活性汚泥へのフェノール添加による汚泥沈降性の改善と細菌群集の解析
Improvement

SludgeofActivatedAddition

theandAnalysIS

bySettability

PhenoI+Of BacterialCommunlty(技)研究圃発部第5研究室
司赤Akira昭Akashi

活性汚泥にフェノールを添加することによる汚泥沈降性の改善と細菌群集の変化を解析した｡曝気槽へ低濃度のフェノール(50mg/L)を添加することにより,汚泥の沈降性が改善されるとともに,処理水の水質も向上した｡汚泥の沈降性は,フェノールの添加を停止した後約2週間維持された｡活性汚泥の沈降性の向上に関与するとされるZo(瞥わe∂用皿唐打∂はフェノール等の芳香族化合物で増殖が促進されることが知られているが,フェノール添加後の活性汚泥からPCR(Polymerase Ch弧1Reactio□)によって本細菌を検出することはできなかった｡変性剤濃度勾配電気泳動(DGGE)解析および制限酵素断片多型(RFLP)解析の結果,フェノール添加前後で活性汚泥の細菌群集が大きく変化していることが明らかになった｡したがって,フェノール添加による汚泥沈降性の改善は,Zr∂皿吻汀∂の増殖(優先化)によるものではなく,これら細菌群が関与していると推察された｡

Theef托ct

ofphe□01011theta□ktoprovide
Ofactivatedbega皿tOfromactivatedwassludgehas

Weektheability

to

aRer

bulki□gthe

With

theSludge.But

thereachedtwo

WaS□Ottotheofweeks

helpof∬Oma土ic

bacteria

werellOt

phe□01‑treatedactivatedsludge.Thisresultilldicatesthatthei皿prOVe皿elltOfactivatedsludge
duemillimu皿tWO

qualityforsatisfactorily

prOpagate
settlealld

aera土ioll

qualityofefnue血SVI

settability,the皿ailltai□edadditio□･ゐ̀瞥わe∂r∂皿耶is血ow□tO
phe□01a□dolle

theimproveme山Ofsludge

additio□OfphellOl.With
ofdecrease

addedtoa□alysed.Phe□01was

al=□itialcollCe山r血iollOf50〃g/mlfor皿0山toril唱SVI弧dthe
sludgeSettability

wassettabilityofactivatedsludge

Weeksefnuellt
aRer

aRer

alsoi皿prOVed.
stoppil唱

co皿pOu□ds
detectedphellOl
suchbyas

PCRillsettabilityof Zr∂皿塔er∂･growth申)′仲brdゞ:
活性

汚汚泥沈

細tわ上47∧b.J(2仇I且/助菌泥法

降 性群集

ActivatedSludge

sludgeprocess

settability

Bacterialco皿mu血ty

ポリメラーセ連鎖反応

Polymerase

変性剤濃度勾配電気泳動

De□aturil唱gradle山gelelectrophoresis(DGGE)

制限酵素断片多型

Restrictio血圧ag皿e□tlell釘hpoly皿OrpblS皿(RFLP)

神鋼パンテツク技報

chaillreCtioll

まえがき

マーセットをもちいて検出した｡
1.4

活性汚泥法は,設備や運転費用が安価で,かつ,良好な処理水がえられることから,有機性廃水の処細菌群集の解析

フェノール添加前後の細菌群集の変化は,PCR‑理方法として広く採用されている｡しかし,汚泥管

DGGE法4)ならびに,RFLP5)により解析した｡

理,とくに,沈殿槽での同夜分離を常に良好に保持

1.4.1PCR‑DGGE法

することはしばしば困難をともなう｡汚泥の沈降性

フェノール添加前後の活性汚泥を定期的にサンプが悪化すると,SSが処理水中に流出し,処理水質リングし,Zhuらの方法6)によりDNAを精製した｡

が悪化して放流基準を満足できなくなるばかりでな

このDNAを鋳型として,真性細β引こ特異的なプラ

く,曝気槽のMLSS濃度の維持が困難になり活性イマーセット(PRBA338fとPRUN519r)7)をもち汚泥の運転そのものが維持できなくなることにもな

いたPCRにより,16SrRNA遺伝子のV3領域を増りかねない｡つまり,活性汚泥法の運転管理者にとっ幅した｡PCR産物は,35〜50%の変性剤濃度勾配て,汚泥管理は活性汚泥運転上もっとも重要な管理の8.0%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分項目であり,簡単かつ安価に汚泥の沈降性を改善す画した｡る方法が提供できれば,この間題の解決に大きく貢1.4.2献できるものと考える｡

RFLP

l.4.1のDNAを鋳型として,真性細菌に特異的なプライマーセット(27fと1492r)8)をもちいた

活性汚泥が良好な沈降性を発揮するためには安定なフロックを形成することが重要であり,その役割は,Zo(瞥Jα∂属細削こ代表される凝集性細乱

PCRにより,16SrRNA遺伝子のほぼ全領域を増幅すした｡PCR産物をMillnute

PCR

PuriBcatiollKit

なわち,フロック形成細菌が果たしているといわれ(Qiage□,Tokyo)をもちいて精製後,Zeroている｡1)われわれは,活性汚泥に少量のフェノー

TOPO

PCR

Clollug

Kit(Ⅰ□Vitroge□Corp.,Carlsbad,

ルを添加することにより,汚泥の沈降性が著しく改CA,USA)をもちいてクローニングし,大腸菌を善されることを見いだした｡本稿では,フェノール形質転換した｡任意に選出した形質転換体64ケからが汚泥の沈降性におよぼす影響とフェノール添加前

QIAprep

後の細菌群集の解析結果について報告する｡

ちいてプラスミドを精製した後,このプラスミドを1.材料･方法鋳型として上記プライマーセットをもちいて1.1活性汚泥の運転16SrRNA遺伝子を増幅した｡PCR産物は上記精製下水処理場から採取した活性汚泥を種汚泥とした｡

Spi□MimprepKit(Qiage□,Tokyo)をもキットをもちいて精製した｡このPCR産物を制限また,合成廃水(グルコース1.6g/L,ペプトン1g/L,酵素Hae札

酵付エキス0.5g/L)を原水として表1に示す条件でた後,その一部をポリアクリルアミドゲル電気泳動

HhaI,および,HpaIIで別々に切断し運転した｡

し,制限酵素切断パターンを比較した｡

1.2

1.4.3

フェノールの添加と汚泥沈降性の評価

Blu山BLAST相同性検索

上記条件で約2年間運転された活性汚泥に最終濃RFLP解析で,フェノール添加前後で個体数に変度50皿g/Lとなるようにフェノールを断続的に供給化が見られたクローンについては,16SrRNA遺伝した｡汚泥沈降性はSVIにより,2)また,処理水質

子の塩基配列を決定し,データベース上でBLASTはSSおよびTOCにより評価した｡

ホモロジー検索(址p://www.□Cbi.□1m血h.gov/)をお1.3

こない,既知の細菌との相同性を比較した｡

PCRによる叫〃ea∫笥皿如raの検出

フェノール添加2週間前とフェノール添加開始後2週間目(汚泥沈降性が最良であった)の活性汚泥

2.結果と考察
2.1フェノール添加による活性汚泥の沈降性と処理水質の改善から精製したDNAを鋳型にしてLuら3)のプライ

曝気槽に50皿g/Lになるようにフェノールを添加し,フェノール添加による活性汚泥の沈降性,およ
表1活仕汚泥の運転条件
TablelOperationalcondition

MLSS(mg/L)
TOC‑SSLoading(kg/kgSS･d)
HRT(d)
Temperature(℃)
J〝

び,処理水質におよぼす影響を調べた｡園1にフェofactivatedsludge5

process000

25±1

ノール添加前後のSVIと処理水のSS濃度,および,0.1

TOC濃度の経時変化を示す｡フェノール添加前の

2

活性汚泥のSVIは150〜180の範囲で推移したが,フェノール添加開始7日目からSVI値の有意な減神鋼パンテツク技報

W.47∧b.J(2仇I且/劫1243500000チ｡
恥00000晋〓岳亀○●†●○●●●

濫伽

2040の古0(軸)

認諾

30

●

宮古08:㌔●｡:○(暑盟び○←｡｡も妙0｡00汐く〉く〉

ⅧSS●●:外;呈:;琶琶｡::｡｡
80100300

200

12一100

柳皿Tlm￠(血y)

図1

活仕汚泥のSVIと処理水質の経時変化

Fig.1

Changesof

SVIofactivatedsludgeandqualityof2

図PCRによるZo噂Jα∂柑皿唐e佗の横山
Detectionof Zo如フe∂r∂皿留erヨby

Fig.2

effluent

Lanel:100bp

laddersize

PCR

marker

2:DNA‑

activated

少が認められ,2週間後に最小の110まで低下した｡

no1
3:DNA‑

activatedsludgeafteradditionofphenol

その後も130前後で推移し,良好な汚泥沈降性が維

4:DNA‑

addition

ofphe

treatment

municlpalwastewater

5:Negative

持された｡また,汚泥沈降性の改善に伴い処理水質

beforesludgeplant

control.

(SS,TOC)も改善された｡とくに,フェノール添弛nol(‑)

加による処理水SS改善効果は著しく,フェノール添加前は沈殿槽からの汚泥の流出がしばしば観察さ

血y･21‑14‑7p血01(＋)
0p血1(‑)

3l

れたが,フェノール添加後は汚泥の流出は認められ.u̲..̲.+ず,低濃度で安定に維持された｡
次に,フェノール添加を停止し,SVIと処理水質の変化を観察した｡フェノール添加停止後約2週間
SVIは約130で沈降性は良好に保持されたが,その後徐々に増加し,1ケ刀後にはフェノール添加前の150〜180の範囲に戻った｡
以上のように,活性汚泥に低濃度のフェノールを添加することで簡単に汚泥沈降性と処理水質を改善することができた｡また,フェノール添加停止後も【=‑‑･一一一‑一一一一■一■+‑少なくとも2週間は良好な汚泥沈降性と処理水質がフェノール添力‖前後の活仕汚泥のPCR‑DGGE解析維持できることが確認された｡
2.2

Z〃喝血eara皿如raの検出

図二二■∴岩淵拙

Fig.3

活性汚泥の沈降性が良好であるためには,活性汚PCR‑DGGE
beforeanalysIS

andafterOf

eubacterialcommunities

phenoladdition

泥がフロックを形成する必要がある｡フロック形成には,ゐ(窄Jα∂属細菌等のフロック形成細菌が関与していることが知られている｡1)また,ゐ(瞥わe∂後(レーン3)の活性汚泥からは,本β酌ま検出され属細菌はフェノールによりその増殖が促進されるこなかった｡したがって,フェノール添加による汚泥とが知られている｡3)そこで,活性汚泥にフェノー沈降性の向上は,Zルを添加することによる活性汚泥の沈降性の改善が,r∂皿吻汀∂の増殖によるものではなく,別の要因によると推察された｡

ゐ(瞥わe∂属細菌の増殖(優先化)によるものか否2.3かを解析するため,フェノール添加前後の活性汚泥

2.2の実験により,フェノール添加による汚泥沈降性の向上は,フロック形成細菌であるZ

中のZ用皿唐打∂をPCRにより検出した(園2)｡
下水処理場活性汚泥(レーン4)とフェノール添加2週前(レーン2)の活性汚泥には,Z用皿唐e柑の16SrRNA遺伝子に相当する約600bpの明確なバンドが検出されたが,フェノール添加2週
tわ上47∧b.J(2仇I且/助フェノール添加前後の細菌群集の解析

用皿唐e用の増殖(優先化)によるものではなく,別の要因によることが推定された｡そこで,フェノー
ル添加前後の細菌群集を解析することによりその要因を考察した｡

神鋼パンテツク技報

JJ

全体の12.5%を占め,フェノール添加前の活性汚泥

2.3.1PCR‑DGGE法による解析
園3にフェノール添加前,添加軋および,添加ではこれらのクローンに相当する細菌が優先してい停止後の細菌群集の経時変化を解析した結果を示す｡

ることが示唆された｡一方,フェノール添加開始2フェノール添加前(レーン1〜4)は,各サンプル週間後の汚泥からは16グループ(ribotype)の細菌共約25本の主要なバンド(細菌種)が見られた｡まが検出され,フェノール添加前にくらべ,ribotypeた,そのパターンはほとんど変化せず,細菌群集は数(細菌の種類数)が減少していた｡これは,フェほぼ一定に保持されていた｡レーン5〜13にフェノーノール(50mg/L)によりそれらの増殖が抑制されル添加中の群集変化を示す｡フェノール添加開始後たためと推察される｡フェノール添加後の汚泥の細7日間は細菌群集に明確な変化は観察されなかった菌群集は,添加前のそれにくらべ大きく変化していが,10日目以降大きな変化が認められ,細菌種によった｡フェノール添加前に優占種であったribotypelて消失(個体数の減少)するもの,あるいは,増加に属する細菌は減少し,代わってribotype2に属すする種が認められた｡また,フェノールの添加を停る細菌が優占種になり全体の42.2%を占めた｡同様

止した後少なくとも1週間はフェノール添加中の汚に,ribotype札

泥と同じパターンを示し,細菌群集に変化は認めら添加前にくらべ増加した｡一九れなかった｡

8,9,11〜13,および,15〜25に属する細菌はフェ2.3.2

RFLPによる解析

26〜33に属する細菌がフェノール
ribotype3,4,7,ノール添加前にくらべ減少した｡
2.3.316SrRNA遺伝子の相同性解析と細菌の同DGGE解析により,フェノール添加前の活性汚

定泥とフェノール添加により汚泥の沈降性が改善された活性汚泥では細菌群集が大きく異なることがわかっ

RFLP解析の結果フェノール添加前後で個体数にた｡そこで,各細菌の菌数の比較をより定量的にお差異が認められたribotypeに属する細菌が活性汚泥こなうため,RFLP解析を実施した｡RFLP解析は,の沈降性に関与している可能性がある｡そこで,こフェノール添加2週間前の活性汚泥ともっとも沈降れらの細菌の16SrRNA遺伝子の配列を決定し,デー性が良好であったフェノール添加開始2週間後の汚タベース上で既存の細菌の16SrRNA遺伝子との相泥で比較した｡

同性解析(BLAST検索)を実施し,細菌の同定をおこなった｡表2に相同性解析結果を示す｡

制限酵素HaeIII,HhaI,および,HpaIIの切断パターンにより分類した結果を園4に示す｡フェノー

フェノール添加前の活性汚泥で優占種であったが,ル添加前の汚泥中の細削ま25グループ(ribotype)

フェノール添加後に減少したribotypelに属する細に分類された｡それらの中で,ribotypelに属するクβ酌ま,皿Culturedγ‑prOteObacteriumと96%の相同性ローンは,解析した64クローン中18クローン(全体を示した｡同様に,フェノール添加により劣勢になっの28.1%),また,ribotype2に属するクローンは,たribotype3,7,8および9に属する細β酌ま,それ匝童]

血吻e

図
Fig.4

4

フェノール添力‖前後の活仕汚泥中の真仕細菌群集のRFLPの比較
Comparisonof

RFLPofeubacterialcommunities

beforeandafter

phenoladdition

J2

神鋼パンテツク技報

W.47∧b.J(2仇I且/劫2

表Table2フェノール添力‖前後の活仕汚泥の主要細菌のBLAST検索
BLAST

homology

Vatednbotypesludgeanalysisbeforeandafterofといわれている｡相同性検索では,フェノール添加
血1aCti‑eubacteriaにどのような役割を果たしているかまでは推定でき

phenoladdition

MostCloselyRelatedBacterialSeq･前後で個体数に変化が見られた細菌がフロック形成%Identity

なかった｡

むすび

1

Uncultured

Gamma

Proteobacterium962

UnculturedGamma

Proteobacterium94

3Uncultured

Bacteria

Clone

97

より短期間で効率よく汚泥の沈降性を向上させ,か7

UnculturedBacteriumCloneKD5‑5893

つ,処理水質を改善させることに成功した｡前述の

8Uncultured

9

九鬼埠y血りちとびSp･KS710

UnculturedBacteriumClone

2732

Bacteria

Clone

F2‑30

F2‑38

少量のフェノールを曝気槽に直接投入することに96

ように,活性汚泥法にとって沈殿槽での同夜分離を

98
97

良好に維持することはきわめて重要な運転管理項目

少0ム∂Cねr血可〝}】(習e〃e595である｡本法はきわめて簡単な方法で実施可能であUncultured

94

るため,汚泥沈降性の悪化した活性汚泥処理設備のRB13ClO

EubacteriumWD243

改善に貢献しうるものと確信する｡
ぞれ皿Cultured
bacteria

clollebacteria

F2‑30,皿Culturedclolle

KD5‑58,u皿Cultured38およびMetbylocystis

bacteria

clolle93,汎sp.KS7と汎[参考文献]
F2‑98%の相同性を示した｡一方,フェノール添加により最優占種になったribotype2に属する細則ま,皿Cul‑turedγ‑prOteObacteriu皿と94%の相同性を示した｡
同様に,第2優占種であるribotypelOに属する細菌
は,u皿Cultured

bacteriu皿

ClolleRB13ClOと97%の相同性を示した｡

1)Bitton,G∴In
Wiley‑Liss,New

2)下水道試験方法
道協会

Wastewater

Microbiology(1994)p.192,

York

上巻1997年版,p.272,日本下水3)Lu,F.,etal∴Wat.Res.,35,p.4011
4)Muyzer,G.,etal:Appl.Environ.Microbiol.,59(1993)
p.695

5)Moyer,C.L∴Appl.Environ.Microbiol.,60(1994)
p･871

前述のように活性汚泥の沈降性は,汚泥のフロッ

6)Zhu,H.,etal∴NucleicAcidsRes.,21(1993)p.5279

ク形成能と密接に関連している｡汚泥のフロックは,

7)￠vreas,L.,et(1997)p.367

フロックを形成する細菌とフロック形成細菌のフロッ8)有馬

ク形成を阻害する細菌の相互作用により形成される

al∴Appl.Environ.Microbiol.,64

啓,田村学造(鮎):生物による環境浄化(1980)p.21,東京大学山版会

連絡先
赤司

昭

技術開発本部
付｢究開発部買‡5付｢究重主任仙こ先見(医学博士)

TEL

FAX

O78‑992‑6525
O78‑992‑6504

E‑maila.akashi@pantec.coJp

tわ上47∧b.J(2仇I且/助神鋼パンテツク技報

J3