分子生物学的手法を用いた水処理装置の微生物診断技術
Motecular
microbia[bio】oglCal

for thetechniques
incommunities

bioLoglCal

analysIS

Of

treatmentwaterplant(技)第2研究開発部第5研究室
赤司昭
AkashiAkira

活性汚泥処理方式を初めとする生物学的水処理装置は古くから多用されてきた｡しかしをがら,それらに関与する微生物に関する知見はほとんどないのが現状である｡その理由として従来の培養を介する分･析方法では,培養できない微生物が多く存在するため,処理に係わる微生物の全貌を解析できないことが挙げられる｡しかし,最近の分子生物学的手法の発達により,培養を介さずに環境や処理装置内の微生物集団を解析することが可能になった｡本稿では,FISH法､DGGE法等の分子生物学的手法に基づいた水処理装置内の微生物集団の解析手法について,n介すると共に,嫌気性廃水処理装置内の微生物集団の解析例について紹介する｡

Biologicaltreatment

water

understandingof

thosecultivatedbyapproaches

tounderstandtreatment

processes

plants.

theFluorescentcommunity.

These

operationand

the+,鞄̲dynamics
in situ

of

By

novel

development

wouldof highoffer

performance

many

since

(FISH) provides

usefulapowerfulinformation

new

water

detectthe(DGGE)anddiversityoptimization

microbialof processequipments.

.野竺4sj,∴▲

生物学的水処理

Biologicalwater

分子生物学的手法

Molecular

biologlCal

treatment

technique(PCR) denaturing(DGGE) ,fluorescent
resis(FISH)
reaction

10togel electrophoresis

forthebeus

biologlCal
tool

ourcamotprovidedor

cananalysethe

we

But

used.

bactedateclmiques

usgradient(TIRFLP)uswidelyin environment

comlnumities

,

been

environmental

biologlCal

denaturingusing

lengthpolymorphism

techmiqueshavesludgemolecular

microbial

hybridization

communities.

fragment

activated

limited,Recenttechniques.

target bacteriainmicrobial
terminal‑restrictionismicroorganisms

conventional

assuch

神鋼パンテツク技報,

polymerase

chain

gradient

gel electropho‑

inhybridization

vol.

situ

45

No.

a(2002/2境や廃水処理装置内に存在する微生物のせいぜい10.

ま えがき
活性汚泥を初めとする廃水処理や鉄バクテリアを%程度と言われており,残りの90%以上の微生物用いた上水からの鉄除去等,生物学的用･廃水処理は,生きているが培養できない(Viable2)

but3)

は,運転費用が安価であり運転方法さえ適切であれnonculturable:VNC)ことになる｡したがって,培養ば優れた性能を発揮することから,古くから頻用さ可能な微生物だけを対象とした研究では,用･廃水れてきた｡また,産業界で最も利用されている微生処理装置の性能(処理水質)と微生物の関係を正し

1)

物利用は廃水処理であると言われているように,級く把握することは不可能である｡

生物を利用した用･廃水処理は我々の生活に深く係最近,分子生物学的手法の発達により,培養操作わっている｡しかし,それらに係わる微生物に関すをおこなうことなく微生物集団を解析することが可る知見は,他の産業,例えば,醸造や医薬品製造な能になった｡本稿では,分子生物学的手法を用いたどで利用される微生物に比べ貧弱と言わざるを得な水処理装置内の微生物集団の解析方法について概説

い｡

する｡
その理由は主に2つの理由に起因すると考えられる｡まず,醸造や医薬品製造等に利用される微生物は,純粋培養されたものであるのに対し,廃水処理

1.細菌数の測定
1.

1全菌数の測定
培養に依存しない微生物の計数法として,顕微鏡では種々の微生物から構成される集団を利用する点下で直接計数する方法がある｡すなわち,微生物細である｡つまり,前者では,ある特定の優れた機能胞内のDNAやタンパク質と親和性のあるDAPIを持つ微生物を利用するため,その微生物の代謝や(41,6‑diamidine‑2‑phenylindole)

FITC遺伝学に関する詳細な研究が進められ,変異や遺伝,あるいは,(Fluorescein‑iso也iocyanate)などの蛍光色素で染色子操作等により種々の改良が進められてきた｡一方,

し,蛍光顕微鏡で観察する方法である｡本方法は,用･廃水処理では,多種多様な微生物の作用により分散性の良いサンプルの場合正確に菌数を測定するその性能が得られるため,一般的には,特定の微生ことができるが,活性汚泥のようにフロックを形成物に着目しても,その微生物の機能が,処理性能をしている場合には,超音波処理等の前処理を行い分反映しているとは言い難い｡第2に,今までは,こ散する必要がある｡の微生物集団を解析する適切な手法がなかった点で

1. 2

年寺定細菌の計数ある｡従来の微生物の検出方法として,ある栄養素

l. 2.

1蛍光in

●

situハイプリダイゼ‑ション法(FISH法)を含んだ寒天培地にサンプルを塗布し,そこに生育したコロニーの数で対象とするサンプルに生息する

蛍光色素を用いた方法では,全細菌数の計測は可微生物の数を推定する方法(培養法)が広く採用さ能であるが,目的とする特定の細菌との区別はできれてきた｡しかし,培養可能な微生物は,実際に環ない｡特に,硝化･脱窒やメタン発酵のように特殊

第l図
Fig.

Vol.

45

No.

2

(20α2/2)

神鋼パンテツク技報

FISH法の原理
I

PrincipleofFISH

11

な機能を有する細菌が,全細菌の中にどれだけ存在は可能であったが,都市下水処理場や河川のようにするか調べたい場合には,アンモニア負荷の低い場合は検出が困難であった｡

situ

感度を上げる方法として,

8)

FISH法(nuorescent inhybridization法)により解析可能である｡第1

図に示すように,FISⅢ法は,蛍光標識したDNA

Yamagucbiらにより
9)

HNPP/FastRed

TR‑FISH法が開発された｡本法をプローブと細菌の標的遺伝子を反応(bybridize)さ4)用いることにより,従来のFISH法にくらベ約10催せ,目的とする細菌だけを検出する方法である｡一の蛍光強度を得ることができ,今までは検出困難て般的には,細菌の標的遺伝子として16SrRNAが多あった河川水中の細菌群集構造の解析が可能になT:用される｡

た｡その他にも,嫌気性廃水処理装置のグラニエー

10)

16SrRNA分子には,細菌の科,属,檀5).

6)レベルで共通の配列が存在するので,目的とする細菌に応じたDNAプローブを使用することにより,特定の細菌だけを検出できる｡また,

16SrRNAのル汚泥の古細菌(メタン生成菌)と真性細菌(酸生11). 12)成菌)の分布状態の解析,バルキングの原因となZ13). 14)
活性汚泥中の糸状性細菌の検出例など種々の細菌￠

7)

細胞内の量と細菌の活性は関連するので,個々の細検出に利用されている｡

菌の蛍光強度からそれぞれの細菌の相対活性を把握

2.細菌の多様性の解析することも可能である｡

2.

本法は,単に目的とする細菌を計数できるだけでなく,グラニユール汚泥のように,立体構造をもつ1変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(DGGE法)
前述のように,生物学的水処理装置内には,多摩微生物群集内における特定細菌の分布を目視的に観多様な細菌種が存在する｡これらの細菌の多様性壱解析する手法としてDGGE(DenaturirlgGradien察できる等の利点がある｡逆に,

Gel15)

16SrRNAの量がの細菌とのDNAプローブの非特異的結合,自家蛍Electrophoresis)法がある｡一般的には,細眉の16SrRNA遺伝子の特定領域(variable regionと口ミばれる領域で,その配列は細菌種毎に異なる)壱PCR(Polymerase Chain Reaction)で増幅した後,光等の問題がある｡さらには,ポリアクリルアミドゲルを支持体とするゲル中で召少ない,つまり,活性の低い細菌は蛍光強度が弱い8)ため検出は困難である｡また,目的とする細菌以外DNAプローブが設計されている細菌しか検出できない欠点もある｡
FISfI法の適応例として活性汚泥のアンモニア酸気泳動し,16SrRNAの塩基配列の違いで分離すj:方法である(第2図).

(PCR産物G;2本鎖DNA化細菌を解析した例がある｡アンモニア負荷が高い2本鎖DNA)にくらベ,部分的に1本鎖に解離し集積培養系では,アンモニア酸化細菌の検出と計数

たDNAはポリアクリルアミドゲル中で移動度が遥

第2図
Fig.

12

DGGE法の原理
2Pr血cipleofDGGE

神鋼パンテツク技報

Vol.

45

No.

a(BOOB/aくなる｡また,濃度勾配の違いにより解像度が大きく変わることを2本鎖DNAの解離は,温度,変性剤濃度と塩基配列が関係する｡したがって,変性剤(尿素とホルムアミドの混合物)が濃度勾配を形成我々は経験している｡

DGGE法は,未知の微生物群集の多様性を比較して存在するポリアクリルアミドゲル中で電気泳動簡単に解析できるため,様々な処理装置の微生物ををすると,同じ長さのPCR産物でもその塩基配列対象に多くの研究が行われてきた｡コンポスト化過の違いによりDNAの解離度が異なり,分離するこ程における微生物種の変遷やバイオレメデイエーショとができる｡

ン実施時の細菌群集構造解析あるいは,嫌気消化槽18), 19)20)

DGGEにより分画したバンドの1本1本は異なる微生物に由来するので,バンドのパターグラニエール汚泥の酸生成菌やメタン菌の多様性解ンから生息する微生物の多様性を把撞することがで析等枚挙にいとまがない｡

きる｡さらに,電気泳動により分画したDNAバン

2.221)

ドをゲルから抽出して再度pcRにより増幅後,そその他の手法

DGGEの他に細菌種の多様性の解析に多用されして,T‑RFLP(Terminal‑Restrictionの遺伝子配列を調べ,データベースからその菌種をる手法と推定することも可能である｡

Fragment(DNA)とするか16SrRNAそのものとするかで得ら16SrRNAれた結果の解釈が若干異なる(第3固)｡遺伝子(DNA)をターゲットとしてPCRを行い,pcR産物を適当な制限酵素で切断した後,蛍光物質で標識されたDNA断片をDNAシークエンサー22)等で分画する方法である｡そのDNA断片の位置かDGGE解析した場合,存在する細菌種の多様性を16SrRNAをターゲット(ReverseTranscrip‑にしてPCR,厳密にはRT‑PCR

Ploymorphism)がある｡これは,5■末端を蛍光標識したプライマーを用いて行ったpcRにより増幅する対象を16SrRNA遺伝子知ることができる｡一方,

Length

ら細菌種を比較することが可能であり,また,断片の数から細菌種の多様性を解析することができる｡
本法もDGGE法と同じく微生物からの核酸の抽出とpcR増幅を伴うため,それらに係わる問題点がtase‑PCR),を行いDGGE解析した場合細菌種の多様性の他に,各細菌の活性を調べることも可能であ指摘されている｡本法の適応例として,下水処理場

16)

23)

る｡の活性汚泥の解析等がある｡

本法は,種レベルで処理装置内の細菌の多様性や

3.

I)GGE法によるフタル酸処理tJASBの嫌気性微生物群の解析例

活性を把握できる点で極めて有用な技術であるが,
17)

いくつかの問題点も指摘されている｡まず,微生物景

3.1背からの核酸(DNA,RNA)の抽出効率である｡つまり,処理装置内には,多種多様の微生物が存在し,それぞれの微生物の殻(細胞壁)の固さもまちまちして多用されており,世界で年間1‑2億トン生産である｡したがって,核酸の抽出方法によっては,活性汚泥で処理されてきたが,近年嫌気性廃水処理壊れやすい微生物の核酸が優先的に抽出される恐れを適応する例が多くなってきている｡しかし,フタがある｡次に,PCR反応時のバイアスやキメラ生成の問題も指摘されている｡また,
DGGE自体もル酸化合物の分解に係わる嫌気性細菌に関する知見使用するポリアクリルアミドゲルの濃度や変性剤の定かつ高効率な運転管理を行うための知見を得るこ

フクル酸化合物は,プラスチック製品の可塑剤とされている｡従来,フタル酸化合物を含む廃水は,は全くない｡以下に,フタル酸化合物処理装置の安16S上＼16SEDNA

B&cteri&

第3図

DGGE法による微生物の多様性と活性の解析

‑

Fig.

3

Analysis
activity

Vol.

45

No.

2

(2002/2)

神鋼パンテツク技報

ofbymicrobialdiversityand

DGGE

18

とを目的として実施した微生物集団の解析例につい4)tLD｢コ:∃て紹介する｡
3.27a層実験方法

̲‑＋＋＋＋＋＋=degradati.n

フタル酸化合物の分解に関与する微生物の解析が容易に行えるようフタル酸化合物を唯一の炭素源とする廃水で装置を立ち上げた｡種汚梶として,ビール工場のグラニエール汚泥を使用した｡フタル酸濃度の測定は,HPLCにより測定した｡グラニユール
汚泥は適宜サンプリングし,核酸を抽出した｡その;1篭
;ミヤ入頚!′!

核酸の16SrRNAの特定領域をpcRにより増幅した
後, DGGE解析に倹した｡また,I∫

一:1(領DGGEパターン解析の結果,種汚据及びフタル酸未分解時には観察されず,分解時に特異的に出現したDNAバンドをフタル酸化合物の分解に関与する微生物と推定した｡
3.3
結
果

2一トー

甲*

一うト▲d

投入したグラニユール汚泥にフタル酸化合物の分

遠賀鶴*

解活性が出現するまでに約2ケ月という長期間ををi.嘗蔓

轟i暑さ盲要した｡これは,ビール工場というフタル酸化合物

3号:.せ.との接触がない装置のグラニュ‑ル汚泥を種汚泥と3して用いたためだと思われる｡
第4図に処理過程の様々な時期に採取したグラニュ‑ル汚泥に存在する真性細菌(酸生成菌,フタル酸化合物分解菌も含まれる)の多様性をDGGE法で解

第5国
Fig･

14

第4図
Fig.

DGGE法によるフ夕ル酸化合物処理装内の細菌群の解析
4

DGGE

analysisofmicrobial

commuJlityin

phthalic

acids‑degrading

anaerobic

granularsludge

分子生物学的手法による水処理装置内の微生物の解析と応用
5

Molecular

biologicaltechmiques

foranalysISOf

microbialcommmities

神鋼パンテツク技報

andtheirapplications

Vol.

45

No.

2

(BOOB/2)

析した結果を示す｡それぞれのバンドは,基本的には一つ一つの細菌種に対応しているo

したがって,するかが重要にをると思われる｡さらには,運転管理に携わる現場の方々にとっては,リアルタイムな,バンドパターンを比較することにより,処理過程であるいは,装置の状態の予測が可能なデータの入手の細菌種の変遷,ひいては,フタル酸分解活性を持が最も重要であると思われる｡これらの点も考慮しつ細菌を特定することが可能となる｡なお,本実験ながら今後の研究開発を進めていきたいと考える｡

は,16SrRNAをターゲットとしたRT‑PCR産物を[参考文献]

DGGEにより解析した｡したがって,出現したバ
ンドの濃度が濃い細菌種は,活性が高い(つまり,1)金川貴博:バイオサイエンスとインダストリー,(2001), p731

活発に活動している)ことを意味する｡

2)Aman,R.I.

種汚泥ヤフタル酸化合物の分解活性が見られない
ときにa,b,4cの3本のバンド(細菌)は,時間が経過するに従い消滅,あるいは,濃度(活性)は低くなった｡一方,

1‑3の3本のバンド(細菌)は,種汚泥やフタル酸化合物の分解がない汚泥には存在せず,分解活性が見られる汚泥にのみ見られた｡従って,これら3本のバンド(細菌)がフタル酸化合物の分解に関与していると考えられる｡
以上のように,DGGE法を用いることにより,比較的短時間で目的とする微生物を推定することができる｡今後は得られた情報を基に,運転管理の最適化や高効率処理装置の開発に結びつけるような研す)

Ammann,R.I

etび

分子生物学的手法の適応により,今までブラックボックスであった生物学的水処理装置内の微生物に(1995), p.143

Rev.,59(1985), p.817

al. : Biorrechol.,3

etal. : Appl.

Environ.

Microbiol.,58(1992) p.3007
5) Gutell, 良.良., et al∴ Microbiol.

Rev.,6 ) vanAcidsRes.,24

Microbiol.,161(1994), p.100

7)dePeeretal.

wagner,R.

: Nucl.

: Arch.

(1994), p.10
(1996), p.3381

5836 (1999), p.19
8)小沼晋他:環境工学論文集:N. et al. : Appl.
Environ.
Microbiol9 ) Yamaguchi,(1996), p.275

p.40515) MtlyZer,etal., : Appl.

G et al. : Appl.

Environ.

Environ.

Microbiol.,Microbiol.,59

解明の手が及ぶようになった(第5図)｡しかし,今まで発表された論文等を眺めてみると,

17)石井浩介他:

Microbes法を用いて処理装置内の微生物群集の解析が可能で18) Aoshima,eta,I., : J. Biosci.

あった+止まりで,装置の処理性能との関連づけを

19) pedro, M. S.,etal., : J. Biosci.Bioerlg.,91
30 (2001), p.27
20)谷桂津治他:環境技術,行った研究は少ないように思われる｡我々水処理に係わるものにとっての最大の関心事は,微生物の状態と装置の処理性能との関連づけであり,今後はこの研究をいかに実施し,運転管理や装置開発に適応

66(1993),

p.695

16) Duineveld, ち. M(2001), p.172｢ある手6239 (1997), p.12
10)山口進康他:用水と廃九36 (1999), p.llll)荒木信夫他:環境工学論文集,12) Market, W., et al. : Wat. Res., 33 (1999), p.2392
13) wagTler, M.et al. : System. Appl. Microbiol., 17 (1994),T.
14) Kanagawa,(2001), p.5043

究に発展させていきたい｡
むet al. : Microbiol.

3 ) colwell,R.R.,

5921)
22)

M.

et al., : Appl.

Environments,

J‑tI., et al､, : Microbiology,

Liu,W.,

al., : Appl.

Environ.

Microbiol.,

15

Bioeng.,wu,etEnviron.

147

9167(2000) p.59
(2001), p.456(2001), p.159,(2001), p.373

Microbiol.,63(1997),

p.451623) Hiraishi,

A.etal., : J. Biosci.

Bioeng.,90(2000), p.148

連絡先
赤司

技術開発本部
第2研究開発部
第5研究室
主任研究員

昭(医学博士)TEL

078‑992‑6525

FAX

O781992‑6504

E‑mail a.akashi@pantec.co.jp

Vol.

45No.

2(BOOB/2)

神鋼パンテツク技報

15