Protein Expression and Purification

Masuda 020726

S. pombe 細胞からタンパク質を精製するには、tag をつけたタンパク質を発現させ、tag に高い affinty を示すタンパク質や抗体などを結合させたカラムを用いてアフィニテイ精製を行う方法が一般的である。Tag には、Hisx6, GST, 3xHA, Pk, Myc, TAP などがよく使われる。pREP vector を用いて tag 付きタンパク質を大量発現させる方法と、ゲノム上の遺伝子に tag を導入し、single copy の遺伝子から発現させる方法がある。
Hisx6, GST は pREP Vector を用いて大量発現させたタンパク質の精製に、HA, myc は抗体を用いた免疫沈降法に、TAP はタンパク質複合体の精製によく用いられている。
1. pREP vectors
pREP vector を使う場合、thiamine 存在下で発現が抑制され、thiamine 非存在下で発現が誘導される。
promotor の強さによって、発現量は pREP1 (pREP2)>pREP41 (pREP42)>pREP81 (pREP82)となる。
Thiamine 存在下、非存在下での相対的な promotor 活性は、以下のとおり（Gene 123, 131-136 (1993)）。
表１。
VectorPromotor
Relative promotor activity- thiamine+ thiamine
pREP1
nmt1801
pREP41
nmt41
120.06
pREP81
nmt81
10.004
現在、lab にある tag 付きの pREP vector については、表２を参照。
表２。
VectorMarkerPromotor
Fusion
pLB33
LEU2
nmt1
GST (N-terminal)
pREP1Hisx6
LEU2
nmt1
Hisx6 (N-term)
pREP1N.3HA
LEU2
nmt1
3xHA (C-term)
pREP41HM
LEU2nmt41
Hisx6+myc (N-term)
pREP42HM
ura4+nmt41
Hisx6+myc (N-term)
pREP41HALEU2
nmt41
3xHA (N-term)
pREP42HAura4+nmt41
3xHA (N-term)
pTN59
ura4+
nmt41
FLAG (N-term)
pTN189LEU2nmt41
GST (N-term)
pTN329LEU2nmt41
Pk (N-term)
pTN63
ura4+nmt41
FLAG (C-term)
pTN201LEU2nmt41
myc (C-term)pTN211
ura4+
nmt41
myc (C-term)
pREP41Pk.C
LEU2nmt41
Pk (C-term)
pREP42Pk.C
ura4+
nmt41
Pk (C-term)
pTN330LEU2nmt81Pk (N-term)
pTN280LEU2nmt81
HA (C-term)

fromOlaf Nielsen
HM
M. Yanagida
Iain Hagan
Iain Hagan
Iain Hagan
Iain Hagan
T. Nakamura
T. Nakamura
T. Nakamura
T. Nakamura
T. Nakamura
T. Nakamura
A.M. Carr
A.M. Carr
T. Nakamura
T. Nakamura2. Hisx6 tag をつけたタンパク質の発現と精製
2.1 Transformation と発現のチェック- pREP vector (pREP1.Hisx6 や pREP41HM など)へ発現させたいタンパク質をコードする遺伝子をサブクローニングする。
- vector を用いて EMM2-leu+thiamine プレート上で leu1-32 株（LEU2 marker の場合）を形質転換させる。
- コロニーを得たら、EMM2-leu+thiamine プレート上に広げる。
- 細胞が増えたら、EMM2-leu+10 M thiamine 液体培地(2-5 ml)で培養する。Overnight。（プレート上の細胞をかき取って glycerol stock を作る。thiamine 非存在下の phenotype を見るために、EMM2-leu-thiamine
プレートに塗り広げて、一日 incubate。）- mid-exponential phase まで培養。細胞数をカウント。107 細胞を遠心で集めて、500 l EMM2 で２回洗う。1ml EMM2 に細胞を resuspend する。
- 50 ml tube に 5 ml の EMM2-leu-thiamine と 100 l 分の細胞(106 cells)を加える。（2 x 105 cells/ml となる）。
- 30℃で 24 hr 培養する。
- 細胞を集めて、氷冷した 1 ml H2O で洗う。
- 100 l H2O に resuspend して、５分間 boil.
- Glass beads で破壊して、SDS-PAGE 用のサンプルを作る。（SDS-PAGE/Blot の項を参照）。
- 抗 Hisx6 抗体や抗 myc 抗体(pREP41HM 等の場合)を用いて、immunoblot で発現をチェック。
2.2 大量培養- 500 ml EMM2-leu/2L flask, １〜４本準備する。
- EMM2-leu+thiamine で前培養した細胞(500 ml あたり 108 cells 必要)を EMM2 で洗い、2 x105 cells/ml でinnoculate.
- 30℃, 225rpm, 24 hr 培養。
- 集菌。4,000rpm x 20 min.
- 10 ml の氷冷した STOP buffer (40 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM EGTA, 50 mM NaF, 1 mM NaN3,pH8.0)を加え、resuspend。
- 50 ml tube に移して遠心。3,500 rpm x 5 min.
- 上清を捨てて、もう一度遠心。3,500 rpm x 2 min.
- 細胞の重さを量る。

- 液体窒素中で細胞を凍結。-150℃保存。
2.3 CRYOPRESS による細胞破壊- 氷上で凍結細胞を溶かす(CRYOPRESS 一回あたり 1g 以下の細胞を使う)。
- 5 ml の TN buffer (40 mM Tris-HCl (pH8), 0.5M NaCl, 10% glycerol) + PI(Roche)* + PI (X)**を加え、resuspend。 * Protease Inhibitor cocktail (Complete-EDTA free). **chymostatin, pepstatin, leupeptin 10
mg/ml in DMSO, 1/1,000 添加。
- 遠心。3,500 rpm x 5 min.
- 上清を捨てて、遠心。35,000 rpm x 2 min.
- 液体窒素中で凍結。
- CRYOPRESS の最も大きいサンプルセルの中に凍結細胞を入れて、破壊 (30sec x 5 回)。破壊の程度を顕微鏡でチェック。
- 2 ml tube へ凍結破壊細胞を移す。
2.4 タンパク質の精製- 1 g cells あたり 4 ml of TN (+ PI)に溶かす。2 ml tube を２本使う。
- cfg. 15,000 rpm x 15 min.
- sup に 0.02 % NP-40 と 40 mM imidazole (pH8)を加える。
- TN + PI + NP-40 + 40 mM imidazole で平衡化した Nickel ProBond resin (100-150 l/tube)に sup を加え、懸濁。
- rotator で tube を回しながら 1 hr 懸濁、4C。
- 1.6 ml の TN + 40 mM imidazole+ PI(X)で 2 回洗う(4,000rpm, flash)。
- ２本の tube の resin を一本にまとめて、更に２回洗う。
- resin の２倍量の Elution buffer (TN + 300 mM imidazole + PI(X))を加えて混ぜる。５分間懸濁。
- 遠心。4,000 rpm, flash. Sup を回収(S1)。
- resin の２倍量の Elution buffer を再度加えて混ぜる。５分間懸濁。
- 遠心。4,000 rpm, flash. Sup を回収(S2)。
- タンパク濃度を測る。
- 必要があれば、透析。
- 分注して、液体窒素中で凍結。-80, or –150℃で保存。