立石科学技術振興財団

助成研究成果集(第32号) 2023

［ 研究助成 (A) ］

心臓機能を調整する自律神経活動の in vitro
モニタリング・コントロール技術の開発
Development of in vitro monitoring and control technology for ANS-innervating cardiac tissues
2201012

研究代表者

産業技術総合研究所
細胞分子工学研究部門

主任研究員

髙山祐

三という課題があった。標的臓器への自律神経作[研 究 の 目 的]用の評価には交感/副交感神経支配を同時に再生体臓器は自律神経系を構成する交感/副交現することが必須である。

感神経の拮抗作用による機能制御を受けており，このために本研究課題では交感/副交感神経それゆえに自律神経作用の恒常性が破綻するこのハンドリングを容易にする 3 次元交感/副交とで不整脈等の疾患が誘起される。自律神経作

感 sphere を作製する。更には電極基板上でヒ用により臓器機能を制御・破綻に導く詳細なメ

ト心筋組織への交感/副交感神経支配を行うた

カニズム解析，および疾患状態に対する創薬応めの微細加工デバイスを作製することで，オン用のためには，生体外において自律神経作用をチップ上で心筋活動への自律神経作用をリアル再構成する技術の確立と自律神経活動のモニタタイムに観測・評価可能なシステム開発を行う。

リング・コントロール技術開発が必須である。
本研究では心臓機能を自律神経シグナルにより[研究の内容，成果］人為的に制御するための自律神経活動の計測・制御インターフェース構築を行う。その先には①自律神経 sphere の作製

ヒト自律神経系への機械的な介入による，生体本研究課題ではまずヒト心筋組織との共培養モニタリング・次世代治療へと発展できると考を行うためのヒト自律神経 sphere の作製を試えている。

みた。生体内の神経節構造を模擬した 3 次元状

申請者は本研究課題に先立ちヒト多能性幹細の細胞 sphere を作製することで，ハンドリン胞 (iPS, ES 細胞) から自律神経前駆細胞及びグ操作性を向上させることが可能となり，これ交感副交感神経の作製技術を開発してきた。特まで困難であった交感/副交感神経の同時共培に前駆細胞の段階から細胞密度，神経栄養因子養が可能になると想定した。の添加濃度を調整することで交感/副交感神経研究代表者らがこれまでに構築したヒト iPSの選択的誘導が可能となっている点が大きな利細胞から自律神経前駆細胞への誘導時に行って点である (Takayama et al., Sci. Rep., 2020; 特いた 3 次元胚様体作製と浮遊培養法を，自律神

6593811)。

経への成熟過程においても継続して行うことで一方で，異なる培養環境による細胞誘導手法

自律神経 sphere の作製を行った。

では，標的細胞組織 (心筋など) との共培養を

なお，交感神経/副交感神経の誘導のために行う際に片方のみとの神経結合になってしまうそれぞれ異なる培養液を用いた神経成熟を行っ― 1 ―立石科学技術振興財団との機能的結合には問題が無いと判断できるが，ている。
上記の通りに作製した交感神経/副交感神経

今後の実験で自律神経 sphere-心筋組織との結sphre の評価のために遺伝子発現解析を行った。

合に問題が生じた場合には，自律神経 sphereqPCR による評価の結果，それぞれの sphereの誘導効率上昇等のプロトコル改善を検討するにおいて交感神経マーカーである TH や DBH予定である。

(交感神経マーカー) 及び CHAT や VACHT(副交感神経マーカー) の顕著な上昇を確認し②自律神経 sphere と心筋組織の共培養た。また，免疫細胞染色実験からも同様の実験

上記で作製した自律神経 sphere と心筋組織結果を得ており，交感神経/副交感神経 sphereとの共培養系構築を行い，機能的結合が生じるの構築を問題無く行えていることを確認していかの解析を行った。

る (図 1)。

心筋活動の解析に当たり，心筋細胞が発生す
る 活 動 電 位 及 び 局 所 電 場 電 位 (LFP: LocalField Potential) を計測するために微小電極アレイ基板 (MEA: Microelectrode Array) 上にヒト iPS 由来心筋細胞 (iCell cardiomyocytes;CDI Japan 社) を播種し，更に自律神経 sphereを播種し共培養を行った。
ヒト心筋細胞のみを培養したサンプル及び交感神経/副交感神経 sphere との共培養を行った
サンプルにおいて，自律神経作動薬であるニコチンを添加した際の心筋活動変化の計測を行った。その結果，心筋細胞のみにサンプルにおいてはニコチン添加による心筋活動への影響は観図1測されなかった。一方，交感神経 sphere との自律神経 sphere の免疫染色結果

共培養系においてはニコチン添加により顕著な一 方 で，交 感 神 経 sphere 内 に 副 交 感 神 経

心拍頻度の増大が，副交感神経 sphere との共マーカーの遺伝子発現上昇や陽性細胞が，副交培養系においては心拍頻度の減少傾向が見られ感神経 sphere 内に交感神経マーカーの遺伝子た (図 2〜4)。

発現上昇や陽性細胞が確認されており，神経細胞の混入が今後課題となる可能性がある。これに対しては，例えば交感神経の選択的な神経毒である 6-OHDA 等を用いることで副交感神経sphere 内の交感神経の大部分を除去可能であることを確認しており，培養法の工夫による分化効率の改善を必要に応じて検討する予定である。
また，作製した自律神経 sphere 内には神経以外にも線維芽細胞や間葉系細胞等の増殖性細胞が増加していることも確認した。後述の通り，
現状では作製した自律神経 sphere と心筋組織

図2― 2 ―

心筋組織のみのサンプルに対するニコチン添加による活動変化

Tateisi Science and Technology Foundationの影響を解析した。心電図の QT 間隔に相当する指標である FPDcF (Field potential duration corrected by Fridericiaʼs formula) に関して，心筋組織のみのサンプルでは 1 μMPaclitaxel 添加前後で大きな変化が見られないのに対 し，自 律 神 経−心 筋 組 織 の サ ン プ ル で はFPDcF の 顕 著 な 変 化 が 見 ら れ た (図 5)。
FPDcF の大きな変動は催不整脈作用の指標となることが知られており，この結果は Pacli図3

交感神経−心筋組織サンプルに対するニコチン添加による活動変化

taxel は自律神経への障害を介して心筋活動への悪影響を及ぼすというこれまでの in vitro 実
験系では解析困難であったメカニズムを示唆するものである。
以上の結果より，自律神経−心筋共培養システムによりこれまでにない化合物アッセイが可能であることが示唆されたと考えている。

図4副交感神経−心筋組織サンプルに対するニコチン添加による活動変化

以上の結果より，作製したヒト交感神経/副交感神経 sphere はヒト心筋組織と機能的な結図5

Paclitaxel 添加による FPDcF の変化率解析。色帯部
は FPDcF の変化率が 10% 以内の部分を示す。

合を形成することが可能であり，自律神経シグナルにより人為的に心筋活動を制御可能である[今後の研究の方向，課題］ことが示唆された。
本研究ではヒト自律神経 sphere とヒト心筋③自律神経由来の心筋毒性解析細胞を共培養することで自律神経−心筋におい②までに構築したヒト自律神経−心筋システて相互作用が形成されること，及び自律神経をムを用いた薬理解析への有用性検証を目的とし，介した心毒性をアッセイ可能な in vitro 系であ抗がん剤の一種である Paclitaxel 添加実験をることを示した。

行った。Paclitaxel は副作用として末梢神経障

一方で当初からの目標である交感神経/副交害と共に催不整脈作用があることが報告されて感神経作用の独立的な心筋組織への作用に関しいるが，この催不整脈作用が直接的な心毒性にてまだ未解決であり，今後は各 sphere の独立よる作用なのか，末梢神経障害を介した作用なした播種と心筋組織への神経突起投射を可能とのかは報告されていない。Paclitaxel を心筋組なる培養デバイスの作製に注力する必要がある

織のみのサンプル及びヒト自律神経と共培養しと考えている。

たサンプルそれぞれに添加した際の心筋活動へ― 3 ―立石科学技術振興財団

2 ．Selective derivation of human peripheral neurons[成果の発表，論文等］
1 ．Specification of peripheral neurons from humanpluripotent stem cells allows construction of nerveinnervating culture models, Yuzo Takayama, Yuka
Akagi, Yasuyuki S. Kida, FENS Forum 2020, online(virtual conference), 2020/07/14― 4 ―in the autonomic nervous system facilitate precise
control of cardiomyocyte beating, Yuzo Takayama,
Hiroko Kushige, Yuka Akagi, Yutaka Suzuki, Yutaro
Kumagai, Yasuyuki S. Kida, ISSCR 2020 Virtual,online (virtual conference), 2020/06/26