LAAN-A-LM027

SHIMADZU APPLICATION NEWS
島津アプリケーションニュース●LC-MSNo.

LIQUID CHROMATOGRAPHY MASS SPECTROMETRY

C55

LC-MSによるタンパク質・ペプチドの分析
Analysis of protein and peptide using LC-MS

生体を構成する主要成分のひとつであるタンパク質は，HPLCによるペプチドマッピング，MALDI-TOFMSによ

生体内でアミノ酸より合成され，抗体・酵素・ホルモン・るマスマッピング等が適用されています。

受容体・生体構造の保持など，体内で重要な役割を果た

本アプリケーションニュースでは，四重極型質量分析しています。産業界におけるタンパク質の利用例は，摂計LCMS-2010EVを用い，ウマ心筋ミオグロビンをモデル

取による食品栄養学的利用以外にも，洗剤用酵素，治療試料とした，LC-MSによるタンパク質の分析およびペプ用医薬品など多岐にわたり，増加傾向にあります。

チドマスマッピング例をご紹介します。

近年，医薬品としてのタンパク質製剤は，生体からのFig.1にミオグロビンの正イオンエレクトロスプレーイ

精製品から組換え技術を用いた製品に移行しており，イオン化（ESI）マススペクトルを示します。シリンジポン

ンシュリン，インターフェロン，エリスロポエチンなどプを用いて，精製タンパク質（5 ％酢酸水，50 ％メタノーが上市されています。品質管理の観点から，組換えタンル溶液）のインフュージョン分析を行いました。m/z 700-

パク質の発現確認は重要な工程であり，ペプチドシーク2000の範囲で，9〜21価の多価イオンが検出されています。

エンサーによるアミノ酸配列分析や，簡便な方法として

S.Yamaki

Int.
Int.
600e317+550e318+

450e3

942.8

400e319+

350e3

893.2

3500e313+998.2

500e3

1305.03000e312+
2500e31413.62000e3

300e3
250e3

11+

20+

200e3

1500e31542.0848.7

150e310+

100e3
50e3

16951.3

4000e315+

16+ 1131.1 14+
1211.81000e3

1696.021+1136.49+1417.7500e30e3
750

1000

1250

1500

1750m/z0e3
16800

Fig.1 ウマ心筋ミオグロビンのマススペクトル
ESI MS spectrum of myoglobin horse heart.

16900

17000

Fig.2 アポミオグロビン中性質量のスペクトルThe zero charged spectrum of apomyoglobin.

(× 10,000,000)
2.50

15TIC

2.25

2.00

1.75

18
1.50

19
1.25

165, 671.00

22210.75178

120.50

23
0.25

114

923
14
13

10

1

20

0.00
0.0

2.5

5.0

7.5

Mass

10.0

12.5

15.0

17.5

Fig.3 ミオグロビントリプシン消化物の全イオンクロマトグラム
Total ion chromatogram of tryptic digests of myoglobin horse heart.

20.0

No.C55
これら多価イオンマススペクトルを代数的演算処理（デ属されます。その結果，このペプチドの分子量は630と計コンボリューション）により中性質量のスペクトルに変算されます。同様にピーク5のマススペクトルからは分子換すると（Fig.2），ミオグロビンの分子量は16951と算出

量2109，ピーク8から分子量1853，ピーク15から分子量1936，されます。アポミオグロビンのアミノ酸組成からの理論

ピーク19から分子量1378，ピーク21から分子量3384と計分子量16951.5（average mass）と比較し，良好な結果が算され，それぞれのペプチドの分子量が算出されます。

得られています。このようにESIでは，目的化合物が複数のイオン化部位を持ち，多価イオンが検出される場合，Table 1に，各ペプチドピークにおける検出イオン，対質量分析計の測定質量範囲を超えて分子量測定が可能な応するトリプシン消化ペプチドイオンの理論m/z 値，ペことが知られています。

プチドの分子量一覧を示しました。トリプシンはタンパ
ク質中のリジン，アルギニンのC末端側を切断するプロ

次にミオグロビンを変性処理後TPCKトリプシンで酵

テアーゼで，タンパク質のアミノ酸配列より酵素消化によっ素消化を行い，ODSカラムを用いてエレクトロスプレーて生成するペプチドを推定することができます（Table 1，LC-MS分析を行いました。Fig.3にトリプシン消化物の全右欄）。ピーク4のペプチドはミオグロビンの一次構造とイオンクロマトグラム（TIC）を示します。おおよそ40ピーの比較から，T140-145（N末端140から145番目）に対応

クが検出されました。代表的なピーク成分のマススペク

すると判断されます。本分析では分子量600〜3500のペプ

トルをFig.4(a)〜(f)に示します。ピーク4ではm/z 316, 631

チドが確認され，それぞれトリプシン消化ペプチドのアにイオンが検出され（Fig.4a），それぞれ2価プロトン化

ミノ酸配列に対応させることができました。

2+および1価プロトン化分子［M+H］+と帰分子 ［M+2H］

Inten.(× 100,000)

Inten.(× 100,000)

316.1+23.0(a)Peak 4:T140-145
MW 630.3

1.00+6352.5423.1+5

Peak 5:T78-96
MW 2109.1(b)

2.50.75+42.0528.7
0.50

+11.5

631.4
1.00.25
0.5+3224.1 372.20.0(c)

500

750

1000m/z

250
Inten.(× 100,000)
2.5

371.7 +51.00

Peak 8:T80-96
MW 1852.9

750

485.3

+4m/z

1000

Peak 15:T32-47
MW 1936.0

2.0+5+4388.3
1.50.75

1.00.50+3+30.25+2339.2 415.6
250
Inten.(× 100,000)(e)646.80.5

618.8

0.00

2.5500

(d)

464.7

3.0

1056.30.00
250
Inten.(× 100,000)

1.25+2704.4

349.9

560.0

927.9
500

750

1000

0.0m/z250
Inten.(× 100,000)

500

Peak 19:T64-77
MW 1377.8

839.1

969.0

750

1.25

460.3 +3+2691.8

1000m/z

677.9

+5(f)
+61.00Peak 21:T103-133
MW 3383.6

565.1

2.00.75
1.5+40.501.0

847.5+2690.3
0.25

0.5

716.8
0.00.00
250

500

750

1000m/z

250500+3888.9

750

Fig.4 トリプシン消化ペプチド（T140-145, T78-96, T80-96, T32-47, T64-77, T103-133）のマススペクトル
Mass spectra of tryptic peptide T140-145, T78-96, T80-96, T32-47, T64-77 and T103-133

1130.31000m/zNo.C55
Table 1

トリプシン消化ミオグロビンからの検出ペプチド
Detected peptides of tryptic myoglobin

NoR.T.
(min)

Detected ions(m/z)

Theoretical m/z value(charge state)

Molecularweight1

1.2

T51-56 : TEAEMK

1.3

1101.5

T48-50+T51-56 : HLKTEAEMK

3

1.5

789.4

T57-62+T63 : ASEDLKK

42.3

630.3

T140-145 : NDIAAK

52.7

2109.1

T78+T79+T80-96 : KKGHHEAELKPLAQSHATK

62.8734.5

T97-98+T99-102 : HKIPIK

73.1

1981.0

T79+T80-96 : KGHHEAELKPLAQSHATK

83.61852.9

T80-96 : GHHEAELKPLAQSHATK

93.9683.4

T43-45+T46-47 : FDKFK

106.2

1501.7

T119-133 : HPGDFGADAQGAMTK

116.91270.6

T32-42 : LFTGHPETLEK

127.8940.4

T146-147+T148-153 : YKELGFQG

13148.3
8.6649.3
1605.8

T148-153 : ELGFQG
T17-31 : VEADIAGHGQEVLIR

159.2

1936.0

T32-42+T43-45+T46-47 : LFTGHPETLEKFDKFK

1610.31359.7

T134-139+T140-145 : ALELFRNDIAAK

1710.6

747.4

T134-139 : ALELFR

1811.81913.42015.32115.7

22

16.9

23

18.5

362.7 (+2)
724.3 (+1)
368.1 (+3)
551.8 (+2)
264.1 (+3)
395.7 (+2)
790.4 (+1)
316.2 (+2)
631.3 (+1)
352.5 (+6)
422.8 (+5)
528.3 (+4)
704.0 (+3)
1055.6 (+2)
245.8 (+3)
368.2 (+2)
735.5 (+1)
397.2 (+5)
496.3 (+4)
661.3 (+3)
991.5 (+2)
371.6 (+5)
464.2 (+4)
618.7 (+3)
927.5 (+2)
228.8 (+3)
342.7 (+2)
684.4 (+1)
501.5 (+3)
751.8 (+2)
424.5 (+3)
636.3 (+2)
471.2 (+2)
941.4 (+1)
650.3 (+1)
536.3 (+3)
803.9 (+2)
388.2 (+5)
485.0 (+4)
646.3 (+3)
969.0 (+2)
454.2 (+3)
680.9 (+2)
374.7 (+2)
748.4 (+1)
377.4 (+4)
502.9 (+3)
753.9 (+2)
460.3 (+3)
689.9 (+2)
605.9 (+3)
908.4 (+2)
564.9 (+6)
677.7 (+5)
846.9 (+4)
1128.9 (+3)
472.0 (+4)
629.0 (+3)
943.0 (+2)
851.7 (+4)
1135.3 (+3)

723.3

2363
724
368
552
264
396
790
316
631
352
423
529
704
1056
246
368
735
397
496
661
992
372
465
619
927
229
343
684
501
752
424
636
471
941
650
536
804
388
485
647
969
454
681
375
748
377
503
754
460
690
606
909
565
678
847
1129
472
629
943
852
1135

1505.91

Estimated peptides (sequence)

T63+T64-77 : KHGTVVLTALGGILK

377.8

T64-77 : HGTVVLTALGGILK

1814.9

T1-16 : GLSDGEWQQVLNVWGK

3383.6

T103-118+T119-133 :YLEFISDAIIHVLHSKHPGDFGADAQGAMTK1884.0T103-118 : YLEFISDAIIHVLHSK

3402.7

T1-16+T17-31 :GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRNo.C55
今回検出したペプチドは，フリーのリジンを除いてミ

なお質量分析では原理上，分子量の等しいロイシンとオグロビンのすべてのアミノ酸領域をカバーすることがイソロイシンの区別ができません。また四重極型MSの分確認できました（Fig.5）。以上の結果から，エレクトロ

解能は質量差0.04 Daのグルタミンとリジンの区別は困難

スプレーLC-MSは，組換えタンパク質の発現確認や，構です。これらアミノ酸を含むペプチド組成の確定にはア

造既知ペプチド中の構造変化の確認，またペプチドシー

ミノ酸組成分析法の併用が有効です。また構造未知ペプ

クエンサーのデータを補完する分子量情報を得る手法とチドのde nove 配列解析には，ハイブリット型質量分析計して有用であることが分かります。

LCMS-IT-TOFなどのMS/MS装置による分析が有効です。

Fig.5 ウマ心筋ミオグロビンのアミノ酸配列
Amino acid sequence of myoglobin horse heart

Table 2LC-MS分析条件
Analytical conditions for LC-MS

Column: Imtakt Cadenza CD-C18 (1.0 mmI.D. × 75 mmL.)
Mobile phase A: 0.1 % formic acid - water
Mobile phase B: 0.1 % formic acid - 70 % acetonitrile
Time program: 5 %B (0 min)→80 %B (30 min)Flow rate: 0.05 mL/min
Injection volume: 5 µL
Column temperature: 40 ˚C
Probe voltage: +4.5 kV (ESI-Positive mode)
CDL temperature: 250 ˚C
Block heater temperature : 200 ˚CNebulizing gas flow : 1.0 L/min
Drying gas pressure : 0.02 MPa
CDL voltage: + 10 V
Q-array DC voltage : Scan-mode
Q-array RF voltage: Scan-mode
Scan range: m/z 200-1200 (1.0 sec/scan)

初版発行：2007年7月

分析計測事業部
応用技術部※本資料は発行時の情報に基づいて作成されており，予告なく改訂することがあります。改訂版は右に示す島津WEBで閲覧できます。

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3100-07702-660-IK
2007.7