原著論文

診療と新薬 2023; 60: 629-635

桂枝加苓朮附湯の関節炎改善作用とその作用機序に関する研究

診療と新薬 Web小林製薬株式会社 中央研究所

松下哲也／萩野 輝／上杉晴香／柴原豪了／赤木淳二● 要約
目的：変形性関節症（Osteoarthritis：以下，OA）をはじめとする関節炎は，関節内および関節周囲の炎症に加え，関節軟骨の変性や減少，関節腫脹を伴うことで，疼痛や可動域制限を生じる。漢方薬である桂枝加苓朮附湯（以下，KJ）は，関節痛の適応を持ち，OA の治療などに用いられるが，これまでにその薬理作用に関する研究は十分に行われていない。そこで本研究では，四肢に関節炎を発症させた関節炎モデルマウスに対する KJ の機能的および組織学的な評価を行い，その作用機序について検討することとした。
方法：関節炎の評価にはコラーゲン誘導性関節炎モデルマウスを用いた。8 週齢の雄性 DBA/1J
Jms Slc マウスにタイプⅡコラーゲン / フロイント完全アジュバントを皮内投与し，一次感作を行った。一次感作から 3 週間後に二次感作として同様の投与を行い，関節炎を発症させた。KJを 7 週齢時から 50 日間経口投与（750 mg/kg 体重 /day）し，二次感作後の四肢の関節炎スコアを経時的に記録した。KJ の投与から 45 日目に前肢の指関節の可動域の評価として懸垂試験を行い，落下するまでの懸垂時間を測定した。50 日間の投与後に膝関節を摘出し，関節軟骨，ヒアルロン酸（Hyaluronic acid：以下，HA），およびⅡ型コラーゲン染色による組織学的評価を行った。また，作用機序を明らかにする目的で，HA 分解酵素であるヒアルロニダーゼならびに軟骨細胞の HA 産生に対する KJ の作用を in vitro で検討した。
結果：KJ は関節炎スコアを有意に改善し，炎症に伴う関節の腫脹や発赤を抑制した。懸垂試験
では懸垂時間の有意な延長を認めた。また，組織染色による評価では対照群において関節軟骨および HA が減少したのに対し，KJ 群では減少の抑制が認められた。また，in vitro において KJに濃度依存的なヒアルロニダーゼ阻害活性および軟骨細胞における HA 産生の促進がみられ，KJ に HA の分解を抑える作用と生み出す作用の両作用が認められた。
考察：KJ は，関節における抗炎症作用に加えて，関節組織の潤滑成分である HA の分解抑制作用と産生促進作用により，関節軟骨の損失を抑え，OA などの関節機能障害の改善に役立つものと考えられた。
Key words：桂枝加苓朮附湯，関節炎，ヒアルロン酸はじめにとして，関節軟骨の損失と広範な骨変化を特徴とす
る 変 形 性 関 節 症（ 以 下，OA） が 挙 げ ら れ， 膝，関節痛は様々な原因によって引き起こされ，男女股，肩，手指，首など様々な関節部位で生じる。日を問わず年齢とともに関節痛を訴える人は増加す

本における OA の有病者数は膝だけでも約 2,530 万る1）2）。なかでも関節痛を引き起こす主な原因疾患

人と推定されており，超高齢化社会の進行に伴い今

連絡先：小林製薬株式会社 中央研究所 松下哲也（〒 567-0057 大阪府茨木市豊川 1-30-3）
TEL：080-7551-9767 FAX：072-640-0118 E-mail：te.matsushita@kobayashi.co.jp

14 （630）

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週齢（期間） 7（0）

8（1）

9（2）

第 10 号（2023 年 10 月）

10（3）

11（4）

12（5）

13（6）

14 週齢
（7 週）

１回 / 日，50 日間

薬物投与
感 作

一次

二次

関節炎スコア
懸 垂
組織切片

図1

表1

試験スケジュールの概要

関節炎スコアの評価

スコア（点）症

01234

症状なし
指など小関節 1 本の軽度発赤腫脹
小関節が 2 本以上，あるいは大きな関節の発赤腫脹
1 肢の発赤腫脹1 肢の全体が最大限に発赤腫脹後の患者の割合はさらに増加すると予想されている 3）。OA は関節軟骨の変形および減少，関節腫脹状

Ⅰ．材料および実験方法に加えて，関節内および関節周囲に炎症を引き起こ

1．使用薬物す疾患であり，炎症に伴う関節液の貯留や，ヒアルKJ は一般用漢方製剤製造販売承認基準 8）に従い，ロン酸（以下，HA）の分解や合成の低下が軟骨面

桂 皮（4）， 芍 薬（4）， 大 棗（4）， 白 朮（4）， 茯 苓4）〜 6）。一般的な治療法（4），生姜（1），甘草（2），附子末（0.5）を括弧内として NSAIDs などの抗炎症鎮痛薬が用いられるの重量比で混合した生薬を熱水抽出し，乾燥させたことが多いが，NSAIDs は長期の服用により消化器ものを使用した。

における適切な潤滑を妨げる障害などを引き起こすことがあり，NSAIDs 以外の治療アプローチとして，HA やステロイドの関節内2．コラーゲン誘導性関節炎モデル作製と薬物投与

注射，コンドロイチン硫酸・グルコサミンの内服，コラーゲン誘導性関節炎モデルとして雄性温熱療法，運動療法などの手段が選択されることもDBA/1J Jms Slc マウス（日本エスエルシー）を 63）週齢にて購入し，実験に使用した。飼育期間中，固ある 。
桂枝加苓朮附湯（以下，KJ）は 8 種の生薬から型飼料（ラボ MR ストック，日本農産工業）およ構成される漢方薬であり，関節痛や神経痛の適応をび水道水を自由に摂取させた。1 週間の予備飼育持つ。これまでに OA を始めとする関節炎の治療に後，KJ 群には，蒸留水に溶解した KJ を 750 mg/kg7）広く用いられているが ，その薬理作用に関する研体重 /day の投与量となるように胃内ゾンデで 50 日究は十分に行われていない。そこで本研究では，間経口投与した。対照群には，蒸留水のみを経口投

KJ の OA に対する薬理作用の解明研究の一環とし与した。また，比較群として，蒸留水に溶解したコて，コラーゲン誘導性関節炎モデルマウスに対するン ド ロ イ チ ン 硫 酸 エ ス テ ル ナ ト リ ウ ム（ 以 下，機能的および組織学的な評価を行うとともに，inCS，小林製薬）を 260 mg/kg 体重 /day の投与量でvitro にて HA の分解や産生に対する作用を検討し経口投与した。薬物投与から 1 週間時点（8 週齢）た。

でタイプⅡコラーゲンによる一次感作を行い，さら診療と新薬・第 60 巻

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15 （631）14

関節炎スコア（点）12＃＃＃＃＃＃

10
＃＃

＊

8＊＊
＃＃

6

正常群

4

対照群

＊＊

KJ群

＃＃
＊＊

2

CS群

＊＊
＊＊

00

7

1421

二次感作からの経過日数（日）Mean ± S.E. （n ＝ 3-6），＃＃：p ＜ 0.01（vs. 正常群），＊：p ＜ 0.05，＊＊：p ＜ 0.01（vs. 対照群）

図2

関節炎スコアに 3 週間後に二次感作を行い，関節炎を発症させ麻酔下で放血安楽致死をさせ，左右後肢膝関節を摘た。タイプⅡコラーゲンは，ウシ関節軟骨由来タイ出した。その後，余分な皮膚や筋肉を除去し，10プⅡコラーゲン末（コラーゲン技術研修会）を 2％中性緩衝ホルマリンに固定した。固定した膝関節

mg/mL となるように 50 mM 酢酸水溶液に溶解し，を 10％ EDTA 液（pH 7.4）で脱灰後，大腿骨滑車

等 量 の フ ロ イ ン ト 完 全 ア ジ ュ バ ン ト（Difco

溝・脂肪体（滑膜）・膝蓋骨を含む正中断面で切りLaboratories）を加えてエマルジョン化したものを出し，パラフィンブロック標本を作製した。パラ使用した。これをイソフルラン吸入麻酔下で，マウフィンブロック標本を薄切後，サフラニン O ファ

ス 1 匹当たり 0.1 mL を尾根部に皮下投与した。なストグリーンによる軟骨基質染色，HA 結合蛋白

お，タイプⅡコラーゲンによる感作を行わない動物（HABP）による HA 染色，および免疫染色によるを正常群とし，対照群と同様に蒸留水のみを経口投Ⅱ型コラーゲン染色をそれぞれ行った。
6．ヒアルロニダーゼ阻害試験与した。
動物実験は，新薬リサーチセンター実験動物委員

ヒアルロニダーゼ阻害試験は Kakegawa らの方会にて審査・承認された内容に従い実施した。試験法 10）を参考に行った。KJ を 0.1 M 酢酸緩衝液（pHスケジュールの概要を図 1 に示した。

4.0）に溶解し，上清を試料溶液とした。酵素溶液

3．関節炎スコア（4 mg/mL，ウシ由来ヒアルロニダーゼ，シグマア

二次感作後の四肢における関節炎の症状についルドリッチジャパン），基質溶液（0.8 mg/mL，ヒ9）て，表 1 の関節炎スコア に従い，2 回 / 週の頻度

アルロン酸カリウム，和光純薬工業），酵素活性化で評価を行い，四肢のスコアの合計値を算出した。

液（0.5 mg/mL，Compound 48/80，シグマアルド

4．懸垂試験

リッチジャパン）を，いずれも酢酸緩衝液を用いて前肢の指関節における可動状況を評価するため，調製した。発色試液（0.1 g/mL，p -ジメチルアミノ

薬剤の投与開始から 45 日目に懸垂試験を実施しベンズアルデヒド，和光純薬工業）は塩酸酢酸混合た。体重の 40％の錘を尾部に負荷し，高さ 15 cm液（10 N 塩酸：酢酸＝ 3：22）を用いて調製し，の位置に水平に張った針金に動物の両側前肢を掛け使用直前に酢酸で 10 倍希釈して使用した。試料溶て懸垂させ，落下するまでの懸垂時間を記録した。

液，酵素溶液，酵素活性化液，基質溶液の順に 2：5．病理組織学的検査

1：2：5 の割合で混合し，37℃で 40 分間酵素反応

最終投与翌日に，動物をイソフルランによる吸入を行い，0.4 N 水酸化ナトリウム水溶液を加えて反16 （632）

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100

第 10 号（2023 年 10 月）＊＃懸垂時間（秒）

80
60
40200
正常群

対照群

KJ 群

CS 群

Mean ± S.E.（n ＝ 3-6），＃
：p ＜ 0.05（vs. 正常群），＊：p ＜ 0.05（vs. 対照群）

図3

応を停止させた。0.8 M ホウ酸緩衝液（pH 9.0）を加え，105℃で 5 分間加熱した後，発色試液を加え懸垂時間Ⅱ．結果て 37℃で 30 分間反応させた後，585 nm における関節炎スコアを図 2 に示した。対照群の関節炎吸光度を測定した。ヒアルロニダーゼ阻害率は試料

スコアは二次感作からの経過日数とともに増加し，を添加した際の吸光度の変化量から算出し，50％二次感作から 3 日目以降のすべてのスコアで正常群阻害濃度（IC50）を算出した。

に対する有意な上昇がみられた。一方，KJ 群は二7．HA 産生試験

次感作から 3，7，10，および 14 日目に対照群に対Chondrocyte growth medium（C-27101， タ カ ラする有意な低下がみられた。CS 群は二次感作から

バ イ オ ） に て 培 養 し た ヒ ト 軟 骨 細 胞（Human

3，14 日目に対照群に対する有意な低下がみられた。

Chondrocyte：HCH，C-12710，タカラバイオ）を懸垂試験における懸垂時間を図 3 に示した。ま150,000 cells/well になるように 6 well プレートにた，懸垂試験の様子を図 4 に示した。正常群の懸播種し，一晩培養した。培養後，蒸留水で抽出した

垂時間は 67.7 ± 9.2 秒に対して，対照群は 13.3 ±KJ を 0.2 µm フィルター処理し，終濃度が 1％にな5.0 秒であり，対照群において懸垂時間の有意な低るように細胞に添加し，4 日間培養した。培養後，下がみられた。一方，KJ 群では 59.5 ± 11.4 秒で培養上清を回収し，HA 量を QnE Hyaluronic Acidあり，対照群と比べて有意に懸垂時間が延長した。

ELISA Assay Kit（BTP-96200，フナコシ）を用い

CS 群は 21.7 ± 5.1 秒であった。て測定した。

膝関節の組織染色の結果を図 5 に示した。正常8．統計解析

群と比べて対照群や CS 群では関節軟骨の染色性が結果はすべて平均値および標準誤差で示した。動低下し、軟骨基質の損失が認められた。一方，KJ

物 実 験 で は， 正 常 群 と 対 照 群 の 有 意 差 検 定 に は群では染色性の低下は認められず，顕著な残存がみStudent の t 検定を用い，対照群と KJ 群および CSられた。HA の染色像においては，正常群において群との有意差検定には Dunnett 多重比較検定を用

関節軟骨部位に HA の集積がみられるのに対し，対いた。また，酵素実験の有意差検定には Dunnett

照群や CS 群では染色性は低下し，HA の減少が認多重比較検定を用い，細胞実験では Student の t 検められた。KJ 群では正常群と同レベルの染色性を定を用いた。いずれの検定においても有意水準は両示し，HA が維持されていた。一方，II 型コラーゲ

側 5％とした。統計解析には Excel 統計 Ver.3.21

ンの染色像においては対照群，KJ 群，および CSを使用した。

群のいずれにおいても正常群に対して染色性の低下

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正 常 群

対 照 群

KJ 群

CS 群

図 4 懸垂試験時の様子（典型例）

正 常 群

対 照 群

関節軟骨
関節軟骨HAヒアルロン酸（HA）

Ⅱ型コラーゲン
Ⅱ型コラーゲン

図5

組織切片染色KJ 群

CS 群

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IC 50 = 4.8（mg/mL）
＊＊60
40＊＊
＊＊

20

HA 産生量（ng/mL）

阻害率（％）

80

6000

＊

5000
4000
3000
2000
1000
000.0160.08

0.4

210終濃度（mg/mL）
Mean ± S.E.（n ＝ 3），＊＊：p ＜ 0.01（vs. 0 mg/mL）

図6

Control

KJ＊

Mean ± S.E.（n ＝ 6）， ：p ＜ 0.05（vs. Control）

図7

HA 産生量ヒアルロニダーゼ阻害活性

与し，軟骨破壊を防ぐことから 11），KJ は関節組織において減少する HA を維持・増加させ，関節軟骨がみられた。
ヒアルロニダーゼ阻害試験の結果を図 6 に示しの破壊を抑制したと考えられる。また，HA は関節た。KJ は終濃度 0.4，2，および 10 mg/mL においにおいて炎症性サイトカイン産生抑制や疼痛抑制をて阻害率 17.6，25.0，および 66.9％を示し，濃度示すことから 5），HA が維持されることで炎症が抑依存的なヒアルロニダーゼ阻害活性が認められた

えられ，関節炎スコアの改善や懸垂時間の延長にも（IC50 ＝ 4.8 mg/mL）。

寄与したと考えられる。

軟骨細胞における HA 産生量の測定の結果を図 7

通常，関節痛改善を目的に KJ は満量処方としてに 示 し た。Control が 3820 ± 243 ng/mL の HA 産

1 日 4.4 〜 4.8 g，CS は 1 日 1.56 g がヒトにおいて生量に対して，KJ では 4502 ± 154 ng/mL であり，服用されており 12）13），KJ の方が 1 日服用量が 2.8 〜有意な HA 産生量の増加がみられた。

3.1 倍多い。今回，このヒト用量比をもとに投与量Ⅲ．考察を設定し，動物試験を行ったところ，KJ 群およびCS 群ともに関節炎スコアの改善が認められたもの

コラーゲン誘導性関節炎モデルマウスを用いての，懸垂時間の延長は KJ 群でのみ観察され，まKJ の薬理作用について評価を行った結果，KJ 群はた，組織学的評価においても，KJ 群でのみ関節軟二次感作後 3 日目から関節炎スコアの有意な改善を骨や HA の維持が認められた。このことから，KJ示し，KJ に炎症による腫脹や発赤を抑える効果がには関節軟骨組織の破壊を防ぐ作用があり，CS と確認された。また，関節炎が十分に進行した薬剤投は異なる働きを示すものと考えられた。

与 45 日目（二次感作から 17 日目）に懸垂試験を次に，HA の分解や産生に対する KJ の作用を明実施した結果，KJ 群において懸垂時間の有意な延らかにするため，HA 分解酵素であるヒアルロニ長が認められた。手指の炎症や腫脹は関節可動の悪ダーゼや，軟骨細胞における HA 産生に対する作用化を引き起こし，懸垂時間の低下に繋がることかを in vitro にて評価した。その結果，KJ の濃度依ら，KJ 投与によって炎症が抑えられたことで可動存的なヒアルロニダーゼ阻害活性や，軟骨細胞にお性が改善し，懸垂時間の延長に寄与したと推察されける HA 産生増加がみられたことから，KJ に HAる。次に KJ 投与による関節組織への影響を検討すの分解を抑える作用と生み出す作用の両作用があるるため，膝関節の組織学的評価を行った。その結ことが分かった。これまでに KJ の構成生薬のうち果，対照群や CS 群において関節軟骨および HA の甘草においてヒアルロニダーゼ阻害作用や HA 合成減少が認められたのに対し，KJ 群ではこれら基質促進作用が報告されており 14）15），KJ による HA の維成分の残存が認められた。HA は関節の潤滑性に関持に構成生薬の甘草が寄与している可能性が推察さ

診療と新薬・第 60 巻れる。一方，漢方薬は複数の生薬の組み合わせでその薬効が発揮される多成分系の薬物であるため，活性に寄与する生薬や活性成分の特定については今後詳細な検討が必要と考えられる。
以上，本研究の結果から，KJ には関節における抗炎症作用に加えて，関節組織の潤滑成分であるHA の分解抑制や産生促進作用が認められた。今後，KJ の薬理作用の詳細がより明らかになり，OAなどの関節機能障害の治療に積極的に利用されることを期待したい。

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生 薬 の 皮 膚 関 連 酵 素 に 対 す る 阻 害 作 用． 薬 学 雑 誌

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