2015/1/29

バイオスーパーコンピューティング名古屋２０１５
平成２７年１月２２日 名古屋

光応答性タンパク質の実験研究者が計算科学に期待すること
神取 秀樹（名古屋工業大学 大学院工学研究科 未来材料創成工学専攻＆ オプトバイオテクノロジー研究センター）1

2015/1/29

発表内容
はじめに：計算科学への期待
１） 色を見分けるしくみ２） 光駆動プロトンポンプのしくみ
３） 様々なイオン輸送性ロドプシン
まとめ：計算科学への期待

はじめに：計算科学への期待
私たちは、ロドプシンなど光応答性タンパク質が１）
色を見分けるしくみ
光を吸収するとなぜ機能を発現できるのか
２） 濃度勾配に逆らって運ぶしくみという問題に対して、分光学を中心とした実験研究により挑み続けている。
３） DNA光回復酵素のしくみから進化へ
計算科学には大きな期待がある一方、「ロドプシンについて理論家の言うことはまとめ：計算科学への期待信用しなくていいから」といつも学生に言っていることも事実である。
計算科学の大いなる発展の中、このような実験研究者の立場から話題提供したい。

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視覚の化学

神取秀樹

Chemistry & Industry (London) 1995

我々の視覚には明暗視と色覚がある

明暗視には１種類の光センサー（ロドプシン＝視紅）がはたらく

色覚には３種類の光センサーがはたらく

視覚の化学

神取秀樹

Chemistry & Industry (London) 1995

我々の視覚には明暗視と色覚がある

明暗視には１種類の光センサー（ロドプシン＝視紅）がはたらく

色覚には３種類の光センサーがはたらく32015/1/29

視覚の不思議：植物は別々の発色団により青色と赤色を感知する

クリプトクロム--？

NN
H

フォトトロピン

NN

O

N +H

HN
O

フィトクロモビリン

NH

ＦＡＤＨ
CysO

OOC
OOC

NH

フィトクロムO

発光ダイオードも別々の材料により異なった色を出す

窒化ガリウム(GaN) - 青
アルミニウムインジウムガリウムリン(AlGaInP) - 黄
ガリウムヒ素リン(GaAsP) - 赤

4

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視覚の不思議：我々は単一の発色団により色を認識できる+

NH

Lys

レチナールを囲む蛋白質部分が色を決める+NH

Lys「ロドプシンについて理論家の言うことは信用しなくていいから」と私が学生に言う理由
明暗視のロドプシンは 2000年に結晶構造が解明されたが色覚視物質の構造は皆無

ロドプシンの結晶構造からホモロジーモデリング＋電子状態計算で赤、緑や青視物質の吸収を再現したという計算科学の論文はたくさんある（＝答えのわかっている問題を正しく解いた） 。

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発表内容
はじめに：計算科学への期待
１） 色を見分けるしくみ２） 光駆動プロトンポンプのしくみ
３） 様々なイオン輸送性ロドプシン
まとめ：計算科学への期待

色覚視物質研究における３つの困難さ
ウシの目玉 100 個から 100 mg のロドプシンが得られる一方、ウシは色覚視物質を発現しない。
培養細胞を用いた発現も行われているが、培養皿 100 枚から 0.1 mg の赤視物質、0.01 mg の青視物質しか得られない。
（１）試料調製の困難さ、（２）退色の問題、（３）構造解析手法の問題

明暗視のロドプシンは原子レベルでの解析が進んでいる

色覚視物質の構造研究はほとんど進んでいない62015/1/29

視物質研究の問題点：光退色
ロドプシンの実験には赤ランプを使う

視物質研究の問題点：光退色
ロドプシンの実験には赤ランプを使う

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赤感受性タンパク質の実験には赤ランプは使えない

赤感受性タンパク質の実験には赤ランプは使えない

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限られた試料に対する構造解析：エレガントな低温赤外分光計測片山耕大君

543 nm (Red)
501 nm (Green)

色覚視物質>660 nm (Red)>610 nm (Green)

初期中間体

77 K でのフォトクロミックな性質を使って退色の問題を克服、データを積算

片山君、色覚視物質の構造解析は世界中で誰も成し遂げていないから、うまくいったら世界中のどこでも連れて行ってあげるよ92015/1/29

片山君、色覚視物質の構造解析は世界中で誰も成し遂げていないから、うまくいったら世界中のどこでも連れて行ってあげるよ

霊長類赤・緑視物質の最初の構造解析：低温赤外分光(Katayama, Furutani, Imai and Kandori, Angew. Chem. Int. Ed. 2010、30紙を超える新聞報道、NHKニュース)

Monkey Green
Monkey Red

Light = Intermediate state

Monkey Green
Monkey Rhodopsin

Dark = Unphotolyzed state

赤と緑の間で驚くほどの構造の類似（共通祖先に由来する進化に対応）と赤だけに見られる疎水環境での水素結合構造、緑だけに見られるαヘリックス構造（色の識別を実現する進化に対応した特異性）

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霊長類赤・緑視物質に結合した水分子の水素結合構造(Katayama, Furutani, Imai and Kandori, Biochemistry 2012、新聞報道)

RedGreenRh内部結合水の振動にも赤と緑で違いが見られた。
一致度が 98 % を超える２つの蛋白質の波長制御に水分子が関わることが示唆された。

霊長類赤・緑視物質の波長制御に関わるシッフ塩基と対イオンの相互作用(Katayama, Okitsu, Imai, Wada and Kandori, submitted)

波長制御には
未 発 表（Ⅰ） レチナールのねじれ（Ⅱ） シッフ塩基と対イオンの相互作用（Ⅲ） 疎水部分の極性が関わると考えられている。

デー

タ

高精度赤外分光解析によりレチナールシッフ塩基の水素結合強度は赤と緑で同一であることを明らかにした。
赤と緑の識別は、疎水部分の極性だけによる11

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赤外分光法を用いた霊長類色覚視物質の構造解析

片山耕大 （Ｈ２５年度学位取得、日本学術振興会育志賞）「力業」とエレガントな計測の組合せにより、今もって世界で唯一の構造解析が実現
青のデータが取れた！
片山、野中（Ｍ１）

未発表

データ発表内容
はじめに：計算科学への期待
１） 色を見分けるしくみ２） 光駆動プロトンポンプのしくみ
３） 様々なイオン輸送性ロドプシン
まとめ：計算科学への期待

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H+
H+

H+

H+

COO -H

H

H+BR
K
L

CN H +COO COO -H

H

H+
H+H+

H+H+H+H+H+

H+

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H+
H+H+

M1

H+

COO -H

H

CN
H

COO -H
COO -HH

H+
H+

H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+

M2

H+

COO -H

H

CN
H

COO -H
COO -

H+
H+

H+H+H+H+

H+

H+

H+
H+H+

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H+
H+

H+

N

H+

COO -

H+

CN H +H

COO -HCOO -H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+

O
COO -H

H

H+

CN H +H

COO -HCOO -H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+

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H+H+

BR
COO -H

H

H+

CN H +COO COO -H

H

H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+

バクテリオロドプシンのプロトン伝導になぜ方向性があるのか？

16

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バクテリオロドプシンは非対称の水素結合ネットワークをもつポンプスイッチとしてのレチナールシッフ塩基部位

Kandori, BBA (2000) Review.
神取秀樹「ロドプシンの分子科学」
Mol. Sci. (2011).

レチナールシッフ塩基より細胞外側は水分子を含んだ水素結合ネットワークが存在する一方、細胞質側にはプロトン経路は存在せず、光反応サイクルで過渡的にプロトンの経路が形成される。
レチナールシッフ塩基部位はスイッチとして両側を隔て、ポンプの逆流を防ぐ。

疎水部にプロトン経路を形成するためのへリックスの動きをどう捉えるか？
バクテリオロドプシン

後期中間体

細胞質側に過渡的にプロトンの経路を形成するため、ヘッリクスが開くような構造変化がさまざまな実験により示唆されてきたが、実時間＆実空間でこれを観測するのはきわめて困難だった。

Visualization of structuralchanges of D96N BR in realtime and real-space柴田幹大博士Shibata, Yamashita, Uchihashi,Kandori and Ando,Nature Nanotech. (2010)

0.7 nm の分子運動を実時間＆実空間で直接、観察17

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プロトン輸送における水分子の重要性
バクテリオロドプシン

後期中間体

55 M の蛋白質に結合した１個の水の濃度： 55 M

水溶液中における水の濃度： 55 M
疎水的なタンパク質内部におけるプロトン輸送を実現するため内部結合水が重要なはたらきをしていると考えられてきた。
X線結晶構造解析により水分子の存在が明らかになったが、水の機能との相関は容易ではない。
赤外分光法は水分子を捉えるのに優れた手法である。ただし、55 mM の蛋白質に結合した1個の水を捉えようとすると、百万個の中から1個の水の信号を抽出しなければならない。

試料中の水を自在に制御することで、蛋白質に結合した水分子の計測を実現！

182015/1/29

水分子の水素結合強度とプロトンポンプ活性との間に見出された相関系統的な赤外分光解析により、「プロトンポンプ活性のあるロドプシンには必ず強い水素結合を形成した水分子が存在する」ことがわかった。
プロトンポンプが水分子を含む水素結合ネットワークを構造安定化に用いるとともに、光励起により不安定化した水素結合エネルギーをポンプに利用していることが示唆された。
最も低い振動数の（＝最も水素結合の強い）
水分子

2600

2400

重水中、77 K でのバクテリオロドプシンの信号

2200

2000Wavenumber (cm-1)
Kandori et al. (2000), Kandori et al. (2001), Furutani et al. (2003), Furutani et al. (2004), Shibata et al. (2004), Hayashi et al. (2004),
Furutani et al. (2005), Shibata et al. (2005), Sumii et al. (2005), Furutani et al. (2006), Kawanabe et al. (2006), Muneda et al. (2006),
Ota et al. (2006), Mizuide et al. (2007), Ikeda et al. (2007), Shibata et al. (2007), Shibata et al. (2008), Suzuki et al. (2008),
Hashimoto et al. (2010); Katayama et al. (2012), Ito et al. (2012), Muroda et al. (2012).

192015/1/29水分子の水素結合が微生物型ロドプシンのプロトンポンプ機能を決定する
水分子を含む水素結合ネットワーク活性中心での構造安定化
光励起後の不安定化によるエネルギーの取込と構造変化

系統的な赤外分光解析により「プロトンポンプ活性のあるロドプシンには必ず強い水素結合を形成した水分子が存在する」ことがわかった。プロトンポンプが水を含む水素結合ネットワークを構造安定化に用いるとともに、光励起により不安定化した水素結合エネルギーをポンプに利用していることが示唆された。

発表内容
はじめに：計算科学への期待
１） 色を見分けるしくみ２） 光駆動プロトンポンプのしくみ
３） 様々なイオン輸送性ロドプシン
まとめ：計算科学への期待

202015/1/29

活性中心でのイオン輸送メカニズム(Ernst, Lodowski, Elstner, Hegemann, Brown & Kandori, Chem. Rev. 2014)

H+ pumpCl- pump

水分子のカルボン酸への水和構造変化がプロトンの移動をもたらす

水分子のクロライドへの水和構造変化がクロライドの移動をもたらす

Tanimoto et al.
Biochemistry (2003).

Shibata et al.
Biochemistry (2005).

21

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バクテリオロドプシンは１アミノ酸の置換でクロライドポンプになる
Sasaki et al. Science (1995).

アミノ酸の一致度 25 ％の２つの光駆動ポンプにおいてバクテリオロドプシンの D85  T の置換で機能転換が実現した。
輸送機構は共通であり、活性中心がイオン選択性を決定することが示唆された。

ハロロドプシンの T  D の置換では？

ハロロドプシンは１０個換えてもプロトンポンプにはならない【非対称な機能転換：２０年近く未解明の謎】
なぜプロトンポンプとクロライドポンプの機能転換が非対称になるのか？

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Sasaki et al. Science (1995)
Muroda et al. Biochemistry (2012)【非対称な機能転換】
赤外分光解析の結果、ハロロドプシンの多重変異体はシッフ塩基の強い水素結合をもたらした一方、水の水素結合は弱いままであることがわかった。
非対称な機能転換の要因は、プロトンポンプ機能を決める強い水素結合を形成した水分子の有無に由来すると結論した。

ナトリウムのポンプは？

これまでによくあった質疑応答

高校生 「光でナトリウムをポンプするロドプシンはないのですか？」
神取 「たいへんよい質問ですが、光スイッチとしてはたらくレチナールシッフ塩基はプロトン化しているので陽イオンなんですよ。だからプロトン自身や陰イオンの結合と輸送はできても、ナトリウムポンプは有り得ないですね。」

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Inoue et al. Nature Commun. (2013).

海洋性細菌に含まれる KR2 は光駆動ナトリウムポンプである。
リチウムイオンもポンプできる。
カリウムより大きな陽イオンがあるとプロトンポンプになる。

KR2 はハイブリッド型ポンプ

100 mM

光駆動ナトリウムポンプのメカニズム
Inoue et al. Nature Commun. (2013).

☆ 細胞外側領域のアミノ酸変異によりナトリウムが結合しなくなったことから結合部位は細胞外側領域にある☆ ナトリウムポンプにはシッフ塩基から対イオンである D116 へのプロトン移動が必須☆ ナトリウムを結合しない変異体でもナトリウムポンプが観察された【ポンプの概念に反する実験事実】
細胞外側領域の結合部位はポンプに必要ではない☆ ナトリウムの結合部位が過渡的に細胞質側にできる24

2015/1/29

なぜナトリウムポンプが発見できたのか？ ロドプシンの機能を決める部位
プロトンポンプナトリウムポンプ

H+Na+

プロトン供与体 D/E

プロトン受容体クロライドポンプ

QA

QT

DS

TDNTN

Cl-

プロトンポンプに必須の２つのカルボン酸（プロトン供与体と受容体）が中性化される一方、その間にアスパラギン酸が導入された興味深い配列
ただしナトリウムポンプとは予想できず…

ナトリウムポンプの反応
サイクルモデルO

NaR
CP closed
D116

-X+

EC openCP closed
D116

-

未

CP closed

Unified model for
発 表 モ デNa+ and H+ pump

D116

ル-X+
EC closed?

EC openX+K

CP open
D116-

Na+ or H+

EC closed?

L⇆M

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脳機能解明のための新技術：オプトジェネティクス（光遺伝学）
光観察から光操作へ

イオン輸送性ロドプシンは必須のツール

Deisseroth Lab(Stanford Univ.)

262015/1/29

１０年で脳の全容解明を…オバマ政権が取り組み【ボストン（米マサチューセッツ州）＝中島達雄】 米紙ニューヨーク・タイムズ
は１８日、オバマ政権が人間の脳機能の全容解明を目指し、今後１０年かけて政府と民間による新たな共同研究に取り組むことを計画中だと報じた。
脳神経ごとの役割を解明し、「脳の活動地図」を作るというプロジェクトで、アルツハイマー病やパーキンソン病の原因究明、うつ病など精神疾患の治療法の開発、人工知能（ＡＩ）の発展につながることが期待されるという。
人間の全遺伝情報（ヒトゲノム）解読プロジェクトに次ぐ、大規模研究になるとみられる。
オバマ米大統領は１２日の一般教書演説で、ヒトゲノム研究の経済効果について、「１ドルごとの投資に１４０ドルのリターンがあった」と紹介。その上で「現在は脳活動地図の作成が重要。１９６０年代の宇宙開発競争に匹敵する、高度な研究開発のために投資すべきだ」と訴えていた。
（記事提供：読売新聞、平成２５年２月）

新規に開発するロドプシンが脳機能を解明
オプトジェネティクスに不可欠なツールの開発
精神・神経疾患のメカニズム解明
イオン濃度の制御による「うつ病などの新規治療」に貢献

27

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さらに予想もしなかった発展性の期待◎◎◎◎

我々が発見したナトリウムイオンポンプは、リチウムイオンもポンプできるが、カリウムより大きなイオンはポンプできない。
遺伝子工学技術を使って、より大きなセシウムイオンを運ぶことができれば、膜反転の技術は確立しているので…

×

137Cs+ 30年, 90Sr2+ 29年

半減期Na+

Na+

分子デザイン

福島原発
Cs+

Cs+

137

137

137

Cs+

Cs+

Cs+
Cs+

137

Cs+
Cs+

137
137

137

Cs+

まとめ

計算科学への期待理論と実験との連携の重要性

28

2015/1/29

謝辞
霊長類色覚視物質の赤外分光解析
片山耕大、野中祐貴（名工大）古谷祐詞（分子研）
今井啓雄、筒井 圭（京大霊長研）
和田昭盛、沖津貴志（神戸薬大）
バクテリオロドプシンの高速AFM
安藤敏夫、内橋貴之、柴田幹大、山下隼人（金沢大）プロトンポンプとクロライドポンプの機能転換
室田浩助、柴田幹大、中島啓介（名工大）出村 誠（北大）、前田章夫、佐々木 純、千 永信（京大）
R. Needleman (Wayne State Univ., USA)
L. S. Brown, J. K. Lanyi (UC Irvine, USA)
光駆動ナトリウムポンプ
井上圭一、吉住 玲、加藤善隆、伊藤洋康、大野 光（名工大）木暮一啓、吉澤 晋（東大）

教授
神取秀樹
特任教授
岩城雅代
特任准教授 角田 聡
助教
岩田達也
助教
井上圭一
学振RPD
吉住 玲

ポスドク
ポスドク
技術補佐
事務補佐
事務補佐
事務補佐

今野雅恵
F. Koua
田中瑞奈
角本喜美子
小出夕子
田平未舟

博士後期３年 １名
博士後期２年 ２名
博士後期１年 １名
博士前期２年 ５名
博士前期１年 ５名
学部４年６名29