博士（医学）猪熊大輔
学位論文題名CTACK/CCL27 accelerates skin regeneration
Iv
ia accumu
lationofbo
nemarrowderived一keratinocytes(CTACK/CCL27による骨髄由来の表皮細胞の皮膚への誘導の促進）

学 位 論 文 内 容 の要 旨
目的
重 症型遺伝 陸疾患 の多くは 、遺伝 子変異に より正 常な生体 の維持に 必要な 分子の機 能が損な われ発症 する。 例えば皮 膚科鎮 域におけ る遺伝陸 疾患と して表皮 水疱症 があるが 、この疾患 では表皮 ・真皮 結合に必 須なタ ンパクを 先天的に 欠損す るため、 皮膚が 脆弱で、 弱い外カで も表皮・ 真皮結 合部が解 離し、 皮膚に容 易に水疱 をきた すふそし て、こ れらの疾 患に対する 有効な治 療戦略 として遺 伝子治 療の開発 が待たれ ている が、実際 に臨床 応用する ために克服 す べ き 壁 は 多 い こと か ら 、よ り 汎 用性 の 高 い、 新 し い治 療 法 の開 発 が 望 まれ て い る。
近 年、多く の臓器 で骨髄幹 細胞が 個々の臓器細胞ヘ分化し、その可塑陸が報告されている。
皮 膚におい ても、 骨髄幹細 胞の一 部が表皮 に遊走し 、正常 な表皮細 胞へと 分化する ことが予想 される。 すなわ ち表皮水 疱症な どの皮膚構成タンパク欠損症に正常骨髄を移植することで、正 常な骨髄 由来の 正常な表 皮細胞 が患者に おいて欠 損した タンパク 質を産 生し、根 本的治療と なる可能 性があ ると考え られる 。
今 回、骨髄 幹細胞 を誘導す るには 何らかの 特定の 因子があ ると考え 、自血 球遊走因 子で創傷 治癒に重 要な役 割を果た すとさ れるケモカインに着目し、骨髄幹細胞の表皮細胞への誘導、分 化につい て検討 した。
方法・ 結果マウス 正常皮 膚および 創傷皮 膚におけ るケモ カインの 発現を、RT‑PCR.Westem‑blot、免疫染色に て検討 したとこ ろS
DF（s的mmceu‐deri・v・edぬぬ、別名C）（C12）、SLC（鰍Mldaび駟1p110idd鬮噛 che伽kぬ 、 男恊 CCL21） 、CTCAK（cl】tan鰍lsReu眦aC
t噛Chern碯ne、男 恊CCL27）の 発 現 を認 め た。次 に造血幹 細胞で あるマウ スの骨 髄CD34陽ピ歸 田胞に おいて、 それぞれ のケモ カインに 対する ケモカイ ンレセプ ター（ Cばニ R4、CCR7、CCR10）の 発現をFACS
で 解析 し た とこ ろ 、 それぞ れのレセ プター を発現し ているpopldadonが認 められ た。また マウ ス の 骨 髄 を FACSで somngし た CD34陽 性 細 胞を 用 い たマ イ グ レー シ ョ ンア ッ セ イに お いても、 それぞ れのケモ カイン の細胞遊走能が認められた。．さらに生体内における検討において 、以 下 の 3っ の 群 にっ い て 解 析し た ： の骨 髄 のみを GFP−Tgマウス由 来の細 胞に置き 換え
た骨髄 移植マ ウス、◎ その骨 髄移植マ ウスにG‐CSF投与（ これに より骨髄 CD34陽陞孫田胞が循 環血 液 中 に多 く 動 員され る）、お よて離 粥FPlrrgマウス の骨髄 をs噺ngしたCD
34
陽 性細胞を正常 マウスに静注投与。その後、＠−◎群のそれぞれのマウスに皮膚倉U・傷を作成し、さら― 309ー

にケモカインを創傷部に皮内投与し検討した。＠群に比ベ◎◎群において、表皮内にGF
P陽性かっケラチン（表皮細胞特異マーカー）を発現する細胞の増加が見られ、中でもCTACK投与で、より増加していた。また、抗CTACK中和抗体を創傷皮膚ヘ投与したところ、骨髄由来のGFP陽陞湘胞の数は減少した。以上より、CTACKは骨髄幹細胞をより多く、表皮へと 誘 導 さ せ 、 分 化 誘 導 さ れ た 骨 髄 由 来 の 表 皮 細 胞 を 増 加さ せ る こと が示 され た。
一方、大きなダメージを受けた組織は、修復する過程で骨髄由来の組織幹細胞が誘導されることで正常な細織として機能することが予想されている。従って皮膚においても同様に、大きな創傷部には骨髄由来の表皮細胞が多く誘導され、組織再生が促進すると考えられ、CTACKがその倉雌討台癒を促進する可能性にっいて検討した。マウスに大きめの皮膚倉u傷を作成し、その周囲にCTACKを投与したところ、創傷治癒は有意に促進した。また、マウスの表皮細胞の増殖アッセイでは、CTACK投与による表皮細胞の増殖は見られず、創傷皮膚の血管の増生はC
T（ニKを投与しない群とは有意な差はなかった。以上より、C1、A（ニK投与により、骨髄由来の表皮細胞がより多く誘導されることで創傷治癒が促進することが確認された。
結論
CTA（※を骨髄幹細胞移植と組み合わせることで、健常人からの骨髄移植による先天性皮膚疾患治療に際して、皮膚に健常な骨髄由来表皮細胞が多く分化誘導され、根本的治療も可能となり得ることが期待される。また他臓器においても、それぞれのケモカインを同定すること によ り、 より効率的た骨髄幹細胞を用いた再生医療が可能になると考えられる。

学位論文審査の要旨
主査教授山本有平
副査教授野村克也
副査教授清々水宏

学位論文題名CTACK/CCL27 accelerates skin regeneration
via accumulation of bone marrow derived−keratinocytes(CTACK/CCL27による骨髄由来の表皮細胞の皮膚への誘導の促進）目的
重 症型 遺伝 陸疾 患の 多く は、 遺伝 子変 異により正常な生体の維持に必要な分子の機能が 損
なわ れ発 症す る。 例え ば皮 膚科 領域 にお ける遺伝陸疾患として表皮水疱症があるが、この 疾患で は表 皮・ 真皮 結合 に必 須な タン パク を先天的に欠損するため、皮膚が脆弱で、弱い外 カでも 表皮 ・真 皮結 合部 が解 離し 、皮 膚に 容易に水疱をきたす。そして、これらの疾患に対 する有効な治療は見っかっていない。
近年、多くの臓器で骨髄幹細胞が個々の臓器細胞へ分 化し、その可塑陛が報告されている。
皮膚 にお いて も、 骨髄 幹細 胞の 一部 が表 皮に遊走し、正常な表皮細胞へと分化することが 予想される。すなわち表皮水疱症などの皮膚構成タンパク 欠損症に正常骨髄を移植することで、正常 な骨 髄由 来の 正常 な表 皮細 胞が 患者 において欠損したタンパク質を産生し、根本的治 療となる可能陸があると考えられる。
今 回、 骨髄 幹細 胞を 誘導 する には 何ら かの特定の因子があると考え、白血球遊走因子で 創傷治癒に重要な役割を果たすとされるケモカインに着目 し、骨髄幹細胞の表皮細胞への誘導、分化にっいて検討した。
方法・結果
マウス正常皮膚および創傷皮膚におけるケモカインの 発現を、RT―P
CR、Western−blot、免疫染色にて検討したところSDF (stromal cell―deriv
ed factor、別名CXC12)、SLC(secondarylymphoidtissuechemokine、男I
J名CCL21)、CTACK(cutaneous
T―cellattractingchemokine、
別名 CCL27)の 発現 を認 めた 。次 に造 血幹 細胞であるマウスの骨髄CD
34
陽陞孫田胞において 、そ れぞ れの ケモ カイ ンに 対す るケ モカ イン レセ プタ ー(CXCR4、 CCR7、CCR10)の発 現を FACSで解 析し たと ころ 、そ れぞ れの レセ プタ ーを発現しているpopulationが認められた。また マウ ス の 骨 髄 を FACSで sortingした CD34陽陸 細胞 を用 いた マ イグ レー ショ ンア ッセ イに おいても 、そ れぞ れの ケモ カイ ンの 細胞 遊走 能が認められた。さらに生体内における検討にお いて、 以下 の3っの 群に つい て 解析 した ：＠ 喟髄 のみ をGFP‑
Tgマウ ス由来の細胞に置き換え た
骨 髄移 植マ ウス 、◎ その 骨髄 移植 マウ スに G‑
CSF投与 にれ によ り骨 髄CD34
陽 幽iロ 胞が 循環
一 3111

血液 中に多 く動員さ れる）、 および ◎GFP
一Tgマウス の骨髄を sorting
し たC
D3
4陽陸 細胞を正常マ ウスに 静注投与。その後、＠―◎群のそれぞれのマウスに皮膚倉l亅傷を作成し、さらにケモカ インを 創傷部に皮内投与し検討した。＠）群に比べ＠垣）群において、表皮内にGFP陽陸かっケ ラチン （表皮細 胞特異マ ーカー ）を発現 する細 胞の増加 が見られ、中でもCTACK投与で、よ り 増加 し て いた 。 ま た、 抗 CTA
CK中 和抗 体 を 創傷 皮 膚ヘ投 与した ところ、 骨髄由 来のGF
Pl生 細胞 の 数 は減 少 し た。 以 上 よ り、 CTA
CKは 骨髄 幹 細胞 をより 多く、表 皮へと誘 導させ 、分 化 誘導 さ れ た骨 髄 由 来の 表 皮細胞を 増加させ ること が示され た。最 後に、CTAC
Kによ って誘導 された 骨髄由来 の表皮細 胞が生 理的に機 能して いるかを 、創傷 治癒の面 から検討 した。
マ ウ スに 直 径 lcmの 皮膚 創 傷 を 作成 し 、 その 周 囲 にCTACKを 投与し たところ 、創傷 治癒は有意 に 促進 し た 。ま た 、 マウ ス の表皮細 胞の増殖 アッセ イでは、 CTA
CK投 与による 表皮細 胞の増 殖 は見 ら れ ず、 創 傷 皮膚 の 血管の増 生はCTAC
Kを投与 しない群 とは有 意な差は なかっ た。
以 上 より 、 CT
ACK投与 に よ り、 骨髄由来 の表皮 細胞がよ り多く誘 導され ることで 創傷治 癒が促進 するこ とが確認 された。
結論
CT
AC
Kを骨髄 幹細脆夥 植と細 み合わせ ること で、健常 人からの 骨髄移植による先天´陸皮膚疾患 治療に 際して、 皮膚に健 常を骨 髄由来表 皮細胞 が多く分 化誘導 され、根 本的治療 も可能とな り得る ことが期 待される 。
主 査 の 山 本 有 平 教 授 か ら は 、 SDFの invivoと invitro
で の 結 果の 違 い 、CTACKの 創 傷治
癒 へ の影 響 の 意義 、 副 査の 野 カ 村 克也 教 授 から は 、 CTA
CK
分 泌にお ける上流 の機序 、CTA
CKと そ の他 の ケ モカ イ ン によ る 相 乗 効果 の 期 待、 副 査 の清水 宏教授 からは、 今後の表 皮水疱症 の治 療の 期待などの 質問などが あったが、 申請者は大 概適切な回 答をした。
この 論文は 、再生医 療の分 野におい て、骨髄 由来の 表皮細胞 が特定 のケモカ インに より、多く 誘導さ れること で、創傷 治癒が 促進する ことが 証明され 、現在 、有効を 治療方法 が無いとさ れる遺 伝陸皮膚 疾患に対 し根本 的治療が 可能と なり得る と期待 される点 が評価さ れた。
審査 員一同 は、これ らの成 果を高く 評価し、 大学院 課程にお ける研 鑚や取得 単位な ども併せ 申 請者 が 博士 （ 医 学） の 学位 を 受 ける の に 充分な 資格を有 するもの と判定し た。