博士（理 学）冲中泰

学位 論 文題 名StudiesonPrimar
yStructureandBi
ndingSiteofMicrobi
alElici
torsfor the Induction of Defense Responses in Soybean Plant（ダイズ植物に防御反応を誘導する病原微生物由来エリシターの一次構造および結合部位に関する研究）

学位論文内容の要旨【第―章】ダイズ組織内のロー1，3‐エンドグルカナ―ゼの作用による糸状菌細胞壁からのエリシターの遊離モデルの提唱（研究の背景）ファイ トアレ キシン は植物 が合成 する抗菌的な低分子化合物であり、その合成・蓄積f
ま病原体に対す る防御 システ ムの― つであ る。ファ イ卜ア レキシ ン合成は病原体が植物ヘ侵入する際に誘導され るが、 その誘 導は病 原体由 来のユニ ークな シグナ ル分子（エリシタ−）を植物が認巌する
結 果 起 こ る と 考 え ら れ て い る 。 以 前 私 の 研 究 室 で は 、 ダ イ ズ 疫 病 菌 （ Phytophthoramegasperma f.sp. glycea冫の細 胞壁中 には、 ダイズの ファイ 卜アレ キシン 合成を 強く誘導する
エリシ タ―が 存在す ること を証明 した。さ らに、 このエ リシターが多糖であり、ダイズ組織内のロ‐1， 3−エン ドグルカナ―ゼ（ロEGと略）の働きにより不溶性の疫病菌細胞壁から遊離されること を明 ら か に した。 しかし 、この 遊離エ リシタ ―（REと 略）が いかな る構造を 持ち、 宿主の ロEGの 作 用 でど の ように 遊離さ れるか は末だ 不明で あった 。そこ で、本 研究では REの― 次構造の解析 を 行 ない 、 その 構 造 から 推 測 され る 遊離 のメカニ ズムの提 唱を行な った。
（研究方法と成果）
まず、 REの分子 量をゲ ル漉遇 クロマ 卜グラ フイ― にて分 析した 結果、お よそ数 百から5万以上に亙ったため、便宜上それらを4分画（RE‐｜、RE‐丶F涯．m、RE‐l
Vは、．それぞれ平均分子量が40，000，15，000，4，000，く500）に分類した。そのうち、RE‐I〜‐‖lだけに高いエリシタ―活性が見られ た。次 に、各 RE：分画 を構成 する単 糖の種 類を調べ るため、REの加水分解物をガスクロマ
トグラ フイ― にて分 析した 。その 結果、4分画とも ほぼ完 全にグ ルコー スから 構成さ れることが判明し た。よ って次 に、Fに 中での グルコ ―スの結 合様式 を調べ るため 、1Hおよ び13C‐NMR分析を行なった。その結果、エリシタ一活性を持つRE小｀‐刪ではロ‐1，3結合およぴロ‐1．6結合の両方が検出されたのに対し、REーW
ではロ・1，3結合のみが検出された。また、RE・l〜・1‖に再度ロE（拠理を行 なって も分解は見られず、またエリシタ一活性にも影響はなかった。―方、RE‐1〜・mを今
度はロ ‐1，3‐ エキソグルカナーゼで処理したところ、各RE分画は低分子化され、エリシタ一活性も消失していた。以上の結果からRE‐I〜―‖Iの主要鎖はロ−1，6結合であり、ロEGにより分解されない1な いし2残 基のロ ‐1，3結 合の側 鎖の存 在が示 唆され た。さらに、その側鎖がェリシタ―活性 に重 要 で あ ること も示さ れた。 この基 本構造 からREの 遊離メ カニズ ムを推測 すると 次のよ うに説明 できる 。疫病菌細胞壁には様々な長さのロ．1，6結合の多糖（グルカン）が存在し、細胞壁― 116 ‑本体とは多様な長さのロー 1，3結合でつながれている。よって、疫病菌がダイズ植物体ヘ進入する際、ダイズ組 織内のロEGによってそのロ・ 1，3結合が切断され、以上 に述べた特徴を持つREが遊離すると考えられる。
【 第二 章】 Pseudomonas syrgaeの 非病 原性 遺伝 子 aw・ D由 来の 特異 的エリシタ―（ シリンゴライ ド ） に 対 す る レ セ プ タ 一 様 タ ン パ ク 質 の ダ イ ズ 可 溶 性 画 分 に お け る存 在（研究の背景）
植 物 と 病 原 体と の間 に みら れる 相互 作用 の うち 、遺 伝子 対 遺伝 子相 互作 用(gene‑for‑geneinteraction) (GFGと略 ）は高い特異性を有すること で有名な現象である。すな わちGFGとは、ある優 性の 1遺 伝子 （抵 抗性 遺 伝子 ）を 持つ 植物 が 、そ れと 対応する優性の1遺伝 子（非病原性遺伝子 ）を 持つ 病原 体 の侵 入に 対し てのみ特異的に抵 抗反応を発現する現象であ る。GFGの事例は
現在 数多 く確認されてい るが、この遺伝子依存的現 象に関する分子生物学的メカ ニズムはまだほとんど解明されていない。
分 子生 物学 的研 究 が比 較的 進ん でい る GFGの 例 に、 ダイ ズの抵抗性遺伝子月 ・pg4と病原細菌
PSeu加′nonass．y加g舶（PSと略）の非病原性遺伝子aw・Dとの系がある。この系で既に解明されていることは、まずaw．Dを 持つPSがダイズに侵入した際 、avr．Dの働きでシリンゴライド（Sりと略） と呼 ばれるシグナル 分子（エリシタ―）を合成 する。この際ダイズがRpg4を 有していると、ダイ ズの 被侵 入部 位 では Sり に依 存し た抵 抗反 応 が誘 導さ れる 。っ ま り、 Rpg4を持 っダイズはSyrを 特異 的に認識し速 やかに抵抗反応を起こすこと で、aw．Dを持つPSの侵入を 防いでいる。私はこ の系 のメカニズムを さらに解明するため、想定 されるシリンゴライドレセプ タ―の単離解析を目 標に 研究を行なって いる。その第ー段階として 、そのようなレセプタ―がダ イズ組織内に実在す るか 否か の検 討 を、 ダイ ズ細 胞成 分 と放 射線 標識 し たSyrとの 結 合実 験に より 行なった。
（研究方法と成果）
方 法と して 、印 卵 を持 っダ イズ の緑 葉 から 細胞 成分 を 抽出し、14Cで標巌し たSyrとの特異的結合 を測 定し た。 そ の結 果、 Syrに対する特異的結 合サイトは予想していた膜画 分には検出されず、細胞可溶性画分に存在す ることが明らかとなった。 この可溶性画分の結合サイトはプロテアーゼに感受性であることから、 ―般的なレセブタ一同様タ ンパク質を成分とすることが示唆された。
また Syrと の特異的結合 のスキャッチャ―ド解析によ り、解離定数（Kd）は340nMで、結合サイトの数 はダ イズ 可溶 性 タン パク 質1mg当 たり 65pm0｜ 存在 す る計 算と なっ た。 さ らに 、Syrの構造類似 体を 用いた実験では 、この結合サイトはエリシ タ―活性を有する類似体とは 強く結合するがエリ シタ 一活性を持たな い類似体とは結合しないと いう機能的相関が示され、こ のサイトがシリンゴ ライ ドレ セプ タ ーで ある こと を強く支持する結 果となった。なお、Syrのよ うな特異的エリシタ―に対するレセブターの研究は、まだほとんど報告例のない先進的分野である。「エリシタ―・レセプタ―モデル」は現在世 界的な支持を受けているGFGのメカニズムの仮説である。．すなわち
植物 の抵 抗性遺伝子がレ セプターをコードし、病原 体の非病原性遺伝子由来の特 異的エリシタ―がそ のレ セプタ―で認識 されるという筋書きである 。しかしながら本研究におい てさらに検討を加え た結 果、 Syrに対 する 結 合サ イトは抵抗性遺伝 子Rpガを持たないダイズにも 同様に存在すること が判 明し た。 っ まり 、Rp〆産 物は レ セプ タ― では な く、より下流のシグナ ル伝達系に関与し抵 抗性 発現のオン・オ フを決定しているものと推 察される。このことは、従来 より支持されてき た エ リ シ タ ー ・ レ セ プ タ ー モ デ ル に ― 石 を 投 じる 重要 な発 見で ある と恩 われ る。

― 117 ‑学位論文審査の要旨
主査
副査
副査

教 授 福 永典 之
教 授 米 田好 文
助教授 山岡直人
学位論文題名

Studieson Primary StructureandBindingSiteofMicrobialElicitors
for the Induction of Defense Responses in Soybean Plant（ ダイ ズ 植 物に 防 御反 応 を 誘導 す る 病原 微 生物 由 来 エリ シ ター の 一次構造
お よび 結 合 部位 に 関す る 研 究）

自然界 において 、植物は 大多数の 病原体に 対して抵 抗反応を示 し、それ ら病原体の侵入から身を 守ってい る。この 抵抗反応 は必ずし も単一の ものではな く、宿物 の種類および侵入する病原 体の種類 によって 異なる多 様なもの であると 思われる。 しかしな がら、植物の抵抗反応は、 宿主の活 発な代謝 を経て感 染後に誘 導される ことが多く 、植物・ 病原体の系において広く認 められる 共通の性 質である と考えら れている 。この現象 を説明す るーつの例として、
以前著 者の研究 室では、 ダイズと ダイズ疫 病菌の系 において、 植物の抵 抗反応は疫病菌細胞壁 に結 合 し た多 糖 エリ シ タ ー(REと 略 ）に よ り誘 起 さ れる こ と、 さ ら にこ の エリシター 分
子 は、 感 染 に際 し 、植 物 の ある 特 定 の因 子 によ り結合が 切断され 遊離する ことが必須 であり、さ らにこの エリシタ ーを遊離 する植物 因子は、 p‑i，3‑endoglucanase(EGと略）である
こ とが 明 ら かと な って い た 。し か し この REの 一次 構造や菌 糸細胞壁 における 存在様式に ついては 不明であ る点が多 く、著者 ゛はそれ を明らか にすべく、 以下の点 について検討を加えた 。ま ず 高 いエ ル シタ ー 活 性が 認 め られ る REを構 成する単 糖の種類 をガスク ロマトグラ フイーに て分析し 、それら のほとん どはグル コースの みから構成 されるこ とを明らかにした。
次 にNMR分 析 によ り 、そ の グ ルコ ー ス の結 合 様式 を 調 ベ、 高 いエ リ シ ター 活 性が認めら れる REは 、 p‑i， 3お よ びp‑i， 6の み の結 合 から なっ ているこ とを明ら かにした 。このREは EGによる 再処理で もエルシ ター活性 を失わず 、またexoglucanase処 理によりそ の活性を失うこと から 、 REの 主 要 鎖は p‑i，6結合 で あ り、 EGに より分解 されない 1ないし2残 基のp‑i，3結合 の側 鎖 が 存在 す るこ と 、 そし て そ の側 鎖 がエ リシター 活性に重 要である ことを示し た。
次に著 者は、遺 伝子対遺伝子相互作用(Gene‑for‑GeneInteraction)(GFGと略）すなわち、ある抵 抗性遺伝 子を持つ 植物がそ れと対応 する非病 原性遺伝子 を持つ病 原体に対し特異的に抵抗性 を示す現 象、の分 子生物学 的メカニ ズムにつ いて検討を 加えた。 比較的研究の進んだGFGの例 に 、 ダイ ズの 抵抗性遺伝 子Rpg4と病原 細菌Pseudomonassyringae(PSと略 ）の非病原性遺伝子avrDとの系がある。この系では、avrDを持つPSが合成するエリシター・シリンゴライド(Syrと略）がシグナルとなり、Rpg4を持っダイズにのみ特異的に抵抗性を誘導する。著者はこの系のさらなる解明のため、想定されるシリンゴライドレセプターの存在確認およびその性質分析を、放射線標識したSyrを用いた結合実験により行なった。まずRpg4を持つダイズ本葉から細胞成分を抽出し、14C標識したSyrとの特異的結合を測定し、Syrの結合サイトが膜画分ではなく細胞可溶性画分にあることを明らかにした。さらに、このサイトは数種のSyr類似体のうちエリシター活性を有するものとのみ強く結合することから、シリンゴライドレセプターであることを示した。さらに著者はSyrの結合サイトが抵抗性遺伝子Rpg4を欠くダイズにも同様に存在することを明らかにし、Rpg4産物がレセプターではなく、抵抗性発現に関するさらに下流のシグナル伝達系に関与していると推察した。このような特異的エリシターの研究は、GFG系の解明に必要不可欠でありながら従来ほとんどなされていなかった分野である。さらに著者の提唱するモデルは、エリシター・レセプターモデ
ルとぃう画一的仮説に頼ってきたGFGの研究界に一石を投じる重要な発見と思われる。
以上著者の研究は、植物と病原体とのまさに接点を成す物理的現象に関して新たな知見を得たものであり、生物間情報伝達の機構解明に向けて少なからず貢献するところである。
よって著者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格のあるものと認める。