真核生物用 DNA 断片化測定キット

FRED Assay Kit for Eukaryotic DNA
マニュアル第 1 版 1911

I 製品説明VI プロトコール

本製品は、標的配列の長さが異なる 2 種類の Primer &① 2 種類の Primer & Probe Mix は、「E100」と「E350」の組

Probe を用いてリアルタイム PCR を行い、得られた Ct 値を合せを通常選択する。DNA が高度に断片化していると予想比較することで、真核生物 DNA の断片化の程度を定量的にされる場合は、「E100」と「E200」を選択して使用する。

評価するためのキットです。本製品は、FRED (Fragmentation
Equivalent② 2 種類の Primer & Probe Mix で、それぞれプレミックス

amplification efficiency and Different amplicon sizes) 法と呼ばれを調製する。以下の通り、DNA 溶液数［N 個＝サンプル数 +る分析技術を採用しており、「DirectAce qPCR Mix PlusNo Fragmentation Control（以下、「NFC」）］に応じる。

analysisusingmultiple

Real-time

PCRs

with

ROX Tube」との組合せで、断片化の程度を示す DNA 断片化指数を算出することが可能です。 加工食品等、DNA が断片化した試料を対象とした遺伝子検査を行う際に、断片化

2 x DirectAce qPCR Mix No ROX

50 x N μl

Primer & Probe Mix

20 x N μl

50 x ROX Passive Reference

指数は DNA の品質の指標として利用することができます。

*1)（0 μl）（ABI Prism® 7500 の場合:

0.2 x N μl）（ABI Prism® 7000/7700/7900 の場合:

II 保存

2 x N μl）

d.d.H2O－20℃（遮光）*1)up to 90 x N μl

ROX 補正を必要としない装置の場合、添加する必要はありません。使用装置に応じて濃度調整して下さい (DirectAceIII 製品内容

qPCR Mix Plus ROX Tube の取扱い説明書 参照)。

No Fragmentation Control 300 µl x 1 本（以下、「NFC」）
E100 Primer & Probe Mix 900 µl x 1 本（約 100 bp 増幅）③ 各プレミックスを、N 個のチューブに 81 μl ずつ分注し、E200 Primer & Probe Mix 900 µl x 1 本（約 200 bp 増幅）

DNA 溶液と混合する。

E350 Primer & Probe Mix 900 µl x 1 本（約 350 bp 増幅）

81 μl

プレミックスIV 注意

DNA 溶液

9 μl

Total

90 μl

本製品は「DirectAce qPCR Mix Plus ROX Tube」と組合せて使用することを前提として設計されたキットです。他のリア④ 調製した各反応液を 96 ウェルの PCR プレート*2) へ、ルタイム PCR 試薬ではご使用になれません。

25 μl x 3 ウェルずつ分注する。

本製品をご使用される際は別途「DirectAce qPCR Mix Plus
ROX Tube」（Code No. 318-07751）をお買い求め下さい。

サンプル配置の例 *3)123456789101112A

V 分析法の原理
標的配列の長さが異なる 2 種類の Primer & Probe を用いてリアルタイム PCR を行うと、鋳型 DNA の断片化の程度に応じて、標的配列の長い増幅曲線の立ち上がりが遅れ、2 つの増幅曲線の Ct 値に差が生じます（下図）。

BNFC

サンプル 1NFC

サンプル 1

C

サンプル 2サンプル 3

サンプル 2

サンプル 3

D

サンプル 4サンプル 5

サンプル 4サンプル 5Eサンプル 6サンプル 7サンプル 6サンプル 7F

サンプル 8サンプル 9サンプル 8サンプル 9Gサンプル 10サンプル 11サンプル 10サンプル 11H

断片化なし

E100

高度に断片化2 つの増幅曲線の Ct 値の差から、100 bp の標的 DNA のう*2)

ち、断片化して鋳型にならない DNA の割合を示す理論値である DNA 断片化指数 【DFI： DNA Fragmentation Index】を算出し、鋳型 DNA の断片化の程度を数値化します。
株式会社ニッポンジーン

www.nippongene.com

E350

8 連チューブなどは使用せず、必ず 96 ウェル PCR プレートを使用する。

*3)

96 ウェル PCR プレートの A 行と H 行は、可能な限り使用しない。

TEL 076-451-6548 FAX 076-451-6547

⑤ 96 ウェル PCR プレートに蓋をし、下記の条件でリアルタ
イ ム PCR を 行 う 。 レポー ター は FAM、 ク エ ン チ ャ ー はTAMRA に設定する。

VIII 分析法の注意事項○ 算出される DFI について
DFI は 0～1 の値で算出されます。「DFI = 0.5」と算出さ・ Up Ramp Rate および Down Ramp Rate をれた場合、理論上、鋳型 DNA 溶液中に含まれる 100

1.6 ℃/sec に設定する。

bp の標的 DNA のうち、約半数の DNA が断片化して・ ABI Prism® 7900 および ABI Prism® 7500 では

PCR の鋳型にならない状態であることを示しています。

Ramp Rate を変更せず、Standard mode で○ Primer & Probe Mix の選択についてリアルタイム PCR を行う。
95℃

10 min.

95℃

30 sec.

58℃

10 sec.

72℃

2 min.

Primer & Probe Mix の組合せは、まず E100 と E350を選択して下さい。対象の DNA が高度に断片化しており、E350 で増幅が認められない場合や、0.99 など極端45 cyclesに高い DFI が算出された場合は、E100 と E200 のPrimer & Probe の組合せを使用して再度評価を行って下さい。

⑥ 反応終了後、解析を行い、各ウェルの Ct 値が算出され長時間加熱された食品由来の DNA など、高度に断片ていることを確認する（Auto 解析でも、Threshold を設定して化していることが予想される DNA の場合も、E100 と解析しても良い）。

E200 の組合せを使用して評価を行って下さい。
○ 鋳型 DNA について

VII DNA 断片化指数（DFI）の算出方法

鋳型 DNA は、DNA 抽出キットで精製された DNA を使① NFC を 2 種類の Primer & Probe Mix で増幅させた際の用して下さい。加工食品からの DNA 抽出には「GMCt 値の差「⊿Ct（NFC）」を求める。

quicker 4」（Code No. 318-07751）の使用を推奨しま∆() =す。

−○ Primer & Probe の組合せと DFI について

② サンプルを 2 種類の Primer & Probe Mix で増幅させた同じ DNA サンプルを評価した場合でも、E100 と E350

際の Ct 値の差「⊿Ct（Sample）」を求める。の組合せで得られた DFI と、E100 と E200 の組合せで∆() =得られた DFI は完全には一致しません。DNA サンプル

−間で DFI を比較する際は、同じ Primer & Probe Mix の組合せを使用して下さい。

③ ⊿Ct（Sample）から⊿Ct（NFC）を引いた「⊿⊿Ct」を求め○ リアルタイム PCR 装置と DFI についてる。

∆∆= ∆()−∆(機種の異なるリアルタイム PCR 装置を使用した場合、)同じ DNA サンプルでも、算出される DFI は完全には一致しません。DFI を比較する際は、同一機種を使用し、④ 得られた⊿⊿Ct から「DNA 断片化指数（DFI）」を求める。

一定のデータ解析方法で評価を行って下さい。

2 種類の Primer & Probe Mix の組合せによって算出方法は異なる。

IX 参考文献

E100 と E350 を使用した場合：

=−

∆∆.

Mano J, Nishitsuji Y, Kikuchi Y, Fukudome SI, Hayashida T,Kawakami H, Kurimoto Y, Noguchi A, Kondo K, Teshima R,Takabatake R, Kitta K: Quantification of DNA fragmentation inprocessed foods using real-time PCR. Food Chem., 226, 149-155

E100 と E200 を使用した場合：=1）(2017)−DFI ＜ 0 の場合は DFI＝ 0 に補正する。

∆∆X 備考本製品は、農研機構、株式会社日清製粉グループ本社、日本製粉株式会社が所有する特許第 6120279 号のライセンスを受けて製造・販売しています。

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