上原記念生命科学財団研究報告集, 31 (2017)147. 神経ペプチドシグナル網による痛覚シグナル調節機構
本庄賢

筑波大学 生命環境系
Key words：痛覚，ショウジョウバエ，神経ぺプチド

緒言

神経細胞が分泌する短鎖ペプチドである神経ぺプチドは、痛覚の重要な調節因子として注目され、過去数十年に渡り研究が進められてきた１）。哺乳類モデルを用いた先行研究から、痛覚修飾に作用する可能性のある神経ぺプチドが多数発見されてきた。しかし一方、神経ぺプチドによる痛覚修飾の生体内機序については、知見が非常に限られている。
神経ぺプチドは神経伝達物質として近傍のニューロンに作用する一方、ホルモンとして血中に分泌され遠心性の作用も持ち、複数の組織で異なる生理機能調節に関わり得る２）。また一種類のペプチドに対応する受容体がしばしば複数存在することから、生体内におけるその作用点を明らかにすることが難しい。さらに、神経ペプチドは他の神経ぺプチドと機能的相互作用を持つことが知られるが、哺乳類では数百種の神経ぺプチドが生体内で活性を持っていると推測されており、多くの神経ぺプチドの機能が未だにわかっていない３）。こうした状況から、痛覚修飾に関わる神経ぺプチドがどれほど存在し、どの細胞に作用し、どのように相互作用しながら痛覚シグナルを調節しているのか、その生体内作用機序はほとんど理解が進んでいない。
我々は生体内における遺伝学的解析手法に優れるショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）をモデルに用い、痛覚修飾に関わる神経ぺプチドの網羅的同定と、その生体内作用機序の解明を目標として研究を進めている。これまでに行った、37 の神経ぺプチド遺伝子に対するノックアウト変異体を用いたスクリーニングからは、欠失した際に痛覚過敏を引き起こす神経ぺプチド遺伝子を５、痛覚鈍化を引き起こすものを７見出した。現在これらの神経ぺプチドについて、ショウジョウバエの遺伝学的実験ツールを利用した生体内解析を進めている。

方法および結果
CRISPR/Cas9 ゲノム編集法で作製した神経ぺプチド遺伝子ノックアウト変異体について、熱プローブを用いた侵害刺激反応試験４,５）を実施し、その熱痛覚反応性をコントロール系統と比較した。テストした 37 の神経ぺプチド遺伝子に対する 47 の変異体系統のうち、ホモ接合で致死であった 8 を除く全てについて、46℃と 42℃の 2 種類のプローブ温度を用いて熱痛覚反応試験を実施した。この結果、欠失した際に痛覚過敏を引き起こす神経ぺプチド遺伝子を５、痛覚鈍化を引き起こすものを７、それぞれ見出した。これらの神経ぺプチド遺伝子およびその受容体遺伝子について、ヒト相同遺伝子の有無を調べたところ、見出された 12 の神経ぺプチドのうち 10（83%）についてヒトでペプチドまたは受容体遺伝子が保存されていることが明らかになった。
スクリーニングで見出された神経ぺプチドの痛覚調節メカニズムを解明するべく、特に哺乳類との保存性の高い神経ぺプチドに注目して解析を開始した。変異体が痛覚過敏の表現型を示した神経ぺプチド A について、その受容体変異体についても熱プローブを用いた痛覚反応試験を実施した。その結果、複数報告のある受容体遺伝子のうち一つの変異体が、神経ぺプチド遺伝子変異体と同様に痛覚過敏の表現型を示すことがわかった（図 1）。

1図 1． 神経ぺプチド A 変異体およびその受容体変異体の熱痛覚反応（A）42℃の熱プローブ刺激に対し、痛覚反応を示すまでの時間を反応時間として計測した
ところ、コントロールに比べて変異体では有意に短い時間で反応が見られた。（B）同様の試験を神経ぺプチド A の受容体変異体について行った結果、受容体変異体も同様に 42℃プローブに反応するまでの時間が有意に短かった。*** p < 0.001, Mann-Whitney U-test.
神経ぺプチド A の抗体と GAL4 発現系統を用いた生体内発現解析を行ったところ、神経ぺプチド A の分泌細胞は幼虫の痛覚四次ニューロンと絡み合うように投射していることがわかった（図 2）。シナプス接続の有無を検出するために用いられる GRASP（GFP Reconstitution Across Synaptic Partners）法を試みたところ、神経ぺプチド A 分泌細胞と痛覚四次ニューロンの間で GRASP シグナルが観察され、神経ぺプチド A 分泌細胞が実際に痛覚四次ニューロンと密接なコンタクトを持っていることがわかった（図 3）。

図 2． 神経ぺプチド A 分泌細胞と痛覚四次ニューロン（A）ショウジョウバエ幼虫の中枢神経系における神経ぺプチド A 分泌細胞と痛覚四次ニューロンの神経投射。緑色は神経ぺプチド分泌細胞（B）、赤色は痛覚四次ニューロン（C）、青色は神経ぺプチド A（D）をそれぞれ特異的にラベルしている。スケールバーは 20μm。

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図 3． GRASP 法による神経ぺプチド A 分泌細胞と痛覚四次ニューロンの接点の検出
GRASP（GFP Reconstitution Across Synaptic Partners）法は、2 種類のニューロンのそれぞれに分割された膜結合型 GFP を発現させる。2 種類のニューロンがシナプス接続している場合など、距離が非常に近い場合、それぞれ発現された膜結合型分割 GFP 分子が再会合し、蛍光を取り戻す。神経ぺプチド A 分泌細胞と痛覚四次ニューロンにそれぞれ膜結合型分割 GFP を発現させた結果、再会合した GFP 分子による蛍光シグナルが認められ、２つのニューロンが接触するほど近接していることがわかった。
（A）マージ像、（B）GFP 再会合による蛍光シグナル（C）神経ぺプチド A 分泌細胞および痛覚四次ニューロン。スケールバーは 20μm。

考察ノックアウト変異体を利用したスクリーニングからは、欠失した際に痛覚反応異常を引き起こす 12 の神経ぺプチド遺伝子を見出すことができた。この 12 の神経ぺプチドシグナル系のうち、実に 10 がヒトとの間で保存されており、ヒトとショウジョウバエとの間で痛覚調節に関わる神経ぺプチドシステムに高い共通性が見出されたと言える。
また哺乳類との間での高い保存性から注目した神経ぺプチド A の解析では、神経ぺプチド A 受容体１の変異体が、神経ぺプチド A 変異体同様に痛覚過敏の表現型を示すことがわかった。また、神経ぺプチド A の発現解析では、神経ぺプチド A 分泌細胞と痛覚四次ニューロンの密接なコンタクトが明らかとなった。これらの結果は、神経ぺプチド Aが受容体１と痛覚四次ニューロンの活動調節を通じて、痛覚調節を行っている可能性を示唆している。現在、受容体のGAL4 発現系統を利用した発現解析を行っており、神経ぺプチド A の痛覚調節作用について、その生体内機序の解明を進めていく予定である。また、スクリーニングから見出されたその他の神経ぺプチドに関しても、同様に解析を進めていく。

共同研究者
本研究の共同研究者は、国立遺伝学研究所の近藤周博士および筑波大学生命環境科学研究科生物科学専攻の柏原秋穂氏である。本研究の推進に当たり、ご支援頂きました上原記念生命科学財団に深く感謝いたします。

文献1） Hoyer D, Bartfai T. Neuropeptides and neuropeptide receptors: drug targets, and peptide and non-peptide
ligands: a tribute to Prof. Dieter Seebach. Chem Biodivers. 2012 Nov;9(11):2367-87. doi: 10.1002/cbdv.
201200288. Review. PMID:23161624
2） van den Pol AN. Neuropeptide transmission in brain circuits. Neuron. 2012 Oct 4;76(1):98-115. doi: 10.1016/j.neuron.2012.09.014. Review. PMID:2304080933） Wang Y, Wang M, Yin S, Jang R, Wang J, Xue Z, Xu T. NeuroPep: a comprehensive resource ofneuropeptides. Database (Oxford). 2015 Apr 29;2015:bav038. doi: 10.1093/database/bav038. Print 2015.
PMID:25931458
4） painless, a Drosophila gene essential for nociception. Tracey WD Jr, Wilson RI, Laurent G, Benzer S. Cell.
2003 Apr 18;113(2):261-73. PMID:12705873
5） Honjo K, Mauthner SE, Wang Y, Skene JH, Tracey WD Jr. Nociceptor-Enriched Genes Required forNormal Thermal Nociception. Cell Rep. 2016 Jul 12;16(2):295-303. doi: 10.1016/j.celrep.2016.06.003. Epub 2016
Jun 23. PMID:27346357

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