ノザンブロッティング＜Non-RI (DIG-Labeling による)＞
山根美穂*分裂酵母の RNA の分離、精製については RNA preparation の項目を参照
このプロトコルは DIG Northern Starter Kit（Roche）の添付説明書および Roche DIG 説明書集（日本語版）8th を参考にしています。
過程が多く、複雑なので、一度よく読んで一通り頭に入れてからとりかかってください。
必要なもの

試薬類
10 X MOPS buffer（ナカライテスク : 23442-81）

37% formaldehyde（Wako : 064-00406）
ホルムアミド（Wako : 066-02301）
20 X SSC（ナカライテスク : 32146-91）→

オートクレーブ滅菌が必要

10% SDS（Invitrogen : 15553）
DynaMarkerRNA High（フナコシ: BDLcode : DM160）

DIG Northern Starter Kit（Roche : 12 039 672 910）
RNase free の滅菌水（大量に必要）
HybondN-plus
3MM paperRNA 試料
1 レーン辺り 2 ㎍の total RNA が必要となる。
10 ㎍ほどを分離精製するつもりで試料を作成するとよい（分裂酵母の場合、経験的には log phase の細胞で 5 x 106 細胞を処理すれば 10 ㎍の RNA が得られるはずであるが、細胞の状態にもよるのであらかじめ検討が必要）

プローブ作製のための DNA テンプレート
この kit には T7、T3、SP6 の 3 種の RNA polymerase がついているので、いずれかのプロモーター下流に目的とする遺伝子配列を挿入し、転写が行われるようにデザインする（経験的には SP6 プロモーターからの転写が一番効率良く行われたが、lot によるものかもしれません）。転写されるプローブの長さは 200-1000bp になるようにする。
また、挿入した遺伝子の下流の制限酵素部位で切断し、linearize しておく（転写がそこで終わるように）。
このとき用いる制限酵素はなるべく 5’突出か平滑末端となるものを選ぶ。

制限酵素処理をして linearize したプラスミドは phenol / chloroform 処理、エタノール沈殿を行い、10mMTris-HCl (pH 8.5)に溶解しておく（プローブの作製の項目で詳述する）。
insert の直後を制限酵素により切断して直鎖化する

200-1000bp

T7、T3、SP6 promoter1.

遺伝子の向きとは逆方向に insert 挿入

プローブの作製
1-1 template の直鎖化


エッペンチューブに以下の溶液を混合する
plasmidDNA

5μg 相当量

10 x buffer

10μl

Restriction Enzyme

3μl

H2O

to 100μl



制限酵素の反応温度にて完全に消化する（37℃で 2 時間程度）

100μl のフェノール / クロロフォルムを加えて混合し、15000 回転、4℃、5分間遠心し、水層を新しいチューブへうつす

10μl の 3M 酢酸ナトリウム、250μl のエタノールを加えて混合する



15000 回転、4℃、15 分間遠心し、沈殿を氷冷した 70%エタノールで洗浄する（15000 回転、4℃、5 分）



沈殿を 15μl の EB（10mM Tris pH8.5）に溶解し、1μl を用いて濃度を測定する（およそ 0.3μg / μl になっているはず）

1-2 ラベリング
エッペンチューブに以下の溶液を混合する
Linearized plasmid DNA

1μg 相当量

RNase inhibitor
H2O


0.2μl
to 10μl

さらに以下試薬を加える（DIG Northern Starter Kit の添付試薬）
5 x Labeling mix (vial 1a)

4μl

5 x transcription buffer (vial 1b)

4μl

RNA polymerase (T7, T3 or SP6)2μl

42℃で 1 時間インキュベート



2μl の DNaseI を加え、37℃15 分間インキュベート

2μl の 0.2M EDTA（pH8.0）を加えて反応を止める1-3 プローブの検定

必要なもの（全て用事調整）

RNA dilution buffer
20 x SSC

300μl

37 % Formaldehyd

200μl

RNase free water

500μl

Washing buffer
10 x Washing buffer

6ml

RNase free water

54ml

Blocking solution
10 x Maleic acid buffer

2.5ml

10 x Blocking solution

2.5ml

RNase free water

20ml

Antibody solution
Blocking solution（上記） 10ml
Anti-DIG-AP

1μl

Anti-DIG-AP は混合する前にチューブを 4℃で 10000rpm 、5 分間遠心するDetection buffer
10 x Detection buffer

1ml

RNase free water

9ml

Hybond-N+ : 3 x 6 cm くらいに切って、滅菌シャーレなどに入れておく

プローブ検定

以下の表のように希釈液を作製する
RNATubeRNA(μl)

From tube #dilution

Dilutionbuffer (μl)
RNA 原液を水で 10 ng / μl になるように希釈する

1



Finalconcentration
10 ng / μl

22118

1 : 101 ng / μl

3231981 : 100

10 pg / μl

415335

1 : 3.33 pg / μl55345

1 : 101 pg / μl65445

1 : 100.3 pg / μl75545

1 : 100.1 pg / μl85645

1 : 100.03 pg / μl95745

1 : 100.01 pg / μl

100-50-0

作製した希釈液の tube 3 ~10 の各 1μl を滅菌シャーレ等に入れたメンブレン上にスポットしていくUV-cross linker にて 0.12 J オートクロスリンク

Washing buffer をシャーレに注ぎ、２分間インキュベートする



液を捨て、新たに 10 ml の Blocking solution を入れて、30 分間インキュベートする



液を捨て、10 ml の antibody solution を入れて、30 分間インキュベート



20ml の Washing buffer にて 15 分間 x 2 回洗浄する



10 ml の Detection buffer にて 2~5 分間インキュベート



3 方を切り開いたハイブリバッグ等の上にメンブレンを置き、CDP-Starを 4 滴ほど滴下する

すぐに上のフィルムでカバーをして、液を行きわたらせる

室温で 5 分間インキュベートしたら、メンブレンの周りをシーラーにてシールするImage Lab 等を用いてシグナルを検出する
Tube7 の spot (0.1pg / μl)くらいまでシグナルが検出されるようであれ
ば、このプローブを用いて本実験を行うことができる

2.

電気泳動とトランスファー
2-1 電気泳動


必要なもの


１.2%ホルムアルデヒドゲル（150mL）←Mupid の 13x12cm ゲル（13 コーム穴用）
RNase free のフラスコに以下を入れる
Agarose

1.8g

H2O(RNase free)

126.9ml

レンジで Agarose を溶解し、適当に冷えたら以下を加える
10 X MOPS buffer

15ml

37% formaldehyde

8.1ml（できればドラフト内で）よく混合し、ゲル型に流し入れて固まるまで待つ（2 時間くらい）

1 x MOPS buffer
滅菌水450ml

10 x MOPS buffer

50ml

RNA loading buffer
まず、以下の組成で作製する（RNA loading buffer Mix. 1）
Glycerol

2.5ml

H2O

2.5ml

BPB

適当に色づくほど200μl くらいずつに分注して-30 度にストックしておく
電気泳動する前に、以下のように混合する（サンプル量に応じて作製するが、少なすぎると作りにくいので、最低以下の量を作製する。ちなみに、*25μl /sample 見ておけば足りる（実際は 21.5μl を使用））
10 x MOPS

50μl

フォルムアミド

250μl

37% formaldehyde

80μl

RNA loading buffer Mix. 150μl

Filtrate する

電気泳動試料の作製
RNA は電気泳動直前にエタノール沈殿を行い精製する。
実際には 10μg 相当量が得られる量を沈殿させ、20μl の H2O に溶解したものをOD 測定し、うち 3μg を用いて電気泳動試料の作製を行う。


エッペンチューブに以下を入れて混合する
Total RNA
H2O3μg 相当

RNA と合わせて 6μl にする

RNA loading buffer

21.5μl

65 度で 10 分間インキュベートし、その後１分間氷上におく

18μl ずつ（RNA2μg 相当）を１.2%ホルムアルデヒドゲルに load する

1 x MOPS buffer にて、50V で 2 時間半くらい電気泳動を行う（できればドラフト内で）

マーカーについてRNA マーカーを用いる場合は、マーカーの説明書に従い調整する。以下に、BioDynamics Laboratory 社の DynaMarkerRNA High を用いる場合について記す。


エッペンチューブに以下を混合する
RNA High

2μl

RNA loading buffer

16μl

EtBr (200μg / ml)

1μl

75 度 3 分間インキュベートし、その後急冷する



全量をゲルに load する

Total RNA 中のリボソーマル RNA をマーカーとして用いる場合


エッペンチューブに以下を混合する
Total RNA (1μg / μl)

2μl

RNA loading buffer

16μl

EtBr (200μg / ml)

1μl

75 度 3 分間インキュベートし、その後急冷する



全量をゲルに load する2-2 トランスファー


電気泳動が終了したら、マーカーレーンを切り離し、撮影しておく（必要であれば、定規などを添える）



マーカー以外の部分は、不必要な部位を切り取った後、15 ㎝滅菌シャーレ等に入れる



滅菌水（RNase free）を注ぎ、15 分間インキュベートする



液を 20 x SSC に変えて 15 分間インキュベートする

新しい 20 x SSC に変えて、さらに 15 分間インキュベートする

サザンブロッティングと同じ要領でメンブレンへのトランスファーを行う（サザンブロッティングの項を参照）～16 時間



トランスファーが完了したら、コーム穴に鉛筆で印をつけておく

3MM ペーパーに 2 x SSC をしみこませ、その上に転写された面を上にしてメンブレンを置く

UV-cross linker にて 0.12 J オートクロスリンク

滅菌水（RNase free）にて軽くリンスし、3MM ペーパー上に置いて風乾させる（乾いたら、ハイブリバック等に入れて４℃でしばらく保管できる）

3ハイブリダイゼーション


DIG Easy Hyb を 68℃に温めておく（10 x 10 cm のメンブレン辺り 12ml 必要）12ml のうち 1ml はエッペンチューブにとりわけておく

ハイブリバッグにメンブレンと温めた DIG Easy Hyb を 11ml 入れて、68℃で30 分間インキュベートする（プレハイブリダイゼーション）

1-2 で作製した DIG ラベルしたプローブ 1.2μg 相当を氷上で溶かす



RNase free H2O を加えて total の液量を 50μl になるようにする

100℃で 5 分間 boil した後、急冷する

プレハイブリダイゼーションが終了したら、先程のプローブを加える（直接濃い液がメンブレンにかからないように、いったん残しておいた 1mlの DIG Easy Hyb にプローブを加え、その後ハイブリバッグにうつすとよい）
68℃で O/N インキュベートする

4

洗浄と検出


必要なもの（全て用事調整）
Stringency wash buffer I(200ml)

20 x SSC

20ml

10% SDS

2ml

RNase free waterStringency wash buffer II

178ml(200ml)20 x SSC

1ml

10% SDS

2ml

RNase free water

197ml

68℃であらかじめ温めておくWashing buffer(250ml)10 x Washing buffer

25ml

RNase free water

225ml

Blocking solution(100ml)10 x Blocking solution

10ml

10 x Maleic acid buffer

10ml

RNase free water

80ml

Detection buffer(100ml)10 x Detection buffer

10ml

RNase free water90ml

Stringency wash buffer I をハイブリオーブン（68℃）に入れて、あらかじめ温めておく

Stringency wash buffer II が十分に温まってきたらハイブリダイゼーシ
ョンを終了し、メンブレンをハイブリバッグから取り出す

100ml の Stringency wash buffer I を 15cm 滅菌シャーレ等、メンブレンが入るサイズの容器に入れ、そこに取り出したメンブレンを入れる



室温で 5 分間洗浄する。2 回繰り返す



液を捨て、新たに Stringency wash buffer II を注ぎ、68℃で 15 分間の洗浄を 2 回繰り返す（各 100ml を使用）

新しい 15cm 滅菌シャーレに 50ml の Washing buffer を入れ、そこにメンブレンをうつして室温で 2 分間インキュベート

Blocking solution 50ml を別の容器（50ml チューブ等）にとりわけておく

シャーレの Washing buffer を捨て、残りの Blocking solution をそそぐ

室温で 30 分間インキュベートする（ブロッキング）

DIG-antibody のチューブを 4℃で 10,000 回転、5 分間遠心し、5μl をチューブに取り分けておいた 50ml の Blocking solution に加える（10,000倍希釈の抗体希釈液）



ブロッキングが終了したら、液を捨て、上記の抗体希釈液を注ぐ



室温で 30 分間インキュベート



液を捨て、100ml の Washing buffer を注ぎ室温で 15 分間洗浄する。2回繰り返す



液を捨て、Detection buffer を注ぎ、3 分から 5 分間インキュベート



3 方を切り開いたハイブリバッグにメンブレンをのせる

CDP-star を滴下し 5 分間インキュベート



余分な液を捨て、メンブレンの周囲をシールするImage Lab 等を用いてシグナルを検出する
10 分から 30 分ほどの露光で十分なシグナルが得られるはずである