博 士（ 水産 科学 ）大塚 周二
学 位 論 文 題 名エゾアワビグ―1，4―マンナナーゼの単離とcDNAク ロ ー ニ ン グ お よ び 大 腸 菌 発 現 系 の 確 立
学 位論文内容の要旨
近年、海藻には血圧低下作用、抗腫瘍活性、コレステロール低下作用などを示す有用な生理活性物質が含まれることが明らかにされるとともに、海藻を医薬品や高機能素材の原料と、して利用しようという試みが盛んになっている。このような海藻の新たな利用方法の広がりに対応するためには、原料となる高品質の海藻を安定に生産・供給できる新たな育種技術を整備することが必要となる。
そのためには、従来の選抜育種法に加え、細胞工学や遺伝子工学といったバイオテクノロジーに基づく新たな種苗生産や品種改良法の開発も必要と考えられる。しかしながら、陸上植物と比較して海藻のバイオテクノロジーは基盤技術の開発および整備が立ち遅れているのが現状である。一般に植物において細胞融合や遺伝子導入を行う際には、常法として細胞壁を多糖分解酵素で消化・除去したプロトプラストが用いられる。植物のバイオテクノロジーにおいて、このプロトプラス卜の作出法の確立は最重要課題のーっといえる。
本研究でプロトプラストの作出の材料として用いた紅藻スサビノリ（Porp々F閉朋D釦sおUeda）
においても、プロトプラストの作出の報告はなされているが、高品質のプロトプラストを高収率で安定に調製する方法は確立されていないのが現状である。現在、スサビノりのプロトプラストの作出では、アワビなど海産軟体動物の内臓をアセトン処理して得られた粉末、あるいは各種の微生物由来の酵素が用いられている。アワビの消化液のアセトン粉末（アワビ粗酵素）中には、様々な多糖分解酵素が含まれているが、各酵素のカ価はアワビの採取時期やアワビ粗酵素の品質などで変化することが知られ、結果としてアワビ粗酵素を用いて作出したプロトプラストの収量が不安定となる傾向がある。また、近年、海洋細菌由来のアガラーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼを混合して用いることによルスサビノりのプロトプラストの作出が行われているが、この場合、プロトプラストの収量は比較的高いが、その再生率が著しく低いことがしぱしば経験される。このように、スサビノりのプロトプラストの作出方法には、その後のプロトプラストの培養法を含め未だ改善の余地があると考えられる。また、現在市販されている酵素では、高品質なスサビノりのプロトプラストを大量に作出するには不十分であり、今後、さらにスサビノりのプロトプラストの作出に適した酵素を開発する必要があると考えられる。そこで、本研究では、スサビノりのプロトプラストの作出のための酵素として、以前より有効性が認められているアワビ粗酵素中に含まれるEndo―1，4−B―D−mannanase（マンナナーゼ）に着目し研究を進めた。
まず、エゾアワビ消化液よルマンナナーゼの単離と、その基本性状の分析およぴ部分アミノ酸配一 1487−

列の決定を試みた。その結果、TOYOPEARLCM−650M
丶ハイドロキシアパタイトおよびTOYOPEARLHW―50F
カラムクロマトグラフイーにより1種類のエンド型ロ―マンナナーゼ(HdMan)が単離できた。HdManの至適温度は45℃であり、他の軟体動物由来のマンナナーゼの至適温度50〜 55℃に比べてやや低く、至適 pHは 弱アルカリ 性のpH 7.
5付近であった。また、実際にスサビノりの葉 状の配偶体をHdM
anで処理したところ、HdManを長時間（4日間）藻体に作用させてもプロトプラストは全く得られなかったが、藻体は断片化され、10〜20細胞から成る細胞塊が生じた。
次に、組換えDNA技術を用いたHdM
anの大 量生産を目的として、cDN
Aクローニングと塩基配列の決定によってHdManの全アミノ酸配列を推定した。その結果、HdManの翻訳領域全体をコードする
cDNAを得ることができた。このcDNAは1，232塩基対からなり、その15番塩基から1，148番塩基までの1，134塩基対が翻訳領域で、377アミノ酸をコードしていた。
最後に、HdManをコードしているcDNAを組み込んだpET―101プラスミドベクターと宿主大腸菌B
L21(DE3)を用いて 発現系を構築し、HdM
anの発 現を試みた。その結果、1，000mlの大腸菌培養液から比活 性2.12 U/mgの 組換 えHdManが 0.66 mg得ら れた 。組 換 えHdManはエゾア ワビ天然H
dM
anと比較して至適温度、至適pH、温度安定性に若 干の違いが見られたが、エゾアワビ天然HdManと同様スサビノりを細胞塊に分散することが確認された。
植物細胞のプロトプラストの作出は、細胞融合、DNAや細胞小器官の細胞からの抽出ならびにそれらの細胞への導入、細胞の観察、変異体の作出など利用価値の高い基礎技術であり、研究のみならず育種の分野にも利用可能である。アマノリ属植物においても、プロトプラストは、形質転換、細胞融合、むsitu
ハイブリダイゼーションな どの実験に利用されている。また、プロトプラストをストレス下で再生させ藻体の選抜を繰り返すことでストレス耐性の品種を選抜育種することが報告されている。海苔養殖で扱われているアマノ・リ属植物の葉状の配偶体は単相世代であり、交雑の効果は顕著に現れてこないため、このようなプロトプラストを用いた選抜育種は重要な技術である。
このようなプロトプラストを用いた研究や育種を可能にするためには、高品質のプロトプラストを高収率で安定に調製するための方法を確立しなければならない。そのためには、プロトプラストの作出に用いる酵素の種類や、最適濃度などについて、純化した酵素を用いた詳細な検討が必要で
あ り 、 こ の よ う な 実 験 に 、 本 研 究 で 得 ら れ た HdManは 応 用 で き る と 期 待 さ れ る 。

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学位論文審査の要旨
主査 教 授 嵯峨直恆
副査 教 授 尾島孝男
副査 教 授 川合祐史
副査 助教授 井上 晶

エゾアワビグー1，4―マンナナーゼの単離とcDNAク ロ ー ニ ン グ お よ び 大 腸 菌 発 現 系 の 確 立
植物細胞のプロトプラストの作出は、細胞融合、DNAや細胞小器官の細胞からの抽出ならびにそれらの細胞への導入、細胞の観察、変異体の作出など利用価値の高い基礎技術であり、研究のみならず育種の分野にも利用可能である。しかし、海産紅藻スサビノりでは、高品質のプロトプラストを高収率で安定に調製する方法は確立されていなぃ。゛そこで本研究では、スサビノりのプロトプラスト 作出に利 用でき る酵素としてマンナナーゼをエゾアワビの消化液より単離した。また、そのcDNAをクローニングし、大腸菌での発現を試みた。その結果、エゾアワビ由来天然マンナナーゼおよび大腸菌由来組換えマンナナーゼ共に、スサビノりのプロトプラスト作出に適していることが明らかとなった。
本論文において、緒言では、全体における緒言を示し、第1章ではエゾアワビの消化液よルマンナナーゼの精製法を示し、得られたマンナナーゼの基本性状およびスサビノりのプロトプラストの作出におけるマンナナーゼの役割、意義、重要性について論じた。第2章ではエゾアワビのマンナナー ゼのcD
NAの クローニ ング法を 示し、 得られたcDNAの構造について論じた。第3章ではエゾアワビのマンナナーゼの大腸菌による発現系の構築法を示し、得られた組換えマンナナーゼの基本性状について論じた。最後に総合考察では、上記研究の結果に基づき、スサビノりのプロトプラストの作出におけるマンナナーゼの有用性を総合的に考察した。
第1章では、エゾアワビ消化液よルマンナナーゼの単離と、その基本性状の分析および部分アミノ酸 配列の決 定を試 みた。その結果、1種類のエンド型ロ―マンナナーゼ(HdMan)が単離できた。
HdManの至適温度は45℃であり、他の軟体動物由来のマンナナーゼの至適温度50〜 55℃に比べてやや 低 く、至 適pHは弱 アルカリ 性のpH 7.5付 近であっ た。海 水のpH
はお およそ pH8であ ること が知られているので、本酵素が弱アルカリ域に至適pHを示すことは、スサビノりのプロトプラストの作出 に適した 特性と 言える。また、実際にスサビノりの葉状の配偶体をHdManで長時間（4日間）処理したところ、プロトプラストは全く得られなかったが、藻体は断片化され、10〜 20細胞から成る細胞塊が生じた。また、スサビノりのプロトプラストの作成にHdManをキシラナーゼと組み合わせて用いることが有効であることが示された。
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第2章では 、組換え DNA技 術を用い たH
dM
anの大量生 産を目的 として、cDN
A
クローニングと塩基配列の決定によってHdManの全アミノ酸配列を推定した。その結果、HdManの翻訳領域全体をコードするcDNAを得るこ とができ た。こ のcDN
Aは1，232塩基対からなり、その15番塩基から1，148番塩基までの1，134塩基対が翻訳領域で、377アミノ酸をコードしていた。そのうち、翻訳領域の5 末端15番塩 基から 68番塩基ま での54
塩 基対は翻 訳開始 メチオニ ンを含 む18残基か らなる シグナル
ペプチ ドをコ ードして いた。 3 末 端には6塩基からなるpoly(A)とその13塩基上流にはAATAAAのpoly(A)付加シグナル配列が認められた。また、推定アミノ酸配列中には、既知のGHF5に保存されているアミノ酸配列が認められた。このことより本酵素もGHF5に属するものであるということが示された。
第3章では 、HdM
anを コード している cDN
Aを組み込んだpET―101
プラスミドベクターと宿主大腸菌BL21(DE3)を用いて発現系を構纂し、HdManの発現を試みた。その結果、1，000mlの大腸菌培養液から比活性2． 12U/mgの組換えH
dManがO．66mg得られた。組換えHdManはエゾアワビ天然H
dManと比較 して至 適温度、至適pH、温度安定性に若干の違いが見られたが、エゾアワビ天然Hd
M
anと同様スサビノりを細胞塊に分散することが確認された。
主 論 文 は平 成 18
年 1月 26
日11時から12時 まで第 二研究棟 特別講 義室にお いて、 審査員お よび
関連教 官13名お よび一般聴講20名出席のもと発表された。一般聴講においては、アワビ由来HdManと組換えHdManの酵素特性の違いについて、および、HdManを用いて作出したプロトプラストの再生率についての質疑・応答がなされた。また、、審査員および関連教官においては、酵素単離にエゾアワビを選んだ理由ついて、プロトプラストの再生について、既知のプロトプラスト作出法について、HdManのー次構造について、および、組換えH
dManの比活性についての質疑・応答がなされた。本研
究で単離されたマンナナーゼは、スサビノりのプロトプラスト作出に利用できるものであり、スサビノりの研究に貢献すると判断し、博士（水産科学）の学位を授与される資格のあるものと判定した。

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