博 士 く JI育 報 科 学 ） 水谷 祐 輔
学 位 論 文 題 名

原子間力顕微鏡を用いた過渡的な細胞力学に関する研究
学位論文内容の要旨【背景】細胞は，胚性幹細胞から始まって分化・増殖因子により前駆細胞，心筋細胞や骨細胞，線維芽細胞などの機能性細胞へと分化し，その後老化し細胞死へと向かう．このような一連のライフサイ
クルには，細胞移動，分化，細胞形態変化などの極めて広い時間スケールの過渡現象が存在する．これらの細胞の過渡現象は，細胞内の生化学反応だけでなく，細胞骨格構造に起因する細胞力学特性により制御されていると考えられているが，前者に比ぺて，後者に関する知見は十分には得られておらず，その方法論も確立しているとは言い難い，本論文は，過渡的な細胞力学特性の精密計測法を提案し．いくっ かの過渡的 な細胞力学 特性を解明 することを 目的として いる．
原 子間力顕 微鏡(AFM)は，細 胞力学 の測定 法の1つ である.AFMは，力 分解能 と空間 分解能の両方に優れ，任意の場所の細胞力学特性を計測することができる.
AFM以外の細胞力学測定法は，細胞構造を不可逆に変化させたり，接着している細胞を剥離させたりするが，それらに比ぺて，AFMの細胞への侵襲度は小さい．
一方で ，AFMはそ の操作 性の煩 雑さか ら1度の 実験で数個の細胞しか測定することはできない欠点をもつ．そのため，AFMの本質的に有しているカ分解能にもかかわらず，細胞力学特性の絶対値の信頼性は高いとは言えない．なぜなら，細胞は同じ環境下で培養された場合でも，時間的なゆらぎや空間的なゆらぎだけでなく，細胞各々のばらっきをもっているからである，特に，細胞力学の過渡現象において，そのような細胞力学特性の不均一性はさらに増大する可能性がある．したがって，細胞力学特 性を精密 に計測 し，過渡的現象の細胞物性の普遍性を解明するには，AFMを用いて多数の細胞を短時間で測定し，細胞力学のアンサンブル平均を議論することができる実験系の確立が必須である．
【目的 】本研究 ではAFMとマイ クロアレ イ技術 を組み 合わせ た多数 細胞測 定法を提案し，過渡的な細胞力学特性を統計分布から解明することを目的する．細胞の過渡現象として，(
1)細胞が増殖し他領域で伸展成育する接着過程の状態，(2)ストレスを受けることによって通常状態から逸脱し肥大する状態，(3)外因性機構に調整を受けたことにより拍動挙動が変化する状態，(4)形質転換過程と呼ばれる 細胞が通 常増殖 から，老化細胞，不死化細胞へと変化する状態と4つの異なった過渡現象の
細 胞 力 学 特 性 を 調 べ る こ と を 目 的 と し た .(3)は 拍 動 挙 動 の 空 間 依 存 性 を 調 べ た ．
【結果・考察】 細胞配列を可能とするマイクロアレイ技術に．より，細胞を整列化させ，マイクロアレイ上の細胞の配列状態および細胞活性の確認を行った．1個の井戸には1個の核のみが確認され，複数の細胞が重なっておらず，単層の細胞アレイが作製でき，井戸への充填率は，98010以上にすることが可能であることが分かった．さらにマイクロアレイ上に播種した細胞のF―アクチンを観察した
結果，培養時間の経過にともなってストレスフんイバー状になっていたことから．マイクロアレイ上
でも 通常培 養ディ ッシュ 上と同 じように 細胞活 性を失 わずに 培養可 能であ ること が分か った，― 940ー

線維芽細胞を用いて初期接着過程における多数細胞のカ学特性の評価を行った結果，培養時間の経過にともなって弾性率は有意に大きくなることが明らかとなり，接着開始時からの細胞骨格の重合促進の経過が培養時間経過にともなう弾性率の有意な増加と一致することが分かった．また，細胞数分布はすべての培養時間において弾性率の分布は対数正規分布であることが分かった．対数正規分布は，細胞力学に限らず様々な自然現象において出現することが知られており，本実験結果も対数正規分布に従ったと考えられる．
筋芽細胞を用いて酸化ストレスによる肥大過程における多数細胞のカ学特性の評価を行った結果，酸化ストレスと同様に活性酸素種を発生させる過酸化水素の付加濃度の増加に従って，弾性率は有意に小さくなることが分かった，F−アクチンを定量的に測定した結果，過酸化水素の付加直後は付加濃度の増加に従ってF―アクチンの量が少なくなることが分かり，弾性率の結果と一致した．その後，付加した過酸化水素を取り除き培養を行うと，培養時間の経過にともなって細胞の肥大が起こり，培養72時間後には弾性率がコントロール群と同程度まで回復することが分かった，弾性率の細胞数分布は，全ての過酸化水素付加濃度および付加後の培養時間において，対数正規分布であった．
心筋細胞の拍動挙動の詳細は，これまでほとんど調べられておらず，空間的相関が明確でない．
そこで，新生児ラット心筋細胞を用いて安定した拍動挙動の空間的測定を行った，拍動挙動を促進する薬剤を用いて過渡状態における拍動挙動の評価を行った結果，拍動挙動には空間依存性が存在し，細胞中心部では細胞が膨張するように変化し。細胞周縁部では変位は小さいが細胞が収縮するように変化する部位があることが分かった．細胞表面のヤング率は，細胞中心部は周縁部よりも小さく，周縁部に向かうに従って大きくなった．拍動挙動を促進するイソプロテレノールを用いてその影響を検討した結果，薬剤付加前後での変位量において増加した部位と変化がなかった部位とが確認され，イソプロテレノールの効果にも空間依存性が存在した．過渡状態であるイソプロテレノール付加前後で弾性率に変化が無く，付加前後の拍動振幅は直下の細胞弾性率に依存しないことが分かった，
これらのことから，今後多数細胞の測定を行うことで，より精密な過渡的現象の評価が行えると考えられた．
ラット皮膚由来線維芽細胞を用いて，形質転換過程における多数細胞のカ学特性の評価を行った結果，細胞の複素弾性率の周波数依存は，通常増殖，老化細胞，不死化細胞と全ての状態において確認でき，べき乗則に従うことが分かった．また，全ての状態においてS
tru
ct
ur
alda
mpingmodelでフイッ トし求 められた 弾性率 のスケ ールフ んクターGoの細胞数分布は対数正規分布に従い，べき指数心 粘性係 数pの細 胞数分布 は正規 分布に 従うこ とが分 かった ，弾性 率のスケールファクター
Go，べき指数a，粘性係数〃の各状態における平均値やバラっきに違いが存在したが，F‑アクチンを脱重合 させる と無くな ることから，これらの違いはF‐アクチンに強く依存することが分かった，【結語 】AFMを用 いた測 定法は 統計的 測定には 不向き であっ たが， 本研究で用いたマイクロアレ
イ技術 により AFMを用い た多数 細胞の 統計的力 学特性 測定が 容易に なった，不安定な過渡的状態において多数細胞を測定することで，細胞の弾性率の細胞数分布は対数正規分布を示すことが分かり，細胞弾性率などのカ学的パラメータの定量的評価が可能となった，さらにこの新たな測定方法を，多種多様な細胞に対して適用可能な手法に改善すれば，様々な不安定である過渡的状態の細胞物性を評価することが可能となり，粘弾性，拍動挙動，接着性などの細胞力学特性の普遍的性質を解明できることを示した．

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学位論文審査の要旨
主査教
授河原剛一
副査教授平田拓
副査准教授岡嶋孝治

学 位 論文題名

原子間力顕微鏡を用いた過渡的な細胞力学に関する研究
細 胞 のラ イ フ サ イクル には，細 胞移動 ，分化， 形態変 化などの 極めて広 い時間 スケー
ルの 過渡現 象が存在 する． これらの 細胞の 過渡現象は，細胞骨格構造に起因する細胞力学特 性によ り制御さ れてい ると考え られて いるが，その詳細は未だ明らかにされておらず， 解明す るための 方法論 も確立し ている とは言い難い．そこで本論文では，細胞力学特性 の精密 計測法を 提案し ，過渡的 な細胞 力学特性を解明することを目的としている．
本論 文 で は ，細 胞 力 学の 測 定 法の 1っ であ る 原 子間 力 顕 微鏡 (AFM)を 用いて いる．
AFMは ， 力 分 解能 と 空 間分 解 能 に優 れ て いる が， ある時 間内で数 個の細 胞しか測 定するこ とはで きない欠 点をも つ．その ため， 細胞が同じ環境下で培養された場合でも，時間的 なゆら ぎや空間 的なゆ らぎだけ でなく ，細胞各々のばらっきをもっているため，細胞力学特性の絶対値の信頼性は高いとは言えなぃ．特に，細胞力学の過渡現象において，そのような細胞力学特性の不均一性はさらに増大する可能性がある．そこで本論文では，
AFMを 用 い て 多数 の 細 胞を 短 時 間で 測 定 し， 細胞 力学の アンサン ブル平 均を議論 すること ができ る多数細 胞測定 法の確立 が必須 であると考え，マイクロアレイ技術により，AFMを 用 い て 多数 の 細 胞を 短 時 間で 測 定 でき るよ う細胞 を整列化 させ， さらに細 胞活性を 失わず に培養可 能であ ることを 明らか にしてい る，細胞 の過渡 現象とし ては，4つの異 なった 過渡現象 を取り 上げ，本 方法を 用いて過渡的な細胞力学特性を統計分布から検討 した． これらの 成果は 以下のよ うに要 約される ．
（1）初 期接着過 程にお ける多数 細胞のカ 学特性
初期 接 着 過 程に お け る多 数 細 胞の カ 学 特性 の評価 は，国 内外で初 めてAF
Mとマイ クロア レイ技 術を組み 合わせ た多数細 胞測定 法を用い て行われ ている ．その結 果I
培養時間の 経過に ともなっ て弾性 率は有意 に大き くなり，接着開始時からの細胞骨格の重合促
進 の 経過 が 培 養 時間経 過にとも なう弾 性率の有 意な増 加と一致 すること を明ら かにし
てい る．ま た，細胞 数分布 は接着過 程の不 安定な状態にも関わらず，全ての培養時間で対数 正規分 布になる ことを 明らかに し，本 手法によって細胞接着の過渡的現象の統計的評価 が可能 であるこ とを実 証した，（ 2） 酸 化 ス ト レ ス に よ る 肥 大 過 程 に お け る 多 数 細 胞 の カ 学 特 性
酸 化ストレ スによる 肥大過 程におけ る多数 細胞のカ学特性の評価は，酸化ストレスと同様 に活性 酸素種を 発生さ せる過酸 化水素 を付加することで行われている．その結果，過酸 化水素 の付加濃 度の増 加に従っ て，弾 性率は有意に小さくなり，ファイバー状の細胞骨 格の量 が，過酸 化水素 の付加濃 度上昇 にともぬう弾性率の有意な減少と一致するこ― 942―

とを明 らかに している ．その後 ，付加した過酸化水素を取り除き培養を行うと，培養時間 の経過 にとも なって細 胞の肥大 化が起 こり弾性 率も回 復し，培 養7
2時間 後には弾 性率が非 付加群 と同程度 まで回復 するこ とを明ら かにし た，（ 3） 拍 動 挙 動 を 促 進 す る 薬 剤 を 用 い た 過 渡 状 態 に お け る 拍 動 挙 動心筋細 胞の拍 動挙動の 詳細は ほとんど調べられていなぃため，新生児ラット心筋細胞を用い て安定 した拍動 挙動の空 間的測定を行っている．拍動挙動を促進する薬剤を用いて過渡 状態に おける拍 動挙動の 評価を行った結果，拍動挙動には空間依存性が存在し，過渡状 態であ る薬剤付 加前後で 弾性率に変化が無く，付加前後の拍動振幅は直下の細胞弾性率 に依存 しないこ とを明ら かにした，今後多数細胞の測定を行うことで，より精密な過渡 的現象 の評価が 可能とな ること が期待さ れる．
（4）形質転 換過程 における 多数細 胞のカ学 特性
形 質転換 過程に おける多 数細胞 のカ学特 性の評価 を行っ た結果， 細胞の 複素弾性 率の周波 数依存 は，通常 増殖，老 化細胞，不死化細胞と全ての状態に韜いて，べき乗則に従うこ とを明 らかにし ている． また，各状態の複素弾性率をStructuraldampingmodelで フイッ トする ことで求 められた 弾性率 のスケー ルファ クターGoの 細胞数 分布は対 数
正規分 布に従 い，べき 指数￠粘 性係数ルの細胞数分布は正規分布に従うことを明らかにした， また， Go ￠ルの 各状態 における平均値やバラっきに違いが存在したが，これらの 違い は ファ イ バー 状 の細 胞 骨格 に 強く依 存すること を明らかに した，
以 上 の 検討 に よ り， 本 研 究で 提案 されてい るA
FMとマイク ロアレイ 技術を 組み合わせた多 数細胞 測定法に より，不 安定である過渡状態のカ学的パラメータの定量的評価が可能に なった と結論づ けている ．
これを 要する に，著者 は，AFMを用い た多数細 胞の統 計的力学特性測定により，様々な過渡 状態に おける細 胞力学に 関する多くの新知見を得ており，生体情報科学とくに細胞力学 に対し て貢献す るところ 大なるものがある．よって著者は，北海道大学博士（情報科学 ）の学 位を授与 される資 格ある ものと認 める．

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