SugarFectⓇ

遺伝子導入試薬

糖認識レセプターを利用した細胞に優しい幹細胞向け遺伝子導入試薬

ver.5

Ⓡ

SugarFect は、多糖をベースに開発された安全で細胞毒性が低い in vitro 用の新規遺伝子導入試薬です。カチオン化した多糖は、アニオン性の核酸物質(プラスミド DNA など)とコンプレックスを形成し、これまでの細胞表面との静電気的相互作用に加え、糖鎖認識レセプターを介して細胞へ遺伝子を導入するため、糖鎖認識レセプターをもつ細胞、特に幹細胞や肝細胞に細胞特異的な高い遺伝子導入効率を示します。
保存条件：購入後は 4℃で保存してください。4℃保存の場合、試薬ラベルに記載されている有効期限内は安定です。
注意事項：初めてご使用になる場合は以下の項目にご注意の上、最適条件をご検討ください。なお、このプロトコル
は接着細胞に遺伝子を導入する為に書かれています。現時点では浮遊細胞に関するデータはありません。

細胞状態
プラスミド DNA

SugarFect(カチオン化多糖)

遺伝子導入時に使用する培地

対数増殖期の細胞をご使用ください。培養細胞は 60−70％コンフルエントの状態にあるものを、初代培養細胞はほぼコンフルエントの状態にあるものをご使用ください。
純度の高いもの(Abs260nm/Abs280nm=1.7−1.9)をご使用ください。TE バッファーはコンプレックス作製、細胞への取り込みを阻害する場合があるので、プラスミド DNA をPBS(−)で溶解することを推奨します。(使用濃度 = 100µg/ml)
使用する細胞種、プラスミドによって最適使用量が異なります。初めてご使用になる場合
は SugarFect：DNA 比(N/P 比※)＝1〜3 の範囲で遺伝子導入を行い条件検討をしてください。(希釈方法は次ページにある表 1 を参照して下さい。) 通常は N/P 比＝1〜3 が最適です。希釈は滅菌済み超純水（または２回蒸留水）で行って下さい。
基本的には無血清培地中で遺伝子導入を行って下さい。(抗生物質入りの無血清培地も使用できます。) 本品は多糖−糖鎖認識レセプターとの相互作用に加えて、従来の細胞表面の負電荷との静電的相互作用も関係しているため、血清中の負電荷をもつタンパク (e.g.
アルブミン) と相互作用して、血清存在下では遺伝子導入率が低下します。

※N/P 比＝(SugarFect 試薬のアミノ基モル数)/(プラスミド DNA のリン酸基モル数)

操作手順：このプロトコルは 12 ウェルプレートを使用して遺伝子導入実験を行う場合での条件を示します。
その他の培養プレートでの使用条件は付録の表 2 を参考にして下さい。
実験を始める前に準備するもの
1) 滅菌済みの超純水（または２回蒸留水）
2) PBS(−)(ダルベッコリン酸バッファー)► 成分組成は付録に記載してあります。
3) 無血清培地 (Opti-MEM でも可)4) 増殖用培地
5) 滅菌済み 1.5 ml エッペンチューブ
6) 12-ウェルプレート
1. 遺伝子導入実験前日：細胞の準備► 細胞数をカウントする。ラット骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)の場合は 5 x 104 cells/ml に増殖用培地(αMEM＋15%FCS + 1%抗生物質)で調製し、1ml/well ずつ播種する。24 時間培養すると遺伝子導入時に細胞密度が 80％コンフルエントとなる。
※ HeLa や HepG2 の場合は 1.25 x 105 cells/ml に増殖用培地で調製し、1ml/well ずつ播種する。
2. 遺伝子導入実験当日
1) SugarFect−DNA のコンプレックス作製► SugarFect 試薬を滅菌済み超純水で最適 N/P 比に希釈する。
► 滅菌済みエッペンチューブに 25µl のプラスミド DNA(100µg/ml)を加える。次に 25µl の最適N/P 比に希釈された SugarFect 試薬を一滴ずつ滴下する。(混合量は 1 well 分です。)※ 加える順序を逆にすると導入効率に影響するので、必ずプラスミド DNA 溶液に SugarFect試薬を加えてください。
► コンプレックス作製のためにチューブを適度にタッピング撹拌し、室温で 15 分間静置する。
2) 無血清培地に交換► コンプレックス作製のため 15 分間静置中に、前日から培養している細胞の培地を吸引除去し、500µl/well の PBS( − ) を 加 え て 洗 浄 す る 。
PBS(−)を吸引除去し、500µl/well ずつ無血清培地(αMEM+1%抗生物質)を加える。
※ HeLa や HepG2 等の樹立細胞株には無血清培
地に Opti-MEM 使用も可。
3) 遺伝子導入(トランスフェクション)► 無血清培地に交換後 50µl/well の SugarFect−
DNA コンプレックスを加え、コンプレックス溶液が均一に行き渡るよう軽くプレートを振り、6時間通常の培養条件(e.g. 37℃, 5%の CO2 インキュベータ内)で培養する。
4) 遺伝子導入後の培地交換► 遺伝子導入開始 6 時間後に無血清培地とSugarFect−DNA コンプレックスを吸引除去し、500µl/well の PBS(−)を加えて洗浄する。
PBS(−)を吸引除去し、1ml/well の増殖用培地を加える。
5) 遺伝子発現解析時まで細胞培養► 発現解析時まで通常の培養条件(e.g. 37℃, 5%のCO2 インキュベータ内)で培養する。
3. 遺伝子発現解析► 導入した遺伝子の機能・発現量を蛍光顕微鏡、リポーターアッセイ等で評価する

本製品は実験用試薬です。診断・治療用目的では使用しないで下さい。

1

実験条件の最適化の為に
SugarFect 遺伝子導入試薬は、実験条件の最適化の為に滅菌済みの超純水で表１のように希釈し、プラスミド DNA(100µg/ml)と一対一の比率(v/v)で混合(e.g.プラスミド DNA 25µl + SugarFect 希釈液 25µl)させて作製した SugarFect−DNA
コンプレックスを用いて遺伝子導入の予備実験を行ってください。予備実験で一番良い導入率・発現率を示した
SugarFect：DNA 比(N/P 比)を遺伝子導入実験にご使用ください。

表1

SugarFect の希釈方法
使用量(µl/well)及び相当する N/P 比SugarFect の希釈
SugarFect

滅菌済み超純水

Total Vol.

SugarFect 希釈液

DNA 溶液相当する N/P 比

10 µl

90 µl

100 µl25µl25µl= 1：120 µl

80 µl

100 µl25µl25µl= 2：130 µl

70 µl

100 µl25µl25µl= 3：1

付録
PBS(−)（ダルベッコリン酸バッファー） (成分組成) 9.6 g (1L) 中
塩化ナトリウム………………………………..8,000 mg
塩化カリウム……………………….…..…….….200 mg
リン酸一水素ナトリウム(無水)…………..….1,150 mg
リン酸二水素ナトリウム(無水) ………………..200 mg
上記の成分を蒸留水に溶解して、全量を 1,000 mL とし、121℃で 15 分間加圧蒸気滅菌またはろ過滅菌する。

表２ 培養プレートごとの使用量

培養容器

培養面積

細胞の播種

無血清培地

SugarFect−DNA
コンプレックス
添加量

96 well
24 well
12 well
6 well35 mm
60 mm
100 mm

0.3 cm2/well
1.9 cm2/well
3.8 cm2/well
9.5 cm2/well
8.0 cm2/plate21.0 cm2/plate55.0 cm2/plate

100µl/well
500µl/well
1ml/well
2ml/well
2ml/well
4ml/well
10ml/well

50µl/well
200µl/well
500µl/well
1ml/well
1ml/plate
2ml/plate
6ml/plate

10µl/well
25µl/well
50µl/well
100µl/well
100µl/well
300µl/well
700µl/well

表３幹細胞
がん細胞
その他

コンプレックス作製の為のSugarFect 希釈液と DNA 溶液の混合量 (Vol./well)
SugarFect
DNA 溶液
希釈液(DNA 量)
5.0µl
5.0µl (0.5 µg)
12.5µl12.5µl (1.25µg)
25.0µl25.0µl (2.5 µg)
50.0µl50.0µl (5.0µg)
50.0µl50.0µl (5.0µg)
150.0µl150.0µl (15.0µg)
350.0µl350.0µl (35.0µg)

導入実績のある細胞

ラット骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)1,2、脂肪由来間葉系幹細胞 、ES 細胞
HeLa、Hep G23、T244
マクロファージ、ラット骨髄由来樹枝状細胞(DC)引用文献

1. 城潤一郎・田畑泰彦 5．多糖 原島秀吉・田畑泰彦(編) ウイルスを用いない遺伝子導入法の材料、技術、方法論の新たな展開 株式会社メディカルドゥ, 2006 pp.
50−55.

4. Kanatani, I, Ikai T, Okazaki A, et al. Efficient genetransfer by pullulan−spermine occurs through bothclathrin−and raft/caveolae−dependent mechanisms.
J. Control Release 2006 116(1): 75−82.

2. Okazaki A, Jo J. and Tabata Y.
A reverse
transfection technology to genetically engineer adultstem cells. Tissue Engineering 2007 13(2): 245−251.

参考文献

3. Jo J. Ikai T. Okazaki A, et al. Expression profile ofplasmid DNA by spermine derivatives of pullulan withdifferent extents of spermine introduced. J. Control.
Release 2007 118(3): 389−398.

1．Jo J, Nagaya N, Miyahara Y, et al. Transplantationof genetically engineered mesenchymal stem cells
improves cardiac function in rats with myocardial
infarction: benefit of a novel nonviral vector, cationizeddextran. Tissue Engineering 2007 13(2): 313−322.

〒612-8043 京都市伏見区本材木町 668−3
TEL：075-621-3179
FAX：075-203-6729
彩都ラボ：〒567-0085 大阪府茨木市彩都あさぎ 7−7−15
TEL：072-641-6690
FAX：072-641-1016
本社：

info@medgel.jp

株式会社メドジェル

本製品は実験用試薬です。診断・治療用目的では使用しないで下さい。

2

SugarFectⓇ遺伝子導入実験手順
1. 遺伝子導入実験前日：細胞の準備
1) セルカウント＆細胞の播種◆ 遺伝子導入時に細胞密度が 80%程度に細胞懸濁液を播種なるよう播種。

24 時間培養

2. 遺伝子導入実験当日
1) SugarFect と DNA のコンプレックス作製①プラスミド DNA 溶液を加える(PBS(−)に溶解)②SugarFect 試薬を滅菌済み超純水で希釈する
プラスミド DNA
(100 µg/ml)

滅菌済み超純水で最適N/P 比に希釈SugarFect③プラスミド DNA 溶液に、同分量(v/v)の最適 N/P 比に希釈された SugarFect 試薬を滴下する④SugarFect−DNA コンプレックス作製：

チューブを適度にタッピングして撹拌

2) 無血清培地(e.g. Opti-MEM)に交換

コンプレックス作製の為室温で 15 分間静置中に2)へ◆ 前日播種した細胞の培地を無血清培地無血清培地に交換に交換
無血清培地無血清培地に交換直後

3) トランスフェクション(遺伝子導入)①
コンプレックスを添加
SugarFect−DNAコンプレックス◆ SugarFect−DNA コンプレックスを無血清培地に交換した細胞に加える
6 時間通常の培養条件で細胞を培養

4) トランスフェクション後培地交換◆ トランスフェクション開始 6 時間後に培増殖用培地に交換
増殖用培地

5)

細胞培養

地を無血清培地から増殖用培地に交換する
遺 伝 子 発 現 解 析 時 ま で 通 常 の 培 養 条 件
で細胞を培養する (e.g. 24 時間)

3．遺伝子発現解析：導入した遺伝子の機能・発現量の解析◆ e.g. ルシフェラーゼアッセイ、蛍光顕微鏡下での観察

本製品は実験用試薬です。診断・治療用目的では使用しないで下さい。

3Substrate-mediated transfection (SubfectionR 法)
幹細胞、初代細胞に適した新規リバーストランスフェクション法
ver.6
Subfection 法はメドジェル独自のコーティング溶液と細胞接着因子を用いた新しい遺伝子導入方法です。
通常の遺伝子導入方法と異なり、遺伝子導入試薬をコートしたプレートに細胞を播種しますので、遺伝子導入前に細胞を播種しておく必要がありません。また血清存在下での遺伝子導入が可能です。
＊ 本プロトコルをお試しいただく場合には、あらかじめ細胞接着因子(プロネクチン wako＃639-02771 あるいはフィブロネクチン wako＃306-13403)をご用意ください。
操作手順：このプロトコルは 12 ウェルプレートを使用して遺伝子導入実験を行う場合での条件を示します。その他の培養プレートでの使用条件はもう 1 枚のプロトコル付録の表 2 を参考にして下さい。
実験を始める前に準備するもの
1) 細胞接着因子（プロネクチンあるいはフィブロネクチン）
2) 滅菌済みの超純水
3) PBS(－) （成分組成は付録に記載）
4) 増殖用培地
5) 滅菌済み 1.5 ml エッペンチューブ
6) 12-ウェルプレート

去し、500µl/well の PBS(－)を加えて洗浄する。
► 作 製 し た SugarFect-DNA コ ン プレ ック ス溶 液に350µl の PBS(-)を加え希釈する。
► プ レ ー ト 中 の PBS(-) を 吸 引 除 去 し 、 希 釈 し た
SugarFect-DNA コンプレックス溶液を加え、37℃で30 分間静置する。

４）細胞の播種► プレートから SugarFect-DNA コンプレックス溶液を吸引除去し、播種後 50～60%コンフルエントになるように細胞を播種する。

５）細胞の培養► 通常の培養条件(e.g. 37℃, 5%の CO2 インキュベータ内)で培養する。

１）コーティング溶液の作製と塗布►►

ReagentA は使用前に 37℃で温めておく
コーティング溶液を 1 ウェルあたり下記の表に従って調整する。

ReagentA20µl
細胞接着因子（1mg/ml） 40µl
PBS(-)
340µl
合計400µl６）遺伝子発現解析
導入した遺伝子の機能・発現量を蛍光顕微鏡、リポーターアッセイ等で評価する。

(参考) 幹細胞で Subfection を行う場合は N/P 比=3 が標準となります。以下の表に従って SugarFect-DNA コンプレックスを調整してください。

► 12 ウェルプレートにコーティング溶液を入れ、37℃で1.5 時間静置する。

（N/P 比=3 の場合 total 50µl/well）

２）SugarFect－DNA のコンプレックス作製► 表１に従って SugarFect 試薬を滅菌済み超純水で希釈する。
► 滅菌済みエッペンチューブに 25µl のプラスミドDNA(100µg/ml) を 入 れ る 。 次 に 25µl の 希 釈 済 み
SugarFect 試薬を一滴ずつ滴下する。
(混合量は 1 well分です。)※ 加える順序を逆にすると導入効率に影響します。
必ずプラスミド DNA 溶液に SugarFect 試薬を加えてください。
► チューブを軽くタッピング攪拌し、室温で 15 分間静置する。

３）SugarFect－DNA コンプレックスのコーティング► 12 ウェルプレートからコーティング溶液を吸引除SugarFect
滅菌済み超純水

7.5µl
17.5µlDNA 溶液(100µg/ml)

25µl

備考・・・・

従来の遺伝子導入法のプロトコルも参照してください。
コーティングする際に、well が完全に乾かないように注意してください。
培地は、増殖用培地を使用してください。無血清培地を使用する必要はありません。
このプロトコルは開発中のものです。予告なく変更になる可能性があります。

コーティング溶液の作製と塗布コーティング溶液を12 well plate に塗布
1.5 時間、37℃でインキュベート

SugarFect－DNA のコンプレックス作製と塗布①プラスミド DNA 溶液を加える②滅菌済み超純水で SugarFect を希釈③希釈した SugarFect をプラスミド DNA に滴下、タッピングし、15 分間静置しコンプレックスを作製④コンプレックスを希釈し、12 well plate に塗布

30 分間、37℃でインキュベート

細胞の播種
セルカウント＆細胞の播種

細胞懸濁液を播種

通常の培養条件で培養(e.g.37℃、5%の CO2 インキュベータ内)

遺伝子発現解析e.g. ルシフェラーゼアッセイ、蛍光顕微鏡下での観察