博 士 （ 医 学 ） 武 田 香 陽子
学 位 論 文 題 名

大腸 発癌に関わるWntシグナル関連夕ンパク質発現の臨床病理 学的解析
学位論文内容の要旨（背景・目的）大腸発癌は癌遺伝子や癌抑制遺伝子の遺伝子異常蓄積の多段階過程であり、
い くっ かの シグ ナル 伝 達経 路の dereg
ulationを誘 導す る。 重要 な遺 伝子 異常のーっは
adenomatous polyposis coli (Apc)の変 異で あり 、そ れは W
ntシ グナ ル伝 達経 路のderegu
lationをもたらす。ロ−CateninはWnt
シグナル伝達に重要な役割を果たしており、ゆピ遺伝子 あるいはロ―C
atenin
遺伝子 自身に変異が発生しW
nt
シグナル伝達経路が活性化さ れた 時、 B ‑Catenin
はTC
F4などの T
CF/LEF HMG box
転写因子フ ァミ1」ーと複合体を形成することによって転写を活性化し、最終的にC‑HlyC、のでノヵDJおよびc‑junを含む標的遺伝子の活性化をもたらす。
癌原遺伝子 であるc―Junは二量体AP−1転写因子の主な構成因子である。AP―1
機能の刺激で重要なメ カニズムはcーJunN―terminal kinases (JNKs)
によるc−Junのアミノ基末端のルン酸化である。1」ン酸化されたc―Jun（p―c‑Jun)はストレス誘導性アポトーシス、細胞の増殖およ び腫瘍形成に関与している。最近、p−c−JunがTCF4と相互作用し複合体を形成して、8―Cateninの存在でその転写活性を協同的に高めることが示され、こうしたc−Jun
リ ン酸 化に 依存 した相互作用はマウス腸管発癌に必須であることが報告された。
さ ら に 近 年 、 Wnt標 的遺 伝子 とし て同 定さ れた leucin
e― r
ich一repe
at―con tamn
ing
G―proteinーcoupled recep
tor5(Lgr5)は小腸と大腸の組織幹細胞の候補とされる陰窩基底部 にあ るcolumnar細胞(CBC細胞 ）で 独占 的に 発現していること がknockーinマウスを利用した実験 で示された。L
gr5陽性CBC細 胞の系統追跡実験では、この細胞が全ての上皮細胞を産生し ていることが立証され、Lgr5陽性細胞が小腸や大腸の幹細胞であることが示唆された。さ らに、このL
gr5陽性幹細胞でAPCを欠損させたマウスは急速に増殖する腺腫を形成し、APCが変異したLgr5陽性大腸幹 細胞が大腸腫瘍の信頼できる起源細胞であることが示唆された。
本研究は、 大腸腫瘍形成に関わるWnt
シ グナル関連因子の発現とその臨床病理学的意義を検討するた めに、第1章ではヒト大腸腫瘍におけるpーc−Jun、TCF4およびロ―C
ateninの核
発 現と その 転写 標的 で ある M
MP7の発 現を 、第 2章 では大腸幹細胞マーカーLgr5の発現を解析した。
（方法）北 海道大学病院にて2000年から2003年の間に外科的または内視鏡的に切除され、ホ ル マ リ ン 固 定 ・ パラ フィ ン包 埋さ れ た原 発性 大腸 腫瘍 検体 （第 1章で はLow― grade
intr
aepi
thelial neOPlasia (LGINs)
19例、 High― grade int
raepithelial neoplasia(HGINs) 14例 お よ び浸 潤癌 35例 の計 68検体 、第 2章 では 同検 体で 腫 瘍の 残存 して いたLGINs17例、HGINs13例および浸潤癌30例の計60検体）を材料とした 。pーcーJun、TCF4、ロ‑C
atenin、MM
P7、Lgr5およびc−Mycの発現は免疫組織化学法によって解析した。p−c―Jun、ー 100―

TCF4、 ロ ‑Catenin、 MMP7お よ びcーMycの 発 現 は免 疫 組 織 化学 ス コ ア ［（ IHCス ゴ ア ）： （ 陽性 細 胞 の 割 合 （ ％ ） ） x（ 染 色 強 度 0〜 3)］ と し て評 価 し た 。Lgr5の発 現 は い ずれ の 陽 性 細胞 も 染 色 強 度 が 同程 度 で あっ た ため 、 陽性 細 胞の 割 合と し て評 価 した 。
（ 結 果 ） 第 1章 に お い て 、 LGINで は p― C― Jun、 TCF4お よ び ロ ー Cateninが、 HGINお よ び 浸
潤 癌 で は p−c−Junと ロ ― Cateninが、 隣 接 す る正 常 上 皮 に比 べ て 有 意に 高 い IHCスコ ア を いず れ も 示 し た （ pく 0． 05)。 こ れ ら3つ のタ ン パ ク 質の IHCス コ アを LGIN、 HGINお よ び 浸潤
癌 の 間 で そ れ ぞ れ比 較 す る と、 p―cーJunの み 有 意な 違 い が あり 、 LGINと HGINで 浸 潤 癌に 比べ て 高 い 値 を 示 した (p二 ニ0． 02)。 さ ら に 、浸 潤 癌 に おい て p― c― Jun発 現 とpT因 子 との 間に 負の関 係性が 観察さ れた（p‑ニ0． 0006)。p―c―Jun、TCF4および口―Cateninの核発現とMMP
7の 細 胞 質 発 現 の 有 意 な 相 関 関 係 は 、 p― cー Junと TCF4（ r O． 25． p 0． 04)、 TCF4とロ ― Catenin（ r 0． 30， p 0． 01)、p― c―JunとMMP7（r 0． 26 p二ニ O．03)、そ してTCF4と MMP7（r 0．39，p 0．0008)の 間にそ れぞれ認 められ た。
第 2章 に お い て 、 隣 接 正 常 大 腸 上 皮 に お け る Lgr5の 発 現 は 陰 窩 基 底 部 に あ る 極 少 数 の細 胞 の 細 胞 膜 と 細 胞 質 に ま ば ら に 検 出 さ れ る だ け で あ っ た が 、 殆 ど の 大 腸 腫 瘍 で は Lgr5
陽 性 細 胞 の 増 加 を 認 め た 。 Lgr5陽 性 細胞 は 通 常 、ク ラ ス タ ーを 形 成 し 、陰 窩 基 底 部に 限 局
せ ず に 、 同 じ 様 な 染 色 強 度 で ま だ ら 状 の 分 布を 示 し た 。全 腫 瘍 領 域に お け る Lgr5の発 現 率は 各 腫 瘍 グ レ ー ド(LGIN、 HGINお よび 浸 潤 癌 ）で 違 い は 認め ら れ な かっ た が 、 明ら か な Lgr5
陽 性 細 胞 の 分 布 の 違 い が そ れ ら の 問 で 観 察 され た 。 そ のた め 、 各 腫瘍 グ レ ー ドで の 内 腔 表面 、 陰 窩 上 部 お よ び 陰 窩 下 部 の 3つ の 腫 瘍 領 域 に 分 け て Lgr5の 発 現 を 評価 す る と 、内 腔 表面 に お け る Lgr5の 発 現 は腫 瘍 グ レ ード の 進 行 と有 意 な 負 の関 係 性 を （p 0． 0004)、 陰 窩下部 で は 有 意な 正 の 関 係性 を 示した（ p 0． 0001)。浸潤 癌にお いては 、内腔 表面に おける Lgr5の 発 現 は pStageと 負 の 関係 性 を 示 し（ p 0．02） 、 進行 し た pStageで は ほ ぽ 全例 で 陰 窩 下部 で の 高 発 現 を 認 め た 。 Lgr5の 発 現 と Wntシ グ ナ ル 因 子 の TCF4、B―Cateninお よ び C― Mycの 発 現 と の間 に は 有 意な 関 係 性 はな か っ た が、 Lgr5とTCF4（ p 0.1）あ るいは ロ‑Catenin（ p〓 0． 2）と の 間 に は僅 か に 正 の関 係 に 傾 く傾 向 が 認 めら れ た 。 また 、 Lgr5陽性細 胞は、 典型的 に ク ラ ス タ ー を形 成 し 、 まだ ら 状 の 分布 を 示 し たが 、 TCF4、 ロ − Cateninおよ び cー MycはLgr5陽性領 域を超え て広く 発現し ていた 。
（ 考 察 ） 第 1章 で は p− cー Jun、 TCF4およ び ロ ― Cateninが腫 瘍 で 隣 接正 常 上 皮 と比 較 し て 高
頻 度 に 過 剰 発 現 し て い る こ と が 明 ら か と な り 、 こ れ ら 3つ の タ ン バク 質 が ヒ ト大 腸 腫 瘍 発
生 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 浸 潤 癌 に 比 べ て LGINsと HGINsで のp一 c− Junの 高 発 現 、 お よ び 浸 潤 癌 に お け る p― c‑Junと pT因 子 進 行 と の 負 の 関 係 性 は 、p−cー Junが 腫 瘍 発 生の よ り 早 期の 段 階 で 重要 な 役 割を果 たしてい る可能 性を示 唆して いる。
さ ら に 、 こ れ ら 3つ の タ ン バ ク 質 発 現 と そ れ ら の 下 流 遺 伝 子 産 物 の ー つ で あ る MMP7発 現の 間 に 認 めら れ た 複 数の 相 関 は 、invitroで立 証 さ れ たp― cー Jun、 TCF4お よび口 ーCateninの 相 互 作 用 が ヒ ト 大 腸腫 瘍 発 生に お い ても 重 要 であ る こ とを 示 唆 す るも の で ある 。
第 2章 で は 、 腫 瘍 の 進 行 過 程 と Lgr5の 内 腔 表 面 で の 発 現 の 間 の 有 意 な 負 の 関 係 性 、 およ び 腫 瘍 進行 の 過 程 とLgr5の陰 窩 下 部 での 発 現 の 間の 有 意 な 正の 関 係 性 が観察 さ．れ た。これ ら の 結 果 は Lgr5陽 性 細 胞 の 分 布 は 大 腸 癌 の 発 生 過 程 で 内 腔 表 面 か ら 陰 窩 基 底 部 へ 移 行
す る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。 ま た 、 浸 潤 癌 に お い て は 内 腔 表面 で の Lgr5の 発 現と pStageと の 間 に 負 の 関 係 性 を 認 め 、 pSt ageの 進 行 例 で は ほ と ん ど 全 て の 腫瘍 で 陰 窩 下部 に Lgr5の 高 発 現 を 認 め た こ と か ら 、 癌 浸 潤 先 進 部 への Lgr5陽 性 細 胞の 分 布 移 行が 大 腸 癌 の進 行 にも 重要な 役割を 果たし ている 可能性 が示唆さ れる。
（ 結 語） p― c―Jun、 TCF4お よびロ ―Cateninの 細胞核 発現はヒ ト大腸 腫瘍発 生に重 要な役 割が あ り 、 特 に p− cー Junは 腫瘍 発 生 の 早期 の 段 階 で中 心 的 な 役割 を 果 た して い る こ とが 示 唆
さ れ た 。 ま た 、 Lgr5幹 細 胞 マ ー カ ー 発現 陽 性 細 胞の 増 加 は 大腸 腫 瘍 形 成の 早 期 に 発生 し 、― 101―

それらの分布が癌浸潤先進部に移行することが大腸癌の発生や進行に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。大腸腫瘍形成に関わるこれらのタンバクの機能やその調節のヌカニズムの解明は大腸発癌のさらなる理解を深め、最終的に大腸癌に対する新しい予防や 治療戦略 の進歩に っなが る可能性 がある 。

ー 102―

学位論文審査の要旨
主査教
授秋田弘俊
授今村雅寛
副査教
宏教授
副査教
松野
吉聡
授
副査准平野

学 位 論 文 題 名

大腸発癌に関わるWntシグナル関連夕ンパク質発現の臨床 病理学的解 析
大腸発癌は癌遺伝子や癌抑制遺伝子の遺伝子異常蓄積の多段階過程であり、レゝくっかのシグ ナル 伝達 経路 のderegulationを誘導する。Ap
c遺伝子あるいはロ‑C
atenin遺伝子自身 に 変異 が発 生し Wntシ グナ ル伝 達経 路が 活性 化さ れた 時、 ロ‑CateninはTCF
4な どのTCF/LEF HMG box転写因子ファミルーと複合体を形成することによって転写を活性化し、最終的にピ一卿ぱ、cyc]iriDJおよびc‑iunを含む標的遺伝子の活性化をもたらす。癌原遺伝子産物であるc―Junは二量体AP−1転写因子の主な構成因子である。APー1
機能の刺激で重要なメカニズムはc一Jun
N―terminal kinases (JNKs)によるc‑Junのアミノ基末端のりン酸化である。リン酸化されたc−Jun（p−c‑Jun)はストレス誘導性アポトーシス、細胞の増殖および腫瘍形成に関与している。最近、 p―cーJunがTCF4と相互作用し複合体を形成して、ローCateninの存在でその転写活性を協同的に高めることが示され、こうしたc―Jun
リン酸化に依存した相互作用はマウス腸管発 癌に必須であることが報告された。さらに近年、Wnt標的遺伝子として同定されたleucine−rich―repeatーcontainingG―protein−coupledreceptor5(Lgr5)は 小腸 と大 腸の 組織 幹細胞の候補とされる陰窩基底部にあるcolumnar細胞(CBC細胞）で独占的に発現していること がknock−in
マウスを利用した実験で示された。L
gr5陽性CBC細胞の系統追跡実験では、この細胞が全ての上皮細胞を産生していることが立証され、Lgr5陽性細胞が小腸や大腸の 幹細胞であることが示唆された。さらに、このLgr5
陽 性幹細胞でAPCを欠損させたマウスは急速に増殖する腺 腫を形成し、APCが変異したL
gr5陽性大腸幹細胞が大腸腫瘍の信頼で きる起源細胞であることが示唆された。本研
究では、大腸腫瘍形成に関わるWntシグナル関連因子の発現とその臨床病理学的意義を検討するために、ヒト大腸腫瘍におけるpーcーJun、TCF4および口―Cateninの細胞核発現とその転写標的であるMMP7の発現を解析した。さ らに、Wnt
標的分子で大腸幹細胞マーカーのLgr5の発現を解析した。ヒト大腸腫瘍におけ るpーc―Jun、TCF4およびロ―Cateninの核発現と その 転写 標的 であ るMMP7の 発 現の解析において、LGIN
では p―c―Jun、TCF4および口‑Cateninが、HGINおよび浸潤癌ではp一cーJunとp―Cateninが、隣接する正常上皮に比べて有意に高いIHCスコアをいずれも示した。これら3つのタンバク質のIHC
スコアをLGIN、HGINおよび浸潤癌の問でそれぞれ比較すると、p―c―Junのみ有意な違いがあり、LGINとHGIN‑ 103一で浸 潤癌に 比べて高 い値を示した。さらに、浸潤癌においてp―C―Jun発現とpT因子との問に 負の関 係性が観 察された。p−c−Jun、TCF4およびpーCateninの核発現とMM
P7の細胞質発 現の有 意な相関 関係は、pーc‑JunとTCF4、TCF4とローC
atenin、pーc‑JunとMMP7、そしてTCF4とMMP7の問にそれぞれ認められた。本研究ではpーcーJun、TCF4およびロ―Cateninが腫瘍で隣接正常上皮と比較して高頻度に過剰発現していることが明らかとなり、これら3つのタ ンバク質 がヒト大腸腫瘍発生に重要な役割を果たしていることが示唆された。浸潤癌に比べてLGINsとHGINsでのp―c−Junの高発現、および浸潤癌におけるpーcーJunとpT因子進行との負の関係性は、p―c―Junが腫瘍発生のより早期の段階で重要な役割を果たしてい る可能 性を示唆 している。さらに、これら3つのタンバク質発現とそれらの下流遺伝
子 産 物の ー つ であるMM
P7
発 現の問 に認めら れた複 数の相関 は、in v
itroで 立証され た
p―c―Jun、TCF4およびロ―C
ateninの相互作用がヒト大腸腫瘍発生においても重要であることを示唆するものである。大腸幹細胞マーカーLgr5の発現解析において、隣接正常大腸上皮におけるLgr5の発現は陰窩基底部にあ．る極少数の細胞の細胞膜と細胞質にまばらに検出されるだけであったが、殆どの大腸腫瘍ではLgr5陽性細胞の増加を認め・た。Lgr5陽性細胞は通常、クラスターを形成し、陰窩基底部に限局せずに、同じ様な染色強度でまだら状の 分布を 示した。 全腫瘍 領域にお けるLgr5の 発現率は 各腫瘍 グレード (LGIN、HGIN
および浸潤癌）で違いは認められなかったが、明らかなLgr5陽性細胞の分布の違いがそれらの間で観察された。そのため、各腫瘍グレードでの内腔表面、陰窩上部および陰窩下部の3つの腫 瘍領域に 分けて L
gr5の発現を 評価す ると、内 腔表面 における Lgr5の発現は腫瘍グレードの進行と有意な負の関係性を、陰窩下部では有意な正の関係性を示した。浸潤癌においては、内腔表面におけるLgr5の発現はpStageと負の関係性を示し、進行したpStage
ではほぽ全例で陰窩下部での高発現を認めた。本研究では、腫瘍の進行過程とLgr5の内腔表面での発現の間の有意な負の関係性、および腫瘍進行の過程とLgr5の陰窩下部での発現の間の有意な正の関係性が観察された。これらの結果はLgr5陽性細胞の分布は大腸癌の発生過程で内腔表面から陰窩基底部へ移行する可能性を示唆している。また、浸潤癌においては 内腔表 面でのLgr5の発現と pStageとの間 に負の関係性を認め、pStageの進行例ではほとんど全ての腫瘍で陰窩下部にLgr5の高発現を認めたことから、癌浸潤先進部へのL
gr5陽性細胞の分布移行が大腸癌の進行にも重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
発 表終了後 、副査の 今村教授から、1）Lgr5陽性細胞の分布の変化の生物学的意義につい て 、2） 大 腸癌に おけるNicheとの 関係につ いて、 3）p‑c‑Jun発現 と多段階 発癌の 逆相関について、副査の松野教授からは、1）p‑c‑Junではなく、全cーJunの発現について、
2） p‑c‑Junと MM
P7の 発現 の 関 係に つ い て、3）今 後の展望 につい て、質問 があった 。
また、Lgr5の発現が腺腫の表層部分と癌の浸潤部で発現していることは癌幹細胞の概念と一 致 する と の コ メン ト が あっ た 。 副査 の 平野准教 授から は、1）LGINとHG
INの 病理診断につしゝて、2）ロ．Ca
tenin、TCF
4、pーc‑Junの陽性コントロールについて、3）免疫染色の1
腫瘍検体当たりの評価細胞数や視野数、評価方法につしゝて、4）相関関係の評価につい て、5）癌幹 細胞マ ーカーCD
133、CD44と の関係について、質問があった。最後に、主査 の秋田 教授から 、1）今後の研究の展開について質問があった。これらの質問に対して、 申請者 は自身の これま での研究 結果と 文献情報をもとに概ね適切ぬ回答を行った。
こ の論文は 、大腸腫 瘍形成に関わるW
ntシグナル関連夕ンパク質の発現を明らかにし、大腸発癌の分子メカニズムのさらなる理解を示した点で高く評価され、今後、大腸癌に対す る新 し しゝ 予 防や 治 療戦 略 の進 歩に っながるこ とが期待され る。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判定した。

‑ 104−