Guia sobre o Controle de Nitrosaminasem Insumos Farmacêuticos Ativos e Medicamentos
Guia no 50/2021 – versão 4Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa
2024

Guia sobre o Controle de Nitrosaminas em Insumos
Farmacêuticos Ativos e Medicamentos
VIGENTE A PARTIR DE 01/08/2024

Este Guia expressa o entendimento da Anvisa sobre as melhores práticas com relação aprocedimentos, rotinas e métodos considerados adequados ao cumprimento de requisitos técnicos
ou administrativos exigidos pelos marcos legislativo e regulatório da Agência.1
Trata-se de instrumento regulatório não normativo, de caráter recomendatório e não vinculante,
sendo, portanto, possível o uso de abordagens alternativas às proposições aqui dispostas, desde que
compatíveis com os requisitos relacionados ao caso concreto. A inobservância ao conteúdo destedocumento não caracteriza infração sanitária, nem constitui motivo para indeferimento de petições,desde que atendidos os requisitos exigidos pela legislação.
As recomendações contidas neste Guia produzem efeitos a partir da data de sua publicação no Portal
da Anvisa.
1Portaria nº 162, de 12 de março de 2021, que dispõe sobre as diretrizes e os procedimentos para melhoria da qualidade

regulatória na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa).

Copyright©2024. Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa. A reprodução parcial ou total
deste documento por qualquer meio é totalmente livre, desde que citada adequadamente a fonte.
A reprodução paraqualquer finalidade comercial está proibida.

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Guia sobre o Controle de Nitrosaminas em Insumos Farmacêuticos Ativos e Medicamentos
Guia nº 50/2021– versão 4, de 31/07/2024SUMÁRIO
1. ESCOPO.............................................................................................................. 4
2. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 4
3. BASE LEGAL ........................................................................................................ 5
4. ASPECTOS QUÍMICOS E REACIONAIS .................................................................. 7a) Formação de nitrosamina como contaminante em processo de obtenção deInsumos Farmacêuticos Ativos..................................................................................10b) Formação de nitrosamina como contaminante em processo de fabricação demedicamentos ..........................................................................................................13
5. GERENCIAMENTO DE RISCO ..............................................................................14
6. FATORES DE PRIORIZAÇÃO PARA AVALIAÇÃO DE RISCO (ETAPA 1) ...................18a) Componentes básicos .......................................................................................18b) Avaliação de purga............................................................................................19
7. TESTES CONFIRMATÓRIOS (ETAPA 2) ................................................................20a) Método analítico ..............................................................................................20b) Lotes a serem tratados......................................................................................20
8. ESTRATÉGIA DE CÁLCULO PARA ATRIBUIÇÃO DE LIMITES DE ACEITAÇÃO .........21a) Limites para nitrosamina única .........................................................................22b) Mais de uma nitrosamina .................................................................................23c) Nitrosaminas novas ..........................................................................................24d) Abordagem Less Than Lifetime..........................................................................24
9. GLOSSÁRIO .......................................................................................................25
10. REFERÊNCIAS ....................................................................................................26
ANEXO I: Limites de aceitação para nitrosaminas .....................................................30
ANEXO II : Abordagem de Categorização de Potência Carcinogênica para Nnitrosaminas - CPCA .................................................................................................32CÁLCULO DA PONTUAÇÃO DE POTÊNCIA ..................................................................34
ANEXO III: Condições do teste de Ames otimizado para N-nitrosaminas ...................38

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1.

ESCOPO

Este documento apresenta recomendações quanto ao controle de nitrosaminas em todos os
Insumos Farmacêuticos Ativos (IFAs) sintetizados quimicamente e medicamentos para uso humano que os
contenham, bem como produtos biológicos, quando cabível.
As recomendações são igualmente aplicáveis para alterações pós-registro que possam resultar
em formação de nitrosaminas, como mudanças relacionadas ao IFA, à composição e à embalagem do
medicamento, não se restringindo exclusivamente a essas.

2.

INTRODUÇÃOAs N-nitrosaminas constituem uma classe de compostos caracterizados pela ligação de um
grupo nitroso (-N=O) a um grupo funcional amina (-NR2). Dentre os compostos desta classe, estão alguns agentes
mutagênicos, genotóxicos e potencialmente carcinogênicos em humanos e, por esse motivo, devem ser
controlados a níveis considerados aceitáveis e seguros. Esses compostos podem ser encontrados na água, carne
curada, peixe processado, cerveja e outras bebidas alcoólicas e não alcoólicas, queijo, molho de soja, óleos,vegetais processados e leite humano e sua exposição dentro de limites seguros representa baixo risco deagravos à saúde (EFSA CONTAM Panel, 2023) (EMA 2020). No entanto, a exposição acima de níveis aceitáveis e
por longo período pode aumentar o risco de câncer (Horne et al., 2023).
Em 2018, as agências reguladoras em todo o mundo ficaram cientes da presença denitrosaminas acima dos níveis permitidos em medicamentos, após fabricantes de insumos farmacêuticos ativos
do grupo de medicamentos comumente denominados de “sartanas” – os antagonistas dos receptores deangiotensina II, utilizados para controle da pressão arterial – emitirem alertas de sua possível presença nessa
classe de medicamentos.
Desde então, essas agências têm promovido ações no intuito de proteger a saúde dos pacientes
da exposição às nitrosaminas em medicamentos acima dos níveis considerados aceitáveis. No Brasil, as ações
de controle promovidas pela Anvisa foram iniciadas com inspeções realizadas em 30 empresas fabricantes demedicamentos, com 111 produtos tendo sido inspecionados. Como resultado, 31 ações sanitárias foram
efetuadas, incluindo interdições, suspensões e recolhimentos. A fonte da contaminação dos medicamentos foi
identificada como sendo oriunda principalmente da presença de solventes em condições químicas que
favorecem a formação de nitrosaminas.
Diante do caso das “sartanas”, as principais agências reguladoras do mundo, juntamente com
as empresas fabricantes de medicamentos, começaram a investigar se outros medicamentos também poderiam
apresentar nitrosaminas acima de níveis aceitáveis. Em 2019, foi reportada a presença de nitrosaminas em
outras classes de medicamentos, como nizatidina, ranitidina e metformina. Adicionalmente, foi evidenciada
possível formação de nitrosaminas a partir do material de embalagem primária contendo nitrocelulose. Desdeentão, tem sido observada formação de nitrosaminas em diversos outros medicamentos, por exemplo naqueles
contendo vareniclina, rifampicina, diosmina e sitagliptina.
Como parte desse processo de investigação, constatou-se, por exemplo, que a presença denitrosaminas em ranitidina apresentou uma fonte diversa da anteriormente encontrada em outros produtos.
Para este fármaco, a formação de dimetilnitrosamina (NDMA) é originária de uma degradação intermolecularque ocorre ao longo do armazenamento do produto, e que pode ser influenciada pela morfologia do cristal damolécula (King et al. 2020), além de ser acelerada pelo armazenamento em temperaturas superiores à
temperatura ambiente. Tais condições podem resultar em exposição do consumidor a níveis inaceitáveis dessa
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impureza (FDA 2020b).
Na Europa, nos meses seguintes à descoberta, diversos fabricantes do insumo ranitidina tiveramseus Certificados de Adequabilidade (Certificate of Suitability - CEP) revogados pelo European Directorate for
the Quality of Medicines (EDQM). Destaca-se ainda que os medicamentos contendo cloridrato de ranitidina
estiveram disponíveis para a população mundial por mais de 30 anos e foram usados para o tratamento deúlceras, esofagites e refluxos gástricos, sem notificações de eventos adversos graves, o que reforça anecessidade de avaliação e controle das nitrosaminas em todas as classes de medicamentos.
É importante enfatizar que embora exista um risco muito baixo de nitrosaminas estarem
presentes em produtos biológicos, estes não podem ser definitivamente descartados. À luz do conhecimento
científico atual, sabe-se que tais riscos se concentram, por exemplo, em produtos com fragmentos sintetizados
quimicamente, aqueles embalados em blísteres contendo nitrocelulose, produtos biológicos com excipientes
em sua composição, ou em que haja a adição intencional de agentes nitrosantes no processo de fabricação(EMA, 2020).
Neste sentido, embora não se espere que as nitrosaminas se formem durante a fabricação damaioria dos IFAs e dos produtos acabados (EMA 2020b), recomenda-se fortemente que os fabricantes,
distribuidoras e fracionadoras de IFAs e empresas fabricantes e importadoras de medicamentos avaliem seus
produtos quanto à possível presença destes contaminantes e, tomem as medidas de precaução necessárias para
minimizar o risco e garantir a segurança desses produtos.
Este guia apresenta conceitos básicos acerca da formação, gerenciamento do risco relativo àpresença, além de recomendações sobre controle de nitrosaminas em insumos farmacêuticos ativos e
medicamentos, bem como esclarece a responsabilidade das empresas, apresenta estratégias de cálculos delimites e aborda outros conceitos.
Ressalta-se que este é um documento que pode ser alterado à medida que novos estudos e
informações estejam disponíveis no que tange a essa área do conhecimento, incluindo limites aceitáveis deexposição às nitrosaminas, tendo em vista a ausência de estudos conclusivos sobre a ingestão a longo prazo.
É importante registrar a cooperação regulatória internacional sobre esse tema. Em 2018, foi
formado um grupo estratégico composto de agências reguladoras de diversos países para tratar o assunto, o
NISG, “Nitrosamines International Strategic Group”. Em 2020, foi estabelecido um grupo derivado do NISG, o
NITWG, ou grupo técnico de trabalho internacional de nitrosaminas (Nitrosamines International Technical
Working Group) com atribuição de endereçar de forma mais aprofundada os temas técnicos ligados à
nitrosaminas. A Anvisa faz parte desses grupos desde 2021.

3.

BASE LEGAL

Lei nº 6.360, de 23 de setembro de 1976, que dispõe sobre a vigilância sanitária a que ficam
sujeitos os medicamentos, as drogas, os insumos farmacêuticos e correlatos, cosméticos, saneantes e outros
produtos;
Resolução RDC nº 73, de 07 de abril de 2016, que dispõe sobre mudanças pós-registro,
cancelamento de registro de medicamentos com princípios ativos sintéticos e semissintéticos;
Resolução RDC nº 76, de 02 de maio de 2016, que dispõe sobre a realização de alteração,inclusão e cancelamento pós-registro de medicamentos específicos.
Resolução RDC nº 166, de 24 de julho de 2017, que dispõe sobre a validação de métodosanalíticos;
Resolução RDC nº 753, de 28 de setembro de 2022, que dispõe sobre os critérios para a
concessão do registro de medicamentos com princípios ativos sintéticos e semissintéticos, classificados como5
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novos, inovadores, genéricos e similares;
Resolução RDC nº 359, de 27 de março de 2020, que institui o Dossiê de Insumo Farmacêutico
Ativo (DIFA) e a Carta de Adequação de Dossiê de Insumo Farmacêutico Ativo (CADIFA);
Resolução RDC nº 412, de 20 de agosto de 2020, que estabelece os requerimentos e condições
para a realização de estudos de estabilidade para fins de registro e alterações pós-registro de produtos
biológicos;
Instrução Normativa nº 65, de 20 de agosto de 2020, regulamenta a classificação das alterações
pós-registro e condições e documentos técnicos necessários para instruir as petições de alteração pós-registro
e de cancelamento de registro dos produtos biológicos;
Resolução RDC nº 511, de 27 de maio de 2021, que dispõe sobre a admissibilidade de códigos
farmacêuticos estrangeiros.
Resolução RDC nº 413, de 20 de agosto de 2020, que dispõe sobre alterações pós-registro ecancelamento de registro de produtos biológicos;
Resolução RDC nº 576, de 11 de novembro de 2021, que dispõe sobre a notificação demedicamentos de baixo risco;
Resolução RDC nº 625, de 09 de março de 2022, que dispõe sobre os requisitos mínimos
relativos à obrigatoriedade, por parte das empresas detentoras de registros de medicamentos, de comunicação
da implementação da ação de recolhimento de medicamentos às autoridades sanitárias competentes e aosconsumidores, em hipótese de indícios suficientes ou comprovação de desvio de qualidade que representem
risco, agravo ou consequência à saúde, bem como por ocasião de cancelamento de registro relacionado à
segurança e eficácia;Resolução RDC nº 654, de 24 de março de 2022, que dispõe sobre as Boas Práticas de Fabricação
de Insumos Farmacêuticos Ativos;
Resolução RDC nº 658, de 30 de março de 2022, que dispõe sobre as diretrizes gerais de boas
práticas de fabricação de medicamentos;
Resolução RDC nº 677, de 28 de abril de 2022, que dispõe sobre avaliação de risco e controle denitrosaminas potencialmente carcinogênicas em Insumos Farmacêuticos Ativos (IFA) e medicamentos de uso
humano.

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4.

ASPECTOS QUÍMICOS E REACIONAISAs N-nitrosaminas possuem a fórmula geral descrita a seguir:

Figura 1- Estrutura geral de N-nitrosaminas.

A química das nitrosaminas tem sido estudada e documentada desde o século passado, tendo
esse campo de estudos sido impulsionado na década de 1950 pelas observações de Magee e Barnes (1956) que
relacionaram essas substâncias ao surgimento de câncer. Dados obtidos na Noruega, no final da década de 50
e início da década de 60, já apontavam a presença de nitrosaminas como causa de hepatotoxicidade em animais
alimentados com ração tratada com nitrito (Ender et al. 1964).
A dimetilnitrosamina (NDMA) é atualmente classificada pelo IARC como provavelmente
carcinogênica para humanos (grupo 2A) (IARC 1987), enquanto duas nitrosaminas específicas do tabaco (ou seja,4-(N-nitrosometilamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK) e N'- nitrosonornicotina (NNN)) são categorizados como
carcinogênicos para humanos (grupo 1) (IARC 2007).
A existência desses compostos é disseminada. Fong e Chan (1973) observaram que a capacidade
dos Staphylococcus aureus reduzir NO3– (nitrato) a NO2– (nitrito) a partir de sais presentes em pescados, poderia
levar à produção de nitrosaminas por meio da reação do nitrito formado com a trimetilamina, substância
presente em grandes quantidades em peixes em decomposição. Água e alimentos defumados também são
comumente citados como fontes de nitrosaminas.
A genotoxicidade das nitrosaminas é dependente da hidroxilação do carbono alfa, que ocorre
através de enzimas do sistema microssomal P-450 (CYP 450). A ativação envolve a produção de íons diazônio,que se decompõem levando à formação de carbocátions, que são espécies positivamente carregadas e
eletrofílicas capazes de se ligarem ao DNA (Rath & Canaes 2009, Carlson et al. 2017). Atualmente, dados deestudos em animais de 228 nitrosaminas revelam que 82% são considerados carcinógenos in vivo (Thresher et
al. 2020); independente da via administrada (Li & Hecht 2022, Preussmann & Stewart 1984).

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Figura 2- Hidroxilação de nitrosaminas mediada pelo sistema P-450 e posterior geração de íons diazônio. Adaptado de EMA (2020a) e(Rath & Canaes 2009).

Quimicamente, as nitrosaminas podem ser formadas a partir de aminas e agentes nitrosantes(geralmente nitrogênio oxidado contendo grupos NyOx) sob certas condições de reação. A nitrosação de aminas
secundárias (Figura 3B), terciárias e compostos de amônio quaternário pelo ácido nitroso é um exemplo geralde formação desses compostos. O ácido nitroso é um composto instável obtido a partir do nitrito de sódio em
meio ácido levando à geração do íon nitrosônio (NO+), o qual é responsável pela N-nitrosação de aminas (Figura
3A).

Figura 3 - Formação de nitrosaminas por nitrosação com ácido nitroso obtido a partir do nitrito de sódio em meio ácido.

De forma geral, as nitrosaminas formadas a partir de aminas primárias são instáveis e levam à
formação direta do íon diazônio correspondente; (Fig. 4C). Ou seja, quando um dos ligantes R 1 ou R2 da amina
demonstrada na Figura 3 é um hidrogênio, ocorre interconversão tautomérica nas nitrosaminas primárias
formadas (algo análogo ao equilíbrio ceto-enólico) (Figura 4A), o que leva à formação de um alquildiazônio
correspondente.
O ácido diazoico tende a desidratar na presença de íons hidrogênio e formar o íon diazônio(Figura 4B). Esse íon é rapidamente decomposto formando um carbocátion e liberando nitrogênio (N2) (Roberts& Caserio 1977, Reusch 1999). Em resumo, não se verificam quantidades apreciáveis de nitrosaminas formadasa partir de aminas primárias pela tendência de decomposição do produto nitrosado.

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Figura 4 - Formação de carbocátion a partir de aminas primárias.

A estrutura da nitrosamina obtida ao final do processo de nitrosação será determinada
primariamente pela estrutura da amina que foi nitrosada. Como exemplo, a formação da dimetilnitrosamina(NDMA) a partir da nitrosação da dimetilamina (DMA) é ilustrada conforme a reação a seguir:

Figura 5 - Nitrosação da dimetilamina (DMA) e formação de dimetilnitrosamina (NDMA).

Da mesma forma, a nitrosação do ácido N-metil-4-aminobutanóico (MBA) leva a formação docarboxipropilmetilnitrosamina (NMBA):

Figura 6 - Nitrosação do ácido N-metil-4-aminobutanóico (MBA) e formação do carboxipropilmetilnitrosamina (NMBA).

Tanto a NDMA quanto a NMBA foram detectadas como impurezas advindas da síntese de IFAs
antagonistas dos receptores de angiotensina II (EMA 2020, FDA 2020). As reações acima descrevem o que
provavelmente ocorreu para que fossem geradas as nitrosaminas NDMA e NMBA, ou seja, formação de ácido
nitroso in situ oriundo da presença de nitrito de sódio, levando a formação do agente nitrosante (NO+) e
consequente nitrosação das aminas DMA e MBA, conforme Figura 3A (EMA 2020).
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Sabe-se que outros compostos contendo grupos NOx, como sais de nitrito e nitritos de alquila,
anidrido nitroso (N2O3), tetróxido de dinitrogênio (N2O4), haletos de nitrosila (NOCl), nitrosiltiocianato enitrosofenol, dentre outros, são capazes de nitrosar aminas (Fig. 7 a 9). Processos como cura da carne, maltagem
antes da fermentação ou durante reações químicas podem levar a produção de alguns desses compostos. Oóxido nítrico é capaz de nitrosar na presença de metais e compostos organometálicos (EMA 2020a).

Figura 7 - Formação de nitrosamina secundária a partir de sal de amônio e nitrito de sódio.

Figura 8 - Formação de nitrosamina a partir de amina terciária e N2O3 como agente nitrosante.

Figura 9- Desalquilação nitrosativa da trietilamina e formação da nitrosamina dietilnitrosamina (NDEA).

A formação de nitrosaminas a partir de aminas terciárias é, geralmente, um processo mais lento
do que o processo de nitrosação de aminas secundárias, pois envolve uma etapa de dealquilação, seguida denitrosação da amina dealquilada e, no que tange a formação de nitrosaminas simples, derivadas detrialquiaminas, espera-se um risco muito menor quando comparado à formação de nitrosaminas derivadas deaminas secundárias, embora essa reatividade reduzida possa não ocorrer com aminas terciárias mais complexas(López-Rodríguez et al., 2020 e Ashworth et al., 2023).

a)
Formação de nitrosamina como contaminante em processo de obtenção deInsumos Farmacêuticos Ativos
Dentre as principais causas da formação de nitrosaminas como contaminantes em IFA, está ouso simultâneo de aminas secundárias ou terciárias e de agentes nitrosantes, fontes de NOx (NaNO2, N2O3 por
exemplo) na síntese ou obtenção de intermediários ou IFAs. Não apenas o uso deliberado desses compostos na
mesma etapa pode levar à formação de nitrosaminas, mas, também, o carreamento de aminas ou fontes deNOx de etapas prévias até etapas subsequentes pode gerar uma condição propícia à formação de nitrosaminas.
Reagentes, materiais de partida, solventes e catalisadores contaminados podem também levar a formação denitrosaminas durante etapas sintéticas.

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As aminas podem também ser geradas in situ. Como exemplo, tem-se o solvente
dimetilformamida (DMF) que pode sofrer hidrólise ácida ou básica em condições favoráveis e gerar adimetilamina (DMA), que é suscetível à nitrosação (Figura 10).

Figura 10- Hidrólise da dimetilformamida (DMF) e formação de NDMA.

A dimetilamina também pode constar como impureza no solvente dimetilformamida (DMF),
advinda do próprio processo de síntese da DMF. De forma semelhante, o solvente metilpirrolidona (NMP) podesofrer hidrólise e gerar substrato passível de nitrosação (Fig. 11) (Klein 2017, EMA 2020).

Figura 11- Hidrólise da metilpirrolidona (NMP) e formação de NMBA.

Os casos acima mencionados constituem possíveis causas da presença das nitrosaminas NDMAe NMBA em alguns processos de obtenção de IFAs (EMA 2020), exemplificando como as condições do processo
devem ser avaliadas quanto ao potencial de formação de aminas suscetíveis à nitrosação, principalmente
quando são empregados agentes capazes de gerar espécies nitrosantes, mesmo que em etapas distintas doprocesso, já que o carreamento de impurezas de uma etapa à outra pode levar a riscos de formação de11
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nitrosaminas. Por exemplo, o nitrito utilizado em uma determinada etapa pode ser carreado a etapas
subsequentes, passando por processos de work-up, cristalização ou por outras operações de purificação
efetuadas (EMA 2020, FDA 2020).
Além das transformações de insumos empregados no processo, exemplificadas com os casos dehidrólise de DMF e NMP, reações diretas entre sais de amônio e agentes nitrosantes também podem ocorrer.
Por exemplo, os catalisadores brometo de tetrabutilamônio (TBAB) ou cloridrato de trietilamina (TEA.HCl)
sofrem desalquilação nitrosativa, reação semelhante à apresentada na Figura 9. Não obstante, o solvente
dimetilacetamida e outras amidas podem seguir o mesmo padrão de degradação mostrado nas Figuras 10 e 11,
gerando aminas passíveis de nitrosação. Digno de nota, além dos casos mencionados até aqui, é a possibilidadede oxidação de hidrazinas, o que pode acontecer inclusive através da simples exposição ao oxigênio do ar (LópezRodríguez et al., 2020, Horne et al., 2023).
Devido ao amplo emprego de aminas em diversos processos de síntese, é possível que estas
estejam presentes como contaminantes em diversos insumos. Adicionalmente, é possível a presença de aminas
menos substituídas em reagentes como aminas terciárias ou sais de amônio. Por exemplo, di-isopropilamina e
isopropiletilamina são possíveis contaminantes da di-isopropiletilamina (DIPEA), assim como dietilamina é uma
provável impureza presente na trietilamina (TEA). Além disso, catalisadores de transferência de fase comocloridrato de trietilamina (TEA.HCl) foram identificados como potencial fonte de trietilamina e dietilamina (EMA
2020).
É de crucial importância a avaliação do processo de obtenção de um insumo farmacêutico ativo(IFA) por completo, incluindo avaliação da obtenção de intermediários chaves e materiais de partida. A
possibilidade de carreamento de um determinado substrato de uma etapa do processo à outra, o uso dereagentes que possuem em seu perfil de contaminantes aminas ou potenciais agentes nitrosantes e ascondições do processo, como temperatura e pH que possam favorecer a degradação de reagentes ou solventes,
são alguns exemplos importantes a serem observados.
Nesse sentido, é importante o conhecimento do grau de pureza dos materiais introduzidos esuas potenciais impurezas. Contaminações dentro de uma mesma unidade fabril ou advindas derecuperações/reutilizações de solventes ou materiais conduzidos por terceiros devem sempre ser consideradas
nas avaliações de risco dos processos de síntese. Possíveis combinações críticas que devem ser observadas são
situações em que as condições gerais de formação de nitrosaminas estão presentes como nos exemplos do
Quadro 1.
Nitrosamina formada

Fonte
de
NOx

Fonte de amina

Amina nitrosada

NaNO2

NaNO2

NaNO2

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NaNO2

NaNO2

NaNO2

NaNO2

Quadro 1– Exemplos de combinações críticas que podem levar a formação de nitrosaminas.

Além da nitrosação de aminas, também devem ser consideradas, durante a avaliação, outras
condições menos clássicas que permitem a formação de nitrosaminas citadas na literatura (López-Rodríguez etal. 2020), como a redução de nitraminas, oxidação de hidrazinas e formação a partir de compostos
organometálicos.

b)
Formação de nitrosamina como contaminante em processo de fabricação demedicamentos
A formação de nitrosaminas durante a produção de medicamentos é menos previsível emcomparação com a produção do IFA. No entanto, as considerações feitas na seção anterior acerca das possíveis
vias de formação das nitrosaminas no IFA podem permanecer válidas para o medicamento, desde que ascondições reacionais estejam presentes.
A formação de nitrosaminas em medicamentos pode ocorrer em decorrência de alguns fatores
ligados ao processo produtivo do medicamento e suas operações unitárias, da interação entre IFA e excipiente
durante o processo produtivo ou durante o armazenamento, da degradação do IFA e outros materiais, dainteração da formulação com o material de embalagem e, também, por contaminação cruzada entre processos.
No contexto da formação de nitrosaminas no produto acabado, a disponibilidade de agente
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nitrosante pode advir das matérias primas utilizadas. Sabe-se que excipientes como crospovidona, hipromelose,
estearato de magnésio, dentre outros podem conter nitrito como impurezas (Boetzel et al. 2022). A interação
do nitrito dos excipientes deve ser avaliada frente a presença de aminas, principalmente secundárias, advinda
de outros excipientes, IFA ou substâncias relacionadas do IFA.
Algumas operações unitárias apresentam riscos potenciais para a formação de nitrosaminas,como o processamento em leitos fluidizados, devido à possibilidade de oxidação de hidrazinas dissubstituídas
ou exposição de aminas secundárias às espécies de nitrogênio oxidado (López-Rodríguez et., 2020) (Horne etal., 2023). A granulação úmida pode facilitar o contato entre o IFA, ou quaisquer substâncias relacionadas com
função amina, e os agentes nitrosantes, principalmente se essa etapa do processo ocorrer em uma faixa de pH
ideal (Horne et al., 2023). Embora os riscos associados à qualidade da água geralmente sejam considerados
baixos, é fundamental controlar adequadamente a qualidade da água e estimar a quantidade de nitrito, ou a
própria presença de nitrosaminas na água. A depender das condições, a formação de nitrosaminas pode tornarse significativa em valores de pH mais baixos (<7) em situações em que os níveis de nitrito estão acima do limite
máximo na água potável permitido pela OMS, que é de 3 mg/L (Answorth, 2020).
A degradação da ranitidina, que ocorre no produto acabado e que pode ser influenciada pela
morfologia do cristal da molécula, é um exemplo de formação de nitrosaminas que envolve a degradação do IFAe é influenciada por fatores diversos dos classicamente atribuídos a formação de nitrosaminas.
As embalagens já foram associadas a presença de NDMA e a NDEA, devido a reações entre asaminas presentes nas tintas de impressão e a nitrocelulose presente nas folhas de vedação das embalagens.
Durante o processo de selagem em alta temperatura, as nitrosaminas podem evaporar e contaminar outros
produtos farmacêuticos na embalagem.

5.

GERENCIAMENTO DE RISCO

Sugere-se que as empresas utilizem os princípios de gerenciamento de risco descritos no Guia
ICH Q9(R1) - Quality Risk Management (ICH 2023) como suporte na realização das análises de risco. Neste
presente guia propomos a realização desta análise em três etapas: Avaliação de Risco (1), Testes Confirmatórios
(2) e Controle de Nitrosaminas para Produtos Regularizados (3).
A Etapa 1 denominada Avaliação de Risco consiste na identificação e avaliação do risco deformação e presença de nitrosaminas. Sugere-se que esta etapa seja iniciada pela análise da rota de síntese do
IFA, que poderá ser feita pelo fabricante, distribuidor ou fracionador do IFA, detentor do registro do IFA (holder)ou ainda pela fabricante do medicamento, caso detenha a rota de síntese completa do ativo. O conhecimentoda síntese completa do IFA engloba o conhecimento das rotas de síntese dos materiais de partida, o controle
dos materiais e o conhecimento da rota de síntese em detalhes. Essas informações estão comumente nas partes
restritas do Dossiê do Insumo Farmacêutico Ativo (DIFA). Após essa avaliação, a empresa prosseguirá com aavaliação do processo produtivo do produto acabado e do potencial de formação de nitrosaminas durante todo
o prazo de validade.
Caso seja identificado risco de presença de nitrosaminas como resultado da Etapa 1, a empresa
deve prosseguir para a Etapa 2 e realizar os testes confirmatórios, a fim de confirmar ou refutar a presença denitrosaminas no IFA ou produto acabado, a depender da origem do risco. Nesta etapa, a empresa deve verificar
se a nitrosamina identificada e quantificada possui um limite de ingestão aceitável definido e publicado pela
Anvisa conforme Anexo I deste guia. Além dos limites apresentados no Anexo I deste guia, caso haja para anitrosamina em questão, limite harmonizado simultaneamente pela EMA, FDA e Health Canada, tal valor poderá
ser adotado pela empresa, desde que presente como nitrosamina única.
Caso a empresa discorde dos limites de nitrosaminas estabelecidos no Anexo I (Limites deaceitação para nitrosaminas) ou a impureza nitrosamina identificada ainda não tenha um limite de ingestão
aceitável harmonizado e publicado, deverá comunicar a Anvisa e propor novos limites com base em novas
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Guia nº 50/2021– versão 4, de 31/07/2024

evidências de segurança por meio de protocolo no sistema Solicita à GESEF (Gerência de Avaliação de Segurança
e Eficácia) utilizando o código de assunto 12194 - Avaliação de limite de segurança para nitrosaminas – Empresa.
Para realizar os ensaios, a empresa deverá utilizar procedimentos analíticos adequadamentesensíveis para a quantificação dessas impurezas. Considera-se ausência de nitrosaminas quando estas estiverem
abaixo de 10% do limite de ingestão aceitável, porém outras abordagens podem ser justificadas, não excedendo
o limite de 30%. Uma vez confirmada a presença de nitrosaminas a partir dos testes realizados na Etapa 2 aempresa deve dar andamento a Etapa 3 onde são definidos os controles de nitrosaminas em seus produtos.
Nas situações em que há identificação da presença de nitrosaminas acima dos limites aceitáveis,
a empresa deve adotar as ações de mitigação de risco necessárias e comunicar a Anvisa (Gerência de Inspeção
e Fiscalização – GGFIS) por meio do protocolo no sistema Solicita utilizando os seguintes códigos de assunto:
70788 - INSUMOS FARMACÊUTICOS ATIVOS - Notificação para Avaliação de Nitrosaminas acima dos Limites
Aceitáveis (fabricantes, distribuidoras e fracionadoras) (petição empresa) e/ou 70789 - MEDICAMENTOS Notificação para Avaliação de Nitrosaminas acima dos Limites Aceitáveis (fabricantes e importadoras).
Importante destacar que em todos os casos a empresa é a responsável por garantir a qualidadee segurança de seus produtos com a avaliação do risco da ingestão pelos pacientes e adoção das ações
apropriadas para evitar ou minimizar a exposição dos indivíduos às nitrosaminas, inclusive nas situações dediscordância com os limites descrito no Anexo I e no período até definição do limite pela Anvisa.
As ações de controle de risco devem incluir as mudanças relacionadas à(s) causa(s) raiz(es)identificada(s) na investigação, bem como avaliação da necessidade de adoção de medidas que restrinjam adisponibilidade do produto no mercado (por exemplo: suspensão de distribuição e comercialização,recolhimento) levando em consideração ações adotadas para mercados em outros países e aspectos como risco
de desabastecimento de mercado e disponibilidade de alternativas terapêuticas.
Para impurezas conhecidas acima do limite estipulado no Anexo I – Limites de aceitação dopresente Guia as empresas devem imediatamente suspender a distribuição e comercialização dos
medicamentos ou IFAs envolvidos, além de avaliar a necessidade de recolhimento que deverão ser tratados
conforme disposto nas Resolução RDC nº 677/2022 e nº 625/2022 e suas atualizações.
Por fim, havendo a confirmação de presença de nitrosaminas e, desde que dentro dos limites
aceitáveis, a empresa deve protocolar junto à Agência, caso aplicável, as respectivas petições pós-registro em
conformidade com a normativa aplicável a cada caso. As inclusões de teste são de implementação imediata ou
notificação imediata e realizadas mediante código assunto específico. Para as petições aplicáveis a
medicamentos e IFAs sintéticos e semissintéticos, deverão ser utilizados os seguintes códigos de assunto:•

12195 - GENÉRICO - Inclusão do teste crítico de controle de nitrosaminas no medicamento – RDC
677/2022•

12198 - GENÉRICO - Inclusão do teste de controle de nitrosaminas no IFA com CADIFA - RDC 677/2022•

12201 - GENÉRICO - Inclusão do teste de controle de nitrosaminas no IFA sem CADIFA - RDC 677/2022•

12197 - NOVO - Inclusão do teste crítico de controle de nitrosaminas no medicamento - RDC 677/2022•

12200 - NOVO - Inclusão do teste de controle de nitrosaminas no IFA com CADIFA - RDC 677/2022•

12196 - SIMILAR - Inclusão do teste crítico de controle de nitrosaminas no medicamento - RDC
677/2022•

12199 - SIMILAR - Inclusão do teste de controle de nitrosaminas no IFA com CADIFA - RDC 677/2022•

12202 - SIMILAR - Inclusão do teste de controle de nitrosaminas no IFA sem CADIFA - RDC 677/2022

Destaca-se que além da inclusão de testes, outras alterações pós-registro podem ser aplicáveis
a fim de mitigar o risco da presença de nitrosaminas. Os casos abaixo ilustram alguns exemplos de alteração
pós-registro necessárias conforme apontamentos da avaliação de risco:
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Exemplo 1: Após a identificação e avaliação de risco do produto X a empresa realizou testes
confirmatórios e verificou a presença de NDMA acima do limite aceitável. Segundo a avaliação de risco daempresa, a causa raiz da presença da nitrosamina foi a reação da nitrocelulose, componente da embalagem
primária, com uma amina presente em excipientes do produto durante o processo de fechamentodo blíster por
aquecimento. A fim de realizar a adequação do produto, a empresa propõe como alteração pós-registro uma
alteração de embalagem a fim de remover a nitrocelulose como componente do blíster. Para isso,realiza-se oprotocolo de uma alteração tipo 7.c (mudança maior de composição de embalagem primária) nos termos da
RDC nº 73/2016, a qual requer protocolo individual e deve aguardar manifestação da Anvisa. Considerando a
correta avaliação de risco realizada, a alteração permite adequação do produto em relação a presença denitrosaminas em níveis aceitáveis e não são necessárias alterações pós-registro adicionais ou paralelas.
Exemplo 2: Após a detecção e confirmação da presença de mais de uma nitrosamina atingindo
limites não aceitáveis, a detentora do registro, por meio de sua investigação, detecta que a causa raiz envolveo próprio IFA e provavelmente a presença de nitrosamina proveniente de solventes que foram utilizados na rotade síntese. Supondo que o fabricante de IFA aprovado optou por descontinuar o IFA em questão, a requerente
decide realizar alteração do fabricante de IFA para adequar o produto. Para esse caso deve ser considerada acondição da presença ou não de CADIFA nos termos da RDC nº 359/2020. Caso o fabricante proposto já tenha
CADIFA e sejam também atendidas as condições descritas na alteração 1.g - Substituição de detentor de CADIFA(implementação imediata) do Anexo I da RDC 361/2020, essa mudança poderá ser de implementação imediata.
Caso tais condições não sejam atendidas ou o fabricante proposto não possua CADIFA, a mudança deve aguardar
deferimento. Nesse caso, tendo em vista que a alteração do fabricante mitiga o risco de nitrosaminas que existia
devido ao fabricante aprovado, a avaliação de risco prévia pode justificar a não necessidade de pós-registrosparalelos adicionais, podendo ser suficiente realizar apenas a alteração do fabricante do IFA.
Exemplo 3: Conforme exemplo acima, a causa-raiz foi identificada como sendo uma nitrosamina
proveniente do processo de fabricação do IFA, porém nesse caso a empresa realizará uma mudança de processo
do IFA que eliminará esse risco. Para esse caso deve ser considerada a condição da presença ou não de CADIFA
nos termos da RDC nº 359/2020 e se a alteração envolve impacto no perfil de impurezas. Considerando oentendimento do Perguntas e Respostas da RDC 73 Edição 5 (Setembro 2023), de que a retirada de uma impurezanão se enquadra em impacto no perfil de impurezas, essa pode ser considerada de implementação imediata nos
termos da RDC nº 361/2020 desde que a mudança não impacte de outra forma no perfil de impurezas (ex.
gerando outra impureza) ou nas especificações do IFA (ex. mudando sua forma cristalina). Por exemplo, para ocaso de mudança de DIFA sem CADIFA, atendendo-se aos requisitos da norma, a alteração pode ser classificada
como uma alteração do tipo 1.d (Mudança do DIFA sem CADIFA (implementação imediata)). Nesse caso, assim
como no exemplo anterior, não haveria necessidade de pós-registros paralelos adicionais, sendo suficiente
realizar apenas a mudança de processo do IFA.
As alterações pós-registro devem ser protocoladas de acordo com a norma vigente, e contendo
toda a documentação pertinente. Assim, por exemplo, nos casos em que houver inclusão do teste de controlede nitrosaminas em IFA ou medicamento sintético, a petição será de protocolo individual e implementação
imediata, nos termos da RDC 73/2016. Já nos casos em que houver mudança na rota de síntese de IFA sintético
para mitigar o risco de formação de nitrosaminas, a mudança pode ser classificada como de análise prévia (adepender das condições no caso concreto), e o fato dela ter como objetivo a mitigação de risco de formação denitrosaminas não faz com que ela possa ser implementada antes da análise.
Quanto às nitrosaminas que ainda não tenham limite de aceitação definido, não se espera queseja protocolada uma mudança pós-registro de inclusão de teste até que os limites sejam aprovados pela
ANVISA. Entretanto, ressalta-se que a empresa detentora do registro deve adotar as medidas de controle
necessárias e realizar o teste o mais rapidamente possível após a identificação de sua necessidade.
É importante mencionar que toda documentação relacionada ao gerenciamento de risco denitrosaminas deve ser arquivada na empresa e a qualquer tempo poderá ser requerida pela Agência ou
verificada durante inspeções de Certificação de Boas Práticas de Fabricação (CBPF), inspeções investigativas ou
auditorias de registro.
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A Figura 12 apresenta síntese das etapas relacionadas a avaliação de risco e as ações necessárias
decorrentes do risco identificado.

Figura 12 - Etapas relacionadas a avaliação de risco e as ações necessárias decorrentes do risco identificado.

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6.

FATORES DE PRIORIZAÇÃO PARA AVALIAÇÃO DE RISCO (ETAPA 1)

Sabe-se que a quantidade de medicamentos registrados por uma empresa pode ser expressivae, por este motivo, sugere-se que a sequência de avaliação dos produtos seja estabelecida com base no
conhecimento prévio sobre eles. As empresas podem considerar fatores como ingestão diária recomendada,
duração do tratamento, indicação terapêutica, números de pacientes tratados ou outros que entendam
pertinentes de acordo com o portifólio ou com a situação do produto. Por exemplo, a ausência decomercialização de determinado produto ou de determinada condição que esteja aprovada (como um
fabricante de IFA alternativo que seja aprovado, mas não seja utilizado pela empresa) podem justificar que esta
avaliação não seja priorizada em um primeiro momento. Porém, nos casos em que determinada condição
aprovada não foi avaliada quanto ao risco de conter nitrosaminas, pois não estava sendo comercializada, aanálise de risco deverá ser realizada antes do reinício da comercialização.
O Quadro 2 apresenta um exemplo de priorização, utilizando os critérios “Duração do tratamento
versus Dose Máxima Diária”, o qual foi proposto pelas entidades representativas do Setor Farmacêutico
Brasileiro em resposta ao “Painel de Discussão sobre o controle de Nitrosaminas em medicamentos”, realizado
no dia 5 de fevereiro de 2020 no Auditório da Anvisa.

Dose Máxima Diária> 1 anoMuito Alto
Alto
Médio

>1000mg
100mg a 1000mg<100mgDuração do tratamento
1 a 12 meses
Alto
Médio
Baixo

≤ 1 mês
Médio
Baixo
Muito Baixo

Quadro 2 - Priorização por Duração de tratamento X Dose Máxima Diária.

Para realizar a avaliação de medicamentos com risco identificado, as empresas também podem
utilizar ferramentas como a Análise de Modo de Falha e seus Efeitos (FMEA) e a Análise de Modo de Falha,
Efeitos e Criticidade (FMECA), conforme descrito na diretriz do Guia ICH Q9 (R1) - Quality Risk Management (ICH2023).

a)Componentes básicos

Espera-se que os fabricantes, distribuidoras e fracionadoras de IFAs e empresas fabricantes eimportadoras de medicamentos trabalhem em conjunto e realizem as avaliações de risco utilizando os princípios
de gerenciamento da qualidade. Ademais, o resultado do trabalho realizado deve ser baseado em conhecimento
científico sempre vinculando a proteção do paciente e observando que o nível de esforço, formalidade edetalhamento da documentação seja proporcional ao nível de risco.
Além disso, os princípios descritos no Guia ICH M7(R2) - Assessment and Control of DNA Reactive(Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk (ICH 2023) em relação à avaliação
de mutagenicidade, estratégias de controle e alterações nos processos de fabricação de substâncias ativas
podem ser aplicados.
É relevante pontuar que caso o risco de formação de nitrosaminas tenha sido avaliado durantea fase de desenvolvimento dos processos de fabricação de IFA/produto acabado, estas informações poderão
ser usadas para fundamentar a avaliação de que trata o presente guia.
Finalmente, ao término da Etapa 1, as empresas devem ter argumentos suficientes para
responder aos seguintes questionamentos:•

Qual o risco de formação de nitrosaminas no processo sintético do IFA, levando em consideração a
combinação de reagentes, solventes, catalisadores e materiais de partida usados, intermediários
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formados, impurezas e degradantes?

b)•

Qual o risco de contaminação por nitrosaminas (por exemplo, de materiais recuperados, comosolventes, reagentes e catalisadores, equipamentos, materiais de partida ou intermediários)?

•

Qual o risco de formação de nitrosaminas durante a fabricação do produto acabado ou durante oarmazenamento ao longo da sua vida útil (por exemplo, possível degradação ou interação com
excipientes e material de embalagem)?

Avaliação de purga

Caso seja verificada a presença de risco potencial de formação de nitrosaminas no processo
sintético do IFA, levando em consideração os reagentes, solventes, catalisadores, materiais de partida,intermediários formados e outras impurezas, pode ser realizada uma avaliação pormenorizada de todo oprocesso de obtenção do fármaco no que tange às possibilidades de eliminação/purga da(s) nitrosamina(s)potencialmente presente(s).
Nessa análise, caso o domínio do processo de obtenção do IFA, e seus parâmetros associados,seja tal que permita determinar que o risco da presença da(s) nitrosamina(s) acima do(s) limite(s) máximo(s)permitido(s) seja negligenciável, a estratégia de controle poderá ser baseada apenas no controle do processo,
não sendo necessários testes analíticos. Essa estratégia é análoga a opção 4 do Guia ICH M7.
Para que tal estratégia de controle seja aceitável, é necessária uma análise de risco formal,
considerando as propriedades físico-químicas da(s) nitrosamina(s) em questão e os fatores do processo deobtenção do IFA que impactam no destino e na eliminação/purga da(s) nitrosaminas, incluindo reatividade
química, solubilidade, volatilidade, ionizabilidade e processos especificamente desenvolvidos para remoção
da(s) nitrosamina(s) em questão. É crucial que fique claramente registrado, e prontamente disponível à Anvisa,
todos os fatores considerados pela empresa e que subsidiaram a estimativa de eliminação em cada etapa doprocesso. Esse tipo de análise deve ser necessariamente conduzido por pessoal qualificado que detenha oconhecimento do processo de obtenção do IFA, a fim de evitar estimativas de purga erradas em virtude da falta
de conhecimento do processo específico ou aplicação errônea dos fatores de eliminação e demais conceitos
aplicáveis e descritos em literatura. O resultado da análise de risco deve estimar um fator de eliminação/purgada(s) nitrosaminas contaminante(s) em questão.
Estudos de contaminação/eliminação poderão ser empregados como forma de evidência dacapacidade do processo em eliminar/purgar a(s) nitrosamina(s) em questão. Quando não for possível
determinar a ausência, ou a presença em níveis negligenciáveis, a partir da análise de risco/fator de purga
estimado, a estratégia de controle deverá incluir testes analíticos no IFA ou em intermediários isolados.
Algumas publicações científicas estão disponíveis e podem ser consultadas para orientar quantoàs melhores práticas de cálculo do fator de purga, estabelecendo requisitos necessários para justificar aeliminação da impureza, inclusive para casos envolvendo nitrosaminas, e podem ser utilizadas como referência
nessa etapa, por exemplo: Teasdale et al. 2010, Teasdale et al. 2013, Barber et al. 2017, Burns et al. 2019, Burns
et al. 2020.

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7.

TESTES CONFIRMATÓRIOS (ETAPA 2)a)

Método analíticoAssim como para outras impurezas, a avaliação laboratorial da presença de nitrosaminas requera aplicação de procedimentos analíticos sensíveis e seletivos, sendo muitas vezes necessária a associação dediferentes técnicas analíticas como de separação cromatográfica associadas à identificação e quantificação por
espectrometria de massas, por exemplo.
Embora a Farmacopeia Brasileira ainda não disponha de método de análise de nitrosaminas,
vários procedimentos têm sido desenvolvidos e tornados públicos inclusive por autoridades regulatórias comoa Agência Europeia de Medicamentos – EMA (EDQM 2020), Agência Americana de Medicamentos e Alimentos- FDA (FDA 2019) e Agência Canadense de Medicamentos - Health Canada (Health Canada 2019).
Há que se considerar também as farmacopeias estrangeiras admitidas no Brasil, conforme a
Resolução RDC nº 511, de 27 de maio de 2021 ou suas atualizações. Estes métodos, caso disponíveis, podem serutilizados pelas empresas como base para a análise de seus produtos.
Considerando os aspectos relacionados à formação destes contaminantes e o catálogo deprodutos da empresa, uma estratégia a se considerar é o desenvolvimento pela empresa de método geral eabrangente que possa ser adequado tanto para análise de insumos ativos, excipientes, como dos produtos
acabados em seus diferentes estágios (produção, estudos de estabilidade e outros). Porém, tendo em vista aespecificidade de cada produto e os diferentes tipos de matriz, um único método para todos os casos pode não
ser possível.
Ressalta-se que, independentemente da estratégia adotada e das adequações realizadas, ométodo de uso deve atender aos critérios estabelecidos na legislação vigente, a Resolução RDC n° 166, de 24 dejulho de 2017, que dispõe sobre validação de métodos analíticos, ou suas atualizações, ou o Guia ICH Q2(R2)(2023) Validação de Procedimentos Analíticos. Neste sentido, destaca-se, mas não se restringe, a necessidadede se observar os limites de detecção ou quantificação e de seletividade, principalmente quando este foraplicável a diferentes matrizes de análise. Importante destacar que a validação analítica deve ser planejada
considerando os dados disponíveis para o produto. Com isso se poderá concluir pela possibilidade de utilização
de validação parcial, ensaio limite, ou mesmo a necessidade de execução de testes adicionais, entre outras
situações.
Há relatos de formação de nitrosaminas inclusive nas etapas de preparação de amostras bem
como de interferência na análise por solventes comumente utilizados na rotina laboratorial. Portanto, a
preparação adequada da amostra é uma etapa crítica na avaliação destes analitos, seja em razão da perda deimpurezas ou da geração dessas durante essa etapa (EMA 2020, King et al. 2020).

b)

Lotes a serem tratados

A etapa em que a nitrosamina será testada (intermediário, IFA ou produto acabado) dependeda origem da impureza. Por exemplo, quando for necessário o teste confirmatório para impurezas provenientes
do processo de fabricação do IFA, estas podem ser testadas no IFA ou em um intermediário do processo, casosua origem seja anterior a esse intermediário. Já se a impureza for de degradação, recomenda- se que os testes
sejam realizados em amostras que representem o produto durante sua validade, por exemplo, lotes submetidos
aos estudos de estabilidade, amostras próximas ao vencimento, dentre outras. Nesse caso, o teste se faz
aplicável tanto no IFA como no produto acabado.
Os ensaios de quantificação dos lotes de IFA feitos pelo fabricante do IFA poderão ser utilizados
pelo detentor do registro do medicamento desde que haja uma avaliação crítica dos resultados, e que ofabricante tenha sido qualificado conforme legislação de Boas Práticas de Fabricação vigente. No entanto, issonão exime a necessidade de avaliação do risco no produto acabado, visto que a formação do contaminante pode
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ocorrer em diversas etapas do processo de produção.
Em relação ao número de lotes que serão testados, este deve ser definido pela avaliação derisco da empresa, conforme recomendações abaixo:••

Para medicamentos registrados, devem ser apropriadamente amostrados e testados, no mímimo, 10% dos lotes anuais, ou 3 lotes por ano, o que for maior.
o

Se menos de 3 lotes forem produzidos no ano, todos os lotes fabricados devem ser testados.

oSe mais de um fabricante, processo de fabricação e/ou fontes de materiais relacionados ao
risco forem utilizados, mais lotes devem ser testados a fim de cobrir todos os fatores de risco.

oQuando a(s) nitrosamina(s) for(em) impureza(s) de degradação, minimamente 3 lotes
representativos do produto durante todo seu prazo de validade devem ser testados.

oOutras abordagens tecnicamente justificadas poderão ser aceitas.

Para novo registro ou petição pós-registro, o o número de lotes testados deve ser condizente com aquantidade requerida pela RDC vigente.
o

•

8.

Além disso, devem ser observados também o quantitativo de lotes requerido no parágrafo
anterior. Por exemplo, para petições que solicitam menos de três lotes, a implementação serácondicionada ao compromisso da empresa em testar os lotes de implementação também
posteriormente, a fim de completar os 3 lotes necessários. Esses dados devem estar
disponíveis para apresentação à Anvisa, quando solicitado ou durante inspeção.

Quando o fabricante do medicamento necessitar realizar a análise do IFA, o número de lotes deve serdefinido pela avaliação de risco da empresa.

ESTRATÉGIA DE CÁLCULO PARA ATRIBUIÇÃO DE LIMITES DE ACEITAÇÃO

Os compostos N-nitrosos são agentes genotóxicos carcinogênicos do grupo denominado “Grupode Preocupação” ou Cohort of Concern. Trata-se de impurezas mais potentes que a maioria dos demais
compostos mutagênicos, portanto, o uso do limite baseado no conceito por “Limiar de Preocupação
Toxicológica” ou TTC (Threshold of Toxicological Concern) estabelecido no Guia ICH M7(R2) de 1,5µg/dia não é
aplicável .
Conforme descrito no Guia ICH M7(R2), para tais compostos espera-se que a ingestão aceitável
seja significativamente menor do que para as demais impurezas potencialmente mutagênicas, de forma que oestabelecimento do limite deve idealmente ser feito caso-a-caso, utilizando, por exemplo, dados decarcinogenicidade de compostos estruturalmente semelhantes.
No ano de 2023, foram desenvolvidas e implementadas estratégias que auxiliam a avaliação desegurança de nitrosaminas, sendo estas amplamente divulgadas por outras Agências, e que são aceitas pela
Anvisa.
A abordagem de categorização da potência carcinogênica (CPCA, do inglês Carcinogenic Potency
Categorization Approach) consiste em um modelo desenvolvido a partir de banco de dados de N-nitrosaminas
e de princípios de relação estrutura-atividade (SAR) e é uma ferramenta adotada pela Anvisa para a derivação
de limite para N-nitrosamina, sendo o AI (acceptable intake) adequado quando se tratar de nitrosamina única.
Para compostos que não possuem dados específicos de carcinogenicidade, trata-se de uma abordagem
conservadora e que representa a melhor evidência disponível no momento, podendo ser refinada à medida quemais dados foram disponibilizados (Anexo II). O detalhamento do desenvolvimento da ferramenta pode serconsultado em Kruhlak et al. (2024).
O teste de Ames otimizado (EAT, do inglês Enhanced Ames Test) define condições para tornar o
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teste de Ames descrito no guia 471 da OECD mais sensível para classificar N-nitrosaminas como positivas paramutagenicidade. As condições foram definidas baseadas na publicação de autoria de Li et al. (2023). O resultado
negativo para mutagenicidade do teste de Ames otimizado implica em AI de 1500 ng/dia para a nitrosamina
testada quando se tratar de nitrosamina única (Anexo III).
As abordagens de avaliação do risco descritas no presente Guia se aplicam para todas as vias deadministração, e correções de limites para diferentes vias de administração não são aplicáveis. Os casos em que
dados científicos justificarem particularidades de uma via de administração específica devem ser avaliados
individualmente.
Para produtos destinados ao câncer avançado apenas conforme definido no escopo da diretriz
ICH S9 (2009), as impurezas N-nitrosaminas devem ser controladas de acordo com as diretrizes ICH Q3A (R2) e
ICH Q3B (R2). Se a própria substância ativa for mutagênica ou clastogênica em concentrações terapêuticas, as
impurezas N-nitrosaminas devem ser controladas em limites para impurezas não mutagênicas de acordo com oguia ICH M7(R2).
Quando determinada nitrosamina resultar em negativo no teste de mutagenicidade in vivo
(Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assay, guia 488 da OECD), os limites de controle dos
guias ICH Q3A(R2) e ICH Q3B(R2) podem ser aplicados, após manifestação da GESEF.
A determinação dos limites aceitáveis ou AI (acceptable intake) das nitrosaminas listadas nesse
guia foi embasada na orientação de cálculo específico para cada composto disposta no Guia ICH M7(R2) e
harmonizada com os limites já aceitos por outras autoridades regulatórias (EMA 2020b, EMA 2023, FDA 2020),
os quais, por sua vez foram obtidos a partir de estudos de carcinogenicidade em animais, de racional subsidiado
por similaridade estrutural, por CPCA ou por testes de mutagenicidade. Os limites para algumas nitrosaminas
conhecidas são descritos no Anexo I.

a)Limites para nitrosamina única

A determinação dos limites aceitáveis ou AI (Acceptable Intake) das nitrosaminas listadas nesse
guia foi embasada na orientação de cálculo específico para cada composto disposta no Guia ICH M7(R2) e
harmonizada com os limites já aceitos por outras autoridades regulatórias (EMA 2020b, EMA 2023, FDA 2020 e
atualizações),os quais, por sua vez foram obtidos a partir de estudos de carcinogenicidade em animais , deracional subsidiado por similaridade estrutural, por CPCA ou por testes de mutagenicidade. Os limites para
algumas nitrosaminas conhecidas são descritos no Anexo I.
Esses valores de ingestão aceitável se aplicam para produto acabado contendo apenas uma
nitrosamina. O limite determinado para um produto específico em ppm pode ser calculado por meio da razão
da ingestão aceitável (em ng) pela Dose Máxima Diária (DMD) do produto (em mg). Por exemplo, considerando
a dose máxima diária de metformina de 2.550 mg e o limite de 96 ng para a NDMA, temos 0,038 ppm (96/2.550)
como limite diário aceitável.
Os valores de ingestão aceitável previstos nesse guia, especialmente os calculados baseados emrelação estrutura-atividade, são limites interinos, considerando as melhores evidências disponíveis no momento
da publicação desse guia. Esses limites podem ser alterados no caso de disponibilidade de novas evidências
científicas para esses compostos.
Caso a empresa decida propor limites superiores aos apresentados no Anexo I, deverá
apresentar as evidências de segurança que subsidie o limite proposto por meio do código de assunto 12194 Avaliação de limite de segurança para nitrosaminas – Empresa.

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b)

Mais de uma nitrosamina

Considerando o caso da detecção de mais de uma nitrosamina no mesmo produto, duasalternativas podem ser utilizadas para definir o limite da soma das nitrosaminas:Opção 1: a soma de todas as nitrosaminas presentes no produto não deve ultrapassar o limite de aceitação
referente à nitrosamina mais potente dentre as presentes.
Opção 2: os limites individuais de cada nitrosamina são ajustados para assegurar que o risco total da exposição
a elas não ultrapasse o risco negligenciável.
A opção 2 considera uma abordagem baseada em risco para aceitar a presença de múltiplas
nitrosaminas, desde que seja demonstrado que o risco final não exceda a razão de 1:100.000, definida no Guia
ICH M7(R2) como risco aceitável de câncer. Assim, caso mais de uma nitrosamina precise ser controlada na
especificação do IFA ou do produto acabado, deve-se estabelecer um limite para a soma dessas nitrosaminas, oqual deve assegurar a manutenção do risco negligenciável. Um exemplo de cálculo considerando a opção 2 édescrito na Figura 13.
Essas abordagens são apenas aplicáveis caso mais de uma nitrosamina esteja de fato presentee necessite ser controlada na especificação do IFA ou produto acabado. Caso exista a possibilidade teórica dapresença de nitrosaminas, mas que tenham sua ausência demonstrada e que não necessitem ser controladasna especificação, o limite para nitrosaminas totais não deve considerar tais impurezas.
Exemplo:Para um IFA que contém apenas NDEA, o limite aceitável de 26,5 ng/dia corresponde ao risco de 1:100.000.
Por outro lado, caso ele contenha apenas NDMA, o limite aceitável de 96 ng/dia corresponde a esse mesmo
risco de 1:100.000.
Em outro cenário, para um IFA que contenha ambas as nitrosaminas, caso fossem mantidos os limites
originais, o risco corresponderia à soma de ambas, portanto o dobro do risco inicial - maior que o risco
negligenciável. Assim, para que o risco seja mantido em 1:100.000, os limites das nitrosaminas devem ser
reduzidos em proporções que assegurem um risco final total negligenciável, conforme descrito abaixo:
Caso o limite de cada uma seja reduzido para 50% do valor original (13,25 ng/dia para NDEA e 48 ng/dia para
NDMA), cada uma representará 50% do risco inicial, e a soma de ambas equivalerá ao risco negligenciável(1:100.000). Alternativamente, proporções variáveis entre os limites individuais estabelecidos para cadanitrosamina podem ser empregadas, por exemplo, 30% do limite de NDEA (7,95ng/dia) e 70% do limite
estabelecido para NDMA (67,2 ng/dia), conforme representado na Figura 13.

Figura 13 - Exemplo de estabelecimento de limites para mais de uma nitrosamina.

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Guia nº 50/2021– versão 4, de 31/07/2024

c)Nitrosaminas novas

Durante a avaliação de risco ainda há possibilidade de serem encontradas outras nitrosaminas,
potenciais ou reais, além das listadas no Anexo I. Frente à ausência de limites específicos, recomenda-se uma
abordagem semelhante à realizada previamente para as nitrosaminas com limites listados nesse guia, com adeterminação de limite específico baseado em estudos de carcinogenicidade, quando disponíveis. Nos casos em
que estudos de carcinogenicidade não estejam disponíveis, recomenda-se a derivação de um limite a partir daabordagem CPCA, preferencialmente. A comparação da relação estrutura-atividade (Structure Activity
Relationship - SAR) com nitrosaminas conhecidas segue como estratégia válida. A aplicação de um TTC específico
para a classe das nitrosaminas também pode ser adotada.
Para a determinação de limite baseado na TD50 de estudos de carcinogenicidade, esses devem
atender a critérios de qualidade e robustez como descrito no Guia ICH M7(R2), por exemplo, estudos com
múltiplas doses (pelo menos 3 grupos) e 50 animais por dose por sexo. Os estudos utilizados para o fim de
determinação do limite serão avaliados caso a caso, ainda que a média harmônica da TD 50 esteja apresentada
na Carcinogenicity Potency Database (CPDB).
Na ausência de estudos robustos que possam subsidiar esse limite, a abordagem SAR segueválida, desde que haja uma análogo adequado para a comparação, e que este composto possua a TD 50 cujo
limite tenha sido derivado a partir de estudo de carcinogenicidade robusto com a estrutura mais similar ao
composto em análise. O uso da abordagem SAR deve ser cientificamente justificado e adequadamente
documentado.
Por fim, como alternativa à derivação de um limite baseado em SAR, o TTC específico para aclasse das nitrosaminas pode ser aplicado. Com base no conhecimento científico e nos dados disponíveis até omomento, o TTC para a classe das nitrosaminas corresponde a 18 ng/dia. Esse valor corresponde ao 5º percentil
dos valores de TD50 para 45 nitrosaminas disponíveis na base de dados sobre carcinogenicidade LCDB (doinglês: Lhasa Limited Carcinogenicity Database) (LhasaLimited 2020), cuja metodologia para derivação da TD50
foi publicada por Thresher e colaboradores (2019).
Apesar de haver dados de carcinogenicidade para um número maior de nitrosaminas na basede dados Carcinogenicity Potency Database - CPDB, de onde se extraíram os dados utilizados para adeterminação do TTC geral para carcinógenos genotóxicos (1,5 µg/dia), os valores de TD 50 da LCDB foram
calculados selecionando apenas estudos que atendiam critérios adicionais de qualidade. Dentre esses critérios
estão a remoção de dados para os quais não existe dose-resposta ou as curvas dose-resposta não são lineares,
exclusão de estudos com um único grupo e de valores de TD50 acima de 1.000.000 mg/kg (Thresher et al. 2019).
Mais recentemente, Thomas et al. (2021) corroboraram a aplicabilidade de uso da base de dados
LCBD considerando apenas estudos mais robustos e da derivação do 5º percentil de modo estatisticamente maisconservador. Os autores discutem que o limite de 18 ng/dia permite considerar um limite de confiança queestime as incertezas e as diferentes potências da classe das nitrosaminas.
A empresa deverá comunicar a Anvisa nos casos de identificação de nova nitrosamina (nãocontemplada no Anexo I e não listada com o limite harmonizado nas páginas da FDA, EMA e Health Canada,simultaneamente, e apresentar evidência baseada em segurança para definição do seu limite por meio deprotocolo no sistema Solicita utilizando o código de assunto 12194 - Avaliação de limite de segurança para
nitrosaminas – Empresa.

d)Abordagem Less Than Lifetime

O termo “Less Than Lifetime” é traduzido livremente para “menos que a vida toda”. Essa
abordagem corresponde à possibilidade de se estabelecer limites maiores para impurezas potencialmente
mutagênicas quando a duração do tratamento se der por períodos menores do que uma vida toda.
Isso significa que os limites variam conforme a duração do tratamento, baseado em um conceito
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fundamental da toxicologia estabelecido pela Lei de Haber:
Concentração x Tempo = Constante
Portanto, o efeito carcinogênico é baseado tanto na dose como na duração da exposição. Esse
conceito é estabelecido na Nota 6 do ICH M7 (R2) (ICH 2023). Com base nesse conceito, foram estabelecidos no
ICH M7 (R2) (ICH 2023) valores de TTC que variam conforme a duração do tratamento, sendo que aos limites
maiores do que os limites definidos para uma vida toda (lifetime ou acima de 10 anos) foram ainda incorporados
fatores de segurança para mitigar o risco de efeitos agudos que poderiam acontecer, como uma possível
saturação das enzimas de reparo do DNA.
No caso das nitrosaminas, o TTC de 1,5 µg/dia não é aplicável devido à sua maior potência,
enquadrando-as no grupo de preocupação (cohort-of-concern). Porém, o Guia ICH M7(R2) não expressa queseus conceitos, como a abordagem LTL, não sejam aplicadas para os compostos enquadrados nesse grupo.
A aplicabilidade do conceito de LTL para nitrosaminas tem sido discutida internacionalmente,no entanto, ainda não há consenso sobre a segurança de sua utilização como ponto de partida para o cálculo delimites aceitáveis. Desta forma, métodos analíticos devem ser desenvolvidos e validados para que sua
sensibilidade (limite de quantificação) seja adequada para as concentrações apresentadas nas situações (a), (b)e (c) do item 8 deste guia e a ausência de nitrosaminas durante os testes confirmatórios, discutida no item 5
desse guia, não deve ser baseada nos limites obtidos através da abordagem LTL. Dada a falta de evidência
científica robusta nesse momento, questiona-se a possibilidade de exceder os mecanismos de reparo do DNA,
especialmente considerando outras possíveis fontes de nitrosaminas, como polifarmácia, exposição alimentar
e ambiental, aumentando consideravelmente o risco de carcinogênese ao aplicar esses fatores para as
nitrosaminas (EMA, 2020b).
Dessa forma, a Anvisa recomenda que a abordagem LTL não seja aplicada como ponto de partidapara o estabelecimento do limite de segurança de nitrosaminas. Este posicionamento é também adotado por
outras Agências, notadamente a EMA (pergunta 10 da revisão 20) (EMA, 2024).

9.

GLOSSÁRIO

Análise de risco: processo que consta de três componentes, sendo eles (1) avaliação de risco, (2) gerenciamentode risco e (3) comunicação de risco.
Abordagem Less than Lifetime: avaliações estabelecidas para risco de câncer baseadas nas exposições quando
essas são menores que a vida toda (70 anos).
Cohort-of-concern: grupo de agentes cancerígenos mutagênicos de alta potência que compreende compostos
semelhantes a aflatoxina, N-nitroso- e alquil-azóxicos.
Ingestão aceitável: um nível de ingestão que apresenta risco desprezível de câncer, ou para indicações sérias/
com risco de vida, em que o risco e o benefício são adequadamente equilibrados.
Limiar de preocupação toxicológica, do inglês Threshold of Toxicological Concern – TTC: conceito desenvolvido
para definir uma ingestão aceitável para qualquer substância química não estudada que represente um risco
negligenciável de carcinogenicidade ou outros efeitos tóxicos.
Limite aceitável: concentração máxima aceitável de uma impureza em uma substância medicamentosa ou
medicamento, derivada a partir da ingestão aceitável e da dose diária do medicamento.
Material: termo usado para denotar matéria-prima (materiais de partida, reagentes, solventes), materiais
auxiliares, intermediários, insumos farmacêuticos ativos e materiais de embalagem e rotulagem.
NDSRIs: Do inglês Nitrosamine Drug Substance Related Impurities – referem-se a nitrosaminas complexas ou
relacionadas estruturalmente ao IFA.
Produtos regularizados/produtos: medicamentos e insumos farmacêuticos ativos (IFA) registrados, notificados
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ou cadastrados.
(Q)SAR e SAR: refere-se à relação entre a (sub)estrutura molecular de um composto e sua atividade mutagênica
usando Relações Estrutura-Atividade (Quantitativas) derivadas de dados experimentais.
Risco negligenciável: risco correspondente a uma incidência de câncer de 1 em 100.000.
TD50: Taxa de dose crônica em mg/kg de peso corporal/dia, que causaria tumores em metade dos animais no
final de uma vida útil padrão para a espécie, levando em consideração a frequência desse tipo de tumor nos
animais de controle.

10.

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ANEXO I: Limites de aceitação para nitrosaminas
Esses valores de ingestão aceitável se aplicam para IFA ou produto acabado contendo apenas
uma nitrosamina.
Nitrosamina(sigla)Nomenclatura

CAS

NDMA
NDEA
NMPA
NPIP
NTHP
NMPEA
NTHP
NDBA
NDPA
NMOR
NNK
NDELA
NPYR
Y101
NMPH
NDLX
NNORT
NDPh
EIPNA
DIPNA
NMBA
MeNP
NNV
NTTP
NNEB
NBP
-

dimetilnitrosamina
dietilnitrosamina
fenilmetilnitrosamina
nitrosaminapiperidina
nitrosaminatetraidropiridina
metilfeniletilnitrosamina
nitrosaminatetraidropiridina
dibutilnitrosamina
dipropilnitrosamina
nitrosomorfolina
butanonapiridinilmetilnitrosamina
dietanolaminanitrosamina
nitrosaminapirrolidina
nitrosaminaoctaidrociclopentapirrol
metilfenidatonitrosamina
nitrosaminaparoxetina
duloxetinanitrosamina
fluoxetinanitrosamina
nitrosaminanortriptilina
difenilaminanitrosaminaácido mefenamiconitrosamina
etilisopropilnitrosamina
di-isopropilnitrosamina
carboxipropilmetilnitrosamina
metilnitrosopiperazina
nitrosovareniclina
trifluormetiltetraidrotriazolnitrosopirazina
nitrosaminarasagilina
pramipexolnitrosamina
diclofenaconitrosamina
nebivololnitrosamina
bisoprololnitrosamina
ciprofloxacinonitrosamina
moxifloxacinonitrosamina
atenololnitrosamina
betaistinanitrosamina
vildagliptinanitrosamina
desloratadinanitrosamina
fenilefrinanitrosamina
buproprionanitrosamina
bumetanidanitrosamina

62-75-955-18-5
614-00-6
100-75-455556-92-813256-11-655556-92-8
924-16-3
621-64-7
59-89-2
64091-91-4
1116-54-7
930-55-2
54786-86-6
55557-03-4
2361294-43-9
2680527-91-5
150494-06-755855-42-0
86-30-62114-63-8
16339-04-1
601-77-4
61445-55-4
16339-07-4
2755871-02-22892260-32-9
2470278-90-9
66505-80-4
1391051-68-5
2820170-76-9864443-44-7
134720-04-0
32635-81-7
1246819-22-6
78658-64-7
2763780-10-3
2490432-02-3

Ingestão
aceitável
(ng/dia)
96,01
26,51
34,31
1.3001
371
81
371
26,52
26,52
127,031003
1.90031.700317004
1.30051.30051006
1006
87
78.0008
78.0009
40010
150010150010
40010
40010
10010
10010
40010
1500101500101500101500101500101500101810
150010
40010
10010
15001015001030

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Nitrosamina(sigla)Nomenclatura

CAS

Ingestão
aceitável
(ng/dia)

NHCTZ
NDAB

hidroclorotiazidanitrosamina
azitromicinanitrosamina
desmetilazitromicinanitrosamina
dabigatrananitrosamina

63779-86-2
2892260-29-4

11
11
11

150012

Quadro 1 - Limites de aceitação para nitrosaminas quando presentes como nitrosamina única
Limite calculado a partir do TD50 obtido pela média harmônica dos estudos de carcinogenicidade listado na base dedados Carcinogenicity Potency Database (CPDB) disponível em https://files.toxplanet.com/cpdb/index.html
2
Limite estabelecido com base em estratégia de relação estrutura-atividade SAR com NDEA.
3 Limite baseado no valor de TD
50 mais sensível derivado do estudo de TD50 mais robusto disponível na base de dados CPDB ou
LCDB
4 Limite derivado utilizando SAR e abordagem read-across tendo o valor de TD de NPYR como ponto departida50
5 Limite derivado utilizando SAR e abordagem read-across tendo o valor de TD
50 de NPIP como ponto de partida
6
Limite derivado utilizando SAR e abordagem read-across tendo o valor de TD50 de NNK como ponto de partida
7
Limite derivado utilizando SAR e abordagem read-across tendo o valor de TD50 de NMPEA como ponto de partida
8
Limite baseado no valor de TD50 mais sensível derivado do estudo de TD50 mais robusto disponível na base de dados CPDB com
aplicação do intervalo de confiança inferior ((% CI) do TD50 estimado (TD50L01))
9 Limite derivado utilizando SAR e abordagem read-across tendo o valor de TD de NDPh como ponto de partida50
10Limite derivado utilizando CPCA
11
Tratada como não mutagênica e controlada de acordo com os guias ICH Q3A(R2)/Q3B(R2)
12Limite baseado em teste de Ames negativo
1

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ANEXO II: Abordagem de Categorização de Potência Carcinogênica para Nnitrosaminas - CPCA
Este documento descreve uma abordagem para atribuir a uma impureza N-nitrosamina(incluindo nitrosaminas relacionadas estruturalmente ao insumo farmacêutico ativo (IFA), do inglês: nitrosamine
drug substance-related impurities [NDSRIs]), uma categoria de potência carcinogênica prevista, com um limite
de ingestão aceitável (AI, do inglês acceptable intake) correspondente, com base em uma avaliação decaracterísticas estruturais ativadoras ou desativadoras presentes na molécula. No contexto deste documento,
características ativadoras ou desativadoras são definidas como subestruturas moleculares associadas a um
aumento ou diminuição, respectivamente, na potência carcinogênica.
Este documento está harmonizado com a Carcinogenic Potency Categorization Approach (CPCA)
adotada por outras agências, como a EMA, FDA, Health Canada.
A Abordagem de Categorização da Potência Carcinogênica (CPCA) é baseada em conceitos derelação estrutura-atividade (SAR) descritos em publicações científicas recentes para compostos de Nnitrosamina1 e também usa um conjunto de N-nitrosaminas com valores TD50 obtidos de estudos em ratos daCarcinogenic Potency Database (CPDB) e/ou da Lhasa Carcinogenicity Database (LCDB)2, classificações depotência relativa conforme definido por Rao et al. (1979)3. A abordagem pressupõe que o mecanismo de αhidroxilação de ativação metabólica4 é responsável pela resposta mutagênica e carcinogênica altamente
potente observada em muitas N-nitrosaminas. Espera-se que características estruturais que aumentem ou
diminuam diretamente a favorabilidade do mecanismo de ativação - ou que aumentem a depuração da Nnitrosamina por outras vias biológicas - devam ter um efeito correspondente na potência carcinogênica.
Portanto, uma previsão do potencial mutagênico e da potência carcinogênica de uma N-nitrosamina pode ser
gerada com base em suas características estruturais.
Reconhece-se que a ciência está evoluindo na previsão do potencial mutagênico e da potência
carcinogênica com base em conceitos de relação estrutura-atividade (SAR). Portanto, a Abordagem deCategorização da Potência Carcinogênica prevista descrita neste documento é uma abordagem conservadora
que representa a melhor ciência disponível no momento e espera-se que seja ainda mais refinada e expandidaà medida que novos dados estiverem disponíveis. Isso pode incluir o aprimoramento dos limites de AI associados
às categorias de potência carcinogênica previstas e alterações nas características estruturais e suas pontuações
de características ativadoras e desativadoras associadas.
A Abordagem de Categorização da Potência Carcinogênica se aplica a N-nitrosaminas com umátomo de carbono em ambos os lados do grupo N-nitroso e onde o carbono não está diretamente ligado
duplamente a um heteroátomo (ou seja, N-nitrosamidas, N-nitrosoureias, N-nitrosoguanidinas e outras
estruturas relacionadas estão excluídas). Além disso, a abordagem de categorização de potência não se aplica a
N-nitrosaminas onde o grupo N-nitroso está ligado a um nitrogênio dentro de um anel heteroaromático (porexemplo, indol nitrosado). Para N-nitrosaminas contendo dois grupos N-nitroso, o grupo com a maior potência
carcinogênica prevista (ou seja, o grupo com a categoria de potência numérica mais baixa) define o limite AI

1

Por exemplo, consulte Cross KP and Ponting DJ, 2021. Developing Structure-Activity Relationships for N-Nitrosamine
Activity, Comput Toxicol, 20:100186; Thomas R, Tennant RE, Oliveira AAF, and Ponting DJ, 2022. What Makes a Potent
Nitrosamine? Statistical Validation of Expert-Derived Structure-Activity Relationships, Chem Res Toxicol, 35:1997–2013; ePonting DJ, Dobo KL, Kenyon MO, and Kalgutkar AS, 2022. Strategies for Assessing Acceptable Intakes for Novel NNitrosamines Derived From Active Pharmaceutical Ingredients, J Med Chem, 65:15584–15607.
2
Consulte Lhasa Carcinogenicity Database, em https://carcdb.lhasalimited.org/.
3
Rao TK, Young JA, Lijinsky W and Epler JL, 1979. Mutagenicity of Aliphatic Nitrosamines in Salmonella typhimurium, Mutat
Res, 66:1-7.
4
7 Li Y, Hecht SS, 2022. Metabolic Activation and DNA Interactions of Carcinogenic N-Nitrosamines to Which Humans Are
Commonly Exposed, Int J Mol Sci, 23:4559.

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para a molécula inteira5. Os carbonos α e β são definidos em relação ao grupo N-nitroso, conforme ilustrado na
Figura 1.

Figura 1 - Representação estrutural de carbonos α e β em uma N-nitrosamina.

O processo para prever a categoria adequada de potência carcinogênica é descrito na Figura 2.
O Quadro 1 resume as cinco categorias previstas de potência carcinogênica e seus respectivos limites AI
associados. Quadros de apoio para calcular a Pontuação de Potência referenciada na Figura 2 estão adiante
neste Anexo II.

* Um α-carbono terciário é definido como um átomo de carbono α em um estado de hibridização sp3, ligado a outros trêsátomos de carbono.
** Para calcular a Pontuação de Potência, consulte os Quadros 3, 4 e 5.
Figura 2 - Fluxograma para predição da potência carcinogênica e respectivo limite de segurança, conforme Abordagem deCategorização da Potência Carcinogênica para N-nitrosaminas.

5

Para as N-nitrosaminas que contenham mais de dois grupos N-nitroso, a requerente deve entrar em contato com a ANVISA
para obter orientações adicionais

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Categoria depotência1

AI recomendado(ng/dia)
18

Comentários

O limite recomendado de AI de 18 ng/dia equivale ao TTC específico
da classe para impurezas de N-nitrosaminas.* As N-nitrosaminas
atribuídas à Categoria 1 são previstas como tendo alto potencial
carcinogênico; no entanto, o TTC específico da classe para Nnitrosaminas é considerado suficientemente protetor aos
pacientes.
2100
O limite recomendado de AI de 100 ng/dia é representativo de duas
N-nitrosaminas potentes e amplamente testadas, a Nnitrosodimetilamina (NDMA) e 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1(butanona) (NNK), as quais têm limites recomendados de AI de 96
ng/dia e 100 ng/dia, respectivamente. N-nitrosaminas designadas
na Categoria 2 são previstas ter potencial carcinogênico nãosuperior ao da NDMA e da NNK.
3400
Comparadas à Categoria de Potência 2, as N-nitrosaminas nesta
categoria possuem uma potência carcinogênica mais baixa devido,
por exemplo, à presença de uma característica estrutural
fracamente desativante. O limite recomendado de AI foi
estabelecido para refletir uma diminuição de 4 vezes na potência
carcinogênica em relação à Categoria 2.
41500
As N-nitrosaminas designadas na Categoria 4 podem ser ativadas
metabolicamente por meio de uma via de α-hidroxilação, masprevê-se que tenham uma potência carcinogênica baixa, por
exemplo, devido à desfavorecimento da via devido a influências
estéricas ou eletrônicas, ou porque as vias de depuração são
favorecidas. O limite recomendado de AI de 1500 ng/dia éestabelecido com base no TTC conforme guia ICH M7 **.
51500
As N-nitrosaminas designadas na Categoria 5 são previstas para não
serem ativadas metabolicamente por meio da via de α-hidroxilação
devido a obstrução estérica ou à ausência de α-hidrogênios, ouprevê-se que formem espécies instáveis que não reagirão com oDNA. O limite recomendado de AI de 1500 ng/dia é estabelecido
com base no TTC conforme guia ICH M7**.
TTC: limiar de preocupação toxicológica, do inglês threshold of toxicological concern; AI: ingestão/ exposição
aceitável, do inglês acceptable intake* Guia 50/2021, emissão inicial a versão vigente** Veja o guia ICH M7(R2), M7Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals To Limit
Potential Carcinogenic Risk. O Valor de limiar de preocupação toxicológica (TTC) de 1,5 µg/dia (1500 ng/dia), conforme
explicado no ICH M7, representa um AI para qualquer substância química não estudada que apresenta um risco
negligenciável de carcinogenicidade ou de outros efeitos tóxicos.
Quadro 1 - Cinco Categorias Previstas de Potencial Carcinogênico e Limites Recomendados de IA Associados para NDSRIs

CÁLCULO DA PONTUAÇÃO DE POTÊNCIA
Para N-nitrosaminas não atribuídas à Categoria de Potência 5, a Pontuação de Potência é
calculada como a soma da pontuação do α-hidrogênio (Quadro 3), pontuação das características desativadoras(Quadro 4) e pontuação das características ativadoras (Quadro 5) com base em características estruturais
selecionadas presentes na N-nitrosamina. A estrutura da N-nitrosamina deve corresponder exatamente a uma
das definições de α-hidrogênio no Quadro 3, mas pode conter múltiplas ou nenhuma característica estrutural
identificada nos Quadros 4 e 5. Nos casos em que uma ou mais características dos Quadros 4 e 5 estão presentes
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na N-nitrosamina, a Pontuação de Potência deve ser calculada conforme descrito do Quadro 2. Nos casos em
que a N-nitrosamina não contém características dos Quadros 4 e 5, a Pontuação de Potência será igual àpontuação de α-hidrogênio.

Pontuação de Potência = pontuação de α-hidrogênio + pontuação de características desativadoras (somar
todas as pontuações para as características presentes na N-nitrosamina) + pontuação das características
ativadoras (somar todas as pontuações para as características presentes na N-nitrosamina).
Quadro 2- Cálculo da pontuação de potência para N-nitrosamina.

Contagemdeátomosde Exemplo
hidrogênio em cada α-carbono,
do mais baixo para o mais alto
0,2

Pontuação de α-hidrogênio.

3*

0,3

2

1,2

3

1,3

3

2,2

1

2,3

1

*Uma pontuação de 3 se aplica quando o α-carbono metileno não faz parte de um grupo etila. Se o α-carbono metileno
fizer parte de um grupo etila, deve-se aplicar uma pontuação de 2.
Quadro 3- Contagem de átomos de hidrogênio em cada carbono α (contagem mais baixa primeiro) e a correspondente pontuação de αhidrogênio. Os exemplos são ilustrativos apenas e não têm a intenção de ser exaustivos.

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Característica
DesativanteÁcido carboxílico em
qualquer lugar na
molécula

N-nitroso em um anelde pirrolidina

N-nitroso em um anelde 6 membros
contendo pelo menosum átomo de enxofre

ExemploPontuação Individual de
Característica Desativante
+3

+3

+3

N-nitroso em um anelde 5 ou 6 membros*+2

Grupo N-nitroso em
um anel de morfolina+1

N-nitroso em um anelde 7 membros+1

Cadeias de ≥5 átomosnão hidrogênio
consecutivos (cíclicosou acíclicos) em
ambos os lados do
grupo N-nitroso
acíclico. Não mais que
4 átomos em cadacadeia podem estar no
mesmo anel

Grupo retirador deelétrons** ligado ao αcarbono em apenas
um lado do grupo Nnitroso (cíclico ou
acíclico).

+1

+1

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Característica
Desativante
Grupos retiradores deelétrons** ligados aos
α-carbonos em ambos
os lados do grupo Nnitroso (cíclico ou
acíclico)

ExemploPontuação Individual de
Característica Desativante+2

Grupo hidroxila ligado
ao β-carbono*** em
apenas um lado do
grupo N-nitroso(cíclico ou acíclico)+1

Grupo hidroxila ligado
ao β-carbono*** emambos os lados do
grupo N-nitroso(cíclico ou acíclico)+2*Exclui exemplos em que o grupo N-nitroso está em um anel de pirrolidina, em um anel de 6 membros contendo pelo
menos um átomo de enxofre ou em um anel de morfolina (todos contados separadamente).
**Exclui ácido carboxílico e aril (contados separadamente) e cetona (dados conflitantes). Exemplos adicionais de grupos
retiradores de elétrons são limitados aos descritos em Cross KP e Ponting DJ, 2021, Developing Structure-Activity
Relationships for N-Nitrosamine Activity, Comput Toxicol, 20:100186, onde são referidos como "grupos retiradores deelétrons β-carbono".
***O β-carbono deve estar em estado de hibridização sp3 para que essa característica se aplique.
Quadro 4- Lista de características desativadoras e suas pontuações associadas. Para calcular a pontuação de características
desativadoras, soma-se as pontuações individuais para todas as características listadas presentes na estrutura da N-nitrosamina. Cada
linha de característica desativadora na tabela só pode ser contada uma vez. Para N-nitrosaminas em que o grupo N-nitroso está dentro
de mais de um anel, a pontuação de característica apenas para o menor anel correspondente deve ser aplicada. Os exemplos são
ilustrativos apenas e não têm a intenção de ser exaustivos.

Característica ativadora
Grupo arila ligado ao α-carbono(ou seja, substituinte benzílico
ou pseudo-benzílico no grupo
N-nitroso).
Grupo metila ligado ao βcarbono (cíclico ou acíclico

ExemploPontuação Individual de
Característica Ativadora-1-1

Quadro 5- Lista de características ativadoras e suas pontuações associadas. Para calcular a pontuação das características ativadoras,soma-se as pontuações individuais para todas as características listadas presentes na estrutura da N-nitrosamina. Cada linha decaracterística ativadora na tabela só pode ser contada uma vez. Os exemplos são ilustrativos apenas e não têm a intenção de serexaustivos.

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ANEXO III: Condições do teste de Ames otimizado para N-nitrosaminas
O Guia OECD nº 471- “Bacterial Reverse Mutation Test”6 é a principal referência para as
recomendações do ensaio de mutação em bactérias, também conhecido como teste de Ames. No entanto, para
N-nitrosaminas, condições otimizadas para a condução do teste de Ames são recomendadas, frente a já
reportada baixa sensibilidade das condições padrão para algumas N-nitrosaminas como a NDMA (Nnitrosodimetilamina). Adicionalmente, pouco se sabe sobre a sensibilidade do ensaio para as NDSRIs (Nnitrosamine drug substance related impurities), que possuem uma variedade maior de grupos funcionais.
Caso o teste de Ames padrão OECD nº 471 foi conduzido e resultou positivo para amutagenicidade, não há necessidade de conduzir teste de Ames adicional com as condições otimizada.
Nesse contexto, o FDA’s National Center for Toxicological Research (NCTR) e outros grupos
avaliaram condições para melhorar a sensibilidade e aumentar a robustez das condições do teste de Ames
aplicado para nitrosaminas (Li et. al., 20237). Essas condições descritas a seguir são consideradas um protocolo
para teste de Ames otimizado, o qual recomenda-se ser utilizado na avaliação de mutagenicidade denitrosaminas. As condições descritas a seguir podem ser atualizadas frente a novas evidências. A presença dedesvios ao protocolo pode ser justificada.
Cepas: Devem ser incluídas as cepas TA98, TA100, TA1535 e TA1537 de Salmonella typhimurium
e Escherichia coli WP2 uvrA (pKM101).
Tipo de ensaio e tempo de pré-incubação: Deve ser utilizado o método de pré-incubação em
detrimento de incorporação em placa. O tempo de pré-incubação recomendado é de 30 minutos.
Espécie e concentração de S9: O ensaio deve ser conduzido tanto na ausência de ativação comfração pós-mitocondrial (S9) quanto na presença de S9 proveniente de fígado de rato a 30% e de S9 provenientede fígado de hamster a 30%. As frações S9 de rato e hamster devem ser preparadas a partir de animais tratados
com indutores das enzimas do citocromo P450 (por exemplo, uma combinação de fenobarbital e βnaftoflavona).
Controle negativo (veículo/solvente): Os solventes devem ser compatíveis com o teste de Amespadrão conforme Guia OECD 471. Os solventes de escolha podem incluir água e solventes orgânicos, comoacetona, metanol e DMSO, não se limitando a esses. Quando um solvente orgânico for utilizado, o menor
volume possível deve ser incluído na mistura de pré-incubação, acompanhado de justificativa que indique queo volume do solvente não interfere com a ativação metabólica da nitrosamina.
Controle positivo: Controles positivos específicos para as cepas devem ser incluídos de acordo
Guia OECD 471. Complementarmente, duas N-nitrosaminas conhecidamente mutagênicas na presença de S9
devem ser incluídas como controle positivo.
A escolha das duas N-nitrosaminas para controle positivo deve ser justificada a partir dometabolismo das N-nitrosaminas e das principais enzimas do citocromo P450 envolvidas nesse metabolismo. A
escolha pode considerar, entre outras: NDMA (CAS # 62-75-9), 1-Cyclopentyl-4-nitrosopiperazine (CAS # 6137966-6) e uma NDSRI. Caso um solvente orgânico seja utilizado na solubilização da substância-teste, recomendase que se utilize um volume semelhante do solvente orgânico para dissolver as N-nitrosaminas utilizadas como
controle positivo, resultando em uma concentração similar para a substância-teste na mistura de pré-incubação.

6

OECD (2020), Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4,
OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264071247-en.
7
Li X, Le Y, Seo JE, Guo X, Li Y, Chen S, Mittelstaedt RA, Moore N, Guerrero S, Sims A, King ST, Atrakchi AH, McGovern TJ,
Davis-Bruno KL, Keire DA, Elespuru RK, Heflich RH, Mei N. Revisiting the mutagenicity and genotoxicity of N-nitroso
propranolol in bacterial and human in vitro assays. Regul Toxicol Pharmacol. 2023 Jun;141:105410. doi:
10.1016/j.yrtph.2023.105410. Epub 2023 May 18. PMID: 37210026.

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Todas as demais condições devem seguir o recomendado no Guia OECD 471.
Destaca-se que caso um teste de Ames padrão (de acordo com do Guia OECD 471) tenha sido
conduzido e apresentado resultado positivo, não há necessidade de conduzir ensaio adicional com a condição
otimizada.

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