博士 （ 水産 科学 ）小川展弘
学 位 論 文 題 名

キンギョCarassiusaztr,at
us再生鱗の初 期石 灰化機構に関する研究
学位論文内容の要旨
硬骨魚類の鱗は、I型コラー ゲンを主成分とした有機基質にりン酸カルシウムのハイドロキシア
パ タイト結晶が沈着することで石灰化する硬組織で、構造が哺乳類の骨組織と極めて類似し強く石灰 化する骨質層と、高次に配向したコラーゲン線維からなり部分的にしか石灰化しない線維層板の2層 か ら 構 成 さ れ る 。 ま た 、 鱗 は 骨 組 織 に 比 べ て 極 め て 強 い 再 生 能 を 持 つ 。
鱗と相同な器官である哺乳類の骨組織にも骨折の治癒能カはある。しかし、複雑骨折の治療には骨 折治癒をサポートする生体組織修復材料、すなわち人工骨が必要となる。現在の主要な治療法の
ひ とっは患者自身の健康な骨を一部切り出し、患部に移植する方法であるが、健康な骨の移植には痛 みや疾病などの大きな障害の可能性を伴うなどの問題があり、高機能な人工骨の開発は極めて重要 な課題となっている。人工骨は患者に移植された場合に免疫反応を引き起こさないことはもちろん のこと、移植先にて効率的に患者自身の骨芽細胞を誘引し、分化させ、それを機能させて骨組織を 誘導する能カを持つ必要がある。一般に生体内の細胞はホルモンや各種増殖因子などの液性因子に よりその機能を調節されているだけでなく、自身を取り巻く細胞外基質から情報を受け取り、その 機能を調節している。骨芽細胞の場合には骨に存在するコラーゲンをはじめとする各種有機基質分 子やハイドロキシアパタイト結晶から情報を受け取り、その機能を調節していると考えられる。
そ こでコラーゲンを用いて、骨と同等のアパタイト結晶構造を持つ人工骨を合成する研究が進められ ている。魚類コラーゲンは人獣共通感染症のりスクが低く、コラーゲンを豊富に含む鱗は人工骨な どの合成に使用するコラーゲンの供給源として極めて有望な組織である。しかし、将来鱗コラーゲ ンを人工骨として利用するためには、骨や鱗などコラーゲン性基質の初期石灰化の分子機構に関す る情報と鱗コラーゲンの性状解析が必要不可欠である。しかしながら、骨の石灰化の分子機構につ いては、哺乳類を中心に研究が進められているものの、その全容の解明には至っていなぃ。上述の ように鱗は骨と似た構造を持つ再生能の高い組織であり、再生鱗においてはコラーゲンの高次構造 が迅速に再構築され、石灰化も急速に進行する。そのため、鱗の再生機構を分子レベルで解明する ことで、「生体反応を模して」合成する鱗コラーゲンを主体とする人工骨の開発に必要な基礎生体 情報を提供することが可能となる。そこで、本研究では鱗コラーゲンを用いた人工骨合成に資する ことを目的に、鱗の再生初期の石灰化について分子レベルで詳細に検討するとともに、魚類コラー ゲ ン の 生 化 学 的 特 性、 特 に 臓 器 ご と の 特 性 の 差 異 に つ い て 解 析 を お こ な っ た。
第一章では鱗が再生するという特徴を利用した石灰化の 人為的制御法の確立と結晶形成機構の組 織 学的 解析 を試 みた 。こ れま でに カル シウ ム(Ca)
とりン(PDの不足した環境条件下では石灰化 度の極端に低い再生鱗（未石灰化再生鱗）が形成され、これを培養することで石灰化を誘起できる ことが報告されている。本章では未石灰化再生鱗および 培養により石灰化させた再生鱗のC
a、Pi含有量を定量し、電顕レベルで結晶成長の様子を観察することで、本実験系が鱗の骨質層基質の‑ 937−

初期石灰化機構を調べるモデルとして有用であることを示すとともに、鱗の骨質層の石灰化がコラー ゲン 線維 間 に存 在 する 高電子密度 物質中でおこる ことを明らか にした。
第二章では、結晶成長に関与すると考えられる有機基質の同定を目指して鱗の基質タンパク質をS
DS‑PAGEによ り比較す ること で、正常 鱗およ び再生鱗 の骨質 層に特異 的なタン パク質を見出した。このことから、鱗を構成するタンパク質の組成が再生過程においてダイナミックに変動することを明らかにした。
第三章では、第一章で開発した未石灰化再生鱗実験系を利用し、石灰化前後の鱗から抽出されるタンパク質を比較することで、初期石灰化に関与するタンパク質をAp01ipoproteinA￣I（ApoA・I冫と同定し、このタンパク質が血液中と同様に鱗においても高密度脂質タンパク質（HDL）として存在するこ とを示 した。ま た、鱗 由来HD
Lの表面 は血液由 来のそれと比べて酸性に荷電していることを明らかにした。
第 四 章で は 、 H
DLの 合 成部 位 を 調べ る た めApoA￣ Iを コー ド す るmRNAのcDNA
ク ロ ー ニン グを おこ な い 、RTPCR
によりApQA．ImRN
A発 現部位 が再生鱗 ではなく 、肝臓 であるこ とを明 らかにした 。一方 、鱗から 精製さ れたHD
Lで抗体 を作製し 、免疫組織化学的手法で局在を解析したところ、 鱗の骨 質層に陽 性反応 が認めら れた。 このこと から、HDLは主に肝臓で合成され、血液中を運ばれて鱗の骨質層に導入されることが明らかになった。さらに、電子顕微鏡レベルでの免疫組織化学により、第一章で初期石灰化を誘導する場所として観察された骨質層の高電子密度物質中にHDLが 局在す ることを 明らか にし、骨 質層に 取り込ま れたHDLが初期 石灰化に 関与する可能性を示した。
第 五 章で は 、 鱗の 基 質 と して 取 り 込ま れ た H
DLの 機能 を 解 析し た 。 鱗の HDLはCa韜 よび Piを生理的濃度で含む環境下で凝集、不溶化することを示した。その凝集は、他のEDT A
可溶性基質
タンパ ク質を 巻き込ん で起こ る可能性 も示唆 された。 さらに、鱗のHD
Lはハイドロキシアパタイ
ト結晶と結合する能カを持っていること、リン酸カルシウム過飽和溶液中では結晶の生成を阻害することを示した。
第六章では、魚類コラーゲンは採取する臓器によって回収効率とサブユニット組成が異なることを示した。また、プロリンおよびりシン残基の水酸化および糖鎖による翻訳後修飾にも違いが認められた。さらに、コラーゲンの熱安定性も採取する臓器により異なり、これがサブユニット組成や糖鎖による修飾により制御されている可能性を示唆した。
これらの結果を総合し、これまでに各種バイオミネラルで報告されている有機基質の性質とそこから推 測され る結晶誘 起に関 わる機能 を参考 に、鱗の 初期石灰化におけるHDLの機能を以下のように推 測した 。すなわ ち、HDLは血液 中から 鱗の基質 に取り込まれる過程でその表面が酸性に荷電 する 。 酸 性に 荷電し た鱗HD
Lは不溶 化する前 にはCa
イ オンや微 細なり ン酸カル シウム結 晶と相互作 用して 結晶成長 を阻害 する。鱗 H
DLは やがてCa
お よびPiイ オン存在 下で鱗 のED′11A可溶性タンパク質を取り込みつつ不溶化し、石灰化を誘導するための場を形成する。また、魚類では同じ種でも臓器ごとにコラーゲンの性質が異なるため、様々な魚種の各種臓器のコラーゲンの特性を解明することで、人工骨をはじめとする体組織修復材料の合成社ど、その利用目的に応じたコラーゲンを選択できる可能性がある。
今後、これらの知見をもとに、非食用部分として処分されてきた魚類コラーゲンと鱗の初期石灰化制御機構から得られた知見を応用することで、生体を模した人工骨など高機能な生体組織修復材料が合成されるようになれば、魚類コラーゲンの価値が格段に向上するものと期待される。これにより養殖魚の付加価値を上昇させることができれば、低環境負荷であるもののコストが高い閉鎖循
環養殖技術の産業化が実現できると考える。

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学位 論文審査の要旨
主 査 教 授 都 木 靖 彰副 査 教 授 足 立 伸 次
副 査 教 授 尾 島 孝 男
副 査 助 教 浦和 寛

学 位 論 文 題 名

キンギョC
arasszusauyatus
再生鱗の初期石 灰化機構に関する研究
硬骨魚類の 鱗はI型コラーゲンを主成分とした有機基質にりン酸カルシウム結晶が沈着することで石灰化した骨様組織で、構造の異なる骨質層と線維層板のニ層よりなる。鱗と相同な器官である哺乳類の骨組織の再生能カは比較的弱く、複雑骨折の治療には骨折治癒をサポートする人工骨が必要とされる。
人獣共通感染症のりスクが極めて低い魚類コラーゲンは、人工骨などの合成に使用するコラーゲンの供給源として極めて有望である。非食用部分として処分されてきた鱗のコラーゲンで人工骨などが合成されるようにな れば、魚類コラーゲンの価値は格段に向上し、養殖産物の高付加価値化も期待できる。
本論文は、鱗コラーゲンを人工骨として利用するために必要不可欠な、鱗のコラーゲン性基質の初期石灰化の分子機構を明らかにするとともに、魚類コラーゲンの基礎性状について解析したものである。
本論文の第 一章では、CaとPiの不足した条件下でキンギョの鱗を再生させることでほとんど石灰化していなぃ鱗（未石灰化再生鱗）を採取し、生理的塩類溶液中で石灰化を誘導させる実験系を完成させた。次に、未 石灰化再生鱗および培養により石灰化させた再生鱗（培養石灰化鱗）のCaおよびP
i含有量を定量するとともに電顕レベルで結晶成長の様子を観察することで、鱗の骨質層の石灰化がコラーゲン線維間に存 在する高電子密度物質中でおこることを明らかにした。
第二章では、結晶成長に関与すると考えられる有機基質の同定を目指して鱗の基質タンパク質を抽出しSD
S‑PA
GEに より比較することで、正常鱗および再生鱗の骨質層に特異的なタンパク質を見出した。
このことから、鱗を構成するタンパク質の組成が再生過程においてダイナミックに変動することを明らかにした。
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9ー第三章では、第一章で開発した実験系を用い、未石灰化再生鱗と培養石灰化鱗から抽出されるタンパク質を比較することで、初期石灰化に関与するタンパク質をスクリーニングした。次にその主要なタンパク質を部分精製し、 N
末端アミノ酸配列解析と質量分析によりApolipoproteinA‑I(ApoA．I）と同定した。さらに、ApoA．I
が血液中と同様に鱗におい ても高密度脂質タンパク質（HDL）として存在する
こ と、 ただ し、 鱗HDLの表 面は 血液 由来 のそ れと比べて酸陸に荷電していることを明らかにした。
第四 章で は、 ApoA．Iを コー ドす るmRN
Aの cD
NAクロ ーニ ング をお こな ぃ 、RT・PCRを 用い てHDLの合成は鱗ではおこなわれておらず、肝臓でおこなわれていることを明らかにした。一方、鱗から精製さ れた H
DLで抗 体 を作 製し 、免 疫組 織学 的手 法を 用い て鱗 の骨 質層 にHDLが局在することを示し、HD
Lは主に肝臓で合成され、血液中を運ばれて鱗の骨質層に導入されることを明らかにした。さらに、
電子顕微鏡レベルでの免疫組織化学により、第一章で初期石灰化を誘導する場所として観察された骨質層 の高 電子 密度 物質 中に HDLが 存在 する こと を示 し、 骨質 層に 取り 込ま れたH
DLがその初期石灰化に関与する分子である ことを強く示唆した。
第 五 章 で は 、 鱗 の 基 質 と し て 取 り 込 ま れ た HDLの 機 能 を由 mr
Dで 解析 し、 鱗の HDLが Caお よぴ
Piを生理的濃度で含む環境下で他の基質タンパク質とともに凝集、不溶化することを示した。さらに、鱗のHDLはハイドロキシアパタイト結晶と結合する 能カを持っていること、リン酸カルシウム過飽和溶液中では結晶の生成 を阻害することを明らかにした。
第一章〜第五章の結果と、これまでに報告されているバイオミネラリゼーションに関わる各種分子の機能に関する仮説から、鱗の初期石灰化機構を以下のように仮説立てた。すなわち、肝臓で合成されたHDLは 、血 液を 通 して鱗の基質に取り込まれる。その際、HDLは表面が酸陸に荷電する。鱗基質中のHDLは、可溶化した状態ではカルシウムイオンや微 細なりン酸カルシウム結晶と相互作用して結晶成長を阻害する。その後 、徐々にカルシウムおよびりン酸イオン存在下で他のタ ンパク質とともにHDLが 凝 集 ・ 不 溶 化 し 、 石 灰 化 を 誘導 する ため の場 が形 成さ れ、 この 中で 初 期石 灰化 が進 行す る。
さらに、本研究第六章では、魚類コラーゲンは採取する臓器によって回収効率とサブュニット組成が異なることを示した。また、プロリンおよぴりシン残基の水酸化およぴ糖鎖による翻訳後修飾にも違いがあることを示した。さらに、熱安定性も採取する臓器により異なり、これがサブユニット組成や糖鎖による修飾により制御されている可能性を示した。この結果から、高機能な生体組織修復材料の合成には 目 的 とす る臓器 に応 じたコ ラー ゲンの 選択 が必要 であ ること を示 唆した 。
以上の成果は脊椎動物の硬組織の初期石灰化の新しいメカニズムを提唱するものであり、基礎生命科

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学に大きく貢献するものであるとともに、水産廃棄物である鱗を医療用材料として利用するための応用研究に大いに寄与するものであると評価できる。よって審査員一同は申請者が博士（水産科学）の学位を授与される資格のあるものと判定した 。

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