平成13年度〔2001〕№46
宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告

土壌から分離した細菌の諸性質に関する研究＊
中瀬 アルバレズ アンジェリーナ＊１・小玉
鮫島暁子＊２・福地哲郎＊２・高橋義和＊２

克嘉＊２・山内博利＊２

Study on Bacteria Isolated From Soil
Angelina M. ALVAREZ-NAKASE, Yoshikazu KODAMA, Akiko SAMESHIMA,Tetsuro FUKUCHI, Katsuyoshi TAKAHASHI and Hirotoshi YAMAUCHI
細菌のセンター株（MPITC ストック）と生分解性プラスチックを埋設した土壌から分離された菌株（Bacillus属）を用い、脂質分解力の強い菌株をスクリーニングした。これらの菌株の油脂分解力を左右する要因を探り、それらの廃棄物処理などへの有効利用を図る目的で試験を行った。最も高いリパーゼ活性は、S. marcescensで観察された。エステラーゼは、４種のBacillusと６系統のS. marcescensにおいて高い活性を有していた。S. marcescensは、天然油と廃油に対して高い脂質分解活性を示した。脂質分解以外の細胞外酵素活性についても調べた。これらの結果は、細菌の脂質分解能に関する基本的理解を提供して、廃棄物処理への利用に繋がる基礎的知見になると考えられる。
キーワード: 細菌、クリアーゾーン、リパーゼ活性、リパーゼ遺伝子、PCR
１ はじめに本研究で用いた細菌は、16SrDNAシーケンス分析により以前に同定されていた。
スクリーニングにより得られたこれらの菌株の、-5）をランダムに選抜した。使用した全ての細菌は、37℃において対数増殖期まで培養し、12-16時間の間隔で新鮮培地に三度植え継ぎを行った。
その後、細菌を固体培地に接種した。液体培地へ油脂分解力を左右する要因を探り、それらの廃棄の接種のさいは、OD660が0.5となるよう行った。

物処理などへの有効利用を図る目的で研究を行っ

基 本 増 殖 培 地 は 、 Nutrient Broth と Nutrient

た。

Agar（Difco, USA） を使用した。 脂肪と油は、 濾過

２ 実験方法（0.22 m, Millipore）ののち、基本増殖培地を滅２−１菌処理後に添加した。

使用した細菌及び培地

センター株の中から２種のBacillus属（MPITC-２−２

脂質分解活性2, MPITC- 14）、 そ し て 、 ７ 種 の Serratia

２−２−１ トリブチリン寒天培地中のクリアゾー

marcescens（SM41, 45, 48, 60, 62, 63, 77）にン形成能（リパーゼ［EC 3.1.1.3］／ついて調べた。そして、生分解性プラスチックをエステラーゼ［EC 3.1.1］活性）埋設した土壌か

ト リ ブ チ リ ン （ １ ％） を 添 加 し た Nutrientら 分 離 さ れ た 細 菌 株 か ら ９ 種 類 の Bacillus 属

Agar培地にストリークすることにより細菌を接（G-1, G-3, R-2, S-1, S-4, N-6-1, N-6-2, M-7, Mo種した。培地はpH５からpH 11に調整した。脂質

＊
＊１
＊２

土壌環境微生物のスクリーニング及び育種に関する研究（第３報）
元 客員研究員
資源環境部

分解活性は、10-48時間培養の後、細菌の周囲に形成されるクリアゾーンとして観察した。脂肪分解の程度は、クリアゾーンの直径に正比例している。プレートは、30℃と37℃で培養した。
11

土壌から分離した細菌の諸性質に関する研究

２−２−２

トリアセチン分解（エステラーゼ活

ミ ル ク を 含 む Nutrient Agar （Milk Agar）、性）ゼラチンを添加したNutrient Broth （Nutrient

細菌をブロモチモールブルー（0.01％）を含むGelatin）に接種して、37℃で24-48時間培養した。

液体栄養培地（pH７）に植菌した。基質として培養の後、デンプン寒天にヨウ素を滴下した。アトリアセチンを２％となるように加えた。同時にミラーゼが存在するならば、ヨウ素は、澱粉と化培地のpHも測定した。

学反応して濃い紫か茶色のクリアーゾーンが澱粉

２−２−３ 長鎖脂肪酸含有天然油の分解（リパー寒天の中に現れる。培地でのクリアーゾーンは、ゼ活性）

カゼイナーゼまたは他のプロテアーゼの存在を示

最終濃度が10％になるように長鎖脂肪酸含有天す。微生物がゼラチナーゼ（プロテアーゼの一種）

然油（大豆油、オリーブ油、ひまわり油、ココナッを生産するならば、 Nutrient Gelatinは液状化

ツ油、豚脂「ラード」）を寒天培地に加えた。ビする。通常、ゼラチンは25℃以下の水の中でゲルクトリアブルー指示薬（0.07％）は、脂肪が脂肪を生ずる。ゼラチンが加水分解されるとき、それ酸に分解されたことにより起こるpH変化（赤色はゲルを形成する能力を失う。

から青色へ）を観察するために加えた。細菌は、２−５効果的な食品廃棄物分解物を得るために、細菌寒天培地上に白金耳でストリークし20℃と30℃で同士が共存可能かを確認する必要がある。複数の培養した。
２−２−４

Bacillus属細菌阻害試験

最小栄養培地における増殖とリパー細菌を１枚のプレートにストリークして、それらゼ活性の共存性について調べた。25日間、室温培養後に100mlのNutrient Brothを用意し、900mlの蒸留水を加え、１リットルの溶液を作製した。これ観察することにより阻害の程度を確認した。
２−６

リパーゼ遺伝子のクローニングを「最小栄養培地」とした。細菌は、10 cfu ml

プライマーは、以前に報告されたリパーゼ遺伝の密度で植菌した。ココナッツオイル、大豆油と子のシーケンスに基づいて設計した。PCR（ポひまわり油を10％になるよう添加の後、30℃で１リメラーゼ連鎖反応）は、ABI GeneAmp 9700

週間培養した。濁度は、660nmにおける吸光度とを使って行った。 PCR産物は、 pGEM T-Easyして測定した。溶液のpHは、対照と比較して測ベクター （Promega） にサブクローン化を行っ定した。細菌培養液の遠心分離（18,000rpm,１分）

た 。 リ パ ー ゼ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 決 定 は 、 ABI

後の上清50 lを用いてリパーゼキットS（大日本

Sequence Analyzer 373で行った。

８製薬）によりリパーゼ活性を測定した。
２−３

廃油と排水を使用した実験

近隣のうどん屋より提供していただいた廃油

３

結果及び考察３−１

トリブチリン分解（１％）を液体栄養培地に加え、滅菌処理の後、

表１は、クリアゾーン形成能に基づき脂質分解室温に冷やしたのちに、５系統のS. marcescens能の高い菌を順番にまとめたものである。の接種を行った。また、廃油を加えた排水（同Bacillus属はpH9まで脂質分解能を有していたの様に滅菌 処理後 冷却） に も、 同様 に５系統 のに対し、S. marcescensは、pH 11の培地で成長すS. marcescensを接種した。植菌した試験管は、ることができトリブチリンを分解した（図１）。

20-22℃で１週間振とう培養を行った。脂肪分解

さらに、クリアーゾーンの直径は、高温においての程度は、ヘキサンで培地中の油を抽出することより大きかった。培養48時間以降は、クリアーゾーによって決定した。

ンの直径はそれほど変化しなかった。この結果に２−４よりリパーゼ活性は48時間ののち弱くなってきた

細胞外酵素活性他の各種物質を分解する細菌の能力を明らかにするするために実施した。細菌は、デンプンを含 む Nutrient Agar （Starch Agar）、 ス キ ム
12と考えられた。

土壌から分離した細菌の諸性質に関する研究

表１ トリブチリン培地中での脂質分解試験を行った。培地の色は培養とともに濃緑色かpH of tributyrin Relative ranking（visual analysis
agarof clear zone around bacteria）

ら黄色あるいはオレンジ色に変化した。液体培地

57, 891011

１．N-6-2
２．S-4
３．N-6-1, S-1, M-7
４．MPITC-14
５．SM41, SM77, SM60, SM63
６．SM62
７．G-3
８．Mo-5
９．SM48, R-2
１．N-6-2, S-4
２．S-1, M-7
３．N-6-1, MPITC-14
４．SM62, SM63, SM77, SM41
５．R-2
６．Mo-5
７．SM45, SM48
１．S-4
２．S-1, MPITC-14, N-6-2
３．M-7, N-6-1, SM77, SM41
４．SM62, SM63
５．R-2
１．SM77, SM60
２．SM41
３．SM62
４．SM63, R-2
１．SM77, SM60, SM62, SM63
２．SM41
３．R-2の色の変化は脂肪酸が生成したことを示す。pH減少度が大きいほどエステラーゼ活性が高いことが示唆される。このことはトリアセチンの加水分解により酸性の脂肪酸と酢酸を生産したことを示唆する。トリアセチンの存在下で、４種のBacillusが際立ったpHの減少を示した（図２）。
このことはトリアセチンの加水分解により酸性の脂肪酸と酢酸を生産したことを示唆する。このことは、色が青から淡いオレンジ色に変化したことによっても明らかである。

RANK : 1-strongest lipolysis

図２３−３

トリアセチン添加培地で３日間培養後のpH減少度
長鎖脂肪酸含有天然油の分解

他方、リパーゼは、長鎖脂肪酸含有油を分解する。細菌の長鎖脂肪酸含有油を加水分解する能力は、これらの酵素の存在を示す。各種天然油を加えた最小栄養培地で細菌を培養した。添加したビ
クトリアブルー指示薬は初め赤みがかっているが、pHが８未満であれば、濃青色となる。５系統のS. marcescensと３種のBacillus属（M-7, S-4, S図１

トリブチリン寒天培地（pH 11）におけるS. marcescensの増殖とクリアーゾーンの形成1）について、細菌をストリークした領域とその周囲は濃青色に変化した。酸生成は油の加水分解によってもたらされた。大豆油は、オリーブ油と３−２トリアセチン分解

ひまわり油とココナッツ油より色の変化の度合い

エステラーゼは、基質として短鎖トリアシルグが高かった。細菌の増殖能は30℃においてより高リセロールを分解する。この実験では、トリアセかったが、脂肪分解能は20℃でより強かった。豚チン（1,2,3 トリアセチルグリセロール）を加え脂（ラード）の存在下では細菌の増殖は20℃ではることによる細菌でのエステラーゼ存在の有無の悪かったが、30℃での増殖は20℃より若干良くなっ13土壌から分離した細菌の諸性質に関する研究た。しかし周囲は青色を示さなかったので、脂肪いて、高温（30-37℃）に比べてリパーゼ活性が分解性は見られなかったことになる。

高かった。このことは、高い温度でプロテアーゼ最も増殖度が高かったのはS. marcescensの系統株であった。これらの結果より、細菌が油をがリパーゼを阻害したことによる可能性が考えられた。

単純な構成成分に分解し、それを炭素源として使多糖類と重合体がS. marcescens系統のリパー用する能 力を有 すること を意味す る。 また 、ゼ活性を誘導することが、以前に報告されている。

S. marcescensは大豆油添加により最も高いリパーそれゆえに、S. marcescensの４つの系統のリパーゼ活性を示した（図３）。オリーブ油、ひまわり

ゼ活性をチェックするために、培地に多糖類と重油、大豆油は不飽和油である。一方ココナッツ油合体を加えた。その結果、CMセルロースとポリは、飽和油である。これらの油はすべてリパーゼビニルアルコールおよびグリコーゲンがリパーゼの基質となる長鎖脂肪酸を含んでいる。これらの活性を増大させることを示す結果が得られた（図結果より、不飽和の天然油においてリパーゼ活性５）。逆に、ペクチンはリパーゼ活性を減少させは高かったということになる。

た。また、Nutrient Brothに食塩（NaCl）を添加３−５することにより、リパーゼ活性の上昇が見られた。

廃油と排水を使用した実験

廃油を含む排水に５系統のS. marcescensを接種して培養後ヘキサン抽出による脂質分解程度の測定結果を図４に示す。リパーゼ活性を測定したが、活性はほとんど検出されなかった。この理由
として、液体培地に出た脂肪酸のためpHが下がったのでリパーゼは不活性化されたのかもしれない。
３−６

細胞外リパーゼ活性の定量

リパーゼ・キットSを使用してリパーゼ活性を測定した結果、用いた18種の細菌の中で５種類のS. marcescensがリパーゼ活性が高かった。１系
統のS. marcescensに関してはリパーゼ活性を全く示さなかった。さらに、低温（18-20℃）にお図４ 天ぷら廃油と混合廃油（動物油脂、植物油）を添加した Nutrient Broth 液体培地で培養した５系統のS. marcescensによる脂質分解量（％）

図３ 油を添加した最小栄養培地で高いリパーゼ活性を有していた細菌（Note）0.1×NB : 10％ nutrient broth powder in distilled water14土壌から分離した細菌の諸性質に関する研究

表２

細菌による分解試験

Bacteria
StarchBacillus species :

図５３−７ポリマーと多糖類添加のリパーゼ活性に対する影響

リパーゼ以外の細胞外酵素活性

大部分の細胞と同様に、細菌は細胞呼吸のためにグルコースとグルコース誘導体を使う。しかし、環境には、遊離のグルコースの十分な供給がない。
これに対処するために、大部分の細菌は、エネル

MilkGelatim

MPITC-2
MPITC-14×○×○

×
○

G-1
G-3×
○

○
○

○
○

R-2
N-6-1○○

○
○

○
○

N-6-2
S-1○○

○
○

○
○

○
○○○○○○×○○
○
○
○

○
○
○
○
○
○
○

S-4○
M-7○
Mo-5○
Serratia marcescens :
SM41×
SM45×
SM48×
SM60×
SM62×
SM63×
SM77×

○−clear zone observed ; degradation
×−no clear zone ; no degradation

ギー源として他の材料を利用するための代謝経路を持つ。細菌は食菌作用を行うことができないの

３−８

細菌阻害試験

で、細胞の外側で大きい食物分子を分解しなけれ

ある種のBacillus属は他のBacillus属の増殖をばならない。細菌は、細胞外酵素の使用によって阻害した （死滅させた）。 お互いに共存可能なこれを達成する。それから、細菌は受動的な拡散Bacillus属も存在した。この結果より５グループまたは能動輸送によって酵素触媒作用により生じ（3-5種 グループ） に分類することができた。

た産物を取り込む。

ま た 、 Bacillus 属 が 増 殖 す る 付 近 で は 、 S.

この試験では、異なる起源から単離した細菌のmarcescensの増殖能は低下する傾向が見られた。

物質分解能をゼラチナーゼ、カゼイナーゼ、アミある種のBacillusは抗生物質などを出すことによっラーゼなどの細胞外酵素の存在を調べることによて他の細菌の生存を阻害することが考えられる。

り明らかにした。３種類の細胞外酵素は、これら３−９の微生物が一般に国内の廃油だけでなく食品廃棄物の分解における有益性を考慮して調べた。

S. marcescensリパーゼ遺伝子のクロー
ニング

PCRによって得た遺伝子産物をシークエンス解デンプンおよびスキムミルクNutrient Agarに析することによって、１系統の S. marcescensのおいてクリアーゾーンの形成を観察した。カゼイ

リパーゼ遺伝子構造を明らかにした。これまでにンはミルクの中の主要なタンパク質であり、ミル報告されているS. marcescensのリパーゼ遺伝子

クに不透明な白い色を与える。カゼインタンパク

lipAとアミノ酸レベルで96％の相同性を示した。

質を加水分解することによりクリアーゾーンが見また、Pseudomonas fluorescensのextracellularられる。ゼラチン添加培地においては、ゼラチン

lipaseと60％の相同性を有していた（図６）。の液化（４℃で冷却された温度で観測できる）を観察した。結果を表２に示す。

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土壌から分離した細菌の諸性質に関する研究

４

まとめ１） S. marcescensはpH 5-11の培地で生育しトリブチリンを分解した。
２） トリ アセチン 含有培 地におい て、 ４種 のBacillus属と６系統のS. marcescensの生育によって培地のpH減少度が大きく、エステラーゼ活性高いことが示唆された。
３）S. marcescensは大豆油含有最小養培地において高いリパーゼ活性を示した。
４）廃油を含む排水においてS. marcescensの働
S. marcescens lipAployurethanase esterase A［Pseudomonas chlororaphis］
extracellular lipase［Pseudomonas fluorescens］

SM48 lipase
96％

きによる、脂質分解が見られたことから、廃棄物処理への利用が期待される。

61％５）CMセルロースとポリビニルアルコールおよ59％

びグリコーゲンがリパーゼ活性誘導の補助因子として作用することが明らかとなった。

図６＊

単分離したMS48リパーゼ遺伝子と、報告されているS. marcescens lipA遺伝子のア
ミノ酸レベルでの比較は同じアミノ酸あることを示す。表は互いの相同性の割合を示したもの。

６）リパーゼ活性以外にもプロテアーゼやアミラーゼなどの細胞外酵素活性を有しており、生ごみなどの食品廃棄物処理にも有効となる可能性がある。
７）S. marcescensリパーゼ遺伝子のクローニングを行い、脂質分解に関与する酵素の遺伝子工学的解析の糸口を掴んだ。
謝辞
英語原作から日本語翻訳：中瀬昌之（南九州大学）

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