FT

RA

D

FT

RA

D

ゲノム診療⽤病理組織検体取扱い規程（案）FT― 初版作成担当 ―⽇本病理学会 ゲノム診療⽤病理組織検体取扱い規程策定ワーキンググループ

RA

委員⻑ ⼩⽥ 義直

D

委員 畑中 豊，桑⽥ 健，森井 英⼀，⾦井 弥栄，落合 淳志

1

2

FT

RA

D

⽬

次

1. 本規程策定にあたって ........................................................................................ 5
2. 診療における病理組織･細胞検体の現状............................................................ 7
3. ホルマリン固定パラフィン包埋組織･細胞検体の適切な取扱い ...................11FT

3.1 プレアナリシス段階 ....................................................................................12a) 固定前プロセス ............................................................................................12RAb) 固定プロセス ................................................................................................14c) 固定後プロセス ............................................................................................16
3.2 アナリシス段階 .............................................................................................17

Da) FFPE ブロックの選択と薄切および HE 染⾊標本へのマーキング ......... 17b) FFPE 検体からの核酸抽出..........................................................................19

4. 検体取扱いに関する実証データ .......................................................................21
5. 参考資料 .............................................................................................................43
補遺............................................................................................................................47

3

4

FT

RA

D

1. 本規程策定にあたって

近年，悪性腫瘍の病理組織・細胞検体を⽤いた体細胞遺伝⼦検査は急増しており，今後
は次世代シークエンサーをはじめとする新規技術を⽤いたゲノム診断の臨床導⼊が⾒込まれている．⼀般社団法⼈⽇本病理学会（以下，本学会）では，ゲノム等オミックス研究に適した質の⾼い病理組織検体を全国のバイオバンク等で収集できることを⽬指し『ゲノム研究⽤病理組織検体取扱い規程』（以下，研究⽤規程）を 2016 年 3 ⽉に策定し，我が国の病理医・臨床医・臨床検査技師・バイオバンク実務者における病理組織検体の取扱い指針を⽰した．これに続き本学会では，今後⽇常診療下での実施が想定されるがんゲノム診断

FTでの使⽤に耐えうる病理組織・細胞検体に関する『ゲノム診療⽤病理組織検体取扱い規程』（以下，診療⽤規程）を定める．

本診療⽤規程では，ゲノム診断で要求される病理組織・細胞検体，とくに最も利⽤が⾒込まれ，検体の取り扱い⽅法により検体の品質差が⽣じやすいホルマリン固定パラフィン

RA

包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded; FFPE）検体の適切な作製・保管⽅法について⽰した．本診療⽤規程が，臨床研究中核病院やがんゲノム医療中核拠点病院(仮称)をはじめとする実際の診療にゲノム情報を⽤いる医療機関のみならず，⽇常業務として作製された病理検体が今後のゲノム診断に供される可能性のあるすべての医療機関の病理医や病理技師，さらには検体採取にかかわる臨床医を対象とした実⽤の書となるよう⼼がけた．なお「ゲノム診療」の対象範囲については，今後の技術⾰新や知⾒の集積，ゲノム診療環境のD

整備状況等を踏まえ刻々と変化していくことが想定されるが，現時点では，医薬品の投与可否判定等の診断に⽤いられることを重視し，「コンパニオン診断薬等に該当する体外診
断⽤医薬品の製造販売承認申請に際し留意すべき事項について」1，もしくは「遺伝⼦検査

システムに⽤いる DNA シークエンサー等を製造販売する際の取扱いについて」2に基づき薬事承認され，保険診療下ですでに実施されている製品（体外診断⽤医薬品および医療機器），もしくは「がんゲノム医療推進コンソーシアム懇談会 報告書」3で⽰された制度設計のなかで，今後承認および保険診療下での実施が想定される製品で適⽤可能となる検体品

1

コンパニオン診断薬等に該当する体外診断⽤医薬品の製造販売承認申請に際し留意すべき事項について（平成 26 年 2⽉ 19 ⽇付厚労省課⻑通知：https://www.pmda.go.jp/files/000159090.pdf）

2

遺伝⼦検査システムに⽤いる DNA シークエンサー等を製造販売する際の取扱いについて（平成 28 年 4 ⽉ 28 ⽇付厚労省課⻑通知：https://www.pmda.go.jp/files/000213137.pdf）3

がんゲノム医療推進コンソーシアム懇談会 報告書（http://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-10901000-Kenkou
kyoku-Soumuka/0000166310.pdf）5質と位置付けている．本診療⽤規程の初版では，現在臨床研究等で⽤いられている⾼い網
羅性を有する遺伝⼦パネル解析で要求される検体品質については副次的な取扱いとしたが，今後薬事承認および保険適⽤等の状況を踏まえ，適時改訂・更新を⾏い，盛り込む必要があると考える．本診療⽤規程では，その根拠となる実証データを合わせて呈⽰した．当該デー
タの取得にあたっては，当学会において実施した検討のほか，複数の公的研究プロジェクト（研究班）および複数のゲノム診断関連企業の協⼒を得て⾏った．
本診療⽤規程は，⽇本病理学会およびその他関連学会が⾏うがんゲノム診療従事者向け教
育・研修プログラムでの教育ツールとしても利⽤される予定である．本診療⽤規程が，今後本

平成 29 年 7 ⽉ 31 ⽇

FT

格的にゲノム診断を⽤いた病理診断および⽇常業務の⼀助となることを期待する．

RA

⼀ 般 社団 法⼈⽇本 病 理 学 会
理事⻑

深⼭ 正 久

ゲノム診療⽤病理組織検体取扱い規程

D

ワーキンググループ委員⻑6

⼩⽥ 義 直2. 診療における病理組織･細胞検体の現状

⽇常の病理組織診断では，⽣検もしくは⼿術等により採取・切除された組織の FFPE 検
体や新鮮凍結検体等が主として⽤いられるが，その⼤部分を前者が占め，形態診断に加え，⽣体分⼦の検索を⽬的とした分⼦診断に供される．また細胞診断を⽬的に採取された細胞検体のうち，穿刺吸引や体腔液採取などによって得られた⼀部の細胞検体からも，FFPE 検体（セルブロック）の作製が⾏われており，平成 28 年の診療報酬改定において当該標本作製が算定可能となったことを背景に，近年その利⽤が⾼まっている．こうした組織・細胞の FFPE 化は，室温下における⻑期保管や繰り返しの検索を可能にし，さらには様々な技

FT術開発により，最近では網羅的な分⼦解析が可能となったことから，診療のみならず，研究における利⽤が加速している．研究利⽤においては，FFPE 化による核酸やタンパク等の⽣体分⼦の変性を最⼩限にとどめ，新鮮検体により近づけた検体作製が望まれるが，こうした将来的にゲノム診療に⽤いられる可能性を意識した検体の取り扱いは多くの医療機
関 で 困 難 な 場 合 も 多 い ． し か し な が ら 次 世 代 シ ー ク エ ン シ ン グ （next-generation

RA

sequencing; NGS もしくは massively parallel sequencing; MPS，以下 NGS）などの新規技術の臨床導⼊を⽬前に控え，今後診療を⽬的としたすべての FFPE 検体に対し，新規技術を⽤いたゲノム診断での利⽤に耐えうる⼀定⽔準以上の品質を保持した FFPE 検体の安定的な作製が求められつつある．

FFPE 検体を⽤いた分⼦診断のプレアナリシス段階では，多数の影響因⼦が知られておDり，各施設におけるこれらの情報（条件）の把握は検体を採取・提出する臨床医，標本作
製担当者およびその管理者においては不可⽋といえる（表 1）．

表 1 FFPE 検体を⽤いた分⼦診断のプレアナリシス段階における主な影響因⼦

プレアナリシス
段階の⼯程

⼯程の主な
責任・担当者

固定前プロセス

臨床医(検体採取医)固定プロセス

病理医
病理技師

固定後プロセス

病理医
病理技師

説 明
・⾎流停⽌から摘出までの時間（温虚⾎時間; warm ischemictime）・摘出から固定までの時間（冷虚⾎時間; cold ischemic time）
・組織の⼤きさ・ホルマリン固定液の組成や濃度，pH・ホルマリン固定の時間や温度・ホルマリン固定時の固定液容量と組織量の⽐率
・固定液の組織浸透法（浸漬，注⼊，マイクロウェーブ加速など）
・組織プロセッサーのタイプおよび機器試薬の交換頻度
・脱⽔・透徹条件（試薬の種類，温度，時間など）
・パラフィン浸透条件（パラフィンの種類，温度，時間など）

7このうち固定プロセスで⽤いられるホルマリンは，核酸やタンパクに化学的および物理的修飾を引き起こし，検体品質にきわめて⼤きな影響を与えることが広く知られており，
これまでにも肺癌，乳癌，胃癌，⼤腸癌における治療効果予測検査（いわゆるコンパニオン診断）関連のガイドラインやガイダンスなどにおいて，固定プロセスに関する推奨が⽰されている．また固定前プロセスの管理，特に臓器の摘出後から固定までの時間（冷虚⾎
時間; cold ischemic time）は，⽣体分⼦の不可逆的変化を最⼩化するうえで極めて重要であり，このプロセスが不適切な場合は，作業⼿順の⾒直しにより⼤きな改善が期待できる．
ゲノム診療を念頭においた NGS の利⽤は，すでに国内の⼤規模ゲノムスクリーニング研

FT

究プロジェクト（SCRUM-Japan）などにおいて進んでおり，このうち消化器癌を対象とした臨床研究（GI-SCREEN 試験）では 2000 例以上の FFPE 検体が解析に⽤いられている．このプロジェクトでは，参加 20 施設から FFPE 検体が提出されているが，検体品質には施設間差が認められており実証データ①，今後の改善は，病理部⾨にとって喫緊の課題である．また 2017 年には厚⽣労働省主導のがんゲノム医療推進コンソーシアム懇談会を⽴ち上げ，当該医療の推進に必RA

要な薬事承認や保険適⽤等の制度設計が議論されており，2017 年 7 ⽉時点において表 2 のような整理・区分化が提案されている．このうち保険診療下で実施が想定されている区分では，
病理部⾨を有する医療機関に対し，NGS 等の新規技術での使⽤に耐えうる検体作製が求められることが予想される．上述の GI-SCREEN 試験では，こうした区分に該当すると考えられる⼩型および⽐較的網羅性の⾼い遺伝⼦パネルが使⽤されており，現⾏のルーチン検体の品質と遺D伝⼦パネルのサイズとの関係を理解するうえで参考となる実証データ①．

表 2 本邦において今後想定される NGS を⽤いたゲノム診療の臨床導⼊当初の形態*

ゲノム関連検査の種類

実施主体

診療制度

薬事的に確⽴した検査項⽬のみ（コンパニオン診断薬）

各医療機関・衛⽣検査所にて実施

薬事承認・保険診療

医学的に意義がある遺伝⼦のパネル検査（承認された医薬品のない遺伝⼦を含む）（NGS パネル）

（必要に応じて先進医療の実
⼀定の要件を満たす医療機関
施を経て）薬事承認し，保険診を指定（がんゲノム拠点（仮））療可とする

全ゲノムシークエンス・免疫関連検査 等

⼀定の要件を満たす医療機関
での実施

先進医療を活⽤した保険外併⽤療養で対応*：本表は「がんゲノム医療推進コンソーシアム懇談会」資料を⼀部改変し作成（http://www.mhlw.go.jp/file/05Shingikai-10901000-Kenkoukyoku-Soumuka/0000162155.pdf）．

8

分⼦診断を⾼い精度で⾏うためには，検査の成否を左右する検体の品質管理は極めて重要である．治療選択に直結しているコンパニオン診断において，不適切な処理が⾏われた
検体の使⽤が原因で検査が実施できない，あるいは誤った結果がもたらされた場合は，患者の治療機会の損失につながり，⼤きな不利益を被ることとなる．多遺伝⼦の検査情報を保証しなければならないゲノム診療においてはパネル検査など複数遺伝⼦を対象とするため，その結果の質を保証するためには，現⾏の単⼀遺伝⼦検査以上に，より厳格な検体の

D

RA

FT

品質管理が求められることに⼗分留意しなければならない．

9

10

FT

RA

D

3. ホルマリン固定パラフィン包埋組織･細胞検体の適切な取扱い

本診療⽤規程では，主としてがんゲノム診断の今後の臨床導⼊への速やかな対応を⽬指し，最も利⽤が⾒込まれ，臨床研究を積極的に⾏う先端的医療機関のみならず，診療を専らとする⼀般医療機関においても要求されうる検体品質を保持した FFPE 検体の適切かつ標準的な取扱い⽅法（プレアナリシス段階）を以下に定める．またゲノム診断に供する
FFPE ブロックの選択⽅法や薄切⽅法などのアナリシス段階の⼀部の作業プロセスについてもあわせて解説する．

FT

FFPE 検体では，形態診断に影響を及ぼさず，また免疫組織化学法による分⼦診断（とくにコンパニオン診断）で推奨される検体作製が同時に求められるため，固定時間の際⽴った短縮化は困難であり，固定による核酸やタンパクの⼀定の変性は不可避となる．FFPE
検体は，⾎液等の液状検体に⽐べかなり多くの⼯程と時間を経て作製されるため，病理技術・診断業務のリソースに限りのある医療機関においては，僅かな作業改善においても⼤RA

きな負担となる可能性があるが，可能な限り本診療⽤規程の推奨に準じた対応を求めたい．

本診療⽤規程は，先⾏策定された研究⽤規程に加え，後述の実証データや⽂献情報等に基づき，以下の凡例に従い推奨するものであり，「診療ガイドライン」等に⾒るような EBMに基づいた推奨グレードは挙げていない．推奨については，⽇常診療におけるベストプラ
クティスとして推奨される事項（clinical recommendation; C）と，ゲノムスクリーニング

D（網羅性の⾼いゲノム解析）に基づいた介⼊研究や保険診療外のゲノム診断等への利⽤が考慮される場合に推奨される事項（research recommendation; R）に区分した．なお本推奨は今後のゲノム診断状況を踏まえ，適時改訂・更新が必要であると考える．

凡例(C)： ⽇常診療において推奨される事項(R)： 臨床研究等への利⽤を考慮する場合に推奨される事項(N)： 回避すべき事項

11

3.1 プレアナリシス段階a) 固定前プロセス《切除・採取直後の組織の取扱い》

1. ⼿術により切除された組織は，摘出後は速やかに冷蔵庫など 4℃下で保管し、1時間以内、遅くとも 3 時間以内に固定を⾏うことが望ましい (C) ⽂献 1，研究⽤規程 1
2. 内視鏡的に切除等された消化管組織など，⽐較的⼩型の組織については，速やかに固定液に浸漬し固定を⾏うことが望ましい (C)FT

3. ⽣検により採取された組織は，速やかに固定液に浸漬し固定を⾏う (C)4. ホルマリン固定パラフィン包埋化を⾏う細胞検体は，必要な前処理を適切に⾏ったのちに，可及的速やかに固定液に浸漬し固定を⾏う (C)5. ⼿術により切除された組織においては，摘出後 30 分以上室温で保持することはRA

極⼒回避する (N)．

[補⾜説明]
1補

これまでの報告では，乳癌の切除から固定までの時間が，ISH 法（HER2）では 2 時間，IHC 法（ホルモン受容体）では 1 時間を超えると，検査結果に影響を与えるとされており⽂献 2，これを踏まえ，乳癌の ASCO/CAP のガイドラインでは 1 時間以内の固D定を推奨している⽂献 1 ．

1補

⼀般的な固定液であるホルマリンの浸透速度は 1mm/時間程度であることを考慮し，とくに⼿術検体では，切り出しまでに充分な固定が⾏える程度の厚みまで，固定前に適切に⼊割することが推奨される (C) ⽂献 3．

1,2,3 補臨床研究等への利⽤を考慮する場合，いずれの組織も切除・採取後は可及的速やかに固定液に浸漬し，固定を⾏うことが求められる (R) 研究⽤規程 1 ．
4補細胞検体のうち，体腔液検体については，固定前に細胞検体の集塊化処理を⾏う．この処理法（セルブロック作製法）は，遠⼼分離細胞収集法や細胞固化法に⼤別され，それぞれ複数の⽅法が存在し現在で⽤いられているが，いまだ標準化されていない．
これら処理法におけるゲノム診断への利⽤の適否については不明であるが，国内では，

12

細胞固化法であるアルギン酸ナトリウム法，遠⼼分離細胞収集法である遠⼼管法やクライオバイアル法などは⽐較的多くの施設で⽤いられ，コンパニオン診断などでの使

D

RA

FT

⽤には耐えうることが確認されている⽂献 4．

13b) 固定プロセス《ホルマリン固定液の組成》

6. ホルマリン固定液の組成は，酸性や⾮緩衝ではなく，中性緩衝ホルマリン溶液を固定に⽤いることが望ましい (C)7. ホルマリン濃度は 10%（3.7%ホルムアルデヒド）を⽤いることが望ましい(C)[補⾜説明]
現在実施されている免疫組織化学法を⽤いた複数のコンパニオン診断において，すで

FT

6,7 補

に 10%中性緩衝ホルマリン溶液が推奨されている（表 3）．免疫組織化学法によるタンパク発現の検索は，ホルマリン固定液の組成と濃度に影響を受けることが⽰されている⽂献 5．またΔCt 値や DIN 値を指標とした DNA 品質に関する検討においても10%中性緩衝ホルマリン溶液の使⽤を⽀持する結果が得られている研究⽤規程 2．
国際共同企業治験等において FFPE 検体の提出が求められる際，10%中性緩衝ホルマ

RA

6,7 補

リン溶液で固定された FFPE 検体との条件が必須となる場合もある．
表 3 コンパニオン診断関連ガイダンス等における固定プロセスの推奨⽂献 1, 6-13
がん種

検査対象分⼦

検査法

HER2

タンパク

IHC 法

HER2

DNA

ISH 法

ER/PgR

タンパク

IHC 法

EGFR

DNA

リアルタイムPCR 法等

ALK

タンパク

IHC 法

ALK

DNA

FISH 法ROS1

RNART-PCR 法

10% NBF

PD-L1

タンパク

IHC 法

10% NBF

⼿術検体 18~36 時間
⽣検検体 4~24 時間
6~48 時間

HER2

タンパク

IHC 法

HER2
RAS
(KRAS/NRAS)

DNA

ISH 法

10% NBF

6~48 時間DNA

PCR-rSSO 法

10% NBF

6~48 時間

BRAF

DNA

リアルタイムPCR 法等

―

―

D

乳癌

効果予測
マーカー

肺癌

胃癌
⼤腸癌
悪性
⿊⾊腫

推奨ホルマ
リン固定液

推奨ホルマリン
固定時間

10% NBF

6~72 時間<6 時間は回避

10% NBF

6~48 時間

10% NBF; 10%中性緩衝ホルマリン（neutral buffered formalin），−；記載なし

14

《ホルマリン固定時間》

8. 組織検体（⼿術検体，内視鏡的に切除された検体，⽣検検体）では，コンパニオ
ン診断等の推奨を考慮し，6−48 時間の固定を⾏うことが望ましい (C) 実証データ②③，研究⽤規程 2，表 3

9. 固定不良（固定不⾜・過固定）による品質劣化は回避しなければならない (N)《ホルマリン固定処理に使⽤する固定液量》

10. ホルマリン固定に使⽤する固定液の容量は，組織量に対し 10 倍量の固定液を⽤《ホルマリン固定処理時の温度》

FT

いることが望ましい (C)RA

11. ホルマリン固定時の処理温度は，室温でよい[補⾜説明]
8補ホルマリン固定による核酸品質への影響として，核酸の断⽚化のほか，核酸塩基の化
学修飾が知られており，特にシトシンの加⽔分解に伴う脱アミノ化によりウラシルに置換し，その後の PCR 増幅反応によってチミンが⽣成（C>T 置換）することが知られている⽂献 14, 15．この反応は固定時間の延⻑により増加し，72 時間から顕著となるこDとから，48 時間以内の固定が望ましい (C) 実証データ②③④．
8補

気管⽀腔内超⾳波断層法（EBUS）等を⽤いて⽣検採取される微⼩な組織検体や細胞検
体では，より短い固定時間で処理が完了するため，業務上⽀障のない範囲で固定時間の短縮化（たとえば 6−24 時間）に努めることが望ましい．⽂献 10．

8補

固定不良，特に 7 ⽇間以上固定された検体では，NGS ⽤のライブラリーの作製（特に網羅性の⾼い遺伝⼦パネル使⽤する場合）が困難となる (N) 実証データ②③，研究⽤規程 2,4．

8補

⼿術検体において診療残余の病変部が存在し，将来のゲノム診断利⽤を考慮しうる場
合，もしくはゲノム診断を⽬的として再⽣検を⾏う場合などでは，核酸の保存に優れた⾮ホルマリン系固定液の使⽤を考慮してよい (R)研究⽤規程 3．

15c) 固定後プロセス《脱灰処理》

13. 硬組織を含む検体をゲノム診断に供する可能性がある場合は，酸脱灰を回避し(N)，EDTA 脱灰を⾏うべきである (C) 研究⽤規程 5《組織のプロセッシング》

14. 従来型の組織プロセッサー（密閉式⾃動固定包埋装置）の使⽤は問題ないが，使⽤薬剤の管理（交換頻度等）の影響については不明である．また迅速型（連続迅《FFPE ブロックの保管》

FT

速⾃動固定包埋装置）では，いまだ⼗分なデータは得られていない

15. FFPE ブロックの保管は，室温でよいが ，多湿を避け冷暗所が望ましい(C)． ゲ
ノム診断を⽬的として作製された FFPE ブロックは，冷蔵下の保存が望ましい(R) ⽂献 16

RA《未染⾊ FFPE 標本の保管》

16. 未染⾊ FFPE 標本の形態で保管する場合は，低温保管やパラフィンコーティングなどの核酸品質劣化を防⽌する対応を⾏うことが望ましいが，原則薄切後時間が経過した未染⾊ FFPE 標本のゲノム診断への使⽤は避け (N)，可能な限り FFPE

D

ブロックから再薄切をすることが望ましい (C)．

[補⾜説明]
16 補

パラフィンコーティングは，マニュアル・マイクロダイセクションや核酸抽出等の作業へ影響を与える場合があり注意を要する．

16

3.2 アナリシス段階a) FFPE ブロックの選択と薄切および HE 染⾊標本へのマーキング《FFPE ブロックの選択》

1. ゲノム診断に供する検体は，病理診断時に作製された HE 染⾊標本の観察や病理
診断報告書の記載等に基づき，解析に必要な腫瘍量を有する FFPE ブロックを，
原則病理医が選択する．このとき出⾎や壊死，炎症細胞などの⾮腫瘍細胞が多い
ブロックの使⽤は可能な限り避ける (C, R)．
2. 同⼀患者において，切除・採取時期が異なる検体が複数存在する場合は，作製時FT期が最新の検体を第⼀選択とすべきである (C, R) 実証データ⑤⑥⑦⑧《FFPE ブロックの薄切および未染⾊標本の作製》

3. FFPE ブロックの薄切時には，検体ごとにミクロトーム刃を交換するなど，他検体のコンタミネーションに⼗分注意する．またグローブを着⽤するなど，核酸分

RA

解防⽌に努めることが望ましい (C)《HE 染⾊標本による確認とマーキング》

4. ゲノム診断⽤に作製した未染⾊ FFPE 標本から，再度 HE 染⾊標本を作製し，原則病理医が標本上にマーキングするとともに腫瘍量（総腫瘍細胞数）や腫瘍割合

D（標本中の全細胞に占める腫瘍細胞の%）を判定する (C) ⽂献 17[補⾜説明]
2補

FFPE ブロックの核酸品質は経年劣化していくことが明らかとなっている実証データ⑤⑥⑦⑧．経年による影響は，NGS の場合，使⽤する遺伝⼦パネルにより異なるが，作製後3 年以内の FFPE ブロックの使⽤が望ましい (C, R) 実証データ⑤，⽂献 18
2補FFPE ブロックは，保管開始とともに検体品質指標（ΔCt 値）や NGS 解析の成功率が変化するなど，核酸品質が経年劣化することが GI-SCREEN 試験の結果から明らかになっており，可能な限り FFPE ブロック作製時期が新しいものを⽤いることが望ましい (C) 実証データ⑤．

4補⼀般にパネル検査に必要な DNA 量は 10〜500ng である。ただし必要な量は使⽤する

17

遺伝⼦パネルや NGS 機器の種類によって異なることから，腫瘍量や腫瘍割合の判定を担当する病理医は，その把握が必要である (C, R)．
4補１有核細胞から得られる DNA 収量は 6 pg 程度と⾒積もられる．仮に 10 ng の DNAを得る場合には約 2000 細胞（未染⾊標本上では腫瘍細胞が豊富なエリアが少なくとも 60~100mm2 程度）からの抽出が必要とされている⽂献 19．

4補腫瘍割合について，SNV（single nucleotide variant）や Indel（small insertion anddeletion）などの変異検出では 30%以上，CNA（copy number alteration）検出を含む
場合は 50%以上の腫瘍細胞を含むように，また遺伝⼦発現量の測定では，可能な限り
⾮腫瘍細胞を含まないようにすることが望ましい．腫瘍割合が満たない場合は，⽤⼿FT

的に⾮腫瘍部分の除去（マニュアル・マイクロダイセクション）が必要となる（C, R）．
なお NGS を⽤いたがん遺伝⼦パネルによるターゲットシ―クエンシングでは，通常ターゲット領域のシークエンス・カバレッジを 250~500x 以上として，変異アレル頻度（variant allele frequency; VAF）の検出閾値を 5~10%とすることが推奨されてい4補RAる実証データ①，⽂献 18, 19, 20．

HE 染⾊標本観察時の腫瘍割合を病理診断報告書へ記録しておくことが望ましい．⾮腫瘍組織の除去操作を実施した場合は，実施した旨と除去操作実施後の腫瘍割合をゲ

D

ノム診断報告書へ記載する（C）．

18b) FFPE 検体からの核酸抽出《核酸抽出》

5. ゲノム診断に使⽤する核酸抽出試薬は，診療での使⽤に適した標準化された市販キットの使⽤が望ましい (C)．また使⽤する各ゲノム診断法において推奨されている市販の核酸抽出キットがある場合には，それを⽤いることが望ましい (C, R)《核酸の純度および収量の確認》

6. 抽出した核酸は，分光光度計等による A260/A280 ⽐の測定や，DNA については蛍光法による dsDNA 濃度の測定等を⾏い，純度や収量を確認することが必要であ《核酸品質の確認》

FTる (C,Ｒ)

7. 核酸抽出を⾏った FFPE 検体が⻑期保管されている場合や過固定等による核酸のRA

品質低下が懸念される場合，核酸品質の確認が推奨される (C, R)[補⾜説明]
5補

市販の核酸抽出キットを⽤いた FFPE 検体からの核酸抽出においては，キット間で純度や収量に差異があり，選択には注意が必要である⽂献 21．
ホルマリンにより⽣成した化学修飾（シトシン塩基の脱アミノ化）を核酸抽出時に酵D

5補素的（ウラシル-DNA N-グリコシラーゼ；UNG）に除去・校正することにより，アー
ティファクトを有するリードの⽣成を抑える（ホルマリン固定により⽣じた変異を正しい塩基配列に戻す）ことが可能である実証データ⑧，⽂献 15．

6補FFPE 検体から抽出した核酸の純度を⽰す A260/A280 ⽐は，⼀般に DNA では 1.7〜1.9
程度，RNA では 1.9〜2.1 程度の範囲とされており，低値を⽰す場合はタンパク等の混⼊が考えられ注意を要する．また DNA 中に RNA が混⼊した場合，A260/A280 ⽐はやや⾼値を⽰す⽂献 22．また他の混⼊物の確認のため A260/A230 ⽐や A220~A320 間のス
キャンニングについても確認をすることが望ましい．

7補

核酸品質確認⽅法には，ΔCt 値をはじめ，表 4 のような指標が知られている．

19

表 4 FFPE 検体の核酸品質確認のための主な指標
指標

対象

説明
リアルタイム PCR（DNA）もしくはリアルタイム RT-PCR（RNA）法により得られる Ct 値を⽤いて核酸品質を評価する⽅法で，特殊な機器を必要としない簡便な⽅法である．DNA 品質
評価では，異なる⻑さの 2 種のアンプリコンサイズ（例：Ct 値/ΔCt 値

50~100 bp 程度の短鎖アンプリコンと，100~300 bp 程度の⻑

DNA/RNA

鎖アンプリコンなど）から得られる Ct 値の差（ΔCt 値）を指標とする⽅法が，⼀般に⽤いられている．国内⼤規模ゲノムスク
リーニング研究（SCRUM-Japan/GI-SCREEN 試験⽂献 23）においては，2000 例を超える FFPE 検体に対し，Thermofisher 社がFT開発したΔCt assay が⾏われ，その有⽤性が⽰されている．
DIN（DNA Integrity Number）はアジレント社の Agilent 2200
TapeStation システムを⽤いた Genomic DNA ScreenTape

DIN

DNA

assay で測定したデータを gDNA の分解度に応じて 1~10 にスコア化された値であり，FFPE 検体の DNA 品質評価が可能であRAる．

Q-value は国⽴がん研究センター中央病院が開発した DNA の品質指標であり⽂献 24，リアルタイム PCR 法を⽤いて得た測定値

Q-valueDNA（Ct 値）を蛍光法による測定値（dsDNA 濃度）で割った値である．Q-value 0.2 以上におけるシーケンス（NCC オンコパネル
v2 使⽤時）の成功率は約 85%である．

D

DV200 はイルミナ社が開発した RNA の品質指標であり， AATI

DV200

RNA

社の Fragment Analyzer またはアジレント社の Agilent 2100
bioanalyzer を⽤いて，200 ヌクレオチド以上の RNA 断⽚の割合を算出する．DV200 による品質区分は，>70%の場合はHigh，50-70%の場合は Medium，30-50%の場合は Low，<30%
は Too degraded としており，<30%の FFPE 検体では，RNA シ
ーケンスのライブラリー調製への使⽤を推奨していない．

20

4. 検体取扱いに関する実証データ

本診療⽤規程策定にあたっては，ゲノム診断の実⽤化を⽬指した臨床研究を推進している，
以下の研究班等およびこれに関係している医療機関および研究機関および関連企業の協⼒を得て，実証データおよび参考データを収集し，編集・編纂を⾏った．

◎協⼒･連携研究班等

FT

厚⽣労働科学研究費 研究班
先端的がん医療実施のための地域完結型病理診断および臨床・病理連携ネットワークの構築に関する研究（研究期間：2014 年度〜2016 年度）
研究代表者 桑⽥ 健

国⽴がん研究センター研究開発費 研究班

RA

がんゲノム情報を⽤いた全国レベルでの precision medicine 体制構築に関する研究（研究期間：2014 年度〜2016 年度）
研究代表者 吉野 孝之

国⽴研究開発法⼈⽇本医療研究開発機構（AMED）委託事業 研究班
産学連携全国がんゲノムスクリーニング事業 SCRUM-Japan で組織した遺伝⼦スクリーニング

D

基盤を利⽤した、多施設多職種専⾨家から構成された Expert Panel による全国共通遺伝⼦解析・診断システムの構築および研修プログラムの開発（研究期間：2016 年度〜2018 年度）
研究開発代表者 吉野 孝之

がんゲノム個別化医療の実現に向けた遺伝⼦診断共通カリキュラム構築と 教育・研修プログ
ラムの実証的開発研究（研究期間：2016 年度〜2018 年度）
研究開発代表者 ⻄尾 和⼈

21

◎実証解析担当機関および協⼒機関等

外科学教室
光冨 徹哉

北海道⼤学病院
コンパニオン診断研究部⾨

特定⾮営利活動法⼈バイオチップコンソー

畑中 豊

シアム（JMAC）

病理診断科/病理部(経済産業省・国際標準共同研究開発事

丸川 活司，畑中 佳奈⼦，三橋 智⼦

業：医療⽤バイオチップ実⽤化促進に向けたヒ

松野 吉宏

ト核酸の測定プロセスに関する国際標準化)

国⽴病院機構 北海道医療センター（連携病理診断実施医療機関）
広瀬 徹，髙橋 宏明

FT

国⽴がん研究センター

的場 亮，⼭本 伸⼦，中江 裕樹(SCRUM-Japan/GI-SCREEN-Japan)
東病院 病理・臨床検査科
桑⽥ 健

RA

東病院 消化器内科
吉野 孝之

東病院 臨床研究⽀援部⾨トランスレーショナルリサーチ推進部

バイオバンク・トランスレーショナル
リサーチ⽀援室D岡本 渉，須藤 智久
三⽊ いずみ

先端医療開発センター 臨床腫瘍病理分野
藤井 誠志

先端医療開発センター ゲノムトランスレーショナルリサーチ分野
⼟原 ⼀哉

近畿⼤学医学部
ゲノム⽣物学教室
⻄尾 和⼈，坂井 和⼦，武⽥ 真幸

22実証解析実施協⼒企業（五⼗⾳順）

イルミナ株式会社
株式会社キアゲン
サーモフィッシャーサイエンティフィック
ライフテクノロジーズジャパン株式会社
シスメックス株式会社
株式会社 DNA チップ研究所

調査協⼒企業（五⼗⾳順）

FT

株式会社理研ジェネシス

アジレント・テクノロジー株式会社
イルミナ株式会社
株式会社医学⽣物学研究所

RA

エムエス機器株式会社（アジェナバイオサイエンス）
株式会社キアゲン

サーモフィッシャーサイエンティフィック
ライフテクノロジーズジャパン株式会社
サクラファインテックジャパン株式会社
シスメックス株式会社

D株式会社 DNA チップ研究所

ナノストリングテクノロジー

バイオラッド ラボラトリーズ株式会社
株式会社理研ジェネシス

ロシュダイアグノスティックス株式会社

23

24

FT

RA

D

FT
D

RA

実証データ

25

26

FT

RA

D

実証データ①
⽇常診療下で作製された FFPE ブロックのゲノム関連検査適⽤性と核酸品質の施設間差《内 容》
・ 国内⼤規模ゲノムスクリーニング研究プロジェクト SCRUM-Japan/GI-SCREEN 試験参加 20 施設から提出された診療時に作製された消化器癌の FFPE 検体（⽣検および⼿術検体）2395 検体のうち，50 症例以上の検体提出を⾏った施設を対象に解析した．
・ FFPE 検体をサーモフィッシャー・サイエンティフィック社の⽶国 CLIA ラボへ送付し，同ラボの⼿順書に従った検査が実施された．必要に応じてマニュアル・マイクロダイセク
ションが実施され、DNA および RNA 抽出後に ΔCt 値アッセイによる確認が⾏われた．
品質基準を満たした検体を対象に，Ion PGMTM システムを⽤いたターゲットシークエン

FT

シング（Oncomine Cancer Research Panel（OCP; 143 遺伝⼦）および Oncomine Solid
Tumour DNA/Fusion Transcript kit（CE-IVD; 26 遺伝⼦）
；サーモフィッシャーサイエンDRA

ティフィック社）が⾏われた．

● ΔCt 値に基づき検体を３つの区分（⾼品質，中間品質，低品質）に分類し，Ct 値が得られなかった検体は PCR 増幅不良検体とした．全体（上図；All）では⾼品質検体が 48%，中間
品質検体が 34%，低品質検体または PCR 他増幅不良検体は 18%を占めた． 50 症例以上の検体提出を⾏った 12 施設における検体品質の施設間差は顕著だった．

27

FT

● ΔCt 値が得られた検体（⾼品質，中間品質，低品質）における網羅性の⾼いパネル（143
遺伝⼦パネル）および⼩型のパネル（26 遺伝⼦パネル）解析での成否については，前図と同様の結果が得られ，低品質検体または PCR 他増幅不良検体の割合が⼤きい施設では，両RAパネルの不成功割合も⾼かった．この集計においても 12 施設における施設間差は顕著であった．全体（上図；All）では，網羅性の⾼いパネルが成功した検体は 67%，⼩型のパネルDのみが成功した検体が 12%，両パネルが不成功となった検体は 21%であった．

● 各品質区分別のシークエンス成功割合では，⾼品質検体では 143 遺伝⼦パネルの成功割合
は約 91%，26 遺伝⼦パネルでは約 98%であった．

28

実証データ②
ホルマリン固定時間延⻑が検体品質および NGS ⽤ライブラリー調製に与える影響《内 容》
・ 単⼀施設において，切除後のホルマリン固定時間（1，2，3，7 および 14 ⽇）の影響を確認するために精度管理⽤に作製された⼤腸癌⼿術検体を⽤いて検討した．
・ 市販の FFPE 組織⽤ DNA 抽出キット（キアゲン社）を⽤いて DNA 抽出を⾏ったのちに，
リアルタイム PCR 法を⽤いた DNA 品質の確認を⾏い．品質基準を満たした検体を対象に，MiSeq システム（イルミナ社）を⽤いたアンプリコンシーケンス（TruSeq Amplicon

D

RA

FT

Cancer Panel；イルミナ社）のライブラリー調製を⾏った．

● 本遺伝⼦パネルで使⽤が推奨されているイルミナ社 FFPE QC assay を⽤いたΔCt 値測定による品質確認では， 7 ⽇および 14 ⽇固定検体は基準を満たさなかった（A；⾚線はカット
オフ）．他のアッセイにおいても同様の結果が得られた（B-F）．

29

● 上述の GI-SCREEN 試験では，特定のハウスキーピング遺伝⼦のアンプリコンサイズの異なるプライマーセットを⽤いたアッセイにより，３つに区分化（⾼品質，中間品質，低品質）されている（D）．この検討では，FFPE ブロック作製後 3 年の検体を使⽤しているが、固定２⽇間のものではΔCt 値は品質区分が中間品質となっている．RNase P 遺伝⼦のアンプ
リコンサイズの異なるプライマーセットを⽤いたアッセイでは，通常のΔCt 値測定ではな
く（E），検量線を利⽤した指標が推奨されている（F）． 各アッセイについては補遺 3 を参
照．

FT

症例 2

D

3 ⽇固定

RA

2 ⽇固定

1 ⽇固定

症例 1

● 150ng の DNA を⽤いてライブラリー調製し，アジレント社の 2100 bioanalyzer を⽤いて，ライブラリーQC の確認を⾏った．イルミナ社 FFPE QC assay によるΔCt 値測定の品質確
認で検体 QC の基準に満たなかった 7 ⽇固定および 14 ⽇固定検体では，ピークが観察されなかった．1 ⽇，2 ⽇，3 ⽇固定検体では，すべての検体においてピークが確認されシークエンス結果が得られたが，症例 2 の 3 ⽇固定検体のピークは微⼩であった．

30

実証データ③
ホルマリン固定時間延⻑による塩基置換アーティファクト⽣成への影響《内 容》
・ TruSeq Amplicon Cancer Panel（イルミナ社）を⽤いたアンプリコンシークエンスによる解析を， 1，2 および 3 ⽇間固定した 2 症例の⼤腸癌⼿術検体を⽤いて検討した．

D

RA

FT

・ サンプル調製に関する詳細は実証データ②を参照．

31

● ΔCt 値等を指標に DNA 品質を検討したところ，7 ⽇固定および 14 ⽇固定検体は当該遺伝⼦パネル使⽤上の品質基準を満たさず，またライブラリー作製が不成功となったため，本検討では 1 ⽇，2 ⽇および 3 ⽇固定検体のみを⽤いた．
● 得られたシークエンスデータの解析を⾏ったところ，固定 1〜3 ⽇の間で，総リード数，リード深度に⼤きな偏りは認められなかった．
● 本遺伝⼦パネルのシーケンス領域の総塩基数（3.5kb）における各タイプの塩基変化数を解析したところ，C>T 置換をはじめ，A>G 置換，A>T 置換などの塩基変化数の増加が，ホルマリン固定 3 ⽇⽬から急速に顕著になった（A）．固定によるアーティファクト変化である可能性が⾼いと判断される変異頻度が 0.1%以下のものに絞り，再解析をおこなったとこ

D

RA

FT

ろ，塩基変化数は全塩基変化数（A）と近似した数となった（B）．

32

実証データ④
ホルマリン固定時間延⻑による総リード数への影響《内 容》
・ 2 種 の ⼩ 型 遺 伝 ⼦ パ ネ ル （GeneRead Actionable Insight Tumor Panel (12 genes)[AIT12]；キアゲン社および TruSight Tumor 15 Kit [TST15]；イルミナ社）を⽤いたアン
プリコンシークエンスによる解析を， 1 ⽇，3 ⽇および 7 ⽇固定を施した 4 検体（⼤腸癌 2 例，肺癌 1 例，胃消化管間質腫瘍（GIST）1 例）を⽤いて検討した．
・ TST15 についてはリアルタイム PCR 法を⽤いた DNA 品質の確認を⾏い，品質基準を満たしていることを確認し，解析を⾏った（実証データ② -検体 QC チェックデータ B）．

FT・ AIT12 を⽤いた遺伝⼦変異パネル解析では 40ng の dsDNA を⽤いてライブラリー作製を
⾏い，ライブラリーQC を⾏った後に，GeneReader システム（キアゲン社）で解析を⾏った．

・ TST15 を⽤いた遺伝⼦変異パネル解析では 20ng の dsDNA を⽤いてライブラリー作製をDRA⾏い，ライブラリーQC を⾏った後に， MiSeq システム（イルミナ社）で解析を⾏った．

33

● いずれの⼩型遺伝⼦パネルにおいても，1〜7 ⽇固定検体での解析が可能であり，核酸品質が低い FFPE 検体に対して特に有⽤であることが推察された．⼀⽅，総リード数は，ホルマ
リン固定時間が延⻑するに従い，減少した．なお，固定時間延⻑に伴う総リード数の減少

D

RA

FT

は，使⽤する遺伝⼦パネルによってその影響の度合いは異なる．

34

実証データ⑤
FFPE ブロック保管期間が DNA 品質（ΔCt 値）に与える影響《内 容》
・ GI-SCREEN 試験参加 20 施設から提出された診療時に作製された消化器癌の FFPE 検体（⽣検および⼿術検体）2395 検体を対象に調査した．

D

RA

FT

・ サンプル調製の詳細は実証データ①および②を参照．

● ⾼品質検体の割合は，経年的に低下する⼀⽅，低品質検体の割合は増加した．
（上図）．また解析の成否についても同様の傾向が認められた（下図）．

35

実証データ⑥
FFPE ブロック保管期間が RNA 品質（総リード数）に与える影響《内 容》
・ ⾮⼩細胞肺癌 169 症例の FFPE 組織検体から抽出した RNA を⽤いて検討した．使⽤したFFPE ブロックの作製年は， 100 検体が 2007 年，49 検体が 2012 年，20 検体が 2013 年であった．
・ 半導体シークエンサーIon PGM システムを⽤いて，Ion AmpliSeqTM RNA Fusion Lung
Cancer Research Panel (サーモフィッシャー・サイエンティフィック社)でのアンプリコ

D

RA

FT

ンシークエンシングを⾏った（測定解析は 2014 年に実施）．

● 本融合遺伝⼦解析パネルにおける総リード数の中央値は，2013 年作製のブロックでは
288,838（最⼩値 157,085−最⼤値 431,332），2012 年作製ブロックでは 257,516（最⼩値149,998−最⼤値 435,890），2007 年作製ブロックでは 282,887（最⼩値 4,987−最⼤値
562,580） であった．

● 169 検体のうち，総リード数が 20,000 以下となり評価困難と判断された 4 例はすべて 2007
年作製ブロックであった．2007 年作製ブロックは，2012 年や 2013 年に⽐べて取得リード数の低下が認められ，経年劣化の影響が考えられた．

36

実証データ⑦
FFPE ブロック保管期間が DNA および RNA 品質（リード数）に与える影響《内 容》
・ ⾮⼩細胞肺癌 110 症例の FFPE 検体から DNA および RNA を抽出した．DNA および RNAの定量は，PicoGreen dsDNA 定量試薬および PicoGreen RNA 定量試薬（サーモフィッ
シャーサイエンティフィック社）を⽤いて定量した．アンプリコンシークエンスでの遺伝
⼦変異解析および融合遺伝⼦解析には，DNA，RNA ともに最⼤ 10 ng を使⽤した．
・ Ion PGM システムを⽤いて，DNA より Ion AmpliSeqTM Colon and Lung Cancer Panel，
RNA より Ion AmpliSeqTM RNA Fusion Lung Cancer Research Panel （サーモフィッシ

DRA

2014 年〜2015 年に実施）．

FTャーサイエンティフィック社）でのアンプリコンシークエンスを⾏った．（測定解析は● DNA を⽤いた遺伝⼦変異パネル解析では，総リード数の中央値は 412,715 であった．110
検体のうち，5 検体で総リード数が 50,000 以下となり，また 1 検体で⼗分な総リード数が得られたものの、 C>T 置換数が 35 と⾼い値を⽰し，解析困難と判定された（A, B）．
● RNA を⽤いた融合遺伝⼦パネル解析では、総リード数の中央値 256,836 であった．110 検体のうち，4 検体で総リード数が 20,000 以下となり，解析困難と判定された（C）．

37

● DNA を⽤いた遺伝⼦変異パネル解析において，解析実施年から 4 年以上経過（2004〜2010
年に作製）した FFPE 検体では解析成功率は 81.8%（n=11）， 3 年以内（2011〜2013 年に（n=41）であった（D）．

FT作製）の検体では 96.6%（n=58），解析実施年（2014~2015 年に作製）の検体では 100%

● RNA を⽤いた融合遺伝⼦パネル解析において，解析実施年から 4 年以上経過（2004〜2010
年に作製）した FFPE 検体では解析成功率は 81.8%（n=11）， 3 年以内（2011〜2013 年にRA作製）の検体では 94.8%（n=58），解析実施年（2014~2015 年に作製）の検体では 97.6%

D（n=41）であった（E）．

38

実証データ⑧
FFPE ブロックの保管期間延⻑による塩基置換アーティファクトの⽣成と UNG 処理によるアーティファクトの除去効果《内 容》
・ 1 ⽇および 3 ⽇固定を施した 2 症例の⼤腸癌⼿術検体を対象に TruSeq Amplicon Cancer
Panel（イルミナ社）を⽤いたアンプリコンシークエンスによる解析を実施した．解析は2014 年（FFPE ブロック作製直後）および 2017 年（作製 3 年後）の 2 回実施した．
・ 2017 年に実施した解析では， UNG 処理の効果を確認するため，3 ⽇固定検体を⽤いて，2 種の核酸抽出キット（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit [処理なし]および GeneRead

D

RA

FT

DNA FFPE Kit [処理あり]；キアゲン社）を⽤いた⽐較検討を⾏った．

● 1 ⽇および 3 ⽇固定検体ともに，⻑期保管期間により，各塩基変化アーティファクトが増加
し，特に C>T 置換では顕著であった（A, B の下図は，上図の拡⼤）．⻑期保管期間により増加した塩基変化数は，保管当初の塩基変化数に⽐例していた．

39

● UNG 処理の有無のキット間⽐較においては，処理なし（UNG−）に⽐べ，処理あり（UNG

FT＋）の検体で，C>T 置換塩基数が低減した．⼀⽅，T>C 置換など⼀部の置換種では置換塩基数が増加した．総リード数および平均リード深度は，UNG＋で 8 倍以上⾼くなったことから，すでに報告されているように UNG 処理により，DNA 品質の改善が期待されるが．効
果が⼀様ではないことから，実施にあたっては事前検討により効果の程度を確認し，UNG

D

RA

処理の要否を判断することが望ましい．

40

実証データ⑨
ホルマリン固定時間がマイクロアレイ測定へ与える影響《内 容》
・ 乳 癌 再 発 リ ス ク 予 測 検 査 で 使 ⽤ さ れ て い る マ イ ク ロ ア レ イ 法 （GeneChip Human
Genome U133 + 2.0 arrays; アフィメトリクス社）における固定の影響を検討するため，
1，2，3，7 および 14 ⽇固定を施した乳癌検体（11 例）を⽤いて検討した．
・ 各検体から抽出された RNA 100ng を⽤いて cDNA の合成を⾏い、その収量確認を⾏った

RA

FT

後に、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション及び蛍光強度の検出を実施した.

● 逆転写反応後の cDNA の収量，マイクロアレイの QC 項⽬である SF 値*1 および%P 値*2 について検討を⾏ったところ，いずれの項⽬においても，3 ⽇固定以降有意なが変化が認められた（*:p<0.05, **:p<0.01）.

D*1 全プローブ発現量の平均蛍光強度を反映する値であり、平均蛍光強度を⼀定の値まで補正するための係数で⽰される。⾼値はアレイが暗いことを意味し、サンプル品質や⼿順等に問題があり、適切に測定できていな
いことを表す.
*2 全プローブのうち発現しているプローブの割合であり、⼀定割合以下の場合は適切に測定できていない可能性が⾼く、マイクロアレイデータの信頼性が低いことを表す.

41

● マイクロアレイ全体のプローブ発現量に与える影響について，固定時間 1 ⽇を対照とした相関解析を実施したところ，固定時間延⻑に伴い相関係数が低下し，とくに発現量の低いプロ

D

RA

FT

ーブの相関が著しく低下した.

42

5. 参考資料

A. 研究⽤規程（ゲノム研究⽤病理組織検体取扱い規程）
⽇本病理学会・ゲノム病理診断検討委員会/ゲノム病理組織取扱い規約委員会作成．2016 年
http://pathology.or.jp/genome/1.

第 3 部「摘出から固定まで」推奨記載および実証データ①：固定までの時間・固定時
間・ホルマリンの種類と濃度の DNA の品質に対する影響

2.

第 3 部「固定液の濃度と種類」推奨記載および実証データ②：固定時間・ホルマリン

3.

FTの種類と濃度の DNA の品質に対する影響
第 3 部「固定液の濃度と種類」推奨記載および実証データ⑤：ホルマリンを含まない
固定液のゲノム DNA の品質への影響
4.

第 3 部「固定時間」推奨記載および実証データ⑧：固定時間・ホルマリンの種類と濃RA

度の DNA の品質に対する影響

B. ⽂ 献1.

Hammond ME, Hayes DF, Dowsett M, et al. American Society of ClinicalD

Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for
immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast
cancer. J Clin Oncol. 2010; 28: 2784-95.

2.

Khoury T, Sait S, Hwang H, et al. Delay to formalin fixation effect on breast

biomarkers. Mod Pathol. 2009; 22: 1457-67.
3.

Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on thecontent and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002; 161: 1961‒1971.

4.

平成 27 年度 厚⽣労働科学研究費補助⾦「先端的がん医療実施のための地域完結型病理診断および臨床・病理連携ネットワークの構築に関する研究」分担研究報告書．2016 年

5.

Sato M, Kojima M, Nagatsuma AK, et al. Optimal fixation for total preanalytic phase43

evaluationinpathology

laboratories:acomprehensive

study

includingimmunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathol Int. 2014; 64: 209-16
6.

⽇本病理学会 編：胃癌・乳癌 HER2 病理診断ガイドライン（第 1 版）．⾦原出版．2015
年

7.

Wolff AC, Hammond ME, Hicks DG, et al. Recommendations for human epidermal
growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of ClinicalOncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin
Oncol. 2013; 31: 3997-4013.
⽇本肺癌学会 バイオマーカー委員会作成：肺癌患者における EGFR 遺伝⼦変異検査のFT

8.

⼿引き（第 3.05 版）．2016 年．
9.

⽇本肺癌学会 バイオマーカー委員会作成：肺癌患者における ALK 融合遺伝⼦検査の⼿引き（第 2.1 版）．2015 年．

RA

10. Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB, et al. Molecular testing guideline for selectionof lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: guideline fromthe College of American Pathologists, International Association for the Study ofLung Cancer, and Association for Molecular Pathology. J Thorac Oncol. 2013; 8: 823859.

11. ⽇本肺癌学会 バイオマーカー委員会作成：肺癌患者における ROS1 融合遺伝⼦検査のD⼿引き（第 1.0 版）．2017 年．

12. ⽇本肺癌学会 バイオマーカー委員会作成：肺癌患者における PD-L1 検査の⼿引き（第1.0 版）．2017 年．

13. ⽇本臨床腫瘍学会 編：⼤腸がん診療における遺伝⼦関連検査のガイダンス（第 3 版）．
2016 年．
14. Williams C, Pontén F, Moberg C, et al. A high frequency of sequence alterations isdue to formalin fixation of archival specimens. Am J Pathol. 1999;155: 1467-71.
15. Do H, Dobrovic A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes
and strategies for minimization. Clin Chem. 2015; 61: 64-71.

16. von Ahlfen, Missel A, Bendrat K, et al., Determinants of RNA quality from FFPE

44

samples. PLoS One. 2007; 2: e1261.
17. Cree IA, Deans Z, Ligtenberg MJ, et al. Guidance for laboratories performing
molecular pathology for cancer patients. J Clin Pathol. 2014; 67: 923-31.
18. Jennings LJ, Arcila ME, Corless C et al. Guidelines for Validation of Next-Generation
Sequencing‒Based Oncology Panels：A Joint Consensus Recommendation of the
Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. J Mol
Diagn. 2017; 19: 341‒365.
19. Chen H, Luthra R, Goswami RS, et al. Analysis of Pre-Analytic Factors Affecting the

FTSuccess of Clinical Next-Generation Sequencing of Solid Organ Malignancies.
Cancers. 2015; 7: 1699‒1715.

20. New York State Department of Health. "Next Generation" Sequencing (NGS)
guidelines for somatic genetic variant detection. 2016; Updated and Revised.

RA

21. Janecka A, Adamczyk A, Gasińska A., Comparison of eight commercially available
kits for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Anal
Biochem. 2015; 476 :8-10.

22. Simbolo M, Gottardi M, Corbo V, et al. DNA Qualification Workflow for Next
Generation Sequencing of Histopathological Samples PLoS ONE. 2013; 8: e62692.

D

23. Yoishino T., SCRUM-Japan GI-SCREEN: The nationwide cancer genome screening
projects for gastrointestinal cancer in Japan. Annals of Oncology 26 (Suppl 7): vii5,
2015.

24. Tanabe Y, Ichikawa H, Kohno T. et al. Comprehensive screening of target moleculesby next-generation sequencing in patients with malignant solid tumors: guiding
entry into phase I clinical trials. Mol Cancer. 2016; 15: 73.

45

46

FT

RA

D

D

RA

FT

補遺 1： 病理部⾨における FFPE 検体の作製と分⼦診断での使⽤の流れ

47

D

RA

FT

補遺２： ゲノム関連検査利⽤のための HE 染⾊標本のマーキング例(A) ⼤腸癌標本の全体像．⻘線；腫瘍細胞が広がっている範囲．⻩線；ゲノム診断に⽤いる範囲．緑線；⼀部トリミングがのぞましい範囲．(B) 腫瘍細胞塊がみられるものの好中球が多数存在するため使⽤は避ける．(C) 腫瘍細胞がみられるものの，形質細胞や筋層など⾮腫瘍細胞が多く存在することから使⽤は避ける．

48

FT

RA

D