［研究報告］

ラジカル消去活性の測定法とヤマブドウ抗酸化性に関する研究
小浜恵子＊、岸 敦＊、米倉 裕一＊＊、大澤 純也＊、澤井 秀幸＊＊＊、長澤 孝志＊＊＊

簡便、高感度かつ多試料を測定可能なラジカル消去活性測定法を確立するため、DPPH ラジカル消去活性、リノール酸メチルペルオキシド生成抑制、oxygen radical absorbance capacity (ORAC)を利用して検討し、ヤマブドウを試料として実際に測定を行った。ラジカル消去活性は試料のポリフェノール含量とほぼ比例し、いずれの方法でも試料間の差を検出することが可能であった。ORAC は検出感度が非常に高く、1000 倍に希釈した試料での検出が可能であった。また、試験管内でのタンパク質の非酵素的糖化抑制を測定したところ、ヤマブドウジュース搾汁残滓の効果が非常に大きかった。
キーワード：ラジカル消去活性、ヤマブドウ、糖化変性

Estimation of Radical Scavenging Activities Using Various Methods
and Antioxidant Activity of Wild Grapes (Vitis coigenetiae)
KOHAMA Keiko, KISHI Atsushi, OHSAWA Junya,
SAWAI Hideyuki and NAGASAWA Takashi
To develop simple and sensitive methods for measuring radical scavenging activities, evaluation
was done using three different analyses: DPPH radical scavenging activities, AAPH-induced lipidoxidation and oxygen radical absorbance capacity (ORAC). Each of the methods were useful for
screening, in particular, ORAC was suitable to test for small amounts because of the high sensitivity.
Using these methods, juice and wine made from wild grapes (vitis coigenetiae) were measured, and theactivities were correlated to polyphenol contents. Skin-seed mixture, after squeeze, showed the highest
activity in these methods. In addition, skin-seed mixture strongly prevented production glycated protein
as well as G-rutin in vitro.
key words : radical scavenging activity, wild grape, glycation
１ 緒法 1)、電子スピン共鳴（ESR）により活性酸素種を測定する方言

生体内で発生する様々な酸化ストレスは生活習慣病発症

法 1)、ラジカルにより進行する不飽和脂肪酸の酸化を、生じに大きく関わっており、酸化ストレスに関与する活性酸素種

る脂質ヒドロペルオキシド量で測定する方法 2)などが用いら等を生体内で防御可能な食品への期待は大きい。たとえば、れている。ESR は直接ラジカルをみるものであるが、他のほお茶のカテキンや赤ワインのポリフェノールなどラジカル消

とんどはラジカル消去活性を間接的に測定しており、通常は去能を有する食品素材が酸化ストレスを低減するものとして２つ以上の原理に基づく方法で測定し総合評価することが多注目されている。

い。

食品素材中のラジカル消去作用は様々な方法によって測本報告では、岩手県内の農林水産物中から高いラジカル消定されている。有色の安定ラジカル DPPH の退色を測定する方去活性を有するものを検索して有効利用するため、多種試料＊
応用生物部（現在＊＊ 醸造技術部＊＊＊岩手大学農学部食品技術部）

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岩手県工業技術センター研究報告第１０号（２００３）を簡便に評価可能な３種類の測定法構築を試みた。試料とし流速 1ml/min、検出波長、234nm。生成量は試料無添加時のリてはヤマブドウを用い、必要量や感度の検討を行った。また、

ノール酸メチルヒドロペルオキシドピークエリア値を 100 と深刻な糖尿病合併症を引き起こす、タンパク質の非酵素的糖して生成率で表示した。メタノールに溶解したα―トコフェ化反応の抑制についても比較検討を行ったので報告する。

ロールを対照として用いた。
Oxygen radical absorbance capacity (ORAC)を指標としたラジカル消去活性は Cao らの方法 5)に準じて測定した。0.2nM

２ 実験方法のβ‑phycoerythrin(75mM リン酸緩衝液 pH7.0)を 170μl、96２−１ 分析試料
試料として、岩手県林業技術センターで選抜された７系統穴プレートに分注し、試料を 100 倍、1000 倍に希釈して 10のヤマブドウ（涼実紫 1,2,4,5 号、川井 1、衣川、山形 2）をμl 添加した。対照として、2, 0.2, 0.02mM の Trolox を添加

除梗後、圧搾、加熱抽出したジュース、破砕後に種皮とともした。37℃にて 10 分間静置後、0.2M AAPH を 20μl 加え、2に通常通りかもし仕込みを行ったワイン及び圧搾残滓を用い時間後に蛍光イメージアナライザー（FMBIOII、宝酒造製）にた。圧搾残滓は適量の水を添加して抽出した後、凍結乾燥しよりラジカルによる蛍光退色の防止作用（Ex:532nm,検出フィて得た粉末を 0.2mg/ml となるように水に溶解して用いた。参ルター605nm）を測定した。

考として市販のヤマブドウジュースも試料とした。

２−４ 糖化タンパク質生成抑制能の測定
糖化タンパク質生成抑制能は次のように測定した。

２−２ 総フェノール及びアントシアニン含量の測定
総フェノール量は Folin‑Denis 法により測定し、没食子酸

BSA‑Fructose 溶液（20mg/mlBSA、500mM fructose、0.2g/l NaN3、相当量として算出した。アントシアニンモノマー含量は、200mM P‑K buffer(pH7.4)）を試験管に 3.96ml 分注後、試料

3)

Wrolstad らの方法 により測定した。ジュース、ワイン試料を 40μl 加え 37℃で 5 日間インキュベートした。対照としてを75倍に希釈してpH1.0及びｐＨ4.5における520nmと700nmは水溶性のＧ−ルチン（東洋製糖）を用いた。Control にはの吸光度から cyanidin‑ 3‑glucoside 相当量として算出した。

200mM P‑K buffer を加えた。インキュベート終了後、氷冷し２−３ ラジカル消去活性の測定

た20%TCA を4ml 加えて混和、遠心分離によって沈殿を回収し、ラジカル消去活性は原理の異なる以下の方法で測定した。

さらに 10%TCA で２回洗浄した後、200mM P‑K buffer７ml に有色ラジカルである DPPH の消去活性は木村らの方法 4)に準じ完全に溶解させた。生成した糖化タンパク質は蛍光強度によて測定した。試料を 5,10,25,50 倍に希釈して 96 穴プレートって測定し（Ex 350nm, Em 425nm）、Control を０としたときに 10μl ずつ分注したものに 50% (V/V)エタノールに溶解しの生成阻害率で表示した。

た 200μM DPPH (1,1‑ diph‑ enyl‑2‑picrylhydrazol, ナカライテスク）を 185μl 加えて５分間振とうした。マイクロプレ

３ 結果および考察ートリーダーにより 550nm の吸光度を測定しラジカル消去に

３−１ 試料中の総フェノール含量と DPPH ラジカル消去活よる退色活性を没食子酸相当量として表示した。試料は３点性分析した平均値とした。

図１にヤマブドウ試料の総ポリフェノール量およびアント脂質酸化の抑制活性についてはモデルとしてリノール酸メシアニンモノマーの占める量を示した。ヤマブドウのアントチルを用いた。試料 160μl に,リノール酸メチル 132μl 及びシアニンは malvidin‑3,5‑diglucoside が主であると報告さ50mM リン酸緩衝液（pH7.4, tween20 を 1.2%含む）8 ml を加れているが、本報告では cyanidin ‑3‑glucoside のモル吸光えた。Vortex により２分間混合後、超音波によりミセル化し係数を便宜上用いた。図２には DPPH ラジカル消去能を示した。

た。
2 ml をガラスバイアルにとり、ラジカル開始剤として 0.2M

総ポリフェノール量と DPPH ラジカル消去活性は、ほぼ比例しAAPH (2,2’‑ azobis(2‑amino‑proppane) dihydrochloride)ていた。ただし川井１、山形２は総ポリフェノールが比較的100μl を加えて 37℃、３時間振とうした。反応液をメタノー高いものの、ラジカル消去活性は他と比較してやや低めであルで 20 倍に希釈し、HPLC によってリノール酸メチルヒドロった。DPPH ラジカル消去活性は、アントシアニン量よりもポペルオキシドを以下の条件で定量した。カラム、Waters

リフェノール量と相関すると報告されており、これらはアンSymmetry C18 5μ 3.9×150mm、
溶媒、水：メタノール（20:80）、トシアニンモノマーの占める割合が高いことが原因と思われ

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ラジカル消去活性の測定法とヤマブドウ抗酸化性に関する研究

圧搾抽出物
圧搾抽出物

圧搾残滓

山形（ワイ山形（ワインン））

山形(ワイ ン ）涼実紫２（ワイ涼実紫２（ワインン））

涼実紫2（ワイ ン ）川井1（ワイ
川井1（ワインン) )川井1（ワイ ン )

市販品
市販品

市販

山形2
山形2

山形2

衣川
衣川

衣川

川井１
川井１

川井１

涼実紫5
涼実紫5

涼実紫5

涼実紫４
涼実紫４
涼実紫２
涼実紫２

涼実紫４

涼実紫１
涼実紫１

涼実紫２00

1000
1000

2000
2000

3000
3000
mg/l
mg/l

アントシアニンアントシアニン

4000
4000

5000
5000

6000
6000

涼実紫１

0200

400

600

800

1000

galic acid(μg/ml)

ポリフェノール
ポリフェノール

図１ ﾎﾟﾘﾌｪﾉｰﾙ・ｱﾝﾄｼｱﾆﾝ含量

図２ DPPH ラジカル消去活性（没食子酸相当）に涼実紫 5 号と 2、4 号とのラジカル消去活性の差も検出可能る。しかし、これらは色調が濃くジュース向きとして期待さであった。蛍光イメージアナライザーの感度を 1/2（感度２れており、他と比べて劣るものではない。市販品のヤマブド５％）に落とした時の 100 倍に希釈した試料と Trolox の比較

ウジュースでは長期間貯蔵されるため、アントシアニンモノ

結果は、ヤマブドウジュースが 0.02mM Trolox と同等以上のマーはほとんど検出されなかった。圧搾残滓抽出液は多量の消去活性を持つことを示しており、圧搾残滓抽出液はそれ以ポリフェノールを含んでいた。

上の活性を有していた。多検体を処理可能で、感度が非常に３−２ 各測定法によるラジカル消去活性の比較高いことから、スクリーニングや活性物質の分画に有効と思

圧搾残滓抽出液、および涼実紫 2、4、5 号のヤマブドウジ

われる。蛍光プレートリーダーを用いれば、定量測定も可能

ュースを用いてリノール酸メチルヒドロペルオキシド生成抑である。

制によるラジカル消去活性を測定した結果をα―トコフェロ

以上のことから、これら２種の方法は、DPPH ラジカル消去ールの濃度 25, 62.5, 125μg/ml とした場合とともに表１に活性と同様に有効な測定方法であり、併用することでより正示した。圧搾残滓、ヤマブドウジュース系統間とのラジカル確なラジカル消去活性を評価可能であると考えられる。

消去活性の差はこの手法でも測定可能であった。
また、同サンプルの ORAC を指標としたラジカル消去活性を

１）試料の配置（各３）解析した結果を図３に示す。ラジカル消去活性を有するもの

Control
210 倍涼実紫２310 倍涼実紫２として Trolox を対照とし、試料の代わりに水を添加し0.02mM Trolox
210 倍涼実紫４310 倍涼実紫４0.2mM Trolox
210 倍涼実紫５310 倍涼実紫５Control とした。1,000 倍に希釈した試料でラジカル消去活性が検出可能であり、残滓とヤマブドウジュースとの差、さら２）検出感度５０％

表１ ヒドロペルオキシド生成による測定
ﾋﾄﾞﾛﾍﾟﾙｵｷｼﾄﾞ生成率(%)
Control
αﾄｺﾌｪﾛｰﾙ 125μg/ml
αﾄｺﾌｪﾛｰﾙ62.5μg/ml
αﾄｺﾌｪﾛｰﾙ25μg/ml
圧搾残滓
涼実紫5涼実紫4
涼実紫2100.046.152.558.243.644.548.047.0３）検出感度２５％

図３ ORAC による測定

792mM Trolox
2
10 倍圧搾残滓310 倍圧搾残滓岩手県工業技術センター研究報告第１０号（２００３）

３−３糖化タンパク質生成抑制活性
ルチン 5ｍＭ３−１で測定に用いた試料を用いて糖化タンパク質生成抑

ルチン 10ｍＭ

制活性を測定した結果を、Ｇ−ルチンを用いた場合とともに圧搾残滓
山形（ﾜｲﾝ）

図４に示した。ジュースの抑制活性の差は DPPH ラジカル消去

涼実紫２（ﾜｲﾝ）
川井1（ワイ ン )活性と同様の傾向を示した。ワインの総ポリフェノールはジ市販
山形2ュースよりも低いが（図１）、糖化抑制はむしろ高い値を示し衣川
川井１た。また、圧搾残滓抽出液の活性が飛び抜けて高いことから、

涼実紫5

種子中フェノール化合物の抑制活性が高いものと推察してい涼実紫４涼実紫２る。対照として用いた抗酸化性を有するＧ−ルチンは糖尿病

涼実紫１Controlの病態として体内に蓄積する糖化タンパク質（後期反応生成020物：advanced glycation end products）の生成を in vivo

406080100抑制率（％）

で抑制すると報告されている。そのメカニズムの１つはラジ
図４ 糖化タンパク質生成抑制

カルの消去と考えられている。10mMＧ−ルチンよりも高い抑6)制活性を圧搾残滓抽出物は有しており、澤井ら によれば本報告で用いた圧搾残滓抽出物を糖尿病ラットに摂取させた場

ドウ圧搾残滓中の高活性成分の分析と利用について検討を進合、肝臓と腎臓における糖化タンパク質の生成を抑制する興める予定である。
本研究は県林業技術センター特用林産部との共同研究にお味深い結果を得ている。今後、さらに検討をすすめる予定でいて、供与いただいたヤマブドウを用いて実施したものであある。

り、関係各位に深く御礼申しあげます。
４ 結言文

岩手県内の農林水産物の有効利用のため、多試料を同列に献

1)篠原和毅、鈴木建夫、上野川修一編：食品機能研究

比較評価可能な３種類のラジカル消去活性測定法の構築を試法、光琳、（2001）

みた。DPPH ラジカル消去活性、リノール酸メチルペルオキシ2)五十嵐脩、島崎弘幸編：過酸化脂質・フリーラジカ

ド生成抑制、oxygen radical absorbance capacity (ORAC)

ル実験法、学会出版センター（1995）

を利用して検討し、ヤマブドウを試料として実際に測定を行った。ラジカル消去活性は試料のポリフェノール含量とほぼ

3)Wrolstad, R. E. : Current Protocols in Food Analytical

比例し、いずれの方法でも試料間の差を検出することが可能

Chemistry, John Wiley & Sons (2001)
4)木村俊之、山岸賢治、鈴木雅博、新本洋士：日食工誌 49, 257であった。ORAC は検出感度が非常に高く、1000 倍に希釈した試料での検出が可能であった。また、試験管内でのタンパク(2002)
5)Cao, G., Verdon, C. P., Wu, A. H. B., Wang,H.:Clin. Chem.,

質の非酵素的糖化抑制を測定したところ、ヤマブドウの圧搾41, 1738(1995)

残滓抽出物は顕著に抑制していた。今後、構築した評価方法

6)澤井秀幸ら：日本栄養・食糧学会大会講演要旨集(2003)

を用いて食品素材のスクリーニングを行うとともに、ヤマブ80