T‑Gl95

書

告

最

終報

2,4 —ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムのほ乳類培養細胞を用いる染色体異常試験

試験番号： T‑G195

試験期間： 2015年 1
2月 1
1 日‑2016年 3月 22 日

試験実施施設株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所〒 156‑0042 東 京 都 世 田 谷 区 羽 根 木 1
‑
3
‑
1
1

試験委託者
厚生労働省

医薬•生活衛生局

審査管理課

化学物質安全対策室〒 100‑8916 東 京 都 千 代 田 区 霞 が 関 1‑
2‑
2

株式会社ボゾリサーチセンター〒 151‑0065 東 京 都 渋 谷 区 大 山 町 3
6‑7

T‑Gl95

1.

GLP陳述書

試験番号

T‑G195

試験表題

2,4 —ジメチ）レベンゼンス）レホン酸ナトリウムのほ乳類培養糾咆を用いる染色体異常試験

本試験！ま以下 0)GLP基準を遵守して実胞したものです。
•「新規化学物質等（こ係る試験を実施する試験加設に関する基準」（平成 23年 3月 3
1 日、薬食発 0331第 8号、平成 23・03・29製 局 第 6号、
環 保 企 発 第 110331010号）

江I& 年 3 月 2ユ 日

試験責任者
株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所

研究部

2

T-G195

2.

目次

1.

GLP 陳述書 ................................................................................................... 2

2.

目次 .............................................................................................................. 33.

試験実施概要 ................................................................................................ 6
3.1

試験番号 ............................................................................................... 6

3.2

試験表題 ............................................................................................... 6

3.3

試験目的 ............................................................................................... 6

3.4

試験委託者 ........................................................................................... 6

3.5

試験受託者 ........................................................................................... 6

3.6

試験実施施設 ........................................................................................ 6

3.7

試験日程 ............................................................................................... 6

3.8

試験責任者 ........................................................................................... 6

3.9

試験担当者 ........................................................................................... 7

3.10

予見することができなかった試験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わなかったこと ............................................ 73.11

資料保存 ............................................................................................... 7

3.12

試験責任者の記名・押印及びその日付 ................................................... 7

4.

要約 .............................................................................................................. 85.

緒言 .............................................................................................................. 96.

試験材料及び方法 ........................................................................................ 106.1

被験物質及び溶媒 ............................................................................... 10

6.1.1

被験物質 ...................................................................................... 10

6.1.2

溶媒 ............................................................................................. 116.1.3

溶媒の選択理由 ............................................................................ 11

6.1.4

調製方法 ...................................................................................... 11

6.1.4.1

細胞増殖抑制試験 ................................................................ 11

6.1.4.2

染色体異常試験 ................................................................... 11

6.1.5

調製頻度 ...................................................................................... 11

6.1.6

被験液の安定性 ............................................................................ 116.2

対照物質 ............................................................................................. 116.2.1

陰性対照 ...................................................................................... 11

6.2.2

陽性対照 ...................................................................................... 126.3

使用細胞株 ......................................................................................... 126.3.1

細胞株 .......................................................................................... 126.3.2

細胞の選択理由 ............................................................................ 136.3.3

培養条件 ...................................................................................... 13

6.4

S9 mix 及び培養液の調製 .................................................................... 133

T-G195
6.4.1

S9 mix ......................................................................................... 136.4.2

培養液 .......................................................................................... 14

6.5

7.

試験方法 1 ) .......................................................................................... 146.5.1

識別方法 ...................................................................................... 15

6.5.2

用量の設定 ................................................................................... 156.5.3

細胞増殖抑制試験 ......................................................................... 156.5.4

染色体異常試験 ............................................................................ 166.5.5

数値の取扱い................................................................................ 176.5.6

標本の観察 ................................................................................... 186.5.7

染色体異常の分類 ......................................................................... 18

6.5.8

判定基準 ...................................................................................... 18

試験結果 ..................................................................................................... 20
7.1

細胞増殖抑制試験 ............................................................................... 207.2

染色体異常試験................................................................................... 20

8.

考察 ............................................................................................................ 21

9.

参考文献 ..................................................................................................... 22

図Fig. 1Results of the Chromosome aberration test in cultured
Chinesehamster(CHL/IU)

2,4-Dimethylbenzenesulfoniccells

treated

with

Acid

SodiumSalt

Monohydrate [Short-term treatment: –S9 mix] ................. 23
Fig. 2

Results of the Chromosome aberration test in cultured
Chinesehamster(CHL/IU)

2,4-Dimethylbenzenesulfoniccells

treated

with

Acid

SodiumSalt

Monohydrate [Short-term treatment: +S9 mix] ................ 24
Fig. 3Results of the Chromosome aberration test in cultured
Chinesehamster(CHL/IU)

2,4-Dimethylbenzenesulfoniccells

treated

with

Acid

SodiumSalt

Monohydrate [Continuous treatment: 24hr] ..................... 25

表
Table 1Chromosome aberration in cultured Chinese hamster(CHL/IU)

cells

2,4-DimethylbenzenesulfonictreatedAcid

Sodiumwith
Salt

Monohydrate [Short-term treatment: −S9 mix] ................ 26
Table 2Chromosome aberration in cultured Chinese hamster(CHL/IU)

cells
4treatedwith

T-G195
2,4-DimethylbenzenesulfonicAcid

SodiumSalt

Monohydrate [Short-term treatment: +S9 mix] ................ 27
Table 3Chromosome aberration in cultured Chinese hamster(CHL/IU)

cells

2,4-DimethylbenzenesulfonictreatedAcid

with

SodiumSalt

Monohydrate [Continuous treatment: 24hr] ..................... 28

付表Appendix 1

Results of the cell-growth inhibition test in cultured
Chinesehamster(CHL/IU)

2,4-Dimethylbenzenesulfoniccells

treated

with

Acid

SodiumSalt

Monohydrate ................................................................. 29
Appendix 2-1

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in
cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with
2,4-DimethylbenzenesulfonicAcid

SodiumSalt

Monohydrate [Short-term treatment: −S9 mix] ................ 30
Appendix 2-2

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in
cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with
2,4-DimethylbenzenesulfonicAcid

SodiumSalt

Monohydrate [Short-term treatment: +S9 mix] ................ 31
Appendix 2-3

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in
cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with
2,4-DimethylbenzenesulfonicAcid

SodiumSalt

Monohydrate [Continuous treatment: 24hr] ..................... 32
Appendix 3-1

Results of observation in the Chromosome aberration
test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwith 2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt
Monohydrate [Short-term treatment: −S9 mix] ................ 33

Appendix 3-2

Results of observation in the Chromosome aberration
test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwith 2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt
Monohydrate [Short-term treatment: +S9 mix] ................ 34

Appendix 3-3

Results of observation in the Chromosome aberration
test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwith 2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt
Monohydrate [Continuous treatment: 24hr] ..................... 35

信頼性保証書 .................................................................................................... 365

T-G195

3.

試験実施概要3.1

試験番号

T-G195

3.2

試験表題

2,4-ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムのほ乳類培養細胞を用いる染色体異常
試験

3.3

試験目的

ほ乳類の培養細胞（CHL/IU 細胞株）を用いて、2,4-ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムの染色体異常誘発能を確認することを目的とした。

3.4

試験委託者

厚生労働省

医薬・生活衛生局〒100-8916

3.5

審査管理課

東京都千代田区霞が関 1-2-2

試験受託者

株式会社ボゾリサーチセンター〒151-0065

3.6

東京都渋谷区大山町 36-7

試験実施施設株式会社ボゾリサーチセンター〒156-0042

東京都世田谷区羽根木 1-3-11

株式会社ボゾリサーチセンター〒412-0039

3.7

3.8

東京研究所
御殿場研究所

静岡県御殿場市かまど 1284

試験日程
試験開始日

：

2015 年 12 月 11 日

被験物質受領日：2015 年

実験開始日：

2015 年 12 月 14 日

実験終了日

：

2016 年

2月

試験終了日

：

2016 年3 月 22 日

9 月 15 日
3日

試験責任者

株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所

6

研究部

T‑0195

3
.
9

試験担当者

被験物質保存吉任者：
化学分析責任者
試験担当者

3.10

予見することができなかった試験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わなかったこと

予見することができなかった試験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わながったことはなかった。

3.11

資料保存

試験計画書原本、記録文書、生データ、染色体標本及び報告書類（最終報告書の原本を含む）は株式会社ボゾリサーチセンター御殿場研究所の資料保存施設に最終報告
雷提出後 10 年間保存する。期間終了後の保存については、厚生労働省
衛生局

審査管理課

化学物質安全対策室と株式会社ボゾリサーチセンター間で協議し、その処置を決定する。

3.12

医薬•生活

試験責任者の記名・押印及びその日付

loI
G 年 3 月 22 日
株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所

研究部

7

T-G195

4.

要約
2,4-ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムの染色体異常誘発能の有無を検討する

ため、チャイニーズ・ハムスター肺由来線維芽細胞（CHL/IU）を用いた染色体異常試験を実施した。
染色体異常試験の用量を設定するため、2100 μg/mL を最高用量とし、以下公比 2で希釈した計 8 用量を設定し、細胞増殖抑制試験を行った。その結果、すべての処理
法で 50%を超える細胞増殖抑制作用は認められず、50%細胞抑制濃度（概略値）は算
出されなかった。以上の結果より、すべての処理法で 2100 μg/mL を最高用量とし、以下公比 2 で希釈した 3 用量を設定し、染色体異常試験を実施した。
染色体異常試験の結果、染色体構造異常の一つの指標であるギャップを含まない染色体異常を有する細胞の出現率（TA 値）及び倍数体の出現率（Poly 値）は、いずれの処理法においても、すべての用量で陰性の判定基準である 5%未満を示したため、陰性と判定した。
なお、すべての処理法において、陰性対照群では染色体構造異常を有する細胞及び倍数体の出現頻度は 5%未満で、陰性の判定基準内にあった。これに対して、陽性対照群では著しい染色体構造異常の誘発が認められた。したがって、試験は適切に実施されたと考えられた。
以上の結果から、2,4-ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムは本試験条件下において、染色体構造異常及び染色体数的異常を誘発しないと結論した。

8

T-G195

5.

緒言
2,4-ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムの安全性評価の一環として、ほ乳類培

養細胞を用いる染色体異常試験を実施したので、その成績を報告する。
なお、遵守した基準及び準拠した毒性試験ガイドラインなどは以下の通りである。
1)

•

GLP
「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準」（平成 23 年 3 月 31 日、薬食発 0331 第 8 号、平成 23･03･29 製局第 6 号、
環保企発第 110331010 号）

2)•

毒性試験ガイドライン「新規化学物質等に係る試験の方法について」（平成 23 年 3 月 31 日：薬食発 0331 第 7 号、平成 23・03・29 製局第 5 号、環保企発第 110331009 号）

9

T-G1956.

試験材料及び方法

6.1
6.1.1

被験物質及び溶媒
被験物質

製造者

：

名称

：

2,4-ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウム別名：

2,4-DimethylbenzenesulfonicAcid

SodiumSalt

Monohydrate
CAS 番号：

827-21-4

官報公示整理番号：(3)-1909（化審法）

構造式又は示性式

：

分子式

：

C8H9NaO3S・H2O

分子量：208.21

物理的状態（20°C）
：

固体

形状

：

結晶～粉末

色

：

白色～ごくうすい黄色

ロット番号

：

U6BHB

純度（イオン交換法）
保存条件：

99.0 %：

冷暗所（冷蔵庫内、許容値：1~10°C、実測値：2.1 ~11.5 °C*、2015 年 9 月 15 日 ~ 2016 年 2 月 17 日）、
密栓

保存場所

：

東京研究所
御殿場研究所

安定性：

被験物質保存室
分析室

実験終了後、株式会社ボゾリサーチセンター

御殿場

研究所で被験物質の安定性を確認した。
取扱い上の注意：

作業場の換気を十分に行い、マスク、保護眼鏡、保護手袋等の適切な保護具を着用し、直接の接触を防ぐ。
取り扱い後は、手、顔等を良く洗い、うがいをする。

使用後の処理：使用後の残量は、関連試験終了後全て廃棄した。

*被験物質保存期間中の実測温度において、最高温度が 11.5°C と許容値を上回ったが、この異常が発生したのが実験終了後である 2016 年 2 月 7 日であること、実験終了後の被験物質の安定性試

10T-G195
験において、安定であったことが確認されていることから、本試験に対する影響は無かったと判断
した。

6.1.2

溶媒

名称

：

注射用水

ロット番号

：

5F84N

製造元

：

㈱大塚製薬工場

保存方法

：

室温

保存場所

：

東京研究所

6.1.3

培養細胞試験室

溶媒の選択理由

供試前試験の結果、注射用水 1mL に被験物質 21.0 mg を溶解できたことから、溶媒として注射用水を用いることとした。

6.1.4
6.1.4.1

調製方法
細胞増殖抑制試験

被験物質 0.2100 g を 10 mL メスフラスコに秤取した。溶媒を添加し、溶解した後に、メスアップして最高濃度の 21.0 mg/mL 被験液（プレートに 0.500 mL 添加した際の最終濃度：2100 μg/mL）を調製した。次いで、21.0 mg/mL 被験液を公比 2（各濃度の被験液 5 mL：溶媒 5 mL）で順次 7 段階希釈し、10.5、5.25、2.63、1.31、0.656、
0.328 及び 0.164 mg/mL の 8 濃度段階の被験液を調製した。

6.1.4.2

染色体異常試験

被験物質 0.2100 g を 10 mL メスフラスコに秤取した。溶媒を添加し、溶解した後に、メスアップして最高濃度の 21.0 mg/mL 被験液（プレートに 0.500 mL 添加した際の最終濃度：2100 μg/mL）を調製した。次いで、21.0 mg/mL 被験液を公比 2（各濃度の被験液 5 mL：溶媒 5 mL）で順次 2 段階希釈し、10.5 及び 5.25 mg/mL の 3 濃度段階の被験液を調製した。

6.1.5

調製頻度

用時に調製した。

6.1.6

被験液の安定性

用時調製のため実施しない。

6.2
6.2.1

対照物質
陰性対照

溶媒として用いる注射用水を陰性対照とした。
11

T-G195

6.2.2
1)

陽性対照

非代謝活性化系

マイトマイシン C（MMC）

2)

ロット番号

：

575AEA

製造元：

協和発酵キリン株式会社

力価：

2 mg（力価）/瓶

保存方法

：

室温、遮光

保存場所

：

東京研究所

培養細胞試験室

代謝活性化系

シクロフォスファミド（CP）

3)

ロット番号

：

WEF3430

製造元：

和光純薬工業株式会社

純度：

生化学用（97.0%以上）

保存方法

：

冷蔵（許容範囲：1~10℃）、遮光

保存場所

：

東京研究所

培養細胞試験室

冷蔵庫

調製方法
調製は全て用時に行った。

(1) MMCMMC の 2 mg 充填バイアルに生理食塩液（日本薬局方、株式会社大塚製薬工場、
ロット番号：K5E97）を 2 mL 加えて溶解した（1 mg/mL）。次に、この溶液を公比 20 で順次 2 段階希釈（溶液 0.250 mL：生理食塩液 4.750 mL）し、0.050
及び 0.0025 mg/mL の溶液を調製した（短時間処理法の非代謝活性化では培養液
4.850 mL に 0.0025 mg/mL 溶液を 0.150 mL 加えた。連続処理法では培養液 4.900
mL に 0.0025 mg/mL 溶液を 0.100 mL 加えた。この時の最終濃度は、それぞれ
0.075 µg/mL 及び 0.050 µg/mL）。
(2) CP
CP 0.0140 g を γ 線滅菌済プラスチック遠沈管（50 mL）に秤取した。これに生
理食塩液（日本薬局方、株式会社大塚製薬工場、ロット番号：K5E97）を 20 mL
加えて溶解し、0.70 mg/mL 溶液を調製した（培養液 4.900 mL に 0.100 mL を加えた。この時の最終濃度は 14 μg/mL）。
4)陽性対照物質の選択理由

毒性試験ガイドライン（前述 5. 2)）に使用が推奨されているため。

6.3
6.3.1

使用細胞株
細胞株

チャイニーズ・ハムスターの肺由来線維芽細胞（CHL/IU）を用いた。独立行政法
人医薬基盤研究所 JCRB 細胞バンクから 2014 年 4 月 2 日に入手し、凍結保存した細胞について定期的に細胞の性状検査を実施して、性状が適正であること（培養形態、
12

T-G195
細胞倍加時間 15~20 時間以内、染色体数の平均が 25 本、マイコプラズマ等の汚染がない）が確認されたものを 30 継代以内で試験に使用した。使用時の細胞継代数は細胞増殖抑制試験で 8 継代、染色体異常試験で 15 継代であった。

6.3.2細胞の選択理由

毒性試験ガイドライン（前述 5. 2)）に使用が推奨されているため。

6.3.3

培養条件

炭酸ガス培養装置を用い、CO 2 濃度 5%、温度 37°C、高湿度条件下で培養した。継代は 1~4 日ごとに行った。

6.4
6.4.1

S9 mix 及び培養液の調製
S9 mix

S9 及 び 補 酵 素 （ S9 ／ コ フ ァ ク タ ー C セ ッ ト 、 ロ ッ ト 番 号 ： C150807051 及 び
C150904061）を混合し、S9 mix を調製した。調製は用時に行った。
1)

S9
名称

：

S9

製造元

：

オリエンタル酵母工業株式会社

ロット番号

：

15080705、15090406

製造日：2015 年 8 月 7 日（ロット番号：15080705）
2015 年 9 月 4 日（ロット番号：15090406）

種・系統

：

ラット•SD 系

週齢・性：

7 週齢・雄誘導物質：

フェノバルビタール(PB)及び 5,6-ベンゾフラボン(BF)

投与方法

：

腹腔内投与

投与期間及び投与量：

PB4 日間連続投与 30+60+60+60(mg/kg 体重)PB 投与 3 日目 BF 投与 80(mg/kg 体重)

使用期限

：

2016 年 2 月 6 日（ロット番号：15080705）
2016 年 3 月 3 日（ロット番号：15090406）

2)

保存方法

：

冷凍(–70°C 以下)

保存場所

：

東京研究所

名称

：

コファクターC

製造元：

オリエンタル酵母工業株式会社

ロット番号

：

C15080505、C15090206

製造日：2015 年 8 月 5 日（ロット番号：C15080505）

培養細胞試験室

超低温フリーザ

補酵素2015 年 9 月 2 日（ロット番号：C15090206）
保存方法：

冷凍(–70°C 以下)
13

T-G195
使用期限：2016 年 2 月 4 日（ロット番号：C15080505）
2016 年 3 月 1 日（ロット番号：C15090206）

保存場所
3)

S9 mix の組成

：

東京研究所

培養細胞試験室

超低温フリーザ(1 mL 中)水：

0.7 mLS9：

0.3 mL

MgCl 2：5 µmol/mL

KCl：

33 µmol/mL

グルコース-6-リン酸：

5 µmol/mL

酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)：

4 µmol/mL

HEPES 緩衝液(pH7.2)
：

6.4.2

4 µmol/mL

培養液

Minimum Essential Medium (MEM)(GIBCO TM 、Cat.No.11095)に非働化（56°C、30分）した牛血清(bovine serum、BS)を 10 v/v%添加した培養液(BS-MEM)を用いた。
調製後の培養液は冷蔵保存した。
1)

2)

6.5

牛血清
ロット番号

：

1517948、1610982

製造元：

Life Technologies Corporation

保存方法

：

冷凍（−20°C 以下）

保存場所

：

東京研究所

培養細胞試験室

冷凍庫

Minimum Essential Medium（MEM）
ロット番号

：

1732934

製造元：

Life Technologies Corporation

保存方法

：

冷蔵

保存場所

：

東京研究所

培養細胞試験室

冷蔵庫

試験方法 1)

試験は以下に示したステージの順に実施した
1. 細胞増殖抑制試験

短時間処理法2. 染色体異常試験

連続処理法
短時間処理法
連続処理法

14

代謝活性化
非代謝活性化
24 時間処理
代謝活性化
非代謝活性化
24 時間処理T-G195

6.5.1

識別方法

以下のように定めた記号又は数字を記したラベルを、シャーレ及びスライドグラスに貼付して識別を行った。
対象

内容

記号又は数字シャーレ

短時間処理法 代謝活性化
短時間処理法 非代謝活性化
連続処理法 24 時間処理
陰性対照群
被験液処理群
陽性対照群
同一処理群内での識別
染色体標本

盲検法によってランダムにコード化した処理内容

6.5.2

用量の設定

1)

+
−
24NC
高濃度から 1、2、3･･･n の枝番号
PC
1、2、3
試験番号とコンピュータが無作為に割り振った「01」~「99」までの 2 桁の番号及びスライドの枚数を表す枝番号

細胞増殖抑制試験
最高用量を遺伝毒性試験ガイドライン（前述 5. 2)）で定められた 2100 μg/mL（10mM 相当）とし、以下公比 2 で希釈した 1050、525、263、131、65.6、32.8
及び 16.4 μg/mL の計 8 用量を設定した。また、これに陰性対照群を設けた。

2)

染色体異常試験
最高用量を 2100 μg/mL とし、以下公比 2 で希釈した 1050 及び 525 μg/mL の計
3 用量を設定した。これに陰性対照群及び陽性対照群を設けた。

6.5.3

細胞増殖抑制試験

染色体異常試験の用量を設定するための予備試験として実施した。なお、以下の試
験操作のうち、無菌性を必要とする場合は、無菌環境下において、滅菌済の器具を用いて、無菌操作によって実施した。
1)

短時間処理法の代謝活性化と非代謝活性化、連続処理法の 24 時間処理のそれぞれに、陰性対照群及び被験物質処理群を設けた。シャーレ（プレート）はプラス
チックプレート（直径 60 mm）を用い、各群 1 枚とした。

2)

プレート当たり 2×10 4 個の細胞（培養液 5.0 mL）を播種した。

3)

培養 3 日後、倒立位相差顕微鏡下で細胞に異常がないことを確認後、下表に従い、培養液の除去及び処理を実施した。

15

T-G195＼
培養液除去量S9 mix 添加量
陰性対照・
被験液添加量4)‑‑ ‑‑短時間処理法
非代謝活性化
代謝活性化
0.500 mL
1.333 mL
0.833 mL
0.500 mL

0.500 mL

連続処理法
24 時間処理0.500 mL
0.500 mL

被験液処理後、肉眼で析出の有無及び培養液の色調を確認した。確認後、短時間処理法では 6 時間、連続処理法では 24 時間培養した。

5)6 時間培養後、短時間処理法については、4)と同様に析出の有無を確認するとともに、倒立位相差顕微鏡下で細胞の状態を確認した。次いで、牛血清を約 2%となるよう添加した生理食塩液で細胞を洗浄し、新しい培養液 5.0 mL を加え、更に 18 時間培養した。

6)

培養終了後、肉眼で被験物質の析出の有無を観察するとともに、倒立位相差顕微
鏡下で観察し、細胞の状態を確認した（短時間処理法の培養終了時の結果は、参考データとした）。

7)

次いで、以下の方法に従い、各プレートの細胞濃度を測定した。

(1) 当該プレートの培養液を廃棄し、Phosphate-Buffered Saline (–)（PBS (–)）を適量加えプレートを洗浄した。
(2) PBS(–) を 廃 棄 し 、 0.25% ト リ プ シ ン 溶 液 （ Trypsin 0.25% 、 Life Technologies
Corporation）を 1 mL 加え、約 5 分間静置した。
(3) ピペッティングで細胞を剥離・分散させた後、プレートに新しい 10%BS-MEM
培養液を 1 mL 添加し、血球計算盤を用いて細胞濃度を測定した。血球計算盤の計数値は、8 区画の平均値の小数点第 1 位を四捨五入したものを相対的細胞数（RCC：Relative Cell Count）の計算に用いた。
8)

得られた細胞濃度から、式 1 に従い、陰性対照群を 100%とした各群の相対的細胞数（RCC）を算出した。
RCC (%)=（被験物質処理群における細胞数）×100（陰性対照群における細胞数）

〔式 1〕
9)

細胞増殖抑制率（=100-RCC）*を算出し、50%を挟む 2 点の直線式から、50%細胞増殖抑制濃度（概略値）を算出した。
*計算値が 0 以下の場合は 0 として扱った。

6.5.4

染色体異常試験

以下の試験操作のうち、無菌性を必要とする場合は、無菌環境下において、滅菌済の器具を用いて、無菌操作によって実施した。
1)

短時間処理法の代謝活性化と非代謝活性化、連続処理法の 24 時間処理のそれぞれに、陰性対照群、被験物質処理群及び陽性対照群を設けた。シャーレ（プレー16T-G195ト）はプラスチックプレート（直径 60 mm）を用い、各群 3 枚（枝番号-1、2 及び 3）とした。ただし、陽性対照群は 2 枚（枝番号-1 及び-2）とした。
2)

プレート当たり 2×10 4 個の細胞（培養液 5.0 mL）を播種した。

3)

培養 3 日後に、倒立位相差顕微鏡下で細胞に異常がないことを確認後、下表に従い、培養液の除去及び処理を実施した。
培養液除去量‑‑‑‑
非代謝活性化0.500 mL
(0.150 mL) *代謝活性化
1.333 mL
(0.933 mL) *0.833 mL
0.500 mL
(CP: 0.100 mL) *‑‑‑‑24 時間処理0.500 mL
(0.100 mL) *S9 mix 添加量
陰性対照・被験液・0.500 mL
0.500 mL
(MMC: 0.150 mL) *(MMC: 0.100 mL) *陽性対照物質液添加量*：（ ）内は、陽性対照群の培養液除去量及び陽性対照物質液添加量を示した。

4)

被験液処理後、肉眼で析出の有無及び培養液の色調を確認し、短時間処理法では
6 時間、連続処理法では 24 時間培養した。

5)6 時間培養後、短時間処理法については肉眼で被験物質の析出を、倒立位相差顕微鏡で細胞の状態を確認した。次いで、約 2%となるよう牛血清を添加した生理食塩液で細胞を洗浄し、新しい培養液 5.0 mL を加え、更に 18 時間培養した。

6)

各群 2 枚のプレート（枝番号-1 及び-2）について、染色体観察用標本作製のため培養終了の約 2 時間前にコルセミド（デメコルシン溶液、10 μg/mL）を 0.1 mL
加えた。

7)

培養終了後、プレートの培養液を遠沈管に移し、0.25%トリプシン溶液（Trypsin
0.25%、Life Technologies Corporation）で細胞を剥がし、回収・遠心分離した。
次いで、遠心分離によって集めた細胞を 0.075M 塩化カリウム溶液で約 15 分間
低張処理し、メチルアルコール：酢酸＝3：1 液で固定した。固定した細胞をス
ライドガラス 1 枚につき 2 箇所に滴下した。染色体標本はプレート当たり 2 枚作製した。細胞滴下後、約 1 日以上空気乾燥し、2%ギムザ液で約 15 分間染色して染色体標本を作製した。

8)

残る各群 1 枚のプレート（枝番号-3）は、肉眼で被験物質の析出を、倒立位相差
顕微鏡で細胞の状態を確認した（短時間処理法の培養終了時の結果は、参考デー
タとした）。その後、細胞増殖抑制試験に準じて細胞濃度を測定し、RCC を算
出した。

6.5.5

数値の取扱いRCC 算出には表示値を用い、下記の桁数に従って計算した。
1)

細胞濃度については、血球計算盤における 8 区画の計数値の平均値の小数点第 1
位を四捨五入し、整数で表示した（単位：計数値の平均値 × 10 4 cells/mL）。

2)

RCC（百分率）については、1) の表示値を用いて計算し、小数点第 1 位を四捨
五入し整数として表示した。

17

T-G195

6.5.6

標本の観察

顕微鏡下でプレート当たり 100 個の染色体が良く展開した分裂中期像を観察し、構造異常の種類と異常を持つ細胞の数を記録した。同時に倍数体の出現数も記録した。
染色体標本の観察はすべてブラインド化して行った。

6.5.7

染色体異常の分類

染色体異常は構造異常と数的異常に大別し、構造異常は更に以下のように定義・分
類した。
1)

構造異常
染色体異常の種類は以下のように定義し分類した。
ギャップ(g)：

染 色 分 体 型 (ctg) 及 び 染 色 体 型 (csg)を 含 む ギ ャ ッ プ とは染色体又は染色分体の同軸上に断片があるもの（非染色部分が染色分体の同軸上にある）であって、その長さが染色分体の幅以下で明瞭な非染色部位が認められるもの。

染色分体型切断(ctb)：

断片が染色分体の同軸上からはずれているもの及び非染色部位が染色分体の同軸上にあっても、その長さが染色分体の幅以上に離れているもの。

染色分体型交換(cte)：

四放射状交換など。

染色体型切断(csb) ：断片が染色体の同軸上からはずれており動原体が認められないもの及び非染色部位が染色体の同軸上にあっても、その長さが染色分体の幅以上に離れているもの。

2)

染色体型交換(cse) ：二動原体染色体、環状染色体など。

その他(other)

断片化(frg)など。

：

数的異常
染色体数が、その細胞が本来持っている固有の数（二倍体）と異なり、倍化した
場合を数的異常と定義した。
倍数性

6.5.8

：

polyploidy（核内倍加体：endoreduplication を含む）

判定基準

判定に際しては統計学的手法を用いず、石館らの基準 1 ) に従い染色体の構造並びに数的異常を持つ細胞の出現率（%）によって以下のように判定した。
異常細胞の出現率
判定基準
5%未満
陰 性（–）
5%以上 10%未満
疑陽性（±）
10%以上
陽 性（+）

18

T-G195
構造異常の総出現率は、ギャップを含む場合（TAG）と含まない場合（TA）とに分
け、総合判定は後者によって行った。
異常細胞の出現率に用量依存性又は再現性が認められた場合を陽性と判定した。

19

T-G195

7.

試験結果

7.1

細胞増殖抑制試験

結果を Appendix 1、Appendix 2-1~2-3 に示した。
被験液添加に伴う析出の有無及び培養液の色調変化は、すべての処理法で認められなかった。細胞毒性の指標である RCC を測定した結果、すべての処理法で 50%を超える細胞増殖抑制作用は認められず、50%細胞抑制濃度（概略値）は算出出来なかった。

7.2

染色体異常試験結果を Fig.1~3、Table 1~3、Appendix 3-1~3-3 に示した。
被験液添加に伴う析出の有無及び培養液の色調変化は、すべての処理法で認められなかった。
構造異常の出現率（TA）は、短時間処理法の非代謝活性化では 2100、1050 及び 525
μg/mL でそれぞれ 0%であった。短時間処理法の代謝活性化では 2100、1050 及び 525
μg/mL で 0、1.0 及び 0.5%であった。連続処理法では 2100、1050 及び 525 μg/mL で0、0.5 及び 0%であった。
数的異常（倍数体、Poly）の出現率は、短時間処理法の非代謝活性化では 2100、1050
及び 525 μg/mL でそれぞれ 0%であった。短時間処理法の代謝活性化では 2100、1050
及び 525 μg/mL で 1.5、0.5 及び 1.0%であった。連続処理法では 2100、1050 及び 525
μg/mL で 0、0.5 及び 0%であった。

20

T-G195

8.

考察
2,4-ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムの染色体異常誘発能の有無を検討する

ため、チャイニーズ・ハムスター肺由来線維芽細胞（CHL/IU）を用いた染色体異常試験を実施した。
染色体異常試験の用量を設定するため、2100 μg/mL を最高用量とし、以下公比 2で希釈した計 8 用量を設定し、細胞増殖抑制試験を行った。その結果、すべての処理
法で 50%を超える細胞増殖抑制作用は認められず、50%細胞抑制濃度（概略値）は算
出されなかった。以上の結果より、すべての処理法で 2100 μg/mL を最高用量とし、以下公比 2 で希釈した 3 用量を設定し、染色体異常試験を実施した。
染色体異常試験の結果、染色体構造異常の一つの指標であるギャップを含まない染色体異常を有する細胞の出現率（TA 値）及び倍数体の出現率（Poly 値）は、いずれの処理法においても、すべての用量で陰性の判定基準である 5%未満を示したため、陰性と判定した。
なお、すべての処理法において、陰性対照群では染色体構造異常を有する細胞及び倍数体の出現頻度は 5%未満で、陰性の判定基準内にあった。これに対して、陽性対照群では著しい染色体構造異常の誘発が認められた。したがって、試験は適切に実施されたと考えられた。
また、本被験物質は Ames 試験で陰性 6 ) と報告されている。
以上の結果から、2,4-ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムは本試験条件下において、染色体構造異常及び染色体数的異常を誘発しないと結論した。

21

T-G195

9.

参考文献

1)

石館基監修 (1987)：<改訂>染色体異常試験データ集、pp. 19-24、エル・アイ・
シー 、東京2)

Ishidate M Jr. and Odashima S (1977): Chromosome test with 134 compounds on
Chinese hamster cells in vitro – A screening for chemical carcinogens, Mutat. Res.,48, 337-354

3)Matsuoka A, Hayashi M and Ishidate M Jr. (1979): Chromosomal aberration tests on
29 chemicals combined with S9 mix in vitro, Mutat. Res., 66, 277-290

4)

石館 基 (1982)：哺乳動物細胞を用いる検索と問題点(Screening Trial to Detect
Possible Chemical Mutagens and/or Carcinogens in the Environment - Mammalian
Cell Systems), 日本香粧品科学会誌, 6, 31-43

5)Ishidate M Jr., Edited by Obe G and Natarajan AT (1989): Chromosomal
Aberrations Basic and Applied Aspects, Springer-Verlag Berlin Heidelberg,
260-2716)(2016)：2,4-ジメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムの細菌を用いる
復帰突然変異試験（試験番号：T-1887）、株式会社ボゾリサーチセンター

22

．

T-G195::110 •TA value

Poly value

90

90 ・

80
70

．
．

70

60

60

50

50 ・
40

40 ・

c

Cell-growth ratio(%)

80

30

30 ・

TA or Poly value(%)

100

100

RCC

20

L

20
10
0

．
10

0 ‑ ̲ ̲ ̲ ̲心 ＿ ＿ ＿ ＿ →

-10

̲
J
0

-10

NC

525

1050

2100

PC

Concentration of test article(μg/mL)

Fig. 1Results of the chromosome aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with 2,4Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Short-term treatment : -S9 mix]
NC : Negative Control (water for injection)
PC : Positive control (mitomycin C : 0.075 μg/mL)23

T-G195

：
RCC

110

100

TA value

Poly value

100

90

90

80
70

70

60

60
50

50
40

40
30

30

TA or Poly value(%)

Cell-growth ratio(%)

80

20

20

10

10
0---- 令---==--~

0

0

-10

-10

NC

525

1050

2100

PC

Concentration of test article(μg/mL)

Fig. 2
Results of the chromosome aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with 2,4Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Short-term treatment : +S9 mix]
NC : Negative Control (water for injection)
PC : Positive control (cyclophosphamide : 14 μg/mL)

24

．

：
：
RCC

110 •

90

Poly value

.
.

90
80

80

Cell-growth ratio(%)

100

TA value

70

．
．

70

60

60

50

.
.
.
40 .
.
30 .
50

40

゜
30
20

20

．
10

10
0
-10

TA or Poly value(%)

100

T-G195

L

NC

0‑,‑

-—•

---0

1050

2100

̲
J
0

-10

525

PC

Concentration of test article(μg/mL)

Fig. 3Results of the chromosome aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with 2,4Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Continuous treatment : 24hr]
NC : Negative Control (water for injection)
PC : Positive control (mitomycin C : 0.050 μg/mL)25

T-G195
Chromosome aberration in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with 2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Short-term treatment:-S9 mix]
Number of cells with numerical chromosome
Conc. of
Number of cells with structural chromosome aberration (%)
Time S9
RCC
aberration (%)
test article
Cells
Judge- (%)
JudgeCells Polyploid(h) mix
ctb
cte
csb
cse
other
TA(%)
g
TAG(%)
other Total (%)(µg/mL)observedmentobserved
cells
ment
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
100
NC
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
200
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
86
525
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
200
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
90
6-18
1050
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
200
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
82
2100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
200
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
100
3
22
0
0
0
25
0
25
100
0
0
0
PC
100
7
28
0
0
0
33
0
33
+
100
0
0
0
200
10(5.0) 50(25.0) 0(0.0)
0(0.0)
0(0.0) 58(29.0) 0(0.0) 58(29.0)
2000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
g: chromatid or chromosome gap, ctb: chromatid break, cte: chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange,other: including fragmentation
TA: total number of cells with aberration excluding gap, TAG: total number of cells with aberration including gap.
NC: Negative control (water for injection)
PC: Positive control (mitomycin C, 0.075 µg/mL)
RCC(%) showed cell counts of tast article treatment group against that of negative control.
Table 1

26

T-G195
Chromosome aberration in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with 2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Short-term treatment:+S9 mix]
Number of cells with numerical chromosome
Conc. of
Number of cells with structural chromosome aberration (%)
RCCTime S9aberration (%)
test article
Cells
Judge- (%)
Cells Polyploid
Judge(h) mix
cte
csb
cse
other
TA(%)
TAG(%)
other Total (%)
ctbg(µg/mL)ment
observed
cells
ment
observed
100
1
0
0
0
0
1
0
1
100
0
0
0
100
NC
100
1
0
0
0
0
1
0
1
100
1
0
1
200
2(1.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(1.0)
0(0.0)
2(1.0)
200
1(0.5)
0(0.0)
1(0.5)
100
0
1
0
0
0
1
0
1
100
1
0
1
97
525
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
1
0
1
200
0(0.0)
1(0.5)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(0.5)
0(0.0)
1(0.5)
200
2(1.0)
0(0.0)
2(1.0)
100
0
1
0
0
0
1
0
1
100
1
0
1
82
6-18
+
1050
100
1
0
0
0
0
1
0
1
100
0
0
0
200
1(0.5)
1(0.5)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(1.0)
0(0.0)
2(1.0)
200
1(0.5)
0(0.0)
1(0.5)
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
87
2100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
3
0
3
200
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
200
3(1.5)
0(0.0)
3(1.5)
100
17
75
0
0
0
79
0
79
100
0
0
0
PC
100
17
76
0
0
0
77
0
77
+
100
0
0
0
200
34(17.0) 151(75.5) 0(0.0)
0(0.0)
0(0.0) 156(78.0) 0(0.0) 156(78.0)
2000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
g: chromatid or chromosome gap, ctb: chromatid break, cte: chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange,other: including fragmentation
TA: total number of cells with aberration excluding gap, TAG: total number of cells with aberration including gap.
NC: Negative control (water for injection)
PC: Positive control (cyclophosphamide, 14 µg/mL)
RCC(%) showed cell counts of tast article treatment group against that of negative control.
Table 227

T-G195
Chromosome aberration in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with 2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Continuous treatment:24hr]
Number of cells with numerical chromosome
Conc. of
Number of cells with structural chromosome aberration (%)
Time S9
RCC
aberration (%)
test article
Cells
Judge- (%)
Cells Polyploid
Judge(h) mix
ctb
cte
csb
cse
other
TA(%)
g
TAG(%)
other Total (%)(µg/mL)observedmentobserved
cells
ment
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
100
NC
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
200
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
92
525
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
200
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
100
1
0
0
0
0
1
0
1
100
1
0
1
89
24-0
1050
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
200
1(0.5)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(0.5)
0(0.0)
1(0.5)
200
1(0.5)
0(0.0)
1(0.5)
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
86
2100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
200
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
100
4
41
0
1
0
46
0
46
100
0
0
0
PC
100
3
32
0
0
0
34
0
34
+
100
0
0
0
200
7(3.5) 73(36.5) 0(0.0)
1(0.5)
0(0.0) 80(40.0) 0(0.0) 80(40.0)
2000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
g: chromatid or chromosome gap, ctb: chromatid break, cte: chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange,other: including fragmentation
TA: total number of cells with aberration excluding gap, TAG: total number of cells with aberration including gap.
NC: Negative control (water for injection)
PC: Positive control (mitomycin C, 0.050 µg/mL)
RCC(%) showed cell counts of tast article treatment group against that of negative control.
Table 328

三︑

T-G195-S9 mix

130+S9 mix]︑ ●¥◆◆

Cell-growth ratio(%)

¥

︱ [

}

90

一
▲

100

︑¥
ご
i

／

110

ヽ
ヽ

4

24hr

120

80
70
60
50
40
30
20
10
0
NC

16.4

32.8

65.6

131

263

525

1050

2100

Concentration of test article(μg/mL)

Appendix 1
Results of the cell-growth inhibition test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with 2,4Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate
NC : Negative Control (water for injection)
Cell-growth ratio was shown as the RCC.

29

T-G195

Appendix 2-1

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with
2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Short-term treatment : -S9 mix]

-

6-18

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)

RCCa)
(%)

Cell-growth inhibition testc)
CellObservation
growthf)
Precipitates/Crystals
inhibition Condition of Color of
d)
e)
cells
medium1)
2)
ratio(%)b)
0-0 (NC)

100

16.4

115

0

-

-

-

-

32.8

100

0

-

-

-

-

65.6

100

0

-

-

-

-

131

115

0

-

-

-

-

263

107

0

-

-

-

-

525

100

0

-

-

-

-

1050

100

0

-

-

-

-

2100

85

15

-

-

-

-

Concentration of 50% cell-growth inhibition : above

2100

μg/mL

NC : Negative Control (water for injection)a) The plate in the negative control group was regarded as a 100% growth.
b) Cell-growth inhibition ratio was shown as 100 - RCC. The value was regarded as 0%, when value was 0 and fewerc) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after additionof the test solutions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test solutions and 2)atthe end of treatment.
d) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
e) - : No changes of colorf) - : Absence of precipitates
All calculations were carried out using Excel 201030

T-G195

Appendix 2-2

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with
2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Short-term treatment : +S9 mix]

+

6-18

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)

RCCa)
(%)

Cell-growth inhibition test
CellObservationc)
growthf)
Precipitates/Crystals
inhibition Condition of Color of
d)
e)
cells
medium1)
2)
ratio(%)b)
0-0 (NC)

100

16.4

103

0

-

-

-

-

32.8

100

0

-

-

-

-

65.6

106

0

-

-

-

-

131

83

17

-

-

-

-

263

106

0

-

-

-

-

525

111

0

-

-

-

-

1050

114

0

-

-

-

-

2100

100

0

-

-

-

-

Concentration of 50% cell-growth inhibition : above

2100

μg/mL

NC : Negative Control (water for injection)a) The plate in the negative control group was regarded as a 100% growth.
b) Cell-growth inhibition ratio was shown as 100 - RCC. The value was regarded as 0%, when value was 0 and fewerc) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after additionof the test solutions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test solutions and 2)atthe end of treatment.
d) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
e) - : No changes of colorf) - : Absence of precipitates
All calculations were carried out using Excel 201031

T-G195

Appendix 2-3

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with
2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Continuous treatment : 24hr]

-

24-0

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)

RCCa)
(%)

Cell-growth inhibition test
CellObservationc)
growthf)
Precipitates/Crystals
inhibition Condition of Color ofd)e)mediumcells
1)
2)
ratio(%)b)
0-0 (NC)

100

16.4

109

0

-

-

-

-

32.8

97

3

-

-

-

-

65.6

100

0

-

-

-

-

131

94

6

-

-

-

-

263

100

0

-

-

-

-

525

91

9

-

-

-

-

1050

85

15

-

-

-

-

2100

76

24

-

-

-

-

Concentration of 50% cell-growth inhibition : above

2100

μg/mL

NC : Negative Control (water for injection)a) The plate in the negative control group was regarded as a 100% growth.
b) Cell-growth inhibition ratio was shown as 100 - RCC. The value was regarded as 0%, when value was 0 and fewerc) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after additionof the test solutions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test solutions and 2)atthe end of treatment.
d) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
e) - : No changes of colorf) - : Absence of precipitates
All calculations were carried out using Excel 201032

T-G195

Appendix 3-1

Results of observation in the chromosome aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwith 2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Short-term treatment : -S9 mix]
Chromosome aberration test
Observationa)
Treatment andS9 time Concentration
Condition of cellsb) Color of mediumc)(μg/mL)mix (hr)-

6-18

Test article

Study type

Precipitates/Crystalsd)1)2)0 (NC)

-

-

-

-

525

-

-

-

-

1050

-

-

-

-

2100

-

-

-

-

-

-

-

-

PC

NC : Negative Control (water for injection)
PC : Positive control (mitomycin C : 0.075 μg/mL)a) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after addition of
the test solutions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test solutions and 2)at the endof treatment.
b) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
c) - : No changes of colord) - : Absence of precipitates33T-G195

Appendix 3-2

Results of observation in the chromosome aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwith 2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Short-term treatment : +S9 mix]
Chromosome aberration test
Observationa)
Treatment andS9 time Concentration
Condition of cellsb) Color of mediumc)(μg/mL)mix (hr)+

6-18

Test article

Study type

Precipitates/Crystalsd)1)2)0 (NC)

-

-

-

-

525

-

-

-

-

1050

-

-

-

-

2100

-

-

-

-

-

-

-

-

PC

NC : Negative Control (water for injection)
PC : Positive control (cyclophosphamide : 14 μg/mL)a) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after addition of
the test solutions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test solutions and 2)at the endof treatment.
b) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
c) - : No changes of colord) - : Absence of precipitates34T-G195

Appendix 3-3

Results of observation in the chromosome aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwith 2,4-Dimethylbenzenesulfonic Acid Sodium Salt Monohydrate[Continuous treatment : 24hr]
Chromosome aberration test
Observationa)
Treatment andS9 time Concentration
Condition of cellsb) Color of mediumc)(μg/mL)mix (hr)-

24-0

Test article

Study type

Precipitates/Crystalsd)1)2)0 (NC)

-

-

-

-

525

-

-

-

-

1050

-

-

-

-

2100

-

-

-

-

-

-

-

PC

／

NC : Negative Control (water for injection)
PC : Positive control (mitomycin C : 0.050 μg/mL)a) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after addition of
the test solutions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test solutions and 2)at the endof treatment.
b) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
c) - : No changes of colord) - : Absence of precipitates35

T‑G19S

信頼性保証書 (
1
/
2
)

試験番号

T‑G195

試験表題

2,
4ージメチルベンゼンスルホン酸ナトリウムのほ乳類培養細胞を用いる染色体異常試験

本試験は以下に示す基準を遵守して実施されたことを保証致します。

•「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準」（平成 23年 3

月 31 日、薬食発 0331第 8号、平成 23・03・29製 局 第 6号、環保企発第 110331010
号）

なお、調査は下記の通り実施致しました。

ふ0
/／ 年

3月 ｝ 互株式会社ボゾリサーチセンター
信頼性保証部門試験における調査
項

目

担当者

調

査

試験責任者及び運営管理者への
報告日

日

試験計画書

2015年 1
2月 1
1日

細胞播種

2016年

1月

9日

2016年

1月 1
2日

調製・保存（被験物質・陽性対

2016年

1月 1
2日

2016年

1月 1
2日

染色体標本作製（固定）

2016年

1月 1
3日

2016年

1月 1
4日

染色体標本作製（染色）

2016年

1月 1
4日

2016年

1月 1
4日

染色体標本観察2016年

1月 27日

2016年

1月 2
8日

被験物質の安定性測定

2016年

2月 1
8日

2016年

2月 1
8日

生データ

2016年

3月

8日

2016年

3月

8日

2016年

3月

8日

2016年

3月

8日

2015年 12月 11日

照物質）、被験物質の処理

最終報告書草案

図・表・付表36

T‑Gl95

信頼性保証書（ 2
/
2
)

項

目

担当者

調

査

試験責任者及び運営管理者への
報告日

日

申請資料

2016年

3月

9日

2016年

3月

最終報告書

2016年

3月 22日2016年

3月 22日

9日

施設調査

項

目

担当者

調

培養細胞の性状検査

3
7

査部門責任者及び運営管理者への
報告日

日

2015年

9月

4日

2015年

9月

7日

2015年

9月

8日

2015年

9月

9日

2015年

9月 I
O日

2015年

9月 II日

2015年

9月 1
7日

2015年

9月 1
7日