神奈川自然誌資料 (42): 33–38, Mar. 2021

原著論文

藤沢市に生育するクゲヌマランの遺伝子解析
大井和之・岸しげみ・一ノ瀬友博
Kazuyuki Ooi, Shigemi Kishi and Tomohiro Ichinose: Genetic analysis ofCephalanthera longifolia (L.) Fritsch in Fujisawa City,Kanagawa, Japan緒かる可能性がある。

言Hayakawa et al. (2014) で は， 核 リ ボ ゾ ー ム DNA のクゲヌマランは，樹林下に生育する地生ランで，ギンITS 領域と葉緑体の rbcL，matK 遺伝子によるキンランて白い花をつけるが，唇弁基部の距が浅くて突出しない

erecta，ササバギンラン C. longibracteata Blume (1859) はラン Cephalanthera erecta (Thunb.) Blume (1859) とよく似属 Cephalanthera の系統樹が示されていて，ギンラン C.

ことで区別できる。本種は，藤沢市鵠沼海岸産の標本にキンラン C. falcata (Thunb.) Blume (1859) に近く，クゲ基づき 1936 年に前川文夫博士により C. shizuoi F. Maek.

ヌ マ ラ ン は 別 の グ ル ー プ に な り，ITS ま た は matK 領として記載された。その後，遊川（2009）は，エゾギン域の塩基配列で分子同定できるとされている。また，Micheneau et al. (2010) では葉緑体 DNA の塩基長が変異

ラン C. elegans Schltr. (1919)，クゲヌマラン，台湾の C.

alpicola Fukuyama (1938) は同一種で，ユーラシア大陸かしやすい領域（葉緑体マイクロサテライト）を用いてヨーらアフリカ北部まで広く分布する C. longifolia (L.) Fritsch

ロッパからアジアに分布する C. longifolia のハプロタイ(1888) に相当すると整理した上で，和名についてはエゾプを報告している。本研究では，藤沢市内の元々から生ギンランの方が早くに命名されているものの，クゲヌマ育しているクゲヌマランと新しい生育地のクゲヌマランランがより一般的に使われているので C. longifolia の和について，これらの先行研究で分析された遺伝子領域の名としてはクゲヌマランを用いることが適切だろうとし遺伝子解析を行って，論文やデータベースに登録されたている。

塩基配列との比較を実施した。

クゲヌマランは環境省レッドデータブックの 2000 年版では絶滅危惧 IA 類とされていたが，2007 年のレッド材料と方法リストおよび 2014 年のレッドデータブックでは絶滅危
惧Ⅱ類になっており，「神奈川県においては，絶滅した2016 年の 5 月と 6 月に，藤沢市内の 3 か所でクゲヌマ自生地があるものの，最近の霊園や公園での発生状況

ランの葉を採取した（図 1）。1980 年代から本種の生育調査報告書：植物篇 (2006)），造成地などで新たに発生体を試料 H，近年の新規発生地である市街地の公園からは帰化植物的であるとされ（神奈川県レッドデータ生物が確認されている個人宅敷地のクロマツ林下から得た個する例が報告されている」と記載されている（環境省，得た個体を試料 O とした。この 2 か所では生育が確認で2015）。神奈川県レッドデータブック 2006 でも絶滅危惧きた個体が少数であったため，現地株の保全を優先してDNA サンプルの葉 1 枚のみを採取した。また，本種のⅡ類とされているが，最近発表された神奈川県レッドリ
スト〈植物編〉2020 では本種はランク外となり掲載さ新規発生地である慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス（以れていない（勝山ほか，2006；神奈川県環境農政局緑政下 SFC）内でも標本採取を行なった。SFC 内には本種だ部自然環境保全課，2020）。

けでなくギンランも生育しているが，調査時は結実期で，藤沢市内でも，公園や大学キャンパスなどで新たに本キンラン属の種判別に重要な花の形態が確認できなかっ種の生育が確認されることが増えてきている。一方で，たため，複数種が含まれる可能性を考慮しつつ，3 標本以前から生育が確認されている場所では，開花株数の減（SFC1–3）を採取し，DNA 解析に用いた。SFC のさく葉生した生育地のものが帰化植物であれば，以前からの生本番号：KPM-NA0306608 〜 KPM-NA0306610）。

少など衰退傾向が見られている。万が一，最近新たに発標本 3 点は神奈川県立生命の星・地球博物館に収めた（標育地の個体とは由来が異なるため，遺伝的な相違が見つ

葉 1/2 枚（長さ約 2 cm 分）を液体窒素で凍結して乳鉢33図 1．本研究に用いた試料の採取地での様子（2016 年 6 月 12 日撮影）． A：従来からの生育地のクゲヌマラン（試料 H）；B：新規生育地のクゲヌマラン（試料 O）；C：SFC 構内のクゲヌマラン（試料 SFC1，標本番号：KPM-NA0306608）；D：SFC 構内のキンラン属の１種（ギンラン）（試料 SFC3，標本番号：KPM-NA0306610）．
表 1．PCR 分析に使用したプライマー

領域
ITS
matK
accD-psa1
trnK-matK
trnS-trnG

名称

プライマー配列ITS5GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC

matKAF

CTATATCCACTTATCTTTCAGGAGT

matK8RAAAGTTCTAGCACAAGAAAGTCGAFGGAAGTATAGCACTAGCTTCR

ACTTATAACTGATGTCCCCAF

ATCTTCCTCCAAAAAATCCC

R

GAGCATTTCAGAATACAAATTCFRGTTCAAGGCAAAGGACAAGTAACACGTATTTTGTTCCTCC
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出典White et al. (1990)
Ooi et al. (1995)
Micheneau et al. (2010)
Micheneau et al. (2010)
Micheneau et al. (2010)

で粉砕し，ISOPLANT II（ニッポンジーン）を使用して& Kudo) Ohwi のクレードに含まれた。

ITS 領域，試料 H と試料 O について matK 領域，試料 H

Micheneau et al. (2010) の Table 3 のハプロタイプ記号で示

ト 3 領域（accD-psa1，trnK-matK，trnS-trnG）の塩基配M，trnS-trnG（216 bp）が Z となった。これは Micheneau

マニュアルに従って DNA を抽出した。全試料について葉緑体マイクロサテライト 3 座位の塩基配列長をと試料 O，試料 SFC1 について葉緑体マイクロサテライ

すと，accD-psa1（124 bp）が H，trnK-matK（169 bp）が列解析を行った。解析に用いたプライマーは表 1 に示す。

et al. (2010) で解析されている中国雲南省で 1981 年に採PCR 反応は Ex Taq（タカラバイオ）を用い，温度サイク取されたキュー植物園の標本（ハプロタイプ HNZ）と 1ルは ITS 領域と matK 領域は 94 ℃ 2 分−（94 ℃ 30 秒−

塩基の相違で最も近い。Micheneau et al. (2010) の Figure 152 ℃ 30 秒− 72 ℃ 1 分 30 秒）× 35 回− 72 ℃ 7 分，葉に藤沢市産クゲヌマランのハプロタイプを加えてハプロ緑体マイクロサテライト 3 領域は 94 ℃ 2 分−（94 ℃ 30タイプの関係を示したものを図 4 に示す。

秒− 55 ℃ 1 分− 72 ℃ 1 分）× 30 回− 72 ℃ 7 分とした。
PCR 反応産物は，QIAquick PCR purification kit（QIAGEN）

考で未反応のプライマーと dNTP を除去した上で，PCR プライマーを片方ずつ使用して DNA シーケンサーで塩基察

藤沢市内に生育しているクゲヌマランは，1980 年代配列を決定した。

から発生が確認されている元々の自生地のものも，最近に挟まれた部分の全長を確定した。ITS 領域（684 bp）

ロサテライトのハプロタイプは同一であり，ヨーロッパ塩基配列は BioEdit で相補配列と照合してプライマー分布を拡げている新しい生育地のものも，葉緑体マイクと matK 領 域（1,170 bp） に つ い て は，NCBI BLAST 検や中東産の C. longifolia のハプロタイプではなく，中国索を行い DNA データバンクに登録された類似度の高い雲南省およびネパール産の標本で報告されているアジア

配列データを取得し，CLUSTAL W でアライメントを行っ型に属していた。このことから，ヨーロッパ産の外来個た後，MEGA X (Kumar et al. 2018) によって分子系統樹体が移入して分布を拡げているわけではなく，日本在来を作成した。系統樹の推定には最尤法を用い，塩基置換の遺伝子型の系統が分布を拡大していることが明らかとモデルとして Tamura-Nei model を，塩基置換速度の分布なった。しかしながら，今回分析した葉緑体マイクロサモデルとして Gamma distribution with Invariant sites (G+I)

テライトは遺伝子型の多型がそれほど多く見られるものを使用した。系統樹の各分岐の信頼性については 500 回

ではなく，北海道から九州まで分布する本種の産地によのブートストラップ分析により評価した。
結る遺伝子型の違いは知られていないため，国内外来の可能性については否定できない。

本種が最近急に増えてきたように見える理由として，

果

今回分析したものと同一の遺伝子型の中に繁殖力が強い

塩基配列の解析結果は、いずれの領域でも試料 H，試系統が存在して，国内外来系統として最近各地に移入し料 O，試料 SFC1 は同一の塩基配列であった。各領域のて分布を拡げているという仮説が考えられる。この仮説

塩基配列の塩基配列長とアクセッション番号を表 2 に示を検証するためには，葉緑体マイクロサテライトよりもす。DNA データバンクに登録されている配列を加えて，はるかに詳細に，個体ごとの遺伝子型を区別できるようITS 領域の塩基配列で作成した分子系統樹を図 2，matKな遺伝子マーカーの分析が必要となる。最近では RAD-遺伝子領域の塩基配列で作成した分子系統樹を図 3 に示

seq や MIG-seq という次世代シーケンサーを用いてゲノす。どちらの系統樹においても，本研究の試料は，試料ムワイドな遺伝子型解析を行う手法が開発されており，

SFC3 を除きクゲヌマラン C. longifolia のクレードに含まこれを適用すれば発生場所による遺伝子型の集団構造がれた。試料 SFC3 の ITS 領域の塩基配列（アクセッショ解析可能と期待される。

ン番号 LC589968）はギンランに近く，分子系統樹でギ一方で，国内外来系統ではなく，地域在来の系統が分ンランとユウシュンラン C. erecta var. subaphylla (Miyabe

布を拡大していることも考えられる。SFC では，本種の表 2．藤沢市に生育するクゲヌマラン C. longifolia の塩基配列分析結果

領域

塩基配列長

アクセッション番号ITS

683 bp

LC589969

matK

1,170 bp

LC589970

accD-psa1

124 bp（プライマーを含む）

LC589971

trnK-matK169 bp（プライマーを含む）

LC589972

trnS-trnG

216 bp（プライマーを含む）

LC589973

35図 2．ITS 領域の最尤法による分子系統樹（各枝の数字はブートストラップ支持確率）．本研究の試料は枠囲みで示した．試料 H，試料 O，試料 SFC1，SFC2 の塩基配列は AY369083 の塩基配列と 100% 一致した．
試料 SFC3 の塩基配列はギンラン C. erecta に最も近かった．

他にギンランとキンランが生育している。生育地は 30の DNA 分析による同定によって，イボタケ科の 3 種のとした常緑広葉樹林の林床である。ラン科植物は微小なることを明らかにした。公園や緑地の植栽林の菌類相が年前に開校したキャンパスの周縁部のシラカシ等を主体菌が本種の種子発芽とその後の実生の成長に関与してい種子が菌類と共生して発芽する。Sakamoto et al. (2017)

キンラン属の種子発芽に適した状態になって，本種の実では本種の菌根の ITS 領域の遺伝子解析からイボタケ科生が発生しやすくなった可能性は高いと考えられる。の複数の種類の塩基配列が得られており，共生菌の特異今回の調査で，分布が拡大しているクゲヌマランは在性は狭くはない。造成から 20 年程度経過して，樹林地来系統か国内外来系統のいずれかであることが明らかとら，周辺から飛散してきた種子が発芽できるようになっ菌類相が発達し生育適地が拡大した，という要因が考えらの菌類相が発達しランの生育に適した状態になってかなった。分布拡大には，①繁殖力が強い系統が増えた，②た可能性が考えられる。東ほか（2020）では横浜市の埋れ，これらの要因が実際にどの程度寄与しているのかを明

立地の植栽林にある自生地において播種実験と共生菌類らかにするためにはさらなる調査解析が必要である。
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図 3．matK 遺伝子領域の最尤法による分子系統樹（各枝の数字はブートストラップ支持確率）．本研究の試料は枠囲みで示した．試料 H と試料 O の塩基配列は既知のクゲヌマラン C. longifolia の塩基配列と100% 一致した．matK 領域は塩基配列の変異に乏しく，クゲヌマランの種内多型は認められなかった．

図 4．クゲヌマラン C. longifolia の葉緑体マイクロサテライトのハプロタイプネットワーク（Micheneau et al. 2010 のFig. 1 を改変）．本研究で分析した試料 H，試料 O，試料 SFC1 は全て HMZ 型であった．

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謝

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辞

クゲヌマランの系統分類に関しては山形大学の横山潤教授，東北大学の牧 雅之教授，国立科学博物館の遊川知久博士から多くの情報提供を受けた。佐賀大学の辻田有紀准教授には原稿に有益なコメントをいただいた。また調査にあたり，青木小四郎氏，岸 一弘氏，大谷房江氏，湯浅拓輝氏にご協力いただいた。ここに記して感謝する。
引用文献
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conformis (Orchidaceae) forma nov.: a new peloric orchid
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東 哲典・蘭光健人・庄司顕則・伊藤彩乃・赤﨑洋哉・松前満宏・山﨑 旬・遊川知久・辻田有紀 , 2020. 埋立造成地に定着したクゲヌマラン（Cephalanthera longifolia (L.) Fritsch）の種子発芽に関与する共生菌相の解明 . 日本緑化工学会誌 ,45(4): 430–435.
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大井和之：一般財団法人九州環境管理協会；岸しげみ：日本ビオトープ管理士会；一ノ瀬友博：慶應義塾大学環境情報学部（受領 2020 年 10 月 26 日；受理 2021 年 1 月 28 日）

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