博 士（医学）澤田早

学 位 論 文 題 名脂 肪 細 胞 特 異 的 Perilipin過 剰 発 現 マ ウ ス に お け る
肥 満 抵 抗 性 ， お よ び 糖 ・ 脂 質 代 謝 改 善 に 関 す る 検討
学位論文 内容の要旨【背景と目的】近年問題になっているメタボリックシンドロームの病態を考える上で，脂肪細胞における脂肪貯留及び分解のメカニズムを解明することは極めて重要な事項である，
脂肪細胞内の脂肪滴表面には多数の脂肪滴結合性蛋白質が存在しているが，それらの中でも
P
erili
pinA
(PeriA)は，脂肪細胞における最多のりン酸化蛋白であり，カテコラミン刺激後にPKA(プロテインキナーゼA)によるりン酸化を受け活性化される，そして，様々な脂質代謝関連蛋白の制御を行なぃ，脂肪細胞内の脂質代謝における中心的な役割を果たしている．
Peri
Aノック アウトマ ウスく KO)
での 研究か ら，PeriAはPKA
非刺激下では脂肪分解を抑制0旨肪貯留）し，PKA
刺激後は反対に脂肪分解を約100倍程度に著しく亢進させる正反対の作用を有することが明らかになっている．当科で以前に作製した脂肪組織特異的P
eri
A過乗I
幌現卜ランスジェニック(Tg)マウスは普通食(ND)投与下で摂餌量に差は無いものの，体重増加の抑制と白色脂肪組織重量の減少，脂肪細胞の小型化を認めた．本研究では，高脂肪食(HFD)投与による体重増加などのフェノタイプや脂質・糖代謝の変化，およびそれらの要因を明らかにする目的で，Tgの生理的・組織学的特徴と，その背景となる遺伝子発現の変化や分子生物学的メカニズムに関する検討を行った．
【対 象と方 法】Tg
はaP2
プロ モーター を用い て脂肪組織特異的にPeriAを過剰発現させたもの であり ，野生型 C
57BL/6マ ウス(WT)と 比較して 褐色脂肪組織で5倍，白色脂肪組織で2倍のPeri
A蛋白発現増加を呈する．全マウスを室温，自由飲水・摂食，12時間毎の明暗期
下 で 飼育 し ， ND
を 投与 した群， H
FDを 生後5週から30週まで投 与した群 （いず れもn=7)をっくり，週毎に体重の推移及び摂餌量を観察した．生後28
週にて腹腔内ブドウ糖負荷試
験(LPGTT)，29週にて腹腔内インスリン負荷試験(IPITT)を施行し，30
週にて酸素消費量測定を行った後に解剖しI血液および各組織を摘出した．そして，脂肪組織の脂質代謝及ぴ細胞分 化関連 分子の発 現をDN
Aマイク ロアレ イ法，リ アルタイムPCR法，ウエスタンブロツト法，免疫組織染色法にて解析した．また，白色脂肪組織から単離した脂肪細胞に対する脂肪分解刺激実験も施行した，【結 果】HF
Dを投与 したTgは ，WTに比し て著明 な体重増 加抑制 を示し， 部位別 各脂肪組
織 重 量も Tgに おい て半 分程度に 有意に 減少して いた， 摂餌量は W
TTgの両群 間で有意 差を認めなかったものの，Tg群では酸素消費，およびエネルギー消費が24時間を通して有意に増加していた，こうした肥満抵抗性やエネルギー代謝亢進の要因を明らかにするために，
DN
Aマイク ロアレイ 法によ る白色脂肪組織の遺伝子解析を行ったところ，Tg
において脂肪酸の B酸 化及び熱 産生に 関連する 遺伝子j及び 脂肪細胞分化に関連する遺伝子の発現増加と，脂肪合成に関連する遺伝子の発現低下を認めた．この解析結果から，発現変化が予想され た 蛋白 に っ い て， リ ア ルタ イ ム P
CRを 施行 し WTと TgのWATに おけ る 発 現量を 比較した， その結 果，脂肪 合成系 遺伝子で あるSC
D1やDGA
T1等の 有意な 発現低下 を認め，白色脂肪 細胞へ の分化に 関与す るR
IP140がTgに て発現低 下していたー方，褐色脂肪細胞への― 253ー

分化 に関与す るP
GClaが有意に 発現亢 進してお り，脂肪 酸のB酸化およびエネルギー燃焼に関 与する遺伝子もTgにて有意な発現亢進がみられた．そして，褐色脂肪細胞に特異的に発現 する脱共役蛋白のU
CP1が，Tgの白色脂肪組織に異所性発現していることが示された，
また ，大きな 単房性 の脂肪滴 形成による中性脂肪蓄積作用を持つ脂肪滴周囲蛋白FS
P27の発現が，Tgの白包脂肪組織では著明に低下していることも確認した．さらに，IPGT
T並ぴにIPI
TTの 結果 で は ，HFDを投 与し たTg
はWTに 比べ，ブ ドウ糖 負荷に対 する血 糖上昇の 抑制と インスリ ン感受 性の改善 を有意に認め，血清中のインスリン，レプチン濃度もHFD投与の Tgにて有意に低下していた，これらの要因を明らかにする目的で，白色脂肪細胞における AMPKの活性化 を，WT及 びTgから 単離した 脂肪細胞 の脂肪 分解反応前後で評価した，その結果，Tgでは脂肪分解刺激の無い定常状態でも既にAMPKの活´1生イ匕が起こっており，PKA刺激を加えることでその傾向は顕著となった．
【考 察】Peri KOマウス (KO)が肥満 抵抗性と脂肪萎縮を認めたことより，Tg
作製当初はTgが肥 満マウスになることを想定していたが，TgもKO同様肥満抵抗性と脂肪萎縮を認めた．
様々 な代謝関 連蛋白 の発現変 化にっいて解析を行った結果，脂肪酸p酸化及び熱産生に関連する遺伝子の発現増加と，脂肪合成関連遺伝子の発現低下が認められた．また，個体における 酸素消費量，エネルギー消費量もTgで有意に増加しており，エネルギー消費亢進がTgにおける脂肪重量減少と関係していることが考えられた．熱産生に関与する蛋白の中でも，特 に WATに お け る UCP1の 発 現 がTgで 顕著 に 認 め られ た ． U
CP1は褐 色 脂 肪の ミ 卜 コン
ド リ アに 特 異 的に 発 現 する 蛋 白 であ る が ，本 研 究 では TgのWATにお けるUCP1の 異所性発現 がmRN
Aレベル ，蛋白 レベル， 及び組 織像で確 認され た．近年，脂肪細胞の発生や分化に 関する報告が相次いでいるが，問葉系幹細胞由来の，脂肪組織内の微小血管周囲に発現す るA
dipo
blastにて PGCla等が 作用すれば褐色脂肪への分化が誘導され，RI
P140等が作用す れば白色脂肪への分化が促されるとされており，白色脂肪が褐色脂肪化する可能性を示唆 している ．本研 究では， TgのWAIにおける RIP140の著明 な発現低下と，PGCla等の発現増 加が認め られ， TgのWAT
内 で褐色脂肪細胞への分化誘導が起きている可能性が考えられる．また，FS
P27のノックアウトマウスの解析結果報告では，同マウスは肥満抵抗性と酸素消費の亢進，耐糖能改善を示し，脂肪酸D酸化等に関与する遺伝子の発現増加など，Tgと類 似 した 特 徴 を呈 し て いた ，今 回の検 討では， TgのWATにてFS
P27がmRNA
レベ ルでも蛋白レ ベルでも 発現低 下してい たことより，脂肪滴の縮小化はFSP27の発現低下を介した可能性 が考えられた．この両マウスの脂肪滴縮小化がどのように白色脂肪の褐色脂肪様変化に結び付くのかは今後さらなる検討が必要であるが，「脂肪滴の大きさ」といった細胞内環境変化が，脂肪細胞の特性そのものを変化させる可能性が考えられる，本研究では他に，Tgにて 高脂肪食負荷に対する耐糖能悪化やインスリン抵抗性，レプチン抵抗性の改善が認められ ，インスリンやレプチンの作用を介さずに糖代謝を改善する系として心岨P
K活性化経路を考 えた．脂 肪細胞内 のPeriA
発 現 に よっ て AMP
Kの 活 性化 が お こる こ と がmvmoの研究 で明らかにされているが，今回Tgから単離した脂肪細胞においても同様の結果が得られて おり，Per仏発 現がAM
PK
活性 化を惹 起するこ とがinvi
tro，exvivoの両者に韜いて示された，【結 論】Pernipin過剰発現マウスでは高脂肪食負荷に対する肥満抵抗性，脂肪組織重量の減少 ，脂肪細胞縮小化が認められた．野生型マウスと比して摂餌量には差を認めなかったが，酸素消費量やエネルギー消費量が亢進していた．これらの背景として，脂肪組織における脂 肪酸酸化や熱産生に関連する蛋白の遺伝子発現亢進，並びに脂肪合成系の遺伝子発現低下 があり， FSP27の 発現低下 が関与すると考えられる白色脂肪組織の褐色脂肪様変化を認めた，高脂肪食投与P
erilipin過剰発現マウスでは，耐糖能の悪化やインスリン抵抗性が有 意 に 改 善 し て お り ， その 要 因と し て心 皿
Kの 活 性 化 が 考 え ら れ た ．

ー 254−

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 筒 井 裕 之

学 位 論 文 題 名

脂肪細胞特異的Pe
ril
ipin過剰発現マウスにおける肥満抵抗性，および糖・脂質代謝改善に関する検討
脂肪細胞内の脂肪滴表面には多数の脂肪滴結合性蛋白質が存在しているが，それらの中でも脂肪細胞における最多のりン酸化蛋白であるPe
rilipinAくPeriA)
は，様カな脂質代謝関連蛋白の制御を行なぃ，脂肪細胞内の脂質代謝における中心的な役割を果たしている．以前に作製した脂肪組織特異的Pe
riA
過剰発現トランスジェニックぐrg）マウスは普通食くND）投与
下 で摂餌 量に差は無いものの，体重増加の抑制と白色脂肪組織重量の減少，脂肪細胞の小型化を認めた．本研究では，高脂肪食（HFD）投与による体重増加などのフェノタイプや脂質・糖代謝の変化，茄よびそれらの要因を明らかにする目的で，Tgの生理的・組織学的特徴と，その背景となる分子生物学的メカニズムに関する検討を行った．全マウスをND投与群，
船よぴH
F
D投与群（いずれもn二ニ7）に分け，週毎に体重の推移及ぴ摂餌量を観察し，腹腔内ブドウ糖負荷試験（IPGTT），腹腔内インスリン負荷試験くIPITT
冫，酸素消費量測定を行った
後 に解剖 した．そ の結果 ，TgはWrに比してHFD投与に対する肥満抵抗性を有意に示した，
摂 餌量は 両群間で有意差を認めなかったものの，Tg群では酸素・エネルギー消費が有意に増加していた，白色脂肪組織の遺伝子解析を行ったところ，Tg
において脂肪合成系遺伝子であ る SCDや DGAT等 の 明 ら か な 発 現 低 下 を 認 め ， 白 色 脂 肪 細 胞 へ の 分 化 に 関 与 す るRI
P140がTgにて発 現低下 していた 一方， 褐色脂肪 細胞への 分化に関与するPGC1也や，脂肪 酸のp酸化な どに関与 する遺 伝子がTgにて有意に発現亢進していた．そして，褐色脂肪細 胞に特 異的に発 現する UCP1が，T呂の白色脂肪組織に異所性発現していることも示された ．さ らに， IPG
TT並び にIPIT
Tの結果で は，HFDを投与 したTgはWTに比べ， 耐糖能 および インス リン感受 性の改 善を有意 に認め， Tgの白色 脂肪細胞 ではAMPKの活性化が認められ た．近 年，白色 脂肪の 褐色脂肪 化に関する報告が相次いでいるが，本研究ではTgのW灯に 韜ける R
亅P140の 著明な 発現低下 と，PGCld等の発現増加が認められ，TgのW灯内で褐色脂肪細胞への分化誘導が起きている可能性が考えられる，また，ある特定の脂肪滴周囲蛋白の 発現を 変化させたマウスの解析結果報告でも，今回のTgと類似した結果を示しており，「脂肪滴の大きさ」といった細胞内環境変化が，脂肪細胞の特性そのものを変化させる可能
性 が 考 え ら れ る が ， そ の メ カ ニ ズ ム に 関 し て は 今 後 さ ら な る検 討 が 必 要で あ る ．
以上の発表後，副査の畠山鎮次教授より数点の質問があった．まず，今回の研究ではへテロ のTgを用 いている が，ホ モTgについ て解析 をしてい るかと の内容であったが，ホモTgは へテロ 同士の交配で作成可能であるが，作成および解析については現在取り組み中であー 255−

る旨を申請者は回答した．また，PeriAの構造や，Peri
Aは脂肪細胞分化のマスター蛋白であるのかに関しても問われたが，Peri
Aの立体構造は現時点では未解明であること，また近年
FSP27なる脂肪滴周囲蛋白を ノックアウトしたマウスにて，本研究のTgと類似した表現型のほ か， R
IP140の発現低下，更にPeri
A mR
NAの代償性発現増加 などが認められた文献報告を引用し，PeriAはFSP27など他の脂肪滴周囲蛋白とともに，脂肪細胞内環境を調節することで脂肪細胞分化をコントロールしている可能性を現時点では想定している旨を回答した，次いで，副査の筒井裕之教授からは，Tgにおける白色脂肪の形態学的変化などについての質 問が あっ たが，Tgの白色脂肪組織はWTよりも小型で軽いが ，KOマウスなどでみられるよ うな 色調 の変化までは呈さなぃこと，また白色脂肪の褐色 脂肪化に関してはU
CP1の異所性発現を確認したことでそう判断した旨を回答した ．その他，AMPKの上流にSirtlなどの因子が存在することが近年相次いで報告されているが，Sirtlなどの検討の有無に関する質問もあったが，本研究の遺伝子解析ではSi
rtlは関与していなぃ旨を回答した．最後に主査の小池隆夫教授より，Peri
Aの臨床応用に関する質問が寄せられたが，P
eriA
は構造蛋白であるため，ヒトの脂肪組織のPeriA発現を直接変化させて治療に結ぴっけることは現時点では困難であること，しかしヒトにおいてP
eri
Aの発現量や，特定の遺伝子型と肥満・糖尿病との関連を示した報告も複数あり，Per:iAを調べることで患者個人個人の肥満・糖尿病治療の方向性を立てるテイラーメイド治療に応用できる可能性がある旨を回答し，また血管内動脈硬化巣（プラーク）における脂肪滴周囲蛋白発現とプラークの安定性に関する最近の 知 見 に 基 づ い た 臨床 研究 を開 始し ている こと に関 して も説明 した ．
この論文は，本学が初めて作製に成功したPe
r仏過剰発現マウスにおける肥満抵抗性や代謝変化の根底に，白色脂肪の褐色脂肪化が存在することを明らかにした点で高く評価され，今後の肥満・糖尿病の臨床において脂肪細胞の質的変化に着目した治療が更に重要性を増すことが期待される．
審査員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申請 者が 博士 （医 学） の学 位を 受け るの に充 分な 資 格を 有す るものと判定した．

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