博 士（ 医 学） ナハルヌルン

学位論文題名BioactivityofhumanchorionlCgon
adotrotpinpro
duCedinf． rOZen― thaWedembryotranSferCyCleSWith●eXOgenouShormonereplaCement（ホルモン補充周期凍結胚移植におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンの生物学的活性についての検討）

学 位論文 内容の要旨【目的】近年、ホルモン補 充周期における凍結胚移植が凍結方法の改良により急速な発展をとげ、生殖補助医療の飛 躍的進歩の一因となっている。いわゆる妊娠黄体の存在する自然 妊 娠 と は 異 な り 、ホ ルモ ン補 充周 期で は 内因 性の ゴナ ドト ロピ ン(LHおよ びFSH)を
gonadotr
opin‑releasing hormone(GnRH)
アナログにて抑制し、外因性のエストロゲン十プロゲステロンを人工的に投 与することで着床環境を整える。一方ヒト絨毛性ゴナドトロピン(human chorionic gonadotropin: hCG)
は妊娠時卜ロ ホブラス卜、あるいは胞状奇胎・絨毛癌などの絨毛性疾患か ら分泌されるホルモンである。hCGはタンパクおよび糖鎖の両方に構造上の多様性を持ち 、妊娠経過にともなぃそのisoformの比率、さらにbioactiv
ityが連続的に変化することが 知られており、この特性を利用して、妊娠の予後を判定しようとする試みもなされてきた 。本研究ではホルモン補充周期凍結胚移植を施行した患者血清中のhCG bioactivrtyを測定するためにラットLeydig
細 胞を用いたアッセイ系を確立し、
hCGbioactiv
ityと妊娠予後の関係について初めて解析を試みたのでここに報告する。【対象、材料と方法】不妊治療を目 的に北海道大学病院不妊内分泌外来を受診した患者のうち、ホル モン 補充 周期 で凍 結胚 移植 を受 け、 血中 hC
G上 昇にて妊娠成立を確認した患者53名を対象とした。vitri
fication
法により凍結された胚を融解し、子宮腔内に移植した後、D‑
23以
降 血中 hCG上昇 をも って 妊 娠を 判定 し、 イン フォ ーム ドコ ンセ ント に基 づき 妊娠4週の時点での血清を採取した。 コントロールとして、当科を受診し、自然妊娠が確認された患者7名 より 経時 的（ 妊娠 4週‑8週）に血 清を採取した。ホルモン補充の有無、妊娠の転帰に より 、妊 娠周 期を H
RT(+)
‑NOR
（ホル モン補充周期、妊娠継続；29周期）、HRT(+)‑MIS（ ホル モン 補充 周期 、流 産； 24周 期） 、HRT(‑)‑NOR（自然周期、 妊娠継続；3周期、13ポイント、平均妊娠期間6週1日）、HRT(‑)‑
MIS（自然周期、流産；4周期、12ポイント、平 均妊 娠期 間5週4日 ）の 4群に 分類 した 。イ ムノ アッセイおよびバイオアッセイのスタン ダー ドと して H
CGモチ ダ 0
3000
単 位を 使用 した 。患 者 血清 中の immunorea
ctive hCG、
血 清中 およ び培 養液 中のテストステロ ン値は化学発光酵素免疫測定法(IMMULYSE)
により―498―測定 した 。hCGパイ オア ッセ イで ある が10‑1
2週令のオスSD
ラット精巣よりLeydig cellenric
hed fractionを抽出し、 hCG
スタンダードあるいは患 者血清の添加24時間後の培養液中テストステロン濃度を測定し、スタンダード 曲線よりbioactive‑hCGを算 出した。患者血 清は immuno
reactive hCGと して EC
so付 近の 値で ある 0.3 mIU/mLと なるよう添加された。h
CGのbioactivityはbio/immuno (b/i)で表 示した。エストラジオール(E2)がhCG
産生に およ ばす 影響 を解 析す るた め、 ヒト 絨 毛細 胞を 採取 し、 培養 液中 にE2を添加し、
imm
unoreactiv
e hCGおよびb/iを測定した。変数間の相関は回帰分析で求めた 。測定値の有意 差検 定に はt検 定を 使用 した 。【 結果 】血清E2
レベル はHRT(+)‑N○Rで227.
8士2
6.2pg/mL、 HRT(+)‑MISで 164.1士 20.6 pg/mL
で あり 、両 群 間に 有意 差を 認め なか った 。
Immun
orea
ctive hCG
は HRT(+)‑N○Rで 555.9士133.4 m
IU/mL、HRT(+)‑M
ISで283.
7土6
3.8mIU/m
Lと 有意 差を 認め なか った ゆ0.
091）。b/iはHRT(+)
‑N
ORで0.
64
士0.
04、HRT(+)‑

MISで0.
67
士0:03
であ り、有意差を認めなかった（p 0．52）。さらにb′iとE2値の相関を
回帰 分析 を用 いて 検討 した 。b/iとE2値は HRT(+)‑NORに おい てr2 =0.035、HRT(+)‑
MISにお いて f
2=0.010であり、p‑値はそれぞれ0.
33および0.
64と、自然妊娠患者サンプルを用いた検討で従来指摘されているような負の相関 を認めなかった。Bioactive hC
Gと血清E2値の相関を再検討するため、人工的にエストロ ゲンの投与が行われていない自然妊娠症
例7例の 検討 を 行っ た。 H
RT(‑)‑NO
Rで のimmu
noreactive h
CGは8070
0士 23940 m
IU/m
L、HRT(‑)‑
MI
Sでは6794士4627 m
IU/m
Lであり、HRT(‑)‑NORで高い傾向があった(p= 0.
078)。
HRT(‑)‑NORでの E2値 は594.1
土 121.9 pg/m
L、 H
RT(‑)‑MISで は260.
1士 90.9 pg/m
Lで あり、HRT(‑)‑MI
Sで有意に低値を示した(p=0.
041）。また、HRT(‑)‑
NORでのb/iは0.
35土0.
052、HRT(‑)‑MI
Sで は0.65
士 0.
12と、 HRT(‑)‑MISで有意に高値であった(p= 0.
031）。回帰分析を行ったが、b/iと 血清E2値の間に有意な相関を認めなかった。b/iと妊娠週数の問にも有意 な相 関は 認め なかった。さらに、絨毛細胞を用いて、 加vitroでのE2のhCG産生能に対す る影 響を 検討 した。E2は100 ng/mlの非生理的高濃度において絨毛細胞におけるhCG産生 量を 増加 させ たが (p=0.014)、絨 毛細 胞が産生するhCGのb/iはE2添加による影響をうけなかった。【結論】ホルモン補充下凍結胚移 植周期の妊娠4週時の血清を 用いてそのbioactivi
tyか ら妊 娠の 予後 を予 測す る試 みを行った。今 回の検討においては血清E2、imm
un
orea
ctiv
e hC
G、b/iの各項目に関し、妊娠継続群と流産群との間に有意 差を認めなかった。さらに、血清中E2値とb/iの回帰分析でも、両項目間に有意な相関を 認めなかった。これらの結果がホルモン補充周期による影響 なのかを確認するため、自然妊娠症例に関し同様の検討を行った。血清中E2値は妊娠継続 群で有意に高値であり、b/iは流産群で有意に高値であった。そのため、E2値とb/iの回帰分析を行ったが、明らかな 相関関係は認め なか った 。hCGのbioactivityはE2のレベルによって直 接制御されるのかを確認する
ため 、絨 毛細 胞に 対す るエ スト ロゲ ン添 加 実験を行った。E2はhCGのimmunoreactivityをわずかに上昇させたが、そのbioactivityは変化させなかった。【結語】ラットLeydig
細胞のバイオアッセイ系を用いて、ホルモン補充周 期凍結胚移植における、妊娠初期のhCGのcharacterizat
ionおよぴ妊娠の予後を推測する試みを初めて行った。自然妊娠症例ではb/iを用いて妊娠予後の推測が可能であったが、ホル モン補充下凍結胚移植周期では、予測は‑ 499−

困 難と思わ れた。E2がhCGのbioactivityに対し絨毛細胞に直接作用するのではなく、何ら かの因子 が介在す ること が示唆さ れた。

●― 500―学位論文審査の要旨
主 査 教 授 水 上 尚 典
副 査 教 授 笠 原 正 典
副 査 教 授 三 輪 聡 一
副 査 教 授 櫻 木 範 明

学位論文題名Bioactiv
ityofhumanchorlon
lCgonadotrot
pin
produ
Cedin
frOZen一 thaWedembryotranSf・ erCyCleSWitheX
OgenouShormonereplaCement（ ホ ル モ ン 補 充 周 期 凍 結 胚 移 植 に お け る
ヒト 絨 毛 性ゴ ナ ドト ロ ピ ンの 生 物学的活 性につい ての検討 ）妊 娠予 後 （ 流 産′ 妊 娠 継続 ） 早 期判 定は体外 受精・ 胚移植法 におい ては強く 求めら れてい る 。 申請 者 は 妊 娠予 後 判 定が 従 来 の方法で は困難 な妊娠早 期の血 清を用い てホルモ ン補充 周 期 凍結 胚 移 植 後妊 娠 に おけ る hC
G生 物 活性 が 妊 娠予 後 を 予測 する か否かを 検討し た。
申 請 者 はラ ッ ト Le
ydig細胞がhCG刺 激に よ ル プロ 、 ゲ ステ ロ ン 産生 ・分泌す ること を利用
し た hCG生 物 活 性 測 定 系 を 用 い て hCG生 物 活 性 を 測 定 し た 。 ホル モ ン 補 充下 凍 結 胚移 植周 期 の 妊 娠 4週 時 の 血 清 中 hCG生 物 活 性 、 hCG免 疫 活 性 、 な ら び に エ ス ド ラ ジ オ ー ル 値
は 、はい ずれも、 妊娠継続群（弧＝29）と流産群（n＝24）の2群間に有意差を認めなかった。
さ ら に 、 血 清 中 エ ス ド ラ ジ オ ー ル値 と hC
G生 物 活性 の 回 帰分 析 で も、 両 者 間 に有 意 な 相関 を 認 めな か っ た 。こ れ ら の結 果 が ホルモン 補充周 期凍結胚 移植妊 娠の特徴 であるの かを
検 討 す るた め 、 自 然妊 娠 症 例に 対 し て同様の 検討を 行った。 自然妊 娠症例で は血清中 エス
ド ラジオ ール値は 妊娠継 続群(・n=13）で は流産群 （n＝12）に比 し有意に 高値であった。また hCG生 物 活 性 は 流 産 群 で 妊 娠 継 続 群 に比 し 有 意に 高 値 であ っ た 。自 然 妊 娠 群に お い ても エ ス ド ラ ジ オ ー ル 値 と hCG生 物 活 性 の両 者 間 には 明 ら かな 相 関 は認 め ら れ なか っ た 。
本 研 究 にお い て は 占然 妊 娠 、ホ ル モ ン補充周 期凍結 胚移植妊 娠いず れにおい てもエス ドラジ オ ー ル 値 と hCG生 物 活 性 の 両 者 問 に 相関 関 係 が認 め ら れな か っ たが 既 報 告 では エ ス ドラ ジ オ ー ル が hCG生 物 活 性 を 直 接 的 に 調節 し て いる 可 能 性を 示 唆 して い た た め、 こ の 点に つい て 珈 v
itro実験 を 行 い検 討 し た。 培 養 絨毛 細 胞 にエ ス ド ラジ オ ー ル を添 加 し h
CGの免 疫 活 性 ぬ ら び に 生 物 活 性 の 変 化を 検 討 した 。 添 加エ ス ド ラジ オ ー ルは hCG免疫 活 性 をわ ずかに 上昇させ たが、 hCG
生物 活性に影 響を与 えなかっ た。
― 501―

自然成立妊娠においては妊娠黄体が形成され、妊娠黄体より分泌される・エストロゲンやプロゲステロンが妊娠維持に重要な役割を果たしていると考えられている。一方、ホルモン補充周期凍結胚移植妊娠においては妊娠黄体は形成されず、エストロゲンとプロゲステロンは外因性に補充されている。このようにホルモン補充周期凍結胚移植妊娠と自然成立妊娠 での両者 問の決定 的な違いは妊娠黄体存在の有無である。自然妊娠症例ではhC
G生物活性が妊娠予後を予測したが、ホルモン補充下凍結胚移植周期で´のhCG生物活性はそれを 予測しな かったこ と、またエスドラジオールはhC
G生物活性に直接的には影響を与えな かったと いう結果 は妊娠黄休から分泌されるエスドラジオール以外の物質がhC
G生物活性を調節している可能性を強く示唆した。
発表終了後笠原教授から、ホルモン補充周期凍結胚移植妊娠においてhC
G生物活性は、妊娠黄体の存在する自然妊娠とは異なり妊娠継続群と流産群とで差がないそのメカニズムについての、また自然周期群での採血の時期がホルモン補充周期凍結胚移植妊娠での採血時期と異なっていることの結果への影響に関する質問があった。次いで、三輪教授から、
hCGアイソ フオーム と抗体認 識部位との 関係や異 なるアッセイ系でめ抗体のhCGアイソフオームに対する親和性ついての質問があった。また、櫻木教授から、不妊治療における妊娠予後を早期に予測する意義についての質問があった。最後に、水ト教授から、妊娠黄体より産生・分泌されるhCGの生物活性を調節する可能性を持つ其体的物質名について、またホ ルモン補 充周期凍 結胚移植妊娠においてhCG生物活性と妊娠週数との関連にっいての質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は自身の研究結果や文献を引用し、おおむね妥当な回答をした。
本論文 は、絨毛 より産生 されるhCGの生物活性を調節する物質がエストロゲンとは異なること、さらにその物質が妊娠黄体から分泌されている可能性を強く示唆した。これは妊娠 黄体 の絨 毛 細胞 へ の影 響 を検 討する上での 重要な知見と 考えられた。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ中 請者が博 士（医学 ）の学位を 受けるの に充分な 資格を有するものと判定した。

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