Ligation-Convenience Kit Manual （第五版）
Code No. 319-05961

100 回分Code No. 315-05963

10 回分

～解説～
目的の遺伝子をベクターDNA と連結することは、遺伝子クローニングを行う上での最初の重要なステップとなります。ライゲーション反応は DNA 末端形状の違いによって効率が異なり、これまでは反応ごとにライゲーション反応の至適化が必要でした。また、通常の T4 DNA Ligase ではライゲーション反応に 1～16 時間かかり、高い形質転換効率を得ることが困難でした。Ligation-Convenience Kit は、これらの煩雑さを解決し、短時間で高効率なライゲーションを行うことができるキットです。

Ⅰ.特長● 本品は、DNA のライゲーションを迅速・簡便に行うためのキットです。
● 2×Ligation Mix には、DNA のライゲーションに必要な反応バッファー、 ATP、DTT、T4 DNA Ligase などが全て含まれており、DNA 溶液と等量の 2×Ligation Mix を加えるだけで DNA ライゲーション反応を行うことができます。
● このキットを使用することで、DNA の末端形状に関わらず 5～30 分でライゲーション反応を行うことができます。また、ライゲーション反応が終了した DNA 溶液は、そのまま形質転換や in vitro パッケージングに用いることができます。

Ⅱ.キット内容
100 回分 *試薬
2×Ligation Mix

10 回分*

250μl×4 本
100μl×1 本* 20μl の反応系で使用した場合の回数です。

Ⅲ.保存および融解方法－20℃保存・ 使用時は氷上にて完全に融解させ、ピペッティングでよく混ぜてから使用して下さい。
・ 50 回までの凍結融解による反応効率の低下は認められておりません。

凍結融解に対する安定性
1.41.2

効率

10.8
0.6
0.4
0.2
00回

5回

10回

20回

30回

凍結融解回数-1-40回

50回

Ⅳ.プロトコールおよび実験例
１．プロトコール(1) DNA 溶液の調製
適当なモル比のべクターDNA とインサートDNA 断片を合わせて 10μl の DNA 溶液を調製する。*2(2) ライゲーション反応液の調製
DNA 溶液と等量の 2×Ligation Mix を添加し、混和する。

ベクターDNA
インサート DNA
ddH2O または TEup to 10μl
*22×Ligation Mix10μl

Total20μl

16℃で 5～30 分間反応させる*1(3) ライゲーション反応
16℃で 5～30 分間反応させる。*1

形質転換または in vitro パッケージング *4～9(4) 形質転換または in vitro パッケージング
反応液をそのまま形質転換や in vitro パッケージングに用いる。*4～9２．ベクターとインサートのモル比の検討
ライゲーションの際の ベクター：インサート のモル比は、ライゲーション効率に大きく影響します。以下は、ニッポンジーンで様々な長さのインサート DNA をライゲーション、形質転換した結果、それぞれ下記の特定の条件で最も良い結果が得られたモル比を示した表です。＊3１．プラスミドベクターライゲーション（１）粘着末端

インサート長ベクター
インサート200 bp
110600 bp 1000 bp 3000 bp
11
15～10 2～100.5～2

ベクター ：EcoRI で切断した pUC19 ( 0.03 pmol )インサート ：EcoRI で切断したインサート DNA( 0.015 pmol , 0.03 pmol , 0.06 pmol , 0.15 pmol , 0.3 pmol )ライゲーション反応：16℃, 5 分間

600 bp151000 bp 3000 bp
1
12～100.5～2

ベクター ：SmaI で切断した pUC19 ( 0.03 pmol )インサート ：SmaI で切断したインサート DNA( 0.015 pmol , 0.03 pmol , 0.06 pmol , 0.15 pmol , 0.3 pmol )ライゲーション反応：16℃, 5 分間

600 bp151000 bp 3000 bp
1151

ベクター ：pGEMⓇ-T Easy; Promega 社 ( 0.03 pmol )インサート ：Gene Taq NT(Code No. 318-03231)で増幅した PCR 産物( 0.015 pmol , 0.03 pmol , 0.06 pmol , 0.15 pmol , 0.3 pmol )ライゲーション反応：16℃, 5 分間

（２）平滑末端

インサート長 200 bp
ベクター
1
インサート
5（３）ＴＡクローニング

インサート長 200 bp
ベクター
1
インサート
10
２．リンカーライゲーション

インサート長 8 bp
ベクター
1
インサート 50以上

ベクター ：HincII で切断した pUC19 ( 0.03 pmol )インサート ：Linker EcoRV (Code No. 318-02251)( 0.3 pmol , 1.5 pmol , 3 pmol , 15 pmol )ライゲーション反応：16℃, 5 分間

-2-

３．実験例＜ 実験例① 粘着末端ライゲーション ＞
T4 DNA Ligase との比較
（1）

pUC19 DNA を EcoRI で切断し、脱リン酸化、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後にTE バッファーに溶解した。*2（2）

ラムダ DNA 由来の DNA 断片 500bp を EcoRI で切断した。

（3）

pUC19 DNA 50ng とインサート DNA 断片 20ng（インサート／ベクターモル比≒2）を含む DNA 溶液10μl を調製した。*2（4）

DNA 溶液 10μl に 2×Ligation Mix を 10μl 添加し、混和した。

（5）

16℃で 5 分～16 時間反応させた。

（6）

反応後、JM109 コンピテントセル 50μl を反応液 5μl で形質転換し、生じたコロニー数を計測した。また、コントロールとして T4 DNA Ligase 単体を用いて同様にライゲーション反応を行った。なお、本実験に使用した JM109 コンピテントセルの形質転換効率は、1.3×108 cfu/μg （pBR322 DNA）である。*4, 5700

1009080706050403020100

コロニー数（個）600500400300200
100016hr

1hr30min

5min

16hr

1hr

30min

5min

T4 DNA Ligase

白コロニー率（%）

粘着末端ライゲーションにおける反応時間の影響

白コロニー
青コロニー
白コロニー率（％）

LigationConvenience Kit

ライゲーション反応時間と形質転換効率の関係（白コロニー数）
反応時間

5 min

30 min

1 hr

16 hr

Ligation-Convenience Kit

450390323

7

T4 DNA Ligase

14512314623「結果」
上記の結果より、Ligation-Convenience Kit を使用した場合、5 分間の反応時間で十分にライゲーション反応が完了していることがわかる。また、ライゲーション反応の時間を 16 時間まで長くすると、逆に形質転換効率が低下する傾向があった。*3-3-

＜ 実験例② 平滑末端ライゲーション ＞
T4 DNA Ligase との比較
（1）

pBluescriptⅡSK(+)を EcoRV で切断し、脱リン酸化、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後に TE バッファーに溶解した。*2（2）

ラムダ DNA 由来の DNA 断片 500bp を EcoRV で切断した。

（3）

pBluescriptⅡSK(+)50ng とインサート DNA 断片 20ng（インサート／ベクターモル比≒2.4）を含む DNA溶液 10μl を調製した。*2（4）

DNA 溶液 10μl に 2×Ligation Mix を 10μl 添加し、混和した。

（5）

16℃で 5 分～16 時間反応させた。

（6）

反応後、JM109 コンピテントセル 50μl を反応液 5μl で形質転換し、生じたコロニー数を計測した。また、コントロールとして T4 DNA Ligase 単体を用いて同様にライゲーション反応を行った。なお、本実験に使用した JM109 コンピテントセルの形質転換効率は、1.3×108 cfu/μg （pBR322 DNA）である。*4, 514010012010080806060404020200

白コロニー率（%）

コロニー数（個）平滑末端ライゲーションにおける反応時間の影響

016hr

60min

30min

5min

16hr

60min

30min

5min

T4 DNA Ligase

白コロニー青コロニー
白コロニー率（％）

LigationConvenience Kit

ライゲーション反応時間と得られた白コロニー数（個）
反応時間

5min

30min

1hr

16hr

Ligation-Convenience Kit

615957

0

T4 DNA Ligase

912111「結果」
Ligation-Convenience Kit を使用した場合、5 分間の反応時間で十分にライゲーションが完了していることがわかる。また、ライゲーション反応時間を 16 時間まで長くすると、逆に形質転換効率が低下する傾向があった。*3-4-

＜ 実験例③ リンカーライゲーション ＞
T4 DNA Ligase との比較（リンカー / ベクターモル比の検討）（1）

pUC19 DNA を HincII で切断し、脱リン酸化、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後にTE バッファーに溶解した。*2（2）

pUC19 DNA ベクター50ng（約 0.03pmol）に対して、リンカーDNA モル比（リンカー／ベクター）が 10, 50,100, 500 になるように混合した DNA 溶液を各 10μl 調製した。*2（3）それぞれの DNA 溶液 10μl に 2×Ligation Mix を 10μl 添加し、混和した。

（4）

16℃で 5 分間反応させた。*1（5）

反応後、JM109 コンピテントセル 50μl を反応液 5μl で形質転換し、生じたコロニー数を計測した。また、コントロールとして T4 DNA Ligase 単体を用いて同様にライゲーション反応を行った。なお、本実験に使用した JM109 コンピテントセルの形質転換効率は、1.3×108 cfu/μg（pBR322 DNA）である。*4, 5100400080300060200040100020005001005010500

1005010T4 DNA Ligase

白コロニー率（％）

コロニー数（個）リンカーライゲーションにおけるリンカー／ベクターモル比の影響
5000

白コロニー
青コロニー
白コロニー率（％）（リンカー／ベクターモル比）

LigationConvenience Kit「結果」
上記の結果より、リンカー／ベクターのモル比が 50～100 倍以上にすることで、リンカーライゲーション効率が高くなる。*3＜ 実験例④ コスミドベクターへのライゲーションおよび in vitro パッケージング ＞（1）

EcoRI で線状化した Charomid 9-36（Code No.311-01401） 1 μg と ColE1 由来の 4 kbp DNA 断片0.5 μg（インサート／ベクターモル比≒4.5）を 10 μl 調製した。*2（2）DNA 溶液 10μl に 2×Ligation Mix 10μl を添加し、混和した。

（3）

16℃で 5 分～16 時間反応させた。

（4）

反応終了液 3μl（パッケージング Extract の 1/10 量）で LAMBDA INN（Code No.317-01741）を用いた
in vitro パッケージングを行った。*6～8（5）また、コントロールとして T4 DNA Ligase を用いてライゲーション反応を行い、同様の in vitro パッケージングを行った。

-5-

in vitro パッケージングにおけるライゲーション時間の影響
60

コロニー数（個）50403020
10Ligation-Convenience kit
T4 DNA ligase

05min30min1hr
反応時間16hr「結果」
Ligation-Convenience Kit を使用した場合、ライゲーション反応時間は 5～30 分間で十分であることが分かる。

また、反応時間を長くすることで逆にパッケージング効率が悪くなった。T4 DNA Ligase を単独で使用した場合は、16 時間反応させてもパッケージング効率はあまり改善しなかった。*3

Ⅴ．注意点*1 16 時間、オーバーナイト等の長時間ライゲーションを行うと、形質転換効率が著しく低下する場合があります。
*2

高塩濃度のバッファーに DNA を溶解させると、ライゲーション効率が著しく低下します。DNA 溶液は ddH2Oまたは TE buffer（pH8.0）にて調製して下さい。

*3

ライゲーション反応に用いる DNA の精製度、使用する制限酵素の違いによってライゲーション効率が異なる場合があります。

*4

形質転換に用いる反応液の量はコンピテントセルの 1/10 量以下にして下さい。多量の反応液を使用すると、形質転換効率が低下することがあります。

*5

反応液の量がコンピテントセルの 1/10 量以上になってしまう場合は、ライゲーション反応後、エタノール沈澱法によって DNA を回収し、その DNA をコンピテントセルの 1/10 量以下になるように ddH2O または TEbuffer（pH8.0）に溶解してから形質転換を行って下さい。

*6

パッケージングに用いる反応液の量はパッケージング Extract の 1/10 量以下にして下さい。多量の反応液を使用すると、パッケージング効率が低下する場合があります。

*7

パッケージング Extract の 1/10 量以上の反応液を使用する場合は、ライゲーション反応後、エタノール沈澱
法によって DNA を回収し、その DNA をパッケージング Extract の 1/10 量以下になるように ddH2O またはTE buffer（pH8.0）に溶解してから形質転換を行って下さい。

*8

Gigapack（Stratagene 社）を使用してもパッケージングを阻害することはありません。

*9

ライゲーション反応終了液を熱処理すると形質転換効率が著しく低下します。熱処理を行う場合は、ライゲーション反応終了溶液を ddH2O（DNase Free）で 2 倍希釈してから熱処理（70℃10 分間）を行って下さい。

-6-

Ⅵ.トラブルシューティング

トラブル

予想される原因

対

全くライゲーションしない 末端の不一致策

末端を確認する

融解後の2×Ligation Mixの濃 氷上で融解後、ピペッティングで良く混ぜる
度が不均一

ライゲーション効率が低い短いDNA断片の混入

制限酵素反応で生じる短いDNA断片を、ゲル電気泳動などで除去する

高塩濃度

塩を含まない水またはTE bufferでDNAを溶解し、ライゲーション反応を行う

ライゲーション時間が長い

ライゲーション時間を1時間以内にする

多量の反応液を使用した形質転換に用いる反応液をコンピテントセルに対して1/10量以内にする

ベクターの脱リン酸化が不十分

セルフライゲーションの有無をあらかじめ確認しておく

トランスフォーメーション
ライゲーション反応終了溶液をddH2O
効率が低い
ライゲーション反応終了液を希（DNase Free）で2倍希釈してから熱処釈しないで熱処理した理（70℃10分間）を行って下さい7

形質転換効率5×10 cfu/μg
コンピテントセルの形質転換効（pBR322 DNA）以上のものを使用し率が低いて下さい-7-

株式会社 ニッポンジーン
TEL 076-451-6548
FAX 076-451-6547
URL: http://www.nippongene.com/siyaku/

Ligation-Convenience Kit Manual 第 5 版（0512MO-1804）-8-