F R O N T I E R

R E P O R T

食中毒細菌の簡易・迅速検出キットの紹介〜カクテル増幅法により複数種の食中毒細菌を一括して検出できる遺伝子検査法〜
大分事業所

西島裕人て，食品中の7菌種または9菌種の生きた２ カクテル増幅法の特徴と原理

食品分野の製品や製造工程の管理にお食中毒細菌を簡易迅速に一括検出できる

２.１ 特徴いて，微生物試験および検出された微生試験法を構築し，その検査試薬のキット物の同定を行うことは衛生管理，汚染原化を行ったので報告する。

１ はじめにカクテル増幅法は，1回の反応で複数種の食中毒細菌由来の遺伝子を同時に，か因の究明およびバイオハザード対策等の面から非常に重要である。現在，それら

表1 カクテル増幅法と培養法の特徴比較

カクテル増幅法の微生物試験の公定法では，培養法が基本となっている。培養法は，培地調製や滅菌処理等の操作が煩雑なだけでなく，増菌培養，選択分離培養，確認培養と目的菌の分離のために何度も培養を繰り迅速性○

当日〜翌日判定可能

×

判定まで5日間前後

効率性○

検出対象細菌に関係なく同一操作

×

検出対象細菌で培地および操作が異なる

コスト○

検出菌種が多いほど同時測定による試薬および労務費の削減効果が大×

検出菌種が多いほどコスト大感度○

増菌培養＋カクテル増幅により，多菌種同時検出でも公定法レベルの検出感度を達成○

規格例： 100cfu（*3）／g

返した後，疑わしいコロニーについて生化学性状試験，血清型別試験，毒素産生性試験等の確定試験 1)，2)を行なうため，判定結果が得られるまでに多大な労力と培養法*3：colony forming unitの略，コロニー（菌集落）を作る単位で，培養により増殖する細菌数を示す。

5日間前後の時間を必要としている。また，対象は食品であり，食中毒細菌が発見されても既に流通し対応が遅れてしま㪈ᣣ⋡㩷

う恐れがあることから，簡便かつ迅速なᷙว䋬ဋ⾰ൻ䉴䊃䊙䉾䉦䊷ᷙวᶧ㩷✭ⴣ䊕䊒䊃䊮᳓╬㪐㪇㫄㪣㩷

試験法の開発が求められている。
近年，Polymerase Chain Reaction（以下，PCR法（*1）という）に代表される遺伝子検出法を利用した技術の発展㘩᧚㪈㪇䌧ၭ㙃ᴺ଀㩷䉦䉪䊁䊦Ⴧ᏷ᴺ㩷

により，微生物（特に病原菌）を特異的ᢙᤨ㑆䌾㪈㪏ᤨ㑆ၭ㙃㪉㪉ᤨ㑆ၭ㙃に簡易迅速検出する手法が注目を集めている。しかし，遺伝子検査法の問題として以下の2点が挙げられる。

ᩭ㉄䉕᛽಴㩷㪜㪱䉟䊷䉳䊷㫤䊶䉦䉪䊁䊦䉕૶↪䈚䈩㪧㪚㪩䈪Ⴧ᏷㩷㪧㪚㪩㪉ᣣ⋡
ㆬᛯჇ⩶ၭ㙃㩷

（1）多種類の遺伝子を検出する場合，反㪊ᣣ⋡

応条件の設定が難しく，特異性および感度が犠牲となる。

Ⴧ᏷䉕⏕⹺ㆬᛯಽ㔌ၭ㙃㩷

（2）消毒，加熱等による死菌由来の遺伝子を検出する可能性がある。
そこで我々は，江崎（岐阜大学大学院医学系研究科）らがPCR法を応用して開発した複数の微生物の特定遺伝子配列

7

SCAS NEWS 2011-Ⅰ㪉㪉ᤨ㑆ၭ㙃㩷㪋ᣣ⋡䉺䊷䉭䉾䊃㪎䌾㪐⩶⒳৻᜝ᬌ಴䋣䋣◲ᤃ䋬ㄦㅦ䉮䉴䊃䊜䊥䉾䊃ᄢ⏕⹺ၭ㙃㩷䋲ᣣ㑆㩷⏕ቯ⹜㛎㩷㪉㪉ᤨ㑆ၭ㙃㩷㪌ᣣ⋡を，同一条件で高感度に増幅させる技術（以下，カクテル増幅法という）を用い㪉㪉ᤨ㑆ၭ㙃

図1 食中毒細菌の検査方法の比較⚂䋵ᣣ㑆分 析 技 術 最 前 線

つ特異的に増幅できる利点があるため，簡易迅速で試薬コストと労力を節約できᓸ↢‛䈎䉌᛽಴䈚䈢ੑᧄ㎮ 㪛㪥㪘䋨㍌ဳ䋩㩷

る安価なスクリーニング手法となる。カ㪪㪫㪜㪧㪈ੑᧄ㎮㪛㪥㪘䉕ᾲᄌᕈ䈘䈞䈩৻ᧄ㎮䉕ᒻᚑ㩷䋨㪐㪌㷄䋬㪈㪇⑽䋩㩷

クテル増幅法と培養法との比較を以下に․⇣㈩೉䍪䍽䍵䍐䍭䍎㪝㩷示す（表1，図1）。
（1）迅速性：培養法では結果取得まで 5日間前後が必要だが，カクテル増幅法では当日または翌日判定が可能である。
（2）効率性：培養法は検出菌種に応じて，㪪㪫㪜㪧㪉㩷
․⇣㈩೉䋫䉺䉫㈩೉䊒䊤䉟䊙䊷䈱㩷䉝䊆䊷䊥䊮䉫㩿㪍㪌㷄䋬㪈㪇⑽㪀㩷

䉺䉫㈩೉
㪋㪇䉰㩷䉟㩷䉪㩷䊦㩷․⇣㈩೉䍪䍽䍵䍐䍭䍎㪩

䉺䉫㈩೉㩷 䋨㕖․⇣䋩㩷㪪㪫㪜㪧㪊㩷䍬䍽䍶䍰䍵䍎䍜䍼䈮䉋䉎િ㐳෻ᔕ䋨㪎㪉㷄䋬㪈㪇⑽䋩

作業手順が異なり作業が煩雑だが，カクテル増幅法は同一操作で 1 回の遺伝子増ੑᧄ㎮ 㪛㪥㪘 䉕ᾲᄌᕈ䈘䈞䈩৻ᧄ㎮䉕ᒻᚑ䋨㪐㪌㷄䋬㪈㪇 ⑽䋩㩷

幅反応により複数種の食中毒細菌由来の遺伝子を増幅することが可能であり，非䉺䉫㈩೉䊒䊤䉟䊙䊷常に効率的である。

䉺䉫㈩೉䊒䊤䉟䊙䊷䈫෻ᔕ㩷（3）コスト：カクテル増幅法では，（2）

䉺䉫㈩೉䊒䊤䉟䊙䊷㪩㩷 㩷の理由から検出菌種が多いほど同時測定での試薬および所要工数の削減効果が大

図2 カクテル増幅法の原理きくなる。て有用な領域である3)，4)，5）。

（4）高感度かつ生菌検出：カクテル増幅

マーでの増幅とを分割させることで，マ法では試料の増菌培養 0 時間と数時間〜

ルチプレックスPCRの短所を解決するこ

現在，販売しているEZイージー ®・

18 時間後を比較し，増殖した菌の DNAとに成功した 3)。具体的に説明すると，カクテルは，9菌種10遺伝子検出用とをターゲットとして遺伝子増幅を行うこ

増幅反応の初期段階（図2中の１サイク7菌種8遺伝子検出用の2種類があり，とにより，培養法と同等の感度と生菌検

ル目）は特異配列プライマーと検出対象それぞれタグ付き特異配列プライマーお出が可能となっている。

遺伝子がアニーリングし，増幅反応が進よびタグ配列プライマーを混合している行する。その後の増幅反応は，タグ配列キットである。本キットは図2に示すカ

プライマーで行うことにより，特異性おクテル増幅法で標的遺伝子の高感度一括

カクテル増幅法の基本原理はマルチプ

よび感度を犠牲にせずに，複数種の検出増幅が可能であり，表1で説明したようレックスPCR法（*4）を応用したもの

対象細菌遺伝子の同一条件下での増幅がに簡易，迅速で試薬コストおよび作業時である。通常のマルチプレックスPCR可能となる仕組みである。

間が大幅に削減できるため，食中毒細菌２.２ 原理の有無のスクリーニング手法として非常法ではプライマーのTm値（*5）をできする必要があるが，感度を考慮するとプ３ 開発したEZイージー®・カク
テルの内容および測定方法

ライマー配列の設計範囲が限られ，特異カクテル増幅法を用いて当社が開合，表2の通りTm値が近接しているこ性を犠牲にすることとなる。一方，特異発した食中毒菌検出キットであるEZとから菌種の特定が困難である。そのた性を考慮すると各プライマーの感度を犠

イージー ®・カクテルの検出対象細菌種め，個別検出用キットであるEZイージー

牲にすることとなる。マルチプレックスおよび標的遺伝子を表2にまとめた。標®・プライマーを用いて個別判定を行う

PCR法では各遺伝子の増幅効率に違いが的遺伝子は検出対象細菌が保有していことで菌種の特定が可能である。

生じ易く，検出対象細菌種を増やすほどる毒素遺伝子とハウスキーピング遺伝検出感度が低下する原因となる。

子（*6）である16SrRNAおよびdnaJるだけ揃え，各プライマーの感度を維持に有用である。
なお，カクテル増幅法で陽性判定の場

江崎らが開発したカクテル増幅法をが 対 象 と な っ て い る 。d n a J は ， プ ラ

図2に示す。カクテル増幅法は非特異でイマーの設計において通常使用される

４ スパイク試 験 に よ る EZイージー®・カクテルを用いたカクテル
増幅法の評価6)共通配列のタグ配列を付けた特異配列プ

16SrRNAの配列より，特異性が高い場

スパイク試験とは，たとえば牛乳にはライマーとタグ配列プライマーとを混合合があることが近年の江崎教授らの研究

大腸菌，豚挽肉にはサルモネラ菌の段階

し，初期の特異配列プライマーでの特異で判明しており，大腸菌や黄色ブドウ球希釈した菌液をそれぞれ食材に添加し，的増幅と初期増幅後のタグ配列プライ菌等の特異遺伝子検出のターゲットとし増菌培養した培養液のDNAを抽出した
SCAS NEWS 2011-Ⅰ8

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後，カクテル増幅法により検出感度を検腸菌標的遺伝子のTm値が測定されたことしている。なお，培養0時間においても遺証する試験である。

から，培養により増殖した大腸菌が検出

伝子増幅が確認されるが，これまでの実された例，つまり大腸菌の生菌検出を示績からTm値が78±1℃の場合，プライ４.１ 実験
検査対象細菌種と食材との関係を以下

表2 ＥＺイージー®・カクテルの検出対象細菌種および標的遺伝子（Tm値，増幅サイズ）の関係に示す。セレウス菌はパックご飯，カンピロバクター菌は鶏ささみ，リステリア

細菌種

標的遺伝子

Bacillus cereus （セレウス菌） (*7)

菌は生ハム，サルモネラ菌は豚挽肉，黄Tm 値 (℃ )cesB（*8）
（嘔吐毒）

80-81

NHENT（*8）
（下痢毒）

80-81

色ブドウ球菌はハンペン，腸炎ビブリオ

Campylobacter jejuni group （カンピロバクター属菌）

16SrRNA

80-81

菌およびコレラ菌はマグロ刺身，大腸菌

Escherichia coli ‐ Shigella spp. （大腸菌・赤痢菌）(*7)

dnaJ

82-83

およびエルシニア菌は牛乳について9菌

Listeria monocytogenes （リステリア菌） (*7)

dnaJ

80-81

種，7食材の組み合わせで実施した。

Salmonella spp. （サルモネラ属菌）(*7)

invA (*8)

83-84

Staphylococcus aureus （黄色ブドウ球菌） (*7)

dnaJ

83-84

本工程は次の3工程に大別される。食材

Vibrio cholerae （コレラ菌）

Cta (*8)80-81の前処理工程は，食材の各10g(mL)にVibrio parahaemolyticus （腸炎ビブリオ菌） (*7)

Tdh (*8)80-81

緩衝ペプトン水90mLを添加してストYersinia enterocolitica （腸炎エルシニア菌）(*7)

dnaJ

84-85

前処理フロースキームを図3に示す。

マッカーを用いて均質化処理を行った®

*7：7菌種8遺伝子検出用EZイージー ・カクテルの検出対象細菌種*8：それぞれの細菌種が保有している毒素遺伝子

後，食材を均質化した懸濁液40mLを分取し，遠心分離後の残渣に数cfu/mL〜103cfu/mLに調製した菌液2mLを添加+する工程である。培養工程（*9）は，二酸化炭素を封入して9菌種の検出対象細㪈㪇୚Ꮧ㉼✭ⴣ䊕䊒䊃䊮᳓㪐㪇㫄㪣㩷䊶䉴䊃䊙䉾䉦䊷䈪ဋ⾰ൻ㩷㘩᧚㩷 㪈㪇㪾㩿㫄㪣㪀㩷菌を一括して増殖できるEZイージー®・ブロスを用いて，菌液を添加した食材残渣懸濁試料を37℃で18時間培養する工程である。核酸抽出工程は，培養0時間および培養18時間後の培養液2mLを分取し，遠心分離後の残渣の核酸をEZイー✭ⴣ䊕䊒䊃䊮᳓䈱 Ộᶧ䊶㪋㪇䌭㪣ಽข㩿㪌㪇㫄㪣ኈ䊐䉜䊦䉮䊮䉼䊠䊷䊑㪀㩷䊶㆙ᔃಽ㔌㩿㪎㪇㪇㪇㪾䋬㪈㪌ಽ㑆㪀ᓟ䋬਄Ẵᶧ㒰෰㩷ᚲቯỚᐲ䈱⩶ᶧ㪉㫄㪣ᷝട㩷䊶䊗䊦䊁䉾䉪䉴䈪 Ộ㩷㪈㪋㫄㪣䈱㪜㪱䉟䊷䉳䊷㫤䊶䊑䊨䉴䈮㪉㫄㪣䈱 Ộ⩶ᶧ䉕ᷝട㘩᧚䈱೨ಣℂᎿ⒟ジー ®・ビーズで物理的破砕により抽出する工程である。
検出対象遺伝子の増幅は，抽出したDNAと9菌種10遺伝子検出用のEZ
イージー®･カクテルとで図2に示す条件

䊶㪈㪏ᤨ㑆ၭ㙃㩷㩿㘩᧚㪋㪾⋧ᒰ䉕ၭ㙃䋩ၭ㙃Ꮏ⒟㪜㪱䉟䊷䉳䊷 㫤 䊶䊑䊨䉴

で一括増幅を行った。判定はリアルタイ࡮ฦ ၭ㙃ᶧ䉕㪉䌭㪣ಽข㩷࡮㆙ ᔃಽ㔌䋨㪎㪇㪇㪇㪾䋬㪈㪌ಽ㑆䋩ᓟ䋬਄Ẵᶧ㒰෰㩷㪫㪜✭ⴣᶧ㪈㪇㪇㱘㪣ᷝട㩷࡮䊗䊦䊁䉾䉪䉴䈪චಽ䈮 Ộᓟ䋬ో㊂䉕㪜㪱䉟䊷䉳䊷 㫤࡮䊎䊷䉵䈮ᷝട䈚㪉ಽ㑆䊗䊦䊁䉾䉪䉴䈮䉋䉍⚦⢩⎕⎈㩷㪫㪜✭ⴣᶧ㪊㪇㪇㱘㪣ᷝട㩷࡮䊗䊦䊁䉾䉪䉴䈪ᡬᜈᓟ䋬㆙ᔃಽ㔌䋨㪎㪇㪇㪇㪾䋬㪈㪌ಽ㑆䋩㩷࡮਄ Ẵᶧ䉕㪊㪇㪇㱘㪣࿁෼㩷

ムPCR（ABI：STEP ONE PLUS）を用いてTm値の測定により行った。

ᩭ㉄᛽಴Ꮏ⒟４.２ 検討結果
スパイク試験により得られた各検出対
象細菌の検出感度を表3に，大腸菌の最低ᩭ㉄᛽಴⹜ᢱ㩿㪧㪚㪩䊁䊮䊒䊧䊷䊃㪀

添加濃度（40cfu/g未満）での遺伝子増幅およびTm値の測定例を図4に示す。
図4は培養0時間と培養18時間後の䊥䉝䊦䉺䉟䊛㪧㪚㪩䈮䉋䉍㪜㪱䉟䊷䉳䊷 㫤 䊶䉦䉪䊁䊦䉕↪䈇䈩Ⴧ᏷นⷞൻᬌ಴

DNA抽出試料の遺伝子増幅に明確な差が認められたことおよび培養18時間後で大9SCAS NEWS 2011-Ⅰ

図3 スパイク試験の前処理フロースキーム

分 析 技 術 最 前 線

マーダイマー（*10）
による増幅であることが確認されている。

表3 スパイク試験による検出感度検証結果
試料

セレウス菌

パックご飯

40＞

表3に示したように

鶏ささみ

各検出対象細菌の検出

生ハム

感度はカンピロバク

豚挽肉

ター菌で40cfu/g，他の8菌種で最低濃度

カンピロバ
クター属菌

単位：cfu／g

リステリア菌サルモネラ 黄色ブドウ属菌
球菌

コレラ菌

腸炎
腸炎
ビブリオ菌 エルシニア菌

大腸菌・赤痢菌

4040＞
40＞

ハンペン

40＞

マグロ刺身

40＞

牛乳

40＞
40＞

40＞の40cfu/g未満であり，すべての菌種で高ᄢ⣺⩶ᬌ಴㩷

感度検出を確認し，良好な結果を示した。

５ まとめၭ㙃㪇 ᤨ㑆㩷㪫㫄୯㪎㪏㷄㩷

スパイク試験によりEZイージー ®・カクテၭ㙃㪈㪏 ᤨ㑆㩷㪫㫄୯㪏㪉㪅㪌㷄㩷

ルを用いたカクテル増幅法の検出感度を検証した結果，すべての検出対象細菌で40cfu/g以下の高感度検出をㆮવሶჇ᏷᷹ቯ㩷確認した。
以上のことから，増菌培養にEZイージー ®・㪫㫄୯᷹ቯ㩷
図4 リアルタイムPCR装置を用いた遺伝子増幅，Tm値測定での大腸菌検出例（添加濃度40cfu/g未満）

カクテルを用いたカクテル増幅法を組み

注 釈

文

合わせることで，検査開始から当日また*1：2本鎖DNAを熱変性させて1本鎖を形成，プラ

1） 厚生労働省監修：「食品衛生検査指針 微生物イマー（*2）と標的遺伝子の反応（以下，アニーリングという），ポリメラーゼを介した伸長反応の3段階でDNA合成反応を行うことにより，標的領域のDNAを特異的かつ大量に増幅させることができる手法編」，日本食品衛生協会（2004）
2） 西島 裕人，増山 博幸：「これからの微生物検出について（簡易・迅速測定法を中心に）」
SCAS NEWS 2005-Ⅱ，pp.7-103） 江崎孝行：日本食品微生物学会雑誌，26（3）pp.150-157（2009）4）T.Ezaki et al.：dnaJ gene as a novel

は翌日には7菌種または9菌種の生きた食中毒細菌を一括して高感度検出が可能であり，本測定法は簡易迅速および安価に食中毒細菌有無の確認が行えるスクリーニング試験として非常に有用であることが確認できた。

６ おわりに近年のHACCPやISO22000などによる品質管理システムの普及により，食品業界の品質チェックやトラブル対策などで微生物試験の範囲は拡大してきており，かつ，迅速な試験結果の提出が強く求められてきている。また，微生物試験なしでバイオハザードのリスク管理は考えられないことから，我々はこうした社会や顧客のニーズに応えるため，今後とも積極的に微生物試験技術の開発や実用化を目指して行きたい。

*2：PCR法において標的領域のDNAを増幅する時に使用されるDNA断片で，増幅したいDNA領域の両端に結合するDNA配列を有する。
*4：複数種のプライマーを混合して，1回のPCRで多種の検出対象遺伝子を増幅させる方法

献

phylogenetic marker for identification ofVibrio species. Syst. Appl. Microbiol. 30,
pp.309-315（2007）5）T.Ezaki et al.：dnaJ gene sequencebased assay for species identification*5：Melting Temperature（融解温度）の略で二本鎖核酸の溶液を加熱し，全体の半分の分子が一本鎖状態（熱変性した状態）になるときの温度。
*6：エネルギー代謝等，細胞機能の維持に必要で細胞中に共通して一定量発現する遺伝子群

and phylogenetic grouping in the genus
Staphylococcus. Syst. Evol. Microbiol.57,
pp.25-30（2007）
6） 西島 裕人，高原 達夫，窪田 佐代子，吉田 滋，
江崎 孝行：第97回日本食品衛生学会学術講演
会講演要旨集，p.45（2009）*9：図3では培養18時間のプロトコールであるが，増殖が速い細菌種（腸炎ビブリオ菌，セレウス菌及び黄色ブドウ球菌）では，4時間培養で40cfu/gの検出感度を確認している。このため，検出下限値の規格や検出対象細菌種の組み合わせにより培養時間を短縮でき，当日判定が可能となる場合がある。
*10：PCRにおいてプライマー同士が部分的に反応し，お互いを鋳型として増幅する現象

西島 裕人（にしじま ひろと）

大分事業所

SCAS NEWS 2011-Ⅰ 10