    

〔総 説〕
四角目

和広 ……… 2

剛、前田恒昭 ……… 6「トランスサイレチン」

水口

峰之 ……… 9「単糖類の 4 位選択的アシル化触媒」

川端

猛夫 ……… 16〈生薬のはなし〉「天然物化学者と民族薬物学調査 大黄と芍薬同属植物の成分研究」

高石

喜久 ……… 12亮、西部隆宏 ……… 14

島尾

永康 ……… 27「計量法計量標準供給制度による標準液について」「計量トレーサビリティの確保された残留農薬試験用標準物質の開発」

井原〈テクニカルレポート〉「microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 の開発」

俊英、齋藤

請川

〔化学大家〕「フリッツ・ハーバー」〔製品紹介〕
有機合成

細胞生物・生化学

アシル化触媒「川端アシル化触媒」 ………………… 19

バンドのきれいなプレキャストゲル

アルコール酸化触媒「2-アザアダマンタン-N - オキシル」… 20

スーパーセップ TM エース…………………… 22

神経伝達物質 カルシウムシグナル関連物質，

環境・分析

JCSS 揮発性有機化合物 23 種混合標準液 ……………

5

GABA 受容体作用物質 ………………………… 26

TRM シリーズ 残留農薬試験用標準物質 ………………

8

ホルボール 12-ミリスタート 13- アセタート ……………… 26

局方生薬試験用試薬 …………………………………… 13

遺 伝 子

細胞生物・生化学

マイクロ RNA アイソレーションキット，マウス Ago2 …… 15

トランスサイレチン，ヒト，組換え体 ……………………… 11

マイクロ RNA アイソレーションキット，ヒト Ago2

プロテインホスファターゼ２A 二量体，ヒト，組換え体 … 20

〜 microRNAの標的mRNA 同定に応用できる実験例の紹介〜… 24…………… 25

カンタリジン ……………………………………………… 20

抗マウス Ago２，モノクローナル抗体

TRAP/ALP 染色キット ………………………………… 21

DNA エキストラクター ® TIS キット ……………………… 32

細胞培養用

抗生物質溶液 …………………………… 21〔お知らせ〕〔お知らせ〕
第 24 回 Wako ワークショップのご案内 ……………………………………11
第 23 回 Wako ワークショップのご案内 …………………………………… 4『アクロモペプチダーゼについて』お知らせ………………………………19
和光純薬時報 75 − 3 訂正案内………………………………………………36

1

R

esearch
計量法計量標準供給制度による標準液について

1 はじめに近年、産業界のみならず環境をはじめ

財団法人化学物質評価研究機構

和広

サビリティを形成する手順によってそのされ、認証された標準物質すなわち「認特性値が決定された認証標準物質は、国証標準物質」がこれに相当するものであ

際社会の中でその重要性が一層増大してる。ISO/REMCOではガイド30の中で、きている。

認証標準物質（Certiﬁed Reference Ma-とする様々な分野で、認証、マネジメン

ここでは、計量法に基づく計量標準

terial：CRM）を「認証書の付いた標準

トシステム、トレーサビリティなどの用供給制度（JCSS：Japan Calibration Ser-

物質で、一つ以上の特性値が、その特性語が用いられている。その背景には、社

vice System）における標準物質のうち、値を表す単位を正確な現示へのトレーサ

会や経済のグローバル化に伴い、地球環

主に標準液について紹介する。

ビリティが確立された手順によって認証

境問題、製品の質や安全に関する問題、各種化学物質の安全性の問題などがひとされ、各認証値にはある表記された信頼水準での不確かさが付いているもの」１）

２ 標準物質とはと定義している。後述する計量法トレー

つの国だけでは解決できないほど大きな問題として注目を集め、これらの問題を

2

四角目

質量や長さなどの物理量の計測におい注⑴サビリティ制度によって供給される標準

新しい枠組みで解決しようとする国際的ては、国際単位系（SI） の枠組の中でガスや標準液、独立行政法人産業技術総な動きがある。このような状況の中で化それぞれの基本量の基準となるものが定合研究所計量標準総合センター（AIST/

学分析は、これらの問題に対する現状把義され、トレーサビリティ体系（実用標

NMIJ）から供給されるNMIJ CRM、社握や解決のためには欠かせないものと準から順次上位の標準を経て国家標準・団法人日本鉄鋼連盟の日本鉄鋼標準物質なっている。近年の社会基盤としての技

国際標準に遡及できる体系）が確立されなどがCRMに相当する。

術の発達、化学分析における濃度の低濃ている。一方、化学量の計測においては、度化や多種多様な化学物質測定に対するSIの基本量であるモルに直接結びつく方

要望が強まったことで、質量や体積の測法を確立することが難しいため、それに定を基本とした重量分析法や容量分析法

代わる方法として標準物質を基準とする

1993年（平成5年）11月施行の計量法から機器分析法へと分析手法がシフト

濃度の測定が行われ、測定結果間の整合のもと、国家計量標準を経済産業大臣がし、最近の化学分析とは機器分析法を指性が保持されている。標準物質（Refer-

特定標準器または特定標準物質として指すと言っても過言ではないほど機器分析

ence Material：RM）の正確な定義とし定し、国家計量標準にトレーサブルな計法が多く用いられている。今日のマスメては、国際標準化機構の標準物質委員会

量標準を供給するトレーサビリティ制度

ディアによって伝えられる化学的な分析（ISO/REMCO） がISOガ イ ド30の 中 でが始められた。計量法トレーサビリティ

注⑵３

計量法トレ−サビリティ
制度の化学標準物質

結果の多くが様々な機器分析法によるも次のように定めている。それによる

制度の開始とともに、標準物質についてのである。例えば、ダイオキシンなどはと、「標準物質とは、測定装置の校正、も標準ガス、pH標準液及びpH標準液以機器分析計によらなければ測定できない

測定方法の評価又は材料に値を付与する

外の標準液（金属標準液、陰イオン標準物質である。ところがこれらの機器分析ことに用いるために一つ以上の特性値が液等）が特定標準物質として指定された。

の結果として得られる値は電流値や電圧十分に均一で、適切に確定されている材

1993年当時は、標準ガス11種類、標準値であるため、測定対象物の濃度として料又は物質」１）と定義されている。また、液30種類が指定されていたが、その後、換算するためには電流値や電圧値と測定

現在では世界中で多くの企業が取得して標準ガス、標準液ごとに特定標準物質が対象物の濃度との関係が明らかとならないるISO 9000シリーズのなかで、測定に追加指定された。2008年7月現在の特定ければならない。このために必要となる用いる機器の標準物質やトレーサビリ

標準液の種類及び実用標準液の供給の現のが標準物質である。重量分析などの化ティに関して「定められた間隔又は使用状を表に示した。

学分析では、主に分析者の技能が分析結前に国際又は国家計量標準にトレース可計量法上「標準物質」とは「政令で定果の質を左右していたが、一般的な機器

能な計量標準に照らして校正又は検証す

める物象の状態の量の特定の値が付され分析では前処理操作等を除けば、分析者る。そのような標準が存在しない場合にた物質であって、当該物象の状態の量のの技能に左右される部分は少なくなり、は、校正又は検証に用いた基準を記録す

計量をするための計量器の誤差の測定に

２）

機器分析法には必要不可欠な標準物質のる。」という記述がある 。これは、特質がそのまま分析値の質につながってい

別な場合を除き測定装置は国際標準又は計量標準供給制度において、標準物質る。このような意味から標準物質の信頼国家標準にトレーサブルな標準物質を用は計量器の校正に用いる他の計量標準と性がそのまま機器分析法による測定結果

いて校正する必要性があることを意味し同じシステムで運用されることとなるの信頼性を反映することとなる。標準物ている。この国家標準にトレーサブルなが、標準物質は計量器の標準（例えば質質の重要性はこの点にある。特にトレー標準物質とは、ISOガイドに従って作製量における分銅）と異なり、①品質が経和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

用いるもの。」と定めている。

時変化を起こしやすい、②消耗品であり、表．特定標準液の種類と濃度範囲使用すると無くなってしまう、③標準物
質の値付けの結果を再確認できない等の特性があり、他の計量標準と同じ体制で

pH 標準液運用することは、国家計量標準の供給の信頼性等の観点から問題が生ずる恐れがある。このため、登録事業者から供給される濃度に係る標準物質については指定

無機標準液

校正機関による濃度信頼性試験注⑶を実施している。これは、認定後の校正能力維持の確認方法として、申請書に添付する

適確かつ円滑に行う技術的能力を有していることを定期的に確認する方法に関する事項」として「国の機関又は指定校正機関が行う標準物質ごとの濃度信頼性試ある。
標準物質の供給体系は、次のとおりである。
１）経済産業大臣の指定を受けた指定校正機関（「標準物質」については

アルミニウム標準液、ひ素標準液、ビスマス標準液、カルシウム標準液、カドミウム標準液、コバルト標準液、クロム標準液、銅標準液、
鉄標準液、水銀標準液、カリウム標準液、マグネシウム標準液、マン
ガン標準液、ナトリウム標準液、ニッケル標準液、鉛標準液、アンチモン標準液、亜鉛標準液、塩化物イオン標準液、ふっ化物イオン標準 登録事業者が実液、亜硝酸イオン標準液、硝酸イオン標準液、りん酸イオン標準液、 用標準液供給
硫酸イオン標準液、アンモニウムイオン標準液、リチウム標準液、バリウム標準液、モリブデン標準液、ストロンチウム標準液、すず標準
液、タリウム標準液、セレン標準液、ルビジウム標準液、臭化物イオ
ン標準液

有機標準液

ジクロロメタン標準液、クロロホルム標準液、1 , 2 - ジクロロエタン標
準液、四塩化炭素標準液、トリクロロエチレン標準液、テトラクロロ
エチレン標準液、トルエン標準液、ベンゼン標準液、o - キシレン標準
液、m - キシレン標準液、p - キシレン標準液、1 , 1 - ジクロロエチレン
標準液、cis - 1 , 3 - ジクロロプロペン標準液、cis - 1 , 2 - ジクロロエチレ
ン標準液、1 , 1 , 1 - トリクロロエタン標準液、1 , 1 , 2 - トリクロロエタ
ン標準液、trans - 1 , 3 - ジクロロプロペン標準液、トリブロモメタン標
準液、ブロモジクロロメタン標準液、ジブロモクロロメタン標準液、
trans - 1 , 2 - ジクロロエチレン標準液、1 , 2 - ジクロロプロパン標準液、 2008 年７月現在
1 , 4 - ジクロロベンゼン標準液、フタル酸ジエチル標準液、フタル酸ジ 登録事業者なし-n - ブチル標準液、フタル酸ジ - 2 - エチルヘキシル標準液、フタル酸ブ
チルベンジル標準液、4-t - オクチルフェノール標準液、4-t - ブチルフェ
ノール標準液、4 -n - ヘプチルフェノール標準液、ビスフェノール A 標
準液、4-n - ノニルフェノール標準液、2, 4- ジクロロフェノール標準液、
フタル酸ジ -n - ヘキシル、フタル酸ジシクロヘキシル、フタル酸ジ -n ペンチル、フタル酸ジ -n - プロピル、フタル酸エステル８種混合標準
液、アルキルフェノール６種混合標準液、アルキルフェノール５種混合標準液、ホルムアルデヒド標準液
下線付きの標準液：2008 年５月に特定標準液として追加指定された標準液財団法人化学物質評価研究機構）
は、自らが保管する標準物質製造装置を用いて特定標準物質を製造し、維持・管理を行う。

登録事業者が実用標準液供給揮発性有機化合物 23 種混合標準液書面」の中の「計量器の校正等の事業をということに基づいて始められたものでしゅう酸塩 pH 標準液、フタル酸塩 pH 標準液、中性りん酸塩 pH 標準 登録事業者が実液、りん酸塩 pH 標準液、ほう酸塩 pH 標準液、炭酸塩 pH 標準液
用標準液供給シアン化物イオン標準液、陰イオン７種混合標準液、金属 15 種混合 2008 年７月現在
標準液、ほう素標準液登録事業者なし「計量器の校正等の実施の方法を定めた験」を受けることをひとつの方法とする

実用標準液の供給の状態

標準液の種類付き証明書を１製品につき１枚発
行することができる。

４ 標準物質の開発

これらの供給体系を図に示す。

２）指定校正機関は、特定標準物質を社会や経済のグローバル化、環境・安もとに特定二次標準物質の濃度の校 正（ 値 付 け ） を 行 う。 こ の 際、指定校正機関は jcss の標章付き証
明書を発行する。
３）独立行政法人製品評価技術基盤機構の認定を受けた登録事業者は、特定二次標準物質をもとに実用標準物質の濃度を校正（値付け）する。
４）指定校正機関は、登録事業者が校正（値付け）した標準物質について濃度信頼性試験を実施し、定められた規格値（判定基準）以内にあれば「適合」とし、登録事業者に通知する。
５）登録事業者は、濃度信頼性試験に「適合」した標準物質を市販する。
この際、登録事業者は JCSS の標章

注⑴：SI は、「国際単位系」という意味のフランス 語（Le Système internationald unités）の頭文字。
注⑵：ISO ガイド 35 が Third edition 2006
として改訂された。この中で、 referencematerial 及び certiﬁed referencematerial の再定義が行われ、ISO ガイド
30の定義から多少の変更があった。ISO
ガイド 35 の翻訳 JIS が発行（2008 年７月）されている。それによると、「標 準 物 質（reference material ; RM）：一つ以上の規定特性について、十分均質、かつ、安定であり、測定プロセスでの使用目的に適するように作製された物質」、「認証標準物
質（certiﬁed reference material：CRM）：
一つ以上の規定特性について、計量学的

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）に妥当な手順によって値付けされ、規定特性の値及びその不確かさ、並びに計量学的トレーサビリティを記載した認証書が付いている標準物質」となっている。
注⑶：現在、計量法による標準物質の供給体系で供給されている標準液については、濃度信頼性試験が行われ、規格値（判定基準）に適合した実用標準液のみが市場に供給されている。これ
らの濃度信頼性試験は、登録事業者が特定二次標準液で濃度の校正（値付け）を行った実用標準液について、一定割合で実用標準液を抜き取り、指定校正機関が特定標準液を用いてその濃度を確認するものである。

3

全問題への関心の高まりとその必要性の評価研究機構（以下、化評研。当時は、増大などの諸問題に的確に対応するため

財団法人化学品検査協会）を中心として有機混合標準液のうち、揮発性有機化には、ISO等の国際ルールに沿った標準スタートした。この開発は、国家標準と合物23種混合標準液については、2008

物質などの知的基盤の整備が必要不可欠

しての高純度物質の確立、標準物質の調年６月から登録事業者による実用標準液となっている。JCSS制度が開始された

製方法の確立、濃度測定方法の確立、保の供給が可能となった。

当時、JCSS標準物質は、無機系標準物

存安定性の評価等を行い国家標準物質に

無機混合標準液については、2008年５

質（標準液及び標準ガス）が41種類にとトレーサブルな体系を構築し、標準物質

月に新規特定標準液として指定されたもどまっており、欧米諸国と比較すると不を広く普及させることを目標とした。

のであり、近い将来、登録事業者から実開発開始時は、単成分の標準物質の開用標準液が供給されることが期待される。

発が中心となり、当時社会的に話題としかしながら、有機標準液の多くが、十分な状況にあった。
このような背景のもと、「産業技術審が、特定標準液として指定されている。

注⑷議会・日本工業標準調査会合同会議知的なったSPEED 98などを受けた環境ホ登録事業者が存在しないため、登録事

基盤整備特別委員会」が「我が国の知的ルモン関連物質や環境測定項目でも規制

業者による実用標準液は供給されてい基盤整備の充実に向けて」と題する報告対象となっている揮発性有機化合物など、ない注⑸。

書（1998）のなかで国家標準物質の集中

有機標準物質の開発が行われた。

標準物質関連の情報提供体制の整備

的、加速的整備（環境計測関連物質を中

また、リチウム、バリウム、モリブデ

心に1999年には1997年当時の42物質の2ンなどの単成分の無機標準液10種類が、倍程度の80物質、2001年前後には120物

特定標準液として追加指定され、現時点

標準物質を広く普及させるには、その質の供給を目標）及びそのための体制整

では、そのうち実用標準液９種類（シア

情報を広く公開することは勿論のこと、

備の必要性について報告した。この報告

ン化物イオン以外）が登録事業者から追入手しやすい方法で提供する必要があ

書をもとに標準物質の加速的な開発が、加供給されている。

る。国際的には、COMAR（国際標準物

５

経済産業省（当時は、通商産業省）の支

さらに、最近の機器分析計は、多成分

質データベース）による情報提供があ援のもと独立行政法人産業技術総合研究

同時測定が可能となっている機器が主流をる。世界 25 か国で製造された 10 , 000 件

所（以下、産総研。当時は、通商産業省

占めつつあることから、混合標準液の開発を超える標準物質が登録されたデータ

工業技術院物質工学工業技術研究所）、も行われてきた。2008年６月時点では、

ベース（http://www.comar.bam.de/）で独立行政法人製品評価技術基盤機構（以

揮発性有機化合物23種混合標準液などのある。2008 月７年の時点では、ドイツ

下、NITE。当時は、通商産業省製品評

有機系混合標準液４種類、陰イオン7種混の BAM（Bundesanstalt für Material-

価技術センター）及び財団法人化学物質

合標準液などの無機系混合標準液２種類

prüfung）が事務局として活動しており、
NITE が、窓口となっている。また、我が国では、認証標準物質及び標準物質に国際単位系 SI

関する情報、関連する国内外機関の情報
AIST/NMIJ

等をインターネットで提供する体制が基準物質の開発「 標 準 物 質 総 合 情 報 シ ス テ ム（http://

供給
指定校正機関濃度信頼性試験

www.rminfo.nite.go.jp/rminfo/jp/index.

基準物質do）」として構築され公開されている。

製造

COMAR と同様に NITE が維持管理して特定標準物質い る。 ま た、JCSS に 関 す る 情 報 は、
校正
登録事業者

jcss

jcss

校正

JCSS

実用標準物質供給
登録事業者が
いない場合

供給

６

トレーサビリティとマネジメントシステム

計量法上の国家標準である特定標準物
質を製造するための基準物質は産総研かユーザーら提供される。産総研では、国際度量衡

図．JCSS 標準物質の供給体系図4

dex.html、http://www.cerij.or.jp/gaiyou/
gyomu̲hyojyun.html 等から入手できる。

特定二次標準物質

校正

http://www.iajapan.nite.go.jp/jcss/in-

委員会物質量諮問委員会が行う国際比較

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

試験へ参加し、標準物質の国際的な同等標準液）の供給の現状について紹介しが明確なものでなければ、世界には通性を確認し、そのJCSS標準物質の信頼てきた。最近、ISO/IEC 17025 等に基用しない時代へと変化しつつある。こ注⑹。

づく試験所認定制度や地域又は国際間のためにも使用者、供給者、関係機関

また、JCSS制度は、1993年11月からの相互承認に向けて様々な動きがあるの国際的観点での対応が今後一層重要

計量法に基づく校正事業者認定制度としが、この中で、技能試験や測定の不確になるものと考えられる。

て運営してきたが、2005年７月より校正かさなどが重要なキーワードとなって事業者登録制度となった。

いる。この技能試験や測定の不確かさ性を担保している

この登録制度は、国際標準化機構及びのいずれも、正確な標準物質を用いる

国際電気標準会議が定めた校正機関に関ことによって初めて、意味をなすもの

する基準（ISO/IEC 17025）の要求事項にとなる。このように標準物質は、ある適合しているかどうかの審査を行い、校特定の範囲内で通用すればよいという

正事業者を登録する制度となっている注⑺。

時代から、国際的に認知された方法に登録に当たっては、ISO/IEC 17025による基づいて製造、値付けされ、その素性〔参考文献〕
１）標準物質に関連して用いられる用語及び定義，日本工業規格，JIS Q 0030（1997）
２）品質マネジメントシステム−要求事項，日本工業規格，JIS Q 9001（2000）

マネジメントシステム、校正方法、不確
かさの見積もり、設備など、校正が適切に実施されるかどうかについて、組織的、技術的な観点から審査される。登録された事業者は、そのトレーサビリティとマ
ネジメントシステムを証明するものとして、JCSSのロゴマーク入りの証明書を発行することができる。JCSSロゴマーク付
き証明書は、そのマークにより国家計量「環
注⑷：1998 年 5 月に環境庁（当時）が、境ホルモン戦略計画 SPEED 98」の中で内分泌攪乱作用を有すると疑われる化学物質 67 物質を発表した。これにより一気に「環境ホルモン」という用語が用いられるようになった。
注⑸：登録事業者がいない場合には、暫定的な措置として指定校正機関から直接、国家標準にトレーサブルな標準物質の供給が可能となっている。

標準へのトレーサビリティと校正事業者の技術能力を証明するとともに、事業者から供給される標準物質が信頼性が高い

注⑹：JCSS 標準物質のうち、標準ガスについては、産総研から指名された機関として化評研が国際比較に参加している。

ものであることを示すものとなる。

７ おわりに

注⑺：国際MRA対応事業者については、
ISO Guide34（標準物質生産者の能力に関する一般要求事項）の要求事項も適用される。国際 MRA 対応事業者とは、
APLAC（アジア太平洋試験所認定協力機構）の相互承認協定、ILAC（国際試験所認定協力機構）の相互承認協定の要求事項に対応できている事業者のことである。国際 MRA 対応事業者は、指定された認定マークを用いることができる。なお、MRA（Mutual Recognition
Arrangement）とは多国間の相互承認のことであり、JCSS（NITE）は 1999 年に ILAC/APLAC の相互承認に署名している。

計量法における化学標準物質（主にP roducts
JCSS（Japan Calibration Service System）
揮発性有機化合物 23 種混合標準液（メタノール溶液）
特

成分一覧

長

●値付け結果に不確かさがついた証明書を添付●証明書に記載の値付け結果はILAC/APLAC の MRA を通じて、国際的に受け入れ可能●各成分の濃度は1, 000 mg/ℓ
コードNo.
224-01721

No.
1
2
3
4
5
6
7
8

成分名
1 , 1 - ジクロロエチレン
ジクロロメタンtrans - 1 , 2 - ジクロロエチレン
cis - 1 , 2 - ジクロロエチレン
クロロホルム1 , 1 , 1 - トリクロロエタン
四塩化炭素
ベンゼン

No.
9
10
11
12
13
14
15
16

成分名
1 , 2 - ジクロロエタン
トリクロロエチレン
1 , 2 - ジクロロプロパン
ブロモジクロロメタン
cis - 1 , 3 - ジクロロプロペン
トルエン
trans - 1 , 3 - ジクロロプロペン
テトラクロロエチレン

品
名23 VOC Mixture Standard Solution（Methanol Solution）

容 量
2 mℓ×5A

No.
17
18
19
20
21
22
23

成分名
ジブロモクロロメタン
o - キシレン
トリブロモメタン
1 , 4 - ジクロロベンゼン
p - キシレンm - キシレン
1 , 1 , 2 - トリクロロエタン

希望納入価格（円）
16,800

当社で取扱っているその他の JCSS 標準液については、http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/ana/pdf/JCSS23.pdf をご参照下さい。

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）5

R

esearch
計量トレーサビリティの確保された残留農薬試験用標準物質の開発
産業技術総合研究所

はじめに

計測標準研究部門

井原

剛、前田

恒昭

ンター（以下、当所）における標準物

リティの確保のために、抜き取られた質 の 生 産 プ ロ セ ス は、ISO ガ イ ド 34

特定のロットについて、「⑤値付け」に適合した品質システムに基づき、通を行うこととした。ここに、市販標準

近年、食品の安全性に関して多くの

常、図１に示す①〜⑦のような流れで物質のメーカが「④均質性評価」と問題が生じており、国としてもその対行っている。すなわち、「①標準物質「⑥安定性評価」等から得られた不確応が急務となっている。2003 年に改正の設計」、「②候補標準物質の選定」、

かさを加えて、「⑦特性値の決定」をされた食品衛生法においては、食品残「③調製・小分け」、「④均質性評価」、行う仕組みとした。したがって、特性留農薬に関して大幅な規制強化がなさ「⑤値付け」、「⑥安定性評価」、「⑦特値はロット毎に管理されており、指定れており、ポジティブリスト制度（2006

性値の決定（認証）」である。値付けされる保存条件を前提に保証期限まで

年５月施行）の導入により、国内外でについては、可能な限り一次標準測定の不確かさも含まれるものである。

流通する約 800 種類の農薬等が規制の法（後述）を適用し、また原理的に異対象となっている。残留農薬試験は食なる複数の方法により堅牢性の高い値

品の安全性と直結するばかりでなく国付けを行うことを方針としている。そ際的な商取引とも関連するため、分析の上で均質性評価及び安定性評価など

農薬原体の純度測定法に関しては、

値の信頼性への要求は高く、公的機関

により得られた結果を不確かさとして確実なトレーサビリティ確保の観点かを含め各試験機関では ISO/IEC 17025

考慮し、標準物質の特性値を決定す

らは国際単位系（SI）に基づく計量学の認定取得など分析精度管理の維持・る。コアとなる値付け技術はもとより的に高度な計測法を適用することが望向上に努めている。分析精度管理にお周辺技術も含めて最高精度を追求する

ましい。しかしながら、本標準物質のいて検量線作成用の標準物質の使用はこともあって、特性値は真値の最良推用途から考察した場合、実用的に十分不可欠であり、既に市販もされている定値と言えるものである。一方、ほぼな不確かさが得られればよい。そこ

が、きわめて種類が多いことに加えて全ての生産プロセスを自らが検証しつで、本開発では、SI トレーサビリティ

規制対象物質の追加又は削除などが頻

つ進めることから、費やす生産期間がを確保しつつ、迅速かつ正確な純度測繁に行われるなどの理由により、計量１年を超えることも少なくない。した定法を新たに構築することを課題とし

トレーサビリティの確保された標準物がって、本課題に当所の標準物質生産

た。SI トレーサビリティ確保の観点

質は供給されてこなかった。

適用した純度測定法と同品質のプロセスを適用するのは困では、前述のように SI に基づく計測

そこで、我々は迅速かつ簡便でありな

難であり、残留農薬試験用標準物質に法、すなわち一次標準測定法の適用ががら計量学的に正確な測定法を導入する

関しては、計量学的に最高の品質を目望ましい。これは国際度量衡委員会傘ことにより、計量トレーサビリティが表指すよりも市場の求める不確かさで迅

下の物質量諮問委員会で「最高の計量明できる新たな残留農薬試験用標準物質

速に供給することを目標にした。

学的質を有し、その方法の操作が完全を開発することとした。また、その技術

そこで、当所が標準物質の設計からに記述され理解されるものであり、そ的方法と併せてトレーサビリティシステ

認証までを行うのではなく、既に市販の不確かさが SI 単位を用いて完全にムについても目的に合わせた見直しを図されているメーカ標準物質を活用する記述される方法」と定義されている 1）。

り、現在、計量法トレーサビリティ制度こととした。具体的には、残留農薬試

一次標準測定法の一つに凝固点降下法（JCSS）で行われているような標準物質

験における検量線作成に用いる農薬原があり、本課題の対象物質の純度測定の値付けの連鎖によるトレーサビリティ

体（いわゆる農薬標準品）をターゲッには有効であると考えた。このとき、とは異なる簡易なシステムを選択した。

トとし、その生産プロセスを見直し供給される標準物質の用途を考慮し、た。すなわち、「①標準物質の設計」、

純度測定の（拡張）不確かさを１% 程

標準物質の生産プロセス「②候補標準物質の選定」、「③調製・

度に設定することで、測定法の簡易化

小分け」については、市販品で過不足に取り組んだ。さらに、定義を満たし無いと判断し、当所は計量トレーサビ

得る計測法として当所で研究を進めて

産業技術総合研究所計量標準総合セ図１．標準物質の生産プロセス

6

俊英、齋藤

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

きた核磁気共鳴法についても、本課題

解範囲及びファントホッフプロットの調整や S/N を良くするなどの工夫をで目標とした不確かさであれば適用可

補正を不確かさの要因に加え、さらに行い、純度測定及びそれらの不確かさ

能と考えられた。そこで、示差走査熱

凝固点降下法で得られる物質量分率評価を試みた。1 H 共鳴周波数 599 . 9

量計（DSC）を用いた凝固点降下法に（mol/mol） を 質 量 分 率（kg/kg） に

MHz の NMR（ Unity INOVA 600 A、

よる連続昇温測定、及び核磁気共鳴装

変換することによる不確かさを加え

Varian 製）を用い、スペクトル幅 100

置（NMR）を用いた内標準法によるた 2）。その結果、表１に示すように純

ppm、90°パルス（11 µs）、データ取りH NMR 測 定 を 試 み た。 な お、DSC

度の不確かさとして0. 2 %〜0. 8 %込み時間４秒、遅延時間 60 秒、積算回を用いた測定では、本課題で対象とし（k = 2）を得た。

数 32 回 と し、 安 息 香 酸（NIST SRM

1

1た物質について揮発成分及び残分（灰次に、NMR での測定であるが、 H

350 a、純度：99 . 9958 % ± 0 . 0027 %）分）が測定できない場合があるため、

NMR では化合物中の水素原子核の数を内標準物質として純度を求めたとこ

熱重量天秤（TGA）による揮発成分の比がピーク面積比に対応する特性をろ、表１に示すように５物質について

測定及び強熱残分測定を併せて行い、持つことから、水素元素の数の比を簡99 . 1 % 〜 99 . 6 %（質量分率）の値を

DSC の純度を補正した。以下に、一

単に確認することができる。したがっ得 た。 た だ し、 γ-BHC（ リ ン デ ン ）例として表１に掲げる農薬原体について、この特性を利用することで純度測については適正なピーク形状が得られて行った純度測定の詳細について述べ定を行うことが可能である。すなわ

なかったため、純度測定ができなかっる。

ち、内標準物質として純度が既知の物た。また、本測定における不確かさに

1

まず、DSC での測定であるが、モ質を定量的に加えて H NMR 測定を

ついては、内標準物質及び対象物質のル凝固点降下現象に基づくため、そも行い、得られたスペクトルの中から定秤量の不確かさに加え、ピーク選択やそも熱力学的には平衡状態での議論で量したい物質および内標準物質それぞ緩和によるものが全体への寄与率が大あり、試料を一定速度で加熱する測定れの適当なピークについて面積と寄与きかった。その結果、表１に示すよう（連続昇温測定）では不確かさが大きする核の数を勘案することで、両者のに純度の不確かさとして 0 . 5 % 〜 0 . 7

くなることが予測されるため、当所でモル比から定量値を得ることができ%（k = 2）を得た。

はこれまで特性値を得るための手法とる。このときピーク面積の比は寄与す以上の測定により得られた２つの純

してはほとんど適用してこなかった。

る核の数に比例することから、本測定

度を平均し、各物質の報告値（99 . 4

しかしながら、本課題においては 1 %は原理的に 1 H 核の数、言いかえれば% 〜 99 . 7 %）とした（表１）。その不程度の不確かさを目標値として設定しSI に基づく純度が得られることにな

確かさについては、DSC 及び NMR の3）たことから、連続昇温測定も適用できる 。ただし、通常の構造解析を主眼

各測定における不確かさに加えて測定る可能性があると判断した。そこで、として 1 H NMR を測定する場合と比間の純度差を不確かさとして考慮し、

イントラクーラーを備えた熱流束型のべ、定量に焦点を当てた場合では、定最終的に目標を満足する 0 . 2 % 〜 0 . 9

DSC（DSC 823 e、Mettler Toledo 製 ）量を行おうとする核が、その数に正確%（k = 2）の不確かさを得た（表１）。

を用い、水銀（NIST SRM 2225）及に比例する条件下での実験を行うこと

本開発では、SI トレーサビリティ

びインジウム（NIST SRM 2232）、又が不可欠な条件となる。そこで、スピを確保しつつ、迅速かつ正確な純度測は イ ン ジ ウ ム 及 び ビ ス マ ス（NIST

ン−格子緩和時間（T 1）の６倍以上定法を新たに構築することを課題と

SRM 2235）で温度及び熱量の校正をの遅延時間をとる条件とし、さらにし、具体的な目標として純度測定にお行った上で、昇温速度 0 . 1℃ / 分又はピークの形状を良好にするためのシム

ける不確かさを 1 % に設定して測定法

２℃ / 分（プロピザミドのみ）で純度を求めたところ、表１に示すように４

表１．純度評価を行った農薬原体とその測定結果の例

物質について 99 . 7 % 〜 99 . 9 %（質量分率）の値を得た（揮発成分及び残分

農

薬

の補正後）
。 た だ し、EPN 及 び エ ト

DSC

NMR

不確かさ
純度（%）
（%, =2）

不確かさ
純度（%）（%, =2）

報告値
純度（%）

不確かさ
（%, =2）

フェンプロックスについては凝固が確

γ-BHC（リンデン）

99.7

0.2

−

−

99.7

0.2

認されなかったため、純度測定ができ

EPN

−

−

99.4

0.7

99.4

0.7

なかった。また、本測定における不確

エトフェンプロックス

−

−

99.5

0.5

99.5

0.5

かさについては、凝固点降下法の原理

プロシミドン

99.9

0.2

99.3

0.5

99.6

0.7

に基づく要因の他に、連続昇温測定に

プロピザミド

99.8

0.8

99.1

0.6

99.4

0.9

よるものとして、純度解析に用いる融DEP（トリクロルホン）

99.7

0.3

99.6

0.5

99.7

0.3

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）7

の簡易化に取り組み、ほぼ満足する結果 を 得 る こ と が で き た。DSC 及 び
NMR での純度測定に関する入力量は国家標準を通して SI へのトレーサビ
リティが実現されており、SI に基づ
く出力値を与えうる分析法であることから、得られた純度は原理的に SI ト
レーサブルな分析値と言える。

計量トレーサビリティについて
本システムは、当所と市販標準物質のメーカがそれぞれ農薬標準物質を生産し、標準物質の値付けを行うことで計量トレーサビリティを確保するのではなく、既述したように一つの標準物
質の生産プロセスを分業することで実現したものである。すなわち、当所は抜き取られた農薬原体について、SI（表）
図２．分析結果報告書の例にトレーサブルな分析法により純度測

サビリティの要求に応えるものであり、おわりに定を行い、得られた純度とその不確かさを分析結果報告書（図２）として発4）（裏）より厳しい精度管理が求められる試験において利用価値がある。

行した 。当該標準物質メーカ（和光

今般、和光純薬工業株式会社から供純薬工業株式会社）では、分析結果報給が開始された残留農薬試験用の新しい告書に記載した純度（不確かさを含標準物質（TRMシリーズ）には、これむ）に均質性評価及び安定性評価等かまで市販されていた農薬標準品には無い

ら得た不確かさを加えて標準物質の特２つの大きな特徴がある。その一つは、性値を決定し、証明書付きの標準物質証明書に計量トレーサビリティについて

衣笠晋一：分析化学，52，1029，（2003）．

として供給する。したがって、本標準の記述がされていることであり、もう一

４）産業技術総合研究所計量標準総合センター

物質の特性値は、当所の分析値を通し

つは、標準物質の特性値（純度）に信頼て SI にトレーサブルであり、計量ト

性の証である不確かさが記載されている

レーサビリティが表明できるものであことである。これらの特徴はどちらも

http://www.nmij.jp/˜measure-sys/topics/

る。

ISO/IEC 17025等における測定のトレー

wako/〔参考文献〕
１）日本分析化学会編：「分離分析化学事典」，
p. 350，（朝倉書店）（2001）．
２）井原俊英，飯島由美子，清水由隆：分析化
学，57，493，（2008）．
３）齋藤剛，井原俊英，佐藤 浩志，J. Harald，のホームページの下記サイトで、これまでに発行した残留農薬試験用標準物質の分析
結果報告書が閲覧可能．

P roducts
残留農薬試験用標準物質〔TRM（Traceable Reference Material）シリーズ〕

8

コードNo.

品

049-30641

DEP Reference Material

名

100mg

12,000054-07801

Ethofenprox Reference Material

100mg

近日発売

165-23461

Procymidone Reference Material

100mg

近日発売

162-23611

Propyzamid Reference Material

100mg

近日発売

和光純薬時報容Vol.76, No.4（2008）

量

希望納入価格（円）

Researchトランスサイレチン
富山大学大学院医学薬学研究部 構造生物学研究室

はじめに

水口

峰之

であるサイロキシンを血液中に貯蔵し細胞にシンよりも強く結合する。また、これらの分輸送する。血中のサイロキシンの約20%は子は、他のサイロキシン結合タンパク質であトランスサイレチンに結合し、中枢神経系のるサイロキシン結合グロブリンには結合しなトランスサイレチンは、分子量55kDaのサイロキシンについては約80%がトランスい 4）。したがって、PCBやPBBはトランスサ

血漿タンパク質であり、サイロキシンやレチ

サイレチンに結合している 1）。トランスサイ

イレチンの機能に大きな影響を与えているとノールを輸送する機能を有する。このタンパ

レチンには２つのサイロキシン結合部位があ思われる。近年では、トランスサイレチンを

ク質は、以前はプレアルブミンとよばれ、り、１つはサイロキシンを強く結合し（解離

利用して内分泌攪乱物質を検出するキットの1974年にKandaらによってアミノ酸配列が定数が〜10 nM）、もう１つは弱く結合する開発も進められている 5）。

報告されて以来、さまざまな視点からの研究（解離定数が〜5μM）。サイロキシン結合部が行われてきた 1）。本稿では、トランスサイ

位は、トランスサイレチンの二量体と二量体

レチンの特徴について簡単に説明したい。

が接している領域に位置し、四量体構造ではトランスサイレチンとアミロイド病

ちょうど中央に位置する（図1B）。

トランスサイレチンの産生と血中濃度

アミロイド線維は、βストランドが線維レチノール輸送の進行方向に多数重合した凝集物であり、難溶性で臓器に蓄積しさまざまな機能障害を引トランスサイレチンは主に肝臓で合成されトランスサイレチンはレチノールを輸送6）き起こす。このような疾患はアミロイド病と血液中に分泌される。肝臓の他には、脳室脈する機能も有する 。サイロキシンの場合総称され、20種以上のタンパク質やペプチド

絡叢、網膜、膵臓などにおいても産生される。

とは異なり、レチノールが直接トランスサ

がアミロイド病の原因物質として同定されて血液中の濃度は、成人で20−40 mg/dlであイレチンに結合することはない。レチノーいる。トランスサイレチンはアミロイド病のり、50歳くらいから徐々に減少する 1）。トラ

ルはレチノール結合タンパク質に結合し、原因タンパク質の１つとして知られている。

ンスサイレチンの血中半減期は1. 9日と短く、その複合体にトランスサイレチンが結合す

トランスサイレチンのアミロイド病は、アミまた、炎症、妊娠、腫瘍、低栄養などで血中る（図１C）。遊離のレチノール結合タンパ

ロイド線維が末梢神経、心臓、腎臓、消化管

ク質はトランスサイレチンと結合しないが、などに蓄積して引き起こされる。したがって、

レチノールが結合するとトランスサイレチ

サイロキシンやレチノールの輸送といったトンに結合できるように立体構造を変化させランスサイレチンの機能が損なわれることにる。さらに、トランスサイレチンの結合は、由来するのではない 1）。

2）

濃度が著しく低下することが知られている 。

トランスサイレチンの立体構造

レチノールとレチノール結合タンパク質のトランスサイレチンが原因のアミロイド

トランスサイレチンの立体構造はX線結結合を強める効果がある。これにより、レ病は２つに大別される 1）。１つは野生型ト晶構造解析によって明らかにされており、チノールが目的細胞以外で解離しないよう

ランスサイレチンによって起こるタイプ

その立体構造は14 kDaの単量体が４つ集にしていると思われる。トランスサイレチ

で、これは老人性全身アミロイドーシス

まったホモ四量体を形成している 。単量体

ンはレチノール結合タンパク質を２分子結（senile systemic amyloidosis : SSA）とよばには２枚のβシートが含まれ、８本のβス合することができ、その結合部位はサイロれる。もう１つはアミノ酸が変異すること

1）

トランドと１本のαヘリックスがギリシャ

6）

キシンの結合部位とは異なっている 。

キーモチーフに類似するトポロジーを形成している（図１A）。単量体と単量体は主に水素結合によって連結され、一方、二量体によって引き起こされるタイプで家族性ア
ミロイドポリニューロパシー（familial amy-

トランスサイレチンと内分泌攪乱物質と二量体の結合には水素結合と疎水性相互loid polyneuropathy : FAP） が 含 ま れ る。
FAPの原因となるアミノ酸変異は多数知られており、トランスサイレチン分子のあらトランスサイレチンは、ポリ塩化ビフェ

ゆる部位において変異が起こることがわ

る研究によると、このタンパク質は熱変性

ニル類（PCB）やポリ臭素化ビフェニル類

かっている。また、変異の種類によってア

温度が100℃程度であり非常に熱安定性が高（PBB）に結合することが知られている 4）。

ミロイド線維の蓄積部位が異なっている。

い。このような高い安定性は、強固な四次

これらの化合物は内分泌攪乱物質と考えられ

多くは肝臓で産生されたトランスサイレチ

構造に由来するものと予想される 3）。

ており、トランスサイレチンのサイロキシン

ンが全身組織に蓄積し末梢神経障害や心筋結合部位に結合する。その結果、サイロキシ

障 害 な ど を 発 症 す る が、D18G変 異 やンがトランスサイレチンから遊離し、体内かA25T変異は髄液中のトランスサイレチン

ら排除されると考えられている。興味深いこが脳に蓄積し中枢神経障害を引き起こす 7）。

とに、PCBやPBBのいくつかは、サイロキ

FAPの治療法としては肝移植が最も有効作用が重要である。熱力学的安定性に関す

サイロキシン結合
トランスサイレチンは、甲状腺ホルモン

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）9図１．トランスサイレチンの立体構造。トランスサイレ
チンを青色のリボンモデルで表示した。（A）単量体構造（PDB ID : 1TTC）。（B）トランスサイレチ
ンとサイロキシンの複合体（PDB ID : 2ROX）。サイロキシンは黒色のスティックモデルで表示した。（C）トランスサイレチンとレチノール結合タ
ンパク質の複合体（PDB ID : 1RLB）。レチノール
結合タンパク質を灰色で、レチノールを黒色のス
ティックモデルで表示した。

であり、1990年にスウェーデンで初めて行われて以来、世界中で試みられている。しかし、肝移植以外には有効な治療法がなく、スサイレチンを利用する試みも行われておトランスサイレチンとアルツハイマー病

新しい治療法の開発を目指して活発に研究が行われている 8）。

興味深いことに、トランスサイレチンはIn vitroの研究によって、トランスサイ

先に述べたアミロイド病以外の疾患にも関レチンが不安定になると立体構造が部分的与している。例えば、トランスサイレチンに壊れた中間体に変化しやすくなり、アミはアルツハイマー病を抑制しているのでは

ロイド線維となって凝集すると提案されてないかと推測されている。この考えは、ア7）いる 。また、FAPなど遺伝性のアミロイ

ルツハイマー病における老人班の主要な構ド病を引き起こすアミノ酸変異は、トラン成成分であるアミロイドβが髄液のトラン

7）

スサイレチンの立体構造を不安定化する 。

スサイレチンによって可溶化されているこ以上の観点から、トランスサイレチンの安とを示した研究に端を発する 11）。この推測定化を目的とした治療法の開発が進められを支持する実験結果はこれまでに数多く報ている。その１つとして、薬物によってト

告されている。例えば、髄液のトランスサ

ランスサイレチンを安定化することで線維イレチン濃度は、アルツハイマー病患者で形成を阻害する試みが行われている。例えは正常対照群よりも有意に減少していば、ジフルニサルなどの非ステロイド性抗る 12，13）。また、最近のアルツハイマー病の炎症薬はサイロキシン結合ポケットに結合

モデルマウスによる研究では、トランスサ

9）

しトランスサイレチンを安定化する 。こイレチンは毒性のあるアミロイドβに結合の他に、Cr 3+ はサイロキシンと協同的にトしてアルツハイマー病の症状を抑制していランスサイレチンに結合し安定化することると提案されている 14）。アルツハイマー病。Cr はサプリメントの他にも、うつ 15，16）や統合失調症 17，18）などとしても利用されていることから、治療への精神疾患においてもトランスサイレチンの応用が期待される。

が減少する。これらの疾患の診断にトランが知られている

10

8，10）

3+

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

り 18，19）、今後の研究の発展が期待される。
〔参考文献〕
1）Hamilton, J. A. and Benson, M. D. : Transthyretin: areview from a structural perspective , Cell. Mol. Life Sci .,58, 1491- 521（2001）.
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malnutrition , Lancet , 2, 106- 109（1972）.
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Quintas, A., Saraiva, M. J. and Brito, R. M. : Comparative
calorimetric study of non-amyloidogenic and amyloidogenic variants of the homotetrameric protein transthyretin , Biophys. Chem ., 88, 61- 67（2000）.
4）Marchesini, G.R., Meulenberg, E., Haasnoot, W.,
Mizuguchi, M. and Irth, H. : Biosensor recognition of
thyroid-disrupting chemicals using transport proteins ,Anal. Chem ., 78, 1107- 1114（2006）.
5）Marchesini, G. R., Meimaridou, A., Haasnoot, W.,
Meulenberg, E., Albertus, F., Mizuguchi, M., Takeuchi, M.,
Irth, H. and Murk, A. J. : Biosensor discovery of
thyroxine transport disrupting chemicals , Toxicol. Appl.
Pharmacol ., in press,（2008）.
6）Monaco, H. L. : The transthyretin-retinol-binding protein
complex , Biochim. Biophys. Acta ., 1482, 65- 72（2000）.
7）Sekijima, Y., Wiseman, R. L., Matteson, J., Hammarström,P., Miller, S. R., Sawkar, A. R., Balch, W. E. and Kelly, J.
W. : The biological and chemical basis for tissue-selective
amyloid disease , Cell , 121, 73- 85（2005）.
8）Ando, Y. : New therapeutic approaches for familial
amyloidotic polyneuropathy（FAP）, Amyloid , 10 Suppl
1, 55- 66（2003）.
9）Sekijima, Y., Dendle, M. A. and Kelly, J. W. : Orally
administered diflunisal stabilizes transthyretin against
dissociation required for amyloidogenesis , Amyloid , 13,236- 49（2006）.

10）Sato, T., Ando, Y., Susuki, S., Mikami, F., Ikemizu, S.,
Nakamura, M., Suhr, O., Anraku, M., Kai, T., Suico, M. A.,
Shuto, T., Mizuguchi, M., Yamagata, Y. and Kai, H. :Chromium（III）ion and thyroxine cooperate to stabilize
the transthyretin tetramer and suppress in vitro amyloid
ﬁbril formation , FEBS Lett ., 580, 491- 496（2006）.
11）Schwarzman, A. L., Gregori, L., Vitek, M. P., Lyubski, S.,
Strittmatter, W. J., Enghilde, J. J., Bhasin, R., Silverman, J.,
Weisgraber, K. H., Coyle, P. K., Zagorski, M. G., Talafous,J., Eisenberg, M., Saunders, A. M., Roses, A. D. andGoldgaber, D. : Transthyretin sequesters amyloidβ
protein and prevents amyloid formation , Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A ., 91, 8368- 8372（1994）.
12）Serot, J. M., Christmann, D., Dubost, T. and Couturier,
M. : Cerebrospinal ﬂuid transthyretin : aging and late
onset Alzheimer s disease , J. Neurol. Neurosurg.
Psychiatry , 63, 506- 508（1997）.

13）Merched, A., Serot, J. M., Visvikis, S., Aguillon, D., Faure,
G. and Siest, G. : Apolipoprotein E, transthyretin andactin in the CSF of Alzheimer s patients: relation withthe senile plaques and cytoskeleton biochemistry , FEBS
Lett ., 425, 225- 228（1998）.
14）Buxbaum, J. N., Ye, Z., Reixach, N., Friske, L., Levy, C.,
Das, P., Golde, T., Masliah, E., Roberts, A. R. and Bartfai,
T. : Transthyretin protects Alzheimers mice from thebehavioral and biochemical eﬀects of Aβ toxicity , Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A ., 105, 2681- 2686（2008）.
15）Sousa, J. C., Grandela, C., Fernández-Ruiz, J., de Miguel, R.,
de Sousa, L., Magalhães, A. I., Saraiva, M. J., Sousa, N. andPalha, J. A. : Transthyretin is involved in depression-likebehaviour and exploratory activity , J. Neurochem ., 88,1052- 1058（2004）.
16）Sullivan, G. M., Mann, J. J., Oquendo, M. A., Lo, E. S.,
Cooper, T. B. and Gorman, J. M. : Low cerebrospinal

ﬂuid transthyretin levels in depression : correlations withsuicidal ideation and low serotonin function , Biol.
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17）Yang, Y., Wan, C., Li, H., Zhu, H., La, Y., Xi, Z., Chen, Y.,
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18）Huang, J. T., Leweke, F. M., Oxley, D., Wang, L., Harris, N.,
Koethe, D., Gerth, C. W., Nolden, B. M., Gross, S.,
Schreiber, D., Reed, B. and Bahn, S. : Disease biomarkers
in cerebrospinal fluid of patients with first-onset
psychosis , : PLoS Med ., 3, e 428（2006）.
19）Gloeckner, S. F., Meyne, F., Wagner, F., Heinemann, U.,
Krasnianski, A., Meissner, B. and Zerr, I. : Quantitative
analysis of transthyretin, tau and amyloid-β in patientswith dementia , J. Alzheimers. Dis ., 14, 17- 25（2008）.

家族性アミロイドーシスの研究に
トランスサイレチン，ヒト，組換え体
トランスサイレチン変異体（V30 M），ヒト，組換え体
トランスサイレチン変異体（L55 P），ヒト，組換え体
トランスサイレチン（TTR）は、生体内では主に血漿、髄液中に存在している 127 個のアミノ酸からなるタンパク質で、通常これを単量体とする四量体を形成しています。甲状腺ホルモンであるチロキシンや、ビタミン A 輸送タ
ンパク質であるレチノール結合タンパク質の輸送に重要な役割を果たしています。TTR 遺伝子の変異は、家族性ア
ミロイドーシス（FAP）の原因と言われています。L55 P の FAP は重症であることも報告されています。
外観 : 凍結乾燥品
バッファー : 20 mmol/ℓ 重炭酸アンモニウム
本品は、６×ヒスチジンタグが付加されております。
コード No.
209-17301
206-17311
203-17321

品
名Transthyretin, Human, recombinant
Transthyretin Variant（V30M）, Human, recombinant
Transthyretin Variant（L55P）, Humna, recombinant

容 量
1mg
1mg
1mg

希望納入価格（円）
近日発売
近日発売
近日発売

Wako ワークショップ

第 24 回

オートファジー 細胞･個体機能の新たな制御機構 ̶ 基礎から臨床へ ̶

開 催 日：平成 20 年 11 月６日（木） 10：00 〜 17：10
開催場所：全電通ホール

東京都千代田区神田駿河台 3 - 6

TEL 03 - 3219 - 2211
総合企画：順天堂大学大学院 医学研究科神経機能構造学
教授

内山

安男 先生

オーガナイザー：順天堂大

木南

英紀 先生

岡崎基礎生物研

大隅

良典 先生

東医歯大院・医水島

昇 先生

順天堂大院・医内山

安男 先生

参 加 費：無料定規格
細胞生物学用
細胞生物学用
細胞生物学用

員：300 名（申込先着順）

参加申込方法：当社ホームページ（URL：http://www.wako-chem.co.jp/）
よりお申し込み下さい。
お問合せ先：和光純薬工業株式会社
学術部

試薬営業本部

ワークショップ係

TEL：03 - 3270 - 8243

和光純薬時報講演プログラム
10：00 〜
10：05 〜
10：10 〜

開催挨拶
和光純薬
はじめに
順天堂大院・医内山 安男
酵母に始まったオートファジーの分子メカニズムの研究
岡崎基礎生物研大隅 良典
10：50 〜 オートファジーによるタンパク質代謝の生理的役割
東医歯大院・医水島
昇
11：30 〜 選択的オートファジーとその生理的意義
臨床医学総研小松 雅明
12：10 〜 （休憩）
13：10 〜 心臓におけるオートファジーの役割と病態への関与
阪大院・医
大津 欣也
斉藤 達哉
13：50 〜 自然免疫応答とオートファジー 阪大・免
14：30 〜 神経細胞におけるオートファジーの生理と病理
慶大・医
柚崎 通介
15：10 〜 （休憩）
15：30 〜 オートファジーと細胞死
順天堂大院・医内山 安男
16：10 〜 オートファジー を考える 順天堂大・医木南 英紀
16：50 〜 おわりに順天堂大院・医内山 安男
17：00 〜 閉会挨拶
和光純薬

Vol.76, No.4（2008）11

−⑬
天然物化学者と民族薬物学調査 大黄と芍薬同属植物の成分研究
徳島大学

高石

喜久

るに過ぎない。依然として地球上には各し、胃潰瘍モデル動物実験を指標とし著者は未開拓薬用植物を素材とした新民族が伝承してきた貴重な薬物が数多くて活性成分を追求した結果、活性成分

規創薬シード化合物探索研究の一環とし埋もれている。しかし残念なことに、前としてトリテルペン配糖体を単離した。

て、1991年から京都大学の本多教授らと世紀末から世界的なグローバル化が進行

２）ジンチョウゲ科Daphne oleoides はト

はじめに

トルコ（４回）、ウズベキスタン（２回）、し、各民族固有の伝統社会が崩壊しつつルコでリウマチ痛、腰痛、解熱に民間

東京工業大学の藤本教授らと南米コロンある。これに伴い各民族が長い時間をか薬として使用されている。リウマチ症

ビア（３回）、現在は徳島大学薬学部のけ伝承してきた民族薬物に関する知恵がに関与しているサイトカインの１種イ

生薬学教室メンバーらと中国雲南省（６失われようとしている。この様な状況に、ンターロイキン−１の産生遊離抑制作回）を訪問し、伝統薬物情報の収集と成貴重な人類の遺産である民族薬物の調用を指標として成分検索を進めた結果、分研究を行っている。年１回は２〜８週

査、情報収集・解析を行い、文献に残し

活性成分としてジテルペン誘導体２種間の予定で、世界のどこかでフィールドておこうとする研究が盛んに進められてとクマリン誘導体１種を単離した。

ワークを実施していることになる。著者いる。論文としてこの情報を残しておけ

３）セリ科Ferula kuhistanica はウズベの専門は生薬学に属するが研究面では天ば、何時か、誰かが、それを研究するこ

キスタンで傷の治療に用いられてい然物化学を中心に展開している。本稿でとが可能となる。この様な論文誌としてる。本植物から、抗菌作用を示す新規

はこの民族薬物学調査とその過程で得らJournal of Ethnopharmacology 他が発刊

セスキテルペン１種、新規p -hydroxy

れた薬用植物の成分について紹介する。

されている。また、J. Chem. Inf. Comu-benzoic acid誘導体を多数単離した。

put. Sci （43巻，218頁，2003年）誌の論

これら化合物は抗菌活性を示すことか

文によると、現在流通している医薬品、ら、現地での使用方法も納得出来る。

合成化合物、天然物の３種を構造上の特４）セリ科Prangos tschimganica はウズ

徴を数値化して、二次元グラフにプロッ

ベキスタンで白斑病の治療に用いられトすると、医薬品及び天然物は同じパている。本植物の樹液が皮膚に着くと、ターンを示すが、合成品は異なっている

皮膚は黒ずみ１週間ほどその色は消えことが報告されている。これは天然物がない。本植物から新規クマリン誘導体、

医薬品となる可能性が高いことを示して

新規モノテルペン誘導体を多数単離しおり、現在使用されている医薬品に天然た。本植物の成分中にxanthotoxinが物をリード化合物としたものが多い事実含まれていた。この化合物は白斑病のを考え合わせると、これからの医薬品開治療薬メトキサレンとして市販されて発において、民族薬物学からもたらされおり、現地で本植物が使用されている

民族薬物学調査の一場面：お年寄りに薬草の聞き取り調査

民族薬物学調査
最近、民族植物学（Ethnobotany）、民る情報は更に重要なものとなるだろう。

エビデンスを提供するものである。
５）キク科Inula macrophylla はウズベキ

族薬物学（Ethnopharmacology）と言う

民族薬物学調査で収集した薬用植物の成分と活性スタンで広く使用される薬草で、胃潰物と伝統的民族社会の相互関係」と解釈

我々は民族薬物学調査で数多くの材料

本植物から天然物として珍しい骨格をされる。民族薬物学もこれに準じ、「伝を入手し、それらの成分と活性について有する新規化合物（新規骨格セスキテ

統的民族社会が保持している伝承薬物情の研究を積極的に進めてきた。その一部

ルペン、C 10 とC 15 の２量体、C 15 の２報の収集・解析」と解釈される。世界のを紹介する。

量体）を数多く単離し報告（Org. Let,

諸民族はそれぞれ文化、歴史、環境が異

１）マメ科Spartium junceum はトルコのT. L 等）した。蛇足であるが、本植物なるため、病気治療・健康維持に用いる

調査で花を胃潰瘍の治療に使用していは材料費が安い（現地で50円で購入）

薬物も独自のものを使用しており、それることが判明した。本植物の花を抽出にもかかわらず、論文を５報作成でき

言葉が文献上に使われている。民族植物学の定義は種々あるが、基本的には「植瘍、リウマチ症などに使用されている。

を民族薬物と言う。民族薬物の中でも有用なものは文明の交流と共に広く世界の市場に出現し、今日流通している生薬、香辛料、ハーブ等として、また一部は医薬品として開発されている。しかし、地球上の資源（植物、動物等）からすると
極僅かな伝統薬物が表舞台に出現してい

12

薬学部

民族薬物学調査で収集した薬用植物から単離した成分の例

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

−⑬た。フィールドワークで材料を採集又生薬の需要拡大と供給量の減少を考える

は購入する時には咄嗟の判断（採集時と、新しい生薬資源の開発が必須となる。

間が短い、値段が高い、植物名は何か、

本研究は民族薬物学調査で得られた薬成分研究はされているのか、材料とし用植物の成分を検索し、現在使用されてて面白いか等）が必要で、その時は天いる生薬との同等性、類似性、及び新た

然物屋の勘が働く気がする。この植物

な生薬としての可能性を探索研究するもはまさに勘が当たったもので、著者にのである。

取っては自慢の材料である。

１）Rheum maximowiczii の成分と活性
本植物は中央アジアに広く分布する

夜は植物と添い寝：私の寝る場所はどこだ !!

タデ科植物である。タデ科植物には40
属、800種の植物が存在し、このうちていないこと、生薬芍薬の代替生薬とRheum 属 に 属 す るRheum palmatum ,して使用出来無いかとの可能性を探る

R. tangutium , R. oﬃcinale 等 は 古 来 かため成分検索を開始した。芍薬の含有

ら大黄の基源植物として神農本草経

成分としてpaeoniﬂorinが２％以上含に収載されている重要生薬の１つでまれることが日本薬局方に記載されてあ る。R. maximowiczii は、 ウ ズ ベ キ

いることから、この含量をまず測定しスタンで瀉下作用を目的に整腸薬とした。局方の定量法を参考にし、標品のて民間で使用されており、大黄と同paeoniﬂorin（和光純薬）を用い定量し新しい生薬資源としての可能性を目指して 大黄、芍薬同属植物の成分研究属植物である。本植物の成分研究は行た結果、本植物根の含量は2. 1％であ

われていないことより、大黄の代替生

り、局方の基準は超えていた。更に本薬として使用出来無いかとの可能性を植物から、paeoniﬂorin関連化合物５

21世紀に入り医療の分野では代替医療探るために成分検索を開始した。根の種を含む新規化合物６種、既知化合物と西洋医療が融合した統合医療が提唱さ成分を検索した結果、大黄に多く含ま14種を単離した。本植物が生薬芍薬のれている。これは①患者中心の医療が求代用品になるかどうかの結論はこの研められていること、②欧米諸国を中心とれているアントラキノン類の含量は少なく、C 6 - C 4 配糖体が植物乾燥重量中して薬草、ハーブ、漢方薬の使用を含む

1. 6％と異常に多かった。本植物は成代替医療が盛んとなっていること、③代分含量からして残念ながら生薬大黄の替医療のエビデンス確立に米国政府が多代替品としては使用できないとの結論

夜なべ仕事：採取した植物を乾燥しやすくするためカット

２）Paeonia hybrida の成分研究と、④欧米諸国、日本を始め諸外国の医おわりに世界中にはまだまだ未知の薬用植物が沢山存在する。我々が訪問したコロンビに達した。

大な予算を出し研究を推進しているこ

究からはまだ判断できない。

アには約５万種以上の植物が存在すると療費の高騰に対し政府が国民にセルフメ

Paeonia 属に属する芍薬（P. lactiﬂora ）言われており、これら植物の成分はまだディケーションを求めていることに起因は根を鎮痙、鎮痛、緩和、収斂を目標

殆ど明らかにされていない。天然物化学している。

に、牡丹（P. suﬀruticosa ）は根皮を駆者は材料がそこにあると、どんな化合物

これら時代の流れを考えると生薬の需

血、通経、排膿などを目標に中医学、が入っているのか、どんな作用があるの

要は21世紀に入り飛躍的に増大すると考漢方医学において多くの処方に含まれか、そしてそれは人の病気治療の役に立えられる。しかし、一方では生薬生産地

る古来からの要薬である。P. hybrida

つ医薬品にならないかと、何時も考えてにおける自然破壊、砂漠化が問題となり、はウズベキスタンで根を神経症や精神いる。地道な研究であるが何時の日か人

中国に於いては生薬輸出を制限する動き

不安に対する民間薬として用いていの役に立つものと確信している。

が見られている。今後進むと予想されるる。本植物に関する成分研究はなされ

局方生薬試験用
コードNo.
019-20851
164-21731
197-13931
194-13941

品
名Albiﬂorin
Paeoniﬂorin
Sennoside A
Sennoside B

規格
局方一般試験法用
局方生薬試験用（薄層クロマトグラフィー用）
局方生薬試験用（成分含量測定用・薄層クロマトグラフィー用）
局方生薬試験用（成分含量測定用）

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

容 量
20mg
10mg
10mg
10mg

希望納入価格（円）22,00013,00016,00018,00013

echnical ReportmicroRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 の開発
和光純薬工業株式会社

はじめに

ゲノム研究所

請川

亮、西部

隆宏

種類（mAgo1 , 2 , 3 , 4 , 5）存在し、そ行った結果、げっ歯類細胞株から高純れぞれがユビキタスに発現していま

度 に microRNA を 取 得 で き る こ と が4）

microRNA は約 22 塩基からなる一群す 。また一群の Argonaute サブファ示されました（図１）。さらに、精製の機能性低分子 RNA で、遺伝子発現のミリータンパク質の中で発現量が最もした RNA 画分をクローニングした結

転写後調節を担うガイド分子として機多 い の は Ago 2 で、 唯 一 標 的 RNA を果、rRNA や tRNA などに由来する分能しており、幹細胞の多分化能の維持

切断する slicer 活性を有していること

解産物の混入がほとんどなく、高純度

や細胞分化、がん化など種々の生命現から、microRNA パスウェイにおいてに microRNA が 含 ま れ て い る こ と が象に深く関わっていることが報告され中心的な役割を担っていると考えられ

示 さ れ ま し た（ 図 ２）。 以 上 か ら 本

1，2，3）

5）。現在までにヒトやマウています 。以上の知見から Ago 2 タ

キットを用いることで電気泳動によるス で は 1 , 000 種 類 以 上 の microRNA のン パ ク 質 に 結 合 し た microRNA を 特

サイズ分画をすることなく効率良く簡存在が報告されており、その数は増加

異的に精製することは、microRNA の便 に microRNA を ク ロ ー ニ ン グ で きの一途をたどっています。このように

機 能 解 明 や 新 規 microRNA を 同 定 することが示されました。

機能未知な新規 microRNA の同定や機る上で重要な技術と考えられます。

ています

能解析が活発に世界中で行われていることからも、microRNA 研究が重要な位置付けにあることは言うまでもありません。

組織からの microRNA 精製細胞株からの microRNA 精製

次に本キットを使用してマウス組織

今 回 開 発 し た microRNA Isolation

からの microRNA 精製を試みました。

細胞中で複数のステップを通してKit, Mouse Ago 2 は高性能な抗マウス

マ ウ ス か ら 肺、 肝 臓、 脳 を 摘 出 し、成熟化した microRNA は RISC（RNA-Ago 2 モノクローナル抗体を用いた免キット添付の Cell Lysis Solution とテ

induced silencing complex）と呼ばれ疫沈降法によって、Ago 2 タンパク質

フロンホモジナイザーを使用して各組るタンパク質複合体に取込まれ、そのに結合した microRNA を高純度に精織から組織抽出液を調製しました。そ主要コンポーネントである Argonaute

製することができます。本キットを用の組織抽出液から本キットプロトコー

サブファミリータンパク質と結合する

いてヒト細胞株（HeLa）、マウス細胞ル に 従 っ て microRNA 精 製 を 行 っ た

こ と が 知 ら れ て い ま す。 こ の株（P 388 D1）、チャイニーズハムス

ところ、使用した３種の組織すべてか

Argonaute サブファミリーはヒトで４ター細胞株（CHO）及びラット細胞ら 高 純 度 の microRNA が 精 製 で き る

種類（hAgo1 , 2 , 3 , 4）
、マウスでは５株（PC- 12） か ら microRNA 精 製 をことが示されました（図３）。

: RNA分子量マーカー: 合成1本鎖RNA（22nt）
1ng
Lane 1 : ヒト細胞株 HeLa細胞抽出液 精製画分
Lane 2 : マウス細胞株 P388D1
細胞抽出液 精製画分
Lane 3 : チャイニーズハムスター細胞株CHO-K1細胞抽出液 精製画分
Lane 4 : ラット細胞株 PC-12細胞
精製画分

クローニング比率
（%）

M
Std.

表１．クローニングされた
microRNAの内訳

クローニングされたsmall RNAの種類

rRNA
tRNA
Others: rRNA分解断片由来cDNA: tRNA分解断片由来cDNA: miRBaseには未登録だが、他の動物種のmicroRNAと相同性を持つcDNA
Unknowns : miRBaseには未登録だが、ゲノム配列と一致するcDNA

microRNA

クローン数

mmu-miR-92a

40

mmu-miR-23a

21

mmu-miR-25

5mmu-miR-315

2

mmu-miR-312

mmu-miR-23b

2

mmu-miR-222

mmu-miR-212

mmu-let-7d2

mmu-miR-652

1

mmu-miR-423

1

mmu-miR-132

1

mmu-miR-18a

1

合

82

計

図２．P388D1 細胞から精製した microRNA 画分のクローニング
図１．培養細胞株からの microRNA 精製
microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 を 用 い て、 ヒ ト 培 養 細 胞（HeLa）及びげっ歯類培養細胞株（P388D1, CHO-K1, PC-12）から精製した microRNA 画分を Urea-PAGE後、銀染色によって検出した。その結果、3 種のげっ歯類細胞株特異的に microRNA 精製が可能であることが示された。使用細胞数は５× 106cells 相当。

14

和光純薬時報microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 を用い、マウス細胞株 P388D1 細胞から microRNA 画分を精製した後、microRNA Cloning Kit Wako （コードNo.290-66501）を使用して small RNA のクローニング及びその分布を解析した。ランダムに選抜した 87 クローンの塩基配列を解読し，データベース（miRBase）と照合した結果、87 クローン中 82 クローン
（全体の 94.3%）
が microRNA であることを確認した。82 クローンの内訳は表 1 に示した。

Vol.76, No.4（2008）

以上のことから microRNA Isolation
Kit, Mouse Ago 2 は培養細胞のみならず動物組織からも高純度な microRNAを精製することが可能であり、げっ歯類の発生分化過程における microRNA
解析や siRNA 創薬における薬物動態解析などにも利用できる有用なツールになるものと考えられます。
M: RNA分子量マーカー
Std.
: 合成1本鎖RNA（22nt）
Lane 1 : 肺組織抽出液 精製画分
（組織12.5mg相当）
Lane 2 : 肝臓組織抽出液 精製画分
（組織12.5mg相当）
Lane 3 : 脳組織抽出液 精製画分
（組織12.5mg相当）〔参考文献〕
1）Kloosterman, W. P. and Plasterk, R. H. : Dev.
Cell , 11 , 441（2006）.
2）Bushati, N. and Cohen, S. M. : Annu. Rev.
Cell Dev. Biol ., 23 , 175（2007）.
3）Houbaviy, H. B., Murray, M. F. and Sharp, P.
A. : Dev. Cell , 5 , 351（2003）.
4）Sasaki, T., Shiohama, A., Minoshima, S. andShimizu, N. : Genomics , 82 , 323（2003）.
5）Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A.,
Dorsett,Y., Teng, G. and Tuschl, T. : Mol.Cell ,15 , 185（2004）.

図３．マウス組織からの Ago2 免疫沈降及び microRNA 精製
microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 を用いてマウス組織から microRNA 精製を行った。各組織から抽出した溶解液から microRNA 精製を行い、Urea-PAGE による分離及び銀染色による核酸検出を行った。その結果、肺、肝臓及び脳組織から microRNA が精製できることが示された。使用した各組織は湿重量 25mg。

P roducts
Argonaute2（Ago2）結合性microRNA精製キット
microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2
microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 は、高品質の抗マウス Ago2 モノ
クローナル抗体を利用した免疫沈降法により、microRNA-Ago2 複合体を回収し、microRNA を簡便かつ高効率に精製するキットです。

特長●マウス、ラット、ハムスター Ago 2 の免疫沈降が可能● Ago2 タンパク質に結合した microRNA を高純度に精製可能● rRNA や tRNA の分解産物や他の small RNA などの夾雑が少ない●精製した microRNA 画分をクローニングやマイクロアレイに応用可能

NEW

NEW

NEW

コード No.
292-67301
014-22023
018-22021
011-22033
015-22031
292-66701
290-66501
298-65103
292-65101

品
名
microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2

規格
遺伝子研究用Anti Mouse Ago2, Monoclonal Antibody

免疫化学用Anti Human Ago2, Monoclonal Antibody ＊免疫化学用

microRNA Isolation Kit, Human Ago2
microRNA Cloning Kit Wako
Single Strand DNA Ligase, thermostable, recombinant,Solution

遺伝子研究用遺伝子研究用遺伝子研究用

容 量
10 回用
50μℓ
100μℓ
50μℓ
100μℓ
10 回用
8 回用
200units
500units

希望納入価格（円）45,00030,00050,00030,00050,00045,00063,00043,00087,000＊ Anti Human Ago2, Monoclonal Antibody のコード No. を変更しました。
旧コード No. 016-20861（50μℓ）→新コード No. 011-22033（50μℓ）。

和光純薬時報 Vol.76, No.4（2008）15

R

esearch
単糖類の４位選択的アシル化触媒
京都大学化学研究所

川端

猛夫

はじめに
糖類に代表されるポリオール類は複数の環境の異なる水酸基を持っている。これらの内、特定の水酸基を直接官能基化することは極めて困難である。糖類の合成は盛んに研究されているが、通常保護̶脱保護操図１．

作を駆使して行われており、位置選択的官
能基化は合成技術の進んだ現在でも酵素法

環境の異なる４つの水酸基を識別しなけれ

さて、４つの水酸基を持つグルコース誘の独壇場と言える。これは丁度、十数年前ばならない。これには前者の触媒設計に比導体を最も代表的なアシル化触媒である4-のラセミ体アルコールのアシル化による速べて格段に困難である。本稿では糖類の位ジメチルアミノピリジン（DMAP）を用い

度論的分割の状況に似ている。触媒的な速置選択的アシル化の現状、及び我々の開発てアシル化するとどうなるだろうか？（図度論的分割が不斉合成研究の中で遅れをした触媒を用いる単糖類の位置選択的アシ３）モノアシル化はトータル47％収率で、とっていたのは、反応点（酸素原子）に隣ル化のscope and limitation、さらに反応機

６位１級水酸基へのアシル化がやや優先す

接する炭素のキラリティーを触媒分子が識構について述べる 5）。

るものの、選択性は皆無に等しい。原料回別して反応（アシル化）を起こす必要が収が31％ある状態で、ジアシル化が22％もにVedjesら 、折山らが 、1997年にはFu

グルコース誘導体のアシル化の位置選択性ら 3）、著者ら 4）が高選択的不斉アシル化をグルコース誘導体のアシル化では、最もに依存して反応が起こった結果である。そ起こす人工の触媒を報告した。その後この反応性の高い６位１級水酸基へのアシル化

こで我々は分子認識能を持つアシル化触媒

分野は大きく発展し、非酵素法によるラセは酵素法により100%の位置選択性で達成を開発すれば位置選択性の制御が可能になあったためである（図１）。しかし1996年
1）

2）

6）

進行する。これは触媒DMAPに分子認識能がなく、それぞれの水酸基の反応性の差

ミ体アルコールの速度論的分割は今やあたされるが 、ジアシル化を起こさずモノアると考え、触媒１を開発した（図４）。触

りまえとなった。即ち、反応点に隣接する

シル化に留める制御が困難である（図２）。

媒１はグルコース誘導体の４つの水酸基を炭素原子のキラリティーを識別する触媒設

一方、無保護の１級水酸基存在下での２級

厳密に見分けて、反応性の高い６位１級水計は現在では困難ではない。一方、グル水酸基選択的アシル化はさらに困難で、最酸基ではなく、本来反応性の低い４位の２

コース誘導体の位置選択的アシル化では、

7）

高で61％の選択性が報告されていた 。

級水酸基のみでアシル化を起こす。これと同じ分子変換を従来法で行えば５工程を要し、総収率も46%と一段階触媒法の半分以下である。
さらに興味深いことに、触媒１の存在下に第１級アルコールである1-フェニルエタ
ノールとグルコース誘導体との競争的アシ

図２．

ル化を行うと、前者は全くアシル化を受けず、後者のみが、しかも４位選択性を保持しながらアシル化を受ける（図５）。つまり、本アシルは加速性を伴って進行することがわかる 5）。

触媒１の設計と選択的アシル化の反応機構
次に、このような高度な分子認識を伴った分子変換を可能にする触媒１の設計とその機構について述べる 5）。触媒１は高活性アシル化触媒である4-ピロリジノピリジン
図３．

16（PPY）を活性中心とし、グルコース認識

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

側鎖として２つのトリプトファン部分を持つ。オクチルエステルは水素結合が有効に働くよう（本触媒の基質認識は水素結合形
成に基づいて設計している）、非極性溶媒中での溶解性向上を意図して導入した。勿論、１以外の触媒も種々合成し検討したが、紙面の都合から主に１について述べる。ト
リプトファン側鎖を持つ触媒１を用いると、常温（20 ℃）の反応でも２級水酸基である４位のアシル化が主反応となる（Table 1, entries 1〜3）。 溶 媒 効 果 が 大 き く
CHCl 3 ＞トルエン＞THFの順で４位選択性が高く、CHCl 3 中では４位選択性が91%に達し、ジアシル体の生成（４%）と原料回収（３%）も抑制される（entry 2）。こ

図４．触媒１は糖の４つの水酸基を厳密に見分けて、本来反応性の低い４位でのみアシル化を起こす。ジアシル化は起きない。同じ分子変換を従来の保護−脱保護法で行うと５工程を要し、収率も 46％と低い。

のようにアシル化の位置選択性はモノアシ
ル化／ジアシル化の比と連動している。一方、DMFを溶媒に用いた場合は６位１級水酸基へのアシル化が主反応となり、原料回収（21%）を伴う状態でもジアシル化（26%）が多く進行し、分子認識能を持たないDMAP触媒と類似の反応性を示すよ

図５．第１級アルコールとグルコース誘導体の競争的アシル化：触媒１の存在下にはグル
コース誘導体の４位２級水酸基へのアシル化が進行する。

うになる。低極性溶媒中で触媒１が良い位
置選択性を示すことから、触媒１の分子認
識能は水素結合に由来すると推定できる。
次に温度効果を検討した。０℃での反応で

図６．６位アシル体から４位への転移は全く見られない。

は位置選択性（98%）やモノアシル化の選択性（97%）が20℃での反応に比べて向上られる。そこで６位アシル体を別途合成し、ル基）から離れて位置するため、アシル化を受けないと推測される。

した（entries 2 vs . 5）。０℃の反応で触媒

同反応条件に付したが、６位アシル体が量を1 mol %に減らすと位置選択性は若干99%回収され、４位への転移は全く観察さ触媒１のインドールNH基の作用を調べ低下するが（96%, entry 6）、−20℃での反れなかった（図６）。即ち、このアシル化る目的で、そのN -Me体である触媒２を用

応では1 mol%の触媒量でもジアシル化やは触媒１の作用により直接４位で起こるこいて同反応を行った（Table 1, entry 9）。

原料回収は見られず、４位のアシル化がとがわかった。

４位アシル化が主反応であるものの（60%）、

99%の 選 択 性 で 進 行 し た（entry 7）。10

さてなぜ、この反応では通常最も反応性

その選択性は低下した（entries 5 vs . 9）。

mol %の触媒１を用いる−50℃での反応での高い６位１級水酸基がアシル化されない

このことはインドールNHが基質との水素は完全な選択性でアシル化が進行し、４位のだろうか？ 我々は「６位１級水酸基が結合に関与することを示唆している。以上

アシル体のみが得られた（entry 8）。これ

先ず、触媒と水素結合を形成することが選の結果を踏まえ、触媒１による選択的アシ

らの溶媒効果は選択性発現に水素結合が関択性発現の鍵を握る」と仮定して本触媒をル化の可能な機構を図８のように考えた。

与すること、また温度効果は選択性発現に設計した。そこでこの仮説を検証するため、（1）触媒１とイソ酪酸無水物からアシルピ

エントロピー項の寄与が大きいことを示唆

６位１級水酸基をメチル基で保護した基質

リジニウム中間体が生成する。（2）この中している。以上より、本触媒を用いるアシを別途合成し同反応条件に付したところ、間体で比較的強い水素結合アクセプターでル化の遷移状態では多重水素結合の関与が非選択的なアシル化が見られた（図７）。

あるアミドカルボニルが、基質の水酸基の推定される（図８）。

つまり６位１級水酸基は触媒１存在下での中で最も反応性の高い６位１級水酸基と水

一方で、この４位選択的アシル化は、ま選択性発現に必須であることがわかった。

素結合を形成する。（3）その結果、触媒側ず反応性の高い６位１級水酸基のアシル化

また６位水酸基は触媒との水素結合により鎖のインドールNHが基質の３位水酸基にが起きた後、４位に転移した結果とも考え

反応点（アシルピリジニウムイオンのアシ

近接し新たな水素結合を形成する、（4）こ和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）17れらの多重水素結合により基質の配座が固Table 1．グルコース誘導体の位置選択的アシル化

定され、４位水酸基がアシルピリジニウム
イオンのアシル基に近接する結果、選択的アシル化を受ける。この機構は仮説の域を超えないが、水素結合形成による遷移状態
安定化は反応加速性（図５）とも符合する。
図８は基質分子が触媒１の上部から接近した場合を図示したもので、この時、基質分子は２ 位の側鎖により認識される。一方、基質分子が触媒の下部から接近する場合は、５ 位の側鎖が基質認識を担当する。触媒１がC 2 対称性を持つため、両方向からの基質の接近は同じ遷移状態に至るため、高選択的なアシル化が進行する。一方、触媒１と同じ側鎖を２ 位でのみ持つ触媒３では、基質が２ 位の方向から接近すると高選
択的なアシル化を起こすが、逆方向から接近すると非選択的アシル化が起こると考えられる。この結果、触媒３では４位選択性がみられるものの、その程度が低下したと理解できる（Table 1, entries 5 vs . 10 ）。

単糖類のアシル化の
位置選択性
触媒１はグルコース誘導体の４つの水酸基を見分け、基質本来の持つ反応性を逆転させた上で、ただ一つの水酸基とのみ反応を起こす。この特性の一般性を調べた（図図７．６位水酸基を保護すると触媒１を用いても非選択的アシル化が進行する。

９）。Octyl β-D-glucopyranoside の 無 水 イ
ソ酪酸を用いるアシル化は98％収率で完璧な４位選択性で進行する（Table 1, entry
8、及び図９）。より一般的なアセチル化は96％収率、96％の４位選択性で進行した。
糖鎖合成のグリコシルドナーとして利用可
能な octyl β-D-thioglucopyranoside でもイ
ソブチリル化、アセチル化共に高い４位選択性（95〜97%）かつ高収率（92〜99%）
で進行した。一方、α-グリコシドである
octyl α-D-glucopyranosideでは４位のアシル体が主生成物ではあるものの、位置選択性（54％）、収率（75％）ともに低下した。
２位水酸基がアキシアル配置をとるoctyl
β-D-mannopyranosideでは高い４位選択性（85％）でアシル化が進行する。一方、４

図８．触媒１による選択的アシル化の可能な機構：触媒分子と基質の糖（青）との間の２つの水素結合（赤）が有効に働いている。

18

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

位水酸基がアキシアル配置をとるoctyl
β-D-galactopyranosideでは様相が一変し、４位アシル化は全く見られず、６位アシル化が主に進行した（91％選択的）。

おわりにグルコース誘導体の４位選択的アシル化を可能にする触媒開発について述べた。糖類に代表されるポリオール類への位置選択的な置換基導入は現在でも極めて困難である。本触媒は一般性には欠けるものの、グルコース誘導体の４位選択的アシル化を完
全な選択性で起こすことのできる唯一の触媒である。本稿では４位の選択的保護についてのみ述べたが、本触媒はグルコース４位への種々の官能基化が可能で、本触媒を用いる配糖体の短段階合成への応用を現在
図９．種 々 の 単 糖 類 の 位 置 選 択 的 ア シ ル 化（ 反 応 条 件 : 触 媒 １(10 mol%)、CHCl3 中、
2,4,6-collidine（1.5 eq））: 主にアシル化を受ける水酸基を赤で示した。

検討している。
〔参考文献〕
1）Vedjes, E., Daugulis, O. and Diver, S. T. : J.
Org. Chem ., 61 , 430（1996）.
2）Oriyama, T., Hori, Y., Imai, K. and Sasaki, R. :Tetrahedron Lett ., 37 , 8543（1996）.
3）Ruble, J. C., Latham, H. A. and Fu, G. C. : J.
Am. Chem. Soc ., 119 , 1492（1997）.
4）Kawabata, T., Nagato, M., Takasu, K. andFuji, K. : J. Am. Chem. Soc ., 119 , 3169（1997）.
5）Kawabata, T., Muramatsu, W., Nishio, T., Shi-bata, T. and Schedel, H. : J. Am. Chem. Soc .,129 , 12890（2007）.
6）（a）Therisod, M. and Klibanov, A. M. : J. Am.
Chem. Soc ., 109 , 3977（1987）.（b）Björkling,F., Godtfredsen, S. E. and Kirk, O. : J. Chem.
Soc. Chem. Commun ., 934（1989）.
7）（a）Kurahashi, T., Mizutani, T. and Yoshida,J. : J. Chem. Soc. Perkin Trans ., 1, 465（1999）.
（b）Kurahashi, T., Mizutani, T. and Yoshida,J. : Tetrahedron , 58 , 8669（2002）.（c）Griswold, K. S. and Miller, S. J. : Tetrahedron , 59 ,8869（2003）.（d）Kattnig, E. and Albert, M. :Organic Lett ., 6 , 945（2004）.

P roducts
選択的アシル化触媒
本品は、選択的にグルコース誘導体の４位をアシル化できる触媒です。
コード No.

品

名

Kawabata Acylation Catalyst【2 , 5 -[4（N -Pyrrolidinyl）
pyridine]
119-00781
bis[（2-acetylamido）-3-（1H -indol-3-yl）]propionic Acid Octyl Ester】

規

格

有機合成用

容

量

50mg

希望納入価格（円）18,000

お知らせ
アクロモペプチダーゼについて
当製品について、菌発見当時の生理的・形態学的性質の知見から、由来は Achromobacter lyticus と表示させていただいておりましたが、近年の細菌分類学に基づいた再同定の結果、由来は Lysobacter enzymogenes であると結論いたしました。当製品の生産菌に関する記載ミスによりご迷惑をおかけしましたことをお詫びいたします。
なお、粗精製品には、生産菌由来の DNA が含まれておりますので、ご使用にあたりましてはご留意下さい。
コード No.
015-09951
014-09661

品
名Achromopeptidase®, Purified, Lytic Enzyme（TBL-1）
Achromopeptidase®, Crude, Lytic Enzyme（TBL-1）

和光純薬時報 Vol.76, No.4（2008）

規 格
生化学用
生化学用

容 量
100,000units
1g

19

ew Products
アルコール酸化触媒
2- アザアダマンタン-N - オキシル【AZADO】
アルコール類の酸化反応は、医薬、農薬、電子材料など
幅 広 い 分 野 の 有 機 化 合 物 の 合 成 に 利 用 さ れ て い ま す。

■ プロテインホスファターゼ2A二量体，ヒト，組換え体，溶液
本品は、PP 2A の二量体であり、触媒活性をもつ C サブ
ユニットと、調節機能をもつ A サブユニットから構成されています。

2 -Azaadamantane-N -oxyl（AZADO） は 堅 牢 な ア ダ マ ン
タン骨格を持つニトロキシルラジカル型の超高活性なアルコール酸化触媒です。

特

構

成

● Protein Phosphatase 2 A dimer, Human, recombinant,Solution長

50 units ×１本● Enzyme Dilution Buﬀer●超高活性1 . 0 mℓ×１本

触媒量：0 . 01 mol％（TEMPO の 20 倍以上）
由来：Human PP 2 A dimer expressed in baculovirus-●立体障害の大きい２級 OH 基の酸化が可能
従来、酸化反応には、クロム酸、超原子価よう素試薬（IBX 酸化、Dess-Martin 酸化）、ルテニウムなどが用いられていますが、これらは安全性・操作性の面で問題を抱え

infected High Five cell
活性：1.15 units/μℓ（初回ロット実績値）
活性の定義：1 unit は、p - ニトロフェニルりん酸（p NPP）
を基質として pH 8 . 4、30℃において１分間ています。また、ニトロキシルラジカル型の酸化触媒としに１nmol のp - ニトロフェノールを生成するて TEMPO[ 2 , 2 , 6 , 6 -tetramethyl 1 -pineridinyloxy] が知られていますが、かさ高い２級アルコール類の酸化を苦手とする他、派生したオキソアンモニウムイオンが塩基性条件

酵素量とする。
形状：20 mmol/ℓ MOPS（pH 7 . 5）, 150 mmol/ℓ NaCl,
1 mmol/ℓ EGTA, 1 mmol/ℓ DTT, 60 mmol/ℓ

下では分解することが知られています。

2 -Mercaptoethanol, 1 mmol/ℓ MgCl 2 , 0 . 1 mmol/ℓ

AZADO は、TEMPO と比較して、極めて高い触媒活性を発揮する他、立体障害の大きいアルコールに対しても有効に作用します。加えて、アダマンタン骨格の堅牢性から

MnCl 2 , 50％ Glycerol
Enzyme Dilution Buﬀer：20 mmol/ℓ MOPS（pH 7.5）,150mmol/ℓNaCl, 1mmol/ℓ EGTA, 1mmol/ℓ

強度が向上し、耐久性も期待できます。

DTT, 60mmol/ℓ 2-Mercaptoethanol,
1mmol/ℓ MgCl2, 0.1mmol/ℓ MnCl2,

N

N
O

O-

-

C9H14NO = 152.21

品■ カンタリジン

C9H18NO = 156.25

2-Azaadamantane- N -oxyl（AZADO）

コード No.

0.1mg/mℓ BSA, 10％ Glycerol

2,2,6,6-tetramethyl 1-pineridinyloxy（TEMPO）

名

014-22001 2 -Azaadamantane-N -oxyl

規

格

有機合成用

容

量

100mg

希望納入価格（円）8,000

コード No.

138-15263

由来：Mylabris phalerata
含量（HPLC）：100. 0％（初回ロッ関連商品
132-15261

PP 2A の阻害剤（IC 50 = 40 nmol/ℓ）です。高濃度では，
PP 1も阻害（IC 50 = 473 nmol/ℓ）します。

品

名

1 -Methyl- 2 azaadamantane-N -oxyl

規

格

有機合成用

容

量

CH3

ト実績値）

希望納入価格（円）

100mg

8,500

乾燥減量：1 . 0 % 以下

500mg

29,000アセトン溶状：試験適合（50 mg ＋O

O

アセトン 5 mℓ）

CH3

シグナル伝達研究に！

O

O

C10H12O4 =196.20

PP2 A 関連 新製品
プロテインホスファターゼ2A（PP 2A）は、セリン/スレオ
ニンホスファターゼの一つであり、ホスホリラーゼキナーゼα20

コード No.

品

名サブユニットの脱りん酸化に関与する酵素です。細胞周期、増Phosphatase 2A dimer,
167-23281 Protein
Human, recombinant, Solution

殖、分化などの細胞内プロセシングに関わる生体内シグナル伝036-20461

達に重要な役割を果たしており、カンタリジン、カリクリンA、

032-20463 Cantharidin

オカダ酸、トートマイシンなどによって阻害されます。

030-20464

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

規格

容量

希望納入価格（円）細胞生物学用 50units

40,000

25mg

4,000

細胞生物学用 100mg

12,000500mg

48,000ew Products
関連商品
コード No.

キット内容
品

名

規格

容量

希望納入価格（円）10μg

11,000032-14451

100μg

30,000150-01653

25μg

10,500100μg

30,000100μg

20,000500μg

75,000038-14453
Calyculin A

Okadaic Acid

生化学用

156-02211

159-02441 Okadaic Acid Sodium Salt

生化学用

100μg

20,000209-12041 Tautomycin

生化学用

100μg

31,000●酸性ホスファターゼ基質液 A

30 mℓ×１本●酸性ホスファターゼ基質液 B

0 . 3 mℓ×１本●核染色試薬10 mℓ×１本

デ ー タ

生化学用

152-02213

3 mℓ×１本●アルカリホスファターゼ プレミックス基質液 30 mℓ×１本

生化学用

154-01651

Okadaic Acid Ammonium Salt

●酒石酸溶液（× 10）

骨組織切片の ALP 及び TRAP 酵素活性の染色

骨代謝の研究に！
TRAP/ALP 染色キット
正常な骨代謝は骨芽細胞による骨形成と、破骨細胞による骨吸収のバランスの上に成り立っていますが、このバランスが崩れ、破骨細胞の骨吸収が異常に亢進すると骨量が標本：マウス 脊髄骨非脱灰 GMA 樹脂包埋２ミクロン切片

低下し、骨粗鬆症につながります。そのため、破骨細胞と（染色写真ご提供先：河原

骨芽細胞の代謝を制御する薬剤の開発が、これらの疾患のコード No.

治療に有効と考えられ、さまざまな研究が行われておりま

294-67001 TRAP/ALP Stain Kit

す。

※本品は培養細胞では24ウェルマルチプレート５回用、96ウェルマルチプレート
６回用、骨組織スライド（１スライドあたり500μℓ使用として）で60枚用に相当

現在、骨芽細胞のマーカー酵素としてはアルカリホス

品

元先生）
名

規格

容量

希望納入価格（円）

病理研究用

60 回用※

25,000ファターゼ（ALP）が、破骨細胞のマーカー酵素としては酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）が知られてお細胞培養のコンタミネーション防止や細胞の選抜にり、組織切片あるいは培養細胞における、骨芽細胞、破骨抗生物質溶液 新製品

細胞の存在を示す一つの指標として用いられております。

各種抗生物質の溶液タイプです。細胞培養時のコンタミ

本キットは、骨組織切片及び培養骨細胞の ALP・TRAP

ネーションの防止や細胞の選抜などにご利用下さい。ろ過

酵素活性の染色に使用されます。骨芽細胞や破骨細胞の染滅菌処理されていますので、そのまま液体培地に添加して色像を観察することにより、細胞の分化状態や、骨組織に使用できます。

おける分布を調べる事が可能です。

品

特

コード
No.

長

●２液を混合するだけで、酸性ホスファターゼの酵素活性
染色用発色基質液が調製できる（酒石酸耐性評価を行う

NEW

072-05481

場合は３液を混合）●アルカリホスファターゼの酵素活性染色はプレミックス

NEW

基質液を使用し、簡単に行うことができる

重染色できる

グラム
陽性菌

きる

和光純薬時報

酵母

カビ

●

●

●

50mg/mℓ Kanamycin Solution
●

規格

容量

希望納入
価格（円）

細胞培養用

10mℓ

8,000

細胞培養用

20mℓ

5,000

細胞培養用

100mℓ

4,000

マイコ
プラズマ

50mg/mℓ Gentamicin Solution

NEW

●

●

161-23201 （Penicillin G 10,000units/mℓ, Streptomycin
10mg/mℓ, L-Glutamine 29.2mg/mℓ）●●培養細胞、骨組織切片（GMA 樹脂包埋切片）に使用で

グラム
陰性菌

Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine
Solution（×100）●酸性ホスファターゼの活性部位を赤紫色に、アルカリホ
スファターゼの活性部位を青色〜茶色がかった青色に２112-00771

名

活性の対象

●

この他抗生物質の溶液タイプは当社ホームページ（http://www.wakochem.co.jp/siyaku/info/bai/article/sosei.htm）
をご参照下さい。

Vol.76, No.4（2008）21

pplication Data
バンドのきれいなプレキャストゲル

スーパーセップ TM エース
本品は、ポリアクリルアミドのプレキャストゲルです。劇物で取扱いに注意を要する
アクリルアミドの粉末を使用することなく開封後すぐに SDS-PAGE などの実験にご利用
いただけます。ゲル中には SDS が含まれていませんので SDS 不含の泳動バッファーを使用することにより Native-PAGE も可能です。

特

長

製品仕様

●タンパク質バンドの分離が良い

プレートサイズ

100 × 100 × 3（mm）●ウェル数が 13 と 17 でマルチチャンネルピペット対応

ゲルサイズ

90 × 85 × 1（mm）●中性のゲルバッファーにより保存安定性が良い

ウェル数

13

●リーズナブルな価格

ウェル容積（μℓ）
総タンパク質量※（μg）

泳 動 例
15% ゲル
1 2 3

30

25

3.3 〜 6.5

1.3 〜 3.9

※きれいに分離できるタンパク質の目安です。

■ CBB 染色
（k）

17

4

5 6 7

8 9 10

180
116
97
79

42
30
20
14
6.5

〔泳動サンプル〕
Lane1 : Molecular Weight Marker, Wide Range（コード No. 296-63301）
Lane2 : −Lane3 : 大腸菌破砕上清（0.7μg/ lane）
Lane4 : 大腸菌破砕上清（0.35μg/lane）
Lane5 : 分裂酵母破砕上清（0.7μg/ lane）
Lane6 : 分裂酵母破砕上清（0.35μg/lane）
Lane7 : 出芽酵母破砕上清（0.7μg/ lane）
Lane8 : 出芽酵母破砕上清（0.35μg/lane）
Lane9 : 出芽酵母破砕上清（0.7μg/ lane）
Lane10 : 出芽酵母破砕上清（0.35μg/lane）

13 ウェル

17 ウェル

一口メモ
スーパーセップ TM エースを銀染色する時の最適条件
スーパーセップ TM エースを銀染色すると、従来品と比較して少し染まりが悪いとのご指摘がありました。そのよ
うな場合には、プロトコールの増感処理を５分から 10 分に延長していただくと効果的です。現像時間も少し長めの
10 分くらいが最適です（銀染色Ⅱキットワコー（コード No. 291 - 50301）の場合）
。
1

2

3

4

5

6

〔泳動条件〕
ゲル：SuperSepTMAce 5-12%, 13well（コード No.197-15011）
電流：20mA/ 枚 定電流〔泳動サンプル〕
Lane1：大腸菌破砕上清（0.7μg/lane）
Lane2：大腸菌破砕上清（0.35μg/lane）
Lane3：大腸菌破砕上清（0.125μg/lane）
Lane4：大腸菌破砕上清（0.06μg/lane）
Lane5：大腸菌破砕上清（0.03μg/lane）
Lane6：大腸菌破砕上清（0.015μg/lane）

22

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）【プロトコール】
１．固定液 -1↓２．固定液 -2
↓
３．増感液
↓
４．洗浄
↓
５．染色液
↓
６．洗浄
↓
７．現像
↓
反応停止＆洗浄10min.
10min.
5min. → 10min.
5min.
15min.
5min.
5min. 〜 10min.

■ ウエスタンブロット〔泳動条件〕
ゲ

ボルボックス胚の各発生ステージにおけるInvEタンパク質の発現をInvE 抗体によりウエスタンブロット解析した。その結果、スーパー
セップエースはバンドの形がより真っすぐになり、分子量約 48 kと約46 kの各バンド間の分離が優れていた。

（コード No. 195-14951）① SuperSepTM 10%
1.5

3

4.5

6

7.5

9

10.5 12（時間）りん酸化 InvE（約 48k）
りん酸化 InvE（約 46k）

② SuperSepTM Ace 10%
りん酸化 InvE（約 48k）
りん酸化 InvE（約 46k）

参考分離パターン： ① SuperSepTM10％、12well（コード No. 196-12921）② SuperSepTMAce10％、13well

サンプルバッファー ：0.1 mol/ℓ Tris-HCl（pH 6.8）
, 0.2 mol/ℓ DTT, 4%
SDS, 20% Glycerol, 0.2% BPB をサンプルと等量
混合泳動バッファー ：25 mmol/ℓ Tris, 0.192 mol/ℓ Glycine, 0.1% SDS
サンプル：ボルボックス胚（トータルライセート）4 μℓロード（左から分裂開始後 0、1.5、3、4.5、6、7.5、9、10.5、12 時間）
電流：サンプルがゲル内に入り切るまでゲル１枚当たり10mA（定電流）で泳動。その後ゲル 1 枚当たり25mA（定電流）で泳動
検出：SuperSignal（Pierce 社）（データご提供先：（独）理化学研究所 フロンティア研究システム 門田 純 先生）
0ル〔WIDE-VIEWTM Prestained Protein Size MarkerⅡ（コード No.239-02291）を用いた場合の分離パターン〕
6%
（k）

7.5%
（k）

10%
（k）

12.5%

（k）
240
140
100

240
240

240

140

（k）

50

100

240

20

50

50
35

15

25
35

7

NEW

50

コード No.
品
名195-15171
SuperSepTM Ace 6%198-14941
SuperSepTM Ace 7.5%
191-14931
195-14951
SuperSepTM Ace 10%
192-14961
199-14971
SuperSepTM Ace 12.5%
196-14981
193-14991
SuperSepTM Ace 15%
190-15001
SuperSepTM Ace 5-12%
199-15191
197-15011
SuperSepTM Ace 5-20%
194-15021
191-15031
SuperSepTM Ace 10-20%
198-15041
下記の濃度につきましては、従来品スーパーセップをご利用下さい
191-14791
SuperSepTM 5%
199-14611
SuperSepTM 3-10%
196-14621
195-14691
SuperSepTM 15-20%
198-14701

3.5

70
50
35

25
20

25
20

15

15

7

35

7

3.5

25

3.5

20
25

NEW

100

100

70

100

50

100
70

25
35

70

240

140

70
100

70

240

140

35
50

140

10 - 20%
（k）

100
70

140

5 - 20%
（k）

140

70
140

240

5 - 12%

15%

（k）

ウェル数
13
13
17
13
17
13
17
13
17
13
13
17
13
17

容
量
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚

希望納入価格（円）18,00014,00014,00014,00014,00014,00014,00014,00014,00018,00014,00014,00014,00014,000

12
12
17
12
17

10 枚
10 枚
10 枚
10 枚
10 枚

19,50018,00018,00019,50019,500

関連商品
サンプル
バッファー
泳動バッファー
タンパク質 MWマーカー
泳動槽
銀染色キット

コード No.
196-11022
191-13272
193-11032
198-13282
184-01291
200-17071
239-02291
230-02221
233-02211
058-07681
299-13841
291-50301

品
名
Sample Buﬀer Solution（2ME+）（× 2）
Sample Buﬀer Solution（2ME+）（× 4）
Sample Buﬀer Solution（2ME−）（× 2）
Sample Buﬀer Solution（2ME−）（× 4）
Running Buﬀer Solution（× 10）
Tricine Running Buﬀer Solution（2ME+）（× 10）
WIDE-VIEWTM Prestained Protein Size Marker Ⅱ
WIDE-VIEWTM Prestained Protein Size Marker
WIDE-VIEWTM Western Size Marker
EasySeparatorTM
Silver Stain Kit Wako
Silver Stain Ⅱ Kit Wako

和光純薬時報

規
格
電気泳動用
電気泳動用
電気泳動用
電気泳動用
電気泳動用
電気泳動用
電気泳動用
電気泳動用
電気泳動用
電気泳動用
電気泳動用
電気泳動用

Vol.76, No.4（2008）

容量
希望納入価格（円）
25mℓ
4,500
25mℓ
7,600
25mℓ
4,500
25mℓ
6,800
1ℓ
5,200
1ℓ
14,000500μℓ（約 50−100 回用）
20,000500μℓ（約 50−100 回用）
18,000250μℓ（約 50−250 回用）
20,000
1 セット
45,000
10 枚用
11,500
10 枚用
9,500

23

pplication Data
microRNA 特異的 精製キット

マイクロ RNA アイソレーションキット , ヒト Ago2
microRNA の標的 mRNA 同定に応用できる実験例の紹介
microRNA Isolation Kit, Human Ago2 は、高品質の抗ヒト Ago2 モノクローナル抗体を利用した免疫沈降法により、microRNA-Ago2 複合体を回収し、microRNA をはじめ Ago2 タンパク質結合性 RNA を取得するキットです。
近年 Ago2 免疫沈降法により得られる RNA 画分には microRNA の標的ｍ RNA も含まれていることが報告され 1，2）、注
目を集めています。当社では microRNA Isolation Kit, Human Ago2 を用いて、その可能性を検討しました。
がん遺伝子として知られている RAS 遺伝子（N-ras、K-ras など）は、mRNA の 3 UTR 領域に let- 7 family の標的となるシード配列を有しており、let- 7 family による制御を受けていることが報告されています 3）。そこで、let- 7 family の１つである let- 7 a を２本鎖 RNA の状態で肝がん細胞株 HuH- 7 に導入し、total RNA 及び Ago2 免疫沈降 RNA 中の N-ras
mRNA 量を定量 PCR 法により調査しました。
原理及びヒト細胞株・組織からの microRNA 抽出例は和光純薬時報 Vol. 76 , No 3 , 12 頁または http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/
info/gene/article/microRNAIsolationKit.htm をご参照下さい。

[Ago2 免疫沈降 RNA 中の標的ｍRNA 検出 ]
実験概要

画分

N-ras

定量

2

定量

図２．let-7a 導入による標的 mRNA 量変化
let-7a 2 本鎖 RNA またはホタルルシフェラーゼ siRNA（GL3）を導入した HuH-7 細胞から精製した Ago2 免疫沈降 RNA 及び
total RNA 中の N-ras、GAPDH mRNA 量を定量 PCR 法により測定した。let-7a を細胞に導入することで let-7a の標的である
N-ras mRNA が特異的に Ago2 免疫沈降 RNA 中に濃縮された。

1

図１．let-7a 導入細胞から精製した Ago2 免疫沈降 RNA 中の
microRNA 量
let-7a 2 本鎖 RNA またはホタルルシフェラーゼ siRNA（GL3）を導入した HuH-7 細胞から精製した Ago2 免疫沈降 RNA 中の
let-7a 量及び miR-21 量を定量 PCR 法により測定した。let-7a を導入した細胞では Ago2 免疫沈降 RNA 中の let-7a 量は約４,000倍増加した。

この実験から特定の microRNA を過剰発現させることでmicroRNA と そ の 標 的 mRNA が Ago2 免 疫 沈 降 RNA 中 に特異的に濃縮されることが示され、Ago2 免疫沈降法によりmicroRNA とその標的 mRNA が共沈することが示されました。
以 上 の こ と か ら microRNA Isolation Kit, Human Ago2 はmicroRNA のみならずその標的 mRNA を解析するツールとしても利用できる可能性が考えられます。

〔参考文献〕
１）Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E. and Meister, G. : RNA

Biol ., 4（2）,76 - 84（2007）.
２）Karginov, F. V., Conaco, C., Xuan, Z., Schmidt, B. H., Parker, J. S., Mandel,
G. and Hannon, G. J. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 104, 19291- 19296（2007）.
３）Johnson, S. M., Grosshans, H., Shingara, J., Byrom, M., Jarvis, R., Cheng,
A., Labourier, E., Reinert, K. L., Brown, D. and Slack, F. J. : Cell , 120 ,635 - 647（2005）.

24

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

コード No.

品

292-66701

microRNA Isolation Kit, Human Ago2

011-22033 ※

NEW

名

規

格

容

遺伝子研究用Anti Human Ago2, Monoclonal Antibody

免疫化学用290-66501

microRNA Cloning Kit Wako

遺伝子研究用

298-65103

Single Strand DNA Ligase, thermostable,
recombinant, Solution

遺伝子研究用

015-22031

292-65101

量

希望納入価格（円）10 回用

45,00050μℓ

30,000100μℓ

50,000８回用

63,000200units

43,000500units

87,000※ Anti Human Ago2, Monoclonal Antibody のコード No. を変更しました。
旧コード No.016-20861 →新コード No.011-22033（50μℓ）

待望のマウスAgo2抗体
免疫沈降、ウエスタンブロット、免疫染色に使用可能

抗マウス Ago2, モノクローナル抗体
Argonaute 2（Ago 2）は、RNAi 経路において、標的 mRNA へのガイド分子となる siRNA や microRNA に結合し、標的 mRNA の認識、切断を行う RISC（RNA-induced silencing complex）の主要コンポーネントとして同定されたタンパ
ク質です。

特

長

性

能

■推奨使用濃度●免疫沈降、ウエスタンブロット、免疫染色に使用可能●マウス、ラット、ハムスターの Ago2 に交差性を示す

使用用途
ウエスタンブロット
免疫沈降
免疫染色

●免疫沈降により RISC に取込まれた microRNA を精製可能
組成：0 . 05 % Sodium Azide, 10 % Glycerol, TBS 溶液 , pH 7 . 4クローン No.：2D 4

■交差性
生物種

サブクラス：IgG 1

細胞種

抗原：マウス Ago 2 N 末端領域の合成ペプチド
保存条件：２〜 10℃・遮光保存，凍結融解の繰り返しは希釈倍率
1 : 200−1 : 1 , 000
5 〜 10μg / IP
1 : 100−1 : 500

ウエスタンブロット
免疫沈降
免疫染色

お避け下さい。

microRNA 精製

Mouse
P388 D1
NIH- 3 T3○○○（NIH- 3T3）○
（P388D1）

Hamster

Rat

Human

CHO

SCC- 131

NCI-H460

○
○

○
○

×
×

NT

NT

×

○

○

×
NT : Non Tested

使 用 例■マウス細胞株 P 388 D1 からの mAgo2 の免疫沈降■げっ歯類細胞株からの Ago2 の免疫沈降

IP
IP（SDS-PAGE銀染色）（ウエスタンブロット）
（ｋ）

250

1

2

1

IP
IP
（SDS-PAGE銀染色）（ウエスタンブロット）

2

（ｋ）

1

2

3

1

2

3

250
150

150

⇦ mAgo2（100k）

100⇦ Ago2（100k）

100
75

75
50

50

37

Lane 1 : mouse IgG
Lane 2 : 本品

Lane 2 : SCC-131（ラット）IP 画分

IP 画分

25

25

図１．マウス細胞株 P388D1 の細胞溶解液に、本品 5μg を固相化した 10% Protein G slurry を 20μℓ添加し免疫沈降を行った。得られた免疫沈降画分を SDS-PAGE に供し、銀染色及び本品を一次抗体として用いたウエスタンブロットを行った。その結果、ともに 100k 付近に内在性マウス Ago2 のバンドが確認された。
使用細胞数は 5 × 106。ウエスタンブロットの一次抗体希釈倍率は 1/1,000。
コード No.
014-22023
NEW

018-22021
NEW

292-67301

品

Lane 1 : NIH-3T3（マウス）IP 画分

37

IP 画分

名

Lane 3 : CHO（ハムスター）IP 画分

図２．NIH-3T3（マウス）、SCC-131（ラット）、CHO（ハムスター）の細胞溶解液に、本品 5μg を固相化した 10% Protein G slurry を 20μℓ添加し免疫沈降を行った。得られた免疫沈降画分を SDS-PAGE に供し、銀染色及び本品を一次抗体として用いたウエスタンブロットを行った。その結果、マウスだけでなく、ラットとハムスターにおいても100k 付近に内在性 Ago2 のバンドが確認された。使用細胞数は 5 ×
106。ウエスタンブロットの一次抗体希釈倍率は 1/1,000。
規格Anti Mouse Ago2, Monoclonal Antibody

免疫化学用

microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2

遺伝子研究用和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

容量

希望納入価格（円）50μℓ

30,000100μℓ

50,000

10 回用

45,00025

ew Products■（+）-ビククリン

神経シグナル伝達研究に！
神経伝達物質 新製品

本品はビクシンのラクトンです。けいれん誘発薬として知られています。GABAA 受容体の選択的アンタゴニスト

カルシウムシグナル関連物質です。

O

細 胞 質 の カ ル シ ウ ム 濃 度 は、 細 胞 膜 上 に あ る Ca 2 +-含量（HPLC）：98 . 0％以上

O

ATPase、Ca 2 +/Na+exchanger に よ る Ca 2 + の 細 胞 外 へ の放出と、小胞体膜上にある Ca 2 +-ATPase による小胞体へ

N
CH3

溶状：メタノールに可溶O

CAS No.：485 - 49 - 4

OOOの取込みによって濃度が保たれています。

C20H17NO6 ＝ 367.35■（−）-ビククリンメトクロリド■ ライアノジン
ライアノジン受容体は小胞体上にある Ca 2 + 放出チャンネルです。ライアノジンが結合すると開口状態に固定され、小胞体から Ca 2 + が漏出すると同時に、細胞内 Ca 2 + 放出が阻害されます。

OH
CH3 CH3OH

H3C

含量（HPLC）：98 . 0％以上

CH3

本品は（+）- ビククリンのメトクロリド塩で水溶性タイプです。GABAA 受容体の選択的アンタゴニストです。
含量（HPLC）：98 . 0％以上

O

溶状：メタノールに可溶O

CAS No.：53552 - 05 - 9

由来：Ryania speciosa
O

CAS No.：15662 - 33 - 6

-

O

O
CH3

HO

コード No.
026-16131
022-16133■ タプシガルギン
小胞体膜状の Ca 2 +-ATPase を非可逆的に阻害することにより、小胞体への Ca

・ClC21H20CINO6 ＝ 417.84

C25H35NO9 ＝ 493.55

2+

O

OH

O

O

3

O

OH

NH

+ CH

CH 3

HO

溶状：メタノールに可溶Nの取込みが阻害されると同時に、

Ca 2 + の小胞体から細胞質への漏出を引き起こします。ま020-16151
026-16153

品

名

概

（+）
-Bicuculline

要GABAA 受容体
アンタゴニスト規格

容量 希望納入価格（円）

細胞生物学用

50mg

9,500

250mg

38,00010mg

22,00050mg

88,000GABAA 受容体（−）
-Bicuculline アンタゴニスト
Methochloride （+）-Bicuculline の細胞生物学用水溶性タイプた、小胞体ストレスによりアポトーシスを誘導します。

当社では神経伝達物質を各種取揃えております。詳しくは、当社ホームページ（http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/men/article/

non-TPA 型発がんプロモーターです。

GABACa.htm）をご参照下さい。

含量（HPLC）：93 . 3％O

（初回ロット実測値）

OO

溶状：アセトニトリル

O

H3C
H3C

に可溶

O
CH3
H3C

CAS No.：67526 - 95 - 8

CH3

強力な発がんプロモーター

H3C O

O
OH
OH O
CH3

O
O

CH3

ホルボール12‐ミリスタート13‐アセタート
本品は、ホルボールエステルを代表する 1 つです。ホルボールエステルは、クロトン油由来の発がんプロモーターで

C34H50O12 ＝ 650.75

あり、プロテインキナーゼ C（PKC）の活性化を介して、発コード No.
181-02281
187-02283
209-17281
205-17283

品

名

概

要

規格

Ryanodine

ライアノジン受容体
アゴニスト

Thapsigargin

小胞体膜上の Ca2+- 細胞生物学用
ATPaseを阻害

容量 希望納入価格（円）

細胞生物学用

がん物質によるがんの形成を強力に促進します。ホルボール

1mg

22,0005mg

88,0001mg

12,000り PKC を活性化します。本品は、ホルボールエステルの中5mg

48,000でも最も強力なプロモーター活性エステルは、細胞内で代謝を受けにくく、細胞内に長く留まを持ちます。また、ヒト T 細胞株

本品は Wako Chemicals USA 製品

中枢神経系及び末梢神経系に存在する GABA 受容体はA から C までの３タイプがあり、A 型はサブユニットが５個連結して形成されている塩素イオンチャンネルです。

26

CH3
CH3

H
H3C

グルタミンが興奮性伝達物質であるのに対し、GABA、

OH
O

コード No.

品

名

H

H

OH
OH

545 - 00261（1 mg）、541 - 00263（5 mg）、
549 - 00264（10 mg）の代替品です。

CH3

O

H3C

も持つと報告されています。

グリシンは抑制性伝達物質です。

O
O

Jurkat の IL- 2 産生能を高める効果

GABA 受容体作用物質

O

CH3(CH2)12

C36H56O8 ＝ 616.83

規格

容量 希望納入価格（円）162-23591

1mg

近日発売

GABAA 受容体は抗うつ薬、抗てんかん薬、鎮静剤などの168-23593 Phorbol 12-Myristate 13-Acetate 細胞生物学用

5mg

近日発売

薬のターゲットとして注目を集めています。

166-23594

10mg

近日発売

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

化学大家 410
フリッツ・ハーバー（1868 . 12 . 9 〜 1934 . 1 . 29）
科学史家

島尾

永康

この知識をものにしたことで、アンモニ

彷

ア合成反応の徹底的な研究が可能になる。

徨

ハーバーはベルリンのシャルロッテン

1906 年、ル・ブランがオストヴァルトの

ブルク工科大学のリーバーマンの許で、後継者としてライプチッヒ大学へ移った

ピペロナール誘導体を研究し、博士学位後、ハーバーが正教授、そして物理化学・はフリートリッヒ・ヴィルヘルム大学（ベ電気化学研究室のディレクターとなった。

ルリン大学）に申請して取った（1891）。

酸素水素爆鳴気反応、ガラス電極、炎反新しい学科として現れてきた物理化学に応、燃焼プロセス、化学反応における電惹かれたので、ライプチッヒ大学のオス子の放出、ガス干渉計など多面的な研究

トヴァルトにつこうとしたが、リーバーをおこなったが、それを可能にした有能

マンに止められた。当時のドイツの化学

なスタッフが集まっていたことも確かで

企業は博士号取得者を採らなかったので、ある。そしてこの時期の最大の業績は、ハンガリーの蒸留会社など、二、三ヵ所

空中窒素の固定だった。

を転々とした。翌年、スイスの連邦工科大学へ入って、１ゼメスター、応用無機化学を学んだ。その後、家業を手伝ったが、父とはそりが合わず、イェナ大学の図１．総髭のハーバー、51 歳。1918 年度ノーベル化学賞に決定の通知を受ける（1919 年11月）。署名。

元素からのアンモニア合成
ハーバーがアンモニア平衡の研究を始めたのは 1904 年である。流管法で、鉄を触媒とし、大気圧、1020℃で、得られたクノルの助手になった。下働きの仕事しか与えられなかった。イェナからオスト製造に成功して、名声を博した。論文集、アンモニア濃度は 0. 005 〜 0. 012％という、ヴァルトに手紙を書き、ライプチッヒま『理論的基盤による工業的電気化学』

き わ め て 低 い も の だ っ た。 同 じ こ ろ ベ

で面接にいったが、採用されなかった。

（1898）は、電気化学者と有機化学者の両ル リ ン 大 学 の ネ ル ン ス ト は、50 気 圧、

親しい友人からカールスルーエ行きを勧方から注目された。これによって准教授

1000℃で、0 . 0032％、とハーバーよりさめられた。カールスルーエ工科大学のブに昇進した。カールスルーエにきてわず

らに小さい濃度を得たが、これがアンモンテ教授の応対は冷ややかだったが、助か４年である。やがてこの大学にも物理

ニア合成で初めての高圧実験だったこと

手にはしてもらえた（1894）。

化学研究室を設置する機運がおこり、化は注目される。1907 年の電気化学学会で、学科の教授はハーバーを推したが、大学両者はいずれも自己の値が正しいと主張

当局はオストヴァルト研究室からル・ブして譲らなかった。ネルンストは 43 歳、カールスルーエでまたオストヴァルト

ラ ン を 招 い て 教 授 と し た（1901）。 ハ ー

物理化学の教授となって 14 年目、ハーバーに助手を申し込んだが、これも成就しなバーが選ばれなかったのは独学のアウトは 39 歳、教授になって２年目である。ネ

かった。もはや自力でやるしかないと決サイダーであること以外に、ユダヤ人でルンストは容赦なく批判し実験のやり直めた。いかなる師にもつかず、いかなるあるためともいわれる。失意のハーバー

しを迫った。

学派にも属さず、独学で物理化学を切りの救いとなったのは、ドイツ・ブンゼン

ハーバーは 30 気圧の実験をおこなって、拓いた。ガスと燃料技術の専門家ブンテ

協会（電気化学協会）から、アメリカの大気圧で得た先の値が正しいことを確認から与えられたテーマは炭化水素の熱分

電気化学工業と教育の実情調査旅行に選した。高圧装置を作ったのは、ラムゼー

独学で新たな専門分野を開拓解だった。独立して書いた最初の論文、ばれたことである（1902）。16 週間の旅行

研究室からきたイギリス人、ル・ロッシ「炭化水素の分解と燃焼」（1896）が大学で 11 の大学と主要な化学工場を視察し、ニョールである。鋼鉄製の円筒に反応器

教員資格論文となった。これは熱分解とアルミニウムの製法の発明者ホールや、を入れて、200 気圧を可能にした（1908）。

いう未開拓分野の古典的研究となった。

ベークライトの発明者ベークランドとも

その金工の腕前には、機械工キルヘンバ

これで私講師となった。この論文をオス

会い、アメリカ人の旺盛な企業意欲、独ウアーも舌を巻いた。オスミウムの良好

トヴァルトに送ったが、これにも応答は

立心、国民的自負を見てとった。

な触媒作用を発見し、それを触媒として、なかった。しかしアレニウスの許で物理

電気化学的プロセスと気体反応の研究

175 気圧、550℃で８％の濃度を得た。こ化学を学んだことがあるオーストリア人から化学熱力学と取り組んだ。『工業的気うして加圧下でのガス循環、生成アンモ

ルッギンが討論相手になってくれたから、体反応の熱力学：七講』（1905）は、工業

ニアの連続的取り出し、反応器から出る

完全に孤独だったわけでもない。私講師的に重要な気体反応の熱力学的取り扱い

熱いアンモニアと送入ガスとの熱交換とになって、電気化学の研究を始めた。ニを、余すところなく論じた最初の書物でいう主要原理を確立した。

トロベンゼンの電解還元によるアニリン

あり、きわめていいタイミングで現れた。

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

バーデン・アニリン・ソーダ社（BASF）

27

図３．最初のアンモニア工場を操業開始したときのカール・ボッシュ、39 歳（1913）。
図２．アンモニア合成実験に成功したときの、カールスルーエ工科大学ハーバー研究室の研究員たち（1909）。
かれらの国籍は13カ国にわたる。一番前、機械工キルヘンバウアー。着席者、左から２人目、ル・ロッ
シニョール（ラムゼー門下生、イギリス人、アンモニア合成の高圧装置を組み立てた）。５人目、ハーバー。
２列目、左端、フリートリッヒ・ベルギウス（ネルンスト研究室から移ってきた。加圧下で石炭液化の実験をした）。左から３人目、コーツ（ラムゼー門下生。ハーバーの科学的業績を詳述した最初の評伝を書く）。
４人目、田丸節郎（アンモニアの生成熱、反応ガスの比熱を測定した。のち東京工業大学教授）。後
ろから２列目の左から３人目、小寺房治郎（のち東京工業試験所所長）。

化 学 戦
次の 22 年間、ハーバーはベルリン郊外
ダーレムの新設のカイゼル・ヴィルヘル
ム物理化学・電気化学研究所所長となり、ベルリン大学教授を兼任した。設立２年で戦争が勃発し、研究所はそれに巻き込はアンモニア合成の工業化には懐疑的（1910）。これより優れた触媒はその後もまれた。第一次大戦は始まったかと思うだった。1900 年、オストヴァルトが鉄を見つかっていない。1913 年９月に年産と塹壕戦になり、戦線は停滞した。これ

触媒として、空中窒素を固定してアンモ6500 ト ン の 最 初 の ア ン モ ニ ア 工 場 がを打開するために 1914 年秋、ネルンスト

ニアを作る方法を発見して、BASF に売り

オ ッ パ ウ で 操 業 を 開 始 し た（ 図 ３）。

はドイツ陸軍省の諮問に応じて、くしゃ込んだ。BASF が追試したところ、アンモ

ハーバーは、生産されたアンモニア１

み剤（ジアニシジン塩）、ついで催涙ガス

ニアは触媒に使った鉄に由来することがkg につき 1 . 5 ペニッヒを受け取る契約（臭化キシリル）を砲弾に詰めて発射させ明らかにされ、オストヴァルトは契約を（1908）によって、1920 年までに数百万取り下げたという一件があったからであ

マルクの収入を得た。ル・ロッシニョー

る。1909 年７月２日、BASF のミッタシュ

ルとキルヘンバウアーのそれぞれと取りはハーバーの公開実験に立会って、高圧決めをして、自分の収入から支払った。

合成法が可能なことをしかと見届けた（図「元素からのアンモニア合成」によって

２）。

28

ハーバーは、1918 年度のノーベル化学賞

アンモニアの大規模合成は BASF のを 1920 年 ６ 月 に 受 賞 し た。1920 年 度 のボッシュによって達成された。スケール

ノーベル化学賞を受賞したのはネルンス

アップの必須条件は高圧に耐える材料とト で あ る。 ボ ッ シ ュ と ベ ル ギ ウ ス は、触媒である。水素が高圧下で鋼を脆くす

1931 年に高圧化学技術の発明と発展に対ることが分かり、ボッシュは反応管の内して、ノーベル化学賞を受賞した。アン

部に、ほとんど炭素を含まない軟鉄を張モニア合成によって化学と工学の結びつり、反応管は高圧に耐える鋼鉄製とし、きが始まり、高圧化学は近代化学工業のこれに何千という小孔を開けて、水素が特徴となった。助手から出発して教授ま鋼鉄と反応することなく排出されるようで昇進し、物理化学者として頭角を現し、にした。ミッタシュは１万回以上の実験

アンモニア合成の大業を達成したカールによって、不純物としてアルミナを含む

スルーエの 17 年間は、ハーバーの人生の鉄に、触媒作用が増す添加剤を加えたも最も輝かしい時期であり、とくに最後ののが、安価で収量が良いことを発見した

５年間が全盛期だった。

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

図４．化学戦の最高指揮者になったときのハーバー、
48 歳（1916）。自らデザインした軍服で人目を引いた。

私の失ったものがはるかに大きいので昇進しなかった。
ハーバーは戦後も、化学兵器の研究開

図５．学生時代のクララ・インマーヴァール。 ハー
バーは人生の節目ごとに記念写真をのこしているが、クララ関係の写真はのこっていない。

す、」という絶望の手紙を書いている。

発は継続すべきであると主張した。「ガスダーレムの研究所で毒ガスの実験が始兵器が飛散する鉄片より残忍ということ

まると、大爆発が起こって、ブレスラウ

は全くない」とした（「戦争における化学」

以来クララにとって親しかったザックー

1920）。ハーバーの研究所は戦後も 1919 年

ルが死亡した。クララはハーバーが毒ガから 1933 年まで毒ガスの秘密生産を続け

ス戦にかかわることに強く反対した。した。1922 年にはスペインへ、さらにソ連

かしハーバーは頑として聞き入れなかっへ毒ガスの技術を導入した。日本でもハーた。イープルでの塩素ガス攻撃が始まっ

バーが関係者に技術指導をおこなったのてから 10 日後、ハーバーが一時帰宅し、は確かであろう（1924）。ガス戦とは別に、

翌日東部戦線での塩素ガス攻撃に出発す

戦時中（1917 年）、害虫による食糧の被害

る早朝、クララは夫のピストルで自殺しを防止するため害虫駆除専門委員会が発た（5 月２日）。クララの死については、

足して、ハーバーがその委員長に就任し、ハーバーは黙して語らなかったが、知人

戦後、研究所にも害虫駆除の部門が設けたちによってさまざまなことが語られた。

たが、いずれも有効でなかった。ハーバーられた。ハーバーの研究所のフルーリの1990 年代に、「自然科学の職業に従事するにも諮問があった。ハーバーが強烈な刺研究室で開発されたチクロンＢ（本体は女性たちの聴聞会」で、クララは第一次激作用と毒性がある塩化カコジルの実験

シ ャ ン 化 水 素 ） が、1941 〜 45 年 に ア ウ

大戦時に始まった化学の大量破壊兵器にを、始めたばかりの 1914 年 12 月 17 日に研シュヴィッツで用いられて、400 万人のユ対して抗議自殺を遂げた女性化学者とさ究室に大爆発が起こり、重要なスタッフ

ダヤ人がその犠牲になった。その中にはれた。化学者の倫理が初めて問われ、クの一人が死亡し、一人が右腕を失った。

ハーバーの親戚もいた。

ララの死は、新しい科学の定義を告げる、その問題は破棄された。ハーバーは大量の塩素ガスをボンベから放射することをのろしとなった（ゲリート・フォン・ラ提案した。塩素もボンベもすぐ入手できハーバーとクララ・インマヴァールは

イトナー、『クララ・インマヴァール事
情̶人間らしい科学のための生涯』たからである。1915 年 4 月 22 日、イープ

21 歳と 19 歳のときに出会い、33 歳と 31 歳

（1994）。明快な解釈だが、かたよりすぎ、

ルで 5000 本のボンベによる塩素雲攻撃がのときに再会した（図５）。すでにクララ単純化しすぎるきらいがある（セレジ・おこなわれた。しかし軍はガスを戦術的はブレスラウ大学の初の女性博士となり、ヤンツェ、1998）。ハーバーとシャルロッに利用できなかった。1916 年春、フランハーバーと同じ学会で発表する化学者とス軍がホスゲン（塩化カルボニル）を詰なっていた。クララはハーバーからのプ

めたガス弾を使用したのが、化学戦の転ロポーズにかなりためらった末、結婚と回点となった。ガス放射からガス弾へと研究の両立を期待して結婚に踏み切った。

変わった。ドイツ陸軍省は化学戦部局を初めの２年間は研究所のセミナーや化学設立し、ハーバーはその指揮者に任命さ会にも出席した。しかし難産で生まれた

れた（図４）。かれの研究所は毒ガス研究

息子の肥立ちが悪く、クララは育児と家の本拠となった。ヴィルシュテッター教事で次第にうつになり、一方、ハーバー

授 を 含 め て、 フ ロ イ ン ト リ ッ ヒ、 オ ッは仕事に没頭して家庭を全く顧みなかっトー・ハーン、ジェームズ・フランク、た。結婚して 4 年目に出たハーバーの『熱ガイガー、グスターフ・ヘルツなど多数

力学』には、「妻クララ・ハーバー博士のの第一級の化学者を協力させた。ハーバー

無言の協力に感謝する、」という献辞がつは実験室での研究から最前線での実戦にいている。クララがデータの検証や計算いたるまで自ら指揮した。ドイツの染料に協力したのであろうが、化学の博士号

化学工業の比類ない発達が毒ガス生産ををもつ妻が無言の協力というのは、異様有利にした。ユダヤ人は将校になれなかっな感じがする。ハーバーがアンモニア合た軍で、ハーバーが大尉に任命されたの成に成功して栄光に輝いた 1909 年に、クは異例だった。しかし化学戦の最高責任

ララは恩師のアベッグ宛てに、「結婚以来者だったにもかかわらず、それ以上にはのこの８年間にフリッツが得たものより、

妻クララの自殺

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

図６．シャルロッテ・ナータンとの結婚式の直後（1917）。ハーバー、49 歳。左端はクララが生んだ息子ヘルマン。

29

図７．ハーバー著、『 講演５題』（、1924）のタイトル。
ノーベル賞受賞講演や、「戦争における化学」
を含む講演集。 大阪を訪問したとき、誰かに贈呈したらしく、署名とともに、「この印象的な都市、大阪でのすばらしい、有益な時間と、そこで受けた大きな友情を、著者はつねに銘記します」と記されている。大阪府立中央図書館蔵。

図８．研究所の物理学部長からゲッティンゲン大学教授に転任する、ジェームズ・フランクの送別の集い（1920）。
前列、左から２人目、アインシュタイン、４人目から、フランク、リーゼ・マイトナー、ハーバー、オットー・ハーン。後列右端、グスターフ・ヘルツ。このうち５人がノーベル賞受賞者となる。

経済史家となり、『世界巨大化学企業形成史』と『魔性の煙霧̶第一次世界大戦

連合（IUPAC）へのドイツの加盟を実現させ、その副会長になった。

の毒ガス攻防戦史』の著述によって知ら
テ・ナータンとの関係を、クララは知っ

れる。

日本訪問
1924 年、ハーバーと夫人シャルロッテ

ていた。東部戦線へ出発する前夜のハーバー家のパーティーにシャルロッテが現

30

は、半年にわたる世界一周の旅に出た。

敗戦と再建れたので、クララがひと悶着おこしたと敗戦によってドイツ帝国は崩壊した。

日本に２カ月滞在した。政財界、学界、もいわれる。またクララの妹ロッテも自1918 年、連合国はハーバーを戦犯リスト

産業界の指導者に会い、各地を訪れた。

殺し、息子ヘルマンもクララとほぼ同年に載せ、身柄の引き渡しを請求したので、奮闘の人ハーバーは、プロシア人のよう齢で自殺したので、家系の遺伝的要素も一時、スイスへ逃避した。1920 年の戦犯に、努力奮闘する日本人に好感をもった。

指摘された。あらゆることを心配の種に

リストにはハーバーの名は消えた。しか帰国後、官界に働きかけ、ベルリンと東した神経質なクララにとって、毒ガス戦

し非難は生涯つきまとった。このころは京に、それぞれ日本研究所（1926）とドは格好の口実になった（ゴラン、1967）。

総髭を生やし、人中に出ても目立たぬよ

イ ツ 文 化 研 究 所（1927） を 設 立 さ せ た。

しかしクララがハーバーに毒ガス戦を止うにしていた（図１）。インフレ下のドイ

日本とドイツの姉妹研究所の設立は、ドめるように懇願したとか、止めなければツ科学を財政的に支援するため、ドイツ

イツの国際関係修復の一環となった。日

自殺するとまで言ったかどうか、明らか

科学緊急援助協会を設立させ、実質的に本訪問はハーバーの生涯の大きな出来事

でない（シュトルツェンベルク、1994）。

これを主導した（1920 − 33）。ドイツは戦だった（図７）。

クララの死の２年後、ハーバーは 21 歳

争賠償金を金で支払うことになっていた

年少のシャルロッテ・ナータンと再婚しので、それを軽減するためハーバーは海た（図６）。学究肌で、繊細で神経質な水から金の経済的抽出を図り、５回の探1912 年、物理化学、物理学、コロイド

クララとは対照的に、快活で楽天的、頭査航海をおこなったが、期待した結果は化学の３部門で発足したが、戦後 1919 年の回転は速いが、知的ではなく、社交好得られなかった（1923 − 26）。ドイツ化学の再建で、有機化学、理論物理学、薬学、きだった。10 年後、離婚し、それ以後、会連合の会長（1928）として、ドイツ科

昆虫学、繊維化学を追加して８部門とし友人関係を保った。この結婚で生まれた学の戦後の国際的孤立からの脱却に努め、た。戦時中は軍事研究に、戦後は海水中

ルートウィッヒ・フリッツ・ハーバーは

1931 年末に、純粋および応用化学の国際の金の問題に集中したので、1926 年から

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

世界的な研究センター

用の新しい知識の刺激の下で、化学反応の速度論とメカニズムを研究した。

流浪

ナ チ ス が 政 権 を 掌 握 す る と、 ユ ダ ヤ
人を排除する公務員法を制定した（1933 . 4 . 7）。ユダヤ人の寄付によって設立され、所長はじめ部長のほとんどがユダヤ人だったハーバーの研究所は真っ先に標的となった。ハーバー自身は大戦での功績によって特免になっていたが、かれはそれを潔しとせず、「わが研究所は 22
年間、平和時は人類のため、戦時には祖国のために尽くした」という言葉を残して所長を辞任した（4 . 30）。ハーバーは研
図９．フリッツとクララ・ハーバーの墓（バーゼル、ヘルンリ墓地）。ハーバーの遺言にもとづき、息子ヘルマンがクララの遺骨をダーレムからバーゼルに移して、1937 年に合葬した。ハーバーは、「許されるかぎり、戦時も平時も国に尽くした」の句を入れたかった。

究員から秘書にいたるまでの受け入れ先

図 10．ハーバー彫像（ハーバーが所長として就任することになっていた、イスラエル、レホヴォッ
トのシェフ研究所、1934 年設立、にある）。

を探すのに奔走した。スペイン、サンタ
ンデルの国際化学会議に出たあと、ハーはこれに応じて、生涯の最後にディアス

バー自身の身の振り方が決まらなかった。

ポラ（離散ユダヤ人）からシオニストへ

窮状を察して日本から招きがあった。ス

転換しようとし、パレスチナへ出発直前、

ペインとスウェーデンからも招かれた。

バーゼルで死んだ。

結局、イギリス、ケンブリッジのポープ
1933 年までがハーバーの研究所の最盛期教授の招きに応じた。そこで２ヶ月間過である。1929 年に研究員 60 人、その半数ごした。「鉄塩を触媒とする過酸化水素のが外国人で、国籍は 10 カ国以上にわたっ

分解の速度論」が最後の研究となった。

た。1919 年 10 月に始まった、２週間毎のイギリスに亡命していたフロイントリッ

Longmans, Green and Co.（1908）. ; Haber, Fritz, Fünf

「コロキューム」を、ハーバーは研究所のヒ、ポランニー、ファーカス、ボルン、

Vorträge , Julius Springer（1924）. ; フリッツ・ハーバー、

重要な活動として位置づけた。

ハルテックなどが続々とケンブリッジに

田丸節郎訳 ,『ハーバー博士講演集 ̶ 国家と学術の研〔参考文献〕
Haber, Fritz, Thermodynamics of Technical Gas-

Reactions : Seven Lectures , trans. by Lamb, A. B.,

究 』（岩波書店）（1931）．; Stoltzenberg, Dietrich, Fritz

フランクを研究所に迎えて物理学部長

集まって、束の間、ダーレムのコロキューとした（1919）。かれがグスターフ・ヘル

ムを再現した。体調はますます悪く、死ツとともにおこなった、電子と原子の相を覚悟したのか、息子宛てに、自分の死

si-Janze, Margrit, Fritz Haber , 1868 - 1934 , Eine Bio-

互作用の実験は、ボーアの原子構造論や後、クララと同じ墓に入れること、といgraphie , C.H.Beck, München （1998）. ; Gerit von

プランクやアインシュタインの量子説のう遺書を書いた（図９）。

Haber, Chemist, Nobel Laureate, German, Jew , Chemical Heritage Foundation, Philadelphia（2004）.: Szöllö-Leitner, Der Fall Clara Immerwahr. Leben für einehumane Wissenschaft , C. H. Beck, München（1994）. ;実験的証明として重視されたが、その実所長辞任後、ハーバーはユダヤ人とし験を研究所で続行した（図８）。フロインて対照的な生き方をした、化学者・政治

トリッヒのコロイド部門が活況を呈した家ハイム・ヴァイツマンと数回会った。

のも戦争直後である。ハーバーは生涯のハーバーがドイツに生まれ、ドイツに同; 高尾楢雄、佐知子訳 ,『リヒャルト・ヴィルシュテッター自伝』

科学的テーマだった、ブンゼン炎の問題化して、ユダヤ人であるがゆえに一層励（日本図書刊行会）（2004）．; 山崎和夫訳 ,『オットー・ハーに復帰した（1922）。ハーバーとボンヘッ

んで国に尽くしたのに対して、ヴァイツ

ン自伝』（みすず書房）（1977）. ; ルッツ・Ｆ・ハーバー著、

ファーの共著、「バンドスペクトルと炎プ

マンはベラルーシ生まれで、イギリスに

佐藤正弥他訳 ,『世界巨大化学企業形成史』（日本評論ロセス」はその豊富なアイデアが注目さ

住んで親英的で、イギリスの委任統治地れた。ボンヘッファーは原子状水素の優だったパレスチナ（現、イスラエル）にれた研究をおこなった。ボンヘッファー

ユダヤ人の国を建設しようとしていた、究』第１号、76−77（1995）．; 広田鋼蔵「アンモニア合と ハ ル テ ッ ク は、 パ ラ 水 素 を 発 見 し た

シオニストである。そこに西欧に劣らな成法の成功と第一次大戦の勃発」、『現代化学』1975 年（1929）。ハーバー、ポランニー、アイリングは、

い立派な研究所を作るから、その所長に2月号．; 宮田親平 ,『毒ガス開発の父ハーバー』（朝日新とハーバーを口説いた（図 10）。ハーバー

聞社）（2007）．

原子構造と、物質とエネルギーの相互作

和光純薬時報Vol.76, No.4（2008）

Goran, Morris, The Story of Fritz Haber , Universityof Oklahoma Press（1967）. ; Coates, J.E., The Haber
Memorial Lecture, J. Chem. Soc. , 1642−1672（1939）.

社）（1984）．; ルッツ・Ｆ・ハーバー著、井上尚英訳 ,『魔性の煙霧̶第一次世界大戦の毒ガス攻防戦史』（原書房）（2001）．; 田丸謙二「父田丸節郎とハーバー」『化学史研318-OHdG測定用のDNA抽出に最適
ヒト、動物の柔組織 DNA 抽出用
DNA エキストラクター® TIS キット
本キットは、主にヒトや動物の柔組織を対象としたDNA抽出キットです。本キットの基本原理であるよう化ナトリウム法は抑制されたDNAの抽出が可能になったため、酸化ストレスマーカーである8-OHdG（8-ヒドロキシ- 2 -デオキシグアノシン）の測定に有用なDNAサンプルの調製が可能です。

特長

キット内容 （50 回用）●酸化ストレスマーカーである 8 -OHdG の検出・測
定に有用

●溶解液

75 mℓ× 2 本●酵素反応液15 mℓ× 1 本●酸化抑制剤

350μℓ× 1 本●よう化ナトリウム溶液 15 mℓ× 1 本●酸化抑制剤を使ってさらに DNA の酸化を抑制● RNA分解酵素液 50μℓ× 1 本●アルコール液

30 mℓ× 1 本●ヒト、動物の柔組織からの DNA 抽出に最適●タンパク分解酵素液 750μℓ× 1 本● PEG 溶液

20 mℓ× 1 本

プロトコール 〔使用法１〕

デ ー タ

約 150mg 組織

マウス肝臓からの DNA 抽出及び 8-OHdG 量の測定
37℃，10min.

ホモジナイズ←15μℓ タンパク分解酵素液

ホモジネート /2mℓ容チューブ

37℃，1hr（20min. 毎にボルテックス）■ 高感度 8 -OHdG Check（ELISA 法）による測定

10,000×g, 5min., 室温600×g, 10min., 4℃

上清 /1.5mℓ容チューブ

沈殿←1mℓ 溶解液
ボルテックス（ppt ほぐす）×2 回

600×g, 10min., 4℃←300μℓ よう化ナトリウム溶液←600μℓ アルコール液
10,000×g, 10min., 室温沈殿←300μℓ 酵素反応液←1μℓ
RNA 分解酵素液
←3μℓ
酸化抑制剤

10,000×g, 5min., 室温×2 回沈殿（DNA）

ボルテックス（ppt ほぐす）
DDW または TE バッファーに溶解※組織の8-OHdGを測定する場合には、組織より抽出したDNA の加水分解などの前処理が必要です。前処理に使用する酵素・バッファー類をセット化した 8-OHdG 測定前処理試薬セット（コード No. 292-67801）がございます。

コード No.
296-67701

品
DNA Extractor® TIS Kit

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

DNA Extractor® WB Kit

DNA Extractor® TIS Kit■ HPLC/ECD による測定←1mℓ 70% エタノール沈殿

マウス肝臓（同一個体）から DNA Extractor® TIS Kit〔使用法 1〕及び DNA Extractor®
WB Kit（コード No. 291-50502）を使って DNA を抽出した。取得した DNA に対し、ヌクレアーゼ P1 処理などを行った後、高感度 8-OHdG Check（コード No. 307-07921）（ELISA 法）及び HPLC/ECD によって 8-OHdG 量を測定し、両者を比較した。
8-OHdG量（pg/μgDNA）←1mℓ 溶解液

8-OHdG 濃度（nmol/ℓ） dG 濃度（μmol/ℓ） 8-OHdG/106dG
DNA Extractor® TIS Kit

0.59

692

0.8

DNA Extractor® WB Kit

1.41

687

2.1

（HPLC 条件）
カラム：Wakopak® Wakosil-Ⅱ 5C18 RS φ4.6mm × 150mm（D） 流 速：1mℓ/min.
溶離液：50mmol/ℓ酢酸ナトリウム（pH 5.2）, 9% メタノール
吸光度：UV260nm
ECD 電解電位：+600mVDNA 抽出操作時の酸化により8-OHdGが発生することが知られているが、DNA Extractor® TIS
Kit を用いることにより、DNA Extractor® WB Kit に比べて、操作中の 8-OHdG 発生量を半分以下に抑制することができた。また、デオキシグアノシン中の 8-OHdG 濃度も非常に低いことが明らかになり、8-OHdG 測定用の DNA 抽出キットとして優れた性能が示された。

名

規格
遺伝子研究用容量
50 回用

希望納入価格（円）照会

関連商品
コード No.

品
名
8-OHdG Assay Preparation Reagent Set

292-67801［セット内容］○酢酸バッファー
950μℓ× 1 本○ヌクレアーゼ P1 500units × 1 本

307-07921
238-51471
234-51473

High Sensitive 8-OHdG Check（日研ザイル㈱） 8-OHdG 測定用 ELISA キット
Wakopak® Wakosil-Ⅱ 5C18 RS φ4.6mm×150mm（D）−
HPLC 用カラム
Wakopak® Wakosil-Ⅱ 5C18 RS φ4.6mm×150mm（W）−○トリスバッファー
1mℓ× 1 本○アルカリホスファターゼ 50μℓ× 1 本

規

格

用

遺伝子研究用途

8-OHdG 測定時のサンプル
DNA の前処理用試薬セット

容量

希望納入価格（円）

50 回用

照

会

96 回用
1本
1本

80,00045,00045,000

収載されている試薬は、試験・研究の目的にのみ使用されるものであり、家庭用、医療用など他の用途には用いられません。
記載希望納入価格は本体価格であり消費税などが含まれておりません。

和光純薬時報 Vol. 76 No. 4
2008 年 10 月 24 日 発行

●製品に対するお問合せはこちらまでお寄せ下さい。

発行責任者
編集責任者
発 行 所

■和光純薬工業株式会社（Japan） http://www.wako-chem.co.jp

印

刷

所

三浦正寛
鰐部梢子
和光純薬工業株式会社〒 540-8605 大阪市中央区道修町三丁目 1 番 2 号
TEL.06-6203-3741（代表）URL http://www.wako-chem.co.jp
共進社印刷株式会社●和光純薬時報に対するご意見・ご感想はこちらまでお寄せ下さい。
E-mail jiho@wako-chem.co.jp

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フリーダイヤル（日本のみ）0120-052-099/Tel 81-6-6203-3741
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E-mail labchem-tec@wako-chem.co.jp■Wako Overseas Oﬃces :・Wako Chemicals USA, Inc. http://www.wakousa.com
Toll-Free（U.S. only）1-877-714-1920
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Los Angeles Sales Oﬃce（Irvine, CA）：Tel 1-949-679-1700 / Fax 1-949-679-1701
Boston Sales Oﬃce（Cambridge, MA）：Tel 1-617-354-6772 / Fax 1-617-354-6774

・Wako Chemicals GmbH

http://www.wako-chemicals.de

European Oﬃce（Neuss, Germany）：Tel 49-2131-311-0 / Fax 49-2131-311100

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操作中の酸化が比較的少ないDNA抽出法として知られていますが、本キットは酸化抑制剤を用いることにより、さらに酸化が