化粧品基材に利用可能なペプチド界面活性剤のバクテリア合成系構築
名古屋工業大学大学院工学研究科

水野稔久

Our aim is to create a bacterial synthesis system for the peptide gemini (PG)-surfactants, previously known for theirantibacterial properties. We focused on the Polymyxin B synthesis enzyme, structurally similar to our target PG-surfactants.
This enzyme, part of the non-ribosomal peptide synthesis (NRPS) family, comprises ten modules, each with an A domain
for substrate amino acid adenylation, a T domain for conversion to thioester form, and a C domain for peptide chainelongation. To adapt this enzyme for PG-surfactant synthesis, we needed to modify the A domain's substrate amino acids
to cysteine derivatives with alkyl chains. Prior studies suggested A domain mutation allows this conversion, yet details on
the Polymyxin B A domain structure and crucial amino acids were scarce. In our study, we cloned and sequenced the ten
Polymyxin B enzyme modules from P. polymyxa NBRC3020, expressed them in E. coli, purified the proteins, and tested
each A domain's adenylation activity. We confirmed their ability to adenylate the respective substrate amino acids. Next, toactivate modified cysteine derivatives with C1, C2, or C3 alkyl chains to SH groups, we introduced mutations in the 10th
module's A domain. Our results showed these mutations successfully enabled the adenylation of these modified cysteine
derivatives.

１．緒

そこで本研究では、比較的安価に単鎖ペプチドの生産が言可能な「バクテリアの非リボソームペプチド合成（NRPS）
3）「マイクロプラスチック問題」や「オーガニック志向」な風系」 に着目し、新たな生産技術の開発に取り組む。具体

潮から、化粧品基材が天然由来成分であることや生分解性的には、「抗菌性 PG-surfactant」に構造類似した抗生物質を持つことは、環境面への配慮のみならず利用者の健康面

Polymyxin B を生産可能な NRPS 合成酵素への変異導入にからも需要は高い。界面活性剤は化粧品に必須の基材であより、「抗菌性 PG-surfactant」の生産を可能とする組換えるが、アミノ酸やペプチドを極性基として含む界面活性バクテリア構築を最終的には目指したい。しかしこのた剤はこの要件を満たす。しかし現状価格が高いため、そのめには、側鎖にアルキル鎖が修飾された Cys 由来の非天利用は限定されている。一方「薬用化粧品」の「有効成分」と然アミノ酸を取り込んだペプチドの合成可能な NRPS 合して、「細胞増殖因子様ペプチド」のような高度な生理活成酵素の開発が必要であった。そこで本研究では、まず性ペプチドの利用も進んでいる。最近我々のグループでPolymyxin B 合成に関する NRPS 酵素の中に含まれる、基は、ペプチドを極性基として持つジェミニ型の界面活性質アミノ酸の活性化に寄与するアデニル化（A）ドメインに剤（PG-surfactant）の研究開発を進めており、低濃度の添関して調査した。次に、この A ドメインへの変異導入に加でも（臨界ミセル濃度 ~ 0.00001wt%）様々な疎水分子をより、側鎖にアルキル鎖が修飾された Cys 由来の非天然水中に分散できる基礎的性質に加え、高い抗菌活性を示アミノ酸を活性化可能な A ドメインの開発に取り組んだ。

す試薬開発に成功した（MIC~ 4µg/mL、以下「抗菌性 PG-

最終的に、Polymyxin B に対する NRPS 合成酵素を持つ P.

1）

surfactant」と呼ぶ） 。更に一部の誘導体については、細polymyxa へこれを組み入れるところまではできなかった

胞毒性なく哺乳類細胞（線維芽細胞や間葉系幹細胞など）にが、側鎖にアルキル鎖が修飾された Cys 由来の非天然アミ効率よく取り込まれるものも見つかっており、種々の生理ノ酸を含む非リボソームペプチド合成を可能とする NRPS

活性ペプチドを細胞内まで送達可能な「細胞膜透過キャリ酵素は天然に存在しないため、多くの示唆を与える結果がア」としての利用も可能である 。しかしこちらの化粧品得られたものと考えている。

2）

基材としての実用化を考えた場合には、生産コストの問題

２．方を解決する必要がある。

法

2 . 1 . 各モジュール遺伝子のクローニングと各モジュールのアミノ酸配列の決定
Construction of Bacterial Synthesis System for peptide gemini surfactants Usable in Cosmetics SubstratesToshihisa Mizuno
Graduate School of Engineering, Nagoya Institute of Technology

P. polymyxa NBRC3020 株 は 独 立 行 政 法 人 製 品 評 価4）

技術基盤機構から入手し、TSBYE を培地に 30 ℃にて一晩培養することで増殖させた。この細菌に表１のプライマーを直接添加して行うダイレクト PCR によって、各モジュール部分の遺伝子クローニングは行った。なお− 58 −

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図 1 Polymyxin B（上、閉環前の構造）と抗菌性 PG-surfactant（下）の化学構造

NBRC3020 株 は 遺 伝 子 情 報 が 存 在 し な か っ た た め、P.
polymyxa E681 株5）の各モジュール部分の遺伝子配列を参考にプライマーは設計した。Gibson Assembly によって、各遺伝子を pET-21d（+）のマルチクローニングサイトに導入し、これを DNA シークエンスすることで各モジュール内のアミノ酸配列は決定した。

2 . 2 . 各モジュールの蛋白質発現と単離精製
各発現ベクターを大腸菌 BL21（DE3）株に導入し、終濃度 0.1 mM と な る よ う に IPTG を 添 加 後、20 ℃、12 時 間の培養条件で蛋白質発現は行った。集菌後、50 mM TrisBuffer（pH 7）に菌を懸濁し、超音波破砕により抽出を行った。ここで上清成分に可溶な蛋白質として得られたモジ
ュールについては、
Ni-NTA His bind resin（ノバジェン社）
を用いて単離精製を行い、限外濾過（Amicon Ultra-4, 分
画分子量 50 kDa）により濃縮を行った。純度確認は、15%SDS-PAGE により行った。

2 . 3 . 各モジュールに含まれる A ドメインのアデニル化活性の評価
モジュール蛋白質（終濃度 10µM）、基質アミノ酸あるい− 59 −表 1 用いたプライマーの DNA 配列

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

はリファレンスとなるアミノ酸（終濃度 1 mM）
、ピロホス

３．結

2ファターゼ（0.2 unit/mL）、MgCl（10mM）、DTT（1 mM）、10% グリセロールを含む 50µL の Tris HCl 緩衝液（50 mM,pH 7.5） を 25 ℃ に 保 ち、 こ こ へ ATP を 終 濃 度 1 mM で6）

果

3 . 1 . モジュール１〜 10 までの遺伝子クローニン
グとアミノ酸配列の決定

添加することにより、酵素反応は開始した 。そのまま

Polymyxin B は 10 個のアミノ酸と、主鎖アミノ基に縮25 ℃ で １ 時 間 反 応 後、Phosphate Assay Kit（BioAssay

合される１個の脂肪酸から構成されており、L-Dab の側Systems 社製）を添加し 25 ℃で 20 分インキュベーション

鎖アミノ基と L-Thr の主鎖カルボキシ基が最後に縮合さすることにより、溶液中に遊離したリン酸イオン濃度の非れることで、環化された目的生成物は合成される。NRPS

色定量を行った。この濃度を元に、間接的に基質アミノ酸酵素全体は、構成する 10 個のアミノ酸に対応する 10 個ののアデニル化割合の定量化を行った。一方でターンオーバ

酵素モジュールが連結された構造を持ち、さらにそれぞれー数 kcat、ミカエリス定数 Km、kcat/Km などは、同様の反のモジュールには基質アミノ酸のアデニル化を担う A ド応を異なる基質アミノ酸濃度、反応時間でそれぞれ測定をメイン、これをチオエステル体として保持する T ドメイン、行い、このプロットデータから得られる反応初速度と、各さらにこれと一つ前の T ドメインにチオエステル体とし基質アミノ酸初濃度のデータを用いた Lineweaver-Burkて保持されている伸長ペプチド鎖どうしを縮合する C ドメ

plot から算出は行った。

インを含む。Polymyxin B の NRPS 合成酵素の各モジュー

410

ルは、pmx A、pmx B、pmx E の３つの遺伝子領域に保持
5）

2 . 4 . 基質アミノ酸認識サイトへの遺伝子変異と S
アルキル化システインを基質アミノ酸として用いたアデニル化活性の評価

ローニングし、それぞれを可溶性蛋白質として得て、さらDNA シークエンス結果により明らかとなった各モジュる。これを勘案し、表 1 に示した DNA プライマーを用いールのアミノ酸配列を元に、Alphafold 2 によって立体構て各遺伝子のクローニングは行った。しかし、モジュール造の推定を行った。

３、４に関しては配列相同性が高いためか、うまくそれぞされている（図 2） 。今回まず、各モジュール遺伝子をクに A ドメインのアデニル化活性を評価可能する必要があれの遺伝子部分のクローニングができなかった。しかしこ

2 . 5 . 基質アミノ酸を、アルキル鎖を側鎖修飾された Cys に変換されたモジュール 10 の構築

ちらは遺伝子領域を切り出すための DNA プライマーをさ立体構造予測を元に活性サイトで基質アミノ酸の識別にれる。得られた各モジュール遺伝子は、Gibson Assembly

キーとなっているアミノ酸を特定し、ここへアミノ酸変異によって pET-21d（+）のマルチクローニングサイトに導を行った変異体を構築することで、改変されたモジュー入し、これを DNA シークエンスすることで各モジュール

ル 10 の構築を行った。モジュール 10 の遺伝子に対して変内のアミノ酸配列は決定した。図 3（a）には、一例として異を導入し、2. 2. 〜 2. 3. と同様の方法にて、蛋白質発現、決定されたモジュール７のアミノ酸配列を示し、図 3（b）単離精製、酵素活性評価を行った。には、決定されたアミノ酸配列を元に推定されたモジューらに最適化することで、最終的には達成できるものと思わ

図 2 Polymyxin B の NRPS 合成に関わる遺伝子の配置（合成酵素を構成する１０個のモジュールは、Pmx A、Pmx B、Pmx E の３種類の蛋白質に振り分けられている）− 60 −

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図 3 決定されたアミノ酸配列の例と Alphafold 2 により推定された酵素モジュールの立体構造：（a）
モジュール７（118.3kDa、基質アミノ酸は L-Dab）のアミノ酸配列、（b）
モジュール１（172.0kDa、基質アミノ酸は L-Dab）、モジュール５（124.6 kDa、基質アミノ酸は L-Dab）、モジュール８（118.3 kDa、基質アミノ酸は L-Dab）、モジュール９（119.3kDa、基質アミノ酸は L-Dab）の推定立体構造

ル 1、5、8、9 の立体構造を示した。いずれのモジュールッファーへの抽出を試みたが、上清画分として得られたのについても、含まれると想定されていた A, T, C ドメインはモジュール 1、5、6、8、9、10 のみであった。モジューなどを含むことがわかり、目的とする各モジュール遺伝子ル２については、Pmx E の一部をモジュール単位で切りのクローニングができていることが示された。また、各モ出す形となるが、クローニングされたシークエンス結果かジュールのアミノ酸情報の報告がある P. polymyxa E681

らは、モジュールの全遺伝子領域は確実に取り出せていた。

株と配列相同性を評価したところ、A ドメインについてはこの結果は、Polymyxin B の各酵素モジュールを水溶性蛋90% 以上の高い相同性を持っていることがわかった。

白質として得るためには、単純にモジュール単位で切り出して蛋白質発現するのではダメな場合もあるということが3 . 2 . 酵素モジュールの大腸菌を用いた蛋白質発現と単離精製わかった。上清画分に得られた酵素モジュールに関しては、各モジュールの発現ベクターを大腸菌 BL21（DE3）株に後のアデニル化活性の評価に十分な純度で得られたことを導入し、蛋白質発現と単離精製に取り組んだ。まず IPTG

SDS-PAGE 分析により確認した（図４（b）には一例として、添加による発現誘導を行ったところ、いずれのモジュールモジュール 1、6 の結果を示す）。

His-tag を用いたアフィニティーカラム精製を行い、そのについても大腸菌による十分な生産量での異種発現が可能であることが分かった（図４（a））
。しかしその後、各酵素モジュールの単離精製のため、超音波処理による破砕バ

3 . 3 . 大腸菌を用いた各モジュールの蛋白質発現、そこに含まれる A ドメインの活性評価モジュール 1、5、6、8、9、10 に含まれる A ドメインのアデニル化活性に関して、評価を行った。各モジュールに特異的な基質アミノ酸、これに構造類似性の高いもの、あるいは Polymyxin B に含まれる他のアミノ酸などを 1 mMの終濃度で加え、さらに ATP を終濃度 100 µM で添加後、25 ℃、１時間の反応条件で酵素反応を行った。なお酵素活性については、アデニル化反応の副生成物となるピロリン酸をリン酸に分解し、このリン酸濃度をモリブデン酸マラカイトグリーンアッセイにより定量化することで、間接的に評価した。

図 4 （a）15% SDS-PAGE を用いた大腸菌 BL21（DE3）株による、 モジュール８、 ９の IPTG 誘 導 による発 現 確 認、（b）
15% SDS-PAGE を用いた単離精製された酵素モジュール１、６の純度確認

その結果、まず各モジュールは想定通りの基質アミノ酸に対して特異性を持つことが分かり、遺伝子クローニングの段階で目的とする各モジュール遺伝子が取得できている− 61 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

度データを元にした Lineweaver-Burk plot により、アデニル化活性のターンオーバー数 kcat、ミカエリス定数 Km、kcat/Km を算出した（表 2）。今回の評価では、T ドメインに対して 4’ - ホスホパンテテイン（4’ -PPT）が導入されたホロ状態で評価を行っていないため、酵素はシングルターンオーバーの条件での評価となり、全体的な活性は低く見積もられた。しかし、得られたパラメーターを比較したところ、
L-Dab を同じ基質アミノ酸として用いるモジュール５、８、９については、類似の酵素活性をもつことがわかった。一方で L-Thr を基質アミノ酸として用いるモジュール 10 については、L-Dab を基質アミノ酸として用いるモジュールと比較し、約 1/50 程度の活性であることが分かった。

3 . 4 . A ドメインが基質アミノ酸を L-Dab にする場
合、L-Thr にする場合にキーとなるアミノ酸残基の構造予測データを元にした考察

L-Dab を 基 質 ア ミ ノ 酸 と す る モ ジ ュ ー ル 1、5、8、9、L-Thr を 基 質 ア ミ ノ 酸 と す る モ ジ ュ ー ル 10 に つ いて、各基質アミノ酸の認識にキーとなるアミノ酸の特定を、Alphafold 2 による立体予測構造を元に行った。まず
図 5 モジュール５（上）、モジュール１０（下）の A ドメインにおける各基質アミノ酸に対するアデニル化活性の基質選択性に関する評価

L-Dab を基質アミノ酸とするモジュール 1、5、8、9 のA ドメインにおける、基質結合サイト周辺の構造類似性に関して、各立体構造を重ね合わせた場合の平均二乗偏差（RMSD）も含めて評価した。まず全体的な傾向として、ことが改めて示唆された（図 5 はモジュール 5 と 10 の結果

L-Dab を基質アミノ酸とするこれらモジュールに含まれを示す）。またモジュール 10 に関しては、元々の基質アミる A ドメインでは、高い配列相同性と共に、認識に関与ノ酸である L-Thr だけではなく、構造的に類似した L-Serするアミノ酸残基コンホメーションの類似性も推測された。

に対しても弱いながら活性をもつことが分かった。一方

具体的には、L-Dab の α- アミノ基は Asp204 の側鎖カルで、L-Dab を基質アミノ酸とするモジュール 1、5、6、8、ボキシ基、γ- 位の側鎖アミノ基は Asp310 により認識され9 については、L-Dab と比較的構造的に類似した L-Lys にる一方で、アデニル化における補因子となる Mg イオンは全く活性をもたないこともわかり、モジュールごとの基は Thr305、ATP 由来のリン酸イオンは Asp394 により認質アミノ酸に対する特異性、厳密さに関しては、モジュー識される（図 6）。これらは、モジュール 1、5、8、9 間でルごとにその性質が異なることが分かった。

高い保存性が見られた。本研究では L-Thr を認識するモ

2+

次に酵素活性の比較的高かった、モジュール 1、5、8、ジュール 10 に対して、側鎖にアルキル鎖修飾された Cys

9、10 について、基質アミノ酸濃度を変化させた時の初速をアデニル化できるように改変を行ったが、もしこれらの表２ Lineweaver-Burk plot による各モジュールに含まれる A ドメインのアデニル化活性の評価− 62 −

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図６ モジュール 1、5、8、9 の L-Dab の結合サイト周辺の立体構造の比較（左）と結合サイト周辺のアミノ酸残基の比較（右）モジュールをアルキル鎖修飾された Cys をアデニル化でき466

Pheるよう改変するのであれば、Asp310 を含めた周辺アミノ酸残基に対する変異が有効であると示唆された。

が明らかに立体障害となることが予想された。

そこで、ここへの Ala 変異体（Phe466Ala）であれば、アルキル鎖修飾された Cys をアデニル化できる A ドメインと一方で、L-Thr をアデニル化するモジュール 10 の A ドして機能することが期待された。PCR と Gibson Assembly

メインについては、L-Thr の α- アミノ基は同様に Asp204

技術を用いてこの変異体の発現ベクターを調製し、E. coliの側鎖カルボキシ基により認識される一方で、L-Thr の側BL21（DE3）株を用いて蛋白質生産を行った。大腸菌から鎖は Phe466 が蓋をする形で認識をしていると推測された。の抽出を行ったところ元のモジュール 10 と同じように上アデニル化における補因子となる Mg イオンは Thr305、

清画分に得られたため、これを His-tag カラムを用いて精ATP 由来のリン酸イオンは Asp394 により認識されるの製し、アデニル化活性の評価を行った。基質アミノ酸には、2+は変わらなかった。したがって、側鎖にアルキル鎖修飾さL-Thr、L-Ser と 共 に、L-Cys、S- メ チ ル L-Cys（L-Cys

れた Cys をアデニル化できるようにモジュール 10 を改変（Me））、S- エ チ ル L-Cys（L-Cys（Et））、S- ア リ ル L-Cys

するには、Phe466 周辺へのアミノ酸変異が有効であるこ（L-Cys（All））を用いて活性評価を行ったところ、元々のとが示唆された。

モジュール 10 の基質アミノ酸である L-Thr や L-Ser に対する酵素活性が大きく減少した。一方で A ドメインで3 . 5 . アルキル鎖修飾システインのアデニル化を可能とするモジュール 10 への改変は全く活性の見られなかった、L-Cys（Me）、L-Cys（Et）、L-Cys（All）に対してアデニル化活性が得られることが明モジュール 10 の A ドメインを、アルキル鎖修飾システらかとなった（図 7）。本来は、この変異体をリードとして、イン誘導体をアデニル化可能なものに変換するための変擬似基質を用いた酵母ディスプレイ法などを用いたセレク異候補残基について、Alphafold2 により予測されたモジション系に進んでいきたかったのであるが、図８に示した

ュール 10 の A ドメインの活性サイトへ S- メチル化 Cys の擬似基質合成法の確立には至ったものの、残念ながら本研

AutoDock7 によるドッキングシミュレーションを元に考究助成期間が終了してしまった。本期間内に達成しきれな察した。Asp204 が L-Thr や L-Cys の α- アミノ基の認識かったのは非常に残念であったが、今後は合成法の確立さに働いていることが予想され、こちらは S. Albus の NRPSれた擬似基質を用いたセレクション系を用い、当初目的とに含まれる Cys を基質アミノ酸として利用する A ドメイ

なる側鎖にアルキル鎖修飾された Cys をアデニル化できるンでも保存されていた。一方で元々の基質アミノ酸であるモジュール取得、さらにこれを P. polymyxa に戻すことで、L-Thr と比較し、アルキル鎖修飾システインでは側鎖方向

抗菌性 PG-surfactant の合成が可能な組換えバクテリアのの立体的嵩高さが大きく、先の項目で指摘していたように構築を目指していきたい。

− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

図７ アルキル鎖を SH 基に修飾されたシステイン誘導体のアデニル化活性の評価；（a）S. albus の Cys 認識 A ドメインと P. Polymyxa NBRC3020 株の Thr 認
識 A ドメインの構造比較、（b）モジュール 10 の A ドメインと、この A ドメインに対 して Phe466Ala 変 異 を 加 え た 変 異 体 で の L-Thr、L-Ser、L-Cys（Me）、L-Cys（Et）、L-Cys（All）に対するアデニル化活性の比較

図８ 合成法の確立ができた擬似基質の化学構造（A ドメインでの反応生成物となる、アデニル化されたアルキル鎖修飾 Cys に類似した化学構造をもつ。ホスホジエス
テル部分をスルホンアミドに変更することで、加水分解を受けずに A ドメインに留まれる。またこの基質を固定相に固定化しセレクション実験に用いるため、ビオチンをアデニン部分にアセチレン化 PEG リンカーを介して導入した。黄緑色の丸部分に、ビオチンは修飾される）

４．総

リボソームペプチド合成酵素の１つであり、Polymyxin B

括に含まれる 10 個のアミノ酸に対応した 10 個の酵素モジュ

本研究では、我々が以前に抗菌活性を示すと明らかにしールが連結された構造をもつ。抗菌性 PG-surfactant の合たジェミニ型ペプチド界面活性剤（抗菌性 PG-surfactant）成を可能とする酵素へと変換する上で、A ドメインの基質のバクテリアによる合成系構築を目指し、構造の比較的類アミノ酸を側鎖にアルキル鎖を含むシステイン誘導体に変似した Polymyxin B の合成酵素に着目した。この酵素は非換が必要であるが、以前の報告において、A ドメインに対− 64 −

化粧品基材に利用可能なペプチド界面活性剤のバクテリア合成系構築

29, 4072-4082.

して変異を加えることで、基質アミノ酸の変換が可能であり、結果産生される非リボソームペプチドへの変異も可能

2） Sumito, N.; Koeda, S.; Umezawa, N.; Inoue, Y.; Tsukiji,となると報告があった。しかし Polymyxin B 合成酵素の A

S.; Higuchi, T.; Mizuno, T. Development of Cell-ドメインに関しては、先行研究による構造情報がほとんど

Penetration PG-Surfactants and Its Application in

なく、各基質アミノ酸の認識でキーとなる A ドメイン内

External Peptide Delivery to Cytosol. Bioconjug. Chem.のアミノ酸残基が不明であった。そこでまず、Polymyxin

2020, 31, 821-833.

B の合成酵素に含まれる 10 個のモジュール遺伝子を P.

3） Sussmuth, R. D.; Mainz, A. Nonribosomal Peptide

polymyxa NBRC3020 株からクローニングし、こちらのア

Synthesis-Principles and Prospects. Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 2017, 56, 3770-3821.

ミノ酸配列を明らかとした。またこれらを大腸菌にて発現し、各モジュール蛋白質を精製後、それぞれに含まれる A

4） He, Z.; Kisla, D.; Zhang, L.; Yuan, C.; Green-Church,

ドメインのアデニル化活性を評価し、確かにそれぞれが対K. B.; Yousef, A. E. Isolation and identification of a

応する基質アミノ酸のアデニル化が可能であること、またPaenibacillus polymyxa strain that coproduces a novel

それらの酵素活性パラメーターの算出を行った。最後に、

lantibiotic and polymyxin. Appl. Environ. Microbiol.

C1、C2、C3 のアルキル鎖を側鎖修飾されたシステイン誘

2007, 73, 168-178.

導体（Cys（Me）、L-Cys（Et）、L-Cys（All））を活性化でき

5） Kim, J. F.; Jeong, H.; Park, S. Y.; Kim, S. B.; Park, Y.

るように、10 番目のモジュールに含まれる A ドメインにK.; Choi, S. K.; Ryu, C. M.; Hur, C. G.; Ghim, S. Y.; Oh, T.

対して変異を加え、結果これらのアデニル化が可能となるK.; et al. Genome sequence of the polymyxin-producing

モジュール 10 の変異体の構築に成功した。本来は、このplant-probiotic rhizobacterium Paenibacillus polymyxa
E681. J. Bacteriol. 2010, 192, 6103-6104.

変異体をリードとして、図 8 に示した擬似基質を用いたセレクション系に進んでいきたかったのであるが、本期間内

6） McQuade, T. J.; Shallop, A. D.; Sheoran, A.;に達成しきれなかったのは非常に残念である。しかし引きDelproposto, J. E.; Tsodikov, O. V.; Garneau-Tsodikova,

続き検討を進めることで、本研究目的の達成を目指してい

S. A nonradioactive high-throughput assay for

きたい。

screening and characterization of adenylation domains
for nonribosomal peptide combinatorial biosynthesis.

（引用文献）

Anal. Biochem. 2009, 386, 244-250.

1） Kimura, R.; Shibata, M.; Koeda, S.; Miyagawa, A.;

7） Sousa, S. F.; Fernandes, P. A.; Ramos, M. J. Protein-Yamamura, H.; Mizuno, T. Development of New

ligand docking: current status and future challenges.

Antimicrobial Agents from Cationic PG-SurfactantsProteins 2006, 65, 15-26.

Containing Oligo-Lys Peptides. Bioconjug. Chem. 2018,− 65 −