2023 年 6 月 19 日
報道関係者各位
学校法人甲南学園

細胞内の RNA 二重鎖の形成を高精度に予測する手法を開発～核酸医薬の飛躍的な改善が期待される～
このたび、標記につきまして別紙の通り、プレスリリースを配信いたします。
つきましては、取材ならびに紙面掲載についてご検討いただけますようお願い申し上げます。

≪本件に関するお問い合わせ先≫［プレスリリース全体について］■甲南学園広報部
兵庫県神戸市東灘区岡本 8-9-1
電話 078-435-2314（直通） Email：kouhou@adm.konan-u.ac.jp［研究内容について］
甲南大学先端生命工学研究所（FIBER）〇髙橋俊太郎（准教授）
電話：078-303-1397

E-mail：shtakaha@konan-u.ac.jp〇杉本直己（所長・教授）
電話：078-303-1416

E-mail：sugimoto@konan-u.ac.jp

本プレスリリース配信先：兵庫県教育委員会記者クラブ、神戸市政記者クラブ、大阪科学・大学記者クラブ

以上細胞内の RNA ⼆重鎖の形成を⾼精度に予測する⼿法を開発〜核酸医薬の⾶躍的な改善が期待される〜【概要】

甲南⼤学先端⽣命⼯学研究所（FIBER）の杉本直⼰ 所⻑・教授、GHOSH Saptarshi 特任研究助教、⾼橋俊太郎 准教授らの研究グループは、細胞内の RNA ⼆重鎖構造の安定性を⾼精度に予測する⼿法を開発しました。この研究成果によって、遺伝性疾患やウイルス感染症の次世代の治療法である RNAi 治療をはじめとする、核酸医薬の効果を⾶躍的に向上できる可能性があります。この研究成果は、英国核酸科学誌「Nucleic Acids Research 誌」に掲載され、掲載号の表紙を飾りました。
RNA は遺伝物質の⼀種で、DNA の遺伝情報からタンパク質が作られる際の伝達物質などとして細胞内に存在します。また新型コロナウイルス等のウイルスのゲノムとしての役割もあります。RNAの分⼦構造は、核酸塩基と呼ばれるアデニン、ウラシル、グアニン、シトシンの四種類を単位として連なった⼀本の直鎖状の形状をとります。これらの核酸塩基にはアデニンとウラシル、グアニンとシトシンがそれぞれペア（塩基対）を組むことできる性質があります。そのため、RNA は塩基対形成によって⼆重鎖構造を形成することができます。細胞などの⽣体内では、RNA が⼆重鎖を形成することで遺伝⼦の機能が制御されることがあります。特に、2006 年にノーベル⽣理学・医学賞の対象となった RNA ⼲渉（RNA interfernce: RNAi）は、標的となる RNA に短い RNA が⼆重鎖を形成することで、その RNA が分解される遺伝⼦発現調節の機構です。そのため、RNAi を活⽤して疾患の原因となる遺伝⼦の RNA や、ウイルスゲノムの RNA を分解して疾患や感染症の治療を⾏う技術が新しい医薬技術として注⽬されています。
これまで、⼆重鎖のできやすさは塩基対の組み合わせで決まることが知られており、その予測法も確⽴されていました。しかし、通常実験を⾏う⾷塩⽔のような溶液環境と異なり、細胞内の⽣体環境は⾼濃度に分⼦で混み合った濃厚な溶液環境です。このような溶液環境での⼆重鎖構造のできやすさを予測することはこれまで困難だったため、RNAi 治療薬に⽤いる RNA の設計は⼿探りの状態だったのが現状です。
今回、FIBER の研究グループは、医薬品添加物としても⽤いられる⽔溶性⾼分⼦であるポリエチレングリコールを⽤いることで、細胞内の混み合った環境を⼈⼯的に再現しました。調整した⼈⼯環境で RNA ⼆重鎖のできやすさを解析することで、細胞内の RNA の⼆重鎖のできやすさを予測することができる新しい予測法の開発に成功しました。本⼿法を⽤いることで、細胞の核、核⼩体、さらには細胞質といった異なる細胞内環境にある RNA ⼆重鎖のできやすさを正確に予測することができます。本研究成果により細胞の環境に合わせて核酸医薬を設計することで、その効果を⾶躍的に向上させることが期待できます。
【論⽂タイトルと著者】“Nearest-neighbor parameters for the prediction of RNA duplex stability in diverse in vitro and cellularlike crowding conditions”
S. Ghosh, S. Takahashi, D. Banerjee, T. Ohyama, T. Endoh, H. Tateishi-Karimata, and N. Sugimoto,Nucleic Acids Res., 51, (2023) 4101-4111.（掲載号の表紙に採択）1

【内容説明】
背景

⽣体内で遺伝⼦として⽤いられる分⼦は核酸（DNA:デオキシリボ核酸、RNA:リボ核酸）と呼ばれます。RNA は、細胞の中では DNA からの遺伝情報からタンパク質が作られるための伝達物質などとして存在します。また新型コロナウイルス等のウイルスのゲノムとしての役割もあります。RNAの構造は、アデニン（A）、ウラシル（U）、グアニン（G）、シトシン（C）の四種類の塩基からなるヌクレオチドと呼ばれる分⼦が鎖状に連なったものです。アデニンとウラシル、グアニンとシトシンがそれぞれワトソンークリック型の塩基対（※1）を形成する特徴があります。この性質から、２本の RNA 鎖間で塩基対を形成することで RNA は⼆重鎖構造を形成します。⼆重鎖構造の形成されやすさを⽰す安定性（※2）は、塩基対に働く相互作⽤に依存します。アデニンとウラシル間には２本、グアニンとシトシンの間には３本の⽔素結合が形成されます。そのため、グアニンとシトシンの塩基対の⽅がアデニンとウラシルの塩基対よりも安定に形成されます。⼀⽅、⼆重鎖構造の安定性は塩基対同⼠は分⼦の重なり合いで働くスタッキング相互作⽤でも安定化されます。分⼦の重なり合いは塩基の分⼦の⼤きさに依存するので、前後の配列の組み合わせで相互作⽤の⼤きさは異なります。以上のように塩基の並び（配列）で⼆重鎖構造の形成しやすさが決まります。そこで塩基対の組み合わせとその直近の塩基対の影響によって決まる最近接塩基対モデルが考案され、配列情報から⼆重鎖形成を安定性を予測することができるようになりました（図 1）。しかし、既存の予測法は標準的な実験環境（例えば 1 M （モル/リットル）NaCl 溶液中）のみにおいて適⽤できるもので、分⼦夾雑環境（※3）にある細胞内環境での⼆重鎖構造の安定性予測はこれまで困難でした。
⼆重鎖構造の安定性への化学的要因
⽔素結合

最近接塩基対モデル∆G˚duplex = ∑∆G˚bp + ∆G˚i
∆ G˚duplex: ⼆重鎖構造の安定性∆ G˚bp: 各隣り合った塩基対による安定性∆G˚i: 末端塩基の持つ安定性

スタッキング相互作⽤例）

5ˊ X1 X2 X3 X4 3ˊ
3ˊ Y1 Y2 Y3 Y4 5ˊ∑∆G˚bp

X1X2X2X3

X3X4

Y1Y2

Y2Y3

Y3Y4

= ∆G˚() + ∆G˚() + ∆G˚()

RNA ⼆重鎖

図 1 RNA ⼆重鎖の安定性を決定する構造的要因（左）および、その構造安定性の予測法である最近接塩基対モデル（右）。

研究⼿法と成果

細胞内の分⼦夾雑環境を再現するために、平均分⼦量 200 のポリエチレングリコール（PEG200）（※4）を⾼濃度含んだ溶液を作製しました。ポリエチレングリコールは医薬品添加物などとしても⽤いられる⽔溶性⾼分⼦で、私たちの実⽣活で幅広く⽤いられています。これらの分⼦夾雑環境において、様々な RNA ⼆重鎖の安定性を紫外吸収-融解曲線（※5）を解析することで網羅的に算出しました（図 2）。その結果、分⼦夾雑環境で RNA ⼆重鎖構造の安定性を予測できるパラメータを決定することができました。このパラメータによって、以前の⽅法では困難であった⽣体内での RNA ⼆重鎖構造の安定性（-∆G°37）を精度良く求めることができました（図 2）。さらに、本研究では異な
2

RNA配列GGCUGUUC
7a:
CCGACAAG

最近接塩基対の組み合わせ
GG GC
CC CG

GGCUGUUC
7b: CCUACAAG

CUGA

UG
AC

GU UU UCCA AA AG

RNA⼆重鎖構造の安定性（‒∆G°37）
RNA配列

実測値
(kcal mol-1)

以前の⽅法での予測値 (kcal mol-1)

本研究での予測値(kcal mol-1)

7a8.7

11.0

9.0

7b8.411.09.0

図 2 （左と右上）同じ最近接塩基対の組み合わせを持った RNA 配列（7a と 7b）の 40% PEG200 を含む分子夾雑環境下における紫外吸収-融解曲線。
（右下）RNA 二重鎖構造の安定性の実測値と予測値の比較。

るイオン濃度、あるいは分⼦量の異なるポリエチレングリコール等の⽔溶性⾼分⼦を含んだ様々な溶液での RNA ⼆重鎖の安定性を測定することで、RNA ⼆重鎖の安定性が溶液中の陽イオン濃度、⽔の活量および添加物による排除体積効果の三つの因⼦の総和で予測できることを⾒出しました。
細胞内の分⼦夾雑環境は⼀様に混み合っているのではなく、細胞の状態や局所的な場所によって環境が異なります。今回開発した予測法は、はじめて分⼦夾雑環境での RNA ⼆重鎖構造の安定性予測を実現できただけでなく、あらゆる分⼦夾雑環境で活⽤できるように拡張できます。すなわち、本⼿法は画期的かつ実⽤的な細胞内環境での RNA ⼆重鎖構造の安定性予測法といえます。実際に、この予測法でリボソームの合成が⾏われている細胞核内の核⼩体（※6）内における RNA ⼆重鎖の安定性を既存の⼿法より精度よく予測することができました（図 3）。既存の⼿法と⽐較するとエネル
ギー値で 4.0 kcal mol-1 の予測精度が向上しました。エネルギー値から⼆重鎖を形成する分⼦数の偏細胞

核核⼩体

分⼦夾雑環境RNAACUGACUGACUG

核⼩体内のRNA⼆重鎖 UGACUGACUGACの安定性
実測値 =17.9 kcal mol-1
Nott et al., Nat. Chem., 8, 569 (2016)

従来法による予測値 =23.1 kcal mol-1
Turner et al., Biochemistry 37, 14719 (1998).

本研究による予測値 =19.1 kcal mol-1
実測値と予測値の誤差の改善度 =平衡定数K = 1.3×1013 K = exp(-∆G°25/RT)
平衡定数K = 8.1×1016

⼆重鎖を形成するDNA数の偏りを意味する平衡定数K、Rは気体定数（1.99 cal mol-1）、
Tは絶対温度平衡定数K = 9.6×1013

K実測 – K予測（従来）K実測 – K予測（本研究）≒ 1000図 3 核小体における RNA 二重鎖の構造安定性の実測値と予測値。

3

り（平衡定数 K）に換算し、形成する RNA ⼆重鎖の数として測定誤差を計算したところ、従来と⽐べて測定誤差が約 1000 倍改善しました。このことからも、本研究によりに細胞内での⼆重鎖形成の予測精度を⾶躍的に向上させることができました。
展望・研究の波及効果

本研究成果によって、RNA ⼆重鎖の形成を利⽤した技術の性能向上が期待できます。その⼀つが2006 年にノーベル⽣理学・医学賞の対象となった RNA ⼲渉（RNA interfernce: RNAi）（※7）を⽤いた治療法です。RNAi は、標的となる RNA に短い RNA が⼆重鎖を形成することで、その RNAが分解される遺伝⼦調節の機構です。そのため、RNAi を活⽤して疾患の原因となる遺伝⼦の RNAや、ウイルスゲノムの RNA を分解して疾患や感染症の治療を⾏う技術が新しい医薬技術として注⽬されています。この⽅法では RNA の⼆重鎖を細胞内でいかに狙った通りに形成させるかが成功のカギとなります。ところが、細胞内の分⼦で混み合った環境での⼆重鎖構造のできやすさを予測することはこれまで困難だったため、RNAi 治療薬に⽤いる RNA の設計は⼿探りの状態だったのが現状です。RNA ⼆重鎖のできやすさを正確に予測することもできました。したがって、本研究成
果により細胞の環境に合わせて核酸医薬を設計することで、その効果を⾶躍的に向上させることが期待できます。
研究⽀援

本研究は、⽇本学術振興会（JSPS）科研費 22H04975（基盤研究(S)）
、18KK0164（国際共同研究加速基⾦（国際共同研究強化(B)））
、21H05108（学術変⾰領域研究(B)）
、19K05723（基盤研究(C)）
、JSPS 研究
拠点形成事業 JPJSCCA20220005、甲南学園平⽣太郎基⾦科学研究奨励助成⾦、伊藤忠兵衛基⾦、旭硝⼦財団研究助成の⽀援を受けました。

【⽤語解説】

１、ワトソンークリック型塩基対（※１）
1953 年に英国の研究者であるジェームズ・ワトソンとフランシス・クリックが提唱した⼆重鎖を形成する塩基対構造のこと。
２、安定性（※２）
DNA 等の分⼦構造は形成と解離の平衡状態にある。DNA ⼆重鎖構造は加熱することで解離する。この解離に必要な温度が⾼ければ⾼いほど、その DNA ⼆重鎖構造は“安定”である。安定性をエネルギー値として⽰したのが⾃由エネルギー（∆G）である。本研究ではヒトの⽣体内反応が⾏われる、⼤気圧、37℃での⾃由エネルギー値（‒∆G°37）を安定性の指標として⽤いた。単位は 1 mol 当たりの熱量として kcal mol-1 を⽤いることが多い。
３、分⼦夾雑環境（※３）
細胞内は核酸、タンパク質などの分⼦がおよそ 400 mg/mL にも及ぶ⾼濃度溶液にある。このような溶液環境は通常実験条件で⽤いられる⽣理⾷塩⽔環境とは異なり、⽣体分⼦の物性に⼤きな影響を及ぼす。核酸⼆重鎖構造も分⼦夾雑環境によりその構造安定性が低下する。
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４、ポリエチレングリコール（※４）
エチレングリコールの重合体で、⽔溶性の⾼い⾼分⼦。細胞内の⽣体⾼分⼦の濃度は 400 g/L にもおよぶとされ、擬似的な細胞環境を再現するために⽤いられる⾼分⼦材料の⼀つ。薬剤の分解防⽌や、保湿効果などを与えるなど、医薬品添加物、洗剤、化粧品など幅広く⽤いられている。
５、紫外吸収-融解曲線（※５）
加熱や冷却によって分⼦構造が変化することで⽣じる分⼦の光吸収の変化を追跡する⽅法。DNA はらせん構造が解離すると 260 nm の吸収が増加する濃⾊効果を⽰す。構造転移の温度依存性を解析することで、構造の安定性（‒∆G°37 値）を得ることができる。
６、核⼩体（※６）
細胞核内に存在する⾮膜性の細胞構成体で、DNA からリボソームの合成反応が起こる領域である。
リボソームはタンパク質を合成する分⼦複合体で、遺伝⼦からタンパク質を合成する⽣命現象の根幹となる反応を⾏う。したがって、核⼩体は DNA が関与する⽣体内反応で極めて重要な細胞内器官の⼀つとして考えられている。
７、RNA ⼲渉（※７）
RNAi(RNA interference :RNA ⼲渉)は、遺伝⼦発現抑制(サイレンシング)と呼ばれる細胞内反応です。その発⾒に対して 2006 年にはノーベル⽣理学・医学賞が贈られています。RNAi は siRNA と呼ばれる短い RNA が対象となる RNA と⼆重鎖結合をすることにより引き起こされます。RNAi 治療薬は、疾患の原因となるタンパク質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を分解し、そのタンパク質が細胞内で作られることを抑える次世代型の治療薬として注⽬されています。

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