3−報文−

遺伝子診断システムの開発
林栗増斉堀保石原井藤江川黒俊芳健寿隆
敬典
文治一一清彦Development of Automated System of Nucleic Acid Based Infectious
Disease Testing : Extraction of Nucleic Acids and Fluorescence Realtime Monitoring of Isothermal Nucleic Acid Amplification.
Toshinori HAYASHI
Yoshihumi KURIHARA
Kenji MASUI
Juichi SAITOH
Ryuichi HORIE
Kiyoshi YASUKAWA
Takahiko ISHIGURO

We developed a novel automated system of NAT (nucleic acid amplification technology) based infectious
disease testing.
extraction kit

The system consists of the automated nucleic acid extractor using the manual DNA／RNAEXTRAGEN

as the reagent and the fluorescence real-time monitor of the TRC (transcription-reverse transcription concerted) amplification in the presence of the INAF (intercalation-activating fluorescence)
DNA probe.

The present system was applied to the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) and demonstrated that the nucleic acids were extracted from as much as 32 specimens within 30
minutes, and 10 copies of the target RNA, mRNA of mecA gene, was detected and quantified in 10 minutes.

1．緒とにより、さらに加速されつつあると言えよう。

言

一般に、検体中のわずかな核酸を増幅する遺伝子検

ヒトの全ゲノム配列情報 の全貌が明らかにされつ

査は、「核酸抽出」、「増幅反応」、「検出」の各工程かつある現在、遺伝子検査は従来の感染症における初期ら構成される。既に、これらの工程のうち部分的に自のスクリーニングや治療効果の観察にとどまらず、造動化した装置が出回っているが、全工程を自動化した血器腫瘍、固形腫瘍、生活習慣病などヒト遺伝子を対システムは血液スクリーニングなどの大規模処理を目象とした検査にまで急速に拡大しつつある。この動向的とした大型システムしかない。そのため、一般の検は、ポストゲノムのハイスループットな分析ツールと査室では個人の手技に依存せざるを得ず、検査の精度してマイクロアレイやDNAチップが実用化されたこ管理が課題となっており、多数試料を簡便に実施でき

1）

（ 3 ）

4

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.45（2001）

うにした。さらに、蛍光検出ユニットのうち、励起光る小型な自動化システムが望まれている。
我々は、「核酸抽出」技術として、DNAとRNAの全源を含む励起光学系や蛍光信号伝達系などの光学部分核酸を遠心沈降方式により抽出するキット試薬を一体で回転させ、32本のサンプルからの蛍光信号を「EXTRAGEN」を開発し、既に市販している。また、順次計測できるようにした。（Fig.１）「増幅反応」技術として、転写反応と逆転写反応を巧

上記のインキュベーターでは、サンプル間の温度差みに組み合わせることで標的RNAを極めて効率的にを解消するため、テープ状ヒーター（坂口電熱株式会複製する転写・逆転写協奏増幅法（TRC反応：社）を温調ブロックのリング外周部に均一に巻き付け、Transcription-Reverse transcription Concerted

32本の全サンプルにおける熱収支が一律となるようにReaction）を開発してきた2）。さらに、「検出」技術とした。なお、制御用の温度センサーには、白金測温抵して、標的核酸と相補結合を形成することによって顕抗体（NR-181-1507、株式会社ネツシン）を用い、温著な蛍光増感を与える発蛍光プローブ（INAFプロー

調ブロック内に埋め込んだ。また、装置全体を小型化

ブ：Intercalation Activating Fluorescence Probe）をするために、励起光源として青色発光ダイオード開発し、TRC反応と組み合わせることで、一定温（NSPB500S、日亜化学工業株式会社）を採用し、干度下にて増幅反応工程と検出工程を一段階で実施する

渉フィルターを介して470nm（FWHM10nm）の励起TRC蛍光モニタリング法を構築した 。

光を温調リングの内側から反応溶液に集光した。反応

3−5）

2）

この度、上記のTRC蛍光モニタリング法の専用装置

溶液からの蛍光は、温調リングの底部から採取し、光「TRC蛍光モニター」、および、「EXTRAGEN」の使用ファイバーで伝達した後、干渉フィルターで特定波長をベースとする自動核酸抽出装置を開発し、一般の検を選別してメタルパッケージ光電子増倍管（H5784、査室においても遺伝子検査を簡便に実施できる小型な浜松ホトニクス株式会社）で検出した。なお、蛍光トータルシステムを構築し、実質的に全工程を自動化

検出波長は520nm（FWHM10nm）と620nmしたので、以下に報告する。

（FWHM10nm）の二系統を用意し、インターナルコントロールの検出や二項目同時検出にも対応できるよ

2．材料および方法うにした。
〔2〕核酸抽出の自動化〔1〕TRC蛍光モニタリングの自動化
TRC蛍光モニタリング法では、TRC反応により標的核酸抽出試薬には検体中の全核酸を遠心沈降方式にRNAを増幅しつつ、その経時変化をリアルタイムかより抽出するキット試薬「EXTRAGEN」（東ソー株

つ連続的（または断続的）に蛍光検出する必要がある。

式会社）を用いた。この抽出性能（回収率）を維持しかも、臨床診断などの市場ニーズに適した仕様とすしたまま自動化するために、Fig.２に記したるためには多サンプルを同時に実行しなければならな「EXTRAGEN」の標準プロトコールのうち、遠心操作い。と上清吸引を繰り返す最も煩雑な操作部分（Fig.２の我々は、これらの課題に対し、TRC反応のインキュベーターとして、ヒーターと温度センサーを装備した

step１
Add 2μl Reagent 1 including 20μg dextran.

リング形状のアルミ合金製温調ブロックを用意し、32本のサンプル容器を密着して同心円上に静置できるよ

step２
Add 500μl Reagent 2 including guanidine
thiocyanate and isopropanol.

LED(470nm)

SamplesHeating Block

step３
Centrifuge at 12,000G for 3 min.

step４
Discard supernatant without disturbing the nucleic
acid pellet.

Stepper motor
to rotate optics
as an unit

Light guideto transmit fluorescence

step５
Add 200μl Reagent 3 and vortex 5 sec to mix well.

520nm
620nm
Dichroic mirror
Photomultipliers

Filters

step６
Centrifuge at 12,000G for 3 min.

Mirror

Fig.１ Diagram of the TRC fluorescence monitor
instrument system.

Fig.２ Standard procedure for the DNA/RNA extraction kit
EXTRAGEN .

（ 4 ）東ソー研究・技術報告 第45巻（2001）

step３〜6）をそのまま自動化することにした。

Reagent１（20.8μl）

自動核酸抽出装置の中核部品として、半径107mm

5Sample(5μl)

Tris-Acetate(pH8.2)
60 mM
KOAc
120mM
Mg(OAC)213mM
Dithiothreitol
10mM
dNTPs
0.75mM
NTPs
3.6mM
Scissor Probe
0.2μM
Primer Set
each 0.2μM
INAF Probe
25nM
Ribonuclease lnhibitor
60U/assayのサンプルローターをポリアセタール樹脂を加工して成形し、32本のサンプル容器を45°に傾斜して放射状に収納できるよう、ホルダー穴を形成した。サンプルローターには一個のステッピングモーター（AS91AA、オリエンタルモーター株式会社）を連結し、遠心操作時の高速回転、および、試薬注入／上清吸引操作時のインデックス回転（位置決め制御回転）の両操作を自動制御できるようにした。さらに、試薬注入と上清吸

Reagent２（4.2μl）

引の自動制御ノズルを45°に傾斜して装備することに

T7 RNA Polymerase
171U/assay
AMV Reverse Transcriptase
42U/assay
RNaseH
0.03U/assay
BSA
0.01％

より、サンプルローターに検体を設置したまま全操作（Fig.２のstep３〜６）を実施できるようにした。なお、サンプルローターの標準回転速度は5,000rpm（遠心加速度3,000G）、インデックス回転時の位置決め精度は±0.2mm以内である。

Fig.３ Procedure for the real-time fluorescence
TRC monitoring of mecA mRNA.

〔3〕TRC蛍光モニタリング
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）のペニシリン結合蛋白（PBP2 ）をコードする耐性遺伝子

2016merのRNAを調製した。

mecAに着目し、そのmRNAを標的とするTRC蛍光モ

また、TRC蛍光モニタリング法の試薬組成と操作手ニタリング法の検出試薬を開発し 、上記自動化装置

順は、41℃の一定温度下において、Fig.3に示した操の評価試薬とした。

作手順に従って実施した。すなわち、サンプルに対し

2）

mecA mRNAのTRC蛍光モニタリングに使用したプて二種類の試薬Reagent１と２を添加し、直ちに密閉ライマー配列とプローブ配列は以下のとおりである。

栓を閉じてTRC蛍光モニターにセットした。なお、

プロモータープライマー（DNA）

YOの蛍光はTRC蛍光モニターが装備する二系統の検5 -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAAA-3'

出系のうち520nmの経路で検出した。

3．結果および考察

アンチセンスプライマー（DNA）〔1〕TRC蛍光モニタリングの自動化

5 -TTCTTTTTTATCTTCGGT-3'
切断プローブ（DNA）（1）TRC蛍光モニターの開発

5 -GTTAGTTGAATATCTTTGCCATCTTTTTTCTTT

開発したTRC蛍光モニターの写真と主な仕様をFig.
４に示す。本装置のインキュベーターは、サンプルをTTCTCT-3'
発蛍光プローブ（INAFプローブ、DNA）静置した効果とリング外周部にヒーターを設置した効5 -TGTTTG*AGGGTGGATAGCAG-3果として、高い温調精度（温度の時間変動；±0.1℃

上記のうち、プロモータープライマーの下線部はT7プロモーター配列であり、発蛍光プローブの＊はインターカレーター性蛍光色素オキサゾールイエロー（YO）の修飾位置を示している。なお、切断プローブの3末端はアミノ基で、発蛍光プローブの3末端はグリコール酸で修飾し、それぞれからの伸長反応を防止した。これらのプライマーとプローブの配列は、特別な変性処理のない条件下でもアニールできるよう、41℃の反応液中で標的RNAが分子内結合フリーとなる領域に設定した2）。さらに、mecA mRNAキャリブ
レーターとして、鋳型DNAからのin vitro転写により、MD Song et al.6）が同定した塩基番号1〜2013を含む（ 5 ）Fig.４ Specifications and photograph of the TRC
fluorescence monitor instrument system.

6TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.45（2001）

以内）と一律な温度制御（サンプル間の温度較差；±によって定量的な分析も可能であると言える。

0.1℃以内）を実現でき、TRC反応を多サンプルに対

このように、本装置はTRC反応の進行に伴うRNAのして高精度に実施することが可能となった。また、蛍増幅過程をリアルタイムに検出することを可能とし、光検出ユニットを一系統とし、しかも、励起光源に発TRC蛍光モニタリングによる迅速・高感度な定性・定光ダイオードを採用したことにより、小型な卓上型装量分析を実現する上で有用な分析ツールであることが置（サイズ；280mm（W）×500mm（D）×370mm（H））

示された。とすることができた。しかも、蛍光検出ユニットの光

2）臨床検体への応用

学部分の回転を繰り返すことで、32本のサンプルすべTRC蛍光モニターとTRC蛍光モニタリング法を臨床てに対して断続的に蛍光を検出できる。このように、検体に応用するため、患者検体に由来するMRSAの培高い精度でTRC反応を実施しつつ、RNAの増幅過程を養コロニー（菌数；106個）をサンプルとして用いた。

リアルタイムな蛍光検出により追跡することが可能と

まず、核酸抽出試薬「EXTRAGEN」（東ソー株式会社）なった。

を使用して１コロニーから全核酸を用手法で抽出し、（2）TRC蛍光モニター（TRC蛍光モニタリング）のその10倍希釈系列を調製してサンプルとした。

有用性評価

Fig.６に、TRC蛍光モニターを用いてTRC蛍光モニ

1）MRSA mecAの発現検出への応用タリング法で測定した結果を示す。図に示したように、

Fig.５は、TRC蛍光モニターを使用し、mecA10 6倍に希釈したサンプルまで蛍光信号の立ち上がりmRNAキャリブレーターをサンプルとして測定したが認められた。このことから本法はMRSAに対して菌TRC蛍光モニタリングの結果である。Fig.５における１個の検出感度をもつことがわかる。

時間原点は、TRC増幅反応の開始時間であり、具体的PCR法に代表されるDNAの増幅反応を利用した遺には、Fig.３における各種酵素を含んだReagent２の伝子検査では、生菌のみならず死菌をも検出すること添加時点に相当する。また、縦軸の蛍光強度比は、反がしばしば問題となる。しかし、本法は、mecA応時間原点の蛍光強度（バックグラウンド蛍光）に対mRNAのように遺伝子の発現過程をみることで生菌のする各時間の蛍光強度の比を表している。

みを選択的に検出できると考えられる。そのため、従Fig.５に示したように、反応液中に標的RNAが存在来の培養法との相関が良好であると考えられ、臨床的しない場合、蛍光信号は一定値（バックグラウンド蛍有用性が期待される。

光）で推移した。これに対し、反応開始前のmRNA量3）感染症7項目への応用が10コピーの場合は約10分で蛍光信号の立ち上がりが上述のMRSAを含めて、HCV（C型肝炎ウイルス）、認められた。このことは、本システムによって極めてHIV-1（ヒト免疫不全ウイルス）、SRSV（小型球型ウ

短時間に高感度分析が実現できることを示している。

イルス：ノーウォーク様ウイルス：NLV-GI）、腸炎ビ

また、蛍光信号の立ち上がり時間と標的RNAの初期ブリオ菌、腸管出血性大腸菌O-157、サルモネラ菌、コピー数の間には相関が認められた。すなわち、立ちの感染症7項目に対して本法を適用した。

上がり時間と初期コピー数から検量線を作成すること

HCV、HIV-1、NLV-GI7）はRNAウイルスであり、そ

2.0

2.8
Ratio of fluorescence intensity

Ratio of fluorescence intensity

2.6
2.4
2.2
2.010

1.87

10106

1.61054103102
10 copies

1.4
1.2

Nega

1.8

1/10

1/104

1/102

1.6

1/105

1/103

1/106

1.4
1.2
1.0

1.0
0.8

0.8
2468101221446810121416

Reaction Time / min.

Reaction Time / min.

Fig.６ Fluorescence profile of variously diluted
solution of MRSA suspended colony obtainedusing the TRC fluorescence monitor .

Fig.５ Fluorescence profile of various copies of mecAmRNA calibrator obtained using the TRC
fluorescence monitor .

（ 6 ）東ソー研究・技術報告 第45巻（2001）

7

れ自体の特異的配列をTRC増幅反応のターゲットとした。また、感染毒素型の食中毒菌である腸炎ビブリオ菌 8）と腸管出血性大腸菌O-157は、腸管感染症や食品中における毒素産生性の判定に有用な毒素遺伝子に着目し、それぞれ、耐熱性溶血毒遺伝子tdh2とベロ毒素VT2遺伝子のmRNAをTRC増幅反応のターゲットとした。また、感染侵入型の食中毒菌であるサルモネラ菌に対しては、侵入性因子関連遺伝子invAに着目し、そのmRNAをTRC反応の増幅ターゲットとした。
各項目の標準RNAをサンプルとして、TRC蛍光モニターを使用したTRC蛍光モニタリングを実施した。得られた蛍光プロファイルから、初期コピー数と蛍光信
Fig.８ Photograph of the automated nucleic acidextraction system.

号の立ち上がり時間の関係をFig.７にまとめた。なお、
蛍光信号の立ち上り時間は、蛍光プロファイルにおいて蛍光強度比がカットオフ値1.2（蛍光初期値＋3SD）く、その後は最大32検体を30分以内に処理することがに到達する時間に設定して算出した。図からわかるよ可能であった。

うに、すべての項目において迅速・高感度な検出と定

また、試薬注入と上清吸引の各ノズルは、試料容器量性を達成することができ、本法の有用性を確認できの内面に接触しないように制御し、さらに、上清吸引た。

ノズルは一検体処理ごとに蒸留水による洗浄操作を繰

以上のように、本開発のTRC蛍光モニターを使用すり返すよう制御した。これにより、ノズルによるキャれば、二種類の試薬を添加するだけの操作により、迅リーオーバー（検体間汚染）が発生しないことを確認

速・高感度なTRC蛍光モニタリング法を高精度に実施した。

でき、増幅反応工程から検出工程を実質的に自動化す（2）核酸抽出試薬の改良ることができた。

上記の自動核酸抽出装置の遠心加速度3,000Gは、抽〔2〕核酸抽出の自動化出試薬「EXTRAGEN」の標準プロトコールで必要と（1）自動核酸抽出装置される遠心加速度（12,000G）の１／４に過ぎない。

開発した自動核酸抽出装置の写真をFig.８に示す。

この遠心加速度にて、標準法と同じ回収率を得ること

本装置では、遠心操作と試薬注入／上清吸引の全工程を目的に、「EXTRAGEN」に含まれるデキストランをサンプルローター上で自動的に実施でき、そのため、（核酸の共沈補助剤）の使用量に着目した。

装置全体を小型な卓上サイズ（500mm（W）×540mm

37コピー／100μlのHCV cDNA（塩基番号1〜1487（D）×500mm（H））とすることができた。さらに、本を含む9））を試料として用い、遠心加速度3,000G（標装置を用いれば、検体に「EXTRAGEN」のReagent１

準プロトコールの１／４に相当）で遠心沈降したときと２を添加して本装置にセットするだけの操作で良551015202530HCVHIV
Norwalk-like viruses G1

1 2 3 4 5 6 7 8log(initial copy number/test)(a)Relative amount of HCV cDNA0

Cut off time / min

Cut off time / min

0.7010152025MRSA(mecA)
Vibrio parahaemolyticus(tdh2)
E.coli O-157;H7(VT2)
Salmonella enteritidis(invA)

12,000G

0.6
0.5
0.4

3,000G

0.3
0.2
0.1
030

1 2 3 4 5 6 7 8log(initial copy number/test)(b)

1060110160

Amount of dextran (μg/tube)

Fig.９ Results of HCV cDNA extraction with various
amounts of dextran. Relative amounts of HCV
cDNA were estimated by the electrophoretic
analysis of PCR products.

Fig.７ The relationship between the log of initial copies
of RNA and the time required for fluorescenceenhancement to reach a cutoff level of 1.2 inthe profile.

（ 7 ）8TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.45（2001）

Table１ Efficiency of mecA mRNA extraction by the automatednucleic acid extraction system and EXTRAGENkit.
The efficiency was estimated from the results of TRC
fluorescence monitoring.

SamplemecA mRNA

Extraction efficiency(number of detected samples/numberof tested samples)
Automation
system（copies/100μl）

Standard manual procedure
person１（expert）

person２（beginner）

1000

２／２

２／２

１／２

300

３／３

３／３

３／３

100

３／３

３／３

２／３

30

３／３

３／３

３／３

10

２／３

２／３

１／３に得られる回収核酸の相対量を求めた。Fig.９は、デを得た。本トータルシステムは、「EXTRAGEN」の使キストラン使用量をパラメータとし、回収した核酸を用をベースとした自動核酸抽出装置とTRC蛍光モニタ

PCR（40サイクル）で増幅後、電気泳動で検出されたリング法の専用装置「TRC蛍光モニター」から構成さバンドの黒化度をデンシトメーターで求めたものであれ、最大32本のサンプルに対して、全工程を１時間以る。図からわかるように、標準プロトコールに比較し内（核酸抽出：30分以内、増幅・検出：30分以内）でて５倍量に相当する100μg／テストのデキストラン実施することが可能である。
それぞれの装置は、試薬を添加してセットした後はを使用することにより、標準プロトコールに相当する回収率を得ることができた。

放っておけるwalk away

システムであるため、多（3）抽出効率の評価数の検体を処理する場合にも、一方の待ち時間の間に改良した抽出試薬「EXTRAGEN」（デキストラン他方を処理（試薬添加と装置へのセット）することが量；100μg／テスト）を用い、本装置の核酸の回収でき効率的と言える。また、各装置ともに小型な卓上率を、「EXTRAGEN」の標準プロトコール（用手法、装置であるため、一般の検査室でも手軽に導入でき、デキストラン量；20μg／テスト、遠心加速度：

個人の手技に依存しない高度な精度管理や検査の標準12,000G）と比較した。サンプルは、MRSAの耐性遺化に寄与すると考えられる。

伝子 mecA のmRNAキャリブレータをTris-saline-5％BSAに添加して用い、TRC蛍光モニタリング法の検出文

献率で評価した。Table１に示した結果からわかるよう

１）JC Venter et al., Science, 291, 1304-1351（2001）に、改良した抽出試薬「EXTRAGEN」を用いて本開２）田谷敏貴，斉藤寿一，林俊典，石黒敬彦，東ソー

発装置で核酸抽出することにより、30コピー以上の核酸を含むサンプルでは100％の検出率、10コピーの核研究報告，43，1-8（1999）
３）斉藤寿一，石黒敬彦，東ソー研究報告，41，13-酸を含むサンプルに対しても２／３の検出率を得ることができ、従来の「EXTRAGEN」を用いた標準プロ

21（1997）
４）T. Ishiguro et al., Nucleic Acids Res., 24, 4992-

トコールに匹敵する性能であることがわかった。また、

4997（1996）

用手法により標準プロトコールでは回収率の結果に個

５）石黒敬彦，Jpn.J.Electroph., 41, 293-300（1997）

人間差が認められるが、本開発装置は熟練者の技術力

６）MD Song et al., FEBS Lett., 221, 167-171に相当する性能を容易に実現できることがわかった。

4．結（1987）７）武田直和論et al., 臨床栄養，94，768-774（1999）

８）西渕光昭，最新医学，52，2079-2085（1997）

以上のように、遺伝子検査の全工程にわたる操作を

９）N. Kato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,

実質的に自動化したトータルシステムの構築に見通し（ 8 ）9524-9528（1990）

東ソー研究・技術報告 第45巻（2001）

著
氏名 林者
俊 典

Toshinori HAYASHI

著

者

著

氏名 栗 原 芳 文者

氏名 増 井 健 治

Yoshifumi KURIHARA9著

者

氏名 斉 藤 寿 一

Kenji MASUI

Juichi Saito

入社 昭和60年４月１日

入社 昭和64年１月１日

入社 昭和62年４月１日

入社 昭和62年４月１日

所属 東京研究所

所属 東京研究所

所属 東京研究所

所属 東京研究所

バイオ有機分野

バイオ有機分野

バイオ有機分野

バイオ有機分野

主任研究員

主任研究員

研究員

主任研究員

著

著

（現在）
科学計測事業部
営業部学術グループ

著者

氏名 堀 江 隆 一
Ryuichi HORIE

者

氏名 保 川清者

氏名 石 黒 敬 彦

Kiyoshi YASUKAWA

Takahiko ISHIGURO

入社 昭和61年４月１日

入社 昭和59年４月２日

入社 昭和58年４月１日

所属 東京研究所

所属 東京研究所

所属 東京研究所

バイオ有機分野

バイオ有機分野

バイオ有機分野

主任研究員

主任研究員

主席研究員

（ 9 ）