タバココナジラミ
バイオタイプ Q 検出キット
Bemisia tabaci Q biotype Detection Kit

取扱説明書
version 8.0.0
製品コードNE0061

タバココナジラミバイオタイプ Q 検出キット
取扱説明書 version 8. 0. 0
【はじめにお読みください】
この度は、タバココナジラミバイオタイプ Q 検出キットをお買い上げ頂き、誠にありがとうございます。この取扱説明書をよくお読みの上、正しい方法でキットを使用してください。
使用上の注意1.

本キットは、LAMP 法を用いてタバココナジラミのバイオタイプ Q を検出することにより、バイオタイプが Q であるか Q 以外であるかを判定するための試薬です。医療行為及び臨床診断等の目的では使用できません。

2.

取扱説明書、検査用チューブ以外の試薬は–20˚C の冷凍庫内に遮光して保存し、納品後 6 ヶ月以内に使用してください。また、過度の冷却及び試薬の凍結、融解の繰り返しは避けてください。

3.

本キットを使用する際は、この取扱説明書の記載内容に従ってください。記載内容と異なる使用方法及び使用目的により発生するトラブルに関しましては、株式会社ニッポンジーンでは一切の責任を負いかねま
すので、あらかじめご了承ください。

4.

本キットによる判定結果を二次利用する場合は、必ず使用者の責任の下で行ってください。キット性能の異常によって発生するトラブルの場合を除き、株式会社ニッポンジーンでは一切の責任を負いかねますので、あらかじめご了承ください。

5.

検査環境の汚染を防ぐため、検査後サンプル及び WF 陽性コントロールの電気泳動法等による操作及びオートクレーブ高圧滅菌処理は行わないでください。

6.

本キットに含まれていない化合物を併用する場合は、使用する化合物の危険性に関して十分な知識が必要です。また、本キットに含まれている試薬に他の化合物を混合しないでください。本キットの安全な取扱については株式会社ニッポンジーンホームページにて製品安全データシート (MSDS) を公開していますので、ご参照ください。
株式会社ニッポンジーン; http://nippongene-analysis.com/

7.

本キットは食べ物ではありません。飲み込んだり、目に入れたりしないようご注意ください。検査中は皮膚等に試薬が触れないよう、白衣、手袋等で身体を保護してください。

8.

LAMP 法は栄研化学株式会社が特許を保有しています。株式会社ニッポンジーンは、LAMP 法を用いたタ
バココナジラミのバイオタイプ検出用キットの開発、製造、及び販売を許諾されています。

目次
ページ
1.

キット説明 ························································································· 1
タバココナジラミバイオタイプ Q 検出キットの概要
バイオタイプ Q の識別
LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) 法
本キットに含まれる合成オリゴヌクレオチドに関して

2.

キット内容 ························································································· 2
キット内容

3.

必要な器具、機器、及び試薬 ·································································· 34.

キット使用方法 ··················································································· 5
簡易プロトコル ············································································· 5
黄色粘着板採取法の補助プロトコル ··················································· 7
検査を行う前の準備及び注意··························································· 8DNA サンプル
器具、機器の準備
検査環境
タバココナジラミバイオタイプ Q 検出 ················································· 10
サンプルの作製
検査反応
判定

5.

トラブルシューティング ········································································ 15

6.

文献・資料 ······················································································· 16

7.

付録 ······························································································ 17
品質管理陽性コントロールのコピー数

本キットに含まれる全ての LAMP プライマーセット及びこの LAMP プライマーセットを用いた LAMP
法によるタバココナジラミバイオタイプ Q の検出技術は、愛知県農業総合試験場によって開発されました。

1. キット説明【タバココナジラミバイオタイプ Q 検出キットの概要】
本キットは、LAMP 法を利用してタバココナジラミのバイオタイプ Q を検出することにより、バイオタイプが Q であるか Q 以外であるかを判定するキットです。LAMP 法はインフルエンザウイルス感染の診断およびノロウイル
ス、レジオネラ属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌等の検査にも用いられている迅速、簡便な DNA 増幅技術であり、その優れた特異性と高い感度を最大の特長とします。本キットでは、LAMP 法によりタバココナジラ
ミ DNA の一部を増幅し、増幅の有無からタバココナジラミのバイオタイプを判定します。
検出に必要な操作は、タバココナジラミ１頭をキットに添付のWF磨砕液を用いて磨砕し、その溶液を検査溶液(WF検査液、WF酵素液、蛍光発色液の混合液) に添加した後、60˚Cに1時間保温するのみであり、きわめて簡便です。
検体のバイオタイプがQである場合、本キットに含まれているQ専用LAMPプライマーセットによってタバココナ
ジラミのバイオタイプQのゲノムDNAに特徴的な配列が増幅されます。一方で、検体のバイオタイプがQでない場
合、DNA増幅は起こりません。
判定にはDNA増幅の有無を蛍光発色液の発色の有無によって確認する目視判定法を採用しており、DNA増幅反応から検出までを同一反応チューブ内の完全閉鎖系で行うため、安全に短時間でタバココナジラミのバイ
オタイプQを検出することが可能です。
【バイオタイプQの識別】
世界中に広く分布しているタバココナジラミは、野菜・花き等の重要害虫であり、トマト黄化葉巻ウイルス(TYLCV) を始めとする植物病害ウイルスを媒介する昆虫であることが知られています。
タバココナジラミは複数のバイオタイプに分類され、国内では従来系統 (バイオタイプ JpL) の他に、バイオタ
イプ B (シルバーリーフコナジラミ) とバイオタイプ Q の発生が確認されています。
バイオタイプ Q は、バイオタイプ B に対して効果の高かったピリプロキシフェン剤、ネオニコチノイド系剤、合成
ピレスロイド系剤への感受性が低い薬剤抵抗性個体群であるため、バイオタイプ Q に対して有効な防除対策を講じる必要があります。
両バイオタイプは外部形態による識別が不可能であるため、PCR 法や LAMP 法による核酸増幅検査が行われています。
【LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) 法】
LAMP法は、一定温度でDNA増幅反応が進行する画期的な技術です。従来の方法と比較して特異性に優れ、またその高いDNA増幅反応効率から、短時間反応及び簡易検出が可能である等の利点を有しています。LAMP
法の詳細な原理については、栄研化学株式会社ホームページをご参照ください。
栄研化学株式会社
Eiken GENOME SITE; http://loopamp.eiken.co.jp/【本キットに含まれる合成オリゴヌクレオチドに関して】
本キットに含まれるプライマーは、全て「リライアブル＆トレーサブルオリゴ」を使用しています。「リライアブル＆トレーサブルオリゴ」は、株式会社ニッポンジーン マテリアルが製造する高信頼性オリゴヌクレオチド「リライアブルオリゴ」の一つです。ISO 13485:2003に準拠した品質マネジメントシステム、専用陽圧ルームでの製造、チェックリストによる工程管理、トレーサビリティー完備を特長としています。詳細に関しましては、株式会社ニッポンジーン マテリアル ホームページをご参照ください。
株式会社ニッポンジーン マテリアル; http://www.nippongenematerial.com/

12. キット内容【キット内容と保存温度】
タバココナジラミバイオタイプ Q 検出キット
12 テスト用 (製品コード： NE0061)
試薬名 (チューブラベル)
取扱説明書
検査用チューブ
WF Q 検査液
WF B/Q 検査液
WF 酵素液
蛍光発色液
WF 陽性コントロール
ミネラルオイルWF 磨砕液核酸フリー水頭部ラベル色
赤色
緑色
黄色
紫色
灰色
青色
橙色
水色

内容量
1部
24 本
87 µl
87 µl
10 µl
10 µl
12 µl
480 µl
1,200 µl
100 µl

保存温度
室温
室温-20˚C (遮光)-20˚C (遮光)-20˚C (遮光)-20˚C (遮光)-20˚C (遮光)-20˚C (遮光)-20˚C (遮光)-20˚C (遮光)取り扱い上の注意*

本キットでは、12 テスト分の検査溶液を作製することにより、12 テスト分の検査反応を行うことが可能です。12 テ
スト以下の検査反応を複数回行う場合、試薬が不足しますのでご注意ください。

*

検査用チューブに水滴が付着している場合は、開封前に完全に乾燥させてから使用してください。

*

取扱説明書、検査用チューブ以外の試薬は-20˚C で遮光して保存し、納品後 6 ヶ月以内に使用してください。

*

WF 磨砕液、核酸フリー水は室温で遮光して保存することも可能です。

*

試薬は使用ごとに融解し、残った試薬は再度-20˚C で保存してください。凍結、融解の繰り返しにより製品の性能が低下する恐れがありますので、必要な場合は試薬を数回分ごとに小分けして保存してください。

*

WF 酵素液を室温あるいは冷蔵庫等に長時間放置したり、過度の冷却により凍結させたりしないようご注意ください。酵素の働きが低下する可能性があります。

*

WF 陽性コントロールには、タバココナジラミ (バイオタイプ B 及び Q) のミトコンドリアゲノム DNA に特徴的な配列の一部が含まれています。検査環境への汚染を防ぐため、使用の際には溶液を飛散させたり、溶液に触れたフィルター付マイクロチップが他の器具や試薬に接触したりしないようご注意ください。

*

連続分注を行うと試薬への汚染が発生する可能性がありますので、フィルター付マイクロチップは 1 回分注するごとに使い捨てとして使用してください。

*

ミネラルオイルに関しては、労働安全衛生法第五十七条の二第一項「名称等を通知すべき有害物 (第五百五十一号)」に該当します。必ず MSDS を参照の上、使用してください。

2

3. 必要な器具、機器、及び試薬
 インキュベーター (恒温器)
ウォーターバス、ヒートブロック、サーマルサイ
クラー、エアーインキュベーター等、60˚C を保持する機器が必要です。

【必ずご準備いただく器具、機器】*

 マイクロピペット(0.5-10 µl、10-100 µl、200-1,000 µl)* フィルター付マイクロチップ (滅菌済) 木製の爪楊枝 氷 (クラッシュアイス)【その他の器具、機器、及び試薬】
 検査溶液調製用チューブ(1.5 ml あるいは 2.0 ml)*

下記の器具、機器、及び試薬は本キットの使用に必須ではありませんので、必要に応じてご準
備ください。
*

 チューブラック

 使い捨て手袋3 簡易遠心機 (1.5 ml チューブ用)

 アルミラックあるいはプレートラック*

 UV 照射装置
蛍光発色液 による検出の際に使用します。
240-260 nm あるいは 350-370 nm の範囲の波長を出力する装置が必要です。

 簡易遠心機 (0.2 ml チューブ用) ボルテックスミキサー

 ピンセット* フロート 防護用ゴーグルあるいはフェイスシールド
 1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液
 70%エタノール ペーパータオル
 黄色粘着板＊マイクロピペット、ピペットチップ、マイクロチューブなど、LAMP 法を用いた遺伝子検査を行うために必要な器具・消耗品類をまとめた遺伝子検査ツールボックス (製品コード： NE4111) も販売しております。

44. キット使用方法【簡易プロトコル】
本キットの詳細な使用方法は 8 ページ以降を参照してください。

簡易プロトコル
A. 直接採取法
A-1.

B. 黄色粘着板採取法

1.5 ml チューブにタバココナジラミを採取する

B-1.

1.5 ml チューブにWF 磨砕液 100 µl を入れる
WF 磨砕液タバココナジラミA-2. WF 磨砕液 100 µl を添加する

B-2.

爪楊枝で
タバココナジラミを採取する

WF 磨砕液黄色粘着板
タバココナジラミ

A-3.

爪楊枝を使ってWF 磨砕液中で磨り潰す

B-3. WF 磨砕液中で磨り潰す

チューブ壁面で磨り潰す

4.

チューブ壁面で磨り潰す

検査溶液を必要量まとめて作製する

Q 検査溶液B/Q 検査溶液

1 テスト
Q 検査溶液B/Q 検査溶液
WF 検査液7.2 µl7.2 µl
蛍光発色液
0.4 µl
0.4 µl
WF 酵素液0.4 µl
0.4 µl
検査溶液合計
8.0 µl8.0 µl* 分注時の液量の不足を防ぐため、数テスト分多めに作製する。
試薬

氷上

5

簡易プロトコル
5.

検査溶液を 1 テストあたり 8.0 µl ずつ分注する

6.

サンプル 2.0 µl を添加する
陰性コントロール検査溶液

磨砕サンプル

核酸フリー水2.0 µl7.

陽性コントロール検査溶液

磨砕サンプル
2.0 µl

WF 陽性コントロール
2.0 µl

ミネラルオイルを入れる
ミネラルオイル 20.0 µl

8.

60˚C、1 時間 (検査反応)

9.

80˚C、2 分間 (反応停止)

10. 判定
発色パターン

UV ランプ

I
陽性

II
陰性

陽性

陽性

Q

Q 以外

Q 検査溶液目視

B/Q 検査溶液
陰性：
淡い赤色

陽性：
鮮明な黄緑色バイオタイプ6

【黄色粘着板採取法の補助プロトコル】
B’. エタノール洗浄法
B’-1.

黄色粘着板上のサンプルにエタノール 15 µl を滴下する

B’-4.

ボルテックスミキサーにて
撹拌により洗浄する

B’-5.

スピンダウンし、エタノールを取り除いた後、風乾する

黄色粘着板

B’-6. WF 磨砕液 100 µl を添加する
タバココナジラミWF 磨砕液B’-2.

ピンセットでサンプルを
1.5 ml チューブに採取する

B’-7.

爪楊枝を使ってWF 磨砕液中で磨り潰す

B’-3. エタノール 50 µl を添加する
エタノール

チューブ壁面で磨り潰す

7

検査を行う前の準備及び注意【DNA サンプル】
コントロール本キットには、検査の成否を確認するための WF 陽性コントロールが添付されています。必要に応じて、WF 陽性コントロールを添加する「陽性コントロール検査溶液」及び核酸フリー水を添加する「陰性コントロール検査溶液」を作製してください。
【器具、機器の準備】

インキュベーター (恒温器)

インキュベーター (恒温器) の電源を入れ、温度を 60˚C に設定します。ウォーターバス、ヒートブロッ
クを使用する場合は温度が安定するまでに時間を要する場合がありますので、あらかじめ電源を入れ、温度計を用いて温度が 60˚C に到達していることを確認してください。エアーインキュベーターを用いる
場合、機器によってはドアの開閉時に庫内温度が大きく変化しますので、ドアの開閉は速やかに行ってください。


器具及び試薬器具及び試薬名

使用方法
各区域専用とし、他の区域で使用した場合は核酸除去操作を施してマイクロピペットから元の場所に戻してください。
各区域専用とし、他の区域で使用した場合は核酸除去操作を施してチューブラックから元の場所に戻してください。
市販のガンマ線滅菌済チューブ等、核酸フリー、ヌクレアーゼフリーのチューブ
グレードを選択してください。
市販のガンマ線滅菌済疎水性フィルター付チップ等、核酸フリー、ヌク
フィルター付マイクロチップ レアーゼフリーのグレードを選択してください。また、連続分注を行うと(滅菌済)
試薬への汚染が発生する可能性がありますので、1 回ごとに使い捨てとして使用してください。
筆記用具
各区域専用とし、持込書類を置く専用のスペースを確保してください。
使い捨てとし、汚染が疑われる場合はすぐに手袋を交換してくださ
手袋い。
白衣
各区域専用とし、袖口からの汚染に注意してください。

8【検査環境】
LAMP 法は高感度な DNA 増幅技術であるため、検査環境に WF 陽性コントロールや検査後サンプ
ル等、鋳型 DNA となる核酸の汚染が発生すると、以降正確な検査を行うことが困難になります。DNA
サンプルの取り扱いにおいては、作業用の着衣及び器具への付着に十分注意し、着衣の交換を徹底してください。以後の検査における誤判定を防止するため、使用済みのチップ、チューブ、検査後サン
プルは二重にしたビニール袋にまとめて廃棄してください。また、検査後サンプル及び WF 陽性コントロールの電気泳動法等による操作及びオートクレーブ高圧滅菌処理は行わないでください。


作業区域

核酸抽出及び核酸増幅を実施していない (核酸による汚染が存在しない) クリーンベンチあるいは作業台を試薬調製作業区域とし、検査溶液は試薬調製作業区域にて作製してください。試薬調製作業
区域では WF 陽性コントロール及び LAMP 法において鋳型 DNA となる核酸を含む溶液、試薬類の取り扱いは行わないでください。
検査溶液への DNA サンプル及び WF 陽性コントロールの添加を行うスペースは試薬調製作業区域と区分し、専用の核酸取扱区域を設けてください。


核酸除去操作

器具は常に清潔に保ってください。洗浄が可能である器具は大量の水道水でよく濯ぐことにより、付着した核酸を希釈、除去できます。
高濃度の核酸を取り扱った場合など、核酸による汚染が疑われるような場合には、1%次亜塩素酸ナ
トリウム水溶液を用いて検査環境中に存在する核酸の除去操作を行います。次亜塩素酸ナトリウム水
溶液は塩素ガスを発生するので、使用の際には換気に十分注意してください。また、金属に対する腐食性があるため、金属に対して使用する際は、迅速に塩素成分を拭き取る等の対応が必要です。高温環境下における劣化が著しいため、1%水溶液調製後の経過日数や保存温度に注意してください。
＜方法＞i) 使い捨て手袋を装着します。
ii) 有効塩素濃度 10,000 ppm (1%) の次亜塩素酸ナトリウム水溶液を準備します。
iii) 次亜塩素酸ナトリウム水溶液を含ませたペーパータオルで作業台、器具を丁寧に拭き、余分な塩
素成分は 70%エタノールを含ませたペーパータオルで拭き取ります。
iv) 非金属の器具は次亜塩素酸ナトリウム水溶液に 1 時間以上浸し、よく濯いで乾燥します。
v) 作業台、器具は常に清潔に保ち、定期的に次亜塩素酸ナトリウム水溶液による拭き取り清掃を行います。

9タバココナジラミバイオタイプ Q 検出
本キットには、2 種類の WF 検査液 (WF Q 検査液及び WF B/Q 検査液) が含まれています。
本キットを用いたタバココナジラミのバイオタイプ識別においては、タバココナジラミ 1 検体ごとに、それぞれの WF 検査液による検査を行ってください。

1. サンプルの作製
本キットは、タバココナジラミ DNA の簡易抽出を行うための WF 磨砕液及び簡易プロトコルを備えています。
重要本キットでは、＜1-A. 直接採取法＞を推奨していますが、直接の採取が困難な場合には、黄色
粘着板を用いた＜1-B. 黄色粘着板採取法＞により、サンプルを作製してください。黄色粘着板の粘着成分がタバココナジラミに多量に付着している場合には、7 ページの＜B’. エタノール洗浄法＞により、サンプルを作製してください。

＜1-A. 直接採取法＞
1.5 ml チューブに 1 頭のタバココナジラミを採取し、WF 磨砕液 100 µl を添加します。
爪楊枝を用いて、採取したタバココナジラミを WF 磨砕液中で磨り潰してください。磨り潰した後、チューブを数回軽く叩く (以下タッピング) あるいはボルテックスミキサーにて 1 秒間×3 回の撹拌をした後、簡易遠心機を用いて溶液をチューブの底に集め (以下スピンダウン)、その溶液を磨砕サンプルとします。
＜1-B. 黄色粘着板採取法＞
チューブラックに 1.5 ml チューブを準備し、WF 磨砕液 100 µl を分注します。
爪楊枝等で黄色粘着板上の 1 頭のタバココナジラミを採取し、爪楊枝ごと 1.5 ml チューブ内の WF 磨
砕液に入れ、タバココナジラミを磨り潰してください。タッピングあるいはボルテックスミキサーにて 1 秒
間×3 回の撹拌をした後、スピンダウンします。その溶液を磨砕サンプルとします。

10

2. 検査反応
2-1. 試薬の融解
WF Q 検査液、WF B/Q 検査液、ミネラルオイルを取り出し、室温で完全に融解します。WF 酵素液と蛍光発色液は-20˚C では凍結しないため、使用する直前にキットから取り出します。
2-2. 混合とスピンダウン
チューブを数回軽く叩く (以下タッピング) あるいはボルテックスミ
キサーにて 1 秒間×3 回の撹拌により混合し均一にした後、簡易遠心機を用いて溶液をチューブの底に集め (以下スピンダウン)、試薬を氷上に静置します。

2-3. 検査溶液の作製
2 本の検査溶液調製用チューブ (1.5 ml あるいは 2.0 ml) を用意し、下記の試薬を必要テスト数分ずつ分注し、タッピングあるいはボルテックスミキサーにて 1 秒間×3 回の撹拌により混合した後、スピンダウンを行います。WF Q 検査液を加えた方を Q 検査溶液、WF B/Q 検査液を加えた方を B/Q 検査溶液とし、氷上に静置しておきます。
＜容量 (各検査溶液にサンプル 2.0 µl を添加して 10.0 µl とする)＞

試薬
WF 検査液
蛍光発色液
WF 酵素液検査溶液合計

1 テスト分
Q 検査溶液B/Q 検査溶液
7.2 µl7.2 µl
0.4 µl
0.4 µl
0.4 µl
0.4 µl8.0 µl8.0 µl*分注時の液量の不足を防ぐため、数テスト分多めに作製する。

11

2-4. 検査溶液の分注
核酸の汚染がないピンセットを用いて検査用チューブを袋から取り出し、アルミブロックあるいはプレートラックに立て、磨砕サンプル 1
検体あたり 2 本の検査用チューブを用意し、Q 検査溶液、B/Q 検査
溶液をそれぞれのチューブに 8.0 µl ずつ分注します。

重要本キットに添付の検査用チューブと容量、形状、及び材質の異なるチューブを使用すると、誤判定の原因となる場合がありますので、使用しないでください。
2-5. DNA サンプルの添加
磨砕サンプル 2.0 µl を各検査溶液に添加します。全てのサンプルを添加した後、各チューブにミネラ
ルオイルを 20.0 µl 程度重層してから、キャップを閉じてください。コントロールを作製する場合、最初に、
陰性コントロール検査溶液のチューブに核酸フリー水 2.0 µl を添加し、ミネラルオイルを 20.0 µl 程度重層してから、キャップを閉じます。最後に、陽性コントロール検査溶液のチューブに WF 陽性コントロー
ル 2.0 µl を添加し、ミネラルオイルを 20.0 µl 程度重層してから、キャップを閉じます。
重要
蒸発による検査溶液の濃縮が起こると検査反応の効率が著しく低下しますので、本キットに添付のミネラルオイルを必ず重層してから、キャップを閉じてください。
2-6. 検査反応
全てのキャップを閉じた状態でタッピングあるいはボルテックスミ
キサーにて 1 秒間×3 回の撹拌にて混合した後、スピンダウンを行い、サーマルサイクラー、インキュベーター、あるいはウォーターバスとフロートを用いて 60˚C で 1 時間保温します。

ヒートブロックフロート

12

3. 判定3-1. 検査の成否の判定
UV 照射なし

陰性コントロール

陽性コントロール

UV 照射あり

陰性コントロール

1 時間経過後、80˚C で 2 分間の熱処理により検査反応を停止し、判定を行います。
使用前の蛍光発色液は淡い赤色を呈していますが、検査反応の進行により鮮明な黄緑色に変化します。この発色は蛍光に由来しているため、UV を照射することでより正確な判定が可能です。この場合は、別途 UV 照射装置 (240-260 nm あるいは 350-370 nm の波長を出力) 及び防護用ゴーグルあるいはフェイスシールドが必要になります。波長が 320 nm 付近の場合、陰性でも蛍光を発して見える場合がありますので、ご注意ください。

陽性コントロール重要
本キットでは、検査結果の判定は 1 時間が経過した時点で行います。誤判定の原因となりますので判定は検査反応終了後速やかに行ってください。

13

3-2. 検体の判定
判定は蛍光の発色の有無を確認してください。
【判定のポイント】
発色パターン

Ⅰ
陽性

Ⅱ
陰性

Ⅲ
陰性

Ⅳ
陽性

陽性

陽性

陰性

陰性

Q

Q 以外

下記を参照してください

Q 検査溶液B/Q 検査溶液

バイオタイプ＜発色パターンⅠ＞「Q 検査溶液陽性かつ B/Q 検査溶液陽性 = バイオタイプ Q」と判定します。
仮に Q 検査溶液で蛍光の発色が微弱であっても、陰性コントロール検査溶液と比較した際に差異が認められる場合には、他のタバココナジラミを採取して検査を行うか、専門の試験場等で詳細な検定を受けてください。
＜発色パターンⅡ＞「Q 検査溶液陰性かつ B/Q 検査溶液陽性 = Q 以外のバイオタイプ」と判定します。
この検体はバイオタイプ B に分類される可能性があります。
＜発色パターンⅢ＞「Q 検査溶液陰性かつ B/Q 検査溶液陰性 = バイオタイプ Q 及び B 以外」と判定します。
この場合は下記のいずれかに該当する可能性があります。
■ 従来系統のタバココナジラミ■ オンシツコナジラミ■ コナジラミ以外＜発色パターンⅣ＞
この発色パターンを示した場合、WF 陽性コントロールを添加する「陽性コントロール検査溶液」及び
核酸フリー水を添加する「陰性コントロール検査溶液」を作製し、再度検査を行ってください。

14

5. トラブルシューティング
本キットの使用において何らかの問題が発生した場合は、以下の項目に従って対処してください。その他の不明な点については株式会社ニッポンジーンまでお問い合わせください。
問題点
コントロール検査溶液が正確な発色を示さない

蛍光発色液が変色した検査溶液が蒸発した

蛍光の発色の有無を判
断しにくい

試薬が不足する

原因及び対処法
A. WF 陽性コントロールの添加量が適切でない。
WF 陽性コントロールの添加量が取扱説明書の指示と異なる場
合、検査反応の効率が低下する場合があります。WF 陽性コントロー
ルの添加量は取扱説明書の指示に従ってください。
B. 試薬あるいは検査環境に汚染が存在する。
陰性コントロール検査溶液が発色している場合、鋳型 DNA となる核酸の混入が疑われます。試薬及び検査環境の汚染モニタリング、1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液による検査器具、機器類の拭き取り操作を行い、汚染を完全に除去した後に検査を実施してください。
C. キレート化合物あるいは金属イオンが持ち込まれている。
EDTA (エチレンジアミン四酢酸) 等のキレート化合物が存在すると検査反応の進行に関わらず蛍光発色液が蛍光を発色します。一方、金属イオンが多量に存在する場合は蛍光発色液の発色が阻害され、判定が困難になりますのでご注意ください。
D. 反応温度、操作手順に誤りがある。
検査の工程で問題が発生していないか確認してください。
A. 検査反応終了後、速やかに判定を行ってください。
蛍光発色液は長時間放置すると検査反応の進行に関わらず蛍光の発色あるいは消光が起こり、誤判定の原因となります。保存及び取り扱いは本取扱説明書の指示に従ってください。
A. 反応チューブが均一に加熱されていない。
ウォーターバス、ヒートブロックを使用する場合に、検査用チューブが均一に加熱されないと蒸発による検査溶液の濃縮が起こり、検査反応の効率が低下します。本キットに添付のミネラルオイルを必ず添加してください。
A. 励起波長が合っていない。
240-260 nm あるいは 350-370 nm の波長を出力する UV 照射装置が必要です。波長が 320 nm 付近の場合、陰性でも蛍光を発する場
合がありますので、ご注意ください。
A. チューブ内壁に試薬が飛散、付着している。
使用前にスピンダウンを行ってください。
B. 保存中に試薬が蒸発している。
使用後はキャップを完全に閉じてください。

15

6. 文献・資料
1. 上田 重文 (2006) タバココナジラミバイオタイプ Q の簡易識別法 九州病害虫研究会報 52: 44-48
2. 上田 重文 (2007) タバココナジラミバイオタイプ Q の簡易識別法 植物防疫 61 (6): 309-314
3. 福田 至朗、吉田 桂子、神戸 三智雄 (2003) LAMP 法によるトマト黄化葉巻ウイルス検出技術の開発 ブレインテクノニュース 100: 28-31
4. 福 田 至 朗 、 穴 井 尚 子 、 加 藤 政 司 、 吉 村 幸 江 、 深 谷 雅 博 、 矢 部 和 則 、 大 矢 俊 夫 、
神戸 三智雄 (2005) 簡易な鋳型調製による loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 法を用いたトマト黄化葉巻ウイルスの検出 関西病虫害研究会報 (47): 37-41
5. 竹内 良彦、福田 至朗、大矢 俊夫 (2006) タバココナジラミのバイオタイプ Q を LAMP 法により迅速に識別できる 平成 18 年度 関東東海北陸農業研究成果情報
6. 福田 至朗、矢部 和則 (2007) LAMP 法によるトマト黄化葉巻ウイルス (TYLCV) 簡易検出法の開発とその応用 農業技術 62 (7): 307-311
7. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. (2000)
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8. Prince AM, Andrus L. (1992) PCR: how to kill unwanted DNA. Biotechniques. 12 (3):358

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7. 付録【品質管理】
キットに添付の WF 陽性コントロール 2.0 µl を検定用サンプルとして 10 µl (1 テスト分) のスケールでDNA 増幅反応を行い、60˚C、1 時間で蛍光発色液が発色することを確認しています。
キットに添付の核酸フリー水 2.0 µl を検定用サンプルとして 10 µl (1 テスト分) のスケールで DNA 増幅反応を行い、60˚C、1 時間で蛍光発色液が発色しないことを確認しています。
【陽性コントロールのコピー数】
WF 陽性コントロールには、2.0 µl あたり 1×109 コピーの標的配列が含まれています。

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【メモ】

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【メモ】

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【メモ】

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