博士 （水 産科 学） 任美珍

学位論文題名Neutraceutical study on marlnea11eniCCarotenoidS
Withant
iーObeSitye
任．eCt
SOnmlCe（海洋性アレンカロテノイドの抗肥満作用に関する栄養・機能学的研究）

学位論文内容の要旨
近年、肥満の増加は社会的にも大きな問題となっており、その予防法の開発に関しては社会的にも大きな課題として注目されている。肥満では脂肪細胞の肥大化と、脂肪細胞数の増加が起きており、さらに高脂血症、高血圧、糖尿病などを併発したメタポリックシンドロームを誘発することが問題である。このような症状が続くことで、死因の代表である心疾患や脳卒中のりスクが高まる。よって、脂肪組織の肥大化を抑制する化合物の探索とその分子機構の解明、それに立脚した予防法及び治療法の確立は極めて重要であると言える。これまでの研究において、ワカメなどの褐藻に含まれるフコキサンチンが糖尿病／肥満マウスKK‑/紗に対し白色脂肪組織の重量増加を抑制することが明らかにされている。更にフコキサンチンを投与したマウスの白色脂肪組織にはフコキサンチノ―ルやアマロウシアキサンチンAが蓄積することが見出されている。これらの知見は脂肪組織に蓄積するフコキサンチノールとアマロウシアキサンチンAが脂肪組織に直接作用することを示唆している。本研究ではフコキサンチンの抗肥満作用の発現に関わる基盤作用として、代謝物による脂肪組織構成細胞への直接作用として脂肪細胞の分化への影響を解明することを第一の目的とした。更に、脂肪細胞の分化抑制機構に関して分子レベルでの解明を試みた。
第一章では、マンジュウボヤからアレン結合をもっフコキサンチン代謝物のアマロウシアキサンチンAを単離するとともに、アセチレン構造をもつ類録カロテノイドであるアマロウシアキサンチンBを分離、同定した。また、ワカメからフコキサンチンを分離した後、リパーゼを用いた加水分解を行いフコキサンチノールを調製した。更に、これをアルカリ処理することによルエポキシド構造を開裂させてイソフコキサンチノ―ルを―l035―得た。
第二章では、第一章で単離、調製したアレン構造を有するアマロウシアキサンチンAの脂肪細胞に対する分化抑制能を検討した。マウス胎児由来3T
3‑L1前駆脂肪細胞を前培養しコンフレントまで増殖させた後、インスリン、デキサメタゾン、IBMXといった
分 化 誘 導剤 を 含む DMEM培地 で 分 化誘 導 を行 っ た。 そ の後 、 D
MEM培地 に 交換 し マンジュ ウポヤから 抽出したア マロウシア キサンチンAとアマロウシアキサンチンBやフコキサンチノールとイソフコキサンチノールを添加し分化抑制能を調べた。その結果、ア マロウシアキサンチンAとフコキサンチノ―ルは3T
3‑L1の分化において誘導され脂肪合成に関わるglycerol
一3ーphosphatedehydrogerase(GPDH)
活性に対して抑制作用を示した。これらニっのカロテノイドはフコキサンチンの生体内代謝物であるが、特にGPDH活 性に対する 抑制作用は フコキサンチノールよりもアマロウシアキアサンチンAが強いことが示された。更に分化抑制に関わる分子メカニズムを解明するため、
分 化 の マス タ ーレ ギ ュレ ー タで あ るPPARyや C/EBPフ ァ ミリ ー のmRN
Aの 発 現量 とタンパ ク質を測定した。その結果、アマロウシアキサンチンA添加した3T
3‑L1細胞では 、C/EBP(CCAA
T/enhancer‑binding protein)a mRNA
発 現が減少す るとともに 、PPARy(peroxisomeproliferatoractiv
atedreceptory）mR
NA発現も大きく低下した。
また、 PPARyとC/EBPocのタンパク 質レベルでの減少も見られた。一方、生体内代謝物ではなぃイソフコキサンチノールやアレン結合をもたないアマロウシアキサンチンB
では、 アマロウシアキサンチンAやフコキサンチノ―ルと比較して3T3‑L1の分化に対する抑制効果が弱いことが分かった。このようにフコキサンチン代謝物のアマロウシア
キサンチンAやフコキサンチノールが脂肪細胞の分化を抑制したことから、フコキサンチンの代謝物が脂肪細胞に船ける脂肪合成に直接作用することが推察された。特に、脂肪組織中の主要な代謝物であるアマロウシアキサンチンAが強い活性をもっことが示された。
第三章では、第二の目的として脂肪細胞の分化が活発に起こり、それに伴いアディポサイトカインの産生異常やマクロファージの浸潤など脂肪組織の質的変化が見られる肥満の初期段階に韜けるフコキサンチンの影響をマウスを用いた動物実験において調べた 。試 験 飼料 は AI
N‑93G組 成に し たが っ て調 製 した 。 1週 間大豆油7％を含む AIN‑93Gを 飼 料 とし て 4
週 齢 の糖 尿 病 ／肥 満 K
K‑A′ マ ウス （ 雌 ）を 温 度23+10C、湿 度‑1036―

50％、明暗を12時間周期として予備飼育を行い、その後フコキサンチン0.
2％を含む飼料量を自由摂取させ、1週間およぴ2週間実験飼育を行った。このマウスから子宮周囲WATアデ ィ ポサ イ トカ イ ンmRNA
発 現 量の 比 較を 行 った 。その結 果、マクロ ファー
ジ の 浸潤 を 誘導 す るMCP‑
1や 炎症 性 を増 大 さ せる TN
F‑ocや PAI‑1の mRN
A発 現量 は1週間飼育 と2週間飼育のコントロール群を比較すると、2週間飼育のコントロール群で有意に増加しており、フコキサンチン群はそれぞれのコントロール群と比較して顕著に mRN
A発 現を 抑 制し た 。脂 肪 組織 で は肥 大 化 とと も にマクロフ ァージやCD8+T細胞 の浸潤が起 こり慢性炎 症が誘発さ れる。そこでマクロファージのマーカーとして
F4/80と C
D8+T
細 胞 のマ ー カー で ある CD 80cの mR
NA発 現を そ れぞ れ 測定 し た。 その結果、各遺伝子発現量がコントロール群に比べてフコキサンチン群は1週間投与では低い傾向にあり、2週間投与では有意に低い発現量であった。以上の結果から、肥満初期 の脂肪組織に対してフコキサンチンは、マクロファージやC
D8+T細胞の浸潤を抑制するとともに炎症性のアディポサイトカインの遺伝子発現を抑制し、炎症を予防し、肥満を抑制しているこどが推察きれた。
第四章では、フコキサンチン機能の脂肪組織に対する新たな制御機能を明らかにする目 的でケモカイン発現の調節にっいて検討した。第三章で肥満の脂肪組織にCD8+T細胞やマクロファージが浸潤することが明らかとなった。このように、脂肪組織には、脂肪滴を有する脂肪細胞のみならず、stroma‑vascularfraction(SVF)と総称される前駆脂肪細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、線維芽細胞など他種類の細胞が含まれている 。本章では、コラゲナーゼを用いて脂肪組織を脂肪細胞とSVFに分離して、得られた分画を用いてケモカインの発現量やタンパク質を測定した。特に、本研究ではアテロー ム 硬化 症 の進 行 に 韜いてT細胞との相 互作用が知 られる、RANTESやSD
Fーlaとこれ ら のレ セ プタ ー に注 目 し W
ATから 分 離し た 脂肪 細 胞と SVF
で の 発現 量 を測 定 した 。 RANTES、 CCR5、 CXCR4mRNA発 現 は 脂 肪 細 胞 と 比 べ SVFで 高 か っ た 。 逆に 、 SDF‑lamRNA発 現 は 成 熟 脂 肪 細 胞 で 高 か っ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 RANTESと CCR
5は 同一 の 細胞 主に発 現するが、 SDF‑locとCX
CR4は同一の細 胞ではをく 他の細胞にパラクリン的に作用することが推察された。さらに、フコキサンチン投与群のWATで は 、 R
ANT
ES、 S
DF‑
locのタ ン パク 質 量も コ ント ロ ール と 比べ 減 少 した 。 一
方 、最近、Nara
Nたちはケ モカインの ーっである CXC
L14を ノックダウ ンしたマウスー103
7―

が高脂肪食によって誘発される肥満に対して抵抗性を示すことを報告した。そこで、
CXCL14の m
RNA
発 現 を測 定 し た結 果 、2週 間フ コ キサ ンチン投 与群でコン トロール群と比べて有意に抑制されていた。また、WATが増大すると低酸素状態になることが知ら れ てい る が、 そ れに よ り誘 導 され る HI
F‑locはleptinやVEGFの分 泌を刺激する。1
週 間投与と2週間投 与を比較す ると、2週間投与の コントロー ル群でHIF‑laのmRN
A
発 現量が有意に増加しており、2週間フコキサンチン投与群はコントロール群と比較して顕著に抑制されていた。これらの結果は、フコキサンチンが肥満初期の脂肪組織において脂肪細胞の分化やアディポサイトカインの産生に加え、ケモカインの産生調節制御機構も有しており、それらが肥満を予防する上で重要な役割をになっていることを示すものである。
ワカメ橙どの褐藻に含まれるフコキサンチンは抗肥満効果が期待されるカロテノイドである。本研究により、その生体内代謝物であるアマロウシアキサンチンAが脂肪細胞の分 化 を制 御 する 転 写因 子 のPPAR
yや C/EBPaの m
RNA
発 現を抑制し 、分化を抑 制することが明らかとなった。更に、肥満初期においてみられるマクロファージやCD8+T細胞の浸潤を抑制するとともに、炎症に関わるアディポサイトカインやケモカインの産生を抑制することを新たに見い出した。このような脂肪組織を構成する細胞に対する複合的効果が、アレン結合を有するフコキサンチンの肥満初期における予防分子機構と推察される。

‑ 1038―

学位論文審査の要旨
主査
副査

教授
教授

宮下和夫
板橋 豊

副 査

准 教 授

細 川 雅 史学位 論文 題名
Neutraceutical study on marlnea11eniCCarotenoidS
Withanti― ObeSitye任 ・ eCtSOnmlCe（海 洋性 アレ ンカ ロテ ノイ ドの 抗肥 満作用 に関 する 栄養 ・機能学的研究）

ワ カメ など の褐 藻に 特徴 的なカロテノイド、フコキサンチンの抗肥満作用が最 近注 目さ れて いる 。フ コキサンチンは生体内で代謝され、フコキサンチ
ノ ー ル や ア マ ロ ウ シ ア キ サ ン チ ン Aと な る こ と も 明 ら か に さ れ て お り 、 こ れらの 代謝 物が フコ キサ ンチ ンの生体内での活性本体と推察できる。しかし、両カ ロテ ノイ ドの 活性 と構 造相関にっいては不明な点も多い。また、その作
用 の 分 子 機 構 に っ い て も UCP1に 対 す る 発 現 誘 導 な ど 一 部 明 ら か に さ れ て い るが、 全容 解明 には 至っ てい ない。そこで、本研究では、フコキサンチンの抗肥満 作用 を明 確に する こと を目的とし、代謝物の活性を脂肪細胞の分化への影 響 を 中 心 に 検 討 し た 。 ま た 、 糖 尿 病 /肥 満 KK‑Ayマ ウ ス を 用 い て 、 フ コ キ
サン チン の投 与が 肥満 形成 の初期において、どのようた影響を脂肪組織に与える かに っい ても 検討 した 。本研究で明らかにした点は以下の通りである。
1． ア マ ロ ウ シ ア キ サ ン チ ン Aと フ コ キ サ ン チ ノ ― ル 、 及 び そ れ ら の 構 造 類
縁 体 で あ る ア マ ロ ウ シ ア キ サ ン チ ン Bと イ ソ フ コ キ サ ン チ ノ ― ル の 、 マ ウ ス
胎 児 由 来 3T3― Ll前 駆 脂 肪 細 胞 に 対 す る 分 化 抑 制 能 を 調 べ た と こ ろ 、 ア レ ン 構造 を 有 す る ア マ ロ ウ シ ア キ サ ン チ ン Aと フ コ キ サ ン チ ノ ― ル の み が 、 コ ン ト
ロー ルと 比較 して 脂肪 細胞 の分 化を有意に抑制することを明らかにした。これ ら ニ っ の カ ロ テノ イド はフコ キサ ンチ ンの 生体 内代 謝物 であ るが 、特 にGPDH活 性 に 対 す る 抑 制 作 用 は フ コ キ サ ン チ ノ ― ル よ り も ア マ ロ ウ シ ア キ ア サン チ ン Aが 強 い こ と も 明 ら か に し た 。
2.ア レ ン カ ロ テ ノ イ ド （ ア マ ロ ウ シ ア キ サ ン チ ン Aと フ コ キ サ ン チ ノ 〜ル ） の 分 化 抑 制 機 構を 解明 する ため 、分 化の マス ター レギ ュレ ータ であ る
PPARyや C/EBPフ ァ ミ リ ー の mRNAと タ ン パ ク 質 発 現 量 を 測 定 し た 。 そ の 結
果 、 ア マ ロ ウ シ ア キ サ ン チ ン Aを 添 加 し た 3T3― Ll細 胞 で は 、 C/EBPocと PPARyの mRNA及 ぴ タ ン パ ク 質 発 現 が 低 下 す る こ と を 見 出 し た 。 以 上 よ り 、 フ コ キ サン チン 代謝物 であ る両 アレ ンカ ロテ ノイドが脂肪細胞における脂肪合成に直接 作用 するこ と、 特に 、脂 肪組 織中 の主要な代謝物であるアマロウシアキサ
ン チ ン Aが 強 い 活 性 を 持 っ こ と を 明 ら か に し た 。
― 1039−3.脂肪細胞の分化が活発に起こり、それに伴いアディポサイトカインの産生異常やマクロファージの浸潤など脂肪組織の質的変化が見られる肥満の初期段階でのフコキサンチンの影響を、マウスを用いて検討した。その結果、マクロファージの浸潤を誘導するMCP一1並びに炎症性を増大させるTNF‑ocやPAI―1のmRNA発現量は、1週間飼育後と比較して2週間飼育後に有意に増加するが、フコキサンチン投与によりこのmRNA発現量の増大は有意に抑制されることを明らかにした。脂肪組織では肥大化とともにマクロファージやCD8十T細胞の浸潤が起こり慢性炎症が誘発される。そこでマクロファージのマーカーとしてF4/80を、また、CD8十T細胞のマーカーとしてCD8aのmRNA発現をそれぞれ測定したところ、各遺伝子発現量がコントロール群に比べてフョキサンチン群は1週間投与では低い傾向にあり、2週間投与では有意に低くなることを明らかにした。以上より、肥満初期の脂肪組織に対してフコキサンチンは、マクロファージやCD8十T細胞の浸潤を抑制するだけでなく、炎症性のアディポサイトカインの遺伝子発現も抑制すること、こうした制御がフコキサンチンの抗炎症作用と抗肥満作用の分子機構であることを明確にした。
4． 脂肪 組織 には 、脂肪 滴を 有する脂肪細胞以外に、stroma−vascularfraction (SVF)と総称される前駆脂肪細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、線維芽細胞など他種類の細胞が含まれている。そこで、コラゲナーゼを用いて脂肪組織を脂肪細胞とSVFに分離し、得られた分画中のケモカインの発現量やタンパク質を測定した。その結果、フコキサンチン投与により、
RANTES、SDF―la,のタンパク質量の減少、CXCL14のmRNA発現量の抑制、HIFー1aのmRNA発現量の抑制が起こることを明らかにした。以上の結果から、フコキサンチンが肥満初期の脂肪組織において脂肪細胞の分化やアディポサイトカインの産生に加え、ケモカインの産生調節制御機構も有して茄り、この作用 が 、 肥満 を 予 防 す る 上 で 重 要 な 役割 を 担 っ て い る こ と を示 した 。
本研究により、フコキサンチンの生体内代謝物であるアマロウシアキサンチンAが脂肪細胞の分化を抑制する活性本体であり、その制御は、PPARyやC/EBPocといった転写因子のmRNA発現の抑制に起因することを明らにした。更に、フコキサンチン代謝物は、肥満初期においてみられるマクロファージやCD8+T細胞の脂肪組織への浸潤を抑制するとともに、炎症に関わるアディポサイトカインやケモカインの産生を抑制することも新たに見出した。このようを脂肪組織を構成する細胞に対する複合的効果が、アレン結合を有するフコキサンチン代謝物の肥満初期における予防分子機構であることを初めて明確にした。これらの成果は、褐藻由来の機能性成分として注目されているフコキサンチンの生理活性解明に資するものであり、明確ぬ学術的基盤に基づ
くメタポリックシンドローム予防成分の創出にも寄与すると考えられる。
よって審査員一同は本研究の申請者が博士（水産科学）の学位を授与される資格のあるものと判定した。