博 士 （医 学 ）山 本

聡

学 位論 文 題名
ドナー由 来TNF‑aによるThl依存的GVHD
エフェクター細胞誘導抑制機構の解明
学位論文内容の要旨
同種造血幹細胞移植は造血器悪性腫瘍や造血不全などの患者に対し有効な根治的治療法のーつである．近年、様々な支持療法の発達により，移植成績は徐々に改善しているが，Graft−versus
一hostdisease（以下GVHDと略す）は依然として移植後の死亡の主因のーつと なってい る．強カ なGV
H反応はMajor
ある いはMinor抗原の 相違を認識した活性化ドナー細胞により引き起こされる．しかしながらサイトカイン調節機構の破綻や，移植前処置による宿主の臓器障害もまたG
VH反応の誘導の増強に関与している．ことが示されている，
な かでもtumor necrosis factorQ（以下 TNF‑aと 略す）は GVHDの病態に深く関与していることが理解されてきている．すなわちTN
F‑aは宿主の臓器に対する直接傷害に加えMaiorhistocompatible（以下MHCと略す）抗原や接着分子の発現を増強する，さらにTN
F‑aはオー トクリシ T
細胞 増殖促 進因子と しても働きうるため，T細胞ク口ーンの増殖が促進される，，またマウスモデルにおいては，抗TNF‑a抗体はGVHDの重症度を低下させることが知られ ている．過去の報告では，ホストのp55T
N
F‑a受容体は早期のGVHDを制御しているとされ ており，またドナーのp55
TN
F‑a受容体はア口抗原反応性T細胞活性化に重要な役割を果た していることも報告されている．以上のことよルホスト由来のTNF‑aはア口抗原に対するT細胞 応答及び急性GVH
Dの重症度を増悪させる働きを有すると考えられる．一方，ドナー 由来のTNF‑aがどのような役割を果たしているかは未だ明確にされていなかった，本研
究 において，私はGV
H
Dマウスモデルを用いてinvivoでのアロ抗原に対するT細胞応答に
お い て ， ド ナ ー 由 来 の TNF‑aが い か な る 役 割 を 果 た し て い る か を 検 討 し た ，
1．ドナー細胞の生着． B
6xDBI
V2Fl（以下BDF1と略す）マウスにC
57B
L/6（以下B6と略す）
マ ウス脾細 胞を移入 するこ とによっ てGW
Dマウスを 作成し た．本GVH
Dマウスにおけるキメリズムをホスト由来のH−2Kd
ハプ口夕イプをマーカーとしてフ口ーサイトメトリーで検討した．したがって，H−2Kd陽性細胞はホスト由来であり，H―2Kd陰性細胞はドナー由来を意 味する， その結果 ，急性 GVH
D誘導2週後に は野生型 B6マウス およびTN
F‑aノッ クアウ
トB
6マウスの 脾細胞 を移入さ れたホス トいず れにおい ても脾腫とドナーT細胞比率の増加 が見られたが、TN
F‑aノックアウトB
6細胞を移入されたホストの脾細胞中のB220陽性細胞 は，野生型B6をドナーとしたホストと比較し早期に減少していた．またCD4陽性細胞やCD8陽性細 胞はTN
F‑aノック アウトB6をドナー とした際 に，よ り早期の 増殖を 認めた．
2．ホス ト細胞に 対する 細胞傷害 性T細胞の誘導，増殖した細胞のホストに対する特異的な 細胞傷害 活性を測 定した ．TNF
‑aノ ックア ウトB6をド ナーとしたホストは，野生型B6をドナーとした群に比ベH―2Kd
抗原に対する細胞傷害性をより強く有していた．また全てのホストにおいてドナー型であるH―2Kbに対する細胞傷害性の増強は認めなかった．CD
8陽性T細胞 分画を分離し測定ところ，ホストに対する細胞傷害活性は濃縮され，ホストに対す る 特 異 的 な 細 胞 傷 害 活 性 は 主 に CD8陽 性 T細 胞 に よ る も の と 考 え ら れ た ，― 397―

3． GVHD
マウ スにおける血清I
FN‑yレベル．これまでの報告ではIFN‑yなどのT
hlサイト
カイ ン は，急 性GV
HDの誘 導に重要 な役割 を果たし ている と考えら れてい るるため それぞれのホス卜における血清I
FN―Yを測定した．G
VHD
マウスにおいてはday4にはIFN一Yの上昇を認め，day6にヒ゜―クを示した．特にTN
F‑aノックアウトをドナーにした群では，野生型
B6をドナーとした群に比し有意に高いI
FN‑yの上昇を認めた．またIF
N
IYノックアウトをドナーとしたホストや対照群では血清IFN‑yの上昇は認めなかった．血清中に上昇したIFN‑yがいかなる細胞から産生されているかを検討するため，ホスト脾細胞の細胞内サイトカイン産生能 を検討 した．野生型B6をドナーとした群に比べ，TNF‑aノックアウトをドナーとした群で I
FN‑rr産生を 伴うCD
4および C
D8の増 加を認 め、特に CD8で 顕著でであった．これらの結 果より 血清IF
N‑yの上昇 は主にドナー由来CD8に由来し，それに付随して活性化さ れ た ホ ス ト T細 胞 に も IFN‑yの 産 生 が 認 め ら れ る こ と が 示 さ れ た ，
4．工 ンドト キシン投 与に対す る血清 T
NF‑aの上昇．GVHD
マウスにおけるエンドトキシンに対する 感受性 を検討す るため ，GVHDを誘導したホストに対しLPSを投与し，TNF‑aの産生能を検 討した ，正常コ ント口 ールマウ スに1 0VgのLPSを投与し ても，血清中のTN
F‑aは測定感 度以下 であった ．LPSを投与し ない場合 ，野生 型B6および TN
F‑aノックアウト
B
6いずれを ドナー にしたホ ストに おいても ，移植 後6日 後，8日後の血清中のTNF‑aは測定感度以 下であ ったが， 移植後 10日後にLPSを投与することにより，著明なTNF‑aの上昇が起こっ た．特 筆すべきことに，この現象はむしろTNF‑aノックアウトB6をドナーとした群に顕著に見られた，これらの結果からTNFーaノックアウトB
6をドナーとしたホストにおいてはエ ンドト キシンに対するの感受性の亢進がみられ，その際増強するTN
F‑a産生はホ´ストの残存細胞に由来していると考えられた．
5． TNF‑aノックア ウトド ナーによ るGVH
反 応増強 のIFN‑y依 存性，IFN
7はGVH
Dの誘導における ア口抗 原反応性T細胞の活性化に重要な役割を有することが報告されているが，我々はTN
F‑aノッ クアウト をドナ ーにすることにより惹起されるGV
H
反応の増強が，ドナーのI
FN―Yに依存性であるかを検討した，野生型B
6及びTN
F‑aノックアウトB6に加えTN
F‑a，
IF
N‑yの両者を欠損するダプルノックアウトマウスを作成し，これをドナーとして用いた．
このダブ ルノッ クアウトマウスをドナーとして用いた場合には移植後7日目に見られたホストの血 清中の I
FN−Yの上昇 や10日目 にLPSを投与した際のTNF‑aの上昇はほとんど見られなかった，次に，CT
L誘導におけるドナー由来のIFN‑yの役割を検討するためH―2がホストタイプ である P
815に対する細胞障害性を検討した，移植後7日目にホストの脾細胞を採取し，BDF1脾細胞と共培養を行ったところ培養上清中のIFN‑Yレベルは野生型B6をドナーとした群 に比ベ ，TNF‑aノックアウトB6をドナーとした群において著しい上昇を認め（結果は 示 さず） ，共培 養4日 後のP815
細 胞に対す る細胞 傷害活性 もTNF‑aノックア ウトB6をドナーとした群で増強していた．しかしTN
F‑a，IFN一Y
両者を欠損したダブルノックアウ
トB6をドナ ーとし て用いた 群では ，培養上清中のIFN‑yの上昇は検出されず，TNF‑aノッ
クアウト B
6をドナ ーとした 群に見 られたP815細胞に対する細胞傷害活性の著明な上昇もダブルノックアウトをドナーとした群では低下していた．
以上のように、本研究において私は、親系マウス脾細胞をFlマウスに移入する急性GVHD
マウスモ デルを 用いて，TN
F‑a
ノックアウトドナー細胞は，移植後早期のThl依存性のCTLの誘導を 促進す ること， すなわ ちドナー 由来のT
NF
‑aは急性GVH反応に対し抑制的に働きうることをはじめて示した，これらの知見により同種造血細胞移植の際のGVH
Dの危険因子を持つ症例の同定において，ドナーのサイトカイン産生に着目した異なったアプ口ーチが考慮されうるという点で重要な新知見であると考えられた．

― 398 ‑

学 位論文審査の要旨
主 査 教授 小池隆 夫
副査 教授 小野江和則
副 査 教授 西村孝 司

学 位 論 文 題 名ド ナ ー 由 来 TNF‑cvに よ る
Thl依 存 的GVHDエ フ ェク タ ー 細胞 誘 導 抑制 機 構 の解 明
急 性 GVHDの 発 症 要 因 の ひ と つ に 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン が 深 く 関 与 し て いる こ とが 知 ら れ て お り 、 中 で も レ シ ピ ェ ン ト 由 来 の TNF‑aは 移 植 前 処 置 に 関 連 し て 産
生 さ れ 、 ア □ 抗 原 反 応 性 T細 胞 の 誘 導 の 増 強 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ とが 、 明 ら か に さ れ て き て い る 。 し か し 、 ド ナ ー 由 来 の TNFー aの 役 割 に 関 して はこ れ まで 明 確 にさ れ て いな い 。 本研 究 で は、 TNF‑
a− ／ −マ ウ ス をド ナーに 用いた
急 性 GVHDマ ウ ス モ デ ル に お い て ド ナ ー 由 来 の TNF‑aが GVHDエ フ ェ ク タ ー 細 胞
誘 導 に お い て い か な る 役割 を 果 たし て い るか を 明 らか に す るこ と を 目的 と し た 。
対 象 と 方 法 と し て は 、 野 生 型 お よ び TNF‑a+C57BL/6マ ウ ス の 脾 細 胞 5x107
個 を BDF1マ ウ ス に 尾 静 注 す る こ と に よ り 誘 導 し、 比 較 検討 し た 。そ の 結 果 TNFーa v‑B6を ド ナ ー に 用 い た レ シ ピ ェ ン ト で は 移 植 後 14日 後 に は 野 生 型 B6を ドナー としたレシ ピェント と比較し 早期の脾 細胞の減 少を認め 、レシピェントタ
イ プ の P815に 対 す る 細 胞 障 害 性 も 増 強 し て い た 。 移 植 後 早 期 の レ シ ピ ェ ント の血 清 IFN‑ア は TNF‑ aI/IB6を ド ナ ー と し た レシ ピ ェ ント で 著 明 な上 昇 を 認め 、 その 産 生 細 胞 は 主 に ド ナ ー 由 来 の CD8陽 性 T細 胞 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。
ま た LPS刺 激 に 対 す る レ シ ピ ェ ン 卜 の TNF― a産 生 能 は TNF― aナ B6を ド ナ ー と した レ シ ピ ェ ン ト に お い て む し ろ 著 明 に 亢 進 し て い た。 さ ら にTNF―aと IFNーアのダ ブ ル ノ ッ ク ア ウ 卜 B6を ド ナ ー に 用 い る と TNFー a/B6を 用 い た 際 に 認 め ら れた 血 清 IFN― ア の 上 昇 、 お よ び LPS刺 激 に 対 す る レ シ ピ エ ン ト の TNF− a産 生 能の増 強 は い ず れ も 著 明 に 低 下 し た 。 ま た 移 植 後 7日 後 の レ シ ピ ェ ン ト 脾 細 胞 をBDF1脾 細 胞 と り ン バ 球 混 合 培 養 を 行 い 再 刺 激 し た 後 、 レ シ ピ ェ ン ト タ イ プ のP815に 対 す る 細 胞 障害 性 を 検討 し た 結果 、 TN
F― a・/Iを ドナ ー に し たレ シ ピ ェントの 脾細胞では 細胞障害 性の増強 が認めら れたが、 ダブルノ ックアウ卜をドナー と し た レ シ ピ ェ ン ト で は 野 生 型 B6を ド ナ ー と し た 場 合 に 比 べ て も 細 胞 障 害性 は 低 下 し て い た 。 以 上 よ り 本 論 文 に お い て 、 ド ナ ー 由 来 の TNF− aの 欠 損が ドナ ー 由 来 の IFN― ア の 産 生 を 増 強 す る こ と に よ り GVH反 応 を 増 強 し て い るこ と から 、 ド ナ ー 由 来 の TNF― aは ド ナ ー の IFN― アの 産 生 を制 御 す るこ と を 介 して GVH
Dエ フ ェ ク タ ー 細 胞 誘 導 に 対 し む し ろ 抑制 的 に働 い て いる こ とが 示 さ れた 。
ー 399 ‑

質疑応答においては副査小野江教授から、LPS刺激をしない際のレシピェン
トのTNF‑aレベルについて、ドナー由来およびホスト由来TNF‑aの働きが異なる理由、さらにホストのTNF‑aはどのような細胞群より産生されているか、およびNK細胞がどのような関与を有しているかにっき質問があった。次いで小池
主査より今回の実験系が使用する種により違いがあるかにっき、ドナー由来のTNF‑Qの役割とレシピェント由来のTNF‑aの役割が相反する理由、さらにドナーにLPS刺激をした際の反応および本研究の成果による臨床応用への可能性にっき質問があった。次いで西村副査よりTNF‑aを用いたGVHDの制御および予測における方向性と今後の展望についての質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は概ね適切に回答した。
本論文における検討から、今後はドナーのTNF‑aの産生能に基づいた急性GVHDの予測における臨床応用や、ドナーのTNF‑a産生能がGVHDの発症に与える新たな作用の解明が期待される。
審査委員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。