プロトコール集（研究用試薬）＜目次＞

免疫組織染色手順（前処理なし） p2
免疫組織染色手順（マイクロウェーブ前処理） p3
免疫組織染色手順（オートクレーブ前処理） p4
免疫組織染色手順（トリプシン前処理） p5
免疫組織染色手順（ギ酸処理） p6
免疫組織染色手順（ギ酸処理後、マイクロウェーブまたはオートクレーブ処理）p7
抗原ペプチドによる抗体吸収試験 p8ウエスタン・ブロッティング (Western Blotting) p9
免疫沈降法 (Immuno-precipitation) p10

p. 1

株式会社免疫生物研究所
URL: http://www.ibl-japan.co.jp E-mail: do-ibl@ibl-japan.co.jp

プロトコール集（研究用試薬）
免疫組織染色手順 (前処理なし
前処理なし)
前処理なし
1.
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脱パラフィン 30 分
脱キシレン
内因性ペルオキシダーゼ処理：メタノール中 0.3 % H2O2 溶液 室温 30 分
80 % エタノール→70 % エタノール→60 % エタノール→流水洗浄 1 分
TBS-T にて軽くリンス洗浄
正常血清ブロッキング処理：室温 30 分
Goat Whole Serum を 5 %に希釈して使用 (※2 次抗体の動物血清を使用)
TBS-T にて軽くリンス洗浄
1 次抗体反応：4 °C 一昼夜インキュベーション※染色試薬によっても反応性が異なりますので、使用濃度は製品説明書の表示を参考に各施設でご検討ください
TBS-T 洗浄 5 分×3 回
2 次抗体反応：室温 30 分例)
1 次抗体がウサギポリクローナル抗体の場合：
Anti-Rabbit IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
1 次抗体がマウスモノクローナル抗体の場合：
Anti-Mouse IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
TBS-T 洗浄
5 分×3 回ABC 試薬の反応：室温 30 分 (Vectastain ABC Kit, PEROXIDASE STANDARD PK-4000)
TBS-T 洗浄
5 分×3 回
発色：室温 1 – 10 分
(DAB ”DOJINDO 349-00903” 30 mg, 30 % H2O2 25 μL/50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mL)
流水洗浄 3 分
核染色 (ヘマトキシリン)
色出し 5 分脱水
透徹
封入
081001/KK
120625/KK
130108/MY

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プロトコール集（研究用試薬）
免疫組織染色手順 (マイクロウェーブ前処理
マイクロウェーブ前処理)
マイクロウェーブ前処理
脱パラフィン 30 分
脱キシレン
内因性ペルオキシダーゼ処理：メタノール中 0.3 % H2O2 溶液 室温 30 分
80 % エタノール→70 % エタノール→60 % エタノール→流水洗浄 1 分マイクロウェーブ処理＊ 90 °C 10 分 (10 mM クエン酸緩衝液, pH 6.0)
放置冷却
流水洗浄 3 分
TBS-T にて軽くリンス洗浄
正常血清ブロッキング処理：室温 30 分
Goat whole serum を 5 %に希釈して使用 (※2 次抗体の動物血清を使用)
10. TBS-T にて軽くリンス洗浄
11. 1 次抗体反応：4 °C 一昼夜インキュベーション※染色試薬によっても反応性が異なりますので、使用濃度は製品説明書の表示を参考に各施設でご検討ください
12. TBS-T 洗浄 5 分×3 回
13. 2 次抗体反応：室温 30 分例)
1 次抗体がウサギポリクローナル抗体の場合：
Anti-Rabbit IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
1 次抗体がマウスモノクローナル抗体の場合：
Anti-Mouse IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
14. TBS-T 洗浄
5 分×3 回
15. ABC 試薬の反応：室温 30 分 (Vectastain ABC Kit, PEROXIDASE STANDARD PK-4000)
16. TBS-T 洗浄
5 分×3 回
17. 発色：室温 1 – 10 分
(DAB ”DOJINDO 349-00903” 30 mg, 30 % H2O2 25 μL/50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mL)
18. 流水洗浄 3 分
19. 核染色 (ヘマトキシリン)
20. 色出し 5 分
21. 脱水22. 透徹23. 封入
1.
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＊家庭用電子レンジを使用する場合① 500 mL ビーカーにクエン酸緩衝液を 500 mL 入れ、組織切片をバスケットごと浸ける② 家庭用電子レンジ内で沸騰後、さらに 10 分照射する(500 W の場合)
注：クエン酸緩衝液が蒸散してしまわないように、軽くラップをかけてください
10 mM クエン酸緩衝液(pH 6.0)の調製① クエン酸 C3H4(OH)(COOH)3 /H2O = 210.14 2.1 g を 900 mL の精製水に溶解する② 水酸化ナトリウム液にて pH 6.0 に調節する。(2M-NaOH でおよそ 13 mL 加える)
③ さらに精製水を加え、1,000 mL にメスアップする
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130108/KK

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プロトコール集（研究用試薬）
免疫組織染色手順（オートクレーブ前処理）
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脱パラフィン 30 分
脱キシレン
内因性ペルオキシダーゼ処理：メタノール中 0.3 % H2O2 溶液 室温 30 分
80 % エタノール→70 % エタノール→60 % エタノール→流水洗浄 1 分
オートクレーブ処理＊ 110 °C 10 分 (10 mM クエン酸緩衝液, pH 6.0)
放置冷却
流水洗浄 3 分
TBS-T にて軽くリンス洗浄
正常血清ブロッキング処理：室温 30 分
Goat whole serum を 5 %に希釈して使用 (※2 次抗体の動物血清を使用)
TBS-T にて軽くリンス洗浄
1 次抗体反応：4 °C 一昼夜インキュベーション※染色試薬によっても反応性が異なりますので、使用濃度は製品説明書の表示を参考に各施設でご検討ください
TBS-T 洗浄 5 分×3 回
2 次抗体反応：室温 30 分例)
1 次抗体がウサギポリクローナル抗体の場合：
Anti-Rabbit IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
1 次抗体がマウスモノクローナル抗体の場合：
Anti-Mouse IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
TBS-T 洗浄
5 分×3 回ABC 試薬の反応：室温 30 分 (Vectastain ABC Kit, PEROXIDASE STANDARD PK-4000)
TBS-T 洗浄
5 分×3 回
発色：室温 1 – 10 分
(DAB ”DOJINDO 349-00903” 30 mg, 30 % H2O2 25 μL/50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mL)
流水洗浄 3 分
核染色 (ヘマトキシリン)
色出し 5 分脱水
透徹封入

＊オートクレーブ処理
500 mL ビーカーにクエン酸緩衝液を 500 mL 入れ、組織切片をバスケットごと浸け、オートクレーブにかける。
10 mM クエン酸緩衝液(pH 6.0)の調製○
1 クエン酸 C3H4(OH)(COOH)3 /H2O = 210.14 2.1 g を 900 mL の精製水に溶解する② 水酸化ナトリウム液にて pH 6.0 に調節する。(2M-NaOH でおよそ 13 mL 加える)
③ さらに精製水を加え、1,000 mL にメスアップする
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プロトコール集（研究用試薬）
免疫組織染色手順（トリプシン前処理）
1.
2.
3.
4.
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11.
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18.
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20.
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22.

脱パラフィン 30 分
脱キシレン
内因性ペルオキシダーゼ処理：メタノール中 0.3 % H2O2 溶液 室温 30 分
80 % エタノール→70 % エタノール→60 % エタノール→流水洗浄 1 分
TBS-T にて軽くリンス洗浄
0.1 %トリプシン処理 室温 30 分
※組織の固定条件や用いる組織により、反応条件が異なる場合がありますので、各施設での条件設定をお勧め致します。
TBS-T にて軽くリンス洗浄
正常血清ブロッキング処理：室温 30 分
Goat whole serum を 5 %に希釈して使用 (※2 次抗体の動物血清を使用)
TBS-T にて軽くリンス洗浄
1 次抗体反応：4 °C 一昼夜インキュベーション※染色試薬によっても反応性が異なりますので、使用濃度は製品説明書の表示を参考に各施設でご検討ください
TBS-T 洗浄 5 分×3 回
2 次抗体反応：室温 30 分例)
1 次抗体がウサギポリクローナル抗体の場合：
Anti-Rabbit IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
1 次抗体がマウスモノクローナル抗体の場合：
Anti-Mouse IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
TBS-T 洗浄
5 分×3 回ABC 試薬の反応：室温 30 分 (Vectastain ABC Kit, PEROXIDASE STANDARD PK-4000)
TBS-T 洗浄
5 分×3 回
発色：室温 1 – 10 分
(DAB ”DOJINDO 349-00903” 30 mg, 30 % H2O2 25 μL/50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mL)
流水洗浄 3 分
核染色 (ヘマトキシリン)
色出し 5 分脱水
透徹封入
081001/KK
130108/MY

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プロトコール集（研究用試薬）
免疫組織染色手順（ギ酸処理）
1.

脱パラフィン

30 分

2.

脱キシレン

3.

内因性ペルオキシダーゼ処理：メタノール中 0.3 % H2O2 溶液

4.

80 % エタノール→70 % エタノール→60 % エタノール→流水洗浄 1 分

5.

ギ酸処理

6.

流水洗浄 3 分

7.

TBS-T にて軽くリンス洗浄

8.

正常血清ブロッキング処理：室温 30 分

室温 30 分濃度は 99 %以上を使用 (70 %以上なら可能)：室温 5 分

Goat Whole Serum を 5 %に希釈して使用 (※2 次抗体の動物血清を使用)
9.

TBS-T にて軽くリンス洗浄

10.

1 次抗体反応：4 °C 一昼夜インキュベーション※染色試薬によっても反応性が異なりますので、使用濃度は製品説明書の表示を参考に各施設でご検討ください

11.

TBS-T 洗浄

5 分×3 回12.

2 次抗体反応：室温 30 分例)
1 次抗体がウサギポリクローナル抗体の場合：
Anti-Rabbit IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
1 次抗体がマウスモノクローナル抗体の場合：
Anti-Mouse IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)

13.

TBS-T 洗浄14.

ABC 試薬の反応：室温

15.

TBS-T 洗浄

5 分×3 回

16.

発色：室温

1 – 10 分

5 分×3 回
30 分 (Vectastain ABC Kit, PEROXIDASE STANDARD PK-4000)(DAB ”DOJINDO 349-00903” 30 mg, 30 % H2O2 25 μL/50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mL)
17.

流水洗浄3 分18.

核染色 (ヘマトキシリン)

19.

色出し

20.

脱水

21.

透徹

22.

封入

5 分

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120420/KK
130108/MY
170925/KI

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プロトコール集（研究用試薬）
免疫組織染色手順（ギ酸処理後、マイクロウェーブまたはオートクレーブ処理）
脱パラフィン 30 分
脱キシレン
内因性ペルオキシダーゼ処理：メタノール中 0.3 % H2O2 溶液 室温 30 分
80 % エタノール→70 % エタノール→60 % エタノール→流水洗浄 1 分
ギ酸処理 濃度は 99 %以上を使用 (70 %以上なら可能)：室温 5 分
流水洗浄 3 分
マイクロウェーブ＊またはオートクレーブ処理 110 °C, 10 分 (10 mM クエン酸緩衝液, pH 6.0)
8. 放置冷却9. 流水洗浄 3 分
10. TBS-T にて軽くリンス洗浄
11. 正常血清ブロッキング処理：室温 30 分
Goat whole serum を 5 %に希釈して使用 (※2 次抗体の動物血清を使用)
12. TBS-T にて軽くリンス洗浄
13. 1 次抗体反応：4 °C 一昼夜インキュベーション※染色試薬によっても反応性が異なりますので、使用濃度は製品説明書の表示を参考に各施設でご検討ください
14. TBS-T 洗浄 5 分×3 回
15. 2 次抗体反応：室温 30 分例)
1 次抗体がウサギポリクローナル抗体の場合：
Anti-Rabbit IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
1 次抗体がマウスモノクローナル抗体の場合：
Anti-Mouse IgG Goat IgG-Biotin (濃度：製品説明書に従う)
16. TBS-T 洗浄
5 分×3 回
17. ABC 試薬の反応：室温 30 分 (Vectastain ABC Kit, PEROXIDASE STANDARD PK-4000)
18. TBS-T 洗浄
5 分×3 回
19. 発色：室温 1 – 10 分
(DAB ”DOJINDO 349-00903” 30 mg, 30 % H2O2 25 μL/50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mL)
20. 流水洗浄 3 分
21. 核染色 (ヘマトキシリン)
22. 色出し 5 分
23. 脱水24. 透徹25. 封入
1.
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＊家庭用電子レンジを使用する場合① 500 mL ビーカーにクエン酸緩衝液を 500 mL 入れ、組織切片をバスケットごと浸ける② 家庭用電子レンジ内で沸騰後、さらに 10 分照射する(500 W の場合)
注：クエン酸緩衝液が蒸散してしまわないように、軽くラップをかけてください
10 mM クエン酸緩衝液(pH 6.0)の調製① クエン酸 ( C3H4(OH)(COOH)3 /H2O = 210.14 ) 2.1 g を 900 mL の精製水に溶解する② 水酸化ナトリウム液にて pH 6.0 に調節する。(2M-NaOH でおよそ 13 mL 加える)
③ さらに精製水を加え、1,000 mL にメスアップする
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170925/KI

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プロトコール集（研究用試薬）
抗原ペプチドによる抗体吸収試験
ペプチドによる吸収法(1) 抗体希釈バッファー (1 % BSA in PBS) へ抗体溶液とペプチド溶液を、抗体：ペプチド＝1 mol： 20 mol になるように加えます。
ペプチド溶液の代わりに精製水を加えたもの(ペプチド(－))をコントロールとします。
(2) 4 °C で一晩転倒混和し十分に反応させます。この時ペプチド(－) も同時におこないます。
(3) 上記の吸収処理を終えたものを WB または免疫染色の一次抗体として使用します。
【計算例】
弊社では抗体の分子量を約150,000として計算しています
抗体 Code No.18415

Anti-Human VEGF-C (103) Rabbit IgG の場合

吸収用ペプチド Code No.18417

Human VEGF-C (103) Antigen Peptides 分子量 1,827

重量比率は抗体： ペプチド ＝ 1 mol： 20 mol ＝ 150,000： 1,827 × 20 ＝ 1g：： 0.24 g となります。
仮に
抗体溶液濃度： 100 μg/mL
ペプチド溶液濃度：100 μg/mLを用いて、抗体終濃度

5 μg/mL の溶液を 1 mL 調製する場合は抗体溶液

ペプチド溶液1 % BSA in PBS

ペプチド(＋)

50 μL

12 μL

938 μLペプチド(－)

50 μL－950 μLの混合比率となります↓
4 °C、一晩、転倒混和↓
WB または免疫染色に使用します。
081001/KK
110622/KKp. 8

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プロトコール集（研究用試薬）
ウエスタン・ブロッティング (Western Blotting)
試薬：・2x Sample Buffer
125mM Tris-HCl (pH6.8), 4% SDS, 20% Glycerol, 10% 2-Mercaptoethanol, 0.02% BPB
・HRP 標識 2 次抗体
Anti-Rabbit IgG (H+L) Goat IgG Fab' HRP (IBL, #17502)

あるいはAnti-Mouse IgG (H+L) Goat IgG Fab' HRP (IBL, #17601)
・ブロッキング溶液
3 % milk, 1 % BSA, 0.05 % NaN3/PBS
・洗浄液
0.05% Tween20/PBS
・ECL western detection kit(GE healthcare, #RPN2106)

方法：
方法：
1.

PAGE：
調製済みサンプル 10 - 20μL を 7-12 %濃度のアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動

2.

ブロッティング：泳動操作によりナイロンメンブランなどの膜に転写

3.

転写膜のブロッキング：ブロッキング溶液 37°C で 2 時間

4.

洗浄液で洗浄 ： 5 分、3 回

5.

1 次抗体の反応 (指定の濃度で)：37°C で 2 時間

6.

洗浄液で洗浄 ： 5 分、3 回

7.

2 次抗体の反応 (製品指定の濃度で)：8.

洗浄液で洗浄： 5 分、3 回

9.

ECL による検出：あるいは 4°C で一昼夜

37°C で 1 時間浸透時間：1 分間、感光時間は 1 分間～1 時間 (サンプルによる)サンプル調製例
1) 細胞 Lysate① 培養細胞を PBS で洗浄、必要であればトリプシン処理② トリプシン停止後、PBS で洗浄(細胞数を計測しておく)③ 2x Sample Buffer に懸濁(1 - 5 x 105 cells/10μL)④ ソニケーション⑤ 沸騰処理： 3 分間
⑥ 遠心分離： 14000rpm, 4°C で 3 分間
⑦ 上清を使用する
2) 細胞培養上清そのまま使用する
081001/KK
130108/MY

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プロトコール集（研究用試薬）
免疫沈降法 (Immuno-precipitation)
試薬
1.

TNE 緩衝液：10 mM Tris-HCl (pH7.8), 1% NP-40, 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 μg/mL aprotinin

2.

Protein G-Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare #17-0618-01)：：
TNE 緩衝液で洗浄しておく

方法
1.

調製したサンプル(抽出物上清など)に Protein G-Sepharose を加える
：50 μL/サンプル 1 mL

2.

転倒混和：4 °C 一昼夜

3.

遠心分離：4 °C 14,000 rpm 20 分

4.

上清に抗体を加える：約 3 μg/サンプル 100 - 400 μL

5.

転倒混和：4 °C 1 時間

6.

Protein G-Sepharose を加える：20 μL/サンプル 100 - 400 μL

7.

転倒混和：4 °C 1 時間

8.

TNE 緩衝液で洗浄：4 °C

9.

沈殿物 (immunoprecipitate)

10.

WB などで確認する

5,000 rpm 1 分 X 5 回081001/KK
130108/MYp. 10

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