博 士 （ 医 学 ） 武芝

学位論文題名Epstein― Barr virus(EBV)― Encoded RNA2 (EBER2)
butNot EBERlPlaysaCriticalRoleinE
BV―Induced
B―CellGrowth Transformation(EBウ イ ル ス が コ ー ド す る 小 RNA EBER1と EBER2のBリン ノヾ球トランスフオーメーションにおける役割）

学位論 文内容の要旨【背景と目的】Epstein‑Barrウイルス(EBウイルス）は、ヘルペスウイルスの一種で、成人の95％以上に無症候性に感染している普遍的なウイルスである。一方で、バーキットリンパ腫および上咽頭がん、T/NK細胞リンパ腫、ホジキン病、胃がんなど、様々な悪性腫瘍への関与も明らかにされている。主な感染の標的はヒトBリンパ球で、潜伏感染の形態をとる。試験管内においてBリンパ球にEBウイルスを感染させると、感染ルンパ球は不死化してlymphoblastoidcellline(LCL)と呼ばれる無限増殖する細胞株となる。
EBERは宿主のRNAポリメラーゼmによって転写され、3 末端にポリA配列をもたず蛋白質に翻訳されない小RNAであり、EBウイルス感染細胞において普遍的かつ多数コピー（1細胞あたり最大107コピー）存在する。EBE
Rは様々な細胞株において、サイトカイン産生を刺激することにより細胞の増殖を促進することが報告されている。
最近、Akata細胞を用いた組換えウイルス産生系を用いてEBERノックアウトEB
ウイル スが 作製 され 、EBER欠 損に よりBリンバ球トランスフオーメーション効率が約1/100に低 下す るこ とが 報告さ れ、EBERがEBVによるBリンパ球トランスフォーヌーションに重要な役割を果たしていることが明らかとなった。E
BERにはE
BER1
および EBER2の 2種類 が存 在す る。 多く のEBウイ ルス 株間 でEBERの塩基配列は良く保存 されており、EBER1では100％同一、EBER2において2塩基置換が認められるに過ぎ ない。EBER1およびEBER2はともに複数のステムループ構造を含む高度な二次構造を形成すると予想されている。しかし、EBE‑R1とEBER2の機能に違いがあるか否かについてはこれまでほとんど検討されていない。
本研究では、EBER1、EBER2のいずれがBリンバ球トランスフオーメーションに寄与しているか検討を行った。
【方法と結果】EBERノックアウトEBウイルス[EBER(‑)EBV]をもとにして、Akata細胞における相同組換え法およびCre/loxPシステムによるマーカー遺伝子の除去により
EBER1再導入EBウイルス[EBERl(+)EBV]、E
E;ER2再導入E
Bウイルス［EBER2(+)EBV]、EBER1およ びEBER2再 導入 EBウ イル ス[EBERs(+)EBV】 を作製 した。また、組換え― 439―

E
Bウイル スを大 量に調製 するた めに、抗 イムノグ 口ブリ ン抗体処 理によ り効率よ くウ
イルス産 生可能 なA
kata
細 胞を組 換えウイ ルス産 生細胞と して用いた。ウイルス産生量を調 べ た 結果 、 い ずれ も 野 生型 であるNeoR
EB
V感染 細胞と同 程度で あること がわかった。 ま た 、等 量 の ウイ ル ス をEB
ウ イルス陰 性D
audi細胞に感 染させ 、その感 染効率を比較 し た 結果 、 組 換え EBVの 感 染 効 率に 差 は 見ら れ な かっ た 。 この こ と から 、 EB
ERは ウ イ ル ス 産 生 と 感 染 効 率 に 影 響し ない こ とが 明 らか と なっ た 。
組 換 えEBウ イル ス の B
リ ン バ球 トランス フォー ヌーショ ン効率は 、臍帯 血リンバ 球に等量の ウイル スを感染 させ、 6週間 培養後の 50％不死 化効率を比較することにより検試し た 。 その 結 果 、EBER(‑)EB
Vの ト ラン ス フ ォー メ ー ション効 率が、 EBE
Rが野生 型で あ る NeoREBVの 約 1/100ま で 低 下 す る こ と が 確 認 さ れ た 。 EBERs(+)EB
Vで は トランス フ オ ーヌ ー シ ョン 効 率 の回 復が認め られた。 EBER2(+)EBVの トラン スフォー メー
シ ョ ン 効 率 は EBERs(+)EBVと 同 程 度ま で 回 復し た が 、EBERl(+)
EBVで はま っ た く回復が認め られな かった。
次 に 、そ れ ぞ れの 組 換 えEBVで 樹立 し た L
CLの 低細 胞 密度に おける 増殖能を 比較した と こ ろ 、 EBER(‑)EBVで 樹 立 し た LCLは NeoREBVや EBERs(+)EBVで 樹 立 し た LCLと比 較 し て低 細 胞 密度 に お ける 増殖能が 低下して いるこ とがわか った。 EBER2(+)EBVで 樹 立 し た LCLは 野 生 型 LCLや EBERs(+)LCLと 同 程 度 ま で 低 細 胞 密度 に お け る増 殖能 が 回 復 し た が 、 一 方 EBERl(+)EBV
で 樹 立 した LCLは ま っ たく 回 復 しな か っ た 。以
上 の 結 果 か ら 、 EBER1で は な く EBER2が Bリ ン パ 球 ト ラ ン ス フ オー メ ー ショ ン お よび低 細 胞 密度 に お ける LCL
増 殖 において 重要な役 割を果 たすこと が明ら かになっ た。
EBE
Rは様 々な細胞 株におい てサイ トカイン 産生を 誘導する ことが 報告され ている。
L
CLが 産生す ると報告 されてい るサイ トカイ： ノにつ いて検討 を行っ た。EB
ER2を発現す る EBVで 樹 立 し た LCLは EBER2を 発 現 し な い EBVで 樹 立 し た LCLと 比 べ て IL‑6の発 現 が 高い こ と がわ か っ た。 EBER2を 発 現し な い L
CLの 増殖 は 培 地に rIL‑6を 加 え
るこ と に より 促 進 され た 。 さら に 、 EB
ER2を発 現 す るLCLの増 殖はIL‑6中 和抗体に より抑 え ら れた 。 ま た、 LCLに rI
L‑6を添加 するこ とにより apoptosisに 陥る細胞 の割合は減少し 、逆にIL‑6の中和抗体を添加することによりapoptosis細胞の割合が増加した。
以上 の 結 果は 、 EB
ER2がIL‑6の発 現 を 誘導 す る こと よ りLC
Lの増 殖および 生存に貢 献して い る こと を 示 唆し て い る。 だ が 、 E
BER2
欠 損 に よる E
BVの トラン スフオー ヌーシ
ヨ ン 効 率 の 低 下 を rIL‑6添 加 の み で 完 全 に 回 復 さ せ る こ と は で き な か っ た 。
【考 察 】 本研 究 に より 、 EBウ イル スによる Bリン パ球ト ランスフ ォーヌ ーション におい て 、 EBER1で は な く EBER2が 重 要 な貢 献 を して い る こと が 明 らか と な った 。 さ らに、 EBE
R2に よる IL‑
6産 生 誘 導が LCLの 増 殖 と生 存 に 寄与 するこ とが示唆 された。 近年、 マ イ ク口 RNA
な ど の 、夕 ン バ ク 質を コ ー ・ド し な い小RN
Aの機 能分子と しての重要 性 が 広 く 認 識 さ れ っ っ あ る 。 EBウ イ ル ス は 非 翻 訳 RNAで ある EBE
Rを 感 染細 胞 内で多量に 発現す ることに より、 感染細胞が増殖優位性を獲得するよう機能していると考え ら れ る 。 本 研 究 に よ り 、 EBER1と EBE
R2が 異な る 機 能を 有 す るこ と が 初め て 示 され た 。 今 後 は 、 EBER1と EBER
2の そ れぞ れ の 機能 と そ の分 子 ヌ カニ ズ ム のさ ら な る解萌が期 待され る。

440−

学位論 文審査の要旨
主 査 教 授 有 川 二 郎
副 査 教 授 今 村 雅 寛
副 査 教 授 高 田 賢 蔵

学位論文題名Epstein− Barr virus(EBV)− Encoded RNA2 (EBER2)
butNotEB
ERlPlaysa
CriticalRoleinEB
V−Induced
B−Cell GrowthTransformation(EBウ イ ル ス が コ ー ド す る 小 RNA EBER1と EBER2のBリンノヾ 球トランスフオーメーションにおける役割）

E
Bウイルス はヒト正常Bリンパ球をトランスフオーメーションする活性をもち、トランスフオー ムされたBリンパ球は免疫能の著しく低下したヒトの体内で増殖して移植後リンパ増殖症 やエイ ズリンパ 腫の原因 となる。EBウイルスがコードする小RNA分子EB
E
Rは、Bリンパ球 トラン スフオー メーショ ンにおいて重要な役割を果たす。申請者は、EB
E
RにはE
BER1とEBER2の二種 類が存在 するこ とをまず 説明し 、本研究 の目的が 、EB
ER1とEBER2のどちら がBリンパ球トランスフオーメーションに寄与しているかを組換えウイルスを用いた解析 により明らかにすることであると説明した。次に、本研究で用いたEBE
R1のみ、
あるいは EBE
R2のみを発現するEBウイルスの作製方法について説明を行った後、結果の説明へと話を進めた。EB
ER2を発現するE
Bウイルスはトランスフオーメーション活性が高く、
E
B
E
R2を発現しないE
B
ウイノレスは低いことを明らかにした。トランスフオームされたBリンパ球(LCLと 呼ばれ る）の細 胞増殖 活性も、 E
BE
R2を 発現する L
C
Lでは高く、EB
ER2を発現しない L
CLで は低かっ た。さら に、EBE
R2を発現するL
C
LではI
L−6の産生が亢進しており、IL―6がL
C
Lのオートクライン増殖因子として働いていることも示した。以上より、二種類のEBERの うちEB
ER2がBリンパ 球トランスフオーメーションに寄与していると結論した。
質疑応答 として 、まず今 村教授 より、EB
E
R2はB
リンパ球トランスフオーメーションに
essentialで あるかcriticalであるか 質問があった。それに対して申請者は、EBE
R2を発現しないウイル′スは効率は低いがBリンパ球をトランスフオームできるのでcriticalであると説明した。また、EBE
Rの発現量と癌の悪性度との間に相関関係が知られているかとの質問に対しては、その点に関してはこれまで詳しく調べられていないと回答した。さらに、EBE
R1の役 割について質問があった。申請者は、L
C
LではEB
E
R2が重要であることが判明した が 、他 の 癌 では EBE
R1の 方が 重 要 な役 割 を 果 たし て い る可 能 性 があ る と 答え た 。
次に、有川教授より、E
BE
R
再導入ウイルスのトランスフオーメーション活性が野生型ウイルスよ り少し 低い理由 について 質問があり、申請者は、EB
E
R
再導入ウイルスではE
B
ER― 4411遺伝 子近傍にloxP配列が入っていることが影響している可能 性があると答えた。また、EB
ERと似た塩基配列をもつ遺伝子が知られているかとの質問に対して、アデノウイルスのVA1とVA2が知られていると回答した。さらに、EBER単独で発 癌活性があるかとの質問があり 、現在作製されつっあるEB
ERトランスジェニックマウスがその答えを与えてくれるであろ うと答えた。
最 後に高田教授より、EBE
R1とE
BE
R2は構造が似ているのに なぜEBE
R2だけがI
L―6を誘導す るのかという質問があった。それに対して申請者は、塩基配列に違いがあるので、塩基配 列に特異的なメカニズムの関与が考えられると回答した。次に、IL―6がLCLの増殖因子で あることはこれまでに報告されているかとの質問に対し、申請者は、IL―6とLCLとの関係 を記載したこれまでの報告について紹介した。さらに、今回の結果がどのように治療に応用されるかについて質問があった。申請者は、エイズリンパ腫で血清IL−6が高い例では抗 IL−6抗体が有効である可能 性があること、さらに、EB
E
R2によるIL−6発現誘導メカ
ニズ ムが明らかになればその経路を抑制する治療法の開発に役立っであろうことを説明した。
こ の論文は、EBE
R1とEB
ER2が異なる機能を果たしているこ とを初めて示した点で重要であ る。組換えE
Bウイルスの作製は手間のかかる作業であるが、申請者は数多くの実験を根気 強く着実におこない、示された実験データは質の高いも のであった。E
BE
R2がBリンパ球 のトランスフオーメーションにおいて重要な役割を果たすことを明確に示した本研究は高 く評価できる。L
CLにおいて EBE
R2がIL―6を誘導するメカニズムについては今後の課題で ある。また、様々なE
Bウイルス関連癌においてEB
ER1とEBER2が異なる機能を果たしてい るかという点も今後明らかにされるべきであるが、本研究で樹立した組換えウイルス
はそ のような研究において多大な貢献をするものと考えられる。EBE
Rの分子メカニズムの解明 を通じて、EBウイルス関連疾患の発症メカニズムおよび治療法の開発にっながるものと期 待される。
審 査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ申 請 者が 博士 （医 学） の学 位を 受け るのに充分な資格を有するものと判定し た。

‑ 442−