評価報告書

急性経口毒性を予測するための in vitro 細胞毒性試験

急性毒性試験資料編纂委員会

平成 30 年（2018 年）年 12 月 11 日

19

急性毒性試験資料編纂委員会
委員長

髙橋

祐次

国立医薬品食品衛生研究所

委員

栗原

正明

国際医療福祉大学（元国立医薬品食品研究所）

笠原利彦

富士フイルム株式会社

若栗忍

一般財団法人萩野

滋延

株式会社資生堂

本山径子

ヤンセンファーマ株式会社

仲井俊司

一般社団法人オブザーバー

2
10

食品薬品安全センター秦野研究所

日本化学工業協会

略語
CLP

Classification, labelling and packaging

CV

Coefficient of variation

DMSO

Dimethyl sulfoxide

ECVAM

European Centre for the Validation of Alternative Methods

EU

European Union

EU CLP

European Union Classification, Labelling and Packaging

GD

Guidance document

UN GHS

Globally harmonised system of classification and labelling by United Nations

HSL

Health and Safety Laboratory, UK

IC50

Concentration producing 50% inhibition of the endpoint measured

ICCVAM

International Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods

IIVS

The Institute for In Vitro Sciences

JRC

Joint Research Center

LD50

Dose that produces lethality in 50% of test animals

MW

Molecular weight

NCD

New chemical database

NICEATMNTP Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods

NR

Neutral red

NRU

Neutral red uptake cytotoxicity assay

NRU EUC

Neutral red uptake cytotoxicity assay for evaluation of unclassified chemicals.
本評価書の対象となった 3T3 NRU により LD50 が＞2,000 mg/kg であることを予測する評価方法

NTP

National Toxicology ProgramOECD

Organisation for Economic Cooperation and Development

RC

Registry of Cytotoxicity

ROC

Receiver operating characteristic

3T3

Cell line derived from BALB/c mouse fibroblasts

TG

Test Guideline

TTX

Tetrodotoxin

3
11

要旨
急性経口投与毒性試験は、動物に化合物を投与したときに発現する有害な影響を質的・量的に明らかにする目的で実施される。毒性発現の究極である「死亡」をエンドポイントとして、投与された動物の半数を致死させる用量（50% Lethal Dose: LD50）は化合物の毒性の強さを共通の指標で示すことができる利便性がある。このため国際的には UN GHS、我が国においては毒物および劇物取締法のもとで、化合物のハザードに応じて取り扱い方法を区別するための規制上の分類と表示のために使用されている。
動物を用いた急性経口毒性試験は、動物使用数を削減するように改良された代替法として、固定用量法（TG420）、急性毒性等級法（TG423）、上げ下げ法（TG425）の 3 種類がOECD から推奨されているが、生きた動物を用いること、また、動物への激しい苦痛を与える可能性が高いことから、依然として批判の対象となっており、その代替法の確立が望まれている。マウス線維芽細胞由来の細胞株である 3T3 細胞を用いた Neutral Red Uptake
cytotoxicity assay （3T3 NRU）は、細胞毒性を評価する方法として広く一般に利用されている。ICCVAM から提案された「in vitro 細胞毒性試験による急性毒性試験の初回投与量設定試験」は、3T3 NRU を用いて化合物の細胞毒性を評価した in vitro 試験の IC50 とデータベー
スから得られた in vivo 試験の LD50 値の相関関係に注目し、その回帰分析によって得られた関係式から LD50 値を予測し、in vivo 急性毒性を実施する際の初回投与量を決定する試験である。本法は in vivo 急性経口毒性試験に要する動物数の削減を目的として OECD ガイダン
スドキュメント（OECD GD 129）に収載されている。
Follow-up study on the predictive capacity of the 3T3 Neutral Red Uptake cytotoxicity assay tocorrectly identify substances not classified for acute oral toxicity under the EU CLP system (LD50>2,000 mg/kg、以下、本評価書）では既報の ICCVAM の関係式を用い、LD50 値が> 2,000 mg/kg
であるか、すなわち EU CLP 区分外（Unclassified、UC）、UN GHS 区分 5 と分類される化合物を識別する方法として ECVAM から提案されたものである。以下、本評価方法を NRUEUC (Neutral Red Uptake cytotoxicity assay for Evaluation of Unclassified Chemicals)と記載する。
IC50 から LD50 の予測に使用された関係式は 2 種類あり、LD50 値と IC50 値の表記単位はモル濃度あるいは質量濃度が使用されている。
（１） Millimole regression model（モル濃度関係式）
log LD50 (mmol/kg)=0.439 x log IC50 (mM) + 0.621（２） Weight regression model（重量濃度関係式）
log LD50 (mg/kg)=0.372 x log IC50 (μg/mL) + 2.024

3T3 NRU の頑健性等の一般的な内容ついては、本報告書の基盤となった ICCVAM の既報
告で確認されており、評価に使用するのに妥当であると判断した。
ECVAM のバリデーション研究の被験物質として、信頼できる in vivo データが入手可能であり、かつ、in vitro 試験の実施が可能である 56 化合物が選択されている。この選択方法
4
12

に妥当性はあるが、LD50 値が> 2,000 mg/kg であることを示すために必要となる濃度が、一般に in vitro 試験の上限とされる 10mM を超えるため適切な評価ができないと考えられる分
子量 174 以下の化合物が 27 あり、適切な試験の実施という観点からは課題と考えられた。
一方、同じく上限とされている 5 mg/mL とした場合には、適切な評価ができないと考えられる分子量 77 以下は 4 化合物であった。なお、本バリデーション研究のプロトコルでは試験最高濃度は 10 mg/mL と一般的な in vitro 試験の最高濃度（10mM, 5mg/mL）と比較すると高濃度であるが、これにより、ほとんどの化合物で IC50 値が求められた。また、IC50 値が10mg/mL より大きい場合には 10mg/mL として式(2)に当てはめることにより評価が可能である。結果として、十分な数の化合物を用いて NRU-EUC が評価されていたと考えられた。
NRU-EUC のバリデーションの正確性および信頼性、並びに試験方法のデータの質については、in vitro 試験を実施するために適切な物性を有している化合物に対しては、バリデー
ション研究として十分であると結論した。一方、水に難溶解性である化合物および揮発性を有するなど in vitro 試験に適さない物性を有する化合物においては実験結果の再現性は低い。
特に、NRU-EUC は LD50 が>2,000mg/kg であることを評価することを目的とした試験である
ため、3T3 NRU を高濃度において実施する必要があり被験物質の溶解性に対する考慮は重要である。
NRU-EUC は in vivo 急性経口毒性試験の代替（Replacement）であり、急性経口毒性試験における使用動物数の削減（Reduction）および死亡動物の削減や動物への苦痛・ストレスの軽減（Refinement）に貢献できる。工業的に利用される化合物では、その約 87％が LD50＞
2,000 mg/kg に分類されているため、細胞毒性のみで判断する本アプローチを実施した場合、動物削減に大きく寄与し、費用対効果が妥当であることが推測される。しかしながら、物性面の制約から 3T3 NRU により適切に評価できる化合物は限定的であり、周辺情報が乏しい
ハザードが未知の物質に対して 3T3 NRU 試験を適用した場合、判断を誤る可能性がある。
一方、市場で既に使用されており急性毒性について確度の高い情報がある化合物と規格が僅かに異なる物質あるいは製剤、既知の化合物と類似性が極めて高い物質についてのみ利用できる可能性がある。具体的には、毒物劇物を含む製剤の除外申請において利用できる可能性がある。劇物からの除外申請においては、原体に関する急性毒性の情報が存在しており、細胞毒性や in vivo での毒性が問題とならない溶媒に溶解または懸濁した状態で供される製剤では、本評価法の実施において問題となる溶解性の問題を回避でき、適切に評価できる可能性がある。
結論として、規制上の利用では新規化合物への適用はその化合物自体や類似物質の情報が十分に無い場合には困難であるが、十分な周辺情報がある化合物や製剤のスクリーニン
グや更に評価すべき物質をランク付けするために使用することは可能であると判断した。

513

1． 試験法の科学的、規制の上での妥当性
急性経口毒性試験から求められる LD50 は、化合物の危険度に応じて取り扱い方法の区別をするための「分類と表示」に使用されている。現在、LD50 を推定するための OECD のガ
イドラインとしては固定用量法（TG420、2001 年）1)、急性毒性等級法（TG423、2001 年）2)、
上げ下げ法（TG425、2006 年）3)が使用されている。これらの TG は被験物質に規制上の限界用量である 2,000 mg/kg（例外的に 5,000 mg/kg）を超える用量でしか毒性を発現しない可能性が高いことを示す情報がある場合には、当該用量を開始用量とする「限度試験」が用いられる。EURL ECVAM Recommendation on the 3T3 Neutral Red Uptake Cytotoxicity Assay for
Acute Oral Toxicity Testing（以下、本評価書）は、これらの代替法として、LD50＞2,000 mg/kg
であることを 3T3 細胞を用いた Neutral Red Uptake cytotoxicity assay(以下、3T3 NRU)により判定する方法として ECVAM より提案されたものである 4)。LD50 が 2,000 ㎎/㎏を超える化
合物は、UN GHS では区分 5 相当、EU CLP では区分外（Unclassified、UC）に相当する。以下、本評価方法を NRU-EUC (Neutral red uptake cytotoxicity assay for evaluation of unclassified
chemicals)と記載する。
In vitro の IC50 値データから in vivo の LD50 値を予測する方法は「in vitro 細胞毒性試験による急性経口毒性試験の初回投与量設定試験（2006）」として ICCVAM のバリデーション
研究の結果から OECD で推薦されているが、その予測モデルの基盤となったのは、Helle の報告したげっ歯類の LD50 値と in vitro 試験で得られた様々な細胞毒性試験の IC50 値によるデータベース、Registry of Cytotoxicity (RC)である。これらのデータは in vivo の LD50 値をmmol/kg として、in vitro のデータを mM として回帰式、RC millimole regression （図 1）として示されている。

図１

NRU-EUC の基盤となった IC50 と LD50 の RC millimole regression

Halle W. 2003. The Registry of Cytotoxicity: Toxicity testing in cell cultures to predict acute toxicity (LD50) andto reduce testing in animals. Altern Lab Anim 31:89-198. (English translation of Halle 1998)
ICCVAM. BACKGROUND REVIEW DOCUMENT In Vitro Cytotoxicity Test Methods for Estimating Acute
Oral Systemic Toxicity, 2006.

614

ニュートラル・レッド（NR）は水溶性の弱陽イオン超生体染色色素である。正常な細胞では、NR は細胞形質膜を透過して陰イオン性のライソゾームマトリクスに結合して濃縮されるが、化合物によって細胞毒性が生じた場合には取り込まれる NR が減少する。NR の取り込み量と生細胞数が比例関係にあることを利用して細胞毒性の評価が可能である。
NICEATM/ECVAM のバリデーション研究で 3T3 NRU を選択した理由としては、細胞の入手が容易であること、前出の ICCVAM のバリデーション研究 5, 6)の報告において再現性が高く適用限界も明らかであること、また、試験は自動化が可能であり、RI を使用せず、危険性のある試薬を使用しないという実施上の利点があること、である。
NRU-EUC は、既報の ICCVAM バリデーション研究を基盤として構築された試験法である。OECD 毒性試験法ガイドラインの in vivo 急性経口毒性試験(TG420、TG423、TG425)は、設定された 4 または 8 段階の用量の一つを選択して動物に投与し、死亡した場合には低用量、生存した場合には高用量を逐次投与することで化合物の LD50 が求められるようにデザインされている。従って、適切な初回投与量の選択が使用動物数削減の鍵となる。既報のICCVAM バリデーション研究では、in vivo 急性経口毒性試験に要する動物数の削減を目的
として OECD ガイダンスドキュメント（GD129）に収載されている 7)。具体的には、3T3 NRU
により被験物質の IC50 値（mM）を求め、RTECS®のデータから抽出した 347 種類の参照化
合物の LD50 値（mmol/kg）と実験によって得られた IC50 値から構築した回帰式を用いて被験物質の LD50 を予測し in vivo 急性毒性試験の初回投与用量を決定する方法である。
ICCVAM のバリデーション研究では 72 化合物が用いられている。その結果、被験物質が低毒性の場合は、使用動物数の削減が可能と考えられた。NRU-EUC は ICCVAM のバリデー
ション研究と同じプロトコールにより LC50 を求め、それから予測される LD50 が 2,000mg/
kg を超えるものについては動物実験を実施せずに UN GHS 区分 5 相当、EU CLP では区分外とラベルする方法である。NRU-EUC と ICCVAM のバリデーション研究の比較を図 2 に
示した。

7
15

図 2．3T3 NRU を用いた既報告（急性毒性試験の初回投与量設定）と本報告（LD50>2,000 ㎎/㎏を予測）の比較

3T3 NRU のエンドポイントは細胞死である。Ekwall は、in vitro 細胞毒性試験における細胞死は基本的な細胞機能への非特異的な影響の結果（basal cytotoxicity）であり、化合物による細胞死が誘発される血中濃度域においては、細胞死と同様のメカニズムが in vivo でも働くと提唱している 8)。すなわち、いずれの細胞にも共通して存在する構造や機能、例えば細胞膜および細胞骨格の正常性が損なわれ、代謝能及び合成能が阻害され、細胞構成物質の分解や機能の障害、細胞内外イオン濃度の調節及び細胞分裂に障害が生ずると細胞死に至る。
細胞死が広範囲に生じると重篤な組織障害を引き起こし、結果として化合物に曝露されていない臓器にも影響し個体死に至る。
一方で、神経や心臓に特異的な毒性を発現する物質、代謝活性化によって毒性発現する物
質については、3T3 NRU では評価できない 5, 9)。神経の受容体やイオンチャネルに特異的に作用する物質は、細胞毒性を生じることなく個体死を引き起こすことがある。例えば、フグ
毒のテトロドトキシン（TTX）やトリカブトに含まれるアコニチンは TTX 感受性ナトリウ
ムチャネルに作用し、呼吸抑制により個体死を引き起こす。このような化合物では細胞死と個体死のメカニズムは異なり、basal cytotoxicity が発現する濃度域より遥かに低い濃度域において個体死を引き起こす。
816

3T3 NRU は、細胞培養液と反応せずに溶解する限りすべての物質について実施可能であるが、細胞培養液に不溶性の物質、揮発性の物質、ライソゾームへ特異的な影響を与える物
質、細胞に残留する性質を有した赤色あるは NR の吸光度と重なる有色の物質の評価は適当ではない。混合物でも評価可能と考えられるが、ECVAM が実施したバリデーション研究では検討されていない。
以上のように、in vivo 試験での LD50 値を推定することを目的とした場合、毒性発現機序
および被験物質の物性に起因する制約があるが、3T3 NRU は前記したような意味での basal
cytotoxicity による細胞毒性を検出する系として、その限界を熟知し、ICCVAM のバリデー
ション研究とそれを基盤にした ECVAM によるバリデーション研究のプロトコルに厳密に従って利用する限りにおいては、妥当な試験であると判断した。
以下に、3T3 NRU のプロトコルの概要を記載する。
試験方法の概要
96well マイクロプレートで培養した株化細胞に被験物質を 48 時間曝露させる。その後、NRを培地に添加し、一定時間インキュベーションした後、細胞内に取り込まれた NR を抽出してプレートリーダーで測定し、コントロール細胞の吸光度値に対する割合を細胞生存率の指標とする。試験は、溶解性試験、用量設定試験及び本試験から構成される。用量設定試験
では、広い範囲の用量をカバーする必要があるため、大きな希釈率で実施する（公比 10）。
本試験では IC50 の推定値を用量段階の中央に設定し希釈率は用量設定試験より小さくする。
細胞、培養液及び Neutral Red (NR)試薬
細胞：3T3 細胞（BALB/c 3T3 マウス線維芽細胞）細胞培養液：DMEM 培地

被験物質希釈用培養液：4 mM グルタミン、200 IU/mL ペニシリン、
200 μg/mL ストレプトマイシン
NR 希釈用培養液：5 % NBCS/NCS、4 mM グルタミン、100 IU/mL ペニシリン、
100 μg/mL ストレプトマイシン
培養液は 2-8℃ で保存し、2 週間以内に使用する。
NR ストック溶液の調製
組織培養グレードの NR ストック溶液 (例：SIGMA #N2889, 3.3 mg/mL)または、NR 粉末
0.25g を 100mL の水に溶解したものを使用する。NR 保存液は室温、暗所で保存し 2 箇月以内に使用する。
NRを含む培養液の調製
NR ストック溶液 0.758 mL (3.3 mg NR dye/mL solution) を予め 37℃に加温したNR 希釈用培養液で100mLとなるように希釈する（終濃度25 μg NR dye/mL）。NRの結晶を除くため、フィルター(例：ミリポア, 0.2 – 0.45 μm)でろ過する。NR Mediumは細胞へ添加する前に温水
9
17

浴槽で37℃に保温し、30分以内に使用する（温水浴槽から取り出してからは15分以内に使用する）。
NR抽出液の組成
1%

氷酢酸

50 % エタノール
49 % 水
被験物質の溶解性試験
溶解性試験は、被験物質が溶解するまで溶媒添加量を段階的に増加させることを基本として実施する。使用する溶媒は、細胞培養液、DMSO、ETOH の順で選択する。溶液を顕微鏡で観察し、溶液が透明で濁りや沈殿物が全く観察されない場合に溶解しているものとみなす。
攪拌方法は、以下のように実施する。
（1）

1-2 分、室温でゆっくりボルテックスをかける。

（2）

被験物質が溶解しなかったら、5 分間超音波処理を実施する。

（3） 超音波処理でも溶解しない場合は、37℃のウォーターバスあるいは CO2 イン
キュベーターで 50-60 分間加温する。
1）溶解性試験の手順(1）段階 1：100 mg の被験物質をガラス試験管に秤取する。0.5 mL の培養液を添加して 200 mg/mL に調製する。溶解しない場合は段階 2 を実施する。
(2）段階 2：10 mg の被験物質をガラス試験管に秤取り、0.5 mL の培養液を添加して 20 mg/mL に調製する。溶解しない場合は段階 3 を実施する。
(3）段階 3：段階 2 の被験物質溶液に、さらに 4.5mL の培養液を添加して全体を 5mL とし 2 mg/mL に調製する。これでも溶解しない場合は DMSO で溶解する。
新しいガラス試験管に被験物質を 100 mg 秤量し、0.5 mL の DMSO を添加して200 mg/mL に調製する。DMSO でも溶解しない場合は ETOH で溶解する。新しいガラス試験管に被験物質を 100 mg 秤量し、0.5 mL の ETOH を添加して 200
mg/mL に調製する。溶解しない場合は段階 4 を実施する。
(4）段階 4：被験物質が、培養液、DMSO、ETOH のいずれにも溶解しない場合は、
段階 3 で溶解しなかった培養液（2 mg/mL）、DMSO (200 mg/mL) および ETOH
(200 mg/mL)の被験物質溶液にそれぞれの溶媒を添加して 10 倍希釈して、培養
液では 0.2 mg/mL、DMSO および ETOH では 20 mg/mL に調製する。これでも溶解しない場合は、段階 5 を実施する。
(5）段階 5：段階 4 で溶解しなかった DMSO(20 mg/mL) および ETOH(20 mg/mL)の被験物質溶液に、それぞれの溶媒を添加して 10 倍希釈し 2 mg/mL を調製する。
(6）段階 6：さらに必要ならば、被験物質を 10 mg ずつ秤量し 50 mL の DMSO また
は ETOH を添加して 0.2 mg/mL の溶液を調製する。

10182）被験物質溶液の希釈
被験物質溶液は、透明且つ沈殿が認められない条件で使用する。被験物質を有機溶媒に溶解した場合は、培養液中の有機溶媒含量は 0.5%以下とする。被験物質を培養液に溶解した
場合は、溶解性試験で溶解した最高濃度の半分、有機溶媒で溶解した場合は、溶解性試験で溶解した最高濃度の 1/200 の濃度を用量設定試験の最高濃度となる。用量設定試験での上限
濃度は、被験物質を培養液で溶解した場合には 10 mg/ｍL、有機溶媒を使用した場合には 1
mg/mL である。
用量設定試験では公比 10 とし、本試験では希釈段階をｎとして 10 のｎ乗根として計算する。
例えば、3 段階希釈では 2.15（3√10）、6 段階希釈では 1.47（6√10）、12 段階希釈では 1.21
（12√10）を用いる。
用量設定試験の上限濃度で毒性が認められない場合、培養液で溶解する場合は 100 mg/mL(2倍のストック液を使用)、DMSO を使用した場合には 2.5 mg/ｍL を上限濃度として再度用量設定試験を実施する。細胞毒性が二相性に発現する場合には、細胞毒性が強く発現する領域（傾きが大きい領域）を選択する。

用量設定試験及び本試験
1）陽性対照物質（PC）
ラウリル硫酸ナトリウム（SLS）を陽性対照物質として、8 用量で濃度反応を確認する。
多数の被験物質の試験を実施する際には、陽性対照物質のプレートは単独で実施する。
2）溶媒対照物質（VC）
被験物質の溶解に有機溶媒を使用した場合には、VC にも被験物質と同じ濃度（0.5%）の有機溶媒を添加する。
3）細胞の播種および前培養
3T3 細胞は、96-well マイクロプレートに 2-3×3 個／100μL／well 播種後 24 時間培養する。
4）被験物質の添加
規定時間前培養後（24 時間）、培養液を除去する。すぐに、37℃に温めた新鮮な培養液をそれぞれのウエルに 50μL 添加し、その後 2 倍濃度の被験物質が入った培養液を 50μL 添加
する。添加後 48 時間培養する。1 用量当たりの well 数は 6 とする。
5）NR 取り込み量の測定
被験物質の曝露終了後、位相差顕微鏡で細胞を観察して、被験物質の毒性によって生じた細胞の形態学変化、細胞の播種エラーの有無および細胞増殖の程度を記録する。（この記録
は、細胞毒性の評価には使用しない）。その後、well の培養液を除去し、Dulbecco’s phosphatebuffered saline（D-PBS）で洗浄後、NR 染色液(NR dye； 3T3: 25 μg/mL)を 250 μL 添加して37℃、5% CO2 で 3 時間培養する。NR 染色液を除去して D-PBS で洗浄後 100 μL の用時調製した NR 抽出液（水：エタノール：氷酢酸＝49：50：1）を添加しプレートシェイカーで 20－45 分間振盪して NR を抽出する。振盪後、プレートは少なくとも 5 分間放置する。吸光1119度の測定は、NR 抽出液を添加してから 60 分以内に実施する。泡を取り除き、プレートリ
ーダーの波長は 540 nm に設定する。泡を取り（OD 540nm）の吸光度をする。
6）試験成立基準(1）PC として使用する SLS の IC50 値は、各研究室で得られたヒストリカルデータの平均値の 2.5 標準偏差（SD）の範囲に入っていること。
(2）VC は 96-well の 2 列目と 11 列目に設定するが、それぞれの列の OD 平均値の差が、全ての VC から算出した平均値から 15%以内であること。
(3）細胞毒性率が 0%以上かつ生存率 50％未満のものが少なくとも一つ、細胞毒性率が 50％以上かつ 100％未満のものが少なくても一つは存在すべきである。
(4）PC の用量相関の R2 値が Hill 式のモデルフィットで 0.85 以上の相関があること。
7）データ解析
生物学/科学的な判断により、評価に適していない well はデータ解析から除外可能である。
ブランクの OD540 値を差し引いた後、細胞生存率を VC の平均値に対する割合として算出する。計算には表計算ソフト（例：Microsoft EXCEL®）を使って計算してもよい。IC50 値を計算するために統計学的ソフト（例：GraphPad Software PRISM®）を用いて、Hill 式の解析を
行う。

12
20

2．試験法の妥当性
3T3 NRU は化合物の細胞毒性試験方法として広く使用されており、ICCVAM が提案した「in vitro 細胞毒性試験による急性経口毒性試験の初回投与量設定試験」5, 6)において IC50 から LD50 を予測することに利用できることが検証された試験系である。ICCVAM のバリデー
ション研究において試験プロトコルが整備されており、その妥当性について検証されていることから 3T3 NRU は一般的な試験法としては妥当性がある。
ICCVAM のバリデーション研究において、3T3 NRU によって得られた IC50 から LD50 を予測する手法は、低毒性の化合物では LD50 の予測性が高いことが示されている。NRU-EUC
は ICCVAM のバリデーション研究を基盤とし、予測性が高い低毒性の化合物（LD50＞2,000
mg/kg）に限定して評価することを目的とした手法であることから妥当性があると判断した。

1321

3．ECVAM のバリデーション(2011)に用いられた物質の分類と妥当性
LD50>2,000mg/kg を予測する ECVAM のバリデーション研究の被験物質として 56 種類の参照化合物が選択されている。基本的には、信頼できる in vivo データが入手可能であり、
かつ、in vitro 試験の実施が可能である化合物が選択されている。
被験物質は、1）ORATS (Online European Risk Assessment Tracking System) database、 2)
Registry of Cytotoxicity(RC), 3) Annex I of Directive 67/548/EEC の 3 つのソースから選択されている。ただし、ICCVAM の「in vitro 細胞毒性試験による急性経口毒性試験の初回投与量設定試験（2006）」バリデーション研究 5)において NICEATM/ECVAM が使用した被験物質、ACuteTox10)で使用した被験物質、医薬品と農薬は除外されている。例外として Annex I of
Directive 67/548/EEC で very toxic に分類される Aconitine と Brucine はバリデーションに使用した被験物質に含まれている。
LD50>2,000mg/kgと評価されている化合物の選択においては、ORATSとRCからは、最初に691の化合物をプールし、SIGMA社から入手不可の化合物、引火性の化合物、Annex I of
Directive 67/548/EEC とRegistry of Cytotoxicity9）で急性毒性区分が異なる化合物を除いたう
えで、ラット経口LD50＞2,000 mg/kgである一般工業化合物が選択されている。最終的に26化合物（液体；13化合物、固体；13化合物）が選択され、そのうち19化合物はCosIng (the European
Commission database for information on cosmetic substances and ingredients)に含まれている物質である。
LD50 ≦2,000mg/kg と評価 されて いる 化合物 の選 択にお いて は、 Annex I of Directive
67/548/EEC からは、最初に 1,020 化合物（harmful；531、toxic；339、very toxic；150）をプールし、段階的選抜により最終的に 30 化合物（液体；11 化合物、固体；19 化合物）が選択された。そのうち 8 化合物は CosIng に含まれている物質である。選択された化合物の Annex
I of Directive 67/548/EEC 区分の内訳は、harmful；22、toxic；6、very toxic；2 である（表 1）
バリデーションに用いられた 56 化合物の物性情報、in vivo データ（LD50）及び規制上の分類について表 2 にまとめた。in vitro 試験の被験物質については、物性面での制約が大きく、一般に揮発性が高い物質、水への溶解度が低い物質は適切な評価ができない。この点か
ら、バリデーションに用いられた化合物の妥当性を考察した。
培養液中の溶解度に関しては、16 の化合物において沈殿が認められた（表 3）。そのうち10 化合物は固体、6 化合物は液体である。ECVAM の報告書 4)の Table 2～3 記載されている
水溶性と培養液中での沈殿生成との関係は必ずしも対応していない。例えば、No3

1,2-

Benzenedicarboxylic acid の水溶性は 0.2 mg/L であるが、沈殿は生じていない。一方で、No28
Diisopropanolamine は 870,000 mg/L の水溶性を有するが、沈殿を生じている。
蒸気圧については、No 44 の Sodium cyanate を除き、30 mmHg 以下であり、物性情報から揮発性が非常に高い物質は含まれていない。一方で、バリデーション研究においては揮発性

1422の影響が考えられた化合物が 17 あり、コントロール群の細胞にクロスコンタミネーション
による影響が認められた。
以上のように、ECVAM の報告書の Table2、Table3 に記載されている物性情報と、実際の試験において生じた現象について齟齬が認められる。これについては、三つの可能性が考えられる。一つは、物性情報に誤りがある可能性である。例えば、No 56

Zinc oxide の水溶性

は 6,431mg/L であるが、バリデーションを行った 3 施設とも沈殿が生じている。PubChem 情報によると Zinc oxide は水に不溶である 11)。また、蒸気圧についても No 19 Barium chloride
は 33,900mmHg とされているが、安全データシートの情報では 0mmHg12)、No 44；Sodium
cyanate は 813mmHg とされているが、安全データシートの情報では 1mmHg (817℃)13)とされており、ECVAM の報告書に記載されたデータは明らかに誤っている。
もう一つは、溶解性の情報は 25℃（一部 12～30℃）の水に対するものであり、実際の実験に用いる培養液には血清を含め様々な成分が含まれているため、溶解性が向上する、あるいは、溶解性が低下することが想定される。そのため、JaCVAM 急性毒性資料編纂委員会では、NRU-EUC の基盤となった ICCVAM の 3T3 NRU のバリデーションに用いられた 67 種
類の参照化合物の溶解性について、インターネット上に公開されているデータベースを用いて独自に調査を行い、ICCVAM のバリデーション研究の結果と比較を行った（表 4、Appendix 1）。データベースの情報では 67 化合物のうち 12 化合物において IC50 値を与える
一方、濃度がその化合物の溶解度を超え、そのうち 6 化合物が LD50＞2,000 mg/kg であった。
ICCVAM のバリデーション研究結果では、6 化合物において沈殿が認められている。また、
データベースの情報では水溶性が高いが、実験では沈殿が認められている化合物が 1 化合物（Sodium Oxalate）あった。
上記以外に、被験物質によって培養液中の成分が変性し沈殿した可能性も考えられる。
ECVAM バリデーション研究では、一部沈殿が生じる濃度域まで実験を行っているが、ほとんどの化合物で IC50 付近では沈殿が認められなかった。また、沈殿は 1 ないし 2 ラボにおいて認められた化合物が 16 物質あったが、3 ラボすべてで沈殿が認められた化合物はな
く、当該バリデーションでは沈殿の影響はほとんどなかったものと考えられた。
以上の検討結果と、各委員の試験経験から、培養液中で沈殿が生じない均一な懸濁液の状態が得られる場合には評価が可能であると結論した。
本試験法は LD50>2,000 mg/kg を予測する試験であるため、高濃度域におけるデータの取得が必要である。溶解性が乏しい化合物の場合、高濃度の試験が実施できない可能性がある。
一方、溶解性が高い物質は高濃度域まで実験が可能である。低分子量の化合物では試験最高濃度を 5 mg/mL とした場合、例えば、バリデーション研究で使用された分子量 53.49 のAmmonium chloride は 5 mg/mL が 90 mM 以上に相当し、細胞培養液の浸透圧が非生理的な条件となり適切な細胞毒性評価ができないことが想定される。一般に in vitro 試験の上限濃度は 10 mM または 5 mg/mL が最高濃度とされる。この視点から、JaCVAM 資料編纂委員会
では、LD50 値予測可能な分子量について考察した。

15
23

IC50 値から LD50 の予測に使用された以下の 2 つの関係式は、347 のデータペア（282 ラッ
トデータおよび 65 マウスデータペア）から得られた回帰直線であるオリジナルの RC
millimole regression 9)をもとに、ラットの急性経口毒性データ（282 データペア）のみを使用して得られたモル濃度及び重量濃度による回帰直線である 5)。LD50 値と IC50 値の表記単位
はモル濃度あるいは質量濃度が使用されており、(1) LD50; mmol/kg

IC50; mM、(2) LD50;

mg/kg IC50 ; μg/mL の組み合わせで関係式が求められている。
（１） Millimole regression model（モル濃度関係式）5)
log LD50 (mmol/kg)=0.439 x log IC50 (mM) + 0.621（２） Weight regression model（重量濃度関係式）5)
log LD50 (mg/kg)=0.372 x log IC50 (μg/mL) + 2.024

関係式から LD50 値が 2,000 mg/kg として分子量を元に IC50 値を計算すると、分子量が 174
以下の化合物では、LD50 値 2,000 mg/kg を与える IC50 値を得るために必要となる濃度が 10
mM を超え、分子量 77 以下では、LD50 値 2,000 mg/kg を与える IC50 値を得るために必要となる実験濃度が 5 mg/mL を超える(Appendix 2)。ECVAM のバリデーション研究で用いられた参照化合物のうち、分子量が 174 以下のものは 27 化合物、77 以下のものは 4 化合物含まれている（表 5）。
通常、in vitro 試験を行う場合、5 mg/mL もしくは 10 mM が最高濃度として選択されるが、ECVAM のバリデーション研究において試験に供された分子量が 174 以下の化合物では、10mM は 0.53～1.73 mg/mL であり、5 mg/mL は 29.0～93.5 mM であった。しかしながら、3T3
NRU により IC50 から LD50 を予測する基盤となった論文 9)のプロトコルでは、試験最高濃度
は 10 mg/mL であり、バリデーション研究における試験可能な最高濃度は通常の in vitro 試
験の最高濃度を超えていたが、実際にはほとんどの化合物で IC50 値が求められていた。一部、沈殿等の認められた化合物もあったが、ほとんどの場合、IC50 値に影響しない濃度で認められた。したがって、バリデーション研究における評価可能物質数は表 7～9 に示されているとおり十分な数の化合物が評価されていると考える。
また、分子量が 174 以下の 27 化合物については、最高濃度を 10 mM とした場合、IC50 値が得られなくなる化合物があり、さらに試験最高濃度（10 mM）で毒性が認められない化合物において、10 mM を用いて関係式により予測した場合、予測 LD50 値が 2,000 mg/kg 未満となり、評価ができなくなる物質が認められた（表 6）。
以上の検討結果から、信頼できる in vivo データが入手可能であり、かつ、in vitro 試験の実施が可能である化合物が選択されている点において、化合物の選択方法に妥当性はあるが、物性データの信頼性は低いと考えられた。加えて、LD50 > 2,000 mg/kg を得るために必要となる濃度が、一般に in vitro 試験の上限とされる 10mM を超えるため適切な評価ができないと考えられる低分子量の化合物が約半数を占めていたため、汎用される場合は、最高濃度を考慮することで、分子量によって適用制限を受ける可能性があるという課題が認めら

1624

れた。このようなことを考えると、3T3 NRU を用いた、LD50 > 2,000 mg/kg を予測する ECVAMのバリデーション研究において使用した化合物を一般的な in vitro 試験で用いられる 5
mg/mL もしくは 10 mM で実験を行った場合、低分子の化合物において正しく UC と評価できた物質数はわずかであったと思われる。しかしながら、実際の ECVAM のバリデーショ
ン研究では非生理的な濃度である 10 mg/mL またはそれ以上の高濃度における試験がなされていながらも、評価可能な結果が得られおり、一致度は 64～67％であることから NRU-EUC
においては非生理的な濃度域までの用量設定をする必要があると考えられる。
表1

ECVAM のバリデーションに用いられた化合物の選択方法

表2

バリデーションに用いられた 56 化合物一覧（ECVAM 報告書 Table2,3,4 から作成）

EINECS： European Inventory of existing commercial chemical substances
C: Classified
UC: Unclassified

17
25

表2

バリデーションに用いられた 56 化合物一覧（ECVAM 報告書 Table2,3,4 から作成）

Chem No

Chemical name

CAS NoVapourpress.
mmHg(25ºC)

MW

Solid/
liquid292.35

Reference
mean*(mg/kg)

C/UC

GHS
toxicity
category

EU CLP
toxicity
category

25646-77-9

6.01 E-6

solid

0.98

-

58

C

3

3

2
3
4

4-Ammonio-mtolyl)ethyl(2hydroxyethyl)ammonium sulphate
1,2,4-Trichlorobenzene
1,2-Benzenedicarboxylic acid
1,2-Dichlorobenzene

120-82-1
68515-48-0
95-50-1

181.45 liquid418.61 liquid
147 liquid

4.02
9.37
3.43

49
0.20
156

756
2550
2065

C
UC
UC

4
5
5

4
UC
UC

5

1-Naphthylamine

134-32-7

143.19

solid

2.25

1700
(20ºC)

540

C

4

4

6

1-Phenyl-3-pyrazolidone

92-43-3

162.1972-(2-Butoxyethoxy)ethanol

112-34-5

82,2',6,6'-Tetrabromo-4,4'isopropylidenediphenol

79-94-7

0.46
8.61 E-7
1.36
0.012
hPa/(30C)
0.004
hPa/(20C)
1.63 E-530(130ºC)
1.76 E-11(20ºC)

9

2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)
phenol90-72-2

5.60 E-4

102,6-Diethylaniline

579-66-8

11

2-Butoxyethyl acetate112-07-2

122-Chloro-4-nitroaniline

121-87-913

2-Ethylhexyl acrylate

103-11-7

14

2-Phenoxyethanol
4'-Tert-butyl-2',6'-dimethyl-3',5'dinitroacetophenone
Acetophenone
Aconitine

122-99-6

0.00383
0.29(20°C)
4.85 E-4
0.15(20°C)
0.007

81-14-1

1.22 E-5

98-86-2
302-27-2

394.46

solid

0.98

144.21 liquid

3.05

1

15

18

Ammonium chloride

12125-02-9

19
20
21

Barium chloride
Benzaldehyde
Benzyl benzoate

10361-37-2
100-52-7
120-51-4

0.397
1.38 E-20
1(160.4C)
3.39 E4
0.127
2.24 E-4

22

Brucine357-57-3

3.13 E-10

16
17

23

Caprylic acid124-07-2

24

Copper sulphate7758-98-7

1(78°C)
7.3

25

Diallyl phthalate131-17-926

Diepoxide 126

27

Di-''isodecyl'' phthalate

28

Diisopropanolamine
Dimethyldioctadecyl ammonium
chloride

2386-87-0
2676140-0
110-97-4
107-64-2

29

0.89

1.16 E+4

255

C

3

3

0.56

1.00E+06

6249

UC

UC

UC

543.877.2

1.00 E-3

5420

UC

UC

UC

265.39 liquid-0.66>850 g/l(20ºC)

1200

C

4

4

149.23 liquid

3.15

670

2245

UC

5

UC

160.21 liquid

1.57

9000

4143

UC

5

UC

172.57

solid

2.12

933

6430

UC

UC

UC

184.28 liquid

4.09

100

6007

UC

UC

UC

138.16 liquid

1.16

2.67 E+4

4565

UC

5

UC

294.31

solid

3.86

-

> 10000

UC

UC

UC

120.15 liquid645.74 solid

1.58
0.13

6130
310

1701
6

C
C

4
2

4
2

solid

-

-

1650

C

4

4

208.23 solid
106.12 liquid
212.24 liquid

1.48
3.97

6570
15.4
3200
(15ºC)
789(30°C)
182(20ºC)
-

294
1300
1990

C
C
C

3
4
4

3
4
4

1

C

1

1

5682

UC

UC

UC

666

C

4

4

822

C

4

4

4500

UC

5

UC

53.49

159.61

solid

solid

-

1.16 E-3

246.26 liquid

3.23

1.8 E-5

252.31 liquid

1.78

5.28 E-7

446.66 liquid

10.36

0.28

64000

UC

UC

UC

2.65 E-3

133.19

solid

-0.82

8.70E+05

6183

UC

UC

UC

-

586.5

solid

9.42

-

12150

UC

UC

UC

292.24

UC

5

UC

solid

-3.86

1000l

4500

217.31 liquid

3.87

C

4

4

solid

0.25

3980

UC

5

UC

105-39-5

4.87

122.55 liquid

0.94102-76-1
110-16-7
109-77-3

2.48 E-3
5.19 E-6
0.125

218.2 liquid
116.07 solid
66.06 solid

0.25
-0.48
-0.6

100-97-0

0.004

140.19

solid

-4.15

17.5
1.10E+5(17°C)
1.94 E+4(30ºC)
5.80E+04
4.41 E+5
1.33 E+5
4.49E+5(12°C)

1407

130.14

101-72-4

7.11 E-5

226.35

solid

3.28

54.6

1034-01-1

2.90 E-9

282.33

solid

3.66

108.09

Edetic acid60-00-431

Ethoxyquin

91-53-232

Ethyl acetoacetate141-97-933Ethyl chloroacetate

34
35
36

Glycerol triacetate
Maleic acidMalononitrile
Methenamine

39

N-isopropyl-N'-phenyl-p phenylenediamine
Octyl 3,4,5-trihydroxybenzoate

40

p-penzoquinone

106-51-4

0.1

41
42
43
44
45
46
47

Phthalic anhydride
85-44-9
Potassium sulfate
7778-80-5
Resorcinol
108-46-3
Sodium cyanate
917-61-3
Sodium salt of chloroacetic acid3926-62-3
Sorbitan monolaurate
1338-39-2
Tetramethylthiuram monosulphide 97-74-5<0.01
3.35 E-5
1
813
0.259
8.23 E-13
2.70 E-4
0.01(20°C)
9.40 E-4
5.73 E-5
5.68 E-18
1.41
2.16 E-22
1.20 E-5
8.58 E-6
2.64 E-12

38

solid

162.23 liquid

4.98 E-13(25°C)
1.32 E-4
1(28.5°C)

30

37

48

Triethanolamine

102-71-6

49
50
51
52
53
54
55
56

Triethylene glycol dimethacrylate
Tripotassium citrateTris(nonylphenyl) phosphite
Trizinc bis(orthophosphate)
Tween 20
Urea
Zinc distearate
Zinc oxide109-16-0
866-84-2
26523-78-4
7779-90-0
9005-64-5
57-13-6
557-05-1
1314-13-2

solid

0.2

148.12 solid
174.26 solid
110.11 solid
65.01 solid
116.48 solid
346.46 liquid
208.37 solid

1.6
-1.03
0.8
-0.46
0.22
4.47
0.75

36
1.11 E+4(18ºC)
6200
7.17 E+5
5.00 E+4

149.19 liquid

7.76

286.32 liquid
324.41 solid
689 liquid386.11 solid
1228 liquid
60.06 solid
632.33 solid
81.39 solid

1.88
-0.28
21.56
-2.15
5.37
-2.11
14.44
1.53

18
26

Water Sol.
mg/l
(25ºC)

Log
Kow

155

C

3

3

3000
708
19.5

UC
C
C

5
4
2

UC
4
2

9200

UC

UC

UC

1047

C

4

4

2335

UC

5

UC

79

C

3

3

4500
6600
535
1500
328
37425
400

UC
UC
C
C
C
UC
C

5
UC
4
4
4
UC
4

UC
UC
4
4
4
UC
4

1.00E+06

5530

UC

UC

UC

3600
6.06E+05
5.45E+05
6431

10750
> 7 200
14750
30000
40370
12590
> 5000
7950

UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC

UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC

UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC

表3

沈殿および揮発性による影響がみられた化合物のリスト

沈殿が認められた化合物（16）揮発性物質（17）

19
27

表4

NRU-EUC の基盤となった ICCVAM のバリデーション研究で用いられた参照化合物のうち不溶性と判断された化合物について JaCVAM で検討した結果
No.

Substance

1
3
15
21
24
27
28
31
32
38
44
57
67

1,1,1-Trichloroethane
5-Aminosalicylic Acid
Carbamazepine
Dibutyl Phthalate
Digoxin
Disulfoton
Endosulfan
Fenpropathrin
Gibberellic Acid
LindaneParathion
Sodium Oxalate
XyleneCAS

Reference (Pubchem)
Molecular Reference
IC50
LD50
WeightWater solubility at
2 (mg/mL)(g/mole)(mg/kg)20～25℃ (mg/L)

71-55-6
89-57-6
298-46-4
84-74-2
20830-75-5
298-04-4
115-29-7
39515-41-8
77-06-5
58-89-956-38-2
62-76-0
108-38-3

133.41
153.10236.30278.30780.90274.42406.91
349.43346.38290.80291.30134.00106.1712078.1 20452.7
3428.0 1666.8
2807.0103.2
8892.0
43.4
28.3
445.5
5.0
399.6
27.8
5.9
75.7
23.3
6039.5 7810.3
100.0
111.5
6.1
37.4
633.0
37.1
4665.0
720.6

Judge

1290 Insoluble
840 Insoluble
17.7 Insoluble
11.2 Insoluble
64.8 Insoluble
16.3 Insoluble
0.5 Insoluble
0.014 Insoluble
5000 Insoluble
7.3 Insoluble
11 Insoluble
37000 Soluble
161 Insoluble

PPT inICCVAM
Validation
Study

PPT
PPT
PPT
PPT
PPT
PPT

PubChem：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Judge: IC50 値がデータベースから得られた溶解性を超える場合に Insoluble と判定
PPT(Precipitate)：ICCVAM のバリデーション研究の細胞培養ウエル内で沈殿が認められたもの

表5

NRU-EUC の基盤となった ICCVAM のバリデーション研究で用いられた参照化合物のうち分子量 174 以下の参照化合物のリスト
Chem No

Chemical name

CAS NoMW

Solid/
liquid

18
54
44
36
56
20

Ammonium chloride
Urea
Sodium cyanate
Malononitrile
Zinc oxide
Benzaldehyde

12125-02-9
57-13-6
917-61-3
109-77-3
1314-13-2
100-52-7

53.49 solid
60.06 solid
65.01 solid
66.06 solid
81.39 solid
106.12 liquid40

p-penzoquinone

106-51-4

108.09

43
35
45
16

Resorcinol
Maleic acid
Sodium salt of chloroacetic acid
Acetophenone

108-46-3
110-16-7
3926-62-3
98-86-2

110.11 solid
116.07 solid
116.48 solid
120.15 liquid

33

Ethyl chloroacetate105-39-5

122.55 liquid

solid

32

Ethyl acetoacetate141-97-9130.1428
14

Diisopropanolamine
2-Phenoxyethanol

110-97-4
122-99-6

133.19 solid
138.16 liquid

solid

37

Methenamine

100-97-0

140.19solid

51-Naphthylamine

134-32-7

143.19solid

23

Caprylic acid124-07-2

144.21 liquid

4
41
48
10
24
11
6
7
12

1,2-Dichlorobenzene
Phthalic anhydride
Triethanolamine
2,6-Diethylaniline
Copper sulphate
2-Butoxyethyl acetate
1-Phenyl-3-pyrazolidone
2-(2-Butoxyethoxy)ethanol
2-Chloro-4-nitroaniline

95-50-1
85-44-9
102-71-6
579-66-8
7758-98-7
112-07-2
92-43-3
112-34-5
121-87-9147148.12149.19149.23
159.61160.21
162.19162.23172.57liquidsolid
liquidliquidsolid
liquidsolid
liquid
solid

20
28

Water Sol.
mg/l
(25ºC)-2.11
5.45E+05-0.46-0.6
1.33 E+5
1.53
6431
1.48
6570
1.11E+4
0.2(18ºC)
0.8
7.17 E+5-0.48
4.41E+05
0.22
1.58
6130
1.94E+40.94(30ºC)
1.10E+5
0.25(17°C)-0.82
8.70E+05
1.16
2.67E+04
4.49E+5-4.15(12°C)
1700
2.25(20ºC)
789
3.05(30°C)
3.43
156
1.6
6200
7.76
1.00E+06
3.15
670
1.57
9000
0.89
11600
0.56
1.00E+06
2.12
933

Log
Kow

Reference
mean*(mg/kg)
1650
12590
1500
19.5
7950
1300

C/UC
C
UC
C
C
UC
C

GHS
toxicity
category
4
UC
4
2
UC
4

EU CLP
toxicity
category
4
UC
4
2
UC
4

79

C

3

3

535
708
328
1701

C
C
C
C

4
4
4
4

4
4
4
4

155

C

3

3

3980

UC

5

UC

6183
4565

UC
UC

UC
5

UC
UC

9200

UC

UC

UC

540

C

4

4

5682

UC

UC

UC

2065
4500
5530
2245
666
4143
255
6249
6430

UC
UC
UC
UC
C
UC
C
UC
UC

5
5
UC
5
4
5
3
UC
UC

UC
UC
UC
UC
4
UC
3
UC
UC

表 6．ECVAM のバリデーション研究で使用された MW 174 以下の化合物 27 物質の最高試
験濃度の違いによる評価可能な化合物数1. Millimole regression model
試験施設

バリデーション研究における評価可能化合物数*

最高濃度別の評価可能化合物数
最高濃度5 mg/mL

最高濃度10 mM

UC 化合物**

C化合物

UC 化合物**

C化合物

UC 化合物**

C化合物

HSL (評価可能24化合物)*

13 (5)

11

13 (5)

11

8 (0)

11

JRC (評価可能25化合物)*

12 (5)

13

12 (5)

13

6 (0)

12

IIVS (評価可能26化合物)*

13 (4)

13

13 (4)

13

8 (0)

13

2. Weight regression model
試験施設

バリデーション研究における評価可能化合物数*

最高濃度別の評価可能化合物数
最高濃度5 mg/mL

最高濃度10 mM

UC 化合物**

C化合物

UC 化合物**

C化合物

UC 化合物**

C化合物

HSL (評価可能22化合物)*

11 (1)

11

11 (1)

11

9 (1)

11

JRC (評価可能24化合物)*

11 (2)

13

11 (2)

13

7 (1)

11

IIVS (評価可能24化合物)*

11 (1)

13

11 (1)

13

9 (1)

13

UC: unclassified, C: classified*バリデーション試験において MW174 以下の化合物 27 物質（うち UC14 化合物、C13 化合物）
から各施設で試験しなかった物質及び、試験最高濃度で毒性がなく、かつ、予測ができなかった化合物を除いたもの**カッコ内は UC を正しく評価できた化合物数

2129

4．試験法の正確性を評価するために用いられた参照化合物の in vivo 参照データ
資料編纂委員会では 56 種類の参照化合物のげっ歯類の LD50 はインターネットで公開されているデータベースから収集し、原著論文を入手した。参照化合物を EU CLP および UN
GHS で分類した場合、それぞれの数は以下のとおり。
(1) EU CLP acute oral toxicity categories:
category 1 (LD50 ≤ 5 mg/kg)

1

(2%)

category 2 (5 < LD50 ≤ 50 mg/kg)

2

(4%)

category 3 (50 < LD50 ≤ 300 mg/kg)

5

(9%)

category 4 (300 < LD50 ≤ 2,000 mg/kg)

16

(29%)

unclassified (LD50 > 2,000 mg/kg)

32

(57%)

category 1 (LD50 ≤ 5 mg/kg)

1

(2%)

category 2 (5 < LD50 ≤ 50 mg/kg)

2

(4%)

category 3 (50 < LD50 ≤ 300 mg/kg)

5

(9%)

category 4 (300 < LD50 ≤ 2,000 mg/kg)

16

(29%)

category 5 (2,000 < LD50 ≤ 5,000 mg/kg)

11

(20%)

unclassified (LD50 > 5,000 mg/kg)

21

(38%)

(2) UN GHS acute oral toxicity categories:

毒性の強い区分 1 および 2 は全体の 6％であるが、2,000 mg/kg を閾値と設定した場合には、EU CLP では LD50 ≤ 2,000 mg/kg が 43％、LD50 > 2,000 mg/kg が 57％、UN GHS では LD50
≤ 2,000 mg/kg が 43％、LD50 > 2,000 mg/kg が 57％である。本試験の目的を考慮すると、妥当な配分数と判断された。

2230

5．試験方法の正確性
ECVAM のバリデーション研究における試験は 3 施設 Health and Safety Laboratory, UK(HSL)、Joint Research Center (JRC)、The Institute for In Vitro Sciences (IIVS)において実施された。再現性については、施設内 IC50 の CV を用いた解析と Millimole regression model（モル濃度関係式）と Weight regression model（重量濃度関係式）を用いて予測される LD50 の再現性を検討した（「3．バリデーションに用いられた物質の分類と妥当性」を参照）。なお、
この項で記載する再現性は、同一施設内で実施された試験間で LD50 の予測値が再現できるか否かという点についての検討であり、in vivo 試験における LD50 を必ずしも反映していない事に注意が必要である。LD50>2,000 mg/kg および LD50≦2,000 mg/kg の予測性については、Millimole regression analysis と Weight regression analysis に 加 え て Receiver Operating
Characteristic (ROC) Curve 分析により検討された。

5.1 施設内 IC50 の CV を用いた解析
ECVAM のバリデーション研究において、IC50 の CV の検討は HSL と JRC の 2 施設が実施している。
全ての化合物の IC50 の CV の平均値は HSL および JRC それぞれ 28.3％（N=39）、
19.1％（N=44）であり同等であるとみなされた。CV への影響要因を化合物の特性（固体、液体、揮発性の高低、培養液中での沈殿の有無、保存条件、Classified 及び Unclassified）によって検討した結果、培養液中での沈殿生成が変動要因としてあげられている。

5.2 施設内予測 LD50 の再現性
各施設においては通常、1 つの化合物について複数回の試験が行われており、それぞれの試験で得られた結果からはほとんどの場合、classified または unclassified の判定が得られている。複数回の試験における判定に再現性があるかについて検討した。複数の予測 LD50 値が得られなかった物質、試験を行わなかった物質、censored により評価ができなかった物質は検討から除外された。
Millimole regression model による判定では HSL においては評価可能な複数回のデータが得られた化合物は 40 物質で、その再現性は 98%(39/40)であった。再現性が確認されなかった物質は 2-(2-Butoxyethoxy) ethanol のみであった。同様に JRC で評価可能な化学物質は 47
物質で、再現性は 94%(44/47)であった。再現性が確認されなかった物質は、
2-(2-Butoxyethoxy)
ethanol、Aconitine および Barium chloride であった。IIVS では 53 化合物すべてが同じ判定であり、IIVS における再現性は 100％（53/53）であった。
Weight regression model においては、HSL では評価可能な化合物は 39 物質で、再現性は97%(38/39)、再現性が確認されなかった物質は Triethanolamine のみであった。JRC では再現
性 は 93%(43/46) で 、 再 現 性 が 確 認 さ れ な か っ た 物 質 は 2-(2-Butoxyethoxy) ethanol 、 2Butoxyethoxy acetate および Glycerol triacetate であった。IIVS では再現性は 98%(45/46)で、再現性が確認されなかった物質は 2-(2-Butoxyethoxy) ethanol のみであった。

23
31

再現性に関して施設間差についても評価され、施設内再現性と同様に、揮発性、溶解性等に問題のある化合物の再現性は低いが、それ以外の化合物についての再現性は高かった。

5.3 予測性
Millimole regression model の回帰式を用いた解析においては、HSL では 44 化合物中、LD50
値が 2,000mg/kg 以上であるか否かが正しく予測された化合物は 28 種類（64％）、
LD50>2,000mg/kg であるものが予測 LD50≦2,000mg/kg と判定（過大評価）された化合物は 15
種類、LD50≦2,000mg/kg のものが予測 LD50>2,000mg/kg と判定（過小評価）された化合物はBenzyl benzoate のみであった。JRC では 51 化合物中、毒性が正しく予測された化合物は 34
種 類 （ 67 ％ ） 、 過 大 評 価 さ れ た 化 合 物 は 15 種 類 、 過 小 評 価 さ れ た 化 合 物 は 1,2,4Trichlorobenzene および Benzyl benzoate のみであった。IIVS では 54 化合物中、毒性が正しく予測された化合物は 35 種類（65％）、過大評価された化合物は 18 種類、過小評価された化合物は Aconitine のみであった。3 施設すべてで判定が得られた化合物は 41 物質であった。そのうち、いずれにおいても正しく予測された化合物は 24 種類（8 unclassified および
16 classified）、過大評価された化合物は 12 種類であった。また、いずれかの施設で過小評価された化合物は 3 種類であった［1,2,4-Trichlorobenzene （JRC）, Aconitine （IIVS）, Benzyl
benzoate（HSL、JRC）］（表７）。
Weight regression model を用いた解析においては、HSL では 40 化合物中、毒性が正しく予測された化合物が 21 種類（53％）、過大評価された化合物は 19 種類、過小評価された化合物は認められなかった。JRC では 46 化合物中、毒性が正しく予測された化合物が 26 種類（57％），過大評価された化合物は 20 種類、過小評価された化合物は認められなかった。
IIVS では 47 化合物中、毒性が正しく予測された化合物は 26 種類（55％）、過大評価された化合物は 21 種類、過小評価された化合物は認められなかった（表８）。
Receiver Operating Characteristic (ROC) Curve 分析においては、感度が高くなることを重視
して、感度と特異度を適正化して閾値を設定している（IC50：485.6μg/mL）。HSL では 47 化
合物中、毒性が正しく陰性（LD50＞2,000mg/kg）と予測された化合物（区分外物質：unclassified
test chemicals）は 15 種類、過大評価された化合物は 12 種類、過小評価された化合物は Barium
chloride, Benzaldehyde, Benzyl benzoate であった。JRC では 52 化合物中、毒性が正しく陰性と予測された化合物は 17 種類、過大評価された化合物は 11 種類、過小評価された化合物
は 7 種 類 （ 1,2,4-Trichlorobenzene, Acetophenone, Ammonium chloride, Barium chloride,
Benzaldehyde, Benzyl benzoate および Maleic acid）であった。IIVS では 53 化合物中、毒性が正しく陰性と予測された化合物は 15 種類、過大評価された化合物は 15 化合物、過小評価された化合物は Benzyl benzoate および Maleic acid であった（表９）。
Millimole regression model および ROC Curve で過小評価された Benzyl benzoate はバリデー
ション研究の報告書に記載の通り、reference oral LD50 value を算出するために使用されたデータベースからの値は 2,080 mg/kg および 1,900 mg/kg で、平均値の 1,990 mg/kg が採用され
た。

24
32

5.4 正確性
3T3 NRU により急性毒性を評価する際の課題は、物性と毒性発現機序に依存する。過小評価される予測率は低いものの、「細胞毒性のみで急性経口毒性が区分外」と判断するアプ
ローチにおいては、試験精度をより正確なものとすべきである。そのためには、化合物の揮
発性、粘度、吸収性などの物性や保管および取り扱い等の影響、並びに作用機序に関する情報が必要となるものと判断される。

5.5 有用性
NRU-EUC による予測 LD50＞2,000 mg/kg の一致度は 64～67％、特異度は 40～44％と予測性は限定的であるが、感度が 94％、偽陰性率は 4～8％であり毒性があるものを見逃す確率は小さい。一般工業化合物において陰性物質(substances not requiring classification)を示す比率
は 87% であることを考慮すると 14)、細胞毒性のみで急性経口毒性試験を実施しない本アプ
ローチを実施した場合、動物削減に大きく寄与し、費用対効果が妥当であることが推測される。
表７.

３施設における予測性の比較（Millimole regression model を用いた評価）
HSL

JRC

IIVS

評価物質（総数）

44

51

54

毒性を正しく予測

64% (28/44)

67% (34/51)

65% (35/54)

42% (11/26)

44% (12/27)

40% (12/30)

58% (15/26)

56% (15/27)

60% (18/30)

94% (17/18)

92% (22/24)

96% (23/24)

6% (1/18)

8% (2/24)

4% (1/24)

Benzyl benzoate

1,2,4-

Aconitine（一致度）「 LD50 値＞ 2,000

mg/kg」を正しく予測（特異度）
毒性を過大評価（偽陽性率）「 LD50 値≦ 2,000

mg/kg」を正しく予測（感度）
毒性を過小評価（偽陰性率）
毒性を過小評価した

Trichlorobenzene,

物質名

Benzyl benzoate

25
33

表８.

３施設における予測性の比較（Weight regression model を用いた評価）
HSL

JRC

IIVS

評価物質（総数）

40

46

47

毒性を正しく予測

53% (21/40)

57% (26/46)

55% (26/47)

17% (4/23)

17% (4/24)

13% (3/24)

83% (19/23)

83% (20/24)

88% (21/24)

100% (17/17)

100% (22/22)

100% (23/23)

0% (0/17)

0% (0/22)

0% (0/23)（一致度）「 LD50 値＞ 2,000

mg/kg」を正しく予測（特異度）
毒性を過大評価（偽陽性率）「 LD50 値≦ 2,000

mg/kg」を正しく予測（感度）
毒性を過小評価（偽陰性率）

表９. ３施設における予測性の比較（ROC Curve 分析）
HSL

JRC

IIVS

評価物質（総数）

47

52

53

毒性を正しく予測

68% (32/47)

65% (34/52)

68% (36/53)

56% (15/27)

61% (17/28)

50% (15/30)

44% (12/27)

39% (11/28)

50% (15/30)

85% (17/20)

71% (17/24)

91% (21/23)

15% (3/20)

29% (7/24)

9% (2/23)

毒性を過小評価した

Barium chloride,

1,2,4-Trichlorobenzene,

Benzyl benzoate,

物質名

Benzaldehyde,

Acetophenone,

Maleic acid

Benzyl benzoate

Ammonium chloride,（一致度）「 LD50 値 ＞ 2,000
mg/kg」を正しく予測（特異度）
毒性を過大評価（偽陽性率）「 LD50 値 ≦ 2,000
mg/kg」を正しく予測（感度）
毒性を過小評価（偽陰性率）

Barium chloride,
Benzaldehyde,
Benzyl benzoate,
Maleic acid26
34

6．試験方法の信頼性
細胞毒性試験 3T3 NRU については、ICCVAM (2006)の「in vitro 細胞毒性試験による急性経口投与毒性試験の初回投与量設定試験」5, 6)において再現性の良い方法であると結論されている。NRU-EUC は ICCVAM のバリデーション研究を基盤としており、本試験法で予測される LD50 値の再現性は良い事が示されている。しかし、この LD50 と in vivo 試験における LD50 との相関は必ずしも良いとは言えないが、2,000 mg/kg を閾値とした「区分外」の判定においては過小評価される予測率は低いと考えられた。

2735

7．その他の試験方法の科学的な報告
細胞毒性試験は、培養細胞に化合物を曝露し細胞の生死により評価を行う。評価法には大きく分けて 2 種類あり、一つは生細胞数または死細胞数、増殖可能な細胞からできたコロニ
ー数など直接的に細胞数を計数する方法であり、もう一つは、細胞に含まれる特定の物質の量や活性、あるいは外部から添加した物質の取り込み量を定量して間接的に細胞数を見積もる方法である。
間接的に細胞数を見積もる方法は、色素取り込み量、細胞内 ATP 量、各種酵素活性を指標にしており、光学的な方法により評価できるため効率的に評価が可能である。
3T3 NRU は、NR が細胞内のライソソームに蓄積することを利用した細胞毒性試験法である。NR を細胞に取り込ませるのに 3～4 時間要し、細胞外の NR を除く洗浄操作、細胞からNR を抽出する操作が必要であり、比較的作業量の多い測定法である 15)。ATP アッセイは非常に感度がよく、10 分程度の反応時間であることからハイスループット化しやすい利点がある 16)。酵素活性を利用する測定法として MTT アッセイがある 17)。ミトコンドリアに取り込まれたテトラゾリウム塩が還元されて不溶性のホルマザンとなる反応を利用した方法であるが、3～4 時間の反応時間と不溶性のホルマザンを細胞から抽出する作業が必要である。
この点を改良した測定した方法として、可溶性のホルマザンに変換され抽出操作を必要としない WST-8 法 18)、reazurin が蛍光物質である resorufin に還元されることを利用した Alamar
blue 法 19-22)がある。
間接的に細胞数を見積もる方法は、細胞の大きさ、ATP 含量及び酵素活性が化合物処理によって影響を受けた場合、直接的に細胞数を計数する方法と結果が異なってくる。実際に、ある種の抗がん剤や変異原物質はミトコンドリア肥大を伴う細胞肥大によって ATP および
NADH 含量を増加させるため ATP アッセイ、MTT アッセイの結果と細胞数に乖離が生じる
ことが報告されている 23, 24)。一方、画像解析装置を用いた High-Content Image Analysis (HCIA)
は細胞が肥大した状態においても、コールターカウンターのように細胞数を計数する方法とほぼ同等の細胞生存率を算出できることが報告されている 25, 26)。
JaCVAM 急性毒性資料編纂委員会では、独自に選択した 16 化合物について実際に 3T3
NRU による評価を行い、細胞生存率の測定結果への測定法による影響を検討した（Annex）。
その結果、細胞周期へ影響する化合物では 3T3 NRU 法での IC50 値が高く評価されるため、LD50 値を大きく評価する可能性が示唆された。
以上のように、種々の細胞毒性評価方法が報告されているが、NRU-EUC 以外には急性経
口毒性における UN GHS 区分外物質識別ための in vitro 代替試験法の報告はない。

28
36

8．3Rs への関与
(1) Replacement
適応される化合物は限定的であるが in vivo 急性経口毒性試験に置き換えるものである。
(2) Reduction
JRC により維持されている New Chemical Database (NCD)によれば、一般工業化合物の約87％が LD50＞2,000 mg/kg に分類されている。動物を用いる急性経口毒性試験を実施する前に in vitro 代替法として NRU-EUC により LD50＞2,000 mg/kg を予測する本アプローチを導入した場合、動物使用数削減に大きく寄与し、費用対効果が妥当であることが推測される。
しかしながら、NRU-EUC により適切に評価できる化合物は極めて限定的であると考えられる（「9．試験方法の有用性と限界」参照）」。
(3) Refinement
動物を使用しない評価であるため、動物への苦痛やストレスはない。

2937

9．試験方法の有用性と限界9.1 物理化学的性質による適用限界
既報告 5, 6)において議論されているように、①水や培養液への溶解性が低い物質、②揮発性の高い物質、③NR の OD 測定を阻害する物質は 3T3 NRU の適用範囲外である。
一般に水溶性が乏しい化合物の in vitro 試験は困難であり適切に評価できないが、JaCVAM
急性毒性資料編纂委員会では、各委員の試験経験から、培養液に混和した場合に沈殿が生じず、均一な懸濁液の状態が得られる場合には評価が可能であると結論した。一方、均一な懸濁状態が得られず、沈殿が生じる場合には 3T3 NRU を適用することはできない。仮に実施可能であったとしてもデータの信頼性が乏しい。実際に、JaCVAM 急性毒性資料編纂委員
会では、独自に選択した 10 化合物について、3T3 NRU を実施した。その結果、溶解性が低く沈殿が生じる Digoxin は再現性のある結果が得られなかった（Appendix 3）。したがって、
3T3 NRU の実施に際しては、事前に細胞培養液への溶解性の試験を実施してデータを得る
必要がある。
In vivo 急性経口毒性試験では、規制上の限界用量（2,000 mg/kg または 5,000 mg/kg）において被験物質に毒性がない可能性が高いことを示す周辺情報がある場合には、数段階の用量を用いた完全な試験は不要であり、2,000 mg/kg または 5,000 mg/kg の一用量のみの「限度試験」が実施される。一般に、高分子かつ難溶解性物質は生体への吸収性が乏しく、経口投与による毒性が弱いため、限度試験が適当と思われる。
水溶性が高く、培養液中で沈殿を生じない物質は適切な評価が可能であるが、本試験法はLD50＞2,000 mg/kg を評価するため高濃度での実験が必要である。本試験法では、LD50 値の予測にモル濃度と重量濃度を使用した 2 種類の関係式が使用されている。関係式から LD50
値が 2,000 mg/kg として分子量を元に IC50 値を計算すると、分子量が 174 以下の化合物では、LD50 値 2,000 mg/kg を与える IC50 値を得るために必要となる濃度が 10 mM を超え、分子量 77 以下では、LD50 値 2,000 mg/kg を与える IC50 値を得るために必要となる実験濃度が5 mg/mL を超える(Appendix 2)。従って、本試験方法では、モル濃度を用いる場合には分子
量 174 以下の物質、重量濃度を用いる場合には分子量 77 以下の物質は適用範囲外である。

9.2 毒性発現機序による適用限界
3T3 NRU には化合物の代謝活性化系が含まれていないため、代謝活性化により毒性発現をする物質の評価はできない。化合物の代謝物の構造についてはある程度の予測は可能であるが、各代謝物の量的関係を予測することは困難である。また、代謝物による細胞毒性を調べるためには代謝物の合成が必要となるが合成が困難な場合もあるため、3T3 NRU で代謝物を評価することは現実的ではない。
3T3 NRU による毒性評価は basal cytotoxicity に起因する細胞死であり、心臓毒性、神経毒性など臓器特異的な毒性を有する化合物の評価には適切ではないとされている。臓器特異的な毒性を示す化合物は、一般に低濃度で生体影響を示し個体死を招く。化合物の構造から
30
38

臓器特異的な生体影響を推測することは難しく、一般に急性経口毒性試験が実施される開発初期段階においては生体影響に関する情報が得られることは少ないため、新規化合物については本試験のみで評価することは困難と考えられる。
生 体影 響に関 する 周辺情 報が ある場 合に は、本 試験 法によ り評 価が可 能で あ る 。
Bulgheroni ら(2009)は 28 日間反復投与毒性試験の情報を用い、NOAEL が 200 mg/kg/day より大きい場合には LD50>2,000 mg/kg と判断することができると報告している 14)。このような情報が得られる場合には本試験法により評価が可能であろう。
JaCVAM 資料編纂委員会では、臓器特異的な毒性を有する化合物の本試験系への適用について、ICCVAM のバリデーション研究で用いられた 67 化合物のデータ (http://ntp.niehs.
nih.gov/pubhealth/evalatm/test-method-evaluations/acute-systemic-tox/in-vitro-validation)と、独自に実施した 3T3 NRU 実験成績を基に議論を行った。
3T3 NRU による LD50 の予測は、低濃度で毒性を発現する化合物においては IC50 から予測される LD50 が in vivo 試験から得られた LD50 よりも大きな値を示し、例えば、in vivo LD50
が 50 mg/kg 以下である化合物の予測値は 14～270.4 倍大きな値を示すことから（表 10）、
本評価法による予測性は極めて低いと考察される。一方、NRU-EUC は LD50＞2,000 mg/kgである化合物を分類する方法として提案されており、2,000 mg/kg を閾値として分類すると
GHS 区分内化合物に含まれる化合物の内では Digoxin（強心配糖体）のみが区分外となる。
Amitriptyline（三環系抗うつ薬、アミントランスポーター阻害）、Nicotine（ニコチン受容体作動薬）、Strychnine（グリシンレセプターアンタゴニスト、強直性痙攣誘発）、Verapamil（抗不整脈薬、Ｌ型カルシウムチャネルアンタゴニスト）など、受容体またはイオンチャネ
ル選択的に作用を及ぼすことが知られている薬物においても、予測される LD50 値は in vivo
LD50 と乖離があるものの LD50＜2,000mg/kg と予測され、「区分外」と判断されることはな
かった。
JaCVAM 資料編纂委員会で独自に実施した試験結果においても、臓器特異的な毒性発現を示すことが知られている物質(Aconitine、Coumarine、Acetamiprid、Imidacloprid)においてIC50 から予測される LD50 は＜2,000mg/kg であり、区分外と判断されることはなかった（Appendix 3）。
以上の結果より、2,000mg/kg を閾値として 3T3 NRU による急性経口毒性の評価が可能であることが示唆される。ただし、評価した化合物は限定的であり、個体死を引き起こす機序と細胞死を引き起こす機序が解離していることがある点に注意が必要である。

9.3 行政的利用の観点からの有用性
本評価法が適用可能であるものは、in vitro 試験が適切に実施できる物理化学的性質を有し、全ての細胞に共通した構造あるいは機能に対する毒性（basal cytotoxicity）によって発現する毒性が致死毒性の機構であることが条件であり、臓器特異的な毒性を示す化合物は適用範囲外である。従って、3T3 NRU のみで評価が可能であると判断できる物質は、極めて豊富
31
39

な情報が明らかな化合物である。本評価法が適用可能と想定される化合物は、急性経口毒性
試験以外の生体影響評価がなされている場合に限定される。
一方で、規制上の利用を考えると、急性経口毒性試験が求められる法律またはガイドライ
ンは、毒劇物の指定、医薬部外品の製造販売承認および化粧品のポジティブリストの改正要請に絞られる。JaCVAM 資料編纂委員会では、NRU-EUC の規制上の利用性について議論を行い、以下の条件においては適用できる可能性があると結論した。
(1) 市場で既に使用実績があるもので豊富な情報がある物質(2) 既知の化合物と類似性が極めて高い物質（1）の条件に関しては、市場で既に使用されており、急性毒性に関する情報あるいは急性毒性を予測可能な情報が入手できる物質、もしくは規格が僅かに異なる物質の評価において in vivo 急性毒性試験を代替することは可能と考えられる。具体的には、急性毒性に関する情報は存在するものの試験が実施された年代が非常に古い場合、あるいはデータの信頼性が乏しいと考えられる場合、急性毒性試験成績は存在しないが Bulgheroni ら 14)の報告にあるように LD50>2,000mg/kg を予測し得る情報がある場合において急性毒性試験のデータを必要とする場合が想定される。
（2）の条件に関しての課題は、化学物質の有害性評価に Read Across が導入されているものの、化合物の類似性を客観的に評価できる手法が確立されていないことである。一般論として構造式の類似性は毒性予測に有効であるが、毒性に差が認められる場合もあることか
ら構造式を用いた予測に加えて、類似化合物の毒性情報や代謝についても検討が必要である。JaCVAM 急性毒性資料編纂委員会では、化合物の類似性を客観的に評価できる手法の開発は、NRU-EUC の適用範囲を広げるために有効であると結論した。
NRU-EUC の具体的な利用法としては、劇物にラベルされた化合物を含む製剤の劇物からの除外申請において適用できる可能性がある。原体が劇物に指定されている物質を含む製剤について、普通物への除外申請がなされる場合には当該製剤の急性経口毒性試験のデー
タの提出が求められる。除外申請においてはいくつかの原則が定められているが、「2,000
mg/kg の用量を用いた経口投与毒性試験において毒性徴候が観察されないこと」が一つの条件である。除外申請される時点においては原体に関する急性毒性の情報が存在しており、溶解性等の物理化学的性状についての情報もあるため、製剤の NRU-EUC への適用性を判断しやすく、結果の解釈もしやすい。一般に製剤は溶媒に溶解または懸濁した状態で供されるため NRU-EUC の実施において問題となる溶解性の問題を回避できる利点がある。一方で溶解性を高めるために添加される界面活性剤の濃度によっては適切に評価できない場合があるため注意が必要である。ICCVAM のバリデーション研究において、3T3 NRU は強毒性の物質については予測性が低いことが示されているが、毒物に判定された化合物の製剤は原則として除外を行わないため、NRU-EUC による評価の対象となることはないと想定される。NRU-EUC を製剤の劇物からの除外申請に適用する際に考慮すべきこととして、並行して原体の in vivo 試験における LD50 を 3T3 NRU により予測できることを示す必要がある。

3240また、NRU-EUC は有機シアン化合物の除外申請において使用できる可能性がある。有機
シアン化合物およびこれを含有する製剤は自動的に劇物指定となるが、これらを普通物とするためには、毒性データを提出して劇物からの除外申請が必要である。NRU-EUC は、
ICCVAM のバリデーション研究 5)において Potassium cyanide を LD50<2,000 mg/kg と評価できている。有機シアン化合物においてはニトリル基が遊離することで発現する毒性が問題である。有機化学の専門家であれば相当の精度をもってニトリル基が遊離するか否かを予測できるが、その評価を行う際に化合物の周辺情報として利用できる可能性がある。なお、
3T3 NRU 法では薬物代謝系が欠損していることも念頭にいれておく必要がある。既に評価されているシアン毒性を有する有機シアン化合物と毒性が無い有機シアン化合物の細胞毒性データを整備することで、有機シアン化合物の劇物からの除外を代替法により達成できる可能性がある。

33
41

表 10

ICCVAM バリデーション研究で用いられた参照化合物の in vivo LD50 値と予測 LD50

値の比較

Substance

Log
Reference Original Reference
Molecular
Original
2
LD50
LD50
Weight IC50 (mM)
LD50
LD50
(g/mole)(mg/kg)(mmol/kg) (mg/kg)(mmol/kg)

Predicted
GHS
Category Category

Cycloheximide
Phenylthiourea
Sodium selenate
Triethylenemelamine
Physostigmine
Disulfoton
Parathion
Strychnine
Aminopterin
Potassium Cyanide
BusulfanThallium Sulfate
Arsenictrioxide
Endosulfan
DigoxinMercury Chloride
Sodium Arsenite
Sodium Dichromate Dihydrate
Dichlorvos (DDVP)
Nicotine
Fenpropathrin
Hexachlorophene
Paraquat
LindaneVerapamil HCl-2.148-1.705-2.072-2.310-1.787-2.137-2.161-2.144-2.167-0.824-2.090-1.241-1.000-1.354-1.637-2.434-0.501-0.719-1.114-0.511-1.288-0.824-0.509-0.585-0.658281.40152.20188.94204.23275.40274.42291.30334.40440.4765.12
246.31504.80197.84406.91780.90271.50129.90298.00220.98162.20349.43406.91
257.20290.80491.08

0.001
0.519
0.154
0.001
0.097
1.456
0.128
0.472
0.000
0.532
0.315
0.011
0.010
0.014
0.570
0.015
0.006
0.002
0.080
2.225
0.067
0.010
0.078
0.384
0.071

0.007
0.020
0.008
0.005
0.016
0.007
0.007
0.007
0.007
0.150
0.008
0.057
0.100
0.044
0.023
0.004
0.316
0.191
0.077
0.308
0.052
0.150
0.310
0.260
0.220

2.00
3.00
1.60
1.00
4.50
2.00
2.01
2.40
3.00
9.77
2.00
29.00
19.78
18.00
18.00
1.00
41.00
56.87
17.00
50.00
18.00
61.00
79.73
75.61
108.00

2.0
3.0
3.0
4.0
5.0
5.0
6.1
6.3
7.0
7.2
12.1
25.0
25.1
27.8
28.3
40.2
43.6
50.5
58.7
69.7
75.7
82.0
92.7
100.0
111.0

47
477
347
47
412
1352
494
1005
14
206
620
288
112
265
2550
180
57
81
305
963
445
228
351
798
643

23.7
158.9
115.6
11.7
82.5
270.4
81.1
159.5
2.0
28.6
51.2
11.5
4.5
9.5
90.2
4.5
1.3
1.6
5.2
13.8
5.9
2.8
3.8
8.0
5.8

C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
UC
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C

C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C

Sodium fluoride
Cadmium chloride
Diquat Dibromide Monohydrate
Phenobarbital
Caffeine
Triphenyltin Hydroxide
Haloperidol
Amitriptyline HCl
Propranolol
Cupric Sulfate Pentahydrate
PhenolLithium carbonate
Glutethimide
Sodium Oxalate
Chloral Hydrate
Atropine Sulfate
Valproic Acid
Meprobamate
Acetylsalicylic Acid
Procainamide HCl
Acetaminophen
Potassium chloride
Carbamazepine
Boric Acid
5-Aminosalicylic Acid
Chloramphenicol
Acetonitrile
Lactic Acid
Sodium Chloride
Xylene2-Propanol
Trichloroacetic Acid

0.632
-0.319-0.173-0.154-0.005-0.921-0.468
0.061
0.201
0.080
0.643
1.206
0.441
0.063
0.462
-0.036
1.009
0.561
0.744
0.856
1.201
1.543
0.918
1.634
1.704
1.021
1.966
1.617
1.710
1.607
1.988
1.486

41.99
183.30362.10232.23194.20367.02375.90313.90295.84249.7094.11
73.89
217.30134.00165.40694.80144.20218.30180.20271.79151.2074.55
236.3061.83
153.10323.15
41.05
90.08
58.44
106.1760.11
163.40

1.858
0.003
0.022
2.524
0.785
0.000
0.016
0.022
0.048
0.151
0.705
7.601
0.833
0.277
1.107
0.109
5.727
2.245
3.754
1.621
0.315
47.6820.437
29.92410.8870.403
193.701
33.79281.207
6.787
58.037
5.519

4.290
0.480
0.671
0.702
0.989
0.120
0.341
1.150
1.589
1.201
4.400
16.064
2.761
1.157
2.896
0.920
10.200
3.637
5.549
7.175
15.89934.9038.282
43.02150.61410.50092.52141.40851.30040.50197.20530.594180.1488.00
243.10163.00
192.0044.00
128.00360.92470.00300.00414.101187.00
600.00155.00479.00639.471470.84794.00999.941950.002404.00
2602.00
1957.00
2660.00
7749.00
3393.00
3798.00
3730.00
2998.00
4300.00
5843.00
4999.00

126.8
135.2
160.0
224.0
310.0
329.0
330.0
349.0
466.0
475.0
548.0
590.0
600.0
633.0
638.0
819.0
996.0
1386.81506.01950.02162.02802.02807.03426.03428.03490.03595.03635.04050.04665.05105.05229.0

230
58
284
1457
730
19
258
248
325
455
337
752
838
319
723
1099
1296
1301
1346
1404
381
1699
686
1149
1825
906
1731
1765
1683
1028
1494
1445

1.8
0.4
1.8
6.5
2.4
0.1
0.8
0.7
0.7
1.0
0.6
1.3
1.4
0.5
1.1
1.3
1.3
0.9
0.9
0.7
0.2
0.6
0.2
0.3
0.5
0.3
0.5
0.5
0.4
0.2
0.3
0.3

C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C

C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC

Dimethylformamide
Citric Acid
Gibberellic Acid
Ethyleneglycol
Dibutyl Phthalate
Diethyl Phthalate
Sodium Hypochlorite
Ethanol
1,1,1-Trichloroethane
Glycerol

1.583
1.194
1.260
2.140
1.635
1.588
2.078
2.483
1.888
2.139

73.10
192.10346.3862.08
278.30222.2074.44
46.07
133.41
92.09

71.4633.981
22.548393.6150.156
0.483
13.971141.588
153.307264.365

38.30415.61718.201138.000
43.11238.713119.694304.066
77.194137.8122800.00
3000.00
6304.60
8567.04
11998.18
8602.00
8910.00
14008.32
10298.48
12691.10

5305.05929.06039.57161.08892.09311.010327.611324.012078.1
19770.0

1990
1472
5683
3574
514
674
990
1693
5078
4452

0.4
0.2
0.9
0.5
0.1
0.1
0.1
0.1
0.4
0.2

C
C
UC
UC
C
C
C
C
UC
UC

UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC
UC

34
42

Ratio
Predicted
Predictede
LD50 (mg/kg) by
RC rat-only mM LD50 /Reference
LD50
Regression

10．結論
3T3 NRU の頑健性等の一般的な内容ついては、既報告の「in vitro 細胞毒性試験による急性毒性試験の初回投与量設定試験」で既に評価が行われ、その妥当性が確認されている。また、LD50 値が 2,000mg/kg 以下であるか否かを判定する方法としても、その再現性や予測性が確認されており、妥当な評価方法である。
バリデーション研究の被験物質として、信頼できる in vivo データが入手可能であり、かつ、in vitro 試験の実施が可能である化合物が選択されている点において、化合物の選択方
法に妥当性はあるが、LD50 値 > 2,000 mg/kg を得るために必要となる濃度が、一般に in vitro
試験の上限とされる 10 mM を超えるため適切な評価ができないと考えられる低分子量の化合物が約半数を占めており、適切な試験の実施という観点からは課題と考えられる。一方、上限を 5 mg/mL とした場合には、評価できる化合物は 9 割を超え、一部、沈殿等の認められた化合物もあったが、ほとんどの場合、IC50 値に影響しない濃度で認められたことから適切に評価されたと考えられる。
NRU-EUC は in vivo 急性経口毒性試験の代替（Replacement）であり、急性経口毒性試験における使用動物数の削減（Reduction）および死亡動物の削減や動物への苦痛・ストレスの軽減（Refinement）に貢献できるものである。しかしながら、物性面の制約から 3T3 NRU により適切に評価できる化合物は限定的であると考えられる。
本評価法が適用可能であるものは、in vitro 試験が適切に実施できる物理化学的性質、特に溶解性が高く basal cytotoxicity によって生体毒性が発現する物質であることが条件である。
周辺情報が乏しいハザードが未知の物質に対して 3T3 NRU 試験を適用した場合、判断を誤る可能性がある。一方で、規制上の利用を考えると、市場で使用実績があるもので豊富な情報がある物質や既知の化合物との類似性が極めて高い物質については適用できる可能性がある。具体的な利用法として原体に関する豊富な情報がある劇物を含む製剤の除外申請に利用できる可能性があると判断された。今後、さらにデータを蓄積・整備する必要がある。

35
43

11．参考文献
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3745

Appendix１
ICCVAM バリデーション試験で使用された参照化合物の溶解度評価

38
46

目的
In vitro 試験は評価する化学物質の物性による制約が大きく、中でも溶解性は重要なファクターであり、水に難溶解性である化学物質においては実験結果の再現性は低い。ECVAM
から提案された評価方法は、LD50＞2,000 mg/kg（GHS 区分外）を 3T3 NRU により評価する
ため、高濃度域においても十分な溶解性を有していることが必要である。
JaCVAM 急性毒性資料編纂委員会では、ICCVAM の 3T3 NRU 試験のバリデーションに用いられた 67 種類の参照化学物質の溶解性について独自に調査を行い、3T3 NRU を用いて
GHS 区分外を判断する評価方法の妥当性を考察する一助とした。この参照化合物の調査を行った理由は、①ECVAM の評価方法の基盤となった試験であること、②参照化合物に臓器特異的な毒性を示す強毒性の化合物（LD50<50 mg/kg）が 17 化合物（25％）含まれていること、③ECVAM の参照化合物とは１種類（Cupric Sulfate Pentahydrate）を除き重複していないことである。

方法
インターネット上に公開されているデータベース（PubChem）により溶解性の調査を行った。得られた溶解性データが 3T3 NRU の IC50 値を与える濃度を下回っている場合にはInsoluble と判定した。

結果
67 化合物のうち 12 化合物において IC50 値を与える濃度がその化学物質の溶解度を超え、そのうち 6 化合物が LD50＞2,000 mg/kg であった。一方、ICCVAM のバリデーション試験結果では、6 化合物において沈殿が認められている。また、データベースの情報では溶解性が高いが、実験では沈殿が認められている化合物が 1 化合物（Sodium Oxalate）あった。
以上の検討結果と、各委員の試験経験から、沈殿が生じない均一な懸濁液の状態が得られる
場合には評価が可能であると結論した。

3947

表１ICCVAM の 3T3 NRU 試験のバリデーションに用いられた 67 種類の参照化
学物質の溶解性調査結果
No.

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67

Substance
1,1,1-Trichloroethane
2-Propanol
5-Aminosalicylic Acid
Acetaminophen
Acetonitrile
Acetylsalicylic Acid
Aminopterin
Amitriptyline HCl
Arsenictrioxide
Atropine Sulfate
Boric Acid
BusulfanCadmium chloride
Caffeine
Carbamazepine
Chloral Hydrate
Chloramphenicol
Citric Acid
Cupric Sulfate Pentahydrate
Cycloheximide
Dibutyl Phthalate
Dichlorvos (DDVP)
Diethyl Phthalate
DigoxinDimethylformamide
Diquat Dibromide Monohydrate
Disulfoton
Endosulfan
Ethanol
Ethyleneglycol
Fenpropathrin
Gibberellic Acid
Glutethimide
GlycerolHaloperidol
Hexachlorophene
Lactic Acid
Lindane
Lithium carbonate
Meprobamate
Mercury Chloride
Nicotine
Paraquat
Parathion
Phenobarbital
PhenolPhenylthiourea
Physostigmine
Potassium Cyanide
Potassium chloride
Procainamide HCl
Propranolol
Sodium Arsenite
Sodium Chloride
Sodium Dichromate Dihydrate
Sodium Hypochlorite
Sodium Oxalate
Sodium fluoride
Sodium selenate
Strychnine
Thallium Sulfate
Trichloroacetic Acid
Triethylenemelamine
Triphenyltin Hydroxide
Valproic Acid
Verapamil HCl
XyleneCAS71-55-6
67-63-0
89-57-6
103-90-2
75-05-8
50-78-2
54-62-6
50-48-6
1327-53-3
51-55-810043-35-3
10043-35-3
10108-64-2
58-08-2
298-46-4
302-17-0
56-75-7
77-92-97758-99-8
66-81-984-74-2
62-73-7
84-66-2
20830-75-5
68-12-22764-72-9
298-04-4
115-29-7
64-17-5
107-21-1
39515-41-8
77-06-5
77-21-4
56-81-5
52-86-870-30-4
50-21-5
58-89-9554-13-2
57-53-4
7487-94-7
54-11-5
1910-42-5
56-38-2
50-06-6
108-95-2
103-85-5
57-47-6
151-50-8
3447-40-7
614-39-1
318-98-9
7784-46-5
7647-14-5
10588-01-9
7681-52-9
62-76-07681-49-4
10102-18-8
57-24-97446-18-6
76-03-951-18-3
76-87-9
99-66-1
152-11-4
108-38-3

Molecular Reference
IC50
LD50
Weight2 (mg/mL)(g/mole)(mg/kg)133.41
60.11
153.10151.2041.05
180.20440.47313.90197.84694.8061.83
246.31
183.30194.20236.30165.40323.15
192.10249.70281.40278.30220.98222.20780.9073.10
362.10274.42406.91
46.07
62.08
349.43346.38217.3092.09
375.90406.91
90.08
290.8073.89
218.30271.50162.20257.20291.30232.23
94.11
152.20275.4065.12
74.55
271.79295.84129.9058.44
298.0074.44
134.0041.99
188.94334.40504.80163.40204.23367.02144.20491.08106.17

Value

Judge

Source (URL)

12078.1 20452.7
1290 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/1_1_1-trichloroethane
5105.0 3488.6 1000000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/isopropanol
3428.0 1666.8
840 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5-Aminosalicylic_acid
2162.047.714000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetaminophen
3595.0 7951.4 >800000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetonitrile1506.0676.44600 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/aspirin
7.0
0.006
3000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/aminopterin
349.0
7.1
9.71 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/amitriptyline
25.1
2.1
37000 http://www.chemicalbook.com/CASEN_1327-53-3.htm
819.0
76.0
2200 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/atropine
3426.0 1850.2
47200 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/boric_acid
12.1
77.7
68900 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/busulfan
135.2
0.5 1200000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Cadmium_dichloride
310.0
152.5
21600 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/caffeine
2807.0103.2
17.7 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/carbamazepine
638.0
183.1 793000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/chloral_hydrate
3490.0130.2
2500 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/chloramphenicol5929.0764.7 383000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/citric_acid475.0
37.6 230500 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Copper_II__sulfate_pentahydrate
2.0
0.2
21000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/cycloheximide
8892.043.4
11.2 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/dibutyl_phthalate
58.7
17.7
8000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/dichlorvos
9311.0107.31080 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/diethyl_phthalate
28.3
445.5
64.8 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/digoxin
5305.0 5224.0 1000000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/n_n-dimethylformamide
160.0
8.0 708000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/115268
5.0
399.6
16.3 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/disulfoton
27.8
5.9
0.53 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/endosulfan
11324.0 6523.0 1000000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/ethanol
7161.0 24435.6 100000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/ethylene_glycol
75.7
23.3
0.014 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Fenpropathrin
6039.5 7810.3
5000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/439551
600.0
181.0
999 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/glutethimide
19770.0 24345.4 5296000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/glycerol
330.0
6.1
14 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/haloperidol
82.0
4.2
140 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/hexachlorophene3635.0 3044.0 1000000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/lactic_acid
100.0
111.5
7.3 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/lindane
590.0
561.6
13100 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/lithium_carbonate
1386.8490.03400 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/meprobamate
40.2
4.1
69000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/mercuric_chloride
69.7
360.9 1000000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/nicotine
92.7
20.1 620000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/paraquat
6.1
37.4
11 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/parathion
224.0
586.1
1110 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/phenobarbital
548.0
66.3
82800 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/phenol
3.0
79.0
2470 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Phenylthiourea
5.0
26.6
7760 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/physostigmine
7.2
34.6 716000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/potassium_cyanide
2802.0 3554.7 355000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/potassium_chloride
1950.0440.750000 http://www.scbt.jp/datasheet-202297-procainamide-hydrochloride.html
466.0
14.1
61.7 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/propranolol
43.6
0.8 100000 https://www.scbt.com/scbt/ja/product/sodium-meta-arsenite-7784-46-5
4050.0 4745.8 360000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/sodium_chloride
50.5
0.6 1870000 http://anzeninfo.mhlw.go.jp/anzen/gmsds/10588-01-9.html
10327.6 1040.0 293000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/sodium_hypochlorite
633.0
37.1
37000 http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_JP_CB5369366.htm
126.8
78.0
43000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/sodium_fluoride
3.0
29.0
898000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Disodium_selenite
6.3
157.9
160 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/strychnine
25.0
5.4
48700 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Thallium_I__sulfate5229.0901.8
54000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/trichloroacetic_acid
4.0
0.3
400000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Triethylenemelamine
329.0
0.0
1 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Triphenyltin_hydroxide
996.0
825.8
2000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/valproic_acid
111.0
34.9
83000 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Verapamil_hydrochloride
4665.0720.6
161 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/m-xylene

40
48

Reference (Pubchem)
Water solubility at 20～25℃ (mg/L)

Insoluble
SolubleInsoluble
SolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleInsoluble
SolubleSolubleSolubleSolubleSolubleInsoluble
SolubleSolubleInsoluble
SolubleSolubleInsoluble
Insoluble
SolubleSolubleInsoluble
Insoluble
SolubleSolubleSolubleSolubleSolubleInsoluble
SolubleSolubleSolubleSolubleSolubleInsoluble
SolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleSolubleInsoluble

Appendix 2関係式から 2,000 mg/kg の LD50 値を与える IC50 値により規定される評価可能
な分子量

41
49

目的
In vitro 試験の実施においては被験物質の物性面での制約が大きい。本試験法は LD50>2,000
mg/kg を予測する試験であるため、高濃度域におけるデータの取得が必要である。溶解性が乏しい化学物質の場合、高濃度の試験が実施できない可能性がある。一方、溶解性が高い物
質は高濃度域まで実験が可能であるが、低分子量の化学物質では細胞培養液の浸透圧が非生理的な条件となり適切な細胞毒性評価ができない。一般に in vitro 試験の上限濃度は 10mM または 5 mg/mL が最高濃度とされる。この視点から、LD50 値予測可能な分子量について考察した。
方法
ICCVAM、ECVAM の評価書では、LD50 の予測値はデータベースより得られた数値を基に回帰分析により関係式を求めて算出している。予測に使用された関係式は 2 種類あり、LD50
値と IC50 値の表記単位はモル濃度あるいは質量濃度が使用されており(1) LD50; mmol/kg
IC50; mM、(2) LD50; mg/kg IC50 ;μg/mL の組み合わせで関係式が求められている。
高いモル濃度域で 3T3 NRU を実施する場合、低分子量の化学物質ほど多くの溶質を細胞培養液に添加することになる。そこで、モル濃度単位を用いた関係式において LD50 値が2,000 mg/kg である場合に、試験濃度が 10 mM または 5 mg/mL 未満で IC50 値が算出可能な分子量を計算した。
計算には以下の 3 種類の関係式を使用した。
1) ICCVAM の「In vitro cytotoxicity test methods for estimating starting doses for acute oral systemic
toxicity testing」および ECVAM の「Follow-up study on the predictive capacity of the 3T3 Neutral
Red Uptake cytotoxicity assay to correctly identify substances not classified for acute oral toxicity
under the EU CLP system (LD50 > 2,000 mg/kg)」で評価された EURL ECVAM Recommendationon the 3T3 Neutral Red Uptake Cytotoxicity Assay for Acute Oral Toxicity Testing (Report EUR
25946 EN, April 2013), P7, "2. Test method definition", "12)" より、ECVAM DB-ALM Protocol
no 139, p3 に記載の 2 式
1-a) Validated millimole regression model (the RC rat-only millimole regression):
Log LD50 (mmol/kg) = 0.439 Log IC50 (mM) + 0.621
1-b) Validated weight regression model (RC rat-only weight regression):
Log LD50 (mg/kg) = 0.372 log IC50 (μg/mL) + 2.024

2) Halle のデータを基にしたデータベース「The Registry of Cytotoxicity (RC)」からの millimole
regression formula:
Log LD50 (mmol/kg) = 0.435 log IC50 (mM) + 0.625

4250

1-a および 1-b の 2 式は「The Registry of Cytotoxicity (RC)」 に記載のデータベース中の 347
物質のうちラット経口 LD50 値の得られた 282 物質を用いて得られたものである。ECVAMの follow-up study では millimole regression で高い予測性が示されている。
1-a および 1-b の式の運用については ECVAM DB-ALM Protocol no 139 中に以下が記載されている。
「Millimole regression model は、分子量がわかっていて純度の高い物質に適している。Weight
regression model は混合物や構造/分子量がわからない物質および不純物の割合が高い物質に使用できる。Weight regression model では高分子量の物質では明らかに overestimate することが validation study からわかっている。」
ただし、実際のバリデーション研究では混合物については試験が行われていない。
1) ICCVAM, ECVAM で評価された式を用いた計算（１）

1-a； Validated millimole regression modellog LD50 (mmol/kg)=0.439 x log IC50 (mM) + 0.621（a）In vitro 試験での最高濃度を 10 mM と設定した場合
LD50 = 2,000 mg/kg, IC50 = 10 mM のとき、以下の式より分子量 (MW) は 174.2
log (2,000 mg/kg÷[MW]) = 0.439 x log (10 mM) + 0.621 = 1.06
2,000/[MW] = 10 1.06 = 11.482[MW] = 2,000/11.482 = 174.2（b）In vitro 試験での最高濃度を 5 mg/mL と設定した場合
LD50 = 2,000 mg/kg, IC50 = 5 mg/mL のとき、以下の式より MW は 76.3
log (2,000 mg/kg÷[MW]) = 0.439 x log (5 mg/mLx1,000÷[MW]) + 0.621
log[MW]=1.8827[MW]=76.327

43
51

表1
MW

2000 mg

計算値(mmol)(log IC50, mM) (IC50, mM) (IC50, mg/mL)
171.696
2.235
8.585
79.780
1.902
5.585
1.817
5.002
65.560

50
70
76.3

40.00
28.57
26.21

80

25.00

1.770

90
100
150
174

22.22
20.00
13.33
11.49

1.653
1.549
1.148
1.001

175

11.43

0.995

200
500
800
1000

10.00
4.00
2.50
2.00

0.863
-0.043-0.508-0.72958.85745.00635.40314.05810.025
9.895
7.300
0.905
0.310
0.187

4.709
4.051
3.540
2.109
1.744
1.732
1.460
0.453
0.248
0.187

関係式から LD50 値が 2,000 mg/kg として分子量を基に IC50 値を計算すると、表 1 の結果となる。分子量が 174 以下の化学物質では、LD50 値 2,000 ㎎/㎏を与える IC50 値を得るために必要となる実験濃度が 10 mM を超え、分子量 76 以下では、LD50 値 2,000 ㎎/㎏を与える
IC50 値を得るために必要となる実験濃度が 5 mg/mL を超える。

（２）

1-b；Validated weight regression modellog LD50 (mg/kg)=0.372 x log IC50 (μg/mL) + 2.024
表2
IC50

LD50

(ug/mL) (mg/kg)
500
1067
1000
1380
1786
2000
2710
5000
8000
10000

2000
2512
2992
3251

分子量が特定できない場合（混合物、不純物が多い等）は、Weight regression model を用いる．試験最高濃度を 5 mg/mL とすると、LD50 値 2,000mg/kg を超える予測は可能となる。
(3) Original RC regressionlog LD50 (mmol/kg)=0.435 x log IC50 (mM) + 0.625
4452

(a) In vitro 試験での最高濃度を 10 mM と設定した場合
LD50 = 2,000 mg/kg, IC50 = 10 mM のとき、以下の式より分子量 (MW) は 174.2
log (2,000 mg/kg÷[MW]) = 0.435 x log (5 mg/mL÷[MW]) + 0.625 = 1.06
2,000/[MW] = 10 1.06 = 11.482[MW] = 2,000/11.482 = 174.193(b) In vitro 試験での最高濃度を 5 mg/mL と設定した場合
LD50 = 2,000 mg/kg, IC50 = 5 mg/mL のとき、以下の式より MW は 77.3
log (2,000 mg/kg÷[MW]) = 0.435 x log (5 mg/mLx1,000÷[MW]) + 0.625
log[MW]=1.8885[MW]=77.349
表3MW2000 mg(mmol)

計算値(log IC50, mM) (IC50, mM) (IC50, mg/mL)
176.244
2.246
8.812
81.318
1.910
5.692
1.811
5.004
64.737

50
70
77.3

40.00
28.57
25.87

80

25.00

1.777

90
100
150
174

22.22
20.00
13.33
11.49

1.659
1.554
1.149
1.001

175

11.43

0.995

200
500
800
1000

10.00
4.00
2.50
2.00

0.862
-0.053-0.522-0.7454.786

59.82445.63335.81714.102

4.107
3.582
2.115
1.744

10.025

1.731

9.894
7.279
0.886
0.301

1.456
0.443
0.240
0.180

0.180

関係式から LD50 値が 2,000 mg/kg として分子量を基に IC50 値を計算すると、表 11-3 の結果となる。分子量が 174 以下の化学物質では、LD50 値 2,000 ㎎/㎏を与える IC50 値を得るために必要となる実験濃度が 10 mM を超え、分子量 77 以下では、LD50 値 2,000 ㎎/㎏を与える IC50 値を得るために必要となる実験濃度が 5 mg/mL を超える。

45
53

結論
以上の検討結果から、バリデーション研究により評価された 2 種の関係式（millimole
regression model と weight regression model）とオリジナルの関係式（millimole regression）の3 種類の関係式中、計算にモル濃度単位を使用した関係式では、分子量 174 以下では LD50
値 > 2,000 mg/kg を得るために必要となる実験濃度が、一般に in vitro 試験の上限とされる
10mM を超えるため、適切な評価ができないと結論された。

46
54

Appendix

3

3T3 NRU の評価に適さないと考えられる化合物の評価

47
55

目的
ECVAM の参照化合物では、強毒性の化合物及び臓器特異的な化合物の割合が少ない。これらは 3T3 NRU の適応限界から外れると考えられる化合物である。JaCVAM 急性毒性資料
編纂委員会では独自に選択した化合物にについて試験を実施し、LD50 値を算出し評価の一助とした。
評価物質と選択理由(1) Thiourea：
ICCVAM リストにおいて、IC50 が 5 mg/mL 以上で急性毒性が 2,000 mg/kg 未満(2) Piperazine：
ICCVAM リストにおいて、IC50 が 5 mg/mL 以上で急性毒性が 2,000 mg/kg 未満(3) 1-Nitropropane：
ICCVAM リストにおいて、IC50 が 5 mg/mL 以上で急性毒性が 2,000 mg/kg 未満(4) 1,3,5-Trioxane：
ECVAM 評価書において 3 施設のうち 1 施設が FN を示した物質(5) Digoxin：
心臓特異的な毒性を有するため 3T3 NRU の適応限界から外れる物質(6) Aconitine：
神経特異的な毒性を有するため 3T3 NRU の適応限界から外れる物質(7) Coumarin：
化粧品関連の物質であり、血液凝固系を特異的に阻害するため 3T3 NRU の適応限界から外れる物質(8) 2,4-Diamino-6-Phenyl-s-Triazine：
細胞毒性が弱いが LD50 が 1,000 mg/kg である(9) Imidacloprid：
神経特異的な毒性を有するため 3T3 NRU の適応限界から外れる物質(10) Acetamiprid：
神経特異的な毒性を有するため 3T3 NRU の適応限界から外れる物質
対照物質と陽性対照物質
陰性対照物質（溶媒）は、Dimethyl sulfoxide（DMSO、和光純薬）および注射用水（光製薬）を使用した。陽性対照材料として、Sodium dodecyl sulfate（SDS）は、Sigma 社から購入した。
細胞および細胞播種
Balb/c 3T3 クローン A31 細胞（マウス胎児由来繊維芽細胞）は DS ファーマより購入した。入手した時点で 3 代のものを、さらに 10 代まで継代して凍結保存した。これを解凍後2 代で試験に用いた。培養は、ウシ新生児血清（NBS, ロット番号：07C001、Biowest 社）を
10 %含む DMEM 培地（GIBCO）を用い、CO2 インキュベーター（CO2 濃度 5%、37C）内で
培養した。

48
56

試験 1 日目に培養フラスコで増殖させた 3T3 細胞をトリプシン溶液で剥離／洗浄後、10%NBS 含有 DMEM 培地に懸濁し、20,000 個／mL に調製した。96well クリアボトムブラック
プレート（ｸﾞﾗｲﾅｰ）に、100μL ずつ（2,000 個／well）播種して約 24 時間、5% CO2、37℃で培養した。3 つのアッセイを実施するため、同じプレートを 3 枚作製した。
薬液調製
薬液調製は、用事調製とし、試験 2 日目に実施した。
用量設定試験では、OECD GD129 に従って、化合物の最終最高濃度については、DMSO に溶解する化合物は 1 mg/mL、水に溶解する化合物は、10 mg/mL とし、公比 3 でばく露した（n=2）。溶媒が DMSO の場合は、深底マイクロプレートのウエルに DMSO を 6μL ずつ分
注しておき、DMSO に溶解した薬液を 3μL ずつ、ピペッティングしながら公比 3 の希釈系
列を作成した後、594μL の血清不含の DMEM 培地を添加した。
水に溶解したピペラジンについては、深底マイクロプレートのウエルに水を 60μL ずつ分
注しておき、水に溶解したピペラジン溶液を 30μL ずつ、ピペッティングしながら公比 3 の希釈系列を作成した後、540μL の血清不含の DMEM 培地を添加した。陽性対照物質の SDSについては、10% SDS 水溶液を調製し、同様に公比 3 の希釈系列を作成し、540μL の血清
不含の DMEM 培地を添加した。
本試験では、表 1 に示すように、用量設定試験から化合物の最終最高濃度を決定し、本試
験は公比 2 でばく露した（n=3）。溶媒が DMSO の場合は、深底マイクロプレートのウエルに DMSO を７μL ずつ分注しておき、DMSO に溶解した薬液を 7μL ずつ、ピペッティング
しながら公比 2 の希釈系列を作成した後、693μL の血清不含の DMEM 培地を添加した。
Aconitin は、DMSO への溶解限度が 100 mg/ml であったので、用量設定試験では最終濃度を0.5 mg/ml で試験を実施したが、IC50 値を算出するのに必要な毒性が得られなかったので、100 mg/mL を 100 倍希釈した 1 mg/ml（最終濃度）で本試験を実施した。水に溶解した
Piperazine については、深底マイクロプレートのウエルに水を 70μL ずつ分注しておき、水に溶解した Piperazine 溶液を 70μL ずつ、ピペッティングしながら公比 2 の希釈系列を作成
した後、630μL の血清不含の DMEM 培地を添加した。また、陽性対照物質の SDS について
は、用量設定試験の結果から、最終濃度を 0.02%としたため、0.4% SDS 水溶液を調製し、血清不含 DMEM 培地で 10 倍希釈し、0.04%とした。
薬液添加
24 時間、前培養した 96well マイクロプレートを注意深く逆さまにして培地を捨てた。ウ
エルに残った培地を捨てるために滅菌したペーパータオルにプレートを丁寧に押し付けた。
あらかじめ 37℃に温めた 10%NBS 含有 DMEM 培地を各ウエルに 50μL ずつ分注し、速やかに所定のウエルに 2 倍濃度の薬液を 50μL ずつ分注した。CO2 インキュベーター（CO2 濃度
5%、37C）内で 48 時間培養した。この操作により、化合物ばく露中の培地の血清濃度は 5%
になる。
試験方法
薬物を添加して 48 時間培養した後、NRU アッセイを実施した。
96well マイクロプレートを注意深く逆さまにして培地を捨てた。あらかじめ 37℃に温め
49
57

た PBS を各ウエルに 250μL ずつ添加した。マイクロプレートを逆さまにして PBS を除去した後、ウエルに残った培地を捨てるために滅菌したペーパータオルにプレートを丁寧に押し付けた。50μg/mL ニュートラルレッド（関東化学）を含んだ 5%NBS 含有 DMEM 培地を各ウエルに 100μL ずつ分注し、CO2 インキュベーター（CO2 濃度 5%、37C）内で 3 時間培養した。培養後、96well マイクロプレートを注意深く逆さまにして培地を捨てた。あらかじめ 37℃に温めた PBS を各ウエルに 250μL ずつ添加した。マイクロプレートを逆さまにしてPBS を除去した後、ウエルに残った培地を捨てるために滅菌したペーパータオルにプレートを丁寧に押し付けた。100μL の NR 脱離液（水：エタノール：氷酢酸＝49：50：1）を各ウエルに添加してマイクロシェイカーで、30 分間、振盪した。5 分間静置してから、ウエル
内に泡が入っていないことを確認して、マルチプレートリーダー（サーモフィッシャーサイ
エンティフィック、バリオスキャンフラッシュ）で吸光度（OD:540nm）を測定した。
IC50 値の算出
IC50 値の算出は、2 種類の方法（①および②）で算出した。
① IC50 値は、下記のように細胞生存率が 50%を挟む濃度とその濃度の細胞生存率を結んだ直線の式から算出した(表 5-1 および 5-2)。
IC50=50% 細胞増殖抑制濃度
細胞増殖抑制率 ＝（100% － 細胞生存率）②

IC50 値は、GraphPad Prism ver.5（エム・デー・エフ社より購入）を使用して算出した(表 6-1 および 6-2)。

試験結果
1-ニトロプロパンおよび 1,3,5-トリオキサンについて細胞毒性は認められなかった。ジゴ
キシンは培養液中に析出が認められ再現性のある結果が得られなかったため、正確な評価はできないと判断した。IC50 値は、生存率 50％を挟む 2 点の用量の細胞生存率の直線式から算出した IC50 値と GraphPad Prism から算出した IC50 値と大きな違いはなかった。
Thiourea、Piperazine、1,3,5-Trioxane、Coumarin、2,4-Diamino-6-Phenyl-s-Triazine、Imidacloprid
および Acetamiprid の 3T3 NRU アッセイ（IC50 値）から換算された LD50 値は、実際の動物試験の LD50 値（文献値）と大きな違いはなかった。Digoxin の細胞毒性試験の IC50 値から換算された LD50 値は 1,000 mg/kg になり毒性を示す結果にはなったが、実際の急性毒性は約20 mg/kg で強い毒性を示す結果となり、実際の動物の結果と大きな乖離があった。1Nitropropane の細胞毒性試験の IC50 値から換算された LD50 値は、＞2,000 mg/kg になり区分外の判定になったが、実際の急性毒性は 500 mg/kg であり、区分外を予測することはできなかった。Aconitine も細胞毒性試験の IC50 値から換算された LD50 値は 2,000 mg/kg 程度の値になり区分外の判定になったが、実際の急性毒性は 6 mg/kg であり、強い毒性を示す結果となり大きな乖離があった。

50
58

表１

本研究に使用した化合物の情報
用量設定試験

本試験

最終
No

化合物名

CAS
No

分子量

性状

溶媒

調製

最高

*1

*2

濃度

濃度

mg/mL

mg/mL

最終
公
比

調製

最高

濃度

濃度

mg/mL

mg/mL

(mM)
1
2
3
4

5

Thiourea

6256-6

Piperazine

11085-0

1-Nitropropane

10803-2

1,3,5-Trioxane

11088-3

Digoxin

76.12

WC

D

200

86.14

WC

W

200

89.09

TL

D

200

90.08

TC

D

200

780.95WCD

200645.74WC

D

100

146.14

WC

D

200

187.2

WC

D

200

255.66WCD

200

222.67WCD

200

424.08

WC

W

10%

2083
0-755

6
7

Aconitine*230227-2

Coumarin9164-51(13.1)
10(116.1)1(11.2)
1(11.1)
1(1.28)
0.5(0.774)1(6.84)

公
比

(mM)

3

400

3

40

3

1000

3

500

3

400

3

100

3

200

3

100

3

400

3

400

2

0.4%

2
(26.3)
2(23.3)
5(56.1)
2.5(27.8)
2(2.56)
1(1.55)
1(6.84)

2
2
2
2

2

2
2

2,4-Diamino-68

9

Phenyl-sTriazine
Imidacloprid

9176-91382
6141-3

10

Acetamiprid

1382
6141-3

陽
性

1354
SDS

1020-7

1
(5.3)
1
(3.9)
1
(4.49)
0.5%(11.7)

0.5(2.67)
2(7.82)
2(8.98)

2

2

2

0.02%
(0.046-

7)*1： WC；White Crystal, WL；White Liquid, TC；Transparent Liquid*2：

D；DMSO, W；Water*3： Aconitine は、DMSO に 100 mg/mL までしか溶解しなかったので、用量設定試験では最高用量を 0.5 mg/mL とし、本試験では 100 mg/mL を培地に 1%になるように添加し、最終濃度を 1 mg/mL にした。

51
59

表2

3T3 NRU アッセイの IC50 値（直線式及び GraphPad Prism）から算出した本 LD50 値と急性毒性 LD50 値の比較

A

No.

化合物名

1 Thiourea
2 Piperazine
3 1-Nitropropane
4 1,3,5-Trioxane
5 Digoxin
6 Aconitine
7 Coumarin
2,4-Diamino-68
Phenyl-s-Triazine
9 Imidacloprid
10 Acetamiprid

CAS No.

細胞毒性 NRU IC50

LD50 換算値 (mg/kg)

急性毒性LD50 （文献値）

生存率50%を挟む2点の直線式より算出

NRU IC50 値より
下記の3つの式で換算

ラットLD50 (No.5はﾏｳｽ）

LD50
出典（mg/kg)
1041
1040
1447
1750 NITE
736
738
1017
1280 NITE＞2181 ＞2166 ＞2512 455-528 NITE
＞1620 ＞1614 ＞1941 6010 NITE
1189
1211
535
17.8 平成22年度食品確保総合調査
2058
2082
933
5.97 平成22年度食品確保総合調査
490
495
560 290-680 NITE

µg/ml

mM

1134.4
439.9
＞5000
＞2500
78.3
348.5
88.4

14.9
5.11
＞56.1
＞27.8
0.100
0.540
0.605

91-76-9

25.4

0.135

325

331

352

138261-41-3
135410-20-7

605.8
647.2

2.37
2.91

1560
1486

1569
1494

1146
1174

62-56-6
110-85-0
108-03-2
110-88-3
20830-75-5
302-27-2
91-64-5

①-a

②

①-b

933

NITE

410 NITE
140-200 AGRITOX①－a：Validated millimole regression model (the RC rat-only millimole regression)
Log LD50 (mmol/kg) = 0.439LogIC50 (mM) + 0.621②：Halleのﾃﾞｰﾀを基にした「The Registry of Cytotoxicity (RC)」から
Log LD50 (mmol/kg) = 0.435LogIC50 (mM) + 0.625①－ｂ：Validated weight regression model (the RC rat-only weight regression)
Log LD50 (mg/kg) = 0.372LogIC50 (g/mL) + 2.024

B
細胞毒性 NRU IC50
No.

化合物名

1 Thiourea
2 Piperazine
3 1-Nitropropane
4 1,3,5-Trioxane
5 Digoxin
6 Aconitine
7 Coumarin
2,4-Diamino-68
Phenyl-s-Triazine
9 Imidacloprid
10 Acetamiprid

CAS No.

62-56-6
110-85-0
108-03-2
110-88-3
20830-75-5
302-27-2
91-64-5
91-76-9138261-41-3
135410-20-7GraphPad Prismより算出

急性毒性LD50 （文献値）
ラットLD50 (No.5はﾏｳｽ）

①-a

②

①-b

11.4
7.16
＞56.1
＞27.8
0.092
0.482
0.678

LD50
出典
（mg/kg)
925
925
1309
1750 NITE
854
855
1153
1280 NITE＞2181 ＞2166 ＞2512 455-528 NITE
＞1620 ＞1614 ＞1941 6010 NITE
1145
1167
518
17.8 平成22年度食品確保総合調査
1958
1982
894
5.97 平成22年度食品確保総合調査
515
521
584
290-680 NITE

0.135

325

330

351

2.78
2.50

1674
1392

1682
1399

1216
1110

µg/ml

mM

866.9
616.8
＞5000
＞2500
71.9
311.1
99.1
25.3
711.0
557.1

LD50 換算値 (mg/kg)
NRU IC50 値より下記の3つの式で換算

933

NITE

410 NITE
140-200 AGRITOX①－a：Validated millimole regression model (the RC rat-only millimole regression)
Log LD50 (mmol/kg) = 0.439LogIC50 (mM) + 0.621②：Halleのﾃﾞｰﾀを基にした「The Registry of Cytotoxicity (RC)」から
Log LD50 (mmol/kg) = 0.435LogIC50 (mM) + 0.625①－ｂ：Validated weight regression model (the RC rat-only weight regression)
Log LD50 (mg/kg) = 0.372LogIC50 (g/mL) + 2.024

A：直線式から算出した本 LD50 値と急性毒性 LD50 値の比較
B：（GraphPad Prism）から算出した本 LD50 値と急性毒性 LD50 値の比較

5260

Annex急性毒性試験代替法に関する研究
画像解析装置を用いた HCIA（High-Content Image
Analysis）
アッセイを含む各種細胞毒性試験の精度比較

平成 29 年 4 月

小島 肇（国立医薬品食品衛生研究所）
協力研究者：笠原 利彦（富士フイルム

安全性評価センター）

53
61

１．要旨
経済協力開発機構（Organisation for Economic Co-operation and Development：OECD） ガイ
ダンス文書 No.129 “Guidance Document on Using Cytotoxicity Tests to Estimate Starting Doses for
Acute Oral Systematic Toxicity Tests“では、動物を用いた急性毒性試験の最高用量を予測するツールとして、3T3 細胞を用いた NRU(neutral red uptake)アッセイが推奨されている。ただし、NRU アッセイは、比較的古い細胞毒性試験法であり、間接的に細胞数を計数する方法
であることから、細胞周期に影響を与える化合物の評価では精度が低下する可能性が考えられる。本研究では、精度よく細胞生存率を算出できる方法を探すため、最近汎用されている ATP アッセイおよび WST-8 アッセイに加え、笠原らが開発した画像解析装置を使用した
HCIA（High-Content Image Analysis）アッセイ 1）について 16 化合物を用いて検討した。HCIA
は細胞数を直接カウントするコールターカウンターと非常に良く相関することが報告されている。HCIA による解析結果との比較により、NRU アッセイ、ATP アッセイおよび WST8 アッセイから算出した IC50 値は抗がん剤や変異原物質のような細胞周期を特異的に停止するような生理活性物質は、実際の細胞数を反映しておらず、IC50 値が高めに算出されることが明らかとなった。さらに、HCIA アッセイは、細胞毒性のメカニズムを説明できる周辺データも同時に取得することができ、精度の高い細胞毒性試験であり、急性毒性試験代替法として有効である可能性が示唆された。

2. 序論
医薬、農薬、医療機器および工業用途などで使用される化学物質のヒトに対する毒性を評価するために、これまで実験動物が中心に使用されてきた。その一つである急性毒性試験（単回投与毒性試験）は、化学物質におけるヒトでの過量投与時の影響を予測するために有用である一方、毒劇物の指定 2)や化学物質安全性データシート（｛M｝SDS:｛Material｝Safety
Data Sheet）の有害性情報の中で、その物質の毒性程度を計る有用な試験法である。投与経路に関しては、化学物質の特性を考慮し、必要に応じて経皮、又は吸入経路を用いるとされている 3)。
経済協力開発機構（OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development）テスト
ガイドライン（TG: Test Guideline）では、急性経口毒性試験として1987年に設定されたTG401に代わり4)、TG420固定用量法およびTG423毒性等級法が2002年に、TG425上げ下げ法が2008
年に公定化されている5-7）。これらは動物実験の3Rs（Replacement：置き換え、Reduction：
使用数の削減、Refinement：苦痛の軽減）を考慮して慎重に被験物質を投与して、毒性分類を行うプロトコルになっている。
本試験法の動物を用いない動物実験代替法（in vitro試験）については多くの検討がなされてきた8-11)。その一つとして、NICEATM (The NTP Interagency Center for the Evaluation of54
62

Alternative Toxicological Methods)/EURL ECVAM(European Union Reference Laboratory foralternatives to animal testing）はこのデータを利用し、回顧的なバリデーション試験を実施した。その結果、3T3細胞を用いたNRU（Neutral Red Uptake）アッセイがUN GHS（United Nations
Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals）によって定義された
急性経口毒性を十分に予測することはできないと報告している。この報告書は、3T3細胞を用いるNRUアッセイが、in vivo急性毒性試験の開始用量を決定するために有用であることのみを結論づけている。これを受けて作成されたOECDガイダンス文書No.129“Guidance

Document on using cytotoxicity tests to estimate starting doses for acute oral systemic toxicity testing”
では、in vitro細胞毒性試験による急性経口毒性試験の初回投与量設定試験が定められた12)。
JaCVAM（日本動物実験代替法評価センター）においても、このガイダンスのもとになった
NICEATM/ICCVAM (The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative
Methods)の資料をもとに13-15)、本分野の専門家による評価がなされており、当該試験法の有用性はそれほど大きなものでない。しかし、これを採用することの利点は存在し、しかも欠点は致命的なものでない。強制力を持たせないで、これを行政的に提案し、推奨することは3Rs原則にそったものであると結論している16）。
細胞毒性試験とは、基本的には培養細胞を化学物質で曝露した後に、細胞数をカウント
し細胞の生存率や増殖抑制率を評価する試験である。しかしながら、一般的に接着細胞の数をカウントするには、酵素処理で細胞を単離し、血球計算盤やコールターカウンターを用いて細胞数を計数する必要があるため、ある程度の細胞数が必要である。我々の経験では、余裕を持ってカウントするには12wellプレート以上の面積が必要である。しかし、実際の現場
では、効率的に実施するため、96well マイクロプレート等のwellより小さい面積のマイクロプレートを使用されていることが多い。96wellプレートのwellの面積では細胞を剥離して、細胞数を直接測定するには細胞数が少なすぎるので、細胞内ATP量、酵素活性および色素取り込みなどの生物学的機能を指標した測定法が使用されてきた。
ガイダンス文書No.129に記載されているNRUアッセイは、ニュートラルレッドが細胞内のライソソームに蓄積することを利用した細胞毒性試験法であるが、ニュートラルレッド
を細胞に取り込ませるのに3～4時間かかり、さらに細胞外のNRを除くために、細胞を洗浄し細胞内のニュートラルレッドを抽出する作業が必要なことから、手間のかかる測定系である17)。一方、ATPアッセイは非常に感度がよく、反応も10分程度で終わることから、ハイ
スループット化しやすいなどの利点がある18)。酵素活性を利用する測定法の代表的な試験法
はMTT（3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法であり、MTTが細胞内の脱水素酵素の活性化に必要なNADHによって不溶性のホルマザンに還元されることを利用した方法である19)。しかし、MTT法は、反応時間が3～4時間かかり、さらに細胞内の不溶性のホルマザンを抽出する作業が必要なことから、最近は細胞内で還元されると可溶性のホルマザンに変換され、抽出作用を必要としないWST-8法(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt)20)や同様の原理でreazurin
5563

が蛍光物質であるresorufinに還元されることを利用したAlamar blue法21-24)が使用されることが多くなった。これらの生物学的指標を利用する測定法で細胞毒性を評価する場合の大前提は、これらの指標がどの細胞にも一定量含まれており、化合物で処理した細胞でもその指標の量が変化しないことである。
また、最近、Chanらや笠原らは抗がん剤や変異原物質が、ミトコンドリア肥大を伴う細胞肥大を誘導することによりミトコンドリア内のATPおよびNADH含量を増加させ、ATPアッセイやMTSアッセイから算出された細胞生存率が、直接細胞数をカウントすることによって算出した細胞生存率と大きく乖離するケースがあることを報告した25, 26)。さらに、笠原は画像解析装置を用いたHCIA (High-Content Image Analysis) アッセイを用いることにより、このように細胞が肥大した状態においても、直接細胞数を計数することによりコールター
カウンターとほぼ同等の細胞生存率を出すことができることを報告した1)。
本研究では、細胞毒性試験の精度をより向上させ、急性毒性試験代替法としての利用価値を上げるため、工業、試薬用途に使用される10化合物に加えて、すでにCHL細胞において細胞肥大作用があることが知られている6化合物26)を加えた16化合物を曝露した際の上記の細胞毒性試験の結果について比較検証した。また、細胞毒性試験に使用する細胞については、
3T3細胞の他に、すでに抗がん剤や変異原物質で肥大が誘導することが知られているCHL細胞についても、同様の操作を行った。

3. 材料と方法
3-1) 被験物質
本研究では、16 化合物について、以下に示す 4 種類の細胞毒性試験を実施した。化合物の種類、メーカー、最高濃度、公比および溶媒を Table 1 に示した。No.1 から No.10 の化合物については重量濃度で調製し、No.11 から No.16 についてはモル濃度で調製した。
3-2) 細胞および細胞播種
Balb/c 3T3 クローン A31 細胞（マウス胎児由来繊維芽細胞、以下 3T3 細胞と略称）および CHL/IU 細胞（チャイニーズハムスター肺細胞、以下 CHL 細胞と略称）は DS ファーマより購入した。3T3 細胞の培養は、10%ウシ新生児血清（NBS, Biowest 社）含有 DMEM 培地（GIBCO）を用い、CHL 細胞の培養は、10%仔牛血清（CS, GIBCO 社）CS 含有 MEM 培地（GIBCO）を用いて、CO2 インキュベーター（CO2 濃度 5%、37C）内で培養した。
試験 1 日目に培養フラスコで増殖させた 3T3 細胞および CHL 細胞をそれぞれトリプシン溶液で剥離／洗浄後、3T3 細胞は 10%

NBS 含有 DMEM 培地に、CHL 細胞は 10 %CS

含有 MEM 培地に懸濁し、それぞれ 20,000 個／mL に調製した。96well クリアボトムブラ
ックプレート（ｸﾞﾗｲﾅｰ）に、それぞれ 100µL ずつ（2,000 個／well）播種して約 24 時間、
56
64

CO2 インキュベーターで培養した。4 種類の細胞毒性試験を実施するため、同じプレート
を 4 枚作製した。
3-3) 被験物質の調製
被験物質の調製は、用事調製とし、試験 2 日目に実施した。
ピペラジン以外の化合物は、表１に示した最高用量の 200 倍の濃度になるように化合物
を DMSO に溶解した。被験物質の希釈系列は、深底マイクロプレートのウエルに DMSO
を 6µL ずつ分注しておき、公比 3 の場合は DMSO に溶解した被験物質を 3µL ずつ、公比2 の場合は 6µL ずつ、ピペッティングしながら希釈系列を作成した後、594µL の血清不含の DMEM 培地（3T3 細胞）あるいは MEM 培地（CHL 細胞）を添加した。水に溶解した
ピペラジンについては、深底マイクロプレートのウエルに水を 60µL ずつ分注しておき、水に溶解したピペラジン溶液を 60 µL ずつ、ピペッティングしながら公比 2 の希釈系列を作成した後、540µL の血清不含の DMEM 培地を添加した。
3-4) 被験物質の添加
24 時間、前培養した 96well マイクロプレートを注意深く逆さまにして培地を捨てた。ウ
エルに残った培地を捨てるために滅菌したペーパータオルにプレートを丁寧に押し付けた。あらかじめ 37℃に温めた 10%NBS 含有 DMEM 培地（3T3 細胞用）あるいは 10%CS 含
有 MEM 培地（CHL 細胞用）を各ウエルにすばやく 50µL ずつ分注し、所定のウエルに 2倍濃度の被験物質を 50µL ずつ分注した。CO2 インキュベーター内で 48 時間培養した。この操作により、化合物曝露中の培地の血清濃度は 5%になる。
3-5）各種試験法
被験物質を添加して 48 時間培養した後、4 種類の細胞毒性試験（NRU アッセイ、ATP ア
ッセイ、WST-8 アッセイおよび HCIA アッセイ）を実施した。
3-5-1) NRU アッセイ
48 時間、被験物質の曝露後、96well マイクロプレートを注意深く逆さまにして培地を捨てた。あらかじめ 37℃に温めた PBS を各ウエルに 250μL ずつ添加した。マイクロプレート
を逆さまにして PBS を除去した後、50 µg/mL ニュートラルレッド（関東化学）を含んだそれぞれの 5%血清含有培地を各ウエルに 100 µL ずつ分注し、CO2 インキュベーター内で 3 時間培養した。培養後、96well マイクロプレートを注意深く逆さまにして培地を捨てた。あら57

65

かじめ 37℃に温めた PBS を各ウエルに 250μL ずつ添加した。マイクロプレートを逆さまにして PBS を除去した後、ウエルに残った NR 含有培地を完全に除去するためにペーパータ
オルにプレートを丁寧に押し付けた。100 µL の NR 脱離液（水：エタノール：氷酢酸＝49：50：1）を各ウエルに添加してマイクロシェイカーで、30 分間、振盪した。5 分間静置してから、ウエル内に泡が入っていないことを確認して、マルチプレートリーダー（サーモフィ
ッシャーサイエンティフィック、バリオスキャンフラッシュ）で吸光度（OD:540nm）を測定した。

3-5-2) ATP アッセイ
48 時間、被験物質の曝露後、96well マイクロプレートを注意深く逆さまにして培地を捨てた。あらかじめ 37℃に温めた PBS を各ウエルに 100 µL ずつ添加した。マイクロプレート
を逆さまにして PBS を除去した後、ウエルに残った培地を捨てるためにペーパータオルにプレートを丁寧に押し付け、素早く PBS を各ウエルに 50 µL 添加した。CellTiter-Glo
Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ）の ATP 反応液を 50 µL 添加して、プレートシェ
イカーで 10 分間振盪し、5 分間静置した後、ウエル内に泡が入っていないことを確認して、マルチプレートリーダーで発光強度を測定した。
3-5-3) WST-8 アッセイ
48 時間、被験物質の曝露後、96well マイクロプレートを注意深く逆さまにして培地を捨てた。あらかじめ 37℃に温めた PBS を各ウエルに 100 µL ずつ添加した。マイクロプレート
を逆さまにして PBS を除去した後、あらかじめ WST-8 溶液１に対して、10 の割合で 5%血
清含有培地を混ぜて調製した WST-8 含有培地を 100 µL ずつ分注し、CO2 インキュベーター
内で 3 時間培養した。培養後、ウエル内に泡が入っていないことを確認して、マルチプレー
トリーダーで吸光度（OD:450nm、リファレンス 650nm）を測定した。
3-5-4) HCIA アッセイ
48 時間、被験物質の曝露後、96well マイクロプレートを注意深く逆さまにして培地を捨てた。あらかじめ 37℃に温めた PBS を各ウエルに 100 µL ずつ添加した。マイクロプレート
を逆さまにして PBS を除去した後、ウエルにエタノールを 100 µL ずつ添加して約 30 分間、室温で固定した。エタノールをデカントで除去し、100 µL の PBS を添加し、測定するまで冷蔵保存した。PBS をデカントで除去した後、ウエルに 5μM ヘキスト 33342（モレキュラ
ープローブ）および 1 µg/ml セルマスクレッド（モレキュラープローブ）を含有した PBS を
100µL ずつ添加して室温、遮光下で 30 分、染色した。染色液をデカントで除去した後、100

58

66

µL の PBS で 1 回洗浄後、フレッシュな PBS を 100µL 添加して、インセルアナライザー2000（GE ヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、2 つの蛍光波長（Ex/Em=350nm/ 461(ヘキスト)、Ex/Em=588nm/ 612(セルマスク)）の画像を 1 ウエルあたり 12 箇所自動取得し、得られた画像を自動解析することで、細胞数、核面積、細胞面積、小核出現率、真円率および細胞周期を算出した。

3-6）IC50 値の算出
IC50 値は、下記の式で算出した。
IC50 値は、下記のように細胞生存率が 50%を挟む濃度とその濃度の細胞生存率を結んだ直線の式から算出した。
IC50=50% 細胞増殖抑制濃度
細胞増殖抑制率 ＝（100% － 細胞生存率）

４．結果
3T3 細胞および CHL 細胞を用いた 4 種類の細胞毒性試験の結果（細胞生存率）を図 1-1
および 1-2 に示した。3T3 細胞では、No.1～No.10 の化合物における NRU アッセイ、ATP ア
ッセイおよび WST-8 アッセイの細胞生存率は、チオ尿素で WST-8 の生存率が高値を示した以外は、どの方法も HCIA アッセイのそれとほぼ同じ値を示した。No.11～No.16 の NRU アッセイ、ATP アッセイおよび WST-8 アッセイの細胞生存率は、どの試験法も HCIA アッセイの細胞生存率よりも高値を示した。CHL 細胞についても、No.1～No.10 の化合物におけるNRU アッセイ、ATP アッセイおよび WST-8 アッセイの細胞生存率は、3T3 細胞の場合と同様に、どの方法も HCIA アッセイのそれと同様な細胞生存率のパターンを示したが、全体的に 3T3 細胞よりも細胞生存率の一致性が低かった。 No.11～No.16 については、NRU アッセイ、ATP アッセイおよび WST-8 アッセイの細胞生存率は、ダウロルビシン(No.15)以外、3T3 細胞の場合と同様に HCIA アッセイの細胞生存率よりも高値を示した。表 2-1、 2-2、
2-3 および 2-4 には、図 1 の各細胞毒性試験における細胞生存率の数値だけでなく、HCIA ア
ッセイで解析した各用量での核の平均面積のコントロール倍、細胞の平均面積のコントロ
ール倍、小核出現率のコントロール倍、細胞真円率が 90%以上になった細胞の割合および細胞周期を示した。細胞真円率は、細胞の形態が丸いかどうかを示す指標であり、真円率が5967

100%の細胞は完全な円を意味する。表 2 では、真円率の数値を 90%以上に設定し、ほぼ丸い細胞の出現率を数値化することにより、細胞の形態変化を評価項目に加えた。両細胞とも、
No.11～No.16 のあらかじめ変異原性があることが報告されている化合物の小核出現率は 2倍以上の誘導を示した。ジゴキシン（No.5）においては、CHL 細胞では小核出現率の増加を誘導しなかったが、3T3 細胞では小核出現率の増加が認められた。図 2 では、HCIA アッ
セイにおいて、細胞肥大を示した化合物について、核と細胞質を染色した写真を示した。3T3細胞は、敷石状に細胞が増えていくので、細胞が肥大したかどうかは見た目では分かりにく
いが、CHL 細胞は細胞間接着により増殖しないので、細胞 1 個 1 個の肥大が明確であった。
図 3 では、NRU アッセイ、ATP アッセイおよび WST-8 の IC50 値と HCIA アッセイの IC50 値の相関を示した。3T3 細胞では、WST-8 アッセイの相関係数が 0.92、NRU アッセイが 0.87、ATP アッセイが 0.83 であった。一方、CHL 細胞では、WST-8 アッセイの相関係数が 0.77、
NRU アッセイが 0.53、ATP アッセイが 0.50 であり、相関性の順番は 3T3 細胞と同じであったが、相関係数は全体的に 3T3 細胞より低かった。

6068

表 1 化合物情報および試験濃度
No

化合物

CAS No.

メーカー

最高用量

公比

溶媒

1

ﾁｵ尿素

62-56-6

和光純薬

2mg/mL (26.3mM)

２

DMSO

2

ﾋﾟﾍﾟﾗｼﾞﾝ

110-85-0

東京化成(TCI)

2mg/mL (23.3mM)

２

水

3

1-ﾆﾄﾛﾌﾟﾛﾊﾟﾝ

108-03-2

東京化成(TCI)

5mg/ml (56.1mM)

２

DMSO

4

1,3,5-ﾄﾘｵｷｻﾝ

110-88-3

東京化成(TCI)

2.5mg/mL (27.8mM)

２

DMSO

5

ｼﾞｺﾞｷｼﾝ

20830-75-5

東京化成(TCI)

2mg/mL (2.56mM)

２

DMSO

6.

ｱｺﾆﾁﾝ

302-27-2

Sigma-Aldrich

1mg/mL (1.55mM)

２

DMSO

7.

ｸﾏﾘﾝ

91-64-5関東化学

1mg/mL (1.55mM)

２

DMSO

8

2,4-ｼﾞｱﾐﾉ-6-ﾌｪﾆﾙ-s-ﾄﾘｱｼﾞﾝ

91-76-9関東化学

0.5mg/mL (2.67mM)

２

DMSO

9

ｲﾐﾀﾞｸﾛﾌﾟﾘﾄﾞ

105827-78-9

関東化学

2mg/mL (7.82mM)

２

DMSO

10

ｱｾﾀﾐﾌﾟﾘﾄﾞ

135410-20-7

関東化学

2mg/ml (8.98mM)

２

DMSO

11

アセトアミノフェン

103-90-2

Sigma-Aldrich

0.15mg/mL (1mM)

３

DMSO

12

カテコール

106-50-3

東京化成(TCI)

0.0011mg/mL (0.1mM)

３

DMSO

13

5-フルオロウラシル

154-93-8

Sigma-Aldrich

0.13mg/mL (1mM)

３

DMSO

14

p-フェニレンジアミン

66-81-9Sigma-Aldrich

0.0032mg/mL (0.03mM)

３

DMSO

15

ダウノルビシン

23541-50-6

Wako

0.0011mg/mL (0.001mM)

３

DMSO

16

ドキソルビシン

25316-40-9

Wako

0.0012mg/mL (0.001mM)

３

DMSO

61

69

図 1-1 16 化合物を用いた NRU ｱｯｾｲ、ATP ｱｯｾｲ, WST-8 ｱｯｾｲおよび HCIA ｱｯｾｲの細胞生存率の比較（3T3 細胞）：NRU アッセイ：WST-8 アッセイ

：ATP アッセイ

62
70：HCIA アッセイ

図 1-2 16 化合物を用いた NRU ｱｯｾｲ、ATP ｱｯｾｲ, WST-8 ｱｯｾｲおよび HCIA ｱｯｾｲの細胞生存率の比較（CHL-K1 細胞）：NRU アッセイ：WST-8 アッセイ

：ATP アッセイ：HCIA アッセイ

6371

表 2-1 HCIA アッセイによる細胞毒性関連項目の測定および各種細胞毒性試験による細胞生存率の比較（3T3 細胞）

6472

表 2-2 HCIA アッセイによる細胞毒性関連項目の測定および各種細胞毒性試験による細胞生存率の比較（3T3 細胞）

6573

表 2-3 HCIA アッセイによる細胞毒性関連項目の測定および各種細胞毒性試験による細胞生存率の比較（CHL 細胞）

6674

表 2-4 HCIA アッセイによる細胞毒性関連項目の測定および各種細胞毒性試験による細胞生存率の比較（CHL 細胞）

6775図 2-1 HCIA アッセイの画像解析で細胞肥大が疑われた化合物で処理した 3T3 細胞の蛍光写真

・・

核：ヘキスト 33342 (Ex/Em=350nm/460nm)

細胞質：セルマスク(Ex/Em=588nm/612nm)

6876

図 2-2 HCIA アッセイの画像解析で細胞肥大が疑われた化合物で処理した CHL 細胞の蛍光写真

核：ヘキスト 33342 (Ex/Em=350nm/460nm)

細胞質：セルマスク(Ex/Em=588nm/612nm)

6977

図 3 各細胞毒性試験（NRU, ATP, WST-8）と HCIA アッセイの IC50 値の相関性

70

78

５．考察
NRU アッセイは、OECD TG129 に収載されている細胞毒性試験であるが、比較的古い細胞毒性試験法であり、比較的作業量が多く、間接的に細胞数を求める手法であるため細胞周期に影響を与える化合物では過小評価される可能性がある。そこで、最近汎用される ATP
アッセイおよび WST-8 アッセイと併せて、96well プレートにおいて細胞数を直接カウント
することができる HCIA アッセイを用い、16 化合物について 4 種の細胞毒性試験を比較検証した。本研究に用いた化合物は、JACVAM 急性毒性試験資料編纂委員会が工業用および試薬を中心に選択した No.1～10 の 10 化合物に、CHL 細胞を肥大させることが知られている No.11～16 の 6 化合物を追加した 26)。CHL 細胞において、No.11 から No.16 の化合物のNRU アッセイ、ATP アッセイおよび WST-8 アッセイの細胞生存率は、HCIA アッセイの細胞生存率より高かった。この理由は、これらの化合物が、細胞周期の中で ATP 量が一番多
い G2/M 期 27)や WST-8 アッセイに必要な NADH 量が一番多い S 期 28)で、細胞周期を特異的に停止するため、両アッセイの値が高くなるものと考えられる。培養細胞は M 期に向けて、細胞の大きさだけでなく細胞機能を維持するために必要なものすべてが 2 倍になる。そのため、ATP、NADH を指標とした細胞生存率の評価は細胞周期による変動があり、その影
響は細胞倍加時間の短い細胞において強く受ける。NRU アッセイについても、ニュートラ
ルレッドが蓄積されるライソソームが細胞分裂の前の G2/M 期に多くなるため、NR の取り込み量が増加すると考えられる。
3T3 細胞では、ピペラジン（No. 2）、クマリン（No. 7）、イミダクロプリド（No. 9）およびアセタミプリド（No. 10）の高用量で細胞肥大が誘導されたが、NRU アッセイ、ATP アッセイおよび WST-8 アッセイの細胞生存率は HCIA アッセイの細胞生存率と大きな差はみられなかった。
このケースでは、細胞面積は増加しているが、核面積の増加が明確に認められなかったた
め細胞面積の増加は被験物質曝露による可能性は低く、したがって細胞周期への影響は無かったと考えられる。画像解析装置は、自動で個々の細胞を認識するため、3T3 細胞のように細胞が敷石状に密集して増殖する細胞を個別に識別する精度は高くない。本研究では、目視で画像を確認して個々の細胞が識別されているか否かを確認しているが、細胞の形態が均一ではないためウエル全体としては個別に細胞を認識できていない可能性もある。一方、
No.11～16 では、CHL 細胞と同様に核および細胞の面積が増加しているため、3T3 細胞においても CHL 細胞と同じ理由で、NRU アッセイ、ATP アッセイおよび WST-8 アッセイの細胞生存率は、HCIA アッセイの細胞生存率より高かったものと思われる。

7179

3T3 細胞は CHL 細胞に比較して、HCIA アッセイによる細胞生存率と他のアッセイによる細胞生存率の相関性は高かった。その理由として、3T3 細胞は CHL 細胞より、細胞周期の回転が遅いために、CHL 細胞ほど十分に G2/M 期や S 期で細胞周期が停止しておらず、細胞生存率とののかい離が出にくくなったものと考えられる。
本実験で実施した NRU アッセイ、ATP アッセイおよび WST-8 の中では、WST-8 が HCIAの IC50 値と一番相関性が高かった。これは、No.11～16 の化合物が ATP 量やライソソームの数が最大になる G2/M 期にアレストを起こす化合物が多く、NADH 量が最大になる S 期で細胞周期をアレストする化合物が少なかったため 10）、WST-8 アッセイは ATP アッセイや
NRU アッセイより影響を受けにくかったと考えられる。また、本研究では、CHL 細胞より
3T3 細胞の方が NRU アッセイ、ATP アッセイおよび WST-8 アッセイの細胞生存率と HCIA
アッセイの細胞生存率が高い相関性を示しているが、これは 3T3 細胞の方が、CHL 細胞よりも細胞周期の回転が遅いため、No.11～16 の化合物のような細胞周期を特異的にアレストする化合物の影響が CHL 細胞よりもでにくいため、NRU アッセイ、ATP アッセイおよび
WST-8 アッセイと HCIA アッセイの生存率の乖離が小さかったと考えられる。笠原らは、
以前、No.11～16 の化合物を 3T3 細胞に 24 時間曝露したとき、細胞肥大はほとんど誘導されなかったことを確認したが（データ示さず）、本研究のように 48 時間曝露させたことにより細胞周期の停止が強く生じたため、細胞肥大が誘導されたと考えられる。
本研究では、細胞周期に特異的な作用を有しない化合物では、細胞毒性測定法による違いは認められないが、細胞周期を特異的に停止するような化合物においては生理活性物質を指標とした細胞毒性試験は実際の細胞数を反映しておらず、IC50 値が高めに算出される可能性があることを示した。このようなケースでは、IC50 値から算出される LD50 は過小評価される可能性があるため、注意が必要である。一方、HCIA アッセイは直接細胞数をカウントすることができるだけでなく、細胞や核の面積のように細胞毒性のメカニズムを説明できる周辺データも同時に取得することができるため、周辺情報が乏しい新規の化合物の評価において、細胞周期に影響する作用の有無にかかわらず評価可能である。また、大量のデー
タを自動的に取得することが可能であるため、ハイスループット化にも対応できる。したがって、本試験法は細胞毒性試験を用いた急性毒性試験代替法の予測率向上に寄与するとともに、迅速化と高効率化が期待される。

72

80

６．参考文献
1) 田原春菜、山本裕介、吉沢広江、松田俊、藤田正晴、勝岡尉浩、笠原利彦 (2016) 画像解
析装置を用いた迅速-画像解析細胞毒性試験の有用性についての検討～既存の細胞毒性試験の比較、第 43 回日本毒性学会学術年会
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衛：臓器毒性・毒性試験、新版

トキシコロジー、日本トキシコロジー学会教育委員会編集、pp.150-153（2009）
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6) OECD, OECD test guideline 423; OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS:
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