〈第 64 回 静岡県学生科学賞県科学教育振興委員会賞〉

真菌類の環境ＤＮＡ検出による生育種の判別に関わる研究～森林生態系の生物調査の手法の開発～
静岡県立掛川西高等学校
自然科学部 2 年
１ 動機
森林生態系には昆虫類、鳥類、土壌動物などが生息している。私たちはこの中でも真菌類に属するうちの特に担子菌類と子嚢菌類を研究対象とした。これらの中には他の昆虫に寄生するもの、菌根菌、腐朽菌などがいる。これらの胞子を環境 DNA として検出できれば森林生態系の状態や宿主等の動物を含めた生物の生息域を分子生物学的に把握することができるのではと考えた。そこで本校独自に作成した空中微粒子採取装置を用いて空気中に浮遊する胞子に由来する DNA を検出し、その地域に生育する担子菌類、子嚢菌類の種を特定しようと考えた。なお担子菌類、子嚢菌類は胞子を放出するため、空気中に浮遊する DNA は胞子に由来するものとした。昨年度の研究では空気中から胞子に由来するシイタケの特異的な増幅長が確認できていることから、空気中から担子菌類の DNAは検出可能であり、応用することとした。

空中微粒子採取装置の仕組み

シイタケ農園で装置を設置した様子

２ 研究方法
（1）実験１ 担子菌類の子実体からの DNA の増幅
子実体の内部を切り取り、DNA 抽出試薬として UniversAll Extraction BufferⅡを 25μＬ加え、95℃で加熱し、５℃で遠心分離を行った。この上澄み液を DNA 抽出液とした。DNA 抽出液１μＬに DNA ポリメラーゼとして KOD One® PCR Master Mix 25μＬ、滅菌蒸留水 22μＬ、プライマー２μＬを加えて図１の温度サイクルで PCR 法による DNA 増幅を行った。今回 PCR 法に使用したプライマーを図２に示す。なお、プライマーについては、九州大学農学部の宮崎和弘博士に情報を提供して頂いた。このプライマーは IGS1 領域を増幅するもので、シイタケの品種識別に使われており、シイタケの安定した DNA の増幅が確認されているため、使用することとした。
その後アガロースゲルを用いた電気泳動法により DNA の増幅の確認を行った。
昨年度は市販されている静岡県産シイタケ・シメジ・エリンギ・ヒラタケ・マッシュルーム・マ
イタケ・エノキ・キクラゲ、そして中国産マツタケの９種を試料とした。
また本年度は自然界に生息する担子菌類として静岡県磐田市桶ヶ谷沼で採取した 21 種の中で、同定できた 10 種（図３，４）と富士山周辺に生息していた 11 種の中で、同定できた９種（図５）を試料とした。昨年度はアガロースゲル濃度を３％としたが、濃度を下げて泳動速度を上げることによって、増幅長の違いを明確にすることが可能となるため、本年度は２％とした。

1

F 5’-TTGCAGACGACTTGAATGG-3’
R 5’-TAGGATTCCCGCGTGGTCCCCCA-3’
図２

図１

図３ カワラタケ

図４ キアミアシイグチ

図５ ホウキタケ（２）実験２ マツタケの生育場所発見への挑戦
2019 年９月～11 月に静岡県 小笠地区の２つの山（それぞれを山 A、山 B とする）の山中にあるアカマツ林において各４地点（①～④）で 16 時間空気を採取した。
山 A はマツタケの生育が一般にはほとんど知られていないが、地元の人から過去の生育情報が得られたため、採取を行った。山 B はマツタケの生育が知られていないが、マツタケの生育条件であるアカマツの生育が確認できたため、生育の可能性が高い場所だと考え、採取を行った。なお、環境保護の観点から調査場所の詳細は明記しない。
（３）実験３ 子嚢菌類の DNA 増幅に用いるプライマーの検討
子嚢菌類である冬虫夏草属は他の生物に寄生をするためこの関係性を用いた宿主の生息域調査が可能だと考えた。そのため、種によって DNA 増幅長に差があらわれるプライマーの検討から始めた。静岡昆虫同好会 NPO 静岡県自然史博物館ネットワークの福井順治様に提供していただいた
セミタケ、ツブノセミタケ、カメムシタケの３種を試料とし、図２のシイタケの品種識別に使われていたプライマーを使用して菌体からの DNA の増幅を試みた。また、琉球大学の松浦教授に情報を提供して頂いたセミ類の冬虫夏草から安定した DNA の増幅が可能なプライマー(プライマー１，２，３)、参考文献４から情報を入手したカメムシタケの特異的なプライマー(プライマー４)を用いることにした。
プライマー１ Ｆ ５′-GAAACTGCGAATGGCT-３′

Ｒ ５′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-３′

プライマー２ Ｆ ５′-GTCTACCACCCGGGCTT-３′

Ｒ ５′-GGCATGTCGTTGTCCAT-３′

プライマー３ Ｆ ５′-CCGGCCACCGTGACTTCAT-３′

Ｒ ５′-ATGACACCGACGGCAACGGTCTG-３′

プライマー４ Ｆ ５′-TCGGCAGGTATTTCTTCGGAGTAC-３′ Ｒ ５′-ATTGCTTGCTTCTTATTTTAG-３′

図６（４）実験４ 真菌類の空中からの環境 DNA の検出と野外採取

冬虫夏草の会の会員の方に協力していただき静岡県内で発見された冬虫夏草属と、発見場所の表を入手し、これを元に、試料を入手することが出来たツブノセミタケ、カメムシタケの県内生息地を図７にまとめた。入手した表によると県内ではセミタケは確認されていなかった。また、私たちの学校が位置する掛川市ではツブノセミタケ、カメムシタケも確認されていなかった。そこで、冬虫夏草属が生息しているとされる「鎮守の森」がある掛川市内の神社に空中微粒子採取装置を設置し、調査を行った。また、「鎮守の森」に指定されている掛川市内の山にも装置を設置した。この山にはアカマツ林があるためマツタケの調査も同時に行い、生息していた担子菌類４種を採取し、DNA の増幅を行った。なお種を同定することが出来なかったため、今回の論文では採取した４種を担子菌類１、担子菌類２、担子菌類３、担子菌類４と記載する。
DNA の増幅には静岡県立大学の河原崎先生から情報を頂いたマツタケの特異的なプライマー(図18)と図２のシイタケの品種識別に使われていたプライマー、図６のセミ類の冬虫夏草属の安定した DNA の増幅が可能なプライマーを使用した。
2カメ
ム
シタケ

３ツブ
ノセミ
タケ

図８ 担子菌類１

図７

図９ 担子菌類３

実験結果
実験１のシイタケの子実体の泳動結果を図 10 に示す。目的の増幅長である 1000bp のバンドが確認でき、今回の DNA の増幅方法は有効であることが分かった。
1000bpNC･･･ネガティブコントロールの略 DNA 抽出液の代わりに滅菌蒸留水を１μL 加えた

図 10

実験１のシイタケ以外の８種類の担子菌類の子実体の電気泳動結果を図 11 に示す。
今回使用したシイタケの品種識別に使われていたプライマーは担子菌類の種類によって、DNA 増幅長が担子菌類の種によって異なった。
担子菌類の種ごとの DNA 増幅長を表１にまとめた。

マツタケ

シ エ ヒ マッメ リ ラ シジ ン タ ュギ ケ ル

図 11ームマ エ キイ ノ ク
タ キ ラケゲ

DNA 増幅長（bp）
約 1000約 850
約 800
700~750
約 600
約 600
約 600
約 500
約 400

担子菌類の種類
シイタケ
キクラゲ
エノキ
マイタケ
マッシュルーム
ヒラタケ
エリンギ
シメジ
マツタケ

表１

自然界の担子菌類の DNA 電気泳動結果を図 12 に示す。ツチカブリ、カワラタケ、ハチノスタケ、キアミアシイグチ、アイシメジ、オニナラタケ、ホウキタケ、ヤマイグチ、ショウゲンジの９種について DNA の増幅が確認された。この実験で昨年度の市販のキノコに加え、自然界の担子菌類についても種によって DNA の増幅長が異なるということが確認できた。

1000bp
800bp

8
ハチノス
タケ

図 12

キア
ミア
シイグチ

担子菌類の種類

ＤＮＡ増幅長(bp)

ツチカブリ

約 1500カワラタケ

約 1250ショウゲンジ

約 1250

ハチノスタケ

約 1000

オニナラタケ

約 900

キアミアシイグチ

約 800

ホウキタケ

約 600

アイシメジ

約 400

ヤマイグチ

400～700

表２3山 A・B での空気中試料の電気泳動結果を図 13 に示す。A・B どちらの山の空気中試料からもマツタケの DNA 増幅長と同じ 400bp の DNA 増幅長が確認できた。さらに山 B では装置設置後と回収後の２回、周辺の調査を行ったところ装置設置後にマツタケの子実体を発見することができた。(図 14)

図 13

図 14

このことから山 B では子実体の発見と DNA 検出結果が一致したことが分かり、今回の調査方法はマツタケにも有効であることが考えられた。また、山 B はマツタケの生育が知られておらず、本研究で新たな生育場所を発見することができた。
実験３では図２のシイタケの品種識別に使われていたプライマーでは子嚢菌である冬虫夏草属の増幅は確認できなかった。安定した増幅が可能と言われるプライマー（図６）では増幅をすることが出来た。今回の実験では種によって DNA の増幅長が異なるということまでは分からなかった。
①ツブノ②セミタケ

セミタケ

①②③

図 15

ＮＣ③カメムシタケ

プライマー1約800bp―

約1000bp

プライマー2―約800bp

約800bp

プライマー3――

約1000bp

プライマー4――約300bp表３

実験４の掛川市内の山、神社の空中からの検出では山、神社のどちらでも図２のシイタケの品種識別に使われていたプライマーを用いてDNAの増幅が確認できた。またどちらでもマツタケのDNA増幅長と一致する400bpのDNA増幅長が確認できた（図16）。しかし、セミ類の冬虫夏草属の安定したDNAの増幅が可能なプライマーを用いて、増幅することはできなかった。また、マツタケであることを特定する特異的なプライマーでもDNAの増幅が確認できなかった。
シイタケの品種判別のプライマーでは、採取されたキノコである担子菌類１の菌体のDNA増幅長がマツタケと同じ400bpであったため、空気中試料から得られた400bpのDNAはこれに由来するDNAであると考えられる。マツタケであることを特定する特異的なプライマーで検出できなければ、他のプライマーで、マツタケと同じ塩基長でもマツタケとは断定できないことが分かった。

DNA増幅長（bp）

図 16

図 17

F プライマー GAGACACAACGGCGAGATT
R プライマー ACCCTTACCCGCTCAGT
図 184

担子菌類１約400

担子菌類２約800

担子菌類３約450

担子菌類４約900
表５４. 考察
今回使用したシイタケの品種識別に使われていたプライマーは担子菌類の種によって特異的なDNA 増幅長を示した。
さらに本年度行った自然界の担子菌類を用いた実験からシイタケの品種識別に使われていたプライマーを用いれば自然界の担子菌類でもDNAの増幅を出来ることが確認できた。また自然界の担子菌類でもDNAの増幅長が種によって異なるということも分かった。
静岡県内の２つの山の野外調査より、今回の調査方法を用いれば絶滅危惧種に認定されたマツタケや、希少な担子菌類の新たな生育域の特定が可能であることが考えられる。
希少な担子菌類の生育場所を特定するのに、これまで経験則による観察調査が主だったが、本研究で用いた手法に、さらに特異的に種を判別するプライマーを組み合わせたり、シーケンス技術を加えたりすることで新しい特定方法になる。
冬虫夏草属についてはセミ類に寄生する冬虫夏草属から安定したDNAの増幅が可能なプライマーを用いたことで３種の子嚢菌類のDNAの増幅が確認できた。しかし種によってDNA増幅長が異なるということまでは分からなかった。
今回装置を設置した場所の空中からは、シイタケの品種判別のプライマーによって特異的な塩基長を示す担子菌類が得られ、その一つはマツタケと同じ塩基長であったがそれはマツタケとは異なる担子菌類であったためマツタケ、冬虫夏草属が生息している検証はできなかった。
５. 今後の展望
空気中に浮遊する胞子に由来する DNA が検出可能な距離について引き続き調査を進め、実用可能な方法へと発展させていく。また、対象の担子菌類の種を増やし、使用するプライマーを増やすことで、増幅長に見られる種との関係性を明らかにしていく。種との関係性が明らかになれば、野外で装置を用いた森林生態系の調査を行っていきたい。
冬虫夏草属については今回の実験では種による DNA 増幅長の差は確認できなかった。今後はデー
タ数 を増やし、種と DNA 増幅長の関係性を明らかにしていきたい。
６. 謝辞
シイタケの品種識別に使われていたプライマーの情報を提供していただいた九州大学農学部・宮崎和弘博士、セミタケ、ツブノセミタケ、カメムシタケの提供や桶々谷沼での採取に同行し案内してくださった静岡昆虫同好会NPO静岡県自然史博物館ネットワークの福井順治様、マツタケの特異的なプライマーの情報を提供してくださった静岡県立大学の河原崎先生、琉球大学にお礼を申し上げます。
７. 参考文献
１．空中環境DNAを使った鳥類調査方法の確立 （掛川西高校自然科学部 2018年）
２．IGS1 領域の塩基配列データを利用したシイタケ品種の識別について(宮崎和弘 平成 24 年)
３．セミの共生菌は冬虫夏草由来－寄生関係から共生関係への進化を実証(国立研究開発法人
産業技術総合研究所、国立大学法人 琉球大学)
４．冬虫夏草菌カメムシタケの寄主、形態および遺伝的特性に関する研究(佐々木 史)

5