環境 DNA 調査・実験マニュアル
Ver. 3.0（2024 年 8 ⽉ 9 ⽇発⾏）

⼀般社団法⼈環境 DNA 学会© 2024 ⼀般社団法⼈環境 DNA 学会© 2024 The eDNA Society⽬次
1. はじめに .................................................................................. 4
2. 調査地点の選定 ......................................................................... 8
2-1. 河川における調査地点の選定 .................................................10
2-2. 池や湖沼等における調査地点の選定 .........................................122-3. 海岸における調査地点の選定 .................................................12
3. 採⽔および濾過 ........................................................................15
３-１．採⽔とカートリッジ式フィルターを⽤いた現場濾過 ..................173-1-1．フィールドデータの記録 ................................................18
3-1-2．採⽔およびシリンジを⽤いた現場濾過 ...............................193-1-3．アスピレーターを⽤いた現場濾過 .....................................21
３-2．採⽔とグラスファイバーフィルターを⽤いた実験室での濾過 ........30
3-2-1．フィールドデータの記録 ................................................31
3-2-2．採⽔および実験室への輸送 .............................................32
3-2-3．グラスファイバーフィルターを⽤いた濾過 .........................33
4．DNA の抽出 .............................................................................38
4-1．カートリッジ式フィルターからの DNA 抽出 ..............................39
4-1-1．実験の準備 .................................................................40
4-1-2．RNAlater の吸引 ..........................................................40
4-1-3．DNA の抽出 ................................................................41
4-1-4．DNeasy Blood and Tissue kit を⽤いた DNA の精製 ............421

4-2．グラスファイバーフィルターからの DNA 抽出 ...........................52
4-2-1．実験の準備 .................................................................53
4-2-2．タンパク質の分解処理 ...................................................53
4-2-3．DNeasy カラムを⽤いた DNA の精製 ................................53
5．DNA の分析 .............................................................................63
5-1．リアルタイム PCR による環境 DNA の種特異的な検出・定量 ........63
5-1-1. 種特異的プライマー（およびプローブ）の設計 ....................63
5-1-2. リアルタイム PCR 実験 ..................................................64
5-2．環境 DNA メタバーコーディング ............................................67
5-2-1．ライブラリーの調製ー１︓1st PCR...................................67
5-2-1-1．1st PCR ..............................................................70
5-2-1-2．1st PCR 産物の精製と濃縮 .......................................72
5-2-1-3．精製・濃縮済み 1st PCR 産物の定量と希釈 ..................73
5-2-2．ライブラリーの調製ー２︓２nd PCR ................................75
5-2-2-1．2nd PCR .............................................................77
5-2-2-2．2nd PCR 産物の精製 ..............................................79
5-2-2-3. 切り出した 2nd PCR 産物の定量 ................................80
5-2-2-4．インデクス関連情報................................................82
5-2-3．MiSeq を⽤いた超並列シークエンス .................................83
5-2-3-1．MiSeq のメンテナンス ............................................84
5-2-3-2．シークエンスの下準備 .............................................87
5-2-3-3．ライブラリー濃度の最終調整 ....................................88
5-2-3-4．シークエンス開始前後の操作 ....................................892

5-2-4．環境 DNA メタバーコーディングデータ解析 ..................... 111
5-2-4-1．MiFish パイプライン ............................................. 111
5-2-4-2．Claident ............................................................ 120
付録 ......................................................................................... 122
引⽤について .............................................................................. 123

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1. はじめに本マニュアルは環境 DNA 分析⼿法の普及と標準化を⽬的として作成された。ここに記された内容は 2024 年（令和 6）年 8 ⽉現在の最新情報であるが、環境 DNA 分析技術は⽇進⽉歩のため、常に最新のマニュアル（本マニュアルのアップデート版）を参照することが重要となる。最新のマニュアルは環境 DNA 学会の web ページ（http://ednasociety.org/）からダウンロードできる。
本マニュアルの改訂は、2019 年 4 ⽉の V2.1、2020 年 4 ⽉の V2.2 に続く 3 回⽬の改訂となる。この間、環境 DNA はさまざまな場⾯で使われるようになるとともに、個々の研究者らが使う現場の実情に応じた⼯夫や改善が⾏われてきた。今回のマニュアル改定では、マ
ニュアルの初版時に記載した⼿法をベースに更新するとともに、本⽂中に書ききれない部分についてはコラム等を⽤いて紹介している。例えば、ろ過による DNA の濃縮および抽出法の部分では、カートリッジフィルターを⽤いたろ過⽅法として、マニュアル初版より掲載
しているシリンジとアスピレーターを⽤いた現場濾過について現在の知⾒に基づいた更新した。
環境 DNA 分析は⼀般的に採⽔、濾過による環境 DNA の濃縮および抽出、分⼦⽣物学的な検出実験といった流れで⾏われる。環境 DNA 検出のための分⼦⽣物学的な実験⼿法としては、リアルタイム PCR を⽤いた種特異的な「単⼀種検出法」と、環境 DNA メタバーコー
ディング⼿法と呼ばれる特定の分類群（例えば⿂類）の次世代シーケンサーを⽤いた超並列的な「多種同時検出法」がよく⽤いられる。単⼀種検出法では特定の対象種を精度良く安価に検出できると考えられる⼀⽅で、対象種ごとに検出系を設計する必要がある。多種同時検出法では単⼀種検出法に⽐べると⼿間と費⽤がかかるものの、多種の情報をまとめて得られるという利点がある。このように、単⼀種検出法と多種同時検出法は相互補完的に⽤いられる技術である。本マニュアルでは、単⼀種検出法に関する⼀般的な事項を記述するとともに、MiFish プライマーを⽤いた⿂類の網羅的検出法に関する具体的な分析法について詳細に記述している。さらに、今回の改定では、多くの会員から要望が寄せられていた環境 DNA
メタバーコーディングデータ解析について、新たな項⽬を⽴ち上げ、詳述している。書⾯の関係上、本⽂中で紹介仕切れない部分については、付録として紹介している。

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なお、本マニュアルには標準的な⼿法を記載するとともに、新しい技術を紹介しているが、紙⾯や公開のタイミングの関係で、本マニュアルで取り上げていない技術も多数存在する。
本マニュアルは、こうした技術を否定するものではなく、また各分析者による DNA 検出感度の改善や⼿間の削減などを⽬的とした⼯夫を妨げるものではない。

環境 DNA 分析全体の注意事項
環境 DNA 分析は、環境中の極微量な対象 DNA をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で分析可
能な量に増幅して検出・定量する技術である。そのため、組織サンプルに由来する DNA やPCR によって得られた増幅産物のような⾼濃度の DNA によるコンタミネーション（汚染）は結果に取り返しのつかない影響を及ぼすことが多々ある。確度の⾼い環境 DNA 分析の実
施は、コンタミネーションとの戦いであると⾔ってもよい。そのために、以下のような点に特に注意する必要がある。
1) 実験環境の整備︓環境サンプルのような「薄い」DNA を扱う部屋と、PCR 産物のような「濃い」DNA を扱う部屋を物理的に隔離することが重要である。また、実験実施⽇において作業者は「薄い」DNA を扱う部屋から「濃い」DNA を扱う部屋へと⼀⽅通⾏で作業を⾏うことを厳守することや、空調設備も含めた実験室間の空気の流れにも気を付けるなど、コンタミネーションの危険性を可能な限り低減するべきである。
2) DNA フリー器具の使⽤︓実験に使う器機は未使⽤の新品、または残留 DNA を除染した
ものを⽤いる。除染には次亜塩素酸ナトリウム溶液（例えば、0.1%濃度）への浸漬が有効であるが、繰り返し使⽤する中で⾦属の腐⾷やプラスチックの劣化などを引き起こす。
こうした劣化を引き起こさない DNA 除染試薬が、各種メーカーより販売されており、
ウェットティッシュタイプもある。チューブラックのような周辺器具については、紫外線照射による除染も有効であるが、陰になって UV が当たらない場所が⽣じないよう注意が必要である。
3) 使い捨て⼿袋の着⽤︓作業時に触れるあらゆるものからコンタミネーションの危険性があるため、清浄な表⾯を保つために使い捨て⼿袋（医療⽤ゴム⼿袋やビニール製の⼿袋など）を着⽤する必要がある。野外サンプルの採取時には、地点間のサンプルのコンタ
ミネーションを防ぐため、採取地点ごとに新品の⼿袋を使⽤する。その後の DNA 測定

5までの全⼯程にわたって常に⼿袋を着⽤し、⾃らの DNA あるいは⼿についた⾷品等に由来する DNA によるコンタミネーションを防ぐ。いずれの作業においても、作業中に⼿袋にサンプルや試薬等が付着したときにはこまめに交換する。
4) フィルターチップの使⽤︓マイクロピペットを介したコンタミネーションを防ぐために、
フィルター付きチップの使⽤が必須である。
5) DNA 低吸着製品の使⽤︓DNA は通常のプラスチック製品に吸着する性質があるため、可能であれば全⼯程、特に抽出時の極低濃度環境 DNA 溶液の取り扱いには DNA 低吸
着規格のマイクロチューブ（例えば Eppendorf 社の DNA LoBind Tube など）などの製品を使⽤することを推奨する。
6) 部屋や機器の除染︓マイクロピペットなどの実験器具、遠⼼機などの機器類を介したコンタミネーションがありうるので、定期的な（できれば実験⽇ごとに）除染を⾏うことを推奨する。また、器具類についてはその後汚染されないよう、除染済みの密閉できる
清浄な容器に収納することを推奨する。また、空気を介したコンタミネーションもありうるので、実験室全体の定期的な掃除や空気清浄機の設置、作業内容に応じたクリーン
ベンチの使⽤も重要である。

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本マニュアルに関わる権利と責任の所属について
本マニュアルは⼀般社団法⼈環境 DNA 学会の標準化委員会委員および環境 DNA 技術の専⾨家が参集して作成した。本マニュアルの著作権は⼀般社団法⼈環境 DNA 学会に、記載内
容に関する責任は、環境 DNA 学会および環境 DNA 技術標準化委員会にある。
環境 DNA 技術標準化委員会（括弧内は担当内容）
委員⻑

⾼原 輝彦 島根⼤学⽣物資源科学部（全体の編集、および、査読）委員

近藤 倫⽣ 東北⼤学⼤学院⽣命科学研究科（査読）（五⼗⾳順）

清野 聡⼦ 九州⼤学⼤学院⼯学研究院（2-1 項、2-3 項の執筆）
⼟居 秀幸 京都⼤学⼤学院情報学研究科（全体の編集、および、査読）中村 圭吾 ⼟⽊研究所⽔環境研究グループ（査読）源利⽂ 神⼾⼤学⼤学院⼈間発達環境学研究科（全体の編集、1 章、
2-2 項、3-1 項、4-2 項、5-1 項の執筆、および、査読）

宮正樹 千葉県⽴中央博物館（3-1 項、4-1 項、5-2-1〜5-2-3 項の執筆）

村岡 敬⼦ ⼟⽊研究所⽔環境研究グループ（全体の編集、2-1〜2-3 項の改訂、および、査読）
⼭川 央

公益財団法⼈かずさ DNA 研究所ゲノム事業推進部（全体の編集、5-2-1〜5-2-3 項の改訂、および、査読）⼭中 裕樹 ⿓⾕⼤学先端理⼯学部（全体の編集、および、査読）委員外執筆者

岩崎 渉

東京⼤学⼤学院新領域創成科学研究科（5-2-4-1 項の執筆）（五⼗⾳順）

佐⼟ 哲也 千葉県⽴中央博物館（3-1 項、4-1 項、5-2-1〜5-2-3 項の執筆）
⽥辺 晶史 東北⼤学⼤学院⽣命科学研究科（5-2-4-2 項の執筆）
朱涛

東京⼤学⼤学院新領域創成科学研究科（5-2-4-1 項の執筆）

⼭本 哲史 農業・⾷品産業技術総合研究機構 農業環境研究部⾨（査読）なお、本マニュアルは環境 DNA 学会の資⾦により作成された。本委員会は本⽂の作成について独⽴した権限を有する。

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2. 調査地点の選定
全般的な注意事項
環境 DNA による⽣物情報は、採⽔地点につながる⽔域に由来する組織⽚等の DNA を含む物質により得られる。そのため、上流側の環境にも着⽬しながら、研究⽬的に応じたサンプ
ルが得られる調査地点を設定する必要がある。⼀⽅、環境 DNA のサンプル中には、そこにつながる⽔域に⽣息する⽣物由来の DNA 以外にも様々な DNA が含まれている可能性がある。その発⽣源は、⿂市場や⽔産加⼯場、養殖・畜養場のような⽔産施設、店舗や家庭から排出される汚⽔、農業で使⽤される飼料や肥料などさまざまである。これらは、河川や⽔路から遠い地域からも合流してくる場合がある。⼀般的に環境 DNA の影響が及ぶ範囲は、河川では数百メートルとされるが、発⽣源からの混⼊量（濃度×⽔量）が多い場合には影響はさらに広範囲に及ぶ可能性がある。⼈間活動の影響を完全に排除することは難しいが、得られたデータを解釈する上で、周辺にどのような施設があるのかあらかじめ把握しておくとともに、可能であればその影響を受けにくい採⽔地点を設定することが望ましい。例えば、下⽔処理施設等を始めとする汚⽔処理施設や⽤排⽔路からの流れ込みがある場合、流れが合流するエリアを極⼒避けるとともに、合流部よりも上流側に、流路幅が⼤きい地点では対岸に調査地点を設けることで、これらの影響を⼩さくすることが期待できる。また、サンプ
リング時にこれら施設等から流れ込む⽔を合わせて採取・分析し、混⼊しうる⽣物種を把握することも結果を解釈する上で役に⽴つと考えられる。調査地点の選定の際、商業施設や市街地、住宅地は、予め地図や、国⼟地理院や⺠間のウェブサイトなどの空中写真からも判別できることが多い。また現地についてからも⽬視で判断が可能である。
⼀⽅、地図や現地の概観的な⽬視では検出できない施設も要注意である。排⽔⼝は堤防下や護岸壁に開⼝しているため、作業従事者が⽴っている岸側から⾒えないことも多い。採⽔前に⽔際を歩きながらその存在の有無を確認する。
また、海⾯や陸上での養殖や蓄養の施設の付近も避けるべきである。そこで飼育している⿂類などの DNA を含んだ排⽔が⽔域に直接放出されている場合が多い。
こうした施設からは、濃度の⾼い DNA が連続的に放出されていることもあり、影響が広範囲に及ぶ場合もある。
また、養殖、養⿂施設で⽤いられている餌や、釣り⼈らが⽤いる撒き餌は地域外で採取された⿂類のミンチなどを含む場合も多いため、その⽔域に⽣息しない⽣物の DNA を検出してしまう可能性がある。
調査に際しては地域住⺠、⽔域を利活⽤している⼈や施設への配慮が必要である。私有地や⺠有地、空港や発電所等の公共施設を避けて採⽔地点を設定する。調査地点や作業内容によ8

っては、事前の許可申請が必要な区域もある。船舶や⽔上バイクといった⽔⾯を往来する他者との衝突回避や、釣り⼈や⽔辺利⽤者への配慮なども重要である。地点や作業内容によっては許可申請などを要する場合もあるため、事前に管理者（場合によっては所有者）と連絡をとって、各種の許認可について確認する。
コラム 1 サンプル中に混⼊する DNA︓環境 DNA のサンプル中には、そこにいた⽣物以
外にも、⼈間活動に伴う様々な DNA が混⼊する。本⽂中にも記載した汚⽔処理設備からの排⽔、農地の⽤排⽔、養殖・養⿂施設、⿂市場などの他にも、屋外の焚⽕跡やゴミ箱、⽝・猫、鶏などの糞に含まれる DNA が⾬天時等に調査地点に流れ込む可能性もある。⾃⾝が調査に⽤いている漁具や⾐類からも混⼊するかもしれない。⼈間活動だけでなく、野⽣動物の糞などに由来する可能性もある。微量な DNA を扱う環境 DNA 分析では、そこにいた⽣物
以外の DNA のサンプルの混⼊とその影響を完全に防ぐことは困難であるため、分析で得られた⽣物リストをそのまま使うのではなく、その種がその環境にいることへの妥当性を考え精査することが重要である。その際、異なる時期や近傍のデータも参考になることもある。近年では DNA よりも分解が早いとされる環境 RNA に関する研究も進んでいる。新しい分析技術により、環境 DNA の由来等を評価できるようになることに期待したい。
コラム 2 河川下流域・海域における調査前に︓港上では、港内における船舶交通の安全等を図ることを⽬的とした港則法や東京湾等の船舶の交通量が多い海域における船舶交通の安全を図ることを⽬的とした海上交通安全法等により交通ルールが定められており、採⽔や採泥の作業を⾏う際には、許可を受ける必要がある場合がある。港則法では、法第⼆条で定める港の港内⼜は港の境界附近で⼯事⼜は作業をしようとする者は、海上保安庁（港⻑⼜は海上保安部⻑等）の許可を受けなければならないことが定められており、許可にあたっては船舶交通の安全のための措置を講じる必要がある。海上交通安全法では、航路⼜はその周辺の海域において⼯事⼜は作業をする場合は海上保安庁の許可を受けなければならず、航路及びその周辺の海域以外の海域において⼯事⼜は作業をする場合は海上保安庁に届出なければならないと定められており、許可等にあっては、港則法と同様に船舶交通の安全のための措置を講じる必要がある。これらの⼯事⼜は作業について、法の対象となる区域では、船舶を⽤いた採⽔だけでなく、橋梁や河岸からの採⽔作業なども対象となる場合があることから、調査計画時に調査地点や作業内容がこれら法令の対象となるか確認し、必要な場合
は申請等を⾏う。なお、港則法及び海上交通安全法の適⽤区域内における作業であっても、場所や内容によっては、許可や届出までを要しない場合もあることから、事前に作業をしようとする場所にある海上保安部署に相談するとよい。

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2-1. 河川における調査地点の選定
河川では環境 DNA が⽣物分布を反映する距離は、発⽣源の DNA 量や形態にもよるが数百m 程度と⾒積もられている。そのため、調査地において数百 m おきに調査地点を設定することが理想的であるものの、それだけの労⼒を割くことができない場合も多い。周辺や上流側のハビタット環境などを踏まえながら、予算規模や⽬的に応じて適宜調整する必要がある。
河川の合流点付近においては、合流点の上流側で採⽔を⾏うとそれぞれの⽀流における分布を理解する助けとなる。
河川での調査地点の設定時の留意点をあげる。環境 DNA の分布や流れによる拡散は、さま
ざまなスケールの地形に影響されるため、マイクロハビタットというスケールでの留意が必要である。また、調査地点の周辺環境もふくめた写真記録も重要である。
1) 河道地形︓ハビタットの重要な構成要素である流れや⼟砂の堆積状況は、河道地形（形状）の影響を受ける。河川の蛇⾏部では、カーブの外側では流速が速く、河岸は侵⾷的であり、淵が形成され、河畔林の⽊々がオーバーハングする。カーブの内側は流速が遅く、堆砂することで砂州の形成が進み、植⽣が定着しやすい。その結果、カーブの左右
岸で⽔深や河床材料などが異なる微地形が形成され、それに応じた⽣態系が存在することとなる。河川の規模等によっては⽚岸の採⽔だけではそのエリアの⽣物相を捉えきれない場合もある。また、調査地点を距離で河⼝から○○km 地点と設定した場合、直線距離なのか、蛇⾏を含む流程に沿った距離なのかなども考慮すべきである。国⼟交通省
が管理する河川区間の左右の堤防上には、河川管理のために川の中⼼を基準に、堤防上に河川距離標が設置されている。
2) 河川の流れ︓調査対象とする⽔域の流れが到達する地点への採⽔地点の設定を意識する。
河川の流速や流向は、同じ断⾯内であっても⼀様ではない。中⼼部を直線的に流れる流⼼、⽌⽔域、渦流発⽣域とでは、物質のトラップの状態が異なり、それに応じて⽔質や⽣物も異なる。ある地点から放出された環境 DNA は、流速に応じて拡散距離が異なるとともに、流れが緩やかな領域では沈降等により⼗分拡散されない場合もある。河川の合流部付近では、合流部の上流側それぞれで調査することで、それぞれの⽀流の分布を知る助けとなる。
3) 河岸構造︓上述のとおり蛇⾏部の植⽣は左右岸でも状況が異なる。例えば葦原などの河
岸植⽣の中は⼩型の遊泳⿂や幼⿂の良好なハビタットとなっている。河岸の⽔際部に護10岸が設置されている場合は、その構造に着⽬する必要がある。⽯組や環境配慮型のブロックによる護岸の場合、護岸の隙間などを⽣物が利⽤することができる。さらに、ブロックの背後からの透⽔性が保たれ、地下⽔や湧⽔が河川に流れ込むことで、低⽔温を好む種のマイクロハビタットが形成されている場合もある。
4) 河床の底質︓地表を流れる河川の⽔の⼀部は、河床の中に浸透して流れ、浸透のしやす
さは河床の底質（岩、礫、砂、粘⼟等の河床材料）により異なる。伏流⽔と呼ばれるこの流れは、礫間のろ過により地表を流れる河川⽔と⽐べて⽔質が良好で、濁りが少ない。
例えば、サケ類は、伏流⽔が噴出する場所を利⽤して産卵する。伏流⽔では、環境 DNAを含む物質も濾過され減少することから、調査地点としては地表を流れる⽔を捉えることができる地点を選ぶ必要がある。⼀⽅、河床材料が粘⼟など細粒分の多い箇所では採⽔時に底質の巻き上げが⽣じやすく、濾過時間や分析結果にも影響を及ぼす可能性がある。採⽔時の対応が難しい場合（例えば採⽔器を⽤いた橋梁上からの採⽔が必要な地点
や⽔深が浅い場所など）には、採⽔地点を少しずらすなどの対応が必要である。
5) 物理場の⼈為的な変化︓河道内の物理的な環境は、出⽔等による⾃然的な攪乱だけでなく、河道整備、橋梁⼯事、堰堤の新設や改築、浚渫や砂利採取などさまざまな⼈為的な影響を受けることがある。また、農業⽤取⽔設備下流における灌漑期と⾮灌漑期、⽤⽔
発電に伴う夜間と昼間のように、⽔利⽤に伴い流況が変化する場合もある。調査⽬的に応じて、このような影響を受けにくい地点を選ぶことも重要である。また、河道の⼯事等が⾏われている期間では、現場への⽴ち⼊り制限や、濁りの発⽣などの影響を受ける可能性もある。計画されている事業については、河川整備計画などで確認することが可能である。
6) 河⼝域・汽⽔域・河川感潮域︓汽⽔域では、同じ地点でも、潮汐により河川⽔と海⽔の混合の状態や、流向・流速が時々刻々変化し、⽔中に含まれる環境 DNA の量や組成もまた変化する。気象庁の公表する潮位表を参考に、調査⽬的に応じた調査時刻を設定する。採⽔時に、採⽔地点の位置情報に加え、潮汐の影響を判断するために、採⽔時間、表層の流向、採⽔した⽔深（表層・中層・底層など）も記載することが望ましい。塩⽔
遡上範囲や混合のパターンは、河床勾配や河川流量、河⼝が⾯する海域の潮位変化の程度や河川の⽔温等により変化する。異なるハビタットが⾯的に分布し、かつ流れが経時的にも変化する⽔域における採⽔地点および採⽔タイミングの設定にあたっては、これらの条件を考慮する必要である。

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2-2. 池や湖沼等における調査地点の選定
その⽔域を代表する⽔サンプルを取ることに留意すべきである。⼩規模な定形の池の場合、どこで採⽔しても検出率に⼤きな違いはないと考えられる。任意の地点で、アクセスしやす
い岸際から表層⽔を採取する。複雑な形状をした、あるいは規模の⼤きな池や湖沼の場合の適切な採⽔数については知⾒が不⾜しているが、できるだけ複数地点で採⽔することが望ましい。岸の構造や底質の影響、⼈為改変の影響などについては河川の場合と同様の注意が必要である。
ダム湖内では湖岸帯の浅場はもともとの地形がダムの⽔⾯付近にある場所に限られ、その周辺の⽔⾯下は、急峻な岩盤が形成されることが多い。そのため、⽔際の植⽣帯はダム湖内
では⾮連続的に分布し、植⽣帯を利⽤する⽣物で移動範囲が⼩さい⽣物の環境 DNA の分布も植⽣帯の分布域の影響を受ける。さらに、河川に⽐べ湖内の流速は⼩さく、⽔深も⼤きい
ため、環境 DNA が拡散しにくい状況がある。ダム湖の湖岸部よりも、上流河川が湖内に流⼊する付近では，湖岸部よりも広い浅場が形成されており、⿂類では、河川流⼊部付近は捕獲される種数・個体数ともに湖岸部より多く、環境 DNA でも多くの種が検出される可能性が⾼い。ダム湖では、出⽔後もしばらく微細な粒⼦が浮遊し、これが PCR 阻害要因となる可能性があることにも留意が必要である。
農業⽤⽔路で調査を⾏う場合にはつぎの点に注意する。下流からのポンプアップや他の地域からのパイプラインによる送⽔などがありうるため、⽔がどこからきているのかを確認する。また、灌漑期に⽔があり、⾮灌漑期に⽔がなくなるなど、季節によって⽔量が異なる場合がある。さらにコンクリート⽔路は滑りやすく、⽔の流れも速い場合があるので、事故が起きないよう注意する。⽔路は⼟地改良区等の団体によって管理されていることから、トラブルを回避するため、調査する場合には了解を得る必要がある。⽔⽥や畑からの排⽔が混ざるので、PCR 阻害要因を含む可能性があることにも留意が必要である。

2-3. 海岸における調査地点の選定
沿岸域の流れは、地形、波浪、⾵向き、潮位などさまざまな要素の影響を受ける。また、沿岸域のハビタットもさまざまなスケールの地形に影響されるため、環境 DNA の拡散は沿岸域の流動、および、マイクロハビタットの分布に留意が必要である。また、事後の確認のためにも、調査地点の周辺環境もふくめた写真記録が重要である。以下に海岸での調査地点の設定時の留意点をあげる。
1) 海岸地形と底質︓海岸地形により汀線付近の波浪条件が異なり、⽔際での底質の粒径や12波による巻き上がりが異なる。また、バケツなどの採⽔器が底質に接触し、巻き上がった砂や泥がサンプル中に混⼊すると濾過作業の効率やサンプルの質に影響するため、⽔深や河床材料を確認して巻き上げの少ない場所を選ぶことが望ましい。
① 磯や岩場︓波による底質の巻き上げが少ないために採⽔しやすい。波浪が⾼く、⾜元が滑りやすいため、落失を防ぐ安全管理がことさら重要になる。
② 砂浜︓アクセスは⽐較的容易だが、汀線（波打際）付近は常に底質を巻き上げているために砂が混⼊しやすい。
③ ⼲潟︓底質が潮汐により⽔塊が常時広範囲に移動するために濁⽔である場合が多い。また、河⼝や⼀次⽣産の⾼い海域であると、植物プランクトンや懸濁物などが多く含まれているため、採⽔後の濾過の作業効率が低下し濾過⽔量が減少することが懸念される。
2) 沿岸流と⽔質︓沿岸流は、沿岸地形により流向流速が⼀様ではない。波浪に曝される磯や砂浜中⼼部、岬や構造物の周辺の⽌⽔域や渦流発⽣域とでは、⽔中に存在する物質のトラップの状態が異なり、それに応じて⽔質や⽣物相も異なる。ある地点から放出された環境 DNA は、流速に応じて拡散距離が異なると考えられる。沿岸では、潮汐の影響
で⽔塊が移動、停滞する。河川淡⽔域のように⼀⽅向に流下・拡散するのではないことに注意が必要となる。また出⽔による淡⽔の影響、停滞の持続、濁度の上昇などの影響にも注意を払う必要がある。
3) 海岸⽣態系構造︓海岸の調査地点における周辺の⽣態系の状態の把握が重要である。特に海藻・海草の藻場は⽔⽣⽣物が⾼密度で⽣息する。これらの繁茂状況は、潜⽔調査、
衛星画像判読で⾏うことができる。
① 海岸植⽣は、背後地の環境が、砂浜、砂丘、崖、⼈⼯空間（⼯業⽤地、市街地、住宅地）により異なる。調査地点付近の広域的な状態の把握は空中写真判読で⾏える。
② 護岸や堤防などの⼈⼯構造物の場合は、⾃然のハビタットの改変の度合いに着⽬する必要がある。特に、コンクリートで隙間なく固めた護岸の場合には、背後地からの地下⽔の浸出や間隙⽣物の⽣息地が失われている。
③ ⽯やブロックを積み上げた護岸の場合、隙間の透⽔性も着⽬すべき点である。コン13

クリートなどで隙間を埋めると、透⽔性や地下⽔湧出を前提としたマイクロハビ
タットが破壊される。堤防の場合も、材料が過去から積まれた粘⼟か、地中に基礎部分を打設したコンクリートかで透⽔性が異なる。
4) 物理場の⼈為的な変化︓浚渫や港湾開発事業、埋め⽴て地の造成や護岸⼯事、消波ブロックや⿂種ブロックの設置などにより物理環境が⼈為的に変化する場合がある。改変の規模、継続性など、影響の時空間スケールの把握が必要である。採⽔時に周辺の環境の記録や写真撮影を⾏うことで、事後の確認や考察に役⽴つ。
① 埋め⽴て⼯事では、⽔域⾃体が消滅するため、モニタリング地点の変更を余儀なくされる場合もある。また、防波堤、突堤など、海中に突き出す構造物では、周辺の流向流速への影響があるため、予め地図で、また、現地で確認する必要がある。このような構造物は、現地に赴いたときに⼯事が始まっている場合もある。⼯事の予定は海岸・港湾・漁港管理者に事前に確認は可能である。
② 航路などの海底掘削では、ハビタットの地形や底質、植⽣が⼤きく改変される。特に砂州の除去では、潜砂性⿂類のハビタットごと消滅する。
③ ⼯事の最中には、濁⽔が発⽣する。濁度が上昇すると、採⽔後の濾過作業に影響する。
5) ⼈⼯構造物（護岸、堤防、防波堤など）
︓消波や構造維持のための施設は種々あるが、構造物の材料と、岸との距離により留意する必要がある。岸との距離では、構造物の⽔中にある根固め、⽔⾯付近の消波、沖で波浪を軽減する離岸堤がある。材質としてはコン
クリート・ブロックと⾃然⽯がある。⾃然海岸の岩礁と微地形と異なる点は、隙間が多く、時折、透過性が⾼い点である。打ち寄せた波による⽔塊がフィルターされる状態となる。離岸堤は沖の⼩島のような存在である。そのため局所的に岩礁⽣態系に近い環境が形成される。

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3. 採⽔および濾過
採⽔の季節
採⽔の季節について、冬場には環境 DNA の検出率が下がることが報告されているので、採⽔調査は春〜秋に⾏うと検出率が向上する可能性がある。⼀⽅で、季節移動など対象⽣物種の⽣態によっては検出しやすい季節や場所があると考えられるので、対象⽣物の⽣態情報を把握しておくことは重要である。また、体外受精の⽣物の場合は繁殖期に環境 DNA 量が著しく増加する。したがって、種特異的検出では対象⽣物の繁殖期の⽅が環境 DNA の検出率が⾼くなることが期待される⼀⽅で、網羅的検出では環境 DNA 量が低い他種の検出率を下げるおそれがある。このため、対象⽣物の繁殖期などに関しては各⼿法の特徴に応じて検討することが望ましい。また、⾚潮やアオコなどの影響で採⽔サンプル中に⾼濃度の PCR
阻害物質が混⼊する場合があるので、このような時期を避けることが望ましい。

安全に採⽔を⾏うために
環境 DNA のサンプリング（＝採⽔）は、季節や場所によってさまざまな環境下で⾏うことになる。夏には熱中症や⽇焼け対策が、冬には防寒対策が必要となり、磯や濡れた突堤、貯⽔池の護岸などでは転倒や落⽔に注意しなくてはならない。また、⽔際の作業であるために濡れてもよい撥⽔性や速乾性の⾼い⾐類を着⽤することも重要である。フィールドでの調査・作業は不測の事態に備えて原則として複数名で⾏う。さらに、特に海岸や⼤規模な河川においては安全を確保するためライフジャケットの着⽤は必須である。万が⼀、⽔難事故が起きてしまった場合は、川や池であれば警察へ 110 番に、海であれば海上保安庁のホットライン 118 番に速やかに通報する。

器材、材料、物資の調達（特に保冷）調査の器材や物資などの現地調達はできる限り避ける。沿岸部の⼈⼝が少ない地域は、コン
ビニエンスストアやホームセンターがほとんど無く、品揃えが悪い場合も多い。
「氷」が必要な場合は、スーパーマーケット、釣具店、鮮⿂店、コンビニエンスストアで調達することになる。このような施設は、⿂介類を販売しているため、氷の袋などへの付着などコンタミ
ネーションには⼗分注意する。瞬間保冷剤の準備があると安⼼である。宿泊を伴う現地調査において「保冷材」を保冷・冷凍するために宿泊施設の冷蔵庫や冷凍庫を利⽤する際には、保冷材が汚染されないようにビニール袋などで覆う必要がある。冷凍のためにドライアイ
スを⽤いることもできる。

15

濾過⼿法について
⽔サンプルの濾過については現場で⾏う場合と、実験室に持ち帰って⾏う場合がある。濾過に⽤いるフィルターには、グラスファイバーフィルターやメンブレンフィルターなどがあり、現地等で使いやすいように密閉する容器や、あらかじめ容器に収められたもの（カート
リッジ式フィルター）もある。ここでは、採⽔後現場でカートリッジ式フィルターを⽤いて濾過する⼿法（3-1）と実験室に持ち帰ってからグラスファイバーフィルターで濾過する⼿法（3-2）について述べる。

16

３-１．採⽔とカートリッジ式フィルターを⽤いた現場濾過
安全に採⽔を⾏うために（再掲）
環境 DNA のサンプリング（＝採⽔）は、季節や場所によってさまざまな環境下で⾏うことになる。夏には熱中症や⽇焼け対策が、冬には防寒対策が必要となり、磯や濡れた突堤、貯⽔池の護岸などでは転倒や落⽔に注意しなくてはならない。また、⽔際の作業であるために濡れてもよい撥⽔性や速乾性の⾼い⾐類を着⽤することも重要である。フィールドでの調査・作業は不測の事態に備えて原則として複数名で⾏う。さらに、特に海岸や⼤規模な河川においては安全を確保するためライフジャケットの着⽤は必須である。万が⼀、⽔難事故が起きてしまった場合は、川や池であれば警察へ 110 番に、海であれば海上保安庁のホットライン 118 番に速やかに通報する。

フィールドデータの記録に必要な道具（例）・ 耐⽔性野帳（測量野帳レベルブックセ-Y11，コクヨ）
・ 耐⽔加圧ボールペン（BDWR-40F-B，パイロット）あるいは鉛筆
・ ハンドヘルド GPS（eTrex20xJ，ガーミン）
・ データロガー導電率計（CD-4307SD，マザーツール）・ 防⽔デジタルカメラ（RICOH WG-30，リコー）

シリンジを⽤いた現場濾過に必要な道具（例）・ カートリッジ式フィルター（ステリベクス, 孔径 0.45µm，SVHV010RS，メルクミリ
ポア）・ 50mL ロックタイプシリンジ（SS-50LZ，テルモ）
・ ルアーフィッティング（注⼊⼝⽤, VRMP6，アイシス）・ ルアーフィッティング（排出⼝⽤, VRSP6，アイシス）
・ バケツ（Soft Bucket 8 型 I-484，ISETO など）
・ ロープ（クレモナ⾦剛打ロープ直径 6mm，ユタカメイク）
・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）
・ 実験⽤ペーパータオル（キムタオル，⽇本製紙クレシア）
・ 組織⽤ RNA 安定化溶液（RNAlater，サーモフィッシャー）・ ⼩型スポイト（E-243，⽇本メディカルサイエンス）
・ 2.0mL チューブ（DNA 低吸着︔ザルスタット）
・ 医療施設⽤泡洗浄ハイター1000 400mL（花王）

17

・ 精製⽔（精製⽔ P ワンタッチ式キャップ 500mL，健栄製薬など）
・ チャック付ポリ袋 140mm × 200mm（ユニパック G-8，⽣産⽇本社）
・ チャック付ポリ袋 100mm × 140mm（ユニパック E-4，⽣産⽇本社）
・ チャック付ポリ袋 17.7cm × 20.3cm（ジップロックイージージッパーM，SC ジョン
ソン/旭化成ホームプロダクツ）
・ カウンター（数取器）・ 筆記具（サインペン）（MO-150-MCBK3，ゼブラ）・ クーラー（ハイパー氷点下クーラーM，ロゴス）
・ 保冷剤（倍速凍結・氷点下パック M，ロゴス）
・ 保冷袋 S サイズ（保冷平袋 S，モロフジ）

アスピレーターを⽤いた現場濾過に必要な道具（例）・ カートリッジ式フィルター（ステリベクス, 孔径 0.45µm，SVHV010RS，メルクミリ
ポア）・ ルアーフィッティング（注⼊⼝⽤，VRMP6，アイシス）・ ルアーフィッティング（排出⼝⽤，VRSP6，アイシス）
・ ⼿提げ平⾓瓶コック付ポリタンク 10L（1-2169-01，アズワン）
・ epTIPS スタンダード 1〜10mL（30000765，エッペンドルフ）・ ルアーフィッティング オスルアーロック 4.0mm（VPRM406，アイシス）・ ルアーフィッティング メステーパー5.0mm（VRF506，アイシス）
・ 排気⽤ゴム管（6-590-01，アズワン）
・ チューブ I 型ジョイント（6-663-02，アズワン）
・ ⽳付きシリコン栓（1-7650-07，アズワン）
・ アスピレーター（GAS-1，アズワン）
・ フィルターホルダーマニホルド（2-258-01，アズワン）
・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）・ 液体塩素系漂⽩剤（病院⽤ハイター，花王）※1※1

使⽤期限（塩素濃度の変化など）に問題がないことを使⽤前に確認する。

3-1-1．フィールドデータの記録
野帳に記⼊する主な項⽬として以下のようなものがあげられる。これらは調査の⽬的などに応じて加減してよい。耐⽔性の野帳への記録には耐⽔性のボールペンや鉛筆、シャーペンで記録するとよい。

18

・採⽔者（サンプリングに同⾏した全員の名前を記録）
・⽇付（YYYY-MM-DD の形式で記録、必要に応じて時間も記録する⽅が望ましい)・測点番号と採⽔地点の地名（プロジェクト略称＋調査番号＋測点番号）
・緯度経度（35.101252N, 139.293012E のような 10 進法が取り扱いやすい）・河岸・湖岸・海岸・底質の分類︓砂浜・砂利浜・岩礁・サンゴ・護岸（コンクリート・テ
トラ・捨て⽯など）
・気象・海象（⾵向・⾵⼒・波⾼を含む）
・⽔温（℃）
︓携帯⽤の⽔質計を⽤いて計測する。
・（海〜河川感潮域では）潮汐（⼤潮・中潮・⼩潮・若潮・⻑潮）と⼲満（満潮・⼲潮・上げ潮・下げ潮）・（海〜河川感潮域では）塩分濃度（‰）
︓携帯⽤の⽔質計を⽤いて計測する。
・透明度（透明・ササ濁り・濁り）
・河川で⾏う場合、わかる場合はダムや発電所の放流量も記録する。
・濾過⽔量（ｍL）
︓必ず記⼊すること。
・⽬視の範囲内で⿂影やその他の⽣物︓抽出した環境 DNA には⿂類以外の⽣物が含まれているので、クラゲやその他の⽬⽴つ⽣物に関する記録が後々に重要となる。
・写真（撮影の有無）
・その他︓環境⽔に影響を与えそうなものの記録（釣り⼈の有無︔排⽔や流れ込みの有無︔
周囲の⽔⽥地域の⽔管理状況など）

3-1-2．採⽔およびシリンジを⽤いた現場濾過
本項では、シリンジにステリベクスを装填して⾏う現場濾過法について記す。常に使い捨て
⼿袋を着⽤し、クロスコンタミネーション防⽌のため採⽔地点ごとに取り替える。ここではバケツで採⽔するケースを説明するが、直接ボトルを⽤いた採⽔や、シリンジを⽤いた直接採⽔を⾏ってもよい。
1） 濾過キットの作成︓例えば 1 採⽔地点で 2 本のステリベクスを⽤いて濾過を⾏う場合（最⼤ 1L x 2 本 = 2L）、2 組を 1 セットとしてキットを作成する。ユニパック G-8を⽤意し、その中に、ステリベクス 2 本とシリンジ 2 本を⼊れる。さらに、RNAlaterが⼊った 2.0ｍL チューブ 2 本と⼩型スポイト 2 本を⼩さなユニパック（E-4）にまとめて⼊れておく。これに、ステリベクスの注⼊孔と排出孔を閉じるためのルアーフィ
ッティングを２個ずつユニパック E-4 にまとめて⼊れる。さらに、濾過後のステリベ
クス 2 本を⼊れるユニパック E-4 を 1 枚キットに⼊れる（図 3-1-2-1, 2）。
２） 採⽔道具の作成︓突堤や防波堤、護岸など⽔⾯よりも⾼い所から採⽔するため、ロープを 15m ほど切り出しバケツにしっかりと結びつける。Soft Bucket 8 型 I-484 を19

使⽤する場合は、取⼿が抜けることがあるため、本体縁にある⽳と取⼿の２箇所にロープを結びつける（図 3-1-2-3）。
3） バケツの除染︓バケツの内部とバケツにくくりつけたロープ先端部に泡洗浄ハイターを吹き付ける（図 3-1-2-4）。数分間放置した後、ハイターを実験⽤ペーパータオルな
どできれいに拭き取る（図 3-1-2-5）。その後、バケツとロープ先端を環境⽔で２回共洗いする。ハイターによる洗浄が不⼗分だとクロスコンタミネーションの恐れがあり、共洗いが不⼗分でハイターが余分に残っているとサンプル中の DNA が分解されるので注意すること。
4） バケツ採⽔︓ロープの末端を岩や橋の欄⼲などに結びつけバケツの逸失を防ぐ。バケツを投げ（図 3-1-2-6）、ロープを⼿繰り寄せて環境⽔の⼊ったバケツを回収する（図3-1-2-7）。データのばらつきを防ぐため、1 回のサンプリングで 10 回のバケツ採⽔を⾏いその都度シリンジを⽤いて 100ｍL の環境⽔を濾過する。この操作でシリンジ1 本あたり１L の⽔を濾過することになる。ただし、環境⽔の濁度が⾼い場合は数100mL で⽬詰まりが起こり、それ以上濾過できなくなることがある。そのような場合
は、それまでの濾過⽔量を記録しておくことが重要になる。
5） ステリベクスを⽤いた現場濾過︓バケツに汲んだ環境⽔を 50ｍL シリンジで吸引する（図 3-1-2-8）。シリンジには 50mL よりも多めに環境⽔を吸引させ、シリンジを上向きにしてシリンジ内の空気や余分の⽔を押し出す。環境⽔の量を 50mL に調整したらステリベクスを装着して加圧濾過を⾏う（図 3-1-2-9）。ステリベクスとシリンジの着脱を繰り返すので、その際にルアーロックを締め過ぎないように注意する。同じバ
ケツ採⽔から濾過を 2 回（50ｍL x 2 回 ＝ 100mL）繰り返したらバケツの⽔を捨てる。新たに環境⽔を汲み上げ、濾過総量が 1L に達するまで、この操作を 10 回繰り返す（シリンジでの濾過作業は合計 20 回となる）。単調な作業のため、カウンター（数取り器）を⽤いて採⽔回数を間違えないようにする。
６） ステリベクス内の⽔分除去︓上記の濾過がすべて終了したら、ステリベクスを取り外してシリンジ内に空気を満たす。再度シリンジにステリベクスを取りつけ、カートリッジ内の⽔分を押し出す（図 3-1-2-10）。この操作を数回繰り返し、⽔分をできるだ
け除去する。
7） ステリベクス排出孔の密閉︓ステリベクス内部の⽔分がほぼなくなったら、ステリベ
クスをシリンジに取りつけたまま、その排出孔をルアーフィッティングで密閉する（図3-1-2-11）。
８） RNAlater の充填︓ステリベクスをシリンジから取り外し、⼩型スポイト（図 3-1-212）を使って注⼊孔から RNAlater を 1-2mL 注⼊する（図 3-1-2-13）。ステリベク20

スの注⼊孔と本体の間に段差があるため、⼩型スポイトの先端がそれに引っかかると
RNAlater がうまく⼊らない。段差を避けるように奥まで⼩型スポイト先端を⼊れるとスムースに RNAlater を注⼊できる。なお、Buffer ATL を⽤いることで収量が上がるとする論⽂が発表されており（Wu & Minamoto 2023）、そのような⼿法を⽤いることもできる。その場合の Bufer ATL の量も 1-2mL 程度で良い。
9） ステリベクス注⼊孔の密閉︓RNAlater をステリベクスに充填したら、注⼊孔をルアー
フィッティングで密閉する（図 3-1-1-14）。ルアーフィッティングを使⽤する場合は、
固く締め過ぎないように注意する。ステリベクス内のフィルター上に集められた DNAの劣化を防ぐために、この作業までを採⽔現場で⾏うのが望ましい。
10）必要事項の記⼊︓ RNAlater 注⼊後、ステリベクス表⾯の⽔分をキムタオルでよく拭う。⽔分を取り除いた後、サインペンでステリベクスの本体に⽇付や測点番号など必要事項を記⼊する（図 3-1-2-15）。
11）濾過済みステリベクスの保管︓必要事項の記⼊が終わった濾過済みステリベクスをユニパック E-4 に⼊れる。ステリベクスが⼊ったユニパックをジップロックに⼊れ、保冷剤が⼊ったクーラーボックスに⼊れて冷暗条件で保管し持ち帰る（図 3-1-2-16）。
ラボに持ち帰ったステリべクスは－20℃以下で保存する。
12) ブランクの作成︓フィールドブランクは、精製⽔を⽤いて上記と同様の作業を⾏い作成する。フィールドブランクの必要性、頻度については、調査⽬的などに合わせ各事
業主体が慎重に判断する。

3-1-3．アスピレーターを⽤いた現場濾過
本項では、AC100V の電源がある実験室や船上で⼤量の⽔を濾過する場合に有効な⽅法を記す。濾過には 10L の活栓付きポリタンクを⽤い、活栓に 10mL のピペットチップを取りつけ、その先端にステリベクスの注⼊孔をねじ込む。さらに、ステリベクスの排出孔にルアーフィッティングを介してアスピレーターに接続し、吸引濾過により⼤量の⽔を濾過する。
コンタミ防⽌のため、常に使い捨て⼿袋を着⽤する。
1） ポリタンクの除染︓ ポリタンクの内部に市販の塩素系漂⽩剤（ハイター）を⼊れ、実効塩素濃度 0.1%以上になるように現場海⽔か⽔道⽔を⼊れて調整する（図 3-1-3-1）。
ポリタンクをよく振り、その後に濾過する現場海⽔で３回共洗いして漂⽩剤を除く。
2） 濾過装置の組み⽴て︓ポリタンクの活栓に 10mL のピペットチップを連結する（図 31-3-2）。ステリベクス排出⼝にルアーフィッティング（オスルアーロック）を装着する（図 3-1-3-3）。ゴム管をチューブ I 型ジョイントとつなぎ、⽳付きシリコン栓を取21

り付ける（図 3-1-3-4）。フィルターホルダーマニホルドの排出孔とアスピレーターをゴム管でつなぐ（図 3-1-3-5, 6）。フィルターホルダーマニホルドの吸⼊孔に前述のゴム管を装着する（図 3-1-3-7）。最後にポリタンクとつなげたチップの先端をステリ
ベクス注⼊孔に強く押し込む（図 3-1-3-8）と⼤量濾過システムが完成する（図 3-13-9, 10）。
3） 濾過︓アスピレーターのタンクに⽔を⼊れる。除染したバケツなどを使って環境⽔を採取してポリタンクに⼊れる。アスピレーターのスイッチを ON にするとポリタンク
からアスピレーターに向かって⽔が流れ、ステリベクスのフィルター上に環境 DNA がトラップされる。事前にポリタンクに 1L ごとにラインを⼊れていくと、吸引濾過した⽔の量を確認しやすい。
４） ステリベクス内の⽔分除去︓濾過が終了したら、ステリベクスをピペットチップから取り外し、そのまま吸引濾過を継続すると、ステリベクス内部の⽔分を除去できる。
5） 濾過後のステリベクスの処理︓前項の 7）以降の操作を続けてステリベクスを保管する。

22

図 3-1-2-1
現場濾過キットの内容︓50mL シリンジ 2
本, ステリベクス 2 本, ⼩型スポイト 2 本,
RNAlater が⼊った 2mL チューブ 2 本,
ユニパック（E-4）1 枚, ユニパック（G8）1 枚。

図 3-1-2-2
現場濾過キットをユニパック（G-8）に詰めた状態。このように 1 袋にまとめておくと現場での使い勝⼿がよい。

図 3-1-2-3
クレモナ⾦剛打ロープを 15m ほど切り出して折りたたみバケツ（Soft Bucket 8 型
I-484）にしっかりと結びつけたところ。
取っ⼿がとれやすいので、かならずバケツの縁にある⼩⽳にロープの先端をくくりつけておくこと。

図 3-1-2-4
バケツの内部とバケツにくくりつけたロープ先端部に泡洗浄ハイターを吹き付けて除染する。

23

図 3-1-2-5
ハイターを実験⽤ペーパータオルできれいに拭き取る。きれいに拭き取らないと、採⽔の際に泡が出て環境⽔を汚染してしまうので注意すること。

図 3-1-2-6
バケツを投げたところ。

図 3-1-2-7
ロープを⼿繰り寄せて環境⽔の⼊ったバケツを回収する。

図 3-1-2-8
50ｍL シリンジを⽤いてバケツで汲んだ環境⽔を吸引する。

24

図 3-1-2-9
ステリベクスを装填して加圧濾過を⾏う。

図 3-1-2-10
濾過が終わったら、ステリベクスを取り外してシリンジ内に空気を満たし、シリンジにステリベクスを再装着し、カートリッジ
内の⽔分を押し出す。この操作をカートリ
ッジから⽔が出なくなるまで数回繰り返す。

図 3-1-2-11
ステリベクスをシリンジに装着した状態
で、排出孔をルアーフィッティングを使って密閉する。

図 3-1-2-12
⼩型スポイトをつかい、2.0mL チューブから 2〜3 回に分けて RNAlater を吸引する。

25

図 3-1-2-13
吸引した RNAlater を注⼊孔から⼩型スポ
イトをつかって注⼊する。

図 3-1-2-14
注⼊孔をルアーフィッティングで密閉する。

図 3-1-2-15
ステリベクスの表⾯の⽔分をキムワイプ
で拭きとり、サインペンでステリベクスの本体に⽇付や測点番号など必要事項を記⼊する。

図 3-1-2-16
同じ測点から得られた 2 本のステリベクス
をユニパックに⼊れ、それをさらにジップ
ロックに⼊れて、保冷剤が⼊ったクーラー
ボックスで保管する。

26

図 3-1-3-1
ポリタンクの内部に市販の塩素系漂⽩剤（ハイターなど）を⼊れ、実効塩素濃度
0.1%以上になるように現場海⽔か⽔道⽔を⼊れて調整する。その後⼗分にすすぐ。

図 3-1-3-2
ポリタンクの活栓の先端に 10mL のピペ
ットチップを押し込む。

図 3-1-3-3
ステリベクス排出孔にルアーフィッティ
ング（オスルアーロック）を取りつける。

図 3-1-3-4
ゴム管と⽳付きシリコンをチューブ I 型ジョイント（⽩いジョイント）を介してつな
ぐ。

27

図 3-1-3-5
フィルターホルダーマニホルドの排出孔とゴム管をつなぐ。

図 3-1-3-6
ゴム管とアスピレーターをつなぐ。

図 3-1-3-7
フィルターホルダーマニホルドの吸⽔孔に前述のゴム管を装着する。

図 3-1-3-8
ポリタンクの活栓に取りつけた 10mL ピ
ペットチップの先端をステリベクス挿⼊
⼝に強く差し込む。

28

図 3-1-3-9
ステリベクスをつかった⼤量濾過システ
ムの完成。

図 3-1-3-10
AC100V の電源があれば、写真のように漁船の上でも容易に⼤量濾過ができる。

29

３-2．採⽔とグラスファイバーフィルターを⽤いた実験室での濾過
安全に採⽔を⾏うために（再掲）
環境 DNA のサンプリング（＝採⽔）は、季節や場所によってさまざまな環境下で⾏うことになる。夏には熱中症や⽇焼け対策が、冬には防寒対策が必要となり、磯や濡れた突堤、貯⽔池の護岸などでは転倒や落⽔に注意しなくてはならない。また、⽔際の作業であるために濡れてもよい撥⽔性や速乾性の⾼い⾐類を着⽤することも重要である。フィールドでの調査・作業は不測の事態に備えて原則として複数名で⾏う。さらに、特に海岸や⼤規模な河川においては安全を確保するためライフジャケットの着⽤は必須である。万が⼀、⽔難事故が起きてしまった場合は、川や池であれば警察へ 110 番に、海であれば海上保安庁のホットライン 118 番に速やかに通報する。

フィールドデータの記録に必要な道具（例）・ 耐⽔性野帳（測量野帳レベルブックセ-Y11，コクヨ）
・ 耐⽔加圧ボールペン（BDWR-40F-B，パイロット）・ ハンドヘルド GPS（eTrex20xJ，ガーミン）
・ データロガー導電率計（CD-4307SD，マザーツール）・ 防⽔デジタルカメラ（RICOH WG-30，リコー）

採⽔および研究室への輸送に必要な道具（例）・採⽔⽤ボトル（1L 以上︓事前に塩素消毒したもの）

サンプル数＋α

・採⽔⽤ボトル（1L の純⽔を⼊れたもの）

1 ⽇につき 1 本※1・10%塩化ベンザルコニウム溶液（1mL ずつに分注したもの）

サンプル数＋α

・使い捨て⼿袋（パウダーフリー）

サンプル数＋α

・採⽔⽤バケツおよびロープ

1式

・スプレー式塩素系漂⽩剤

1本

※2

・純⽔

適宜

・ペーパータオル

適宜

・ゴミ袋

適宜

・⻑靴・胴⻑等
・⽔質計（必要に応じて）・マジック、ガムテープ等

30

・クーラーボックス・保冷剤※1

塩化ベンザルコニウム溶液の使⽤に関しては特許が取得されており、使⽤にはロイヤリ
ティが必要になる場合があるため、利⽤者各⾃で事前確認が必要である。⽔サンプルのDNA 分解抑制⼿法には、塩化ベンザルコニウム溶液の使⽤のほか、⽔サンプルを冷蔵・冷凍で保存する⽅法などがある。

※2

市販の精製⽔や蒸留⽔など、PCR 等の検査で DNA 残留が認められない品質の⽔のことを指す。

グラスファイバーフィルターを⽤いた実験室での濾過に必要な道具（例）・フィルターホルダー（事前に塩素消毒したもの[図 3-2-2-1]）

適宜・アスピレーターまたは真空ポンプ

適宜

・グラスファイバーフィルター（平均孔径 0.7μm）

濾過数の 2 倍・ピンセット（事前に塩素消毒したもの）

適宜

・アルミホイル

適宜・チャック袋

適宜

・塩素処理⽤バケツ

適宜

・塩素系漂⽩剤

適宜

・純⽔

適宜

・使い捨て⼿袋（パウダーフリー）

適宜

・冷凍庫（－20℃以下）

3-2-1．フィールドデータの記録
野帳に記⼊する主な項⽬として以下のようなものがあげられる。耐⽔性の野帳に耐⽔性のボールペンあるいは鉛筆、シャープペンシルで記録するとよい。
・採⽔者（サンプリングに同⾏した全員の名前を記録）
・⽇付（YYYY-MM-DD の形式で記録、必要に応じて時間も記録する⽅が望ましい)・測点番号と採⽔地点の地名（プロジェクト略称＋調査番号＋測点番号）
・緯度経度（35.101252N, 139.293012E のような 10 進法が取り扱いやすい）・河岸・湖岸・海岸・底質の分類︓砂浜・砂利浜・岩礁・サンゴ・護岸（コンクリート・テ
トラ・捨て⽯など）
・気象・海象（⾵向・⾵⼒・波⾼を含む）
・⽔温（℃）
︓携帯⽤の⽔質計を⽤いて計測する。

31

・（海では）潮汐（⼤潮・中潮・⼩潮・若潮・⻑潮）と⼲満（満潮・⼲潮・上げ潮・下げ潮）
・（海では）塩分濃度（‰）
︓携帯⽤の⽔質計を⽤いて計測する。
・透明度（透明・ササ濁り・濁り）・濾過⽔量（ｍL）
︓1000ｍL 未満の場合には必ず記⼊すること。
・⽬視の範囲内で⿂影やその他の⽣物︓抽出した環境 DNA には⿂類以外の⽣物が含まれているので、クラゲやその他の⽬⽴つ⽣物に関する記録が後々に重要となる。
・写真（撮影の有無）
・その他︓環境⽔に影響を与えそうなものの記録（釣り⼈の有無︔排⽔や流れ込みの有無など）

3-2-2．採⽔および実験室への輸送
常に使い捨て⼿袋を着⽤し、クロスコンタミネーション防⽌のため採⽔地点ごとに取り替える。
1) ⽔辺からの直接採⽔︓直接⽔辺にアクセスできる場合は、採⽔ボトル（事前に塩素消毒したものなど, 図 3-2-2-1）を直接⽔につけて採⽔を⾏う。現場の環境⽔でボトルを 2回、共洗いした後、サンプルを 1L より少し多めに採取する。コンタミネーション防⽌のため、共洗いした⽔は、河川の場合下流側に捨てるなど、共洗いした⽔がサンプルに混⼊しないよう注意する（図 3-2-2-2）。作業時には底泥を巻き上げないように注意する。
2) バケツを⽤いる場合︓⽔辺への直接のアクセスが困難な場合には、バケツを⽤いて河川⽔を採取する(ア) バケツの除染︓バケツの内部とバケツにくくりつけたロープ先端部に泡洗浄ハイ
ターを吹き付ける（図 3-2-2-4）。数分間放置した後、ハイターを実験⽤ペーパー
タオルなどできれいに拭き取る（図 3-2-2-5）。その後、バケツとロープ先端を環境⽔で２回共洗いする。ハイターが余分に残っているとサンプル中の DNA が分解されるので注意すること。
(イ) バケツ採⽔︓バケツを投げ、ロープを⼿繰り寄せて環境⽔の⼊ったバケツを回収する（図 3-2-2-6）。採⽔した⽔でバケツを 2 回、共洗いする。その後採⽔した⽔でボトルを 2 回、共洗いした後、サンプルを 1L より少し多めに採取する。コンタ
ミネーション防⽌のため、共洗いした⽔は、河川の場合下流側に捨てるなど、共洗いした⽔がサンプルに混⼊しないよう注意する。
3) フィールドブランク︓実験室から運んだ純⽔が⼊ったボトルをフィールドで開封し、サンプルと同様に処理する。

32

4) 実験室への輸送︓採⽔後のサンプルは直射⽇光および⾼温をさけて実験室に輸送する。
採取した⽔を保存するためには、いくつか⽅法がある。１）DNA の分解抑制のために、サンプル 1L に 10%塩化ベンザルコニウム溶液を 1mL 添加し（終濃度 0.01%）、密閉後転倒混和を⾏ってしっかりと混ぜたものを持ち帰る（図 3-2-2-3）。２）その場でクーラーボックスに⼊れて冷蔵して持ち帰る。塩化ベンザルコニウムを添加した場合は、常温下でも数⽇程度は DNA が保存されるが、できるだけ低温での管理が望ましい（ただし、現在のところ、塩化ベンザルコニウムを添加すれば、⽔サンプルは冷凍させない⽅がよいと考えられている）。また、紫外線は DNA にダメージを与えるので、直射⽇光を避けて輸送する。輸送後、速やかに以下の濾過作業を⾏う。

3-2-3．グラスファイバーフィルターを⽤いた濾過
実験室に持ち帰ったサンプルはできるだけ早期に（採⽔後 48 時間以内を推奨）濾過を⾏う。
常に使い捨て⼿袋を着⽤する。
1) 塩素処理の準備︓塩素処理⽤バケツに⽔道⽔を⼊れ、市販の塩素系漂⽩剤を実効塩素濃度 0.1%以上になるように添加する。
2) 道具の塩素処理︓フィルターホルダーおよびピンセットは使⽤前に 5 分以上塩素処理バ
ケツに漬け（図 3-2-3-1）、⽔道⽔ですすいだ後、蒸留⽔ですすいでから使⽤する。この塩素処理はサンプルが変わるごとに⾏う必要がある。使⽤後のボトルはボトル表⾯も含めて全体を除染する必要があるので、塩素処理バケツに全体を沈めて５分以上の塩素除染を⾏い、次回以降の調査に⽤いる。
3) 濾過︓⽔サンプルの濾過にはグラスファイバー製のフィルター（平均孔径 0.7μm）を、
1L につき 1〜2 枚⽤いて濾過する（図 3-2-3-2 ~ -4）。なお、サンプル⽔によっては
1L の濾過が困難な場合があるので濾過⽔量は必ず記録する。濾過⽔量を減らした場合
でもサンプルあたりのフィルター枚数は 2 枚までとすることを推奨する。未使⽤フィル
ターにサンプル⽔がかかることによるコンタミネーションを防ぐため、フィルターの容器を開け放しにしないことやサンプル⽔より⾼いところにおいておくことなどの注意が必要である。
4) フィルターの保存︓濾過が終わったフィルターは濾過⾯を内側にして半分におり、2 枚のフィルターをあわせてアルミホイルで包む（図 3-2-3-5）。アルミホイルにサンプル
名などを記⼊し、ユニパックなどの袋に⼊れて冷凍庫（-2０℃以下）で保存する（図 32-3-6）。なお、できるだけ早く次の処理（DNA の抽出）を⾏うことが望ましい。
5) 濾過ブランク︓濾過時以降のコンタミネーションの有無を評価するため、１⽇の作業に33

つき 1 回、純⽔ 1L を「濾過ブランク」を⽤意し、サンプルと同様に扱う。ただし、「フィールドブランク」で濾過ブランクの代⽤としてもよい。輸送の際に、塩化ベンザルコ
ニウム添加している場合は、同様に純⽔ 1L に 10%塩化ベンザルコニウム溶液を 1mL添加し（終濃度 0.01%）、密閉後転倒混和を⾏ってしっかりと混ぜたものを「濾過ブランク」として扱う。

34

図 3-2-2-1
採⽔ボトルは使⽤前に塩素系漂⽩剤などにより除染する。

図 3-2-2-2
共洗い後の環境⽔は下流側など、サンプルに影響しないところに捨てる。

図 3-2-2-3 （保存オプション）
採⽔後、1Ｌあたり 10%塩化ベンザル
コニウム溶液 1mL を添加する。

図 3-2-2-4
バケツの内部とバケツにくくりつけたロープ先端部に泡タイプの塩素系漂⽩剤を吹き付けて除染する。

35

図 3-2-2-5
ハイターを実験⽤ペーパータオルなどできれいに拭き取る。きれいに拭き取らな
いと、採⽔の際に泡が出て環境⽔を汚染してしまうので注意すること。

図 3-2-2-6
バケツを投げ、ロープを⼿繰り寄せて環
境⽔の⼊ったバケツを回収する。

図 3-2-3-1
濾過に使⽤する器材は使⽤前に塩素系漂⽩剤などにより除染する。

図 3-2-3-2
濾過の様⼦。

36

図 3-2-3-3
濾過後のグラスファイバーフィルターの状態。

図 3-2-3-4
濾過後のグラスファイバーフィルターの状態

図 3-2-3-5
濾過後のグラスファイバーフィルターを
アルミホイルで遮光する。

図 3-2-3-6
アルミホイルにサンプル情報等を書き込
み、ユニパックなどの袋で冷凍保存する。

37

4．DNA の抽出
サンプル保管上の注意
環境⽔を濾過したフィルターは冷凍庫に保管する。冷凍庫の温度管理には⼗分な注意を払い、凍結融解を繰り返すことのないように注意する。

DNA 抽出に共通の注意点
コンタミネーションのリスクを軽減するために、DNA 抽出の作業場所は、PCR 以降の装置やサンプルと物理的に隔離すること、PCR 以降の操作を⾏った作業者が同じ⽇に DNA 抽出
以前の操作を⾏うことのないように、1 ⽇の作業内容・順序を事前に確認することが重要である。また、作業開始前と終了後には、作業場所と使⽤器具、機器類の除染を⾏うことを推奨する。
以下にカートリッジ式フィルターからの DNA 抽出（4-1）およびグラスファイバーフィル
ターからの DNA 抽出（4-2）について記す。

38

4-1．カートリッジ式フィルターからの DNA 抽出
はじめに
本項では、ステリベクスフィルターから DNA を抽出する⽅法を記す。本⼿法はビデオジャーナルである Journal of Visualized Science (Miya et al. 2016) に発表した⼿法を若⼲改変したもので、⼀連の技法は動画に収められているので参考にされたい。なお、本プロトコールでは、DNeasy キットに付属の Buffer ATL を使⽤しないが、Buffer ATL を⽤いることで収量が上がるとする論⽂が発表されている（Wu & Minamoto 2023）。また、DNA 抽
出の際の試薬量を増やすことで収量が上がるとする論⽂も発表されており（Wong et al.
2020）、それらの⼿法を⽤いることもできる。
ここからが実験室での⼯程となるので、外来 DNA の混⼊には⼗分注意を払わなくてはならない。特に、この段階でコンタミネーションが起こると、以降の実験（リアルタイム PCR
⽤サンプルや次世代シーケンス⽤ライブラリーの調製）が台無しになってしまう。そうならないように、DNA 抽出のみの専⽤の実験室（DNA 抽出室）を設け、PCR 関連の部屋とは空間的に⼗分隔離しなければならない。さらに、組織からの抽出 DNA や PCR 産物を扱った
当⽇は DNA 抽出室に⼊らないなどの細⼼の注意を払う。

DNA 抽出に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ 恒温器（中にミニローテーターを設置でき、56℃で使⽤できるもの）
・ ミニローテーター（ACR-100，アズワン）と付属の 10mL/15mL チューブホルダー
・ QIAvac 24 Plus システム（QIAvac 24 Plus Vacuum Manifold を含む接続アダプター
⼀式（QIAvac 24 Plus），Vacuum トラップと Connecting チューブ、設置トレー⼀式（QIAvac Connecting System），および Vacuum Pump，いずれもキアゲン）※1
・ 遠⼼分離機（50mL コニカルチューブが回せるもの）
・ 微量⾼速冷却遠⼼機（2.0mL チューブと DNeasy カラムが回せるもの）
・ 卓上⼩型遠⼼機（マイクロシックス MS-1，アズワン）
・ ボルテックス・ミキサー（VORTEX-GENIE 2 Mixer，エムエス機器）と 3 インチプラッ
トホーム・ ルアーフィッティング（吸引装置接続⽤，VPRM406，アイシス）・ ルアーフィッティング（注⼊⼝⽤，VRMP6，アイシス）・ ルアーフィッティング（排出⼝⽤，VRSP6，アイシス）
・ 50mL コニカルチューブ（⽇本ジェネティクス）
・ DNeasy Blood and Tissue kit（キアゲン）・ 96〜99.5%エタノール（分⼦⽣物学⽤、富⼠フィルム和光純薬）

39

・ DNA 低吸着 2.0mL チューブ（ザルスタット）・ DNA 低吸着 1.5mL チューブ（ザルスタット）
・ PBS (-)（マグネシウムとカルシウムを含まないリン酸緩衝⽣理⾷塩⽔，細胞科学研究所）※2
・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100（ピペットマン，ギルソン）
・ DNA 低吸着フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種，使⽤マイクロピペットに適合したもの）
・ 標準型ピンセット（IPT-12, アズワン）
・ 1.5mL/2.0mL ⽤チューブラック※1

QIAvac 装置を使うかわりに、50mL コニカルチューブと 2.0mL チューブを組み合わせ、遠⼼分離機で RNAlater を抜き取ってもよい（Miya et al. 2016 が参考になる）。

※2

本プロトコールでは、DNeasy キットに付属の Buffer ATL は使⽤しないが、Buffer ATL
を⽤いたほうが収量が上がるとする論⽂も発表されており（Wu & Minamoto, 2023）、
そのような⼿法を⽤いることもできる。

4-1-1．実験の準備
常に使い捨て⼿袋を着⽤する。作業中に⼿袋の汚染を感じた場合は速やかに交換する。
1） 乾熱滅菌器を 56℃に設定する（温まるのに時間がかかるので事前に準備しておく︔図4-1-1-1）。
2） RNAlater が充填された濾過済みのステリベクスを準備する。凍結保存されていた場合
は、作業前に室温に置いてあらかじめよく解凍しておく（図 4-1-1-2）。

4-1-2．RNAlater の吸引
1） DNeasy Blood and Tissue kit と PBS (-) を使って抽出液（プレミックス）の準備をする（図 4-1-3-1）。1 本のステリベクスあたり 20μL の Proteinase K（600mAU/ml、キット付属）、200μL の Buffer AL、220μL の PBS (-) の割合でプレミックスを調製する。これには、DNA 抽出中のコンタミネーションを検知するための「抽出ブランク」
⽤の 1 本分も含める。
2） ルアーフィッティングを介して QIAvac 24 Plus Vacuum Manifold とステリベクスを接続する（図 4-1-2-1）。
3） QIAvac のポンプのスイッチを⼊れ、注⼊孔側から排出孔側に向かって RNAlater を吸40

引し除去する。ステリベクスのカートリッジ内には、構造上の問題で若⼲の RNAlaterが残るが、これ以降の DNA 抽出で問題は⽣じない。
4） ルアーフィッティング（VRSP6）をステリベクスの数だけ⽤意する。
5） RNAlater を除去したステリベクスをマニホールドから外し、ルアーフィッティング（VRSP6）で排出孔に封をする（図 4-1-2-2）。

4-1-3．DNA の抽出
1)

ステリベクスの注⼊孔を開封し、マイクロピペット（P-1000）と 1000μL ⽤のフィル
ターチップを⽤いて上記のプレミックス（4-1-2-1)）を充填する（注意︓注⼊孔とカートリッジの接合部に段差があるため、チップ先端の挿⼊具合によって液が溢れ出ることがある︔図 4-1-3-2）。

2)

ルアーフィッティング（VRMP6）でステリベクスの注⼊孔側に封をする（図 4-1-3-3）。

3)

ミニローテーターの 10mL/15mL チューブホルダーにステリベクスを差し込み、ステリベクスが⽔平になるようにチューブホルダーをローテーター本体に取り付ける。

4)

ステリベクスを取り付けたローテーターを恒温器内に置き、10rpm で回転させ 56℃
で 20 分間加温する（注意︓ミニローテーターの耐久温度は 60℃︔図 4-1-3-4）。

5)

ステリベクスを加温中に DNA 回収⽤の 2.0mL チューブ（DNA 低吸着）と 50mL コ
ニカルチューブを⽤意し（図 4-1-3-5）、2.0mL チューブのキャップを折り曲げて50mL コニカルチューブ内に⼊れる（注意︓2.0mL のチューブにはあらかじめキャッ
プに番号など必要事項を記⼊しておく。コニカルチューブの奥まで押し込まない︔図４-1-3-6）。

6)

ステリベクスの加温が終了後、注⼊孔側のルアーフィッティングを内部の液が漏れないように注意深く取り外す。

7)

ステリベクスの注⼊孔を、コニカルチューブ内に⼊れた 2.0mL チューブ内に挿⼊し、そのまま 50mL コニカルチューブの底まで押し込む（図 4-1-3-7）。きちんと奥まで押し込まれていないと遠⼼中に 2.0mL チューブが破損することがある。その後しっかりとコニカルチューブのキャップを閉める（図４-1-3-8）。

8)

ステリベクスを⼊れたコニカルチューブを 6,000g で 1 分間遠⼼し（図 4-1-3-9)、抽出 DNA を 2.0mL チューブに回収する（図 4-1-3-10）。

9)50mL コニカルチューブを遠⼼機から取り出し、ピンセットを使ってステリベクス（図41

4-1-3-11）、2.0mL チューブの順に取り出す（図 4-1-3-12︔注意︓2.0mL チューブはキャップが開いた状態なので注意深く扱うこと）。
10) 使⽤済みステリベクスを廃棄し、2.0mL チューブのキャップをしっかりと閉じる。

4-1-4．DNeasy Blood and Tissue kit を⽤いた DNA の精製
1） ステリベクスの本数に抽出ブランク 1 本を加えた本数の DNeasy Blood and Tissue
kit（以下 DNeasy）付属のカラムを⽤意する（図 4-1-4-1）。カラムのキャップに必要事項を記⼊する。
2） 抽出 DNA が⼊った 2.0mL チューブに 200μL の 96〜99.5%エタノールを⼊れピペットでよく混和する（図 4-1-4-2）。
3） マイクロピペット（P-1000）の吸引量を 700μL にセットし、カラムに抽出 DNA を⼊れる（注意︓RNAlater が少量残っているため溶液は 640μL より多くなることがある︔
図 4-1-4-3）。抽出ブランクには、4-1-3 で⽤意した混合溶液 440μL に 200μL の 96
〜100%エタノールを加えてピペットで混和したものを⽤いる。
4） 溶液が⼊ったカラムを 6,000g で 1 分間遠⼼する（図 4-1-4-4）。
5） 遠⼼を終了後、カラムのコレクションチューブを外して新しい 2mL コレクションチ
ューブにカラムに載せ替える（図 4-1-4-5）。使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する（図 4-1-4-6）。
6） カラムに 500μL の Buffer AW1 を⼊れ（図 4-1-4-7）、6,000g で 1 分間遠⼼する。
7） 遠⼼を終了後、カラムを新しい 2mL コレクションチューブに載せ替える（図 4-1-48）。使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。
8） カラムに 500μL の Buffer AW2 を⼊れ（図 4-1-4-9）、使⽤している遠⼼分離機の最⼤遠⼼速度で 3 分間遠⼼する。
9） 新しい DNA 低吸着の 1.5mL チューブを⽤意し、キャップに必要事項を記⼊する（図4-1-4-10）。
10）遠⼼を終了後、カラムを 9）で⽤意した 1.5mL チューブに載せ替える（図 4-1-4-11）。
使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。
11）100~200μL の Buffer AE（溶出バッファー）をカラムのメンブレン上に注ぎ（図 41-4-12）、室温で 1 分間インキュベートした後に 6,000g で 1 分間遠⼼する（図 4-1-

42

4-13）。なお、回収 DNA 濃度が希薄となることが予想される場合には、溶出バッファー量を 50μL 程度まで減じることも可能である。溶出に使⽤したバッファー量を記録しておく。
12）遠⼼を終了後、カラムを取り外してチューブのキャップをしっかりと閉じる（図 4-14-14）。使⽤済みカラムを廃棄する。
13）この状態で－20℃で安定的に保存可能である（図 4-1-4-15）。

参考⽂献
Miya, M., Minamoto, T., Yamanaka, H., Oka, S., Sato, K., Yamamoto, S., Sado, T., Doi,
H. 2016. Use of a filter cartridge for filtration of water samples and extraction ofenvironmental DNA. Journal of Visualized Experiments (117): e54741. doi:
10.3791/54741
Wong, M. K-S., Nakano, M., Hyodo, S. 2020. Field application of an improved protocol
for environmental DNA extraction, purification, and measurement using Sterivex
filter. Scientific Reports 10: 21531. doi: 10.1038/s41598-020-77304-7
Wu, Q., Minamoto, T. 2023. Improvement of recovery yield of macro-organismal
environmental DNA from seawater samples. Analytical Sciences 39: 713-720. doi:
10.1007/s44211-023-00280-1

43図 4-1-1-1
恒温器を 56℃にセットする。指定の温度に達するまで時間がかかるので、抽出前に余裕をもってセットすること。

図 4-1-1-2－20℃に凍結してあったステリベクスを解凍する。冷蔵の場合はそのままでよい（図 4-1-1-2）。

図 4-1-2-1
ステリベクスの排出孔を開封し、ルアーフィッティングを介して QIAvac と接続し、ステリベクス内に充填した RNAlater を抜き取る。

図 4-1-2-2
再度、ステリベクスの排出孔を閉じる。

44

図 4-1-3-1抽出に必要な試薬を⽤いてプレミックスを作成・準備しておく（4-1-2-1）。

図 4-1-3-2
ステリベクスの注⼊孔を開封し、マイクロ
ピペット（P-1000）と 1000μL ⽤のフィルターチップを⽤いて準備しておいたプレミックスを充填する。

図 4-1-3-3
ステリベクスの注⼊孔に封をする。ステリベクスを 56℃に加熱する際、液が膨張するのでしっかり封をすること。

図 4-1-3-4
ステリベクスを取り付けたローテーターを恒温器内に置き、10rpm で回転させ 56℃
で 20 分間加温する。

45

図 4-1-3-5
ステリベクスを加温中に DNA 回収⽤のDNA 低吸着 2.0mL チューブと 50mL コ
ニカルチューブを⽤意する。

図 4-1-3-6
2.0mL チューブを 50mL コニカルチュー
ブに挿⼊したところ。

図 4-1-3-7
ステリベクスの注⼊孔を 2.0mL チューブ内に挿⼊し、そのまま 50mL コニカルチ
ューブの底まで押し込む。

図 4-1-3-8
ステリベクスと 2.0ｍL チューブをコニカ
ルチューブの底に押し込んだら、しっかりとコニカルチューブのキャップを閉める。

46

図 4-1-3-9
ステリベクスを⼊れたコニカルチューブを
6,000g で 1 分間遠⼼する。

図 4-1-3-10
コニカルチューブ内で 2.0ｍL チューブに回収された抽出 DNA。

図 4-1-3-11
ピンセットを使ってコニカルチューブからステリベクスを取り出す。

図 4-1-3-12
次いでピンセットを使ってコニカルチュー
ブから 2.0mL チューブを取り出す。キャップが開いたままなので注意深く取り出すこと。

47

図 4-1-4-1
DNeasy Blood and Tissue kit 付属のカラム（コレクションチューブ付き）を開封してチューブラックに並べる。

図 4-1-4-2
抽出 DNA が⼊った 2.0mL チューブに200μL の 96〜100%エタノールを⼊れピ
ペットでよく混和する。

図 4-1-4-3
カラムに抽出 DNA を⼊れる。

図 4-1-4-4
抽出 DNA が⼊ったカラムを 6,000g で 1
分間遠⼼する。

48

図 4-1-4-5
遠⼼を終了後、カラムのコレクションチューブを外して新しい 2mL コレクションチ
ューブにカラムに載せ替える。

図 4-1-4-6
使⽤済みのコレクションチューブは廃棄する。

図 4-1-4-7
カラムに 500μL の Buffer AW1 を⼊れる。

図 4-1-4-8
遠⼼を終了後、カラムを新しい 2mL コレ
クションチューブに載せ替える。

49

図 4-1-4-9
カラムに 500μL の Buffer AW2 を⼊れる。

図 4-1-4-10
DNA 低吸着の 1.5mL チューブを⽤意し、キャップに必要事項を記⼊する。

図 4-1-4-11
遠⼼を終了後、カラムを図 4-1-4-10
で⽤意した DNA 低吸着 1.5mL チューブに載せ替える。

図 4-1-4-12
100〜200μL の Buffer AE（溶出バッファー）をカラムのメンブレン上に注ぐ。

50

図 4-1-4-13
室温で 1 分間インキュベートした後に6,000g で 1 分間遠⼼する。

図 4-1-4-14
遠⼼を終了後、カラムを取り外してチュー
ブのキャップをしっかりと閉じる。チュー
ブ内に集められた溶液が DNA サンプルであるので、間違って捨てないように注意する。

図 4-1-4-15
この状態で－20℃で安定的に保存可能である。

51

4-2．グラスファイバーフィルターからの DNA 抽出
はじめに
本項では、グラスファイバーフィルターから DNA を抽出する⽅法を記す。なお、本⼿法はUchii et al. 2016 に発表した⼿法を若⼲改変したものである。
なお、本プロトコールでは、DNeasy キットに付属の Buffer ATL を使⽤しないが、Buffer
ATL を⽤いることで収量が上がるとする論⽂が発表されている（Wu & Minamoto 2023）。
また、DNA 抽出の際の試薬量を増やすことで収量が上がるとする論⽂も発表されており（Wong et al. 2020）、それらの⼿法を援⽤することもできる。
また、ここからの実験室での⼯程では外来 DNA の混⼊には⼗分注意を払わなくてはならな
い。特に、この段階でコンタミネーションが起こると、以降の実験（リアルタイム PCR ⽤
サンプルや次世代シーケンス⽤ライブラリーの調製）が台無しになってしまう。そうならないように、DNA 抽出だけの専⽤の実験室（DNA 抽出室）を設けるべきである。また、DNA
抽出室は PCR 関連の部屋とは空間的に⼗分隔離しなければならない。さらに、組織からの抽出 DNA や PCR 産物を扱った当⽇は DNA 抽出室に⼊らないなどの細⼼の注意が必要となる。

DNA 抽出に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・遠⼼分離機（サリベットチューブが回せるもの）
・微量⾼速冷却遠⼼機（2.0mL チューブと DNeasy カラムが回せるもの）
・恒温器（56℃に設定、ヒートブロックでも良い）・サリベットチューブ

サンプル数分・ピンセット

サンプル数分

・DNeasy Blood & Tissue Kit

サンプル数分・Buffer AL および Proteinase K
・1.5mL エッペンドルフチューブ（DNA 低吸着）

サンプル数分・96〜99.5%エタノール（分⼦⽣物学⽤）

適宜

・TE バッファ（pH8.0: 分⼦⽣物学⽤）

適宜

・使い捨て⼿袋（パウダーフリー）・マイクロピペット P-1000，P-200，P-100（ピペットマン，ギルソン）・フィルターチップ各種
・1.5mL/2.0mL ⽤チューブラック52

4-2-1．実験の準備
常に使い捨て⼿袋を着⽤する。作業中に⼿袋の汚染を感じた場合は速やかに交換する。
1） 56℃の恒温器を準備する（温まるのに時間がかかるので、事前に準備しておく）。
2） ⽔サンプルを濾過して折りたたんでいたフィルター※1 を、折り⽬を下にしてサリベッ
トに⼊れる（図 4-2-1-1、-2）。1 サンプルに 2 枚のフィルターを⽤いた場合は 2 枚ま
とめて⼀つのサリベットに⼊れる。
3） サリベットの上部および下部に、サンプル番号を振っておく（図 4-2-1-3）。
※1フィルターに残存する⽔分が塩化ベンザルコニウムを含む場合に DNA 収量の低下やバラツキが⽣じる可能性が指摘されており、必要に応じて本処理前に⽔分除去の⼿順（5,000g，1 分間遠⼼など）の追加を検討してもよい。

4-2-2. タンパク質の分解処理
1) サンプルあたり、400μL の Buffer AL、40μL の Proteinase K（600mAU/ml）を添加する（4-2-2-1）。サンプルがｎ個であればそれぞれ試薬をｎ＋１倍まとめて調製してから分注するとよい。
2) 恒温器で 56℃、30 分間保温処理する（図 4-2-2-2）。加熱するとサリベットのキャッ
プが⾶ぶ場合があるため、バスケット部分と下のチューブの部分との間を少し緩め、⽴てて恒温器に⼊れる。
3) その後、3,000〜5,000g で 3 分間遠⼼分離する（図 4-2-2-3）。50mL コニカルチュー
ブ内にサリベットチューブを⼊れて遠⼼してもよい。この時点でサリベットの下部に濾液が 800〜1,000μL となる（図 4-2-2-4）。
4) サリベット内のフィルターにまだ DNA が残っているので、これをさらに回収するため、
220μL の TE を添加（図 4-2-2-5）して 1 分間静置する。その後、3,000〜5,000g で3 分間遠⼼分離する。

4-2-3. DNeasy カラムを⽤いた DNA の精製
1) フィルターの⼊ったサリベットの上部を外して捨て、下部の DNA 溶液（図 4-2-3-1）に、400μL の 96〜99.5%エタノールを添加する（図 4-2-3-2）。
2) ピペッティング（図 4-2-3-3）で混ぜてから DNeasy のカラム（図 4-2-3-4）へ 650μ53

L 程度（半分程度）移し（図 4-2-3-5）、6,000g で 1 分間遠⼼する（図 4-2-3-6）。
3) 下の 2mL コレクションチューブにたまった濾液を捨て（図 4-2-3-7、-8）、サリベット下部に残っている DNA 溶液を再びカラムに移し（図 4-2-3-9）、6,000g で 1 分間遠⼼する。この作業を DNA 溶液がなくなるまで繰り返す。
4) カラムを新しい 2mL コレクションチューブに載せ替え（図 4-2-3-10）、500μL の Buffer
AW1 を添加後（図 4-2-3-11）、6,000g で 1 分間遠⼼する。
5) カラムを新しい 2mL コレクションチューブに載せ替え（図 4-2-3-12）、500μL の Buffer
AW2 を添加後（図 4-2-3-13）、使⽤している遠⼼分離機の最⼤遠⼼速度で 2 分間遠⼼する。
6) 遠⼼機から取り外すときや移動させるときなどは、揺れなどで下部の液を上部のカラム部分の先に付着させることのないように注意する。
7) DNA 低吸着の 1.5mL チューブを⽤意し、サンプル名等を記載する（図 4-2-3-14）。
8) カラムを DNA 低吸着の 1.5mL チューブに載せ替える（図 4-2-3-15, -16）。

9) 100〜200μL の Buffer AE（溶出バッファー）を添加し（図 4-2-3-17）、1 分間静置する。6,000g で 1 分間遠⼼分離後（図 4-2-3-18）、カラムの出⼝部分が抽出溶液に付着しないように気をつけながらカラムを取り外し、 1.5mL チューブの蓋をしっかりとしめる（図 4-2-3-19）。この状態で－20℃で安定的に保存可能である。なお、回収 DNA
濃度が希薄となることが予想される場合には、溶出バッファー量を 50μL 程度まで減じることも可能である。溶出に使⽤したバッファー量を記録しておく。

補⾜事項
サリベットを遠⼼できるサイズの遠⼼機がない場合は、サリベットの代わりに⼩型スピン
カラムを⽤いた抽出法を⽤いることもできる。詳細は Yamanaka et al. 2016 などを参考にするとよい。

参考⽂献
Uchii, K., Doi, H., Minamoto, T. 2016. A novel environmental DNA approach to quantify
the cryptic invasion of non-native genotypes. Molecular Ecology Resources 16 (2):415-422. doi: 10.1111/1755-0998.12460

54

Wong, M. K-S., Nakano, M., Hyodo, S. 2020. Field application of an improved protocol
for environmental DNA extraction, purification, and measurement using Sterivex
filter. Scientific Reports 10: 21531. doi: 10.1038/s41598-020-77304-7
Wu, Q., Minamoto, T. 2023. Improvement of recovery yield of macro-organismal
environmental DNA from seawater samples. Analytical Sciences 39: 713-720. doi:
10.1007/s44211-023-00280-1
Yamanaka, H., Motozawa, H., Tsuji, S., Miyazawa, R. C., Takahara, T., Minamoto, T.
2016. On-site filtration of water samples for environmental DNA analysis to avoid
DNA degradation during transportation. Ecological Research 31 (6): 963-967. doi:
10.1007/s11284-016-1400-955図 4-2-1-1
冷凍庫から取り出したフィルターをサリベットに移し替える。

図 4-2-1-2
サリベットに⼊ったフィルター。フィル
ターは折り⽬を下にして⼊れることを推奨。

図 4-2-1-3
サリベットの上部と下部にサンプル番号を書く。

図 4-2-2-1
Buffer AL と Proteinase K の混合液をフィルターに添加する。

56

図 4-2-2-256℃で 30 分間保温する。

図 4-2-2-3
遠⼼機で遠⼼し、フィルター上の液体をサリベット下部に落とす。

図 4-2-2-4
遠⼼後の様⼦。サリベット下部に DNA
溶液が 800〜1,000μL 程度回収される。

図 4-2-2-5
サリベット内のフィルターに TE バッフ
ァを添加する。

57

図 4-2-3-1
⼆度⽬の遠⼼後の様⼦。

図 4-2-3-2
サリベット上部を取り外し、下部のDNA 溶液にエタノールを添加する。

図 4-2-3-3エタノール添加後、ピペッティングでよく混ぜる。

図 4-2-3-4
DNeasy カラム。

58

図 4-2-3-5
サリベット下部の DNA 溶液を DNeasy
カラムに移す。

図 4-2-3-6
遠⼼で、カラムを通過させる。

図 4-2-3-7
DNA がカラム部分にトラップされるため、下部の液体は廃液である。

図 4-2-3-8
廃液を捨てる。

59

図 4-2-3-9
再びサリベットからカラムに DNA 溶液
を移し、遠⼼する。

図 4-2-3-10
遠⼼後、カラムを新しい 2mL コレクションチューブに載せ替える。

図 4-2-3-11
Buffer AW1 を注ぐ。

図 4-2-3-12
遠⼼後、カラムを新しい 2mL コレクションチューブに載せ替える。

60

図 4-2-3-13
Buffer AW2 を注ぎ、遠⼼する。

図 4-2-3-14
DNA 低吸着の 1.5mL チューブを⽤意
し、サンプル番号を書く。

図 4-2-3-15
1.5mL チューブに遠⼼を終えたカラムを載せ替える。

図 4-2-3-16
1.5mL チューブにカラムを載せ替えた状態。

61

図 4-2-3-17
Buffer AE を注ぎ、1 分静置の後、遠⼼する。

図 4-2-3-18
遠⼼後の状態。この時点では下部に落ちた溶液が DNA サンプルであるので、間違って捨てないように注意する。

図 4-2-3-19
カラムを外し、蓋をしっかりと締め、冷凍保存する。

62

5．DNA の分析

5-1．リアルタイム PCR による環境 DNA の種特異的な検出・定量
はじめに
本項では、リアルタイム PCR を⽤いた環境 DNA の種特異的な検出および DNA 量の定量について記す。種特異的な検出には対象種ごとに検出系を設計する必要があるため、ここで記すのは⼀例にすぎない。実験条件などについてはそれぞれの系について⼗分な検討が必要である。

5-1-1. 種特異的プライマー（およびプローブ）の設計
種特異的なプライマーに求められる条件は、対象種の DNA を効率よく増幅することと、同所的に⽣息する近縁種の DNA を誤増幅しないことである。そのためのプライマー設計の⼿順は以下のとおりである。
1) 塩基配列情報の⼊⼿︓対象種および同所的近縁種の塩基配列情報をダウンロードす
る。NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）や BOLD（http://www.
barcodinglife.org）等のデータベースを適宜利⽤する。ただし、データベース上の情報には誤りが含まれていることに留意し、複数のシークエンス情報を元に検討することが望ましい。
2) プライマーの設計︓対象種と近縁種の間に塩基配列の差異のある領域を探し、プライマーを設計する（図 5-1-1-2）。プライマーの３ʻ末端付近に対象種に特異的な塩基があるとよい。プライマーの設計に際しては Tm 値が適切な範囲にあるかなど、プライマー設計の⼀般的な注意点を参考にするとよい。必要に応じて TaqMan プローブも作成する。
3) In silico でのチェック︓Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/
primer-blast/）などを⽤いて、プライマーの特異性を確認する。同所的に⽣息する他の⽣物種が増幅されないことの確認を⾏う。
4) In vitro でのチェック︓対象種および近縁種の組織などから抽出した DNA サンプルを⽤いて PCR 実験を⾏い、DNA 増幅の有無をチェックして特異性を確認する（図 5-11-4）。
5) 環境 DNA のシーケンスチェック︓環境サンプルに由来する DNA 増幅が確認された場

63

合には、PCR 増幅産物（アンプリコン）をダイレクトシーケンスなどを⾏い、対象種のDNA が間違いなく増幅していることを確認する。

5-1-2. リアルタイム PCR 実験
以下は⼀例である。器材や試薬、対象種によってプロトコールの調整が必要である。

リアルタイム PCR 実験に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・リアルタイム PCR 装置（96 ⽳）・PCR 試薬（2×Environmental Master Mix 2.0︓サーモフィッシャー）
・UNG 酵素（AmpErase Uracil N-Glycosylase︓サーモフィッシャー）・Assay Mix（各 18μM のプライマー，2.5μM の TaqMan プローブ ※1）・96 ⽳ PCR プレートおよびシール
・使い捨て⼿袋（パウダーフリー）・マイクロピペット P-1000，P-200，P-100（ピペットマン，ギルソン）・フィルターチップ （各種）※1

対象種ごとにプライマーおよびプローブを設計する必要がある。なお、TaqMan プロー
ブを作成する際には、
Tm 値（⼆本鎖 DNA の 50％が⼀本鎖 DNA に解離するときの温度）
をプライマーのものよりも⾼く設定することで特異性の向上が期待できる。

PCR1 反応あたりの試薬組成（例）・2×Environmental Master Mix 2.0

10.0μL・AmpErase Uracil N-Glycosylase（UNG 酵素） 0.1μL
・Assay Mix

1.0μL

・環境 DNA サンプル

2.0〜5.0μL

・DNase/RNase フリー⽔

適量

・合計

20.0μL

全ての PCR 反応（ポジティブコントロール [定量スタンダード]、環境 DNA サンプル、フィールドブランク、濾過ブランク、PCR ブランクを含む）を 3 繰り返し以上で⾏う。なお、
定量を⾏う際には、定量スタンダードとして、⼈⼯合成遺伝⼦を⽤意し、4 段階以上の希釈系列を⽤いて定量する※2。

64

PCR 反応の条件は様々であるので、ここでは⼀例として上記の試薬組成でプライマーの Tm
値が 60℃前後、2 ステップ PCR を⾏う場合について以下に記載する。
50℃で 2 分、95℃で 10 分の初期ステップの後、95℃で 15 秒、60℃で 1 分からなるサイクルを 50-55 回程度繰り返す。
PCR プレートごとにポジティブコントロール（あるいは定量スタンダード）と PCR ブラン
クを載せるので、すべての PCR 反応を３繰り返しで⾏う場合、⼀度に解析できるサンプル（フィールドブランク、濾過ブランクを含む）数は 27 サンプル（定量の場合）、または、
30 サンプル（在不在検出の場合）である。
環境 DNA サンプルを 3 繰り返しで実施した場合、3 繰り返しのうち 1 つでもポジティブであったサンプルを陽性と判断する（図 5-1-2）。定量測定の場合は定量スタンダードのデー
タを⽤いて DNA 量を測定する※2。陽性であった環境 DNA サンプルの少なくとも⼀部は、
PCR 増幅産物を⽤いたダイレクトシーケンスなどを実施して、確かに対象の DNA であることを確認する。特に、リアルタイム PCR 時の Cq 値（Ct 値）が⼤きいサンプルについてはシーケンスを確認することが望ましい。
※2

定量スタンダードの合成⽅法として、プラスミド、直鎖 2 本鎖 DNA（IDT 社の gBlooks®
Gene Fragments などを購⼊）、PCR 産物などを⽤いる⽅法がある。なお、購⼊した⼈
⼯合成遺伝⼦の収量は⽬安であり、精製されていないため夾雑物の影響があると考えられる。そのため、精製キットなどを⽤いて精製を⾏うことが望ましい。その後、Qubit や
デジタル PCR 等を⽤いて濃度測定してから⽬的の濃度まで希釈して⽤いる。

PCR 阻害による陰性に対する対応
環境 DNA サンプルには腐植酸などの PCR 阻害物質が含まれることがある。ここで紹介した PCR の反応系は⽐較的 PCR 阻害の影響を受けにくいものと考えられているが、時として PCR 阻害による偽陰性の結果が得られることがある。PCR 阻害による偽陰性が疑われる
場合、インターナルポジティブコントロール（内部標準）として増幅実績のある DNA をス
パイクインするなどの⽅法で阻害の影響の有無を確認することができる。阻害が確認された場合には DNA 溶液を希釈して PCR を⾏うと結果が改善する場合がある。また、DNA に含まれる阻害物質を除去するキットも複数展開されている。

参考⽂献
福岡有紗, ⾼原輝彦, 松本宗弘, 兵庫県⽴農業⾼校⽣物部, 丑丸敦史, 源利⽂ 2016. 在来希少種カワバタモロコの環境 DNA による検出系の確⽴. ⽇本⽣態学会誌 66 (3): 613-620.

65図 5-1-1-2
プライマーの設計。カワバタモロコのプライマー設計の例※3。
（福岡ら 2016 より）
図 5-1-1-4
In vitro の増幅チェック。対象種の DNAが増幅し（⾚線）、近縁種の DNA が増幅しない（その他の⾊）ことを確認する。

図 5-1-2
リアルタイム PCR の結果の⼀例。

※３

対象種によっては⽬的とした DNA 配列に種内多型がみられる場合がある。そのため、作成した（公表されている）プライマー/プローブでは対象種が検出困難な地域個体群など（偽陰性）が存在する可能性にも留意する。ここに記載のプライマー/プローブも地域個体群によっては完全に⼀致しないことが知られている。

66

5-2．環境 DNA メタバーコーディング
5-2-1．ライブラリーの調製ー１︓1st PCR
はじめに
環境 DNA メタバーコーディング法では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を⽤いてターゲッ
トとなる環境 DNA 群を分析可能な量に増幅すると同時に、PCR 産物の両端に各種のアダプ
ターを付加することによって次世代シークエンサーで分析可能な分⼦に加⼯する（ライブ
ラリーの調製）。
PCR は⼤量の DNA 断⽚を合成するため、実験の汚染源となりやすい。したがって、PCR の準備（試薬の調合等）を⾏う実験室（プレ PCR ルーム）と、PCR の実施や PCR 産物そのものを扱う実験室（ポスト PCR ルーム）は空間的に隔離すべきである。また、PCR 産物を扱った当⽇には DNA 抽出やその他の実験を⾏わないなど、コンタミのリスクを減らす⼯夫も必要となる。さらには、⼆段階 PCR を⾏うため、最初の PCR（1st PCR）産物を希釈して⼆回⽬の PCR（2nd PCR）のテンプレートにする操作が必要となる。そのため、この操作の際に⽣じるコンタミを防ぐためのクリーンベンチや、クリーンなオープンスペースをつくるテーブルコーチ（KOACH T 500，KOKEN）等を設置する必要がある。また、マイクロ
ピペット、チューブラック、実験机は泡ハイター等を使⽤してあらかじめ除染し、PCR 反応に⽤いるチップ、チューブなどの消耗品、および⽔は、可能な限り信⽤のおけるメーカーから購⼊した除染済のものを使⽤する。
以下、MiFish プライマーを⽤いたメタバーコーディングサンプル調製の例について記載する。

1st PCR に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ サーマルサイクラー（96 ウェルプレートが仕掛けられるものがよい）
・ KAPA HiFi HS ReadyMix（KK2602，KAPA Biosystems）※1
・ MiFish プライマー※2、※3、※4
板鰓類⽤（サメ・エイ類に最適化したプライマー）
MiFish-E-F-v2 (61 mer):5’-ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNN RGT TGG TAA
ATC TCG TGC CAG C-3’
MiFish-E-R-v2 (68 mer):67

5’-GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TNN NNN NGC ATA GTG
GGG TAT CTA ATC CTA GTT TG-3’
硬⾻⿂類⽤ ①（硬⾻⿂類全般に適⽤可能なユニバーサルプライマー） 2
MiFish-U-F (60 mer):5’-ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNN GTC GGT AAA
ACT CGT GCC AGC-3’
MiFish-U-R (67 mer):5’-GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TNN NNN NCA TAG TGG
GGT ATC TAA TCC CAG TTT G-3’
硬⾻⿂類⽤ ②（温帯の沿岸域で⼀般的なアナハゼ類に最適化したプライマー）
MiFish-U2-F (60 mer):5’-ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNN GCC GGT AAA
ACT CGT GCC AGC-3’
MiFish-U2-R (67 mer):5’-GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TNN NNN NCA TAG GAG
GGT GTC TAA TCC CCG TTT G-3’
・ DNase/RNase フリー⽔（分⼦⽣物学実験⽤）
・ TE バッファー（分⼦⽣物学実験⽤）
・ キャップ⼀体型 8 連チューブ
・ 1.5mL チューブ（DNA 低吸着）・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100，P-20，P-2（ピペットマン，ギルソン）
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ 電動マイクロピペット 0.5〜10μL，5〜100μL（Xplorer Plus, エッペンドルフ）
・ 1.5mL/2.0mL チューブ⽤チューブラック
・ 8 連チューブ⽤チューブラック
・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）※1

陸⽔のような PCR 阻害物質（たとえば腐植酸）を含むことが多い環境⽔や泥試料から抽出した DNA では、KAPA HiFi HS で 1st PCR 産物が得られないことがある。このような場合、KOD FX Neo や KOD One（東洋紡）、Platinum SuperFi II DNA Polymerase（サーモフィッシャー）などを⽤いることで良好な増幅が得られることがある。ただし、酵素によって⾮特異的増幅の起きやすさや配列毎の増幅効率などの特性が異なるので、使⽤の際には特性の違いを理解する必要がある。また、⽐較解析を⾏うのであれば異なる酵素を⽤いた結果を混在させない⽅が安全である。PCR のプロトコールについては、
基本的にはメーカーが提供するものをそのまま利⽤できる。なお、PCR 阻害物質の影響
で増幅がうまくいかない場合、サンプルを希釈するとうまく増幅する場合もある。また、
DNA に含まれる阻害物質を除去するキットも複数展開されている。

※2

TE バッファーで 100μM に希釈済みのものを注⽂すると便利である。合成メーカーにより混合塩基の偏りが⾒られることがある。

※3

アユ、ワカサギ、スナヤツメなど、⿂種によっては、プライマー部分に変異があるため

68

に増幅効率が低下するものがある。これらの⿂種が⽣息する環境で⽤いる場合、配列を修正したプライマーを少量混合すると検出可能になる。
※４

ここでは先⾏して研究が進んでいる⿂類を対象として分析する場合のプライマーの例を⽰している。必要な分類学的解像度や利⽤するシーケンサーが可能な読み取りの⻑さ等に基づいて適切にプライマーセットを選定する。なお、以降の分析ステップは MiFish
プライマーを使⽤した場合の例を記述している。

1st PCR 産物の精製と濃縮に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ 卓上⼩型遠⼼機（Force Mini SBC-140，LabNet）
・ プレート遠⼼機（PC-2R，アズワン）
・ 1.5mL チューブ（DNA 低吸着）・ 96 ウェルプレート（DNA 低吸着）・ SPRIselect※1（ベックマン・コールター）
・ 85%エタノール
・ Buffer EB（キアゲン）
・ 96 ウェルプレート⽤マグネットプレート※2（DynaMag-96 Side，サーモフィッシャー）・ 96 ウェルプレート⽤遠⼼機（スピンダウン⽤）・ マイクロピペット P-1000、P-200、P-100（ピペットマン，ギルソン）
・ 8 連マイクロピペット P-200、P-10
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種、使⽤マイクロピペットに適合したもの）・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）※1

PCR 産物精製⽤スピンカラム（サイズカットが厳密でない）を⽤いて精製と濃縮を⾏う
こともできる。ただし、抽出した環境 DNA 溶液中にターゲット断⽚の含量が少なかった場合、PCR の結果 100bp-150bp あたりに現れるプライマー由来産物の含量が多くなるため、使⽤するカラムの特性によっては精製の状況が変わってくることがある。また、
厳密なサイズ分画可能なスピンカラムも発売されているので、カラム法にこだわるのであればそういったものを使⽤することもできる。ただし、カラムにしてもビーズにしても、断⽚回収量や配列内訳などのパフォーマンスがメーカー間で同じとは限らないため、安定したデータを得るためには使⽤するプライマーセットごとに常にどれか決まった１つの製品を使うべきである。

※2

96 ウェルプレート⽤マグネットプレートは各社からいろいろなものが発売されているが、⼗分に磁⼒が強いものを選ぶ。また、今回の⽬的では、ビーズをウェルの底に集め69

るタイプでなく、側⾯に集めるタイプの⽅が使い勝⼿がよい。

精製・濃縮した 1st PCR 産物の定量に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ TapeStation 4150（アジレント・テクノロジー）
・ High Sensitivity D1000 Screen Tape（5067-5584，アジレント・テクノロジー）
・ High Sensitivity D1000 Reagents（5067-5585，アジレント・テクノロジー）
・ 4150/4200 TapeStation Loading Tips（5067-5598，アジレント・テクノロジー）
・ 卓上撹拌器（ボルテックス MS3 ベーシック，イカジャパン）
・ 8 連チューブ⽤卓上遠⼼機（マイクロ PCR スピナー MS-PCR，アズワン）
・ 1.5mL/2.0mL ⽤卓上遠⼼機（マイクロシックス MS-1，アズワン）
・ 電動マイクロピペット 0.5〜10μL（Xplorer plus, エッペンドルフ）・ マイクロピペット P-10 または P-2（ピペットマン，ギルソン）
・ フィルターチップ 10μL（ピペットマンに適合したもの）
・ 8 連チューブ・ 8 連チューブラック
・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）・ DNase/RNase フリー⽔

5-2-1-1．1st PCR
環境⽔中から抽出した DNA をテンプレートに PCR を⾏う場合、抽出 DNA に含まれる⿂類
由来の DNA 量は事前にわかっていない。したがって、本番実験を⾏う前に予備実験を⾏う
ことで、PCR のサイクル数など⾄適な実験条件を探索することが重要になる。
常に使い捨て⼿袋を着⽤する。作業中に⼿袋の汚染を感じた場合は速やかに交換する。
1） 実験を始める前にサーマルサイクラーの電源を⼊れる。
2） プライマーの希釈︓市販の TE バッファーを⽤いて、プライマーの原液（100µM）を20 倍に希釈する。希釈済みプライマーを以下の⽐率で混合してプライマーミックスを作る。MiFish-E-F/R-v2 : MiFish-U-F/R : MiFish-U2-F/R=1:2:1（淡⽔⿂だけの場
合は MiFish-U-F/R のみでよい）
3） 試薬の組成︓全容量 12μL（DNA 量 2μL を含む）で PCR を⾏う場合に、チューブ 1本あたりのプレミックスの組成は以下のようになる。
（注意︓試薬は必要量の 1.1〜1.2倍程度の量を調合しないと、電動ピペットで分注する際に不⾜することがある）。プラ
イマーの終濃度は、フォワードプライマーミックス、リバースプライマーミックスそ70

れぞれが 583 nM 程度となる。
KAPA HiFi HS ReadyMix

6.0µL

プライマーミックス

2.8µL

DNase/RNase フリー⽔

1.2µL4） PCR の繰り返し数︓PCR での取りこぼし (PCR dropouts）を最⼩限に抑えるために、同⼀のサンプル（環境 DNA）に対して複数回繰り返し PCR を⾏うのがよい。例えば、
8 連チューブ 1 本を使い、繰り返し数 8 回の PCR を⾏う。なお、1st PCR を実施する
際に⽣じるコンタミネーションをモニターするために、濾過ブランク、抽出ブランクとは別に、1st PCR の反応セット毎に新たなブランク（1st PCR ブランク）を加える
ようにする。1st PCR ブランクは、抽出 DNA の代わりに DNase/RNase フリー⽔をテンプレートとする（図 5-2-1-1-1）。
5） 上記試薬を必要量の 1.1 倍程度調合してプレミックスを作成し、これを電動ピペット
で 8 連チューブに 10μL ずつ分注する。
その後、個々のチューブに抽出済みの環境 DNA
を 2μL ずつ電動ピペットで分注する。PCR の繰り返し数が 8 回の場合、抽出 DNA を
2µL × 8 ＝ 16μL 使うことになる。
6） サーマルサイクラーの設定は以下のようにする︓
95℃の DNA 変性を 3 分間 （初期変性と HotStart 酵素の活性化）
98℃の DNA 変性を 20 秒
65℃のアニーリングを 15 秒

35 サイクル

72℃の伸⻑反応を 15 秒
72℃の伸⻑反応を 5 分間（最終伸⻑）
4℃
7） 反応終了後はチューブを速やかに取り出して-20℃で凍結保管し、なるべく早く次の精製ステップに進む。

注意 1︓アニーリング温度は KAPA HiFi Ready Mix の特性（少なくとも 60℃以上）によりかなり⾼めに設定してある。これより⾼いとプライマー配列とのマッチングが低い⿂種が検出漏れとなり、逆にこれより低いと⾮特異的な産物（微⽣物の 16S rRNA 由来と推定される産物）が多くなる。両者のトレードオフを考えるとこのくらいのアニーリング温度が適正と思われるが、各⾃の⽬的に応じて最適化する。
注意 2︓サイクル数について、冬期のような⿂の活性が低い場合や、PCR 阻害物質の影響

71

で、35 サイクルだと⼗分な増幅が⾒られないことがある。また、PCR 産物が確認できないからといってサイクル数を多くしすぎると、⾮特異的増幅が起きて解析に⽀障をきたす場
合もある。各⾃の状況に合わせ、最適なサイクル数を検討する。

5-2-1-2．1st PCR 産物の精製と濃縮
本稿では、磁性ビーズを⽤いた 1st PCR 産物の精製・濃縮の例について記す。
常に使い捨て⼿袋を着⽤する。作業中に⼿袋の汚染を感じた場合は速やかに交換する。
1） 繰り返し反応した 1st PCR 産物を 1 本の 1.5mL チューブにまとめる（図 5-2-1-21）。1st PCR はチューブ 1 ウェルあたり 12.0μL なので、例えば 8 繰り返しをすべて合わせると 96.0μL になる。
2） SPRIselect のボトルをよく攪拌し、沈殿したビーズをよく分散させる（図 5-2-1-22）。1 サンプルあたり 300μL の 85%エタノールを⽤意する。
3） PCR 産物溶液に対し、等量の SPRIselect を添加し、ピペッティングを 10 回⾏ってよく攪拌後、全量を 96 ウェルプレートに移し替える（図 5-2-1-2-3）。室温で１分間静置する。
4） 96 ウェルプレートを 96 ウェルプレート⽤マグネットプレートにセットし、液が透明になるまで静置する（図 5-2-1-2-4）。
5） ビーズを吸わないように上清を慎重に除去する（図 5-2-1-2-5）。
6） マグネットプレートにセットしたまま、150μL の 85%エタノールを加え（図 5-2-12-6）、室温で 30 秒静置する。ビーズを吸わないように P-200 の 8 連ピペットで上清を慎重に除去する。
7） マグネットプレートにセットしたまま、再度 150μL の 85%エタノールを加え、室温で 30 秒静置する。ビーズを吸わないように P-200 の 8 連ピペットで上清を慎重に除去する（図 5-2-1-2-7）。
8） プレートをスピンダウンして再度マグネットプレートに置き、P-10 の 8 連ピペットとチップを使って残留エタノールを完全に取り除く（図 5-2-1-2-7）。
9） プレートを取り外し、Buffer EB を 25μL 添加してピペッティングを 10 回⾏ってよく攪拌する。室温で 1 分間静置する（図 5-2-1-2-7）。
10） マグネットプレートにセットし、液が透明になるまで静置する（図 5-2-1-2-8）。

7211） ビーズを吸わないよう注意しながら透明な上清を全て回収し、それぞれ新しい 1.5mL
チューブ（DNA 低吸着）に移す（図 5-2-1-2-9）。この状態で－20℃で安定的に保存が可能である。

5-2-1-3. 精製・濃縮済み 1st PCR 産物の定量と希釈精製によってプライマーダイマー等が除かれているかを確認すると同時に PCR 産物の量を測定する。ここでは、アジレント社の TapeStation 4150 を⽤いたプロトコールを記す。また、⽤いるキットは High Sensitivity D1000 ScreenTape System になる。ScreenTapeには予めゲルが充填されており、⼀度に最⼤ 16 本の 1st PCR 産物を定量できる。DNA ラ
ダーを使⽤する場合は 15 本の産物が定量できる。なお、TapeStation 以外に他社の同等の機器でも同様の分析が可能である。
常に使い捨て⼿袋を着⽤する。
1） 30 分前に試薬を室温に戻しておく（図 5-2-1-3-1）。
2） TapeStation 4150 付属のコンピューターを起動する。起動完了後に TapeStation
4150 の本体の電源を⼊れる（図 5-2-1-3-2）。
3） TapeStation とコンピューターの接続が確認できたら、TapeStation 4150 コントローラーを起動し、High Sensitivity D1000 ScreenTape と必要な数の 4150/4200
TapeStation Loading Tips をセットする（図 5-2-1-3-3）。
4） 8 連チューブを⽤意し、High Sensitivity D1000 Ladder（1 本）とサンプル数を合計した本数の High Sensitivity D1000 Sample Buffer 2μL を分注する（図 5-2-1-34）。
5） 分注した 2μL の Buffer に、Ladder もしくは精製濃縮済み 1st PCR 産物を 2µL ずつ⼊れ（図 5-2-1-3-5, 6）キャップをする。軽く遠⼼後、ボルテックスを使⽤し 2000rpm
で 1 分間撹拌する（図 5-2-1-3-7）。攪拌後に再度軽く遠⼼し、溶液をチューブの底に集める。
6） 遠⼼後、溶液が⾶び散らないように注意深くキャップを開け、TapeStation 4150 のカセットにセットする（図 5-2-1-3-8）。
7） TapeStation 4150 コントローラーの指⽰に従って泳動を開始すると（図 5-2-1-3-9,
10）、20 分ほどでターゲットのバンド（約 310bp）がフェログラムと共に表⽰される（図 5-2-1-3-11）。マーカーのピークが読み取られない場合がまれにあるが、その時73

には適宜マニュアルで補正を⾏う。
8） ターゲットバンドの濃度を読み取り、DNase/RNase フリー⽔で 0.1ng/µL に希釈する。High Sensitivity D1000 の測定レンジは 10pg-1000pg なので、バンドの濃度がレンジを超えている場合は適切な希釈率にサンプルを希釈して再度測定を⾏い、適切なレンジ内に収めて希釈率を決める。ブランクについては原則としてシグナルが得られないため、ポジティブサンプルの平均希釈率を便宜的に⽤いて希釈する。ただし、
例えば⾮特異的増幅が顕著な場合は 2nd PCR 後に濃度を調整したほうがよい。その際は 5-2-2-1 の 11)のステップでサンプルを 1 つのチューブにまとめず、個別に精製と DNA 濃度の測定を⾏う。
注意︓精製・濃縮済み 1st PCR 産物の希釈にあたっては、PCR 準備室で個々のサンプルの希釈に必要な DNase/RNase フリー⽔を予め 1.5mL チューブに分注しておき、それを PCR
室に持ち込むとよい。精製・濃縮した１st PCR 産物を PCR 準備室に持ち込むと、クロスコ
ンタミの⼤きな原因となるので注意すること。また、所定の濃度に達しないときは、
0.05ng/µL に希釈して 2nd PCR のサイクル数を増やすなど⼯夫する。
9） 希釈後の 1st PCR 産物は、作製したその⽇のうちに使⽤し、冷蔵保管や凍結保管は⾏わない。希釈前の 1st PCR 産物は－20℃で保存するが、なるべく凍結融解を⾏わない
よう、以降の作業を設計する。

74

5-2-2．ライブラリーの調製ー２︓２nd PCR
実験を始める前に
本項では、定量済みの 1st PCR 産物をテンプレートに⽤いて 2nd PCR を⾏う⽅法について記す。2nd PCR は、シークエンスプライマーが付加したテンプレート（定量済み 1st PCR産物）に、インデクス（タグ）配列とフローセル結合配列を付加することが主な⽬的となる。
テンプレートを増幅することが⽬的ではないので、サイクル数は通常 10 回にとどめているが、1st PCR 産物が⼗分量得られなかった場合（0.1ng/µL 未満にしか調整できない場合）
は、濃度に応じて 2nd PCR のサイクル数を増やすなどの⼯夫が必要になる。また、ラン間のキャリーオーバー（MiSeq 内部の流路に残存する前回ランのライブラリー）の影響を最⼩限にするために、1 回使ったインデクス配列の組み合わせはその後の数回（2〜3 回）のランでは使うべきではない。

2nd PCR に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ サーマルサイクラー（96 ウェルプレートが仕掛けられるものがよい）・ 定量済み 1st PCR 産物（0.1ng/µL)・ KAPA HiFi HS ReadyMix（KK2602，KAPA Biosystems）
・ インデクス付きプライマー（インデクス配列については本項末尾に関連情報を記す）※
1，※2

フォワードプライマー（⻘の部分が 8 塩基からなるインデクス配列）
5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACx xxx xxx xAC ACT CTT TCC
CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3’
リバースプライマー（⾚の部分が８塩基からなるインデクス配列）
5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT xxx xxx xxG TGA CTG GAG TTC AGACGT GTG CTC TTC CGA TCT-3’
・ DNase/RNase フリー⽔（または分⼦⽣物学実験⽤のハイグレードな滅菌⽔）・ TE バッファー（分⼦⽣物学実験⽤のハイグレードなもの）
・ 8 連チューブ・ 1.5mL チューブ（DNA 低吸着）・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100，P-20，P-2（ピペットマン，ギルソン）
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ 電動マイクロピペット 0.5〜10μL，5〜100μL（Xplorer Plus, エッペンドルフ）
・ 1.5mL/2.0mL チューブ⽤チューブラック75

・ 8 連チューブ⽤チューブラック
・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）※1

TE バッファーで 100μM に希釈済みのものを注⽂すると便利である。

※２

1st PCR で使⽤するプライマーに合わせて配列を変更する必要がある。ここでは本マニ
ュアルで⽰した MiFish プライマーを 1st PCR に使⽤した場合の例を⽰す。

2nd PCR 産物の切り出しに必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ E-Gel Power Snap Plus Electrophoresis Systems（G9110, サーモフィッシャー）・ E-gel SizeSelect II 2%（G661012, サーモフィッシャー）・ 分⼦サイズマーカー（ターゲットサイズ近辺を判別できるもの）
・ 2nd PCR 産物（1 本あるいはライブラリーごとに複数本のチューブにまとめたもの）
・ DNase/RNase フリー⽔・ 1.5mL チューブ（DNA 低吸着）・ マイクロピペット P-100（ピペットマン，ギルソン）
・ フィルターチップ 100μL
・ 1.5mL/2.0mL チューブ⽤チューブラック
・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）

切り出した 2nd PCR 産物の定量に必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ Qubit 4.0 Fluorometer（サーモフィッシャー）・ Qubit dsDNA HS Assay（Q32851［100 サンプル⽤］，サーモフィッシャー）（Q32854［500 サンプル⽤］，サーモフィッシャー）・ Qubit 測定⽤ 500μL 専⽤チューブ（Q32856, サーモフィッシャー）・ 500μL チューブ⽤チューブラック
・ 卓上⼩型遠⼼機（マイクロシックス MS-1，アズワン）
・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100，P-20，P-2（ピペットマン，ギルソン）
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種、ピペットマン適合型）
・ E-Gel で回収した 2nd PCR 産物
・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）76

5-2-2-1．2nd PCR
常に実験⽤の使い捨て⼿袋を着⽤する。作業中に⼿袋の汚染を感じた場合は速やかに交換する。以下に記す⽅法は、使⽤する試薬の量を減らすと同時に、2nd PCR で得られる各ラ
イブラリーのリード数ができるだけ均⼀になるように⼯夫したものである。
注意︓PCR の準備は必ず PCR 準備室（プレ PCR ルーム）で⾏うこと。また、希釈したとはいえテンプレートは PCR 産物を含む。したがって、テンプレートを PCR 準備室に持ち込ん
ではならない。テンプレートの分注は PCR 室（ポスト PCR ルーム）内のクリーンベンチ内（あるいはそれに相当するスペース）で⾏うこと。PCR 室でテンプレートを分注する際には、部屋のファンを停めて実験室内のチリが舞い上がらないように注意する。
1） 実験を始める前にサーマルサイクラーの電源を⼊れる。
2） プライマーの希釈︓市販の TE バッファーを⽤いて、プライマーの原液を 5μM に希釈する。
3） 試薬の組成︓全容量 15μL（DNA 量 1.86μL を含む）で PCR を⾏う場合に、チューブ
1 本当たりの組成は以下のようになる。
（注意︓試薬は必要量の 1.2 倍程度の量を調合しないと、電動ピペットで分注する際に不⾜することがある）。プライマーの終濃度は、フォワードプライマー、リバースプライマーそれぞれが 293 nM 程度となる。
KAPA HiFi HS ReadyMix

7.5µL

プライマー

各 0.88µL

DNase/RNase フリー⽔

3.88µL

濃度調整済 1st PCR 産物

1.86µL

注意︓2nd PCR では、フォワードプライマーとリバースプライマーに含まれるインデクス
配列の組み合わせをサンプルごとに変える。こうすることによって、シークエンス後に異なるサンプルの識別が可能になる。インデクス配列の組み合わせ⽅にはいろいろな⽅法があるが、ここでは 8 連チューブをチューブラックに並べたときの「⾏」と「列」でインデクス
配列を変える⽅法（Combinatorial Dual Index ⽅式，CDI）を採⽤する。8 連チューブの場合、⾏数は 8 に固定されている⼀⽅で、列数は使⽤する 8 連チューブの本数で調整できる。例として、8 種のフォワードプライマー（インデクス配列は D501〜508）と 4 種のリバースプライマー（インデクス配列は A701〜704）を⽤いることで、32 ライブラリー（＝サンプル）の並列シークエンスを可能にする組み合わせを⽰す※1。また、冒頭に記したように、ラン間のキャリーオーバー（MiSeq 内部の流路に残存する前回ランのライブラリー）の影響を最⼩限にするために、1 回使ったインデクス配列の組み合わせはその後の数回（2〜3 回）のランでは使⽤を避けた⽅がよい。

77

D501/A701

D501/A702

D501/A703

D501/A704

D502/A701

D502/A702

D502/A703

D502/A704

D503/A701

D503/A702

D503/A703

D503/A704

D504/A701

D504/A702

D504/A703

D504/A704

D505/A701

D505/A702

D505/A703

D505/A704

D506/A701

D506/A702

D506/A703

D506/A704

D507/A701

D507/A702

D507/A703

D507/A704

D508/A701

D508/A702

D508/A703

D508/A704

上記のような組み合わせの場合、⾏⽅向（横⽅向）には標記のフォワードプライマー（D501〜508）を含むチューブ 4 本分のプレミックスを 8 種類、列⽅向（縦⽅向）には標記のリ
バースプライマー（A701〜704）を含むチューブ 8 本分のプレミックスを 4 種類作成すればよい（図 5-2-2-1-1）。このように（プライマーのみを 1 本 1 本分注するのではなく）プ
ライマーを含むプレミックスを作成することで、PCR 反応の総量が⼩さくても（ここでは15µL）正確な反応溶液の調製が可能になる。
4）分注が終了した 8 連チューブのキャップを軽く閉じ、卓上⼩型遠⼼機で遠⼼して溶液をチューブの底に振り落とす。
5）8 連チューブをチューブラックごと PCR 室のクリーンベンチ（あるいはそれに相当する空間）に持って⾏く。
6）8 連チューブのキャップをプレミックスが⾶散しないように注意深く開け、希釈済み 1st
PCR 産物を所定のチューブに 1.86µL ずつ⼊れる。
7）8 連チューブのキャップをしっかりと閉じ、卓上⼩型遠⼼機で溶液をチューブの底に落とす。
8）2nd PCR では、アニーリングと伸⻑反応を合わせたシャトル PCR を⾏う。サーマルサ
イクラーを以下のように設定する。
95℃の DNA 変性を 3 分間（初期変性と HotStart 酵素の活性化）
98℃の DNA 変性を 20 秒
72℃のアニーリング+伸⻑反応を 15 秒

10 サイクル

72℃の伸⻑反応を 5 分間（最終伸⻑）
4℃
9）8 連チューブをサーマルサイクラーにセットし 2nd PCR を開始する。
10）反応終了後は速やかにサイクラーから取り出し、次の作業まで-20℃で凍結保管する。

7811）2nd PCR が終了すると、サンプルごとに固有のインデクスが付加されているので、酵
素失活処理もしくはインデクスプライマー除去後に 1 本のチューブにまとめることができる。まとめて分析したいサンプル（たとえば 1 回の調査でとられた 10 サンプル）ごとに 1 本のチューブにまとめる（図 5-2-2-1-2）。１st PCR 後に希釈を⾏っている
場合、特に濃度調整などは不要である。ただし、PCR 阻害物質の混⼊しているサンプ
ルでは希釈しても増幅率に影響が残ることがあり、取得リード数が少なくなる場合がある。
※１

イルミナ社製シークエンサーでは、シーケンシング中に発⽣するインデックスホッピン
グ（サンプル識別のために付加したタグの⼊れ替わり）の影響を極⼒⼩さくするため、2nd PCR で使⽤するフォワードプライマーとリバースプライマーを列間もしくは⾏間で共⽤せず、1 サンプルごとにまったく別の組み合わせのプライマーを使⽤することもある（Unique Dual Index ⽅式）。特に iSeq 等のパターンドフローセルを採⽤している
シーケンサーではインデックスホッピングの発⽣率が⾼いため、メタバーコーディング
解析で対象機種を利⽤する際には UDI の採⽤は必須と考えてよい。

5-2-2-2．2nd PCR 産物の精製
2nd PCR 産物には、MiSeq を⽤いた超並列シークエンスに必要なフローセル結合配列（計53bp）とインデクス配列（計 16bp）が 1st PCR 産物（約 300bp）の両端に付加されている。1st PCR 産物には、ターゲットとなる⿂類由来の産物に加えて 70bp ほど⼤きな⾮特異的産物（微⽣物の 16S rRNA 由来の産物と推定されている）が含まれることが多い。本項では、⿂類由来の 2nd PCR 産物（約 370bp）のみを E-Gel を⽤いたゲル電気泳動で切り出す⽅法（実際にはピペットで吸いとる⽅法）を記す。
常に実験⽤の使い捨て⼿袋を着⽤して作業する。
1） E-Gel Power Snap Plus Electrophoresis Systems（以下 Power Snap）のスイッチ
を ON にする。
2） E-gel SizeSelect II 2%（プラスチックケースに封⼊されたゲルで以下「ゲル」と呼ぶ）が⼊ったパッケージを開封し、ゲルのウェルに挿⼊されたコーム 2 個を注意深く取り外し（図 5-2-2-2-1）、Power Snap に挿⼊する（図 5-2-2-2-2）。
3） 分⼦サイズマーカーを適切に調製し、総量 25µL とする。また、2nd PCR 産物 22.5µLと付属の Loading Buffer 2.5µL を混合し、総量 25µL とする。

79

4)

全てのウェルに⽔を 50 μL ずつ⼊れた後、分⼦サイズマーカーと 2nd PCR 産物 を上段の各ウェルにロードする。分⼦サイズマーカーはサンプルと別のウェルにロードする。

5） Power Snap のフィルターカバーを閉める（図 5-2-2-2-3）。画⾯で Category と Typeを操作して、E-Gel EX ２％を選択し、泳動時間をとりあえず 14 分にセット後、スタートする。
6） 泳動開始後 10 分程度以降は、View Gel 機能を操作して産物の状態をチェックする。
ゲルの回収ウェルに約 370bp のターゲットバンドが近づくまで、泳動時間を調整しつつ泳動する。
7） ターゲットバンドが⼗分回収ウェルに近づいたところで停⽌する（図 5-2-2-2-4）。泳
動は、停⽌後も多少惰性で継続されるので、停⽌のタイミングに注意すること。
8） 回収ウェルに DNase/RNase フリー⽔を 25μL 補充する。
9） 慎重に泳動を再開する。回収ウェルにバンド全体が⼊ったところで泳動を停⽌する。
10）ピペットを⽤いて回収ウェルからターゲットバンドを吸い出し、ライブラリーごとに1.5mL チューブにまとめる。回収する際に、ウェルの底にピペット先端で⽳を開けないように注意する。
注意︓多くの場合、⼀回の回収で⼗分量の 2nd PCR 産物を吸い出せるが、定量後に 4nMに調整するには濃度が不⾜することがある。そのような場合は、回収ウェルに
DNase/RNase フリー⽔を満たして泳動を再開し、⼀旦バンドを回収ウェルの下流側に出し、泳動モードを Reverse E-Gel にして回収ウェルに戻して再び吸い出すという操作を繰り返すことも可能。この場合、スピンカラムなどをつかって産物を濃縮すると⼗分な濃度の2nd PCR 産物が得られる。

5-2-2-3. 切り出した 2nd PCR 産物の定量
本項では、E-Gel を⽤いて切り出したライブラリーの Qubit による簡易濃度測定法について記す。より正確に濃度を決めるには qPCR による測定がイルミナ社から推奨されているが、経験的には Qubit 測定でも⼗分であろう。ここでは Qubit 4.0 を使⽤する場合を例に解説する。
常に実験⽤の使い捨て⼿袋を着⽤して作業する。
1） Qubit dsDNA HS Assay キットを冷蔵庫から取り出し 30 分以上かけて室温に戻す

80

（図 5-2-2-3-1）。
2） Qubit の濃度測定に必要なチューブの本数は校正⽤スタンダード#1 と＃2 にライブラ
リーの数を加えたものになる。
3） キットが室温に戻ったら、 1 測定あたり 199µL の Qubit dsDNA HS Buffer に Qubit
dsDNA HS Reagent を１µL を加えた計 200µL のプレミックスを必要本数分調製する（図 5-2-2-3-2, 3）。濃度を測定するライブラリーが 1 本の場合、校正⽤スタンダ
ード 2 本を含めて計 3 本が必要になるので、Qubit Reagent を 3µL に Qubit Bufferを 597µL 加えたプレミックスを調製する。
4） Qubit 測定⽤ 500µL 専⽤チューブを 2 本取り出し、校正⽤スタンダード#1 と#2 ⽤にプレミックスを 190μL ずつ分注する。その後、キットに付属するスタンダード#1と#2 をそれぞれのチューブに 10μL ずつ⼊れ（図 5-2-2-3-4）、チューブのキャップを閉めてボルテックスで 2〜3 秒撹拌し軽く遠⼼する。
5） 濃度を測定するライブラリーの数だけ 500µL チューブを⽤意し、それぞれにプレミッ
クスを 198μL ずつ分注する。その後、ライブラリーを 2μL ずつ⼊れ（図 5-2-2-3-5）、
チューブのキャップを閉めてボルテックスで 2〜3 秒撹拌し軽く遠⼼する。2 分間室
温で静置する（図 5-2-2-3-6）。
注意︓最低でも 2 分間室温で静置しないと測定値が安定しない。
6） Qubit Fluorometer の電源を⼊れて起動する（図 5-2-2-3-7）。画⾯から dsDNA を選択し、次いで使⽤するキット（ここでは dsDNA High Sensitivity）を選択する。校正⽤スタンダードを⽤いた校正を選択し、4）で⽤意したスタンダード#1 と#2 を Qubitの指⽰に従って順番に測定する（図 5-2-2-3-8）。
7） 次にライブラリーの濃度測定を⾏う。チューブをセットし、使⽤するサンプルの量を2μL に設定して濃度を測定する（図 5-2-2-3-9, 10）。同じサンプルの濃度測定を、計
測値が安定するまで複数回⾏うとよい。
8） Qubit 4.0 ではサンプル濃度（ng/µL）及びそれを 100 倍希釈した測定溶液の計測値（ng/mL）が表⽰される（図 5-2-2-3-11）。サンプル濃度が 1.0ng/ µL 未満の場合には、複数ウェルから同⼀ライブラリーを回収し、それをカラムで濃縮するなど⼯夫が必要になる。

81

5-2-2-4．インデクス関連情報
インデクス配列は、Hamady et al. (2008) にリストアップされているものから適当なものをピックアップすればよい。ただし、i5 同⼠、i7 同⼠では、同時に使⽤するインデクス
配列はカラーバランスに留意し、また、3 塩基以上違うものを選択する必要がある。MiSeqのランで⽤いるサンプルシートに記⼊する際には、i7 の配列は逆相補鎖に変換して記⼊しないとならないが、iSeq100、NextSeq550 など、機種によって記⼊の仕⽅が異なるので注意が必要である。ランごとにインデクスを変えることにより、ラン間のクロスコンタミネー
ション（MiSeq 内部の流路に残存する前回ランのライブラリーに由来するコンタミネーション）を避けることができるので、⼿持ちのインデクス配列は多めに⽤意しておくのがよい。

参考⽂献
Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. 2008. Error-correcting
barcoded primers forpyrosequencing hundreds of samples in multiplex. Nature
Methods 5: 235–237. doi: 10.1038/nmeth.1184.

82

5-2-3．MiSeq を⽤いた超並列シークエンス
シークエンスを始める前に
本項では、イルミナ社の MiSeq を⽤いた超並列シークエンス法について記す。本⼿法によるシークエンスを成功に導く最も重要な点は、アダプターダイマーや⾮特異的産物を含まない、MiFish アンプリコンのみからなる良質のライブラリーを調製することである。このような良質のライブラリーを得ると同時に、ライブラリーごとにほぼ均等なリード数を得るため、本プロトコールでは 1st PCR 産物に対して精製・定量を⾏い、1st PCR 産物を⼀定濃度（0.1ng/µL）に調整したテンプレートを⽤いて 2nd PCR を⾏うプロトコールを採⽤した。また、ランを失敗しないためにも MiSeq のメンテナンスが⾮常に重要になるので、最初にメンテナンスに関連する情報を列記した。なお、MiSeq（ランダムフローセルを採⽤）の他にイルミナ社の iSeq100（パターンドフローセルを採⽤）でも、MiFish プライマーを⽤いた分析で、ほぼ同様の分類学的検出結果を得られることが確認されている（Nakao et
al. 2021）。

MiSeq のメンテナンスに必要な試薬・消耗品（例）・ Tween 20 (P7949，Sigma-Aldrich)・ DNase/RNase フリー⽔・ 50mL ⾃⽴式遠沈管・ 500mL 洗浄瓶
・ 0.01%次亜塩素酸溶液
・ MiSeq Disposable Wash Tubes（MS-102-9999，イルミナ）
・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）

シークエンスに必要な実験器具と試薬・消耗品（例）・ MiSeq（イルミナ）
・ MiSeq Reagent Kit v2（300 サイクル）（MS-102-2002，イルミナ）
︓総リード数 1500万本が必要な場合は本品を⽤いる。それより少なくてよい場合は、必要なリード数に応
じて MiSeq Reagent Micro Kit v2（MS-103-1002︔総リード数約 400 万本）あるい
は MiSeq Reagent Nano Kit v2（MS-103-1001︔総リード数約 100 万本）を⽤いる。
・ 濃度測定済みのライブラリー・ 0.2N NaOH（2N などの濃度の⾼いストックから実験のたびに調製する）

83

・ PhiX Control v3（FC-110-3001，イルミナ）
・ 99.5% 分⼦⽣物学⽤グレードエタノール（富⼠フィルム和光純薬）
・ DNase/RNase フリー⽔・ 脱イオン⽔・ 1.5mL チューブ （DNA 低吸着）・ ボルテックス・ミキサー（VORTEX-GENIE 2 Mixer，エムエス機器）と 3 インチプラッ
トホーム・ マイクロピペット P-1000，P-200，P-100，P-20，P-2（ピペットマン，ギルソン）
・ フィルターチップ（マイクロピペットの容量に合わせて各種）
・ チップ 1000μL
・ レンズクリーニングティシュ（2105-841，ワットマン）
・ 卓上⼩型遠⼼機（マイクロシックス MS-1，アズワン）
・ 試薬キット解凍⽤バット（W373×D273×H63 程度の⼤きさ）（PB-2，アズワン）
・ 使い捨て⼿袋（パウダーフリー）
MiSeq Reagent Kit には、冷凍保存品として 1）HyB Buffer チューブと 2）試薬カートリッジ（図 5-2-3-A）が、冷蔵保存品として 3）PR2 ボトルと 4）フローセル（図 5-2-3-B）の４点が含まれる。冷蔵と冷凍を間違えないように保管する。また、冷凍保存品は解凍したら再凍結させない。

5-2-3-1．MiSeq のメンテナンス
MiSeq では次の 3 通りの洗浄を⾏う。1）メンテナンスウォッシュ︓2 回のウォッシュ液交
換を伴う 3 × 20 分のウォッシュで⽉に 1 回必ず⾏う（前回のランから 1 ヶ⽉以上経過す
ると、MiSeq 側から強制的にメンテナンスウォッシュを⾏うように要求される）
︔2）スタンバイウォッシュ︓ 1 回のウォッシュ液交換を伴う 2 × 50 分のウォッシュで、1 週間以
上 MiSeq をアイドリング状態にすると MiSeq 側からこのウォッシュを⾏うように要求される︔3）ポストランウォッシュ︓ウォッシュ液交換のない 1 × 20 分のウォッシュでラン
終了後に⾏う。なお、ポストランウォッシュには、イルミナが提供するアダプターを⽤いた
次亜塩素酸ウォッシュというプロトコールがあるので、通常はこちらを⽤いて前回ランの持ち越しライブラリーを流路から取り除くようにする。ラン終了後、ポストランウォッシュ
を⾏いスイッチオフにした場合、以下のような流れで⼀連のウォッシュを⾏い、次のランに進むことになる。なお、前回ウォッシュを⾏なった⽇付はウォッシュのトップ画⾯に⽇付が表⽰されるので、それを参考にする。
① MiSeq 本体のスイッチオン（MiSeq コントロールソフトウェアが起動）↓

84

② メンテナンスウォッシュ（前回のランから 1 ヶ⽉以上経過した場合）↓③ 次亜塩素酸を⽤いたポストランウォッシュ（前回ランのライブラリーを除去）↓④ MiSeq のラン開始↓⑤ 通常のポストランウォッシュ（次亜塩素酸を⽤いない）↓⑥ MiSeq 本体のスイッチオフ
すべてのウォッシュに共通する操作
常に実験⽤の使い捨て⼿袋を着⽤して作業する。
1） 10% Tween 20 ウォッシュ液の作成︓Tween 20 原液（図 5-2-3-1-1）を希釈して10%の Tween 20 溶液（ストック可能）をつくり、さらにそれを希釈して実際に⽤いる 0.5% Tween 20 ウォッシュ液とする。10%に調製済みの Tween 20 を購⼊して使ってもよい。50mL 遠沈管に 5mL の Tween 20 を注意深く注ぐ（Tween 20 は⾮常 に 粘 性 が ⾼ い の で ⼊ れ 過 ぎ な い よ う に 注 意 ︔ 図 5-2-3-1-2 ）。 こ の 遠 沈 管 に
DNase/RNase フリー⽔を加えて 50ｍL にメスアップ。遠沈管をよく撹拌して溶液を混和する。1 回のウォッシュで 10%の Tween 20 溶液を 25mL 使⽤するので、これが 2 回分のウォッシュ液になる。
2） 0.5% Tween 20 ウォッシュ液の作成︓上記の 10%の Tween 20 溶液 25mL を 500mLの 洗 浄 瓶 に ⼊ れ （ 図 5-2-3-1-3 ）、 洗 浄 び ん の ⽬ 盛 り で 500mL に 達 す る ま で
DNase/RNase フリー⽔を加える。10 回ほど転倒混和する。
3） ウォッシュ液の充填︓溶液の⼊った洗浄瓶を使ってウォッシュカートリッジにウォッシュ液を注⼊する（図 5-2-3-1-4）。ウォッシュカートリッジのポート（孔）の上から
1cm 程度までウォッシュ液を注ぐと約 6mL ⼊る。すべて注ぎ終えたら残りのウォッ
シュ液をウォッシュボトル（350mL 程度）に移し替える（図 5-2-3-1-5）。
4） ウォッシュの準備︓MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）のトップ画⾯（図 5-23-1-6）の左下にある Perform Wash ボタンを押と 3 通りのウォッシュが表⽰される（図 5-2-3-1-7）。実施したいウォッシュを選択する。使⽤済みフローセル（前回のランで使⽤したフローセル）がフローセルコンパートメントにセットされていることを確認する（図 5-2-3-1-8）。画⾯右下の Next を押すと、ウォッシュカートリッジとウォッシュボトル、廃液ボトルの取り出し画⾯に変わる。
5） ウォッシカートリッジのセット︓しばらくすると、カートリッジやボトルが取り出さ85

れる様⼦が画⾯に現れる（図 5-2-3-1-9）。MiSeq 本体の試薬コンパートメントのドアを開け、次に試薬チラーのドアを開ける。試薬チラー内に⼊っている前回ランのカー
トリッジ、もしくは前回ウォッシュに⽤いたウォッシュカートリッジを引き出し、⽤意したウォッシュカートリッジを奥まできっちり⼊れ（図 5-2-3-1-10）、試薬チラーのドアを閉める。
6） ウォッシュボトルと廃液ボトルのセット︓次に試薬コンパートメントのシッパーハン
ドルを引き上げる。⽤意したウォッシュボトルをセットし（図 5-2-3-1-11）、廃液ボ
トルを空にして所定の位置にセットしたら、シッパーハンドルを引き下げる（図 5-23-1-12）。
7） ウォッシュの開始︓ウォッシュカートリッジ、ウォッシュボトル、廃液ボトルのセットが完了したら、MiSeq の試薬コンパートメントの扉を閉じ、画⾯右下の Next を押
すとウォッシュが始まる（図 5-2-3-1-13）。
8） ポストランウォッシュの終了︓ウォッシュが終了すると右下に Done と表⽰されるので、それを押すと MiSeq コントロールソフトウェアのトップ画⾯に戻ってウォッシュの全⼯程が終了する。メンテナンスウォッシュとスタンバイウォッシュの場合は、以下に記すようにウォッシュ液の交換が必要となるため、ウォッシュ中に先ほど使⽤した洗浄瓶を⽔道⽔でよく洗いミリ Q ですすいだ後、再度 0.5% Tween 20 ウォッシュ
液を⽤意する。使⽤する分をまとめて調製しておくとよい。
9） ウォッシュ液の交換︓メンテナンスウォッシュかスタンバイウォッシの場合、最初のウォッシュが終了するとウォッシュ液を交換するメッセージが表⽰される。MiSeq の試薬コンパートメントにあるウォッシュカートリッジとウォッシュボトルを取り出し、両者の中に残っている溶液を廃棄する。カートリッジのポートとボトル内部を⽔道⽔でよく洗った後に DNase/RNase フリー⽔でよくすすぐ。新たに作成した 0.5%
Tween 20 ウォッシュ液を前述と同様にポートとボトルに満たし、再度 MiSeq の試薬
コンパートメントにセットする。廃液はそれほど溜まらないので、廃液ボトルはそのまま使⽤してもよい。
10）ウォッシュの終了︓メンテナンスウォッシュかスタンバイウォッシュの場合、全ての⼯程が終わると右下に Done と表⽰される（図 5-2-3-1-14）。Done を押すと MiSeq
コントロールソフトウェアのトップ画⾯に戻ってウォッシュの全⼯程が終了する。
次亜塩素酸を⽤いたウォッシュ
1） ウォッシュの準備︓ウォッシュカートリッジを⽤意し、17 番ポートに、0.01%に調整した次亜塩素酸溶液を 1mL ⼊れた MiSeq Disposable Wash Tubes を差し込む（図86

5-2-3-1-15, 16）。17 番ポート以外は通常のポストランウォッシュと同様に 0.5%
Tween 20 ウォッシュ液⼊れ、残りをウォッシュボトルに⼊れる。
2） 準備が終わったらトップ画⾯の左下にある Perform Wash ボタンを押す。3 通りのウ
ォッシュが表⽰されるので Post-Run wash を選択する。画⾯が切り替わると次亜塩
素酸溶液を使⽤・不使⽤のチェックボックスが中央やや下に現れるのでチェックを⼊れる。
3） 右下の Next を押す。これ以降は、前述のウォッシュの実施と同じ。ウォッシュが終了
すると右下に Done と表記されるので、それを押すと MiSeq コントロールソフトウェ
アのトップ画⾯に戻る。
ラン終了後のポストランウォッシュ
ランが終了すると、右下に Start Wash と表⽰されるので押す。以降は前述のウォッシュの実施と同じ。
MiSeq 本体の起動法
MiSeq 本体の右側の後ろにあるスイッチを⼊れる。本体付属の OS である Windows が起動し、起動が完了すると⾃動的に MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）が起動する設定になっている（図 5-2-3-1-17）。起動が完了するには 5 分程度必要になるので、ラン開始の時間を⾒計らって MiSeq 本体を起動すること。なお、ランの途中停⽌などのトラブルを避けるために、ラン前のウオッシュがすべて終了したところで MiSeq 本体を再起動することを勧める。

5-2-3-2．シークエンスの下準備
本項では、シークエンスを実際に開始する遅くとも 1 時間前までに終えるべき操作について記す。常に実験⽤の使い捨て⼿袋を着⽤して作業する。
1） 冷凍品の解凍︓バットを⽤意し、冷凍保存してある試薬カートリッジと HyB Buffer のチューブを⼊れ、カートリッジの側⾯にある最⼤⽔量線まで脱イオン⽔を静かに注ぐ（図 5-2-3-2-1）。脱イオン⽔に漬けたまま約 1 時間静置し、キット内部の試薬を⼗分に解凍する。前⽇から 4℃に⼊れて⼀晩解凍してもよい。4℃では最⻑１週間、試薬を安定に保存できる。
2） 0.2N NaOH 溶液の準備︓0.2N NaOH 溶液は、ライブラリーの DNA を⼀本鎖に変性させるために⽤いる。ランごとに 2N NaOH 溶液（ストック可）から DNase/RNase

87

フリー⽔を⽤いて希釈し、新鮮な 0.2N NaOH 溶液を調製する。使⽤する量は微量なので、1.5mL チューブに 1mL 調製すれば、希釈時の誤差も⼩さく⼗分量が得られる。
調製した 0.2N NaOH 溶液は使⽤するまで氷上もしくは冷蔵庫に保存し、12 時間以内に使⽤する。12 時間以内であれば他のランにも使⽤可能である。残った NaOH 溶液
は施設毎の廃棄基準に従って廃棄する。
3） サ ン プ ル シ ー ト の 作 成 ︓ MiSeq 本 体 に 搭 載 さ れ て い る ソ フ ト ウ ェ ア Illumina
Experiment Manager（以下 IEM）を起動し、画⾯の指⽰に従ってサンプルシートを作成する。サンプルシート作成に必要な試薬カートリッジの番号（例︓MS-XXXXXXX300V2.csv︔図 5-2-3-2-2）がカートリッジ側⾯に記してあるので記録しておく。なお、保存形式が CSV 形式になっていれば、サンプルシートはエクセル等のスプレッド
シートとして編集可能である。したがって、ベースとなるファイルを IEM で作成し、それを別途スプレッドシートで編集し直すのが効率的であろう。作成したサンプルシートは、MiSeq 本体の Illumina/Illumina Control Software フォルダー内に保存する。

5-2-3-3．ライブラリー濃度の最終調整
本項では、シークエンス反応が⾏われるフローセル上において適正な密度でクラスターが形成され、同時にクラスター間の分離がよくなるような実験⼿法について記す。なお、以下の操作を⾏うことで得られることが期待されるリード数はキット記載の総リード数からス
パイクインした PhiX の割合を除いた数である。
1） 4nM への調整︓Qubit で定量した濃度に基づきライブラリーを 4nM に調整する。モル数の計算に⽤いるのはライブラリー⻑（平均 372bp）と 1 塩基あたりの分⼦量（660g/mol）になるが、複数の単位（micro/nano/pico）にまたがって濃度を計算しなくてはならないので、予めスプレッドシートにモル数換算式を⼊れておくとよい。
また、サンプル数が異なる複数のライブラリーを⼀度にシークエンスする場合は、サンプル数（ブランクを除いたもの）とサンプル毎の取得希望リード数の割り当てから混合⽐を算出し、それぞれの混合量を決定する。2nd PCR 産物をサイズセレクション
したライブラリは平均 372bp のライブラリー⻑となる。その溶液の重量濃度がang/µL の時、モル濃度はa*106/372*660 の計算式で求めることができる。
2） DNA の変性︓新しい 1.5mL チューブに、
4nM に調整したライブラリーを 5μL と 0.2N
NaOH を 5μL ⼊れてピペットで混合する。その後、数秒間ボルテックスし、軽く遠⼼して溶液をチューブの底に集め、室温で 5 分間静置してライブラリー中の DNA を変性する。この時点での濃度は 2nM である。

88

3） 20pM への調整︓変性した DNA に HyB Buffer を 990µL 加え、20pM に調整する（100 倍希釈）。
4） 最終濃度（12pM）への調整︓MiFish アンプリコンの場合、最終濃度を 12pM に調整
すると 800〜1000K/mm2 のクラスター密度が得られ、メーカーのスペックにほぼ⼀致するリード数が得られる。最終濃度を 12pM にするには、360µL のライブラリー溶液に HyB バッファーを 240µL 加える。なお、クラスター密度をより正確にコントロールするには、イルミナライブラリー定量のための qPCR キット（東洋紡の GenNext
NGS Library Quantification Kit など）でクラスター形成できる断⽚のみを濃度評価
して 最終濃度を調整する。
5） PhiX のスパイクイン︓フローセル上に形成されるクラスター同⼠のシグナル分離をよくするため、イルミナ社から販売されている PhiX control v3 をスパイクインとして10-25％⼊れる。これをサンプル DNA と同様に 0.2N NaOH で変性し、HyB Buffer
で 20pM に調整する。10% PhiX とする場合は、例えば上記の 600µL のライブラリーから 60µL を抜き取り、20pM に調整した PhiX を 36µL、HyB Buffer を 24µL 加える。ライブラリーによって適切な PhiX 添加量を決める必要がある。
以上の操作で、12pM に調整されたライブラリー600µL が⽤意できたので、これを試薬カートリッジに注⼊し、MiSeq にロードする。

5-2-3-4．シークエンス開始前後の操作
本項では、シークエンス開始前後に必要な操作について記す。既にライブラリーは 12pM に調整されており、機器を正しく設定すればシークエンスできる段階になっている。
常に実験⽤の使い捨て⼿袋を着⽤して作業する。
1） 試薬カートリッジ内の試薬が完全に解凍されたことを確認し、キムタオルでカートリ
ッジ外側についた⽔滴を⼗分に拭き取る。試薬カートリッジをおだやかに 10 回程度
転倒撹拌し、カートリッジ内の試薬を混和する。試薬内の気泡を取り除くため、キムタオルを敷いた実験台の上にカートリッジを何回か軽く叩きつける（図 5-2-3-4-1）。
2） 1000µL のピペットチップをつかってライブラリー注⼊ポート（オレンジ⾊が⽬印）のホイルに孔を開ける（図 5-2-3-4-2）。使⽤したチップはそのまま廃棄する。
3） 1200µL または 1000µL の新しいピペットチップを使って、12pM に調整されたライ
ブラリー600µL を試薬カートリッジの注⼊ポートに⼊れる（図 5-2-3-4-3）。気泡が⼊らないようにピペット操作には注意すること。注⼊⼝をパラフィルムなどで蓋をし、遮光してランまで 4℃保管する。

894） MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）を起動し SEQUENCE ボタンを押してランのセットアップに進む。
5） MiSeq を イ ン タ ー ネ ッ ト に 接 続 し て い る と 、 SEQUENCE ボ タ ン を 押 し た 後 に
BaseSpace（イルミナ社が提供するクラウド環境）を使⽤するかどうかの確認ボタンが表⽰される（図 5-2-3-4-4）。BaseSpace の利⽤にあたっては、事前に MyIllumina
へのユーザー登録が必要となる。
6） BaseSpace を使⽤する場合には、Use BaseSpace for storage and analysis のボックスにチェックを⼊れ、表⽰欄に MyIllumina アカウント登録時に使⽤した情報を⼊⼒する。BaseSpace を使⽤しない場合はこのボックスを空欄にしておけばよい。選択が終わったら、Next ボタンを押すとフローセルのセッティング画⾯に切り替わる。
7） 冷蔵保存されていたフローセルを、プラスチック製ピンセットを使って容器から取り出す。フローセルは容器内でバッファーに浸かった状態で保存されているので、MiSeqにセットする前にフローセルのガラス部分とプラスチック部分を DNase/RNase フリ
ー⽔でよくリンスする。特に、フローセルのプラスチックケース内にバッファーが残りやすいので、その部分はよくリンスすると共にケース内の⽔分を（注意深く）軽く振り出す。この際、ガスケット（試薬やサンプルへの流路の⼊り⼝）部分に強く⽔流が当たらないように注意する。
8） レンズクリーニングティッシューに 99.5%エタノールを少量滴下し、フローセルのガラス部分についた⽔分を軽く拭き取る。ガラス部分に汚れや染みがないか⽬で確認し、きれいになるまでレンズクリーニングティシュで軽く磨く。フローセルのプラスチッ
ク部分にある 2 ⽳のガスケットポートには触れないように注意すること。
9） MiSeq のフローセルコンパートメントのドアを開け、更にフローセルラッチを開けて使⽤済みのフローセルを取り出す。この時、中のフローセルが⾶び出さないように、ラッチの上⾯に⼿を当てた状態でラッチを開ける銀⾊のボタンを押し、急なラッチの跳ね上がりを防ぐとよい。フローセルラッチの台座に埃や析出したバッファーがある
場合には、フローセルを磨いたレンズティッシューで拭き取る。
10）フローセルを台座の所定の位置に載せ、カチッと⾳がするまでラッチを静かに押し下げ固定する。
11）MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）の画⾯左下をチェックし、フローセルに記された ID（RFID）の読み取りがうまくいっていることを確認する。RFID が読まれていたら、フローセルコンパートメントのドアを閉め、Next ボタンを押す。
12）冷蔵保存の PR2 ボトル（シークエンスバッファー）を取り出し、軽く混和してからス

90

クリューキャップを開ける。
13）MiSeq の試薬コンパートメントのドアを開け、シッパーハンドルを引き上げる。右側の部分に冷蔵保存の PR2 ボトルをセットし、廃液ボトルを空にする。セットが完了したらシッパーハンドルを引き下げる。
注意︓シッパーハンドルを引き下げなくてもランが始まってしまうので注意する。引き下げ
ないとバッファーを吸い取ることができないので（おそらくは）ランが停⽌してしまう。
14）MCS の画⾯左下をチェックして、RP2 のボトルに記された ID（RFID）が読み込まれていることを確認する。
15）試薬チラーのドアを開け、ウォッシュカートリッジに挿⼊されているシッパーが完全に引き上げられるまで待つ。シッパーが上がる前にウォッシュカートリッジを引き出そうとすると、シッパーが折れてしまうので注意する。
16）ライブラリーが充填された試薬カートリッジを試薬チラーの奥まで確実に挿⼊する。
17）試薬チラーのドアを閉める。MCS の画⾯左下をチェックして、試薬カートリッジに記された ID（RFID）の読み取りがうまくいっているかどうか確認する。
18）画⾯上に実験名と解析ワークフローが表⽰されるので確認する。画⾯左下でサンプルシートのフォルダーの階層を確認して Next を押す。
19）プレランチェックの画⾯に移⾏する。チェック項⽬が表⽰され、全ての項⽬にチェッ
クが⼊ると Start Run ボタンがアクティブになる。ランを開始してよければボタンを押す。
20）Start Run ボタンを押してからしばらくの間はシークエンスの初期トラブルが発⽣しやすい。試薬がフローセルに流れ込むまではランの再開が可能な場合があるので、5 分
間ほどは MiSeq ランの進⾏を機器の前で⾒守るとよい。

参考⽂献
Nakao, R., Inui, R., Akamatsu, Y., Goto, M., Doi., H., Matsuoka, S. 2021. Illumina iSeq
100 and MiSeq exhibit similar performance in freshwater fish environmental DNA
metabarcoding. Scietific Reports 11: 15763. doi: 10.1038/s41598-021-95360-5
Miya, M., Sato, Y., Fukunaga, T., Sado, T., Poulsen, J. Y., Sato, K., Minamoto, T.,
Yamamoto, S., Yamanaka, H., Araki, H., Kondoh, M., Iwasaki, W. 2015. MiFish, a91

set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes:detection of more than 230 subtropical marine species. Royal Society OpenScience 2 (7): 150088. doi: 10.1098/rsos.150088

92

図 5-2-1-1-1
同⼀サンプルに対して８連チューブ 1 本をつかった 8 繰り返しの 1s tPCR をセットアップしたところ。

図 5-2-1-2-1
繰り返し反応したサンプルをそれぞれ１つにまとめる。

図 5-2-1-2-2
SPRIselect のボトルをよく攪拌して磁性
ビーズを分散させる。

図 5-2-1-2-3
繰り返し分を 1 つにまとめた PCR 産物に等量の SPRIselect を添加してピペッティ
ングで攪拌し、96 ウェルプレート（DNA低吸着）に移す。

93

図 5-2-1-2-4
マグネットプレートに設置し、液が透明になるまで静置する。

図 5-2-1-2-5
上清を慎重に除去する

図 5-2-1-2-6
マグネットプレートに設置したまま 85%
エタノールを加え、30 秒静置し、上清を慎重に除去する。これを 2 回繰り返す。

図 5-2-1-2-7
遠⼼で壁⾯に残った上清を集め、再度マグ
ネットプレートに設置して磁性ビーズから
残留エタノールを完全に除去した後、マグネットプレートから取り外し、Buffer EB
を 25μL 添加してビーズをよく分散させる。

94

図 5-2-1-2-8
再度マグネットプレートに設置し、液が透明になるまで静置する。

図 5-2-1-2-9
磁性ビーズを吸わないよう注意しながら上清を全て回収する。

図 5-2-1-3-1
TapeStation 4150 ⽤のキット。High
Sensitivity D1000 Screen Tape（左）と試薬（右）。

図 5-2-1-3-2
TapeStation 4150 付属のコンピューターを起動する。

95

図 5-2-1-3-3
High Sensitivity D1000 Screen
TapeScreenTape と必要な数の4150/4200 TapeStation Loading Tips ピ
ペットチップをセットする。

図 5-2-1-3-4
High Sensitivity D1000 Sample Buffer
を 2μL ずつ分注する。

図 5-2-1-3-5
High Sensitivity D1000 Ladder ラダー
2µL を 1 本⽬のチューブに分注する。

図 5-2-1-3-6
残りのチューブに精製濃縮済み 1st PCR
産物を 2µL ずつ分注する。

96

図 5-2-1-3-7
2,000rpm で 1 分間撹拌した後、卓上⼩型
遠⼼機で液をチューブの底に集める。

図 5-2-1-3-8
8 連チューブのキャップを中の液が⾶び散らないように静かに開け、TapeStation
4150 のカセットにセットする。

図 5-2-1-3-9
左側の 8 連チューブのイメージ像で、ラダーと測定する PCR 産物のチューブ上での並びを指定する。

図 5-2-1-3-10
分析を開始すると、⾃⼰診断の後に⾃動で分析を⾏う。泳動中は残り時間が表⽰される。

97図 5-2-1-3-11
泳動が終了するとターゲットのバンド（約310bp）がフェログラムと共に表⽰される。

図 5-2-2-1-1
サンプル数が 40 の場合。

図 5-2-2-1-2反応溶液を全量 1 本のチューブにまとめる。

図 5-2-2-2-1
コームを注意深く取り外す。

98

図 5-2-2-2-2
ゲルの右側から iBasePower Snap に挿⼊する。

図 5-2-2-2-3
Power Snap のフィルターカバーを閉める。

図 5-2-2-2-4
基準線回収ウェル直上に到達したターゲッ
ト産物（約 370bp）。中央がラダー（サイズマーカー）。回収ウェルのやや上にターゲット産物（370bp）がある。ターゲット
バンドの上にスメアと共に時折⾒られるバ
ンドは⾮特異的産物なので、回収ウェルに⼊れないように注意する。

99

図 5-2-2-3-1
Qubit dsDNA HS Assay キットを冷蔵庫から取り出して 30 分以上かけて室温に戻す。

図 5-2-2-3-2
新しいチューブに Qubit dsDNA HS
Buffer を⼊れる。

図 5-2-2-3-3
Qubit dsDNA HS Reagent を⼊れる。

図 5-2-2-3-4
スタンダード#1 と#2 をそれぞれのチューブに 10μL ずつ⼊れる。

100

図 5-2-2-3-5
チューブにライブラリーを 2μL ⼊れる。

図 5-2-2-3-6
2 分間室温で静置する。この操作を怠ると計測値が安定しない。

図 5-2-2-3-7
Qubit 4 Fluorometer の電源を⼊れて起動
する。

101

図 5-2-2-3-8
スタンダード#1 と#2 を Qubit の指⽰に従って順番に測定し、検量線を作成する。

図-5-2-2-3-9
Qubit のチューブに加えたサンプルのボリ
ューム、結果の表⽰単位などを⼊⼒する。

102

図 5-2-2-3-10
サンプルの濃度を計測しているところ。

図 5-2-2-3-11
続けてサンプルの測定を⾏うと、サンプル
DNA の濃度が表⽰される。上段がサンプ
ルの濃度、下段は測定チューブ内の DNA
濃度。

103

図 5-2-3-A
冷凍保存品の HyB チューブ（⼿前右）と試薬カートリッジ（⼿前左）。

図 5-2-3-B
冷蔵保存品の PR2 ボトル（中央）とフローセル（右）。

図 5-2-3-1-1
Tween 20 原液。

図 5-2-3-1-2
50mL 遠沈管に 5mL の Tween 20 を注意
深く注ぐ。Tween 原液は粘性が⾼いので取り扱いに注意すること。

104

図 5-2-3-1-3
10%の Tween 20 溶液 25mL を 500mLの洗浄瓶に⼊れる。

図 5-2-3-1-4
ウォッシュカートリッジにウォッシュ液を注⼊する。

図 5-2-3-1-5
すべて注ぎ終えたら残りのウォッシュ液をウォッシュボトル（350mL 程度）に移し替える。

図 5-2-3-1-6
MiSeq コントロールソフトウェア（MCS）のトップ画⾯。

105

図 5-2-3-1-7
Perform Wash ボタンを押と 3 通りのウ
ォッシュが表⽰される。

図 5-2-3-1-8
使⽤済みフローセルがフローセルコンパー
トメントにセットされていることを確認する。

図 5-2-3-1-9
試薬カートリッジやボトルが取り出される様⼦が画⾯に現れる。

図 5-2-3-1-10
⽤意したウォッシュカートリッジを試薬チラーに⼊れる。

106

図 5-2-3-1-11
⽤意したウォッシュボトルをセットする。

図 5-2-3-1-12
セットが完了したらシッパーハンドルを引き下げる。ハンドルを引き下げるのを忘れてもランが始まってしまうので注意すること。

図 5-2-3-1-13
画⾯右下の Next を押すとウォッシュが始まる。

図 5-2-3-1-14
全ての⼯程が終わると右下に Done と表⽰
される。

107

図 5-2-3-1-15
次亜塩素酸溶液⽤専⽤チューブ

図 5-2-3-1-16
17 番ポートに次亜塩素酸溶液が⼊った専
⽤チューブを⼊れる。

図 5-2-3-1-17
MiSeq コントロールソフトウェアが起動してシークエンスの準備が始まる。

図 5-2-3-2-1
HyB Buffer のチューブを⼊れ、カートリ
ッジの側⾯にある最⼤⽔量線まで脱イオン
⽔を静かに注ぐ。１時間放置して完全に試薬を解凍する。

108

図 5-2-3-2-2試薬カートリッジの番号はバーコードの真下に書かれている。⼩さく読みにくいので転記する際に間違えないように注意すること。

図 5-2-3-4-1
キムタオルを敷いた実験台の上にカートリ
ッジを何回か軽く叩きつけて試薬類をチューブの底に落とす。

図 5-2-3-4-21000µL のピペットチップをつかって注⼊
ポートに⼤きな孔をまず開ける（オレンジ⾊の 17 番ポート）。その後、シッパー挿⼊時にチューブが折れないように各ポートの中⼼に⼩さな孔を開けておく（中の試薬にピペットの先が触れないように注意すること）。
図 5-2-3-4-3
試薬カートリッジの注⼊ポート（オレンジ⾊）に 1200µL のピペットチップをつかって調製済みライブラリー600µL を⼊れる。

109

図 5-2-3-4-4
SEQUENCE ボタンを押すと BaseSpaceの確認ボタンが表⽰される。

110

5-2-4．環境 DNA メタバーコーディングデータ解析
はじめに
環境 DNA（eDNA）メタバーコーディングで得られた⼤量のデータの解析では、いくつかのソフトウェアを組み合わせて実⾏され、「パイプライン」ともよばれる。それらパイプラ
インは、複数の種類があり、それぞれ操作性やアルゴリズムの違いなどがある。したがって、
どのパイプラインを利⽤するかは使⽤者の選択による。ここでは、国内でも利⽤されることが多い⼆つのパイプライン、“MiFish パイプライン”の使⽤⼿順と“Claident”の概要を例として⽰す。

5-2-4-1. MiFish パイプライン
FASTQ ファイルの準備
5-2-3.（MiSeq を⽤いた超並列シークエンス）で述べたワークフローに従ってシーケンスが完了すると、MiSeqOutput/BaseCalls フォルダ（MiSeq を使⽤した場合）に FASTQ ファイルが作成される。これらの FASTQ ファイルはそれぞれひとつのサンプルのそれぞれのリードに対応し、ファイル名には samplename_S1_L001_R1_001.fastq.gz のようにサンプル名（5-2-3-2 項）が含まれる。ファイル名、FASTQ ファイルの構造、MiSeq を使⽤した FASTQ ファイル⽣成のワークフローに関する詳細情報は、次のリンクを参照︓
https://support.illumina.com/content/dam/illuminasupport/documents/documentation/software_documentation/miseqreporter/mise
q-reporter-generate-fastq-workflow-guide-15042322-01.pdf
単⼀サンプルデータの解析⼿順
FASTQ ファイルの解析には、ここではオンラインの MiFish パイプラインの利⽤について紹介する。なお、GitHub（ソフトウェア開発のプラットフォーム）から、このパイプライ
ンをダウンロードしてローカル PC などにインストールすることでも実施できる。
1) ウ ェ ブ ブ ラ ウ ザ で MiFish pipeline web platform （ http://mitofish.aori.utokyo.ac.jp/mifish/）にアクセスする。
2) 1 サンプルについて read1 および read2 のふたつの FASTQ ファイルをウェブプラッ
トフォームに読み込む（図 5-2-4-1-1）。

1113) アップロードしたファイルが正しく認識されたことを確認する（図 5-2-4-1-2）。
4) FASTQ ファイルを MiFish サーバにアップロードする（図 5-2-4-1-3）。
5) パラメータを表⽰・調整する。ほとんどの場合、デフォルトの設定で問題ない（図 5-24-1-4）a) MiFish Ref. DB: 参照データベースを選択する。デフォルトでは、最も多くの⿂種数を含む最新バージョンになっている。以前の解析結果を再現するために、古いバージョンを選択することもできる。
b) Filter reads by length: デフォルト値は MiFish プライマーに適している。
c) BLASTN identity: デフォルトでは、97%以上の同⼀性がある場合、デノイズされたハ
プロイド（半数体）配列がターゲット⽣物に割り当てられる。この値を⼤きくすると、
環境 DNA（eDNA）が各種に由来するかどうかの判定について、網羅性は減るがより正確なものになる。
6) "Run"ボタンをクリックする。ウェブブラウザーはこのタスク専⽤の別タブ（結果ページ）を起動する。このページは将来の参照⽤にブックマークとして保存することができる。
注意︓結果ページは MiFish サーバーに 1 ヶ⽉間保存される。すべての表と図を保存しておくことを推奨する。
結果の⾒⽅
結果ページでは、⽣シーケンスリードの統計情報、同定された⿂種の全リスト、および下流の解析結果を⾒ることができる。
1) クオリティコントロールの結果（図 5-2-4-1-5）。この図は右上の ボタンをクリック
するとエクスポートできる。データファイルは右上のボタンをクリックするとエクスポートできる。
︓a) ⽣リードb) ⾼品質リードc) マージリードd) "N"塩基を含まない⾮曖昧リードe) ⻑さでフィルタリングされたリード（5-2-4-2 節のステップ 5b）f) ユニークリードg) デノイズされたハプロイド配列

112h) 同定された⿂種
注意︓⻑さでフィルタリングされたリードの数が、"N"塩基を含まない⾮曖昧リードの数よりも著しく少ない場合（図 5-2-4-1-6）、シーケンスデータに重⼤なオフターゲット（意図していないゲノム領域）増幅やライブラリー構築のミスなどのエラーが存在する可能性がある。
2) 以下の６つの列を含む、同定された⿂種の完全リスト（図 5-2-4-1-7）︓a) FishBase（https://www.fishbase.se/search.php）による写真。写真がない種はデフ
ォルトのアイコンで表⽰される。
b) 学名、⼀般名、およびいくつかの重要な⽣態学的特徴を表⽰するタグ。名前は NCBI
Taxonomy（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy）から、⽣態学的特徴のデー
タは FishBase から取得する。
c) 種同定の信頼度を⽰す high/moderate/low のラベル。低い信頼度は、同⼀または類似のバーコード配列を持つ他の⿂種が存在するため、同定された⿂種が曖昧であることを⽰す。
d) その種に由来する DNA の読み取り数を⽰すリード数。
e) 区別できたハプロイドの数。対応する

ボタンをクリックすると、ハプロイドのリス

トを表⽰する新しいボックスがポップアップ表⽰される（図 5-2-4-1-8）。
f) 代表バーコード配列。対応する

ボタンをクリックすると、新しいタブが開き、MitoFish データベースから類似配列を検索できる。
表は 10 ⾏ごとにページ分割される。右上のボタンをクリックすると、全体の表を Excel

形式でエクスポートできる。
注意︓オフターゲット増幅やコンタミネーションにより、表中に⿂類以外の種が含まれる場合がある。
3) このサンプルに含まれる全てのハプロイドの系統樹（図 5-2-4-1-9）。環境 DNA リード
数（リードアバンダンス）は異なる⾊と⼤きさの円で⽰されます。右上のボタンをクリックすると、SVG および NEWICK 形式でファイルをエクスポートできる。
4) 異なる分類レベルの相対存在量の積み上げ棒グラフによる表⽰（図 5-2-4-1-10）。図の上のタブをクリックすることで、異なる分類レベル（綱、⽬、科、属）を切り替えることができる。この図は、右上の ボタンをクリックしてエクスポートすることができる。

113

複数サンプル（グループ）データの解析⼿順
MiFish パイプラインは、様々な場所や時点から得られたサンプルや、同⼀条件下での⽣物学的レプリケートから得られたサンプルなど、複数のデータセットを解析することもできる（図 5-2-4-1-11）。⼿順は 5-2-4-2 節で説明した⼿順とほぼ同じだが、ステップ 3 において、サンプルをグループ分けすることができる（図 5-2-4-1-12）。通常は、異なるサン
プリング条件のものは異なるグループとし、同⼀条件のサンプル（レプリケート）は同じグ
ループとする。
結果の⾒⽅
結果ページの構成は、上述の「単⼀サンプルデータ」で説明したものとほぼ同じになる。
異なるサンプルの解析結果は、"Taxonomic Classification"のナビゲーションタブをクリックすることで切り替えることができる（図 5-2-4-1-13）。また、複数のグループについて解析する場合は、グループ間のα多様性とβ多様性に関する結果を、それぞれ散布図とヒートマップで表⽰する（図 5-2-4-1-14、図 5-2-4-1-15）。外部ファイルへの出⼒⽅法
は、5-2-4-2 節で⽰したものと同様になる。
注意 1︓解析結果で種の識別が困難なとき、サンプリング場所における⽣息地の観点を加えて種を推定できることがあるが、その場合、結果に注釈を付記するなどの対応が望ましい。
注意 2︓種の同定結果はデータベースの整備状況に起因する差異が含まれているため、解析に⽤いた MiFish パイプライン、遺伝⼦データベースのバージョン情報を明記することが必要である。

Q&A
Q︓参照データベースとは何ですか︖
A: メタバーコーディングのための参照データベース（リファレンスデータベース）とは、ターゲットとなる可能性のある⽣物種（様々な⿂種など）のターゲットプライマー（MiFish プライマーなど）領域の塩基配列の網羅的なセットです。DNA 配列と⽣物種は参照データとの類似性検索によって結びつけられるため、参照データベースはメタバ
ーコーディング解析の鍵となります。MiFish パイプラインに組み込まれた参照データベ
ースは、その完全性を保つために毎⽉定期的に更新され、その正確性を保証するために専⾨家によってキュレーションされています。
Q︓Run ボタンを押した後はどうなりますか︖

114

A︓Run ボタンを押すと、アップロードされた FASTQ ファイルは、⼀連の前処理ステップ
を経て、データに含まれる⽣物種を特定するために参照データベースと⽐較されます。
これらのステップには、品質と⻑さのフィルタリング、アンプリコン領域への切断、デノイズ、類似性検索、系統解析、⽣物多様性解析が含まれます。ワークフローの詳細な説 明 に つ い て は 、 次 の リ ン ク を 参 照 し て く だ さ い ︓ http://mitofish.aori.utokyo.ac.jp/mifish/help/
Q︓フィルタリングとは何ですか︖（図 5-2-4-1-5）
A︓⽣のイルミナシーケンスリードには、参照データベースと⽐較する前に除去しなければならないノイズデータが含まれています。例えば、ノイズデータには以下が含まれます。
a) ベースコールの低品質領域として⽰されるシーケンスエラーb) アンプリコンに繋がった過剰なプライマーまたはアダプターc) 異常な⻑さを持つオフターゲットアンプリコン
MiFish パイプラインは、このようなノイズの多いリードの⾃動的な除去を⾏うツール
を統合しています。
Q︓デノイズ（ノイズ除去）とは何ですか︖（図 5-2-4-1-5）
A︓環境 DNA メタバーコーディングにおいては、マイナーな⽣物種（すなわち真の陽性）または⼈⼯的なシーケンスエラー（すなわち偽陽性）により、低存在量の DNA 配列が観察されることがあります。デノイズは、そうした低存在量の DNA 配列が偽陽性である
場合は、ほとんど同じ配列で存在量の多い配列を伴うという事実に基づいて、真陽性と偽陽性を識別する技術です。MiFish パイプラインはデノイズによって真の陽性配列を得ます。
Q︓アルファ多様性とは何ですか︖（図 5-2-4-1-14）
A︓アルファ多様性とは、特定の場所または 1 つのサンプルに含まれる⽣物群集がどのくらい多様な種や個体から構成されているかを表す値です。種の数に基づく指標（chao 1 指数）や種の相対量分布に基づく指標（シャノン指数やシンプソン指数）など、様々な指標が⽤いられます。
Q︓ベータ多様性とは何ですか︖(図 5-2-4-1-15）
A︓ベータ多様性とは、様々な場所やサンプル間で観察される⽣物群集のばらつきのことです。ベータ多様性の値が⾼いほど、サンプル間の種組成の違いが⼤きいことを意味しま
す。

115

参考⽂献
Iwasaki, W., Fukunaga, T., Isagozawa, R., Yamada, K., Maeda, Y., Satoh, TP., Sado,T., Mabuchi, K., Takeshima, H., Miya, M. Nishida, M. 2013. MitoFish and
MitoAnnotator: a mitochondrial genome database of fish with an accurate andautomatic annotation pipeline. Molecular Biology and Evolution 30: 2531-2540.
doi: 10.1093/molbev/mst141
Sato, Y., Miya, M., Fukunaga, T., Sado, T., Iwasaki, W. 2018. MitoFish and MiFish
Pipeline: A Mitochondrial Genome Database of Fish with an Analysis Pipeline forEnvironmental DNA Metabarcoding. Molecular Biology and Evolution 35: 15531555. doi: 10.1093/molbev/msy074
Zhu, T., Sato, Y., Sado, T., Miya, M., Iwasaki, W. 2023. MitoFish, MitoAnnotator, andMiFish Pipeline: Updates in ten years. Molecular Biology and Evolution 40:
msad035. doi: 10.1093/molbev/msad035

116

図 5-2-4-1-1
FASTQ ファイルの読み込み。圧縮ファ
イル（拡張⼦.gz、.bz2、.xz）に対応している。読み込んだファイルを削除するには、左側の×ボタンをクリックする。
図 5-2-4-1-2
アップロードしたファイルが正しく認識されているかの確認。

図 5-2-4-1-3
FASTQ ファイルの MiFish サーバへのアップロード。右側の↑ボタンをそれ
ぞれクリックし、アップロードする。
アップロードに成功したファイルは緑⾊で表⽰され、削除することはできない。
図 5-2-4-1-4
パラメータの表⽰・調整。デフォルト
設定はほとんどの場合に適しており、通常は変更する必要はない。
図 5-2-4-1-5
⽣リードのクオリティコントロールの結果、デノイズされたハプロイドの数、同定された⽣物種の数を⽰す棒グ
ラフ。
図 5-2-4-1-6
エラーを含む可能性のあるシークエン
シングデータの例。⼀定の⻑さの領域
から急激にリード数が減少している。

117

図 5-2-4-1-7
同定された⿂種のリスト。

図 5-2-4-1-8
同⼀⿂種に属する別個のハプロイド（デノイズ済みの異なるリード配列）のリスト。
図 5-2-4-1-9
同⼀サンプル内の全ハプロイドの系統樹。

図 5-2-4-1-10
異なる分類レベルでの相対的存在量の統計量。

図 5-2-4-1-11
MiFish パイプラインを⽤いた複数サン
プルの解析。

118

図 5-2-4-1-12
複数のサンプルのグループへの割り当て。最⼤ 3 グループまで割り当てが可能。この図はそれぞれ２つの⽣物学的レプリケートを含む２グループの解析を⽰している。

図 5-2-4-1-13
異なるサンプルの結果の切り替え。ナ
ビゲーションタブをクリックすることで切り替えられる。
図 5-2-4-1-14
アルファ多様性の散布図による表⽰。2つの⽣物学的レプリケートを持つ 2 つのサンプルグループを⽰している（Group 1 は SJ2 と SJ4、Group 2 はTH2 と TH4）。
図 5-2-4-1-15
ヒートマップで⽰されたβ多様性。⾊が濃いほど、2 つのサンプル間の距離が短い（つまり似ている）ことを⽰す。

119

5-2-4-2. Claident
5-2-4-2-1. はじめにClaident「クライデン」は、メタバーコーディングや DNA バーコーディングのための塩基配列データ解析プログラム集になる。MiFish パイプラインとの違いはおおまかには以下の点になる。
• MiFish プライマーを⽤いた⿂類メタバーコードデータだけでなく、全⽣物・ウィルスのあらゆる遺伝⼦座のデータに対応• ⾮定量および定量メタバーコーディングをサポート• より柔軟で詳細な解析に対応• Web サービスはなく、⾃前のコンピュータで解析を⾏う• 使⽤のための前提知識・必要な物品は多い
ここでは Claident のインストールから内部標準 DNA を利⽤した定量メタバーコーディン
グの⽅法を解説する。Claident のサポートページを下記 URL に設置しているので、適宜参照いただきたい。
• https://github.com/astanabe/eDNAmanual
また、サンプルデータ、サンプルファイル、本章の原稿ファイル等が置いてある下記 URLを参照すること。
• https://www.claident.org/
なお、5-2-4-2 節のフルバージョンは別紙として下記 URL より閲覧可能である。
https://github.com/astanabe/eDNAmanual/blob/main/metabarcodinganalysiswithClaident.pdf

5-2-4-2-2. 動作環境
Claident は、以下の環境で動作するように作成されている。
• Debian 11 以降 (Windows 上の WSL 環境を含む)• Ubuntu 20.04 以降 (Windows 上の WSL 環境を含む)• Linux Mint 20 以降• RedHat Enterprise Linux 8 以降

120

• AlmaLinux 8 以降 (Windows 上の WSL 環境を含む)• Rocky Linux 8 以降
• Homebrew をインストールした macOS• MacPorts をインストールした macOSClaindent のインストールの詳細については、下記 URL（別紙フルバージョン）を参照する
こと。
https://github.com/astanabe/eDNAmanual/blob/main/metabarcodinganalysiswithClaident.pdf

5-2-4-2-3. データ解析全体の流れと前提条件
Claident によるデータ解析は以下の流れになる。
1. デマルチプレックス
2. ペアエンド配列の連結
3. 低品質配列の除去
4. デノイジング
5. 参照配列データベースを⽤いないキメラ除去
6. 内部標準配列クラスタリング
7. 参照配列データベースを⽤いたキメラ除去
8. インデックスホッピング除去
9. ネガティブコントロールを利⽤したデコンタミネーション
10. 分⼦同定
11. OTU 組成表の作成・加⼯
12. カバレッジベースレアファクション
13. 内部標準 DNA リード数を利⽤した DNA 濃度の推定
最終的に得られた OTU 組成表を R やその他の統計解析環境で処理することで、作図や要約、仮説検証を⾏う。Claident ⾃体には統計解析機能はない。Claident は⼤抵のメタバー
コードデータの解析に使⽤可能であるが、ここでは以下のようなデータを仮定して解説を進める。下記を満たしていないデータを解析できないわけではないが、本章では説明の対象としない。
・

環境⽔を濾過して濾過フィルターから抽出した環境 DNA サンプルとネガティブコン

121トロールとしてのフィールドブランクが含まれる
・

以下の⽅法でライブラリ調製をする
濃度のわかっている複数の内部標準 DNA を添加して MiFish プライマーを使⽤–して tailed PCR (1st PCR)（5-2-1. ライブラリーの調製ー１: 1st PCR, p.67）
1st PCR 産物を鋳型にしてインデックスプライマーを使⽤して tailed PCR（2nd–PCR）（5-2-2. ライブラリーの調製ー２:2nd PCR, p.75）
できあがるライブラリは、両端にインデックスがあるデュアルインデックスライ

–

ブラリ
・

各サンプルの 2nd PCR 産物を混合してイルミナ社製シーケンサで 1 ランまたは 1 レ
ーン専有で解読する–

オーバーラップのある、つまり、連結可能なペアエンドシーケンス–.bcl を含むランデータまたはインデックスシーケンス分も含めて未デマルチプレックス FASTQ が⼿元にあるしたがって、サンプル・ブランクごとに以下の情報がわかっている必要がある。
・

サンプル・ブランクのいずれなのか

・

濾過⽔量

・

抽出 DNA 溶液量(回収液量ではなく、最後の溶出時に使⽤した液量)

・

内部標準 DNA 塩基配列

・

内部標準 DNA 濃度

・

1st PCR 時のプライマー配列のうち、シーケンサの読み始めになる部分配列

・

2nd PCR 時のプライマー配列のうち、インデックスとして読まれる部分配列

塩基配列データ処理などの作業の詳しい説明については下記（別紙フルバージョン）を参照
すること。
https://github.com/astanabe/eDNAmanual/blob/main/metabarcodinganalysiswithClaident.pdf

付録
⽥ 辺 晶 史 2024. Claident を ⽤ い た 定 量 メ タ バ ー コ ー デ ィ ン グ 解 析 .
https://github.com/astanabe/eDNAmanual/blob/main/metabarcodinganalysisw
ithClaident.pdf（フルバージョン）

122引⽤について本マニュアルを引⽤する場合は以下のような引⽤⽅法を推奨します。

マニュアル全体
環境 DNA 学会 (2024) 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 3.0.
第２章
清野聡⼦, 源 利⽂ (2024) 調査地点の選定. 環境 DNA 学会 環境 DNA 技術標準化委員会（編）
環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 3.0. 8–14 ⾴.
第3章
宮 正樹, 佐⼟哲也 (2024) 採⽔とカートリッジ式フィルターを⽤いた現場濾過. 環境 DNA 学
会 環境 DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 3.0. 17-29 ⾴.
源 利⽂ (2024) 採⽔とグラスファイバーフィルターを⽤いた実験室での濾過. 環境 DNA 学会
環境 DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 3.0. 30-37 ⾴.
第4章
宮 正樹, 佐⼟哲也 (2024) カートリッジ式フィルターからの DNA 抽出. 環境 DNA 学会 環境
DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 3.0. 39-51 ⾴.
源 利⽂ (2024) グラスファイバーフィルターからの DNA 抽出. 環境 DNA 学会 環境 DNA 技
術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 3.0. 52-62 ⾴.
第5章
源 利⽂ (2024) リアルタイム PCR による環境 DNA の種特異的検出・定量. 環境 DNA 学会 環
境 DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 3.0 63-66 ⾴.
宮 正樹, 佐⼟哲也 (2024) 環境 DNA メタバーコーディング. 環境 DNA 学会 環境 DNA 技術
標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 3.0. 67-110 ⾴.
朱 涛，岩崎 渉（2024）環境 DNA メタバーコーディングデータ解析: MiFish パイプライン. 環
境 DNA 学会 環境 DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 3.0.
111-119 ⾴.
⽥辺晶史（2024）環境 DNA メタバーコーディングデータ解析: Claident. 環境 DNA 学会 環境
DNA 技術標準化委員会（編） 環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver 3.0. 120-122 ⾴.

123環境 DNA 調査・実験マニュアル Ver. 3.0（2024 年 8 ⽉ 9 ⽇発⾏）
© 2024 ⼀般社団法⼈環境 DNA 学会© 2024 The eDNA Society

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