NGSアプリケー
ション紹介(MiSeqシステム）

イルミナ株式会社
サービス・サポート部
仲 健太© 2014 Illumina, Inc. All rights reserved.
Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cBot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate,
HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iScan, iSelect, ForenSeq, MiSeq, MiSeqDx, MiSeqFGx, NeoPrep, Nextera, NextBio, NextSeq, Powered by Illumina, SeqMonitor, SureMDA, TruGenome, TruSeq,
TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks of Illumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the U.S. and/or
other countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners.

第２部 NGSを利用した実験の組み立て方

2

多岐にわたるNGSの応用分野
遺伝性疾患
癌

生殖医療

遺伝学

農業

感染症

基礎研究

3

法医学

製薬

NGSの代表的なアプリケーション
全ゲノム解析
エクソーム解析
トランスクリプトーム解析
HiSeq2500
1000 Gb / ラン
6日 / ラン

遺伝子発現プロファイル解析
メチル化解析
メタゲノム解析
微生物ゲノム解析
ターゲットリシーケンシング

ChIP-Seq解析
NextSeq 500
120 Gb / ラン
1日 / ラン

Small RNA解析
多サンプルアンプリコンシーケンス
アンプリコンシーケンス
ライブラリQC

4MiSeq~15 Gb / ラン
～3日 (55時間) / ラン

研究の目的と実験デザイン
研究の目的
なにを読むのか– 生物種：ヒト、動物、植物、微生物– メタゲノム

どう読むのか– リシーケンス– アセンブル

どこを読みたいのか– 全ゲノム– 遺伝子領域

目的は何か
–
–
–
–

SNP & indel探索、1塩基変異
染色体構造、コピー数変化
発現プロファイリング
ピーク検出

どういう精度を得たいのか– ざっくりと傾向をつかむ– ある程度の精度で詳細に観察

ランのデザインリード長の選択– 35bp, 50bp, 75bp, 100bp….（任意）ライブラリーの選択– シングルリード（片側読み）– ペアエンド（両端読み： 200-500bpインサート）– メイトペア（両端読み： 2-5kbインサート）

データの厚み– 10x、20x、30x….

実験をする上での制約
コスト– プロジェクトの予算（試薬）時間– ランにかかる日数とこなすべきプロジェクト数

サンプル– 数、量、クオリティ など

検証– その他の手法は？

5

第２部

NGSを利用した実験の組み立て方

ライブラリー調製からデータ解析
1.

DNAシーケンス解析
1. 疾患パネル紹介
2. メタゲノム解析

2.

6RNAシーケンス解析

イルミナが提供する主なライブラリー調製キット
DNA用

RNA用

TruSeq DNA
PCR-Free

TruSeq Custom
Amplicon Low Input
TruSeq Amplicon
Caner Panel

TruSeq Stranded
mRNA

TruSeq Synthetic
Long-Read

TruSeq Exome
TruSeq Rapid Exome

TruSeq Stranded
Total RNA

Nextera DNA

Nextera Rapid Capture
Custom Enrichment

TruSeq Small RNA

Nextera XT

TruSight Tumor 15

TruSeq RNAAccessNextera Mate Pair

TruSight Myeloid

TruSight RNA
Pan-Cancer
TruSeq Targeted
RNA Panel

TruSeq Nano DNA

TruSight
疾患パネル
TruSeq ChIP
7

TruSeq RNA

データ解析

全ゲノム
DNA
ターゲット
アプリケー
ションの選択
mRNA
RNA

データ解析

Total RNA
解析ツールの選択

8

BaseSpace(イルミナ)
サードパーティ

BaseSpace 概念図
配列データ、解析データの保存・共有・譲渡
所有または共有されたデータを使用してアプリを実行

データをBaseSpaceに
アップロード

配列データ、解析データの保存、共有、所有データの譲渡
ラン・解析データの管理

9

データの共有クリックによる解析が可能

データ解析計算量例
アプリケーション(250 iCredit)
条件

iCredit

サンプル数

300 PE

0.025

10,000サンプル

500Gb 300 PE

4.5

55サンプル

3M 150SE

0.25

100サンプル

Isaac Enrichment

8Gb 75SE

6

41サンプル

BWA Enrichment

8Gb 75SE

9

27サンプルRNA Express

10M 75SE

0.125

2,000サンプル

TopHat Cufflinks

30M 75SE

6

41サンプル

TopHat Cufflinks

50M 75PE

13

19サンプル

Isaac WGS

120Gb 150PE

27

9サンプル

BWA Whole Genome

120Gb 150PE

144

1サンプル

微生物
Kraken (16S)
SPAdes(de novo)

100K

アンプリコンシーケンス

Amplicon DS
エクソーム

トランスクリプトーム

全ゲノム解析

10

BaseSpaceで提供されているアプリケーション
全ゲノムシーケンス

メタゲノム解析11

ターゲットシーケンス

トランスクリプトーム

バクテリア de novo アセンブル

その他

Methyl-Seq

1. DNAシーケンス・疾患パネル紹介
・メタゲノム解析

12

DNAライブラリー調製の主な方法
gDNA

物理的な断片化酵素による断片化

アンプリコン生成

TruSeqNextera, TruSight

TruSeq Amplicon

超音波による断片化＋
アダプター
ライゲーション

トランスポソームによる断片＋
PCRによるアダプター付加

2つのプローブによる伸長とライゲーション＋
PCRによるアダプター付加

キャプチャー

キャプチャークラスター形成、シーケンス
全ゲノム
13

ターゲット

全ゲノム

ターゲット

アンプリコン

物理的な断片化方法

超音波による断片化＋アダプターライゲーション

RNA(Except for TruSeq PCR-free)

データシート：TruSeq DNA PCR-Free サンプル調製キット（Pub. No. 770-2013-J001 20MAR2013）14 http://jp.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet_truseq_dna_pcr-free_sample_prep-j.pdf

酵素による断片化方法

15

トランスポソーム断片化＋ PCRアダプター付加

データシート：Nextera DNAサンプル調製キット（Pub. No. 770-2011-J021 07DEC11）
http://jp.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet_nextera_dna_sample_prep-j.pdf

標的領域濃縮方法構築したライブラリー
ストレプトアビ
ジンビーズ

サンプルライブラリーをプール

3 ストレプトアビジンビーズを用いて濃縮

1

変性した２本鎖のDNAライブラリー

ビオチンプローブ

ビーズからの溶離

ビオチン化プローブをターゲット領域にハイブリダ
イゼーション

PCR, クラスター形成 &シーケンス

データシート：Nextera Rapid キャプチャーエクソーム（Pub. No. 770-2013-J002 ）16 http://jp.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet_nextera_rapid_capture_exome-j.pdf

TruSight疾患パネル

17

One

疾患関連4813遺伝子をターゲトとしたエク
ソーム解析

Cardio

遺伝性心臓疾患174遺伝子をターゲット

癌パネル

癌の素因に関係する94遺伝子をターゲット

遺伝性疾患パネル

重篤な小児遺伝性疾患に関与する552遺伝
子をターゲットTruSight Cancer – 94 遺伝子

よくある癌、稀な癌の遺伝的素因を同定
癌との関連が報告されている284 SNPsが解析できる

臨床応用– 患者サンプルを用い、稀な複数の癌に対するコスト効率のよい遺伝的素因
テスト（1種類の稀な癌パネルであればコストが高くかかってしまう）– 同定した変異から、家族への検査の必要性を決定– 癌種ごとに、治療法の可能性を提供

研究– 癌サンプルをコスト効率よく迅速に区分け（既知遺伝子に基づくサンプルの情報引き出し）– 現在の手法は多くのDNA量を必要とし、ワークフローに時間がかかる

•
•

18

Somatic （体細胞変異）ではなく、Germline （生殖細胞変異／SNP）にフォーカス
サンプルは、正常細胞を想定（癌細胞ではない）• 例） 癌患者の血液サンプル• 例） 健康者の血液サンプル

TruSight Cancer Panelがターゲットにしている癌
遺伝性腫瘍・家族性腫瘍
遺伝性腫瘍の病名

原因遺伝子その他にできやすいがんの例

リンチ症候群（遺伝性非ポリポーシス大腸がん；
HNPCC）

MSH2, MLH1

子宮体がん、卵巣がん、胃がん、小腸がん、卵巣がん、腎盂（じんう）・尿管がん

家族性大腸ポリポーシス（家族性大腸腺腫症）
遺伝性乳がん・卵巣がん症候群

胃がん、十二指腸がん、デスモイド腫瘍
APC
BRCA1, BRCA2 前立腺がん、膵臓がん

リー・フラウメニ症候群

TP53

乳がん、急性白血病、脳腫瘍、副腎皮質腫
瘍

網膜芽細胞腫（もうまくがさいぼうしゅ）

RB1

骨肉腫、肉腫多発性内分泌腫瘍症（MEN）1型

MEN1

下垂体・膵ランゲルハンス島・副甲状腺腫
瘍または過形成

多発性内分泌腫瘍症（MEN）2型

RET

甲状腺髄様がん、副甲状腺機能亢進症、褐
色細胞腫

独立行政法人国立がん研究センターがん対策情報センター
http://ganjoho.jp/public/cancer/data/genetic-familial.html

TruSight Cancer Panelはこれら全ての遺伝子を含んでいます。
19

TruSight Portfolio

Tumor
CancerCardioOne

Inherited
Disease

TruSight 心疾患パネル

17の遺伝性心臓疾患に関与する174 遺伝子のエクソン領域をカバー
遺伝的要因と関連する心疾患にフォーカス

コンテンツはImperial College of Londonとの共同研究

20

心疾患の遺伝的要因を包括的なテストで解析

Cardio

心疾患の
臨床表現
型を示す

TruSight
心疾患パ
ネルで解
析

治療法の
選択
心疾患に関
与する変異
を同定

家族に同
じ変異が
あるかを
テスト

YES: 毎年
の健康診
断で
チェック

新しいプロセス– 心疾患の遺伝的要因の包括的な遺伝子セットで解析利点– 迅速な治療選択肢を提供 1週間– 家族スクリーニングの必要性も判定（遺伝性の有無）21

NO: とくになし

遺伝性心疾患
臨床的関連のある遺伝子をカバー

Aortic Valve Disease3

Marfan Syndrome

3

Loeys-Dietz Syndrome

4

Short QT Syndrome4# of genes

CPVT

6

Familial Hypercholesterolemia

7

Restrictive Cardiomyopathy9

Non-compaction Cardiomyopathy

10

Noonan Syndrome

11

AVRC

11

Brugada Syndrome

13

Structural heart disease

15

Long QT Syndrome

15

Familial Aortic Anuerysm

16

Familial atrial fibrillation

21

Hypertrophic Cardiomyopathy

47

Dilated Cardiomyopathy

59
0

22

10

20

30

40

50

60

70

TruSight Portfolio

Tumor
CancerOne

Inherited
DiseaseCardioTruSight 遺伝疾患パネル

552遺伝子のコーディングエクソン、イントロン-エクソン境界、
病原性変異を含む既知の領域をカバー
重度の小児疾患に寄与する遺伝子にフォーカス
Stephen Kingsmore博士、Carol Saunders博士、Hilger Ropers博士らによる設計– マーシー子供病院（CMH）小児ゲノム医療センター– マックスプランク研究所
23

TruSight Inherited Diseases – 552 遺伝子
小児疾患（遺伝性疾患）の特徴付け
臨床症候を
示す子供

特定疾患
と同定で
きず

単一遺伝子
疾患のテスト
を実施

該当なし

別の単一
遺伝子疾患
のテストを
実施

該当なし

現在のプロセス– 疾患が同定できるまで、繰り返し単一遺伝子疾患のテストを実施

臨床症候を
示す子供

特定疾患
と同定で
きず

TruSight
遺伝性疾
患で解析

疾患同定
の可能性

新しいプロセス– 網羅的な遺伝子セットで解析利点– スピード（数ヶ月 > 1週間）
– コスト効率– 網羅性

Dr. Stephen Kingsmore： 現在LDT（ラボ開発テスト）としてこの製品を実行に移している（小児患者の疾患診断のための最初のテストとして利用
24

TruSight Portfolio

Tumor
CancerOne
TruSight
One

CardioInherited
Disease4813 遺伝子をカバー
TruSight Exomeに追加コンテンツを搭載した、疾患関連遺伝子解析用のパネル

25

TruSight Oneシーケンスパネル
包括的な疾患関連遺伝子のエクソーム解析

TruSight Exome
希少疾患パネル(2,761 genes)
HGMD + OMIM
(1,966 genes)

GeneTests.org(69 genes)
Other TruSight(17 genes)

26

疾患関連遺伝子のエクソームをターゲットとした
TruSight Oneの実績27日本におけるTruSight One解析例

弊社ウェブページ「研究者の声」より抜粋
http://jp.illumina.com/science/featured_researchers.html
28

先天性疾患の原因変異探索の研究デザイン例

疾患状態

29

家族内集積がある
遺伝性疾患

家族内集積なし
孤発性疾患

仮説

常染色体劣性遺伝

De Novo 変異

スクリーニング

親子兄弟

親子兄弟

検証実験

別家系1~2組

別家系の発症者2~3名

アンプリコン疾患パネル
TruSeq Amplicon
Cancer Panel

血液および固形腫瘍に関与する48遺伝子のホットスポットをターゲット

TruSight Tumor 15

固形癌に関与する15の遺伝子をターゲットとしたマルチプレックスPCRパネル

TruSight Tumor 26

肺癌、大腸癌、メラノーマ、胃癌、卵巣癌に関与する26遺伝子をターゲット

TruSight Myeloid

骨髄性悪性腫瘍に関連する54遺伝子をター
ゲット

Coming soon

TruSight Lymphoid

リンパサンプルにおける変異の検出

Coming soon

TruSight ALL

急性リンパ性白血病に関連する約60遺伝子をターゲットComing soon

TruSight Myeloma

骨髄腫関連遺伝子をターゲット30

アンプリコン生成方法

プローブ伸長/ライゲーション＋PCRアダプター付加

データシート：TruSeq Custom Amplicon Low Inputライブラリー調製キット（Pub. No. 770-2015-J012 11DEC2015）31 http://jp.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet_tru_seq_custom_amplicon_low_input.pdf

がん研究における次世代シーケンサーの活用

リスク予測

32

スクリー
ニング

診断

薬剤応答

転移/再発

ICGC: International Cancer Genome Consortium
https://dcc.icgc.org/

国際共同研究（国際がんゲノムコンソーシア
ム）
50種類のがんについて
それぞれ500症例（500
ペア、1000人分）のゲ
ノム解読が目的
現在12,807人ドナーが登録

33

TCGA : The cancer genome atlas pan-cancer
analysis project
米国NIH
20種類以上のがんを対象としたオミックス解析
– 変異
– CNV
– 遺伝子発現– DNAメチル化– microRNA– RPPA– 臨床データ

Weinstein, John N., et al. "The cancer genome atlas pan-cancer analysis project." Nature genetics 45.10 (2013): 1113-1120.
34

イルミナがん関連シーケンスコンテンツセットの概要
腫瘍

再発

不均一性

寛解

TruSight Cancer••••

94 遺伝子
濃縮ベース
遺伝リスクの探索
平均カバレッジ 500x

TruSight 腫瘍パネル

TruSeq Amplicon Cancer••••

48 遺伝子 (血液腫瘍を含む)
アンプリコンベース
体細胞変異の探索
低コスト、ハイスループット

•
•
•
•
•

15もしくは26 遺伝子
アンプリコンベース
体細胞変異の探索
最高の検出限界
最高のカバレッジ

TruSight RNA Pan Cancer
•
•
•
35

1385 遺伝子 (血液腫瘍を含む)融合遺伝子、バリアント、発現プロファイルの評価
MiSeqでも1ランあたり8サンプルの解析が可能

イルミナがんパネルの比較
TruSight Myeloid

TruSeqAmpliconCancer

TruSight
Cancer

体細胞変異

体細胞変異

生殖細胞変異肺癌、卵巣癌、
大腸癌、結腸直腸癌、メラノーマ

骨髄性悪性

乳癌、卵巣癌、大腸癌、白血病

肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、
メラノーマ

20ng

30-300ng

50ng

150-250ng

50ng

検出変異頻
度

5%

5%以下

5%

5%

NA

遺伝子数

15 遺伝子26 遺伝子54 遺伝子48 遺伝子94 遺伝子

ターゲット

44 kb

21 kb

141 kb35 kb

255 kb

アンプリコン

アンプリコン

アンプリコン

アンプリコン濃縮

リード長151bp x2

121bp x2

150bp x2

150bp x2

150bp x2

カバレッジ

20,00x以上

7,000x

500x

1,000x

100x

解析アプリ

TruSight Tumor
15

Amplicon DS

TruSeq Amplicon

TruSeq Amplicon

BWA
Enrichment

TruSight Tumor
15

TruSight Tumor
26

利用形態

体細胞変異

体細胞変異

がん腫

肺癌、卵巣癌、
大腸癌、結腸直腸癌、メラノー
マ、乳癌

スタート量

手法

36

対象とする遺伝子の比較
TruSeq Amplicon Cancer (48 genes)
TruSight Tumor 26
TruSight Tumor 15
RET
GNA11

AKT1
BRAF

EGFR
ERBB2

GNAQ
KIT

KRAS
MET
NRAS

PDGFRAPIK3CA
TP53

FOXL2

ALK
APC

CDH1 FBXW7CTNNB1 FGFR2

GNAS
PTEN

SMAD4
SRC
STK11

MAP2K1
MSH6

ABL1 ERBB4 HNF1A
KDR
PTPN11
RB1ATM
FGFR1 HRAS
MLH1
CDKN2A FGFR3 IDH1
MPL SMARCB1
CSF1R
FLT3
JAK2 NOTCH1
SMO
JAK3
NPM1
VHL

37

カスタムパネル製品
TruSeq Custom Amplicon Low Input

38

TruSeq Custom Amplicon Low Input
10ngインプット量からのアンプリコンシーケンス
NEW !
TruSeq Custom Amplicon
Low Input

TruSeq Custom Amplicon
v1.5

gDNAインプット量

10 ng

50 ng

FFPEインプット量

10 ng ~

250 ngアッセイ時間

6.5時間

10時間

キットサイズ16, 96+サンプル

96+サンプル

アンプリコン数

16 ~ 1,536

16 ~ 10,000*

150, 175, 250 bp

150, 175, 250, 425 bp

製品名

アンプリコンサイズ*イルミナコンシェルジュサービスのご利用によりデザイン可能

価格も大幅改定！
例）200アンプリコン、16サンプルのライブラリー調製からシーケンスまで
ライブラリー調製キット；286,000円、シーケンス試薬キット；178,000円
サンプルコスト わずか29,000円（＊インデックスキットも含む）
39

TruSeq Custom Amplicon Low Input
10ngインプット量で、5%アリル頻度を検出
gDNAサンプル

高品質FFPEサンプル
Sample 1: 10ng

Sample 1: 5ng

25.0%
20.0%
15.0%

10.0%
5.0%
0.0%
0.0%

40

10.0%

20.0%

30.0%

35.0%
30.0%
25.0%
20.0%
15.0%
10.0%
5.0%
0.0%
0.0%

10.0%

20.0%

30.0%

イルミナが提供するライブラリー調製手法
物理的な断片化酵素による断片化+ Capture

アプリケー
ション

+ Capture

全ゲノム

Exome

全ゲノム

Exome / Target

Target

TruSeq DNA

TruSeq
Exome

Nextera DNA

TruSeq Rapid
Exome

TruSeq Custom Amplicon

TruSight One
TruSight Panels

TruSeq Amplicon Cancer(48 genes)
TruSight Tumor (26 genes)
TruSight Myeloid

製品名

DNAインプット量

アンプリコン生成

100-1000ng

100 ng1-50 ng

50 ng

30-300 ng

FFPE対応

No

No

No

No

Yes / No

カスタム対応

No

No

No

Yes

Yes

41

ターゲットシーケンス解析ワークフロー

ライブラリー調製

シーケンス

アライメント変異コール

アノテーション
フィルタリング

Enrichment

VariantStudio

Nextera Rapid
Capture Exome
TruSight One

サンプルから答えまで、一連の工程をサポート
42

アライメント＆変異コール用解析アプリの選択
BWA Enrichment v2.1
① Project WindowでLaunch Appを選択する② BWA Enrichment v2.1を選択する

43

解析レポートでライブラリーの品質を確認

標的領域にアライメントされたリード割合

カバレッジの均一性

44

X10、X20以上でカバーされる標的領域の割合
製品スペック (x10以上のカバー領域>80%)
Nextera Rapid Capture Exomeの場合

ゲノムブラウザ The Broad’s IGV
Broad Instituteが開発した多機能ゲノムブラウザ
ゲノムへのアライメントとバリアントを可視化

45

IL1F10遺伝子領域のアライメントとバリアント「IL1F10」と入力

拡大/縮小

46

どの変異が疾患と関連したものなのか？
アノテーション

フィルタリング– 変異した塩基に関する情報付加– 疾患に関連しない変異を除外

30,000~
エクソン領域

10,000 ~疾患関連遺伝子100~
NHLBI
Exome Variant Server

有害な変異

10~
稀

47

アノテーション＆フィルタリング用解析アプリの選択
VariantStudioの実行① Project WindowでLaunch Appを選択

ソフトのインストールが必要
・64-bit Wndows OS(Wndows 7以降)
・インターネット接続が必要
・メモリ2GB以上
・25 MB以上の空き領域② Variant Studioの実行

48

VariantStudioが提供する変異アノテーション情報

Annotation & Classificationタブから”Annotate”を選択
 dbSNP 各人種集団でのアレル頻度
 タンパク質構造への影響度 (SIFT、Polyphen) COSMIC: 癌由来の体細胞変異データベース
 ClinVar:臨床的表現型に関連のある変異データベースなど

結果閲覧したい変異解析結果(VCF
ファイル)を選択

49

VariantStudioでのフィルタリング
疾患の遺伝様式に基づいた絞り込み疾患に関わることが報告されている変異を絞り込
みフィルタリング50

アレル頻度での絞り込みエクソーム解析ワークフローのまとめ
BWA Enrichment
アライメント(BWA)

変異コール(GATK)

VCF
アノテーション

VariantStudio
VCFの入力51

アノテーション

フィルタリング

レポートの出力メタゲノム解析52

メタゲノム解析=微生物を集団で解析する
16s rRNA解析
 微生物ゲノムの16s rRNA遺伝子のみをシーケンスする 16s遺伝子はウィルスを除くすべての微生物に存在する
 16s rRNAの配列は多様性を持つため、その配列の解析からサンプルに含まれる微生物を同定可能

ショットガン解析
 微生物の全ゲノム・転写物をシーケンスする 遺伝子の機能予測やウィルスの解析まで期待できる

53

16S rRNA 遺伝子配列とは？
16S rRNAは1,542塩基長の原核生物 のリボソームRNAの一部である。 （真核生物の場合は18Sとなる）

16S rRNA遺伝子は保存領域と可変領域を有しており、保存領域をターゲッ
トとしてプライマーをデザイン することで、可変領域の増幅およびシーケン
スが可能。

54

16S rRNA領域の増幅用プライマーの注意点
V1とV2領域を挟むF27-R338
プライマーセットは、細菌への特異性が高い一方で腸内細菌叢の主要コミュニティであるBifidobacterium属（ビフィズス菌など）の検出感度が低いV4領域を囲む F515-R806プ
ライマーセットは細菌や古細菌など多様性高いコミュ
ニティを感度良く検出することができる一方、皮膚常在菌のPropionibacterium属（アクネ菌など）の増幅が困難

55“Experimental and analytical tools for studying the humanmicrobiome” Kuczynski et al., Nat Rev Genet. 2011 Dec
16;13(1):47-58

参考になる大規模な国際プロジェクト
プロジェクト

期間

内容

2010-

地球上の様々な環境サンプルを収集し約200,000サンプルを解析し、細菌叢ゲ
ノムリファレンスを構築。

2008-2012

健常者、肥満者、IBD患者の糞便を解析。

NIH Human Microbiome Project(HMP)

2008-2013

健康な242名の様々な組織からサンプリ
ングし、細菌叢ゲノムリファレンスを構築。

NIH The Integrative Human
Microbiome Project (iHMP)

2013-

早産、炎症性腸疾患、2型糖尿病を対象とした疾患コホートを立ち上げ

Earth Microbiome Project(EMP)

MetaHIT

56

菌叢解析の研究例

肥満• 菌叢の多様性が低い傾向• Chatelier E. et al, Nature (2013)糖尿病• マーカー遺伝子の同定• Junjie Qin et al, Nature (2012)

大腸癌• マーカー菌種の同定• Zeller G et al, Mol Syst Biol. (2014)• Zackular J et al. Can Prev Res. (2014)

肝癌• 肝癌誘発菌種の同定• Yoshimoto et al. Nature (2013)

食生活• 人工甘味料による耐糖能異常• Suez J. et al., Nature. (2014)

Aymé Spor, Omry Koren & Ruth Ley, Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nature Reviews
Microbiology 9, 279-290 (April 2011)57

細菌共生バランス失調と疾患

虫歯
歯周病
歯肉炎

肥満
メタボリック症候群
糖尿病
C. difficile 感染
大腸癌
炎症性腸疾患
精神疾患
アレルギー
ニキビ
乾癬
アトピー
外胚葉異形成症
皮膚がん

早産
絨毛羊膜炎
慢性絨毛炎症TORCH症候群

細菌性膣症
性行為感染症膣カンジダ症

Human microbiomes and their roles in dysbiosis, common diseases, and novel therapeutic approaches.
Belizário JE and Napolitano M, Front Microbiol. 2015 Oct 6;6:1050.
58

16S rRNA解析 ワークフロー

59

プライマー
合成

V3-4領域の配列を利用して、
460 bpのアンプリコンを生成するオリゴプライマーペアを発注

ライブラリー
調製

V3-4領域を少ないサイクル数で増幅し、Nextera XTキットでライブラリー調製

シーケンス
MiSeq

96インデックスを利用した場合、1サンプルあたり100,000リードで、
V3-4領域を十分なカバレッジにより精確にシーケンス

データ解析
MSR/
BaseSpace

Greengenesデータベースを利用した分類を行い、属あるいは種のレベルでグラフィカルに表示

16s領域をPCRで増幅

60

16S rRNA解析のための検証済プロトコール
MiSeqを利用したプロトコール– V3-V4領域を含む460 bの領域をPCR
増幅– シーケンス条件： 2x250–2x300– 解析：MSRまたはBaseSpace

応用可能なプロトコール– ユーザー独自のPCRプライマーが設計可能なアダプター配列情報– ユーザー独自のPCRプライマーを用いる際の Tm値設定 ガイド

61

プロトコール(pdf): http://jp.support.illumina.com/content/dam/illuminasupport/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide15044223-b.pdf

Earth Microbiome Project 標準プロトコル
サンプル調製方法の詳細が記載
http://www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/

62

16S菌叢解析用ライブラリー作製 : Tailed PCR• 16S 菌叢解析用のサンプル調製キットは存在しない• お客様ご自身でオリゴの合成 ～ PCRを実施いただく必要がある

63

32サンプルを1度に同時解析
16S rRNA遺伝子のV４領域（254bp）を対象に、32サンプルを1ランで、150塩基ペアエンドで解析
Qiime (J G caporaso, J Kuczynski, J stombaugh, et al., 2010) を用いて門(Phylum)のレベル
で分類

Dog

Owner 1

Owner 2

Soil

Human Samples Malawi

We thank Jeeff Gordon for the Malawi human fecal samples and Rob Knight for donation of the family study
human/canine host-associated samples from different body sites and soil samples.
64

イルミナウェビナーシリーズ：
16S rRNA遺伝子から始める腸内細菌菌叢解析
http://www.illuminakk.co.jp/65

16S rRNA解析・メタゲノム解析BaseSpaceアプリ

16S Metagenomics
16S rRNA菌叢解析

66

Kraken Metagenomics
メタゲノム系統解析

DNAライブラリー調製を詳しく学ぶには
データシート：TruSeq PCRフリーDNAサンプル調製キット– Pub. No. 770-2013-J001 20MAR2013– http://jp.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet_truseq_dna_pcr-free_sample_prep-j.pdf
データシート：Nextera DNAサンプル調製キット– Pub. No. 770-2011-J021 07DEC11– http://jp.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet_nextera_dna_sample_prep-j.pdf
データシート：TruSeq Custom Amplicon Low Inputライブラリー調製キット– Pub. No. 770-2015-J012 11DEC2015）– http://jp.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet_tru_seq_custom_amplicon_low_input.pdf
データシート：Nextera メイトペアサンプル調製キット– Pub. No. 770-2012-J052 05MAR2013– http://jp.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet_nextera_mate_pair_sample_prep-j.pdf

67

RNAシーケンス

68RNA-Seq：キットの選択
ストランド
情報に
興味がある
Yes

No

TruSeq RNA Sample Prep Kit v2
ncRNAにも興味がある

No FFPEサンプルを使用したいYes

TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit

Yes

Yes
細胞質だけでなくミトコンドリアのrRNAも除去したい

No

TruSeq RNA Access Library Prep Kit
No

TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero H/M/R
血液サンプルを使用したいNo

TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Gold

Yes

TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Globin
植物に
興味がある

TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Plant
Yes

Small RNAに
興味がある

69

TruSeq Small RNA Sample Prep Kit
Yesストランド情報
ストランド情報：– 2本のDNA鎖のどちらの鎖からRNAが生成されたのかを示す

ストランド情報の重要性– 鋳型となる鎖がわかれば、ゲノムに特異的にマッピングすることができるため、結果として効率よく配列を読むことができ、サンプルとコストを抑えることかできる– 遺伝子調節の重要な役割を示すアンチセン
スRNAの発現を検出することが可能

ATPH遺伝子発現（青色）の解析
Total RNAキットで解析した場合、ncRNAの偽遺伝子の発現（赤色）を解析できる
ストランド情報も参照すると、反対の向きでこのncRNA偽遺伝子が発現していることがわかる

ncRNA偽遺伝子が発現
70

データシート：TruSeq Stranded mRNA and Total RNA Sample Preparation Kit（Pub. No. 770-2012-010）
http://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_truseq_stranded_rna.pdf

ストランド情報
センスとアンチセンスに分けることで、転写産物の定量が精密に観察できる

オーバーラップした遺伝子上でも、明確な定量が可能

71

ストランド情報を維持したライブラリー作製原理

RNA
1st Strand cDNAの合成
2nd Strand cDNA合成の際に dUTP を使用

1st Strand cDNA
2nd Strand cDNA
アダプター付加

3’

DNAの
増幅
High Fidelity PCR酵素を利用することで、dUTPを使った2nd Strand cDNAは増幅されず、1st Strand cDNA側からのみ増幅

72

RNAライブラリー調製の主な方法
Total RNA

TruSeq mRNA

TruSeq RNA Access

PolyAを含むmRNA

rRNA除去断片化、cDNA合成、アダブター付加

キャプチャークラスター形成、シーケンス
73

TruSeq Total RNA

TruSeq RNAライブラリー調製の手順
Total RNA から poly Aを含む mRNA を回収

RNA の断片化

ランダムプライマーを用いた cDNA 合成

AAAAA

AAAAA
NNNNNN

NNNNNNP
P

末端修復、リン酸化、Aテイル付加
P
A

A

P

インデックス付アダプターのライゲーション
T
A

A

T

A

A
T

T

T

ビーズによるサイズ選択
A

74

T

PCR

A

RNAライブラリー調製の主な方法
Total RNA

TruSeq mRNA

TruSeq RNA Access

PolyAを含むmRNA

rRNA除去断片化、cDNA合成、アダブター付加

キャプチャークラスター形成、シーケンス
75

TruSeq Total RNA

TruSeq Total RNAライブラリー調製の手順
リボソームRNA

Ribo-ZeroによるリボソームRNAの除去

Total RNARNA の断片化
ビオチン標識プローブ
B

ランダムプライマーを用いた cDNA 合成

B
B

B

dUTPを利用した2本鎖 cDNA 合成

B

B
B

ストレプトアビジン
ビーズ

末端修復、リン酸化、Aテイル付加

インデックス付アダプターのライゲーション

ビーズによるサイズ選択

B

B

B

B
B
B

PCR

76

TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero

複数の Ribo-Zero に対応
Ribo-Zero キット

内容

Human/Mouse/Rat

ヒト、マウス、ラットの rRNA除去
（細胞質）

Gold

ヒト、マウス、ラットの rRNA除去（細胞質 + ミトコンドリア）

Plant

植物の rRNA除去（細胞質 + 葉緑体）

Globinグロビン mRNA除去

77

FFPEサンプル;トラスクリプトーム解析における大きな課題
パラフィンブロックの中には莫大な量の価値あるデータが埋もれている
FFPE由来のRNAは、ホルマリン固定の過程で断片化されたり化学的に修飾されたりするため、解析が最も困難なものサンプルのひとつ

FFPE

78

Fresh/Frozen

RNAライブラリー調製の主な方法
Total RNA

TruSeq mRNA

TruSeq RNA Access

PolyAを含むmRNA

RNAの分解が進んでいる
場合、Poly-Aではキャプ
チャーできないrRNA除去断片化、cDNA合成、アダブター付加

キャプチャークラスター形成、シーケンス
79

TruSeq Total RNA

mRNAを網羅できるが、ncRNAも拾うため、大量のシーケンスデータが必要

TruSeq RNA Accessライブラリー調製の手順
RNA の断片化
ランダムプライマーを用いた cDNA 合成
dUTPを利用した2本鎖 cDNA 合成
末端修復、リン酸化、Aテイル付加

インデックス付アダプターのライゲーション

PCR
ターゲット領域の濃縮

PCR

80

RNAライブラリー調製の違いによるデータ比較

TruSeq Stranded
Total RNA – 5億
リード

TruSeq Stranded
Total RNA
6000万リード
TruSeq RNAAccess
5000万リード
ブローブ領域
RefSeq Genes

コーディング領域（mRNA）
だけを効率よくシーケンス
TruSeq Stranded Total RNA
TruSeq RNA Access81

データシート：TruSeq RNA Access Library Preparation Kit（Pub. No. 470-2013-J004 01MAY2014）
http://www.illuminakk.co.jp/documents/pdf/datasheet_truseq_rna_access_library.pdf

イルミナが提供するライブラリー調製キット

TruSeq mRNA

TruSeq RNA Access

TruSeq Total RNA

mRNA

mRNA

mRNA & ncRNA

Poly-Aによる回収

コーディング領域を濃縮

rRNAの除去

解析対象RNA種
手法
ストランド情報

No

Yes

Yes

Yes

製品名

TruSeq RNA
v2

TruSeq Stranded
mRNA

TruSeq RNA Access

TruSeq Stranded Total
RNA

Total RNA
インプット量100-1000ng

100-4000 ng

10-20 ng100-1000 ng

FFPE対応

No

No

Yes

Yes

アッセイ時間

2日間

2日間

2.5日間

2日間

ハンズオン時間

12時間

9時間

11時間

8時間

82

トランスクリプトーム解析ワークフロー

ライブラリー調製

シーケンス

アライメント

発現量比較

TopHatCufflink

パスウェイ解析

有償オプション

TruSeq mRNA
TruSeq RNA Access
TruSeq Total RNA

サンプルから答えまで、一連の工程をサポート
83

トランスクリプトーム解析の考え方
cDNAをシーケンスすることで塩基配列を取得（リード）
リードの塩基配列を参照配列に対してアライメント
アライメントされたリードをカウント

13,025 リード

8,037 リードFKBP8 遺伝子発現
84

Brain

UHRR

3,115 リード

31,109 リード

RPS3 遺伝子発現

Brain

UHRR

RNA-Seq解析のアライメント
RNA-Seq解析のアライメントは、スプライスジャンクションの考慮が必要

リファレンスゲノム
エクソン
アライメントされたリード85

RNA-Seq解析の発現量比較
発現量の比較解析をする場合は、サンプル間のデータ量を揃える必要がある→正規化
遺伝子1

遺伝子2

サンプル1；5000万リード

サンプル2；6000万リード

FPKM（Fragments per kilobase of exon per million mapped sequence reads）
FPKM = エクソン1kbあたりにマッピングされたリード数
マッピングされた全リードにおける100万リードあたり

FPKM ≒ 1細胞あたりおよそ1コピー程度の発現量86

発現量比較用解析アプリの実行Cufflink Assembly& DE 実行結果
カウントされた遺伝子・トランスリプト
新規転写産物の数について

発現量の違いがみられた遺伝子・トランスクリプトの数

発現差のある遺伝子

サンプル間の相同性

スキャッタープロット

87

特定遺伝子の表示

発現量変動の大きい遺伝子だけをフィルタリング
significant = “yes”
log2(fold-change)でソート

88

トランスクリプトーム解析ワークフロー
TopHat Alignment
アライメント(TopHat 2)

融合遺伝子
検出
(TopHatFusion)

変異コール(Isaac)Cufflink Assembly & DE
発現定量
(Cufflinks)

有償オプション

89

アセンブル統合(Cuffmerge)

パスウェイ解析

比較解析(Cuffdiff 2)

発現定量(Cufflinks)

RNAライブラリー調製を詳しく学ぶには
データシート：TruSeq RNA Accessライブラリー調製キット– Pub. No. 470-2013-J004 01MAY2014– http://jp.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet_truseq_rna_access_library.pdf

ウェビナー：RNA-Seq～研究にあわせたアプリケーションの選び方～– http://jp.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/apac/japan/documents/pdf/2015_techsupport_session7.pdf

ウェビナー：NGSをはじめよう！RNA-Seq入門（キットの選び方、実験デザイン）– http://jp.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/apac/japan/documents/pdf/2014_techsupport_session2.pdf

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