博 士（ 医 学） 千 葉広 司
学位論文題名Neutrophils secreteMIP‑lグ after adhesion to lammln
contained in basement membrane of blood vessels．
（血管基底膜中のラミニンヘ接着した好中球はMIP―1グを分泌する）．学位論文内容の要旨【背景・目的】
好中球は微生物に対する生体の抵抗カにおいて重要な役割を担っている。なかでも貪
食細胞として微生物に対する防御反応の第一線において重要な働きをしていると考えられている。細菌感染局所にはまず好中球が浸潤し、ついでマクロファージや樹状細胞が浸潤し、最終的にはりンパ球の浸潤が起こると考えられている。こうした感染巣への各種免疫応答細胞の遊走と活性化は非特異的免疫応答と特異的免疫応答機構においては重要なステップであり、これによって生体は微生物を効果的にかつ能率よく除去している。最近鈴木らは、granuloc
ytecolony一stimulatingfactor(G‑CSF)が、好中球を刺激してep
ithelial
一cell―deri'ved−neu
trop
hil―a
cti
vati
ng
‑fac
tor78(ENA−78)の産生を誘導し、好中球の遊走を刺激することを発表した。この報告は、好中球自身が感染巣で好中球の集積を増強する可能性を示唆している。っまり好中球が貪食作用等の抗菌作用以外に、ケモカインの産生を介した免疫応答細胞の感染局所への遊走カスケードを刺激する作用を持っている可能性を示唆している。本研究においては、好中球の寿命が数時間と短命であると言う事実から、好中球が血管内から感染局所に移動する途中で何らかのケモカインを産生し、免疫応答細胞の遊走を刺激していると言う仮説を立て、その検証を行った。具体的には血管基底膜中の細胞外基質タンパクであるフィブロネクチン、ラミニン、マトリグルヘ接着後、好中球がどのようなケモカインを産生するのかを検討した。
【方法】
1）ヒト好中球の単離と細胞外マトリックス蛋白との接着
末梢血を正常ポランティアより20ml採取し、まずFicoll−Paqueにて単核球を分離後、2％メチルセルロースにて赤血球と好中球に分離した。好中球分画に残存した赤血球はhypoton
ic shockにて除去した。この方法で得られた好中球分画は、99％以上が好中球で占められ、残りの1％以下は好酸球であった。アガロース、フィブロネク
チン、ラミニン、マトリゲルを各コーテイングしたdishを作成し、各コーテイングデイッシュで単離されたヒト好中球を2一24時間培養した。培養後に培養上清と好中球を各々回収した。
2）好中球のケモカイ，ンmRN
A発現
培 養 好 中 球 の 各 種 ケ モ カ イ ン mRNA発 現 を Real time PCR法 に て 検 討 し た 。
3）培養上清中へのMIP―1ロ分泌の検討
培養上清中のmacrophageinflammatoryproteinくMIP)−1ロをELIZA法(QuantikineHumanMIP−iB immunoassay)で測定した。
4）ヒト樹状細胞の培養‑ 94−

ヒ ト 樹 状 細 胞 は 正 常 ポ ラ ン テ イ ア の 末 梢 血 よ り 、 末 梢 血 単 核 細 胞 （ PBMNC） をFi
coll− Paque勾配 遠心 分離 によ って 単離 後 1
時 間培 養し 、接着細胞(adherentcell）の み を 分 離 し た 。 こ の 接 着 細胞 をGM一CSFとIL−4で 6
日 間培 養後 、LPSで1日 培養 して樹 状細 胞と し た。 この 細胞 はCD83陽 性で あり 樹状 細胞 であ るこ とが 確 認さ れた 。
5）ノー ザンプロット法およぴRealt
ime PCR
回 収 さ れ た 好 中 球 か ら RNAを 抽出 し、 ノー ザン ブロ ット 法で MIP― 1ロのmRNAの発 現を確認した。Real t
ime PC
Rで、各コーテイングデッシュ上で培養した好中球ののMIP―1ロの発現を検討した。
6）ラミ ニンヘの接着
ラミニンヘの接着に関与する接着因 子の検討は、好中球を固相化ラミニン上で培養し、抗 al、 抗 a2、 抗 a6抗 体 を 添 加 し て 接 着 阻 止 が お こ る か ど う か で 検 討 し た 。
7）トラ ンスウエル・チャンバー・アッセイ
各種 培養 上清 を チャ ンバ ー下 室へ 、樹 状細 胞を チャ ンバ ー上室へいれ4時間培養後、下室 側へ 遊走 し てき た樹 状細 胞を頭微鏡でカウントし、各種培養 上清の樹状細胞遊走刺激 能を 検討 し た。 また 樹状 細胞の遊走が抗MIPー1ロ抗体で阻止 されるか否かも検討した。
【結果】
1． MIPー 1ロのmRNA発現 量は ラミニン、マトリゲルで培養した好 中球で有意に高かった。
2． ラ ミ ニ ン ヘ の 接 着 因 子 を 検討 した とこ ろ、 好中 球の ラミ ニン ヘの 接 着は 抗a6抗体に て抑 制さ れ た。 同時 に好 中球 のMIP
− 1ロの mR
NA発現 量も 抗a6抗体 に て抑 制さ れた。
3．好中 球はD6を発現していた。
4． MIP− 1ロ の 分 泌 量 は ア ガ ロ ー ス 80pg/ml、 フ ィ ブ ロ ネ ク チ ン 75pg/ml、 ラミ ニ ン 250pg/ml、 マ ト リ ゲ ル 200pg/mlで 、 ラ ミ ニ ン 、 マ ト リ ゲ ル 下 で 培 養した好中球の培養上清が有意に高か った。
5．ラ ミニ ン、 マト リゲ ルで 培養 した 好中 球 の培 養上 清で樹状細 胞の遊走が有意に高かった。
6．樹状 細胞の遊走は抗MIP−1ロ抗体で阻止された。
【考案】
血管 内腔 から 炎 症組 織へ 遊走 してくる好中球は、血管内から血管 外へ移動する為には血管 内皮 細胞 と 血管 基底 膜を 通過しなければならなぃ。その際、 血管基底膜中の各種の細 胞外 マト リ ック ス蛋 白と 接着しながら移動する。従来の報告 では、好中球は感染
局所 に移 動し た 後LPS
等 の細 菌由 来の 物質 に よっ て刺 激されてMIP―1ロを分泌するとされ てき た。 し かし なが ら、 好中球の寿命は数時間と短命であり 、感染局所に移動す
る前 に何 らか の ケモ カイ ンを 産生して遊走カスケードを動かすほ うが生体防御においては 有利 であ る と考 えら れる 。また、実際の生体内でも各種の免 疫応答細胞の遊走カスケ ード が働 い てい るこ とを 考えると、生体内でも同様の現象が 起こっていると推測でき る。 本研 究 の結 果は 、好 中球が血管外へ移動する際、血管基 底膜に含まれるラミニン と接 着し 、 M
IP―1ロ を分 泌しているという可能性を示し、感 染局所に移動する前に好 中球 が樹 状 細胞 の遊 走を 刺激するケモカインを産生している 可能性を示唆した。
この 結果 より 好 中球 が非 特異 的免疫応答から特異免疫応答への橋 渡し役を担っている可能性が示唆された。
【結語】
好中 球は 血管 基 底膜 中に 特異 的に存在する細胞外基質タンパクで あるラミニンと接着する こと によ り 、MIP− 1ロの mRNAの発現が亢進し、MIP―1ロを分 泌した。さらに分泌されたMI
P−1ロは樹状細胞の遊走を 促進すると考えられた
一 95−

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 今 村 雅 寛
副 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 武 蔵
学

学位論文題名NeutrophilssecreteM
IP‑1汐afteradhesiontolaminincont
ainedinbasementmembr
aneo
fbloodvess
els・（血管 基底膜中の ラミニンヘ接着した好中球はMIP−1グを分泌する）
好中球は微生物、特にバクテリアに対する免疫応答において非特異的な反応を担う重要な細胞であり、炎症局所で細菌のu）sなどの刺激でケモカインを産生することが知られている。しかし、好中球は非常に短命であり、炎症局所に到達する前に別の細胞を遊走刺激するケモカインを産生する方が、より効率的に免疫担当細胞への遊走カスケードを作動させ得ると推測される。そこで、好中球が血管内腔から基底膜を通過する際、基底膜に特異的に含まれるラミニンとの接着で好中球のケモカイン産生が亢進すると考えた。予備実
験として好中球が細胞外基質タンパクであるフアブロネクチン、ラミニン、マトリゲルに接着後、好中球のケモカイ ン発現(
MIP−1ば、MIP‑1ロ、IL‑8、ENA78、MCP1など）をRT‑PCRで検討し、好中球のラミニン接着後のrvnP‑1ロの発現が認められたため、その詳細な解析を行った。好中球が各細胞外基質タンパクヘ接着後、好中球のMLP‑1ロmR
NAの発現をrealt
imePC
R法で検討した結果、ラミニン、マトリゲルとの接着でその発現は高く、発現亢進はラミニン接着10分後から認められ、また、ノーザンブロット法でもマトリゲル存在下では、好中球のrvnP‑lロm
恥岨の発現亢進が示された。次に、Mm‐1口発現にいたる好中球のラミニン接着に使用される接着分子の同定を抗VLA抗体存在下でadhcsi
叩譌sりにて比較検討したところ、ラミニンおよびマトリゲルでの接着率が抗a6抗体で強く抑制され、抗a1抗体では抑制されなぃこと、ラミニン接着後の好中球MI
P‐1ロInJひnの発現は抗a6抗体で阻害されること、抗ば1および抗ゼ2抗体では発現低下の認められないことが示された。また、フローサイトメトリーで約20％の好中球細胞表面にa6の発現が確認された。次に、各細胞外基質タンパクにおける好中球MIP・1ロタンパク産生をE
uS
A法で比較検討し、ラミニン接着後のM田‐1ロのタンパク産生亢進を確認した。次に、産生されたMm‐1ロがヒト樹状細胞の遊走を刺激するかどうかを各細胞外基質タンパク下で好中球を培養した上清を用い、トランスウエル・チャンバー・アッセイで比較検討した結果、遊走してきた樹状細胞数はラミニン、マトリゲルで高く、それらは抗MIPlロ抗体で阻止された。以上より、好中球は血管基底膜中に含まれるラミニンヘゼ6a1を用いて接着し、接着後MI
P‐1ロを産生し、樹状細胞の遊走を刺激することが結論付けられた。これらの結果より、―96―

好中球 は血管 外に遊 走する際 、基底 膜中の ラミニ ンと接 着して MIP‑1ロを産 生し樹 状細胞 の血管外への遊走を刺激 し、非 特異的 免疫応答から特異的免疫応答への媒介役として働いている可能性が示唆された。さらに、
G‑CSF投与は これら 非特異 的およ び特異 的免疫 応答を 修飾す ると考え られた 。
口頭発 表後、 副査の 武蔵学 教授よ り、ラミ ニン単 独の濃 度とマ トリゲル中のラミニンの濃度について、ヒト樹状 細胞が 炎症局 所へMIP‑1ロ で遊走 後にそ の局所 濃度が 高いまま 、どの ように して所 属リンパ節へ移動するの かにつ いて質 問があっ た。こ れに対 して申 請者は 、ラミ ニンのコーテイング濃度が20pg/mlに対し、
マト リ ゲ ルは1mg/mlで コーテ イング しマト リゲル 中の約 50％にラ ミニン が含ま れてい ると回答 した。 ヒト樹状 細 胞 の所属 リンパ 節への移 動に関 しては 、その 細胞が バクテ リアを 貪食後 あるいは 抗原提 示の段 階でMIP‑1ロのレ セプタ ーの発 現低下 がおこ り、所 属リン パ節か ら産生さ れる他 のケモ カイン によって所属リンパ節 へ 移 動 する 可 能 性 を示 し た 。 次に 、 副 査 の浅 香 正 博 教授 よ り 、 抗a6抗 体 の特 異 性、ゼ1やa6は分 子特性、 ラミニ ンは量 依存性に MIP‑1ロを 発現亢 進する のか、 セレクチ ンの検 討の有 無、MIPー1ロの臨床応用の 可 能 性 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 こ れ に 対し 申 請 者 は抗 a6抗体 が VLA6に 対 す る抗 体 で あ り、 alや ば6はイン テグリ ンファ ミリーに 属する 接着分 子であ ること 、また ラミニンの量依存性に関してはコーテイング濃度を 段階的 に調整 して実験 は行っ ていな いもの の、今 回のラ ミニンとマトリゲルの比較からは量依存性ではない と考え られる こと、セ レクチ ンと好 中球の 接着に おける ケモカインの発現に関しては、今回検討はしていぬ いが、 証明す るために はセレ クチン をコー テイン グした デイッ シュで 好中球を 培養し同様にMI
P‑1ロのmRNAの発 現 と タ ンパ ク 産 生 の検 討 が 必 要で あ る こ と、 G‑CSF投与 に よ り 免疫 応 答 を増強で きる可 能性を示し た。次 に、主 査の今村 雅寛教 授より 自験例 もしく は文献 的にG‑(ニ SFで好中 球のMIP‐lロの発現亢進
がある かどう か、MIP‑1dや MCP1など 他のケ モカインの検討、ケモカインで遊走された好中球のneg
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back機 構、好 中球MIP―1ロm恥 乢Aの発 現亢進 持続の意 義、抗 d6抗体の みが好 中球の ラミニ ンヘの 接着を 阻害し 、 ま た Mロ ― 1ロ のmRNA発現 を 抑 制 して い る 理 由に つ いて 質問が あった。 これら に対し 申請者 は、自験例で G℃SFによ る好中 球のM田 ‐1ロの 発現が 確認さ れてい ると、他 のケモ カイン に関し ては、RT‐1℃Rによ る 予 備 実 験 で MIP11aや MCP1は 発 現 亢 進 が 認 め ら れ な か っ た こ と、 賦 gadvcf。cdback機 構 に つい ては貪 食 さ れ るバ ク テ リ アな ど が な くな り 炎 症 の沈 静 化 に 伴って 鵬gativefeedbackの 誘導が 予想さ れること 、 好 中 球 MIP― 1ロmRNAの 発 現 亢 進持 続 の 意 義は 明 確 な 回答 は で き なぃ が mRNAの 分 解 遅延 が 起 き ている 可 能 性 が ある こ と 、 抗a6と 抗 a1抗 体 は 共に ラ ミ ニ ンの 接 着 を 阻害 す る が 、抗 a1抗体 は 他 に コラ ー ゲンIVに も 親和 性 が あ り、 抗 a6抗体 の 方 が 抗dl抗 体 よル ラ ミニ ンに対 して特異 性の高 いこと が予想 されると回答 した。
本研究 は感染 におけ る免疫 応答機 構には、 好中球 のMIP‐ 1ロの関与が重要であることを複数の実験系で証明した 点で高 く評価 され、今後さらなる研究により、様々なケモカインと免疫応答機序の解明が期待される。
審査員 一同は 、これ らの成果 を高く 評価し 、申請 者が博 士（医 学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと 判定し た。

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