博 士 （ 医 学 ） 三 栖賢 次 郎
学位論 文題名
Cdc50p， aconserved endosomal membrane protein，
controls polarized growth in Sacchar07nyces cerevisi匸 た(endosomeに存在し、保存されている蛋白質であるC
dc50pは出芽酵母Saccharomycescere'vzsz
aeの極性成長を制御する）

学位論文内容の要旨
緒言
生物の初期発生から形態形成時において個々の細胞は極性を有し、様々な組織や器官を形成する。また体細胞においても極性は存在し、神経や上皮系の細胞はその典型で、癌細胞では細胞極性の乱れが顕著に認められる。細胞極性の確立は、細胞表面のある部分が特徴的な役割を持ち始める一連の流れの始まりと言える。このような細胞極性、すなわち非対称的な細胞骨格構造、細胞内輸送、生態膜構造などは、特徴的な極性を持つactin細胞骨格系に制御されている。
本研究で用いられた出芽酵母Saccharomyce
sce
rev
isi
aeは細胞および細胞骨格系の制御を研究するためには非常に優れたモデル生物である。S
accharomycescerevisi
aeは細胞壁が局所的に伸展した結果である出芽によって成長し、この出芽は極性を有する細胞内輸送によって成り立っている。このような細胞内輸送に関連して、細胞が成長する際にactinは2つの形態をとり、actinp
atchおよびactinc
ableといわれる。出芽の際にはactinp
atchとactinc
ableは芽の先端に局在し、芽を長軸方向に極性を持って伸ばす役割を持つ。
出芽の開始はR
hofamilysmallG′I、PaseであるC
dc42pや、Cdc42pのguaninenucleotideexchangefactorであるCdc24pの活性化によるものであり、さらに下流の複雑に絡み合った様々な蛋白質へのシグナルを介して極性が制御される。このような細胞極性を制御する蛋白質の多くは、それ自身も芽の先端やcytokinesisの部位などに極性を持って存在する。しかし、これらの蛋白質がどのような仕組みで極性 を持 っよ うにな って いる のか にっ いて は、 ごく 一部 のも のを 除い ては不 明で ある。
本論文では細胞周期に関する変異体として発見されたC
DC50遺伝子にっいて、細胞極性の面から機能解析した。cdc50変異体は低温では小さな芽を出した状態で成長が停止し、actinp
atchの極性は消失する。さらに極性をもっ はずのBnilpやGiclpも通常とは異なる位置に存在する。我々の実験結果から
Cdc50pは細胞極性を制御する新しい蛋白質であることが示唆された。
実験結果
MY03とMY05は 出芽 酵母 Sa
ccharomyces cerev
isiaeの typeI
myosinをコードしている。コードされたそれぞれの蛋白 質My03pとMy05pはact
in patchの形成を制御している。本実験では、M
y05pの温度感受性変異体であるmy03my05―360株を用いて、その温度感受性を抑圧する遺伝子を検索した
結 果、 8種 類の 遺 伝子 を認 めた 。そ の1っが CDC
50であ る。 CDC50は391アミノ酸からなる蛋白質(Cdc50p)をコードしており、分裂酵母、線虫、ショウジョウパェ、ヒトまでホモ口グを持ち、種を越え て 保 存 さ れ て い る 。 ま た 、 ア ミ ノ 酸 配 列 か ら は 膜 蛋 白 質 で あ ると 予 想 さ れ た 。
我々 はCDC50遺 伝子 の欠 損株 (cdc50株）を作製し、Cdc50pの機能を解析した。cdc50株は18℃の低温において小さな芽を出した状態で成長を止めた。また、野生株では楕円形に近い形態であるが、cdc50株はやや円形に近い形であった。成長を停止した状態のcdc50株で、本来極性をもっはずのactinとmyosiri(My05p)は極 性を失い、細胞全体に散在していた。その他、Bnilp、Giclpなどは極性を失いながら、それぞれ 特徴的な構造をなしていた。cdc50株が極性成長を失った原因として、その― 457 ‑regulatorが 適当な 位置に存 在でき ないこ とにあ ると示 唆され た。
Cdc50pは 膜蛋白質 である ことが 予想さ れてい たが、 実際に 細胞内 の局在を 探索し た。螢 光染料を用いた 形 態 学 的 な 観 察 で は Cdc50pは lateendosomalノ prevacuolarcompartmentに 存 在 する と 考 え られた。 さらに生 化学的 な分析 を加え た。ま ず、界 面活性 剤を用 いた可溶性から、アミ・/酸配列で予想された通 り、膜蛋 白質で あるこ とが証 明され た。続 いて、 sucroseによる 濃度勾配沈降によっていずれの細胞内 小 器 官 と 同 じ 動 向 を 示す の か を 調べ た と こ ろ、 endosomal/prevacuolarcompartmentの markerと同じ 挙動を示 した。
Cdc50pが endosomal compartmentに 局在 し て い るこ と は 、 vacuole（ 液 胞 ） の機 能 に も 関わ っ ている と予想さ れた。 野生株 におい てはvacuoleは小さ なもの が集合し 、一つの大きなものを形成するが、cdc50株 で は 、小さ なもの が散在 してい るのみで あった 。機能 的な差 異にっ いて実 験した ところ 、ともに内 部は酸性 であり 、形態 学的な 違いの みであると考えられた。v
acuoleが断片化する変異体とレてはvpsmutantが知 ら れ て いる が 、 cdc50株 も vps mutantに属 す る も のか 実 験 し た。 そ の 結 果、 cdc50株は 小胞 体か ら ゴ ル ジ体 、 さ ら にゴ ル ジ 体 から vacuoleへ の 輸 送が 若 干 遅 くな っ て い るも の の、 従来の vps
mutantに当 てはま らない 特殊な 変異体 である ことが 判明した 。
cdc50株 の構 造 に さ らに 迫 る た めに 、電 子顕微 鏡で観 察した 。cdc50株は 低温で 小胞が 集族し 、異常に 大き な 膜 様構 造物が 認めら れた。 これら はcdc50株に 特徴的 であり 、野生 株には ほとん ど見ら れなかっ た。 そ の 正体 は突き 止める ことが できな かった が、お そらく微 分干渉 像(DIC)で 見られ た断片 化した
vacuoleを表 してい ると考 えてぃ ．る。
細 胞 表 面 のレ セ プ 夕 一な ど は endocytosisに よって 細胞内に 取り込 まれ、 vacuoleに運 ばれる ことによ って 分 解 され る。cdc50株にお いてこ の経路は どのよ うにな ってい るのか にっい ても調 べてみ た。まず 細胞 膜 を 染 料(FM4―64)で 染 め た後 に培 養する ことで 、endosytosisが 形態学 的にど のよう に変化す
る のか 観 察 した 。低温 下での cdc50株で はinternalizeさ れるも のの、 vacuoleは形成 せず、 断片化 してい た。 さ ら に 細胞 表 面 の レセ プ 夕 一 をmarkerと し て 分解 さ れ る速度 を測定 したが 、cdc50株で は低下
し て い た 。 す な わ ち 、 Cdc50pは internalization後 の 経 路 に 関 与 し て い る と 考 え ら れ た 。
考察本 実 験で は 種 を 越え て 保 存 され て いる膜 蛋白質 である Cdc50pを、細 胞極性 と膜輸 送とい う両面 から
解 析 し た 。 生 化 学 的実 験 より 膜 蛋 白質 で ある こ と を明 ら か にし 、 さら に そ の局 在 はendosomal/prevacuolar compartmentで あ る こ と が 判 明 し た 。 当 初 、 CDC50遺 伝 子 は MY05変 異 体の 抑圧遺 伝子と して得 られた もので あったが 、その 一部の 機能の み抑圧することができる。また、cdc50
株 で は actin細 胞 骨 格系 に 異 常 をき た している 。っま り、CDC50遺伝子 は細胞 極性に関 与して いると 言え る 。 さ ら に cdc50株 で は細 胞 内 輸 送お よ び vacuoleの 形成 に も 異 常を 来 た す 。こ の よ う にCDC50遺伝 子 は 細 胞骨 格系、 細胞極 性とい う世界 と、細 胞内輸送 という 2つの世 界をっ なぐ新 しい遺 伝子で あると 言 え る 。こ のCDC50遺 伝子は 今回実験 に用い た出芽 酵母に とどま らず、 高等生 物であ るヒトま で保存
さ れてお り、今 後、ヒ トにお ける細 胞極性の 形成の 制御を 解明す る手が かりに なるも のと考えている。

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学 位論文審査の要旨
主 査 教 授 守 内 哲 也
副 査 教 授 田 中 一 馬
副 査 教 授 加 藤 紘 之

学位論文題名Cdc50p， aconserved endosomal membrane protein，
controlspo
larizedgrowthinS
acc
har07nycescerev
iside(endosomeに存在し、保存されている蛋白質であるCdc50pは出芽酵母Saccharomycesc
erev
zszaeの極性成長を制御する）

真 核生物で は個々 の細胞は 極性を有 し、様 々な組織 や器官 を形成す る。神 経や上皮 系の細胞は その典 型で、癌 細胞で は細胞極 性の乱 れが顕著 に認め られる。 このよう な細胞 極性、すなわ ち 非 対称 的 な 細胞 骨 格 構造 、細胞 内輸送 などは、 特徴的 な極性を 持つactin細胞骨 格系に制御さ れてしゝ る。
本 研 究で 用 い られ た 出 芽酵 母 Sa
ccharomyces cerev
isia
eは細胞 骨格系の 制御を研 究するには非常 に優れた モデル 生物であ る。S． cerev
isiaeは細胞壁が局所的に伸展した結果である
出芽 によっ て成長し 、この 出芽は極 性を有 する細胞 内輸送 によって 成り立っ ている 。出芽の際 に actinは 芽 の 先 端 に 局 在 し 、 芽 を 長 軸 方 向 に 極 性 を 持 っ て 伸 ば す 役 割 を 持 つ 。
出 芽 の開 始 は R
ho family sm
all GTPaseで あ るCdc42pや 、Cdc42pの gu
anin
e nu
cleo
tidee
xcha
ngefact
orで ある Cdc
24pの 活性 化 に よる も の であ り 、 さら に 下 流の 複 雑 に絡 み 合った様 々な蛋 白質への シグナ ルを介し て極性 が制御さ れる。 このよう な細胞極 性を制 御する蛋白質 の 多 くは 、 そ れ自 身 も 芽の 先端や cytokinesisの 部位な どに極性 を持っ て存在す る。しかし 、これ らの蛋白 質がど のような 仕組み で極性を 持つよ うになっ ているの かにつ いては、ごく一部 のものを 除いて は不明で ある。
本 研 究で は 細 胞周 期 に 関す る 変 異体 と し て発 見 さ れ たCDC50遺 伝 子に つ い て、 細 胞極 性と膜 輸 送 の両 面 か ら機 能 解 析し た。cdc50
変異 体は低温 では小 さな芽を 出した 状態で成 長が停止 し 、 actinの 極 性 は消 失 し た。 さ ら に極 性 を も つべ き Bn
ilpやGicl
pも 通 常と は 異な る位置 に 存 在し た 。 これ ら の 研究 結 果 から Cdc
50pは 細胞 極 性と膜 輸送を制 御する 新しい蛋 白質である ことが示 唆され た。
MY03と MY05は 出 芽 酵 母 S． cerevisiaeの typeImyosinを コ ー ド し て し ゝ る。 コ ー ドされ たそ れ ぞ れの 蛋 白 質My03
pと My05pはactinpat
chの 形成 を 制 御し て い る。 本 実験 では、
My05pの 温 度 感 受 性 変 異 体 で あ る my03 my05― 360株 を 用い て 、 その 温 度 感 受性 を 抑 圧する 遺 伝 子 を 検 索 し た 結 果 、 8種 類 の 遺 伝 子 を 認 め た 。 そ の 1っ が CDC50で あ る 。 CDC50は
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1ア ミ ノ酸 か ら なる 蛋 白質 (Cdc50p)をコー ドして おり、ヒ トまで保 存され ている。 また、ア ミノ 酸 配 列か ら は 膜蛋 白 質 であ る と 予想 さ れ た。
ま ず CDC50遺 伝 子 の 欠 損 株 (cdc50株 ） を 作 製 し 、 Cdc50pの 機 能 を 解 析 し た 。 cdc50− 459―

株は18℃の低温において小さな芽を出した状態で成長を止めた。また、野生株では楕円形に近い形態であるが、cdc50株はやや円形に近い形であった。成長を停止した状態のcdc50株で、本来極性をもっはずのactinとJ:nyosiri(My05p)は極性を失い、細胞全体に散在していた。その他、Bnilp、Giclpなどは極性を失いながら、それぞれ特徴的な構造をなしていた。cdc50株が極性成長を失った原因として、そのregulatorが適当な位置に存在できないことにあると示唆された。
Cdc50pは膜蛋白質であることが予想されていたが、実際に細胞内の局在を探索した。螢
光染料を用いた形態学的な観察ではCdc50pはlate endosomal/prevacu
olarcom
partm
entに存在すると考えられた。さらに生化学的な分析では、まず、界面活性剤を用いた可溶性から、膜蛋白質であることが証明された。続いて、sucroseによる濃度勾配沈降によっていずれ の 細 胞 内 小 器 官 と同 じ 動 向 を 示 す の かを 調ぺ たと ころ 、endosomal/prevacuolar
compartmentのmarkerと同じ挙動を示した。
Cdc50pがendosomal compartmentに局在していることは、vacuole（液胞）の機能にも関わっていると予想された。野生株においてvacuoleはーつの大きなものを形成するが、cdc50株では、小さな小胞が散在しているのみであった。機能的な差異について実験したと
こ ろ 、 と も に 内 部 は 酸 性 で あ Iり 、 形 態 学 的 な 違 い の み で あ る と 考 え ら れ た 。
cdc50株をさらに電子顕微鏡で観察した。cdc50株は低温で小胞が集蔟し、異常な膜様構造物も認められた。これらはcdc50株に特徴的であり、野生株にはほとんど見られなかった。
その正体は突き止めることができなかったが、おそらく微分干渉像(DIC)で見られた小胞を表していると考えられる。
cdc50株におけるendocytosisの経路も追跡した。低温下でのcdc50株では、細胞膜を染料(FM4ー64)で染めると、internalizeされるものの、vacuoleは形成せず、断片化していた 。 す な わ ち 、 Cdc50pは internalization後 の経 路に 関与 して いる と考 えら れた 。
本研究では種を越えて保存されている膜蛋白質であるCdc50pを、細胞極性と膜輸送という両面から解析した。生化学的実験より膜蛋白質であることを明らかにし、さらにその局在はendosomal/prevacuolar compartmentであることが判明した。また、cdc50株ではactin
細胞骨格系に異常をきたしている。っまり、CDC50遺伝子は細胞極性に関与していると言える。さらにcdc50株では細胞内輸送およびvacuoleの形成にも異常を来たす。このようにCDC50遺伝子は細胞骨格系、細胞極性という領域と、細胞内輸送という2つの領域をっなぐ新しい遺伝子であると言える。このCDC50遺伝子は今回実験に用いた出芽酵母にとどまらず、高等生物であるヒトまで保存されており、今後、ヒトにおける細胞極性の形成の制御を解明する手がかりになるものと考えられる。
口頭発表において田中一馬教授より細胞極性と細胞内の膜輸送について両者の関係についての質問があった。っづぃて加藤紘之教授より臨床応用を考えた場合の機序についての質問があった。また守内哲也教授よりCDC50蛋白質における膜の内外の構造に関する質問があったが、いずれの質問に対しても、申請者は誠意ある妥当な回答をし、発表の内容、主旨をよく理解していた。
細胞骨格系、細胞極性の制御と、細胞内輸送の制御という両面に関わる新しい遺伝子であるCDC50遺伝子の機能を解析した本研究の意義は大きく、審査員一同協議の結果、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ、申請者は博士（医学）の学位授与に値するものと判定した。

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