博 士 （ 医 学 ） 片 山 知 也
学 位 論 文 題 名Type I interferon prolongscell cycle progressionvi
ap21WAFl/CI
Plinductioninhumancol
oncancercells（I型インターフェロンはp21W
AFl/CIPl発現誘導を介し
大 腸 癌 の 細 胞 周 期 進 行 を 遅 延 さ せ る）

学位論 文内容の要旨【 背 景 】 大腸 癌 は 最 も頻 度 の 高 い悪 性 腫 瘍 の1っ であ り 、 治 療の 第 一 選 択は 積 極 的 な切 除で あ るが 、 そ の 約30％ に 再発 が 見 ら れる 。 よ っ てそ の 予 後 向上 に は 原 発巣の 切除と ともに再 発 の 予 防 と 治 療 が 必 要 で あ る 。 こ れ に 対 し 5FUを 中 心 と し た 数 多 くの 化 学 療 法が 行 わ
れ て い る が、 未 だ 満 足す べ き 結 果に は 至 っ てい な い 。 その よ う な 中、 Interferon(IFN)‑Bを 用い た 化学 療 法が 進 行 大腸 癌 症例に有効 であったと の報告があ った。
IFN‑6は IFN‑aと 同 じ I型 IFNに 分 類 さ れ 、 共 通 の IFNQreceptor (IFNAR)を 介 し て細 胞 内 に シ グ ナ ル を 伝 達 す る 。 こ れ まで I型 IFNに は 、抗 ウ イ ル ス効 果 の 他 に、 血 管 新 生
抑 制 作用 お よ び 直接 的 細胞増 殖抑制 作用と いった 抗腫瘍 効果が あるこ とが報告 されて おり、細 胞 増 殖 抑 制 メ カ ニ ズ ム に 関 し て は 、 Gl期 停 滞 や S期 進 行 遅 延 ・ S‑G2fM期 移 行 遅 延な どの 細 胞周 期 の 進 行制 御 や 、 アポ ト ー シ ス誘 導 が 関 与し て い る こと が 報 告され ている 。本研
究 で は 大 腸 癌 細 胞 に 対 す る I型 IFNの 増 殖 抑制 効 果 を 確認 し 、 そ の標 的 分 子 を明 ら か に す
ると ともに 増殖制 御メカ ニズム を解析し た。
【 材 料と 方 法 】 2種 類 のヒ ト 大 腸 癌細 胞 株 (HT29， SW480)に対 し 、 ま ず＠ IFNARくIFNAR‑1，IFNAR‑2b、 IFNAR‑2c)の 発 現 を ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト (WB)法 で 確 認 し 、 ◎ 2種 類 の I型
IFN(IFN‑a2b， IFN‑B)の増殖 抑制効 果を濃度 別(50， 500，5000IU/mD、 添加時 間別(48， 96，144h冫 に 、 コラ ー ゲ ン ゲル 培 養 薬 剤感 受 性 試 験(CD‑DST)を用 い て 比 較検 討した 。同期 させた 大 腸 癌 細 胞 に IFN(500 IU/ml） を 添 加 し 、 48時 間 後 ま で の 細 胞 周 期 変 化 を 各 周 期 別（GO／ G1期，S期，G2／M期）にフローサイトメトリー（F（コM）を用いて測定するとともに、細胞 周 期制 御 蛋 白 群（ CyclinA， CyclinB， Cdk1，Cdk2，p19，p21， p27）の 発現変 化をWB法 にて 調 べた 。 IFN添 加群 （ IFN．Q2b，IFN．6，10001U／ml）お よび非 添加群の p21プロ モータ ー
遺 伝 子 の 転 写 活 性 を ル シ フ ェ ラ ー ゼ レポ ← タ ー アッ セ イ （ LRA） に て 比 較検 討 し た 。RNAinterferenceく RNAi） 法 を 用 いて p21を knock‐ downした 大腸癌細 胞株（ SW480）を 作成し 、IFN添 加 後 の 細 胞 周 期 変 化 お よ び 周 期 制 御 蛋 白 の 発 現 変 化 を 調 べ た 。
【 結 果 】 2種 類 の 大 腸 癌 細 胞 株 （ HT29， SW480） は と も に イ ン タ ー フ ェ ロ ン レ セ プ タ ー（ IFN虹め の 発 現 があ り 、 両 細胞 株 に 対 しIFN‐ n2bおよ びIFN．6は 増殖抑 制効果 を示し た。
そ の 効 果 は 濃 度 依 存 性 で あ り 、 い ず れの 濃 度 に おい て も IFN・Q2bに 比 べ IFN． 8の方 が 有
意に 高かっ たが（ Pくo．05） 、添加 時間と 増殖抑 制効果 の間に は相関性は認められなかった。
FCMに て 細 胞 周 期 変 化 を 調 べ た 結 果 、 IFN添 加 群 で は 非 添 加 群 に 比 べ 細 胞 周 期 の 進 行が 遅 延 し て い る の が 認 め ら れ 、 特 に S期 で の 遅 延 が 特 徴 的 で あ っ た 。 S期 進 行 は 、Cdk2． CychnA， Cdk1‐ CyclinAお よ びCdk1・CyclinB複 合 体 に よっ て 制 御 され て い る 。よ19 ‑ってS期遅 延のメカ ニズム を調べる ためS期制御 蛋白の発 現変化 を調べた結果、IFN添加群では C
yclinA，CyclinBの 発現は非 添加群 に比べ遅 延して おり、その発現パターンはS期細胞 数の増 加に相関 してい た。また Cdk(Cdkl，Cdk2 and Cdk4)蛋白の発現はIFN
添加群および非添加群とも実験期間内を通じて変化は認めなかった。
Cdkinhibitors(CKIs)
はcyclin‑Cdk複合体に結合しその酵素活性を阻害するが、一般にそ の発 現量 は細胞 周期を通 じて変 化を認め ない。 しかしp21発現は IFN添 加により 増加し、S期細 胞数増加 や増殖 抑制効果 と同様、IFN*Bの方がその発現増加効果が高いことも認 めた 。 ま たLRAに てp21プロ モ ー ター 遺 伝 子の 転 写 活性 が IF
N添加に より約2倍に 増加する ことが 示され、 さらに p21 knock‑down細胞に おいて はI
FNの 細胞周期遅延作用が減弱し、細胞周期制御蛋白（特にCyclinA，CyclinB)の発現変化も消失することが認められた。
【考察 】様々 な正常細 胞や腫 瘍細胞に 対する I
FNの細 胞周期作 用として、主にGl期停止がよく 知られ ているな か、S期進行 遅延やS‑G2f
M期移行阻 害など の報告もある。このようにIFNには 様々な生物学的活性が報告されているが、その作用は細胞種によって大きく分類できる。DaudiBurkitt 8リンパ腫や白血病など造血系腫瘍ではGl期停止が多く報告されて いる一 方、肝細 胞癌や 前立腺癌 などの 固形腫瘍 において はS期進行遅延やS‑G2fM
期移行 阻害が 特徴的である。大腸癌細胞株を用いた本研究でも、S期増加を特徴とした細胞 周期 遅 延 作用 が IFN
添 加 に より 認 め られ た 。 Qinら はこ う した S
期 細胞増加 は、pRb依存性 Gl chec
kpoi
nt機能の欠 如とS‑G2lM期 移行阻害 のため 引き起こされると述べている が、 HobeikaらはRb
遺 伝子コ ードが欠 損して いる細胞 において もGl arrestの誘導 が認めら れたと 報告して いる。 本実験で 使用し たHT29におい てはpRb発現異常は認めない
がS期細胞 の増加が みられ た。それ ゆえRbだ けでなく 、その他 の細胞周期制御分子の異常化も関与していると考えられた。
S‑G2/M期進 行遅延の原因を調べるため、S期関連蛋白の発現変化を解析した。本来ならば、cyclinAおよびcyclinBの発現により即座にcyclin‑Cdk複合体が形成・活性化され、その結果S期進行が促進されてG2/M期への移行が誘導される。しかし本研究ではcyclin
Aおよびcyclin
Bの発現にも関わらずS期進行は促進されず、これらの発現は正常細胞に比べ遅くS期細胞数の増加に相関するものであった。さらにp21発現を抑制によりS期細胞数の増加がなくなるとCyclinA，Cyclin
B発現の遅延・増加も消失した。これらの結果から、CyclinA，
CyclinB発現はIFNにより制御されているのではなく、S期細胞数変化を反映したものであると考えられ、こうした結果はIFNとCdk‑inhibitors(CKIs)の関与を推測させるものであった。C
KIsの発現変化を調べた結果ではIFNによりp21発現が増加することを認め、さらにその発現 増加が 転写レベルで調節されていることを認めた。またp21発現を抑制することでIFNの 細胞周 期遅延作用は減弱することが分かり、p21がIFNの細胞周期遅延作用における重要な標的分子であると考えた。DulicらはS‑G2/M期進行遅延メカニズムとして、p21発現によりcyclinA‑Cdk2活性が抑制されM期への移行が阻害されるためと報告している。今回の結果においても、p21によるcyclinA‑Cdk2の機能障害が示唆された。cyclinAの量的変化がS期細胞 を反映し ている 2次的 なもので あるこ と、およ びC
dk2発現がI
FN
添加により変化しな いこと より、p21は細胞周期制御蛋白を量的に調節しているのではなく、機能的にCdk2活性を抑制していると考えられた。
ま た 本研 究ではIF
N‑a2bとIF
N‑
Bの増殖 抑制効 果に差異 が認め られた。 I
FN‑aとI
FN‑Bの生物学的効果の違いについては、細胞内シグナル伝達の差異や受容体鎖への相互作用・結合能の差異、およびアポトーシス誘導能の差異などが原因と報告されている。本研究では この 増 殖 抑制 効 果 の 差異 は 2つの IFNの p21
発 現 誘 導の 差 異 に一致 しており 、p21発現量とIFN増殖抑制効果の相関を裏付けるものと考えた。
今 回 我々 は大腸癌 細胞株に 対する I型IFNの増 殖抑制効 果がS‑
G2fM
期 進行遅延 を特徴とした 細胞周 期遅延作用に依存していることを示すとともに、その作用にはp21発現が大きく関与していることを示した。
ー20―

学 位論文審査の要旨

主 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 秋 田 弘 俊
副 査 教 授 藤 堂
省

学位論文題名TypeIinterferon prolongscellcycleprogression
viap21
WAFl/CIPlinductioni
nhuma
ncolonc
ance
rcells（エ型インターフェロンはp21WAFl/CIPl
発現誘導を介し大腸癌の細胞周期進行を遅延させる）本研究では大腸癌細胞におけるI型IFNの増殖抑制効果および増殖制御メカニズムを検討するとともにその標的分子を明らかにした。IF
N‑aおよびIF
N‑Bは同じI型IFNに分類され、共通のインターフェロンレセプターを介して細胞内にシグナルを伝達する。その効果には抗ウイルス効果の他に、血管新生抑制作用および細胞増殖抑制作用といった抗腫瘍効果があることが報告されており、その増殖抑制メカニズムに関してはGl期停滞やS期進行遅延。G2/M期移行遅延など細胞周期の制御や、アポトーシス誘導の関与が示されている。今回我々はインターフェロンレセプター発現をもつ2種類の大腸癌細胞株(HT29，SW480)に対するI
FN‑a2bおよびI
F
N‑6の増殖抑制効果を確認した。増殖抑制効果
は濃度依存性であり、いずれの濃度比較においてもIF
N‑a2bに比べIFN‑6の方が有意に高かった。
増殖抑制メカニズムを解析するため、フローサイトメトリーを用いて細胞周期変化を調べた結果、IFN添加群では非添加群に比べ細胞周期の進行遅延がみられ、特にS期細胞数の増加が特徴的であった。S期進行は主にCdk2‑CyclinAlB複合体によって制御されているため、S期制御蛋白の発現変化を調べたところ、IFN添加群ではCyclinA，CyclinBの発現が非添加群に比ベ増加していた。理論上はcyclinの発現により即座にcyclin‑
Cdk複合体が形成・活性化され、その結果S期進行が促進されてG2!
M期への移行が誘導されるはずである。しかし本研究ではcyclinAおよびcyclinBの発現にも関わらずS期進行は促進されず、その発現パターンは非添加群に比ベ遅くS期細胞数を反映するものであった。
次にcyclin‑Cdk複合体の酵素活性を制御するCdkinhibitorsの発現変化を調べたところ、IFN添加によりp21発現が誘導されることが認められた。p21発現とIFNの増殖抑制効果には正の相関がみられ、
p21knock‑down
細胞においては細胞周期遅延作用の減弱が認められた。加えてルシフェラーゼレポーターアッセイではIF
N添加によりp21プロモーター遺伝子の転写活性が約2倍に増加することが示さ
れ 、 p21が IFNの 細 胞 周 期 遅 延 作 用 に お け る 重 要 な 標 的 分 子 で あ る と 考 え ら れ た 。
以上の内容発表後、副査の秋田教授から1）実験で使用したIFN
濃度と実際の臨床現場での使用濃度の差異について、2） IFNのアポトーシス誘導能について、3）p21によるGlarrest誘導はみられたか、‑21‑4）抗 癌剤 と の併 用効 果に つい て の質 問があった。続いて主 査の浅香教授から5）研究対 象としてなぜ大 腸 癌細 胞株 を選んだのか、6） 他の癌細胞株ではどのような 報告があるのかについて質 問があった。
ま た、副査の藤堂教授からは、7） antivi
ral activi
tyに関して行われている最近の治研について、8）IFN
レ セ プタ ーか らp21発 現ま での シ グナ ル伝 達系 に つい ての 質問 があった。申請者は、こ れらの質問に対 し 、1） 本 実験 で使 用し たIFN濃 度は それぞれ静脈内および 動脈内に直接投与した場合 に近い濃度を設 定 して 韜り 臨床 応 用を 踏ま えた デー タであること、2） TUNEL法、DNA ladder法にて調 べた結果lFN
添 加 によ るア ポト ー シス 誘導 作用 は本 研究では認められなか ったこと、3）S期進行遅延 を特徴とした
細 胞 周期 全体 の遅 延 であ りGlarreStを 特徴とした変化ではな かったこと、4）S期をター ゲットとした
5FU系 抗癌 剤 との 併用 では 相乗 効 果が 見られたと回答した。 5）臨床現場で数多く診療す る疾患であるの に 対し IFNの抗 腫瘍 効果 が今 ま でほ とんど研究されていな かったためであること、6） 一般に浮遊系
細 胞 では G1arrestが 報告 され てい るの に 対し 固形 腫瘍 では S期 遅延 作 用が IFNの効 果と して多く報告
さ れ てい るこ と、7）IFNの抗ウイ ルス活性に関してnon．codingmicroRNAを用いた治研が 最近報告されて いること、8）JAK゜S1、ATチロシンキナーゼリン酸化経路の活性化が報告されているがまだ充分には解析 されていないと返答した。
本 研 究 は 、I型IFNが大 腸 癌に 対し て増 殖 抑制 作用 を有 して お り、 p21発現 誘導 を介 した 細 胞周 期
遅 延 作用 がそ の主 要 メカ ニズ ムで ある こ とを 示し たこ とで 高 く評 価さ れ、 今 後臨 床上 でp21がIFN治療 を行う上でのターゲット分 子となることが期待される。
審 査員 一同 は、 こ れら の成 果を 高く 評価し、大学院課程に おける研鍛や取得単位など も併せ申請者が 博士（医学）の学位を受け るのに十分な資格を有するも のと判定した。

― 22一