博 士 （ 医学 ） 樋口 正 人
学 位 論 文 題 名HT
LV‑I LTR‑env・pX遺伝子導入ラットにおけるCD4+ CD25+T細胞 の異常に 関する検 討
学位論文内容の要旨
I，緒 言
ヒ ト T細 胞 白 血病 ウ イ ルスI型 (HTLVーI）， は，gag pol，env， pXの構造 遺伝子 からな る
ヒ ト 感 染 性 レ ト ロ ウ イ ル ス で あ る ． HTLV一 Iは 成 人T細胞 白 血 病 (ATL)の 原 因ウ イ ル ス であるの みなら ず，痙 性脊髄 麻痺， ぶどう 膜炎，慢性関節症，肺胞性気管支炎，シェーグレン症
候 群 類 似 の唾 液 腺 炎 など の 病 因 とも 深 く 関 連し て い る こと が 明 ら かと な っ て きて い る ．
p40Tax (Tax)は 宿 主 細胞 の さ ま ざま な 遺 伝 子の 発現 や分子 の働きを 制御す ること が知ら れて いる ， Taxを コー ド す るenv−pX遺 伝子を 導入し たHTLV―ILTR−envーpX遺 伝子導 入ラッ ト(envーpXラ ット） では， 種々の 血管膠 原病を発 症する ，本ラ ットの 末梢リ ンパ球 は疾患 発症の 有無 に 関 わ らず ICAM‑1や CD80/86など の 副 シ グナ ル 分 子 を発 現 し て おり 発症以 前から 活性 化さ れ や す い状 態 に あると 考えら れてい る．正 常個体 では、 自己反 応性T細 胞は何ら かの機 構で 除 去 ま たは 不 活 化 され て い る もの と 考 え られ 、 こ れ らの 機 構 と してT細胞性抑 制機構が近 年注目 されて いる， env−pXラ ットにお ける自 己免疫 疾患の 病因と して， リンパ 球の易 反応 性 以 外 にも ， 自 己 免疫 反 応 抑 制細 胞 の 異常 も関与 してい る可能 性を考 慮する必 要があ る． 本 研 究 では env‑pXラ ット に お け る免 疫 制 御系の 異常の 有無を 明らかに するた めに，
正 常ラ ッ ト か ら脾 細 胞 を採取 し，env―pXラッ トに投 与して疾 患発症 の有無 を病理 組織学 的に解析 した， また， マウス におい て自己 免疫反 応抑制能 が報告 されて いるCD4゛ CD25゛T細胞に つい て ， ラッ ト に おけ る 成 熟過 程 及 び臓 器 分 布 につ い て 比較 検 討 した ， さ らに
CD4゛CD25゛ T細胞を 単離し ，invitroで その増 殖反応 性なら ぴに免疫 反応抑 制効果 を比較検討した ，n.材料と 方法
1． 生 後 7週 か ら 8週 齢 の WKAHラ ッ ト よ り 調 製 し た 脾 細 胞 を 疾 患 未 発症 の 生 後 7週 齢のenv−pXラッ トに定 期的に 投与し 、6カ月 後に犠 牲死さ せ，各臓 器に関 して病 理組織 学的検索を 行 っ た ， 2．出 生 直 後 およ び 生 後 5日 目， 10日 目， 14日 目， 21日目 の WKAHラ ッ ト なら びに env− pXラ ッ ト のり ン パ 系 組織 よ り 単 核球 を 調 製 し、 FITC標 識 抗 ラ ット CD4抗 体 およ びPE標 識 抗 ラ ッ ト CD25抗 体 を 反 応 さ せ ， FACS解 析を 行 っ た ．3．生 後 7週 か ら 8週 齢 のWKAH
ラッ ト な ら びに env− pXラッ トを使 用し、 これら のラッ トの脾 臓また はりンパ 節より 非付着系単 核 球 を 調製 し ， MACSを 用い て CD4゛ CD25゛ T細胞を 単離し た，4． 抗ラッ トCD3抗体 を固相 化 し た 96穴 丸 底 プ レ ー ト で ， WKAHラ ット な ら び にenv一 pXラッ ト の 脾 臓か ら 単 離 した
CD4+CD25゛ T細 胞 を 72時 間 培 養 し た ． 抗 CD3抗 体 を 固 相 化 し な い 場 合を 対 照 と し， 細 胞増殖 性 を 3H← thymidineの取 り 込 み によ り 定 量 した ， 5． 抗 ラ ッ トCD3抗 体を 固相化 した96
穴 丸 底 プ レ ー ト に ，WKAHラッ ト の り ンパ 節 か ら 採取 し た 付 着系 細 胞 （ マイ ト マ イ シン 処理 後 ） と CD4゛ CD25− T細 胞 を 混 合 し た， こ れ に ，WKAHラッ ト ま た はenvー pXラッ ト の 脾‑ 400―

臓 か ら 単 離 し た CD4゛ CD25
゛ T細胞 を濃 度勾 配を っけ て添 加し ，96時間 培養 した ．
3H− thynidineの 取 り 込 み に よ り ， 細 胞 増 殖 性 を 定 量 し た ，m．結果
1．正常脾細胞を定期的に投与されたenv‑pX
ラットでは，種々の血管膠原病の発症頻度が低下 した ．2． 正常 W
KAHラットのりンパ節では生後5日目にはCD4゛T細胞中にわずかに検出されるようになり，生後10日目，14日目とその比率は増加して10％程度まで上昇した，
脾臓では，CD4十C
D25゛T細胞は出生直後 からC
D4十T細胞の5％程度に 認められ，生後14日目には一過性にその比率が約20％まで上昇し，その後は5から10％で推移することが明らかとなった，一方、env―p
Xラットの脾臓では正常ラットに認められた生後14日をピークとするような一週性の上昇が認められ なかった．3． MACSを使用しラット脾臓からのC
D4+CD25゛T細胞を単離した．純度は約85％で再現性高くCD
4十CD25
゛T細胞を単離することが可能であった．4．正常WKA
Hラットの脾臓から単離培養したCD
4+CD25゛T細胞は自律性増殖を示さず，抗CD3抗体を介した牽｜J激に対しても増殖応答を示さなかった，これに対し，env‑pX
ラットから単離したCD
4゛CD
25
゛T細胞は，抗CD3抗体を 固相化していないプレートで培養した場合でも，正常WKAHラットから単離した同細胞と比較して有意な自律性増殖を示したうえ，抗CD3抗体を介した刺激に対しても有意な増 殖応答を示した．
5，in vitroで CD4+CD25−T細胞の増 殖抑制能を確認する実験ではWK
AH
ラットの脾臓から単離したC
D4
゛CD25十T細胞を反応系に添加した場合，細胞数依存的に抗CD3抗体による増殖反応が抑制された．しかし、envーpXラットの脾臓から単離したCD4゛C
D25゛T細胞を添加した場合には，増殖反応は抑制されなかった，
IV．考察
正常W
KA
Hラットの脾細胞を付着系細胞と非付着系細胞に分け，固相化抗CD3抗体でりンパ球を刺激する反応系に添加してその抑制能を検討したところ，付着系細胞の分画には増殖反応抑制能は認められず，非付着系細胞分画に抑性能が認められた，この実験の結果ならぴにマウスにおける知見から，ラット脾細胞に含まれる免疫反応抑制細胞の候補として
CD4十C
D25+T細胞を考えた．正常ラットにおけるC
D
4十C
D25
゛T
細胞の経時的解析では，脾臓ではりンパ節とは異なるC
D4゛C
D25゛T細胞の比率変動が観察された．一方，env−pX
ラットの脾臓におけるC
D4十C
D25゛T
細胞の比率は出生直後から正常WK
AH
ラットとは異なっており，何らかの機能異常に反映されている可能性が考えられた，生後7週から8週齢のラット脾
臓からC
D4+CD25゛T細胞を単離し，invitroでその増殖反応性ならびに免疫反応抑制効果を検討したが，正常ラット由来の同細胞はマウス同様アナジーの状態にあると同時に，免疫反応抑制能を発揮したが、env―pX
ラット由来のCD4+
CD
25゛T
細胞には自律性増殖や，抗CD3抗体を介した刺激に対して増殖反応が認められたうえ、免疫反応抑制能が認められなかった．導入遺伝子産物であるTaxによりC
D4℃D25゛T細胞自体にさまざまな遺伝子発現の異常が生じている可能性が考えられる，V.
結語
自己免疫疾患を発症するenv−pXラットにおいて，マウスで自己免疫反応抑制細胞として知られているC
D4+CD25→T細胞について解析した．env−pX
ラットの脾臓では，成熟過程におけるC
D4‑lCD25゛T細胞の量的推移が正常ラットと異なっていた，また，成熟後の同細胞の機能に増殖不応答性の解除が認められ，免疫反応抑制能の欠落も示唆された．env―pX
ラットの自己免疫疾患発症にはりンパ球の易反応性以外にも自己免疫反応抑制細胞の機能異常も関与している可能性がある。

ー 401学位論 文審査の要旨
主 査 教授 小池隆夫
副査 教授 小野江和則
副 査 教授 西村孝司

学 位 論 文 題 名HTLV― ILTR‑env‑pX遺 伝 子 導 入 ラッ ト に おけ る
CD4+ CD25+T細 胞 の 異 常 に 関 す る 検 討

ヒ 卜T細胞 白血 病ウ イ ルス I型(HTLV‑I)のemr pX遺 伝子を導入したHTLV‑I LTR‑env‑pX遺伝子導入ラット(enwpXラット）では，種々の自己免疫疾患を発症しりンパ球の易反応性を認める。申請者はemrpXラットにおける免疫制御系の異常の有無を明らかにするために、正常ラットから脾細胞を採取し、emrpXラットに投与して疾患発症の有無を病理組織学的に解析した。また、マウスにおいて自己免疫反応抑制能が報告されてい るCD4+CD25+T細胞について、 ラットにおける成熟過程及び臓器分布について比較検討し、さらに CD4+CD25+T細胞を単離し、血 vitroでその増殖反応性ならびに免疫反応抑制効果を比較検討した。
検討 に際しては、＠．生後 7過から8週齢のWKAHラット より調製した脾細胞を疾患未 発症の生後7週齢のenvTXラットに定期的に投与し、6カ月後に犠牲死させ、各臓器に関して病理組織学的検索を行った 。◎．出生直後および 生後5日目、10日目、14日目 、21日目のWKAHラットなら びにenv‑pXラットのりンパ系組織より 単核球を調製し、FITC標識抗 ラットCD4抗体およびPE標識抗ラットCD25抗体を反応させ、FACS解析を行った。◎．抗ラットCD3抗体を固相化したプレ一卜で、WKA
Hラットならびに emr pXラ ット の脾 臓 から 単離 した CD4+CD25+T細胞 を72時間 培 養し た。 抗CD3抗体を固相化しない場合を対照とし、 細胞増殖性を3H‑thymidineの 取り込みにより定量した。＠抗ラットCD
3抗体 を 固 相 化 し た 96穴 丸 底 プ レ ― ト に 、 WKAHラ ッ ト の り ン パ 節 か ら 採 取 し た 付 着 系 細 胞 とCD4十 CD25‑T細胞 を混 合し た 。こ れに 、WKAHラ ッ 卜ま たは env‑pXラッ トの 脾臓 から 単 離し た
CD4十CD25゛T細胞を濃度 勾配をっけて添加し、96時間培養した。3H‑thymidineの取り込みにより、細胞増殖性を定量した。
その結果、env．p
Xラットの脾臓では、成熟過程におけるCD4十CD25十T細胞の量的推移が正常ラットと異なっていた。また、 成熟後の同細胞の機能に増殖不応答性の解除が認められ、免疫反応抑制能の欠落も示唆された。env．p
Xラットの自己免疫疾患発症にはりンパ球の易反応性以外にも自己免疫反応抑制細胞の機能異常も関与している可能性を認めた。
質疑 応答においては副査西 村教授より固相化抗CD3抗体 で刺激した場合のCD4十CD25．T細胞、あるいはtotalCD4叩細胞、 CD8叩細胞の反応性に関する 質問があった。続いて、CD4＋CD25叩細胞の単 離 に お い て puriゆ が 80％ 台 で あ っ たが 、混 入 した 細胞 につ い ての 影響 につ いて ど うか 、
CD4十CD25叩細胞と類似した細胞としてn1細胞との違い、共通点、サイ卜カイン産生の違いに関する質問があった。次いで、副査小野江教授より過去におけるCD4十CD25叩細胞の異常に関して過去に報‑ 402 ‑告があったか、ラット成長過程におけるCD
4十CD25゛T細胞の動態、について、また、それとのenwp
X
ラッ卜における疾患発症との関連性、MACSにおけるpositi
ve selecti
onにおいて細胞への刺激を与える 可 能 性 に つ い て 、 CD4十 CD25+T細 胞 に お け る CTLA‑4の発 現に つ いて 、CD4+CD25+T細 胞に
CD4＋CD25‑T細胞 を 混和 した 場合 の反 応 性に 関しての質問があった。 最後に主査小池教授より
env‐pXラットにおけ るCD4十CD25叩細胞にはclonah
ゆを認めるか、T細胞レセプタ―は確認されているか、env．pXラットにおけるCD4十CD25叩細胞の異常が疾患発症に関連する根拠、6週目以降でのCD
4十CD25・トr細胞の応答性はどうかなどの質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は現在までのenv・pXラットや CD4十CD25叩細胞に対する知見や関連する論文報告などを引用し、また申請者自身の考察を交えて概ね妥当な応答をした。
この論文は、envIpXラ ットのC
D4十C
D25゛T細胞に機能異常が生じていることを示し、自己免疫疾患の発症に免疫制御系細 胞の異常が関与する可能性を考察した点で高く評価され、今後のm1V．I関連疾患の病因解明の―翼を担うものとして期待される。
審査員―同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるめに充分な資格を有するものと判定した。

― 403ー