平成17年度〔2005〕No.50
宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告

ピーマン種子抽出物から分離した抗菌性物質の特徴（第２報)＊
小窪正人＊1・三角敏明＊1・水谷政美＊2

Purification and Characterization of Antimicrobial Substances from Green Pepper Seeds（Ⅱ）
Masato KOKUBO, Toshiaki MISUMI, and Masami MIZUTANI
塩析およびカラムクロマトグラフィーにより，ピーマンの成熟種子の水抽出物から抗菌性物質を分離精製した。その結果，陰イオン交換クロマトグラフィー（DEAE Sepharose FFカラム）により分画した抗菌性画分の数は，中熟種子の場合に比べて大幅に増加し，その分子量は数千から数千万とそれぞれ異なっていた。
また，抗菌性画分は酵母の細胞をい縮させ，破裂を誘導するとともに，その増殖も長時間にわたり抑制することを確認した。
キーワード：ピーマン，成熟種子，水抽出物，抗菌性，陰イオン交換クロマトグラフィー
１

はじめに

Sepharose FFカラムに重層した後，同上緩衝液

ピーマン種子の水抽出物に酵母や細菌の増殖をで溶出した（0.7ml/min，0.5M-NaClリニアグラ抑制する作用のあること，ならびに，種子内に抗ジエント）。溶出液は，280nmにおける吸光度に菌性物質が生成されるには果実の熟度と種子の乾よりそれぞれの画分に分画し，水に対して透析し燥温度が大きく関わっていることをこれまでに明た後，真空凍結乾燥してDEAE分画試料とした。

らかにしてきた１〜３）。本研究では，成熟した果実

DEAE分画試料は，水に溶かしSephadexより採取した種子（成熟種子）の水抽出物を用い，G200カラムに重層した後，同上緩衝液で溶出しカラムクロマトグラフィーなどにより抗菌性物質た（0.2 ml/min，0.2M-NaCl）。溶出液はDEAEを分離精製し，その特徴について検討したので報分画試料と同様の方法で分画し，水に対して透析告する。

した後，真空凍結乾燥して最終分画試料とした。
２−２２

抗菌活性の評価

抗菌活性の評価は，DEAE分画試料および最終実験方法４）分画試料について行った。各分画試料1mgにYMP

真空凍結乾燥した成熟種子の水抽出物を水1L培地0.9mlを加え良く混合し，オートクレーブに溶かし，氷水で冷却しながら561gの硫酸アン（120℃，20分）で滅菌した。放冷後，10４個/mlモニウムを徐々に加え，完全に溶解させた後，４℃オーダーに希釈した酵母（S.cerevisiae）0.1mlをで一夜放置した。生成した沈殿物は，遠心分離加え良く混合し，28℃で48時間培養後の増殖の（10,000rpm，20min）により回収し，20mMり程度を観察した。

ん酸カリウム緩衝液（pH7.0）100mlに溶解させ２−３２−１

水抽出物の分画た。これを同上緩衝液に対して室温で透析した後，透析液を真空凍結乾燥し，脱硫安試料とした。

＊

溶出位置による分子量の測定５）

分子量の測定は，最終分画試料について行った。
前述と同様の条件で，Sephadex G200カラムに脱硫安試料は同上緩衝液20mlに溶かし，DEAE

分子量が既知の標準タンパク質を重層し，その溶農林畜水産物を用いる食品開発に関する研究

出位置から標準曲線を作成した。得られた標準曲＊１ 食品開発部

線上に各分画試料の溶出位置をプロットして分子＊２ 応用微生物部量を求めた。使用した標準タンパク質は，Catalase，83ピーマン種子抽出物から分離した抗菌性物質の特徴（第２報)

BSA，OvalbuminおよびCytochrome Cの4種であD-Ⅱ画分にのみ抗菌活性が認められ，その収量はる。

2.8mgであった。

２−４

酵母の生育状況の観察

DEAE分画試料1mgにYMP培地0.9mlを加え良く混合し，オートクレーブ（120℃，20分）で滅菌した。放冷後，10５個/mlオーダーに希釈した酵母0.1mlを加え良く混合した。その一部をスライドグラスにとりカバーグラスをかけ，周囲を接着剤で密封し，28℃で培養しながら酵母の状態を経時的に観察した。また，試験管を用いて同様に培養し，菌数の経時的な増減を測定した。
３

結果および考察３−１

抗菌性画分の分別

80％飽和硫酸アンモニウムを使用して，成熟種子の水抽出物18.4gから塩析を行った結果，8.9gの

図２

ゲルろ過クロマトグラフィーによる成熟種子の分画脱硫安試料が得られた。
この脱硫安試料0.3gを用いて，DEAE
Sepharose FFカラムによる陰イオン交換クロマトグラフィーを行った結果，９つの画分（Ａ〜Ｉ）にこれらの結果から，陰イオン交換クロマトグラ分画された（図１）。各画分の抗菌活性を評価した

フィー（DEAE Sepharose FFカラム）により分ところ全ての画分に抗菌活性が認められ，その収画された抗菌性画分の数は，中熟果実より採取し量は順に23.6，25.0，15.5，12.3，19.5，12.0，た種子（中熟種子）を用いた場合に比べて大幅に51.1，22.0および15.0mgであった。

増加していることが分かった２）（図３）
。

図３
図１

陰イオン交換クロマトグラフィーによる陰イオン交換クロマトグラフィーによる中熟種子の分画

成熟種子の分画
しかし，これらの抗菌性画分をゲルろ過クロマトグラフィー（Sephadex G200カラム）によりＡ〜Ｉ画分のそれぞれ半量を用いて，Sephadex分画すると，ほとんどの画分で抗菌活性が失われG200カラムによるゲルろ過クロマトグラフィーていた。その原因として，２つ以上の物質が分離を行った結果，Ａ〜Ｇ画分は２画分（1・Ⅱ），Ｈされることにより抗菌活性を失った可能性が考えおよびＩ画分は３画分（Ⅰ・Ⅱ・Ⅲ）に分画されられた。そのため，分画したものを再度混合してた（図２）。各画分の抗菌活性を評価したところみたが，抗菌活性は復活しなかった。

84ピーマン種子抽出物から分離した抗菌性物質の特徴（第２報)

３−２４

抗菌性画分の分子量まとめ

標準タンパク質の溶出位置と最終分画試料の溶

成熟種子の抽出物から抗菌性物質を分離精製

出位置から各画分のおおよその分子量を求めたとし，その特徴について検討したところ，以下のこころ，A-Ⅰ〜G-Ⅰ画分は120万〜220万，A-Ⅱとが分かった。

〜G-Ⅱ画分は1,400〜6,500の範囲であった。ま1)

成熟種子の水抽出物を陰イオン交換クロマト

た，H-ⅠおよびI-Ⅰ画分はそれぞれ1,400万およグラフィー（DEAE Sepharose FFカラム）に

び2,100万，H-ⅡおよびI-Ⅱ画分はそれぞれ72万より分画した抗菌性画分の数は，中熟種子の場および130万，H-Ⅲ及びI-Ⅲ画分はそれぞれ合に比べて３種から９種へ大幅に増加し，その1,700および4,300であった（表１）。

分子量は数千から数千万とそれぞれ異なっていた。これらの原因として，種子の成熟に伴う抗表１
画分

Ａ−Ⅰ
Ａ−Ⅱ
Ｂ−Ⅰ
Ｂ−Ⅱ
Ｃ−Ⅰ
Ｃ−Ⅱ
Ｄ −Ⅰ
Ｄ−Ⅱ
Ｅ−Ⅰ
Ｅ−Ⅱ

抗菌性画分の分子量

分子量画分

1,600,000
1,600
1,200,000
1,400
1,500,000
1,700
2,200,000
6,500
1,500,000
3,500

Ｆ −Ⅰ
Ｆ−ⅡＧ −ⅠＧ−ⅡＨ −ⅠＨ −ⅡＨ−Ⅲ
Ｉ −Ⅰ
Ｉ−Ⅱ
Ｉ−Ⅲ

菌性物質の分子構造の変化が考えられた。
分子量1,600,000
3,900
1,600,000
3,500
14,000,000
720,000
1,700
21,000,000
1,300,000
4,300

2)

DEAE分画試料をゲルろ過クロマトグラフ
ィー（Sephadex G200カラム）により分画すると，ほとんどの画分で抗菌活性が失われた。
原因については今後の検討が必要である。

3)

抗菌性画分は酵母の細胞をい縮させ，破裂を誘導するとともに，その増殖も長時間にわたり抑制した。

このように，陰イオン交換クロマトグラフィー

５

参考文献

により分画された抗菌性画分の数が，中熟種子の1)

平川良子，水谷政美，小窪正人，宮崎県食品開発センター研究報告，48，105（2003）

場合に比べて３種から９種へ大幅に増加したこと，また，その分子量が数千から数千万とそれぞ2)

開発センター研究報告，49，77（2004）

れ異なっていたことから，種子内の抗菌性物質は，種子の成熟に伴う代謝などにより修飾を受けた

3)

３−３

水谷政美，平川良子，小窪正人，特願2004197813（特開2006-14695）

り，重合したりすることによって，分子構造が変化していくものと考えられた。

小窪正人，三角敏明，水谷政美，宮崎県食品4)

Mizuo Yajima,Tsutomu Takayanagi,Kazuhiko
Nozaki and Koki Yokotsuka, Food Sci.Techn-

酵母の生育状況

ol.,Int.2,234(1996)

0.1％のDEAE分画試料を含むYMP培地で酵母を培養しながら細胞の状態を観察したところ，数時間で細胞が徐々にい縮し始め，その後破裂する

5)

岡田雅人，宮崎香験ノート上巻

編：

改訂タンパク質実p.13-135，羊土社（1999）

細胞がいくつか観察された。またこの間，菌数の増加は全く認められなかった（図４）。
無添加

0.1％DEAE分画試料添加

図４ 抗菌性画分が酵母の生育に及ぼす影響85