神経糖鎖生物学研究室	  	  	  	  	  	  	  	  教授	  黒坂	  光	 	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  助教	  中山喜明	 	 	 １．研究概要	 

よびその分子の機能は全く理解されていない．我々は脳	  タンパク質への糖鎖の付加は，主要な翻訳後修飾反応におけるムチン型糖鎖の働きを調べるために，これらのの一つであり，付加された糖鎖は細胞間の接着や認識な分子の生化学的な特徴，さらに脳の発生・分化におけるどに重要な働きをする．糖鎖の構造は，糖とタンパク質役割を，培養細胞やゼブラフィッシュを用いて解析しての結合様式によっていくつかのタイプに分類されるが，きた．これまで，ゼブラフィッシュを用いた実験系では，

我々は N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)やマンノース

脳特異的な GalNAc-T9,	 GalNAc-T13，および WBSCR17 に（Man）とタンパク質中のセリン，トレオニン残基のヒド対するアンチセンスモルホリノオリゴを用いて，それぞロキシル基との間に形成される O−グリコシド型結合れの分子の発現を抑制し，発生に与える影響を調べ，（GalNAcα1→Ser/Thr,	 Manα1→Ser/Thr）に注目し，そWBSCR17 の発現抑制胚で最も顕著に後脳領域において発れらの主に脳における機能を解析している．GalNAcα1→生異常が起こることを報告してきた．	 

Ser/Thr の構造を有する糖鎖は，消化器官，呼吸器官等

２）α-dystroglycan のムチン型，および O−Man 型糖鎖にの上皮細胞が分泌する粘性タンパク質であるムチンに多関する研究	 く見られることから，ムチン型糖鎖とも呼ばれる．この	  α-dystroglycan（以降αDG）は，O-Man 型糖鎖とムチン構造の糖鎖はムチン分子のみならず，他の多くの細胞表型糖鎖を有する．ある種の先天性筋ジストロフィーでは面や分泌糖タンパク質中にも存在して，粘膜の保護だけ筋肉の症状とともに，特徴的に知的発達遅滞やてんかんでなく，リンパ球と血管内皮細胞の相互作用，微生物やなど中枢神経症状を呈するが，その原因としてαDG の毒素の認識などの生物現象に関与することが知られていO-Man 型糖鎖に合成不全が起こり，αDG のリガンドへの結る．一方，ほ乳類における Manα1→Ser/Thr の構造を有す合能が低下することが考えられている．今日ではαDG のる O-Man 型糖鎖は，筋肉や神経系などの限定されたタン糖鎖修飾異常により引き起こされる疾患はα-dystro-	 パク質にのみ存在しており，その合成異常は筋ジストロ

glycanopathy と呼ばれているが，その一方でαDG のムチフィーなどの疾病と関係している．	 

ン型糖鎖の機能についてはほとんど調べられていない．	  複雑な細胞間ネットワークを形成する神経系の細胞で本研究では，ゼブラフィッシュを用いてαDG の翻訳後修は，複合糖質の糖鎖が重要な役割を果たしており，プロ飾，特にムチン型糖鎖の修飾とαDG の機能の関係を明ら

テオグリカンやＮ−グリコシド型糖鎖（GlcNAcβ1→Asn）

かにすることを目的としている．	 

が，シナプスの形態変化や神経回路の形成に関わるなど	 の報告がなされてきた．しかし，O-グリコシド型糖鎖の２．本年度の研究成果	 

神経系におけるはたらきについては，ほとんど解析され１）神経特異的なムチン型糖鎖の合成反応と，糖鎖の機ていない．このような背景を踏まえ，我々の研究室では，	 能解析	 

O-グリコシド型糖鎖，およびそれに関連した分子の脳に	  GalNAc-T 遺伝子ファミリーと高い相同性を持つが，酵おける機能解析を研究の目的として，次のような研究を

素活性が検出されていない WBSCR17 の生化学的な性質を行っている．	 

調べた．WBSCR17 の細胞内局在性を，ヒト WBSCR17 と GFP

１）神経特異的なムチン型糖鎖の合成反応と，糖鎖の機の融合タンパク質を HeLa 細胞，Cos7 細胞で発現させて能解析	 調べたところ，融合タンパク質は他の GalNAc-T と同様に	  ムチン型糖鎖の生合成の開始反応は，UDP-GalNAc：cis-Golgi を中心とした細胞内膜系に多く発現していた．

polypeptide	 N-acetylgalactosaminyltransferase	 (以後このことは，WBSCR17 が糖転移酵素として機能する可能

GalNAc-T	 と略する)	 が触媒する．この酵素はタンパク質性を示唆している．次に，Tn 抗原，T 抗原などを認識す中のムチン型糖鎖の数と位置を決定する重要な酵素であるレクチンを用いて，細胞染色，レクチンブロット解析，る．近年我々は，神経特異的に発現する GalNAc-T9,およおよび N-アジドアセチルガラクトサミン(GalNAz)を用い

び GalNAc-T と高い相同性を持つ分子をクローニングした糖鎖の代謝標識法を用いて糖鎖の解析を行った．レクた．後者の分子は精神遅滞を伴う遺伝病である

チンを用いた解析では，WBSCR17 発現細胞とコントロー

Williams-Beuren 症候群（WBS）の欠失領域（WBS	 critical	 

ル細胞間での違いは見られなかったが，代謝標識した糖region）に含まれる WBSCR17 遺伝子としても知られていタンパク質糖鎖をシュタウディンガー連結反応によりプる．GalNAc-T9，WBSCR17 とも in	 vitro の酵素活性，おローブを結合させて検出する実験においては，WBSCR17

発現細胞で発現が増加するバンドを検出した．この結果

Beuren syndrome (WBS).

We carried out biochemical

は，WBSCR17 が糖転移活性を持つことを示唆している．	 

characterization of WBSCR17, and knockdown of brain-	  ゼブラフィッシュを用いた実験系では，WBSCR17 の発

specific isozymes (GalNAc-T9, -T13, and WBSCR17), and

現を抑制したときに見られる後脳領域での発生異常の原

obtained the following data.

因同定を調べるために，WBSCR17 発現抑制胚における後i) WBSCR17 was predominantly expressed in the cis-Golgi as

脳のマーカー分子の発現を分析した．その結果，wnt1，

is the case with other GalNAc-T isozymes, when its

rfng などの後脳の境界の形成に関わる分子の発現パター

recombinant molecule with GFP was expressed in

ンが消失あるいは乱れていることを見いだした．さらに，

mammalian cells.

特異的なアンチセンスモルホリノオリゴを用いて wnt1,	 

that WBSCR17 may work as a glycosyltransferase.

The subcellular localization suggests

rfng の発現抑制胚を作製したところ，WBSCR17 抑制胚とii) Carbohydrate profiles were studied in the cells with

よく似た表現型の異常を示したことから，WBSCR17 はconstitutively expressed WBSCR17 by metabolic labeling

wnt1,	 rfng などのシグナル系に関連している可能性が考of carbohydrates using GalNAz.

えられた．	 

metabolically labeled glycoproteins from the cells with２）α-dystroglycan のムチン型，および O−Man 型糖鎖にoverexpressed

関する研究	 

enhanced expression, indicating the possible glycosylation

WBSCR17

The detection ofdemonstratedbandswithby WBSCR17.	  この実験ではゼブラフィッシュの初期胚に FLAG タグを有するαDG を発現させる．その際，アンチセンスモルiii) The knockdown (KD) of WBSCR17 in zebrafish generated

ホリノオリゴを用いて特定の GalNAc-T の発現を抑制し

most severe malformation of hindbrain compared with theて，どのアイソザイムがαDG のムチン型糖鎖生合成に関other brain-specific isozymes.

わっているかをスクリーニングする．今年度は，組換αDG

expression of some hindbrain markers, and found that wnt1のコンストラクトを作製した．	 

and rfng were lost or ectopically expressed.	 

either wnt1 or rfng in zebrafish showed the similar

３．Research projects and annual reports

phenotype to that of the WBSCR17 KD embryos.

O-Glycosylation

isanimportantpost-translational

on

the

carbohydrate-protein

linkagestructures.

GalNAcα1→Ser(Thr) is the most frequently observed linkage,

The KD ofAll

these data indicate the WBSCR17 is somehow related tomodification of proteins, and is classified into several subtypes
based

We then examined thesignal transduction of wnt1 and/or rfng.
2) Analysis of functions of O-glycosidic carbohydrates inα-dystroglycan (αDG)

and O-glycans with this structure are called the mucin

The aim of this project is to identify GalNAc-T isozymes

carbohydrates since they are highly expressed on mucins

involved in mucin-type O-glycosylation of αDG, and tosecreted from epithelial cells.

There is another O-glycosidic

identify the roles of αDG mucin-carbohydrates.

structure, Manα1→Ser(Thr).

Contrary to the mucin sugars,

FLAG-tagged αDG in zebrafish, we generated its construct.

To express

the occurrence of O-mannosylated carbohydrates is mostly

We are introducing the construct into the embryos.	 

confined to the tissues, such as muscle and brain.	 

Ourinterest is to define functional roles of these two types of４．発表論文

O-glycosylation in the brain, and we carried out the following

K. Yamauchi, and A. Kurosaka: Expression and function of glycogenexperiments.

synthase kinase-3 in human hair follicles. Arch. Dermatol. Res.

1) Analysis of synthesis and function of neuron-specific

302(4): 263-270 (2010)

mucin-type carbohydratesaUDP-GalNAc:

polypeptideI, Kimura, Y. Nakayama, M. Konishi, T. Kobayashi, M. Mori, M.

N-acetylgalactosaminyl-Ito, A. Hirasawa, G. Tsujimoto, M. Ohta, N. Itoh, M. Fujimoto:transferase (GalNAc-T) catalyzes the initial step in the

Neuferricin, a novel extracellular heme-binding protein, promotes

biosynthesis of mucin-type glycans.

neurogenesis. J. Neurochem. 112(5): 1156-1167 (2010)

We previously cloned anovel neuron-specific isozyme, designated GalNAc-T9, andmore recently identified a putative GalNAc-T gene, which is５．著書および総説	 also mainly expressed in the embryonic and adult brain.

The

S. Sasaki, Y. Nakayama, M. Konishi, A. Miyake, N. Itoh: The FGF

gene for this putative isozyme is also known as WBSCR17,

Family in Humans, Mice, and Zebrafish: Development, Physiology,

one of the genes identified in the region critical to Williams-and Pathophysiology. Genetic Disease. in press

	 
６．招待講演、シンポジウム等	 なし	 	 

７．学会発表	 
N. Nakamura, M. Tawara, K. Nishimura, K. Hachiga, H. Nishizaki, Y.
Nakayama, A. Miyake, N. Itoh, A. Kurosaka, The Biological Rolesof Brain-specific Polypeptide GalNAc-transferases in Zebrafish.
International Carbohydrate Symposium (ICS2010), Yokohama(Japan), 2010.8.1-6.
A. Kurosaka, S. Toba, T. Satoh, N. Nakamura, Y. Nakayama, K.
Ozaki Suppression of a novel brain-specific UDP-GalNAc:
polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase causes cell death in
P19 embryonic carcinoma cells during neural differentiation.
International Carbohydrate Symposium (ICS2010), Yokohama(Japan), 2010.8.1-6.
N. Nakamura, M. Tawara, K. Nishimura, K. Hachiga, H. Nishizaki, Y.
Nakayama, A. Miyake, Nobuyuki Itoh, A. Kurosaka, The BiologicalRoles of WBSCR17, a Gene Homologous to Polypeptide
GalNAc-transferases in Zebrafish. 第 33 回日本分子生物学会年会/第 83 回日本生化学会大会合同年会，神戸市，2010.12.7-10
H. Fujiwara, T. Satoh, Y. Nakayama, N. Nakamura, A. Kurosaka,
Functional analysis of brain-specific polypeptide N-acetylglactosaminyltransferase-related genes, 第 33 回日本分子生物学会年会/
第 83 回日本生化学会大会合同年会，神戸市，2010.12.7-10
Y. Nakayama, Y. Tsuji, N. Nakamura, A. Kurosaka, Characterizationof brain-specific polypeptide GalNAc-transferases in P19 cells, 第33 回日本分子生物学会年会/第 83 回日本生化学会大会合同年会，神戸市，2010.12.7-10

８．その他特記事項	 	  	  なし