博 士 （ 医 学 ） 江 平 宣 起

学位論文題名Anembryoーs
pecificex
presslngTGF―pfamilyprotein，
grOWth― difEerentiationfaCtor3（ GDF3） ，aug
mentSprogreSS
10nofB
16me
lanoma（ 胚 性 幹 細 胞 特 異 的 遺 伝 子 の GDF3はマウスB
16
悪性黒色腫細胞の腫瘍形成を促進する）

学位論文内容の 要旨【背景と目的】Gro
vvth‑
differentiationfactor3 (GDF3)は転写成長因子であるTGF‑ロスーパーファミ リー に 属し 、GDF3の 発現 は 、原 発性 の精 巣 生殖細胞腫瘍や、精上 皮腫、そして乳癌でも認めら れて い る． しか しな がら 、 GDF3の役 割は い まだ明らかではない， 通常組織において、GDF3は胚性幹細胞(embryonic stem；ES)細胞や 早期胚でも発現している．ま た一方悪性腫瘍細胞は胚性抗 原を 発 現し てい るこ とが 多 く、 ES細 胞と の 共通抗原も多い．胚性 抗原の多くが腫瘍形成や腫瘍増大に関係してい る，
今回われわれ は癌と胚性幹細胞特異的遺 伝子の関係を明らかにすべく 実験系を形成し、それらを論ずるにあたり、(The cancerstemcell; CSC，Thecancer stem cells；CSCs)仮説に着目した．
CSC仮 説は 最近 の 研究 では 固形 癌も CSCに由 来 するという証拠が得ら れている．既出の論文ではヒ ト悪 性 黒色 腫も CSCを含 み、 そし て CSCか ら 分化 した 腫瘍 がABCB5を発 現していると報告されている．マウスの悪 性黒色腫B16‑Fl0細胞もCSC様の細胞を含んでおり、それらはCD133、CD44、そしてCD24を発現して いる．
数種の胚性幹 細胞特異的遺伝子が腫瘍形 成を誘導することをうけて、 他の腫瘍形成を促進する胚性幹細胞特異的遺伝 子を同定することを試みた ．
また 、CD24はが ん患 者に おい て 、低 い予 後を 規 定するパターン認識受 容体なので、腫瘍増大におけるGDF3‑CD24 pathwayの役割の可能性を論じる ことにした．
【 材料 と方 法 】B16― Flと B16‑Fl0悪性 黒色腫細胞，GlとG5の肝細胞 癌細胞は10％fetal bovineserumを加 えた RPMI1640内 で培 養し た， C57BL/6と BALB/c mice (10‑20週齢 ）は ホク ドー株式会社から 購入した（札幌、日本），数種の 胚性幹細胞特異的遺伝子は 腫瘍形成を誘導することが明 らかになっているため、他の腫瘍 形成 を促 進 する 胚性 幹細 胞 特異 的遺 伝子 を同 定 する こと をPCRに より試み、それらを定量化するため にqPCRを用いた，腫瘍形成 前後の遺伝子発現を調べる ため、B16悪性黒色腫細胞、Gl、G5肝細胞癌細胞を10‑cm dish
内 で 培 養 ， マ ウ ス を 麻 酔 し 、 腫 瘍 細 胞 は C57BU6も しく はBALB/cの 皮下 に注 射し た ．腫 瘍体積は計測 器にて1日もしくは2日ごと に測定した，
夕ンパク 発現の確認については、dish中もしくは切除した腫瘍を 適宜処理した細胞を用い、FlowcytometryやWestem blot analysisを 用い行った．

‑ 273−

【結果】GD
F3の過剰発現はマウスのB16ーFlとB16‑
Fl0による悪性黒色腫の腫瘍形成を促進するが、GlとG5による肝細胞癌では促進しなかった．さらにGDF
3過剰発現はB16‑F1とB16‑F10の両者においてCD24の発現を増加させた，B
16サプライ ンにおけるCD24の発現分析は、GD
F3の分析と一致するが 、肝癌細胞GlとG5の細 胞サ プラ インはGDF3によるCD24発現を導く能カが欠陥していた．GD
F3によ るC
D24発現上昇のメカニズムは不明である．
【考察】今回の実験では、上述したCS
Cマーカー全てを発現する細胞集団を単離することはできなかったが、これは一般にCSCが腫瘍中にごくわずかしか存在しないためではないかと推測される．しかしながら、B16悪性黒色腫細胞におけるCS
Cマーカーの発現は、CS
C細胞が腫瘍形成中に増加することを示唆している．
C
D24、CD44とも陽性の細胞がGD
F3発現のB16‑Fl0における細胞群で、コ ントロール群の細胞よりも腫瘍形成中により多く観察できた．しかし、GDF3が腫瘍形成を促進するメカニズムは未だ不明である．
最近のCSC
理論では、CS
Cは正常の幹細胞から発生することが報告されている．いくつかの論
文はこのモデルを支持しているが、すべてのC
SCが正常の幹細胞から発生しているかどうかは不明である腫瘍細胞で生じたゲノムの不安定性から、本来発現が抑制されているGD
F3の発現が上昇してしまうことで分化細胞の幹細胞化（脱分化）を引き起こす能カのある遺伝子の発現が上昇し、癌幹細胞が生じている可能性も推測される．
腫瘍表面のC
D24の欠落は、増殖反応を抑制し、腫瘍細胞内においてアポトーシスを誘導するという最近の報告があるので、腫瘍細胞における高いCD
24レベルは、担癌患者の予後の不良さを示しうる．我々は悪性黒色腫におけるGD
F3過剰発現が、腫瘍の増大を助長する高いCD
24発現と関連していることを示唆したが、まだ、未知の知見がある．
B16サプライ ンにおけるCD24の発現分析は、GD
F3の分析と一致するが 、肝癌細胞GlとG5の細 胞サ ブラ インはGDF
3によるCD24発現を導く能カが欠陥している．GD
F3によ るC
D24発現上昇のメカニズムは不明である．われわれは、CD24が腫瘍の微少環境中のdamageassociatedmolecularpattern(DAMP)の存在にシグナルを伝達し、それにより、GDF
3‑CD24
経路が機能する
B
16Fl/Fl0では病理学的な腫瘍増大を促進して炎症反応を助長するが、その経路が機能しない
Gl/G5細 胞 で は 、 そ の 炎 症 助 長 が 起 こ ら な い と い う 推 測 を し て い る ．
【結論】
1．マウスの正常皮膚と比較し、マウス悪性黒色職種細胞B
16における胚性幹細胞特異的遺伝子の発現を同定した．
2． 胚 性 幹 細 胞 特 異 的 遺 伝 子 の う ち GDF3が 腫 瘍 形 成 中 に 上 昇 す る こと がわ かっ た．
3．G
D
F
3の過剰発現はマウスのB16―FlとB
16‑Fl0による悪性黒色腫の腫瘍形成を促進するが、GlとG5による肝細胞癌では促進しなかった，4．

GDF3過 剰 発 現 は B16・ Flと B16‑Fl0の 両 者 に お い て CD24の 発 現を 増加 させ た．

5．移植した腫瘍細胞における強制発現させたGD
F3の発現レベルはトランスフウクション後、徐々に減少する．

ー 274ー学位論文審査の要旨
主査 准教授 濱田淳一
副査 教 授 田中伸哉
副査 教 授 佐邊壽孝副査 教 授 志田壽利
副査 教 授 浅香正博

学位論文題名Anembryo―s
pecifice
xpresslng
TG
F―pfamily
protein，
growth― di任 ． erent
iationfactor3（ GDF3），
augmentS
prog
reS
S
10nof
B
16melanoma（ 胚 性 幹 細 胞 特 異 的 遺 伝 子 の GDF3はマウスB16悪性黒色腫細胞の腫瘍形成を促進する）
悪 性 腫 瘍 細胞 は ES (embryonic stem)細 胞 に 特異 的 な 抗 原を 含 め 胎 児性 抗 原を発 現して いる
こ と が 多 い ，こ れ ら 悪 性腫 瘍 中 に 観察 さ れ る 胚性 抗 原 の 多く が 腫 瘍 形成 や 腫 瘍 の悪 性 化 に関 係して いる，

Growth‑differentiationfactor3(GDF3)は転 写成長因子であるT
GF‑pスーパーフ ァ ミ リ ー に属 し ， 胚 性幹 細 胞 や 早期 胚 で も 発現 し て い る． GDF3の 高 発 現は ， ヒ ト 精巣 に発 生 し た 胚 細 胞 性 腫 瘍 で あ る 精 巣 上 皮 腫 ， な ら ぴ に 乳 癌 で 観 察 さ れる ， し か しな が ら 、GDF3の役割は いまだ 明らか ではな い．
本 研 究 では 癌 と 胚 性幹 細 胞 特 異的 遺 伝 子 の関 係 を 明 らか に す べ く実 験 系 が 形成 さ れ 、 それ らを論 ずるに あたり 、(Thecancerstem cell；CSC，Thecancerstemcells；CSCs)仮説に着目 してい る，
CSC仮 説 は最 近 の 研 究で は 固 形 癌も CSCに 由 来す る と い う証 拠 が 得 られ て い る ．既 出 の 論
文 で は ヒ ト 悪 性 黒 色 腫 も CSCを 含 み 、 そ し て CSCか ら 分 化 し た 腫 瘍 が ABCB5を 発 現 し て いる と 報 告 され て い る ．マ ウ ス の 悪性 黒 色 腫 B16― Fl0細 胞 もCSC様 の 細 胞を 含んで おり、 それら はCD133、 CD44、そし てCD24を発 現して いる．
実 験 結 果 で は ， GDF3の 過 剰 発 現は マ ウ ス のB16‑Flと B16‑Fl0に よる 悪 性 黒 色腫 の 腫 瘍 形成 を 促 進 す る が 、 Glと G5に よ る 肝 細 胞 癌 で は 促 進 し な か っ た ， ま た GDF3過 剰 発 現 はB16‑FlとB16‑Fl0の 両者にお いてCD24の発現 を増加 させた，
B16サ ブ ラ イ ン に お け る CD24の 発 現 分 析 は 、 GDF3の 分 析 と 一 致 す る が 、 肝 癌 細 胞 Glと G5の 細 胞 サ ブ ラ イ ン は GDF3に よ る CD24発 現 を 導 く 能 カ が 欠 陥 し て い た ， GDF3に よる CD24発現上 昇のメ カニズ ムは不 明であ る．
‑275―

審査会で，副査の田中 教授からは，今回なぜ悪性黒色細胞を固形がんのなかから選択したのか，という質問なされた，申請者は今までの論文で癌幹細胞の存在が示唆されていた固形癌のうちのーっであっ たこと，成長が早く，実験材料として扱いやすかったからであると 回答 した ．ま た， 幹細胞に特異的なsp
here形成 などの確認はなされているか，GD
F3の免疫学的染色がなされて いるか，またヒトへの応用の全段階としてヒトの悪性黒色腫の使用 は考 えら れな かっ たかという質問がなされた． 申請者はsphere形成実験やGD
F3の免疫学的染色は本研究ではな されておらず，ヒトの悪性黒色腫も研究過程で培養を試みたが発育 が 悪 く ， 実 験 材 料 と し て 不 適 切 で あ っ た 可 能性 が あ る と 回 答 し た ．
副査の佐邊教授からは ，本研究の移植実験において，腫瘍細胞がマウスに皮下注射される際の，EMT獲得についての考察がなされているかと いう質問があった．すなわち皮下注
射そのものが炎症を惹起 し，それによるサイトカインの誘導によりEMTlikeな変化が起こった可能性を示唆され， それを確認するための少量の腫瘍細胞の導入などを試みているかとの質問であった．申請者は，今回，腫瘍細胞の少量移植はなされておらず，今後の課題として考えたいと回答した ．副査の志田教授からは，本実験ではモノクローナルな腫瘍ではなぃのではないかと疑問 を呈された．申請者は，本研究過程でGFPを発現する細胞クローンを樹立し，それによる モノクローナルな細胞集団を得ることを試みたこと，しかしそれらは今回確立し得なかっ たと回答した．また，本研究では癌幹細胞ではなくても腫瘍形成能があるように見受けら れるので，その定義などにっいて質問があった．申請者は，過去の論文で様々な腫瘍全体 における様々な癌幹細胞の割合が報告されていると回答した，主査の浜田准教授から癌幹細胞様の働きをする細胞を説明する語彙の使用が色々とあること，またその言葉は各研究者 がある範囲で定義しても良いが，その定義に従い実験系を組み立てることの助言があった ，副査 の浅 香教 授か ら，GD
F3はES細胞に発現して いる遺伝子であることから，胎児性の細胞は使用しなかったの か，また他の癌種の使用についての質問があった，申請者は今回の 実 験 で は ， そ れ ら の 細 胞 の 使 用に は 至 ら な か っ た こ と の経 緯を 説明し た，
最後に，主査の浜田准 教授からは，論文記載の際の語彙の使用，また学位論文に関しての助言があり学位申請審 査を終了した．
本研 究は ，GDF3が 腫瘍増殖を促進するとともに C
D24の発現を誘導することを示した最初の報告であり，今後， C
D24‑Siglec
G経路と腫瘍浸潤と腫瘍増殖中に構築される自然炎症反応の関連を明らかにす る研究が期待される．
審査員一同は，これら の成果を高く評価し，大学院課程における研鑽やや取得単位なども併せ申請者が博士（医 学）の学位を取得するのに十分な資格を有するものと判定した．

― 276―