研究用試薬 製品データシート

p.1

Code No. 27996

Human FGF19 Assay Kit - IBL
96 Well

230 μL 加え混和しその溶液 230 μL を 750 pg/mL の希釈用テストチューブに加え混和します。順次 2 倍連続希釈をおこない 1,500 pg/mL～23.4 pg/mL までの 7 点を希釈標準品とし、0 pg/mL を検体ブランクとします。 (図(1) 参照)
図 (1) 標準液希釈操作例

1. はじめに
FGF19、FGF21 および FGF23 から構成される FGF19 サブファミリーは、α/βKlothoを共受容体とし、ホルモン様機能を有する因子群です。α/βKlotho および FGF19 サブフ
ァミリーから構成される制御系は、ミネラル、脂質、エネルギー、アミノ酸などの代謝を統合的に行う新たなシステムといえます。この新たな制御システムは、肝臓での胆汁酸代謝、コレステロール代謝（FGF19）、飢餓時におけるエネルギー代謝、糖脂質代謝（FGF21）、腎臓でのリン・カルシウム代謝並びにビタミン D 代謝（FGF23）という生体にとって重要な恒常性維持機構に関与しています。
FGF19 は腸管より分泌され、血流にのって肝臓に到達し、肝臓における胆汁酸の合成を抑制したり、グリコーゲンとして糖を貯蔵する肝臓機能を調節したりします。
FGF19 は FGFR4 と βKlotho から構成される受容体と結合し、FGF19 ホルモンの異常による下痢や便秘などの消化器疾病や、糖尿病などの代謝疾患に関しての研究が行われています。血中濃度の測定により、多嚢胞性卵巣症候群、胆汁酸性下痢、冠動脈疾患、NASH（非アルコール性肝臓疾患）、空腹時血糖値の異常、クローン結腸炎、肝がん、II 型糖尿病、食欲不振症などの疾患との関連が報告されています。
本キットは、ヒト FGF19の濃度を定量することができます。

2. 原理および測定方法
本製品は、サンドイッチ法による ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)キットです。1 次抗体はプレートに固相されていますので、検体および標準物質を加え 1 次反応をおこないます。洗浄後、HRP 標識された 2 次抗体を加え 2 次反応をおこないます。反応後過剰の 2 次抗体を洗浄除去した後、Tetra Methyl Benzidine (TMB) により発色させます。この呈色は、Human FGF19 の量に比例します。

3. 測定範囲
23.4 ～ 1,500 pg/mL

4. 使用目的
ヒトの EDTA-血漿および細胞培養上清中の Human FGF19 を測定できます。
正常のヒト EDTA-血漿検体の希釈の目安は 4 倍～16 倍程度です。

5. 構成試薬
12345678

抗体プレート (抗 Human FGF19(12B1)Mouse IgG MoAb 固相)
96Well x 1
標識抗体濃縮液 (30 倍濃度 HRP 標識抗 Human FGF19(16A1)Mouse IgG Fab’ ) 0.4mL x 1
標準物質 (Recombinant Human FGF19)
0.5mL x 2
希釈用緩衝液*30mL x 1標識抗体用溶解液*
12mL x 1
TMB 基質液
15mL x 1
停止液*12mL x 1
濃縮洗浄液*
50mL x 1

標準品 230 μL

希釈用緩衝液230 μL
濃度 (pg/mL)

検体の希釈方法
検体は必要に応じて希釈用緩衝液で適宜希釈し測定してください。
正常のヒト EDTA-血漿検体の希釈の目安は 4 倍～16 倍程度です。
(3) 測定操作方法
試薬は使用前に常温に戻し、数回静かに転倒混和し変化のないことを確かめてく
ださい。
検体の測定と同時に希釈標準品を測定し検量線を作成してください。
抗体プレートで以下の操作をおこないます。
1 ブランクの添加 (以降図 (2) 参照)
試薬ブランクのウェルを設定し希釈用緩衝液を 100 μL 入れます。
2 検体、希釈標準品の添加
検体 100 μL および希釈標準品各 100 μL ならびに検体ブランク 100 μL をそれぞれのウェルに入れます。
3 プレートカバーをして 4°C 1 夜反応4 ウェルの反応液を除去します。洗浄液を加え除去します。*
5 標識抗体の添加
検体、標準、検体ブランクに標識抗体を各々100 μL 添加します。
6 プレートカバーをして 4°C 30 分間反応
7 ウェルの反応液を除去します。洗浄液を加え除去します。*
8 TMB 基質液の添加
あらかじめ必要量を採取用容器にとり、そこからすべてのウェルに TMB 基質液を 100 μL 添加します。TMB 基質液添加後、反応液は徐々に青色に変ります。この時の反応は遮光してください。また、採取用容器に残った TMB 基質液は、コンタミの原因になりますので元に戻さないでください。
9 遮光をして常温 30 分間反応
10 停止液の添加
すべてのウェルに停止液を 100 μL 添加します。プレートの側面を軽くたたいて混和します。反応液は青色から黄色に変化します。
11 吸光度測定
プレート底面のよごれや水滴を拭き取り液面に気泡がないことを確認した後、30 分以内に試薬ブランクを対照として検体および標準ならびに検体ブランクの波長 450nm における吸光度を測定してください。

試料

プレートリーダー (測定波長：450nm)
希釈用テストチューブ
精製水
ペーパータオル
冷蔵庫 (4°C として)マイクロピペットおよびチップ
メスシリンダーおよびビーカー
グラフ用紙 (両対数)
洗浄ビン
採取用容器 (清潔な試験管など)(2) 準備図 (2) 測定操作一覧
検 体
標 準

検体ブランク試薬ブランク

検体

希釈用緩衝液

希釈用緩衝液希釈標準品

100 μL100 μL100 μL
プレートカバーをして 4°C 1 夜反応
4 回 (洗浄液 350 μL 以上)

100 μL

標識抗体

100 μL100 μL100 μL
プレートカバーをして 4°C 30 分反応
5 回 (洗浄液 350 μL 以上)－TMB 基質液

100 μL

6. 用法および用量 (操作方法)(1) 必要な器具・器材① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦⑧
1,500 750 375 187.5 93.8 46.9 23.4 0

100 μL100 μL
遮光常温 30 分間反応

100 μL停 止 液
100 μL100 μL100 μL100 μL
プレートをたたいて反応液を混和し、30 分以内に試薬ブランクを対照として 450 nm における検体、標準、検体ブランクの吸光度を測定

濃縮洗浄液の希釈方法
濃縮洗浄液は、40 倍濃度です。使用前に常温に戻し十分に転倒混和します。
濃縮洗浄液 50mL に対して精製水を 1,950mL 加え混和します。これを洗浄液とします。冷蔵保存し 2 週間以内に使用してください。
標識抗体濃縮液の希釈方法
標識抗体濃縮液は 30 倍濃度です。
別に用意した採取用容器にて、必要量に応じて標識抗体濃縮液を標識抗体用溶解液で 30 倍希釈してください。これを標識抗体とします。
希釈例)
1 スリット (8 ウェル) 使用する場合=800 μL 必要(最低量)(標識抗体濃縮液を 30 μL とり、標識抗体用溶解液 870 μL を加え良く混和し、100 μL ずつ使用します。)
この操作は、標識抗体添加の直前におこなってください。
標識抗体濃縮液の残りは、蓋をしっかり閉め冷蔵にて保存してください。有効期限内に再度使用できます。
標準物質の希釈方法
標準物質バイアル瓶に精製水を 0.5 mL 加えて完全に溶解します。
この時標準物質濃度は 3,000 pg/mL となります。
希釈用テストチューブを 8 本用意し希釈用緩衝液を 230 μL ずつ量り取ります。各々のテストチューブに
1,500 pg/mL, 750 pg/mL, 375 pg/mL, 187.5 pg/mL, 93.8 pg/mL, 46.9 pg/mL,23.4 pg/mL, 0 pg/mL の表示をします。
1,500 pg/mL の希釈用テストチューブに 3,000 pg/mL の標準物質溶液を株式会社

免疫生物研究所

7. 操作上の注意事項
1 検体は、採取後速やかに測定してください。保存する場合は、凍結保存とし、検体の凍結融解を繰り返さないでください。また、融解は低温でおこない測定前に十分混和してください。
2 検体は必要に応じて希釈用緩衝液で希釈してください。
3 検体や標準物質は、二重測定することをおすすめします。
4 検体は、中性域のものを使用してください。また、有機溶媒等の混入も反応に障害がありますので注意してください。
5 抗体プレ－トの洗浄は必ず付属の洗浄液を使用してください。不十分な洗浄は、測定誤差の原因となりますので正確におこなってください。
6 洗浄後は、プレートをペーパータオルの上でたたいて完全に水分を切ってください。この時ペーパータオルがウェルの中に入らないよう注意してください。
7 TMB 基質液は、光に対して敏感です。遮光保存してください。金属との接触も避けてください。
8 吸光度測定は、停止液添加後 30 分間以内におこなってください。

8. 測定結果の算出方法
対数グラフの縦軸に吸光度を、横軸に検体濃度をとり各標準物質濃度の吸光度値から検体ブランクの吸光度値を引いた値をとり検量線を設定します。
試料検体の吸光度値から検体ブランクの吸光度値を引いた値を検量線に当てはめ、検体濃度を読みとります。

URL: http://www.ibl-japan.co.jp

E-mail: do-ibl@ibl-japan.co.jp

研究用試薬 製品データシート
9. 測定値と検量線作成例
標準品濃度(pg/mL)

p.2

Code No. 27996

11. 使用上または取り扱い上の注意

吸光度(450nm)

1,500

2.436

750

1.267

3750.649

187.5

0.332

93.80.175

46.9

0.095

23.4

0.059

0 (検体ブランク)

0.023

上記検量線は作成例です。測定に当たってはその都度検量線を作成してください。

10. キットの性能

1 保存は、2～8°C としてください。使用の前に全ての試薬は常温に戻してください。
2 標準物質は、凍結乾燥品です。開封は、十分注意しゆっくりとおこなってください。
3 停止液は強酸性 (1N 硫酸) です。衣服・皮膚等への接触および廃棄には十分注意してください。
4 使用後の抗体プレートや試薬は、多量の水で洗い流してから廃棄してください。
5 希釈用緩衝液、標識抗体濃縮液および濃縮洗浄液は、まれに析出を認める場合がありますが、性能に問題はありません。
6 構成試薬には動物血液成分を含む物があります。取り扱いに注意し使用後は手洗いなどをおこなってください。
7 ロットが異なる製品の構成試薬や他のキットの構成試薬を混ぜたり、交換したりして使用しないでください。
8 期限切れの試薬は、使用しないでください。
9 本キットは、研究用試薬です。診断等に用いることはできません。

12. 保存方法および有効期限
2～8°C 保存
使用期限は外箱に記載(1) 希釈試験
600500

Dilution linearity of Medium(RPMI-1640 with 10%FCS added)

13. 包装単位および製品番号

pg/mL

40096 Well
製品番号 27996

30020014. 参考文献

100000.25

0.50.75

1

1. Maeda R, Imura A, Nabeshima Y. Complex regulation and diverse functions ofDilution (1; doubling diluted medium
with 750 pg/mL of standard added)alpha-klotho. Contrib Nephrol. 2013;180:25-46.

600

2. Tomiyama K, Maeda R, Urakawa I, Yamazaki Y, Tanaka T, Ito S, Nabeshima Y,
500

Dilution linearity of EDTA Plasma

Tomita T, Odori S, Hosoda K, Nakao K, Imura A, Nabeshima Y. Relevant use

pg/mL

400
300of Klotho in FGF19 subfamily signaling system in vivo. Proc Natl Acad Sci USA.

200

2010 Jan 26;107(4):1666-71

10015. 問合せ先000.250.50.75

株式会社 免疫生物研究所

1Dilution (1; doubling diluted EDTA Plasma)2016 年 11 月更新＊

Version 2.
(2)同時再現性

関連製品

測定値 (pg/mL)

SD (pg/mL)

CV (%)

n721.8

18.5

2.65

177.8

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2.8

555.7

4.0

7.2

5

測定値 (pg/mL)

SD (pg/mL)

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n713.1

16.8

2.4

3

177.5

6.3

3.5

356.7

4.27.53

製品番号

製品名容量27996

Human FGF19 Assay Kit-IBL96Well27997

Human FGF21 Assay Kit-IBL

96Well27998

Human soluble α-Klotho Assay Kit - IBL

96Well(3) 測定間再現性(4) 特異性
測定物質
Human FGF19
Human FGF21

交差率100％0.1％以下(5) 感度
7.2 pg/mL
本キットの感度は、NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)の評
価 方 法 に 従 い 求 め ま し た 。 (National Committee for Clinical Laboratory Standards
Evaluation Protocols, SC1, (1989) Villanova, PA : NCCLS 参照

株式会社

免疫生物研究所

URL: http://www.ibl-japan.co.jp

E-mail: do-ibl@ibl-japan.co.jp