博士（医学）須藤章

学 位 論文 題 名
Leigh syndrome caused by mitochondrial， DNA G13513A
mutation: frequency and clinicalfeature
SinJapan．
（ ミ トコ ン ド リ ア DN
A1351
3G→A変異に よる Leigh症候 群：
日 本 にお け る 頻 度 と臨 床 的 特 徴 ）学 位 論 文 内 容 の 要旨

ミトコンド1Jア病 は、細胞内のェネルギー産生 に重要な小器官であるミト コンドリアの機能異常のために 、脳 や 筋肉 、心 臓、 腎臓 な ど様 々な 臓器に障害をもたらす疾患 である。小児においては、高 乳酸血症 、 卒 中 様 症状 を 伴う ミト コン ド リア 病(MELAS）と 、 Leigh症 候群 が代 表的 であ る 。特 に後 者は 、乳
幼児 期よ り 精神 運動 発達 遅延 を 示し 、感 染などを契機に発達停止、 退行し、けいれんや呼吸障害 等で早期に 死亡 す る可 能性 のあ る重 症 な疾 患で ある が、 そ の原 因や 治療 法 に関 して は、 未解 明の点が 多い。
ミ ト コ ン ド リ ア 病 の 原 因 と し て は 、MELASでは 主 にミ トコ ンド リア DNAの異 常 に起 因す るこ とが判 明 し て い るが 、 Leigh症 候群 では 、核 DNAとミ トコ ン ドリ アDNAの 両方 の異 常が 報 告さ れて いる が、
全 容 は 明 ら か で は な い 。 ミ ト コ ン ド リ ア DNA 13513G→ A変 異 は 、 MEL'Sの 新 し い 変 異 と し て1997年に報 告さ れ たが 、比較的頻度が高い変異 であることが判明したため、 Leigh症候群についても同変 異が存在するかを検索し、そ の変異を有する臨床的特徴を 調査した。
く 対 象 ・ 方法 ＞ 対象 は、 1990年 から 2000年ま での ll年間 に、 Leigh症 候群 を疑 わ れ、 筋肉 また は血液 の DNAが 採 取 され た84例 。Leigh症候 群の 診断 には 、 （1） 小 児期 発症 で、 発達 遅 延ま たは 退行 を示す、 （2）血 中ま たは 髄 液中 の乳 酸値 が 20m〆 dlを こ える 、（ 3） 頭部 CTや MRI検査 で、 基底核ま たは脳幹に左右対称性の病変 を認める、の3つの基準を満 たしているものとした。ただし、筋生検が行われ、1ゲ。
を こ え る 赤 色ぽ ろ 線維 （RRF） や血 管周 囲の ミ トコ ンド リア の 蓄積 像（ SSV）を 認め たも の はMELASの可 能 性 が あ る の で 除 外 し た 。 ミ ト コ ン ド リ ア DNA13513G→ A変 異 の 検 索 に は 、 PCRに よ る DNAの 増幅
後、 制限 酵 素断 片長 の違 いを 電 気泳 動で 判別 して 行 った 。ま た、 断 片の 濃度 より 変異 率を計算 した。
く 結 果 ＞ Leigh症 候 群 と 考 え ら れ た 84例 中 6例 （ 7ワ 。 ） に 、 ミ トコ ンド リア DNA13513G→A変 異を認 め た 。 い ず れ の 患 者 に も 、 こ れ ま で Leigh症 候 群 で 報 告 さ れ て いる 既知 の変 異 （ミ トコ ンド リアDNA8993，9176，8344， 3243の各変異）を認めなか った。その他の症例中6例に、ミトコンドリアDNAの8993T→ Gま た は T→ C変 異 を 、 4例 に 9176T→ C変 異 を 、 2例 に l1777C→ A変 異 を 、 1例 に 8344A→ G変 異 を認 め た 。 ミ ト コ ン ド リ ア DNA13513G→ A変 異 を 示 し た 6例 は 、 検 査 時1〜 7歳 の小 児 （男 2例 、女 4例）
で 、 発 症 年 齢 は 9力 月 か ら 5歳 で 、 症 状 と し て 、 眼 瞼 下 垂 （ 5例 ） やWPW症 候群 など の心 伝 導障 害（ 4―81―

例）が多かった。検査所見として、全例で髄液乳酸値は、25〜85mg/dlの高値を示し、画像上の脳幹病変も認めた。筋病理｜ま、非特異的なミオパチ一所見のみであり、チトクロームC酸化酵素の欠損線維も認めなかった。筋肉中の変異ミ卜コンドル アD
NAの割合は、42^‑70c9;（平均59%)であったが、変異率と発症年齢、重症度との間に関連を認めな かった。ミトコンドリアの呼吸鎖酵素活性を6例中4例で測定したが、有意′よ低下を認めなかった。
く 考案 ＞過 去の 論文 で 、ミトコンドリアD
NA
1351
3G→A
変異がIVtELASの病因であることの根拠として、次の5点が上げられている。（1）病変臓器で変異率が高い。(2)ミトコンドリア呼吸鎖複合体Iのサブュニット蛋白であるN
D5を構成する、生物進化上で高度に保存されているアミノ酸配列を変化させる。(3)健常人に変異を認めない。(4)単一筋線維での分析で、ミトコンドリア異常が明らかな赤色ぼろ線維のある筋線維での変異率が高い。(5)同じアミノ酸変異をもたら す13514A→G変異でも、MELASを発症する。過去のマウスの実験において も、NADH脱炭酸酵素がND5遺 伝子に強く依存していることが示されており、その異常を招く本変異が ミトコンドルア病の原因となることは間違いないであろう。
本 研究 では 、日 本人 の L
eigh症侯群86例中6例（7gra)に、ミトコンドリアD
NA13513G→A変異を認めた。一方、これまでL
eigh症候群に最も多いミトコンドルア異常と考えられている8993変異も今回は同じ6例であった。それゆえ、1苅13変異はLeigh症候群におしゝても、比較的高頻度に見られる変異であることが判明した。しかし、8993変異は、これまでの報告では、Leigh症候群の15〜 20%を占めるという幸＆ 告も ある こと から 、 現時 点で は13513変異 は2番 目の高頻度変異と考えた方が良いであろう。
13513変異を有する患者は、乳児期前半に発症することの多い一般的なLeigh症候群と比較すると、発症が やや 遅く 、症 状も 比 較的軽い印象であった。また、眼鹸下垂やWPWなどの心伝導障害を6例中5例で認めた。これらの症状は、他の変異によるミトコンド1」ア病ではあまり述べられていないため、この変異に出現しやすい臨床的特徴と考えられた。しかし症例数が少ないため、この変異と臨床的特徴との関連については、まだ明確なことは言えない。
これまでの報告とは異なり、今回の6例中4例の筋肉で調ぺた呼吸鎖酵素活性は正常であった。その理由としては、13513変異が臓器によって変異率が異なる性質を示すため、筋肉では変異率が低く酵素活性カj正常範囲となった可能性がある。過去に報告されたマウスの実験によると、ミトコンドリアDNAの変異が閾値に達するまで増加しないと、酵素活性は正常というデータがある。一方で、13513変異では変異率が低くてもLeigh症候群を発症するという最近の報告もあり、変異率の酵素活性との関連については、今後の研究が待たれる。
13513変 異がなぜ、MELASとLeigh症候群の両方の疾患の原因となりうるのかは不明である。両者において変異率を検討した我々の他のデータでは、変異率に差を認めなかった。しかし、MELASの患者には、赤色ぽろ線維などの筋病理所見を多く認めた。13513
変異は2つの表現系と関係しでいる珍しい変異であるため、この変異について研究することは、一般的なミトコンド1」ア遺伝子変異と表現系との関係を考える上でも、重要である。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 有賀正
副 査 教 授 佐木直
副 査 教 授 筒 々 井 秀 之裕

学位論文題名Leigh syndrome caused by mitochondrial DNA GI3513A
mutation:frequencya
ndclinic
alfeaturesi
nJapan．
（ミトコンドリアDNA13513
G→A変異によるLeigh症候群：
日本における頻度と臨床的特徴）

ミトコンドリア病は、 細胞内のエネルギー産生に重要な小器官であるミトコンドリアの機能異常のために、脳や筋 肉、 心 臓、 腎臓 など 様カ な 臓器 に障 害を も たら す疾 患で ある 。小児においては、卒中様症 状を伴うMELASと 、Leigh症候 群が 代表 的 であ る。 特に 後 者は 、乳 幼児 期に 発症し、基底核や脳幹が左右 対称性に障害 され 特 徴的 な病 理像 を示 す 重症 の脳 変性 疾 患で ある が、 原因 は未解明な点が多い。1997年 に報告された MELASの 新し い 変異 （ミ トコ ンド リ アDNA 13513G→A)が、こ れまで報告されてきたtRNA領 域の点変異ではなく、呼吸鎖酵 素を構成する重要な蛋白（ 複合体IのND5)のアミノ酸構造を変えることから、Leigh症候群にも同変異を認めるかどうかを研究した。1990v‑2000
年に、インフオームド・コンセントのもとに筋肉または血 液の DNAが採 取 され 、国 立精 神神 経 セン ター に保 存さ れ ている 症例中で、Leigh症候群と臨 床的に診断確実な84例を対象と した。Leigh症候群の診断基 準としては、以下の4つ全てを満たすこととした。(1)
小児期発 症で あ るこ と(2)精 神運 動発 達遅 延 また は退 行に 加え て 他の神 経症状を有すること(3)血液 または髄液の 乳酸 値 が高 値(>20mg/m） （ 4）頭 部 MR亅 また はCT画像 所 見で 基底 核ま た は脳 幹の 特徴的な 病変を有する こと 。 ただ し、 MEIASか Leigh症 候群 か鑑 別 が困 難な ケー スは 、筋病理所見と主治医臨床診 断を重要視し た。 ミ トコ ンドリアDNAの変異解析 には、変異を含む領域をPCRで増幅させて制限酵素で切断 し、電気泳動により判定した。 プラスミドを用いて100％変異株と100％野生株を作り、変異率が10％毎10ー90％にした
ものを電気泳動することで、変異率とバンド濃度との関係をグラフ化した。このグラフをもとに、バンドの濃度から変異率を計算した。 その結果、84例中6例（7％ ）で、13513G→A変異を認めた。同時に調べた他の変異は、8993T→ （ W変 異 を 6例 、 9176T→ C変 異 を 4例 、 11777C→ A変 異 を 2例 、 8344A→ G変 異 を 1例で 認め た 。
13513G→A変異は、ヘ テロプラスミーを示し、筋肉 での変異率は42ー70％であった。健康人コントロール150
例 お よ び 3243A→ G変 異 を 有 す る 120例に は 同変 異を 認め なか っ た。 13513G→ A変 異を 示し た Leigh症 候群は 、発 症 年齢 が乳 児期 後半 か ら幼 児期 であ り 8993T→G変異 より 遅く、全例で脳幹病変を伴い 、6例中5― 83ー

例で 眼 瞼下 垂と WPW症候 群な どの 心 伝導 障害 を認 めた 。 筋病 理で は特 異 的な 所見はなく、呼吸 鎖酵素活性は調べた4例とも 正常範囲であった。ただし 、複合体I単独での酵素活性は測定しなかった。これまでの文献も合わせると、この変異がミ卜コンドリア病の原因となりうる根拠として、次の4点が上げられる。(1)罹患臓器で変 異 率が 高い (2)ミト コン ドリア呼吸 鎖複合体Iの構成蛋白のうち 重要なND5の進化上高度に保 存されているアミノ酸を置換し、酵素活性を低下させて影響を与える。そのため、同じアミノ酸変異をもたらす13 513A‑*G変 異 で も 、 MELASを 発 症 す る (3)健 康 人 に 変 異 を 認 め な い (4) MELAS症 例 の 単 一 筋 線 維 で の 分 析
で、 ミ トコ ンド リア 異常 が 明ら かな 赤色 ぼ ろ線 維の ある筋線維での 変異率が高い。本変異の表 現型が、MELASと Leigh症 候群 の両 方 を示 す理 由と し ては 、単 純な 変異 率 だけ では 説明 が困 難 で、 未解 明の 他 の因子（核遺伝子な ど）の関与が推察された。今回の研究により、L
eigh症候群にも13 513G‑*A変異を認め、その頻度が8993変異 と同程度に比較的高いことが 初めて示された。臨床的に も、これまで良く知られた8993T→G変異とは異なる 特徴を有していた。また、 Leigh症候群のおよそ2割が既知のミトコンドリアDNAの変異で説明可能となり、原因の解明が進んだ。
公 開 発表 に際 し、 副査 の 筒井 裕之 教授 か ら症 例の 心筋 収縮 力 、WPW症 候群 をきたす機序等に っき質問をされた。また、副査の佐々．木秀直教授からは、髄液乳酸値が高いことの理由、ミトコンドリア病の共通概念など の質問が あった。主査の有賀正教授 からは、母親の表現型と変異 率について8993変異との違 い、変異率が年齢とともに 増加して発症する可能性、罹患臓器とミ卜コンドリアDNAの変異率との関係、生化学的・遺伝学 的側面か ら疾患分類の変更の必要性 がないか等の質問があった。 いずれの質問に対しても、 申請者は実験データや、文 献をもとに、適切な回答をな し得た。質疑応答の時間は、約15分であった。なお、出席者はおよそ10名であった。
この論文は、未 解明な点が多かったLeigh症 候群に新たなミトコンドリアDNAの変異が原因となり、その頻度 が 比 較 的 高 い こ と を 示 し た 点 、 特 徴 的 な 臨 床 像 を示 すこ と を明 らか にし た点 で 高く 評価 され た 。
審査員一同は、 これらの成果を高く評価し、 これまでの豊富な臨床研究発表なども併せて、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判定した。

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