非線形過程を用いない可視光ニードルスポット顕微鏡技術東北大学 多元物質科学研究所
准教授 小澤 祐市
2022年7月14日

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レーザー走査型（蛍光）顕微鏡技術における3次元画像構築と課題

深さ1.5 mm

最先端2光子励起in vivoイメージング
によるマウス脳神経細胞の3次元可視化例

ここを高速にできないか︖

R. Kawakami et al., Biomed. Opt.
Express 6, 891 (2015).

>1 mm深さでの3次元イメージング:
数十分 - 時間オーダーでの取得

実用化されている高速なイメージング法 スピニングディスク型レーザー顕微鏡法
 ライトシート型顕微鏡法
 2次元像取得の高速化
 3次元像を得るには「観察面の移動」が必須
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深さ情報を面内方向に変換する:～光の波面制御に基づく高速3次元イメージング法• 波面制御に基づく「深さ情報 ⇒ 面内情報」への変換• 観察面の移動無しに深さ情報を一度に取得

深さ情報

面内情報に変換

アレイ検出器https://www.tohoku.ac.jp/en/press/engineered_light_wave_enable_rapid_recording_3d_microscope_images.html

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エアリービームを用いた空間転置検出に基づく
光ニードル走査型3次元レーザー顕微鏡法

深さ方向への一斉励起（長焦点深度スポット）• 特許第6537153号, Sci. Rep. 9, 11687 (2019)• 2020年度新技術説明会(7/16)

Airy beam
自己湾曲性（曲がるビーム）⇒深さ分解4波面制御技術を駆使した検出深度・深さ分解能のさらなる向上
エアリービーム特性による深さ分解
検出面
放物線型の伝搬特性

より理想的な検出光の伝搬特性
線形な面内シフ
Detector plane
ト伝搬特性• 深さ方向 – 面内方向に対するキャリブレーションが不要• 深さ分解能は深さ位置に無依存
蛍光に対する波面制御• エアリービームの伝搬特性が観察深度・結像性能を制限• 深さ分解能は深さ位置に依存*)[*] Y. Kozawa and S. Sato, Sci. Rep. 9, 11687 (2019).

多重化計算機合成ホログラム(CGH)による線形シフト特性を持つ点像分布関数（PSF)の実現
特許第7021772, T. Nakamura et la., Opt. Lett.
43, 5940 (2018)5多重化計算機合成ホログラフィ(CGH)の原理に基づく波面制御
 設計した深さ範囲が検出面での1次元方向に展開（深さ分解分解）できる

XY (MIP, Projected along z)

2018 µm

20 µm
60 µm
31 volumes/s

5 µm

0

Depth (µm)

水中に浮遊する1-µm蛍光ビーズ

ニードルスポットの2次元連続走査による ビデオ
レート・リアルタイムでの3次元画像取得(NA = 1.15, λ = 1040 nm)
Y. Kozawa et al., Biomed. Opt. Express 13, 1702 (2022).

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本イメージング法の特徴
リアルタイム3次元イメージング

20 µm (16 ch)

94 volumes /s

7.6 µm(20 pixels)

厚みのある試料の迅速な3次元観察
固定マウス脳スライス標本

260 µm(13 scans)Flow(1-µm beads)=196 slices

2次元レーザー走査のフレームレート
で試料の3次元像を高速に取得できる（ニードル深度内）

100 µm以上の厚みのあるサンプルに対しても少ない2次元走査回数で画像取得が可能（従来法に比べて10倍以上高速化）

Y. Kozawa et al., Biomed. Opt. Express 13, 1702 (2022).

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3次元情報を得るための励起（照明）側のキーコンセプト:
長焦点深度ニードルスポット走査
円環状ビーム集光による非回折ニードル状スポット（ベッセルビーム）の形成

円環の直径・幅で制御可能（アキシコンでも生成できる）• 光ニードルスポットによる『超』長焦点深度イメージング• 焦点深度内の全ての深さ(z位置）情報が重畳
8長焦点深度ベッセルビームのサイドローブ
5xDOF

10xDOFyx

20 µm4 µm

通常の集光

15xDOF（例）通常のレーザー走査型蛍光顕微鏡に可視光ベッセルビームを用いた場合@532 nm
通常の蛍光ビーズ像ベッセルビームを用いた場合

2 µm

2 µmzx焦点深度を伸ばすほど，サイドローブも広がる（トレードオフの関係）⇒このような強度分布を直接3次元イメージングの走査励起光として適用するとアーティファクトが発生する
λex = 532 nm, NA = 1.15 (n = 1.33)

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フェムト秒レーザーを用いた多光子励起過程によるサイドローブの抑制
2光子励起顕微鏡PSF = (励起光スポットの強度分布)2
ベッセルビーム1光子励起

ベッセルビーム2光子励起

S1

S1

S0S0

ベッセルビームに特有のサイドローブサイドローブが抑制
中心スポットのみで励起

非線形光学効果に基づく多光子励起過程（多くは２光子励起過程）を利用すると、ベッセルビームのサイドローブの影響を低減できる
102光子励起光ニードル形成の例（従来の技術）
4 µm

2×DOF

5×DOF

10×DOF15×DOF

yx

20 µm

励起波長：1040 nm
パルス幅: ~200 fs (10 MHz)
オレンジ蛍光ビーズ(200 nm)の像を取得

通常の集光

zx

フェムト秒パルスレーザー光による2光子励起イメージングでは、サイドローブが抑制されたニードル状のPSFを形成できる11

従来技術とその問題点（3次元ニードル顕微鏡法に関して）
1次元アレイ型検出器
励起光（超短パルスレーザー光源）

結像レンズ
空間光変調器（多重化CGH）

サイドローブフリー
蛍光面内方向深さ分解された蛍光像対物レンズ

深さ方向

蛍光体ニードルスポットの2次元走査本イメージング法の課題• 2光子励起を得るには超短パルスレーザー光（フェムト秒レーザー）が必須• 高コスト、要メンテナンス、システムの大型化• 多光子励起が可能な蛍光イメージング系に限定される

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可視光（CW光）を用いると︓サイドローブが問題
1次元アレイ型検出器

励起光（可視CW光源）

サイドローブが発生

結像レンズ
空間光変調器（多重化CGH）

蛍光対物レンズ

深さ方向蛍光体

ニードルスポットの2次元走査

蛍光像にサイドローブが重畳（概念図）
 コントラストの低下
 アーティファクトの発生 信号クロストークの原因• 1光子励起による蛍光イメージングにはサイドローブが問題となり適用不可
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本技術︓
（非線形過程を用いない）可視光ベッセルビームでもサイドローブの影響を抑制した3次元イメージングを実現
1次元アレイ型検出器

結像レンズ
強度分布制御励起光（可視CW光源）
空間光変調器（多重化CGH）
1方向にのみサイドローブ抑制
蛍光対物レンズ

深さ方向

蛍光体

ニードルスポットの2次元走査

検出軸方向に対してサイドローブの影響を低減できる！
⇒ 1光子励起でもニードルイメージングが可能

新技術のポイント• ベッセルビームのサイドローブをすべて抑制する必要は無い• 像面での検出軸方向に対してサイドローブを抑制できれば良い• 照射レーザー光に対する強度分布制御によって実現可能

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本技術を実現する例︓欠損部を持つ円環状ビーム
NA = 1.15, λ = 532 nm を仮定した数値計算結果

通常の円環マスク
瞳面( )欠損角: 20度

欠損角: 40度

欠損角: 60度

Pupilsize

焦点(xy)

5×5 µm2

焦点(xz), (yz)
5×20 µm2zzxy

非回折性を維持したまま欠損部を持つ方向にサイドローブを抑制⇒1方向にのみサイドローブが抑制されたニードル状分布を形成
15可視光ニードルに基づくレーザー顕微鏡光学系
深さ分解CGHマスク

2回反射光学系

532 nm (CW)
アキシコン波面

切り欠き型円環マスク

 液晶型空間光変調器(SLM1)による励起光強度分布の整形
 蛍光信号に対する波面制御(SLM2)とアレイ検出器による深さ位置検出
Objective lens: NA = 1.15 (water), ×40, Nikon; SLM1/SLM2: SLM-100, santec
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欠損部を持つニードルスポット生成の効果
NA = 1.15 (water), λ = 532 nm

通常のレーザー走査型顕微鏡で蛍光ビーズを観察 ⇒ 励起光PSFに対応
励起光の振幅分布の制御パターン（空間光変調器面）

円環マスク

欠損角: 36°

欠損角: 52°

欠損角: 64°

200 nm蛍光ビーズ像
2 µm
同心円状のサイドローブ

円環状マスクに対して切り欠きを施すと、励起光PSFに対して1方向にサイドローブが抑制
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3次元イメージングのデモンストレーション
NA = 1.15 (water), λ = 532 nm

40 × 20 × 20 µm (z: 16 ch)
30 vps (Scan: 1.5 µs / pixels)

水中に浮遊する蛍光
ビーズ (Orange, 1 µm)

20 µm(16 ch.)Needle(2次元走査)20-µm needle, 欠損角有り

可視光を用いた1光子励起によるベッセルビームの連続2次元走査から、ビデオレートかつリアルタイムで3次元イメージングできる
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新技術の特徴・従来技術との比較• ベッセルビームに固有のサイドローブを焦点面で1方向にのみ抑制する方法およびそのようなニードル状集光スポットに基づくレーザー顕微鏡法• 可視光を照明光とする1光子励起蛍光イメージングにおいて、ニードルスポット走査による3次元画像取得が可能• ニードルスポットの2次元走査のみから3次元画像を取得でき、3次元画像取得の大幅な高速化につながる• 非線形過程が不要⇒安価な可視CW光源（ex. 半導体LD）が利用できる⇒蛍光に加えて、反射・散乱光、ラマンなどの線形応答信号に対する3次元イメージングへの適用可能性
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想定される用途• 3次元レーザー走査型顕微鏡システム
蛍光イメージング
散乱・反射光：表面計測への応用• 生物顕微鏡（基礎研究・臨床）への応用，表面検査などの工業顕微鏡への産業応用も期待

20実用化へ向けた課題• 様々な検出信号に対する適用可能性の検討– インコヒーレント／コヒーレントイメージング– 観察可能深度の増大（現状は高NA条件下で数十µm）– 高速性の追求• 励起光・検出光に対する波面制御技術の開発– 現状は液晶型の空間光変調器が少なくとも２台必要（励起側・検出側）– より安価／簡便／堅牢な波面制御技術の必要性（振幅・位相）⇒回折光学素子• 計測システムとしての実装– 検出系⇒多チャンネル同時計測– 通常のレーザー顕微鏡システムに対するアドオンが可能か︖
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企業への期待• 企業の研究開発の現場で3次元（立体）的な観察・検査対象を高速・迅速に可視化したいニーズがあればぜひご相談ください。
⇒本イメージング法が適用できるか︖といったご相談も歓迎します。
• 新規波面制御技術、検出光学系・システムの開発、高速データ処理技術の統合へ向けてご協力いただける企業• 独自の顕微鏡装置・検査装置開発への適用可能性の検討（ライセンス／共同研究のいずれでも対応可能）⇒本技術の実用化へ向けたパートナーを募集

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：スポット光生成装置、光学情報検知装置及び顕微鏡• 出願番号 ：PCT/JP2021/031166
• 出願人
：東北大学
• 発明者
：小澤祐市
関連特許：特許第6537153号,特許第7021772号
23お問い合わせ先
東北大学
産学連携機構 総合連携推進部
ウェブサイトhttps://www.rpip.tohoku.ac.jp/jp/
TEL
０２２－７９５ － ５２７５FAX
０２２－７９５ － ５２８６E-mail souren@grp.tohoku.ac.jp
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