分子生物学的手法をもちいた生物学的廃水処理装置の微生物相の角牢析
‑フタル酸分解嫌気性細菌の特定‑
Analy引SOf

MicrobialCommunitiesin

Wastewater

theSystems

Treatment

BiologlCal(技)研究開発部第5研究室
赤司
昭Molecu】arwith

AbraAkashi

Bio10glCalTechniques
of‑Specification

phtha】ate‑degrading

bacteria

anaerobic

RT‑PCR‑DGGE‑

u引ng

分子生物学的手法の発達により,培養を介さずに廃水処理装置内の微生物集団を解析することが可能になった｡本稿では,RT‑PCR‑DGGE法をもちいて,フタル酸を処理する上向流嫌気性ブランケット反応器(UASB)内のフタル酸分解細菌を特定した結果について報告する｡ビール工場より採取したグラニユール汚泥を種汚泥として,テレフタル酸とイソフタル酸を炭素源とする廃水で口ASB反応器を立ち上げた｡種汚泥,および,経時的にサンプリングした汚泥の微生物群集の解析から,種汚泥や分解活性のない汚泥には存在せず,分解活性のある汚泥のみに特異的に出現する細菌,すなわち,フタル酸分解菌を3種特定した｡

RecentdevelopmentofmolecularbiologicaltecImiquesprovidedus

newapproacbesto血eanalysIS

OfmicrobialdynamicsinbiologlCalwastewatertreatment
Were

SpeCifieduslng

systems.Phthalate‑derading

biologicaltech血que,RT‑PCR‑DGGE.An

mOlecular

anaerobic

bacteria

anaerobic

sludgeupflow

bla止et(UASB)reactorwasinoculatedwi也granularsludge丘･Omafull‑SCaleUASB
breweryas

wastewater,弧dcarbon

Witb

was托dspecificandisopb血alate,butnotin

bands

wereseedsludgepatte皿didnotchangein

tbeAf亡ercbangeofco皿pOnentthedisappeared･Tbese
terephthalateanaerobic

resultsindicate

sludgeOfduringcontaining
treatment

obseⅣedin也eandgranular

andisopb也alate,and

granularwastewater

syn也etic

bacterialdiversity

source.Cbangesin

DGGE.Three

witb

the

granularsludgeduringsludgetbeinfluent

botb

sludgethe托edand/Orisopbthalate
werecompounds

degradedwhich

did notdegrade

whichmonitored
terephtbalate

tbe compounds.DGGE

oftereph血alate‑COntainlng

toisopb也alate,Onethat twokinds

of

tbat

o也er

contributed血e

theof

terephtbalate

reactortreating

bacteriaOfpa血cipatedin
degradation

WaSteWater.

bands

tbeset址eetb

degradationofwasofboth

terephtbalatein

ansystem.

上向流嫌気性ブランケット法

口p皿owanaerobic

嫌気Anaerobic

テレ

フ タ

ル酸

Tereph也dicイ

ソ

フタ

ル酸

Isopbthalic

性 細 菌

ポリメラーゼチェインリアクション

変性剤濃度勾配ゲル電気泳動

sludgebla止et(UASB)

bacteria
acid
acid

Polymerasechainreaction(PCR)
Denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)

神鋼パンテツク技報

lわJ.4β肋.2(20〃β/2)

建設中とのことである7〉｡当社では,PANIiIC‑Eを変えがき活性汚泥法や上向流嫌気性ブランケット法はじめとする嫌気的処理装置を製造･販売しており,UASI∋)等の生物学的廃水処理方法は,ランニン

フタル酸もそれらの処理対象のひとつになりうるもブコストが安価で,運転管理も比較的容易であるこのと考えられる｡このように,実機レベルの運転がこから有機性廃水の処理方法として広くもちいられ実施されているにもかかわらず,フタル酸を分解す〔いる｡本来,生物学的処理方法では,そこに生息る嫌気性細菌に関する情報はきわめて少ない｡｢る微生物により廃水の浄化がなされるわけである

最近,Wuら8)はテレフタル酸を処理するUASB

卜ら,それらの微生物の状態を把握しながら,運転装置より採取したグラニユール汚泥を種汚泥として,穿理がなされるべきである｡しかしながら従来,こテレフタル酸を唯一の炭素源とする廃水で馴養し,tら生物学的廃水処理装置の運転は,流入原水と処そこに生息する微生物群集を明らかにした｡しかし,堅水の水質を指標にしてもっぱら現場担当者の勘と彼らは,これらの微生物群のうち,どの細菌がテレ至験に頼る部分が大であった｡つまり,装置の性能フタル酸の分解に関与しているかについては明らかと左右する微生物に関してはブラックボックスのまにしていない｡

本研究では,フタル醸を処理する嫌気的処理装置E運転がなされてきた｡

廃水処理装置内には多種多様な微生物が存在し,の微生物学的側面からの運転指標の確立を目的とし二れらの微生物の共同作用により浄化がおこなわれて,PCR‑DGGEをもちいて,テレフタル酸やイソ:いるが,このような複合微生物群集を解析する適

フタル酸の分解に関与する嫌気性微生物を特定したロな手法がなかった｡従来微生物の検出･定量に傍結果について報告する｡

目されている培養法では,廃水処理装置(環境)に1.材料･方法

巨息する微生物のせいぜい10%しか検出できない

1.1フタル酸処理口ASB反応器の運転

卯00×1000mm(容積約8L)の反応器にビールこいわれており1),残りの90%以上の微生物は,生きているが培養できない(Viablebutnonculturable:工場より採取したグラニユール汚泥を約2.7L投入｢NC)2)ことになる｡したがって,培養可能な徴生し,テレフタル酸(TP)とイソフタル酸(IP)のわだけを対象とした研究では,処理装置の性能と微両成分を炭素源とする廃水を連続的に供給すること主物との関係を正しく把握することは不可能である｡

により立ち上げた｡反応器の温度は,35〜37℃に医学･生物学分野で発展した分子生物学手法が,なるように制御した｡表1に廃水組成と計画TOD‑

罠境微生物の研究に適用されるようになり,培養操SS負荷を示す｡運転立ち上げは,TOD‑SS負荷0.05

巨を経ずに廃水処理装置内の微生物群集を解析するkg/kg/dより開始し,フタル酸の分解率を見ながらChainことが可能になった｡中でも,Polymerase

徐々にアップした｡その後,廃水組成をTP単独,次いで,IP単独に換え運転した｡.eaction(PCR)法3),Fl甘OreSCentあざ血Eybridization 1.2
GradientGelFISIi)法4),および,Den血dng･1ectropboresis(DGGE)法5)の貢献は大きく,今ま

微生物群集の解析

グラニエール汚泥に生息する微生物群集の解析は,きブラックボックスであった装置内の微生物群集にDGGE法により実施した｡経時的にサンプリング冒する理解を飛躍的に深めた｡

したグラニエール汚泥からRNAを精製し,真性細本報告では,細菌の16SrRNAをターゲットとし菌(酸生成細菌)に特異的なプライマーセットをも二RT‑PCR‑DGGE法を活用してUASB装置内のフリレ酸分解細菌を特定した例について報告する｡テ/フタル酸をはじめとするフクル酸は,世界で製造きれる化学物質の上位50位内に入る大量合成品であ表1UASIiの運転条件
TablelOperating),1994年における全世界でのテレフタル酸生産量
丈,年間1000万トンにも達する5)｡従来,本物質をcondition
Compositionof

Run

In凸uentofUASB

reactor
TOD‑SSLoading(kg化g/d)｢有する廃水は,活性汚泥法等の好気的廃水処理方

1妄により処理されていた｡近年,UASB等のエネル

2TP3

IP

0.1,0.15,0.24

TP0.1,0.15,0.2

ゴー消費の少ない嫌気的処理方法をフタル酸含有廃(の処理に適応する例が増えてきている｡1999年の*TP:Tereph也alate

乏告では,世界で約10基の実装置が稼働,もしくは,**IP‥Isoph也alatebJ.4β肋.2(2003/2)

神鋼パンテツク技報

TP*＋lP**

0.05,0.1,0.20.2ちいたRT‑PCRにより16SrRNAのV3領域を含む12回おこない,16SrRNA遺伝子を増幅した｡計32DNAを増幅した｡PCR産物は,40〜45%の変性都濃度勾配の6.5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動

回の増幅反応後,72℃7分の反応を1回おこなっにより分画した｡

脱塩･濃縮した後DGGEに供試した｡

1.2.1RNAの精製

1.2.3

た｡PCR産物は,マイクロコンー100(Mi11ipore)でグラニエール汚泥のRNAは,TRIzoIReagent

DGGE

DGGEは,40〜45%の変性剤濃度勾配(100%(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA)をもちいて抽出し,引き続いて,RNeasy
MiniEit(qiagen,変性剤は,40%ホルムアミドと7M尿素の混合物Tokyo,Japan)で精製した｡すなわち,グラニエー用した｡脱塩･濃縮した500ngのPCR産物をアプである)を含む6.5%ポリアクリルアミドゲルを使

ル汚泥約100mgと1mLのTRIzoIReagent,ならびライし,50V30分の泳動後,200V5時間の泳動をに,0.2mLのクロロホルムを混合し,1mLのガラおこなうことにより実施した｡泳動終了後,ゲルをスビーズ(直径0.1m皿)を含む2mL容のスクリューSYI∋R

キャップチューブ中で,3000rpm,3分間振とうして観察した｡

することにより摘出した｡租精製したRNAは,

2.結DNase処理により混在するDNAを分解後,RNeasy

2.1t岨SBによるフタル酸の処理

Mini瓦itをもちいて精製した｡

UASB反応器は,ビール工場のUASf主反応器から採取したグラニュール汚泥を種汚泥として立ち上

1.2.2

RT‑PCR

Goldで20分染色後,302n皿の紫外線を照射

果Ace(東洋紡)をもちい,製造者の推奨する反応条件によりおげた｡表1に示すように,まず,テレフタル酸とイこなった｡すなわち,90℃,5分熟変性した0.1〟g供給することにより装置を立ち上げた(Runl)｡のRNAに25pmolesのrandom

計画TOD‑SS負荷0.05kg/kg/dより運転を開始し,cDNAの合成は,逆転写酵素ReverTra

hexamer,1mMのソフタル酸の両成分を炭素源とする廃水を連続的にdNTP,反応溶液,および,100Uの逆転写酵素を加え,25℃で15分処理した後,42℃で45分反応すその後テレフタル酸とイソフタル酸の分解を見ながることによりcDNAを合成した｡

引き続き,廃水組成をテレフタル酸単独廃水に換え

PCRは,真性細菌の16SrRNA遺伝子のV3領域を増幅するGC‑PRIiA338fとPRUN518r9)をプライ約1ケ月運転した後(Run2),イソフタル酸単独廃水に換え運転した(Run3)｡

マーとしてもちいた｡反応液は,10ngのcDNA,2

図1,2にそれぞれテレフタル酸の一日当たりのら順次0.1kg/kg/d,0.2kg/kg/dに負荷をアップした｡

mMのdNTP,2mMのMgSO4,0.5/JMのプライ除去量とガス発生量の推移を示す｡運転開始後テレ

マー,1Uの耐熱性DNA

polymerase(KOD‑Plus‑,東洋紡),および,1×監OD‑Plns‑bufねr(東洋紡)

フタル酸とイソフタル酸の分解活性が出現し始めるより成る｡この反応液を94℃,2分処理後,94℃去量は上昇し,TOD‑SS負荷0.1kg化g/d運転時のテ30秒,65℃30秒,72℃30秒の反応を10回,引き続

レフタル酸の最大除去量は10.6g/d(除去率78.4%),イソフクル酸の最大除去量は3.1g佃.(除去率99､3き,94℃30秒,60℃30秒,72℃30秒の反応を10回,までに約90[]必要とした｡その後徐々に両成分の除さらに,94℃30秒,56℃30秒,72℃30秒の反応を
Runl35Run2Run316●コ閤凶tl‑‑､‑

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100200150250300350‑TOD‑SSLoadin呈m叱(pも急患切口司dOJ∽∽･凸○ト0■

1つ】

Fig.1Cbange

ofpbthalate○二00 30

1044 ハリ
0050

100

150

200

250300二‡504000perationT血e(days)

固degradation

一(エ0perationTiI℃e(days)

図1フタル酸分解の経時変化♭醐鵡鍔nXU:爵国42Fig.2

神鋼パンテツク技報

ガス発生量の経時変化
Cbangeofgasproduction

1わ乙4β肋.2(200β/2)450(pも当叫旦的亡弓dOJ∽∽･〇〇←

0 3(p＼已ロ〇一ち戸で○占鳶0△∨■ニモ=<UGasProductionβ￠(肘什)○■･圏

ト冬二●(pも)ロ○召dq一戸ヨ一山‑〇一∈コ○日く‑TOD‑SSLoading

Run4｡百官8｡㍗

圏TPElilnination◇◇RuI13

0.4O◇IPElimination

Run2Runl20

Run4つエ%)であった｡TOD‑SS負荷0.2kg/kg/d運転時は,それぞれ16.7g/d(除去率56.4%)と6.4g/d(除去率91.1%)であった｡0.2kg化g/dにおける運転期間(レーン2と3)では存在する微生物群集に差は見られなかった｡しかし,フタル酸分解活性の発現と中,イソフタル酸の除去量は,6g/d前後でほぼ一ともに,新しい3本のバンド(図3レーン4‑10,矢印a,b,C),すなわち,細菌が出現した｡これ定だったのに対し,テレフタル酸の除去量は一定せらのバンド(細菌)は,種汚泥や分解活性のない汚ず,不安定であった｡また,除去量が増大するに従泥には見られず,分解活性のある汚泥に特異的に見い,ガス発生量も増大した｡

られ,かつ,長期に渡り安定に観察されたことから,テレフタル酸とイソフタル酸の両成分を含有するこれら3種の細菌がテレフタル酸とイソフタル酸の廃水の処理を280日間継続したが,両成分の除去量分解に密接に関与しているものと考えられる｡の増加は認められなかったので,廃水組成をテレフ2.2.2

廃水組成の変化にともなう微生物群集の変化

タル酸単独廃水に変更し処理を継続したが(Run2),除去量の上昇は認められなかった｡
引き続き,廃水組成をイソフタル酸単独に換え処

テレフタル酸とイソフタル酸の両成分を含有する廃水から,テレフタル酸だけ含有する廃水,次いで,理をおこなった(Run3)｡負荷の上昇にともないイソフタル酸含有廃水,さらに,テレフタル酸含有除去量も急激に上昇し,TOD‑SS負荷0.25kg化g/d

廃水と廃水の組成を変え,それにともなう微生物群運転時に最大30.1g/d(除去率89.7%)の除去量が集の変化をRT‑PCR‑DGGE法により解析した(図えられた｡

4)｡テレフタル酸だけ含む廃水で約1ケ月処理したが,バンドパターンに変化は見られなかった(レーなお,′実験期間中,処理水の酢酸濃度は10mg几
未満であった｡
2.2

RT‑PCR‑DGGE法によるフタル酸分解細菌の特定

ン3‑5)｡次いで,イソフタル酸含有廃水に換えたところ(レーン6‑8),aとcのバンドに変化

2.2.1テレフタル酸とイソフクル酸含有廃水での馴養期間中における細菌群集の変化とフタル表酸分解細菌の特定

Table2In8uence

廃水組成とフタル酸分解菌の出現

2of血凸uent

Ofph血alate‑degrading

図3にテレフタル酸とイソフタル酸両成分を含有
Band

TP＋IPTPIP

a＋一＋＋b＋＋C＋＋(R皿1)における細菌群集の経時変化をRT‑PCR‑DGGEにより解析した結果を示す｡種汚泥(レーン1),および,フタル酸の分解活性のない汚泥

123910TPElimination(g/d00.1 1.2 4.5 6.7 10 9.5 1011IPElimination蜘) 0456783Fig.3

h凸nent2T,Ⅰ T,Ⅰ＋34567891011T

TTⅠⅠⅠTTT

0.1 0.8 1.4 2.9 2.8 2.7 5.9 6.1

ofbacterialcomunitiesin

4Fig.4

Runlにおける細菌群集の変化
C血anges

1Lane

図雪presence

Co皿pOSitionofInfhent

する廃水でグラニエール汚泥を馴養した期間

Lane

thecompositio皿On
bacteria

Runl

原水組成の変化にともなう細菌群集の変化
ChangesCbanges※Thea汀OWSindicatetheDNAbandsw血ichwereobservedin血egranularsludge
W血ich had phthalate‑degrad圭ngactivity.

Iわヱ.4β肋.2(20〃β/2)

神鋼パンテツク技報

ofbacterialcom皿皿ities

ofin仇1eIlt

COmpOSition托)110Wlng

也eは見られなかったが,7日目にバンドbが消失した

酸処理口ASI∋装置内のフタル酸分解菌を特定する(レーン6)｡また,一度消失したバンドbは,廃水組成をテレフタル酸に戻しても復活しなかった(図ことができた｡今回えられた情報は,従来の運転管理方法に加え,微生物学的側面からの運転管理指標

4レーン9‑11,表2)｡を提供するものであり,フタル酸処理装置のより適

今回の実験は,フタル酸を唯一の炭素源とする廃切で安定な運転管理が可能になるものと期待される｡

水でUASB反応器を立ち上げた｡したがって,種汚泥ヤフタル酸分解活性のない汚泥には見られず,分解活性を有する汚泥に特異的に出現するバンド(細菌)がフタル酸の資化,すなわち,分解に関与しているものと考えられる｡
今回の結果から,テレフタル酸とイソフタル酸の[参考文献]

1)R.Ⅰ.Amm皿etal.,Microbiol.Revリ59(1995),p.143
2)R.k.coIwelletal.,Bio/Tec血01.,3(1985),p.817
3)R.K.SaikietalリScience,230(1985)

分解には,少なくとも3種類の細菌が関与しており,

4)R.Ⅰ.Amametal.,Microbiol.Revリ59(1995),p.143
et alリAppl.Environ.Microbiol.,(1993),
5)G.Muyzer

その内2種(aとc)は,両物質の分解に関与しており,残り1種(b)はテレフタル酸だけの分解に

6)M‑Y.Turetal.,J.EnvironEngin.,123(1997),pユ093関与していることが示唆された｡

7)R.瓜e訂ebeze皿et(1999),p,1161

むすび

p.695

alリAppl.Environ.Microbiol.,65

8)J一甘.Wuetal.,Microbiology,147(2001),p.373
9)L.◎weasetal.,Appl.Environ.Microbiol.,64(1997),

最新の分子生物学的手法であるRT‑PCR‑DGGEをもちいることにより,今まで未知であったフタル

p.3367

連絡先
赤司昭(医学博士)

技術開発本部
研究開発部
第5研究室
主任研究員

TEL

O78‑992‑6525

FAX

O78‑992‑6510

E‑maila且kasbi@pantec.co.jp

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