◆研究助成金による研究成果報告 4 ◆染 性 人 工 関 節 再 置 換 術 に お け る超 迅 速 メ チ シ リン耐性ブ ドウ球菌診 断法 の 開発
一 超 音 波 処 理 と マ イ ク ロ フ ィル タ ー 濾 過 を 用 い た リア ル タ イ ム

PCR法 の 応 用 一

横浜市立大学 整形外科 Jヽ 林 直実
は じめ に人工関節置換術後 の感 染は最 も重 篤 な合併症 の一つで あ り、そ の治療 には難渋す る ことが 多 い。感染 の確定診断 として、細菌培養法 は現在 一般 的 に行われて いる方法 で あるが、問題点 として迅速性 が十分ではな い点が挙 げ られ る.ま た近年、通常 の細菌培養 だ
けでは菌 の存在 が証 明 で きな い、 いわ ゆる low grade infection"と 言われ る不 顕性の 人工関節周 囲感染 の存在 が注 目され て い る 10,14.21.22

Polymerase Chain Reaction(PCR)法 はそ の迅速性や簡便性 か ら多 くの研 究 がなされてお り、整形外 科領域 で の 臨床応用 も増加 して いる
Real― time PCR法 の迅速性20。

は従来 の細菌培養法 と比 べ極 めて優 れて いるが、検体 の準備段 階 で の DNA抽 出 には 23時 間 を要 し、術 中診断は不 可能で あ った。 われわれは超音波処理 による DNA遊 離効果 に注 目し、簡 易的 で迅速性 に優れ た前処置 を行 い、そ の後 メチ シ リン耐性 ブ ドウ球菌(MRS)に 特 異的な PCRを 施行す る とい う新 しい方法 によ り感 染 の術 中判 断 を可能とした。
本研 究 の 目的 は、 1.超 音波処理 と Real― time PCRに よる細菌 同定法 の検 出限界 を明らか にす る こと、2.本 方法 を実 際 に臨床応用 しそ の有用性 を検 討す る ことで あ る。

が 2検 体 、そ の他 の MRS(Staphylococcushorninis)力 ｀4検 体 、S. aureusが 6検 体 、対象および方法<超 音波処理 による検 出限界 >細菌培養 によ り起炎菌が 同定 されている組織

Streptoc∝ cusが 8検 体 で あった.そ れぞれ のまたは貯留液 26検 体 を用 いて 、超音波 処理後に PCRを 行 った群 (超 音波群 )と 従来 の DNA

検体 を同 一 量 (組 織 :1辺 約 5mm、 貯留液 :約

抽 出後 に PCRを 行 つた群 (DNA抽 出群 )に 分に滅 菌 プラステ ィ ック袋 に入れ超音波処理 を5分間行 い (超 音波処理群)、 もう 1つ は DNA抽

けそれ ぞ れ の PCR増 幅 開始 点(CrOssing200ul)に 2分 割 し、1つ は滅菌水 1000ulと 共出 を行 った (DNA抽 出群)。 そ の後 MecA― gene―をター ゲ ッ トとす る MRS特 異的 Real― time
培養結果はmethicnlin― resistant Staphyl∝ ∝Point)に つ いて 比較 した。 対 象 と した組織 のcus aureus(MRSA)が 6検 体、methicillin― re―sistant Staphyloc∝ cus epidellllidis(N【 RSE)

PCR(MRS― PCR)を 施行 した。超 音波処理群と DNA抽 出群 にお ける Crossing Pointの 相19違 を比較 した。

もの を5検 体認 め、いずれ も組織検 体 であ つた。

<術 中鰺晰の日床応用 >2007年 1月 か ら 2008年 4月 までに当科 で<輌 中鰺 晰 の 日床応 用 >術 中 リアル タイム PCR錮 菌18姜 、病 理所 見の 全 結 果 を Table lに 示 す。 日 菌培 姜 で はMRSAが 2例 、MRSEが 2例 、MRSが 2例 検
出 され 、これ らの うち 4例 で 術 中 PCRは 鵬性 を手術 を施行 した感 染性人工関節 30例 を対象 とした。 手術 の内訳は 人工股 関節 (THA)抜 去が 12例 、THA再 置換が 9例 、 人工藤関節(TKA)抜 去が 3例 、TKA再 置換 が 3例 、その他が 3例 であつた。これ らの手術中に検体 を採取 し、超音波処理後 にマイク ロフ ィルター を用 いた purificationを 行 い、そ の後 Real time

PCRを 行 つた (Fな ure l)。

示 した。術 中PCRが 陽性 で日 菌培養陰性 で あ つたもの を 2例 認 めたが、これ らは いずれ も病理所見で急性炎症反応 の所見を認 めた。日菌培養で MRS以 外 の日菌が薇認 されたものが 5例 認め られたが、 これ らのいずれ も PCRは 陰性 であった。

■青菫饉凛併 用輌中リアルタイム PCR

日菌培養 でMRSが ●38さ れた例をMRS感 染
あ りと診断 した場合、超音波処理機 Real time
PCRの 感度は 67%.特 異度 は 92%で あった。

イ―帯電r一 l■<代 表症例 >73歳 の女性 で、他院 にて人工骨頭置換術後の近位mtratiOnに 対 して人工股関節再■換術が施行されたが、術後数年でゆるみを認め当科紹介受診とな った。初鰺時 の 単純 X線 像 にて臼…
…

…

…

F:ctre l
また同一部位 の検体 に対 し痢理担繊評価および日菌培姜を施行 した。Real‐ ■m,PCRの 結果
はその他の検査結果と合わせて人工関節再置換か抜去か の判断 の材料 とした。基本的 に MRSた。

断で手術 を施行 した。術中 に採取 した検体に対して超音波処理機に Real ume PcRを 施行 した。 MRS‐ PCRに お いて 陽性 で あつたため(Fture 2)、 人工関節抜去術 を施行 した。

ε ｔ ●メ ● ８ う■

感染陽性 と判断 された場合は人工関節再臓換術を施行せず にバンコマイ シン充墳 ハイ トロキシ
アパ タイ トプロックまたはセ メン トスペーサ ーの留置 を行 い 2期 的再置換術 を第 一 選択 とし董 コンポーネン ト周囲 の骨透亮像 を認 めた。血液検査 上 CRP値 は 304mg/dlと 上昇を88め たが、局所炎症所見や全身熱発な ど感染 を疑わせる所見は認 めなかった。人工殷目節ゆ るみ の診

Ｅ︐結果諭

MRS
tの 相違は、<燿 音波処 理 によ る検 出口 昇 >超音波処理群 と DNA抽 出群 との Crossing
PCRで 平均28(04〜 4.1)サイクルであ り、超音波処 理群 では検出サイクルの運延を認 めた。 DNA抽 出群 で陽性 となったにもかかわ らず超音波処理群で陰性 となった

20――Fiau(e 2Tabに 1 全症例 における PCR、 細菌培養、病理所見結果

No. Prosthesis

Operation

PCR

1H'p

Revision (two-stage)

2H'p

Revision (two-stage)3

Hb

lrrplant removal

4Hblnplant removal

+

5

H'p

lrrplant removal

+

6

Hip

lnplant removal

十7

Hip

Revision (two-stage)8

H'p

lrrplant removal

9

Knee

lrrplant removal

10

Kree

Revision (two-stage)

11Hb

Revision (one-stage)

12

Hb

Revision (two-stage)

13

Hlc

Revision (ore-stage)14

Hb

lrrplant removal

15

Knee

Revision (two-stage)

16

Knee

lrrplant removal

17

Hip

lrrplant removal

18

Hip

lnplant removal

19

Knee

lnplant removal

20

Knee

HA block r@lacement

21

H'p

Revision (two-stage)

22

Kree

HA block replacement

23

Hiplrrplant removal

24

Hip

Revision (one-stage)

25

Hip

Implant removal

26

HipImplant removal

27

Hip

Revision (rwo-stage)

28

Knee

Revision (cwo-stage)

29

Knee

Debridement

30

Hip

Revision (cwo-stage)

CultureHistopathology

MRS+

MRSA
MRSE
MRSE+十+++・MRSA+

Streptococcus+

Streptococcus

十S. aureus

十十+S. aureus+

一N,RS＋CNS

９

人工関節抜 去時 術 中 ReJ― ume PcR結 果 2検体 で PCR陽 性 が確認 され、MRS感 染 と診 断 した約 6ヵ 月 の待機 期 間 の後 、 術 中 Real― time

PCRお よび迅 速病理 診断 によ り感 染が沈 静化して いる ことを確 認 し、 再置換術 を施行 した。
術後 6ヵ 月現在、感 染 の再燃 は認 めて いな い。

<考察>

診 断 に 関す る研 究 は盛 ん に行 われ て いる 17,18
が、 整形外科 領域 にお け る臨床応 用 は少 な く
6.8,9、

Realtime PCR法 を用 いて 術 中 に起 炎菌同定 を行 うという試みは本研究が初めてであると思われ る。
超音波処理 によ り細 菌性 DNAが 遊離 され る
ことは過去 に報告 されて いるが 3,12、 本研究 では従 来 のDNA抽 出法 と比較 した場合 は感度 が人工関節周 囲感染 の診断は時 に困難な場合があ り、い くつか の検査所見 を合 わせた慎重 な判低下す る ことが示 され、本方法 の 限界 の一つである。膿や関節液な どの液状検体 にお いて は超断 を要す る 116。 特 に再置換術 の際 には 1期 的再置換 を行 うか、または 2期 的再置換 として人工音 波 の効果 は波及 しやす く、感 度低 下 は少なか つたが、組織検体 では感度 の低下 によ り検 出関節抜去 を行 うか の判 断や、感 染が沈静化 しているか否か の判断 は非常 に重 要 で ある。本研 究不能 で あった症例 を認 めた。 また PCR法 は細菌性 DNAを 検 出す るので、既 に活性 を失 つた

では Real― time PCR法 を臨床応用 し、MRS感死菌 を検 出す る可能性 があ る。そ のため抗菌薬投 与 下 で 細 菌 培 養 が 陰 性 とな る場 合 で も、染 の有無 につ いて 術 中 に判断 を行 った。
本研究 で用 いた迅速診断法 にお ける最 も大 き

PCRは 陽性 とな る可能性 は十分 にあ る。Real―な特徴 は、検体 に対 して通常 の DNA抽 出を行わず、超音波処理 によ り簡 易的 に細菌性 DNA

time PCRの 結果 はあ くまで一 つの判断材料 でを遊離 させ、それ を精 製す る ことによ り微 量な

検査所見 を加 味す る ことが重 要 で あ る。本方法ではDNA抽 出 を行 わな いため に感度 は若千低

DNAを 検 出す る点で ある。Realtime PCRとしては MRSに 特 異的 な MRS― PCRを 用 い た。

あ り、必ず 病理組織 、肉眼所見、そ の他 の術前検体採取か ら結果 を得 るまで に約 80〜 90分

下す る ものの、術 中診 断 とい う画期 的な迅速性を得 る ことが可能 とな り、感度 90%、 特 異度とい う迅速性 を実現 させ、一般 的な人工 関節再78%は 臨床応 用 にお いて十 分許容 され る もの

置換術 の術 中 に感 染 の有 無、起炎菌 (MRS)の確 認 を行 う ことがで きる。 MRS感 染が確定すである と考 える。今後 さ らに迅速性 を高める工夫 とともによ り高 い感度、特異度 を実現す るた

ればバ ンコマイ シン充填 アパタイ トブロ ックなどを留置 し、術直後 よ リバ ンコマイ シン、まための研究 が必要で ある。

は感染程度 によっては リネ ゾ リ ドの全身投与 を<ま とめ >開始す る。

超音波処理後 に MRSに 特 異的な Real time
PCRを 施行 し、 人工関節再置換術 中 に起炎菌

整形外科 領域感 染症 にお ける PCR法 の 臨床応用 として はMarianiに よる報告 Hが 最初 で あり、TKA後 の 関節液 に対 して PCRの 有用性 を述 べ て いる。そ の後 い くつか の研 究が報告 され同定 を試 みた。感度 は 67%、 特異度 は 92%であった。DNA抽 出 を行 つた場合 と比 べ 、感度の低下 を認 め るが、高 い特 異性 を示 し、そ の迅てお り2,19、 従来 の Conventional Universal
PCR法 につ いて は否定 的な もの4,15を 散見す る

速性 による術 中起 炎菌 同定 は臨床的意 義 が高く、今後 の さ らな る感度、迅速性 改善 の ため のものの、近年は様 々 な新 しい方法 と組み合わせた方法 による臨床応用 の可能性 が注 目されて い研究 が必要で ある。

る5,7,13。 Real― time PCR法 は比較的近年 に開発され た PCR法 で あるが、 そ の迅速性 と簡便性

<謝 辞 >の点 で様 々な分野で の臨床応用が報告 されて いる。 特 に血液培養ボ トル にお け る MRSA迅 速

本研究 は財団法人 日本股関節研究財団 の研究助成 によ り行 われた。

つ４つ４

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