博 士 （ 理学）森 田直樹
学 位 論 文 題 名Biochemical studies on the fatty acid synthesis in relation tolow― temperature adaptation inapsychrophilic bacterium，￣ 眈 ろ 九 〇 sp． strainABE― 1（ 好 冷 性 細 菌 W6rめ sp． s
trai
nABE―1の低 温適 応に 関わ る脂 肪 酸合 成の 生化 学的 研究 ）学 位 論 文 内 容の 要 旨
Vlbrio sp. stirain ABE−1（Vibno ABE―1株）は、至適生育温度を15℃、最高生育温度を 20℃ にも つ 好冷 性細 菌で ある 。Vibrio ABE―1株 は0〜20℃まで温度範馴において膜の流 動性 を適切な状態に保つ能カを持っていることか ら、低温環境に非常に良く適応している と思 われ る 。膜 脂質 の脂 肪酸 組成 は膜 の流 動性 の調 節に 重要であると考えられているが、VibrioAB
E―1株の脂肪酸組成は、（1）炭素数16の脂肪酸（16：0、16：1（9c）、16：1（7c）、16：1（9t））に富む、（2）これら炭素数16の脂肪酸の割合は全脂肪酸の80％を占め、そ の割 合は 生 育温 度が 変化 して も殆ど変動しをぃ、（3）最高生育温度付近でユニークなトラン ス型脂肪酸16：1(9t）が合成される、以上3つの特徴をもつ。これらの特徴的な脂肪酸 組成 をもつ膜脂質が低温環境下で膜の流動性を適 切な状態に保つことによって、Vibrio
ABE―1株の 好 冷性 はも たら され ると 考え られ てい る。 しか し、本菌の脂肪酸合成の調節機構に関してはこれまで不明であった。
本研 究は 、 特に Vibrio AB
F.←1株 のお ける 脂肪 酸の 鎖長 調節川fのM定と不飽和脂肪酸の合成 機構の解明に焦点を当て、好冷性微生物の膜の流動性調節機構を′！t
化学的側面から明らかにすることを目的に行われた。
VlbriorV
3E
一1株の脂肪酸の鎖長調節機構を明らかにするため、ネ0f
胞質1山1う の55〜75％
硫 安沈 殿を 本 菌の 脂肪 酸合 成酵 素(FAS)画分とし、 ［1‑1C]
マ□ニルC（1Aを魅質とするinvitr〇 脂肪 酸 合成 反応 を行 った 。本菌のFASによる 脂肪酸合成はアシルキャリア一夕ンバ
ク 質(ACP)の 濃度 に完 全に 依存 し、 又、 ［ 14C］マ □二 ルCoAの脂 肪酸 への 取り 込み がチオ ラク 卜マイシンによって完全に阻害されることか ら、II型び〕AへSであることが示された 。史 に、本菌のFASは 炭素数16、18の脂肪酸に加え、炭素数20〜3（）の超長鎖脂肪酸をアシル ーACPの形で合成する能丿Jを潜在的に有していることがnハ′ffrU
脂肪酸合成実験から明らかとなった。この糸占果は本菌のFAS自体には、J亅旨肪酸鎖長洲節能/Jが命くないことを意味している。
本菌 の脂 肪 酸の 鎖長 調節 機構 を明らかにするために、まず、面みぱ0脂肪酸合成反応にお ける A
CP濃度の影響を 訓べた。その結果、反応系r書IのACP濃度が｜奇くなるにっれて合成される脂肪酸の炭素鎖艮が短くなることが確認された。本菌細胞lllのA（：i・亅濃度は明ら
か に さ れ て い な ぃ が 、 こ の 結果 はACP濃度 が脂 肪酸 鎖長 を調 節し て いる 要因 の1っで ある こ と を 示 唆 す る も の で あ る。 次に 、 F
ASを調 製す る際 に除 かれ る 細胞 質画 分の O
〜 55％ 硫 安 沈 澱 （ 55％ 画 分 ） を 面WnIo
脂 肪 酸合 成反 応系 に加 えた とこ ろ、 合成 され た脂 肪酸の約 50％は本菌が本来もっている炭素数14、16の遊離脂肪酸として1¨1Jl乂された。又、この活 性は加熱処理によって完全に失われることから、酵素活性、只I亅ちチオェステラーゼ
活 性で ある こ とが わか った 。そ こで 、本 活性 の鎖 長特 異性 を調べたところ、炭素数16のアシル 一ACl〕とアシルーCO
Aに対して最も高い活性を示した。 以Jニの結果より、本菌の主要脂肪酸を炭素数16のJl旨肪酸としている要因の1っは、この55％｜‖11分I
I｜びjチオエステ
ラーゼ活性の鎖長特嶷 1゛1：にあると示唆される。
釧菌 のモノ小飽和脂肪酸合成経路には、嫌気（非酸化）経路 とむ「気（酸化）経路の2つの存他 が知られている。嫌気経路ではモノ不飽和脂肪酸はIIの）脂JIん酸合成酵素により飽一 22‑

和脂肪 酸ととも に合成 される。 一方、 好気経路 ではモ ノ不飽和 脂肪酸は酸素に依存した飽和脂肪酸の不飽和化反応によって合成される。
VibrioABE―1株に好気条件下で[14C］酢酸を与えて脂肪酸をパルスラベルすると、16：1、18：1の 他に14：1の合 成が認め られた 。しかし 、これ らの脂肪 酸のうち 14：1はその合 成が 嫌気 経 路 の特 異 的 阻害 剤 で ある 3― デシ ノ イ ル ‑Nア セ チルシ ステアミ ンの存 在下で完全 に阻 害 さ れた が 、 16： 1、18：1の合成は 阻害され なかっ た。これ らの結 果は、本 菌の14:1は嫌気 経路に よって合 成され ること、 即ち、好 気条件 下でも嫌気経路が機能している
こ とを示 している 。また 、16:1、18：1
は好 気経路に よって も合成さ れるこ とを示唆 するもので ある。一 方、本 菌に嫌気 条件下 、好気条件下で［14CII
14:0を与え、本菌の脂肪酸をバルス ラペルす ると、 嫌気条件 下では 不飽和脂 肪酸の 合成は見 られなかったが、好気条件下では 飽和脂肪 酸とし て16：0が、不 飽和脂肪酸として16：1が合成された。しかし、14：1の合成 は認めら れなか った。こ れらの 結果は、 好気条 件下にお いて、14:0は速やかに鎖長伸 長、 好 気 的不 飽 和 化を 受 け 、16： 0、 16:1に 変 換 され る ことを示 す。よ って、本 菌は16:0を好気 的不飽 和化する ことが 明らかと なった。 以上の 結果から、本菌が好気条件下で不飽和 脂肪酸を 嫌気、 好気の両 経路を 経て合成 するこ とが示さ れた。両経路をもつことによ る不 飽 和 脂肪 酸 供 給能 の 高 さが、 本菌の低 温生長（ 適応） を可能に してい ると思わ れる 。これ まで生物 は上述 の2つ の経路 の内、い ずれか一 方のみ をもっと 考えら れてきて おり 、単一 の生物で これら 2つの 経路に よって不 飽和脂肪 酸を合 成すると いう例 は本菌が 初めてである。
本薗の 最高′k育温J
蔓付近で合成されるユ二一クな16：1(9t)は、これまでの研究で16：1(9c)のシス 一卜ラ ンス異性 化反応 によって 合成され ること が間接的に示されているが、直接的な 証明はな されて いなかっ た。16:1 (9t)の生合成経路を明らかにするために、重水素化され た16:1(9c)を本菌に 与えて その代謝を調ぺた。訓製した脂肪酸メチルエステルを硝酸銀簿 層ク□マ 卜グラ フイーで シス型 とトランス型不飽和脂H方懴に分けた後、各々を二重結合の 位置決定 に非常 に有効な 二硫化 ジメチル 付加物 としてGC一MSでう｝折した。その結果、L6:1（9t)は16：1(9c)が異性化されることによって生成されることが示され、同様に重水素化された16：1（9t)を用いることによって16：1(9t)から16：1(9c)が生成さ才1ることも明ら かにさ れた。こ ォ1までに知 られて いるシス ー卜ラン ス異性 化反応と 興なり 、本菌の シス 一 卜 ラ ン ス 異 性 化 反 応 は 二 重 結 合の 位 置 の 移動 を 伴 わな い 点 でユ ニ ー /ノ で あ る。
次 に、本 菌にお ける卜ラ ンス型脂 肪酸の 機能を明 らかに するため に、5℃で培 養した細胞 を20℃ の培 地 に 植え 継 ぎ 、そ の 後 の炭 素 数 16の 脂 肪 酸の 代謝を詳 細に調 べた。16：1(9c） の割合は 植え継ぎ後に激減するが、その後は漸増を示した。L6：0の割合は植え継ぎ後に増加するが、対数増殖期後矧になると減少を始め、それに伴って1（j：1(9L)の割合は増カr1し 始めた 。又、［ 14C］ 酢酸を用 いて本 菌の出novo
飽 和脂肪 酸合成能 を植え 継ぎ後か ら経時的に 訓べたと ころ、 弛え継ぎ 後には 合成能が 上がる が、その 後減少を続けることが明らかにな った。こ のこと は、本菌 の飽和 脂肪酸合 成を副 る1‑ASが比較的熟に不安定であることを示唆している。これまで、16:1(9t）の機能にっいては、トランス！馴脂肪酸の融点が飽
和脂肪 酸とシス 型不飽 和脂肪酸 の融点 の間にあ ること から、膜 流動性の微妙な調節に関与していると考えられていたが、以上の結果は、16:1(9t）は細胞l勺の16：0の合成能の低下を補 償 す る た め に 合 成 さ れ る と い う 新 し い 可 能 性 を示 唆 する も ので あ る。
このよ うに、 Vibrio AB
E−1株におい ては、炭 素数16の アシル− A
CPに特異的なチオエス
テ ラー ゼ に よる 厳 密 な脂 肪 酸 の鎖長 調節、嫌 気経路と 好気的 不飽和化 の両経 路をもつ ことによ る不飽平 ‖脂肪 酸の高い 供給能 力、そし て16：1(9c)のシストランス其1生化反応によって 、本菌の 特徴的 な脂肪酸 組成が 決定され 、それ によって 本薗の膜脂質の流動性が適切に訓節さォ1ていると結論される。

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学位論文審査の要旨
主査
副査

教授
教授

石川落合

鑛
廣副査 教 授副査 助教授

吉田 静夫
奥山英登志

学 位 論 文 題 名Biochemical studies on the fatty acid synthesis in relation tolow―tem
perat
ure adaptati
on inaps
ychrophil
ic bacterium，￣ Vibri〇sp．strain ABE―1（好 冷性 細 菌Vibrio sp. strainABE―1の低温適応に関わる脂肪酸合成の生化学的研究）
細 菌 の温 度適 応に 関 する 従米 の研 究は 、 温度 変化 と細 胞成 分組成及びf｜ ！1！u活性の変動を
関 連 付 け る と ぃ う 現 象 面 の 記 載 に と ど ま って いた 。本 研 究は 至適 生育 温度 を 15℃ 、・ 巌高 生
育温 度 を20℃に もつ 灯 冷性 細菌 （Vibrio sp．strain ABE‑1）という好適な 制・料を得て、かつ本襾 の 脂質 に関 する 詳 荊0な 分析 結 果を もと にし て 、細 菌の 低温 適応 機 構を J亅 旨肪 酸代謝の而からf量三化学的 に斛19jすぺく行われたもの である。以下に、そのイi丿『究成永の熨点を述ぺる。
（1）本1謝はIIJF
iUのJ
亅旨J
jん職合成酵素をもち、本酵素には鎖長訓節能丿丿はなく、滞イ｜：的に炭素 数 30ま で の 超 K鎖 〃 冑 肪 酸 を 合 成 す る 能 カ を 有 し て い る こ と を 19jら か に し た 。
（ 2） 本 菌 の 細 胞 質 中 に は ア シ ル ― 中 間 体 を 遊 離 脂 肪 酸 と す る 活 性 、 チ オ エ ス テ ラ ー ゼ活性 が あ り 、 本 菌 膜 脂 質 の 主 要 脂 肪 酸 を 炭 素 数 16と し て い る 要 因 の 1っ は 、 こ の チ オ エステラーゼ活性の鎖長特異性にあることを示唆する結果を得た。
（ 3） ACP濃 度 が 脂 )1)jpr$2:合 成 の 炭 素 鎖 長 に 影 響 を 与 え る こ と を I川 ら か に し た 。
（4） 本 菌の イく 飽和 1脂 肪職 は、 好 気条 件下 では 、 好気、嫌 気のfl町経路を経て合成さ れること を り ］ ら か に し た 。 全 脂 質 の 80％ 以ヒ が 不飽 和脂 肪酸 によ っ てlITめ られ てい る本 菌の場 合、 両経 路に よっ て不飽和脂肪酸が供給で きることの低温適応における生理的意義は極めて人きい。
（ 5） 重 水 素 化 さ れ た JJ旨 Jl)j舷 を ト レ ー サ ー と し 、 そ の 結 果 を GC・ MSで 分 析 す る こ とに
よってホmのトランス ！叫脂肪酸、16:1(9t)は二 重結合の他越の移勦をf｀1とわないシスートランスy′1．′1イヒ反応により合成されるを明らかにした。
（6） 16:1(9t)は 、l6:0の合 成能 の低 下を 補 償し 、膜 の流 動性 を 適り 丿な 状態 に維持す るために合成されることを Jミ唆する結果を得た。
こ れら の成 釆 は、 I11｜占 将が ラジ オア イソトープをJrJいた 実験とそのデ｀一夕のj巾r、 夕ン
パ ク 質 と 脂 質 の 分 離 ・ 分 析 、 G C‑MSな ど の 機 器 分 析 、 代 謝 iin.:IJ:刑 の 利 川 と デ ー タ の 解析な どの mfで 勝 れた 能丿 丿を 発揮 し たこ とに より 得 られ たも ので ある。また、1 ．記の諸 知見は、 好冷性釧簡の低温適応機構の理解にとって重要 なもので、この分野の発艇に寄与するところ大であり、1勺外よ りの高い評価を得ている。
こ れ ら の f沂 究 成 果 を ま と め た 主 論 文 の 内 容 、 お よ び 凵 頭 発 表 に よ る 妓終 試 験の 成績 を総合して検討した結果、審 備員，同は中請者が障上(l:qlt'f:）の学f、・′．を受けるのに充分な資格をイrするものと認めた。

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