博 士 （ 医 学 ） 二 浦 洋 子
学位 論文題名

AnalysisofDonor‑typeChimerisminLineage‑speciflic
Cell Populationsaf
terAllogene
icMyeloablat
iveandNonmyeloablative Stem Cell Transplantation（同種造血幹細胞移植後の末梢血液細胞亜分画におけるキメリズム解析）

学 位論文 内容の要旨
骨髄非破壊 的前処置を 用いたミ二 移植は高齢 者や合併症 を有する患者においても安 全に施行さ れており、 近年増加し ている。し かし、混合 キヌラや拒絶が課 題となって おり、これ らの指標と してドナー とレシピェ ントの造血細胞比 率を定量的 に、かっ経 時的にとら えることが 重要である 。そこで造 血 幹細 胞 移植 後 の患 者 の C
D3，CD14.15， CD56の 各陽 性細胞 のキヌリ
ズム 解 析を 行 い、 各 細胞 亜 分 画の キ ヌリ ズ ムと 移 植片 対 宿主病(graft−versus一hostdisease：GVHD)、再発、拒絶、生存率との関連性を検討した。
検体は急性 自血病、慢 性自血病、 骨髄異形成 症候群、多 発性骨髄腫、悪性 ル ン バ 腫 な ど の 造 血 器 悪 性 腫 瘍 に よ り conventiona
l myeloablative
stem cell transplantation(CST)を 施 行 し た 36例 と nonmyeloablativestem cell transplantation(NST)を 施 行し た 3
4例 の計 70例で検討し た。
方 法 は 患 者 の 末 梢血 単 核球 を 分離 し 、 3Xl06細 胞に 抗 CD14、抗 CD15抗体磁気ビー ズを加え、 MagneticCell Sorting (MACS)
にて カラム吸着細胞を抗体陽性細胞として、非吸着細胞を抗体陰性細胞として分離した。次に、
非吸 着 細胞 に 抗CD3ある い は抗 CD
56抗 体磁 気 ピー ズ を加 えて 、同様にCD
3陽性 細 胞、 CD56陽 性細 胞 を分 離 精製 し た。 末 梢血 単 核 球をMACSで 分離した 後 、 QIA amp DNA mini kitを 使 用 し て DNAを 抽 出 し た 後、 4種類 の マ
イ ク 口 サ テ ラ イ ト プ ライ マ ー(D3S1359， D6S89， ACTBP2， HGH)を 用い 、PCRを 施行 し た。 ABI 310Genet
ic analyzer
を 用いて泳動 されるマイ ク口サテライト のピークの 大きさを定 量的に解析 し、移植前 のレシピェ ントとドナーの泳 動バターン を比較して キヌリズム 解析を行っ た。磁気ピ ーズを用いた分離 では80％以上 の純度を認 め、細胞比率は3％より検出が可能であった。
患者の年齢 中央値はCS
Tが33歳(16−54)で 、NSTは53歳(27ー65)であり、
前 処 置 は CSTで は V
P− 16
十 cyclophospham
ide十tot
al body irr
adiation(TBI)、NSTではfludarabine baseが主であ った。Grade II―IVの急 性GVH
DはCSTにお い ては 18例、NSTにおいては 13例で認めら れた。観察 期間はCST− 51―

で15ケ月（1ー52)、NSTで11ケ月（1ー61）であり、CS
Tでは無病生存は19
例で15例 が 死 亡 し て お り 、 原 因 は 再 発 12例 、 慢 性 GVHD
3例 、 治 療 関連 死 亡2例 であ っ た。 NSTで は 無病 生 存18例で 14例 が 死 亡し て おり 、 原因 は再発 9
例 、 拒 絶 2例 、 急 性 GVHD3例 、 治療 関 連死 亡 1例 で 拒絶 後 生存 し てい る 症例が2例であった。
CST、NST
そ れ ぞれ の 症例 に おい て ド ナー と レシ ピ エン ト の造 血細 胞比
率 とGVHD、 再 発、 拒 絶、 生 存率 と の関連性を 検討した結 果、前処置 にT
BIを 施行 し てい な い症 例 にお い て、 CS
TではC
D3陽 性細胞で（ p 0.
02)、NSTでは全 ての分画でday28での混合キヌラ（ドナー細胞90％未満）が有意に多く認められた（pく0.
001，p――0.
0014，pく0.
001)。N
ST後のday14での解析では、CD3陽性細胞 のドナー細 胞が51％以上 の症例で有意にgradeIIーI
Vの急性 GVHDが 認 め ら れ (p=0.029)、 CD3、 CD
56陽 性 細 胞 が 50％ 以 下 の 症例 では拒絶が多く(p=0.
016，p二ニ0.
002)、CD56陽性細胞が50％以下の症例では再発 が多 く 認め ら れた (p=0.029)。そ してday14におい てC
D56陽性細胞の ドナー比率が50％未満の症例は有意に一年生存率が低かった（pく0.
001）。NS
T
後 の day 28に お い て は CD14.15陽性 細 胞お よ びCD56陽 性 細胞 の ドナ ー 比率が90％未満の症例で有意に一年生存率が低かった（p 0.
005、p 0.
002)。
CSTに 関し て はday 28のCD3陽性 細 胞が 90％ 以 上 の症 例 にお い て有 意に急性GVHDが 多 く 認め ら れ(p=0.009)、CD14.15
陽 性 細胞 の ド ナー 比 率が90％未満の症例においては有意に再発が多く（p〓ニ0.
015)、一年生存率が低かった(p=0.
002)。
生存率に 関しては、 検出感度3％を考 慮し、ドナー比率90％以上と98％以上の両 方で検討してみたが、完全キヌリズムの基準を90％以上とした場合、より生存率を反映することがわかった。
今 まで造血幹 細胞移植後 の生着の指 標として血 液型や性染 色体が用い られ てきたが、 本研究のよ うにマイク ロサテライ トによるキ ヌルズム解 析は
非 常に有用で あり、とく に細胞を亜 分画にわけ ることによ って、生着 、拒絶 、再 発 、急 性 G
VHDを早 期 に予 測 でき る こと が わか っ た。 こ れら 臨床病態の早 期予知に際 し、T細 胞の有用性 は以前から報告されていたが、我々はそ の 他 CD14.15， NK細 胞 も 分離 し 、生 着 、GVHD、 再 発、 生 存率 と の関 係
を 検 討 し 、 早 期 に お け る CD
14.1
5， N
K細 胞の キ ヌリ ズ ム 解析 が 有用 で ある ことを初め て示した。 今後、造血 幹細胞移植 後の造血器 悪性腫瘍患 者にお ける早期の キメリズム 解析を行う ことによっ て、免疫抑 制剤の調整 等を慎 重に 行 うこ と がで き 、早 期 の重 症 急性 GVH
D予 防、 再 発予 防 、そ して生存 率の向上に 貢献する臨 床的に非常 に有用な情 報が得られ ることを明 らかにした。

学位論 文審査の要旨
主査 教授 小野江和則
副査 教 授 浅香正博
副査 教 授 今村雅寛

学位論文題名
AnalysisofD
onor―typeC
himerlSminLineage−Spe
Cifi
CCe11POpulati
onSafterAllogenelCMyeloablatiVeandNOnmyeloablatiVeStemCe11TranSplantation（同 種 造 血幹 細胞移 植後の末 梢血液細 胞亜分画 における キメリズ ム解析）造 血 幹 細胞 移 植 後の ド ナ ーと レ シピェン トの造血 細胞比 率を定量 的に、 かつ経時的 に と ら え るこ と は 再発 、 拒 絶、 移 植 片対 宿 主 病 (GVHD)の 制 御に 重 要 であ る 。 申請 者は 本研究 におい て造血幹 細胞移 植後の患 者のCD
3、CD14.15、CD56の各表面 抗原
陽 性 細 胞 の キメ リ ズ ム解 析 を 行い 、 各 細胞 亜 分 画 のキ メ リ ズム と 移 植片 対 宿 主病(GVHD)、再 発、拒絶 、生存率 との関 連性を検 討した 。
症 例 は造血器 悪性腫 瘍に対し て造血 幹細胞移 植を行 った70
例（ convent
iona
lst
emcelltr
ansplantati
on：C
ST3
6例、nonmyeloab
lati
vest
emc
elltransplantation：
NST 34例 ） で 、患 者 の 末梢 血 単 核 球を MACSに て 各細 胞 亜 分画 に分離 後、DNAを抽出し 、4種 類 のマ イ ク ロサ テ ラ イト プラ イマーを 用いて PCRを施 行し、キ メリズ ム解析を行っ た。
結 果 は 前処 置 に 全身 放 射 線照 射 (TBI） を 施行 し て いな い 場 合、 CST
で は CD
3陽 性細 胞 で 、 NS
Tで は 全て の 分 画で day28で の混 合 キ メラ が 多 かっ た 。 NST後 のday14
で は、 CD3
陽 性細胞 のドナー 比率が 51％以上の 症例で 有意にgradeIIーI
Vの急性 GVHDが 多く 、50%以下の 症例では 拒絶が 多かった 。C
D56陽性 細胞のド ナー比 率が500h以下の 症例 で は 拒絶 、 再 発が 多 く 、有 意 に 一 年生 存 率 が低 か っ た。NS
T後のday28
ではCD14.15お よび CD56陽 性 細 胞の ドナ ー比率が 90％未満 の症例で 有意に 一年生存 率が低かった。CSTに 関し て は day 28の CD3
陽 性 細 胞が 90％以 上 の 症例 に お いて 有 意 に急 性GVHDが 多 く 、CD14. 15陽性 細 胞 のド ナ ー 比率 が 90%未 満の 症例で は有意に 再発が多く 、一年生存率が低かった。以上より、今回の研究によって早期のCD14.15，CD56
陽 性 細 胞 のキ メ リズ ム解 析 が非 常 に有 用 であ るこ と がわ か った 。
公 開 発表にあ たって 、副査浅 香正博 教授より 、CD3、CD1
4.15、CD56
各 陽性細胞 のキ メリ ズ ム の解 析 の 意義 、 一 番の 強調点 は何か、 N
STで もTBIは 必要で あるのか 等の―53―質問があった。CD3はT細胞、CD14. 15は骨髄球、単球、CD56
はNK細胞の表面抗原であり、それらのキメリズムは種々の臨床病態と密接に関連しており、今回の研究
では特に移植後早期のNK細胞のキメリズム解析を行うことによって、再発、拒絶、一年生存率を予測できる点が重要であると回答した。また、NSTにてTBIを施行した場合は一年生存率72a}6であったのに対し、TBIを施行していなぃ場合は40%と有意差が認められ、TBIは必要であると回答した。次いで、副査今村雅寛教授より、ドナー細胞の比率の設定基準について、より早期でもキメリズム解析は可能か、CSTにおけるTBIの必要性にっいて質問があった。NSTのday 14に関しては臨床的に50%と設定し、解析を行ったところ、より種々の臨床病態を反映する結果が得られた。D
ay28の90%に関しては検出感度が3%であったので、ドナー細胞98%から解析を始めたが、有意差が認められなく、95%、90%と解析を行ってみたが、90%で一番有益な結果が得られたため、それに決定したと回答した。Da
y7のキメリズム解析に関しては、患者の細胞数が非常に少ない時期であり、現在の方法では分離することは難しいこと、他の方法で分離することは可能と思われるが、現在そのデータはなく、今後是非検討していきたいと回答した。また、CSTではTBI施行症例は1年生存率60%であったのに対し、TBI未施行症例は40%で有意差はでなかったものの、生存率向上にはTBIは有効であると回答した。最後に、主査小野江和則教授より、造血幹細胞移植におけるNK細胞の役割、day 14とday 28で解析する必要性についての質問があった。
NK細胞の役割として、gra
ftーversus―leukemia(GVL)
効果増強、GVHD効果抑制が言われており、今回の研究でGVL効果増強が示唆されたと回答した。また、CSTと異なり、NSTの場合は混合キメラの期間が長く、day14でキメリズム解析を行うことによって、発症しっっある種々の臨床病態に速やかな対策を図ることができ、生存率の改善に向けて非常に重要な時期であると回答した。
本研究は造血器悪性腫瘍患者における造血幹細胞移植後の各細胞亜分画の早期キメリズム解析を行うことによって、種々の臨床病態に迅速かつ適切な対策を図ることが でき るこ と、そ の結 果、 生存率 の向 上に 寄与 し得ることを示した。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判定した。

−54―