博士（ 医学）長嶋健一郎

学位論文題名． Adaptor Protein Crk Is Required forEphrin‑Bl‑induced Memdrane Ruffling andFocalCo
mplexAssem
blyofHumanAorticEndot
hel
ialCells（ヒ ト大動脈血 管内皮細胞におけるE
phr
in‑Bl
刺激依存性の細胞膜伸展と先 端 接 着 斑 の 形 成 に は ア ダ プ タ ー 蛋 白 Crkが 必 要 で あ る ）学 位論文内容の要旨

血管内皮細胞の遊走は血 管発生・血管新生における重要な要素であり、受容体型チロシンキナーゼを介した調節系 は、その中心的な役割を担っていると考えられている。これらにはVEGFなどの増殖因子の ほかに、細胞膜上に発現するりガンドであるephrinとその受容体にあたるEph受容体などがある。これまでEph/ephrinに関しては、リガンド(ephrin)と対応する受容体(Eph)が動脈と静脈の内皮細胞それぞれに発現することにより、互いの認識による反発を介して動静 脈の分離した発生にかかわっているとされていた。しかし、一部のEph受容体は動静脈両者に発現が認められているなどEp
h−ephrinと細胞遊走にかかわる細胞内の下流分子につい てはいまだ十分な検討がなされていなぃ。本研究ではEp
h受容体を介した血管内皮細胞の 遊走における細胞内情報伝達系について、ヒト太動脈肉皮細胞(HAEC)を用いて検討した。
はじ めに 免疫 沈降法(IP)
よってHAECにEphBl受容体が発現していることを確 認した。
ま た可 溶性 のephrinBlを用いてephrinBl
刺激依存 性にEphB1
受容体がりン酸化 されることも同様にIPで確認した。また、GFP（螢光蛋白）を導入して螢光ラベルしたH
AECを螢光頭微 鏡 下 で 観 察 し、 ephrin
B1刺激 依存 性 にHAE
Cの 遊走 が惹 起さ れる こと を確 認し た。
次にEp
h受容体の下流分子を検討するにあたって、細胞の遊走や接着に関与することが示唆されているアダプター 蛋白であるCrkに着目して研究をすすめた。このC
rk
Iのephrin
刺激に依存した細胞内での局在変化をりアルタイムに観察するため、DsR
ed螢光タンパクのTagをっけたC
rkI（DsRed−CrkI）と、細胞骨格と細胞接着に関する重要な分子であるactinにGF
PlTagをっけたもの（GFP―actin）とをH
AECにcoーtransfect
し螢光顕微鏡下で観察した。その結果、刺激前には 主にfocaladhesion（actin
線維の両端）に局在していたC
rkIがephr
inB1
刺激依存性にfocaladhesionよりもずっと小さなfocalcom
plex（先端接着斑）に移動することが観察された 。
このephrin
B1
刺激による C
rk
Iの局在変化に関与する分子を検討するため、細胞接着の場でCrkIと結合することが 知られている蛋白p130CasとP
axillinを螢光ラベルし（GFP―‑ 595―

Cas，GFP―Paxillin)、DsRed一C
rk
IとともにHAECにco−transfectして、それぞれの細胞をephr
inBlによって刺激し観察した。その結果Cr
kIは同様に刺激依存性に細胞先端(focalcomplex)に 移動した。またPaxillinは刺激後に細胞先端には移動せず、CrkIとは離れて局在していた 。一方、CasはCr
kIと同様に foc
al complexに移動しCr
kIとco−localizeする
こ とが 確認 され た。 こ のこ とか らCrkIがephrinBl刺激依存性にp130Casと ともにfoc
alcomplexに移動することがわかった。
この、新 たなfoc
al complexの形成は 細胞膜の伸展、すなわちmembrane rufflingに伴うものである。HAECにおいてephrinBl
刺激による前後での細胞のサイズを比較したところ、刺激後に有 意にサイズが増大していたことで刺激依存性のmembranerufflingの誘導が定量 的 に 確 認 で き た 。 と こ ろ が 、 こ の と きHAECに Crkの domina
nt n
egat
ive mutantを
co−transf ectした場合や、Crk
IのsiRNAをHAECに導入して細胞内のCrk
Iの発現を抑えた
場合には刺激依存性の細胞サイズの変化（増大）は観察されなかった。membraneruf
flingは細胞の遊走 に先行することが知られており、この結果、HAECにおけるephrinBl
刺激による細 胞 遊 走 に Crkを 介 し た シ グ ナ ル が 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
細胞内情 報伝達系におけるアダプター蛋白として知られるCrkは低分子量G
TP結合蛋白の グア ニン ヌクレ オチド交換因子(GEF)である C3GやDOCK180などの蛋白と結合してエフェ クタ ーで ある低 分子量G
TP結合蛋白のRaplやRaclにシグナルを伝えるとされている。
そこでHAECにおいてこれらエフェクター分子の働きを抑制した場合 のC
rk
Iの細胞内での局在の変化 を観察した。Raclの機能を抑制した細胞ではephr
inBl
刺 激依存性のmemb
ranerufflingは みられずCrk
Iのfoc
al complexへの移動も認められなかった。また刺激後の細胞サイメの 変化も認められなかった。同様にRaplを抑制した細胞においても刺激依存性の
CrkIの局在 変化は認められず、細胞サイズも増大しなかった。しかしこの細胞では、細胞辺縁におい て細かいmembrane rufflingが認められた。この細胞を詳細に観察すると細胞先端がいっ たん拡がってはすぐに縮んでしまうことが観察されたが、このとき拡がっていこ うと する 細胞先 端へのCrkの移動が観察され ず、このC
rkを含むfocal com
plex
形成不全 の た め に membrarreが 足 場 を 失 い 細 胞 が 拡 が れ な い の で は な ぃ か と 考 え た 。
最後に実 際にruf
flingしているmembraneでのRaplの活性を、その モニター蛋白である
RaichuーRaplを用いて検討した。その結果ephrin
B1
刺激によってrufflin
g部でのRaplの活性化が観 察されたが、このときCrkのdom
inant negative mut
antをco−transfect
すると その 活性 は観 察さ れ なか った 。こ のことか らephrinBl刺激依存性のH
AECのmembranerufflingにおけるCrkIとRaplの関係がダイナミックに示された。
以上、HAECを用いた検討から血管内皮細胞の遊走においてEp
h一ephrinを介したシグナルの下流でC
rk−Rapl，Raclなどさまざまな蛋白が関与していることが示唆された。今後はC3Gや DOCK180等 のGEFの局在の変化やCrk以外の細 胞接着分子の動向等も検討できれぱと考えている。

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学位 論文審査の要旨
主 査 教 授 石 橋 輝 雄
副 査 教 授 北 畠顕副 査 教 授 守 内 哲 也

学位論文題名Adap
torProteinCrkIsRe
quir
edfor
Ephrin‑Bl‑induced Memdrane Ruffling andFoc
alComplexAssemblyofHu
manAor
ti
cEn
dot
heli
alCells（ ヒ ト 大 動 脈 血 管 内 皮 細 胞 にお け る Ephrin‑Bl刺激 依 存 性の 細 胞膜 伸 展 と
先 端 接 着 斑 の 形 成 に は ア ダ プ タ ー 蛋 白 Crkが 必 要 で あ る ）血 管内 皮 細 胞の 遊走は血 管発生・ 血管新生 における 重要な要 素であり、 受容体 型 チ ロシ ン キナ ーゼを 介した調 節系は、 その中心 的な役割 を担ってい ると考え ら れ てい る 。こ の う ちEph受 容 体は 、 動静 脈 の分離 した発生 にかかわっ ている と さ れて い たが 、細胞 内の下流 分子につ いては不 明の点が 多い。本研 究ではEph受 容体を介 した血管 内皮細胞 の遊走に おける細胞 内情報伝 達系について、ヒト 大動脈内 皮細胞(HAEC） を用いて 検討した 。
免 疫沈降法 （IP）と可 溶性のり ガンドを用いた実験によって、HAECにおいて刺激 依 存 性に EphBl受容 体がりン 酸化され ることを 確認した 。また、 GFP（螢光蛋白 ） で 螢光 ラ ベル したHAECを 螢光顕微 鏡下で観 察し、ephrinBl刺 激でHAECの遊走 が惹起さ れること を確認し た。
次 にア ダ プ ター 蛋 白で あ る Crkに 着 目し Eph受 容体 の 下流 分 子 を検 討 し た。
螢 光夕ンノ ヾクTagをっ けたCrkI(DsRed−CrkI）と、actin(GFP−actin)をH
AECに co− transfectし 、 螢 光 顕 微 鏡 下 で 観 察 し た と こ ろ 刺 激 前 には 主 に focaladhesionに 局 在 して い たCrkIが 刺 激 後あ ら たな focalcomplexに移動 することが 観察され た。
次 に p130Casと Paxillinに 着 目 し て Crkの focalcomplexで の 共存 分 子に つい て 検 討し た 。そ の 結 果CrkIは ephrinBl刺 激依 存性に pユ30Casととも にfocalcomplexに 移動する ことがわ かった。
ま た Crkの dominant negative mutantや siRNAを 用 い た 実 験か ら HAECにおー 597―

け る ephrinBl刺 激 に よ る 細 胞 遊 走 に Crkを 介 し た 系 の 関 与 が 示 唆 さ れ た 。
Crkは 低分子量 GTP結合蛋白の RaplやRaclにシグ ナルを伝 えるとさ れている 。
Raclの 機 能 を 抑 制し た 細胞 で は ephrinBl刺 激 依 存性 の membrane rufflingやCrklの focalcomplexへ の移 動 も認めら れなかっ た。同様 にRaplを不活 化により 刺激依存 性のCrkIの局在 変化は認 められな かった。 しかし、 細胞辺縁 において 細 かい membranerufflingが 認められ たが、こ のとき拡 がってい こうとす る
細 胞 先 端 へ の Crkの 移動 が 観 察さ れ ず、 こ の Crkを 含 む focal complex形成 不全 の ため に membraneが足 場 を失 い 細 胞が 拡 が れな い ので は ないか と考えた 。
最後 に モニ タ ー 蛋白 で ある Raichu−Raplを 用 いて 実 際 にrufflingし ている
membraneでの Raplの活性を 確認した。
以上 、 血管 内 皮 細胞 の 遊走 に おいてEph− ephrinを介した シグナル の下流でCrk− Rapl， Raclな ど さ ま ざ ま な 蛋 白 が 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
口頭 発表に際 し、副査の北畠教授から血管新生における細胞遊走の極性決定とEph受 容体 機 能と の 関 連に つ いて 、 血 管内 皮 細胞 と 神 経細 胞 における Eph受容体 の機能の 差異にっい ての質問 がなされ た。次い で副査の 守内教授 からCrkIとCrkIIの細 胞内発現 量のバラン ス、今回 の研究の 臨床的意義、可溶性のりガンドを 利用した 治療の可能 性につい て質問が なされた 。最後に 主査の石 橋教授からdominantnegativcmutantを 使 用し た場合とsiRNAを 使用した 場合の刺 激後の変化 の差、Rap1と Rac1の活性の量 的な差に ついて質 問がなさ れた。い ずれの質 問に 対しても 、申請者は 研究結果 に基づい て、ある いは文献 的知識に より、概ね
適 切 な回 答 を行 っ た 。こ の 論文 は、血 管内皮細 胞におい てのEph受容 体の下流
シ グナルの 一部を明ら かにした ものとし て意義の あるもの と評価さ れ、審査員
一 同は、こ れらの成果 を高く評 価し、大 学院課程 における 研鑚や取 得単位なども 併せ申請 者が博士（ 医学）の 学位を受 けるのに 充分な資 格を有す るものと判定し た。