VHH抗体の構造と熱安定性のモデリング埼玉大学工学部情報工学科
松永康佑
ymatsunaga@mail.saitama-u.ac.jp
計算メディカルサイエンス ワークショップ2021
オンライン(Zoom) 2021年9月6日

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省略

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省略

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経産省サポイン事業 「ITバイオと進化工学を融合した高機能化人工次世代抗体VHHの開発」 令和2年度9月〜令和4年度
株式会社Epsilon Molecular Engineering、三井情報株式会社、埼玉大学との共同研究

内容 「ラクダ科動物由来の一本鎖重鎖抗体VHHライブラリの多様化」

http://www.saitama-u.ac.jp/topics_archives/2020-0907-1030-9.html 4

VHH(nanobody)とは︖
Light Chain (VL)

VHH (naobody)
Heavy Chain(VH)

VH

PDBより

ヒトの抗体

PDBより

ラクダ科の抗体

通常の抗体のVH/VLに比べて、分子量が小さい(扱いやすい)、構造が安定、中和能も同程度、これまで不可能だった抗原にも結合する、という特徴があり、新たな抗体創薬として注目されている

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VHHの構造
相補性決定領域 (complementarity determiningregion; CDR)

Heavy Chain onlyCDR

CDR

CDR

PDBよりラクダ科の抗体
L. S. Mitchell and L. J. Colwell, “Comparative analysis of nanobody
sequence and structure data,” Proteins, vol. 86, no. 7, pp. 697–706 (2018)

CDRの中でも特にCDR H3ループの構造が抗原結合にとって重要
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CDR H3ループはVHHによって多様な構造をとる
VHH

ヒト抗体のVL/VH
CDR H3
CDR H3L. S. Mitchell and L. J. Colwell, “Comparative analysis of nanobody
sequence and structure data,” Proteins, vol. 86, no. 7, pp. 697–706 (2018

CDRは可変領域であり、アミノ酸配列が変化することが可能。結果として様々な構造をとる
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その中でも特に、H3 ループは構造の変化が大きい今日の内容• 分子動力学シミュレーションによるCDR H3ループ構造のモデリング– レプリカ交換法を用いた効率的な探索• 分子動力学シミュレーションによるVHH抗体の熱安定性の解析– 網羅的なAlchemical free energy perturbationによる高精度解析

8今日の内容• 分子動力学シミュレーションによるCDR H3ループ構造のモデリング– レプリカ交換法を用いた効率的な探索• 分子動力学シミュレーションによるVHH抗体の熱安定性の解析– 網羅的なAlchemical free energy perturbationによる高精度解析

9抗体ライブラリの構造多様性は抗原の様々な結合部位(エピトープ)へ最適化するために重要

VHHのCDR H3ループ構造は大まかに”Upright”, “Roll”“Half Roll”の3つのタイプに分類。
それぞれのタイプで、抗原の異なる結合部位へ結合するEME社のHPより https://www.epsilon-mol.co.jp/tsuchiya_column/20201221/

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良いライブラリを設計するためには、何らかの手段で多様な構造が含まれているか検証することが必要
ライブラリから得た
VHHのアミノ酸配列>4KRN_1|Chain A|Nanobody/VHH domain
EgA1|Lama glama (9844)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTF
SSYAMGWFRQAPGKQREFVAAIRWSGGYTYYTDSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATYLSSDYSRYALPQRPLDYD
YWGQGTQVTVSSLEHHHHHH

実験 or
構造モデリング・予測

Upright型？

Roll型？

11機械学習・AI によるCDR H3構造予測の限界
CDR H3ライブラリから得た
VHHのアミノ酸配列>4KRN_1|Chain A|Nanobody/VHH domainEgA1|Lama glama (9844)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTF
SSYAMGWFRQAPGKQREFVAAIRWSGGYTYYTDSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATYLSSDYSRYALPQRPLDYD
YWGQGTQVTVSSLEHHHHHH

Alpha Fold2
オレンジ色は、この構造のconfidence
level (pLDDT)が低いことを示す

CDR部位の構造は、機械学習・AIが利用している進化情報に基づいていないため、構造予測が困難 (訓練データがない)

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構造予測のもう一つのアプローチ：
分子動力学シミュレーション
分子シミュレーションではまずコンピュータの中にタンパク質構造を作る。
次に、物理法則をまねて原子を動かすことで原子の動きを観測する
ニュートンの第二法則

𝐹 = 𝑚𝑎原子の動きを観察© Dr. Sugita (RIKEN)

顔写真
M. Karplusらにより開発
2013年ノーベル化学賞(nobelprize.orgより引用)

物理法則の利点： 訓練データがなくても原理的に予測が可能 (優れた汎用性)
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分子動力学シミュレーションの欠点

シミュレーションが短いと、不安定な構造しかサンプルすることができない

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AntibodiesやVHHシミュレーションの先行研究••••••Multicanonical MD sampling of CDR-H3 loop structures in antibodies– H. Shirai, N. Nakajima, J. Higo, A. Kidera, and H. Nakamura, J. Mol. Biol. 278, 481 (1998).
– S. T. Kim, H. Shirai, N. Nakajima, J. Higo, and H. Nakamura, Proteins 37, 683 (1999).
GPCR-nanobody binding by accelerated MD simulations.
– Y. Miao and J. A. McCammon, PNAS 115, 3036 (2018).
Metadynamics simulations for sampling CDR-H3 loops in antibodies.
– M. L. Fernàndez-Quintero, J. R. Loeffler, J. Kraml, U. Kahler, A. S. Kamenik, and K. R. Liedl,
Front Immunol. 9, (2019).
Thermal stabilities of VHH investigated by MD simulations– G. Bekker, B. Ma, and N. Kamiya, Protein Science 28, 429 (2019).
Binding affinity estimations by MD simulations– M. A. Soler, S. Fortuna, A. de Marco, and A. Laio, Phys. Chem. Chem. Phys. 20, 3438 (2018).
– M. A. Soler, A. de Marco, and S. Fortuna, Scientific Reports 6, 1 (2016).
– X. Cheng, J. Wang, G. Kang, M. Hu, B. Yuan, Y.Zhang, and H. Huang, International Journal ofMolecular Science 20, 17 (2019)
Many enhanced sampling methods
Response of antibody to antigen binding
have been applied so far– K. Shinoda and H. Fujitani, Scientific Reports 7, 1 (2017).
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Replica Exchange method
Sugita and Okamoto, Chem. Phys. Lett. 314, 141-151 (1999)
𝐹(𝑧)High temperature
Replica1MDMD

Replica2

Replica3
Low temperature𝑧しかし、系全体の温度を交換しようとすると、交換確率がとても小さくなってしまう
一部の自由度に絞って温度交換を行うことができないか？
REST (Liu 2005), REST2 (Terakawa 2011), gREST (Kamiya and Sugita 2018) 16

This study proposes to use gREST for enhanced sampling of H3 loop structure
Kamiya and Sugita, J. Chem. Phys. 149, 72304 (2018)

gREST can change the “temperatures” of both local specific residues and potential energy terms

Local residues

Potential energy terms

ednchaenV ( r ) = ∑ kb ( ri,i+1 − r0 )2Chemical bondpotential energybonds+ ∑ ka (θ i,i+1,i+2 − θ 0 )2Angularpotential energy

anglesWe propose to change
the “temperature” of H3loop with gREST

Dihedral+ ∑ kt ⎡⎣1 + cos ( nφi,i+1,i+2,i+3 − ω )⎤⎦ potentialenergytorsions⎡⎛ σ ⎞ 12 ⎛ σ ⎞ 6 ⎤Waals interaction+∑ ∑ ε ⎢⎜ ⎟ − ⎜ ⎟ ⎥ Van(LJ)derpotential
energyrr⎢⎝ ij ⎠⎝ ij ⎠ ⎥⎦i j>i⎣qi q jj>i 4πε 0 rij

Which potential energy terms +∑ ∑should be selected for
efficient sampling?

iElectrostatic interaction(Charge) potential energy

17Purpose and computational protocols
Test systems (PDB ID: 4KRN, 4IDL)

Problem we address
gREST can selectively change the ”temperature” of H3loop region. But which potential energy terms should
be selected for efficient sampling?

H3 loops

Computational Protocols
Homology modelingfrom sequence withSWISS-MODEL

Sampling of H3 loop
structure by gREST
simulations

We apply gREST method to CDR H3 loop and examine the combinations of potential energy terms,
ALL, DIHEDRAL, CHARGE, LJ, to evaluate which terms are effective for efficient sampling.
SWISS-MODEL used for homology modeling. GENESIS of RIKEN used for gREST simulation with 8 replicas.

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Simulation results (PDB ID: 4KRN)
RMSDs from experimental H3 loop structure

Experimentexperimentinitial(homologymodeling)

ALL

CHARGEDIHEDRALLJ

MD snapshot

Conventional MD

Homology modeling

DIHEDRALDIHEDRAL

HomologyModeling(cis proline)

MD snapshot(trans proline)

gREST with DIHEDRAL terms rapidly found the experimental structure
Higashida and Matsunaga, in preparation

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Simulation results (PDB ID: 4IDL)
RMSDs from experimental H3 loop structure
Conventional MDHomology modelingExperiment

MD snapshot
Beta-hairpin formed
but tilted

Homologymodeling

DIHEDRAL

experiment

DIHEDRAL

initial(homologymodeling)

gREST with DIHEDRL terms successfully forms the beta-hairpin structure.
But the hairpin is still tilted compared to the experimental structure.

20構築中のVHHライブラリから選んだ4つの代表配列に対する
gRESTシミュレーション結果

非公開

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今日の内容• 分子動力学シミュレーションによるCDR H3ループ構造のモデリング– レプリカ交換法を用いた効率的な探索• 分子動力学シミュレーションによるVHH抗体の熱安定性の解析– 網羅的なAlchemical free energy perturbationによる高精度解析

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VHHの構造安定性は創薬にとって重要低温搬送しなければならない場合、市場流通のためのコストが跳ね上がる非公開

冷蔵庫

構造の熱安定性が高ければ、例えばVHH抗体をエアロゾルで肺へ直接与えることができる
肺L. S. Mitchell and L. J.
Colwell Proteins, vol. 86,
no. 7, pp. 697–706 (2018)

CDR領域は可変なので、FR領域の配列を最適化することで23
熱安定性の高いVHHをデザインできないか？

シミュレーションによる熱安定性解析の先行研究
CDR H3

実験的に変性温度(Tm)がわかっているいくつかのVHHについて分子動力学シミュレーションを行い、Q-value (天然構造におけるコンタクトの再現割合)と良い相関があることを示した
G. Bekker, B. Ma, and N. Kamiya, “Thermal stability of single-domain
antibodies estimated by molecular dynamics simulations,”
Protein Science, vol. 28, no. 2, pp. 429–438, 201924

Free energy G

熱安定性を測る厳密な熱力学量: ΔΔGmutation

変異による熱安定性の変化

熱力学サイクルを考慮したΔΔG計算の置き換え

Ramadoss, V., Dehez, F. & Chipot, C. AlaScan: A Graphical User Interface for Alanine
Scanning Free-Energy Calculations. J. Chem. Inf. Model. 56, 1122–1126 (2016).

Alchemical free energy perturbation (FEP)𝑉 = 𝜆𝑉% + 1 − 𝜆 𝑉&

https://www.cresset-group.com/about/news/flarealchemical-fep/

Alchemical FEPはモダンなソフトウェア実装により低コスト化・高速化が実現しており、網羅的な計算が可能になりつつある
GENESISでのgRESTとの組み合わせ

H. Oshima, S. Re, and Y. Sugita, “Prediction ofProtein–Ligand Binding Pose and Affinity Using thegREST+FEP Method,” J. Chem. Inf. Model., vol. 60,
no. 11, pp. 5382–5394, 2020

NAMD version 3.0でのFEPのGPU化

H. Chen et al., “Boosting Free-Energy Perturbation
Calculations with GPU-Accelerated NAMD,” J. Chem.
Inf. Model., vol. 60, no. 11, pp. 5301–5307, 202028

複数個のVHHについて、全てのアミノ酸を一つずつAlanineへ点変異させた時のΔΔG (alanine scanning)非公開予備的結果：ΔΔGの結果を参考に表面電荷(GLU)を導入した変異体の高温でのシミュレーション結果

非公開

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まとめ• VHH抗体のCDR H3ループ構造をモデリングするための手法として、レプリカ交換法の一種であるgRESTを提案した。CDR H3ループと、DIHEDRAL項を温度変化させると効果的であることがわかった
非公開• 今後、こうした「網羅的」なシミュレーションにより、抗体創薬により役立つ情報を提供できるよう手法開発を行なっていく
謝辞• 経済産業省 戦略的基盤技術高度化支援事業 JPJ005698• Epsilon Molecular Engineering, 三井情報株式会社の皆様• 埼玉大学工学部松永研究室 東田さん、小田さん、岡田さん

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