２００５年度知的財産翻訳検定問題【化学／生化学問題】※解答作成前に必ず下記の注意事項に目を通してください。
【解答にあたっての注意事項】
１．下記明細書の【特許請求の範囲】の【請求項１】のうち（C）、（D)および（E)を除いた部分（翻訳はセミコロンで終わってください）と、パラグラフ【０００７】及び【００３４】（見出しを除く）を出願用に翻訳してください。
２．翻訳にあたっては、必要に応じて明細書の他の部分を参照してください。
３．解答にはパラグラフ番号を忘れずに付記してください。
４．解答中、℃は degree C とし、μl はスペルアウトしてください。ギリシャ文字の使用は不可とします。HNO3 の 3 は下付き文字と見なします。解答も HNO3 のままで結構です。
**************【特許請求の範囲】【請求項１】
以下の（Ａ）～（Ｅ）の何れかの塩基配列からなるホウ素トランスポーター遺伝子。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列；（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ素トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホウ素トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；【発明の詳細な説明】【技術分野】【０００１】
本発明は、シロイヌナズナにおけるホウ素トランスポーター及びその遺伝子に関する。
【背景技術】【０００２】
ホウ素は高等植物の微量必須元素の一つである（例えば、非特許文献１参照）。ホウ素は毒性も持っており、過剰に摂取すると植物の生育が阻害されたり、動物では急性中毒で死亡したりする。土壌溶液中でホウ素は無電荷の分子状で存在する。そのため比較的容易に溶脱し、農作物において欠乏症が発生しやすい。ホウ素欠乏症による農業上の収量、品質の低下は 130 品種、日本を含む世界 80 カ国以上で報告されている（例えば、非特許文献２参照）。また、ホウ素は他の元素と比較して至適濃度範囲が狭いことが知られており、乾燥地での土壌集積や過剰施肥による過剰症の発生も報告されている。
1【０００３】
最近になり植物におけるホウ素の役割が明らかにされてきた。ホウ素が細胞壁のペクチン質多糖を架橋することが明らかとなり（例えば、非特許文献３参照）、この架橋が植物の生育に必須であることが示された（例えば、非特許文献４参照）。これが植物におけるホウ素の生理機能に関する最初の分子レベルの知見である。その一方で植物体でのホウ素輸送機構には不明な点が多く残されている。ホウ素は長い間、脂質二重膜の受動拡散によって細胞内に入り、蒸散流によって植物体内を輸送されると考えられていた（例えば、非特許文献５参照）。一方、生育に適したホウ素栄養条件は種間や品種間で大きく異なることが知られていた。吸収や転流、利用効率の違いがその原因の可能性として挙げられていたものの、その要因となる分子は不明であった。近年になりチャネルを介した輸送が提唱された（例えば、非特許文献６参照）が、その根拠はアフリカツメガエルの卵母細胞での発現系や膜小胞を用いた in vitro の実験にすぎず、実際の植物個体でそれらチャネル分子がホウ素輸送に関与するかは示されていなかった。また、ヒマワリの根の吸収実験から輸送体による能動輸送の存在が示唆された（例えば、非特許文献７参照）ものの、それを担う輸送体の同定には至っていなかった。
【０００４】
本発明者らは、生物界で初めて排出型ホウ素トランスポーターＢＯＲ１をモデル植物であるシロイヌナ
ズナより単離した（例えば、特許文献１参照）。ＢＯＲ１は低ホウ素栄養条件下で導管への積極的なホウ素輸送を担うと考えられている（例えば、非特許文献８参照）。また、ホウ素輸送を担うトランスポーターとしてＢＯＲ１以外には、酵母のＹＮＬ２７５ｗが知られている（例えば、非特許文献９参照）。
【発明の開示】【発明が解決しようとする課題】【０００６】
ホウ素の環境中からの取込みは重要な制御段階であるが、ホウ素輸送を担うトランスポーターはシロイヌナズナのＢＯＲ１と酵母のＹＮＬ２７５ｗしか知られていなかった。植物体におけるホウ素輸送機構を分子レベルで解明し、ホウ素輸送における主要な経路や制限要因を明らかにすることは効率的な施肥方法や育種戦略への知見を与えるものであると考えられる。また、植物体でホウ素輸送に関与する遺伝子を同定することはホウ素欠乏・過剰耐性品種の作出に直接つながると考えられる。本発明の課題は、環境中からのホウ素の取込みや生体内でのホウ素の輸送をより効率良く制御することが可能となる、これまでに知られているトランスポーターとは異なる活性を持つホウ素輸送を司る新たな遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】-------------------【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究し、シロイヌナズナゲノムに存在する６つのＢＯＲ１相同遺伝子のうち、シロイヌナズナにおいて発現しているＡｔ３ｇ６２２７０、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａ
ｔ１ｇ１５４６０、Ａｔ１ｇ７４８１０、Ａｔ５ｇ２５４３０の５遺伝子の完全長ｃＤＮＡを取得した。
Ａｔ３ｇ６２２７０、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａｔ１ｇ１５４６０について、ＧＡＬ１プロモーター下流に５'と３'側双方の非翻訳領域を含む完全長ｃＤＮＡをつないだコンストラクトを構築し、酵母のＢＯＲ１相同遺伝子であるＹＮＬ２７５ｗの破壊株に導入した。酵母の菌体内水溶性ホウ素濃度を測定した
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が、ベクターコントロールと遺伝子を導入した酵母において有意な差は見られなかった。また、ホウ酸を含む培地における耐性も見られなかった。そこで、５'と３'側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡをＧＡＬ１プロモーター下流につないだコンストラクトを構築し、酵母に導入した。ホウ素を含む培地で６０分間培養したところ、いずれもベクターコントロールと比較して菌体内水溶性ホウ素濃度の低下が見られた。また、２０～８０ｍＭのホウ酸を含む固形培地で生育させたところ、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａｔ１ｇ１５４６０を発現させた酵母ではベクターコントロールと比べてホウ酸耐性を示した。Ａｔ１ｇ１５４６０を発現させた酵母ではＢＯＲ１を発現させた酵母よりも強い耐性を示した。
本発明は上記知見に基づいて完成するに至ったものである。
-------------------【発明を実施するための最良の形態】【００１３】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００１５】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版"と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１６】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００２３】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつホウ素トランスポーターを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。例えば、本発明の遺伝子の５'と３'側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡをＧＡＬ１プロモーター下流につないだコンストラクトを好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の3

遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、酵母用発現ベクター、植物細胞用発現ベクター、細菌用発現ベクター、動物細胞用発現ベクター等を用いることができるが、酵母用発現ベクターや植物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。
【００２９】
本発明のホウ素トランスポーター遺伝子のスクリーニング方法としては、各種植物、酵母等の遺伝子ライブラリーを用いて、ＹＮＬ２７５ｗ遺伝子が欠損し、ＹＮＬ２７５ｗを発現しないＹＮＬ２７５ｗ破
壊酵母を形質転換し、得られた形質転換ＹＮＬ２７５ｗ破壊酵母をホウ素含有培地で培養し、該形質転換ＹＮＬ２７５ｗ破壊酵母のホウ素トランスポーター活性を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、ホウ素トランスポーター活性の測定・評価としては、酵母菌体内の水溶性ホウ素濃度の測定・評価を挙げることができる。また、ＹＮＬ２７５ｗの破壊株としては、Saccharomyces
cerevisisiae１１６９株（Winzeler, E. A.; Shoemaker, D. D.; Astromoff, A.; Liang, H.; Anderson, K.;
Andre, B.; Bangham, R.; Benito, R.; Boeke, J. D.; Bussey, H.; Chu, A. M.; Connelly, C.; Davis, K.;
Dietrich, F.; Dow, S. W.; El Bakkoury, M.; Foury, F.; Friend, S. H.; Gentalen, E.; Giaever, G.;
Hegemann, J. H.; Jones, T.; Laub, M.; Liao, H.; Liebundguth, N.; Lockhart, D. J.; Lucau-Danila, A.;
Lussier, M.; M'Rabet, N.; Menard, P.; Mittmann, M.; Pai, C.; Rebischung, C.; Revuelta, J. L.; Riles,L.; Roberts, C. J.; Ross-MacDonald, P.; Scherens, B.; Snyder, M.; Sookhai-Mahadeo, S.; Storms, R.
K.; Veronneau, S.; Voet, M.; Volckaert, G.; Ward, T. R.; Wysocki, R.; Yen, G. S.; Yu, K. X.;
Zimmermann, K.; Philippsen, P.; Johnston, M.; Davis, R. W. (1999) Functional characterization of
the Saccharomyces cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science 285: 901-906）
を好適に例示することができる。
【００３３】［ホウ素トランスポーター遺伝子を発現する酵母の作製］
ｐＹＥＳ２ベクタ－を用い、ＧＡＬ１プロモーター下流に５'と３'側双方の非翻訳領域を含むＡｔ３ｇ６２２７０、Ａｔ３ｇ０６４５０、Ａｔ１ｇ１５４６０の各ｃＤＮＡをつないだコンストラクトを構築した（ｐＴＦ４８５；Ａｔ３ｇ６２２７０，ｐＴＦ４８４；Ａｔ３ｇ０６４５０，ｐＴＦ４８３；Ａｔ１ｇ１５４６０）。また、５'と３'側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡをＧＡＬ１プロモーター下流につないだコンストラクトを構築した（ｐＴＦ５２４；Ａｔ３ｇ６２２７０，ｐＴＦ５２２；
Ａｔ３ｇ０６４５０，ｐＴＦ５２０；Ａｔ１ｇ１５４６０）。これらのコンストラクトをＹＮＬ２７５ｗの破壊株である１１６９株に導入した。コロニーは２％（ｗ／ｖ）グルコース，２０ｍｇ／ｌヒスチ
ジン，３０ｍｇ／ｌロイシン，２０ｍｇ／ｌメチオニンを含む最小培地（ＳＤ）（Sherman, F. (1991)
Getting started with yeast. Methods. Enzymol. 194: 3-21）を用いて選択した。
-------------------【００３４】［酵母のホウ素濃度の測定］
酵母のホウ素濃度の測定には、ＳＤ培地のグルコースをガラクトースに代えた最小培地（ＳＧ）を用い、培養は３０℃で行った。２日間培養した酵母１１６９株の培養液５ｍｌを２００ｍｌの培地に加え、対数増殖期になるまで１６時間培養した。５０ｍｌの培養培養液を５０ｍｌプラスチックチューブに移して３０００×ｇで５分間遠心した。上清を除いた後、２０ｍｌの０．１、０．５、１、１０ｍＭのホウ酸を含むＳＧ培地（Ｔｒｉｓを用いてｐＨ５．５に調整）を菌体に加えて６０分間培養した。培養した酵母を遠心し、菌体を氷上で冷やした蒸留水で２回洗浄した。菌体を１ｍｌの蒸留水に懸濁し、チュー4ブに移して３０分煮沸した。これを３０００×ｇで２０分間遠心し、上清を水溶性ホウ素画分として集めた。菌体に２５０μｌの蒸留水を加え、上清を水溶性ホウ素画分と合わせた。菌体を８０℃で４８時間乾燥させ、乾燥重量を測定した。水溶性ホウ素画分サンプルは蒸留水で２．７ｇに合わせ、０．３ｍｌの５０ｐｐｂ Ｂｅを含む０．８ＮのＨＮＯ3.溶液を加えた。サンプルのホウ素濃度は Inductively
Coupled Plasma - Mass Spectrometery（ＩＣＰ－ＭＳ）（SEIKO, Chiba, Japan）で測定した。実験は３つの独立した形質転換体を用いて行った。
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