複合超短パルスレーザ３次元微細加工技術の開発と高機能デバイス作製への応用
国立研究開発法人理化学研究所 光量子工学研究センター
チームリーダー 杉岡 幸次
国立研究開発法人理化学研究所 脳神経科学研究センター
研究員 河野 弘幸（平成 29 年度 重点研究開発助成 A グループ研究 AF-2017201）
キーワード：フェムト秒レーザー，３次元加工，バイオチップ

１．研究の目的と背景短があり、一つの加工法であらゆる３次元構造や機能を構近年、３次元造形技術（3D プリンティング）が注目を集築できる訳ではない。そこで本研究では、それぞれの加工め、レーザはその主要な加工ツールとなっている。３次元法の弱点を補いつつ特長を融合することにより、より複雑造形技術は Additive Manufacturing とも呼ばれ、付加加かつ高機能な構造を実現する複合超短パルスレーザ３次工技術に分類される。３次元造形技術により、これまで作元加工技術の開発を行った。開発した複合超短パルスレー製が困難であった複雑な３次元構造体の構築が可能とな

ザ３次元加工技術により微小擬似生体バイオチップを作った。一方超短パルスレーザは、ピーク強度がきわめて高製することを提案し、がん細胞の侵襲・転移のメカニズムいため、非線形多光子吸収により透明材料に対しても強い解明等、生体内で起こる現象の観察・解明へ応用した。

吸収を生じさせることができる。これにより超短パルス秒
レーザ光を適当なエネルギーで透明材料内部に集光する

２．実験方法と、集光点でのみ効率的に多光子吸収を誘起でき、透明材

図１に、複合超短パルスレーザ３次元微細加工技術の手料内部の改質•加工を行なうことができる。この特長を利順を示す。まず超短パルスレーザガラス内部３次元加工技

用することにより超短パルスレーザは、付加加工術（図１(a)-(c)）により、３次元マイクロ流体構造を作(Additive Manufacturing, 3D プリンティング)だけでな製する 1)。具体的には、透明なガラスに対して超短パルス

く、除去加工(Subtractive Manufacturing)、無変形加工レーザ３次元直描を行なう（図１(a)）。ここでレーザ光を(Undeformative Manufacturing)の３つの異なる形態の３適当な強度でガラス内部に集光すると、集光点でのみ多光次元加工を実行することができる。それぞれの加工法の代子吸収を誘起でき、図１(b)に示すように材料内部の３次表例は、除去加工技術がガラス内部への３次元流体構造形元改質を行うことができる。レーザ改質領域はレーザ未照成 1), 2)、無変形加工がガラス内部の屈折率制御による３射領域と比較してフッ酸水溶液に対し 50 倍程度大きいエ3)次元光導波路描画 、付加加工が紫外線硬化樹脂を用いたッチング速度を有する。その結果、フッ酸エッチングによ多光子造形 4)であり、世界の多くの研究者が現在も活発にりレーザ光照射領域を選択的に除去することができ、図１研究開発を行っている。一方それぞれの加工法には一長一(c)に示す３次元マイクロ流体構造をガラス内部に形成す

図１

複合超短パルスレーザ３次元微細加工技術の手順ることができる。作製したマイクロ流体構造にネガ型フォの結合部の手前に、図１(e)-(g)に示した多光子造形を用トレジストを充填し（図１(d)）
、同じ超短パルスレーザをいた超短パルスレーザボトルシップ型集積技術により、パ用いて流体構造内部で多光子造形を行う（図１(e)）。それンパイプ型のポリマーナノチャネルアレイを配置した。前により図１(f)に示すように、３次元ガラス流体構造内部

述にように、通常のボトルシップ集積加工の加工解像度はに３次元ポリマーマイクロ•ナノ構造を内包した高機能バ500 nm 程度であり、ガラスマイクロ流体構造内部に、さイオチップを作製することができる。本技術は、ガラス流らに細いチャネル構造をポリマーで形成しようとした場体構造内部に後から３次元ポリマー構造体を集積化する

合、そのチャネル幅は最小で 2μm が限界である。ここで5)

ため、ボトルシップ集積加工技術とも呼ばれる 。

は SLM によりレーザ光の波面の制御を行うことにより、加多光子造形の一般的な加工解像度（最小 voxel 寸法）は工解像度を約 100 nm に改善した。その結果、ガラス流体100nm 程度である。一方ボトルシップ集積加工技術では、チャネル中に集積化されたポリマーナノチャネルアレイ

レーザ光は空気/ガラス/レジストの３つの異なる屈折率のチャネル幅として 900 nm を実現した 6)。

媒体中を伝搬するため、各界面で球面収差が生じ、解像度が低下する。実際、ボトルシップ集積の加工解像度は 500

3・2タンパク質の多光子造形とボトルシップ集積nm 程度であり、ガラスマイクロ流体構造内部に、さらに多光子造形では、前駆体としてネガ型フォトレジストが細いチャネル構造をポリマーで形成しようとした場合、そ主として用いられ、付加加工によりポリマーの３次元マイのチャネル幅は最小で 2μm が限界である。そこで本研究

クロ・ナノ構造体が構築される。我々は、本手法をタンパ

では、ガラス流体構造内部で行う多光子造形の加工解像度ク質の３次元造形に拡張することを試みた。前駆体としてを改善するため、空間位相変調器(SLM)を用いてレーザ光ネガ型フォトレジストの代わりに、タンパク質分子（ウシの波面の制御を行った。

血清アルブミン:Bovine serum albumin (BSA)）に、光重

一方、微小擬似生体バイオチップの高機能化を図るため、

合 開 始 剤 （ Sodium 4-[2-(4-Morpholino) benzoyl-2-タンパク質の３次元多光子造形技術を開発し、さらにタンdimethyl-amino] butylbenzenesulfonate: MBS)を混合しパク質３次元微細構造のボトルシップ集積加工を試みた。

た溶液を用いた。図３に、ガラス基板上に造形した BSA のタンパク質の３次元造形では、タンパク質分子と光重合開３次元マイクロ構造を示す。本手法のメカニズムは以下の始剤を混合した前駆体質溶液中で超短パルスレーザ３次ように考察される。(1) 前駆体溶液中の光重合開始剤分子

元直描を行う。前駆体溶液を充填したガラス流体構造内部が超短パルスレーザ多光子吸収により励起される。(2) 励に超短パルスレーザ光を集光し、ガラスチップを保持した起された光重合開始剤分子がタンパク質分子をさらに励x-y-z ステージを PC 制御により３次元走査することで、起する。(3) 励起されたタンパク質分子同士が重合し、固タンパク質のボトルシップ集積加工を行った。

体のタンパク質３次元構造が形成される。さらに本手法とボトルシップ集積加工技術を組み合わせることにより、タ３．研究成果
3・1

ンパク質本来の性質を利用して、より生体に近い環境をガ複合超短パルスレーザ３次元微細加工による微小ラスマイクロ流体素子中に創成することを試みた。実験では、ガラスマイクロ流体素子に、タンパク質と光重合開始

擬似生体バイオチップの作製
図２に示すように、まず T 字型のガラスマイクロ流体構剤を混合した前駆体溶液を充填し、フェムト秒レーザーの造を図１(a)-(c)に示した超短パルスレーザ３次元ガラス３次元直描を行った。その結果、図４に示すように、ガラ加工技術により作製した。続いて直交する２つのチャネル

In channel

Channel width: 900 nm~ 2 m
図２

複合超短パルスレーザ３次元微細加工により作製した微小擬似生体バイオチップ

図３

多光子造形法によりガラス基板上に作製された
BSA の３次元マイクロ構造

図４

ボトルシップ集積加工技術により、ガラスマイクロ流体構造の天井面に形成されたウッドパイル構造のタンパク質（BSA）
スマイクロ流体素子中に集積化されたウッドパイル構造
7）のタンパク質（BSA）を集積化することに成功した 。

るが、がん細胞の転移を抑制することができれば、がんによる死亡率を劇的に低減することが可能である。図５に示さらに副次的な成果として、前駆体中のタンパク質濃度

すように、がん細胞の転移はまずがん細胞が基底膜や体内を上げ、かつレーザー光の照射強度を高くすることで、光組織を通り抜け、その後リンパ流や血流に沿って他の部位重合開始剤を使用しない純粋なタンパク質の３次元造形に移動することによって生じる。がんの転移の初期過程に8)技術を開発した 。光重合開始剤を混合した溶液を前駆体

おいては、がん細胞の大きさが数μm〜数十μm であるたとして用いると、光重合開始剤分子が造形した構造体中にめ、図５に示すように、基底膜や体内組織を通り抜けるた混入するという問題点を、ラマン分光法により明らかにしめに、その形状を大きく変形させる必要がある。実際、がた。光重合開始剤は毒性を持つものもあり、そのような汚ん細胞が自身の大きさより狭い領域を通り抜けることが染の混入は、生体内で起こる現象観察・解明を行う微小擬できることは知られている 9)。一方、その際がん細胞がど似生体バイオチップには望ましくない。純粋なタンパク質のように形状を変化させ、かつその時がん細胞内部の核やを３次元造形できることにより、より生体の機能を模した小器官がどのようになっているかはほとんど分かっていバイオチップが実現できることが期待される。
3・3

微小擬似生体バイオチップによるがん細胞マイグ(a)

レーションの観察
病気の早期診断、発症メカニズムの解明、生体内で起こる様々な現象の観察や理解は、人類の健康・長寿の社会を実現する上で重要であり、今日、生物・医学者が精力的に研究を行っている。日本人の死亡原因の第１位はがんであ

(b)

図６
図５

がん細胞の転移の様子

ナノチャネル中を移動するがん細胞の光学顕微鏡による観察

(b)

(a)

図７

ナノチャネル中を移動するがん細胞の共焦点蛍光顕微鏡による観察、(a) 細胞核のみを赤色蛍光タンパク質で染色したがん細胞、(b) 核に加えて、細胞体を緑色蛍光タンパク質で染色したがん細胞ない。がん細胞の転移を抑制するためには、まずがん細胞の寸法（〜数十μm）より１桁以上狭いサブナノメータ幅転移のメカニズムを知る必要があり、その一つとしてがんの領域を通り抜けることが可能である。(2) ナノチャネル細胞が自身の大きさより狭い領域をどのようにして通りを通過したのちも 100%のがん細胞は生存しており、活性抜けるのかを調べる必要がある。そこで、複合超短パルスを保っている。(3) 細胞核はナノチャネルを移動中その形

秒レーザ３次元加工技術を用いて作製した微小擬似生体状を大きく変形させ、50μm 程度伸長するが、変形によるチップを用い、がん細胞が自身の寸法より狭い領域を通り損傷は生じていない。(4) ナノチャネルを通り抜けた後も抜ける際の振る舞いを調べた。

分裂というがん細胞の機能を維持おり、かつ分裂の生じる微小擬似生体チップとしては、図２に示した T 字型のガ確率は移動前と変わらない。

ラスマイクロ流体構造に、パンパイプ型のポリマーナノチャネルアレイを集積化したものを用いた。ポリマーナノチ

４．結論

ャネルの幅は 900 nm であり、観察に用いたがん細胞（ヒ超短パルスレーザを用いると、その超高強度性により透ト由来前立腺癌：PC3）の平均寸法数十μm と比較すると明材料に多光子吸収を誘起でき、付加加工、除去加工、無はるかに狭い。図６に、ポリマーナノチャネル中をがん細変形加工の異なる形態の３次元加工を実行することがで胞が移動する様子を、光学顕微鏡で観察した結果を示す 6)。

きる。本研究では、超短パルスレーザ３次元加工の高度化

がん細胞は図面下方より、左から３番目のナノチャネルを図ることを目的とし、異なる形態の３次元加工技術を組（チャネル長 11μm）に侵入し、反対側（図面上方）に通み合わせた複合超短パルスレーザ３次元加工技術の開発り抜けようとしている（図６(a)）。25 分後、がん細胞が完を行った。開発した技術により、ガラス３次元流体構造内全にナノチャネルを通り抜けた後、分裂を生じる（図６部に３次元ポリマーナノ構造体を集積化させ、微小擬似生(b)）。細胞の分裂は、がん細胞にとっては一般的な現象で体バイオチップの作製を行った。作製したバイオチップは、ある。

がん細胞の転移メカニズムの解明のための研究に応用し、さらにがん細胞の核や細胞体を蛍光タンパク質で染色いくつかの新しい知見を得た。さらに、本研究ではタンパし、ナノチャネルを通り抜ける際の変形の様子を共焦点蛍ク質の３次元光造形技術の開発も行った。ガラス３次元流10)。図７(a)に、細胞核のみ体構造内部に集積化する３次元ナノ構造体を、ポリマーかを赤色蛍光タンパク質で染色したがん細胞が、ナノチャネらタンパク質に置き換えることにより、より生体の機能をル中を移動している様子を観察した結果を示す。核がナノ模したバイオチップが実現され、がん細胞の転移メカニズ

チャネル内でその形状を大きく変形させ、50μm 程度伸長

ムの解明のみならず、多様な医学・生理学研究に応用されして移動していることを確認した。核に加えて、細胞体をることが期待される。

光顕微鏡により観察を行った

緑色蛍光タンパク質で染色し、その移動の様子を観察した
結果を図７(b)に示す。細胞体は、核よりさらに伸長し、核も細胞体内部で変形していることを確認した。

謝辞

本研究は、公益財団法人天田財団平成 29 年度重点研究

複数のがん細胞のナノチャネル中での振る舞いを観察

開発助成 A グループ研究（AF-2017201）を受けて遂行されすることにより、以下の知見を得た。(1) がん細胞は自身たものであり、ここに深く感謝の意を表する。また本研究

テーマの共同研究者である CETAL, National Institutefor Lasers, Plasma and Radiation Physics, Romania のFeliX Sima 博士に心から感謝する。

5) D. Wu, J. Xu, L. Niu, S. Wu, K. Midorikawa, andK. Sugioka, Light Sci. Appl. 4 (2015), e228.
6) F. Sima, H. Kawano, A. Miyawaki, L. Kelemen, P.
Ormos, D. Wu, J. Xu, K. Midorikawa, and K. Sugioka,

参考文献
1) K. Sugioka, Y. Hanada, and K. Midorikawa, Laser
Photon. Rev. 3 (2010), 386.
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4) S. Kawata, H. B. Sun, T. Tanaka, and K. Takada,Nature 412 (2001), 697.

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7) D. Serien, H. Kawano, A. Miyawaki, K. Midorikawa,and K. Sugioka, Appl. Sci. 8 (2018), 147.
8) D. Serien and K. Sugioka, ACS Biomater. Sci. Eng.
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9) C. M. Denais, R. M. Gilbert, P. Isermann, A. L.
McGregor, M. te Lindert, B. Weigelin, P. M.
Davidson, P. Friedl, K. Wolf, and J. Lammerding,Science, 352 (2016), 353.
10) F. Sima, H. Kawano, M. Hirano, A. Miyawaki, K.
Obata, D. Serien, and K. Sugioka, submitted.