称号及び氏名

博士(農学) 藤原

学位授与の日付

平成 1９年３月３１日

論「Studies on Substrate Specificity of Fructosyl-Amino Acid

文

名真紀

Oxidases（糖化アミノ酸オキシダーゼの基質特異性に関する研究）」
論文審査委員

主査

川口剛司

副査

川崎東彦

副査

宮武和孝

副査

炭谷順一

論文要旨
緒論
糖尿病は慢性の高血糖状態で、その治療には血糖コントロールが重要である。現在、糖尿病の診断方法として最も一般的なものは、グルコースオキシダーゼ法 (GOD 法) による尿糖試験紙・血糖値測定であるが、血糖値そのものは直前の食事内容に大きく影響されるため、測定する際には絶食等の食事調整が必要になる。糖尿病患者は血糖コントロールのために頻繁に血糖値を測定しなければならないが、上記のような測定法は、たびたび利用するには患者への負担が大きく、不向きである。そこで、食事等に影響されない指標として、ヘモグロビン A1c やフルクトサミンなどの血中の糖化タンパクの測定が行われている。糖化タンパクとは血中グルコース濃度に比例して、タンパクに非酵素的、不可逆的に糖が付加したもので、そのタンパクが分解されるまで糖を保持し続けるため、食事に左右されず、過去の血糖値を反映するよい指標となる。しかし、糖化タンパクの測定はその還元能を利用していたり、HPLC 法によっているため、それぞれ、特異性が低い、高価な機器が必要で、しかも多サンプルの処理には向かない等の欠点を持つ。これら既存の測定法の問題点を克服する方法として、特異性が高く、且つ安価な酵素を用いた測定法が考えられる。糖化タンパクを特異的に脱糖化し、H2O2 を生成するオキシダーゼを用いれば、peroxidase 法等、既存の H2O2 定量法を利用して糖化タンパクを特異的に測定することができる。このような背景から多くの糖化アミノ酸オキシダーゼ (FOD) が主に糸状菌より単離された。血中の主な糖化タンパクとして Fructosyl lysine (FK) を持つ糖化アルブミンと、Fructosyl valine (FV) を持つヘモグロビン A1c が挙げられるが、糸状菌由来の FOD は多くの場合、FK のモデル化合物である Nε-fructosyl-Nα-Z-lysine (FZK) と FV の両方に作用する。

そこで、FOD の遺伝子に変異を導入し、FK (FZK)、FV のどちらか一方にのみ作用する変異酵素を作製し、特異性の高い臨床診断薬として応用すると共に、FOD の基質特異性に関して分子レベルでの知見を得ることを目的として本研究を行った。
第一章

Fusarium oxysporum 由来糖化アミノ酸オキシダーゼ (FOD-F) の基質特異性の改変FOD-F 遺伝子への変異導入およびスクリーニング
dNTP の濃度にバイアスをかけ、且つ、Mn2+ を共存させることで Taq polymerase に塩基の取り込みミスを誘発させた PCR にて FOD-F 遺伝子に変異を導入し、増幅した断片を発現ベクターに挿入、大腸菌を形質転換することで変異ライブラリーを作製した。この内、12,922 株を発色プレート上での 1st スクリーニングに供し、有望と思われる 164 株を取得した。この 314 株から無細胞抽出液を調製し、タイタープレート上での 2nd スクリーニングに供したところ、FV にほとんど反応しない 1 株が得られた。塩基配列を調べたところ、導入された変異は T885A と A1118G の 2 ヶ所であり、アミノ酸レベルでは K373R の 1 ヶ所で、このリジンからアルギニンへの置換のみで FV にほとんど作用しなくなることがわかった。
Lys-373 置換体の作製と精製
上記スクリーニングに用いたランダム変異はランダムとはいうものの置換されやすい塩基には偏りがあり、得られた置換アミノ酸が最も基質特異性に影響を与えるアミノ酸とは限らない。そこで、最適置換アミノ酸を調べるために、Lys-373 部位が全てのアミノ酸に置換しうる mix primer を用いて Lys-373 部位に部位特異的ランダム変異を導入した。変異体
200 株から K373R 株と同等か、それ以上に FV に対する活性を失ったと思われる 34 株が得られ、置換アミノ酸を調べたところ、置換アミノ酸は 9 種類に集約されたが、置換されたアミノ酸に共通する特徴は見出せなかった。
作製した変異酵素のうち、粗酵素液の性質から、トリプトファン、メチオニン、スレオニン、バリン、アルギニン置換体について注目し、さらに詳しい性質を調べるためにこれ ら の 精 製 を 行 っ た 。 培 養 液 4 liter か ら 菌 体 を 回 収 し 、 無 細 胞 抽 出 液 を 調 製 後 、DEAE-TOYOPEARL、Phenyl-TOYOPEARL に供することで、電気泳動的に均一な標品を得ることができた。比活性は約 25～45 倍に上昇し、回収率は 14～60 % であった。
変異酵素の諸性質
精製酵素を用いて kinetic パラメータを算出したところ、変異酵素の場合、基質が FZKの場合は Km 値が、FV の場合は Km 値と kcat 値が大きく変化していた。その結果、変異酵素は FV に対する活性をほとんど示さず、FZK に対する特異性が著しく上昇していた。
また、様々な金属イオンの存在下で酵素活性を測定したところ、Ca2+、Mn2+、Mg2+ 存在下で、変異酵素で活性の著しい増大が見られ、特に FV に対する活性は数十倍に上昇した。
そこで、Mg2+ 存在下で kinetic パラメータの測定を行ったところ、K373W では基質が FZKの場合、Km 値が大きく変化することで反応性が回復し、wild type に近づいていた。一方、基質が FV の場合には kcat 値が大きく上昇することで反応性が回復するものの、依然 wildtype との差は大きく、両基質間の比は wild type とは大きく異なったままであった。次に、糖化アルブミンの測定を想定して、臨床濃度での活性測定を行ったところ、変異酵素ではFV に対する有意な活性を検出することはできなかった。また、Mg2+ を添加することで、

wild type 並みの酵素使用量で FZK のみを検出することができた。
変異酵素の基質特異性と基質の構造得られた変異酵素は FZK より FV に対する活性が低下していたが、両基質の構造の違いから基質のカルボキシル基の位置に注目した。切断点からのカルボキシル基の位置が異なる 3 種類の基質を新たに合成し、それぞれに対する kineteic パラメータを求めた。wild
type の反応性に対する K373W の反応性を調べたところ、カルボキシル基が基質の切断部位に近接する FV、Fructosyl alanine ほど、変異導入によって大きく活性が失われ、カルボキシル基が切断部位から離れる FZK、ε-Fructosyl-aminocaproic acid では失われる活性は相対的に少なかった。
Lys-373 の役割
本 FOD-F を含め、現在までに報告されている糸状菌由来糖化アミノ酸オキシダーゼには、C 末端側にサルコシンオキシダーゼとの有意な相同性が見られ、今回変異の導入された Lys-373 部位も多くの FOD、サルコシンオキシダーゼ間で保存されている。このうち、Bacillus sp. B-0618 株由来のサルコシンオキシダーゼは、その基質アナログ、ジメチルグリシンを用いた X 線結晶解析が行われており、Lys-373 に相当するリジン残基はジメチルグリシンのカルボキシル基と結合している。FV とジメチルグリシンは切断点からのカルボキシル基の位置が等しく、FOD-F における Lys-373 は FV のカルボキシル基と結合している可能性が示唆された。
第二章

Ulocladium sp. JS-103 由来糖化アミノ酸オキシダーゼ (FOD-U) の基質特異性の改変
第一章にて FZK への特異性を高めた変異 FOD-F を取得することができたが、そのスクリーニング過程において、FZK より FV に対して高い活性を示す変異酵素はほとんど取得することができなかった。そこで FZK より FV に対して高い活性を示す FOD-U に変異を導入することで、FV 特異的な変異酵素を取得することを試みた。第一章と同様の方法
で FOD-U 遺伝子にランダム変異を導入し、スクリーニングを行ったところ、1 株の有望株が得られた。塩基配列を調べたところ、アミノ酸レベルでは 4 ヶ所の変異が導入されていることがわかった。そこでそれぞれのシングルミュータントを作製し、その活性を調べたところ、R94W の 1 ヶ所の変異のみで FZK に対する活性が著しく低下することがわかった。Arg-94 部位に部位特異的にランダム変異を導入し、スクリーニングを行うことで新たにフェニルアラニン、ロイシン置換体を取得し、トリプトファン置換体と共に精製、諸性質の検討を行った。精製酵素を用いて kinetic パラメータを算出したところ、FV に対して最も高い特異性を示したのはトリプトファン置換体で、wild type の 14 倍であった。
総括
本研究ではランダム変異を導入することで、FZK、FV に対する特異性を高めた変異FOD を作製した。これら変異 FOD は糖化アルブミンやヘモグロビン A1c などの糖化タンパクの簡便且つ迅速な測定法の開発に役立つものと考えられる。

審査結果の要旨
現在、糖尿病の診断方法として最も一般的なものは、グルコースオキシダーゼ法による血糖値測定である。この測定法では、直前の食事内容の影響が大きいため、測定する際には絶食等の食事調整が必要になり、頻繁に血糖値を測定しなければ ならない糖尿病患者には重い負担となる。そこで、食事等に影響されない指標として 、ヘ モ グ ロ ビ ン A 1c や フ ル ク ト サ ミ ン な ど の 血 中 の 糖 化 タ ン パ ク の 測 定 が 行 わ れ て いる。糖化タンパクとは血中グルコース濃度に依存して、タンパクに非酵素的、不可逆的に糖が付加したもので、そのタンパクが分解されるまで糖を保持し続けるため 、食事に左右されず、過去の血糖値を反映するよい指標となる。しかし、現状の糖化タンパクの測定法は、特異性が低い、高価な機器が必要、多サンプルの検定には向かない等の欠点を持つため，新たな簡便で安価な測定法の開発が求められている。
糖化アミノ酸オキシダーゼは、糖化アミノ酸を特異的に脱糖化し、その際 H 2 O 2 を生成する酵素であり、糖化アミノ酸をタンパクから遊離させるためにプロテアー ゼを併用することで、既存のH 2 O 2 の 定量法を利用した測定が可能となる。このよう な
背 景 か ら 多 く の 糖 化 ア ミ ノ 酸 オ キ シ ダ ー ゼ （FOD） が 主 に 糸 状 菌 よ り 単 離 さ れ た 。
血中の主な糖化タンパクとしてFructosyl lysine（FK）を持つ糖化アルブミンと 、Fructosyl valine（FV）を持つヘモグロビンA 1c が挙げられるが、糸状菌由来のFOD
は 多 く の 場 合 FKの モ デ ル 化 合 物 で あ る N ε -Fructosyl- N α -Z-lysine（ FZK） と FVの両方に作用する。本研究では、FODの遺伝子に変異を導入し、FK（FZK）、FVのどちらか一方にのみ高い特異性を有する変異酵素を作製し、臨床診断酵素として応 用すると共に、FODの基質特異性に関して分子レベルでの知見を得ることを目的と して行われたものである。
前半では、Fusarium oxysporum 由来糖化アミノ酸オキシダーゼ（FOD-F）の基質特異性の改変が試みられた。エラープローン PCR 法 により FOD-F 遺伝子にランダムに変異を導入し、大腸菌を用いて発現変異ライブラリーを構築した。そこか ら
2 回のスクリーニングを経て、FV にはほとんど活性を示さない変異酵素を取得す ることに成功した。その変異遺伝子の塩基配列を調べたところ、導入された変異は
T885A と A1118G の２ ヶ所であり、アミノ酸レベルでは K373R の１ヶ所である こと が 分 か っ た 。 さ ら に 、 こ の 位 置 で の 最 適 置 換 ア ミ ノ 酸 を 調 べ る た め に 、 Lys-373
部位が全てのアミノ酸に置換しうる mix primer を用いて部位特異的ランダム変 異を導入した。変異体 200 株から K373R 株 と同等か、それ以上に FV に対する活性を失ったと思われる 34 株が得られ、置換アミノ酸を調べたところ、置換アミノ 酸は 9 種類に集約された。
次 に 、 作 製 し た 変 異 酵 素 の う ち 、 特 に 特 異 性 の 高 か っ た Trp、 Met、 Thr、 Val、Arg置 換 体 に 注 目 し 、 詳 し い 性 質 を 調 べ る た め に こ れ ら の 精 製 を 行 い 、 電 気 泳 動 的に均一な精製酵素を得た。それぞれのkineticパラメータから、変異酵素の場合FZKに対しては K m 値が、FVに対しては K m 値と k cat 値が大きく変化していた。その結果として、変異酵素はFVに対する活性をほとんど示さず、FZKに対する特異性が 著しく上昇していた。また、様々な金属イオンの存在下で酵素活性を測定したところ 、Ca 2+ 、Mn 2+ 、Mg 2+ 存 在下で、変異酵素で活性の著しい上昇が見られ、特にFVに 対する活性は数十倍に上昇した。そこで、Mg 2+ 存在下でkineticパラメータの測定を 行っ た と こ ろ 、 K373Wで は FZKに 対 し て の K m 値 が 大 き く 変 化 す る こ と で 反 応 性 が 回復し、wild typeの比活性に近づいていた。一方、基質がFVの場合には k cat 値が大きく上昇することで反応性が回復するものの、依然 wild typeとの差は大きく、両基 質間の比はwild typeとは大きく異なったままであった。糖化アルブミンの測定を想 定して、臨床濃度範囲での活性測定を行ったところ、変異酵素では FVに対する有意な活 性 を 検 出 す る こ と は で き な か っ た 。 ま た 、 Mg 2+ 存 在 下 で も FVは 検 出 限 界 以 下 であり、wild type並みの酵素使用量でFZKのみを検出することが可能であったこと から、臨床診断用酵素として応用できる可能性が示された。
変異酵素が FZK より FV に対する活性が大きく低下した理由について、両基質のカルボキシル基の位置の違いに着目した。酵素による切断点からのカルボキシル 基の距離が異なる 3 種の基質を新たに合成し，それぞれに対する wild type と K373Wの kinetic パラメータを求めた。その結果、切断点からのカルボキシル基の距離 が近いほど変異導入によって大きく活性が失われ、遠いほど影響が少なかった。こ のことから、この変異を導入された Lys-373 の役割に関して、FOD-F と相同性があり既に基質アナログであるジメチルグリシンとの複合体の X 線結晶解析が行われ ているサルコシンオキシダーゼと比較することによって考察した。その結果、Lys-373は FV のカルボキシル基と結合している可能性が示された。
後半では、FOD-F 変異体とは逆に FZK より FV に特異的な FOD を作出することを試みた。ももともと FZK より FV に対して高い活性を示す Ulocladium sp. JS-103
由来の糖化アミノ酸オキシダーゼ（FOD-U）を対象として、前述と同様の方法で 目的の変異 FOD-U を取得し、FZK に対する活性の低下は R94W の１ヶ所のアミノ酸置換によることが明らかとなった。さらに、Arg-94 に部位特異的ランダム変異を 導入しスクリーニングを行うことによって、新たに同様に FZK に対する活性が特 異的に低下した Phe，Leu 置換体を取得した。Trp 置換体と共に精製、諸性質の検 討を行い、それぞれの kinetic パラメータを求めたところ、FV に最も高い特異性を 示したものは Trp 置換体でその FV に対する活性は wild type の 14 倍であった。
以上のように、本研究で作出された特異性の高い糖化アミノ酸オキシダーゼ変異酵素は、試料を適切に処理することによって糖化タンパク特異的に定量すること が可能であり、臨床診断用酵素として応用できる可能性が示された。
以上の成果は、応用微生物学、酵素化学、応用分子生物学の分野だけでなく、臨床診断といった応用分野に大きく貢献するものであり、本論文の審査ならびに最 終試験の結果とあわせて、博士（農学）の学位を授与することを適当と認める。