月例卓話

琵琶湖など閉鎖性水域における難分解性有機物の起源解明―リアルタイム PCR を用いる藻類の影響評価―
山
1．はじめに田悦＊ては，カラム分画法，炭素安定同位体比分析及び琵琶湖北湖では 1984 年を境として生物化学的分光分析などを用いて 1995 年以降多くの研究が酸素要求量（BOD）は横ばいあるいは減少傾向なされている．当初は外来性の土壌フミン物質がなのに対し，化学的酸素要求量（COD）は増加主な原因ではないかと考えられていたが，外来性傾向にあり，COD と BOD の乖離現象が生じての土壌フミン物質に加えて内部生産の藻類由来有いる（図 1）．流入河川の COD 値には大きな変動

機物など親水性有機物の寄与があること，さらには見られないことから，これは微生物による分解底質からのフミン物質の溶出があることが明らか

が 困 難 な 難 分 解 性 の 溶 存 有 機 物 質（Dissolvedになってきた．これらについては，陸水学会近畿Organic Matter: DOM）の増加が原因と考えられ支部会の陸水研究に総説る．このような BOD と COD の乖離現象は，琵

では，琵琶湖における藻類由来有機物の特性と動琶湖北湖以外にも霞ヶ浦，十和田湖及び野尻湖な態，及び定量リアルタイム PCR を用いる藻類のどの湖沼や富山湾などの他の閉鎖性水域でも報告

影響評価を中心に述べる .

としてまとめた．ここ

1）

されている．難分解性 DOM は，浄水場の塩素処

2．藻類由来有機物の特性と動態理過程で生成する発がん性のトリハロメタン（THM）の前駆物質であるとされており，また難琵琶湖における親水性有機物は植物プランクト

分解性 DOM の蓄積による水生態系等への影響がンによる内部生産と推測されたが，その DOM へ懸念されることから，難分解性 DOM の蓄積の原の寄与に関する研究はほとんどなかった．そこで，因解明は重要である .

琵琶湖に生息する 3 種の植物プランクトン，1985

琵琶湖における DOM の特性や起源解明につい年以前と以後の優占種となった緑藻類のと褐色鞭毛藻類の及びアオコの原因である藍藻類のを培養し，増殖時と生分解時における藻類由来 DOM の可視及び蛍光特性を評価した．琵琶湖の難分解性有機物へのこれら藻類由来 DOM の影響とその特性を，蛍光検出−ゲルクロマトグラフ法及び三次元蛍光光度法（3-DEEM）などを用いて検討した．
琵 琶 湖 水 DOM の ゲ ル ク ロ マ ト グ ラ ム（Ex/図1

Em=340/435 nm） に は 3 つ の ピ ー ク，Peak 1

琵琶湖における COD および BOD の経年変化○ COD，● BOD，△ COD − BOD（RT=30 min），Peak 2（RT=32 min）及び Peak

京都工芸繊維大学名誉教授＊

第 338 回京都化学者クラブ（平成 30 年 8 月 4 日）講演

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3（RT=35 min）が検出され，これらのピークのあるが， ．

由来のものは分解しやすく，分子量はそれぞれ 5‒10 kDa，3‒5 kDa，3 kDa 未藻類の種類により生分解性や分子量が異なること満と見積もられた．土壌フルボ酸（FA）は，特が分かった．琵琶湖北湖では，寒天質状の細胞外に Peak 1 の蛍光強度が高く，琵琶湖水中のフル多糖類（粘質鞘）を有する藻類種が増加し，粘質ボ酸様蛍光物質に含まれる 5‒10 kDa の物質は土鞘の一部が難分解性有機物に変化しているとの報壌 FA が寄与していると推測される．一方，植物告がある．これらの結果より，琵琶湖の難分解性プランクトン培養時における藻類由来 DOM のフ有機物の増加には内部生産の藻類由来の難分解性ルボ酸様蛍光物質のゲルクロマトグラムでは，3DOM の寄与が大きいと推測できる．

種類の藻類とも Peak 3 の蛍光強度が最大となる

3．定量リアルタイム PCR を用いる藻類のことから，藻類由来 DOM は分子量 3 kDa 以下の物質の割合が大きく，土壌 FA よりも低分子量影響評価

である．琵琶湖水中 DOM のフルボ酸様蛍光物質

藻類が難分解性 DOM に与える影響を明らかにには，Peak 1 と Peak 3 が共に検出されることかするためには，藻類の生態をモニタリングし，そら，その起源には，土壌 FA と藻類由来 DOM のの量を把握する必要がある．しかし，現在藻類の両方が寄与していると推測される .

モニタリングは顕微鏡による形態学的分類に基づ

藻類由来 DOM を 3-DEEM で測定すると，3 種いた直接計数法が主で，非常に時間と労力が掛かの藻類共に 2 つのフルボ酸様蛍光ピークと 1 つのる上，形態学的に類似した種の区別が困難など

タンパク質様蛍光ピークが検出され，フルボ酸様様々な問題がある．そこで，種特異的なプライ蛍光物質は土壌 FA と蛍光特性は同じだが主に親マーを用いた定量リアルタイム PCR（polymerase

水性であり，タンパク質様蛍光物質は主に疎水性chain reaction）による藻類の分子認識に基づくである．琵琶湖北湖で成層期に表層付近で DOC同定・定量法について検討した．

濃度が高くなるのは，主に親水性有機物の増加に赤潮やアオコのモニタリングのため，有害な藻よるためであり，藻類由来 DOM の大半が親水性類から DNA 抽出後にリアルタイム PCR 分析をDOM であることから，成層期の DOC 濃度の増行い，その原因藻類の同定・定量に適用されてい加は植物プランクトンの増殖に伴う藻類由来有機る物の増加が関与していると考えられる．また，藻琶湖水中の植物プランクトンの分子分類による識類 由 来 有 機 物 の THM 生 成 能 は．

別について検討し，＞ ．の順で，藻類同定・定量について報告している＞ ．

．石川らは，リアルタイム PCR を用いて琵

2‒5）などの．

6, 7）の種類によってかなり異なり，土壌起源のフミン

PCR とは DNA の熱変性，プライマーのアニー物質の THM 生成能より低い値を示した．培養時

リング，DNA の伸長反応を 1 サイクルとし，この．のサイクルを繰り返し行うことで，DNA の特定由来 DOM を分画すると，親水性有機物の領域を増幅させる技術であり，種特異的なプライ．

， ．

及 び

存在割合はそれぞれ 61.6，81.4 及び 85.6％であり，親水性 DOM の割合が大きい．疎水性の土壌 FA

DNAに対し，藻類由来フルボ酸様蛍光物質は親水性でプー

分子量も低く異なる特性だが，藻類の種類に関係ー ンなく大部分が土壌 FA と同様に難分解性である．
一方，タンパク質様蛍光物質は， ．と．

由来は比較的難分解性でTransactions of The Research Institute ofOceanochemistry Vol. 32 No. 1, Apr., 2019

図261

PCR の原理

マーを用いることで目的の DNA のみを増幅させる（図 2）．リアルタイム PCR 分析は PCR による増幅産物量をリアルタイムに解析する方法で，S

reen

従来の電気泳動に基づいた PCR 法よりも定量的，高感度かつ正確である．リアルタイム PCR 分析による増幅曲線を図 3（A）に示す．この増幅曲線に対し，PCR 増幅量の閾値を設定した場合，そ の 閾 値 と そ れ ぞ れ の 増 幅 曲 線 が 交 わ る 点，
Threshold Cycle（Ct 値 ） が 決 定 で き る， 鋳 型

図4DNA 量と決定した Ct 値をプロットすると検量インターカレーション法の原理線が得られ，未知試料の鋳型 DNA 量を求めるこ

湖の植物プランクトンネット試料に適用した ．とができる（図 3（B））．鋳型 DNA 量の代わり藻類の培養液を純水で希釈した細胞密度系列のに細胞密度を用いることができる．リアルタイム

検量線用試料，培養試料，植物プランクトンネッ

PCR における DNA の検出法には，インターカ

ト試料について，DNeasy Plant Mini Kit を用いレーション法やハイブリダイゼーション法などがて DNA 抽出した． 2 mL バイアルの約 1/3 量にある．インターカレーション法とは，蛍光物質がなるようにビーズを入れ，藻類試料を 1.5 mL 加二本鎖 DNA に入り込み励起光の照射によって蛍えて蓋をし，2500 rpm で 30 秒間遠心分離して細光を発する特性を利用した手法である（図 4）．

胞のビーズ破壊を行った．破砕後の試料を ‑808）

本研究では，藻類は上述した 3 種に琵琶湖でもよく観測される珪藻類の℃ で 凍 結 し， 凍 結 後 の 試 料 を 凍 結 乾 燥 し，を

DNeasy Plant Mini Kit を用いて DNA 抽出した．

加え，4 種の藻類に特異的なプライマーを設計し，抽出後の試料は，リアルタイム PCR 測定まで

DNeasy Plant Mini Kit を 用 い る DNA 抽 出 法‑80 ℃で保管した．

（DNeasy 法）とリアルタイム PCR 分析による藻リアルタイム PCR に使用した藻類のプライ類モニタリング法を開発し，培養試料や琵琶湖北マーを表 1 に示す． ．

用のプライマーは石川らが報告しているものを用い，これA以外の藻類用のプライマーはプライマー設計ソフ
ト Primer3Plus を用いて設計し，その種特異性はBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）を用いて確認した .
PCR チ ュ ー ブ に SYBREx Taq 12.5µL，フォワード及びリバースプライマー（それぞれ 5 µM）各 1 µL，DNA 抽出液 2 µL，滅菌水
8.5 µL により PCR 反応液を調製し，初期熱変性
95 ℃で 180 秒の加熱を 1 サイクル行い，熱変性
95 ℃で 2 秒，アニーリング 58 ℃で 5 秒，伸長反応 72 ℃で 5 秒の加熱を 45 サイクル行った後，最終伸長反応 78 ℃で 60 秒の加熱を行った．閾値
（Ct 値）は，CFX manager
図3TMを用いるフィットポイント法（500RFU）により決定した．それぞPCR 増幅曲線（A）と検量線（B）

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表1ClassSpecies

使用した各藻類のプライマー

Primer nameCyanobacteria

Chlorophyceae

Cryptophyceae

Bacillariophyceae

Sequences (5'-3')Position

Product length(5'-3')(bp)

Number275

FJ461750

195

LC037445

172

AB240952

167

LC037435

Micro 2F

ATGAGCAGCCACACTGGGAC

252-271

Micro 2R

AGACTTGGCTGACCACCTGC

507-526

STAU 1F

GGTCTGCCTACCGGTTGATAC

610-630STAU 1R

GGTCCCGAAGACCAACACAA

785-804

Crypto 1F

AAGCAGGCTGTTGCTTGAAT

638-657

Crypto 1R

TGCTTTCGCACAAGTTCATC

790-809

Frag 2F

GGGCCTTTACAGGTCTGGCA

426-445

Frag 2R

ACGGCCCATCCACAAATCCA

573-592

GenBankれの測定は 3 回行い，融解曲線分析は，60〜95

る直接計数法と比較した（図 6）． ．

℃で行った．PCR 生成物はアガロースゲル電気

細胞密度は両法で良い一致を得たのに対し，他の泳動により確認した．

3 種の藻類の細胞密度はリアルタイム PCR 分析

藻 類 の 細 胞 密 度 と Ct 値 と の 間 に は，， ．

， ．のの方がやや高かったが，いずれも細胞密度の増減及びは同様の変化を示した．リアルタイム PCR 法を．

について，それぞれ細胞密度，2.7

植物プランクトンネット試料中の藻類種の細胞密10 ‑ 2.7

10 ，8.2

度定量にも適用し，良い結果が得られた．

22.1

10 ‑ 8.2710 及び 4.610 ‑10 cells mL の範

しかし，DNeasy 法による DNA 抽出では，琵囲で直線性が得られ，この細胞密度範囲での定量

琶湖北湖のように水中の藻類の細胞密度が低い試性が示された．PCR 効率値は， ．

料には適用できず，細胞の DNA だけでなく，細4．

10 ‑ 4.610 ，2.143， ．

5-1，及び ．

胞外の DNA を検出する可能性があった．そこで，に対し，それぞれ 117，87，66 及び 84% であった．

より高感度で簡便な DNA 抽出法として，メンブ

さらに，リアルタイム PCR 法では，他の藻類やレンフィルター上に捕集した藻類細胞から DNA湖水に含まれる浮遊物質（SS）などの影響は小抽出（フィルター法）後，リアルタイム PCR 分さかった（図 5）．リアルタイム PCR 法を培養期析する方法を開発し，琵琶湖北湖でこれら藻類の間の藻類種の細胞密度定量に適用し，顕微鏡によ鉛直分布や月変化など動態解析に適用し良い結果を得た ．
9）50

4．終わりにCt value40琵 琶 湖 北 湖 で は 1985 年 以 降， 難 分 解 性 の30

DOM の増加が問題となっており，フミン物質と20

藻類由来 DOM などが原因であることがわかって10きた．
琵琶湖での藻類の増加は，親水性有機物のみで00

図5246log cell density (cells mL-1)なくフミン物質（疎水性酸）の増加にも寄与する．

8

藻類由来 DOM は主に親水性だが，藍藻類や珪藻類由来 DOM は 30% 程度が疎水性である．藻類の Ct 値と細胞密度の関係
単独 ; ● ,とが共存する場合 ,琵琶湖水希釈系 : ▲ ,単独
純水希釈系 : ● ,Transactions of The Research Institute ofOceanochemistry Vol. 32 No. 1, Apr., 2019由来のフルボ酸様蛍光物質は土壌 FA と同様の蛍光特性をもつが低分子量（主に 3 kDa 以下）で，63図6

培養期間における 4 種の藻類の細胞密度の直接計数法（赤棒グラフ）とreal-time PCR 法（青棒グラフ）との比較
（a）
,（b）
,（c）
,（d）

藻類の種類に関係なく大部分が難分解性である．

3）R. Kamikawa, Y. Sako, Nippon Suisan

一方，タンパク質様蛍光物質は 30 kDa 以上の高Gakkaishi, 73, 299‒301 (2007).

分子量のものが約 90% 以上であり，藻類の種類

4）N. Tomioka, T. Nagai, T. Kawasaki, A. Imai,

により分子量や分解性が異なる．琵琶湖表層部でA. K. Matsushige, K. Kohata, Microbes andは，太陽光によるフミン物質の蛍光強度の減少とEnvironments, 23, 306‒312 (2008).

低分子化が生じている．難分解性であるフミン物

5）T. Yoshida, R. Nakai, H. Seto, M. K. Wang,質（フルボ酸）の底質からの溶出も明らかになっ

M. Iwataki, S. Hiroishi, Microbes andてきたので，その底質での機構解明が求められる．

Environments, 18, 216‒222 (2003).

藻類由来及び琵琶湖水のタンパク質様蛍光物質に

6）K. Ishikawa, S. Hosoi-Tanabe, Y. Sako: Verh.

ついても二次元電気泳動や MALDI-TOF-MS にInternat. Verein. Limnol., 29, 1103‒1106

より同定してきたが，未だ不明な点も多い．環境(2005).

水中 DOM への藻類の寄与を解明するには，藻類

7）石川可奈子：湖沼のプランクトン分子分類にのモニタリングが重要であり，ここで述べた種特基づく識別とモニタリングへの適用，科学研

異的なプライマーを用いる定量リアルタイム

究費補助金研究成果報告書（2011）．

PCR による藻類の同定・計数法は有効な藻類モ

8）H. Mizuguchi, Soh Fujii, Shiori Fujii, R. Higa,

ニタリング法と言え，今後の発展が期待される．

K. Ishikawa, K. Hayakawa, T. Okamoto, Y.
Fuse, H. Karatani, E. Yamada, Limnological

参考文献
1）山田

Study, 5, 3‒12 (2018).
悦，水口裕尊，布施泰朗，陸水研究，

9）藤井6，21‒30（2019）．

颯リアルタイム PCR を用いる琵琶湖北湖における藻類の動態解析，2017 年度

2）R. Kamikawa, J. Asai, T. Miyahara, K.

京都工芸繊維大学大学院工芸科学研究科機能Murata, K. Oyama, S. Yoshimatsu, T.

物質化学専攻修士論文（2018）．

Yoshida, Y. Sako, Microbes andEnvironments, 21, 3, 163‒173 (2006).

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