博士 （生命 科学）賀 川裕貴
学 位 論 文 題 名Patched細胞質断片の生成を介した新規発癌抑制機構に関する研究
学位論文内容の要旨
Patchedは 、細胞の分化と増殖 をコン卜口―ルする細胞外分 泌蛋白質Sonic Hedgehog (shh)の12回膜 貫通 型レセプタ―蛋白質で ある。Patchedが機能不全を 起こすと胚性致死になるこ とが知られており、生 物の初期発生に必須の蛋白質 であると考えられている。また、Patchedはヒトにおい て皮 膚癌 の中 でも 世 界で 最も 罹患 患者数の多い基底細胞癌 (Basal Cell Carcinoma)や 、脳腫瘍(Medulloblastoma)等の癌の抑制遺伝子としても知られており、Patchedの変異によってこれらの癌が発症するこ とが明らかとなっている。
今日 まで 、Patched研 究は 主 に形 態的な発生遺伝学の分野 で進められてきたが、近年Patchedの 蛋 白 質 と し て の 重要 性に 着 目し た生 化学 的 解析 が進 みつ っあ り 、そ の結 果shhを 受容 する
Patched細胞 外 領域 の機 能が 明 らか になってきた。しかし、 Patched細胞内領域の機能は 全く明らかとなってい ない。嶋田らはこれまでにPatched線虫ホモログのひとつであるTR
A一2において、第 7細胞 質ド メイン(ICD7)が膜直 下で切断され、核内移行する ことでシグナルを核内に伝 達していることを明ら かにしたが、哺乳動物におい て同様の現象が起こるかは 不明であった。さらに、
BCC発 症 患 者 の Patched解 析 に よ り 、 Patched ICD7の1アミ ノ酸 置 換が BCCの原 因と なっ ていることが報告さ れているが、発癌に至る機構 は明らかでない。
本研 究で は、以上の知見よりPatched ICD7の重要性に着目 し、ヒト培養細胞を用いてPatched
ICD7の機能を解 析した。その結果、Patched ICD7がりン酸化、プロセシ ングを受け、その切断断片 が核 内に 移行することを新しく 見出した。さらに第7細胞質 ドメインに核移行性蛋白質 であるp32が結合し、Patched ICD7切断断片の核移 行を調節しているという新知見を得た。また、報告されている発癌性 点突然変異により、Patched ICD7の安定性が低下し、そ のことが起因となって発癌因子である核 内転写因子Glilが活性化する ことも発見した。
まず、Patchedの機能 を解析する目的で、ヒト全長 Patched遺伝子を発現ベクタ ーにクロ一二ングし 、シ ング ルコピーをHeLa細胞遺伝子 に導入することで、Patchedの安定発現細胞株を構築した。 その 結果 、 分子 量150kDaの 全長 Patchedの発 現を 確認 す ると 同時 に、 C末 端タ グにのみ反応する断片が生成してい ることが明らかとなった。 N末端とC末端それぞれのタグ で免疫染色したとこ ろ、 PatchedN末 端と C末 端で は細胞 内局在パタ―ンが異なり、N末端側は細胞質にドット状に分 布す る一 方で、C末端側は核内に移行 していることが明らかとな った。同様の結果は細胞分―1481―

画 でも 確認 で きた 。ま た、 Patched ICD7C末端 20ア ミノ 酸 を抗 原と する 抗体 を 用いて、内在性Patchedの C末 端 を 観 察 し た と こ ろ 、 同 様 に 核 に 蓄 積 し て い る こ とも 確認 され た 。生 成す るPatchedC末 端 断片 の分 子 量は ほぼ ICD7の大 き さに 相当 する こ と、 また 断片 のほ ぼ 全量 が核 内に 移行 して い るこ とか ら、 全 長Patchedのプロセシ ングにより生じたICD7相当断 片が核内に移行し てい るも の と考 えら れる 。 線虫 TRA− 2の ICD7断 片は 転写因子TRA一1の活性を 直接調節しうること、ま たPatchedの下流ターゲット としてTRA―1ホモ口グのGlilが同定されていることから、一番 可 能 性 が 考 えら れる の が、 PatchedC末端 断 片が 癌原 性転 写 因子 Glilと相 互作 用 する こと である。そ こで、Glilをターゲットにしたレポータ一解析を行った。P
atche
d安定発現細胞株でGlilの活 性が 抑制 さ れる と同 時に 、 Patched ICD7断片 の みの 発現 でも 全長 Patchedと 同程度Glilの活性を抑制 することが明らかとなった 。この結果は、Patched ICD7の核内タ―ゲットがGlilであることを示し ている。
Patchedは常 時プ ロ セシ ング を受けるわけではな く、その調節には何らかのシ グナルが必要であること が考えられた。そこでPatched ICD7を過剰発現させ、解析したところ、リン酸化を受けていること が明らかとなった。また、各種変異体を作成することによって、リン酸化修飾を受けない変異 体を 作成、観察したと ころ、PatchedC末端断片の 生成が確認できず、全長のま ま発現していることが確 認された。これにより、Patchedはりン酸化修飾を受けることによって、そのプロセシングが調節さ れていることが明らかとな った。
生 成 す る PatchedC末 端 断 片 に は 核 移行 シグ ナル (NLS)配 列 は確 認で きな い。 そ こで 、何 らか のり クル―ト蛋白質と 結合し、核内に輸送されて いるのではないかと考え、PatchedC末端断片と 免 疫 共 沈 降 する 蛋白 質 をア ミノ 酸配 列分 析 によ り同 定し た 。そ の結 果、 NLSを有 する p32とPatchedC末端断片が結合することが 明らかとなった。
現在 、多 く のPatchedヒ ト発 癌性変異が報告され ているが、その中でも発症機 構が不明である
ICD7の 1ア ミノ 酸置 換 型変 異体 に着 目し て 解析 を行 った 。 Patched ICD7蛋白 質 をHeLa細胞内で発 現さ せたところ、1311番、あるいは1315番のロイ シンがプロリンに置換された 発癌性点変異体
で は発 現量 が 低下 し、 MG132や 、リソソ―ム阻害剤 であるロイペプチン処理によ って発現量が回復するこ とが明らかとなった。
さら に、 こ の発 現量 の低 下 がPatched ICD7の 不 安定 化に由来するものか確認 するためにシク
口ヘキシ ミド(CHX)処理し、チェイス 実験を行ったところ、ICD7ヒ卜発癌性変異体の安定性が正常型 (WT)と比 較 して 低下 して い ることが確認された。 このことは、BCC患者の発癌 にPatched ICD7の不安定 化が関与していることを示 唆する。
以上 の結 果 から 、Patchedヒ ト発 癌性 変 異体 では 生成 するC末端断片の安定性 が低下することに より 癌原 性 遺伝 子産 物Glilの抑 制機 能を 失い 、 結果 として発癌に向かう可能 性が示された。
PatchedC末 端 断片 には 未 知の 発癌 抑制 機能 が 存在 する 可能 性 が非 常に 高く 、こ の 機能 を解 析
す るこ とで Patched ICD7の 発 癌性 変異 由来 のBCC患 者の 新 規治 療タ ーゲ ット を 提案できると考えている 。

‑ 1482―

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授 有賀寛芳
教授 松田 正講師 米田 宏教授 川原裕之（首都大学東京
大 学 院 理 工 学 研 究 科 ）学位 論文題名Patched細胞質断片の生成を介した新規発癌抑制機構に関する研究P
atc
hedは、細胞の分化 と増殖をコントロ ールする細胞外分 泌蛋白質Sonic Hedgehog (shh)の12回 膜貫通型レセプタ ー蛋 白質であり、 生物の初期発生に 必須の蛋白質である と考えられている 。また、Patc
hedは基底細胞 癌や、脳腫瘍等の 癌の抑制 遺伝子としても知 られている。また 、SrLhを受容するPat
ched
細 胞外領域の機能が明 らかになってきたが、P
atc
hed
細 胞内 領 域の 機能 は 全く 明ら か とな って い ない。嶋 田らはPatc
hed線虫ホモ口グ のひとつであるTRA‑2が第7細胞質ド メイ ン(ICD7)が 膜直 下 で切 断され、核内移行 し核内にシグナル 伝達することを明ら かにしたが、哺乳 動物での機能は不 明で あっ た 。ま た、 BCC
発 症 患者 のPatched解 析に より 、 Patched ICD7の1アミノ酸置換が B
CCの原因 との報告があるが 、発癌に 至る機構は明らか でない。
本研 究では、Patc
hedI
CD7の重要性に着目し、ヒト培養細胞を用いてPatchedI
CD7の機能を解析した。その結果、Patc
hed
ICD7が り ン酸 化、 プ ロセ シン グ を受 け、 そ の切断断 片が核内に移行す ることを新しく見 出した。さらに第7細胞質ド メ
イ ンに核移行性 蛋白質であるp32が結合し、 P
atch
ed IC
D7
切断 断片の核移行を調節 しているという新 知見を得た。また 、報告さ れている発癌性点 突然変異により、 P
atched IC
D7の安定 性が低下し、その ことが起因となっ て発癌因子である核内転写因 子Glilが活性化す ることも発見した 。
まず 、 Patche
dの 機能 を解析す る目的で、ヒト全長 P
atched遺伝子を発現ペクタ ーにクローニング し、シングルコピ ーを He
La細 胞遺 伝子 に 導入 する こ とで 、Patchedの 安定 発現 細 胞株 を構 築した。その結果 、分子量150k
Daの全 長Patchedの 発現 を 確認 する と 同時 に、 C末端 タ グに のみ 反 応す る断 片 が生 成し て いる こと が 明ら かとなっ た。N
末端 とC
末端 それ ぞれ の タグ で免 疫 染色 した と ころ 、PatchedN末端 と C
末 端 では 細胞 内局在バターンが 異なり、N末端側は細胞質に ドット状 に分布する一方で 、C末端側 は核内に移行して いることが明らか となった。同様の結果は細胞分画でも確認できた。
ま た、 Pat
ched ICD7C
末端20ア ミノ 酸 を抗 原と す る抗 体を 用 いて 、内 在 性Patc
hedのC末 端を観察 したところ、同様 に核 に蓄 積 して いる こ とも 確認 さ れた 。生 成 する Pa
tched
C末 端断 片 の分子量はほ ぼI
CD7の大きさに 相当すること、ま た
断 片の ほ ぽ全 量が 核 内に 移行 し てい るこ と から、全 長P
atche
dのプ口セシングに より生じたIC
D7
相 当断片が核内に移 行
し て い る も の と 考 えら れ る。 線虫 TRA‑2の I
CD7断片 は 転写 因子 TRA‑1の 活性 を直 接 調節 しう る こと 、ま た P
atche
dの下 流タ ー ゲッ トと し てTRA‑
1ホ モロ グ のGlilが 同定されてい ることから、一番可 能性が考えられる のが、Patc
hedC
末端断 片が 癌 原性 転写 因 子Glilと 相 互作 用す る こと であ る 。そ こで 、 Glilをターゲ ットにしたレポー ター解析を行った 。
Patched
安定発 現細胞株でGlilの活 性が抑制されると 同時に、Patc
hedI
CD7断片のみの発現 でも全長Patchedと同程度Glilの活性 を抑制することが 明らかとなった。 この結果は、Patc
hed I
CD7の核内夕ー ゲットがGlilであ ることを示している。

Patchedは 常 時プロ セシングを受けるわ けではなく、その 調節には何らかの シグナルが必要であ ることが考えられ た。
そ こで Patched ICD7を過剰発現 させ、解析したと ころ、1」 ン酸化を受けてい ることが明らかとな った。また、各種 変異体 を作 成 する こと に よっ て、 リ ン酸 化修 飾を受けない変異 体を作成、観察し たところ、Patc
hedC末端断片の生成が 確認
で きず 、 全長 のま ま発現してい ることが確認され た。これにより、Patched
は りン酸化修飾を受け ることによって、 そのブ口 セシングが調節され ていることが明ら かとなった。
生成 す るPatc
hedC末端 断片 に は核 移行 シ グナ ル(NLS)
配 列 は確 認で き ない 。そ こ で、 何ら か のり クル ート蛋白 質と結 合し 、 核内 に輸 送 され てい る ので はな いかと考え、Patched
C末端断片と免 疫共沈降する蛋白質 をアミノ酸配列分 析によ り 同 定 し た 。 そ の 結 果 、 NLSを 有 す る p32と PatchedC末 端 断 片 が 結 合 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。
現在 、 多く のPatchedヒ ト発 癌性 変 異が 報告 さ れて いる が 、そ の中 で も発 症機 構が 不明であるIC
D7の1アミノ酸 置換型 変異 体 に着 目し て 解析 を行 っ た。 Patched ICD7蛋 白 質を He
La細 胞内 で発 現 させ たところ、1311番、あるいは1315番の 口イ シ ンが プ口 リ ンに 置換 さ れた 発癌 性 点変 異体 で は発 現量が低 下し、MG132や、リソソーム 阻害剤であるロイ ペプチン 処理によって発現量 が回復することが 明らかとなった。
さ らに、この発現量の 低下がPa
tc
hed ICD7の不安定化に由来する・ものか確認するためにシク口ヘキシミド(CHX)処理し、チェ イス実験を行ったと ころ、ICD7
ヒト発 癌性変異体の安定 性が正常型(WT)と比 較して低下してい ることが確認された。
この ことは、BCC患者の発癌にPatched I
CD7の不安定 化が関与している ことを示唆する。
以上 の 結果 から 、 P
atchedヒ ト発 癌 性変異体で は生成するC末端断片の安定 性が低下することに より癌原性遺伝子 産物
Glilの 抑 制機 能を 失い、発癌に 向かう可能性が示 された。Patc
hedC
末 端断片Iこは未知の発癌抑制 機能が存在する可 能性が あ る こ と か ら Patched ICD7の 発 癌 性 変 異 由 来 の BCC患 者 の 新 規 治 療 タ ー ゲ ッ ト を 提 案 で き る と 考 え ら れ る 。

よって著者 は，北海道大学博 士（生命科学）の学 位を授与される資格あるものと認める。