博 士 （ 医 学 ） 齋 藤

見学 位 論 文 題 名

ヒト悪性黒色腫細胞におけるsimv
astatinの抗腫瘍効果の検討
学位論文内容の要旨【背景と目的】悪性黒色腫はメラノサイト由来の悪性腫瘍であり、発生件数は増加傾向にある。早期例 では外 科的切 除によ り治癒が期待でき、10年生存率は95％以上である。一方、リンパ節転移症
例では、5年生存率は40〜50%ヘ低下し、さらに遠隔転移を来たした場合には、約10〜15%となり、化 学療法 や免疫 療法を 含む各 種治療法 に対し て非常 に抵抗 性があ る。こ のため、予後改善のために悪性黒色腫の新たな治療法の開発が期待されている。
スタチン系薬剤は、コレステロール合成の過程において、3―hydroxyー3―methlglutarylcoenzyme
A (HMG−CoA)から メバロ ン酸を 合成す る反応 を触媒 する酵素 である HMG−CoAreductaseを阻害する。現在、この薬剤は高コレステロール血症に対する治療薬として、また心血管病のハイリスク患者への予防のために広く使用されている。
ス タチン 系薬剤 は多彩 な薬理 効果をも っとさ れ、近 年では 悪性腫 瘍細胞 に対する抗腫瘍効果を検討するための基礎的研究が行なわれるようになってきた。しかし、これまでに、悪性黒色腫細胞に 対する 抗腫瘍 効果の 検討を行なった報告は少なく、その機序についても不明な点が多い。そこ
で 、本研究では、本邦で実際に使用されているsimvastatinの、ヒト悪性黒色腫細胞に対する抗腫瘍効果とその機序についての検討を行なった。
【方法と結果】
悪 性 黒 色 腫 細 胞 株 で あ る A375M， G361， C8161， GAK， MMAcに 対 し て 濃度 、 時 間 を変 えて 、 simvastatinを 作 用さ せ た 。 悪性 黒 色 腫 細胞 に お け るsimvastatinの抗 腫 瘍効 果とそ の機 序 を 検 討 す る た め に 、 増 殖 能 、 細 胞 形 態 、 Apoptosis、 細 胞周 期 、 DNA合成 能 、 細 胞周期関連遺伝子の発現に関する解析を行った。
WSTー8アッ セイに よる細胞 増殖能 の測定 では、 細胞株 の種類 により 感受性が異なるものの、simvastatinは こ れ ら 細胞 株 に 対 して 増 殖 抑 制効 果 を 示 し、 そ の 効 果は GAKで 弱 くA375MとC8161で強い 結果とな った。 位相差 顕微鏡 を用い て、形態変化を観察したところ、濃度依存性に接着性の低下を認め、細胞形態は円形を呈していた。
次 にsimvastatinの 細胞増 殖抑制 効果に おいて 、メバロン酸経路がどのように関与しているか検討するために、simv
astatinとともに、この経路の中間代謝産物であるファルネシルピロリン酸(FPP)
ま たはゲ ラニル ゲラニ ルピロリン酸(GGPP)を加えてWST−8アッセイを行なった。すると、GGPPを加えた細胞では、FPPを加えた細胞よりcellvi
abilityが回復しており、simv
astatinの細胞増殖抑制‑382ー

効果 には、 メバロ ン酸経 路中間 代謝産物 である GGPPの低 下が関 与していることが考えられた。次
いで 、simvastatinによるアポトーシス誘導を検討するために、DNA断片化アッセイを行なった。すると 、A375Mと G361ではラ ダー状 のバン ドを認め、simvastainがこれらの細胞のアポトーシスを誘導することが示唆された。次に、simvastatinが細胞周期に与える効果の解析を、propidium iodide(PI)染 色 後 に、 フ ロ ー サイ ト メ ト リー に て 行 なっ た 。 す ると 、 G361と MMAcでは濃 度依存 性にGO/G1期 の細胞 の割合が 増加し 、S期の 割合が 減少し ていた 。この結果より、これらの細胞株では細胞 周期Gl期 での停 止(Glアレ スト） が誘導 される ことが 示され た。ま た、DNA合 成能をELISAにて解 析した ところ 、G361とMMAcで、simvastatinの作用 により DNA合成能が低下しており、フローサイトメトリーの結果が裏付けられた。さらに、simvastatinが、細胞周期関連遺伝子の発現に与える変 化 を検 討 す る ために 、RT―PCRを 行なっ た。す るとMMAcと G361では 、simvastatin処 理した 細胞に おける p21、p27の発現が、対照細胞よりも強く認めた。これらの結果から、G361とMMAc
では、simvastatinの 作用に より、 細胞周 期の進 行を抑 制する 役割を もつp21と p27が強発 現し、Glアレストを来たしていることが示唆された。
【考 察】こ れまで にスタ チン系 薬剤が、 膵臓癌 細胞、 多発性 骨髄腫細胞や乳癌細胞など様々な悪性腫 瘍細胞 において抗腫瘍効果を示すことが多数報告されている。しかし、これまでに、ヒト悪性黒 色 腫 細 胞 に お け る ス タ チ ン 系 薬 剤 の 抗 腫 瘍 効 果 に 関 す る 詳 細 な 検 討 は 、 ShellmanらやCollissonら の報告に限られている。今回の研究では国内で臨床使用されているsimvastatinを用いて、ヒト悪性黒色腫細胞における抗腫瘍効果を検討し、ヒト悪性黒色腫細胞における、simvastatinの抗腫瘍効果を明らかにすることができた。
ヒ ト 悪性 黒 色 腫 細胞に おける スタチ ン系薬剤 の抗腫 瘍効果 の機序 には、 smallG蛋白 のプレニ ル化の 阻害や アポトーシスの誘導が関与していることが報告されてきたが、細胞周期との関連は示されていなかった。また、simv
astatinの抗腫瘍効果の機序に関する詳細な報告はこれまでなかった。
今回 の研究 では、 simvastatinの抗 腫瘍効果の機序に、アポトーシス誘導Glアレストが関与していることが示唆された。
アポトーシスや細胞周期と、癌患者の予後には相関があることが報告されている。アポトーシスと悪性 黒色腫 の予後 につい ては、 Bcl―2ファ ミリー に属す るBaxとBak（アポトーシス抑制系）の蛋
白発 現低下 が、患 者予後 の増悪 が相関し ている との報 告があ る。また細胞周期関連遺伝子と悪性
黒 色 腫の 予 後 に ついて は、p21の 発現低 下が、 無再発 生存の 低下と相 関して いると の報告 やp27の発 現低下 がtumor thicknessの増加 と結節型メラノーマにおける無病生存の低下と関連しているとの報告がある。このような研究結果から、アポトーシスを誘導し、細胞周期の進行を制御することは、悪性黒色腫の治療として有効であると考えられる。simvasta
tinの抗腫瘍効果については，さらに詳 細な機 序の解 明が必 要だが ，simvastatinが 悪性黒 色腫に 対する有 カな治 療手段 のーっになりうるのではないかと期待された．
【結 論】HMG一 CoA還元 酵素阻害 剤simvastatinが，ヒ ト悪性黒 色腫細 胞にお いて抗 腫瘍効果を有することが明らかになった，その機序としては，simvas
tatinによるアポ卜ーシス誘導と，p21およびp27遺伝子発現亢進を介したGlアレストが考えられた．

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学位論 文審査の要旨
主 査 教 授 山 本 有 平
副 査 教 授 福 田
諭
副 査 教 授 近 藤哲

学 位 論 文 題 名

ヒト悪性黒色腫細胞におけるslmvastatinの抗腫瘍効果の検討
ス タチン 系薬剤 は、コ レステ ロール 合成の 過程に おいて、 HMG‑CoAからメバロン酸を合成する
反 応 を 触 媒す る 酵素 である HMG‐COAreductaseを阻害す る。現 在、こ の薬剤 は高コ レステ ロール血症に対する治療薬として、また心血管病のハイリスク患者への予防のために広く使用されている 。スタ チン系 薬剤は 多彩な 薬理効 果をもっとされ、近年では悪性腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討するための基礎的研究が行なわれるようになってきた。しかし、これまでに、悪性黒色腫細胞 に対す る抗腫 瘍効果 の検討 を行な った報告は少なく、その機序についても不明な点が多い。そこ で、本 研究で は、本 邦で実 際に使 用されて いるsimvastatinの、ヒト悪性黒色腫細胞に対する抗腫瘍効果とその機序についての検討を行なった。
細 胞増殖 能の測 定では 、細胞 株の種 類によ り感受 性が異な るものの、simv
astatinはヒト悪性
黒 色腫細 胞株に 対して 増殖抑 制効果 を示した。また、位相差顕微鏡を用いて、形態変化を観察した ところ 、濃度 依存性 に接着 性の低 下を認め 、細胞 形態は 円形を呈していた。次にsimvastatinの 細胞増 殖抑制 効果に おいて 、メバ ロン酸経 路がど のよう に関与 してい るか検 討するために、
simva
statinとともに、この経路の中間代謝産物であるファルネシルピロリン酸（FPP）またはゲラニ ルゲラ ニルピ ロリン 酸（GGPP） を加え て細胞 増殖能 の測定 を行な った。す ると、 GGPPを加えた 細胞で は、FPPを 加えた 細胞よ りce11viabdityが 回復し ており 、simvastatinの 細胞増殖抑制
効 果には 、メバ ロン酸 経路中 間代謝 産物であ るGGPPの 低下が 関与し ているこ とが考 えられた。
次いで、simvastatinによるアポトーシス誘導を検討するために、DNA断片化アッセイを行なった。
す ると、 A375MとG361で はラダ ー状の バンド を認め 、8imvastainがこれらの細胞のアポトーシスを 誘導す ること が示さ れた。 次に、 simva8tatinが細 胞周期 に与え る効果の 解析を 、propidiumiodide（PI冫染 色後に 、フロ ーサイ トメトリーにて行なった。すると、G361とMMAcでは濃度依存性 にGO／G1期の細胞 の割合 が増加 し、S期 の割合 が減少 してい た。この結果より、これらの細胞株 では細 胞周期 G1期での 停止（ G1アレス ト）が 誘導さ れるこ とが示された。また、DNA合成能をELISAに て 解 析 し た と こ ろ 、 G361と MMAcで 、 8imvastatinの 作 用 に よ り DNA合 成 能 が低 下しており、フローサイトメトリーの結果が裏付けられた。さらに、simvastatinが、細胞周期関連遺伝
子 の 発 現 に 与 え る 変 化 を 検 討 す る た め に 、 RTlPCRを 行な っ た 。 する と MMAcと G361で は 、― 384―

simvastatin処理した細胞におけるp21、p27の発現が、対照細胞よりも強く認められた。これらの結 果 から 、G361と MMAcでは 、simvastatinの 作用に より、 細胞周 期の進 行を抑制 する役 割をもつp21とp27が強発現し、Glアレストを来たしていることが示された。
これ までに スタチ ン系薬 剤が、 前立腺 癌細胞 、多発性 骨髄腫 細胞や 乳癌細 胞など様々な悪性腫瘍細胞において抗腫瘍効果を示すことが多数報告されている。しかし、これまでに、ヒト悪性黒色腫 細胞に おける スタチ ン系薬剤の抗腫瘍効果に関する詳細な検討は、ほとんどされていなかった。 今回の 研究で は国内 で臨床 使用され ている simvastatinを用いて、ヒト悪性黒色腫細胞における 抗腫瘍 効果を 検討し 、ヒト 悪性黒色 腫細胞 におけ るsimvastatinの抗腫瘍効果を明らかにすることができた。そして、その機序としてアポトーシスの誘導と細胞周期の停止が関与していることが示された。アポトーシスの誘導と、細胞周期の制御は、癌治療において有効な機序と考えられて
おり 、simvastat
inが悪性黒色腫に対する有カな治療手段のーっになりうるのではなぃかと期待された．
公 開 発 表 に お い て 、 副 査 福 田 諭 教 授 よ り 1） 使 用 し た 細 胞 株 の 由 来 、 2） ス タ チ ン系 薬 剤 の 臨 床 使 用 と 、 悪 性 黒 色 腫 患 者 の 生 存 率 と の関 係 、 3） 臨 床応 用 へ の 方法 、 4） in
VIVOで の 研 究 の 実 施 の 有 無 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 次 い で 、 副 査 近 藤 哲 教授 よ り 1） ス
タ チ ン系 薬 剤 と 癌発 生 に 関 する 疫 学 的 な報 告 の 有 無、 2）本 研 究 に おい て simvastatinを選択 し た理 由 、 3） 研 究 で使 用 し た simvastatin濃度 と 、 臨 床に お い て 使用 さ れ て いる濃 度の違 い 、 4） 臨 床 応 用 し た 際 の 副 作 用 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 最 後 に 、 主 査山 本 有 平 教授よ り 1） simvastatinを 悪 性黒 色 腫 患 者へ 臨 床 応 用す る こ と は可 能 か 、 2） 他 の悪 性腫 瘍細胞 株 と比 較 し 、 悪性 黒 色 腫 に特 異 的 な 機序 は あ っ たの か と い う質 問 が あ った 。 い ずれの 質
問 に 対し て も 、 申請 者 は 学 位論 文 の 背 景お よ び 本 研究 の 経 過 と結 果 に つ いて 詳 細 な説明 を交え、最新の知見を引用し、概ね適切に回答した。
この 論 文 は 、ヒ 卜 悪 性 黒色 腫 細 胞 株に お い て simvstatinが 抗 腫 瘍 効果 を 有 す ること を明ら か にし た 点 で 高く 評 価 さ れた 。 す で に国 内 に お いて 高 コ レ ステ ロ ー ル 血症 な ど を対象 に臨 床 使用 さ れ て いる こ と な どか ら も 、 今後 、 皮 膚 悪性 黒 色 腫 に対 す る 治 療手 段 の ーっに なりうると期待される。
審査 員 一 同 は、 こ れ ら の成 果 を 高 く評 価 し 、 大学 院 過 程 にお け る 研 鑽や 取 得 単位 なども併 せ 申請 者が博 士（医 学）の学 位を受け るのに 十分な資 格を有 するもの と判定 した。

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