変形性関節症予防を目的とした関節軟骨変性とリンクする
肥大軟骨細胞分化を制御する標的分子の同定と機能解析
鹿児島大学大学院医歯学総合研究科
医療関節材料開発講座
前田真吾、石堂康弘
運動機能修復学講座 整形外科学
栫博則、今村勝行、篠原直弘、松山金寛、河村一郎、小宮節郎

はじめにして骨棘が形成される事が分かっている

進行した変形性関節症(OA)は不可逆的[1, 2]。軟骨の肥大・成熟化には Runx2

なので、一生を自身の関節で活動する為の発現が必要であり、このプロセスを骨には軟骨変性を予防する他ない。これか形成蛋白(BMP)シグナルは協調的に促進らの更なる高齢化社会や若年 OA 患者にする[3-5]。実際、動物の関節内に BMP-2とって、この関節軟骨変性の進行抑制治を注入すると関節軟骨細胞の肥大化を来療は、待望される次世代医療であろう。

たし、内軟骨性骨化過程が異常に進行し薬物治療は一つの理想的なアプローチでて骨棘を形成し、OA の表現型になる [6]。

あるが、しかしその開発の前提となる関したがって Runx2 活性と BMP シグナルの節軟骨変性の分子メカニズムは、完全に亢進が OA 病理の一部である事が示唆さ解明されていない。我々は、この関節軟れており、これを抑える事が OA の進行抑骨変性における責任分子の同定と、その制や治療に繋がる可能性がある。最近、機能解析を目的として研究を行って来た。 我々は BMP で誘導した軟骨細胞分化にお軟骨細胞の分化は、間葉系細胞が凝集し いて、転写抑制因子 SnoN の発現が増加し、てマスター転写因子 Sox9 を発現する事

BMP シグナルの下流メディエーターであで始まり、II 型コラーゲン(Col2a1)やアる Smad1/5/8 と共役する Smad4 の機能をグリカン(Acan)を発現する増殖軟骨細胞、 阻害する事で、negative feedback 的に B
さらに X 型コラーゲン(Col10a1)を発現

MP シグナルと、これに付随する軟骨細胞する肥大軟骨細胞へと成熟して周囲の基肥大化を抑制する事、そして SnoN が変性質を石灰化し、最終的にはマトリック初期から中程度のヒト OA 関節軟骨に発ス・メタロプロテネース 13(Mmp13)等を現していて、OA 進行に対して抑制的に働発現して終末分化を遂げる。正常な関節いている可能性を報告した[7]。しかし、軟骨は、Col2a1 や Acan を発現する静止

SnoN の軟骨肥大化に対する役割は部分的軟骨細胞で占められるが、OA になるとこであり、他にも BMP シグナルの下流で誘れらが異常に分化進行して成熟・肥大化導される責任因子があると考えた。そこ

し Col10a1 を発現し、軟骨基質も石灰化で我々は、筋芽細胞 C2C12 において Runxを伴い、内軟骨性骨化が進行した結果と2 と BMP-2 によって協調的に誘導される S14

mpd3 遺伝子[8]に着目した。Smpd3 の los誘導した。軟骨基質をアルシアン・ブルs-of-function 変異 fragilias ossium

ーで、肥大軟骨石灰化基質をアリザリ(fro)マウスの成長軟骨においては、肥大ン・レッドで染色した。

軟骨層が著明に拡大しており、Smpd3 がコードする neutral sphingomyelinase23)RNAi3)RNAi
RNAi は Dharmacon 社の ON-TARGET plus(nSMase2)が軟骨細胞の肥大・成熟に抑制

SMART pool を、Invitrogen 社の Lipofec的に働く可能性が考えられたからである

tamine RNAiMax で導入した。

[9]。重要な事に、Smpd3 のノックアウト

4)プラスミドとアデノウイルス
4)プラスミドとアデノウイルス
マウス Smpd3 cDNA は ATDC5 細胞より RT(KO)マウスの膝関節は著明に変形し骨棘を伴う正に OA の表現型を示した[10]。nSMase2 は細胞質内にセラミドを合成し、これが間接的に Akt シグナルを抑制する-PCR 法を用いて増幅し、pEF-DEST51 発現
ベクター、pAd/CMV/V5-DEST アデノウイ
ルスベクターにそれぞれクローニングし事が分かっている[11]が、軟骨細胞におた。

ける分子作用メカニズムについては不明

5)抑制剤と5)抑制剤と C2C2-セラミド
新生蛋白合成阻害剤シクロヘキシミドであった。本研究では、軟骨細胞においても Runx2 と BMP シグナルによって Smpd
3 が誘導されるか、そしてその場合、Smp(CHX, Sigma 社)は 10mM で BMP-2 添加２

d3/nSMase2 の軟骨細胞分化、特に肥大・時間前に導入した。nSMase 機能阻害剤 G

成熟過程における役割について検討した。 W4869 (Sigma 社)は 1μM、細胞内セラミド機能、すなわち nSMase2 の働きを mimi

方法

c できる細胞膜透過性 C2-セラミド(Enzo1)使用細胞と分化誘導
1)使用細胞と分化誘導
マウス軟骨細胞株 ATDC5、ヒト軟骨細胞

Life Sciences 社)は 10μM で用いた。PI3K 阻害剤 LY294002 (Sigma 社)と Akt 阻

株 C28/I2、マウス間葉系前駆細胞 C3H10

害剤 MK2206(Chemie Tek 社)、そして mTO

T1/2 細胞、マウス初代軟骨細胞を用いた。 R 阻害剤ラパマイシン(Sigma 社)も BMP-2
マウス初代軟骨細胞は生後２日目の C57B 添加と同時に導入した。
L/6J マウスの大腿骨頭、大腿骨膝関節面、 6)ウエスタンブロット
6)ウエスタンブロット
脛骨膝関節面より関節軟骨を採取し、コ用いた抗体は、anti-Runx2(8G5, MBL 社)、ラジェネース D による消化にて採取した。 anti-nSMase2(H-195, Santa Cruz 社)、a
いずれも DMEM/Ham’s F12 (1:1)+10% FB

nti-aggrecan(H-300, Santa Cruz 社)、a

S 培養液で維持し、軟骨細胞分化は、BMP

nti-collagen type II α1(LSBio 社)、a-2(300ng/ml, Peprotech 社)とインシュ

nti-phospho-Akt(S473)(587F11, Cell sリン/トランスフェリン/セレニウム(ITignaling 社)、anti-Akt(5G3, Cell SignS)添加剤にて誘導した。

aling 社)、anti-phospho-S6 ribosomal2)マウス胎仔中足骨器官培養
胎生 16.5 日の C57BL/6J マウス胎仔よりprotein(Ser235/236)(D57.2.2E, Cell Signaling 社)、anti-S6 ribosomal prote

中足骨を採取し、軟骨細胞と同様に分化in(54D2, Cell Signaling 社)、anti-pho15

spho-PI3K(no. 4228, Cell Signalingrmo Scientific 社)を用いて cDNA に逆転社)、anti-PI3K (p85)(no.610045, BD T

写した。qPCR は、SYBR premix Ex Taq I

ransduction Laboratories 社) 、anti-pI(Takara 社)と Thermal Cycler Dice TP

hospho-Smad1/5/8(no. 9511, Cell Sign

850(Takara 社)を用いて施行した。

aling 社) 、anti-Smad1(no. 9743, Cell

結果

Signaling 社) 、horseradish peroxida
ndary antibody、anti-mouse secondary

Smpd3/nSMase2 の発現誘導パターン
ATDC5 細胞に BMP-2 を添加すると、Acanantibody (Cell Signaling 社) 、anti-tは１日目から３日目にかけて急速に発現ubulin antibody(DM1A, T9026, Sigmaが立ち上がり、従って分化初期マーカー社)である。 ウエスタンブロットのシグとして認識されているが、後期成熟・肥ナルは LAS 4000 Mini Image Analyzer

大軟骨マーカーである Col10a1 は７日後(Fujifilm 社)で検出した。

よりゆっくりと発現増加する(図 1A)。Sm7)免疫細胞・組織蛍光染色
7)免疫細胞・組織蛍光染色
用いた抗体は、anti-aggrecan(H-300,pd3 は、Acan と Col10a1 を融合した様な

se (HRP)-conjugated anti-rabbit seco発現様式で、BMP 刺激１日目より１４日

Santa Cruz 社) 、anti-collagen type Iまで上昇し続けた(図 1A)。In vivo 軟骨

I α1(LSBio 社) 、anti-nSMase2 rabbit

組織においては、マウス胎生 17.5 日の上polyclonal antibody(H-195, Santa Cr

腕骨における免疫蛍光染色で観ると、nSuz 社) 、anti-Has2 mouse monoclonal a

Mase2 蛋白は骨(b)に著明に発現していた

ntibody(D-8, Santa Cruz 社)で、Anti-mが、肥大軟骨(h)、特に前肥大軟骨(ph)ouse Alexa Fluor 488 と anti-rabbit Aにも中程度の発現を認めた(図 1B)。In v

lexa Fluor 568 (Invitrogen) で蛍光標

itro における BMP-2 による Smpd3 の誘導識した。ウサギ、マウスの正常 IgG を陰が下流の Smad1/5/8 を介した直接的なも性対照に置いた。ヒアルロン酸 (HA) ののか、あるいは新生蛋白を介した間接的検出には、 サンプルを streptavidin/biなものか判別するために CHX で処理する

otin blocking kit (Vector 社) でブロと、BMP-2 による Smpd3 の誘導は起きなックし、0.05%の trypsin を 1 U/ml の chかった(図 1C)。同時に、C2C12 細胞で報ondroitinase ABC(Sigma 社)で消化した。 告されている様に Runx2 も必要なのか si
さらに CAS block 処理後、biotin-conj RNA 実験をすると、Runx2 ノックダウン下ugated HA-binding protein(HABP)(Hoku

ではやはり BMP-2 による Smpd3 の誘導はdo 社)と 1 μg/ml の Alexa Fluor 488-cなかった(図 1D)。この事は nSMase2 蛋白

onjugated streptavidin(Invitrogen 社)レベルでもウエスタンブロットで確認さを反応させた。

れた(図 1E)。従って、軟骨細胞において、
Smpd3/nSMase2 は BMP-Smad シグナルと R

8)定量的
8)定量的 RTRT-PCR (qRT(qRT-PCR)
RNA は TRIzol reagent (Invitrogen 社)

unx2 と協調的に直接誘導され、かつこれらシグナル系が高まる分化後期に発現量で抽出し、1 µg を Verso cDNA Kit(Theが増加する事が分かり、したがって OA 軟16骨変性期に発現する可能性が示唆された。 d3 によって増強されたアルシアン・ブル
Smpd3/nSMase2 の軟骨細胞分化への影響
ATDC5 軟骨細胞に siSmpd3 を導入して lー染色性が、MK2206 によりほぼ完全にキoss-of-function を観察すると、Col2a1

Col2a1、Col10a1 の発現を調べると、Aktも Col10a1 も、特に BMP-2 刺激下においの上流の PI3K の阻害剤 LY294002(LY)、Mて著明に発現が亢進した(図 2A)。これがK2206(MK)、下流の mTOR 阻害剤ラパマイ

軟骨基質産生にも反映されるかアルシアシン(Rp)、いずれもこれらの発現を抑制ン・ブルー染色を行った。ATDC5 軟骨細した(図 3C)。すなわち、Smpd3/nSMase2胞と初代軟骨細胞の両者において BMP-2は PI3K/Akt/mTOR 経路を抑制する事で、ャンセルされた(図 3B)。同様に、Acan と刺激で青く染まる様になるが、nSMase2軟骨細胞分化を制御している事が示唆さ阻害剤 GW4869 を加えるとさらに染色性れた。

が増強し、nSMase2 の機能を mimic する C2-セラミドは逆に減弱させた(図 2B)。確Smpd3/nSMase2 の ex vivo 軟骨器官培養系と、ヒアルロン酸産生への関わり

かに GW4869 は用量依存的に Col2a1 発現

Smpd3/nSMase2-セラミド経路が組織レを亢進したし(図 2C)、C2-セラミドは逆ベルでも軟骨成熟肥大化に抑制的か、マに Col2a1 と Col10a1 の発現を減弱させたウス胎仔 16.5 日中足骨器官培養系をア(図 2D)。さらに nSMase2 の関与を確かめ

ルシアン・ブルー／アリザリン・レッド

る為にアデノウイルスで Smpd3 を過剰発で染色して調べた。BMP-2 添加により肥現しても、C2-セラミドと同じ結果が得ら

大軟骨細胞明瞭領域の拡大と石灰化軟骨れた(図 2E)。したがって Smpd3/nSMase2

基質の出現が観られるが、GW4869 は著明-セラミド経路は軟骨細胞分化を抑制すにこれを亢進し、C2-セラミドは逆に抑制る事が分かった。

した(図 4A)。

Smpd3/nSMase2 の軟骨細胞分化における分子メカニズム

OA 軟骨からのヒアルロン酸(HA)産生が減る事は周知だが、その原因はよく分か

Fibroblast において Smpd3/nSMase2-セっていない。Fibroblast において Smpd3

ラミド経路が Akt 経路を抑制するが[11]、 /nSMase2-セラミド経路が Akt 経路抑制
Akt 経路は軟骨細胞分化に対して促進的を介して HA 合成酵素 Has2 の発現を抑制に機能する事が分かっているので、初代する[11]事に注目し、軟骨細胞で調べた。

軟骨細胞における nSMase2 の Akt への影

BMP シグナルは軟骨細胞を成熟へと導き、響をウエスタンブロットで検討した。BMOA ステージに向かわせると考えられるが、P-2 刺激は Akt と下流の S6 蛋白のリン酸

確かに BMP-2 添加によって Has2 の発現は化を惹起したが、Smpd3 発現アデノウイ下がった(図 4B)。重要な事に、同時に Sルスは、これらを抑制し、siSmpd3 は逆mpd3 をノックダウンすると Has2 発現がにこれらリン酸化を増強した(図 3A)。nS回復し(図 4B)、この効果は Akt 阻害剤 M

Mase2 の作用に Akt が関わっているか阻

K2206(MK)でキャンセルされた(図 4C)。

害剤 MK2206 を用いて検討すると、siSmp蛋白レベルで確認する為に免疫細胞蛍光17

染色を行うと、BMP-2 添加により nSMase

成果2 発現が増強すると同時に Has2 と HA の本研究の一部は 2014 年に Journal of B

シグナルは著明に減弱し、さらに Smpd3

iological Chemistry 誌に掲載された。

をノックダウンすると Has2 と HA は元にKakoi H, Maeda S, Shinohara N, Mats回復した(図 4D)。したがって、Smpd3/nS

uyama K, Imamura K, Kawamura I, Naga

Mase2 は軟骨分化のみならず HA 産生をもno S, Setoguchi T, Yokouchi M, Ishid

抑制する事が示唆された。

ou Y, and Komiya S. Bone Morphogenic考察Protein (BMP) Signaling Up-regulates Neutral Sphingomyelinase 2 to Supp

今回、軟骨細胞において、Smpd3/nSMas

ress Chondrocyte Maturation via thee2-セラミド経路が Akt 経路の制御を介

Akt Protein Signaling Pathway as a N

して分化を成熟させない様に適度に調節

egative Feedback Mechanism. J. Biol.

している事が分かり、このシステムの破綻が OA に繋がる可能性が示された。また、同時に HA 産生も抑制している事が分か

Chem., 289:8135-8150,2014.

謝辞

り、Smpd3/nSMase2-セラミド経路が強す

本研究は平成２４年度公益財団法人日ぎても関節軟骨を OA に傾ける可能性が

本股関節研究振興財団の研究助成によりあり、Smpd3/nSMase2 の発現量は、BMP シ行いました。同財団に深謝致します。

グナルと Runx2 の量と機能によって、fine-tuning されている可能を指摘出来る。
これらの微妙な調節は、BMP/Runx2 が誘導する Smpd3/nSMase2 の negative-feedb
ack とも言える。一方で骨の再生医療や骨折治療を考えた場合、Smpd3/nSMase2セラミド経路を抑制すれば、内軟骨性骨化過程のスピードを速める事が出来るかもしれず、その効果を示す抑制剤 GW4869等が現に存在している。逆に OA の予防や進行抑制に鑑みたとき、これを抑制しうるコンパウンドとして今回セラミドが候補に挙がった。いずれも化学合成物質であるので、動物実験を重ねながら臨床応用に適したそれぞれの化合物の derivati
ve が開発されれば、新しい整形外科領域の薬剤開発へと発展するかもしれない。

18

K., Setoguchi, T., Yokouchi, M.,
Ishidou, Y., and Komiya, S. (20Sandell, L. J., and Aigner, T.
12) SnoN suppresses maturation o(2001) Articular cartilage and cf chondrocytes by mediating sign
hanges in arthritis. An introduc
al cross-talk between transformition: cell biology of osteoarthr
ng growth factor-β and bone morp
itis. Arthritis Res. 3, 107-113
hogenetic protein pathways. J. B
Dreier, R. (2010) Hypertrophic diol. Chem. 287, 29101-29113
ifferentiation of chondrocytes i
8. Chae, Y. M., Heo, S. H., Kim, J.
n osteoarthritis: the developmenY., Lee, J. M., Ryoo, H. M., antal aspect of degenerative jointd Cho, J. Y. (2009) Upregulation
disorders. Arthritis Res. Ther.
of smpd3 via BMP2 stimulation a12, 216
ndRunx2. BMB Rep. 42, 86-90
Zheng, Q., Zhou, G., Morello, R.,
9. Khavandgar, Z., Poirier, C., Cla
Chen, Y., Garcia-Rojas, X., andrke, C. J., Li, J., Wang, N., Mc
Lee, B. (2003) Type X collagen
Kee,
M. D., Hannun, Y. A., and M
gene regulation by Runx2 contrib
urshed, M. (2011) A cell-autonom
utes directly to its hypertrophi
ous requirement for neutral sphi
c chondrocyte-specific expressiongomyelinase
2 in bone mineraliz
n in vivo. J. Cell Biol. 162, 83
ation. J. Cell Biol. 194, 277-28
3-842
9Volk, S. W., Luvalle, P., Leask,T., and Leboy, P. S. (1998) A B 10. Stoffel, W., Jenke, B., Holz, B.,
Binczek, E., Gunter, R. H., Kni
MP responsive transcriptional refka, J., Koebke, J., and Niehoff,gion in the chicken type X colla
A. (2007) Neutral sphingomyelin
gen gene. J. Bone Miner. Res. 13,ase (SMPD3) deficiency causes a
1521-1529
novel form of chondrodysplasia aKempf, H., Ionescu, A., Udager,nd dwarfism that is rescued by C
A. M., and Lassar, A. B. (2007)
ol2A1-driven smpd3 transgene exp
Prochondrogenic signals induce aression. Am. J. Pathol. 171, 153
competence for Runx2 to activat-161
e hypertrophic chondrocyte gene
11. Qin, J., Berdyshev, E., Poirer,expression. Dev. Dyn. 236, 1954C., Schwartz, N. B., and Dawson,
1962
G. (2012) Neutral sphingomyelin
van Beuningen, H. M., Glansbeek,ase 2 deficiency increases hyalu
H. L., van der Kraan, P. M., anronan synthesis by up-regulationd van den Berg, W. B. (1998) Difof Hyaluronan synthase 2 throug
ferential effects of local appli
h decreased ceramide production
cation of BMP-2 or TGF-β1 on bot
and activation of Akt. J. Biol.
h articular cartilage compositio
Chem. 287, 13620-13632
n and osteophyte formation. Oste

引用文献
1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

oarthritis Cartilage 6, 306-317
Kawamura, I., Maeda, S., Imamura,19

図表
図 1 Smpd3/nSMase2 の発現誘導様式と BMP/Runx2 の必要性

20

図 2 Smpd3/nSMase2 の軟骨細胞分化への影響

21

図 3 Smpd3/nSMase2 は Akt 経路を介して軟骨細胞分化を制御する

22

図 4 Smpd3/nSMase2 の軟骨器官培養系と、ヒアルロン酸産生への関りの軟骨器官培養系と、ヒアルロン酸産生への関り

23