博 士（ 地 球環 境科 学 ）高田 修治
学 位論 文 題 名Detection and cloning of X‑linked locus that escapes
DNA methylation by the RLGs‑rvi method・(RLGS‑M法に よ るDNAメチ ル化を免 れるX連鎖 座位の検出 とクロー ニング）

学位論文内容の要旨
X染 色 体 上に は 細胞 の機能 や個体の 生存のた めに必須な 遺伝子が 多数存在 するにも かか
わら ず 、 哺乳 類 の雌 と 雄 の間 に はそ の 数 にニ 倍 の差が ある。こ のため、 雌では2本 のX染色体の― 方が不活 性化され ることによ り雌雄間 の〉漣鎖遺伝子量が補正されるが、X染色体とY染色 体 の相 同 部 分であ る偽常染 色体領域 は例外で、 不活性化 は及ばな い。偽常 染色体領域はヒ トでは〉 （染色体短腕の遠位側とY染色体短腕の遠位側、マウスではX染色体の遠位側と Y染 色 体長 腕 の 遠位 側 に それ ぞ れ存 在 す る。 X染色体 の不活性 化は発生 の初期に 起こり、 ど ち らの X染 色 体が 選 ば れる か は細 胞 に よっ てラン ダムに決 まる。ヒ 卜ではX染 色体の偽常染 色体領域 外にも不 活性化を免 れる遺伝 子がいく っか報告 されてい るが、マウスではそれら の相同遺 伝子のう ちXeア69/Smcx,Utx,8IF‑y以外の ほとんど は不活性化を受けている。
X連 鎖 遺 伝子 で CpG島 を も っも の は、 そ の 発現 と CpG島 の メ チル 化 に 相関 が みら れる。
すな わ ち 、活 性 アレ ル は メチ ル 化を 受 け てお ら ず、不 活性アレ ルはメチ ル化を受 けている。 X染 色 体の 不 活 性化 を 免 れる 機 構は ほ と んど 分かっ ていない が、マウ スのX染色 体はヒ卜 の X染 色体 よ り もより 完全に不 活性化し ているため 、マウス の不活性 化を免れ る遺伝子の同定 は不活性 化の機構 を解析する 手掛かり となる可 能性があ る。そこ で、本研究では〉（染色 体の不活 性化を免 れる遺伝子 の同定を 目的に、すべてのX染色体が単一の起源をもつ 〉 欧 、 XO、 XYマ ウ ス を 作 成 し 、 そ の ゲ ノ ム 上 の メ チ ル 化 の 違 い を RLGS‑M法（ Restriction landmark genomic scanning using methylation‑sensitiveendonuclease method)に よ り 探 索 し た 。 RLGS‑M法 は メ チ ル 感 受 性 制 酵 素 を 用 い 、 その制限部 位を放射 性同位元 素で標識す るため、 ゲノム上 のメチル 化されて いない制限部位
はDNAの 二 次元 電 気泳 動 に よル ス ボッ ト と して 検 出す る 。 また 、 そ のス ポ ッ卜 の強 度は
アレ ル の 数に 比 例す る 。 X染 色体 の 不活 性 化 を免 れ る遺 伝 子 のCpG島 はDNAの メ チル化を免れてい るものと 考えられ るため、〉 cく、XO、XYマ ウスにおいてそのような遺伝子に相当す る ス ポ ッ 卜 の 強 度 は そ れ ぞ れ 1、 0.5、 0.5に な る も の と 推 測 さ れ る 。
メ チ ル 感 受 性 制 酵 素 と し てNotlを 用 いて XX、XO、 XYマ ウス を RLGS‑M法 で 解 析し た とこ ろ 、 8っ の 候 補 座 位 を 検出 し た 。そ の 1っ をク 口 ー ニン グ 後、 周 辺 を含 む コス ミ ド ク
口一 ン を 単離 し 部分 塩 基 配列 を 決定 し た 。RLGS‑Mで検 出 し た座 位 は CpG島 内 にあ り、その 近 傍 に は 3っ の マ ウ ス のEST(expressed sequencetag） に相 同 性の あ る 配列 が 見いだされた。RTーPCRによりこの3っのESTは2っの転写単位をコ―ドしていることが確認された。両転写単位の塩基配列はともにヒトEXLM1に有意な相同性が認められたため、Exlmla, Exlmlbと名付けた。ヒ卜EXLM1遺伝子はX染色体の不活性化を免れるものとして、RLGSーM法により最近同定されたものである。アミノ酸配列を推定し比較したところ、 Exlmlbはヒ 卜EXLM1全体 と類 似して いた が、 ExlmlaはヒトEXLM1のN末端側にのみ相同性があった。ExlmlaのヒトEXLM1と相同性のない部分は齧歯類にのみ存在する82繰り返し配列であった。B2配列はORFの31側と3'UTRに及んでおり、ポリA付加配列はB2に由来するものであった。マウスExlmla、bに存在するヒトEXLM1相同性領域の塩基配列を比較すると完全に一致し、この領域はサザンハイブリダイゼーションによルマウ
スのゲノム中の1座位にしか存在しないことから、両者は選択的RNAスプライシングにより1つの遺伝子Ex!mアから発現されたものであると考えられた。また、日本産野生マウス由来の近交系統であるMSM(Mus rT7USCUIUSrnoloss,nus）と実験用マウスC3H/He（M/，domesticus）の戻し交配によって得た55頭のマウスを用いて連鎖解析を行い、X染色体の近位側領域にマッブした。この領域はヒトのEXLMア遺伝子付近とsyntenicであった。以上のことからマウスExlmア遺伝子はヒ卜EXLM1遺伝子の相同遺伝子であると考えられる。
Ex/m7遺伝子の発現はX染色体と16番染色体の相互転座であるSearle転座を持つマウスを用いてRT‑PCR法により解析した。Searle転座を持つ雌マウスでは、正常X染色体が必ず不活性化しているため、ゲノムに多型が存在すればExlmアがどのX染色体から発現しているか知ることができる。そのため、日本産愛玩マウス由来の近交系JF1マウスの正常X染色 体と 転座 X染色体を同時に持つマウスを作成して検討したところ、Exlmla、Exlmlb共に活性X染色体のみから転写されており、Exlmア遺伝子は不活性化を受けることが明らかになった。マウスExlm7遺伝子のゲノム構造を解析するため、コスミドク□一ンの塩基配列を決定した。Exlmlaを含むゲノム配列は18.5kbあり、11個のエキソンからなっていた。B2配列は最後のエキソンに存在し、スプライシングによりExlmlaに取り込まれたものと考えられる。プライマ一伸長法で転写開始点を解析したところ、RLGS‑M法で検出したNotl制限部位を含むCpG島中の数個所から転写の開始が認められた。
マ ウス Exlm7の cDNAと ヒ ト EXLM1のcDNAは ORFだ け で な く 5IUTRに も相 同性 が見られたが、マウスでは不活性化を受け、ヒ卜では不活性化を免れる。また、ヒトEXLM1遺伝子でもマウスExlm7遺伝子と同様に5｜UTRがGCに富んでいるため、転写開始部位がGpG島にあると考えられる。ヒトEXLMア遺伝子の構造とメチル化状態は今のところ不明であるが、マウスExlmア遺伝子との比較により、不活性X染色体上の遺伝子が活性であるか、不活性となるかを決定する塩基配列の同定が期待される。

学 位 論 文審 査 の 要 旨
主査副査
副査
副査

教授
教授
助教授
助教授

高木信夫
吉田廸弘
瀧谷重治
鈴木 仁

学位論文題名
Detectionandcloni
ngofX‑linkedlocu
sthatescapes
DNA methylation by the RLGS‑M method．
(RLGS‑M法によるDNAメチル化を免れるX連鎖座位の検出とクローニング）

一般に、遺伝子量のバランスは生物にとって極めて重要な意味を持っている。最も良く知られているヒトやマウスの例を挙げるならば、常染色体のモノソミーは着床前に失われ、トリソミー個体は流死産や出産直後の死を引き起こす重大な影響を与える 。し かし 、X染色 体は 例外で 、雌 で2本、 雄で 1本 と2倍の差があるにも関わらず、不都合は生じていない。性染色体とはいっても、X染色体には常染色体同様、細胞の機能や個体の生存のために必須な遺伝子が多数存在する。哺乳類では、このため雌の2本のX染色体の一方を不活性化することにより、雌雄間に存在する二倍のX連鎖遺伝子量差を補正している。ただし、X染色体とY染色体の相同領域である偽常染色体領域は例外で、不活性化はこの領域には及ばない。偽常染色体領域以外にも、ヒトでは不活性化を免れる遺伝子が多数知られているが、マウスではそれらの相同遺伝子はほとんどが不活性化を受けており、マウスで不活性化を免れる遺伝子として知られているものは極めて少なぃ。不活性化センターで始まった不活性化は染色体の両端に向かって広がり、一旦不活性化が終了するとその状態は安定に保たれ、体細胞分裂をくり返しても活性化することはないとされている。従って、不活性X染色体上に散在する不活性化を免れる遺伝子は不活性化の機構を解明するためだけではなく、不活性化現象の進化とぃう観点からも興味ある検討対象である。本論文はマウスの不活性X染色体上で不活性化を免れる遺伝子をRLGS法によって検索し、あわよくば不活性化に働く遺伝子の検出を試みたものである。結果的には不活性化関連遺伝子の同定には至らなかったが、興味ある遺伝子のクローニングに成功した。
CpG島をもつX連鎖遺伝子ではその発現とCpG島のメチル化に相関が見られる。不活性アレルではメチル化され、活性アレルではメチ渺化されていない。そこで、本研究で は X染 色体 の 不活性 化を免れ る遺伝子 を探索す るために 、兄妹交 配を30代くり 返し
た XO系 統 の マウ スを利 用し、単 一起源の X染色体を 持つXX，XO， XY個体のゲ ノム上のメ チ ル イ ヒ の 違 kゝ を RLGS‑M法 (Restriction Landmark Genomic Scanning using
methylation‑snsitiveendonuclea
semethod)により解析した。R
LGS‑M法はメチルイ匕感受
性制 限酵素を 用い、そ の切断部 位を放射 性同位元素 で標識す るため、 ゲノム上のメチル 化 され て い ない 制 限部 位 は DNAの 二 次元 電 気 泳動 に よル ス ポ ット と し て検出 できる 。 また 、 ス ポット の強度は アレルの 数に比例 する。不 活性化を 免れる遺伝 子のCpG
島 は DNAの メ チ ル化を免 れている と考えら れるので 、XX，XO．XYマ ウスでは その様な
遺 伝 子に 相 当 するス ポットの 強度はそ れぞれ1， 0.5，0.5になる ものと推 定される。
メチ ル 化 感受 性制限 酵素とし てNotIを用い て解析し たところ 、8個の候 補座位を検出し た。その ひとっを クローニ ング後、 周辺を含む コスミド クローン を単離し、部分配 列 を決 定 し た。 そ の結 果 、 この 座 位は CpG島内に あり、そ の近傍に は3個のマウ スEST(expressed sequence tag)に相同性のある配列が見出された。これらをもとに、不活性 X染 色 体上 に 存在し ながらメ チル化を 免れる遺 伝子座の クローニ ングに成功 した。
そ こ には 不 活 性化を 免れるヒ ト遺伝子 EXLM1のマウス 相同遺伝 子Exlmヱが存 在し、腎臓 で 選択 的 ス プライ シングに よると観 られる転 写単位、 Exlmla，bが見出 された。推定 さ れる ア ミ ノ酸 配 列を 比 較 した と ころ 、 Exlmlbは ヒ トEXLM1に酷 似 し 、ExlmlaはEXLM1の N末 端 側 にの み 相同 性 を 示し た 。ま た 、ExlmlaにはORFの 3 側と3 UTRにおよ ぷ マウ ス B2配 列が認 められた 。遺伝子 は11個のエ キソンを 含み18.5 kbであ る。B2
配列 は最後の エキソン に存在し 、スプラ イシングに よりExlmlaに取 り込まれたものと考 え られ る 。 ゲノム の多型を 用いた解 析により 、Exlmヱ遺伝 子はX染色 体の近位側 にマ ッ プさ れ 、 ヒトと は違って 不活性化 を受ける ことが判 明した。 CpG島内の他の 部位
では メチル化 されてお り、当研 究では不 運にも例外 的な部分 を検出し たものと思われる。
以上のよ うに、本 研究では 初期の目 的に合う 遺伝子を分離することは出来なかったが、意欲 的な検索 の結果、 注目に値 する遺伝 子のクロ ーニングに到達した。ヒト相同遺伝子と の比較に よって不 活性化の 機構を解 明する手 掛かりとなる可能性もあり、今後の発展 を期待し たい。
審査員一 同は、こ れらの成 果と努カ を高く評 価し、大学院課程における研鑽や単位取得など も併せ申 請者が博 士（地球 環境科学 ）の学位 を受けるのに十分な資格を有するものと 判断した 。