ヒアルロン酸・コラーゲンのナノ粒子化による新規皮膚浸透促進技術の開発とそのメカニズムの解明
佐賀大学

徳留嘉寛

It is known that hyaluronic acid (HA) and collagen (COL) in the skin decrease with aging and environmental changes,
causing wrinkles. It is important to add reduced HA and COL, but it is difficult to deliver water-soluble polymers from theskin into the body. Therefore, in this study, hyaluronic acid collagen nanoparticles were prepared by the poly-ion complex
method. Particle size was increase, zeta potential did not change, and PDI was increase, depending on buffer concentration.
Transmission electron microscopy images showed that the particles had a particle-like structure. Skin permeability wasconfirmed with nanoparticles made of fluorescently labeled collagen. As a result, fluorescence was observed in the skin with
nanoparticulated collagen compared to non-particulated collagen. Hyaluronic acid collagen nanoparticles were shown to bea potential material for improving skin penetration of water-soluble polymers.

１．緒であるため受動拡散では角層を通過できない。現在、HA言や COL を皮膚に直接補充できる方法は、注入療法またはヒアルロン酸（Hyaluronic acid, HA）は皮膚や関節、脳、血液などに広く分布し、全身の HA のうち約 50 ％が皮膚1）

マイクロニードル 8）を用いた場合のみとされている。また、現在多くの化粧品に配合されている HA や COL は、皮膚に存在している 。D- グルクロン酸と N- アセチル -D- グの表面に留まることで水分蒸散を防ぎ、保湿機能を担ってルコサミンの二糖単位が連結したアニオン性グリコサミノいる。
著者らは、ポリイオンコンプレックス（polyion complex：グリカンであり、生体で最大の水溶性高分子ポリマーであ2）る 。コラーゲン（Collagen, COL）は皮膚、血管、骨組織PIC）技術を用いたヒアルロン酸ナノ粒子（HANP）によっなど、体を構成するタンパク質の 30 ％を占めており、真て HA の皮膚浸透性の向上を報告している 9 , 10）。

皮では約 70 ％を占めている。COL を構成するアミノ酸は

本課題では HA と COL の相乗効果を期待し、PIC 技術にGly-Pro-Hyp を中心とした Gly-X-Y の繰り返し構造からよるヒアルロン酸・コラーゲンナノ粒子（HACOLNP）になり、三本のポリペプチド鎖が三重らせん構造を形成しよる新規皮膚浸透促進技術の開発とそのメカニズムの解明

3）ている 。COL 線維に熱を加えることでタンパク変性をを目的としている。特にこの研究課題では HA と COL か起こし、三重らせん構造が解離して一本鎖となる。変性ら成るナノ粒子の調製と物性評価結果、また、本課題では

後 COL は酵素分解することで断片化され、コラーゲンペ特に COL の皮膚浸透性を評価した。

プチドへ変化することが知られている。COL 線維の分子２．方量は約 300 kDa とされており、変性後 COL の分子量は約100 kDa、COL ペプチドは約 0 . 1 ~ 10 kDa とされる。COL法

2 . 1 . 実験材料の種類は、皮膚の真皮や骨などに存在するⅠ型 COL、軟ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量 1 , 200 kDa）は化骨の主成分であるⅡ型 COL を代表として、現在約 28 種類粧品グレードのものを入手し使用した。水溶性コラーゲの COL が存在している 4）。近年では人工臓器や人工皮膚

ンマリンジェン S- 06（PF）は新田ゼラチン株式会社（大阪、5）日本）から供与された。蛍光標識コラーゲンはコスモ・バなどのバイオマテリアルとしての利用が増えている 。
真皮中の HA や COL は、加齢や紫外線暴露などの要因によって減少し、皮膚弾力性の低下を引き起こす 6 , 7）。こイオ（東京、日本）から購入した。試薬は特級グレードのものを精製せずにそのまま用いた。

れらの改善には、減少した HA や COL を補充することが重要であるとされているが、HA や COL は水溶性高分子

2 . 2 . ヒアルロン酸・コラーゲンナノ粒子の調製
ヒアルロン酸とコラーゲンの水溶液を調製し、それを撹

Development of novel skin penetration
enhancement technology by nanoparticulation of hyaluronic acid and collagenand its mechanism
Yoshihiro Tokudome
Laboratory of Cosmetic Sciences, SagaUniversity拌混合することで粒子を得た。蛍光標識コラーゲンナノ粒子は同様に蛍光標識コラーゲン水溶液とヒアルロン酸水溶液を撹拌混合することで得た。

2 . 3 . 粒子物性の測定− 37 −

粒子径、多分散指数（PDI）は動的光散乱法で、ゼータコスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

電位はレーザードップラー電気泳動法により、ゼータサイ

３．結果と考察ザーウルトラ（Malvern、UK）により測定した。

3 . 1 . ナノ粒子の物性評価

2 . 4 . 透過型電子顕微鏡観察

1 , 3 , 15 , 20 , 30 そして 50 mM のクエン酸緩衝液（pH 4）粒子の形態観察は透過型電子顕微鏡を用い、ネガティ中でヒアルロン酸・コラーゲンナノ粒子を調製した。調製

ブ染色法で行った。ナノ粒子水溶液をカーボンコーティする際のクエン酸緩衝液濃度が高くなるにつれてナノ粒ングされた銅グリッド（400 メッシュ）に吸収させ、2 % タ子の粒子径は大きくなった（Fig. 1 a）。ゼータ電位は調製ングステン酸溶液（pH 7 . 0）により 15 秒染色した。観察する際の緩衝液濃度には大きな影響は受けなかった（Fig.

は JEM- 1400 Plus（日本電子株式会社、東京、日本）によ1 b）。粒子径の分散を示す PDI は調製した緩衝液濃度が高り加速電圧 100 kV で測定した。画像は CCD カメラ（EM-くなるに従って大きくなり、特に 30 mM を超える濃度の14830 RUBY 2、日本電子株式会社）により撮影した。

ときに PDI は大きくなった（Fig. 1 c）。今回の試験で用いている粒子はイオンコンプレックスという技術により調製

2 . 5 . 皮膚浸透性の確認している。ポリイオンコンプレックスは陽または陰イオン
2縦型 拡 散 セ ル（ 有 効 透過面積 0 . 785 cm ）にヒト 摘 出を有する高分子を水溶液として混合した際に、互いのイオ皮膚を装着し、24 時間の皮膚透過試験を行った。拡散センを打ち消すように反応することで粒子化すると考えられ

ルは 32 ℃で保持し、開放系で、ドナー溶液はクエン酸ている。イオン濃度が低いときはヒアルロン酸とコラーゲ

Buffer 群、非粒子コラーゲン、粒子化した HACOL 群まンのイオンが反応して粒子化していることが想定されるが、たは粒子化した FITC 標識コラーゲン・ヒアルロン酸とし、高い濃度の緩衝液中ではその緩衝液に含まれるイオンが粒それぞれを 0 . 2 mL ずつ適用した。

子化を妨げている可能性が考えられる。我々の以前の検討試験開始 24 時間後に皮膚を採取し、表面をよく洗ったで、ヒアルロン酸とポリリシンからなる粒子をリン酸緩衝あとに凍結切片を作成した。FITC 標識 COLHA 粒子や液中に混合した際に、粒子が破壊されることを報告していFITC コラーゲンを適用した群は、蛍光顕微鏡で観察した。

る 10）ので、今回もそのようなメカニズムで粒子が不安定a）b）c）

Fig. 1 種々濃度のクエン酸緩衝液中で調製したヒアルロン酸コラーゲンナノ粒子の粒子径（a）、ゼータ電位（b）、PDI（c）
グラフは３回以上の繰り返しの測定を行い、平均±標準偏差で示した。

− 38 −

ヒアルロン酸・コラーゲンのナノ粒子化による新規皮膚浸透促進技術の開発とそのメカニズムの解明

Table 1 ヒアルロン酸コラーゲンナノ粒子と FITC コラーゲンヒア
ルロン酸の粒子径、ゼータ電位、PDIa）

b）

グラフは３回以上の繰り返しの測定を行い、平均±標準偏差で示した。

化している可能性がある。また、別に蛍光標識したコラーゲンを使用してヒアルロン酸コラーゲン粒子を調製した。

Fig. 2 ヒアルロン酸コラーゲンナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像
粒子はネガティブ染色法で観察した。スケールバーは 200 nmを示した。

その結果、非標識コラーゲンを使用したときと大きく変わらない物性をもつ粒子が調製された（Table 1）。
ノ粒子化したコラーゲンでは皮膚中に強い蛍光が観察され

3 . 2 . ヒアルロン酸コラーゲンナノ粒子の透過型電子顕微鏡観察た。興味深いことに非粒子化コラーゲンでは角層部分に強調製したナノ粒子を透過型電子顕微鏡で観察した。画像くなった。これらのことからコラーゲンは粒子化することを Fig. 2 に示す。粒子は比較的球状であり、粒子の表面にで効率的に皮膚内に浸透することが示唆される結果が得らは斑点のような模様があることがわかった。今回行ったネれた。我々は以前に粒子化したヒアルロン酸が皮膚内に浸ガティブ染色の場合、水に親和性の高いところは黒く、水透している可能性を報告しており、ヒアルロン酸コラーゲに親和性の低いところは白く観察される。今回はイオンコ

ンナノ粒子はヒアルロン酸とコラーゲンを同時に皮膚内にンプレックスで粒子を作成しているので、白く観察されて送達可能な非常に興味深いマテリアルであることが推察さいるところは完全に陽イオンと陰イオンが電荷を打ち消しれた。しかし、この蛍光画像の数値化ができておらず、定合っているところであり、黒い部分はイオンが遊離してい量的な評価ができていないことが今後の課題である。また、ることが推察される。このようにヒアルロン酸コラーゲン

もう一つの課題として、この蛍光が蛍光標識コラーゲン由

ナノ粒子の表面は均一な電荷状態ではないことが想定され来であることを証明することが必要であり、サイズ排除クた。

ロマトグラフィーなどでの検討が必要である。こちらも現い蛍光が観察されたが、粒子化するとその蛍光は比較的弱在検討を進めている。なぜ、粒子化することで高分子のコ3 . 3 . ヒアルロン酸コラーゲン粒子の皮膚浸透性ラーゲンが皮膚浸透するのかは議論の対象である。一般に蛍光標識されたコラーゲンを用いてヒアルロン酸コラーイオン性化合物は皮膚浸透性が低いとされる。イオンコン

ゲンナノ粒子を調製し、ヒト皮膚を介した皮膚浸透試験をプレックスを作ることで一部のイオンが打ち消されること行った。24 時間後に皮膚表面を洗浄、凍結切片を作成し、で皮膚への浸透経路が変わり、皮膚浸透性が高まった可能蛍光顕微鏡で皮膚中の蛍光を測定した（Fig. 3）。

性もあるが詳細は不明であり、今後の検討を要する。

調製した Buffer 液、非粒子化コラーゲンと比較して、ナFig. 3 FITC コラーゲンヒアルロン酸（ヒアルロン酸コラーゲン）
ナノ粒子の皮膚浸透性
緑色は FITC コラーゲン由来である。スケールバーは 200µm を示した。

− 39 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

４．総4） Kadler K. E., Baldock C., Bella J., Boot-Handford R. P.,

括Collagens at a glance, J. Cell Sci., 120, 1955-1958（2007）．

ヒアルロン酸コラーゲンナノ粒子を調製し、ヒト皮膚に5） Lee C. H., Singla A., Lee Y., Biomedical applicationsof collagen, Int. J. Pharm., 221, 1-22（2001）.

適用したところ非粒子化コラーゲンと比較して粒子化したコラーゲンは皮膚浸透性が高い可能性が示された。また、

6） Morifuji M., The beneficial role of functional food

以前の我々の検討とも合わせて考えると、ヒアルロン酸コ

components in mitigating ultraviolet-induced skin

ラーゲンナノ粒子はヒアルロン酸とコラーゲンを同時に皮

damage, Experimental Dermatol., 28, 28-31（2019）.

膚内に浸透させる画期的なマテリアルであることが推察さ

7） Kon A., Hyaluronan in the skin and its correlation
with dermatopathology, Trends Glycosci. Glycotechonol.,

れた。

22, 68-79（2010）.
謝辞8） Henry S., McAllister D. V., Allen M. G., Prausnitz M.

本研究の遂行にあたりご支援をいただきました公益財団R., Microfabricated microneedles: a novel approach to

法人コーセーコスメトロジー研究財団に深謝申し上げます。

transdermal drug delivery, J. Pharm. Sci., 87, 922-925（2008）.
9） Tokudome Y., Komi T., Omata A., Sekita M.,（引用文献）A new strategy for the passive skin delivery of1） Susan S., Antonei B. C., Robert S., Hyaluronidase

nanoparticulate, high molecular weight hyaluronic acidexpression in human skin fibroblasts, Biochem.

prepared by a polyion complex method, Sci. Rep., 8,2336（2018）.

Biophys. Res. Commun., 266, 268-273（1999）.
2） Weissmann B., Meyer K., Sampson P., Linker A.,10）Shigefuji M., Tokudome Y., Nanoparticulation ofIsolation of oligosaccharides enzymatically produced

hyaluronic acid: A new skin penetration enhancing

from hyaluronic acid., J. Biol. Chem., 208, 417-429（1954）.

polyion complex formulation: Mechanism and future3） Rich A., Crick F. H. C., The molecular structure ofcollagen, J. Mol. Biol., 3, 483-506（1961）.

− 40 −

potential, Materialia, 14 , 100879（2020）.