［研究報告］

アルコール耐性清酒酵母の取得と醸造特性
小浜恵子 、伊藤山本＊忠 、櫻井＊良仁 、米倉裕一 、廣純也＊、大澤＊＊＊＊＊

高濃度のアルコール存在下で増殖可能であり、耐性を示す清酒酵母の効率的な取得を実施し、醸造特性について検討した。協会701号酵母を変異処理した後、胞子形成培地で生育良好なものを選択し、15％エタノールを含むYPD培地にレプリカし、さらに20％エタノールを含むYPD培地で生育可能なものを釣菌した。取得した菌株の麹エキス培地でのエタノール生産性及び生育を調べたところ、2/3以上が親株より良好であり、2株は20％エタノール存在下での生存率が親株の100倍以上であった。取得した2株を用いて小仕込み試験を実施した結果、もろみ後半での酵母の生存率が親株より高く、ボーメの切れも良い傾向が見られた。
キーワード：清酒酵母、アルコール耐性、清酒醸造

Isolation of Ethanol-Tolerant Sake Yeasts and Characterizationof BrewingKOHAMAKeiko, ITO Yoshihito, YONEKURA Yuichi,YAMAMOTO Tadashi, SAKURAI Hiroshi and OHSAWA Junya
Weattemptedtoisolate ofsakeyeastthatwasabletogrowinthemediumcontaining20%ethanol.
Saccharomyces cerevisiae Kyokai No.701 was treated with ethyl methansulfonate, and incubated on
sporulationmediumfornitrogen starvation. Colonies appeared onthemediumwerereplicated onto YPD
agarmedium addedwith20%ethanol.Themutantsthatcouldgrowonthemediumwereselected,and17
mutants had abilityofethanolproducingmorethanparentstrain. Amongtheisolatedstrains,5-8and 6-1
showed high cell viability in the 20% ethanol solution. In a small sake brewing test, the fermentation
progressed similarly for 5-8, 6-1andparentstrain. Activities of cells in moromi measuredby methylene
blue stainingshowed 5% activefortheboth mutants and15%activeforparentstrain.Aminoacidityand
totalacidityhadnodifferencebetweensakemadewiththesestrains.
keywords： sakeyeast,ethanoltolerance
１緒

言

清酒酵母はもろみ末期において自己生産したエタノして実用化されている。秋田ら 2 ) は、より長鎖アルコールであるイソアミルアルコール耐性株から効率的にエールにより増殖が止まり、さらには死滅し自己消化するタノール耐性酵母が取得できるとしている。また、これことに従い、アミノ酸度、酸度、着色などが進んで製成らのエタノール耐性株がキラートキシン耐性を示すこと酒の品質が劣化しやすくなる。このため高エタノール濃を利用して、朝田らはエタノール耐性株を取得している度でも増殖可能な酵母で、もろみ中でも高いエタノール

３）耐性を示すものが望まれる。エタノール耐性酵母は原ら母を選択すると高濃度エタノール存在下でも増殖可能なによって協会 7 号酵母から分離され、協会 11 号酵母と株が取得できるとしている。エタノール耐性には、

1)

＊

応用生物部

＊＊

醸造技術部

。また、伊野本ら４）は窒素飢餓培地で耐久性の高い酵

岩手県工業技術センター研究報告
１）高濃度エタノール下での生存性、２）高濃度エタノ第７号（２０００）

遠心分離により上槽した。

ール下での発酵性、３）高濃度エタノール下での増殖性製成酒の一般分析及びメチレンブルー(MB)染色率の測が考慮される。本研究においては前述したようなエタノ定は、国税庁所定分析法注解５）に従った。エタノールはール耐性酵母の取得法に加えて、エタノール耐性の３つ２−３に準じ、有機酸はカルボン酸分析計（S‑3000、東の要素を備えるような選抜方法を設定し、エタノール耐京理化製）で測定した。

性株を取得し醸造特性について検討した。
３２２−１

実験方法

結３−１

果

変異株の分離と生育及びエタノール生成能

実験方法で述べたように胞子形成培地で３週間培養し、供試菌株及び培地

協会酵母701号を親株として用いた。酵母の培養には、15 ％ YPD 培地にレプリカし、さらに 20 ％ YPD 培地にYPD培地（1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グルコレプリカして 200 株を得た。生育良好な 70 株を用いてース）を用いた。窒素飢餓培地としては、胞子形成培地増殖及びエタノール生成を測定した。培養１１日目の結（Mclary medium, Sharmans medium）を用いた。高濃度

果を図１に示した。

エタノール存在下で増殖可能な突然変異株の分離にはエ

ｸﾚｯﾄ単位

タノールを15％または20％含んだ YPD培地（15％及び20400.0％ YPD培地）を用いた。また、エタノールの生産性及び350.0
親株生存率の測定には麹エキス培地を用いた。以上の培地は必要に応じて、２％寒天を加えた平板培地とした。
２−２

高濃度エタノール下増殖可能な変異株の分離

10mlのYPD液体培地に協会701号酵母を植菌し、30℃、一昼夜培養後、滅菌水で２回洗浄した菌体に突然変異処

300.0

濁度

250.0
200.0
150.0
6.00

6.50

7.00

7.50

8.00

8.50

9.00

9.50

10.00

10.50

エタノール濃度（％）

理を施した。突然変異処理は、5％エチルメタンスルフォン酸（EMS)を含むリン酸緩衝液（pH 7）で30℃、45分

図１

変異株の増殖とエタノール生成間処理を行った。6％チオ硫酸ナトリウムでEMSを中和後、処理菌体を２回洗浄してYPD液体培地にて30℃、一昼夜培養した。次に、培養液を胞子形成培地に塗抹し、22℃、約 50 株についてはエタノール生成能が親株よりもすぐれ、うち 17 株については生育も良好であった。

3週間培養後、生育したコロニーを15％ YPD平板培地にレプリカし、30℃、２日培養後、さらに20％ YPD平板培地にレプリカして生育良好な株を釣菌した。

３−２

高濃度エタノール下での生存率分離した 50 株から特に生育とアルコール生成能の高かった 17 株を実験方法に従って１週間 20 ％エタノー

２−３

増殖とアルコール生成能及び高濃度アルコールル存在下においた時の生存率を表１に示した。
親株を含めたほとんどの変異株が死滅していたが、下での生存率取得した変異株を麹エキス培地（Brix 10)で30℃、205-8 及び 6-1 株の生存率が非常に高かった。

時間前培養後、麹エキス培地（Brix 20)に植菌し、15℃での増殖をクレット計を用いて測定した。11日後のエタ

３−３

清酒小仕込み試験

ノール生産量をガスクロマトグラフィー（HP5890 ヒュ取得したアルコール耐性酵母 5-8 及び 6-1 株を用い、ーレットパッカード社製）を用いて、国税庁所定分析法親株である協会 701 号を対照として清酒小仕込み試験

注解５）に従い測定した。

を行った。CO2 発生にともなうもろみの重量減少による高濃度エタノール中での生存率は、20％エタノールを6

発酵経過を図２に示した。

含む麹エキス培地（Brix 16）に2.0×10/mlとなるよう親株である協会701号酵母と変異株では発酵経過にはに植菌し、15℃、１週間静置培養後の生菌数を測定した。

差がないことが示された。もろみ後半では変異株の方が発酵力が強い傾向が見られた。もろみ日数２１日目の製２−４

小仕込み試験

成酒の一般成分を表２に、有機酸組成を表３に示す。

難波ら６）の方法に従った。選抜した変異株を使用し、変異株 5-8 及び 6-1 は親株にくらべてボーメの切れが総米１ｋｇ（精米歩合 70%）の３段仕込みで行った。仕よい傾向にあった。酸度、アミノ酸度ともに変異株と親込温度は水麹、初添、踊りを15℃として仲添12℃、留添株にはほとんど差がみられない一方で、上槽時のメチレは10℃となるように仕込を行い、留後２日目より品温をンブルー染色率は変異株が約 5%、親株が 15%であり生一日に１℃づつ上げ、最高品温を15℃となるようにした。

存率は明らかに変異株の方が高かった。有機酸組成はCO発生に伴うもろみ重量の減少が300ｇになった時点で26-1 に関してはリンゴ酸が若干高い値を示した。

アルコール耐性清酒酵母の取得と醸造特性
表１

変異酵母の高濃度エタノール下生存率

表２
菌株

菌株

生存菌数
（cells/ml)
１−１57
１−８0
１−１０0
２−８0
２−９0
４−４
32
４−５3４−６70
４−８17４−１０
10５−８
2.4×102６−１
1.0×104
６−３
8７−２
5７−４
1７−５0
７−８
6Ｋ７０１4小仕込み試験の製成酒一般分析

日本酒度 酸度

ｱﾐﾉ酸度 ｱﾙｺｰﾙ CO 2 発生

MB染色率(ml)

(ml)

(%)

(g)

(%)

5-8-52.9

2.518.0300

5.66-1-8

3.0

2.719.3

293

5.1701-10

2.7

2.519.029215.6

表３

製成酒の有機酸組成

菌株

有機酸（ppm)
乳酸

酢酸

リンゴ酸 コハク酸

5‑849057567643

6‑160477682783

K70155962535720

CO 2 発生量（ｇ）

それは、主にリンゴ酸、コハク酸の増大によるものであ350るといわれており ８）、ともに協会７号酵母の２倍程度ま300で増大する。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH2 ）活性250
5-86-1k701200
150
100の増大も報告されている９）。今回の取得株では酸度の増大も顕著ではなく、リンゴ酸、コハク酸が大幅には増加していない。これらのことから、既知のものとは異なるメカニズムによるものであることも推察される。協会5011 号酵母や秋田らの報告したアルコール耐性酵母はＫ047 1 1 1 4 18
もろみ日数（日）21

１キラートキシン耐性が報告されており２ , 1 0 )、今回取得した変異酵母も耐性を示すかを検討する必要がある。また、一般にアルコール耐性酵母はヒートショックタンパ

図２

小仕込み試験でのCO2 発生量

ク質などストレス耐性に関与する遺伝子群が恒常的に発現しているといわれており、中には菌体内にグリセロー

４

考察ルを 70 ％も蓄積しているものも報告されている９）。一エタノール耐性に関しては、前述したようにいくつか方、伊野本らの報告４）によれば Zymolyase に耐性を示さの変異株が取得され、性質が検討されている。しかしなないアルコール耐性酵母も取得可能であり、酸度はむしがら、メカニズムについては未だ不明な部分も多い。今ろ低くなるともいわれている。

回、胞子形成培地による窒素飢餓状態での選択と 20 ％

今回、取得した２株の変異株がどのような変異により、アルコールを含む培地による選抜で図１に示したようにエタノール耐性を獲得しているのかを検討し、既知の変効率的なアルコール耐性変異株の取得が可能であった。

異株とは異なることが証明できれば岩手県の遺伝子源と小仕込み試験の結果は実際のもろみ中でのエタノール耐して貴重であると考える。また、今回は１ｋｇの小仕込性を示唆するものであり、分離した耐性株は長期発酵をみ試験の結果であるので、今後スケールアップをした場要する製造や、あるいは発酵経過が急速で酵母の死滅が合の醸造特性の追試も必要であると思われる。

生じたもろみの救済にも使用できるものと思われる。
従来のエタノール耐性酵母についてはいくつかの特徴

５結語が報告されている。１つには細胞壁溶解酵素 Zymolyase

協会701号酵母を親株とし、高濃度のエタノール存に対する感受性の変化である。協会 11 号酵母に関して在下で増殖可能であり、耐性を示す清酒酵母の効率的なあるいは朝田らの報告３）でも Zymolyase に耐性を示し

７）取得を実施し、醸造特性について検討した。

難溶になると報告されている。今回取得した変異株につ１）胞子形成培地で生育良好なものを、高濃度エタノー

いては、まだ実験を行っていないので同様であるかはわ

ルを含む平板培地で選択することにより、効率的なエからない。しかし、既知の変異株の特徴としては、アルタノール耐性株の取得が可能であった。

コール耐性による菌体の死滅が少ないのでアミノ酸度は２）得られた耐性株のうち20％エタノール存在下での生低くなるものの、酸度が高くなる傾向が報告されている。

存率が親株の100倍以上である変異株が2株（5‑8,岩手県工業技術センター研究報告
6‑1）取得できた。

第７号（２０００）

３）朝田朝子, 内山博文, 今村武司：生物工学, 78 , 77３）5‑8及び6‑1を用いて小仕込み試験を実施した結果、発酵経過は特に差がないものの、もろみ後半での酵母の生存率が親株より高く、ボーメの切れも良い傾向が(2000)
４）伊野本真彦, 山田修, 五味勝也, 飯村

穣：醸協,93 , 224 (1998)見られた。製成酒は一般分析値に大きな差異はみられ

５）日本醸造協会：第４回改訂国税庁所定分析法注解なかった。

６）難波幸之祐, 小幡孝之, 萱島

なお、本研究は中小企業庁地域活性化連携促進事業費補助金の一環として実施されたものである。
文１）原昌道,佐々木雅春, 小幡孝之,野白喜久雄：修, 渡辺隆幸, 蓮尾徹夫, 小幡孝之, 原道：発酵工学, 68 , 95 (1990)

昌道, 溝口晴彦, 小幡孝之, 飯村

穣,戸塚昭, 野白喜久雄：醸協, 73 , 408 (1978)

８）原昌道, 小幡孝之, 佐藤俊一, 壺阪興一郎,下田高久, 野白喜久雄：醸協, 72 , 610 (1977)

醸協, 71 , 301 (1976)
２）秋田村上光彦, 下田高久：醸協, 73 ,295 (1978)７）原献進, 山崎与四郎,９）下飯昌

仁：日本農芸化学会講演要旨集,74 , p.485(2000)１０）原昌道, 山本徳雄, 深田雄一, 小幡孝之,

野白喜久雄：醸協, 71 , 564 (1976)