立石科学技術振興財団

助成研究成果集(第32号) 2023

研究助成成果報告 研究助成 (S)

血液ろ過機構を評価可能なオールヒト iPS 細胞の腎臓糸球体チップの開発
Development of an all- hiPSC glomerulus on a chip capable of evaluating filtration
2208001

研究代表者

京都大学

共同研究者

理化学研究所
生命機能科学研究センター

大学院工学研究科

授

横川チーム
リーダー

髙里教

隆司
実

[研 究 の 目 的]
現在，人工透析を受けている腎臓病患者は定期的な透析なしには生存できない上に，高血圧や動脈硬化などのさまざまな合併症を起こすなど，著しく QOL が低下している。この現状を改善して，人間らしい創造的な生活を送ることが可能になれば，透析医療費年間 1 兆 5 千億円の削減や，末期腎不全患者の健康寿命の延長に資することができ，膨れ上がる社会福祉費の削減という喫緊の課題の解決につながる。
本研究では，腎臓の糸球体が担う血液のろ過機構を生体外で再現することで，その機能解明を通して創薬につながる研究開発を進めてきた。
具体的な研究目的は，機械工学的に作製した微図1(a) 腎臓機能の背景，(b) 糸球体ろ過障壁モデル

小環境 (細胞ニッチ) においてヒト由来 iPS 細内に近い糸球体ろ過機能を再現し，これまでの胞 (hiPSC) を培養することにより，未だ再生血液透析装置では担うことのできなかった腎生医療分野で実現していない腎臓ろ過機能の再構

理学的機能を有する新たな細胞−機械融合型の築という課題に挑戦することである。糸球体の血液ろ過システムを実現する。

構造と機能を模倣した生体模倣システム (糸球[研究の内容，成果]

体チップ) は，血液側と尿側を模したマイクロ流路および細胞外基質からなる微小環境と，hiPSC から分化誘導した糸球体足細胞と血管内

1) 糸球体足細胞 (ポドサイト) の開発

皮細胞を組み合わせて再現する (図 1)。生体― 14 ―ポドサイトは，市販の不死化細胞と hiPSCTateisi Science and Technology Foundation

い，サイズごとに細胞集合体を分画した。ポドサイトが，細胞分離溶液やセルストレイナーのせん断応力の影響を受けても細胞塊状態を保持する特長を活かし，得られた直径 40‒70 μm の細胞集合体をポドサイト塊として分取した。これと MACS 法で得た Podocaylxin+ 細胞を比較したところ，NPHS1 と SYNPO の発現量はほぼ同じレベルであることが分かった。さらに，不死化ポドサイトに比べても複数のマーカー遺図2

本研究で確立したポドサイト比較プロトコル

伝子の発現上昇が見られ，オルガノイド由来のポドサイトがより生理学的機能を有することがから分化誘導した細胞を並行して用いることで，示された。FACS 法や MACS 法で単離した細hiPSC の有用性を検討した。まず，各種 hiPSC胞と異なり，ポドサイト塊が高い生存性と接着

か ら 誘 導 し た ポ ド サ イ ト を 作 製 す る た め，性を持つことも分かった。そこで，本研究では201B7 株，585A1 株，23C27 株，CRL1502.3 株

以降の実験においてサイズソーティングを用いなどから高里らの分化誘導方法を用いて腎オルた単離法を採用することとした。

ガノイドを作製した。細胞分離溶液である Ac-

本研究項目では，共同研究者の高里らの協力

cumax を用いてオルガノイドを分散し，単一によりオルガノイド作製技術を京大に移転した浮遊細胞の懸濁液を作製した後，抗 podoca-

後，複数の hiPSC に適用しポドサイト塊の分lyxin 抗体を用いて，FACS 法あるいは MACS取プロトコルを最適化した。結果的に，サイズ法より糸球体上皮細胞を単離した (図 2)。単ソーティングにより得られるポドサイトの量は離 直 後 お よ び 培 養 後 の 糸 球 体 上 皮 細 胞 は，少ないものの，ポドサイト特異的な遺伝子やタqPCR に よ り NPHS1，NPHS2，PODXL な どンパク質発現を保ったまま培養することが可能

マーカー遺伝子発現を評価した。さらに，免疫となった。以上より，不死化ポドサイトに加え，染色により同遺伝子産物のタンパク質マーカー

iPS 細胞由来ポドサイト塊を用いてオンチップ

Nephrin，Podocin，Podocalyxin の発現を評価化する実験を進めることとした。

した。その結果，Podocaylxin+ 細胞は生体内の糸球体上皮細胞と類似な形態を持つこと，糸2) 腎臓糸球体チップの作製

球体上皮細胞マーカー遺伝子およびタンパク質ソフトリソグラフィにより 3 流路 (血管側，の発現量が高いことがわかった。しかし，培養

糸球体基底膜 (GBM)，原尿側) を有するマイ

した Podocaylxin 細胞では単離直後と比較し，クロ流体デバイスを作製し，ポドサイト塊と血マーカー遺伝子およびタンパク質の発現量が減管内皮細胞 HUVEC あるいは糸球体由来血管少したことから，単離直後の機能的な細胞を内皮細胞 hGMEC の共培養を実現した (図 1b)。

チップに搭載することが必須であることがわ

中央の流路内に Fibrin，Collagen IV，Laminin

かった。

521 の 混 合 ゲ ル を 入 れ，ポ ド サ イ ト 塊 とそこで，hiPSC は CRL1502.3 株を用いるこ

HUVEC をそれぞれ両側の流路を介してゲルのととし，ポドサイトの単離方法を最適化した。

両 側 に 播 種 し た。Phalloidin，Synaptopodin，

培養 26 日目のオルガノイドを細胞分離溶液にPodocin 等の免疫染色により評価し，チップ内より分散して細胞集合体の懸濁液を作製した。に培養した細胞についてもこれらのマーカータ

更に，70 μm と 40 μm のセルストレイナーを用

ンパク質の発現が維持されており，ポドサイト― 15 ―

立石科学技術振興財団を設定し，蛍光強度の経時変化を測定した。ア様の構造を有することも確認できた (図 3)。
二種類の内皮細胞のバリア機能を評価した

ルブミンろ過量の経時変化を評価したところ，

ところ，hGMEC の場合は蛍光強度が緩やかろ過実験開始から 15 分後には HUVEC 層を完に上昇し 7 分間ほどで最大となった。一方，

全に通過し，アルブミン溶液が ECM ゲル内にHUVEC の場合においては測定時間内では蛍光侵入するが，ポドサイト塊側ではバリア形成に強度の変化は見られなかった。HUVEC は密なより 30〜45 分後においてもほとんどアルブミバリアを形成するのに対し，hGMEC は糸球体ンの通過が見られなかった。また，イヌリンが特有の有窓性を持つためと考えられる。

アルブミンの 10 倍程度透過しアルブミンの透過量は 1 % 程度であったことから，本デバイ
ス上でイヌリンとアルブミンの選択的ろ過を実現することができた。
さらに，本共培養系を用いたアルブミンとイ
ヌ リ ン の ろ 過 実 験 に つ い て，複 数 回 (n>3)の実験を行いイヌリン (60 分で 2 %) がアルブミン (60 分で 6 %) の 3 倍程度透過することを安定的に確認することができた。hiPSC 由来ポドサイトを用いた場合に，不死化ポドサイ

図3

トに比べより選択的にイヌリンとアルブミンをhiPSC から単離したポドサイトと糸球体チップろ過することも明らかになった (図 4)。よって，アルブミンに対して糸球体ろ過障壁特有の3) 腎臓糸球体チップを用いたろ過機能評価
ポドサイト塊と HUVEC 共培養系を用いて，二日間の培養後，Alexa Fluor 488 標識されたろ過障壁機能を生体外で再構築することができた。

アルブミンあるいは FITC 標識されたイヌリン

次に，選択的なろ過機能が確立した糸球体を HUVEC 側の流路に入れてろ過実験をおこチップを用いて，PAN によるろ過障壁の崩壊なった (図 4)。3 流路それぞれについて ROIを評価した。hiPSC 由来のポドサイトのみが感受性を有する濃度 200 μg/mL において PANを 24 時間投与すると，イヌリンとアルブミンのろ過量が一致し，その選択性がなくなった(図 5)。また，そのろ過量 (60 分で 25%) は，PAN による障害を受ける前に比べイヌリンが13 倍，アルブミンが 4 倍に増加しておりバリア機能が低下していることがわかった。
PAN に加え，アドリアマイシン (ADR) に対する感受性も評価した (図 6)。不死化ポドサイトの IC 50が 30.7 μg/mL であったのに対し，hiPSC ポドサイトでは 12.4 μg/mL と感受性が高く PAN と同様の傾向が見られた。IC 50 よりも低い濃度 5 μg/mL においてポドサイトに

図4

hiPSC ポドサイトと不死化ポドサイトを用いた糸球体チップの機能比較

暴 露 し た と こ ろ，ADR 障 害 時 に 見 ら れ る
Semaphorin 3A の発現上昇が見られた。ろ過― 16 ―

Tateisi Science and Technology Foundation

図5(a) hiPSC と不死化ポドサイトの PAN 感受性の違い。
(b) PAN 処理によりイヌリンとアルブミンに透過性の違いがなくなることを示した

実験においても，PAN と同様に ADR 暴露によりイヌリンとアルブミンのろ過に差が見られなくなることを示した。
以上のろ過実験を通して，ポドサイトを共培

図6

養した場合に HUVEC 層の透過性が上昇することに気付いた。そこで，共培養によりポドサ(a) hiPSC と不死化ポドサイトの ADR 感受性の違い。
(b-c) ADR 処理により Semaphorin 3A の発生量が上昇することを示した

イトから内皮細胞の形質を変えることで，糸球[今後の研究の方向，課題]体内皮細胞が有する有窓性を向上させているのではないかとの仮説を元に HUVEC の網羅的な遺伝子解析を実施した。GO 解析の結果，細本研究では，hiPSC 由来のポドサイトを用い

胞 内 で 生 じ る イ ベ ン ト に 注 目 し た biologicalて糸球体チップを作製し，不死化細胞に対するprocess に関わる遺伝子の内，48 時間後に共培

薬剤感受性の高さ，選択的なろ過機能の高さを養により発現量の変化が生じた遺伝子は 74 で実 証 す る こ と が で き た。一 方，HUVEC をあった。その内，細胞の成長速度調節等に関わhiPSC 由来の血管内皮細胞に置き換えて，更なるメタロチオネインファミリーの発現低下が抽る高機能性を実証するには至らなかった。また，

出され，この遺伝子発現変化が HUVEC の透生体内に比べるとイヌリンとアルブミンのろ過過性を向上させているのではないかとの結論に比が小さく，血流に対応したろ過量についても至った。今後は，共培養が HUVEC の形態に検証はこれからである。今後は，糸球体の構造与える影響を SEM で評価すること，関連すると機能の相関を検証しながら，糸球体チップのシグナル経路を調査することによりポドサイト機能性を高めることを目指す。の効果を明らかにする。
― 17 ―

立石科学技術振興財団[3][成果の発表，論文など]〈論文発表〉[1]

田渕史，渡部祥山，Stanislav L. Karsten，籔内

研佑，佐原義基，髙里実，藤本和也，横川隆司「血管内皮細胞とポドサイトの共培養により構築した糸球体濾過障壁における透過性評価」電気学会 E 部

門誌，143，9，2023 (掲載決定済)[2]

Trush Olena, Minoru Takasato “Kidney or-ganoid research: current status and applications”
Curr Opin Genet Dev, 75, 101944, 2022
[3]

Antigoni Gogolou, Celine Souilhol, Ilaria Granata,

Filip J Wymeersch, Ichcha Manipur, Matthew Wind,
Thomas JR Frith, Maria Guarini, Alessandro
Bertero, Christoph Bock, Florian Halbritter, Minoru
Takasato, Mario R Guarracino, Anestis Tsakiridis,“Early anteroposterior regionalisation of humanneural crest is shaped by a pro-mesodermal factor”
eLife, 11, e74263, 2022
[4]

Joan Li, Minoru Takasato, Qihe Xu, Roel Bijkerk“Editorial: Epithelial plasticity and complexity indevelopment, disease and regeneration” Front Cell
Dev Biol, 10, 1105402, 2023

Toxicity of Cell Barriers Constituted of Kidney
Organoid-Derived Glomerulus.” The 25th International Conference on Miniaturized Systems forChemistry and Life Sciences (μTAS 2021),473-474, Online, 2021/10/10-14 (Poster)[ 4 ] A. Tabuchi, K. Yabuuchi, Y. Sahara, M. Takasato,
R. Yokokawa. “Evaluation of the Permeability ofCell Barriers Constituted of Kidney OrganoidDerived Glomerulus.” The 34th International
Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS 2021), 536-539, Online, 2021/1/2529 (Poster)[ 5 ] Wei Zhao, Minoru Takasato “A single-cell transcriptome approach to investigate the mechanism ofmesoderm

lineage-specification

using

humaniPSCs” 55th Annual Meeting of the JapaneseSociety of Developmental Biologists, 2022. 06. 01，
金沢文化ホール, 金沢市[6]

Olena Trush, Minoru Takasato “Towards under-phogenesis”

A. Tabuchi, K. Yabuuchi, Y. Sahara, M. Takasato,

K. Fujimoto, R. Yokokawa. “Comparison of Selective
Filtration of On-Chip Glomerulus Comprised ofOrganoid-Derived and Immortalized Podocytes.”
The 36th International Conference on Micro
Electro Mechanical Systems (MEMS 2023),
301-304, Munich, Germany, 2023/01/15-19 (Poster)[2]

Yokokawa. “Evaluation of Permeability and Pan

standing the mechanism of early nephron mor-

〈国際会議発表〉[1]

A. Tabuchi, S. Watabe, K. Yabuuchi, Y. Sahara,

M. Takasato, K. Fujimoto, S. L. Karsten, R.

A. Tabuchi, S. Watabe, K. Yabuuchi, Y. Sahara,

M. Takasato, K. Fujimoto, S. L. Karsten, R.
Yokokawa. “Building On-Chip Glomerular Barrier
from Human iPSCs Derived Podocytes for Rapid
Evaluation of Filtration Function and Nephrotoxicity Studies.” ISSCR/JSRM Tokyo 2021 International Symposium, Poster #308, Tokyo, 2021/10/
27-29 (Poster)― 18 ―

55th

AnnualMeetingoftheJapanese Society of Developmental Biologists,
2022. 06. 01，金沢文化ホール，金沢市[7]

FilipWymeersch,

UkariUsuda,

MinoruTakasato “Understanding the cell origin and developmental signals during mammalian bladderdevelopment.” 55th Annual Meeting of theJapanese Society of Developmental Biologists,
2022. 06. 01，金沢文化ホール, 金沢市[ 8 ] Yukari Usuda, Yuya Aoto, Tomoko Horinouchi,
Tomohiko Yamamura, Kandai Nozu, Kazumoto
Iijima, Minoru Takasato “Generating Kidney Organoids from Nephrotic Syndrome Patients-derived
iPSCs” 55th Annual Meeting of the JapaneseSociety of Developmental Biologists, 2022. 06. 01，
金沢文化ホール，金沢市