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教授 黒坂 光

神経糖鎖生物学研究室	 	 Prof. Akira Kurosaka, Ph. D.

Laboratory of Neuroglycobiology

助教 中山喜明
Assist. Prof. Yoshiaki Nakayama Ph. D.

１．研究概要酵素とは異なった機能を持つ可能性も指摘されている．

タンパク質は翻訳後に正しくフォールディングされ，さらこのような背景を踏まえ，我々の研究室では， O-グリコに様 々な修 飾 反 応 を受 けて機 能 的 な分 子 となる．糖 鎖シド型糖鎖，およびそれに関連した分子の主に脳におけの付 加 反 応 は重 要 な修 飾 反 応 の一 つであり，糖 鎖 はタる機 能 解 析 を研 究 の目 的 として，次 のような課 題 に取 り

ンパク質の安定化，細胞間の接着や認識などに関わる．

組んでいる．

糖 鎖 の構 造 は，糖 とタンパク質 の結 合 様 式 によっていく1) 細 胞 膜 輸 送 に お け る ム チ ン 型 糖 鎖 合 成 酵 素

つかのタイプに分類されるが，我々は N−アセチルガラク

GalNAc-T17 の機 能 解 析トサミン(GalNAc)，マンノース（Man），あるいはＮ−アセチ

我々は GalNAc-T17 が，成体の脳においては海馬やルグルコサミン(GlcNAc)とタンパク質中のセリン，トレオニ視床, 小脳の神経細胞に強く発現し，神経分化に関わン残基のヒドロキシル基との間に形成される O−グリコシドることなどを報告してきた. 近年, HEK293T 培養細胞を型 結 合 （ GalNAcα1 → Ser/Thr, Manα1 → Ser/Thr,用いたゲノミクス解析により, GalNAc-T17 がエンドサイト

GlcNAcβ1→Ser/Thr）を持 つ糖 鎖 に注 目 し，それらのーシス経路を調節している可能性が指摘された. そこで，

主に脳における機能を解析している．この中で我々は GalNAc-T17 が関わる新たな機能について詳細

GalNAcα1→Ser/Thr の構造を有する糖鎖は，消化器官，な研究を行った．

呼吸器官等の上皮細胞が分泌する粘性タンパク質であ２) ゼブラフィッシュを用 いた GalNAc-T ファミリーのるムチンに多 く見 られることから，ムチン型 糖 鎖 とも呼 ばれる．

近年，GalNAc-T ファミリーのいくつかのアイソザイムのムチン型糖鎖の合成開始反応は糖転移酵素
UDP-GalNAc:

網羅的な発現および機能解析

N-acetylgalactosaminyl-

基質が明らかにされてきた．しかしながら，GalNAc-T ファtransferase (以降 GalNAc-T)により触媒される. この酵

ミリーは，互いに重複する組織発現，および基質特異性

素はヒトにおいては 20 種類から成る大きな遺伝子ファミリを有 するため，ファミリー全 体 の機 能 解 析 は進 んでいなーを形成する（Fig. 1）が，それぞれのアイソザイムの性質

い．我々は GalNAc-T9, -T17 等の Y サブファミリーに属はまだ明らかになっていない．我々はこれまでに，するアイソザイムを中心として機能解析を行ってきたが，GalNAc-T9，-Ｔ17 をクローニングし，これらが神経特異今年度は，ゼブラフィッシュにおける GalNAc-T ファミリー的に発現することを報告してきた．この 2 つのアイソザイムの網羅的な機能解析に着手した．

は，酵 素 活 性

３） P19胚性腫瘍細胞を用いた新規神経分化モデに関わるモチ

polypeptide

機能解析がなされ，疾患との関連，および一部の内在性

Enzymaticallｙ inert subfamily

ルの確立

ーフ内の保存神 経 細 胞 の機 能 や分 化 の解 析 等 に用 いられる，多 分されたアミノ酸化能を有するマウス胚性腫瘍由来 P19 細胞は，レチノイ残基に置換をン酸 存 在 下 で浮 遊 培 養 することで，神 経 ，およびグリア持ち，in vitro細胞へと分化する．しかしこの方法では，非神経系細胞での酵素活が増 殖 すること，成 熟 した神 経 細 胞 への分 化 に長 期 間性がほとんどの培養が必要である等の問題点があった．我々は，接着検出されず，

培 養 系 に神 経 分 化 に関 わる因 子 を加 えて培 養 すること

生化学的なで，P19 細胞を短期間で効率よく神経細胞へと分化させ解析は極めてる事に成功した．

困 難 なサブフ３）その他のO-グリコシド型糖鎖の機能解析

ァミリーに属する．一方で，このサブファミ
リーは従来のゼブラフィッシュを用いて，新規 O-グリコシド型糖鎖のFig. 1 A phylogenetic tree of human
GalNAc-Ts

機能解析を行った．今年度は糖鎖合成酵素の発現抑制実験を行った．

２．本年度の研究成果ることを見いだした．

1) 細 胞 膜 輸 送 に お け る ム チ ン 型 糖 鎖 合 成 酵 素
GalNAc-T17 の機 能 解 析３） P19 胚性腫瘍細胞を用いた新規神経分化モデ

HEK293T における GalNAc-T17 について，細胞生物ルの確立

学的手法を用いて機能解析を行い，以下の新しい知見

P19 細胞の従来の分化方法は，レチノイン酸存在下でを得た． (i) GalNAc-T17 がゴルジ局在性の分子である

浮 遊 培 養 し，細 胞 凝 集 塊 を形 成 させる方 法 が用 いられこと．(ii) 細胞内栄養状態の指標である GlcNAc の濃度てきた．我々は，浮遊培養が非神経細胞の増殖の原因依存的に GalNAc-T17 の発現量が増加すること． (iii)と考 え，接 着 培 養 を基 本 とした短 期 間 で効 率 の良 い神GalNAc-T17 が液相エンドサイトーシスの一種であるマク経 細 胞 分 化 系 を確 立 した．これまでの神 経 細 胞 分 化 に

ロ ピ ノ サ イ ト ー シ ス 経 路 を 負 に 制 御 す る こ と ． (iv)

関 わる因 子 の研 究 に基 づき，(i) ラミニンをコートした培

GalNAc-T17 によるその調節メカニズムの破綻が膜タン養皿上で培養する，(ii) インスリンやトランスフェリン等のパク質の輸送異常によるリソソーム病様の症状を引き起神経分化因子含む無血清培地を用いる，(iii) レチノインこすこと. これらの結果は GalNAc-T17 により形成される酸に加えて，ノッチシグナル阻害剤である DAPT を添加

ムチン型糖鎖が, マクロピノサイトーシスを通じた細胞外する，(iv) 分化の初期段階に FGF8 を添加する等の条分子の取り込みを制御することにより, 細胞内栄養状態件をとり入れた．その結果，3〜4 日目に神経突起が形成のホメオスタシスの維持に関与することを示唆している.

され，6 日目にはより活発な突起伸張が観察された．免

2) ゼブラフィッシュを用 いた GalNAc-T ファミリーの疫染色やウェスタンブロッティングなどによる解析により，網羅的な発現および機能解析

6 日目では成熟神経細胞への分化が認められたにもか

デ ー タ ベ ー ス 検 索 よ りゼ ブ ラフ ィッ シ ュ が 18 種 類 のかわらず，グリア細 胞 は存 在 しなかった．以 上 より，新 し

GalNAc-T アイソザイムを発現していること，GalNAc-T8

い方法では，P19 細胞は従来の約半分以下の時間で，と-T18 がそれぞれ５種類，および２種類のパラログ遺伝効率よく神経細胞にのみ分化することが明らかとなった．

子を有することを見いだした．我々はパラログも含めてほ４）その他のO-グリコシド型糖鎖の機能解析

とんど全てのアイソザイム cDNA のクローニングを完了し細胞質，および細胞外で発現する新規 O-グリコシド型た．次に，決定した塩基配列をもとに，ゼブラフィッシュの糖鎖の機能を，ゼブラフィッシュを用いて調べた．我々は初期胚(主に２４時間胚)における発現を whole mount in

この糖鎖構造の合成に関わる糖転移酵素が初期胚におsitu hybridization (WISH) 法により解析した。その結果，いて脳に強く発現することを見いだした．また，本酵素のそれぞれのアイソザイムは特徴的な発現パターンを有す発現を抑制すると，脳において形態異常を生じるのに対るものの，その多し，他の組織での表現型の変化は観察されなかった．こくは脳，およびの事から，この酵素が主に脳において機能する事が示唆

尾の筋肉に発現された．

する事が明らか３．Research projects and annual reportsと な っ た (Fig. 2) ．
さらに，GalNAc-O-Glycosylation is an important post-translational

T18 についてはmodification of proteins, and is classified into several

発現抑制実験をtypes

行 い，機 能 阻 害structures.

胚 において尾 部

chains with the linkage structures, GalNAcα1→Ser(Thr),に嚢胞が生じる

Manα1→Ser(Thr), or GlcNAcβ1→Ser(Thr).

等の表現型の変them, GalNAcα1→Ser (Thr) is the most frequently

化を観察した．

observed linkage, and O-glycans with this linkage are

尾部凍結切片をcalled the mucin carbohydrates since they are highly

解 析 したところ，expressed in mucins secreted from epithelial cells.

細胞接着に関わmucin carbohydrate biosynthesis is initiated by a groupofるカドヘリンやインテグリンの局
在 性 に変 化 があFig. 2 Expression of GalNAc-Ts inzebrafish embryos

basedonthecarbohydrate-protein

linkage

We have been investigating roles of sugar

enzymes,

UDP-GalNAc:

polypeptide

galactosaminyltransferases (GalNAc-Ts).

AmongThe

N-acetylGalNAc-Ts

consist of a large gene family with 20 isozymes inhumans (Fig. 1).

Interestingly, GalNAc-T8, -T9, -T17,

isozymes under the conventional assay conditions.

Toand -T18 are catalytically inactive when assayed withcarry out comprehensive analysis of the GalNAc-T

classical assay methods, while GalNAc-T9 and -T17,

family, the expression of all the isozymes in zebrafish

which were cloned by us, are brain-specific isozymesembryos were investigated by WISH, finding that mostandneuralof the isozymes have characteristic expression patterns

Based on these backgrounds, we havein the embryos with most frequent expression in thearebiologicallydifferentiation.

important

for

the

focused on the functions of glycosyltransferases to makebrains and the tail muscles.

O-glycan carbohydrate-linkage structures, and obtainedexpressions

the following findings.

paralogue genes, designated GalNAc-T18a and -T18b,

1) Roles of mucin-type carbohydrates in intracellularantisense morpholino oligos specific for each paralogueofGalNAc-T18.

We then suppressed theSince

ithas

twomembrane trafficking

was designed to suppress each paralogue independently.

Recent genome-scale analysis of HEK293T cells

Suppressionofeachparaloguegave

similartreated with a high GlcNAc concentration demonstrated

morphological alterations in the embryos, giving rise tothat GalNAc-T17 is one of the genes upregulated, which

abnormal fin fold with cysts in some of the morphants.

are possibly involved in the fluid phase endocytosis.

This indicates that GalNAc-T18 is involved in tailTo assess its roles in membrane trafficking, we firstdevelopment in zebrafish.

biochemically characterized recombinant GalNAc-T173) A rapid and efficient method for neuronalin

COS7cells,anddemonstrated

that

itwasN-glycosylated, and localized mainly in the Golgi
apparatus.

induction of P19 embryonic carcinoma cell line
P19 mouse embryonic carcinoma cells are pluripotent

We then suppressed the expression ofcells, and can differentiate into neurons and glial cells byendogenous GalNAc-T17 in HEK293T cells using

performing nonadherent cell culture in the presence ofsiRNA.

retinoic acid (RA) to form cell aggregates.

The suppression led to phenotypic changes of

The method,

the cells with reduced lamellipodia formation, alteredhowever, has several drawbacks that it takes long time to

O-glycanof

differentiate into mature neurons, and that non-neuronalglycoconjugates in the late endosomes and lysosomes.

profiles,

cells occupy the majority of cell population after day 10.

Analysis

To overcome these problems, we employed an adherentofandunusual

endocytic

accumulation

pathwaysrevealed

thatmacropinocytosis, but neither clathrin- nor caveolin-serum-free culture in a laminin-coated dish.

dependent endocytosis, was elevated in the knockdown

γ-secretase inhibitor, DAPT, and a neural inducing factor,cells.

FGF8 were included in the medium together with RA to

This was further supported by the findings thatA

recombinant GalNAc-T17 overexpressed in HEK293T

accelerate neurogenesis.

cells

thewith RA, FGF8, and DAPT for 2 days, with FGF8 andOur data

DAPT for the following 2 days, and with DAPT for theinhibited

macropinocytosis,andrescuedinfluences observed for the knockdown cells.

The cells were first cultured

provide the first implication that a subset of mucin-typelast 2 days.

O-glycosylation produced by GalNAc-T17 is involved indifferentiated into cells with neurite-like protrusions

the control of dynamic membrane trafficking probably

within 4 days.

between the cell surface and the late endosomes throughexpression of neural progenitor and neuron markers 2macropinocytosis,

and 4 days after the induction, respectively.

in

responsetothenutrient

concentration as exemplified by the environmentallyavailable GlcNAc.

With the new method, P19 cells efficiently
Western blot analysis demonstrated the4) Analysis of other O-glycosylation
We investigated the expression and roles of glycosyl-2) Comprehensive Analysis of GalNAc-T family intransferases that are involved in the formation of novel

zebrafish embryos

O-glycosylation.

We found that the enzyme was highly

Recently, functions and endogenous substrates of

expressed in the brain, and that its suppression insome of the GalNAc-T isozymes have been clarified.

zebrafish embryos resulted in altered brain development.

The overall function of the family, however, still remains

This indicates that the enzyme is responsible for thetonormal development of brain.

beelucidated.

We

havebeeninvestigating

GalNAc-T7 and -T17 that are catalytically inert

４．発表論文

T. Kawai, E. Kaneda, N. Nakayama, N. Nakamura, A.

A. Miyake, S. Nihno, Y. Murakoshi, A. Satsuka, Y. Nakayama, N.

Kurosaka: Functional analysis of polypeptide N-acetyl-Itoh: Neucrin, a novel secreted antagonist of canonical Wnt

galactosaminyltransferase-like 4 and 8 in zebrafish.

signaling, plays roles in developing neural tissues in zebrafish.

Asian Federation of Laboratory Animal Science Associations

Mech. Dev. 128, 577-590

Congress (AFLAS 2012), Bangkok (Thailand) 2012.10.

I. Kimura, Y. Nakayama, M. Konishi, K. Terasawa, M. Ohta, N.
Itoh, M. Fujimoto: Functions of MAPR (membrane-associatedThe 5th10-12.
Y. Nakayama, N. Nakamura, A. Kurosaka: A Putativeprogesterone receptor) family members as heme/steroid-Polypeptide

binding proteins. Curr. Protein Pept. Sci. 13(7) 687-696

Regulates Cell Adhesion and Endocytic Pathways inY. Nakayama, N. Nakamura, S. Oki, M. Wakabayashi, Y.

HEK293T cells. American Society for Matrix Biology andIshihama, A. Miyake, N. Itoh, A. Kurosaka: A putative

Society for Glycobiology Joint Meeting 2012, San Diego

polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase/WilliamsBeuren syndrome chromosome region 17 (WBSCR17)

N-Acetylgalactosaminyltransferase/WBSCR17(USA) 2012.11.11-14
N. Nakamura, Y. Nakayama, A. Miyake, N. Itoh, A. Kurosaka:

regulates lamellipodium formation and macropinocytosis. J.

Developmental roles of mucin-type glycosylation in zebrafish.

Biol. Chem. 287(38) 32222-32235

American中村直介, 黒坂 光: ゼブラフィッシュを用いた筋ジストロフィーに関係する糖鎖修飾機構の解析 京都産業大学総合学術研究
所所報 7:73-78 2012

SocietyforMatrixBiology

andSociety

for Glycobiology Joint Meeting 2012, San Diego (USA)2012.11.11-14
和 田 あゆみ，中 山 喜 明 ，中 村 直 介 ，黒 坂 光 ：単 層 培 養 条 件 下におけるマウス胚性腫瘍由来 P19 細胞の神経分化誘導．第５．著書および総説

35 回日本分子生物学会年会，福岡市，2012.12.11-14

Y. Nakayama, N. Nakamura, D. Tsuji, K. Itoh, A. Kurosaka:

川合多美子，青木俊輔，高橋由衣，中村直介，中山喜明，黒Genetic diseases associated with protein glycosylation

坂光：ゼブラフィッシュ初期発生におけるポリペプチド N-アセdisorders in mammals. Genetic Disorders ， Intech, in press.

チルガラクトサミン転移酵素の機能解析第 35 回日本分子生物学会年会，福岡市，2012.12.11-14

６．学会発表

金田鋭一，中村直介，中山喜明，黒坂光：ゼブラフィッシュにおA. Kurosaka, N. Nakamura, Y. Nakayama: Roles of mucin-type
carbohydrates in zebrafish development.

The 2012 CU-

ける N-acetylgalactosaminyltransferase-like4 の機能解析．第35 回日本分子生物学会年会，福岡市，2012.12.11-14

KSU-MUSC Joint Seminar in Science & Technology,Bangkok (Thailand) 2012.3.15-16
Y. Nakayama, N. Nakamura, A. Kurosaka: Roles of mucin-type
carbohydrates in endocytosis.

The 2012 CU-KSU-MUSC

７．その他特記事項
１） 外部資金
科学研究費補助金・基盤研究（B）

Joint Seminar in Science & Technology, Bangkok (Thailand)

課 題 名 ：ダイコンの雄 性 不 稔 ・稔 性 回 復 システムの分 子 機 構 と2012.3.15-16

その多様性形成メカニズムの解明

中村直介，中山喜明，田原聖明，西村和真，三宅歩，伊藤信

研究分担者：黒坂 光, 取得年度：H22-24 年 (3 年)行，黒坂光： ゼブラフィッシュ後脳において WBSCR17 が関わるムチン型糖鎖の機能解．2012 年度 包括脳ネットワーク

私立大学戦略的研究基盤形成支援事業

夏のワークショップ，仙台市，2012.7.26

課題名：オルガネラゲノムの研究成果を基盤とする有用植物の中山喜明，中村直介，黒坂光：GalNAc-T 様遺伝子 WBSCR17はエンドサイトーシス経路を調節する. 第 31 回日本糖質学会

育成
研究分担者：黒坂 光，取得年度：H20-24 年（5 年）

年会. 鹿児島市. 2012.9.17-20
A. Kurosaka, N. Nakamura, N. Nakayama: Biological roles of a

学術研究助成基金助成金・若手研究(B)brain-specific polypeptide GalNAc-transferase in zebrafish.

課題名：網膜発生に関わるムチン型糖鎖の機能解明に向けた

The 5th Asian Federation of Laboratory Animal Science

GalNAc-T の解析

Associations Congress (AFLAS 2012), Bangkok (Thailand)

研究代表者：中山喜明, 取得年度：H23-24 年 (2 年)

2012.10.10-12.
新学術領域，神経糖鎖生物学

課 題 名 ：神 経 回 路 形 成 におけるムチン型 糖 鎖 による新 たな膜
輸送制御システムの解析研究代表者：中山喜明, 取得年度：H24-25 年 (2 年)

産学連携共同研究（インタープロテイン社）
課 題 名 ：ＶＥＧＦシステム調 節 薬 のスクリーニング系 に関 する研究研究代表者：黒坂 光，取得年度：H24 年（1 年）

２） 知財権等 なし

３） 学外活動黒坂 光：日本生化学会評議員，日本薬学会近畿支部委員

４） 受賞等 なし

５） その他
黒坂 光：タイ国 Kasetsart 大学を訪問し，協定締結の打ち合わせを行った．
黒 坂 光 ：教 員 免 許 状 更 新 講 習 （モデル動 物 を用 いた神 経 発
生遺伝学）を担当した（2012.8.24）．
黒坂 光：放射線取扱主任者として RI 管理を行った．

ラボ集合写真：１５号館裏にて