博 士 （ 理 学 ） 鷲 谷 公 人
学位論文 題名
Synthesis and characterizationof photosensitive glycoconJugateS（光応答 性複合糖 質の合成及び機能に関する研究）

学位論文内容の要旨
糖 鎖の 重 要性 が 認 識さ れ 、その研究 が精力的 に進めら れるよう になって 、すでに 20年
ほ ど経過し ている。 その結果、 生体内に おいて単 なるエネルギー源として扱われてきた糖質 が、実は 複合糖質 として生物 情報伝達 などかな り高度な生命現象に関わっていることがわ かってき たのは大 きな進歩と ぃえよう 。しかし 、現在得られている糖鎖合成とそれらの高 次利用等 にうぃて の知見は、 いまだ十 分とはい えない。
糖 鎖の 構 造と 機 能 に関 す る研究が思 うように 進まない 背景には 主に以下 のような 問題点 があげら れる。
1、 基 本 単 位 の 単 糖 に は 比 較的 反 応 性に 富 んだ 水 酸 基が 多 数 存在 す るた め 、 その化 学的 特性が複雑で特に合成分 野での研究を困難にしてい る。
2、 生 命 現 象 に 密 接 に 関 わ る複 合 糖 質は 生 体内 で の 発現 量 が 非常 に 少量 の た め分
離 精 製が 困 難で あ る上 に 、一 分 子の もてる情報 量が極端に 多いため、 その存在 意義を特 定するの が非常に難 しい。
3、糖 鎖 は遺 伝 子 の二 次 産物 で あ り真 核 細 胞以 上 の生 物で主に 利用され ているが 、糖 鎖 の関 わ る比 較 的単 純 な現 象 でさ えもさまざ まな生体高 分子が複雑 に関与し ているた めメカニ ズムの解明 が難しい 。
こ のように 、糖鎖自 体が抱える 潜在的な 困難さの ため、これらの問題の解決には合成法や分 析技術の 向上など が強く望ま れる。そ こで、本 研究では、これまでに例のないタイプの新 しい光応 答性の糖 鎖化合物の 合成法を 開拓し、 これらを用いた機能解明法の確立を目的と した。
糖 鎖合 成 で最 も 問 題と さ れているの は糖と糖 をっなぐ 段階、す なわちグ リコシル 化反応 で あ る。 そ こで 、 着 目し た のが 光 (UV)に よっ て ラジ カ ル を発 生 し、 ま た その 化 学 的特 性から、 SN2反応など により螢光プローブなどを導入しやすい官能基としての「ヨウ素」で ある。本 研究では 立体化学制 御のでき る隣接基 としてヨウ素を用いて、簡単で汎用性に富 むグリコ シル化法 を初めて開 発した。 また、そ の後、SN2反 応、水素 化反応な どにより様 々 な グリ コ シド に 変 換し た。その 中には合 成が困難 とされて きたp‑マン ノシドや p‑デオ キシグリ コシドも 含まれる。 またこの グリコシ ル化法を用いれば、従来まで合成困難であ っ た アス パ ラギ ン 結 合型 糖 蛋白 質 糖 鎖コ ア 構造 の 合 成が 可 能 であ る こと も 示 した 。
一 方、糖鎖 は、遺伝 子→夕ンパ ク質→糖 鎖とぃう ように遺伝子の情報をもとにして二次的 に合成さ れる物質 である。こ のため、 夕ンパク 質を研究するときにそのタンパク質をコー ドしてい る遺伝子 を見っける のが重要 なように 、糖鎖を合成している酵素を検出し解析することは最重要項目のーっとされる。
合成酵素である糖転移酵素の反応には基質が複数存在する。従来、こういった酵素の活性測定には、ラジオアイソトープを用いる方法、螢光ラベル基質を用いる方法が用いられてきた。しかし、放射能はぃうまでもなく危険であり、螢光ラベルを用いる方法は間接的で、生成物をHPLCなどで分離しなければならないためいずれも連続的な測定は不可能である。そこで本研究では、FRET（螢光エネルギー移動法）とぃう手段に着目した。FRET法はニつの螢光物質が〜 60A程度の近距離で放射と励起波長が重なったときに起こる螢光エネルギー移動を利用する方法である。この方法が糖鎖加水分解酵素に非常に有用であることはすでに当研究室により示されているが、糖転移酵素にはまだ応用できていない。
本研究ではFRET法を糖転移酵素に応用し簡便な活性測定と分離精製手段を確立した。
夕ーゲットにした糖転移酵素はシアリルトランスフェラーゼ(SiaT）とガラクトシルトランスフェラーゼ（GalT）である。まず、ナフチルメチル基（螢光ドナー）とダンシル基（螢光アクセプター）を導入した両酵素の基質誘導体を効率的に合成した。このような二基質系を用いると目標としたFRET法を用いて酵素活性を測定できることを初めて示した。
このFRET法を用いての活性測定は、安全、簡単、直接的で非常に有用な方法であることが示された。これにより、FRET法は合成酵素などの、多分子→一分子というような一般的な 酵素 反応の 連続 的な 活性 測定や分離精製にも応用可能であることがわかった。
また、アゾ化合物は照射される光の波長によって窒素二重結合部位がシスートランスの構造変換をすることが知られている。そこで、アゾ化合物を構造中に含む糖鎖をデザインし、光スイッチよる分子認識機能の制御を検討した。すなわち、アゾベンゼン誘導体にガラクトース及び長鎖アルキル基を導入し、これによる単分子膜を形成させて光の波長により膜がどのような物性を示すかを考察した。またこの際の膜とレクチンとの相互作用を詳しく検討した。予想されたとおり、膜の構造及びレクチンとの相互作用は照射する光の波長により大きく変化することが確かめられた。また、アゾベンゼン化合物特有の性質により、この化合物はスモールスケールの糖鎖合成の際に有用な保護基としても十分な有効性を示すことがわかった。今後、新しいバイオセンサー開発研究などに大いに貢献できることが予想される。
以上の研究により、簡便で汎用性に富む新しいいくっかの糖鎖合成法を開発する事に成功した。また、安全、簡単、連続的な糖転移酵素の活性測定および、光の波長を制御することにより分子認識機能を変化させることが可能な光応答性複合糖質などの合成が達成された こと により 、今 後の 糖鎖 研究を支える新しい方法論の確立に大きく貢献した。

学位論文審査の要旨
主査

教授

西 村 紳一 郎

副査

教授

田中

副査

教授

西副査

教授

坂 入 信夫 （ 大学 院地球 環境科学 研究科）

副査

助教授

勲
則 雄 （大 学 院地球環 境科学研 究科）

吉田孝

学位論 文題名
Synthesis and characterizationof photosensitive glycoconugateS（ 光 応 答 性 複 合 糖 質 の 合 成 及 び 機能 に 関 する 研 究 ）生物情報伝達の新しい様式として糖鎖シグナルとこれを識別するレセプターの組み合わせがいたるところで発見されている。血液型や免疫・癌などのマーカー物質としての細胞表層糖夕ンバク質や糖脂質の機能などはその最も具体的な例といえよう。細胞が分化・成長・臓器形成する際などにも複雑な糖鎖構造の消長が観察されているので複合糖質の糖鎖構造の移り変わりや生合成メカニズムなどを詳細に解析する事は生物学的に極めて重要な研究課題となっている。そのためには糖鎖やその関連化合物の迅速かつ簡便な合成法の確立や構造・機能解析技術の向上などが強く望まれている。
申請者は本研究論文においてこれまでに報告例のないいくっかの新しい光応答性糖鎖化合物の設計と合成を行いこれらが糖鎖機能の解明にとって極めて有効なプ口ーブとなることを実 験的に証 明した 。本論文 は6つ の章で 構成され ている 。1
章 は序論， 2章から5章が 本論 で そ の内 容 を6章で総括 してい る。以下 に論文 審査の概 要につ いて説明 する。
第2章は糖鎖 合成で 最も難解とされている6型マンノース残基を含む化合物の合成に有効な新しいグリコシル化反応の開発について述ぺられている。すなわち、アノマー位での立体化学制御を可能とする隣接基として新たにヨウ素原子を採用して簡単かつ汎用性に富む新規グリコシル化法の実現に成功した。このタイプのグリコシドは弓f
き続き2位炭素上でのSN2反応により合成が困難とされてきたp‐マンノシドやp‐デオキシグリコシドに容易に変換が可能であった。また、この手法がアスバラギン結合型糖夕ンバク質に普遍的に存在する糖鎖コア構造の合成に応用できることも実験的に示している。2位炭素への光応答性基の導入に関してもこれを選択的にアクシャル配置で実現できるため今後生化学的な分野での展開が期待できる。
3章 と4
章 ではそ れそれシ アル酸転 移酵素 、ガラクトース転移酵素とよばれる2種類のー274―

糖転移酵素に対する新規な螢光基質の合成と評価について述べている。従来、このような合成酵素の活性測定には、ラジオアイソトープを用いる方法あるいは螢光ラベルされた基質を用いる方法が主として用いられてきた。しかし、両者とも生成物をク口マトグラフイーなどにより分離した後に定量せざるを得ないため，反応を連続的に追跡する事が不可能である。従って，これらの方法では速度論的バラメーターを決定する事も困難であるうえ、操作が煩雑であったり危険を伴う場合も少なくない。本研究ではこれを解決するために螢
光エネルギー移動法という原理に基づく新規な手法を開発し連続的な糖転移反応の解析に
世 界ではじ めて成 功してい る。こ の手法は 近距離（ 10―20オン グスト ローム程度）に置かれた一対の螢光プローブ、例えばナフチルメチル基（螢光ドナー）とダンシル基（螢光アクセプター）の間で生じる螢光工ネルギー移動という現象を巧みに利用して酵素反応をモニタリングするもので，螢光ドナーを．280nmで励起すれば螢光アクセプターから放射 される52 5nmの螢光を 測定するだけで生成物（糖鎖）の定量が可能となる。糖鎖が生成 しなけれ ばナフ チルメチル基の本来の放射光である340nmの螢光のみが観察されるため極めて特異的で感度の良い手法である事が証明されている。これらの螢光ラベルされた糖ヌクレオチドや糖鎖の合成に関しても極めて効果的な独自の合成ルートを考案しており，今後このタイプの化合物をデザインする際に有効ないくっかの汎用的な方法論を確立している。この方法により両酵素についての連続的な活性測定に成功しており，速度バラメー
ターの決定をはじめ酵素量の定量なども実証している。この方法は糖転移酵素に限らず，生体高分子の生合成にかかわる酵素に一般的な多分子→一分子という反応の連続的な活性
測 定 に も 応 用 可 能 と考 え られ る ため イ ンバ ク トの 大 きな 成 果 であ る 。
5章においては光照射によルシス・トランス異性化することが知られているアゾベンゼ
ンを構造中に含む新規な両親媒性ガラクトース誘導体を合成し、光スイッチによる糖鎖の分子認識機能制御を検討している。この光応答性糖脂質モデル化合物は予期した通りの単分子膜形成能を発現し、しかも照射する光の波長により膜の物性が著しく変化する事を確かめている。次いでタンパク質との界面における相互作用を解析した結果、夕ンノペク質は糖鎖の配向性に依存してトランス型の直立した糖脂質単分子膜表面に特異的に吸着していることを証明した。これは糖脂質の機能解明，特に分子集合体形成メカニズムと機能発現の 研 究 に と っ て 新 し い ブレ ーク ス ルー と なる ア プロ ー チで ある 。
以上のように申請者は簡便で汎用性に富む新しいいくっかの糖鎖化合物の合成法を開発し、これらの全てが複合糖質の機能解明研究に有効な光応答性プローブとなることを証明した。審査貝一同はこれらの成果を高く評価し、申請者が博士（理学）の学位を受けるに充分な資格を有するものと認定した。

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