博士（医学）堀内伊織
学 位 論 文 題 名低酸素誘導転 写因子(hypoxia‑inducible factor‑l叱HIF‑1口）に 結合 し て機 能を 制 御す る因 子 の同 定
学位論文内 容の要旨

［緒 言］生体 内にお いては全 身の細胞が血管を通じて酸素や栄養素の供給を受けているため，時に血管の狭窄や閉塞が起こるとその血管の下流にある細胞は酸素不足や栄養不足に曝される。また癌組織では血管の構築が異常であるために，正常組織と比較して低酸素環 境 に あ る と 考 え ら れ て い る 。細 胞 が 低酸 素 に 曝さ れ る と， 低 酸 素誘 導 転 写因 子(Hypoxi
a‑induci
blefactor‑l，HIF‑1）を構成するHI
F‑la蛋白の分解が阻害されて低酸素適応応答に関連した血管新生因子，糖輸送蛋白，解糖系酵素などの遺伝子の転写を誘導すること が明らかになっている。したがって、HIF‑1は低酸素環境に対する適応応答のマス夕一遺 伝子と言 って過 言でない 重要な転写因子と考えられる。最近になって，HIF‑la蛋白の分 解機構に ついて ，まず酸 素濃度センサーからのシグナルがH
I
F‑
la
蛋白のりン酸化などの構造変化をおこし，統いてvonHippel‑Lindau(VHL)病の原因遺伝子の産物であるV
H
L蛋白によってユピキチン化され、最終的にプロテアソームによって分解される機構が提唱され ている。 著者は ，HIF‑la蛋白に結合する蛋白を探索することによってH
IF‑la蛋白の機能 を制御する因子を同定できるのではないかと考え，本研究では、酵母を利用するtwohybridsystemを用いてHIF‑la蛋白に結合する蛋白の同定を試みた。候補遺伝子産物について は，哺乳 動物細 胞内での HIF‑la蛋白との結合を確認し，その機能についても検討した。
［材料と方法］
1． Two‑hybrid法によるHI
F‑la結合蛋白のスクリ一二ング：
1） Baitベ ク夕一 は，HIF‑laの アミノ酸 636‑826の 部分に相当するcDN
A
断片を酵母発現ベ ク 夕 ‑ pAS2Cの GAL4の DN
A結 合 部と in‑frameと な るよ う に 挿 入す る こ とに よ り 構
築し た。Preyベ ク夕一は 酵母転 写因子GA
L4の 転写活 性化部と 融合さ せたヒト リンパ球cDNAライブラリーを用いた。
2） 酵 母 レ ポ 一 夕 一 株 Y190（ レ ポ 一 夕 一 遺 伝 子 ： HIS3， 1ac2） の baitベ ク 夕 一による形質転換3） TRP． HIS無 添 加 プ レ ー ト で の 増 殖 能 カ の 確 認 と 3ATの 至 適 濃 度 の 決 定4） Ba
itを 発現し ている酵 母コ口ニ‑ Y
190へのスクリーニングcD
N
Aライブラリーの導入
5）ローガラクトシダーゼ活性の検出
61酵母からのプラスミドDN
Aの回収と大腸菌の形質転換
7） Bait DNAと 陽 性 prey DNAの 再 導 入 に よ る 結 合 特 異 性 ・ 再 現 性 の 確 認
81塩基配列の決定
2． 発現 ベ ク 夕一 の 構 築と哺 乳動物 細胞への 導入： FLAG‑VB
P‑1発現ベ ク夕一（ pFLAG‑
CMV‑
2fVBP‑l)
お よびHIF‑la発 現ベク夕 一（pcDNA3.lhygro/HA‑
HIF‑la)を構築 し，COS7細胞に導入した。
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3． Western Blot法 ： 培養 細胞 から全 細胞蛋白 質抽出 液およ び細胞 質蛋白 抽出液 と核蛋 白抽出 液 を 得 た 。 蛋 白 抽 出 液 を 7.5％ ま た は 14％ SDS‑PAGEに て 分 離 後 ， PVDFヌ ン ブ レ ン に転 写 し た。 BJocking bufferに て 非 特 異的 結 合 を blockし 一 次抗 体 で 標 識し た 。二次 抗体と反 応させ ECLdetectionkitを 用いて検 出した 。
4．免疫 沈降法 ： ProteinGsepharoseレジン をlysisbufferに 懸濁し これを 抗体を 入れた チュー プ に 加え 口 一 テ 一夕 一 で 撹 拌し た 後 ， 蛋白 抽 出 液 と混 合 し 口 一テ 一 夕 一 で撹拌 した。 遠心 し レ ジ ン を 沈 殿 さ せ ， こ れ を SDS‑PAGEと Western Blot法 に よ り 分 析 し た 。
5． RT‑PCR： 細 胞 よ り TRIzolを 用 い て 全 RNAを 抽 出 し 逆 転 写 酵 素 に て 処 理 し cDNAを 得た 。これ を用いて PCR法に よりcDNAの 増幅を 行った 。
［ 結果］
1． Twohybridsystemに て 同 定 さ れ た HIF‐ 1a蛋 白 に 結 合 す る 候 補 蛋 白 ：酵 母 Two‐ Hybrid法 に よ り cDNAラ イ プ ラ リ ー に 対 す る ス ク リ 一 二 ン グ を 行 っ た 結 果 ，
HIF‐ 1Q蛋 白 の 分 解 に 関 与 す る VHL蛋 白 に 結 合 す る 蛋 白 と し て ク 口 一 二 ン グ さ れ た VHL
bindingprotein． 1（ VbP‐ 1） を 含 む 21種 31個 の 候 補 蛋 白 が 得 ら れ た 。
2． 哺 乳 動 物 細 胞 内で の 結 合 の確 認 ： FLAGッ BP． 1発 現 ベ ク夕 一 と HIF― 1a発 現 ベク 夕 一 が
導 入 さ れ た 細胞 で そ れ ぞれ FLAG一 vBP‐ 1蛋 白 とHIF‐ 1a蛋白 が 発 現 して い る こ とを 確 認 した 。 両 発現 ベ ク 夕 一を 同 時 に 導入 し た 細 胞で は Anti‐HIF‐ 1aantibodyにて 免疫沈 降した 蛋
白 中にVBP‐ 1蛋白が 認めら れた。
3．VBP． 1強 制 発 現後 の HIF‐1制御 遺伝子 発現： 低酸素 誘導遺伝 子であ る糖輸 送蛋白 GJut‐1と 解 糖 系 酵 素aldolaseAの い ずれ に お い ても ， 親 株 とvector導 入 株で は 低 酸 素下 で 遺 伝 子
発 現 が 亢 進 し た が ， VBP＿ 1導 入 株 で は 低 酸 素 下 で の 発 現 亢 進 が 認 め ら れ な か っ た 。
4．VBP‐ 1強 制 発 現後 の HIF‐ 1a蛋 白 発 現： 正 常 酸 素分 圧 下 お よび 低 酸 素 分圧 下いず れにおい て も 核 蛋 白お よ び 細 胞質 蛋 白 の 両方 で ， 導 入し た HIF‐ 1Qの 蛋 白 の発 現 量 が VBP‐ 1導入に よ っ て著 し く 減 少し ， さ ら に低 酸 素 分 圧下 で は endogenousな HIF‐1a蛋 白発現 量もVBP‐ 1導 入によ って減少 した。
［ 考 案 ］低 酸 素 応 答の 主 要 な 制御 因 子 で ある 低 酸 素 誘導 転 写 因 子（ HIF‐ 1）の サブユ ニツ
ト HIF− 1Qは ユ ピ キ チ ン 化 ・ プ 口 テ ア ソー ム 分 解 系に よ っ て 制御 さ れ て おり ， VHLの 遺伝子 産 物 が そ の oxygendependentdegradationdomainに直 接 結 合 する こ と が ユピ キ チ ン 化の最 初のス テップと なると されて いる。
今 回 著 者 が 同 定 し た HIF− 1a結 合 蛋 白 で あ る VBP‐ 1は ， 1996年 に VHL蛋 白 に 結 合 す る蛋 白 と して 報 告 さ れた が ， その後 その機 能につい ては明 らかに されな いまま となっ ていた 。
VBP− 1が HIF‐ 1Q蛋 白 と VHL蛋 白 の 両 者 に 結 合す る こ と から 細 胞 内 蛋白 の ユ ビ キチ ン 化 に
お い て 標 的 蛋 白 HIF‐ 1Qと ユ ビ キ チ ン 化酵 素 蛋 白 VHL蛋 白 と の 結合 を 促 進 する 足 場 蛋 白質と し て HIF‐ 1aの 分解 を 促 進 して い る 可 能性 が 考 え られ た 。 VBP‐1を 強制 発 現する とHIF−
1Q蛋 白 の 発 現 量 が 減 少す る と い う結 果 は ， VBP・ 1がHIF‐ 1Q蛋白 の 分 解 を促 進 す る 働き をし て い る こ と を 示 し て お り ， 著 者 の 仮 説 と 矛 盾 し な い 結 果 と 考 え られ た 。 現 在は ， VHL
蛋 白 を 欠 損 して い る 細 胞に お い て VBP‐ 1を強 制 発 現 させ る こ と によ り HIF− 1Q蛋 白 の 発現が ど の よ う な影 響 を 受 ける の か を 検討 し て い る。 今 回 の 研究 結 果 か ら， VBP‐ 1が HIF‐ 1Q
蛋 白 の 分解 に 何 ら かの 関 与 を して い る 可 能性 が 示 唆さ れたが ，VBP‐1の どの部 位がHIF‐1Q
蛋 白 お よ び VHL蛋 白 と 結 合 す る の か ， VBP‐1の強 制 発 現 によ り HIF‐ 1Q蛋 白 の ユビ キ チ ン
化 が 促 進 す る こ と な ど ， 今 後 確 認 すべ き 課題 も 数多 く 残さ れ て いる 。
［結語］VHLbin
dingprotein‐1（VBP．1）がHIF‐1a蛋白にも結合することが判明した。VBP−1蛋 白 は ， VHL蛋 白 と HIF・ 1a両 者 に 結 合 す る 能 カ を 持 ち VHL依 存 性 も し く は 非 依 存 性 に
HIF‐ lQ蛋白の 分解を 促進し ている 可能性 が示唆 された。

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学位論 文審査の要旨
主 査

教 授

今 村 雅 寛副査
副査
副査

教授 浅香正博
教授 西村正治
教 授 細川 眞澄男

学 位 論 文 題 名

低酸素誘導転写因子(hypoxia‑induci
blefactor‑l￠HIF‑1ぱ）に結合して機能を制御する因子の同定

生体内においては全身の細胞が血管を通じて酸素や栄養素の供給を受けているため、時に血管の狭窄や閉塞が起こるとその血管の下流にある細胞は酸素不足や栄養不足に曝される。また癌組織では血管の構築が異常であるために、正常組織と比較して低酸素環境にあると考えられている。細胞が低酸素に曝されると、低酸素誘導転写因子(hypoxia−induciblefactor‑l，HIF‑1)を構成するHI
F−la蛋
白の分解が阻害されて、低酸素適応応答に関連したさまざまな遺伝子の転写を誘導することが明らかになっている。したがって、HI
F―1は低酸素環境に対する適応応答のマスター遺伝子と言って過言でない重要な転写因子と考えられる。申請者は、HI
Fー1
ば蛋白の機能を制御する因子を同定するために
酵母two−hybrid法を用いてHIF‑
1a蛋白に結合する蛋白の同定を試みた。また候補遺伝子産物のひとつVB
P―1にっいて哺乳動物細胞内でのHIF―18蛋白との結合を確認し、その機能について検討した。
H
IF―1aのアミノ酸636−826の部分に相当するcDNA
断片を用いて構築したbait
ベクター、preyベクタ
ーとしてヒトリンパ球cDN
A
ライブラリー、酵母レポーター株Y190（レポーター遺伝子：HIS3，lacZ)を用いて酵母two―hybrid法によるスクリーニングを行った。その結果、21種31個の候補蛋白が得られた。そのうちHIF―la蛋白の分解に関与するVH
L蛋白に結合する蛋白として同定されたが、その機能が明らかにされていないV
H
Lbindingprotein―1(VBP―1）に着目した。哺乳動物細胞発現ベクターとしてFLAG―VB
Pー1発現ベクターおよびHI
F‑1ロ発現ベクターを構築し、COS7細胞に導入した。両発現ベクターを同時に導入した細胞では抗HI
F‑1ロ抗体にて免疫沈降した蛋白中にVB
P―1が認められた。この結果より、HIF‑1aとVB
P―1が哺乳動物細胞内でも結合することが示された。V
B
P−1の機能を明らかにするために、VB
P―1を強制発現させた細胞におけるHI
F―1制御遺伝子である解糖系酵素aldolase
Aの発現をRT―PCR法により検討した。親株とベクター導入株では低酸素下でaldolaseAの発現が亢進したが、V
BP−1
導入株では低酸素下での遺伝子発現の亢進が認められなかった。この結果より、VB
P―1がHI
F‑1aの機能を抑制する可能性が示唆された。この機序として、まず第ーにV
BP―1がHIF―la蛋白の分解を促進する可能性を検討した。V
B
P−1を強制発現させた細胞におけるHI
F―la蛋白の発現をW
esternblot法により検討した。その結果、低酸素および正常酸素分圧下いずれにおいてもHIF‑1Qの蛋白の発現量がVBP―1導入によって著しく減少した。この結果はVB
Pー1がHI
F−la蛋白の分解を促進する可能性を示唆した。以上の結果より次のような考察を行った。1）酵母twoーhybrid法にてHI
F―la蛋白に結合する多くの蛋白を同定することができたが，VBP−1以外の蛋白については今後の検討が必要である。
2）低酸素応答の主要な制御因子であるHIF‑1のサブュニツ卜HI
F―1
ばはユビキチン・プ口テアソ←ム
分解系によって制御されており、vonHippe
l―Lin
dau
病の原因遺伝子であるVH
L
癌抑制遺伝子の遺伝子産物がHI
F―laに直接結合することがユビキチン化の最初のステップとなるとされている。今回同定‑ 339―したV
B
P―1は、ユビキチン゜プロテアソーム蛋白分解系における標的蛋白H
I
F―laとユビキチン酵素蛋
白VHLの両者に結合することから足場蛋白質として働く可能性が考えられた。3）VB
P−1を強制発現す
るとHI
F―la蛋白の発現量が減少することより、VB
P―1がHI
Fー1ば蛋白の分解を促進する働きをしていることが示唆された。
公開発表にあたり、副査浅香正博教授より、1）酵母two−hybrid法においてbaitとしH
I
F‑1皿636―826の部分を用いた理由 、2）正常酸素分圧下と低酸 素分圧下でのaldol
aseA
発現量の差の再現性、3）癌の種類、正常組織との間でのVBP−1発現の差、4）遺伝子治療への応用の可能性、5）VB
P―1の強制発現によるendogenous
なHI
F―1ば蛋白量の変化について、副査西村正治教授より、1）今回の実験の結果は生理的な条件下でも働いているのか、さらに今後の展望、2）VB
P―1の低酸素下での動向、3）
V
BP―1がHIF
一1ロのregulatorとして働いている可能性、4）VB
Pー1の強制発現により低酸素下で逆にaldolase
Aの発現が低下している理由、5）HIF−la蛋白発現の時間経過、6）HIF−18IuRNAの正常
酸素、低酸素下での 発現の変化について、副査細川眞澄男教授より、1）教室で初めてtwo−hybrid法を行った感想とその有用性、2）スクリーニングで得た21種の候補遺伝子産物のうち，VB
P
一11以外に興味のある蛋白、3）VB
P―1をregulateする因子にっいての質問があり、最後に、主査今村が、低酸素でのHIF‑1a蛋白 の分解、HIF
一la蛋白のpositiv
e regulatorの候補などについて質問した。申請者はこれらの質問に、自らの実験経験および、これまで学習した知識を駆使して適確にしかも明確に回答した。
本研究の成果は、低酸素環境に対する適応応答のマスター遺伝子であるH
I
Fーlaの機能を制御する多くの候補蛋白を同定したこと、そのひとっV
B
P―1がHIF−1
ば蛋白の分解に関与する可能性を示唆したこと、また、今後V
B
P‑1が低酸素、低栄養という厳しい環境に適応している癌の制御に利用される可能性を提示した点で、高く評価される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程にける研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位に受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

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