博 士 （ 医 学 ） 折 茂 達 也

学位論文題名Proteomicprofilingreveal
stheprogno
sticvalueof
Adenomatous PolyposlSC01i―End−BindingProteinlin
hepatOCe11ularCarClnonla（肝細胞癌 のプロテオ ーム解析による予後因子A
PC―bindin
gproteinE
B1の解明）

学 位論文 内容の要旨【 背景と 目的】肝 細胞癌 は世界における癌死の第3位を占め、予後不良な癌として知られている。予後不良の主要な要因として術後の高い再発率があげられ、再発予測のためのバイオマーカーはより適切な治療戦略を立てる上で重要である。肝細胞癌の分化度は予後に関係する主要な臨床病理学的な指標であり、その分子学的背景は重要な予後因子を含むと推察される。肝細胞癌の分子学的な予後因子に関する網羅的解析については、ゲノム、トランスクリプトームの分野では少数の報告が見られるが、プ口テオームの分野での報告は極めて少なく、なかでも分化度と関連づけたプ口テオーム解析は皆無である。本研究では肝細胞癌の分化度の背景にあるタンバクを網羅的に解析し、その中で予後に関係するタンパクを同定することを目的とした。
【 材料と 方法】プ 口テオ ーム解析には患者同意を得た外科切除検体45例（正常肝7例、肝細 胞癌症 例の背景 肝11例、 高分化肝 細胞癌 6例、 中分化肝細胞癌14例、低分化肝細胞癌7例）を使用した。それぞれの検体を薄切した後、レーザーマイクロダイセクションを使用して肝細胞、癌細胞を1検体にっき厚さ10ロm、面積lrrirri2の量で回収した。解析したすべて の検体 を混合し た内部 標準をCy3で螢 光標識し 、各検体はCy5で螢光標識した。螢光二次 元電気 泳動法(2D‑DIGE法）を用 いてタ ンパク分 離を行った。レーザースキャナーでタン バク発 現の情報 を回収 し、画像 解析ソ フトウェ ア(DeCyder)を使用し てCy5情報をCy3情報で補正した。パイオインフオマテイクスの手法を用いて、夕ンバク発現情報をもとに階層的クラスタルング解析、主成分分析を行った。さらに統計解析によって分化度に相関するタンパクスポットの同定を行った。夕ンパク同定のために、ゲル中のタンパクをトリプシン処理することでべプチド化して抽出し、質量分析装置を用いて分化度に相関するタンバクを同定した。同定したタンバクの検証にウェスタンプ口ッテイング法を使用した。同定したタン パクの 機能的な 相関関 係をみるために、文献データマイニング用のMeta
Coresoftwareを使用した。また同定したタンバクのうちA
PC‑bindingproteinEBl(EBl)の肝細胞癌における発現と臨床病理学的因子、予後との関係を検討するため、プ口テオーム解析に使用した−328ー

症 例 と は 独 立 し た 肝 細 胞 癌 切 除 症 例 145例 を 用 い て 免 疫 組 織 学 的 染 色 を 行 っ た 。
【結 果】 2D‑DIGE
法 の結 果、 内部標準 で80％以上再現性の見られるタンバクスポットは3319存在し、以降これらを解析対象 とした。3319スポットを用いた階層的クラスタリング
解析と主成分分析の結果、正常肝、背景肝、高分化肝細胞癌、中分化肝細胞癌、低分化肝細胞癌のタンバク発現はそれぞれの組 織学的所見、分化度を反映する傾向にあった。3319ス
ポットの中からKruskal‑Wallis testを用いて（pく0.01、各群間の発現差の最大値が3倍以上）各群間に統計学的に有意差を 持つタンバクスポットを求めた結果、41のタンパクスポットが同定され、これらを分化度に相関するタンバクスポットとみなした。質量分析装置を用いたタンバク同定の結果、41の タンバクスポットは26のタンバクを含むことが確認された。同定されたタンバクの機能分類の結果、発癌と脱分化の過程で増加するタンバクは細胞増殖、ヒートショックプロテイン、細胞骨格に関するものが多く、減少するタンバクはアミノ酸代謝、酸化還元、脂質代謝に 関するものが多かった。同定されたタンバクのうち、E
B
1、Proliferatingcellnuclearantigen (PCNA)、Heatshockp
rot
ein90、Arginase‑lに対する抗体を用いてウェスタンプロッテイングを行ったところ、ウェスタンブ口ッティン
グの 結果 は2D‑DIGE法の 結果 と同 様の 傾向 で あっ た。 またMetaCore softwareを用いた
解 析 の 結 果 、 26の タ ン バ ク の う ち 14は c myc、 AP‑1、 HIFIA、 HNF4‑alpha、 Rassuperfamily(RhoA、CDC42、Racl)と機 能的にルンクしていた。同定したタンバクのうちE
B1は予 後不良とされている低分化肝細胞癌に多く発現し、また 肝細胞癌の悪性度と関係する といわれているc・ myc、Rho
A、CDC42の下流で機能していた。肝細胞癌145例のE
B1の免疫染色の結果、EB1の発現は肝細胞癌の分化度と有意に相関し（pく0.
001)、その他には
AF
P値、TNM stage、腫瘍径、門脈浸潤 の有無、肝内転移の有無と有意に相関した。また
EB1
陽性 症例は陰性症例に比ベ再発、生存ともに有意に予後不良であり（pく0.
0001)、臨床病 理 学 的 因 子 を 含 め た 多 変 量 解 析 の 結 果 で も 独 立 し た 予 後 因 子 で あっ た 。
【考察】プ口テオーム解析の結果、肝細胞癌のプロテオーム像はその組織学的所見を主に反映しており、また発癌、脱分化の過程で増加するタンバクと減少するタンバクの機能には明らかな違しゝが見られ、夕ンパク発現はランダムな現象ではなく、ある一定の傾向があることが判明した。またこれらのタンバクはc ‑ myc、AP‑1、Rassuperfamilyなど肝細胞癌との関連が報告されている分子の下流で機能し、肝細胞癌の分化度の分子学的背景をある程度俯瞰することができた。同定したタンバ クのうちEB1は肝細胞癌の悪 性度と関係するといわれている分子の下流で機能しており、 本研究でもEB1陽性症例は低 分化肝細胞癌に多く予後不良 であることから、EB1は肝細胞癌の悪性度と深くかかわってい ると考えられる。E
B1はAdenomat
ous P
olyposis Coli (APC)に結合するタンバクとして 知られており、EB1はAPCと結 合することで細胞遊走能の促進や細胞接着能の低下を起 こすとの報告がある。また食 道癌においては、EB1の過剰発現がWnt経路を活性化することで細胞増殖を促進するとの 報告 があ る 。こ れら のこ とか らEB1と APC
は 細胞 の骨 格制御、遊走能、増殖に対して重要な働きを持ち、その異常な制御が肝細胞癌の悪性度に関係し、予後と相関している可能性 がある。また今回同定されたタン バクの中にはHepatoma‑derived growth factor、PCNA、Vimentinなど肝細胞癌の悪性度 、予後と関係するとされる既知のタンパクも含ま― 329−

れていた。一般に低分化肝細胞癌は予後不良であるが、その背景にはこれらのタンバクやEB1が関わっている可能性がある。
【結論】肝細胞癌のプロテオーム解析を行い、分化度の背景にあるタンパク発現情報を同定した。 その中 でもEB1は分化度だけではなく予後にも強い相関を示し、肝細胞癌術後の再発、生存の指標になりうる。

― 330ー

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 福 田
諭
副 査 教 授 藤 堂
省

学位論文題名Proteomicprofilingrevealstheprognosticv
alueofAdenomatous Polyposis Coli―EndーBinding Proteinlin
hepatocellular carclnoma（ 肝 細 胞 癌 の プ ロ テ オ ー ム 解 析 に よる
予 後 因 子 APC― binding protein EB1の 解 明 ）肝細胞癌の分子学的な予後因子に関する網羅的解析については、ゲノム、トランスク1j
プトームの分野では少数の報告が見られるが、プ口テオームの分野での報告は極めて少なく、なかでも分化度と関連づけたプロテオーム解析は皆無である。本研究では肝細胞癌の分化度の背景にあるタンパクを網羅的に解析し、その中で予後に関係するタンバクを同定することを目 的と し た。患 者同意 を得た外 科切除 検体45例（ 正常肝 7例、 肝細胞癌 症例の 背景肝1例、高 分化肝 細胞癌6例、中 分化肝 細胞癌14例、低分化肝細胞癌7例）を使用し、レーザーマイク口ダイセクションと螢光二次元電気泳動法を用いてプ口テオーム解析を行った。バ
イオインフオマテイクスの手法を用いて、夕ンバク発現情報をもとに階層的クラスタリング解析、主成分分析を行ったところ、正常肝、背景肝、肝細胞癌のタンパク発現はそれぞれの組織学的所見、分化度を反映する傾向にあった。質量分析器を用いて分化度に相関する26のタンバクを同定した。同定したタンバクの検証にウェスタンプロッテイング法を使用し、同定したタンバクの組織内発現は螢光二次元電気泳動法の結果とよく相関した。また同定した26のタンバクのうち、14はc‑myc、AP‑
1、HIFIA、HNF
4‑alpha、Rassuperfamily（RhOA、
CDC42、Rac1）と機能的にりンクしていた。同定したタンパクのうちAPC．bi
ndin
gproteinEB1（EB1）は予後不良とされている低分化肝細胞癌に多く発現し、また肝細胞癌の悪性度と関係す るとい われてい るc・myc、RhoA、CDC42の下流で 機能して いた。プロテオーム解析とは 独立し た肝細胞 癌145例 のEB1の免疫染 色の結 果、EB1の発現 は肝細胞癌の分化度―3311と 有意に相 関し（ pく0.
001)
、 その他にはAF
P値、TNMstage、腫瘍径、門脈浸潤の有無、肝 内転移の 有無と 有意に相 関した。EB
1
陽性症例は陰性症例に比べ再発、生存ともに有意に予後不良であり（pく0.
0001)、臨床病理学的因子を含めた多変量解析の結果でも独立した予後因子であった。
公 開発表後、まず副査の福田教授より◎各サンプルを泳動した回数、◎26のタンバクのう ち EB
1を 選 んだ 理 由 、◎ 正 常 肝で の EB
1の 陽 性 陰性 の 有 無、 @EB
1と 無 再発 生存 率との 関係、◎ E
B1の 血清診断 の可能性について、の質問があった。◎に対し、各サンプルを3回泳動 しその平 均をと って解析 したと 回答した 。◎に 対し、EB1はプロテオーム解析、We
ster
nblot共に低分化肝細胞癌で発現増強がみられ、肝細胞癌の悪性度と関係する分子の下流で機能しているため、EB1も肝細胞癌の悪性度と関係している可能性が高いと考え、
ま た抗体が 入手で きるもの がE
B1を含め限られていたためと回答した。◎に対しては、免疫染色のタイトレーションの設定の仕方により変化するが、本研究では全例陰性であったと回 答した。 ＠に対 しては、 再発だけでなく無再発生存率もEB
1
陽性症例は有意に予後不良で あったと の回答 があった 。◎に対しては、EB1は骨格制御に関わるタンパクなので血清に 分泌され ている 可能性は 非常に低 いと回 答した。 次に主査の浅香教授より、 EB
1はその 機能発現 にA
PCとの結合 が必須で あるの か、◎EB1は浸潤のマーカーとかんがえてよいの か、◎予 後マー カーとし てA
FPを越える可能性について、＠これからの研究の方向性につ い て 、の 質 問 があ っ た。◎に 対し、 過去の文 献的な 報告から E
B1の 機能発現 にはAPCとの結合が重要と考えられるが、他の報告からは必ずしもそれだけではないと思われると回答 した。◎ に対し 、E
B1は 各臨床病理学的因子との関連の解析により浸潤のマーカーと考え ら れ ると 回 答 した 。 ◎に対し 、血清 診断とい う面で はE
B1はAFPに 劣るが、 組織内発現 ではAFPを越え る可能性 があると 回答し た。＠に 対しては、E
B1の肝細胞癌の肝移植後の 再発に及 ぼす影 響や、RFA後の再発に及ぽす影響を考慮中であると回答した。最後に副査の藤堂教授より、c． mycやAP‑1などはプロテオーム解析で同定されたかとの質問があり、プ口テオーム解析では同定されず、ネットワーク解析で同定されたと回答した。また最後に藤堂教授より網羅的解析だけでなく、一つの分子をより深く調べる方法論も重要であるとのコメントがあった。
いずれの質問に対しても、申請者は概ね妥当に回答した。肝細胞癌の新しいバイオマーカー であるEB1の可 能性を示 し、将来的な臨床応用への課題を含め、重要な知見を示した。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や単位取得なども併せ
申 請 者 が博 士 （ 医学 ） の 学位 を 受 け取 る の に十 分 な 資 格を 有 す るも の と 判定 した。

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