ラット変形性膝関節症モデルに対する電気刺激誘発性筋収縮運動が組織学的な病態におよぼす影響

戸来柾人・宮原祥汰
要旨
変形性膝関節症（以下，膝 OA）モデル動物を用いた先行研究では，トレッドミル運動によって生じる関節へのメカニカルストレスは関節軟骨や軟骨下骨の変性を抑制することが明らかにされている．一方，臨床では大腿四頭筋の筋収縮運動が広く実践されているが，膝 OA の関節軟骨や軟骨下骨の変性や滑膜炎に対する影響については明らかにされていない．そこで，本研究では，ラット変形性膝関節症モデルに対する電気刺激誘発性筋収縮運動が組織学的な病態におよぼす影響について検討した．その結果，関節軟骨および軟骨下骨の変性は運動介入の有無に関わらず同程度に進行していたが，筋収縮運動を負荷した群では滑膜における単位面積あたりのマクロファージ数は有意に減少していた．これらの結果から，膝 OA 患者に対して大腿四頭筋の筋収縮運動を負荷すると滑膜炎を軽減できる可能性が示唆された．

はじめに制されるという．これに対して，関節軟骨に過度の機械刺激が加わると，関節軟骨や軟骨下骨の変性を進行させてしまうことも明らかにされている
6)．これらの知見から，運動によって関節軟骨に適度な機械刺激が加わると関節軟骨や軟骨下骨の変性が抑制されると考えられる．
一方，臨床では膝 OA に対する運動療法として下肢伸展位挙上運動（SLR）や膝伸展運動による大腿四頭筋の筋収縮運動が広く実践されている．そして，本邦における多施設共同研究 7)では，8 週間大腿四頭筋の筋収縮運動を継続すると非ステロイド性消炎鎮痛剤と同等の鎮痛効果が得られることが明らかにされており，このような運動が膝 OA の組織学的な病態に何らかの好影響をおよぼしているのではないかと考えられている．しかしながら，このような運動が膝 OA の組織学的な病態にどのような影響をおよぼすかについてはこれまで明らかにされていない．また，前述の先行研究の多くが関節軟骨や軟骨下骨の変性に焦点をあてているが，膝 OA の主要な組織学的な病態の 1 つである滑膜炎におよぼす影響についてはほとんど検討されていない．
そこで本研究では，ラット膝 OA モデルを用いて，臨床で広く実践されている膝関節伸展運動による大腿四頭筋訓練を電気刺激誘発性筋収

国 際 変 形 性 関 節 症 学 会 （ OsteoarthritisResearch Society International）の診療ガイドライン 1)をはじめとした世界各国の変形性膝関節症
診療ガイドラインでは，運動療法は膝 OA に対する非薬物療法の第一選択治療として推奨されており，臨床では，有酸素運動や筋収縮運動が実践されている．先行研究では，膝関節の内側半月板切除術が適用となった患者が運動療法を 4週間実践すると，関節軟骨におけるグリコサミノグリカン量が増加することが報告されている 2)．また，膝 OA モデル動物や培養組織を用いた基礎研究においても運動が関節軟骨の保護作用を有することが明らかにされている．具体的には，Chen ら 3)は，ラット膝 OA モデルの発症後から中等度のトレッドミル運動を負荷すると，関節軟骨の組織学的な変性の進行を抑制する効果が得られることを報告している．また，Holyoak ら 4)は，筋力の影響を除くため，ラット膝 OA モデル発症後から運動を模した周期的な機械刺激を関節軟骨に負荷すると，関節軟骨の変性が抑制されることを明らかにしている．そして，Iijima ら 5)によると，ラット膝 OA モデルに対してトレッドミル歩行を負荷すると軟骨下骨における骨嚢胞の発生が抑－1ー縮運動でシミュレーションし，大腿四頭筋の筋収縮運動が膝 OA の組織学的な病態におよぼす影響について検討した．

強度2～3mAの条件で，大腿四頭筋を2秒間収縮，4秒間弛緩させることで膝関節伸展運動を誘発した．そして， 1日20分，週5回の頻度で4週間継続した．

材料と方法
4．試料作成実験期間終了後，麻酔下のラットの左心室より生理食塩水を灌流して脱血を行い，その後，4%パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（pH 7.4）を灌流し，組織固定を行った．灌流固定後は右側膝関節を摘出し，4%パラホルムアルデヒドにて24 時間後固定を行い，Morse 液を用いた脱灰処理後に，通法のパラフィン包埋を行った．

１．実験動物実験には 7 週齢の Wistar 系雄性ラット 14 匹を用い，これらを無作為に 1）8%モノヨード酢酸（Mono-iodoacetic acid，以下，MIA）溶液 25μLを右膝関節腔内に投与し，膝 OA を惹起させた
後，32 日間通常飼育する OA 群（n=5），2）同様の方法にて右膝関節に膝 OA を惹起させた後，膝関節伸展運動を負荷する運動群（n=4），3）
MIA 投与の擬似処置として生理食塩水を投与した後，32 日間飼育する擬似処置群（n=5）に振り分けた． なお，本研究は長崎大学動物実験委員会で承認を受けた後，同委員会が定める動物実験指針に準じ，長崎大学先導生命科学研究支援センター・動物実験施設で実施した．（承認番号：1808091472）

5．組織学的検索
各群の個体について，5μm厚の前額断薄切切片を作成し，トルイジンブルー染色に供した．そして，光学顕微鏡下にて観察し，Gerwinら 10) の先行研究で示されている組織学的評価スコアに基づいて，関節軟骨および軟骨下骨の変性を評価した．

2. 膝 OA モデルの作成方法
OA 群および運動群の各ラットに対しては，3種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン 0.375mg/kg，ミタゾラム 2mg/kg，酒石酸ブトルファノール 2.5mg/kg）を腹腔内へ投与して麻酔した後，30 ゲージの注射針（NIPRO 社）を膝蓋靱帯の直上に刺入し8%MIA 溶液 25μL を右膝関節腔内に投与した．
なお，擬似処置群の各ラットに対しては，同様の手順で生理食塩水を右膝関節腔内に投与した．
3．膝関節の伸展運動の実施方法
本研究において採用した膝OAモデルは，先行研究に準じており，Oritaら8)の報告ではMIA投与後4日目から足底の痛覚閾値が低下することが報告されている．また，Hoshinoら9)の先行研究
では，MIA投与後5日目の組織学的所見が早期膝OAに相当するとされている．これらの知見を参考にして，運動群に対する運動介入はMIA投与後5日目から開始した．具体的には，前述の3種混合麻酔薬を腹腔内へ投与して麻酔を行った
後，低周波治療器トリオ300（伊藤超短波社）を用
い，刺激周波数50Hz，パルス幅250μsec，刺激

6．免疫組織化学的検索
滑膜炎の動態を評価するため，抗 CD68 抗体を用いてマクロファージに対する免疫組織化学的染色を実施した．そして，内側および外側関節包を 400 倍の拡大像で顕微鏡用デジタルカメラにて撮影し，パーソナルコンピュータに取り込んだ．その後，各画像における滑膜内膜を含む100μm の範囲内を検索対象として陽性細胞数と面積を計測し，1 ㎟当たりの陽性細胞数を算出し，各群で比較・検討した．
7．統計処理関節軟骨および軟骨下骨の組織学的評価スコアの比較には，Kruskal-Wallis 検定を適用した．
また，単位面積あたりのマクロファージ数の比較には，一元配置分散分析を適用した．各検定において有意差を認めた場合は，事後検定としてBonferroni 法を適用した．なお，全ての統計手法とも有意水準は 5%未満とした．

結果－2ーabca：擬似処置群，b：OA 群，c：運動群．bar=200µm．矢印：軟骨の変性．

図 1 関節軟骨のトルイジンブルー染色像

abc

a：擬似処置群，b：OA 群，c：運動群．bar=200µm．矢頭：軟骨下骨の変性．

図 2 軟骨下骨のトルイジンブルー染色像a) 関節軟骨b) 軟骨下骨****151413121110987*

*

OA群
OA群

運動群
運動群

5432
1600

擬似処置群
擬似処置群

OA 群
OA群

疑似処置群
擬似処置群

運動群運動群＊：擬似処置群との有意差．p<0.05

図 3 関節軟骨および軟骨下骨の組織学的評価スコア－3ー1．組織学的所見ならびに組織学的評価スコア
関節軟骨について，擬似処置群では脛骨と大腿骨においてトルイジンブルーに濃染した正常な関節軟骨が認められた．一方，OA 群および運動群では，脛骨の関節軟骨の消失や著しい染色性の低下が認められ，また，大腿骨においても関節軟骨の菲薄化や染色性の低下が認められた（図 1）．
次に，軟骨下骨について，擬似処置群では，骨基質内に骨細胞が散在する骨組織と球形の骨髄細胞が満たす骨髄腔が観察された．一方，
OA 群および運動群では，軟骨下骨の損傷を示す代償的な軟骨過形成や骨髄腔における線維芽細胞様の紡錘形細胞の集積が認められた（図2）．
そして，これらの所見を組織学的評価スコアに基づいて評価したところ，関節軟骨および軟骨下骨のいずれも，OA 群，運動群は擬似処置群と比べて有意に高値を示し，この 2 群間に有意差は認められなかった（図 3）．
2．滑膜における単位面積あたりのマクロファージ数
擬似処置群の染色像では，滑膜表層に褐色の陽性反応を呈する CD68 陽性細胞が散在する所見が認められた．これに対して，OA 群では，滑膜表層から滑膜下層に CD68 陽性細胞が多く認められた．一方，運動群においても滑膜表層から滑膜下層に陽性細胞が認められたが，その程度は OA 群と比べて少ない所見であった（図4）．そして，各群の単位面積あたりの CD68 陽性細胞数を比較すると，OA 群および運動群は，擬a：擬似処置群，b：OA 群，c：運動群．bar=50µm．矢印：CD68 陽性細胞．

図 4 抗 CD68 抗体に対する免疫染色像

単位面積あたりのCD68 陽性細胞数(cells/mm²)

180＊
＊

160＊
＊ ＃
＃

＊＃

140120100806040200

擬似処置群
疑似処置群

OA 群
OA群

運動群
運動群

＊：擬似処置群との有意差．＃：OA 群との有意差．p<0.05

図 5 滑膜のおける単位面積あたりの CD68 陽性細胞数－4ー

似処置群と比べて有意に高値を示し，運動群はOA 群と比べて有意に低値を示した（図 5）．

考察
本研究では，ラット膝 OA モデルを用いて，早期から負荷する膝伸展運動が膝 OA の病態におよぼす影響について検討した．
まず，組織学的検索の結果，OA 群では関節軟骨の消失や関節軟骨の細胞外基質の減少を示す染色性の低下といった，末期膝 OA 患者にみられる組織学的所見と同様の所見が観察された．また，軟骨下骨においては軟骨過形成や骨髄腔における線維芽細胞様の紡錘形の細胞の浸潤が認められた．一方，運動群においても OA群と同様の組織学的変化が関節軟骨や軟骨下骨において認められ，それぞれの組織学的評価スコアは 2 群間に有意差を認めなかった．これらの結果より，今回の条件で膝伸展運動を負荷しても，関節軟骨や軟骨下骨の変性を抑制できない可能性が示唆された．前述したように，膝 OAの動物モデルに対して発症後からトレッドミル運動を負荷すると関節軟骨や軟骨下骨の変性の進行が抑制されることが報告されている．そして，このメカニズムには，軟骨細胞の細胞膜に存在するメカノレセプターを介して生物学的応答を惹起することが関与しているとされている 11)．実際，
培養軟骨様組織に対して間歇的な圧刺激を負荷すると，細胞外基質の分解酵素であるADAMTS5 の遺伝子発現が抑制されることが報告されている 12)．また，外傷性膝 OA モデルに対してドレッドミル運動を負荷すると軟骨細胞において Bone morphogenetic protein（BMP）の発現が増加し，これは軟骨保護作用を有することが明らかにされている 13)．つまり，運動を実施することで軟骨細胞に適度な機械刺激が加わり，種々の細胞応答が惹起され，関節軟骨の変性が抑制されると考えられる．しかし，本研究で採用した膝OA モデルラットでは，解糖系酵素阻害剤であるMIA 投与によって軟骨細胞のアポトーシスを誘導されるため，膝伸展運動を負荷しても前述のような細胞応答が得られず，その結果，関節軟骨の変性やそれに続く軟骨下骨の変性を抑制でき－5ーなかった可能性が考えられる．
次に，単位面積あたりの CD68 陽性細胞数について，OA 群と運動群は擬似処置群と比べて有意に高値を示し，この 2 群を比較すると，運動群は OA 群に比べて有意に低値を示した．このことから，膝 OA の早期から膝伸展運動を負荷すると滑膜におけるマクロファージの減少，すなわち滑膜炎を軽減できる可能性が示唆された．
Ishikawa ら 14)の先行研究では，ラット急性膝関節炎モデルの発症後早期から膝伸展運動を負荷すると滑膜におけるマクロファージ数の減少が認められ, 滑膜炎に早期に軽減される可能性があることが報告されている．また，Castrogiovanni ら15)の先行研究では，前十字靱帯切断によって誘発した膝 OA モデルラットに低強度のトレッドミル走行を負荷すると，滑膜細胞において抗炎症性サイトカインである IL-10 の発現が増加することが明らかにされている．そして，Chen ら 16)によると，抗炎症性サイトカインである IL-10 は，組織の炎症に際してマクロファージの遊走を促進する
monocyte chemoattractant protein（MCP）-1 や炎症性サイトカインである IL-1β の産生を抑制し，炎症を軽減させるという．これらの知見を参考にすると，膝 OA 発症後に膝伸展運動を負荷すると滑膜細胞において IL-10 の発現が増加し，その作用によって MCP-1 の産生が抑制されることで滑膜におけるマクロファージの集積が抑制されるのではないかと考えられる．ただ，これらの点については本研究では検討できておらず，今後の検討課題である．

謝辞
本研究を進めるにあたり，ご指導・ご協力くださいました長崎大学大学院医歯薬学総合研究科運動障害リハビリテーション学研究室の諸先生方に厚く御礼申し上げます．

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（指導教員：坂本淳哉）－6ー