生産と技術

第60巻第２号（2008）

共鳴ラマン分光法によるヘムタンパク質の構造解析
宇 野 公 之＊

技術解説

Structure Analysis of Heme Proteins by Resonance Raman Spectroscopy
Key Words： Resonance Raman Effect, Heme Protein, Active Site

1．はじめに現象がラマン効果であり、レイリー散乱とラマン散

1928 年に C. V. Ramanらがラマン効果を報告 1)し乱の差（＝シフト）を測定すればν1 が得られるこて以来、ラマン分光法は様々な分子の構造解析に適とになる。励起光ν0 を分子の電子吸収帯（いわゆ用されてきた。ラマン効果とは、分子に光を照射しる紫外可視吸収帯）に合わせるとラマン散乱光は著た際に、散乱される光のエネルギーが分子の振動エしく増大し（共鳴ラマン効果）、通常 104〜106 程度にネルギー分だけずれる現象である。したがって、散スペクトルが増強される。したがって、特定の発色乱光のスペクトルを調べれば、分子の振動エネルギ団に共鳴するように励起波長を選べば、得られるスーに関する情報が得られる。振動スペクトルは分子ペクトルには実質上その発色団に由来する振動ピー構造の微小な変化に敏感であるため、その解析からクのみが観測される。

分子の電子状態やコンフォメーションの変化を検出することができる。同様の情報は赤外吸収（IR ）ス

ラマン効果はきわめて微弱な現象であり、その量子収率は 10 -14 〜 10 -10 程度であるため、わずかなケペクトルからも得られるが、後述するように生体試イ光性不純物（通常量子収率は 10 -1 程度）の混入に料の解析にはラマン分光法が圧倒的に有利である。

より測定が著しく妨害される。また、微弱な信号をさらに、共鳴ラマン分光法を利用することにより、検出する一方でわずかなピークの変化を観測するた

微量生体試料中に含まれる特定の分子団に関する有め、測定には高感度かつ高分解能の装置が必要とな用な構造情報が得られる。本稿では特にヘムタンパる。そのため、ラマン分光計は高額なものとなってク質の構造解析に絞り、共鳴ラマン分光法についてしまい、ラマン分光法の普及にとって大きな障害と概説する。

なっていた。
しかし、ラマン分光法には以上の短所を補ってあ2．共鳴ラマン分光法

まりある長所がある。たとえば、もうひとつの振動振動数ν1で振動している分子に振動数ν0 の光を分光法である IR では分子の振動数ν1 に相当する光照射すると、入射光と同じ振動数ν0 の光（レイリ（赤外光）の吸収を直接観測するのに対し、ラマンー散乱）に加えて、ν0 ±ν1という分子固有の振動分光法では通常可視域の光を用いてν0 -ν1 を観測し、数ν1を含む光（ラマン散乱）が観測される。この間接的にν1 を測定する。したがって、IR で使用される KBr 等の高価なセルを必要とせず、可視光が＊Tadayuki UNO

1958年1月生
東京大学大学院薬学系研究科・博士課程修了（1986年）
現在．大阪大学大学院 薬学研究科 分子反応解析学分野 教授 薬学博士 生
物分析化学、生物物理化学
TEL：06-6879-8205
FAX：06-6879-8209
E-mail：unot@phs.osaka-u.ac.jp

通る安価なガラスセルを利用できる。また、選択律の違いにより、ラマンスペクトルでは IR に比べて水の変角振動モード（1650 cm - 1 付近）が弱いため、水溶媒が測定上の妨害にならない。一方、通常ラマン散乱の励起にはレーザーが用いられるが、そのビーム幅だけの微量試料（数μL 程度）で測定が可能である。さらに、共鳴ラマン効果を利用すれば、μMオーダーの希薄試料で測定が可能になるとともに、複雑な分子中に含まれる特定の分子発色団の振動情− 27 −

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報を選択的に得ることができる。以上の利点は、貴ィリン環は芳香族性を示して平面構造をとり、中心重な生体高分子を測定する際にきわめて有利であり、には鉄がキレートされている。鉄は通常２価（還元特にヘムタンパク質を研究する上で共鳴ラマン分光型）あるいは３価（酸化型）が安定であり、それぞ法は必要不可欠のものとなっている。

れ３d 軌道に６個あるいは５個の電子を持つ。３d軌道は５つの軌道からなるが、ピロール窒素及びヘ3．ヘムタンパク質

ム面上下の軸配位子により縮退が解け、図２に示しヘムタンパク質とは、活性中心に鉄ポルフィリンたようなエネルギーレベルに分裂する。これらの軌錯体（ヘム）を含むタンパク質の総称である。図１

道に６個あるいは５個の電子をつめる場合、通常そに代表的なヘムであるヘムb の構造を示す。ポルフれぞれ２通りの方法が可能である。電子が各軌道へばらばらに入ってスピン量子数 S が大きくなる場合を高スピン状態（hs）、できるだけ対を作って S が小さくなるように入る場合を低スピン状態（ls）とよぶ。これらの電子のつまり方は軸配位子の種類と数によって決まる。すなわち、強い配位子場を持つ共有結合性の配位子が軸配位子となる場合には低スピン状態となり、弱い配位子場を持つイオン結合性の軸配位子の場合には高スピン状態となる。また、軸配位子が１つの場合（５配位状態）には、通常高図１

ヘム b の構造スピン状態となる。
以上のように、ヘム鉄は軸配位子によってさまざまな状態をとりうるが、これはヘムタンパク質の機能にとってきわめて重要である。たとえば、シトクロム c はミトコンドリア呼吸鎖を構成するヘムタンパク質であるが、シトクロム bc1 複合体とシトクロム c 酸化酵素との間の電子授受を媒介する。このような電子キャリアータンパク質のヘムは多くの場合

図２3d軌道の分裂と電子配置６配位型となっており、シトクロムcでは His とMe tの側鎖がヘム鉄に軸配位している（図３a ）。
このような２つの強い配位子の結合はヘム鉄の酸化還元電位を変化させ、電子の出入りを容易にするとともに、還元型ヘム鉄に高い親和性を持つ酸素等の配位を阻害している。すなわち、酸素が配位しうる配位座を占有しておくことにより、酸素がヘム鉄を酸化（＝ヘム鉄が酸素を還元）してしまうのを防ぐことができる。
逆に、酸素運搬・貯蔵機能を担うヘモグロビンやミオグロビンでは、酸素が結合しやすいように第６配位座が空位となった５配位型ヘムを含んでいる。
さらに、還元型ヘム鉄が酸素により酸化されないよう、結合酸素のそばに位置する His 残基（遠位 His ）が酸素へ水素結合を形成している（図３b）。
一方、ミオグロビンと同じく His を軸配位子とし図３

ヘム周辺構造て持つペルオキシダーゼは、酸素の O-O 結合を活− 28 −

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性化し、その酸化当量を用いて種々の基質を酸化すつ。特に、面内振動モードにはラマン活性な 35 種

る。本酵素は H2O2 の O-O 結合をヘテロに解裂させ、（ 9A1g + 9B1g + 8A2g + 9B2g ）と IR 活性な 18 種

自身のヘム鉄が形式上の酸化数５価（複合体 I ）次（Eu）が存在する2)。実際にはビニル基やプロピオいで４価（複合体 II ）という高酸化状態を経て３価ン酸基等の側鎖置換基が存在するためにヘムの対称へと戻る間に基質を２電子当量分酸化する。このヘ性は低下し、Eu モードも弱く観測されうる。

テロ解裂には、軸配位子 His（近位 His ）と近傍の酸

一方、ヘムπ電子の最高被占軌道（HOMO）は性 Asp 残基、及び遠位側の塩基性残基（His、Arg）

a1u と a2u からなり、これらは軌道の形が異なるにもが関与している（図３c）。すなわち、負電荷を持つかかわらずエネルギーがほぼ等しいという特徴を持Asp 残基が近位 His の NH プロトンと強く水素結合つ（偶然の縮退）。また、最低空軌道（LUMO）はすることにより His を負に帯電させる。その結果、二重に縮退した eg＊である。したがって、π電子のHis からヘム鉄への電子供与が促進されてヘム鉄の遷移（π→π＊）として a1u → eg＊ と a2u → eg＊ の２

酸化還元電位は低下し、高酸化状態が安定化する。

つが可能であるが、両者はエネルギーが近いために一方遠位側では正電荷を帯びた塩基性残基が結合酸相互作用し、よりエネルギーの大きな遷移と小さな素へと水素結合し、酸素の分極を促進することによ遷移が観測される。前者は 400 nm 付近に現れてＢり O-O 結合をヘテロに解裂させる。このような近帯（あるいは Soret 帯）と呼ばれるのに対し、後者位側からの電子 push 効果と遠位側の電子 pull 効果は 550 nm 付近に現れてＱ帯と呼ばれる。
ヘムタンパク質の共鳴ラマン散乱を励起するためによって酸素が活性化されると考えられている。
近位側からの電子供与は酸素の活性化に必須と考には、これらの電子吸収帯に共鳴する波長を選ぶ。

えられ、His 以外の軸配位子でも可能である。たとアルゴンイオンレーザー（発振波長 515、488 nm 等）

えば、ヒト肝に含まれる薬物代謝酵素シトクロムや固体グリーンレーザー（532 nm ）を用いればＱ帯

P450（CYP）では、ヘム鉄の軸配位子はCysのチオで、クリプトンイオンレーザー（発振波長 407、レート基となっている（図３d）。本酵素は結合酸素413 nm 等）や He-Cd レーザー（442 nm ）を用いれを活性化してヘテロ解裂させ、酸素１原子分を基質

ばＢ帯で励起できる。後者では、ラマン活性なモーに導入する。その高酸化状態の構造は未だ不明であドの中でも特に A1g（全対称伸縮振動）に属するもるものの、Cys からの電子供与がきわめて重要であのが強く観測される。また、Ｑ帯に比べてＢ帯のると考えられている。さらに、H2O2 を水と分子状方が数倍大きなモル吸光係数を示すので、共鳴効果

酸素に不均一化するカタラーゼでは軸配位子が Tyrも大きい。
振動モードのうち、1300 〜1700 cm-1 の領域にはのフェノレート基となっている（図３e）。
以上のように、ヘムタンパク質は共通のヘムを含共役結合の面内伸縮振動がいくつか観測される。

みながらも多様な機能を発現しており、それらはヘ1970 年代の半ばから1980 年代初期にかけてヘムタ

ム鉄の近位側軸配位子と、ヘムをはさんで反対側のンパク質の共鳴ラマンスペクトルが精力的に研究さ遠位側アミノ酸環境によって制御されている。したれ、ヘムの構造と相関するピークが見出された（表１）。たとえば、1360 cm - 1 付近に強く出現するν4がって、ヘムタンパク質の機能を理解する上で、これらの構造的性質を明らかにすることはきわめて重要となる。そのための手法として共鳴ラマン法は最適であり、以下で実例とともに解析法を紹介する。
4．面内伸縮振動
前述のように、ヘムの骨格はπ電子共役系を持つため平面構造となり、ヘム鉄を通ってヘム面に垂直な４回回転軸を持つ正方形（D4h 対称性）に近似できる。対称中心を持つため、IR 活性な振動モードとラマン活性な振動モードとの間に交互禁制が成り立− 29 −表１ヘム鉄の構造マーカーバンド（cm-1）

酸化状態

FeII

FeII

FeIII

FeIII

FeIII

FeIV

スピン状態高低高高低低

配位子数566566

ν37 (Cβ-Cβ)ν2 (Cβ-Cβ)ν38 (Cα-Cm)ν3 (Cα-Cm)ν4 (Cα-N)

1585

1605

1580

1590

1600

1605

1560

1585

1560

1570

1580

1585

1520

1560

1520

1535

1555

1565

1470

1495

1480

1495

1505

1510

1360

1360

1375

1375

1375

1380

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モード（ A 1g ）は主としてピロール環の N- Cα伸縮振動に帰属されるが、その波数は鉄が２価の時1355 〜 1360 cm -1に、３価の時 1370 〜1375 cm -1に、４価の複合体 IIでは〜1380 cm -1 となる。このように、

ν4 モードの波数はヘム鉄の酸化数を反映することから、酸化還元マーカーバンドとよばれている。鉄の価数の変化はそれに配位するピロール窒素の電子状態に大きく影響し、N- Cα結合に違いをもたらすためにこのような波数変化が生ずると考えられる。
一方、1500 cm - 1 付近のν3（A 1g）や1570 cm - 1付
近のν2 モード（A 1g）はヘム鉄の酸化還元状態やスピン状態、配位子数を反映して変化する。ν37 、

ν38 モード（Eu）を含め、これらのピークはヘム鉄の状態に応じて平行移動する。ν2、ν37 は主としてピロール環の Cβ- Cβ 伸縮振動に、ν3、ν38 は主

図４

還元型ミオグロビンの共鳴ラマンスペクトル（407 nm励起）としてピロール環とメチン炭素の Cα- Cm 伸縮振動に帰属されるが、これらの波数変化は主にヘム骨格5．第５配位子伸縮振動の中心コアサイズに起因するものと考えられている。

特にＢ帯で励起した場合、前述の面内伸縮振動にすなわち、ヘム鉄が低スピン状態をとるとき、その加えて軸配位子に由来する振動ピークが観測される

イオン半径は 2.00 Å 程度であるが、高スピン状態場合がある。最初に見出されたのは鉄２価５配位状になると 2.07 Å 程度に大きくなるため、ヘムコア態における FeII-His 伸縮振動である3)。たとえば、酸素キャリアータンパク質では 220 cm -1 付近の低波は押し広げられる。その結果、骨格を形成する化学する。また、高スピン状態となったヘム鉄は、５配数領域に観測されるのに対して、ペルオキシダーゼ
では 240 cm - 1 付近に出現する。この結果は、後者位型では軸配位子に引っ張られて面外へ逃げるため、において His からヘム鉄への強い電子供与が起こっヘムコアの拡張は緩和される。その一方で、６配位ていることを示し、先述の電子 push 効果によって高スピン状態ではヘム鉄は第６配位子によって面内酸素が活性化されるという根拠になっている。

結合は引き延ばされて弱くなるため、低波数シフト図５にミオグロビンとインドールアミン二原子酸へ引き戻されるため、コアは相対的に拡張される。
このようなわずか 0.1 Å 程度の構造変化を鋭敏に検

素添加酵素（IDO）の共鳴ラマンスペクトルを示す。

出できるのがラマン分光のひとつの利点である。

ミオグロビンでは FeII-His 伸縮振動が 221 cm -1 に出現しているのに対し、IDO では 233 cm - 1 に観測さ図４に還元型ミオグロビンの共鳴ラマンスペクトル（ 407 nm 励起）を示す。ν4 が 1357 cm - 1 に観測れている。この結果は、IDO ではミオグロビンとされていることから、２価のヘム鉄を含むことがわペルオキシダーゼの中間的な電子供与が起こっていかる。また、ν2、ν38、ν3 がそれぞれ 1565、1525、1473 cm -1 に観測されていることから、ヘム鉄は５ることを示す。前述のように、ミオグロビンは酸素分子保持のため酸素を活性化しない方が好ましいの配位高スピン状態にあることがわかる。ESR を用に対して、ペルオキシダーゼは O-O 結合をヘテロいることにより酸化型ヘム鉄のスピン状態を直接観解裂させる。一方 IDO は酸素分子をそのまま基質測することが可能であるが、この手法では通常試料トリプトファンに添加する酵素であり、O-O 結合をを液体ヘリウム温度程度まで冷却しなければならな解裂させないまま活性化しなければならない。そのい。また、還元型ヘム鉄は事実上 ESR 不活性である。

性質が中間的な電子供与性となって現れていると考したがって、室温付近の生理的条件下における構造えられる。

を調べるには、共鳴ラマン法の方が有利となる。

酸化型のヘムにおいても、５配位状態においてFe III - 軸配位子伸縮振動に帰属されるラマン線が検− 30 −

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振動は通常 570 cm - 1 付近に観測され、ヘムタンパク質の種類が異なってもあまり大きな差を生じない。
しかしながら、CYP ではチオレートアニオンの強い電子供与性により FeII-O2 伸縮振動が 540 cm -1 付
近へと大きく低波数シフトする8)。また、興味深いことに CYP では結合酸素由来の O-O 伸縮振動も1140 cm - 1 付近に観測される9)。この振動モードは通常共鳴ラマン法では観測されず、IR によって測定されている。IR により観測されたミオグロビンやヘモグロビンの O-O 伸縮振動は 1150 cm -1 付近となり、CYP より高波数である。このことは、CYP
では O-O 結合が相対的に弱くなり、切れやすくなっていることを示している。いずれにしてもこれらの波数は O2 の O=O 伸縮振動（1551 cm -1 ）とH2O2
図５の O-O 伸縮振動（877 cm -1 ）との中間になり、O2-･（1145 cm - 1 ）に近い。したがって、ヘムに配位し還元型ミオグロビンとIDOの共鳴ラマンスペクトル（407 nm励起）

た酸素はスーパーオキシドと近い電子配置をとって出されている。たとえば、CYP ではヘム鉄の第５いることがわかる。

配位子が Cys 由来のチオレート基であり、390 nm

酸素を結合したヘムは不安定な場合が多いのに対付近にＢ帯の吸収極大を示す。これの短波長側 364nm で励起すると Fe III-Cys 伸縮振動が 351 cm - 1 にし、酸素と同様な２原子分子である一酸化炭素（CO）は還元型ヘム鉄に高い親和性を持つため、観測される4) が、長波長側の 407 nm 励起ではヘム安定な複合体を形成する。さらに好ましいことに、の面内振動ピークに埋もれてうまく観測できない。
一方、FeIII - Tyr 伸縮振動はＱ帯励起で 600 cm -1 付近

CO は共鳴ラマン法によって「見える」配位子であり、Ｂ帯励起により FeII - CO 伸縮振動や FeII - C - O 変角に観測される5) が、Ｂ帯励起でも検出できる6) こと振動、さらには配位 CO 由来の C-O 伸縮振動が観測がモデル錯体を用いて示されている。このように、される。これら振動モードの波数には相関があり、共鳴ラマン法では励起波長の選択がきわめて重要でFeII - CO 伸縮振動数が高いほどFeII - C - O 変角振動数あり、共鳴条件をうまく見つけることにより、あらは高く、C-O 伸縮振動数は低くなる10)。また、FeII -たな構造情報を引き出せる可能性がある。

O 2 伸縮振動とは異なり、Fe II - CO 伸縮振動は COの周りの環境によって大きく波数シフトする。すな6．第６配位子伸縮振動

わち、CO のそばに塩基性のアミノ酸が存在するとヘムタンパク質には基質として酸素を用いるもの

FeII - CO 伸縮振動は高波数側にシフトし、極性が低が多いため、酸素に由来する共鳴ラマンピークの検下すると低波数シフトする。さらに、C-O 伸縮振動

出は反応機構に関する直接的な証拠を与える。たとえば、Fe IV =O 伸縮振動（780 cm - 1 付近）、Fe III -数との相関関係はヘム鉄第５配位子の種類（Cys か、FeIII - OH 伸縮振動
OOH 伸縮振動（350 cm -1 付近）（490 cm -1 付近）といった酸素に由来するピークがHis か、あるいは水等の弱い配位子か）によって変わるため（図６）、それらの波数から逆に第５配位子のアミノ酸を同定することが可能になる11)。

酵素反応過程で観測されれば、これら中間状態を経

図７に、ヒト脳で発現するニューログロビンの由して反応が進行していることを証明できる7)。ただし、反応中間体は短寿命種である場合が多いため、

CO 結合型共鳴ラマンスペクトル12) を示す。FeII CO 伸縮振動に帰属されるラマン線が 521 cm - 1 とその観測には工夫が必要となる。

494 cm -1 に２本出現していることから、CO が存在

それに対し、反応の初発過程で形成されるFeII-O2結合については多くの研究報告がある。FeII-O2 伸縮しているヘムポケット内には２種類の状態があることがわかる。また、521 cm -1 の成分はミオグロビン− 31 −

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機能解析へと向かっている。21 世紀に入り、ヒトゲノム解析から次々に見出されてくる新規ヘムタンパク質が測定対象となってきており、共鳴ラマン分光法は今や円熟期を迎えていると思われる。
最近の各種光学技術の発展は、ラマン分光法にとって追い風となっている。たとえば近年、安価・小型・長寿命の半導体レーザーがラマン分光計に組み込まれつつある。発振波長が限られているため、共鳴ラマン分光法への利用は限定的ではあるが、従来用いられてきた高額・大型の水冷式ガスレーザーを駆逐していくと思われる。また、ラマン散乱測定上
図６

Fe-COとC-Oの波数相関の大きな障害となるレイリー散乱を効果的にカットするノッチフィルターが開発され、小型・高感度な分光計が現実のものとなっている。さらには、従来の光電子増倍管に代わり、CCD 検出器が普及してきた。広帯域のスペクトルが瞬時に得られ、積算も可能であるため、今や測定上必要不可欠の検出器となっている。これらの技術的発展は、従来検出できなかった短寿命分子種や１分子レベルでの計測を可能にしつつあり、ラマン分光法の新たな地平を開いていくものと期待される。
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7．おわりに共鳴ラマン分光法は、レーザーの発明を契機とし

７）Varotsis, C., Zhang, Y., Appelman, E. H., andて 1970 年代から急速に発展してきた。ヘムタンパ

Babcock, G. T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,

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検出を経て、90 年代以降はより測定が困難な短寿
命分子種の検出や、遺伝子工学の技術に支えられた９）Bangchaoenpaurpong, O., Rizos, A. K., Cham-− 32 −

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