博士（生命科学）中村彰良

学位論文題名StructuralandfunctionalanalysisoftRN
A―dependentam
idotrans：feraSeG
atCAB(tRNA依存アミド基転移酵素GatCA
Bの構造機能解析）

学位論文内容の要旨
ア ミ ノ アシ ル tR
NA合 成 酵素 (aaRS)は， 20種の ア ミ ノ酸 と 対 応す る t
RN
Aを正し く結合させてアミノアシルtRNAを生成する．フランシス・クリックによるアダプター仮説の提唱以来，aa
RSは20種類の アミノ 酸に対応 し20種類 存在すると思われてきた．しかし，様々なゲノム解 析の結 果，古細 菌と多くの真正細菌にはグルタミンとそれに対応するtRNA(tRNAom)
を結び 付ける グルタミ ニルtR
NA合 成酵素(GlnRS)が存 在しなぃ ことが 明らかになった．これらの 生物で は，誤っ た組み合わせのG
lu̲tRNAGlnを一旦合成し，その後アミド基転移酵素(Glu‑AdT)の働きに より， 正常なGln‑tR
NAa に 変換する ．Glu‑Ad
TによるGln̲t
RN
Acmの合成は3種類 の反応で 行われる ．Glu‑Ad
Tは誤っ て対合したGlu̲tR
NAomのみを正しく識別し，ATPを用いたりン酸化反応によりG
lu‑tR
NAa を活性化する．次いで，アンモニアを用いたアミド基転移反応により，活性化したG
lu
̲tRNAanを.
Gln・tRNAGlnに変換する．興味深いことに，
Glu‑AdTはアミド 基転位反 応に用いるアンモニアをグルタミンの加水分解反応により生成している．Glu‑AdTは，これらの反応を正確に制御することにより厳密な校正反応を行う．真正細 菌の Glu‑AdTは GatC， Gat
A， GatBの 3
つ の サ ブユ ニ ッ トか ら な り (GatCAB)，古細 菌ではG
atD，GatEの2つ のサブュ ニット からなる (GatDE)， アミノア シル化 反応にお いて，別生物種で異なる反応経路が使われることも，また異なる分子が関与することも，他には例がなく大変興味深い現象である．本酵素の構造機能解析は，遺伝暗号の起源という生命の誕生に 直接 関 わ る重 要なイ ベントに 構造生 物学の基 盤を与え るもの として大 変重要 である．
本研究 では， 黄色ブド ウ球菌 由来Ga
tC
ABの 大量調製系を構築後，結晶化を行い，GatCABの立体構造を2.
sA分解能で決定することに成功した．さらに，グルタミン加水分解反応の基質であ るGlnとの複合 体の立 体構造解 析を行い ，GatAに存 在する グルタミ ン加水分解反応―1325―サイトを特定することに成功した．またAD
PとGatCABの複合体の立体構造解析にも成功し，
Gat
Bの りン 酸化 ・ア ミド 基転 移反応サイトを同定した．同定したGatAとGatBの2つの反応サイトは，お互いの反応がカップリングしているにもかかわらず30Aも離れていた，しかし，
本研究では2つのサイトが分子内のチャネルで連結して いることを明らかにし，このチャネルがアンモニアの輸送を担 うアンモニアチャネルであると提唱した．さらに，GatCA
Bおよぴ基 質で ある tRNAGlnの変 異 体を作成し結合実験を行い，GatBのC末端ドメインがtR
NAGli
認 識 に 重 要で ある こと ，お よび Ga
tCABが tR
NAGlnの U
1‑A72 base pairとD‑loopを認 識していることを明らかにした．しかし，認 識に重要であるG
at
BのC
末端 ドメインの電子密度が観 察 出 来 な い な ど ， GatCABの 詳 細 な tRNAom認 識 機 構 の 解 明 に は 至 ら な か っ た ．
そ の後 ，本 研究 では Gat
CABの結 晶化 条件 の最 適化 を続 ける こと で，最終 的にG
at
CA
Bの立体 構造 を1.9A
分 解能 で 決定 し， 唯一 モデル構 築が出来なかったG
at
BのC
末 端ドメインの立体構造を明らかにすることに成功した ．このC
末端ドメインには真 正細菌で高く保存されたLys‑ric
hloopが存在し，tRNA認識に関 与することが変具体解析によって明らかになった．
よ り 詳 細 な tRNA認 識 機 構 を 議 論 す る ため に， すで に構 造解 析が 行わ れて いる 古細 菌型
GluIAdTであ るG川）Eとt
RN
AGl 複合体の立体構造情報を用い，GatCAB
腿NAや1 複合体モデルを作成した．また，小角X線散乱により作成した複合体モデルの妥 当性を評価した．作成した複合体モデルと一次構造比較から， Ga侶に存在する310ターンが t
RNAGlnのU1‐A
72basepairを認識することが示唆された．その後，310ターンの変異体を調製し活性測定を行ったと
こ ろ ， 野 生 型 の GatQ壥 は 厳 密 に U1― A72basepa
irのtRNAの み を認 識す るの に対 し， 310
タ ー ン 変 異体 はtRN
A認 識が 緩く なり ，G1．C72b
asepairのtRNAに も活 性を 示し た． 以上の 結 果 か ら ， GatCABは GatBの 310タ ー ン と C末 端 ド メ イ ン の L恥 ． richloopの 2カ 所 でtRN
AGlnを厳 密に認識していることが明らかになった，

学位 論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授

田中勲教授

小布施

力史教授

綾部時芳准教授

姚閔

学位論文題名Structural and functional analysis oftRNA− dependent amidotransferase GatCAB(tRNA依存アミド基転移酵素GatCABの構造機能解析）

ア ミノ ア シ ルtRNA合 成 酵 素(aaRS)は ， 20種 の アミ ノ酸と対 応する t
RN
Aを正し く結 合させて アミノ アシルtRNAを生成する．フランシス・クリックによるアダプター仮説 の提唱以 来，aaRSは20種類のアミノ酸に対応し20種類存在すると思われてきた，しかし，様々なゲノム解析の結果，古細菌と多くの真正細菌にはグルタミンとそれに対応す る tR
NA (tRNAGln)
を 結 び 付 ける グ ル タミ ニ ル t
RNA合成 酵 素 (GlnRS)が 存 在し ない ことが明らかになった．これらの生物では，誤った組み合わせのG
lu
̲
t
RN
Aalnを一旦合 成し，その後アミド基転移酵素(Glu‑AdT)の働きにより，正常なG
lnーtRNAGlnに変換す る．Glu‑Ad
Tによる Gln̲t
RNAGlnの 合成は3種類 の反応で 行われ る，Glu‑AdTは誤って 対 合 した Gluー tRNAGlnの み を 正 しく 識 別 し， ATPを 用 い たり ン 酸 化反 応 に よりGlu̲tRNAGInを活性化する．次いで，アンモニアを用いたアミド基転移反応により，活性化 したGlu̲tRNAGlnをGlnーtRNAomに変換する．興味深いことに，Glu‑AdT
はアミド基転位 反応に用いるアンモニアをグルタミンの加水分解反応により生成している．Glu‑AdT
は ，これら の反応 を正確に 制御す ることに より厳密 な校正 反応を行 う．真 正細菌のGlu‑AdTはGatC， Gat
A， GatBの 3っの サ ブ ユニ ッ ト からなり (GatCAB)，古細 菌ではGatD，Gat
Eの2っのサブ ユニッ トからな る(GatDE)．アミノ アシル 化反応に おいて，別生物種で異なる反応経路が使われることも，また異なる分子が関与することも，他には例がなく大変興味深い現象である，本酵素の構造機能解析は，遺伝暗号の起源という生 命の誕生 に直接 関わる重 要なイベントに構造生物学の基盤を与えるものとして大変重要である．
本 研究では ，黄色 ブドウ球 菌由来 G
at
CA
Bの大量 調製系を 構築後， 結晶化 を行い，GatC
ABの 立体構 造を2.
sA分解 能で決 定するこ とに成 功した． さらに ，グルタ ミン加水 分解反応の基質であるGlnとの複合体の立体構造解析を行い，Gat
Aに存在するグルタ― 1327 ‑ミ ン 加 水分 解 反 応サ イ ト を 特定 す るこ とに成功 した． またADPとG
atC
ABの複 合体の立体構造解析にも成功し，Gat
B
のりン酸化・アミド基転移反応サイトを同定した．同定
し たG
atAとGatBの2っの 反応サ イトは， お互い の反応が カップ リングしているにもかか わらず 30Aも離 れていた ，しか し，本研究では2っのサイトが分子内のチャネルで連結していることを明らかにし，このチャネルがアンモニアの輸送を担うアンモニアチャ
ネ ルであ ると提唱 した，さ らに， Gat
CA
Bおよび 基質であ るtRNA
Glnの変異体を作成し結 合 実 験を 行 い ，GatBのC末 端 ドメ イ ン がtRNAGln認識 に 重 要で あるこ と，およ ぴ
GatC
ABがtRN
AGlnのUl‑A72 base p
aむと D‐100pを認識していることを明らかにした．
し か し ，認 識 に 重要 で あ る Ga毋 の C
末 端ドメイ ンの電 子密度が 観察出 来ないな ど，GaにA
Bの詳細なtR
N
AGlll認識機構の解明には至らなかった，
そ の後， 本研究で はG
atC
ABの結 晶化条件の最適化を続けることで，最終的にGatC
ABの 立体構 造を1．9A分解能 で決定 し，唯―モデル構築が出来なかったG
atBのC
末端ドメイ ンの立 体構造を明らかにすることに成功した，このC
末端ドメインには真正細菌で高く 保存さ れたLys−dch
100pが存在し ，tRN
A認識に関与することが変異体解析によって
明 らかに なった， より詳細 なtR
NA
認識 機構を議論するために，すでに構造解析が行われ て い る 古 細 菌 型 Glu‐ AdTで あ る G伽 Eと tR
NAGk
複 合 体 の立 体 構 造情 報 を 用い ，
GaにAB′tRNAGb
複合 体モデ ルを作成 した． また，小 角X
線 散乱に より作成した複合体モデルの妥当性を評価した，作成した複合体モデルと一次構造比較から，Gat
Bに存在する310タ ーンがtR
NAGlnのU1−A72basepajrを認識することが示唆された．その後，310タ ーンの 変異体を 調製し活 性測定 を行った ところ ，野生型 のG
atC
A
Bは厳密にU
1ーA72basepairのt
RN
Aのみを 認識す るのに対 し，310ターン 変異体 はt
RN
A認識が緩くなり，
G1− C72basepairのtR
NAに も活性 を示した ．以上 の結果か ら，GatC
ABはG
at
Bの310ターンとC
末 端 ド メイ ン の Lysmch
100pの 2カ 所で tRNAGmを厳 密 に 認識し ているこ とが明らかになった．
以 上， 本 研 究で は ， X
線 結 晶 構造解 析により ，tRNA
依存 アミド基 転移酵 素G
atCA
Bの構造・機能を解明し，遺伝暗号の起源と進化について重要な構造科学的基盤を与えた．
本研究が生命科学に及ばす貢献には多大なものがあり，よって審査員一同は，申請者が北 海 道 大学 博 士（ 生 命 科学 ） の学 位 を 授与 さ れる 資 格 ある も の と認 めた ．

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