第 86 回 日本細菌学会北海道支部学術総会
The 86th Annual Conference ofJapanese Society for Bacteriology Hokkaido Branch2021 年 8 月 28 日（土）August 28, 2021 (Sat)オンライン
Online北海道大学人獣共通感染症国際共同研究所
Hokkaido University International Institute for Zoonosis Control

一般演題：発表 10 分間、質疑応答 2 分間
Oral Session: Presentation 10 min, Discussion 2 min

特別公演：公演 50 分間、質疑応答 10 分間
Special Lecture: Lecture 50 min, Questions and Answers 10 min

プログラム
開会挨拶
鈴木 定彦

Program
9:00-9:10

北海道大学人獣共通感染症国際共同研究所

セッション１ Session 1
9:10-10:10
座長： 佐藤 豊孝 札幌医科大学・医学部
Chair: Toyoyaka Sato, Sapporo Med Univ School of Med
演題１. 口腔カンジダ症患者と非口腔カンジダ症患者由来の Candida albicans の病原性の比較〇大内 千里 1, 2、長谷部 晃 2、北川 善政 1、坂田 健一郎 11
北海道大学大学院歯学研究院 口腔診断内科学教室、2 北海道大学大学院歯学研究院 口腔分子微生物学教室
演題 2. Porphyromonas gingivalis の Mfa1 線毛構成タンパク質をコードする遺伝子の多型解析榮 宏太朗 1、〇永野 恵司 2、長谷川 義明 1
1
愛知学院大・歯・微生物、2 北海道医療大・歯・微生物
演題 3. Salmonella 属菌における百日咳毒素様毒素(ArtAB)遺伝子の細胞内発現〇佐藤 凜 1、三浦 祥 1、村田 亮 1、玉村 雪乃 2、渡久川 兼誉 1、別府 美保 1、
野崎 千遥 1、楠本 正博２、内田 郁夫１１
酪農学園大学・獣医学群・獣医細菌学ユニット、２農研機構・動物衛生研究
部門・人獣共通感染症研究領域
演題 4. 抗菌薬の繰り返し暴露が Clostridioides difficile の性状に与える影響の解明〇
鈴木 和総 1、福田 昭 1、中島 千絵 2、鈴木 定彦 2、臼井 優 1
1
酪農学園大学 獣医学類 食品衛生学ユニット、2 北海道大学 人獣共通感染症
国際共同研究所 バイオリソース部門
演題 5. Host-based approach for identifying virulence factors of pathogens〇
Atmika Paudel1, Yoshikazu Furuta1, Suresh Panthee2, Hiroshi Hamamoto3,
Kazuhisa Sekimizu2, Hideaki Higashi1
1Division of Infection and Immunity, International Institute for Zoonosis Control,
Hokkaido University, Hokkaido, Japan, 2 Drug Discoveries by Silkworm Models,Faculty of Pharma-Science, Teikyo University, 3 Teikyo University Institute ofMedical Mycology
休憩

10:10-10:25

セッション２ Session 2
10:25-11:15
座長：タパ ジーワン 北大・人獣国際共同研
Chair: Jeewan Thapa, Hokkaido Univ Intl Inst Zoonosis Contl
演題 6. Genome investigations of livestock-associated methicillin-resistant
Staphylococcus aureus ST398 from food products in Thailand

Wimonrat Tanomsridachchai1, Yukari Fukushima1, Pimlapas Leekitcharoenphon2,
Neunghatai Supha3, Joseph Yamweka Chizimu1, Jirachaya Toyting1, Thoko Flav
Kapalamula1, Chie Nakajima1,4, Orasa Suthienkul3, Yasuhiko Suzuki1,4
1
Division of Bioresources, Hokkaido University International Institute for Zoonosis
Control, 2Research Group for Genomic Epidemiology, National Food Institute,
Technical University of Denmark, 3Department of Microbiology, Faculty of Public
Health, Mahidol University, Thailand, 4International Collaboration Unit, Hokkaido
University International Institute for Zoonosis Control〇

演題 7. Molecular epidemiological study of Staphylococcus argenteus clinical isolates in
Hokkaido〇
Meiji Soe Aung1）、漆原 範子 1）、川口谷 充代 1）、伊藤 政彦 2）、
幅寺 敏 2）、小林 宣道 1）1）
札幌医科大学医学部衛生学 2）札幌臨床検査センター
演題 8. Analysis of genetic diversity of Bacillus anthracis strains and spatial distributionof anthrax vaccination in Southern Africa〇
Kamboyi H.K1, Hang’ombe B.M2, Munyeme M3, Furuta Y1 and Higashi H1
1
Division of Infection and Immunity, Research Center for Zoonosis Control,
Hokkaido University, 2Microbiology Unit, Paraclinical Studies, School of Veterinary
Medicine, University of Zambia, 3Public Health unit, Disease Control Studies, Schoolof Veterinary Medicine, University of Zambia
演題 9. Development of ELISA based on Bacillus anthracis capsule biosynthesis protein
CapA for naturally acquired antibodies against anthrax〇
Tuvshinzaya Zorigt1,2, Yoshikazu Furuta1,2, Manyando Simbotwe1, Akihiro Ochi3,
Mai Tsujinouchi1, Misheck Shawa1,2, Tomoko Shimizu1, Norikazu Isoda4,
Jargalsaikhan Enkhtuya5, and Hideaki Higashi1,21Division of Infection and Immunity, International Institute for Zoonosis Control,
Hokkaido University, 2Graduate School of Infectious Diseases, School of Veterinary
Medicine, Hokkaido University, 3Equine Research Institute, Japan Racing
Association, 4Laboratory of Microbiology, School of Veterinary Medicine, Hokkaido
University, 5Laboratory of Food Hygiene, Institute of Veterinary Medicine,
Ulaanbaatar, Mongolia
休憩

11:15-11:30

セッション 3 Session 3
11:30-12: 20
座長：福田 昭 酪農学園大・獣医学類
Chair: Akira Fukuda, Dept Vte Med, Rakuno Gakuen Univ
演題 10. 下水およびシンクから採取した繊毛虫の Legionella pneumophila に対する感
受性の検討〇
川代 愛梨１、玄行 理子１、大久保 寅彦１、中村 眞二２、Jeewan Thapa３、
山口 博之１
１
北大院 保科・病態解析、２順天堂大院 医・形態解析イメージング、３北大・
人獣リサーチセンター演題 11. 3D プリンターで作製したエアサンプラーを用いた空気浮遊細菌の分離と同定〇
森 沙彩 1 、宮崎 悟 1、石黒 咲良 1、鷲見 優斗 1 、大久保 寅彦 1、
大森 亮介 2、山口 博之 1
1
北大院・保科・病態解析、2 北大・人獣リサーチセンター
演題 12. 高頻度接触乾燥面での大腸菌の生存性を規定する因子の同定とその制御法の探索〇
今野 綾乃１、藤井 菜央 1、榎枝 秀朗１、大久保 寅彦１、Thapa Jeewan2、
佐藤 豊孝 3、横田 伸一 3、山口 博之 1
１
北大院・保科・病態解析、２北大・人獣リサーチセンター、３札医大・医・微生物
演題 13. アメーバによる細菌運搬現象と Na+/H+ アンチポーターNhaA との関係性の検証〇
大久保 寅彦１、田中 菜那１、Thapa Jeewan2、佐藤 豊孝 3、横田 伸一 3、
山口 博之 1
１
北大院・保科・病態解析、２北大・人獣リサーチセンター、３札医大・医・
微生物休憩

12:20-13:20

セッション 4 Session 4
13:20-14:10
座長：パウデル アトミカ 北大・人獣国際共同研
Chair: Atmika Paudel, Hokkaido Univ Intl Inst Zoonosis Contl
演題 14. Impact of substituents at 1 and 8 of fluoroquinolones on the activity against
mutant DNA gyrases of Salmonella Typhimurium〇
Pondpan Suwanthadaa, Nami Ajimaa, Lawrence P. Belotindosa, Jirachaya Toytinga,
Ruttana Pachanona, Kentaro Koideb, Hyun Kimb, Chie Nakajimaa,c, Siriporn
Kongsoid, Yasuhiko Suzukia,caDivision of Bioresources, Hokkaido University International Institutefor Zoonosis Control, b Department of Bacteriology II, National Institute of
Infectious Diseases, c International Collaboration Unit, Hokkaido University
International Institute for Zoonosis Control, d Department of Veterinary Public
Health, Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, Thailand
演題 15. WQ-3034 & WQ-3154: The New Fluoroquinolones with High Inhibitory Effectagainst Quinolone-Resistant Salmonella Typhimurium DNA Gyrase〇
Jirachaya Toyting1, Nami Ajima1, Wimonrat Tanomsridachchai1,
Lawrence P. Belotindos1, Thoko Flav Kapalamula1, Hyun Kim2, Fuangfa
Utrarachkij3, Jeewan Thapa1, Chie Nakajima1,4, Yasuhiko Suzuki1,4*
1
Division of Bioresources, Hokkaido University International Institute for Zoonosis
Control, 2Department of Bacteriology II, National Institute of Infectious Diseases,
3
Department of Microbiology, Faculty of Public Health, Mahidol University,
Thailand, 4Global Institution for Collaborative Research and Education, Hokkaido
University

演題 16. Whole Genome Sequencing Reveals Recent Transmission of Multi-drug
Resistant Mycobacterium tuberculosis Central Asian Strains in Lusaka,
Zambia〇Joseph Yamweka CHIZIMU1,2,3, Eddie SOLO1,3, Yukari FUKUSHIMA1, Precious
BWALYA1, Victor MUKONKA2,3, Chie NAKAJIMA1, Yasuhiko SUZUKI1
1
Division of Bioresources, Hokkaido University International Institute for Zoonosis
Control, 2Zambia National Public Health Institute. 3Ministry of Health, Zambia
演題 17. Characterization of mutations associated with streptomycin resistance inmultidrug resistant Mycobacterium tuberculosis in Zambia〇
Precious Bwalyaa,b, Tomoyuki Yamaguchia, Eddie Solob, Joseph Y. Chizimua,
Grace Mbulob, Chie Nakajimaa,c,*, Yasuhiko Suzukia,c,*aDivision of Bioresources, Hokkaido University International Institute for Zoonosis
Control, bDepartment of Pathology and Microbiology, University Teaching Hospital,
Ministry of Health, Zambia, cInternational Collaboration Unit, Hokkaido University
International Institute for Zoonosis Control
休憩

14:10-14:25

セッション 5 Session 5
14:25-15:25
座長：大久保 寅彦 北大・保健科学研究院
Chair: Torahiko Okubo, Hokkaido Univ Faculty of Health Sci
演題 18. 焼成ホタテ貝殻粉末と石灰窒素による堆肥中の薬剤耐性菌制御の可能性〇
江浪 誠俊 1、福田 昭 1、中島 千絵 2、鈴木 定彦 2、臼井 優 1
1
酪農学園大学 獣医学類 食品衛生学ユニット、2 北海道大学 人獣共通感染症
国際共同研究所 バイオリソース部門
演題 19. 消毒薬曝露が薬剤耐性遺伝子の接合伝達頻度に及ぼす影響の解明〇
塩野 由花、福田 昭、臼井 優
酪農学園大学 食品衛生学ユニット
演題 20. コリスチン耐性遺伝子保有プラスミドが与えるコリスチン治療および生体内定着への影響評価〇
佐藤 豊孝 1, 山本 聡 1、小笠原 徳子 1、臼井 優 2、林 航 3、長野 則之 3、土井 洋平 4,5、田村 豊 6、髙橋 聡 7,8 、横田 伸一 11
札幌医科大学・医学部・微生物学、2 酪農学園大学・獣医学群・食品衛生学、3 信州大学大学院・総合医理工学研究科・医学系専攻、4 藤田医科大学・微生物学・感染症科、5 ピッツバーグ大学医学部・感染症内科、6 酪農学園大
学・動物薬教育研究センター、7 札幌医科大学・医学部・感染制御・臨床検査医学、 8 札幌医科大学附属病院・検査部
演題 21. Enterobacter cloacae complex におけるコリスチン耐性機序の解明〇
福澤 翔太 1,2、佐藤 豊孝 1、青木 弘太郎 3、福島 由華里 4、山本 聡 1、小笠
原 徳子 1、中島 千絵 4、鈴木 定彦 4、髙橋 聡 5,6、横田 伸一 1１
札幌医科大学医学部微生物学講座、２北海道がんセンター臨床検査科、3 東邦大学医学部微生物・感染症学講、4 北海道大学人獣共通感染症リサーチセンター、5 札幌医科大学医学部感染制御・臨床検査医学講座、6 札幌医科大学
附属病院検査部
演題 22. Clonal transmission of multidrug-resistant Escherichia coli ST69 between
poultry and humans in Lusaka, Zambia〇
Misheck Shawa,a Yoshikazu Furuta,a Atmika Paudel,a Bernard Hang’ombe,bHideaki Higashia#aDivision of Infection and Immunity, International Institute for Zoonosis Control,
Hokkaido University, Sapporo, bDepartment of Para-clinical Studies, School of
Veterinary Medicine, University of Zambia, Zambia
休憩

15:25-15:40

特別公演
座長：鈴木 定彦 北大・人獣国際共同研
Chair: Yasuhiko Suzuki, Hokkaido Univ Intl Inst Zoonosis Contl

15:40-16:40

わが国における動物由来薬剤耐性菌研究の過去・現在・未来
田村 豊
酪農学園大学動物薬教育研究センター

支部会賞授賞式

16:40-16:55

閉会式

16:55-17:00

演題１

支部会賞選考対象者

口腔カンジダ症患者と非口腔カンジダ症患者由来のCandida albicans の病原性の比較〇

大内 千里 1, 2、長谷部 晃 2、北川 善政 1、坂田 健一郎 112

北海道大学大学院歯学研究院 口腔診断内科学教室
北海道大学大学院歯学研究院 口腔分子微生物学教室

口腔カンジダ症は口腔内の常在菌である Candida 属菌種による日和見感染であり、Candida 菌は宿主の加齢や薬剤による免疫機能の低下、口腔乾燥や義歯の使用によって増殖し、口腔内の疼痛や味覚異常などの様々な症状を引き起こすことが知られている。しかし宿主側だけではなく Candida 菌自体の違いもある可能性があるではないかと考え、口腔カンジダ症患者と非口腔カンジダ症患者由来の Candida
albicans を用いて病原性を比較・検討することにした。
対象は北海道大学病院歯科診療センターを受診し口腔内の疼痛等の症状を訴えカンジダ検査を実施した患者とした。歯科用ミラーにて舌背を 10 回程度擦過し採取したサンプルを Candida 菌と特異性の高いクロモアガー培地に接種し 48 時間インキュベーターにて培養した。その結果、当センター診断基準に基づきコロニーが 10 個以上あったものを口腔カンジダ症、コロニーが検出されても 10 個未満であったものを
非口腔カンジダ症と判断した。クロモアガー培地で検出された C. albicans をサブロ
ー液体培地で培養後、使用時まで冷凍保存した。これらの冷凍保存株を用いて以下の、①寒天培地を用いた細胞外分泌酵素活性（アスパラギン酸プロテアーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ヘモリジン）の測定、②PCR による C. albicans の遺伝子型の同定、③口腔上皮細胞系細胞の C. albicans 刺激で誘導される IL-8 の ELISA法による測定、ならびに④ C. albicans により誘導される口腔上皮細胞系細胞への細胞死の誘導を LDH の測定で調べる方針とし、結果を比較して口腔カンジダ症患者と非口腔カンジダ症患者での病原性の違いを検討し
た。

演題 2

Porphyromonas gingivalis の Mfa1 線毛構成タンパク質をコードする遺伝子の多型解析
榮 宏太朗 1、〇永野 恵司 2、長谷川 義明 1
1

2

愛知学院大・歯・微生物
北海道医療大・歯・微生物

Porphyromonas gingivalis（グラム陰性嫌気性細菌）は、歯周病の発症や進行に強く関連する。本菌は、通常、FimA および Mfa1 と呼ばれる 2 種類の線毛を発現する。
両線毛は、主要タンパク質である FimA および Mfa1 に加え、それぞれ、4 つのアクセサリータンパク質（FimB～FimE および Mfa2～Mfa5）から構成される。また、これらのタンパク質をコードする fimA～fimE 遺伝子および mfa1～mfa5 遺伝子は、染色体上で、それぞれクラスターを形成している。
fimA には 5 つの遺伝子型が存在し、遺伝子型と病原性との間に関連性が存在する
ことが報告されている。一方、mfa1 には、53 型（mfa153）および 70 型（mfa170）の2 つの遺伝子型が報告されているが、病原性との関連は明確ではない。本研究では、
P. gingivalis のゲノム未解読の 12 株と、ゲノムが公開されている 62 株（計 74 株）の、mfa1～mfa5 の遺伝子多型について解析した。また、fimA～fimE、および mfa 遺伝子クラスターの下流に位置 し、遺伝子多型が報告されている ragA および ragB の多型についても解析した。
mfa1 遺伝子型は、これまでの報告通り、mfa153 と mfa170 に分類されたが、mfa170
は、さらに、2 つのサブタイプ（70A および 70B 型）に分類されることが示された。
また、mfa2～mfa4 にも多型が認められ、それらの遺伝子型は、mfa1 の遺伝子型と一致した。ただし、70 型のサブタイプは観察されなかった。一方、mfa5 は、他の遺伝子型とは独立し、5 つの遺伝子型（A～E）がみられた。遺伝子型 A はさらに 2 つのサブタイプ（A1 と A2）に分類された。また、驚いたことに、mfa5 遺伝子が、2 つ連
続して並んで存在する株が存在した。さらに、その場合、2 番目の mfa5 は、すべてE 型であった。Mfa5 タンパク質の C 末側は、すべての遺伝子型で高い相同性がみら
れ、IX 型分泌装置によって認識される C 末端ドメインも高度に保存されていた。一方、A、B および C 型の N 末側には、von Willebrand factor ドメインや免疫グロブリ
ン様ドメインが検出されたが、D および E 型にはみられなかった。mfa1 遺伝子型は、
ragA／ragB 遺伝子型と相関する傾向がみられたが、fimA 遺伝子型との相関は認められなかった。
本研究から、Mfa1 線毛の遺伝子型と病原性との解析には、mfa1 遺伝子型だけではなく、アクセサリータンパク質の遺伝子型、特に、mfa5 との関連性、さらに、他の遺伝子の多型との関連性について検討する必要が示唆される。

演題 3

支部会賞選考対象者

Salmonella 属菌における百⽇咳毒素様毒素(ArtAB)遺伝⼦の細胞内発現○佐藤 凜 1、三浦 祥 1、村⽥ 亮 1、⽟村 雪乃 2、渡久川 兼誉 1
別府 美保 1、野崎 千遥 1、楠本 正博２、内⽥ 郁夫１．
酪農学園⼤学・獣医学群・獣医細菌学ユニット
農研機構・動物衛⽣研究部⾨・⼈獣共通感染症研究領域
１２【背景】Salmonella Typhimurium ファージ型 DT104 (DT104) 、S.Worthington (SW) などのサルモネラ属菌が百⽇咳毒素と類似した毒素 ArtA/ArtB (ArtAB) を産⽣することが報告されている。これまでの研究により、artAB 遺伝⼦はマイトマイシン C(MTC) 、キノロン系抗⽣物質、H₂O₂などの処理により誘導的に発現することが知られているが、in vivo での発現は不明である。そこで本研究では DT104 をマクロファージ様細胞 RAW264.7 に貪⾷させ、リアルタイム PCR 法および蛍光免疫染⾊法により細胞内における artAB の発現について解析した。
【⽅法】DMEM 培地で RAW264.7 細胞を培養後、phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA ; 0.2μ M) を添加し、マクロファージ由来の H₂O₂産⽣を誘導した。そこへ
Syncase 培地で⼀晩振とう培養し、正常マウス⾎清によりオプソニン化した DT104
を MOI 50:1 となるように加えインキュベートした。その後、ゲンタマイシン処理に
より細胞外の菌を除去し、3 時間培養後、0.1 ％の Triton X-100 で細胞を溶解して得られた細胞内の菌から total RNA を抽出した。この RNA を⽤いて、リアルタイム
PCR 法により各遺伝⼦の発現量を定量した。
【結果と総括】RAW264.7 細胞内での DT104 の artA 発現量は、in vitro での発現量と⽐較して有意に増加した。また、細胞の H₂O₂を含む活性酸素種の産⽣を刺激することが知られている PMA で処理した群では、無処理群と⽐較し発現量がさらに増加していた。これらのことから artAB は RAW264.7 細胞内で誘導的に発現し、その発現誘導はマクロファージ由来の H₂O₂で増強することが⽰唆された。また、DT104 では oxyR と cⅠの発現量に有意な変化が認められなかったが、SW では細胞内で oxyRと cⅠが有意に増加し、artA の有意な増加が⾒られなかった。以上より、マクロファージ内における DT104 の artAB は H₂O₂により誘導的に発現するが、SW のようにoxyR の発現応答が強い菌では CⅠによりファージ誘導が抑制されるために artAB の細胞内発現が弱くなることが⽰唆された。

演題 4

支部会賞選考対象者

抗菌薬の繰り返し暴露がClostridioides difficile の性状に与える影響の解明○

鈴木 和総 1、福田 昭 1、中島 千絵 2、鈴木 定彦 2、臼井 優 1
1

2

酪農学園大学 獣医学類 食品衛生学ユニット
北海道大学 人獣共通感染症国際共同研究所 バイオリソース部門【背景・目的】Clostridioides difficile（CD）は芽胞を形成するグラム陽性偏性嫌気性桿菌で、抗菌薬関連下痢症の主要な原因菌である。CD 感染症は再発率が高いことが問題となっており、要因の一つとして、治療後も芽胞が腸内に残存することが考えられている。CD はヒトと動物の腸内に高率に存在し、ヒトおよび獣医療において、頻繁に抗菌薬に暴露されている。それゆえ、抗菌薬による耐性変異体や芽胞の選択が繰り返されているが、抗菌薬の繰り返し暴露が CD の性状に与える影響の評価は不十分である。そこで、ヒトおよび獣医療において使用頻度が高い抗菌薬を CD に繰り返し暴露し、影響について芽胞形成率に着目して評価した。
【材料と方法】
CD ATCC1382 にセファゾリン、シプロフロキサシン（CPFX）、テトラサイクリ
ンを 5 回暴露した。すなわち、最小発育阻止濃度（MIC）の 0.25～4 倍（低濃度）、または MIC の 10 倍（高濃度）の抗菌薬を含有する液体培地で継代を繰り返した。その後、暴露菌群および単離された進化株の MIC と芽胞形成率を測定した。
また、芽胞形成率が上昇した進化株の全ゲノム解析を行った。
【結果と考察】低濃度暴露では CPFX 暴露群のみ CPFX に対する MIC が上昇した。一方、高濃度暴
露では MIC に変化はなく、全ての抗菌薬の暴露で芽胞形成率が上昇した。全ゲノム解析の結果、複数の遺伝子に変異が認められた。以上の結果より、抗菌薬の繰り返
し暴露により、芽胞が選択され、集団での芽胞形成率が上昇した。また、芽胞形成率の上昇は、複数の遺伝子の変異による複合的な変化によって起こることが示唆された。以上のことから、CD の芽胞形成率は、抗菌薬の種類に関わらず、抗菌薬暴露により上昇することが明らかとなった。

演題 5

支部会賞選考対象者

Host-based approach for identifying virulence factors of
pathogens○1

Atmika Paudel1, Yoshikazu Furuta1, Suresh Panthee2, Hiroshi Hamamoto3,
Kazuhisa Sekimizu2, Hideaki Higashi1

Division of Infection and Immunity, International Institute for Zoonosis Control, Hokkaido
University
2
Drug Discoveries by Silkworm Models, Faculty of Pharma-Science, Teikyo University
3
Teikyo University Institute of Medical Mycology

Pathogens sense host factors after coming in contact with the host and produce virulence factors.
Virulence factors production allows pathogens to survive and resist host attack and prepare afavorable environment for the establishment of infection. Therefore, a host-based approach is
required for understanding the behavior of the pathogens during infection. I propose the use ofsilkworm (Bombyx mori), an invertebrate animal, as the in vivo platform for identifying
pathogen virulence factors required for infection. Silkworms possess innate immunity andrespond to pathogen invasion by activating humoral and cellular immune responses. Human
pathogenic bacteria are also pathogenic to silkworms, and infected worms can be rescued byclinically used antibiotics indicating that they can be used as model animals to study infections
caused by human pathogens. Furthermore, silkworms are big enough to inject with the precise
number of microbial cells, allowing the quantitative comparison of virulence among thepathogens. Yet, they are small enough and easy to handle to facilitate large-scale screening.
Using the silkworm infection model, we screened the gene-disrupted mutant library of a highly
pathogenic Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. We discovered eight novel virulence
factors which were also required for virulence of S. aureus in the mice infection model. We
characterized one of the virulence factors, YjbH, and found that it regulates the expression ofmany virulence-related genes and protects the bacteria from oxidative stress in vivo. Due to agood correlation of the virulence factors in silkworms and mice, we propose that silkworm isa suitable animal model for determining the virulence of pathogens. In this presentation, I will
introduce the utilization of silkworms to identify virulence factors of pathogenic bacteria.

演題 6

支部会賞選考対象者

Genome investigations of livestock-associatedmethicillin-resistant Staphylococcus aureus ST398 fromfood products in Thailand〇

Wimonrat Tanomsridachchai1, Yukari Fukushima1, Pimlapas Leekitcharoenphon2,
Neunghatai Supha3, Joseph Yamweka Chizimu1, Jirachaya Toyting1, Thoko Flav
Kapalamula1, Chie Nakajima1,4, Orasa Suthienkul3, Yasuhiko Suzuki1,4

1

Div Bioresources, Hokkaido University International Institute for Zoonosis Control
Research Group for Genomic Epidemiology, National Food Institute, Technical Universityof Denmark, Denmark
3
Dept Microbiology, Faculty of Public Health, Mahidol University, Thailand.
4International Collaboration Unit, Hokkaido University International Institute for Zoonosis
Control

2

Background: Animal food products might serve as potential vehicles for the transmissionof Livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (LA-MRSA) ST398. LAMRSA ST398 is the most widely disseminated in European countries, while ST9 is more
predominant in Asian countries. In recent years, the LA-MRSA ST398 in Thailand was
detected in swine and pork. However, the origin and route of transmission of LA-MRSA ST398
in Thailand are unclear and have not been investigated. The objective of this study was todetermine the possible origins of LA-MRSA ST398 in Thailand.
Methods: Genomic characterization of seven Thai LA-MRSA ST398 from slaughtered pig(n=1) and pork samples (n=6) were performed by whole-genome sequencing (WGS).
Moreover, genomes from the public database were included in this analysis to reconstruct
phylogenetic relationship based on Single-nucleotide polymorphisms (SNPs).
Results: The results showed that Thai LA-MRSA ST398 in animal food products wererelated to Danish lineage. L1 and L3 were the dominant lineage in these isolates. All seven
LA-MRSA ST398 strains were of SCCmec type V. Six of all LA-MRSA ST398 strains were
spa t034 and one was spa t1255. All isolates were found to carry exoenzyme genes (aur) andtoxin genes (hlgA, hlgB, and hlgC). There was one isolate carrying genes encoding
staphylococcal enterotoxins (seg, sei, sem, sen, and seu) that belonged to spa t1255.
Conclusions: It is important to continue investigating the origin of LA-MRSA ST398
among animal food production chain. Moreover, implementation of effective measures toprevent the transmission of LA-MRSA among pigs, humans, and animal foods is necessary.

演題 7

Molecular epidemiological study of Staphylococcus
argenteus clinical isolates in Hokkaido〇

Meiji Soe Aung1）、漆原 範子 1）、川口谷 充代 1）、伊藤 政彦 2）、幅寺 敏 2）、
小林 宣道 1）
1）

札幌医科大学医学部衛生学
2）
札幌臨床検査センター

BACKGROUND: Staphylococcus argenteus is a novel staphylococcal species that is
genetically close to S. aureus. Although it has been increasingly reported worldwide as a
causative agent of various infectious diseases, the epidemiological situation in Japan has not
yet been well clarified. This study was conducted to determine prevalence of S. argenteus
clinical isolates in Hokkaido, and analyze their genetic characteristics, including drug
resistance determinants and virulence factors.
METHODS: S. argenteus were isolated from various clinical specimens that were submitted
to the Sapporo Clinical Laboratory Inc., Sapporo, Japan, from medical facilities in Hokkaido
for one year from August 2019. Initial screening of S. argenteus was performed by MALDITOF MS and confirmed genetically by PCR and direct sequencing of NRPS gene. Resistanceto various drugs were examined by broth microdilution test, genotypes and the presence ofvirulence factors/drug resistance genes were analyzed by PCR and sequencing.
RESULTS: A total of 82 strains of S. argenteus were isolated in one year, whichcorresponded to 0.66% of total number of S. aureus isolates in the same period. They wereclassified into three genotypes, ST2250-coa-XId (37, 45.1%), ST1223-coa-XV (25, 30.5%),
and ST2198-coa-XIV (20, 24.4%). The source of clinical specimens was diverse, mostly
from sputum, followed by stool, nasal discharge, and otorrhea. All the ST1223 isolates had
egc-2 cluster (seg-sei-sem-sen-seo-seu) and 60% of isolates harbored seb (seb3 and one novel
variant seb6). All the ST2250 isolates had sey, and 68% of this ST carried sel26-sel27.
Panton-Valentine leucocidin (PVL) genes were detected in only an ST2250 isolate, andanother one ST2250 isolate was resistant to oxacillin and had mecA gene located in SCCmecIVc. Various drug resistance genes such as blaZ, erm(C), msr(A), aac(6’)-Ie-aph(2’’)-Ia, andlnuA were identified mostly in ST2198 isolates that showed resistance to penicillin,
macrolide, and aminoglycoside.
CONCLUSION: This study revealed the persistently low prevalence of S. argenteus
comprising three STs in Hokkaido, Japan. Antimicrobial susceptibility and the prevalence ofvirulence factors were different depending on ST.

演題 8

支部会賞選考対象者

Analysis of genetic diversity of Bacillus anthracis strains
and spatial distribution of anthrax vaccination inSouthern Africa〇

Kamboyi H.K1, Hang’ombe B.M2, Munyeme M3, Furuta Y1 and Higashi H1

1

Division of Infection and Immunity, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido
University
2
Microbiology Unit, Paraclinical Studies, School of Veterinary Medicine, University ofZambia, Zambia
3
Public Health unit, Disease Control Studies, School of Veterinary Medicine, University ofZambia, Zambia
Bacillus anthracis, the causative agent of anthrax, is a multi-host zoonotic pathogen
affecting populations worldwide, especially in resource limited countries. B. anthracis forms
spores that are highly resistant to extremes of weather and chemicals, enabling it to survive insoil for several decades.
We conducted anthrax risk mapping and anthropogenic assessment for sporadic
outbreaks in Zambia. A total of 80 spatially compounded environmental and biological samples
were collected within livestock production and wildlife conservation areas in the upper
Zambezi basin. B. anthracis was identified via multiplex PCR targeting the chromosomal
BA813 and 16S rRNA genes, pXO1 protective antigen (pag) gene, and pXO2 capsule (cap)gene. From the 80 samples, 15 (10 soil and 5 carcass) pure isolates of B. anthracis wereobtained, which were spatially clustered across four districts. Questionnaires (n = 113) wereadministered in independent villages distinct in time and space. Multivariate logistic regression
revealed 12 biologically plausible variables, including herd size (OR = 10.46; 95% CI = 8.8–16), carcass disposal method (OR = 6.9; 95% CI = 3.4–9.8), poor veterinary services (OR =10.87; 95% CI = 4.8–15.9), and management system (OR = 2.57; 95% CI = 1.3–7.5). The odds
of outbreaks were 10 times more in non-vaccinated herds than those vaccinated in similar
endemic areas. Our results suggested that poor veterinary services, particularly the lack ofanthrax vaccination, increased the likelihood of outbreak recurrency. Furthermore, theobserved environmental contamination with B. anthracis spores was likely caused by anthrax
carcass dressing and meat distribution, a common practice in the study area.
In southern Africa, anthrax has emerged as a serious transboundary disease, but control
strategies vary in each country. Given our previous findings, we intend to expand our analysis
to include other countries in the southern African region. We will conduct a whole genomebased analysis of the genetic diversity of B. anthracis strains to detect single nucleotide
polymorphisms, insertions, and deletions. As a novel approach, we will also map the
distribution of anthrax vaccine-induced antibodies detected on enzyme-linked immunosorbent
assay versus outbreaks to show the correlation between vaccination levels and outbreaks. We
envisage the findings of this study will influence policy direction in southern Africa aimed atharmonizing effective anthrax control strategies.

演題 9

支部会賞選考対象者

Development of ELISA based on Bacillus anthracis
capsule biosynthesis protein CapA for naturally acquired
antibodies against anthrax〇

1

Tuvshinzaya Zorigt1,2, Yoshikazu Furuta1,2, Manyando Simbotwe1, Akihiro Ochi3, Mai
Tsujinouchi1, Misheck Shawa1,2, Tomoko Shimizu1, Norikazu Isoda4, Jargalsaikhan
Enkhtuya5, and Hideaki Higashi1,2Division of Infection and Immunity, International Institute for Zoonosis Control, Hokkaido
University
2
Graduate School of Infectious Diseases, School of Veterinary Medicine, Hokkaido
University
3
Equine Research Institute, Japan Racing Association
4
Laboratory of Microbiology, School of Veterinary Medicine, Hokkaido University
5
Laboratory of Food Hygiene, Institute of Veterinary Medicine, Ulaanbaatar, Mongolia

Abstract: Anthrax is a worldwide zoonotic disease caused by Bacillus anthracis, which remains
hyperendemic in parts of Africa and Asia. Detecting naturally acquired antibodies against
anthrax in animals is critical for anthrax surveillance and effective control measures.
Serological assays based on protective antigen (PA) of B. anthracis are primarily used foranthrax surveillance and vaccine evaluation. Even though the assay is reliable, it is challenging
to distinguish the naturally acquired antibodies from vaccine-induced immunity in animals
because PA is cross-reactive to both antibodies. Although additional data on the vaccination
record of animals could bypass this problem, such data are not readily accessible in many cases.
Here we developed a new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) specific toantibodies against capsule biosynthesis protein CapA antigen of B. anthracis, which is noncross-reactive to vaccine-induced antibodies in horses. Using in silico analyses, we screened
coding sequences encoded on pXO2 plasmid, which is absent in the veterinary vaccine strain
Sterne 34F2 but present in virulent strains of B. anthracis. Capsule biosynthesis protein CapA
(GBAA_RS28240) and peptide ABC transporter substrate-binding protein (GBAA_RS28340)
were detected by antibodies in infected horse sera among the 8 selected candidates. Of these,
CapA has not yet been identified as immunoreactive in other studies to the best of ourknowledge. In view of the solubility and specificity of whole length CapA, we prepared the Cterminus region of the protein, named CapA322, and developed CapA322-ELISA based on ahorse model. Comparative analysis of the CapA322-ELISA and PAD1-ELISA (ELISA using
domain 1 of PA) showed that CapA322-ELISA could detect anti-CapA antibodies in sera from
infected horses but was non-reactive to sera from vaccinated horses.
The CapA322-ELISA could contribute to anthrax surveillance in endemic areas, and two
immunoreactive proteins identified in this study could be additives to the improvement of
current or future vaccine development.

演題 10

支部会賞選考対象者

下水およびシンクから採取した繊毛虫のLegionella pneumophila に対する感受性の検討○

川代 愛梨１、玄行 理子１、大久保 寅彦１、中村 眞二２、Jeewan Thapa３、山口 博之１
１

２

北大院 保科・病態解析
順天堂大院 医・形態解析イメージング
３
北大・人獣リサーチセンター【背景・目的】河川や土壌に存在するレジオネラ属菌は、エアロゾルを発生させる
人工環境(循環式浴槽、冷却塔等)を介して人に感染するとレジオネラ肺炎などを引き起こす。これら人工環境には、様々な原生生物が生息し、その中でもアメーバは、レジオネラが増殖する場を提供する。一方、アメーバ同様にそれらの環境に生息する繊毛虫のレジオネラの生態における役割は不明な点が多い。アメーバと同様に身の回りの生活用水中に存在する繊毛虫とレジオネラの相互作用について明らかにするために、本研究では下水のシンクトラップから採取した繊毛虫２種および実験室
株の繊毛虫とレジオネラをそれぞれ共培養し、繊毛虫のレジオネラに対する感受性を検討した。【材料・方法】Ⅳ型分泌装置の遺伝的背景が異なる２種の Legionella
pneumophila (Lp) JR32 および JR32 ∆dot/icm (静岡県立大 三宅博士より分与)と、マンホール下水から採取された Anteglaucoma sp. CS11A、シンクトラップから採取された
Colpoda sp. E6、実験室株の Tetrahymena thermophila IB の３種の繊毛虫を用いた。レ
ジオネラと繊毛虫を MOI 10,000 で混和し室温で共培養した。経時的に蛍光顕微鏡と共焦点レーザー顕微鏡を用いて繊毛虫の形態と捕食された Lp の様子を観察し、レジオネラ数と繊毛虫数を算定した。また、Lp JR32 トランスポゾン(Tn)挿入変異株ライ
ブラリーを作成し、一部の繊毛虫への感受性が変化した株の選別も行った。【結果・考察】Tetrahymena IB とは対照的に Anteglaucoma CS11A は dot/icm 依存的に Lp
JR32 との共培養で全滅した。Colpoda E6 は Lp JR32 の取込み量が少なく、Lp の存在に関わらずシスト化した。このように Anteglaucoma CS11A は Lp Ⅳ型分泌装置依存
的に Lp に殺滅され、Colpoda E6 はシスト形成を介して Lp の感染から回避すると考えられた。現在 Anteglaucoma CS11A の死滅に関与するエフェクター分子を探索する
ために、Lp Tn 挿入変異株を用いた Anteglaucoma CS11A との共培養実験を進行中である。

演題 11

支部会賞選考対象者

3D プリンターで作製したエアサンプラーを用いた空気浮遊細菌の分離と同定〇

森 沙彩 1、宮崎 悟 1、石黒 咲良 1、鷲見 優斗 1、大久保 寅彦 1、大森 亮介 2、
山口 博之 11

2

北大院・保科・病態解析
北大・人獣リサーチセンター

浮遊細菌のありのままの生態をより正確に理解するためにもバイアスが生じる遺伝子増幅に頼らない生菌レベルでの捕獲法が必要である。その一方、浮遊細菌の検出にはエアサンプラーが用いられるが、収量の多いフィルター法は乾燥しやすいために生菌数の算出が難しく、生きた細菌の回収に適したインピンジャー法は収量が少ないという欠点がある。本研究では浮遊細菌を生きたまま効率的に回収できるデバ
イスの構築を目的に、サンプラーを 3D プリンターで自作し、その有効性を検証した。エアサンプラーは 3D モデリングソフトウェアで設計し 3D プリンターで作成（素材:PLA、吸気量 2,000L/min）した。予備実験としてサンプラー回収菌数と自由落下細菌数を比較(n=11)した結果、サンプラー回収菌数(687.818±494.045CFU)は落下
細菌数(249.091±224.853CFU)よりも有意に多かった(p=0.018)。次に、実際の採材(n=37)としてビル 3 階の窓を開放してサンプラーを 2 時間稼働させ、内部の R2A 寒天培地に空気を吹き付けた後、30℃で培養して生菌数を数えた。得られた生菌数は
平均 625.811 CFU で、最大 4,320 CFU から最小 19 CFU まで幅があった。また、浮遊細菌数と気象条件（気温・湿度・風速・日射量・降水量、気象庁データを使用）の関係を調べるためにスピアマンの順位相関係数を求めたところ、生菌数と正の相関があった気象条件は風速(rs=0.416, p=0.012)・日射量(rs=0.464, p=0.005)と、負の相関があった気象条件は湿度(rs=-0.521, p=0.002)・24 時間雨量(rs=-0.436, p=0.045)だった。これは、乾燥した風の強い日に生菌数が増加したことを示しており、塵埃の影響と考えられた。さらに、総菌数と生菌数の相関性を確認するため、サンプラーで精製水に空気を吹き付けて得られた回収液から DNA を抽出し、16S rRNA 遺伝子量を測定した結果、遺伝子量と生菌数には正の相関(rs=0.344, p=0.041)がみられた。分
離株のうち、指標菌(S.aureus, E.coli)に対して抗菌活性を有する菌株を阻止円形成の有無で調べた結果、ランダムに選んだ 952 株のうち 67 株(7.04％)がいずれかの指標菌に対し阻止円を形成した。このうち 50 株は Bacillus sp.で、その中でも Bacillus
velezensis は高い抗菌活性を示していた。以上より、3D プリンターを用いた今回のエアサンプラーは、空気中浮遊細菌の生け捕りに有効であり、浮遊細菌と環境因子の関係の推定や分離株の性状解析など多目的に用いることができた。

演題 12

支部会賞選考対象者

高頻度接触乾燥面での大腸菌の生存性を規定する因子の同定とその制御法の探索〇

今野 綾乃１、藤井 菜央 1、榎枝 秀朗１、大久保 寅彦１、Thapa Jeewan2、
佐藤 豊孝 3、横田 伸一 3、山口 博之 1
１

２

北大院・保科・病態解析
北大・人獣リサーチセンター
３
札医大・医・微生物

手すりやドアノブ等の高頻度接触面は、病原細菌を含め多くの病原体が付着するホットスポットであり、接触感染の主要な原因である。これらの接触面は、乾燥環境であり、病原細菌は乾燥抵抗性因子を駆使してその過酷な環境に適応していると考えられている。しかしながら、乾燥面での病原細菌の制御法や乾燥面での生存性を規定する細菌因子は良く分かっていない。一方、私達は、乾燥面での大腸菌の生存性が、37℃程度に温めることで顕著に低下することを発見し(Shimoda ら PLoS ONE,2019)、大腸菌 Tn 挿入変異株ライブラリーから乾燥面での抵抗性を規定する責任遺伝子の候補として Na+/H+ アンチポーターをコードする nhaA を同定した(未発表)。そこで本研究では、温度変化と連動して変化する湿度が、乾燥面での大腸菌の生存性を温度で制御する際に与える影響を検討すると共に、大腸菌 NhaA 欠損株を作成し、NhaA の乾燥面での役割について明らかにした。恒温恒湿度環境は、平衡調温調湿方式の培養装置(制御範囲: -20～＋150℃, 30～95% rh)にて構築した。LB 液体培地に懸濁した大腸菌 DH5α 菌液をプラスチックシャーレ上に滴下（105 CFU/spot）して自然乾燥させ、様々な恒温恒湿度環境(22~37℃, 45~75% rh)にて放置した。最大４日静置
後にスポットを洗浄回収して生菌数を算出した。その結果、37℃で湿度の上昇に伴い大腸菌の生存生は著しく低下した。また E.coli DH5α を元株に、nhaA 欠損株（Red/ET recombination で作製）と再導入株を作出して実験に供試した。その結果、
元株および再導入株では４日目まで菌の生存が認められたが、欠損株は速かに死滅した。また NhaA 特異的阻害剤 2-Aminoperimidine hydrobromide 暴露は、大腸菌の乾燥面での生存性を有意に低下させた。現在、様々な恒温恒湿環境での大腸菌の nhaAの発現変化について検討を進めている。以上の結果より、大腸菌の乾燥面での生存性は、温度のみならず湿度を制御することでより一層抑制できることが明らかになった。また NhaA が大腸菌の乾燥抵抗性を規定する責任分子であることが明らかになった。乾燥時に菌体から細胞外へ Na+を排出することで、水分減少に伴う塩分濃縮に抵抗している可能性がある。

演題 13

アメーバによる細菌運搬現象とNa+/H+ アンチポーターNhaA との関係性の検証〇

大久保 寅彦１、田中 菜那１、Thapa Jeewan2、佐藤 豊孝 3、横田 伸一 3、山口 博之 1
１

２

北大院・保科・病態解析
北大・人獣リサーチセンター
３
札医大・医・微生物

本研究室では以前、土壌から環境クラミジア(Neochlamydia S13)が共生するアメーバ(S13 アメーバ)を分離・株化し(Matsuo et al, Environ Microbiol Rep, 2010)、このアメーバがヒト病原性細菌（大腸菌、サルモネラ、緑膿菌など）を共生細菌依存的にアメーバ表面に固着させ寒天培地上で生きたまま運搬する現象を見いだした(Okubo et al,Environ Microbiol Rep, 2018)。また、大腸菌トランスポゾン挿入変異株ライブラリーを用いた実験から、この現象に関わる細菌側因子として細胞内から細胞外への Na+の輸送を担う Na+/H+ アンチポーターNhaA がその候補であることを特定した（田中ら、日本細菌学会北海道支部会 2019）。本研究では nhaA が運搬現象に関わる因子であることの検証を進めるとともに、その機序についての検討を行なった。E.coli
DH5α を元株に、nhaA 欠損株（Red/ET reconmination で作製）と再導入株を作出し、S13 アメーバと寒天培地上で共培養した結果、欠損株では細菌運搬現象が完全に消失したのに対し、再導入株では現象が復帰した。また、NhaA 特異的阻害剤である 2Aminoperimidine hydrobromide（以下 2-AP） 10/50/100µM 添加下で共培養した結果、2-AP の濃度依存的に細菌運搬現象が減弱した。これらの結果から、S13 アメーバによる細菌運搬現象には細菌の NhaA が必要であることが示された。一方、NhaA を欠損または阻害した E.coli の形態を SEM やグラム染色にて観察すると、本来の菌体形状と比べてフィラメント状の細長い形態になることが確認された。そこで菌体形状のフィラメント化によって運搬現象が阻止されたと仮定し、mitomycin C 0.01 /0.05µg/mL 添加下でフィラメント状になった E.coli DH5α と S13 アメーバを共培養を行ったところ、NhaA 阻害時と同様に運搬現象が減弱した。以上の結果は、S13 アメーバによる細菌運搬現象に関わる細菌側因子として菌体形状が重要であることを示唆している。

演題 14

支部会賞選考対象者

Impact of substituents at 1 and 8 of fluoroquinolones on
the activity against mutant DNA gyrases ofSalmonella Typhimurium
Pondpan Suwanthadaa, Nami Ajimaa, Lawrence P. Belotindosa, Jirachaya Toytinga,
Ruttana Pachanona, Kentaro Koideb, Hyun Kimb, Chie Nakajimaa,c, Siriporn Kongsoid
and Yasuhiko Suzukia,c〇a

Div Bioresources, Hokkaido University International Institutefor Zoonosis Controlb
Dept Bacteriology II, National Institute of Infectious Diseases, Japanc
International Collaboration Unit, Hokkaido University International Institutefor Zoonosis Controld
Dept Veterinary Public Health, Faculty of Veterinary Medicine,
Kasetsart University, Thailand
Aims:
To elucidate the inhibitory activities of WQ-3810, WQ-3334, and WQ-4065, which
had the substituents at 1 and 8 of fluoroquinolones against supercoiling activity ofrecombinant S. Typhimurium mutant DNA gyrases
Materials and methods:
In vitro assays to evaluate inhibitory effects of WQ-3810, WQ-3334, and WQ-4065
against supercoiling activity of recombinant S. Typhimurium DNA gyrase with GyrAWild Type (WT), GyrA-Ser83Ile, GyrA-Ser83Phe, GyrA-Asp87Gly, GyrA-Asp87Asn,
GyrA-Asp87Tyr, and GyrA-Ser83Phe-Asp87Asn were performed. And the Minimum
Inhibitory Concentrations (MICs) for S. Typhimurium and S. Enteritidis of these drugs wereassessed by the micro-broth dilution method.
Results:
Half-maximum Inhibitory Concentrations (IC50s) of WQ-3810 and WQ-3334 against
WT and mutant S. Typhimurium were lower than IC50s of WQ-4065. In addition, the MIC
against S. Typhimurium and S. Enteritidis of WQ-3810 and WQ-3334 were lower than WQ4065.
Conclusion:
This study highlighted the impact of a substituent at 1 and 8 of fluoroquinolones on
WQ-3810 and WQ-3334, which can be candidate drugs for the treatment offluoroquinolone-resistant Salmonellosis.

演題 15

支部会賞選考対象者

WQ-3034 & WQ-3154: The New Fluoroquinolones withHigh Inhibitory Effect against Quinolone-Resistant
Salmonella Typhimurium DNA Gyrase
Jirachaya Toyting1, Nami Ajima1, Wimonrat Tanomsridachchai1,
Lawrence P. Belotindos1, Thoko Flav Kapalamula1, Hyun Kim2, Fuangfa Utrarachkij3,
Jeewan Thapa1, Chie Nakajima1,4, Yasuhiko Suzuki1,4*
1

Div Bioresources, Hokkaido University International Institute for Zoonosis Control
2
Dept Bacteriology II, National Institute of Infectious Diseases
3
Dept Microbiology, Faculty of Public Health, Mahidol University, Thailand
4
Global Institution for Collaborative Research and Education, Hokkaido University

Abstract:
Introduction: Nontyphoidal Salmonella is one of the prominent pathogens causing acutegastroenteritis globally. In 2017, the World Health Organization (WHO) specifically ranked
fluoroquinolone-resistant Salmonella as a high-priority pathogen for the research anddevelopment of new antibiotics. WQ-3034 and WQ-3154 are relatively new synthetic
fluoroquinolones with modification on their R1, R7, and R8 positions.
Objectives: To evaluate the inhibitory effect of WQ-3034 and WQ-3154 against wild-type andmutant Salmonella Typhimurium DNA gyrases.
Materials & Methods: The inhibitory effect of WQ-3034 and WQ-3154 were examined alongwith ciprofloxacin by measuring the drug concentration that inhibit half of the enzyme activity(IC50) in fluoroquinolone-inhibited DNA gyrase supercoiling assay.
Results: WQ-3034 demonstrated an inhibitory effect at the lowest concentration in both wildtype and mutant Salmonella Typhimurium DNA gyrases with amino acid substitution at codon
83 and/or 87, followed by WQ-3154 and ciprofloxacin, respectively. Remarkably, WQ-3034
and WQ-3154 exhibited a significantly higher inhibitory effect than ciprofloxacin in the double
mutation of Salmonella Typhimurium DNA gyrase (Ser83Phe-Asp87Asn).
Conclusion: This study revealed that WQ-3034 and WQ-3154 could potentially be theeffective therapeutic agents against quinolone-resistant nontyphoidal Salmonella.

演題 16

支部会賞選考対象者

Whole Genome Sequencing Reveals Recent Transmissionof Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis
Central Asian Strains in Lusaka, Zambia〇

1

Joseph Yamweka CHIZIMU1,2,3, Eddie SOLO1,3, Yukari FUKUSHIMA1, Precious
BWALYA1, Victor MUKONKA2,3, Chie NAKAJIMA1, Yasuhiko SUZUKI1Div Bioresources, Hokkaido University International Institute for Zoonosis Control
2
Zambia National Public Health Institute3
Ministry of Health, Zambia

Lineage 3 is one of the seven human-adapted Mycobacterium tuberculosis (MTB) lineages
predominant in eastern Africa, Middle East and northern India. Despite its low proportions
when compared to the predominant lineage 4 in Zambia, lineage 3 strains (CAS1_Kili) wereassociated with multi-drug resistance in the previous study in Lusaka (Solo et al, 2020). Thus,
this study aims to evaluate recent transmission among patients with MDR-MTB CAS1_Kili
strains in Lusaka, Zambia, by whole genome sequencing (WGS).
Selected 15 CAS1_kili strains, clustered by MIRU-VNTR and spoligotyping from theprevious study, were analyzed with WGS. All evaluated CAS1_Kili strains belonged to acluster as they differed by 12 or fewer single nucleotide polymorphisms (SNPs) in their coregenomes. While 9 strains were involved in a recent transmission event as they differed by ≤ 5
SNPs. Several strains shared the same combination of drug-resistance associated mutations torifampicin, isoniazid and other anti-TB drugs suggesting transmission events of MDR-MTB.
All the strains had ethambutol resistance associated mutations though only 23% were detected
to be resistant by phenotypic methods.
WGS revealed that these CAS1_Kili isolates were closely related, suggesting a recent
transmission event as they exhibited comparatively low variabilities in SNPs.

演題 17

支部会賞選考対象者

Characterization of mutations associated withstreptomycin resistance in multidrug resistant
Mycobacterium tuberculosis in Zambia〇

Precious Bwalyaa,b, Tomoyuki Yamaguchia, Eddie Solob, Joseph Y. Chizimua,
Grace Mbulob, Chie Nakajimaa,c,*, Yasuhiko Suzukia,c,*a

Div Bioresources, Hokkaido University International Institute for Zoonosis Control
Department of Pathology and Microbiology, University Teaching Hospital, Ministry of
Health, Zambia.
cInternational Collaboration Unit, Hokkaido University International Institute for Zoonosis
Control, Sapporo, Japanb

Abstract
Objective: Streptomycin (STR) is recommended for the management of multidrug
resistant tuberculosis (MDR-TB). STR resistance conferring mutation types and frequency are
influenced by genotypes of circulating strains in a population. This study aimed to characterizemutations in in MDR-TB isolates and examine their relationship with the genotypes in Zambia.
Methods: A total of 138 MDR-TB isolates stored at UTH-TB reference laboratory in
Zambia were analyzed using spoligotyping, and sequencing of STR resistance associated genes.
Results: Streptomycin resistance was observed in 65.9% (91/138) of MDR-TB isolates.
Mutations in rpsL, rrs and gidB accounted for 33%, 12.1% and 49.5%, respectively. Aminoacid substitution K43R in rpsL was strongly associated with CAS1_Kili (p<0.0001). The
combination of three genes could predict 91.2% of STR resistance. Clustering of isolates basedon resistance conferring mutations and spoligotyping was observed.
Conclusion: Results showed a high prevalence of STR resistance and that sequencing ofrpsL, rrs and gidB can adequately predict STR resistance. Clustering of isolates suggest thatthe increase of STR resistant MDR-TB in Zambia is fueled by spreading of resistant strains
and inadequate treatment. Therefore, rapid detection of STR resistance is recommended before
use in MDR-TB treatment in Zambia.

演題 18

支部会賞選考対象者

焼成ホタテ貝殻粉末と石灰窒素による堆肥中の薬剤耐性菌制御の可能性〇

江浪 誠俊 1、福田 昭 1、中島 千絵 2、鈴木 定彦 2、臼井 優 1
1

2

酪農学園大学 獣医学類 食品衛生学ユニット
北海道大学 人獣共通感染症国際共同研究所 バイオリソース部門【背景】家畜糞尿由来堆肥に含まれる耐性菌/耐性遺伝子（ARG）の除去には堆肥化
温度の上昇が有効であるが、不十分な温度上昇などにより耐性菌/ARG が残留することが問題となっている。この問題に対して、廃棄物由来の焼成ホタテ貝殻粉末（HSSP）や、肥料等に用いられる石灰窒素が、殺菌効果のある副資材として、耐性菌/ARG の減少に利用できる可能性がある。そこで今回、 HSSP 及び石灰窒素を利用した堆肥化が耐性菌/ARG の減少に有効かを明らかにするために、家畜糞尿存在下における HSSP 及び石灰窒素の殺菌効果と、堆肥への添加による pH、大腸菌数/ARG 量、細菌叢の変化を調べた。【材料と方法】牛糞尿上清に、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸球菌、Clostridioides difficile（CD；芽胞形成菌）を添加した。そこへ、HSSP または石灰窒素（0.5～4％）を添加し、24 時間後の添加細菌の生菌数を調べた。次に、牛糞尿、麦稈及び 2％量の HSSP または石灰窒素を堆肥原料とし、不十分な温度上昇条件でのシミュレーション試験を実施した。
この間、経時的にサンプルを回収し、pH、大腸菌数、ARG 量、細菌叢解析を行った。【結果と考察】HSSP/石灰窒素を 2%添加することで CD 以外の細菌が、4％の添加により CD も検出できなくなった。堆肥化試験では、HSSP/石灰窒素添加直後にpH は 10 以上を示したが、堆肥化終了時には対照群と同様に pH は 8 程度になった。
HSSP/石灰窒素添加により、堆肥化終了時に大腸菌数は 86％以上/100%減少した。
ARG 量について、HSSP 添加では明確な変化は認められなかったが、 石灰窒素添加
では試験した全ての ARG が減少した。細菌叢に与える影響は、石灰窒素添加の方がHSSP 添加に比べて大きかった。以上より、HSSP と石灰窒素の堆肥への添加は、堆肥 pH を上昇させることで芽胞形成菌を含む細菌を減少させることが可能であり、
HSSP や石灰窒素を利用した堆肥化は耐性菌対策として有効である可能性を示した。ARG 量や細菌叢の変化への影響も考慮し、最適な添加量や条件を解明する試験を実施中である。

演題 19

支部会賞選考対象者

消毒薬曝露が薬剤耐性遺伝子の接合伝達頻度に及ぼす影響の解明〇

塩野 由花、福田 昭、臼井 優

酪農学園大学 食品衛生学ユニット【背景と目的】薬剤耐性菌(ARB)、耐性遺伝子(ARG)の拡散は公衆衛生上重要な課題である。ARB 及び ARG が拡散する主要な経路として接合伝達が挙げられる。接合伝達は、主に ARG をコードするプラスミドが ARB から感受性菌へ伝達し、感受性菌が耐性を獲得する現象である。これまでに、抗菌薬や消毒薬の曝露により接合伝達頻度が上昇し、ARB 及び ARG の拡散を加速する可能性が示されているが、その機序(特に消毒薬曝露時)については、未だ解明されていない事が多い。そこで、本研究では接合伝達頻度を上昇させる消毒薬の種類とその機序の解明を目的として実験を行った。
【材料と方法】プラスミド性のセファゾリン耐性 bla 遺伝子を持つ牛糞便由来の大腸菌 4 株をドナー株、リファンピシン耐性大腸菌（実験室株）をレシピエント株とし、6 種類の消毒薬曝露後の接合伝達頻度を算出した。また、消毒薬を曝露した際のROS 生成、SOS 応答を測定した。更に、ROS 生成を促進した消毒薬について、ROS阻害剤存在下での接合伝達頻度を算出した。
【結果と考察】ドナー株に TC7-1 を用いた場合、薬剤非曝露時と比較し、トリクロ
サン(TRI)曝露では約 6 倍、塩化ベンザルコニウム(BZK)曝露では約 5 倍の接合伝達
頻度の上昇が確認された。その他のドナー株を用いた場合、接合伝達頻度の上昇は確認されなかった。TRI および BZK 曝露は ROS 生成を促進し、これは TC7-1 において最も顕著であった。一方、試験に用いた 6 種類全ての消毒薬は SOS 応答を促進しなかった。TRI、BZK による接合伝達頻度の上昇は、ROS 阻害剤存在下では阻害された。以上の結果より、TRI、BZK の曝露は ROS の生成を起こすことで、接合伝達を促進していることが示唆された。接合伝達を制御するためには、抗菌薬と同様に消毒薬を適正に使用し、消毒薬の使用による ARG の拡散を防ぐ必要がある。

演題 20

コリスチン耐性遺伝子保有プラスミドが与える
コリスチン治療および生体内定着への影響評価○

佐藤 豊孝 1, 山本 聡 1、小笠原 徳子 1、臼井 優 2、林 航 3、長野 則之 3、土井 洋平 4,5、田村 豊 6、髙橋 聡 7,8 、横田 伸一 11

札幌医科大学・医学部・微生物学; 2,
酪農学園大学・獣医学群・食品衛生学3
信州大学大学院・総合医理工学研究科・医学系専攻
4
藤田医科大学・微生物学・感染症科
5
ピッツバーグ大学医学部・感染症内科
6
酪農学園大学・動物薬教育研究センター
7札幌医科大学・医学部・感染制御・臨床検査医学8札幌医科大学附属病院・検査部
2

コリスチンは多剤耐性グラム陰性菌感染症への最終選択薬と位置づけられている。
近年、特に生産動物由来腸内細菌科細菌でのプラスミド性耐性遺伝子(mcr)の拡散が危惧されている。一方で、mcr 保有プラスミドなどのコリスチン耐性因子がヒト医療で問題となる病原性細菌に伝播された際の治療効果や病原性に関わる評価は乏しい。本研究では、ヒトの医療現場で問題となっている international high-risk clone のキ
ノロン耐性大腸菌 ST131 に染色体性(pmrAB の変異)およびプラスミド性(mcr-1,mcr3,mcr-5 保有プラスミド)のコリスチン耐性因子を付与させ、マウス感染モデルにてマ
ウス生体内での毒力・定着性およびコリスチンの治療効果を評価した。
一部の mcr 保有プラスミド(IncI2_mcr-1, IncX4_mcr-1, IncP1_mcr-3)の導入はマウス
での毒力および定着性の低下をもたらした。一方で、染色体性コリスチン耐性の獲得(pmrB 変異)では、感染宿主における毒力・定着性が維持され、コリスチン治療効
果は減弱していた。IncI2_mcr-1 プラスミドの導入によるマウスに対する毒力および定着性の低下は mcr-1 欠損プラスミド導入においても同様であり、この毒力および定着性の低下には IncI2_mcr-1 プラスミド 上に存在する mcr-1 以外の因子の関与が示唆された。RNA-Seq 解析の結果、IncI2_mcr-1 プラスミドの付与は ST131 の遺伝子発現を大きく変化させていることが明らかになり、この変化にはプラスミド上に存在する 2 種類の hypothetical proteins をコードする遺伝子(hypo-1 および hypo-3)が関与することが示唆された。
以上から、大腸菌でのコリスチン耐性の付与によるヒトへの健康危害を考えた場
合、染色体性遺伝子(pmrB)の変異の方が、mcr 保有プラスミドの獲得よりも、毒力の保持およびコリスチンの治療効果の減弱が想定され、リスクがより高いであろうと考えられた。また、IncI2_mcr-1 プラスミドの付与による毒力・定着性の低下へのmcr-1 の関与は小さく、その近傍に存在する hypo-1 および hypo-3 の関与が示唆された。

演題 21

支部会賞選考対象者

Enterobacter cloacae complex におけるコリスチン耐性機序の解明〇

福澤 翔太 1,2、佐藤 豊孝 1、青木 弘太郎 3、福島 由華里 4、山本 聡 1、
小笠原 徳子 1、中島 千絵 4、鈴木 定彦 4、髙橋 聡 5,6、横田 伸一 1１

札幌医科大学医学部微生物学講座
２
北海道がんセンター臨床検査科
3
東邦大学医学部微生物・感染症学講4
北海道大学人獣共通感染症リサーチセンター
5
札幌医科大学医学部感染制御・臨床検査医学講座
6
札幌医科大学附属病院検査部【背景】Enterobacter cloacae complex（ECC）は、腸内細菌科細菌に属するグラム陰性桿菌である。ECC は Enterobacter 属感染症の主な原因菌で多剤耐性化が問題となっている。多剤耐性化した ECC にはコリスチン（CST）が使用される可能性が有る
が、ECC が CST 耐性を獲得する詳細な遺伝子的メカニズムは不明である。
【目的】本研究は ECC の分子疫学的解析及び CST 耐性機序の解明を目的とした。
【対象】札幌医科大学附属病院にて、外来・入院患者（2017 年 5 月から 2018 年 5 月)の臨床検体から分離された ECC167 株（札幌医科大学附属病院 IRB 承認番号 272-70）を供試した。
【方法】1. hsp60 部分塩基配列解析によるクラスター分類を行い、各クラスターのCST 耐性株の割合を算出した。2. Average Nucleotide Identity (ANI)解析による菌種同定を行い、各種の CST 耐性株の割合を算出した。3. Population Analysis Profiling test
(PAP test)を行い、対象株の CST heteroresistance の有無を評価した。4. CST 耐性に関与することが知られている phoPQ、eptA、arnT 欠損株を作製し、CST の MIC を測定した。5. CST 耐性株と感性株の arnT 転写量を RT-qPCR にて測定し比較した。
【結果】hsp60 の部分塩基配列解析により CST 耐性株は特定のクラスター（Ⅱ,Ⅳ）に集積し、ANI 解析によって CST 耐性株の多くは E. kobei 及び E. roggenkampii であることが分かった。PAP test の結果、CST 耐性株全てが heteroresistance の表現型を有していた。phoPQ 及び arnT 欠損株で CST 耐性株の CST 耐性が失われたが、eptA 欠損株では CST 耐性に変化は認められなかった。arnT 転写量を測定した結果、CST 耐性株は感性株に比較し、有意な転写量の増加が認められた。
【考察】本研究の結果から、ECC の CST 耐性は特定の遺伝的背景を有する菌種に集積していることがわかった。また、これらは CST heteroresistance の表現型を有し、本表現型の獲得には、phoPQ および arnT の関与が示唆された。

演題 22

支部会賞選考対象者

Clonal transmission of multidrug-resistant Escherichia
coli ST69 between poultry and humans in Lusaka, Zambia
Misheck Shawa,a Yoshikazu Furuta,a Atmika Paudel,a Bernard Hang’ombe,b Hideaki
Higashia#〇aDivision of Infection and Immunity, International Institute for Zoonosis Control, Hokkaido
Universityb
Department of Para-clinical Studies, School of Veterinary Medicine, University of Zambia,
ZambiaAbstract
Risk factors for transmitting multidrug-resistant (MDR) Escherichia coli to humans
include various food animals, especially poultry. In Zambia, reports on MDR E. coli strains
among apparently healthy chickens have become frequent, but no comparative analyses havebeen conducted to evaluate their clonality with human isolates. Considering that poultry is themost consumed protein source in the country, it is necessary to investigate the potential spreadof MDR E. coli between poultry and humans.
Twenty cefotaxime-resistant E. coli strains collected from poultry in Lusaka, Zambia,
were screened for MDR and subjected to whole-genome sequencing using MiSeq and MinION
platforms. After de novo reconstruction of nearly complete genomes, we compared the poultry
strains to 36 previously sequenced cefotaxime-resistant E. coli isolates obtained from inpatientsat the University Teaching Hospital, Lusaka.
All (20/20, 100%) the poultry strains displayed resistance to ampicillin,
chloramphenicol, and doxycycline, with 18/20 (90%) also resistant to the quinolones;
ciprofloxacin and nalidixic acid. Twenty-seven antimicrobial resistance (AMR) genes
belonging to 11 classes were detected, with aminoglycoside resistance genes dominating (7/27,
25.9%), followed by genes encoding resistance to β-lactams (3/27, 11.1%), quinolones (3/27,
11.1%), and trimethoprim (3/27, 11.1%). Phylogenetic analysis and hierarchical clustering
using AMR profiles, AMR genes, and plasmid replicons suggested the clonal spread of E. coli
O17:H18-ST69 between poultry and humans. The E. coli O17:H18-ST69 clone accounted for
4/20 (20%) poultry- and 9/36 (25%) human-associated strains that shared two plasmids (IncFI
and IncI-complex) harboring 14 AMR genes. Furthermore, our analysis showed that the strains
also had other AMR plasmids distinct for each niche; all the poultry strains carried an IncFII(pCoo) plasmid containing the blaCTX-M-55 gene, while human isolates possessed the blaCTX-M14 gene on an IncHI plasmid.
Our results suggested clonal transmission of MDR E. coli O17:H18-ST69 between
poultry and humans, with the potential acquisition of distinct, niche-specific AMR plasmids.
These results demand strategic and concerted efforts from human and animal health sectors toprevent and control foodborne MDR.

特別公演
わが国における動物由来薬剤耐性菌研究の過去・現在・未来
田村 豊
酪農学園大学動物薬教育研究センター
当初、薬剤耐性菌は動物の感染症治療の阻害要因としてのみ捉えられ、その研究も原因菌の表現型である薬剤感受性を中心とするものであった。ところが 1959 年に日本の複数の医師が奇しくも別々の地域で多剤耐性赤痢菌から大腸菌へ薬剤耐性が伝達される現象を発見し状況が一変した。後に群馬大学の三橋進教授のグループに
よって R 因子（現在の R プラスミド）と名付けられ、今なお色褪せない薬剤耐性菌研究における金字塔を打ち立てた。動物分野で最初に R 因子に着目したのは、動物
医薬品検査所（動薬検）に勤務していた寺門誠致先生であった。1973 年に豚萎縮性鼻炎の起因菌である Bordetella bronchiseptica の R 因子を報告し、以後の動物分野における薬剤耐性菌研究に多大な影響を与えた。
1969 年に家畜の成長促進目的に使用される抗菌薬は、薬剤耐性菌を増加させ、家畜やヒトの健康を損なう恐れがあるとの報告書（スワンレポート）が英国議会に提出された。この報告により動物由来薬剤耐性菌は食物連鎖を介してヒトに伝播し、感染症治療に悪影響を与えるとの考えが広く認識されるようになった。1976 年にわが国も曖昧であった飼料添加の抗菌薬を治療用の動物用医薬品と成長促進用の飼料
添加物に厳密に区別して規制を強化した。規制強化の効果を検証するため、1976 年と 1992 年に農林省により初めて全国的な薬剤耐性菌調査が実施された。全国の家畜保健衛生所での調査手法の平準化を行うために、動薬検において R 因子の検出を含めた技術研修会が開催された。これを契機に薬剤耐性菌に関する最新の技術と知識が日本各地の家畜保健衛生所に広まり、動物分野における薬剤耐性菌研究の裾野を広げることに大いに貢献した。
1997 年頃から効果的な対策を策定するために、薬剤耐性菌を監視することの重要性が各種の国際会議で指摘されるようになった。そこで 1999 年に動薬検を中心に全国の家畜保健衛生所とネットワークを構築した家畜衛生分野における薬剤耐性モニ
タリング体制（JVARM）が確立された。JVARM により動物由来薬剤耐性菌に関する全国を俯瞰した網羅的な科学的データが毎年蓄積され、世界に発信するようになった。
2016 年にわが国の抗菌薬耐性対策アクションプランが制定され、One Health での各種薬剤耐性菌対策が進められている。この中で、薬剤耐性菌や耐性遺伝子がヒト
や動物や環境などの生態系で循環していることから、One Health での対策の重要性が認識された。
以上のように、講演ではわが国の動物由来薬剤耐性菌研究とその対策の歴史を振り返るとともに、今後の期待についても述べたい。