博 士 （ 医 学 ）繩 手聡

Reciprocal changes in endothelium‑derived hyperpolarizing
factor‑and nitric oxide‑system in the mesenteric arteryof adult female rats following ovariectomy（ラット腸間膜動脈の内皮由来過分極因子系とNO系は卵巣摘出により逆方向に変化する）

学位論文内容の要旨
く背景及び目的冫
エストロゲン補充療法が閉経後女性での心血管イベントのりスクを減少させること
は疫学的データからもよく知られているが、その機序は完全には解明されていない。
その機序の解明のために、卵巣摘出動物の血管を用いて弛緩反応の変化が検討されてきたが、これらの研究は一種類の血管における一種類の血管弛緩因子の解析に限られていた。すなわち大動脈などの伝導血管でのNOもしくは腸問膜動脈などの抵抗血管での内皮由来過分極因子(EDHF)などである。一般的には血圧調節には抵抗血管が重要で あり 、また抵抗血管は大血管と異なり、弛緩因子としてNOおよびEDHFの両者を遊離することが知られている。そこで本研究では、腸間膜動脈を用いて、卵巣摘出 に よ る EDHF系 と NO系 の 変 化 お よ び そ の 機 構 に つ い て 検 討 し た 。
く方法冫
40週齢雌性Wistarラットを、偽手術施行群(CON)、卵巣摘出術施行群(OVX)および卵巣摘出術後エストロゲン補充療法施行群(OVX+E2）の3群に分け、4週間飼育後に実験に用いた。摘出した腸間膜動脈を用いて血管平滑筋の膜電位測定および等尺性張力測定を行った。膜電位測定および張力測定は常法のごとく行った。腸間膜動脈の弛緩反応の測定はフェニレフリン処理により前収縮させた後、AChを投与することにより行った。遮断薬のない場合を全弛緩反応とし、COX阻害薬（インドメタシン）とCa活性化Kチャネル遮断薬（アパミンとシャリブドトキシン）存在下におけるAChに よる 弛 緩 反 応 を NO誘 発 性 弛 緩反 応と し， COX阻 害薬 とNOS阻 害薬(L‑NOARG)
存在下におけるAChによる弛緩反応をEDHF誘発性弛緩反応とした。腸間膜動脈から抽 出した total RNAを 用い 、RTPCRを 施行 した 。Western blot法を 用い て、
cohne
xin(cx)‑40，cx‑43，eNOS，cal
modu
lin，heatsho
ck prote
in 90(hsp90)，
caveo
lin‑l，iNOSの蛋白レベルを定量した。
く結果冫
OVX群では子宮重量と血漿17ロ‑estradiolは減少し、血中NO代謝物、総コレステ
ロ ー ルは 増 加 し た 。 血圧 と 心 拍 数に変 化は みられ なかっ た。
OVX群の 腸間 膜動 脈に おいて は、 AChによ って 誘発 される EDHFを介した弛緩反―313―

応と膜過分極反応は減少したが、ACh誘発性のNOによる弛緩反応は増加した。また
AChによ る全弛緩反応は変化しなかった。OVX群及び対照群において、EDHFによる弛緩反応はgapju
nction遮断薬である18ロ・グリチルリチン酸の投与によりほぼ完全に抑制された。
OVXによりgap j
unctionの主要構成成分であるcx‑40、cx‑43の蛋白レベルは減少した。eNOS及びその活性化因子であるcalmodulinやhsp90のレベルは変化しなかったが、eNOS抑制因子であるcaveo
lin‑lは減少した。またiNOSレベルが増加した。
eNOSおよびiNOSの収縮反応への寄与を検討するためフェニレフリン収縮に対する各 NOS阻害薬の影響を検討した。対照群の収縮反応は非特異的NOS阻害薬（両NOSを阻 害）であるL‑NOARGにより増大したが、iNOS特異的阻害薬であるアミノグアニジンでは変化しなかった。OVX群のフェニレフリン収縮は減弱していたが、L‑NOARGにより対照群と同程度まで回復するとともに、アミノグアニジンにより増大した。
OVX+E2群 で は OVX群 で生 じた 全て の変 化が 対照 群のレ ベル に戻 った 。 ，く考察冫OVXはラ ット 腸間 膜動 脈の EDHFによ る弛 緩反 応を減弱させたが、NOによる弛緩反応を増強する結果，全弛緩反応には影響を与えなかった。すなわちエストロゲン
低 下は 内 皮 依 存 性の 血 管 弛 緩 反 応に は 影 響 を 与え な か った。
EDHFによる反応は186．グリチルリチン酸によりほぼ完全に抑制されることから
ラット腸間膜動脈におけるEDHFの本体はgap j
unctionを介した内皮細胞から平滑筋細胞への膜過分極の伝達と考えられた。エストロゲン欠乏におけるEDHF
反応の減弱はgap junctionの主要構成成分であるcx‑40，cx‑43の蛋白レベルの低下が原因であると考えられた。ラットのcx‑40，cx‑43遺伝子のプロモーター領域にはエストロゲン応答エレメント(ERE)が存在しており、cx‑40やcx‑43の蛋白レベルの変化はおそらくEREを介した転写調節によると考えられる。
エストロゲン欠乏におけるNO弛緩反応の増強は、caveol
in‑l蛋白レベルの減少によって生じるeNOS活性化の増強及びiNOS蛋白レベルの増加が原因であると考えられた。caveolin‑1のプロモーター領域にもEREが存在しており、cx‑40，cx‑43と同様なメカニズムによりcaveolin‑lが減少すると考えられた。iNOSのプロモーター領域にはEREは存在しないが、NF‑KB，AP‑1の転写因子の結合領域を持っことが報告されている。エストロゲンレセプターがこれらの部位に対し抑制的に働くことが知られており、このメカニズムによっておそらくエストロゲンがiNOSを制御していると考えられた。
フ ェニ レフ リン による収縮はOVX群において減少し、L‑NOARGにより対照群と同レベルまで増強した。これは，OVX群の動脈が対照群に比べてより多く．のNOを放出することを示す。対照群では収縮はアミノグアニジンにより変化せず、OVX群で増強し た。 これ はOVX群でiNOSによるNO産生が亢進していることを示し、Western
blotでのiNOSレベルの増加と一致する。L‑NOARG投与後の収縮とアミノグアニジン投 与後 の収 縮量 の差 はeNOS由来 のNOが関 与す る部分とみなされるが、OVX群でその差は増大した。これは、eNOS抑制因子であるcaveol
in‑lレベルの減少の結果と一致する。
以上の結果、エストロゲン欠乏は血管径には影響を与えないが、iNOSレベルの増加による過剰なNO産生は血中コレステロール増加とともに動脈硬化促進的に作用することが明らかとなった。

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学 位論文審査の要 旨主 査 教 授 筒 井 裕 之
副 査 教 授 三 輪 聡 一
副 査 教 授 吉 岡 充 弘

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ng ovariecto
my（ラット腸間膜動脈の内皮由来過分極因子系とNO系は卵巣摘出により逆方向に変化する）

エストロゲン補充療法が閉経後女性での心血管イベントのりスクを減少させること
は疫学的データからもよく知られているが、その機序は完全には解明されていない。
その機序の解明のために、卵巣摘出ラットの腸間膜動脈を用いて、内皮由来過分極因子くEDHF)系とNO系の変化およびその機構について検討した。卵巣摘出によるエスト ロゲ ン減少は、AChによって誘発されるEDHFを介した弛緩反応と膜過分極反応を減弱させたが、その一方AChによって誘発されるNOによる弛緩反応を増強させた。
そ の結 果AChによる全弛緩反応には影響がないことが確認された。EDHFによる反応がギャップジャンクション遮断薬の投与によりほば完全に抑制されることから、ラット腸間膜動脈におけるEDHFの本体はギャップジャンクションを介した内皮細胞から平滑筋細胞への膜過分極の伝達であることが確認された。エストロゲン減少によるEDHF反応減弱のメカニズムとして、ギャップジャンクションの主要構成蛋白質であるconnexi
n‑43，40の減少が原因であることが確認された。ラットのconnex
in‑43,40遺伝子のプロモーター領域にはエストロゲン応答エレメント(ERE)が存在しており、connexm蛋白レベルの変化はEREを介した転写調節が関与している可能性が示唆された。
エストロゲンの減少によって、eNOS及びにその活性増強因子であるcalmodu
lin,hsp90の蛋白レベルには変化はなかったが、eNOS活性抑制因子であるcaveolin‑lの蛋白レベルの低下を認めた。このことからエストロゲン減少におけるNOによる弛緩反応の増強は、caveol
in．1蛋白レベルの減少によって生じるeNOS活性化の増強が原―315―

因であることが確認された。caveoli
n‑lのプロモーター領域にもEREが存在しており、
connexin‑43，40と同様なメカニズムによりcaveol
in‑lが減少することが示唆された。
フェニレフリン収縮に対する各種NOS阻害薬を用いた実験において、卵巣摘出群の腸間膜動脈での収縮反応の減弱が認められた。この原因としてはeNOS由来のNO産生の亢進及びにiNOS由来のNO産生が亢進していることが確認された。卵巣摘出群でのiNOS蛋白レベルの増加はWestern blotによっても証明されている。iNOSのプロモーター領域にはEREは存在しないが、NF‑KB，AP‑1の転写因子と結合する領域を持つことが報告されており、エストロゲンレセプターがこれらの部位に対し抑制的に働くことが知られており、このメカニズムによってiNOSが制御されていると考えられた。
以上から卵巣摘出でのエストロゲンの減少により、EDHF系とNO系が逆方向に働くことで、血管径自体には影響を与えないが、iNOSの増加に伴う過剰なNO産生と血中コレステロール増加の影響が、動脈硬化促進性に作用する可能性が示唆された。
口頭発表に際し、吉岡教授からは、卵巣摘出モデルにおける体重増加のメカニズムについて、ギャップジャンクションを介する過分極伝達のメカニズムについて、iNO
S由来のNOと動脈硬化の関連について、血管内皮細胞におけるエストロゲンレセプターの局在にっいての質問があった。三輪教授からは今回の研究の意義及び過去の研究との相違点にっいての意見が述べられた。筒井教授からはエストロゲン補充によるEDHF反応 の回 復の メカ ニズ ムに つい て、エ スト ロゲンの急性効果におけるEDHF反応への影響についての質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は研究結果に基 づいて 、あ るいは 文献 的知識 によ り、概 ね適 切に回 答し 得た。
この論文は、卵巣摘出におけるエストロゲン減少でのEDHFとNOの変化及びにその機序を明らかにしたものとして意義のあるものと評価された。審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑚や取得単位なども併せ、申請者が博士 （ 医 学 ）の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た。

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