研究用試薬 製品データシート

p.1

Code No. 27719

Human Amyloidβ (1-42) (FL) Assay Kit - IBL
図 (1) 標準液希釈操作例

96 Well

標準品 230 μL

アルツハイマー病は 1907 年ドイツの神経病理学者 A. Alzheimer によって最初に報告され、現在では老人性認知症の最も大きな原因となっています。アルツハイマー病の脳に多く現れる老人斑はアミロイドベータタンパク(Aβ)によって構成されています。Aβ は40-42 (43)アミノ酸からなるペプチドで、β- および γ-セクレターゼの働きにより、前駆体タンパク質 Amyloid precursor protein (APP) (695, 751 または 770 アミノ酸からなる膜タンパク)から切り出されてくるといわれています(文献 1)。また Human APP をコードした cDNA を Mouse Neuroblastoma Cell にトランスフェクタントした培養液中において多数のバリアント Aβ の存在が明らかにされています(文献 2)。
さらに 1995 年には、西道らにより、老人斑に優位にかつ今までとは異なる別の Aβ ペ
プチド種、Aβ (N3pE)が発見されました。この分子は分子内の脱水反応によって第 3 番目のグルタミン酸がピログルタメートに変換された分子から始まります(文献 3)。
本製品は、N端末を保持したヒトAβ (1-42)を測定するキットです。Aβ (1-42)のN末端およびC末端それぞれに対して特異性の高いモノクローナル抗体を使用しておりますので、より高い特異性と検出感度でAβ (1-42)のFull-length (FL) 分子を測定できます。

希釈用緩衝液230 μL1. はじめに

2. 原理および測定方法
本製品は、サンドイッチ法による EIA (Enzyme Immuno Assay)キットです。1 次抗体
は、プレートに固相されていますので、検体および標準物質を加え、1 次反応をおこない洗浄後 HRP 標識された 2 次抗体を加え 2 次反応をおこないます。反応後、過剰の 2 次抗体を洗浄除去します。Tetra Methyl Benzidine (TMB) により発色させます。この呈色は、Human Aβ (1-42)の量に比例します。

3. 測定範囲
1.56 ～ 100 pg/mL(0.35～ 22.17 pmol/L, : Aβ (1-42)の分子量を 4,510 とした場合)

4. 使用目的
EDTA-血漿、脳脊髄液および培養上清中の Human Aβ (1-42)を測定できます。

5. 構成試薬
12345678

抗体プレート (抗 Human Aβ (38-42) (44A3) Mouse IgG MoAb A.P. 固相) 96Well x 1
標識抗体濃縮液 (30 倍濃度 HRP 標識抗 Human Aβ (N) (82E1) Mouse IgG A.P.) 0.4mL x 1
標準物質 (Human Aβ (1-42))
0.5mL x 2
希釈用緩衝液*30mL x 1標識抗体用溶解液*
12mL x 1
TMB 基質液
15mL x 1停止液*
12mL x 1
濃縮洗浄液*
50mL x 1

濃度 (pg/mL)
濃度 (pmol/L)(3) 測定操作方法
試薬は使用前に常温に戻し、数回静かに転倒混和し変化のない事を確かめてください。
検体の測定と同時に希釈標準品を測定し検量線を設定してください。
1 ブランクの添加 (以降図 (2) 参照)
試薬ブランクを設定し希釈用緩衝液を 100 μL 入れます。
2 検体、希釈標準品の添加
検体 100 μL および希釈標準品各 100 μL ならびに検体ブランク 100 μL を入れます。
3 プレートカバーをして 4°C overnight 反応
4 ウェルの反応液を除去します。洗浄液を加え除去します。*
5 標識抗体の添加
検体、標準、検体ブランクに標識抗体を各々100 μL 添加します。
6 プレートカバーをして 4°C 60 分間反応
7 ウェルの反応液を除去します。洗浄液を加え除去します。*
8 TMB 基質液の添加
あらかじめ必要量を採取用容器にとり、そこからすべてのウェルに TMB 基質液を 100 μL 添加します。TMB 基質液添加後、反応液は徐々に青色に変ります。
この時の反応は遮光してください。また、採取用容器に残った TMB 基質液は、コンタミの原因になりますので元に戻さないでください。
9 遮光をして常温 30 分間反応
10 停止液の添加
すべてのウェルに停止液を 100 μL 添加します。プレートの側面を軽くたたいて混和します。反応液は青色から黄色に変化します。
11 吸光度測定
プレート底面のよごれや水滴を拭き取り液面に気泡がないことを確認した後、30 分以内に試薬ブランクを対照として検体および標準ならびに検体ブランクの波長 450nm における吸光度を測定してください。
図 (2) 測定操作一覧(1) 必要な器具・器材
マイクロピペットおよびチップ
メスシリンダーおよびビーカー
グラフ用紙 (両対数)
洗浄ビン
採取用容器 (清潔な試験管など)(2) 準備濃縮洗浄液の希釈方法
濃縮洗浄液は、40 倍濃度です。使用前に常温に戻し十分に転倒混和します。濃縮洗浄液 50mL に対して精製水を 1,950mL 加え混和します。これを洗浄液とします。冷蔵保存し 2 週間以内に使用してください。
標識抗体濃縮液の希釈方法
標識抗体濃縮液は 30 倍濃度です。
別に用意した採取用容器にて、必要量に応じて標識抗体濃縮液を標識抗体用溶解液で 30 倍希釈してください。これを標識抗体とします。
希釈例）
1 スリット (8 ウェル) 使用する場合=800 μL 必要(最低量)(標識抗体濃縮液を 30 μL とり、標識抗体用溶解液 870 μL を加え良く混和し、100 μL ずつ使用します。)
この操作は、標識抗体添加の直前におこなってください。
標識抗体濃縮液の残りは、蓋をしっかり閉め冷蔵にて保存してください。有効期限内に再度使用できます。
標準物質の希釈方法
標準物質バイアル瓶に精製水を 0.5 mL 加えて完全に溶解します。
この時標準物質濃度は 200 pg/mL となります。
希釈用テストチューブを８本用意し希釈用緩衝液を 230 μL ずつ量り取ります。
各々のテストチューブに
100 pg/mL, 50 pg/mL, 25 pg/mL, 12.5 pg/mL, 6.25 pg/mL, 3.13 pg/mL, 1.56 pg/mL,
0 pg/mL の表示をします。
100 pg/mL の希釈用テストチューブに 200 pg/mL の標準物質溶液を 230 μL 加え混和しその溶液 230 μL を 50 pg/mL の希釈用テストチューブに加え混和します。順次 2 倍連続希釈をおこない 100 pg/mL～1.56 pg/mL までの 7 点を希釈標準品とし、0 pg/mL を検体ブランクとします。 (図(1) 参照)

株式会社

免疫生物研究所⑥ ⑦⑧3.13 1.56 00.69 0.35 0検体の希釈方法
検体は希釈用緩衝液で適宜希釈し測定してください。

6. 用法および用量 (操作方法)

プレートリーダー (測定波長：450nm)
希釈用テストチューブ
精製水
ペーパータオル
冷蔵庫 (4°C として)

① ② ③ ④ ⑤
100 5025 12.5 6.25
22.17 11.09 5.54 2.77 1.39

試

検 体
検体

料

標 準
希釈標準品

検体ブランク
希釈用緩衝液試薬ブランク
希釈用緩衝液100 μL100 μL100 μL
プレートカバーをして 4°C over night 反応
4 回 (洗浄液 350 μL 以上)*

100 μL

標識抗体

100 μL100 μL100 μL
プレートカバーをして 4°C 60 分間反応
5 回 (洗浄液 350 μL 以上)*

－TMB 基質液

100 μL100 μL100 μL
遮光常温 30 分間反応

100 μL停 止 液

100 μL100 μL100 μL
100 μL
プレートをたたいて反応液を混和し、30 分以内に試薬ブランクを対照として 450 nm における検体、標準、検体ブランクの吸光度を測定

7. 操作上の注意事項
1 検体は、採取後速やかに測定してください。保存する場合は、凍結保存とし、検体の凍結融解を繰り返さないでください。また、融解は低温でおこない測定前に十分混和してください。
2 検体は希釈用緩衝液にて適宜希釈してください。
3 検体や標準物質は、二重測定することをおすすめします。
4 検体は、中性域のものを使用してください。また、有機溶媒等の混入も反応に障害がありますので注意してください。
5 抗体プレ－トの洗浄は必ず付属の洗浄液を使用してください。不十分な洗浄は、測定誤差の原因となりますので正確におこなってください。
6 洗浄液は、プレートをペーパータオルの上でたたいて完全に除去してください。ペーパータオルをウェルの中に入れる事はしないでください。
7 TMB 基質液は、光に対して敏感です。遮光保存してください。金属との接触も避けてください。
8 吸光度測定は、停止液添加後 30 分間以内におこなってください。

8. 測定結果の算出方法
対数グラフの縦軸に吸光度を、横軸に検体濃度をとり各標準物質濃度の吸光度値から検体ブランクの吸光度値を引いた値をとり検量線を設定します。
試料検体の吸光度値から検体ブランクの吸光度値を引いた値を検量線に当てはめ、検体濃度を読みとります。

URL: http://www.ibl-japan.co.jp

E-mail: do-ibl@ibl-japan.co.jp

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Code No. 27719

9. 測定値と検量線作成例＊

11. 使用上または取り扱い上の注意

標準品濃度(pg/mL)

吸光度(450nm)

100

2.576

50

1.302

250.658

12.50.323

6.250.169

3.130.087

1.560.051

0 (検体ブランク)

0.010

1 保存は、2～8°C としてください。使用の前に全ての試薬は常温に戻してください。
2 標準物質は、凍結乾燥品です。開封は、十分注意しゆっくりとおこなってください。
3 停止液は強酸性 (1N 硫酸) です。衣服・皮膚等への接触および廃棄には十分注意してください。
4 使用後の抗体プレートや試薬は、多量の水で洗い流してから廃棄してください。
5 標識抗体濃縮液は、まれに析出を認める場合がありますが、性能に問題はありません。
6 構成試薬には動物血液成分を含む物があります。取り扱いに注意し使用後は手洗いなどをおこなってください。
7 ロットが異なる製品の構成試薬や他のキットの構成試薬を混ぜたり、交換して使用することは避けてください。
8 期限切れの試薬は、使用しないでください。
9 本キットは、研究用試薬です。診断等に用いることはできません。

上記検量線は作成例です。測定に当たってはその都度検量線を作成してください。
12. 保存方法および有効期限

10. キットの性能

2～8°C 保存
使用期限は外箱に記載(1) 希釈試験 (標準物質を添加したサンプルを使用しています)
検体培地(10%FCS 添加
RPMI-1640)
血漿(EDTA)
(健常人)

脳脊髄液

希釈倍率(x)測定値(pg/mL)

理論値(pg/mL)%13. 包装単位および製品番号

438.33

45.15

84.9

8

21.23

22.58

94.0

96 Well
製品番号 27719

1611.24

11.29

99.6

4

29.20

45.15

64.7

8

16.63

22.58

73.6

16

9.64

11.29

85.4

4

34.74

45.15

76.9

8

20.48

22.58

90.7

16

10.33

11.29

91.5

14. 参考文献
1. Selkoe DJ. Normal and abnormal biology of the beta-amyloid precursor protein.
Annu Rev Neurosci. 1994;17:489-517.
2. Wang R, Sweeney D, Gandy SE, Sisodia SS. The profile of soluble amyloid beta
protein in cultured cell media. Detection and quantification of amyloid beta protein
and variants by immunoprecipitation-mass spectrometry. J Biol Chem. 1996 Dec
13;271(50):31894-902.
3. Saido TC, Iwatsubo T, Mann DM, Shimada H, Ihara Y, Kawashima S. Dominant anddifferential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), insenile plaques. Neuron. 1995 Feb;14(2):457-66.

(2) 添加回収試験
検体培地(10%FCS 添加RPMI-1640)(x8)

血漿(EDTA)(健常人) (x16)脳脊髄液(x16)

理論値 (pg/mL)

測定値 (pg/mL)

%

90.30

99.18

109.8

45.15

47.81

105.9

22.58

24.38

108.0

11.29

13.31

117.9

90.30

80.20

88.8

45.15

39.17

86.8

22.58

18.93

83.8

11.29

9.93

88.0

90.30

95.05

105.3

45.15

46.31

102.6

22.58

25.00

110.7

11.29

12.94

114.6

本製品は、独立行政法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構 (NEDO) 委託事業である、基礎研究から臨床研究への橋渡し促進技術開発／橋渡し促進技術開発「アルツハイマー病総合診断体系実用化プロジェクト：根本治療の実現に向けて」の研究成果の一部です。
15. 問合せ先株式会社 免疫生物研究所

2016 年 9 月更新＊

Version 2.

(3) 同時再現性
測定値 (pg/mL)

SD 値

CV 値 (％)

n69.61

3.43

4.92148.66

2.094.32131.49

4.04

12.821

測定値 (pg/mL)

SD 値

CV 値 (％)

n74.633.74

5.0450.24

3.58

7.1436.59

3.54

9.74(4) 測定間再現性(5) 特異性
測定物質
Human Aβ (1-42)
Human Aβ (1-40)
Human Aβ (1-43)

交差率100.0 %
≦0.1 %＜0.8 %

Mouse/Rat Aβ (1-42)との交差(10 – 40 %程度)はありますが、反応性が異なるため正確な測定はできません。

(6) 感度
0.29 pg/mL
本キットの感度は、NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)の評
価 方 法 に 従 い 求 め ま し た 。 (National Committee for Clinical Laboratory Standards
Evaluation Protocols, SC1, (1989) Villanova, PA : NCCLS 参照)

株式会社

免疫生物研究所

URL: http://www.ibl-japan.co.jp

E-mail: do-ibl@ibl-japan.co.jp