博 士 （ 医学 ） 深谷 進 司
学 位 論 文 題 名

TNFぱ変換酵素の過剰発現が炎症・線維化病態に及ぼす影響について
学位論文内容の要旨【 背 景 と 目 的 】TNFa
変 換酵 素(TACE)は ADAMファ ミリ ーに 属す るI型 膜蛋 白で ，免 疫や発生・分化 に関わる多様な膜型蛋白を細胞膜から切断し，可溶型蛋白に変換する酵素である ， TACEは prodomainを 含 む 約 120kDaの 非 活性 型と して 産生 され た後 ，furinに より
prodomainの切断を受けることによって 約lOOkDaの活性型となり，細胞膜表面に運ばれ基質と接触し ，酵素としての機能を発揮する．実験的に関節炎モデル やL
PS投与による急性
肺 障害 モデ ル， ブレオマイシン誘 導皮膚硬化モデルなどでTACE阻害薬の有効性が認めら
れ るこ とや ヒ トでは発症早期強 皮症患者の末梢血単球におけるTACEの発現亢進と治療による発現 低下が報告されていることから，TACEの過剰発現または活性化の亢進が関節リウマチや強 皮症などにおける炎症・線維化病態に関わっている可能性が示唆される．本研
究では，TACEの炎症性疾患や線維化病態への関与を明らかにするために，TACEを全身臓器で 過 剰 発 現 す る TACE遺 伝 子 導 入 マ ウ ス (TACEー Tg)を 作 製 し ， 解 析 を 行 っ た ．
【 材料 と方 法】 マウス由来の全長 TACE cD
NAの3′側にFLA
G夕グを付加したコンストラク
トをローactin
プ口モーターにより全身発現させたT
ACE一Tgを作製した．対照には同週齢の野生型マウ ス(WT)を用いた．マウスの各臓器または培養細胞におけ るTAC
E，I型コラーゲン ，Q SMAの m
RNA発現をりアルタイムRT一PCR法で測定した．蛋白発現の評価として．抗TACE
抗 体と 抗FLAG抗体を用いてwestern blottingを行った．TACE
活性はキットを用いて測定した． TACE―TgおよびW
Tの背部皮膚から初代線維芽細胞を培養し，PMA LPS，ブレオマ イシ ン， lYSOPhOSPhatidic acidで刺 激し ，TAC
E活性型への変化をwestern blottingで調べた．
PMA (0. 08肛g/100UlPBS)
をTACE−TgおよびWTの背部皮下2か所に投与し，1日後と7日後に犠牲死させ，投与部位の 皮膚の一方から組織標本を作製し，もう一方からRNA抽出 また は蛋 白抽 出を 行っ た， 皮膚 HE
標 本に つ いて ．投 与部 位と その中心から1cm離れた周囲 の正常部位で真皮厚を計測した，TACEーTg
およびWTの培 養線維芽細胞をP
M
A刺激 した 後に りア ルタイムRT―PC
R法でI型コラーゲンおよびaSMA発現の変化を測定した．
【 結果 】6週 齢の T
ACEーTgの各 臓器 にお ける TA
CE mR
NAの発 現は WT
よ りも高く，導入遺伝子由来蛋 白の発現がT
AC
E−Tgの全身臓器で確認された．導入遺伝子由来TAC
E
蛋白は主とし て約 120kDaの 非活 性 型と して 検出 され た．6週齢のT
AC
E―Tgの全身組織をWTと比較した が， 明ら かな 組織学的違いは認 められなかった．導入遺伝子由来のTACEが活性を持つことを確認 するため TAC
E―Tgの皮膚と筋肉の組織抽出液にfurinを反応させたところ・
無 刺激 時に TA
CE活性 は T
ACE―TgとWTで同 程度であったが，TAC
E−Tgではfurin濃度依存的に活性型 に変換され それに伴い酵素活性も有意に上昇した．Furinに代わる生体内に投与可能な 刺激物質を探索するため，培養線維芽細胞を各種物質で 刺激したところ．PMAが 最も 強く TACEを活性型に変換し た．P
MAの個体レベルでの作 用を調べるため，PMAをマウスに皮下 投与した，PMA
投与後の皮膚 ではt
1日目のTAC
EーTgにおしゝてTACEが活性型にー 176―

変換されてい ることが確認された．7
日目 には活性型TAC
Eの量は投与前のレベルに戻ってい た． PM
A投与後1日目の皮膚では，皮下組織に強い好中球浸潤が見られた ものの，炎症細 胞の 種類や浸潤 の程度にはTACE−TgとWTでは明らかな差は認めなかった ．PMA
投与後7日目では真皮 が肥厚し，皮下組織には瘢痕状の線維化が誘導された． PM
A投与周辺の正常部位の真皮厚 に対するP
MA
投与部の真皮厚 の比を計測したところ，TACEーTg
ではWTに比べて 有意 に高 い値 であ った ， 同様 に7日目の皮膚におけるI型コラーゲンとa SMAの発現を
TA
CE―TgとWTで比較したところ，統計学的な有意差は認められなかったもののTA
CE―Tgで高 い傾 向を示した ．皮膚線維芽細胞におけるTACEの量的な差がTA
CE−TgとWTの組織学的変 化の 差を 生じ させ たこ と を裏 付けるために ，初代培養線維芽細胞をP
MA 20 nMおよび1300 nMで刺 激し ，I型コ ラ ーゲ ン，aSMAのmRNA発現を検討した，その結果，I型コラーゲ ン に つい ては T
ACE−Tg由来 線維 芽細 胞に おい てPMAの濃 度依 存的 に発 現が 亢進 し，
1300nMでは無 刺激と比較して有意差を認めた，このことから，皮膚線維芽細胞のTACEの過剰 な 発 現 と 活 性 化 が I型 コ ラ ー ゲ ン 発 現 に 促 進 的 に 働 く こ と が 示 唆 さ れ た ．
【考察】TA
CE―Tgは強皮症あるしゝは関節炎モデルになることが期待されたが，作製したTACE―Tg
は無 刺激時には固有の表現型を示さなかった．無刺激状態では導入遺伝子由来のTA
CEはほとん どが非活性型として組織中に存在しており，酵素活性もWTと同等であった．
このことが TACEーTgとWTに明らかな表現型の差が表れなかった原因と考えられた，Furinに 代わ る生 体に 投与 可能 な T
ACE活性化刺激を 検討したところ，PMAが最も 効率良くT
ACEを 活性 型に 変換 する こと が 分か った P
MAをマ ウス に皮 下 投与 したところ，1日目のTAC
E活 性化 に引き続い て7日目には皮膚線維化が誘 導された．これまでにPMA
刺 激を皮膚線維化誘導物質と して用いたモデルはなく，本研究で初めて単回のPMA投与で皮膚線維化を誘導 でき ること，ま た，この系においてTAC
Eが線維化に促進的に関与するこ とを示した，
PMA皮下 投与 によ るTAC
E― Tgと WTの 皮膚線維化の程度の違いは線維芽細胞 におけるTAC
Eの 量的 な差 とそ れに よる 基 質切 断の 差か ら生 じた と考 えら れた，具体的 にどのようなTACE
基 質が関わっ ているかは現段階では不明であるが，線維化病態に関わ るTAC
E基質を介したシグナ ル経路の候補のひとっとして，EGFレセプターリガンドがTACE−Tgで過剰となり，線維芽 細胞の増殖あるいはI型コラ ーゲン発現に影響した可能性が考えられる．複数 のEGFレセ プタ ーリ ガン ドが TA
CEで切 断さ れる こと が 知ら れており，切断されたEGF
レ セプ ター リガ ンド が線 維 芽細 胞上に発現す るE
GF
レセプターにau
tocrine，paracr
ineに作用し 細 胞外マトリックスの産生や増殖が促進される可能性が考えられる．具体的に
ど の よ う な EGFレ セ プ タ ー リ ガ ン ド が 関 与 す る か を 今 後 さ ら に 検 討 し た い ．
【結諭】TA
CEを全身臓器で過剰発現するTACEーTgを作製した．通常の飼育環境下では導入遺伝子由来の TACEが活性化されないため，TACEーTg
固有の表現型が観察されなかったが，PMA刺激によりTACE活性化が誘導され 新 たな皮膚線維化モデルを作製できた、このモデ
ル を用 いることに より，皮膚線維芽細胞におけるTACEの過剰な発現と活性 化が皮膚の線維化に対して 促進的に作用することが明らかとなった，ー 177―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 西 村 正 治
副 査 教 授 笠 原 正 典

学 位 論 文 題 名

TNFば 変換酵素の過剰発現が炎症・線維化病態に及ぼす影 響について
TNFa変換酵素(TACE)は AD
AMフ ァミ リーに 属するI型膜蛋 白で、 免疫や発 生・分 化に関わる多様な膜型蛋白を細胞膜から切断し、可溶型蛋白に変換する酵素である。ヒトでは発症 早期強 皮症患者 の末梢 血単球に おけるTACEの発現亢進と治療による発現低下が報告されているが、病態におけるTACEの役割は不明な点が多い。
本研究では、TACEの炎症性疾患や線維化病態への関与を明らかにすることを目的とした。
研 究には 、マウス 由来の 全長TA
CE c
DNAの3′側にFLA
G夕グを付加したコンストラクトを
ロ‑actinプロモーターにより全身発現させたTA
CE―Tgを作製し、対照には同週齢の野生型
マ ウス(WT)を 用い解析 を行っ た。6週齢のTA
CEーTgの各臓器におけるTA
CEm
RN
Aの発現は
WTよりも高く、導入遺伝子由来蛋白の発現がT
AC
E−Tgの全身臓器で確認された。導入遺伝
子 由来TACE蛋 白は主と して非 活性型と して検出され、このことがTAC
E―TgとWTに明らかな表現型の差が表れなかった原因と考えられた。
導入遺伝子由来のTACEが活性を持つことを確認するため、TACEーTgの皮膚と筋肉の組織抽出 液にfurinを反応 させた ところ、 TACE―Tg
ではfurin
濃度依存的に活性型に変換され、そ れに伴 い酵素活性も有意に上昇した。Furinに代わる生体内に投与可能な刺激物質として PMAに 着 目 し 、PMA (0. 08ug/100ul PBS)
をT
ACEーTg
およ びW
Tの背部 皮下2か所に 投与 し、1日後と 7日後 に犠牲 死させ、 投与部位の皮膚の一方から組織標本を作製し、もう一 方から RNA抽出または蛋白抽出を行った。皮膚HE標本について、投与部位とその中心から1 cm離れた周囲の正常部位で真皮厚を計測した。PMA
投与後の皮膚では、1日目のTACEーTgに おいて TACEが活性型 に変換 されてい ること が確認さ れた。 7日目には活性型TACEの量は 投与前 のレベル に戻っ ていた。 PMA
投与後1日目の皮膚では、皮下組織に強い好中球浸潤が見られたものの、炎症細胞の種類や浸潤の程度にはTACE―TgとWT
では明らかな差は認め なかっ た。PM
A投与後 7日目 では真皮 が肥厚し、皮下組織には瘢痕状の線維化が誘導され た。PM
A投与周 辺の正 常部位の 真皮厚に対するPMA
投与部の真皮厚の比を計測したところ、TAC
EーTgではWTに比べて有意に高い値であった。
同 様に7日目の 皮膚にお けるI型コラ ーゲン とa S
MAの 発現を T
ACE―Tgと町で比較したところ、統計学的な有意差は認められなかったもののTACE―Tgで高い傾向を示した。皮膚線維 芽細胞 における TAC
Eの量的 な差がTA
CE―TgとWTの組織学的変化の差を生じさせたことを 裏付け るために 、初代 培養線維 芽細胞を P
MA 20 nM
お よび1300 nMで刺激し、I型コラ― 178−

ー ゲン、a SM
AのmRNA発現を検討した。その結果、I型コラーゲンについてはT
A
CE−Tg
由来線維芽細胞においてPMAの濃度依存的に発現が亢進し、1300nM
では無刺激と比較して有意差を認めた。このことから、皮膚線維芽細胞のTACEの過剰な発現と活性化がI型コラー
ゲン発現に促進的に働くことが示唆された。本研究で初めて単回のPMA投与で皮膚線維化を誘導できること、また、この系においてTACEが線維化に促進的に関与することを示した。
PMA皮下投 与によ るT
ACE−TgとWTの皮膚線 維化の程度の違いは線維芽細胞におけるTACEの量的な差とそれによる基質切断の差から生じたと考えられた。線維化病態に関わるTACE
基質を介したシグナル経路の候補のーつとして、EGFレセプターリガンドがTACEーTgで過剰となり、線維芽細胞の増殖あるいはI型コラーゲン発現に影響した可能性が考えられる。
複 数のEG
Fレセプ ターリガンドがT
AC
Eで切断されることが知られており、切断されたE
GF
レ セプター リガン ドが線維 芽細胞上 に発現 するE
GF
レセプターにau
tocr
ine、paracrineに作用し、細胞外マトリックスの産生や増殖が促進される可能性が考えられる。以上から、
本 研究によ り皮膚 線維芽細胞におけるTACEの過剰な発現と活性化が皮膚の線維化に対して促進的に作用することが明らかとなった。
質疑応答では、副査の笠原正典教授より、PMA投与局所でのTA
CE
活性、組織切片上の線維化の測定法、PM
A投与部でのTA
CE基質の変化、ヒト強皮症患者の皮膚におけるTA
CE活性について、副査の西村正治教授からは、TA
C
E―Tgとヒト強皮症の線維化病態との類似点・相違点、PMA投与部での線維化の範囲、肺でTACEを多く発現している細胞がなにかの質問があった。主査の小池隆夫教授からは、ヒト強皮症の単球でみられたTA
CEの高発現とTA
CE―Tgを用いて示したT
A
CEの向線維化作用のっながりをどう考えるか、炎症・線 維化病態 におい てT
ACE阻害を行うことの展望についてどう考えるかについて質問があ っ た 。 い ず れ の 質 問 に 対 し て も 、 申請 者 は概 ね 適切 に 回答 し た。
この論文は、T
AC
Eの誘導型高発現モデルを新規に作製し、線維化促進作用をI
nvivoおよびIn v
itroで 解析したことが高く評価され、今後のTAC
E基質の病態における役割の解析やTACEをターゲットとした治療応用が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申 請者が博 士（医 学）の学 位を受 けるのに 充分な資 格を有 するもの と判定した。

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