●博 士 （ 水 産 科 学 ） 粉 川 愉 記
学 位 論 文 題 名

ウイルス性神経壊死症におけるウイルス混合感染の重要性とその対策
学位論文内容の要旨
我 が国の水産増 養殖業では、多くの魚種を対象とした生産技術が確立されてきたが、そ れに伴い様々な 病気が発生し大きな問題となっている。特にウイルス病では実 用的な治療法が なく、種苗生産施設などの隔離施設においては、親魚選別、卵 消毒、飼育水の 殺菌等の防除対策に重点が置かれてきた。一方、天然環境から の隔離が困難で ある養殖場においては、防除対策に加え予防免疫等の積極的な 対策が不可欠で あり、魚類ウイルス病に対する様々なワクチンが開発されてき た。しかしなが ら、開発された魚類ウイルスワクチンの多くは、実験的には十 分な防御効果が 認められるものの、養殖現場において安定的な防御効果が認め られず、市販に は至らなぃ現状にある。本研究では、養殖現場に韜け るワ ク チン 効 果の不 安定性がウイ ルス混合感染 に起因すると 考えた。即ち、養殖現場 で混合感染症が 発生した場合、一方の病原ウイルスに対するワクチンを投与し たとしても、他 方のウイルスよる死亡を抑えることは不可能であり、これが現 場におけるワク チン効果の不安定性に繋がると考えた。そこで、
マハタE
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sぷeptemf
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ロtu
ぷのウイルス神経壊死症(viralnervous

necrosis，VNN）を モデルとし、 第1章では、VNNの原 因ウイルスである魚類ノダウイルスの 増殖性が、混合 感染しているレトロウイルスにより亢進されることをin vitroで明らかにし 、次いで第2章で は、長崎県下 で発生したマハタのVNNは ノダ ウ イル ス 以外 の 病原 ウイ ル スが 存 在す る 混合 感染であるこ とを明らかにした。 さらに第3章では 、ウイルス混 合感染にも対 応可能な新しい免疫法で ある Poly（ I:C） 免疫法の効果 およぴ用法・用 量についてマ ハタVNNをモデルに検証し 、総合考察にお いてウイルス混合感染の重要性と対策について提言した。
VNNの原 因ウイルスで ある魚類ノダ ウイルスは、ノ ダウイルス科べーター
ノダ ウイ ル ス属 に 属す る エン ベ ロー プを 持 たな い 小型 球形のRNAウイ ルスで―943ーある。本ウイルスの培養には、ストライプト・スネーク＾ッドO
pカi
cepカロlus
ぷ trfロ tuぷ 由来 の SSN‑1細 胞 が多 用され る。 SSN‑1細胞が レト ロウイ ノレ ス（snakehead retrovirus，SnRV）に持続感染していることが明らかにされているが、 SnRVの 存在 がノダ ウイ ルスの 増殖 にどの よう に影響 して いるの かについては 明らか にさ れてい ない 。そこ で第 1章で は、ま ず、 ブルー ギル 工epomiぷmロcrocカir us由来BF‑2細胞を用い、SnRV持続感染細胞（PI‑BF‑2細胞）を作出し、 BF‑2お よび PI‑BF‑2細胞 のノ ダウイルス産生量を比較することでノダウイルス の増殖 性に 対する SnRVの影響 について検討した。その結果、PI‑BF‑2細胞にお けるノ ダウ イルス の産 生量は 、BFー2細胞に比べ50‑100倍以上高くなったこと から、 SnRVがノダ ウイ ルスの 増殖 性を大 幅に 亢進す るこ とが明 らかになっ た 。ま た 、 魚 類 ノ ダ ウイ ル ス は RNAウ イ ル ス で あ るた め 、 通 常DNA型の ウイル

スゲノムは存在しない。しかし、ノダウイル′スを接種したPI‑
BF‑2細胞にお い てノ ダ ウ イ ル ス の DNA型 ゲ ノ ムが 検 出 さ れ た 。 本DNA型 ゲ ノムは 、混 合
感 染 し て い る SnRV由 来 の 逆 転 写 酵 素 に よ り 産 生 さ れ た と 考 え ら れ た 。
次い で 第 2章 で は 、 長 崎 県 下 で発 生 し た マ ハ タ のVNNに お いて、 ノダ ウ
イルス以外のウイルスとの混合感染が起こっていることで、ノダウイルスワク
チン で十分 な防 御効果 が認 められ ないことを実証した。まず、VNN罹病魚の脳磨砕濾液または同脳磨砕濾液を中性界面活性剤であるTriton X‑100で処理し、エン ベロー プを 持っウ イル スを除 去し た脳磨 砕濾 液から 調製 したホ ルマリン
不活化ワクチンを投与したマハタを、病魚磨砕濾液で攻撃したところ、病魚脳磨 砕 液不 活 化 ワ ク チ ン 投与 区 で の 生 残 率 は96％ で あ っ た の に 対し、 Triton
X‑100処理 脳磨砕 濾液 不活化 ワク チン投与区の生残率は57％となり、両区で大きな差異が認められた。次いで、病魚脳磨砕濾液のマハタに対する半数致死量（LDso）を求めたところ、同液のLDsoはノダウイル

ス量に換算して101．5TCIDso／fishであった。これに対し、同脳磨砕濾液より分離した培養ノダウイルスのLDsoは103．4TCID50／fishであった。即ち、病魚脳磨砕濾液のマハタに対するLDsoは、培養ノダウイルスの約1／100であることが示された。以上の結果から、
病魚脳磨砕濾液にノダウイルス以外の病原ウイルスが存在することが示され、
長 崎 県下 の VNNマ ハ タ は ウ イ ルス混 合感 染症で ある ことが 明ら かにな った 。
エンベロープを持たないノダウイルスの病原性は、Triton X‑100で処理しても低下しないが、病魚脳磨砕濾液をTriton X‑100で処理するとその病原性は半減した 。さら に、 Triton X‑100処理 病魚 脳磨砕 濾液 にSnRVを添 加して もその病原性が戻らなかったことから、病魚脳磨砕濾液中に存在するノダウイルス以外の病 原ウイ ルス は、エ ンベ ロープ を持 っウイ ルス である が、 SnRVと は異なる―944―

ウイルスであると考えられた。

第2章では、ウ イルス混合感 染において、病 魚脳磨砕濾液をホルマリンで不活 化 した ワ クチン を投与するこ とで十分な防 御効果が誘導可 能であることを示したが 、病魚脳磨砕 濾液を安定的かつ大量に生産することは困難である。
そこで第3章では、ウイルス混合感染症を視野に入れた新しい免疫方法として、インターフ ェロン（IFN）誘導物質であるPoly（I:C）を用いた免疫法の有効性
およぴ用法・用量について検討した。まず、Poly（I:C）を投与したマハタをノダウイルスで攻撃したところ、一尾の死亡も認められず、Poly（I:C）の投与により、マハタ が抗ウイルス 状態になることが確認された。また、これらの生残魚からノダウ イルスに対す る特異抗体が検出されたこと、さらに生残魚をノダウイルスで再攻撃しても死亡が認められなかったことから、Poly（I:C）に続きノダウイルス を接種するこ とで、ノダウイルスに対する特異免疫が誘導されることが明らかになった。次いで、Poly（I:C）の用法・用量について検討したところ、Poly（I:C）を50p,g／fis
h以上投与し、投与直後から4日以内にウイルスを接種するこ とで、ウイル スに対する免疫が誘導可能であることが明らかになった。本Poly（I:C）免疫 法は、魚類体内でIFNを誘導することで魚類を抗ウイルス状態（非 特異的）とし 、この間に病原ウイルスを接種することで接種したウイルスに対 する特異免疫 を誘導する方法である。即ち、未同定のウイルスあるいは分離・ 培養が困難な ウイルスに対 しても応用が可 能である。従って、第2章で述べたウイルス混合感染症に対してもPoly（I:C）免疫法が十分有効であると考えられた。
以上、本研究 では、ノダウイルスワクチンが効かなかった原因がウイルス
混合 感 染症 で ある こ とを 明ら か にし た が、 こ れは マハタVNNに限 定されるものではない 。養殖現場で 期待されたワクチン効果が認められない場合、一病気に一病原体 という概念に 囚われることたく、ウイルス混合感染症を疑い、対策を立てる必要があると考える。

― 945ー

学位論文審査の要旨
I
主 査 教授 吉水 守
副 査 教授 都木 靖彰
副査 准教授 西澤豊彦

学 位論文 題名

ウイルス性神経壊死症におけるウイル ス混合感 染の重要性とその対策
我が 国 の 水産 増 養 殖業 で は 多く の 魚 種を 対 象 と した 生 産 技術 が 確 立さ れ てきたが 、それ に伴い 様 々 を病 気 が 発生 し 問 題と な っ てい る 。 特に ウ イ ル ス病 で は 実用 的 な 治療法 がなく 、種苗生産 施 設 など 隔 離 施設 に お いて は 、 防除 対 策 に重 点 が 置 かれ て い る。 一 方 、天然 環境か らの隔離が 困 難 であ る 養 殖場 に お いて は 、 予防 免 疫 等の 防 疫 対 策が 不 可 欠で あ り 、魚類 ウイル ス病に対す る 様 々な ワ ク チン が 開 発さ れ て きた 。 し かし 、 開 発 され た ワ クチ ン の 一部は 、実験 的には十分 な 防 御効 果 が 認め ら れ るも の の 、養 殖 現 場に お い て 安定 的 た 防御 効 果 が認め らない ものもある 。 本 研究 で は 、養 殖 現 場に お け るワ ク チ ン効 果 の 不 安定 性 が ウイ ル ス 混合感 染に起 因すると考えた 。マハタ E
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ヽ NN） を モ デ ル と し 、 第 1章 で は 、 ¥rNNの 原 因 ウ イ ル ス で あ る 魚 類 ノダ ウ イ ルス の 増 殖性 が混 合 感 染 し て い る レ トロ ウ イ ルス に よ り亢 進 さ れる こ と をin v
itroで明 ら か にし 、 次 いで 第 2章 で は 、 長 崎 県 下 で 発 生 し た マ ハ タ の VNNは ノ ダ ウ イ ル ス 以 外 の 病 原 ウ イル ス が 存在 す る 混合 感 染 症 で あ る こ と を明 ら か にし た 。 さら に 第 3章 で は 、ウ イ ル ス混 合 感 染 症に も 対 応可 能 な
Poly(I:C)を 用 いた 免 疫 法の 効 果 およ ぴ 用 法 ・用 量 に つい て 魚 類ノ ダ ウ イル スをモ デルに 検証し、 総合 考 察に お いて ウ イル ス混 合 感染 の 重要 性と対策に っいて提言した 。
魚類ノダ ウイルスの培養には、ストライプト・スネーク＾ッド〔)phicephalusstriatus由来のS
SN‑1細 胞 が 多用 さ れ る。 SSN‑1細 胞は レ ト ロ ウイ ル ス (snakehead retrovirus，SnRV)に持続 感
染し て い るこ と が 明ら か に され て い るが 、 Sn
RV の 存在 が ノ ダウ イ ル スの 増 殖にどの ように 影
響 し て い る の か は 明 ら か に さ れ て い な い 。 そ こ で 第 1章 で は 、 ま ず 、 ブ ル ー ギ ル Lepomis
macrochir us由 来 BF‑2細 胞 を 用 い 、 SnRV持続 感 染 細 胞(PI‑BF‑2細 胞 ） を作 出 し 、BF‑2およびPI‑BF‑2細 胞 の ノ ダ ウ イ ル ス 産 生 量 を 比 較 す る こ と で ノ ダ ウ イ ル ス の増 殖 性 に対 す る SnRVの影 響 に っ い て 検 討 し た。 そ の 結果 、 PI‑BF‑
2細 胞 にお け る ノダ ウ イ ル スの 産 生 量は 、 BF
‑2細 胞に 比 べ お よ そ 100倍高 く な った こ と から 、 Sn
R． Vがノ ダ ウ イル ス の 増 殖性 を 大 幅に 亢 進 する ことが明ら かになっ た。
次 い で 第 2章 で は 、 長 崎 県 下 で 発 生 し た マ ハ タ の M蜘 Nに お い て 、ノ ダ ウ イル ス 以 外の ウイルスとの混合感染により、ノダウイルスワクチンで十分な防御効果が認められないことを実証した。まず、VNN罹病魚の脳磨砕濾液または同脳磨砕濾液を中性界面活性剤であるTriton
X‑100で処理し、エンベロープを持っウイルスを除去した脳磨砕濾液から調製したホルマリン不活化ワクチンを投与したマハタを、病魚磨砕濾液で攻撃したところ、病魚脳磨砕液不活化ワ
クチン投与区での生残率は96％であったのに対し、Trit
on X‑100
処理脳磨砕濾液不活化ワクチ
ン投与区の生残率は57％となり、両区で大きな差異が認められた。次いで、病魚脳磨砕濾液のマハタに対する半数致死量(LDso)を求めたところ、同液のLDsoはノダウイルス量に換算してloi.
sTCID
so／fishであったのに対し、培養ノダウイルスのLD
soはl03.4T
CI
Dso／fishとたり、病魚脳磨砕濾液のマハタに対するL
Dsoは、培養ノダウイルスの約1/100であることが示された。
以上の結果から、病魚脳磨砕濾液にノダウイルス以外の病原ウイルスが存在することが示さ
れ 、 長 崎 県 下 の VNNマ ハ タ は ウ イ ル ス 混 合 感 染 症 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。
第3章では、ウイルス混合感染症を視野に入れた新しい免疫方法として、インターフェロン(IFN)誘導物質であるPoly (I:C)を用いた免疫法の有効性および用法・用量について検討した。まず、Poly(I:C)を投与したマハタをノダウイルスで攻撃したところ、死亡は認められず、Po
ly (I:C)の投与により、マハタが抗ウイルス状態になることが確認された。また、これらの生残魚からノダウイルスに対する特異抗体が検出されたこと、さらに生残魚をノダウイルスで再攻撃しても死亡が認められなかったことから、Poly(I:C)に続きノダウイルスを接種することで、ノダウイルスに対する特異免疫が誘導されることが明らかになった。次いで、Poly(I:C)の用法・用量にっいて検討したところ、Poly(I:C)を50 Vg／fish以上投与し、投与直後から4日以内にウイルスを接種することで、ウイルスに対する免疫が誘導可能であることが明らかになった。
以上、本研究は、現場でノダウイルスワクチンの効果が不安定であった原因がウイルス混合感染症であることを明らかにし、その対策としてPoly(I:C)免疫法が応用可能であることを示したものである。これらの成果は水産科学に寄与するところ大と考え、審査員一同は申請者が 博士 （ 水 産 科 学） の 学 位 を 授 与さ れ る 資 格 のあ る も の と判 定した 。

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