博士（理学）中村浩之
学位論文題名
Studies on the Mechanisms of Fertilization
Envelope Formation in the Sea Urchin Eggs
（ウニ卵における受精膜形成機構に関する研究）

学位論文内容の要旨
近年、 ヒトを含めた哺乳動物の生殖・発生に関する研究は活発 であるが、個体発生の出発点である 受精の化学的機構については不明な点が多い。卵は成熟して初めて受精可能となる。
成熟卵は 、引き金が引かれれば賦活され、受精膜形成を含む一連 の受精反応を起こす能カを持つ。精 子の働きのーっはその引き金を引く事である。既知の因 子で人工的に卵を賦活する事で精子 の働きを真似し、引き金が何かを調ぺる方法がある。188
7年に発表されたO
．He
rt
wig
及びR．Hertwigによる人工的卵賦活実験以来、多くの物質によっ てあるいは機械的刺激によって卵が 賦活される事が示された（Harvey，1956)。卵賦活の機構についての統一的な説明は未だにな されていないが、卵の賦活から受精膜形成までに、次の ような一連の反応が起こると考えられている(TrimmerandVacquier，1986;Berridge，1993）。くD
精子と卵表面に存在する精子受容 体との結合、◎G
タンパク質（あるいはTyrosinekinase)の活性化、◎P
hos
phol
ipase
C (PLC)の活 性化 、＠ IP
3の 細胞 質内 増加 、◎ 小胞 体か らの Ca
2゛ の遊 離、◎表層顆粒の 開
口分泌、◎受精膜の形成。
しかし 、（1）引き金とは何か、（ 2）それはどのように引かれ るのか、という問題について は未 解決 であ り 、（ 3） 上記 の＠ 一◎ の経 路 が唯 一の もの かど うか 、についても明確 な実験的証 拠があるわけではない。現在まで、ウニ精子から卵賦活 能を持つ物質は精製されていない。 従って、これらの問題を解決する手段として、新しい人 工賦活剤の開発は不可欠である。本 研究は、受精研究では輝かしい成果をあげてきたウ二卵 を用い、新しい人工賦活剤の 探索 から はじ め 、賦 活剤 の作 用機 構を 解析 する事によって、（1）←（3）の問題を解 析する事を試みた。
第1章： バフ ンウ ニ 卵に 受精 膜形 成を 誘起 する オニ コン ブ由 来の レク チン 様タンパク質、Diabolinの発見
バフンウニ成熟卵をオニコンブ葉状部の海水抽出 物で処理すると受精膜が形成された。しかし 、こ の抽 出物 はエ ゾバ フン ウ二 及び キタ ムラサキウニ卵 には無効であった。抽出液を600C、5分間 熱処 理 すると受精膜形成能が失われたので、有効 物質はタンパク質性で、しかも精製に使用を試みたSe
phadex gel
をカラム内で凝 集させる性質を持つことから、レクチン様物質であると推測し、レクチンを不活性化させる 各種の糖存在下でのオニコンブ抽出液による バフ ンウ ニ未 受精 卵へ の受 精膜 形成 能を 検討した。その 結果、Glc
NAcが最も強い抑制効果を示した。レクチンによるウ二卵の賦活につい ての報告は皆無であったので、この有効物質 を新 しい人 工賦 活剤 とし て利 用す ることを目的に、この物質の精製を試みた。
80％飽和硫安沈殿後、TSK gel DE
AE‑
Toyopearl6
50M
、TSKg
elToyopearlHW‑55F、TSKgelA
F‑Blue Toyopearl 650M
Lによるchromatographyを行い、native PAG
E的に単一のCoomassieebrilliant blue染色バンドになるまで精製した。精製物質（夕ンパク質）のゲル濾過による推定分 子量 は120 kDaで、100％受精 膜形成を起こす最低濃度はO．SUg/mlであった。精製物質によ る受 精膜 形成 能はGlcNAcによ って最も強く抑制され、精製物質4．2Ug/mlによる受精膜形成 能は 24pLMの Glc
NAcで完 全に 抑制 され た。 しか し、 同じ 抑制 効果 を示 すためにはG
lcN

は GlcNAcの2、 000倍 の 濃度 を 必 要 とし た 。 なお 、 GlcNAc
は 精 子によ る受精 膜形成は 抑制
し なかった 。精製 物質に対 する抗 ウサギ抗 体を用いての免疫組織化学的検討によって、この物 質はオニ コンブ の粘液腔 道を構 成する細 胞が腔道内に分泌したものであることが明らかにな った。こ の物質 は血球凝 集は起 こさない ので、レクチンとは断定できないが、レクチン様タンパク質と結論し、Diabolinと命名した。
非ジヒド口ビリジン系の2種類のCa
2←‐チャンネル阻害剤（Diltiazem、Verapamil）を用いてDiabolinの作用 機構を検 討した 結果、200 UMのD
iltiazemに よる前 処理卵でのDiabolinによ る受精膜 形成率 は14％で、 先体反 応後の精 子による受精膜形成率は63％であった。また、
500 pt
MのDiltiazemによる 前処理 卵でのDiabolinによる受 精膜形 成率はO％で、先体反応後の 精 子 によ る 受 精膜 形 成 率は 27％で あっ た。一方 、200 UMのVe
rapamilによ る前処理 卵では Diabolinに よる受 精膜形成 率は27％ で、先体 反応後 の精子に よる受精 膜形成 率は92％であ った。更 に、500 pt
MのVe
rapamil前処理 卵では、Diabolin
及び先体反応後の精子による受精 膜 形 成率は 共に0％であ った。Verapamil
存在 下では 、受精膜 形成の有 無に関 らず媒精 90分 後 に 約30％の 卵に細 胞分裂が 認めら れたので 、精子の 侵入は 起こって いるも のと考え られる。
ウ ニ卵は脱 分極性 の外向き 電流に よっても 、細胞 外液のK←濃度 を高くしても活性化されない（ Jaffe，1976;HagiwaraandJaffe，1979)
ことが広く認められているので、卵の電位依存性Ca2←チ ャンネ ルは受精時には働いていないと考えられている。上記の定説を踏まえ、本研
究の結果を以下に考察する。
Diabolinは、卵表 面に存在すると考えられるDi
abolinレセプ夕―作動性C
a2←チャンネルを開 口し、細 胞外Ca2゛の細胞内への流入を促進させ、受精膜形成を引き起こすものと考えられる 。 GlcNAcはDiabolinによ る受精 膜形成を 抑制する が、精 子による 受精膜 形成を抑 制しない ことから 、Diabolinが受 精膜形 成におい て精子 を完全に mimic
し ているとは言えないが、両 者は部分 的に類 似の作用機構を持ち、同一のCa2←チャンネルの開口に関与しているものと考 える。Diabolinの効果に 種特異 性がある ことは、精子との類似点であり、Diabolinの作用が 精 子 受容体 を介し ているこ とも考え られる 。従って 、卵賦 活の引き 金は、 ＠種特異 的糖鎖 を 持 つ卵表 面の精 子受容体 にあり、 ◎精子 が持つレ クチン あるいは レクチ ン様の物 質によ って引き 金が引 かれ、◎ レセプ ター作動 性Ca2
゛ チャン ネルの開 口によって引き起こされるものと推測する。
第2章：細胞内フッ素イオン（F‑)
によるウ二卵の受精膜形成
l‑fluoro‑2，4‑dinitrobennzene(FDNB)をエゾバフンウ二卵に与えると受精膜が形成された。
100％ 受 精 膜 形 成 を 起 こ す FDNBの 濃 度 は 0． lmMで あっ た 。 FDNBはバ フ ン ウ二 、 キ タ ム
ラサキ ウニ卵に も受精 膜形成を 誘起し た。しか し、FDNBの フッ素の 位置が 塩素に置 き換わったl‑chloro‑2，4‑dinitrobennzene(CDNB)には受精膜形成能は認められず、しかも卵懸濁液に加 え た NaFで は 受 精 膜 は 形 成 さ れ な か っ た 。 FDNBは SH基 と 結 合し て フ ッ素 イ オ ン(F‑)
を放出することが知られているので（WallenfelsandStreffer，1965;Gold，1968)、FDNBによる 受精 膜 形 成は FDN
Bか ら 放出 さ れ たフ ッ 素 イオ ン に 起因す るものと 推測さ れる。ま た、L‑cysteine存在 下で媒精 した場合 は受精 膜は形成 された が、FDNBによ る受精 膜形成は 起こらなか った。更 に、SH基 阻害剤で あるiodoacetamideで前 処理した卵を媒精した場合、受精膜は形 成された が、FDNBに よっては 受精膜 は形成さ れなか った。こ れらの 結果は、 細胞内のフッ 素イオン は表層 反応のあ る段階を促進するが、細胞外のフッ素イオンは無効であることを示す。
受精膜 形成におけるフッ素イオンの作用点を特定するために、Ca2←‑ionophoreの一種であるionomycin（ Liu and Hermann，1978)とFDN
Bの受精膜 形成に 対する作 用効果を 、細胞 内Ca2+の移動を阻害することが知られているTM
B‑8（Stapletonet馴．，1985）で前処理した卵につ いて 比 較 検討 し た 。O． 2 mM TMB‑8存 在 下 で は、 FDNBに よる受精 膜形成 率はO％であ ったが、 ionomycmによる 受精膜形 成率は 60％あった 。C舛ochalasin
B前処 理卵では ionomycin
による 受精膜形 成は完 全に阻害 され、FDNBについても同様であった。Ca2゛−ionophoreの作
用点は p
ユの 作用点 と同じで あること が知ら れている ので、 上記の結果は細胞内フッ素イオンの作用点がPユの産生以前の段階にあることを示すと思われる。
以 上 、 本研 究 で 明ら か に され た Di
abolinと FD
NBに よるウニ 未受精 卵への受 精膜形成 は動物卵 一般にお ける受 精膜形成 機構の研究の発展に貢献するだけでなく、未だ完全には理解されていない精子による卵賦活機構の解明に資するものと考える。
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学位論文審査の要旨
主査

教授

鈴木 範 男副査

教授

山下 正 兼

副査

助教授

副査

主 任 研究 員

清水隆
野村晃司 （東京都 老人総合 研究所）

学位論文題名
Studies on the Mechanisms of Fertilization
Envelope Formation in the Sea Urchin Eggs
（ウニ卵における受精膜形成機構に関する研究）

近 年、ヒト を含めた 哺乳動物 の生殖・ 発生に関 する研究は活発であるが、個体発生 の出発点 である受 精の分子 機構につ いては未 だ不明な点 が多い。卵は成熟して初め て受精可 能となり 、成熟し た卵は精 子の接近 、結合によ って賦活され、受精膜形成 を含む一 連の化学 反応を起 こし、精 子・卵両 細胞の融合 （受精）に至る。即ち、
受 精 に おけ る 精 子の 働 きの ー っ は卵 を賦活させ る事であ る。19世紀 後半から 既知の 物質によ って人工 的に卵を 賦活する事で精子の受精における役割の1っを真似し、卵 の賦活か ら受精膜 形成に至 る機構を 調ぺる研 究が行われ てきた。その結果、卵賦活 の機構に ついての 統一的な 説明は未 だになさ れていない が、卵の賦活から受精膜形 成までに 、次のよ うな一連 の反応が 起こると 考えられて いる：＠精子と卵表面に存 在 する 精子受容 体との結 合、◎G夕 ンパク質（ あるいは チロシン キナ―ゼ ）の活性 化 、 ◎ホ ス フ ォリ パ ーゼ C (PLC)の活性化 、＠イノシ トールト リスリン 酸(IP3)の 細 胞 質内 増 加 、◎ 小 胞体 か ら のCa2゛ の遊 離 、 ◎表 層 顆粒 の 開口 分泌、◎ 受精膜 の形成。 しかし、 （1）卵の 賦活は何 によって 引き起こされるか、（2）それはどの よ うな 仕組みな のか、と いう問題 は未解決で あり、（ 3）上記の ＠ー◎の 経路が唯 一 のも のかどう か、につ いても明 確な実験的 証拠が提 出されて いない。 その1つの 理由は、 卵の賦活 を容易に 引き起こ す人工賦 活剤が無い ことにあるものと考えられ る。本学 位論文は 、受精の 研究に頻 用され、 輝かしい成 果をあげてきたウ二卵を用 い、新し い人工賦 活剤の探 索からは じめ、賦 活剤の作用 機構を解析する事によって 、 （1） ―（3）の 問題を解 析する事 を試みたも ので、2つ の章から 構成され ている ： 第1章 は「バフ ンウニ卵 に受精膜 形成を誘起 するオニ コンブ由 来のレク チン様夕 ンパク質 、Diabolinの発見 」、第2章 は「細胞 内フッ素 イオン（F')によるウ二卵の 受精膜形 成」に関 するもの である。
第 1章では 、バフン ウニ成熟 卵をオニ コンブ葉状 部の海水 抽出物で 処理する と受精 膜が形成 されると いう発見 に端を発 して、こ の有効物質 を精製し、有効物質の本体 （ Diabolinと命 名）が分 子量120kDaのレ クチン様 夕ンパク質 であるこ とを明ら

か にし 、こ のタ ンパク 質を用いた研究から、卵賦活は、＠種特異的糖鎖を持つ卵表面 の精 子受 容体 に、◎ 精子が持つレクチンあるいはレクチン様の物質の結合によって 開始 され 、◎ 受容体 作動 性Ca2゛ チャ ンネ ルの開 口によって引き起こされる示唆した。
第2章では、l‑fluoroー2，4‑dinitrobennzene(FDNB)
をエゾバフンウニ卵に与えると受精 膜が 形成 され るとい う発見に端を発して、この機構を詳細に調ぺ、細胞内のフッ素 イオ ンが 細胞 内二次 伝達 物質 の1つで ある IP3の 産生 以前 の段 階で 表層 反応を 促進することによって引き起こされることを明らかにした。
以上 、本 学位 論文で 明ら かに され たDiabolinと FDNBによ るウ ニ未 受精 卵への 受
精膜形成は動物卵一般における受精膜形成機構の研究の発展に貢献するだけでなく、未だ完全には理解されていない精子による卵賦活機構の解明に資するものと考える。
よって著者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格あるものと認める。