博士（医学）林 利彦
学位論文題名ケロイドにおけ．るアラキドン酸代謝とコラーゲン産生に関する解析
学位 論文内容の要旨
緒言
ケロイ ドは持続 する炎症 、境界 部での健 常組織 への浸潤 性増殖 などの特 徴をもつ皮膚の良性腫瘍性 病変で ある。ケ ロイド の病態は 線維芽 細胞の増 殖と細胞 外基質 の過剰な増生を主体とした真 皮の肥 厚を特徴 として おり、創 傷治癒 過程の何 らかの異 常によ って生じると考えられる。
マクロ ファージ 遊走阻止 因子macr
ophagemi
gr
ati
onin
hibitoryfactor(MIF）は、炎症反応のイニ シエー タとして 重要な 役割をも ってい る。また 、アラキ ドン酸 代謝において重要な役割をも つcytosoli
cphospholipaseA2（cPLA2） やcyclooxygenase−2(COX―2）を活性化する。 ア ラ キド ン酸代 謝産物の ひとつ であるprostagla
ndinEz(PGEz)
は 線維芽細 胞の増 殖とコラーゲ ンの産 生を抑制 するこ とが知ら れてお り、PG
E2はcAld
Pをsecondmessengerとしてコラーゲン の産生 を制御す る。
本 研 究で は、 MIFを 投与した 場合の ケロイド 由来線 維芽細胞 (KF)と正常 皮膚由来 線維芽 細胞(NF)の cPLA2やCOX―2の発現 を解析 し、また 、両細 胞におけ るPGE2の産 生につい て検討 した。また 、KFとNFに おいて コラーゲ ン産生の 抑制因 子である P
GE2を反応 させたときのコラーゲンの抑 制効果 の解析を 行った 。
材料と 方法
1．検 体：同 意の得ら れた患 者より手 術によっ て採取 したケロ イド（6例）、成熟瘢痕（4例）および 正常皮膚 （6例 ）を用 いた。
2． 免 疫 組 織 化 学 染 色 ： 正 常 皮 膚 、 瘢 痕 お よ び ケ ロ イ ド に て MIFの 発 現 を 比 較 し た 。
3． c
PLA
2の活性化 の評価 ：NFとKFをMI
Fで刺 激後、[3H]で ラベル したアラ キドン 酸の遊離量を解析 すること でc
PLA2の活性化 を評価し た。
4． RT―PC
R解析：NFとKFをMI
FまたはIL−1ロで刺激後、cPL
A2とcOxー2のmRNAの発現をRTーPCRにて解 析した。
5．ウ エスタ ンブロッ ト解析 ：N
FとKFをMI
Fで刺 激後、リ ン酸化 E
RKの発 現と無刺 激時の E
P2の発現を ウエスタ ンブロッ トにて 解析した 。
6． PGEz
また はcAM
Pによ るコラー ゲン産生に対する抑制効果の検討：N
FとKFにPG
E2またはcAM
Pを 濃 度別 に 添 加後 、 pro
collagentypeIC―peptide (PICP)を 測 定す る こ とでI型コ ラーゲンの 産生量を 比較した 。
7． P
GE2
産生量の検討：N
FとKFをMI
FまたはIL−1ロで刺激後、PG
E2産生をELISAにて解析した。
8． cAMPレ ベ ル の 解 析 ： NFと KFを PGE2で 刺 激 後 、 cAMP産 生 を ELISAに て 解 析 し た 。
― 604一結果お よび考察
PGE
2は線 維芽細胞 におけ る細胞増 殖とコラ ーゲン 産生を抑 制し、 また、線 維芽細 胞自体もPGEzを産 生 す る。 そ こ で われ わ れ は、 KFにお け る P
GE2の産生 能の低下 が、ケロ イドに おける 細 胞 外 基 質 の コ ラ ー ゲ ン 過 剰 産 生 の 原 因 の ひ と つ で ある と考 え た。
MIFは 炎 症 性サ イ ト カ イン とし てのみな らず、 細胞の分 化、増 殖に関わ る重要な タンパ クである 。また 、MIFはextracellularsignal−regulatedkinase(ERK） をりン酸 化する ことでcPLA2を 活 性化 し 、 cOx― 2のRNAレペ ル の 発現 を 促 進す ること でアラキ ドン酸 代謝を活 性化する ことが 報告され ている 。また、 本研究に おいて 、免疫組 織化学 染色によ ルケロ イドの線維 芽 細 胞に 過 剰 のMIFの 発現 を認める ことを 示した。 以上のこ とから 、本研究 ではア ラキ
ドン酸代 謝の刺 激因子と してMIFを選択 した。
MIFの 反 応 に 対 す る cPLA2の 活 性 化 を 検 討 し た 結 果 、 MIFは cPLA2の 活 性 化 を NFよ りKFに お い て 促 進 し た 。 MIFは ER
Kの り ン酸 化 を 促進 し 、 また 、 リ ン 酸化 し た E
RKは c
PLA2を活性 化 す る 。 MIF添 加 15分 後 の ERKの り ン 酸 化 を NFと KFで 比 べ る と 、 KFに お い て よ り強 い
増強 が 認 めら れ た 。す な わ ち、 アラキド ン酸の 遊離量の 差は、cPL
A2を活 性化する ために 必要なER
Kのりン 酸化の程 度が関 与してい ると考 えられた 。
MIF
またはI
L− 1ロ で刺 激 す ると 、 KF
よ り NFで PGE2の 産生 が増加し た。PGEz
は アラキド ン酸から COX−2の作 用によっ て生成 される。 そこで 、MIFま たはIL−1ロ刺 激後、cOx−2のmRNAの発 現 を R
T− PC
Rに て 解 析し た 結 果、 KFより NFで強 い cO
x− 2のmRNAの発 現 を 認め た 。すなわ ち 、 MIFに 対 す る PGEzの産 生 量 の差 は 、 M
IFに よっ て 誘 導 され る cO
x― 2のmRNAのレベルの差を反 映して いると考 えられ た。
免 疫 組 織 化 学 染 色 では MIF
は KFで強 く 染 色さ れ た 。し か し 、 K
Fに お いて は 、 M
IFが 強く発現し ている にもかか わらず 、MIFの 刺激によ るPG
E：産生の 促進作 用に対す る感受 性が低下
して い た 。す な わ ち、 ケ ロ イ ドに お け る過 剰 な コラ ー ヴン産 生は、 K
Fにおける コラー ゲン抑制因子 である PGE2産生の 低下が原 因のひと つであ ると考え た。
以上の 結果から 、NFとKF
両 細胞にお ける炎 症性サイ トカイン の刺激によって増加するPGE：量の 差 は 、原 料 と なる ア ラ キ ドン 酸 量 より も CO
X− 2activityの 差が重要 である ことが示 唆された。 しかし 、MIF刺 激によ ってNF
より K
FにおいてERKのりン酸化が増強するという知見は、
ケロ イ ド にお い て M
IFが 過 剰発 現してい るとぃ う結果と 合わせて 、KFの増 殖および アポト ーシス 耐 性 にMIFが深 く 関 与 して いる可能 性を示 唆してい る。また 、KFにお いてアラ キドン 酸
産生が 促進し ていると ぃう結 果は、ア ラキドン 酸自体 あるいは プロス タンディ ン以外 の代謝産物で あるロ イコ卜リ エンが ケロイド の成因に 何らか の関わり をもつ 可能性も 推察さ れる。
今後は、 これら の点をよ り詳細 に検討す る必要 があると 考える。
本研究 におい て、PG
E2の コラーゲ ン抑制作 用はNFに 比べてKFで低下し ているこ とを明 らかにした。 これは 、NFに比ぺ てKFにお いてPG
E2の レセプタ ーであ るE
P2（Eprostanoidreceptor2）の 発現が 低下していることが原因であることを示した。しかし、レセプター非依存性にcAMP
レベル を上昇 させると 、NF，KF
両 細胞とも にコラ ーゲンの 産生が 濃度依存 性に低下 した。 すな わ ち 、 cAMPは コ ラ ー ゲ ン 産 生 の 重 要 な 制 御 因 子 に な り 得 る こ と が 示 唆 さ れ た 。
結語
ケロ イド線維 芽細胞と 正常皮 膚線維芽 細胞の アラキド ン酸代 謝を比較 検討した ところ 、ケロイド 線維芽 細胞にお いて炎 症性サイ 卜カイ ン刺激に 対するコ ラーゲン抑制因子であるPG
E：の産生 が低下 していた 。また 、PGE
2のコラ ーゲン 抑制効果 は、正 常皮膚線 維芽細 胞に比較して ケロ イ ド 線維 芽 細 胞 で減 弱してい た。し かし、PG
E：のsecondme
ssengerである cAM
Pレベルを上 昇させ ると両線 維芽細 胞におい ても同 じように コラーゲ ン抑制 効果を示 した。 以上の結果よ り、ケ ロイド線 維芽細 胞におけ るP
GE：の産生 とP
GE： に対す る感受性 の低下 がケロイ‑ 605―

ドの成因に関与していること、また、今後はcAMPのコラーゲン産生に対する抑制作用を用いることで新しいケロイドの治療法の開発にっながる可能性が期待されると考えられた。

― 606―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 山 本 有 平
副 査 教 授 三 浪 明 男
副 査 教 授 秋 田 弘 俊

学 位 論 文 題 名

ケロイドにおけるアラキドン酸代謝とコラーゲン産生に関する解析
ケロイドは持続する炎症、境界部での健常組織への浸潤性増殖などの特徴をもつ皮膚の良性腫瘍性病変である。ケロイドの病態は線維芽細胞の増殖と細胞外基質の過剰な増生を主体とした真皮の肥厚を特徴としており、創傷治癒過程の何らかの異常によって生じると考えられる。
PGE2は線維芽細胞における細胞増殖とコラーゲン産生を抑制し、また、線維芽細胞自体もPGE2を産生する。そこでわれわれは、ケロイド線維芽細胞におけるPGE2の産生能の低下が、ケロ イド にお ける 細胞 外基 質の コラー ゲン 過剰 産生 の原 因のひとっであると考えた。
マクロファージ遊走阻止因子（MIF）は炎症性サイトカインとしてのみならず、細胞の分化、増殖に関わる重要なタンパクである。また、M
IFはextracellularsig
nalーregulatedkinase (ERK）をりン酸化することでcPLA2を活性化し、COX−2のRNAレベルの発現を促進することでアラキドン酸代謝を活性化することが報告されている。また、本研究において、免疫組織化学染色によルケロイドの線維芽細胞に過剰のMIFの発現を認めることを示した。以上 の こ と か ら 、 本 研 究 で は ア ラ キ ド シ 酸 代 謝 の 刺 激 因 子 と し て MIFを 選 択 し た 。
MIF、IL−1ロ刺激によるPGEzの産生量は正常線維芽細胞と比較してケロイド線維芽細胞において低下していた。また、その原因は、MIF、IL―1
ロ刺激によるcO
xー2のmRNAの発現量の相違によると考えられた。
さらに、PGEzのコラーゲン抑制効果は正常線維芽細胞と比較してケロイド線維芽細胞で低下していた。その原因は、PGE2のR
ceptorのひとっであるE
P2の発現が、ケロイド線維芽細胞で低下しているためと考えられた。しかし、cA
MP activatorであるFor
skolinで刺激した場
合、正常線維芽細胞とケロイド線維芽細胞においてコラーゲン抑制効果に有意な差は認めなかった。すなわち、cAMPより下流のシグナル伝達には正常線維芽細胞とケロイド線維芽細胞とも違いがないと考えられた。
本研究においては、ケロイド線維芽細胞はコラーゲン抑制因子であるPGEzの産生が低下しており、また、PGE2のコラーゲン抑制効果が減弱していることが、ケロイドにおけるI型コラーゲンの過剰産生の原因に関与していることが示唆された。また、cAMPactivatorである
Forskolinは、ケロイド線維芽細胞においてもコラーゲン抑制効果が認められたことより、
今 後 、 cAMP製 剤 は ケ ロ イ ド 治 療 に 応 用 で き る 可 能 性 が あ る と 考 え ら れ た 。
ケロイド線維芽細胞におけるアラキドン酸代謝とコラーゲン産生に関する解析を行い、ケ− 607−

ロイド線維芽細胞において正常線維芽細胞と比較してPGE2の産生量が低下していることや、その原因がcOx―2のmRNAの発現量の相違によることが明らかとなった。また、PGEエのコラーゲン抑制効果は正常線維芽細胞と比較してケロイド線維芽細胞で低下していることや、その原因がEP2 Re
ceptorの発現がケロイド線維芽細胞で低下しているためであることが明らかとなった。
公開発表に当たり、副査三浪明男教授より、1）ケロイドと肥厚性瘢痕におけるMIFの発現やコラーゲン産生の違いについて、2）ケロイドに好発部位がある原因を本研究の知見から説明できる可能性について、3）MIFがアラキドン酸カスケードに作用する機序っいて質問があった。次いで、副査秋田弘俊教授より、1）正常線維芽細胞とケロイド線維芽細胞においてCOX−2の発現が異なる原因について、2）ケロイドにおいてEP2の発現が低下している原因について、3）本研究の知見から今後の臨床応用の方向性について質問があった。次に、主査山本有平教授より、1）肺線維芽細胞とケロイド線維芽細胞において無刺激の状態におけるPGEユの産生量が異なる原因について、2）肺線維症およびケロイド治療にcAMP製剤を用いる場合の具体的な投与法などにっいて質問があった。いずれの質問に対しても申請者は自らの研究内容と文献を引用し、妥当な解答をした。
この論文は、ケロイドにおけるコラーゲンの過剰産生が、PGE2の産生と感受性の低下が深く関与していることを初めて明らかにした点で高く評価され、今後ケロイドの病態の解明や新たな治療法の開発にっながることが期待される。
審査員一同、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分な 資 格 を 有 す る も の と 判 定し た。

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