早期治癒を支援するレーザー生理活性コーティング技術開発
国立研究開発法人 産業技術総合研究所 電子光基礎技術研究部門 先進レーザープロセスグループ
研究グループ長 奈良崎 愛子（平成 29 年度 重点研究開発助成 B 課題研究 AF-2017202）
キーワード：レーザー転写，生理活性タンパク質, アパタイト

１．研究の目的と背景示すため，アパタイトコーティングは様々なインプラント

我々はこれまで，レーザー転写プロセスを駆使した物質材料（例えば，歯根および人工骨）に適用されてきた．従デリバリー手法を考案，プロセス解明ならびに産業応用に

来のアパタイトコーティング技術は，非位置選択的であり，向けた研究開発に取り組んできた[1-3]．レーザー転写は，高温や長時間処理を必要とする．その中で，過飽和リン酸一般にレーザー誘起前方転写法（Laser-Induced Forward

カルシウム溶液中でアパタイトを基材表面に析出させるTransfer, LIFT）と呼称され，レーザーアブレーション等のバイオミメティック法[13]は，非熱コーティング技術であレーザー誘起現象を推進力に利用して物質を移すデリバり，タンパク質などの熱に弱い生理活性物質も高い生理活リー手法であり，微小ドットから膜形状まで多様な構造を性を保持した状態で膜中に担持できる．しかしソフトプロ転写堆積することができる（図１）．古くは 1970-80 年代セスであるがゆえ数百ナノメートルからミクロン厚のアから金属等のレーザー転写に関する研究報告が始まってパタイト膜を形成するのに数時間から数日かかる．

いる[4,5]．レーザー転写法の特長として，固体・液体選ば

そこで本研究では，レーザー転写法を基盤技術に，生理ず原料（ドナー）とでき，金属[6,7]，半導体[1,3]，酸化物活性アパタイトの高速・高密着コーティング手法を提案，[2,3]，銀ナノインク[8,9]やバイオインク[10]，タンパク質

歯周病再生医療の新しい歯科術式に資する「早期治癒を支や細胞など生体材料[11]，最近ではグラフェン[12]と新材援するレーザー生理活性コーティング」手法として，その料を含め適用範囲を拡大し続けている．近年では，金属，基礎実証に挑戦する．我が国の成人の約 8 割が罹患してい導電性酸化物や銀ナノインク等の配線描画によるエレクるといわれる歯周病治療では，歯周ポケット周囲の感染部トロニクス応用や，他技術では難しい高粘性バイオインクを除去後，ぺリオドンタルアタッチメントの再形成を試みや細胞の 2D・3D プリンティングによるバイオ・医療応用る．しかし，歯周病に罹患した歯は，本来の歯に比べ，ぺなどが注目を集めている．一方で，レーザー転写技術の主リオドンタルアタッチメントが再構築されにくく，再度のな課題は，転写物の形状・堆積位置制御といった高精度化

細菌感染・増殖により歯周病が再発し易い．そこで，歯面と，転写時のドナー物性保持や転写物と転写先基板（レシにヒトの歯や骨の主要無機成分であり優れた生体親和性ーバー）の密着性などの高品位化にあり，欧米を含め研究と骨結合能を有するアパタイトをコーティングできれば，開発が活発化している．

ぺリオドンタルアタッチメント形成を促進できる．さらに，我々はその様な背景のもと，歯や骨の主な無機成分で細胞接着性や骨形成促進能などを有する生理活性タンパあり生体親和性に優れるハイドロキシアパタイト

ク質をアパタイトに担持できれば，ぺリオドンタルアタッ(Hydroxy apatite, Ca10(PO4)6(OH)2 , 以下アパタイト)のレーチメント形成にかかる時間を短縮化，その結果術後の細菌ザー転写に取り組んでいる．アパタイトは，骨伝導性なら感染リスクも低減できるため，患者の QOL に大きく貢献

びにヒトの軟組織および硬組織との良好な生体適合性をする．以下，本研究により得られた成果を報告する．

２．実験方法2・1

バイオミメティック法による生理活性タンパク質

担持アパタイト転写原料膜の調製
図 2 に，本研究のレーザー転写用原料膜（ドナー）となる，細胞接着性因子としてフィブロネクチン（fibronectin,Fn）を担持あるいは非担持のアパタイト膜のバイオミメテ
ィック成膜手法を示す．Fn は，細胞接着性タンパク質の一種であり，細胞の接着・伸展を促進する機能を有する．
アパタイトを成膜するため，透明キャリア（サポート）と
図 1 レーザー転写法の例．
(a) ナノ/マイクロドット描画と(b)膜転写．

してポリエチレンテレフタレート（PET）を使用，その上に犠牲層（レーザー光を吸収しアブレーションを起こす層）としてカーボン膜を蒸着法により成膜した基材を用いた．この基材をカルシウム溶液とリン酸溶液に交互浸漬処

図 2 バイオミメティック法を用いた Fn 担持/非担持ア

図 3 レーザー転写システムの構成例．

パタイト成膜によるレーザー転写用原料膜の調製．

理することで，カーボン犠牲層表面にアパタイトの前駆体レーザー転写プロセスがタンパク質の生理活性に与えであるアモルファスリン酸カルシウム（ACP）ナノ粒子をる影響を検討するため，以下の要領の細胞培養試験により，プリコートした．次に，アパタイトに対して過飽和なリンレーザー照射前の Fn 非担持/担持アパタイト原料膜ならび酸カルシウム水溶液（コーティング液）に 5 時間浸漬した．にそれらのレーザー転写構造物について，細胞接着性を評

このコーティング液への浸漬により，基材表面の ACP が価した．24 ウェル細胞培養プレートを用い，各サンプルアパタイトの核形成を誘起し，過飽和溶液中のイオンやリ．に CHO-K1 細胞を播種した（5×104 細胞/0.5 mL/ウェル）ン酸カルシウムクラスターが膜成長するバイオミメティ

3 から 24 時間培養後，クリスタルバイオレットによりサック手法を利用し，アパタイト原料膜を調製した．さらにンプル上の細胞を固定化・染色し，光学顕微鏡観察を実施

前記の交互浸漬処理のためのカルシウム溶液とリン酸溶した．

液ならびにリン酸カルシウム過飽和溶液に Fn を添加する
ことで，膜中に Fn を担持させたアパタイト膜（Fn 担持ア2・4パタイト，Fn-apatite）を調製した．成膜後，Fn の失活抑本手法の歯面への適用を基礎実証する目的で，Fn 担持制のため凍結乾燥処理を行った．同条件での比較検討のたアパタイト膜のヒト象牙質基材（インフォームドコンセン

め，Fn 担持/非担持に関わらず凍結乾燥処理を実施した．

ト後，提供された抜去歯牙より作製）への転写を実施した．

Fn 担持アパタイト膜のヒト象牙質への転写

得られた原料膜については，薄膜 X 線回折測定より析

象牙質は，硬組織の無機成分であるアパタイトが 70％と出相を分析，共焦点レーザー顕微鏡および SEM 観察より

残りはコラーゲンなどの軟組織で構成され，外部から歯の表面モルフォロジーと膜厚を評価した．

中心の歯髄まで無数の象牙細管が走っている．歯周病や加齢などにより歯茎が下がりセメント質が薄れるなどする

2・2

細胞接着性フィブロネクチン(Fn)担持/非担持ア

パタイト膜のレーザー転写
図 3 に本実験で用いたアパタイトのレーザー転写装置
例を示す．レーザー光源に波長 1064 nm の DPSS ナノ秒パと，この象牙細管が露出する．この象牙質への転写を検討するため，透明サポートを PET から衝撃吸収性の高いPDMS に変更，さらにカーボン犠牲層を蒸着後，Fn アパタイト膜を成膜した．

ルスレーザー(fwhm 40 ns, 10 kHz)を用い，凍結乾燥処理し転写した Fn アパタイト膜と象牙質の界面を観察するたた Fn 担持/非担持アパタイト膜を転写原料膜（ドナー）とめ，集束イオンビーム（Focused Ion Beam, FIB）加工によし，透明サポートである PET 側からレーザーパルスを照り膜断面を形成，その SEM 観察を行った．

射，アパタイト膜をレシーバー基材へ転写した．アパタイ
トが脆性材料であり，転写時に膜にかかる衝撃を低減するため，ドナー膜とレシーバー基材を接触配置させた状態でレーザーパルス照射を実施した．また，衝撃吸収性の異な

３．研究成果3・1

アパタイト転写原料膜への Fn 添加効果：モルフ

ォロジー変化と細胞接着性の向上

る PET，ポリジメチルシロキサン（PDMS）の 2 種類のレ

図 4 にバイオミメティック法で作製した(a)アパタイトシーバーについて検討した．レーザーパルスはガルバノミ

転写原料膜と，成膜時の Fn 添加により調製した(b)Fn 担持ラー/fθ レンズを用いて，各スポットに単一ショット照射

アパタイト膜の表面 SEM 写真を示す．両試料ともフレーとなるようビーム集光（ガウシアンビーム）走査し，転写ク状の表面構造が共通して見られるが，Fn 添加によりそ物の 2 次元パターニングについても検討を行った．の構造サイズが微細化することが分かった．また過飽和溶液への浸漬時間は両試料ともに 5 時間であるが，得られた

2・3

細胞活性評価

平均膜厚は Fn 非担持のアパタイト膜試料が約 500 nm，Fn3・2 レーザー転写コーティング：レシーバー物性の影響
レーザー転写では，転写物とレシーバーの衝突を伴うため，脆性材料では破砕し易い．そこで，衝撃を吸収・緩和する衝撃吸収材をレシーバーとして使用すれば，膜破砕を低減できると仮定，以下の検討を行った．
一般に，ポリマー材料は変形時に弾性と粘度を示す．正弦波応力により計測される複素弾性率は，貯蔵弾性率 E 'と損失弾性率 E "に分解される[15]．前者は弾性成分で変形中のエネルギー貯蔵に直接比例するのに対し，後者は粘性成分であり外部拡散するエネルギー損失に相当する．損
失正接（tanδ= E "/ E '）は損失エネルギーと保存されたエネルギーの比であり，tanδ の値が大きいほど，より多くの
図4(a)アパタイト，(b)Fn 担持アパタイト原料膜のSEM イメージ． CHO-K1 細胞培養後，クリスタルバイオレットで固定染色した(c) アパタイト，(d)Fn 担持アパ
タイト膜の光学顕微鏡イメージ（濃い紫色が細胞）． Fn
タンパク質担持膜上では伸展する細胞が多数みられる．

エネルギーが拡散（衝撃吸収）する．一般的な PET の tanδの値は約 10-2（1 Hz の測定周波数，室温）であるのに対し，PDMS の値は PET のそれより約 1 桁大きく，PDMS の方が衝撃吸収能が高いことを示している[16]．
この仮説を検証するため, PDMS（ソフト表面）と PET（ハード表面）の 2 つの異なるレシーバーを用い，アパタ担持試料が約 200 nm であった．以上の結果から，細胞接イト膜のレーザー転写を検討した．図 5 は，(a)PDMS およ

着性タンパク質であるフィブロネクチン添加による膜のび(b)PET レシーバーに転写堆積したアパタイトマイクロ

緻密化が示唆される．

チップの共焦点レーザー顕微鏡イメージを示す． PDMS

次に，原料膜の生理活性効果を調べるため，原料膜表面レシーバー上のアパタイトマイクロチップは，レーザースへの CHO-K1 細胞播種による細胞接着性評価を行った．

ポットに対応した円形の膜形状を維持しており，比較的高細胞播種後 3 時間を経てクリスタルバイオレットで細胞品位な転写が得られている．一方，PET レシーバーでは，の固定化, 染色した光学顕微鏡イメージを図 4(c,d)に示す．

顕著な膜破砕が観察された．レーザー転写時に発生する衝

図 4(c)がアパタイト，(d)が Fn 担持アパタイト原料膜上の撃力のモデルを図 5(c)に示す．衝撃吸収性の高い PDMS染色細胞のイメージである．図 4(c)のイメージから，Fnの場合，衝撃は効果的に吸収されるため，転写膜の破砕を添加の無いアパタイト膜上では，ほとんどの細胞は球形状軽減できる．対照的に，PET レシーバーの場合，衝撃は表のままであり，細胞伸展は見られない．一方，図 4(d)にあ面近くに保存されるため，膜破砕が容易に起こる．さらに，るように Fn 担持アパタイト膜上では，多数の細胞伸展が柔軟性にも優れる PDMS は，ドナー膜とギャップなく接見られ，本原料膜の優れた細胞接着特性を示している．

触しやすく，フライト距離を低減できるため，フライト時以上より Fn 添加効果として，原料膜の緻密化などモルフの応力付加を低減できる効果もある．以上より，PDMS レ

ォロジー変化ならびに細胞接着性向上が確認された[14]．

シーバーの利用により，アパタイトのような脆性材料も転写可能であることを基礎実証できた[14,17-18]．
図 6 に PDMS 上に形成したアパタイトの連続パターン転写によるコーティングの様子を示す．基材表面約 80%の被覆率での連続転写堆積を実現している[19-21].

図 5 膜転写におけるレシーバー基材の効果．
図 6 アパタイトコーティングの共焦点レーザー顕微鏡像．

図 7 転写構造の Fn 添加およびパルスエネルギー依存性．
3・3

レーザー転写：Fn 添加効果

次に，Fn 担持/非担持膜を原料に用いたレーザー転写を比較検討，Fn 添加が転写挙動に与える影響を考察した．
図 7 に PDMS レシーバー上に転写堆積した Fn 担持/非担

図 8 (a)Fn 担持と(b)非担持アパタイトチップ（直径約持アパタイトマイクロチップのパルスエネルギー依存性100 µm）を 2 次元配列した PDMS 上の CHO-K1 細胞を示す[14]．Fn 担持試料では，転写閾値は約 70-90 μJ/pulse（濃い紫色，10～数十µm）の光学顕微鏡イメージ．にある．90-130 μJ/pulse のパルスエネルギー範囲では，膜破砕の無い緻密な状態を維持した転写が実現でき転写に3・4転写した Fn 担持アパタイトの生理活性評価好適な条件と言える．尚ここには示さないが，より高エネ

図 8 に，(a)Fn 担持アパタイト(Fn-apatite)ならびに(b)非ルギー領域では，クラック発生が頻発化し，膜破砕が生じ担持アパタイト(apatite)マイクロチップを転写形成した始めることを確認している．よって，高品位膜転写の最適

PDMS 上で 24 時間培養された CHO-K1 細胞の光学顕微鏡

エネルギー範囲は，転写閾値エネルギー近傍に存在する．

イメージを示す．直径約 100 μm の円形ディスクの淡い紫

一方，Fn 非担持のアパタイト原料膜の場合は，70 µJ/pulse

色のパターンは，転写により形成されたマイクロチップににおいて部分的ではあるが転写物が確認され，転写閾値が相当する．これら両方のマイクロチップ上に細胞が選択的Fn 担持膜に比べ低エネルギーにシフトした．一般的にレに密集する様子が確認された一方で，PDMS 上の細胞はまーザー膜転写では，膜を支持する透明サポート（本実験のばらであった．この結果は，本手法プロセスで形成された場合は犠牲層）からの剥離エネルギー（密着性に依存），アパタイトおよび Fn 担持アパタイトマイクロチップが，ビームパターンを型抜きするための膜内結合切断エネル

PDMS に比べて，CHO-K1 細胞に対して優れた細胞適合性ギー（膜の密度，結合エネルギーに依存），レシーバーにを示す．さらに，Fn-apatite マイクロチップ上の細胞の多移すエネルギー（放出部の重量，即ち膜厚に依存）が必要

くが，Fn 担持アパタイト原料膜（図 4（d））と同様に, 進となる．本実験での Fn 添加の結果，転写閾値が高エネル展している様子が確認できる（図 8(a)）．このことから，ギーにシフトしており，Fn 添加による膜の緻密化や下地Fn の細胞接着性が，レーザー転写後も保持されていると層（犠牲層）への高密着化が起こっている可能性が示唆さ推察される．これらに加え，細胞の多くがアパタイトチッれる．転写チップの表面観察から，Fn 非担持の場合は転プの周囲に沿って局在・整列する傾向がみられることから，写によるクラック発生が多数確認され,タンパク質の添加

本手法によるパターニングが細胞操作能力を有する可能によりクラック発生が抑制されている．以上より，細胞接性が示唆される．即ち，本手法によると，細胞接着などに着性タンパク質添加が，クラックレスな高品位膜転写に対加え細胞の局在化や伸展方向など多様な制御が可能な生しても有効な手法であることが分かった．タンパク質は細理活性コーティングを実現できる[18]．

胞接着性向上を含め様々な生理活性機能の付与を可能にするため，タンパク質担持材料の転写は，インプラントなど医用材料表面の高機能化や医療応用が期待される．

3・5

ヒト象牙質への転写

本研究では，レーザー転写をベースとした生理活性タンパク質材料のコーティング，即ち「レーザー生理活性コー課題もあり，アパタイト膜の表面は図 4(a,b)に示すようにフレーク状のモルフォロジーを有し平滑でないため，界面には小さなギャップが存在している．そこで今後は，転写原料膜の表面モルフォロジー制御など界面にフォーカスした技術開発を進め，コーティングに重要な界面の評価と高次制御を実現したいと考えている．

４．結言
本研究では，レーザー転写法を基盤技術に，生理活性タンパク質担持アパタイトの高速・高密着コーティング手法
図 9 PDMS サポートを利用した新たな転写手法．

を提案，基礎実証に挑戦した．
細胞接着性タンパク質であるフィブロネクチン（Fn）を固い PET レシーバー上へ高品位な転写堆積を実現．

添加したアパタイト膜を原料ドナーとし，レーザー転写用犠牲層と衝撃吸収性レシーバー基材を用いることで，脆性ティング」技術の開発を目指している．そこでヒト象牙質材料であるアパタイト膜においても膜形状を維持した良基材への Fn 担持アパタイト膜のレーザー転写を図 9 左に好な膜転写を実現できた．Fn 担持効果として，高細胞接示す実験配置で実施した．図 3 実験との違いは，象牙質レ着性，さらに膜のモルフォロジー変化とクラック発生を低シーバーに高品位転写堆積を実現するため，アパタイト原減した高品位転写が確認できた．細胞接着性タンパク質の料膜を支持する透明サポート側に衝撃吸収性と柔軟性を添加が，生理活性向上にとどまらずレーザー転写挙動にも有する PDMS を利用した点である．この Fn-apatite/PDMS影響し，レーザー転写用原料として優れた特性を有するこサポートからなるドナーを用い，PDMS に比べハードな表とがわかった．

面をもつ PET レシーバーへの転写堆積を検討した結果を，ヒト象牙質への本技術の適用を目指し，衝撃吸収性サポ

図 9 右下に示す．図 9 右上の Fn-apatite/PET ドナーを用いートを開発した結果，象牙質への Fn 担持アパタイトの転た場合は転写膜の破砕が顕著にみられたのに対し，今回の写堆積と高品位界面の形成に成功した．

PDMS サポートを用いた場合は，破砕の伴わないレーザー

今後，細胞接着などに加え細胞の局在化や伸展方向などビーム形状を反映した転写が可能なことを実証できた．

自在な細胞制御が可能なレーザー生理活性コーティング

そこで，上記の PDMS サポートを用い，ヒト象牙質へ技術を展開したい．の Fn タンパク質担持アパタイトのレーザー転写を検討した結果，Fn-apatite マイクロチップの高品位転写堆積に成謝辞功した（図 10 上段左）
．さらに，転写した Fn-apatite と象本研究の実施にあたり公益財団法人天田財団より重点牙質の界面を観察するため，FIB 加工により試料を薄片化研究開発助成 B（AF-2017202）を賜りました．ここに深甚（図 10 上段中央・右），断面 SEM 観察を実施した結果をなる謝意を表します．

図 10 下段に示す．Fn-apatite 膜と象牙質界面に大きな隙間のない高品位界面の形成を初めて基礎実証できた．ただし

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