カラマツ類の枝樹皮組織における二次代謝物の集積（北林産試）○関

1.

一人、折橋健緒言
樹皮の基本的機能のひとつとして、病原菌、植食性昆虫および哺乳類などの外敵に対して、樹木自身を物理的および化学的に防御することが知られている 1) 。一般的に成熟した樹皮組織は、外側に死滅組織であるリチドーム、内側に生組織である二次師部からなる。マツ科樹種は、樹皮の二次師部においてテルペノイドやフラボノイドなどの二次代謝物を生合成して 2) 、外敵に対して自らを恒常的に化学的防御する 3) 。これに対して、コルク層に被覆されているリチドームは専ら物理的防御を担当すると考えられてきたが 1) 、ごく最近、カラマツ類のグイマツ（Larix gmelinii var. japonica）の枝樹皮において、リチドームの形成機構によりジテルペノイドを最外側のリチドームに配置し、より強固な化学的防御を形成することが示唆されている 4) 。しかし、グイマツ以外の樹種や他の二次代謝物の樹皮における集積状況はいまだ把握されていない。
サハリンやクリル諸島南部から北海道へ導入された北方系カラマツ類であるグイマツは、本州中央部から導入されたカラマツ（L. kaempferi）と比較して、野ネズミによる樹皮食害に対して高い抵抗性が認められるとともに、樹皮の化学的防御との関連性が多数の先行研究 5, 6) で示唆されてきた。
一方、カラマツ類は容易に種間雑種を形成する特徴があることから、林木育種により両樹種から初期成長性、材質、野ネズミ食害抵抗性、炭素固定能などの点で優れた形質を受け継いだグイマツ雑種 F 1（♀グイマツ×♂カラマツ、以下 F 1 という）が創出されてきた 7) 。近年、F 1 の道内の年間造林面積は 500 ha 以上 8) と年々増加してきており、将来的な主力造林樹種として期待されている。
そこで本研究では、樹木の化学的性質を利用した新たな林木育種開発に関する基礎的情報の取得に向けて、カラマツ類のグイマツ、カラマツ、F 1 の枝樹皮組織における主要テルペノイドやフラボノイドの組成および集積分布について比較検討するとともに、その分布と生合成、樹皮形成との関係について考察した。
2.

実験方法

2.1

リチドームおよび二次師部における主要テルペノイドの定量

北海道立総合研究機構

林業試験場

道東支場（新得町）において、グイマツ、カラマツ、F 1 の各 12 個体（30 年生）より、リチドームの発達した生枝（地上高約 8m、枝齢 10～15 年、直径 3～5cm）を採取し、直ちに － 20℃の冷凍庫に保存して実験に供した。
枝の樹幹側の部位において、最内側の周皮を境にしてリチドームと二次師部を正確に分離した。
得られたリチドームと二次師部をそれぞれ液体窒素存在下で粉砕した。10ml 容スクリューキャップ付き遠沈管において、200mg の各樹皮粉砕物を、内部標準物質として 200mg/ml の n-tridecane を含有する 4ml 酢酸エチルで超音波洗浄機を用いて 10℃以下で 1 時間抽出したのち、遠心分離した。抽出液は硫酸ナトリウムで 24 時間脱水したのち、ガスクロマト質量分析計（GC-MS）およびガスクロマトグラフィー（GC-FID）を用いて、モノ-およびセスキテルペノイドを市販標準物質または MS
スペクトルデータベースと比較することにより同定したのち定量し、乾燥試料中における含有量を算出した。
10ml 容遠沈管において、200mg の各樹皮粉砕物を、内部標準物質として 200μg/ml の heptadecanoic

acid を含む 4mL の石油エーテル－ジエチルエーテル（1:1, v/v）で超音波洗浄機を用いて 10℃以下で 1 時間抽出したのち、遠心分離した。得られた上清は窒素気流下で乾燥させたのちジアゾメタン含有ジエチルエーテルを添加してメチル化を図った。メチル化試料は GC-MS および GC-FID 分析に供し、8 種のジテルペノイド 3) を標準物質として、乾燥試料中における含有量を算出した。
2.2

リチドームおよび二次師部におけるフェノール性成分および主要フラボノイドの定量

2.1 の試料を凍結乾燥したのち、10mL 容遠沈管において、100mg の粉砕物を 4mL のメタノールで超音波洗浄機を用いて 10℃以下で 1 時間抽出したのち、遠心分離した。(+)-catechin を標準物質として Folin-Ciocalteu 法および DMACA 法を用いて、得られた上清のそれぞれ総フェノールおよび総フラバノールを分析した。また、内部標準物質として 500μg/ml の phtalic acid を含む前記同様のメタノール抽出液を調製し、高速クロマトグラフィー（HPLC）とフラボノイド標準品を用いて、抽出液中のフラボノイドを同定・定量した。
3.

結果と考察
3 樹種の二次師部およびリチドームの樹皮組織の各抽出物から、いずれも 17 種のモノテルペノイド、9 種のセスキテルペノイド、8 種のジテルペノイドが同定された。テルペノイドの総量は、両樹皮 組 織 と も に グ イ マ ツ >F 1 >>カ ラ マ ツ の 順 に 高 か っ た 。 グ イ マ ツ に お い て モ ノ テ ル ペ ノ イ ド で は3-carene、ジテルペノイドでは larixol が最多の化合物であり、同様にカラマツではそれぞれα-pinene、abietic acid が最多の化合物であった。F 1 ではグイマツとカラマツの主要テルペノイドの量的組成の中庸よりややグイマツよりの傾向を示した。また、3 樹種ともに、主要テルペノイドの相対比は両樹皮組織で近似していたが、その含有量はリチドームの方が二次師部と比較して高かった（Figure 1）。
3 樹 種 の 樹 皮 の 各 抽 出 物 か ら 、 い ず れ も 3 種 の flavan-3-ol 型 の フ ラ ボ ノ イ ド （ (+)-catechn、(–)-epicatechin、 (–)-epiafzelechin） が 同定 さ れ た 。総 フ ェ ノ ール 量 、 総 フラ バ ノ ー ル量 、 (+)-catechnおよび(–)-epicatechin 量は、カラマツ＞F 1 ＞グイマツの順に高い傾向を示した。また、3 樹種ともに、総フェノール量、総フラバノール量、(+)-catechn および(–)-epicatechin 量は、二次師部の方がリチドームと比較して高かった（Figure 2）。
一般にマツ科樹種の樹皮において、テルペノイドは二次師部のより細胞活性の高い内側（conducting phloem） に存在するエピセリウム細胞において生合成されたのち、他の化合物群にほと ん ど 再 合 成 さ れ る こ と な く 9) 、 そ れ ら を 主 要 成 分 と す る オ レ オ レ ジ ン と し て 二 次 師 部 の 外 側（non-conducting phloem） で 肥大 化傾向 の高 い水平 樹脂 道や樹 脂嚢 などの 内分 泌構造 に集 積される2)。カラマツ類の樹皮はリチドームの形態から“うろこ状樹皮”に分類されている 1, 2) 。グイマツでは主要ジテルペノイドのリチドームへの偏在性が認められており、二次師部の外側からのリチドームの形成機構に起因することが示唆されている 4) 。したがって、カラマツや F 1 におけるテルペノイドのリチドームにおける偏在性は、同属であるグイマツと同様にリチドームの形成機構によることが推定された。
フラボノイドは生組織において生合成されたのち、さらに多種多様な配糖体や縮合型タンニンに再合成される 10) 。カラマツ類 3 樹種では、二次師部の内側の柔細胞で生合成された 3 種のフラボノイドが、さらに配糖体、プロシアニジン、縮合型タンニンなどに再合成されたのち、リチドームに取り込まれる二次師部の外側ではなく、内側にその多くが集積していることが推定された。
これまでに、カラマツ類の雑種 F 1 における葉のモノテルペノイド 11) および樹皮のジテルペノイド5)は、両親種から量的遺伝を受けることが認められている。今回検討した F 1 の樹皮における総フェノール量、総フラバノール量、フラボノイド量も両親種から量的遺伝を受ける可能性のあることがmg/g bark tissue

示唆された。

3-Carene

5α-Pinene

5Larixol

544443333222211110000Lg

F1LkLgF1LkLg

F1Abietic acid

5Lk

Lg

F1Lk

Larix species
Figure 1. Contents of the constitutive mono- and diterpenoids in the rhytidome and secondary phloem in thebranch bark of Larix species: Lg, Larix gmelinii var. japonica; F1, hybrid larch F 1 (L. gmelinii var. japonica ×mg/g bark tissue

L. kaempferi); Lk, L. kaempferi.
n = 12, based on the dry weight of the bark tissues:200(+)-Catechin

200, rhytidome;(-)-Epicatechin

200, secondary phloem

Total flavanols

200150150150150

1001001001005050505000Lg

F1

Lk0Lg

F1

Lk

Total phenols

0Lg

F1

LkLg

F1

Lk

Larix species
Figure 2. Contents of (+)-catechin, (-)-epicatechin, and total phenols and flavanols, in the rhytidome andsecondary phloem in the branch bark of Larix species: Lg, Larix gmelinii var. japonica; F1, hybrid larch F 1 ; (L.
gmelinii var. japonica × L . kaempferi); Lk, L. kaempferi.
n = 12, based on the dry weight of the bark tissues:, rhytidome;, secondary phloem

参考文献
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japonica ×L. kaempferi and their parent trees. J Wood Sci 55: 32–40.
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謝辞
本研究の一部は、科学研究費補助金（課題番号 20580166, 25450221）の助成を受けて実施された。