博 士 （ 医 学 ） 李章 輔

IvIigratio
nand differentiat
ion of nuclear fluorescence‑labeledbone marrow stromal cells (BIVISCs) after transplantation
into cerebral infarct and spinalc
ord inj
ury in mice
（マウス脳梗塞および脊髄損傷モデルに対する骨髄問質細胞移植）

学位論文内容の要旨【 研究目的】骨髄問質細胞（Bonemarrowstro
malcells；BMSCs)は移植した組織特有の細胞に分化する能カを有 し．移 植細胞 として 注目を 集めて ぃる，ま た中枢 神経再生におぃてBMSCsが生体内および生体外いずれの環
境 におぃ ても神 経細胞 などへ分化することが明らかになっている．本研究ではマウスの中大脳動脈永久閉塞によ る脳梗 塞モデ ルおよ び脊髄 損傷モ デルヘBMSCsを移植 し移植 細胞の 病巣へ の遊走と 神経細 胞など への分化を 確認す ること を目的 とした ，マウ ス脳梗塞 モデル および脊髄損傷モデルに対してマウスBMSCsを移植し中枢神 経再生 を確言 忍した 実験は 本研究 が初めて である ，【 実験方 法】
〔 マ ウ ス BMSCsの 採 取 〕 5‑8週 齢 の C57BU6系 統 マ ウス か ら BMSCsを 採 取 した ． 頚 椎 脱臼 に て 安 楽死 さ せ
70%アルコ― ルにて 消毒し た．マウスの大腿骨両端を切断後，骨髄に21ゲ―ジの注射針を挿入し109'0ヘパリン入 り培養 液を注 入して 骨髄を 採取し た．培養 液の交 換は週 3回行な った．
〔 フ ロ ー サイ 卜 メト リーに よるBMSCsの 確認〕 初期培 養にお ぃてBMSCsは 培養フ ラスコ の底に 付着し 造血斡
細 胞から 分離す ること が可能 である ．培養細 胞がBMSCsであることの確認のためフローサイトメトリ―を行な
い CD34，CD45， CD90および Sca‑lに対 する表 面抗原 を調べ た．
〔 脳梗塞 モデル の作製 〕イソフルレンにて吸引麻酔を行なぃ十分な麻酔深度に達したことを確認した後，右側頭 骨 に 約 2mmの 骨 窓 を 設け 手 術 顕 微鏡 下 で バイボ ―ラー 摂子にて 中大脳 動脈を 凝固し 脳梗塞 を作製 した．
〔 脊髄損 傷の作 製〕イ ソフルレンにて吸入麻酔を行なぃ第10胸椎椎弓切除後，ニューマチックインパック卜デバ イスを 用いて インパ クター の速度 を2m/s，衝 撃時のインパクタ―の硬膜からの深さを0．25mmに設定して不完 全脊髄 損傷を 作製し た・〔 マウス BMSCsの移 植〕BMSCsの 螢光標 識のた め移植 24時間前 に1メg/mlの ビスベンザマイド(Hoechst33045)を 培 養 液 に混 合 した ．螢光 標識し たBMSCsの移 植は， 脳に対 しては ブレグ マから 3mm右に骨 窓を設 け定位 装置 にて頭 部を固 定し5メ 1のハミ ル卜ン シリン ジ針を 硬膜から 4mmの深 さまで 挿入し線 条体に 速度lUl/minで5)ul (5Xl03個）注 入した ．また 脊髄に 対して は脊髄 損傷部位から2mm頭側で硬膜からImmの深さに1.5メ1（1.5xiol個）の 細胞液を 0,5ルl/minの 速度で 移植し た．対 照群（ n=2)として Balb/c系統マウスの正常脳に移植し多 ．実験 群とし てBalb/c系 統マウス で作製 した脳 梗塞マ ウス（ n=4)に脳梗 塞24時間後に移植し，C57BL/6系
統 マウス で作製 した脊 髄損傷 マウス （n=3）に 脊髄損 傷7日後 に移植 した．
〔 病理組 織学的 評価〕 BMSCs移植28日目にイ ソフル レンに よる吸 入麻酔 下に開 胸後23ゲ ージ針 を左心室より− 90 ‑

上行 大動脈 に挿入し ヘバリ ン入り 生理食 塩水を 約20ml点滴 した． 次に右 心房を 切開し て脱血 した後に4%ホル
マ リ ンを 約 60ml点滴し 濯流固 定を行 なぃ脳 および 脊髄を 採取し ‑80℃の液 体窒素 にて凍 結固定 した，5メmの厚 さ で 切 片 を 作 製 し 4種 類 の 螢 光 免 疫 染 色 (GFAP． MAP2． NeuN． Doublecortin(DCX))を 行 な っ た ，【結果】〔 フ ロー サ イ 卜 メト リ ー に よる BMSCsの確 認 〕 採 取時 に 円 形で あった BMSCsは2‑3回 、継代培 養した 後に均ー な 紡錘 形 の 細 胞に 変 化 し てい た ，フ ロ―サ イトメト リ―で はCD34は 陰性． CD45は低レ ベル、 CD90およびSca‑Iは 高 レ ベ ルに 発 現 し てお り 培養 細胞の 大部分 が非造 血幹細 胞以外 のBMSCsであ ること が確齠 できた ・〔 マ ウス 正 常 脳 に移 植 し た BMSCsの 分 化〕 BMSCs移植 4週 後 の 組 織学 的 検 査 でBMSCsは移 植部位 である 線条体を 中心と して生着 し移植 部位か ら離れ た視床 におぃ ても確 認でき た．螢光免疫染色では移植したBM
SCsの一部 が 神経 細 胞 表 面マ ー カ ― であ る NeuN． MAP2お よ びDCXで 陽 性であ ったがア ストロ サイト の表面 マーカ ーであるGFAPでは陰性であった．
〔 脳 梗塞 マ ウ ス に移 植 し た BMSCsの 分 化〕 移 植 4週 後 の組 織 学的 検査で BMSCsは損傷 した大 脳皮質 および 脳梁 に 遊 走 し て ぃ た ． 螢 光 免 疫 染 色で は 遊 走 して い た BMSCsの ― 部 はNeuN．MAP2お よ び DCXで陽 性 で あ ったがGFAPでは陰性であった・〔 脊 髄損 傷 マ ウ スに 移 植 し たBMSCsの 分化 〕 移 植 10日 目 およ び 4週 目 の 組 織学 的 検 査で BMSCsは移植 音B位に生着しほとんどの細胞がGFAP陽性であった．
【考 察】今 回の研究 では． 脳に移 植した BMSCsが神 経細胞に 分化し たことが確認できた．マウスの脳梗塞および 脊 髄損 傷 に お ぃて 移 植 し たBMSCsが 損傷部 位に遊 走する 要因と して損 傷を受 けた組 織に発現 するMCP‑1の関与が報告されてぃる．
成体 ラット 脊髄由 来の神 経幹細胞 を海馬 の歯状回に移植し，それが神経細胞へ分化しするが，脊髄に移植した場 合はア ス卜ロサ イトヘ 分化し たとの 報告がある．神経幹細胞を脊髄に移植した場合にアストロサイトヘ分化 し た原 因 は 不 明で あ る が ，脊 髄 損傷 後にCNTFの 発現が 増加す るとの 報告か らCNTFが移 植細胞 をアス 卜ロサイ卜に分化させる重要な因子であると考えられる，移植した細胞を標識する方法としてプ．ロムデオキシブ．リジン(BrdU)，B．ガラクトシダ―ゼ，グリーンフルオ
レ セ ンス プ ロ テ イン (GFP)およ び Yク ロモゾ― ムなど がある ．BrdUの 場合，細 胞培養 を繰り 返し行 なうと 標
識能 が徐々 に低下す ること が知ら れてぃ る，また遺伝子操作によるp・ガラクトシダーゼおよびGFP．またハイプ．リダイゼーションによるYクロモゾ―ムによる標識は技術的に容易ではなぃ．その点ビス′ヾンザマイドは細胞毒 性が低 く細胞分 裂に関 与する DNA．RNAお よびク ロマチ ンに悪影 響を与 えなぃ とぃっ た利点がある，しかし生 体外で のビスベ ンザマ イドの 染色パ ターンと移植後の宿主内での染色パターンは同一ではなっかった．これは移植細胞の分裂，凍結による標本作製およびコンピュ―タ―上での画像処理が影響してぃると考えられた，中枢神経系への幹細胞移植に関する多数の幸侵告があるが、移植した細胞の生理学的な機能についての報告はなぃ ．神経 機能の回 復が移 植細胞 の神経 細胞ヘ分化した結果なのか，または移植された神経組織に対する移植細胞 の神経 栄養因子 の生産 および 保護作 用によ るもの なのか は不明 である．ただし移植したBMSCsと移植を受けた 中枢神 経組織と の相互 作用が 神経栄 養因子の生産を誘導しさらに損傷した中枢神経組織の機能回復に関係して ぃると 考えられ る．BMSCsはイン ターロ イキン などの様 々なサ イトカインを分泌する，これらサイトカインの 一部が 神経細胞 への分 化，増 殖に重 要な役割をしてぃることが明らかとなっておりこれらが中枢神経再生を促進すると考えられる．
【結 語】マ ウス脳 梗塞モデルおよび脊髄損傷モデルに対するマウスBM
SCs移植が中枢神経再生に使用可能であるこ とが確 認できた ．また 移植細 胞の標 識としてビスベンザマイドは移植細胞の遊走および分化を評価するために非常に簡便で有用な方法であると考えられた，―91―

学 位論文審査の要旨
主査 教授 長 嶋和郎
副査 教授 佐々木秀直
副査 教授 岩 崎喜信

Migration and differentiation of nuclear fluore
sce
nce‑labeledbone marrow stromal cells (BMSCs) after transplantation
into cerebral infarct and spi
nal cord injury in mice
（マウス脳梗塞および脊髄損傷モデルに対する骨髄問質細胞移植）

骨 髄 問質 細胞 (Bonemal一rowstromalce‖s；BMSCs）は移 植細胞 として 注目さ れており BMSCsが生 体内外 いず れの環 境にお ぃても 神経細 胞など へ分化 するこ とが明ら かとな ってぃる．本研究ではマウス脳梗塞モデルおよ び脊髄 損傷モ デルヘ BMSCsを移 植し移植 細胞の 遊走と 神経細 胞など への分 化を確 認する ことを目的とした．
対 象 およ び方 法は5． 8週齢の C57BL／6系 統マウス を用い た．大 腿骨両 端を切 断し骨 髄腔に 注射針 を挿入しBMSCsを 採取 し た ， 培養 液 は 週 3回 の 交換 し た ． フ口 一 サ イ トメ 卜 リ ― にて CD34． CD45．CD90お よびSca―
1を 測定 し 培 養 細胞 が BMSCsで あ る こ とを 確 認 し た， マ ウ ス 脳梗塞 モデルは 吸入麻 酔後右 側頭骨 に骨窓 を設
け 双極性 電気凝 固器に て中大 脳動脈 を凝固 し脳梗 塞を作製 した． 脊髄損傷は吸入麻酔後ニュ―マチックインパ
ク 卜 デ バ イス を 用 い て不 完 全 脊 髄損 傷 を 作 製し た ， BMSCsの 螢光標 識のた め移植 24時間前 にlug／ mlのビス
ベ ン ザ マ イド を 培 養 液に 混 合 し た． 螢 光 標 識し た BMSCsの 移 植 は 、脳 梗 塞 に 対し て は ブ レグ マ か ら 3mm右に 骨 窓 を 設け て 5ulの ハ ミル 卜 ン シ リン ジ 針 を 硬膜 か ら 深 さ4mmま で 挿 入し 線 条 体 に速 度1pl／minで5p（5X103個） で 注 入 した ． 脊 髄 に対 し て は 脊髄 損 傷 部 位か ら 2mm頭 側で 硬 膜 か ら深 さ lmmに 1． 5uI（1．5X103個 ）の細 胞液を 速度0． 5‖1／minで移植した．対照群（n＝2）としてBalb/c系統マウスの正常脳に移植した．実験 群 と し てBalb／c系統 マ ウ ス で作 製 した脳 梗塞マ ウス（n：4）に 脳梗塞24時間後 に移植し ャC57BU6系 統マウ ス で 作 製し た 脊 髄 損傷 マ ウ ス （n＝ 3） に損 傷 7日 目 に 移 植した ．BMSCs移 植28日目 に吸入 麻酔後 ．灌流固定 を 行 い 脳お よ び 脊 髄を 採 取 し 液体 窒 素 に て凍 結 保 存 した ． 5umの厚さ で切片 を作製 し4種類 の螢光 免疫染色 （GFAP、 MAP2．NeuN、 DOublecortin）を 行った ．
結 果 は、 フ 口 ― サイ ト メ ト リ― で はCD34は 陰性． CD45は低レ ベル、 CD90および Sca‐｜ は高発現 してお り培 養 液 の 大部 分 が BMSCgで あ る こと が 確 認 でき た ． マ ウス 正 常 脳 にお け る BMSCsの 分 化 は移 植 28日後 の 病
理 学 的 検 査で BMSCsは移 植 部 位 であ る 線条体 を中心 として生 着し移 植部位 から離 れた視 床にお ぃても 確認でき た ， 螢 光 免 疫 染 色 で は 移 植 し た BMSCsの 一 部 が 神 経 細 胞 表 面 マ ― カ ― で あ る MAP2． NeuNお よ び―92―

Doublecortinで陽性であったがアストロサイ卜のマ―カ―であるG
FAPは陰性であった．脳梗塞マウスにおけるBM
SCsの分化は移植28日目の病理学的検査でBMSCsは損傷した大脳皮質および脳梁に遊走してぃた．螢
光免疫染色ではMAP2、NcuNおよびDoublccortinで陽性であったがGFAPは陰性であった．脊髄損傷マウスにおけるBM
SCsの分化は移植10日目および28日目の病理学的検 査でB
MS
Csは移植部位に生着 しほとんどの細胞はG
FAP陽性であった．
以上、本研究の結果からマウス脳梗塞モデルおよび脊髄損傷モデルに対するマウスB
M
S
Cs
移植が中枢神経再生に使用可能であることが確認できた．また移植細胞の標識としてビスベンザマイドは移植細胞の遊走および分化を評価するために非常に簡便で有用な方法であると考えられた，
公開発表におぃて佐々木秀直教授から脳梗塞と脊髄損傷で移植時期を変えた理由． B
M
S
Csの最適な移植時期について等の質問があった．次いで岩崎喜信教授から移植したBMS
Csが脳梗塞では神経細胞に，脊髄損傷
ではアストロサイ卜に分化した理由． B
M
SCs
移植群とコン卜ロール群との機能的差について質問があった．
さらに長嶋和郎教授かぢ脳梗塞 に移植したB
MS
CsでNeuN陰性 であった細胞について．M
AP2陽性であった細胞について・他の標識方法と比較してビスベンザマイドが有用な点について等の質問があった．またフ口アーから正常脳と脳梗塞での移植細胞の遊走能の違いについて・脊髄損傷での移植細胞の遊走の程度について質問があった．いずれの質問に関しても申請者は自らの研究に基づく経験や過去の論文の結果を引用し明確に回答した，
本研究はマウス脳梗塞モデルおよび脊髄損傷モデルに対してマウスBM
S
Csを移植し中枢神経再生を確認した初めての実験であり、今後の中枢神経再生における基礎的実験として貴重な研究であると考えられた．
審査員―同はこれらの成果を高く評価し、また研究者として誠実かつ熱心であり申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した，

一 93ー