環境 DNA 調査・実験マニュアル
Ver. 2.2（2020 年 4 ⽉ 3 ⽇発⾏）

⼀般社団法⼈環境 DNA 学会© 2020 ⼀般社団法⼈環境 DNA 学会© 2020 The eDNA Society⽬次
1. はじめに .................................................................................. 3
2. 調査地点の選定 .......................................................................... 6
2-1. 河川における調査地点の選定 ................................................... 6
2-2. 池や湖沼における調査地点の選定 ............................................. 8
2-3. 海岸における調査地点の選定 ................................................... 93. 採⽔および濾過 ......................................................................... 12
3-1. 採⽔とカートリッジ式フィルターを⽤いた現場濾過 ..................... 13
3-1-1. フィールドデータの記録.................................................. 15
3-1-2. 採⽔およびシリンジを⽤いた現場濾過 ................................ 15
3-1-3. アスピレーターを⽤いた現場濾過 ...................................... 17
３-2. 採⽔とグラスファイバーフィルターを⽤いた実験室での濾過......... 26
3-2-1. フィールドデータの記録.................................................. 27
3-2-2. 採⽔および実験室への輸送 ............................................... 28
3-2-3. グラスファイバーフィルターを⽤いた濾過 ........................... 29
4. DNA の抽出 .............................................................................. 33
4-1. カートリッジ式フィルターからの DNA 抽出 ............................... 34
4-1-1. 実験の準備 ................................................................... 35
4-1-2. RNAlater の吸引 ............................................................ 35
4-1-3. DNA の抽出 .................................................................. 36
4-1-4. DNeasy Blood and Tissue kit を⽤いた DNA の精製 ............. 37
4-2. グラスファイバーフィルターからの DNA 抽出 ............................ 47
4-2-1. 実験の準備 ................................................................... 471

4-2-2. タンパク質の分解処理 .................................................... 48
4-2-3. DNeasy カラムを⽤いた DNA の精製 .................................. 48
5. DNA の分析 .............................................................................. 57
5-1. リアルタイム PCR による環境 DNA の種特異的な検出・定量 ......... 57
5-1-1. 種特異的プライマー（およびプローブ）の設計 ..................... 57
5-1-2. リアルタイム PCR 実験 ................................................... 58
5-2. MiFish メタバーコーディング ................................................. 61
5-2-1. ライブラリーの調整ー１︓1st PCR .................................... 61
5-2-1-1. 1st PCR ................................................................. 64
5-2-1-2. 1st PCR 産物の精製と濃縮 ......................................... 65
5-2-1-3. 精製・濃縮済み 1st PCR 産物の定量と希釈 .................... 67
5-2-2. ライブラリーの調整ー２︓２nd PCR .................................. 69
5-2-2-1. 2nd PCR ................................................................ 71
5-2-2-2. 2nd PCR 産物の切り出し ........................................... 73
5-2-2-3. 切り出した 2nd PCR 産物の定量 ................................. 75
5-2-2-4. インデクス関連情報 ................................................. 76
5-2-3. MiSeq を⽤いた超並列シークエンス ................................... 77
5-2-3-1. MiSeq のメンテナンス............................................... 78
5-2-3-2. シークエンスの下準備............................................... 81
5-2-3-3. ライブラリー濃度の最終調整 ...................................... 82
5-2-3-4. シークエンス開始前後の操作 ...................................... 83

2

1. はじめに本マニュアルは環境 DNA 分析⼿法の普及と標準化を⽬的として作成された。ここに記された内容は 2020 年（令和 2）年 4 ⽉現在の最新情報であるが、環境 DNA 分析技術は⽇進⽉歩のため、常に最新のマニュアル（本マニュアルのアップデート版）を参照することが重要となる。最新のマニュアルは環境 DNA 学会の web ページ（http://ednasociety.org/）からダウンロードできる。
環境 DNA 分析は⼀般的に採⽔、濾過による環境 DNA の濃縮および抽出、分⼦⽣物学的な検出実験といった流れで⾏われる。環境 DNA の濃縮および抽出法には主として⼆種類の⼿法が⽤いられている。ひとつはカートリッジ式のフィルターを⽤いた⼿法、もうひとつはグラスファイバーフィルターを⽤いた⼿法である。本マニュアルでは両⼿法を併記する。また、環境 DNA 検出のための分⼦⽣物学的な実験⼿法としては、リアルタイム PCR を⽤いた種特異的な「単⼀種検出法」と、環境 DNA メタバーコーディング⼿法と呼ばれる特定の分類群（例えば⿂類）の次世代シーケンサーを⽤いた超並列的な「多種同時検出法」がよく⽤いられる。単⼀種検出法では特定の対象種を精度良く安価に検出できると考えられる⼀⽅で、対象種ごとに検出系を設計する⼿間がかかる。多種同時検出法では単⼀種検出法に⽐べると⼿間と費⽤がかかるものの、多種の情報をまとめて得られるという利点がある。このように、単⼀種検出法と多種同時検出法は相互補完的に⽤いられる技術である。本マニュア
ルでは、単⼀種検出法に関する⼀般的な事項を記述するとともに、MiFish プライマーを⽤いた⿂類の網羅的検出法に関する具体的な分析法について詳細に記述する。
なお、本マニュアルには標準的な⼿法を記載しているが、各分析者による感度改善や⼿間の削減などを⽬的とした⼯夫を妨げるものではない。

環境 DNA 分析全体の注意事項
環境 DNA 分析は、環境中の極微量な対象 DNA をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で分析可
能な量に増幅して検出・定量する技術である。そのため、組織サンプルに由来する DNA やPCR によって得られた増幅産物のような⾼濃度の DNA によるコンタミネーション（汚染）は結果に取り返しのつかない影響を及ぼすことが多々ある。確度の⾼い環境 DNA 分析の実
施は、コンタミネーションとの戦いであると⾔っても良い。そのために、以下のような点に

3特に注意する必要がある。
1) 実験環境の整備︓環境サンプルのような「薄い」DNA を扱う部屋と、PCR 産物のような「濃い」DNA を扱う部屋を物理的に隔離することが重要である。また、実験実施⽇において作業者は「薄い」DNA を扱う部屋から「濃い」DNA を扱う部屋へと⼀⽅通⾏で作業を⾏うことを厳守し、コンタミネーションの危険性を可能な限り低減するべきである。
2) DNA フリー器具の使⽤︓実験に使う器機は未使⽤の新品、または残留 DNA を完全にデコンタミネーション（除染）したものを⽤いる。デコンタミネーションには次亜塩素酸
ナトリウム溶液（例えば、0.1%濃度）への浸漬が有効である。ピペットやチューブラッ
クなどについては，紫外線照射による除染も有効である。オートクレーブは有効であるが、廃液や廃棄物などと同じ機器を⽤いることは避けたほうが良い。
3) ⼿袋の着⽤︓作業時に触れるあらゆるものからコンタミネーションの危険性があるため、清浄な表⾯を保つために医療⽤ゴム⼿袋などの⼿袋を着⽤する必要がある。野外サンプ
ルの採取から DNA 測定までの全⼯程にわたって⼿袋を着⽤し、⾃らの DNA あるいは⼿についた⾷品等に由来する DNA によるコンタミネーションを防ぐ。作業中に⼿袋にサンプルや試薬等が付着したときにはこまめに交換する。
4) フィルターチップの使⽤︓マイクロピペットを介したコンタミネーションを防ぐために、
フィルター付きチップの使⽤が必須である。
5) DNA 低吸着製品の使⽤︓DNA は通常のプラスチック製品に吸着する性質があるため、特に保存などには低吸着のマイクロチューブ（Eppendorf 社の DNA LoBind Tube など）などの製品を使⽤することを推奨する。
6) 部屋や機器の清浄︓マイクロピペットなどの実験器具、遠⼼機などの機器類を介したコンタミネーションがありうるので、定期的な洗浄を⾏うことを推奨する。実験室の掃除も重要である。

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本マニュアルに関わる権利と責任の所属について
本マニュアルは⼀般社団法⼈環境 DNA 学会の標準化委員会委員および環境 DNA 技術の専⾨家が参集して作成した。本マニュアルの著作権は⼀般社団法⼈環境 DNA 学会に、記載内
容に関する責任は、環境 DNA 学会および環境 DNA 技術標準化委員会にある。
環境 DNA 技術標準化委員会（括弧内は担当内容）
委員⻑源利⽂ 神⼾⼤学⼤学院⼈間発達環境学研究科（全体の編集、および
1 章、2-2 項、3-1 項、4-2 項、5-2 項の執筆）

委員

近藤 倫⽣ 東北⼤学⼤学院⽣命科学研究科（査読）（五⼗⾳順）

清野 聡⼦ 九州⼤学⼤学院⼯学研究院（2-1 項、2-3 項の執筆）
⾼原 輝彦 島根⼤学⽣物資源科学部（査読）⼟居 秀幸 兵庫県⽴⼤学⼤学院シミュレーション学研究科（査読）中村 圭吾 ⼟⽊研究所⽔環境研究グループ（査読）宮正樹 千葉県⽴中央博物館 ⽣態・環境部（3-1 項、4-1 項、5-2 項の執筆）

⼭中 裕樹 ⿓⾕⼤学理⼯学部（査読）委員外執筆者

佐⼟ 哲也 千葉県⽴中央博物館（3-1 項、4-1 項、5-2 項の執筆）（五⼗⾳順）

⼭本 哲史 京都⼤学⼤学院理学研究科（査読）なお、本マニュアルは環境 DNA 学会の資⾦により作成された。本委員会は本⽂の作成について独⽴した権限を有する。

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2. 調査地点の選定
全般的な注意事項
⿂市場、店舗、⾷堂などの産業系の排⽔には、⿂類をはじめとする⽔⽣⽣物の DNA が含まれている可能性が⾼く、環境 DNA 分析結果の解釈を困難にする原因となる。住宅からの⽣活排⽔も同様である。したがって、⽤排⽔路、下⽔処理場、導⽔路からの流⼊の影響を受けにくい地点を選ぶことが重要である。特に、下⽔処理施設は放流⽔量が⼤きいため、調査結果への影響が懸念される。処理⽔の放流⼝（処理施設と離れていることもある）を確認し、その近傍を避けるようにする。調査地点の選定の際、商業施設や市街地、住宅地は、予め地図や、国⼟地理院や⺠間のウェブサイトなどの空中写真からも判別できることが多い。また
現地についてからも⽬視で判断が可能である。
⼀⽅、地図や現地の概観的な⽬視では検出できない施設も要注意である。排⽔⼝は堤防下や護岸壁に開⼝しているため、作業従事者が⽴っている岸側から⾒えないことも多い。採⽔前に⽔際を歩きながらその存在の有無を確認する。
また、海⾯や陸上での養殖や蓄養の施設の付近も避けるべきである。そこで飼育している⿂類などの DNA を含んだ排⽔が⽔域に直接放出されている場合が多い。また、餌は地域外で採取された⿂類のミンチなどを含む場合も多いため、その⽔域に⽣息しない⽣物を検出してしまう可能性がある。
釣り⼈とのトラブルもあり得るので、釣り⼈から離れて採⽔を⾏うと良い。また、釣り⼈による撒き餌の影響も考えられるため、（河川の場合）釣り⼈の上流側で採⽔するなど撒き餌の影響を受けないように注意する必要がある。
また、調査に際しては漁業権などの権利関係に配慮し、管理者（場合によっては所有者）と連絡をとって、各種の許認可について確認するべきである。

2-1. 河川における調査地点の選定
環境 DNA が⽣物分布を反映する距離は、数百 m 程度と⾒積もられている。そのため、調査地において数百 m おきに調査地点を設定することが理想的である。しかし、それだけの労⼒を割くことができない場合も多いので、予算規模や⽬的に応じて適宜調整する必要がある。

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河川の合流点付近においては、合流点の上流側で採⽔を⾏うとそれぞれの⽀流における分布を理解する助けとなる。
河川での調査地点の設定時の留意点を挙げる。環境 DNA の流れによる拡散は、さまざまなスケールの地形に影響されるため、マイクロハビタットというスケールでの留意が必要である。また、調査地点の周辺環境もふくめた写真記録も重要である。
1) 河川地形︓河道の形状により、河川流の流速や⼟砂の堆積が異なる。河川の蛇⾏部では、カーブの外側では流速が速く、河岸は侵⾷的であり、淵が形成され、河畔林の⽊々がオーバーハングする。また内側では流速が遅く、堆積的で、堆砂により砂州の形成が進み、植⽣が定着しやすい。その結果、カーブの左右岸で異なる微地形が形成され、それに応じた⽣態系が存在するので、調査地点の設定時に地形も判断に⼊れる。例えば、調査地点を距離で河⼝から○○km 地点と設定した場合、直線距離なのか、蛇⾏を含む流程に沿った距離なのかなども考慮すべきである。
2) 河川の流れ︓河川の流れは、河道内で⼀様の流向や流速ではない。中⼼部を直線的に流れる流⼼、⽌⽔域、渦流発⽣域とでは、物質のトラップの状態が異なるため、それに応じて⽔質や⽣物も異なる。ある地点から放出された環境 DNA は、流速に応じて拡散距
離が異なる。
3) 河岸構造︓⾃然の植⽣は、上述のとおり蛇⾏の左右岸の地形の差異により形成や繁茂状況が異なる。河畔林の下や葦原などの河岸植⽣の中は良好なハビタットとなっている。
⼀⽅、護岸や堤防などの⼈⼯構造物の場合は、⾃然のハビタットの改変の度合いに着⽬する必要がある。特に、コンクリートで隙間なく固められた護岸の場合には、背後地からの地下⽔の浸出や間隙⽣物の⽣息地が失われているなどの影響がありうる。⽯やブロックを積み上げた護岸の場合、隙間の透⽔性が着⽬点である。コンクリートなどで隙間を埋めると、透⽔性や地下⽔湧出を前提としたマイクロハビタットが破壊される（例
ミミズハゼ）。堤防の場合も、材料が過去から積まれた粘⼟か、地中に基礎部分を打設したコンクリートかで透⽔性が異なる。
4) 河床の底質︓河床の底質（材料）は、岩、礫、砂、粘⼟により⽔の透過性が異なる。例
えば、サケ類の産卵場では、堆積した礫の下から⽔が噴出している。採⽔作業では、河床材料が粘⼟など細粒分の多い箇所では細⼼の注意が必要である。バケツなどの採⽔器が河床に接触すると、底質の巻き上げが発⽣し、⽔が濁って濾過が困難となる。また、河床や河岸が岩の場合には、採⽔器が岩の突起などにひっかかって回収できなくなる可能性がある。そこで作業従事者が採⽔器を回収するために無理な動作をすると落⽔する

7危険性があるので注意する必要がある。
5) 河川⼯事などの⼈為改変︓河川管理者（⼟⽊⾏政）の⼯事による撹乱には注意が必要である。河川流が流下しやすくするための河道掘削では、ハビタットの地形や底質、植⽣が⼤きく改変される。特に砂州の除去では、潜砂性⿂類のハビタットごと消滅する。モ
ニタリング時に周辺の環境の記録写真を撮影しておくのは、これらの撹乱の検知のためもある。⼯事の最中には、濁⽔が発⽣する。河川⽔の濁度が上昇すると、採⽔後の濾過作業に影響する。
6) 河⼝域・汽⽔域・河川感潮域︓河川⽔と海⽔の混合の状態に留意すること。同じ地点でも、潮汐により時々刻々環境条件が変化するため、気象庁の公表する潮位表を参考にして状況に応じた調査時刻を設定する。採⽔時に、地点の位置に加え、潮汐の影響を判断するために、時間、⽔深、表層・中層・底層なども記載するのが望ましい。塩⽔遡上や混合のパターンは、河床勾配や河川流量により異なる。海からの河⼝に向けての強い外⼒の影響としては、潮位上昇や強波浪による河川への海⽔流⼊量の増加と、それに伴う河川⽔の海への拡散の抑制がある。

2-2. 池や湖沼等における調査地点の選定
流⽔域である河川に⽐べると、注意すべきポイントが特段多いわけではないが、その⽔域を代表する⽔サンプルを取ることに留意すべきである。⼩規模な定形の池の場合、どこで採⽔しても検出率に⼤きな違いはないと考えられる。任意の地点で、アクセスしやすい岸際から表層⽔を採取する。複雑な形状をした、あるいは規模の⼤きな池や湖沼の場合の適切な採⽔数については知⾒が不⾜しているが、できるだけ複数地点で採⽔することが望ましい。岸の構造や底質の影響、⼈為改変の影響などについては河川の場合と同様の注意が必要である。
農業⽤⽔路で調査を⾏う場合には下記の点に注意する。下流からのポンプアップや他の地域からのパイプラインによる送⽔などがありうるため、⽔がどこからきているのかを確認する。また、灌漑期に⽔があり、⾮灌漑期に⽔がなくなるなど、季節によって⽔量が異なる場合がある。さらにコンクリート⽔路は滑りやすく、⽔の流れも速い場合があるので、事故が起きないよう注意する。⽔路は⼟地改良区等の団体によって管理されていることから、トラブルを回避するため、調査する場合には了解を得る必要がある。⽔⽥や畑からの排⽔が混ざるので、PCR 阻害要因を含む可能性があることにも留意が必要である。

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2-3. 海岸における調査地点の選定
海岸での調査地点の設定時の留意点を挙げる。環境 DNA の流れによる拡散は、さまざまなスケールの地形に影響されるため、マイクロハビタットを考慮したスケールでの留意が必要である。調査地点の周辺環境もふくめた写真記録が重要である。
1) 海岸地形と底質︓海岸地形により汀線付近の波浪条件が異なり、⽔際での底質の粒径や波による巻き上がりが異なる。また、バケツなどの採⽔器が底質に接触すると、砂や泥を⽔中に巻き上げる。⽔サンプルの質や濾過作業の効率に影響するため、巻き上げの少ない環境を選ぶのが望ましい。
① 磯や岩場︓波による底質の巻き上げが少ないために採⽔しやすい。波浪が⾼く、⾜元が滑りやすいため、落失を防ぐ安全管理がことさら重要になる。
② 砂浜︓アクセスは⽐較的容易だが、汀線（波打際）付近は常に底質を巻き上げているために砂が混⼊する。
③ ⼲潟︓底質が潮汐により⽔塊が常時広範囲に移動するために濁⽔である場合が多い。また、河⼝や⼀次⽣産の⾼い海域であると、植物プランクトンや懸濁物などが多く含まれているため、採⽔後の濾過の作業効率が低下し濾過⽔量が減少することが懸念される。
2) 沿岸流と⽔質︓沿岸流は、沿岸地形により流向流速が⼀様ではない。波浪に曝される磯や砂浜中⼼部、岬や構造物の周辺の⽌⽔域や渦流発⽣域とでは、⽔中に存在する物質のトラップの状態が異なるため、それに応じて⽔質や⽣物も異なる。ある地点から放出された環境 DNA は、流速に応じて拡散距離が異なることが考えられる。沿岸では、潮汐の影響で⽔塊が移動、停滞する。河川のように⼀⽅向に流下・拡散するのではないことに注意が必要となる。また出⽔による淡⽔の影響、停滞の持続、濁度の上昇などの影響にも注意を払う必要がある。
3) 海岸⽣態系構造︓海岸の調査地点における周辺の⽣態系の状態の把握が重要である。と
くに海藻・海草の藻場は⽔⽣⽣物が⾼密度で⽣息する。これらの繁茂状況は、潜⽔調査、
衛星画像判読で⾏うことができる。
① 海岸植⽣は、背後地の環境が、砂浜、砂丘、崖、⼈⼯空間（⼯業⽤地、市街地、住宅地）により異なる。調査地点付近の広域的な状態の把握は空中写真判読で⾏える。

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② 護岸や堤防などの⼈⼯構造物の場合は、⾃然のハビタットの改変の度合いに着⽬する必要がある。とくに、コンクリートで隙間なく固めた護岸の場合には、背後地からの地下⽔の浸出や間隙⽣物の⽣息地が失われている。
③ ⽯やブロックを積み上げた護岸の場合、隙間の透⽔性が着⽬点である。コンクリー
トなどで隙間を埋めると、透⽔性や地下⽔湧出を前提としたマイクロハビタットが破壊される。堤防の場合も、材料が過去から積まれた粘⼟か、地中に基礎部分を打設したコンクリートかで透⽔性が異なる。
4) 底質︓底質（材料）は、岩、礫、砂、粘⼟により⽔の透過性が異なる。採⽔作業では、⼲潟や細砂の砂浜など、海岸材料が粘⼟など細粒分の多い箇所では細⼼の注意が必要となる。バケツなどの採⽔器が底に接触すると、底質の巻き上げが発⽣し、⽔が濁り、濾過が困難となる。また、磯の岩場の場合には、採⽔器が岩の突起などにひっかかると回収できなくなる可能性がある。作業従事者が採⽔器を回収するために無理な動作をすると落⽔する危険性があるので、安全管理には注意する必要がある。
5) 海岸⼯事など⼈為改変︓海岸管理者（⼟⽊⾏政）や開発事業者などによる⼯事による撹
乱には注意する必要がある。撹乱の規模、継続性など、影響の時空間スケールの把握が必要である。モニタリング時に周辺の環境の記録写真を撮影するのは、これらの撹乱の検知と記録のためである。
① 埋め⽴て⼯事では、⽔域⾃体が消滅するため、モニタリング地点の変更を余儀なくされる場合もある。また、防波堤、突堤など、海中に突き出す構造物では、周辺の流向流速への影響があるため、予め地図で、また、現地で確認する必要がある。このような構造物は、現地に赴いたときに⼯事が始まっている場合もある。⼯事の予定は海岸・港湾・漁港管理者に事前に確認は可能である。
② 航路などの海底掘削では、ハビタットの地形や底質、植⽣が⼤きく改変される。と
くに砂州の除去では、潜砂性⿂類のハビタットごと消滅する。
③ ⼯事の最中には、濁⽔が発⽣する。濁度が上昇すると、採⽔後の濾過作業に影響する。
6) ⼈⼯構造物（護岸、堤防、防波堤など）
︓消波や構造維持のための施設は種々あるが、構造物の材料と、岸との距離により留意する必要がある。岸との距離では、構造物の⽔中にある根固め、⽔⾯付近の消波、沖で波浪を軽減する離岸堤がある。材質としてはコン

10クリート・ブロックと⾃然⽯がある。⾃然海岸の岩礁と微地形と異なる点は、隙間が多く、時折、透過性が⾼い点である。打ち寄せた波による⽔塊がフィルターされる状態となる。離岸堤は沖の⼩島のような存在である。そのため局所的に岩礁⽣態系に近い環境が形成される。

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3. 採⽔および濾過
採⽔の季節
採⽔の季節について、冬場には環境 DNA の検出率が下がることが報告されているので、採⽔調査は春〜秋に⾏うと検出率が向上する可能性がある。⼀⽅で、季節移動など対象⽣物種の⽣態によっては検出しやすい季節や場所があると考えられるので、対象⽣物の⽣態情報を把握しておくことは重要である。また、体外受精の⽣物の場合は繁殖期に環境 DNA 量が著しく増加するため、種特異的検出では対象種の繁殖期を選ぶ、網羅的検出では優占種の繁殖期を避けるなど、対象⽣物の繁殖期を考慮する必要がある。⾚潮やアオコなどの影響で採⽔サンプル中に⾼濃度の PCR 阻害物質が混⼊する場合があるので、このような時期を避けることが望ましい。

安全に採⽔を⾏うために
環境 DNA のサンプリング（＝採⽔）は、季節や場所によってさまざまな環境下で⾏うことになる。夏には熱中症や⽇焼け対策が、冬には防寒対策が必要となり、磯や濡れた突堤、貯⽔池の護岸などでは転倒や落⽔に注意しなくてはならない。また、⽔際の作業であるために濡れても良い撥⽔性や速乾性の⾼い⾐類を着⽤することも重要である。フィールドでの調査・作業は不測の事態に備えて原則として複数名で⾏う。さらに、特に海岸や⼤規模な河川においては安全を確保するためライフジャケットの着⽤は必須である。万が⼀、⽔難事故が起きてしまった場合は、川や池であれば警察へ 110 番に、海であれば海上保安庁のホットライン 118 番に速やかに通報する。

器材、材料、物資の調達（特に保冷）調査の器材や物資などの現地調達は出来る限り避ける。沿岸部の⼈⼝が少ない地域は、コン
ビニエンスストアやホームセンターがほとんど無く、品揃えが悪い場合も多い。
「氷」が必要な場合は、スーパーマーケット、釣具店、鮮⿂店、コンビニエンスストアで調達することになる。このような施設は、⿂介類を販売しているため、氷の袋などへの付着などコンタミ
ネーションには⼗分注意する。瞬間保冷剤の準備があると安⼼である。
「保冷材」をフィー
ルドで保冷、冷凍するために、宿泊施設の冷凍庫を借⽤、冷蔵庫を利⽤する場合がある。冷凍庫は⾷品がストックされていることが多いため、保冷材への付着を回避するためにビニール袋などで覆う必要がある。冷凍のためにドライアイスを⽤いることもできる。

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濾過⼿法について
⽔サンプルの濾過については現場で⾏う場合と、実験室に持ち帰って⾏う場合がある。濾過のための機材にもカートリッジ式フィルターと、グラスファイバーフィルターがある。ここ
では、採⽔後現場でカートリッジ式フィルターを⽤いて濾過する⼿法（3-1）と実験室に持
ち帰ってからグラスファイバーフィルターで濾過する⼿法（3-2）について述べる。

３-１．採⽔とカートリッジ式フィルターを⽤いた現場濾過
安全に採⽔を⾏うために（再掲）
環境 DNA のサンプリング（＝採⽔）は、季節や場所によってさまざまな環境下で⾏うことになる。夏には熱中症や⽇焼け対策が、冬には防寒対策が必要となり、磯や濡れた突堤、貯⽔池の護岸などでは転倒や落⽔に注意しなくてはならない。また、⽔際の作業であるために濡れても良い撥⽔性や速乾性の⾼い⾐類を着⽤することも重要である。フィールドでの調査・作業は不測の事態に備えて原則として複数名で⾏う。さらに、特に海岸や⼤規模な河川においては安全を確保するためライフジャケットの着⽤は必須である。万が⼀、⽔難事故が起きてしまった場合は、川や池であれば警察へ 110 番に、海であれば海上保安庁のホットライン 118 番に速やかに通報する。

フィールドデータの記録に必要な道具（例）・ 測量野帳レベルブック（セ-Y11，コクヨ社など）
・ 耐⽔加圧ボールペン（BDWR-40F-B，パイロットなど）
・ ハンドヘルド GPS（eTrex20xJ，ガーミン社など）
・ データロガー導電率計（CD-4307SD，マザーツール社など）
・ 防⽔デジタルカメラ（RICOH WG-30，リコー社など）

シリンジを⽤いた現場濾過に必要な道具（例）・ カートリッジ式フィルター（ステリベクス, 孔径 0.45µm，SVHV010RS，メルク・ミ
リポア社）
・ 50ml ロックタイプシリンジ（SS-50LZ，テルモ社）
・ パラフィルム（エルエムエス社）
・ ルアーフィッティング（VRMP6，株式会社アイシス, 注⼊⼝⽤）
・ ルアーフィッティング（VRSP6，株式会社アイシス, 排出⼝⽤）

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・ バケツ（Soft Bucket 8 型 I-484，ISETO 社など）
・ ロープ（クレモナ⾦剛打ロープ直径 6mm，ユタカメイク社など）
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）
・ 分⼦実験⽤ペーパータオル（61440，⽇本製紙クレシア社など）
・ RNAlater Solution（Ambion 社）
・ ⼩型スポイト（E-243，⽇本メディカルサイエンス）
・ 2.0mL チューブ（DNA 低吸着︔ザルスタット社）
・ 医療施設⽤泡洗浄ハイター1000 400mL（花王）
・ 精製⽔（精製⽔ P ワンタッチ式キャップ 500mL，健栄製薬社など）
・ チャック付ポリ袋 140mm × 200mm（ユニパック G-8，⽣産⽇本社）
・ チャック付ポリ袋 100mm × 140mm（ユニパック E-4，⽣産⽇本社）
・ チャック付ポリ袋 17.7cm × 20.3cm（イージージッパーM，ジップロック社）
・ カウンター（数取器，プラス社など）
・ 筆記具（サインペン）（MO-150-MCBK3，ゼブラなど）
・ クーラー（ハイパー氷点下クーラーM，ロゴス社など）
・ 保冷剤（倍速凍結・氷点下パック M，ロゴス社など）
・ 保冷袋 S サイズ（保冷平袋 S，モロフジなど）

アスピレーターを⽤いた現場濾過に必要な道具（例）・ カートリッジ式フィルター（ステリベクス, 孔径 0.45µm，SVHV010RS，メルク・ミ
リポア社）
・ パラフィルム（エルエムエス社）
・ ルアーフィッティング（VRMP6，株式会社アイシス, 注⼊⼝⽤）
・ ルアーフィッティング（VRSP6，株式会社アイシス, 排出⼝⽤）・ ⼿提げ平⾓瓶コック付ポリタンク 10L（1-2169-01，アズワン）
・ epTIPS スタンダード 1〜10mL（30000765，エッペンドルフ社）
・ ルアーフィッティング オスルアーロック 4.0mm（VPRM406，株式会社アイシス）・ ルアーフィッティング メステーパー5.0mm（VRF506，株式会社アイシス）
・ 排気⽤ゴム管（6-590-01，アズワン）
・ チューブ I 型ジョイント（6-663-02，アズワン）
・ ⽳付きシリコン栓（1-7650-07，アズワン）
・ アスピレーター（GAS-1，アズワン）
・ フィルターホルダーマニホルド（2-258-01，アズワン）
・ 液体塩素系漂⽩剤（病院⽤ハイター、花王）

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3-1-1．フィールドデータの記録
測量野帳レベルブックに記⼊する主な項⽬として以下のようなものがあげられる。これら
は調査の⽬的などに応じて加減して良い。耐⽔性の野帳に耐⽔性のボールペンで記録するとよい。
・採⽔者（サンプリングに同⾏した全員の名前を記録）
・⽇時（YYYY-MM-DD の形式で記録)
・測点番号と採⽔地点の地名（プロジェクト略称＋調査番号＋測点番号）
・緯度経度（35.101252N, 139.293012E のような 10 進法が取り扱いやすい）・河岸・湖岸・海岸・底質の分類︓砂浜・砂利浜・岩礁・サンゴ・護岸（コンクリート・テ
トラ・捨て⽯など）
・気象・海象（⾵向・⾵⼒・波⾼を含む）
・⽔温（℃）
︓携帯⽤の⽔質計を⽤いて計測する。
・（海〜河川感潮域では）潮汐（⼤潮・中潮・⼩潮・若潮・⻑潮）と⼲満（満潮・⼲潮・上げ潮・下げ潮）・（海〜河川感潮域では）塩分濃度（‰）
︓携帯⽤の⽔質計を⽤いて計測する。
・透明度（透明・ササ濁り・濁り）
・河川で⾏う場合、わかる場合はダムや発電所の放流量も記録する。
・濾過⽔量（ｍL）
︓必ず記⼊すること。
・⽬視の範囲内で⿂影やその他の⽣物︓抽出した環境 DNA には⿂類以外の⽣物が含まれているので、クラゲやその他の⽬⽴つ⽣物に関する記録が後々に重要となる。
・写真（撮影の有無）
・その他︓環境⽔に影響を与えそうなものの記録（釣り⼈の有無︔排⽔や流れ込みの有無︔
周囲の⽔⽥地域の⽔管理状況など）

3-1-2．採⽔およびシリンジを⽤いた現場濾過
本項では、シリンジにステリベクスを装填して⾏う現場濾過法について記す。以下の作業では、コンタミネーション防⽌のため、常に使い捨ての実験⽤ゴム⼿袋を着⽤すること。⼿袋
は採⽔地点ごとに取り替える。ここではバケツで採⽔するケースを説明するが、直接ボトルを⽤いた採⽔や、シリンジを⽤いた直接採⽔を⾏っても良い。
1） 濾過キットの作成︓例えば 1 採⽔地点で 2 本のステリベクスを⽤いて濾過を⾏う場合（最⼤ 1L x 2 本 = 2L）、2 組を 1 セットとしてキットを作成する。ユニパック G-8を⽤意し、その中に、ステリベクス 2 本とシリンジ 2 本を⼊れる。さらに、RNAlaterが⼊った 2.0ｍL チューブ 2 本と⼩型スポイト 2 本を⼩さなユニパック（E-4）にまとめて⼊れておく。これに、ステリベクスの注⼊孔と排出孔を閉じるためのルアーフィ
ッティング 2 個もしくはパラフィルム（1cm×5cm を 6 枚ほど）をユニパック E-4 に

15

まとめて⼊れる。なお、濾過後のステリベクス 2 本を⼊れるユニパック E-4 を 1 枚キットに⼊れる（図 3-1-2-1, 2）。
２） 採⽔道具の作成︓突堤や防波堤、護岸など⽔⾯よりも⾼い所から採⽔するため、ロープを 15m ほど切り出しバケツにしっかりと結びつける。Soft Bucket 8 型 I-484 を使⽤する場合は、取⼿が抜けることがあるため、本体縁にある⽳と取⼿の２箇所にロープを結びつける（図 3-1-2-3）。
3） バケツの除染︓ゴム⼿袋を着⽤し、バケツの内部とバケツにくくりつけたロープ先端部に泡洗浄ハイターを吹き付ける（図 3-1-2-4）。数分間放置した後、ハイターを分⼦
実験⽤ペーパータオルなどできれいに拭き取る（図 3-1-2-5）。その後、バケツとロープ先端を環境⽔で２回共洗いする。ハイターによる洗浄が不⼗分だとクロスコンタミ
ネーションの恐れがあり、共洗いが不⼗分でハイターが余分に残っているとサンプル
中の DNA が分解されるので注意すること。
4） バケツ採⽔︓ロープの末端を岩や橋の欄⼲などに結びつけバケツの逸失を防ぐ。バケツを投げ（図 3-1-2-6）、ロープを⼿繰り寄せて環境⽔の⼊ったバケツを回収する（図3-1-2-7）。データのばらつきを防ぐため、1 回のサンプリングで 10 回のバケツ採⽔を⾏いその都度シリンジを⽤いて 100ｍL の環境⽔を濾過する。この操作でシリンジ1 本あたり１L の⽔を濾過することになる。ただし、環境⽔の濁度が⾼い場合は数100mL で⽬詰まりが起こり、それ以上濾過できなくなることがある。そのような場合
は、濾過⽔量を記録しておくことが重要になる。
5） ステリベクスを⽤いた現場濾過︓バケツに汲んだ環境⽔を 50ｍL シリンジで吸引する（図 3-1-2-8）。シリンジには 50mL よりも多めに環境⽔を吸引させ、シリンジを上向きにしてシリンジ内の空気や余分の⽔を押し出す。環境⽔の量を 50mL に調整したらステリベクスを装着して加圧濾過を⾏う（図 3-1-2-9）。ステリベクスとシリンジの着脱を繰り返すので、その際にルアーロックを締め過ぎないように注意する。同じバ
ケツ採⽔から濾過を 2 回（50ｍL x 2 回 ＝ 100mL）繰り返したらバケツの⽔を捨てる。新たに環境⽔を汲み上げ、濾過総量が 1L に達するまで、この操作を 10 回繰り返す（シリンジでの濾過作業は合計 20 回となる）。単調な作業のため、カウンター（数取り器）を⽤いて採⽔回数を間違えないようにする。
６） ステリベクス内の⽔分除去︓上記の濾過がすべて終了したら、ステリベクスを取り外してシリンジ内に空気を満たす。再度シリンジにステリベクスを取りつけ、カートリッジ内の⽔分を押し出す（図 3-1-2-10）。この操作を数回繰り返し、⽔分をできるだ
け除去する。
7） ステリベクス排出孔の密閉︓ステリベクス内部の⽔分がほぼなくなったら、ステリベ

16

クスをシリンジに取りつけたまま、その排出孔をルアーフィッティングかパラフィル
ムを使って密閉する（図 3-1-2-11）。
８） RNAlater の充填︓ステリベクスをシリンジから取り外し、⼩型スポイト（図 3-1-212）を使って注⼊孔から RNAlater を 1-2mL 注⼊する（図 3-1-2-13）。ステリベク
スの注⼊孔と本体の間に段差があるため、⼩型スポイトの先端がそれに引っかかると
RNAlater がうまく⼊らない。段差を避けるように奥まで⼩型スポイト先端を⼊れるとスムースに RNAlater を注⼊できる。
9） ステリベクス注⼊孔の密閉︓RNAlater をステリベクスに充填したら、注⼊孔をルアー
フィッティングかパラフィルムを使って密閉する（図 3-1-1-14）。ルアーフィッティ
ングを使⽤する場合は、固く締め過ぎないように注意する。ステリベクス内のフィル
ター上に集められた DNA の劣化を防ぐために、この作業までを採⽔現場で⾏うのが望ましい。
10）必要事項の記⼊︓濾過が終了後、ステリベクス表⾯の⽔分をキムタオルでよく拭う。
⽔分を取り除いた後、サインペンでステリベクスの本体に⽇付や測点番号など必要事
項を記⼊する（図 3-1-2-15）。
11）濾過済みステリベクスの保管︓必要事項の記⼊が終わった濾過済みステリベクスをユニパック E-4 に⼊れる。ステリベクスが⼊ったユニパックをジップロックに⼊れ、保冷剤が⼊ったクーラーボックスに⼊れて冷暗条件で保管し持ち帰る（図 3-1-2-16）。
ラボに持ち帰ったステリべクスは-20℃以下で保存する。
12) ブランクの作成︓フィールドブランクとして、精製⽔を⽤いて上記と同様の作業を⾏ってフィールドブランクを作成する。フィールドブランクの必要性、頻度については
各事業主体が慎重に判断するべきである。

3-1-3．アスピレーターを⽤いた現場濾過
本項では、AC100V の電源がある実験室や船上で⼤量の⽔を濾過する場合に有効な⽅法を記す。濾過には 10L の活栓付きポリタンクを⽤い、活栓に 10mL のピペットチップを取りつけ、その先端にステリベクスの注⼊孔をねじ込む。さらに、ステリベクスの排出孔にルアーフィッティングを介してアスピレーターに接続し、吸引濾過により⼤量の⽔を濾過する。
以下の作業では、コンタミ防⽌のため、常に実験⽤ゴム⼿袋を着⽤する。
1） ポリタンクの除染︓ ポリタンクの内部に市販の塩素系漂⽩剤（ハイター）を⼊れ、実⾏塩素濃度 0.1%以上になるように現場海⽔か⽔道⽔を⼊れて調整する（図 3-1-3-1）。
ポリタンクをよく振り、その後に濾過する現場海⽔で３回共洗いして漂⽩剤を除く。

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2） 濾過装置の組み⽴て︓ポリタンクの活栓に 10mL のピペットチップを連結する（図 31-3-2）。ステリベクス排出⼝にルアーフィッティング（オスルアーロック）を装着する（図 3-1-3-3）。ゴム管をチューブ I 型ジョイントとつなぎ、⽳付きシリコン栓を取り付ける（図 3-1-3-4）。フィルターホルダーマニホルドの排出孔とアスピレーターをゴム管でつなぐ（図 3-1-3-5, 6）。フィルターホルダーマニホルドの吸⼊孔に前述のゴム管を装着する（図 3-1-3-7）。最後にポリタンクとつなげたチップの先端をステリ
ベクス注⼊孔に強く押し込む（図 3-1-3-8）と⼤量濾過システムが完成する（図 3-13-9, 10）。
3） 濾過︓アスピレーターのタンクに⽔を⼊れる。除染したバケツなどを使って環境⽔を採取してポリタンクに⼊れる。アスピレーターのスイッチを ON にするとポリタンク
からアスピレーターに向かって⽔が流れ、ステリベクスのフィルター上に DNA が吸着・濃縮される。事前にポリタンクに 1L ごとにラインを⼊れていくと、吸引濾過した⽔の量を確認しやすい。
４） ステリベクス内の⽔分除去︓濾過が終了したら、ステリベクスをピペットチップから取り外し、そのまま吸引濾過を継続すると、ステリベクス内部の⽔分を除去できる。
5） 濾過後のステリベクスの処理︓前項の 7）以降の操作を続けてステリベクスを保管する。

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図 3-1-2-1
現場濾過キットの内容︓50mL シリンジ 2
本, ステリベクス 2 本, ⼩型スポイト 2 本,
RNAlater が⼊った 2mL チューブ 2 本,
パラフィルム 6 枚, ユニパック（E-4）1枚, ユニパック（G-8）1 枚。

図 3-1-2-2
現場濾過キットをユニパック（G-8）に詰めた状態。このように 1 袋にまとめておくと現場での使い勝⼿がよい。

図 3-1-2-3
クレモナ⾦剛打ロープを 15m ほど切り出して折りたたみバケツ（Soft Bucket 8 型
I-484）にしっかりと結びつけたところ。
取っ⼿がとれやすいので、かならずバケツの縁にある⼩⽳にロープの先端をくくりつけておくこと。

図 3-1-2-4
バケツの内部とバケツにくくりつけたロープ先端部に泡洗浄ハイターを吹き付けて除染する。

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図 3-1-2-5
ハイターを分⼦実験⽤ペーパータオルできれいに拭き取る。きれいに拭き取らないと、採⽔の際に泡が出て環境⽔を汚染してしまうので注意すること。

図 3-1-2-6
バケツを投げたところ。

図 3-1-2-7
ロープを⼿繰り寄せて環境⽔の⼊ったバケツを回収する。

図 3-1-2-8
50ｍL シリンジを⽤いてバケツで汲んだ環境⽔を吸引する。

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図 3-1-2-9
ステリベクスを装填して加圧濾過を⾏う。

図 3-1-2-10
濾過が終わったら、ステリベクスを取り外してシリンジ内に空気を満たし、シリンジにステリベクスを再装着し、カートリッジ
内の⽔分を押し出す。この操作をカートリ
ッジから⽔が出なくなるまで数回繰り返す。

図 3-1-2-11
ステリベクスをシリンジに装着した状態
で、排出孔をルアーフィッティングかパラ
フィルムを使って密閉する。

図 3-1-2-12
⼩型スポイトをつかい、2.0mL チューブから 2〜3 回に分けて RNAlater を吸引する。

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図 3-1-2-13
吸引した RNAlater を注⼊孔から⼩型スポ
イトをつかって注⼊する。

図 3-1-2-14
注⼊孔をルアーフィッティングかパラフ
ィルムで密閉する。

図 3-1-2-15
ステリベクスの表⾯の⽔分をキムワイプ
で拭きとり、サインペンでステリベクスの本体に⽇付や測点番号など必要事項を記⼊する。

図 3-1-2-16
同じ測点から得られた 2 本のステリベクス
をユニパックに⼊れ、それをさらにジップ
ロックに⼊れて、保冷剤が⼊ったクーラー
ボックスで保管する。

22

図 3-1-3-1
ポリタンクの内部に市販の塩素系漂⽩剤（ハイター）を⼊れ、実⾏塩素濃度 0.1%以上になるように現場海⽔か⽔道⽔を⼊れて調整する。

図 3-1-3-2
ポリタンクの活栓の先端に 10mL のピペ
ットチップを押し込む。

図 3-1-3-3
ステリベクス排出孔にルアーフィッティ
ング（オスルアーロック）を取りつける。

図 3-1-3-4
ゴム管と⽳付きシリコンをチューブ I 型ジョイント（⽩いジョイント）を介してつな
ぐ。

23図 3-1-3-5
フィルターホルダーマニホルドの排出孔とゴム管をつなぐ。

図 3-1-3-6
ゴム管とアスピレーターをつなぐ。

図 3-1-3-7
フィルターホルダーマニホルドの吸⽔孔に前述のゴム管を装着する。

図 3-1-3-8
ポリタンクの活栓に取りつけた 10mL ピ
ペットチップの先端をステリベクス挿⼊
⼝に強く差し込む。

24

図 3-1-3-9
ステリベクスをつかった⼤量濾過システ
ムの完成。

図 3-1-3-10
AC100V の電源があれば、写真のように漁船の上でも容易に⼤量濾過ができる。

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３-2．採⽔とグラスファイバーフィルターを⽤いた実験室での濾過
安全に採⽔を⾏うために（再掲）
環境 DNA のサンプリング（＝採⽔）は、季節や場所によってさまざまな環境下で⾏うことになる。夏には熱中症や⽇焼け対策が、冬には防寒対策が必要となり、磯や濡れた突堤、貯⽔池の護岸などでは転倒や落⽔に注意しなくてはならない。また、⽔際の作業であるために濡れても良い撥⽔性や速乾性の⾼い⾐類を着⽤することも重要である。フィールドでの調査・作業は不測の事態に備えて原則として複数名で⾏う。さらに、特に海岸や⼤規模な河川においては安全を確保するためライフジャケットの着⽤は必須である。万が⼀、⽔難事故が起きてしまった場合は、川や池であれば警察へ 110 番に、海であれば海上保安庁のホットライン 118 番に速やかに通報する。

フィールドデータの記録に必要な道具（例）・ 測量野帳レベルブック（セ-Y11，コクヨ社など）
・ 耐⽔加圧ボールペン（BDWR-40F-B，パイロットなど）
・ ハンドヘルド GPS（eTrex20xJ，ガーミン社など）
・ データロガー導電率計（CD-4307SD，マザーツール社など）
・ 防⽔デジタルカメラ（RICOH WG-30，リコー社など）

採⽔および研究室への輸送に必要な道具（例）・採⽔⽤ボトル（1L 以上︓事前に塩素消毒したもの）

サンプル数＋α

・採⽔⽤ボトル（1L の純⽔を⼊れたもの）

1 ⽇につき 1 本

・10%塩化ベンザルコニウム溶液（1mL ずつに分注したもの）

サンプル数＋α

・使い捨て⼿袋

サンプル数＋α

・採⽔⽤バケツおよびロープ

1式

・スプレー式塩素系漂⽩剤

1本・ペーパータオル

適宜

・ゴミ袋

適宜

・⻑靴・胴⻑等
・⽔質計（必要に応じて）・マジック、ガムテープ等
・クーラーボックス

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・保冷剤

グラスファイバーフィルターを⽤いた実験室での濾過に必要な道具（例）・フィルターホルダー（事前に塩素消毒したもの[図 3-2-2-1]）

適宜・アスピレーターまたは真空ポンプ

適宜

・グラスファイバーフィルター（平均孔径 0.7μm）

濾過数の 2 倍・ピンセット（事前に塩素消毒したもの）

適宜

・アルミホイル

適宜・チャック袋

適宜

・塩素処理⽤バケツ

適宜

・塩素系漂⽩剤

適宜

・純⽔

適宜

・使い捨て⼿袋

適宜

・冷凍庫（-20 度以下）

3-2-1．フィールドデータの記録
測量野帳レベルブックに記⼊する主な項⽬として以下のようなものがあげられる。耐⽔性の野帳に耐⽔性のボールペンで記録するとよい。
・採⽔者（サンプリングに同⾏した全員の名前を記録）
・⽇時（YYYY-MM-DD の形式で記録)
・測点番号と採⽔地点の地名（プロジェクト略称＋調査番号＋測点番号）
・緯度経度（35.101252N, 139.293012E のような 10 進法が取り扱いやすい）・河岸・湖岸・海岸・底質の分類︓砂浜・砂利浜・岩礁・サンゴ・護岸（コンクリート・テ
トラ・捨て⽯など）
・気象・海象（⾵向・⾵⼒・波⾼を含む）
・⽔温（℃）
︓携帯⽤の⽔質計を⽤いて計測する。
・（海では）潮汐（⼤潮・中潮・⼩潮・若潮・⻑潮）と⼲満（満潮・⼲潮・上げ潮・下げ潮）
・（海では）塩分濃度（‰）
︓携帯⽤の⽔質計を⽤いて計測する。
・透明度（透明・ササ濁り・濁り）・濾過⽔量（ｍL）
︓1000ｍL 未満の場合には必ず記⼊すること。
・⽬視の範囲内で⿂影やその他の⽣物︓抽出した環境 DNA には⿂類以外の⽣物が含まれているので、クラゲやその他の⽬⽴つ⽣物に関する記録が後々に重要となる。
・写真（撮影の有無）
・その他︓環境⽔に影響を与えそうなものの記録（釣り⼈の有無︔排⽔や流れ込みの有無な

27

ど）

3-2-2．採⽔および実験室への輸送
1) ⽔辺からの直接採⽔︓直接⽔辺にアクセスできる場合は、採⽔ボトルを直接⽔につけて採⽔を⾏う。現場の環境⽔でボトルを 2 回、共洗いした後、サンプルを 1 リットルより少し多めに採取する。コンタミネーション防⽌のため、共洗いした⽔は、河川の場合下流側に捨てるなど、共洗いした⽔がサンプルに混⼊しないよう注意する（図 3-2-2-2）。
作業時には底泥を巻き上げないように注意する。採取した⽔に、DNA の分解抑制のために 10%塩化ベンザルコニウム溶液を 1mL 添加し（終濃度 0.01%）、転倒混和を⾏ってしっかりと混ぜる（図 3-2-2-3）。
2) バケツを⽤いる場合︓⽔辺への直接のアクセスが困難な場合には、バケツを⽤いて河川⽔を採取する(ア) バケツの除染︓ゴム⼿袋を着⽤し、バケツの内部とバケツにくくりつけたロープ先
端部に泡洗浄ハイターを吹き付ける（図 3-2-2-4）。数分間放置した後、ハイター
を分⼦実験⽤ペーパータオルなどできれいに拭き取る（図 3-2-2-5）。その後、バケツとロープ先端を環境⽔で２回共洗いする。ハイターが余分に残っているとサンプル中の DNA が分解されるので注意すること。
(イ) バケツ採⽔︓バケツを投げ、ロープを⼿繰り寄せて環境⽔の⼊ったバケツを回収す
る（図 3-2-2-6）。採⽔した⽔でバケツを 2 回、共洗いする。その後採⽔した⽔でボトルを 2 回、共洗いした後、サンプルを 1 リットルより少し多めに採取する。
コンタミネーション防⽌のため、共洗いした⽔は、河川の場合下流側に捨てるなど、共洗いした⽔がサンプルに混⼊しないよう注意する。採取した⽔に、DNA の分解防⽌のために 10%塩化ベンザルコニウム溶液を 1mL 添加し（終濃度 0.01%）、
転倒混和を⾏ってしっかりと混ぜる（図 3-2-2-3）。
3) フィールドブランク︓実験室から運んだ純⽔が⼊ったボトルをフィールドで開封し、サンプルと同様に 10%塩化ベンザルコニウム溶液を 1mL 添加し（終濃度 0.01%）、転倒混和を⾏ってしっかりと混ぜる。
4) 実験室への輸送︓採⽔後のサンプルは直射⽇光および⾼温をさけて実験室に輸送する。
塩化ベンザルコニウムの添加により、常温下でも数⽇程度は DNA が保存されるが、できるだけ低温での管理が望ましい（ただし、現在のところ、塩化ベンザルコニウムを添加すれば、⽔サンプルは冷凍させない⽅が良いと考えられている）。また、紫外線は DNAを分解するので、直射⽇光を避けて輸送する。輸送後、速やかに以下の濾過作業を⾏う。

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3-2-3．グラスファイバーフィルターを⽤いた濾過
実験室に持ち帰ったサンプルはできるだけ早期に（採⽔後 48 時間以内を推奨）濾過を⾏う。
濾過を⾏う者は作業を通じて⼿袋を着⽤する。
1) 塩素処理の準備︓塩素処理⽤バケツに⽔道⽔を⼊れ、市販の塩素系漂⽩剤を実⾏塩素濃度 0.1%以上になるように添加する。
2) 道具の塩素処理︓フィルターホルダーおよびピンセットは使⽤前に 5 分以上塩素処理バ
ケツに漬け（図 3-2-3-1）、⽔道⽔ですすいだ後、蒸留⽔ですすいでから使⽤する。この塩素処理はサンプルが変わるごとに⾏う必要がある。使⽤後のボトルはボトル表⾯も含めて全体を除染する必要があるので、塩素処理バケツに全体を沈めて５分以上の塩素除染を⾏い、次回以降の調査に⽤いる。
3) 濾過︓⽔サンプルの濾過にはグラスファイバー製のフィルター（平均孔径 0.7μm）を、
1 サンプルにつき 2 枚⽤いる。サンプル⽔を 500mL ずつ 1 枚のフィルターで濾過する（図 3-2-3-2 ~ -4）。
なお、
サンプル⽔によっては 500mL の濾過が困難な場合がある。
そのようなときには、フィルター1 枚あたりの濾過⽔量を減らし、複数枚に分けて濾過をし、濾過⽔量を記録する。濾過⽔量を減らした場合でもサンプルあたりのフィルター
枚数は 2 枚とする。未使⽤フィルターにサンプル⽔がかかることによるコンタミネーシ
ョンを防ぐため、フィルターの容器を開け放しにしないことやサンプル⽔より⾼いところにおいておくことなどの注意が必要である。
4) フィルターの保存︓濾過が終わったフィルターは濾過⾯を内側にして半分におり、2 枚のフィルターをあわせてアルミホイルで包む（図 3-2-3-5）。アルミホイルにサンプル
名などを記⼊し、ユニパックなどの袋に⼊れて冷凍庫（-2０℃以下）で保存する（図 32-3-6）。この状態で数ヶ⽉程度は安定して保存可能である。
5) 濾過ブランク︓濾過時以降のコンタミネーションの有無を評価するため、１⽇の作業につき 1 回、純⽔ 1 リットルに 10%塩化ベンザルコニウム溶液 1mL を添加（終濃度0.01%）した「濾過ブランク」を⽤意し、サンプルと同様に扱う。ただし、「フィールドブランク」で濾過ブランクの代⽤としても良い。

29

図 3-2-2-1
採⽔ボトルは使⽤前に塩素により除染する。

図 3-2-2-2
共洗い後の環境⽔は下流側など、サンプルに影響しないところに捨てる。

図 3-2-2-3
採⽔後、10%塩化ベンザルコニウム溶液を 1mL 添加する。

図 3-2-2-4
バケツの内部とバケツにくくりつけたロープ先端部に泡洗浄ハイターを吹き付けて除染する。

30

図 3-2-2-5
ハイターを分⼦実験⽤ペーパータオルな
どできれいに拭き取る。きれいに拭き取らないと、採⽔の際に泡が出て環境⽔を汚染してしまうので注意すること。

図 3-2-2-6
バケツを投げ、ロープを⼿繰り寄せて環
境⽔の⼊ったバケツを回収する。

図 3-2-3-1
濾過に使⽤する器材は使⽤前に塩素により除染する。

図 3-2-3-2
濾過の様⼦。

31

図 3-2-3-3
濾過後のフィルターの状態。

図 3-2-3-4
濾過後のフィルターの状態

図 3-2-3-5
濾過後のフィルターをアルミホイルで遮光する。

図 3-2-3-6
アルミホイルにサンプル情報等を書き込
み、ユニパックなどの袋で冷凍保存する。

32

4．DNA の抽出
サンプル保管上の注意
カートリッジフィルターまたはグラスファイバーフィルターを⽤いた濾過の後、サンプルは冷凍庫に保管される。冷凍庫の温度管理には⼗分な注意を払い、凍結融解を繰り返すことのないように注意する。

DNA 抽出に共通の注意点
以下にカートリッジフィルターからの DNA 抽出（4-1）およびグラスファイバーフィルタ
ーからの DNA 抽出（4-2）について記す。コンタミネーションのリスクを軽減するために、どちらの作業も、PCR 以降の装置やサンプルと物理的に隔離すること、PCR 以降の操作を⾏った作業者が同じ⽇に DNA 抽出以前の操作を⾏うことのないように、1 ⽇の作業内容・順序を事前に確認することが重要である。

33

4-1．カートリッジ式フィルターからの DNA 抽出
DNA 抽出を始める前に︓コンタミネーションのリスクを減らす⽅策
本項では、ステリベクスフィルターから DNA を抽出する⽅法を記す。なお、本⼿法はビデ
オジャーナルである Journal of Visualized Science (Miya et al. 2016) に発表した⼿法
を若⼲改変したもので、⼀連の技法は動画に収められているので参考にされたい。
また、ここからが実験室での⼯程となるので、コンタミネーション（外来 DNA の混⼊）には⼗分注意を払わなくてはならない。とくに、この段階でコンタミネーションが起こると、以降の実験（リアルタイム PCR や次世代シーケンス⽤ライブラリーの調整）が台無しになってしまう。そうならないように、DNA 抽出のみの専⽤の実験室（DNA 抽出室）を設けるべきである。また、DNA 抽出室は PCR 関連の部屋とは空間的に⼗分隔離しなければならない。さらに、組織からの抽出 DNA や PCR 産物を扱った当⽇は DNA 抽出室に⼊らないなどの細⼼の注意が必要となる。

DNA 抽出に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ 乾熱滅菌器（56℃に設定）
・ ミニローテーター（ACR-100，アズワン）と付属の 10mL/15mL チューブホルダー
・ QIAVac Connecting System（QIAvac 24 Plus マニホールドと QIAGEN Vacuum
Pump，キアゲン社）1・ 卓上超遠⼼機（PZ5557-A000，クボタ社）
・ 微量⾼速冷却遠⼼機（MX-307，TOMY 社）
・ 微量⾼速冷却遠⼼機⽤ローターラック（AR015-24，TOMY 社）
・ 卓上⼩型遠⼼機（マイクロシックス MS-1，アズワン）
・ ボルテックス・ミキサー（VORTEX-GENIE 2 Mixer，エムエス機器株式会社）と 3 イン
チプラットホーム・ ルアーフィッティング（VPRM406 オスルアーロック 4mmID ⽤，株式会社アイシス）
・ 50mL コニカルチューブ
・ DNeasy Blood and Tissue kit（キアゲン社）
・ エタノール（分⼦⽣物学⽤）
・ 2.0mL チューブ （DNA 低吸着︔ザルスタット社）
・ 1.5mL チューブ（DNA 低吸着︔ザルスタット社）
・ PBS (-)（マグネシウムとカルシウムを含まないリン酸緩衝⽣理⾷塩⽔，細胞科学研究所）2
・ パラフィルム

34

・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）・ マイクロピペット P-5000，P-1000，P-200，P-100（ピペットマン，ギルソン社）
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ ハサミ（パラフィルムを切るためのもの）
・ 標準型ピンセット 1 本（IPT-12, アズワン）
・ 1.5mL/2mL ⽤チューブラック
1

QIAVac を使うかわりに、50mL コニカルチューブと 2.0mL チューブを組み合わせ、卓上超遠⼼機で RNAlater を抜き取ってもよい（Miya et al. 2016 が参考になる）。
2

本プロトコールでは、DNeasy キットに付属のバッファーATL は使⽤しない。

4-1-1．実験の準備
実験中は必ずゴム⼿袋を着⽤する（これ以降作業中に⼿袋の汚染を感じた場合は速やかに交換する）。
1） 乾熱滅菌器を 56℃に設定する（温まるのに時間がかかるので事前に準備しておく︔図4-1-1-1）。
2） RNAlater が充填された濾過済みのステリベクスを準備する（凍結している RNAlaterは常温で⽐較的すぐに解凍できる︔図 4-1-1-2）。

4-1-2．RNAlater の吸引
1） ステリベクスの排出孔をふさいでいたキャップもしくはパラフィルムを外し、ルアー
フィッティング（VPRM406）を取りつける。
2） ルアーフィッティングを介して QIAvac 24 Plus マニホールドとステリベクスを接続
する（図 4-1-2-1）。
3） QIAvac のポンプのスイッチを⼊れ、注⼊孔側から排出孔側に向かって RNAlater を吸引する（ステリベクスのカートリッジ内には、構造上の問題で若⼲の RNAlater が残るが、これ以降の DNA 抽出で問題は⽣じない）。
4） パラフィルムを 1cm × 5cm 程度の⼤きさに切り、ステリベクスの数だけ⽤意する（ルアーフィッティング［VRSP6］を使⽤した場合はパラフィルムは不要）。
5） RNAlater を吸引したステリベクスをマニホールドから外し、パラフィルムもしくはル
アーフィッティングで排出孔に封をする（図 4-1-2-2︔パラフィルムを使⽤する場合

35

は、乾熱滅菌器で温めた際にステリベクス内の空気が膨張し、パラフィルムが破れて液漏れすることがあるので、排出孔の部分をフィルムで数回重ねて封をすること）。

4-1-3. DNA の抽出
1） DNeasy Blood and Tissue kit と PBS (-) を使って抽出液（プレミックス）の準備をする（図 4-1-3-1）。
1 本のステリベクスあたり 20μL の Proteinase-K（600mAU/ml）、
200μL の AL、220μL の PBS (-) の割合でプレミックスを調整する。これには、DNA抽出中のコンタミネーションを検知するための「抽出ブランク」⽤の 1 本分も含める。
2） ステリベクスの注⼊孔を開封し、マイクロピペット（P-1000）と 1000μL ⽤のフィル
ターチップを⽤いて上記のプレミックスを充填する（注意︓注⼊孔とカートリッジの接合部に段差があるため、チップ先端の挿⼊具合によって液が溢れ出ることがある︔
図 4-1-3-2）。
3） パラフィルムを 1cm × 5cm 程度の⼤きさに切り出し、ステリベクスの注⼊孔側にしっかりと封をする（注意︓ルアーフィッティング［VRMP6］を使⽤の場合はパラフィルムは不要︔図 4-1-3-3）。
4） ミニローテーターの 10mL/15mL チューブホルダーにステリベクスを差し込み、ステリベクスが地⾯と平⾏になるようにチューブホルダーをローテーター本体に取り付ける。
5） ステリベクスを取り付けたローテーターを乾熱滅菌器内に置き、10rpm で回転させ56℃で 20 分間加温する（注意︓ミニローテーターの耐久温度は 60℃︔図 4-1-3-4）。
6） ステリベクスを加温中に DNA 回収⽤の 2.0mL チューブ（DNA 低吸着）と 50mL コ
ニカルチューブを⽤意し（図 4-1-3-5）、2.0mL チューブを 50mL コニカルチューブに⼊れる（注意︓2.0mL のチューブにはキャップに番号など必要事項を記⼊、コニカ
ルチューブの奥まで押し込まない︔図４-1-3-6）。
7） ステリベクスの加温が終了後、注⼊孔側のパラフィルムもしくはルアーフィッティン
グを内部の液が漏れないように注意深く取り外す。
8） ステリベクスの注⼊孔を、コニカルチューブ内に⼊れた 2.0mL チューブ内に挿⼊し、そのまま 50mL コニカルチューブの底まで押し込む（図 4-1-3-7）。その後しっかりとコニカルチューブのキャップを閉める（図４-1-3-8）。
9） ステリベクスを⼊れたコニカルチューブを 6,000g で 1 分間遠⼼し（図 4-1-3-9)、抽出 DNA を 2mL チューブに回収する（図 4-1-3-10）。

3610）50mL コニカルチューブを遠⼼機から取り出し、ピンセットを使ってステリベクス（図4-1-3-11）、2.0mL チューブの順に取り出す（図 4-1-3-12︔注意︓2.0mL チューブはキャップが開いた状態なので注意深く扱うこと）。
11）使⽤済みステリベクスを廃棄し、2.0mL チューブのキャップをしっかりと閉じる。

4-1-4. DNeasy Blood and Tissue kit を⽤いた DNA の精製
1） ステリベクスの本数に抽出ブランク 1 本を加えた本数の DNeasy Blood and Tissue
kit（以下 DNeasy）付属のカラムを⽤意する（図 4-1-4-1︔注意︓カラムのキャップに必要事項を記⼊すること）。
2） 抽出 DNA が⼊った 2.0mL チューブに 200μL の 96〜100%エタノールを⼊れピペッ
トでよく混和する（図 4-1-4-2）。
3） マイクロピペット（P1000）の吸引量を 700μL にセットし、カラムに抽出 DNA を⼊れる（注意︓RNAlater が少量残っているため溶液は 640μL より多くなることがある︔
図 4-1-4-3）。抽出ブランクには、4-1-3 で⽤意した混合溶液 440μL に 200μL の 96
〜100%エタノールを加えてピペットで混和したものを⽤いる。
4） 溶液が⼊ったカラムを 6,000g で 1 分間遠⼼する（図 4-1-4-4）。
5） 遠⼼を終了後、カラムのコレクションチューブを外して新しい 2mL コレクションチ
ューブにカラムに載せ替える（図 4-1-4-5）。使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する（図 4-1-4-6）。
6） カラムに 500μL の Buffer AW1 を⼊れ（図 4-1-4-7）、6,000g で 1 分間遠⼼する。
7） 遠⼼を終了後、カラムを新しい 2mL コレクションチューブに載せ替える（図 4-1-48）。使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。
8） カラムに 500μL の Buffer AW2 を⼊れ（図 4-1-4-9）、20,000g で 3 分間遠⼼する。
9） 新しい DNA 低吸着の 1.5mL チューブを⽤意し、キャップに必要事項を記⼊する（図4-1-4-10）。
10）遠⼼を終了後、カラムを 9）で⽤意した 1.5mL チューブに載せ替える（図 4-1-4-11）。
使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。
11）200μL の溶出 Buffer AE（溶出バッファー）をカラムのメンブレン上に注ぎ（図 4-14-12）、室温で 1 分間インキュベートした後に 6,000g で 1 分間遠⼼する。なお、回37

収 DNA 濃度が希薄となることが予想される場合には、溶出バッファー量を 50μL 程度まで減じることも可能である。その際は溶出バッファー量を記録しておくこと。
12）遠⼼を終了後、カラムを取り外してチューブのキャップをしっかりと閉じる（図 4-14-13）。使⽤済みカラムを廃棄する。
13）この状態で－20℃で安定的に保存可能である。

参考⽂献
Miya, M., Minamoto, T., Yamanaka, H., Oka, S., Sato, K., Yamamoto, S., Sado, T.
& Doi, H. 2016. Use of a filter cartridge for filtration of water samples andextraction of environmental DNA. Journal of Visualized
Experiments, (117):e54741. doi: 10.3791/54741
なお、本論⽂のビデオについては
https://sites.google.com/site/masakimiyalab/publications-1から低解像度版の視聴が可能である。

38

図 4-1-1-1
乾熱滅菌器を 56℃にセットする。指定の温度に達するまで時間がかかるので、抽出前に余裕をもってセットすること。

図 4-1-1-2-20℃に凍結してあったステリベクスを解凍する。冷蔵の場合はそのままでよい（図4-1-1-2）。

図 4-1-2-1
ステリベクスの排出孔を開封し、ルアーフィッティングを介して QIAvac と接続し、ステリベクス内に充填した RNAlater を抜き取る。

図 4-1-2-2
再度、パラフィルムでステリベクスの排出孔を閉じる。

39

図 4-1-3-1抽出に必要な試薬を準備する。

図 4-1-3-2
ステリベクスの注⼊孔を開封し、マイクロ
ピペット（P-1000）と 1000μL ⽤のフィルターチップを⽤いて上記のプレミックスを充填する。

図 4-1-3-3パラフィルムでステリベクスの注⼊孔に封をする。ステリベクスを 56℃に加熱する
際、液が膨張するのでしっかり封をすること。

図 4-1-3-4
ステリベクスを取り付けたローテーターを
乾熱滅菌器内に置き、10rpm で回転させ56℃で 20 分間加温する。

40

図 4-1-3-5
ステリベクスを加温中に DNA 回収⽤の2.0mL チューブ（DNA 低吸着）と 50mL
コニカルチューブを⽤意する。

図 4-1-3-6
2.0mL チューブを 50mL コニカルチュー
ブに挿⼊したところ。

図 4-1-3-7
ステリベクスの注⼊孔を 2.0mL チューブ内に挿⼊し、そのまま 50mL コニカルチ
ューブの底まで押し込む。

図 4-1-3-8
ステリベクスと 2.0ｍL チューブをコニカ
ルチューブの底に押し込んだら、しっかりとコニカルチューブのキャップを閉める。

41

図 4-1-3-9
ステリベクスを⼊れたコニカルチューブを
6,000g で 1 分間遠⼼する。

図 4-1-3-10
コニカルチューブ内で 2.0ｍL チューブに回収された抽出 DNA。

図 4-1-3-11
ピンセットを使ってコニカルチューブからステリベクスを取り出す。

図 4-1-3-12
次いでピンセットを使ってコニカルチュー
ブから 2.0mL チューブを取り出す。キャップが開いたままなので注意深く取り出すこと。

42

図 4-1-4-1
DNeasy Blood and Tissue kit 付属のカラム（コレクションチューブ付き）を開封してチューブラックに並べる。

図 4-1-4-2
抽出 DNA が⼊った 2.0mL チューブに200μL の 96〜100%エタノールを⼊れピ
ペットでよく混和する。

図 4-1-4-3
カラムに抽出 DNA を⼊れる。

図 4-1-4-4
抽出 DNA が⼊ったカラムを 6,000g で 1
分間遠⼼する。

43

図 4-1-4-5
遠⼼を終了後、カラムのコレクションチューブを外して新しい 2mL コレクションチ
ューブにカラムに載せ替える。

図 4-1-4-6
使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。

図 4-1-4-7
カラムに 500μL の Buffer AW1 を⼊れる。

図 4-1-4-8
遠⼼を終了後、カラムを新しい 2mL コレ
クションチューブに載せ替える。

44

図 4-1-4-9
カラムに 500μL の Buffer AW2 を⼊れる。

図 4-1-4-10
DNA 低吸着の 1.5mL チューブを⽤意し、キャップに必要事項を記⼊する。

図 4-1-4-11
遠⼼を終了後、カラムを図 4-1-4-10
で⽤意した 1.5mL チューブに載せ替える。

図 4-1-4-12200μL の溶出 Buffer AE（溶出バッファー）をカラムのメンブレン上に注ぐ。

45

図 4-1-4-13
室温で 1 分間インキュベートした後に6,000g で 1 分間遠⼼する。

図 4-1-4-13
遠⼼を終了後、カラムを取り外してチュー
ブのキャップをしっかりと閉じる。

図 4-1-4-14
この状態で-20℃で安定的に保存可能である。

46

4-2.グラスファイバーフィルターからの DNA 抽出
DNA 抽出を始める前に︓コンタミネーションのリスクを減らす⽅策
本項では、グラスファイバーフィルターから DNA を抽出する⽅法を記す。なお、本⼿法はUchii et al. 2016 に発表した⼿法を若⼲改変したものである。
また、ここからが実験室での⼯程となるので、コンタミネーション（外来 DNA の混⼊）には⼗分注意を払わなくてはならない。とくに、この段階でコンタミネーションが起こると、以降の実験（ライブラリーの調整）が台無しになってしまう。そうならないように、DNA 抽
出だけの専⽤の実験室（DNA 抽出室）を設けるべきである。また、DNA 抽出室は PCR 関連の部屋とは空間的に⼗分隔離しなければならない。さらに、組織からの抽出 DNA や PCR
産物を扱った当⽇は DNA 抽出室に⼊らないなどの細⼼の注意が必要となる。

DNA 抽出に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・遠⼼分離機（サリベットチューブが回せるもの）
・遠⼼分離機（1.5mL チューブが回せるもの）
・ヒートブロックまたは恒温器（56℃に設定）
・サリベットチューブ

サンプル数分・ピンセット

サンプル数分

・DNeasy Blood & Tissue Kit

サンプル数分
1

・Buffer AL および Proteinase K

・1.5mL エッペンドルフチューブ（低吸着）

サンプル数分・エタノール（分⼦⽣物学⽤）

適宜

・TE バッファ（pH8.0: 分⼦⽣物学⽤）

適宜・ゴム⼿袋（パウダーフリー）・マイクロピペット各種
・フィルターチップ各種
・1.5mL/2mL ⽤チューブラック
1

本プロトコールでは、DNeasy キットに付属のバッファーATL は使⽤しない。

4-2-1．実験の準備
実験中は必ずゴム⼿袋を着⽤する（これ以降の作業中に⼿袋の汚染を感じた場合は速やかに交換する）。
1）

56℃の恒温槽を準備する（温まるのに時間がかかるので、事前に準備しておく）
。

47

2）

⽔サンプルを濾過したフィルターをサリベットに⼊れる（図 4-2-1-1、-2）。1 サン
プルに 2 枚のフィルターを⽤いた場合は 2 枚まとめて⼀つのサリベットに⼊れる。

3）

サリベットの上部および下部に、サンプル番号を振っておく（図 4-2-1-3）。

4-2-2. タンパク質の分解処理
1) サンプルあたり、400μL の Buffer AL、40μL の Proteinase-K（600mAU/ml）を添加する（4-2-2-1）。サンプルがｎ個であればそれぞれ試薬をｎ＋１倍まとめて調整してから分注すると良い。
2) 恒温槽で 56℃、30 分間保温処理する（図 4-2-2-2）。恒温槽で加熱するとサリベットのキャップが⾶ぶ場合があるため、バスケット部分と下のチューブの部分との間を少し緩め、⽴てて⾼温槽に⼊れる。
3) その後、3,000g で 3 分間遠⼼分離する（図 4-2-2-3）。この時点でサリベットの下部に濾液が 800〜1,000μL となる（図 4-2-2-4）。
4) サリベット内のフィルターにまだ DNA が残っているのでこれをさらに回収するため、
220μL の TE を添加後（図 4-2-2-5）、1 分間静置する。その後、3,000g で 3 分間遠⼼分離する。実験中は必ずゴム⼿袋を着⽤する。

4-2-3. DNeasy カラムを⽤いた DNA の精製
1) フィルターの⼊ったサリベットの上部を外して捨て、下部の DNA 溶液（図 4-2-3-1）に、400μL のエタノールを添加する（図 4-2-3-2）。
2) ピペッティング（図 4-2-3-3）で混ぜてから DNeasy のカラム（図 4-2-3-4）へ 650μL 程度（半分程度）移し（図 4-2-3-5）、6,000g で 1 分間遠⼼する（図 4-2-3-6）。
3) 下の 2mL コレクションチューブにたまった濾液を捨て（図 4-2-3-7、-8）、サリベット下部に残っている DNA 溶液を再びカラムに移し（図 4-2-3-9）、6,000g で 1 分間遠⼼する。この作業を DNA 溶液がなくなるまで繰り返す。
4) カラムを新しい 2mL コレクションチューブに載せ替え（図 4-2-3-10）、500μL の Buffer
AW1 を添加後（図 4-2-3-11）、6,000g で 1 分間遠⼼する。
5) カラムを新しい 2mL チューブに載せ替え（図 4-2-3-12）、500μL の Buffer AW2 を添加後（図 4-2-3-13）、使⽤している遠⼼分離機の最⼤遠⼼速度で 2 分間遠⼼する。

486) 遠⼼機から取り外すときや移動させるときなどは、ゆらして下部の液を上部のカラム部
分の先に付着させることのないように注意する。
7) 低吸着の 1.5mL チューブを⽤意し、サンプル名等を記載する（図 4-2-3-14）。
8) カラムを低吸着の 1.5mL チューブに載せ替える（図 4-2-3-15, -16）。

9) 100~200μL の Buffer AE を添加し（図 4-2-3-17）、1 分間静置する。6,000g で 1 分
間遠⼼分離後（図 4-2-3-18）、カラムの出⼝部分が抽出溶液に付着しないように気をつけながらカラムを取り外し、 1.5mL チューブの蓋をしっかりとしめる（図 4-2-3-19）。
この状態で-20℃で安定的に保存可能である。なお、回収 DNA 濃度が希薄となることが予想される場合には、溶出バッファー量を 50μL 程度まで減じることも可能である。
その際は溶出バッファー量を記録しておくこと。

補⾜事項
サリベットを遠⼼できるサイズの遠⼼機がない場合は、サリベットの代わりに⼩型スピン
カラムを⽤いた抽出法を⽤いることもできる。詳細は Yamanaka et al. 2016 を参考にす
るとよい。

参考⽂献
Uchii, K., Doi, H., & Minamoto, T. 2016. A novel environmental DNA approach toquantify the cryptic invasion of non-native genotypes. Molecular Ecology Resources
16 (2): 415-422. Doi: 10.1111/1755-0998.12460
Yamanaka, H., Motozawa, H., Tsuji, S., Miyazawa, R. C., Takahara, T., Minamoto, T.
2016. On-site filtration of water samples for environmental DNA analysis to avoid
DNA degradation during transportation. Ecological Research 31 (6): 963-967. Doi:
10.1007/s11284-016-1400-949図 4-2-1-1
冷凍庫から取り出したフィルターをサリベットに移し替える。

図 4-2-1-2
サリベットに⼊ったフィルター。

図 4-2-1-3
サリベットの上部と下部にサンプル番号を書く。

図 4-2-2-1
Buffer AL と Proteinase K の混合液を
加える。

50

図 4-2-2-256℃で 30 分間保温する。

図 4-2-2-3
遠⼼機で遠⼼し、フィルター上の液体をサリベット下部に落とす。

図 4-2-2-4
遠⼼後の様⼦。サリベット下部に液体が800〜1,000μL 程度回収される。

図 4-2-2-5
フィルターに TE バッファを加える。

51

図 4-2-3-1
⼆度⽬の遠⼼後の様⼦。

図 4-2-3-2
サリベット上部を取り外し、下部にエタ
ノールを添加する。

図 4-2-3-3エタノール添加後、ピペッティングでよく混ぜる。

図 4-2-3-4
DNeasy カラム。

52

図 4-2-3-5
サリベット下部の液を DNeasy カラムに移す。

図 4-2-3-6
遠⼼で、カラムを通過させる。

図 4-2-3-7
DNA がカラム部分にトラップされるため、下部の液体は廃液である。

図 4-2-3-8
廃液を捨てる。

53

図 4-2-3-9
再びサリベットからカラムに DNA 溶液
を移し、遠⼼する。

図 4-2-3-10
遠⼼後、カラムを新しい 2mL チューブに載せ替える。

図 4-2-3-11
バッファーAW1 を注ぐ。

図 4-2-3-12
遠⼼後、カラムを新しい 2mL チューブに載せ替える。

54

図 4-2-3-13
バッファーAW2 を注ぎ、遠⼼する。

図 4-2-3-14
低吸着の 1.5mL チューブを⽤意し、サ
ンプル番号を書く。

図 4-2-3-15
1.5mL チューブに遠⼼を終えたカラムを載せ替える。

図 4-2-3-16
1.5mL チューブにカラムを載せ替えた状態。

55

図 4-2-3-17
バッファーAE を注ぎ、1 分静置の後、遠⼼する。

図 4-2-3-18
遠⼼後の状態。この時点では下部に落ちた溶液が DNA サンプルであるので、捨てないように注意する。

図 4-2-3-19
カラムを外し、蓋をしっかりと締め、冷凍保存する。

56

5．DNA の分析

5-1．リアルタイム PCR による環境 DNA の種特異的な検出・定量
はじめに
本項では、リアルタイム PCR を⽤いた環境 DNA の種特異的な検出および DNA 量の定量について記す。種特異的な検出には対象種ごとに検出系を設計する必要があるため、ここで記すのは⼀例にすぎない。実験条件などについてはそれぞれの系について⼗分な検討が必要である。

5-1-1. 種特異的プライマー（およびプローブ）の設計
種特異的なプライマーに求められる条件は、対象種の DNA を効率よく増幅することと、同所的に⽣息する近縁種の DNA を誤増幅しないことである。そのためのプライマー設計の⼿順は以下のとおりである。
1) 塩基配列情報の⼊⼿︓対象種および同所的近縁種の塩基配列情報をダウンロードす
る。NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）や BOLD（http://www.
barcodinglife.org）等のデータベースを適宜利⽤する。ただし、データベース上の情報には誤りが含まれていることに留意し、複数のシークエンス情報を元に検討することが望ましい。
2) プライマーの設計︓対象種と近縁種の間に変異のある領域を探し、プライマーを設計する（図 5-1-1-2）。プライマーの３ʻ末端付近に対象種に特異的な塩基があると良い。プライマーの設計に際しては Tm 値が適切な範囲にあるかなど、プライマー設計の⼀般的な注意点を参考にすると良い。必要に応じて TaqMan プローブも作成する。
3) In silico でのチェック︓Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/
primer-blast/）などを⽤いて、プライマーの特異性を確認する。同所的に⽣息する他の⽣物種が増幅されないことの確認を⾏う。
4) In vitro でのチェック︓対象種および近縁種の組織などから抽出した DNA サンプルを⽤いて PCR 実験を⾏い、DNA 増幅の有無をチェックして特異性を確認する（図 5-11-4）。
5) 環境 DNA のシーケンスチェック︓環境サンプルに由来する DNA 増幅が確認された場

57

合には、PCR 増幅産物（アンプリコン）をシーケンスし、対象種の DNA が間違いなく増幅していることを確認する。

5-1-2. リアルタイム PCR 実験
以下は⼀例である。器材や試薬、対象種によってプロトコールの調整が必要である。

リアルタイム PCR 実験に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・リアルタイム PCR 装置（96 ⽳）・PCR 試薬（2×Environmental Master Mix 2.0︓サーモフィッシャー）
・UNG 酵素（AmpErase Uracil N-Glycosylase︓サーモフィッシャー）・Assay Mix（各 18μM のプライマー、2.5μM の TaqMan プローブ *1）・96 ⽳ PCR プレートおよびシール
・ゴム⼿袋（パウダーフリー）・マイクロピペット （各種）・フィルターチップ （各種）*1

対象種毎にプライマーおよびプローブを設計する必要がある。

PCR1 反応あたりの試薬組成（例）・2×Environmental Master Mix 2.0

10.0μL・AmpErase Uracil N-Glycosylase

0.1μL

・Assay Mix

1.0μL

・DNA

2.0〜5.0μL

・ミリ Q ⽔（超純⽔）

適量

・合計

20.0μL

全ての PCR 反応（ポジティブコントロール[定量スタンダード]、環境 DNA サンプル、フィールドブランク、濾過ブランク、PCR ブランクを含む）を 3 繰り返し以上で⾏う。なお、
定量を⾏う際には、定量スタンダードとして、⼈⼯合成遺伝⼦を⽤意し、4 段階以上の希釈系列を⽤いて定量する。
PCR 反応の条件は様々であるのでここでは⼀例として上記の試薬組成でプライマーの Tm
値が 60℃前後、2 ステップ PCR を⾏う場合について以下に記載する。
５０℃で 2 分、95℃で 10 分の初期ステップの後、95℃で 15 秒、60℃で 1 分から

58

なるサイクルを 50-55 回程度繰り返す。
PCR プレートごとにポジティブコントロール（あるいは定量スタンダード）と PCR ブラン
ク３繰り返しを載せるので、⼀度に解析できるサンプル（フィールドブランク、濾過ブラン
クを含む）数は 27（定量の場合）または 30 サンプル（在不在検出の場合）である。
3 繰り返しのうち、ひとつでもポジティブであったものを陽性と判断する（図 5-1-2）。定量測定の場合は定量スタンダードのデータを⽤いて DNA 量を測定する。陽性であったサン
プルの少なくとも⼀部は PCR 増幅産物をシーケンスして確かに対象の DNA であることを確認する。特に、リアルタイム PCR 時の Cq 値（Ct 値）が⼤きいサンプルについてはシーケンスを確認することが望ましい。

PCR 阻害による陰性に対する対応
環境 DNA サンプルには腐植酸など PCR 阻害物質が含まれる事がある。
ここで紹介した PCRの反応系は⽐較的 PCR 阻害の影響を受けにくいものであるが、時として PCR 阻害による偽陰性の結果が得られることがある。PCR 阻害による偽陰性が疑われる場合、インターナ
ルポジティブコントロールとして増幅実績のある DNA をスパイクインするなどの⽅法で阻害の影響の有無を確認することができる。阻害が確認された場合には DNA 溶液を希釈して PCR を⾏うと結果が改善する場合がある。

参考⽂献
福岡有紗, ⾼原輝彦, 松本宗弘, 兵庫県⽴農業⾼校⽣物部, 丑丸敦史, 源利⽂ 2016 在来希少種カワバタモロコの環境 DNA による検出系の確⽴. ⽇本⽣態学会誌 66 (3): 613-620.

59図 5-1-1-2
プライマーの設計。カワバタモロコのプライマー設計の例。
（福岡ら 2016 より）
図 5-1-1-4
In vitro の増幅チェック。対象種の DNAが増幅し（⾚線）、近縁種の DNA が増幅しない（その他の⾊）ことを確認する。

図 5-1-2
リアルタイム PCR の結果の⼀例。

60

5-2．MiFish メタバーコーディング
5-2-1．ライブラリーの調整ー１︓1st PCR
実験を始める前に︓コンタミのリスクを減らす⽅策
MiFish メタバーコーディングでは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を⽤いてターゲットとなる環境 DNA を分析可能な量に増幅すると同時に、PCR 産物の両端に各種のアダプターを付加することによって次世代シークエンサーで分析可能な分⼦に加⼯する（ライブラリーの調整）。⼀⽅、PCR は⼤量の DNA 断⽚を合成するため、実験の汚染源となりやすい。したがって、PCR の準備（試薬の調合等）を⾏う実験室（プレ PCR ルーム）と、PCR を⾏ったり PCR 産物そのものを扱う実験室（ポスト PCR ルーム）は空間的に隔離すべきである。
また、PCR 産物を扱った当⽇には DNA 抽出やその他の実験を⾏わないなど、コンタミのリ
スクを減らす⼯夫も必要となる。さらには、MiFish メタバーコーディングでは⼆段階 PCRを⾏うため、最初の PCR（1st PCR）産物を希釈して⼆回⽬の PCR（2nd PCR）のテンプ
レートにする操作が必要となる。そのため、後者の実験室（ポスト PCR ルーム）には、この操作の際に⽣じるコンタミを防ぐためのクリーンベンチや、クリーンなオープンスペー
スをつくるテーブルコーチ（KOACH T 500，KOKEN）等を設置する必要がある。また、あらかじめマイクロピペット、チップ、チューブ、チューブラック、ミリ Q ⽔は殺菌灯式電気消毒器（NB-5，⽇鈑⼯業株式会社など）を使って除染を⾏い（図 5-2-1-1）、実験机も泡ハイター等を使⽤して除染すべきである。

1st PCR に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ サーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9700，Applied Biosystems など）
・ 殺菌灯式電気消毒器（NB-5，⽇鈑⼯業株式会社など）
・ KAPA HiFi HS ReadyMix（KK2602，KAPA Biosystems 社）1
・ MiFish プライマー 原液（TE バッファーで 100μM に希釈済みのものを注⽂すると便利）
板鰓類⽤（サメ・エイ類に最適化したプライマー）
MiFish-E-F-v2 (5´–3´; 61 mer):
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNRGTTGGTAAATCTCGTGCCAGC
MiFish-E-R-v2 (5´–3´; 68 mer):
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNGCATAGTGGGGTATCTAATCCTAG
TTTG
硬⾻⿂類⽤ ①（硬⾻⿂類全般に適⽤可能なユニバーサルプライマー） 2

61

MiFish-U-F (5´–3´; 60 mer):
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC
MiFish-U-R (5´–3´; 67 mer):
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGT
TTG
硬⾻⿂類⽤ ②（温帯の沿岸域で⼀般的なアナハゼ類に最適化したプライマー）
MiFish-U2-F (5´–3´; 60 mer):
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNGCCGGTAAAACTCGTGCCAGC
MiFish-U2-R (5´–3´; 67 mer):
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCATAGGAGGGTGTCTAATCCCCGT
TTG
・ ミリ Q ⽔（または分⼦⽣物学実験⽤のハイグレードな滅菌⽔）3・ TE バッファー（分⼦⽣物学実験⽤のハイグレードなもの）
・ 8 連チューブ・ 1.5mL チューブ（DNA 低吸着）・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100，P-20，P-2（ピペットマン，ギルソン社など）・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ 電動マイクロピペット 0.5〜10μL，5〜100μL（Xplorer Plus, エッペンドルフ社など）
・ 1.5mL/2.0mL チューブ⽤チューブラック
・ 8 連チューブ⽤チューブラック
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）
1

陸⽔のような PCR 阻害物質（たとえば腐植酸）を含むことが多い環境⽔や泥試料から抽出した DNA では、KAPA HiFi HS で 1st PCR 産物が得られないことがある。このような場
合、KOD FX Neo や KOD One（東洋紡）を⽤いることで良好な増幅が得られることがある。ただし、酵素によって⾮特異的増幅の起きやすさなどの特性が異なるので、使⽤の際には特性の違いを理解する必要がある。プロトコールについては、メーカーが提供するものをそのまま利⽤している。PCR 阻害物質の影響で増幅がうまくいかない場合には、サンプルを希釈するとうまく増幅する場合もあるが、その場合には 1stPCR 時の PCR サイクル数を増やすことも検討すると良い。ただし、40 サイクル以下とすること（5-2-1-1.参照）。
2

アユ、ワカサギ、スナヤツメなど⿂種によって、プライマー部分に変異があるために増幅効率が低下するものがある。これらの⿂種が⽣息する環境で⽤いる場合、配列を修正したプ
ライマーを少量混合すると検出可能である。
3

実験室共⽤でミリ Q ⽔を使っているとコンタミの原因となりやすい。ミリ Q ⽔を使う場

合は殺菌灯で実験のたびに除染するか、そうでない場合は分⼦⽣物学実験⽤の滅菌⽔を購⼊した⽅がよい。

62

1st PCR 産物の精製と濃縮に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ 微量⾼速冷却遠⼼機（MX-307，TOMY など）
・ ボルテックス・ミキサー（VORTEX-GENIE 2，エムエス機器など）
・ 8 連チューブ⽤卓上遠⼼機（マイクロ PCR スピナー MS-PCR，アズワンなど）
・ 1.5mL/2.0mL ⽤卓上遠⼼機（マイクロシックス MS-1，アズワンなど）
・ GeneRead Size Selection Kit（180514，キアゲン）１・ 2.0mL コレクションチューブ（19201，キアゲン︔キットの不⾜分を補うために別途購
⼊）・ 1.5mL チューブ（DNA 低吸着）・ 80%エタノール（適量）・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100，P-20，P-2（ピペットマン，ギルソン社など）・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）
１

DNA 精製試薬キット Agencourt AMPure XP や SPRIselect （両者共にベックマン・コールター社）等のビーズで精製しても良好な結果が得られている。この場合、それぞれの試
薬は PCR 産物と等量をもちいて、プロトコールはメーカーが提供するものをそのまま利⽤している。

精製・濃縮した 1st PCR 産物の定量に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ TapeStation 2200（アジレント・テクノロジー）1・ High Sensitivity D1000 Screen Tape（5067-5584，アジレント・テクノロジー）
・ High Sensitivity D1000 Reagents（5067-5585，アジレント・テクノロジー）
・ TapeStation ⽤ピペットチップ（5067-5153，アジレント・テクノロジー）
・ 卓上撹拌器（ボルテックス MS3 ベーシック，イカジャパン）
・ 8 連チューブ⽤卓上遠⼼機（マイクロ PCR スピナー MS-PCR，アズワンなど）
・ 1.5mL/2.0mL ⽤卓上遠⼼機（マイクロシックス MS-1，アズワンなど）
・ 電動マイクロピペット 0.5〜10μL（Xplorer plus, エッペンドルフ）・ マイクロピペット P-2（ピペットマン，ギルソンなど）
・ フィルターチップ 10μL
・ 8 連チューブ・ 8 連チューブラック
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）63

・ ミリ Q ⽔（超純⽔）１

同社が販売するの BioAnalyzer でも良好な結果が得られている。この場合、プロトコー

ルはメーカーが提供するものをそのまま利⽤している。

5-2-1-1．1st PCR
環境⽔中から抽出した DNA をテンプレートに PCR を⾏う場合、抽出 DNA に含まれる⿂類
由来の DNA 量は事前にわかっていない。したがって、本番実験を⾏う前に予備実験を⾏う
ことで、PCR のサイクル数など⾄適な実験条件を探索することが重要になる。なお、実験中は必ずゴム⼿袋を着⽤すること（これ以降作業中に⼿袋の汚染を感じた場合は速やかに交換する）。
1） 実験を始める前にサーマルサイクラーの電源を⼊れる。
2） プライマーの希釈︓市販の TE バッファーを⽤いて、プライマーの原液（100µM）を20 倍に希釈する。希釈済みプライマーを以下の⽐率で混合してプライマーミックスを作る。MiFish-E-F/R-v2 : MiFish-U-F/R : MiFish-U2-F/R=1:2:1（淡⽔⿂だけの場
合は MiFish-U-F/R のみでよい）
3） 試薬の組成︓全容量 12μL（DNA 量 2μL を含む）で PCR を⾏う場合に、チューブ 1本あたりのプレミックスの組成は以下のようになる。
（注意︓試薬は必要量の 1.1〜1.2倍程度の量を調合しないと、電動ピペットで分注する際に不⾜することがある）。
KAPA HiFi HS ReadyMix

6.0µL

プライマーミックス

2.8µL

ミリ Q ⽔

1.2µL4） PCR の繰り返し数︓PCR での取りこぼし (PCR dropouts）を最⼩限に抑えるために、同⼀のサンプル（環境 DNA）に対して 8 連チューブ 1 本をつかった繰り返し数 8 回の PCR を⾏う。なお、1st PCR を実施する際に⽣じるコンタミネーションをモニターするために、1st PCR に必ず 1 本以上のブランクを⼊れること（繰り返し数は 1 回で抽出 DNA の代わりにミリ Q ⽔をテンプレートとして⼊れる）。濾過ブランクと抽出ブ
ランクも同時に実験する場合でも、1st PCR の段階で必ず PCR ブランクは含める（図5-2-1-1-1）。
5） 上記試薬を必要量の 1.1 倍程度調合してプレミックスを作成し、これを電動ピペット
で 8 連チューブに 10μL ずつ分注する。
その後、個々のチューブに抽出済みの環境 DNA
を 2μL ずつ電動ピペットで分注する。PCR の繰り返し数が 8 回の場合、抽出 DNA を64

2µL × 8 ＝ 16μL 使うことになる。
6） サーマルサイクラーの設定は以下のようになる︓
最初に 95℃の DNA 変性を 3 分間を挿⼊
98℃の DNA 変性を 20 秒
65℃のアニーリングを 15 秒

35 サイクル

72℃の伸⻑反応を 15 秒
最後に 72℃の伸⻑反応を 5 分間を挿⼊
注意︓アニーリング温度は KAPA HiFi Ready Mix の特性（少なくとも 60℃以上）によりかなり⾼めに設定してある。これより⾼いとプライマー配列とのマッチングが低い⿂種が検出漏れとなり、逆にこれより低いと⾮特異的な産物（微⽣物の 16S rRNA 由来と推定される産物）が多くなる。両者のトレードオフを考えるとこのくらいのアニーリング温度が適正と思われるが、今後さらなる検討が必要である。
7） 1st PCR のサイクル数について︓冬期のような⿂の活性が低いときには 35 サイクル
だと⼗分な増幅が⾒られないことがあるため調整が必要となる。そのような時は、40回以下の範囲でサイクル数を増やすことで DNA の回収量を確保する。例えば房総半島沿岸では、冬期以外の暖かい時期では 35 サイクルで⼗分量の 1st PCR 産物（海⽔１L を濾過）が得られたが、⽔温が下がると同じ量の 1st PCR 産物を得るためには 38サイクルが必要となった。また、PCR 産物が確認できないからといってサイクル数を
40 回より多くすると、ブランクにも明瞭な PCR 産物ができてしまうなど誤検出の原因となる。このようにサイクル数によってデータの質が変わりうるので、慎重に検討する必要がある。

5-2-1-2．1st PCR 産物の精製と濃縮
本項ではスピンカラム（GeneRead Size Selection Kit︔以下「カラム」と記す︓図 5-2-12-1）を⽤いた精製・濃縮法について記す。環境 DNA メタバーコーディングでは、事前に濃度が不明な微量の DNA を分析可能な量まで増幅させるため、それ以降の実験を阻害する
プライマーダイマーやアダプターダイマーが残りやすい。これらを取り除くことが良質のライブラリーを作成するための必須条件となるため、以下のプロトコールでは同じ精製を 2回繰り返している。1 回の精製でも⼗分な場合もあるが、精製を２回繰り返すことにより、ゲル上で検出できないレベルまでダイマー類を除去することができる。
1） 8 繰り返しした 1st PCR 産物を 1 本の 1.5mL チューブにまとめる（図 5-2-1-2-2）。
８連チューブ 1 本あたりの反応系が 12.0μL なので、すべて合わせると 96.0μL になる。ブランクについては 1 繰り返しのため 12.0μL のまま。

65

2） 各 1.5mL チューブに 4 倍量の SB1 溶液（384µL︔ブランクの SB1 溶液量は 48µL）を⼊れ（図 5-2-1-2-3）、よく撹拌してから軽く遠⼼する。室温で 1 分間静置。
3） GeneRead Size Selection Kit に付属する専⽤のカラム（コレクションチューブ付き）
を必要分⽤意し、キャップに必要事項を記⼊する（図 5-2-1-2-4）。
4） コレクションチューブにセットされたカラムに SB1 を混合した PCR 産物を⼊れ（図5-2-1-2-5）、20,000g で 1 分間遠⼼する（図 5-2-1-2-6）。
5） 遠⼼後、コレクションチューブを外し、新しいコレクションチューブにカラムを載せ替える（図 5-2-1-2-7）。使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する（図 5-2-1-28）。
6） カラムに 700μL の 80%エタノールを添加し（図 5-2-1-2-9）20,000g で 1 分間遠⼼する（図 5-2-1-2-10）。終了後、カラムを新しいコレクションチューブに載せ替える。
使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。この操作（80%エタノールによる精製）を 2 回繰り返す。
7） GeneRead Size Selection Kit に付属する 1.5mL のチューブを⽤意し、キャップに必要事項を記⼊する。カラムをその 1.5mL チューブに載せ替える（図 5-2-1-2-11）。
8） キットに付属の TE バッファー90μL をカラムに注ぎ（図 5-2-1-2-12）、室温で 1 分
間静置する。
9） カラムを 1 分間静置した後、20,000g で 1 分間遠⼼する。
10）1.5mL のチューブに回収された産物 90μL に対して 2 回⽬の精製を⾏う。TE バッフ
ァーで溶出した抽出 DNA（90µL）の 4 倍量の SB1 溶液（360µL）を 1.5mL チュー
ブ⼊れ（図 5-2-1-2-13）、よく撹拌してから軽く遠⼼する。室温で 1 分間静置する。
11）カラムを新たなコレクションチューブに載せ、4 倍量の SB1 溶液を加えた 1 回⽬の精製済み産物をカラムに注ぐ（図 5-2-1-2-14）。20,000g で 1 分間遠⼼する。
12）遠⼼後、コレクションチューブを外し、新しいコレクションチューブにカラムを載せ替える。使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。
13）カラムに 700μL の 80%エタノールを加えて 20,000g で 1 分間遠⼼する。終了後、カラムを新しいコレクションチューブに載せ替える。使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。この操作（80%エタノールによる精製）を 2 回繰り返す。
14）DNA 低吸着の 1.5mL チューブ を⽤意し、必要事項をキャップに記⼊する。キャップを開けたままその上にカラムを装着する。

6615）キットに付属する EB バッファー17μL を、カラムのメンブレンの中⼼に注意深くピペットで注ぎ⼊れ（図 5-2-1-2-15）、室温で 1 分間静置。
16）1 分間静置したカラムを 20,000g で 1 分間遠⼼。終了後、カラムを取り外してチュー
ブのキャップをしっかりと閉じる（図 5-2-1-2-16）。カラムは廃棄する。この状態で－20℃で安定的に保存が可能（図 5-2-1-2-17）。

5-2-1-3. 精製・濃縮済み 1st PCR 産物の定量と希釈精製によってプライマーダイマー等が除かれているかを確認すると同時に PCR 産物の量を測定する。ここでは、アジレント社の TapeStation 2200 を⽤いたプロトコールを記す。ちなみに、TapeStation 以外にも同社の BioAnalyzer、あるいは他社の同等の機器でも同様の分析が可能である。
⽤いるキットは High Sensitivity D1000 ScreenTape System になる。
ScreenTape には予めゲルが充填されており、⼀度に最⼤ 16 本の 1st PCR 産物を定量できる。DNA ラダーを使⽤する場合は 15 本の産物が定量できる。
1） 30 分前に試薬を室温に戻しておく（図 5-2-1-3-1）。
2） TapeStation 2200 付属のコンピューターを起動する。起動完了後に TapeStation
2200 の本体の電源を⼊れる（図 5-2-1-3-2）。
3） TapeStation とコンピューターの接続が確認できたら、TapeStation 2200 コントローラーを起動し、ScreenTape と必要な数のチップをセットする（図 5-2-1-3-3）。
4） 8 連チューブを⽤意し、DNA ラダー（1 本）とサンプル数を合計した本数の HighSensitivity D1000 Sample Buffer 2μL を分注する（図 5-2-1-3-4）。
5） 分注した 2μL のバッファーに、ラダーもしくは精製濃縮済み 1st PCR 産物を 2µL ず
つ⼊れ（図 5-2-1-3-5, 6）キャップをする。軽く遠⼼後、ボルテックスを使⽤し2000rpm で 1 分間撹拌する（図 5-2-1-3-7）。攪拌後に再度軽く遠⼼し、溶液をチューブの底に集める。
6） 遠⼼後、溶液が⾶び散らないように注意深くキャップを開け、TapeStation 2200 のカセットにセットする（図 5-2-1-3-8）。
7） TapeStation 2200 コントローラーの指⽰に従って（図 5-2-1-3-9, 10）泳動を開始
すると、20 分ほどでターゲットのバンド（約 310bp）がフェログラムと共に表⽰される（図 5-2-1-3-11）。
8） ターゲットバンドの濃度を読み取り、ミリ Q ⽔で 0.1ng/µL に希釈する。ブランクに67

ついては、ポジティブサンプルの平均希釈率を便宜的に⽤いて希釈する。ただし、⾮特異的増幅が顕著である場合などは 2nd PCR 後に濃度を調整したほうが良い場合もある。その場合は 5-2-2-1 の 18)のステップでサンプルを 1 つのチューブにまとめずに、精製と DNA 濃度の測定を⾏う必要がある。
注意︓精製・濃縮済み 1st PCR 産物の希釈にあたっては、PCR 準備室で個々のサンプルの希釈に必要なミリ Q ⽔を予め 1.5mL チューブに分注しておき、それを PCR 室に持ち込むとよい。精製・濃縮した１st PCR 産物を PCR 準備室に持ち込むと、クロスコンタミの⼤きな原因となるので注意すること。また、希釈に必要なミリ Q ⽔の量を計算する際には、精製濃縮済み 1st PCR 産物の全量ではなくその⼀部（例えば 10.0µL）に対して⾏うと希釈の精度が上がる。こうすることで、2nd PCR 産物の量（リード数）がほぼ⼀定になる。また、所定の濃度に達しないときは、0.05ng/µL に希釈して 2nd PCR のサイクル数を増やすなど⼯夫する。
9） 希釈後の 1st PCR 産物と、残った希釈前の 1st PCR 産物は－20℃で保存する。

68

5-2-2．ライブラリーの調整ー２︓２nd PCR
実験を始める前に
本項では、定量済みの 1st PCR 産物をテンプレートに⽤いて 2nd PCR を⾏う⽅法について記す。2nd PCR は、シークエンスプライマーが付加したテンプレート（定量済み 1st PCR産物）に、インデクス配列とフローセル結合配列を付加することが主な⽬的となる。テンプ
レートを増幅することが⽬的ではないので、サイクル数は通常 10 回にとどめているが、1st
PCR 産物が⼗分量得られなかった場合（0.1ng/µL 未満にしか調整できない場合）は、濃度に応じて 2nd PCR のサイクル数を増やすなどの⼯夫が必要になる。また、ラン間のキャリーオーバー（MiSeq 内部の流路に残存する前回ランのライブラリー）の影響を最⼩限にするために、1 回使ったインデクス配列の組み合わせはその後の数回（2〜3 回）のランでは使うべきではない。

2nd PCR に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ サーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9700，Applied Biosystems など）
・ 殺菌灯式電気消毒器（NB-5，⽇鈑⼯業株式会社など）
・ 定量済み 1st PCR 産物（0.1ng/µL)・ KAPA HiFi HS ReadyMix（KK2602，KAPA Biosystems 社）
・ インデクス付きプライマー原液（TE バッファーで 100μM に希釈されたものを注⽂すると便利︔インデクス配列については本項末尾に関連情報を記す）
フォワードプライマーの⼀例（⻘の部分が 8 塩基からなるインデクス配列）
2nd PCR F D501 (5´–3´; 70 mer)
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
リバースプライマーの⼀例（⾚の部分が８塩基からなるインデクス配列）
2nd PCR R D701 (5´–3´; 66 mer)
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGAT
CT・ ミリ Q ⽔（または分⼦⽣物学実験⽤のハイグレードな滅菌⽔）・ TE バッファー（分⼦⽣物学実験⽤のハイグレードなもの）
・ 8 連チューブ・ 1.5mL チューブ（DNA 低吸着）・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100，P-20，P-2（ピペットマン，ギルソン社など）

69

・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ 電動マイクロピペット 0.5〜10μL，5〜100μL（Xplorer Plus, エッペンドルフ社）
・ 1.5mL/2.0mL チューブ⽤チューブラック
・ 8 連チューブ⽤チューブラック
・ 実験⽤ゴム⼿袋（パウダーフリー）

2nd PCR 産物の切り出しに必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ E-Gel iBase Power System（G6400, Invitrogen）
・ E-Gel Safe Imager E-Gel Real-Time Transilluminator（G6500, Invitrogen）
・ E-gel SizeSelect II 2%（G661012, Invitrogen）
・ 分⼦サイズマーカー︓50bp DNA Ladder（10416014, Invitrogen）
・ 2nd PCR 産物（1 本あるいはライブラリーごとに複数本のチューブにまとめたもの）
・ ミリ Q ⽔・ 1.5mL チューブ （DNA 低吸着）・ マイクロピペット P-100（ピペットマン，ギルソン社など）
・ フィルターチップ 100μL
・ 1.5mL/2.0mL チューブ⽤チューブラック
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）

切り出した 2nd PCR 産物の定量に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ Qubit 2.0 Fluorometer（Life Technologies）
・ Qubit dsDNA HS Assay（Q32851［100 サンプル⽤］，Life Technologies）（Q32854［500 サンプル⽤］，Life Technologies）
・ Qubit 測定⽤ 500μL 専⽤チューブ（Q32856, Life Technologies）
・ 500μL チューブ⽤チューブラック
・ 卓上⼩型遠⼼機（マイクロシックス MS-1，アズワン社など）
・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100，P-20，P-2（ピペットマン，ギルソン社など）・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）・ E-Gel で回収した 2nd PCR 産物
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）70

5-2-2-1．2nd PCR
実験中は必ずゴム⼿袋を着⽤する（これ以降作業中に⼿袋の汚染を感じた場合は速やかに交換する）。事前にピペットやチューブ類は殺菌灯式電気消毒器で 20 分程度照射して除染しておく（図 5-2-1-1-1）。なお、以下に記す⽅法は、使⽤する試薬の量を減らすと同時に、2nd PCR で得られる各ライブラリーのリード数ができるだけ均⼀になるように⼯夫したものである。
注意︓PCR の準備は必ず PCR 準備室（プレ PCR ルーム）で⾏うこと。また、希釈したとはいえテンプレートは PCR 産物を含む。したがって、テンプレートを PCR 準備室に持ち込ん
ではならない。テンプレートの分注は PCR 室（ポスト PCR ルーム）内のクリーンベンチ内（あるいはそれに相当するスペース）で⾏うこと。PCR 室でテンプレートを分注する際には、部屋のファンを停めて実験室内のチリが舞い上がらないように注意する。
1） 実験を始める前にサーマルサイクラーの電源を⼊れる。
2） プライマーの希釈︓市販の TE バッファーを⽤いて、プライマーの原液を 5μM に希釈する。
3） 試薬の組成︓全容量 15μL（DNA 量 1.86μL を含む）で PCR を⾏う場合に、チューブ
1 本当たりの組成は以下のようになる。
（注意︓試薬は必要量の 1.2 倍程度の量を調合しないと、電動ピペットで分注する際に不⾜することがある）。
KAPA HiFi HS ReadyMix

7.5µL

プライマー

各 0.88µL

ミリ Q ⽔3.88µL

定量済み 1st PCR 産物

1.86µL

注意︓2nd PCR では、フォワードプライマーとリバースプライマーに含まれるインデクス
配列の組み合わせをサンプルごとに変える。こうすることによって、シークエンス後に異なるサンプルの識別が可能になる。インデクス配列の組み合わせ⽅にはいろいろな⽅法があるが、ここでは 8 連チューブをチューブラックに並べたときの「⾏」と「列」でインデクス
配列を変える⽅法を採⽤する。8 連チューブの場合、⾏数は 8 に固定されている⼀⽅で、列数は使⽤する 8 連チューブの本数で調整できる。以下に、8 種のフォワードプライマー（インデクス配列は D501〜508）と 4 種のリバースプライマー（インデクス配列は A701〜
704）を⽤いることで、32 ライブラリー（＝サンプル）の並列シークエンスを可能にする
組み合わせを⽰す。また、冒頭に記したように、ラン間のキャリーオーバー（MiSeq 内部の流路に残存する前回ランのライブラリー）の影響を最⼩限にするために、1 回使ったインデ
クス配列の組み合わせはその後の数回（2〜3 回）のランに使うべきではない。

71

D501/A701

D501/A702

D501/A703

D501/A704

D502/A701

D502/A702

D502/A703

D502/A704

D503/A701

D503/A702

D503/A703

D503/A704

D504/A701

D504/A702

D504/A703

D504/A704

D505/A701

D505/A702

D505/A703

D505/A704

D506/A701

D506/A702

D506/A703

D506/A704

D507/A701

D507/A702

D507/A703

D507/A704

D508/A701

D508/A702

D508/A703

D508/A704

上記のような組み合わせの場合、⾏⽅向（横⽅向）には標記のフォワードプライマー（D501〜508）を含むチューブ 4 本分のプレミックスを 8 種類、列⽅向（縦⽅向）には標記のリ
バースプライマー（A701〜704）を含むチューブ 8 本分のプレミックスを 4 種類作成すればよい（図 5-2-2-1-2）。このように（プライマーのみを 1 本 1 本分注するのではなく）プ
ライマーを含むプレミックスを作成することで、PCR 反応の総量が⼩さくても（ここでは15µL）正確な反応溶液の調整が可能になる。
4） 全体に必要なプレミックス（KAPA＋ミリ Q ⽔のみのプレミックス）を必要量の 1.2倍作成する。上記の 32 ライブラリーの場合であれば、KAPA 7.5µL x 32 x 1.2 =288µL にミリ Q ⽔ 3.88µL x 32 x 1.2 = 149µL を加える（総量 437µL）。
5） フォワードプライマー8 種＋リバースプライマー4 種に⽤いる計 12 本の 1.5mL チューブを⽤意してキャップに必要事項を記⼊する。
6） 上記のフォワードプライマー8 種のチューブに必要なプレミックス（7.5µL + 3.88µL)
x 4 x 1.12 / 2 = 25.5µL を 8 本のチューブに分注する（1.12 倍量）。
7） 上記のリバースプライマー4 種のチューブに必要なプレミックス（7.5µL + 3.88µL)x 8 x 1.12 / 2 = 51µL を 4 本のチューブに分注する（1.12 倍量）。
8） 6）の各チューブに必要な 8 種のフォワードプライマーを 0.88µL x 4 x 1.12 =3.94µL ずつ分注する。
9） 7）の各チューブに必要な 4 種のリバースプライマーを 0.88µL x 8 x 1.12 = 7.88µLずつ分注する。
10）各フォワードプライマーを含むプレミックスを横⽅向に 6.57µL ずつ分注する。
11）各リバースプライマーを含むプレミックスを縦⽅向に 6.57µL ずつ分注する。
12）分注が終了した 8 連チューブのキャップを軽く閉じ、卓上⼩型遠⼼機で遠⼼して溶液をチューブの底に振り落とす。

7213）8 連チューブをチューブラックごと PCR 室のクリーンベンチ（あるいはそれに相当する空間）に持って⾏く。
14）8 連チューブのキャップをプレミックスが⾶散しないように注意深く開け、希釈済み
1st PCR 産物を所定のチューブに 1.86µL ずつ⼊れる。
15）8 連チューブのキャップをしっかりと閉じ、卓上⼩型遠⼼機で溶液をチューブの底に落とす。
16）2nd PCR では、アニーリングと伸⻑反応を合わせたシャトル PCR を⾏う。サーマル
サイクラーを以下のように設定する。
最初に 95℃の DNA 変性を 3 分間を挿⼊
98℃の DNA 変性を 20 秒
72℃のアニーリング+伸⻑反応を 15 秒

10 サイクル

最後に 72℃の伸⻑反応を 5 分間を挿⼊
17）8 連チューブをサーマルサイクラーにセットし 2nd PCR を開始する。
18）2nd PCR が終了すると、サンプルごとに固有のインデクスが付加されているので 1 本のチューブにまとめることができる。まとめて分析したいサンプル（たとえば 1 回の調査でとられた 10 サンプル）ごとに 1 本のチューブにまとめる（図 5-2-2-1-2）。１
st PCR 後に希釈を⾏っている場合、特に濃度調整などは不要である。

5-2-2-2．2nd PCR 産物の切り出し
2nd PCR 産物には、MiSeq を⽤いた超並列シークエンスに必要なフローセル結合配列（計53bp）とインデクス配列（計 16bp）が 1st PCR 産物（約 300bp）の両端に付加されている。1st PCR 産物には、ターゲットとなる⿂類由来の産物に加えて 70bp ほど⼤きな⾮特異的産物（微⽣物の 16S rRNA 由来の産物と推定されている）が含まれることが多い。本項では、⿂類由来の 2nd PCR 産物（約 370bp）のみを E-Gel を⽤いたゲル泳動で切り出す⽅法（実際にはピペットで吸い出す⽅法）を記す。
1） 分⼦サイズマーカー（50bp DNA Ladder）原液 80µL にミリ Q ⽔ 920µL を加えて希釈する。
2） E-Gel iBase Power System（以下 iBase）を E-Gel Safe Imager E-Gel Real-TimeTransilluminator（以下 Safe Imager）の上にのせ、両者を付属のケーブルで接続してスイッチを ON にする。

733） E-gel SizeSelect II 2%（プラスチックケースに封⼊されたゲルで以下「ゲル」と呼ぶ）が⼊ったパッケージを開封し、ゲルのウェルに挿⼊されたコーム 2 個を注意深く取り外す（図 5-2-2-2-1）。
4） ゲルの右側から iBase に挿⼊する（図 5-2-2-2-2）。
ゲルが正しく差し込まれると iBaseのライトが点灯する。
5） 2nd PCR 産物と付属の Loading Buffer を混合し、上段の各ウェルに 20〜25µL ロー
ディングする。DNA マーカーをサンプルと別のウェルに 20〜25µL ローディングする。未使⽤のウェルにはミリ Q ⽔を同じ分量ローディングする（図 5-2-2-2-3）。
6） 中段のウェル（回収⽤のウェル）の全てにミリ Q ⽔を満たす。回収ウェルにミリ Q ⽔を⼊れ忘れると、泳動が正常に進⾏しないので注意すること。
7） iBase に観察⽤プレートユニット（オレンジ⾊のフィルター付きユニット）をセットし（図 5-2-2-2-4）、モードボタンを何回か押して Run SizeSelect ２％（No. 9）モ
ードにセットする。泳動時間はとりあえず 15 分にセットする。
8） 慣れないうちは、LED 照射ボタンを泳動中に押して産物の状態をチェックするとよい。
本マニュアルで指定した分⼦サイズマーカーは 350bp が他のサイズより明るく光る
ので、約 370bp のターゲットバンドの良い⽬安となる。
9） 15 分が経過するとチャイムが鳴って泳動が⼀時停⽌する。LED 照射ボタンを押してターゲットバンドの位置を確認する。回収ウェルの直上に切り込まれたサイズマーカ
ー（基準線）に達していなければ、さらに泳動を数分間追加する。
10）基準線にターゲットバンドが達したら泳動を⼀時停⽌する。
11）回収ウェルのミリ Q ⽔が泳動中に減少するので、減少した分を補充する。
12）泳動を再開する。回収ウェルにバンド全体が⼊ったところで泳動を停⽌する。
13）ピペットを⽤いて回収ウェルからターゲットバンドを吸い出し、ライブラリーごとに1.5mL チューブにまとめる（図 5-2-2-2-5）。回収する際に、ウェルの底にピペット
先端で⽳を開けないように注意する。
注意︓多くの場合、⼀回の回収で⼗分量の 2nd PCR 産物を吸い出せるが、定量後に 4nMに調整するには濃度が不⾜することがある。そのような場合は、回収ウェルにミリ Q ⽔を満たして泳動を再開し、⼀旦バンドを回収ウェルの下流側に出し、泳動モードを Reverse
E-Gel にして回収ウェルに戻して再び吸い出すという操作を繰り返すことも可能。この場合、カラムをつかって産物を濃縮すると⼗分な濃度の 2nd PCR 産物が得られる。

74

5-2-2-3. 切り出した 2nd PCR 産物の定量
本項では、E-Gel を⽤いて切り出したライブラリーの濃度測定法について記す。
1） Qubit dsDNA HS Assay キットを冷蔵庫から取り出し 30 分以上かけて室温に戻す（図 5-2-2-3-1）。
2） Qubit の濃度測定に必要なチューブの本数は校正⽤スタンダード#1 と＃2 にライブラ
リーの数を加えたものになる。
3） キットが室温に戻ったら、 Qubit Reagent を１µL に Qubit Buffer を 199µL 加えた
計 200µL のプレミックスを必要本数分調整する（図 5-2-2-3-2, 3）。濃度を測定するライブラリーが 1 本の場合、校正⽤スタンダード 2 本を含めて計 3 本が必要になるので、Qubit Reagent を 3µL に Qubit Buffer を 597µL 加えたプレミックスを調整する。
4） Qubit 測定⽤ 500µL 専⽤チューブを 2 本取り出し、校正⽤スタンダード#1 と#2 ⽤にプレミックスを 190μL ずつ分注する。その後、キットに付属するスタンダード#1と#2 をそれぞれのチューブに 10μL ずつ⼊れ（図 5-2-2-3-4）、チューブのキャップを閉めてボルテックスで 2〜3 秒撹拌し軽く遠⼼する。
5） 濃度を測定するライブラリーの数だけ 500µL チューブを⽤意し、それぞれにプレミッ
クスを 198μL ずつ分注する。その後、ライブラリーを 2μL ⼊れ（図 5-2-2-3-5）、チ
ューブのキャップを閉めてボルテックスで 2〜3 秒撹拌し軽く遠⼼する。2 分間室温で静置する（図 5-2-2-3-6）。
注意︓最低でも 2 分間室温で静置しないと測定値が安定しない。
6） Qubit 2.0 Fluorometer の画⾯をタッチして起動する。画⾯から DNA を選択し、次いで dsDNA High Sensitivity を選択する。校正⽤スタンダードを⽤いた校正をするかどうか聞いてくるので、4）で⽤意したスタンダード#1 と#2 を Qubit の指⽰に従って順番に測定する（図 5-2-2-3-8, 9）。
7） 次にライブラリーの濃度測定を⾏う。チューブをセットし、Caluculate Stock Concをタッチし、使⽤するサンプルの量を 2μL に設定して濃度を測定する。同じサンプルの濃度測定を、計測値が安定するまで複数回⾏うとよい。
8） Qubit ではテンプレートを 100 倍希釈した計測値（ng/mL）が表⽰される（図 5-22-3-10）。この値が 10.0ng/mL 未満の場合には、複数ウェルから同⼀ライブラリー

75

を回収し、それをカラムで濃縮するなど⼯夫が必要になる。

5-2-2-4．インデクス関連情報
以下に⽰す表は、メタバーコーディングで広く使われているイルミナ社のインデクス配列（８塩基）である（A501〜508/A701〜712/D501〜508/D701〜712）。カスタムプライ
マーを注⽂する際には、i5 の配列をフォワードプライマーに、i7 の配列をリバースプライ
マーに、それぞれそのまま挿⼊する。以下の表では 8 塩基の配列が記載されている。MiSeqのランで⽤いるサンプルシートに記⼊する際には、i7 の配列は逆相補鎖に変換して記⼊しないとならないので、以下の表でも逆相補鎖に変換して記載している。iSeq100 など、機種によっては記⼊の仕⽅が異なるので注意が必要である。なお、これ以外のインデクスを使⽤したい場合は、 Hamady et al. (2008) にリストアップされているインデックス配列か
ら適当なものをピックアップすれば良い。⼿持ちのインデクス配列を増やすと、同時に分析できるライブラリーの数が増えると共に、ランごとにインデクスを変えることにより、ラン間のクロスコンタミ（MiSeq 内部の流路に残存する前回ランのライブラリーに由来するコンタミ）を避けることもできる。また、異なる研究室間で相乗りシークエンスを⾏えるようになるため、研究経費の節約にもつながる。
Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., and Knight, R. (2008) Errorcorrecting barcoded primers forpyrosequencing hundreds of samples in multiplex.
Nature Methods 5: 235–237.
イルミナ社公認のインデクス配列に関する最新の情報については、以下のサイトからを⼊⼿することができる（2018 年 6 ⽉現在）。
https://support.illumina.com/content/dam/illuminasupport/documents/documentation/chemistry_documentation/experimentdesign/illumina-adapter-sequences-1000000002694-06.pdf
Name

i5 basesName

i7 basesName

i5 basesName

i7 bases

A501

TGAACCTT

A701

ATCACGACD501

TATAGCCTD701

ATTACTCG

A502

TGCTAAGT

A702

ACAGTGGTD502

ATAGAGGC

D702

TCCGGAGA

A503

TGTTCTCT

A703

CAGATCCA

D503

CCTATCCT

D703

CGCTCATTA504

TAAGACACA704

ACAAACGG

D504

GGCTCTGA

D704

GAGATTCC

A505

CTAATCGA

A705

ACCCAGCA

D505

AGGCGAAG

D705

ATTCAGAA

A506

CTAGAACA

A706

AACCCCTC

D506

TAATCTTA

D706

GAATTCGT

A507

TAAGTTCC

A707

CCCAACCT

D507

CAGGACGT

D707

CTGAAGCT

A508

TAGACCTA

A708

CACCACAC

D508

GTACTGAC

D708

TAATGCGC

A709

GAAACCCA

D709

CGGCTATG

A710

TGTGACCA

D710

TCCGCGAA

A711

AGGGTCAA

D711

TCTCGCGC

A712

AGGAGTGG

D712

AGCGATAG

76

5-2-3．MiSeq を⽤いた超並列シークエンス
シークエンスを始める前に
本項では、イルミナ社の MiSeq を⽤いた超並列シークエンス法について記す。本⼿法によるシークエンスを成功に導く最も重要な点は、アダプターダイマーや⾮特異的産物を含まない、MiFish アンプリコンのみからなる良質のライブラリーを調整することである。このような良質のライブラリーを得ると同時に、ライブラリーごとにほぼ均等なリード数を得るため、本プロトコールでは 1st PCR 産物に対して精製・定量を⾏い、1st PCR 産物を⼀定濃度（0.1ng/µL）に調整したテンプレートを⽤いて 2nd PCR を⾏うプロトコールを採⽤した。また、ランを失敗しないためにも MiSeq のメンテナンスが⾮常に重要になるので、最初にメンテナンスに関連する情報を列記した。なお、MiSeq の他にイルミナ社の iSeq100
でもほぼ同様の解析が可能であることが確認されている。

MiSeq のメンテナンスに必要な試薬・消耗品（例）・ Tween 20 (P7949、Sigma-Aldrich)・ ミリ Q ⽔・ 50mL ⾃⽴式遠沈管・ 500mL 洗浄瓶
・ 0.01%次亜塩素酸溶液
・ 次亜塩素酸溶液⽤専⽤チューブ（MiSeq Disposable Wash Tubes: PN: MS-102-9999）
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）

シークエンスに必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ MiSeq（イルミナ社）
・ MiSeq Reagent Kit v2（300 サイクル）（MS-102-2002，イルミナ社）
︓総リード数1500 万本が必要な場合は本品を⽤いる。それより少なくてよい場合は MiSeq Reagent
Micro Kit v2（MS-103-1002︔総リード数約 400 万本）か MiSeq Reagent Nano Kit
v2（MS-103-1001︔総リード数約 100 万本）を⽤いる。
・ 濃度測定済みのライブラリー・ 0.2N NaOH（2N などの濃度の⾼いストックから実験のたびに調整する）
・ PhiX Control v3（FC-110-3001，イルミナ社）
・ 99.5% 分⼦⽣物学⽤グレードエタノール（和光純薬⼯業）

77

・ ミリ Q ⽔・ 脱イオン⽔・ 1.5mL チューブ （DNA 低吸着）・ ボルテックス・ミキサー（VORTEX-GENIE 2 Mixer，エムエス機器株式会社）と 3 イン
チプラットホーム・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100，P-20，P-2（ピペットマン，ギルソン社など）・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ チップ 1000μL
・ レンズクリーニングティシュ（2105-841，ワットマン）
・ 卓上⼩型遠⼼機（マイクロシックス MS-1，アズワン社など）
・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100，P-20，P-2（ピペットマン，ギルソン社など）・ 試薬キット解凍⽤バット（W373×D273×H63 程度の⼤きさ）（PB-2,アズワンなど）
・ ゴム⼿袋（パウダーフリー）
MiSeq Reagent Kit には、冷凍保存品として 1）HT1 チューブと 2）試薬カートリッジ（図5-2-3-A）が、冷蔵保存品として 3）PR2 ボトルと 4）フローセル（図 5-2-3-B）の４点が含まれる。ごくまれに、業者の勘違いですべてが冷凍状態で納品されることがあるが、PR2ボトルとフローセルは凍結すると劣化するので、そのようなキットの使⽤は避けるべきである。

5-2-3-1．MiSeq のメンテナンス
MiSeq 内部には、シークエンス反応が⾏われるフローセルにライブラリーや試薬を送るチ
ューブが縦横に張り巡らされている。これらチューブの流路を、前回ランの影響が残らない
ようにきれいに保つことがランを成功に導く⼤きな要因の⼀つになる。
MiSeq では次の 3 通りの洗浄を⾏う。1）メンテナンスウォッシュ︓2 回のウォッシュ液交
換を伴う 3 × 20 分のウォッシュで⽉に 1 回必ず⾏う（前回のランから 1 ヶ⽉以上経過す
ると、MiSeq 側から強制的にメンテナンスウォッシュを⾏うように要求される）
︔2）スタンバイウォッシュ︓ 1 回のウォッシュ液交換を伴う 2 × 50 分のウォッシュで、1 週間以
上 MiSeq をアイドリング状態にすると MiSeq 側からこのウォッシュを⾏うように要求される︔3）ポストランウォッシュ︓ウォッシュ液交換のない 1 × 20 分のウォッシュでラン
終了後に⾏う。なお、ポストランウォッシュには、イルミナが提供するアダプターを⽤いた
次亜塩素酸ウォッシュというプロトコールがあるので、通常はこちらを⽤いて前回ランの持ち越しライブラリーを流路から取り除くようにする。ラン終了後、ポストランウォッシュ78

を⾏いスイッチオフにした場合、以下のような流れで⼀連のウォッシュを⾏い、次のランに進むことになる。なお、前回ウォッシュを⾏なった⽇付はウォッシュのトップ画⾯に⽇付が表⽰されるので、それを参考にする。
① MiSeq 本体のスイッチオン（MiSeq コントロールソフトウェアが起動）↓② メンテナンスウォッシュ（前回のランから 1 ヶ⽉以上経過した場合）↓③ 次亜塩素酸を⽤いたポストランウォッシュ（前回ランのライブラリーを除去）↓④ MiSeq のラン開始↓⑤ 通常のポストランウォッシュ（次亜塩素酸を⽤いない）↓⑥ MiSeq 本体のスイッチオフ
すべてのウォッシュに共通する操作
1） 10% Tween 20 ウォッシュ液の作成︓Tween 20 原液（図 5-2-3-1-1）を希釈して10%の Tween 20 溶液（ストック可能）をつくり、さらにそれを希釈して実際に⽤いる 0.5% Tween 20 ウォッシュ液とする。なお、10%に調整済みの Tween 20 を購⼊して使ってもよい。ゴム⼿袋を着⽤し、50mL 遠沈管に 5mL の Tween 20 を注意
深く注ぐ（Tween 20 は⾮常に粘性が⾼いので⼊れ過ぎないように注意︔図 5-2-3-12）。この遠沈管にミリ Q ⽔を加えて 50ｍL にメスアップ。遠沈管をよく撹拌して溶液を混和する。1 回のウォッシュで 10%の Tween 20 溶液を 25mL 使⽤するので、これが 2 回分のウォッシュ液になる。
2） 0.5% Tween 20 ウォッシュ液の作成︓上記の 10%の Tween 20 溶液 25mL を 500mLの洗浄瓶に⼊れ（図 5-2-3-1-3）、洗浄びんの⽬盛りで 500mL に達するまでミリ Q ⽔を加える。10 回ほど転倒混和する。
3） ウォッシュ液の充填︓溶液の⼊った洗浄瓶を使ってウォッシュカートリッジにウォッシュ液を注⼊する（図 5-2-3-1-4）。ウォッシュカートリッジのポート（孔）の上から
1cm 程度までウォッシュ液を注ぐと約 6mL ⼊る。すべて注ぎ終えたら残りのウォッ
シュ液をウォッシュボトル（350mL 程度）に移し替える（図 5-2-3-1-5）。
4） ウォッシュの準備︓MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）のトップ画⾯（図 5-23-1-6）の左下にある Perform Wash ボタンを押と 3 通りのウォッシュが表⽰される（図 5-2-3-1-7）。実施したいウォッシュを選択する。使⽤済みフローセル（前回のランで使⽤したフローセル）がフローセルコンパートメントにセットされていることを確認する（図 5-2-3-1-8）。画⾯右下の Next を押すと、ウォッシュカートリッジとウ79ォッシュボトル、廃液ボトルの取り出し画⾯に変わる。
5） ウォッシカートリッジのセット︓しばらくすると、カートリッジやボトルが取り出される様⼦が画⾯に現れる（図 5-2-3-1-9）。MiSeq 本体の試薬コンパートメントのドアを開け、次に試薬チラーのドアを開ける。試薬チラー内に⼊っている前回ランのカー
トリッジ、もしくは前回ウォッシュに⽤いたウォッシュカートリッジを引き出し、⽤意したウォッシュカートリッジを奥まできっちり⼊れ（図 5-2-3-1-10）、試薬チラーのドアを閉める。
6） ウォッシュボトルと廃液ボトルのセット︓次に試薬コンパートメントのシッパーハン
ドルを引き上げる。⽤意したウォッシュボトルをセットし（図 5-2-3-1-11）、廃液ボ
トルを空にして所定の位置にセットしたら、シッパーハンドルを引き下げる（図 5-23-1-12）。
7） ウォッシュの開始︓ウォッシュカートリッジ、ウォッシュボトル、廃液ボトルのセットが完了したら、MiSeq の試薬コンパートメントの扉を閉じ、画⾯右下の Next を押
すとウォッシュが始まる（図 5-2-3-1-13）。
8） ポストランウォッシュの終了︓ウォッシュが終了すると右下に Done と表⽰されるので、それを押すと MiSeq コントロールソフトウェアのトップ画⾯に戻ってウォッシュの全⼯程が終了する。メンテナンスウォッシュとスタンバイウォッシュの場合は、以下に記すようにウォッシュ液の交換が必要となる。したがって、ウォッシュ中に先ほど使⽤した洗浄瓶を⽔道⽔でよく洗いミリ Q ですすいだ後、再度 0.5% Tween 20 ウ
ォッシュ液を⽤意する。
9） ウォッシュ液の交換︓メンテナンスウォッシュかスタンバイウォッシの場合、最初のウォッシュが終了するとウォッシュ液を交換するメッセージが表⽰される。MiSeq の試薬コンパートメントにあるウォッシュカートリッジとウォッシュボトルを取り出し、両者の中に残っている溶液を廃棄する。カートリッジのポートとボトル内部を⽔道⽔でよく洗った後にミリ Q ⽔でよくすすぐ。新たに作成した 0.5% Tween 20 ウォッシ
ュ液を前述と同様にポートとボトルに満たし、再度 MiSeq の試薬コンパートメントにセットする。廃液はそれほど溜まらないので、廃液ボトルはそのまま使⽤してもよい。
10）ウォッシュの終了︓メンテナンスウォッシュかスタンバイウォッシュの場合、全ての⼯程が終わると右下に Done と表⽰される（図 5-2-3-1-14）。Done を押すと MiSeq
コントロールソフトウェアのトップ画⾯に戻ってウォッシュの全⼯程が終了する。
次亜塩素酸を⽤いたウォッシュ
1） ウォッシュの準備︓ウォッシュカートリッジを⽤意し、17 番ポートに次亜塩素酸溶液80

⽤専⽤チューブ（図 5-2-3-1-15︔MS-102-9999 MiSeq Disposable Wash Tubes）
を⼊れ（図 5-2-3-1-16）、その中に 0.01%に調整した次亜塩素酸溶液を 1mL 注ぐ。
17 番ポート以外は通常のポストランウォッシュと同様に 0.5% Tween 20 ウォッシ
ュ液⼊れ、残りをウォッシュボトルに⼊れる。
2） 準備が終わったらトップ画⾯の左下にある Perform Wash ボタンを押す。3 通りのウ
ォッシュが表⽰されるので Post-Run wash を選択する。画⾯が切り替わると次亜塩
素酸溶液を使⽤・不使⽤のチェックボックスが中央やや下に現れるのでチェックを⼊れる。
3） 右下の Next を押す。これ以降は、前述のウォッシュの実施と同じ。ウォッシュが終了
すると右下に Done と表記されるので、それを押すと MiSeq コントロールソフトウェ
アのトップ画⾯に戻る。
ラン終了後のポストランウォッシュ
ランが終了すると、右下に Start Wash と表⽰されるので押す。以降は前述のウォッシュの実施と同じ。
MiSeq 本体の起動法
MiSeq 本体の右側の後ろにあるスイッチを⼊れる。本体付属の OS である Windows が起動し、起動が完了すると⾃動的に MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）が起動する設定になっている（図 5-2-3-1-17）。起動が完了するには 5 分程度必要になるので、ラン開始の時間を⾒計らって MiSeq 本体を起動すること。なお、ランの途中停⽌などのトラブルを避けるために、ランを開始するたびに MiSeq 本体を再起動することを勧める。

5-2-3-2．シークエンスの下準備
本項では、シークエンスを実際に開始する遅くとも 1 時間前までに終えるべき操作について記す。他の実験（とくに PCR）とは異なりこの段階でのコンタミの恐れは低いが、実験中は必ずゴム⼿袋を着⽤して事前にピペットやチューブ類は殺菌灯式電気消毒器で 20 分程度照射し除染しておく。
1） 冷凍品の解凍︓バットを⽤意し、冷凍保存してある試薬カートリッジと HT1 バッファーのチューブを⼊れ、カートリッジの側⾯にある最⼤⽔量線まで脱イオン⽔を静かに注ぐ（図 5-2-3-2-1）。そのまま約 1 時間脱イオン⽔に漬けたまま静置し、キット内部の試薬を⼗分に解凍する。

81

2） 0.2N NaOH 溶液の準備︓0.2N NaOH 溶液は、ライブラリーの DNA を⼀本鎖に変性させるために⽤いる。毎ランごとに 2N NaOH 溶液（ストック可）からミリ Q ⽔を⽤いて希釈し、新鮮な 0.2N NaOH 溶液を調整することが重要。使⽤する量は微量なので、1.5mL チューブに 1mL 調整すれば、希釈時の誤差も⼩さく⼗分量が得られる。
調整した 0.2N NaOH 溶液は使⽤するまで冷蔵庫に保存する。
3） サ ン プ ル シ ー ト の 作 成 ︓ MiSeq 本 体 に 搭 載 さ れ て い る ソ フ ト ウ ェ ア Illumina
Experiment Manager（以下 IEM）を起動し、画⾯の指⽰に従ってサンプルシートを作成する。サンプルシート作成に必要な試薬カートリッジの番号（例︓MS-XXXXXXX300V2.csv︔図 5-2-3-2-2）がカートリッジ側⾯に記してあるので記録しておく。なお、保存形式が CSV 形式になっていれば、サンプルシートはエクセル等のスプレッド
シートで編集可能。したがって、ベースとなるファイルを IEM で作成し、それを別途スプレッドシートで編集し直すのが効率的。作成したサンプルシートは、MiSeq 本体の Illumina/Illumina Control Software フォルダー内に保存する。

5-2-3-3．ライブラリー濃度の最終調整
本項では、シークエンス反応が⾏われるフローセル上において適正な密度でクラスターが形成され、同時にクラスター間の分離がよくなるような実験⼿法について記す。なお、以下の操作を⾏うことで得られることが期待されるリード数はキット記載の総リード数からス
パイクインした PhiX の割合を除いた数である。
1） 4nM への調整︓Qubit で定量した濃度に基づきライブラリーを 4nM に調整する。モル数の計算に⽤いるのはライブラリー⻑（平均 372bp）と 1 塩基あたりの分⼦量（660g/mol）になるが、複数の単位（micro/nano/pico）にまたがって濃度を計算しなくてはならないので、予めスプレッドシートにモル数換算式を⼊れておくと良い。
また、サンプル数が異なる複数のライブラリーを⼀度にシークエンスする場合は、サンプル数（ブランクを除いたもの）から混合⽐を算出し、それぞれの混合量を決定する。2nd PCR 産物をサイズセレクションしたライブラリは平均 372bp のライブラリー⻑となる。その溶液の重量濃度がa ng/µL の時、モル濃度はa*106/372*660 の計算式で求めることができる。
2） DNA の変性︓新しい 1.5mL チューブに、
4nM に調整したライブラリーを 5μL と 0.2N
NaOH を 5μL ⼊れてピペットで混合する。その後、数秒間ボルテックスし、軽く遠⼼して溶液をチューブの底に集め、室温で 5 分間静置してライブラリー中の DNA を変性する。この時点での濃度は 2nM。
5） 20pM への調整︓変性した DNA に HT1 バッファーを 990µL 加え、20pM に調整する

82

（100 倍希釈）。
6） 最終濃度（12pM）への調整︓MiFish アンプリコンの場合、最終濃度を 12pM に調整
すると 800〜1000K/mm2 のクラスター密度が得られ、メーカーのスペックにほぼ⼀致するリード数が得られる。最終濃度を 12pM にするには、ライブラリーを 360µL に
HT1 バッファーを 240µL 加えればよい。ライブラリーが低品質の場合（本来の⻑さである 370bp 付近よりも短い DNA が混ざっている場合）、最終濃度を 12pM に調整
するとオーバークラスターとなりランを失敗するので注意すること。
7） PhiX のスパイクイン︓フローセル上に形成されるクラスター同⼠のシグナル分離をよくするため、塩基バランスが良い PhiX をスパイクインとして 10-25％⼊れる。イルミナ社から販売されている PhiX control v3 は 10nM に調整済みのバクテリオファージに由来する既知配列に基づくライブラリーである。これをサンプル DNA と同様に0.2N NaOH で変性し、HT1 バッファーで 20pM に調整する。その後、上記の 600µLのライブラリーから 60µL を抜き取り、20pM に調整した PhiX を 36µL、HT1 バッフ
ァーを 24µL 加える。
以上の操作で、12pM に調整されたライブラリー600µL ができた。後は、調整済みライブ
ラリーを試薬カートリッジに注⼊し、ランを開始するにあたっての最終操作を⾏えばよい。

5-2-3-4．シークエンス開始前後の操作
本項では、シークエンス開始前後に必要な操作について記す。既にライブラリーは 12pM に調整されており、機器を正しく設定すればシークエンスできる段階になっている。
1） 試薬カートリッジ内の試薬が完全に解凍されたことを確認し、キムタオルでカートリ
ッジ外側についた⽔滴を⼗分に拭き取る。
試薬カートリッジを 10 回程度転倒撹拌し、
カートリッジ内の試薬を混和する。試薬内の気泡を取り除くため、キムタオルを敷いた実験台の上にカートリッジを何回か軽く叩きつける（図 5-2-3-4-1）。
2） 1000µL のピペットチップをつかってライブラリー注⼊ポート（オレンジ⾊が⽬印）のホイルに孔を開ける。
3） 1200µL または 1000µL のピペットチップをつかって 12pM に調整されたライブラリー600µL を試薬カートリッジの注⼊ポートに⼊れる（図 5-2-3-4-3）。気泡が⼊らないようにピペット操作には注意すること。
4） MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）を起動し SEQUENCE ボタンを押してランのセットアップに進む。

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5） MiSeq を イ ン タ ー ネ ッ ト に 接 続 し て い る と 、 SEQUENCE ボ タ ン を 押 し た 後 に
BaseSpace（イルミナ社が提供するクラウド環境）を使⽤するかどうかの確認ボタンが表⽰される（図 5-2-3-4-4）。BaseSpace の利⽤にあたっては、事前に Myillumina
へのユーザー登録が必要となる。
6） BaseSpace を使⽤する場合には、Use BaseSpace for storage and analysis のボックスにチェックを⼊れ、表⽰欄に Myillumina アカウント登録時に使⽤した情報を⼊⼒する。BaseSpace を使⽤しない場合はこのボックスを空欄にしておけばよい。選択が終わったら、Next ボタンを押すとフローセルのセッティング画⾯に切り替わる。
7） 冷蔵保存されていたフローセルをプラスチック製ピンセットを使って容器から取り出す。フローセルは容器内でバッファーに浸かった状態で保存されており、MiSeq にセットする前にそのバッファーを完全に洗い流す必要がある。この洗浄が⼗分でないと、残存したバッファーがシークエンス中にフローセル上に析出し、データが読み取れなくなる恐れがある。洗浄にあたってはゴム⼿袋を着⽤し、MiSeq にセットする前にフローセルのガラス部分とプラスチック部分をミリ Q ⽔でよくリンスする。とくに、フローセルのプラスチックケース内にバッファーが残りやすいので、その部分はよくリンスすると共にケース内の⽔分を（注意深く）軽く振り出す。この際、ガスケット（試薬やサンプルへの流路の⼊り⼝）部分に強く⽔流が当たらないように注意する。
8） レンズクリーニングティッシューに 99.5%エタノールを少量滴下し、フローセルのガラス部分についた⽔分を軽く拭き取る。ガラス部分に汚れや染みがないか⽬で確認し、きれいになるまでレンズクリーニングティシュで軽く磨く。フローセルのプラスチッ
ク部分にある 2 ⽳のガスケットポートには触れないように注意すること。
9） MiSeq のフローセルコンパートメントのドアを開け、更にフローセルラッチを開けて使⽤済みのフローセルを取り出す。この時、中のフローセルが⾶び出さないように、ラッチの上⾯に⼿を当てた状態でラッチを開ける銀⾊のボタンを押し、急なラッチの跳ね上がりを防ぐとよい。フローセルラッチの台座に埃や析出したバッファーがある
場合には、フローセルを磨いたレンズティッシューで拭き取る。
10）フローセルを台座の所定の位置に載せ、カチッと⾳がするまでラッチを静かに押し下げ固定する。
11）MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）の画⾯左下をチェックし、フローセルに記された ID（RFID）の読み取りがうまくいっていることを確認する。RFID が読まれていたら、フローセルコンパートメントのドアを閉め、Next ボタンを押す。
12）冷蔵保存の PR2 ボトル（シークエンスバッファー）を取り出し、軽く混和してからス

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クリューキャップを開ける。
13）MiSeq の試薬コンパートメントのドアを開け、シッパーハンドルを引き上げる。右側の部分に冷蔵保存の PR2 ボトルをセットし、廃液ボトルを空にする。セットが完了したらシッパーハンドルを必ず引き下げること。
注意︓シッパーハンドルを引き下げなくてもランが始まってしまうので注意すること。引き下げないとバッファーを吸い取ることができないので（おそらくは）ランが停⽌してしまう。
14）MCS の画⾯左下をチェックして、RP2 のボトルに記された ID（RFID）が読み込まれていることを確認する。
15）試薬チラーのドアを開け、ウォッシュカートリッジに挿⼊されているシッパーが完全に引き上げられるまで待つ。シッパーが上がる前にウォッシュカートリッジを引き出そうとすると、シッパーが折れてしまうので注意すること。
16）ライブラリーが充填された試薬カートリッジを試薬チラーに挿⼊する。最後まで押し込まないと試薬チラーのドアが閉まらないので注意すること。
17）試薬チラーのドアを閉める。MCS の画⾯左下をチェックして、試薬カートリッジに記された ID（RFID）の読み取りがうまくいっているかどうか確認する。
18）ここまで操作が順調に進むと、画⾯上に実験名と解析ワークフローが表⽰されるので確認する。画⾯左下でサンプルシートのフォルダーの階層を確認して Next を押す。
19）プレランチェックの画⾯に移⾏する。チェック項⽬が表⽰され、全ての項⽬にチェッ
クが⼊ると Start Run ボタンがアクティブになる。ランを開始してよければボタンを押す。
20）Start Run ボタンを押してからしばらくの間はシークエンスの初期トラブルが発⽣しやすい。試薬がフローセルに流れ込むまではランの再開が可能な場合があるので、5 分
間ほどは MiSeq ランの進⾏を機器の前で⾒守るとよい。

参考⽂献
Miya, M., Sato, Y., Fukunaga, T., Sado, T., Poulsen, J. Y., Sato, K., Minamoto, T.,
Yamamoto, S., Yamanaka, H., Araki, H., Kondoh, M., Iwasaki, W. 2015. MiFish, a
set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes:detection of more than 230 subtropical marine species. Royal Society OpenScience, 2 (7): 150088. doi: 10.1098/rsos.150088

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図 5-2-1-1
殺菌灯式電気消毒器で紫外線消毒中のマイクロピペット、フィルターチップ、チュー
ブ、チューブラックなど。実験を始める前に必ず消毒する習慣をつけると、実験室由来のコンタミのリスクが減る。

図 5-2-1-1-1
同⼀サンプルに対して８連チューブ 1 本をつかった 8 繰り返しの 1s tPCR をセットアップしたところ。右写真の場合、サンプ
ル数は 5 で濾過ブランク、抽出ブランク、
1st PCR ブランクの計 3 本を含む。

図 5-2-1-2-1
GeneRead Size Selection Kit と追加注⽂した 2.0mL コレクションチューブ。

図 5-2-1-2-2
8 繰り返しの 1st PCR 産物を 1 本の1.5mL チューブにまとめているところ。

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図 5-2-1-2-3
まとめた産物に対して 4 倍量の SB1 を加えてピペッティング。

図 5-2-1-2-4
スピンカラムを⽤意しキャップに必要事項を記⼊する。

図 5-2-1-2-5
混和した PCR 産物＋SB1 溶液をカラムに注ぐ。

図 5-2-1-2-6
20,000g で 1 分間遠⼼する。

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図 5-2-1-2-7
カラムを新しいコレクションチューブに載せ替える。

図 5-2-1-2-8
使⽤済みのコレクションチューブと廃液を廃棄する。

図 5-2-1-2-9
カラムに 700 µL の 80%エタノールを注ぐ。

図 5-2-1-2-10
20,000g で 1 分間遠⼼する。

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図 5-2-1-2-11
カラムを 1.5mL チューブに載せ替える。

図 5-2-1-2-12
カラムのメンブレン上に 90 µL の TE バッ
ファーを注いで 1 分間静置し、20,000g
で 1 分間遠⼼する。

図 5-2-1-2-13
回収した溶液（１回⽬の精製を⾏った PCR産物）に 4 倍量の SB1 を加えてピペッテ
ィング。

図 5-2-1-2-14
混和した溶液をカラムに注ぐ。

89

図 5-2-1-2-15
２回⽬の精製を終え、カラムのメンブレン
上に 17µL の EB バッファーを注いでいるところ。1 分間静置した後、20,000g で 1
分間遠⼼する。

図 5-2-1-2-16
1.5mL チューブ（DNA 低吸着）に精製された 1st PCR 産物を回収したところ。

図 5-2-1-2-17
ー20℃で冷凍保存する。

図 5-2-1-3-1
TapeStation 2200 ⽤のキット。High
Sensitivity D1000 Screen Tape（左）と
試薬（右）
。

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図 5-2-1-3-2
TapeStation 2200 付属のコンピューターを起動する。

図 5-2-1-3-3
ScreenTape と必要な数のピペットチップをセットする。

図 5-2-1-3-4
Buffer 2μL を電動マイクロピペットを使⽤して分注する。

図 5-2-1-3-5
ラダーを 1 本⽬のチューブに 2µL 注ぐ。

91

図 5-2-1-3-6
精製濃縮済み 1st PCR 産物を 2µL 注ぐ。

図 5-2-1-3-7
2000rpm で 1 分間撹拌した後、卓上⼩型
遠⼼機で液をチューブの底に集める。

図 5-2-1-3-8
8 連チューブのキャップを中の液が⾶び散らないように静かに開け、TapeStation
2200 のカセットにセットする。

図 5-2-1-3-9
全てがセットされた状態の TapeStation
2200。

92

図 5-2-1-3-10
左側の 8 連チューブのイメージ像で、ラダーと測定する PCR 産物とチューブ上での並びを画⾯上で指定する。

図 5-2-1-3-11
ターゲットのバンド（約 310bp）がフェログラムと共に表⽰される。

図 5-2-2-1-1
サンプル数が 40 の場合。

図 5-2-2-1-2反応溶液を全量 1 本のチューブにまとめる。

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図 5-2-2-2-1
コームを注意深く取り外す。

図 5-2-2-2-2
ゲルの右側から iBase に挿⼊する。

図 5-2-2-2-3産物をローディングする。

図 5-2-2-2-4
iBase に観察⽤プレートユニット（オレンジ⾊のフィルター付きユニット）をセットする。

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図 5-2-2-2-5
基準線に到達したターゲット産物（約370bp）。左から⼆番⽬がラダー（サイズ
マーカー）で、基準線に達している明るい
ラダーが 350bp になる。そのやや上にターゲット産物（370bp）があり、さらにその上にスメアと共に⾒られるバンドは⾮特異的産物なので、回収ウェルに⼊れないよ
うに注意する。
図 5-2-2-2-5泳動した産物を回収する。

図 5-2-2-3-1
Qubit dsDNA HS Assay キットを冷蔵庫から取り出し 30 分以上かけて室温に戻す。

図 5-2-2-3-2
新しいチューブに Qubit Buffer を⼊れる。

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図 5-2-2-3-3
Qubit Reagent を⼊れる。

図 5-2-2-3-4
スタンダード#1 と#2 をそれぞれのチューブに 10μL ずつ⼊れる。

図 5-2-2-3-5
チューブにライブラリーを 2μL ⼊れる。

図 5-2-2-3-6
2 分間室温で静置する。この操作を怠ると計測値が安定しない。

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図 5-2-2-3-7
Qubit 2.0 Fluorometer の画⾯をタッチして起動する。

図 5-2-2-3-8
スタンダード#1 と#2 を Qubit の指⽰に従って順番に測定する。

図 5-2-2-3-9
サンプルの濃度を計測しているところ。

図 5-2-2-3-10
テンプレートを 100 倍希釈した計測値（ng/mL）が表⽰される

97

図 5-2-3-A
冷凍保存品の HT1 チューブ（⼿前右）と試薬カートリッジ（⼿前左）。このボック
スが冷蔵で解凍状態で送付されたら、納⼊業者にクレームをつけてリプレース品を送ってもらうこと。

図 5-2-3-B
冷蔵保存品の PR2 ボトル（中央）とフローセル（右）。これらが凍結されて送付されたら、納⼊業者にクレームをつけてリプ
レース品を送ってもらうこと。

図 5-2-3-1-1
Tween 20 原液。

図 5-2-3-1-2
50mL 遠沈管に 5mL の Tween 20 を注意
深く注ぐ。Tween 原液は粘性が⾼いので取り扱いに注意すること。

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図 5-2-3-1-3
10%の Tween 20 溶液 25mL を 500mLの洗浄瓶に⼊れる。

図 5-2-3-1-4
洗浄瓶を使ってウォッシュカートリッジにウォッシュ液を注⼊する。

図 5-2-3-1-5
すべて注ぎ終えたら残りのウォッシュ液をウォッシュボトル（350mL 程度）に移し替える。

図 5-2-3-1-6
MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）のトップ画⾯。

99

図 5-2-3-1-7
Perform Wash ボタンを押と 3 通りのウ
ォッシュが表⽰される。

図 5-2-3-1-8
使⽤済みフローセルがフローセルコンパー
トメントにセットされていることを確認する。

図 5-2-3-1-9
試薬カートリッジやボトルが取り出される様⼦が画⾯に現れる。

図 5-2-3-1-10
⽤意したウォッシュカートリッジを試薬チラーに⼊れる。

100

図 5-2-3-1-11
⽤意したウォッシュボトルをセットする。

図 5-2-3-1-12
セットが完了したらシッパーハンドルを引き下げる。ハンドルを引き下げるのを忘れてもランが始まってしまうので注意すること。

図 5-2-3-1-13
画⾯右下の Next を押すとウォッシュが始まる。

図 5-2-3-1-14
全ての⼯程が終わると右下に Done と表⽰
される。

101

図 5-2-3-1-15
次亜塩素酸溶液⽤専⽤チューブ（イルミナ社のサポートに連絡すると無料で送付してくれる）。

図 5-2-3-1-16
17 番ポートに次亜塩素酸溶液が⼊った専
⽤チューブを⼊れる。

図 5-2-3-1-17
MiSeq コントロールソフトウェアが起動してシークエンスの準備が始まる。

図 5-2-3-2-1
HT1 バッファーのチューブを⼊れ、カートリッジの側⾯にある最⼤⽔量線まで脱イ
オン⽔を静かに注ぐ。１時間放置して完全に試薬を解凍する。

102

図 5-2-3-2-2試薬カートリッジの番号はバーコードの真下に書かれている。⼩さく読みにくいので転記する際に間違えないように注意すること。

図 5-2-3-4-1
キムタオルを敷いた実験台の上にカートリ
ッジを何回か軽く叩きつけて試薬類をチューブの底に落とす。

図 5-2-3-4-21000µL のピペットチップをつかって注⼊
ポートに⼤きな孔をまず開ける（オレンジ⾊の 17 番ポート）。その後、シッパー挿⼊時にチューブが折れないように各ポートの中⼼に⼩さな孔を開けておく（中の試薬にピペットの先が触れないように注意すること）。
図 5-2-3-4-3
試薬カートリッジの注⼊ポート（オレンジ⾊）に 1200µL のピペットチップをつかって調整済みライブラリー600µL を⼊れる。

103図 5-2-3-4-4
SEQUENCE ボタンを押すと BaseSpaceの確認ボタンが表⽰される。

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引⽤について本マニュアルを引⽤する場合は以下のような引⽤⽅法を推奨します。

マニュアル全体
環境 DNA 学会 (2020) 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 2.2.
第２章
清野聡⼦, 源利⽂ (2020) 調査地点の選定. 環境 DNA 学会 環境 DNA 技術標準化委員会（編）環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 2.2. 6–11 ⾴.
第3章
宮正樹, 佐⼟哲也 (2020) 採⽔とカートリッジ式フィルターを⽤いた現場濾過. 環境 DNA 学
会 環境 DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 2.2. 13-25 ⾴.
源利⽂ (2020) 採⽔とグラスファイバーフィルターを⽤いた実験室での濾過. 環境 DNA 学会
環境 DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 2.2. 26-32 ⾴.
第4章
宮正樹, 佐⼟哲也 (2020) カートリッジ式フィルターからの DNA 抽出. 環境 DNA 学会 環境
DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 2.2. 34-46 ⾴.
源利⽂ (2020) グラスファイバーフィルターからの DNA 抽出. 環境 DNA 学会 環境 DNA 技術
標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 2.2. 47-56 ⾴.
第5章
源利⽂ (2020) リアルタイム PCR による環境 DNA の種特異的検出・定量. 環境 DNA 学会 環
境 DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 2.2. 57-60 ⾴.
宮正樹, 佐⼟哲也 (2020) MiFish メタバーコーディング. 環境 DNA 学会 環境 DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 2.2. 61-104 ⾴.

環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver. 2.2（2020 年 4 ⽉ 3 ⽇発⾏）
© 2020 ⼀般社団法⼈環境 DNA 学会© 2020 The eDNA Society105