変形性関節症の病気進行予測と病態解明を目的としたプロテオーム解析
順天堂大学医学部整形外科
湯浅崇仁、末原義之、牧野祐司、金子和夫
湯浅崇仁、末原義之、牧野祐司、金子和夫
OA 関節にはしばしば炎症反応がみられ、はじめに局所での炎症や免疫反応が関節破壊に関超高齢社会となった日本において、関節与する可能性が示唆されている。このよ疾患は要支援の原因の第 1 位であり、運うに OA の病態は個人差が大きく多様で動器の健康寿命の延伸が喫緊の問題となあり、このことが OA の病態理解を一層困っている。変形性関節症（以下 OA）は本難としている。
邦で 800 万人以上の患者数が存在すると近年のプロテオーム解析の進歩により、されている。関節痛の原因である OA は関疾患関連タンパク質の解析が可能となり、節への負担が原因で起こる関節疾患で、がん研究にいては鑑別診断[5]、疾患予後軟骨の破壊および軟骨と骨の変形をきた
予測[6, 7, 8]、治療効果判定[9]が可能
し慢性の関節炎を伴う。変形性関節症がとなった。本研究ではプロテオーム解析進行し重症になると、関節の変形や運動により、変形性股関節症に特異的に発現時痛･可動域制限により起立や歩行に大きな影響を与えるため、生活の質（QOL） するタンパク質を網羅的に探索し、そのを著しく低下させる。OA は加齢や過度の 機能を解析することで病態解明・病期進行予測診断・治療に役立てることを目的
関節運動･遺伝的素因･外傷による関節不とする。
安定症･体重の増加によって（あるいは複合的な要因によって）発症すると考えら対象と方法れている。その病態として持続的な荷重、人工股関節全置換術を行った変形性股軟骨細胞基質の消失[1]、軟骨細胞のアポ関節症患者（OA）10 名および大腿骨頚部トーシスの亢進[2]、軟骨細胞のミトコン骨折で人工骨頭置換術を行った患者（Fx）
ドリア変性などが報告されている[3] が、10 名の大腿骨頭から採取した骨･軟骨をその原因は未だに解明されていない。
検体とした。ヒト標本の採取については
OA の進行は個人によって軟骨変性･消失
順天堂大学医学研究倫理委員会の承認との速度、軟骨下骨硬化の程度、骨棘の程被験者の同意を得た。そのうちそれぞれ度などが異なり、とくに軟骨下骨変化に8 検体をプロテオーム解析に使用した。
ついては軟骨変性に先立って起こるとす
残り 2 検体は検証用セットとして使用しる報告もあるが、現在は軟骨表面の破綻た。特異抗体を用いたウェスタンブロッが先行するという報告もある[4]。さらに
ト解析は 20 例全例で行った。患者データ
OA は軟骨組織に比較的限局した破壊と修は表 1 に示すとおりである。
復反応の蓄積であると考えられていたが、2

凍結検体を破砕し粉末状として lysis

で PRDX2 の発現を検討したところ OA 群とbuffer で処理し、遠心後の上清をタンパ

比 較 し て Fx 群 に お い て 有 意 に 高 い

ク解析に使用した。定量的なタンパク質（p<0.0001）ことが示された。2D-DIGE発現プロファイルを作成するためにタンによって測定された相対的なタンパク質パク質は Cy3,Cy5 で蛍光色素標識し、二量とウェスタンブロット解析の結果は変次 元 電 気 泳 動 （ 2D-DIGE: florescence

形性関節症の進行と緊密に関連していた

two-dimensionalgel（図３）。検証サンプル 4 検体（OA2 例、

electrophoresis, GE Healthcare 社）をFx2 例）を用いて SDS-PAGE/ウェスタンブ行った。蛍光二次元電気泳動で獲得したロット分析で PRDX2 の発現を確認したとイメージは、DeCyder (GE Healthcare 社)

ころ、Fx 群では発現が高く、OA 群では発の画像解析ソフトを使用し、各タンパク現を認めなかった(図 4)。年齢、性別、質スポットを発現量としてテキストファKL grade には PRDX2 の発現との間に有意イルに変換する。そのデータを cDNA マイな相関性を認めなかった。

difference

クロアレイのデータ解析と同様に、多変考察
量解析、機械学習法の手法でテータマイ
プロテオーム解析はゲノムの機能的なニングを行った。2 群間で統計学的に有意差を認める（Wilcoxon test, p<0.01） 翻訳であるプロテオームが直接細胞表現タンパク質スポットを確認し、検討項目 型を調節していることにより他の研究よりも利点があり、潜在的なバイオマーカごとに重要と判断されたタンパク質スポーを探索しやすい。本研究ではプロテオットについては、Finnigan ORBITRAP XLーム解析を用いて OA 関連タンパクの検質量分析計(Thermo Electron 社)にて対討を行った。その結果、15 遺伝子産物に応するタンパク質の同定を行った。統計一致する 32 種のタンパクを同定した。そ学的解析は Fisher’s exact test、カイれらには酸素/タンパク質結合、脂肪酸/2 乗検定を使用した。
アポリポ蛋白質結合、表皮/細胞骨格の構結果
造的成分および中間フィラメントに関与32 のタンパク質スポットが 2 群間で統するタンパク質、およびペルオキシダー計学的に有意差(p<0.01)を認めた。図１
ゼ活性に関与するタンパクを認めた。そは２D ゲルイメージでの 32 個のスポットの中で、PRDX2 が最も有意差が高く発現です。質量分析計のタンパク分析では、量の差を認めた。PRDX2 は細胞質に豊富15 の別個の遺伝子産物に 32 のタンパクに発現し、細胞の酸化還元調節を担って質スポットが相当したことを確認できたいる[10, 11]。PRDX2 は peroxiredoxin(図 2)。32 のタンパク質スポットのうちファミリーに属し、過酸化水素を減少さ2 つが PRDX2 に相当し、PRDX2 の発現レベせる抗酸化酵素の一つである。そのタンルは 2 群間での差が最も大きかった
パクは細胞を抗酸化作用から守る役割を（p=0.00016, fold difference=6.22）をしており、CD8 陽性 T 細胞では抗ウィル認めた。さらにウェスタンブロット解析
ス活性に関与していると考えられている。

3PRDX2 は抗酸化的役割と関連しており、謝辞正常な大腿骨頭でより発現が強かった。
本研究は、公益財団法人日本股関節研究
今回の結果から OA 進行と PRDX2 の関連は振興財団の研究助成をもとに行いました。
明らかとなったが、その役割や病態に関心より感謝いたします。
する機序は明らかでない。PRDX2 は OA と関節リウマチ(RA)の滑膜線維細胞に発現参考文献していることが報告されている[12]が、O

1.

A 進行との関連は検討されていない。PRD
X のアイソフォームに関しては、PRDX5 は正常軟骨細胞と比較して OA の軟骨細胞で強く発現していることが報告されている[13]。PRDX4 は OA と比較して RA の滑膜組織で強い発現を認めた[14]。PRDX6
2.
は OA の軟骨細胞で発現が低下していることが報告されている[15]。OA の原因はいまだ不明であるが、酸化ストレスは軟骨細胞の老化を誘導することが報告されており[16]、抗酸化作用に関連する酵素である PRDX が軟骨細胞の老化に関連して OA 発症に関与していることが示唆された。
3.
今回の解析で OA に強い発現をみとめたタンパクは、アポリポプロテイン A1(APOA1)、SEC13、脂肪酸結合蛋白質 4(FABP4)であった。APOA1 は HDL の主要タンパク

4.

成分として同定され、OA や RA 患者の血清で発現していることが確認されており[17, 18]、軟骨細胞データベース中のタンパク質の 1 つと報告されている。興味深いことに OA 患者の血清を用いた研究から脂質代謝異常と OA 進行の関連が指摘されている[19]。今後、関節軟骨基質
5.

分解や OA 進行過程における PRDX2 の解析と他の PRDX アイソフォーム、APOA1 などの関連について詳細な解析が必要である。

4

Yuasa T, Otani T, Koike T, Iwamoto M, and Enomoto-Iwamoto M. Wnt/β-catenin signaling stimulates
matrix catabolic genes and activ
ity in articular chondrocytes: its possible role in joint degeneration. Lab Invest. 88(3): 264-7
4, 2008.
Yuasa T, Kondo N, Yasuhara R, Sh
imono K, Mackem S, Pacifici M, I
wamoto M, and Enomoto-Iwamoto M.
Transient Activation of Wnt/β-C
atenin Signaling Induces Abnormal Growth Plate Closure and Articular Cartilage Thickening in Pos
tnatal Mice. Am J Pathology. 175(5): 1993-2003, 2009.
Aigner T and Richter W. Age-rela
ted OA- a concept emerging frominfancy? Nat Rev Rheumatol 8: 70-72,2012.
Yasuhara R, Ohta Y, Yuasa T, Kon
do N, Hoang T, Addya S, Fortina
P, Pacifici M, Iwamoto M, Enomot
o-Iwamoto M. Roles of β-cateninsignaling in phenotypic express
ion and proliferation of articul
ar cartilage superficial zone cells. Lab Invest. 91(12):1739-52,
2011.
Suehara Y, Kondo T, Fujii K, Hasegawa T, Kawai A, Seki K, Beppu
Y, Nishimura T, Kurosawa H, Hirohashi S. Proteomic signatures corresponding to histological clas
sification and grading of soft-t

issue sarcomas. Proteomics 2006; 11. Rhee SG, Kang SW, Chang TS, Jeon
6:4402-9.
g W, Kim K. Peroxiredoxin, a nov
6. Kikuta K, Tochigi N, Shimoda T,el family of peroxidases. IUBMBYabe H, Morioka H, Toyama Y, Hos
Life 2001;52:35-41.
ono A, Beppu Y, Kawai A, Hirohas 12. Bo GP, Zhou LN, He WF, Luo GX, Jhi S, Kondo T. Nucleophosmin asia XF, Gan CJ, Chen GX, Fang YF,
a candidate prognostic biomarker
Larsen PM, Wu J. Analyses of diof Ewing's sarcoma revealed byfferential proteome of human synproteomics. Clin Cancer Res 200
ovial fibroblasts obtained from9;15:2885-94.
arthritis. Clin Rheumatol 2009;2
7. Orimo T, Ojima H, Hiraoka N, Sai
8:191-9.
to S, Kosuge T, Kakisaka T, Yoko 13. Wang MX, Wei A, Yuan J, Tricketto H, Nakanishi K, Kamiyama T, To
A, Knoops B, Murrell GA. Expres
do S, Hirohashi S, Kondo T. Protsion andregulation of peroxiredo
eomic profiling reveals the prog
xin 5 in human osteoarthritis. F
nostic value of adenomatous poly
EBS Lett 2002;531:359-62
posis coli-end-binding protein 1 14. Chang X, Cui Y, Zong M, Zhao Y,
in hepatocellular carcinoma. He
Yan X, Chen Y, Han J. Identifica
patology 2008;48:1851-63.
tion of proteins with increased
8. Suehara Y, Kondo T, Seki K, Shib
expression in rheumatoid arthrit
ata T, Fujii K, Gotoh M, Hasegaw
is synovial tissues. J Rheumatola T,Shimada Y, Sasako M, Shimoda
2009;36:872-80.
T, Kurosawa H, Beppu Y, Kawai A, 15. Ikeda D, Ageta H, Tsuchida K, YaHirohashi S. Pfetin as a progno
mada H. iTRAQ-based proteomics rstic biomarker of gastrointestin
eveals novel biomarler of osteoa
al stromal tumors revealed by prrthritis. Biomarkers 2013 Augustoteomics. Clin Cancer Res 2008;112.
4:1707-17.
16. Brandl A, Hartmann A, Bechmann V,
9. Okano T, Kondo T, Fujii K, Nishi
Graf B, Nerlich M, Angele P. Oxmura T, Takano T, Ohe Y, Tsuta K,
idative stress induces senescenc
Matsuno Y, Gemma A, Kato H, Kude in chondrocytes. J Orthop Resoh S, Hirohashi S. Proteomic sig
2011:29:1114-20.
nature corresponding to the resp 17. Wu J, Liu W, Bemis A, Wang E, Qi
onse to gefitinib (Iressa, ZD183
u Y, Morris EA, Flannery CR, Yan9), an epidermal growth factor rg Z. Comparative proteomic chara
eceptor tyrosine kinase inhibito
cterization of articular cartila
r in lung adenocarcinoma. Clin Cge tissue from normal donors andancer Res 2007;13:799-805.
patients with osteoarthritis. A
10. Arner ES, Holmgren A. Physiologi
rthritis Rheum 2007;56:3675-84.
cal functions of thioredoxin and 18. Jmeian Y, El Rassi Z. Micro-highthioredoxin reductase. Eur J Bi-performance liquid chromatograp
ochem 2000;267:6102-9.
hy platform for the depletion of5high-abundance proteins and sub
sequent on-lineconcentration/cap
turing of medium and low-abundance proteins from serum. Applicat
ion to profiling of protein expr
ession in healthy and osteoarthr
itis sera by 2-D gelelectrophoresis. Electrophoresis 2008;29:280
1-11.
19. Castro-Perez JM, Kamphorst J, De

Groot J, Lasfeber F, Goshawk J,Yu K, Shockcor JP, Vreeken RJ, H
ankemeier T. Comprehensive LC?MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Ide
ntification in Osteoarthritis Patients. J Proteome Res 2010:9: 2377-89.

表１ 患者データ
OAFx

65.5 (52-85)

75.2 (60-98)

男01

女

109

X 線 KL grade 0010grade 4100

年齢
性別

図１ Cy3 ラベルされた対象サンプルの 2D ゲル・イメージ6

図 2 発現プロファイリングの解析結果

7

図 3 ウェスタンブロット解析による PRDX2 の発現
A

OA、Fx 検体における PRDX2 の発現

B

2 つのスポットでの PRDX2 発現の解析

8

図 4 検証検体における PRDX2 の発現9