原著論文

診療と新薬 2019; 56: 826-835

鉄欠乏性貧血回復期におけるマウス脾臓マクロファージの分極化と役割

診療と新薬 Web

株式会社林原 研究部門

須山 晶／新井成之／宮田聡美／河野惠三／太田人水／原島有安利夫／三皷仁志／牛尾慎平

哲／

● 要旨
目的：鉄欠乏性貧血からの回復期におけるマクロファージの分極化とその役割を検証することを目的とした。マクロファージの分極化と役割について鉄欠乏性貧血モデルマウスを用いて検討
し，併せて細網内皮系マクロファージを活性化する NK-4 の影響を比較解析した。
方法：4 週齢の雌性 BALB/c マウスに 8 週間鉄欠乏飼料（LID）を与え，鉄欠乏性貧血の特徴である小球性低色素性赤血球の出現を確認した。次いで全群の飼料を通常飼料（ND）に戻し，貧血からの回復を促した。ND への切替えと同時に細網内皮系マクロファージを活性化する NK-4
（100，500μg/kg/day）の経口投与を開始し，2 週間継続した。血液学的検査，病理組織学的検
査およびフローサイトメトリー法による脾臓中のマクロファージ解析を行った。
結果：ND への切替えにより，LID 群‐対照群のヘモグロビン値は徐々に増加したが，2 週間では完全には回復しなかった。このとき NK-4（500μg/kg/day）の経口投与により，ヘモグロビン
値は増加し，ND 群と同等まで回復した。貧血回復期に，脾臓マクロファージ（F4/80 +）に占める赤脾髄マクロファージ（F4/80 hi，VCAM1 +，CD11b lo）および抗炎症型マクロファージ（M2；F4/80 +，CD206 +）様細胞は増加し，さらに NK-4 投与により M2 の増加は顕著に亢進した。
結論：鉄欠乏性貧血の回復期に，脾臓 M2 の増加がヘモグロビン値の回復に寄与することを明らかにした。NK-4 はマクロファージの分極化を亢進して貧血回復を促進した。
キーワード：鉄欠乏性貧血，マクロファージ，M2，ヘモグロビン，NK-4

は じ め に

低色素性赤血球の出現で鉄欠乏性貧血と診断される 2）。

生体内の鉄は，赤血球による酸素運搬や細胞内に鉄代謝や赤血球産生には様々な因子が関わるが，おける DNA 合成酵素等の活性中心，ミトコンドリ

脾臓や骨髄における細網内皮系細胞マクロファージ

アでの酸化還元反応など様々な役割を果たすことがの役割は大きい。脾臓の赤脾髄に存在する赤脾髄マ

知られているが，その大部分は赤血球中にヘモグロ

クロファージ（F4/80 hi，VCAM1 +，CD11b lo）は，ビンとして存在している 1）。何らかの要因でそれら老化や変性した赤血球を取り込んでヘモグロビンをの鉄が減少すると，生体の恒常性維持機構が働き分解し，鉄を再利用可能な状態に変換するととも

フェリチンなどの貯蔵鉄を利用することで補われに，余剰となった鉄を安定な形にしてその胞体内にる。さらに，体内の貯蔵鉄が枯渇すると赤血球産生貯蔵する 3）〜 5）。またこれらのマクロファージは赤血機能が低下し，鉄欠乏性貧血に陥る。その症状は動球前駆細胞である赤芽球の成熟に関与しており，赤悸，息切れ，倦怠感などがあり，血液検査所見では芽球集合体である赤芽球島を形成して鉄を受け渡す

血清フェリチン値やヘモグロビン値の減少，小球性とともに，赤芽球を脱核させ赤血球産生に寄与す

診療と新薬・第 56 巻

表1

第 11 号（2019 年 11 月）

19 （827）

鉄欠乏飼料（LID）と通常飼料（ND）の組成および鉄含量

成

分

鉄欠乏飼料

通常飼料

（LID）

（ND）

配合量 *

鉄含量 *

配合量 *

鉄含量 *

コーンスターチ（鉄含有量 0.0008％）

62,62519

62,43519

鉄含有 ミルクカゼイン
成分 （鉄含有量 0.0003％）

22,00018

22,00018

FeC6H5O7･nH2O（鉄含有量 16.67％）
結晶セルロース
鉄不含 精製大豆油
成分 ミネラル類（鉄以外）
ビタミン類
合

計

─

─

190

3,167

5,000
4,000
6,010
365

─
─
─
─

5,000
4,000
6,010
365

─
─
─
─

100,000

3,204

100,000

37*：mg/100 g‐飼料

る 6）。

購 入 し， 温 度 23 ± 3 ℃， 湿 度 55 ± 15 ％， 明 期 12

マクロファージはその機能から，病原菌などの感時間（7:00 〜 19:00）の環境下，通常飼料（CE-2，

染防御に働く炎症型のマクロファージ（M1）と組

日本クレア㈱）と脱イオン水を自由摂取させて予備織修復を担う抗炎症型のマクロファージ（M2）の飼育した後，4 週齢から試験に供した。

2 つのフェノタイプに大別されてきたが，近年 in2 鉄欠乏性貧血の誘導と回復処置

vitro 試験によるアプローチからもマクロファージ

4 週齢の雌性 BALB/c マウス 32 匹を体重が均等

分極と鉄代謝について解析されている。周囲の環境になるように，通常食（Normal diet；ND）群（nに応じてマクロファージが M1 もしくは M2 に分極＝ 8） と 鉄 欠 乏 食（Low iron diet；LID） 群（n ＝すると鉄の貯蔵や放出の挙動は変化し，M1 は鉄を24）の 2 群に分け，ND もしくは LID を脱イオン水

フェリチンとして貯蔵するが，M2 はヘム鉄を積極とともに自由摂取させた。各飼料は日本クレア㈱か的に取り込み分解した後，鉄を細胞外に放出するとら購入し，飼料組成を表 1 に示した。鉄含有量は，報告されている

7）8）。

ND：320.4 ppm，LID：3.7 ppm であり，それぞれ以上のように鉄代謝におけるマクロファージ機能マ ウ ス の 鉄 要 求 量（〜 35 ppm） の 約 10 倍， 約についてはさまざまに報告されているものの，貧血1/10 の鉄を含有する。鉄欠乏性貧血の誘導状態を回復期におけるマクロファージの分極化およびその確認するため，LID 給与開始 5 週目（9 週齢）から役割については明らかになっていない。我々はマウ

伏在静脈血の血液学的検査を行い，8 週目（12 週

スを用いて鉄欠乏性貧血モデルを作出した後，貧血齢）に鉄欠乏性貧血が誘導されたと判断した。

回復期に細網内皮系を活性化させる NK-4（クリプ貧血誘導が確認された 12 週齢時に，LID 群 24

トシアニン O.A.1）を経口投与することにより，脾匹について血液パラメータ（ヘモグロビン値，赤血臓マクロファージの造血機能に関わる分極化を比較

球数，平均赤血球色素量（MCH），赤血球サイズ，解析したので報告する。

網状赤血球数）を指標として 3 群（各 n ＝ 8）に分

Ⅰ 材 料 と 方 法
1 動物

け た。 次 い で 全 群 の 飼 料 を ND に 切 替 え，NK-4（100 もしくは 500μg/kg/day）を 2 週間経口投与した。その間，経時的に伏在静脈採血し血液学的検査

本試験は㈱林原研究部門動物実験管理委員会の承を行った後，深麻酔下で全採血して脾臓を採取し認を得た後，同動物実験規程に則り実施した。3 週

た。貧血ストレスによって試験中に尾を噛み切った

齢，雌性 BALB/c マウス 32 匹を日本クレア㈱から個体（LID‐対照群，n ＝ 1）は，断尾による影響

20 （828）

診療と新薬・第 56 巻

3

4

5

6

7

8

第 11 号（2019 年 11 月）

9

10

11

12

13

14 週齢

ND（Control） （n = 7）
ND + NK-4（100μg/kg/day）（n = 8）
ND + NK-4（n = 8）（500μg/kg/day）

鉄欠乏飼料（LID）
（LID）
ND

ND

通常飼料（ND）

図1（n = 8）

試験スケジュール

が大きいため，データ解析から除外した。試験スケ
ジュールは図 1 に示した。
3

H5C2

NK-4

NK-4（ ク リ プ ト シ ア ニ ン O.A.1，1-ethyl-4-

N+

N

C2H5

I

［（1Z,3E,5E）-1-（ 1-ethylquinolin-1-ium-4-yl）-5（1-ethylquinolin-4-ylidene) penta-1,3-dien-3-yl］

N+quinolin-1-ium; iodide, PubChem CID: 5489539，

C2H5図 2） は， ㈱ 林 原 で 製 造 し た 微 粉 末 結 晶 を，I

図 2 NK-4 の構造式

0.5 w/v％のカルボキシメチルセルロース（CMC）
溶液で終濃度 100 もしくは 500μg/mL となるように懸濁し，1 mL/kg‐体重を口腔内滴下することでを反映しているため，その強度により各細胞の粒度

経口投与，嚥下を確認した。ND 群および LID‐対を解析した。

照群には，0.5 w/v％の CMC 溶液を同様に経口投血清フェリチン量は，剖検時に採取した血液の血 清 を Ferritin（Mouse）ELISA Kit（#KA1941，

与した。

Abnova Corporation）を用いて定量した。

4 血液学的検査
抗凝固処理のためヘパリン管に採取した血液で，

5 脾臓および骨髄の組織観察

ヘモグロビン値はヘモグロビン B テストワコー

剖検により採取した脾臓を二分割し，スライドガ（#271-83901，富士フィルム和光純薬㈱）を用いてラスにスタンプ塗抹した後，組織を固定した。常法

測定した。

により，パラフィン包埋，組織切片を作製し，ヘマ

赤血球数，赤血球サイズ，網状赤血球数，網状赤トキシリン・エオジン染色と鉄染色（ベルリンブ

血 球 サ イ ズ は， フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー（FCM；

ルー法），過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色を施し，

GALLIOUS/Beckman Coulter）を用いて測定した。

Olympus BX50 お よ び Olympus cellSens を 使 用 し抗凝固処理血液を 0.1％ウシ血清アルブミン含有リて写真撮影，画像解析を行った。スタンプ標本は，ン酸緩衝生理食塩水（BSA/PBS）で 500 倍希釈し，メタノール固定，ギムザ染色して観察した。骨髄は網状赤血球染色のためアクリジンオレンジ（終濃度

左右の大腿骨を EDTA 脱灰処理した後パラフィン

0.05μg/mL）を添加，転倒混和後，遮光して室温

包埋，ヘマトキシリン・エオジン染色を施して観察で 30 分静置した。次いで血球数換算用の内標準し た。 組 織 に 存 在 す る 成 熟 赤 芽 球 の 抽 出 は，TM

標 準 粒 子，#7547053，

Olympus cellSens を用いた画像解析により染色性と

Beckman Coulter）を添加し，標準ビーズ 1000 個

大きさ（面積）で行い，一定面積中のオブジェクトに対する赤血球画分の細胞数から赤血球数を，その数を赤芽球数とした。

ビ ー ズ（Flow-Count内 FL2 陽性細胞の割合を網状赤血球数として算出

6 FCM を用いた脾臓のマクロファージ解析した。また前方散乱光（FS）の強度は細胞サイズ

二分割した脾臓をセルストレイナー（メッシュ診療と新薬・第 56 巻

70μm，Corning Inc.）を用いて分散した脾細胞を

第 11 号（2019 年 11 月）

21 （829）した。

用いた。5％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーⅡ 結

グ ル 培 地 で 脾 細 胞 を 遠 沈 管 に 回 収 し， 遠 心 分 離果（1,000 rpm，4 ℃，5 分 ） し た。 上 清 を 除 去 し，

1 鉄欠乏性貧血モデルマウスの作製

溶血剤（168 mM NH 4Cl，10 mM KHCO 3，EDTA・

4 週齢から LID を 8 週間摂取させたマウス（122Na 1 mM，pH 7.3）600μL を 添 加 後， 静 置（ 室週齢）の血液所見を図 3 に示した。試験期間を通温，4 分）して赤血球を溶血させた。反応停止のたじて赤血球数の有意な減少は見られなかったが，ヘ

め 20 倍量の（−）ハンクス平衡塩溶液を加え，遠モ グ ロ ビ ン 値 は ND 群 18.7 ± 0.5 g/dL に 対 し，

心 分 離（1,000 rpm，4 ℃，5 分 ） 後 に 上 清 除 去 し

LID 群 11.7 ± 0.3 g/dL と 有 意 に 低 値（p ＜ 0.01）8た。細胞濃度が約 1 × 10 cells/mL となるようにを示した（図 3 ⒜）。さらに，LID 群の MCH は著

0.1％ BSA/PBS を添加し，脾細胞懸濁液を調製ししく減少していた（図 3 ⒜）ことから，鉄欠乏性た。脾細胞懸濁液を U 底 96 穴プレート（Thermo

貧血の特徴である小球性低色素性赤血球の出現が示

Fisher Scientiﬁc）に 10μL ずつ分注し，2 倍濃度のされ，血液塗抹（図 3 ⒝）および赤血球粒度分布

Puriﬁed rat anti-mouse CD16/CD32（#553142，BD（図 3 ⒞）においてもその出現を確認した。赤血球

Biosciences）を 10μL 添加し，インキュベーショ

新生の指標である網状赤血球は，LID 群で ND 群にンした（室温，5 分）。続いて，赤脾髄マクロファー

比べ有意に増加していたが小球性であった

ジ評価用抗体カクテルもしくは M1/M2 評価用抗体（図 3 ⒜⒞）。体重や一般状態に両群に顕著な差はカクテルを 20μL 添加し，インキュベーションし認められなかった（データ未掲載）。

た（室温，30 分）。なお赤脾髄マクロファージ評価

2 鉄欠乏性貧血からの回復期間の血液学的推移

用抗体カクテルは，抗 CD11b（M1/70）-Alexa 488

12 週齢の鉄欠乏性貧血モデルマウスに対し飼料

抗 体（#53-0112-82，Thermo Fisher Scientiﬁc， 終を ND に 切 替 え，NK-4（100 も し く は 500μg/kg/

濃 度 12.5μg/mL）， 抗 F4/80-PE 抗 体（#123110，

day）を 2 週間経口投与したときのヘモグロビン値

BioLegend Inc.， 終 濃 度 0.5μg/mL）， 抗 VCAM1-の推移を表 2 に示した。2 週間の ND 摂取によりAPC 抗体（#105718，BioLegend Inc.，終濃度 1.25

LID‐対照群のヘモグロビン値は徐々に増加し，μg/mL）を混合して調製した。M1/M2 評価用抗体14.0 週齢では 15.4 ± 0.3 g/dL に達したものの，依カ ク テ ル は， 抗 CD86-Alexa488 抗 体（#105018，

然 と し て ND 群（16.4 ± 0.1 g/dL） よ り 有 意 に 低

BioLegend Inc.， 終 濃 度 5μg/mL）， 抗 F4/80-PE

かった。それに対し NK-4 500μg/kg/day を投与し抗 体， 抗 CD206-APC 抗 体（#141708，BioLegend

た群では，13.6 週齢以降でヘモグロビン値は LID

Inc.，終濃度 1.25μg/mL）を混合して調製した。

‐対照群よりも有意に増加し，14.0 週齢では 16.3

各抗体カクテル処理後，0.1％ BSA/PBS を 200μL± 0.3 g/dL と ND 群と同等まで回復し，差は認め

添加し遠心分離（1,500 rpm，5 分），上清除去後，られなかった。

再 度 500μL の 0.1 ％ BSA/PBS で 細 胞 を 懸 濁 し，+FCM 測定に供した。脾臓の F4/80 細胞に占める
hi

+

lo

F4/80 ，VCAM1 ，CD11b 細 胞 を 赤 脾 髄 マ ク ロ++

ファージ率（％），F4/80 ，CD86 細胞を M1 様細
+

+

胞率（％）
，F4/80 ，CD206 細胞を M2 様細胞率（％）としてそれぞれ算出した。

赤血球数，赤血球サイズ，MCH，網状赤血球数
は，試験期間中，NK-4 投与による有意な変化は認められなかった。
3 体内貯蔵鉄に対する NK-4 の影響
試験終了時の血清フェリチン量を図 4 ⒜に示した。ND 群に比べて何れの LID 群の血清フェリチン

7 統計解析

量は極度に少なく，体内貯蔵鉄は回復していなかっパラメトリック解析として ND 群と LID 群の 2

た。NK-4 投与による血清フェリチン量の有意な増群比較は Student s t 検定，LID（対照）群を軸とす

加は認められなかったものの，個体差があった。

る 4 群の比較には Dunnett s 検定を用い，危険率 5

脾臓組織標本のベルリンブルー陽性顆粒（貯蔵鉄％未満を有意差ありとした。全ての統計解析は，

ヘモジデリン）の画像解析結果を図 4 ⒝に示した。

SPSS（ver. 25，日本アイ・ビー・エム㈱）を使用

ベルリンブルー陽性顆粒は，ND 群では赤脾髄に比22 （830）

診療と新薬・第 56 巻

第 11 号（2019 年 11 月）⒜ ヘモグロビン値，赤血球数，MCH，網状赤血球比率（LID 群：n ＝ 23，ND 群：n ＝ 8）

20
15
10
5
0

LID

1,400
1,200
1,000

ND

800
600
400

平均赤血球
色素量（MCH）＜ 0.01
30

14

25

12

20
15
10

200

5

0

0

LID

ND

網状赤血球

網状赤血球（%）< 0.01MCH（pg）

25

赤血球数
赤血球数（×104 cells/mL）

ヘモグロビン値（g/dL）

ヘモグロビン値＜ 0.05

10
8
6
4
2

LID

0

ND

LID

ND

⒝ LID 群および ND 群の代表的な血液像
ND

LID

Bar = 5μm⒞ 赤血球および網状赤血球の粒度分布（LID 群：n ＝ 23，ND 群：n ＝ 8）
40

LID
ND
頻度（%）

30
20

20
10

0

0

図3

LID
ND

30

10

前方散乱光強度

網状赤血球

≦20
≦25
≦30
≦35
≦40
≦45
≦50
≦55
≦60
≦65
≦70
≦75
≦80
80＜

赤 血 球

≦20
≦25
≦30
≦35
≦40
≦45
≦50
≦55
≦60
≦65
≦70
≦75
≦80
80＜

頻度（%）

40

前方散乱光強度

12 週齢鉄欠乏性貧血モデルマウスの血液学的検査

較的多く認められたが，LID 群ではほとんど認めら（図 5 ⒜）。脾臓包膜下や脾洞の毛細血管周囲にはれず，NK-4 投与の影響もなかった。

LID 群で多数の赤芽球集積が見られ，画像解析した

4 脾臓および骨髄の病理組織学的観察

赤脾髄に占める赤芽球の割合を図 5 ⒝に示した。

脾臓の組織学的観察ではいずれの群でも赤脾髄に同様に骨髄の赤芽球比率を図 5 ⒝に示した。両者

赤血球を貪食したマクロファージが散見され，それともに NK-4 投与によって増加する傾向が認められらは PAS 陽性を示した。そこで赤脾髄の PAS 陽性

た。脾臓スタンプ標本では各所にマクロファージを

マクロファージ数を計測すると，LID 群で ND 群よ中心とする赤芽球島が見られ，NK-4 投与群でマクり増加する傾向がみられたが有意差はなかった

ロファージを取り囲む赤芽球の増加が確認された

診療と新薬・第 56 巻

第 11 号（2019 年 11 月）

23 （831）

表 2 鉄欠乏性貧血の回復期におけるヘモグロビン値（g/dL）の推移
週

齢

LID ＋

12.3

12.6

13.0

13.3

13.6

14.0

0

11.3 ± 0.3

12.2 ± 0.5

14.0 ± 0.5

14.9 ± 0.3

14.2 ± 0.2

15.4 ± 0.3

NK-4
100
（μg/kg/day） 500

11.1 ± 0.4
11.4 ± 0.4

12.1 ± 0.4
12.5 ± 0.7

13.7 ± 0.3
13.5 ± 0.3

14.9 ± 0.2
14.5 ± 0.4

14.5 ± 0.2
14.7 ± 0.2 *16.1 ± 0.2
16.3 ± 0.3 *ND

17.8 ± 0.4 **17.8 ± 0.4 **17.5 ± 0.3 **18.0 ± 0.4 **17.1 ± 0.1 **16.4 ± 0.1 *

結果は，平均値 ± 標準誤差で示した（n ＝ 7 〜 8，* ＜ 0.05，** ＜ 0.01 vs LID‐対照群）。

⒜ 血清フェリチン量（n ＝ 7〜8）
< 0.01400

LID ‑ 対照群

ND ‑ 対照群

350

ベルリンブルー
陽性面積（%）

血清フェリチン（ng/mL）⒝ 脾臓組織切片のベルリンブルー陽性反応面積（n ＝ 4）

300
250
200
150
100
50
0

Bar = 10μm

7
6
5
4
3
2
1
0

< 0.01

0
100 500 ND
NK-4（ g/kg/day）LID

0
100 500 ND
NK-4（ g/kg/day）
LID

図 4 14 週齢マウスにおける脾臓貯蔵鉄（図 5 ⒞）。

の分極化とその役割を明らかにするため，マウスを

5 脾臓マクロファージの FCM 解析

用いて鉄欠乏性貧血を誘導し，脾臓マクロファージ

赤血球の鉄回転に関わる赤脾髄マクロファージを解析した。Kobayashi らの方法 9）に準じて幼若マ（F4/80 hi，VCAM1 +，CD11b lo；図 6 ⒜）の割合は，ウスに LID を給餌し体内貯蔵鉄を枯渇させること

ND 群 9.0 ± 1.0％に対し LID‐対照群で 12.4 ± 1.2

で，小球性低色素性赤血球の出現をみる鉄欠乏性貧％ と 顕 著 に 増 加 し て い た も の の，NK-4 投 与 の血モデル動物を 8 週間で作出することができた。マ

影響は認められなかった（図 6 ⒝）。脾臓マクロウスからは血液パラメータ以外のいわゆる貧血症状

+

+

+

ファージの M1（F4/80 ，CD86 ）と M2（F4/80 ，+は見られず，飼料中の鉄以外の栄養組成が等しいた

CD206 ）の分極化をみると（図 7 ⒜），M1 は各群め一般状態に変化が見られなかったと考えられた。

30 〜 40％程度で貧血回復誘導や NK-4 投与によるまた，試験期間中に顕著な赤血球減少は認められ変化は認められなかった（図 7 ⒝）。一方，M2 はず，失血等による急激な貧血誘導とは異なり緩やか

ND 群 15.3 ± 1.1％に対し，LID‐対照群 20.2 ± 1.1にヘモグロビン値が減少し鉄欠乏状態が進行した。

％と有意な増加がみられた。さらに，NK-4 の投与

BALB/c マウスの赤血球寿命は約 43 日と報告され用量に応じて M2 の割合は増加し，LID‐NK-4 500ている 10） ことから，LID 給餌開始時期に産生されμg/kg/day 投与群では 25.0 ± 1.1％と LID‐対照群

た正常な赤血球は試験開始から 1 カ月は残存しておに比べ有意に増加していた（図 7 ⒞）り，試験初期の鉄需要は老化した正常赤血球中の鉄Ⅲ 考察

貧血回復時の赤血球産生に関わるマクロファージと体内貯蔵鉄によって補われるため，実際の鉄欠乏は LID 給餌後 1 カ月以上経てから生じたと考えられた。緩やかに病態が進行する本鉄欠乏性貧血モデ

24 （832）

診療と新薬・第 56 巻⒜ 過ヨウ素酸シッフ（PAS）陽性マクロファージの代表的な画像およびその数（▲；PAS 陽性マクロファージ，n ＝ 4）

第 11 号（2019 年 11 月）⒝ 骨髄の赤芽球数計測に使用した代表的な画像処理例（抽出した赤芽球を黄色で示した）と脾臓および骨髄の赤芽球数（ヘマトキシリン・エオジン染色，n ＝ 4）

Bar = 50μm
700

25

600

20
15
10
5
0

500
400
300
200

2,500
2,000
1,500
1,000

0

100 500 ND
NK-4（ g/kg/day）

0

100 500 ND
NK-4（ g/kg/day）
LID

LID

＜ 0.05500

100
0＜ 0.013,000＝ 0.051
赤芽球数（骨髄）30
赤芽球数（脾臓）PAS 陽性マクロファージ数

Bar = 10μm

00

100 500 ND
NK-4（ g/kg/day）
LID⒞ LID ‑ 対照群と LID ‑ NK-4 投与群（500μg/kg/day）の脾臓の代表的な赤芽球島像（Mφ：赤芽球島を形成するマクロファージ；ギムザ染色）
LID

対照群

LID NK-4 投与群(500 g/kg/day)MφMφBar = 5μm

図514 週齢マウスの脾臓および骨髄の組織学的観察

ルは，一般的なヒトの鉄欠乏性貧血と類似した妥当に必須の鉄，続いて体内貯蔵鉄の順に鉄を補給するなモデルといえる。

ため 11），本試験ではヘモグロビン回復後期から体内

鉄欠乏性貧血モデルマウスに対し，ND を 2 週間

貯蔵鉄回復初期を観察したと考えられた。マクロ

与えて病態回復を促すと，ヘモグロビン値の緩やか

ファージを活性化する NK-4 を 2 週間継続して経口な回復は認められたものの完全には回復せず，血清投与すると，ヘモグロビン値の回復は促進され，ほフェリチン量および脾臓貯蔵鉄量も著しく低く体内ぼ正常値まで回復したことから，マクロファージが貯蔵鉄はほとんど回復していなかった。鉄欠乏性貧ヘモグロビン値回復に関与することが示唆された。

血の回復期では，初めにヘモグロビン等の生体維持

今回の試験では NK-4 投与による体内貯蔵鉄の回復

診療と新薬・第 56 巻

第 11 号（2019 年 11 月）⒜ 赤脾髄マクロファージ（F4/80hi，VCAM1+，CD11blo）の代表的な
2 パラメーターヒストグラムにおける検出例（ND 群）

赤脾髄マクロファージ（%）⒝ 14 週齢マウス脾臓中の赤脾髄マクロファージ率（n ＝ 7〜8）

赤脾髄
マクロファージ

F4/80

CD11b

gatingCD11b

25 （833）

25＜ 0.05

20
15
10
5
0

VCAM1

0
100
500
NK-4（ g/kg/day）

ND

LID

図6

14 週齢マウスの脾臓における赤脾髄マクロファージの比率⒜ M1（F4/80 hi，CD86+）および M2（F4/80+，CD206+）の代表的な
2 パラメーターヒストグラムにおける検出例（ND 群）

M2

CD86

CD206

M1

F4/80

F4/80

⒝ M1（F4/80+，CD86+）率（n ＝ 7〜8） ⒞ M2（F4/80+，CD206+）率（n ＝ 7〜8）
M1
F4/80＋CD206＋ cells（%）

F4/80＋CD86＋ cells（%）

50
40
30
20
10
0

M2

35

＜ 0.0130
25
20
15＜ 0.01

10
5
0

0

100

500

ND

0

100

500

NK-4（ g/kg/day）

NK-4（ g/kg/day）

LID

LID

ND

図 7 14 週齢マウスの脾臓における M1，M2 の比率は認められなかったが，NK-4 はヘモグロビン値のする可能性がある。

回復を早めていた。血清フェリチン量も NK-4 投与

脾臓では，特に LID 群で赤血球を貪食した赤脾で個体差があるものの応答がみられることから，摂髄に局在するマクロファージが見られるとともに，取期間を延長すれば NK-4 は体内鉄の回復をも促進

FCM 解析においても LID 群の赤脾髄マクロファー

26 （834）

診療と新薬・第 56 巻

第 11 号（2019 年 11 月）

ジが増加しており，貧血回復に赤脾髄マクロファー

けるマクロファージ分極の評価法については議論のジが関与することが示された。貧血回復期の赤脾髄余地があるものの，今回初めて鉄欠乏性貧血回復期

マクロファージは，鉄欠乏で菲薄化した赤血球を貪の生体内で M2 の増加が観察されたことは，今後の食し，その鉄を赤血球産生に補ったと推察される

マクロファージ分極の解明の一助になると言える。

が，NK-4 投与による赤脾髄マクロファージの増加

まはみられなかったため，ヘモグロビン値の回復促進とめに赤脾髄マクロファージは関与しないと考えられ

本研究では，鉄欠乏性貧血モデルマウスを作出た。一方，脾臓マクロファージの M1/M2 の分極化

し，鉄欠乏性貧血回復期における血液パラメータのをみると，M1 は各群に差はなかったが，M2 は貧推移とマクロファージの分極を評価した。貧血回復

血誘導後の回復時に増加し，NK-4 投与によってそ期において，マクロファージは M2 に分極することの増加は亢進したことから，ヘモグロビン値回復にが明らかとなり，NK-4 経口投与によって M2 の増関与するマクロファージは M2 である可能性が示さ

加とヘモグロビン値の回復が促進されたことから，れた。一般的に赤脾髄マクロファージのような組織

M2 への分極がヘモグロビン値の回復を促進する可常在性マクロファージは M2 様であると言われるも能性が示された。以上より，鉄欠乏性貧血の回復期

12）のの ，今回の結果では赤脾髄マクロファージとにおけるマクロファージ分極の重要性を明らかにしM2 は一致しておらず，赤脾髄マクロファージとはた。

異なる機能を有する M2 が増加したと考えられた。

利益相反：開示すべき利益相反はない。

その他の組織常在性マクロファージとして，白脾髄
文

濾胞辺縁部で生体防御に関与する辺縁帯マクロ

献ファージや白脾髄中で免疫寛容に関係する可染体マ1）Muckenthaler MU, Rivella S, Hentze MW, et al. A red

クロファージが挙げられるが 13），脾臓所見ではこれ

carpet for iron metabolism. Cell 2017; 168: 344-361.

らの顕著な違いは認められなかった。組織常在性マ2）塩崎宏子，泉二登志子．Ⅱ．鉄欠乏：4．鉄欠乏性貧血の検査と診断．日内会誌 2010; 99: 1213-1219.

クロファージ以外の特異的な脾臓所見として，LID

3）Kohyama M, Ise W, Edelson BT, et al. Role for Spi-C in

群の脾臓では髄外造血および赤芽球島の形成を認

the development of red pulp macrophages and splenicめ，NK-4 投与群では対照群よりも赤芽球数が増加

iron homeostasis. Nature 2009; 457: 318-321.

し，中心のマクロファージを取り囲む赤芽球数が多い傾向にあった。骨髄においても NK-4 投与による赤芽球数の増加が認められ，赤芽球島マクロファー4）Yousself LA, Rebbaa A, Pampou S, et al. Increased
erythrophagocytosis induces ferroptosis in red pulp
macrophages in a mouse model of transfusion. Blood
2018; 131: 2581-2593.

ジの活性化が示唆された。赤芽球島のマクロファー5）Kurotaki D, Uede T, Tamura T. Functions andジは赤芽球に鉄を積極的に受け渡すことから 6）M2

development of red pulp macrophages. Microbiol様であると考えられ，今回観察された M2 の増加
は，赤芽球島を形成するマクロファージの増加を反映した可能性が考えられた。赤芽球島マクロファー
ジが増加して機能を発揮するには，そこに鉄を補給するマクロファージの増加が必要と推測されるが，今回の測定時点では他のマクロファージに顕著な差

Immunol 2015; 59: 55-62.
6）de Back DZ, Kostova EB, van Kraaij M, et al. Of
macrophages and red blood cells; a complex love story.
Front Physiol 2014; 5: 1-11.
7）Chávez-Galán L, Olleros ML, Vesin D, et al. Much morethan M1 and M2 macrophages, there are also CD169 +and TCR + macrophages. Front Immunol 2015; 6: 1-15.
8）Cairo G, Recalcati S, Mantovani A, et al. Iron traﬃckingは認められず，さらなるマクロファージ分極の解明

and metabolism in macrophages: contribution to theには，経時的な観察が必要であると推察された。

polarized phenotype. Trends Immunol 2011; 32: 241-

近 年，NK-4 が マ ク ロ フ ァ ー ジ に も 発 現 す る
TRPV2 に作用することが報告され，その作用機作も明らかになりつつあるが 14）15），マクロファージの247.
9）Kobayashi M, Kato H, Hada H, et al. Iron-heme-Bach1
axis is involved in erythroblast adaptation to irondeﬁciency. Haematologica 2017; 102: 454-465.

分極化については未解明であり，今後さらなる評価

10）Coupland LA, Cromer D, Davenport MP, et al. A novelが必要である。In vivo のような複雑な条件下におfluorescent-based assay reveals that thrombopoietin

診療と新薬・第 56 巻

第 11 号（2019 年 11 月）

化機構．化学と生物 2015; 53: 593-599.

signaling and Bcl-X（L）inﬂuence, respectively, platelet
and erythrocyte lifespans. Exp Hematol 2010; 38: 453-

14）Iwata Y, Katayama Y, Okuno Y, et al. Novel inhibitor
candidates of TRPV2 prevent damage of dystrophic

461.
11）岡田

27 （835）

myocytes and ameliorate against dilated cardiomyopathy

定．Ⅱ．鉄欠乏：5．鉄欠乏性貧血の治療指針．

in a hamster model. Oncotarget 2018; 9: 14042-14057.

日内会誌 2010; 99: 1220-1225.
12）Davis LC, Jenkins SJ, Allen JE, et al. Tissue-resident15）Link TM, Park U, Vonakis BM, et al. TRPV2 has apivotal role in macrophage particle binding andmacrophages. Nat Immunol 2013; 14: 986-995.
13）香山雅子．組織マクロファージのサブセットとその分

phagocytosis. Nat Immunol 2010; 11: 232-239.

Polarization and Roles of Mouse Splenic Macrophages
in the Recovery Phase of Iron Deﬁciency Anemia
Aki SUYAMA ／ Shigeyuki ARAI ／ Satomi KOYA-MIYATA ／ Keizo KOHNO ／ Hitomi OHTA ／Akira HARASHIMA ／ Toshio ARIYASU ／ Hitoshi MITSUZUMI ／ Shimpei USHIO
R&D Division, Hayashibara Co., Ltd.

Abstract
Objectives: The purpose of this study was to evaluate the polarization and the roles of macrophages
during the recovery phase of iron deﬁciency anemia in mice. In addition, the eﬀect of NK-4, which is
known to activate reticuloendothelial macrophages, was examined on the recovery from irondeﬁciency anemia.
Methods: Four-week-old female BALB/c mice were given low iron diet（LID）for 8 weeks to induce
the appearance of microcytic hypochromic erythrocytes, which is a feature of low iron deficiency
anemia. Then, they were given normal diet（ND）for two weeks to recover from anemia. Some mice
were orally administered NK-4（100 or 500μg/kg/day）during the recovery phase. After 10 weeks,
they were hematologically and histopathologically examined. The population of splenic macrophages
were analyzed by ﬂow cytometry.
Results: The hemoglobin levels in the LID（control）group were gradually increased after switching
to ND, but they did not reach the levels of ND group of mice in two weeks. Administration of NK-4（500μg/kg/day）promoted the increase in the hemoglobin levels, and finally the levels wererecovered to comparable levels of the ND group of mice. Both the ratios of red pulp macrophages（F4/80 hi, VCAM1 +, CD11b lo）and alternatively activated macrophages（M2; F4/80 +, CD206 +）to thetotal splenic macrophages（F4/80 +）were increased in every group of mice during the anemia
recovery phase. Especially, the increase in the population of M2 macrophages was significantly
promoted by NK-4 administration.
Conclusion: We found that the increase in the M2 macrophage population contributed to recovery
from iron deﬁciency anemia. Furthermore, our study indicated that NK-4 promoted the recovery fromanemia through increasing the M2 macrophage population.
Key Words: Iron deﬁciency anemia, Macrophage, M2, Hemoglobin, NK-4