博 士 （ 医 学 ） 飛 駻 陽 子
学 位 論 文 題 名

脂肪毒性下におけるsmall:N/Iaf因子の膵r8細胞調節機構
学位 論文内容の要旨【背景と 目的】 2型糖 尿病に おける病 態の主因 は，イ ンスリン抵抗性と膵B細胞の機能低下と考えられる。耐糖能が正常な肥満者では，膵ロ細胞量が増加し，インスリン抵抗性をインスリン分泌を増加させることで代償するが，膵ロ細胞量が減少すると耐糖能異常が出現する。2型糖尿病患者における膵D細胞量の経時的減少の主因は，糖毒性と脂肪毒J陸である。
遊離脂肪酸などは膵島機能を障害し，高濃度の脂肪酸暴露はインスリン遺伝子の発現を低下させる。
インス リン遺伝 子プロモ ーター に存在す るCl/RIPE3b領域(MafResponsiveElement：MARE)に 結合する 転写因子 MafAは，largeM
af群に 属し，膵 ロ細胞特異的に発現する。その発現は短時間のグルコース刺激では増加し，長時間のグルコース刺激や酸化ス卜レス下では減少する。脂肪酸（パルミチン酸）暴露は，MafAmRNAの発現減少によルインスリンの発現を減少させる。
Small M
af群 には，分 子量約 18kDaの相 同性の 高いMa
fF，MafG，MafKがあり，転写活性化ドメインを欠如する。SmallMafは全身の多くの組織で発現し，酸化ストレス下で発現が誘導され，プロモーター上のARE/StreB/
EpRE
配列に結合し抗酸化物質の発現を誘導するが，膵ロ細胞 におけ るsmall Ma
fの発現や 機能に っいては これまで 明らか にされて いない 。
本研究では，高脂肪食負荷マウスの単離膵島を用いてsmallMaf発現量を検討した。次に，
膵ロ細胞 株を用 いて脂肪 刺激下 における各smallM
afm
RNAの発現をりアルタイムP
CR法により 評 価 し， レ ポ ータ ー ア ッセイに より脂肪 刺激下 のインス リンの 発現を検 討した 。
【材料と 方法と 結果】ま ず，肥 満や脂質代謝異常を伴う2型糖尿病モデルマウスとして高脂肪食を負荷したマウスを用い，生体内における血糖値と遊離脂肪酸，中性脂肪が上昇した状態において，高脂肪食群の単離膵島内のsmallM
af発現が増加していることをウエスタン
ブロツ卜法にて確認した。また，膵ロ細胞に対する糖毒性の影響を直接評価する目的で膵ロ細胞株を用いグルコース濃度を変えsmallMafの発現を確認したが変化は認めず，糖毒性により発現 が変化 するMa
fAと は異なり，smallM
afの発現調節に糖毒性は関与しないことが示唆された。
高脂肪食群の膵島細胞における現象は，脂肪毒性により引き起こされると仮説を立て，飽和遊離脂肪酸であるパルミチン酸を膵ロ細胞株に添加する実験を行った。これまでのsmallMafに関する報告では，酸化ストレス物質であ丶る過酸化水素や生体異物への暴露によって，smallMafの転写促進が認められているが，MafF，MafKと細胞外ストレスについての報告はほとんど なく不明な点が多かった。このためMafF，MafG，MafKそれぞれの発現の違いを確認する目的で，特異的なプライマーを設定した。ここではパルミチン酸の膵ロ細胞への純粋な影響を見るためにグルコース濃度は生理的濃度である5． 5mMに固定した。M
afF，MafKの発現はmRNAレベルで増加し，パルミチン酸刺激を除去することにより発現増加が抑制された。
脂肪刺激によりsmallMafの核内移行によってその転写活性が調節されるか否かを検言寸した。細胞質成分と核抽出物に分離しウエスタンブロット法により解析した結果，脂肪刺激によるsmallMaf
蛋白の細胞内局在に変化はなく，恒常的に核内に存在し，その発現が誘導されることを確認した。
‑ 272―

インスリン遺伝子プロモーター上に存在するM
AREを介して転写調節が行われているかを解析した 。MI
N6細胞にインスリン遺伝子プロモーター領域のM
A
R
Eを含んだ野生型ルシフェ
ラーゼベ クター と，small MafとしてF
lag−Maf
KまたはMockを強制発現させルシフェラー
ゼ活性を 測定したところ，Flag
一Maf
Kの導入により4分の1程度までインスリン転写活性が低下した 。さら に，small MafのMAREへの結合を確認する目的で，F
lag―Maf
KまたはMockを強制発 現させ 抗F
lag抗体を 用いてクロマチン免疫沈降を行ったところ，Flag‑MafKを導入したサ ンプルではM
A
REを含んだインスリンプロモーター領域が増幅されバンドが検出され た が ， Mockを 導 入 し た サ ン プ ル で は バ ン ド が 検 出 さ れ な か っ た 。
次に，smallMafによるインスリン遺伝子転写活性に対する影響を検討するため，インス
リン遺伝 子プロモーター領域のMA
REを含むルシフェラーゼベクターを用い実験を行った。
インスリ ン遺伝子転写活性を上昇する因子のーっとしてMaf
Aが挙げられるが，Maf
Aは脂肪毒性によって発現が低下することが報告されているため，インスリン遺伝子転写活性を上昇させる他の因子として，LargeM
af群のーっであるc−Mafを使用した。c―Maf
導入により誘導されたインスリン転写活性がパルミチン酸刺激により抑制される機序として，smallMafの発現増加が考えられた。以上より，膵ロ細胞において脂肪刺激下では，smallMafの発現が 転 写 を 介 して 増 加し ， イ ンス リ ン転 写 活 性を 低 下 する こ とが 示 唆 され た 。
【考察】 膵ロ細 胞にはイ ンスリン 発現を 増加させ る因子 としてMafAが 存在し ，2型 糖尿病の病態である酸化ストレスや脂肪毒陛下では，その発現や安定性の低下が確認されている。
一方，転写活性ドメインを欠きインスリン転写活性を低下させるsmallMafも膵ロ細胞内に発現して いることが確認され，脂肪毒性存在下でその発現が増加することから，MAREを介して両者が競合し，ストレスなどの細胞外環境に応じてインスリンの発現やロ細胞機能を調節している可能性が想定された。
本研究により，2型糖尿病でみられる脂肪毒性に伴うインスリン発現の低下にはsmallMafが関与し ている ことが示 唆された 。今後，勝ロ細胞内の転写因子MafAとsmallMafの相互作用をより詳細に解明することにより，2型糖尿病の発症と進展への新たな病因解析が可能になり，2型糖尿病の新規治療への発展が期待される。
【 結 果 】 高 脂 肪 食 負 荷 マ ウ ス の 膵 島 細 胞 で は small Mafが 増 加 し て い た 。
膵B細 胞株では，グルコース濃度によるsmallMafの発現には変化を認めないが，脂肪刺激によってMaf
F，MafKのmRNA発現は増加した。またsmallMafの蛋白発現は増加した。S
mallMafは脂肪刺激により，恒常的に核内に存在した。
脂肪刺激によって増加したsmallMafは，インスリンプロモーター領域のMAREを介して，インスリン遺伝子転写活性を低下させた。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 筒 井 裕 之

学 位 論 文 題 名

脂肪毒性下におけるsmallrv
Iaf因子の膵r8細胞調節機構
2型糖 尿病患者 における膵B
細胞量の経時的減少の主因は、糖毒性と脂肪毒性である。遊離 脂肪酸 などは膵 島機能を障害し、高濃度の脂肪酸暴露はインスリン遺伝子の発現を低下させることが知られている。
インスリ ン遺伝子プロモーターに存在するM
afR
espon
siveElement：M
AREに結合する転写 因子MafA
は 、膵ロ 細胞特異 的に発現 する。SmallM
af群には相同性の高いM
afF、MafG、MafKがあり、 転写活 性化ドメ インを欠 如する。SmallM
afは全身の多くの組織で発現し、酸 化スト レス下で 発現が 誘導され 、プロ モーター上のAREなどの配列に結合し抗酸化物質の 発現を 誘導する が、膵 ロ細胞に おける smallMafの発現や機能にっいてはこれまで明らかにされていない。
生体内に おける血糖値と遊離脂肪酸、中性脂肪が上昇した状態において、高脂肪食群の単 離膵島 内のsmallMaf発現が増加していることを確認した。また、smallMafの発現調節に糖毒性は関与しないことが示唆された。パルミチン酸刺激によりMafF，MafKの発現はmRNA
レ ベルで 増加し、 パルミチン酸刺激を除去することにより発現増加が抑制された。脂肪刺激 により 核内移行 によってその転写活性が調節されるか否かを検討し、蛋白の細胞内局在に変化はなくその発現が誘導されることを確認した。
MIN6細胞にMAREを含んだ野生型ルシフェラーゼベクターと、Flag―MafKを強制発現させル シフェ ラーゼ活 性を測定したところ、インスリン転写活性が低下した。抗Flag抗体を用い てクロ マチン免 疫沈降を行い、Flag
一MafKを導入したサンプルではMAREを含んだインス
リンプロモーター領域が増幅されバンドが検出された。smallMafによるインスリン遺伝子
転 写活性 に対する 影響を検討するため、インスリン遺伝子プロモーター領域のMAREを含むルシフェラーゼベクターを用い実験を行った。c‑Maf導入により誘導されたインスリン転写活性がパルミチン酸刺激により抑制される機序として、smallMafの発現増加が考えられた。
以上より、膵ロ細胞において脂肪刺激下では、smallMafの発現が転写を介して増加し、インスリン転写活性を低下することが示唆された。
small Mafは脂 肪毒性 存在下で その発 現が増加することから、MAREを介してMaf
Aと競合
し 、スト レスなど の細胞外環境に応じてインスリンの発現や口細胞機能を調節している可能性が想定された。今後、MafAとsmallMafの相互作用をより詳細に解明することにより、2型糖 尿病の発 症と進展への新たな病因解析が可能になり、2型糖尿病の新規治療への発展が期待される。
学位公開 発表にお ける質 疑応答は 、畠山 鎮次教授から脂肪刺激によるsmallMaf発現増加 までの 機序にっ いて、 また、リ ポータ ーアッセ イを使い インス リン遺伝子転写活性をsmallM
af発現増加によって抑制する実験においてc一Mafを使用した理由と実験結果について の説明 、脂肪毒 性とし て遊離脂 肪酸以 外にTGやス フイン ゴミエリ ンなどで同様の反応‑ 274―

が起こるか、その他のlarge Maf（例えばc一Maf)
はMAREに対して拮抗作用があるのではないかという質問があった。
次いで筒井裕之教授からロ細胞 内で機能的にインスリン分泌を抑制するということはどういう意味をもつのか、また、smallM
afを増加させることは糖尿病の治療に使えると思う
か 、 small Mafに よ る 抗 酸 化 メ カ ニ ズ ム 、 ス ト レ ス応 答に っ いて の質 問が あっ た。
最後に小池隆夫教授からパルミチン酸は脂肪毒陸と同じと考えてよいのか、また、smallMaf
はlarge Mafと競合することに よってM
AREを介してインスリン遺伝子転写活性を調節しているという概念でよいか、数 的なものではなく質的にM
AREに与えるsmallMaf、Maf
Aの影響を検討しているか、インス リン分泌増加やがてはロ細胞量低下はM
afAとsmallMafの競合だけで説明が出来るか、2型糖尿病治療に対する治療展望についての質問があった。
いずれの質問に対しても、申請者 は、現在報告されている事と自身の実験結果を引用し、質 問 に 対 し て ま た 、 small Mafの ロ 細 胞 内 の 機 能 に っ い て 回 答 し た 。
この論文は、脂肪毒陛下におけ る膵ロ細胞内のsmall Mafの 機能を解析したことで高く
評 価 さ れ 、 今 後 の 2型 糖 尿 病 の 病 因 解 析 や 治 療 へ の 応 用 と し て 期 待 さ れ る 。
審査員一同は、これらの成果を 高く評価し、大学院過程における研鑽や取得単位なども併せ 申請 者 が博 士（ 医学 ）の 学位 を受 ける のに 充分 な資格を有するものと判定した。

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