた（図 5-6，54 ページ）
．即ち，Dえる．以上のように，DV ステム，インターナルルー

ステムの塩基対は完全に破壊され，その前半（G10 かプ領域，アンチコドン･アームは一続きのステム構造

52

5.3

考察

を形成しているが（図 5-5）
，その主軸はインターナル

取っていた．更に TΨC ステム，アクセプター･ステ

ループ領域の部分で約 30° 折れ曲がっている．その結ムも通常の tRNA とほぼ同じ構造であった．このよう

果，アンチコドン･アームの部分は，ArcTGT A サブユに，ArcTGT に結合した tRNA は，歪ながらも，全体

ニットの C 端ドメインと，B サブユニットの触媒ドメ

的には L 字型構造を取っている（図 5-4，53 ページ）．

インの間に形成されているクレフトに収まる形となっ本論文では，この tRNA の構造を，tRNA がとりうるている（図 5-8，56 ページ）．

もう一つの高次構造という意味をこめて，オルタナ

一方，DV ステムの上方には TΨC アームが存在しティブ型 tRNA と呼ぶことにする．

て い る．DV ス テ ム の 一 番 上 側 の 塩 基 対（G23:C48）

オルタナティブ型 tRNA の形成に DV ステムがどは TΨC ループの A59 とスタックしているが（図 5-6，のように影響しているかを検討する為に，DV ステム

54 ページ），この 3 者の相互作用は通常の tRNA にを作れないような tRNA の変異体（図 5-1，50 ページ，

見られる，D ループ G15 とバリアブル・ループ C48

パネル B，C）を作成し，酵素活性のアッセイを行った．

と TΨC ループ 59 位の相互作用に類似している（図その結果，45°C においては，DV ステムを壊した変異

5-6）．一方，TΨC ループは，D ループとの相互作用を体で野生型 tRNA に比べて 23% に活性が落た（表 5-2，

失っていながらも，通常の tRNA とほぼ同じ構造を

51 ページ，DSTBL2）．即ち，DV ステムはオルタナティ

A

U55

B

8

G

Ar
Yeast tRNAPhetRNAVal

図 5-4 通常型とオルタナティブ型 tRNA の高次構造の比較(A) ArcTGT に結合した状態の tRNA と，(B) 酵母 tRNAPhe の結晶構造（Shi & Moore, 2000）の比較．

B

35

-

1
ACCA
G-C
G-C
G - C 70
C-G
C-G
C-G
59
G-C
U AA
U
GCCCC
G
G
UU GA
CGGGG
U C U G10
G
C
U
U
48C U
G
U C AU G A C G
G20C -G AG
C -G
G -C
30 C - G 40
C -G
C A
U
G
UAC

-

1
ACCA
G-C
G-C
G - C 70
C-G
C-G
C-G
59
G-C
10
U AA
GCCCC
AU C U G G U
G
G
CGGGG
C
UU
A U G - C 50
U
U
GGUC
A-U
20
C-G
G
G
C GA
C -G
G -C
30 C - G 40
C -G
C A
U
G
UAC

-

A

35

図 5-5 通常型とオルタナティブ型 tRNA の二次構造の比較(A) ArcTGT に結合した状態の tRNA と，(B) 通常型 tRNA の 2 次構造模式図．

53

第 5 章 ̶ ArcTGT による tRNA の認識機構

A

TΨC arm

acceptor stem

59

TΨC arm

acceptor stem

59

48

23

48

23

protruded
D arm

D

D

in

in

anticodon arm

anticodon arm

variableloop

TΨC arm

B

59

TΨC arm

acceptor stem

59

48

D arm

acceptor stem

48

D arm

anticodon arm

anticodon arm

図 5-6 通常型とオルタナティブ型 tRNA のコア構造の比較(A) ArcTGT に結合した状態の tRNA と，(B) 酵母 tRNAPhe の結晶構造（Shi & Moore, 2000）それぞれのコア部分の比較（ステレオ図）．

ブ型 tRNA の形成にある程度は寄与しているが，DVないように，低 GC 含量を保ったまま進化したのではステムが単独でオルタナティブ型 tRNA の方を通常型ないかと考えられる．

tRNA よりエネルギー的に安定にしてしまう程の寄与

ところで，RNA の二次構造予測ソフトウェア mfoldはないと推測される．オルタナティブ型 tRNA が通常（Zuker, 1989）により，通常型 tRNA とオルタナティブ

型 tRNA よりエネルギー的に安定になる為には，5.3.3型 tRNA の安定化エネルギー（∆G ）を計算したとこ

節（55 ページ）以降に述べる酵素と tRNA の相互作用

ろ，通常型 tRNA は ∆G = –36 kcal/mol，オルタナティが欠かせないのであろう．一方で，DV ステムを不安

ブ型 tRNA は ∆G = –35 kcal/mol と，両者ともほぼ同じ定にするだけでなく，D ステムをすべて G:C 塩基対にであるという結果になった．しかし，このソフトウェ

置換して安定化した変異体では大きく活性が低下した

アでは，通常型 tRNA で初めて可能となる多くの高次（表 5-2，DSTBL1）．P. horikoshii 由来の tRNA は，耐熱

2+的相互作用や，Mg イオンの配位による安定化，非ワ性の要請の為，ステムの塩基対の殆どが G:C ペアにトソンクリック型塩基対による安定化など，多くの要なっており，アクセプター，アンチコドン，TΨC ステ

素が無視されている．その為，二価イオンが存在する

ムの GC 含量は平均で 95% 以上となっている．しか溶液中では，通常型 tRNA の方がエネルギー的に安定しながら，D ステムの GC 含量は，平均で 60% 程度と， である筈である．ただ，ArcTGT がオルタナティブ型
大腸菌 tRNA のステムの GC 含量とさほど変わらない． tRNA に結合するには ATP 等のエネルギー源が不要で好熱菌の tRNA において，もし D ステムが他のステあり，更に 20°C でも結合できることから，両者のエムと同様に高 GC 含量になると，この変異体の例のよ

ネルギー差とその間に存在するエネルギーバリアはそうにオルタナティブ型の折り畳みを取りにくくなるとれほど高くないと推測される．

考えられる．即ち，tRNA 熟成の過程に支障をきたさ

更に，他の tRNA でも DV ステムを作ることが出
来 る か ど う か を 検 討 し た 結 果，P. horikoshii，E. coli の

54

5.3

tRNA のうちバリアブル･ループが（本研究で用いた P.

考察

5.3.3 C 末端ドメインによるアクセプター・ステ

horikoshii tRNAVal(UAC) と同じ）5 残基であるものはすべ

ムの認識て同様の DV ステムを組みうるということがわかった．
更に，4 残基タイプのものに関しては，今回の結晶構

ArcTGT は，tRNA の中でも，アクセプター・ステム

造だけからは DV ステムがどのように形成されるかは及び D アームの前半と多くの相互作用を形成し厳密

不明ではあるものの，少なくともどの tRNA においてに認識している（図 5-7，55 ページ）
．本節では C 末端

も 2 残基以上のステム構造を組みうる．一方，長いバ

ドメインによるアクセプター･ステム認識について議

リアブル･アームを持つ Type-II 型 tRNA に関しても，論する．

H. volcanii の tRNA 解析から，全てアーケオシンを有することがわかっている（Sprinzl et al., 1998）．その為， 5.3.3.1

ドメイン C3（PUA ドメイン）による認識

何らかのオルタナティブな高次構造を取る筈ではあドメイン C3 の β シート上には塩基性残基が集中しるが，実際どのような構造を取るかを理解する為にはて お り， 特 に Arg573，Lys576，Arg578 が tRNA G69 かType-II 型 tRNA と ArcTGT 複合体の高次構造解析が必ら C72 の燐酸バックボーンと静電的相互作用してい要であろう．tRNA は本来，このようなオルタナティ

る（ 図 5-9，56 ペ ー ジ， パ ネ ル A）． 更 に，tRNA の 負

ブな高次構造をとるように進化してきたのかもしれなに帯電した燐酸バックボーン（3′ 側）に対応するようい．

に，ドメイン C3 の分子表面には正電荷を帯びた大きなパッチが形成されており，ステム構造を認識してい

F519

A76

C74

D525

G572

Acceptor stem

E515

5′

3′

A73

G2

C71

G3

R573

E11
K576

C70

R483
R578

C4 G69
E421

A418

T481

TΨC arm

T490

C6 G67R478

G7 C66K473

A59

C5 G68

U60

G9

G10

U11

C12

U13

A484
Q419
D485

Protruded D arm

K529

F527

C72

C75

G1

Q471

R261

G
57

C56

U55

E462

A24 U47
T466

K103

C25 G46

K430

G45

G26

A44
U22

A21

U20

C20a

G19

G18 C20a

C27

Internal loop
regionG43

C28 G425′

G29 C41
C30 G40
C31 G39

tRNA
D136

G37

A35

U33

C36

ArcTGT と tRNA の相互作用の模式図

C32 A38

U34

図 5-7

A58 U54

Q169
S96

D95

Q100

Y104

C61 G53

G23 C48

F99

U17

C62 G52“DV” stem A59

G15
U16

C63 G51

F229

C64 G50

K465

D249

A14

G65 C49

U8

T466

A367

H339

Y204
Y256
Y268

E202

S250

R205
D136

3′

tRNA residue
Putative metal ion
Protein residue in A subunit
Protein residue in B subunit
Watson-Crick base pair
Non Watson-Crick base pair
Stacking/hydrophobic interaction
Protein-tRNA interaction

Anticodon arm

55

第 5 章 ̶ ArcTGT による tRNA の認識機構

図 5-8tRNA のアンチコドン･アームと ArcTGTの相互作用

tRNA を水色のリボンモデルで，酵素サブユニット A の C
末端ドメインを茶色，サブユニット B の触媒ドメインを紺色のリボンモデルで示した．

y

A
A

A

C7

C7

C7

C75

domain C3 (PUA domain)

domain C3 (PUA domain)BC

図 5-9 ArcTGT C 末端ドメインによる tRNA アクセプター・ステムの認識
全てステレオ図．(A) ArcTGT のドメイン C3（PUA ドメイン）とアクセプター・ステムの相互作用．RNA と，相互作用にかかわる蛋白残基をスティックモデルで示した．(B) ArcTGT のドメイン C3，C2 とアクセプター・ステムの相互作用．酵素を表面モデル
で示し，表面電荷により赤（–10 kT/e），白（0 kT/e），青（10 kT/e）に着色した．tRNA はリボンモデルで示した．また，tRNA の CCA
末端をボールスティックモデルで示した．(C) ArcTGT のドメイン C3，C2 とアクセプター・ステムの相互作用．酵素，tRNA 共にリ
ボンモデルで示した．また，tRNA の 5′ 末端の残基と，それと相互作用している酵素側の残基をスティックモデルで示した．

56

5.3

考察

る（図 5-9，パネル B）．一方，5′ 側の主鎖は酵素と逆

ル A）． 具 体 的 に は，C75 と Phe527，A76 と Phe519 の側に位置しており直接的には認識されていないが，5′芳香環がスタック相互作用している．ドメイン C3 の末端はドメイン C3 のヘリックス α23 の C 末端側と接これらの残基は ArcTGT の間で保存されている（図するように配置されている（図 5-9，パネル C）．即ち， 3-6，32 ページ）
．一方で，生化学的な実験結果からは，ドメイン C3 の表面は，電荷だけでなくその形状もア

ArcTGT の触媒活性には tRNA の CCA 末端は必要でクセプター･ステムの末端にフィットしている（図 5-9， ないことがわかっている（Watanabe et al., 2000）．完成
パネル B）．

前の tRNA には CCA 末端を欠くものが存在し，tRNA

更 に，ArcTGT で は，tRNA の CCA 末 端 が ド メ イ ン

熟成の段階で CCA 付加酵素により付加される為（Aebi

C3 の縁で認識されている（図 5-10，57 ページ，パネ

et al., 1990），この生化学的な実験の結果はある意味妥

A

B

C

R307

ArcTGT-tRNA
TruB-RNAArcTGT-tRNA
TruB-RNA

図 5-10 ArcTGT C 末端ドメインによる tRNA 認識（その２）全てステレオ図．(A) ArcTGT のドメイン C3（PUA ドメイン）による tRNA CCA 末端の認識．(B) ArcTGT のドメイン C2 の β18β19 ヘアピンと tRNA の相互作用．(C) ArcTGT のドメイン C3（PUA ドメイン；水色）と tRNA アクセプター・ステムの相互作用と，TruB の C 末端ドメイン（Hoang & Ferré-D’Amaré, 2001; ピンク色）とステム RNA の相互作用の比較．両酵素で RNA 認識に関わっている残基をスティックモデルで示した．両者とも主鎖の構造は良く似ているが，RNA 認識様式が大きく異なっている．

57

第 5 章 ̶ ArcTGT による tRNA の認識機構

TΨC arm

acceptor stem

D armvariable loop

anticodon arm

Mg2+
図 5-11 通常型 tRNA の D アームの付け根に配位した Mg2+ イオン
Phe
酵母 tRNA の結晶構造（Shi & Moore, 2000）の結晶構造において，D アームの2+
Phe
付け根部分に見られる Mg イオンを金属球で示した．tRNA に限らず，他の
2+tRNA においてもこの位置に Mg イオンが配位している．

当である．今回の結晶構造で見られた CCA 末端とド5.3.3.2

ドメイン C2 による認識

メイン C3 の相互作用は，CCA 末端が他の相互作用のドメイン C2 の β シート上の塩基性・親水性残基邪魔にならないように，或いはふらついて分解され（Arg483，Arg478，Gln471，Thr481，Thr490）が tRNA C66てしまわないように止めておく，という役割があるのから C69 にかけての燐酸バックボーンを認識しておではないだろうか．逆に，5′ 末端或いは 3′ 末端に一本り，ドメイン C2 の表面に塩基性パッチを形成してい鎖 RNA が付加したような，末端のトリミングを受ける．この塩基性パッチは C3 上の塩基性パッチと同様ていない状態の tRNA でも，ArcTGT に結合できるとに tRNA の燐酸バックボーンに沿うように存在して推測される．即ち，ドメイン C3 と tRNA の相互作用いる（図 5-9，56 ページ ，パネル B）．更に，ドメインの様式では，5′ 末端側の燐酸周囲は，酵素のドメイン

C3 と C2 の塩基性パッチは連続しており，ドメイン

C3 と逆側の方向は溶媒に面しており（図 5-9，56 ペー

C3 と C2 は協同的に tRNA のアクセプター・ステムをジ，パネル B），この方向に RNA 鎖が伸びた状態で認識している（図 5-9 ，パネル B）．この協同的な認識

結合することが出来るだろう．一方，3′ 末端側も，A76

が tRNA の G15 を正確に位置づけることを可能にしの塩基はドメイン C3 に結合しているが，リボース，ているのだろう．

とくに 3′-OH 基は溶媒に面しており（図 5-9，パネル

更 に，β18β19 ヘ ア ピ ン と そ の 先 端 に 位 置 す るB），この先に RNA 鎖が伸びたとしても立体障碍は起Lys465 が， ド メ イ ン C2 の 表 面 か ら 突 き 出 し て お

こらない．このように，ArcTGT による修飾は，tRNAり（ 図 5-9， パ ネ ル B； 図 5-10，57 ペ ー ジ， パ ネ ル

プロセシングの中で，tRNA の末端のトリミングより

B），構造変化した tRNA のコアの部分にめり込んで前の段階で行われている可能性があると考えられる．

い る．ArcTGT と 通 常 の L 字 型 tRNA を 結 合 さ せ る

一方，5′ 側或いは 3′ 側にお互い相補的な RNA が付と，丁度この部分が tRNA のコア構造とぶつかる（特加し，アクセプター・ステムが伸びたような状態のに U8，C49，C25 と β18β19 ヘ ア ピ ン の 残 基 Thr466，

tRNA の場合では，5′ 末端側がドメイン C3 のヘリック

Lys465）．一方で，構造変化した tRNA を結合していス α23 の C 末端側と立体障碍を起こし，結合できない

る複合体の状態では，Thr466 は C25 の 2′-OH 基と水と推測される．実際に，tRNA の 5′ 末端を延長してア素結合し，Lys465 は U8，U49 の燐酸と静電的相互作用

クセプター･ステムを長くした変異体（図 5-1，50 ペーをしている（図 5-10；図 5-7，55 ページ）
．即ち，このジ，パネル A）を作成し，活性測定を行った結果，45°

β18β19 ヘアピンが構造変化した tRNA を認識するのC では劇的に活性が減少することがわかった（表 5-2，に重要であると考えられる．また，ArcTGT の間でこ51 ページ，1GGU）．このように，ドメイン C3 がアクの β18β19 と先端の塩基性残基はかなり保存されていセプター・ステムの末端構造を認識しているというる（図 3-6，32 ページ）．

ことは，ArcTGT が tRNA のアンチコドン・アーム等，

一 方，β18β19 ヘ ア ピ ン の 残 基 463 か ら 466 を 削 除

生体内に存在しているステムループ構造を持つ RNAした変異体 ∆(463-466) では，かなりの活性の低下が見に誤って結合してしまうのを防いでいるのではないだ

られた（表 5-2，51 ページ）
．β18β19 ヘアピンが失われろうか．

ると，通常の L 字型 tRNA でも ArcTGT に結合できる
ようになると推測される．その結果，効率的に D ルー

58

5.3

プを触媒サイトに配置することができなくなり，結果として活性が大きく低下してしまうのだろう．ところで，通常型 tRNA の構造では，L 字型の脇の部分，D2+

考察

5.3.4 高次構造の壊れた D アームの認識
5.3.4.1

D アーム前半 U8 から U13 の認識

アームの付け根に Mg イオンが特異的に配位するサ

既に述べたように，ArcTGT に結合した tRNA の D

イトが存在している（図 5-11，58 ページ）．ArcTGT が

アームは，通常の L 字型 tRNA のものと比べて，完全tRNA に結合する際，まずこの Mg イオンが β18β19に高次構造が壊されていた（図 5-4，53 ページ）．D ス

ヘアピン先端の Lys465 側鎖のアミノ基と置き換わり，テムの前半 U8 から U13 は一本鎖状態になって酵素にそれが引金となってオルタナティブ型への構造変化が結合している．各残基の塩基はお互いにスタックし起こるのかもしれない．

て溶媒側に向いており，バックボーン側を酵素の方に2+向けている．その結果，tRNA のこの領域と酵素の相Domain C1

A

Domain C1

U13

U13

R261

C

Ca

(subunit B)(subunit B)

B

G15

G15

C

図 5-12 飛び出した D アームの認識
全てステレオ図．(A) 飛び出した D アームの，元 D ステム領域（8–13 位）の認識．酵素の主鎖を細いチューブで，RNA の主鎖を太いチューブで示した．また，酵素の A サブユニットは黄色で，B サブユニットは紺色で示した．酵素と RNA の相互作用を点線で示した．(B)，(C) D ループ（14, 15, 16 位）認識．(B) では酵素を表面モデルで，(C) ではリボンモデルで示した．

59

第 5 章 ̶ ArcTGT による tRNA の認識機構

A
P199

E202
I235

I235

H233

A251

R261

B

A251

R261

V46

V46
A254

A254

L255
A251

Q44

L255
A251

Q44

V39

V39

U16

U16

N41

N41
Q100

Q100

図 5-13 A14 と U16 の認識
全てステレオ図．(A) A14 の認識．(B) U16 の認識．いずれも，酵素の主鎖をリボンモデルで，認識に関わる酵素側の残基をス
ティックモデルで示した．また，tRNA の主鎖をチューブモデルで，A14，U16 残基をボールスティックモデルで示した．(B) に関しては，16 位にプリン塩基を置いた場合のモデルを，半透明のボールスティックで示した．

互作用は，酵素側の塩基性・親水性の側鎖と tRNA 側のメチル化と G15 のアーケオシン化はある程度相関の燐酸とによるものが主体となっている（図 5-12，59があるが，逆に例外も見られる．G10 のメチル化がページ，パネル A； 図 5-7，55 ページ）
．一方で，G9 とArcTGT の負の決定因子となっている可能性が示唆さ

G10 の 2 位のアミノ基が酵素の Ala418，Glu421 とそれれるが，更なる検討が必要であろう．

ぞれ相互作用している（図 5-12，パネル A）．しかし，
2 位（或いはそれに相当する位置）に置換基を持つ塩

5.3.4.2

G15 とその前後の残基の認識基は G のみであり，G 以外の残基が結合した場合でも，

U8 から U13 の認識では塩基は酵素に殆ど認識され水素結合はできなくなるが，立体障碍や電荷の反撥はていないが，それに比べて A14，G15，U16 はバック起こらないだろう．即ち，この相互作用は，この位置

ボーンの部分だけでなく，塩基の側も認識されている．

の塩基をグアニンに限定するようなものではなく，他A14 と U16 は，触媒ドメインのバレル構造の縁にあの塩基でも収容できると推測される．更に，tRNA のるポケットに結合しており，更に G15 はバレル構造

この領域の温度因子が他の部分に比べて低いことからの中央にある触媒サイトに結合している（図 5-12，59も（図 4-8，46 ページ），酵素により厳密に認識されてページ，パネル B，C）．
A14 と U16 を結合しているポケットは，主に疎水いることがわかる．
ところで，ArcTGT は修飾された酵母 tRNA

Phe

を殆ど

性の側鎖から構成されており，塩基の特異性はないよ

基質としないことが報告されている（行木博士私信）．

うに見え，（図 5-13，60 ページ）他の塩基も結合する

Phe

は G10 の 2-アミノ基がメチル化されて可能性が示唆される．特に U16 を結合しているポケッ

おり，上述の G10 と Glu421 の相互作用が阻害されトは，ピリミジンだけでなく，プリンも十分に結合でることが原因として考えられる．また，H. volcanii 全

きるスペースを持っている（図 5-13，パネル B）．一

tRNA の配列解析の結果（Gupta, 1984）によると，G10方で，G15 の塩基は酵素の側鎖と多くの水素結合を形

酵母 tRNA

60

5.3

考察

成しており，厳密に認識されている（図 5-14，62 ペー

なステム構造に 9 残基以上の一本鎖領域が付加した

ジ，パネル A）
．形成されている水素結合のパターン

RNA ということになる．実際このような RNA を合成

はほぼグアニンとの複合体（3.2.2.2 節，35 ページ；図

し活性測定を行った結果，野生型 tRNA とほぼ同等の

3-11，36 ページ）の場合と同じであるが，tRNA との複活性を有することが明らかになった（表 5-2，51 ペー

合体における G15 の認識様式は，5.3.5 節で後述する

ジ，Microhelix）．このように，ArcTGT が認識する最小

ように，いくつか重要な違いがある．

構造は，一本鎖 RNA とそれに一部二本鎖領域を持つ
RNA であることがわかる．

5.3.4.3

ArcTGT はいかにして tRNA 15 位を探し当てているか

上述の最小構造は，正規の折り畳みを持つ tRNA には全く見られない構造である（図 5-5，53 ページ，パ序論で既に述べたとおり，過去の生化学的な実験の

ネル B）．tRNA がオルタナティブな折り畳みになる

結果から，ArcTGT は tRNA の塩基配列の情報に頼らことで，この最小構造が tRNA の部分構造として現れずにその 15 位を正確に探し当てることができることてくるわけである．即ち，上述の DV ステムや新しいが分かっていた．即ち，15 位を G 以外の残基に置換し， tRNA のコア構造は，tRNA が酵素に対してこのような更にその前後を G にしても，誤って前後の残基を交部分構造を提示する為に必要であると考えられる．

換してしまうことはない．同様に，G15 より手前に残ところで，P. horikoshii の生育温度（98°C）により近い基を挿入した場合も活性は大幅に低下している．しか70°C では，どの tRNA 変異体においても一律に 60%

し，逆に G15 より手前の残基（U8 から A14）をさまほど活性が上昇している．tRNA の折り畳みを維持す

ざまな配列に変えても（長さが変わらない限りは）もるようなコンポーネントが全く存在しない in vitro のとの tRNA とほぼ同程度に認識することができる（表アッセイ条件下では，tRNA は予期しない（例えば一1-1，4 ペ ー ジ；Watanabe et al., 2000）．15 位 の G が 厳

部変性した）高次構造を取っている可能性がある．上密に認識される機構はグアニンと ArcTGT の複合体の述のように，ArcTGT の認識に必要な最小構造はかな

構造から解明されたが，どのようにして 15 位を探し

り単純である（表 5-2，51 ページ，Microhelix）．この最当てているかは全く不明であった．

小構造を持つように一部変性した tRNA が基質とな

この ArcTGT の tRNA 認識機構は今回の結晶構造かり，活性が上がっている可能性が高い．しかし高温でら以下のように説明される．即ち，5.3.3 節（555 ペー

は，変性して一本鎖になった部分は容易に化学的，或ジ）から 5.3.4.2 節（60 ページ）にかけて述べたとおいは酵素的に分解されてしまうだろうし，好熱菌の細り，ArcTGT は tRNA の塩基を殆ど認識せずに各残基

胞内には tRNA の折り畳みを維持するコンポーネントのバックボーンの糖・燐酸をひとつずつ認識し 15 位が存在し，自発的な tRNA の変性を防いでいると考えを活性サイトに配置しているのである．まずアクセられる（例えば Thermus thermophilus 由来 Trbp111 など；

プター・ステムをドメイン C2 と C3 が厳密に認識す

Swairjo et al., 2000）．その為，P. horikoshii の細胞内におることで酵素に対してアクセプター･ステムを正確いて，未修飾・修飾後 tRNA が単独でかつ変性した状に配置し（図 5-9，56 ページ）
，次に，ドメイン C2 の態で存在しているとは考えにくい．

β18β19 ヘアピンは D アームがコアから飛び出す根元

以上のような理由から，70°C の測定結果より寧ろの部分の位置を正確に規定している（図 5-9，パネル

45°C の状態の方が生体内の状態を反映しているのでB； 図 5-10，57 ページ，パネル B）．更に，コアから飛はないだろうか．更には，中等度好熱性，或いは常温

び出した D アームの U8 から U13 は酵素のサブユニッ

古細菌を含め殆ど全ての古細菌に ArcTGT が見出され

トにまたがるクレフトの部分で長さが精密に認識されており，配列アラインメント上に生育温度に相関したており（図 5-12，59 ページ，パネル A），結果として大きな違い（ドメイン構成の違いなど）は見出されな

14 位が触媒ドメインのバレル構造の縁にあるポケッい（図 3-5，31 ページ；図 3-6，32 ページ）．ArcTGT にトに格納されるようになる．

よる tRNA 認識には温度による違いによらない共通の機構が存在すると推測され，それが ArcTGT と tRNA

5.3.4.4

ArcTGT による認識に必要な RNA の最小構造

以上の結果に基づくと，ArcTGT による認識に必要の相互作用や，DV ステムによるオルタナティブな
tRNA 高次構造の安定化であると考えられる．

な 最 小 構 造 は 図 5-2（50 ペ ー ジ ）， パ ネ ル A の よ う
61

第 5 章 ̶ ArcTGT による tRNA の認識機構

AB

図 5-14 ArcTGT・tRNA 複合体における触媒サイトの構造
全てステレオ図．(A) ArcTGT・tRNA 複合体における触媒サイトの構造．(B) ArcTGT・グアニン複合体における触媒サイトの構造．
酵素の Asp95，Asp249 残基と，tRNA の G15，U16 残基をオミットして計算した |Fo|–|Fc| 焼き鈍しオミットマップ（6.5σ レベルで表示）を暗青色で示した．(A)，(B) いずれも，酵素をリボンモデルで，核酸とその認識や触媒に関わっている酵素側の残基をスティックモ
デルで表示した．

5.3.5 触媒サイトの構造

5.3.5.2

Asp249 の役割

Asp249 は触媒サイトにみられる酸性残基の一つでArcTGT・tRNA 複合体における触媒サイトの構造とあり，求核触媒残基の候補のうちの一つであった．しG15 残基のグアニン基の認識様式は，3.2.2 節（35 ペー

かし，QueTGT 或いは ArcTGT と塩基のみとの複合体

ジ）で述べた ArcTGT・グアニン複合体の結晶構造のの結果からは，基質からかなり離れた位置に存在して場合と比較して劇的な変化は見られなかったものの，いた為（図 5-14，62 ページ，パネル B），触媒に関与

いくつかの重要な違いが見られた．

していないと推測されてきた．ところが，ArcTGT とtRNA の複合体においては，Asp249 のカルボキシル基

5.3.5.1

Phe99 の役割

が G15 のリボース基の C1′ にかなり近い位置（3.5 Å）

塩基のみを結合した ArcTGT の結晶構造では Phe99に存在している（図 5-14，パネル A）．この違いは，の芳香環は塩基の 5 員環とスタックしていたが（3.2.2.2

酵素に対して塩基が結合する位置が，塩基のみとの複節，35 ページ参照），tRNA との複合体では寧ろ G15 の合体の場合と tRNA との複合体の場合でかなり異なっ

リボースと相互作用しているように見える（図 6-2，67．即ち，ていることに起因する（図 5-14，パネル A，B）

ページ，パネル E）．この Phe99 は ArcTGT，QueTGT

リボースや燐酸だけでなく，前後の残基も存在する

で Tyr に保存されている．塩基交換反応の遷移状態でtRNA との複合体状態では，塩基の位置が塩基のみとは，G15 のリボース基はオキソカルベニウム・カチオの複合体に比べ，Asp249 側に移動しているのであるンになるが，Phe99 は π-カチオン相互作用によりオキ（図 5-14，パネル A）．一方で，従来求核残基であるとソカルベニウム・カチオンを安定化していると推測さ考えられていた Asp95 は，C1′ からかなり外れた（4.3 Å）

れる．

位置に存在していた．

62

0

0

0

0

5.3

考察

以上の結果を踏まえて，Asp249 を Ala，Asn にそれぞわっているということを強く示唆する結果と言える．

れ置換した変異体を作成し活性測定を行ったところ，

ArcTGT と小分子リガンドとの複合体構造解析（2.2.2

両変異体とも全く活性が検出されなかった（表 5-2，51

節，26 ページ）の結果も踏まえた塩基交換反応の機構

ページ）．この結果は，Asp249 が Asp95 と同様に，酸に関する議論は，6.1 節（65 ページ）に詳述した．

性残基である必要性を示している．また，Asp249 が単□に触媒サイトを形作るだけではなく，反応に直接関

63

第6章

総合討論

本章では，ArcTGT・tRNA 複合体の構造だけでなく，ArcTGT と小分子リガンドとの複合体の構造解析の結果も含め，「塩基交換反応の触媒機構」，「tRNA 修飾酵素による tRNA の認識機構」について総合的に議論した．また更に，本研究で解明された tRNA 認識機構が，他の系における酵素による RNA 認識の構造生物学的な基盤となる可能性等に関しても議論した．

6.1 塩基交換反応の触媒機構
6.1.1 Asp249 の役割

ArcTGT の Asp249 は His227 や Gly230 の主鎖のアミノ基と水素結合しているが，AlkA の求核残基（Asp）も周ε1

ArcTGT・tRNA 複合体における触媒サイトの構造か

囲の Trp272 残基の N と水素結合しており，置かれら，G15 の C1′ 原子に最も近く位置している酸性残基ている環境が類似している（図 6-1，パネル B）．このは，従来求核触媒残基であると考えられていた Asp95

AlkA ･ DNA 複合体における求核触媒と C1′ 相当原子

ではなく，Asp249 であった（5.3.5.2 節，102 ページ参照）． の距離は 3.2 Å であった．今回の結晶構造でも Asp239
δ1

しかしながら，ArcTGT・tRNA 複合体の結晶構造は分の O から G15 の C1′ の距離は上述のように 3.5 Å 程

解能が中程度であり，距離情報の信頼性が髙くないと度である．即ち，他の系との共通性からも，ArcTGTいう問題点がある．

において Asp249 が求核触媒として働いているというところで，Asp や Glu 残基が求核触媒として働き，仮説が支持されるのである．

かつ，酵素と糖が共有結合した中間体をへてグリコ

ただ，反応機構に関する Romier らの主張（Romier etシド結合が切断されるという反応は，他の酵素にもal., 1996b）に問題点があったように，結晶構造と単純

いくつか見られる．DNA 修復にかかわる DNA N-グな変異体の活性測定のみから結果を結論付けることは

リコシラーゼは，損傷を受けた DNA 残基の N-グリ

危険である．TGT においてどの残基が求核触媒に関

コシド結合を切断し，abase サイトを作り出す反応をわっているかどうかを解明するには，TGT と tRNA が触 媒 す る（Cunningham, 1997 ; Krokan et al., 1997）．E.

共有結合した中間体を質量分析等で解析し，実際にどcoli 由来 AlkA DNA グリコシラーゼはアルキル化されの残基が共有結合を形成しているかを解明する必要がた塩基を除去する DNA 修復酵素で，DNA との複合あるだろう．

体が髙分解能で解明されており，その結果から求核触媒残基 Asp による SN1 的な反応機構が提唱されて6.1.2 Asp95 の役割いる（Hollis et al., 2000）．E. coli AlkA ･ DNA 複合体の従来求核触媒残基であると言われてきた Asp95（Z.

構造と ArcTGT ･ tRNA 複合体の構造を標的残基のリ

mobilis QueTGT では Asp102）も，その Ala や Asn へのボースの配置を元に重ね合わせると，AlkA の求核残基置換体は全く活性を失う．その為，Asp95 も触媒機構

Asp238 は ArcTGT の Asp95 よ り も 寧 ろ，Asp249 と よにおいて何らかの重要な役割を果たしていると考えらく一致する（図 6-1，116 ページ，パネル A，B）
．また，

れる．
65

第 6 章 ̶ 総合討論

AB

図 6-1 ArcTGT・tRNA 複合体と , DNA 修復酵素 AlkA・DNA 複合体構造の触媒サイトの比較
全てステレオ図．(A) ArcTGT・tRNA 複合体における触媒サイトの構造．図 5-14（114 ページ），パネル A と同じものを比較の為再掲した．(B) DNA 修復酵素 AlkA・DNA 複合体（Hollis et al., 2000）の触媒サイトの構造．(A)，(B) いずれも，酵素をリボンモデルで，核酸とその認識や触媒に関わっている酵素側の残基をスティックモデルで表示した．

リガンド・フリーの ArcTGT，4 種類のリガンドとのるグアニンの互変異性体では N3 は脱プロトン化して複合体の構造を比較すると，Asp95 の側鎖が以下の 2

いる為，このプロトンは Asp95 によりもたらされた可種類のコンフォメーションを取りうるということがわ

能性が髙い．N3 のプロトン化により，基質ポケット

かる（tRNA との複合体も敢て比較すれば，(1) の分類に結合した状態の塩基にどのような変化が生じるかはに入る）：

未知であるが，塩基に正電荷を付与することは確かで

1.

側鎖が塩基のほうを向いたコンフォメーショ

ある．この正電荷が塩基の 9 位の電荷状態に影響する（図 3-9，67 ページ，パネ
ン．グアニン，preQ0，（正に分極する）可能性があると仮定すると，Asp95 にル B，C）との複合体，或いはグアノシンとの複よる塩基のプロトン化が原因で N-グリコシド結合が合体（図 6-2，118 ページ，パネル C）

切断されることになる．
（N9 が正に分極すると，そ側鎖が Asn63・Gln100 とそれらに水素結合しの電荷が N-グリコシド結合を通してリボースの O4′

た水分子の側を向いたコンフォメーション．

に転移しやすくなり，結果として N-グリコシド結合

リガンド･フリー，デオキシグアノシン類似体が切断されてオキソカルベニウム・カチオンが生じる．

（図 6-2，パネル A，B）．QueTGT・preQ1 複合体

図 6-3，120 ページ参照．
）

2.

の構造（図 6-2，パネル D）もこれに近い．

3.2.2.4 節（57 ページ）で述べた，グアノシンとの複δ2

すでに述べたように，塩基の 3 位と Asp95 の O 両合体の構造（図 3-12，70 ページ，パネル A）においては，

者が脱プロトン化した通常の状態では，Asp95 は両者

上述のような変化が起こった結果として N-グリコシの電荷の反撥により (1) のコンフォメーションを取り

ド結合が切断され，リボースが脱離した状態になって

δ2

にくいと考えられる．塩基の 3 位と Asp95 の O の間いると考えることが出来る．一方，デオキシグアノシにはプロトンが介在し，水素結合を形成している可能Asp95 の側鎖は 2 のコンフォン類似体との複合体では，性が髙い．そう仮定すると，通常の pH 環境下におけメーションを取っているが（図 6-2，パネル B），これ

66

6.1
δ2

塩基交換反応の触媒機構

は，何らかの理由で塩基の N3 と Asp95 の O が水素リガンドのほうであり，リガンド側の違いに起因して結合を形成できない為と考えられる．リボースの O4プロトン化していると考えた．
）′ が炭素に変わることで間接的に塩基の互変異性が影

ところで，Asp のカルボキシル基は通常の pH 下で響を受け，例えば N3 がプロトン化された状態が安定

は電離していると考えられる．上述の議論のように，

δ2化されたとすると，プロトン化された Asp95 の O は

Asp95 が基質のない状態でもプロトン化しているには，

N3 と反撥し，(1) のコンフォメーションを取れなくな

周囲にその状態を安定化するような環境が必要である．

δ2

るだろう．
（逆に塩基の N3 も，Asp95 の O も，とも

(2) のコンフォメーション（例えばリガンド・フリーに脱プロトン化していても電荷の反撥により同じ結果

ArcTGT の構造）では Asp95 は水分子を介して Asn63になりうる．しかし，グアノシンとの複合体とデオキと水素結合している．この相互作用がプロトンの供給

シグアノシン類似体との複合体で，異なっているのは源になる可能性がある．

A

Asp95

Asp95

Asn63

Asn63

B
Asp95

Asp95

dG analog

Gln100dG analog

Asn63

Gln100

Asn63

C

Asp95

Asp95
Gln100

Asn63

Gln100Asn63

図 6-2 Asp95 の向きの比較
全てステレオ図．(A) リガンド・フリー，(B) グアノシン，(C) デオキシグアノシン類似体 における，Asp95（或いは相当残基）の配座を同じ向きから示した．(C) に関しては，Asp95 をオミットした |Fo|–|Fc| 焼き鈍しオミットマップ（4σ レベル）を暗青色で示した．
（68 ページに続く）

67

第 6 章 ̶ 総合討論

D
preQ1

preQ1

Asp102

Asp102

E（67 ページから続く )（E）（D）QueTGT・preQ1 複 合 体，
ArcTGT・tRNA 複合体における，Asp95（或いは相当残基）の配座を同じ向きから示した（ステレオ図）．

A

B

C

N

N
O

O

O

14
O
O

P

N

OH

O

N
O

N

O

O

O

N

NH2

H
O

O

P

P

O

Asp95

16
O

P

N
O

OH

N
H

NH2

O

O

-

P

O

O

Asp95

16
O
O

P

P

N

OH

N

O

O

O

OH

P

O

NH2

O

O

N
O

Asp95

16
O
O

N
H

-

O

OH
O-

N

O-

O

N

O

OH
O-

O

N
O

O

O

N
O

O

N

OH

O

-

O

14

O-

OH

O

O

14

O-

O

N
O

P

OH
O-

図 6-3 塩基交換反応・第一段階目の反応機構
塩基交換反応の第一段階目の求核置換反応で起こっていると考えられる電子移動の模式図．(A) まず触媒サイトに結合したグアノ
シンの N3 が酸触媒として働く Asp95 によりプロトン化される．(B) 正電荷は塩基の共役した π 電子により非局在化する．正電荷は，塩基と周囲の残基（Asp130，Gln169，Gly196 等）との相互作用により，N9 位付近に非局在化するように制約されている可能性がある．
(C) 更に正電荷がリボース上に転移すると N グリコシド結合が切れ，オキソカルベニウムイオンが生じる．このカチオンが Asp249
により攻撃されると反応が次の段階に進むが，逆に，正電荷が塩基の方に戻れば，反応は振り出しにもどることになる．

ただ，この「Asp95 が酸触媒として働き N-グリコシ証も必要であろう．一方で，Asp95 とそれに相当する

ド結合の開裂を促進している」という仮説は，プロト

QueTGT の変異体解析では，この残基が酸性残基であンを観察することが出来る構造解析の手法（NMR やることが重要であると報告されているが（Kittendorf et

中性子線回折）を用いて実証する必要があるだろう．

al., 2001），これは上述の仮説を支持するものであると更には，Asp95 変異体 ArcTGT とグアノシンとの複合いえる．

体の結晶構造においてリボースが見出されるか等の検

68

6.2

ArcTGT による tRNA 認識と他の酵素･ RNA 相互作用の比較

6.2 ArcTGT による tRNA 認識と他の酵素･ RNA 相互作用の比較ページ）で述べたとおり，塩基特異性がないものに

6.2.1 QueTGT による tRNA 認識との比較なっていると考えられる．

序論 8 ページでも述べたように，QueTGT は tRNAのアンチコドン・ループの 34 位にキューオシンを導6.2.2 SnoRNP 複合体による基質 RNA 認識との対比

入する反応に関わっている酵素である．QueTGT による tRNA 認識は詳細に研究されており，その反応には真核生物の rRNA，snRNA には非常に多くの修飾がtRNA のアンチコドン･アームだけで十分であること含まれており（Gu et al., 1996; Maden, 1990），これらが分かっている（Curnow & Garcia, 1995）．また，Que-の 修 飾 は snoRNP に よ り 行 わ れ て い る（Kiss, 2001）．

TGT は 34 位とその前後の残基，即ち U33-G34-U35

snoRNP 複合体の RNA 構成要素 snoRNA は，修飾さを配列依存的に認識している（Nakanishi et al., 1994）．

れる rRNA，snRNA 標的サイト付近と相補的な配列を

このように ArcTGT と QueTGT の tRNA 認識は全く対持っている（図 6-5，122 ページ）
．snoRNA はこれら照的なものであるが，いくつか共通点が見出された．

の基質 RNA と二重鎖を形成することで修飾サイトを

即 ち，5.3.4.2 節（98 ペ ー ジ ）で 述 べ た よ う に，Arc-決定するガイドとして働いている．即ち，snoRNA は

TGT・tRNA 複合体の構造では，触媒ドメインのバレ

この相補領域の 3′ 側下流に特徴的な保存配列を持ち，ル構造のふちにあるポケットで A14，U16 が認識されsnoRNP の蛋白コンポーネントはこの保存配列を特異ていた．ArcTGT と QueTGT の分子表面を比較すると， 的に認識しつつ，この保存配列から標的サイトまでの
この塩基結合ポケットは QueTGT にも保存されてい距離と，ガイド･基質で形成された二重鎖を認識してることがわかる（図 6-4，121 ページ）
．上述のように修飾するサイトを決定していると言われている（Kiss,

QueTGT は tRNA の修飾標的の前後の残基 U33，U35

2001, 2002）．例えば，rRNA と snRNA の Ψ 化にかかわ残基の塩基を特異的に認識するが，Z. mobilis QueTGTる box H/ACA snoRNA は，H 或いは ACA box と呼ばれの結晶構造解析の結果から，Romier らは QueTGT とる保存配列と，その上流に修飾標的サイトと相補的

tRNA とのドッキングモデルを作成し，このポケットな配列を持っている．標的サイトと H/ACA box の間で前後の残基を結合すると予測していた（Romier et al.,は 14–16 残基と決まっており，snoRNP の蛋白質コン

1996a）．更に，前後の U 残基を特異的に認識するのポーネントが両者を認識して RNA の Ψ 化を行っていに重要であろう残基も推定されていた（Romier et al.,る（Bortolin et al., 1999; Ganot et al., 1997a; Ganot et al.,1996a）．QueTGT の前後の U33，U35 残基を特異的に

1997b; Ni et al., 1997; 図 6-5）
．また，rRNA と snRNA の認識していると推定される残基（Z. mobilis QueTGT の2′-O-メチル化にかかわる box C/D snoRNA も，同様に，

K52，K264，D267 等）は ArcTGT のポケットでは疎水

C 或いは D box と呼ばれる保存配列とその上流に修飾

性或いは小さな側鎖に置換している．その結果とし標的サイトと相補的な配列を持っており，これらのて ArcTGT のバレルのふちのポケットは 5.3.4.2 節（98保存配列と標的 RNA との相補部分により修飾サイト

A

B
G34

G15

U33

A14
U16

U35

図 6-4 ArcTGT，QueTGT の RNA 結合ポケットの比較(A) ArcTGT，(B) QueTGT の RNA 結合ポケットの比較．両者とも酵素は表面モデルで示した．また，RNA残基の結合ポケットを円で示した．

69

第 6 章 ̶ 総合討論

A

B

5'

Box D'AGUC

Box C'AGUAGU

CH3

NΨ

3'

NΨ
3'

CH3

rRNA
snRNA

rRNA/snRNA
3'

AGUAGUR
Box C

AGUC
Box D

5'

rRNA
snRNA

5'
5'

m3GpppANANNA
Box H

3'

5'

ACA NNNOH
Box ACA

m3Gppp3'OH

図 6-5 SnoRNA による基質 RNA 認識(A) Box H/ACA snoRNA と rRNA 或いは snRNA との複合体の模式図．シュードウリジン化されるサイトを Ψ で示した．(B) Box CD
snoRNA と rRNA 或いは snRNA との複合体の模式図．メチル化されるサイトを CH3 で示した．

が決定されている（Cavaille et al., 1996; Kiss-Laszlo et al.,ターゲットとなる U 残基を正確に結合しているので1996; Tycowski et al., 1996; 図 6-5）．

はないだろうか．

このように，ArcTGT による tRNA 認識と snoRNP 複

ところで，序論 9 ページでも述べた，先天性角化異合体による基質 RNA 認識には「位置特異的な RNA 認常症の家系において最も頻繁に見つかっている変異識」という点において関連性が多い．ArcTGT は tRNA

A353V は，PUA ドメインの RNA 相互作用に関わってアクセプター･ステムの末端から 15 残基目（途中に二いる面とは逆側に位置していた．その為，dyskerin の重鎖部分を含む）の G を配列に依存せずに認識してい

PUA ドメインが ArcTGT の PUA ドメインと同じ様式

るが，上記の box H/ACA snoRNP も，H/ACA box からで RNA 認識に関わっていると仮定すると，この変異

14–16 残基目（途中に二重鎖部分を含む）を認識し，Ψ

は RNA 認識を阻害するものではないと推測される．

を導入している．更に，この box H/ACA snoRNP の触SnoRNP には Cbf5p/dyskerin 以外の蛋白質コンポーネ媒コンポーネントである Cbf5p は C 末端に PUA ドメ

ントが数種類存在しており，A353 は蛋白・蛋白間の疎インを持っている．

水的相互作用に関わっている可能性が考えられる．

ArcTGT の ド メ イ ン C3 は， 序 論 で 既 に 述 べ た よう に「PUA ド メ イ ン 」（Aravind & Koonin, 1999）と相 同 性 が あ る． 特 に ArcTGT の ド メ イ ン C3 は， こ

6.2.3 構造変化による修飾導入は RNA 以外の系にありうるか？

の Cbf5p の PUA ドメインと相同性が髙い（図 3-6，65

生体髙分子の化学修飾は，RNA のみならず，蛋白質ページ）．ArcTGT でステム認識に関わっている上述にも数多く見出されている．特に，チロシン，セリンの残基（Lys576，Arg578）は Cbf5p においても保存されの燐酸化や塩基性残基のアセチル化，メチル化は，生ており，これらの残基が Cbf5p でも RNA ステムの認体内で重要な役割を果たしている．しかし，これらは識に関わっている可能性がある．ArcTGT と Cbf5p の

いずれも分子認識にかかわっているものであり（燐酸PUA ドメインは，「位置特異的な RNA 認識」におい

化は細胞内シグナル伝達系に良く見出され，アセチルて，RNA のステムを正確に認識して配置する，という化はヒストン蛋白質等に良く見出されている），修飾

共通の役割を担っている可能性がある．即ち，Cbf5p

サイトは分子表面に露出している．

と snoRNP の他の構成要素は，H/ACA box を配列特異

一方で，構造安定化にかかわっている蛋白質の修飾的に認識し，その部分から RNA バックボーンの燐酸

は，コラーゲンのヒドロキシプロリンが挙げられる．

を 1 残基ずつ数えるように認識しつつ，ArcTGT の場

コラーゲンは 3 本のポリペプチド鎖がより合わさった合と同様に rRNA/snRNA とガイド RNA により形成さ三重らせん（プロコラーゲン）を形成し，更にその三れるステム構造を PUA ドメインにより正確に認識し，重らせんが複数会合して繊維を形成している．この三重らせん同士の相互作用にヒドロキシプロリンの水酸

70

6.3

オルタナティブ型 tRNA の意義基が重要であり，この修飾が正常に行われないと出血

現時点では，RNA 以外の系において，大きな構造変性の傷害が各器官に起こる「壊血病」になることは有化を伴って構造安定化する修飾が導入される例を挙げ名である．ただ，この修飾サイトは三重らせん繊維とることは出来ないが，今後見つかってくる可能性は十いう単純な構造の表面に露出している為，コラーゲン

分にあると考えられる．

の修飾には構造変化は不要である．

6.3 オルタナティブ型 tRNA の意義
一方で，このような tRNA の大きな構造変化の繰り6.3.1 tRNA 修飾酵素の超分子複合体 “modiﬁco-

返しは，tRNA の熟成過程において大きな律速段階に

some”

-1
なると推測される（P. horikoshii ArcTGT の kcat は 0.082 s

本研究で解明した ArcTGT ･ tRNA 複合体の結晶構程度である ; Watanabe et al., 2000）．更に，それぞれの造から，tRNA コアに埋もれた 15 位の修飾は，二次構tRNA コアを修飾する酵素が，個別に構造変化を起こ

造・髙次構造を組替えたオルタナティブ型 tRNA をした tRNA を認識していたのでは非常に効率が悪い

認識して行われていることがわかった．15 位の修飾だろう．また，構造変化の途中段階では，露出したは古細菌に特有のものであるが，tRNA コアには他に，コアがヌクレアーゼ等により分解されてしまう危険s U8, m G9, m G10, Ψ13, m A22, m 2G26, m G46, m C48

や，他の分子と誤った相互作用を起こし不可逆的な変等，普遍的に存在する修飾を含め，数多くの修飾が存性を起こしてしまう危険性も伴う．真核生物の rRNA

在している（Sprinzl et al., 1998; 図 1-4，4 ページ）
．これや snRNA の熟成は，“processosome” と呼ばれる超分子らの修飾も，このようなオルタナティブ型の tRNA を

複合体で行われているということが提唱されているが認識して行われている可能性があると考えられる．

（Eichler & Craig, 1994），tRNA の場合も，修飾酵素が細

4

A

1

2

1

Canonical-form
tRNA

TruB

C

2

7

5

B
Alternative-form
tRNA

TruB

TruB
図 6-6 TruB によるオルタナティブ型 tRNA 認識の可能性(A) TruB（Hoang & Ferré-D’Amaré, 2001）と正規のL 字型 tRNA とのドッキングモデル．D ループの部分が酵素にめり込んでしまうことがわかる．(B)TruB とオルタナティブ型 tRNA とのドッキングモ
デル．D ループは TΨC ループと相互作用していな
い為，TruB は立体障碍なしに，tRNA に結合できる．
(C) ArcTGT・tRNA 複合体に TruB が結合したドッキ
ングモデル．ArcTGT と TruB の tRNA 認識領域はお互い重ならない為，ArcTGT と TruB はぶつかることなしにオルタナティブ型 tRNA に結合できる．

71

第 6 章 ̶ 総合討論

胞内で局在化して弱い超分子複合体を形成し，構造変化を起こした tRNA に一度に修飾を導入するような機構が存在するのではないだろうか．

6.3.2 Ψ 55 修飾酵素 TruB との比較

6.3.3 RNA シャペロンとしての ArcTGTRNA 修飾酵素は，修飾を導入するだけでなく，RNAの折り畳みを助けるシャペロンとして働いている可能性が示唆されている（Gutgsell et al., 2000; Ofengand,

近 年，tRNA 修 飾 酵 素 の 一 つ で あ る Ψ55 合 成 酵 素2002）．即ち，修飾酵素は RNA に修飾を導入するこ

TruB と ス テ ム ･ ル ー プ RNA 複 合 体 の 結 晶 構 造 が 解とで RNA の折りたたみの道筋に「しるし」を付け，

明 さ れ た． そ の 結 果 に よ る と，TruB は TΨC ル ー プ

誤って RNA が折りたたみの道筋を逆行したり，変性に酵素の His43 とその前後の残基を挿入し U55 をフした状態に陥ったりしないようにする役割があると推リップさせて触媒サイトに結合させていた（Hoang &測されている．

Ferré-D’Amaré, 2001）．正規の tRNA においては，この本研究の結果から，ArcTGT は主に tRNA のアクセ

His43 が存在する位置には，U55 と塩基対を形成してプター･ステムと引き延ばされた D アームを認識している G18 が存在している．実際，TruB と正規の L 字いることが明らかになったが，tRNA の D アームは他型 tRNA のドッキングモデルを作成すると，D ループの部分と比べて誤ったコンフォメーションを取りや側が TruB に大きくめり込んでしまうことがわかる（図すく，誤った二量体化などに関与していることが示唆

6-6，126 ページ，パネル A）．ところで，ArcTGT に結されている（Kholod et al., 1998b）．更に，このような合した状態のオルタナティブ型 tRNA では，D ループ

二量体化した tRNA が，アミノアシル tRNA 合成酵素

が tRNA から飛び出し，TΨC ループとの相互作用を完の基質になりにくいことも報告されている（Kholod et

全に失っていた（図 5-4，106 ページ，パネル A）．その

al., 1998a）．また，ミトコンドリア tRNA の遺伝子の為，TruB は D ループ側と全く衝突することなしにオ変異が原因とされているある種のミトコンドリア病

ルタナティブ型 tRNA と結合できる（図 6-6，パネル

においては，D ループ上の残基の変異により tRNA のB）．

二量体化が促進されることと病気の関連が指摘され

更 に，ArcTGT と TruB は， こ の オ ル タ ナ テ ィ ブ 型ている（Wittenhagen & Kelley, 2002）．実際，P. horikoshii

tRNA に全くぶつかることなく同時に結合できる（図tRNAVal の T7 転写産物も，非変性 PAGE の結果から，

6-6，パネル C）．ArcTGT は古細菌の酵素であるが，かなり割合で二量体化していると推測された（図 4-2，古細菌 tRNA にも Ψ55 が存在する為，TruB の相同分子

81 ページ）．更に，この転写産物に ArcTGT を添加す種は存在している筈である（P. horikoshii ゲノム上にもると，二量体化していると推測されるバンドは完全にTruB と推定される ORF が存在する）．もちろん TruB

消失した（図 4-2）．ArcTGT は本来 D アームどうしで自体，in vitro で他のコンポーネントなしに tRNA を修縺れやすい tRNA の D アームを引き延ばして結合し，飾できるが（Nurse et al., 1995），in vivo において，他の正常にコアを形成させるシャペロンとして働いている修飾酵素と共同し，より効率的に tRNA を修飾していと推測される．更には，ArcTGT を含むほかの修飾酵る可能性があるだろう．上述のような tRNA 修飾酵素

素も，6.3.1 節（125 ページ）で述べたような超分子複の超分子複合体中で，この図のような状態がスナップ合体を形成して，順序だてて tRNA に修飾を導入しつショットとして存在しているのではないだろうか．

つ，折り畳みを進行させている可能性がある．

72

6.4

オルタナティブ型 tRNA とミトコンドリア tRNA の対比

6.4 オルタナティブ型 tRNA とミトコンドリア tRNA の対比
ミ ト コ ン ド リ ア に は， 通 常 の tRNA と は か な り

ムの配列がワトソンクリック塩基対を組めないよう

異 な っ た 二 次 構 造 を と る と 推 測 さ れ る tRNA が 数になっている（図 6-7）
．これらの，D ステムが形成で多く知られており，中には完全に D アームを欠失きない，或いは D アームを欠失したミトコンドリア

し て い る も の も 存 在 す る（Okimoto & Wolstenholme,tRNA は，以下のようなステップを経て，オルタナ

1990; Watanabe et al., 1994; Wolstenholme et al., 1987;

ティブ型の tRNA から進化したのではないだろうか．

Wolstenholme et al., 1994）．正規の L 字型 tRNA の構造

1.

D ステムに変異が入り，D ステムが組めなくを元にしたモデリングから，D アームを欠失したミなった tRNA は，必然的に（正規の L 字型よりトコンドリア tRNA でも L 字型の構造を取りうるこは）オルタナティブな L 字型構造をとりやすくとが推測されている（Steinberg et al., 1994）．また，D

なる．オルタナティブ型 tRNA は正規の L 字型

Ser

アームの大部分を欠失した Ascaris suum mt-tRNA (UCU)tRNA とアクセプター，アンチコドンの配置がの NMR 法による構造解析の結果からは，短くなっ類似している為，翻訳マシナリー中で（効率はた D アームとバリアブル･ループがステム構造を形成

落ちるかもしれないが）正常に働くことが出来

し，アンチコドンステムの上方にスタックしているこると考えられる（X. laevis mt-tRNAとが判明している（Ohtsuki et al., 2002; 図 6-7，128 ペー階に相当）．

ジ）．これらの研究結果から推定されるミトコンドリ

Asn

2.

はこの段

ステム・ループ構造が取れない D アームに欠

ア tRNA の髙次構造は，本研究で明らかになったオル

失変異が起こり，短くなったとしても，オル

タナティブ型 tRNA の髙次構造と共通点が多い．特に，

タナティブ型構造の tRNA は L 字型構造を取る

オルタナティブ型 tRNA で見られた DV ステムを中心ことが出来る（A. suum mt-tRNA はこの段階にとしたコア構造は，上記のミトコンドリア tRNA のコ

相当）．

Ser

このようにしてミトコンドリアの tRNA は，翻訳マ

ア構造と非常に類似している（図 6-7）．
一 方 で， 大 幅 に D ア ー ム を 欠 い た A. suum mtSer

シナリー中で機能できるという最小限の要求を満たし

tRNA と正規の tRNA の中間状態のような 2 次構造

つつ，出来るだけ短い tRNA へと進化した可能性が考を持つミトコンドリア tRNA も存在する．例えば，

えられる．

Asn

Xenopus laevis mt-tRNA（Roe et al., 1985）は正規の

□

(GUU)

tRNA とほぼ同じ長さの D アームを有するが，D ステ

Pyrococcus horikoshii

.
-

-

.
-

35

C
54

1
UCCA
G.U
A-U
C-G
A-U
A-U
A-U
40
U.G
8
C C U AAG34
A
U UG G A G
U U
U U
U .U
C -G
A -U
15 G - C 27
G .U
U -A
C A
U 21 A
UCU

-

74

1
GCCA
U-A
A-U
G - C 68
A-U
A-U
U-U
57
G-C
10
A GG
UGCCC
UCGAA
C
G
GU U GG
GCGGG
A-U
A UC
U.U
U.G
.
74
AG U
GCCA
G U - AA
1
U-A
U -A
A-U
U -A
G - C 68
28 A - U 38
A-U
G -C
A-U
57
U-U
C A
AG G
G-C
U
A
14
UGCCC
A
GUU
G
U G C U C GA
GCGGG
33
U
A UC
U
G
U
GA U U G AG
G
U -A AUU -A
U -A
28 A - U 38
G -C
C A
U
A
GUU

-

B

76

1
ACCA
G-C
G-C
G - C 70
C-G
C-G
59
C-G
G-C
10
U AA
GCCCC
U
C
U
G
G
U
A
G
G
CGGGG
UU
A U G- C
U UC
GGUC
A- U
20
C- G
G
76
G
ACCA
C GA
1
G-C
C -G
G-C
G -C
G - C 70
30 C - G 40
C-G
C -G
C-G
C A
59
C - G 66
U
G
U AA
15
G-C
UAC
GCCCC
U
UGA
G
G
U
35
49
CGGGG
U C U G 10
G
U UC
C
G
U
U
G
A
C
U C A
G
G
26
C -G AG
C -G
G -C
30 C - G 40
C -G
C A
U
G
UAC

-

A

Ascaris suum mt

33

Xenopus laevis mt

図 6-7 オルタナティブ型 tRNA とミトコンドリア tRNA の構造(A) 通常の tRNA，(B) X. laevis ミトコンドリア tRNAAsn(GUU)，(C) A. suum mt-tRNASer(UCU)，それぞれの二次構造模式図．(A) と (B) に関しては，オルタナティブ型の状態の二次構造も示した．

73

Appendix. A

記号･略号及び備考

A.1 アミノ酸の略号
略号

英語表記

A.2 核酸の略号

日本語表記

略号

英語表記

日本語表記

A, Alaalanineアラニン

A, Adeadenosine

アデノシン

C, Cyscysteine

システイン

C, Cytcytidine

シチジン

D, Aspaspartic acid

アスパラギン酸

G, Guaguanosine

グアノシン

E, Gluglutamic acidグルタミン酸Gun

guanineグアニン

F, Phephenylalanine

フェニルアラニン

T, m5Uthymidine

G, Glyglycine

グリシン

チミジン；
5-メチルウリジン

H, Hishistidine

ヒスチジン

U, Uriuridineウリジン

I, Ileisoleucine

イソロイシンQ

queuosine

キューオシンK, Lyslysineリジン

preQ07-cyano-7-deazaguanine

7-シアノ-7-デアザグアニ
ンL, Leuleucine

ロイシン

preQ1

M, Metmethionine

メチオニン

7-aminomethyl-7deazaguanine

7-アミノメチル-7-デアザ
グアニン

N, Asnasparagine

アスパラギンΨ

pseudouridine

シュードウリジン

P, Proprolineプロリン

Ddihydrouridine

ジヒドロウリジン

4sU

4-thiouridine

4-チオウリジン

Gm2′-O-methylguanosine

2′-O-メチルグアノシン

m1 G

1-methylguanosine

1-メチルグアノシン

m2 G

N 2-methylguanosine

N 2-メチルグアノシン

Q, Glnglutamine

グルタミン

R, Argarginine

アルギニン

S, Serserineセリン

T, Thrthreonine

スレオニン

V, Valvalineバリン

m22G

N 2,N 2-dimethyl
guanosine

N 2,N 2-ジメチルグアノシン

W, Trptryptophan

トリプトファン

m 5C

5-methylcytidine

5-メチルシチジン

Y, Tyrtyrosine

チロシン

11-methyladenosine

1-メチルアデノシン

mA

75

Appendix. A ̶ 記号･略号及び備考

A.3 その他の略号

略号

76

英語表記

日本語表記

RNA

ribonucleic acid

リボ核酸

DNA

deoxyribonucleic acid

デオキシリボ核酸

TGT

tRNA-guanine transglycosylasetRNA グアニントランスグリコシラーゼ

ArcTGT

Archaeosine TGT

アーケオシン TGTQueTGT

Queuosine TGT

キューオシン TGT

TruBtRNA Ψ55 pseudouridine synthasetRNA Ψ55 合成酵素

GMP

guanosine 5′-monophosphate

グアノシン 5′- 一燐酸ATPadenosine 5′-triphosphate

アデノシン 5′- 三燐酸CTP

cytidine 5′-triphosphate

シチジン 5′- 三燐酸GTPguanosine 5′-triphosphate

グアノシン 5′- 三燐酸UTPuridine 5′-triphosphate

ウリジン 5′- 三燐酸Tristris[hydroxymethyl]aminomethane

トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン

HEPES

N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N ′-[2-ethanesulfonic acid]ADA

N-[2-acetamido]-2-iminodiacetic acid

IPTG

isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside

MPD(±)-2-methyl-2,4-pentanediol(±)-2-メチル -2,4-ペンタンジオール

DTTdithiothreitol

ジチオスレイトール

2-ME

2-mercaptoethanol

2-メルカプトエタノール

PAGE

polyacrylamide gel electrophoresis

ポリアクリルアミドゲル電気泳動

PCR

polymerase chain reaction

ポリメラーゼ連鎖反応

PMSF

phenyl-methylsulfonyl ﬂuoride

フッ化フェニルメチルスルフォニル

r. m. s. d.

root-mean square deviation

M.W.C.O.

molecular weight cut oﬀ

NCS

non-crystallographic symmetry

ORF

open reading frametRNAtransfer RNA

転移 RNArRNA

ribosomal RNA

リボソーム RNA

snRNA

small nuclear RNA

核内低分子 RNA

snoRNA

small nucleolar RNA

核小体低分子 RNA

snoRNP

small nucleolus ribonucleoprotein

核小体低分子リボ核蛋白質

CBB

coomassie brilliant blue

クマジーブリリアントブルー

TCA

trichloro acetic acid

トリクロロ酢酸MAD

multi-wavelength anomalous dispersion

多波長異常分散

NMR

nuclear magnetic resonance

核磁気共鳴

MD

molecular dynamics

分子動力学法Appendix. A ̶ 記号･略号及び備考

A.4 備考･酸素，および窒素原子が 3.5 Å 以内の距離で相対し，適切な配向をとるとき水素結合を形成していると
みなした．

･

相対する原子が 5.0 Å 以内の距離に存在し，かつ両原子間の相互作用が水素結合とみなされない場合，
van der Waals 相互作用を形成しているとみなした．

･

アミノ酸，核酸の残基名，原子名は，PDB (Protein Data Bank) Format Description Version 2.2 に準拠する表記
方法によった．ただし，′ (prime) やギリシャ文字はそのまま表記している．

77

Appendix. B

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謝辞

謝辞
本硏究は，指導教官の横山茂之教授の熱心なご指導と温かい激励のもとでおこなわれたものです．心から感謝いたします．本硏究の遂行にあたり，実験技術をはじめとする硏究全般にわたって丁寧なご指導をして下さった横山硏究室の濡木理助教授に心から感謝いたします．
SPring-8 での測定に関しては，理硏播磨硏究所の神谷信夫室長，髙輝度光科学硏究センターの河本正秀硏究員，
酒井久伸硏究員（以上 BL41XU），理硏播磨硏究所の足立伸一硏究員（BL44B2），河野能顕硏究員（BL45PX）より惜しみない援助を頂きました．深く感謝いたします．本硏究は，SPring-8 の髙輝度な X 線なくしては，遂行できなかったであろうことを追記しておきます．
坂本健作助手をはじめとする横山硏究室の皆様と，理硏ゲノム科学総合硏究センターの武藤裕博士，北畠真博士，行木信一博士，寺田貴帆博士には，硏究面で多大なご助言，ご指導および激励を頂きました．特に，深井周也博士には結晶構造解析に関する多くの助言をいただきました．心より感謝いたします．秘書の武藤喜里子さん，武藤久美さんには，事務面で様々な便宜を図っていただきました．深く感謝いたします．
東京業大学・生命理

学部・岡田硏究室の岡田典弘先生，渡邉正勝博士，雉本禎哉さんには，酵素の精製や発現系を譲与して頂いただけでなく，数々の貴重なご助言を頂きました．深く感謝いたします．
理化学硏究所・生体分子解析室の瀧尾擴士博士にはセレノメチオニン標識体酵素の質量分析をしていただきました．深く感謝いたします．
東京医科歯科大学・生体材料

学硏究所・杉山弘先生にはデオキシグアノシン類似体を頂きました．貴重な試料を譲与して頂いたことを深く感謝いたします．
最後に，大学院での硏究生活を支援して下さった両親に心より感謝いたします．

2003 年 2 月
石谷 隆一郎83