Jpn J Clin Ecol（Vol.25 No.2 2016）

82

総説

シンポジウム

病院待合室における細菌叢の実態
柳 宇

加 藤 信 介

永 野 秀 明工学院大学

藤 井 結 那光 岡 眞 知 子

建築学部

Microbiome in a Japanese Hospital Waiting Rooms
U Yanagi, Shinsuke Kato, Hideaki Nagano, Yuina Fujii, Machiko Mitsuoka
School of Architecture, Kogakuin University

要約

細胞核の中にある遺伝情報（genetic information）の本体である DNA の二重らせん構造が解明されたのは1953年であった。その後、1977年にイギリス人 Sanger が DNA 塩基配列決定するためのサンガー法を開発し、1985年にアメリカ人 Mullis が PCR 法と呼ばれる遺伝子配列増幅方法を開発した。PCR 法の開発によって、関連研究がさらに急ピッチで進んできている。1995年に細菌ゲノムの完全配列が決定された。
また、2010年に次世代シークエンサーが開発された契機に、近年微生物ゲノム解析関連の研究が急に進み、これまで知られていない細菌に関する膨大な情報を得ることができるようになった。
本報では、微生物 DNA 解析の略史、DNA 解析の原理と現状を紹介したうえで、筆者らが実施した病院待合室環境中の細菌叢に関する調査の結果について述べる。次世代シークエンス解析により、不特定多数の人が集まる場所である病院の待合室に多くの病原性細菌が存在している可能性が明らかになった。また、待合室から検出されている菌のうち、まだ病原性についてわかっていない細菌も多く含まれており、今後病原性の解明により、より多くの詳細な情報が得られる。
（臨床環境 25：82－87，2016）《キーワード》病院待合室、マイクロバイオーム、実態

Abstract
The double helix structure of DNA (Deoxypentose Nucleic Acids) which is the main part of genetic
information in a nucleus was clarified in 1953. Then, the Sanger method to make a DNA base sequence
decision was developed by British Sanger in 1977. American Mullis developed the genome sequence
amplification method called the PCR (polymerase chain reaction, polymerase chain reaction) method in1985. By development of the PCR method, related research increased notably. The full arrangement of

受付：平成28年９月18日，採用：平成28年９月19日
別刷請求宛先： 柳 宇
工学院大学建築学部〒163-8577 新宿区西新宿1-24-2

臨床環境医学（第25巻第2号）

83

a bacteria genome is determined in 1995. Moreover, by using the next-generation sequencer developedin 2010, the research on bacterial genome analysis can increase suddenly in recent years, and the huge
information about the bacteria which are not known until now can be acquired now.
This paper describes the results obtained by the investigations about Microbiome in hospital waitingroom, after introducing the history of microbe DNA analysis and the principle and the present conditionof DNA analysis. A possibility that many pathogenic bacteria existed in the waiting room of the hospitalwhich is the place in which many and unspecified persons gather in became clear by the next-generation
sequence analysis. Moreover, many bacteria which are not known about pathogenicity yet among thebacilli detected from the waiting room are also contained, and many detailed information is acquired
more by elucidation pathogenic from now on.
(Jpn J Clin Ecol 25 : 82－87, 2016)《Key words》

Ⅰ．微生物ＤＮＡ解析の略史

1985年にアメリカ人 Mullis によって開発された

微生物の存在が人間によって初めて確認されたPCR（polymerase chain reaction、ポリメラーゼのは17世紀に入ってからである。記録によれば連鎖反応）法と呼ばれる遺伝子配列増幅方法であ1673年にオランダ人 Leeuwenhoek が自ら制作しる。Mullis は 9 年後の1994年にノーベル化学賞をた顕微鏡で“小動物”（微生物）を観察したとい受賞した。Mullis はドライブ中に PCR 法を閃き、う。約200年後の1860年にフランス人 Pasteur がその場でメモをとったと伝えられている。

肉汁ブイヨンを用いて、空気中の微生物の存在をPCR 法の開発によって、関連研究がさらに急証明し、1881年にドイツ人 Koch がジャガイモをピッチで進んできている。1995年に細菌ゲノムの主成分とする固形培地を用いて空気中から微生物完全配列が決定され、2003年 3 月に起きた集団感の 分 離 に 成 功 し た 。1884年 に デ ン マ ー ク 人

染の SARS の病原体である SARS Co-V の DNA

Gram がグラム染色法を開発し、細菌をグラム陰配列を決定するのに 2 か月も要しなかった。

１）性菌とグラム陽性菌に分類した。1889年にオラン
ダ人 Beijerinck がウイルスの概念を提唱した。微生物構造の解明はその64年後であった。

Ⅱ．ＤＮＡ解析の原理と現状

図 2 に DNA の 構 造 を 示 す。DNA は リ ン 酸

1953年にイギリス人 Watson と Crick の 2 ペー（P）、デオキシリボース（OH）、および 4 つの塩ジの論文が Nature 誌に掲載された 。その論文

基（アデニン A、グアニン G、シトシン C、チミの 内 容 は 細 胞 核 の 中 に あ る 遺 伝 情 報（geneticン T）から構成される。二重らせん DNA の 2 本information）の本体である DNA（Deoxypentose

鎖でかつ A と T、C と G が対になるような配列をNucleic Acids、デオキシリボ核酸）の二重らせんとる。A と T、C と G は互いに水素結合で結びつ構造の解明であった（図 1 ）。この発見は後に20世いているため、高温（90℃以上）にするか、変性紀最大の発見といわれている。なお、二人は 9 年

剤を加えると水素結合が切れて 1 本鎖の DNA に後の1962にノーベル生理学・医学賞を受賞した。

なる。また、温度を70℃以下（プライマによってDNA 構造の解明を契機に関連研究が活発的行わ設定温度が異なる）に下げるか、変性剤を除去すれるようになった。1977年にイギリス人 Sangerると、元の 2 本鎖 DNA に戻る（図 3 ）。これを 1が DNA 塩基配列決定するためのサンガー法を開サイクルと呼ぶ。一般的に PCR 処理を n 回サイ発 し、1980年 に ノ ー ベ ル 化 学 賞 を 受 賞 し た。

クル行うと、 1 つの 2 本鎖 DNA から目的部分をDNA 配列を決定するためには、ある程度の DNA2 n 倍に増幅する。長い DNA を増幅するには、量を確保する必要があり、その役割を担うのはターゲットを決めて一部だけ増幅するか、すべて２）

Jpn J Clin Ecol（Vol.25 No.2 2016）

84

図4 次世代シーケンサー開発の推移
増幅するかによって解析手法が異なる。前者には図116S rRNA 解析（細菌）と18S rRNA 解析（真菌）DNA の二重らせん構造２）などがあり、後者には全メタゲノム解読方法がある。
このような全ゲノム解読できるようになったのは、次世代高速 DNA 解読装置（次世代シークエンサー、NGS）が開発されたおかげである。1987
処理能力（Mb）

年にアプライドバイオシステムズ社が世界初の自図2DNA の構造

図 2 DNA の構造
2 本鎖 DNA

動 DNA シークエンサー ABI 370を発売し、1995
年に Richard Mathies らが蛍光色素によるシークエンシング技術を発表し、1998年に Phil Greenと Brent Ewing が配列解析ソフト phred を発表した。
近年になるとそのシークエンサーの進歩が目まぐるしい。図 4 に海外各社における次世代シークエンサー開発の推移を示す（図中の円の直径は解読長さを表す）３）。図に示す通り、2005年以後次世
図 4 次世代シーケンサー開発の推移
代のシークエンサーの開発のピッチが上がってい加熱

冷却

1 本鎖 DNA

図 3 PCR による 2 本鎖 DNA 増幅のイメージ
図3 PCR による2本鎖 DNA 増幅のイメージ解析（細菌）と 18S rRNA 解析（真菌）などがあり、後者には全メタゲノム解読方法がある。
このような全ゲノム解読できるようになったのは、次世代高速 DNA 解読装置（次世代シークエンサー、NGS）が開発されたおかげである。1987
年にアプライドバイオシステムズ社が世界初の自る。また、近年これらのシークエンサーを使用しした研究発表が増え始めている。
た研究発表が増え始めている。

Ⅲ．病院待合室における細菌叢の実態
Ⅲ．病院待合室における細菌叢の実態
1．調査方法1 ．調査方法
測定対象を東京都内にある
M 病院の総合受付
測定対象を東京都内にある M 病院の総合受付（1F）と呼吸器系待合室（5F）の室内と屋外の空（1F）と呼吸器系待合室（5F）の室内と屋外の空中、総合受付と呼吸器系待合室椅子の表面とした。
中、総合受付と呼吸器系待合室椅子の表面とし測定は 3 回（2015 年 10 月 16 日、11 月 26 日、11た。測定は 3 回（2015年10月16日、11月26日、11月 27 日）であり、そのうちの 2 回（11 月 26 日、月27日）であり、そのうちの 2 回（11月26日、1111 月 27 日）に同じフィルタを使用し、二日間の月27日）に同じフィルタを使用し、二日間の累積累積細菌を採取した。
総合受付と待合室の表面付着微生物を滅菌緩衝リン酸液、室内と屋外の空中微生物をエアポンプ（Air Check、XR5000）と PTFE (Polytetrafluoroethylene) 0.3 Filter を用いて測定した。空気のサンプリング量を 180ℓ（3ℓ/min×60min）とした。
2．DNA 抽出方法
試料採取後、フィルタを安全キャビネット内で臨床環境医学（第25巻第2号）細菌を採取した。
総合受付と待合室の表面付着微生物を滅菌緩衝リン酸液、室内と屋外の空中微生物をエアポンプ（Air Check、XR5000）と PTFE（Polytetrafluoro

病院環境内から 9 門、19綱、37目、74科、109属の細菌が検出された。図 5 に検出された主な属
菌を示す。
以下に病原性、生育特性、種類、発生源の視点ethylene）0.3 Filter を用いて測定した。空気のサから見た病院内の細菌の実態について述べる。

ンプリング量を180ℓ（ 3 ℓ/min×60min）とした。

1 ）病原性

2 ．DNA 抽出方法

85

病原菌を含む菌は Actinomyces 属、Anaerococcus

試料採取後、フィルタを安全キャビネット内で属、Corynebacterium 属、Haemophilus 属、取り出し、ストマッカー80 スタンダードバック

Halomonas 属、Lactobacillus 属、Neisseria 属、スに入れた後、DNA フリー水 5 mℓを加え、ス

Sphingobacterium 属、Sphingomonas 属、トマッカーバイオマスターにかけ DNA を抽出しStaphylococcus 属、Streptococcus 属、Yersinia 属 がた。その後袋から 1.5mℓの試験管に抽出液を入検出された。

れ、遠心機（KUBOTA5911）に 4 ℃ ×3,000回転

日 和 見 感 染 菌 を 含 む 菌 は Acinetobacter 属、×30分をかけ細菌を抽出した。

Actinomyces 属、Anaerococcus 属、Bradyrhizobium

3 ．DNA の精製と増幅方法

属、Corynebacterium 属、Leptotrichia 属、DNA の精製には Nucleo Spin を使用し、ボルNovosphingobium 属、Pseudomonas 属、テックスで液を混合させ、昇温、エタノール添加、

Psychrobacter 属、Ralstonia 属、Sphingomonas 属、

遠 心 分 離 な ど22の 工 程 を 経 た。PCR を 用 い た

Staphylococcus 属、Streptococcus 属が検出された。

DNA の増幅には、次に示すプロットコールで

ま た、 呼 吸 器 病 原 菌 を 含 む Ralstonia 属、行った。

Sphingomonas 属検出された。

① 94°C× 3 分、② 94°C×45秒、③ 50°C×60秒

植 物 病 原 菌 を 含 む Pleomorphomonas 属、④ 72°C×90秒、⑤ 上記の② ~ ④を35回繰り返す

Pseudomonas 属、Ralstonia 属、Sphingomonas 属、⑥ 72°C×10分、⑦ 4 °C で保持

Janthinobacterium 属が検出された。

4 ．解析方法

図 6 に室内空中、表面、外気中検出された主なAgilent 2200TapeStation を用いて、解析必要病原菌を有する細菌属と日和見感染菌を有する属とされる核酸濃度および総量の検定を行った結を示す。円の重なっている部分は共通の意味をし果、品質条件を満たさない一部サンプルを除外している。待合室内のみから検出されたのが 7 属、た後、作成したシーケンスライブラリーを混合し室内空中と外気中が共通しているのは 3 属、室内た。混合したライブラリーを品質向上のため、空中と表面が共通しているのは 1 属、室内表面のAMPureXP（ベックマ・コールター社製）を用いみから検出されたのは 1 属があった。したがった。シーケンスの解析にイルミナー社次世代シクて、室内に外気が影響を及ぼすものの、在室者かエンサー Miseq を用いて塩基配列を取得した。

らや室内表面からの影響も大きいことがわかる。

16S rRNA の解析において、クラスタリング、2 ）生育特性

相 同 性 検 索（Blast 検 索、DDBJ 16S ribosomal

好気性菌を含む Acinetobacter 属、Azospirillum

RNA データベース Ver.2016_01_12使用）、系統分属、Bradyrhizobium 属、Cor ynebacterium 属、類（QIIME パイプライン使用）、系統樹データのHaemophilus 属、Halomonas 属、Hydrogenophilus

作成（QIIME パイプライン使用）、Rarefaction 解属、Hymenobacter 属、Janthinobacterium 属、

析（QIIME パ イ プ ラ イ ン 使 用 ）、 菌 叢 比 較Micrococcus 属、Neisseria 属、Novosphingobium（QIIME パイプライン使用）を行った。

属、Paracoccus 属、Petrobacter 属、5 ．結果

Pleomorphomonas 属、Pseudomonas 属、（ 1 ）検出された細菌叢

Psychrobacter 属、Ralstonia 属、SphingobacteriumJpn J Clin Ecol（Vol.25 No.2 2016）

86

図5 病院の待合室内と屋外から検出された菌（属）図 5 病院の待合室内と屋外から検出された菌（属）属。

属、Sphingomonas 属が検出された。
嫌 気 性 菌 を 含 む Actinomyces 属、Anaerococcus

Actinomyces Leptotrichia
Haemophilus Neisseria
Anaerococcus Yersinia
Bradyrhizobium

属、Paracoccus 属、Pseudomonas 属が検出された。
通 性 嫌 気 性 菌 を 含 む Corynebacterium 属、Corynebacterium
Staphylococcus Acinetobacter
Streptococcus

Enhydrobacter 属、Haemophilus 属、Halomonas属、Lactobacillus 属、Staphylococcus 属、Streptococcus 属、Yersinia 属が検出された。
偏 性 嫌 気 性 菌 を 含 む Leptotrichia 属、Streptococcus 属が検出された。
3 ）発生源水由来：Acinetobacter 属、

室内空中

Pseudomonas
Sphingomonas

外気中Halomonas
Novosphingobium
Sphingobacterium

Psychrobacter

Haemophilus 属、Lactobacillus 属、Leptotrichia 属、Novosphingobium属

Pleomorphomonas

属 、

図 6 病原性・日和見感染菌
病原性・日和見感染菌
図6、

Psychrobacter 属、Ralstonia属、Sphingomonas 属。
土壌由来：Acinetobacter
Bradyrhizobium

属 、 HyHymenobacter 属、Janthinobac属 、 Novosphingobium 属
Pleomorphomonas

表面ヒ ト 由 来：Acinetobacter 属、Actinomyces 属、Anaerococcus 属、Cor ynebacterium 属、Enhydrobacter 属、Halomona属 、Psychrobacter 属、Ralstonia属、Sphingomonas 属。
（2）主座標解析結果
図 7 に各サンプルから得ら科・属のデータを用いた 3 次

Micrococcus 属、Neisseria 属、Pseudomonas 属、属、Staphylococcus 属、Streptococcus
P l e属、Ralstonia
omorphomonas 属、Pseudomonas 属、Psychrobacter 属、Ralstonia 属、Staphylococcus 属、Psychrobacter 属、Ralstonia 属、Sphingobacterium

Streptococcus 属。

属、Sphingomonas 属。

水 由 来：Acinetobacter 属、Bradyrhizobium 属、土 壌 由 来：Acinetobacter 属、Azospirillum 属、Enhydrobacter 属、Halomonas 属、Micrococcus 属、Bradyrhizobium 属、Hydrogenophilus 属、Novosphingobium 属、Paracoccus 属、Hymenobacter 属、Janthinobacterium 属、

臨床環境医学（第25巻第2号）

10/16, 5F中待合室
11/26,27, 外気

10/16, 外気
10/16,1F外来待合室
11/26,27, 1F外来待合室

11/26,27, 5F中待合室椅子表面
11/26,27, 1F外来待合室椅子表面

871） 柳 宇：環境マイクロバイオーム、空気清浄、細な情報が得られる。さらに、マイクバイオーム
Vol.53、No.5、pp.1550-53、2016を解析することによって、微生物の発生源とその2） 柳 宇、加藤信介、永野秀明、瀬島俊介、藤伝搬経路などを特定できる可能性が示唆された。
井結那、井沢圭、畑中未来、高橋雄大、松野
注 重夫：諸環境におけるマイクロバイオームの本報は、下記示す既発表の内容をもとに、加筆比較、第 33 回空気清浄とコンタミネーションを加え再構築したものである。
コントロール研究大会予稿集、pp.145-148、2016 宇： 環 境 マ イ ク ロ バ イ オ ー ム、 空 気 清 浄、

1 ）柳

3） 柳宇：環境マイクロバイオーム、第25 回日-53、2016
Vol.53、No.5、pp.1550

2 ）本臨床環境医学会学術集会抄録集、
柳 宇、加藤信介、永野秀明、瀬島俊介、藤井結那、p.16、2016
井沢圭、畑中未来、高橋雄大、松野重夫：諸環境に
4） 藤井結那、柳 宇、永野秀明、井田寛、加藤
おけるマイクロバイオームの比較、第33回空気清浄
信介：病院施設におけるマイクロバイオームとコンタミネーションコントロール研究大会予稿集、に関する調査研究、
第 25 回日本臨床環境医学
pp.145-148、2016

図 7 主座標解析の結果
主座標解析の結果
図7量を 3 成分に重みづけ）の結果を示す。主座標分
Micrococcus 属、Novosphingobium 属、Paracoccus
析は主成分分析と異なり、多（高）次元のデータ属、Pleomorphomonas 属、Pseudomonas 属、を 2 次元や 3 次元に落として視覚化するときに用Psychrobacter 属、Ralstonia 属、Sphingobacterium
いられる。ユークリッド距離の代わりに類似度（相属、Sphingomonas 属。
同性）を用いるため、相関の高いもの同士が近い（ 2 ）主座標解析結果配置になるようにプロットされる。従って、図 7
図 7 に各サンプルから得られた菌の門・網・に示すプロット間の距離はマイクロバイオームの目・科・属のデータを用いた 3 次元主座標分析類似度が高い意味をしている。病院の待合室の表（情報量を 3 成分に重みづけ）の結果を示す。主座面と空中のマイクロバイオームが異なることがわ
標分析は主成分分析と異なり、多（高）次元のかる。
データを 2 次元や 3 次元に落として視覚化するときに用いられる。ユークリッド距離の代わりに類Ⅳ．結び似度（相同性）を用いるため、相関の高いもの同次世代シークエンス解析により、不特定多数の士が近い配置になるようにプロットされる。従っ人が集まる場所である病院の待合室に多くの病原て、図 7 に示すプロット間の距離はマイクロバイ性細菌が存在している可能性が明らかになった。
オームの類似度が高い意味をしている。病院の待また、待合室から検出されている菌のうち、まだ合室の表面と空中のマイクロバイオームが異なる
病原性についてわかっていない細菌も多く含まれことがわかる。ており、今後病原性の解明により、より多くの詳細な情報が得られる。さらに、マイクバイオーム

Ⅳ．結びを解析することによって、微生物の発生源とその次世代シークエンス解析により、不特定多数の伝搬経路などを特定できる可能性が示唆された。
人が集まる場所である病院の待合室に多くの病原性細菌が存在している可能性が明らかになった。
注
また、待合室から検出されている菌のうち、まだ本報は、下記示す既発表の内容をもとに、加筆病原性についてわかっていない細菌も多く含まれを加え再構築したものである。ており、今後病原性の解明により、より多くの詳

3 ）会学術集会抄録集、p.68、2016
柳 宇：環境マイクロバイオーム、第25回日本臨床環境医学会学術集会抄録集、p.16、2016
5） 柳宇、加藤信介、永野秀明：外気中の微生
4 ）藤井結那、柳 宇、永野秀明、井田寛、加藤信介：
物による室内への影響－生菌からマイクロバ
病院施設におけるマイクロバイオームに関する調査
イオームまで、日本建築学会大会学術講演梗
研究、第25回日本臨床環境医学会学術集会抄録集、概集、pp.715-718、2016
p.68、20165 ）光岡眞知子、柳柳 宇、加藤信介、永野秀明：外気中の微生物によ6）宇、藤井結那、永野秀明、る室内への影響－生菌からマイクロバイオームまで、
井田寛、加藤信介：病院待合室におけるマイ日 本 建 築 学 会 大 会 学 術 講 演 梗 概 集、pp.715-718、

クロバイオームの実態に関する調査研究

第2016報-室内・屋外の細菌叢、日本建築学会大会
6 ）1光岡眞知子、柳宇、藤井結那、永野秀明、井田寛、
学術講演梗概集、pp.743-744、2016
加藤信介：病院待合室におけるマイクロバイオームの実態に関する調査研究
第 1 報 - 室内・屋外の細7） 藤井結那、柳宇、永野秀明、井田寛、加藤
菌叢、日本建築学会大会学術講演梗概集、pp.743-

信介：病院待合室におけるマイクロバイオー744、2016
ムの実態に関する調査研究 第 2 報 細菌叢7 ）藤井結那、柳 宇、永野秀明、井田寛、加藤信介：の解析結果、日本建築学会大会学術講演梗概
病院待合室におけるマイクロバイオームの実態に関する調査研究 第 2 報 細菌叢の解析結果、日本建築集、pp.745-746、2016
学会大会学術講演梗概集、pp.745-746、2016

謝辞

謝辞
本研究は、科学研究費助成事業課題番号 15H02277
本研究は、科学研究費助成事業課題番号15H02277（研（研究代表者：加藤信介）による。
究 代表者：加藤信介）による。

参考文献

参考文献
1）
柳 宇：室内環境と微生物、空気清浄、第 52 巻、

1） 第柳 1 号、pp.45-54、2014
宇：室内環境と微生物，空気清浄，第52巻，第154，2014号，pp.45-，
2） J.D.Watson
F.H.C.Crick ： Molecular Structure of
J.D.Watson，F.H.C.Crick：MolecularStructureof2） Deoxypentose
Nucleic Acids， Nature，Vol.171，
Deoxypentose
NucleicAcids，Nature，Vol.171，
pp.738-739，
April
25， 1953
April
pp.738739，25，
19533） Shadi Shokralla， Jennifer L. Spall， Joel F. Gibson
Shadi
Shokralla，Jennifer L. Spall，Joel sequencing
F. Gibson3） andMehrdad
Hajibabaei：Next-generationand MehrdadforHajibabaei：Next-generation
technologies
environmental DNA research ，sequencing
technologies
for environmental DNA
Molecular Ecology 21， pp.1794–1805，2012
research，Molecular Ecology 21，pp.1794‒1805，2012