博士（理学）斉藤玉緒
学 位 論 文 題 名Biochemical Study on gp64, a Putative Cell‑Cell
Adhesion Protein of the Cellular Slime IVIold,
Polysphondyliひ m. pallidひ rn（ 細 胞 性 粘 菌 Polysphon〔 炒 ZfMmpaZZZdMmの細 胞 接 着 夕 ン パ ク 質gp64の 生化 学的 研究 ）学 位 論 文 内 容の 要旨

近 縁 の Dictyostelium discoideumと 同 様 、 細 胞 性 粘 菌 Polyspカ ondylium
pallidumの 細 胞 集 合 は 、 中 心 細 胞 か ら 放 出 さ れ る 走 化 性 物 質 と そ れを 受 容 す る 周 辺
細 胞 の シ グ ナ ル リ レ ー 系 、 細 胞 間 接着 タ ン パ ク 質 に 支 配 さ れ 、 最 終 的 に 数 万の 細胞から な る 集 合 体 が 形 成 さ れ る 。 細 胞 性粘 菌 の 細 胞 接 着 の 分 子 的 仕 組 み の 解 析 は、 粘菌の細 胞 集 合 の み な ら ず 発 生 機 構 の 分 子 的 基 礎 を な す と 考 え ら れ る 。
P. pallidumで は EDTA耐 性 の 2種 の 細 胞 間 接 着 成 分 が 存 在 し て い る 。 一 っ は 、 マ
イ ナ ー な 成 分 で 集 合 前 期 に 発 現 し 始め 、 も う ー っ は 主 要 な 成 分 で 増 殖 期 か ら発 生後期に か け て 存 在 す る も の で あ る 。 こ の主 要 な 成 分 は 、 一 価 抗 体 に よ る 接 着 阻 害実 験から分 子 量 64kDaの 糖 タ ン パ ク 質 （ gp64） で あ る こ と が 明 ら か に さ れ た 。 精 製 gp64に 対し て 作 製 し た 単 ク ロ ー ン 性 抗 体 は P． palliclumの!ffll胞 接若 を阻 害し 、こ の阻 害能はL‑フ コ ー ス に よ り 中 和 さ れ た 。 こ の結 果 は 、 gp64の 桝 i鎖 が 知 I胞 接 着 に 関 与す ることを 示唆 して いる。
こ れま で、 細胞性 粘菌 の翁 ‖胞 1刊 接着 夕ンパ ク質 の柵 造に 13す る研 究は ほとんどなされて いな い。 P. p´ 1′ ′´ f′Umのgp64は D．イ ´sc0′deUmの荊n胞接着タン．パクcontactsitcsA（ csA） よ り も 量 的 に 多 い こ と か ら 構 造 解 析 に 適 し た タ ン パ ク 質 で あ る 。 そこ で 、 夕 ン パ ク 質 の 構 造 解 析 を す る 前 提 と し て gp64の 大 量 精 製 の シス テ ム を 碓 立 した 。 本 精 製 法 は 、 界 面 活 性 剤 に よ る可 溶 化 、 超 遠 心 に よ る 可 溶 化 成 分 の 分 離、 硫酸アン モ ニ ウ ム に よ る 塩 析 、 DEAEセ ル ロ ー ス ・ ク 口 マ 卜 グ ラ フ ィ ー の 4っ の ス テ ッ プ か‑159− ・

ら なる 。 特 に有 効 なス テ ップ は 硫酸 ア ンモニ ウムによる 塩析の過程 で、2.5M〜3.
0Mの 硫安 で 現れ る 不溶 性 の浮 上 画分 を 回収 す るこ と にあ る 。 本方 法 によ り3x1010の 集 合 期 の 細 胞 か ら 6.4mgの gp64を 短 時 日 で 精 製 す る 事 が で き る 。
先 に 決 定 さ れ て い た gp64の cDNA配 列 か ら 、 gp64の ア ミ ノ 酸 配 列 に は 次 の 3つ の構造 上の特徴が 見られた。 1）全体 で10箇所のア スパラギン 結合糖鎖の付加可能な部位が存在すること。2）N末端とC末端の両側に疎水性アミ丿・酸の配列が存在し糖脂質
ア ンカ ー による修飾 が予想され ること。3）cDNA配列か ら予想され るアミノ酸 320残基中 システイン が36残基存在す ること。
そ こで 、 これらの特 徴に基づき gp64がどのよう に細胞接着 に関わるの か、その分 子的機 構を明らか にする目的 でgp64の構造解析 を行った。
ま ず、 糖 鎖の種類を 調べるため に、精製gp64の へキソサミ ン分析を行 ったところ 、gp641分子 あ たり 9.9分 子 のグ ル コサ ミ ンを 検 出し た が、 ガ ラ クト サ ミンは 検出され なか っ た。このこ とから、gp64に 存在する糖 鎖はセlJン・ス レオニン結 合型糖鎖で はな く 、アスパラ ギン結合型 であると判 断した。糖 鎖付加可能 な配列を持 つ10箇の小 さなペプチ ドを精製し 、各ペプチドについてアミノ酸組成分析とアミノ酸配列分析に より糖鎖の 有無を調べ た。その結 果、NXT／Sの配列 を持つ6箇所は全て糖鎖が付加 し て い る が 、 NXCの 4箇 所 に つ い て は 付 加 が 認 め ら れ な か っ た 。
次 に、 N末端とC末端の プ口セッシ ングと糖脂 質アンカー による修飾 についての 解析を 行っ た 。 ピリ ジ ルエ チ ル化 gp
64を 直接 エドマン分 解に供する ことにより 、N末端19残基 から なるシグナ ル・ペプチ ドのプロセ ッシング（ 除去）があ ることを明 らかに した 。 次 に真 の C
末 端 を決 定 する た め、 ピリジルエ チル化gp
64
をり シルエンド ペ
プチ ダーゼで消 化し逆相HPL
Cでギお製後、全てのペプチドの帰属を決定したが、C末端を 含むと考え られるペプ チドのみは 回収できな かった。そ こで、C末端にりジンを持っ ペプチド（ リジンペプ チド）を特典的に回収するアンヒド口トリプシン親和性カラ ムに よ ルリジンペ プチドとC末端ペプ チドの分離 を行い真の C末端 を決定した 。その 結果 真 のC
末端 は予想より 22残基N末端側のScr279であ ることが明 らかとなっ た。
こ れら の 特徴からgp64
は 糖脂質アン カー型タン パク質と想 定し、アン カーの榊造 解析 を 進 め た 。 gp64の 糖 脂 質 ア ン カ ー は Thy‑l antigen， variantsurfacc
glycoprotc
ln （ VSG） のよ う なフ ォ スフ ァチジルイ ノシ卜ール 特異的フォ スフォリ パ ー ゼ C（ PI． PLC） で 切断 さ れる 典 型的 な もの と は 異な り P
I． P
LCに は非 感 受― 160―

性で、亜硝酸による脱アミノ反応により切断を受ける。しかも、脱アミノ反応によって生じ る物 質が フォ スファ チジ ルイ ノシ卜 ール （PI）と は異なった。アンカーに含まれる脂肪酸はエステル結合を切断する弱アルカリ処理では切断されず、アミド結合を切 る 強 酸 処 理 で 切 断 さ れ る もの で あ っ た 。主な 脂肪 酸は C
22：0でヒ ド口 キシ 脂
肪酸は 含ま れて いな かった 。こ のこ とは、 gp64の糖 脂質 アンカーが酵母などの下等真核生物に見られるセラミドを含むものであることを示唆するものである。そこで、
脂肪 酸 抽 出 後の サンプ ルに 長鎖 塩基 の有無 を分 析し 、C18フ ァイ トスフ アン ゴシ ンを持つ こと を明 らか にした 。っ まり 、gp64の糖 脂質 アン カーは一般のPIを含むアンカーではなくフォスフォセラミドを含むものであることが明らかになった。細胞接着タンパク質には糖脂質アンカーを持っものが若干報告されているが、細胞性粘菌においては解析された接着タンパク質の全てが糖脂質アンカーを持つことが示されている。
また、セラミドを持つ糖脂質アンカーは下等真核生物に限られており、細胞性粘菌の進化的立場を考える上でも興味深い点である。
最後 に gp641分 子 あ た り 36残 基存 在 す る シ ス テ イ ン の 存 在 様式 に つ い て 調 べた 。
ま ず SH基 検 出 試 薬 DACMに よ る 反 応 を 行 な い 、 36残 基 全 て が S‑S架 橋 を 形 成し ているも のと 推定 され た。そ こで、そのS‑
S架橋の位置を決定することにより他の接着タン パ ク 質 と の topologicalな相 同 性 を 調 べ た 。 精 製 gp64を各 種 の タ ン パ ク質 分
解酵 素 に よ り分 解し、 得ら れた 全て のペプ チド を逆 相HP
LCで2回 精製後 、ア ミノ 酸
組成分 析と アミ ノ酸 配列分 析に より S
‑S架橋 の位 置を決 定し た。最終的に1分子あたり18箇 所 存 在す るS‑
S架 橋のう ち15箇所 を決 定した 。そ の結 果、 フィブ ロネ クチ ン
や補 体 系 の タ ン パ ク 質 に 特 徴 的に 見 ら れ る S
ushidomain
を 少な くと も5つ持 つこ とが明 ら か と な っ た 。 Sushidoma
inの 存 在 を S− S架 橋 構 造 を 含め て 明 ら か に した のは無脊椎生物については本研究が始めてである。このドメインの機能についてはまだはっきりしていないが、タンパク質ータンパク質の相互作用に関与することが示唆されており、細胞接着にこのドメインがどのように関わるのか大変興味のある今後の課題である。

‑ 161―

学 位 論 文 審査 の 要 旨
主査 教授
副査 教授
副査 教授
副査 助教授落合 廣
吉 川正 明高 橋孝 行奥山英登志

学 位 論 文 題 名Biochemical Study on gp64, a Putative Cell‑CellAdhesion Protein of the Cellular Slime Mold,
Polysphondyliu,rn palli 'urn
（細胞性粘菌Polysphondyliumpallidumの細胞接着夕ンパク質gp64の生化学的研究）

細胞性粘菌の細胞接着の分子的仕組みの解析は、粘菌の細胞集合のみならず発生機構の分子的 基礎 をなす 研究 と考 えら れる。Po恥！pめぬ面価珊閉矼織zn疋はEDTA耐性の2種の細胞間接着成分カ靖荘している。―つは、マイナーな成分で集合前期に発現し始め、もうーつは主要な成分で増殖期から発生後期にかけて存在するもので分子量64k田の糖タンパク質（gp64）である。
これまで、細胞性粘菌の細胞間接着タンパク質の構造に関する研究はほとんどなされていな
い。P．p日Z眦轟lmの餌）64はD
匝如鹹ぬumの細胞接着タンパク質CCnlZは頭：teSA（CsA）よりも量的に多いことから構造解析に適したタンパク質である。

そごで、申請者はタンパク質の構造解析をする前提としてまず帥64の大量精製のシステムを検討し、3x1010の集合期の細胞から6．4mgの鮮）64を短時日で精製するシステムを確立した。
先に 決定さ れて いた gp64のc睇峨配列から、申請者はgp64のアミノ酸配列に次の3つの構造上の特徴を認めた。1）全体で10箇所のアスパラギン結合糖鎖の付加可能な部位カ蒋在すること。2）N末端とC末端の両側に疎水性アミノ酸の配列カヰ薙し糖脂質アンカーによる修飾
一162−

が予 想さ れること。3） cDNA配列から予想されるアミノ酸320残基中システインが36残基存在すること。
まず、糖鎖の結合部位を明らかにするために、糖鎖付加可能な配列を持つ10箇の小さなぺプ
チドを精製し、各ペブチドについてアミノ酸組成分析とアミノ鬱鐘己列分析により纜鑞の有無を調べ た。 その結果、cr/sの配列を持つ6箇所には全て糖鎖カ咐加しているカs NXCの4箇所には付加を認めなかった。
次に、N末端とC末端のプロセッシングと糖脂質アンカ―による修飾についての解听を行った。
ピリジルエチル化gp64を直接エドマン分解し、N末端19残基からなるシグナル・ペブチドのプロセッシング（除去）があることを明らかにした。次に真のC末端を決定するため、C末端にりジンを持つぺプチド（リジンペブチド）を特異的に回収するアンヒド口卜リブシン親和性カラムによルリジンペブチドとC末端ペプチドの分離を行い真のC末端を決定した。その結果
真の C末 端は 予想よ り22残基 N末 端側 のSer279であることを明らかにした。これらの特徴
から餌）64は糖脂質アンカ一型タンパク質と想定し、アンカ―の構造解析を進めた。罫）64の糖脂質アンカ―はフオスフんチジル・イノシト−´い寺異的フオスフォリパーゼC（PI−PLC）に非感受性で、亜硝酸による脱アミノ反応により切断を受けた。また、脱アミノ反応によって生じた物質はフオスファチジルイノシ卜一ル（PI）ではなかった。主な脂肪酸はC22：Oでこれらの脂肪酸はアミド結合型のものであった。このことは、g晒4の糖脂質アンカーがセラミドを含むものであることを示唆するものである。そこで、脂肪酸抽出後のサンブルを長鎖塩基の有無について分析し、C18フんイ卜スフアンゴシンを持つことを明らかにした。っまり、堺）64の糖脂質アンカ―は一般のPIを含むアンカ―ではなくフオスフォセラミドを含むものであることを明らかにした。
最 後に 堺641分子あたり36残基存在するシステインの存在様式について調べた。精製

gp64を各種のタンパク質分解酵素により分解して得られた全てのぺブチドをアミノ醸組成分析とアミノ酸配列分析によりS―S架橋の位置を決定した。最終的に1分子あたり18箇所存在す
るS‐S架橋のうち15箇所を決定した。その結果、gp64
カフアブロネクチンや補体系のタンパ

ク質 に特 徴的 に見 られ る亂 血dCma血 を少 なくと も5つ持 つこ とを 明らかにした。Sl竝虹一163−．

dcmainの存在をS―S架橋構造を決定して明らかにしたのは無脊椎生物については本研究が初めてである。このドメインの機能についてはまだはっきりしていないカt夕ンパク質―夕ンパク質の相互作用に関与することカ詠唆されており、細胞接着にこのドメインがどのように関わるのか新たな展望を開いたものといえる。

7編の参考論文のうち6編は英文で、米国生化学会誌（J．B
ioI.
Chem.誌）の2編を含め権威有る国際誌に投稿されており、最終試験の結果も満足するものであった。審査員―同は申請者が博士（理学）の学位を受ける十分な資格を有すると認めた。