博 士 （ 理 学 ） 半 澤 芳 恵
学位論文題名MolecularandGeneticAnalysesof the Arabido姑ぬ4CA乙現ZS5gene．
（シロイヌナズナのA（M乙死脚遺伝子に関する分子遺伝学的解析）

学位論文内容の要旨
ロゼット植物であるシロイヌナズナは、栄養成長期においてはロゼット状に平らに葉を展開し、ほとんど節間成長を行わないが、生殖成長期ヘ移行後、花芽の形成に伴って急速に花茎を伸長させる。このように植物の花序の全体的な形態は、いつ・どこの節間の茎が・どの程度伸長するかによって決定されている。本研究では、植物の花序形成機構を理解するために、花茎の伸長に特異的に欠損を持つa塑ulis(acl)5変異株の解析を行うと共に、染色体歩行によってその原因遺伝子を単離した。
ac15変異株は栄養成長期においては野生型株との形態的差異はほとんど見られないが、生殖成長期に移行した後の花茎伸長に特異的に著しい欠損が観察された。花茎の細胞切片の観察から、茎の長さに比例して細胞が短くなっていることが明らかになった。また、細胞伸長にかかわると予想されており細胞壁構造変化に関与するエンド型キシログル
カン転移酵素、E'XT A‑ヱと液胞膜の水チャネルタンパク質、gTIPのac15の茎におけるmRNA量は著しく低いことが示された。これらのことから、ACL5遺伝子は花茎の細胞伸長に関与する機能を持っと予想された。一方、ジベレリンやブラシノライド等の植物ホルモン添加によって表現型の回復は見られなかった。このようにac堕は新規のグループに属する矮小変異株と考えられた。
そこでACE5遺伝子の機能を解明するために、染色体歩行による遺伝子単離を目指して、染色体座位を決定したところ、5番染色体上腕のマーカー、nga106の近傍に位置することが示された。この点からYACクローンを用いて染色体歩行を開始し、1つのYAC上の約400Kb内に存在することが示された。続いてこの領域をP1クローンを用いた染色体歩行によってcontigを作成し、AC工5の存在領域を1つのP1クローン、約80Kbに絞り込んだ。
そこでまずこのP1のミニ・ライブラりをAファージベクターを用いて作成し、この80Kb領域のゲノミックDNAファージクローンによるcontigをっなげた。続いてこの領域内に制限酵素多型を検出するPCRマーカーを多数見つけてさらに存在範囲の絞り込みを目指した。
その結果最終的に5つのスクローンにわたる約54Kbに狭めることができた。しかしながら この領域は 、シ口イ ヌナズナ ゲノムプ ロジェク トによる 塩基配列解読がまだ進められてい な いた め、さ らに2‑3Kbのサ ブクロー ンを作成 して全体を 網羅し、 この領域 の全塩基 配列 を決定した 。
こ の 塩 基 配 列 を 解 析 し た 結 果 、 少 な く と も 11個 の 遺 伝 子 が 存 在 す るこ と が明 ら
か に なり 、 続 いて こ れら の 中 から ACL5の候補と なる遺伝子 を探索し た。はじ めにこれ らの 遺 伝子 の発現 器官をノ ーザン解 析により 明らかにし 、花序・ 花茎で発 現の見ら れる6個の 遺 伝子 を ACL5候 補遺 伝 子と し た 。さ らにこれ らの遺伝子 のac15変異株 における 塩基配列 を決定し、 野生型株 との比較 からac15変異 の原因と なる塩基 配列突然変異を持つ遺伝子を 探 索し た。そ の結果、 1個の遺伝 子に突然 変異部位が 見っかっ た。この 遺伝子は 予想され るアミノ酸 配列から これまで 動物や植 物、酵母 、大腸菌 などに広く見っかっているポリア ミン合成酵 素のーつ 、スペル ミジン合 成酵素と 高い相同 性が見られた。ポリアミンは動物 では核酸に 結合し、 核酸の安 定化やタ ンパク質 の翻訳な どに関与していること、生理活性 としては細 胞増殖・ 分化を促 進する成 長調節物 質である ことが示されている。植物でも古 くから細胞 増殖など の生理活 性を持つ ことが示 唆されて いるが、その役割はよくわかって お らず 、大変 興味深い 。また発 見された 突然変異部 位は、ス ペルミジ ン合成酵 素のc0‑factorで ある脱炭酸 型S．アデ ノシルメ チオニンの結合部位と予想されているよく保存された 領域に存在 すること が明らか になった 。
そ こ でこ の 遺 伝子 を 最重 要 ACL5候 補遺 伝 子と 考 え 、こ の 遺伝 子領 域と上流 約1.5kbを 含 むゲ ノム断 片をac15変異 株へ遺伝 子導入し 、相補性検 定を行っ た。その 結果、8個 体の 形 質転 換株が 得られ、 そのうち 7個体がTl世 代において ac15表現型を 完全に相 補し野生型 表現型を示 した。ノ ーザン解 析により 発現部位 を調べる と、花茎で特に強い発現が見られ た。この結 果はac15表現 型とよく 一致する 。さらに 、ac15変異株 における発現量は、野生 型 株の 約 20倍 に 上 昇し て いる こ と が明らか になった。 このこと から、通 常この遺 伝子の 発現は負の フ彳ード バック調 節を受け ているこ とが示唆 された。以上のことから、このス ペ ルミ ジ ン 合成 酵 素と 高 い 相同 性 を示す 遺伝子がACL5遺 伝子その ものであ ることが 確認 された。
単 離 され た ACL5遺伝 子 が スベ ル ミジ ン 合 成酵 素 活 性を 保 持し て い るか ど うか 確 認
す るために、 夕ンパク 質発現ベ クターに 導入し、 大腸菌内 で活性の測定を試みた。しかしな がら融合タ ンパク質 を誘導す ると、ス ペルミジ ンではな く、スペルミジンを基質として生 成されるス ペルミン のスポッ トが新た に検出さ れ、逆に スベルミジン量は大きく低下して い た。 こ の 結果 か ら、 ACL5遺 伝 子は スペルミ ン合成酵素 活性を持 つ可能性 が示唆さ れた 。植物では スペルミ ジン合成 酵素を含 むその他 のポリア ミン合成酵素は複数単離されてい るが、スベ ルミン合 成酵素は 植物で初 めて単離 された。 さらに、植物においてポリアミン 合成遺伝子 の欠損が 成長・分 化にもた らす影響 に関する 報告は未だ見られず、本研究によ って初めて 形態形成 にポリア ミンが関 与してい ることが 遺伝子レベルで直接的に示された。
‑252−学位論文審査の要旨
主 査 教授 米田好文
副 査 教授 落合 廣
副査 助教授 加藤敦之
学位 論 文 題 名
Molecular and Genetic Analysesof the Arabidopsis ACAULIS5 gene・（ シ ロイ ヌ ナ ズ ナ の ACA ULIS5遺伝 子に 関す る分 子遺 伝学 的解 析）

植 物 の 花 序 形成 機 構 を 理 解 す る た め に 、花 茎 の 伸 長 に 特 異 的 に 欠 損 を持 つ
aca ulis(acl)5変異株の解析を行うと共に、染色体歩行によってその原因遺伝子を単離した。
ac15変 異 株 は 栄 養成 長 期 に お い て は 野 生 型 株 と の 形 態 的 差 異は ほと んど 見ら れな
いが 、生 殖成 長期 に移 行し た後 の花茎伸長に特異的に著しい欠損が観察された。花茎の細胞切 片の 観察 から 、茎 の長 さに 比例して細胞が短＜なっていることが明らかになった。また、 細胞 伸長 にか かわ ると 予想 されており細胞壁構造変化に関与するエンド型キシログル
カ ン 転 移 酵 素 、 EXT A‑ヱ と 液 胞 膜 の 水 チ ャ ネ ル タ ン パ ク 質 、 gTIPの ac15の茎 にお ける
mRNA量 は 著 し く 低 い こと が 示 さ れ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、 ACL5遺伝 子は 花茎 の細 胞伸
長に 関与 する 機能 を持 っと 予想 された。ー方、ジベレリンやブラシノライド等の植物ホル
モン 添加 によ って 表現 型の 回復 は見られなかった。このようにac15は新規のグループに属する矮小変異株と考えられた。
そ こ で ACL5遺伝 子 の 染 色 体 座 位 を 決 定 し た と こ ろ 、 5番 染 色 体 上 腕 の マ ー カ ー 、nga106の 近 傍 に 位 置 する こ と が 示 さ れた 。こ の点 から YACク ロー ンを 用い て染 色体 歩行を 開 始 し 、 1つ の YAC上の 約 400Kb内 に存在 する こと が示 され た。 続い てこ の領 域を Plク
ロー ンを用いた染色体歩行によってcontigを作成し、ACL5の存在領域を1つのPlクローン、約 80Kbに 絞り 込ん だ。 そこ でま ずこ のPlの ミニ ・ラ イブ ラり をス ファ ージ ベク ター を用いて 作成 し、 この 80Kb領域 のゲ ノミ ック DNAフ ァー ジク ロー ンによるcontigをっなげた。
続い てこ の領 域内 に制 限酵 素多 型を 検出 するPCRマ ーカ ーを 多数見つけてさらに存在範囲の 絞 り込 みを 目指 した 。そ の結 果最 終的に 5つ のス クロ ーン にわ たる約 54 Kbに 狭め ることが でき た。 さら に2‑3Kbの サブ クロ ーン を作 成し て全 体を 網羅し、この領域の全塩基配列を決定した。

少な くと も11個の遺 伝子 が存 在す ること が明らかになり、これらの遺伝子の発現器官をノーザン解析により明らかにし、花序・花茎で発現の見られる6個の遺伝子をACL5候補遺伝子とした。その結果、1個の遺伝子に突然変異部位が見っかった。この遺伝子は予想されるアミノ酸配列からこれまで動物や植物、酵母、大腸菌などに広く見っかっているポリアミン合成酵素のーつ、スペルミジン合成酵素と高い相同性が見られた。
そこでこの遺伝子を最重要ACL5候補遺伝子と考え、この遺伝子領域と上流約1.5kbを含むゲノム断片をac15変異株ヘ遺伝子導入し、相補性検定を行った。その結果、8個体の形質転換株が得られ、そのうち7個体がTl世代においてac15表現型を完全に相補し野生型表現型を示した。ノーザン解析により発現部位を調べると、花茎で特に強い発現が見られた。この結果はac15表現型とよく一致する。さらに、ac15変異株における発現量は、野生型株の約20倍に上昇していることが明らかになった。このことから、通常この遺伝子の発現は負のフイードバック調節を受けていることが示唆された。以上のことから、このスペルミジン合成酵素と高い相同性を示す遺伝子がACL5遺伝子そのものであることが確認された。
単離されたACL5遺伝子がスペルミジン合成酵素活性を保持しているかどうか確認するために、夕ンパク質発現ベクターに導入し、大腸菌内で活性の測定を試みた。しかしながら融合夕ンパク質を誘導すると、スペルミジンではなく、スペルミジンを基質として生成されるスペルミンのスポットが新たに検出され、逆にスペルミジン量は大きく低下していた。この結果から、ACL5遺伝子はスペルミン合成酵素活性を持つ可能性が示唆された。植物ではスベルミジン合成酵素を含むその他のポリアミン合成酵素は複数単離されているが、スペルミン合成酵素は植物で初めて単離された。さらに、植物においてポリアミン合成遺伝子の欠損が成長・分化にもたらす影響に関する報告は未だ見られず、本研究によって初めて形態形成にポリアミンが関与していることが遺伝子レベルで直接的に示された。
よって著者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格があるものと認める。