立石科学技術振興財団

助成研究成果集(第31号) 2022

［ 研究助成 (A) ］

インクジェット超瞬間凍結による凍結困難バイオリソースの凍結保存への挑戦
Experimental attempt of cryopreservation for uncryopreservable bioresources
by inkjet printing based superflash freezing
2201001

研究代表者

信州大学

学術研究院繊維学系

教

授

秋山

佳

丈の熟練度により解凍速度が安定せず，生存率の[研 究 の 目 的]低下やばらつきが大きくなる原因となっていた。
細胞の凍結保存技術は，細胞を取り扱う多くそこで，本研究では，超瞬間凍結保存法を他の研究分野及び臨床医療において必要不可欠なの多くのバイオリソースへ適用できるようにす技術のひとつである。細胞をそのままゆっくりるために，解凍工程を自動化することで，再現と凍結すると，凍結過程において細胞内外の水性と生存率を向上させることを目的とした。

分子が結晶化し，これが細胞膜や細胞小器官を[研究の内容，成果]傷つけることにより，細胞に致死的ダメージを与える。そのため既存の凍結手法では，ジメチルスルホキシド (DMSO) やグリセロールなど

1．インクジェット超瞬間細胞凍結法
超瞬間凍結に用いた装置および方法について，の凍結保護剤を添加し，細胞内部の水分子の結晶化を抑制しガラス化状態にすることで凍結保以下に簡潔に述べる。マウス繊維芽細胞 NIH存を実現していた。しかし凍結保護剤自身の細3T3 細胞懸濁液 (1.0×10 7 cells mL −1) をイン胞毒性や，凍結過程における脱水によるダメークジェットヘッド内に充填し，約 40 pL の微小ジが問題視されていた。

液滴内に細胞を内包した状態で吐出し，液体窒

それに対し，著者らは，冷却速度はサイズを素で冷却されたガラス基板に着滴，超瞬間凍結小さくすればするほど向上すること，そして，させた。ガラス基板は，シリコンウェハに載せ臨界冷却速度以上で冷却することで純水であっられた状態で，液体窒素が入った断熱チャンてもガラス化できるという物理化学的根本に立バー内に設置したアルミニウム製ベース上に置ち戻った。そして，超瞬間的に凍結することでかれた。また，吐出の際に，ガラス基板を含む世界で初めて凍結保護剤を用いずに動物細胞凍断熱チャンバーを自動ステージで移動させるこ結保存することに成功した。その一方で，凍結とで，液滴が重ならないようにした。なお，従保存において冷却工程同様に解凍工程も重要で

来の解凍操作では，凍結液滴を基板に載せたまあるにもかかわらず，充分な検討を行えていな

ま，シリコンウェハを冷やしたピンセットで持かった。これまでの解凍は，凍結細胞を含む液ち，基板ごと 37 ℃の解凍用培地に投げ入れた。

滴を載せた凍結基板を，予温した培地に手動で投げ込むことで行っていた。そのため，操作者― 1 ―立石科学技術振興財団

1000 fps にて撮影した。撮影された動画から画

2．自動解凍装置の開発
Fig. 1 に，自動解凍装置の写真と概要図を示

像処理により，各時間でのガラス基板を載せたす。自動解凍装置は，3D プリンター (Agilista,アルミニウム製キャリアの回転角度を算出したKeyence) とアルミ板，ばねヒンジを用いて作(Fig. 2)。その結果，アルミニウム製キャリア製した。液滴の解凍速度を高めるために，基板が液体窒素冷却面から離れてから，20 ms で回の着滴面側を初めに解凍用培地に浸漬させる必転を終え，基板を解凍用培地に投げ落としてい要があった。そのため，ばねヒンジを用いて基ることが確認された。これにより自動解凍装置板を載せたアルミニウム製キャリアを半回転さを用いた際の基板運搬時間は約 20 ms であり，せる機構を作製し，回転によって基板を解凍用

各加速度は 0.23 °/ms2，角速度は 11.1 °/ms で培地に投げ落とした。

あることが確認された。

作製した自動解凍装置の基板回転速度を，高次に，自動解凍装置での解凍工程における液速度カメラ (EX-ZR1000, CASIO) を用いて測滴の温度変化について評価する必要があるが，定した。ばねヒンジが画面の中心になる様にカ基板表面の液滴は非常に微小であり，その温度メラを設置し，十分に光が照射された状態で測定を直接行うことは非常に困難である。そのために有限要素法による熱流体解析ソフトウェア (COMSOL Multiphysics ver. 5.5) を用いて，液滴の温度変化を計算した。解析モデルの概要
を Fig. 3A に示す。温度変化を確認する液滴のサイズは，高速度カメラで撮影することで計測した。ばねヒンジによる基板の回転速度は，高速度カメラで撮影した画像から算出し，基板と基板周囲の初期温度は −190 ℃とし，周囲の温度は 20 ℃とした。
回転開始後 0 ms, 10 ms および 20 ms の温度分布を Fig. 3B から D に示す。従来法では，基板持ち上げ直後から昇温が確認されており，約1 秒でガラス転移温度を超えた。一方，自動解凍装置を用いた際は，基板が投げ落とされる

Fig. 1

Automatic thawing apparatus for the cryoprotectantfree cryopreservation of cells

Fig. 2

Rotational angle of the alminum career

20 ms 後でも約 −190 ℃を保っていた。液滴がFig. 3 Thermal flow simulation of the droplet on substrate― 2 ―Tateisi Science and Technology Foundation

ばねヒンジにより回転させて，解凍用培地にその慣性で基板ごとを落下させていた。試しに，トランスポータ上面に直接液滴を載せて回転させ，フレームにぶつけたところ，その衝撃で凍結液滴が離脱することが確認できた。この離脱した液滴を解凍用培地へ直接落下させれば，基板の影響を受けないさらに高速な解凍が可能となる。
まず，蛍光色素を用いて液滴離脱前後でトラ
Fig. 4 Cell viabilities achieved via the conventional method
using 10% DMSO and by superflash freezing
followed by manual or automatic thawing

ンスポータ上の液滴を観察し，離脱率を算出した。Uranine を終濃度 1.0 mM で溶解したリン酸緩衝液を，約 40 もしくは 200 pL の微小液滴

運搬中に昇温をしなかった理由として，液滴周として 1500 滴インクジェットヘッドから吐出囲に冷やされた空気の層が形成され，回転中はし，冷却されたトランスポータに着滴させた。

層を避ける様に室温の空気が流れたためである

その後，着滴した液滴を USB カメラとズームと考えられる。以上より，開発した自動解凍装

鏡筒 (Z16APO, Leica) を用いて蛍光観察した。

置は，凍結液滴がガラス転移温度を超えずに低そして，離脱操作後すぐにトランスポータ上を温を保ったままの状態で，解凍用培地に投入し再度蛍光観察し，液滴数を画像解析ソフトウェ解凍することが可能であることが分かった。

ア (ImageJ Fiji, NIH, USA) によりカウント

そして，超瞬間凍結した細胞をこの自動解凍した。

装置を使って解凍し，その生存率を比較した。

離脱前後のトランスポータ上面の液滴分布をFig. 4 に示すように，手動で解凍した場合は若Fig. 5 に示す。吐出直後は約 1500 滴の液滴が干，DMSO 用 い た 従 来 法 よ り 生 存 率 が 低 く確認されたが，トランスポータの回転による離なっていたものが，自動解凍装置により同等の脱操作後に再び同じ場所を確認したところ，40生存率となった。また，自動解凍装置により標pL で 6 個，200 pL で 13 個とほとんど確認さ準偏差を表すエラーバーが小さくなっており，れなかった。これにより，本装置は，衝突の衝再現性も向上したことが確認できた。

撃でほぼ全ての液滴を離脱できることが確認できた。

3．衝撃液滴離脱による超瞬間解凍法

次に，液滴の落下速度をハイスピードカメラ

自動解凍装置により従来法同等の生存率を確と画像解析を用いて算出した。まず，ハイス認できたが，現手法は，液体窒素温度まで冷却

ピードカメラを用いて 40 および 200 pL それぞされた基板も共に予温した培地に浸漬しており，れの離脱後の落下を撮影した。次に，運動解析

これの冷却されている基板によって解凍速度がソフトウェア (DIPP-Motion V/2D, DITECT)低下させられている可能性がある。この影響をを用いて液滴を追跡し，それらの速度を算出し除くことが出来れば，さらなる解凍速度の上昇

た (Fig. 6)。それぞれの平均落下速度は 40 pLとそれによる生存率向上が見込まれる。

で 5.1 m/s, 200 pL で 5.0 m/s であったことか

そこで，基板を必要としない衝撃による液滴ら，液滴の落下距離，すなわちトランスポータ離脱を用いた超瞬間解凍法を検討した。これまと予温した培地間の距離は約 5 mm なので，落での解凍操作では，凍結液滴が載った基板をア

下時間は液滴サイズによらずおおよそ 1 ms のルミニウム製トランスポータに載せた状態で，非常に短時間の現象であることが確認できた。

― 3 ―立石科学技術振興財団したのだろう。
以上のように，衝撃離脱法により解凍速度を低下させていた基板を用いない解凍を実現できた。特に，200 pL の液滴の解凍は，液滴のみの解凍によりその生存率が大幅に上昇し，凍結保護剤を用いた従来法変わらないレベルにまで達した。
[今後の研究の方向，課題]
本研究において，凍結工程のみならず解凍工程も含めて検討することで，凍結保護剤を用いFig. 5

Fluorescence images of the frozen droplets on thealuminum transporter before and after the impactinduce droplet releasing

ずに安定して従来法同等の生存率を達成できるようになった。衝撃離脱法にについては，40pL 液滴の落下中の昇温が懸念されるが，200pL については非常に有効であることも確認できた。このように高い生存率を安定して達成できるようになったので，現在各種バイオリソー
スの凍結保存に取り組んでいるところである。
以下に簡単にその進捗を纏める。微生物については，製品評価技術基盤機構 (NITE) の協力の下，いくつか藻類にチャレンジした。その結果，生存率は低いもののこれまでに凍結保存の報告のない微生物の凍結保存に成功しており，その再現性を確認しているところである。また，

Fig. 6 Squential images of the falling droplets releasedby an imapct

血球の中でも凍結どころか冷蔵保存によっても機能低下が見られる血小板について，凍結解凍最後に，衝撃離脱法における解凍後の細胞生実験を行った。その結果，本手法で凍結解凍し存率を測定し，比較した。衝撃離脱法で解凍したラット血小板も，未凍結のものと同様にアドた場合の生存率は 40 pL で 72.9 %, 200 pL では

レナリン刺激により仮足が出現することを確認

79.3 % と共に 70 % 以上の生存率を実現した。

できた。さらに，ヒトの間葉系幹細胞 (MSC)

しかし，基板を用いた場合と比較すると，200や人工多能性幹細胞 (iPSC) については，細pL では生存率が約 20 % 上昇したのに対し，胞の生存を確認できたが，従来法と比べて生存40 pL では約 10 % 減少した。これは，40 pL の率が大きく低下してしまった。

液滴は落下中に室温の空気に晒され昇温し，脱今後は，これらの対象に対しても凍結保護剤ガラス化したためだと考えられる。これに対しフリーの凍結保存実現に向けて，液滴のさらなてサイズの大きい 200 pL では，脱ガラス化がる微小化や自動解凍装置の改良などにより，さ液滴の外層にのみ限定され，落下時の昇温は生らなる凍結および解凍速度の向上を目指す必要存率に影響を与えなかった上に，基板無し解凍がある。今後も研究を進めていき，最終的にはによる解凍速度向上の恩恵を受け生存率が向上

本手法を一般的な凍結保存法として確立したい。

― 4 ―Tateisi Science and Technology Foundation

・ 渡部広機，湯浅裕太，秋山佳丈，凍結保護剤フリー細胞凍結法の高生存率化に向けた液滴単独落下解凍[成果の発表，論文等]とその評価，第 66 回低温生物工学会, 2021.

・ 渡部広機，湯浅裕太，秋山佳丈，凍結保護剤フリー

・ 渡部広機，湯浅裕太，秋山佳丈，インクジェットを細胞凍結保存のための衝撃液滴離脱による超瞬間解用いた超瞬間細胞凍結法における生存率の凍結解凍

凍法，低温生物工学会誌 67(2) : 121-124, 2022.

速度への依存性，日本機械学会 2021 年度年次大会,

・ H. Watanabe, Y. Akiyama, Improved and reproduc-

2021.

ible cell viability in the superflash freezing method

・ H. Watanabe, Y. Akiyama, Development of automat-using an automatic thawing apparatus, Cryobiology

ic thawing apparatus for cryoprotectant-free cryo-

96 : 12-18, 2020.

preservation, Cryo2020, 2020.

・ 渡部広機，諫田泰成，秋山佳丈，インクジェット超・ 渡部広機，秋山佳丈，超瞬間細胞凍結法のための自瞬間凍結法のヒト幹細胞への応用，第 21 回日本再動解凍装置開発と熱解析による評価，日本機械学会

生医療学会総会，2022.

ロボティクス・メカトロニクス 講演会, 2020.

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