博士（水産科学）洪磊

学位論文題名Immunochemical and molecular biological studies ofchoriogenininred lipmullet（く1ノhel07zhae7natocheilus)（ メナ ダ の コリオ ジェニン に関する免 疫生化学 的および 分子生物 学的研究 ）学位論文内容の要旨
内 分 泌か く 乱 化学 物 質 (EndocrineDisruptingChemicals:EDCs)は、生体 内の内分泌因 子と類似 した作用 を顕すこと 、もしく はその作 用を阻害 すること により、生体の内分泌機 能をかく 乱する物 質群である 。これら EDCsは河川を 含む広域 な環境中に混入し、ヒトを 含めた野 生生物に深 刻な影響 を及ばす 可能性が ある。生 物の生体反応を用いてその応答性を評 価する手 法（バイ オアッセイ ）は、未 確認な化 学物質に 起因する 環境汚染を調査する際に大 変有効な手 段となる 。一般に 卵生脊椎 動物の卵 黄蛋白前駆物質であるビテロジェニ ン(Vg)お よ ぴ卵 膜 蛋 白前 駆 物質 で あ るコ リ オジ ェ ニ ン(Chg)は、 工スト ロジェン 感受性の 雌特異蛋 白質とし て知られる 。これら の蛋白質 は外因性 のエストロジェン暴露によっても産 生される ことから、 エストロ ジェン様 活性を持 つEDCs（環境 エストロジェン）のバイオアッ セイにお ける生物指標分子（バイオマーカー）として利用される。
メナダ （Chelonhaematocheilus)
は生息域が広く、主に底性のデトライタスを索餌するこ とから底質 の影響を 受けやす いため、 環境エス トロジェ ン調査の対象魚種とされている。 しかし、本 種のバイ オマーカ ーに関す る基礎的な性状解析例は非常に少なく、特にChgに関する 報告はこれ までにな い。さら に近年の 研究によ り、多く の魚類でこれらバイオマーカ ーには分 子多型性が 確認され ているが 、メナダ における 知見はな い。多型性を考慮したバイオ マーカーの 性状解析 を進める ことは、 本種を用 いた正確 で実用的なバイオアッセイ の確立に 必要不可欠 である。 本研究で は、メナ ダを用い た実用的 な環境エストロジェン― 937ー

のバイ オアッセ イ系の確立 を目的と して、そ の基礎と なるバイ オマーカ ーの詳細な性状解析を、 主に免疫 生化学と 分子生物学的手法を用いて行い以下の知見を得た。
メナダ にエストラ ジオール 一17ロ（E2)を 投与し、その血清から種々のクロマトグラフ
イー を 用い て 2種 類 のChgを 精製 し た 。精 製 品の イ ン タク ト 分子 量 は ゲル 濾過 で215kDa
および69kDaで あり、その 他SDS―PAGEでの 分子量・アミノ酸組成・抗原性等の解析から、前 者 を 本 種 の ChgHサ ブ タ イプ 、 後者 を ChgLサ ブタ イ プと 同 定 した 。 また 、 各 々を 家 兎に 免疫 し 、 ChgHに対 する特異 抗体(anti―ChgH）お よぴChgLに対 する特異 抗体(anti―ChgL）を作 製した。 一方、近縁 種のポラ で作製し たサブタイプ特異抗体を用い、メナダ血清にお い て 抗 原 性 と 分子 量 の異 な る 3種 のVgサブ タ イ プ(VgA， VgB，VgC)を 同 定 し、 こ のうち 特にVgBサブタ イプを精 製し、そ の特異抗体を作製した。
エス トロジェン 処理を行 ったメナ ダの肝臓 から3種類 の完全長 ChgcDNA(ChgHl、Chg
H2、 ChgL） と2種類 の Vg (VgA，VgB)cDNA断 片 を 単離 し た。 メ ナ ダの Vg遺伝子サ ブタイプをボ ラのそれら と同様に 分類し、 その相同 性と上記 の抗原性 を併せて考慮した結果、メナ ダ のVgBcDNAは 本 種の 主 要な Vgであ る VgB蛋白 を コー ド す る事 が 確認 さ れ た。 一 方 、特 に 混乱 し てい る Chgサブ タ イプ の 分 類に 際 し、 Chgを 含む zonapellucida (ZP)遺伝 子
フ ァ ミリ ー にお け る 新た た 分類法 を確立し 、これに 基づき、 上記メナ ダChg遺伝子サ ブタ
イ プ を Chg Hal、 Chg Ha2お よ び ChgLに 分 類 し た 。 こ れ ら 完 全 長 Chgサブ タ イプ cDNAの演繹 アミノ酸配列の相同性はメナダとメダカ間で最も高かった(50―77％）。卵膜蛋白の内部
アミ ノ酸配列 のペプチド マッピン グと各Chgサ ブタイプ の推定分 子量を考 慮した結果 、Chg
Ha cDNAは ChgH蛋 白 を 、 ChgLcDNAは ChgL蛋 白 を コ ー ド す る 事 が 示 唆 さ れ た ふ
2種 の Chg (ChgH， ChgL） 船 よ び VgB血 中 量 は 、 各 々 の サ ブ タ イ プ特 異 抗体 を 用 いて 確 立し た Mancini法 に よ り測 定 した 。 一 方、 各 Chg船 よ ぴ VgB遺 伝 子の 発 現 量は サ ブ タイプ 特異プラ イマーを用 いたりアルタイム定量RT―PCR(qRT―PCR)にて測定し、内部標準とし た elongationfactor1― a(EF1−a）遺 伝 子 発現 量 で標 準化 した。人 工海水中 で数ケ月間馴 致した未 成熟メナダ へのエス トロジェ ン投与実 験におい て、全て の投与群で 、これら
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マ ー カ ー の 遺 伝 子 発 現 お よ ぴ 蛋 白 誘 導 の ピ ー ク 値 は VgB〉ChgH＞ ChgLと なり 、 特 に蛋白 に 関し て は 、低 濃 度のエス トロジェ ン処理に 対し、VgB蛋 白のみに 誘導が確 認された。
こ の こと か ら 、メ ナ ダではVgBが 最も感度 が良く、 広いダイ ナミック レンジを 持つ優れたバ イオマーカ ー分子で あること が確認さ れた。
一 方、汚染河 川のモデ ルである 函館市の 常磐川と 小田島川 のエストロ ジェン活性を、河 口域にて採 取した未 成熟個体 の血清に おける各 マーカー の蛋白量か ら比較し たところ、両 河 川で 非 常 に多 量 のVgBが誘導 された個 体が出現 したが、 血中量に 個体差が 大きく両河川 間 で有 意 差 は認 め られなか った。し かし、Chg蛋 白の誘導 は、常磐 川からの 個体にのみ
見 ら れ、 両 河 川間 に エス ト ロ ジェ ン 活 性の 差 が確 認され た。この 例からVgBと 同時にChgの 発現量を測 定するこ とによっ て、環境 エストロ ジェンの 影響評価の 精度が向 上することが 示 唆さ れ た 。さ ら に、 両 河 川に お い て検 出 され た各Chgと VgB蛋白量は 、エスト ロジェ
ン 投 与実 験 の イニ シ ャル コ ン トロ ー ル 群に お ける べース ライン(Mancini法 の検出限 界以下 ）や、比較 的清浄で あると判 断される 中国の天 津沿岸域 で採取され た雄個体 中の各蛋白量 と比べ明ら かに高値 を示し、 成熟雌魚 の血中レ ベルと同 様であった ことから 、同河川域に おける強い 環境エス トロジェ ン活性が 示唆され た。
以 上 、本 研 究 では 、 メナ ダ の 2種 のChgと VgBを 免 疫 生化 学 的船 よ ぴ 分子 生 物学的 手法 を 用い て サ ブタ イ プレベル で同定し た。特に Chgの一次構 造解析は 、独自の サブタイプ
分 類法に基づ いて行い 、その精 製法の確 立と併せ 、ポラ科 魚類を含む 海産魚で 初めての詳
細 な分子性状 解析とな った。ま た各マー カー蛋白 質・遺伝 子発現のサ ブタイプ 特異的な定量 法を新たに 開発し、 これらを同時に用いて各分子のエストロジェン投与による発現性状、な ら ぴに 未 成 熟お よ ぴ成 熟 雌 雄に お け る発 現 性状 に関す る本種の 基礎的な 生理知見を 得た 。さらに汚 染モデル 河川にお ける予備 的な環境 エストロ ジェン活性 調査を行 い、複合的な 多型バイオ マーカー を用いる 重要性を 示唆した 。以上の 知見は、メ ナダを用 いた環境エス トロジェン のバイオ アッセイ において 、その正 確性と実 用性を飛躍 的に向上 する成果であ り 、 今 後 の 本 研 究 分 野 の 発 展に 大 きく 寄与 す るも のと 期 待さ れる 。
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学位論文 審査の要旨
主 査 教授 原彰 彦
副 査 教
授 足伸 次副 査 准 教 授 東 立孝
副 査 助
教 平 藤 尚 志松

学位論文題名Immunochemical andmolecularbiological studiesof
choriogeninin
redlipmullet(Chelon,haeynatocheilus)（ メナ ダ の コリ オ ジェ ニ ンに 関する免 疫生化学 的および分 子生物学 的研究）

内分 泌かく 乱化学物質(EndocrineDisruptlng
Chemicals：EDCs）は、生体内の内分泌因子と類似した作用を顕すこと、もしくはその作用を阻害することにより生体の内分泌機能をかく乱する物質群である。ED
Csはヒトを含めた野生生物に深刻な影響を及ぼす可能性があり、その影響調査には生物の生体反応を用いて応答性を評価する手法（バイオアッセイ）が有効な手段となっている。卵生脊椎動物の卵黄蛋白前駆 物質ビ テロジェ ニン(vg)
お よび卵膜 蛋白前 駆物質コ リオジ ェニン(Chg)は、 エストロジェン感受性の雌特異蛋白質として知られる。これら蛋白質は外因性のエストロジェン暴露によっても産生されることから、エストロジェン様活性を持つEDCs（環境エストロジェン）のバイオアッセイにおける生 物指標 分子（バ イオマーカー）として利用される。メナダ（Chelonhaematocheilus)は生息域が広く、主に底性のデトライタスを索餌することから底質の影響を受けやすいため、環境エストロジェン調査の対象魚種とされている。しかし、本種のバイオ々ーカーに関する基礎的な性状解析例は非常に少なく、特にChgに関する報告はこれまでになぃ。本研究では、メナダを用いた実用的な環境エストロジェンのバイオアッセイ系の確立を目的として、．その基礎となるバイオマーカーの詳細な性状解析を免疫生化学的手法およぴ分子生物学的手法を用いて行い以下の知見を得た。
メ ナダの 血清から 種カのクロマトグラフイ←を用いて2種のChg
蛋白を精製した。精製品のゲル濾過― 940−

での分 子量(215 kDa
お よぴ69 kDa)やSDS―PAGEでの 分子量(68 kDa
およ び51kDa)、さらに アミノ酸組 成およ び抗原性 等の解析から、高分子のChgを本種のChgH、もう一方をChgLと同定した。一方、血清に 3種 のVg (VgA，VgB
お よぴvgC)を同 定し、 このうち 本種の 主要なVgで あるVgBを精製した。
ま た、これ ら3つの精製 蛋白(ChgH、ChgL
およ びVgB)に対 する特異 抗体を 作製した 。
肝 臓か ら 3種の 完 全長Chg cDNA (Chg Hl、Chg H
2およぴ ChgL）と2種のVg (VgAおよ びVgB) cDNA断 片を単離 した。 本種およ び他魚種のChgを含むzonapellucida遺伝子ファミリーにおける新たな分類法を 確立し 、上記Ch
g遺伝 子をChg Hal、Chg Ha
2およぴChgLに分類し た。ペ プチドマッピング解析 と各 Chg
サ ブ タ イプ の 分 子 量査 定 の 結果 、 Chg Ha cDN
Aは ChgH蛋白 、Chg
Lc
DNA
はCh
gL
蛋 白をコードすることを明らかにした。一方、VgBc
DN
Aは相同性と抗原性からVgB蛋白をコードすることを確認した。
2種 の Chg (Chg
Hおよび ChgL）とVg
Bに関し て、特 異抗体を 用いた M
ancini
法お よび特 異プライ マーを用いたりアルタイム定量RTーPCR法を確立した。未成熟個体へのエストロジェン投与実験を行い、各マーカーの遺伝子発現様式および蛋白誘導様式を観察した結果、Vg
Bは最もエストロジェン刺激に対する感度が高く、広いダイナミックレンジを持つ優れたバイオマーカーであることを確認した。一方、函館市の常磐川と小田島川の河口域にて採取した未成熟個体の血清における各マーカーの蛋白量を測定し、両河川のエストロジェン活性を評価した。両河川の個体で成熟雌個体に観察される濃度と同等またはそれ以上の多量なVgBが検出され、本種の正常べースラインおよぴ他の清浄水域（中国天津沿岸）から得られた雄個体血中VgB量と比べ明らかに高値を示したことより、同河川域における強い環境エストロジェン活性を示唆した。この際、血中VgB濃度には河川問で有意差は認められなかったものの、Chg
蛋白は常磐川からの個体にのみ検出され、両河川にエストロジェン活性の差を確認した。このことから
Vg
Bと同時にChgを測定することによって、活性評価の精度が向上することを示した。
以上、 本研究は 、メナダ の多型 C
hgとVgBを蛋白およぴ遺伝子レベルで同定した。特にChgの一次構造解析は独自の分類法に基づぃて行い、精製法の確立と併せて海産魚で初めて詳細な分子性状を解析した。また、各蛋白質・遺伝子発現に対する特異的な定量法を新たに開発し、各分子のエストロジェン投与による発現様式に関する知見を得た。さらに予備的な野外調査の結果から、各バイオマーカーを併用‑ 941―

することで詳細かつ正確な環境エストロジェン活性の評 価が可能となることを示した。これらの結果は、メナダを用いた環境エストロジェンのバイオアッセイにおける正確性と実用性を飛躍的に向上する成果を提供した。よって審査員一同は申請者が博士（水産科学）の学位を授与される資格のあるものと判定した。

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