ヒト HGF 臓器抽出試薬

研究用試薬 添付文書** 2011 年 3 月 全面改訂
* 2009 年 7 月
改訂

《抽出例》

ヒ ト HGF 臓 器 抽 出 試 薬
本試薬は、添付文書をよく読んでから使用してください。
本試薬は研究用試薬であり、臨床診断には使用できません。

臓器重量

抽出液量

1～5 mg（生検レベル）

例
抽出液量100～200 容

1 mg
5 mg

200 μL500 μL

ホモジナイザー又は超音波破砕（マイクロチップ、氷冷）

5～50 mg

10～100 容

5 mg
50 mg

500 μL500 μL

超音波破砕（マイクロチップ、氷冷）

50～100 mg

5～10 容50 mg
100 mg500 μL500 μL

超音波破砕（マイクロチップ、氷冷）

100 mg 以上

5容

100 mg
1g

500 μL
5 mL

超音波破砕（氷冷）
ポリトロン（氷冷）など① 粗抽出液原液で測定する場合、HGF 値の測定には 50 μL（n=1 測定）又は 100μL（n=2 測定）の粗抽出液原液が必要です。
② ホモジナイザーや超音波破砕（マイクロチップ使用）で抽出する場合には 500 μL
程度の液量で行うと容易に操作できます。
③ 粗抽出液の HGF 濃度（目安）は、臓器 1 mg に抽出液 100 μL の割合で抽出した場合 正常肝：1 ng/mL 前後、疾患肝：正常肝と同レベル～数十倍の濃度となります。
④ 以上のことを考慮して、抽出液添加量を決定します。

【使用目的】
本品はヒト肝細胞増殖因子（HGF）のヒト臓器からの抽出、および抽出検体を測定するための試薬です。
測定には本品の他にイムニス○R HGF EIA キットが必要です。

【操作方法】(1) 酵素基質液（発色剤含有）
酵素基質 3 mL に発色剤 1 錠を加えて暗所に静置し、錠剤が完全に溶解したのを確認後、よく混合します。使用するウェルの数に応じて必要量を調製してください。
この調製は使用の約 15 分前に行い、60 分以内に使用してください。

1.
イムニス○R HGF EIA で必要な試薬
HGF 標準液以外の全ての試薬
その他準備が必要な試薬* 2.
(1) Phenylmethanesufonyl fluoride（PMSF）
例） SIGMA 社 Phenylmethanesufonyl fluoride （P7626)*【臓器抽出用試薬の調製法】

必要な器具・器材

2.

(1) マイクロピペット

50 µL，100 µL(2) メスピペット

10 mL(3) メスシリンダー

1L

at

100 mM PMSF の調製
PMSF 17.4 mg を量り取り、1 mL のイソプロパノールに溶解します。
PMSF の添加(1) 抽出液 30 mL に 100 mM PMSF を 0.3 mL 加えてよく混合します。
（PMSF の最終濃度 1 mM）

rm

2.

n

(2) 洗浄液
洗浄原液を精製水で 20 倍に希釈します。未使用の洗浄液は 2～10℃で保存してください。

(2) イソプロパノール（PMSF 溶解用）

1.

試薬の調製方法（イムニス○R HGF EIA キット試薬）

1.

【必要な試薬】

io4.
5.

抽出液 ···············································································30 mL×5 本
検体希釈液 H ····································································15 mL×1 本
HGF 標準液１ （0 ng/mL） ················································0.5 mL×1 本
HGF 標準液２ （0.3 ng/mL） ·············································0.5 mL×1 本
HGF 標準液３ （1 ng/mL） ················································0.5 mL×1 本
HGF 標準液４ （3 ng/mL） ················································0.5 mL×1 本
HGF 標準液５ （6 ng/mL） ················································0.5 mL×1 本
洗浄原液（20 倍濃縮液） ···················································25 mL×1 本
プレートシール（付属品）··································································1 枚

抽出方法

臓器重量

【試薬の構成】
1.
2.
3.

1

(4) マイクロプレート振盪器(5) アスピレーター及びポリ洗浄瓶又はマイクロプレートウォッシャー
(6) 暗箱（暗い戸棚又は引き出しでも可）info(2) 検体希釈液 H 15 mL に 100 mM PMSF を 0.15 mL 加えてよく混合します。
（PMSF の最終濃度 1 mM）※試薬は必要量を使用時に調製してください。
【臓器抽出検体の調製法】
1.

臓器検体の重量測定

ent(1) 臓器片はアルミホイル等、吸湿しないものにのせて秤量してください。
このとき、臓器片が小さく mg 単位の場合は微量天秤を使用してください。

Reag(2) 臓器片をポリプロピレン製又は、ポリエチレン製容器に移します。
〈注意〉 HGF はガラスに吸着しやすいのでガラス製容器は使用しないでください。
(3) 重量 20 mg 以上の大きさの臓器片は、できるだけ小片化します。
（ハサミで小片化します。ハサミに付着した臓器片や臓器の滲出液は、抽出液添加時に洗い込んでください。）
2.

抽出液の添加(1) 臓器重量に対して 5～100 容の抽出液を添加します。
（1 容とは臓器 1 mg につき抽出液 1 μL の割合です。）(2) 臓器重量によって 5～100 容の範囲で適宜抽出液の添加量を工夫してください。
5～100 容抽出で、ほぼ同等の抽出が可能です。
「抽出例」をご参照ください。
3.

抽出操作

(1) 抽出液を添加した臓器をホモジナイザー等で破砕します。
抽出方法は臓器重量によって適宜工夫してください。
《抽出方法の例》
・ 臓器重量が 5 mg 未満の場合：ホモジナイザーで抽出できます。
〈注意〉ガラス製ホモジナイザーは使用しないでください。
（例えば、エッペンドルフ社のマイクロテストチューブとマイクロ乳棒を組み合わせて使用できます。）
・ 臓器重量が 5 mg 以上の場合：超音波破砕（マイクロチップ、氷冷下）
・ 臓器重量が g 単位の場合：ポリトロン抽出（氷冷下）もできます。
〈注意〉HGF は熱に不安定なので、超音波破砕、ポリトロン抽出は必ず氷冷下で行なってください。
(2) 15,000 rpm で 30 分間遠心します。（卓上遠心機も可）
遠心は 4℃条件下が望ましいですが、室温でも可能です。
臓器重量が 10 mg 以下の場合には臓器残渣が少ないので、15,000 rpm, 5 分間でも可能です。
4.

粗抽出液の回収
最上層の lipid 層、最下層の臓器残渣を混ぜないように中間層のみをきれいに回収します。
〈注意〉回収にはガラス製容器は使用せず、ポリプロピレン製又は、ポリエチレン製容器を使用してください。

ｹ M729608311(7) マイクロプレートリーダー（主波長 492 nm 又は 490 nm、副波長 620 nm 以上）

3. 臓器抽出検体の測定操作法
測定にはイムニス○R HGF EIA キットを用います。
測定は原則として二重以上で行うことをお奨めします。
キットの各試薬は使用前に必ず 20～30℃に戻してください。
図 1 に示すように、測定ごとに HGF 標準液用ウェル（2 ウェル×5 種=10 ウェル）を設けて測定してください。
1

2

A

0

6

S4

B
C

0

6

S4

0.3

S1

S5

D

0.3

S1 S5

E

1

S2

S6

F
G

1

S2

S6

3

S3 S7

H

3

S3

4
0

0.3

1

S1 S2 S3

3

6･･･････; HGF 標準液 (ng/mL)
; 検体

S7

図 1 検体割付例(1) 検体の予備希釈
臓器抽出検体は適宜、抽出液で予備希釈します。
《粗抽出液の HGF 濃度の目安》
臓器 1 mg に対して 100 μL の抽出液で抽出した場合
正常肝：1 ng/mL 前後疾患肝：正常肝と同レベル～数十倍の濃度(2) 抗 HGF 抗体固相プレートの前処理
プレートの各ウェルに抽出液を 200 μL ずつ分注し、プレート上面に添付のプレートシールを貼り、マイクロプレート振盪器に固定して 20～30℃で 10 分間振盪します。
(3) 洗浄プレートシールをはがし、ウェル内容物をアスピレーターで吸引除去します。ポリ洗浄瓶を用いてプレートの各ウェルを「1．試薬の調製方法 (2)」で調製した洗浄液で満たし、プレートを逆さにして洗浄液を振り流します。この洗浄操作を 5回繰り返して行います。マイクロプレートウォッシャーを用いて洗浄する場合も 5回洗浄してください。
最後に清潔なペーパータオル上でプレートを逆さにして叩き、ウェルから十分に洗浄液を除きます。
〈注意〉洗浄操作中、プレートのウェル内面が乾燥しないように注意し、洗浄終了後は、迅速に次の操作を行ってください。
(4) 検体の添加方法
以下のとおり、HGF 標準液、臓器抽出検体、検体希釈液を各ウェルに加えます。

ヒト HGF 臓器抽出試薬

操作上の注意2.
測定法

HGF 標準液（ヒト HGF 臓器抽出
試薬）

標準液測定

50 μL

検体測定

－

検体希釈液

(1) 測定器具の精度を確認し、各器具の操作法に従い測定してください。

検体希釈液（イムニス HGF
EIA）

検体希釈液 H（ヒト HGF 臓器
抽出試薬）

－

－

50 μL

50 μL

50 μL

－

臓器抽出検体* (2) 有機溶剤を含む発色剤、テトラメチルベンチジン（TMB）を使用した他の ELISA
測定系と同じ場所で酵素反応を行うと、発色剤（OPD)の反応が阻害され、測定に影響を与えることがあります。
(1) 検体は HBV、HCV、及び HIV などによる感染の危険性があるものとして取り扱
い、検体に使用した器具類は 0.1％次亜塩素酸等の液に浸漬してください。
(2) 酵素基質、発色剤及び反応停止液は皮膚や粘膜に接触させないように注意してください。もし皮膚にかかったときは、多量の水で洗い流してください。（毒性、刺激性で火傷のおそれがあります。）必要があれば、医師の手当て等を受けてください。

(5) 第１次反応
プレート上面に添付のプレートシールを貼り、マイクロプレート振盪器に固定して、20～30℃で 1 時間振盪します。（200～700 rpm）

(3) 検体希釈液、HGF 標準液にはアジ化ナトリウムが添加されているので、廃棄の際には爆発性の金属アジドが生成しないよう十分注意して多量の水を流しながら行ってください。

(6) 洗浄「(3) 洗浄」と同じ手順で洗浄します。
(7) 酵素標識モノクローナル抗体の添加
全ウェルに酵素標識モノクローナル抗体を 100 μL ずつ加えます。

(4) 試薬及び器具等を廃棄する際には、イムニス○R HGF EIA の添付文書に従って処理してください。

(8) 第 2 次反応
プレートシールを貼り、マイクロプレート振盪器に固定して、20～30℃で 1 時間振盪します。

【貯法及び有効期間】
凍結を避け、2～10℃で保存。
製造後 1 年間有効（包装に表示の使用期限内に使用してください。）(9) 酵素基質液（発色剤含有）の調製
第 2 次反応終了の約 15 分前に、「1．試薬の調製方法 (1)」の手順に従って酵
素基質液（発色剤含有）を調製します。

【包装単位】(10) 洗浄「(3) 洗浄」と同じ手順でプレートを洗浄します。

1 キット ：96 テスト（抽出液 1 mL / 1 検体として使用した場合）
CODE：1Z72
大型の臓器から抽出する場合には、別途ご相談ください。

(11) 酵素基質液（発色剤含有）の添加「(9) 酵素基質液（発色剤含有）の調製」で調製した酵素基質液（発色剤含有）を全ウェルに 100 μL ずつ加えます。

【参考文献】

測定系の確認と特異的吸光度(Net OD)の算出

atin(1) HGF 標準液 1 （0 ng/mL）の吸光度が 0.050 未満であることを確認します。

fo【測定結果の判定法】

rm(14) 吸光度の測定
マイクロプレートリーダー（主波長 492 nm 又は 490 nm）で各ウェルの吸光度を測定します。2 波長測定の場合の副波長は 620 nm 以上とします。反応停止後 2
時間以内に測定してください。

io(13) 反応停止液の添加
全ウェルに反応停止液 50 μL を加えてよく混合します。

HGF 標準液による検量線の作成

Re
ag

2.

en
t

(2) HGF 標準液 1 の吸光度の 2 ウェルの平均値を算出します。もし 2 ウェルのうち、いずれか一方が 0.050 以上となった場合には、平均せずに 0.050 未満の方を吸光度とします。2 ウェル共に吸光度が 0.050 以上となった場合には、再測定してください。
Net OD

1.0(1) 両対数グラフの X 軸に標準液の濃度を、Y 軸に Net OD をプロットし、検量線を作成します。
3.

HGF 濃度の算出

1）Nakamura T, Nawa K, Ichihara A：Partial purification and characterization ofhepatocyte growth factor from serum of hepatectomized rats. Biochem Biophys
Res Commun 122：1450-1459, 1984.
2）Nakamura T, Nishizawa T, Hagiya M, et al：Molecular cloning and expression ofhuman hepatocyte growth factor. Nature 342：440-443, 1989.
3）Nakamura T：Structure and function of hepatocyte growth factor. Prog Growth
Factor Res 3：67-85, 1991.
4）Yamada A, Matsumoto K, Iwanari H, et al：Rapid and sensitive enzyme-linked
immunosorbent assay for measurement of HGF in rat and human tissues. Biomed
Res 16：105-114, 1995.
5）武藤泰敏、河合忠、佐藤俊一、他：肝疾患患者における血清ヒト肝細胞増殖因子（hHGF）レベル測定の臨床的意義（全国 19 施設による検討）. 肝胆膵 25：
541-549, 1992.
6）松田康伸、中村敏一：肝細胞増殖因子（HGF）の分子生物学.日本臨床 51：
435-445, 1993.

n(12) 酵素反応
プレートを暗所に入れて、20～30℃で 30 分間静置します。

(3) 各ウェルの吸光度から「HGF 標準液 1」の吸光度の平均値を差し引いて、各ウェルの Net ODを算出します。

【問い合わせ先】株式会社 特殊免疫研究所 営業部〒112-0004
東京都文京区後楽一丁目 1 番 10 号
日本生命水道橋ビル
TEL 03-3814-4081 FAX 03-3814-5957

ウェルの割付と手順

0.1(1) 検体の Net OD を検量線に当てはめ、HGF 濃
度を読みとります。

(2) 検体の吸光度が HGF 値 6 ng/mL（標準液の上限）を超えた場合は検体を抽出液で希釈して再測定してください。
4.

取扱い上の注意3.

HGF 標準液（ヒト HGF 臓器抽出試薬）；0、0.3、1、3、6 ng/mL の 5 濃度を使用し、第 1 次反応以降はイムニス○R HGF EIA と同じ方法で行います。

1.

手順
0.01
0.1

0.3

1.0
HGF (ng/mL)

臓器重量当たりの HGF 量の算出
下式に基づいて臓器重量当たりの HGF 量を算出します。

HGF 濃度（ng/mL）×検体予備希釈倍率×抽出液添加量（mL）
臓器重量（mg）【使用上又は取扱い上の注意事項】
本添付文書に記載された使用方法に従って使用してください。記載された使用目的及び操作方法以外での使用につきましては測定結果の信頼性を保証しかね
ます。
一般的注意

検体予備希釈抽出液

2

抗 HGF 抗体固相プレートの前処理

抽出液

3

洗浄

4

標準液
又は検体の添加5

第 1 次反応20～30℃ 1 時間 振盪

6洗浄

5 回繰り返しHGF 標準液
検体
検体希釈液(イムニス）
検体希釈液 H

50 µL
－
－
50 µL

酵素標識モノクロー 酵素標識モノクローナ
7ナル抗体の添加ル抗体
8

第 2 次反応

9 酵素基質液の調製
10洗浄(2) 製造番号の異なるキットの試薬を組み合わせて使用しないでください。

11 酵素基質液の添加(3) 抽出液、検体希釈液 H は、マウス・ラット HGF 臓器抽出液、ラット HGF EIA、及びマウス HGF EIA とは異なるので、共用しないでください。

12(4) キット中の容器、付属品は他の目的に転用しないでください。

14

測定

15

結果の判定

100 µL

－
50 µL
50 µL
－

100 µL20～30℃ 1 時間 振盪（第 2 次反応終了 約 15 分前）
5 回繰り返し
酵素基質液（発色剤含有）100 µL100 µL20～30℃ 30 分間 暗所 静置

酵素反応

13 反応停止液の添加

臓器抽出検体(2C～12H)

粗抽出液の HGF 濃度の目安（臓器 1mg につき抽出液 100－
μL の割合で抽出した場合）
正常肝：1 ng/mL 前後
疾患肝：正常レベル～数十倍
200 μL20～30℃ 10 分間 振盪
5 回繰り返し

1(1) 使用期限を過ぎた試薬は使用しないでください。

ｹ M729608311

HGF 標準液 1～5(ヒト HGF 臓器抽出試薬）
(1A～1H, 2A～2B)

試薬

3.0 6.0

臓器重量当たりの HGF 量（ng/mg） ＝

1.

2

反応停止液

50 µL

50 µL

吸光度主波長 492 nm 又は 490 nm （副波長 620 nm 以上）

製造販売元

HGF Extraction Reagent for Immunis HGF EIA

Note: HGF is thermally unstable. When a Sonicator or Polytron is used,homogenize on ice.
Centrifuge the extracted mixture at 15,000 rpm for 30 min. (A table top
centrifuge will do.)
It is desirable to centrifuge the sample at 4oC. If this is not possible,
centrifuge it at the room temperature. (When the tissue sample weighs lessthan 10 mg, it can be centrifuged at 15,000 rpm for 5 min as the volume of theresidual tissue is small.)

Instruction Manual2)

HGF Extraction Reagent

for use with IMMUNIS® HGF EIA• Thoroughly read this instruction manual before use of this kit.
• This kit is intended for research use only.
I.

4.

General description
This kit is developed for extraction of human hepatocyte growth factor (hHGF)
from the human tissues for determination with IMMUNIS® HGF EIA available
as a separate kit. This kit is for research purpose only and should not be used for
diagnostic applications.

3

Recovering of hHGF
Recover the intermediate layer without mixing it with the top lipid layer orthe bottom tissue layer.
Note: Do not use a glass vessel for recovery of the sample. Use apolypropylene or polyethylene vessel.

1)[Examples of extraction]
Components
Extraction buffer ........................................................................ 30 mL x 5 vials
Sample diluent H.......................................................................... 15 mL x 1 vial
HGF standard solution 1 (0 ng/mL) ............................................ 0.5 mL x 1 vial
HGF standard solution 2 (0.3 ng/mL) ......................................... 0.5 mL x 1 vial
HGF standard solution 3 (1 ng/mL) ............................................ 0.5 mL x 1 vial
HGF standard solution 4 (3 ng/mL) ............................................ 0.5 mL x 1 vial
HGF standard solution 5 (6 ng/mL) ............................................ 0.5 mL x 1 vial
20x concentrated washing solution .............................................. 25 mL x 1 vial
Plate seal .................................................................................................. 1 sheet
Components of IMMUNIS® HGF EIA required for determination ofsamples extracted from human tissues

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Anti-HGF monoclonal antibody coated microplate (8 wells/strip x 12) .. 1 plate
Sample diluent ............................................................................. 15 mL x 1 vial
Enzyme labeled monoclonal antibody.......................................... 10 mL x 1 vial
Enzyme substrate ......................................................................... 30 mL x 1 vial
Color developer......................................................................................4 tablets
Reaction stopper ............................................................................ 6 mL x 1 vial
20x concentrated washing solution ............................................ 25 mL x 2 vials
Plate seal ................................................................................................ 3 sheets1.

2.

Addition of 100mM PMSF solution
Add 0.3mL of 100 mM PMSF into 30 mL of Extraction buffer and mix. (final
concentration of PMSF should be 1 mM)
2) Add 0.15 mL of 100 mM PMSF into 15 mL of Sample diluent H and mix.
(final concentration of PMSF should be 1 mM)
Note: Prepare a sufficient volume of those reagents shown above before use.

2.

Re
ag

en
t

in

Preparation of 100 mM PMSF solution
1) Dissolve 17.4 mg of PMSF in 1 mL of isopropyl alcohol.

1.

Preparation of a tissue sample for extraction of hHGF

Sample weight measurement
1) Place a sample tissue section on a sheet of non-absorbent material such asaluminum foil and weigh. Use a micro balance when the sample is small insize and weighs several milligrams only.
2) Transfer the sample to a polypropylene or polyethylene vessel.
Note: Do not use a glass vessel as HGF adsorbs easily on the glass surface.
3) Cut tissue samples into as much small pieces as possible when they weighmore than 20 mg. (Use scissors to cut samples. Wash tissue samples andtissue exudates adhered to the scissors into Extraction buffer, when the buffer
is added to the sample.)
Addition of Extraction buffer
1) Add to samples 5 ~ 100 volumes of Extraction buffer per tissue sample
weight.
(1 volume: 1 µL of Extraction buffer / 1 mg of a tissue sample.)2) Adjust the volume of Extraction buffer in the range of 5 to 100 volumes
depending on the size of tissue samples. 5 to 100 volumes assure the same
extraction efficiency.
Refer to the table [Examples of extraction] below.

3.
1)Operation

Preparation of reagents (for the component of IMMUNIS® HGF EIA)
Enzyme substrate solution (containing the color developer)
Add one tablet of Color developer into 3 mL of Enzyme substrate and leave
the solution in a dark place. Thoroughly mix the solution after the Colordeveloper is dissloved completely. Prepare a sufficient volume of thissolution to cover all wells to be used for the test. This solution must be
prepared 15 minutes before use and used up within 60 min.
2) Washing solution
Dilute 20x concentrated washing solution 20 times with purified water. Keepthis solution at 2 ~ 10oC.
1)

1.

VI.

2.

Materials required but not provided
Micropipettes, 50 µL and 100 µL
A measuring pipette, 10 mL
A measuring cylinder, 1 L
A microplate shaker
An aspirator and a polypropylene washing bottle, or a microplate washer
A dark box (A light tight cupboard or drawer will do.)7) A microplate reader (main wavelength 492 nm or 490 nm, sub wavelength
620 nm or longer)

1)
2)
3)
4)
5)
6)

Assay procedure (Use IMMUNIS® HGF EIA)
It is desirable to test the same
0
6
S4
A
sample twice. Bring all kit
S4
0
6
B
o
reagents to 20 ~ 30 C before use.
C 0.3 S1 S5For each test, determine theD 0.3 S1 S5
HGF standard solution (2 wells E 1 S2 S6x 5 concentrations) as illustrated. F 1 S2 S6

3.

G

1)

Extraction.
Homogenize by a homogenizer the mixture of a tissue sample and Extraction
buffer prepared above. Select the optimum extraction method for the size ofa sample.
[Examples of the extraction method]• Tissue samples weighing less than 5 mg: Homogenizer
Note: Do not use a homogenizer made of glass. (Combination of an
Eppendorf micro test tube and a micro pestle will serve the purpose.)• Tissue samples weighing 5 mg or over: Sonicator (with a micro tip and onice).
• Tissue samples weighing 1 g or over: Polytron (on ice).

ｹ M729608311

Homogenizer or Sonicator(with micro tip and on ice)

5 mg
500 µL Sonicator (with micro tip
50 mg
500 µL and on ice)
50 mg
500 µL Sonicator (with micro tip
100 mg500 µL and on ice)
100 mg500 µL Sonicator (on ice)
100 mg or over 5 volume
1g
5 mL
Polytron (on ice)
(1) For determination of HGF in crude extract solution, 50 µL (for n=1
determination) or 100 µL (for n=2 determination) is required.
(2) 500 µL is the optimum volume for extraction by a homogenizer or sonicator(with a micro tip).
(3) The HGF concentration of 1 mg of an tissue sample extracted in 100 µL of
Extraction buffer is roughly 1 ng/mL for a normal liver and the same toseveral ten times higher than a normal liver level for livers with disorder.
(4) Taking into consideration the above factors, select the volume of Extraction
buffer to be added.
Note: When HGF is extracted from a large tissue sample, contact us for ourrecommendation.

VII.

Preparation of extraction reagents

1)

200 µL500 µL

fo

V.

1 mg
5 mg

rm

IV.
Reagents not provided but needed
1. Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)
2. Isopropyl alcohol

1 ~ 5 mg
100 ~ 200
(Biopsy sample
volumeweight)10 ~ 100
5 ~ 50 mg
volume5 ~ 1050 ~ 100 mg
volumeExamplesTissue Extraction
weight buffer vol.

n

III.

Extraction
buffer vol.

io

4.
5.

Tissue weight

at

II.
1.
2.
3.

2)

3

S3

0.3

1

S1 S2

S3

0

3

6

･･･････; HGF standard(ng/mL); Samples

S7

S3 S7
3
Preliminary dilution ofHsamples
Dilute as required the extracted samples with Extraction buffer. When HGF
in 1 mg of a tissue sample is extracted in 100 µL of Extraction buffer, HGF
concentration is roughly as follows.
- Normal liver:
1 ng/mL- Liver with disorder: Same as a normal liver to several ten times higher than anormal liver.
Pre-treatment of the anti-HGF coated microplate
Pipette 200 µL each of Extraction buffer in the wells for determination of the
HGF standard solution and samples and cover them with the plate seal
provided. Set the microplate on a microplate shaker and shake it for 10 min at
20 ~ 30oC.

HGF Extraction Reagent for Immunis HGF EIA

3)Washing
Remove the plate seal and suck out the well contents by an aspirator. Wash
all wells 5 times with the washing solution prepared under “2) Washingsolution” in “1. Preparation of reagents”, using polyethylene washingbottle, or a microplate washer. Then tap the microplate upside down on aclean paper towel. Then tap the microplate upside down on a clean paper
towel.
Note: Exert extreme care not to dry inside the wells. Follow the next step
immediately after washing is completed.
4) Dispensation of samples and the HGF standard solutions
Diluent
Sample diluent H(of HGF Extraction
Reagent)

--

--

50 µL

50 µL

50 µL

--

Operational precautions
Check accuracy of tools and properly use them according to their instructions.
Do not make react with any other enzyme immuno assay system using color
developers contain organic sorbent, such as Tetramethylbenzidine. The
reaction of OPD may be inhibited and it may affect the results.

1)
2)

3.

Handling precautions
All samples should be handled as if they were capable of transmitting HBV,HCV and/or HIV and all tools must be immersed in and sterilized with 0.1%
sodium hypochlorite.
2) Avoid contact of reagents. If they contact skin, wash with plenty of water. Get
medical care if necessary.
3) Sample diluent H and HGF standard solution contain sodium azide and should
be washed down with a sufficient volume of water to prevent formation of
explosive metal azide.
4) When reagents or tools are discarded, it should be handled and disposed
accroding to the instraction manual of IMMUNIS® HGF EIA.
1)X.

Storage and shelf life
Store the kit at 2 ~ 10oC and avoid freezing. This kit is stable for 1 year after thedate of manufacture. Validity of kit is shown in the package.

XI.

Package
1 kit for 96 tests

XII.

Code No. 1Z72

Reference
Nakamura T, Nawa K, Ichihara A：Partial purification and characterization ofhepatocyte growth factor from serum of hepatectomized rats. Biochem
Biophys Res Commun 122：1450-1459, 1984.
2) Nakamura T, Nishizawa T, Hagiya M, et al：Molecular cloning and expressionof human hepatocyte growth factor. Nature 342：440-443, 1989.
3) Nakamura T：Structure and function of hepatocyte growth factor. Prog Growth
Factor Res 3：67-85, 1991.
4) Yamada A, Matsumoto K, Iwanari H, et al：Rapid and sensitive enzyme-linked
immunosorbent assay for measurement of HGF in rat and human tissues.
Biomed Res 16：105-114, 1995.
1)

Re
ag

en
t

in

fo

HGF Standard solution: Use 5 standard concentrations of 0, 0.3, 1, 3 and 6
ng/mL in this reagent.
After the primary reaction, follow the instructions described in the instruction
manual of the IMMUNIS® HGF EIA.
5) Primary reaction
Cover the microplate with the plate seal provided and shake the microplate ona microplate shaker at 200 ~ 700 rpm for 1 hr at 20 ~ 30oC.
6) Washing
Repeat the procedure 3) above to wash the microplate wells.
7) Addition of Enzyme labeled monoclonal antibody.
Pipette 100 µL of Enzyme labeled monoclonal antibody to each well.
8) Secondary reaction
Cover the microplate with the plate seal and shake the microplate on a
microplate shaker for 1 hr at 20 ~ 30oC.
9) Preparation of Enzyme substrate solution
Approximately 15 min before the end of the secondary reaction, prepare the
enzyme substrate solution (containing the color developer) according to the
instructions given in 1) under “1. Preparation of reagents”.
10) Washing
Repeat the procedure 3) above to wash the microplate wells.
11) Addition of the enzyme substrate solution
Pipette 100 µL of the enzyme substrate solution (containing the color
developer) prepared in 9) above to each well.
12) Enzyme reaction
Cover the microplate with new plate seal and leave the microplate at 20 ~30oC in the dark for 30 min.
13) Addition of Reaction stopper
Remove the plate seal and stop color development by adding 50 µL of
Reaction stopper in all wells, and mix sufficiently.
14) Absorbance measurement
Measure absorbance of each well at 492 nm or 490 nm. When a dual
wavelength microplate reader is used, set the reference wavelength at 620 nm
or longer. Abosrbance must be measured within 2 hrs after stopping the
enzyme reaction.

2.

n

--

Sample diluent(of IMMUNIS®
HGF EIA)

General precautions
Do not use expired reagents.
Do not use reagents of different production lots.
Extraction buffer and Sample diluent H of this kit are not identical to those of
HGF Extraction buffer for Mouse & Rat HGF, Rat HGF EIA, or Mouse
HGF EIA, and should not be used with those reagents.
4) Vials and tools provided should not be used for other purposes.
1)
2)
3)

io

50 µL

1.

at

Extracted
samplesWarnings and precautions
This kit must be used according to the instructions and for the purpose
described in this manual. No result is guaranteed in any use or for any
purpose other than those described in this manual.

rm

Determinationof the standard
solution
Determinationof samples

HGF standard
solution(of HGF
Extraction
Reagent)

IX.

4

Net OD

VIII.
1.

Determination

Validation of assay and calculation of thespecific absorbance (Net OD).
1) Make sure that absorbance of the HGF standard
solution 1 (0 ng/mL) is less than 0.050.
2) Calculate the mean value of the 2 absorbancereadings of the HGF standard solution 1. If
either of the reading is 0.050 or more, disregard
that reading and use the other reading. Whenboth readings are 0.050 or more, assay is voidand should be repeated again.
3) Subtract the mean absorbance reading (or one
reading) of the HGF standard solution 1 from thereading of each well to calculate the Net OD.

2.
1)

3.

4.

1.0

0.1

0.01
0.1

0.3

1.0

3.0 6.0

HGF (ng/mL)

Preparation of the calibration curve by HGF standard solution
Using the logarithmic scales, prepare a calibration curve by plotting
concentration of the standard solution on the X axis and Net OD on the Y
axis.

Calculation of HGF concentration
1) Apply the Net OD of each sample to the calibration curve and read HGF
concentration.
2) When absorbance of samples exceeds 6 ng/mL (the highest concentration of
the HGF standard solution), dilute samples and determine again.
Calculation of the amount of HGF per tissue weightAmount of HGF/organ weight (ng/mg) =Preliminary sample
HGF concentration
Amount of added
××
dilution folds(ng/mL)
Extraction buffer (mL)
Organ weight (mg)Assay procedure and well arrangement
Well Arrangement

Reagents

HGF standard
1A - 1H, 2A - 2B

Samples
2C - 12H
Rough HGF concentration in
extracted samples
Normal : 1 ng/mL
Disorder: 1 ng/mL to ten times

1

Preliminary dilutionof samples

Extraction buffer--2

Pre-treatment of theanti-HGF coatedmicroplate

Extraction buffer

200 µLfor 10 min at 20 ~ 30oC, shaking

3

Washing

4Addition of HGF
standard solution andsamples5

Primary reaction

6

Washing

7Addition of Enzyme
labeled antibody

8

Secondary reaction

10

Washing

Addition of Enzyme
11
substrate solution
Enzyme reaction
Addition of Reaction
stopper
Absorbance14
measurement

5 times
HGF standard
SampleSample diluent of
ImmunisSample diluent H-50 µL
50 µL

50 µL

--

for 1 hr at 20 ~ 30oC, shaking
5 times
Enzyme labeled
monoclonal antibody

100 µL100 µLfor 1 hr at 20 ~ 30 oC, shaking
5 times
Enzyme substratesolution (containing
the color developer)

100 µL100 µL
o

12

13

50 µL
---

for 30 min at 20 ~ 30 C in the dark
Reaction stopper

50 µL

50 µL

492 nm or 490 nm

Manufacturerd and sold by;

Institute of Immunology Co., Ltd.
1-1-10, Koraku, Bunkyo-Ku,
Tokyo 112-0004, JAPANTel : +81-3-3814-4081
Fax : +81-3-3814-5957
March, 2011

ｹ M729608311