《シリーズ《シリーズ診断》

診断》

ナノポアを用いたマイクロ RNA の迅速診断技術と応用展開
保皓大

東京農工大学

工学部

生命工学科

平谷 萌恵

東京農工大学工学府

生命工学専攻川野 竜司

1

東京農工大学

工学研究院

生命機能科学工学部門

准教授

ポア計測を組み合わせた miRNA 迅速計測に関する幾つはじめにかの研究について紹介する。

マイクロ RNA（miRNA）は 20 塩基程度の短いノンコーディング RNA の一種であり，細胞の成長やアポ1）トーシス，シグナル伝達などの制御を担っている 。また癌細胞中のマイクロ RNA は癌の種類に応じ，特異的に異常な発現を示す

2,3）

2

ナノポアを用いた電気的核酸検出法

細胞膜表面には，細胞の内外の物質のやりとりを制御。異常な発現は複数種類のするチャネルを持った膜タンパク質が多数存在する。膜

miRNA で発生し，発現量が上昇するものもあれば減少タンパク質の中でもチャネル型の膜タンパク質はイオするものもある。さらに miRNA の異常な発現は未成熟

ン透過を担うイオンチャネルや分子を輸送する膜輸送な癌細胞でも見られ，血液や尿などの体液中の miRNA体，それ以外にも膜中にポアを形成し細胞死を誘導する組成に反映する。体液を用いた検出は簡便かつ非侵襲で毒素タンパクも存在する。これまで構造生物学や電気生行うことができることから，癌の早期診断マーカーとし理学といった分野において，チャネル膜タンパク質の電て注目されている

4,7）

。

気生理学的な性質やその構造を明らかにするために様々

miRNA の検出には，マイクロアレイ法

8）や定量的逆な研究が行われてきた。特にチャネルの上下に電圧を印が主に用いられているが，迅速診断とし加し，チャネルを流れる電流を観測するパッチクランプての使用を考えた場合課題も多い。マイクロアレイ法は法はチャネル膜タンパク質一分子レベルでの信号が得ら低濃度の miRNA に対しては感度が低いため miRNA のれることから強力な研究ツールとなっている。またパッ

転写 PCR 法

9）

精製を追加で行わなければならないことや

10）

，プロー

チクランプ法を応用し，平面状に作製した脂質二分子膜ブとなる核酸分子を標的 miRNA の種類分用意しなくて内に膜タンパク質を再構成し，チャネル電流を計測するはならないという課題がある。定量的逆転写 PCR 法も，in vitro での計測系が知られている。ナノポア計測では，逆転写反応や PCR を行うため操作が煩雑であり検出に1 〜 2 nm のポアを膜中に形成するチャネル型膜タンパ数時間程度かかる。迅速診断のためには新しい検出方法

ク質を平面脂質膜中に再構成し，パッチクランプ法でのの開発が必要となってくる。本稿では，ナノポアと呼ば測定原理を利用しナノポア内を通過する一分子を電気的れるチャネル膜タンパク質が有するナノスケールの孔をに検出する方法である。この方法では一分子を高速にか用いたセンシング技術

11,12）を中心に，筆者らが最近取り組んでいる DNA コンピューティング技術

13,14）とナノつ電気的に検出でき，主に用いられるナノポアのサイズと核酸分子のサイズが近いことから，ナノポアシーケン

PHARM STAGE Vol.17, No.2 20171

《シリーズ診断》

スや核酸の一分子検出に応用されている。とくにシーケ認識を行うシステム，さらに小細胞肺癌から分泌されるンスに関しては，2016 年 Oxford nanopore 社が小型のmiRNA-20a

ナノポアシーケンサを $1000 という価格で販売を開始

瘍抑制を行うアンチセンス核酸医薬のその場で自律的にし市場を驚かせた。また最近では miRNA や短鎖の DNA放出する系の構築に成功しているの迅速検出に向けて研究が進んでいる。次からは最近筆

ステムは，point-of-care testing のような簡易癌診断へ者らが取り組んでいるナノポア計測と情報科学を融合しの応用や，病気の診断と治療を同時に行う theranostics

た一分子検出法，特に癌の超早期診断マーカーとして最への展開を行う。

18）が存在すると認識し，小細胞肺がんの腫19）。今後これらのシ近注目されている miRNA の検出に関して紹介する。

DNA コンピューティングによる自律的癌診断・薬剤放出システムの構築

3DNA コンピューティングは元々 DNA を用いた並列計算を目的に研究されていた

13,14）

1 種類の癌に対して異常に発現する miRNA は，複雑な組み合わせを持つ2,3）。そのため，体液中から miRNA。しかし最近のシリコを検出して癌を特異的に診断するためには，発現量が異ン型コンピュータのマシンパワーの向上から，並列の常な複数種類の miRNA を組み合わせで認識する必要が計算を行うよりも DNA が生体分子であることを利用しある。しかしながら，すべての miRNA の塩基配列は短く，た in vivo での診断・治療に応用する研究が行われてい似たような長さであるため，ナノポアセンシングで複る

15）。DNA を用いた演算では，核酸分子を論理演算の数種類の miRNA の同時検出を試みると，通過した分子20）入力および出力に対応させることで，特定の核酸分子の種類によらず非常によく似た通過信号が得られるの有無を二進数で表現することができ，核酸分子の反応そのため，通過信号から分子の種類を識別することが困結果として得られた出力を次の反応に用いることができ難であった。前項では DNA コンピューティングを用いる。この方法を用いれば，特定の組み合わせの miRNAた方法について紹介したが，本稿では通過信号に周波数が存在するときのみ蛍光を出力するシステム

16）

や，特定の mRNA の転写量が増加したときに治療効果のある薬剤を出力するシステム

17）。

解析を適用し，ナノポア計測からダイレクトに miRNA種類を同定する取り組みについて紹介する。

を構築することができる。

周波数解析は信号処理手法の一種であり，近年のパー

しかし，従来の DNA コンピューティングの手法では，ソナルコンピューターの発達により様々な分野の研究計算結果として出力される分子を確認するために，PCRで用いられるようになったでの増幅，ゲル電気泳動をした後に蛍光により確認する書を参考にしていただきたいがなど多段階のステップを要し，結果を得るまでに長い時いることで時間あたりのデータを周波数あたりのデー間がかかることが課題であった。また miRNA はがん細タへと変換することができる。生物学的な分野の研究で胞から複数種類の RNA が同時に発現増加，減少するよも，ウシの呼吸からケトン症を診断する研究

うなパターンでの変化が起こることが知られ，このパ物に搭載したデバイスから動物の行動を解析する研究

ターンをすべて調べる必要がある。

25）

そこで筆者らは，DNA コンピューティング技術とナ

2

ナノポアセンシングと周波数解析による複数種類 miRNA の同時検出421）。詳しい原理などは専門
22,23），周波数解析を用

24）や，動などで周波数解析が用いられている。筆者らの研究

では，膀胱癌の診断マーカーとして尿中に放出される
26）

ノポア計測を組み合わせることにより迅速に miRNA

miRNA-126 と miRNA-182の発現パターンを診断し，また直接 DNA アンチセン

より同時に検出し，信号を識別することを目的とし，こス薬剤により治療する系の構築に取り組んでいる。具

れらの通過信号に対して周波数解析を適応した。その結体的には，小細胞肺がんになると発現増加する 2 種の果どちらの miRNA にも固有の周波数成分が現れること

miRNA が同時に存在した時だけ出力分子を生成（ANDが明らかになりつつある。周波数解析とナノポアセンシ

ゲート）し，ナノポア計測により検出可能なパターン

ングの組み合わせにより複数種類の miRNA が同時に検PHARM STAGE Vol.17, No.2 2017をナノポアセンシングに《シリーズ診断》

出可能になれば，体液中の miRNA を網羅的に検出でき

direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA

る癌の簡易診断デバイスの構築が可能になる。

11 : 1737-1744, 200510）S. Dangwal, C. Bang, T. Thum, Novel techniques and targets in5

おわりにcardiovascular microRNA research. Cardiovasc. Res. 93 : 545-554,
2012

本稿では，miRNA の迅速診断のための新しい技術，

11）L. Q. Gu, O. Braha, S. Conlan, S. Cheley, H. Bayley, Stochastic

ナノポア計測，に関して筆者らの最近の取り組みを中心

sensing of organic analytes by a pore-forming protein containing aに紹介してきた。miRNA は癌の診断マーカーだけでは

molecular adapter. Nature 398 : 686-690, 1999

なく，最近は老化や体内の様々な変化を反映するマーカ

12）J. J. Kasianowicz, E. Brandin, D. Branton, D. W. Deamer,ーとしての可能性が指摘されている。今後ナノポア計測

Characterization of individual polynucleotide molecules using aをはじめ，この miRNA を迅速にかつ安価に検出する技

membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 : 13770-13773,

術は幅広い応用展開が見込まれる。

199613）Y. Benenson, T. Paz-Elizur, R. Adar, E. Keinan, Z. Livneh, E. Shapiro,
Programmable and autonomous computing machine made of

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PHARM STAGE Vol.17, No.2 2017

3《シリーズ診断》21）B.P. Marchant, Time-frequency Analysis for Biosystems
Engineering. Biosystems Engineering 85 : 261-281, 200322）R. N. Bracewell, "The Fourier Transform and its Applications."
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