博 士 （ 医 学 ） 伊東 広 臨
学位論文題名Protective effeCtS0ferythrop01etinanditSnonhematopoie6C
deriVatiVeSOnn10uSeCyClOSponnenephropat11y（エリスロポエチンおよびエリスロポエチン非造血性誘導体のマウスシクロスポリン腎症における保護作用）
学位論 文内容の要旨

背 景お よ び 目 的： 近 年 シ クロ ス ポ リン(CsA） 治療は ，移植 領域の みなら ず，多く の自己 免疫疾 患・腎疾患 へと臨 床応用 が拡大 しその 有用性 が示さ れてきた 。一方 ，対象 疾患の 性質上 ，投与期間が長くな りC8Aの 慢 性 腎毒 性 が 大 きな 問 題 と なっ て い る 。CsA長 期 投 与は ， 閉 塞 性細 動 脈 症， 虚血性糸 球体 病変 ， 縞状 問質繊 維化等 を特徴 とする慢 性C8A腎 症を惹 起する。 これら の病変 は非可 逆的で ，しばしぱ1曼 性腎疾 患へと 進行す るが， 確立さ れた予 防・治 療法は存在しない。最近の報告によれぱ，慢性CsA腎症 の 機序と して， 血管作 動性因 子の撹 乱によ る虚血 陸障害と 直接的 な尿細 管細胞 毒性， またそれによ り惹起 される 尿細管 細胞の アポト ーシス が重要な 役割を 果たし ている とされ る。エリスロポイ
エチン CEpo）は ，赤血 球前駆細 胞に作 用する造血因子であるが，最近の研究において，神経系，循環器系，腎 等多く の臓器 で，様 々な組 織傷害 に対す る保護作 用を有 するこ とが明 らかに なってきている。
そ の機 序 と し て， 内 皮 型 一酸 化 窒 素合成 酵素（eNOS）の産 生を増 加させ 局所血流 を回復 させる ことや，直 接的な アポト ーシス 抑制作 用の存 在が指 摘されて いる。 臨床応 用に向 け，組 織保護を期待する
場 合に 副 作用 となる 造血作 用を弱 め，組織 保護効 果を高 めた様 々なEpo類 似物質 の研究 ・開発 が行わ
れ てい る 。 我 々は ， 慢 性 C8A腎 症 の 病 態に 対 し こ れら の Ep0製 剤の 組 織 保 護作 用 が 有効 である可 能性があ ると考 えた。
我 々 は ， 慢性 CsA腎 症 マウ ス モ デ ルを 作 成 ， C8A腎 症 の 病 態に 関 与 し てい る 可 能 性のあ る因子 につ い て 検 討 し ， ま たEやoお よび 2種 類 の 非 造血 性 Epo誘 導体 asialoEpoQ壥 po） と carbamylatedEp0（CEpo） の慢性 〔：sA腎 症に対 する腎 保護作用 にっい て検討 を行っ た。
方 法： 5週 齢 の オ スICRマ ウ ス を ，ラン ダムに COIltr01群， CsA単独群 ，C出十 Epo群（Epo併用群 ），CsA十 AEpo群 は Epo併 用 群 ） ， C鹸 十 CEpo群 （ CEpo併 用 群 ） の 5群 に 分 け た 。 実 験 開 始 の 1週 間
前 から 0． 01％の 低Na飼料 にてコ ンディ ショニ ングを 行い， CsAは30mg瓜 g／doseを連 日皮下 注射で ，各 Epo製 剤 は 1000HMoseを 週 2回 皮 下 注 射 で 投 与し た 。 4週 間 の薬 剤 投 与 の後 ， 血 液 ，腎 組 織 を 採取，各 種解析 を行っ た。
採 取 し た血液 は，一 部でヘ マトク リット （Ht）値 を測定 ，残り を遠心分 離し血 中尿素 窒素（ BUN）および 血清ク レアチ ニン（ 8Cre）値を 測定し た。
腎 組 織 は ，新 鮮 凍 結 ，PIP固 定 ， ホル マ リ ン 固定 の 三 種 類の方 法で標 本化した 。新鮮 凍結船 よび
―255−

PLP
固 定標 本 は， 各種 免疫染色およびTUNE
L解析に用いた。ホルマリン固定 標本は，H‑E染色およびPA
Sにて染色し，尿細管問質病変の評価に用いた。
結果：Cs
A投与開始2週間後から，CsA単独群のマ ウスに外見上，明らかな消耗が認められた。3週間後からは，体重 減少が顕著となった。E
po併 用群，AEpo併用群，CEpo併用群では，明らかな消耗や体重減少は認めなかった。4週間後の採血において，Epo併用群のマウスでは，control群，CsA
単独群と比較して10％程度のHt値の上昇を認めた。
BUNおよ ぴ s
Cre値を 測定 し腎 機能 を評 価し た。 Cs
A単独群と比較して，AEpo併用群，CEpo
併用 群で B
UN値 の有 意な 低下 を認 めた 。ま た， Epo併 用群，CEpo併用群でsCre値の有意な低下を認めた。
病理組織学的に，尿細管問質病変の定量評価を行った。CsA単独群と比較して，各E
po製剤併用群で尿細管問質病変領域の有意な減少を認めた。尿細管問質繊維化の評価のためm型コラーゲンの免疫染色を行ったところ，CsA単独群と比較して，各E
po製剤併用群でIII型コラーゲン沈着の有意な減少を認め，病理組織学的評価とー致した結果となった。
Cs
A腎症におけるレニン・アンギオテンシン系の影響を評価するため，レニンの免疫染色を行った。
control群を含む全ての群において，糸球体血管極近傍の細胞にレニンの強い発現を認めた。群問の有意差は認めなかった。
CsA腎症 に おけ るeNO
Sお よぴ i
NOSの発 現の 変化 を免疫染色にて評価した 。CsA
単独群では，c01血D1群と比較して著明な鑞OS発現の増加と，eNOS発現の減少を認めた。E
po製剤併用群では，（ 】 sA単 独 群 と 比 較 し て ， 有 意 な 蝌 OS発 現 の 減 少 と ， eNOS発 現 の 回 復 を 認 め た 。
C8A腎症の尿細管問質障害におけるサイトカインの影響を評価するため，腎尿細管における代表的な炎症性サイトカインであるオステオポンチン（OPN）とそのレセプターであるCD44の免疫染色を行った。Epo製剤併用群では，（：8A群と比較して，有意なOPN
およぴC
D44の発現の減少を認めた。
尿細管上皮細胞のアポトーシスを評価するため，実験開始から1週，2週，4週に採取した腎組織にっいて，飢｝N
EL法およぴcleavedc
aspa8e‐3の免疫染色を行った。飢TNE
L法では，（：鹸単独群で，C8A投与期間の延長とともに著明な飢TNE
L陽陸細胞数の増加を認めた。一方，Epo併用群では，2週， 4週で ，AEpo
併 用群 では ，2週 のみ で， CE
po併用 群で は， 1週， 2週， 4週 の全てでC8A単独群と比較してTUNEL陽性細胞数の有意な減少を 認めた。cleavedcaspa
8e．3免疫染色では，CsA単独群との比較にて，全てのEpo製剤併用群で，1週，2週，4週の全てで有意なcleavedcaspa8e・3陽性細胞数の減少を認めた。
考察：最近の研究にて，CsA腎症の発症・進展においては，血管作動性因子の撹乱から惹起される虚血・低酸素性の組織障害と，直接的な細胞毒性による組織障害のニっが主要な役割を果たしているとされている。また，Epo製剤の細織保護作用については，直接的なアポトーシス抑制や血管拡張因
子 で あ る eNOSの産 生を 増 加さ せる こと によ る局 所血 流の 改善 等の 関与 が指 摘さ れ てい る。
今回の我々の実験では，C8A投与により，機能的・病理組織学的腎障害が出現し，尿細管上皮細胞の アポ トー シス が増 加， 組織障害性NOSである iNOSの発現が増加，血管拡張因子であるeNOSは減少，炎症性サイト カインであるOPNとそのレセ プターであるC
D44の発現が増加することが示され，C8A腎症の発症・進展には，これらが重要な役割を持っことが示唆された。一方，Epo製剤の投与により，機能的・病理組織学的腎障害は明らかに軽減し，尿細管上皮細胞のアポトーシスは著明に256−

抑制，iNOSの発現は減少，eN
OSの 発現は増加，OPN． C
D44の発現は抑制されることが示され，Epo製剤による慢性Cs
A腎症に対する組織保護効果は，これらの作用によるものであることが示唆された。最後に，組織保護効果を期待する場合には，副作用となる造血作用にっいてであるが，Epo群
では，Ht値の上昇が見られたのに 対し，AEpo群，CEpo群では，Ht値の上昇を認めなかった。Epoの過剰投与によって，脳血管・心血管イベントが増加するという報告もあり，慢性CsA腎症において腎保護を期待してEp0製剤を使用する際には，造血作用を示さないA
Epo，CEpoが有望であると考えられた。

― 257ー

学 位論文 審査の要旨
主査

教授

野 々村 克 也

副査

教授

久下裕司

副査

教授

岩永敏彦

副査

教授

有賀副査

教授

筒井裕之

正学位論文題名P
rotective effeCt
SO
ferythr
op01
eti
na
ndit
S
nonh
enl
atopoieti
C
deriVatiVeSOnmouSeCyClOSporlnenephropat11y（エリスロポエチンおよぴエリスロポエチン非造血性誘導体のマウスシクロスポリン腎症における保護作用）

シクロスポリン(CsA）治療は、 近年移植領域のみならず多くの自己免疫疾患・腎疾患への臨床応用が拡大し、その有用性 が示されてきた。一方、対象疾患の性質上、投与期間が長期 化し CsAの 慢性腎毒性が 大きな問題となっている。CsAの長期投与は、閉塞性細動脈症、虚血性糸球体病変、縞状問質 繊維化等を特徴とする慢性C8A腎症を惹起する。これらの病 変は 非 可逆 的で腎不全へと進行し得るが、確立され た予防・治療法は存在しない。
最近、赤血球前駆細胞に作用する造血因子であるエリスロポイエチン（Epo）が、神経系、循環器系、腎等多くの臓器におい て、様々な組織傷害に対する保護作用を有することが明らかになってきている。また臨床 応用に向けて、造血作用を減弱し組織保護効果を高めた
様々 なEp0類似 物質の開発が 積極的に行われている。代表的な組織保護性・非造血性 Epo
誘導 体と し ては 、asia10Epo（AEpo） 、 及び carbamylatedEpo（CEpo）が挙げられる。
我 々は 、 マウ スモ デル を用 いて 、慢 性C8A腎症に対す るEp0製剤くEp0、AEpo、CEpo）の腎保護作用に関する検討を行っ た。5週齢のオスICRマウスを、ランダムにCo
ntrol群、C8A単 独群 、C8A十Epo群 （Ep0併用 群） 、く ：8A＋AEpo群（AEpo併用群）、C出十CEpo群（CEpo併 用 群） の5群に 分け た。 Cs
A投 与開 始1週 間前 から 0． 01％ の 低Na飼料にてコンデ ィ シ ョ ニ ン グ し 、 C8Aを 連 日 皮 下 注 （ 30mg瓜 g/dose） 、 各 Epo製 剤を 週2回 皮下 注（10001U/dose）にて投与した。1，2，4週間後に、血液、腎組織を採取し各種解析を施行した。
腎 機能 （ BUN、血清クレア チニン値）の検討においては、C8A単独群と比較して、AEp0併用 、CEp0併用 群で BUN値の 有意 な低 下 を認 めた 。ま た、 全て のEp0製剤併用群で血清クレ アチ ニ ン値 の有 意な 低下 を認 めた 。ま た病 理組 織学 的検 討と し て尿細管問質病変ー 258―(stripedfibrosis、tubularatrophyに関する定量的解析を施行したところ、C8A単独群に比べ、全 てのEpo製剤併 用群で尿細管問質病変領域の有意な減少を認めた。さらに問質型
m型コ ラーゲン の免疫 染色によ っても 繊維化の 有意な軽快が示された。Ep0製剤大量投与による造 血効果を 検討したところ、Epo併用群では、control群、C8A単独群に対して有意なへマトクリット（Ht）値の上昇を認めた。AEpo、CEpo併用群では、Ht値上昇を認めず、組織保護 を目的と したEp
o製剤大量投与における非造血性誘導体のメリットが示された。
次に、Epo製剤 のCsA
腎 症保護効 果に関 するメカ ニズム にっいて 検討し た。NOS発現様式に関する免疫組織学的検討では、C8A単独群では、control群に比し、尿細管上皮細胞におけ る iN
OS発 現の 著 明 な上 昇 、 細動 脈 に おけ るe
NO
S発現の 低下を 認めた。 E
po製 剤併用群 で は 、iNOS
発 現 上 昇の 抑 制 とeNOS
発 現 の回復 が有意に 認めら れた。ま たC
sA腎症
発症進展 に関与す る代表的炎症性サイトカインであるオステオポンチン（OPN）とその受容体であ るC
D44の発 現性を免 疫組織 学的に評 価した。 C8A
投 与により 傷害尿細管上皮に0PN、 C
D44発現 の 著 しい 誘 導 が認 め ら れる が 、Epo製 剤併用群 におい ては、OPN、CD44発現の誘導が有意に抑制されていた。様々な腎症の発症進展に関与する因子であるレニンアンジオテンシン系賦活化に関しても検討を行ったが、本マウスモデルにおいては全群においてNa制 限によ る著しい 腎内レニ ン発現 上昇が認 められ 、今回の 実験系 におけるRA
S系の積極 的関与は 考え難かった。CsA
投与は、直接、又間接的に尿細管上皮細胞のアポトーシスを もたらす 事によ り慢性腎 症発症 に関与し得る。CS
A開始1、2、4週後の腎組織を用い、TUNE
Lアッ セイ、cleavedcaspase．3の 免疫染 色を施行 したと ころ、CsA
曝露期間の延長と共に、アポトーシス陽性細胞の有意な増加を認めた。飢TNEL陽性細胞数の抑制は、各製剤問 で違いが 認めら れ、特に CEpo併用群 で最も高い陽性細胞数減少が認められた。
今後の展 開として 、2種の誘導体（AEp0、CEpo）による様々な効果の違いや各カの至適投与量設定に関しさらに追求する必要性がある。
審 査 に際 し 、 副査 の 久 下裕 司 教 授よ ル アポ トーシ ス検討に おける nn也Lア ッセイ とCaSpa
Se‐3発現 の解離、副査の岩永敏彦教授よりeNO
S発現の定量性、内因性Epo発現に関する質問があった。また副査の筒井裕之教授から、eN
OS発現の腎における局在性、レニンアンギオ テンシン 系評価 に関する 質問が なされた。副査の有賀正教授からは、C
S
AとEpoの相互作 用の可能 性、ヒトEp0製剤に対するマウスの感受性に関する質問がなされた。最後に主査 の野々村 克也教授より、本動物モデルの妥当性、非造血性Epo製剤の臨床応用に関 す る 質 問 が な さ れ た 。 各 々 の 質 問 に 対 し 、申 請 者 から 適 切 な返 答 が 得ら れ た 。
本研究は 非造血 性E
po製 剤が、Epo大量 投与による過剰な造血等の副作用なしに、慢性C
sA腎症 を抑制し 得る事 を示した点で高く評価され、また本腎症の予防・治療法の確立や
将 来 的 な 非 造 血 性Epo製 剤の 臨 床 応用 に っ なが る 可 能性 を 示 すも の と 考え ら れ た 。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請 者が 博 士（医学 ）の学 位を受け るのに 充分な資 格を有す るもの と判定し た。

― 259ー