平成17年度〔2005〕No.50
宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告

県産農産物のがん細胞増殖抑制活性 ＊酒井美穂＊1・柚木崎千鶴子＊1・岡部玲二＊2

Antitumor Activity of Agricultural Products in Miyazaki Prefecture
Miho SAKAI, Chizuko YUKIZAKI and Reiji OKABE
本県産農産物39作物64品種136部位について，肝がん細胞の増殖抑制活性を評価した。その結果，茶，バジル，ローズマリー，レモンバーム，ペパーミント，スペアミント，ステビア，カモミール，香酸柑橘果
皮，ニガウリ種子，茎葉利用カンショ葉・茎は肝がん細胞の増殖を抑制した。また，これまでの機能性評価によりスクリーニングされた，抗酸化活性及びがん細胞（HL60，肝がん細胞３種)増殖抑制活性の両機能を有する作物について，抗酸化成分とがん細胞増殖抑制成分の関係について検討した。その結果，シソ科ハーブ類の抗酸化成分３成分のうち２成分はがん細胞増殖抑制活性を有することがわかった。しかし，各細胞種で細胞増殖抑制要因が異なる結果となった。
キーワード：農産物，ハーブ，HL60細胞，肝がん細胞，過酸化水素
１

はじめに

２

これまで，本県を産地とした農産物の機能性を，抗酸化活性およびHL60細胞増殖抑制活性を指標と1)，2)して網羅的に評価してきた。

実験方法

２−１

抽出物の調製宮崎県総合農業試験場で栽培された農産物（39すでに，高抗酸化作物64品種136部位）を収穫期にあわせて提供を作物として茶，シソ科ハーブ類，マンゴー果皮，茎受け，即日，可食部および非可食部の部位ごとに葉利用カンショ葉，ゴボウ，ニンジン葉をスクリー分けて真空凍結乾燥機（FTS SYSTEM，Dura-ニングし，その活性成分のひとつが，caffeic acid，

Top MP & Dura-DRY MP）で乾燥した。乾燥試

chlorogenic acid，dicaffeoyl tartaric acid，

料は，超遠心粉砕器（MRK & RETSCH, EM-1

rosmarinic acidであること，また，茶，シソ科ハ型）で0.5mmのスクリーンを通して（一部糖分のーブ類，有色米，香酸柑橘果皮がHL60細胞の増殖多い試料は5mmスクリーン使用）粉砕した。

を強く抑制することを報告してきた。

凍結乾燥試料1gに30mlの80%エタノールを加本研究では，肝がん細胞３種を用いた県産農産

えてボルテックスで30秒かくはんし，NO.5Aの物の増殖抑制活性を評価するとともに，これまでろ紙で吸引ろ過した。そのろ液をエバポレーターの機能性評価によりスクリーニングされた作物ので濃縮し，凍結乾燥後，抽出物を得た。抽出物はうち，抗酸化活性及びがん細胞増殖抑制活性を有dimethyl sulfoxide（DMSO）に再溶解し，供する作物について，抗酸化成分とがん細胞増殖抑試した。

制成分の関係について検討したので報告する。

２−２細胞および培養条件

HL60ヒト白血病細胞（RCB0041）は（独）＊バイオマーカーによる県産農産物の機能性評価

理化学研究所バイオリソースセンターより，肝がに関する研究（第３報）

ん細胞（HLE，HLF，HuH-7）は宮崎大学医学＊1 食品開発部部より分譲を受けた。それぞれ10%ウシ胎児血清＊2 宮崎県総合農業試験場（現 宮崎県農政水産部東を含むRPMI1640培地あるいはDMEM培地で，臼杵農林振興局）

37℃，5%CO 2存在下，相対湿度100%の条件で87

県産農産物のがん細胞増殖抑制活性培養した。

えた。続いて，1200μM DPPH（1,1-diphenyl-２−３2-picrylhydrazyl,和光純薬）エタノール溶液をHL60細胞増殖抑制試験

測定培地中で試料終濃度が62.5，125，250，８連ピペットを用いて加え反応を開始させた。室500μg（extract）/mlになるようにDMSOで希温で20分間放置後，520nmにおける吸光度をマ釈し，1μlずつ96穴プレートに分注した。ここにイクロプレートリーダーで測定した。なお，反応

5細胞懸濁液（1×10 cells/ml）を99μlずつ加え液の最終エタノール濃度は50%になるように調製て混合し，48時間培養した。その後，テトラカラし，活性は，凍結乾燥粉末試料絶乾物1g当たりーワン試薬（生化学工業）10μlを加えてさらにのTrolox（Aldrich）相当量として３連の平均値４時間培養し，650nmの吸光度を参考波長としを表示した。て450nmの吸光度をマイクロプレートリーダー

２−７（ナルジェヌンクインターナショナル，Immuno1)DPPH-HPLCオンライン法3)

抗酸化成分の特定Mini NJ-2300）で測定した。測定は３連で行い，DPPH-HPLCオンライン法を用いてDPPHラジ細胞にDMSO 1μlを添加したものをcontrolとし，カル消去活性成分を検出した。HPLCで分離した細胞増殖はcontrolの平均吸光度に対する百分率

抗酸化成分は，ポストカラムで10-5Ｍ DPPHメタで算出した。また，対control%が50%の時の試料ノール溶液と約50秒間反応させると，517nmで濃度をIC50として増殖抑制活性を示した。

負のピークとして検出される。供試試料は，80%

２−４ 肝がん細胞3種増殖抑制試験

エタノールで抽出後0.45μmフィルターでろ過

4細胞懸濁液（1×10 cells/ml）を96穴プレートに50μl添加し，24時間接着させた。その後終濃し，直接HPLC分析に供した。HPLCの測定条件は以下のとおりであった。

度が125，250，500，1,000μg（extract）/mlになるようDMSOで希釈した試料を培地に懸濁さ

装 置：JASCO PU-980，DG-980

せ，あらかじめ細胞を接着させてある96穴プレー

検出器：PDAトに50μlずつ分注した。48時間培養後，テトラカラム：Finepak SIL-5（4.6mm×250mm）

カラーワン試薬10μlを加えてさらに３時間培養

カラム温度：40℃

し，650nmの吸光度を参考波長として450nmの移動相：Ａ液；0.2%ギ酸，Ｂ液；0.2%ギ酸含有CH3CN吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
測定は３連で行い，細胞にDMSO 1μlを添加した

流ものをcontrolとし，細胞増殖はcontrolの平均吸

グラジエント：Ｂ液10→45%(20分)→55%（10量：1ml/min光度に対する百分率で算出した。また，対分）−55%(10分)→100%（10分）

control%が50%の時の試料濃度をIC50として増殖抑制活性を示した。

2)HPLCによる抗酸化成分の特定

カタラーゼ添加による細胞増殖抑制試験

DPPH-HPLCオンライン法で抗酸化活性を示

最終濃度が50U/mlになるようにカタラーゼをすピークを特定した後，標品を用いて，溶出時間添加した培地を用いて，2-3，2-4と同様に試験および吸収スペクトルの比較により成分の特定をを実施した。

行った。

２−５

２−６

DPPHラジカル消去活性の測定

凍結乾燥試料に適量の80％エタノール溶液を加えてスターラーでかくはんしながら10分間抽３

結果および考察出し，0.45μmフィルターでろ過し試料抽出液と３−１

肝がん細胞増殖抑制効果結果した。96穴マイクロプレートに調製した試料抽

県産農産物80%エタノール抽出物の肝がん細胞出液，pH6.0の200mM MES（2-morpholinoet３種増殖抑制試験の結果を表１に示した。IC50の値

hanesulphonic acid, 同仁化学）緩衝液を順次加が，200μg/ml以下を示すものを強い作用，20088

県産農産物のがん細胞増殖抑制活性

μg/ml以上500μg/ml未満を中程度の作用，500

キカンショ，ブルーベリー可食部の80％エタノー

μg/ml以上1,000μg/ml未満を弱い作用，1,000

ル抽出物は，抗酸化活性およびがん細胞増殖抑制

μg/ml以上を今回の試験では効果なしとした。

活性を併せ持つことが分かった（図１）。これよ

その結果，いずれの肝がん細胞でも茶，バジル，り，抗酸化成分ががん細胞増殖抑制活性を有する

ローズマリー，レモンバーム，ペパーミント，ス可能性が考えられたため，抗酸化成分を特定し，ペアミント，ステビア，カモミール，香酸柑橘果

そのがん細胞増殖抑制活性について検討を行った。

皮，ニガウリ種子，茎葉利用カンショ葉・茎に活本試験では，抗酸化活性およびがん細胞増殖抑制性が認められた。よって活性成分による細胞の選活性の両機能を強く併せ持つシソ科ハーブ類５種択性はないものと思われた。

について検討した。

３−２DPPH-HPLCオンライン法およびHPLCを用い抗酸化成分の特定

これまで，抗酸化活性およびがん細胞増殖抑制て，シソ科ハーブ類５種の抗酸化成分（DPPHラ活性を指標とし，県産農産物の機能性を評価してジカル消去活性）を分離した結果，バジルではきた。その結果をまとめると，茶，シソ科ハーブ

eugenol，シソ科ハーブ類５種でrosmarinic acid，類５種（バジル，ローズマリー，レモンバーム，ローズマリーではcarnosic acidと３種の化合物をペパーミント，スペアミント，）ステビア，ムラサ検出した。
（図2-1，2-2）

表１ 県産農産物の肝がん細胞増殖抑制活性（IC50）

HLE

ＨＬＦ

強い作用
200μｇ/ml以下
茶、ローズマリー、香酸柑橘果皮
中程度の作用
200μｇ/ml以上500μｇ/ml未満
ニガウリ種子、バジル、レモンバーム、スペアミント、ペパーミント、ステビア
弱い作用500μｇ/ml以上1000μｇ/ml未満
ムラサキカンショ、茎葉利用カンショ葉・茎、金柑未熟種子、カモミール、香酸柑橘果皮

強い作用200μｇ/ml以下
ローズマリー、香酸柑橘果皮
中程度の作用
200μｇ/ml以上500μｇ/ml未満
茶、ニガウリ種子、バジル、レモンバーム、スペアミント、ペパーミント、ステビア
香酸柑橘果皮弱い作用
500μｇ/ml以上1000μｇ/ml未満
ムラサキイモカンショ、茎葉利用カンショ茎・葉、カモミール

HuH-7

強い作用
200μｇ/ml以下
茶、香酸柑橘果皮
中程度の作用
200μｇ/ml以上500μｇ/ml未満
ニガウリ種子、バジル、ローズマリー、レモンバーム、スペアミント、ペパーミント、ステビア
香酸柑橘果皮弱い作用
500μｇ/ml以上1000μｇ/ml未満
茎葉利用カンショ葉・茎、カモミール

89

県産農産物のがん細胞増殖抑制活性

３−３

抗酸化成分の寄与率

抗酸化活性（（DPPH（DPPHラジカル消去活性）
DPPHラジカル消去活性）
ラジカル消去活性）

シソ科ハーブ類５種から検出した抗酸化成分のDPPHラジカル消去活性の寄与率を表２に示す。

茶
シソ科ハーブ類５種

寄与率は，各ハーブの持つDPPHラジカル消去活（ペアミント、ペパーミント
バジル、レモンバーム、ローズマリー） 有色米

性を100%とし，特定した成分がその活性に何％寄与するかを示す値であり，各成分の含有量から算出した。その結果，rosmarinic acidは５種全

マンゴー果皮ニンジン葉ゴボウ、
カラーピーマン
パプリカてのハーブから検出され，その寄与率は10〜35％程度であった。バジルでは，rosmarinicacidとeugenolの寄与率が全体の抗酸化活性の50％を占めた。また，ローズマリーでは，ros-がん細胞（Huh-7,HLE（Huh-7,HLE、Huh-7,HLE、HLF
HLF、HL60
HL60）
増殖抑制活性ステビア
サトイモ皮
ムラサキイモブルーベリー
茎葉利用カンショ葉・茎

トウガラシ種子、
ホウレンソウ、
柑橘未熟果果皮
ニガウリ果肉・ 胎座・ 種子
サトイモ可食部
エンドウ豆、レ タス
ダイコン葉、金金柑未熟果種子
柑未熟

図１ 県産農産物機能性評価結果のまとめ

marinic acidとcarnosic acidが全体の抗酸化活性とほぼ等しい値となったことから，rosmarinic acidおよびcarnosic acidが，ローズマ
リーのDPPHラジカル消去活性本体であることが推測された。
３−４

抗酸化成分のがん細胞増殖抑制活性特定した成分のがん細胞増殖抑制活性を，HL60細胞，肝がん細胞３種（HLE，HLF，HuH-7）を用いて検討した。また，成分のがん細胞増殖抑制活図2-1性に対する寄与を確認するため，eugenolはバジル

DPPH-HPLCオンライン法によるバジル
抗酸化成分の特定（*は抗酸化活性を示すピークであり，1，2，3，4，6は未同定）に，rosmarinic acidはレモンバームに，carnosicacidはローズマリーに含まれる濃度で試験を実施した。その結果，eugenolはいずれの細胞の増殖も抑制しなかったが，rosmarinic acidはHL60細胞の増殖を抑制し，carnosic acidは強弱はあるが全ての細胞の増殖を抑制した。
（図3-1，2，3，4，5）
がん細胞増殖抑制活性の認められたrosmainicacidおよびcarnosic acidは，いずれもポリフェノールに分類される。最近の研究で，ポリフェノールを細胞培養用培地に添加すると，過酸化水素が発生し，それが原因となってがん細胞の増殖が抑制されるという報告がある。４),5),6),7)そこで，発図2-2生していると推測される過酸化水素をカタラーゼ

マリー抗酸化成分の特定（*は抗酸化活性を示すピークであり，1，2は未同定）添加により分解し，rosmarinic acidおよびcarnosic acidのがん細胞増殖抑制活性をIC50を挟む濃度２点で検討した。その結果，カタラーゼ添加により，rosmarinic acidおよびcarnosic acidのHL60細胞増殖抑制作用は阻害されたが，carnosic acidの肝がん細胞増殖抑制作用は阻害されなかった。
（図4-1，2，3，4，5）

90

DPPH-HPLCオンライン法によるローズ表２シソ科ハーブ類抗酸化成分の寄与率（％）

県産農産物のがん細胞増殖抑制活性

120

100

viable cell number (control%)viable cell number (control%)120

レモンバーム抽出物
rosmarinic acid

8060
402010060
4020000

図3-150100150
200
抽出物濃度 μg(extract)/ml

250300rosmarinic acidのHL60増殖抑制活性（rosmarinic acid 濃度左から（10, 20, 40, 80μM））

0

図3-2

100
150
200
抽出物濃度 μg(extract)/ml

250300carnosic acidのHL60増殖抑制活性

160
viable cell number (control%)viable cell number (control%)50(carnosic acid 濃度左から（11.25, 22.5, 45, 90μM))

140120
ローズマリー抽出物
carnosic acid

10080
60
4020140
ローズマリー抽出物
carnosic acid

12010080604020000

図3-3

ローズマリー抽出物
carnosic acid

80

100

200300400
抽出物濃度 μg (extract)/ml

5000600

carnosic acidのHLE増殖抑制活性(carnosic acid 濃度左から（22. 5, 45, 90, 180μM))

図3-4ることが推測された。加えて，肝がん細胞では，carnosic acidが直接肝がん細胞の増殖抑制作用に寄与している可能性が考えられた。

500600carnosic acidのHLF増殖抑制活性

ca120
viable cell number (control%)

発生した過酸化水素の影響で増殖を抑制されてい

200
300
400
抽出物濃度 μg(extract)/ml(carnosic acid 濃度左から（22.5, 45, 90, 180μM))

これより，HL60 細胞は，rosmarinic acidおよびcarnosic acidを培地に添加することにより

100

100

ローズマリー抽出物
carnosic acid80ac6040
200４0まとめ

100200300400
抽出物濃度 μg(extract)/ml

500600

県産農産物のがん細胞増殖抑制活性について検討した結果は以下のとおりであった。

図3-51） 茶，バジル，ローズマリー，ペパーミント，(carnosic acid 濃度左から（22.5, 45, 90, 180μM))

carnosic acidのHuH-7増殖抑制活性

スペアミント，レモンバーム，ステビア，カモ91

県産農産物のがん細胞増殖抑制活性

図4-1

rosmarinic acidのHL60増殖抑制活性

図4-2

carnosic acidのHL60増殖抑制活性

図4-3

carnosic acidのHLE増殖抑制活性

図4-4

carnosic acidのHLF増殖抑制活性

図4-5

carnosic acidのHuH-7増殖抑制活性

ミール，香酸柑橘果皮，ニガウリ種子，茎葉利用カンショ葉・茎は肝がん細胞3種（HLE，HLF，HuH-7）の増殖を抑制した。
2） 抗酸化活性およびがん細胞増殖抑制活性を併せ持つ作物は茶，シソ科ハーブ類５種（バジル， レモンバーム，ローズマリー，ペパーミ
ント，スペアミント，），ステビア，ムラサキカ
ンショ，ブルーベリー可食部であった。
3)

シソ科ハーブ類の抗酸化成分として，バジル
ではeugenol，シソ科ハーブ類５種ではrosma

4)6)

カタラーゼ添加試験の結果，rosmarinic

rinic acid，ローズマリーではcarnosic acid のacid及びcarnosic acidのHL60細胞増殖抑制作３種の化合物を検出した。

用は培地での過酸化水素発生によるものと推測

シソ科ハーブ類５種のDPPHラジカル消去活された。加えて，肝がん細胞では，carnosic性に対するrosmarinic acidの寄与率は，20〜acidが直接肝がん細胞の増殖抑制作用に寄与し30%程度であり，バジルではrosmarinic acidている可能性が推測された。とeugenolが全体の50％を占めた。また，ロー7)

carnosic acidは，抗酸化活性および肝がんズマリーでは，rosmarinic acidとcarnosic acid

細胞増殖抑制活性の両方の機能を有する成分でがDPPHラジカル消去活性本体であることが推あると推測された。

測された。
5)

92

特定した抗酸化成分のうちeugenolはいずれ５

参考文献の細胞の増殖も抑制しなかったが，rosmarinic

1)

柚木崎千鶴子，小村美穂，アショク・クマル

acidはHL60細胞の増殖を抑制し，carnosic・サーカー，岡部玲二，宮崎県工業技術センタ

acid は強弱はあるが実験に用いた全ての細胞のー・宮崎県食品開発センター研究報告，第48増殖を抑制した。

号，P91-98(2003)．

県産農産物のがん細胞増殖抑制活性

2） 小村美穂，柚木崎千鶴子，アショク・クマル
・サーカー，杉下弘之，岡部玲二，宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報
告，第49号，P81-84(2004)．
3） アショク・クマル・サーカー，柚木崎千鶴子，小村美穂，小窪正人，岡部玲二，宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報
告，第49号，P95-101(2004)．
4） Lee Hua Long，Marie Veronique Clement，Barry Halliwell， BBRC， 273， 1， p50-53（2000）
5） Phing Chian Chai，Lee Hua Long，BarryHalliwell
BBRC，304，4，p650-654(2003)
6） 久保田芳美，湯浅（小島）明子，湯浅勲，生活科学研究誌，Vol.2 (2003)
7） Hiroshi Nakagawa，Keiji Hasumi，JeTae Woo，Kazuo Nagai，Masaaki Wachi，Vol25，9，p1567-1574（2004）
8） 新本洋士，食品機能研究法，光琳, 2000，
p.275-278
9） 豊川哲也，鎌田靖弘，山城利枝子，比嘉賢一，
吉田安彦，花城薫．沖縄県工業技術センター研究報告，第3号，2001，p91-95
10）新本洋士，鈴木雅博，木村俊之，山岸賢治．
日本食品科学工学会誌，48，10，p787-790，2001．
11） 江藤公美，岩下恵子，武井利之，八巻幸二，
篠原和毅，小堀真珠子．日本食品科学工学会誌，
49，4，p250-256，2002．

93