博 士 （ 医 学 ） 高 阪 真 路
学 位 論 文 題 名

癌遺伝子誘導細胞老化を回避する細胞の解析
学位論文内容の要旨【背景と目的】1960
年代，Hayflickにより正常なヒトの体細胞をinv
itroで培養すると，一定の回数細胞分 裂を繰り返した後に分裂寿命を迎え細胞分裂を不可逆的に停止することが発見された．
この現象，細胞老化は，癌抑制や個体老化の基礎機構として働いている可能性が示唆されてきた．
1990
年代 後半には癌遺伝子産物であるRasの強制発現によって，正常二倍体の細胞が，細胞老化と同様の細胞周期停止が起こることを示し，OI
S(oncogene‑
inducedsenescence)と呼ばれ，以後内因性の癌抑 制機構として注目されてきた．OI
Sの発見からこれまでにOISは生体内で腫瘍形成に対する第一の防御壁となることが数多くの研究により示されおり，O
ISの回避にはp16，p53pathwayの抑制が 重要であることが明らかにされてきている，しかしながら，O
IS回避は直接発癌にっながるのか という点は不明であり，それらを解決することがO
I
Sの発癌防御機構としての有効性を
評 価 する 上で 重要 で ある と考 えら れる ．今 回、 我々 はヒ ト正 常二 倍体 線維 芽 細胞 にお いて
retrovirusvectorを用いてHーRasV12を発現させOIS誘導させた際に，ある細胞集団はOISが誘導され ず に 増 殖 を 続 け る と い う 興 味 深 い 現 象 を 観 察 し た ． 我 々 は こ の OIS回 避 細 胞 を OISEC(oncogene‑inducedsenescenceescapedcell)と名付け，その性質を調べることで腫瘍形成におけるOIS回避の意味を考察した，【材料と方法】ヒト正常二倍体線維芽細胞，B
Jにレトロウイルスベクターを用いてconstitutiv
elyactive form
であるHーRas
V12を強制発現させ，導入20日後にOIS誘導されることなくspindle
な形態 を保 ち増 殖し た細胞をOISECとし，その性 質を調べた，O
IS細胞とOISECの細胞周期に関与するタンパ ク発現量をW
estem blott
ing法により比較検討した．OISECのstress‑inducedprematuresenescence (SIPS)
誘導性を明らかにするために，OISECのH202処理に対する感受性を評価した，
OISE
Cの足場非依存性の増殖能をsof
tagarcolonyfor
mationassayを用いて評価し，腫瘍形成能をヌードマウスの皮下に細胞を注入することで判定した，フ口ーサイトメーターとfluorescencei
nsitu
hybr
idization(FISH)
解析を用いてOISECのchromosomalinstabilityについて分析した，O
ISECの転写因子のmRN
A発現量を半定量的逆転写PCR法で測定した．
【結果】 B
J細胞にH‑R
asV12を導入10日後に平坦で幅広い細胞形態 への変化を認め，senescence
マーカーであるsenescence‑
associated‑ロ‑galactosidase(SA‑ロ‑gal)に濃染することを認めたが，H‑
RasV12を導入14日後にOISを回避し てspindleな形態を保ち増殖 を続ける細胞を認め，20日後には，増殖細胞が老化細胞よりも優勢な増殖を示した．R
as，リン酸化E
RK，Ets‑2，p53，p21の蛋白量はOI
S細胞とOISEC間で大きな差はみられなかったが，p16
蛋白発現量は著明な低下を認めた，
OISECではH‑RasV12の再導入，p16の導入，ストレス刺激によって，senescenceの再誘導がされた，
―307―

H
20
2処理5日後にOISECの細胞増殖停止，p16
蛋白発現誘導を認めがみられ，10日後に平坦な細胞形態への 変化， S
A‑ロ‑gal陽性を認 めた．O
ISECにcolony形成はみられなかったが，SV40earlyregion(ER)をOI
SECに導入したところ，colony形成を認め、なおかつinvivoでの腫瘍形成能を認めた．OIS
ECの大 部分はdiploidであ ったが ，SV40ERを導入 された O
ISECは高 率でaneuploidであっ た ． 約75％ のOISECのcbromosome1の コピー数 は2コ ピーで あったが ，SV40ERを導 入することで，コピー数の増加を認めた．OISECはOct3/4，Sox2，Nanogなどのいずれの転写因子の発現も 認 め た が ， OIS細 胞 に お い て 明 ら か な 発 現 を 示 し た の は Nanogの み で あ っ た ，【考 察 】 O
ISECにおいてp16蛋自 発現が消 失して いたこと から， 当初はp16プロ モーター がメチル化状態であると想定したが，methylations
pecificPCR
解析により明らかなp16
プロモーターのメチル化は認めなかった． OISECにおけるp16発現機構の保持はH202
処理によって，p16
蛋白発現誘導を認 め，senescenceが誘導されたことより示された．さらにH‑RasV12をOISECに再導入することでsenescenceが誘導されたことから。senescenceを誘導するのに必要なRasの閾値がOISECにおいて上 昇して いること が示唆 された， 転写因 子EtsやIdlによ るp16発現調節 がRa
s‑inducedsenescenceを制御していることから，OISECにおいてEts，Idlによるp16発現調節機構が破壊されている可 能性が ある．OISECにSV40ERを 導入す ることで 形質転 換能が示 されたこ とから ，p53
およ び Rbの 破 壊 がOISECの 形質転換 に必要 であると 考えられ る．SV40ER導 入によ り形質転 換したOISE
Cにおいて異数体の割合の増加を認めたことは，p16，p53は発癌刺激により異数体になることか ら細胞 を守る発 癌防御 機構とし て働く ことを示 した．OIS
ECに幹細胞性に関わるとされるNanog，Oct3/4，Sox2などの転写因子の発現を認め，OI
Sを回避する細胞は幹細胞性の集団である可能性 が示唆された．逆に幹細胞は発癌刺激に対して抵抗性を持ち，DN
A損傷から守られており，OISから容 易に回避 すると 考えるのは理にかなっている．polycomb
遺伝子群であるBmi‑lはInk4alocusにあるp16，p19の転写抑制することで，造血幹細胞や神経幹細胞の自己複製および増殖を制御 するこ とを考慮 すると ，OIS
ECに おける p
16の抑 制はOISECの持つ幹細胞性な特徴のーつであると考えられる，【結論】 本研究において我々は一部の幹細胞性をもった細胞はOISを回避することを見出した．
OIS
ECは 悪性形質 転換して いない ことが判 明した が，その 理由はp16およびp53が機能しているためにDNA損傷が蓄積した細胞や，異数体細胞を除去する抗癌機構が存在するためであり．p16，
p53 pathway
を 破壊する ことで O
IS
回避 細胞は 癌化する ことが 示された，今後我々はO
IS
E
CにおけるOI
S抵抗性 獲得の機 序，実 際の生体 内にお けるOISE
Cの存在 場所，およびOIS
E
Cの幹細胞性についてさらに検討してしゝく必要性がある，‑ 308―

学 位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査
副査

准 教授

濱教 授

佐教 授

田教 授

高教 授

藤田淳一
邊壽孝中伸哉田賢藏
堂 省

学 位論文題 名

癌遺伝 子誘導細 胞老化 を回避す る細胞の解析

ヒト 正常ニ 倍体線維 芽細胞に癌遺伝子産物であるRasを強制発現させると、細胞老化と同様 の細胞周 期停止 現象が生 じるこ とが知ら れてい る。この現象は、oncogene‑induced
senescence(OIS)と呼ばれ、正常細胞に備わった発がん防御機構として注目されている。
本研 究では、 OISの 回避とが ん化（悪性形質転換）の関連性を、不死化したヒト正常二倍体線維芽細胞BJを用いて、分子細胞生物学的に解析した。その結果、以下の興味深い知見を得 ている。 （1）幹細胞 性を有 する細胞 はO
ISを 回避すること、（2）OISを回避した細胞 (OIS escap
ed cells，OISEC)
は 悪性形 質転換し ていな いこと、 （3） またOI
SE
Cが悪性形 質転換し ていな い原因と して、 がん抑制 遺伝子 であるpl6INK4およびp53が機能しており 、DNA損 傷を受 けた細胞 や異数体細胞を排除する機構が働いていることを明らかにした。さらに、申請者は、本研究成果に対する独自の解釈ならびに今後どのように研究を発展さ せていく かにつ いて紹介 した。
発表 後、副 査の佐邊 教授から 、OISECが出現す る原因ならびにp53の遺伝子変異の有無についての質問があった。申請者は、BJ細胞株を構成する細胞には多様性があり、幹細胞性 の 高い 細 胞 に比 較 的低量 のRasが導入さ れた際 にOISECと なる可 能性を論 じた。 がん抑制 遺伝子p53の変 異につい ては調べていないと回答した。また、固形がんは一般的に上皮細胞由来であるので、線維芽細胞であるBJ細胞よりも上皮系の正常細胞を用いて解析した方がより有用な情報が得られるとの助言がなされた。申請者も上皮系細胞を使用することの重要性を認識しており、今後の課題とする旨の回答をした。さらに、論文中の文献引用の不備が指摘され、申請者は指摘箇所を訂正し論文を提出する旨の回答をした。副査の田中 教授から 、OISECがO
ISに 陥った 細胞に由 来して いないことをどのように証明したの‑ 309―

か質問がなされた。申請者は、リアルタイムで同一細胞を顕微鏡下で追跡することによってOISECが OIS
細 胞 か ら生 じ て ない こ と を観 察 し たと 回 答 し た。 副 査 の高 田教授 は、O
ISECに再 び Ra
sを 導 入す る と O
ISが 引き 起 こ され る理由お よび個々 の実験 の再現性 について 尋ねた。 申請者 は、ある 閾値以上 のRas蛋白が発現された場合にOISが引き起こされる可能性について回答した。実験の再現性については、すべて複数回の実験を行い、同様の傾向の結果が確認されていると回答した。副査の藤堂教授より、本研究で得られた知見を臨床の場で役立てる手だてについての意見が求められた。申請者は、ヒトがん組織にお け る OISECの 検 出 法を 確 立 し、 が ん 組 織内 の OI
SECの分 布 な らび に OI
SECを標 的 とした治療等に結ぴっけていく展望を述べた。最後に主査の浜田准教授から質問があった。
本研 究 で 行 われ た 蛋 白や mRN
Aの 発 現解 析 で は、 OIS
細 胞 集 団 にお け る O
ISECの混在、なら び に OI
SEC細胞 集団に おける O
IS細胞 の混在を 否定で きない。 フロー サイトメ トリ
ーな ど で OI
S細 胞 とOISECを選別 できれば 、両者の 混在を 危惧する 必要が なくなる 。そのためには、細胞老化に特異的な分子マーカーが必要となるが、フローサイトメトリーなどで利用可能なものがあるのかとの質問であった。申請者は、現時点では細胞老化を特異的 に 検 出 で き る マ ー カ ー は 、 senescence‑associated ロ ‑ galactosidaseやsenescence‑associatedheterochromaticfociなどが知られているが、いずれも細胞表面に局在するものではをく、フローサイトメトリーを利用した老化細胞の選別には不向きであると回答した。
この論文は、正常細胞が元来備えている発がんの防御機構を解明する上で重要な知見を提示しており、腫瘍生物学のさらなる発展に寄与するものと期待される。審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医 学 ）の 学 位を 受け る のに 充 分な 資 格を 有するも のと判定した。

‑ 310―