博 士 （ 医 学 ） 夏 賀健

h/Iolecular genetics of plectin‑deficient epidermolysis
bullosa and identification of IgA and IgE autoantibodies
in anti‑laminin 332 mucous membrane pemphigoid（プレクチン欠損型表皮水疱症の分子遺伝学的解析および粘膜類 天疱瘡患者 の抗ラミニ ン332I
gA．IgE
自己抗体同定）学位論文内容の要旨
研究 1． Molecular geneticsofplectin― deficientepidermolysisbullosa（プレクチン欠損型表 皮水疱 症の分 子遺伝 学的解 析）【 背 景 と目 的 】 プ レク チ ン は 、中 央 の rod domainをN末端 と C末 端 の globulardomainがそれ
ぞれ 挟み込 む、独 特なダ ンベル 様構造 を呈す る細胞骨格リンカー蛋白であり、皮膚・筋肉・消化管を はじめ とした 様カな 臓器で 発現し ている ．プレクチンには全長の蛋白とともに、roddomainが除 かれた rodlessプレ クチン が選択 的スプ ライシン グによ って生 じることが知られて船り、ヒト で は 表皮 細 胞 と 筋細 胞 で の 発現 が 報 告 され て い る．こ のroddomainは 、プレ クチン 遺伝子(PLECl)の エ クソ ン 31によ っ て コ ード さ れ て いる ， PLECIの遺 伝子変 異は、 筋ジス トロフイ ー合 併 型 表皮 水 疱 症 (EBS‑MD)と幽門閉 鎖合併 型表皮 水疱症 (EBS→PA)と いうニ つの異 なる表皮 水疱症 を引き 起こす ．しか しなカミら、PLEC1変異によって、なぜニつの病型が生じるか知られていない ．本研 究の目 的は、 PLEC1変異に よって 生じる ニつの 表皮水 疱症の 病型について病態を解明する ことで ある．
【 対 象 と方 法 】 PLEC1変 異 が 同定 さ れ て いる 6人 の EBS‑MD、 3人のEBS― PA患者皮 膚組織 を解析し た ． プレ ク チ ン のN末端 領 域、rod領 域、C末 端領域 のそれ ぞれに対 する抗 体を用 いて、 螢光抗 体法で 患者皮 膚組織 のプレ クチンの 発現パ ターン を明ら かとし た，ま た、EBS‑MD患 者由来 培
養線 維芽細 胞とEBSー PA由来 羊水細胞 のプレ クチン 発現パ ターン につい て、それぞれの抽出液を
免 疫 ブ ロ ッ ト 法 で 解 析 す る と と も に 、 RT― PCRで mRNAレ ベ ル の発 現 に つ いて も 検 討 した ．
【 結 果 】解 析 し た 9症 例の う ち 、 EBS― MDの 2症 例は 新規 のPLEC1変 異を有し ていた ，螢光 抗体法の 結果、 EBS−PA皮 膚組織 では、プ レクチ ンのす べての 領域に ついて 発現が減弱〜消失していた ． こ れに 対 し て EBS− MD皮膚組 織では 、N末端 とC末端 の発現 は減弱 しなが らも保た れてい たが、 roddomainの発 現はほ ば消失 してい た．免 疫ブロ ットと RT−PCRの結果、正常ヒト線維芽細胞 では、 全長の プレク チンと rodlessプレク チンが 発現し ていた ．これ に対し てEBS―MD由 来線
維芽 細胞で は全長 のプレ クチン が消失 し、rodlessプレクチンのみが発現していた．EBS−PA由来
羊水 細胞で は、全 長、rodlessプレク チンと もにほぼ 消失し ていた ．
ー 455―

【 考察 】本 研 究の 結果 は、 ほ とん どの EBS一MDの患 者で PLEC1変 異が rod領域をコードする エク
ソ ン31に認 め られ 、逆 にEBS― PAで はエ ク ソン 31以 外の 部 位に 変異 を持 っことが多いとい う事
実 と一 致す る ．EBS患 者のプレクチ ンの発現について検討した過 去の報告では、rod domainに対す る抗 体が 主 に用 いら れていたため 、全長とrodlessプレクチン の存在について判別するこ とができなか った，しかしながら、本研 究ではN末端、C末端を認識す る抗体と合わせて使うこと で、
螢 光抗 体法 と 免疫 ブロ ット法にて全 長とrodlessプレクチンの発 現を解析することができた ．なぜ rodlessプレ クチ ン のみ が発 現し てい る と筋 ジストロフイー を合併し、全長とrodlessプ レク
チ ンが とも に 欠損 して いる と 幽門 閉鎖 症を 生じ るかといった詳 細なメカニズムは解明され ておら ず、 今後 の 課題 とな る．
【結論】 EBS―MDでは、全長のプレク チンは発現していないが、 rodlessプレクチンの発現が 保たれている ．これに対して、EBSーPAで は全長、rodlessプレクチン ともに著明に減弱〜消失し ている，

研究2．

Iden
tific
ationof I
gA and IgEauto
antib
odiesin antiーlamin
in 33
2 muc
ous membra
nepemphigoid（ 粘 膜 類 天 疱 瘡 患 者 の 抗 ラ ミ ニ ン 332IgA． IgE自 己 抗 体 同 定 ）【背景と目的 】抗ラミニン332型粘膜類天 疱瘡は、慢性に経過する稀な 自己免疫性水疱症である．
患 者血 清中 のラ ミ ニン 332に 対 する IgG抗体 につ いて 、こ れまで文献的に記載 されているが、ラミ ニ ン 332に 対す るIgA抗 体や IgE抗体 の存 在に っい て は知 られ てい な ぃ． 本研 究2では 、抗 ラミ ニ ン 332型 粘膜 類天 疱瘡 患者 血 清中 にラ ミニ ン332と 結合 す るIgAま たは IgE抗 体 が存 在す るかを解明する ことである．
【 対象 と方 法】 下 記の 4つの 基 準を 満た した 4人 の患 者血 清と皮膚組織を使用 した． (1)粘膜を主 とし て表 皮下 水 疱が 認め られ る． (2)患 者皮 膚組 織の 表 皮基 底膜 にお い てinvivoでIgGの沈着 が証 明さ れて い る， (3)患者 血清中に、lMNaCl処理正常人皮膚(split―skin)の真皮側と反応す るIgG抗 体が 存在 する ．(4)患 者血 清 中に 認め られ たIgG自 己抗 体 は、 真皮 抽出 液を用いた免疫 ブロ ット でVII型 コラ ーゲ ン (290kDa)やラ ミ ニン ッ1(200kDa)の蛋白と反応 しなぃ．ラミニン
332に対するIgG/IgA/IgE血中抗体は免疫ブ ロットにて解析した，【 結 果 】 4人 の 患 者 血 清 か ら 、 そ れ ぞ れ ラ ミ ニ ン 332の ッ 2、 a3/v2、 a3、 03ノ ロ 3/'y2サ ブ
ユ ニ ッ ト に 対 す る IgG自 己 抗 体 が 検 出 さ れた ．4人 の 患者 のう ち1名か らは 、ラ ミ ニン 332の83／ ロ3ノッ 2サ ブュ ニッ トに 対 する IgA自己 抗体 が同 定さ れた，また、4人の患 者のうち1名からはッ2サブユニ ットに対するIgE自己抗体が 検出された，【 考察 】水 疱性 類 天疱 瘡な どの 他の自己免疫性水 疱症では、IgG自己抗体のほ かに患者血清中で皮 膚基 底膜 構成 蛋 白に 反応 する IgA抗体 やIgE抗 体が 存在 することが知られて いる．本研究によっ て 抗 ラ ミ ニ ン332型 粘膜 類天 疱 瘡で もIgG自 己抗 体の ほか に 、IgA抗 体や IgE抗 体 が検 出さ れる こと が証 明さ れ た． しか しな がら 、 検出 され るIgA抗 体やIgE抗体の病的意 義は不明である．
【 結論 】一 部の 抗 ラミ ニン 332型粘 膜類 天疱 瘡 患者 では 、IgG自 己抗 体と と もに 、ラミニン332に対するIgAと IgE抗体が同定される，ー 456 ‑学位論文審査の要旨
主 査 教 授 山 本 有 平宏
副 査 教 授 清 水有正副 査 教 授賀 哲
守也
副 査 教 授 笠 内 正 典
副 査 教 授原

IVIolecular genetics of plectin‑deficient epidermolysis
bullosa and identification of IgA and IgE autoantibodies
in anti‑laminin 332 mucous membrane pemphigoid（プレクチン欠損型表皮水疱症の分子遺伝学的解析および粘膜類天 疱瘡患者の 抗ラミニン 332IgA・IgE
自己抗体同定）第一章のM
oleculargeneticsofplectin‑deficientepidermolys
isbullosa（プレクチン欠損型表皮水疱症の分子遺伝学的解 析）では、プレクチンの変異によって生じるニつの異なる表 皮水 疱 症、 筋ジ スト ロフ イー 合併 型表 皮水 疱症 (EBS‑MD)と 幽門閉鎖合併型表皮水疱症 (EBS‑PA)の発生機序の解明にっいての研究内容が発表された 。さまざまな遺伝学、分子生物学的な手法を用いた結果 、EBS‑MDでは、全長のプレクチンは発現していないが、rodlessプレクチンの発現が保たれていた。これに対して、EBS‑PA
では全長、rodlessプレクチ ンと も に著 明に 減弱 〜消 失し てい るこ とが 明ら かに なった という内容であった。
審 査で は、EBS‑M
Dの症状について変異の位置によって症状の重 症度が異なるかと問われた。発表者からは変異の位置に よって皮膚症状の程度や筋ジストロフイーの発症時期が異なるという回答が得られた。ま た、EBS‑PAにおいて幽門がなぜ閉鎖するかという点が問われた。これに対しては、プレク チンとインテグリンの結合が幽門の発生に重要であるという説と、幽門が消化管のうちで 最も狭いところであり、消化管粘膜の障害から二次的に線維 化を 起 こし て幽 門が 閉鎖 する とい う説 のニ っが 発表 者から 紹介された。E
BS‑MDとEB
S‑PAの 臨 床的 特徴 につ いて も質 問が あっ た。 EBS‑MD
で は中年 以降まで生存することが多いが、呼吸筋が侵されること によって呼吸不全に陥って死亡するといったことが説明され た。 ま た、 E
BS‑PAで は幽 門閉鎖 に対する外科的治療を施しても、生後1年以内に死亡してしまう症例がほとんどであ ると発表者から回答があった。E
BS‑PAのうち、解析した1症例 で認 めら れて いた スプ ライ ス部位変異にっいて、mRNAを解 析したところいくっかのニ種類の転写産物が認められた という点について質問があった。発表者からは、当該患者 由 来 の 培 養 細 胞 か ら mRNAを 抽出 し、 RT‑PCR
し てcDNAを 作成 した の ちに 変異 部位 を増幅 させ たものをT
Aクローニングで解析した結果であると説明が あった。T
Aクローニン― 457―

グで 60ほどのクローンを採取してシーケンスした結果、二種類の転写産物が得られたと説明さ れた。プレクチンの配列にっいてデータベース上で異なったものがぃくっもみられるとい う点にっ いて質問 があっ た。発表者は、プレクチンのN末端については様々なスプライス バリアントがあると報告があり、特にラットなどでは10種類近くのものが記載されている ことを回 答した。
第二 二章のId
entif
ic
at
ionofIg
AandIgE
autoantibodie
S
inanti．lamin
i
n3
32mu
C0u
S
membranepem
phigoid（粘 膜類天 疱瘡患者 の抗ラミ ニン33
21gA．I
名E自己 抗体同定 ）では、 一部の抗 ラミニン 332型 粘膜類天疱瘡患者では、IgG自己抗体とともに、ラミニン33
2に 対す る IgAと IgE
抗 体 が 同定 さ れ るこ と が 証明 さ れ たと い う 内 容の 発 表 であ った。
審査では同定されたIg
A、Ig
E
自己抗体の病的意義について問われたが、発表者からは、今回 の研究ではいまだ病的意義は明らかとならず、臨床症状との相関についてもはっきりしな いという回答であった。どのような方法をとれば病的意義が解明されるかという点も問わ れた。こ れに対し て発表 者は、患 者血清 からIgAやIgEを抽出して、これをマウスなどの 実験動物に投与し、ヒトの疾患の表現型が再現されるかを観察するような実験系が最も適 している と回答し た。
この論文は、第一章、第二章ともに疾患の病態メカニズムを明らかにする重要な手掛かりを 提起したといった点で高く評価され、今後のさらなる病態解明や治療法の開発などにっな がる第一 歩となる ことが 期待され る。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ申 請 者 が 博士 （ 医 学）の学 位を受 けるのに 十分な資 格を有 するもの と判定 した。

― 458―