ヒト特有の表皮セラミド合成経路および生理機能の解明
北海道大学大学院薬学研究院

大野祐介

The stratum corneum, which constitutes the outermost layer of the epidermis, consists of corneocytes and lipid lamellae.
The lipid lamellae, comprising a multi-layered lipid structure, are important for the skin permeability barrier that protects
against the invasion of pathogens and foreign substances and prevents water loss through the skin. Ceramides account for
approximately 50% of the lipid lamellae (by weight) and play a pivotal role in the skin permeability barrier function. Incontrast to most tissue, a variety of ceramides exist in the stratum corneum. Ceramides containing a 6-hydroxy long-chain
base (H-ceramides) are unique to the human stratum corneum and are the predominant ceramides. However, the biosynthetic
pathway and physiological function of H-ceramides remain unclear.
In this study, we demonstrated that H-ceramide production increases in a keratinocyte-differentiation-dependent manner,and treatment with ascorbic acid enhances its production. Meanwhile, treatments with cosmetic ingredients that haveantioxidant properties, such as kojic acid, coenzyme Q10, and astaxanthin, did not enhance the production of H-ceramides,indicating that antioxidative effects are not involved in the H-ceramide production. By comprehensive expression analysis
using RNA sequencing, we identified i) 1073 genes increased (≥2-folds) during keratinocyte differentiation, ii) 159 genes
increased (≥2-folds) by a treatment with ascorbic acid, and iii) 87 genes increased in both conditions. Among them, wecloned 16 genes and investigated their activity to produce H-ceramides by an overexpression assay using HEK 293Tcell. However, H-ceramides were not produced at least in our assay condition. Therefore, further analyses, including toestablishment in vitro and in vivo assay systems, are required to identify the gene responsible for H-ceramide synthesis. Ourfinding contributes to future studies identifying an H-ceramide synthase, elucidating the mechanisms of its production, anddeveloping novel cosmetic materials/products.

１．緒

我々のグループをはじめとする解析により，H セラミドは言

ヒトの角質層に特有であり，かつヒトの角質層では主要なセラミドは単一の分子の名称ではなく，長鎖アミノアルセラミドクラスであることが明らかとなった（図 1）3 , 4）。

コール（長鎖塩基）と脂肪酸がアミド結合した構造をもつ
1）セラミドは皮膚の透過性バリア機能の向上を目的として，脂質の総称である 。ヒトのセラミドは長鎖塩基および脂化粧品，美容液，ドリンク等様々なセラミド配合製品が市肪酸の構造（二重結合・水酸基の有無，位置）の違いによ販され，広く認知されるようになってきた。しかし，配合り 30 のセラミドクラス（遊離セラミド 25 クラス，結合型されているセラミドの殆どはヒトの角質層セラミドとは分セラミド 5 クラス）に分類され，各クラスには炭素鎖長の子種や組成が異なっており，セラミドによるバリア機能を異なるセラミド分子種が存在する。皮膚の最外層である表十分に発揮できていない可能性が高い。ヒト角質層セラミ

皮の角質層は，角質細胞および脂質ラメラと呼ばれる脂質ド組成を反映した製品開発の障壁となっていた主たる要因の多層構造体によって構成されており，脂質ラメラは皮膚として，ヒト角質層に存在する多様なセラミド分子種の存を介した生体内外の物質の透過（体外からの病原体・異物

在量・組成の詳細とその多様性を生み出す分子機構が不明の侵入，体内からの水分蒸散）を制限するバリアとして特であったことがあげられる。特に H セラミドはヒト角質層に重要である。セラミドは脂質ラメラの約 50 %（重量比）で最も多いセラミドクラスであるにもかかわらず，その発を占め，多くの組織とは異なり角質層には多様なセラミド

見から 30 年を経た現在においてもその合成経路および生分子種が存在することが知られていたが，各分子種の詳細理機能は依然不明である。そこで本研究では，H セラミドな存在量・組成比については不明な点が多く残されていの合成酵素を同定し，産生経路を解明することを目的とした。長鎖塩基の 6 位に水酸基をもつセラミド（H セラミド）た。

2）

は 1994 年にヒトの皮膚に存在することが明らかにされ ，

２．方法

2 . 1．細胞培養
Synthetic pathway and physiological
function of human-specific epidermal
ceramidesYusuke Ohno
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Hokkaido University

ヒト不死化ケラチノサイト（Evercyte，NHEK-SVTERT3-5）
は CnT-prime epithelial proliferation medium（CELLnTEC）を用いて培養することで増殖させた。細胞の分化は CnTprime epithelial 3 D barrier medium（CELLnTEC）を用いて培養することで誘導し，14 日間培養した。HEK 293 T− 97 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

図1

H セラミドの構造と角質層での存在比率

細胞は，10 % 仔ウシ血清，100 units/mL penicillin および物細胞発現用ベクター pCE puro 3 × FLAG- 1 にサブクロ

100 µg/mL streptomycin（Merck） を 含 む Dulbeccoʼsーニングした。

Modified Eagleʼs medium（D 6429；Merck）を用いて培養３．結した。遺伝子導入には Lipofectamine plus（Thermo Fisher

果3 . 1．アスコルビン酸による H セラミドの増加

Scientific）を用いた。

ケラチノサイトの分化時にアスコルビン酸を添加する

2 . 2．RNA シークエンスと H セラミドと予想されるセラミド量が増加することが分化させたヒト不死化ケラチノサイトより NucleoSpin

TLC を用いた解析により示唆されていた 5 , 6）。そこでまず，RNA（Takara）を用いて RNA の抽出を行った。NEBNext®

アスコルビン酸が H セラミド産生増加に関与することをPoly（A）mRNA Magnetic Isolation Module（New England

証明するため，アスコルビン酸存在下／非存在下においてBiolabs），NEBNext® UltraTM II Directional RNA Library

各日数分化させたケラチノサイトより脂質を抽出し，LC-Prep Kit（New England Biolabs）を 用 い て シ ー ケ ン ス

MS/MS により H セラミド量を定量した。その結果，分化ラ イ ブ ラ リ ー の 調 製 を 行 っ た。Illumina NovaSeq 6000

日数依存的に H セラミド量が増加し，アスコルビン酸非添（Illumina）を用いて測定を行い，両端 150 bp のペアエンド加群に比べ，添加群では顕著に増加した（図 2

リードでリード数 6 Gb のデータを取得した。データのク倍；10 日，7 . 1 倍；14 日，11 . 3 倍；21 日，6 . 7 倍）。

7 日，3 . 7

オリティチェック，トリミング，マッピング，リードカウン

アスコルビン酸は抗酸化物質，分化促進または水酸化ト，TPM の算出はそれぞれ FastQC（バージョン 0 . 11 . 7）
，酵素の補酵素として働くことが知られている 7 , 8）。そこで，

Trimmomatic（ バ ー ジ ョ ン 0 . 38），HISAT 2（ バ ー ジ ョ ン

アスコルビン酸による H セラミドの産生増加が抗酸化作用

2 . 1 . 9），featureCounts（バージョン 1 . 6 . 3）を用いて行った。

によるものかどうかを明らかにするため，抗酸化作用を目的とした化粧品材料として用いられるコウジ酸，コエンザ2 . 3．セラミドの測定

イム Q 10 およびアスタキサンチンの H セラミド産生への影

14 日間分化させたヒト不死化ケラチノサイトを 100 µL

響を調べた。各抗酸化剤を不死化ケラチノサイト分化時にH 2 O に懸濁させ，375 µL CHCl 3 /CH 3 OH= 1 : 2（v/v）を加添加し，脂質を抽出後，H セラミド量を調べたところ（図 3），えて激しく撹拌した。125 µL H 2 O および 125 µL CHCl 3 を加えて激しく撹拌後，遠心により二層に分離させた。下層を回収し，溶媒を留去後，200µL CHCl 3 /CH 3 OH=1 : 2（v/v）に再懸濁させ，液体クロマトグラフィー連結型タンデム質量分析（LC-MS/MS；Xevo TQ-S，Waters）によるセラミドの検出，定量を行った。

2 . 4．候補遺伝子のクローニング
ヒト不死化ケラチノサイト（分化 7 日）の cDNA および各遺伝子特異的なプライマーを用いて各候補遺伝子を PCR に よ り 増 幅 し（KOD FX，TOYOBO），dA 付 加後，pGEM-T Easy vector（Promega）にクローニングした。
配列の確認後，目的遺伝子を制限酵素により切り出し，動図2− 98 −分化，アスコルビン酸依存的な H セラミドの産生増加

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いずれの化合物も H セラミド産生を増加させないことが明らかとなった。

3 . 2．アスコルビン酸依存的な遺伝子発現変動の網羅的解析
H セラミド量がケラチノサイトの分化依存的に増加したことから，未同定の H セラミド合成酵素は分化依存的に発現が増加すると考えられる。また，アスコルビン酸存在下で H セラミド産生が増加したことから，アスコルビン酸が H セラミド合成酵素の発現を増加させた可能性が考えられる。そこで，H セラミド合成酵素の候補を探索するため，
RNA シークエンスによりケラチノサイトの分化による発現変動を網羅的に調べた。各分化日数におけるケラチノサ
イトから RNA を抽出し，RNA 濃度，純度を調べたところ，

図3

分化日数 10 日，14 日，21 日の RNA は分解が進んでいた。

H セラミド産生への抗酸化剤の影響

これは皮膚では角質層を形成する段階までケラチノサイトは分化が進行すると，DNA や RNA の分解が進行するためであると考えられる。分化日数 7 日では RNA の分解が進んでおらず，アスコルビン酸依存的な H セラミドの増加が見られたため，分化 7 日における RNA を用いて RNA シークエンス解析を行った。その結果，i）分化依存的に発現増加（2 倍以上）する 1073 遺伝子，ii）アスコルビン酸依存的に発現増加（2 倍以上）する 159 遺伝子，i）かつ ii）の条件

図 4 ケラチノサイトの分化依存的，アスコルビン酸依存的な遺伝子発現の増加を満たす 87 遺伝子を同定した（図 4）。

3 . 3．水酸化酵素候補遺伝子の活性解析
RNA シークエンス解析により発現増加していた遺伝
子 の う ち， 脂 質 代 謝 関 連 遺 伝 子（SPTLC 3，SPTSSB，いことが明らかとなった。

PSAPL 1，CLN 8，PTGS 1，FADS 6，ABHD 1 2 B，４．考察，総括

ABHD 17 B），脂質トランスポーター（GLTP，STARD 5），水酸化および不飽和化関連遺伝子（CYP 1 A 1，CYP 2 C 18，

H セラミドはヒト特有かつ角質層で最も多いセラミドク

CYP 2 E 1，CYP 2 W 1，CYP 561 D 1，SDR 16 C 5）を H セラスであるにもかかわらず，産生経路や生理機能は不明でラミド合成酵素の候補遺伝子としてクローニングし，哺乳あり，H セラミドを配合した製品もこれまで販売されてい類発現細胞発現用ベクターに組み込んだ。HEK 293 T 細ない。本研究では，H セラミドの産生量がケラチノサイト胞に各プラスミドをそれぞれ導入し，脂質を抽出後，LC-の分化依存的に増加すること，さらにその産生量はアスコ

MS/MS により H セラミドの検出を行った。しかし，いルビン酸添加によって大幅に増加することを見出した。アずれの遺伝子の発現によっても H セラミドは検出限界以スコルビン酸は抗酸化作用を目的として食品等に用いられ下であった。ジヒドロセラミド水酸化／不飽和化酵素でるが，抗酸化作用をもつ化粧品材料であるコウジ酸，コエある DEGS 2 は水酸基および二重結合共にもたないセランザイム Q 10，アスタキサンチンは H セラミド産生を亢進

ミドの長鎖塩基部分の 6 位に水酸基を導入する酵素であしなかったことから，アスコルビン酸の作用は抗酸化作用る。DEGS 2 が別の因子の存在によってセラミドの 4 位に以外によることを明らかにした。アスコルビン酸の抗酸化水酸基を導入する活性を発揮する可能性を考え，DEGS 2作用以外の機能として，ケラチノサイトの分化に関与すると上記の各候補因子を HEK 293 T 細胞に共過剰発現させことが知られていることから 7 , 9），網羅的な発現解析を行た。細胞から脂質を抽出し，LC-MS/MS により H セラミったところ，ケラチノサイトの分化依存的かつアスコルビド産生を調べたところ，H セラミドは検出限界以下であっン酸依存的に発現増加する 87 の遺伝子を同定することにた。これらの結果から，クローニングした各遺伝子は少な成功した。これまでにアスコルビン酸により発現が増加す

くとも今回用いた実験系では H セラミド合成活性を示さなる遺伝子の網羅的解析を行った報告はなされておらず，ケ− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

ラチノサイトの分化メカニズムには不明な点が多く残されacylceramides. Prog. Lipid Res., 63, 50-69（2016）ていることから，詳細な本研究で得られた結果は H セラミ

2） Robson KJ, Stewart ME, Michelsen S, Lazo ND,ド産生酵素の同定のみならず，ケラチノサイトの分化メカ

Downing DT. 6-Hydroxy-4-sphingenine in human

ニズムを理解するための重要な知見となることが予想されepidermal ceramides. J. Lipid Res., 35, 2060-2068（1994）
3） K a w a n a M , M i y a m o t o M , O h n o Y , K i h a r aる。
網羅的遺伝子発現解析の結果をもとに，H セラミド合成

A. Comparative profiling and comprehensive酵素の候補として 16 遺伝子を選択し，HEK 293 T 細胞へ

quantification of stratum corneum ceramides in

過剰発現させることで活性を調べたが，いずれの遺伝子をhumans and mice by LC/MS/MS. J. Lipid Res., 6 1,発現させても H セラミドは産生されなかった。その要因と884-895（2020）．

して以下の３つの可能性を考えている：i）選択した候補遺

4） Suzuki M, Ohno Y, Kihara A. Whole picture of

伝子はいずれも H セラミド合成酵素でない，ii）候補遺伝

human stratum corneum ceramides, including the

子に H セラミド合成酵素が含まれているが，単独では活性chain-length diversity of long-chain bases. J. Lipid Res.,を発揮できない（HEK 293 T 細胞には活性に必要な別の因63, 100235（2022）

子が発現していない），iii）H セラミド産生におけるアスコ5） Ponec M, Weerheim A, Kempenaar J, Mulder A,

ルビン酸の役割は遺伝子発現ではなく，水酸化活性の補助

Gooris GS, Bouwstra J, Mommaas AM. The formation

因子である。そのため今後はこれら 3 つの可能性を検証すof competent barrier lipids in reconstructed human

るため，i）H セラミドをもたないマウスケラチノサイトのepidermis requires the presence of vitamin C. J. Invest.

RNA 発現とヒト RNA 発現の比較解析による別の候補遺伝

Dermatol., 109, 348-355（1997）

子のスクリーニングと活性解析，ii）HEK 293 T 細胞では

6） Uchida Y, Behne M, Quiec D, Elias PM, Holleranなく，ケラチノサイトを用いた過剰発現実験もしくはノッWM. Vitamin C stimulates sphingolipid production andクアウト細胞の作成と H セラミド産生量の解析，iii）分化

markers of barrier formation in submerged human

ケラチノサイトの総細胞抽出液もしくは膜画分を用いた in

keratinocyte cultures. J. Invest. Dermatol., 117, 1307-

vitro の活性解析系の構築とアスコルビン酸添加時の H セ
ラミド産生活性解析，をそれぞれ行う必要があると考えて1313（2001）
7） Catani MV, Savini I, Rossi A, Melino G, Avigliano L.
Biological role of vitamin C in keratinocytes. Nutr. Rev.,いる。
本研究期間中において H セラミド合成酵素の同定には至63, 81-90（2005）

らなかったが，H セラミド産生におけるアスコルビン酸の8） Wang K, Jiang H, Li W, Qiang M, Dong T, Li H. Role

関与を証明し，アスコルビン酸依存的に発現変動する遺伝of Vitamin C in Skin Diseases. Front. Physiol., 9, 8 1 9子を同定することに成功した。今後は上述の可能性を検証（2018）

することで H セラミド合成酵素，合成経路および産生の分9） Pasonen-Seppanen S, Suhonen TM, Kirjavainen M,

子メカニズムが明らかになることで，H セラミドの生理機

Suihko E, Urtti A, Miettinen M, Hyttinen M, Tammi

能の解明およびヒトセラミドとしての新たなコスメトロジ

M, Tammi R. Vitamin C enhances differentiation of aー製品への応用へ発展することが期待される。

continuous keratinocyte cell line（REK）into epidermis
with normal stratum corneum ultrastructure and（引用文献）

functional permeability barrier. Histochem. Cell Biol.,

1） Kihara A. Synthesis and degradation pathways,．
116, 287-297（2001）

functions, and pathology of ceramides and epidermal− 100 −