転写因子 Nrf3 を標的としたシミ予防研究へのHIV-1 プロテアーゼ阻害剤リポジショニング
同志社大学生命医科学部医生命システム学科遺伝情報研究室和久剛

Melanin is a pigment produced from the amino acid L-Tyrosine in melanosomes. The CNC-family transcription factor
Nrf3 is expressed in the basal layer of the epidermis, where melanocytes reside. Our previous in vitro study using mousemelanoma B16F10 and human normal melanocytes showed that Nrf3 promotes melanogenesis by upregulating the coremelanogenic gene circuit, which includes Mitf, Tyr, Tyrp1, Pmel, and Oca2. Nrf3 also induces the gene expression ofseveral autophagosome-related factors for melanin precursor uptake by macropinocytosis, an evolutionarily-conserved
fluid-phase form of endocytosis. In parallel, Nrf3 prompts autophagic degradation of melanosome for melanocyte survival.
Furthermore, Nrf3-mediated melanin production is suppressed by an HIV-1 protease inhibitor nelfinavir (NFV). Here, weinvestigated the anti-melanogenic effect of NFV by histological and gene expression analyses using a mouse model of UVinduced hyperpigmentation. In this model, C57BL/6 mice were exposed to 130 mJ/cm2 UV once every two days for 2weeks. For the next 2 weeks of UV treatment, 10 μM NFV was topically applied to the right ear (UV+NFV), while the left
ear received either vehicle oil (UV). Then, mouse ear specimens were fixed in formalin and embedded in paraffin. Brightfield microscopy images of none stained paraffin section were used for melanin quantification. We found that NFV treatment
attenuates UV-induced melanin accumulation. Furthermore, we confirmed that NFV treatment suppressed the UV-induced
gene expression of core melanogenic and autophagosome-related factors, including Mitf, Tyr, and Cln3. These results
indicate the anti-melanogenic potential of NFV in vivo.

１．緒Pmel 17（Pmel）などのメラノサイト構造マトリックスタ

言

ンパク質の遺伝子発現などメラニン生成のマスター転写因

皮膚は、紫外線（UV）照射、環境汚染、乾燥など、様々子として機能する 5）。Mitf は、Mitf-A、Mitf-C、Mitf-H、な有害刺激に対する物理的バリアとして機能している 1 , 2）。

Mitf-M の少なくとも 4 つのアイソフォームから構成され

特に、過度の紫外線照射は DNA 損傷や遺伝子変異を引きている。Mitf-M はメラノサイトにのみ発現し、このアイ起こし、皮膚がんの発生につながる。そこで、皮膚は表皮ソフォームを欠くマウスは表皮と毛包にメラノサイトがなの基底細胞層にあるメラノサイトで作られる天然色素のメいことが知られている 6）。

3）

ラニンを使って、過剰な紫外線から身を守っている 。

メラノソームの形成は多段階にわたる。まず、Pmel タ

メラニン生成は、遺伝子発現、酵素反応、膜輸送を含むンパク質は、初期エンドソームと呼ばれる色素を含まないメラニン生成カスケードとして知られている 3）。メラニン

ステージ I および II のメラノソームでフィブリル構造を形生成カスケードは、メラノサイト内においてメラニン生成成する。その後、Tyr と Tyrp 1 タンパク質がトランスゴの内因性誘導物質として機能する α -メラノサイト刺激ホルジからエンドソーム膜に選別され、メラニン生成が開始ルモン（αMSH）に応答して、G タンパク質共役型受容体される。このメラニン生成は、ステージ III および IV のメであるメラノコルチン 1 受容体（MC 1 R）が活性化するこ

ラノソームの Pmel フィブリルに豊富に存在している。こ4）とによって始まる 。そして、活性化された MC 1 R はア

れらの知見は、多くのメラニン生成成分がエンドソーム起デニル酸シクラーゼに細胞内の環状アデノシン一リン酸源であることを示唆している 7 - 9）。Tyr タンパク質はメラ（cAMP）の増加を促し、cAMP シグナル伝達経路を介しニン合成の律速酵素であり、アミノ酸 L- チロシン（L-Tyr）てメラノサイト誘導転写因子（Mitf）の遺伝子発現を誘導から L-DOPA、さらにメラノソームへの仕分け後に L- ドする。Mitf タンパク質は、チロシナーゼ（Tyr）やチロシーパキノンを触媒する 10）。さらに、陰イオン輸送体タンナーゼ関連タンパク質 1（Tyrp 1）などのメラニン生合成パク質と考えられている眼皮アルビニズム 2 型（Oca 2、別酵素チロシナーゼファミリーや、メラノサイトタンパク質

名 P for pink-eyed dilute）は、メラノソームの pH を調節

Drug Repositioning of a HIV-1 Protease
Inhibitor as an anti-melanogenic reagent targeting Nrf 3してメラニンを生成するのに必須である 11 , 12）。
NRF 3 は CNC-bZip ファミリーに属する転写因子の一つとして同定され、そのホモログには NRF 1 および NRF 2

Tsuyoshi Wakuが存在する 13）。通常、NRF 3 は小胞体膜に繋留されておLaboratory for Genetic Code, Department of Medical Life Systems, Facultyof Life and Medical Sciences, Doshisha
Universityり、ERAD ユビキチン結合酵素 HRD 1 によるユビキチン・プロテアソーム系によって分解されている 14）。しかしアミノ酸欠乏などのストレスに応答して、NRF 3 はアスパ

− 149 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

ルチルプロテアーゼ DNA-damage-inducible 1 homolog 215）

介組織はエタノール / キシレンで置換し、その後パラフィ。次に、切断された Nrf 3ンブロック中に耳介組織を包埋した。ミクロトームを用タンパク質は核内に移行し、小 MAF（sMAF）タンパクいて 6 µm に薄切し、組織切片を作製した。組織中のメラ質とヘテロ二量体を形成する。その後、NRF 3 -sMAF 複ニンとして、未染色の明視野像に観察される黒色領域を合体はゲノム DNA 中の抗酸化応答配列に結合し、下流のImageJ で定量した。

（DDI 2）によって切断される遺伝子の発現を誘導する 13）。また我々は、HIV- 1 プロテアーゼ阻害剤が DDI 2 の酵素活性を阻害する、すなわちNRF 3 の阻害剤として機能する可能性を見出している

16）

定量的リアルタイム PCR。

Isogen II（ナカライテスク）を用いて、未固定の耳介組織

興味深いことに、マウスではケラチノサイトやメラノサからTotal RNAを精製した。次にM-MLV RTase（Invitrogen）

イトが存在する表皮基底層で Nrf 3 が高いレベルで発現を用いてcDNAを合成した後に、TB Green Premix Ex Taq

し、さらにケラチノサイトにおける Nrf 3 の紫外線誘発アⅡ（TaKaRa）を 用 い て リ ア ル タ イ ム PCR を 行 っ た。 各17）

ポトーシス効果を報告があった。近年、我々はマウス

遺 伝 子 の mRNA 量 は ΔΔCt 法 で 数 値 化 し た 後、β-actin

メラノーマやヒトメラノサイトを用いた in vitro 解析から、mRNA 量で標準化した。使用したプライマー配列は表 1

Nrf 3 が Mitf や Tyr, Tyrp 1 , Oca 2 といった既知のメラニに示す。

ン産生遺伝子の発現を誘導することでメラニン産生を促進

３．結していることを見出した。また興味深いことに、Nrf 3 は複数のオートファジー因子（Cln 3 , Ulk 2 , Gabarapl 2）も同時に発現誘導し、メラニン前駆体の細胞内取り込みやメラノ果

NFV は UV 照射マウス耳介組織におけるメラニン蓄積を減弱できるーマ細胞の生存に寄与していることも明らかにしている 18）。

Nrf 3 は通常、小胞体にアンカーされており、タンパク

そこで本研究では、この Nrf 3 - メラニン産生経路を標的と質切断を受けることで活性化する転写因子である。このした新たなシミ予防の可能性を検討するため、Nrf 3 阻害

Nrf 3 のタンパク質切断を担う酵素がアスパルチルプロテ効果を期待できる HIV プロテアーゼ阻害剤ネルフィナビ

ア ー ゼ DDI 2 で あ る。X 線 結 晶 構 造 解 析 か ら、DDI 2 はル（NFV）のメラニン産生抑制効果を in vivo で検証した。

HIV- 1 プロテアーゼと類似した酵素活性ドメインを有し2．方ていることが明らかになっている 19）。HIV- 1 プロテアー法

ゼは、後天性免疫不全症候群（AID S）の発症原因となるUV 照射マウスモデル作製と薬剤処理

ヒト免疫不全ウイルス（HIV）が持つプロテアーゼである。

19 - 21）。4 週 齢 の C 57 BL/

そのため、これまでに様々な HIV- 1 プロテアーゼ阻害剤

6 NCrSlc マウス（清水実験材料）に、130 mJ/cm 2 の強度が開発され、AIDS治療薬として臨床利用されてきた。我々で 2 日に 1 回 UV を照射した。UV 照射には、Handy UVは先行研究において、Nrf 3 によるメラニン産生の促進が、先行研究を参考に実施したLamp（ ア ズ ワ ン 254 nm suv- 4）を 用 い た。14 日 以 降 はHIV- 1 プロテアーゼ阻害剤の１つであるネルフィナビル

UV 照射直前に、10 µM NFV を右耳介に塗布し、左耳介（NFV）によって減弱することを、マウスメラノーマ細胞には溶媒のみを塗布した。溶媒には、1 % プロピレングリ

B 16 F 10 を用いた in vitro 解析から見出している。しかし

コール : エタノール（5：3）混合溶液を用いた。NFV 塗布

NFV が in vivo においても同様のメラニン産生抑制効果をして 14 日後に耳介を回収した。またコントロールとして、有するのかは未だ不明であったため、本研究では UV 照射

UV 照射しない同系同週齢マウスの耳介を用いた。

マウスモデルを用いて検証した。まず C 57 BL/ 6 NCrSlc マウス（4 週齢）に、130 mJ/cm 2 の強度で 2 日に 1 回 14 日間パラフィン切片作製とメラニン定量

UV を照射した。その後は、UV 照射直前に 10 µM NFV を耳介組織を 4 ％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液右耳介に塗布し、左耳介には溶媒のみを塗布した。NFV（Wako）に浸漬し、4 ℃で 24 時間固定した。固定後の耳塗布して 14 日後に耳介を回収した。またコントロールと表1

リアルタイム PCR プライマー配列− 150 −

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して、UV 照射しない同系同週齢マウスの耳介を用いた。

ていた 18）。そこで UV 照射マウス耳介において、これら 3

これらの耳介組織をパラホルムアルデヒドで固定した後つの遺伝子（Mitf, Tyr, Cln 3）の発現が NFV 塗布によってにパラフィンブロックを作成し、ミクロトームを用いて変動するのか検討した。まず上述と同様にマウス耳介組織6 μm の組織切片を作製した。次いで組織中のメラニンとを回収し、表１に示すプライマーを用いて定量的リアルタして、未染色の明視野像に観察される黒色領域を定量比イム PCR を行った（図 2）。その結果、Mitf, Tyr, Cln 3 の較した（図 1 A）。その結果、耳介組織中のメラニンは UV３遺伝子すべての mRNA 量が UV 照射で増加し（Ctrl vs.

照射によって増加した（図 1 B, Ctrl vs. Vehicle）。しかし、Vehicle）、さらに NFV によって減少することを明らかに

このメラニン増加は NFV 塗布によって減弱した（図 1 B,した（Vehicle vs. NFV）。この結果は、NFV が Nrf 3 を阻

Vehicle vs. NFV）
。この結果は、NFV は UV 照射によるメ害してメラニン産生を抑制していることを示唆している。

ラニン蓄積を抑制できることを示している。

４．考察

NFV は耳介組織でも Nrf 3 - メラニン産生経路に関与する遺伝子発現を抑制する剤のシミ予防研究へのリポジショニングを目的としている。

上述したマウス耳介の組織学的解析から、NFV が UVUV 照射モデルを用いた組織学的解析の結果、NFV は皮膚照射によって誘導されるメラニン産生を減弱できることをにダメージを及ぼすことなく UV 照射によるメラニン蓄積見出した。そこで次に、NFV が Nrf 3 - メラニン産生経路を抑制できることを明らかにした。また遺伝子発現解析のを阻害できているのかを検討した。マウスメラノーマ細胞

結果、NFV は Nrf 3 を阻害してメラニン産生を抑制していやヒトメラノサイト細胞を用いた先行研究から、Nrf 3 はる可能性を見出した。しかし今回行った遺伝子発現解析でMitf や Tyr のメラニン産生遺伝子に加え、オートファジは、耳介組織を全て用いているため、メラノサイトとケラー関連因子である Cln 3 も発現誘導していることを見出しチノサイトは区別できない。さらにマウス個体への NFV

図1

本研究は、Nrf 3 抑制効果のある HIV- 1 プロテーゼ阻害

UV 照射マウス耳介組織のメラニン量に NFV 塗布が及ぼす影響（A）各マウス耳介組織の代表的な明視野像。四角で囲った領域の拡大像を下段に表示した。
（Ctrl：コントロール、Vehicle：溶媒のみ、NFV：10 μM NFV 塗布）（B）各マウス耳介組織のメラニン定量（n= 3 , mean±SD）

図2

UV 照射マウス耳介組織における遺伝子発現解析（n= 3 , mean ± SD）（Ctrl：コントロール、Veh：Vehicle/ 溶媒のみ、NFV：10 μM NFV 塗布）− 151 −

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塗布が、実際にメラノサイト内の Nrf 3 タンパク質切断を

5） Hida, T. et al. Elucidation of melanogenesis cascade

阻害できているのか確認できていない。そこで今後は、マfor identifying pathophysiology and therapeutic

ウス耳介からメラノサイトを単離して解析する必要がある。

approach of pigmentary disorders and melanoma.

また NFV が耳介の皮膚構造に及ぼす影響や、NFV 以外のInternational Journal of Molecular Sciences 2 1, 1-2 3（2020）

HIV- 1 プロテアーゼ阻害剤も検討する必要がある。
美意識の変化から女性のみならず男性も皮膚の健康、特6） Flesher, J. L. et al. Delineating the role of MITFに美白需要が高まってきている。現在、これらのメラニン

isoforms in pigmentation and tissue homeostasis.

産生経路を標的に、効率的にメラニン蓄積を予防・改善で

Pigment Cell and Melanoma Research 3 3, 2 7 9-2 9 2

きる方法が求められている。シミ（色素斑）の原因は日光（2020）性と加齢性に大別される。日光性色素斑は日焼けに代表さ

7） Hossain, M.R. et al. Diversified stimuli-inducedれるもので、強い紫外線を含む日光を長時間浴びることがinflammatory pathways cause skin pigmentation.

引き金となる。また加齢性色素斑は、わずかな紫外線でもInternational Journal of Molecular Sciences 2 2, 3 9 7 0

メラニンが過剰に作られやすくなることや（紫外線感受性（2021）の増加）、メラニンを含む皮膚細胞が垢となって剥がれ落

8） O h b a y a s h i , N . e t a l . R e c e n t a d v a n c e s i n

ちることなく長期間皮膚に留まり続けること（皮膚細胞のunderstanding the molecular basis of melanogenesis

ターンオーバー低下）が原因であると考えられている。現in melanocytes. F1000Res. 9, F1000 Faculty Rev-608

在、日光性色素斑の予防を目的とした数多くの日焼け止め（2020）製品が市販されており、その主成分は、紫外線が皮膚に入

9） Raposo, G., and Marks, M.S. Melanosomes - dark

り込むのを防止する紫外線吸収剤と紫外線散乱剤である。

organelles enlighten endosomal membrane transport.

一方の加齢性色素斑の予防には、トラネキサム酸などで紫Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 7 8 6-7 9 7

外線感受性を低下させることが有効である。またビタミン（2007）

C 誘導体やコウジ酸のように、Tyr の酵素活性やメラノソ10）Eisenhofer, G. et al. Tyrosinase: a developmentallyーム形成を低下させることで、メラニンの産生や蓄積を抑specific major determinant of peripheral dopamine.

制することも美白効果が認められている。このような紫外The FASEB Journal 17 , 1248 - 1255（2003）

線の入り込み防止や感受性低下、律速酵素やメラノソーム

11）Brilliant, M.H. The mouse p（pink-eyed dilution）の阻害を目的とした既存製品とは異なり、本研究で着目しand human P genes, oculocutaneous albinism type

た HIV- 1 プロテアーゼ阻害剤は Nrf 3 活性を阻害すること

2（OCA 2）, and melanosomal pH. Pigment Cell andでメラニン産生を包括的に抑制できる可能性がある。またMelanoma Research 14 , 86 - 93（2001）

HIV- 1 プロテアーゼ阻害剤と既存製品の併用は、紫外線12）Grønskov, K., Ek, J., and Brondum-Nielsen, K.

を防止しつつ多層的にメラニン産生を抑制し日焼けや加齢

Oculocutaneous albinism. Orphanet Journal of Rareに伴うシミの原因となるメラニン蓄積を強力に阻害できる、

Diseases 2 , 43 - 48（2007）

より有効なシミ予防・美白製品の開発につながると期待で13）K o b a y a s h i , A . e t a l . M o l e c u l a r c l o n i n g a n dfunctional characterization of a new Cap’ n’ collar

きる。

family transcription factor Nrf 3 . Journal of Biological（引用文献）

Chemistry 274 , 6443 - 6452（1999）

1） Ovaere, P. et al. The emerging roles of serine14）Chowdhury, AMMA. et al. Multiple regulatory

protease cascades in the epidermis. Trends inmechanisms of the biological function of NRF 3

Biochemical Sciences 34, 453-463（2009）（NFE 2 L 3）control cancer cell proliferation. Scientific2） Hsu, Y. C., Li, L. & Fuchs, E. Emerging interactions
between skin stem cells and their niches. NatureReports 7（2017）,15）Hirose, S. et al. NRF 3 activates mTORC 1 argininedependently for cancer cell viability. iScience 2 6 ,Medicine 20, 847-856（2014）

106045 - 106045（2023）

3） D’ Mello, S. A. N. e t a l . Signaling pathways inmelanogenesis. International Journal of Molecularpotentiates cytotoxicity of proteasome inhibitors.

Sciences 17, 1144（2016）
4） T h o d y , A . J . α - M S H a n d t h e r e g u l a t i o n o fmelanocyte function. Annals of the New York Academyof Science 885, 217-229（1999）

16）Gu, Y. et al. Nelfinavir inhibits human DDI 2 andCellular Signalling 75 , 109775（2020）17）Siegenthaler, B. et al.（2 0 1 8）Nrf 3 promotes UVinduced keratinocyte apoptosis through suppression− 152 −

転写因子 Nrf3 を標的としたシミ予防研究への HIV-1 プロテアーゼ阻害剤リポジショニングof cell adhesion. Cell Death & Differentiation 25 , 1749 -20）Fang, Y. et al. Spherical Nucleic Acids for Topical
Treatment of Hyperpigmentation. Journal of the1765 .
18）Waku T. et al. The CNC-family transcription factor

American Chemical society 143 , 1296 - 1300（2021）Nrf 3 coordinates the melanogenesis cascade through21）Patzelt, A. et al. In vivo investigations on themacropinocytosis and autophagy regulation. Cell

penetration of various oils and their influence on theReports 42 , 111906（2023）

skin barrier. Skin Research and Technology 1 8 , 3 6 4 369（2012）19）Kumar, KJS. et al. In Vitro and In Vivo Studies
Disclosed the Depigmenting Effects of Gallic Acid: A22）Sivá, M. et al. Human DNA-Damage-Inducible 2

Novel Skin Lightening Agent for HyperpigmentaryProtein Is Structurally and Functionally Distinct fromSkin Diseases. International Union of Biochemistry andIts Yeast Ortholog. Scientific Reports 6 , 30443（2016）

Molecular Biology 39 , 259 - 270（2013）− 153 −