【操作上の留意事項】(1) 測定試料の性質
検体は新鮮な血清を用いて下さい．
(2) コンタミネーション
PCR産物が検体にコンタミネーションすると結果が異なります．じゅうぶん注意して下さい．

〒112-0004 東京都文京区後楽1-1-10
株式会社 特殊免疫研究所
TEL 03-3814-4081
FAX 03-3814-5957

HCV GENOTYPE プライマーキット（50回分）
取り扱い説明書【その他】【使用上又は取扱い上の注意】【開発の経緯】

AmpliTaq®は、Roche Molecular Systems社の、又、NuSieve®とSeaKem®はFMC社の登録商標です．

【測定方法（測定原理）】

C型肝炎ウイルス（HCV）の核酸塩基配列の解析の研究により、本ウイルスは変異に富むウイルスであるが、比較的保存された領域の遺伝子配列の類型から少なくとも５つのジェノタイプに分類できること、又それぞれのジェノタイプの分布に地域的な偏りがあることが報告されています．
HCVのジェノタイプを型判定することは、臨床的には感染源の同定、並びに感染ルートの解明に有用であると言われ、今後のHCVの研究に役に立つものと考えられています．1) 2)
又、肝炎の病態や治療に対する抵抗性がジェノタイプの型により異なるとも言われ、治療面からも注目されています．3)
本製品は、HCVをコア領域の遺伝子配列の類型により、Ⅰ(1a)、Ⅱ(1b)、Ⅲ(2a)、Ⅳ(2b)、並びにⅤ(3a)型に分類する岡本ら4)により開発された方法を用いた
HCV GENOTYPE プライマーキットです.

本法は、HCVタイプ特異的プライマーを用いて、DNA増幅を行い、増幅産物を電気泳動し、その大きさを比較することにより、HCV-RNAのタイピングを行うものです(図1).
HCV陽性血清から抽出したHCV-RNAを用い、各ジェノタイプ共通のコア領域の一部（272bp）を逆転写反応し、増幅します．得られた増幅DNAを鋳型とし、各ジェノタイプ特異的プライマーを用い、DNA増幅を行い、電気泳動によってその大きさを測定し、HCV-RNAのジェノタイプを決定します．

5'C En(1) キット中の各試薬及び検体は、使用前に室温に戻して泡立てないように混和し、液を均一にしてから用いて下さい．
(2) ロット番号の異なる試薬を混合して使用しないで下さい.
(3) キットは表示されている条件に保存し、有効期限内に使用して下さい．
(4) 試薬は細菌汚染されないように注意して下さい．
(5) 保存中強い光を避けて下さい．
(6) ウイルス感染の危険性を避けるために、検体はじゅうぶんに注意して取り扱うようにして下さい．
(7) 検体及びキット中の各試薬並びに検査に使用したすべての器具（チューブ、チップ）は、次のいずれかの方法で処理を行って下さい．
◇ 1％ホルマリン溶液に1時間以上浸すこと．
◇ 2％グルタルアルデヒド溶液に1時間以上浸すこと．
◇ 0.1％以上の次亜塩素酸ナトリウム溶液に1時間以上浸すこと．
◇ 121℃で1時間以上オートクレーブにかけること．

2000年6月作成
2000年7月改訂

研究用試薬【製造・販売元】

NS1 NS2

NS3 NS4 NS5(U)n 3'io

1st amplification

at272bp(nt 480 to 751)

rm

【特徴】
【包装単位・貯法・有効期限・製品コード】

in【主要文献】Reag(1) Okamoto, H. et al., (1992) " Typing hepatitis Cvirus by polymerase chain reaction with typespecific primers: application to clinical surveys
and tracing infectious sources", Journal of General
Virology, 73, 673-679(2) Okamoto, H. et al., (1992) " Full-length sequenceof a hepatitis C virus genome having poor homology
to reported isolates : comparative study of four
distinct genotypes ", Virology, 188, 331-341(3) Kanai, K. et al., (1992) " HCV genotypes inchronic hepatitis C and response to interferon ",Lancet, 339,1543(4) Okamoto, H. et al., (1993) " Characterization of
the genomic sequence of type V (or 3a) hepatitis C
virus isolates and PCR primers for specificdetection", Journal of General Virology, 74, 23852390

49bp(nt 489 to 537)
144bp(nt 489 to 632)

TypeⅢ
(2a)

174bp(nt 489 to 662)

TypeⅣ
(2b)

【本質（キットの構成）】

品名

内容123bp(nt 489 to 611)

TypeⅤ
(3a)

本キットには次の試薬が含まれています．
数量内容量(赤) RTプライマー溶液

逆転写用プライマー

5本15μL(緑) 1stプライマー溶液

1st用プライマー

5本60μL(黄) 2ndプライマー溶液

2nd用プライマー

5本60μL(白) 10×dNTPs

dNTPs

5本100μL(青) 滅菌水

滅菌水

5本1ｍL

(紫) マーカー

タイプスペシフィックマーカー

5本110μL(茶) ゲルローディングバッファー

サンプルアプライ用

5本100μL

88bp(nt 489 to 576)

（図１）

HCVジェノタイプ判定原理

参考）Okamoto, H. et al., Journal of General Virology (1993),
74, 2385-2390【効能・効果（使用目的）】
C型肝炎ウイルスRNA塩基配列のジェノタイプ検出4

2nd amplification with type-specific primers

TypeⅡ
(1b)

fo

HCV GENOTYPEプライマーキット
50テスト
-20℃
外箱に記載
8C01ent

製品名
包装単位
貯法
有効期限
製品コード

TypeⅠ
(1a)

本製品の特徴としては、逆転写反応により得られたcDNAを各ジェノタイプに特異的なプライマーにより増幅し、増幅されたHCVコア領域遺伝子を電気泳動し、鎖長の異なる各タイプの増幅バンドを検出するだけで、型判定できることが挙げられます．従って、本製品を使用することにより簡単かつ正確なHCVジェノタイプ判定が可能になります．

1

※注意◇溶液の調製には、必ず、PCR増幅前の溶液の取扱い専用の容量可変シングルチャンネルピペットを使用して下さい．又、フィルター付きのピペットチップを使用して試薬毎・検体毎にチップを取り替えて下さい．
◇酵素の失活や非特異反応を抑えるために、反応液の調製は氷浴上にて行って下さい．
◇PCR増幅前の溶液の取扱い専用の容量可変シングルチャンネ
ルピペットではPCR産物を取扱わないで下さい．
◇PCR産物のPCR増幅前の溶液への汚染は、擬陽性増幅反応を生じ判定を誤る危険がありますので、PCR増幅の前後で操作エリアと器具・機材を分離区分することをお薦めします．

1−1.

3−3.

意して下さい．次に、コームを静かにセットし室温でじゅうぶんに固化させます．コームをゲルから抜く際には、少量の1×TAEバッファーをコーム付近に注いでから注意深く抜くようにします．ゲルは1×TAEバッフ
ァー中で数日間保存できます．

【用法・容量（操作法）】

３.

2nd PCRプライマー溶液
10×dNTPs
AmpliTaq®
10×PCR Buffer
滅菌水

cDNAの合成

RNA溶液
5×RTバッファー
20mM dNTP mix
0.1M DTT
RTプライマー溶液
RNaseインヒビター
逆転写酵素

PJ2000、あるいは同等品）⑦ 耐熱性DNAポリメラーゼ（※Roche Molecular Systems社製
AmpliTaq®）(2) 上記のPCR反応液をPCR用微量チューブ（※0.5mL容量、滅菌済、thin walled）に入れ、その上にミネラルオイル（※light white oil、DNase/RNaseフリー）25μLを添加します.
(3) 1st PCR 産物のうち1μLを上記のチューブに加えます．
(4) ボルテックスでミキシングした後、微量遠心機を用いて1000〜3000rpmで10〜30秒間遠心し、壁面に残った液を落とします．
(5) 次の条件をプログラムしたサーマルサイクラーを用いて、DNAを増幅します．

5.00 μL （血清100μLから抽出）
2.00 μL （SuperScriptTMⅡ添付）
0.25 μL
1.00 μL （SuperScriptTMⅡ添付）
1.00 μL （本キット）
0.25 μL （Promega社製 RNasin®、40u/μL）
0.50 μL （BRL社製 SuperScriptTMⅡ、200u/μL）

DNA熱変性
アニーリングDNA伸長

10.00 μL

⑧ 逆転写酵素（※BRL社製 Super Script Ⅱ [RNaseH- Reverse(3) 上記のチューブにミネラルオイル（※light white oil、DNase/RNaseフリー）25μLを添加します．
(4)反応液をよく混合後、次の温度プログラムにて反応を行います．

① 電気泳動装置（※アドバンス社製ミューピッド電気泳動シス

酵素失活42℃↓95℃↓
4 ℃

テム、あるいは同等品）② 電気泳動ゲル作成装置（※アドバンス社製ミューピッドゲ

保持over2.

in

1st PCR 反応(1) 次の 1st PCR反応液を調製します．

用）⑥ インスタントカメラ用フィルム（※ISO3000程度のもの）⑦ 紫外線保護用具⑧ NuSieve® GTGアガロース⑨ SeaKem® GTGアガロース⑩ トリスヒドロキシメチルアミノメタン（※Tris base）⑪ 氷酢酸⑫ EDTA（※エチレンジアミン四酢酸）⑬ 臭化エチジウム（※発ガン性、取扱い注意）

io

3−4.

15分

ent

3−2.

Ⅰ(1a)49 bp

7分

Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
(1a)(1b) (2a) (2b)(3a)

over

電気泳動

(1) 泳動槽にゲルとバッファー（1×TAE）を入れます．
(2) 2nd PCR 産物10μLにゲルローディングバッファー2μLを混ぜ、ウェルに注入します．次に、マーカー（タイプスペシフィックマーカー）10μLをウェルに注入します．
(3) 電圧100Vで40分間泳動します．
(4) ゲルを臭化エチジウム染色液に浸し、約15分間振盪します．
(5) トランスイルミネーターを用い、泳動像を撮影します．

ag

1st PCR反応液の組成（1テスト用）

5.00 μL （本キット）
4.00 μL （本キット）
0.25 μL （Roche Molecular Systems社製）
3.00 μL （AmpliTaq®添付品15mM MgCl2含有）27.75 μL （本キット）

Re

1st PCRプライマー溶液
10×dNTPs
AmpliTaq®
10×PCR Buffer
滅菌水

サイクル数 25回

注意：上記温度条件については使用機器の特性により変更が必要になることがあります．必要に応じて微調整して下さい．

60分

ルメーカーセット、あるいは同等品）③ 容量連続可変シングルチャンネルピペット（※各種容量)④ 紫外線照射装置（※トランスイルミネーター）⑤ 撮影装置（※インスタントカメラ、橙色-赤色フィルターを着at

逆転写反応保持Ⅲ(2a)174 bp
Ⅱ(1b)144 bp
Ⅳ(2b)123 bp
Ⅴ(3a)88 bprm

必要な器具・器材・試薬（電気泳動）

サイクル終了後

30秒
30秒
30秒

マーカー

fo

1−2.

94℃
60℃
72℃
↓72℃
↓
4 ℃

n

TMTranscriptase]、あるいは同等品）⑨ RNaseインヒビター（※Promega社製 RNasin®
[Ribonuclease Inhibitor]、あるいは同等品）⑩ ミネラルオイル（※light white oil、DNase/RNaseフリー）

5.00 μL （本キット）
5.00 μL （本キット）
0.25 μL （Roche Molecular Systems社製）
5.00 μL （AmpliTaq®添付品15mM MgCl2含有）33.75 μL （本キット）
49.00 μL

RT反応液の組成（1テスト用）① 容量連続可変シングルチャンネルピペット(※各種容量)② ピペットチップ（※滅菌済、フィルター付）③ PCR用微量チューブ（※0.5mL容量、滅菌済、thin walled）④ 回転式ミキサー（※ボルテックスミキサー）⑤ 微量遠心機（※PCR用微量チューブ用）⑥ 自動温度制御装置（※Perkin Elmer社製サーマルサイクラー

得られた電気泳動のパターンからHCV-RNAのジェノタイプの判定を行います．
下図のように、TypeⅠ(1a)は49bp、TypeⅡ(1b)は144bp、TypeⅢ(2a)は174bp、TypeⅣ(2b)は123bp、TypeⅤ(3a)は88bpの位置に増幅バンドがあらわれます．
観察されるバンドの位置から5つのジェノタイプに分類します．
なお、HCV-RNA濃度が高い場合、1stPCR産物の増幅バンド（272bp）があらわれます．

2nd PCR反応液の組成（1テスト用）(1) RNA溶液を、HCV-RNAの３次構造を崩す目的で、70℃にて2分間、加温します．（※この操作は、オプションのため、必須の操作ではありません．）(2) 次のRT反応液をPCR用微量チューブ（※0.5mL容量、滅菌済、thin walled）に調製します．

キット以外に必要な器具・器材・試薬（RT〜PCR）【測定結果の判定】(1) 次の 2nd PCR反応液を調製します．

操作手順プロトコール

3−1.

2nd PCR 反応

40.00 μL

試薬の調製
① 50×TAEバッファー：（室温保存）
組成：Tris base 242g、氷酢酸 57.1mL、0.5M EDTA
(pH8.0）100mLを加え蒸留水で全量を1000mLにします（要時、蒸留水で50倍に希釈する）．
②臭化エチジウム染色液：（室温保存）
蒸留水に1μg／mLの濃度になるように臭化エチジウ
ムを溶かします．
臭化エチジウムは強力な発癌物質です．取扱い時にはビニール手袋を必ず着用し、皮膚に付着しないようにして下さい．
③ 4％アガロースゲル（NuSieve®：SeaKem®＝3：1）
ミューピッド電気泳動装置の説明書に従いゲルの枠を組み立てます．
1×TAEバッファーに4％のアガロース（NuSieve®：SeaKem®＝3：1）を加え、オートクレーブ処理（121℃3〜5分間）して完全に溶解させます．
室温下、均一になるようにじゅうぶん混和します．
アガロース溶液の温度が約60℃まで下がったら、ゲル枠に注ぎ入れます（大ゲルには約30mL、小ゲルには約15mL）．この時、ゲル表面に気泡が残らないよう注(2) 上記のPCR反応液をPCR用微量チューブ（※0.5mL容量、滅菌済、thin walled）に入れ、その上にミネラルオイル（※light white oil、DNase/RNaseフリー）25μLを添加します．
(3) 合成cDNA 10μLを上記のチューブに加えます．
(4) ボルテックスでミキシングした後、微量遠心機を用いて1000〜3000rpmで10〜30秒間遠心し、壁面に残った液を落とします．
(5) 次の条件をプログラムしたサーマルサイクラーを用いて、DNAを増幅します．
DNA熱変性
アニーリング
DNA伸長
サイクル終了後
保持

94℃
55℃
72℃
↓72℃
↓
4 ℃

30秒
30秒
60秒

サイクル数 35回

7分
over

注意：上記温度条件については使用機器の特性により変更が必要になることがあります．必要に応じて微調整して下さい．

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