ISSN 1347-4804

October 2019Vol.87 No.4

水平型共培養容器「UniWellsTM」の模式図（左）と実物の写真（右）〔総説〕「「生体暗証番号」解読のための共培養研究とエクソソーム」

島崎

猛夫……… 2

「新規組織化学染色脱色法」

小澤

秋沙……… 8

「Wakopak® Core C18 ADRA を用いた皮膚感作性評価法“ADRA”の習熟化合物の分析例」

須藤

勇紀……… 10

〈テクニカルレポート〉【連載】〈ペプチド医薬合成基礎講座〉「第 3 回ペプチド合成の新展開

山本法と NCL」

佐藤

健太郎……… 12〈エクソソームと生命現象〉「第 7 回

エクソソームとがん」

小坂

展慶……… 14

洲﨑

悦生……… 16

〈基礎から応用までよくわかる組織透明化技術〉「第 3 回CUBIC を用いた組織透明化と 3 次元観察」〔化学大家〕「セント＝ジェルジ・アルベルト」

仲野

徹……… 29〔製品紹介〕
有機合成

細胞生物

ゼオライトパック… ………………………………………… 23

りん酸化 Tau T181 ELISA キットワコー、Tau ELISA キットワコー…… 24

核酸合成用 反応補助試薬… …………………………… 23

貴金属ナノコロイド「i-colloid®」シリーズ … …………… 27

環境・分析

遺

ADRA 用カラム、試薬キット……………………………… 11

Cas9 タンパク質 /gRNAトランスフェクション試薬

OA･DTX1 混合標準液…………………………………… 20「GenomONE ®-GE 」……………………………………… 26

高純度 NMR 溶媒………………………………………… 20

培

ポジティブリスト関連農薬・動物用医薬品標準品… …… 21

水平型共培養容器「UniWellsTM」………………………

ICP 分析用単元素標準液………………………………… 22

ヒト iPS 細胞由来疾患モデル細胞「iCell® DDP」……… 28

HM1000A 用 8 種フタル酸エステル混合試料… ……… 22

病

L

組織標本脱色試薬…………………………………………

AL

リムルス ES-Ⅱシリーズ、PYROSTAR

TM

ES-F シリーズ… … 32

伝

子

養

6

理

9

CUBIC Trial Kit… ……………………………………… 19〔お知らせ〕
第 35 回 Wako ワークショップ開催のご案内… ……………………………………………………………… 7
農薬・動物用医薬品標準品・混合標準液カタログのご案内………………………………………………… 21
神経科学研究用試薬カタログのご案内………………………………………………………………………… 25

1

R

esearch「生体暗証番号」解読のための共培養研究とエクソソーム

はじめに

島崎

猛夫

のメリットは、まさに基本的な機能解ム内に含まれる機能性物質の解析によ析であり、機械に例えればスイッチをり、疾患マーカーとして、治療ター

押すとどうなるか試してみたというこ

ゲットとして、治療応用としての研究

近年、生物学においてエクソソームとである。しかし、このような研究手が盛んになっている。特に miRNA がを含めた細胞外小胞が各種細胞のコ法は、ただスイッチを押すだけであ

エクソソームに含まれ細胞間を移動す

ミュニケーションに大きな役割を果た

り、実際の生体では、多量の抽出エクる可能性が示されて以来 6, 7）、エクソ

していることが明らかになり、論文数

ソソームが投与されたのと同じことがソーム内 miRNA の解析研究が盛んには劇的に増加してきている。現在のエ起こるのか？言い換えれば、それ程のなっており、疾患をスクリーニングでクソソーム研究の主流は、各種疾患に強いスイッチが押されているかも不明

きるとする報告が相次いでいる。エク関係すると思われるエクソソームをである。また、この研究手法では生体ソソーム研究は、主に３つのアプロー

抽 出・ 解 析 す る 手 法 で あ り、Liquidに「暗証番号のような仕組み」（Figureチで行われていることが多い。①エク

Biopsy と表現されている手法の一つ

1.）があり、その強さ、順番などが大ソソームを取り出し、内包物を解析すである。しかし、エクソソームは細胞きく関係している場合には、全く役にる研究、②取り出したエクソソームを間相互作用のキープレーヤーであり、立たない。

他の細胞などに投与して反応を確かめ

真にエクソソームを介した細胞が持つ

論文投稿を予定しているため詳細はる研究、③エクソソームをラベルして機能や疾患の特性を解析するには、エ

割愛するが、我々は生体には「生体暗細胞内での動態解析及び①～③の組み

クソソームを抽出し解析するといった証番号のような仕組み」が存在してい合わせの研究である。これらの手法を体力測定的な研究だけでなく、練習試

ることを確認している。エクソソーム

もっと単純に分類すると、エクソソー

合のように生体内で起きている現象をを抽出し、他の細胞に投与する研究はムを抽出するか否かで大分類が可能でin vitro でも再現し、相互作用研究を

単独のスイッチ機能の解析には有用である。

行う必要がある。

あり、これからも基本的な解析手法でここで重要な点は、エクソソームをというのも、これまでのエクソソー

あ る こ と に 変 わ り は な い。 し か し、抽出・精製し、別の細胞に添加し、細ムに関する機能解析を目的とした基礎「生体暗証番号」を解析するには、抽胞への取り込みや細胞の変化を解析す研究では、大雑把に表現すれば、例え出手技を伴わず、細胞同士の自然な相る実験において、１）抽出する際の手ば、がん細胞から抽出したエクソソー

互作用観察を可能とする共培養研究が法によるエクソソーム集団の特徴に注

ムを他の細胞に投与して、その細胞の有用である。これまでに共培養を利用意が必要であり、２）抽出した多量の挙動を観察・解析し、そのエクソソー

した研究は多く行われているが、現時

エクソソームによる現象が生体内でのムが持つ機能を論じていることが多点で共培養技術を利用したエクソソー

現象をシミュレーションしているかどい。その上で、そのエクソソームに含ム研究は比較的少ない。エクソソーム

うかは明らかでない、ということであまれる内包物を解析し、その内包物のの本態である相互作用を解析するためる。

機能について分子生物学的手法を駆使には、共培養技術の活用は重要であ１）抽出手法による影響についてしてさらに解析する。このような手法

り、エクソソームについての詳細な解

エクソソームを抽出した解析を行う説は多くの総説をご一読いただくとし場合は、回収されたエクソソームは抽て、本稿では、生体における暗証番号

出方法により性質の偏った集団になるを解読するためのエクソソーム研究手

場合がある。というのも、各種抽出手法における注意点と解読ツールとして法は、その回収効率について議論されの共培養システムについて解説する。

ることが多いが、そもそも回収したエエクソソーム研究の注
意点についてクソソームの性質も抽出方法に影響をFig 1．生体暗証番号の概念図

2

株式会社ギンレイラボ

受けたものしか集められていないという点に注意が必要である。

これまでには、エクソソーム研究でエクソソームの抽出法には、超遠心

は、血液などの生体由来の検体や細胞を 利 用 し た サ イ ズ 分 画、 あ る い は、

培養上清に含まれるエクソソームを抽フィルターや微細孔をもつ構造物によ出して解析する研究が主流を占めておる分画、ゲルろ過を用いた抽出速度のり、Liquid Biopsy として数多くの報違い、表面に発現している蛋白質やテ告がある 1-5）。これらは、エクソソー

トラスパニンを利用した抗体や親和性

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）

物質による分離など、エクソソームのCD63 などのテトラスパニンが検出さソーム研究方法であることは間違いな抽出方法は乱立している。

れる小胞であること以外の絶対的な指い 16-21）。

抽出方法が乱立している理由は、エ標は存在せず、それゆえ、これまではクソソームの何たるかがわかっていな

超遠心を用いてある一定のサイズ分画

いことである。エクソソームを含めたに検出される小胞であるか、あるい細胞外小胞は、初期の報告では、血小は、各種市販抽出キットで処理を行っ

これまでに注意点として述べたエク板や赤血球から分泌され、細胞のゴミた小胞で、そのサイズを確認して、テソソーム研究の課題をクリアする研究として理解されていた 8, 9）。1983 年にトラスパニンが検出されることをもっ手法が存在する。それは、抽出を行わ

Johonstone 博士が羊の網状赤血球かて「エクソソームを抽出した」としてず、細胞が分泌したものをそのまま間ら分泌された小胞に対してエクソソーいる研究が多い。

接的に相互作用させる系である細胞共10）「生体暗証番号」解読のための共培養研究。多くの細胞がエク

我々の解析では、表面のテトラスパ

培養である。細胞共培養は、それぞれソソームを分泌し、血液などの体液にニン量は一定ではなく、細胞種や細胞の細胞の自然な相互作用を観察するこも存在する。エクソソームは、多くのの状態によって発現の有無、発現量はとができる。また、細胞同士の自然な機能が未知で、蛋白質や核酸などを内大きく異なっており、さらには薬剤に相互作用は、あたかも細胞同士で「生包している。脂質二重膜を持ち細胞膜

よってその発現量も変化する。そのた

体暗証番号」を押しあっている研究でを 4 回貫通する構造を持つ膜蛋白質

め、CD9 や CD81 な ど の テ ト ラ ス パ

あり、単なるスイッチを押しただけのファミリーであるテトラスパニン、膜ニンに対する抗体反応を利用して定量ような現象とは異なる現象が観察され輸送蛋白質、インテグリンなどの接着するキットの場合は、そのようなことることも多い。つまり、「生体暗証番分子を持つ。エクソソーム以外に、細を念頭に置いた解析をお勧めしたい。

号」を解読するためには、まずは細胞胞が分泌する細胞外小胞には、エクソ

つまり「見たいものしか見ていない」

同士の相互作用研究である共培養研究

ソームよりやや大型サイズで形質膜由可能性に注意を払う必要がある。我々をお勧めしたい。

来のマイクロベシクルや、細胞がアポは、出来るだけ表面マーカーが特定の共培養研究は細胞間コミュニケー

トーシスを起こす際に放出されるアポ集団のエクソソームにならないようション研究として 1980 年代に広まり、

トーシス小体なども含まれる 11）。用に、超遠心法あるいは脂質への接着を

以後各領域研究において使用されてき語の定義が研究者間で統一されていなTM利用した簡便なキット（MagCapture

た。共培養システムを研究に用いる主かったため、混乱していた時期もある

エクソソームアイソレーションキット

な動機は、細胞や微生物間の相互作用

が、近年は、国際細胞外小胞学会を中PS）を用いて解析を行っている。

を研究することや心にエクソソームの概念が統一されつ

２）エクソソームの投与実験における互作用を利用した新たな細胞工学の手ムと命名したつある。細胞外小胞は、現在主に３つ

注意点

22）

、そのような相法を開発するためである 23, 24）。エクソのグループに分けられている。（1）直抽出したエクソソームを標識して他ソームに関する共培養研究において、

径 50nm-150nm の サ イ ズ の 脂 質 二 重の細胞や動物に投与して解析する手法

エクソソームの表面マーカーである膜を含むエクソソーム、（2）100nm-も用いられている。蛍光プローブを用

CD63 や CD81、CD9 などを蛍光標識

1000nm の細胞から直接分泌された小

いて標識し、エクソソームのイメージ

し、細胞内動態や細胞への取り込みを胞のマイクロベシクル、（3）アポトー

ングによる解析 12, 13） や、酸化鉄ナノ研究する方法がある。これらの研究のシスを起こした細胞から生じるアポ微粒子をプローブとしたエクソソーム

利点は、エクソソームを介した自然なトーシス小体である 11）。特にブレイの標識方法 14, 15） も用いられている。

作用を観察することができる点にあクスルーな出来事として、2006 年か

しかし、精製されたエクソソームが大る。 し か し、CD63 な ど の 表 面 マ ー

ら 2007 年 に か け て miRNA や RNA量に投与されたことによる結果は、本カーの発現は、細胞の種類や状態にがエクソソームに含まれており、エク来の生理的な機能とは異なる結果をよっても異なり、一部の表面マーカー

ソソームを介して細胞間を移動する可導き出している可能性に注意が必要

は発現していない細胞も存在する。ま

6, 7）

。以後

である。量が多いと逆の反応を示す経

た、蛍光標識を使った研究について

世界中の研究者が細胞外小胞に注目路も存在するため、濃度的な確認も重も、標識分子の識別精度といった光学

し、様々な分野におけるエクソソーム

要な要素である。しかし、これまでに特性上の課題も残っている。しかしこ

研究が飛躍的に発展した。しかし、依多く行われている投与実験である「スれらの手法は、生体内で行われている

然としてエクソソームは、脂質二重膜

イッチを押したらどうなるか？」的な細胞間相互作用を研究するための重要を 持 つ 何 か で あ り、 表 面 に CD9 や解析研究は、一つの確立したエクソな研究手法である。共培養システムを能性が示されたことである

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）3

利用したエクソソーム研究は増えてき

り、細胞集団として解析することがで

これら以外に培養液を交換する方法 32）ており、例示すると、エクソソーム表

きるのみである。また接触による直接もバクテリアなどの研究では用いられ面に局在する蛋白質である CD63 との作用だけでなく、実際には、液性因ている。フィルターを使い上下方向に

GFP との融合蛋白質を利用して、エ子による影響も混ざっている点に注意

容器が接続するタイプの共培養容器

クソソームの挙動の可視化を試みた報が必要である。そのため、手軽ではあは、Boyden chamber33-35） あ る い は、、Mesenchymal stroma stem cells

るが、結果の解釈が難しくなる。一

Boyden chamber を改変した Transwell®

（MSC）由来のエクソソームが乳がん

方、間接共培養は、細胞を別々の環境

co-culture plate が標準的に使用され細胞に取り込まれ、MSC 由来の細胞におき、細胞間相互作用は、液性因子てきた。Boyden chamber は、1962 年、MSC 由来のを介して行われる。培養容器やフィルに Stephan Boyden により開発され、CD90 が共培養で発現したことを明ら

ター、ゲルなどを用いて細胞が直接物

上下で培養容器を接続し、上側の培養、蛍光標識を用いた理的に接触しない状態に置いてから容器の底面をフィルターにすることに実験として、エクソソームの交換・移細胞同士の作用を観察するため、間接より、フィルターを介して共培養するがある。これ的な液性因子による作用を明らかにす方 式 で あ る。Transwell® co-culture

までにも、細胞を混ぜない培養研究とることができる。間接共培養の技術

plate 以外に、一般名として Cell culture

して、上下タイプの共培養容器を使用

は、主に３つの方法に分けられる

31）

insert と呼称されることも多い。初期

した実験は、一つの重要なモデルであ（Figure 2.）。①フィルターで分離すは、invasion などの評価に用いられたる。糖尿病モデルラット心筋細胞とマるタイプ、②ゲルなどの半固形物を利が、これまで多くの間接共培養の方法

ウス心筋内膜細胞との共培養で血管増用して細胞同士を分離し、ゲルを介しとして標準的に用いられるようになっ生が抑制され、エクソソーム及びエクて因子を交換するシステムタイプ、③た。しかし、上側にある培養容器の細ソソーム中の miR-320 が関与してい完全な分離はできないが、段差や水滴胞は、顕微鏡の焦点距離の問題によや、Virusなどを利用して細胞をコロニー状に培り、精細な画像を得ることが難しく、由来の miRNAs がエクソソームを介養し、分離物を用いない方法である。

また上側の細胞培養容器の底面の素材

告11）

能力を獲得した報告
かにした報告25）

25）

行を確認した報告

25-27）ることを証明した報告

27）

して、他の細胞に伝達されることを証明した報告もある 28）。また、Transwell®
co-culture plate の膜の上下で細胞を培養し、直接細胞が接触しない条件
で、エクソソームを介して細胞の性質が変化することも報告されている 29, 30）。
In vitro BBB モデルでは、Transwell®
co-culture plate を使用した報告がある 13）。脳血管内皮細胞、ペリサイト、
アストロサイトの 3 種類の細胞を共培
養 し た モ デ ル で あ り、 血 液 脳 関 門（BBB）を模擬している。これらは、
co-culture plate を上手に利用している。

共培養研究の方法について
既存の共培養システムは、一般的に細胞同士の接着の状態により、接触型の直接共培養と非接触型の間接共培養の２つのグループに分けられる。細胞を混ぜる方法は、直接共培養であり、細胞同士は直接接触している。直接共培養は一般的によく行われるが、一つFig 2．共 培養方法の概略

一つの細胞を解析するのが困難であ4

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）

が、下側の細胞培養容器の素材と異なるといった不利な点がある。細胞の挙動は、底面の素材により影響を受けることも多く、底面の素材が異なる影響は大きい。また、フィルターを一体化して容器を作る必要があるために、フィ
ルターの種類は少なくなってしまう。
また、共培養に関する効率の点でも、上下タイプの共培養容器は、その構造上の特性からどうしても、バケツの中にバケツを入れたような構造となってしまう。そのため、容器の容積比が１：３といったように大きく異なり、細胞が分泌した液性因子の希釈が起こってしまう。また、上側の容器の細胞はフィルターの上に位置するため、細胞密度が高くなるとフィルターの穴を塞ぐことになり、共培養効果が時間とともに低下してしまう。

Fig 3．共培養容器の使い方

意外なことに、横方向に接続するタ考えられる 24）。

イプのフィルター分離タイプの容器はとなり、かつ両者の細胞を下面から存在しなかった。最近、バクテリア研

同時観察が可能なことである。使い方

究のための横方向の容器の報告があるには、２つの方法があり、１つは、単が 32）、観察を目的としていない。我々体で培養した後、２つの容器を接続

は、横方向接続型の新しい細胞培養容（結合）して共培養する方法である。

様々な研究が展開されているがん、器で、顕微鏡で観察が可能な水平型共

もう１つは、最初から２つの容器を接免疫疾患、神経疾患、再生医療分野だ

培養容器を開発した（UniWellsTM : 富

続して組み立てておき、接続面までのけなく、現在は原因やメカニズムが未士フイルム和光純薬株式会社より販高さを利用して、共培養状態をコント

知の疾患についてもエクソソームの関売）。

エクソソーム研究の今後についてロールする手法である。組み立ては容与が明らかになってきている。エクソ

我々が開発した共培養容器 31） であ易であり、研究者は任意の 2 つの方法

ソームと疾患に関する研究は、エクソ

るため、本稿にてご紹介すると、容器を選択して使用することができる。ゲソームの抽出方法が標準化していないと容器の間に市販の任意のフィルタールなどを利用して３D 培養を行えば、という注意点はあるものの、疾患とエを入れることができる培養容器であ3D 培養での共培養も可能である。セル

クソソーム内包物の関係が明らかにり、それぞれの容器は単体でも培養でカルチャーインサートタイプの容器なってくると思われる。しかし、エクき、任意の時点で 2 つの容器を結合すは、上下方向で培養容器を繋いでいる

ソソームに関する生理学的機能、分ることができる。別々の環境で培養しため、顕微鏡で両方の細胞を同時には

泌・取り込みの基礎的なメカニズムにてから共培養に持ち込み、培養液の量観察できないが、我々の開発した共培関する知見がまだまだ不足しており、をコントロールすることで容易に共培

養容器は、水平方向に接続させている

特に生体内にあたかも暗証番号のよう養状態をコントロールすることもできため、両方の細胞を同時に観察するこな相互作用システムが存在する可能性

る（Figure 3.）。この水平型共培養容とができる。いずれのシステムを用いを考えると、革新的な研究を成し遂げ

器の最大のメリットは、細胞とフィルるにせよ、Co-culture systems は、細るためには、共培養システムを用いた

ターの位置関係が離れていることか

胞間相互作用を観察する研究や、細胞

エクソソーム研究が重要であると考えら、前述のデメリットであった細胞高の相互作用を利用する細胞工学技術にている。共培養システムを利用した先密度による液性因子の移動性低下も認とって有効である。共培養システム

駆的な研究が多く行われることにより、めず、また容器の容積比も１：１であは、細胞工学にとって様々な手法を提今後エクソソームを介した「生体暗証ることから、共培養効果は最大の効率供可能にし、薬剤探索にも大変有効と番号」が解明されることを期待する。

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）5

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35）A lbini, A. et al . : Cancer Res ., 47, 3239
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共培養が変わる
水平型共培養容器 UniWellsTM
本品は、細胞間相互作用研究用の新しい培養容器です。従来は、一般的に上下タイプの共培養容器が用いられていました。上下タイプの共培養容器の問題として、両細胞を同時に顕微鏡などで観察できない、培養容器底面の素材が異なるため細胞の挙動が変わる可能性がある、細胞でフィルターが詰まる点が挙げられます。本品は、これらの欠点を解消する「横に接続する方式の細胞培養容器」です。

特長● 2 細胞の顕微鏡観察が容易●同時観察が可能● 2 細胞を同一条件で培養可能●ウェル間のフィルターが目詰まりしにくい●それぞれの細胞を独立して培養可能●滅菌済み

UniWellsTM Horizontal Co-Culture Plate  1 個

コード No.

メーカーコード

384-14421

2501-02FW

388-14441
381-14431

2525-06FW
2525-003FW

385-14451

2596-01FW

品
名用
途
培養容器本体
UniWellsTM Horizontal
Co-Culture Plate（材質：ポリスチレン）
専用フィルター（孔径 0.03μm）
UniWellsTM Filter 0.6μm
UniWellsTM Filter 0.03μm 専用フィルター（孔径 0.6μm）
96 ウェルプレートサイズのホルダー
UniWellsTM Adapter 96
UniWellsTM 本体を 8 個セット可能

容 量
希望納入価格（円）
10 セット58,000（計 20 個）50 枚
23,00050 枚
35,000１個

30,000

関連商品
コード No.
299-77603
293-77601

品
TM

MagCapture

名規

Exosome Isolation Kit PS

格

遺伝子研究用

容 量
2 回用
10 回用

希望納入価格（円）20,00080,000…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

6

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）第 35 回

Wako ワークショップ「ミクログリア研究の最前線 －基礎から臨床へ－」
日時：2019 年 11 月 12 日（火）10：00 〜 17：00（終了時間は変更になる場合があります。）

場

所：秋葉原コンベンションホール
〒 101 - 0021

オーガナイザー：津田誠

東京都千代田区外神田１丁目 18 -13

九州大学

大学院薬学研究院

秋葉原ダイビル２F

ライフイノベーション分野

主催：富士フイルム和光純薬株式会社

定

員：250 名（申し込みは先着順で、定員になり次第、締め切らせていただきます。）

参
申

加
込

費：無料（事前登録制）
方

法：下記ホームページ「応募フォーム」よりお申し込み下さい。

ホ ー ム ペ ー ジ：https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/seminar/019824 .html
Wako セミナー

検索

お 問 合 せ 先：Wako ワークショップ係
TEL : 06 - 6203 - 1788e-mail : ffwk-seminar@fujifilm.com〈講演プログラム〉■ミクログリアの発生・起源と脳疾患細胞治療への応用
京都薬科大学

統合薬科学系

高田和幸

薬品作用学教室

小山隆太

脳卒中ルネサンスプロジェクト

七田

崇

津田

誠

加藤

隆弘

小泉

修一

■ミクログリアによるシナプス貪食の可視化とそのメカニズムの解明
東京大学

大学院薬学系研究科■脳梗塞におけるミクログリアの機能解析
東京都医学総合研究所■ミクログリアサブセットと慢性疼痛
九州大学

大学院薬学研究院

ライフイノベーション分野■ヒト血液を用いた精神疾患ミクログリア仮説解明のための橋渡し研究
九州大学

大学院医学研究院

精神病態医学分野■ミクログリア－アストロサイト連関と脳機能
山梨大学

大学院総合研究部医学域

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）

基礎医学系

薬理学講座

7

echnical Report
新規組織化学染色脱色法
麻布大学獣医学部

解剖学第二研究室

小澤

秋沙

本法は組織化学染色として臨床検査

め、組織切片にほとんどダメージを与の有機溶媒に浸漬する。この際に無理及び研究で最も汎用されているヘマト

えずに多くの染色法による再染色を可にカバーグラスを外そうとすると組織

キシリン・エオジン（HE）染色また能にする脱色方法が開発されることが切片が崩れてしまうことがあるので注はマッソン・トリクローム（MT）染

望まれてきた。

意する必要がある。また、封入剤が組色で染色された組織切片を脱色し、他

今回、我々が開発した deColorizing

織切片上に残留した状態で次の手順にの染色への再利用を可能にする方法でSolution は、HE 染色を施しその組織進むことで、水溶性色素が水和後にある。

の状態（特定の構造や細胞の存在）を落ちていない状態になり、その後の

これまで１つの組織化学染色につき確認した後に、異なる染色への再利用

deColorizing Solution による脱色効果

最低組織切片 1 枚を用いることが一般を行うことで、同一組織切片からよりが弱くなるので、キシレン等の有機溶的であり、そのため組織化学染色の方

多くの情報を得ることを可能にする方媒に十分に浸漬することがポイントと法の数だけの組織切片を用意すること法である。本方法の特徴はこれまで脱なる。古い標本ほど、封入剤の固化がが必要である。しかし、組織切片作製

色が困難であったヘマトキシリン、鉄進んでいるので、封入剤がとれづらいには手技の熟練及び組織サンプルの状

ヘマトキシリンを脱色することができことに注意する。次に、組織切片を各態・大きさ等多数の要因によって評価ることである。

濃度のエタノールで順次水和し、最後に適した複数の組織切片を揃えること

使用方法はまず染色・封入されたスは蒸留水に浸漬する。この水和のときが困難な場合がある。また、同一細胞

ライドグラス標本からカバーグラスにエオジン等の水溶性色素のほとんどの評価をする場合は隣接した切片を用が自然に剥がれ落ちるまでキシレン等が脱色され、ヘマトキシリンの染色が

図１．deColorizing Solution 1 を 用 い た
HE 染色後組織切片の脱色と再染色

図２．deColorizing Solution 1 を 用 い た
HE 染色後組織切片の脱色と再染色

A：HE 染色したマウス海馬の組織像
B：deColorizing Solution 1 を 用 い て 脱色した後の A と同一箇所の組織像
C：脱 色後に抗 IBA1 抗体を用いて蛍光免疫組織化学染色した A 及び B と同一箇所の組織像

A：HE 染色したマウス肝臓の組織像
B：deColorizing Solution 1 を 用 い て 脱色した後の A と同一箇所の組織像
C：脱色後に抗 PCNA 抗体を用いて免疫
組織化学染色した A 及び B と同一箇所の組織像いる方法が一般的だが、たとえ隣接の組織切片が適切に得られたとしても、観察したい同一の組織構造や同一の細胞内構造が 2 つの隣接した組織切片にまたがって存在していないこともある。そのような場合には、すでに観察したい特徴を持った細胞や構造がある
ことがわかっている組織切片の再利用は大変有用である。HE 染色は組織の大まかな特徴を捉えるために最初に行われる代表的な染色法の１つであり、HE 染色で認められた目的の構造をもつ組織切片が再染色可能になること
は、臨床検査や研究の結果の精度を向上させることにつながる。
これまで、組織切片の脱色にはアルコールと塩酸の混合溶液、シュウ酸、
過マンガン酸カリウム含有溶液等が用いられてきた。しかし、これらの脱色
方法では脱色後の再染色性に問題が生じることがあった。実際にアルコールに塩酸を加えた溶液ではヘマトキシリン等の色素は脱色が不十分であるし、また、過マンガン酸カリウム、シュウ酸による脱色では組織切片へのダメー
ジが大きく、再染色の際に切片の剥離等により組織構造が崩れてしまうことがあり、再染色方法が限定され、組織切片の再利用に制限がある。そのた8

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）組織切片上に残っている状態になる。
このヘマトキシリンによる染色が残っている組織切片を使用濃度に希釈した
deColorizing Solution 1 に 浸 漬 す る。
脱色する組織切片の染色されてからの経過期間によるが、室温で１時間のdeColorizing Solution 1 へ の 浸 漬 によって、ほとんどのヘマトキシリンが脱色される。鉄ヘマトキシリンを脱色する場合には deColorizing Solution 1
への１時間の浸漬後、蒸留水で 3 回洗い、次に deColorizing Solution 2 へ浸漬する。脱色の程度（残留した染色）が次の染色への影響がないかを光学顕微鏡で確認し、蒸留水に浸漬して 3 回洗い、この時点で次の染色へと用いる

図３．deColorizing Solution 1 及び 2 を用いた MT 染色後組織切片の脱色
A：MT 染色したマウス肝臓の組織像
B：deColorizing Solution 1 及び 2 を用いて脱色した後の A と同一箇所の組織像
C：MT 染色したマウス腎臓の組織像
D：deColorizing Solution 1 及び 2 を用いて脱色した後の C と同一箇所の組織像事ができる。
これまでに、deColorizing Solutionを用いた脱色後の再染色として、HE
染 色、PAS 染 色、MT 染 色、 免 疫 組

で染色されていた核を含む殆どの色素

織化学染色が可能であることを確認しが図３B 及び D ではきれいに脱色さ

ている。

れている。

のダメージは認められていない。
本方法を用いる利点として、これまで長期にわたり大学、研究所、病院等

図１と図２はそれぞれマウスの海馬

図１C はマウスの海馬を脱色した後で保存、蓄積されている希少な組織切または肝臓の HE 染色後に上述の手順に抗 IBA １抗体（富士フイルム和光

片をその組織切片が作製された時点でで deColorizing Solution を 用 い て 脱純薬株式会社）で免疫組織化学染色しは開発されていなかった染色方法や新色した図である。図１A 及び図２Aた図である。図１A 及び B と同一の規抗原に対する抗体を用いて、再評価で見られるように核を含むヘマトキシ箇所の図である。脱色後の海馬切片ですることで新しい情報が得られること

リンで染色されていた部分のほとんど

も IBA １陽性のマイクログリアの突が可能になると考えられる。

の染色が、図１B 及び図２B では脱色起が検出されていることがわかる。同

現時点では、deColorizing Solution

されていることがわかる。また、図３様に図２C はマウスの肝臓を脱色後にの適用は HE 染色または MT 染色とはマウスの肝臓または腎臓を MT 染

抗 PCNA 抗体で免疫組織化学染色しなっているが、本方法の適用を拡大す

色 し た あ と に deColorizing Solutionた図である。PCNA 陽性が主に肝細ることで、脱色という方法がさらに組

１及び２を用いて脱色した図である。

胞の核で認められる。

織切片の再利用による有用性を高める

また、脱色による組織切片の崩れ等

図３A 及び C では鉄ヘマトキシリン

であろう。

組織標本脱色試薬
deColorizing Solution 1
deColorizing Solution 2
HE 染色標本を脱色する場合は、deColorizing Solution 1 のみを使用します。一方、MT 染色標本を脱色する場合は、
deColorizing Solution 1 と２の両方が必要となります。 本品を使用し、脱色した後に、異なる染色を行うことにより、
1 つの組織標本から複数の染色情報を得ることができます。
コード No.

043-34561
046-34551

品

名deColorizing Solution 1
deColorizing Solution 2

規

格

病理研究用
病理研究用

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）

容

量

250mL
250mL

希望納入価格（円）

8,500
8,500

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echnical Report

Wakopak® Core C18 ADRA を用いた皮膚感作性評価法“ADRA”の習熟化合物の分析例
須藤 勇紀

富士フイルム和光純薬株式会社 機能性材料研究所

１．はじめに

表１．LC 条件

今般、動物愛護や動物実験に関する
3Rs（Reduction：削減、Refinement：
苦痛の軽減、Replacement：置き換え）の観点により動物実験に対する規制が進んでいます。特に EU では 1993 年
から化粧品に対する動物実験が段階的に禁止、2003 年には 2013 年以降に EU
域内では動物実験を行った原料を含む化粧品販売禁止の指令 1）が出され、2009 年には規則化 2）されました。

機器
カラム
移動相 A
移動相 B
NAC のグラジエント
条件

Agilent UHPLC 1290 infinity Ⅱ（Agilent 社）
Wakopak® Core C18 ADRA 3.0 × 150mm（D）
0.1% トリフルオロ酢酸-水溶液
0.1% トリフルオロ酢酸 - アセトニトリル溶液
0min.（A：B=70：30）→ 9.5min.（45：55）→ 10.0min（0：100）→
13.0min.（0：100）→ 13.5min.（70：30）→ 25.0min.（70：30）

NAL のグラジエント
条件
流量
ミキサー容量
カラム温度
検出波長
注入量

0min.（A：B=80：20）→ 9.5min.（55：45）→ 10.0min（0：100）→
13.0min.（0：100）→ 13.5min.（80：20）→ 25.0min.（80：20）
0.3mL/min.
35μL
40℃
UV 281nm
10μL

このような背景から動物実験代替法

well plate で は な く、PP 製 マ イ ク ロ

ロマトグラム例を図 2 に示します。今の開発が世界的に求められており、日チューブを用いて反応を行いました。

回、Wakopak® Core C18 ADRA を 用

本でも 2005 年に日本動物実験代替法

次に LC 条件を表 1 に示します。分析

いて ADRA における習熟化合物のガ

評価センター（JaCVAM）が設立さ

時間における 13.5 分間以降の平衡化

イドラインで示されている範囲内の減れ、多くの日本発の動物実験代替法が

時間は装置の構成やミキサー容量に少率が得られました。

経済協力開発機構（OECD）のテスト

よって異なりますのでご注意下さい。

ガイドラインに収載されています 3）。

３．結®

今 回 上 市 し た Wakopak Core C18

当社のホームページ 10） にはキット果を用いた実験操作の動画やプロトコルの資料も掲載していますので、皆様の習熟化合物の評価結果を表 2 に、ク

ADRA は、富士フイルム株式会社が開発し、2019 年 6 月 18 日に OECD テ
ストガイドラインに収載された皮膚感
作 性 試 験 代 替 法 で あ る Amino acid4）
Derivative Reactivity Assay（ADRA）の要件に適合するカラムです。ADRA
では N（-2（-1-Naphthyl）acetyl）-L-cysteine（NAC）及びα-N（-2（-1-Naphthyl）acetyl-

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本 稿 で は ADRA キ ッ ト（ コ ー ド
No. 296-80901）及びそのプロトコルを用いて実験を行いました。ただし、今回 は 本 来 の ADRA と は 異 な り、96
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図１．NAC と NAL の構造式

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２．実験方法015160

象薬物と反応させ、その減少率を評価

参考文献をご参照下さい 5-9）。

10

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10

Assay（DPRA）との違いについては

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手法である Direct Peptide Reactivity

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なお、ADRA に関する詳細や既存

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個の習熟化合物の分析例を紹介します。

50

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L-lysine（NAL）（図 1）をそれぞれ対として実施することが必要である 10

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します。本稿では ADRA の技術習得

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図２−１．習熟化合物のクロマトグラム
緑：薬物、赤：NAC または NAL、青：薬物＋NAC または NAL

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）min0表２．習熟化合物の一覧と評価結果
No.

テスト薬物

p - ベンゾキノン
p -トルエンスルホンクロロアミドナトリウ
2
ム三水和物（クロラミンT）
3
シンナムアルデヒド
4
塩化パルミトイル
5
イミダゾリジニル尿素
6ファルネサール
7
グリセリン
8
ベンジルアルコール
9イソフタル酸ジメチル
10p -ヒドロキシ安息香酸プロピル
1

CAS No.

性状

分子量

評価溶媒

ADRA による予測

106-51-4固体

108.09水陽性

既知の減少率（%）
NAC
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90-10040-70

減少率の結果（%）
NAC
NAL
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61

7080-50-4

固体

281.69水

陽性90-10090-100100

9714371-10-9
112-67-4
39236-46-9
19317-11-4
56-81-5
100-51-6
1459-93-4
94-13-3

液体
液体
固体
液体
液体
液体
固体
固体

132.16274.87388.29220.3592.09
108.14194.19180.20アセトニトリル
アセトニトリル
水
アセトニトリル
水
アセトニトリル
アセトニトリル
アセトニトリル

陽性
陽性
陽性
陽性
陰性
陰性
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40-100< 10
10-45
10-40＊
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< 20
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＊現在のガイドラインに記載の値と異なりますが改正予定です。
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ADRA を用いた分析にご活用頂けま

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したら幸いです。

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〔参考文献〕

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1）E uropean Commission : “DIRECTIVE
2 0 0 3 / 1 5 / E C O FmAU
THE EUROPEAN
80
70
PARLIAMENT AND
OF THE COUNCIL
60
of 27 February 2003,
amending Council
50
40
Directive 76/768/EEC
on the approximation
30of the laws of the Member
States relating
20
10
to cosmetic products”, Official J. European
0Union , L66/26（2003）.
2）E uropean Commission:“REGULATIONmAU
500（EC）No 1223/2009400OF THE EUROPEANPARLIAMENT AND
OF THE COUNCIL
300
o f 3 0 N o v e m b e r200 2 0 0 9 o n c o s m e t i c
products”, Official 100J. European Union , L
0342/59（2009）.
3）宮 崎 博 之， 吉 山 友 二： 日 薬 理 誌，151，48（2018）.
mAU
804）OECD：“In Chemico
Skin Sensitisation :70
Amino acid Derivative
Reactivity Assay
60
50（ADRA）”,OECD Guideline
for the Testing
40
30
of Chemicals 442C（2019）.
20
105）山本裕介 他：和光純薬時報，87（1），12（2019）.
06）F ujita, M. et al . : J. Pharmacol. Toxicol.
Methods , 70, 94（2014）.
mAU7）Yamamoto, Y. et al .80 : J. Appl. Toxicol ., 35,701348（2015）.
608）Fujita, M. et al . : J. 5040Appl. Toxicol ., 39, 191
30（2019）.
209）Fujita, M. et al . : Toxicol.
in Vitro , 59, 161
100（2019）.
10）富 士フイルム和光純薬株式会社ホームペー
ジ：ADRAキット，https://labchem-wako.
fujifilm.com/jp/category/01294.html
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図２−２．習熟化合物のクロマトグラム
緑：薬物、赤：NAC または NAL、青：薬物＋NAC または NAL

本品は、ADRA の分析に最適な、粒子径 2 . 6μm のコアシェル型充てん剤を使用した専用カラムです。
カラム 1 本ごとに NAC、NAL、薬物の分離を確認し、Column Performance Report を添付しています。
コード No.

品

233-63991

Wakopak® Core C18 ADRA Φ 3mm＊150mm

名

容

量

希望納入価格（円）98,0001本

ADRA を簡便に実施できる試薬キットです。
コード No.

296-80901

品

ADRA Kit

名規格

皮膚感作性評価用容量

希望納入価格（円）1キット

75,000…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）

11

SH

ペプチド医薬合成基礎講座

SH
H

第３回

ys
Sec C

Cys

Glu

Lys

Ala

Ala

OH
H

ペプチド合成の新展開

Sec

Cys
Lys

山本法と NCL
サイエンスライター

S

佐藤

健太郎

タンタルは、この保護基のカルボニル基酸素と、エステル

ルイス酸触媒によるペプチド合成

カルボニル基の酸素にキレートされる形で、反応を触媒す

ペプチド合成の新しい手法について紹介する本シリーズ

るものと考えられる。ただし 9 - フルオレニルメチルオキ

であるが、ごく最近中部大学の山本尚・村松渉らのグルー

シカルボニル基（Fmoc）やフタロイル基（Pht）は、タ

1）

プから、全く新しいアプローチのペプチド合成法 が発表

ンタルのルイス酸性のため脱保護されてしまい、この反応されたので、こちらをまず紹介したい。

には適用できない。

これまでのペプチド合成におけるアミド縮合反応は、全てカルボキシ基側を何らかの形（酸ハロゲン化物、酸アジ
ド、活性エステルなど）に変換して活性化し、ここにアミノ基が攻撃してくるという形で結合形成が行われていた。

図２．タンタル触媒の配位

しかしこの方法では、アミノ酸α位のエピ化を起こしやすい。tert - ブチルオキシカルボニル基（Boc 基）などのカルタンパク質を構成する 20 種のアミノ酸のほとんどで、

バマート系保護基で保護されたアミノ酸を結合させる場合

良好な収率でジペプチドが得られている。ただしtert - ロにはこの問題は小さいが、長鎖フラグメント同士を結合さイシンなど、立体障害の大きいアミノ酸では収率の低下がせる場合には顕著となる。

見られた。また特筆すべきこととして、ジペプチド合成のこのため、ペプチド鎖を伸ばしていく際には、液相法で際にアミノ酸α位のエピ化はほとんど起こらない。

も固相法でも、N 端へ向けて一アミノ酸ずつ結合させていさらに山本・村松らは、この手法をフラグメント同士の結くことがほとんどだ。必然、ペプチド合成の工程数は長く合に展開している。検討の結果、こちらの場合はチタン（Ⅳ）

なり、総収率は低下し、分離困難な欠陥ペプチド（途中のイソプロポキシド（Ti（OPr）
4）が触媒として好適である

アミノ酸が抜けたもの）が生成するといった、種々の問題

こ と が 示 さ れ て い る。 た と え ば Boc-Ala-Met-Ala-OH と
H-Gly-Ala-Ala-Ot -Bu をクロロホルム溶媒中で結合させ、を引き起こしていた。
これに対し、山本らの方法ではN - 保護アミノ酸のメチルエステルなど、活性化されていないアミノ酸誘導体を用

収率 98％でほとんどエピ化なしに目的のヘキサペプチドが得られている。

いる。これを無溶媒でアミノ基無保護のアミノ酸tert - ブチ

今までのペプチド合成では、当量の高価な縮合試薬を用

ルエステルと混合し、触媒としてルイス酸性のタンタル（Ⅴ）

いて、一残基ずつ延長していくことになるため、極めて高メトキシド（Ta（OMe）
5）を加えて加熱することで、アミコストであった。しかし今回の方法では、シンプルなタンド結合が生成するというものだ。アミノ酸はどちらか一タルまたはチタン化合物を触媒量用いるだけであり、溶媒方を 2 ～ 2 . 5 当量、Ta（OMe）
5 は 10 mol％を用いて、40 ～も不要であるので、低コストかつ環境負荷も小さい。ま70℃、72 時間程度で反応は完結する。

た、収束的合成によって合成工程を大幅に減らすことも可能となっており、従来に比べて 1000 分の 1 以下の価格でペプチドを供給できると山本は述べている。触媒として用いられるタンタルやチタンは毒性が低い元素であり、使用や廃棄に特別の配慮は不要であることもメリットだろう。
反応時間など課題もあるものの、全体として非常にポテンシャルの高い方法であることは間違いなく、今後の進展

図１．タンタル触媒によるアミノ酸縮合反応が待たれる。この後に述べる NCL 法との組み合わせなど

アミノ酸誘導体同士を無溶媒で混合するというのは意外

により、さらに効率的に複雑なペプチドを作れる可能性もな条件だが、ジクロロメタンやN , N - ジメチルホルムアミあるだろう。今まで供給面に難のあったペプチド医薬はもド（DMF）などの溶媒を用いると、収率は低下もしくはちろん、繊維材料や化粧品など広く影響を与えそうだ。

全く生成物が得られなくなる。無溶媒であるので、反応終了後は適当な溶媒を加え、そのままシリカゲルカラムで精製を行うという簡便な操作で目的物が得られる。

12

NCL 法の展開
NCL 法は、無保護のペプチド鎖同士を結合させる手法

N 端側のアミノ基保護基としては、Boc、ベンジルオキ

で、1994 年に Kent らによって発表された 2 - 4）。チオールエ

シカルボニル基（Z）、アリルオキシカルボニル基（Alloc）、

ステルとシステインの持つメルカプト基とのエステル交換

2 , 2 , 2 - トリクロロエトキシカルボニル基（Troc）、p - トル反応を利用し、分子内でアシル基が転位することで目的のエンスルホニル基（Ts）などが利用可能で、触媒となるペプチドが得られる。

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）

Glu

OH

SH
SH
H

ys
Sec C

Lys

Glu

Cys

Ala

OH
H

Sec

S

Ala

S

ペプチド医薬合成基礎講座

Cys

Cys
Lys

OH

Glu
His

テルの形で切り出す方法もいくつも発表されている。これ
らは総説 3 a）にまとめられているので、参考にされたい。
NCL 法の最も大きなネックとなるのは、システイン残基のある位置でしかペプチド鎖同士の接合を行えない点だ。そこで、NCL を行った後にシステインを脱硫し、アラニンに変える方法が広く用いられている。アラニンはタ
ンパク質内に最も多く存在するアミノ酸なので、これに図３．NCL 法によるアミド結合生成

よって合成戦略の自由度が大幅に上がった。脱硫方法とし
この方法は、結合生成できるのがシステイン残基の位置ては、Raney ニッケルがよく用いられていたが、効率などのみに限られるが、特殊な試薬などが必要ないというメの点で問題がある。近年では、水溶性のラジカル開始剤

リットがある。類似の方法として、アジドとホスフィン

VA- 044 とホスフィン類の組み合わせによって脱硫を行うの反応（Staudinger 反応）を利用する方法、α- ケト酸とケースが多い。

ヒドロキシルアミンの反応を利用する KAHA 法などが考案されているが、簡便な NCL 法が最もよく使われている。
NCL 法は発表から四半世紀を経てさまざまな応用展開がなされており、その一部は以前に富士フイルム和光純薬㈱図５．VA-044

発行 Organic Square Vol. 53 で紹介しているので、そちらも参照していただきたい。

こうした手法の組み合わせにより、以前では考えられな

チオエステル部分は、S - アルキル型よりS - アリール型

かったサイズのポリペプチドが化学合成できるようになっの方が置換反応が速いが、安定性などの問題もあるため、ている。さらに近年では、遺伝子組み換えの手法で生産し場合によって使い分けられる。チオグリコール酸メチルなたペプチド鎖に、NCL で合成ペプチド鎖を導入する合成

どは、水溶性が高いために除去しやすい。

法も行われるようになっている。この方法によれば、遺伝NCL 法に必要なチオールエステルの合成法も、種々開子組み換え法だけでは不可能な糖タンパク質や、蛍光タグ

発されている。たとえばペプチドの C 末端をヒドラジドとでラベルしたタンパク質の合成も可能になる。たとえば

し、ここに亜硝酸塩を作用させてアジドに変えた上で、チPratt らは、140 残基から成り、87 番目のセリンに糖が結オールとの置換を行う方法がある 4）。

合したタンパク質である、α- シヌクレインの全合成に成また最近、ペプチドヒドラジドにアセチルアセトンを作用させてN - アシルピラゾールとし、ここにチオールを作功している 6）。
また Camarero らは、18 残基から成る環状ペプチドθ-

用させる方法が報告された 5）。酸化剤などを使用せずマイディフェンシン 1 の合成を行っている 7）。遺伝子組み換え

ルドで、ワンポットでチオールエステルへの変換が行える法で作ったペプチド鎖をペプチダーゼで処理し、NCL のため、今後使用が増えそうだ。

手法で N 端と C 端を結合させ、環化に成功している。環状ペプチドは医薬の骨格として有望であるから、NCL の応用として注目すべきアプローチといえるだろう。
〔参考文献〕

図４．チオールエステルの合成

その他、固相法で合成したペプチド鎖を、チオールエス

1）Muramatsu, W. et al . : J. Am. Chem. Soc ., 141, 12288（2019）.
2）Dawson, P. E. et al . : Science , 266, 776（1994）.
3）NCL の総説：a）Agouridas, V. et al . : Chem. Rev ., 119, 7328（2019）. ;b）Conibear, A. C. et al . : Chem. Soc. Rev ., 47, 9046（2018）.
4）Fang, G. et al . : Angew. Chem. Int. Ed ., 50, 7645（2011）.
5）Flood, D. T. et al . : Angew. Chem. Int. Ed ., 57, 11634（2018）.
6）Lewis, Y. E. et al . : ACS Chem. Biol ., 12, 1020（2017）.
7）Gould, A. et al . : Mol. BioSyst ., 8, 1359（2012）.

当社では、ペプチド合成用試薬をラインアップしています。詳しくは、当社 HP をご覧下さい。
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和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）13

エクソソームと生命現象

第７回

エクソソームとがん
東京医科大学

分子細胞治療研究部門

小坂展慶

がん細胞は、微小環境に存在する細じ治療が困難となる。この卵巣がんによる可能性がある。そこで以下にがんの悪性胞と常にコミュニケーションをとっており、腹膜播種にもエクソソームが関わってい化に関わるエクソソームを標的にしたがん

3）

それによってがんの悪性化が進展している 。卵巣がんから分泌されたエクソソーる。このがん細胞と周辺細胞の細胞間コ

ムは、腹膜を形成している中皮細胞に取ミュニケーションを明らかにすることは、

り込まれ、それらの細胞にアポトーシスを

Nivolumab のような画期的ながんの治療誘導する。これにより腹膜に穴が開き、薬の開発につながる。これまでの研究でがん細 胞の腹 膜 播 種が促 進される 3）。

我々や他のグループの研究により、がは、細胞間コミュニケーションに関わる因

一方、同じように治療が困難ながんの転ん細胞のエクソソーム分泌を阻害すること

治療法の例に関して概説する（図２）。

１．が ん細胞のエクソソーム分泌を抑える子として、接着分子、細胞外基質、サイ移であるがんの脳転移に関してもエクソ

でがんの転移が抑制される可能性が示さトカインやケモカインなどが中心に研究されソームが関係している。血液脳関門と呼れた 1）。そのためがん細胞におけるエクてきたが、最近、エクソソームが新たなばれる生体バリアーは、栄養以外の物質

ソソームの分泌を抑制する方法が研究さ

細胞間コミュニケーション因子として注目さの脳への自由な移行を制限しているが、れている。しかし、エクソソームは生体内れてきている。細胞外に分泌される小胞がん細胞はこのバリアーを突破し転移をの多くの細胞から分泌されており、免疫であるエクソソームは、脂質の二重膜で成立させている。我々は、脳転移性乳が細胞由来のエクソソームのように、がんの構成されており蛋白質や核酸が含まれてん細胞株のエクソソームが、血液脳関門

悪性化に抑制的に働くエクソソームも存いる。エクソソームは、様々な生理活性を形成する細胞の一つである血管内皮在するため、全てのエクソソームを抑制物質の複合体であるという点において、細胞に入り込み、血管内皮細胞同士のするような方法では、有効ながんの治療

これまでに報告されてきた他のコミュニ

強い細胞間相互作用を緩めることにより、法にならない。またエクソソームは様々な

4）ケーション因子と違っている。特にこれまがんの転移を成立させることを示した 。

生理学的な機能も持っているため、全てでコミュニケーションツールとして考えられまた乳がんは、５年や 10 年と長期にわのエクソソームの分泌を抑制する方法でてこられなかった細胞内蛋白質や、核酸

たる再発リスクが存在することが知られては、思わぬ副作用が出る可能性もある。

分子などがエクソソームにより運搬される。

いる。その理由の一つとして、乳がん細そこで、がん細胞といった疾患特異的な発見当初、細胞内の不要物を排出する胞が骨髄中に入り、長期間の休眠に入る

エクソソームの分泌経路を明らかにするこ

ゴミ袋のような機能を果たしていると考えらというメカニズムが提唱されているがそのとで、その疾患特異的なエクソソーム分れてきた。しかし多くの研究により、生体分子機構に関しては不明な点が多い。

泌経路を標的とした治療法を確立する必の様々な生理機能や、その破綻による疾

我々は、骨髄中の間葉系幹細胞のエクソ要がある。エクソソームの分泌経路はわ

患に関わることが明らかとなってきた。特ソームによって、乳がん細胞が休眠するこ

からないことが多いが、がん細胞は正常にがんにおいては、がんの悪性化のすべとを明らかにし、乳がんの再発におけるエ細胞に比べてエクソソームの分泌量が明ての段階において重要な役割に関わって

5）

クソソームの重要性を示した 。

らかに多い。このことからもがん細胞のエ

1）いる 。以下に当研究室がこれまでに報このようにこれまでに紹介してきた我々

告してきたがんの悪性化におけるエクソの研究だけでなく、世界中の多くの研究機構が存在すると考察される。そのためソームの機能に関して簡単に紹介する。

者によりがんの悪性化におけるエクソソー

それらの分子を同定し、その分子を標的

クソソームの分泌は正常細胞と違う分子がん細胞は非常に速く分裂するため、ムの役割が報告されている（図１）。もちとしてエクソソームの分泌を抑制すること

生存のために栄養を必要としている。そろんがんの悪性化には、がん細胞から分がこのアプローチによる治療の実現に向のためがん細胞は、腫瘍内に血管を誘泌されるエクソソームだけではなく、がんけて重要である。

導することで、栄養を獲得している。我々

微小環境に存在するがん以外の細胞かは、がん細胞から分泌されるエクソソーム

ら分泌されるエクソソームも、がんの悪性が、腫瘍血管を誘導することを明らかに化に関わっている。これまでのサイトカイン

2）

14

医学総合研究所

２．がん細胞由来の血中のエクソソームを除去する

した 。また、セラミド合成酵素の一つでやケモカインといった分泌因子や接着分血中に存在するがん細胞由来のエクソ

ある nSMase2（中性スフィンゴミエリナー子なども含めると、がん細胞とその微小ソームを除去するというアプローチは、前ゼ２）の発現を抑えることによりがん細胞

環境に存在する周辺細胞との細胞間コ転移ニッチ形成や薬剤耐性などに関わのエクソソームの分泌を減少させた結果、

ミュニケーションは非常に複雑であると言るエクソソームの機能を阻害する方法で腫瘍内の血管が誘導されなくなり、結果える。しかし、がん細胞のエクソソームにある。 前 転 移 ニッチ（pre-metastatic

的にがんの転移が抑制された。

よって、がんの悪性化が進展するのであniche）は、がん細胞が転移予定の臓器

卵巣がんは、がんの悪性化が進行すれば、そのエクソソームを標的とした治療に転移する前に、がん細胞が生存しやす

ると、腹部にがんが広がる腹膜播種を生法が、がんの転移の抑制に有効である

いように予め整備された環境のことであ

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）エクソソームと生命現象

図１．がんの悪性化におけるエクソソームの役割

図２．がん細胞由来エクソソームに対する新規のがん治療

エクソソームは、がんの悪性化の多段階に関わる。がん細胞は増殖を繰り返すため、絶え間なく変化する環境に適応するために、自身の利益になるような微小環境に作り変える。この際、サイトカインやケモカインの他にエクソ
ソームが関わっている。 例えば栄養の摂取や低酸素環境下の場合には血管新生を促すために血管内皮細胞にエクソソームを送り込み腫瘍血管を作成する（１）。がん転移においては、生体バリアーとなっている腹膜の中皮細胞のアポトーシスを誘導し、自身の遠隔転移を可能にする（２）。さらに同じように生体バリアーとして重要な血液脳関門における血管内皮細胞の細胞間結合を緩めるようなエクソソームを送っている（３）。また骨髄中に存在するがん細胞は、間葉系幹細胞のエクソソームを受け取ることで休眠状態になり、がんの長期再発の一因になっていると考えられている（４）。さらにがん細胞由来のエクソソームが前転移ニッチ形成に関わっていることも報告されている（５）。

がん細胞から分泌されたエクソソームを標的とした新規のがん治療として以下の２通りを例示する。例えば、がん細胞のエクソソームを受け取った血管内皮細胞は、血管新生を誘導し、がん細胞への酸素と栄養の供給に関わって
いる（A）
。この時、
（１）エクソソームの分泌の阻害、（２）循環エクソソー
ムの除去、を行い、がん細胞由来のエクソソームを血管内皮細胞に届かな
くすることで、新規の血管新生阻害剤の開発へとつながる（B）。

析に用いることができない。これらの背景
により、エクソソーム研究は複雑かつ困難な状況にある。しかし、がん細胞の情報を多く持ち、がんの悪性化に関わっているエクソソームは、新規のがん診断・治る。これまでの研究により、様々なサイトカのエクソソーム除去によるがん治療の可療の非常に魅力的な研究対象であり、インやケモカインが前転移ニッチ形成に重能性が示唆されたが、本論文では CD63

今後のさらなる研究の発展が期待されて要であることが報告されてきたが、がん細や CD9 といった多くのエクソソームで発いる。

胞 由 来のエクソソームも前 転 移ニッチ

現が確認されている分子を標的としてい形 成に関わっていることが報告されているため、正常細胞のエクソソームにも結る 6，7）。血液中のエクソソームによるがん合する可能性が存在している。そのため悪性化の他の例として、トラスツズマブの実際の臨床の現場では、がん細胞特異

ように HER2 を標的とした抗体医薬が血的なエクソソームの抗原を同定し、その液中に循環している HER2 陽性のエクソ分子を標的にする必要がある。

ソームに結合してしまい、腫瘍まで届か

エクソソーム研究が世界中で盛んにず薬効を示せない可能性も示唆されていなってから、まだ 10 年ほどであるため、

る 8）。そこで、このような血液中に循環しエクソソームにはまだわからないことが多ているエクソソームを除去するがん治療のい。エクソソームは、複数の分子から成可能性が研究されている。

り立つ複合体であり、また細胞や細胞の

我々のグループでは、ヒト乳がん細胞

置かれている環境によって分泌されるエク株をマウスに移植し、エクソソーム上のソソームの質が変わる。さらにエクソソー

CD63 もしくは CD9 を標的とする抗体をムが 100nmという大きさであるため、これ投与した結果、乳がん細胞株の転移をまでの生命科学の研究で用いられてきた有意に抑制した 9）。これにより、血液中

機器や技術を、そのままエクソソームの解

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1）Kosaka, N. et al . : J. Clin. Invest ., 126（4）,1163-72（2016）.
2）Kosaka, N. et al . : J. Biol. Chem ., 288（15）,10849-59（2013）.
3）Y okoi, A. et al . : Nat. Commun ., 8, 14470（2017）.
4）Tominaga, N. et al . : Nat. Commun ., 6, 6716
（2015）.
5）O no, M. et al . : Sci. Signal ., 7（332）, ra63
（2014）.
6）Peinado, H. et al . : Nat. Med ., 18（6）, 883-91（2012）.
7）Hoshino, A. et al . : Nature , 527（7578）, 329-35（2015）.
8）Ciravolo, V. et al . : J. Cell. Physiol ., 227（2）,658-67（2012）.
9）Nishida-Aoki, N. et al . : Mol. Ther ., 25（1）,181-191（2017）.

エクソソーム Wako

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〔参考文献〕

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）15

基礎から応用までよくわかる組織透明化技術

第３回

CUBIC を用いた組織透明化と３次元観察
東京大学大学院医学系研究科システムズ薬理学教室

はじめに
今から 100 年以上も前、ドイツのSpalteholz は有機溶剤のベンジルアル
コールとサリチル酸メチルを混合した
組織透明化試薬を開発し、ヒト組織を洲㟢

悦生

織透明化手法の開発を継続している。

然、観察のための蛍光シグナルは透明

本項ではその詳細とアプリケーション化後も残存している必要がある。これ

例を紹介したい。

らの仕様要件を満たす組織透明化技術

CUBIC 技術のコンセプトと
開発経緯

は、筆者らが CUBIC 開発をスタートさせた 2010 年から 2011 年ごろには存在しておらず、新規の技術を開発する

1）

CUBIC （Clear, Unobstructed

必要があった。折しも、理化学研究所（これらのサンプルの一部は現在でもBrain/Body Imaging Cocktails andの濱・宮脇らのグループが、蛍光タンドレスデンの公衆衛生博物館で見るこComputational Analysis）は、臓器全

パク質のシグナル保存に適した水溶性とができる）。その後 1980 年代に入る

体、あるいは全身のすべての細胞を観化合物ベースの組織透明化試薬

まで、組織透明化技術の目立った発展察対象とし、細胞種、細胞機能、細胞「Scal e」を発表したことから 6）、我々や応用例は見られなかったが、1989

同士の接続などの情報をノンバイアス

は直感に頼らずベストな水溶性化合物

年 に Dent が Murray’s clear ま た はかつ網羅的に収集し解析する技術コンを選択するための独自のスクリーニン

BABB 法 と 呼 ば れ る 改 良 Spalteholz

セプトである（図 1）。細胞解像度のグ法を立ち上げ、40 化合物の定量的

3 次元的に観察した例を報告した

2）

試薬の利用例を報告 、さらには画像データを収集するためには光のモ

スクリーニングを行なった。その結1990 年代以降にロシアの Tuchin ら、ダリティが適切であり、不透明な大型果、最終的に Scal e の主要成分である

台湾の Chiang らが水溶性化合物によ組織サンプルを 3 次元観察するために尿素に我々が新規に発見したアミノア

る組織透明化法を報告し 3, 4）、近代的は組織を光学的に透明にする必要があ

ルコールを加えた「Scal eCUBIC 試薬」

な組織透明化技術の開発に道を開いる。特に、CUBIC が対象とする臓器を開発するに至った 7）。さらに我々は、全体や全身を現実的な時間スケールでアミノアルコールが組織中の主要な吸5）た。特に、2007 年の Dodt ら 、20116）による蛍光 3 次元イメー

光学観察するには、ライトシート顕微

光物質であるヘムを除去し、後述するジングへの適応例が端緒となり、ここ鏡と呼ばれる光学切片をサンプル内に「脱色」の過程で重要な働きをもつこ

10 年で数十に及ぶ組織透明化手法が作製し 2 次元画像スタックを収集できとを見出した 8）。これらの特徴により、

年の濱ら開発されるとともに、主要な組織観察る特殊な顕微鏡が適している （図 1、

Scal eCUBIC 試薬はマウス脳、マウス

手法の一つとして一般化されつつあ「臓器全体の 3D イメージング」部分）。

全身、ヒト組織などの高度な透明化とる。 我 々 の グ ル ー プ で は 2014 年 にしかし、ライトシート顕微鏡は横から

3 次元観察を可能とした。

CUBIC と 名 付 け た 全 臓 器・ 全 身 ス

励起光を照射し上部から蛍光シグナル

その後我々のグループは、マウス全ケール細胞解析技術のコンセプトを発を観察するため、サンプル全体が高度

脳全細胞観察のための膨潤透明化法

表し 7, 8）、そのコンセプトを実現するに（理想的には文字通り見えないほど「CUBIC-X」、1600 以上の水溶性化合

重要な技術要素の一つとして高度な組に）透明化されている必要がある。当物をスクリーニングし成分を刷新した

5）

図１．CUBIC の技術コンセプト概略
CUBIC は、臓器全体・全身の網羅的細胞解析を実現する技術コンセプトである。蛍光ラベルを施した組織サンプルを光学的に透明にし、大型サンプル全体を高速に撮像可能なライトシート顕微鏡を用いて細胞解像度の画像取得を行う。取得した画像の定量解析により、細胞種・細胞活動・細胞ネットワー
ク構造などの情報を抽出する。アトラスの図は Allen Brain Atlas（http://portal.brain-map.org）より使用。

16

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）基礎から応用までよくわかる組織透明化技術

表１．CUBIC 試薬一覧
第 2 世代試薬は Scal e の主成分である尿素を使用していないため、「CUBIC- 〇〇」の表記に統一した。
文 献

含む霊長類組織はげっ歯類組織より脱脂の難易度が高いため、同じく大規模
スクリーニングによりさらに高い脱脂

試薬の世代

役 割

主要な成分

Scal eCUBIC-1

第 1 世代脱脂・脱色

アミノアルコール（クアドロール）、尿素、Triton X-100

13）

発した 11）。CUBIC 試薬は多くの蛍光タ

Scal eCUBIC-1A

第 1 世代脱脂・脱色

アミノアルコール（クアドロール）、尿素、Triton X-100

http://cubic.riken.jp

ンパク質（GFP バリアント、mCherry、Scal eCUBIC-2

第 1 世代屈折率調整

アミノアルコール（トリエタノールアミン）、尿素、スクロース

13）

CUBIC-X

第 1 世代膨潤＋屈折率調整

アンチピリン、イミダゾール

9）CUBIC-L

第 2 世代脱脂・脱色

アミノアルコール（N - ブチルジ
エタノールアミン）、Triton X-100

11）
11）

CUBIC-P

第 2 世代脱色

1- メチルイミダゾール、アミノ
アルコール（N - ブチルジエタノールアミン）、Triton X-100

CUBIC-B

第 2 世代骨脱灰EDTA、イミダゾール

11）

CUBIC-HL

第 2 世代

脱脂・脱色
（一部のヒ
ト組織）

1,3- ビス（アミノメチル）シク
ロヘキサン、ドデシルベンゼンス
ルホン酸ナトリウム

11）

CUBIC-R第 2 世代

屈折率調整

アンチピリン、ニコチンアミドまたは N - メチルニコチンアミド

11）

能を達成した試薬（CUBIC-HL）も開

tdTomato、mKate2 な ど ） の 保 存 性に優れるが、発現量が非常に少ない場
合は十分なシグナルが得られないこともある。また、一部の蛍光タンパク質とは相性が悪い。このため、実サンプ
ルを用いて蛍光シグナルの残存を評価することを推奨する。サンプルを最小限のサイズにして処理時間を短くするとともに、脱脂を 37℃ではなく室温で行うと蛍光シグナルの改善が見られる。また、Scal eCUBIC-1 試薬の蛍光シグナル保存性をさらに高めた「 第 二 世 代 CUBIC 試 薬（CUBIC-L/R（Triton X-100）とアミノアルコールがScal eCUBIC-1A（Reagent-1A）試薬のほか）」、マウス全脳解析基盤としての1）のステップに重要である。また、2）レシピも公表している（http://cubic.

1 細胞解像度アトラス「CUBIC-Atlas」のステップにおいては、Scal eCUBIC

riken.jp）。最新の CUBIC-L 試薬と合（表 1）。
などの要素技術を発表した 9-11）

試 薬 で は ス ク ロ ー ス が、 第 二 世 代

わせてご検討いただきたい。

さらに現在では、高度な 3 次元染色プ

CUBIC 試薬ではアンチピリンとニコ

組織透明化過程の概略を図 2 にまと

ロトコル、マウス全脳 1 細胞解析基

チンアミド誘導体が重要である。屈折

めた。組織透明化は固定組織サンプル

盤、高速全細胞観察顕微鏡などの最新率調整剤はタンパク質などの生体物質に適応される手法であり、プロトコルの要素技術についても発表準備中であの屈折率に近い 1.5 前後の高い屈折率に応じた固定法を選択する必要がある。CUBIC 技術の利用を検討されてを持っており、「透明化」はこの屈折る。CUBIC では通常 4% パラホルム

いるユーザーの方々には、これらの最率調整剤への置換を以て完了する。しアルデヒド固定を推奨する。固定剤の新の開発成果もフォローいただきた

かしながら、Scal eCUBIC-1 試薬でもpH は中性を保ち、固定温度、架橋時い。

アミノアルコールと尿素の組み合わせ

間は原則的にサンプル間で条件が揃うにより比較的高い屈折率（1.43）が達ようにする。脱脂・脱色期間はサンプ

成されており、単剤でも比較的明瞭なルによって異なるため、推奨プロトコ

CUBIC による組織透明化
物体が光学的に透明であるというこ

透明化が達成されるため、全く透明化

ルに実施例のない組織については条件とは、入射した光が内部で散乱・吸収手法に馴染みのないユーザーや、小型検討が必要である。脱脂・脱色後のサされずにほぼ直進して射出されるといのサンプルを短時間で透明化し、共焦

ンプルはスポンジ状になるため、サンうことである。組織が不透明であるの

点顕微鏡や 2 光子顕微鏡で観察したい

プルのダメージを避ける操作が必要では、組織中のさまざまな成分が光学的

ユーザーがはじめにトライする試薬とある。筆者らは薬さじにサンプルを乗に不均一で入射光が強く散乱されるかして推奨できる。より高度な透明化にせてハンドリングしている。また、こらであり、また血液のヘムのように可は脱脂・脱色剤＋屈折率調整剤の 2 スの段階のサンプルは防腐剤を入れた

視光を強く吸収する色素が含まれていテップによる透明化を推奨する。また

PBS な ど で 長 期 保 存 が 可 能 で あ る。

るからである。このため、組織透明化

骨組織についてはさらに脱灰も必要で屈折率調整剤は非常に高濃度の試薬では 1）組織中の光散乱・光吸収物質のある。我々は 1600 以上の大規模化合あるため、先に蒸留水で 50% に希釈

除去、2）組織成分と周囲の溶媒成分

物スクリーニングを実施するにあたっし た 試 薬 で 1 日 以 上 置 換 し た の ち、の光学的特性（特に屈折率）の均一て脱灰化合物も探索対象とし、EDTA

100% の試薬に置換する。希釈した屈化、の 2 つのステップによって達成さにイミダゾールを加えた脱灰試薬

折率調整剤の処理時間が不十分だと、れ る。CUBIC 試 薬 で は 界 面 活 性 剤（CUBIC-B）を報告している。ヒトを内部の透明化が達成されない、組織の和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）17

基礎から応用までよくわかる組織透明化技術

活動を解析した例も報告している 14）。
この例では計 8 条件で 20 匹のマウス脳を使用し、最終的にマイクロアレイ
解析などで汎用されるクラスタリング
解析を行なって、特定の時間帯・実験条件で特異的に活動している神経細胞群を同定することに成功した。興味のある方は原著論文を参照いただきたい。さらに、第二世代 CUBIC 試薬を用いて高度にマウス全身を透明化し、

図２．CUBIC を用いた組織透明化・イメージングの流れ
CUBIC 試薬はパラホルムアルデヒド（PFA）固定組織に最適化されている。固定組織は脱脂・脱色をへて屈折率調整により透明化される。間の洗浄過程でサンプルの保存が可能である。試薬の詳細については表１を参照。

がん転移モデルマウスの全身解析を行なった例についても報告している 10）。
この例では全身の 3 次元イメージング

変形が起こるなどのトラブルが起こり筆者らが想定していなかったようなア

データから、臓器中に散見される微小うる。観察後の組織は PBS で洗浄す

プリケーション例も散見される。この転移巣ももれなく検出できることを示ることで、脱脂・脱色後のサンプルとため、利用を検討しているユーザーにし（図 3B）、CUBIC による全身解析

同等に保存することが可能である。

は、まず文献などを検索し適用例を探アプローチの有用性を証明した。

CUBIC のアプリケーション
例
医学生物学研究における組織透明化していただくのがスムーズな導入の一

CUBIC は核染色や免疫染色などの助になると思われる。ここでは特に筆組織学的手法にもコンパチブルであ者らのグループから報告した CUBIC

り、一部の抗体については脳や消化の適応例について報告する。

管、腎臓などの臓器を丸ごと染色しイ技術の使用例は年々急速に拡大して上述のように、CUBIC は「臓器全メージングできることを報告していおり、文献を検索すればさまざまな体・全身の網羅的細胞解析」をコンセ

る 8, 10, 15）（図 3C）。また、ヒト組織に7, 13）

生物種や組織への適応例を見つけるこ

プトとしており、最初の論文についても透明化や免疫染色、パラフィと が で き る。 例 え ば“CUBIC tissueて、まず光刺激ありなしの 2 個体 2 条

ン包埋法とのコンパチビリティを検討

clearing”で google scholar を検索す

件によるマウス全脳神経活動比較解析

し、3 次元病理学の例として大腸癌リ

ると 8000 件余りがヒットし、対象サの例を報告している（図 3A）。そのンパ節転移の検出率を 100% まで向上

ンプルも幅広い。中にはダンゴムシ・

後サンプル数を拡張し、薬物投与下マさせることができることを報告していウスを時系列サンプリングし全脳神経る 16）。3 次元の抗体染色を実施するにカニなどの甲殻類への適用例

12）

など、

図３．CUBIC を用いたアプリケーション例
A：神経活動を蛍光タンパク質 Venus の発現でラベリングできるトランスジェニックマウス（Arc-dVenus Tg）19）に光刺激を与えたのちサンプリングを行い、光刺激なしのコントロールと比較する実験を行なった。標準脳データに双方のデータをレジストレーションし標準化を行なったのち、重ね合わせ画像を作成して直接比較を行なった。データは文献 13）より改変して使用。
B：がん転移モデルマウスの全身を透明化・3D イメージングした例。mCherry でラベルされた癌細胞の微小転移も漏らさず検出可能である。データは
文献 10）より改変して使用。
C：マウス全脳免疫染色の例。血管平滑筋をラベリングするα-Smooth Muscle Actin（SMA）抗体で脳全体を染色後、透明化・3D イメージングを行なった。データは文献 10）より改変して使用。

18

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）基礎から応用までよくわかる組織透明化技術

あたっては、抗体のシグナルノイズ比

なく最新の文献をフォローすることをが高く染色性が良好なモノクローナル推奨する。CUBIC に関する技術的な抗体を使用することが望ましい。筆者

質問は筆者（esusaki@m.u-tokyo.ac.jp）

らは脱脂・脱色後の組織で凍結切片をまでお問い合わせいただければ随時お作製し、抗体の動作確認を行なってい答えする。本項が組織透明化技術を自る。また、3 次元浸透の行程を繰り返

身の研究へ活用しようと考えている

さないように、1 次抗体に直接蛍光物

ユーザー各位の参考となれば幸いであ

質をラベリングした抗体を使用するこる。

とを推奨する。抗体によっては屈折率
調整剤中ではがれるものもあるため、染色後に 1% 程度の PFA で後固定を〔参考文献〕
1）Spalteholz, W. “: Über das Durchsichtigmachen2）Dent, J. A., Polson, A. G. and Klymkowsky,
M. W. :“A whole-mount immunocytochemical

ナルが残存する必要最小限の条件で実

analysis of the expression of the intermediate

施することが望ましい。現在まで発表

filament protein vimentin in Xenopus.”,Development , 105, 61（1989）.

済みのプロトコルでは抗体の深部浸透

3）Tuchin, V. V. et al . : Proc. SPIE , 3863, 10の問題が完全に解決しておらず、筆者（1999）.

らはこの点を大きく改善させた最新の

4）Liu, Y.-C. and Chiang, A.-S. :“High-resolution

プロトコルを発表準備中である。興味

confocal imaging and three-dimensional
rendering.”,Methods , 30, 86（2003）.

のあるユーザーは今後の論文発表を

5）Dodt, H. U. et al . :“Ultramicroscopy: Three-

フォローいただきたい。

dimensional visualization of neuronal networks
in the whole mouse brain.”,Nat. Methods , 4,

おわりに

331（2007）.
6）Hama, H. et al . :“Scal e: a chemical approachより詳しい情報が必要なユーザー向

for fluorescence imaging and reconstruction

けに、透明化・3 次元イメージングにof transparent mouse brain.”,Nat. Neurosci .,関する英文総説を発表しているのでご参照いただきたい

14, 1481（2011）.
7）Susaki, E. A. et al . :“Whole-brain imaging

17, 18）。組織透明化技

with single-cell resolution using chemical

術は優れたプロトコルが複数発表されcocktails and computational analysis.”,Cell,ており、ユーザーは目的に応じて最適

157, 726（2014）.

なプロトコルを選択することができる

8）T ainaka, K. et al . :“Whole-body imaging
with single-cell resolution by tissue decolor-

状況にある。ただし、当研究チームもization.”,Cell , 159, 911（2014）.

含め、開発グループの多くはなお技術

9）Murakami, T. C. et al . :“A three-dimensionalを向上させており、最初の論文だけでcancer metastasis with single-cell resolution.”,

Cell Rep ., 20, 236（2017）.
11）Tainaka, K. et al . :“Chemical Landscape for
Tissue Clearing based on Hydrophilic
Reagents.”,Cell Rep ., 24, 2196（2018）.
12）Konno, A. and Okazaki, S. :“Aqueous-based
tissue clearing in crustaceans.”,Zoological

S. Hirzel, Leipzig（1914）.

と透明化が阻害されるため、抗体シグ

clearing.”,Nat. Neurosci ., 21, 625（2018）.
10）Kubota, S. I. et al . :“Whole-body profiling ofLett ., 4, 13（2018）.

von menschlichen und tierischen Präparaten .”,行うとよい。ただし、固定が強すぎる

CUBIC-X expansion microscopy and tissue13）S usaki, E. A. et al . :“Advanced CUBIC
protocols for whole-brain and whole-bodyclearing and imaging.”, Nat. Protoc ., 10,1709（2015）.
14）Tatsuki, F. et al . :“Involvement of Ca 2+Dependent Hyperpolarization in Sleep
Duration in Mammals.”, Neuron , 90, 70（2016）.
15）Hasegawa, S. et al . :“Comprehensive threedimensional analysis（CUBIC-kidney）visualizes
abnormal renal sympathetic nerves after
ischemia/reperfusion injury.”, Kidney Int .,96, 129（2019）.
16）Nojima, S. et al . :“CUBIC pathology: threedimensional imaging for pathological diagnosis.”,Sci. Rep ., 7, 9269（2017）.
17）Tainaka, K. et al . :“Chemical Principles in
Tissue Clearing and Staining Protocols for
Whole-Body Cell Profiling.”, Annu. Rev. Cell

Dev. Biol ., 32, 713（2016）.
18）Susaki, E. A. and Ueda, H. R. :“Whole-bodyand Whole-Organ Clearing and Imaging
Techniques with Single-Cell Resolution:
Toward Organism-Level Systems Biology in
Mammals.”,Cell Chem. Biol ., 23, 137（2016）.
19）Eguchi, M. and Yamaguchi, S. :“In vivo andin vitro visualization of gene expression
dynamics over extensive areas of the brain.”,

Neuroimage, 44, 1274（2009）.

single-cell-resolution whole-brain atlas using

CUBIC Trial Kit
本キットは、1）Sca l eCUBIC- 1 Solution、2）Sca l eCUBIC- 2 Solution、3）Mounting Solution 1、4）
Mounting Solution 2 の 4 成分で構成されています。キット成分を調製し、透明化を行うことが可能です。
透明化プロトコール例、アプリケーション例は、当社 HP をご覧下さい。

CUBIC

検索

Wako

➡

コード No.

290-80801

品

CUBIC Trial Kit

名

規
危

格

組織透明化用

容

量

1 キット

希望納入価格（円）

45,000…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）19

ew Products
コード No.

下痢性貝毒標準液NEW

OA・DTX1 混合標準液
海洋生物由来毒素は、魚介類がもつ自然毒で食中毒の原
因となります。海洋生物由来毒素は魚介類だけでなく、海洋微生物やプランクトンなどの微細藻類あるいは海藻にも存在し、食物連鎖により生物濃縮され、それを口にしたヒトに中毒を引き起こします。日本では、主にフグ毒（テトロドトキシン）や二枚貝（牡蠣、ホタテなど）による食中毒が毎年発生し、食品衛生法で規制・管理されています。
本品は、下痢性貝毒として知られるオカダ酸（OA）、及びジノフィシストキシン -1（DTX1）を各 1mg/L（1ppm）
混合した標準液です。NMIJ CRM のオカダ酸、及びジノ
フィシストキシン -1 にトレーサブルであり、二次標準としてご使用頂けます。

二枚貝

下痢性貝毒

名
危

規格

容量 希望納入価格（円）

食品
分析用

2mL

24,000

関連製品
NMIJ CRM
コード No. メーカーコード

品名

容量 希望納入価格（円）NMIJ CRM Okadaic Acid Standard Solution
637-32001
危6206-aNMIJ CRM Dinophysistoxin-1 Standard Solution634-32011
危6207-a

下痢性貝毒
コード No.

1mL

8,775

1mL

8,775

原体
品

名

152-03271
Okadaic Acid
158-03273
155-03381 Okadaic Acid Sodium Salt
042-33671 Dinophysistoxin-1

規格

容量 希望納入価格（円）

25μg
100μg
生化学用 100μg
生化学用 100μg
生化学用16,00046,00055,10054,000

不純物確認試験や定量試験に最適な重溶媒〈マリントキシンの分類と毒性成分〉
分 類
フグ毒
魚類
シガテラ毒
その他魚毒
藍藻類
藍藻類毒
海綿動物 海綿毒品

OA・DTX1 Mixture Standard Solution
156-03551（each 1mg/mL Methanol Solution）

成

高純度 NMR 溶媒

分

テトロドトキシン
シガトキシン（CTX1B・CTX3C）
パリトキシン
ミクロシスチン（LR・RR）
カリクリン A、ミカロライド B
オカダ酸
（OA）
、ジノフィシストキシン -1（DTX1）

本品は、NMR 測定に影響する不純物を低減した NMR
測定用溶媒です。水分と軽水素溶媒以外のシグナル※を認めません。他の溶媒などの不純物を含まず、低水分値を保証しているため医薬品の品質試験や定量 NMR などを実施する際に有用な高純度 NMR 溶媒です。
※ベースラインとの強度差が 30% 以上のシグナル

製品規格 クロロホルム-d, 99.8%
（高純度）

分析測定例

試験項目
外 観
水 分
重水素化率
含量（GC）
不純物（NMR）（1H）
不純物（NMR）（13C）
不純物（NMR）（31P）
不純物（NMR）（19F）

規格値
無色澄明の液体0.003％以下
99.8％以上
99.9％以上
試験適合
試験適合
試験適合
試験適合

H NMR チャート例 クロロホルム-d, 99.8%（高純度）1

当社高純度 NMR 溶媒

Column: Wakopak® Ultra C18-2   2.1mm × 75mm
Eluent: A）2mmol/L HCOONH4, 50mmol/L HCOOH in H2O
	  B）2mmol/L HCOONH4, 50mmol/L HCOOH in	      95vol%CH3CN
Gradient: Time（min.）
A（%）
B（%）
		
0
60
40
		
2.5
60
40
		
7.5
0
100
		
12.5
0
100
Injection Volume : 5μL
Flow rate: 0.2mL/min.（40℃） Ionization : ESI
Instrument : Shimadzu LCMS-8040
Detection: LC/MS

A 社品…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

20

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）［次頁に続く］ew Products
B 社品
近日
発売

コード No.
品
名018-27901 Acetonitrile-d3, 99.8%（High purity）

規格

容量

NMR用 1mL×5A
031-25531 Chloroform-d, 99.8%（High purity）
NMR用 1mL×5A
044-34471 Deuterium Oxide, 99.8%（High purity）
NMR用 1mL×5A
040-34571 Dichloromethane-d2, 99.8%（High purity） NMR用 1mL×5A
危

希望納入価格（円）照 会
20,00020,00035,000品目は順次追加予定です。

農薬・動物用医薬品標準品・混合標準液
カタログ発行！

C 社品

ポジティブリスト一斉試験法に活用いただける「PLシリーズ」や水道法に対応した「水質シリーズ」など、当社の農薬・動物用医薬品標準品・混合標準液を一冊にまとめたカタログを発行しました。

〈各社比較表〉当社高純度 NMR 溶媒
実測値
規 格0.000%
0.003％以下
水 分（0.00015%）
含量（GC）
100％
99.9％以上

A 社品
実測値
規

格

0.005%

0.02％以下

100％−

不純物（NMR）
（1H）

試験適合

備考：1.49ppm 付 近（水分）由来のシグナルが大きい

水 分
含量（GC）

B 社品
実測値
規 格
0.0013%
0.01％以下
100％
99％以上

C 社品
実測値
規 格
0.0015%
0.01％以下
100％
99％以上

不純物（NMR）（1H）●当社の全混合標準液・標準品を収録●各混合標準液について、分析例・公定法情報を掲載●カラムや溶媒などの豊富な関連製品情報●成分名・CAS RN® と製品の対応リストを掲載
詳細・カタログのご請求はこちら↓
https://labchem-wako.fujifilm.
com/jp/catalog/index.html

備考：1.24、1.51、2.00、 備考：1.25、1.51、2.10ppm
2.16、2.27ppm 付近
付近に不純物ピークをに不純物ピークを確認
確認

追加品目のお知らせ

コード No.

ポジティブリスト関連農薬・動物用医薬品標準品
当社では、ポジティブリスト制度の対象となる農薬標準品、動物用医薬品標準品を取扱っています。
下記品目を新たに発売しました。
農薬標準品■ アクリナトリン標準品■ アラクロール標準品■ ベンゾエピンスルフェート標準品■ ブタミホス標準品■ カルボフラン標準品■ クロロネブ標準品■ N- 2 , 4 - ジメチルフェニルホルムアミド標準品■ フサライド標準品■ インドキサカルブ -MP 標準品■ MCPP 標準品■ メフェナセット標準品■ メタラキシルＭ標準品■ 2 , 4 -PA 標準品■ プロフェノホス標準品■ ピラジフルミド標準品■ セトキシジムM2-SO2標準品■ チフルザミド標準品■ トルフェンピラド標準品

動物用医薬品標準品■ モエノマイシン A 標準品

品

名014-16653 Acrinathrin Standard
NEW 012-16333 Alachlor Standard
NEW 026-06763 Benzoepin Sulfate Standard
NEW 026-10933 Butamifos Standard
危NEW 039-16323 Carbofuran Standard
NEW 036-14493 Chloroneb Standard
NEW048-34491 N -2,4-Dimethylphenylformamide Standard
NEW 061-01594 Fthalide Standard
NEW 095-04993   Indoxacarb-MP Standard
NEW 132-10423 MCPP Standard
NEW 133-11673 Mefenacet Standard
NEW 134-15623 Metalaxyl M Standard
危NEW 163-18153 2,4-PA Standard
NEW 169-17653 Profenofos Standard
危NEW 168-28571 Pyraziflumid Standard
M2-SO2
NEW
190-18781 Sethoxydim
StandardNEW
204-14774 Thifluzamide Standard
NEW
209-16843 Tolfenpyrad Standard
NEW 131-18911 Moenomycin A Standard
NEW

規

格

容量 希望納入価格（円）

残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg

25,0009,000
20,00010,00010,00015,000残留農薬試験用 100mg 20,000
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 50mg

7,000
10,00015,00012,00029,000
6,000
10,00025,000残留農薬試験用 100mg 15,000
残留農薬試験用 100mg 32,000
残留農薬試験用 100mg 26,000
高速液体クロマトグラフ用 20mg 45,000

随時、当社 HP のリストに発売品目を追加・更新しています。
詳細は当社 HP をご覧下さい。
試薬事業トップ→分析→食の安全・安心→残留農薬分析（標準品）→
ポジティブリスト制度 関連試薬 取り扱い標準品一覧
https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/category/00370.html…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）21

ew Products
微量元素分析にフタル酸エステル試験用

ICP 分析用単元素標準液

HM1000A 用 8 種フタル酸エステル混合試料

近年、電子材料や水質の他、食品や医薬品でも微量元素

本品は、（株）日立ハイテクサイエンスの「加熱脱離質の管理が必要とされています。微量元素分析では多元素一量分析計 HM1000A」用の検量線作成用試料です。

斉分析が主流のため、使用する標準液中の不純物元素の情

PVC 樹脂に 8 種のフタル酸（DEHP、BBP、DBP、DIBP、報は重要です。当社では不純物の少ない高純度な標準液を

DNOP、DINP、DIDP、DnHP） が 各 1,000ppm 含 ま れ て品揃えしています。2019 年 7 月より、不純物元素の測定います。

法を変更し、より厳しい不純物元素保証になりました。

特長● JCSS 実用標準液または NIST SRM にトレーサブル●現品説明書に不純物元素情報をロット毎に記載●不 純物元素の測定を ICP-MS で実施、目標値はすべて
0 . 05 mg/L 以下《現品説明書（単元素標準液）》
加熱脱離質量分析計 HM1000A●製品に現品説明書を添付●ト レーサビリティ元、濃度測定①の手法を記載（①）●不純物元素情報を記載（②）②

混合試料外観

使用方法
１．試料（本品）をカットする。
２．カットした試料をサンプルパンの中央にセットし、秤量する。
※試 料は 0.16-0.24mg（サンプルパンを除く）になるよ

ラインアップ
チタン・けい素・イットリウム・モリブデン・ランタン
標準液を新たに追加し、44 元素をラインアップしています。今後も順次、追加予定です。

うに調整して下さい。
３．装置のサンプルトレイに設置する。
〈使用上のご注意〉
本品の製法上、製品の一部が変色している場合がありま

ICP 分析用 ラインアップありす。変色部分を取り除いてからご使用下さい。
コード No.

品

名

8 Phthalates Mixture forNEW
168-28691
HM1000A（each 1000ppm）

規格

容量 希望納入価格（円）

フタル酸エス
テル試験用

1g

42,000

関連製品
コード No.

品

名Lanthanum Standard Solution（La 1000）
Molybdenum Standard SolutionNEW
135-18931（Mo 1000）
Silicon Standard Solution
NEW 197-18671（Si 1000）
Titanium Standard Solution
NEW 200-21001  
（Ti 1000）
Yttrium Standard Solution
NEW 255-00671（Y 1000）NEW

123-06841

規格

容量 希望納入価格（円）ICP分析用 100mL

15,000

ICP分析用 100mL

10,000

ICP分析用 100mL

8,200

ICP分析用 100mL

10,000

ICP分析用 100mL

10,000HM1000A 用 校正試料
RoHS 指令の規制対象品目に追加されたフタル酸エステ
ル類 4 種（DEHP、DBP、BBP、DIBP）のうち、DEHP は代表的な可塑剤として多く使われています。DEHP には不純物として非規制物質である DOTP、DnOTP を含むため、測定時に DOTP、DnOTP 量を補正する必要があります。
本品は（株）日立ハイテクサイエンスの「加熱脱離質量分析計 HM1000A」用の校正試料です。

その他の元素標準液は、当社 HP をご覧下さい。

コード No.

品

試薬事業トップ→分析→元素分析→単品標準液→ ICP 分析

030-25481

Correction sample for
HM1000A DOTP Fragment

フタル酸エス
テル試験用

1g

28,000036-25601

Correction sample for
HM1000A DnOTP Fragment

フタル酸エス
テル試験用

1g

28,000用元素標準液https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/category/00442.html

名規格

容量 希望納入価格（円）…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

22

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）ew Products
有機溶媒の脱水処理に便利

お求めやすい 1 本販売になりました！

ゼオライトパック

核酸合成用

ゼオライトは有機溶媒の脱水処理に用いられます。本品

当社では、核酸合成法であるホスホロアミダイト法に用は、各重量の合成ゼオライトを不織布で小分けしたゼオラ

いられる反応補助試薬を取扱っています。これまで 4 本単

イトパックです。不織布に包むことで、ゼオライトの粉末

位での販売でしたが、お客様のご要望にお応えして 1 本単が溶媒に混入するのを防ぎます。使用後は、不織布ごと瓶位でお求めいただけるようになりました。小～中量合成のから取り出せるので、廃棄処理が簡単です。

際、便利にお使いいただけます。
コード No.

反応補助試薬品

名規格

容量 希望納入価格（円）

核酸
合成用

3L

22,000核酸
合成用

3L

11,000

Activator Solution-1
核酸
011-19681 （0.25mol/L 4,5-Dicyanoimidazole,
合成用
危
Acetonitrile Solution）

3L

22,000

Activator Soluiton-2
011-19701 （0.45mol/L 1H -Tetrazole,
Acetonitrile Solution）

核酸
合成用

3L

25,000

Activator Solution-3
核酸013-20011 （0.25mol/L 5-Benzylthio-1H -tetrazole,
合成用
危
Acetonitrile Solution）

3L

27,000

Activator Solution-4
核酸018-19691 （0.25mol/L 5-Ethylthio-1H -tetrazole,
合成用
危
Acetonitrile Solution）

3L

35,000Cap A Solution-2
核酸
030-19011 ［Tetrahydrofuran/Acetic Anhydride/
合成用
危
Pyridine（8:1:1）Solution］

3L

22,000Cap B Solution-2
037-19021 （10vol% 1-Methylimidazole/
Tetrahydrofuran Solution）

3L

22,000危

核酸
合成用

Cap A Solution
031-25391 ［1-Methylimidazole-Acetonitrile（2:8）］

核酸
合成用

3L

22,000危

10g：120mm × 65mm

Cap B1 Solution
034-25381 ［Acetic Anhydride-Acetonitrile（4:6）］

核酸
合成用

3L

22,000危

50g：120mm × 65mm

033-25633

Cap B2 Solution［Pyridine-Acetonitrile（6:4）］

危

核酸
合成用

3L

照  会

037-25371

Cap B2 Solution
核酸［2,6-Lutidine-Acetonitrile（6:4）］ 危 合成用

3L

25,000核酸
合成用

3L

29,000Oxidizing Solution-2
核酸
156-02451 ［0.1mol/L I2・THF:Pyridine:Water
合成用
危（78:20:2）Solution］

3L

22,000Oxidizing Solution
核酸
158-03511 ［Iodine Solution（abt. 0.05mol/L）］
合成用
危［Pyridine:Water（9:1）］

3L

22,000デブロッキング試薬

製品概要

Deblocking Solution
043-34441 ［Dichloroacetic Acid-Toluene（3:97）］●ゼオライトの粒形は球状●サイズは 3g・10g ・ 50g の 3 種類
●保存袋は吸湿性の低いアルミ袋を採用

Deblocking Solution-1
042-28921 （3w/v% Trichloroacetic Acid,
Dichloromethane Solution）●アルミ袋内は脱気

アクチベーター試薬⇒容器のサイズに合わせて選択可能⇒未開封状態での吸湿防止●不織布の材質：ポリプロピレン / ポリエチレン

危

危

キャッピング試薬

各ゼオライトパックの外観〈サイズ〉
3g：60mm × 65mm

コード No.
NEW

261-02271

品

名

規格

容量

希望納入価格（円）3g×20

Zeolite Packs［Zeolite Synthetic, A-3,
NEW
267-02273
乾燥用 10g×20
Beads, 1.40〜2.36mm（8〜12mesh）］
NEW

265-02274

50g×10

4,000
6,000
7,500

Cap B Solution
034-25401 ［Acetic Anhydride-2,6-LutidineAcetonitrile（2:3:5）］

危

酸化試薬

…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）23

ew Products
デ ー タアルツハイマー病研究に■ ヒト脳脊髄液での測定

りん酸化 Tau T181 ELISA キットワコー

りん酸化 Tau T181
（pg/mL）

Tau ELISA キットワコー
Tau は、微小管結合タンパク質の一つで、主に中枢神経系の神経細胞に発現しており、微小管の安定性を制御しています。アルツハイマー病患者の脳では、りん酸化
Tau が蓄積した神経原線維変化が形成され、その出現の程度が認知症の重症度と相関すると報告されています。そのため、Tau はアルツハイマー病の原因究明や治療薬開発のために研究されています。また、脳脊髄液中の Total
Tau とりん酸化 Tau の濃度はアルツハイマー病患者で非認知症患者よりも上昇すると報告されています。
当社ではりん酸化 Tau（T181）と Total Tau を簡便に測定可能な ELISA キットを取扱っています。アルツハイ
マー病の研究にご活用下さい。

50

Control

MCl

AD■ 認知機能診断テスト（MMSE スコア）との相関データ
30
R2 = 0.6

MMSE スコア

25

長

●高感度

20
15
10
5

能

0

検量線範囲
測定対象
検 体
必要検体量
測定時間
検出系
※1
※2

100

非認知症者（Control）、軽度認知障害患者（MCI）、アルツハイマー
病患者（AD）の脳脊髄液を本キットで測定した。
非認知症者（Control）、軽度認知障害患者（MCI）、アルツハイマー
病患者（AD）の間で有意差が見られた。

●少量検体で測定可能

性

150

0

りん酸化Tau測定用■ りん酸化 Tau T181 ELISAキットワコー
特200

4.4 〜 500pg/mL
りん酸化 Tau T181
ヒト脳脊髄液（CSF）※ 1
20μL ～
20時間
発光系※ 2

血漿、血清サンプルでの測定不可
測定には発光プレートリーダーが必要です。

50

100

150

200

本キットで測定した脳脊髄液中のりん酸化 Tau T181 濃度と脳脊髄液を採取した患者の MMSE スコアの相関性を検討した。
23 点以下；認知症の疑い、24 〜 27 点；軽度認知障害の疑い、
28 〜 30 点；正常
りん酸化 Tau T181 の濃度と MMSE スコアに相関が見られた。

特長●少量検体で測定可能

発光

●高感度

性
HRP- ストレプトアビジン

エピトープ：Tau 中央部分
（211-231a.a.）

抗りん酸化 Tau T181 モノクローナル抗体

能
検量線範囲
測定対象
検 体
必要検体量
測定時間
検出法

ビオチン標識抗 Tau モノクローナル抗体

※3
※4
※5

4.10 ～ 1,000pg/mL
Total Tau
ヒト脳脊髄液（CSF）※ 3
10μL ～※ 43時間
発光系※ 5

血漿、血清サンプルでの測定不可
希釈の正確さを考慮して検体量は 50μL を推奨します。
測定には発光プレートリーダーが必要です。

…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

24

250

りん酸化 Tau T181
（pg/mL）

Total Tau測定用■ Tau ELISAキットワコー

測定原理
発光基質

0

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）［次頁に続く］ew Products
測定原理

コード No.
発光基質

発光

品

名

規格

容量 希望納入価格（円）Phosphorylated Tau T181
NEW 298-81701
ELISA Kit Wako

免疫化学用 96回用

98,000296-80401 Tau ELISA Kit Wako

免疫化学用 96回用

98,000

関連製品
Tau抗体

HRP- ストレプトアビジン

コード No.

ビオチン標識抗 Tau モノクローナル抗体
エピトープ：Tau 中央部分
（211-231a.a.）

抗 Tau モノクローナル抗体
エピトープ：Tau C 末端側（412-432a.a.）■ ヒト脳脊髄液での測定
1,200

800
600

016-26961 Anti Mouse Tau, Rat Monoclonal012-26963 Antibody（RTM47）017-27351 Anti 2N-Tau, Rat Monoclonal013-27353 Antibody（2C2）016-27681 Anti Phosphorylated Tau S422,012-27683 Monoclonal Antibody（AP422）

400
200

Control

MCl

AD

コード No.

非認知症者（Control）、軽度認知障害患者（MCI）、アルツハイマー病患者（AD）の脳脊髄液を本キットで測定した。
非認知症者（Control）、軽度認知障害患者（MCI）、アルツハイマー病患者（AD）の間で有意差が見られた。

■ 認知機能診断テスト（MMSE スコア）との相関データ

品

10,00035,00010,00035,00010,00035,00010,00030,00010,00030,00010,00030,00010,00030,00010,00030,00010,00035,00012,00050,00098,000【掲載内容】●透明化試薬・イメージング試薬●神経細胞培養関連試薬●キット●抗体●タンパク質・低分子化合物・ペプチド●神経栄養因子・神経新生関連サイトカイン●キナーゼ●生体試料●蛍光色素・病理染色試薬
●機器

15
10
5

1,500

当社 HP より、PDF 版をダウンロード頂けます。
神経科学研究用試薬カタログ Wako

検索➡

本キットで測定した脳脊髄液中の Tau 濃度と脳脊髄液を採取した患者の MMSE スコアの相関性を検討した。
23 点以下；認知症の疑い、24 〜 27 点；軽度認知障害の疑い、
28 〜 30 点：正常
Tau の濃度と MMSE スコアに相関が見られた。

免疫化学用 96回用

試薬・機器などをまとめたカタログです。

20

1,000

容量 希望納入価格（円）アルツハイマー病研究を含む、神経科学研究に関する25

ヒト Tau（pg/mL）

規格

神経科学研究用試薬カタログ

R2 = 0.7311

500

名High Molecular Amyloid β298-80101
Oligomer ELISA Kit Wako

30

MMSE スコア

免疫 10μL
化学用 50μL
免疫 10μL
化学用 50μL
免疫 10μL
化学用 50μL
免疫 10μL
化学用 50μL
免疫 10μL
化学用 50μL
免疫 10μL
化学用 50μL
免疫 10μL
化学用 50μL
免疫 10μL
化学用 50μL
免疫 10μL
化学用 50μL
免疫 10μL
化学用 50μL

AβオリゴマーELISAキット

00

規格 容量 希望納入価格（円）012-26603 Anti Phosphorylated Tau T181, Rat
016-26601 Monoclonal Antibody（2E2-A6）
019-26613 Anti Phosphorylated Tau S199, Rat
013-26611 Monoclonal Antibody（5B8-1E2）
014-27121 Anti Phosphorylated Tau S262, Rat
010-27123 Monoclonal Antibody（TIP1-35）

1,000

0

名

012-26583 Anti 3R-Tau, Rat Monoclonal
016-26581 Antibody（2A1-1F4）
019-26593 Anti 4R-Tau, Monoclonal Antibody
013-26591 （3E8-1A6）

デ ー タ

ヒト Tau（pg/mL）

品

011-26891 Anti Human/Mouse/Rat Tau, Rat
017-26893 Monoclonal Antibody（RTM38）019-26951 Anti Human Tau, Rat Monoclonal
015-26953 Antibody（RTM49）…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）25

ew Products■C as9 タンパク質、gRNA、ドナー DNA の導入（ノッCas9 タンパク質 /gRNA
トランスフェクション試薬

クイン）
GenomONE ®-GE を用いて Cas9
タンパク質、gRNA、制限酵素
Bam HI サイトを付加したドナー
DNA（ssODN）を HeLa 細胞に導入した。
2 日後、ターゲット遺伝子を含む断片を PCR で増幅後に制限
酵素 Bam HI 処理したサンプル
をアガロースゲル電気泳動にて解析した。

GenomONE -GE®

GenomONE ®-GE は、Cas9 タンパク質及びガイド RNA（gRNA）を細胞に導入するトランスフェクション試薬です。簡便な操作で Cas9 タンパク質と gRNA を細胞へ導入
でき、エレクトロポレーションのように特別な装置は必要ありません。これまでトランスフェクションが困難であった 免 疫 細 胞 に 対 し て も、 高 効 率 で Cas9 タ ン パ ク 質 と使用可能回数gRNA を導入することが可能です。

特

容量

長

1セット
4セット
16セット

●導 入が難しい免疫細胞にも Cas9 タンパク質、gRNA の導入が可能●試薬の混合と遠心のみの簡便な操作で、短時間に導入ベクターの調製が可能

コード No. メーカーコード

品名●バイオセーフティーレベル１の実験室で使用可能

96wells
325
1,300
5,200

容量

希望納入価格（円）容量

希望納入価格（円）75μg

23,000300μg

75,000メーカー

容量

希望納入価格（円）ニッポンジーン

50回用

54,000メーカー

容量

希望納入価格（円）ニッポンジーン

50μL

15,000容量

希望納入価格（円）384-15261 GG001
NEW
380-15263 GG004 GenomONE ®-GE
NEW 388-15264
GG016

1セット
4セット
16セット

NEW

●ドナー DNA をあわせて使用することでノックインが可能

原

使用可能回数（Wells）
24wells
48wells
65
130
260
520
1,040
2,080

6wells16
65
260

28,00075,000280,000

関連製品

理GenomONE ®-GE はセンダイウイルスのエンベロープ（HVJ-E）がもつ膜融合能を利用したトランスフェクション試薬です。

Cas9タンパク質
コード No.

品

名

メーカー

Cas9 Nuclease protein NLS
319-08641
ニッポンジーン（3μg/μL）
Cas9 Nuclease protein NLS
ニッポンジーン
316-08651（15μg/μL）

gRNA合成キット
コード No.

314-08691

品

名CUGA ®7 gRNA Synthesis Kit
危

T7 Endonuclease Reaction Mix
コード No.

313-08801

使 用 例■M
 ouse primary T cell へ の Cas9 タ ン パ ク 質 及 び
gRNA の導入
Product ANo
treatment
Cas9 ﬁnal conc.(nmol/L)
gRNA ﬁnal conc.(nmol/L)

0
0

200
N.C.200

200
200

12.5
12.5

200
N.C.200

200
200

Product B
12.5
12.5

200
N.C.200

200
200

6
12

Parental band→
Cleaved band 1→

Cleaved band 2→

Cleaved eﬃciency (%) = sum of cleaved band intensities/(sum of the cleaved and parental band intensities)×100
NC：ネガティブコントロール

T cell は BALB/c マウスから採取した Splenocytes を PMA/ionomycin
で 1 日間刺激後、カラムを用いて分離した。GenomONE ®-GE 、
他社製品 A、他社製品 B を用いて Cas9 タンパク質及び Cyclophilin B
標的 gRNA を導入した。
2 日後、T7 Endonuclease I アッセイでゲノム編集効率を検証した。

品

名

T7 Endonuclease I reaction Mix

GenomONE ®シリーズ
コード No. メーカーコード

388-15281
384-15283
382-15284
388-15286
385-15291
381-15293
389-15294
385-15296
381-15271
387-15273
385-15274
381-15276

GS001
GS004
GS016
GS040
GX001
GX004
GX016
GX040
GN01F
GN04F
GN16F
GN40F

387-15251

CF001

383-15253

CF004

381-15254

CF016

品

名

用

途

in vitro に お け る 1セット
GenomONE ®- siRNA/miRNA の 4セット
トランスフェクション 16セット
Si
キット
40セット
1セット
in vitro におけるプラ 4セット
GenomONE ®スミド DNA のトラン
GX
16セット
スフェクションキット
40セット
in vivo に お け る 1セット
プ ラ ス ミド DNA・ 4セット
GenomONE ®siRNA/miRNA・ タ
Neo（FD）
ンパク質のトランス 16セット
40セット
フェクションキット
細胞融合キット
1セット
GenomONE ®- （ハイブリドーマの作
4セット
製、脱核未受精卵CF
16セットへの核移植）…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
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26

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）

28,00075,000280,000
650,000
11,00040,000150,000
310,000
20,00060,000
195,000
440,000
18,00055,000190,000

ew Products
使 用 例

分散性に優れたレーザ製ナノコロイド
i-colloid® シリーズ

輸入元：アイシン精機㈱

貴金属ナノコロイドは、数十ナノメートルの直径を持つ■ 生体分子修飾コロイド〈抗体修飾＊ 1〉
i-colloid® AuPt

i-colloid® Au

金属微粒子です。その特徴的な色彩と抗体修飾の容易さか
ら、インフルエンザ検査薬などにおいて広く利用されています。通常、貴金属ナノコロイドは化学合成法で作製されますが、界面活性剤や反応副産物などの不純物の混入による分散性の低下が課題であり、また、合金コロイドの作製も困難でした。
®

i-colloid は、水中の金属板にパルスレーザを照射し、プラズマを発生させることで作製される貴金属ナノコロイ
ドです。界面活性剤、反応副産物などをほとんど含まず高エクソソームへの標識（データご提供：公益財団法人がん研究会
がん研究所 蛋白創製研究部 芝先生）

ラテラルフローへの適用〈PEG とペプチドマルチリガンド修飾＊ 1〉

純度なため、表面が清浄で粒子荷電量が大きく、分散性に優れます。このユニークな特性は生体分子修飾に適しており、さまざまなバイオ研究に使用されています。i-colloid®
は独自技術により粒子径及び光学特性の品質が確保されています。金コロイド及び、視認性に優れた黒色の金‐プラ

細胞観察への利用

チナ合金コロイドを販売しています。
i-colloid® AuPt
抗体修飾が容易でかつ黒色のためラテラル
フローの視認性向上に最適です。また金と併用して多項目検出も可能です。

特＊1 修
 飾プロトコルは https://nano.imra.com よりダウンロードして下さい。

〔参考文献〕

長●化学添加物を含まない●高い分散性と分子修飾率●制御性の高い表面修飾

製 造 法
純水

光音響イメージング増感（ デ ータご 提 供：Universityof Michigan Biomedical
Engineering Dept. Paulus
先生）

i-colloid ®

レーザ光

化学合成品

コード No.

プラズマ
金

原料が水・金・塩のみで表面が清浄 1）

デ ー タ■ 分散性比較
ナノ粒子1個あたりの添加PEG(5K)分子数

化学合成品 20 nm

被覆率が低いと凝集が発生

品

名

AU20-1-50W
AU20-1-100W
AU20-5-50W®
AU20-5-100W i-colloid
Gold Nanoparticles
AU40-1-50W 【i-colloid® Au】
AU40-1-100W
AU40-5-50W
AU40-5-100W
i-colloid®
AP40-1-50W Gold-Platinum Nanoparticles【i-colloid® AuPt】

粒子径 濃度＊2 容量 希望納入価格（円）

50mL
100mL
20nm
50mL
OD5
100mL
50mL
OD1
100mL
40nm
50mL
OD5
100mL
OD1

40nm OD1

22,00033,60064,00096,00022,00033,60064,00096,00050mL 34,000＊ 2 Au の場合は吸収が最大となる波長の光（粒径 20nm : 521 ±525 nmの吸収比率

i-colloid ® 20nm

1）Qian, W. et al . : J. Phys. Chem. C , 115, 23293（2011）.［分散性比較］
2）Cederquist, K. B. et al . : Colloids Surf. B Biointerfaces , 149, 351（2017）.
［ラテラルフローへの適用］
3）Matsumura, S. et al . : J. Extracell. Vesicles , 8, 1579541（2019）.［エクソソームへの標識］
4）Wu, P.-H. et al . : Int. J. Nanomedicine , 12, 5069（2017）.［細胞観察への利用］
5）Tian, C. et al . : Adv. Sci ., 3, 1600237（2016）.［光音響イメージング増感］
6）Nguyen, V. et al . : Sci. Rep ., 9, 5945（2019）.［光音響イメージング増感］

2.5nm、粒径 40nm : 524 ± 2.5nm）が試料 1cm を透過した時の光学濃度（Optical Density : OD）。AuPt の場合は波長 400nmにおける試料 1cm 時の OD。

上記以外のデータ、使用例なども多数 IMRA America,

ナノ粒子1個あたりの添加PEG(5K)分子数

Inc の HP に掲載していますので、ご覧下さい。
https://nano.imra.com…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）27

ew Products疾患メカニズム研究・創薬スクリーニング用
ヒト iPS 細胞由来疾患モデル細胞

特●疾患の特徴をin vitro （細胞レベル）で再現し、創薬研究に適切な研究材料を提供

iCell® DDP（Disease Diversity Products）●“isogenic”コントロール細胞の利用により、遺伝的変

本品は、iPS 細胞技術を用い疾患の特徴を in vitro （細異の結果を直接的に研究することが可能

胞レベル）で再現した細胞です。疾患メカニズムの解明や● iCell Ⓡ DDP のラインアップはパーキンソン病、ALS、

医薬品候補物質の創薬スクリーニング、薬効評価などの創

アルツハイマー病及び肥大性心筋症をカバー

薬研究におけるさまざまな用途でご利用いただけます。

各iPS細胞株のドナー

iCell Ⓡ DDP 製品群は、患者由来 iPS 細胞を樹立後分化誘

ドナー情報
性別
年齢層
民族性
組織起源

導する“innate”法、及び、健常人由来 iPS 細胞に疾患や薬剤反応性に関与する変異を遺伝子編集により導入後分化誘導する“engineered”法を用いて作製しています。また、engineered 法を患者由来 iPS 細胞にも適用し、疾患

リプログラミング方法

遺伝子変異を修復後分化誘導することで遺伝的背景が同一なコントロール細胞“isogenic”も樹立しています。

innateHealthy Donor

01279 株男性
55-59 歳Caucasian
PBMC
エピソーマル
ベクターの使用例
Syn1/PSD95 pancta staining

Reprogramming
to iPSC

iCell® DopaNeurons

MyCell® SNCA A53T
DopaNeurons

PSD95 Syn1 Merge

PSD95 Syn1 Merge

Synchronous Burst
iCell® DopaNeurons
500
400
300

2000

GenomeEngineering

MyCell® SNCA A53T
DopaNeurons

1500
1000

200

iPSC
Diﬀerentiation

01434 株女性
18 歳以下Caucasian
線維芽細胞
レトロウイルス
ベクター

使 用 例

Donor with
Genetic Disease

Healthy Donor

01178 株女性
50-59 歳Caucasian
PBMC
エピソーマルベクター■ SNCA A53T ドーパミン神経細胞（engineered 法）

engineered

Donor with
Genetic Disease

長

100
0

500
0

Controls

SNCA A53T ドーパミン神経細胞のシナプス関連タンパク質のsyn1（synaptophysin 1）及び PSD95（post synaptic density 95）の陽性シグナルは、コントロールである iCell® DopaNeurons に比べ減少していた。また、SNCA A53T ドーパミン神経細胞の同期
バースト発火の回数も減少を示した。

iCell Ⓡ DDP 製品群の iPS 細胞技術：患者由来 iPS 細胞の innate 及び健常人由来 iPS 細胞に疾患遺伝子編集した engineered

コード No. メーカーコード

品

名

遺伝子型【疾患】容量（細胞数 /vial）希望納入価格（円）

コントロール細胞※2
コード No.（メーカーコード）

遺伝子編集疾患 iPS 細胞由来分化細胞“engineered”
ドーパミン神経細胞553-34791 C1112 1M MyCell® DNC（SYN A53T）01279 Cells ※ 1
556-34801 C1113 5M MyCell® DNC（SYN A53T）01279 Cells ※ 1

150
150

SNCA（A53T）【パーキンソン病】

  1.0×106 cells） 130,000 551-33511（C1087）
1Vial（＞  5.0×106 cells） 457,000 551-33371（C1028）
1Vial（＞心筋細胞
  4.0×106 cells） 457,000 552-33301（C1006）
550-34821 C1153 4M iCell® CMC（CACNA1C G490R）01434 Cells 150 CACNA1C（G490R）【心臓不整脈、ブルガダ症候群3】 1Vial（＞
運動神経細胞554-34841 C1160 3M iCell® MNC（SOD1 G93A）01434 Cells
551-34851 C1161 3M iCell® MNC（TDP43 Q331K）01279 Cells
558-34861 C1162 3M iCell® MNC（TDP43 M337V）01279 Cells

SOD1（G93A）【筋萎縮性側索硬化症（ALS）】
150 TDP43（Q331K）【筋萎縮性側索硬化症（ALS）】
150 TDP43（M337V）【筋萎縮性側索硬化症（ALS）】
150

  3.0×106 cells） 457,000
1Vial（＞ー  3.0×106 cells） 457,000 557-33471（C1048）
1Vial（＞  3.0×106 cells） 457,000 557-33471（C1048）
1Vial（＞GABA 抑制性神経細胞559-34911 C1175 4M iCell® NRC（APOE4/4）01434 Cells
疾患 iPS 細胞由来分化細胞“innate”

150

  4.0×106 cells） 457,000 556-33321（C1012）
APOE4/4【APOE4/4対立遺伝子変異アルツハイマー病】 1Vial（＞150

MYH7（R403Q）【肥大性心筋症】

心筋細胞556-34781 C1081 4M MyCell® CMC（MYH7 R403Q）01178 Cells ※ 1
遺伝子修復コントロール細胞“isogenic”

  4.0×106 cells） 457,000 553-34811（C1119）
1Vial（＞心筋細胞553-34811 C1119 4M MyCell® CMC（MYH7 corR403Q）01178 Cells ※ 1 150 MYH7（corR403Q）変異を修復

  4.0×106 cells） 457,000
1Vial（＞※1 MyCell は在庫が無くなり次第、品名が iCell に切り替わります。
※2 コントロール細胞は別売です。
®

®

…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 10 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

28

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）ー化学大家 448
セント＝ジェルジ・アルベルト（1893 . 9 . 16 ～ 1986 . 10 . 22）
大阪大学大学院生命機能研究科

仲野徹

セント＝ジェルジ・アルベルトほどが、適切な名前をつけないと却下する

波瀾万丈の生涯を送った科学者はいなとの怒りの返事をうけとるはめにない。ビタミン C の発見によるノーベる。そして、最終的には 1928 年にヘル生理学・医学賞の受賞と、第二次世

キスロン酸として発表された。

界大戦中のスパイ活動でヒトラーに名ケンブリッジから祖国のセゲド大学

をあげて罵られたこと。このふたつの

医化学の教授に就任した 1931 年の秋、出来事だけで十分かもしれない。しか米国ビッツバーグ大学の生化学者、ビし、それだけではない。研究面では、

タミン C の研究をしていたチャール

クエン酸回路発見の直前まで達していズ・キングの研究室で経験を積んだ

たし、アクチンとミオシンによる筋収

ジョー・スワーベリが留学してきた。

縮の発見も行っている。さらに、第二ヘキスロン酸がビタミン C である可次世界大戦直後には、祖国ハンガリー

能性を考えたこともあったセント＝の大統領候補にもなった。いやはや信

ジェルジであったが、ビタミンのことじられない人生だ。

が好きでなかったので、その方面でのセント＝ジェルジは、1893 年にハンガリーのブダペストで生まれた。母
方のレノセック家はハンガリーきっての学者一家で、ブダペスト大学の解剖学教授を伯父に持つ。子どものころは成績が悪かったが、ギムナジウムの頃研究を行っていなかった。しかし、ス
図１．セント＝ジェルジ・アルベルト（ウィキペディア※から）※ https://ja.wikipedia.org/wiki/ セント＝ジェルジ・アルベルト（2019 年 7 月
22 日閲覧）から急速に成績が向上した。医学生

ワーベリには「これを試してごらん。
こ れ は ビ タ ミ ン C だ と 思 う よ 」 と、
ヘキスロン酸の入った小瓶を渡した。
瞬く間に研究は進み、その年の暮
れには、ヘキスロン酸がビタミン C
であることがほぼ確定した。旧師キになって、「直感的に核心に迫る質問

ベル賞を受賞することになるアセチル

ングとの板挟みになって悩むスワーをすることのできる能力」に気づき、コリンの同定を行いつつあったヘン

ベリに、セント＝ジェルジは「君は「何か偉大な発見ができるのではない

リー・デールの研究室に押しかけて還キングに手紙を書いて、君の発見をか」という自信を持つようになった。

元物質の単離を試みるも失敗。失意の知らせたら良い」と伝える。その手第 一 次 世 界 大 戦 に 招 集 さ れ る が、うちに自殺しようとまで思い詰める。

紙 を う け と っ た キ ン グ は、 大 急 ぎ「戦争自体がペテン師まがいの軍人にしかし、最後の思い出にと参加したで“THE CHEMICAL NATURE OF

よって支配され」ていることに我慢が1926 年の国際生理学会議で、これもVITAMIN C（ビタミン C の化学的性できなくなり、戦線からの離脱を決意

後に成長促進ビタミンの発見でノーベ質）”という論文を Science に投稿しする。そのために、自らの左腕に向けル賞を受賞するフレデリック・ホプキ

た。ただし、これはデータなど全く示て発砲し、戦傷を装った。目的のためンスと出会い、ケンブリッジの研究室されてない、ごく短いメモみたいなもには手段を問わない若者であった。

に参加することになった。

のであった。

１．ノ ーベル賞に輝いたビタミン C

は「誰が発見しようと、科学にとっこれを知ったセント＝ジェルジ

戦争終結後、ポゾニ（現在のブラチスラバ）からプラハ、ベルリン、ハン
ブルク、ライデン、グローニンゲンへの発見ては取るに足らない」と言いながらと場所を変えながら研究を行った。そ

困難の末、オレンジジュースから還も 激 怒 し、“Hexuronic Acid as theのテーマも、伯父に指導をうけた解剖

元物質を抽出・結晶化することに成功

Antiscorbutic Factor（抗壊血病因子

学から、生理学、物理化学、薬理学とし、C6H8O6 の組成を持った弱酸性のとしてのヘキスロン酸）”という短報

移ろい、最終的には生化学へと至っ

炭水化物であることを明らかにする。

を Nature に投稿した。掲載されたのた。ベルリンでは、愛知医科大学（いBiochemical Journal に 投 稿 す る に あは、キングの論文が 1932 年の 4 月 1

まの名古屋大学医学部）に職を得る前たり、ラテン語の「わからない」を意日、わずかに遅れてセント＝ジェルジのミハエリス ― 酵素反応速度論のミ味するイグノスコと、糖の接尾辞オーとスワーベリの論文が同 16 日だった。

ハエリス・メンテン式のミハエリスだ

スから、イグノースと名付けるが、編このような事情から、ビタミン C― とも知遇を得ている。

集主幹のアーサー・ハーデンに軽薄な発見の先取権争いが勃発する。スワー

副腎に還元物質が存在することを発

命名をとがめられた。懲りずに神のみ

ベリとキングの手紙のやりとりなどか見したセント＝ジェルジは、後にノーぞ知るゴッドノースとして投稿した

ら、セント＝ジェルジの発見と正しく

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）29

は「水素の受容体、供与体と代わるがわる作用する中間体の存在」を指摘し、セント＝ジェルジは、それが生体酸化の本質だと見抜いた。
同時に 25 もの研究テーマを行っていたというセント＝ジェルジである。
細胞呼吸の研究も続けていた。鳩胸筋のミンチを使った実験で、呼吸速度は次第に低下するが、少量のコハク酸やフマル酸を加えると元通りに回復する
ことを見出した。この結果から、コハク酸やフマル酸が触媒であると考えた。ただ、残念ながら、代謝が回路になっているとは想像しなかったのだ。
この話は、ビタミン C のような先取権争いなどではない。セント＝ジェ
ルジが先駆者で、クレブスが発見者で

図２．セント＝ジェルジのビタミン C につ
いての Nature 論文（文献 3）ある。クレブスがセント＝ジェルジをはじめとする巨人の肩に乗って大発見認められ、ノーベル医学生理学賞は1937 年、セント＝ジェルジの単独受賞を発表する。

を行った、というところだ。おそら
図３．キ ン グ の ビ タ ミ ン C に つ い て のScience 論文（文献 4）ビタミン C を大量に含み、セントあったので、クレブスには「回路」という思考が頭にこびりついていたのだ＝ジェルジがその単離に使ったパプリ

れたクレブスだが、ホプキンスの助けろう。ホプキンスの同門である二人のカの歌が作られ、セゲドではたいまつ

でケンブリッジにリクルートされ、つ関係はずっと良好で、セント＝ジェル

行列がでるほどの大騒ぎになった。一いで、シェフィールド大学へと移る。

ジは「この仕事中、科学者として最高方の米国では、ノーベル賞がひとつ掠そこで成し遂げたのが、クエン酸回の知的満足を味わった」と語っている。

われたというように取り上げられた。

路、別名クレブス回路の発見だ。この

ただし、当事者の反応はクールで、キ

成果は 1937 年に発表され、1953 年のングは何も批判がましいことは言わな

ノーベル医学生理学賞に輝いている。

３．最大の貢献、ミオシンとアクチンによる筋収縮かったし、セント＝ジェルジは「先取じつは、セント＝ジェルジはクエン

うまくいっている時は極端に快活で権の問題は、後代の人たちによって公酸回路のほとんどを発見している。ク

あるが、ダメな時は自殺しようとまで平に扱われるべきである」と述べるにレブスが「この回路を組みたてる個々

考える。セント＝ジェルジはかなりのとどまった。

の知見は数名の研究者の努力によって躁鬱気質であった。1937 年にノーベ明らかにされてきた。中でもセント＝ル生理学医学賞を受賞したが、ビタミ

ジェルジの発見は大きかった」と述べ

ン C やクエン酸回路以上に魅力的な

２．あと一歩だったクエン酸回路
クレブス・サイクルに名を残すハンているほどだ。セント＝ジェルジは、テーマが見つからず、完全に元気をな

ス・クレブスはユダヤ系ドイツ人医「細胞呼吸の自己調節的な連鎖経路」

くしていた。しかし、そのような状態学者だ。医師免許取得後、カイザー・を見出していたが、最も重要なことにも長くは続かなかった。

ウィルヘルム研究所の偉大なる生化学

思いいたらなかった。

1939 年、Nature に掲載された、ミ者オットー・ワールブルクの研究室で1924 年、セント＝ジェルジはすでオ シ ン が ATP を 分 解 す る 作 用 が あ研究を開始する。四年後に研究室を追に細胞呼吸についての論文を出しているという論文を読んで、ミオシンとい出されてしまうが、フライブルク大た。その論文を引用したことが、1926

ATP の相互作用が筋収縮の鍵である学で臨床医をしながら研究を続け、尿年の国際生理学会議でセント＝ジェルとひらめいた。これは論理的な思考の素のオルニチン回路を発見する。

ジがホプキンスに招かれるきっかけに

結果ではなく、あくまでも直感であっなったのである。その時、ホプキンス

た。セント＝ジェルジのこういうとこ

ナチスが台頭するドイツで職を追わ

30

く、オルニチン回路の発見のことが

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）

ろは本当にすごい。「これこそ、私たたかった。その秘密交渉役として、セちの生命を理解する道だ」と叫びまで

ント＝ジェルジに白羽の矢がたった。

したという。そして、その直感はある

そして親書を携え、イスタンブールで程度正しかった。

英国諜報機関の長官と接触する。

セゲド大学は研究環境に恵まれてお「私の政治活動のピークは、ヒット

らず、コールドルームや分光光度計な

ラーが私の名を大声で怒鳴ったことでどもなかった。ATP も市販されておす」と述懐するセント＝ジェルジ。立らず、ウサギの筋肉から精製する必要

派にスパイの役目を果たしたのだ。ハがあった。研究は人海戦術で行われンガリーがソ連によって解放されたた。ミオシン糸を精製し、ATP を加1945 年には、国民的英雄として民主えたところ、顕微鏡下で糸はゆっくり

ハンガリー国家の初代大統領と期待さと収縮した。「筋収縮をガラス器内でれるまでになる。親ソ連だったセント

捕らえた！」発見は、数多くの発見を＝ジェルジだが、ハンガリーでの占領したセント＝ジェルジにとって「生涯ソ連軍の蛮行を目の当たりにし、政治の中で最大の発見」であった。

に嫌気がさして研究へと舞い戻る。

女性の実験助手イロナ・バンガがミ

しばらくはハンガリーのために働いオシンを抽出せずに一晩放置したとこ

たが、友人がソ連に捕らえられて国外

ろ、溶液がねばねばになっていた。こ

追放になったことを機に米国への移住の現象は重要であると、またしてもひを決意する。ウッズホール海洋生物学

らめくセント＝ジェルジ。ねばねばの研究所や NIH で研究を進めたが、そ溶液に ATP を加えると粘度が著しくれ以後は先の 3 つに匹敵するような成低下した。

果はあげていない。

そして、この研究はブルーノ・スト

90 歳を越えても、「研究できなきゃ

ラウブにゆだねられた。呼吸酵素の研

生きてはおれんのだ。だから今、何を究をしぶしぶ中断してミオシンの研究研究するかを考えているんだ」と言っを開始したストラウブだったが、粘性ていたセント＝ジェルジであったが、の高い溶液には別のタンパク質が存在

1986 年に腎不全でなくなった。第二することを発見する。このタンパク質

次世界大戦後のセント＝ジェルジにはは、ミオシンに活性（activity）を与

物足りなさを感じないでもないが、そえることから、セント＝ジェルジにれは望みすぎというものだろう。

よってアクチン（actin）と命名され、Discovery consists of seeing what

れた。

everybody has seen and thinking
what nobody has thought.（ 発 見 は、

命科学における最大の貢献とされてい誰もが見てきたことを観察することる。しかし、セント＝ジェルジは満足と、誰も思いつかなかったことを考えしていなかった。これを生命の本質とることによって成立する）

まで考えることができなかったのだ。
いやはや、レベルが違いすぎる。

第二次世界大戦が始まったころか〔参考文献〕
キャビアを 科学者セント＝ジェルジの冒険』（岩波書店）（1989）．
２）Hughes, R. E. :“From ignose to hexuronic
acid to vitamin C”,Trends Biochem. Sci. , 8,
146（1983）.
３）Szent-Gyorgyi, A. :“Hexuronic Acid as the
Antiscorbutic Factor”, Nature , 129, 943（1932）.
４）K ing, C. G. and Waugh, W. A. : “THEA discovery is said to be an accident
meeting a prepared mind.（発見とは４．その後

この原稿は、参考文献１を元にしており、括弧でくくったコメントはその本からの引用です。ちなみに、その『朝からキャビアを』というタイトルは、第二次世界大
戦後にソ連に招かれたセント＝ジェルジは最大級の賓客であったので三食すべてにキャビアが供された、というエピソードに由来します。また、拙著『生命科学者たち
のむこうみずな日常と華麗なる研究』（河出文庫）でも、もう少し詳しく紹介していますので、ご参照いただければ幸いです。

１）ラルフ・W・モス著、丸山工作訳：『朝から1942 年にストラウブの単名で報告さこの研究は、セント＝ジェルジの生図４．
『朝からキャビアを 科学者セント＝ジェルジの冒険』（文献 1）準備された心がでくわす偶発事みたいなものだ）

ら、反ナチの姿勢で政治活動に巻き込まれていく。ハンガリーは親独の立その研究を振り返ると、セント＝場であったが、時の首相ミクロシュ・

ジェルジの残した名言がじつに味わい

カーライは同盟国側との関係も維持し深く思えてくる。

和光純薬時報 Vol.87, No.4（2019）

CHEMICAL NATURE OF VITAMIN C”,

Science , 75, 357（1932）.
５）Krebs, H. A. :“The citric acid cycle and the
Szent-Gyorgyi cycle in pigeon breast
muscle”,Biochem. J. , 34, 775（1940）.
６）Rall, J. A. :“Generation of life in a test tube :Albert Szent-Gyorgyi, Bruno Strab, and thediscovery of actin”,Adv. Physiol. Educ. , 42,277（2018）.

31エンドトキシン特異的反応試薬
リムルス ES-Ⅱ シリーズ
PYROSTARTM ES-F シリーズ

エンドトキシン
活性化
ファクターC

ファクターCるライセート試薬を使用します。試料中にエンドトキシンが含まれる場合、セリンプロテアーゼ前駆体であるファクター C、ファク

ファクターBター B、凝固酵素前駆体が順次、増幅活性化されていきます。最活性化
ファクターG
活性化
ファクターB

阻害

凝固酵素

凝固酵素前駆体

終的にコアギュローゲンが水解されてコアギュリンとなり、不溶性のゲルが形成されますが、試料中に（1→3）-β-D- グルカンが含まファクターG

コアギュローゲン

コアギュリンれる場合、ファクター G の活性化により、凝陽性反応が生じます。
ライセート試薬 ES シリーズは、反応系に大過剰の（1→3）-β-D-

ゲル形成

リムルステストの反応カスケード

グルカン（カルボキシメチル化カードラン）を共存させることにより、β-グルカンによるライセート試薬の活性化を阻害し、エン
ドトキシンを特異的に検出することが可能です。
こ の 度、 従 来 の 製 品 に 加 え、 新 た に 表 示 感 度 0.03EU/mL、リムルス ES- Ⅱ
シングルテストワコー

0.25EU/mL をラインアップしました。

特長●検体中の（1→3）-β-D-グルカンの影響を受けることなく ､ エンドトキシンを特異的に検出可能● ES- Ⅱシリーズ：日本薬局方収載 ｢ エンドトキシン試験法 ｣ に適用● ES-F シリーズ：米国輸出品目の最終製品試験に適用（※米国食品医薬品局（FDA）の認可を取得）●トキシノメーター ® による比濁法では、高感度な検出が可能（※定量範囲は 0 . 01 ～ 10EU/mL（表示感度 0 . 015 の製品の定量下限は 0 . 0078EU/mL））●測定試料の pH の影響を受けにくいため、安定したエンドトキシン測定が可能

ES-Ⅱシリーズ

ES-Fシリーズ■ シングルテスト■ シングルテスト

コード
No.

品

名

290- Limulus ES-Ⅱ Single Test
81401 wako 0.03（CSE付）
296- Limulus ES-Ⅱ Single Test
NEW
81501 wako 0.25（CSE付）
NEW

表示感度
（EU/mL）

規格

容量

希望納入
価格（円）

エンドトキシン
25回用 32,000
検出用
エンドトキシン
0.25
25回用 32,000
検出用
0.03

コード
No.
NEW

名

298- Limulus ES-Ⅱ Test wako
NEW
81201 0.03（CSE付）
290- Limulus Amebocyte Lysate
NEW
51214 ES-Ⅱ, Lyophilized
293- Limulus Amebocyte Lysate
NEW35841 ES-Ⅱ, Lyophilized 0.03
298- Limulus Amebocyte LysateNEW35911 ES-Ⅱ, Lyophilized 0.25

Limulus Amebocyte Lysate
292PYROSTARTM ES-F Single
81601
Test 0.03（CSE付）

0.03

規格

希望納入
価格（円）

容量

エンドトキシン
25回用 32,000
検出用■ マルチテスト■ マルチテスト品

表示感度（EU/mL）

名

CSE：Control Standard Endotoxin

CSE：Control Standard Endotoxin

コード
No.

品

表示感度
（EU/mL）

規格

容量

希望納入
価格（円）

エンドトキシン 50回用（5.2mL
0.03
31,000用×1本）
検出用
エンドトキシン 50回用（5.2mL
0.015
29,000用×1本）
検出用
エンドトキシン 50回用（5.2mL
0.03
26,000用×1本）
検出用
エンドトキシン 50回用（5.2mL
0.25
26,000
用×1本）
検出用

コード
No.

品

表示感度
規格
（EU/mL）

名

298- Limulus Amebocyte Lysate PYROSTARTM
35891 ES-F MULTI TEST 0.03
294- Limulus Amebocyte Lysate PYROSTARTM
NEW
81301 ES-F MULTI TEST 0.03 with CSE
295- Limulus Amebocyte Lysate PYROSTARTM
NEW
35921 ES-F MULTI TEST 0.25
NEW

希望納入
価格（円）

容量

エンドトキシン 50回用（5.2mL
26,000
検出用
用×1本）
エンドトキシン 50回用（5.2mL
0.03
31,000
検出用
用×1本）
エンドトキシン 50回用（5.2mL
0.25
26,000
検出用
用×1本）
0.03

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…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
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…特定毒物
  
…毒物
…劇物
…毒薬
…劇薬 危 …危険物
…向精神薬
…特定麻薬向精神薬原料特定    
…化審法 第一種特定化学物質…化審法 第二種特定化学物質…化学兵器禁止法 第一種指定物質…化学兵器禁止法 第二種指定物質
毒素等 …国民保護法
覚 …覚せい剤取締法
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…カルタヘナ法収載されている試薬は、試験・研究の目的にのみ使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
記載希望納入価格は本体価格であり消費税などが含まれておりません。

和光純薬時報 Vol. 87 No. 4
2019 年 10 月 15 日 発行
発行責任者
編集責任者
発 行 所

印

32

刷

所

吉井陽市
大西礼子
富士フイルム和光純薬株式会社〒 540-8605 大阪市中央区道修町三丁目 1 番 2 号
TEL.06-6203-3741（代表）URL http://ffwk.fujifilm.co.jp
共進社印刷株式会社●和光純薬時報に対するご意見・ご感想はこちらまでお寄せ下さい。
E-mail ffwk-jiho@fujifilm.com●製品に対するお問合せはこちらまでお寄せ下さい。

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Tel +1 804 714 1920 / Fax +1 804 271 7791

・FUJIFILM Wako Chemicals Europe GmbH http://www.wako-chemicals.de
European Office（Neuss, Germany）：Tel +49 2131 311 0 / Fax +49 2131 311 100

Vol.87 No.4

エンドトキシン試験には、カブトガニの血球抽出物から作られ（1→3）-β-D-グルカン