ペ
塩 プ
基 チ
脱 道
片九
山州
研大
究学
平 室大
成
学
弐
院
拾
漆
工
年
学
如
研
月
究
吉
院
日

保
護
流
極
意

外
伝

☆ 注意が必要なアミノ酸、試薬【Arg(Pbf), Asn(Trt), Gln(Trt), Asp(Odmab), Ser(PO(Obzl)OH), Thr(PO(Obzl)OH), Tyr(PO(Obzl)OH) 】 不十分な縮合反応◆ カップリング反応が十分に進まない。
☞ 立体障害による原因が一つ。樹脂密度の見直しやカップリング反応前にDCMによる十分な樹脂の膨潤を行う。反応条件を改善する。
【Cys, Met】 副反応（空気酸化）◆ 空気酸化によって、MSのピークが16（？）ズレる。
☞ 抗酸化剤（還元剤）を用いた脱保護をする。過剰な吸引は避ける。
【Arg、Trp】 脱保護での副反応◆ “N”への保護基の再結合反応（求電子反応）により、脱保護が不完全になってしまう。
☞ 反応時間を1.5時間から2～4時間に延ばす。
【Asp, Glu】 HPLCでの精製◆ カルボキシル基のプロトン化が不十分だと、ピークが分裂してしまう。
☞ 再沈殿後に溶かすバッファーのpHを酸性にする。
【Fluorescein-COOH, Rhodamine-COOH】 HPLCでの精製◆ リンカー部位のカルボキシル基の修飾部位が、5位と6位の混合物の場合、HPLCピークが2つ分かれる。
☞ ほとんどの実験で問題ないので、2つとも回収する。
【Lys(ivDde)】 副反応◆ ivDde基の脱保護条件（ヒドラジン）では、脱Fmocも副反応として起きてしまう。
☞ ①ヒドラジン処理の前に脱Fmoc＆アセチル化する。
②Bocアミノ酸を用いる。
③ hydroxylamine hydrochloride/imidazole (1.3:1) in NMPを用いる（aapptexプロトコル1182参照）。
【Mmt、Mtt】 不十分な脱保護反応◆ Mmt基やMtt基は、ペプチド配列や樹脂密度によっては、1%TFA条件では外れにくい場合が多い。
☞ 2%TFAによる脱保護、反応時間を5分から10分に延ばす。（KaiserテストやUV-visスペクトルで確認）2

☆ Fmoc定量

3【増減を繰り返す場合】
・測定溶液の秤量がきちんとできていない。

【急に値が下がったとき】
・日数が経って、縮合剤や試薬が劣化した。

120

120

100

100

100

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Reaction ratio (%)

120
Reaction ratio (%)

Reaction ratio (%)

・立体障害が大きく、反応効率の悪いアミノ酸を使った。

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0

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No.

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6

8

☞ 試薬の調製☞ 反応条件の検討（濃度、温度、撹拌）☞ 樹脂（低い樹脂密度）や縮合剤（COMUの変更【反応効率が最初から低い】
・最初のアミノ酸の導入効率が低い。

【理想的なFmoc定量】
・試薬、反応条件、操作、定量が完璧。

100

Reaction ratio (%)

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No.

☞ 反応条件の検討☞ 樹脂や試薬の劣化

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No.

2

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No.

☞ ピペットマン、溶液の調製の正確に

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10

No.

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0

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20

20

0

Reaction ratio (%)

【急に値が下がって、また戻ったとき】・DMFに長期保存しており、脱Fmocが進んでいる。（そのまま反応を続けて問題ない）
・劣化した試薬を新しく入れ替えた。

810☞ 長期保存はNMP中に保存する☞ 試薬の保存に気を付ける（窒素置換）☆ トラブルシューティング
ペプチドの分子設計

配列の順番とカップリングの順番を間違わない。Fmocアミノ酸の純度は99％程度のため、20~30残基以上では、必要な目的物の収量と純度から判断して、スケールアップと反応効率の改善を行う。

樹脂の選択、膨潤20残基以上や立体障害の大きいペプチド、繰り返し配列などを用いる場合、樹脂密度の低い物を選択する。最初のアミノ酸の導入方法や、脱樹脂後のC末端側の官能基の種類についても選ぶ。

試薬、容器の準備

DIEAやPPDはCO2、縮合剤カクテルは水分の混入が命取り。必ず窒素置換を行う。黄いく変色は、交換のサイン。
溶液の継ぎ足しは劣化した試薬が残留するので共洗いをする。カラムの種類は樹脂に合わせる。

各操作

過流撹拌できているか。カラムの半分以上溶液を入れていない。フタに溶液や樹脂が残っていない。100%の反応
点が、反応できるように、分子レベルで最適化を行う。また樹脂の保存はNMPで行う(DMFは脱Fmocを起こす）。

脱Fmoc＆カップリング

振盪中に液漏れをしていない。樹脂が十分液に浸かっている。Fmoc定量を適宜実施する。
装置の状態が悪いとき、Fmocスペクトルが得られない場合があるので注意（次のアミノ酸で測り直す）

脱保護、脱樹脂

副反応を起こしやすいアミノ酸、保護基がある場合は、脱保護カクテルと反応時間を最適化する。MS測定により、残存保護基は確認できる。

再沈殿、溶解再沈殿溶媒が多すぎない。溶解するバッファーが1%TFA/waterや1%TFA/acetonitrilleに溶けない場合は、溶出液と混和性のあるDMSOやMethanolなどを用いる。（極性を下げすぎないように！）

HPLC精製、MS分析

検出強度が500以上と十分高い。MSのピークのS/N比やシグナル強度が十分高い。
また塩基性アミノ酸よりも酸性アミノ酸を多く含むペプチドの場合、マトリックスや測定モードに注意する。

特殊なアミノ酸、蛍光標識

高額の場合、必ずFmoc定量やMS分析で、純度や品質を担保してから導入する。蛍光標識は、NHSの蛍光基よりもカルボキシル基蛍光基と縮合剤を用いる方が簡便に導入できる。

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☆合成カラム

5① PD-10 Empty Columns （GEヘルスケア、17-0435-01）19,800円/50本 スケール：（13.5 ml）～0.1 mmol、1-2 ml② エコノパックカラム（BIO RAD、732-1010） 27,000円/50本 スケール：（20 ml）～0.3 mmol
③ ミニカラム（SARSTEDT社、CC.07） 13,000円/100本 スケール：（3～5 ml）～0.03 mmol
④ ポリプロピレン製LibraTube（ハイペップ、RT-5M） 16,500円/100本 スケール：（5 ml）～0.05 mmol※③の上フタはスピッツ管（栄研）、下フタは①のフタを使用可能。（純正品は、上フタ：CC.03、下フタ：CC.04）

①

②

③

④

ペプチ道之掟【実験を始める前に】➤ 試薬のMSDSを確認（DCM：発がん性、DMF：催奇形性）【実験が終わったら】➤ ヒーターの電源OFF、コンセントを抜く➤ 振盪器の電源OFF➤ 溶媒の補充（DCM、DMF etc…）➤ Kaiserテスト試薬、スピッツ管の補充➤ ゴミ箱が溜まる前に、中身を捨てる➤ 廃液の処理（1 M塩酸で中和）※ シアン廃液はpH10以上に調製！酸性にしたら死にます！
➤ ピペットマン、チップの整理、汚したら洗浄➤ 汚れは、メタノールとペーパータオルで落とす！
☞ カラムの上下のふたは、壊れていなければ再利用する！

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