立石科学技術振興財団

助成研究成果集(第32号) 2023

［ 研究助成 (A) ]生体外ヒト疾患モデルの高い再現性を実現する細胞バリア機能計測技術の開発
Development of accurate cell barrier function measurement technology for in vitro human disease model2221024

研究代表者

京都大学

共同研究者

京都大学
高等研究院物質−細胞統合システム拠点

大学院工学研究科

師

平

井義

客員准教授

亀井謙一郎

講

和ス テ ム (MPS: Microphysiological Systems)」[研 究 の 目 的]が世界的に注目されている。なかでも，異なる手のひらサイズのマイクロ流体デバイスで複臓器細胞を培養した細胞培養チャンバ間をマイ数の臓器細胞をマイクロ流路と循環ポンプで連クロ流路で接続して細胞培養液をポンプによっ結した「ボディ・オン・チップ (BoC: Body onて循環させることで，従来のマイクロウェルをa Chip)」は，ヒト体内と同様の臓器間相互作使った細胞培養法では難しい血液循環による臓用を部分的に発現できることが実証されてきた。

器間相互作用を再現した BoC は，新薬開発のその相互作用の結果を可視化するためには，一プラットフォームのみならず，疾患メカニズム般的に細胞工学的イメージング (蛍光標識) がを解明するための革新的なツールとして期待さ用いられるが，近年は試験中に「非標識・リアれている。そこで我々の研究グループでは，世ルタイム計測可能な技術」へのニーズが増加し界的に患者数が増加傾向にある非 NAFLD のている。そこで本研究は，未だ不明点が多い非疾患メカニズムについて，BoC を駆使して解ア ル コ ー ル 性 脂 肪 性 肝 疾 患 (NAFLD: Non-明することに挑戦している。NAFLD は，肝脂Alcoholic Fatty Liver Disease) の理解に向け肪症，肝硬変，がんなどにつながる慢性肝疾患た「小 腸−肝 臓 モ デ ル」の BoC を 構 築 す る。

であり，重度の肝疾患患者の治癒には肝移植がまた細胞バリア機能 (細胞間の密着結合) の評

唯一の方法であるものの，患者に適したドナー

価 指 標 で あ る「経 上 皮 電 気 抵 抗 値 (TEER:を見つけるこが非常に困難となっている。

Trans Epithelial Electrical Resistance)」を

本研究は，NAFLD の発症と進行に最も重要

BoC で正確に計測できるセンサ技術を開発すな要素の一つであると言われている腸と肝臓のることで，疾患機序の解明に向けたセンサ搭載相互作用「腸−肝臓軸 (GLA: Gut-Liver Axis)」型 BoC の構築を目指す。に着目した (図 1)。NAFLD における GLA を研究するために，腸肝連結プラットフォームと[研究の内容，成果]呼ばれる小腸・肝臓連結臓器チップを開発した(図 2)。このマイクロ流体デバイスをベースと1．腸・肝連結臓器チップの開発する腸肝連結プラットフォームは，ガス透過性，マイクロ流体デバイス技術によって細胞の微生体適合性，透明性の高いシリコーン樹脂であ小環境を時空間的に制御し，ヒトの臓器機能やる PDMS (Polydimethylsiloxane) をソフトリ生体システムを生体外で模倣する「生体模倣シソグラフィと呼ばれる成形加工技術で作製する。

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図3
図1

腸肝軸と非アルコール性脂肪性肝疾患

小腸・肝臓連関の再現と生存率評価(Caco-2 細 胞) と 肝 実 質 細 胞 (HepG2 細 胞)をそれぞれ個別に導入し，続いて細胞培養液をマイクロポンプで循環して共培養した (図 3)。
まず，従来法のウェルプレートで培養した
Caco-2 細胞の機能化には，21 日間程度の培養が必要であったが，腸肝連結プラットフォーム

図2

ソフトリソグラフィで作製した小腸・肝臓連結臓器
チップ (2 層構造，赤色：灌流層，青色：制御層)の循環灌流条件下では，7 日間で機能を発揮することが確認できた。また，培養液を循環することによって，HepG2 細胞の生存率は変わ

デバイスは，小腸・肝臓細胞を培養するためのらなかったものの，Caco-2 細胞の生存率は向灌流層と，細胞培養液の流れを制御するための上 す る こ と を 確 認 し た。さ ら に 共 培 養 下 の制御層などで主に構成される。マイクロバルブ

HepG2 細胞は，単培養と比較してアルブミンやポンプを搭載して，デバイス内の細胞培養液の発現が増加したため，肝機能性が向上していの流れや細胞培養チャンバへの個別のアクセスることが観察された。したがって，腸肝連結プを制御する。

ラットフォームにおける循環灌流は，Caco-2

図 2 に示す小腸・肝臓連結臓器チップの灌流細胞と HepG2 細胞の両方にとって従来の生体層 に は，マ イ ク ロ 流 路 (幅：200 μm，高 さ：外細胞培養法よりも良い組織機能発現に適した45 μm) で接続された 2 つの細胞培養チャンバ環境を実現できることが示された。

(幅：2.1 mm，高さ：220 μm) を設計した。制さらに生体外における GLA の再現を試みた。

御層には，PDMS 薄膜 (大きさ：200 μm×200NAFLD を誘引することで知られる遊離脂肪酸μm，厚さ：20 μm) で形成された圧力駆動型(FFA: Free Fatty Acid) を投与することで，マイクロバルブとポンプを設計した。圧力駆動

初期および進行性 NAFLD を表した細胞状態型マイクロポンプは，制御層のマイクロ流路か(例：細胞内脂質貯蔵) を誘導した。より具体ら PDMS 薄膜に圧縮空気による圧力を印加す

的には，小腸細胞，肝臓細胞ともに遊離脂肪酸ると PDMS 薄膜がドーム状に変形し，灌流層投与による脂肪酸の蓄積を確認し，流体デバイのマイクロ流路を封鎖する「バルブ機能」を利ス内で共培養することで GLA による細胞死誘用する。この PDMS 製マイクロバルブを 3 つ導への抵抗性が向上したことを確認した。さら組み合わせ，駆動する順番と時間を制御するこに RNA シーケンス法による全 mRNA 発現をとで，デバイス内の循環灌流を精密に制御でき解析した結果，遊離脂肪酸がアルブミン発現なる。マイクロポンプをデバイス内に集積するこどの肝臓細胞における肝機能へ影響するだけでとで培養液のデッドボリュームが少なくなるたなく，小腸細胞・肝臓細胞の共培養による遊離め，微小空間での生体システムをより正確に再脂肪酸の細胞周期や代謝活性への効果を確認し現できる。作製した小腸・肝臓連結臓器チップた。

を 用 い て，細 胞 培 養 チ ャ ン バ に 小 腸 細 胞― 2 ―本研究では，ヒト体内の GLA をさらに高度

Tateisi Science and Technology Foundation

図5(a) 全体，(b) 細胞培養チャンバと多孔質膜の電子顕微鏡で観察した断面写真

図4

マイクロ流体デバイスと使った 4 端子法による細胞層の TEER 計測の原理

析し，得られた細胞層の抵抗値を細胞培養領域多層ソフトリソグラフィで作製した小腸・肝臓連結臓器チップ (多層構造，赤色：細胞培養チャンバ，および灌流用流路，黒色：ポンプ制御流路)の面積で規格化して導出する (図 5)。
マイクロ流体デバイスを使用した MPS のTEER 計測では，作用電極と参照電極を使っに再現する BoC として，細胞培養チャンバとた 4 端子法で行うことが多いが，TEER 電極循環灌流チャネルが PDMS 製の多孔膜で仕切レイアウトに依存して計測値が大きく異なるこられた多層構造の BoC も構築した (図 4)。当とが課題となっていた。これは TEER 電極か

該デバイスでは，各細胞培養チャンバにおいて，ら電圧を印加した際，細胞培養チャンバ内に形機械的刺激 (せん断力) による小腸細胞と肝臓成される電流密度分布に TEER 値が依存する細胞の機能発現を制御し，かつ多孔膜による細ことに起因する。したがって TEER 計測の高胞膜の物質透過を再現できる構造を設計した。

精度化を目的としたデバイス設計においては，

この BoC で炎症性腸疾患を誘導するリポポリ

電流密度分布を均一にするために，細胞培養サッカライドを小腸細胞にのみ添加すると，小チャンバの大部分を TEER 電極で覆う設計ア

腸・肝臓細胞の誘導性一酸化窒素合成酵素の発プローチが有用である。しかし細胞培養中や染現増加を確認でき，小腸炎症時における肝臓と色後の細胞観察のための顕微鏡観察領域を確保の相互作用と炎症発症機序の解明に BoC が有するためには，細胞培養チャンバの上下面にお用であることを実証した。

ける開口部 (ガラス領域) の割合が一定以上となることも求められる。そこで本研究では，高2．トポロジー最適化を用いた TEER 電極設計

精度な TEER 計測と大面積の細胞観察を同時法に可能とする TEER 電極レイアウトについて，

BoC の細胞培養チャンバ内での細胞の状態構造最適化手法の 1 つであるトポロジー最適化をリアルタイムかつ非侵襲的に計測できるセンを用いた新しい設計法を開発した。

サがオンチップ化できると，試験結果の評価やトポロジー最適化は，制約条件を満たしなが解析の信頼性がさらに向上すると予想され，そら目的関数と呼ばれる関数を最小，または最大の技術開発が世界中で進んでいる。例えば，細とするような設計変数 θ (材料の分布) を求め胞間密着結合に由来するバリア機能を評価するる問題として定義される。これを一般的に使わ経上皮電気抵抗 (TEER) は，細胞培養チャンれている機械構造物の設計ではなく TEER 計

バに培養した細胞層の分化と完全性の指標とし測に適用する場合，前述した 4 端子法におけるて用いることができる。TEER は，多孔膜上作用電極と参照電極を同時にトポロジー最適化に培養された細胞層に交流電圧を印加して得らするため，「マルチマテリアルトポロジー最適れるインピーダンススペクトルを等価回路で解化」の問題に分類される。ただし一般的なマル― 3 ―立石科学技術振興財団

チマテリアルトポロジー最適化でのアプローチは，本研究の電極レイアウトの設計にはそのまま適用できない。そこで，図 6 に示す細胞培養チャンバの解析モデルに 2 層の電極層を設定することで，この課題を解決した。ここで，内側の電極層 θ 1 は電極レイアウトを決定，外側の仮想的な電極層 θ 2では，2 種類の電極を区別する役割をする。
前述した BoC の細胞培養チャンバを設計対象として，トポロジー最適化による TEER 電極レイアウトの結果を図 7 に示す。本研究の電極レイアウトの最適化結果では，設計変数 θ が0.5 以下となる部分を電極とみなす。つまり赤色で示された領域では θ が 0 付近の値をとるた(a) 電極レイアウトの比較，(b) TEER 計測における誤差の比較

図8

め，TEER 電 極 が 存 在 す る と み な す。ま た，

異なる TEER 電極レイアウト間での比較

表 1 各電極レイアウトでの開口率と RSD の比較

細胞培養チャンバ中央付近の内外 2 層の重複部は作用電極，それ以外の内側の電極層における電極領域は参照電極とみなす。
図 8 と表 1 に本研究のトポロジー最適化で得られた TEER 電極レイアウトと他の電極レイ電極レイアウト

RSD

開口率最適化
AB

4.7%
29%
15%

73%
80%
70%

C

2.2%

30%

アウトについて，電流密度分布の均一性と開口一性は，電極レイアウト間の比較を容易にする率を比較して示す。ここで，電流密度分布の均ため，細胞層における電流密度分布の標準偏差を 平 均 値 で 割 っ た 変 動 係 数 (RSD: RelativeStandard Deviation) を指標とした。
まず，トポロジー最適化で得られた TEER
電極レイアウトは，良好な RSD を有し，電極レイアウト B と同程度の広い顕微鏡観察領域

図6

細胞培養チャンバの解析モデルを実現している。さらに，顕微鏡観察領域を細胞培養チャンバの長手方向全体で確保しており，せん断応力を印加する細胞培養チャンバ (主に小腸細胞) の長手方向に沿った細胞観察が可能となる点も優位となる。次に電極レイアウト
A と B は，RSD が悪く，電極レイアウト C は，良好な RSD で設計できている。電極レイアウ
ト C は，細胞培養チャンバの大部分を電極で覆うことで電流密度分布を均一に設計したものの，細胞培養チャンバ全体を金属電極が覆っているため，細胞観察ができるガラス領域が中央(a) 電極層の結果，(b) 仮想的な電極層の結果

図7付近に制限される。
次 に 小 腸 細 胞 (Caco-2 細 胞) の 一 般 的 な

トポロジー最適化で得られた電極レイアウト― 4 ―Tateisi Science and Technology Foundation

TEER 値である 250〜1500 Ωcm 2 において計測

腸疾患など) に関する新しい知見も期待される。

誤差を比較すると，RSD が最も良い電極レイ

さらに，実験動物を使用しない疾患研究が可能

アウト C で計測誤差が小さくなるが，トポロになるため，新しい動物代替法としての応用も

ジー最適化による電極レイアウトでも計測誤差期待される。

は 10% 未満であり，十分な計測精度を有する。
以 上 の 結 果 か ら，ト ポ ロ ジ ー 最 適 化 し た[成果の発表，論文など]

TEER 電極レイアウトは小さい RSD を保ちな・Jiandong Yang, Yoshikazu Hirai, Kei Iida, Shinji Ito,が ら 大 き い 開 口 率 を 持 つ た め，BoC で のMarika Trumm, Shiho Terada, Risako Sakai,

TEER 計測に適した電極レイアウトと言える。

Toshiyuki Tsuchiya, Osamu Tabata, Ken-ichiro

本研究のトポロジー最適化のアプローチは様々な MPS の TEER 計測デバイスに展開できるほか，4 端子法を用いたインピーダンス計測全般にも適用可能な汎用性の高い手法と考えられる。また，異なるデバイス間で TEER 値のKamei, “Integrated Gut-Liver-on-a-Chip Platform
as an in Vitro Human Model of Non-Alcoholic Fatty
Liver Disease”, Commun. Biol., Vol. 6, 310, 2023
・Dongxiao Zhang, Jiandong Yang, Yoshikazu Hirai,Ken-ichiro

Kamei,OsamuTabata,Toshiyuki

Tsuchiya, “Microfabrication of PolydimethylsiloxaneParylene Hybrid Microelectrode Array Integrated

比較を行うための電極レイアウトの設計手法とInto a Multi-Organ-on-a-Chip”, Jpn. J. Appl. Phys.,しても有用である。今後は，最適化した電極レVol. 62, 017002, 2023

イアウトを実装した BoC によって，NAFLDの発症機序の理解につながるデバイスシステムであることの実証結果を積み重ねる。

・Jiandong Yang, Satoshi Imamura, Yoshikazu Hirai,
Toshiyuki Tsuchiya, Osamu Tabata, Ken-ichiro
Kamei, “Gut-Liver-Axis Microphysiological System for Studying Cellular Fluidic Shear Stress andInter-Tissue Interaction”, Biomicrofluidics, Vol. 16,044113, 2022

[今後の研究の方向，課題]

・Jiandong Yang, Yoshikazu Hirai, Ken-ichiro Kamei,Osamu Tabata, Toshiyuki Tsuchiya, “Simulation

本研究では，マイクロ流体デバイス技術を駆使した腸肝連結プラットフォームを用いてNAFLD を再現すること，また細胞バリア機能

Model to Characterize Volumetric Flow Rate Generated by Polydimethylsiloxane Peristaltic Micropump for Body-on-a-Chip”, The 18th IEEE International Conference on Nano/Micro Engineered andをリアルタイムにセンシングする TEER 計測

Molecular Systems (IEEE-NEMS 2023), Jeju,用電極のトポロジー最適化設計法を開発するこ

KOREA (May 14-17, 2023), pp. 714-715とに成功した。将来的に細胞機能をリアルタイ・合 田 晴 紀，石 田 尚 之，古 田 幸 三，泉 井 一 浩，VanKeulen Fred，亀 井 謙 一 郎，土 屋 智 由，田 畑 修，ムに解析するセンシング技術は，創薬スクリー

平井義和，“高精度な経上皮電気抵抗計測のためのニングや各種オミクステクノロジーと組み合わトポロジー最適化による電極設計”，第 39 回「センせることで，NAFLD 発症に関するより深い知サ・マイクロマシンと応用システム」シンポジウム

見と，薬剤候補の発見への貢献が期待される。
また，本研究の腸肝連結プラットフォームでは，腸肝軸に関連する様々な障害 (例えば，炎症性― 5 ―(電気学会 E 部門大会)，電気学会，徳島，2022 年
11 月 14 日−16 日，16A2-M-1