植物ウイルスを知れば利用してみたくなる！	  
ー知られていない植物ウイルスの世界ー
植物ウイルスを手なずけろ！

北海道大学大学院農学研究院

増田税

図はすべてオリジナルというわけではなく、ウェブページからダウンロードしたものに説明を入れたものも含まれます。	  
論文に掲載したものは出典を入れました。

1

動物ウイルスと植物ウイルスの違いについて

Simple is the best!

どっちが賢く進化したのか？？

2

コロナウイルスはこのタイプ

3インフルエンザウイルス	
マイナス鎖RNA4

コロナウイルス
プラス鎖RNA

マトリックスタンパク質はエンベロープに組み込まれている5

プラス鎖RNA

筆箱のようなコアHIV	  エイズウイルス6

マイナス１本鎖RNA

ストッキングをはいたかのようなエンベロープ
エボラウイルス7

タバコモザイクウイルス

棒状ウイルス8キュウリモザイクウイルス	球状ウイルスCMV	  Genome	  RNA11aRNA22aRNA33a2bCP
9

病気の様相を病徴という10	  	  

この里は、いつも霜が降りるのでしょうか。夏の野で私が見た草は色づいてしまっていました。

も野 継 こみに ぎ のち我 て 里
たが 霜 はり見 やけし 置り草 くは夏の	  

世界一古いウイルス病の記載！

万葉集 752年頃	  孝謙天皇

11

ヒヨドリバナの葉の黄化

Tobacco	  leaf	  curl	  virus	  (TLCV)	  12

チューリップ狂時代	  1635年

オランダ
13

potyvirus
tulip	  breaking	  virus

ひも状ウイルス	  太さ：13	  nm	  長さ：750	  nm14RNAサイレンシング：後述
突然変異によって色素遺伝子の転写産物が分解されるようになって黄ダイズができた

ウイルス感染が色素遺伝子の発現を復活させる！

15

ウイルスに寄生する小さなRNAがいるとタバコが鮮黄色に変化	  RNAサイレンシングとの関わり合い（後述）16

鬼として扱われるウイルスだが、鬼のにおいのしない鬼もいる！
病徴出さないウイルス：弱毒ウイルス→
植物と共生することができるということか植物を変身させる弱毒ウイルスの不思議！！

17SEMINAR

ROOM

セ ミナー 室ためにな る植物 ウイル ス‑5

植 物 ワ クチ ン
佐山春樹

日本 デルモ ンテ(株)トマトのキュウリモザイクウイルス病

干渉効果：弱毒ウイルスを先に接種しておくとその後、強毒ウイルスに感染しない。	  
動物のワクチンのようなもの！！
植 物 ウ イ ル ス は世 界 中 で900種

あ ま りあ る と言 わ れ てい る が, 同 じ種 類 の ウ イ ル ス で も, 植 物 に感 染 して 強 い症 状 を 示 す ウ イ ル ス もあ れ ば, ご く軽 い症 状 しか 示 さ ない ウ イ ル ス もあ る. こ の弱 い ウ イ ル ス を植 物 に予 防 接 種

CMVとCMVはは
その 名 が 示 す 通 り, キ ュ ウ リ に感 染 す る こ とは もち ろん で あ るが, 1,000種 あ ま りの 植 物 に感 染 す る

し て お く と強 い ウ イ ル ス が 感 染 して も守 られ る こ と を,こ とが 知 られ て お り, 植 物 ウイ ル ス の 中 で は寄 生 植 物 がSalaman(1)が1933年

最 も多 い. 私 た ち の 周 囲 に あ る花, 野 菜, 樹 木, 雑 草 なに発 表 して 以 来, こ の 現 象 が ど う

し て起 こ るの か を解 明 し よ う とす る, また この 現 象 を利どに も多 く感 染 して い る. この ウ イ ル ス は ア ブ ラ ム シ に用 して植 物 を強 い ウ イ ル ス か ら防 除 し よ う とす る研 究 はよ っ て媒 介 さ れ るが, 植 物 に感 染 す る と, 葉 に緑 の 濃 淡

数 多 くな され て きた. しか し, 実 際 に実 用 化 さ れ て い るが 現 わ れ る モ ザ イ ク症 状, 葉 先 が細 くな る糸 葉 症 状, 病

植 物 ウ イ ル ス の種 類 は ご く少 数 で あ る.

斑 部 が黒 褐 色 に な る え そ症 状 な ど を起 こす こ とが 知 られ

筆 者 ら は, 植 物 ウ イ ル ス の 中 で も最 も寄 生 植 物 の 種 類が 多 い キ ュ ウ リモ ザ イ ク ウ イ ル ス (CMV)を使 っ た 防 除て い る. ま た植 物 の 生 育 が 抑 制 さ れ, 草 丈 が低 くな っ た
り果 実 の 品 質 が悪 くな っ た りし て, 収 量 が 減 少 す る こ と法 を 実 用 化 させ る こ とが で き た の で, 本 稿 で 紹 介 す る.

も あ る (図1,

予 防 接 種 に使 う弱 い ウ イ ル ス は 「弱 毒 ウ イ ル ス」 と呼 ば

内 で 増 殖 す る た め, そ の後 どん な農 薬 を散 布 して も効 果れ るが, こ の 言 葉 は 一 般 の 人 々 に と っ て な じ み が 少 なは な い.

く, また 誤 解 を招 きや す い. そ こで 筆 者 ら は, 動 物 の ワ

ま た, CMVは2). さ ら にCMVは,感 染 す る と植 物 体

温 帯 か ら熱 帯 地 域 に わ た る広 い地 域 でク チ ン とは 原 理 が 異 な る が,「 植 物 ワ ク チ ン」 と呼 ぶ こ

生 息 す る こ とが知 られ て い る. 日本 で は, トマ ト, キ ュとを提 唱 し て お り, 本 稿 で も植 物 ワ ク チ ン と呼 ぶ こ と とウ リ, ピー マ ン, メ ロ ン な どの 野 菜, あ る い は リ ン ドす る.

ウ, ユ リ, トル コギ キ ョウ, ペ チ ュ ニ ア な どの花 類 で その 被 害 が 大 き い. 海 外 で も, トマ ト栽 培 の 盛 ん な イ タ リ

18454

化 学 と 生 物 Vol. 41,

No. 7, 2003

CMV	  弱毒ウイルスに感染するとビタミンCが増加
19

いも焼酎のはなし！
弱毒ウイルス接種

SPFMV

ウイルスが感染したほうが焼酎が旨い？
弱毒ウイルスを接種することによって先端部が細くなった。破砕の効率が上がり、加工特性がよくなった。

20

JYMV

21

強毒感染

弱毒接種

健全

とろろの話！

大差なし

22
有意差はなかったが平均値では弱毒ウイルス感染で甘さとねばねば増大傾向！！

ビタミンCと弱毒植物ウイルスと抗ウイルス剤の関係!

鬼滅のビタミンC!!

23

植物のウイルス病対策

①②
③④⑤⑥

媒介昆虫の防除（殺虫剤の使用）
昆虫を防ぐ隔離施設
発病作物の伐採
耐病性品種の利用
ウイルスフリー化株の利用	  
弱毒ウイルスの利用⑦

抗ウイルス剤の開発？

24

弱毒ウイルスはそう簡単にみつけることができない！
弱毒ウイルスによるウイルス防除は広く実用化されるも・・・

１．すべてのウイルス病に弱毒ウイルスが準備できない	  ２．弱毒ウイルスが作られても強毒化の心配	  ３．接種の手間がかかる	  ４．弱毒ウイルスの利用といえども費用対効果

弱毒ウイルスを理解するには、宿主のRNAサイレン
シングとウイルスのRNAサイレンシングサプレッ
サーについての少しお話しが必要です。

25

RNAサイレンシングとは塩基配列特異的なRNAの分解機構であり、内生遺伝子の発現調節を行う一方で、外来RNAなどの２本鎖RNA（dsRNA）を分解する

一方、ウイルスはRNAサイレンシングサプレッサー（RSS）によって!
RNAサイレンシング経路の進行を阻害することができる

26

27

28

サイレンシングをひっくり返すRSSの力について！
ペチュニア‘レッドスター’

キュウリモザイクウイルス	  （CMV）が感染

花弁の白色部分は、RNAサイレンシングによりアントシアニン合成酵素が発現せず、	  アントシアニンが蓄積しない

RSSの作用により、	  RNAサイレンシングが抑制され、	  花弁のアントシアニンが蓄積	  (Koseki	  et	  al.,	  2005	  )ウイルス感染ダイズ種子に発生する果皮の着色も、ウイルスによるRNAサイレンシングの抑制による。	  
野生ダイズ

CMV感染ダイズ

健全ダイズ
29

そもそも弱毒ウイルスはなぜ弱毒になったのか？

RNAサイレンシングサプレッサー（RSS）の力が弱いだったらRSSを阻害する薬を使えば、強毒をみかけ上、弱毒にできないか

30

CMVのRSS（2bタンパク質）の病徴への影響

健全個体!

CMV感染個体!

2b欠失CMV感染個体

わい化
モザイク
31

強毒ウイルスを弱毒ウイルスに変身させられるのでは！
抗植物ウイルス剤の探索

強毒ウイルスのRNAサイレンシングサプレッサーを標的とする薬剤を探索薬

RNAサイレンシングによるウイルスの増殖抑制

RNAサイレンシングの打破（ウイルスの増殖）

抗ウイルス剤処理によりRNAサイシングを回復
32

＜RSS阻害剤のスクリーニング系＞

12〜45〜6(Shimura	  et	  al.,	  2008)
化合物とRSSの結合!
BiacoreシステムでRSSとsiRNAの結合を抑制する化合物5000種をスクリー
ニング!
Gel shiftアッセイおよびプロトプラストアッセイを用いて、スクリーニングで得られた化合物をさらに評価して絞り込み!
33

センサーチップにsiRNAを結合させて、色々なRSSを流し、結合するか
2b (TAV)

HC-Pro (TuMV)

Hc-Pro (PVY)

TAT (HIV-1)

NS1 (Influenza A virus)

まずRSSはdsRNAに結合するか？

MBP

34

動物ウイルスにもRNAサイレンシングは機能しているのか？

The Nucleocapsid Protein of Coronaviruses Acts as a Viral Suppressorof RNA Silencing in Mammalian Cells
Lei Cui, Haiying Wang, Yanxi Ji, Jie Yang, Shan Xu, Xingyu Huang, Zidao Wang, Lei Qin, Po Tien, Xi Zhou, Deyin Guo, Yu Chen
State Key Laboratory of Virology, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, Hubei, ChinaABSTRACT

RNA interference (RNAi) is a process of eukaryotic posttranscriptional gene silencing that functions in antiviral immunity inplants, nematodes, and insects. However, recent studies provided strong supports that RNAi also plays a role in antiviral mechanism in mammalian cells. To combat RNAi-mediated antiviral responses, many viruses encode viral suppressors of RNA silencing (VSR) to facilitate their replication. VSRs have been widely studied for plant and insect viruses, but only a few have been defined for mammalian viruses currently. We identified a novel VSR from coronaviruses, a group of medically importantmammalian viruses including Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), and showed that the nucleocapsidprotein (N protein) of coronaviruses suppresses RNAi triggered by either short hairpin RNAs or small interfering RNAs in mammalian cells. Mouse hepatitis virus (MHV) is closely related to SARS-CoV in the family Coronaviridae and was used as a coronavirus replication model. The replication of MHV increased when the N proteins were expressed in trans, while knockdown ofDicer1 or Ago2 transcripts facilitated the MHV replication in mammalian cells. These results support the hypothesis that RNAi
is a part of the antiviral immunity responses in mammalian cells.

Nタンパクがあるとコロナウ
イルスが元気になる

IMPORTANCE

RNAi has been well known to play important antiviral roles from plants to invertebrates. However, recent studies provided
strong supports that RNAi is also involved in antiviral response in mammalian cells. An important indication for RNAimediated antiviral activity in mammals is the fact that a number of mammalian viruses encode potent suppressors of RNAsilencing. Our results demonstrate that coronavirus N protein could function as a VSR through its double-stranded RNA
binding activity. Mutational analysis of N protein allowed us to find out the critical residues for the VSR activity. Using theMHV-A59 as the coronavirus replication model, we showed that ectopic expression of SARS-CoV N protein could promote
MHV replication in RNAi-active cells but not in RNAi-depleted cells. These results indicate that coronaviruses encode a
VSR that functions in the replication cycle and provide further evidence to support that RNAi-mediated antiviral response
exists in mammalian cells.

RNA interference (RNAi) is originally regarded as a mechanism of
eukaryotic posttranscriptional gene regulation mediated by smallinterfering RNA (siRNA)-induced sequence-specific RNA degrada-

and cauliflower mosaic virus P6 disrupt the components of RNAi
machinery (14, 15). In insect viruses, flock house virus (FHV) B2
blocks RNAi by dsRNA binding (16, 17), and Wuhan nodavirus

35余談ですが・・・・コロナウイルスのRSSもCMV2bと同じようにsiRNAに結合するのではウイルスのRSSのdsRNA結合部位の類似性
ウイルス

RNAサイレンシングサ
プレッサー(RSS）dsRNA結合部位（プラスチャージ）

CMV	

2b	

KKQRRR!

HIV	

Tat	

RKKRRQRRR!

Influennza virus A	

NS1	

RLRRDQK!

Coronavirus	

N	

KKPRQKR!

K：リシン（塩基性），R:アルギニン（塩基性），Q:グルタミン（中性），L:ロイシン（中性）P:プロレリン（中性），D:アスパラギン酸（酸性）36スクリーニングされた化合物（NS6390、NS5589）による	  RSS（CMV	  2b）とsiRNAとの結合抑制

NS6390とNS5589は、濃度依存的にRSSとsiRNAの結合を抑制
37

ビタミンC登場！！
抗RSS活性を指標に!
スクリーニングされたRSS阻害剤
クロコン酸!
黄色結晶性固体!
高い分極性能をもつ!

活性本体の構造

酸化型アスコルビン酸!

酸化型アスコルビン酸のヘミアセタール構造 	

RSS阻害剤と酸化型アスコルビン酸の重ね合せ38アスコルビン酸とその類縁体

Ascorbic	  acid

Dehydroascorbic	  acid	  (DHA)

Sodium	  L-­‐Ascorbate

Ascorbyl	  palmitate
L(+)-­‐	  Ascorbic	  Acid	  2-­‐Sulfate	  Disodium	  Salt	  Dihydrate
安全性が知られている、入手が容易であるなどの利点から、以後はビタミンC誘導体を抗ウイルス剤として利用することにした

Ascorbic	  Acid	  2-­‐Glucoside39

ビタミンC処理したカブ葉におけるYFP発現TuMVの局在対照	  （無処理）処理区（接種1時間後に葉挿し処理）(Fujiwara et al., 2013)!

ビタミンC処理によりウイルス感染点が70%減少し、感染点サイズも小さくなったビタミンC誘導体を利用した茎頂からのウイルス除去試験

福地ホワイト北海道在来	  (富良野)	  北海道在来	  (常呂)41

北海道産ニンニクに感染している主要病原ウイルス科		  Potyviridae		

属		  Potyvirus				  Leek	  yellow	  stripe	  virus	  (LYSV)	  Onion	  yellow	  dwarf	  virus	  (OYDV)	  Shallot	  yellow	  stripe	  virus	  (SYSV)	  Alphaﬂexiviridae	  Betaﬂexiviridae		  Allexivirus	  Carlavirus		  Garlic	  virus	  A,B,C,D	  	  (GarV-­‐A,B,C,D)		  Garlic	  common	  latent	  virus	  (GCLV)	  Shallot	  latent	  virus	  (SLV)

病徴・生育の不良	  ・鱗茎の未発達、わい化	  ・モザイク病徴

ニンニクは花粉稔性が低いため栄養繁殖する	  → 親株が感染すると、子株にもウイルスが伝搬する	  茎頂培養によりウイルスフリー株を作出し、	  それを栽培することでウイルスの蔓延を防止
42

病徴の程度＋ウイルス感染の組み合わせ	病徴	

LYSVのみ＋	Allexivirus	  のみ＋	

LYSV＋OYDV＋＋	＋	＋	  or	  ＋＋	＋	  or	  ＋＋	＋＋	＋＋	

LYSV＋Allexivirus	  LYSV＋OYDV＋Allexivirus

＋＋

生育不良	

LYSV、OYDV、Allexivirus属のいずれか2つに感染していると、病徴が激しくなる傾向がある。
一つウイルスを抜けば、病徴がかなり軽くなると予想。

43

切り出す茎頂の大きさとウイルスフリー化率（ニンニク）

ウイルスフリー化するのは約0.3mm程度の茎頂組織
ウイルス
フ
リ

顕微鏡下での作業	  熟練の技術が必要

ー

茎頂を小さく切り出すほど、	  ウイルスフリー化率が上がる。	  
しかし、茎頂を小さく切り出すと	  植物体再生率は低下する。

ウイルス
が検出さ
れる
44

切り出す茎頂組織の大きさと感染ウイルスの残存程度の関係

ウイルス感染率	(％)

100!
LYSV!
OYDV!
Allexiviruses!
SLV!

80!
60!
40!

0.5	  mm20!
0!
1!

2!

3!

4!

4+S.D.!
4+茎盤

葉原基の数	

茎盤を残した個体は、全てのウイルスが残存する確率が非常に高い	  45

切り出しサイズが1-­‐5mmの茎頂断片でのビタミンC処理効果	  MS培地
LYSV感染鱗片から	  茎頂周辺組織を切り出し	  茎盤は完璧に外さないてもよい	  
肉眼でも切り出し可（1mm程度）	  葉原基も１，２枚残すこともOK

ビタミンC処理でウイルスフリー化率向上が期待できるため、0.4mmの切り出し不要

ビタミンC添加	  培養14日目以降LYSV蓄積量
をqRT-­‐PCRで定量

4645000	  35000	  LYSV/ac\n	

ウイルス蓄積量

40000	  30000	  MS培地のみ	  ビタミンC処理

25000	  20000	  15000	  10000	  5000	  0	  
14日目	

28日目	

42日目	

1	  mm以上の大きな茎頂組織でも、ビタミンC処理により	  ウイルスの蓄積が阻害された	  472.	  北海道在来種のウイルスフリー化	  〈一鱗茎あたりの鱗片数〉

Lサイズの鱗茎	  (6.5〜7cm)
横から見た鱗茎

剥いてみると・・・

鱗片

感染個体	  ウイルスフリー個体	  ウイルスフリー個体のニンニク球は、均一の鱗片を含み、分裂数も少ない	  482.	  北海道在来種のウイルスフリー化	  〈根量〉

3	  (5)

2.5	  

*	  *	  根量	  (g)	2	  1.5	  (5)1	  0.5	  0	  infected	  

感染個体

virus	  free	  ウイルスフリーウイルスフリー個体の根量は、感染個体の2.3倍になった
49

2.	  北海道在来種のウイルスフリー化	  〈鱗片生重量〉

(8)

10	  

*	  *	  9	  8	  鱗片重	  g	  7	  6	  (8)5	  4	  3	  2	  1	  0	  infected	  virus	  free	  ウイルスフリー個体の鱗片重は、感染個体の鱗片重の1.74倍になった
50

フラクタンの量を測定
およそ2倍の差！

鱗片1	  gあたりのフラクタン量

鱗片1	  gあたりのフラクタン量(mg/g)

160	  140	  120	  100	  80	  60	  40	  20	  0	  infected	  free	  512.	  北海道在来種のウイルスフリー化	  〈アリシン含量〉

アリシン：辛味、ニンニク臭、滋養強壮、殺菌作用など	  
方法：UPLC	  MS/MS
16	  (4)アリシン量(相対値)14	  12	  10	  (3)8	  *	  6	  4	  2	  0	  infected	  Virus	  Free	  アリシン含量は、感染個体の方がウイルスフリー個体よりも1.6倍高かった	  53

ビタミンCを農薬へ！

ビタミンC誘導体実証試験（野外試験）

トマト黄化葉巻病
トマト黄化葉巻ウイルス Tomato	  yellow	  leaf	  curl	  virus（TYLCV）
Geminiviridae科Begomovirus属

病原1996年に国内初確認
タバココナジラミにより永続的に媒介	  接ぎ木伝染するが、	  種子伝染、土壌伝染、汁液伝染はしない
（防除策）
①②③④⑤

タバココナジラミの防除	
微細（0.4mm）なネットで覆う	
罹病トマトを抜き取る	
抵抗性品種を育成	
弱毒ウイルスの利用	

54ビタミンC防除にはいくつかの制約がある
アスコルビン酸（AsA）はTYLCVの増殖を抑制できるが	⇒ 一定量以上のウイルスの感染を制御できない	
⇒ 媒介昆虫の数を制御する必要がある	
試験時期や条件によって効果の変動が大きい	⇒ 春夏と秋冬の試験あるいは天候で効果が変動	
⇒ 無処理区よりも発病が多い場合もある	
内在AsA量が日照時間や	⇒ 温室で効果が高く出ることがある温度で変動することが影響？
⇒ 薬の最適濃度は，環境や個体差に依存55

内在性アスコルビン酸のレベルが高い品種はウイルス耐性

カブ9品種の内生アスコルビン酸量と	  Turnip	  mosaic	  virus	  (TuMV)抵抗性の関連
総アスコルビン酸量が高いほどウイルス抵抗性が高い
内在AsA量がウイルス抵抗性に関与（TuMV-­‐YFPを接種）

総AsA量	  （µg/gFW）

京の雪	  1280

雪姫かぶ	  1438

早生大蕪	  1603

(Fujiwara	  et	  al.,	  2016)

弱毒ウイルス感染トマト
でビタミンCが上昇したのは、偶然ではなく宿主のウイルス抵抗性発動の結果だ！！

56

ご清聴ありがとうございました

57