拡張一世代繁殖毒性試験の試験法の概要および
海外評価機関における要求状況の調査
勝山真多，齊藤陽子，大森正和独)農林水産消費安全技術センター 農薬検査部

拡張一世代繁殖毒性試験は，OECD で 2011 年 7 月にテストガイドライン（TG）が採択された繁殖毒性を評価するための新規の試験法である．この試験では繁殖毒性だけでなく，発達神経毒性および発達免疫毒性も同一試験で評価することが可能である．また，毒性の程度によって二世代目を作出し，影響を評価する等試験項目を選択することができるという特徴を持っている．従来の手法より試験動物の有効活用（使用動物数の削減）や開発コストの軽減が見込めるため，当該試験を今後農薬登録申請における要求試験とすることについて検討がなされるものと考えられる．当該検討に資するため，OECD から公表されているテストガイ
ドライン 1)をもとにその試験方法を調査したので，概要を紹介する．また，米国および EU における当該試
験の要求・評価状況についての調査も実施したので併せて紹介する．
Keywords：拡張一世代繁殖毒性試験，繁殖毒性，発達神経毒性，発達免疫毒性，OECD TG443，ガイダンス
文書 117，コホート，EPA，EFSA，REACH緒

1． 拡張一世代繁殖毒性試験の試験方法
1．1． 目的言

繁殖毒性試験は主にラットを用いて行われ，妊娠発育期における被験物質暴露の影響を評価するとともに，妊娠および授乳期の雌および出生した児動物への全身毒性の評価に資することができる．また，被験物質が雌雄の生殖器系の健全性および繁殖能（性周期・精子パラメータに対する影響，受胎率，胎児の生存率等）に与える影響についても確認できる．
拡張一世代繁殖毒性試験ではこれらに加え，児動物の一部を用いて，胎児～生後発達期の神経系（脳，拡張一世代繁殖毒性試験（TG443）は，Cooper
等が 2006 年に発表した“ライフステージ試験への段階的アプローチ”を改良したもので，TG は 2011年 7 月に OECD で採択された．本試験は，供試動物数の削減を図り動物愛護に資する試験である．
2016 年に行われた OECD-WNT（Working Group ofthe National Coordinators of the Test Guidelines
Programme）において，将来的に二世代繁殖毒性試
験（TG416）2)を廃止し，拡張一世代繁殖毒性試験に置き換えることが提案されており，この結果によっては「農薬の登録申請に係る試験成績について」（平成 12 年 11 月 24 日付け 12 農産第 8147 号農林水産省農産園芸局長通知）の大幅な見直しが必要となることが見込まれる．
このため，本調査では①拡張一世代繁殖毒性試験の内容，②従来法である二世代繁殖毒性試験との差異および③EU および米国の要求・評価状況を調査し，拡張一世代繁殖毒性試験を導入する際の課題を整理した．

脊髄，末梢神経等）の構造および運動・感覚機能に対する毒性である「発達神経毒性」，同時期の IgM抗体反応等の免疫系に対する毒性である「発達免疫毒性」も同時に評価することが可能である．
1．2． 試験系
1．2．1． 動物種
背景データの充実，一般毒性試験との同等性の観点からラットが推奨されている．性的に成熟した雌雄を用い，雌は未経産・非妊娠とする．

5

1．2．2． 試験群第一世代（F1）

通常，少なくとも 3 段階の用量群と 1 つの対照群を設けなければならない．各群に対し妊娠した母動物 20 匹を得るために，十分な数の雌雄を割り当てる．
適切な用量を選定するため，他試験から得られた投与情報，妊娠または非妊娠動物の体内動態データ，乳汁への移行程度およびヒトでの暴露推定など入手可能な全ての情報を考慮する必要がある．最高
投与量は体内動態において飽和状態にならない用量，もしくは当該動物に死亡や著しい苦痛を与え離乳から成熟まで被験物質を投与する．第二世代（F2）を評価する場合は，F2 の離乳まで，または試験の終了まで投与を継続する．
投与スケジュールを図 1 に示す．
1．2．4． 交配，出生児の調整
P 世代の雌は同じ投与群から無作為に選択された血縁のない単独の雄と共に，交尾の証拠（膣栓あるいは精子）が見られるまで，あるいは 2 週間が経過するまで同居させる．

ず，いくらかの全身毒性を引き起こす用量を選択す
る．

F1 は出生より 4 日後，それぞれの同腹児の数を，雌雄各 5 匹に近づくよう，過剰な児動物を無作為に1．2．3． 投与
投与期間中は毎日混餌（混水）または強制経口投与により被験物質を投与する．

選択して除外することで調整する．
1．2．5． コホートへの割付け選抜した F1 は離乳時に，特定のサブグループ（コ親世代（P）両性に対して 2 週間の交配前投与が求められホート 1～3）に割付け，各種検討を行う（詳細は後述）．

る．この期間は雌では 3~4 回の発情周期，雄では精巣上体上での成熟精子の移動に必要な時間

1．2．6． 試験項目の選択に等しく，性周期への影響および精子形成障害を検出することができる．

規制当局の要求や被験物質に関する既知の情報をもとに F2 の評価を行うかどうか，発達神経毒性

交配前投与，交配期間 2 週間を経て，雄には第一世代（F1）の離乳まで（投与開始から最低コホートや発達免疫毒性コホートを省略するかどうかを決定する．

10 週間），雌には妊娠，哺育を経て F1 の離乳まで（投与開始から 8~10 週間）投与を継続する．

F1 までの評価結果から F2 評価を行うかどうかをどのように判断するかについては，米国およびカナダにおける運用をもとに作成された別のガイダンス文書 1173)に記載されている（後述）．
剖検P 動物

投与
交配前期間

交配期間

P♂

2 週間

2 週間

P♀

2 週間

2 週間

交配後期間
6 週間
F1妊娠

授乳期

子宮内発生

離乳前

図 1． 投与スケジュール

6離乳後

1．3． 離乳後試験のための児動物の振り分け
離乳時に選抜された F1 を無作為にコホート 1 から3 に振り分ける．

コホート 2B（10 匹／性／群）：離乳時神経病理組
織学的評価用．匹数が足りない場合

コホート 1（1A および 1B）：繁殖毒性試験

2A を優先．
コホート 3（10 匹／性／群）： T 細胞依存性抗体

コホート 2（2A および 2B）：発達神経毒性試験
コホート 3：発達免疫毒性試験

産生検査（TDAR）用．陽性対照のため，対照群から追加の児動物が必要な場合がある．
各コホートの概要を表 1 に示す．

コホート 1A（20 匹／性／群）：生殖器官への影響，一般毒性の評価用．最優先で振り分ける．

すべてのコホートに供給するだけの同腹中の児

コホート 1B（20 匹／性／群）：必要な場合，F2作出に用いる．繁殖毒性/内分泌毒性

動物数が不十分な場合には，コホート 1 が優先する．被験物質に神経毒性，免疫毒性または繁殖毒性の疑いがある場合またはコホート 1Aの結果があいまいな場合に追加の病の疑いがある場合など，特別な懸念がある場合は追加の児動物をどのコホートに振り分けてもよい．こ理組織学的データを得るのにも使用する．

れらの児動物は別の時点での検査に用いるか，または補足の評価指標の評価に用いてもよい．

コホート 2A（10 匹／性／群）：神経行動学的/神経病理組織学的評価用．

コホートに振り分けられなかった児動物は血液生化学的検査および剖検にあてられる．

表 1． 各コホートへの振り分け
親世代

コホート

用途

動物数/群

剖検時のおおよその週齢

性的成熟

1A

繁殖毒性

雌雄各 20 匹

13済

1B

繁殖毒性

雌雄各 20 匹

14（F2 の評価を実施する場合 20~25）

済

母動物

2A

神経毒性

雌雄各 10 匹

11~12済20 匹/群2B

神経毒性

雌雄各 10 匹

3未3

免疫毒性

雌雄各 10 匹

8済余剰

予備3未1．4． 第二世代（F2）評価実施に関する判断基準（ガイダンス文書 117）
ガイダンス文書 117 は F2 の評価が必要かどうかについて米国（米国 EPA 農薬プログラム部）およびカナダの規制当局（病害虫等管理規制庁）の判断基準を示したものである．米国およびカナダが作成し， OECD-WNT で承認された後，拡張一世代繁殖毒性試験と同時に公開された．表 2 に判断基準の概要を示す．

表 2． F2 評価を推奨する基準
評価エンドポイント

F2 評価が推奨される場合

成体
P 受胎率
(着床，妊娠率，妊娠間隔)

受胎率の低下が見られるものの，それに付随した生物学的に関連性のある変化や用量依存性の変化が生殖組織に見られない場合

F1 発情周期評価

発情周期の長さに生物学的に関連性のある変化や用量依存性の変化が見られ，母動物に強い毒性が見られない場合 a7

幼体
F1 同腹児パラメータ(同腹児の大きさ)

生物学的関連性および用量依存性の低下が見られ，母動物に強い毒性または致死性が見られない場合 aF1 発達標識
体重変化の影響ではない生物学的関連性および用量依存性の作用が見(AGD，乳頭保持率，性成熟，PPS， られる場合VO)
F1 出生後生存率低下

母動物に強い毒性が見られない場合 a

F1 奇形

母動物に強い毒性が見られない場合 a

F1 出生指数低下

母動物に強い毒性が見られない場合 a

F1 体重低下

生物学的関連性のある低下であり，母動物に体重減少が見られない場合

a 作用の種類，発生率，規模および重大性は，母動物の毒性と関連付けて考慮される．
2． 二世代繁殖毒性試験との比較
拡張一世代繁殖毒性試験の繁殖毒性試験部分と，既存の二世代繁殖毒性試験を比較した．

F2 世代：13 匹／腹×20 腹×4 群 誕生
生後 4 日に雌雄各 5 匹／腹に調整（任意）生後 21 日に離乳，剖検
使用動物計 2240 匹

2．1． 動物数交配させた全ての雌が妊娠し，13 匹の児動物（F1）を産むと仮定する（実際はより多くの動物数が必要）．

③二世代繁殖毒性試験
P 世代：雌雄各 20 匹×4 群（同時対照群＋3 段階用量群）
F1 世代：13 匹／腹×20 腹×4 群 誕生
生後 4 日に雌雄各 8 匹／腹に調整（任意）生後 21 日に離乳 雄 1 匹と雌 1 匹／腹（雌雄各 20 匹）×4 群→F2 作出①拡張一世代繁殖毒性試験（一世代繁殖）
P 世代：雌雄各 20 匹×4 群（同時対照群＋3 段階用量群）
F1 世代：13 匹／腹×20 腹×4 群 誕生
生後 4 日に雌雄各 5 匹／腹に調整（任意）生後 21 日に離乳，調整後各コホートに振り分ける
コホート 1A：雄 1 匹と雌 1 匹／腹（雌雄各 20 匹）×4 群
コホート 1B：雄 1 匹と雌 1 匹／腹（雌雄各 20 匹）×4 群
使用動物計 1200 匹

F2 世代：13 匹／腹×20 腹×4 群 誕生
生後 4 日に雌雄各 8 匹／腹に調整（任意）生後 21 日に離乳，剖検
使用動物計 2240 匹
繁殖毒性試験に限れば拡張一世代繁殖毒性試験
で二世代にわたって評価する場合と従来の二世代繁殖毒性試験で使用する動物数は同等である．一方，毒性が低く，二世代目を評価する必要がない場合や
発達神経毒性試験および発達免疫毒性試験を実施する必要がある場合には，拡張一世代繁殖毒性試験を選択することで，使用動物数およびコストを抑え②拡張一世代繁殖毒性試験（二世代繁殖）
P 世代：雌雄各 20 匹×4 群（同時対照群＋3 段階用量群）
F1 世代：13 匹／腹×20 腹×4 群 誕生
生後 4 日に雌雄各 5 匹／腹に調整（任意）生後 21 日に離乳，調整後各コホートに振り分ける
コホート 1A：雄 1 匹と雌 1 匹／腹（雌雄各 20 匹）×4 群
コホート 1B：雄 1 匹と雌 1 匹／腹（雌雄各 20 匹）×4 群→F2 作出

ることができる．
2．2． 試験期間
両試験において二世代繁殖を行う場合，P 世代交配後の期間に差はない．しかし，交配前投与期間は二世代繁殖毒性試験では 10 週間と定めているのに対し，拡張一世代繁殖毒性試験では 2 週間と定めていることから，拡張一世代繁殖毒性試験のほうが投与期間を短くすることができる．

82．3． 評価項目
両試験ガイドラインで要求されている一般毒性および/繁殖毒性に関わる評価項目を以下に示す．
①拡張一世代繁殖毒性試験

上記のように一般毒性および/繁殖毒性に関しては，評価項目はほぼ同じである．拡張一世代繁殖毒性試験では二世代繁殖毒性試験に加え，血液学的/P 世代：一般状態，体重，摂餌量，性周期，血液学的検査/血液生化学的検査，尿検査，精子パラメータ，肉眼的病理検査，着床痕，器官重量（生殖器官，脳，肝臓 etc.），病理組織学的検査（生殖器官，標的器官）
F1 世代（親/児）：一般状態，体重，摂餌量，母動物ごとの産児数，性，生存/死亡児数，肉眼的異常，肛門・生殖結節間距
離，性成熟（膣開口・包皮分離），性周期，血液学的検査/血液生化学的検査，尿検査，精子パラメータ，肉眼的病理

血液生化学的検査や尿検査などが追加で求められている．F2 の具体的な評価項目に関しては定められていない．
3． 海外の試験要求および評価状況
3．1． 試験要求状況①EPA（米国）
連 邦 規 則 集 （ CFR Title 40, Chapter 1,Part158）4)では二世代繁殖毒性試験および発達神経毒性試験が要求試験としてリストアップされており，それぞれのテストガイドラインが 公 開 さ れ て い る （ OPPTS 870.38005 ） ,870.63006)）．また，同規則集において発達神経毒性試験は繁殖毒性試験と組み合わせることが推奨されている．
一方，拡張一世代繁殖毒性試験はリストアップされておらず，テストガイドラインも公開されていない．しかし，通常の二世代繁殖毒性試験ガイドラインに従うか，拡張ガイドラインもしくは代替法を採用するかについては被験物質の情報をもとに決定されるという

検査，
（着床痕）
，器官重量（生殖器官，脳，肝臓 etc.），病理組織学的検査（生殖器官，標的器官）（F2 世代）：体重，母動物ごとの産児数，性，生存/死亡児数，肉眼的異常，肛門・生殖結節間距離②二世代繁殖毒性試験
P 世代：一般状態，体重，摂餌量，性周期，精子パラメータ，肉眼的病理検査，着床痕，器官重量（生殖器官，脳，肝臓etc.），病理組織学的検査（生殖器官，標的器官）

注釈がついており，試験開始前に試験プロトコルと科学的根拠を提出すれば代替法で行うことも可能とされている．
拡張一世代繁殖毒性試験において二世代目を作出する基準（ガイダンス文書 117）が存在することから，当該試験はこの代替法の一つと考えられ，実施にあたっては具体的な試験方法（試験プロトコル）について EPA と事前協議がなされると考えられる．

F1 世代（親）：一般状態，体重，摂餌量，性周期，精子パラメータ，肉眼的病理検
査，着床痕，器官重量（生殖器官，脳，肝臓 etc.），病理組織学的検査（生殖器官，標的器官）
F1 世代（児）：母動物ごとの産児数，性，生存/死亡児数，肉眼的異常，体重，身体的・行動異常，性成熟（膣開口・包皮分離），機能検査，肉眼的病理検査，器官重量（脳，脾臓，胸腺），病理組織学的検査（肉眼的異常組織，標的器官）
F2 世代：母動物ごとの産児数，性，生存/死②EFSA（EU）委員会規則（EU）No 283/20137)8)によると農亡児数，肉眼的異常，体重，身体的・行動異常，機能検査，（肛門・生殖結節間距離），肉眼的病理検査，器官重量（脳，脾臓，胸腺），病理組織学的検査（肉眼的異常組織，標的器官）

9

薬では少なくとも二世代以上のラットにおける繁殖毒性試験が要求されており，OECD の二世代繁殖毒性試験を基にしたテストガイド
ラインが公開されている（Regulation(EC)No440/20089））．また，拡張一世代繁殖毒性試験についても代替法として言及されている．
化学物質全般の管理について定めた
REACH（Registration, Evaluation, Authorisation

and Restriction of Chemicals）では，動物愛護等の観点から拡張一世代試験が推奨されている
10)．被験物質の暴露量，他試験から得られた情報および F1 での結果を受け，F2 の評価を申求や既存情報を反映することで決定される．
これについて，米国ではガイダンス文書 117のような基準を設け，EPA が判断している．
我が国では登録・検査は農林水産省・FAMIC，リスク評価は食品安全委員会が行っているた請者が提案もしくは ECHA（欧州化学機関：
European Chemicals Agency）から申請者に求めることとされている．

め，試験項目の選択に係る運用について関係機関との協議が必要と考えられる．
おわりに

3．2． 評価状況
近年我が国で登録となった農薬原体 50 成分について，EPA および EFSA での評価状況を調査した．
その結果，EPA では 24 成分，EFSA では 26 成分で評価がなされていたが，拡張一世代繁殖毒性試験の実施例については確認できなかった．
このことから，農薬分野において拡張一世代繁殖毒性試験の二世代繁殖毒性試験代替法としての利拡張一世代繁殖毒性試験の特徴として，大きく以下の二点が挙げられる．
①F1 を 3 種のコホートに分けることで，繁殖毒性，発達神経毒性，発達免疫毒性をまとめて評価することができる．
②繁殖毒性における F2 評価，発達神経毒性試
験，発達免疫毒性試験の実施は規制当局の要請や既存情報により実施するかどうか選択することができる．
F2 評価を実施しない場合，発達神経毒性試験，発達免疫毒性試験を別に実施する場合において，当該試験は従来の二世代繁殖毒性試験と比較して使用動物数を抑えることができる．

用は進んでいないといえる．
4． 導入における課題①第二世代（F2）への影響に関する情報が得られなくなることについて
拡張一世代繁殖毒性試験において F2 評価を実施する場合は，既存の二世代繁殖毒性試験と得られる情報は大きく異ならないが，F2 評

米国や EU では農薬に関しては原則二世代繁殖毒性試験を要求試験としており，拡張一世代繁殖毒性試験は要求試験ではなく，また，評価事例は確認出来なかった．ただし，米国および EU では二世代繁殖毒性試験の代替法として認められている．
本稿は現在の要求試験である二世代繁殖毒性試
験に代わるとされる拡張一世代繁殖毒性試験について，OECD のテストガイドライン等をもとに，当該試験の内容，従来法との比較，海外における要求および評価事例を調査し，導入における課題を取りまとめたものである．当該試験について代替法としての導入を検討する際に参考となることを期待す

価を行わない場合，F2 への影響に関する情報は得られなくなる．このため，本試験を導入した場合，農薬の繁殖毒性を評価する上で十分な情報が得られるかについて，第二世代の実施に関する基準も含めて，評価機関等との十分な協議が必要と考える．
②発達神経毒性試験および発達免疫毒性試験について
拡張一世代繁殖毒性試験には発達神経毒性試験および発達免疫毒性試験が含まれているが，現行の国内ガイドラインでは，これらのる．
参考文献試験は要求していない．拡張一世代繁殖毒性試験の導入に際しては，発達神経毒性試験お（全 URL のリンクについての確認は，2017 年 7 月 21 日に実施．
）

よび発達免疫毒性試験の要否に関しても併せて検討する必要がある

1)③試験の円滑な実施について
拡張一世代繁殖毒性試験では F2 を評価する
か，発達神経毒性コホート，発達免疫毒性コホートを省略するかについては規制当局の要10OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF
CHEMICALS
Test
No.443:Extended
One-Generation Reproductive Toxicity Study(2012 OECD)
http://www.oecd-ilibrary.org/docserver/download/
9712211e.pdf?expires=1500597968&id=id&accn
ame=guest&checksum=BF4E827367CC535C163
040D06B00C964

2)

3)

4)

5)

6)

7)

8)

9)

OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF
CHEMICALS Test No.416: Two-Generation
Reproduction Toxicity Study (2001 OECD)
http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/43965
303.pdf
GUIDANCE DOCUMENT 117 ON THE
CURRENT
IMPLEMENTATIONOFINTERNAL TRIGGERS IN TEST GUIDELINE
443 FOR AN EXTENDED ONE GENERATIONREPRODUCTIVETOXICITY STUDY， IN THE
UNITED STATES AND CANADA (2011 OECD)
http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisp
laydocumentpdf/?cote=ENV/JM/MONO(2011)21&docLanguage=En
CODE OF FEDERAL REGULATIONS, Title40,Chapter 1, PART 158-DATA REQUIREMENTS
FOR PESTICIDES(2007 Office of the FederalRegister)
https://www.ecfr.gov/cgi-bin/text-idx?SID=1f3e01
c0f6084c1db4047eee1828c05d&mc=true&node=
pt40.26.158&rgn=div5#se40.26.158_133
Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.3800
Reproduction and Fertility Effects (1998 EPA)
https://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/suppdocs/feddocs/epa/epa_870_3800.pdf
Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.6300
Developmental Neurotoxicity Study (1998 EPA)
https://nepis.epa.gov/Exe/ZyPDF.cgi/P100G6UI.P
DF?Dockey=P100G6UI.PDF
COMMISSION REGULATION (EU) No
283/2013 of 1 March 2013 setting out the datarequirements for active substances, in accordancewith Regulation (EC) No 1107/2009 of theEuropean Parliament and of the Council
concerning the placing of plant protection
products on the market
http://www.reach-compliance.eu/web/english/legi
slations/EU/pesticides/docs/EC-283-2013.pdf
Commission Communication in the framework ofthe implementation of Commission Regulation(EU) No 283/2013 of 1 March 2013 setting out
the data requirements for active substances, inaccordance with Regulation (EC) No 1107/2009of the European Parliament and of the Council
concerning the placing of plant protection
products on the market
http://ctgb.nl/docs/default-source/gewas.-toetsings
kader/evaluation-manual-ppp-1107-2.0/commission_communication_2013_c95_01-data-requiremen
ts-for-plant-protection-products.pdf?sfvrsn=2
COUNCIL REGULATION (EC) No 440/2008 of30 May 2008 laying down test methods pursuantto Regulation (EC) No 1907/2006 of the EuropeanParliament and of the Council on the Registration，Evaluation, Authorisation and Restriction ofChemicals (REACH)
http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/PD

11F/?uri=CELEX:32008R0440&qid=150059659240
2&from=EN
10) COMMISSION REGULATION (EU) 2015/282
of 20 February 2015 amending Annexes VIII, IX
and X to Regulation (EC) No 1907/2006 of theEuropean Parliament and of the Council on theRegistration, Evaluation, Authorisation andRestriction of Chemicals (REACH) as regards the
Extended One-Generation Reproductive Toxicity
Study
http://www.cea.adas.co.uk/Portals/0/EOGRTS%2
0Regulation%20EU%202015_282.pdf