目次
・マラリア原虫の赤血球侵入。免疫回避の方策

１．マラリア原虫の赤血球侵入、そのメカニズム
２．人類とマラリアはともに進化してきたのか？
３．赤血球侵入を阻止するワクチンは開発できるか？

マラリア原虫種による感染流行地の違い

媒介蚊の生息領域
熱帯熱マラリアが90%以上

ヒト赤血球上のレセプター

熱帯熱＆三日熱マラリア
三日熱マラリアが90%以上

ヒトの赤血球の異常

赤血球膜表面のレセプター分子が、メロゾイト
侵入の前のtight junction形成に必須である
Duffy antigen
Positive RBC

Duffy antigen
Negative RBC

RDg

Mn

Tight junction

Form the tight junction andstart to invade into RBC

Form only fine fibril but
fail to invade into RBC

鎌状赤血球症について
鎌状赤血球症は遺伝性の貧血病で、赤血球の形状が鎌状になり酸素運搬機能が低下して起こる貧血症。

常染色体劣性遺伝をする。遺伝子型がヘテロ接合型のマラリア原虫に感染すると赤血球のpHが低下するこ
場合、低酸素状態でのみ発症する。遺伝子突然変異にとにより、赤血球の鎌状化が進む。鎌状化した赤血より、11番染色体にあるヘモグロビンβ鎖の6番目のア球は脾臓で除去され、また、鎌状化した赤血球によミノ酸に置換が生じることが原因である。
りマラリア原虫は機械的に壊される。

マラリア原虫種による感染流行地の違い

媒介蚊の生息領域
熱帯熱マラリアが90%以上

ヒト赤血球上のレセプター

熱帯熱＆三日熱マラリア
三日熱マラリアが90%以上

ヒトの赤血球の異常

三日熱マラリア原虫は肝細胞内で冬を越す？
戦地でマラリアに罹患した軍人が、治療して帰国後、しばらくしてマラリアを再発した

赤血球感染へ

肝内型原虫

スポロゾイト

寄生胞
メロゾイト

肝細胞侵入

休眠体

長期型（韓国など）と短期型（タイなど）の存在が知られている。
休眠に入る機構も、眠りから覚める機構も全くわかっていない。

このため、三日熱マラリア原虫の対策は困難である。

マラリア原虫の進化

Hayakawa et al., Mol Biol Evol (2008) 25 (10): 2233-2239.

マラリア原虫は人類とともにアフリカ大陸から移動した？

Tanabe et al., Curr Biol. 2010 Jul 27;20(14):1283-9.

目次・マラリア原虫の赤血球侵入。免疫回避の方策

１．マラリア原虫の赤血球侵入、そのメカニズム
２．人類とマラリアはともに進化してきたのか？
３．赤血球侵入を阻止するワクチンは開発できるか？

抗マラリア戦略＜発病阻止法＞

薬剤耐性原虫の出現

抗マラリア薬
新規ワクチン開発

未だに効果が示された
ワクチンはないメロゾイトの赤血球侵入にはAMA1という分泌タンパク質が重要な役割を担う

Srinivasan et al., PNAS 2011

AMA1の結晶構造と、株間のバリエーション

Dutta et al., PNAS 2007; 104: 12488-93

AMA1ワクチン効果の臨床試験結果
すべての結果ワクチンに用いたのと同じ種類のマラリア原虫

感染阻止効果64.3%

感染阻止効果17.4%

400 Malian children with either the malaria vaccine or a control (rabies) vaccine
administered on D0, D30, D60 and followed them for 6 months. The primary end point wasclinical malaria, defined as fever and at least 2500 Pf asexual parasitemia / µl.
Thera et al., NEJM 2011; 365: 1004-13

マラリアワクチン臨床試験（Burkina Faso, 2011）
Transportation

Registration

マラリアワクチン臨床試験（Burkina Faso, 2011）
Health check

Physicians

マラリアワクチン臨床試験（Burkina Faso, 2011）
Double blind test

Freezer (present)

Vaccine shipment

Past

抗マラリア戦略＜発病阻止法＞

薬剤耐性原虫の出現

抗マラリア薬
新規ワクチン開発

未だに効果が示された
ワクチンはない

マラリア原虫は、ヒトの免疫システムをくぐり抜ける工夫がある参考文献
Boyle MJ, Wilson DW, Beeson JG, Int J Parasitol, 43 (1) : 1 – 10. 2013
Richards & Beeson. Immuno Cell Biol (2009) 87:377-390
Kappe et al. Science (2010) 328:862-866
Trends in Parasitology 24(12):557-563, 2008
Marti M et al. J Cell Biol (2005) 171:587-592
Maier et al. Nature Rev Microbiol. (2009) 7:341-354
Miller LH et al., Nature Med, 19(2):156-167, 2013
Tanabe et al., Curr Biol. 2010 Jul 27;20(14):1283-9.
Hayakawa et al., Mol Biol Evol (2008) 25 (10): 2233-2239.
Srinivasan et al., PNAS 2011
Thera et al., NEJM 2011; 365: 1004-13
Dutta et al., PNAS 2007; 104: 12488-93
Sirima et al., NEJM 2011; 365: 1062-4

参考文献
大阪大学微生物病研究所
http://www.biken.osaka-u.ac.jp/act/act_tanabe.php
Wikipedia 鎌状赤血球症
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/92/Sicklecells.jpg
FN の高校物理 -鎌状赤血球貧血症とマラリアの分布http://fnorio.com/0080evolution_theory1/sickle_cell_anemia1/sickle_ce
ll_anemia1.htm
九州大学総合研究室博物館
http://www.museum.kyushu-u.ac.jp/bulletin/index.html
Mosquito production mooted as fast track to malaria vaccine
http://www.nature.com/nature/journal/v425/n6957/full/425437a.html

目次・マラリアとは？マラリアの発見。マラリア対策の現状。

・マラリア原虫の赤血球侵入。免疫回避の方策
・分子生物学のメスでマラリア原虫を切り開く
・感染流行地におけるマラリアワクチン開発研究マラリア攻略の鍵はどこにあるのか？
＜感染阻止法＞＜発病阻止法＞
抗マラリア薬

新規ワクチン開発

感染阻止ワクチンの可能性
γ線照射された感染蚊

感染蚊

２週間後感染が防御された！

弱毒化スポロゾイトによるワクチン効果試験
放射線照射した弱毒化原虫

Radiation AttenuatedSporozoite (RAS)
Vaccine免疫- 95% 有効 (24/26人：10ヶ月)- メカニズム:–CD8+ T cells–Antibodies>1000 irradiated infected
Mosquitoe bites, total

Challenge

5 infectedmosquitoes

Hoffman, 2002, JID 185:1155

Stephen Hoffman博士（58）は、毎年100万人が命を落とすマラリアを防ぐワクチンの開発のために、バイオ企業のSanaria 社を創設。2007年10月26日にメリーランド州
ロックビル（Rockville）に製造工場をオープンした。
サハラ以南のアフリカ地域の毎年2500万人の新生児が摂取できるように毎年7500万から1億本のワクチンの製造を目指すという。この開発によって「蚊をワクチンの製造工場に変えることができる」と胸を張った。1匹の蚊からは2本のワクチンが製造できるという。
Epstein, 2011, Science 334:475-80

経皮注射：No protection

蚊吸血：>90% protection

考えられる防御免疫誘導のしくみ
スポロゾイト

肝臓感染ステージ原虫を標的としたワクチン開発は有望

防御免疫誘導候補抗原を選定するために、原虫の寄生戦略の分子基盤を解明すべきどうやってマラリアの研究をすればいいのか？

宿主特異性の高い複数のマラリア原虫種が存在する

ほとんどのマラリア原虫のゲノムが解読されている

熱帯熱マラリア
三日熱マラリア
四日熱マラリア
卵形マラリア例）熱帯熱マラリア原虫
23Mbp, 14 染色体,5300 遺伝子ねずみマラリア

マラリア研究の歴史
1880年 マラリアの原因が原虫であることが見出される（ラヴラン、1907年にノーベル賞）
1898年 原虫がハマダラカにより媒介されることが証明された（ロナルド・ロス、1902年にノーベル賞）
1997年 ネズミマラリアにおける相同組み替え法の確立
2002年 熱帯熱マラリア原虫の全ゲノム読了
Nature. 2002 Oct 3;419(6906)

マラリア原虫類の遺伝子データベースの構築
EST データベース・DNAマイクロアレイ解析・MS

解析

遺伝子とは？
人の場合、核の中には４６本の染色体がある

染色体にはDNAが折り畳まれている人間の体は約６０兆個の細胞でできている

タンパク質
転写

翻訳

マラリア原虫の場合、14本の染色体を持ち、約5000の遺伝子をコードする。

医学研究における遺伝子工学の歩み
DNAには形質を転換させる働きがある：1944年

DNAは二重らせんである：1953年

DNAが残った

塩基配列決定法の開発:1977年
PCR法の開発：1985年
ヒトゲノムプロジェクト：1990-2003年

遺伝子組み換え原虫を作ると何ができる？
原虫の動きを記録したい！

→GFP発現原虫を作成しよう
標的蛋白の挙動を見たい！
→GFPとの融合蛋白質を発現させよう
標的蛋白機能を欠損させてみたい！
→標的遺伝子を欠損させた原虫を作成しよう

GFP

マラリア原虫の生活環と研究戦略
スポロゾイト

蚊
唾液腺

肝臓

メロゾイト

ヒトへの感染の入り口
赤血球

感染戦略を分子レベルで解明し、中腸効果的なマラリア予防法開発に繋げる
トロホゾイトネズミマラリア原虫をモデルとして、遺伝子改変原虫作成により分子基盤を生殖母体明らかにする

スポロゾイトオオシスト

マラリア原虫のヒトへの感染準備段階
受精

生殖母体(gametocyte)

唾液腺スポロゾイト
選択的に発現する分泌タンパク質の探索
唾液腺

中腸

哺乳類への感染性を唾液腺へのスポロゾイト侵入獲得する唾液腺に侵入したスポロゾイトとその内部構造

唾液腺スポロゾイトに特異的に発現する分泌型タンパク質: SPECT2・唾液腺スポロゾイトに選択的に発現・シグナルペプチド・膜障害に関与するドメイン
・分泌小器官のひとつ、マイクロネームに局在

MACPF (membraneattach complex/perforin related)domain

500 nm

ほ乳類への感染に関与する？

SPECT2欠損原虫は哺乳類に感染できるのか？

唾液腺

Sporozoites

SPECT2欠損原虫は、げっ歯類への感染性が野生型に比べて、静脈投与で1/20程度、皮内投与で1/100程度まで減少した。

SPECT2は、肝臓感染に関わる分子である！！！

スポロゾイトは肝細胞に寄生する
細胞通過

Sporozoite

認識細胞寄生

寄生寄生胞

SPECT2欠損原虫は、肝細胞に正常に寄生する

肝内型原虫

メロゾイト

SPECT2欠損原虫は細胞を通り抜けることができない

唾液腺

スポロゾイト

マラリア伝播においてどんな意味があるのだろ
欠損スポロゾイト
野生型スポロゾイトう？

Amino R et al. Cell Host & Microbe. 3, 88 - 96 (2008)

SPECT = Sporozoite Micronemal Protein Essential for Cell Traversal蚊の吸血に伴い皮膚に注入されたスポロゾイト
Sporozoites injected by a mosquito into theskin

Frischknecht F. Cell. Microbiol.
9: 1630-1640 (2007).

Vanderberg JP& Frevert U. Int. J. Parasitol. 34: 991-6 (2004).

スポロゾイトがほ乳類に感染を成立させるまで
Cell Host & Microbe 4, September 11, 2008

移動細胞通過？？？

細胞認識/
侵入

肝臓ステージ原虫の発育

寄生胞崩壊／
メロゾイト放出細胞通過能は皮膚内での移動に必須である
野生型原虫

SPECT2欠損原虫

遺伝子欠損原虫を感染させた蚊Amino R et al. Cell Host & Microbe. 3, 88 - 96 (2008)

スポロゾイトはどうやって肝細胞に到達するのか？

Hepatocyte

Endothelarrest
perisinusoidai
Space of DissePradel et al, Comparative Hepatology, 3(suppl 1):S47, 2004

スポロゾイトが肝細胞に到達するのに細胞通過能が必要a) 皮内で血管内へと侵入する際b) 肝臓内で肝細胞へと到達する際

マラリア原虫スポロゾイトは、肝細胞に到達する為に、障害となる細胞層を通り抜ける、あるいは貪食細胞から逃れる為に、標的細胞膜に障害を与えながら当該細胞を通り抜ける機構を持つ

マラリア原虫はシステムの再利用を行う？

スポロゾイトとオオキネートに共通基盤が存在？

MAOP

Cell Microbiol. 2004 Dec;6(12):1119-25.

マラリア原虫が哺乳類に感染成立させるまで
Cell Host & Microbe 4, September 11, 2008

移動／細胞通過細胞認識/
侵入

肝臓ステージ原虫の発育

寄生胞崩壊／
メロゾイト放出LISP1, LISP2

スポロゾイトの細胞侵入＆寄生機構
細胞通過

SPECT1/2

SporozoiteGliding

皮膚内 & 類洞壁認識?

肝細胞内寄生

寄生胞

肝内型原虫

メロゾイト

細胞に寄生するスポロゾイトのライブイメージング
Cell traversal

Cell infection

Sporozoite

HepG2 cells

17 min:11 Z-sections参考文献
Hoffman, 2002, JID 185:1155
Epstein, 2011, Science 334:475-80
Nature. 2002 Oct 3;419(6906):498-511.
Nature. 2002 Oct 3;419(6906):512-9
Nature. 2002 Oct 3;419(6906):520-6.
Nature. 2002 Oct 3;419(6906):527-31.
Nature. 2002 Oct 3;419(6906):531-4.
Nature. 2002 Oct 3;419(6906):534-7.
Nature. 2002 Oct 3;419(6906):537-42.
Ishino et al, PLoS Biol. 2004 Jan;2(1):E4.
Ishino et al, Cellular Microbiology 7(2), 199–208, 2005

参考文献

Amino R et al. Cell Host & Microbe. 3, 88 - 96 (2008)
Vanderberg JP& Frevert U. Int. J. Parasitol. 34: 991-6 (2004).
Frischknecht F. Cell. Microbiol. 9: 1630-1640 (2007).
Thiberge et al., NATURE PROTOCOLS 2(7), 2007, 1811
Kadota et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2004, 101(46):16310-5.
Ishino et al, Mol Microbiol. 2006 Mar;59(5):1369-79.
Yuda & Ishino, Cell Microbiol. 2004 Dec;6(12):1119-25.
Ishino et al, Mol Microbiol. 2005 Dec;58(5):1264-75.
Kariu et al., Cell Microbiol. 2009 Sep;11(9):1329-39.
Ishino et al, Mol Microbiol. 2013 Jan;87(1):66-79.
Stephen Hoffman, Scientific American. 2008 Mar.
Baum et al, Trends in Parasitology. 2008 Dec;24(12):557-563.

参考文献
Photolibrary
http://www.photolibrary.jp/img74/4286_222442.html
誰でもわかる遺伝子検査辞典 – ヒトの遺伝子検査とは？ http://dna.kokoronogohan.com/040qgiaqih/genome.html
もりの小学校 – がんと細胞 –http://www.morinogakko.com/classroom/sansu/tanni/gensiryoku/yasai/gan.html
DNA 超らせん
http://ja.wikipedia.org/wiki/DNA%E8%B6%85%E3%82%89%E3%81%9B%E3%82%93
イラストレーター Okasanta
http://fitmugen1130.web.fc2.com/site/sozai/popular/popular_21.html
The Quest for a Malaria Vaccine and the Man Who Risked Everything toFind It
http://mentalfloss.com/article/27056/quest-malaria-vaccine-and-manwho-risked-everything-find-it
By Michael Myser Business 2.0: The Malaria

参考文献
Malaria in Southern Africa, General Malaria Information.
http://www.malaria.org.za/Malaria_Risk/General_Information/general_inf
ormation.html
肝細胞の極性http://g-transfer.hustle.ne.jp/a-site/introduce/research_2/hepato/
E-module d’enseignement sur le paludisme - 1.9.1 Merozoite invasion
erythrocyte http://fr.impactmalaria.com/web/formation_paludisme/parasites_merozoite_TAGCyx 技術情報
http://www.tagcyx.com/technical.html
理科ねっとわーく : 肺炎双球菌の形質転換のイラスト
http://rikanet2.jst.go.jp/contents/cp0400/movies/03.swf
Web な野鳥の道草写真館 -ツバメhttp://nina-kaz.com/photos/birds/barn_swallow.html
Self-Experimenters: Malaria Vaccine Maven Baits Irradiated Mosquitoes
with His Own Arm