原著論文

診療と新薬 2023; 60: 297-307

くず餅由来乳酸菌の免疫調節機能によるスクリーニングと免疫賦活作用

診療と新薬 Web

神山恭子 1）／跡部季子 2）／上杉泰介 3）／一般社団法人くず餅乳酸菌研究所

は

じ

め

に

日本古来の和菓子「くず餅」は和菓子ではめずら
しい発酵食品である。その製法はグルテンを取り除球細胞系 THP-1 細胞を用いて免疫調節の代表的な因子である免疫系サイトカイン インターロイキン（以後 IL）-12，10，6 の産生量を指標に各乳酸菌の免疫調節機能についてスクリーニングした。

いた小麦でんぷんを長期間にわたって発酵・熟成す

乳酸菌の免疫調節作用に関しては，これまでマクる。その発酵の際に関与する乳酸菌のうち 20 種がロファージや樹状細胞などの免疫担当細胞を乳酸菌

すでに分離同定されている。

が刺激することにより炎症性サイトカインである

他方，発酵食品を介して摂取した乳酸菌が生体にIL-12 や IL-6 産生を促進することで Th1 細胞を活与える様々な健康効果が報告されており，間接的に性化させて Th2 細胞を抑制し，Th1/Th2 バランス

関与するプロバイオティクスとしての腸内フローラの崩れを改善する効果が多数報告されている 3）4）。

の改善だけでなく，バイオジェニックスとして直接

抗炎症性サイトカイン IL-10 の産生誘導によって免疫担当細胞と直接的な相互作用を介することによTh2 細胞を活性化するという報告もある 5）。

る免疫調節作用，抗変異原性作用などがある 1）2）。

そこで，腸管免疫系における免疫担当細胞であるくず餅にも乳酸菌が含まれるので，摂食することでマクロファージや樹状細胞のモデルとしてヒト由来

上記のような免疫賦活作用が期待できれば，感染不の培養細胞である THP-1 細胞を利用した。THP-1

安の高まる現代日本において日本人の健康に寄与す

細胞は急性単球性白血病の患者より得られた単球細ることができると考えられる。

胞であり，Phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）

そこで本稿ではくず餅由来乳酸菌 20 種の内最もで処理することにより樹状細胞化し，各種抗原の貪

免疫調節作用が高い乳酸菌のスクリーニングと，そ食細胞を獲得する。また，分化した THP-1 細胞はの抗炎症性サイトカインの産生量の定量，免疫担当

細胞表面に Tall like receptor をはじめとした抗原細胞への取り込み率の評価などを行い，くず餅由来認識を行う様々な受容体を発現しており，共存する乳酸菌の免疫調節作用について調査したので報告す乳酸菌などを認識することでインターロイキンなどる。

の細胞間の情報伝達物質であるサイトカインを分泌

Ⅰ．免疫調節作用を有する乳酸菌のスクリーニング
くず餅の原料から分離・同定した計 20 種類の乳する。そのため，当該試験において免疫担当細胞として採用することとした。
1．試験方法酸菌株のなかで最も免疫調節機能の高い乳酸菌をス

1）乳酸菌検体の調製

クリーニングするため，免疫担当細胞としてヒト単

くず餅原料から分離された計 20 種類の乳酸菌株

1）株式会社船橋屋 2）株式会社ニュートネクス 3）東京工業大学 生命理工学院
キーワード：乳酸菌，免疫，スクリーニング，免疫賦活，IL-12，IL-6，IL-10，くず餅，くず餅乳酸菌

26 （298）

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

（凍結グリセロール溶液）を MRS 液体培地（BD（−）を 100μL 添加して洗浄し，PBS（−）を取りBioscience, Difco Lactobacilli MRS Broth 5.5％）を除いた。その後，IFN- γを最終濃度 100 ng/ml に用い，液体培養を実施した。液体培養は卓上型振盪

なるよう添加した培地を 100μl ずつ加えた。

恒温槽（タイテック社製，PERSONAL-11）にて行

その後，1）において加熱処理した試料 10 μL

い，培養後培養液の回収を行った。培養条件を表 1（2.5 × 106 cells 相当）を加えた。ネガティブコンに示す。18 時間培養後の培養液は遠心分離（10,000

トロールとして 10 μL の PBS（−），ポジティブコ

xg，4℃，10 min）ののち培養上清を除き，10 mL

ントロールとして試料同様に菌体濃度を調製し，加の PBS（−）溶液に懸濁した。その後再度遠心分熱処理した乳酸菌 JCM1132 株を 10 μL（2.5 × 106

離（10,000 xg，4℃，10 min）後，培養上清を取り

cells 相当）をそれぞれ加えた。

除いて 10 mL の PBS（−）溶液に再懸濁して菌体

調 製 後，5 ％ CO2 下 の イ ン キ ュ ベ ー タ ー 内 で

懸 濁 液 を 調 製 し た。 こ の 菌 体 懸 濁 液 を Dry

37℃，24 時間のインキュベートを行った後，培養

ThermoUnit（タイテック社製，DTU-1B）にて加熱

上清を 100 μL 回収した。

処理（100℃，10 min）を実施し，試料を作成した。

4）各種インターロイキン（IL）の定量

なお，調製した各乳酸菌死菌体を含有する試料に3）において回収した THP-1 細胞培養上清 100 μL

ついてトーマ血球計算盤を用いて懸濁液あたりの乳を用いて，上清中の免疫系サイトカインである IL-

酸菌総菌数（cells/mL）を計算し，各試料の乳酸菌

12，IL-6，IL-10 の濃度を ELISA のキットを用いて8

総数が 2.5 × 10 cells/mL となるように PBS（−）

定量した。定量に用いた測定キットの一覧を表 2溶液を用いて希釈を行い，菌体濃度を調製した。

に示す。
2．結

2）免疫担当細胞 THP-1 細胞の調製
THP-1 細胞（JCRB 細胞バンク，JCRB0112.1 株）
5果

本試験ではくず餅原料から単離・同定された計について 3 回以上細胞継代を実施し，5 × 10 cells/

20 種 類 の Lactobacillus 乳 酸 菌 を 検 体 と し て 用 い

mL になるように THP-1 細胞培養用培地（RPMI1640

た。 ま た ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル と し て 乳 酸 菌培地＋ 10％ウシ血清アルブミン，100 units/mL ペ

Lactobacillus acidophilus JCM1132 を相対値算出用

ニシリン G，100μg/mL ストレプトマイシン硫酸の比較対照菌株として用いた。JCM1132 株は免疫塩）に懸濁し，96 ウェルプレート（Corning 社製，調 節 作 用 の 高 い 6）Lactobacillus acidophilus の type353046） に 懸 濁 液 を 100μL ず つ 添 加 し， さ ら に

strain であり，高い IL-12 活性を持つ菌株として知PMA を終濃度が 100 nM となるように添加した。

られている 7）8）。

37℃，48 時間，5％ CO2，暗所下のインキュベー

1）炎症性サイトカイン IL-12 産生量の定量

ターで培養を行い，THP-1 細胞を分化させた。48

炎症性サイトカインの代表的な分子である IL-12

時間後の分化後，さらに THP-1 細胞の表層たんぱ
く質等の発現誘導するために，THP-1 細胞培地用

表 1 乳酸菌の培養条件

培地に IL-4（終濃度：20 ng/mL）を添加したもの

項に培地交換を行い，37℃，48 時間，5％ CO2，暗所
3）THP-1 細胞への試料の添加調製した THP-1 細胞を前培養した培地を取り除き， フ ィ ル タ ー（ 孔 径 0.22μm） 滅 菌 し た PBS1

測定対象
IL-12
IL-6
IL-10

メーカー
R＆D Systems
BioLegend
BioLegend

条

培養規模（mL）
植 菌 量（mL）
培養温度（℃）
振 盪 度（rpm）
培養時間（hr）

下のインキュベーターで培養を行った。

表2

目

10
0.3
37
120
18

インターロイキン測定キット一覧
キット名
Human IL-12/IL-23 p40 DuoSet ELISAELISA MAXTM Deluxe Set Human IL-6
ELISA MAXTM Deluxe Set Human IL-10

件

型

番

DY1240-05
430504430604

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

27 （299）

120
100
80
60
40
20

PBS

#A-12

#A-15

#C-14

#C-6

#B-22

#A-8

#A-5

#A-4

#C-17

#A-9

#A-30

#A-13

#A-16

#A-19

#A-34

#A-35

#A-24

#A-10

#A-27

#C-7

JCM1132 株

0＊

JCM1132 株の IL-12 産生量（pg/mL）を 100 とした場合の相対値

図1

各乳酸菌の IL-12 産生量相対値（降順）（n ＝ 3）

表3

900

乳酸菌 3 菌株の IL-12 産生量（n ＝ 3）＊＊

p ＜ 0.01

800

菌株

＊＊

700

＃C-7
＃A-13
＃A-15

600
500

IL-12 産生量（pg/mL）
1回目

2回目

3回目

平均値

標準
偏差

732
135
−1

821
197
− 62

554
112
− 72

703
148
− 45

111
36
31

400
300
200

著に IL-12 産生量が高く，ポジティブコントロール

100である JCM1132 株を上回る活性をもつことが明らかになった。

0
#C-7

#A-13

#A-15

図 2 乳酸菌 3 菌株の IL-12 産生量（pg/mL）比較（n ＝ 3）

上 記 の 結 果 に 関 し， 再 現 性 を 確 認 す る た め，
IL-12 産生量の高活性→中活性→低活性がみられた
代表的な 3 株として C-7 株→ A-13 株→ A-15 株について再度 THP-1 細胞に添加し，IL-12 産生量をは抗アレルギーや感染症予防に効果的な免疫賦活作定量した。結果を図 2 と表 3 に示す。

用の高い乳酸菌のスクリーニング指標として頻繁にその結果，再現性試験を実施しても初回と同様に定量されている分子である。IL-12 のサブユニット

乳酸菌 C-7 株において顕著な IL-12 産生量が認めらのうち，より定量性の高い p-40 に関してキットをれ，中活性株である A-13 株に比べて有意に高い

用いて定量し，JCM1132 株を 100 とした場合の相IL-12 産生量を呈した。

対値として各乳酸菌の THP-1 細胞における IL-122）炎症性サイトカイン IL-6 産生量の定量

産生量を比較した。結果を図 1 に示す。菌株の違

炎症性サイトカインである IL-6 は IL-12 と同様

いにより IL-12 産生量が大きく異なり，IL-12 産生に，免疫応答や炎症反応の調節において重要な役割

量相対値を降順に並べると，菌株番号 F1805 株（本を果たしている主要な分子である。IL-6 も乳酸菌

報告内では，試験菌株管理番号

等の刺激により免疫細胞などから産生され，制御性

C-7 と呼ぶ）が顕28 （300）

診療と新薬・第 60 巻

表4

第 5 号（2023 年 5 月）

各乳酸菌の IL-6 産生量（pg/mL）（n ＝ 3）IL-6 産生量（pg/mL）

菌株番号
＃A-10
＃A-13
＃A-15
＃C-6
＃C-7
＃C-14
＃A-19
＃A-24
＃A-27
＃A-34
JCM 1132 株
PBS（−）

1 回目

2 回目

3 回目

平均値

158
0
0
0
540
−6
158
0
30
0
251
0

121
0
0
0
659
103
84
0
−6
0
176
0

−6
0
0
0
461
139
214
0
84
0
121
0

91
0
0
0
553
79
152
0
36
0
183
0

標準偏差
70
0
0
0
81
62
53
0
37
0
53
0

700
600
500
400
300
200
100

）
S（

−

株
PB

JC
M

11
32

4
A

-3

7
#

A

-2

4
#

#

A

-2

9
-1
A
#

C14
#

C7
#

5

C6
#

#

A

-1

3
-1
A
#

#

A

-1

0

0

図 3 乳酸菌 10 菌株の IL-6 産生量 （pg/mL）比較（n ＝ 3）T 細胞の活性を抑える一方で，T 細胞サブセットのIL-12 産生量が顕著に高かった C-7 株が IL-6 産生一つである Th17 細胞への分化促進を行うことによ量でも顕著に高い産生量を示し，ポジティブコント

り主に身体に侵入した細菌やウイルスなどの異物をロールである JCM1132 株の約 3 倍の IL-6 産生量を排 除 す る た め の 役 割 を 担 う。 こ の IL-6 に 対 し て示した。

ELISA キットを用いて定量し，各乳酸菌の THP-13）炎症性サイトカイン IL-10 産生量の定量

細胞における IL-6 産生量を比較した。実験工数の

抗 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る IL-10 は IL-12 や関係上，分析対象とする乳酸菌数を IL-12 の結果を

IL-6 などの炎症性サイトカインによって，増強さもとに半数に絞り込み試験を行った。結果を表 4，

れた免疫反応が過剰になった場合に引き起こされ図 3 に示す。

る，自己を構成する正常な成分までも攻撃してしま診療と新薬・第 60 巻

表5
菌株番号

第 5 号（2023 年 5 月）

29 （301）

各乳酸菌の IL-10 産生量（pg/mL）（n ＝ 3）
IL-10 産生量（pg/mL）
1 回目

2 回目

3 回目

平均値

8
3
1
2
4
2

5
1
1
10
5
10

5
4
0
3
3
3

6
3
0
5
4
5

＃A-13
＃A-15
＃C-7
＃A-34
JCM 1132 株
PBS（−）

標準偏差
1
1
0
4
1
4

表 6 乳酸菌 10 菌株の IL-12，IL-6 産生量（n ＝ 3）
菌株番号IL-6 産生量（pg/mL）

IL-12 産生量（相対値※）

＃A-10
＃A-13
＃A-15
＃C-6
＃C-7
＃C-14
＃A-19
＃A-24
＃A-27
＃A-34
JCM 1132 株

91
0
0
0
553
79
152
0
36
0
183

39
31
22
23
110
22
34
36
52
35
100

※

JCM1132 株の IL-12 産生量（pg/mL）を 100 とした場合の相対値

う自己免疫疾患などを抑制する役割を果たす。この140

ような過剰な攻撃を抑制するために，IL-10 は主に症性サイトカイン IL-12 等が調節する Th1 細胞と対比して抗炎症性の主要な働きを担う。これまでいくつかの乳酸菌は免疫賦活作用として IL-12 や IL-6等の炎症性サイトカイン産生促進だけでなく，抗炎症性サイトカイン IL-10 の産生誘導を示すことが報

#C-7

120
IL-12 産生量（相対値）

2 型ヘルパー T 細胞（Th2 細胞）から産生され，炎JCM1132
100
80
60 #A-27
#A-10
#A-19

40

告されている 。そこで，前項までで IL-12 や IL-6

#C-14
20
#A-15

産生量が比較的高かった C-7 株，A-13 株，A-15 株

09）を含めた複数の乳酸菌株に関して ELISA 測定キッ

0

200

400

600

IL-6 産生量（pg/mL）

トを用いて定量し，IL-10 産生量を比較した。
結果を表 5 に示す。

図 4 乳酸菌 10 菌株の IL-12，IL-6 産生量の相関解析

ポジティブコントロールである JM1132 株を含め今回検討に用いたすべての乳酸菌株について，ネガ

3．ま と めティブコントロールである PBS（−）とほとんど

くず餅由来の乳酸菌 20 種類の免疫調節作用を解同値であり，極めて低い IL-10 産生量であることが析した結果，乳酸菌株の違いにより免疫調節作用が明らかになった。この結果から，今回検討に用いた

大 き く 異 な る こ と が 明 ら か と な っ た。 中 で も，乳酸菌には抗炎症性サイトカインに関する調節作用

Lactobacillus に属ずる C-7 株が，免疫調節作用の有はほとんど望めないことが明らかになった。

無を測る指標の一つである IL-12，IL-6 の高い産生30 （302）

診療と新薬・第 60 巻

図5

第 5 号（2023 年 5 月）

C-7 株の推定される免疫調節作用

酸菌が取り込まれる機構が明らかになっており 13），量を示すことが認められた。
IL-12 産生量（相対値）と IL-6 産生量（絶対値）

乳酸菌株の食作用指数と IL-12 誘導能は正の相関を示す 14）。さらに取り込みにかかる因子のマスキングの相関を表 6，図 4 に示す。
上記より，くず餅由来乳酸菌のうち，C-7 株が特異的に高活性であり，ポジティブコントロールとして採択した JCM1132 株より IL-12，IL-6 産生量が高いことが明らかになった。

や取り込み阻害剤を用いることで IL-12 産生能が落ちることも報告されている 15）。
マクロファージや樹状細胞は上皮細胞の隙間に樹状突起を伸長させ，腸管腔内の乳酸菌菌体もしくはこれらの結果から，くず餅由来の乳酸菌 C-7 株

その一部を直接認識し，免疫担当細胞が乳酸菌を認が免疫担当細胞を刺激し，高い IL-12，IL-6 産生量識することでサイトカイン産生や T 細胞の分化・を誘導する免疫調節機能の高い乳酸菌として選抜さ抗体産生などが活性化すると考えられている 16）。それた。また抗炎症サイトカイン IL-10 についてはほ

こで，IL-12，IL-6 産生量の高かった C-7 株を含め

とんど産生されなかった。

た複数の乳酸株において，免疫担当細胞内への取り

C-7 株の想定される免疫調節作用を図 5 に示す。
Ⅱ．免疫担当細胞内への取り込み率の評価
免疫調節機能の高い乳酸菌はマクロファージ等の免疫担当細胞内に取り込まれることで刺激されるメ
10）

カニズムがよく知られている 。

込み率について差があるかフローサイトメトリー法
によって評価した。
1．試験方法1）乳酸菌検体の調製スクリーニングにおいて IL-12，IL-6 産生量が高活性，中活性，低活性であった C-7 株，A-13 株，

経口的に摂取された乳酸菌は腸管壁を覆う上皮細A-15 株，および A-34 株とポジティブコントロール

胞や，免疫担当細胞であるマクロファージや樹状細として Lactobacillus acidophilus JCM1132 株の計 5胞により認識される。腸管上皮細胞に認識された乳株において培養を行った。液体培養の培地・培養条酸菌は，IL-12 や IL-6 などのサイトカイン産生制御

件・洗浄法はスクリーニングと同様に行い，各乳酸による免疫調節に寄与することによって，感染防御

菌死菌体試料を作成した。

や抗アレルギー作用生体に有益な効果をもたらす11）12）

また上記にて得た死菌体を含有する試料 1 mL に

。近年の研究により，これら乳酸菌の免疫調

対 し，5(6)-CFDA, SE（ANASPEC 社 製，AS-89000）

節機能に関しマクロファージや樹状細胞による乳酸が 5 mM となるよう DMSO に溶解した蛍光標識液

菌の認識が重要であることがわかってきている。例

10 μL を添加し，30℃，1 時間，暗所下でインキュ

えば，腸管関連リンパ組織のパイエル板被覆上皮にベートした。その後，遠心分離（10,000 xg，4℃ ,10存在する M 細胞を介して，免疫調節作用がある乳min）ののち培養上清を除き，1 mL の PBS（−）

診療と新薬・第 60 巻

表7

第 5 号（2023 年 5 月）

供試乳酸菌の IL-12，IL-6 産生量（n ＝ 3）
IL-6 産生量（pg/mL）

IL-12 産生量（相対値※）

＃A-13

0

31

＃A-15
＃C-7
＃A-34

0
553
0

110
35

菌株番号

※

22

JCM1132 株の IL-12 産生量（pg/mL）を 100 とした場合の相対値

図6

THP-1 細胞内に取り込まれた乳酸菌の蛍光画像

図 7 フローサイトメトリー法による乳酸菌取り込み率

31 （303）32 （304）

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

溶液に再懸濁し，さらに 30℃，1 時間インキュベー

EC800）に取込み，蛍光標識された菌体を取り込む

トし，蛍光標識試料を作成した。

ことにより生じる細胞の蛍光シフトを検出した（使なお，調製した試料についてトーマ血球計算盤を用フィルタ：FL1，光源：λ＝ 488 nm レーザー）。

用いて蛍光標識試料あたりの乳酸菌総菌数（cells/

測定後，THP-1 細胞内への菌体の取込み率を以7下の計算式により算出し，各菌体について 3 回ずつmL）を計算し，各試料の乳酸菌総数が 5.0 × 10

cells/mL となるように PBS（−）溶液を用いて希実施した。

釈を行い，菌体濃度を調製した。
取込み率（％）＝

2）免疫担当細胞 THP-1 細胞の調製

蛍光シフトした細胞数÷全細胞数× 100

THP-1 細胞（JCRB 細胞バンク，JCRB0112.1 株）についてスクリーニング時と同様に THP-1 細胞を

2．結

調製した。

果

スクリーニングにおいて IL-12 産生量が特徴的で

3）THP-1 細胞への試料の添加調製した THP-1 細胞を前培養した培地を取り除あった乳酸菌株について免疫担当細胞内への取り込

き， フ ィ ル タ ー（ 孔 径 0.22 μm） 滅 菌 し た PBS

み率を評価した。供試乳酸菌の一覧を表 7 に示す。

（−）を 100 μL 添加して洗浄し，PBS（−）を取

1）THP-1 細胞の蛍光画像の比較

り除いた。

フローサイトメトリー法による取り込み評価直前

その後，1）において調製した蛍光標識された乳の THP-1 細胞の乳酸菌取り込みの状態を視覚的に5評価するため，蛍光セルイメージャーを用いた細胞

cells 相当）を加えた。ネガティブコントロールとの蛍光画像の取得を実施した。なお，蛍光の直前にして 10 μL の PBS（−）を加えた。

乳 酸 菌 を 取 り 込 ま せ た THP-1 細 胞 を 3 回 PBS

酸 菌 を 含 有 す る 蛍 光 標 識 試 料 10 μL（5.0 × 10

調 製 後，5 ％ CO2 下 の イ ン キ ュ ベ ー タ ー 内 で
37℃，2 時間のインキュベートを行った。
4）セルイメージャーによる蛍光画像の取得（−）にて洗浄しているため，THP-1 細胞に取り込まれなかった蛍光標識された乳酸菌体に関しては培養液中から除去されている。結果を図 6 に示す。

3）において蛍光標識された試料と THP-1 細胞をIL-12 産生量が最も高かった C-7 株と免疫担当細2 時間インキュベートした後，THP-1 細胞内に取り胞である THP-1 細胞をインキュベートした場合込まれなかった乳酸菌体を含む培養上清を取り除に，顕著に蛍光標識された C-7 株が THP-1 細胞にき，100 μL の PBS（−）で 3 回 THP-1 細胞を洗取り込まれている様子が確認された。また IL-12 産

浄した。その後，蛍光セルイメージャー ZOE（BIO-

生量が中活性である A-13 株，A-34 株に関しても

RAD 社製，1450031J1）を用いて THP-1 細胞へのC-7 株ほどではないものの THP-1 細胞に取り込ま乳酸菌体の取り込みに関する画像を取得した。

れている様子が確認された。一方で，IL-12 産生量5）フローサイトメトリーによる菌体取り込み率の評価が低かった A-15 株に関してはほとんど蛍光ラベル
された乳酸菌体を THP-1 細胞内に確認することは4）において PBS（−）で 3 回洗浄した THP-1

できなかった。この結果から，蛍光画像の確認にお細胞についてプレートに接着した THP-1 細胞を引い て，IL-12 産 生 量 と 蛍 光 標 識 さ れ た 乳 酸 菌 のきはがすために 1 mM EDTA を添加した PBS（−）

THP-1 細胞内での局在は相関する可能性が示唆さを各ウェルに 150 μL ずつ加え，マイクロプレート

れた。

ミキサー（アズワン製，NS-P）にて 5 分間攪拌した後に，各ウェルをマイクロピペッターでピペッ

2）フローサイトメトリーによる菌体取り込み率の評価

ティングすることで細胞懸濁液を回収した。その

1）と同一の THP-1 細胞を使用して，フローサイ

後，各細胞懸濁液を 40 μm のセルストレーナー

トメトリー法による THP-1 細胞内への蛍光ラベル（Falcon 製，352340）によりフィルターをろ過し，された乳酸菌体の取り込み率の定量的評価を実施し細胞懸濁液 140 μL を回収した。この細胞懸濁液

た。

140μL を フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー（SONY 製，結果を図 7 に示す。

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

33 （305）

表 8 フローサイトメトリー法による取込み率
THP-1 細胞の乳酸菌取込み率

菌株番号
＃A-13
＃A-15
＃C-7
＃A-34
PBS（−）（ネガティブコントロール）
JCM1132 株（ポジティブコントロール）

1 回目

2 回目

3 回目

平均値

標準偏差

9.5％
0.4％
35.0％
3.1％
0.1％
24.2％

10.2％
0.6％
38.8％
3.2％
0.0％
−

9.0％
0.3％
24.2％
2.6％
0.1％
−

9.6％
0.4％
32.7％
2.9％
0.1％
24.2％

0.5％
0.1％
6.0％
0.3％
0.0％
−

40
＊＊

p ＜ 0.01

＊＊

35
30
25
（％）20
15
10
5

株

）
11
M
JC

PB

S（

32

−

4
#

A

-3

7
C#

-1
A
#

#

A

-1

5

3

0

図 8 フローサイトメトリー法による乳酸菌取り込み率（n ＝ 3）

蛍 光 標 識 さ れ た 乳 酸 菌 を 含 有 す る THP-1 細 胞

関する可能性が示された。そこでこのフローサイト

は，右下の画分にライトグリーンのドットとしてカ

メトリー法による取り込み率測定を計 3 回実施し，ウントされる一方で，蛍光標識された乳酸菌を含有

それらの結果をもとに各乳酸菌の取り込み率を算出

していない THP-1 細胞は左下の画分にグレーのした。結果を表 8，図 8 に示す。

ドットとしてカウントされる。

取り込み率を定量した結果，C-7 株の 3 割以上がこれを踏まえて，それぞれの乳酸菌を添加した場

THP-1 細胞内に取り込まれている結果となり，次合のグレーとライトグリーンのドットの分布を見比に取り込み率の高かった IL-12 産生量が中活性株でべ る と，IL-12 産 生 量 が 最 も 多 い C-7 株 を THP-1

ある A-13 株と比較しても C-7 の取り込み率は有意

細胞に添加した場合に，多数のグレーのドットがラに高く，ポジティブコントロールとして使用した

イトグリーンのドットにシフトしていることが確認

JCM1132 株と比較しても取り込み率が上回る結果された。このことから，蛍光標識された C-7 株をとなった。

添 加 し た 場 合 に， 多 数 の THP-1 細 胞 が 積 極的 に

3．ま と めC-7 株を取り込んだことからこのような結果に至っ

本項では，IL-12 産生量が顕著に高かった F1805

たと考えられる。また C-7 株以外を比較すると，

株（試験内識別名：C-7 株）を中心に，それらの乳A-13 株＞ A-34 株＞ A-15 株の順に蛍光標識された酸菌において免疫担当細胞である THP-1 細胞内へ乳酸菌を含有する THP-1 細胞の割合が多く，1）のの取り込み率の評価を実施したところ，F1805 株

結果と同様にフローサイトメトリー法においても（C-7 株）株の約 3 割の菌体が THP-1 細胞内に取りIL-12 産生量と THP-1 細胞内への取り込み率は相込まれており，顕著に取り込み率が高いことが認め34 （306）

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

ら れ た。 ま た， 興 味 深 い こ と に IL-12 産 生 量 とTHP-1 細胞への取り込み率の相関解析を実施した

120ところ（図 9），両者は非常に高い正の相関関係に

100

IL-12 産生量が高くなる可能性が強く示唆された。
お

わ

り

に

本稿では日本古来からの発酵食物であるくず餅の

IL-12 産生量（相対値）

あり，THP-1 細胞内に取り込まれやすい乳酸菌は#C-7
JCM1132

R2 ＝ 0.9382

80
60
40

#A-34 #A-13

20
#A-15

製造過程で働く乳酸菌の免疫賦活作用の有無を，炎00症性サイトカインの IL-12，IL-6 産生量，抗炎症性

10

20

30

40

THP-1 細胞内への取込み率（％）

サイトカインの IL-10 産生量および免疫担当細胞への取り込み率で評価し，紹介した。その結果，くず餅製造工程で単離同定された乳酸菌 20 種のうち，

図9

乳酸菌の IL-12 産生量および免疫担当細胞への取り込
み率の相関解析

Lactobacillus 属の乳酸菌 1 種である F1805 株（試験 内 識 別 名：C-7 株 ） に つ い て IL-12，IL-6 産 生の予防効果など機能性食品への応用が期待できる量，免疫担当細胞への取り込み率などから高い免疫が，F1805 株の特異性は他の乳酸菌と比較して，賦活効果が認められた。

F1805 株のどのような特徴によるものなのかは今のLactobacillus 属乳酸菌は腸内細菌叢でも善玉菌とところ不明であり，免疫担当細胞による F1805 株

して作用することから，経口摂取した際にプロバイ株の認識されやすさ，F1805 株の細胞表面の特異性

オティクスとして腸内細菌叢のバランスを改善するなどさまざまな可能性が考えられる。今後これら作効果が見込まれる17）が，免疫賦活効果が見込まれる乳酸菌は摂取することでバイオティクスとしての用機序の解明についてさらなる研究の可能性が考え
られる。

18）

働きも期待できる 。

参 考 文 献ヒトの免疫応答において，Th1 細胞は主に液性免疫のなかでマクロファージや樹状細胞などの貪食作

1）冠 木 敏 秀： 健 康 機 能 を 有 す る 乳 酸 菌 の 可 能 性．Milk
Science 65：203-209;2016.

用を活性化し，Th2 細胞は主に液性免疫の中で B

2）加地留美：乳酸菌の免疫調節作用に関わる細胞内シグ細胞を刺激して抗体産生を活性化させるが，相対的ナルとその制御．化学と生物 50 (3)：182-187;2012．

に Th1 細胞より Th2 細胞が優位であればアレル

3）八村敏志：乳酸菌の免疫調節機能．Jpn J Acid Bacteria

ギー性疾患が増大する。一方で，Th2 細胞より Th1細胞が優位であれば，過剰な免疫応答により自己免
疫疾患につながる可能性がある。ヒトの免疫恒常性を維持するためには Th1 細胞と Th2 細胞のバラン
スを整えることが重要である。特に衛生環境の整った現代においては，Th1 細胞より Th2 細胞が優位となり，アレルギーやアトピー等の疾患になる報告

18 (2)，54-57;2007．
4）飛田啓輔，大谷元：数種の乳酸菌およびトール様受

容体 2 リガンドで刺激したマウスマクロファージ様株
化細胞 J774.1 による IL-12 産生を Lactobacillus crispatus
KT-11 株は促す．Milk Science 64 (1)：1-6;2015.
5）Lightfoot YL, Mohamadzadeh M: Tailoring gut immune
responses with lipoteichoic acid-deficient Lactobacillus
acidophilus. Front Immunol: 4: 25; 2013.
6）Yanagihara S, Goto H, Hirota T, et al: Lactobacillus

例が増えている 19）。IL-12，IL-6 の産生促進によりacidophilus L-92 cells activate expression of

Th1/Th2 のバランスを改善し免疫応答を整えるこ

immunomodulatory genes in THP-1 cells. Biosciとは現代病としてもあげられるアレルギーやアト

Microbiota Food Health 33: 157-164; 2014.

ピーの予防効果が期待でき，実際に乳酸菌を活用したアトピー性皮膚炎の改善も報告されている 20）。

7）Zeuthen LH, Christensen HR, Frøkiaer H: Lactic acidbacteria inducing a weak interleukin-12 and tumor
necrosis factor alpha response in human dendritic cells

本稿で乳酸菌 F1805 株（試験内識別名：C-7 株）inhibit strongly stimulating lactic acid bacteria but actに高い IL-12，IL-6 産生量と免疫担当細胞への取り

synergistically with gram-negative bacteria. Clin

込み率が確認されたことからアレルギーやアトピー

Vaccine Immunol 13 (3), 365-75; 2006.

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

35 （307）8）Wang G, Yu Y, Garcia-Gutierrez E, et al: Lactobacillus14）Onishi K, Mochizuki J, Sato A, et al: Total RNA andacidophilus JCM 1132 Strain and Its Mutant withgenomic DNA of Lactobacillus gasseri OLL2809 induce

Different Bacteriocin-Producing Behaviour Haveinterleukin-12 production in the mouse macrophage cell

Various In Situ Eﬀects on the Gut Microbiota of Healthyline J774.1 via toll-like receptors 7 and 9. BMC

Mice. Microorganisms 8 (1): 49;2020.

Microbiology 20: 217; 2020.

9）Lightfoot YL, Mohamadzadeh M: Tailoring gut immune

15）Taverniti V, Marengo M, Fuglsang E, et al: Surface

responses with lipoteichoic acid-deficient Lactobacillus

Layer of Lactobacillus helveticus MIMLh5 Promotes

acidophilus. Front Immunol 4: 25; 2013.

Endocytosis by Dendritic Cells. Appl Environ Microbiol

10）八村敏志：乳酸菌の免疫調節作用．Jpn J Lactic Bact
18: 54-57;2007．
11）Miyazawa K, He F, Yoda K, et al: Potent eﬀects of, and85: e00138-19; 2019.
16）加地留美：乳酸菌の免疫調節作用に関わる細胞内シグナルとその制御．化学と生物 50 (3)：182-187;2012．

mechanisms for, modification of crosstalk between17）Mekkes MC, Weenen TC, Brummer RJ, et al: The

macrophages and adipocytes by lactobacilli. Microbiol

development of probiotic treatment in obesity: a review.

Immunol 56: 847-54; 2012.
12）Yanagihara S, Goto H, Hirota T, et al: Lactobacillus
a c i d o p h i l u s L- 9 2 C e l l s A c ti v a t e E x p r e s s i o n o f
Immunomodulatory Genes in THP-1 Cells. Biosci
Microbiota Food Health 33: 157-164; 2014.
13）Yanagihara S, Kanaya T, Fukuda S, et al: UromodulinSlpA binding dictates Lactobacillusacidophilus uptake byintestinal epithelial M cells. International Immunol 29:357-363; 2017.

Benef Microbes 5: 19-28; 2014.
18）Mitsuoka T: Development of Functional Foods. Biosci
Microbiota Food Health 33: 117-128; 2014.
19）Eyerich K, Novak N: Immunology of atopic eczema:
overcoming the Th1/Th2 paradigm. Allergy 68: 974982; 2013.
20）藤村響男：アトピー性皮膚炎に対する乳酸菌の効果．
皮膚の科学 7 (Suppl.10)：A38-A44；2008.