平成17年度〔2005〕No.50
宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告

焼酎もろみ中の乳酸菌（第２報）
高山清子＊1・工藤哲三＊1・水谷政美＊1・山本英樹＊1・柏田雅徳＊2

Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolated from Shochu Mash
Kiyoko TAKAYAMA, Tetsuzo KUDO, Masami MIZUTANI, Hideki YAMAMOTO
and Masanori KASHIWADA
焼酎もろみから分離・保存している乳酸菌1, 2)について，プライマーを変えて遺伝子解析の追加試験を行った（16S-23S rDNA解析）。また，焼酎もろみ中に生育する乳酸菌の性質の調査を目的として，それらの乳酸菌の耐アルコール試験，初発pH試験を行った。その結果，焼酎もろみ中に生育する乳酸菌は，幅広いpH，高いアルコール濃度で増殖した。
キーワード：焼酎もろみ，乳酸菌，16S-23S rDNA解析，耐アルコール，初発pH

１

はじめに表１ Type strain

焼酎は南九州の特産品として注目されている。
焼酎の製造工程で使用される白麹および黒麹菌により生成されるクエン酸は，もろみのpHを下げる働きがある。その結果として温暖な気候の下でも雑菌の汚染を防ぎ，安定なアルコールの発酵を可能にする。今回は，高酸度，高アルコール濃度の焼酎もろみに生育している乳酸菌の特性調査を行った。
２実験方法

２−１

供試菌株

供試菌株は県内焼酎もろみより分離，培養した乳酸菌（菌株No.25, 10, 11, 23, 15, 24, 41, 48,102）を用いた。比較として用いたType strainは，16S-23S間のrDNAを増幅した後 ( primer16-(独)理化学研究所（JCM）から入手した（表１）。

1A, 5

２−２ 16S-23S rDNA解析

1B,5 -GGGTTCCCCCATTCGGA-3 ) 塩基配

乳酸菌の遺伝子解析においては，16S rDNA-GAATCGCTAGTAATCG-3,23-列を解析した。PCR，サイクルシーケンスにはとその直後にある23S rDNAとの遺伝子間領域

Gene Amp（intergenic spacer region）の塩基配列で多く

Biosystems, U.S.)，DNAシーケンスにはABI3)

PCR System 9700 (Appliedの菌群が分類可能であるという報告がある 。抽PRISM 310TM Genetic Analyzer（Applied出したゲノムDNAを鋳型として，PCRによりBiosystems, U.S.) を使用した。
２−３ 耐アルコール試験＊1 応用微生物部＊2 現 食品開発センター所長兼食品開発部長

アルコール濃度 (%)：0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5,15, 17.5, 20, 22.5となる10種類のGYP液体培地
117

焼酎もろみ中の乳酸菌（第２報）を調製し，十分に生育した前培養液を１滴接種後，下段の数字のみのものは，焼酎もろみから分離30℃で３日間培養した。増殖の程度は，肉眼およした菌株であり，上段には比較としてType4)

び濁度（OD660）測定により判定した 。

strainを示した。その結果，分離株No.25, 10,２−４ 初発pH試験

11, 24, 41, 102はそのType strainに比べて高い

各種pH条件 ( pH 3.3, 3.5, 3.9, 4.4, 5.8, 7.5, 8.1,アルコール濃度でも増殖した。焼酎もろみに生育8.6, 9.4, 9.8）の10種のGYP液体培地を調製し，する乳酸菌は，アルコール濃度の高い焼酎もろみ十分に生育した前培養液を10倍希釈したもののうで生育することにより，アルコール耐性を獲得しち１滴を接種後，30℃で３日間培養した。増殖のたものと考えられた。

程度は，肉眼での判定および濁度 (OD700）測定に３−３4)初発pH試験より判定した 。また，分離株で最も多く見られた初発pH試験の結果，増殖が確認された試験区

L. paracasei ssp. tolerans/L. paracasei ssp. paracasei

を矢印で示す（図２）。下段の数字のみのものは，についてはBIO-PHOTORECORDER (ADVANTEC

焼酎もろみから分離した菌株であり，上段には比TN-2612) を用いて増殖度を調べた。

較としてType strainを示した。その結果，分離株No.25, 15, 24, 41, 102はそのType strainに比３結果および考察３−１ 16S-23S rDNA解析
1)

前報 に示したように，ほとんどの株は16S
rDNA解析で同定できたが，２株については同定

べ，低いpH下で増殖した。焼酎もろみは，麹菌の生産するクエン酸によりpHが低く保たれている。したがって，このような生育環境で生育する乳酸菌は，耐酸性を獲得したと考えられた。

できなかった。この２株について16S-23S rDNA
解析をおこなった結果，Type strain（JCM1171

L. paracasei ssp. tolerans, JCM8130 L. paracaseissp. paracasei）の塩基配列と一致したことから，
L. paracasei ssp. tolerans/L. paracasei ssp.
paracaseiと同定した。
３−２

耐アルコール試験

耐アルコール試験の結果，増殖が確認された試験区までを矢印で示す（図１）。

図２ 初発pH試験結果
また，焼酎もろみから分離した乳酸菌65株中30株がL. paracasei ssp. tolerans/L. paracasei ssp.

paracaseiであった1) 。そこで，分離株No.25（L.
paracasei ssp. tolerans/L. paracasei ssp.
paracasei）についてBIO-PHOTORECORDER(ADVANTEC TN-2612) を用いて増殖度を調べた。 各種pH条件 ( pH 3.9, 4.3, 5.6, 7.6, 8.1, 8.5）
図１ 耐アルコール試験結果のGYP液体培地を用意した。十分に生育した前培
養液を10倍希釈したもののうち１滴を接種後，118焼酎もろみ中の乳酸菌 (第２報）

28℃で静置培養し，30分間隔で経時的に培養液のμ = ln(A2 /A1 )/ (t2 - t1 )濁度を測定した。その増殖曲線を図３に，誘導期，A : 濁度

比増殖速度，および定常期の濁度（ODmax）を表２t : 時間cに示す。その結果，pHの違いにより，誘導期，増定常期の濁度殖速度，定常期の濁度に差がみられた。pH5.6，7.6の試験区では，他の試験区に比べ誘導期の値が４まとめ小さく，比増殖速度が大きいという結果が得られ

16S rDNA塩基配列解析で解析できなかったた。このことから，短時間で急激に増殖したpH5.6２株について，16S-23S rDNA解析の結果， L.

〜7.6が増殖に適していると示唆された。

paracasei ssp. tolerans/L. paracasei ssp. paracaseiと同定した。耐アルコール試験の結果，焼酎もろみ中の乳酸菌はType strainと比べると高いアルコール濃度で増殖し，Alc10〜12.5%まで増殖した。初発pH試験においてもType strainに比べ，幅広いpHで増殖する菌株があり，焼酎もろみから分離した乳酸菌はpH3.5〜8.6で増殖した。誘導期（Ｌ），比増殖速度（μ），定常期の濁度（ODmax）の結果より，pH5.6〜7.6が増殖に適していた。

図３ pHの違いによる増殖曲線（菌株No.25；L. paracasei ssp. tolerans/L. paracaseissp. paracasei）

５

参考文献

1)

竹下淳子他，宮崎県工業技術センター・食品開発センター研究報告，49，119(2004)

2） 竹下淳子他，宮崎県工業技術センター・食品表２

誘導期（Ｌ），比増殖速度（μ），定常期の濁度（ODmax）

開発センター研究報告，49，127(2004)
3)

G.W.TANNOCK et al，APPL. ENVIRON.
MICROBIOL，65，4264（1992)

μ4)

小崎道雄，内村泰，岡田早苗 :乳酸菌実験マニュアル−分離から同定まで− ，朝倉書店

a

誘導期（lag phase;Ｌ）は，誘導期の直線を時間軸に平行に延長したものと，対数的増殖期の直線を逆向きに外挿した直線との交点をもって，便宜上誘導期の長さとした。
b

比増殖速度（ μ ）は，縦軸に濁度の対数を，横軸に培養時間をとり，得られた直線の傾斜を計算により求めた。
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