神奈川自然誌資料 (42): 129–134, Mar. 2021

報

告DNA バーコーディングで明らかにされた真鶴半島におけるビロウ Livistona chinensis (Jacq.) R.Br. ex Mart.（ヤシ科）の野生化
大井和之・大西亘Kazuyuki Ooi and Wataru Ohnishi: DNA barcoding reveals naturalization ofLivistona chinensis (Jacq.) R.Br. ex Mart. (Arecaceae)
in the Manazuru Peninsula, Kanagawa, Japan緒ている遺伝子領域の塩基配列をデータベース化し，登録言されたリファレンス配列との一致により生物種を同定する方法で，芽生えや種子，葉の断片等の形態情報が真鶴半島は相模灘に突き出た半島で，その先端部に位不十分な標本からでも，DNA が抽出できれば分析でき置する約 50 ha の通称「お林」とよばれる樹林地は，県指定天然記念物，魚つき保安林および県立自然公園としる。DNA バーコーディングの結果，該当の植物はシュて保護されており，江戸時代に植林されたクロマツのほロやワシントンヤシ，ワシントンヤシモドキ W. robusta
H.Wendl. ではなく，ビロウ Livistona chinensis (Jacq.) R.Br.

か，暖帯性のクスノキやスダジイなどが生育する。お林ex Mart. と推定された。本報告は，本州におけるビロウ

では，近年シュロに似た団扇形の葉をつけるヤシ科植物の稚樹の侵入が顕著となっている。ヤシ科は熱帯〜亜熱の野生化を初めて報告するものである。

帯を中心に分布する大きなグループで，世界中に約 2,400

なお，台湾から九州南部に分布するビロウは楕円形の種が知られている。地面から幹を垂直に伸ばし、幹の先果実を持つことから L. chinensis var. subglobosa (Hassk.)

形状でいくつかのグループに分けられる他は類似の種間で区別できるものではないとして，中国南部・海南島にBecc. という変種にされていたが，果実の形態は連続的端に放射状に重なる大きな葉が特徴的な一群だが，葉ので顕著な識別形質に乏しく，特に稚樹の状態での形態で分布する基準変種 L. chinensis forma typica のシノニムとされた（Dowe, 2009）。DNA データバンクのビロウのリの識別はしばしば困難である。

ファレンス配列にも変種名の記載はなく区別できないた

ヤシ科植物は日本では琉球，小笠原を中心に 6 種がめ，本報告では L. chinensis として取り扱った。

自生するほか，かなりの種が街路樹や庭園樹および観賞用として栽培される（國府方，2015）。『神奈川県植物誌 2018』によると，神奈川県内にヤシ科植物の自生材料と方法

Trachycarpus fortunei (Hook.) H.Wendl. の実生の生育が記2019 年 12 月 1 日に，真鶴半島お林内で確認されたヤはないが，県内各地で栽培株の鳥散布種子由来のシュロ

シ科植物 1 株（図 1）から葉の先端約 10 cm を切り取り，録されている。また，真鶴半島の該当植物について「真DNA 用標本（KPM-NA0306727）とした。

鶴半島のシャボテン公園跡地では，ワシントンヤシと言われているものが種子繁殖して周辺の樹林内に逸出状態

DNA 用標本は冷凍保存し，IsoPlant II（ニッポンジーン）になっている」と記載されている（神奈川県植物誌調査を使用してマニュアルに従って DNA 抽出を行った。抽(Linden ex André) H.Wendl. ex De Bary が当てられているイオ）を使用して精製し，PCR 反応に供した。

出後の DNA は Nucleospin gDNA Clean-up kit（タカラバ会，2018）。ここではワシントンヤシ Washingtonia filifera

が，確実な種同定は実施されていない。複数の種類が街DNA バーコーディングに用いられる国際的なデー

路樹や庭園樹として利用されており，鳥による果実の採タ ベ ー ス で あ る Barcode of Life Data Systems (BOLD) で出の可能性のある母種を絞り込むのは容易ではない。該と matK 遺 伝 子 領 域 が 採 用 さ れ て い る（Erickson et al,は，植物の DNA バーコードとして葉緑体 DNA の rbcL

食によって離れた場所へも種子散布されることから、逸2010）。しかしながら，これらの領域は塩基配列の変異

当植物は稚樹であり，形態での同定が困難であるため，
DNA を用いた分子同定（DNA バーコーディング）を実が比較的少ないことが知られており，同属種間では塩基配列が 100 % 一致して区別できないことが多い。そのた施した。DNA バーコーディングは，生物が普遍的に持っ129

め，葉緑体 DNA の遺伝子間領域（例えば psbA-trnH 領域，Pang et al., 2012）や核 DNA の遺伝子（例えば PRK，RPB2，Thomas et al., 2006）の塩基配列も DNA バーコー
ディングに用いられている。ただし，これらの領域はリファレンスとなる塩基配列が登録されていない場合も多く，また解析対象の分類群に適合した PCR プライマーを用いて分析を行う必要がある。本分析では，ヤシ科の DNA バーコーディングや分子系統解析に用いられている複数の遺伝子領域の PCR プライマーを試行したところ，表 1 に示した葉緑体 DNA の 2 領域（matK，psbA-trnH）と核 DNA のシングルコピー遺伝子 2 領域（CISP5，PRK）について PCR 増幅産物が得られ，その産物を用いて塩基配列を決定した。PCR 反応は KODOne（TOYOBO）を用い，温度サイクルは 94 ℃ 10 秒−（98 ℃ 10 秒− 55 ℃ 5 秒− 68 ℃ 15 秒）× 35 回とした。
アガロースゲル電気泳動で増幅が確認できた PCR 産物は，ExoSAP-IT（ThermoFisher LT）で余剰の dNTP 等を分解した後，PCR プライマーまたはシーケンス用インターナルプライマーを 1 つずつ用いて BigDye Terminatorv3.1 でシーケンス反応を行い，3500 Genetic Analyzer で塩基配列を決定した。得られた塩基配列は，BioEdit 及
び CLUSTAL W を用いてアセンブルと精査，整列を行っ

図 1．DNA サンプルを採取した株（2019 年 12 月 1 日撮影）．

た。系統樹の推定には最尤法を用い，塩基置換モデルとして Tamura-Nei model を，塩基置換速度の分布モデルとして Gamma distribution with Invariant sites (G+I) を使用した。系統樹の各分岐の信頼性については 500 回のブートストラップ分析により評価した。以上の計算には MEGAX (Kumar et al., 2018) を用いた。

表 1．分析に使用したプライマー．* 領域欄の * はシーケンスプライマー，無印は PCR とシーケンス両方に使用したプライマーを示す

名称

配列領域

出典

matKAF

CTATATCCACTTATCTTTCAGGAGT

matKOoi et al. (1995)

matK8RAAAGTTCTAGCACAAGAAAGTCGAmatK

Ooi et al. (1995)

matK-19F

CGTTCTGACCATATTGCACTATG

matK

Molvrey et al. (2000)

trnK2RAACTAGTCGGATGGAGTAG

matK

Johnson & Soltis (1994)

LivmatKintF

CCCATCCATCTGAAAATCTTGGT

matK*This study

psbA_FGTTATGCATGAACGTAATGCTC

psbA-trnH

Al-Qurainy et al. (2011)

trnH_RCGCGCATGGTGGATTCACAATCC

psbA-trnH

This study

CISP5_F

CACAGAGAAGTTAAGTGCCA

CISP5Bacon et al. (2007)

CISP5_R

ATCAAGGAGTACCGTGGCAA

CISP5Bacon et al. (2007)

CISP5_F011

TATTGGGTGAGTTGAGGGCA

CISP5*

This study

CISP5_R586

GTGATGGCATCCTGAAGCTG

CISP5*

This study

PRK-717F

GTGATATGGAAGAACGTGG

PRK

Lewis & Doyle (2002)

PRK-969R

ATTCCAGGGTATGAGCAGC

PRK

Lewis & Doyle (2002)130結領域の分子系統樹を図 2 に，CISP5 領域の分子系統樹を果

図 3 に示す。

，psbA当該ヤシ科植物 DNA から matK 領域（1793 bp）

BOLD system による matK 遺伝子領域の DNA バーコー

，CISP5 領域（612 bp），PRK 領域（646trnH 領域（717 bp）

ディングでは，システムが解析に用いる最大塩基長がのアクセッション番号は LC589974 〜 LC589977 である

たものが Livistona で 10 種あったが，このうちの 8 種はbp）の塩基配列を決定した。DNA データバンク（INSD）

1300 bp（カバー率 72.5 %）であるため，100 % 一致し（表 2）。NCBI BLAST で，カバー率（比較対象塩基数／NCBI BLAST の登録配列全長（カバー率 93 % 以上）の比較では 1– 4 塩基の相違があった。また，ワシントンヤ塩基長）が 80 % 以上あり相同性が高いデータベース登録配列（リファレンス）を検索したところ，matK 領域は

シ属は 4 塩基違いの 99.77 ％一致，シュロは 7 塩基違い

Livistona chinensis と L. saribus (Lour.) Merr. ex A.Chev. の 2の 99.60 ％と長い塩基配列を解析しても違いはわずかで

種 と 100 % 一 致 し，psbA-trnH 領 域 は L. chinensis と 100あった。葉緑体 DNA の遺伝子間配列 (IGS) である psbA-% 一致した。CISP5 領域は L. chinensis，L. saribus，ノコtrnH 領域では Livistona chinensis の登録配列と 100 % 一

ギリヤシ Serenoa repens (W.Bartram) Small の 3 種が 100 %致し，他に 100 % 一致するリファレンス配列はなかっ一致であった。 PRK 領域は 100 % 一致するリファレンた。psbA-trnH 領域は葉緑体ゲノム LSC 領域の逆位反復

スがなく，最も相同性が高いのは Johannesteijsmannia 属

配列 (IR) に近い位置にあり，挿入欠失が多いほか，短の 3 種で 97.84 % 一致していた（表 2）。また，psbA-trnH

い逆位反復配列によるループ構造が認められる。この表 2．塩基配列分析と相同性検索結果．一致度 は一致する塩基数 / 比較対象塩基数で求めた

BLAST 検索結果上位配列

塩基配列解析結果
領域

matK

psbA-trnH

CISP5PRKAccession No.

LC589974

LC589975

LC589976

LC589977

塩基長1793 bp

717 bp612 bp646 bpAcc. No.

種名AM114574

Livistona chinensis

100% (1775/1775)

HQ720335

L. chinensis

100% (1690/1690)

HQ720336

L. saribus

100% (1668/1668)

HQ720341

L. fulva

99.9% (1729/1730)

HQ720342

L. inermis

99.9% (1729/1730)

HQ720344

L. lorophylla

99.9% (1729/1730)

HQ720343

L. mariae

99.9% (1711/1712)

HQ720345

L. benthamii

99.9% (1710/1711)

HQ720334

L. nasomophila

99.9% (1680/1681)

HQ720339L. concinna

99.9% (1710/1712)

HQ720340

L. nitida

99.8% (1739/1743)

AM114586

Washingtonia robusta

99.8% (1771/1775)

HQ720328

W. filifera

99.8% (1716/1720)

AM114570

Trachycarpus fortunei

99.6% (1747/1754)

AB331261

Livistona chinensis

100% (709/709)

GU135381

L. chinensis

100% (584/584)

MK756443

L. chinensis

98.5% (672/682)

MK756449

L. speciosa

98.5% (672/682)

HQ720794

Livistona chinensis

100% (612/612)

HQ720793

L. chinensis

100% (567/567)

HQ720806

L. saribus

100% (612/612)

HQ720834

Serenoa repens

100% (577/577)

HQ720798

L. jenkinsiana

99.3% (608/612)

HQ720799

L. lanuginosa

99.2% (523/527)

KF991988

Johannesteijsmannia magnifica

97.8% (632/646)

KF991725

J. altifrons

97.8% (632/646)

KF991681

J. lanceolata

97.8% (632/646)

131

一致度

図 2．psbA-trnH 領域の最尤法による分子系統樹（各枝の数字はブートストラップ支持確率）．本研究の試料は枠囲みで示した．

ループ構造の 10 塩基が逆転しただけで他の塩基配列が考完全に一致するリファレンス配列が，L. chinensis で 1

配 列（MK756443） と L. saribus，L. jenkinsiana Griff.，L.

察

今回解析した遺伝子領域において、供試個体はビロウ

speciosa Kurz の 3 種であった。核 DNA の機能不明遺伝に最も合致したが、配列が類似した種間の塩基配列の差なったが，ワシントンヤシ属やシュロ属のリファレンス的近年に急速な多様化を遂げた分類群であり、種間の分子イントロンである CISP5 領域でも複数種と同一配列と異が少ない傾向にあった。このことはヤシ科植物が比較配列とは 94–97 ％程度の一致率で明確に異なっていた。

岐の深い他分類群と比較して、種間の DNA 配列の違い

PRK 領域は，ヤシ科の分子系統解析によく用いられていは少ない傾向にあることを反映したものと考えられるる（Roncal et al., 2008, Baker et al., 2011）が，Livistona 属（Hahn, 2002）。このため，1 遺伝子領域だけでは 1 種に絞は使えなかった。ただし，PRK 領域についても福岡市西た。今回分析した領域では psbA-trnH 領域と CISP5 領域や近縁属のリファレンス配列が少なく本試料の種同定にることが難しく，複数領域の塩基配列情報が必要であっ公園に植栽されているビロウの DNA サンプルから同一の 2 つが，比較的塩基配列の変異が多くリファレンス配配列を得ている（大井・山口，未発表）。

列の登録数も多いため，ヤシ科植物の種レベルの同定に以上から，今回分析したヤシ科植物はビロウと判定し有用であった。

た。インドシナに分布するビロウの近縁種 L. saribus も，

ビ ロ ウ は， 東 ア ジ ア の 亜 熱 帯 地 域（ 中 国 南 部 〜 琉

リファレンスが得られている matK，psbA-trnH，CISP5球）が原産とされるが，フロリダ，ハワイ，カリブ海の％一致となるが，本種が真鶴半島に植栽され，生育してており，侵略的外来植物として在来の植生に悪影響をの 3 領域の塩基配列は，psbA-trnH の逆位を除くと 100

バーミューダやインド洋のモーリシャス等で野生化しいる可能性は低いであろう。

与える可能性が指摘されている（CABI Invasive Species132図 3．CISP5 領域の最尤法による分子系統樹（各枝の数字はブートストラップ支持確率）．本研究の試料は枠囲みで示した．

図 4．お林におけるヤシ科植物稚樹の分布確認範囲（地理院タイルに加筆して作成）．

133

。本種は自殖可能な両性花をつけ，結実率Compendium）

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も発芽率も高いことが知られている（Dowe, 2009）。直立する幹の高さが 5 m 程度になれば花序をつけ，果実は鳥や哺乳類によって種子散布される。海岸から標高 600m まで分布し，土壌に関する選好性もなく，幼植物は被陰 に も 強 い（CABI Invasive Species Compendium）。このように，本種は野生化しやすい条件を備えている。国内
では関東以南の暖地で公園樹や街路樹として露地栽培されるが，国内の自生地北限は福岡県宗像市の沖ノ島とされ，主な生育地は九州中南部以南の沿海地や島しょ部である。四国にも足摺岬付近や愛媛県南部の離島で限定的。しかながら分布が報告されている（Yoshida et al., 2000）

し，これまでに本州でのビロウの生育や野生化は報告されていなかった。

今回の DNA バーコーディングによる同定結果が得られた後，周辺地域でのビロウの探索を行った（図 4）。今回のビロウと同様の幹が成長していない 1–2 m の掌状葉をつけたヤシ科植物稚樹はお林の西半分のエリアに点々と 25 株ほどが生育していた。また，お林の西側に隣接する「お林展望公園」に樹高 10 m 弱のビロウと思われる成木が植栽されていることを確認した。お林展望公園の敷地は，1963 年から 2004 年初まで営業していた「真鶴サボテンランド」の跡地であり，この木はサボテンランド時代に植栽されたものと考えられる。この木がお林内に広がる稚樹の親木の可能性もあるが，結実を確認できていない。また，鳥による種子散布が考え得る周辺地域にはお林展望公園以外にもビロウの植栽があり得ることから，お林内の稚樹の由来については，さらなる調査とマイクロサテライト遺伝子多型等を用いた分析を要すると考えられる。

謝辞

調査にあたりお世話になった真鶴町産業観光課に感謝の意を表する。

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大井和之：一般財団法人九州環境管理協会；大西亘：

神奈川県立生命の星・地球博物館（受領 2020 年 10 月 30 日；受理 2021 年 1 月 28 日）

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