立石科学技術振興財団

助成研究成果集(第32号) 2023

［ 研究助成 (C) ]人工細胞膜と受容体タンパク質を利用した脳神経インタフェースの開発
Development of brain-machine interface device with lipid bilayers and membrane proteins
2207005

研究代表者

東京工業大学

大学院機械系

博士課程

彭共同研究者

東京工業大学

大学院機械系

教

八授

祖木癸
透

[研 究 の 目 的]
脳神経インタフェースは，脳と機械を接続し人間の機能/知能を拡張できる技術として注目されている。神経ネットワークは，シナプス前細胞が放出する神経伝達物質をシナプス後細胞が感知して，信号伝達を行っている。高度な脳神経インタフェースを実現するには，神経伝達物質を精確に感知する計測技術の開発が必要である。これまで，神経細胞の電気活動を細胞外で計測する細胞外記録法や，微小ガラス管を用いた細胞内記録法などの電気生理学的手法が長図1

年に渡って用いられてきた。しかし，細胞外電提案手法の概要

位からは基本的に活動電位しか計測できないた

ナプス後細胞を実現する。その後，生細胞を人め，微弱なシナプス電位 (活動電位の 1/100〜工細胞膜に接着させ，電気計測を行う。

1/10 程度) を感知できない。一方，微小ガラ

本研究の目標は人工細胞膜とナノチューブをス管では単一細胞に対して複数点から接続する利用することにより，分子レベルで神経細胞のことは極めて困難である。

活動電位を計測する技術の開発である。従来よ

そこで本研究では，人工細胞膜と受容体タンりも詳細な活動電位の記録が可能であるため，パク質と近い性質を持つナノチューブを利用しシナプス電位の同時取得により神経可塑性の発てシナプス後細胞を人工的に実現し，シナプス現メカニズムを明らかにし，神経科学や神経工前細胞から放出される神経伝達物質を検出する学分野の発展に貢献する脳神経インタフェース手法の開発を目的とする (図 1)。具体的には，の実現における重要なマイルストーンとなるこ

自発展開現象 (固体表面に人工細胞膜の構成成とが期待できる。

分である脂質を付着させ，界面の相互作用により人工細胞膜が固体表面上に広がる現象) を利[研究の内容，成果]

用して，人工細胞膜を作製する。作製した人工細胞膜上にナノチューブを配置し，人工的なシ― 1 ―提案手法の実現に向け，これまで下記の 3 つ立石科学技術振興財団のサブテーマに取り組んだ。
A)：長期的な計測に適した機械的強度の高い人工細胞膜の形成
B )：人工細胞膜上のナノチューブの物質透過性の評価
C )：細胞接着を促進する手法の開発
以下にそれぞれの詳細を示す
A)：長期的な計測に適した機械的強度の高い人工細胞膜の形成
・背景

従来の支持物のない人工細胞膜は機械的強度が低く，電極先端に長時間にわたって存在できない。一方，内部に固体を導入し人工細胞膜を支持する方法では，人工細胞膜上に固定されたナノチューブが固体に衝突し機能が損なわれる。
そこで，多孔材料であるポリカーボネート基板

図 2 a) 人工細胞膜のポリカーボネート基板上での自発展
開 の 様 子。白 い 矢 印 は 人 工 細 胞 膜 の 先 端 を 示 す。
b) 原子間力顕微鏡によるフォースカーブ計測の結果。

上に人工細胞膜を作製し，人工細胞膜の機械的強度を向上させた。

顕微鏡計測の結果，人工細胞膜の特徴的な粘弾・方法

性 質 を 示 す フ ォ ー ス カ ー ブ が 観 察 さ れ た。

人工細胞膜の原材料である脂質は以下のフォースカーブから算出した人工細胞膜のバネ手 順 で 準 備 し た。ま ず 13 mM の L-α-

定数は 0.039±0.007 N/m であり，先行研究 (I.

Phosphatidylcholine from egg yolk (egg-PC)

Mey et. al. 2009) と同等な機械的強度を有し溶 液 お よ び 1.3 mM の 1, 2-Dihexadecanoyl-ていることを示している (図 2(b))。これらのsn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (fluores-ことから，自発展開法は提案手法の実現に有用

cein- DHPE) を，それぞれ 100 ml と 10 ml でであることが示唆された。

混合した。窒素ガスを用いて溶媒であるクロロホルムを蒸発させた後，減圧したチャンバー内B )：人工細胞膜上のナノチューブの物質透過で一晩静置してクロロホルムをさらに蒸発させ，粘着性の混合脂質を得た。22℃条件下で，表面性の評価
・背景に 50 nm の小孔を有するポリカーボネート基

ナノチューブの物質透過性は，提案手法の実板上に混合脂質を塗布し，全体をバッファー現において極めて重要な性質である。人工細胞(100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl; pH 7.6) に浸膜との相互作用によって，ナノチューブの物質すことで人工細胞膜を自発展開させた。

透過が変化することが知られている (J. Geng

・結果

et. al. 2014)。そこで，本研究では人工細胞膜共焦点顕微鏡による蛍光観察の結果，多孔質上でのナノチューブの物質透過性を評価するた基板であるポリカーボネート基板上に人工細胞

め，モデルナノチューブである単層カーボンナ膜が展開できることが分かった (図 2(a))。さノチューブ (SWNT) を人工細胞膜上に導入

らに FRAP 実験の結果，人工細胞膜が流動性し，一定の電圧を加えることで，そのイオン透を有していることが判明した。最後に原子間力過性を調査した。

― 2 ―Tateisi Science and Technology Foundation

・方法

SWNT の 電 気 計 測 に は，Droplet Interface
Bilayer (DIB) 法を用いた (図 3)。具体的には，ま ず 銀 線 を 2 本 用 意 し，そ れ ぞ れ AgCl化した後，agarose-LM ゲルでコーティングした。Agarose が ゲ ル 化 し た あ と，ゲ ル に 対して 5 μl の SWNT 溶液 (150 mM KCl, 10 mMHEPES, pH 8.0) を滴下し，10 mg/mL の 1,2diphytanoylphosphatidylcholine，1,2-di-(3,7,11,15-tetramethylhexadecanoyl) -sn-glycero-3phosphocholine (DPhPC) の ヘ キ サ デ カ ン 溶液に挿入した。両媒性分子である DPhPC が相互作用により，液滴まわりを脂質一重膜でコーティングできるため，2 つの液滴を接触させることで人工細胞膜形成した。その後，膜内に挿入された SWNT に対して 50 mV の電圧を印加

図 4 a) SWNT の人工細胞膜挿入の一例。b) SWNT のコンダクタンスのヒストグラム。

し，SWNT の 電 流 応 答 値 を 記 録 し た (Axppatch 200B)。得られた電流応答値をもとに，を示唆する。図 4(b) に，電圧値と電流応答値

SWNT のコンダクタンス値を算出した。

から算出した，SWNT のコンダクタンスのヒストグラムを示す (0.1 nS 以下のデータは，電流が流れていないときのデータを除外するために カ ッ ト し て い る)。0.40〜0.45 nS と 1.00〜1.05 nS にピークが観察されている。先行研究で報告した SWNT のコンダクタンス値が 0.63
nS 前後であることから (J. Geng et. al. 2014)，
低いピークが単一の SWNT，高いピークが 2
本の SWNT が同時に人工細胞膜に挿入したことを意味すると推察できる。しかし，SWNTのコンダクタンス値が SWNT の長さ，直径に依存するため，今後はシミュレーションなどの手法を用いて，コンダクタンス値の二峰性の理

図3

由を精査する必要がある。

SWNT の電気計測の模式図C )：細胞接着を促進する手法の開発

・結果

図 4(a) に電気計測の結果の一例を示す。人・背景

工細胞膜に対して電圧印加したところ，50 pA

提案手法で細胞を計測するためには，細胞をのステップを確認できたことから，イオンが人人工細胞膜上に接着させる必要がある。通常，工細胞膜に挿入された SWNT を透過できるこ

細胞は人工細胞膜に対する生着率が低いと思わとがわかった。電流値の上下は，SWNT が膜れるため，本研究では磁気粒子を用いて細胞のへの挿入と膜からの離脱を繰り返していること接着を促進する技術を開発した (図 5)。

― 3 ―立石科学技術振興財団

図5

SWNT の電気計測の模式図

・方法

C2C12 細 胞 は 理 研 セ ル バ ン ク (RCB0987;RIKEN) か ら 入 手 し た。培 地 は 10% 牛 胎 児
血 清 (Sigma-Aldrich) お よ び 1 % PenicillinStreptomycin Solution (PS) (Sigma-Aldrich)を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM; Sigma-Aldrich) を 成 長 培 地(Growth Medium: GM) として培養した。培地は一日ごとに交換した。60〜70% コンフルエ

図6ントに達した時点で，培地 1 ml あたり 0.5 μl，2.5 μl，5 μl のマグネタイトナノ粒子を添加しa) 染 色 し た C2C12 と マ グ ネ タ イ ト ナ ノ 粒 子。
b) 中心線より右側に磁力によって集まった細胞。
c) 磁石上に集まった C2C12 細胞の数の比。

た (以降のマグネタイト濃度はすべて培地に対た，中心線に沿って磁石がある側に細胞が集する体積比率で表す)。磁性粒子，細胞核，細まっていることが確認された (図 6(b))。磁石胞質を染色し，磁性粒子の細胞への取り込みを上の C2C12 細胞の数と，マグネタイトナノ粒観察した。磁さらに，磁石に対する細胞の反応子を含む培地で磁石を使わずに培養した細胞のを調べるために，培地中に磁性粒子を入れた細数を数えた (n=3, SE; *p<0.01; 図 6(c))。0.5-,胞を用意した。24 時間後に細胞を培養皿から2.5-, 5 μl/ml の い ず れ の 群 で も，磁 石 あ り取り出し，12 ウェルプレートに 5×104 cell の(Magnet+，オレンジ色) の方が磁石なし (よ細胞を播種し，磁石をウェルの中心線から右寄り細胞数が有意に多かった。磁石を下に置かなりの底面に配置した。4 時間後，プレートを顕かったグループでは全群で変化がなかった。以微鏡で観察し，境界から右側 (磁石領域内：上の結果から，磁気粒子を用いた手法が細胞接N in) と左側 (磁石領域外：N out) の細胞数の比着の促進に有用であると考えられる。

率を，1 ウェルあたり 3 箇所で測定した (mag[今後の研究の方向，課題](+))，磁石を置かない群 (mag(−)) も用意した。N inと N outの有意差は Student t-test により算出した。

本研究では，人と機械の融合を目指して「人工細胞膜と受容体タンパク質を利用した脳神経・結果

磁性体粒子を培地に添加してから 24 時間後インタフェースの開発」を提案した。これまで，の細胞を観察したところ，粒子が核の周りに散提案手法の実現に向け，A)：長期的な計測にらばっていることが観察された (図 6(a))。ま適した機械的強度の高い人工細胞膜の形成，― 4 ―Tateisi Science and Technology FoundationB)：人工細胞膜上のナノチューブの物質透過[ 2 ] Z. Peng, K. Wada, K. Shimba, Y. Miyamoto, T.

性の評価，C)：細胞接着を促進する手法の開Yagi. “Formation of Agarose-supported Liposomes

発の 3 つの要素技術に取り組み，一定性の成果

by Polymer-assisted Method toward Biosensor”,
IEEJ Transactions on Electrical and Electronicをあげてきた。しかし，最重要課題である提案

Engineering, Vol. 141, No. 5, pp. 646-653, 2021.

手法を用いた神経細胞の計測がまだ実現できて[ 3 ] S. Kanno, Z. Peng, K. Shimba, Y. Miyamoto, T.

いない。今後は，上記の 3 つの要素技術をもとYagi. “Functional Analysis of Liposomes Containing
Single-WalledCarbon

Nanotubes (SWNTs) byに，提案手法を完遂し，脳神経インタフェース

Fluorescence Microscopy, “Formation of Agarose-としての有用性を評価していく。

supported Liposomes by Polymer-assisted Method
toward Biosensor”, IEEJ Transactions on Electricaland Electronic Engineering, Vol. 141, No. 5, pp. 620-

[成果の発表，論文など]

626, May, 2021.
[ 4 ] Y. Kirihara, H. Miyata, Z. Peng, K. Shimba, Y.

[学術論文誌]
Z. Peng, K. Shimba, Y. Miyamoto, T. Yagi. “AMiyamoto, K. Shimizu, H. Honda, T. Yagi. “Effect ofStudy of the Effects of Plasma Surface Treatment

Magnetic Nanoparticle Internalization on Cellon Lipid Bilayers Self-Spreading on a Polydime-

Density in Skeletal Muscle Tissue”, IEEJ Trans-

thylsiloxane Substrate under Different Treatment

actions on Electrical and Electronic Engineering,Times”, Langmuir, Vol. 141, vol. 37, 36, pp. 10732-

Vol. 141, No. 7, pp. 795-801, May, 2021.

[1]

10740, 2021. 8.

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