Dec. 2020

〈総THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

73―493（ 1 ）説〉
発熱性好中球減少症のメタゲノム解析を目指した
シークエンス技術の臨床応用酒井純

埼玉医科大学病院感染症科・感染制御科（2020 年 9 月 29 日受付）
臨床現場において血流感染症の判定には，血液培養ボトルによる菌の培養は必要不可欠な検査である。一方で，血液培養ボトル陽性から菌種同定までにはタイムラグがあり，迅速診断が必要な血流感染症の症例では懸念が残る。とりわけ，発熱性好中球減少症の例では，血液培養が陰性であることも多い上，タイムラグにより予後不良になりやすい。近年，新しい次世代シーケンサーとして，ノート型 PC に USB ポートで接続が可能なナノポア型シーケンサー MinIONTM が開発された。今回，発熱性好中球減少症の起因菌診断に，今後 MinION シーケンスが有用か検証した。
方法は，血液培養ボトルからゲノム DNA を抽出・調整した後，ゲノム DNA にバーコードを付加した。バーコード付加後の DNA 溶液を，PC に接続している MinIONTMフローセルに滴下した。PC 内の MinKNOW を起動させ，フローセルに添加した溶液中の DNA 情報を記号化した。記号化されたデータを，Epi2ME にて解析し，既存データから最も相同性の高い菌種を同定結果とし，既存の菌種同定法の結果と比較した。
また，同時に ESBL 関連遺伝子が検出可能かも検証した。
結果，グラム陰性菌は，MALDI-TOF MS, 16S rRNA シーケンスの結果と 100% 一致となった。一方で，グラム陽性菌は 60% 程度の一致率であり，とりわけ Staphylococcusaureus, Staphylococcus caprae の一致率が低かった。ESBL 関連遺伝子は 2 検体で検出され，Disk 法による判定と一致した。

MInION シークエンスは，通常煩雑かつ時間経過がかかる次世代型シーケンサーをポータブル化し，その解析・菌種同定まで短時間かつ簡易的な手技で可能にした技術である。本研究では，血液培養ボトル陽性となった時点から，6 時間程度で菌名同定まで判定可能であり，グラム陰性菌単菌種に関しては感度 100% と良好な結果を示したことから，MALDI-TOF MS や 16S rRNA シーケンスと比較して，グラム陰性菌の血流感染症診断の新たな診断技術として可能性が見出された。一方，グラム陽性菌
では同様の手法での感度は低く，DNA 抽出方法に関して改善の余地も残した。今後，上記問題点を解決し，発熱性好中球減少症に対する MinION シーケンスの可能性に関して検証を続ける。

94（ 2 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

I. 序文

73―4

Dec. 2020【ナノポア型シーケンサー MinIONTM】
近年，ナノポア型シーケンサー MinIONTM がOxford Nanopore Technologies（USA）社より発売【背景：臨床現場における血流感染症診断】された。本シークエンサーは，元来の手間と時間臨床現場において，血液培養ボトルを用いた一のかかるシーケンサーと異なり，ノート型 PC に般細菌の培養と培養陽性後の菌種同定は，血流感USB ポートで接続が可能であり，かつ PC 内にダ染症の診断・抗菌薬決定に必要不可欠な検査であウンロードした関連アプリケーション MinKNOWる。菌種同定は，通常血液培養ボトル内の培養液 （MinIONTM を介して DNA を専用記号化するアプを発育培地に滴下し，ボトル内の菌を純培養する。 リケーション），Epi2ME（記号化されたデータを純培養で発育が見られた細菌は，グラム染色等の解析するソフト）と共に用いることで，菌種同定各種検査を行うことで最終的に菌種同定を行う。 に加え，薬剤耐性遺伝子も抽出・分析が可能とまた，純培養された菌を用いて，薬剤感受性試験を行い，発育した菌の抗菌薬への感受性を確認する。

なった 1〜5）。
今回我々は，発熱性好中球減少症の起因菌判定に有用か判定する目的で，ナノポア型シーケン

近年では，元来の手法に加えて Matrix-assisted

サー MinIONTM のもつ菌種同定能と耐性遺伝子検

laser desorption ionization-time of flight mass

出能を様々な検体を用いて検証し，その簡便性，spectrometry（MALDI-TOF MS）用いた菌種の迅同定能に関して現時点の調査結果をまとめたため速診断が確立し，以前より迅速かつ簡易的に菌種報告する。の同定が可能になった。一方で，血液培養ボトル

II. 材料と方法

内で菌が発育してから菌種同定に至るまでにタイムラグがあることから，感染者の診断がしばしば遅れ，予後不良になる原因の一となっている。

FN 患者血液を用いたメタゲノム解析に先立ち，2018 年に埼玉医科大学病院細菌検査室に提出さ【背景：発熱性好中球減少症】

れた血液培養ボトルのうち，ボトルから抽出した急性骨髄性白血病や抗腫瘍薬によって，血液中全ゲノム DNA を用い，含まれる病原体のメタゲの免疫応答機構の一つである好中球が減少するこ

ノム解析技術を確立した後，シーケンス・データとがある。とりわけ，末梢血中の好中球数＜500/の解析パイプライン構築を行った。

mm の場合，一般細菌による感染症が発生しやす3くなる。本状態で感染症を発症した場合，発熱性 【検体と標準株取得】
好中球減少症（Febrile neutropenia; FN）と呼ばれ，しばしば予後不良の転機をたどる。

FN は，その原因の主病因は血流感染症である

埼玉医科大学病院細菌検査室に提出された血液培養検体のうち，培養陽性となった計 38 検体を対象とした。

ことが知られている。本疾患発症時は，菌種とそ

ま た，標 準 株 と し て，グ ラ ム 陽 性 菌 のの薬剤感受性の迅速診断が必要となるが，血液培

Staphylococcus 属 2 菌種，グラム陰性菌 4 菌種，真養の判定までタイムラグが存在することから診断

菌 Candida 5 種の計 11 種は岐阜大学微生物遺伝資の遅れ・予後不良につながることが懸念されてい源保存センターより菌株分離を行った。

る。

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THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

73―495（ 3 ）【MALDI-TOF MS と 16S rRNA シ ー ケ ン ス，薬 （https://www.ezbiocloud.net）で評価した。
剤感受性試験】（1）MALDI-TOF MS（3）薬剤感受性検査

培養陽性ボトルより，菌体の存在している培養コロニーを白金耳で掻き取った後，液体培地中液を血液寒天培地上に散布した。35°C, over nightに懸濁した。コロニーを懸濁した液体培地を Data

でコロニーの発育を確認した後，コロニーを白金耳

Management System software （version 22.28） とで抽出した。抽出したコロニーを用いて，Matrix-Microscan WalkAway 96 Plus System （Beckman

assisted laser desorption ionization-time of ﬂight mass

Coulter, Inc, USA）のプロトコルに準じて調整し，

spectrometry （MALDI-TOF MS; Bruker Daltonics

抗菌薬入りの 96 wells plate に滴下した。35°C でGmbH, Bremen, Germany）による菌株同定を行っover night した後，各種抗菌薬の感受性を評価した。

た。

（2）16S rRNA シーケンス【DNA 抽出・バーコード付加・MinION シーケン

血液寒天培地上に発育したコロニーを，白金耳にス・解析（Figure 1）】て抽出した後，滅菌済み PBS に懸濁した。懸濁後， （1）DNA 抽出

QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）
を用いて菌の DNA を抽出・調整した。

対象となる血液培養ボトルから，500 μL を抽出した後，0.1–0.2 mm 径のガラスビーズによる物理抽出液を用いて，Polymerase chain reaction（PCR） 的 破 砕 を 行 っ た。 QIAamp PowerFecal DNA Kitを行った。反応条件は 94°C, 1 分後，95°C 30 秒， （Qiagen, Hilden, Germany）を用いて DNA を抽出

60°C 30 秒，72°C 90 秒で 35 回，最後 72°C 5 分で反した。AMPure XP ビーズ（Beckman Coulter）を応させた。使用 primers は 515F-1497R 領域を増幅

用 い て DNA を 精 製 し た 後，最 終 的 に Qubit 2.0

可能な，forward primer（5′-GTG CCA GCA GCC

ﬂuorometer（Thermo Fisher Scientiﬁc, Waltham, USA）

GCG GT-3′）， reverse primer （5′-TAC GGY TAC

を用いて精製液中の DNA 量を定量し，200 ng/μL

CTT GTT ACG ACT T-3′）を用いた。反応後 DNA 溶に調整した。

液は Euroﬁn Genomics 社（Tokyo, Japan）でシーケンスを行った後，菌種同定を EzBioCloud database

Figure 1. 血液培養ボトルからの遺伝子抽出と MinION シーケンスまでの過程

96（ 4 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS（2）バーコード付加

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出可能か検証した。今回，ESBL 関連遺伝子が検

Barcording kit 1D sequencing Kit（ONT）を用い， 出可能か確認した。
2

先述調節したゲノム DNA にバーコード付加・ラESBL 産生菌として知られている Escherichia coli,イブラリ調整を行った。バーコード付加により， Klebsiella pneumoniae の検体から，ESBL 関連遺最大 12 検体まで同時にシーケンスが可能となる。

伝子（bla）が存在するか，PCR 法で検討した。

PCR の primers は，計 8 種類（blaCTX-M1, blaCTX-M2,（3）MinION シーケンス

bla CTX-M8, bla CTX-M9, bla CTM-M26, bla OXA, bla SHV,

シ ー ケ ン ス 機 器 は MinION Flow Cell（FLO-blaTEM） を 用 い た。 GoTaq Green Master Mix

MIN107 R9.5 Version）を使用した。バーコード付 （Promega）を酵素として用い，参考文献に従い加された DNA 溶液を，PC に接続した MinIONTM

PCR を行った 6,7）。PCR のシーケンス結果を，blastn

Flow Cell に 滴 下 し た。PC 内 の MinKNOW ONT

version 2.5.0 で 解 析 後， MinION シ ー ケ ン ス・software （v1.4.2）（MinION

Epi2ME での ARMA で検出された bla 遺伝子の結TMを 介 し て DNA を専用記号化するアプリケーション）を起動させ， 果と照らし合わせた。

MinIONTM に添加した溶液中の DNA 情報を記号III. 結果化した。
（4）情報解析【MinION シ ー ケ ン ス， Epi2ME の 同 定 結 果

WIMP via EPI2ME（2.52）（https://epi2me.nano （Table 1）】
poretech.com/user）を用いて解析し，シーケンス・血液培養ボトル陽性計 38 例のうち，グラム陰リードから微生物の網羅的同定（メタゲノム解析） 性菌は 18 例，グラム陽性菌は 19 例，真菌は 1 例でならびに薬剤耐性遺伝子の網羅的検出が可能かどあった。分離リードの内訳は，Total reads に占めうか検証した。さらに，正確な解析データを入手

る Non-human reads の割合は，グラム陽性菌はグするために必要なシーケンス・データ量についてラム陰性菌と比較して低い傾向が見られた。

も検証した。

ま た， Non-human reads に 占 め る Top hit readsの比率は，菌種・検体ごとに異なり，グラム陰性【ESBL 関連遺伝子検出能】

菌 は 24.0–91.0%, グ ラ ム 陽 性 菌 は 10.0–89.7% で血液培養ボトルより一般細菌・真菌が検出されあった。最も低値であったのは，グラム陰性菌はた場合，菌種同定に並行して薬剤感受性試験を行Enterobacter cloacae complex（24.0%），グラム陽い，培養された菌の薬剤への感受性を判定する。 性菌は S. caprae（10.0%）の検体であった。
通常，菌同定目的のシーケンスでは薬剤感受性を判定することは困難である。MinION シーケンス 【MALDI-TOF MS, 16S rRNA シーケンスと比較
では，菌種同定と同時に，薬剤感受性に関与するした MinION シーケンス同定能（グラム陽性菌）遺伝子を同時に抽出することが可能であり，その （Table 1）】検出能に関しても評価した。記号化されたデータ

グラム陽性菌 19 例に関して MinION シーケンを，Epi2ME（記号化された reads から菌名を選びス，MALDI-TOF MS, 16S rRNA シーケンスの結出すアプリケーション）の ARMA workﬂow を用果を比較した。

いて解析し，菌種同定に並行して耐性遺伝子が検

グラム陽性菌では MALDI-TOF MS と 16S rRNA

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Table 1. MinION シーケンスによる菌種同定（a）標準株。
（b）血液培養陽性ボトルを用いた臨床検体例。
（c）Total reads 中の Non-human reads の内訳。

97（ 5 ）

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シーケンスの結果は一致したが，グラム陰性菌とケンスと比較して良好であり，菌種同定一致率比較して MinION シーケンスの結果との一致率は100% であった。

低く（63.1%），特に S. aureus（42.8%），S. caprae（0%）は低かった。

【ESBL 遺伝子検出能（Table 3）】
グ ラ ム 陰 性 菌 の 検 体 No. 9 E.coli, No. 15 K.

【MALDI-TOF MS, 16S rRNA シーケンスと比較

pneumoniae の ARMA に よ る 解 析 に て，各 々した MinION シーケンス同定能（グラム陰性菌） CTX-M 型，SHV 型が検出された。他の E. coli, K.
（Tables 1, 2）】

pneumoniae 検体では，ESBL 関連遺伝子は検出されグラム陰性菌に関して MinION シーケンスで 1stなかった。死菌から DNA 抽出を行い，CTX-M・classiﬁed reads と 判 定 さ れ た 菌 種 は，16S rRNA

SHV・TEM primer による PCR を行ったところ，シーケンス，MALDI-TOF MS にて一例ずつ判定

上記 2 症例で CTX-M 型，SHV 型 bla の陽性を確認が異なった（No. 16, No. 18）。No. 16 は，MinIONした。また，薬剤感受性検査（Disk 法）にて確認

シ ー ケ ン ス と MALDI-TOF MS で は Klebsiella

検査を施行したところ，2 株とも ESBL 産生菌とvariicola と診断されたが，16S rRNA シーケンス確定された。

で は K. pneumoniae と 診 断 さ れ た。 K. variicola/

pneumoniae は，16S rRNA シーケンスのみの診断は

IV. 考察困難であり，菌同定の誤同定と判定した。No. 18
は，MALDI-TOF MS にて Fusobacterium 属までの血液培養ボトルが陽性となり，菌種が同定でき同定となったが，16S rRNA シーケンスと MinIONるのは FN 症例では少ない。陽性になった症例でシーケンスは F. striatum まで診断可能であった。

は，以前はグラム陰性桿菌が多くを占めていた

本結果より，MinION シーケンスのグラム陰性が，近年グラム陽性菌が占める割合が増加してい菌の同定能は，MALDI-TOF MS, 16S rRNA シーる 8〜10）。真菌例もあり，多菌種をカバーできる新Table 2. グラム陰性菌における MALDI-TOF MS, 16S rRNA シーケンス，MinION シーケンスの菌種同定

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73―499（ 7 ）Table 3. ARMA による ESBL 関連遺伝子と Disk 法の判定結果

たな迅速同定法が必要となっていることがうかがリゾスタフィンを用いた手法や，ビーズを用いたえる。FN 症例における血液検体からの菌種同定

直接的破砕法が報告されている 12〜14）。しかし，実に関しては，グラム陽性菌や真菌からの迅速かつ際は血液検体から直接グラム陽性菌のゲノム DNA高精度なゲノム抽出が必要である。今回の研究にを抽出するのは困難である。血液検体から直接菌より，MinION シーケンスは，血液培養ボトルかのゲノム DNA の分離を促す方法は，同時にヒトゲらのグラム陰性菌の迅速な同定，ESBL 産生菌のノム DNA 量も増加することから，MinION シー判定を可能にする技術と考えた。一方で，グラムケンスにて菌種同定を妨げる要因になったとの報

陽性菌の同定能は 19 例中 12 例（63.1%）であり， 告もあり 15），グラム陽性菌からのゲノム DNA 抽
グラム陽性菌の同定能は他 2 種の方法と比べて劣っていた。

出に関して今後も検討する必要がある。
また，抽出過程後に PCR で 16S rRNA の遺伝子

グラム陽性菌の中で，今回特に一致率が低い増幅を行い，菌種判定に必要な reads を増やしてStaphylococcus 属は，細胞壁の構成要素にペンタグ

菌同定を検討した報告もある 16〜19）。菌種同定にリシンが多く存在しており，グラム陰性菌の溶菌有用と考えられる一方，ESBL 産生菌等の ARMAに用いられる SDS の効果を低下させる作用を持っでの薬剤耐性に関連する遺伝子抽出も可能か検証。今回グラム陽性菌例では Total reads がしていることから，16S rRNA 以外のゲノム DNA少なかったことから，本法ではグラム陽性菌から総量増加法を検討する必要がある。薬剤耐性遺伝

ゲノム DNA 抽出が不十分であるため，Total reads

子の検出能は，WIMP と ARMA による解析ではが少なく，誤判定に至ったと考えられた。グラム

フルオロキノロン耐性などの関連遺伝子の点突然陽性菌のゲノム DNA を抽出する方法として，ペ変異等による耐性化を検出することは，現時点でンタグリシンと結合して菌体の分解を進める酵素は困難と報告されている 20）。耐性遺伝子の存在がている11）

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直接薬剤の耐性に結びつく場合では，MinION
シーケンスで薬剤感受性を予測することが可能と

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引用文献

1）Jain M, Fiddes IT, Miga KH, et al.: Improved dataanalysis for the MinION nanopore sequencer.
Nat Methods. 2015; 12: 351–6.の予測は，検討が必要と考えられた。
2）Lu H, Giordano F, Ning Z: Oxford Nanopore
MInION シーケンスは，通常煩雑かつ時間経過
MinION sequencing and genome assembly.
がかかる次世代型シーケンサーをポータブル化
Genomics Proteomics Bioinformatics. 2016; 14:265–79.
し，その解析・菌種同定まで短時間かつ簡易的な）
Cao MD, Ganesamoorthy D, Elliott AG, et al.:3
手技で可能にした技術である。本シーケンサーにStreaming algorithms for identiﬁcation of
よる菌種診断は今後も検証すべき部分が散見され
pathogens and antibiotic resistance potential from
たが，これらシーケンス含めた総ゲノムシーケン
real-time MinIONTM sequencing. Gigascience.
2016; 5: 32.
スは，臨床現場において菌種同定，耐性菌同定に）Juul S, Izquierdo F, Hurst A, et al.: Whatʼs in4
加えて，現場のサーベイランスへの貢献が可能で
my pot? Real-time species identiﬁcation on theあり，今後の感染症診断への有用なツールになり
MinIONTM. bioRxiv 2015; doi:http://dx.doi.
うる 21,22）。本研究でも，血液培養ボトル陽性とorg/10.1101/030742
5）Brown BL, Watson M, Minot SS, Rivera MC,
なった時点から 6 時間程度で菌種同定まで可能でFranklin RB: MinIONTM nanopore sequencing
あり，グラム陰性菌単一検出例では感度 100% とof environmental metagenomes: A synthetic
良好な結果を示したことから，MALDI-TOF MS
approach. Gigascience. 2017; 6: 1–10.
や 16S rRNA シーケンスなどの従来の診断法に加6）The RIVUR Trial Investigators, Hoberman A,
Greenﬁeld SP, et al.: Antimicrobial prophylaxis
えて，新たな菌種同定法になりうると考えられ
for children with vesicoureteral reﬂux. N Engl Jた。
Med. 2014; 370: 2367–76.
我々は今後も MinION シーケンスによる菌種同7）Schwaber MJ, Navon-Venezia S, Schwartz D,
定能に関して研究・解析を継続し，新たな菌種同Carmeli Y: High levels of antimicrobial
coresistance among extended-spectrum
定法としての可能性を検討していく。
β-lactamase-producing Enterobacteriaceae.
Antimicrob Agents Chemother. 2005; 49: 2137–謝辞39.
この研究は，2019 年度日本感染症医薬品協会奨8）Kanamaru A, Tatsumi Y: Microbiological datafor patients with febrile neutropenia. Clin Infect
励賞とその助成金により遂行したものです。このDis. 2004; 15: 39.
場を借りて深く御礼申し上げます。
9）Cometta A, Calandra T, Gaya H, et al.:Monotherapy with meropenem versus combination
利益相反
therapy with ceftazidime plus amikacin as empiric
therapy for fever in granulocytopenic patients with
利益相反はございません。
cancer. Antimicrob Agents Chemother. 1996; 40:
1108–15.
［この総説は 2019 年度日本感染症医薬品協会奨10）Gonzalez-Barca E, Fernandez-Sevilla A, Carratala
励賞受賞者 酒井純先生が，2019 年 11 月 22 日にJ, Grañena A, Gudiol F: Prospective study of 288
episodes of bacteremia in neutropenic cancer
行われた受賞記念講演の内容を纏めたものです。］
patients in a single institution. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 1996; 15: 291–6.
考えられる一方，塩基配列変異などによる耐性化

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THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

11）Unno H, Inada M, Nakamura A, et al.: Improved
rapid and eﬃcient method for Staphylococcus
aureus DNA extraction from milk for
identiﬁcation of mastitis pathogens. J Vet Med
Sci. 2015; 77: 1007–9.
12）Schindler CA, Schuhardt VT: Lysostaphin: a newbacteriolytic agent for the Staphylococcus. Proc
Natl Acad Sci USA. 1964; 51: 414–21.
13）Osipovitch DC, Therrien S, Griswold KE:
Discovery of novel S. aureus autolysins andmolecular engineering to enhance bacteriolytic
activity. Appl Microbiol Biotechnol. 2015; 99:6315–26.
14）Yuan S, Cohen DB, Ravel J, Abdo Z, Forney
LJ: Evaluation of methods for the extraction andpuriﬁcation of DNA from the human microbiome.
PLoS One. 2012; 7: e33865.
15）Anson LW, Chau K, Sanderson N, et al.: DNA
extraction from primary liquid blood culturesfor bloodstream infection diagnosis using wholegenome sequencing. J Med Microbiol. 2018; 67:347–57.
16）Ashikawa S, Tarumoto N, Imai K, et al.: Rapid
identiﬁcation of pathogens from positive blood
culture bottles with the MinION nanopore
sequencer. J Med Microbiol. 2018; 67: 1589–95.
17）Mitsuhashi S, Kryukov K, Nakagawa S, et al.: A
portable system for rapid bacterial composition

73―4101（ 9 ）analysis using a nanopore-based sequencer andlaptop computer. Sci Rep. 2017; 7: 5657.
18）Benítez-Páez A, Portune KJ, Sanz Y: Specieslevel resolution of 16S rRNA gene amplicons
sequenced through the MinIONTM portable
nanopore sequencer. Gigascience. 2016; 5: 4.
19）Kilianski A, Haas JL, Corriveau EJ, et al.:Bacterial and viral identification anddiﬀerentiation by amplicon sequencing on theMinIONnanopore sequencer. Gigascience. 2015;
4: 12.
20）Schmidt K, Mwaigwisya S, Crossman LC, et al.:Identification of bacterial pathogens andantimicrobial resistance directly from clinicalurines by nanopore-based metagenomicsequencing. J Antimicrob Chemother. 2017; 72:104–14.
21）Phan HTT, Stoesser N, Maciuca IE, Toma F,Szekely E, et al.: Illumina short-read and MinION
long-read WGS to characterize the molecularepidemiology of an NDM-1 Serratia marcescens
outbreak in Romania. J Antimicrob Chemother.
2018; 73: 672–9.
22）Tarumoto N, Sakai J, Sujino K, et al.: Use of theOxford Nanopore MinION sequencer for MLST
genotyping of vancomycin-resistant enterococci.
J Hosp Infect. 2017; 96: 296–8.

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73―4Dec. 2020

An identiﬁcation protocol for detecting bacteriain bloodstream by using a MinION sequencing
Jun Sakai
Saitama Medical University Hospital,
Department of Infectious Disease and Infection Control
Purpose: It is necessity of new rapid method for detecting microorganisms in bloodstream
infection. Especially, patients with febrile-neutropenia tends to be poor prognosis. We focused on
the new sequencing system, MinION. The new third-generation sequencing platform MinION is
an attractive maintenance-free and disposable portable tool that can perform long reads and realtime sequencing. In this study, we validated this technology for the identiﬁcation of pathogens
from positive blood culture (BC) bottles.
Methodology: A total of 38 positive BC bottles collected from the patients of bloodstream
infection, among which 18 isolates of Gram-negative (GN) bacteria and 19 isolates of Grampositive (GP) bacteria were identiﬁed using16S rRNA sequencing, were enrolled in this study.
One case detected fungus from blood culture bottles. DNA was extracted from each aliquot using
an extraction protocol that combined glass bead-beating and chemical lysis. Up to 200 ng of eachpuriﬁed DNA sample was processed for library preparation and whole genome sequencing wasperformed on up to 12 samples through a single Minion Flow Cell.
Results: All GN bacteria identiﬁed on the basis of the most frequent classiﬁed reads by
MinION sequencing for 30 min using WIMP via EPI2ME were consistent with those identiﬁedby 16S rRNA sequencing. On the other hand, the results of identification by 16S rRNA
sequencing and those by MinION agreed in 12 of 19 GP bacteria specimens. The ARMA analysis
was able to detect extended spectrum β-lactamase (ESBL)-associated genes among various
antimicrobial resistance-related genes.
Conclusion: We demonstrated the potential of the MinION sequencer for the identiﬁcationof GN bacteria from positive BC bottles and its confirmation of an ESBL phenotype. This
innovative sequence technology and application could be a breakthrough technology for thediagnosis of infectious diseases.