博士 （生命 科学）武 内伸治
学 位 論 文 題 名

高感度レポーター遺伝子アッセイ法を用いた環境化学物質の核内受容体転写活性の検出及びダイオキシン類簡易測定法の開発
学位論文内容の要旨【 はじ めに 】
内 分 泌 攪 乱 物質 やダ イオ キシ ン類 は、 核内 受容 体 や芳 香族 炭化 水素 受容 体(AhR)な どの 「リガ ン ド 依 存 性 の 転 写 因 子 」 と そ れ ぞ れ 特 異的 に結 合し 、遺 伝子 発現 を介 して 内 分泌 系を はじめ 、 神 経 系 、 免 疫 系 な ど の 様 々 な 生 理 機 能に 被害 を及 ばす 。現 在ヒ トで は48種 類の 核内 受容体 が 知 ら れ て い る 。 人 の 産 業 活 動 な ど に よ り 環 境 中 に は 5万 種 類 以 上の 化学 物 質が 存在 すると い わ れ る が 、 核 内 受 容 体 や AhRを 介 し た こ れ ら の 化 学 物 質 に よ る 作用 はほ と んど 明ら かにさ れ て い な い 。 し た が っ て 、 人 が 曝 露 す る化 学物 質、 食品 、環 境試 料に つい て 、こ れら の受
容 体 活 性 を 明 ら か に す る こ と は 、 人 の 健 康を 守る ため に重 要で ある 。本 研究 で は、 化学 物質に よる 核内 受 容体 を介 した 作用 を検 出で きる 高感 度な レポ ータ ー遺 伝 子ア ッセイ系を確立し、
ヒ ト が 曝 露 す る 可 能 性 が 高 い と 考 え ら れ る 253物 質 に つ い て 、 9種 類 の 核 内 受 容 体 を 介 し た
作 用を 調べ た 。
食 品 や 環 境 中 に 広 く 存 在 す る ダ イ オ キ シン 類の 測定 は、 従来 の機 器分 析法 で は多 大な 費用と 労 カ を 要 し て い た 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 ダ イ オ キ シ ン 類 が 特 異 的 に結 合す るAhRを介 した
活 性 を 高 感 度 に 検 出 で き る レ ポ ー タ ー 遺 伝子 アッ セイ 系を 確立 し、 ダイ オキ シ ン類 の主 要な
曝 露源 であ る 食品 や環 境試 料中 のダ イオ キシ ン類 の簡 便で 迅速 な簡 易 測定 法の開発を試みた。
【結 果と 考察 】
1． 植物 由 来成 分31物質 の核 内受 容体 を介 した 作用野 菜 、 果 物 、 穀 物 など に広 く含 まれ る植 物由 来化 学物 質 及ぴ その 代謝 物31物質 の核 内受 容体 活 性 を 調 べ た と こ ろ 、 エ ス ト ロ ゲ ン 受 容 体 (ER)矼 ア ゴ ニ ス 卜 活 性 が 18物 質 、 ERpア ゴ ニス ト 活 性 が 20物 質 に 認 め ら れ た 。 エ ス ト ロ ゲ ン 活 性 を 示 し た 20物 質 の う ち 19物 質 が 、 ERpの方 がERaより も強 い活 性を 示し た。 これ らの 活性 の発 現に は7‐ 位及 び4 −位 の水 酸基が重要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ERpは 、 ERaを 介 し た 乳 ガ ン 細 胞 の 増 殖 を 抑 制 する こと が報 告
さ れ て お り 、 上 記 の 化 合 物 の 乳 ガ ン 予 防 作 用 が 期 待 さ れ る 。 さ ら に 、 プ レ グ ナ ン X受 容 体(PXR)ア ゴ ニ ス ト 9物 質 、 ERpア ン タ ゴ ニ ス ト 1物 質 、 ア ン ド ロ ゲ ン 受 容 体 (AR)ア ンタ ゴニ ス
ト2物質 、 PPARa
ア ゴニ スト 1物質 を新 たに 見出 した 。
2． フ タ ル 酸 エ ス テ ル 類 22物 質 の 核 内 受 容 体 を 介 し た 作 用可 塑 剤 と し て プラ スチ ッ クな どに 広く 使用 され るフ タル 酸エ ステ ル類 22
物 質に つ いて 、核内 受 容 体 活 性 を 調べ た。 そ の結 果、 芳香 環の 側鎖 を有 する フタ ル酸 ジフ ェニ ルを 除 いた 、側ー 317ー

鎖の炭素鎖長が3〜6の範囲に入るフタル酸ジェステル類が、ERaに対してアゴニスト活性、ERD及 びARに対 して は、 アンタゴニスト活性を示すことが明らかになった。これらの分子サイ ズが ERや ARの りガン ド結 合部 位に 適合 する ため と考えられる。また、既に報告がある PPARaア ゴ ニ ス ト 1物 質 の 活 性 を 確 認 し 、 新 た に PXRア ゴニ スト 14物 質を 見出 した 。
3．農薬200物質のERa/p、ARを介した作用
過去 に使 用さ れたも のを 含む 代表 的な 農薬 200物 質にっいてERa/p、ARを介した作用を調べたところ、ERaアゴニスト活性が47物質、ERpアゴニスト活性が33物質に認められた。
さらに、ERaアンタゴニスト活性が5物質、ER[3アンタゴニスト活性が2物質に認められた。
一方、ARへのアゴニスト活性を示した農薬は全く認められなかったが、66物質もの農薬にARアン タゴ ニス ト活性 が認 めら れた 。本 研究 によ り、 農薬 200物 質の うち 34農 薬が 、ERアゴニスト活性及ぴARアンタゴニスト活性を併せ持つことが明らかになり、これらの農薬が環境中で生物を雌性化の方向に導く可能性が示唆された。
4．農薬200物質のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体(PPAR)ocly、PXR、甲状腺ホルモン受容体(TR) al/t31、レチノイドX受容体(RXR)aを介した作用
3．と同じ農薬200物質のPPARa/yを介した作用を調べたところ、PPARyアゴニスト活性を示す農薬は認められなかったものの、PPARaアゴニスト活性が3物質に認められた。これら
3物 質を C57B L/6マウ スに腹腔内投与し、肝臓におけるPPARa誘導性CYP4Asの発現を調べた結果、ジクロホップメチルは、加vitroでは陽性対照物質(WY14643）と比較して1/7以下の活性 であ った が、 加vivoではWY14643に匹敵する活性が認められ、生体内でより強い活性を有する化学物質に変化する可能性が考えられた。他の核内受容体活性にっいては、116物質に PXRアゴ ニス ト活性 が認 めら れた もの の、 TR ai/pi、RXRa、PPARyを介した作用を示した農薬は全く認められなかった。
5． 高 感 度 な AhRア ッ セ イ 系 の 開 発 と 農 薬 200物 質 の AhRを 介 し た 作 用
7つのダイオキシン応答配列を組み込んだレポータープラスミドをHepa‑lclc7細胞に導入し、DR細胞株を確立した。このDR細胞はダイオキシン類に対して高感度であり、アッセイ時 の煩 雑な 操作 を省 略でき簡便性にも優れていた。DR細胞を用いて前述の農薬200物質のAhR活 性を 調べ たと ころ、 11物 質に AhRアゴ ニス ト活性を認めた。このうち強い活性を示し た3農薬 につ いて 、C57BL/6マウ スを 用い て肝 臓にお ける AhR誘導 性CYPIAsの発現を調べ たと ころ 、い ずれ もCYPIAs mRNAの有 意な 発現 を認め、生体内においてもAhRのりガンドとして作用することが示唆された。
6． AhR活性を指標とした魚介類、大気、排ガス、燃え殻・ばいじん中ダイオキシン類の測定5． で述 べた DR細 胞を応 用し、AhR活性を指標としたダイオキシン類の測定法(DR細胞アッセイ法）を開発した。魚介類(
25試料）、大気試料(80試料）、大気中ダイオキシン類の主要な発生源である焼却炉の試料（排出ガス(31試料）、ばぃじん・燃え殻(44試料））について、DR細胞アッセイ法による測定値と機器分析法による測定値を比較したところ、極めて高い相関(r=0.96、0.98、0.
94、0.96)が認められた。このことから、DR細胞アッセイ法はダイオキシン類簡易測定法として使用できることが示唆された。
【結語】
本研究により、多くの化学物質が核内受容体（特にERa/13、AR、PXR)を介した作用を有すること、複数の核内受容体を介した作用を併せ持つことが明らかになった。核内受容体は様カ‑ 318―

な医薬品のターゲットにもなっており、本研究で得られた知見は創薬の面からも有用と考えられる。一方、現在の法規制に関わる毒性評価では、化学物質によるりガンド依存性転写因子を介した作用の評価項目が無いことから、これらの作用はチェックがほとんどなされていない。今後はヒトが曝露する可能性が高いより多くの化学物質や、食品や環境試料について、
核 内受容体 及びAhRを介し た作用を 明らかに していく ことが衛生化学的に重要と考える。
AhR活 性を高感 度に検出で きるDR細胞 を確立し 、ヒトが曝露する可能性のある食品や環境試料に含まれるダイオキシン類の迅速で簡便な測定法を開発した。本法は、これらの試料中ダイオキシン類の測定への適用が十分に可能と考えられ、コストと労カがかかる機器分析法に先立つスクリーニング法として期待できる。

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学位論文審査の要旨
主査

教授

松田正

副査

教授

三浦敏明

副査

講師

南保明日香

副査

研究主査

小島弘幸（北海道立衛生研究所）

学 位 論 文 題 名

高感度レポーター遺伝子アッセイ法を用いた
環境化学物質の核内受容体転写活性の検出及びダイオキシン類簡易測定法の開発
核内受 容体や芳 香族炭化水素受容体(
AhR)は、特定の化学物質と結合し、内分泌系をはじめ、神経系、免疫系などの様々な生理作用に関わっている。人の産業活動などにより非常に多くの化学物質 が環境 中に存 在するが、それらの化学物質による核内受容体やAhRを介した作用は、これまでほとんど明らかにされていない。本研究では、化学物質による核内受容体を介した作用を検出できる高感度なレポーター遺伝子アッセイ系を確立し、ヒトが曝露する可能陸が高いと考えられる253物質について、9種類の核内受容体を介した作用を調べた。
物の燃焼などで発生するダイオキシン類は、食品や環境中に広く存在することが知られているが、ダイオキシン類の測定は、従来の機器分析法では多大な費用と労カを要していた。そこで本研究では 、ダイ オキシ ン類が特異的に結合するA
hRを介した活性を高感度に検出できるレポー夕一遺伝子アッセイ系を確立し、ダイオキシン類の主要な曝露源である食品や環境試料中のダイオキシン類の簡便で迅速な簡易測定法の開発を試みた。
野菜、果物、穀物などに広く含まれるフラポノイドやりグナンなど31物質の核内受容体活性を調
べたと ころ、 エスト 口ゲン 活性を 示した20物質のうち19物質が、ERpの方がERaよりも強い活性を示した 。ERpは、 ERaを介 した乳ガ ン細胞 の増殖を抑制することが報告されており、上記の化合物の乳ガン予防作用カミ期待される。
可塑剤として広く使用されるフタル酸工ステル類22物質について、核内受容体活性を調べた。その結果、側鎖の炭素鎖長が3〜6の範囲に入るフタル酸ジエステル類の多くが、ERocに対してアゴニスト活 性、ERp及 OARに対 しては、 アンタ ゴニスト活性を併せ持つことが明らかになった。これらの 分 子 サ イ ズ が ERや ARの り ガ ン ド 結 合 部 位 に 適 合 す る た め と 考 え ら れ る 。
過去に 使用さ れたも のを含 む代表 的な農薬200
物質についてERa/p、ARを介した作用を調べたと
ころ、 ER,aアゴニ スト活 性が47物 質、ERDアゴニ スト活性 が33物 質に認められた。さらに、ERnc
アンタ ゴニス ト活性 が5物質 、ERpアン タゴニ スト活 性が2物 質に認められ、66物質もの農薬にARアンタゴニスト活性カミ認められた。多くの農薬がERアゴニスト活性及びARアンタゴニスト活性を− 320 ‑

併せ持 つこと が明らか になり 、これ らの農薬カ黼中で生物を雌性化の方向に導く可能性が示唆された。
同じ農薬200物質において、P】，AI成アゴニスト活性が3物質に認められた。特にジク口ホップメチ
ルは 、 泣 vitroで は 陽 性対 照 物 質 (WY14643)と比較 してU7以 下の活 性であ ったが 、血VIVOで はW｜14643に匹 敵する 活性が 認めら れ、生体内でより強い活性を有する化学物質に変化する可能性
が 考 え ら れ た 。 ま た 、 PxRア ゴ ニ ス ト 活 性 が n6物 質 も の 農 薬 に 認 め ら れ た 。
7つのダイオキシン応答配列を組み込んだレポータープラスミドをHepa・1clc7細胞に導入し、DR細胞株を確立した。このDI細胞はダイオキシン類に対して高感度であり、アッセイ時の煩雑な操作を省略でき簡便性にも優れていた。DI湘胞を用いて前述の農薬200物質のAbR活性を調べたところ、
n物 質こ AhRア ゴ ニス ト活性 を認め た。この ことか ら、DR細 胞は化 学物質 のAhR活性 のスク リー
ニングにおしゝても有用であることが示された。
このDR細 胞を応 用し、 AhR活性を 指標としたダイオキシン類の測定法のR細胞アッセイ法）を開発した。魚介類、大気試料、大気中ダイオキシン類の主要な発生源である焼却炉の試料aI出ガス、ばいじん・燃え殻について、DI湘胞アッセイ法による測定値と機器分析法による測定値を比較した
ところ、いずれも極めて高い相関を認めた。このことから、DR細胞アッセイ法はダイオキシン類簡易測定法として使用できることが示唆された。
本研究により、多くの化学物質が核内受容f本やAhRを介した作用を有すること、複数の核内受容体やAhRを介した作用を併せ持つことが明らかになった。したがって、ヒトが曝露する可能性が高い化学物質や、食品や環境試料について、核内受容体及びAhRを介した作用を明らかにしていくことは衛生化学的に重要と考えられる。また、核内受容体は様々な医薬品のターゲットにもなっており、本研究で得られた知見は創薬の面からも有用と考えられる。さらに、AhR活性を高感度に検出できるDR細胞を確立し、ヒトが曝露する可能性のある食品や環境試料に含まれるダイオキシン類の迅速で簡便な測定法を開発した。本法は、これらの試料中ダイオキシン類の測定への適用が十分に可能と考えられ、コストと労カがかかる機器分析法に先立つスクリーニング法として期待できる。

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