71●糖化ヘモグロビン（HbA1c）自動免疫測定試薬の開発
バイオサイエンス事業部 開発部 AIA試薬開発G

1.

津浦
三澤
新谷井上

正史
孝一
晃司
益男

測定試薬（ST AIA−PACK HbA1c）を開発したので報はじめに告する。

糖化ヘモグロビン（HbA1c）はヘモグロビン（Hb）が2ステップのnon−enzymaticな反応により糖化した安定な化合物（安定型HbA1c）である。最初の反応では2.

測定原理と材料

ヘモグロビンのβ鎖N末端バリンにグルコースが結合

糖化ヘモグロビン自動免疫測定試薬は、全血検体をし不安定型HbA1c（Schiff base）を生成する。2段階

溶血・変性処理するための前処理試薬と、抗原抗体反目の反応では、結合部位がアマドリ転移より変換され応の場となる免疫反応試薬からなる。前処理試薬は界安定型HbA1cとなる。最初の反応は可逆的であるが、面活性剤を含む弱酸性緩衝液からなり、免疫反応試薬

2段階目の反応は不可逆的であり、2段階の反応を通しはヘモグロビン（HbA1cを含む）を固相化させるためて生成される安定型HbA1cがHbA1cと定義される。この未感作ビーズと酵素標識された抗HbA1c抗体をカッのHbA1cの生体内での寿命は100−120日と言われておプ内に凍結乾燥形態で密封した測定試薬である。本測り、過去1−2ヶ月の平均血糖を反映する

1）〜4）

定原理は、下記に示すようにHbA1cへの酵素標識抗。

HbA1c濃度（HbA1c ／ Total Hb、％）は総ヘモグロHbA1c抗体の結合と未感作ビーズへのヘモグロビンとビン量（Total Hemoglobin）中に占めるHbA1cの割合

HbA1cの競合結合を組み合わせた測定方法である（％）を測定することで決定される。このHbA1c濃度（図１）。の増加は、血中グルコースの平均濃度に依存し、血糖まず、ヘモグロビンは血球内部に存在することと、値のように食前・食後等の日内変動がなく糖尿病患者

HbA1cの抗体結合部位（エピトープ）が立体構造内部の血糖状態を長期的に知る重要なマーカーであり、糖に折りたたまれていることから、溶血・変性処理（前尿病診断及び治療経過観察の指標として必須の項目で処理）が必要であり、前処理試薬をもちいて40℃、205）〜12）ある分間、前処理を行う。その後、前処理済み検体を免疫。

糖尿病患者は、世界で現在約2億4,600万人いるとい反応試薬カップに分注させることにより、凍結乾燥体われ、今後さらに増加傾向にある。そのため糖尿病患は溶解し抗原−抗体反応およびヘモグロビンの未感作者の診断・治療・予防は、今後の医療に最も重要な項ビーズへの結合が開始する。37℃、10分間の反応後、目の1つである。当社では、すでにHPLC法を用いた結合していないヘモグロビン（HbA1cを含む）と酵素

HbA1c測定装置（東ソーグリコヘモグロビン分析計

標識抗体等をB／F分離により洗浄除去し、酵素基質でHLC−723シリーズ）を上市しており、世界的に広くある4−メチルウンベリフェリルりん酸（4MUP）を分販売している。

注後、経時的に蛍光強度を測定し単位時間あたりの4−米国での糖尿病患者人口は約2300万人で、総人口のメチルウンベリフェロン（4MU）の生成量を測定す

約 7.8％ を 占 め る と ADA（ American Diabetesる。基質の蛍光強度は固定化された全ヘモグロビンにAssociation）は公表しており、中小規模施設において占めるHbA1cの割合〔HbA1c（％）〕に依存するため、も糖尿病診断需要がある。しかしながら、これらの中あらかじめヘモグロビンに対して既知の割合〔HbA1c

小施設では糖尿病診断専用装置の導入は経済的でない（％）〕でHbA1cを含む標準品を用いその蛍光強度とことからHbA1cを含む多項目が測定できるシステムにHbA1c（％）による標準曲線を作成し、検体の蛍光強対する要望が強い。そこで、HPLC法とは異なる市場度より未知のHbA1c（％）を算出する。測定の際、前での販売が期待される東ソー自動エンザイムイムノア

処理済み検体のカップへの分注、一定時間下での抗ッセイ装置（AIA−360またはAIA−600II）によるHbA1c

原−抗体反応、B／F分離、基質分注、蛍光強度の測定（ 71 ）72

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

Free

未感作ビーズ
酵素標識抗体Bound

ヘモグロビン（Hb）
検体分注

B／F分離

（抗原抗体反応）＋（ヘモグロビンの固定化反応）

ヘモグロビンA1c（HbA1c）

基質分注

（洗浄）

酵素基質（4MUP）（蛍光測定）

酵素反応生成物（4MU）

図１

HbA1c測定模式図

は全自動エンザイムイムノアッセイ装置により自動で用い、6残基目以降にアミノ基の置換があっても影響行われ、測定開始から約18分後に結果が得られる。前なく測定できる、すなわちこれら異常ヘモグロビンも処理時間を含めると約50分程度で結果が得られること同様に測定できるよう開発を行った。になる。

これらの検討を行った結果、20分の前処理を必要とするものの、既存のAIAシステムに搭載することので3.

きるHbA1c測定試薬を開発することができたのでそのAIA試薬の開発評価結果を以下に報告する。

本試薬の開発にあたっては、最も重要なことは既に上市されている当社HPLC法（東ソー自動グリコヘモグロビン分析計HLC−723G7 バリアントモード、以下G7 Variantと略す）と良好な相関性を有する試薬を開4.

基本性能評価（1）再現性発すること、及び米国での販売を考慮して、NGSP測定内再現性試験、測定間再現性を濃度の異なる3（National Glycohemoglobin Standardization Program）種のEDTA全血検体を用いて行った。使用した3検体に対して適合していることが求められる。

（Low、Middle、High）は1回の測定分を小分け分注

本試薬の特性として、全血検体を用いること、前処し使用まで凍結保存した。20回同時測定による測定内理を要すること、及び変性ヘモグロビン（HbA1cを含再現性試験の結果、各検体の測定値の変動係数

む）を、固定化抗体を用いずに直接固定化するという（coefficient of variation；CV）は、1.8〜2.3％の範囲内既存のAIA試薬とは異なる原理にて測定することが挙であった（表１）。20回（＞90日間）の測定を各4重測げられる。抗原−抗体反応およびヘモグロビン固定化定にて行った測定間再現性試験の結果、各検体の測定条件の最適化、溶血・変性条件の最適化等を実施し、値のCVは、2.7〜4.3％の範囲内であった（表２）。

検体間差の影響の低減に努めた。
また、ヘモグロビンの中には一部のアミノ酸配列が

表１

測定内再現性異なる異常ヘモグロビンが存在する場合がある。国内においては、比較的単一な種族から成り立っていることからあまり例はないものの、米国では多種多様な種族から成り立っていることもあり、比較的多く存在することが報告されている。本測定試薬は主に米国でのSampleHWB−Low
HWB−Middle
HWB−High

Mean
Pooled SD［HbA1c％］
［％］
5.4
0.112
8.20.151
13.10.304

Coefficientof Variation［％］
2.1
1.82.3

販売を考えており、異常ヘモグロビンも通常ヘモグロビンと同様に測定できることが求められている。主な
表２

異常ヘモグロビンとして、異常ヘモグロビンSはβ鎖測定間再現性

6残基目Glu→Val13）、異常ヘモグロビンCはβ鎖6残基
目Glu→Lys14）、異常ヘモグロビンEはβ鎖26残基目

15）

Glu→Lys 、異常ヘモグロビンDはβ鎖121残基目Glu→Gln16）

等が挙げられる。本測定系においては、β鎖N末端糖化バリンから5残基目までを認識する抗体を（ 72 ）

SampleHWB−Low
HWB−Middle
HWB−High

Pooled SD
Mean［％］［HbA1c％］0.201
5.40.225
8.20.565
13.1

Coefficientof Variation［％］
3.7
2.74.3

東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）（2）検量線と最小検出感度73

表４

HbA1c標準品（6濃度）を測定し作成した検量線直線性試験結果

Expected Value Observed Value Recovery［HbA1c ％］ ［HbA1c ％］ ［％］Low：High
100.0
3.4
3.4
Low Undiluted
97.8
4.5
4.6
9：1
100.0
5.8
5.8
8：2
98.6
6.9
7.0
7：3
97.6
8.0
8.2
6：4
101.1
9.5
9.4
5：5
101.9
10.8
10.6
4：6
103.4
12.1
11.7
3：7
104.7
13.5
12.9
2：8
102.8
14.5
14.1
1：9
100.0
15.3
15.3
High Undiluted（検量範囲は2.0〜16.0％）を図２に示した。また、最小検出感度（MDC）を標準品Calibrator（1）を20回測定し、蛍光強度の平均値＋2×SDに対応する濃度を検量線より濃度換算することにより算出した。本測定
試薬6ロットを用いてMDCを求めた結果、0.5％以下となり、本測定試薬の目標とする検量域下限である2.0％を十分に達成する結果を得た（表３）。

Y ＝ Ax 3 ＋ Bx 2 ＋ Cx ＋ D
Rate
50.0
40.0

Func［A］＝1.360741e−02
Func［B］＝3.755202e−01
Func［C］＝4.730935e−01
Func［D］＝4.558346e−01

抗凝固剤としてはEDTA、解糖系停止物質としてNaFを各々表２に記載の濃度まで添加し、本測定試薬にて測定した。未添加EDTA全血検体に対して測定値はい30.0

ずれも±10％以内の変動であり、これら物質による影
20.0

響は添加量上限まで認められないと判断した（表５）。
また、修飾ヘモグロビンに対する影響を確認した。

10.0

不安定型A1cの影響はEDTA全血検体にグルコースを5.0

10.015.0

1,000 mg／dLまで添加したもの、カルバミル化ヘモグ

Conc

ロビンの影響はシアン酸ナトリウムを50 mg／dLまで
図２

検量線添加したもの、アセトアルデヒド化ヘモグロビンはアセトアルデヒドを50 mg／dLまで添加したものを、

表３

各々37℃、4時間インキュベートして測定した。未添

最小検出感度(MDC）加EDTA全血検体に対して測定値はいずれも±10％以
HbA1c
MDC
免疫反応試薬 lot＃ ［HbA1c％］
GZ15759
0.19
H115760
0.36
H115761
0.46
H1157620.28
H6157640.28
H6157650.27内の変動であり、これら修飾ヘモグロビンの影響はみとめられないと判断した（表６）。

表５（3）希釈直線性試験
Total Hb濃度を14.0 g／dLに調整した低濃度サンプル（HbA1c＝3.4％）と高濃度サンプル（HbA1c＝15.3％）を任意の割合で混合し混合サンプルを用い3共存物質および抗凝固剤影響

遊離型ビリルビン
抱合型ビリルビン
脂質
ヒト血清アルビミン
アスコルビン酸
EDTA
フッ化ナトリウム

添加量16181,60050201010［mg／dL］［mg／dL］［mg／dL］［mg／mL］［mg／dL］［mg／mL］［mg／mL］

重測定を行った。混合サンプル各々の理論値に対して測定値回収率は97.6〜104.7％の範囲内であり、HbA1c濃度3.4〜15.3％の範囲において良好な直線性性能を有していることが認められた（表４）。
（4）共存物質および修飾ヘモグロビンの影響
検体中に含まれる可能性のある各物質を高濃度でEDTA全血検体へ添加し、測定値への影響を確認した。
共存物質としては遊離型ビリルビン、抱合型ビリルビン、脂質、ヒト血清アルブミン、アスコルビン酸を、（ 73 ）

表６

修飾ヘモグロビンの影響

修飾ヘモグロビン［mg／dL］
グルコースシアン酸ナトリウム ［mg／dL］
アセトアルデヒド ［mg／dL］

添加量1,0005050

注：各添加物をEDTA全血サンプルと混合した後、37℃、 4 時間インキュベートし、修飾ヘモグロビン検体とした17），18）。

74

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）（5）国際標準品の測定

いて本測定試薬の１次標準品濃度をNGSPに適応させ

HbA1cの標準化は主に３極化しており、欧州：た。

IFCC（International Federation of Clinical Chemistry

IFCC（％）とNGSP（％）の相関式

and Laboratory Medicine）、日本：JDS（日本糖尿病

NGSP（HbA1c％）＝ 0.915 × IFCC（HbA1c％）
＋2.15

学会）
、そして米国：NGSP（National Glycohemoglobin
Standardization Program）がある。米国での販売を目その結果、HbA1c Calibrator SetのLot Melbourne的としていることから、NGSPに準拠していることが2007のNGSP変換値との適合率は97.7〜101.5％と良好必要である。しかしながらNGSPの直接的な標準品がな結果であり、本測定試薬は米国で用いられるNGSP存在しないことから、IFCC HbA1c Calibrator Setの（％）に適応していることを確認した（表７）。
また、図３に本測定試薬標準品のトレーサビリティ

Lot Melbourne 2007を基準物質 （Reference Material）とすることとした。IFCC（％）とNGSP（％）の相関ーフローを示した。

式は以下のような式で示されることが公表されてお（6）HPLC法との相関

19）
, 20）

、

EDTA全血検体117検体を本測定試薬とG7 Variant

IFCC HbA1c Calibrator SetのLot Melbourne 2007を用で測定し、測定値の比較を行った結果、G7 Variant

り、NGSP（％）への変換が可能であることから

表７IFCC Cal Level 1
IFCC Cal Level 2
IFCC Cal Level 3
IFCC Cal Level 4
IFCC Cal Level 5
IFCC Cal Level 6
IFCC Cal Level 7
IFCC Cal Level 8

IFCC HbA1c Calibrator Set測定値

IFCC表示値
NGSP換算値
測定値
測定値／NGSP換算値［HbA1c IFCC ％］［HbA1c NGSP ％］ ［HbA1c NGSP ％］Recovery［％］
5.0
4.9
98.0
3.1
5.8
5.798.3
3.9
6.8
6.9
101.5
5.1
8.1
8.1
100.0
6.5
9.1
9.0
98.97.6
10.1
10.1
100.0
8.6
10.5
10.5
100.0
9.1
12.9
12.6
97.7
11.8

ST AIA−PACK HbA1c CALIBRATOR SET Traceability Chain
Methods

Calibration
Assignment

Materials

Reference material（IFCC HbA1c Calibrator
set Lot Melbourne 2007）
を用いてNGSP（％）に適合していることを確認
NGSP（HbA1c％）＝0.915×IFCC（HbA1c％）＋2.15

TOSOH HbA1c 1次標準品
TOSOH HbA1c 2次標準品はTOSOH HbA1c1次標準品よりAIA装置を用いて値を設定する。

TOSOH HbA1c 2次標準品

TOSOH HbA1c 製品標準品はTOSOH HbA1c2次標準品よりAIA装置を用いて値を設定する。
TOSOH HbA1c 製品標準品

図３

HbA1c標準品トレーサビリティフロー（ 74 ）

東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）

75（x）と本測定試薬（y）間の、相関係数（r）は0.992、られるフッ化ナトリウム（NaF）入りEDTA全血の2回帰係数は1.056、y切片は-0.183と良好な相関性が認タイプの採血管が主として用いられる。そこで、本測められた（図４）。

定試薬においても同時に同一人物から採取したEDTA（7）EDTA全血とフッ化ナトリウム（NaF）入り全血とNaF入りEDTA全血を用いて相関性試験を行っ

EDTA全血た結果（EDTA全血（x）、NaF+EDTA全血（y））、63

HbA1cの測定はEDTA全血と血糖測定時によく用い例での相関係数（r）は0.992、回帰係数は0.985、ｙ切片は0.070と良好な相関性が認められた（図５）。したがって、本測定試薬はNaF入りEDTA全血を用いても16

EDTA全血と同等な測定値を与える試薬であることを

y ＝ 1.056x − 0.183
r ＝ 0.992
n ＝ 117

確認できた。
（8）異常ヘモグロビンを含む検体の測定
異常ヘモグロビンの主たるタイプのである異常ヘモ

本測定試薬［HbA1c ％］12グロビンSおよびCが通常タイプのヘモグロビンと同様の反応性を示すこと確認するために異常ヘモグロビ
ンSおよびCを含む検体を本測定試薬とG7 Variantに8て測定し測定値を比較した。その結果、G7 Variantに対して±20％以内であった（表８）。
（9）貧血検体の測定
ヘモグロビン（Total Hb）濃度は、健常人で12〜184481216

G7 Variant［HbA1c ％］g／dLであるが、貧血検体の場合にTotal Hbは＜10 g／dLと低くなることがあり、測定結果への影響が懸念される。そこで本測定試薬におけるTotal Hb濃度の影

図４

ST AIA−PACK HbA1cとG7 Variantとの相関図

表８Specimen I.D.
A／S Variant 001
A／S Variant 002
A／S Variant 003
A／S Variant 004
A／S Variant 005
A／S Variant 006
A／S Variant 007
A／S Variant 008
A／S Variant 009
A／S Variant 010
A／S Variant 011
A／S Variant 012
A／S Variant 013
A／S Variant 014
A／S Variant 015
A／S Variant 016
A／S Variant 017
A／S Variant 018
A／S Variant 019
A／S Variant 020
A／S Variant 021
A／S Variant 022
A／S Variant 023
A／C Variant 001
A／C Variant 002

響を確認した。入手した貧血検体を含む91検体

異常ヘモグロビンSおよびCの測定

G7 Variant［HbA1c ％］
5.4
5.9
6.4
4.4
5.9
10.6
6.1
5.0
6.6
6.8
6.0
5.9
6.3
6.0
4.1
5.5
4.3
6.0
4.9
5.0
7.2
5.2
5.1
6.1
5.0

本測定試薬
［HbA1c ％］
6.0
6.2
6.2
5.0
6.6
10.4
7.0
5.5
6.9
7.0
6.2
6.3
6.2
6.3
4.6
5.5
5.0
6.3
5.5
5.3
7.7
5.4
5.6
6.5
5.6（ 75 ）本測定試薬 ／ G7 Variant
Recovery ［％］
111.1
105.1
96.9
113.6
111.9
98.1
114.8
110.0
104.5
102.9
103.3
106.898.4105.0112.2
100.0
116.3
105.0
112.2
106.0
106.9
103.8
109.8
106.6
112.0

76TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

標準品濃度を設定しており、また、G7 Variantとの相EDTA with NaF whole blood［HbA1c ％］12関性試験も良好な結果を示した。異常ヘモグロビン

y ＝ 0.985x ＋ 0.070
r ＝ 0.992
n ＝ 63（タイプSおよびC）、貧血検体の測定結果においても
G7 Variantに対して±20％以内であった。

10

本測定試薬は、スクリーニング・治療・経過観察における診断薬として十分な性能を有しており、AIAシステムの利便性を考えると中小規模施設での運用に大8いに活躍することが期待できる。

6

文献１）Mayer TK., et al, Clin. Chem. Acta.,127, 147（1983）.

44681012２ ） Bunn H. F., et al, Biochem. Biophysi. Res.

EDTA Whole Blood［HbA1c ％］Conmun., 19, 103（1975）.
３）Bunn H. F., et al, J. Clin. Invest.., 57, 1652（1976）.

図５

EDTA全血とフッ化ナトリウム（NaF）入り
EDTA全血の相関図

４）Baynes J. W., et al, Diabetes Care, 7, 602（1984）.
５）Rochman H., et al, Ann. Clin. Lab. Sci..,10, 111％ Bias［本測定試薬／G7 Variant］（1980）.
６ ） Diabetes Control and Complications Trial

40

Research Group, N. Engl. J. Med.., 329, 977

20（1993）.
0７）Larsen ML., et al, N. Engl. J. Med.., 323, 1062（1990）.

−20８）Koenig R. J.,et al, Diabetes., 25, 230 (1976).

−40681012141618９）Nathan D. M., et al, N. Eng. J. Med., 310, 341

Hemoglobin Concentration［g／dL］（1984）.
10）DCCT Reseach Group., N. Eng. J. Med.., 329, 977

図６Total Hbの影響（1993）.
11）Larsen M. L., et al, N. Eng. J. Med., 323, 1021
（1990）.

（ Total Hb濃 度 ： 6.9〜 16.0 g／dL） を 用 い て 、 G7
Variantと本測定試薬にて測定した。その結果、すべ12）Nathan D. M., et al, N. Eng. J. Med.., 323, 1062
（1990）.ての本測定試薬の測定値はG7 Variantと比較して±13）Ingram V. M., et al, Biochem. Biophys. Acta., 36,20％以内であった（図６）。

402 （1959）.
5.

14）Hunt J. A., et al, Biochem. Biophys. Acta., 42, 409

ま と め（1960）.

今回開発したHbA1c測定試薬について基本性能は、

15）Hunt J. A., et al, Biochem. Biophys. Acta., 49, 520（1961）.

測定内再現性は、2.3％以内、測定間再現性は4.3％以内と良好であり、最小検出感度は0.5％以下、検量線

16）Harano T., et al, Hemoglobin, 11, 177（1987）.の直線性は3.4〜15.3％の範囲で良好な直線性を示し

17）Tetsuo M., et al, JJCLA., 23, 691（1998）.

た。検体中の共存物質や抗凝固剤の影響がないこと、

18）田端介富、機器・試薬、20、274 （1997）.

EDTA全血とフッ化ナトリウム（NaF）入りEDTA全19）Gas W., et al, Clin. Chem., 54, 240（2008）.

血の両検体を同等に測定可能なことが確認され、また20）Andrea G., et al, Clin. Chem., 54, 1379（2008）.

修飾ヘモグロビンの影響もないことが確認された。
また、本測定試薬はNGSP（％）に適合するように（ 76 ）