Biosci. Bio1ech. Biochem., 61 (8). 1373-1375, I 997
Note
Inhibition of Sulfur Oxidizing Activity by Nickel Ion in Thiobacillus thiooxidans NBl-3
Isolated from the Corroded Concrete
Yasuo NoGAMI, Terunobu MAEDA,* Atsunori NEGISHI, * and Tsuyoshi SuGio tf

Department o Biological Function and Genetic Resources Science, Faculty of Agriculture, Okayama University, 1-1-1
Tsushima Naka, Okayama 7UU, Japan* Hazama Corporation, Technical Research Institute, 515-1 Nishimukai Karima Tsukuba, Japan

Received December 16, 1996

It is of great importance to find ways to protect concrete fromcorrosion, to maintain the concrete structure for a long time. A
sulfur-oxidizing bacterium, Thiohacillus t/ziooxida11s, has been
known to play a crucial role in concrete corrosion and the concrete
supplemented with nickel was resistant to corrosion. To obtain
biological bases of this Ni protection, the effects of Ni on sulfur
dioxygenase and sulfite oxidase of T. thiooxida11s NBl-3 isolated
from corroded concrete were studied. Nickel sulfate strongly
inhibited a sulfur dioxygenase that catalyzes the oxidation ofelemental sulfur to shlfite and a sulfite oxidase that catalyzes
oxidation of sulfite to sulfate. Nickel sulfate, antimycin A, 211-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide, and myxothiazol inhibited
both sulfite oxidase and ubiquinol oxidase. Reduced mammalian
cytochrome c was not oxidized by a cell extract of strain NBl-3.
The hand a-type cytochromes in the plasma membrane was reducedby sulfite and ubiquinol-2 and these reductions were inhibited by
NiSO ..i. The amounts of Ni in the plasma membrane with or without
0.1 mM nickel treatment were 32.6 and 2.8 nmol/mg protein,respectively. These results indicate that nickel binds to the plasma
membrane and inhibits sulfur dioxygenase and sulfite oxidase, andas a result, inhibits cell growth.
Key words:

sulfur-oxidizing bacterium,
Thiobacillus thiooxidans; concrete: corrosion; nickel

Concrete is considered to be one of the most durable con­struction materials. However, serious corrosion was noted insome concrete structures constructed for sewage treatment. In theprocess of concrete corrosion, hydrogen sulfide produced in the
sewage pipe by the action of sulfate-reducing bacteria is oxidized
by sulfur-oxidizing bacteria to give sulfuric acid. 1 -si The concrete
structure just after construction contains calcium hydroxide andthus has a pH of 12-13. Carbon dioxide in the atmosphere has arole in neutralizing concrete structure and prompts concrete
corrosion. The sulfuric acid produced by sulfur-oxidizing bacteria
accelerates the neutralization of concrete, binds with calcium inthe concrete, and give calcium sulfate, and as a result, decomposes
the concrete.
Sulfur-oxidizing bacteria, Thiobacillus 1hiooxidans, Thiobacillus
neapolitanus, T. intermedius and T. novel/us, were isolated fromthe corroded concrete and sewer systems_ 1.z.s.9i To protect
concrete from the corrosion, endurance tests have been done on
the concrete supplemented with or without additives.10-111
Recently, we have prepared portland cement bars (4 x 4 x 16 cm)
containing various kinds of inorganic and organic compounds andthese bars were hung from the lid of the a sludge tank manhole
and exposed to 5-10 ppm hydrogen sulfide atmosphere. 1 2i After2 years of exposure, it was found that the surface of the portland
cement containing nickel was especially smooth, while that without'

C orrespondmg author

nickel was brittle and rough.121 We isolated T. thiooxiclans NB1-3
from the corroded concrete to study the biological bases of thisprotection of portland cement corrosion by nickel, and showedthat cell growth on elemental sulfur medium is completely inhibitedby 0.1 % metal nickel or 5 mM NiS0 4 and the nickel completely
inhibits elemental sulfur oxidation of this bacterium at IO mM.131
However, the precise inhibition site(s) of nickel in the sulfur
oxidizing system of this bacterium remains unsolved. In T.
thiooxiclans. elemental sulfur is oxidized to sulfite by sulfur
dioxygenase and sulfite thus formed is oxidized to sulfate by sulfite
oxidase.14- 1 71 Thus, we studied the effects of nickel on sulfur
dioxygenase and sulfite oxidase activities. In this report, by using
T. thiooxidans isolated from corroded concrete we first show thatnickel binds to the plasma membrane and strongly inhibits sulfur
dioxygenase and sulfite oxidase.
T. thiooxidans NBl-3 isolated from corroded concrete in
Fukuyama City, Japan, was used throughout this study.131 The
bacterium was grown on a sulfur-salt medium under aerobic
conditions at 30℃ for 170 h.131 The oxidative activity on sulfite
was measured by the oxygen uptake caused by the oxidation of
sulfite in a Warburg manometer.131 Ubiquinone-1 (Q 2 ) was kindly
supplied by Eizai (Tokyo) and the reduced form (Q 2 H 2 ) was
prepared as described by Rieske. 181 Ubiquinol oxidase activity wasmeasured spectrophotometrically at 15 ° C by following the increasem absorbance at』'/.'l nm as described by Matsushita.1"'Oxid 亨
activity for N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD)
was measured spectrophotometrically at 25 ° C by following theincrease in absorbance at 608 nm. Nickel bound to the plasma
membrane was measured as follows. The plasma membrane ofstrain NBl-3 cells (3 mg protein) was incubated in 5 ml of 0.1 M
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid buげer (MOPS buffer), pH
7.0 supplemented with 0.1 mM NiS0 4 for I h at 30℃ The rnem­
brane treated with NiS0 4 was washed three times with MOPS
buffer (pH 7.0), and ashed in a crucible at about 800℃ for 2h.
The ashes were dissolved in IN HCL The amount of nickel wasmeasured by atomic absorption spectroscopy with a Shimadzu
AA-625-01 spectrophotometer using an air-acetylene flame. The
spectral line chosen was 2320 A. The standard solution of nickel
ion was prepared by dilution of the l 000µg/ml standard nickel
solution for atomic absorption spectroscopy (Ishizu Pharmaceu­
tical Co., Ltd.) with I N HCJ.
The effects of nickel sulfate (NiSO ..) on sulfur dioxygenase andsulfite oxidase were studied. Suzuki showed that sulfur dioxygenase
in T. thiooxidans cells stoichiometrically oxidizes elemental sulfur
to sulfite with oxygen consumption in the presence of 2-11-heptyl4-hydroxyquinoline-N-oxide (HQNO) at pH 7.0. 171 T. thioo.ヽidans
NB!-3 produced sulfite from elemental sulfur with oxygen
consumption in the presence of 2 fLM HQNO (Fig. l). The sulfur
d10xygenase activity of strain NB 1-3 was inhibited 91 % and I 00%

1374

Y. NOGAMI er al.
Table Effects o「Inhibitors on Electron Transport Chain on Sulfite
Oxidase Activity
Concentrat1011

Inh1b1tor
None
NaCN

0.1 mM
I OmM
I.OmM
10.0µM
20 OµM゜

NaN 3
Ant1mycm A
2-Heptyl-4-hydroxyqumolme
N-ox1deM1xoth1azol

0.1

20.0µM

Relative sulfite
ox1dase (%)
100
32

゜，゜
6

15

10

NiS04 (mM)

\
＼

＼
,

Fig. I. Effects of Nickel Sulfate on the Activity of Sulfur Dioxygenase
Activity of Intact Cell of T 1hioox1dans.
Sulfur dioxygenase activities of washed intact cells (●） and boiled cells (O) of strain
NBl-3 were measured by the sulfite produced by the oxidation of elemental sulfur
in the presence of 2-11-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide (HQNO) at pH 7.5. The'on mixture with NiSO, (5 ml) contams cells of stram NB 1-3 (0.2 mg of protein),
し ，, Tris-HCI buffer (pH 7.5) (4.0ml), elemental sulfur (0.2 g), HQNO (2 µM) and
NiSO,

\

ー

‘

＼
＼

0
0
0
5
O
dnz
+
ゴ）a1Cll
一
（

＼

400

500

600

Wavelength (nm)2040Time (min)60

f.~ 2. Effects of Nickel Sulfate on Sulfite Oxidase Act1V1ty
Sulfite ox1dase activity was measured by the oxygen uptake caused by the oxidationof sodium b1sulfite in a Warburg manometer. The reaction mixture wnh N1SO ↓(3.0 ml) contains the plasma membrane of strain NB1-3 (I mg of protein), 0.1 M
MOPS buffer (pH 7.0) (2.0 ml), sodium bisulfite (20 µM), and NiS0 4. Symbols: thefollowing concentrations of NiS0 4 were added to the reaction mixture; △，0.01 mM;▲, 0.1 mM; 口，l .OmM; I.ii, 3.0mM; 0, lOmM. Sulfite oxidase act1V1ty was measured
with the reaction mixture without NiSO, (●）
by 3.0 and 10 mM NiS0 4 , respectively.
Sulfite oxidizing activity was located on the plasma membraneof T. thiooxidans. 20- 2 2> Therefore, the effects of NiSO 4 on theactivity of sulfite oxidase was studied with the plasma membrane
of NBl-3. The enzyme activity was inhibited 74% and 94% by
1.0 and IO mM NiS0 4 , respectively (Fig. 2). Sulfate ion that is areaction product of sulfite oxidation did not affect the sulfite
oxidase activity at IO mM (data not shown). Sodium cyanide(1 mM), sodium azide (] mM), antimycin A (lOµM), HQNO (1µM),
and myxothiazol (20 JIM) strongly inhibited sulfite oxidase activity(Table). The plasma membrane ofNB1-3 did not have cytochromec oxidase activity. However, it had ubiquinol oxidase activity(l. 13µmoljmg/min) and TMPD oxidase activity (13. 6111110!/mg/min), suggesting that ubiquinol oxidase. but not cytochrome coxidase functions as a terminal oxidase in T. thiooxidans NB1-3.

Fig. 3. Absorption Spectra of the Cytochromes from T/ziobacillus
thiooxidans NBl-3.
Lines: l.Oml of the plasma membrane or stratn NBl-3 (10 mg of protein) reducedwith sodium hydrosulfite (―) or oxidized wnh potasslUm permanganate (一―-一）．
Ubiquinol oxidase activity was inhibited46 .4%, 64.4%, and 41.3%
by 20µM Antimycin A. 20µM HQNO, and IOµM myxothiazol,
respectively.
The spectra of cytochromes of strain NB1�3 are shown in Fig.
3. The absorption maximum at 557 nm is representative of thea-peak of reduced cytochrome b and the absorption maximum at
6 08 nm is probably a-peak of a-type cytochrome. Effects ofNiS0 4
on the reduction of these cytochromes by sulfite ion was monitoredby the increment of absorbance at 557 nm. The reduction wascompletely inhibited by IO mM NiS0 4 (Fig. 4). Ubiquinol-2 (Q 2 凡）
also reduced b and a-type cytochromes. supporting the idea thatubiquinol oxidase plays a role as a terminal oxidase in T.
thiooxidans NBl�3. Ubiquinol oxidase activity of strain NB1�3
was completely inhibited by 500µM NiS0 4 (Fig. 5). To investigate
whether nickel binds to the plasma membrane of strain NB1�3 or
not、the amount of nickel in the membrane after nickel treatment
was measured by the methods shown in Materials and Methods.
The plasma membrane without nickel treatment contained 2.8
nmol nickel per mg protein. In contrast. the cells treated with
0.1 mM NiS0 4 contained 32.6 nmol nickel per mg protein.
The sulfur oxidation system of T. thiooxidans is composed ofNickel Inhibition of T. thiooxidans Isolated from Corroded Concrete

500

600

10 mM NiS04

3 mM NiS04

none

500

600

500

600

Wavelength (nm)Fig. 4. Effects of Nickel Sulfate on the Reduction of Cytocrome b in the
Plasma Membrane of Strain NBl-3 by Sulfite.

1375

JCM 7814 has only an APS-independent pathway. 16· 20 ·21> In thisreport, it was found that (i) nickel binds to the plasma membrane
and inhibits both sulfur dioxygenase and sulfite oxidase activities
of T. thiooxidans NBl-3 isolated from corroded concrete, (ii) a
ubiquinol oxidase functions as a terminal oxidase in this bacterium
and the activity is inhibited by nickel ion, and (iii) the reductionof cytochrome b by sulfite is inhibited by nickel. The informations
on the membrane bound sulfite oxidase are still limited and there
have been no reports on ubiquinol oxidase in the case of T.
thiooxidans. The reasons why reduction of a-type cytochrome bysulfite was faster than that of cytochrome b and the levels of
inhibition by NiS0 4 and HQNO were different between sulfite
oxidase and ubiquinol oxidase remain unsolved. However, theresults obtained in this report suggest the possibility that the siteof inhibition by NiS0 4 and HQNO is not identical, or that NiS0 4
inhibits more than one site on the sulfite oxidation system of thisbacterium. To clarify the iphibition mechanism of sulfur oxidation
by Ni more precisely, purifications of ubiquinol oxidase from theplasma membrane of strain NBl-3 are now under way.
Acknowledgmenl. We greatly thank Eizai Co., Ltd. (Tokyo) for kindly
providing ubiquinol 2 (Q 2 ).

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The reaction mixture with NiS0 4 (1.0 ml) contains the plasma membrane (20µg of
J. S. Rieske, Methods En::ymol., IO, 239-245 (1967).
protein), O. l M MOPS buffer (pH 7.0) (500µ1), Q 2 凡(30µM), Tween 20 (0.02%), andK. Matsushita, E. Shinagawa. 0. Adachi. and M. Ameyama、Pro し
NiSO,. Symbols: the f'ollowing concentral!ons of NiSO, were added to the reaction
mixture; △， 1 .0/IM; ▲，2.0µM; □，]0.0µM; ■，100 /tM; O. 500µM. Ubiquinol ox,dase
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, 9863—9867 (1990)
activity was measured with the reaction mixture without NiSO, (●）20) K. Nakamura, H. Yoshikawa, S. Okubo, H. Kurosawa, and Y.
Amano, Biosci. Biotech. Biochem., 59, 11-15 (1995).
sulfur dioxygenase and sulfite oxidase.15·17 1 Sulfur-oxid1zmg
21) K. Nakamura, S. Kuribayashi, H. Kurosawa, and Y. Amano、Biosci.
bacteria, such as Thiobacillus denitrifican 231 and Thiobacillus
Biorech. Biochem., 56, 261-263 (1995).
thioparus, 241 are known to oxidize sulfite to sulfate via adenosine r 22) S. Takakuwa, Plant & Cell Physiol.、17, 103-110 (1976).
23) T. J. Bowen, F. C. Happold, and B. F. Taylor, Biochim. Biophys
5'-phosphosulfate (APS-dependent pathway). However, T. thiooxActa, 118, 566-576 (1966).
idans probably does not use an APS-dependent pathway to oxidize24) H. D. Peck, Proc. Nm/. Arne/. Sci. US.A .. 46, 1053-1057 (1960)
sulfite because Nakamura recently showed that T. thiooxidans
The reduction of cytochrome b m the plasma membrane of stram NB 1-3 by sodium
bisulfite was monitored by the increment of absorbance at 557nm due to the�-peakof cytochrome b. The reaction mixture with NiS0 4 (1.0ml) contains the plasma
membrane (10mg of protem); 0. 1 M MOPS buffer (pH 7.0) (500µ1), and sodium
b1sulfite (l.Oµmol )

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腐食コンクリ ー トより単離した硫黄酸化細菌Thiobaci I !us thiooxidans NB1-3株のニッケルイオ
ンによる硫黄酸化酵素活性の阻害［ノ

岡山大農、 噌月組技術研※※
野上康雄、 前田照信 、 根岸敦規 、 杉尾
岡山大学
屯株式会社

ー

剛

農学部総合農業科学科 〒700岡山市津島中1-1-1
間組 技術研究所 〒305茨城県つくば市苅問字西向515-1
1996年12月16日

長期間に渡ってコンクリ ー ト構造物を健全に保持するためにコンクリ ー ト腐食の防止法を開発することは重要である。 硫黄酸化細菌Tllioa
b cillus 山ioox1d
ー
ansがコンクリ
ト腐食に重要な役割を持っていること、 またコンクリ ー トに添加されたニッケルがコ
ンクリ ー ト腐食を遅らせることが報告されているので、 腐食コンクリ ー トより単離した硫黄酸化細菌N
Bl-3株のsulfur dioxygenaseおよびsulfite oxdi sa e
活性に及ぽす ニ ッケルの影響を検討した。 元素硫黄
を亜硫酸に酸化するsulfur
dioxy genaseおよび亜硫酸の硫酸への酸化を触媒するsulfite oxidase活性は
NiSOぶ：よって強く阻害された。 NiSO 4 , antimycin A, 2- .u-- heptyl- 4- hydroxyquinol one- N- oxidide,myxothiazolは、 sulfite oxidaseとubiquinol oxidase活性を阻害した。 NBl-3株の無細胞袖出液は、 還元型のmammaliancytochrome cに対する酸化活性を持っていなかった。 細胞膜のcytochrome bとa型C
ytochromeは亜硫酸および ubiquinol-2に よって還元され、 この還元はNiSO"によって阻害され た。
ニッケル無処理および処理細胞膜の ニ ッケル含量は、それぞれ2.8および32.6nmoVmgタンパク質であった。 こ れらの結果は、 ニ ッケルが細胞膜に結合してSU血r dio羽genaseおよびsulfite oxidase活性を阻害し、 本菌の増殖を阻害することを示している。
ー ー ‘‘

キ リ ト(pp.1373'"'-'1375)

ト]：硫黄酸化細菌； T.tl1ioox1da11s ;腐食；ニッケル

コンクリ ー トは最も耐久性のある材料と考えられてきた。 しかし、 下水処理場のコンクリ ー ト建造物に激しい腐食が発生することが注目され てきた。 コ
ンクリ ー トの腐食プロセスは硫酸塩を還元する。 下
水管中に細菌の作用で生じた硫化水素が硫黄を酸化する他の細菌により酸化され硫酸を生ずることによ!
る - 8) 。打設直後のコンクリ ー トは水酸化カルシウ
ムを含みpHは1213である。 大気中の炭酸ガス
はコンクリ ー トを中和する働きをし、 腐食を早める。
硫黄酸化細菌によって作られ た硫酸は、 コンクリ ー
ミトの中和を促進させ、 コンクリ ー ト中のカルシウムと結合し、 硫酸カルシウムを生成し、 やがてはコン
クリ ー トを崩壊する。
腐食したコンクリ ー トや廃水処理施設からT.tJlio
oxidans、 T.neapoli四11S、
T.iI1tennedius、 T.110veJJ/IS等の硫黄酸化細菌が単離された I , 2, 5, 9) 。 コン~

クリ ー トの腐食を防止するため、 添加剤を加えた耐
IO
久テストが行われている , I I)。 最近では、 我々は受理
゜

各種の有機、 無機の化合物を含んだ爪 ルトランドセメント片(4 x 4 x 16cm)を用いて汚泥タンクのマンホ ー ルの蓋に吊し、 5 lOppmの硫化水素の空気中にさ
口)

~

らした
。 2年間の後にニッケルを含む炉）Vトランドセ
メントの表面は滑らかであったが、 ニ ッケルを含まなI
いものは粗くガサガサしていることが見出された 2) 。
我々は腐食したコンクリ ー トからT.tln·oo立d皿sNBl‘‘0-3株を単離し、 ニ ッケルによるホ )yトラント セメントの腐食の防止作用の生物学的基礎を研究し、 0.1 %の金
属ニッケル又は5mM NiSO• により硫黄元素培地で増殖が完全に防止され、 ニ ッケルはlOmMでこの細菌の元素硫黄の酸化を完全に防ぐことをつきとめIた 3) 。 しかし、 細菌の硫黄酸化機構の正確な防止機構は未だ分かっていない。 T.tl1iooXJ油11Sでは元素
硫黄はsulfur dio羽genaseにより亜硫酸塩に酸化され、 これはsulfite oxidaseによりさらに硫酸塩に酸14
dio羽gensa e
化される - 17) 。 これにより、 sulfurとsulfite o xidaseの作用に及ぽす ニ ッケルの効果が分かった。 本報告では、 まず腐食したコンクリ ー トから単離したT.thioox1d皿sを用いて ニ ッケルが細胞膜と結合しsulfur dio幻genaseとsulfite oxidaseを強＜阻害している状況を述べる。
本研究では、 福山市の腐食したコンクリ ー トから1
単離したT.tlnooxidi111S NBl-3株を用いた 3) 。 細菌
は好気性条件で30℃、 170時間、 硫黄塩培養地で口増殖させた I 。 亜硫酸塩での酸化作用はワ ー ルプ
ルグ検圧計中の亜硫酸塩の酸化によって生ずる酸素
口。 エ ー ザイ社（東京）の吸収度によって測定したの好意によりUbiquino ne- 2 (Q 2)を入手し 、 リIースケ 8) の記述に従って還元体(Q2H2)を準備した。 Ubiquinol oxidaseの作用は分光分析法により
1
松下 9) の記述に従って、 25℃で275mnにおける吸収の増加によって測定した。 N,N,N',11たtetramet
hyl- JL phenylenediamine(TMPD)に対する oxidaseの活性度は分光分析で25℃で608nmでの吸収の増加により測定した。 細胞膜に結合した ニ ッケルは次の ように測定した。 NBl-3株の細胞膜(3mg蛋白）を5mlの0.1M3-(N- morpholino)propanesulfonic酸)\'"ッファー (MOPS/\"ッ7ァー ）中に入れ、 pH'l.OでO.lmM Ni
so 4 を添加し、 30℃で1時間培養した。 NiSO, で処理した膜をMOPS/ドッ7ァー (pH'l.0)で3回洗い、 るっぽで800℃ 2時間で灰化する。 灰分を1N HCJで洗った。 空気アセチレン炎を用い、 島津AA-62501分光光度計で原子吸着分光分析をおこなってニッケルの量を測定した。 選んだスペクトル線は232
OAであった。 1N HCJを用いて原子吸着分光分祈（石津製薬（株））をするため、 1000 J.J. g /ml標準
ニッケル溶液を薄めて標準ニッケル溶液を準備した。
Sulfur dioxygenaseとsulfite oxidaseに及ぽす硫酸ニッケル(NiSOりの 効果を調べた。 鈴木の報告ではT. t111·ooxid皿S 細胞中のsulfur dioxygenaseはpH7.0
で2- n- heptyl- 4- hydroxyquinolineー 炉酸化物(HQNO)の存在下で酸素を消費して元素硫黄を化学盤られている。 しかし、 T.tJ11ooxid皿sは多分酸化にA
PSー依存通路を使っていないと思われる。 なぜなら中村が最近T.山iooxid皿s JCM7814のみがAPS依I 6, 2 0, 2 1)
存通路を持っていると報告している。 この報告で次のようなことが見い出された。 (I)ニッケルは細胞膜と結合し、 腐食したコンクリ ー トから単離されたT.山iooxid皿s NBl-3株の sulfur diox

論的に酸化する 7) 。 T.tl11ooxid皿s NBl-3株は2µ
M HQNOの存在下で酸素 を消費して元素硫黄から亜硫酸塩を生成する（図1)。 3.0および10m1\1 NiS
0 4によりNBl-3株のsulfur dioxygenaseの作用はygenaseと亜硫酸塩oxidaseの両方の活性を阻害する。 (II)Ubiquinol oxidaseのtennmal ox1daseとしての作用はこッケルイオンにより阻害される。 (III)亜硫
酸塩によるcytochrome bの還元はニッケルによっ

各々91 %および100 %阻害された。 亜硫酸塩の 酸化作用はT.tl11ooxid皿Sの細胞膜のところでおこなわ
2
れる o- 2 2) 。 それ故、 sulfite oxidaseの働きに対す
るNiS04の効果はNBl-3株の細胞膜で試してみた。
LOおよびlOmNIのNiSOぷより酵素の活性は各々て阻害される。 膜と結合し た 亜硫酸塩oxidaseの知識は未だ少なくT. 山iooxid皿Sの場合のubiquinoloxid°
aseについての報告も無い。 亜硫酸塩によるaタイ7
゜のcytochromeの還元がb タイフ の場合より早いのはoxidase
なぜか、 また亜硫酸塩 oxidaseとubiquinolの間でNiSO心HQNOによる阻害のレベルが違うのはなぜかについては未知である。 しかし、 本研究で得られた結果から見て、 多分NiSO,とHQNOの阻害の場面が同じでないか、 NiS応はこの細菌の亜硫酸酸化システムの複数の場面で作用しているのであろう。 Niによる阻害メカニズムを更に明確にするた め、 目下NBl-3株からの細胞膜からの ubiq
uinol oxidaseの精製を行っている。

I

74 %および94 %阻害された（図2)。 硫酸塩イオ
ンは亜硫酸塩の酸化により生成したものでlOmM
においてsulfiteoxidaseに影響を及ぽすことはない。
（デ ー タ表示なし）シアツ化ナトリウム(lml'v!)、 sodium azide(lmM)、 antimycin A(lO且M)、 HQNO (1且M)、
myxot1J.iazol(20且M)は亜硫酸塩oxidaseの活性を強＜阻害した（表）、 NBl-3株の細胞膜はcytochrome C oxidaseの働きをもっていなかった。 しかし、 U
biquinoloxidase作用(1認J.J. mol/mg/min)とTMPD oxidase作用(13.6nmo1/mg/min)があり、 T. 山iooxidan
s NBl-3株でterminaloxidaseとして働くのはubiqu
inoloxidaseで あってcytochrome Coxidaseではない。
Ubiquinol oxidaseの働きは20 J.J. M Antimycic A、
20 J.J. M HONO、 および10且M myxothiazolにより各々46.4 %、 64.4 %および41.3 %阻害された。
゜
NBl-3株のcytochromesのい クトルは図3に示す。
557nmでの吸収の最大値は還元されたcytochrome b°
0のa t ー クであり、 608nmでの最大値はa タイ7 cy
゜tochromeのat ー クであると思われる。 亜硫酸塩によるこれらの cytochromesの 還元に対するNiSO aの効果は557nmにおける吸収の増加によって観察した。 還元はlOmM NiSO孔こより完全に阻害された（図4)。 Ubiquinol-2(Q 2 H 2)もやはりbおよび゜a タイフ のcytochromesを還元した。 これは、 ubiqu:inolox:idaseがT且UOOXJaans NBl-3株でterminal oxidaseの役を果たして いることを裏付ける。 NBl-3
株のubiquinol oxidaseの作用は500 J.J. M NiSO孔こより完全に阻害された（図 ー 5)。 ニ ッケルがNB
1-3株の細胞膜と結合するかどうかつきとめるため、 ニ ッケル処理後、 膜中のニッケルの量を「材料および方法」で示した方法で測定した。 ニ ッケル処
理をしていない細胞膜はmg蛋白中2.8nmolの ニ ッケルを含有していた。 これに対しO.lm1\1 NiSO aで処理した細胞は32.6nmolの ニ ッケルを含んでいた。
T. tl1ioox1d皿S の硫黄酸化システムはsulfur dioxyge
Inaseと 亜硫酸塩oxidaseから出来ている 5, I 7) 。 T.
2
dew碑c皿 3) およびT.tl1iopan1s 2 4'のような硫黄酸化細菌はadenosine 5'- phosphosulfate (APSー依存通路）を経て亜硫酸塩を硫酸塩に酸化することが知＜謝辞>
エ ー ザイ株式会社（東京）よりubiquinol- 2(Q 2)が入手できたことを感謝する。

く文献＞
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図1

T.tlnooxida11sの不活性細胞のsulfur dioxygenaseの作用に及ぽす硫酸ニッケルの効果洗浄した不活性細胞(.)とボイルした細胞(0)のsuJfur dioxygenase作用を2 一 正 hepvJl- 4-hydroX'Jquinolin
e 炉酸化物(HQNO)と共にpH7.5で元素硫黄の酸化した亜硫酸で測定した。 NiSOパ5ml)と合わせた混合（本はNB l-3株(0.2mgの蛋白）の細胞、 O.llvI Tris- HCl !\''ッ7ァー (pH7.5)(4.0ml)、 元素硫黄(0.2g)、 HQND(2 ,u M)とN
iSO 4 を含むー

図2

亜硫酸酸化oxidaseに及ぽす硫酸ニッケルの効果

vr‘‘sulfite oxidaseの作用をリー ） ルク の検圧計中での2亜硫酸ナトリウムの酸化による酸素の吸収によって測定した。
NiSO 4 (3.0ml)と合わせた反応混合体はNBl-3株の細胞膜(1mgの蛋白質）、 O.lMMOPSJ\"ッ7ァ-(pH7.0)(2.0m1)、
2亜硫酸ナトリウム(20 ,u. M)、 NiSO 4 を含む。

図3°

T.tl1ioox1da11s NBl- 3株のcytochromesの吸収J.ヘ クト）V（実線））＼イト渭亜硫酸ナトリウムで還元した1.0mlのNBl-3株、 細胞膜(10mgの蛋白）‘ヽ（点線）過マンカ ン酸カリで酸化した細胞膜

表

亜硫酸酸化作用での電子移動チェ ー ンに及ぽす阻害剤の効果

阻害剤

図4

20.0µ_ M

51

NaN3
Antimycin A
2- Heptyl- 4- hydroxyquinoline
N-oxideMixothiazol

O.lmM
l.OmM
l.OmM
10.0mM
20.0µ_ M02
0 0 96
0
ー3

None
NaCN

亜硫酸酸化比率（％）

濃度

NBl-3株の細胞膜中の亜硫酸によるcytochrome bの還元に及ほす硫酸ニッケル効果‘‘

NBl-3株の細胞膜中のcytochrome bの2亜硫酸リ ータ による還元をcytochrome bのaピ ー クによる557nmにおける吸収の増量によって観測した。 NiSO • (1.0ml)と合わせた反応混合物は細胞膜(10mgの蛋白）O.lM MOPD
) \''ッファー(pH7.0)(500は1)、 2亜硫酸ナトリウム(1.0且mol)を含む。
図5

Ubiquinol oxidaseの作用の及ぽす硫酸ニッケルの効果

Ubiquinol oxidaseの作用をubiquinol-2(Q 2 Hりの酸化により測定した。 NiSO • (1.0ml)と合わせた反応混合体
は細胞膜(20はg蛋白）、 O.lM MOPS J\''ッ7ァ- (pH7.0)(500m1)、 Q 2 H 2 (30はM)、 トゥイ ー ン20(0.02 %)、 NiSO淀含む。