TUMSAT-OACIS Repository - Tokyo
University of Marine Science and Technology(東京海洋大学)
ニジマスA型精原細胞の持つ幹細胞能に関する基礎的・応用的研究メタデータ

言語: Japanese
出版者:
公開日: 2014-06-23
キーワード (Ja):
キーワード (En):作成者: 佐藤, 茉菜
メールアドレス:所属:

URL

https://oacis.repo.nii.ac.jp/records/991

博士学位論文

ニジマス A 型精原細胞の持つ幹細胞能に関する基礎的・応用的研究

平成 25 年度
（2014 年 3 月）

東京海洋大学大学院
海洋科学技術研究科
応用生命科学専攻佐藤茉菜

ニジマス A 型精原細胞の持つ幹細胞能に関する基礎的・応用的研究
目次

緒論

1

第 1 章 -1

ニジマス残留 A 型精原細胞の持つ幹細胞能
緒言

10

材料および方法

12

結果

18

考察

19

参考文献

21

図説明

23

図

24

第 1 章 -2

ニジマス A 型精原細胞集団の持つ幹細胞活性の季節的変化
緒言

27

材料および方法

29

結果

39

考察

47

参考文献

54

図説明

58

図

67

表

90

第2章

幹細胞活性の高い A 型精原細胞集団特異的に高発現する遺伝子の探索
緒言

92

材料および方法

94

結果

99

考察

101

参考文献

107

図説明

111

図

113

表

118

第 3 章 Production of genetically diversified fish seeds using spermatogonialtransplantation

Abstract

124

Introduction

126

Materials and Methods

129

Results

132

Discussion

135

References

140

Figure legends

145

Figures147

Tables

150

総括

154

謝辞

162

緒論

配偶子は、次の世代に唯一遺伝情報を伝達可能な細胞系譜であり、種を存続させるうえで極めて重要となる。雄はより多くの子孫を残すために、生涯にわたり大量の精子を繰り返し産生する。例えば、ヒトは 1 回の心拍の間におよそ 1000 細胞の精子を産生し、一生のあいだに 1012 細胞にも及ぶ大量の精子を産生すると推定されている（Griswold and Oatley, 2013）。雄が大量の精子を枯渇させることなく、生涯にわたり産生し続けることができるのは、精巣内に「精原幹細胞」と呼ばれる幹細胞が存在するためである（Oatley and Brinster, 2012）。精原幹細胞は、他の幹細胞と同様に、自己複製能と分化能を兼ね備えた幹細胞の一種であり、精子のみに分化可能な単能性の幹細胞である。精原幹細胞は、雄の継続的な精子産生を可能にするために、自己複製を行い自分自身の数を維持しながら、同時に、精子へと分化することが運命づけられた分化型細胞を生み出し続ける。もし、精原幹細胞の自己複製と分化のバランスが崩れ、精巣内の精原幹細胞が枯渇してしまえば、雄は精子を産生できず子孫を残すことはできない。これを防ぐために、精巣内では精原幹細胞の自己複製と分化のバランスは周囲の微小環境により、厳密に制御されていると考えられている（Meng et al., 2000; Spradling et al., 2001）。精原幹細胞システムは、精巣機能の恒常性の維持さらには種を存続させるうえで、極めて重要な機構であり、このシステムの解明を目指した研究がマウスやショウジョウバエなどモデル生物を中心に現在も活発に行われている。
魚類の精子産生もまた、他の動物種と同様に、精原幹細胞の存在により維持されていると考えられてきた（Schulz and Miura, 2002）。一方で、魚類における精原幹細胞研究は立ち遅れており、その殆どは組織学的解析から得られた知見に留まっていた。これまでに、サケ科魚類を中心にして精子形成に伴う精巣構造の変化について
組織学的解析が多く行われた。その結果、精巣内には分化度の異なる数種類の生殖
1

細胞が存在することが明らかとなった。その中で、最も未分化な生殖細胞として捉えられているは A 型精原細胞（ASG）である。ASG は、精子形成を開始する前の未成熟期の精巣内に存在する唯一の生殖細胞である。精子形成が開始すると、ASG
は、B 型精原細胞、精母細胞、精細胞を経て精子へと分化する。ただし、一部のASG は精子へと分化せず、常に精巣内に維持されることが明らかとなった。この特徴は、サケ科魚類の精巣において特に顕著に認められ、精子形成の完了した繁殖期の精巣内には大量の精子の他に ASG のみがわずかに残されている様子が認められている（太田ら, 1965; Hiroi and Yamamoto, 1970; Billard, 1983）。近年、タイセイ
ヨウタラにおいても同様の精巣構造を示すことが報告された（Almeida et al., 2008）。
このように、大量の精子とわずかな ASG のみが存在する精巣であっても、翌年には再び大量の精子産生が行われることから、ASG は精子形成の源となる細胞すな
わち精原幹細胞であると考えられてきた（Hiroi and Yamamoto, 1970; Billard, 1983;
Schulz and Miura, 2002）。また、一部の魚種において、生殖細胞の核の形態的特徴が詳細に解析された（Leal et al., 2009; Schulz et al., 2010）。これまでに、マウスにおいて機能的な解析の結果から精原幹細胞を含むことが証明された生殖細胞集団（未分化型 A 型精原細胞）が同定されており、この細胞集団の核の形態的特徴が詳細に記載されている（de Rooij and Russell, 2000; Chiarini-Garcia et al., 2001）。この形態的特徴を指標としてゼブラフィッシュやティラピアの生殖細胞を細分化したところ、魚類の ASG の核の形態はマウスの未分化型 A 型精原細胞の核の形態によく似ることが明らかとなった（Leal et al., 2009; Schulz et al., 2010）。このことから、ASG は
未分化な状態であると結論付けられ、ゼブラフィッシュにおいて ASG は精原幹細胞としての性質を備えた細胞であると提唱された（Leal et al., 2009; Nóbrega et al.,2010）。さらに、ニジマスの ASG は、核の形態的特徴を指標に、分化度の異なる 2種類の細胞に細分化されており、ASG 集団は不均一な細胞集団であると推察されている（Loir, 1999）。さらに、ASG の形態的不均一性はゼブラフィッシュにおいて
2

も指摘されている（Leal et al., 2009）。以上の組織学的解析の結果は、魚類の ASG
がその一部に精原幹細胞を含む不均一な細胞集団であることを示唆する。しかし、
精原幹細胞は自己複製能と分化能を兼ね備えた細胞として定義されるため、固定標本を用いた組織学的解析では、幹細胞としての性質を備えた細胞すなわち精原幹細胞を検出することは原理的に不可能である（Yoshida, 2012）。つまり、魚類の ASG集団が精原幹細胞を含む集団であることを証明するには、精原幹細胞の自己複製能と分化能の両方を評価可能な機能的解析系を構築することが必要不可欠であるといえる。
近年、本研究室では、ニジマスをモデルにした精原細胞移植系を確立し、魚類のASG 中に精原幹細胞が存在することを初めて機能的に証明した（Okutsu et al.,2006）。この移植実験では、ドナーに未成熟期のニジマス個体から単離した ASG のみを含む精巣を用い、これら精巣から精巣細胞懸濁液を調整した後、宿主孵化稚魚の腹腔内へと移植した。すると、ドナー精巣細胞に含まれていた ASG 集団の一部の細胞が宿主の生殖腺へと移動し、生着することが明らかとなった。宿主生殖腺内に生着したドナーASG は、宿主自身の生殖細胞と同調した増殖および分化を行った後、繁殖期にはドナー由来の機能的な精子を産生した。さらに、ドナーASG は、宿主の生涯における数回の繁殖期に、数億もの精子を繰り返し産生することが明らかとなった。このことは、生着したドナーASG が、宿主生殖腺内で長期にわたり自分自身を維持しながら精子を産生したこと、つまり精原幹細胞としてふるまっていたことを示している。この事実により、魚類の ASG 集団がその一部に精原幹細胞を含む細胞集団であることが初めて機能的に証明された（Okutsu et al., 2006）。精原細胞移植系の確立により、魚類の精巣内に精原幹細胞が存在することが明らかとなった一方、依然として、魚類の精原幹細胞が精巣内のどこに存在し、どのような生化学的・形態学的特徴を持った細胞で、どのようにその性質が制御されているのか、その生物学的知見は殆ど明らかとなっていない。その主な要因は、魚類の精原
3幹細胞を識別可能な分子マーカーが存在せず、精巣細胞中のごく一部に含まれることが予想される精原幹細胞を同定・単離することができないためである。つまり、
精原幹細胞を識別可能な分子マーカーを同定することは、魚類の精原幹細胞研究において極めて重要な課題であるといえる。
そこで、この問題を解決するために、精原幹細胞を多く含む ASG 集団と含まな
い ASG 集団を同定し、両集団間を網羅的遺伝子発現解析により比較すれば、精原幹細胞特異的に強く発現する分子すなわち精原幹細胞の分子マーカーを同定できるのではないかと考えた。そのためには、1）魚類の精巣細胞中に存在する ASG を識別かつ単離することができること、2）単離した ASG 集団中に存在する精原幹細胞の頻度を定量的に解析可能であることが重要となる。そこで本研究では、ASGの識別と単離が可能な材料として、本研究室で樹立された vasa-GFP（green
fluorescent protein）遺伝子導入ニジマス（Yoshizaki et al., 2000, Takeuchi et al., 2002）に着目した。本系統は、生殖細胞で特異的に発現する vasa 遺伝子の発現制御領域の下流に GFP 遺伝子を組み込んだ発現コンストラクトが導入されており、生殖細胞でのみ緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する。また、vasa-GFP 遺伝子導入ニ
ジマスの分化型生殖細胞は、分化に伴い発現が低下する内在性 vasa 遺伝子の発現パターンと連動して、その GFP 強度が徐々に低下することが明らかとなっている（Yano et al., 2008）。この性質を利用することで、様々な分化段階の生殖細胞が存在する精巣細胞であっても、フローサイトメトリーにより生殖細胞の GFP 強度を指標に ASG のみ単離することが可能となった（Yano et al., 2008）。そこで、本研究では材料に vasa-GFP 遺伝子導入ニジマスを用いることにした。
次に、単離した ASG 中に存在する精原幹細胞頻度の定量的解析には、精原細胞移植系を利用することにした。Okutsu ら（2006）は、移植後に宿主生殖腺内にドナーASG の生着が認められた個体の割合と、繁殖期にドナー由来配偶子を産生した個体の割合がほぼ等しかったことを報告している。このことは、宿主生殖腺へ生4着したドナーASG は、生着後、脱落することなく宿主生殖腺内で精原幹細胞としてふるまっていたことを示している。つまり、ドナー精巣細胞中に含まれる精原幹細胞のみが、宿主生殖腺へと生着する能力を保持するといえる。この性質から、ドナー精巣細胞中に含まれる精原幹細胞の頻度は、ドナー精巣細胞を宿主へ移植した
後に、ドナーASG の生着した宿主の割合を調べることで定量的に解析することが可能となった。
次に、精原幹細胞を高頻度で含む ASG 集団の候補として、繁殖期のニジマス精巣内に存在する残留 ASG に注目した。ニジマスは、1 度の繁殖で斃死する他のタイヘイヨウサケ属魚類と異なり、繁殖後も生残し、繰り返し繁殖を行うことのできる多回産卵型の繁殖様式を示す。つまり、ニジマスは繁殖期が終了した後も、再度翌年の繁殖期に向けた精子産生を行う必要がある。そのため、繁殖期のニジマス精
巣内には大量の精子の他に、次の精子形成の源となるために残された ASG（残留ASG）がわずかに存在する（太田ら, 1965）。残留 ASG は、次の精子形成期に行われる数百億もの大量の精子産生のすべてを担う ASG 集団である。そこで、残留 ASG
集団こそが精原幹細胞なのではないかと予想した。
本研究では、精原幹細胞を識別可能な分子マーカーの同定を最終目標に掲げ、その第一歩として、第 1 章では残留 ASG 集団が精原幹細胞を高頻度で含む細胞集団であるのか精原細胞移植系を用いて確認した。その結果、ニジマス ASG 集団が精原幹細胞としてふるまう能力（幹細胞活性）に、季節により差が存在する可能性が示唆されたため、このことについて詳細に解析した。続いて、第 2 章では、第 1章で同定した幹細胞活性の異なる ASG 集団を用いて、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行い、幹細胞活性の高い ASG 集団で特異的に高発現する遺伝子の探索を行った。第 3 章では、これら精原幹細胞の特徴を利用した、水産業への応用を目指し、精原幹細胞の移植による遺伝的に多様な種苗の生産技術の開発を行
った。
5

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8

第1 章 -1

ニジマス残留 A 型精原細胞の持つ幹細胞能9

緒言

多くの動物種で、雄は生涯を通して大量の精子を産生し続ける。これが可能なのは、精巣内に精原幹細胞が存在するためである。精原幹細胞は、自己複製により自分自身を維持しながら、精子へと分化することで、長期にわたる精巣機能の恒常性を維持する（Kubota and Brinster, 2006）。これまでの研究から、魚類の精巣機能もまた、精原幹細胞により支えられていることが明らかとなった（Okutsu et al., 2006）。
しかし、魚類の精原幹細胞を識別可能な分子マーカーが同定されていないことから、精巣細胞の一部に存在すると予想される精原幹細胞を同定・単離することはできない。このことは、魚類の精原幹細胞システムの解明を目指すうえで、大きな障害となっており、魚類の精原幹細胞に関する生物学的知見は、依然として乏しい状態となっている。もし、精原幹細胞を高頻度で含む A 型精原細胞（ASG）集団が同定できれば、魚類の精原幹細胞に関する知見は飛躍的に集積すると期待される。
近年、我々は、精原細胞移植技術の確立に成功し、これにより ASG 集団がその一部に精原幹細胞を含む集団であることを初めて機能的に証明した（Okutsu et al.,2006）。さらに、ドナー精巣細胞を宿主へ移植した後に、ドナーASG が生着した宿主の割合（移植成功率）を調べることで、ドナー精巣細胞中に存在する精原幹細胞の頻度を定量的に解析することが可能となった。この性質を利用することにより、精原幹細胞を多く含むドナー精巣細胞を探索することが可能となった。具体的には、
精原幹細胞の頻度が異なることが予想される ASG 集団を用いて移植を行い、移植後に各 ASG 集団から得られた移植成功率を比較することで、ASG 集団に存在する
精原幹細胞の頻度を相対的に評価する。そこで本研究では、精原細胞移植系を用いた定量的解析により、精原幹細胞を高頻度で含む ASG 集団の探索を試みることにした。
精原幹細胞を高頻度で含む ASG 集団の候補として、繁殖期のニジマス精巣内に10存在する残留 ASG 集団に注目した。残留 ASG は、繁殖期の後に再開する次の精子産生のために精巣内に残された ASG 集団である（Hiroi and Yamamoto, 1970; 高橋,1989）。精巣内にわずかに残された残留 ASG は次の繁殖期において、およそ数百億もの大量の精子産生を一手に引き受けることから、残留 ASG 集団こそが精原幹細胞なのではないかと予想し、精原細胞移植系を用いてこの可能性について検証した。

11

材料と方法供試魚
1）ドナー魚
東京海洋大学水圏科学フィールド教育研究センター陸水域生産フィールド大泉
ステーションにて、10 ℃の流水下で屋外飼育された大泉系統ニジマス（Oncorhynchus mykiss）の雌の排卵魚、および vasa-GFP 遺伝子導入ニジマス（Yoshizaki et al., 2000; Takeuchi et al., 2002）雄の排精魚から、それぞれ採卵および採精を行った。得られた卵と精子は、1.1% NaHCO3 浸漬法による媒精を経て、受精卵を作製した。作製した受精卵は 10 ℃の流水下で飼育した。実験区のドナーには、初回成熟を迎え排精が確認された満 2 歳の成熟個体を、2010 年 2 月 4、6、9 日にサンプリングし移植に用いた。対照区のドナーには、9 ヶ月齢に達した未成熟個体
を用いた。

2）宿主魚
東京海洋大学水圏科学フィールド教育研究センター陸水域生産フィールド大泉
ステーションにて、水温 10 ℃の流水下で屋外飼育された野生型ニジマス雌の排卵魚および野生型ニジマス雄の排精魚から、卵および精子をそれぞれ採取し、1.1%
NaHCO3 浸漬法による媒精を経て、受精卵を作製した。受精卵は、10 ℃の流水下で飼育し、受精後 28-33 日齢に達した胚を宿主魚として移植に用いた。

精原細胞移植1）精巣の単離と結合組織の剥離
各供試魚は、350 ppm の 2－フェノキシエタノール（和光純薬工業株式会社, 大阪）溶液中で麻酔処理を施した後、精巣を外科的に摘出した。摘出した精巣の一部
12

は、組織学的解析に用いるためブアン氏液により固定を行い、残りの精巣組織は移植実験に用いた。移植実験用に単離した精巣は、5%の FBS（Invitrogen Co., Grand
Island, NY）を含む MEM 培地（日水製薬株式会社, 東京）（pH 7.8）にて、氷上で一時保存した。その後、精巣は冷却したニジマス等張液中に移し、実体顕微鏡（SMZ-10; Nikon, Tokyo）下で精巣間膜および精巣間膜に付随する血管を、ピンセットを用いて剥離した。処理を行った精巣は、蛍光実体顕微鏡（SZX12; Olympus; 東京）下で、緑色蛍光を発していない体細胞部を、ウェッケルシザース（MB-41; 格式会社夏目製作所, 東京）で切除した。

2）精巣の分散
血管および結合組織を剥離した精巣組織は、一つ穴血液反応板の上に置き、ウェ
ッケルシザースまたは眼科用解剖はさみ（MYSCO-7; テックジャム, 大阪）を用いて細切した。成熟個体から単離した精巣（成熟精巣）は精子を大量に含むため、細切した精巣片をそのまま分散処理に用いた場合、壊れた精子から由来すると考えられる DNA の強い粘性により分散効率が低下する。そこで、分散処理を行う前に、成熟精巣の精巣片に含まれる精子を出来る限り除去した。まず、5 ml チューブに 2
ml の MEM FBS 5%（pH 7.8）培養液を分注した後、細切した精巣片を入れ、ゆるやかに 10 回のピペッティングを行った。その後、精巣片を吸わないように注意しながら上清を捨て、2 ml の MEM FBS 5%（pH 7.8）培養液を加えた。精巣片内に含まれる精子をできる限り取り除くため、同様の操作を 5－6 回繰り返し行った。また、この操作による移植成功率への影響を考慮するため、未成熟精巣も同様に処理した。次に、得られた各区の精巣片は、0.855 Unit のトリプシン（Worthington
Biochemical Corporation, Lakewood, NJ）/PBS（+）溶液中に移し、20 ℃のインキュベ―ト内で 2 時間の振盪を行った。インキュベート中は、精巣片の分散を促進する
ため、30 分ごとにゆるやかにピペッティング処理を行った。酵素処理後、得られ13

た精巣細胞懸濁液は 2 ml ずつ 5 ml チューブに分注し、MEM FBS 5%（pH 7.8）培養液を全液量が 5 ml になるように加え、ピペッティングによりゆるやかに混和した。その後、スイングローターを用いて 10 ℃、1,000 rpm で 15 分間遠心し、精巣細胞のペレットを形成させた。続いて、上清を捨てた後、再度 MEM FBS 5%（pH 7.8）
培養液を 2 ml 加えた。酵素溶液を完全に取り除くために、同様の遠心操作によるリンスを 3 度行った。酵素溶液の除去後は、MEM FBS 5%（pH 7.8）培養液を 2 ml
加え、ピペッティングにより精巣細胞を再懸濁させた。得られた精巣細胞懸濁液は、
42 µm のナイロンメッシュ（株式会社 NBC メッシュテック, 東京）により濾過し、分散処理により乖離されなかった精巣片の除去を行った。得られた精巣細胞は、パーコール密度勾配遠心分離法に供すまでの間、10 ℃のインキュベ―ト内で保存した。

3）パーコール密度勾配遠心分離法
成熟精巣から得られた精巣細胞懸濁液には大量の精子が混在するため、パーコー
ル密度勾配遠心分離法を用いて精巣細胞中の精子の除去を行った。まず、高圧蒸気滅菌処理した Percoll PLUS（GE Healthcare UK Ltd., Little Chalfont, England）原液 9に対して、10×PBS を 1 の割合で混合し、100% Percoll 溶液を作製した。さらに、100% Percoll 溶液を PBS FBS 1%溶液で希釈し、28.8％および 50.2%の Percoll 溶液を作製した。続いて、15 ml チューブに 3 ml の 50.2% Percoll 溶液を移し、その上に2 ml の 28.8% Percoll 溶液を、各 Percoll 溶液の境界面が乱れないようにゆっくりと重層した。最上層には、PBS FBS 1%溶液 1 ml あたり精子を除いた精巣細胞数が約106 個になるように調整した精巣細胞懸濁液を 1 ml 重層した。作製したチューブは、
スイングローターを用いて 10 ℃、800g、30 分間遠心した。遠心後、28.8％と 50.2％
Percoll 溶液の間に分離された細胞を、ピペットを用いて回収した。次に、回収した細胞懸濁液１に対して 5 倍量の PBS FBS 1%を加え、ゆっくりと転倒混和した後、14スイングローターを用いて、10 ℃、1,000 rpm で 15 分間遠心した。遠心後は上清を捨て、MEM FBS 5%（pH 7.8）培養液を 3 ml 加え再懸濁させた。細胞懸濁液中のPercoll 溶液を完全に取り除くために、同様の遠心操作によるリンスを 3 度行った。
Percoll 溶液の除去後は、MEM FBS 5%（pH 7.8）培養液に再懸濁させ、移植実験までの間、10 ℃のインキュベ―ト内で静置した。また、パーコール密度勾配遠心分離法による移植成功率への影響を考慮するため、未成熟精巣も同様に処理を行った。

4）ドナーA 型精原細胞の移植
細胞移植用のガラスピペットは、ガラス管（G-1; 株式会社成茂科学器械研究所,東京）をプーラー（PW-6; 株式会社成茂科学器械研究所）で加工した。ガラスピペ
ットの先端の内径は、研磨機（EG-3; 株式会社成茂科学器械研究所）を用いて、60-70µm に調整した。実体顕微鏡下に設置したマイクロマニピュレーター（BP-1; 株式会社成茂科学器械研究所）およびマイクロインジェクター（IM-9A; 株式会社成茂
科学器械研究所）を用いて、ガラスピペット内に A 型精原細胞（ASG）が約 500細胞になるように細胞懸濁液を吸引し、麻酔を施した宿主腹腔内へ顕微注入した。
移植操作を施した宿主は、ニジマス等張液内で約 2 日間、10 ℃で飼育した。その後、10 ℃の流水下に移し、移植後 20 日目の生着確認まで飼育した。

宿主生殖腺内への生着確認移植に用いたドナー精巣細胞中に含まれる ASG は GFP を発現しているため、その緑色蛍光を指標に、宿主生殖腺内における挙動を追跡可能であった。そこで、移植後 20 日目に宿主を解剖し、GFP 蛍光観察用フィルター（U-MWIB2; Olympus）
がセットされた蛍光顕微鏡（BX51; Olympus）下で、宿主生殖腺にドナーASG が生着しているか否か確認した。移植を行ったすべての宿主においてドナーASG の生着確認を行い、ドナーASG が生着した宿主個体の割合（移植成功率）を算出した。
15

移植成功率は下記の式により求めた。

移植成功率（%）＝

ドナーASG の生着が認められた宿主の個体数×100
解析した宿主の個体数

精巣組織の包埋および組織切片の作製
ドナーに用いた精巣組織の一部は、組織学的解析に用いるため、ブアン氏液にて
4 ℃、24 時間の固定を行った。成熟精巣は、固定開始 5 時間後に、固定液の浸透を促進するため、精巣組織を厚さが 3 mm 程度になるように薄切し、引き続き固定をおこなった。固定の完了した精巣組織は 70%エタノールに置換し、パラフィン包
埋するまでの間 4 ℃で保存した。パラフィンブロックを作製する際には、自動ティッシュプロセッサー（TP1020; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）を用い、室温下で、固定組織のエタノール系列による脱水と、キシレンによる透徹処理を行った。続いて、パラフィン包埋装置（EG1150H; Leica Microsystems）を用いて、パラフィン内に包埋した。作製したパラフィンブロックは、回転式ミクロトーム（ERM-200P; ヱルマ販売株式会社, 東京）を用いて厚さ 4 µm に薄切し、連続組織切片を作製した。作製したパラフィンリボンは適当な大きさに切り揃えた後、蒸留水を張った剥離防止スライドグラス（MAS-GP; 松波硝子工業株式会社, 大阪）に乗せ、36 ℃の伸展機上で伸展させた。組織が十分に伸展した後は、過度な伸展処
理による精巣組織の破損を防ぐため、余分な蒸留水を取り除き再び伸展機上で乾燥させた。十分に乾燥し切片がスライドガラスに接着したことを確認後、36 ℃に温めたインキュベーター内で一晩乾燥させた。

ヘマトキシリン・エオシン染色
精巣組織を接着させたスライドガラスは、キシレン中で脱パラフィンし、エタノール系列により水和させた。続いて、マイヤーヘマトシキリン液（和光純薬工業株
16

式会社, 大阪）により染色を行った後、20 分間の流水水洗により色出しを行った。
続いて、エオシン溶液（エオシン Y, 和光純薬工業株式会社）による染色を行った。
染色が完了したスライドガラスは、エタノール系列による脱水およびキシレンによる透徹を行った後、非水溶性封入剤のエンテランニュー（Entellan new, Merck KGaA,
Damstadt, Germany）を用いて封入し、一晩乾燥させた後、組織学的観察を行った。

統計処理
移植結果は、平均値±標準誤差で表した（n=3）。有意差検定には、GraphPad Prism
Version 5.0 (GraphPad, La Jolla, CA)を用いて、Mann-Whitney の U 検定を行った（P <0.05）。

17

結果

残留 A 型精原細胞のもつ幹細胞活性
繁殖期のニジマス精巣内に存在する残留 A 型精原細胞（ASG）が、精原幹細胞を高い頻度で含む集団なのか明らかにするために、精原細胞移植系を用いて定量的に解析した。まず、ドナーに用いた精巣の状態を確認するため、組織学的解析を行った。その結果、対照区に用いた未成熟精巣内には、ASG のみが認められた（図1. A）。繁殖期の成熟精巣内には、精小嚢内腔に排精された大量の精子の他に、精小嚢の壁に残留 ASG がわずかに点在している様子が認められた（図 1. B）。これら
ドナー個体から精巣細胞を調整し宿主へ移植した後、移植後 20 日目に各実験区から得られた移植成功率を解析した。その結果、未成熟精巣由来 ASG をドナーとして用いた場合、その移植成功率は 36.7 ± 0.9％だった（図 2）。一方、残留 ASG をドナーとして用いた場合、その移植成功率は 2.6 ± 2.6％と、未成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率に比べ有意に低い値だった（図 2）。

18

考察

精原幹細胞を高頻度で含む ASG 集団を同定するために、繁殖期のニジマス精巣内に存在する残留 ASG こそが精原幹細胞であると予想し、移植系を用いてその可能性について検討した。その結果、残留 ASG から得られた移植成功率は極めて低
く、残留 ASG 集団は精原幹細胞を高頻度で含んでいないことが明らかとなった。
残留 ASG 集団の幹細胞活性が低い要因として、2 つの可能性が考えられた。まず 1 つ目は、ASG の老化による影響である。本研究では、満 2 歳の成魚の精巣（成熟精巣）由来 ASG 集団の幹細胞活性は、9 ヶ月齢の未成魚の精巣（未成熟精巣）
由来 ASG 集団の幹細胞活性に比べて低かった。このことから、精巣が老化したことで、ASG 集団内の幹細胞活性の低下が起きたことが予想された。これまでに、マウスで老化に伴い精原幹細胞の数および質の低下が起きることが報告されている（Zhang et al., 2006）。このことから、本研究結果で認められた残留 ASG 集団の低い移植成功率は、精巣の老化に伴う精原幹細胞の数の減少あるいは質の低下を反映していたことが予想された。2 つ目に、ニジマス成魚の精巣内に存在する ASG
集団が、季節により異なる制御を受け、それにより性質を変化させていた可能性が考えられた。ニジマスは、ある特定の時期にのみ繁殖を行う季節繁殖型の繁殖生態を示し、その精巣機能は 1 年の間に大きく変化する（太田ら, 1965; Schulz, 1984）。
春から夏にかけてニジマスの精巣は、繁殖期に向けた活発な精子産生を行い、秋に繁殖期が開始すると精子形成は完了し、秋から冬の間は精巣内で精子の貯蔵と残留
ASG の維持を行う。このように、ニジマス精巣は 1 年の間、精子産生を行う時期と精子産生を行わない時期に明瞭に区別されており、これら精巣内に存在する
ASG 集団は、時期によりそれぞれ異なる制御を受けていることが予想される。このことから、繁殖期の精巣内では、残留 ASG の幹細胞活性の低下をもたらす機構が働いていた可能性が考えられた。今後、より詳細な解析を行い、ASG 集団の幹19

細胞活性の違いを生み出す要因が明らかになることで、ASG の幹細胞活性を制御する機構の解明につながると期待される。

20

参考文献

Hiroi O, Yamamoto K. (1970) Studies on the maturation of salmonid fishes-Ⅱ. : Changes
in the testis of the masu salmon, Oncorhynchus masou, during anadromous migration.
Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ., 20: 242-263.

Kubota H, Brinster RL. (2006) Technology insight: in vitro culture of spermatogonial stem
cells and their potential therapeutic uses. Nat. Pract. Endocrinol. Metab., 2: 99-108.

Okutsu T, Suzuki K, Takeuchi Y, Takeuchi T, Yoshizaki G. (2006) Testicular germ cells cancolonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs infish. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 2725-2729.

太田勲, 山本喜一郎，高野和則，坂口任一. (1965) ニジマスの成熟に関する研究－Ⅱ

一年魚の精巣発達について. 日本水産学会誌, 31: 597-605.

Schulz R. (1984) Serum levels of 11-oxotestosterone in male and 17β-estradiol in female
rainbow trout (Salmo gairdneri) during first reproductive cycle. Gen. Comp.
Endocrinol., 56: 111-120.

高橋裕哉. (1989) 精巣の構造と配偶子形成. 水族繁殖学（隆島史夫・羽生功編）, 緑書房, 東京, pp.35-64.

Takeuchi Y, Yoshizaki G, Kobayashi T, Takeuchi T. (2002) Mass isolation of primordial
germ cells from transgenic rainbow trout carrying the green fluorescent protein gene21

driven by the vasa gene promoter. Biol. Reprod., 67: 1087-1092.

Yoshizaki G, Takeuchi Y, Sakatani S, Takeuchi T. (2000) Germ cell-specific expression ofgreen fluorescent protein in transgenic rainbow trout under control of the rainbow
trout vasa-like gene promoter. Int. J. Dev. Biol., 44: 323-326.

Zhang X, Ebata KT, Robaire B, Nagano MC. (2006) Aging of male line stem cells in mice.
Biol. Reprod. 74: 119-124.

22

図説明

図 1．ドナー精巣の組織切片 HE 染色像（A）対照区に用いた未成熟精巣。精巣内には A 型精原細胞（ASG: 矢尻）のみが存在した。
（B）実験区に用いた成熟精巣。精巣内には精子の他に、精小嚢の壁に残留 ASG（矢尻）が点在している様子が認められた。スケールバーは
10 µm を示している。

図 2．各ドナーASG から得られた移植成功率
対照区の未成熟精巣由来 ASG（未成熟）および実験区の残留 ASG（残留）から得られた移植成功率（平均値 ± 標準誤差）を示す。移植は 3 回試行した。
アスタリスクは、2 群間で有意差があることを示している。

23

A

B

精子

図1. ドナー精巣の組織切片HE染色像

24

40

移
植 30
成
功 20
率
（ 10
%
） 0

*
未成熟

残留

図2. 各ドナーASGから得られた移植成功率25

第1 章 -2

ニジマス A 型精原細胞集団の持つ幹細胞活性の季節的変化

26

緒言

精巣内に存在する精原幹細胞は、雄の継続的な精子産生を可能にするうえで、極めて重要な細胞集団である。精原幹細胞の自己複製と分化のバランスは、周囲の特殊な微小環境により厳密に制御され、精原幹細胞プールの枯渇による精巣機能の喪失が防がれている（Brinster, 2002）。近年、他の動物種と同様、魚類の精子形成も A型精原細胞（ASG）内の一部に存在する精原幹細胞の存在により支えられていることが明らかとなった（Okutsu et al., 2006）。しかし、依然として魚類の ASG 集団内で、精原幹細胞の性質や数がどのように制御され、維持されているのか明らかとなっていない。
前章では、精原幹細胞を高頻度で含む ASG 集団の同定を目指し、細胞集団中の精原幹細胞頻度を定量可能な精原細胞移植系を用いて、繁殖期のニジマス精巣内に存在する残留 ASG 集団が精原幹細胞を多く含んでいるのか否か検証した。その結果、残留 ASG 集団から得られた移植成功率は極めて低く、残留 ASG 集団は精原幹細胞を高頻度で含んでいないことが明らかとなった。そこで、残留 ASG 集団の幹細胞活性が低かった要因として以下の 2 つの可能性を考えた。まず、精巣の老化により、ASG 集団中の精原幹細胞頻度の低下あるいは精原幹細胞の幹細胞能が低下した可能性が考えられた（Zhang et al., 2006）。だが、前章で用いたドナーは、初回成熟を迎えた直後の満 2 歳の個体であり、繁殖期が終了した後も再度繁殖を行う必要があることから、精巣の老化により幹細胞活性が低下したとは考えにくい。そこ
で、2 つ目の可能性としてニジマス ASG 集団の幹細胞活性が季節により変化するのではないかと考えた。ニジマスは、ある特定の季節に繁殖を行う季節性繁殖型魚
類で、ニジマスの精巣は 1 年の生殖周期の間で、精子産生を行う時期と精子産生を行わない時期でその働きが明瞭に区別される（太田ら, 1965; Schulz, 1984）。このことから、ニジマス成魚精巣内の ASG 集団は、精子産生を行う時期と精子産生を行27

わない時期で異なる制御を受けていた可能性が考えられた。そこで本研究では、この可能性を明らかにするために、ニジマス成魚の精巣内に存在する ASG 集団の幹細胞活性について、1 年の生殖周期を通して精原細胞移植系を用いて解析した。

28

材料および方法

供試魚
1）ドナー魚実験区
東京海洋大学水圏科学フィールド教育研究センター陸水域生産フィールド大泉
ステーションにて、10 ℃の流水で屋外飼育された大泉系統ニジマスの雌の排卵魚、および vasa-GFP 遺伝子導入ニジマス（Yoshizaki et al., 2000; Takeuchi et al., 2002）雄の排精魚を用いて、2008 年 10 月 29 日および 2009 年 10 月 1 日にそれぞれ採卵および採精を行った。得られた卵と精子は、1.1% NaHCO3 浸漬法による媒精を経て、受精卵を作成した。作成した受精卵は、10 ℃の流水で屋内飼育し、初回成熟を迎え排精が確認された満 2 歳の雄を、後述の日程に従ってサンプリングし、実験区のドナーとして実験に用いた。

対照区
東京海洋大学水圏科学フィールド教育研究センター陸水域生産フィールド大泉
ステーションにて、10 ℃の流水で屋外飼育された野生型系統ニジマス雌の排卵魚、および vasa-GFP 遺伝子導入ニジマス雄を用いて、採卵および採精を行った。得られた卵と精子は、1.1% NaHCO3 浸漬法による媒精を経て、受精卵を作成した。作
成した受精卵は、10 ℃の流水で屋内飼育し、8－13 ヶ月齢に達した精子形成期前の未成熟個体をドナーとして用いた。

2）宿主魚
東京海洋大学水圏科学フィールド教育研究センター陸水域生産フィールド大泉
ステーションにて、水温 10 ℃の流水で屋外飼育された野生型ニジマス雌の排卵魚、
29

および屋内飼育された野生型ニジマス雄の排精魚から、卵および精子をそれぞれ採取し、1.1% NaHCO3 浸漬法による媒精を経て、受精卵を作成した。受精卵は、10 ℃の流水水槽内で飼育し、受精後 25－35 日齢に達した胚を宿主魚として移植に用いた。

3）サンプリング
供試魚の腹部を絞り精子が体外へ排出されたこと（排精）が確認できた日を 0日とし、排精確認後 1 ヶ月未満を排精 0 ヶ月、1 ヶ月以上 2 ヶ月未満経過したものを排精 1 ヶ月とし、排精 0、1、3、5、7、9、11 ヶ月目、および、翌年の排精 1 ヶ月目にあたる排精 15 ヶ月目に供試魚をサンプリングした。排精確認は、週に 1－2回行った。2008 年 10 月 29 日作成の供試魚は、排精 7、9、11 ヶ月目に、各実験区につき 3－4 個体サンプリングした。2009 年 10 月 1 日作成の供試魚は、排精 0、1、
3、5、7、9 および 15 ヶ月目に、各実験区につき 3－5 個体サンプリングした。な
お、翌年の生殖周期の 1 ヶ月目が排精 13 ヶ月目ではなく排精 15 ヶ月目となったのは、繁殖期の開始が前年度より 2 ヶ月程遅れたためである。サンプリング後の供試
魚は、麻酔処理後、体重および生殖腺重量を測定し、生殖腺体指数を下記の式により算出した。
生殖腺体指数 (GSI)＝

生殖腺重量
体重

× 100

摘出した精巣組織は、精原細胞移植および組織学的解析に用いた。

精巣細胞の調整
1）精巣の分散およびパーコール密度勾配遠心分離法
第 1 章 -1 で記載したものと同様の方法により、ドナー精巣の単離および酵素処
理による分散を行った。得られた精巣細胞懸濁液は、パーコール密度勾配遠心分離
30

法に供し、精巣細胞中の精子を除去した。分散処理およびパーコール密度勾配遠心分離法による移植成功率への影響を考慮するため、対照区の未成熟精巣も同様の処理を行った。

2）セルソーターによる A 型精原細胞（ASG）の単離
パーコール密度勾配遠心分離後に得られた精巣細胞中には、生殖細胞の他に精巣体細胞が多く存在する。精巣体細胞が、ドナーA 型精原細胞（ASG）の宿主生殖腺への生着を阻害する可能性を排除するために、フローサイトメトリーにより、GFP
強度を指標にして ASG のみを単離した（Yano et al., 2008）。フローサイトメーター
は、488 nm のアルゴンレーザーを搭載した MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL）
を用いた。前方散乱光（Forward scatter）および側方散乱光（Side scatter）は、リニ
アアンプを用いて検出し、GFP 蛍光は、ログアンプを用いて検出した。シース圧は30 psi 以下とし、サンプル供給量が毎秒 2000－5000 細胞の速度となるように、ASGを分取した。

ドナーASG の移植
第 1 章 -1 と同様の方法で行った。

宿主生殖腺内への生着確認移植したドナーASG は GFP を発現しているため、その緑色蛍光を指標に、宿主生殖腺内における挙動を追跡した。移植後 20 日目および移植後 60 日目に宿主を解剖し、GFP 蛍光観察用フィルター（U-MWIB2; Olympus, 東京）を装着した蛍光顕微鏡（BX51; Olympus）下で観察を行い、ドナーASG の宿主生殖腺内への生着を確認した（図 1）。すべての宿主魚の生着確認を行った後、ドナーASG の生着が認められた個体の割合（移植成功率）を算出した。移植成功率は下記の式により求めた。
31

移植成功率(%) =ドナーASG の生着が認められた宿主の個体数解析した宿主の個体数

× 100

なお、本研究の移植実験は 1 年を通して行ったことから、すべての移植実験において、単一の親魚から作成した宿主を用いることが不可能であった。そのため、実験区間で移植成功率を比較した場合、宿主の遺伝的な違いによる移植成功率のばらつきが含まれる可能性が考えられた。そこで、このばらつきを補正するために、未成熟期の精巣に含まれる ASG の移植成功率は常に一定であると仮定し、各実験区の成熟精巣由来 ASG の移植成功率を対照区の未成熟精巣由来 ASG の移植成功率との相対値で表した。具体的には、下記の式を用いて、成熟精巣由来 ASG の移植成功率として算出した。
成熟精巣由来 ASG の移植成功率（相対値）＝

成熟精巣由来 ASG の移植成功率（%）
未成熟精巣由来 ASG の移植成功率（%）

また、移植後 20 日目および移植後 60 日目に行ったドナーASG の宿主生殖腺内への生着確認の際には、GFP 蛍光観察用フィルター（U-MWIB2; Olympus）を装着した蛍光顕微鏡（BX51; Olympus）下で、宿主生殖腺内に生着したドナーASG 数の計数を行った。なお、移植後 60 日目において宿主は形態的性分化後であったことから、卵巣のラメラ構造の有無を指標に宿主の雌雄を区別した（図 1. D, F）。また、宿主生殖腺内に生着したドナーASG のコロニー形成能を評価するために、ドナー
ASG 由来の大型のコロニーを生殖腺内に保持する宿主の出現頻度を解析した。その際、雌宿主では 30 細胞以上のドナーASG から形成されたコロニーを大型のコロニーと定義し、雄宿主では 15 細胞以上のドナーASG から形成されたコロニーを大型のコロニーと定義した。ドナーASG 由来の大型のコロニーを保持する宿主の出現頻度は、以下の式により求めた。

32

ドナーASG 由来の大型のコロニーを保持する宿主の出現頻度（%）＝

ドナーASG 由来の大型のコロニーを保持する宿主の個体数
ドナーASG の生着が認められた宿主の個体数

精巣組織の包埋および組織切片の作製
第 1 章 -1 と同様の方法で行った。

ヘマトキシリン・エオシン染色
第 1 章 -1 と同様の方法で行った。

ニジマス精巣内に存在する生殖細胞の分類
ニジマス精巣内には異なる数種類の生殖細胞が存在する。本研究では、Billard（1983）、Loir（1999）、Schulz et al.（2010）により記載された基準を基に、各生殖細胞を分類した（図 2）。ASG は、生殖細胞の中で最も大型で、精巣内で単一の細胞として認められる（図 2. A）。2 個以上の生殖細胞が隣接し、細胞同士が細胞膜により明瞭に区別され単一の細胞として認識された場合でも、これら細胞同士がよく似た核サイズ・形態を示した場合は B 型精原細胞とした。B 型精原細胞以降の分化が進行した生殖細胞は、細胞間が連結したまま細胞分裂を行うため、形態が類似した複数個の細胞で構成されたシスト構造を示す（図 2. B-E）。ASG に比べヘマト
キシリンで濃染する小型な核を保持した細胞は、B 型精原細胞とした（図 2. B）。
精母細胞は、核の大きさ・核の形態・分裂像を指標にして判別した（図 2. C, D）。
核が凝縮し最も小型な細胞で構成されたシストを精細胞とした（図 2. E）。精子は、精細胞の形態とよく似るが、シストを形成せず、精小嚢内腔に排精されたものとした（図 2. F）。

33

ASG の形態的特徴に基づく細分化
移植に用いた各実験区の成熟精巣の中央部を用いて組織切片を作成した後、ヘマ
トキシリン・エオシン染色を行った。作成した組織標本は、光学顕微鏡（BX51;
Olympus）下で、顕微鏡用デジタルカメラ（DP72; Olympus）を用いて精巣横断面
全体をランダムに写真撮影した。続いて、得られた写真を用いて画像解析した。
ASG の細分化は、Loir（1999）の用いた形態学的指標に基づいて行った。核サイ
ズが 10μm 以上で、大型で明瞭な dense body を一つ保持する細胞を A1 細胞とした（図 2. A）。核径の測定には、ImageJ（free software supplied by National Institute of
Mental Health, Bethesda, MD）を用いた。各精巣あたり 50 細胞以上の ASG を用いて解析を行った。

蛍光免疫染色目的の組織切片を接着させたスライドガラスは、脱パラフィンおよび親水処理を行った。続いて、抗原性を回復させるために、HistoVTone（ナカライテスク株式会社, 京都）を用いた抗原の賦活化処理を定法に従い行った。処理後のスライドガラ
スは、0.1% Tween 20 （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）/ PBS（PBST）へと移した後、室温へ戻るまで静置した。処理後のスライドガラスは、抗体の非特異的結合を防ぐため、ブロックエース（DS ファーマバイオメディカル株式会社, 大阪）溶液によるブロッキング処理を湿潤箱内で室温、30 分間行った。その間、抗体の希釈溶液を作成した。抗体の希釈には Can get signal immunostain solution（東洋紡株式会社, 大阪）を用い、抗体を最適な濃度になるように希釈した（各抗体の希釈濃度は後述）。
2 重蛍光免疫染色を行う際は、2 種類の抗体を最適濃度になるように混合して希釈した。作成した 1 次抗体溶液は、ブロッキング処理後の組織切片に滴下し、1 次抗体反応を湿潤箱内で 4 ℃、一晩行った。反応後、PBST による洗浄を 5 分間 3 回行い、反応しなかった余剰の 1 次抗体を洗浄した。2 次抗体溶液の作成には、1 次抗34

体で用いたものと同一の希釈液を用い、蛍光標識された 2 次抗体が最適な濃度になるように希釈した。作成した 2 次抗体溶液は、1 次抗体を洗浄した後のスライドガ
ラスに滴下し、2 次抗体反応を湿潤箱内で室温、30 分間行った。反応終了後は、PBST
による洗浄を 5 分間 3 回行い、余剰の 2 次抗体を洗い落とした。抗体の洗浄後、カバーガラスでスライドガラスを覆い、目的に合った蛍光観察用フィルター（Olympus）を装着した蛍光顕微鏡下（BX51; Olympus）で、シグナルを観察した。

蛍光免疫染色法による生殖細胞の検出
供試魚は、vasa-GFP 遺伝子導入ニジマスであったことから、抗 GFP 抗体（Anti-GFP mouse monoclonal antibody; Roche Applied Science, Penzberg, Germany）を用いた免疫染色により、生殖細胞の検出が可能であった。そこで、生殖細胞を検出するために、1 次抗体に抗 GFP 抗体を用い、Can get signal Solution A（東洋紡株式会社）で 1,000 倍に希釈した。2 次抗体には生殖細胞を緑色蛍光で標識するために、
Alexa 488 goat anti-mouse IgG（H+L）抗体（Life technologies, Carlsbad, CA）を 200倍に希釈したものを用いた。蛍光免疫染色後は、GFP 蛍光観察用フィルター（U-MNIBA2; Olympus）を装着した蛍光顕微鏡（BX51; Olympus）により観察した。
観察後のスライドガラスは、続けてヘマトキシリン・エオシン染色を行った。ヘマ
トキシリン・エオシン後のスライドガラスは、正立顕微鏡（BX51; Olympus）下で再度観察し、免疫染色によりシグナルの得られた細胞の種類を形態学的に判別した。

免疫染色法によるアポトーシス細胞の検出
ASG の細胞死頻度を定量的に解析するために、生殖細胞とアポトーシス細胞を識別可能な 2 種類の抗体を用いた 2 重蛍光免疫染色法を行った。1 次抗体には、生殖細胞の検出のためにモノクローナル抗体の抗 GFP 抗体と、アポトーシス細胞の検出のために活性型カスパーゼ 3 に対するポリクローナル抗体である抗35

ACTIVE-Caspase 3 抗体（Anti-ACTIVE Capase-3 pAb, Promega Co., Fitchburg, WI）を用いた。活性型カスパーゼ 3 は、細胞内のタンパク質を分解し、細胞のアポトーシ
スを誘導するエフェクターカスパーゼのひとつで、アポトーシスマーカーとして利用されている。1 次抗体の希釈の際には、Can get signal solution B を希釈液として用い、各 1 次抗体の希釈率がそれぞれ 1,000 倍となるように混合した。2 次抗体は、生殖細胞を緑色蛍光でアポトーシス細胞を赤色蛍光で標識できるように、Alexa
488 goat anti-mouse IgG（H+L）抗体（Life technologies）および Alex 546 goat anti-rabbit
IgG（H+L）抗体（Life technologies）を、Can get signal solution B を希釈液に用いて、それぞれ 200 倍希釈になるように混合した。免疫染色後のスライドガラスは、GFP
蛍光観察用フィルター（U-MNIBA2; Olympus）を装着した蛍光顕微鏡（BX51;
Olympus）により精原細胞の同定を行った。続けて、Alexa Flour 546 蛍光観察用フィルター（U-MWIG2; Olympus）を用いて、同定された精原細胞がアポトーシス細胞であるか判断した。なお、精子形成期の精巣は GFP 陽性の分化型生殖細胞が大量に含まれるため、蛍光顕微鏡下での観察だけでは ASG の識別が困難であった。
そこで、精子形成期の精巣組織は、免疫染色後に蛍光顕微鏡下で顕微鏡用デジタルカメラ（DP72; Olympus）を用いて精巣全体をランダムに写真撮影した。続けて、観察後のスライドガラスはヘマトキシリン・エオシン染色し、画像保存した箇所と同じ像を正立顕微鏡（BX51; Olympus）により観察し、GFP 抗体および
ACTIVE-Caspase 3 抗体の二重陽性細胞が ASG であるのか形態学的に判断した。各精巣あたり 500 細胞以上の ASG を用いて解析を行い、ASG の細胞死頻度は下記の式を用いて算出した。
ASG の細胞死頻度(%)＝

Active − Caspase 3＋GFP 二重陽性の ASG 数
GFP 陽性の ASG 数

36免疫染色法による分裂細胞の検出
ASG の増殖活性を定量的に解析するために、生殖細胞と分裂細胞を識別可能な 2種類の抗体を用いた蛍光免疫染色法を行った。1 次抗体には、生殖細胞の検出のためにモノクローナル抗体の抗 GFP 抗体と、分裂細胞の検出のためにポリクローナ
ル抗体の抗リン酸化ヒストン H3（PH3）抗体（Anti-phospho Histone H3 (Ser10）; Merck
Millipore, Billerica, MA）を用いた。ヒストン H3 タンパクは、染色体の凝縮に関与しており、G2 期の後期にリン酸化され細胞分裂の中期までリン酸化状態が維持されることから（Prigent and Dimitrov, 2003）、分裂期マーカーとして利用される。1次抗体の希釈の際には、Can get signal solution A を希釈液として用い、各 1 次抗体の希釈濃度がそれぞれ 1,000 倍となるように混合した。2 次抗体は、生殖細胞を緑色蛍光で分裂細胞を赤色蛍光で標識できるように、Alexa 488 goat anti-mouse IgG（H+L）抗体（Life technologies）および Alex 546 goat anti-rabbit IgG（H+L）抗体（Lifetechnologies）を、Can get signal solution A でそれぞれ 200 倍希釈になるように混合し作成した。免疫染色後のスライドガラスは、GFP 蛍光観察用フィルター（U-MNIBA2; Olympus）を装着した蛍光顕微鏡（BX51; Olympus）により精原細胞の同定を行った。続けて、Alexa Flour 546 蛍光観察用フィルター（U-MWIG2;
Olympus）を用いて、同定された精原細胞が分裂細胞であるのか確認した。なお、精子形成の進行が認められた精巣は、先述の理由により、免疫染色およびヘマトキ
シリン・エオシン染色を行った後、画像解析により分裂頻度を算出した。各精巣あたり 500 細胞以上の ASG を用いて解析を行い、ASG の分裂頻度は下記の式を用いて算出した。
ASG の分裂頻度（%）＝

PH3 抗体＋GFP 抗体二重陽性の ASG 数
GFP 抗体陽性の ASG 数37精巣内に存在する全 ASG 数の推定移植実験でドナーに用いた各実験区の成熟精巣の中央部からパラフィンブロッ
クを作成した後、厚さ 4 µm の組織切片を作成した。各個体の精巣切片は、ヘマト
キシリン・エオシン染色を行った後、光学顕微鏡（BX51; Olympus）下で、顕微鏡用デジタルカメラ（DP72; Olympus）により、精巣全体を網羅するようにランダムに写真撮影した。続いて、撮影した精巣組織切片上に存在する全 ASG を計数した。
そして、組織切片の密度を 1 g/cm3 と仮定し、1 g あたりに含まれる ASG 数を推定した。最後に、推定した 1 g あたりに含まれる ASG 数と各実験区の生殖腺重量（g）の積により、各ドナー個体の精巣内に存在する全 ASG 数を推定した。

統計処理
全ての結果は、平均値 ± 標準誤差で表している。各実験区間の有意差検定には、GraphPad Prism Version 5.0 (GraphPad, La Jolla, CA）を用いて、Tukey の多重比較検定を行った（P < 0.05）。

38

結果

Ⅰ. 精巣構造の季節的変化
ニジマスは季節性繁殖型魚類で、1 年の生殖周期の間、明瞭な季節性を持ってその精巣構造が大きく変化する。まず、初回成熟以降のニジマス成魚で認められる精巣構造の形態的変化について基礎的知見を得るために、その外部形態および精巣の組織像について詳細に記載した。その結果、ニジマスの生殖周期は、繁殖期、退行期、精子形成期の 3 ステージに明瞭に区別された。
【繁殖期】排精 0－5 ヶ月目（8 月－翌年 2 月）では、ニジマスの腹部を圧迫すると排精が認められた。この期間、精巣のサイズは極めて大きく（GSI, 0 ヶ月: 5.76 ±0.61、1 ヶ月: 3.63 ± 0.24、3 ヶ月: 2.86 ± 0.12、5 ヶ月: 2.81 ± 0.33）、精巣は精子に満たされ白色であった（図 3. A, B）。これらの精巣は、その組織学的特徴から繁殖期の前半（排精 0、1 ヶ月）と後半（排精 3、5 ヶ月）で区別された。排精 0、1 ヶ月
目の精巣は、精小嚢内に排精された精子の他に、精小嚢の壁に精子形成途中のシス
トと A 型精原細胞（ASG）が存在した（図 4. A）。排精 0 ヶ月目では、精小嚢の壁に様々な分化段階のシストが存在していたが（図 4. A）、排精 1 ヶ月目の精巣では、わずかに精細胞のシストが存在するだけとなった。排精 3、5 ヶ月目の繁殖期の後半の精巣の外部形態は、排精 0、1 ヶ月目のものと類似していた（図 3. B）。しかし、精巣内には精小嚢の壁に存在していた分化型生殖細胞のシストは全てなくなり、精小嚢内腔に排精された精子と、精小嚢の壁に点在する ASG のみが存在した（図 4. B）。
翌年の排精 1 ヶ月目の精巣と同一ステージにあたる排精 15 ヶ月目の精巣は、排精
1 ヶ月目と同様の外部形態（GSI: 3.20 ± 1.05）および精巣組織像を示した。
【退行期】排精から 7 ヶ月（翌年 3 月－4 月）が経過すると、腹部を圧迫しても排精が認められない個体が出現するようになった。これらの精巣は、繁殖期のものに比べ小型化した（GSI: 0.93 ± 0.14）。排精終了直後の精巣では、その外部形態が繁39

殖期のものとよく似ており、精子で満たされ白色だった（図 3. C）。精子の除去が進行すると、精子の除去された赤い部分と精子の残された白い部分が混在するようになった（図 3. D）。これらの精巣内では、精子の除去が完了した精小嚢や（図 5. A）、
精小嚢の壁に存在する食細胞により精子が除去されている様子が認められた（図5. B）。
【精子形成期】排精 9－11 ヶ月目（翌年 6－9 月）の精巣内では、精子形成の進行が認められるようになった。排精 9 ヶ月目の精巣は小型で（GSI: 0.36 ± 0.04）、精子の除去が進行し赤くなった部分と精子が残されている白い部分が混在した（図3. E）。精巣内では、精子の除去が完了した精小嚢の他に、精子形成の進行が認められるようになり、分化型生殖細胞が出現した（図 6. A）。続いて、排精 11 ヶ月目の精巣は、排精 9 ヶ月目に比べ大型となり（GSI: 3.2 ± 1.05）、精子が残存していた白い部分が無くなり薄いピンク色となった（図 3. F）。精巣内では、その大部分が分化型生殖細胞で占められており、ASG は精小嚢の壁にわずかに点在していた（図6. B）。

Ⅱ. ニジマス A 型精原細胞の幹細胞活性の季節的変化①ニジマス ASG の幹細胞活性の季節的変化
初回成熟以降のニジマス成魚精巣内に存在する ASG 集団の幹細胞活性が、生殖周期の進行に伴いどのように変化するのか、精原細胞移植を用いて検証した。なお、宿主の遺伝的背景の違いによる移植成功率のばらつきを考慮するため、各実験区の成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率は（図 7. A, 図 9. A）、対照区に用いた
未成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率（図 7. B, 図 9. B）との相対値で示した（図 8, 図 10）。まず、移植後 20 日目の移植成功率は、繁殖期前半にあたる排精
0 ヶ月目および 1 ヶ月目において 0.52 ± 0.22、0.87 ± 0.16 と高い値を示した（図 8）。
その後、繁殖期後半の排精 3 ヶ月目および 5 ヶ月目の精巣では、その移植成功率は40

それぞれ 0.09 ± 0.03、0.03 ± 0.02 となり、排精 0、1 ヶ月目の移植成功率に比べ有意に低下した。排精 7 ヶ月目の退行期の移植成功率は、個体によりばらつきが認めら
れ 0.37 ± 0.11 となった。精子形成が開始した排精 9 ヶ月目の精巣では、その移植成功率は 0.66 ± 0.08 となり、排精 5 ヶ月目に比べ有意に高い値を示した。また、排精11 ヶ月目の移植成功率は 0.31 ± 0.21 だった。翌年の排精 1 ヶ月目にあたる排精 15ヶ月目の移植成功率は 0.94 ± 0.13 で、排精 1 ヶ月目のものと同程度であった（図 8）。
移植後 60 日目に成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率は、移植後 20 日目と同様の傾向を示した（図 10）。繁殖期前半にあたる排精 0、1 ヶ月目の移植成功率は、それぞれ 0.71 ± 0.45、0.92 ± 0.04 と高い傾向を示した。その後、繁殖期後半の排精 3、5 ヶ月目の移植成功率は、それぞれ 0.20 ± 0.09、0.09 ± 0.07 と低い傾向を示した。排精 7 ヶ月目の退行期における移植成功率は 0.02 ± 0.06 だった。その後、
排精 9、11 ヶ月目の精子形成期に入ると、その移植成功率は 0.95 ± 0.26、0.76 ± 0.64と回復傾向を示した。翌年の排精 1 ヶ月目にあたる排精 15 ヶ月目の移植成功率は1.05 ± 0.20 で、排精 1 ヶ月目の移植成功率と同程度だった（図 10）。
なお、移植後 20 日目および移植後 60 日目において、対照区の未成熟精巣由来
ASG から得られた移植成功率は 1 年を通してほぼ一定であったことから（図 7. B,
図 9. B）、宿主生殖腺が腹腔内に存在するドナーASG を取り込む効率、すなわち宿主生殖腺が「ドナーASG を受け入れる能力」に、季節の与えた影響は小さかったと考えられた。つまり、各実験区の成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率の変化は、季節により ASG 集団の幹細胞活性が変化したことを反映した結果であると考えられた。

②宿主生殖腺内におけるドナーASG の増殖能
ドナーの精巣ステージの違いにより、ドナーASG の宿主生殖腺内における増殖活性に違いが生じるのか明らかにするために、移植後 20 日目および移植後 60 日目
41に宿主生殖腺内のドナーASG 数を計数し、その数の変化を解析した。その結果、移植後 20 日目に宿主生殖腺内で認められたドナーASG 数は、個体間でばらつきが認められたものの、実験区および対照区ともに同程度で 1 年を通してほぼ一定に保たれていた（図 11）。移植後 60 日目では、宿主生殖腺に生着したドナーASG が増殖している様子が認められた（図 1）。排精 0、1、9、15 ヶ月目の成熟精巣由来 ASGを移植した場合、宿主生殖腺内において対照区の未成熟精巣由来 ASG を移植した
場合と同程度まで、その数が増加する傾向が認められた（図 12, 図 13）。しかし、
排精 3、5、7 ヶ月目の成熟精巣由来ドナーASG を移植した場合は、対照区の未成
熟精巣由来 ASG を移植した場合に比べ、移植後 60 日目の宿主生殖腺内における生着ドナー細胞数が少ない傾向にあった（図 12, 図 13）。特に、雌宿主においてこの傾向は強く認められた（図 12）。このことから、排精 3、5、7 ヶ月目の成熟精巣に存在する ASG 集団は、宿主生殖腺内における増殖活性が低い状態となっている可能性が考えられた。なお、各実験区から得られた移植後の宿主生殖腺内における平均生着ドナー細胞数は表 1 に示している。
次に、季節によりドナーASG の宿主生殖腺内におけるコロニー形成能に違いが生じているのか明らかにするために、移植後 60 日目にドナーASG の生着が認められた宿主のうちドナーASG 由来の大型のコロニーを保持していた宿主の出現頻度を解析した。その結果、排精 0、1、9、15 ヶ月目の成熟精巣由来 ASG を移植した
宿主は、雌雄ともに対照区と同程度の頻度で大型のコロニーを保持していた（図14）。しかし、排精 3 ヶ月目の成熟精巣由来 ASG を移植した雌宿主では、対照区に比べて大型のコロニーを保持する宿主の出現頻度が低い傾向が認められた（図 14.
A）。
そして、排精 5 ヶ月目および排精 7 ヶ月目では、対照区においてそれぞれ 68.8％
および 45.0%の雌宿主が大型のコロニーを保持していたにも関わらず、大型のコロニーを保持する宿主の出現は認められなかった（図 14. A）。また、雄宿主においても同様の傾向が認められ、排精 3、5、7、11 ヶ月目の成熟精巣由来 ASG を移植し42

た雄宿主では、大型のコロニーを保持する宿主の出現が認められなかった（図 14.
B）。

Ⅲ. ニジマス A 型精原細胞の幹細胞活性に影響を与える要因の探索
移植実験の結果から、ニジマス成魚の精巣内に存在する ASG から得られる移植成功率は、精巣構造の変化に伴い大きく変動することが明らかとなった。つまり、
ASG 集団の幹細胞活性は季節により変化していることが明らかとなった。そこで、ニジマス ASG の幹細胞活性に影響を与えたことが予想される要因の探索を行った。

① ニジマス ASG の形態的特徴と ASG の幹細胞能の関連
これまでに、ニジマスの ASG は、形態学的指標に基づき分化度の異なる 2 種類の ASG に細分化されている。Loir（1999）は、大型の核に dense body をひとつ保持した ASG を最も未分化な ASG とし、A1 細胞と分類した（図 2. A）。そして、A1細胞に比べ小型な核で複数個の dense body を保持した ASG を分化の進んだ ASG とし、A2 細胞と分類した（図 2. A）。ゼブラフィッシュでは、A1 細胞と同様の形態を保持した ASG は精原幹細胞として提唱されている（Leal et al., 2009; Schulz et al.,2010）。以上の報告を踏まえ、本実験では A1 細胞が精原幹細胞としてふるまう細胞であると仮定し、その可能性について検証した。もし、A1 細胞が精原幹細胞ならば、幹細胞活性の高い精巣ステージでは、A1 細胞が多く出現すると予想される。
そこで、各実験区の成熟精巣内に存在する A1 細胞の出現頻度を解析し、幹細胞活性との関連について検討した（図 15）。その結果、ASG の幹細胞活性が高かった排精 0、1、15 ヶ月目の精巣内に、A1 細胞の出現が認められなかった。同様に、幹細胞活性の低かった排精 3、5 ヶ月目の精巣においても、A1 細胞の出現は認められなかった。幹細胞活性の回復が認められるようになった排精 7 ヶ月目から精子形成期の 11 ヶ月目までの間、A1 細胞の出現が認められた（図 15）。
43

②ニジマス ASG の幹細胞活性に影響を与える要因の探索
ニジマス ASG の幹細胞活性を変化させた要因として、以下の 2 つの可能性が考えられた。1）ASG 集団中に存在する精原幹細胞の頻度が変化した可能性、2）精原幹細胞の性質そのものが変化し、幹細胞としてふるまう能力（幹細胞能）を失った可能性が考えられた。2）の可能性を明らかにするためには、より詳細な解析が必要であったことから、本研究では、まず、1）精原幹細胞の頻度が変化した可能性について検討した。

1）ASG の細胞死と幹細胞活性の変化
ASG の細胞死が、ASG 集団の幹細胞活性に影響を与えた可能性について検討した。まず、排精 1－3 ヶ月目に、幹細胞活性が低下した要因として、ASG 集団中に存在する精原幹細胞の頻度が低下したことが考えられた（図 16）。次に、排精 5－9ヶ月目に、幹細胞活性が回復した要因として、ASG 集団中の幹細胞能を持たない
ASG の頻度が低下した可能性が考えられた（図 16）。もし、このような変化が起きていた場合、排精 1－3 ヶ月目および排精 5－9 ヶ月目において、ASG の細胞死頻度が上昇すると考えられた。そこで、これらの仮説を検証するため、各実験区の成熟精巣に存在する ASG の細胞死頻度について定量的に解析した。その結果、ASGの細胞死頻度は、1 年を通して大きく変化していなかったことが明らかとなった（図 17）。このことから、ニジマス ASG 集団の幹細胞活性の変化を引き起こした要因について明らかにすることはできなかった。

2）ニジマス ASG の増殖と幹細胞活性の変化
次に、ASG の増殖が、ASG 集団の幹細胞活性に影響を与えた可能性について検討した。まず、排精 1－3 ヶ月目に、幹細胞活性が低下した要因として、ASG 集団
44

中の幹細胞能を持たない ASG が増加した可能性が考えられた（図 18）。また、排精 5－9 ヶ月目に幹細胞活性が回復した要因として、ASG 集団中の精原幹細胞が増加した可能性が考えられた（図 18）。もし、このような変化が起きていた場合、排精 1－3 ヶ月目、排精 5－9 ヶ月目において、ASG の分裂頻度が上昇することが予想された。そこで、これらの仮説を検証するため、各実験区の成熟精巣に存在する
ASG の分裂頻度について定量的に解析した。その結果、ASG の分裂頻度は、繁殖期の排精 0－5 ヶ月目の間、低い状態で一定に保たれており、幹細胞活性が低下した排精から 1－3 ヶ月目にかけて、ASG の分裂頻度に大きな変化は認められなかった（図 19）。このことから、幹細胞能を持たない ASG 頻度の増加により、幹細胞活性の低下が引き起こされた可能性は低いと考えられた。一方、幹細胞活性の回復
した排精 5－9 ヶ月目にかけて、ASG の分裂頻度が有意に上昇し、精子形成期間中を通して ASG の分裂頻度は高い状態で維持された（図 19）。このことから、ASGの幹細胞活性が回復した要因として、ASG 集団全体の増殖活性の上昇に伴い、ASG
集団内の精原幹細胞頻度が上昇していた可能性が考えられた。

3）精巣内に存在する全 ASG 数の季節的変化
1）および 2）の実験により、ASG 集団の幹細胞活性が低下した排精 1－3 ヶ月目
において、細胞死頻度・増殖活性に大きな変化が認められなかった。そのため、幹細胞活性が低下した要因を明らかにすることはできなかった。しかし、ASG の細胞死頻度が、ASG の分裂頻度を上回っていた場合、ASG 集団中の精原幹細胞頻度がゆるやかに低下していた可能性が考えられた（図 20）。同様に、ASG の分裂頻度が細胞死頻度を上回っていた場合、ASG 集団中の幹細胞能を持たない ASG の増加
がゆるやかに起きていた可能性が考えられた（図 20）。そして、いずれの可能性が起きた場合でも、精巣内に存在する全 ASG 数に変化が生じると予想した（図 20）。
そこで、各実験区の成熟精巣内に存在した全 ASG 数を推定し、その数の変化を明45

らかにすることで、ASG 集団の幹細胞活性に変化をもたらした要因を探索した。
その結果、幹細胞活性の低下した排精 1－3 ヶ月目にかけて、精巣内に存在する全ASG 数に大きな変化は認められなかった（図 21）。このことから、幹細胞活性の低
下した要因を明らかにすることはできなかった。一方、幹細胞活性の回復した排精
5－9 ヶ月目にかけて、精巣内の全 ASG 数が増加傾向を示していたことが明らかとなった（図 21）。

46

考察

前章では、繁殖期のニジマス精巣内に存在する残留 A 型精原細胞（ASG）集団の幹細胞活性が極めて低い状態であることを明らかにした。しかし、残留 ASG 集
団は、翌年の精子形成を一手に担う重要な細胞集団である。そのため、残留 ASG
集団の幹細胞活性が低下したまま、翌年の精子形成を再開するとは考えにくい。また、前章の移植実験の結果は、ニジマスの 1 年の生殖周期における、ある一時期に起きていた現象を切り取って観察したものに過ぎない。これらのことから、1 年の生殖周期におけるいずれかの季節において、ASG 集団の幹細胞活性が変化していた可能性が残された。そこで、本章では、ASG 集団の幹細胞活性を定量的に解析可能な精原細胞移植系を用いて、ニジマス成魚の精巣内に存在する ASG 集団が、1年の生殖周期の間に幹細胞活性を変化させるのか否か検証した。移植実験のドナー細胞には、精巣体細胞がドナーASG の宿主生殖腺への生着を阻害する可能性を排除するために、ASG のみを単離し用いた。また、実験区間で移植条件をできる限り統一するため、全移植実験においてドナーASG が一定細胞数になるように移植した。その結果、対照区に用いた未成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率は、
1 年を通して一定であった。この結果から、宿主生殖腺が腹腔内に存在するドナー
ASG を取り込む効率、すなわち宿主生殖腺が「ドナーASG を受け入れる能力」に季節の影響はなかったと考えられた。一方、ニジマス成魚の精巣から単離した ASG
をドナーに用いた場合、ドナーASG から得られる移植成功率は、季節性を持って変化することが明らかとなった。繁殖期のニジマス精巣内に存在する残留 ASG 集
団から得られる移植成功率は、繁殖期の前半では高かったが、繁殖期の後半に入ると著しく低下することが明らかとなった。そして、排精が終了し退行期を迎えると、低下していた移植成功率は回復傾向を示し、精子形成期では、高い移植成功率が得られるようになった。また、翌年の排精 1 ヶ月目にあたる排精 15 ヶ月目の残留 ASG
47

から得られた移植成功率は、排精 1 ヶ月目のものと同様に高かった。このことから、本研究で明らかとなった移植成功率の変化には周期性があることが予想された。これら移植実験により得られた結果は、ニジマス成魚の精巣内に存在する ASG 集団
が、1 年を通してその幹細胞活性を一定に維持しておらず、季節性を持って変化させていることを示している。ASG 集団の幹細胞活性の著しい変化は、繁殖期の残留 ASG 集団において起きており、繁殖期の前半では高い状態で維持されていた残留 ASG 集団の幹細胞活性が、繁殖期の後半にかけて極めて低い状態へと移行していたことが明らかとなった。そして、ASG 集団は、幹細胞活性の低下した状態で精子形成を再開するのではなく、精子形成の再開に先立ち、退行期から精子形成期にかけて徐々に幹細胞活性を回復させることが明らかとなった。このことから、初回成熟以降のニジマス成魚は、生殖周期に伴い精巣構造を季節的に変化させるだけ
でなく、ASG 集団の幹細胞活性さえも季節性をもって制御していたことが明らかとなった。
移植後 20 日目および移植後 60 日目において宿主生殖腺に生着したドナーASG数を解析した結果、宿主生殖腺内におけるドナーASG の増殖能は季節により異なる可能性が考えられた。幹細胞活性の高い繁殖期前半および精子形成期の成熟精巣由来 ASG を移植した場合、移植後 60 日目における宿主生殖腺内のドナーASG 数
は対照区と同程度で、ドナーASG 由来の大型のコロニーを保持する宿主の出現頻度も対照区と同程度であった。しかし、幹細胞活性の低下していた繁殖期後半および回復時にあたる退行期の成熟精巣由来 ASG を移植した場合、移植後 60 日目における宿主生殖腺内のドナーASG 数は対照区に比べ少ない傾向が認められた。さらに、ドナーASG 由来の大型のコロニーを保持する宿主の出現が認められなかった。
このことから、幹細胞活性の低下した繁殖期後半および回復時の退行期の精巣内に存在する ASG は、宿主生殖腺内で増殖する能力が低下していた可能性が考えられた。すなわち、生殖周期に伴い ASG 集団の性質そのものが変化し増殖能の低い状
48

態へと移行していた可能性が考えられた。しかし、繁殖期後半および退行期の成熟
精巣由来 ASG を移植した際に、ドナーASG の生着が認められた宿主の数が十分に得られていないことから、今後は解析個体数を増やし、この可能性についてより詳細に解析していく必要がある。
これまでに、ニジマスの ASG は、核の形態を指標に分化度の異なる 2 種類の ASGに細分化されている（Loir, 1999）。Loir は、大型の核にひとつの dense body を持つ
ASG（A1 細胞）が、ASG 集団内で最も分化度の低い細胞であると推察した。さらに、ゼブラフィッシュでは、同様の形態的特徴を保持した ASG が精原幹細胞であると提唱されている（Leal et al., 2009; Nóbrega et al., 2010）。その際、ゼブラフィッ
シュにおける精原幹細胞の検出には、Label retaining cell（LRC）を利用した方法が用いられた。これまでに、幹細胞を識別するための方法のひとつとして、LRC を検出する方法が用いられてきた（Li and Clevers, 2010）。一般に、幹細胞は増殖活性の低い細胞であると考えられており、核内の DNA をブロモデオキシウリジン（BrdU）などで標識すると、増殖活性の高い細胞は分裂に伴い標識が希釈される
ため、時間の経過とともに標識が検出できなくなるが、分裂頻度の低い幹細胞では核内に標識を保持した細胞（LRC）として識別される（Li and Clevers, 2010）。ゼブ
ラフィッシュでは、大型の核にひとつの核小体を保持した ASG が LRC として検出されたことから、ASG が幹細胞としてふるまう細胞すなわち精原幹細胞であると提唱された（Nóbrega et al., 2010）。以上の報告から、A1 細胞こそがニジマス精巣内において精原幹細胞としてふるまう ASG であり、ASG 集団の幹細胞活性を変化させる主な要因となっているのではないかと考えた。つまり、ASG 集団内に A1 細胞が多く出現したとき幹細胞活性が高くなり、A1 細胞の出現が少ないとき幹細胞活性が低くなるのではないかと考えた。そこで、ニジマス成魚の精巣内における A1細胞の出現について解析した結果、幹細胞活性の低かった繁殖期の後半において、ASG 集団中に A1 細胞の出現が認められなかった。そして、退行期から精子形成期
49

にかけて幹細胞活性の回復が起こると、ASG 集団中に A1 細胞が出現することが明らかとなった。すなわち、繁殖期の後半から精子形成期までの間、A1 細胞の出現と幹細胞活性の変化が一致していた（図 22. B, C）。しかし、幹細胞活性の高かった
繁殖期の前半において、ASG 集団中に A1 細胞は存在していなかった（図 22. B, C）。
以上の結果から、ASG 集団の幹細胞活性の変化と A1 細胞の出現は、必ずしも一致していないことが明らかとなった（図 22. B, C）。このことは、A1 細胞のみが精原
幹細胞としての能力を保持した ASG ではなく、A1 細胞と異なる形態を保持した
ASG 集団内にも精原幹細胞としての能力を備えた細胞が存在していることを示唆する。したがって、A1 細胞が ASG 集団の幹細胞活性に影響を与えている可能性は捨てきれないが、A1 細胞の出現のみを指標に ASG 集団のもつ幹細胞活性を予測することは困難であると考えられる。これらのことから、本研究で明らかとなった
ASG 集団の生殖周期に伴う幹細胞活性の変化は、従来の形態的指標からは捉えることのできない性質の変化であり、精原細胞移植系を用いた機能的解析を行うことで、初めて明らかとなった事実であるといえる。
移植実験の結果から、残留 ASG 集団の幹細胞活性は、繁殖期の前半から後半にかけて著しく低下することが明らかとなった。そこで、残留 ASG 集団の幹細胞活性が低下した要因として、以下の 2 つの可能性を考えた。まず、1）ASG 集団中に存在する精原幹細胞の頻度が低下した可能性、2）ASG の性質が変化し、宿主生殖腺への生着能あるいは宿主生殖腺内での生存性が低下した可能性である。2）の可能性を検証するためには、より詳細な解析を行っていく必要があったことから、まず、本研究では 1）の精原幹細胞の頻度が変化した可能性に注目し検討した。ASG
集団内に存在する精原幹細胞の頻度が変化した場合、幹細胞活性の低下した排精 1－3 ヶ月目にかけて、ASG の細胞死頻度、増殖活性および精巣内に存在する全 ASG数に変化が起きるのではないかと予想した。そこで、これらの要素を定量的に解析した結果、排精 1－3 ヶ月目において、ASG 集団の細胞死頻度、増殖活性、全 ASG
50

数に大きな変化が認められなかった（図 22. B, D-F）。この要因として、ASG 集団
中に存在する精原幹細胞の割合が極めて低く、その変化を捉えることができなかったことが考えられた。あるいは、2）ASG 集団の性質そのものが変化したために、数の変化として捉えられなかった可能性が考えられた（図 23）。しかし、現在、魚類の精原幹細胞を識別可能なマーカーが存在しないことから、本研究では、残留ASG 集団の幹細胞活性の低下がどのようにして引き起こされたのか結論づけることはできなかった（図 23）。
残留 ASG 集団の幹細胞活性の低下は、精巣内に分化型生殖細胞が存在する排精
1 ヶ月目から、分化型生殖細胞の出現が認められなくなった排精 3 ヶ月目にかけて起きた。このことから、分化型生殖細胞の存在により、ASG 集団の幹細胞活性が維持されていた可能性が考えられた。マウスでは、分化型生殖細胞が、近傍に存在するセルトリ細胞へ働きかけることで、未分化型 A 型精原細胞が分化する時期を制御していると考えられている（Sugimoto et al., 2012）。このことから、魚類では、分化型生殖細胞と接するセルトリ細胞が、近傍に存在する ASG に働きかけること
で ASG の持つ幹細胞能の維持に関与していた可能性が考えられた。しかし、これまでに魚類において、分化型生殖細胞を包むセルトリ細胞と ASG 間の相互作用を示唆する知見はなく、今後より詳細に解析していく必要がある。
低下していた残留 ASG 集団の幹細胞活性は、退行期から精子形成期にかけて徐々に回復することが明らかとなった。このことから、ASG 集団の幹細胞活性の回復は、ASG 集団内の精原幹細胞頻度が上昇したことで引き起こされたのではな
いかと予想した。そこで、この可能性について検証した結果、幹細胞活性の回復が起きた排精 5－9 ヶ月目にかけて、ASG の細胞死頻度は一定だったが、増殖活性および精巣内に存在する全 ASG 数の増加が起きていたことが明らかとなった（図 22.
B, D-F）。このことから、退行期から精子形成期にかけて認められた幹細胞活性の回復は、ASG 集団中の精原幹細胞頻度が上昇することにより引き起こされた可能51

性が考えられた（図 23）。これまでに、ニジマスおよびマスノスケにおいて、精子形成期に生殖腺刺激ホルモンの一種である濾胞刺激ホルモン（FSH）の血中量が増加することが報告されている（Gomez et al., 1999; Cambell et al., 2003）（図 22. G）。
FSH は、出生後から性成熟前において、仔マウスおよび仔ラット精巣内でセルトリ
細胞数の増加を促すことが明らかとなっている（Meehan et al., 2000; Johnston et al.,2004）。また、一過性に甲状腺機能の低下を誘導し、セルトリ細胞数を増加させたマウスでは、精巣内の精原幹細胞数の増加、および精原幹細胞を維持するための微小環境であるニッチ数の増加が報告されている（Oatley et al., 2011）。さらに、FSH
はセルトリ細胞を介して、精原幹細胞の維持に関わるサイトカインである glial-cellderived neurotropic growth factor（GDNF）遺伝子の発現を誘導し、これにより精原幹細胞の分裂を促すことが示唆されている(Tadokoro et al., 2002）。これらの結果か
ら、マウスにおいて、FSH はセルトリ細胞数の増加や精原幹細胞の維持に関わるサイトカインの分泌を誘導することで、精原幹細胞数の増加に関与している可能性が考えられる。一方、魚類における FSH の働きのすべては明らかとなっていないが、アフリカナマズ（Clarias gariepinus）において、片側の生殖腺除去を行うと、精巣内の FSH 受容体遺伝子の発現上昇とセルトリ細胞および ASG の分裂頻度の増加が報告されている（Schulz et al., 2012）。以上の研究結果を踏まえると、退行期から精子形成期にかけて認められた ASG 集団の幹細胞活性の回復は、精子形成期に分泌量が増加する FSH の働きにより（図 22. B, G）、セルトリ細胞数の増加および精原幹細胞胞の増殖を促すサイトカインの分泌促進の両方、あるいはその一方が誘導されたことで、全 ASG 数および精原幹細胞数の増加が引き起こされたと考えられた（図 23）。しかし、魚類の FSH が、セルトリ細胞数の増加や精原幹細胞の維持に関わるサイトカインの分泌を誘導する直接的な証拠は得られておらず、今後より詳細な研究を行っていく必要がある。
以上、ニジマス成魚の精巣内に存在する ASG 集団は、1 年の生殖周期において52

その幹細胞活性を一定に維持しておらず、精巣構造の変化に伴い季節性を持って幹細胞活性を変化させていることが明らかとなった。そして、この幹細胞活性の変化
は、ASG の形態的特徴から予測することは不可能であり、精原細胞移植系を介することで初めて明らかにすることができた。このことは、精原細胞移植系が、魚類の精原幹細胞研究において極めて有効な手法であることを意味するとともに、移植系を用いることなく魚類の精原幹細胞を検出するには、新たな形態的指標あるいは
分子マーカーを探索していく必要があることを示唆している。本研究により、繁殖期の精巣内に存在する残留 ASG 集団は、繁殖期の前半と後半で幹細胞活性が明瞭に異なる細胞集団へ区別されることが明らかとなった（図 22. B）。さらに、これら
残留 ASG 集団間の細胞死頻度および増殖活性に違いは認められなかった（図 22. B,
D, E）。つまり、繁殖期の前半と後半に存在する残留 ASG 集団は、幹細胞活性のみが明瞭に異なる ASG 集団であるといえる。近年、本研究室においてニジマス生殖腺由来の転写産物を基に DNA マイクロアレイが作成され（Hayashi et al., 2012）、
生殖腺内で発現する遺伝子について網羅的に解析することが可能となった。そこで、幹細胞活性のみが異なるこれら残留 ASG 集団を材料にして、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行えば、細胞増殖や細胞死に関わる遺伝子の影響を受けることなく、幹細胞活性の高い ASG 集団で特異的に強く発現する遺伝子、さらには精原幹細胞特異的分子マーカーの同定が可能になると期待される。

53

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57

図説明

図 1. 宿主生殖腺に生着したドナーASG
生殖腺（破線）内に存在する緑色の細胞は、移植後に宿主生殖腺内へ生着したドナーASG である。（A, B）移植後 20 日目の宿主生殖腺に生着したドナー
ASG の様子。（C, D）移植後 60 日目の雄宿主精巣内で認められたドナーASGの様子。（E, F） 移植後 60 日目の雌宿主卵巣内で認められたドナーASG の様子。宿主の性は卵巣のラメラ構造（矢尻）の有無を指標にして識別した。A, C,
E は蛍光視野像、B, D, F は明視野像。スケールバーは 20 μm を示している。

図 2. ニジマス精巣内に存在する生殖細胞（A）A 型精原細胞（ASG）。大型の核を持ち、単一の細胞として精巣内に存在する。黄色の矢尻は A1 細胞、白色の矢尻は A2 細胞を示す（Loir, 1999）。
（B）
B 型精原細胞。細胞間が連結したまま体細胞分裂を行うため、類似した形態の核を保持した複数個の細胞によるシストを形成する。ASG に比べ、核が小型でヘマトキシリンに濃染する。（C）精母細胞。減数分裂期へ入った生殖細胞。B型精原細胞に比べ、小型で円型の核を保持した細胞からなるシストを形成する。
核の中心から放射線状にヘマトキシリンに濃染する筋状の構造が認められる。
（D）第一減数分裂中の精母細胞。（E）精細胞。第 2 減数分裂が完了後、半数体の細胞となるためシスト構造を示す生殖細胞の中で最も小型で円型の核となる。
（F）精子。シストを形成していたセルトリ細胞間の連結が崩壊し、精小嚢の内腔に排精された状態で確認される。スケールバーは 10 μm を示している。

図 3. ニジマス精巣の外部形態の季節的変化（A）繁殖期前半（排精 0、1 ヶ月目）の精巣。大型で、精子に満たされ白色58である。（B）繁殖期後半（排精 3、5 ヶ月目）の精巣。繁殖期前半の精巣と同様の外部形態を示す。（C, D）退行期（排精 7 ヶ月目）の精巣。排精終了直後の精巣の外部形態は繁殖期の精巣とよく似るが小型である（C）。排精終了以降、精子の活発な除去が開始するため精子が除去され、赤くなった箇所が認められるようになる（D）。
（E, F）精子形成期の精巣。排精 9 ヶ月目の精巣は、排精 7ヶ月目のものとよく似る（E）。排精 11 ヶ月目の精巣は、精巣内において精子形成が活発に進行するため大型となる。また、精子の産生量が少ないことから全体的に薄いピンク色の精巣となる（F）。スケールバーは 1 cm を示している。

図 4. ニジマス精巣組織の季節的変化（繁殖期）
ASG を可視化するため、抗 GFP 抗体による蛍光免疫染色像およびヘマトキ
シリン・エオシン染色組織像を結合させた写真を示す。緑色の細胞は ASG を示している。（A）繁殖期前半（排精 0、1 ヶ月目）の精巣。精小嚢の壁には、精子形成途中のシストが多く存在する。排精確認以降、時間の経過とともに、精小嚢の壁に残存していたシスト数は減少する。精小嚢の壁には ASG が点在する様子が認められる。（B）繁殖期後半（排精 3、5 ヶ月目）の精巣。精小嚢
内腔に排精された精子および、精小嚢の壁には ASG のみが認められる。スケールバーは 10 μm を示している。

図 5. ニジマス精巣組織の季節的変化（退行期）
緑色の細胞は ASG を示している。（A）排精 7 ヶ月目の精巣。精小嚢内腔の精子は除去され、精小嚢内には ASG のみが認められるようになる。（B）精小嚢の内壁に存在する細胞により精子が貪食除去されている様子が認められる（矢印）。スケールバーは 10 μm を示している。

59

図 6. ニジマス精巣組織の季節的変化（精子形成期）
緑色の細胞は ASG を示している。（A）排精 9 ヶ月目の精巣。精子形成が開始し、精小嚢内には ASG の他に様々な分化段階の生殖細胞が認められる。
（B）
排精 11 ヶ月目の精巣。精巣内の大部分は、精母細胞や精細胞で占められるようになる。ASG は精小嚢の壁にわずかに認められる。スケールバーは 10 μm を示している。

図 7. 移植後 20 日目に各ドナー精巣由来 ASG から得られた移植成功率（A）成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率。（B）対照区の未成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率。縦軸は移植成功率（%）、横軸は各実験区を示している。各実験区は 3－7 回試行した。異なるアルファベット間には、有意差があることを示している（P<0.05）。

図 8. 移植後 20 日目に成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率
宿主の違いによる移植成功率のばらつきを補正するため、成熟精巣由来 ASGから得られた移植成功率を、対照区に用いた未成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率との相対値で示している。縦軸は成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率（相対値）、横軸は各実験区を示している。各実験区は 3－7 回試行した。異なるアルファベット間には、有意差があることを示している（P<0.05）。

図 9. 移植後 60 日目に各ドナー精巣由来 ASG から得られた移植成功率（A）成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率。（B）対照区の未成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率。縦軸は移植成功率（%）、横軸は各実験区を示している。各実験区は 3－7 回試行した。異なるアルファベット間には、60

有意差があることを示している（P<0.05）。

図 10. 移植後 60 日目に成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率
宿主の違いによる移植成功率のばらつきを補正するため、成熟精巣由来 ASGから得られた移植成功率を、対照区に用いた未成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率との相対値で示している。縦軸は成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率（相対値）、横軸は各実験区を示している。各実験区は 3－7 回試行した。各実験区間で移植成功率に有意な差は認められなかった。

図 11. 移植後 20 日目の宿主生殖腺内で認められたドナーASG 数
各ドットは、各宿主個体が保持していたドナーASG 数を示す。縦軸は宿主生
殖腺内に生着したドナーASG 数、横軸は各実験区を示す。対照区の未成熟精巣
由来 ASG を移植した際に得られた生着細胞数を「未」、実験区の成熟精巣由来
ASG を移植した際に得られた生着細胞数を「成」と示している（0 ヶ月目: 対
照区, n=27; 実験区, n=18、1 ヶ月: 対照区, n=34; 実験区, n=33、3 ヶ月: 対照区,
n=41; 実験区, n=5、5 ヶ月: 対照区, n=32; 実験区, n=1、7 ヶ月: 対照区, n=51; 実験区, n=20、9 ヶ月: 対照区, n=57; 実験区, n=43、11 ヶ月: 対照区, n=17; 実験区,
n=8、15 ヶ月: 対照区, n=41; 実験区, n=37）。

図 12. 移植後 60 日目に雌宿主の卵巣内で認められたドナーASG 数
各ドットは、各宿主個体が保持していたドナーASG 数を示す。縦軸は宿主生
殖腺内に生着したドナーASG 数、横軸は各実験区を示す。対照区の未成熟精巣
由来 ASG を移植した際に得られた生着細胞数を「未」、実験区の成熟精巣由来
ASG を移植した際に得られた生着細胞数を「成」と示している（0 ヶ月目: 対
照区, n=15; 実験区, n=16、1 ヶ月: 対照区, n=27; 実験区, n=31、3 ヶ月: 対照区,
61

n=22; 実験区, n=9、5 ヶ月: 対照区, n=16; 実験区, n=2、7 ヶ月: 対照区, n=20; 実
験区, n=3、9 ヶ月: 対照区, n=28; 実験区, n=34、11 ヶ月: 対照区, n=9; 実験区,
n=3、15 ヶ月: 対照区, n=26; 実験区, n=15）。

図 13. 移植後 60 日目に雄宿主の精巣内で認められたドナーASG 数
各ドットは、各宿主個体が保持していたドナーASG 数を示す。縦軸は宿主生
殖腺内に生着したドナーASG 数、横軸は各実験区を示す。対照区の未成熟精巣
由来 ASG を移植した際に得られた生着細胞数を「未」、実験区の成熟精巣由来
ASG を移植した際に得られた生着細胞数を「成」と示している（0 ヶ月目: 対
照区, n=12; 実験区, n=9、1 ヶ月: 対照区, n=25; 実験区, n=23、3 ヶ月: 対照区,
n=29; 実験区, n=5、5 ヶ月: 対照区, n=15; 実験区, n=1、7 ヶ月: 対照区, n=15; 実
験区, n=3、9 ヶ月: 対照区, n=22; 実験区, n=22、11 ヶ月: 対照区, n=9; 実験区,
n=3、15 ヶ月: 対照区, n=20; 実験区, n=25）。

図 14. ドナーASG 由来の大型のコロニーを保持する宿主の出現頻度（A）ドナーASG 由来の大型のコロニーを保持していた雌宿主の出現頻度。
（B）ドナーASG 由来の大型のコロニーを保持していた雄宿主の出現頻度。雌宿主では 30 細胞以上のドナーASG から形成されたコロニーを大型のコロニーと定義し、雄宿主では 15 細胞以上のドナーASG から形成されたコロニーを大型のコロニーと定義した。縦軸は大型のコロニーを保持する宿主の出現頻度（%）、横軸は各実験区を示している。解析に用いた個体数は、図 12 および図13 と同じ。

図 15. 成熟精巣内の ASG 集団における A1 細胞の出現頻度
各実験区の成熟精巣内に存在する ASG 中に認められた A1 細胞の出現頻度。
62

縦軸は A1 細胞の出現頻度（%）、横軸は各実験区を示している。各実験区は 3－7 回試行した。

図 16. 仮説: ASG の細胞死に伴う幹細胞活性の変化（上段）成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率の季節的変化を示したグラフ。（下段）幹細胞活性の変化時（低下: 排精 1－3 ヶ月、回復: 排精 5－9ヶ月）に、ASG 集団の細胞死頻度に変化が認められた場合、ASG 集団内で起きていたことが予想される ASG の挙動。下段・左）幹細胞活性の低下が、精原幹細胞の減少により引き起こされていた場合。下段・右）幹細胞活性の回復
が、幹細胞能を持たない ASG の減少により引き起こされた場合。赤色の細胞
は精原幹細胞、緑色の細胞は幹細胞としてふるまう能力（幹細胞能）を持たな
い ASG を示す。

図 17. 成熟精巣内 ASG 集団における細胞死頻度の季節的変化
各実験区の成熟精巣内に存在する ASG 中で認められたアポトーシス（抗 GFP
抗体および抗 ACTIVE-Caspase 3 抗体の 2 重陽性細胞）細胞の出現頻度。縦軸は ASG の細胞死頻度（%）、横軸は各実験区を示している。各実験区は 3－5回試行した。各実験区間で細胞死頻度に有意な差は認められなかった。

図 18. 仮説: ASG の増殖に伴う幹細胞活性の変化（上段）成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率の季節的変化を示したグラフ。
（下段）幹細胞活性の変化時 （低下: 排精 1－3 ヶ月、回復: 排精 5－9ヶ月）に、ASG 集団の分裂頻度に変化が認められた場合、予想される ASG の挙動を示す。下段・左）幹細胞活性の低下が、幹細胞能を持たない ASG の増加により引き起こされていた場合。下段・右）幹細胞活性の回復が、精原幹細63

胞の増加により引き起こされた場合。赤色の細胞は精原幹細胞、緑色の細胞は幹細胞能を持たない ASG を示す。

図 19. 成熟精巣内 ASG 集団における分裂頻度の季節的変化
各実験区の成熟精巣内に存在する ASG 中で認められた分裂細胞（抗 GFP 抗
体および抗 PH 3 抗体の 2 重陽性細胞）の出現頻度。縦軸は ASG の分裂頻度（%）、横軸は各実験区を示している。各実験区は 3－7 回試行した。異なるアルファ
ベット間には、有意差があることを示している（P<0.05）。

図 20. 仮説: 幹細胞活性の低下と全 ASG 数の変化
（上段）成熟精巣由来 ASG から得られた移植成功率の季節的変化を示したグラフ。
（下段）精巣内に存在する全 ASG 数が認められた時、起きていたことが予想される ASG の挙動。①精巣内の全 ASG 数が減少した場合、ASG 集団の細胞死頻度が増殖活性を上回っていたことが予想される。つまり、幹細胞活性の低下は、精原幹細胞数の減少により誘導された可能性を示唆。②精巣内の全ASG 数が増加した場合、ASG 集団の増殖活性が細胞死頻度を上回っていたことが予想される。つまり、幹細胞活性の低下は、幹細胞能を持たない ASG の増加により誘導された可能性を示唆。赤色の細胞は精原幹細胞、緑色の細胞は幹細胞能を持たない ASG を示す。

図 21. 成熟精巣内に存在する全 ASG 数の季節的変化
各実験区の成熟精巣内に存在する全 ASG 数の季節的変化を示したグラフ。
精巣内に存在する全 ASG 数は、排精 0 ヶ月目の全 ASG 数を 1 とした時の相対値で示している。縦軸は精巣内に存在する全 ASG 数（相対値）、横軸は各実験区を示す。各実験区は 3－7 回試行した。異なるアルファベット間には、有意64差があることを示している（P<0.05）。

図 22. ASG 集団の幹細胞活性の変化時に起きていた様々な変化（A）各精巣ステージで認められた代表的な組織像を示す。左から、繁殖期
前半、繁殖期後半、退行期、精子形成期。
（B）ASG 集団の幹細胞活性の変化。
繁殖期の後半において、ASG 集団の幹細胞活性の著しい低下が認められた。低下した ASG 集団の幹細胞活性は退行期から精子形成期にかけて回復した。
（C）
成熟精巣内 ASG 集団中に認められた A1 細胞の出現頻度の変化。繁殖期の精巣
内では A1 細胞の出現が認められなかった。退行期から精子形成期間の間、A1細胞の出現が認められた。（D）ASG の細胞死頻度の変化。ASG 集団の細胞死頻度は、一年を通してほぼ一定に維持された。（E）ASG の増殖活性の変化。
繁殖期を通して ASG の増殖活性は低下したが、退行期以降 ASG の増殖活性は高い状態となった。（F）精巣内に存在する全 ASG 数の変化。繁殖期から退行期まで、精巣内に存在する全 ASG 数はほぼ一定に維持されている。精子形成以降、全 ASG 数は上昇傾向を示し、翌年の繁殖期までにはおよそ 2 倍となった。（G）雄のニジマス成魚において認められる血中濾胞刺激ホルモン（FSH）
量の推移（Gomez et al., 1999 を改変）。

図 23. ASG 集団の幹細胞活性の変化時に起きていたことが予想される各 ASG の挙動（上段）各精巣ステージで認められた代表的な組織像。左から、繁殖期前半、繁殖期後半、退行期、精子形成期。
（中段）各実験区の ASG 集団で認められた幹細胞活性の変化を示している。繁殖期後半において ASG 集団の幹細胞活性が著しく低下した。低下した ASG 集団の幹細胞活性は、退行期から精子形成期にかけて徐々に回復した。（下段）ASG 集団の幹細胞活性が変化した時、起65きていたことが予想された各 ASG の挙動モデル。繁殖期の前半から後半にかけて起きた幹細胞活性の低下は、ASG 集団中の精原幹細胞頻度の低下、または
精原幹細胞の保持していた幹細胞能の低下により引き起こされた可能性が考えられた。幹細胞活性の回復は、ASG の増殖活性の上昇と同時期に起きていたことから、精原幹細胞が活発に増殖することで ASG 集団中の精原幹細胞頻度が上昇した可能性、あるいは、増殖開始が引き金となり精原幹細胞の失われていた幹細胞能が回復した可能性が考えられた。赤色の細胞は精原幹細胞、緑色の細胞は幹細胞能を持たない ASG、青色の細胞は幹細胞能が低下した精原幹細
胞を示す。

66

A

B

C

D

E

F

図1. 宿主生殖腺に生着したドナーASG

67

68

D

A

F

C

図2. ニジマス精巣内に存在する生殖細胞

E

B

A

B

C

D
E

F

図3. ニジマス精巣の外部形態の季節的変化
69

70

A

図4. ニジマス精巣組織の季節的変化（繁殖期）

B

10µm

71

A

図5. ニジマス精巣組織の季節的変化（退行期）

B

72

A

図6. ニジマス精巣組織の季節的変化（精子形成期）

B

A

50
b

bc
ab

ab

ab

ASG
%

移成
植 熟 40成精
功 巣 30率由（ 来 20
）
10
の

ac

0

ac
a

0

1

3

5

7

9

11 15 （ヶ月）

0

1

3

5

7

9

11 15 （ヶ月）

B

%

70
移未
植 成 60
成 熟 50
功 精 40率巣（ 由 30） 来 2010の0ASG

図7. 移植後20日目に各ドナー精巣由来ASGから得られた移植成功率

73

1.2
移 1
植
成 0.8
功 0.6
率 0.4
（
相 0.2
対
値 0
）

b

b

b

ab

ab

ab
a

0

1

3

a

5

7

9

11 15 （ヶ月）

図8. 移植後20日目に成熟精巣由来ASGから得られた移植成功率

74

A

a
a

ab

ac

ASG
%

70
移 成 60
植 熟 50成精
功 巣 40率 由 30
（来
20
）
の 10
0

B

bc

b

bc

b

0

1

3

5

7

9

11 15 （ヶ月）

0

1

3

5

7

9

11 15 （ヶ月）

80

%

移未
植成
成 熟 60
功精
率 巣 40
（由
）来
ASG

の

20
0

図9. 移植後60日目に各ドナー精巣由来ASGから得られた移植成功率

75

1.6

移
植 1.2
成
功 0.8
率
（
相 0.4
対
値
0
）

0

1

3

5

7

9

11 15 （ヶ月）

図10. 移植後60日目に成熟精巣由来ASGから得られた移植成功率

76

生
着
ド
ナ
ー

数

ASG

77

未

未
1

成

未
3

成

未
5

成

未
7

成

未
9

成

未
11

成

図11. 移植後20日目に宿主生殖腺内で認められたドナーASG数

0

成

未

15

成

認雌
め宿
ら主
れの
た卵
ド巣
ナ内
ーで

数

ASG

78

0

成

未
1

成

未
3

成

未
5

成

未
7

成

未
9

成

未
11

成

図12. 移植後60日目に雌宿主の卵巣内で認められたドナーASG数

未

♀

未

15

成

認雄
め宿
ら主
れの
た精
ド巣
ナ内
ーで

数

ASG

79

0

成

未
1

成

未
3

成

未
5

成

未
7

成

未
9

成

未
11

成

図13. 移植後60日目に雄宿主の精巣内で認められたドナーASG数

未

♂

未

15

成

A
雌大
宿型
主の
のコ
出ロ
ニ
現ー
頻を
度保
（持
％
）す
る

80

♀

60

成熟

40
20

0
0

B
雄大
宿型
主の
のコ
出ロ
ニ
現ー
頻を
度保
（持
％
）す
る

未成熟

60
50

1

3

5

7

9

♂

11 15 （ヶ月）

未成熟
成熟

40
30
20

10
0
0

1

3

5

7

9

11 15 （ヶ月）

図14. ドナーASG由来の大型のコロニーを保持する
宿主の出現頻度

80

A1
細
胞
の
出
現
頻
度
（
％
）

8
6
4
2
0
0

1

3

5

7

9

11 15 （ヶ月）

図15. 成熟精巣内のASG集団におけるA1細胞の
出現頻度

81

82

低下

の細胞死

図16. 仮説: ASGの細胞死に伴う幹細胞活性の変化:精原幹細胞の細胞死

精子形成【幹細胞活性の回復】

回復

退行:幹細胞能を持たないASG

排精後期【幹細胞活性の低下】

移
植
成
功
率

排精前期

ASG

1

%

0.8
の
細 0.6
胞
死 0.4
頻 0.2
度
（ 0
）

0

1

3

5

7

9

11 15 （ヶ月）

図17. 成熟精巣内ASG集団における細胞死頻度の
季節的変化

83

84

移
植
成
功
率

低下

精子形成

:幹細胞能を持たないASGの増殖

図18. 仮説: ASGの増殖に伴う幹細胞活性の変化:精原幹細胞

の増殖

回復

退行

【幹細胞活性の回復】

排精後期【幹細胞活性の低下】

排精前期

ASG
%

の
分
裂
頻
度
（
）

5
4

b

b

b

3

2
1

a

a

0

1

a

a

3

5

a

0
7

9

11 15 （ヶ月）

図19. 成熟精巣内ASG集団における分裂頻度の
季節的変化

85

86

低下

精巣内の全ASG数が増加②増殖＞細胞死

精巣内の全ASG数が減少①細胞死＞増殖

精子形成

図20. 仮説: 幹細胞活性の低下と全ASG数の変化:精原幹細胞②①

退行:幹細胞能を持たないASG

排精後期【幹細胞活性の低下】

移
植
成
功
率

排精前期

3
2.5
数 2
精 1.5
巣 1
（
相 0.5
対 0
値
）

全

ASG /

b

ab

0

a

a

1

3

a

ab

7

9

b

a

5

11 15 （ヶ月）

図21. 成熟精巣内に存在する全ASG数の季節的変化

87

非繁殖期（春－夏）

繁殖期（秋－冬）

A
B 活幹
性細
胞

A1
の
出
現

D

細
胞
死

E

増
殖

F

全

ASG

C

数

FSH

G

図22．ASG集団の幹細胞活性の変化時に起きていた様々な変化

88

89

幹細胞活性の低下:幹細胞能を持たないASG:幹細胞能が低下した精原幹細胞:精原幹細胞

幹細胞活性の回復

ASGの増殖の開始

非繁殖期（春－夏）

図23. ASG集団の幹細胞活性の変化時に起きていたことが予想される各ASGの挙動

活幹
性細
胞

繁殖期（秋－冬）90

12.0 ±5.2 (5)24.1 ±8.0 (5)9.3 ±3.4 (2)6.3 ±0.8 (2)8.4 ±2.7 (6)15.9 ±6.2 (7)14.0 ±3.4 (4)(1)
5.7

43.7 ±12.3 (4)(1)
6

31.2 ±6.4 (4)5.4 ±2.7 (2)24.2 ±5.1 (3)13.3 ±2.5 (3)male 未成熟 12.8 ±4.4 (3)成熟 10.2 ±9.2 (2)各値は、各試行における平均生着ドナー細胞数の平均値 ± 標準誤差を示している

a 移植後日数を示している

41.1 ±7.9 (5)50.0 ±19.6 (5)56.4 ±16.6 (3)18.8 ±14.8 (2)15ヶ月 (n)2.5 ±0.2 (5)2.4 ±0.8 (5)34.1 ±9.8 (7)23.8 ±8.3 (7)11ヶ月 (n)2.1 ±0.2 (3)1.3 ±0.2 (3)34.1 ±15.9 (5)16.5 ±1.5 (2)宿主生殖腺内で認められた平均生着ドナーASG数
9ヶ月 (n)7 ヶ月(n)5 ヶ月(n)3 ヶ月(n)2.2 ±0.3 (7)2.8 ±0.2 (5)4.9 ±0.9 (4)3.1 ±0.8 (4)1.8 ±0.4 (7)1.8 ±0.3 (5)(1)
2
1.8 ±0.4 (3)45.1 ±10.8 (4)(1)
3.5

1 ヶ月(n)4.0 ±0.3 (3)3.0 ±0.5 (3)41.3 ±5.8 (4)22.4 ±7.7 (3)0ヶ月 (n)2.9 ±0.7 (3)2.3 ±0.8 (3)45.5 ±7.6 (3)28.8 ±5.4 (3)

未成熟
成熟

ドナー

60 female 未成熟 45.8 ±13.1 (3)成熟 35.8 ±20.8 (3)20

dpTPa sex

表1 宿主生殖腺内で認められた平均生着ドナーASG数

第

2 章

幹細胞活性の高い A 型精原細胞集団
特異的に高発現する遺伝子の探索

91

諸言

魚類が継続的に大量の精子を産生することができるのは、精巣内に、自己複製能と分化能を兼ね備えた精原幹細胞が存在するためである（Okutsu et al, 2006; Schulz
et al., 2010）。これまでに、精原細胞移植系を用いた機能的解析の結果、魚類の A型精原細胞（ASG）の一部に、幹細胞としての能力を保持した ASG すなわち精原
幹細胞が存在することが明らかとなっている（Okutsu et al, 2006）。また、数種の魚種において、形態学的解析により ASG の形態の不均一性が報告されている（Loir,
1999; Leal et al., 2009）。以上の結果は、魚類の ASG 集団がその一部に精原幹細胞を含む不均一な細胞集団であることを示唆している。しかし、機能的に解析された精原幹細胞の生化学的・形態学的特徴は、未だ十分に明らかとなっていないため、依然として ASG 集団中のどの ASG が精原幹細胞としてふるまう細胞なのかを同定することは不可能である。このことは、魚類の精原幹細胞システムを理解していくう
えでの大きな障害となっている。
マウスでは、これまでに精原幹細胞を含むことが明らかとなっている未分化型 A型精原細胞で特異的に発現する遺伝子（GFRα1、Plzf、E-cadherin、Oct-4、Neurogenin3、Nanos2 など）が多く同定されている（Meng et al., 2000; Buaas et al., 2004; Ohmura etal., 2004; Tokuda et al., 2007; Yoshida et al., 2004; Sada et al., 2009）。さらに、これら遺伝子の中には、未分化型 A 型精原細胞集団内で不均一な発現パターンを示す遺伝子が存在し、機能的解析の結果、GFRα1 および Nanos2 は、Neurogenin3 に比べ、より未分化な細胞集団で発現していることが明らかとなった（Sada et al., 2009;
Nakagawa et al., 2010）。一方、魚類では、精原幹細胞を含む A 型精原細胞（ASG）
において特異的に発現する数種類の遺伝子（Ly75、Notch1、Plzf など）が同定されているが、これら遺伝子は ASG において不均一な発現パターンを示さない（Yano etal, 2009; Nagasawa et al., 2010; Ozaki et al., 2010）。近年、ティラピアにおいて、GFRα1
92

が ASG 集団内で不均一な発現パターンを示すことが報告されたが、この発現パターンが ASG の分化度の違いを反映しているのかは明らかとなっていない（Lacerda
et al., 2013）。したがって、現在、魚類 ASG の分化度を同定可能な分子マーカーは存在しない。
マイクロアレイ解析は、細胞内に存在する mRNA 量を網羅的に解析可能な技術であり、これによりサンプル間で発現量の異なる遺伝子を網羅的に探索することが可能となった。近年、本研究室において、ニジマス生殖腺由来の転写産物を用いた
DNA マイクロアレイが作成され（Hayashi et al., 2012）、ニジマスの生殖腺において発現する遺伝子を網羅的に解析することが可能となった。そこで、精原幹細胞の存
在頻度が異なる ASG 集団を同定し、これらのサンプルを用いてマイクロアレイ解
析を行えば、精原幹細胞で特異的に高発現する遺伝子が同定できるのではないかと考えた。
前章では、初回成熟以降のニジマス成魚において、ASG 集団から得られる移植成功率すなわち ASG 集団の幹細胞活性が 1 年の生殖周期の間に大きく変化することを見出した。特に、幹細胞活性の大きな変化は、繁殖期のニジマス精巣内に存在する残留 ASG 集団で認められ、繁殖期の前半と後半で幹細胞活性の異なる２種類の ASG 集団に明瞭に区別された。さらに、これら残留 ASG 集団の細胞死頻度と増殖活性について解析したところ、集団間で差がなかった。つまり、異なる季節に存在する残留 ASG 集団は、幹細胞活性のみが異なる ASG 集団であることが明らかとなった。そこで本研究では、魚類の精原幹細胞を識別可能な分子マーカーの同定を最終目標とし、その第一歩として、幹細胞活性の異なる ASG 集団に発現する遺伝子を、マイクロアレイ解析により網羅的に比較し、幹細胞活性の高い ASG 集団に特異的に高発現する遺伝子の探索を試みた。

93

材料と方法

幹細胞活性の異なる ASG 集団を用いた網羅的遺伝子発現解析
前章で、幹細胞活性が異なることが明らかとなった排精 1、3、15 ヶ月目および未成熟期の精巣から単離した ASG 集団の遺伝子発現パターンを、マイクロアレイ
解析により網羅的に比較した。

マイクロアレイ解析用サンプル
第 1 章 -2 において行った移植実験の結果より、幹細胞活性の高い ASG 集団であることが明らかとなった排精 1、15 ヶ月目の成熟精巣由来 ASG および未成熟精巣
由来 ASG、幹細胞活性の低い ASG 集団であることが明らかとなった排精 3 ヶ月目の成熟精巣由来 ASG をマイクロアレイ解析のサンプルとして用いた。その際、細胞死や増殖に関わる遺伝子の影響を排除するため、排精 1、3、15 ヶ月目の成熟精巣由来 ASG は、細胞死頻度および増殖活性が同程度で、移植後 20 日目の移植成功率のみが明瞭に異なるロットを選択した。各 ASG 集団の移植成功率、細胞死頻度、増殖活性は、第 1 章 -2 の結果を利用した（表１）。
解析に用いた ASG サンプルの単離は、第 1 章 -2「材料と方法」にて記載した「セルソーターによる A 型精原細胞の単離」において、MoFlo XDP (Beckman Coulter,
Miami, FL)を用いて行った。セルソーターにより単離した ASG は、350 µl の 1% βメルカプトエタノールを含む RLT 溶液（RNeasy Mini Kit: QIAGEN, Hilden,
Germany）を分注した 1.5 ml チューブ内に直接、3 万細胞ずつ分取した。ASG サ
ンプルは、1 サンプルにつき 30 万細胞（3 万細胞×10 チューブ）を回収した。回
収した ASG は、RLT 溶液とよく混合した後、マイクロアレイ解析を行うまでの間、－80℃で保存した。

94

マイクロアレイ解析
ASG サンプルから、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）により、添付のマニュアルに従って、total RNA を抽出した。得られた total RNA を 25 ng 使用し、Low Input Amp
Labeling Kit（Agilent Technologies, Santa Crala, CA）により、添付のマニュアルに従い、
cyanine3-CTP でラベル化した cRNA を合成した。ラベル化後の cRNA は、RNeasy
Mini Kit（QIAGEN）を用いて精製した後、Nano Vue（GE Healthcare UK Ltd., Little
Chalfont, England）により蛍光色素の取り込み効率を算出した。取り込み効率が、Agilent Technologies の推奨値（6 pmol/µg）を満たしていることを確認後、1.65 µgのラベル化 cRNA をハイブリダイゼーションに用いた。本実験で使用した DNA マ
イクロアレイは、本研究室において作成されたプローブ数 55936 個の
RTG_Array_Ver.2（Agilent Technologies）（Hayashi et al., 2012 を改変: 表 2）を用いた。ハイブリダイゼーション後は、Gene Expression Wash Pack 1（Agilent Technologies）
をガラス容器に入れ、その容器内でスライドグラスを室温、1 分間洗浄した。続けて、37 ℃で保温しておいた Gene Expression Wash Pack 2（Agilent Technologies）に、スライドグラスを入れ 1 分間洗浄した。次に、G2565CA Microarray Scanner System（Agilent Technologies）によりマイクロアレイスライドをスキャンし、Feature
Extraction 10.6（Agilent Technologies）によりマイクロアレイで得られたシグナルを数値化した。

データ解析
得られたマイクロアレイデータは、Gene Spring GX11.5.1 Software（Agilent
Technologies）を用いて解析した。まず、サンプル間のデータのばらつきを補正す
るため Quantile 法により正規化した。そして、Feature Extraction フラグを Gene Spring
フラグへ、Not positive and significant（not detected）; not above background (notdetected); not uniform（compromised）; saturated（compromised）; a population outlier95

（compromised）の設定で変換した。全サンプルにおいて Not detected の flag が立てられた遺伝子のすべて、および、4 サンプル中 1 サンプルに compromised の flag が立てられた遺伝子を除去した。次に、正規化およびフィルタリング後のデータを用いて、以下の解析を行った。まず、各サンプル間の類似性を明らかにするために、
重心法のアルゴリズムを用いて階層的クラスタリングを行った。次に、各サンプルデータを基に、ASG 集団の幹細胞活性の差を生み出す遺伝子の抽出を行った。まず、細胞死や増殖に関わる遺伝子の影響を排除するため、細胞死頻度および分裂頻度が同程度で、移植成功率のみが異なる排精 1、3、15 ヶ月目の精巣由来 ASG から得られたサンプルデータを用い、主成分分析を行った。主成分分析により得られたデータから、幹細胞活性の違いを反映する主成分軸の探索を行った。主成分軸の決定後、主成分に対する寄与率の高い遺伝子すなわち幹細胞活性の違いに大きく影響する遺伝子の抽出を行った。さらに、抽出した遺伝子のうち、移植成功率の高い
ASG 集団で強く発現する遺伝子を選ぶために、移植成功率の高かった排精 1、15
ヶ月目の精巣由来 ASG および未成熟精巣由来 ASG で、移植成功率の低かった排精
3 ヶ月目の精巣由来 ASG と比べ、4 倍以上発現量が高かった遺伝子を抽出した。

幹細胞活性の高い ASG 集団で高発現する遺伝子の探索
候補遺伝子の選択
上記の解析により抽出した遺伝子群のうち、発現量の高かった17遺伝子を選出した。

cDNA合成マイクロアレイ解析に用いた各ASGサンプルから抽出したtotal RNAを、
Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads（GE Healthcare UK Ltd.）により、オリゴ（dT）アダプタープライマー（5’-CTGATCTAGAGGTACCGGATCCT18-3’）を用い96

て、付属のマニュアルに従い一本鎖cDNA化した。

幹細胞活性の高いASG集団で高発現する遺伝子の探索
GenBankに登録されている17遺伝子の部分塩基配列を入手し、得られた塩基配列を基に特異的プライマーを設計した（表3）。設計した各プライマーセットを用いて、各ASGサンプル由来cDNAを鋳型にしPCR反応を行った。PCR反応溶液は、1 µlの鋳型cDNA、0.25 unitの TaKaRa Ex Taq（タカラバイオ株式会社、滋賀）、1 µlの10×Ex Taq Buffer、0.2 mMのdNTP、1µMのプライマーを用いて、全量10 µlになるよ
うに調整した。PCR時の反応温度およびサイクル数は、表4に示した。なお、サイ
クル開始前に94 ℃、3分間の熱変性とサイクル後に72 ℃、3分間の伸長反応を行った。幹細胞活性の高かった排精１、15ヶ月目の精巣由来ASGおよび未成熟精巣由来
ASGにおいて、幹細胞活性の低かった排精3ヶ月目の精巣由来ASGよりも発現量の高かった遺伝子を電気泳動により得られたバンドの濃淡を指標に選出した。なお、
鋳型cDNA量の補正には、β-actin遺伝子を内部標準として用いた。また、陰性対照
区には鋳型cDNAの代わりにイオン交換水を用いた。

各候補遺伝子の塩基配列の確認
RT-PCR の結果から、幹細胞活性の高い ASG 集団（排精１、15 ヶ月目の精巣および未成熟精巣）で高発現することが明らかとなった遺伝子は、GenBank に登録されている部分塩基配列を基に、BLAST 検索による相同性検索を行い、遺伝子の同定を行った。

cellular retinoic acid binding protein（crabp）の系統樹解析
GenBank に登録されているゼブラフィッシュ、マウス、ラットの crabp1 およびcrabp2 の全長 cDNA 配列を基にアミノ酸配列を推測し、Salmo salar crabp から得ら97れた推定アミノ酸配列が、どちらのアイソフォームに属するのか明らかにするために系統樹解析を行った。CLC Sequence Viewer（QIAGEN）を用いて、近隣結合法による系統樹解析およびデンドログラムの作成を行った。

98

結果

Ⅰ．幹細胞活性の異なる ASG 集団間でのクラスタリング
各サンプル間の類似性を比較するために、排精 1、3、15 ヶ月目および未成熟期の精巣由来 ASG から得られたマイクロアレイデータを基に、階層的クラスター解析を行った。その結果、排精 1 ヶ月目および排精 15 ヶ月目の成熟精巣由来 ASG 集
団は、排精 3 ヶ月目の成熟精巣由来 ASG 集団に比べ、類似性が高いことが明らかとなった。未成熟精巣由来 ASG 集団は、排精 1、3、15 ヶ月目の精巣由来 ASG 集団との類似性が低いことが明らかとなった（図 1）。

Ⅱ．幹細胞活性の高い ASG 集団で特異的に高発現する遺伝子の同定①幹細胞活性の異なる ASG 集団間で発現パターンの変化する遺伝子の選出
サンプル間の遺伝子発現量の違いには、個体の違い、月齢の違い、季節の違いなど多くの因子による影響を受けていることが予想されることから、幹細胞活性の違いに強い影響を与える遺伝子のみを抽出するために主成分分析を行った。主成分分
析には、細胞死や増殖に関わる遺伝子の影響をできる限り排除するため、移植成功率のみ大きく異なった排精 1、3、15 ヶ月目の成熟精巣由来 ASG から得られたマイクロアレイデータを用いた。その結果、第一主成分（Component 1）において、幹細胞活性の違いが反映された（図 2）。そこで、各遺伝子の第一主成分に対する寄与率が－1.6 以下、1.6 以上の遺伝子すなわち幹細胞活性の違いに大きく影響する遺伝子を抽出した結果、14739 遺伝子が得られた。さらに移植成功率の高い ASG 集団で特異的に高発現する遺伝子を絞り込むために、主成分分析で選出された 14739
遺伝子のうち、移植成功率の高い ASG 集団（排精 1 ヶ月目、排精 15 ヶ月目、未成熟）で、移植成功率の低い ASG 集団（排精 3 ヶ月目）に比べ、４倍以上発現の高かった遺伝子を抽出した結果、189 遺伝子が得られた。
99

②幹細胞活性の高い ASG 集団で特異的に高発現する遺伝子の同定
先の解析により得られた遺伝子のうち、特に発現量の高かった 17 遺伝子を選出した（図 3, 表 3）。さらに、マイクロアレイから得られた結果の妥当性を検討する
ために、RT-PCR 法により 17 遺伝子が幹細胞活性の高い ASG 集団で特異的に高発現しているのかを確認した。その結果、5 遺伝子（no.2 GNYA1SO04H7VRH、no.5
YGL02.22943.C1、no.13 YGL02.21918.C1、no.14 YGL02.4986.C1、no.17
YGL02.7269.C1）が幹細胞活性の高い ASG 集団で特異的に高発現していることが明らかとなった（図 4）。残り 12 遺伝子のうち、5 遺伝子は増幅が認められず、7遺伝子は幹細胞活性の高い ASG 集団特異的に高い発現が認められなかった。
次に、これら遺伝子の機能を同定するために、幹細胞活性の高い ASG 集団で特異的に高発現することが明らかとなった 5 遺伝子に対して、BLAST 検索により相同性の高い遺伝子の探索を行った。その結果、no.2 YGL02_GNYA1SO04H7VRH は
Oncorhynchus mykiss creatine kinase brain type（脳型クレアチンキナーゼ）、no. 5
YGL02.22943.C1 は Salmo salar cellular retinoic acid binding protein（細胞内レチノイ
ン酸結合タンパク）と高い相同性が認められた。一方、他の 3 遺伝子に関しては、
相同性のある遺伝子を同定することができなかった（表 5）。

100

考察

前章では、ニジマス成魚の A 型精原細胞（ASG）集団が、季節性をもってその幹細胞活性を変化させていることを明らかにした。また、ASG 集団の幹細胞活性の変化は、従来用いられてきた ASG の形態的指標からでは捉えることのできない性質であるため、精原細胞移植系を介することなく精原幹細胞を検出するためには新規の形態的特徴あるいは分子マーカーを探索する必要があると考えられた。そこで、本研究では、精原幹細胞特異的マーカーの同定を目指し、その第一歩として、前章で同定された幹細胞活性のみが異なる ASG 集団を材料に用い、ASG 集団間を網羅的遺伝子発現解析により比較することで、幹細胞活性の高い ASG 集団で特異的に高発現する遺伝子の同定を試みた。その結果、幹細胞活性の高い ASG 集団において特に高発現する 5 遺伝子を同定し、そのうち 2 遺伝子は、creation kinase braintype（脳型クレアチンキナーゼ）および cellular retinoic acid-binding protein（細胞内レチノイン酸結合タンパク）と高い相同性を示すことが明らかとなった。今後は、これら遺伝子の発現解析や機能解析を通して、精原幹細胞の分子マーカーとしての有用性を確認していく必要がある。
幹細胞活性の異なる ASG 集団から得られたマイクロアレイデータを用いて、クラスター解析を行った結果、幹細胞活性の高い排精 1 ヶ月目および排精 15 ヶ月目
由来 ASG 集団は、幹細胞活性の低い排精 3 ヶ月目由来 ASG 集団に比べ、類似性が高いことが明らかとなった。排精 15 ヶ月目由来 ASG 集団は、翌年の生殖周期の排精 1 ヶ月目にあたり、排精 1 ヶ月目由来 ASG 集団と同様の性質を保持していることが予想される。なお、翌年の生殖周期の 1 ヶ月目が排精 13 ヶ月目ではなく排精15 ヶ月目となったのは、繁殖期の開始が前年度より 2 ヶ月遅れたためである。前章にて行った実験結果から、排精 1 ヶ月目および排精 15 ヶ月目由来 ASG 集団から得られた移植成功率、A1 細胞の出現頻度、細胞死頻度、増殖活性のすべてが同様
101

の傾向を示しており、両集団間は性質の似た ASG 集団であることが推察された。
さらに、本章で行ったクラスター解析の結果から、分子レベルでも両 ASG 集団間が類似した ASG 集団であることが強く示唆された。一方、排精 3 ヶ月目由来 ASG
集団は、排精 1 ヶ月目および 15 ヶ月目の ASG 集団間に比べ、類似性の低い ASG集団であることが明らかとなった。前章の結果から、排精 3 ヶ月目の ASG 集団は、
排精 1 ヶ月目および 15 か月目の ASG 集団に比べ、幹細胞活性の低い ASG 集団であることが明らかとなっていることから、クラスター解析により得られた結果は、
ASG 集団の持つ幹細胞活性の違いを反映した結果であると考えられた。以上の結果は、前章の解析結果により明らかとなったニジマス成魚の ASG 集団における幹細胞活性の季節的変化の周期性を分子レベルでも強く裏付けるとともに、ASG 集
団の幹細胞活性の違いを反映する遺伝子が存在することを示唆している。つまり、その遺伝子群こそが ASG 集団の幹細胞活性を支配する遺伝子である可能性が考えられた。
本研究では、幹細胞活性の高い ASG 集団で、幹細胞活性の低い ASG 集団に比べて発現量が 4 倍以上高い遺伝子を、189 遺伝子得ることができた。さらに、得られた遺伝子群の中で特に発現量の高かった 17 遺伝子を候補遺伝子として選定し、これら 17 遺伝子が幹細胞活性の高い ASG 集団で特異的に高発現するのか RT-PCR 法
により検証した。その結果、増幅が確認できた 12 遺伝子のうち 41.7 %にあたる 5遺伝子のみがアレイにより得られた結果を反映していることが明らかとなった。
Hayashi ら（2012）は、遺伝子の発現量が低い場合、シグナル値はバックグラウン
ドノイズの影響を強く受けるため、アレイから得られた遺伝子間の発現量の差は実際の発現量の差を反映しにくくなることを報告している。本研究では、最も高い発現量を示した遺伝子のシグナル値が約 log219 だったのに対して、幹細胞活性の差を反映し発現量の変化した遺伝子から得られたシグナル値は最大 log212 で、その殆どは log24－log210 と低かった。そのため、解析に用いた候補遺伝子のシグナル値の102多くも log26－log210 と低い傾向を示した（図 3）。つまり、候補遺伝子のシグナル
値はバックグラウンドノイズの影響を強く受けていたため、アレイから得られた結果は実際の発現量を反映しづらい状態であったと考えられた。
幹細胞活性の高い ASG 集団に特異的に高い発現量を示すことが明らかとなった
creation kinase（クレアチンキナーゼ）は、主にエネルギー要求量の高い心筋、平滑筋、神経細胞などで強く発現していることが知られている（Wallimann et al., 2011）。
クレアチンキナーゼはクレアチンにリン酸基を付加し、高エネルギーリン酸結合を有するクレアチンリン酸を合成することでエネルギーの貯蔵を行い、また、細胞内の ATP 量の欠乏が生じた場合にはクレアチンリン酸のリン酸基を ADP へ付加しATP 合成を行い、細胞内に ATP を供給すると考えられている（Wallimann et al., 2011）。
つまり、クレアチンキナーゼは、解糖系とは異なる経路を介し、細胞内のエネルギ
ー供給量を調節していると考えられている。一般的に、細胞増殖にはエネルギー（ATP）が必要であると考えられている。このことから、排精 3 ヶ月目の ASG 集
団では、エネルギー供給量を低下させることにより細胞増殖を強く抑制している可能性が考えられた。これまでに、マウスの造血幹細胞（HSC）に関する研究が多くなされ、HSC 内には分裂速度の異なる 2 種類の幹細胞が存在することが明らかにされている。分裂頻度の低い HSC は、複製エラーによる変異の蓄積や細胞死を防ぐことで、自身の喪失を防いでいると考えられている（Suda et al., 2011）。また、分裂頻度の低い幹細胞は、細胞毒性のある薬剤に対する耐性を示すことも知られている（Suda et al., 2011）。つまり、幹細胞は分裂頻度を低下させ休止状態となることで、様々なストレスに対する防御を行っていると考えられる。このことから、排精 3 ヶ月目において認められたクレアチンキナーゼの発現量の低下は、エネルギー
供給量を低下させ ASG を休止状態にすることで、DNA の損傷など様々なストレス
要因から与えられる負の影響を回避している可能性が考えられた。
また、近年マウスにおいて、クレアチンキナーゼの働きを欠損または阻害した星103

状膠細胞および胎児繊維芽細胞において、細胞の移動能が低下することが報告された（Kuiper et al., 2009）。このことから、クレアチンキナーゼを介した ATP 供給は細胞の移動能に影響を与えている可能性が考えられた。魚類の精原細胞移植では、腹腔内へ移植されたドナーASG の一部の ASG が、宿主生殖腺に向かって細胞自律的に移動した後、生殖腺へと生着すると考えられている（Yoshizaki et al., 2012）。
つまり、宿主生殖腺へ生着能を保持する ASG は、宿主生殖腺内で精原幹細胞としてふるまう能力を有するとともに、高い移動能を保持した細胞であることが予想される。以上のことから、排精 3 ヶ月目の ASG 集団では、クレアチンキナーゼを発現する運動能の高い ASG すなわち精原幹細胞数の減少、あるいは精原幹細胞におけるクレアチンキナーゼの発現低下が誘導されたために運動能が低下した状態へと移行したことで、ドナーASG の宿主生殖腺への生着すなわち移植成功率の低下が起きていた可能性が考えられた。今後は、クレアチンキナーゼを介した ATP 供
給が、魚類 ASG の分裂頻度や運動能に関与しているのか、詳細に解析していく必要がある。
幹細胞活性の高い ASG 集団に特異的に高発現することが明らかとなった cellularretinoic acid-binding protein（crabp）は、レチノイン酸と高い親和性を示す細胞内タンパク質で、crabp1 および crabp2 の 2 種類のアイソフォームが存在することが知られている。CRABP1 はレチノイン酸をレチノイン酸不活化酵素である CYP26 へと運搬する働きを担い、CRABP2 はレチノイン酸を核内受容体であるレチノイン酸受容体（retinoic acid receptor : RAR）に受け渡す働きを担っていることが明らかとなっている（Dong et al., 1999）。レチノイン酸の結合した RAR およびレチノイド X
受容体（RXR）とのヘテロ 2 量体は、様々な標的遺伝子のプロモーター領域に結合することで遺伝子の転写を制御する（Dong et al., 1999）。つまり、CRABP2 はレチノイン酸の RAR-RXR への受け渡しを介して、遺伝子の発現調節を行っていると考えられている。また、この 2 種類の CRABP のアミノ酸配列は種間で保存されてい104

ることが明らかとなっており（Sharma et al., 2003）、本研究において幹細胞活性の高い ASG 集団に特異的に高発現することが明らかとなった crabp はその推定アミノ酸配列から、crabp2 のホモログであると推測された（図 5）。このことから、幹細胞活性の高い ASG 集団では、CRABP2 が、レチノイン酸の核内への輸送を介し、
RAR-RXR による標的遺伝子の転写活性化を誘導していた可能性が考えられた。これまでに、マウスの生殖細胞において、レチノイン酸が Stra8（stimulated by retinoic
acid-8）の転写を誘導することで減数分裂の開始を促すことが明らかとなっている（Bowles and Koopman, 2007）。しかし、本研究においてマイクロアレイ解析に供した各 ASG サンプルは、ASG のみが存在する精子形成完了後の繁殖期の成熟精巣由来 ASG および精子形成前の未成熟精巣由来 ASG を用いていることから、レチノイン酸により減数分裂が誘導されているとは考えにくい。したがって、ニジマスにおいては、レチノイン酸は、減数分裂に関連する遺伝子とは異なる遺伝子を標的とし転写調節を行っている可能性が考えられた。幹細胞活性の高い時期に crabp の発現が高いことから、レチノイン酸が幹細胞活性の維持に関与する遺伝子の発現を誘導していた可能性が考えられるが、これまでに魚類の ASG において RAR-RXR が標的とする遺伝子は明らかとなっておらず、今後より詳細に解析していく必要がある。
本実験で用いたマイクロアレイは、転写産物の 3’ 側配列のみを決定したトランスクリプトーム解析を基に各プローブが設計されている（Hayashi et al., 2012）。そのため、各プローブの cDNA 塩基配列は 3’ 側のみであり、目的のプローブによっては、既知遺伝子との相同性を示さず、in silico での情報を得ることが困難な場合がある。実際に選定した幹細胞活性の高い ASG 集団に特異的に強発現する 5 遺伝子のうち 3 遺伝子で、データベースに登録された既知遺伝子と有意な相同性を示さなかった。このような既知の配列と相同性を示さない遺伝子断片配列としては、1）3’ 非翻訳領域のみの遺伝子配列情報であり、既知の配列と相同性が低い、2）新規の遺伝子である、3）non-coding RNA である等の可能性が考えられる。ホモログを105

同定できなかった 3 遺伝子に関しては、今後、cDNA 全長配列を決定し、遺伝子の同定を行う必要がある。
本章では、幹細胞活性の明瞭に異なる ASG 集団を用いて、網羅的遺伝子発現解析を行い、ASG 集団の幹細胞活性の差を反映する 5 つの遺伝子を同定した。今後は、これら遺伝子の発現細胞の特定や機能解析を通して、精原幹細胞の分子マーカ
ーとしての有用性を確認していく必要がある。さらに、これら遺伝子の発現量がASG 集団の幹細胞活性の指標となれば、精原細胞移植を行う前に遺伝子の発現量を調べるだけで、ドナーASG の幹細胞活性を予測することが可能となる。これにより、幹細胞活性の高い時期のドナーASG を選択的に用いることができ、少ない
移植回数で十分量の宿主魚を確保することが可能となることから、精原細胞移植技
術の効率化に寄与することが期待される。

106

参考文献

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110

図説明

図 1. 幹細胞活性の異なる ASG 集団間のクラスタリング
重心法のアルゴリズムを用いた階層的クラスター解析の結果。幹細胞活性の高い排精 1 ヶ月目由来 ASG 集団と排精 15 ヶ月目由来 ASG 集団は、幹細胞活
性の低い排精 3 ヶ月目由来 ASG 集団に比べ高い類似性を示した。

図 2. 主成分分析の結果
主成分分析を行い、幹細胞活性の違いを反映する主成分軸を決定した。茶色の点は幹細胞活性の低い排精 3 ヶ月目、青色・赤色の点はそれぞれ幹細胞活性の高い排精 1 ヶ月目および排精 15 ヶ月目由来 ASG 集団を示す。Component 1
において、幹細胞活性の違いが反映された。

図 3. 幹細胞活性の異なる ASG 集団を用いた網羅的遺伝子発現比較により得られたスキャッタープロット
幹細胞活性の高い排精 1 ヶ月目と幹細胞活性の低い排精 3 ヶ月目のマイクロアレイデータの比較により得られたスキャッタープロットを代表例として示す。軸は遺伝子の発現量を 2 の自然対数（log2）で示している。赤色の点は、選定した 17 遺伝子のうち、RT-PCR によりマイクロアレイデータから得られた結果を反映していたことが確認された 5 遺伝子（no.2 GNYA1SO04H7VRH、no.5
YGL02.22943.C1、no.13 YGL02.21918.C1、no.14 YGL02.4986.C1、no.17
YGL02.7269.C1）。黄色の点は選定した 17 遺伝子のうち幹細胞活性の異なる
ASG 集団間で発現量の差が認められなかった遺伝子。白色の点は、生殖細胞特異的マーカーに用いられる vasa 遺伝子。

111

図 4. 幹細胞活性の高い ASG 集団で特異的に高発現する遺伝子の同定
マイクロアレイ解析により選定した 17 遺伝子が、実際に幹細胞活性の高い
ASG 集団特異的に高発現するのか否か RT-PCR 法により確認した。その結果、5 遺伝子（no.2 GNYA1SO04H7VRH、no.5 YGL02.22943.C1、no.13
YGL02.21918.C1、no.14 YGL02.4986.C1、no.17 YGL02.7269.C1）が幹細胞活性の高い ASG 集団特異的に高い発現を示した。

図 5. cellular retinoic acid-binding protein の推定アミノ酸配列を用いた系統樹解析
幹細胞活性の高い ASG 集団で発現することが明らかとなった cellular retinoic
acid-binding protein（crabp）が、CRABP1 および CRABP2 どちらのアイソフォームに属するのか明らかにするために系統樹解析を行った。解析の結果、目的の Salmo salar crabp から得られた推定アミノ酸配列（赤枠）は、既知の CRABP2と同じ枝に属することが明らかとなった。

112

排
精
15
ヶ
月

排
精
1
ヶ
月

排
精
3
ヶ
月

未
成
熟

図1. 幹細胞活性の異なるASG集団間のクラスタリング

113

Component 2

第
二
主
成
分
（

）
第一主成分（Component 1）

図2. 主成分分析の結果

114

排
精
3
ヶ
月
（

115

13

2

7 9 5 4
12 15
10
16
17
14

3

排精 1ヶ月（log2）

11

8

6
1

vasa

図3. 幹細胞活性の異なるASG集団を用いた網羅的遺伝子発現比較により得られたスキャッタープロット

）

log 2

未

1

3

15

DW

#2
#5
#13
#14
#17

β-actin

図4. 幹細胞活性の高いASG集団で特異的に高発現する遺伝子の同定

116

117

図5. cellular retinoic acid-binding protein の推定アミノ酸配列を用いた系統樹解析

表1 各ASGサンプルから得られた移植成功率、細胞死頻度、分裂頻度
サンプル
1
3
15
未成熟

移植成功率（%）
25.7
5.4
38.1
42.1

細胞死頻度（%）
0.23
0.16
0.08
0.89

118

分裂頻度（%）
0.21
0.11
0.11
0.96

119

TargetID
rtdnd
rtnos1b
rtnos2
rtnos3rtPlzfrtRestrtGFRa1
rtGDNF

Sequence
Probe Length
GGCCTGATAGTGTTGAAGCACAGATCCCATACTTTGTTTTAATTATGAAAATACTTCATG60
ACACAATTAAGTACTGTCCACTCTCCAAAGATCAACCAACCCAGCGACCATTAAAGGGAG
60
CGGGGGACTGTGGAGTAGAAAACAGGAGGAAAATCAATCTGTACATATTTATGGAGAAAA60GGACTTTAATGTTAAGTTTAATCTCACTTTAAAGAACTGCGCTACCCCATGTTGAATAGT
60
CAGGTTACCACAGCAGTGAAAGTGTTATCTGTTATTACATTAAACCTGCGTATGTGTTGA60
CTTTGTCCTGTTTGCAAGTACGCCGCTTCCAAGAAGTGCAACCTGCAGTATCACATCAAA60
GTCTTGTAGCCATGCTGCATTTCAAAAACATGGACAGACTCAATTTGTATAAAGAAGAAA60
AGAGTCAATAGTAGTGAGAGAACATGGCTTGGATCAAAACCAAGATACATATTGTAGAGG
60

表2 RTG_Array_ver.2 (Hayashi et al., 2012改変)に追加されたプローブ一覧
Tm
75.97
80.84
78.24
76.31
77.87
82.62
77.03
76.96

表3 RT-PCRに用いたプライマー
No. Contig ID/Sequence ID
1 GNYA1SO04IA4K0

PrimerSequenceF
TTGATCCCCTGATTTCTGTTR
GGGAGTTCAATACCCCCATT
2 YGL02_GNYA1SO04H7VRHF
CAGCAAGCACGAGAAGTTTG
R
ACCAGCTCCACCTCAGAGAA
3 YGL02_GNYA1SO04JZEOMF
TTCGAAAGGGGTCAGAGAAA
R
CCCATTAGGTTCCCCAAGAT
4 YGL02_GNYA1SO04IB1IVF
AAGACACACACTAGTAAAAGACAAACGR
AGGTTACCTACGTCGTTTCTTATC
5 YGL02.22943.C1
F
TCCTGACCATGAGTGCAGACR
GGGGTTTGTGGAGTGAGTGA
6 YGL02_GNYA1SO04JB34EF
GGTGCCACCACATTGTTAAA
R
CTACTCCCTGTGTGTCCTTGG
7 YGL02.18460.C1
F
CGGGGTAACCTTTATTTAACCTTTR
TGTCAATCGACTAGGTGTCCA
8 YGL02_GNYA1SO04I1QGEF
CAAACTCAAAACCCCTCTCC
R
TCAACATCTGTAGGTCCTGCTT
9 YGL02.4986.C2
F
CTCCTCAGCCTGAACTGTCCR
TCATCACATGCTCCTTTCCA
10 YGL02.22575.C1
F
TGTCCGATCGGTGTGTATGTR
GTGCCTTCCTGATTCTCTGG
11 YGL02.9438.C1
F
CCCGTGCTTACAGCACTACAR
CTGATTGGCAGCTGTGTCAT
12 YGL02.4564.C1
F
GGATGCTGAACTGATGCTGARTGATTGGTCAACAGGCACAT
13 YGL02.21918.C1
F
ATGGGTCATTGTCTCGGAAGR
TCTTTCAACCGAGTGCTGTG
14 YGL02.4986.C1
F
CTACACAGGCATCCCCAGATRGCGGACGACAGATTACACAA
15 YGL02_GNYA1SO04H17QNFGAAAAGATGGCTTGGTGGTG
R
GCCTGAGTTGCGATTGTATG
16 YGL02.5638.C1
F
ACTGGTCTGGCAGCTCAAATRAACGATTCAGTCACCGTCCT
17 YGL02.7269.C1
F
CCCAACTGCATGCTTGTTTT
R
CCTGGAAATGAACCTGGAGA
β-actinF
TGCAGAAGGAGATCACCTCTCTR
TTGCTGATCCACATCTGCTG

120

121

No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

Contig ID/Sequence ID
YGL02_GNYA1SO04IA4K0
YGL02_GNYA1SO04H7VRH
YGL02_GNYA1SO04JZEOM
YGL02_GNYA1SO04IB1IV
YGL02.22943.C1
YGL02_GNYA1SO04JB34E
YGL02.18460.C1
YGL02_GNYA1SO04I1QGEYGL02.4986.C1
YGL02.22575.C1
YGL02.9438.C1
YGL02.4564.C1
YGL02.21918.C1
YGL02.4986.C1
YGL02_GNYA1SO04H17QNYGL02.5638.C1
YGL02.7269.C1
β-actin

Denature
Annealing
Extension
温度（℃） 時間（sec） 温度（℃） 時間（sec） 温度（℃） 時間（sec）
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30
94
30
58
30
72
30

表4 各遺伝子のPCR反応の条件
cycle
30
29
30
30
29
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
29

122

no. Contig ID/ Sequence ID
Accesion no. Total Score E-value
遺伝子名
2 YGL02_GNYA1SO04H7VRH Oncorhynchus mykiss brain creatine kinase b
FJ548753
744
0.0
5 YGL02.22943.C1
Salmo salar cellular retinoic acid-binding protein NM_001140880
733
0.0
13 YGL02.21918.C1
not found
14 YGL02.4986.C1
not found
17 YGL02.7269.C1
not found-

表5 Blast 検索の結果

第 3 章

Production of genetically diversified fish seeds using spermatogonialtransplantation

123

Abstract

Large-scale release of hatchery-produced seeds has been conducted in order to restore
worldwide fishery production; however, concerns exist regarding the genetic effects ofhatchery stock on wild fish populations, due to the reduced genetic variation often
associated with hatchery-reared fish. Therefore, it is important that fish seeds used in stockenhancement possess sufficient genetic diversity to mitigate their genetic impact on wild
fish populations. To promote genetic diversity of artificial seeds, seed production should be
performed using a sufficiently large broodstock; however, maintenance of large
broodstocks requires significant investments with respect to space, labor, and otherassociated costs. In order to circumvent the need for these investments, the present study
proposed a means of producing gametes that possess a large amount of genetic diversity
using only a small number of surrogate-broodstock through spermatogonial transplantation.
We previously established spermatogonial transplantation methodology capable ofproducing functional eggs and sperm derived from donor-type A spermatogonia (ASGs). It
was expected that if ASGs isolated from testes of different donor individuals were mixed
prior to their transplantation into the peritoneal cavity of a single recipient, the resulting
recipient would produce gametes derived from several donor individuals. To determine thefeasibility of this scenario, mixed donor ASGs derived from vasa-GFP, vasa-DsRed andhsc-GFP transgenic rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) were transplanted into triploid
recipients. At 20 days post-transplantation, approximately 80% of recipients possessed
donor ASGs derived from all three strains within their gonads and mean numbers ofincorporated ASGs derived from each donor strain were nearly equal. At 100 days
post-transplantation, incorporated donor ASGs proliferated within the gonads of both maleand female recipients, and some had differentiated into oocytes within recipient ovaries.
124

Furthermore, in order to ascertain whether incorporated donor ASGs derived from the threestrains could differentiate into functional gametes, gametes collected from mature male andfemale recipients were used in artificial insemination with gametes obtained fromwild-type fish of the opposite sex. Phenotypic analysis of F1 offspring revealed thatfunctional sperm and eggs derived from three donor strains were successfully produced in
the gonads of individual recipients. These results suggested that individual recipients thatreceived ASGs from multiple donors were capable of producing gametes with different
genetic backgrounds. Therefore, it was concluded that the method of spermatogonialtransplantation outlined in the present study could serve as a novel and efficient method of
producing fish seeds with increased genetic diversity for use in stock enhancement.

125

Introduction

In order to restore declining wild fish resources, stock enhancement through therelease of hatchery-produced seeds into natural environments has been carried out in many
countries. These efforts have resulted in growing concerns regarding potential alterations
to the genetic structures of wild fish populations. These concerns are based on the fact that
hatchery fish populations often exhibit reduced genetic variation caused by seedproduction involving relatively small broodstocks and/or inbreeding over multiple
generations (Ryman and Ståhl 1980; Verspoor, 1988; Sekino et al., 2002; Hara and Sekino,2007). This deficiency could eventually lead to a reduction in genetic diversity of local
populations resulting from reproductive interaction between released individuals andnative individuals. Indeed, several studies have suggested that massive releases ofhatchery-produced seeds had the potential to alter genetic structures of local populations(Eldridge and Naish, 2007; Kitada et al., 2009). Therefore, maintaining genetic variation inhatchery-produced seeds is necessary in order to ensure the preservation of the genetic
diversity of local fish populations.
In order to achieve a level of genetic diversity equivalent to that of local
populations, seed production should be performed using a sufficiently large broodstock;
however, several obstacles preventing the use of increased broodstock exist. The
maintenance of sufficient numbers of broodstock requires increases in space, labor andassociated costs. In addition, parent fish have to simultaneously participate in spawning
immediately prior to egg collection; however, it is difficult to synchronize the spawning
time of each parent fish. Consequently, the number of parent fish contributing to seedproduction tends to be much smaller than that the total number of parent fish held in agiven spawning tank.
126

In order to overcome the obstacles associated with production of geneticallydiverse seeds, the authors of the present study focused on development of surrogate
broodstock technique. We previously reported the establishment of a spermatogonialtransplantation system using Salmonids (Okutsu et al., 2006) and, using this technique,demonstrated that donor-derived type A spermatogonia (ASGs) were capable of beingcolonized within the gonads of xenogeneic sterile recipients and of differentiating intoeither functional eggs or sperm depending on the sex of the recipient (Okutsu et al., 2007).
This technique has also been applied using several other marine species (Takeuchi et al.,2009; Yazawa et al., 2010; Higuchi et al., 2011; Morita et al., 2012). If smaller-bodied fish
were used as recipients for large-bodied donor fish, donor gametes could be produced
using a smaller fish tank. This would allow for seed production using a larger number ofparent fish, even when using broodstock tanks of limited size. Furthermore, if ASGs are
isolated from several donor individuals and mixed prior to their transplantation into asingle recipient, the resulting recipient would be expected to produce gametes geneticallyderived from several donor individuals. If one pair of surrogate parent fish produced using
this methodology were to mate, they could produce seeds whose genetic diversity would beequivalent to seeds derived from several pairs of parent fish. Using this surrogate
broodstock technique for seed production, it would be possible to produce geneticallydiverse seeds in a small space with low costs and labor requirements.
In order to achieve this goal, donor ASGs derived from multiple donor individuals
have to colonize a single recipient gonad and produce functional eggs and sperm withdifferent genetic backgrounds. In previous studies, we reported that several donor-ASGs
were detected in a recipient gonad at 20 days after spermatogonial transplantation (Okutsu
et al., 2006; Kise et al., 2012; Lee et al., 2013). However it remained unclear whether thesedonor cells were derived from clonal proliferation of a single donor ASG or they were127

originated from multiple donor ASGs. In addition, previous studies reported thatcompetitive confrontation between different germ cell populations exists in mice (Mintz,
1968; Shinohara et al., 2002). Therefore, in this study, in order to examine the feasibility ofusing surrogate broodstock technology to obtain genetically diversified seeds, germ cells
derived from three different donor strains were transplanted into a single recipient in which
donor cell fate was analyzed.

128

Materials and methods

Specimens
All of the fish used in the present study were maintained at the Oizumi Station of theField Science Center (Yamanashi, Japan), Tokyo University of Marine Science andTechnology under a natural photoperiod at a water temperature of 10 C. Three transgenic
rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, strains that carried different foreign genes encoding
fluorescent proteins were used as donors. The vasa-GFP strain carried ASGs labeled withstrong green fluorescence (Yoshizaki et al., 2000; Takeuchi et al., 2002). The vasa-DsRed
strain was produced by replacing the GFP gene used in the vasa-GFP strain with theDsRed gene. The hsc-GFP strain carried GFP gene driven by regulatory elements of theheat-shock-cognate gene (Yamamoto et al., 2011; Kawamura and Yoshizaki, unpublisheddata) and showed green fluorescence throughout the entire body. To prepare the donors
having different genetic backgrounds, the vasa-GFP, vasa-DsRed, and hsc-GFP strains
were produced using Okutama strain established in Okutama Branch of Tokyo Fisheries
Experimental Station (Tokyo, Japan), Oizumi strain established in Oizumi Station of theField Science Center, and recessive albino-mutant strain obtained from Tochigi Prefectural
Fisheries Experimental Stations (Tochigi, Japan) (Boonanuntanasarn et al., 2004),
respectively. Non-transgenic triploid rainbow trout (Oizumi strain) were used as recipients.
The fertilized eggs were induced to triploidy using methodology described by Okutsu et al.
(2007) in order to prevent them from producing their own gametes. Eggs were reared inwater at 10 C prior to transplantation.

Preparation of testicular cell suspensions
Testes were collected from 3-9 individuals of each hemizygous transgenic strain
129

(vasa-GFP/-, vasa-DsRed/-, and hsc-GFP/-) when they were between 10 and 13 months inage. Collected testes were immature and primarily consisted of ASGs. Testes isolated fromeach strain were pooled for use in subsequent experimentation. Testes were minced anddissociated by enzymatic treatment in accordance with the methodology described by Kise
et al. (2012). Dissociated testicular cells were washed three times by centrifugation with
Eagle’s MEM medium (pH 7.8; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan)
supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen Co., Grand Island, NY) and 20
mM Hepes (Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, MO) in order to eliminate enzyme activity, andfiltered through a 42-µm-pore-sized nylon screen (NBC Meshtech Inc., Tokyo, Japan) inorder to remove non-dissociated cell clumps. Resulting donor testicular cells weresuspended in the previously described medium and kept on ice prior to theirtransplantation.

Spermatogonial transplantation
Testicular cells isolated from vasa-GFP, vasa-DsRed and hsc-GFP transgenic
rainbow trout were used as donors for transplantation assay. Since germ cells isolated fromthe hsc-GFP strain did not exhibit strong green fluorescence, they were stained with the
red-fluorescent membrane dye, PKH26 (Sigma-Aldrich, Co.) in order to visualize their
behavior within recipient gonads (Kise et al., 2012). The same number of ASGs from eachstrain were mixed together prior to transplantation (Fig. 1A, B). Approximately 1.5×104
total ASGs were transplanted into the body cavity of each recipient rainbow trout hatchling(32-36 dpf) using methodology described by Okutsu et al. (2006). We repeated thetransplantations three times using at least 50 recipients for each experiment. At 20 days
post-transplantation, recipients were dissected and incorporation rates of donor ASGs
within their gonads were analyzed under a fluorescent microscope (model BX-51N-34FL;
130

Olympus, Tokyo, Japan) equipped with a GFP filter set (U-MWIB and U-MNIBA;
Olympus) and a DsRed filter set (U-MWIG; Olympus). Incorporation rate was defined as
the number of recipients carrying transplanted donor ASGs within their gonads divided by
the total number of recipient individuals. Numbers of each type of donor ASGs
incorporated into recipient gonads were also counted. Furthermore, at 100 days
post-transplantation, proliferation and differentiation of donor ASGs derived from eachtransgenic strain within the recipient gonads were morphologically observed.

Progeny test
Recipient fish were reared for 1-2 years until they reached maturity. To ascertain
whether mature male recipients produced donor-derived functional sperm, milt wascollected from 1- and 2-year-old male recipients and used to fertilize eggs from wild-type
females. Additionally, whether or not female recipients produced donor-derived functional
eggs was determined by collecting eggs from 2-year-old mature female recipients andfertilizing with sperm from wild-type males. Phenotypic analysis was conducted on all F1
offspring obtained from each male recipient and more than 100 randomly selected F1
offspring obtained from each female recipient using fluorescent microscopy.

Statistical Analysis
All data are presented as mean values ± SEM. Statistical significance wasdetermined by using one-way ANOVA followed by Tukey multiple comparisons test using
a statistical significance level of P < 0.05. All analyses were carried out by using GraphPad
Prism Version 5.0 (GraphPad).

131

Results

1. Colonization of donor-derived ASGs from three different strains within a single recipient
In order to determine whether mixed donor ASGs were incorporated into the
gonads of individual recipients, the presence of donor ASGs in recipient gonads was
confirmed using fluorescent microscopy. At 20 days post-transplantation, donor ASGs
labeled with three different colors of fluorescence were detected within recipient gonads(Fig. 1C, D), which suggested that donor ASGs from each strain had been incorporated
into the gonads of individual recipients. The rate of recipients carrying ASGs derived fromat least one donor strain was 89.6% ± 1.4% (Fig. 1E). Furthermore, 78.2% ± 5.3% ofrecipients carried donor ASGs derived from all three strains (Fig. 1E). The mean number ofdonor ASGs incorporated into recipient gonads did not significantly differ among donor
strains, with 7.9 ± 2.3, 7.6 ± 2.3, and 7.4 ± 2.1 donor ASGs from vasa-GFP, vasa-DsRed,and hsc-GFP having been observed in recipient gonads, respectively (Fig. 1F).
At 100 days post-transplantation, proliferation of donor ASGs derived fromvasa-GFP and vasa-DsRed strains within the gonads of both male and female recipientswas observed (Fig. 2); however, donor ASGs derived from hsc-GFP strain fish could not
be detected within recipient gonads as the intensity of PKH26 fluorescence was reduced
due to dilution caused by cell division. The sizes of GFP-positive and DsRed-positive
colonies did not show any clear differences. In female recipient ovaries, some donor ASGs
had already differentiated into oocytes with diameters of nearly 50 µm (Fig. 2C).

2. Production of donor-derived gametes possessing different genetic backgrounds
In order to confirm whether a single male recipient produced functional sperm
derived from different donor-strains, progeny tests were conducted using triploid recipients132

that had received donor ASGs. Although the majority of non-transplanted control triploids
did not produce milt, a small number were capable of milt production. The milts obtained
from these triploids were used to fertilize eggs obtained from wild-type females. All F1
offspring derived from the milt of non-transplanted triploids were severely malformed anddied around the time of hatching (Table 1, #24 and #10). Therefore, resulting recipientswere expected to produce only donor-derived offspring. At 1 and 2 years
post-transplantation, 16 males out of l04 mixed-sex recipients and 44 males out of 100
mixed-sex recipients (four individuals died after the first spawning season) reachedmaturity and produced milt, respectively. Milt samples collected from nine randomly
selected 1-year-old male recipients and 13 randomly selected 2-year-old male recipientswere used to artificially inseminate eggs from wild-type females. Developmental rates andswim-up rates of the resulting eggs are summarized in Table 1. The F1 offspring producedby the aforementioned crosses were subjected to phenotypic analyses.
In the present study, donor ASGs isolated from transgenic individuals whosetransgenes were hemizygous were transplanted into recipients. Consequently, half of theF1 offspring were expected to be donor-derived transgenic fish (Table 2). When observed
using fluorescent microscopy, some of the offspring exhibited green fluorescencethroughout their entire bodies (Fig. 3A, B), while some possessed germ cells which
exhibited either green or red fluorescence (Fig. 3C-F). The remainder of the F1 progeny
consisted of non-transgenic wild-type-fish. These results suggested that the donor ASGs,
which had been isolated from vasa-GFP, vasa-DsRed, and hsc-GFP strain transgenic fish,
were capable of differentiating into functional sperm within the testes of recipients. At 1
and 2 years post-transplantation, 16 out of 17 (94.1%) male recipients produced F1
offspring derived from all three donor strains during their first spawning season (Table 2,#1, 6, 7, 9, 12, 13, 15, 18, 23, 26, 61, 62, 77, 80, 94, and 97). Five male recipients (Table 2,133#1, 6, 7, 9, and 15) that matured during the first spawning season were also used inprogeny tests during the subsequent spawning season. Of these five male recipients, four
produced F1 offspring derived from all three donor strains across two consecutive
spawning seasons (Table 2).
Additional progeny tests were performed using 2-year-old female recipients that
had received donor ASGs whose transgenes were hemizygous. At 2 years
post-transplantation, 24 females out of 100 mixed-sex recipients reached maturity andproduced eggs. Eggs were collected from 15 randomly selected mature female recipients
and were artificially inseminated using milt from wild-type males. The rates of eggs thatreached the eyed stage, as well as eggs' hatching rates and swim-up rates are summarizedin Table 3. It was determined using fluorescent microscopy that each of the 15 female
recipients produced F1 offspring derived from all three donor strains (Table 4).

134Discussion

In the present study, it was demonstrated that a single recipient that received
ASGs derived from multiple donors was capable of producing functional eggs and sperm
possessing different genetic backgrounds. This method of spermatogonial transplantation
could be used as an efficient means of producing genetically diversified gametes from asingle surrogate broodstock, thereby allowing for the mass production of fish seeds
possessing increased genetic diversity.
Several donor ASGs labeled with three different colors of fluorescent proteins anda dye were found within the gonads of individual recipients. Okutsu et al. (2006)previously reported that an average of 4.6 donor ASGs had been detected within recipient
gonads at 20 days post-transplantation; however, it remained unclear whether or not thesedonor cells originated from a single donor ASG and proliferated afterwards, or if they were
derived from multiple donor ASGs. The results of the present study provided clear
evidence that a single recipient was capable of incorporating at least three different donor
ASGs into their gonads. In mice, larger amounts of donor cells have been incorporated into
recipient testes when germ cell-deficient recipients were used (Shinohara et al., 2002). This
result suggested that competition between donor spermatogonial stem cells andendogenous stem cells for available niches existed. Therefore, providing available niches
in recipient testes could be considered an important factor for successful and efficientcolonization of donor ASGs (Dobrinski, 2006). When trout hatchlings in which
endogenous germ cells had been eliminated by knocking down a specific gene, such as
dead-end (Weidinger et al., 2003), were used as recipients, more donor ASGs would beincorporated into niches within recipient testes.

135

When 5,000 ASGs derived from one donor strain were transplanted into recipients,
the incorporation rate was approximately 90% at 20 days post-transplantation (data notshown). In this study, when 15,000 ASGs derived from three donor strains (5,000 ASGs
per strain) were transplanted into recipients, the rate of recipients carrying all threedonor-derived ASGs was 78.2% ± 5.3% at 20 days post-transplantation. When moreindividual donors were used to prepare donor-cell mixtures, the rates of recipients carrying
ASGs derived from all donor individuals would be expected to decrease unless theincorporation rate of each donor cell reached 100%. Shinohara et al. (2002) has shown thatenriched populations of donor stem cells could facilitate the colonization of donor germ
cells within recipient testes following spermatogonial transplantation in mice. The authorsof the present study previously developed methodology for ASG enrichment by lightscattering properties using flow cytometry (Kise et al., 2012) or by differential plating(Shikina et al., 2008). Combining these methods may allow for further increase in numbersof individual donors without resulting in a reduced success rate of donor cell incorporation
into recipient gonads.
In the present study, incorporation rates of donor ASGs derived from vasa-GFP
and vasa-DsRed strain were similar (88.8% ± 0.7% and 92.1% ± 4.0%, respectively; data
not shown). Furthermore, numbers of incorporated donor ASGs derived from vasa-GFP
and vasa-DsRed strains were also similar (7.9 ± 2.3 and 7.6 ± 2.3, respectively). These
results suggested that donor testicular cells isolated from immature testes contained thesame concentrations of transplantable ASGs and that those ASGs had an almost equal
potential to occupy niches within recipient gonads, even though they possessed different
genetic backgrounds. In progeny tests, the average occurrence rate of vasa-GFP strain was
significantly higher than those of the other two strains, which suggested that donor ASGs
from different strains possessed unequal proliferation potentials, survival abilities, and/or136differentiation abilities. It seems that this difference among strains was not due to genetic
distance between donor and recipient since the genetic distance between the vasa-GFP
strain (recessive albino-mutant strain) and the recipients (Oizumi strain) was larger thanthat between the vasa-DsRed strain (Oizumi strain) and the recipients (Oizumi strain). On
the other hand, female recipients displayed no such differences in proportions of F1
offspring origins. In rainbow trout, males produce more gametes than females and as suchgonial germ cells need to proliferate more frequently in males. Therefore, the difference
between sexes observed in progeny tests could have been the result of differences inproliferation ability among donor strains, which would have had a stronger effect on
propagation of donor ASGs in male recipients than they would have had in female
recipients. A similar phenomenon has been observed in mice that possessed germ cellmosaicism from two different strains with respect to coat color (Mintz 1968). Mintz
reported that the proportion of black coats as opposed to agouti coats among progeny
declined over successive litters. In the present study, a similar tendency was observed withrespect to the proportions of vasa-DsRed and hsc-GFP-derived F1 offspring produced bycertain recipients, which were lower in the second spawning season than they were in thefirst. Further studies incorporating progeny tests over multiple spawning seasons are
required in order to further understand this phenomenon.
In the present study, functional donor derived eggs possessing three distinct
genetic backgrounds were produced in the ovaries of female recipients. The authors of thepresent study previously performed progeny tests using female recipients that had received
donor ASGs along with wild type XY males (Yoshizaki et al., 2010a). These tests revealed
that one-third of the resulting F1 males were YY males, which are viable and fertile. Since
YY males would produce only males in F2 generation, it could be a potential problem to
use the resulting offspring for stock enhancement. One possible solution to this problem
137was transplantation of oogonia. Intraperitoneally transplanted oogonia have been
incorporated into recipient gonads, where they differentiated into fully functional eggs
(Yoshizaki et al., 2010b). Using oogonial transplantation could allow female recipients to
produce only mature eggs carrying one X chromosome.
It has been estimated that fish seeds produced in hatcheries possess lower fitness
than wild fish populations (Reisenbichler and McIntyre, 1976; Miller et al., 2004; Araki etal., 2007). In order to avoid reductions in the fitness of hatchery produced fish seeds, seeds
should be produced using locally captured wild fish; however, maintenance of wild fish as
broodstock is difficult as they cannot acclimatize to rearing environments within hatcheries.
By transplanting donor germ cells derived from wild fish into domesticated recipients
carrying desirable traits (e.g., disease and/or handling resistance), production of genetically
healthy seeds could be achieved more easily. Recently, Lee et al. (2013) reported that
donor ASGs obtained from cryopreserved whole testes could be incorporated into recipient
gonads where they generated functional eggs and sperm. Using the cryopreservation
methodology developed by Lee et al. (2013), candidate donor fish were sacrificed and theirtestes cryopreserved on-site immediately after harvesting, allowing donor whole-testes tobe cryopreserved for the entire duration of their storage prior to transplantation. Thismethodology would allow sufficient numbers of donor testes to be collected from local
wild fish and stored using liquid nitrogen without having to rear donor individuals in
captivity. The combination of this method of cryopreservation with the system oftransplantation developed in the present study could provide a powerful and efficient toolcapable of producing genetically healthy fish seeds suitable for use in stock enhancement.
Application of these technologies to commercially important species would contributesignificantly for sustainable stock enhancement program.

138

Recently, successful transplantation of spermatogonia into the testes of adultrecipients has been performed in tilapia (Lacerda et al., 2010), pejerrey (Majhi et al., 2009)and zebrafish (Nóbrega et al., 2010). If these techniques can become applicable to thetransplantation of ASGs derived from multiple donors, they would also be useful in thecreation of genetically diversified seeds.

139

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144

Figure Legends

Fig. 1 Colonization of donor ASGs in recipient gonads at 20 days post-transplantation. A,
B) Mixed donor testicular cells isolated from three transgenic strains. Green and red
florescent cells were donor ASGs derived from vasa-GFP and vasa-DsRed strains,respectively. Cells labeled with PKH26 (yellow fluorescence) were testicular cells derived
from the hsc-GFP strain. C, D) Incorporation of donor ASGs derived from vasa-GFP(white-arrowheads), vasa-DsRed (red-arrowheads), and hsc-GFP (arrow) strains into a
recipient gonad. E) Incorporation rates of donor ASGs within recipient gonads (meanvalues ± SEM of three independent experiments). ‘3 strains’ indicated the recipient
carrying donor ASGs derived from all three donor strains. Similarly, 2 and 1 strains
indicated the recipient carrying donor ASGs derived from 2 and 1 donor strains,respectively. F) The number of each donor ASG incorporated into the recipient gonads(mean values ± SEM of three independent experiments). A, C, fluorescent view; B, D,
bright-field view. Dashed lines indicate the edges of the recipient gonad. Bars = 20 µm(A-D)

Fig. 2 Proliferation of donor ASGs within a recipient gonad at 100 days
post-transplantation. Both vasa-GFP (green fluorescence) and vasa-DsRed (redfluorescence) strain-derived ASGs proliferated in the recipient testis (A, B) and ovary (C,D). Furthermore, some of the donor-derived ASGs differentiated into oocytes (arrows)
within the recipient ovary (C). A, C, fluorescent view; B, D, bright-field view. Dashed lines
indicate the edges of the recipient gonad. Bars = 50 µm

145

Fig. 3 Donor-derived offspring obtained from progeny tests. A, B) Some newly hatched F1
offspring derived from recipient fish showed obvious green fluorescence, which suggested
that they were derived from the hsc-GFP strain (arrows). C-F) Some F1 offspring derived
from recipient fish possessed GFP (C) and DsRed (E) -positive germ cells, whichsuggested that they were derived from the vasa-GFP and vasa-DsRed strains, respectively.
A, C, E, fluorescent view; B, D, F, bright-field view. Bars = 20 µm (C-F)

146

Fig. 1 Colonization of donor ASGs in recipient gonads
at 20 days post-transplantation.

147

Fig. 2 Proliferation of donor ASGs within a recipient gonadat 100 days post-transplantation.

148

Fig. 3 Donor-derived offspring obtained from progeny tests.

149

Table 1. Developmental rates of F1 offspring obtained from male recipients.

Male
#1
#6
#7
#9
# 13
# 15
# 18
# 23
# 26
# 24 (non-TP)a
WT-1b
#1
#6
#7
#9
# 12
# 15
# 61
# 62
# 69
# 77
# 80
# 94
# 97
# 10 (non-TP)a
WT-2b

Age
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2

No. of eggs
analyzed
249
213
205
209
183
267
200
208
205
200
192
255
256
248
260
337
292
290
348
296
270
230
285
272
150
246

Eyed stage
(%)
71.5
49.8
50.7
63.6
76.5
61.8
74.0
71.6
71.7
52.5
69.8
82.4
65.6
50.0
72.7
86.4
87.7
64.5
76.1
45.3
67.0
70.4
44.6
80.1
44.0
48.8

a

Recipient triploid that did not receive transplantation.

b

Wild-type diploid that did not receive transplantation.

150

Hatching (%)
69.5
48.8
50.7
63.6
74.9
60.7
61.0
70.7
69.3
31.5
69.8
80.4
65.6
50.0
71.5
85.2
87.0
62.1
75.0
44.6
67.0
70.0
43.9
79.0
18.7
48.0

Swim-up (%)
68.3
48.4
50.7
62.7
74.3
59.6
49.5
69.7
61.0
0
69.8
78.0
64.5
48.0
69.2
83.1
85.3
60.7
71.3
41.6
65.6
69.6
43.2
73.5
0
47.6

Table 2. Occurrence rates of each donor-derived F1 offspring obtained from male recipients.

Male
#1
#6
#7
#9
# 13
# 15
# 18
# 23
# 26
WT-1a
#1
#6
#7
#9
# 12
# 15
# 61
# 62
# 69
# 77
# 80
# 94
# 97
WT-2a

Age
1
1
1
1
1
1
1
1
1
mean ± SEM
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
mean ± SEM
2

No. ofhatchlings
analyzed
170
103
104
131
136
159
99
145
125
100
199
165
119
180
280
249
176
248
123
177
160
123
200
117

Percentage of donor-derived F1 offspringvasa-GFP
54.1
32.0
51.9
41.2
64.0
51.6
10.1
41.4
24.8
41.2 ± 5.6*
0
62.3
60.0
68.1
58.9
64.3
54.2
50.0
46.4
68.3
54.8
49.4
42.3
41.0
55.4 ± 2.6*
0

* Mean values differ significantly (P < 0.05).
aWild-type diploid that did not receive transplantation.

151

vasa-DsRed
10.0
1.0
5.8
0.8
2.9
0.6
15.2
2.8
24.8
7.1 ± 2.7
0
4.5
0.6
0.8
2.8
1.1
0.8
1.1
4.4
0
1.1
1.9
8.9
27.5
4.3 ± 2.00

hsc-GFP
0.6
29.1
6.7
22.1
5.9
18.9
35.4
23.4
6.4
16.5 ± 4.0
0
0
5.5
4.2
11.1
3.2
16.9
17.0
10.5
8.9
7.3
13.8
14.6
0.5
8.7 ± 1.6
0

WT
35.3
37.9
35.6
35.9
27.2
28.9
39.4
32.4
44.0
35.2 ± 1.7*
100
33.2
33.9
26.9
27.2
31.4
28.1
31.8
38.7
22.8
36.7
35.0
34.1
31.0
31.6 ± 1.2*
100

Table 3. Developmental rates of F1 offspring obtained from female recipients.
Female
#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
#8
#9
#10
#11
#12
#13
#14
#15
WTa
a

Age
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2

No. of eggs
analyzed
2231
1507
1511
2660
2131
3060
2021
2115
1570
2066
1506
2185
1865
2834
2779
850

Eyed stage (%)
37.7
79.6
45.9
88.9
58.1
83.6
72.2
88.8
91.3
82.8
82.8
78.6
79.9
81.2
47.4
98.2

Wild-type diploid that did not receive transplantation.

152

Hatching (%)
34.9
76.2
44.8
88.2
54.4
80.4
70.2
86.5
90.4
81.5
79.7
77.8
77.9
77.3
44.7
98.2

Swim-up (%)
30.2
73.0
41.7
72.5
50.1
73.2
66.2
81.9
86.8
77.5
77.5
72.7
74.4
65.1
39.0
97.3

Table 4. Occurrence rates of each donor-derived F1 offspring obtained from female recipients.

Female
#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
#8
#9
#10
#11
#12
#13
#14
#15
WT*

Age
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
mean ± SEM
2

No. ofhatchlings
analyzed
162
150
184
184
148
194
144
195
208
194
179
177
204
151
151
100

Percentage of donor-derived F1 offspringvasa-GFP
35.2
25.3
22.3
6.5
19.6
38.1
13.9
0.5
2.4
13.4
0.6
14.1
9.8
35.8
23.2
17.4 ± 3.2ab0vasa-DsRed
8.0
12.0
26.6
12.0
13.5
24.2
29.2
47.7
40.9
20.1
51.4
25.4
31.9
21.2
25.2
26.0 ± 3.3a0Different lower-case letters denote mean values that differ significantly (P < 0.05).
*Wild-type diploid that did not receive transplantation.

153

hsc-GFP
21.0
20.7
2.2
38.6
23.0
10.8
10.4
4.1
2.9
21.6
0.6
13.6
18.1
0.7
8.6
13.1 ± 2.8b
0

WT
35.8
42.0
48.9
42.9
43.9
26.8
46.5
47.7
53.8
44.8
47.5
46.9
40.2
42.4
43.0
43.5 ± 1.6c
100

総括

本研究では、魚類の精原幹細胞に関する基礎から応用に及ぶ知見の集積を目指した。第 1 章および第 2 章では魚類の精原幹細胞に関する基礎的知見を得ることを目的とし、第 3 章では精原幹細胞の性質を利用した応用技術の開発を目指した。
第 1 章 -1 では、精原幹細胞を高頻度で含む ASG 集団の同定を目指した。そこで、繁殖期のニジマス精巣内に存在する残留 A 型精原細胞（ASG）集団こそが精原幹細胞であると予想し、その可能性について検討した。その結果、残留 ASG 集団から得られる移植成功率は極めて低く、予想に反して、残留 ASG 集団は幹細胞活性の極めて低い ASG 集団であることが明らかとなった。このことから、第 1 章 -2
では、ニジマス成魚の精巣内に存在する ASG 集団の幹細胞活性を 1 年間の生殖周期を通して解析し、低下している ASG 集団の幹細胞活性がどのように変化するのか調べた。その結果、繁殖期の後半において ASG 集団の幹細胞活性が著しく低下
し、その後、退行期において精子形成に先立ち幹細胞活性が回復することが明らかとなった。つまり、ニジマス ASG 集団のもつ幹細胞活性は、生殖周期を通して一定の状態で維持されているわけではなく、精子形成を行わない繁殖期の特定の時期において幹細胞活性が極めて低い状態へと移行することが明らかとなった。このことから、ニジマス ASG 集団の幹細胞活性は、季節性を持って大きく変化することが明らかとなった。
続いて、ニジマス ASG 集団の幹細胞活性の変化に影響を与えた要因を明らかにするために、これまでに形態学的解析の結果から、精原幹細胞として扱われてきた
ASG（A1 細胞）の存在に注目した（Loir ,1999; Schulz et al., 2010）。ニジマス ASG
集団の幹細胞活性の変化は A1 細胞の存在により影響を受けているのではないかと考え、その可能性について検討した。その結果、ASG 集団の幹細胞活性の変化は
A1 細胞の出現と必ずしも一致しないことが明らかとなった。つまり、A1 細胞のみ
154

が精原幹細胞としてふるまい ASG 集団の幹細胞活性に影響を与えているのではな
く、A1 細胞以外の形態を示す ASG 集団中にも精原幹細胞としてふるまう能力を保持した ASG が存在することが示唆された。このことは、ASG 集団中に存在する精原幹細胞の同定には、従来の形態学的指標だけではなく、新規の形態的指標あるいは分子マーカーを同定する必要があることを示していた。
そこで第 2 章では、精原幹細胞で特異的に発現する分子マーカーを探索することを最終目標とした。その第一歩として、まず、第 1 章で同定した幹細胞活性が明瞭に異なる ASG 集団を材料にして網羅的遺伝子発現解析を行い、幹細胞活性の高い
ASG 集団で高い発現を示す遺伝子の探索を行った。その結果、幹細胞活性の高い
ASG 集団において特異的に強発現する 5 つの遺伝子を同定することに成功した。
続いて、第 3 章では、精原細胞移植系を用いた、新規の種苗生産技術の開発を行った。魚類の精原幹細胞は、性的両能性を有しているため、精原細胞移植系を利用することで、宿主生殖腺内で精原幹細胞由来の卵と精子を生産することが可能である。この性質を利用して確立された代理親魚技法は、水産業への応用が強く期待されている。そこで、代理親魚技法による遺伝的多様性を保持した人工種苗の創出技術の開発を行った。具体的には、異なる遺伝的背景を保持したドナー由来精原幹細胞を混合し宿主魚へ移植することで、1 尾の宿主魚からドナーに用いた個体数分の
遺伝的多様性を保持した配偶子を得ることを目的とした。本研究では、3 系統のニジマス由来 ASG を混合したドナー細胞を移植した結果、1 尾の宿主魚はその生殖腺内で 3 系統のドナー全てに由来する機能的配偶子を生産可能であることを明らかにした。このことから、本移植技術は種苗の遺伝的多様性創出において極めて有効な技術となりうることが証明された。
魚類の精原幹細胞は、マウスなど哺乳類とは異なり、性的可塑性を示すことから、
精原幹細胞さえ手に入れば、卵や精子さらには個体の作出が可能である（Okutsu etal., 2006）。そのため、今後、精原細胞移植系を用いた代理親魚技法は、絶滅危惧種
155

の保全、水産上有用魚種の育種選抜、優良形質を保持した系統の維持、種苗生産など多岐にわたり利用されていくことが予想される（Yoshizaki et al., 2011, 2012）。そして、代理親魚技法が実用化されるうえで、可能な限り高い移植成功率を安定的に得ることができる技術の開発は解決すべき課題の一つとなるだろう。現在、ドナー細胞の宿主生殖腺への生着を確認するには、生着確認までの間、数週間にわたり宿
主魚の飼育を行う必要がある。さらに、海産魚を宿主に用いた場合、移植後の生残率が極めて低いことから、大量の宿主魚に対して移植を行う必要がある（Yazawa etal., 2010; Morita et al., 2012）。すなわち、移植の成否を確認するまでの間、多大な労力、飼育スペース、コストの確保が必要となるのである。もし、ドナーに季節性繁殖型の魚種を用いた場合、第 1 章で明らかにしたように、ASG 集団の幹細胞活性が極めて低く、高い移植成功率が見込めない時期が存在することが想定される。また、ドナーとなる魚種の捕獲場所と実際に移植を行う実験室とが遠く離れている場
合、長時間の運搬作業により新鮮な状態の精巣が手に入らず、高い移植成功率が望めない可能性も想定される。このように高い移植成功率が見込めない可能性のあるドナー細胞であっても、移植の成否を確認するまでの間は上述した労力、飼育スペ
ース、コストを避けて通ることはできないだろう。そのため、移植に用いるドナー
ASG が、宿主生殖腺へと生着しやすい状態であるのか否かを移植前に判断することは、代理親魚技法の効率化において極めて重要となる。そこで、第 2 章で明らかにした各遺伝子が、ASG 集団の幹細胞活性の指標となる分子マーカーとして利用可能となれば、精原細胞移植を行う前に各遺伝子の発現量を調べるだけで、ドナー細胞の幹細胞活性を予測することが可能となる。これにより、幹細胞活性の高い時期や状態のドナーASG のみを選択し移植に用いることで、少ない移植回数で十分な数の宿主魚を確保することが可能となり、代理親魚技法の効率化への貢献が期待される。
これまで、魚類の精原幹細胞に関する研究の多くは、組織学的解析を中心とした156

ものだった。1960－1980 年代には、魚類の精巣発達を明らかにするために組織学的観察が多く行われ、繁殖期の魚類精巣内に残留 ASG が存在することが報告された。繁殖期の精巣内にはわずかな数の ASG しか残されないにも関わらず、翌年には大量の精子産生が行われる様子から、ASG 集団は精原幹細胞を含む存在であると捉えられるようになった（太田ら, 1965; 高橋, 1986; Hiroi and Yamamoto, 1970;
Schulz and Miura, 2002; Schulz et al., 2010）。そして、魚類の ASG の形態的特徴を基に精原幹細胞の同定が試みられ、ASG 集団中に存在する大型な核に dense body をひとつ保持した ASG（A1 細胞）が精原幹細胞であると考えられるようになった（Loir, 1999; Chaves-Pozo et al., 2005; Leal et al., 2009; Nóbrega et al., 2009）。だが、精原幹細胞は自己複製能と分化能を保持した細胞と定義されるため、固定標本を用いた組織学的解析では、A1 細胞が精原幹細胞であることを証明するのは不可能であった。2006 年に、ニジマスにおける精原細胞移植系を用いた解析により、ASG 集
団中に精原幹細胞が存在することが証明された（Okutsu et al., 2006）。それ以降、精原幹細胞の同定を目指し、精原幹細胞の機能と形態の関連付けや分子マーカーの同定が試みられるようになった。その結果、現在、精原幹細胞の機能と形態の関連が示されたのは、ゼブラフィッシュにおいて行われた Label retaining cel（LRC）の検出による精原幹細胞の同定である。一般に幹細胞の分裂頻度は低いと考えられており、細胞の核内の塩基を試薬で標識した場合、幹細胞の標識は増殖の盛んな細胞に比べて希釈されにくい（Li and Clevers, 2010）。この性質を利用し、マウスでは LRC
は幹細胞の検出を行う際に用いられている（Li and Clevers, 2010）。近年、ゼブラフ
ィッシュにおいてこの検出法が用いられ、A1 細胞と類似した形態を示す ASG が
LRC であったことから精原幹細胞であると提唱された（Nóbrega et al., 2010）。しかし、LRC が実際に自己複製能と分化能を備えた ASG なのかは明らかにはされなかった。また、メダカ卵巣内に幹細胞としての能力を保持した細胞が存在するのか否か細胞系譜解析により検証が行われた（Nakamura et al., 2010）。その結果、Nanos2
157

遺伝子を発現する卵原細胞のすべてあるいはその一部が、幹細胞としての能力を保持していることが示された（Nakamura et al., 2010）。以上のように、これまで魚類の生殖幹細胞の機能と、形態や分子マーカーとの関連付けが試みられてきたが、その知見は数種の魚種に限られ、極めて乏しいのが現状である。本研究では、精原細胞移植系を用いた機能的解析によりニジマス ASG 集団の幹細胞活性が季節的に大きく変化することを見出し、これにより ASG の幹細胞能は、ASG の形態的特徴だ
けでは捉えることのできない性質であることを明らかにした。さらに、幹細胞活性が明瞭に異なる ASG 集団の存在を見出し、これら ASG 集団間で発現する分子を網羅的に比較することで ASG 集団の幹細胞活性に寄与する分子の同定が可能となった。今後、幹細胞活性の異なる時期で発現パターンの異なる分子を同定し、これら分子の発現解析や機能解析を行うことで、ASG 集団の幹細胞活性を生み出す分子
さらには精原幹細胞マーカーとして利用可能な分子が明らかになることが期待される。そして、それら因子の制御機構の解明が行われることで、魚類の精原幹細胞
システムさらには季節性繁殖型の精原幹細胞システムの機構解明において、多くの知見がもたらされることを期待する。

158

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161

謝辞

本研究の遂行および論文の作成において、御多忙にも関わらず多くの時間を割いて終始丁寧に御指導、御鞭撻、御校閲を賜り、また素晴らしい研究環境と多くの貴重な研究経験を与えて下さった東京海洋大学海洋科学部海洋生物資源学科水族生
理学研究室教授 吉崎 悟朗博士に心より感謝の意を表します。
本論文の御校閲を賜り、有益なご教示を下さった東京海洋大学海洋科学部海洋生
物資源学科ゲノム科学研究室教授 廣野 育生博士、同水族病理学研究室准教授 坂本 崇博士、同大先端科学技術研究センター准教授 竹内 裕博士に謝意を表します。
研究遂行に際して、適切なご助言を頂いた同水族生理学研究室助教 矢澤 良輔博士および博士研究員 林 誠博士、また、実験魚の飼育だけでなく大泉ステーション
での生活面においても多大なる御厚情を賜った東京海洋大学水圏フィールドセン
ター大泉ステーション三井 拓也技官、佐久間 賢志技官に深く感謝の意を表します。
博士学位取得までの様々な場面において、研究生活を楽しく豊かなものにしてくださった全ての学生、卒業生の皆様、研究員の皆様、職員の皆様に心から感謝の意を表します。
最後に、研究遂行のために犠牲となった数多くの実験魚の命に対し、感謝と慰霊の念を表します。

162