研究用試薬

製品データシート

2022 年 6 月

Code No. 27901

第 1 版作成

Human secreted α-Klotho Assay Kit - IBL(3) 標準物質の希釈方法

96 Well

標準物質バイアル瓶に精製水を 0.5 mL 加えて完全に溶解します。
この時標準物質濃度は 9,000 pg/mL となります。溶解後の標準物質は凍結保存することができます。凍結融解の繰り返しはできません。
希釈用テストチューブを 7 本用意し希釈用緩衝液を 230 μL ずつ量り取ります。
4,500 pg/mL の希釈用テストチューブに 9,000 pg/mL の標準物質溶液を230 μL 加え、混和し、その溶液 230 μL を 2,250 pg/mL の希釈用テストチ
ューブに加え混和します。順次 2 倍連続希釈をおこない、4,500 pg/mL～70.31 pg/mL までの 7 点を希釈標準品とします。

ご使用の際はこの添付文書をよく読んでから使用してください。
全般的な注意本キットは、研究用試薬です。診断等に用いることはできません。

形状・構造等（キットの構成）
1 抗体プレート(Anti-secreted α-Klotho Rabbit IgG A.P.固相)96Well x 12 標識抗体濃縮液(30 倍濃度)
(HRP 標識抗 Human Klotho (91F1) Mouse IgG MoAb Fab’ A.P.) 0.4mL x 13 標準物質(Recombinant secreted α-Klotho)
0.5mL x 24 希釈用緩衝液
30mL x 1
5 標識抗体用溶解液
12mL x 16 TMB 基質液
15mL x 17 停止液
12mL x 18 濃縮洗浄液
50mL x 1

Tube-1Tube-2Tube-3Tube-4Tube-5Tube-6Tube-7(4) 検体の希釈方法
検体は添付の希釈用緩衝液で、下記の希釈倍率にて希釈してください。
ヒトの血清、EDTA-血漿及び脳脊髄液の場合は、2～4 倍

測定対象
ヒト血清、EDTA-血漿および脳脊髄液

測定原理

3 測定操作方法 (測定操作一覧 参照)

本製品は、サンドイッチ法による ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
キットです。1 次抗体はプレートに固相されていますので、検体および標準物質を加え 1 次反応をおこないます。その後、HRP 標識された 2 次抗体を加え 2 次反応をおこない、反応後過剰の 2 次抗体を洗浄除去した後、Tetra Methyl Benzidine (TMB)により発色させます。

(1) 検体ブランクの添加
検体ブランクのウェルを設定し、希釈用緩衝液を 100 μL 入れます。
(2) 検体、希釈標準品の添加
検体 100 μL および希釈標準品各 100 μL をそれぞれのウェルに入れます。
(3) プレートカバーをして第１反応(4) 洗浄ウェルの反応液を除去します。洗浄液を加え除去します。
(5) 標識抗体の添加
標識抗体を 100 μL 添加します。
(6) プレートカバーをして第２反応(7) 洗浄ウェルの反応液を除去します。洗浄液を加え除去します。
(8) TMB 基質液の添加
TMB 基質液を 100 μL 添加します。
(9) 遮光して発色反応(10) 停止液の添加
停止液を 100 μL 添加します。
(11) 吸光度測定
プレート底面のよごれや水滴を拭き取り液面に気泡がないことを確認した
後、検体ブランクを対照とした検体および標準の吸光度を測定してください。
測定波長：450 nm、2 波長の場合は主波長：450 nm、副波長：600～650 nm

操作上の注意123456789101112

検体は、採取後速やかに測定してください。保存する場合は、凍結保存とし、検体の凍結融解を繰り返さないでください。また、融解は低温でおこない測定前に十分混和してください。
検体は希釈用緩衝液で希釈してください。
検体や標準物質は、二重測定することをおすすめします。
測定に当たってはその都度検量線を作成してください。
検体は、中性域のものを使用してください。また、有機溶媒等の混入も反応に障害がありますので注意してください。
試薬は使用前に常温に戻し、数回静かに転倒混和し変化のないことを確かめてください。
抗体プレ－トの洗浄は必ず付属の洗浄液を使用してください。不十分な洗浄は、測定誤差の原因となりますので正確におこなってください。
洗浄は機械洗浄（wait time 0 秒）を推奨いたします。洗浄瓶を用いて洗浄する
場合は、洗浄液をウェルに満たした後、直ちにプレートを逆さまにして振り払い洗浄液を除去します。この洗浄操作を規定回数おこなってください。操作は洗浄むらのないよう十分注意しておこなってください。
洗浄操作を規定回数おこなった後に、プレートをペーパータオルの上でたたいて、完全に水分を除去してください。この時ペーパータオルがウェルの中に入らないよう注意してください。
TMB 基質液は、光に対して敏感です。遮光保存してください。金属との接触も避けてください。使用に際しては必要量を採取用容器にとり分けてください。
TMB 基質液添加後、反応液は徐々に青色に変ります。この時の反応は、遮光してください。また、採取用容器に残った TMB 基質液は、コンタミの原因になりますので元に戻さないでください。
吸光度測定は、停止液添加後 30 分間以内におこなってください。

測定操作一覧

試

必要な器具・器材
プレートリーダー
希釈用テストチューブ
精製水
ペーパータオル
冷蔵庫

料

第１反応
洗

用法および用量 (操作方法)
1

マイクロピペットおよびチップ
メスシリンダーおよびビーカー
プレートウォッシャー
採取用容器 (清潔な試験管など)検体ブランク

検体

希釈標準品

希釈用緩衝液100 μL100 μL100 μL

プレートカバーをして 2～8℃ overnight 反応
4 回 (洗浄液 350 μL 以上)（操作上の注意 8.9 参照）
100 μL

第２反応

プレートカバーをして 2～8℃ 60 分間反応

100 μL

発色反応
停 止 液

濃縮洗浄液を精製水で 40 倍希釈してください。これを洗浄液とします。
必要量を調製してください。
(2) 標識抗体濃縮液の希釈方法
標識抗体濃縮液を別に用意した採取用容器にて、標識抗体用溶解液で 30倍希釈してください。これを標識抗体とします。

群馬県藤岡市中 1091-1
1100 μL

100 μL

5 回 (洗浄液 350 μL 以上)（操作上の注意 8.9 参照）

浄TMB 基質液(1) 濃縮洗浄液の希釈方法

免疫生物研究所

標 準

浄吸光度測定

株式会社

検 体

標識抗体

洗2 準備製造販売元

4,500pg/mL
2,250pg/mL
1125pg/mL
562.5 pg/mL
281.25 pg/mL
140.63 pg/mL
70.31 pg/mL

100 μL100 μL

遮光常温 30 分間反応
100 μL100 μL450 nm / 600～650 nm

100 μL研究用試薬

製品データシート

2022 年 6 月

Code No. 27901

Human EDTAPlasma (x4)

測定結果の算出方法
グラフの X 軸に標準物質濃度を、Y 軸にその吸光度をプロットします。各プロットに適当な回帰曲線を当てはめ(例：両対数変換の二次回帰等)、検量線を作成します。
検体の吸光度を検量線に当てはめ、濃度を読みとります。
その値に検体の希釈倍率を乗じ、検体の濃度を算出します。

123

Human CSF
(x2)

測定値と検量線作成例
標準品濃度( pg/mL)

吸光度(450nm)

4,500

3.007
1.630

1,1250.844

562.5

0.427

281.250.225

140.63

0.113

70.31

0.057

105
OD 4502,250

Human CSF
(x4)

101002

測定範囲70.31 ～ 4,500 pg/mL

1000

10000

CV (%)

n2184.73
559.64191.43104.54
23.64
13.17

4.8
4.2
6.9242424

測定値(pg/mL)

SD(pg/mL)

CV (%)

n2247.34
566.24186.30127.96
29.34
11.37

5.7
5.2
6.1

1111116

妨害物質の影響
溶血ヘモグロビン
490 mg/dL
遊離ビリルビン
19.1 mg/dL
抱合ビリルビン20.7 mg/dL
乳ビ 1650（ホルマジン濁度）まで影響は受けません。

8特異性
Substance
Human secreted α-Klotho
Human β-Klotho
Human transmembrane α-Klotho Isoform

Dilution linearityof Human serum

pg/mL

pg/mL

使用上または取り扱い上の注意
1

取り扱い上(危険防止)の注意(1) 構成試薬には動物血液成分を含む物があります。取り扱いに注意し使用後は手洗いなどをおこなってください。
(2) 停止液は強酸性 (1N 硫酸) です。衣服・皮膚等への接触および廃棄には十分 注意してください。

2

使用上の注意(1) 標準物質は、凍結乾燥品です。開封は、十分注意しゆっくりとおこなってください。
(2) 保存は、2～8°C としてください。
(3) 希釈用緩衝液、標識抗体濃縮液および濃縮洗浄液は、まれに析出を認める場合がありますが、性能に問題はありません。
(4) ロットが異なる製品の構成試薬や他のキットの構成試薬を混ぜたり、交換したりして使用しないでください。
(5) 期限切れの試薬は、使用しないでください。

3

廃棄上の注意使用後の抗体プレートや試薬は多量の水で洗い流してから廃棄してください。

000.75

11/Dilution (1;2-fold diluted of Humanserum)

00.25
0.50.75
11/Dilution (1;2-fold diluted of HumanEDTA plasma)

Dilution linearityof Human CSFpg/mL
2000040.25
0.50.75
11/Dilution (1;2-fold diluted of HumanCSF)

貯蔵方法・有効期間

添加回収試験

検体

Human Serum(x2)Human Serum(x4)Human EDTAPlasma (x2)

製造販売元

Cross reactivity (%)
100%
≦0.1%
≦0.1%

Dilution linearity of Human
EDTA plasma

400

200400

測定間再現性

7

希釈試験

0.5

同時再現性

0.01

感度9.87 pg/mL (標準品を用いて NCCLS 法にて算出)

0.25

93.1
94.5
92.5
91.6
92.9
96.9
97.8
98.4
95.9
99.0
100.5
103.6

SD(pg/mL)

0.1101166.29
652.64378.54246.102345.411355.76818.01546.31
2292.071250.57
705.14435.20測定値(pg/mL)

性能

400

1252.98690.48409.23268.612524.221399.22836.72555.472388.841263.84701.34420.091

Human secreted α-Klotho (pg/mL)

31125.00
562.50281.25140.632250.00
1125.00
562.50281.252250.00
1125.00
562.50281.25

第 1 版作成

添加量(pg/mL)

理論値(pg/mL)

測定値(pg/mL)%1125.00
562.50281.25140.631125.00
562.50281.25140.631125.00
562.50281.25140.631364.31801.81520.56379.941224.54662.04380.79240.171420.78
858.28577.03436.411116.25659.96457.58351.831029.07572.52338.54211.141308.29779.97528.53400.91

81.8
82.3
87.9
92.6
84.0
86.5
88.9
87.9
92.1
90.9
91.6
91.9

株式会社免疫生物研究所

2～8°C 保存
使用期限は外箱に記載

包装単位および製品番号
96 Well
製品番号27901

問合せ先株式会社 免疫生物研究所〒375-0005 群馬県藤岡市中 1091-1
電話：0274-50-8666
FAX：0274-23-6055
URL: https://www.ibl-japan.co.jp
E-mail: do-ibl@ibl-japan.co.jp

群馬県藤岡市中 1091-1
2