博 士 （ 理 学） 横 山

毅

学位論 文題 名Na， K‑ATPaseの 反 応 機 構 に 関 す る 研 究―2種の螢光プロープを用いた構造変化の解析と酵 素の四 量体 構造 にお ける りガ ンド の結合一学位論文内容の要旨
動物細胞の形質膜を隔てた¥
aとKの電気化学的勾配の維持はぬ，K―ATP
aseによってなされる 。この酵素はATPを加水分解と共役し、3個のNaを細胞外部/丶、2個のKを細胞内部ヘ輸送するぬポンブである。ぬ，K一A
TPaseは加水分解及びイオン輸送能を担う分子量約11万の Q鎖と 糖鎖 を含 む分 子量 約3． 5万のB鎖 から なる 。本 酵素がQロや（Qロ）2で機能しているかについては様々な報告 があるが、我々の研究から（aロ）4で機能していることが 示唆された。反応サイクル中に ATPのv位のりン酸基がa鎖の A
sp369に転移されたりン酸化酵素中間体(EP)を形成することから、本酵素はPーtypeA
TPaseに属する。その反応様式として、Na結合型酵素(NaEl）がATPからのりン酸化により、AD
P感受性のりン酸化酵素中間体(EIP)、ついでK感受性の りン酸化酵素中間体(E2P)を 経て、脱リン酸化されK結合型酵素(KE2)を形成後Naと反応して、再びNaElへと移行するP
ost一Albers
機構が知られている。
しかし、ATPの化学エネルギーのイオン輸送エネルギーへの変換機構について、また、サブユニット問の相互作用がイオン輸送とどのように共役しているかについての知見は少ない。これらの疑問に対して我々の研究室では、螢光プローブをぬ，K−ATPaseに導入して、反応中間体形成に伴う螢光プローブ周辺の微小環境変化を反映した螢光強度変化、反応中間 体 形 成 量 や り ガ ン ド の 結 合 量 を 測 定 し 、 酵 素 の 構 造 変化 の解 析 を行 って いる 。
構造変化の解析を行うために酵素への様カな化学修飾が行われているが、中でもF
IT
C、
AP
2PLに代 表さ れる よう な、 AT
P結 合部 位へ の親 和標 識試 薬で は本 来 のATP
ase活性 を失ってしまい、ATPで引き起こされるイオン輸送に伴う酵素の構造変化についての知見は得られない。本研究では酵素標品 への導入後もA
TP
ase活性に影響を与えない、BIP
MおよびR
H‑421を用いることで、各反応中間体形成時の両プローブの螢光強度変化、EP形成及びKの同族体であるRbによる分解、Rbの閉塞の時間経過を比較する事により、ATPで引き起こされる酵素内のイオン輸送と構造変化の関連について追跡した。
また、Post‑Albers機構で示される各反応中間体形成時のATPを含めた各種リガンドの結合 量を測定した。特にATPに関して、反応を厳密にコントロー ル可能な条件で測定出来る、二重膜フィル卜レーション 法による測定系を再構築し、リン酸標識部位の異なるATPを 用い るこ とに より 、反 応サイ クル中のATPの結合量を測定 した。本論文の要旨は‑ 204―

lEIPが 形 成 す る 条件 で RH‑421、BIP¥
Iブ 口 一ブ 螢 光 強度 変 化 を測 定 し た とこ ろ 、RH− 421
螢 光 強度 はB
IPVI螢光強度 変化やEP形成より も速く減 少した ュNaを酵素 ヘ閉塞状態にすることが可能なoligomycinを用いるとR
H―421
螢光強度変化は消失し、BJP¥
I
堂光強 度変化は 変化量が小さくなり、変化の速度は上昇した，E2Pが形成する条件ではEIP形 成と同様 な面ブ口一ブ螢光強度の減少が起こり、EP形成の後に増加したュまた、
RH‑421、BIP丶I
螢光強度変化の比より、これらの反応では両プローブ螢光強度変化は異なる事象を反映することが示された。
これらのことから、EP形成の段階ではR
H−421
螢光強度変化はNaの閉塞状態を、B
I
P．、I
螢光強度変化はNaの閉塞状態とN
a一丶I
g―ズr
P酵素複合体の形成を反映することが示唆された 。また、 両ブローブはE2P形成後のりガンドの結合状態をモ二夕ー出来ることが示された，
2R.bE2が 形成す る条件 でR
H―421、BIPX
Iプローブ 螢光強 度変化を 測定した ところ 、
RbはE2P
ま での反 応に影響 を及ぼさ なかっ た。Rb
添加 時に両 ブ口ーブの螢光強度変化の減少、 E2Pの分 解、Rbの 閉塞とは 同様の 経時変化 を示し た。Rb
E2が分解される段階
ではRbの脱閉塞と両ブロープ螢光強度変化の減少とは同様の経時変化を示したが、低濃度のATPを同時に 添加す るとRbの脱 閉塞に は影響を 及ぽさ なかった が、両プ口一ブ螢
光 強 度 は ATP濃 度 に 応 じ て 反 応 開 始 の レ ベ ル を 保 持 し た 後 、 減 少 し た 。
これらの ことから、EP分解の段階ではRH―421、BIP．＼I螢光強度変化はRbの閉塞状態を反映するのではないことが示唆された，従って、この段階では両ブローブ螢光はNa、
丶Ig、Piなどの結合状態の変化を反映すると考えられる。
3ニ 価 カ チ オ ン 非 存在 下 、 酵素 が ES複 合 体 を形 成 し てい る 条 件（ 2MNaCl、 10 mMCDT A）、では従来の遠心法、及び本研究において再構築した測定系である二重膜フィルト レーショ ン法で はA
TPの 結合量 はほぼ同 じ値を示 し、本 測定法が 酵素とATPの結合の測定において有効であることが示された。
二価カテオン存在下では従来の遠心法では遠心分離に要する時間中にATPが加水分解を受けるため、有意なATPの結合は検出されていなかった。二重膜フィルトレーション法により、反応時間等の条件を制・御するニとで、Mg存在下でもATP濃度に依存した酵素へのATPの結合が検出されたっまた、EP形成量とNa．A
TPase活性を測定したところ、
EP形 成量は低 濃度の A
TPで飽 和した が、Na．A TP
ase活性は A
TP
濃 度に依存して活性他された：
RbE2が 形 成 す る 条 件（ 16mMNaCI、 1984mM
choli
ne． Cl、 lmlヽ ICaCl。、 320uMRbCl） では、 Rb非存在下 に比べ EP形成量は 減少し、その減少量に対応して、2倍のRbの 閉塞が観 察され たっしか し、ATPの結合 はRbの有無に関わらず一定の値を示した，
これらのことからEPを形成しないサブユニッ卜には反応サイクル中で常に，灯Pが結合 し て お り 、 こ の ご rPの 結 合 は ATPase反 応 を 促 進 す る こ と が 示 唆 さ れ た っ‑ 205 ‑以上の知見から酵素が形質膜上では（QB）4というオリゴマー構造をとって機能しており、 2つの サブ ュニ ッ卜 のEP形成とは相をずらし てイオンの輸送が起こり、EPを形成
しな い2つ のサ ブュ ニッ トに はATPが結 合レ てお り、 それ によってATP
ase反応を促進していることが示唆されたっ
BIPM、RH‑421ブローブはそれぞれ膜貫通部位に 存在し、イオンの結合状態を反映するニ とが 示 唆さ れた 。特 に、 BIP↓ヽ lはa鎖 lmol当た りlmolがCvs‑964に結合することから、ATPによって引き起こされる、個々のサブュニットの 構造変化の情報を得ることが出来ると考えられる，両ブ口 一ブはイオン輸送、酵素の構造変化、サブュニット間相互作用を結びっける上で極めて 有効であると考えられるュ
これらの結果は、従来妻で広く 受け入れられてきたPostーAlbers
機構だけでは説明で
きず 、Na，K‑ATP
aseがオリゴマ一構造をとってお り、サブュニット同士がEP形成状態とATP結合状態で相互 作用しながらl動いているこ とを初めて直接示したことになるっ― 206 ‑学位論文審査の要旨
主 査 教 授 谷 口和 彌
副 査 教 授 矢 澤道 生
副査 教授 菊池九二三
副査 教授 田村 守

学位論 文題名Na， K‑ATPaseの 反 応 機 構 に 関 す る 研 究―2種の 螢光プロ ーブを 用いた構造変化の解析と酵 素 の四 量 体構 造におけ るりガン ドの結合 ―動物 細 胞 の形 質 膜 を隔て たN
aとKの電気 化学的勾 配の維 持はNa，KーATPa
seに よって な され る 。 この 酵 素 のNa結 合型 酵 素 （NaE1） は ATPに よ ル リン 酸 化 され 、 ADP
感
受 性 の1jン 酸化 酵 素 （E1P）、 つ い でK感 受 性の り ン酸化 酵素（E2P）を 経て、脱 リン 酸 化さ れ K結合 酵 素 （KE2）を 形 成 後、 Naと反 応 し て 、再 び Na
E1へ と移 行 し、この 反 応と 共 役 して 3個 のNaを 細胞 外 部 へ、 2個 のKを 細胞内部 に輸送す る。し かし、
A．T
Pの化学 工ネル ギーのイ オン輸送エネルギーへの変換機構について、また、サブュニッ トの役割 につい ての知見 は少なか った。 これらを理解するため申請者は各反応中
間 体 形成 時 の 螢光 プ ロ ーブ の 螢 光強 度 変 化、 EP形成 及びKの同族体 である Rbによる分 解 、Rbの 閉塞 の 時 間経 過 を 比較 し た 。ま た 各 反応 中間体形 成時のATPとRbの 結合量 を 測定 し た 。そ の 結 果NaE1
か ら ATP結 合 に伴 う Naの分 子内への 閉塞に 伴い、RH―421螢 光 、 次 に BIPM螢 光 の 減 少 が生 じ 、 次 にEP形 成が 生 じ 、そ の 後 、緩 慢 な B
IPMと RH― 421
螢 光 の 増加 が 観 察さ れ た 。以 上 の 結果 は 従 来 のRHq2
1螢 光 変化 が EP形成を反 映すると した結 果を明確 に否定し 、両プ ローブがむしろ輸送される、イオンのポン プ 分子 内 部 にお け る 移動 を 認 識す る こ とを 示 して いる。 又ATPaSe反応 中の3やと8゜Rbの結合 測定系 を構築し た結果、 ポンプ が4分 の1、2分の1、4分の3及び1の反応性をRb
゛ の結合量 、EP形態 、A．T
P結合量 、及び酸 に不安定なADPとPiの酵素への結合、及び ウアパイ ン結合 量から示 すことが できた 。これは ポンプ が4量 体プ口ト マーとして 機 能し て い るこ と を意 味してい る。さ らにりン 酸化酵 素ElPとE
2Pの 非リン酸 化サプ ュ ニッ ト に 酸に 不 安 定な ADPと Hが 、及 び Rb
閉 塞 酵 素 、RbE2の 非 閉 塞サ ブ ュニット に も同 様 に A
DPと Hが 結 合 して い る こと が 示 され た。 以上の結 果は低 A
TP濃度 では
従 来 のPost− Abers機 構に 従 っ てElP，E2P， K
E2を順 に経由し てATP加水分解 が生じるが 、より生 理的濃 度のA．TP存在下 では、 これら中 間体が いずれも A
DPとHを結合した 中 間体 と し てATP加水 分 解 を行 う こ とを 明 白 に示 してい た。以上 の結果 はN
a輸送

ポン プ分 野の 研究の みな らず 、H，K及びCa，H―輸送ATPas es、さらに非輸送ATPases研究一般にも大きなインバクトを与えるものである。よって申請者は北海道
大 学 博 士 （ 理 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資格 あ る も の と 認 め る。