博 士 （ 地 球 環 境 科 学）
゛アラ テ イス リカ ン ト

ク ル カラ ニ

学 位 論 文 題 名C
hlorophyllBi
osynthesis:ATargetofO
xidativeStress（ ク ロ ロ フ イ ル 合 成 ： 酸化 ス ト レス の 標 的）学 位論文内容の要旨
Due to sedimentary and stationary phase of life, plants have to facevarious biotic and abiotic stresses. Although each of the various stressconditions has distinctive characteristics and elicits its own specificresponses when subjected on plants, they share a common feature:establisYunent of oxidative stress that resulted into furtherdama
ge.Dueto
involvement of potent intermediates like porphyrin molecules and due tohaving certain enzymes which have shown to be redox regulated, chlorophyll
biosynthesis pathway can be a one of the major targets of oxidative stress.
In this study therefore, I have studied the effects of oxidative stress on
chlorophyll biosynthesis pathway using the vascular plant Cucumis sativus
as a model.
To generate reactive oxygen species (ROS), cucumber cotyledons both
14 h illuminated (green) and etiolated were treated with 100 pM methyl
vilogen (MV) and were subjected to dark (D) or low light (1) (40‑45pE/rrr2/s) condition. Upon MV treatment the cotyledons could not accumulate
chlorophyll compared to control upon illumination and this observation was
mainly attributed to significant inhibition of chlorophyll biosynthesis at
precursor level i.e. at ALA synthesis. This suggested the inhibition ateitherGlutamyl tRNA reductase (GluTR/) and/or Glutamate‑l‑semialdehyde(GSA‑AT). MV treatment also showed to exacerbate its effects on later stageof tetrapyrrole porphyrin molecule synthesis when cotyledons are provided
with 5‑aminolevullinic acid (ALA) and quantitatively analyzed by highperformance liquid chromatography. It showed the accumulation of Proto IX,Mg‑proto IX and Mg‑proto IX ME and there was an increase in theaccumulation of intermediates upon subjection of cotyledons from D to L.
This increase in the accumulation of porphYTin molecules was always
accompanied with decreased concentration of Protochlorophyllide (Pchlide),― 1329―the end productofchlorophyllbiosynthesisindark.ThissuggestedthatMV
induced oxidative stress has inhibitory effects on intermediate
tetrapyrrole synthesis also. The accumulationof Mg‑proto IX MEmight bedue to inhibition at Mg‑proto IX ME cyclase whereas theaccumulation ofProto IX can be ascribed to inhibition of any or all of the following
enzymes: Mg‑chelatase,Fe‑chelataseandProtoporphyrinogenIXoxidase.When
effects of MV treatment on chlorophyll biosynthesis were compared witheffect on PS II activity,former one was observed tobemoresusceptible.
As like MV treatment, I also checkedtheeffects of high light(HL)
induced oxidative stress on chlorophyll biosynthesis during whichetiolated cotyledons failed to synthesize chlorophyll entirely unlike
greencotyledons.WhentransfertoL conditions, theetiolated cotyledons
could resume the chlorophyll biosynthesis and subsequent accumulation
following an initial 2‑12 h delay. This severe inhibition found in
etiolated cotyledons was also mainly because ofimpairment at the step ofALA synthesis.However,itwasnotdue to decrease in theproteinlevelof
respectiveenzymesi.e. GluTRandGSA‑AT.Theexpression ofI‑lE'M41 wasalso not foundto be inhibitedunderHLtreatment. Thissuggestedthatthe
inactivation of respective enzymes orthedeformation of complex between
GluTR and GSA‑AT may be the reason behind this inhibition. However,neither heme nor flu protein was the responcible factorssince hemelevelremain unchanged during HLandthiseffectwe observed mainly underlight
where Pchlide was not accumulated to exert effect of flu. Like MVtreatment, HL also showed to affect the intermediatory steps of pyrrole
biosynthesis in chlorophyll biosynthesis pathway. Upon feedingwith 0.5
mg/ml ALA, HL treatedcotyledons accumulated Proto IX with concomitantdecrease in the Pchlide concentration. This again suggested that either
single or in combination Mg‑chelatase (Mg‑ che I) or Fe‑chelatase orProtoporphyrinogenIX oxidase (PPXI)mightbeinhibitingunderhighlight.
Upon western blotting (W. B.) analysis, PPX I and Mg‑che I didnotshow
any decrease in their level which indicated that inactivation of enzymes
is the probable cause behind the effect observed. From these results,Idemonstrated that oxidative stress impedes key steps in chlorophyll
biosynthesis by either directly or indirectlyinhibiting the activity oftheseenzymes.

‑ 1330ー

学 位論文審 査の要旨
主 査 教 授 田 中歩
副 査 教 授 森 川章
副 査 教 授 原志彦
正登

学位論文題名Chlorophyll Biosynthesis:
ATargetofOxidativ
eStress（ クロ ロ フ イル 合 成： 酸 化スト レスの標的 ）ク ロロ フイルは、光エネルギーを捕捉し、電子伝達の機能を担う、光合成に不可 欠な 分子 である。しかし、クロロフイルとその代謝中間体は光を受けると活性酸素 を生 み出 す危険な分子でもある。そのため、クロロフイル合成は極めて厳密な調節 を受 けな ければならない。もし、このような調節機構を失い、クロロフィル代謝
中 間体 やタ ンパク質に取り込まれないクロロフィル分子が蓄積すると、植物は直ちに枯死する。
植物 は、 低温、強光、乾燥、塩など様々なストレスを日常的に受けている。これら のス トレ スは、多くの場合、最終的には酸化ストレスとなって、活性酸素の発生を 伴う 。こ のような活性酸素を安全に除去できない場合、植物は傷害を受け、枯死に 至る 。酸 化ストレスの標的は、光合成における二酸化炭素の固定酵素、活性酸素除 去酵 素、 タンパク質合成系などいくっか報告されているが、クロロフアル合成が酸化ストレスの標的になっているかは不明であった。
本研 究は 、酸化ストレスがクロロフィル代謝にどのような影響を与えるかを明らかにすることを目的に行われた。
酸化 スト レスの影響を調べるため、キュウリ子葉に除草剤として知られているパラ コ ー ト (Methyl viologen，MV)処理 をお こな い活 性酸 素を 発生 させ た。 MV処 理
した子葉では、黄化子葉、緑化子葉共に、クロロフアルの蓄積は完全に阻害された。
そ こで 、MV処理がクロロフイル合成のどの段階を阻害しているのかを調べるため、
ク ロロ フィ ル合 成の 律遠 段階 と考 えら れて いる5―ア ミノ レブ リン 酸(ALA)の合成
活 性を 測定 した 。そ の結 果、 ALA合 成活 性はMV処理によって大きく阻害された。次に 、ク ロロ フイ ルの 前駆 体で ある ALAを 子葉に与え、クロロフィル合成を促進した
時 に蓄 積す るクロロフイル代謝中間体を調べた。その結果、MV処理した子葉で、プロトポリフィリンIX (ProtoIX)、Mg−プロトポリフアリンIX (Mg−ProtoIX)、Mg−プロ トポ リフ ィリ ンIXモノ メチ ルエ ステ ル(Mg−ProtoIX ME)が蓄 積し た。このことは 、ク ロロ フィ ル合 成経 路の 複数 の段 階が MV処理 によ って 阻害 され ていることを示 唆し てい る。次に、酸化ストレスを生み出す強光処理を行い、クロロフィルの合成 活性 を調 べた。その結果、黄化葉では、強光処理がクロロフアル合成を完全に阻害したのに対して、緑化子葉では、クロロフイル合成の阻害が観察されなか・った。
また 、 MV処 理 と同 様 に 強光 が ALA合 成にあた える影響 を調べた ところ、ALA合 成は黄化葉で は阻害され たのに対 して、緑 化葉では 阻害が見 られなかった。また、強光処理した 黄化葉では 、ALAを与え ると、ク ロロフィ ル中間体のProtoIXが蓄積した。
次に MV処 理 や 強光 処 理 が実 際 に活 性酸素 の発生を 伴ってい るかを染色 法によっ て調べたと ころ、クロ ロフイル の合成阻 害とH202の発 生が一致していることが確認された。さ らに、酸化 ストレス によるク ロロフイ ル合成の 阻害機構を調べるため、クロロフィル合成酵素の遺伝子発現や、抗体を用いた酵素タンパク質の定量を行った。
その結果 、酸化スト レスは、 遺伝子発 現や酵素 タンパク 質の合成には影響しないことが明らかになった。これらの結果から、酸化ストレスによるクロロフイノレ合成の阻害は、 酵素活性の 阻害と予 想された 。
本研究に よって、ク ロロフィ ル合成が 酸化スト レスによって調節されることが明らかにな った。特に 、緑化初 期にその 影響が大 きく、こ れは活性酸素消去系が十分働かない ためと予想 される。 これらの 研究は、 酸化スト レスの作用のーっを明らかにしたこ とに留まら ず、植物 の生態現 象の解明 にも重要 を貢献をするものと期待される。
審査員一 同は、これ らの成果 を高く評 価し、ま た研究者として誠実かつ熱心であり、大学 院博士課程 における 研鑽や修 得単位な どもあわ せ、申請者が博士（地球環境 科 学 ） の 学 位を 授与 され る資 格 を有 する もの と 判定 した 。