博士（医学）棄谷将城
An irradiation‑freenonmyeloablative bone marrowtransplantation model:Importanceof thebalancebetween
donor T‑cellnumber andtheintensityofconditioning（ ミ ニ 移 植モ デル の確 立： ドナ ーT細 胞数 とコン デイ ショ ニン グのバランスの重要性）

学位論文内容の要旨【背 景と 目的 】
従 来の 骨髄 移植が様々な血液疾患において有効であることは広く知られてはいるが，それ には レジ メン 毒性 ，感 染， そして 移植 片対 宿主 病(GVHD)とい った 問題がある．最近そ れに 取っ て代わるものとして骨髄非破壊的幹細胞（骨髄）移植（ミニ移植）が行われる よう にな り，従来の骨髄移植の問題点が改善され，適応患者および適応疾患の拡大にっ いて も報 告さ れつ っあ る． これま での ミニ移植モデルでは，MHCバリアー(HVGR)を乗 り 越 え て ド ナ ー細 胞生 着を 得る ため に免 疫抑制 剤に 加え て放 射線 照射 やT細 胞に 対す る 抗 体 が 用 い ら れ て き た ． そ の HVGR抑 制 に 対 し て Fludarabine (Flu)とCyclophosphamide (CPA)の 組み 合わせ によ る投 与が 有効 であ ると の報 告もこれまでになさ れて いる ．
前 臨 床 お よ ぴ 臨 床デ ー タ で は ， 移 植 骨 髄 細 胞 中 から T細胞 除去 (TDBMC)する事 はGVHD
発症 予防 に効 果的であるが，移植片拒絶，白血病再発，免疫再構築の遅延の頻度が増加する 事が 示さ れている，以上の事から筆者らはドナー細胞生着を促進するのに必要なドナ ー T細 胞 数 は conditioning (FluとCPAの投 与量 ）に 依存 する と仮 定し た．そ して この両 者のバ ランス が生着 におい て重 要な要 因と考 え，検討を加えた．
【実験方法】
ドナーとしてC57BL/6N(B6；H−2b)，レシピアン．トとしてDBA/2N(DBA/2；H−2d)マウスを用いた．フローサイトメトリーを目的にFI
TC標識抗CD3，CD4，CD8，B220，Macー1，Gr―1およびH−2Kd抗体，PE標識抗H―2Kb抗体を，またT細胞除去のための抗CD
4，CD8，Thyl.2抗体 を用 いた ．Conditioningに はFlu，CPA， Cyclosporine (CyA)を用いた．前処置として移植8日前(Day−8）よりFluの投与(100，150，200mg/kg)を開始し，3日前(Day−3）まで連日腹腔内投与した．また，6日前．5日前(Day−6およびDay―5）にCPAの投与(75，100; 150mg/kg)を 行っ た． Day0にド ナー 由来 の2xl07個 の骨髄細胞あるいはT細胞除去
骨 髄細 胞と 5 x107個 の脾 細胞 ある いは enrichし たT細 胞を 2xl05から 4xl07個 の範 囲でレ シ ピ ア ン ト に 尾 静 注 す る こと に より 移植 を行 った ．全 ての レシ ピア ント に対 してDay― 2か ら Day18の 問 ， 2日 ごと に CyAの腹 腔内 投与 (10mg/kg/day)を行 った ．キ メリ‑ 426 ‑ズム解析 は脾細胞な らびに骨 髄細胞を調整して抗H一2KbおよびH―2Kd抗体で二重染色した後にフ ローサイト メトリー によって 行った．
【結果】
＠適切な投与量でのFlu，CPA
による骨髄非破壊的前処置(Flu〓150(mg瓜〆dり 6dりs），CPA＝150（mg瓜g/dり×2dりs））を行うと過度の薬物毒性なく（移植前死亡率：0／12），全てのマ ウスでド ナー細胞 生着が見 られ（9/9）， 骨髄球系 ，リンパ 球系とも に完全ドナーキ メリズム を達成し ていたこ とからこの 投与量が最も適切であると考えられた。 ま た ，筆 者 らの 用 い た骨 髄非破 壊的レジメ ンにおい ては，Fluと CP．Aがとも に必須である事が分かった．
◎ ドナー細 胞生着に おいては ，骨髄細胞 ではなく ，ドナー T細胞が重 要な役割 を果た
し た．
◎ この 研究にお ける骨髄 非破壊的条 件下にお いては， ドナーT細 胞数と前 処置薬投 与
量 と の 間に 微 妙な バ ラ ンス が 存在し ，ドナー 細胞生着 促進のた めにそれ らが互い に相 補 的 な役 割 を演 じ て いる こ とが 分 か った ・

【考案 】
本研究 は，免疫 抑制剤の みを用い た前処置 でMHC完全不 一致のドナ ー―レシ ピアントコンビ ネーショ ンにおけ るミニ移 植（骨髄 非破壊的骨髄移植）を安定して成し得たモデ
ル の初 め て の報 告 であ る．FluとCPAの みを前処 置薬とし て用いた 過去のミ ニ移植モデルの報 告では， 混合キメ リズムを 伴った高 いドナー 細胞生着率 (70−90%)を示しているが，完 全ドナー キメリズム，100%のドナー細胞生着率ではなかった．また，過去のTDBMCの移植 による移 植片拒絶 増加の報 告に基づ き，申請 者らはFluを用 いた前処 置強度とドナーT細 胞の役割 について 特に焦点 を当てた ・骨 髄 非 破壊 的 レ ジメン において ，Fluはいわ ゆるkey drugと考 えられる ．CPAのような他の 免疫抑制 剤とは違 い，分裂 期および GO−Gl期にあ るりンパ球 ，特にT細 胞に作用してそ のアポト ーシスを 誘導する と言われ ている． したがって ，Fluはより 免疫抑制的に 働き ， レ シピ ア ント 由 来 T細 胞に よ るHVGRを 抑 制す るのに非 常に有効 と思われる ．
申 請者 ら は CPAと の 組み合 わせで様 々な投与 量での前 処置を試 み，Fluのわ ずかた投与量の変 化(100−200mg/kg/day)がドナー細胞生着率に大きな変化を及ばすことを示した．
筆者ら の結果は ，放射線 や抗体を 用いない 同種ミニ移植下で安定したドナー細胞生着を得 るた め に は， Flu，CPAはと もに適切 量であり ながら十 分量用い る必要が あることを示して いる．
申請者 らはまた ．骨髄 細胞とと もに脾細 胞あるい はenrichしたT細胞 を移植することによ り，ドナ ーT細胞が 骨髄非破 壊的同種 骨髄移植 後の重要な ドナー細 胞生着規定因子であ ることを 示すと同 時にこれ までの実 験を通じ てドナーT細 胞数と前 処置薬投与量のバラ ンスが重 要である というこ とをミニ 移植モデルによって初めて定量的に示した．
いくっ かのグル ープから ，放射線 や抗体を 使用せず にFluを用いた 骨髄非破 壊的レジメ
ン がFlか らそ の parentへ の 移植 系 に おい て 報告 さ れてい るが，そ れらの系 ではHVG反応 のみ し か 観察 さ れ詮 いのに対 し，今回 のモデル はGVH，HVG反応 共に観察 され，かつドナー T細胞と前 処置強度 の微妙な バランス の上に完 全ドナーキ メリズム が成り立って−427ーいるため，ドナーキメリズムに影響を与える因子（例えばドナーT細胞，同種反応性NK細胞，制御性T細胞あるいはNKT細胞などのGVH，HVG反応に影響する因子）の解析モデルとして有用であると思われる．

【結論】
この骨髄非破壊的骨髄移植モデルの確立を通じて，MHC完全不‑致のバリアーを乗り越えるためには必ずしも放射線照射や抗体投与が必要ではないことが示された．同時に，今回のモデルはドナー細胞生着およぴ完全ドナーキメリズムが微妙なバランスの上に成り立っているため，HVG/GVH反応に関わる様々な因子の解析に非常に有用であると考えられる．

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学位論文 審査の要旨
主査
副査
副査

教授 今村雅 寛
教授 浅香正 博
教授 小野江和則

学位論文題名Anirradiation−freenonmyeloablatiVebonema
rrOW
tranSplantationmodel：ImportanCeof
thebalanCebet
WeendonorT―CeunumberandtheintenSityofCOnditioning（ ミ ニ 移 植 モ デ ル の 確 立 ： ド ナ ー T細 胞 数 と゛ コ ン デイ シ ョ ニン グ のバラ ンスの重 要性）
レジメン毒性、感染といった問題を抱える従来の骨髄破壊的前処置による造血幹細胞移植に取って代わり、最近骨髄非破壊的前処置による造血幹細胞移植（ミニ移植）が広く行われるようになりつっある。これまでのミニ移植モデルでは，MHCバリアーを乗り越えてドナー細胞生着を得るために免疫抑制剤に加えて抗癌剤、放射線照射やT細胞に対する抗体が用いられてきた。過去の報告では、移植骨髄細胞中からT細胞除去(TDBMC)する事はGVHD発症予防に効果的であるが、移植片拒絶、自血病再発、免疫再構築の遅延の頻度が増加することが示されている。以上のことから、申請者はドナー細胞生着を促進するのに必要なドナーT細胞数は前処置の強度に依存すると仮定し、この両者のバランスが生着において重要な要因と考え、検討を加えた。
本研究は、Fludarabine (Flu)とCyclophosphamide (CPA)のみを用いた前処置でMHC完全不一致のドナーノレシピアントコンビネーションにおけるミニ移植を安定して成し得たモデルの初めての報告である。骨髄非破壊的レジメンにおいて重要と考えられるFluは、レシピアント由来T細胞によるHost―versus−graft(HVG)反応を抑制するのに非常に有効と思われる。申請者はCPAとの組み合わせで様々た投与量での前処置を試み、Fluの僅かな投与量の変化がドナー細胞生着率に大きな変化を及ぼすことを示した。すなわち、放射線や抗体を用いない同種ミニ移植下で安定したドナー細胞生着を得るためには、FluとCPAはともに適切かつ十分量用いる必要があることを示した。
さらに、骨髄細胞とともに脾細胞あるいはT細胞を移植することにより、ドナーT細胞がミニ移植後の重要なドナー細胞生着規定因子であることを示し、ドナーT細胞数と前処置薬投与量のバランスが重要であるということを初めて定量的に示した。いくっかのグループから、放射線や抗体を使用せずにFluを用いた骨髄非破壊的レジメンがFiからその一429−

parentへ の 移 植系 に おい て報告 されてい るが、そ れらの系 ではHVG反応の みしか観 察されな いの に 対 し、 今 回の モ デルはGVH、 HVG反応共に 観察され 、かっドナ ーT細胞と 前処置強度の微 妙なバラ ンスの上 に完全ド ナーキメ リズムが成 り立って いるため 、ドナー キメリズ
ム に影 響 を 与え る 因子 （ 例 えぱ ド ナー T細 胞 、 同種 反 応性NK細胞、 制御性T細 胞あるい はNKT細胞な ど）の解 析モデル として有 用である と思われた 。
口頭発 表に際し 、副査の小野江和則教授よルドナーノレシピアント切コンビネーションの 決定 法 、 ドナ ー T細 胞の 活 性 化マ ー カー の 変 化、 GOT．GPT上 昇 とGVHDの 重 症度 判 定の妥当性 について の質問が あった。これに対して、申請者は様々なドナーノレシピアントの組み 合わ せ で 網羅 的 に移 植 を行い見 出したこ と、トナ ーT細胞の活 性化マー カーにつ いては未検討 であるこ と、GOT・ GPTの 上昇度も 含め検討 した結果、GVHDの発症に関しては期待されたよ うな改善 が認めら れなかっ たと回答 した。次い で、副査 の浅香正 博教授よ り、今回の 前処 置 薬 に用 い たFluと通 常の骨髄 移植でよ く用いら れているBusulfanと の差異、 固形癌に対 する移植 応用の可 能性につ いて質問 があった。 これに対 して、申 請者は文 献を引用し、Fluは 分裂期お よびGo−Gi期 にあるり ンパ球、 特にT細胞に 作用して そのアポ トーシスを 誘導 し 、 した が って よ り免疫抑 制的に働 くこと、 固形腫瘍へ の応用に 当たって はNKT細胞の輸 注の併用 が有効で ある可能 性を推察 として回答 した。最 後に、主 査の今村 雅寛教授
よ り、 Fluの 投与 量 がヒ トと 比較して かなりの 高用量で ある理由、 前処置に 放射線を 用いな ぃモ デ ル を作 成 した 理 由、GVHDを抑 制しつつ GVT/GVL効果を引 き出すこと ができる 細胞の 存在 の 可 能性 に つい て の質問が なされた 。これに 対して、申 請者はマ ウスのFluの 代謝能 カが ヒ ト の10〜20倍 である との報告 があるこ と、放射 線照射によ るinvivoでのサ イト
カイン ストーム の影響を 除外し、より簡便なモデル作成を目的とした，こと、文献と自らの実 験結 果 か ら抗 腫 瘍効 果 とGVHD抑制効 果の両面 が期待さ れるNKT細胞が 有望であ ろうとの回答を した。
本研究 は、免疫 抑制剤の みで安定 したドナ ー細胞生着 と完全ド ナーキメ リズムを 達成した 初め て の モデ ル であ り 、ドナー T細胞数と 前処置の 強度のバラ ンスの重 要性を定 量的に示した ことでも 高く評価 された。 この研究 を基により 安全で確 実な移植 療法の開 発、新たな移植 免疫療法 への応用 が期待さ れた。
審査員 一同は、 これらの 成果を高 く評価し 、大学院課 程におけ る研鑽や 取得単位 なども併 せ申請者が 博士（医学 ）の学位を 受けるに充 分な資格を 有するもの と判定した 。

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