DNA マイクロアレイ手法による次世代酵母の開発
小山誠司* ・ 橋本建哉* ・ 関東宣道** ・ 伊藤謙治***
食品バイオ技術部 ・ **宮城県酒造組合
清酒製造に使用されている酵母は、もろみ中で高泡を形成することが知られており、泡の形状等の状ぼうを発酵管理の指標として利用してきた。しかし、近年では成分分析により管理する手法が一般的となり、必ずしも泡の形成は必須ではなくなってきている。宮城県が開発した純米酒用酵母「宮城マイ酵母」は高泡形成株であり、その泡無し化について要望があった。そこで、宮城マイ酵母の泡無し株の開発を行った。
キーワード： 清酒、酵母、高泡非生成た。仕込み試験の際は、前培養として麹液培地を使用し１．緒言た。麹液培地は以下のように調整した。米麹 0.5kg に対し清酒製造に使用されている酵母は、もろみや酒母中で水 1L、塩化カルシウム 0.2g、リン酸一カリウム 2g、硫酸マ

かさ高い泡（高泡）を形成することが知られている。もろみグネシウム・7 水和物 0.8g を加え、少量のグルク SB、グルの泡をはじめとする状ぼうは、発酵管理の指標として有効ク 100 を添加して 65℃、20 時間インキュベートした。そのであるが、今日、通常の発酵管理においては、もろみ成

後 95℃、2 時間加温し、室温まで冷却後ろ過を行った。こ

分を分析して管理する手法が一般的となってきており、のろ液を麹液原液とした。この原液をボーメ 6.0 まで水で必ずしも泡の形成は必須のものではなくなってきている。

希釈した後、乳酸を用いて pH4.0 に調整し、121℃、30 分

他方、もろみの泡は、発酵槽の使用効率を低下させ、まオートクレーブして麹液培地とした。

た泡消しなど煩雑な操作を必要とする。そのため、高泡を形成しない高泡非形成株（泡無し株）の開発がこれまで2.2 高泡非形成株の分離進められており、泡無し株の利用は広く行われている。宮2.2.1 Froth floatation 法

城県では協会酵母 12 号原株を親株として純米酒用酵母Froth floatation法は布川らの方法1)に従った。50mLの（宮城マイ酵母 ： 宮城酵母 MY-3102 株）を開発し、県内液体培地中で 30℃、48 時間培養を行い、7,000～各酒造場へ広く普及しているが、高泡を形成する酵母で8,000rpm、15分間遠心分離を行って酵母菌体を回収した。

あることから泡無し株の要望があった。そこで、本研究でこれを水で 3 回洗浄した後、50ｍLの水に懸濁してこれをは、宮城マイ酵母の高泡非形成株の開発を行った。

酵母懸濁液とした。この酵母懸濁液を一部取り、酵母の終濃度がO.D.660nmで 0.3～0.4 程度になるように、30mLの 0.2％蔗糖エステルP-1570 及び水を加えて 100mLに２．実験方法希釈した。この希釈液 80mLをシリンダに取り、エアポンプを 用い て 底面か ら 通気し た 。 こ の 際の 通気量は2.1 供試酵母菌株及び培養方法
酵母菌株については当センター保存菌株を使用した。

600mL/min程度とし、泡がシリンダ上部から溢れ出なくな

特に断りがないときは完全培地（ブドウ糖 20g、ポリペプトる時点を終点とした。残存した液を少量採取して液体培

ン 5g、酵母エキス 5g、リン酸一カリウム 1g、硫酸マグネシ

養に供し、以後同様の操作を繰り返した。

ウム・7 水和物 0.4g を水に溶かして 1L にする）を使用した。固体培地の場合は、これに 2.5％の寒天末を添加し21

３．実験結果及び考察

2.2.2 蔗糖エステル法
蔗糖エステル凝集法は大内らの方法2)に準じた。10mLの液体培地中で30℃、24時間培養を行い、これに1.0mL

3.1 突然変異株の分離の 0.25％蔗糖エステルP-1570 を加えた。これを 1 分間激高泡形成する清酒酵母は、細胞表面の疎水･親水度しく攪拌した後、0.5～1 時間静置した。この際、高泡形成、の性質により気泡に対して吸着性を示す。この性質を利非形成株を対照として同様の操作を行い、それぞれにつ用することにより、突然変異によって生じた泡無しの高泡いて生じる沈殿を注意して観察、比較した。その後、この非形成株を分離することが出来る。

液の上部から一部取り、液体培養に供してこの操作を繰

宮城酵母 MY-3102 株は高泡形成する酵母であるため、り返した。

気泡に対して吸着性を示す。そこで 2.2.1 に従って
MY-3102 株を親株とし、Froth floatation 法を行った。高泡非形成の対照株として協会酵母901号を使用し、泡の2.2.3 気泡吸着性試験
30℃、24 時間静置培養した 2mL の酵母培養液をよく生じ方や量などを適宜比較したところ、10 回の試行でお攪拌し、光学顕微鏡で観察した。この際、倍率は 400 倍とよそ 901 号と同程度となった。そこで残存液の一部を分し、スライドグラスに滴下する際やカバーグラスを乗せる取して 48 時間培養し、平板培地に接種した。単一コロニ際に細かい気泡が液中に残るように注意した。

ーとして約 1,500 株を分離し、これらの株について顕微鏡観察による気泡吸着性の評価をそれぞれ行った（図1）。同時に蔗糖エステル凝集法によってフロック形成の2.3 醸造試験

有無を観察し、これらの結果より、突然変異株として 60

2.3.1 小仕込試験3)株を分離した。

小仕込試験は難波ら の方法に準じて行い、蒸米、麹に換えてα化米、乾燥麹を使用した。総米200gの場合は炭酸ガス発生に伴う総重量の減少を基にし、それ以上のAB

総米量の場合はもろみから一部を分取して成分分析を行い、発酵管理した。品温の制御は水浴によって行い、急激な温度変化を起こさないよう注意した。

2.3.2 試験醸造

図 1 気泡吸着性試験

試験醸造は総米量を 200kg とし、難波らの方法に準じ

A ： 宮城酵母 MY-3102 株、 B ： 高泡非形成突然変異株た。発酵はもろみを一部分取して成分分析を行うことによって管理した。上槽はアルコール度として約 19％を目標3.2 高泡非形成株の選抜とした。

得られた 60 株について、総米200g の小仕込試験を実施した。培養期間中に高泡形成した 5 株を除外し、試験中に高泡形成が観察されなかった 55 株を評価対照とし2.3.3 成分分析
成分分析はもろみを一部分取して、ろ過または遠心分て選抜した。これらのもろみを遠心分離し、得られた製成離した試料に対して国税庁所定分析法4)に準じて行った。

酒の成分分析と官能評価を行った。親株 MY-3102 の製酸度、アミノ酸度の測定の際は湯浴及び激しく攪拌する成酒と比較し、アルコール度が同等以上で酸度、アミノ酸ことにより、炭酸ガスによる誤差の影響を防いだ。

度が低い 7 株を選抜した。7 株からさらに選抜するために、総米 1kg の小仕込試験に供し、アルコール度が 19％以上となるまで発酵させた後、同様に成分分析を行った

22（表 1）。

表 1 総米 1kg 小仕込試験における各変異株の比較
菌株
MY-3102
MY-3203
MY-3207
MY-3226
MY-3227
MY-3230
MY-3235
MY-3241時間

アルコール酸度

アミノ酸度

（日）

（％）

（mL）

（mL）

21
1919201819181819.0
19.2
19.1
19.1
19.1
19.2
19.0
19.3

3.02
2.80
2.60
2.65
2.70
2.70
2.80
2.75

1.60
1.68
1.62
1.70
1.60
1.75
1.75
1.87

表 2 試験醸造酒の一般成分比較
アルコール（日）（％）

MY31022218.9MY32272119.0日本酒度

いずれの変異株も、発酵の全期間を通じて泡は形成しなかった。発酵の速度は標準株である MY-3102 株より 1～2 日程度先行し、最終的なアルコール度は同等であった。変異株のうち、官能的にすぐれており、アミノ酸度が低い MY-3227 株を選択し、総米 10kg の小仕込試験を実施したが、MY-3102 株の値より酸度、アミノ酸度ともに低く、アルコール度、発酵速度はやや高くなることが確認された。

酸度

アミノ酸度（mL）（mL）+4.52.50

1.30+7.0

2.101.16

温度 ( ℃ )15201510105

アルコール度 ( % )時間

株50510152025時間 ( 日 )3.3 試験醸造
MY-3227 株が実用株として充分な性能を有しているかを検証するために、総米 100kg の試験醸造を実施した。米は精米歩合 60％の宮城県産ひとめぼれを使用した。もろみの経過（図 3）は最高品温を 13.5～14.0℃とし、アルコール度が 15％付近のとき徐々に温度を下げていった。
高泡を形成する酵母は泡中に存在し、高泡形成期には酵母による酸の生成が高まる傾向がある。そのため、高泡非形成変異により製成酒の酸度が低下することが知られている。MY-3227 株及び親株である MY-3102 株を使用して醸造された製成酒の成分分析値を表 2 に示す。ほぼ同等のアルコール度となるのに MY-3227 株の方が 1 日早く、酸度は MY-3102 株を下回っていた（図4）。アミノ酸度は、親株と比較して若干低い値となり、末期においても充分な生存率であることが示された。

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図 3 もろみの温度経過とアルコール度の推移● ： MY-3102（温度）、 ○ ： MY-3227（温度）■ ： MY-3102（Alc.％）、 □ ： MY-3227（Alc.％）
32100510152025時間（日）図 4 もろみの酸度とアミノ酸度の推移■ ： MY-3102（酸度）、□ ： MY-3227（酸度）● ： MY-3102（アミノ酸度）、 ○ ： MY-3227（アミノ酸度）

これらの結果を受けて、県内の酒造会社 8 社において実地醸造をおこなったところ、いずれの場合でももろみ全期間において高泡の形成は見られなかった。また
MY-3102 株による製成酒と比較して酸度もやや低い傾向が見られ、発酵の速度は 1～1.5 日程度早かった。最終到達アルコール度は 19％台で親株と同等であり、もろみ末期でも酵母の死滅によるアミノ酸度上昇が観察されず、安定した発酵性を示した。これらにより、実地醸造においても実用上問題ないことが示された。
４．結言
以上の結果から、宮城県の純米酒用酵母 MY-3102
株 よ り 高 泡 非 形 成 株 MY-3227 株 が 造 成 さ れ た 。
MY-3227 株は全期間を通じて泡無しの形質であり、もろみ末期まで安定した発酵性を示すことが確認された。製成酒も MY-3102 株とほぼ同等で、且つ酸度の低い値となることが示された。
なお、本研究は宮城県酒造組合との共同研究であり、県内各酒造会社の協力を得て実施されました。この場を借りて感謝の意を表します。
参考文献
1) 布川弥太郎，堀越直樹，大内弘造 ： 日本醸造協会誌
67(1972), p.968-971
2) 大内弘造，布川弥太郎 ： 日本醸造協会誌 67(1972),
p54-573) 難波康之祐，小幡孝之，萱島進，山崎与四郎，村上光彦，
下田高久 ： 日本醸造協会誌 73(1978), p.295-300
4) 西谷直道，伊藤清，岩野君夫，太田剛雄，大場俊輝，岡崎直人，小幡孝之，木崎康造，北本勝ひこ，熊谷知栄子，小林信也，五味勝也，斎藤和夫，斎藤泰夫，佐伯宏，高橋利郎，高宮義治，蓼沼誠，玉城武，蓮尾徹夫，若林三郎 ：国税庁所定分析法注解 第四回改正(1993), p.12-33

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