診療と新薬・第 50 巻

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エスワンメイジⓇ配合カプセル T25 のヌードマウスを用いたヒト胃癌細胞皮下移植モデルにおける抗腫瘍効果の検討
Meiji Seika ファルマ株式会社

倉田靖

土屋敏行

打田光宏

平塚一幸

間中正恵

酒井東日

佐溝邦夫

梅木祐仁

要旨

Meiji Seika ファルマ株式会社が開発したエスワンメイジ Ⓡ 配合カプセル T25（以下，S-1Meiji）について，先発医薬品である大鵬薬品工業株式会社のティーエスワンⓇ配合カプセ
ル T25（以下，TS-1）を比較対照に，ヌードマウス皮下移植ヒト胃癌細胞に対する抗腫瘍効
果並びに造血器及び小腸への影響を検討した。
MKN45 ヒト胃癌細胞を 6 週齢の雌ヌードマウスの背部皮下に移植し，移植の 11 日後より，S-1Meiji 及び TS-1 ともに各々 10 mg/kg の用量を 1 日 1 回の頻度で 9 日間，強制経口投与した。投与期間終了後，動物は継続して 12 日間の観察期間を設けた。投与及び観察期間中に腫瘍径を測定した。サテライト群として一部の動物は両製剤の 10 mg/kg を 9 日間強制経口投与後に解剖し，全採血を行い，造血器への影響を検討するため白血球数を計測した。
また，これらの動物の小腸について病理組織学的に投与の影響を検討した。
その結果，S-1Meiji 投与群では媒体対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑制効果が観察された。S-1Meiji の平均腫瘍体積の推移を標準製剤である TS-1 投与群と比較すると，ほぼ同様の抑制傾向が示され，S-1Meiji と TS-1 の薬効はほぼ同様であると考えられた。
サテライト群では，媒体対照群と比較して両製剤群に有意な白血球数の減少が観察されたが，両製剤群間では差はなかった。また，小腸陰窩上皮細胞に軽度の単細胞壊死と TUNEL染色陽性のアポトーシスの増加が両製剤ともにみられたが，これらの程度は両製剤間で差はみられなかった。
以上より，エスワンメイジⓇ配合カプセル T25 の薬効並びに造血器及び小腸への影響は，標準製剤であるティーエスワンⓇ配合カプセル T25 とほぼ同様と考えられた。
キーワード：フルオロウラシル，テガフール，ギメラシル，オテラシルカリウム，胃癌，抗腫瘍効果，後発医薬品

は じ め に配合した経口抗悪性腫瘍剤である。ギメラシルは5-FU の分解阻害剤で血中 5-FU 濃度を上昇させてティーエスワンⓇ配合カプセル T25 は，フルオロ抗腫瘍効果を高める目的で，さらにオテラシルカリウラシル（5-FU）のプロドラッグであるテガフー

ウムは消化管粘膜細胞に分布し，5-FU のリン酸化ルに，二つのモジュレーターであるギメラシル及び酵素を阻害して消化管毒性を軽減する目的で配合さオテラシルカリウムをモル比で各々 1：0.4：1 にてれている 1）。

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Meiji Seika ファルマ株式会社が開発したエスワ

5×10 7 cells/mL の細胞濃度で懸濁した。細胞数のンメイジⓇ配合カプセル T25（以下，S-1Meiji）は，計測は血球計算盤を用いて行った。調製した細胞懸先発医薬品であるティーエスワン Ⓡ 配合カプセル

濁液は移植まで氷上にて維持した。動物にイソフルT25（以下，TS-1）と有効成分であるテガフール並

ラン麻酔を施した後，この腫瘍細胞懸濁液（5×10 6びにその配合剤であるギメラシル及びオテラシルカ

cells/100μL/animal）を右背部皮下に移植した。

リウムを同量含有する同一剤型の薬剤である。

2）投与液の調製

今回，S-1Meiji の胃癌に対する抗腫瘍作用につい投与液の調製は，各製剤の 1 カプセル（25 mg）て，ヒト胃癌細胞株である MKN45 細胞をヌードマ中の薬剤を蒸留水（株式会社大塚製薬工場）に溶解ウスに移植した系を用い，標準製剤である TS-1 とさせ，該当する用量に応じて投与液濃度を調整し比較検討した。また，投与終了時の血液を用いて，た。

抗腫瘍効果に伴う骨髄抑制を反映する白血球数の変3）投与方法

動と小腸の病理変化を両製剤について検討した。

腫瘍細胞移植の 11 日後（投与開始日）に，腫瘍体積を指標に動物を選択した。選択された動物は腫Ⅰ．材料及び試験方法

瘍体積で順位付けを行い，主群として各群の平均腫1. 使用薬剤

瘍体積が均一になるように 1 群 12 匹の 3 群に分Ⓡ試験製剤としてエスワンメイジ 配合カプセル

け，媒体対照群と 10 mg/kg の S-1Meiji 及び TS-1T25（Meiji Seika ファルマ株式会社）を，標準製剤投与群に割り付けた。選択されなかった動物から血としてティーエスワンⓇ配合カプセル T25（大鵬薬液学的検査及び小腸の病理組織学的検査実施のサテ品工業株式会社）を使用した。

ライト群として任意に 9 匹を選択し 1 群 3 匹の 3群に群分けし，各々を媒体対照群と 10 mg/kg の2. 使用動物
nu5 週 齢 の 雌 ヌ ー ド マ ウ ス（CAnN.Cg-Foxn1 /S-1Meiji 及 び TS-1 投 与 群 と し た。S-1Meiji 及 び

CrlCrlj マウス，日本チャールス・リバー株式会社）

TS-1 投与群の各々の投与液は投与開始日より 1 日を 4 日間の検疫期間を含む 10 日間の馴化飼育の1 回の頻度で 9 日間経口投与した。媒体対照群の動後，6 週齢で試験に供した。動物は入荷後，ポリ物には蒸留水を同じ投与スケジュール及び投与経路カーボネート製ケージにて飼育した。

で投与した。投与容量は 10 mL/kg とし，当日の体試験期間中は，体重測定，外観，行動などの一般症状観察を行った。
動物は，温度 22 ± 3℃，相対湿度 50 ± 20％，換重を基に投与液量を算出した。なお，投与量及び投与期間の設定は既報を参考に設定した 2）3）。
4）腫瘍径の測定

気回数 10 〜 20 回 / 時，照明時間 7:00 〜 19:00 の動物にイソフルラン麻酔を施した後，腫瘍の長径環境下で飼育し，飲料水は水道水を給水ビンにて，及び短径について電子ノギス（株式会社ミツトヨ）

飼料は放射線滅菌固型飼料 CE-2（日本クレア株式を用いて測定し，腫瘍体積は次式を用いて算出し会社）を自由摂取させた。

た。

3. 試験方法
1）ヒト胃癌細胞移植マウスの作製

32

腫瘍体積（mm ）＝ 長径（mm）× 短径（mm）× 0.5

ヒト胃癌細胞株，MKN45（独立行政法人理化学

また，各測定日における媒体対照群の平均腫瘍体積研究所 筑波研究所 バイオリソースセンター）を，及び各薬剤投与群の平均腫瘍体積から以下により腫10％牛胎児血清及び抗生物質含有 RPMI1640（Life瘍増殖抑制率を計算し，両製剤の最大となる抑制率Technologies）で約 4 週間培養したものを移植に供を算出した。

した。
移植当日に，培養細胞をトリプシン処理した後回収し，50％の BD マトリゲル基底膜マトリックス（BD Biosciences） を 含 む D-PBS（Dulbecco s
Phosphate-Buﬀered Saline，Life Technologies） に

腫瘍増殖抑制率 ＝⎛薬剤投与群の平均腫瘍体積 ⎞⎜1 −⎜×100（％）
媒体対照群の平均腫瘍体積 ⎠⎝診療と新薬・第 50 巻

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5）血液学的検査及び小腸の病理組織学的検査関する基準」（平成 18 年 4 月 28 日環境省告示第 88

最終投与日の翌日に，サテライト群の動物にイソ号）」及び「動物実験の適正な実施に向けたガイドフルラン麻酔を施し開腹した。腹部後大静脈よりシライン」（日本学術会議，平成 18 年 6 月 1 日）にリンジ及びマイクロティナ微量採血管（日本ベクト合致し，株式会社ボゾリサーチセンター つくば研

ン・ディッキンソン株式会社）を用いて全採血を究所 動物実験委員会の承認を得て，試験施設で定行った。全採血終了後，小腸を摘出しホルマリン固めている実験動物の管理及び福祉に関する指針（動定 し た。 採 取 し た 血 液 は 総 合 血 液 学 検 査 装 置物実験委員会規則）に従って実施した。

ADVIA2120i（Siemens Healthcare Diagnostics

Ⅱ．結K.K.）を用いて白血球（WBC）数を計測した。摘果

各投与群における平均腫瘍体積の推移を Fig. 1

出した小腸は常法に従いパラフィン包埋，ヘマトキに示した。

シリン・エオジン染色標本を作製し病理組織学的に薬剤投与による影響を検討した。また，小腸陰窩上

S-1Meiji の 10 mg/kg 投与群の腫瘍体積は，媒体皮細胞のアポトーシスの検出のために TUNEL 法

対照群と比較して，投与開始後から増殖抑制効果がⓇ

Peroxidase In Situ Apoptosis

みられ，投与期間終了後の腫瘍細胞移植 20 日後以Detection Kit，日本ミリポア株式会社）による染色降において媒体対照群と比較して有意な抗腫瘍効果を実施した。病理標本作製及び検査は Meiji Seikaが示された。S-1Meiji 投与による腫瘍体積の推移

ファルマ株式会社にて実施した。

は，標準製剤である TS-1 と比較して有意差はな（The ApopTag

4. 統計学的処理

く，類似した抗腫瘍効果が示された。さらに，腫瘍腫瘍体積の有意差検定は Student s t-test により増殖抑制率は両製剤ともに観察期間終了時である移実施した。体重は各群の投与開始時と試験終了時の植後 31 日で最大となり，S-1Meiji 及び TS-1 では体重について Paired t-test，白血球数では各群間で各々 48％と 47％と同様の値を示した。
各群の試験開始及び終了時の動物数と平均体重をStudent s t-test により実施した。

Table 1 に示した。媒体対照群を含めた各群の試験

検定には GraphPad Prism 5 を使用し，有意水準開始時の体重は，試験終了時に比較して減少が認めは両側 5％とした。
5. 動物倫理られた。また，両製剤投与群の終了時の平均体重は

本実験は，株式会社ボゾリサーチセンター つく対照群に比較して低い値を示したが，両製剤群間にば研究所の施設で実施された。本実験は，「動物の差は認められなかった。投与期間中に死亡例はみら愛護及び管理に関する法律（昭和 48 年 10 月 1 日

れなかったが，投与終了後の観察期間中（投与終了

法 律 第 105 号， 平 成 23 年 8 月 30 日 法 律 第 105

後 5 日目）に TS-1 投与群の 1 例に死亡が認められ号」，「実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減にた。

1250

Vehicle Control
S-1Meiji 10 mg/kg

Tumor volume (mm3)1000

TS-1 10 mg/kg
Administration time points

750
＊＊
＊＊
＊
＊

500

＊
＊

＊＊

＊＊＊

250

01114172024Time after implantation (Day)2731Fig. 1 Tumor volume
MKN45 tumor-bearing mice wereadministered orally with S-1Meiji or TS-1
daily for 9 days followed by observation
periods of 12 days without treatment.
Each value represents the mean ± SEM.
Signiﬁcant diﬀerence from vehicle control
group at the same time point.
＊ ＊＊,and ＊ ＊ ＊ : P ＜ 0.05, 0.01 and 0.001,
respectively38 （708）

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Table 1 Body weights in female nude mice after treatment with S-1Meiji and TS-1 for 9days followed by observation period of 12 days
GroupsNo. of mice

Dose

Body weights (g)(mg/kg)

InitialFinal

InitialFinal

01010121212121211 a）

17.8 ± 0.7
17.8 ± 0.6
17.9 ± 0.6

15.9 ± 0.8 ＊＊＊Vehicle Control
S-1MeijiTS-1

14.5 ± 0.5 ＊＊＊14.9 ± 0.7 ＊＊＊Each value represents the mean ± SEM.
a)
One animal died on 24 days after implantation.
Signiﬁcant diﬀerence from initial body weight in each group. ＊＊＊：P ＜ 0. 001

サテライト群の各群における平均白血球数を

MKN45 ヒト胃癌細胞皮下移植ヌードマウスモデ

Fig. 2 に，各群の小腸粘膜の病理組織写真を Fig. 3ルを用いて，腫瘍増殖抑制効果，体重変化，白血球に示した。投与期間終了の翌日に測定された媒体対数及び小腸の病理変化を指標に S-1Meiji と標準製

2照群の平均白血球数は 26.4 ± 5.9（×10 個 /μL，剤である TS-1 の薬効及び忍容性を比較検討した。

平 均 値 ± 標 準 偏 差 ） で あ っ た が，S-1Meiji 及 び

投 与 及 び 観 察 期 間 中 の 腫 瘍 体 積 推 移 で は，

2

TS-1 投与群では各々 8.6 ± 4.0（×10 個 /μL）と2S-1Meiji は媒体対照群と比較して有意な腫瘍増殖抑4.5 ± 1.4（×10 個 /μL）であり，両製剤とも媒体制効果が観察された。また，S-1Meiji 投与群の平均対照群に比較して有意な減少がみられた。しかし，腫瘍体積の推移を標準製剤である TS-1 投与群と比両製剤群間に差は認められなかった。

較すると，ほぼ同様の抑制傾向が示され，本試験系

小 腸 の 病 理 組 織 学 的 検 査 で は，S-1Meiji 及 び
TS-1 投与（9 日間）による明らかな障害性の変化において S-1Meiji の薬効は標準製剤とほぼ同様と考えられた。

は観察されなかったが，媒体対照群（Fig. 3-a）に体重変化に関しては，媒体対照群を含む全ての群比較して両製剤ともに小腸陰窩上皮細胞に単細胞壊で体重の減少がみられたが，S-1Meiji と TS-1 の両死 が 軽 度 に み ら れ た（Fig. 3-c，e）。 さ ら に，製剤投与群では，媒体対照群よりもさらに体重減少

TUNEL 法による免疫組織化学的検討では，これらがみられた。媒体対照群でみられた体重減少は，同部位の小腸陰窩に TUNEL 陽性の細胞が散見されMKN45 皮下移植腫瘍の増殖による影響と考えられた（Fig. 3-d，f）。

た。一方，両製剤投与群でみられた媒体対照群を超Ⅲ．考察

Meiji Seika ファルマ株式会社が開発したエスワⓇえる体重減少は，両製剤投与の影響によるものと考えられたが，S-1Meiji と TS-1 投与群の体重減少の程度はほぼ同様と考えられた。

ンメイジ 配合カプセル T25 は，経口抗悪性腫瘍剤既報において，TS-1 の有効成分である 5-FU にであるティーエスワンⓇ配合カプセル T25 の後発医

は造血器系及び消化器系に対する影響が報告されて薬品である。後発医薬品は，「後発医薬品の生物学いる 2）4）5）。血液学検査（白血球数測定）では，両製的同等性試験ガイドライン」に従い製剤評価（溶出剤群において，媒体対照群と比較して有意な白血球試験及びヒトでの生物学的同等性試験）を実施し，数の減少が観察された。白血球減少は TS-1 投与で先発医薬品と同等であることが認められ，製造販売認 め ら れ る 副 作 用 の 1 つ で あ る が，S-1Meiji と承認される医薬品である。一方，後発医薬品はこれTS-1 の白血球減少作用に大きな差はないと考えらら承認申請に必要なデータの他に，可能な限り品質れた。また，小腸の病理学的な検討では両製剤投与や治療効果，副作用に関する情報提供が必要と考え群ともに著しい影響は認められなかったが，小腸陰られる。本稿では先発品と同様の有効性および安全

窩上皮細胞の単細胞壊死が何れの製剤群においても性が得られるかどうかについて，MKN45 細胞移植軽度にみられ，両製剤間では小腸に与える影響に大系による in vivo モデルを用いて検討した。

きな差はなかった。一方これら小腸陰窩上皮の単細診療と新薬・第 50 巻

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WBC count (x102/μL)

403020＊10＊＊0Vehicle
Control

S-1Meiji
10 mg/kgTS-1
10 mg/kg

Fig. 2 Leukocyte counts
Leukocyte counts of nude mice after treatment with
10 mg/kg S-1Meiji or TS-1 for 9 days.
Each value represents the mean ± SD (n ＝ 3).
Signiﬁcant diﬀerence from vehicle control group.
＊, ＊＊ : P ＜ 0.05, 0.01, respectively

TUNEL

H&E

abcdefVehiclecontrol

S-1MeijiTS-1

Fig. 3

Photomicrographs of H & E and TUNEL staining sections (x200) of the small intestinal mucosa ofvehicle control (a, b) and after treatment with 10 mg/kg of S-1Meiji (c, d) and TS-1 (e, f) for 9 days,respectively. The small intestine in MKN45 tumor-bearing mice in the vehicle control group was innormal appearance (a) and TUNEL staining showed negative in the crypt (b). Single-cell necroses(arrows) in the crypt cell were mildly seen in the mice treated with S-1Meiji (c) and TS-1 (e). TUNEL
staining revealed positive cells (arrows) mainly in the crypt (d, f). Scale bars: 50μm

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胞壊死の出現部位に一致して TUNEL 陽性細胞が認

alternate-day versus consecutive-day treatment with

められ，これらはアポトーシスと考えられた。両製

S-1: assessment of tumor growth inhibition and toxicity剤の活性体である 5-FU は腸上皮のアポトーシスをreduction in gastric cancer cell lines in vitro and in vivo.
Int J Clin Oncol, 13: 515-20, 2008.

誘導することが知られている 6）。これらのことか

3）Kodera Y, Fujiwara M, Yokoyama H, Ohashi N, Miura S,

ら，両製剤の 9 日間の投与により認められた腸の変

Ito Y, Koike M, Ito K, Nakao A: Combination of oral

化は同程度であり，また，その変化にはいずれもアfluoropyrimidine and docetaxel: reappraisal ofポトーシスの出現を伴っていた。

synergistic eﬀect against gastric carcinoma xenografts.

以上から，ヒト胃癌細胞皮下移植ヌードマウスモ

in vivo, 19: 861-6, 2005.
4）Lokich JJ, Ahlgren JD, Gullo JJ, Philips JA, Fryer JG: A

デルを用いた評価におけるエスワンメイジⓇ配合カ

prospective randomized comparison of continuous

プセル T25 の薬効並びに造血器及び小腸への影響

infusion ﬂuorouracil with a conventional bolus schedule

は，標準製剤であるティーエスワンⓇ配合カプセル

in metastatic colorectal carcinoma: a Mid-Atlantic

T25 とほぼ同様と考えられた。
文献1）Shirasaka T: Development history and concept of anoral anticancer agent S-1 (TS-1 ®): its clinical usefulness
and future vistas. Jpn J Clin Oncol, 39: 2-15, 2009.
2）Arai W, Hosoya Y, Haruta H, Kurashina K, Saito S,Hirashima Y, Yokoyama T, Zuiki T, Sakuma K, Hyodo
M, Yasuda Y, Nagai H, Shirasaka T: Comparison ofOncology Program Study. J Clin Oncol, 7: 425-32, 1989.
5）E f f i c a c y o f i n t r a ve n o u s c o n t i n u o u s i n f u s i o n o ffluorouracil compared with bolus administration inadvanced colorectal cancer. Meta-analysis Group InCancer. J Clin Oncol, 16: 301-8, 1998.
6）P r i t c h a r d D M , P o t t e n C S , H i c k m a n J A : T h erelationships between p53-dependent apoptosis,
inhibition of proliferation, and 5-fluorouracil-induced
histopathology in murine intestinal epithelia. Cancer
Res, 58: 5453-65, 1998.

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ANTI-TUMOR EFFECTS OF S-1MEIJI Ⓡ COMBINATION CAPSULES T25
IN NUDE MICE IMPLANTED WITH
HUMAN GASTRIC CANCER-DERIVED CELLS
Yasushi KURATA, Toshiyuki TSUCHIYA, Kazuyuki HIRATSUKA,
Masae MANAKA, Toki SAKAI, Kunio SAMIZO and Yuji UMEKI
Meiji Seika Pharma, Co., Ltd.

Abstract
S-1Meiji® Combination Capsules T25 (test formulation) developed by Meiji Seika Pharma, Co.,
Ltd. was examined on its anti-tumor eﬀects in comparison with TS-1 combination capsule® T25(Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.; standard formulation) that have been mainly used in treatment ofgastric cancer. We used female nude mice (CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj) subcutaneously implantedwith the human gastric cancer cell lines, MKN45. After 11 days of tumor cell transplantation,
mice were administered orally with test or standard formulation at dose of 10 mg/kg daily for 9days, respectively. After the treatment with the two formulations, all animals were observed for
12 days. The size of the tumor was measured for comparison from the start of treatment to theend of the study. Leukocyte counts and intestinal mucosal injury were examined in the additional
three groups of mice treated with two formulations at dose of 10 mg/kg for 9 days.
As a result, a tendency of tumor growth inhibition by the test formulation was observed during aperiod of 9 days treatment. Thereafter, tumors in the test formulation group significantlydecreased in volume throughout the observation period of 12 days. Similar antitumor eﬀects fortumor growth during the study period were seen for the test and standard formulation.
Leukocyte counts in two groups of formulations were significantly decreased. Furthermore,
intestinal mucosal damage in both groups was not clearly evident, however, single-cell necroses orapoptotic cells stained with TUNEL in the crypts were mildly observed in the groups.
The degree of decrease in leukocyte counts and the change of crypt cells of small intestine by thetest formulation were comparable to those induced by the standard formulation.
The results concluded that the test formulation is expected to exert therapeutic eﬀects in humans
as in the case of standard formulation.
Key words: 5-ﬂuorouracil, tegafur, gimeracil, oteracil potassium, gastric cancer,
anti-tumor eﬀect, generic drug