［再録］Biosci. Biotechnol.Biochem.,63(11), 1921-1926, 1999

Polypeptide Compositions and NH-terminal
2Amino Acid Sequences ofProteins in Foxtail and Proso millets
Keiko KOHAMA*, Takashi NAGASAWA** and Naoyuki NISHIZAWA***Iwate Industrial Research Institute; Morioka, Iwate 020-0852, Japan and United Graduate School of Agric. Sci., Iwate Univ.;**Department.ofBioscienceandTechnology,FacultyofAgriculture,IwateUniversity,Morioka,Iwate020-8550,Japan

Seed protein of foxtail and proso millets were fractionated into polypeptides that were analyzed for their major protein,prolamin, and NH-terminal
2amino acid sequences of proteins were determined. The proteins extracted from foxtail and proso
millet were64.1and80.0%prolamin, respectively.Polypeptides of prolaminswereclassifiedintotwogroups.Majorpolypeptidesof 27-19 kDa were rich in leucine and alanine, whereas the 17-14 kDa polypeptides were rich in methionineandcysteine.
Glutelin-like proteins that wereextracted with reducedreagent were high in proline content and the major polypeptides w e r e 1 7
and20kDarespectively. NH-terminal
2amino acidsequenceshowedthat the major polypeptides of prolaminwerehomologousto
α-zein and glutelin-like protein containing

Pro-Pro-Pro sequence like repetitive sequence of γ-zein. Although the prolaminconsistedofasimilarsubunitaszein,polypeptideswithvariouspIvaluewerefoundamongthem.
Keywords:millet,prolamins,polypeptidecomposition,NH-terminal
2amino acidsequence;homology

アワ(Foxtail millet)及びキビ(Proso millet)種子タンパク質のポリペプチド構成とＮ末端配列
小浜恵子 、長澤孝志 、西澤直行＊＊＊＊＊

本研究ではHDLコレステロール代謝に影響を与えるアワとキビ種子タンパク質の構造について検討した。主成分であるプロラミン画分のポリペプチドは、１９から２７ｋＤａのLeu及びAla高含量のものと１４から１７ｋＤａのMet及びCys含量の多いものに分類された。１９ー２７kDaのポリペプチドのＮ末端配列はα‑ゼインと相同性を有しており、ホモオリゴマー構造をとることが示唆された。更に還元剤の存在下で水溶性であるグルテリン様のポリペプチドはPro含量が高く、γーゼイン様のProの繰り返し配列を有していた。アワ、キビのプロラミンでは含有するポリペプチドの数や等電点に相違が認められたがゼインのサブユニットとの共通性が見られた。

＊岩手県工業技術センター＊＊岩手大学農学部応用生物学科

［再録］Biosci. Biotechnol.Biochem.,63(11), 1921-1926, 1999

雑穀種子タンパク質の構成成分と機能性
２

実験方法

添付したpaper原稿の部分を参照願いたい。

４

今後の計画

以上のことから、paper の新規性を守るため、今回は報告書への掲載を見合わせたい。

３

結果と現在までの経過

今年度は分画した成分の何がＨＤＬ上昇効果を有して和文要約の部分に述べたような結果が得られている。

いるのかを調べていく予定である。また、ＨＤＬ上昇以

アワとキビの主な貯蔵タンパク質の構成ポリペプチドを外の生理活性も有している可能性（抗ガン性）もでてき分画し、アミノ酸組成と他の穀類タンパク質との比較をたのでどの程度有望か見極める。農研センターへの技術行った。ポリペプチド組成はトウモロコシの貯蔵タンパ

協力は現在のデータを提供する方向で進めたい。

ク zein （ゼイン）に似ていた。しかし、トウモロコシにおいてはＨＤＬの上昇効果は報告されていない。
アワ、キビのポリペプチドについて分画・解析した例はほとんどなく現在、添付したように paper にまとめている。投稿先は Journal of Agricultural Food Chemistry（アメリカの雑誌）を想定、現在は native の方による英文の校正前なのでまだ完成ではない。
さらに、県北農研センターで栽培された品種についてタンパク質の抽出を実施している。今後県北農研センターで県内の雑穀の分類を進める、とのことであり抽出法を教えて欲しいとの話が進行中である。

岩手県工業技術センター研究報告第４号（１９９７）

表１

変異株のPGA生産性
生成 PGA 量（mg/ml）

菌株

B.natto M6.0M-177.0

M-217.0

図１

PGAの分子量の測定

またＬＢ液体培地で３７℃２４時間培養時の培養上清のGGT 活性は親株よりもＭー１７、Ｍー２１ともに高かった（表２）。Ｍ株とＭー２１をＬＢ培地及びＬＢＧＮ培地で培養したときの growth と培養上清の GGT 活性の経時変化を図２に示した。 またこのときの２４時間後、５４時間後の相対粘度と GGT 活性はＭー２１の方が高かった（表３）。

雑穀種子タンパク質の構成成分と機能性
３ー３

変異株を用いた納豆の試作と評価

製品のナットウキナーゼ活性（Tyr 1nmol/mgprotein・min を１ U とした）相対粘度、アンモニア濃度を表４

図２

菌株の増殖とGGT活性の発現に示した。官能検査ではＭー１７が一番粘りが感じられた。アンモニア量には差異が認められなかったがＭー２がよかったが、使用した大豆「鈴の音」は発酵時間がほの香りが良く思われた。Ｍー２１は菌の被りが均一ではかの大豆より長く必要との製造業者の意見もあることかなく、外観としては好ましくなかった。

ら、プロテアーゼ活性の高いＭー２が適したとも考えられる。ほかの大豆での試作もする必要がある。また粘性４

考察については好みがあると考えれ、商品イメージによって納豆は健康食品として注目を集めており今後も需要が調節が可能であればバラエティに富んだものが得られる増すものと考えられ、多様なニーズに合わせた製品開発と思われる。PGA の生成経路については B. Anthracis にが必要である。今回、ナットウキナーゼ高生産株を取得

おいてプラスミド上に粘質物の生産に係わる遺伝子が存したが親株と特に遜色ない試作品ができた。むしろ香り在しているとの報告があり８）、納豆菌については生産
表４

表２ＬＢ培地培養上清のGGT活性菌株

菌

試作納豆の分析値

GGT 活性（mU/ml）

株ﾅｯﾄｳｷﾅｰｾﾞ活性

相対粘度(U)（％）

B.natto M

160.0M

M-17211.0

M-2

13.02.50.2

M-21265.8

M-176.22.90.2

M-214.52.70.2

表３6.2

ｱﾝﾓﾆｱ量2.50.2

ＬＢＧＮ培地培養上清の相対粘度とGGT活性に係わる遺伝子としてはコンピテンシィに関与する遺伝菌株

相対粘度

GGT 活性(mU/ml)

子の破壊によって生産性がなくなるとの報告９）がある。
PGA を合成する枯草菌は GGT 活性が高いことが知られ

24hr

54hr

24hr54hrているが１０）、GGT の PGA 生産における役割を直接証明した例はない。図２及び表３に示したように GGT は

B.natto M

1.62.069.7

M-212.7

3.0104.6107.0221.5

定常期以降に培地中に分泌されており、グルタミン酸ナトリウムを添加したＬＢＧＮ培地すなわち PGA 生産培地においてはＬＢ培地より分泌されるのが遅く、PGAの培地への分泌にともなって分泌されてくる。変異株はPGA 生産が GGT 活性が高いことによって生産性が高いのではなく、早期から PGA が培地中に分泌されてきているのではないかと推察している。GGT 活性が高い理由としては菌体外酵素の調節変異が考えられるが、ほかの主な菌体外酵素としてプロテアーゼ活性とアミラーゼ活性を調べたところ、差がなかった（データ未発表）。
最近 B.subtilis の GGT 遺伝子がクローニングされ１１）、カタボライトリプレッションを受けることが報告されており今回取得した変異株Ｍー２１、Ｍー１７について調べたところ、親株よりも GGT 活性が強く阻害された１２）。

岩手県工業技術センター研究報告

この点については遺伝子レベルで現在検討中である。
また図１に見られるように変異株とのあいだに分子量的な差はないが構成アミノ酸のＤＬ比についてはまだ検討していないので今後の課題である。
５

結語

納豆菌の変異処理によって高ナットウキナーゼ生産株と PGA 生産変異株を取得した。 PGA 生産変異株はGGT 活性が親株よりも高く、 PGA が速く培地中に分泌されると推察された。取得した変異株で納豆を試作した
ところ、高ナットウキナーゼ活性株は親株と遜色なくPGA 生産変異株は相対粘度がわずかに高かった。
文献1) 須見洋行：醸造協会誌, 85, 518 (1990 )2)江崎ら：日本食品工業学会誌：37, 474 ( 1990)
3) M.Kimura: Poulty Science 65,1217 ( 1986)
4) H.Itokawaetal.: Chem. Pharm.Bull .,42, 604 ( 1994)
5) 小寺ら：日本農芸化学会大会講演要旨集 ,281 (1997)
6) E.Ichisima, Y.Takeda,K.TairaandM.Takenouhi:
Biochim.Biophys.Acta, 869 , 178 ( 1986)
7) 藤井ら：日本農芸化学会誌, 37, 407 ( 1963)
8) I.Uchidaetal.,: Molecular Microbiology, 9, 487 ( 1993)9)永井ら：日本農芸化学会大会講演要旨集,67 (1997)
10) A.Aumayr,T.Hara and S. Ueda: J.Gen.Microbiol ., 27,115(1981)
11) K. Xu and M. A. Strauch: J.Bacteriol., 178,4319(1996)
12)小浜ほか：日本食品科学工学会大会講演要旨集 ,149
(1997)

第４号（１９９７）

雑穀種子タンパク質の構成成分と機能性細胞外プロテアーゼによる消化が最も重要であるとは考えられるが、細胞内プロテアーゼが発酵中にどのような役割を果たしているのか興味がもたれる。
最近、一島らは好アルカリ性の Bacillus 属から、pH
１２で高い活性を有する細胞内プロテアーゼの遺伝子をクローニングし、その性質について検討しているが９）、今回クローニングした細胞内プロテアーゼと非常に似ており、Ｃ末側８残基が長いこと、４アミノ酸が異なる他は全く同一であった。Kinema の菌株は pH10 で生育不能であることから、アミノ酸の相違がアルカリ耐性の性質の差であると推察される。
４結語

Bacillus subtilis kinema から細胞内プロテアーゼ遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。３３１アミノ酸から構成されており、Bacillus subtilis ISP-I 及びBacilluspolymixia の細胞内プロテアーゼと高い相同性を示した。また、Alkalophilic Bacillus sp.の細胞内プロテアーゼと１２アミノ酸の相違しかないことから、アルカ上段：

リ耐性の細胞内プロテアーゼとの性質の相違について今中段：

後検討する必要がある。

下段：
図

３

細胞内プロテアーゼのアミノ酸相同性

本研究を実施するに当たり、キネマの菌株を分譲、併せてご指導ご助言していただいた東北大学農学部一島英４

考察治教授に感謝いたします。

Bacillus 属の生産する菌体内プロテアーゼは、胞子文形成期に活性が認められることから、遺伝子レベルでの献活性調節機構と、胞子形成過程との関連について検討さ

1)須見洋行：醸造協会誌,85, 518 (1990)

れ、ISP-I の制御機構については多くの報告がある。

2)小浜恵子：岩手工技セ研報, 2, 83 (1995)

ISP-I は、他の不要タンパクを分解し、胞子の特異的タ3)Maniatis, T. et al.: Molecular cloning. Cold Spring

ンパクの新生に必要とも言われていたが、胞子形成に必Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, New York( 1982)

須ではないとの報告が有力である。他の細胞内プロテア

4)Sanger, F. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463

ーゼ ISP-II なども胞子形成には関連しているが必須で(1977)

７）はない。胞子形成期の細胞内プロテアーゼの生理的役
８）割については、今後の報告が待たれるところである。

食品製造、納豆製造におけるプロテアーゼの役割は、

5)KoidoY.etal.: J.Bacteriol ., 167, 110 ( 1986)
6)TakekawaS.etal.: J.Bacteriol., 173 , 6820 ( 1991)7)SastryK.J.etal.: JBacteriol., 153, 511 ( 1983)

岩手県工業技術センター研究報告第４号（１９９７）

8)村尾澤夫：日本農芸化学会誌, 65, 56. ( 1991)
9)YamagataYandIchishimaE. : Curr.Microbiol., 30, 357(1995)

図１

キネマから精製したセリンプロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動

レーン１：分子量マーカー
レーン２：精製蛋白質
レーン３：キネマ培養液の上澄単一のバンドとして検出され、分子量約 30,000 であった（subtilisin kinema)。既に精製、クローニングされている Baciilus natto のセリンプロテアーゼ（ナットウキナーゼ）subtilisin NAT ６ ） と同様である。
また、精製された酵素の活性は、セリンプロテアーゼ阻害剤である phenylmethylsulfonyl fluoride ( PMSF )10mM 存在下で完全に阻害された。得られた精製酵素の比活性は、Tyr 1mol/mg protein・ sec を１ Kat としたと
き 40nKat であった。
図２には、今回精製した酵素のＮ末端配列を解析した結果を示した。比較として Bacillusnatto の生産する
subtilisin NAT、及び既に報告されている各種 Bacillus
属の生産する細胞外セリンプロテアーゼ subtilisin E ８）
、subtilisin amylosacchariticus １０）、 subtilisin BPN １１）、

９）

subtilisin Carlsberg １２） を示した。図２に示した通り、
subtilisin NAT 等のプロセッシングを受けた後、細胞外に分泌された酵素の最初の 12 残基と全く同一であった。
Ｎ末からの番号
蛋白質の由来1Subtilisin Kinema

AQSVPYGISQIK

Subtilisin NATAQSVPYGISQIK

Subtilisin E

AQSVPYGISQIK

Amylosaccharitics

AQSVPYGISQIK

Subtilisin BPN

AQSVPYGVSQIK

Subtilisin Carlsberg

AQTVPYGIPQIK

図２

10

キネマ及び関連細菌のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列
４考察

Bacillus subtilis Kinema から今回精製した subtilisin
kinema は 、Bacillus subtilis Natto からのセリンプロテ

雑穀種子タンパク質の構成成分と機能性
アーゼ Subtilisin NAT と分子量やＮ末のアミノ酸配列

文献では同じであるが、其質特異性を検討しないと同一性に

1) 小浜恵子：岩手工技セ研報,2 ,83( 1995)

ついて明確な評価はできない。特に、この Bacillus sub2) 須見洋行：醸造協会誌, 85, 518 ( 1990)

tilis Kinema からは、今回精製した subtilisin kinema の3) 木内

他に 90kDa の分子量で等電点が 3.9 である細胞外セリ4) E. Ichishima, Y. Takeda, K. Taira,and M.Takeuchi :幹, 鈴木英也：食品と科学, 33, 8 5 (1 9 9 1 )ンプロテアーゼが精製され、Bacillopeptidase F と相同性

Biochim.Biophys.Acta, 869 , 178( 1986)

が高いこと、等電点がこのように低いセリンプロテアー

5) M.Bradford: Annal.Biochem. , 72, 248 ( 1976)

７）

ゼは例がないことが報告されている。

6) V.K.Laemmli: Nature , 227, 680 ( 1970)

こうした点で、いわゆるナットウキナーゼと呼ばれてい

7) T.Nakamura,Y.Yamagata,andE.Ichishima:

る今回精製した細胞外酵素の基質特異性、フィブリン塊

Biosci.Biotech.Biochem., 56, 1869 ( 1992 )（血栓）溶解活性等の生理活性については今後検討する

8) T.Kato,Y.Yamagata,andE.Ichishima: Biosci.Biotech.
Biochem., 56, 1166 ( 1992)

ことにしている。
５

結語

9) M.L.StahlandE.Ferrari: J.Bacteriol., 158, 411

Bacillus subtilis Kinema から今回精製した subtilisin(1984)

kinema は 、Bacillus subtilis Natto からの酵素などとと10) S. L. Wong, C. W. Price, D. S. Goldfarb, and R. H.

もに subtilisin ファミリーに属するものであるが、Doi

subtilisin E などとは免疫的同一性などに差異が見られ

11) T.Yoshimoto,H.Oyama,T.Honda,H.Tone,T.

: Proc.Natrl.Acad.Sci.U.S.A. , 81,1184 ( 1984)

ることより、基本的な構造特性による検討だけでは不十Takeshita,T.Kamiyama,andD.Tsuru: J.Biochem. ,分であり、反応特性解析が今後の課題である。

103, 1060 (1988 )12) N. Vsantha, L. D. Thompson, C. Rhodes, C. Banner,

本研究を実施するに当たり、キネマの菌株を分譲、併せて、ご指導ご助言していただいた農林水産省食品総合研究所新国浩一微生物研究室長に感謝いたします。

J.Nagle,andD.Filpula: J.Bactriol., 159 , 811(1984)
13) M.Jacobs,M.Eliasson,M.Uhlen,andJ.-I.Flock,Nucl.Acid.Res. , 13, 8913 (1985)