49●高吸着容量型イオン交換カラムTSK−GEL BioAssist
シリーズの開発
科学計測事業部 ゲル製造部 セパレーションセンター
企画開発室

村中 和昭
津田 輝彦
森山 弘之

して生産しております。これまでの製造法では、粒子1．はじめに径の小さい微粒子を製造する際に、粒子径分布をシャ

近年、バイオテクノロジーの発展に伴い、タンパクープなものとするため分級工程を必要とし、最終的な質、核酸など生体構成物質の分析、分取には種々の方収率が20〜30％程度となってしまう問題点を有してお法が提案されております。その中でも液体クロマトグりました。

ラフィーを用いた分析、分取手法は古くから行われてBioAssistシリーズでは、用いる基材の製造方法といる手法でありますが、対象化合物の広さ、自動化のして粒子径のそろった微粒子が作成可能であるシード

容易さ、操作の容易さ、そして実用的な感度と迅速性重合法を採用しました。これによりFig.１に示したよなどの面において、液体クロマトグラフィーに変わるうに、収率ほぼ100％で目的粒子径の微粒子を製造可分析、分取手法は提案されておらず、今後も発展して能となり、また従来ロット間差を引き起こす原因であいくものと考えられます。

った、粒子径分布が非常に狭い粒子を作成可能となり当社ではバイオテクノロジーに用いられる液体クロマトグラフィー装置及び充填カラムの開発を行ってきました。
2.2

イオン交換基構造ました。近年ハイスループット、高分離能に対する要

カラム充填剤性能を示す指標として、保持力及び吸求が高まり、高い試料吸着容量及び高分離能を有する着容量を挙げることができます。これらの指標は充填カラム充填剤の発展に着手し、昨年度アニオン及びカ剤が有するリガンド構造に依存している項目でありまチオン交換型のイオン交換カラムTSKgel BioAssist

す。BioAssistシリーズの開発においては高い吸着容Q及びTSKgel BioAssist Sを上市いたしました。本報量を目標としました。充填剤の粒子径が同一であり且告では充填剤の基本構造及び特性について紹介しまつ充填剤が有する細孔径が測定試料に対し十分に大きす。

い場合、吸着容量は充填剤の表面積に比例します。充填剤の表面積を増やすためには、充填剤が有する細孔2．TSK−GEL BioAssistシリーズの概要
2.1

容積を大きくすること及び細孔径を小さくすることが基材合成技術有効であります。しかし細孔容積を大きくすると充填

BioAssistカラム充填剤は、親水性多孔質ポリマー剤の機械的強度が減少し、また細孔径を小さくすると、微粒子を基材として用いております。当社は同種の充測定試料が細孔内部に侵入できなくなることにより、填剤を懸濁重合法によりPWシリーズやトヨパールと逆に吸着容量が低下します。この様なことから、吸着B

A

Fig.１

SEM picture of TSKgel G5000PWXL（A）and TSKgel BioAssist（B）.

（ 49 ）50

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.46（2002）

Table１ Characteristics of TSK-GEL BioAssist series

Base matrix
Diameter（μm）
Pore size（Å）
Ion Exchange capacity（eq/L-gel）
Ion siteColumn Size

容量には実質的な上限が存在しました。この問題を解

TSKgel BioAssist Q

TSKgel BioAssist S

Polyacrylate
1040000.1
Polyamine
4.6mm I.D.×5cm

Polyacrylate
71300
0.1
Sulfopropyl
4.6mm I.D.×5cm

2.4

選択性、保持力比較決する方法として、充填剤表面にリガンドを有するポ同一測定条件下で当社従来カラム及び競合品との分リマーをグラフトし、試料を充填剤表面に多層的に保離比較を行った図がFig.３です。BioAssist Qは従来持させる手法が提案されています。しかしこの手法で型イオン交換体と比較し1.5〜2.0倍の保持力を有し、は充填剤表面のグラフトポリマー鎖が送液抵抗を発生

BioAssist Sも従来品の1.2〜1.5倍の保持力を示していさせるため、充填剤機械的強度の制約から充填剤を小ます。また従来品以上のピーク形状を有しており、測さくすることができず、高性能化の用件の一つである定条件を変更し同一分析時間で比較した場合でも従来高分離能を両立できませんでした。BioAssistシリー品以上の分離能を示します。

ズでは充填剤表面のグラフトポリマー鎖を緩く架橋さ2.5

回 収 率

カラムにタンパク質溶液を注入し、溶出した試料のせることにより、高吸着容量、低操作圧および高分離UV吸収によるピーク面積から回収率を算出する方法能を両立させました。
また、アニオン交換型で対象となるタンパク質はカにより種々のタンパク質に対する回収率を算出しまし

チオン交換型で対象となるタンパク質よりも種類が多た。その結果BioAssistシリーズは低注入量域での回く、また分子量が500kDa以上の大きなタンパク質が収率に優れるカラムであることがわかりました。代表

対象となる場合も多々あります。このためアニオン交的な例として、γ−グロブリンを試料として、微量注換型であるBioAssist Qに用いた充填剤は、従来当社

入域での回収率を競合品と比較した結果をFig.４に示が有していたアニオン交換型充填剤よりも、細孔径をします。BioAssistシリーズは、タンパク質に対して大きく設定し、幅広い分子量のタンパク質に対して高特異的吸着の少ない充填剤であることがわかります。

い吸着容量を維持するように設計を行いました。

2.6

応用

Table１にカチオン交換型カラム充填剤BioAssist S及マウス腹水中のモノクローナル抗体の精製にびアニオン交換型BioAssist Qの基本的物性を示しまBioAssist Qカラムを用い検討を行いました。競合他す。

社品との比較クロマトをFig.５に示します。競合品で2.3

動的吸着容量比較

はモノクローナル抗体とマウス腹水中に大量に存在す

カラム充填剤の吸着容量をカラムに直接タンパク質るアルブミンの分離が不十分でありますが、溶液を送液し、漏れだした時点から充填剤が吸着したにより、当社従100

来カラム及び競合他社品との比較を行いました。測定

動的吸着容量90は低分子量から高分子量の種々のタンパク質を用い、試料分子量が与える影響も比較いたしました。結果をFig.２に示します。一般的な構造のイオン交換カラムである他社競合品よりもBioAssist Qは広い分子量範囲にわたって2倍程度の吸着容量を示します。また当Binding capacity g/L-gel

吸着容量を算出する

70
50403020105PWと比較しても低分子量側でほぼ同一、高分子量010,000

すが、BioAssist Qはその低下がほとんど見られません。
（ 50 ）

SuperQ-5PW

60

社従来品の高吸着容量型イオン交換カラムSuperQ側においてSuperQ-5PWは吸着容量が極端に低下しま

BioAssist Q

80

Commercial Q-type

100,000

1,000,000

Mw of protein

Fig.２

Effect of molecular weight of protein on bindingcapacity

東ソー研究・技術報告 第46巻（2002）

51

BioAssist Q

1

BioAssist S

4223531123

A社 Q-Type10μm

5413322

A社 S-Type10μm

1DEAE-5PW

2132345SuperQ-5PW
113205Fig,３SP-5PW

1015Retention time（min）（A）

32

A社 Q-Type
15μm

54

A社 S-Type15μm

12005

1015
20
Retention time（min）（B）

25

Compersion Chromatograms of anion-exchange columns (A) and cation-exchange columns (B).
Sample：anion-exchange Conalbumin (1), Ovalbumin (2), Trypsin inhibitor (3), Cation-exchangeMyoglobin (1), alpha-Chymotrypsinogen A(2), RNase A(3), Cytochrome C(4), Lysozyme (5)BioAssist Qではアルブミンとの分離も良好でFig.６120のSDS-PAGEによる分析結果からも分かるように単一ステップで高度な精製が可能であることが分かりま80す。

60

3．おわりに

4020

タンパク質、核酸類の分析、分取に用いられるイオ

00.1

Fig.４

1.0
10.0
Loading weight（μg）

ン交換カラムとして開発しましたBioAssistシリーズ

100.0は、高吸着容量、高保持力、高分離能、高回収率を有するカラムであり、生化学分野での精密分析、精密分Compersion of recovery rate. Sample：
γ-Globulin○ BioAssist S, ● commercialcolumm

取に有用なカラムであります。

BioAssist Q

Commercial Column

290

1.090

F-280
0.8F-3F-10.490
F-34050mV

140

60

0.2F-4F-10.6F-240300.4

F-5200.2

100−1005Fig.５

1015200.0−10051015

Compersion chromatograms of mouse asities on BioAssist Q and Commercial column（ 51 ）

200.0

Na Cl (M) in eluent

0.6

0.8

70
Na Cl (M) in eluent

190

1.0F-4240mV

Recovery ％100

52

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.46（2002）

Maker Stock

1

Fraction No.
2
34Maker

Maker Stock

1

Fraction No.
234

209

124
80
49.1
34.8
28.9
20.6
kDa
BioAssist Q

Commercial column

Fig.６ SDS-PAGE（ 52 ）

5Maker東ソー研究・技術報告 第46巻（2002）（ ＋ ）＋