DROPLET DIGITAL PCR

遺伝子組換え細胞のカウンティングを可能とするWhole CellベースのドロップレットデジタルPCR（wc-ddPCR）アプリケーション
ProtocolこのプロトコルはDroplet Generatorを用いて細胞それぞれをカプセル化し、導入遺伝子とリファレンス遺伝子をターゲットとして内部DNAを増幅することにより細胞数をカウントできるよう設計されています。このアプリケーションは少ない細胞量でも編集または改変された細胞集団の正確で精密なセルカウントを可能にします。
Materials
注： 本プロトコルの ddPCR 部分を実施するためには、追加の試薬または機器が必要となる場合があります。
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Single Cell ddPCR Enhancer Reagent A (1000ウェル分）(Cat# 12013425）■

ddPCR Multiplex Supermix (500ウェル) (Cat# 12005910)■

RPP30 FAM Copy Number Assay, 1,000 reactions(Cat# 10031241, Unique Assay ID: dHsaCP2500313)■

SOD1 HEX Copy Number Assay, 1,000 reactions(Cat# 10042962 , Unique Assay ID: dHsaCNS642774914)■

Dithiothreitol (DTT) Pack 300 mM (Cat#12012171)■

制限酵素 HaeⅢ(3,000 units）またはBrsl (1,000 units)(NEB catalog# #R0108S またはR0527S)

Equipment and Consumables■

QX200 Droplet Generatorシステム (Cat# 1864002JA)■

QX200 Droplet Readerシステム PC付き (Cat# 1864003JB)■

PX1 PCR Plate Sealer (Cat#1814000J1)■

C1000 Touchサーマルサイクラー＋96 Deep wellリアクション
モジュール (Cat#1851197JA)■

ddPCR Plates 96well セミスカート (Cat#12001925)■

Droplet Generatorオイル for Probes (Cat# 1863005)■

DG8カートリッジ＆ガスケットセット(960ウェル分)(Cat# 1864007)■

ddPCR用 ホイルヒートシール (Cat#1814040)■

Droplet Readerオイル(1000ウェル分) (Cat# 1863004)■

TC20全自動セルカウンター (Cat# 1450101J1)

General Workflow
1x ddPCR
reactionに細胞を添加

Droplet内に細胞ごとカプセル化

サーマルサイクルによるエンドポイント
アッセイ

検出および結果の解析

Counting Genetically Modified Cells using Whole Cell-Based Droplet Digital PCR (wc-ddPCR)

Key Workflow Considerations

Duplexアッセイ :■ Duplexアッセイの場合、FAMでRPP30またはHEXでSOD1のいずれかを選択し、反対側の蛍光色素（FAMまたはHEX）にCAR-T固有のアッセイを追加します。このアッセイでは、RPP30またはSOD1アッセイから総細胞数を算出し、TC20全自動セルカウンター (Cat#1450101J1)で結果を確認します。導入遺伝子は、導入遺伝子のコピー数/ µl（細胞数/ µl）として算出されます。最後に、リンケージ%もこれら2つのアッセイを使用して計算されます。リンケージの%値が低い場合は、プロトコルが正しく実行されていることを確認するために、追加のコントロールとしてTriplexアッセイの実行を検討してください。また、必要に応じて、RPP30 / 導入遺伝子またはSOD1 /導入遺伝子のデュプレックスを使用した第二ウェルの実行をすることもできます。

■ Tip 1 ▬ 細胞とマスターミックスを準備する順番が重要です。最初に細胞を調製して氷上にセットし、次に1xマスターミックスを調製します。
マスターミックスは20分以内に使用してください。DG8カートリッジをフォルダーにセットし、細胞をマスターミックスに添加してから5分以内にドロップレット作製を実行してください。

■ Tip 2 ▬ マスターミックスに細胞を添加してから5分以内にドロップレット作成を実行する効率的なワークフローは、より多くの細胞をカウントし、遊離DNAを減らすために重要な工程となります。多少の細胞溶解により遊離DNAが生じることもありますが、リンケージ解析にはほとんど影響しません。

■ Tip 3 ▬ 安定した再現性の高い結果を得るには、各コンポーネントをしっかりミキシングまたはボルテックスすることが不可欠です。マスター
ミックスと細胞は、混合前と添加後の各ステップでそれぞれボルテックスを行います。

コントロールとテストRun：■ 品質の高いデータを確実するために、K562 細胞株と目的のサンプル細胞を用いたRPP30 および SOD1のduplexアッセイを使用し、簡単なコントロールRunの実行をお勧めします。すべてのヒト細胞は RPP30 と SOD1 の両方を含んでいるので、データコントロール
Runでは、プロット比率が 1 を示し、RPP30 と SOD1 のコピー数/μl（細胞数/μl）が等しくなる必要があります（図 1）。さらに細胞の総数は TC20セルカウンターの細胞数から予測される値に等しく、最終的にリンケージパーセンテージは> 90%である必要があります（解析データを参照）。

■ Tip 4 ▬ ボルテックスを容易にするため、マイクロ遠心チューブを用いたサンプル調整をお勧めします。

Best Practices
アッセイのセットアップ
このアプリケーションを実行する際、2種類の設定を行うことができます。1つ目はall-in-oneウェルtriplexアッセイで、2つ目はsingleウェルduplexアッセイです（図1）。最良の結果を得るために、CAR-T特異的または導入遺伝子アッセイではRPP30および/またはSOD1が、制限酵素にはHaeIIIが推奨されます。場合によっては、アンプリコンがHaeIIIによって切断されないよ
う、 CAR-T固有のアッセイを再設計する必要が生じます。
Triplexアッセイ :■ 最良の結果を得るために推奨：CAR-T特異的または導入遺伝子アッセイでRPP30および/またはSOD1を使用し、制限酵素としてHaeIIIを使用します。
■

All-in-oneウェルtriplexアッセイの場合、 CAR-T特異的または導入遺伝子の検出用プローブはFAM蛍光色素で標識されたアッセイとHEX蛍光色素で標識されたアッセイをそれぞれ準備する必要があります。
ターゲット遺伝子のFAMとHEXアッセイを比率1:1で混合し、FAMのRPP30とHEXのSOD1と一緒にウェルに添加します。この混合により、３つの陽性クラスターと、一つのドロップレットを複数の目的遺伝子の蛍光が共有したクラスターを含むTriplexアッセイが確立されます（図2）。
クラスターが明確に分離されていない場合は、いずれかのアッセイ濃度を下げる条件検討が推奨されます。

図1. Duplexアッセイ オレンジのクラスターには、両方のアッセイで陽性となったDropletが含まれている。緑と青のクラスターは遊離DNAを示している。黒いクラスターは陰性Dropletを示している。
アッセイ1 ： リファレンス遺伝子（RPP30）, FAM標識
アッセイ2 ： リファレンス遺伝子（SOD1）, HEX標識

図2. Triplexアッセイ オレンジのクラスターには3つのアッセイすべてに陽性なDropletが含まれている。緑と青のクラス
ターは遊離DNAを示している。黒いクラスターは陰性Dropletを示している。
アッセイ1 ： ターゲット遺伝子（AP3B1）, FAM標識
アッセイ2 ： リファレンス遺伝子（RPP30）, FAM/HEX標識
アッセイ3 ：リファレンス遺伝子（SOD1）, HEX標識© 2020 Bio-Rad Laboratories, Inc.

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Counting Genetically Modified Cells using Whole Cell-Based Droplet Digital PCR (wc-ddPCR)

Protocol14細胞の調製、事前カウンティング、生存率の評価
ddPCR 反応液をセットアップする前に、PBS + 0.1%BSA で細胞を調製します。培養した新鮮な細胞や凍結細胞、またはヌクレオソーム解析を目的とした細胞をサンプルとして使用することができます。細胞カウントおよびddPCR 反応に加える前に、細胞を1-2回ウォッシュすることが推奨されます。細胞は ddPCR 反応液に添加するまで氷上に静置しておきます。一部の細胞およびヌクレオソー
ム解析では、ユーザーにより事前検討され最適化された細胞調整プロトコールが必要となる場合があります。ヌクレオソーム解析の場
合は、OMNI-ATACプロトコルと各種バッファー ( SureCell ®
ATAC-Seq Library Preparation Kit User Guide, section 3 ) を参照してください。バイオ・ラッドのTC20自動セルカウンターによる2回の細胞数カウントおよび生存率測定が、正確な細胞数カウントおよび細胞生存率の評価のために推奨されています。4,000細胞 / μlの細胞濃度5μlを用いたアッセイが0.1%までの編集効率検出に最適です※。

ddPCR プロトコル（反応液 20 µl と Droplet Generator Oil70 µl）を使用してDropletを作成します。手順の詳細については、QX200 Droplet Generator 取扱説明書をご参照ください。

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注： 通常このプロトコルでは、1ウェルあたり 10,000 以下のDropletカウントとなります。
表2. サーマルサイクリングパラメータ

1x ddPCR反応液の調整細胞またはヌクレオソームを調製し、氷上で静置した後、表1に示す試薬すべてを用いてddPCR反応液を調製します。ボルテックスのステップを簡素化および迅速に行うために、レプリケートアッセイ用のマスターミックスと細胞は1本のマイクロ遠心チューブで調整します。

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重要： ddPCR反応液をしっかり混合します。プレートを用いる場合はしっかりシーリングした後にボルテックスにかけ、軽く遠心します。
チューブの場合はしっかり蓋を閉め、十分にボルテックスを行います。

重要： 良好な結果を得るためには、Droplet作成前に細胞を十分にボルテックスすることが重要なステップとなります。
表1. 1x ddPCR反応液の調整
Volume, µl
6.25

Restriction enzyme ※※ ≥ 10 U
20x assay 1

120x assay 2

1.25

DTT0.34

ddPCR Enhancer Reagent A

0.5

Cells in PBS + 0.1% BSA※※※Water

5 µlまで (20% PBSを超えない)トータル

251.25

トータル25 μlに調整※※

推奨および検証済の非アンプリコン切断制限酵素はHaeIIIまたはBsrl + Sma1です※※※

QuantaSoft Software解析では、 最大60,000 / ウェル（3,000 コピー/μl）までの細胞は、コピー数/ μlから細胞数/ μlに直接変換することが可能です© 2020 Bio-Rad Laboratories, Inc.

時間30 min

ランプ速度, ° C / sec
2

サイクル数129510 min

2139430 sec

2604552 min26059810 min2

164

Hold―6解析

細胞内在のDNAがカウントされているので、算出されたコピー数/ μlは、細胞数/ μlとして使用することができます。

1x ddPCR反応液に細胞を添加

コンポーネント

温度, ° C37

RPP30 細胞数/ μl = SOD1 細胞数/ μl

ボルテックスで細胞を再懸濁し、1x ddPCR反応に添加し、ステップ2と同様によく混合します。

ddPCR Multiplex Supermix

ステップ
1

解析はQuantaSoft Softwareバージョン1.7、QuantaSoft
Analysis Pro ソフトウェア、または QX Manager ソフトウェアを用いて実行してください。Triplexアッセイの解析にはQX
Manager ソフトウェアが適しています。慎重に各ウェルのクラスターにラベルを付けを行い、Thresholdを設定します。ソフト
ウェアから算出されたコピー数/ μl の濃度は、直接sc-ddPCR反応の細胞数/ μl に換算できます。総細胞数のコピー/ μlは、2つのリファレンスアッセイRPP30とSOD1から算出されます。
これら 2 つの数値は互いに等しくなければなりません。

細胞の調整を事前に終え、氷上での静置ステップまで先に進め、マスターミックスに加える準備が完了した後に、ddPCR反応液の調整を開始するフローが重要です。この手順により細胞およびddPCR反応液はフレッシュな状態が確保され、アッセイの安定性および結果の再現性が上がります。

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サーマルサイクルによるエンドポイントアッセイ
プレートシールを行いサーマルサイクルを実行します（表2 参照）。Dropletの読み取りは、サーマルサイクル終了後24時間以内に行うことが推奨されます。

※1ウェルあたり最大60,000個まで細胞を添加できます。

2細胞のDroplet内へのカプセル化

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Counting Genetically Modified Cells using Whole Cell-Based Droplet Digital PCR (wc-ddPCR)

図3. QuantaSoft Software 1.7のテーブルビューでのリンケージ値の表示

Analysis Tips
注: 細胞懸濁液から通常わずかな浮遊型 DNA セグメントが見られます。
遊離DNA を考慮するには、リンケージパーセンテージの確認が有用です。
RPP30_FAM + SOD1_HEXウェルを使用して、細胞内の2つのDNAターゲットのリンケージを計算します。リンケージパーセンテージは、ソフトウェ
アの表ビューで表示されているリンケージコピー数/ μl を使用して計算することができます（図3）。このリンケージ値は、ランダム分布で発生すると予想されるDouble Positiveクラスターのコピー数/ μ l以上の値を示しています。このリンケージを使用して、(リンケージ濃度 [コピー数 / μl ] / 濃度 [コピー数 / μl ] x 100) を計算することにより、リンケージパーセンテージを計算します。
Duplex DNAコピー数アッセイを行った細胞ではほぼ同じ濃度で濃度比が1となり、Positive Dropletのほとんどがリンケージされているはずです。最適化された実験では95～98％のリンケージパーセンテージが理想的です。
リンケージパーセンテージが100%に近い場合は、正確性を確保するため、リファレンス遺伝子とターゲット遺伝子（GOI）の非リンケージ濃度を使用します。ポアソン分布とリンケージの詳細については、Droplet Digital PCRアプリケーションガイド（bulletin 6407）およびBio-RadのDroplet Digital PCRシ
ステムを使用したバリアントのフェージングに関するガイドライン（bulletin6718）を参照してください。

プロトコルが使用する細胞でワークしていることを確認するために、RPP30やSOD1のような2つのコピー数DNAを測定するDuplexアッセイを用いたコントロールウェルを用意することが非常に重要です。
あるいは、2つのDNAアッセイにGOIアッセイを加えたTriplexアッセ
イでも確認が可能です（Best Practice：アッセイのセットアップセクションを参照）。Triplexアッセイの使用を選択した場合は、QX
Manager または QuantaSoft Analysis Pro ソフトウェアを使用して、ペアワイズでの各アッセイを組み合わせたリンケージを計算することができます。2つのDNAリファレンスを用いたDuplexアッセイを用いた場合、すべての細胞には両リファレンス遺伝子が含まれているので、FAMおよびHEXポジティブ（Double-Positive）となります。

細胞ベースのDroplet Digital PCRを用いた遺伝子組換え細胞のカウンティングに関する詳細は、bio-rad.com/ddPCRwholecellをご覧ください。
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