マニュアルVer. 3.0
Code No. 316-07791

目 次Ⅰ 製品説明

2

Ⅱ キット内容

2Ⅲ 保存

2

Ⅳ 使用上の注意

3

Ⅴ JAS 法表示品目に対応したプロトコールの選択

3

Ⅵ プロトコール4＜プロトコール 1： 乾燥した食品からの DNA 抽出方法＞

5＜プロトコール 2： 水分を多く含む食品からの DNA 抽出方法＞

6

Ⅶ データ集

8

Ⅷ トラブルシューティング

12

Ⅸ 関連製品

13Ⅹ 参考文献14１

GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

Ⅰ 製品説明GM quicker 4 は、食品中の DNA を抽出および精製するためのキットです。本キットは、カオトロ
ピックイオン存在下にて核酸がシリカへ吸着する原理を応用しており、フェノールやクロロホルムなどの毒性有機溶媒を使用することなく、食品中に含まれる DNA を回収することが可能です。
本キットで使用するスピンカラムは、一般的な遠心機のローターが使用可能な範囲で、容積を最大限確保しており、シリカ膜は、食品中の DNA を回収するために充分な吸着能を有しています。
本キットによって得られた DNA は、PCR 法や LAMP 法等の酵素反応に使用することが可能なため、遺伝子組換え食品の検査や、特定原材料検査、食品微生物検査、原材料検査等への適応が期待できます。

Ⅱ キット内容
GE1 Buffer

100 ml × 2 本 *GE2-M Buffer

20 ml × 1 本

GB3 Buffer

12.5 ml × 3 本 *GW Buffer

40 ml × 1 本 *TE (pH8.0)

10 ml × 1 本 *Proteinase K (20 mg/ml)

1 ml × 1 本 *α-Amylase (高濃度品)

0.1 ml × 1 本 *RNase A (100 mg/ml)

0.5 ml × 1 本 *Spin Column

50 本マニュアル

1部＊ 別途、単品でお買い求めいただけます。詳細については 13 ページをご参照ください。

Ⅲ 保存
本キットに含まれる Proteinase K、α-Amylase 以外の全ての試薬と Spin Column は室温保存（15℃～25℃）が可能です。Proteinase K、α-Amylase は冷凍保存（‐20℃）して下さい。
RNase A は室温保存が可能ですが、長期間ご使用にならない場合には、冷蔵保存（2～10℃）
もしくは冷凍保存（‐20℃）して下さい。
GW Buffer にはエタノールが含まれています。ご使用後は蒸発を防ぐために速やかに蓋を閉め、保管して下さい。

２GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

Ⅳ 使用上の注意
・ 本キットは試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。
・ 本キットのお取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。
・ マニュアル記載内容と異なったお取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。

Ⅴ JAS 法表示品目に対応したプロトコールの選択（参考）プロトコール 1：乾燥した食品（フリーズドライ食品等）①凍り豆腐、おから及びゆば ②きな粉 ③大豆いり豆 ④乾燥馬鈴薯 ⑤コーンスナ
ック菓子⑥コーンスターチ⑦ポップコーン⑧ポテトスナック菓子⑨馬鈴薯でん粉
プロトコール 2：水分を多く含む食品（液状の食品や滅菌水を加えてホモジナイズした食品）⑩豆腐類及び油揚げ類
豆瓶詰

⑪納豆

⑯冷凍とうもろこし

⑫豆乳類

⑬みそ

⑭大豆煮豆

⑮大豆缶詰及び大⑰とうもろこし缶詰及びとうもろこし瓶詰⑱冷凍馬鈴薯
その他：対象品目の形状が様々で分類が困難な食品
以下の品目については、上記分類を参考にプロトコールを選択してください。
①～⑱までに掲げるものを主な原材料とするもの、大豆（調理用）を主な原材料とするもの、大豆粉を主な原材料とするもの、大豆たんぱくを主な原材料とするもの、枝豆を主な原材料とするもの、大豆もやしを主な原材料とするもの、コーンフラワーを主な原材料とするもの、コーングリッツを主な原材料とするもの（コーンフレークを除く）、とうもろこし（調理用）を主な原材料とするもの、馬鈴薯（調理用）を主な原材料とするもの、アルファルファを主な原材料とするもの、甜菜（調理用）を主な原材料とするもの。

３GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

Ⅵ プロトコール＜本キット以外に必要な試薬、機器など＞
・ マイクロピペット
・ ピペットチップ
・ 50 ml コニカルチューブ
・ 2.0 ml マイクロチューブ
・ 1.5 ml マイクロチューブ
・ フードミル（カッターミル等）
・ 遠心機
・ 試験管ミキサー
・ 恒温槽＜食品の前処理方法について＞
食品検査では、サンプリングの誤差を小さくするため、食品が均一になるように十分ホモジナイズする必要があります。ホモジナイズの方法として、JAS 分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル」＜改訂第 3 版＞では、試料重量と同じ重量の滅菌水を加えて粉砕する方法、または、試料をフリーズドライ等により乾燥させて粉砕する方法が考えられるとしており、主に滅菌水を加えてカッターミル等でホモジナイズする方法が記載されている。
本キットでは、プロトコール１として、フリーズドライ等の乾燥した食品を対象として開発した方法を記載しており、プロトコール 2 として、液体の食品や試料に滅菌水を加えてホモジナイズした食品を対象として開発した方法を記載している。

４GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

＜プロトコール１ ： 乾燥した食品からの DNA 抽出方法＞① 50 ml コニカルチューブに 1.0 g の破砕試料を秤量し、4.0 ml の GE1 Buffer、10 μl のRNase A、2 μl の α-Amylase および 20 μl の Proteinase K をそれぞれ添加する。壁面に付着した試料や Buffer をフラッシュ遠心によりチューブの底に集めた後、試験管ミキサーにて良く攪拌する（30 秒間以上）。（注１）② 30 分間、65℃で加温し、10 分間毎に試験管ミキサーにて 10 秒間最高速で攪拌する。
③ 400 μl の GE2-M Buffer を添加し、試験管ミキサーにて良く攪拌する。
④ 遠心（≧4K × g, 10 分間, 4℃）する。（注２）⑤ 上清 800 μl を新しい 2.0 ml マイクロチューブに移す。（注３）⑥ 600 μl の GB3 Buffer を添加し、10～12 回チューブを転倒させ、よく混和する。
⑦ 遠心（≧10K × g, 5 分間, 4℃）し、上清を可能な限り 2.0 ml マイクロチューブに回収する。
（注４）⑧ ⑦の上清を Spin Column に 700 μl 移し、遠心（≧10K × g, １分間, 4℃）し、濾液は廃棄する。
⑨ ⑦の残りの上清全量を⑧の Spin Column に移し、遠心（≧10K × g, １分間, 4℃）し、濾液は廃棄する。
⑩ 600 μl の GW Buffer を Spin Column に添加した後、遠心（≧10K × g, １分間, 4℃）し、濾液は廃棄する。
⑪ Spin Column を新しい 1.5 ml マイクロチューブに移す。
⑫ 50 μl の TE（pH8.0）をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。
⑬ 遠心（≧10K × g, １分間, 4℃）し、濾液を回収する。

５GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

＜プロトコール２ ： 水分を多く含む食品からの DNA 抽出方法＞① 50 ml コニカルチューブに 1.0 g の破砕試料を秤量し、1.0 ml の GE1 Buffer、10 μl のRNase A、2 μl の α-Amylase および 20 μl の Proteinase K をそれぞれ添加する。壁面に付着した試料や Buffer をフラッシュ遠心によりチューブの底に集めた後、試験管ミキサーにて良く攪拌する（30 秒間以上）。（注１）② 30 分間 65℃で加温し、10 分間毎に試験管ミキサーにて 10 秒間最高速で攪拌する。
③ 200 μl の GE2-M Buffer を添加し、試験管ミキサーにて良く攪拌する。
④ 遠心（≧4K×g, 10 分間, 4℃）する。（注２）⑤ 上清 800 μl を 2.0 ml マイクロチューブに移す。（注３）⑥ 600 μl の GB3 Buffer を添加し、10～12 回チューブを転倒させ、よく混和する。
⑦ 遠心（≧10K×g, 5 分間, 4℃）し、上清を可能な限り 2.0 ml マイクロチューブに回収する。（注４）⑧ ⑦の上清を Spin Column に 700 μl 移し、遠心（≧10K×g, １分間, 4℃）し、濾液は廃棄する。
⑨ ⑦の残りの上清全量を⑧の Spin Column に移し、遠心（≧10K×g, １分間, 4℃）し、濾液は廃棄する。
⑩ 600 μl の GW Buffer を Spin Column に添加した後、遠心（≧10K×g, 1 分間, 4℃）し、濾液は廃棄する。
⑪ Spin Column を新しい 1.5 ml マイクロチューブに移す。
⑫ 50 μl の TE（pH8.0）をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。
⑬ 遠心（≧10K×g, １分間, 4℃）し、濾液を回収する。

６

GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

(注１)攪拌操作が不十分な場合、DNA 収量が著しく減少します。試験管ミキサーに対してチューブを垂直にあて、そのまま 30 秒間、しっかりと攪拌して下さい。攪拌が不十分であれば、更に 30～60 秒間攪拌して下さい。

(注２)

使用する冷却遠心機のローターの最高回転数およびコニカルチューブの最大耐 g を確認して遠心して下さい。

(注３) 沈殿物や上清表面に浮かんでいる膜状の物質を可能な限り取らないように上清を回収して下さい。
(注４) 沈殿物や上清表面に浮かんでいる膜状の物質がある場合は可能な限り取らないように上清を新しい 2.0 ml チューブに移して下さい。

７

GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

Ⅶ データ集１．本キットで抽出した DNA の吸収スペクトル
A260 付近に吸収ピークがあることから、本キットで抽出した DNA は純度が高いことが示唆された。
0.350.3

Abs.

0.25
0.20.150.10.050220240260280300

320

Wavelength [ nm ]図１．きな粉から抽出した DNA の吸収スペクトル（プロトコール１）

0.25

Abs.

0.2
0.15
0.1
0.050220240260280300

320

Wavelength [ nm ]図２．豆乳から抽出した DNA の吸収スペクトル（プロトコール２）

８GM quicker 4 Manual Ver. 3.00.9
0.80.7Abs.

0.6
0.50.40.3
0.2
0.1
0220240260280300

320

Wavelength [ nm ]図３．粉末コーンスープから抽出した DNA の吸収スペクトル（プロトコール１）

0.8
0.70.6Abs.

0.50.40.30.20.10220240260280300320

Wavelength [ nm ]図４．ポテトスナック菓子から抽出した DNA の吸収スペクトル（プロトコール１）

９GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

２．本キットで抽出した DNA のアガロースゲル電気泳動
ダイズ加工食品（きな粉：プロトコール１および豆乳：プロトコール２）から DNA を抽出した。いずれのダイズ加工食品からも DNA を抽出できた。

M

123456M

Lane M : OneSTEP Marker 6 (λ/ StyI digest)
Lane 1, 2 , 3: きな粉由来の DNA
Lane 4, 5, 6 : 豆乳由来の DNA
本キットで抽出した DNA 溶液の 1／10 量(5 l)を 1% Agarose S で電気泳動した。
トウモロコシ加工食品（粉末コーンスープ：プロトコール１およびホールコーン缶詰：プロトコール２）から DNA を抽出した。いずれのトウモロコシ加工食品からも DNA を抽出できた。

M123456M

Lane M : OneSTEP Marker 6 (λ/ StyI digest)
Lane 1, 2 , 3: 粉末コーンスープ由来の DNA
Lane 4, 5, 6 : ホールコーン缶詰由来の DNA
本キットで抽出した DNA 溶液の 1／10 量(5 l)を 1% Agarose S で電気泳動した。

１０

GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

３．PCR による内在性遺伝子の検出
ジャガイモ内在性 DNA UGPase オリゴヌクレオチド（Code No.: 310-05991）を用いて、本キットで抽出したポテトスナック菓子由来の DNA 溶液を鋳型として PCR した。PCR の条件は、以下の通り。95℃, 10 min → （95℃, 30 sec → 60℃, 30 sec → 72℃, 30 sec）
×40 Cycle → 72℃, 7 minM

1234M111 bp

Lane M : OneSTEP Marker11 (pUC19/MspI digest)
Lane 1 : ネガティブコントロール（TE 溶液）
Lane 2-4 : ポテトスナック菓子
PCR 産物の一部（5 l）を 3% Agarose 21 ゲルで電気泳動
４．リアルタイム PCR による内在性遺伝子の検出
コメ内在性 DNA PLD オリゴヌクレオチドセット 2（Code No.: 312-07531）を用いて本キットで抽出したビーフン及びライスペーパー由来の DNA の定量試験を行った（n=3）
。

②Delta Rn①④③

ABI7500 Fast System による増幅曲線(Base Line 3-15, Th.Line=0.128)① ビーフン DNA(190,000 copies/2.5 l) ② 10 倍希釈ビーフン DNA(12,800 copies/2.5 l)③ ライスペーパーDNA(1,840 copies/2.5l) ④ 10 倍希釈ライスペーパーDNA(147copies/2.5 l)
本キットで抽出したコメ加工食品の DNA は、リアルタイム PCR で定量可能であった。

１１GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

Ⅷ トラブルシューティング問題

遠心分離の後、十分な量 の上 清を回収できない。

スピンカラムが目詰まりする。

考えられる原因
試料に 対して GE1
Buffer が足りない。

試料の量を減らすか、GE1 Buffer の量を増やして下さい。

遠心力が不十分。

遠心 g を上げるか、遠心する時間を長くして下さい。

粗抽出液が 65℃から室温に下がっていない。

⑤の上清を回収するための遠心分離の直前に、数分間の氷冷操作で温度を下げると効果的な場合があります。

沈殿物や上清表面の浮遊物が混入した。

沈殿物や浮遊物の混入を避けるため、⑤の上清を 1.5 ml もしくは 2.0 ml マイクロチューブへ一旦移し、より強い g にて遠心を行った後、再度上清を回収し、GB3 Buffer を加えて下さい。
遠心後に放置しておくと沈殿物が浮遊してくる場合があります。沈殿物が浮遊してきた場合は、上清を回収する前に再度、遠心を行って下さい。

試料の破砕が不十分。

出来るだけ細かく、均質になるように試料を破砕して下さい。

抽出効率が悪い。

GE1 Buffer および酵素の添加後は、試験管ミキサーにてよく混合して下さい。また、加温反応中は粘性が低下し、攪拌効率が上がりますので、よく混合して下さい。

溶出が不十分。

TE(pH8.0)をスピンカラムへ添加した後、直ぐに遠心分離を行った場合、DNA 収量にばらつきが生じます。室温で数分間静置し、十分溶出した後、遠心分離して下さい。

試料中に含まれるDNA 量が少ない。

試料を 2 本以上用意し、GB3 Buffer 添加後の遠心で⑦の上清を回収するまで、それぞれ別々に操作を行う。その後、回収した上清を 1 つにまとめ、Spin Column へ複数回に分けて全量を添加すると DNA 収量の増加が期待出来る。

酵素処理温度が低すぎる、もしくは高すぎる。

マニュアル記載の温度(65℃)に調節して下さい。また、加温操作は熱伝導効率のよいウォーターバスやヒートブロック等の使用を推奨します。

分解酵素の失活。

Proteinase K および α-Amylase は-20℃で保存して下さい。

RNase A が失活している。

GE1 Buffer と RNase A は混合して保存することができません。
それぞれを別々に保存して下さい。

DNA の収量が少ない。

RNA の混入が多い。

考えられる対策

滅菌水等で希釈した後、PCR を行って下さい。
PCR で DNA を増幅できない。

PCR 阻 害 物 の 残存。

スピンカラムに試料由来の色素が着色する場合、i) GW Bufferによる⑩の洗浄操作を 2 回行うか、ii) ⑩の洗浄操作の後、80%エタノールで洗浄すると効果的な場合があります。

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GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

Ⅸ 関連製品
Code No.

製品名包装単位

317-06361

GM quicker
GM quicker 2
GM quicker 3
GM quicker 96
On-Site Column Set for GM quicker
GE1 Buffer
GE2 Buffer
RNase A（100 mg/ml）
GW Buffer
GE2-K Buffer
GB3 Buffer
GM quicker 2 Enzyme Set(Proteinase K 2 ml, α-Amylase 0.2 ml)
Collection Tube

50 回用

310-06591
311-07241
319-07161
317-07341
314-06371
311-06381
318-06391
311-06641
318-06651
315-06661
312-06671
319-08141

１３50 回用
50 回用
96 ｳｪﾙﾌﾟﾚｰﾄ×4
20 回用
500 ml200 ml
0.5 ml×540 ml×2
100 ml12.5 ml×2
1 Set100 回用

GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

Ⅹ 参考文献
1) Yasutaka Minegishi, Junichi Mano, Yasuo Kato, Kazumi Kitta, Hiroshi Akiyama
and Reiko Teshima, Japanese Journal of Food Chemistry and Safety, 20, 96-104(2013)

１４

GM quicker 4 Manual Ver. 3.0

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