博士（医学）池田俊朗
学 位 論 文 題 名

メタンフェタミン、ヒ素並びにブロムワレリル尿素の法薬毒物学的検査法に関する検討
学位論文内容の要旨

死因究明をはじめとする法医学的な鑑定においては， 肉眼的あるいは組織学的な解剖検査所見はもとより，解剖のときなどに得られる種々の試料 について薬物や毒物（以下薬毒物という）の検査をすることは死因を判断する上で密接に関 わることがあるため重要である．本
研究では，薬物としての乱用が最も多く社会問題になっ ている覚せい剤のメタンフェタミンのスクリーニング法，事件に使用され注目を集めた毒物 であるヒ素の簡易で確実な検出法及び市販の催眠薬の成分として自殺の例に用いられること の多いブロムワレリル尿素の分析法について検討を行い，それぞれの有用性について考察し た・
第ーにメタンフェタミンの標識化合物を合成し，電気 化学的イムノアッセイの確立を試みた，
この方法は，フェロセンを薬毒物に導入した標識化合 物を用いるイムノアッセイである．
この標識化合物はフェロセン誘導体として電気化学的手 法（ポルタンメトリー）により検出でき ，ま たグ ルコ ース オキ セダ ーゼ (GOD)の電 子受 容体としての役割 も演じられる一方で抗体に対して抗原として働く．標識化合物は抗体を加え ると抗原抗体反応により抗体との結合体を生じるので，結合していない自由な標識化合物濃 度が低くなる．それに対して非標識（検査対象）薬毒物の共存下では標識化合物と非標識化 合物が抗体に対して競争的に反応して抗体結合体を生成するので標識化合物と抗体の結合体 の濃度が低くなり，自由な標識化合物の濃度が高くなる．このようにして自由な標識化合物 の濃度は検査対象薬毒物濃度に比例する．
今回，p−アミノメタンフ ェタミンとフェロセン酢酸を縮合させてメタンフェタミンの標識化合物を合成し，また一方で抗メタンフェタミン抗体としてp―アミノメタンフェタミンと牛血清アルブミンをグルタルアルデヒドで縮合させたもの を免疫原として作製された抗メタンフェタミンポリクローナル抗体を用い，この電気化学的 イムノアッセイをメタンフェタミン検査に応用した。
標識化合物の抗体に対する挙動及び非標識メタンフェ タミンに対する競争反応について直流サ イク リッ クポ ルタ ンメ トリー(CV)による検討を行った．その結果 ，標識化合物のピー
クは抗体の添加により強く低下し，標識化合物が抗原と しての性質を持っていることが示され，抗体と標識化合物とが抗原抗体反応を起こしたことが示された．また，非標識メタンフ．
エタミン共存下ではその競争反応によルピークの低下が 抑制された．このことにより，標識化合物が非標識のメタンフェタミンと互いに競争的に反 応していることが示され，非標識のメタンフェタミンが抗体と結合したことにより結合でき なかった自由な標識化合物が電極反応に 寄与 し， 電流 が低 下し なかったことが示された．さらに，これら の反応はブドウ糖一G
OD系により電流の増幅を受 けて明瞭になった．
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そこ で次の 測定操作 により検量線を作成した．1
尚容ガラス製測定セルに緩衝液(pH7．4）
をと り，標 識化合物 のエタノール溶液を加え，メタンフェタミン標準溶液を加える．よく攪拌し た後， 抗メタン フェタミン抗体溶液をセルに加え37℃で10分インキュベートする．次いでブドウ糖溶液とG
OD溶液を加え攪拌後電極3本（作用電極：金ディスク電極，対極：白金線，参照電極：銀／塩化銀電極）をセルに入れ，37℃において電位0〜 +400mV(vs．Ag/AgCl)の範囲を掃引速度5mV/sでCV測定する．
今回 の検討 の結果， 次のような特長があり，覚せい剤のスクリーニング法として有用と認められた，
1．操作が簡便で1検体の検査が20分以内で完了する，
2．検出限界がlOnM（1．5ng／ml）と低い．
3．検査 濃度の範 囲が10nM−100ルM（1．5ng−15pg/ml）と濃度域が非常に広く，検査試料の希釈操作が簡便である．
4．放射性核種や往々にして安全性に問題のある発色試薬を用いない等，安全性の面で心配がない．
5．高価な装置を必要とせず，ランニングコストも低い．
第二 に ラ イン シュ 反応を応 用した 電子プロ ーブX線マイ クロアナ ライザ （EPMA）によ る
ヒ素の検出法について検討した，
ライ ンシュ 反応はヒ 素など の検出の ための 予試験として知られた検査法で，ヒ素（m）イオン が塩酸 酸性溶液 中でヒ化銅として金属銅上に析出し灰黒色を呈することを利用したもの
であ る，今 回，高性 能機器の前処理法としてその簡易さに着目して検討を行い，ラインシュ反応 を行っ た銅板を そのままE
PM
Aによる元素分析の試料とすることにより，ヒ素の検出法として検査資料に応用した，測定操作は次のとおりである，試料溶液1mlをフラスコにとり，濃塩酸0．5rnlを加えた後1X2mm
大（厚さ0．25nlr11）の銅板を投入する．沸騰水浴上で時々振とう攪拌しながら30分問加温する ．銅板 を取り出 した後，水で洗浄し乾燥する．乾燥した銅板を炭素試料台に導電性両面テー プで接 着し電子 頭微鏡 及びEP
MAの試 料とす る，電子 顕微鏡 下1000倍の視 野で加速電圧20kV， 試料吸収 電流1XlO
IllA
で 測定しヒ 素の1線（10．542keV）のスペクトルを検査する，今回の検討の結果，ヒ素の検出法として，測定が1時間以内で終了し，正確に検出でき，処理が簡易であるという利点を持つ優れた方法と認められた．また，゛血液試料について本法の応用 を検討 した結果 ，血液の混在により検出強度は減少したが，血液を希釈し，酸消化後に還元 剤とし て硫酸ヒ ドラジンを添加することにより減少が抑えられるので，血液試料にも有効な方法であると示唆された．
第三にエレクトロスプレーイオン化（ESI）高速液体クロマトグラフ質量分析計（LC／MS）によるブロムワレリル尿素の分析について検討した．
ブロ ムワレ リル尿素 は熱で分解することから，一般に薬物の分析において最もよく用いられるガスクロマトグラフイー（（℃）及ぴガスクロマトグラフイー／質量分析くG′MS）は困難で あり， 加熱を要 しない高速液体クロマトグラフイー（HPLC）及ぴ質量分析と組み合わせた高 速液体 クロマト グラフ質量分析計（LC′MS）による分析が適している，LC／MSについて
種々 のイオ ン化法が 検討され報告されているが，いずれも条件検討が困難であるなどの制限があった．イオン化法として近年実用化された大気圧イオン化法のうちESI法は従来のイオン化 法 の制 限 を 受け な い も のと し て 注目 さ れてい ること から，本 薬物の分 析に応 用した．
今回，逆相系セミミクロカラム（直径2mm）を用い，移動相はメタノール十水（40十60）を流量0．2nツ分として，正イオンモード測定（キャピラリー出口電圧：looV）を行った．その結果， 注入量 500ng
以上 では擬分子イオン及ぴナトリウム付加イオンが，注入量500ng未満ではナト リウム 付加イオ ンのみが検出され，同定能カの高い分析法と認められた．このナトリウ
ム付 加イオ ンを対象 とした検出限界はスキャンモードで質量スペクトルを確認するためには― 21 ‑

注 入量で 100ng（イ オンピークを観察できるためには10ng)，選択イオンモニタリング(SIM)モ ー ド で の検 出 限 界は Ing(SfN比 10)で あり ，十分 な検出感 度の分 析法と認 められ た，― 22―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 寺 沢 浩 一
副 査 教 授 石 橋 輝 雄
副 査 教 授 宮 崎 勝 巳

学 位 論 文 題 名メタンフェタミン、ヒ素並びにブロムワレリル尿素の法薬毒物学的検査法に関する検討
薬物と しての乱用が最も多い覚せい剤のメタンフェタミンのスクリーニング法、事件で注目された 毒物であるヒ素の簡易で確実な証明法及び中毒事故が多いブ口ムワレリル尿素の適用しやすい同定法について検討を行い、有用性について考察した。
第‑Iこp￣アミノメタンフェタミンとフェ口セン酢酸を縮合させて標識化合物を合成し、電気化学的イムノアッセイをメタンフェタミン検査に応用した。
標識化 合物の挙動を直流サイクルックポルタンメトリー(CV)に より検討した結果、標識化合物の ピークは抗体の添加により強く低下し、非標識メタンフェタミン共存下ではピークの低下が 抑制された。このことにより、標識化合物が非標識メタンフェタミンと互いに競争的に抗体 と反応していることが示された。これらの反応はブドウ糖―グルコースオキシダー
ゼ (GOD)系に より 電流 の増 幅を受けて明瞭になった。そこで次の測定操作によ り検量線を作成した 。測定セルに緩衝液(pH7.
4)をとり、標識化合物溶液、メタンフェタミン標準溶液、抗メタン フェタミン抗体溶液を加えて37℃で10分インキュベートする。次いでブドウ糖溶液とGOD溶液を加え攪拌後電極3本（作用電極：金ディスク電極、対極：白金線、参照電極：銀／塩化銀 電極）をセルに入れ、37℃で電位十100〜 +400mVを掃引速度5mV/sでCV測定する。
今回の 検討の結果、次のような特長があり、覚せい剤のスクリーニング法として有用と認められた。1．操作が簡便で1検体の検査が20分以内で完了する。2．検出限界がlOnM（1.
5ng/ml)と低い。 3．検査濃度の範囲が10nMー10011Mと濃度域が非常に広い。4．放射性核種や安全性に問題の ある発色試薬を用いない。5．高価な装置を必要とせず、ランニングコストも低い。
第二に ヒ素などを検出するための予試験であるラインシュ反応を行った銅板をそのまま電子 プ口 ーブ X線マ イク ロア ナライザ(EPMA)による元素分析の試料とする、ヒ素 の検出法について検討した。
―23−測定操作は次のとおりである。試料溶液Imlをとり、濃塩酸0.5mlを加えた後ix2mm大（厚さ0.25mm)の銅板を投 入し、沸騰水浴上で30分間加温する。銅板を洗浄、乾燥し炭素試料台に導 電性 両面テープで接着し電子顕微鏡及びEPMAの試 料とする。1000倍の視野で加速電圧20kV、試 料吸 収電 流lX10‑IIAで 測定 しヒ素のK線（10.
542keV)のスベクトルを検査する。
今回の検討の結果、ヒ素の検出法として、測定が1時間以内で完了し、正確に検出でき、処理が簡易であるとレゝう利点を持つ優れた方法と認められた。
第 三に ェレ クト 口ス プレ ーイ オン 化(ESI)
高 速液 体ク □マ トグラフ質量分析計 (LCIMS)によるプ口ムワレリル尿素の分析について検討した。
ブ口ムワレリル尿素は熱で分解することから、´加熱を要しないLC/MSによる分析が適している。種々のイオン化法が報告されているが、いずれも条件検討が困難であるなどの制限があ り 、 こ の 制 限 を 受 け な い も の と し て ESIを 本 薬 物 の 分 析 に 応 用 し た 。
今回、逆相系セミミク口カラムを用い、移動相はメタノール十水(40:60)を流量0.
2ml/分として、正イオンモード測定を行った。その結果、注入量500ng以上では擬分子イオン及びナトリウム付加イオンが、、注入量500ng未満ではナトリウム付加イオンのみが検出され、同定能カの高い分析法と認められた。検出限界はスキャンモードにおいて注入量で100ng、選択イオ
ン モ 二 夕 リ ン グ モ ー ド で Ing (S/N比 10)で あ り 、 十 分 な 検 出 感 度 と 認 め ら れ た 。
公開発表では、石橋教授から電気化学的イムノアッセイの測定電流のノイズ、尿の夾雑物成分の除去法、ヒ素中毒者の血液中濃度とヒ素の濃縮法、ブ口ムワレリル尿素の質量スペクトルピークの有効性についての質問があった。宮崎教授からメタンフェタミンのイムノアッセイの干渉物質、我国の乱用覚せい剤の種類、検量線が原点を通らない理由、検出感度の実務での有効性、ブ口ムワレ1
Jル尿素に関する本LC/M
S法の利点についての質問があった。寺沢教授から3法の特長に関して質問があった。いずれの質問に対しても申請者は概ね妥当な回答をした。
この論文は、薬毒物の検査法の確立についての基礎的な検討として、電気化学的イムノアッセイによる覚せい剤のメタンフェタミンのスクリーニング法を、ヒ素の簡易で確実な証明法を、
ブ口ムワレリル尿素の実用的な同定法を、それぞれ初めて行ったものであり、本研究の成果は高く評価され、今後本研究が応用可能となることが期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

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