Oct. 2018

〈原THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

71―5225（ 45 ）著〉
肺炎マイコプラズマ感染症迅速診断としてのマイコプラズマ rRNA 検出試薬 TRCReady MP の臨床評価
石和田稔彦 1）・長澤耕男 2）・菱木はるか 2）・阿部克昭 3）・
静野健一 4）・北田清悟 5）・込山修 6）・森伸晃 7）

千葉大学真菌医学研究センター感染症制御分野

1）

千葉大学医学部附属病院小児科2）

千葉市立海浜病院小児科3）

千葉市立海浜病院臨床検査科

4）

国立病院機構刀根山病院呼吸器内科

5）

国立病院機構東京医療センター小児科

6）

国立病院機構東京医療センター総合内科7）（2018 年 8 月 6 日受付）
自動遺伝子検査装置 TRCReady-80 システムを利用し，新規に開発された肺炎マイコプラズマ・リボゾーム試薬（TRCReady MP）を用いて，小児及び成人呼吸器感染症患者における肺炎マイコプラズマ感染症迅速診断の有用性評価を行った。290 例に関して検討したところ，TRCReady MP 法の PCR 法との一致率は 96.2%（感度 98.2%，特異度 95.7%），LAMP 法との一致率は 96.2%（感度 100%，特異度 95.3%）であった。

TRCReady MP は検体処理後 1 時間以内に結果を得ることが出来る。以上の結果より，
TRCReady MP 法は，肺炎マイコプラズマ感染症迅速診断法として有用と考えられた。

なってきている 3）。肺炎マイコプラズマは，一般序文

細菌と異なり細胞壁を有しないことから，β-ラクタム系の抗菌薬が無効であること，ときに呼吸不Mycoplasma pneumoniae（肺炎マイコプラズマ） 全などを呈する重症化や髄膜炎などの合併症を伴は，ヒトに感染すると気管支炎や肺炎などの呼吸器感染症を惹起する代表的な病原微生物である

うこともあることから，迅速な病原診断が望まれ。 る感染症の 1 つである。一方，一般細菌と異なり

1, 2）

特に学童から比較的若い成人の市中肺炎の原因微グラム染色が利用できず，かつ培養には特殊培地生物としての頻度が高い。従来，肺炎マイコプラを必要とし分離までに時間がかかるため，従来はズマは 4 年周期での流行がみられたが，近年この抗体測定が病原診断の主体であった。しかし，最状況は変化し，毎年小流行が認められるように

近，迅 速 抗 原 キ ッ ト や Loop-mediated Isothermal226（ 46 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

Ampliﬁcation（LAMP）法が開発，市販され，保険収載されるようになってきている

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図 1. 検査のフローチャート。東ソーが開4, 5）

発した転写 - 逆転写協奏反応（Transcription reverse

transcription concerted reaction：TRC 反応）を原理とした TRCReady は，PCR 法よりも速く核酸を増幅・検出できる方法である 6）。さらに今回，煩雑であった核酸精製から核酸増幅・検出を自動化した TRCReady システムを利用し，開発したマイコ
プ ラ ズ マ・リ ボ ゾ ー ム RNA （rRNA）試 薬（TRCReady MP）を用い，本試薬の臨床的有用性を評価したので，報告する。

材料と方法
対象は，千葉大学医学部附属病院小児科，千葉市立海浜病院小児科，刀根病院呼吸器内科，東京医療センター総合内科・小児科を受診し，臨床的に肺炎マイコプラズマ感染症が疑われた症例を含む急性呼吸器感染症と診断した患者とした。そのうち，研究への同意が取得できた者（小児の場合

院：第 2017–8，刀根山病院：1621，東京医療センには，本人 and/or 代諾者）から咽頭ぬぐい液ある

ター小児科 28–15，総合内科 28–16。

い は 喀 痰 を 採 取 し た。採 取 し た 検 体 の 一 部 を

Loopamp マイコプラズマ P 検出試薬（栄研化学）

結果（以 下， LAMP）法 な ら び に PCR 法（株 式 会 社ビー・エム・エル）により肺炎マイコプラズマの検査対象とした患者の内訳は，小児 100 例，成遺伝子検出を行った。細菌培養検査が必要と判断

人 190 例であった。検体別では，咽頭ぬぐい液 112した症例に関しては，細菌培養検査も同時に実施

検体（小児 78 検体・成人 34 検体），喀痰 178 検体した。残りの検体は必要な場合−20°C に保存し， （小児 22 検体・成人 156 検体）であった。

TRCR 核 酸 精 製 キ ットにより核酸抽出を行い，全 290 例の TRCReady MP キット（以後本キッTRCReady MP にて測定を行った。TRCReady MPト）と PCR 法 の 解 析 結 果 の 比 較 を 表 1 に 示 す。の測定結果を PCR 法ならびに LAMP 法と比較しPCR 法を基にした本キットの感度は 98.2%，特異た。検査の流れを図 1 に示す。

度は 95.7%，全体一致率は 96.2% であった。表 2

本試験は，各医療機関における倫理審査委員会に本キットと LAMP 法の解析結果比較を示す。の承認を得て，ヘルシンキ宣言に基づいた倫理原

LAMP 法を基にした本キットの感度は 100%，特理を遵守し，「人を対象とする医学系研究に関す異度は 95.3%，全体一致率は 96.2% であった。

る倫理指針」に従って実施した。
承認番号：千葉大学：T28003，千葉市立海浜病

つぎに小児・成人例でのキットと PCR 法の比較 を 表 3・表 4 に 示 す。小 児 例 を 対 象 と し た 本

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71―5227（ 47 ）表 1. TRCReady MP と PCR 法との比較（全数）

表 2. TRCReady MP と LAMP 法との比較（全数）

表 3. TRCReady MP と PCR 法の比較（小児例）表 4. TRCReady MP と PCR 法の比較（成人例）

キットの感度は 97.7%，特異度 93.0%，全体一致表 6 に示す。上咽頭ぬぐい液でのキットと PCR の率 95.0% であった。成人例を対象とした感度は比較では感度 97.6%，特異度 88.7%，全体一致率100%，特 異 度：96.6%，全 体 一 致 率 96.8% で あ92.0% であった。喀痰でのキットと PCR 法の比較

り，いずれも成人の方が高い感度・特異度・全体の感度 100%，特異度 98.8%，全体一致率 98.9% で一致率を示した。

あり，感度・特異度・全体一致率いずれも喀痰の最後に検体別の本キットと PCR 法の比較を表 5， 方が咽頭ぬぐい液に比べ高い値を示した。

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表 5. TRCReady MP と PCR 法の比較（上咽頭ぬぐい液検体）

表 6. TRCReady MP と PCR 法の比較（喀痰検体）

図 2. TRCReady-80 の外観

場合 10 分程度で精製から検出まで自動化されて考察おり，検体を機器にセットして 40 分程度で結果が得られるため，Point of Care Testing に準じた形

TRCReady-80 システムは，核酸精製から核酸増での臨床応用が可能である。今回開発された試薬

幅・検出工程を自動化し迅速・簡便に結核菌群とは，肺炎マイコプラズマの rRNA を標的とした遺非結核性抗酸菌症を検出するシステムであり， 伝子検査試薬であり，基礎的な検討において，102014 年 9 月から市販されている（図 2）。その測定コピー程度の rRNA 量で検出可能であり，肺炎マ原理は，TRC 法といい，一定温度で微生物特異的イコプラズマ以外のマイコプラズマ属菌，肺炎クな rRNA を増幅し検出する方法である 。検体のラミジアとの交差反応性は認められていない

7）

前処理は咽頭ぬぐい液であれば 5 分程度，喀痰の （表 7）（表 8）。実際に今回臨床検体を用いて検討

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71―5229（ 49 ）表 7. 交差反応性に関する検討結果

1,000,000 CFU/test または 10,000,000,000 copies RNA/test を測定

表 8. Mycoplasma pneumoniae RNA 量（コピー数）と検査感度に関する検討結果したところ，保険収載されている LAMP 法と比較非特異増幅反応ではないことが示された。残りのした場合，95% 以上の感度，特異度であった。ま2 例については配列解析を行うことが出来ず，評た，汎用されている PCR 法との比較においても価不能であった。LAMP 法の結果と乖離した 11

95% 以上の高い感度，特異度を有しており，検査例のうち，9 例に関しては TRC 反応産物の配列解診断薬としては問題ないと思われた。PCR 法との析により肺炎マイコプラズマの配列が確認できた乖離例に関しては，PCR 法陽性，本キット陰性とため非特異増幅反応でないことが示された。残りなった 1 例は LAMP 法においても陰性であり，検の 2 例については配列解析を行うことが出来な体中にごく微量しか肺炎マイコプラズマが含まれかったため，評価不能であった。ていなかったため偽陰性となったと考えられた。

今回，小児と成人を対象としたが，いずれも高一方，PCR 法陰性，本キット陽性であった 10 例のい感度，特異度であった。また，検体として咽頭うち 8 例に関しては TRC 反応産物の配列解析にぬぐい液と喀痰で比較したところ，いずれも高いより肺炎マイコプラズマの配列が確認できたため感度，特異度を示したが，喀痰検体の方がより高230（ 50 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

い値を示した。肺炎マイコプラズマ診断においては下気道からの検体の方が菌量が多いため，検体採取にあたっては本法においても留意する必要があると思われた 8〜10）。今回発熱などの臨床症状の出現時期と検査実施時期の検討や，肺炎マイコプラズマの定量的な評価は個々の症例に関しては行っておらず，今後の検討課題である。現在，市販されている迅速抗原キットの PCR 法と比較した際の感度は 57.6%，特異度は 91.6% と報告されており 11），LAMP 法との比較データを合わせると

TRCReady は専用機器を必要とはするものの，迅速抗原診断より感度が良く，LAMP 法と同等の感度・特異度を有することから汎用性が期待できるものと考えられた。
利益相反
本研究は東ソーとの受託・共同研究契約に基づき実施され，研究費用は東ソー株式会社が負担した。

引用文献
1）Yamasaki K, Kawanami T, Yatera K, et al.:Signiﬁcance of anaerobes and oral bacteria incommunity-acquired pneumonia. Plos ONE
2013; 8: e63103.
2）中村 明：気管支肺感染症病因診断の問題点
EBM の時代を迎えて。日本小児科学会雑誌
2003; 107: 1067–73.
3）成田光生：感染症 現状の問題点と未来への展望 マイコプラズマ感染症の診断と治療。
臨床と微生物 2017; 44: 174–7.

71―5

Oct. 20184）山崎 勉，黒木春郎，板垣 勉，他：肺炎マ
イコプラズマ感染症の診断におけるリボソー
ムタンパク L7/L12 抗原検出試薬の検討。日本感染症学会雑誌 2015; 89: 394–9.
5）山口惠三，館田一博，中森祥隆，他：LAMP 法を用いた Mycoplasma pneumoniae と Legionella
spp. による呼吸器感染症の迅速診断試薬の評価。医学と薬学 2007; 58: 565–71.
6）田村 卓，富永健司，坂本和美，他：TRC 法を用いた結核菌検出法（TRCRapid M.TB 東ソー）の有用性に関する検討。日本臨床微生物学会雑誌 2008; 18: 15–9。
7）保 川 清：新 し い 遺 伝 子 検 査 法 の 進 歩 ③
TRC 反応による RNA 増幅とリアルタイム検出。医学のあゆみ 2003; 206: 479–83。
8）Kakuya F, Kinebuchi T, Okubo H, Matsuo K.:
Comparison of oropharyngeal and nasopharyngeal
swab specimens for the detection ofMycoplasma pneumoniae in children withLower respiratory tract infection. J Pediatr.
2017; 189: 218–21.
9）Räty R, Rönkkö E, Kleemola M: Sample type iscrucial to the diagnosis of Mycoplasma
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Microbiol. 2005; 54: 287–91.
10）Brunner H: Adherence and pathogenicity of
Mycoplasma pneumoniae: a review, Microbial
surface components and toxins in relation topathogenesis, 81–9, EZ Ron and S Rottem,Plenum Press, New York, 1991.
11） Sano G, Itagaki T, Ishiwada N, et al.:Characterization and evaluation of a novel
immunochromatographic assay for pharyngeal
Mycoplasma pneumoniae ribosomal protein L7/
L12 antigens. J Med Microbiol. 2016; 65: 1105–10.

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THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

71―5231（ 51 ）Clinical evaluation of TRCReady MP for rapid diagnosis
of Mycoplasma pneumoniae infection
Naruhiko Ishiwada1), Koo Nagasawa2), Haruka Hishiki2), Katsuaki Abe3),
Kenichi Shizuno4), Seigo Kitada5), Osamu Komiyama6) and Nobuaki Mori7)
1)

Department of Infectious Diseases,
Medical Mycology Research Center, Chiba University
2)
Department of Pediatrics, Chiba University Hospital3)
Department of Pediatrics, Chiba Municipal Kaihin Hospital
4)
Department of Clinical Laboratory, Chiba Municipal Kaihin Hospital
5)
Department of Respiratory Medicine, National Hospital Organization,Toneyama National Hospital
6)
Department of Pediatrics, National Hospital Organization,
Tokyo Medical Center7)
Department of General Internal Medicine,National Hospital Organization, Tokyo Medical Center
Tosoh TRCReady MP is a newly developed automatic Mycoplasma pneumoniae rapid
detection method using a transcription reverse-transcription concerted reaction. We analyzed theperformance of the TRCReady MP assay by comparing with polymerase chain reaction (PCR)
method and Loop mediated isothermal ampliﬁcation (LAMP) method with clinical samples. As
for the result of 290 clinical samples in which detection of M. pneumoniae was targeted, the rateof concordance between TRCReady MP and PCR method was 96.2% (sensitivity, 98.2%;specificity, 95.7%), and that between TRCReady and LAMP method was 96.2% (sensitivity,100%; specificity, 95.3%). It takes within one hour for detection using TRCReady MP after
sample preparation processing. These results indicate that TRCReady MP is useful for the rapid
diagnosis of M. pneumoniae infection.