平成２８年度サイエンスメンタ―事業研究発表会

平成２９年３月２９日

トウモロコシはアルツハイマー病に効くか？
アセチルコリン・コリンの定量分析

明石工業高等専門学校
木村 真悠

背景
①アルツハイマー病( Alzheimer’s disease, AD )を知った②薬での治療法には副作用がある③アセチルコリン(Acetylcholine, ACh)の作用系を知った④食べ物を通じて、ADの予防はできないか⑤トウモロコシに辿り着くアルツハイマー病
主な症状
・迷子になる・質問を繰り返す・家族や友人を認識しにくくなる
・コミュニケーション能力の喪失
・衝動的行動・体重減少・けいれん発作(公財)先端医療振興財団・臨床研究情報センター HP
http://adinfo.tri-kobe.org/worldwide-alzheimers-information/symptoms.html

背景①アルツハイマー病( Alzheimer’s disease, AD )を知った②薬での治療法には副作用がある③アセチルコリン(Acetylcholine, ACh)の作用系を知った④食べ物を通じて、ADの予防はできないか⑤トウモロコシに辿り着く

ChoCho : コリン
ACh : アセチルコリン

AChAChACh

脳内における ACh による神経伝達系
山西 嘉晴，上野 正孝，小倉 博雄：アルツハイマー病治療薬の基礎 ,日本薬理学雑誌, 130 (6), 489-491, 2007
青葉 安里：アルツハイマー型痴呆治療薬開発の現状と臨床試験のあり方,臨床薬理, 29 (5), 774, 1998

ACh の発見
1914年
ヘンリー・ハレット・デール ( Henry Hallett Dale )ACh 発見
1921年
オットー・レーヴィ ( Otto Loewi )ACh が神経伝達物質であることを証明

1936年
2人でノーベル生理学・医学賞受賞

50種類ほど知られている神経伝達物質の1つ

AD の機序 ①
山西 嘉晴，上野 正孝，小倉 博雄：アルツハイマー病治療薬の基礎 ,日本薬理学雑誌, 130 (6), 489-491, 2007
青葉 安里：アルツハイマー型痴呆治療薬開発の現状と臨床試験のあり方,臨床薬理, 29 (5), 774, 1998

×AD の機序 ②
山西 嘉晴，上野 正孝，小倉 博雄：アルツハイマー病治療薬の基礎 ,日本薬理学雑誌, 130 (6), 489-491, 2007
青葉 安里：アルツハイマー型痴呆治療薬開発の現状と臨床試験のあり方,臨床薬理, 29 (5), 774, 1998

背景
①アルツハイマー病( Alzheimer’s disease, AD )を知った②薬での治療法には副作用がある③アセチルコリン(Acetylcholine, ACh)の作用系を知った④食べ物を通じて、AD の予防はできないか⑤トウモロコシに辿り着く

先行研究よりトウモロコシの芽および子葉鞘節において、ACh の作用および存在が分かっている。

Yoshie S. Momonoki, Tokuhiro Momonoki, Joanne H. Whallon : Acetylcholine as a Signaling System to Environmental Stimuli in Plants,
Japanese Journal of Crop Science, 65 (2), 261, 1996

研究目的
食物により ACh と Cho を摂取することにより、脳内 ACh 濃度が上昇し、AD の治療や進行抑制が可能になると期待できる。

• トウモロコシに ACh およびその前駆体であるCho が含まれているかどうかを検討することもし、 ACh と Cho が含まれていた場合、• トウモロコシの 実から ACh と Cho を効率的に抽出・回収する方法を検討すること• 抗原抗体反応を応用した ACh および Cho 測定キットによる定量分析をすること

ACh の化学的性質
CH3COO(CH2)2N+(CH3)3• 正に帯電• 水に溶けやすい• 低極性の有機溶媒に溶けにくい• pH4.0 で最も安定
Andrezej Tretyn, Richard E. Kendrick: Acetylcholine in Plants:
Presence, Metabolish and Mechanism of Action, THE BOTANICALREVIEW, 57(1), 33-73 , 1991

試料(-80℃凍結試料,41.1031g)

実験方法

磨砕(コーヒーミル,4℃)
80% エタノール (pH3.9)
乳鉢で磨砕
80% エタノール (pH3.9)
攪拌(20 分間)遠心分離 (4℃, 15,000rpm, 20 分間).
上清沈殿物.

減圧濃縮(40℃)
蒸留水
定容 (50ml)* pH4.0 であった。
約 10ml
ろ過分取

ACh ・ Choの測定へ
ACh・Choの測定へ

ACh の測定試料の調製方法

×2

実験方法

基質
酵素反応因子二次抗体一次抗体

キャプチャー抗体

ACh抗原・抗体反応を利用した ACh 測定の原理（サンドイッチアッセイ法）
Andrezej Tretyn, Richard E. Kendrick: Acetylcholine in Plants: Presence, Metabolishand Mechanism of Action, THE BOTANICAL REVIEW, 57 (1), 33-73, 1991

結果
1. トウモロコシの実に ACh が含まれることを初めて明らかにした。
含有量は 43.5 ng/kg 湿重量,(2.98×10-10 mol/kg 湿重量) であった。
2. Cho 濃度は 306 mg/kg 湿重量,
(2.93×10-3 mol/kg 湿重量) であった。

食品中の Cho 含有量-文献値との比較
食品(単位)
牛肝臓(100g)
卵(大玉)
リンゴ(中1個)
オレンジ(中1個)
ブドウ果汁(170g)
バナナ(中1個)
ピーナッツ(28.4g)
ジャガイモ(1個)
トマト(中1個)
トウモロコシ(1本)遊離コリン(mg)61.0
0.20.4
2.9
9.0
2.9
13.0
6.0
5.548.0

Cho の摂取目安量(米国農務省)男性 : 550 mg/day
女性 : 420 mg/day

S.H.Zeisel , D Char, NF Sheard , J. Nutr., 116 (1) , 50-58 ,1986Jean A. Pennington , Judith S. Spunguen , Bowes & Church’s Food values of portions commonly used, 16th ed.,
J.B. Lippincott Williams & Wilkins , 19 Cdr edition , JB Lippincott , 1994
Institute of Medicine and National Academy of Sciences USA. In Dietary Reference Intakes for Folate,Thiamin,Riboflavin, Niacin, Vitamin B12, Panthothenic acid, Biotin, and Choline , National Academy Press ,Washington DC , 1998

食品中の Cho 含有量-文献値との比較
食品(単位)
牛肝臓(100g)
卵(大玉)
リンゴ(中1個)
オレンジ(中1個)
ブドウ果汁(170g)
バナナ(中1個)
ピーナッツ(28.4g)
ジャガイモ(1個)
トマト(中1個)
トウモロコシ(1本)遊離コリン(mg)
61.0
0.2
0.4
2.9
9.0
2.9
13.0
6.0
5.5
48.0

Cho の摂取目安量(米国農務省)男性 : 550 mg/day
女性 : 420 mg/day

S.H.Zeisel , D Char, NF Sheard , J. Nutr., 116 (1) , 50-58 ,1986
Jean A. Pennington , Judith S. Spunguen , Bowes & Church’s Food values of portions commonly used, 16th ed.,
J.B. Lippincott Williams & Wilkins , 19 Cdr edition , JB Lippincott , 1994
Institute of Medicine and National Academy of Sciences USA. In Dietary Reference Intakes for Folate,Thiamin,Riboflavin, Niacin, Vitamin B12, Panthothenic acid, Biotin, and Choline , National Academy Press ,Washington DC , 1998

Cho 前駆体の経口投与について
佐藤幸治先生の研究グループの成果よりCho の前駆体であるグリセロホスフォコリン(α-GPC) を健康な高齢女性に経口投与し、中程度の有酸素運動を行った際に認知機能の向上が見られた。
Atsushi Yuhaku , Koji Sato , Satoshi Fujita , Takeshi Okubo , Takafumi
Hamaoka , Motoyuki Iemitsu : Combination of α-Glycerophosphocholine(α-GPC) intake and aerobic exercise improves cognitive functions inhealthy older women , ECSS 2013 abstract , 2013

考察と今後の展開
本研究により、トウモロコシの実に ACh およびその前駆体である Cho が含まれていることが分かった。

考察と今後の展開
本研究により、トウモロコシの実に ACh およびその前駆体である Cho が含まれていることが分かった。

トウモロコシを摂取することで、体内および脳内でCho が増加する可能性があり、 ACh の濃度の低下を補えるかもしれない。

考察と今後の展開
本研究により、トウモロコシの実に ACh およびその前駆体である Cho が含まれていることが分かった。

トウモロコシを摂取することで、体内および脳内でCho が増加する可能性があり、 ACh の濃度の低下を補えるかもしれない。
脳内の ACh 作用系の働きが向上する可能性がある最近の新聞記事から『ナス、神経伝達物質多く信州大発見 ピーマンの 1000 倍 』

ナスに神経伝達物質の ACh が大量に含まれていることを発見した。ピーマン、ニンジンなどの農産物に比べて 1000 倍以上含まれているという。
今後、機能性表示食品として登録を目指す(中村浩蔵准教授)。
日本経済新聞 , 2016年12月30日付朝刊より

謝辞
神戸大学(メンタ―)
同大学
同大学

白杉 直子先生
蘆田 弘樹先生
佐藤 幸治先生

日本科学協会の皆様明石工業高等専門学校(担当教諭) 石田 祐先生
神戸大学 3年生

鷲塚晋さん

ACh・Cho 供給源としてのトウモロコシ利用法
トウモロコシの実
磨砕
沈殿物

上清↓

↓飼料
醸造原料などコーンスターチ

ACh・Cho サプリメント？
環境省 廃棄物・リサイクル対策 HP
http://www.env.go.jp/recycle/food/05_conf/wg1-03a.html

補足スライド認知症の定義 (世界保健機構)
脳疾患によって起こる認知機能障害であり、意識清明な状態で記憶障害を中核とするさまざまな認知機能障害が出現し、その程度は日常生活を損なうような程度に重度で、一過性のものではなく長期にわたり持続しているもの
補足スライドアルツハイマーの原因 (仮説)・Cho仮説脳内の神経伝達物質の一種である ACh が減少するために認知機能が低下すると考えられている。治療法としては、脳内の ACh を増加させればよいとされている。
・アミロイド仮説
AD 患者の脳内には Aβ というペプチドが凝集・繊維化した老人斑が多くできる。 Aβ が神経毒性を示すため、神経細胞が死に、認知機能が落ちると考えられている。治療法としては、老人斑を分解すれば良いとされている。
杉本 八郎：ベータアミロイド仮説に基づくアルツハイマー病治療薬の開発研究,薬学雑誌,
130 (4) , 521-523, 2010

補足スライド補足スライドAD の機序 ③
山西 嘉晴，上野 正孝，小倉 博雄：アルツハイマー病治療薬の基礎 ,日本薬理学雑誌, 130 (6), 489-491, 2007
青葉 安里：アルツハイマー型痴呆治療薬開発の現状と臨床試験のあり方,臨床薬理, 29 (5), 774, 1998

補足スライドAD の機序 ④
山西 嘉晴，上野 正孝，小倉 博雄：アルツハイマー病治療薬の基礎 ,日本薬理学雑誌, 130 (6), 489-491, 2007
青葉 安里：アルツハイマー型痴呆治療薬開発の現状と臨床試験のあり方,臨床薬理, 29 (5), 774, 1998

ACh の定量分析方法

補足スライドガスクロマトグラフィー分析
・固定相と移動相より成る平衡の場において、試料の各成分の両相への相互作用の大きさに差があることを利用して、それぞれの成分を分離する方法

バイオアッセイ・ ACh に対する、単離した動物の臓器、組織または全体の抗原・抗体反応を利用する。
・ ACh に加えて、ヒスタミンの様に、植物内で発生し、バイオアッセイの感度に影響を与える、薬理学的に活性のある物質は他にも存在するため、ACh だけで活性が認められることを確認する必要がある。
Andrezej Tretyn, Richard E. Kendrick: Acetylcholine in Plants: Presence, Metabolishand Mechanism of Action, THE BOTANICAL REVIEW, 57 (1), 33-73, 1991

・Acｈ の定量方法

ACH ELISA KIT E-EL-0081 (Elabscience) 使用①プレートの固体相の一次抗体をビオチン標識抗体とし、ACh と競合させた。
②過剰に結合した ACh のサンプルや結合していないサンプルを洗浄した。
③西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase：HRP）酵素に結合したアビジンを各マイクロプレートに加えた。ビオチン標識した二次抗体と HRP で標識したアビジンを用いて反応を行った。
ビオチンとアビジンが強く結合することを利用している。
④培養するために乾燥機に入れ温めた。この際、乾燥しないようにアルミホイルを巻いた。
⑤続いて TMB 基質溶液を各マイクロプレートに加え、発色させた。
酵素-基質反応を硫酸溶液の添加により停止させ、色の変化を450 nm±2 nm の波長で分光光度的に測定した。
⑥分光光度計を用いて ACh の含有量を調べた。
なお、Cho の定量には、 Choline Assay (Cho) (ScienCell)を使用した。

補足スライド