軟骨細胞様細胞において ILIL-4 は力学的負荷誘導性のRUNX2 および MMPMMP-13、13、ADAMTSADAMTS-5 の発現を抑制するか
岡山大学大学院
鉄永智紀、鉄永智紀、西田圭一郎、古松毅之、成瀬恵治、広畑聡、斎藤太一、尾崎敏文

はじめに変形性関節症（OA）の病態はいまだ明らかでないが、MMP に代表される一連の蛋白分解酵素が軟骨破壊の進展に重要であると考えられてきた。多くの MMPs は IGD の A
sn341-Phe342 結合部位を切断するが、現在までに OA の進行過程で Asn341-Phe342 とは全く異なる部位でも切断されることがわかってきている。特に OA での主な切断部位は Glu373-Ala374 であり、ADAMTS-4,-5 がこの部位での切断に関与する酵素であることが判明した。また、近年 OA 発症におけるメカニカルストレスのターゲットとして RUNX-2 も注目されている。いくつかの ADAMTS 遺伝子のプロモーター領域には RU
NX-2 結合領域が存在することが報告されており、今回我々は軟骨細胞におけるメカニカルストレス―RUNX-2―アグリカナーゼ経路について解析した。
OA 治療として ADAMTS 阻害剤を応用する場合、軟骨変性が進行し MMPs によるⅡ型コラーゲンの破壊が進行してからでは ADAMTS 阻害剤の効果は期待しにくい。従って OA 初期のアグリカナーゼ活性を解明する必要があるが、現在 OA におけるアグリカナーゼの特異的転写因子、調節機構は十分に解明されていない。本研究では、メカニカルストレスにより RUNX-2 発現が亢進するかどうかの検討、RUNX-2 と MMP-13、ADAMTS-family の軟骨破壊における役割の解明、RUNX-2 による軟骨破壊の促進が軟骨保護作用を有するとされる IL-4 により抑制されるか否か、及びその機序について検討した。

方法

ロールとして使用した。

細胞培養： SW1353(ヒト軟骨細胞様細胞)を 10mL DMEM（10% FBS、37℃、5% CO

RTRT-PCR、PCR、RealReal-time PCR：
PCR：cDNA は 111の RNA から作製し、10pmol のプライマー2）で単層培養した。

で RT-PCR を行った。使用したプライマー

ストレッチ（CTS：SW1353
を 2×2 cmストレッチ（CTS）
CTS）：のストレッチチャンバー上で単層培養しは表 1 に示す。RT-PCR は 32 サイクル(G3た。ST140(STREX 社)を使用して CTS(0.5UNX-2 は 55℃)30 秒、72℃30 秒、72℃7

PDH は 25 サイクル)、94℃30 秒、60℃ (RHz、10%伸張刺激、30 分間)を負荷した。 分行った。Real-time PCR は CTS 直後の
このシステムを使用することでほとんど遺伝子発現を１とし、COL2A1、A11recan、の細胞に均一な伸張負荷を加えることがRUNX-2、MMP-13、ADAMTS-4、-5、-9 遺伝

できる[1]。CTS を加えないものをコント

子発現を G3PDH で除して表した。

1図 1 CTS の違いによる COL2A1 遺伝子発現の変化、10遺伝子発現の変化、10％10％CTS にて14 時間後に一過性に減少したが 30 時間後には回復した。
*p=0.0041、*p=0.0041、**p=0.0459

RUNXRUNX-2 過剰発現：過剰発現：RUNX-2 の過剰発現がMMP-13、ADAMTS-4、-5、-9 遺伝子発現にコンフルエントの SW1353 に対し、1.5Lの Oli1ofectamine、siRNA(2M)を導入及ぼす影響について検討した。RUNX-2 のした。siRNA 導入後 48 時間で CTS を負荷過剰発現には 0.5L の FuGENE6、250n1

し RUNX-2、MMP-13、ADAMTS-4、-5、-9 遺の RUNX-2 expression plasmid[2]を使用

伝子発現について RT-PCR、real-time PCした。導入後、細胞を 24 時間培養し、そR で検討した。の後 CTS(0.5 Hz、10%、30 分間)を負荷した。RUNX-2 と ADAMTS-5 遺伝子発現は CT

免疫染色：RUNX-2と ADAMTS-5 の局在を免疫染色：免疫染色で検討した。CTS 負荷後 1 時間

S 1 時間後、MMP-13、ADAMTS-4、-9 は 24で固定し、抗 RUNX-2 抗体(10m1/mL)、抗時間後に細胞を回収し RT-PCR および reaADAMTS5 抗体(10m1/mL)を使用した。
また、

l-time PCR を行った。

Alexa Fluor 488-conju1ated antibody

siRUNXiRUNX-2：Silencer Select Pre-desi1
ned siRNA を用いて RUNX-2 small inter(10m1/mL、anti-mouse)、Alexa Fluor 5

ferin1 RNA(siRNA) assay を行った。30%echst 33342(1m1/mL)を使用した。

68-conju1ated phalloidin(2m1/mL)、Ho

表 1 RTRT-PCR および realreal-time PCR で使用したプライマー2

図 2 CTS が RUNXRUNX-2、MMPMMP-13、13、ADAMTS に与える影響。(A)CTSに与える影響。(A)CTS
後で RUNXRUNX-2 のリン酸化が起こった。(B,C)CTSのリン酸化が起こった。(B,C)CTS 後に 15 分
で RUNXRUNX-2 の発現が亢進した。(B,D,E,G)CTS24の発現が亢進した。(B,D,E,G)CTS24 時間後には
MMPMMP-13 、 ADAMTSADAMTS-4 、 ADAMTADAMT-9 、 の 発 現 が 亢 進 し た 。
(B,F)ADAMT(B,F)ADAMT-5 は二時性に発現が亢進した。
は二時性に発現が亢進した。
*p<0.0001,**p=0.0001, † p=0.0002, ‡ p=0.0009, §p=0.0017,○
p=0.0017,○=CTS(=CTS(-),■),■=CTS(+)

Western blot 法および MAPKs：
MAPKs：CTS 負荷
1 時間後に細胞を回収し SDS-PAGE(101導入しその効果を検討した。
ILIL-4 treatment: SW1353 をストレッチ
チャンバー上で培養後、hrIL-4 (10 n1//lane)を行った。抗体は抗-p38、-p44/42、-JNK MAPK、-phospho-p38、-p44/42、 ml)を 24 時間添加した。その後、CTS を-JNK MAPK 抗体を使用し、1:1000(phosp

負荷し、IL-4 の影響について検討した。

ho-p38 は 1:2000)、 4℃、over ni1ht でinvivo: ラット膝に対して ACL、MCL、M行った。二次抗体は horseradish peroxi

M を切除することで OA モデルを作製し、

dase-conju1ated anti-mouse secondaryrrIL-4 (10, 50, and 100 n1/joint/da

antibody (1:10000)、anti-rabbit secy)を関節内注射した。その後、2、4、6

ondary antibody (1:10000)を使用した。 週で膝関節から組織を採取しサフラニン
Western blot の濃度解析には Ima1e J sO 染色を行った。軟骨破壊について modi

oftware を使用した。また、5–50 M の

fied Mankin score および Osteoarthrit

p38 抑制剤(SB203580)、p44/42 抑制剤(Uis Research Society International sc0126)、JNK 抑制剤(JNK inhibitor II)をorin1 system で評価した。

3統計解析：全ての検討は3 回以上繰り返
統計解析：
し、同様の結果が得られた。グループ間影響について検討するために CTS を負荷の解析は one-もしくは two-way ANOVA、B

ected at 15 minutes after CTS (図 2onferroni post-hoc test を用い、平均A)。CTS により RUNX-2 mRNA は 1 時間後±95%信頼区間で表している。統計的有意をピークとして約 4.5 倍に(p¬<0.0001)

差は P＜0.05 とした。

(図 2 B、C)、MMP-13、ADAMTS-4、9 は RUした。RUNX-2 phosphorylation was det

NX-2 より遅れて 24 時間後より約 3 倍に結果発現が亢進した(MMP-13; p=0.0002、ADASW1353 cells lost their phenotypic
type II colla1en and a11recan 1ene e

MTS-4; p=0.0017、ADAMTS-9; p¬<0.0001)

xpression after 10% CTS.
まず、CTS が SW1353 の type II colla1

現は CTS 直後に亢進し(p¬<0.0001)、3 時間後に減少(p=0.0975)、24 時間後に再度en と a11recan 遺伝子発現に及ぼす影響亢進した(p¬<0.0001) (図 2 B、F)。

について検討した。細胞形態については

MMPMMP-13 and ADAMTSADAMTS-5 1ene expression
was controlled by RUNXRUNX-2.
RUNX-2 の過剰発現が CTS 負荷時の遺伝(図 2 B、D、E、G)。ADAMTS-5 遺伝子発CTS の前後で変化は認めなかった(data not shown)。
5% CTS では 15 時間(p=0.462)
および 30 時間(p=0.832)の両方とも COL2子発現に及ぼす影響を検討した(図 3)。RA1 遺伝子発現に変化を認めなかったが、 UNX-2 の過剰発現により RUNX-2 遺伝子発10% CTS では 15 時間(p=0.0041)まで徐々現は著明に亢進した(p¬<0.0001) (図 3 A、に発現量の低下し、30 時間後に(p=0.753

B)。また、RUNX-2 の過剰発現により MMP3)元のレベルまで回復した(図 1)。この-13，
ADAMTS-5 遺伝子の発現が亢進した(M結果より、10% CTS が SW1353 に対して異MP-13; p=0.0001, ADAMTS-5; p=0.0002)化的に働くものと考えた。

(図 3 A、C、E)。一方、ADAMTS-4 (p=0.

CTS stimulated MMP-13 and a11recana5199) と ADAMTS-9 遺伝子発現(p=0.071)

se 1ene expressions in chondrocyte-l

は RUNX-2 過剰発現で特に変化を認めな

ike cells.

かった(図 3 A、D、F)。

メカニカルストレスが SW1353 に及ぼす
図 3 RUNXRUNX-2 過剰発現。CTS過剰発現。CTS により RU
NXNX-2,MMP2,MMP-13,ADAMTS13,ADAMTS-4,4,-5,5,-9 遺伝子発
現は亢進した。MMP
現は亢進した。MMPMMP-13(A,C),ADAMTS13(A,C),ADAMTS-5(A,E)遺伝子発現は(A,E)遺伝子発現は RUNXRUNX-2 の過剰発現にて亢進した。一方、ADAMTSて亢進した。一方、ADAMTSADAMTS-4,4,-9 遺伝子は変化なかった(A,D,F)
は変化なかった(A,D,F)*p<0.0001,**p=0.0062,†p=0.0001,‡
p=0.0001,‡p=0.0103,§p=0.0103,§p=0.00024CTSCTS-induced MMPMMP-13 and ADAMTSADAMTS-5 1ene expression was inhibited by siRUNX-2.

S-9 遺伝子発現(p=0.781)は RUNX-2 siRN

次に、RUNX-2 siRNA を導入した。RUNX-よび ADAMTS-5 遺伝子発現(p-<0.0001)は2 siRNA の導入により RUNX-2 遺伝子発RUNX-2 siRNA 導入により抑制された(MMP

現は 90% 抑制された(p¬<0.0001)(図 4-13、p=0.2949; ADAMTS-5, p=0.4065)

A)。また、RUNX-2 siRNA の導入により M(図 4 B、C)。また、免疫染色では、RUNX

MP-13 (p=0.003)と ADAMTS-5 遺伝子発現-2、MMP-13 および ADAMTS-5 の染色性は sA の導入前後で変化は認められなかった(図 4 A、D、F)。CTS 誘導性の MMP-13 おも著明に抑制された(p¬<0.0001) (図 4 B、 iRUNX-2 の導入で低下した(data not shoC)。一方、ADAMTS-4 (p=0.3918)と ADAMTwn)。

図 4 sRUNXsRUNX-2 の導入。sRUNXの導入。sRUNXsRUNX-2 の導入(A)の導入(A)により(A)により MMPMMP-13(B),ADAMTS13(B),ADAMTS-5(C)遺伝子発現は抑制さ5(C)遺伝子発現は抑制された。CTSれた。CTS 誘導性の MMPMMP-13,ADAMTS13,ADAMTS-5 発現は sRUNXsRUNX-2 の導入後は認められなかった(B,C)の導入後は認められなかった(B,C)。
(B,C)。
*p<0.0001,**p=0.003

Mechanical stretch increases the RU
NXADAMTSNX-2 and ADAMTS-5 expressions.て免疫染色で検討した。CTS によりストSW1353 において CTS が細胞接着とスト

red si1nals)。しかしながら、ストレスレスファイバー形成に及ぼす影響についファイバーの方向はストレッチの方向とレスファイバーの染色性が増加した(図 5、5は一致しなかった。CTS により RUNX-2 は-5 の染色性は細胞質で亢進していた(図染色性が亢進し核に染まっていた (図 5、 5、ADAMTS-5、1reen si1nals)。
RUNX-2、1reen si1nals)。一方、ADAMTS

図 5 CTS により stress fiber が増加した(CTS,redが増加した(CTS,red si1nal),RUNXsi1nal),RUNX-2 は核に、ADAMTSADAMTS-5 は細胞質に認められる。矢印,胞質に認められる。矢印,ストレッチの方向,Bar,100
ストレッチの方向,Bar,100μ,Bar,100μm

CTS stimulated phosphorylation of M
APKs in SW1353 cells.
RUNX-2 の発現亢進メカニズムの解明のて検討した。SB203580 は CTS 後の RUNX-ために、MAPKs（p38、p44/42, JNK）のリ2(図 6 C、p¬<0.0001)、MMP-13 (図 6 D、ている。
MAPKs 抑制剤の影響を real-time PCR にン酸化について検討した。CTS により p3p¬<0.0001)と ADAMTS-5 遺伝子発現(図 68 のリン酸化が CTS を負荷しないものとE、p¬=0.0152)を用量依存性に抑制した

比較し 6.2 倍増加した(p-<0.0001)(図 6(図 6 C、D)。一方、U0126 と JNK inhibiA 上、B)。p44/42 と JNK のリン酸化は増tor II は RUNX-2、MMP-13 および ADAMTS加しなかった(p=0.0741、0.6616) (図 6-5 遺伝子発現に特に影響を及ぼさなかA、中、下、B)。この結果は CTS が p38 をった(data not shown)。

介した経路を活性化していることを示し6

図 6 CTS 誘導性の RUNXRUNX-2,MMP2,MMP-13,ADAMTS13,ADAMTS-5 発現は p38MAPK 経路を介している。(A,B)CTS経路を介している。(A,B)CTS 後 30分で p38 のリン酸化は認められるが p44/42,JNK のリン酸化は認められなかった。RUNX2(C),MMPのリン酸化は認められなかった。RUNX2(C),MMP-13(D),ADAMTS13(D),ADAMTS-5(E)は5(E)は SB203580 により用量依存性に抑制された。
*p<0.0001,**p=0.0313,†*p<0.0001,**p=0.0313,†p=0.0451,‡
p=0.0451,‡p=0.0152,§p=0.0152,§p=0.0174

ILIL-4 inhibit CTSCTS-induced MMP and a1
1recanase 1ene expressions.

S を制御していると考えられる RUNX-2 にIL-4 treatment を行った後 CTS を負IL-4 treatment の効果を in vivo で確認

ついても同様に発現が抑制された。また、荷した。IL-4 treatment により CTS で亢するために組織学的検討を行った。IL-4

進した MMP-13、ADAMTS-4、-5、-9 の発現

treatment により有意に Mankin score がは低下した（図 7）。また MMP-13、ADAMT低下した（図 7）。

7

図 7 ILIL-4 の軟骨保護効果。CTSの軟骨保護効果。CTS
ILで亢進した遺伝子発現が IL-4により抑制された(A,B,C,D,E)
により抑制された(A,B,C,D,E)
コア(F)Mankin ス コア(F) *p<0.0001,
a:p<0.05,b:p<0.0001 vs sham1
roup,c:p<0.05,d:p<0.01 vs notreatment(OA) 1roup

考察から OA 治療薬になりえていない。従って、軟骨細胞は圧迫刺激に対して蛋白レベ

OA の治療において、これらの酵素のよりルあるいは遺伝子レベルで良く反応する上流のメカニズムの解明が必要である。A細胞である。日常生活において関節軟骨

DAMTS-4、-5 のプロモーター領域には RUは 15％の圧迫刺激（5％の伸張刺激）をNX-2 結合領域が存在する。このことは A受けている。弱い機械的刺激はプロテオ

DAMTS-4、-5 が RUNX-2 の下流にあり、そグリカンやⅡ型コラーゲンの産生を促し、のターゲットとなりうることを示してい
強い機械的刺激はマトリックスの産生を る。さらに RUNX-2 は MMP-13 のプロモー抑制し軟骨破壊をきたす。本研究においター領域も刺激し軟骨変性を来たす。本て、Ⅱ型コラーゲン遺伝子の発現は 0.5H

研究では、RUNX-2 が機械的刺激誘導性のz、5%の CTS では抑制されなかったが、1ADAMTS-5 および MMP-13 の調節因子であ0%の CTS を負荷することで抑制された。

ることを初めて示した。これは RUNX-2 がこのことは 10% CTS が SW1353 においてマトリックス変性におけるターゲットと異化的な刺激であることを示しているなりえることを示している。

（図 1）
。

ADAMTS 遺伝子発現はそれぞれ異なった

MMPs や ADAMTSs などが軟骨変性におい調節を受けている。例えば ADAMTS-4 はて重要な役割を演じており、ADAMTS の中IL-1、TNF、TGF-などの炎症性サイでも ADAMTS-4、-5 は最も蛋白分解活性がトカインによってコントロールされてい高く、OA の病因に関与する主要なアグリる。我々はこれまでに ADAMTS-9 が IL-1カナーゼである。しかし現在のところ、Mあるいは TNFに誘導されることを報MP あるいは ADAMTS 抑制剤はその副作用告している[3]。本研究において、CTS の8

24 時間後に ADAMTS-4、-9 遺伝子発現がDAMTS-5 遺伝子発現は p38 が中心的な役亢進した（図 2）。しかしながら、ADAMTS割を演じていることが分かった。ヒト軟-4、-9 遺伝子発現は RUNX-2 の直接的な骨細胞において IL-1誘導性の MMP-13影響は受けていなかった。ADAMTS-4、-9

遺伝子発現は p38 を介しているとの過去

遺伝子発現は機械的刺激により誘導されの報告は我々の結果を支持するものと考ている可能性もあるが、RUNX-2 とは別のえられる。

因子、例えば CTS 誘導性の IL-1 等の影響

本研究により、軟骨細胞様細胞である Sを受けている可能性もある。一方、ADAM

W1353 において異化的な機械的刺激が誘TS-5 活性がどのようにコントロールされ導する MMP-13、ADAMTS-5 は RUNX-2 によているかはいまだ解明されていない。c-り調節されており、また p38 MAPK 経路がfos、c-jun などの転写因子は刺激後 1 時関与していることが分かった。

間で増加するとの報告があるが、炎症性

1.

サイトカインの ADAMTS-5 に対する影響

Naruse K, Yamada T, Sokabe M. In
volvement of SA channels in orieについては議論の余地がある。本研究でntin1 response of cultured endot

は CTS 後に ADAMTS-5 は二峰性に発現が亢

helial cells to cyclic stretch.

進した。CTS 後 1 時間での発現亢進は機Am J Physiol 1998; 274: H1532-15

械的刺激誘導性の RUNX-2 経路を介して38.

おり、24 時間後に亢進した発現は炎症性

2.

サイトカインによる影響がある可能性がFurumatsu T, Shukunami C, Amemiy
a-Kudo M, Shimano H, Ozaki T. Scあると考えられるが、これについては今

leraxis and E47 cooperatively re後の課題である。

1ulate the Sox9-dependent transc

また IL-4 の軟骨保護効果については、I

ription. Int J Biochem Cell Bio

L-4 treatment により有意に Mankin scol; 42: 148-156.

re の低下を認めた。IL-4 の添加で CTS で3.

亢進した RUNX-2,MMP-13、ADAMTS いずれ

Demircan K, Hirohata S, Nishida
K, Hatipo1lu OF, Oohashi T, Yoneの発現も抑制されたことより、IL-4 が Rzawa T, et al. ADAMTS-9 is syner

UNX-2 あるいは従来から考えられている

1istically induced by interleuki

ように IL-1 に作用することで軟骨保護

n-1beta and tumor necrosis facto的に働く可能性が示唆された。今後のさr alpha in OUMS-27 chondrosarcom

らなる検討により OA 治療への応用も考a cells and in human chondrocyte

えられる可能性が示唆された。

s. Arthritis Rheum 2005; 52: 145

MAPK が MMP-13 および ADAMTS-5 に及ぼ1-1460.

す影響についても検討した。SW1353 において、CTS 後に p38 のリン酸化が起こり、また、SB203580 は用量依存性に RUNX-2、MMP-13、ADAMTS-5 遺伝子発現を抑制した。
このことより RUNX-2 誘導性の MMP-13、A9