博士（理学）山口雅裕
学位論 文題名Studies on the mechanisms of hemoglobin transitionand erythropoleSlSintheSalamander，め簓〇 ろZ勿S髭勿凡を彪S（エゾ サンショウウオにおけるヘモグロビン転換および造血機 構に関する研究）
学位 論文内容の要旨

両生類に おけるへ モグロビ ンの幼生 型から成 体型への 転換は、脊椎動物における遺伝子発現調節 機構のモ デル実験 系として 、おもに 無尾類を 用いてよく研究されている。その転換は甲状 腺ホルモ ンによっ て弓Iき起こされることや、幼生型ヘモグロビンのみを持つ赤血球が、成 体型ヘモ グロビン のみを持 つ赤血球 に置き換 えられることがこれまでに分かっている。
一方、エ ゾサンシ ョウウオ は、日本 で唯一、 幼形成熟 （ネオテニー）の記録の残る有尾両生類で あり、外 部形態の 変態とは 独立に、 体内の組 織や生化学的物質が転換する可能性が考えら れる。事 実、無尾 類と同様 、本種で も変態期 にへモグロピンが幼生型から成体型に転 換 す るが 、 そ の転 換 は、 外部形態 の変態を 促す甲状 腺ホルモン の作用に は依存し ない、独特 のもので あること が報告さ れている 。そこで 、本研究は、このエゾサンショウウ
オ に お ける へ モグ 口ビ ン の転 換機 構 を明 らか に する 目的 で 行わ れた 。
第1章では 、赤血球 に含まれ るへモグ ロビンの 分子種、 赤血球の密 度、形態 、浸透圧 といった諸性 質が、変 態ととも にどのよ うに変化 するかが 観察された。その結果、幼生と成体の赤血球 は、これ らの性質 において 異なるこ とが分か り、また、幼生型から成体型に転換する際に は、中間 的性質を 持つ赤血 球が多数 現れるこ とが観察された。特に、転換期の個体の赤血 球は、異 なる密度 を持つニ つの赤血 球の集団 に分画されることはなく、幼生赤血球と成体 赤血球の 中間の密 度を持つ ことが示 された。
さらに、幼 生型ヘモ グロビン 、成体型 ヘモグロ ビンをそ れぞれ特異的に認識する抗体を作製し、脾 臓の連続 組織切片 や末梢血 の塗抹標 本を免疫 染色した結果、ヘモグロビン転換の前後を通 じて脾臓 は造血活 性を持ち 続けるこ とや、転 換期の個体では、同一の赤血球が両方のタイ プのへモ グロビン を持つこ とが確か められた 。これらの結果は、エゾサンショ
ウウオのへ モグロビ ン転換が 、無尾類 で報告さ れている ような細胞集団の置き換え（「置き換えモデ ル」）に よって生 じるので はなく、 同一の細 胞系譜の中で、遺伝子発現の切り替え （「 切り 替えモデル 」）によって生じることを示 唆している。
第 2章 で は、 第 1章 で示唆さ れたエゾ サンショ ウウオヘ モグロビ ン転換の 「切り替え モデル 」 を 遺伝 子 発 現レベ ルで検証 するため 、幼生型 、及び成 体型グロ ビンのcDNAク口 ーンが 単 離 され 、 こ れらの 遺伝子の 発現バタ ーンが解 析された 。その結 果、個体の 発生に伴っ て グ 口ピ ン mRNAも幼 生 型 から 成 体 型に 転 換す る こ とが 確 認さ れ た 。し か し、そ の転換はきわめてゆっくりと進み、変態後1年以上を経た個体でも、少量の幼生型グ口ビンmRNAを 持つこ とが 分かった。ウエスタンブ口ットの結果、このmRNAの少なくとも一部は幼生型のグ口ビンタンバクに翻訳されていた。また、薬剤によって変態を阻害された個体でも、通常飼育個体と同じタイミングで成体型グ口ビンmRNAを発現した。これらの結果は、エゾサンショウウオのへモグ口ビン転換が甲状腺ホルモンの作用とは独立に生じることを重ねて示している。
一方、脾臓の組繊切片を二重血釘tuハイブリダイゼーションした結果、転換期の個体の赤血球には、両方のタイプのグ口ビンmRNAが共存することが直接的に証明された。
また、薬剤によって個体に脱血を誘導しても、無尾類の場合と異なり、変態完了前の個体ではへモグ口ビンの転換が早まることはなかった。これらの結果から、工ゾサンショウウ
オのへモグ口ビン転換が多くの他の両生類とは異なり、「切り替えモデル」に従って生じることが示された。
第3章では、前2章の結果を受け、造血部位の同定が行われた。一般に脊椎動物の血球は胎仔型と成体型に分類され、胎仔型の赤血球には幼生型（胚型）、成体型の赤血球には成体型のへモグ口ビンが含まれることが知られている。また、これらは由来する部位も異なるとされ、アフリカツメガエルの場合、胎仔型の赤血球は腹部血島に由来し、背側側板の細胞は成体型の赤血球に分化することが報告されている。ところが、エゾサンショウウ
オの場合、前述のように単一の赤血球中に両夕イプのへモグ口ビンが共存するため、胎仔型と成体型の2種類に赤血球を分別することは難しい。このような種における赤血球の由来を調べるため、エゾサンショウウオのGATA‑1、及びGA11A−3のCDNAクローンが単離され、グロビンやこれらの遺伝子の発現部位を探ることにより、造血部位の同定がなされた。その結果、背側側板の細胞は、腹部血島の細胞とともに、孵化前の時期から幼生型グロビンを発現し、赤血球としてその場所で分化することが分かった。一方、成体型血球細胞のマーカーであるGATA―3は、孵化前の時期に、もっぱら背側側板で発現していた。このことは、側板の細胞は、発生のより後期における血球供給源でもあることを示唆している。このように、エゾサンショウウオは腹部血島と背側側板の2カ所の造血部位を持っという点で、無尾類やそれより高次の脊椎動物と同様の特徴を示した。一方、背側側板の細胞が早期に幼生型ヘモグロビンを持つ赤血球に分化する点で、無尾類や高次脊椎動物と異なる特徴を示した。ゼプラフイッシュなどの硬骨魚類では、血島に当たる造血部位は存在せず、胚型ヘモグロビンを持つ赤血球が胚体内の中間細胞塊に由来する。この点では、エゾ サン シ ョ ウ ウオ の 赤 血 球造 血 は 魚 類に 類 似 し てい る と 言 える。
これらの観察に基づぃて、成体型ヘモグロビンのみを持つ「成体型赤血球」がエゾサンショウウオにも存在し、この赤血球は変態期に甲状腺ホルモンの作用によって増殖・分化を誘導される、というモデルが提唱された。薬剤によって変態を抑制しても、ヘモグロビン転換は通常個体と同じタイミングではじまるが、転換終了は少し遅れること、逆に甲状腺ホルモンを人為的に投与するとへモグロビンの転換は早まること、また、薬剤によって一度脱血を誘導した後、変態完了後にへモグ口ビンバターンを調べると、脱血誘導個体の方 が へ モ グ 口 ビ ン 転 換 が 速 く 進 む こ と 、 な ど はこ の モ デ ル を 支 持す る 。
本研究は、エゾサンショウウオのへモグ口ピン転換が、単一の赤血球系譜中での遺伝子発現の切り替えによって生じることを世界にさきがけて示した。両生類の変態に伴う体内組織、器官の作り替えは、おもに幼生型細胞の細胞死と成体型細胞の選択的増殖・分化としてとらえられている。しかし、本種におけるへモグロビン転換はこのモデルには当てはまらず、両生類の変態を研究する上で、新しい独特の系を提供するものと考えられる。
また、本研究によって、エゾサンショウウオの造血機構は、魚類と無尾類の中間的性質を示すことが示された。脊椎動物の初期発生における造血は一般に胚体外（または腹部）血島ではじまるのに対し、魚類では胚体外での造血が認められない種が多く、両者の間にはギャヅプが存在する。本研究によって示されたエゾサンショウウオの造血部位はこのギャップを埋めるもので、本種における造血機構の研究は脊椎動物の造血の進化を考える上で、有益であると考えられる。

学 位 論 文 審 査 の要 旨
主査
副査
副査

教授 山下正兼助 教授 若原正己
教授 浦野明央

学位論文題名
Studieson the mechanisms of hem
oglobin tran
sitionand erythropoleSlSintheSalamander，
月シ刀〇みZ勿S
髭勿0伽彪S（エゾサンショウウオにおけるヘモグロビン転換および造血機構に関する研究）

両生類におけるへモグ口ピンの幼生型から成体型への転換は、脊椎動物における遺伝子発現調節機構のモデル実験系として、おもに無尾類を用いて研究されてきた。その転換は両生類の変態ホルモンである甲状腺ホルモンによって引き起こされることや、幼生型ヘモグ口ビンのみを持つ赤血球が、成体型ヘモグ口ビンのみを持つ赤血球に置き換えられることがこれまでに分かっている。一方、工ゾサンショウウオは、幼形成熟（ネオテニー）の記録の残っている日本で唯一の有尾両生類であり、両生類の変態現象、脊椎動物の進化、生物多様性などの理解にとってきわめて貴重な動物種であるにもかかわらず、本種の研究はほとんど手っかずに残されてきた。
本論文は、エゾサンショウウオにおけるヘモグ口ピンと赤血球の幼生型から成体型への転換、及びその造血機構を、細胞生物学的・免疫組織化学的・分子生物学的手法を用いて解明したものである。
第1章では、赤血球に含まれるヘモグ口ピンの分子種、赤血球の密度、形態、浸透圧といった諸性質が、変態とともにどのように変化するかを詳細に観察している。その結果、赤血球が幼生型から成体型に転換する際には、二つの赤血球の集団に分画されることはなく、両者の中間的性質を持つ赤血球が現れることを示した。さらに、幼生型ヘモグ口ピン、成体型ヘモグ口ビンをそれぞれ特異的に認識する抗体を作製し、脾臓の連続組織切片や末梢血の塗抹標本を免疫染色した結果、転換期の個体では、同一の赤血球が両方のタイプのへモグ口ビンを持つことを確かめた。これらの結果から、工ゾサンショウウオのへモグ□ピン転換が、無尾類で報告されているような細胞集団の置き換え（「置き換えモデル」）によって生じるのではなく、同一の細胞系譜の中での、遺伝子発現の切り替え（ 「切 り 替 え モ デ ル 」 ） に よ っ て生 じ る こ と を 世 界 に 先 駆 けて 明 ら かにし た。
第2章では、エゾサンショウウオヘモグ口ビン転換の「切り替えモデル」を遺伝子発現レベルで検証するため、幼生型、及び成体型グ口ビンのcDNAク口ーンを単離し、これらの遺伝子の発現バターンを解析している。脾臓の組織切片を二重加situハイブリダイゼーションした結果、転換期の個体の赤血球には、両方のタイプのグ口ビンmRNAが共存していることを疑問の余地なく示した。また、薬剤によって個体に脱血を誘導しても、無尾類の場合と異なり、変態完了前の個体ではへモグ口ビンの転換が早まることはなかった。これらの結果は、エゾサンショウウオのへモグ口ピン転換が多くの他の両生類とは異な り 、 「 切 り 替 え モ デ ル 」 に 従 っ て 生 じる こ と を 重 ね て 証 明し て い る 。
第3章では、工ゾサンショウウオの造血調節遺伝子であるGATA‐1、及びGATA‐3のcDNAク口ーンを単離し、グ口ピンやこれらの遺伝子の発現部位を、主としてinsitLzハイブリダイゼーション法で探ることにより、本種における造血部位の同定を行った。その結果、背側側板の細胞は、腹部血島の細胞とともに、孵化前の時期から幼生型グ□ビンを発現し、赤血球としてその場所で分化することが分かった。一方、成体型血球細胞の分化マーカーであるGATA‑3｜ま、孵化前の時期に、もっぱら背側側板で発現していた。このことは、側板の細胞は、発 生のより後期における血球供給源でもあることを示唆している。このように、エゾサン ショウウオは腹部血島と背側側板の2力所の造血部位を持っという点で、無尾類やそれよ り高次の脊椎動物と同様の特徴を示した。他方、背側側板の細胞が早期に幼生型ヘモグ口 ピンを持つ赤血球に分化する点では、多くの魚類に類似していた。っまり、エゾサンショ ウウオの赤血球造血は、無尾類と魚類の中間的特徴を持っている こと を明らかにした。
これを要するに、著者は 、エゾサンショウウオのヘモグ口ピン転換が、単一の赤血球系譜中での遺伝子発現の切り 替えによって生じること、その造血機構が、魚類と無尾両生類の中間型を示すことを世界 にさきがけて明らかにし、両生類の変態と造血機構及び脊椎動物の進化を研究する上で、 まったく新しい独特の実験系を提供するとともに、発生生物学・進化生物学の発展に貢 献するところ大なるものがある。
よって著者は、北海道大 学博士（理学）の学位を授与される資格があるものと認める。