平成13年度〔2001〕№46
宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告

土壌より分離したPCE分解菌群の諸性質に関する研究＊鮫島

暁子＊１・小玉 義和＊１・中瀬 アルバレズ アンジェリーナ＊２

高橋克嘉＊１・神力はるな＊２・松下昌代＊３・山内

博利＊１

Study on the PCE-Degrading Capability of Mixed Culture of Microorganisms
Akiko SAMESHIMA, Yoshikazu KODAMA, Angelina M. ALVAREZ-NAKASE, Katsuyoshi TAKAHASHI,
Haruna KOURIKI, Masayo MATSUSHITA and Hirotoshi YAMAUCHI
テトラクロロエチレン（PCE）汚染土壌を微生物源として、PCE分解活性を持つ微生物群を見出し、その活性維持に最適な培養条件の検討を行った。組成の異なる培地を用いてPCE分解を経時的に調べた結果、培地組成によって分解速度が異なることを確認した。また得られたKY、MIX微生物群から全DNAを抽出し、16S rDNAの部分断片をPCR-DGGE法により解析を行い、培地中の微生物相が異なることを確認した。
キーワード：テトラクロロエチレン（PCE）、土壌細菌、混合菌、PCR-DGGE
１ はじめによる分解菌群集構造の評価を行ったので報告する。

テトラクロロエチレン（PCE） は、機械類や繊維製品の洗浄剤として広く使用されていた。近

２

実験方法

年、その難分解性や発ガン性が指摘されてから、２−１

汚染された土壌などの環境をいかに浄化するか、

２−１−１

PCE分解菌群の培養
土壌の採取

その技術確立が求められている。現在、有害な揮実験に供した土壌は、PCEを溶剤として使用

発性有機塩素化合物を処理する方法として、吸引、している宮崎県内のクリーニング工場の排水溝よ汲み上げ、曝気、活性炭による吸着除去、触媒酸り採取した。

化などの物理・化学的な手法が採用されている。

２−１−２

PCE分解菌群の前培養

しかし、これらの技術は汚染物質の根本的な無害

採取した土壌10gをあらかじめ滅菌したPCEを化技術ではないため、浄化処理後の２次処理が必添加したMMY培地に加え、30℃で１週間前培養要になる。そこで、注目されているのが、微生物を行った。MMY培地の組成（g l）は、K２HPO４ 7、の浄化能力を活用するバイオレメディエーション

KH２PO４ 2、MgSO４・7H２O 0.1、
（NH４）２SO４ 1、である。中でも、発ガン性のある有害な揮発性有クエン酸 3 ナトリウム 2 水和物 0.5、酢酸ナト

機塩素化合物を分解する微生物は、汚染土壌や水リウム 0.4、Yeast Extract 2 であり、PCEは、

環境の浄化への応用が期待されている。

培地オートクレーブ滅菌後、0.5 l加えた。

本研究では、宮崎県内土壌よりPCE分解に関

２−１−３

わる微生物群を見出すとともにPCE分解性を保１）持した継代培養条件を検討し、PCR-DGGE法に＊有用土壌環境微生物の調査と育種に関する研究
（第２報）

第１報

培地の検討

において集積培養を行った微生物群のPCE分解活性を測定した結果、活性が見られなかったことから、再度、培地の検討を行った。
試みとして、滅菌した採取土壌を培地に加えた

＊１

資源環境部

ところ、活性が見られたことから、土壌成分の分＊２

元客員研究員

析を蛍光X線測定装置により行った。この成分組＊３

南九州大学園芸学部食品工学科

成をもとに培地の調整を行った（KY培地）。
1土壌より分離したPCE分解菌群の諸性質に関する研究

また、比較のために、PCE分解菌群の培養が可能であったMIX培地

２）を用いてKY培地同様にエチレン）を適宜調製して使用した。
２−４

微生物群の培養を行った。
２−１−４

標準液は、市販のPCE及びTCE（トリクロロ
至適温度の検討

KY及びMIX液体培地について分解微生物群の培養方法

培養は、図１のようなアルミシールバイアル瓶

生育至適温度の検討を行った。10、15、20、25、（ジーエルサイエンス社製125ml）を用いた。こ30、35、40、50、60、70℃で培養を行い、PCE

れに、KYあるいはMIX液体培地50mlとPCE2 l

分解活性試験を行った。

（64mg l）を入れ、上部気相の窒素置換を行った

２−５

至適pHの検討

後、菌の培養液１mlを加え、ふたにテフロンコー

KY及びMIX液体培地について分解微生物群のトブチルゴムセプタムを用い、さらにアルミシー

生育至適pHの検討を行った。それぞれの液体培

ル（S型）をシールした状態で、30℃で１週間静地を各pH（pH3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、置嫌気培養を行った。その後は、それぞれの液体

7.5、8.0、8.5、9.0、10.0）に1N NaOHまたは1N培地において１週間ごとに継代培養を行った。な

HClで調整後、30℃にて培養を行い、PCE分解活

お、培地はその都度、調製した。

性試験を行った。
２−６

PCE分解経時変化試験

至適温度及び至適pHでの、PCE分解活性試験
を１週間行い、KY及びMIX培地両方の微生物群のPCE分解の経時変化を調べた。
２−７
KY培地

検知管によるヘッドスペースガス分析

培養後のKY及びMIX培地は、バイアル瓶を開封したとき、特異な臭気がしたため、バイアル瓶
中のヘッドスペースに含まれるガス成分の簡易分析を行った。分析は、テドラーバッグに培養後のバイアル瓶の内容物をすべて入れ、密封し、5lのMIX培地

窒素を充填した後、図２に示す操作により測定を
行った。

図１

PCE含有培地による分解微生物群の培養

２−２

KY、MIX培地それぞれに含まれる微生物群の分離

KY、MIX培地それぞれに含まれる微生物の分離を試みた。それぞれ1.5％寒天を加えた培地で、出現したコロニーを純粋分離した。その後、それぞれについてPCE分解活性試験を行った。
２−３

PCE分解活性試験

PCE分解活性は、ヘキサンにより培養後のPCEを抽出し、非放射線源式電子捕獲型検出器付柳本

図２

検知管によるガス分析

ガスクロマトグラフG2800EN（以下ECD-N GC）
を用いて定量した。ECD-N GC条件は、カラム：

２−８

培養後のKY培地の沈殿物の分析

DMCSφ3mm×3m、カラム温度：90℃、キャリ

培養後のKY、MIX液体培地に発生した、黒い

アガス：He、検出器：非放射線源式電子捕獲型

沈殿物の無機成分分析は、ICP発光分析装置（セ検出器（ECD-N）、試料注入量：3 lとした。

イコー-SPS-1500VR）により行った。

2

土壌より分離したPCE分解菌群の諸性質に関する研究

２−９

硫酸還元菌の定性試験

ン培地を用いて鉄還元菌の定性試験を行った。培地

硫酸還元菌選択培地を用いて硫酸還元菌の定性組成（g l）は、K２HPO４ 3、KH２PO４ 0.8、KCl 0.2、）試験を行った。その培地組成は、（溶液１（mg l）

MgSO４・7H２O 0.2、Yeast Extract 0.5、アスパ

NH４Cl 1,000、Na２SO４ 1,000、CaCl２・2H２O 10

ラギン 5、グルコース 20、クエン酸鉄（Ⅲ）１で0、FeSO４・7H２O 200、MgSO４・7H２O 2,000、Cあり、pHはHClあるいはNaOHで７に調整した。

H３CH（OH）COONa（70％）3,500、Yeast Extract

KY、MIX培養原液及び希釈液各１mlを試験管

1,000、H２ O 980ml、（溶液２（g l）
K２ HPO４ 10、に７mlずつ分注した鉄還元菌選択液体培地に植H２ O 200、（溶液３（g l））HSCH２ COONa 0.45、菌し、30℃で５日間培養を行った後、菌の生育状

H２O 10であり、各溶液はpH7.1〜7.4に合わせ、オー態と鉄還元の有無を調べた。判定法は、10％酢酸

ト クレ ーブ 滅 菌 した 。使 用 直 前 に ボイ ルし たに溶解した0.2％α,α'-ジピリジル溶液１mlを培

溶液１に溶液２を10ml及び溶液３を無菌的に加養後の試験管に加え、赤変したものを二価鉄生成

え、気泡が入らないように混和した。KY及びMIX陽性とみなした。また、上記とは別に鉄還元菌選培養液について培養原液を含む10倍希釈溶液を５択液体培地７mlにKY、MIX培養原液及び希釈液

段階作製し、滅菌済み試験管（シリコ栓付き）に各１mlを加えたものを用意し、80℃にて15分間調製した液体培地7.5mlを入れたものにそれぞれ加熱処理した後、30℃にて培養しα,α'-ジピリジ

１mlずつ加えた。試験管上部を窒素置換し、嫌気ル溶液を用いて鉄還元性の判定を行った。この方パック中（アネロパック 三菱ガス化学社）におい法により陽性を示した菌は、鉄還元性の胞子形成て30℃、暗条件下で３日間培養を行った。なお、菌（Bacillaceae）とみなした。

各希釈段階につき、５本の培養管を作製した。

２−12

２−10

鉄還元菌の分離及び活性試験

硫酸還元菌の分離及び活性試験

鉄還元菌存在確認の後、鉄還元菌選択培地であ二重皿法を用いて硫酸還元菌の分離を行った。

るグルコース・アスパラギン培地及びラクトース・

培地は、2-7で使用した硫酸還元菌選択培地（溶アスパラギン培地（培地組成：前者培地組成のグ

液１）に寒天15gを加えて使用した。外ぶたと内ルコースをラクトース置換）を用いてKY、MIX

皿を同じ向きにして乾熱滅菌したガラスシャーレ

培地に含まれる微生物群より、鉄還元菌の分離をの内皿をはずして外ぶたにのせ、KY及びMIX培試みた。滅菌シャーレにKY、MIX培養原液及び２

地の希釈培養液（10倍、10 倍）１mlを外ぶたに

希釈液各１mlをそれぞれ分注し、 0.001％TTC

入れ、硫酸還元菌選択培地を20ml加え、緩やか（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride） 水溶 液 とに混釈を行った。培地固化後、その上に1.5％寒

1.5％寒天を加えた各鉄還元菌選択培地をそれぞ

天溶液を流し込み気泡が入らぬよう内皿を落としれ15ml加えて固化し、30℃で５日間暗条件で嫌た。培地が固まったことを確認し、寒天の蒸発乾気静置培養を行った。培養後、出現した赤いコロ固を防ぐため、二重皿をビニールに包んで30℃、ニーを同様の寒天培地に画線塗抹し、嫌気静置培暗条件下で３日間培養を行った。培養後、黒色で養を行い、単離菌になるまで同様の植継を行った。

輪郭の不明瞭な円形のコロニーを掻き取り、滅菌

その後、KY、MIX培地で培養を行い、PCE分解

水１mlに溶解したものを、再び二重法により菌活性試験を行った。

の培養を行った。さらに出現した黒色コロニーを

２−13

GC-MSによるヘッドスペースガス分析

あらかじめ滅菌シャーレに硫酸還元菌選択培地を

ヘッドスペース中に含まれる成分にPCE及び固化させたものに画線塗抹し、嫌気パック中にてTCEの分解生成物を確認するため、ヘッドスペー

培養を行い、単離菌になるまで植継を繰り返した。

スガスクロマトグラフ質量分析計（パーキンスエ

その後、KY、MIX培地で培養を行い、PCE分解

ルマー社製 HS40、島津製作所製 QP-5000）によ活性試験を行った。

る測定を行った。

２−11

２−14

鉄還元菌の定性試験

鉄還元菌選択培地であるグルコース・アスパラギ

PCR-DGGE

DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）
3

土壌より分離したPCE分解菌群の諸性質に関する研究

法は、微生物に共通の遺伝子の増幅を行い、同じとした。

遺伝子断片を、わずかな塩基配列の違いによって２−14−２

PCR反応

遺伝子変性剤の濃度勾配をつけたアクリルアミド

PCRには、プライマ−5Fと531R、dNTPs、Ex.

ゲル中で電気泳動的に分離する手法であり、今回、

Taq ポ リ メ ラ ー ゼ（TaKaRa 社 ）を 用 い て 16S

図３のフローに従い実験を行った。

rDNAの約500bpの増幅を行った。

PCE含有液体培地による微生物群の培養↓
遠心分離による微生物の回収↓
微生物の全遺伝子の抽出↓抽出した全遺伝子を鋳型としたPCR（16S rDNA断片の増幅）↓
尿素濃度勾配ゲルによる電気泳動↓
DGGE断片のゲルからの切出し↓
クローニングシーケンス
図３

PCR-DGGE実験手順

２−14−３

PCR-DGGE

アクリルアミド濃度は８％、尿素濃度勾配は、
20〜50％及び30〜50％に調製した。
装置は、BIO-RAD社製DCodeユニバーサルミュー
テーション検出システムを用いた。泳動条件は、
電圧150V、泳動層温度60℃、泳動用緩衝液１×T
AEで５〜７時間で行った。
２−14−４クローニング

電気泳動後のアクリルアミドゲルをエチジウム
ブロマイド染色を行い、UVによりバンドを確認し、ゲルカッターにて切り出しを行った。
得られたDGGE断片からDNAの精製を行い、クローニ ングを 行った。 クローニ ングには 、
pGEM-T Easy Vector SystemⅡ（Promega）を

２−14−１遺伝子の抽出用 い て 行 っ た 。 す な わ ち 、 精 製 し た DNA とKY及びMIX培養液50mlをアルコール滅菌した

pGEM-T Easy Vector0.5 lを、Ligase1 l、２×R

濾紙（5A）でそれぞれろ過した後、濾紙は少量

apid Ligation Buffer T4 DNA Ligase0.5 lを用の滅菌水で洗い、ろ液25mlを50mlのプラスチッ

いてLigation反応をし、１時間放置後、エタノー

ク遠沈管に移し、遠心分離（15,000rpm、２min）

ル沈殿を行った。遠心分離（10,000rpm、15min）した。上清を取り除いた後、滅菌水５mlを加え、を行い、上清を除去し、70％エタノール100 lを加10秒間撹拌し、遠心分離（15,000rpm、２min）

え、再び遠心分離（10,000、10min）後、上清を除し、同様の操作をさらに２回行った。最終的に残っ

去し、５分間の真空遠心により完全にエタノールた沈殿に１mlの滅菌水を加え、10秒間の撹拌のを除いた。得られた沈殿をTE6 lに溶解し、３ l

後、マイクロチューブに移し、遠心分離（15,000を形質転換に使用した。まず、JM109の50 lにDrpm、２min）した。上清を取り除き、GenTLEⅠ

NA3 lを加え、氷上で30分間静置後、ヒートブロッ（TaKaRa社製）540 lを加え、撹拌し、GenTLEⅡ

クで42℃、３分間加温し、再び氷上で５分間静置

60 lを加えた後、再度撹拌し、70℃で10分間反応した。15mlプラスチック遠沈管にSOClmlと処理させた。その後GenTLEⅢ300 lを加え、緩やかしたDNAを入れ、37℃で45分間緩やかに振とうに転倒混和し、氷上にて２分間静置後、再び転倒

し、遠心分離（5,000rpm、２min）した。上清を混和し、遠心分離（12,000rpm、５min）を行い、500 l除去し、残りを攪拌した後、X-Gal50 lとIP

上清を２mlのマイクロチューブへ移した。それ

TG100 lを加え、LA寒天培地に塗抹し、37℃で一にイロプロパノール600 lを加え、撹拌し、遠心晩培養した。LA寒天培地に生育したコロニーの分離 （12,000rpm、５min）を行った。その後上

うち、Whiteコロニーを釣菌し、LA液体培地及

清を除去し、冷70％エタノール200 lを加え、撹

びLA寒天培地に植菌し、12〜16時間、37℃で培拌し、遠心分離（12,000rpm、５min）をし、上養（液体培地は振とう培養）を行った。対照とし清を除去した。真空遠心によりエタノールを取りてBlankであるBlueコロニーも同様に培養を行っ除いた後、TE15 lを加えて溶解し、PCR用鋳型

た。

4

土壌より分離したPCE分解菌群の諸性質に関する研究

２−14−５プラスミドの抽出していることが明らかになった。 併せてMIX培

培養後のLA液体培地より１mlを取り、遠心分地の組成も表３に示す。また、PCE分解活性試

離（14,000rpm、１min）を行い、上清を除去し験のクロマトグラフ結果も図４に示す。図４に見た後、Plasmid prep kit（BIO-RAD社製）を用られるようにKY、MIX培地両方において当初64

い て プ ラ ス ミ ド の 抽 出 を 行 っ た 。 ま ず 、 Cell

mg l含まれていたPCEのほとんどがTCEに分解

Resuspension Solution200 lを加え、撹拌し、懸され、また、さらにTCEも分解されていること

濁させ、Cell Lysis Solution250 lを加え、緩やが明らかになった。このことから、それぞれの培

かに混和転倒した。Nentralization Solution250

地中の微生物群をPCE分解微生物群と推定した。

lを加え、緩やかに混和転倒後、遠心分離（14,000rpm、５min）を行った。スピンフィルターをセッ

表１トした新たなマイクロチューブを用意し、それにelement g 100g element g 100g element g 100g

上清を移した後、Quantum Matrix200 lを加え、ピペッティングを行った。遠心分離（14,000rpm、30sec）の後、Wash Bufferによる洗浄を２回行
い、スピンフィルターを新しいマイクロチューブ

蛍光X線分析による土壌中成分分析結果

Si

57.3

Ca

0.391

Sr

0.050

Al

19.6

S

0.196

Zn

0.038

Fe

10.1

P

0.128

Mn

0.032

K

8.5

Cl

0.100

Cu

0.030

Ti

1.69

Zr

0.084

Ni

0.017

に移し、TEを25 l加え、遠心分離（14,000rpm、

Na

0.996

V

0.064

Nb

0.010

１min）を行った。同様の操作を再度行い、精製

Mg

0.672

Rb

0.053

As

0.009

表２

KY培地

プラスミド50 lを得た。
２−14−６

EcoRⅠによるインサートチェック

マイクロチューブに得られた精製プラスミド２組

成（mg 1,000ml）

lを移し、10×H Buffer５ lとEcoRⅠ、超純水

Yeast Extract

43 lを加え、37℃で２時間反応させた。その後、Na２HPO４500

0.8％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、MgSO４・7H２O

100

KH２PO４100

CaCl２・2H２O

70

K２HPO４30

FeCl３・6H２O
AlCl３・6H２O
pH

30

Positive transformant（陽性）であることを確認した。分子量マーカーには、λ-HindⅢ及びλEcoT14digest（ともにTaKaRa社製）を用いた。
２−14−７

シーケンス反応及び解析

シーケンス反応には、BigDye（ABI社製）及

2.000

30
7.4

びユニバーサルプライマー21M13、M13RVを用いて調製を行った。反応後、スピンカラムにより

表３

MIX培地

精 製 を 行 い 、 シ ー ケ ン ス を ABI Prism 310

組

Genetic Analizer（PE Applied Biosystems社製）

KH２PO４7,000

により解析した。 解析には同社製のソフト

K２HPO４2,000

Microseq 16S rDNASequence Databasesを用い、Yeast Extract

2,000

さらにデータベース上で検索を行った。

NaHCO３

200

KCl

30

NH４Cl

30

FeCl３・6H２O
MgCl２・6H２O
MgSO４・7H２O
CaCl２・2H２O
CoCl２・6H２OpH30

３ 結果及び考察
３−１

培地組成

採取した土壌の蛍光X線分析による結果を表１に示す。
表１を参考に様々な検討を行った結果、表２に示すKY培地組成がPCE分解微生物群の生育に適成（mg 1,000ml）

20
10
4
1
7.4
5

土壌より分離したPCE分解菌群の諸性質に関する研究

３−４

KY、MIX培地における分解微生物群の生育至適pH

各pH条件で培養し、ECD-N GCにおいてPCE
分解活性を測定した結果を図６に示す。KY微生物群は、pH５〜９の間で、80％以上の活性を示したのに対し、MIX微生物群は、pH7.5で80％近くの活性を示したにすぎなかった。これらの結果
より、至適pHについても至適温度と同様にKY培
図４

培養後の培地中残存PCE濃度の測定地の方が広い範囲において微生物群を増殖させる
ことが明らかになった。

３−３

KY、MIX培地における分解微生物群の
生育至適温度各温 度条件 で培養 し、 ECD-N GCにおい て
PCE 分解 活 性を 測 定し た結 果 を図 ５ に示 す。
MIX培地における微生物群（以下MIX微生物群）
は、30〜35℃において80〜90％の活性を示すのに対し、KY培地における微生物群（以下KY微生物群）は、20〜35℃の広い範囲において100％近い活性を示し、また、15℃、40℃においてもなお、
60％の活性を保持していた。これらの結果より、
KY培地の方がMIX培地と比較してより広い温度帯で微生物群を増殖させることが明らかになった。

図６

KY，MIX培地それぞれの微生物群における至適生育pH

また、 PCE分解微生物群が増殖することにより、それぞれの培地において白から黒へと培地の色が変化した。KY微生物群は35℃で、MIX微生

３−５

KY、 MIXそれぞれの微生物群による
PCE分解の経日変化

物群は30℃を頂点として最も黒い濁り及び沈殿物

KY、MIX培地両方の微生物群によるPCE分解を生じた。このことは、至適生育温度とも一致しの経日変化を調べた結果を図７に示す。このグラていた。全体的にKY微生物群の方が、MIX微生

フより培地組成の違いによる微生物群のPCEの物群よりも培地を濃い黒色にし、多くの沈殿を生分解速度が異なることを確認した。KY微生物群

じさせていた。

については、培養開始１日目にはPCEをほとん
ど分解し、同時に発生したTCEもその後緩やかに分解し、７日目にはPCE、TCEともに分解した。また、MIX微生物群については、PCEを緩やかに分解し、KY微生物群と同様に７日目にはすべて分解し、TCEについては終始わずかにしか検出されなかったが、これも最終的には分解した。これらの結果より、PCEの分解速度、分解の形態が異なったことから、KY、MIX培地それぞれに含まれる微生物群の菌相に違いがあることが推測された。

図５

6KY，MIX培地それぞれの微生物群における至適生育温度

土壌より分離したPCE分解菌群の諸性質に関する研究

表５

ICPによる沈殿物の分析結果

element（mg l）

element（mg l）

Fe

41.8

K

2.7

Ca

18.8

Mg

2.4

Al

14.3

Co

0.8

Na

3.7

３−８

硫酸還元菌の有無

２−７に従い、培養を行った結果を図８に示す。
図７

嫌気条件下におけるPCE分解の経時的変化

硫酸還元菌の有無は、鉄イオンを含む硫酸還元菌
選択液体培地の黒変（硫酸還元による硫化鉄の生３−６

検知管によるヘッドスペースガス分析結成）によって硫酸還元菌の生育の有無の判定を行果う。KY微生物群では、濃度の薄いものでも黒いヘッドスペースガスに含まれる成分の分析をガ沈殿を生じたことから、硫酸還元菌の存在を確認

ス検知管により行った結果を表４に示す。ガスのした。また、MIX微生物群についても同様に黒中でKY、MIX培養バイアル瓶ヘッドスペースにい沈殿が見られたが、KY微生物群ほど多量では最も多く含まれていたのは硫化水素であった。次なかったことから、その存在量が少ないのではな

いでメチルメルカプタン、アミン類、メルカプタ

いかと考えられた。 これらのことから、 KY、ン類であった。

MIX培地に含まれる微生物群の菌相に違いがあることが推測された。

表４

ガス検知管によるヘッドスペースガス分析
結果

Gas Name

Used GDT

NH３（kita）105SD

0.7

1.2

H２S

（kita）120SE

17

11.5

0.8

2

6

7

（C２H５）213S
３N （kita）

0

0.6

Amines

（gas）
180

4

6

Mercaptans（gas）
70L

5

6.5

（C２H５NH＋（kita）222S（CH３）３N
CH３SH

（gas）
71

×１

KY（mg l） MIX（mg l）

×10

×10２

×10３

×10４

×10３

×10４

KY培地
×１

×10

×10２

GDT ：gas detector tube（ガス検地管）（kita）：北川製,（gas）：gastec製

３−７

KY培地の沈殿物の分析結果

MIX培地

表５は培養後のKY培地沈殿物のICPによる分

図８

硫酸還元菌定性試験

析結果を示したものである。沈殿物の主成分は鉄であることが明らかになったことから、硫化鉄ではないかと推測された。

３−９

硫酸還元菌の分離

２−８に従って分離した結果、KY微生物群、MIX微生物群ともに、黒色で輪郭の不明瞭な円形のコロニーが確認されたため、硫酸還元菌と判断した。
7

土壌より分離したPCE分解菌群の諸性質に関する研究

単離した硫酸還元菌をKY、MIX培地で培養をることが明らかになった。また、MIX微生物群

行い、PCE分解活性試験を行ったが、活性は認のPCE分解生成物も、トリクロロエチレンを経められなかった。培養の際、KY、MIX培地には由するが、シス-1,2ジクロロエチレンのみが分解

特有の臭気があり、黒色沈殿が見られたが、活性生成物となっていた。このことから、経日変化のは見られなかったことから、色の変化及び臭気は分解速度や分解形態の違いが裏付けられた。さら

活性とはあまり関係はないものと判断した。

にKY、MIX微生物群の菌相の違うことも示唆さ３−10れた。また、KY、MIX微生物群の最終分解生成

鉄還元菌の有無

鉄還元菌の存在確認をジピリジル法により行っ物がシス-1,2ジクロロエチレンであったことから、さらなる検討を行う必要があり、また、新たな菌た結果を図９に示す。
２−10に従って、培養を行った後、α,α'-ジピの検索も必要であると考えられた。

リジル溶液を加えたところ、二価鉄生成陽性であ

表６る赤変が認められ、鉄還元菌の存在がKY、MIX
微生物群ともに確認された。さらに胞子形成菌についての実験を行った結果、KY、MIX微生物群
ともに陽性を示した。これらのことから、KY、
MIX微生物群のどちらも鉄還元菌及び鉄還元胞子形成菌を有していると判断した。
また、 鉄還元菌についてPCE分解活性試験を行った結果、硫酸還元菌と同様、活性は見られなかった。KY、MIX微生物群の単離菌のPCE分解
活性もなかったことから、PCE分解は、種々の微生物の共存及び共代謝により分解が進むものと

塩ビモノマー
1,1-ジクロロエチエン
ジクロロメタン
トランス-1,2-ジクロロエチエン
シス-1,2-ジクロロエチエン
1,1,1-トリクロロエタン
1,2-ジクロロエタン
トリクロロエチレン
1,2-ジクロロプロパン
1,1,2-トリクロロエタン
テトラクロロエチレン

KY
nd
nd
nd
2.07
22.32
nd
nd
2.70
nd
6.00
nd

MIX
nd
nd
nd
nd
27.12
nd
nd
2.24
nd
nd
nd

nd：非検出３−12

推察された。

ヘッドスペースガス分析結果

PCR-DGGE法による電気泳動結果

PCR-DGGE法による泳動結果を図10に示す。
Blank Before add to
add toα、α′Dipyridy1

図９３−11

MIX KYMIX KY

尿素濃度： 20〜50％
泳動時間：
5h

20〜50％
7h

鉄還元菌の判定（ジピリジル法）

GC-MSによるヘッドスペースガス分析
結果

バイアル瓶ヘッドスペース中に含まれるガス成
分のGC-MSによる分析結果を表６に示す。
KY微生物群のPCE分解生成物は、TCEを経由

図10 PCE 分解微生物群のPCR-DGGE解析結果

して、1,1,2トリクロロエタン、トリクロロエチ
レン、シス-1,2ジクロロエチレン、トランス-1,2当初、尿素濃度勾配を20〜50％及び30〜50％にジクロロエチレンと分解されているが、ほとんどつけて実験を行っていたが、どちらもほとんど変はシス-1,2ジクロロエチレンにまで分解されていわらなかったことから、20〜50％に限って行った。

8

土壌より分離したPCE分解菌群の諸性質に関する研究

その結果、KY微生物群とMIX微生物群のバンド群を得たが、その生育至適温度は、それぞれ20を比較すると、上部は、ほとんど変わらない泳動〜35℃、 30〜35℃であった。 また、 生育至適バンドを示していた。しかし、中程から下段にか

pHは、KY微生物群が５〜９、MIX微生物群がけては、同じ箇所にバンドが見いだせるものもあ

7.5であった。

るが、特に下段については全く違ったバンドになっ

KY、MIX微生物群のPCE分解経時変化を調ていた。電気泳動を5時間行った写真では、バン

べたところ、培地組成の違いにより分解速度がドの間隔が狭く確認しづらいが、７時間泳動を行っ異なることが明らかになり、また、分解過程がた写真ではそれがはっきりと確認できた。このこ

異なること及び菌相の違うことが示唆された。

とからも、KY、MIX微生物群菌相の違いが示唆

KY、MIX微生物群ともに硫酸還元菌及び鉄還元菌の存在が確認されたが、それぞれ単菌で

された。
３−13

シーケンス結果シーケンスの結果について、データベースで検索を行ったところ、「mlel-2」と98％の高い相同は、PCE分解活性が見いだせなかったことか
ら、種々の微生物による共存及び共代謝により
PCEは分解されるものと推測された。

性が得られた。DGGE-DNAとの相同性を表７に

KY、MIX微生物群のヘッドスペースガス分示す。この微生物は、製薬工場の排水バイオリ

析の結果、PCEの分解最終生成物がシス-1,2ジ

アクターから検出された菌であることが分かっ

クロロチレンであることが明らかになった。さて い る 。高 い 相 同 性 を 示 し た 微 生 物 は 、他 にらに、KY、MIX微生物群では、TCEを経てシBacteroides sp.があげられ、「mlel-2」もこの微ス-1,2ジクロロチレンに至るまでの分解過程が生物の近縁種ではないかと推測された。また、こ異なることから、両微生物群の菌相の違いが示の菌はKY微生物群、及びMIX微生物群共通の上唆された。また、PCEの分解最終生成物がシ部の泳動バンドより検出されたことから、両方のス-1,2ジクロロエチレンであったことから、脱微生物群に存在することが明らかになった。

塩素化し、無害化を行うために、さらなる検討及び新たな微生物の検索が必要であると考えら

表７

データベースシーケンスとDGGE-DNAと
の相同性

れた。
PCR-DGGE法を用いた微生物群解析の結果、「mlel-2」 を見出したが、 この微生物はKY、MIX両方に存在することが明らかになり、 他に高い相同性を示したBacteroides sp.の近縁種ではないかと推測された。
５

参考文献

１）小玉義和他．宮崎県工業技術センター研究報
告No.44, 1-3（1999）
２ ） 永 渕 義 孝 他 ． 用 水 と 廃 水 . Vol38 No.12,
1996.
６

謝辞
本研究を行うにあたり、ご助言をいただいた南

４ まとめ
宮崎県内土壌より、PCE分解微生物群を見出

九州大学食品工学科の松下昌代教授ならびに同講
座卒論学生の皆様に深謝します。

し、その活性維持に最適な培養条件を確立した。

また、試料測定の際にご助力いただきました衛KY、MIX微生物群の２つのPCE分解微生物

生環境研究所の冨山典孝主任研究員に深謝します。
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