技術レポート
残留農薬分析業務における分析法の検討１（イプロジオンとその代謝物を LC/MS による一斉試験法に追加することの妥当性検証）
安本明弘１, 加藤直樹１, 中村圭介１, 佐々木秀幸２, 中山祐輔３, 鈴木徹也４
山田篤司４, 青山吉一５, 大谷有二６, 葛原茂広７, 臼井裕一７

イプロジオンとその代謝物について,厚生労働省の LC/MS による農薬等の一斉試験法Ⅰ（農産物）の最終試験液をメタノールからアセトニトリルに変更した試験法が導入可能か,各試験室においてシングルラボラトリーバリデーションを行い,妥当性が確認されたことから導入できると考えられた.
・FAMIC 仙台センター 農薬実態調査課（以下「仙台」という.）・FAMIC 本部横浜事務所 農薬実態調査課（以下「横浜」という.）・FAMIC 名古屋センター 農薬実態調査課（以下「名古屋」という.）・FAMIC 神戸センター 農薬実態調査課（以下「神戸」という.）

緒 言
イプロジオンはジカルボキシイミド系の殺菌剤で幅広く農作物に使用されている.イプロジオンとその代謝物(以下「イプロジオン等」という.）は，最終試験液にメタノールを使用する厚生労働省の LC/MS による農薬等の一斉試験法Ⅰ（農産物）１)（以下「通知一斉試験法」という.）で分析可能とされている.しかし, 農
薬実態調査課では,通知一斉試験法による分析において，添加回収率が 70％を満たさず,妥当性が確認できなかった. イプロジオンはメタノール中で分解するとの報告２）,３）もあり,最終試験溶液がアセトニトリルの個別試験法４）で対応している.
平成 24 年度,全国の農薬実態調査課では 110 検体について個別試験法で分析を行った.個別試験法は通知一斉試験法に比べると操作が煩雑で多くの時間を要することから,イプロジオン等の分析を通知一斉試験法に組み入れることが可能であるならば，分析業務について,かなりの効率化が見込まれる.
そこで，最終試験液の溶媒としてアセトニトリルを追加した通知一斉試験法の改良法によるイプロジオン等の分析について,妥当性を検証したので報告する.

2．試料および添加濃度
試料は,「平成 24 年度 国内産農産物における農薬の使用状況及び残留状況調査」５）による農薬使用履歴データより,イプロジオンの使用頻度の高い農産物であるなす,ねぎおよびメロンを選択した.
添加回収用試料および添加標準溶液は,各試験室がそれぞれ調製したものを用いた.
各試験室の試料および添加濃度は,表 1 のとおり.
表 1．各試験室が調製した試料およびイプロジオン等の添加濃度
添加濃度（ppm）
試験室
試料
高濃度 低濃度材料および方法
1．検証を行った試験室
以下の 5 つの試験室で検証を行った.
・（独）農林水産消費安全技術センター（以下「FAMIC」という.）農薬検査部農薬実態調査課（以下「小平」という.）
１２
３４５６７

メロン

0.50.05ねぎ

0.20.02

仙台,神戸

メロン,ねぎ0.50.05

横浜,名古屋メロン,なす0.50.05小平

独立行政法人農林水産消費技術センター農薬検査部
独立行政法人農林水産消費技術センター仙台センター,現 農薬検査部
独立行政法人農林水産消費技術センター仙台センター,現 表示監視部
独立行政法人農林水産消費技術センター本部横浜事務所
独立行政法人農林水産消費技術センター名古屋センター,現 神戸センター
独立行政法人農林水産消費技術センター名古屋センター,現 横浜事務所
独立行政法人農林水産消費技術センター神戸センター733．試薬等
イプロジオンおよびイプロジオン代謝物はDr.Ehrenstorfer 社製の農薬分析用標準品を使用した．
抽出,精製過程の有機溶媒は,残留農薬試験用を使用した.LC/MS の移動相のメタノールは,LC/MS 用を使用した.
その他試薬は,残留農薬試験用または特級を使用した.
グラファイトカーボン/アミノプロピルシリル化
シリカゲル積層ミニカラム（500 mg/500 mg）
は,SIGMA-ALDRICH 社製の SUPELCO Supelclean
ENVI-Carb/NH2 6 mL SPE Tube を使用した.

5．測定条件LC/MS の条件を表 2 に示した.
表 2．LC/MS 条件
LC conditions
ColumnODS ( i.d.×length, particle size )2.1mm×100mm, 3µm

4．前処理方法
前処理方法は通知一斉試験法の最終試験液をメタノールからアセトニトリルに変更し,アセトニトリル溶解時の希釈率を通知一斉試験法より 10 倍高くした方法とした.
4．1． 抽出試料 20.0 g を量り採り,表 1 に示した添加濃度になるように調製した標準溶液を 1 mL 加えた.これにアセトニトリル 50 mL を加え,ワーリングブレンダ
ー型またはポリトロン型ホモジナイザーを使用しホモジナイズした後,吸引ろ過した．ろ紙上の残留物にアセトニトリル 20 mL を加え、同様にホモジナイズした後,吸引ろ過した.得られたろ液を合わせ,アセトニトリルを加えて正確に 100 mL とした.
抽出液 20 mL を採り,塩化ナトリウム 10 g および0.5 mol/L リン酸緩衝液（pH7.0）20 mL を加え,振とうした.静置後,分離した水層を捨て,アセトニトリル層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した.無水硫酸ナトリウムをろ別した後,ろ液を 40℃以下で減圧濃縮し,溶媒を留去した.残留物をアセトニト
リル：トルエン（3:1）混液 2 mL で溶解した.
4．2． 精製
アセトニトリル：トルエン（3:1）混液 10 mL でコンディショニング済みのグラファイトカーボン/アミノプロピルシリル化シリカゲル積層ミニカラムに４．１で得られた溶液を負荷した.次にアセトニトリル：トルエン（3:1）混液 20 mL で溶出し,全溶出液を 40℃以下で１mL 以下に減圧濃縮した.これにアセトン 10 mL を加えて 40℃以下で１mL 以下に減圧濃縮し,再度アセトン 5 mL を加えて減圧濃縮し,溶媒を留去した.残留物をリン酸トリフェニル 1µg/mL を含むアセトン：ｎ-ヘキサン(1:1)混液で溶解し,正確に 1 mL とした.
この試験溶液 0.125 mL をマイクロピペットで量り採り,窒素ガスを穏やかに吹き付けて溶媒を留去した．残留物をアセトニトリルで溶解し,精確に 5mL とした.これをメンブレンフィルター(0.45 µm 以下)でろ過し,LC/MS 用試験溶液とした.

Column temp.

40℃

Injection volume2 µL

Solvent A

aq. 5mmol/L ammonium acetate

Solvent B

MeOH.
5mmol/L ammonium acetate

Gradient profile

Solvent A %Solvent B %085

150.6760

402.33604045050

5.33

4555

11.67

595

16.5

595

2085

15Time (min.)Flow rate

0.2 mL/min

MS conditions
Ionization

ESI negative mode

DateSIMacquisition mode
Monitor ion
Iprodionem/z 243 (Quantitative)
m/z 245 (Qualifier)Iprodion metabolite

m/z 328 (Quantitative)
m/z 330 (Qualifier)6．試験法の妥当性評価方法
厚生労働省の「食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドライン」６）（以下「ガイドライン」という.）に基づき,1 の各試験室において単一試験室による妥当性確認を行った.
農産物ごとに,試験対象である農薬を含まない試料（ブランク試料）に試験対象の農薬を添加した試料（添加試料）を試験法に従って試験し,その結果から以下の 6.1-4 に示した性能パラメータを求め,

74

それぞれの目標値（表 3）等に適合していることを確認した.
試験はガイドラインの枝分かれ実験計画（併行条
件=2,室内再現条件=5）に従い行った.

2．室間再現精度
小平,仙台,横浜,名古屋および神戸の室間再現精度について,メロンの添加回収試験の結果より調査した（単一試験室妥当性確認に用いた各試験室におけるすべてのデータを併行データとした.）結果を
表 9 にまとめた.
HORRAT 値７）を算出した結果，イプロジオンの高濃度添加では 0.33,低濃度添加では 0.59,代謝物では高濃度添加では 0.29,低濃度添加では 0.53 と 2を下回っており，本手法は FAMIC 農薬実態調査課において十分な精度を持つことが確認された．

6．1． 選択性
ブランク試料を試験法に従って試験を行い,定量を妨害するピークの有無を確認した.
6．2． 真度（回収率）
添加試料 10 検体を試験法に従って試験を行い,得られた試験結果の平均値の添加濃度に対する比を求めた.
6．3． 精度
添加試料の試験を繰り返し,得られた試験結果の標準偏差および相対標準偏差を求め,併行精度および複数の分析者または分析日による室内精度を評価した.
6．4． 定量限界
標準溶液を機器分析したクロマトグラムのピー
クとノイズから S/N=10 相当の濃度を定量限界とした。

おわりにすべての試験室,農産物において,単一試験室での妥当性評価の性能パラメータが，それぞれの目標値等に適合していることを確認した.
以上の結果から,検証を行ったすべての試験室において,イプロジオン等について最終試験液をアセトニトリルに変更した一斉試験法の改良法を導入できると考えられた.
引用文献
１）http://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/iyaku/syoku-anzen/zanryu3/3-002.html(2014 年 10 月 30 日閲覧)
２）A. K. M. Anisuzzaman, T. Storehalder,
D. C. Williams, N. Ogg, T. D. Kilbourne,
J. J. Samuel, C. E. Cottrell,
J. Agric.Food Chem.,56,pp.502-506(2008)３）織田哲郎,新家薫子,相川恵子,四尾秋寿
石川県保健環境センター研究報告,45,32-42(2008)
４）http://www.mhlw.go.jp/topics/ bukyoku/iyaku/syoku-anzen/zanryu3/2-020.html(2014 年 10 月 30 日閲覧)
５）http://www.maff.go.jp/j/press/ syouan/nouyaku/140716_1. html
（2014 年 10 月 30 日閲覧）
６）http://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/
iyaku/syoku-anzen/zanryu2/dl/101224-1.pdf(2014 年 10 月 30 日閲覧)
７）AOAC Inc.(2005).Appendix D : Guidelines for
Collaborative Study Procedures to Validate
Characteristics of a Method of Analysis. In Official
Methods of Analysis of AOAC Int.18ed.
Gaithersburg,MD,USA

結果および考察
通知一斉試験法の最終試験液をメタノールからアセトニトリルに変更した結果,添加回収率が 70％を下回ることはなかった.また,最終試験液を 10 倍希釈したことにより LC/MS 分析でのキャリーオーバーの影響がなくなった.
1．妥当性評価の結果
1．1． 選択性
ブランク試料について試験を行ったところ,すべての試験室において, いずれの試料でもイプロジオン等の定量を妨害するピークは認められず,選択性に問題がないことを確認した.
1．2． 真度（回収率）および精度すべての試験室で,真度（回収率）および精度（併行精度および室内精度）は,いずれの試料でもガイドラインに示された目標値を満たしていた.表 4-8に各試験室の結果をまとめた（表 4：小平, 表 5：仙台, 表 6：横浜, 表 7：名古屋, 表 8：神戸）.
1．3． 定量限界
定量限界は通知法に示された 0.01ppm よりもすべての試験室で低かった.

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表 3．単一試験室妥当性確認の真度,併行精度および室内精度の目標値
Spike level (ppm)

Recovery %RSDr %RSDR %

0.01＜～≦0.1

70 ～ 120

15 ＞

20 ＞

0.1＜70 ～ 120

10 ＞

15 ＞

表 4．小平における真度,併行精度および室内精度
SamplePesticide

MelonGreenonion

Recovery %RSDrn=10%

RSDR %

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Iprodione
Iprodione metabollite

101.7
101.5

99.3
102.0

5.4
4.0

9.9
6.1

8.9
6.3

7.9
5.7

Iprodione
Iprodione metabollite

91.0
83.5

80.3
81.8

8.1
5.3

2.2
3.2

13.3
9.9

4.9
5.4

表 5．仙台における真度,併行精度および室内精度
SamplePesticide

Recovery %RSDrn=10%

RSDR %

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Melon

Iprodione
Iprodione metabollite

106.6
106.2

115.5
113.8

3.1
4.5

2.0
1.6

5.3
8.2

2.2
2.2

Greenonion

Iprodione
Iprodione metabollite

78.4
85.4

74.9
84.4

8.8
3.6

2.2
3.8

8.8
10.4

3.5
4.5

表 6．横浜における真度,併行精度および室内精度
Samplepesticide

Recovery %

RSDr

n=10%

RSDR %

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Melon

Iprodione
Iprodione metabollite

108.0
106.2

92.1
94.6

4.03.4

3.4
4.2

4.5
3.9

3.7
5.4

Eggeplant

Iprodione
Iprodione metabollite

102.4
105.8

94.2
104.6

9.0
6.4

3.3
3.3

9.0
7.4

4.4
5.7

表 7．名古屋における真度,併行精度および室内精度
SamplePesticide

Recovery %

RSDr

n=10%

RSDR %

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Melon

Iprodione
Iprodione metabollite

103.8
103.6

95.9
99.3

4.7
2.5

2.4
2.1

4.7
3.4

2.4
2.4

Eggeplant

Iprodione
Iprodione metabollite

102.5
109.2

99.4
99.7

3.0
0.8

1.2
2.0

3.33.63.6
3.576

表 8．神戸における真度,併行精度および室内精度
SampleRecovery %Pesticide

RSDrn=10%

RSDR %

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Low conc.

High conc.

Melon

Iprodione
Iprodione metabollite

93.9
94.7

94.3
97.7

4.1
4.8

4.8
2.9

5.5
4.8

6.0
6.6

Greenonion

Iprodione
Iprodione metabollite

93.2
86.9

91.3
93.3

2.8
6.8

6.2
5.4

8.2
9.3

6.6
7.5

RSDr %RSDR %PRSDR %

HORRAT

5.8
4.8

8.3
10.5

25.1
17.8

0.33
0.59

5.6
4.8

7.3
9.3

25.117.6

0.290.53

表 9． FAMIC における真度,併行精度および室間再現精度
Spike level
Mean level
Pesticide
Recovery %
(ppm)
(ppm)
0.05
0.0508
101.6
Iprodione
0.5
0.496
99.2
Iprodion
metabolite

0.05
0.5

0.05070.510

101.4
102.077