<第 66 回 鈴木賞 正賞>

SSR 解析を用いた日本と台湾の茶の系統解析
静岡県立掛川西高等学校
自然科学部３年 須山杏友莉 他２名
１ 研究の目的チャノキ（Camelia sinensis：茶）は現在世界各国で飲用や食用など様々な用途を目的として栽培されている。また、茶には発がんの抑制や、老化の予防など様々な効能をもつ可能性があることが近年の研究からわかってきた。日本には九州地方や京都府など、多くの茶の名産地が存在する。その中でも静岡県は有数の産地で、主に掛川市やその周辺の牧之原台地での生産が盛んである。このように茶に囲まれた環境で生活している私たちは、近年、DNA による茶の系統解析が行われていると知り(１)、日本国内において私たちの住む地域の茶や、名産地の茶がどのような系統に分かれているのか調査しようと考え、研究に着手した。また、本研究では、日本と同様に茶が有名である台湾の茶の系統解析もあわせて行うこととし、台北市立建國高級中學との共同研究を行った。
２ 方法
今回の研究では、参考文献(１)と同様に、SSR マーカーを用いた蛍光プライマー法により、反復配列の繰り返し数の違いを調べ、系統解析を行うこととした。SSR とは、単純反復配列(simple sequencerepeat）の略であり、DNA 塩基配列中にみられる、短い配列の繰り返しである。SSR マーカーはこの繰り返し数の差異に着目するもので、品種識別や DNA 鑑定で用いられている。
本研究では、①各地で茶葉を採取し、②茶葉から DNA を抽出した後、DNA 抽出液を蛍光色素で標識したプライマーを用いた PCR 法で増幅、DNA 増幅液をフラグメント解析し、SSR を含む DNA 長を測ることで繰り返し数の違いを測定した。
なお、実験に使用した SSR 座は、京都府立大学の先行研究と同じものを使っている。

（１） 茶葉の採取
茶葉の採取方法は、３本程度の茶の木からそれぞれ木の中央付近の、きれいかつやわらかい葉を 3～5 枚程度採取した。採取した葉は 75％エタノールで消毒し、マイナス 20℃の冷凍庫で保管した。実験で使用する葉は、静岡県農林技術研究所茶業研究センターで「やぶきた」の基準木とされている木から採取したものと、「さ図１ 茶葉の採取の様子
やまかおり」や「おくひかり」、「かなやみどり」などの基準木から採取した栽培品種と、京都府京田辺市、宮崎県宮崎市、福岡県八女市、静岡県掛川市、菊川市、島田市、牧之原市、台湾の坪林で採取した在来種を対象とした。在来種の茶葉の採取地は以下の図２の地図にまとめている。

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図２ 静岡県内(左)と日本各地(中央)、台湾(右)の在来種茶葉の採取地（２） DNA の抽出・増幅とフラグメント解析
採取した葉をピンセットで１ cm 程度切ったものを使用した。これをホモジェナイズし、DNA 抽出液として Mighty Prep reagent for DNA を加え、95℃で 10 分加熱した後、遠心分離を行い、上澄み液をDNA 抽出液とした。
この DNA 抽出液１ µL に DNA ポリメラーゼとして KOD one Master Mix もしくは Quick
Taq を加え、蛍光標識プライマーを用いた PCR 法により DNA を増幅した後、アガロースゲルを用いた電気泳動法で DNA の増幅を確認した。PCR 法を行う際の温度サイクルを図３に示す。プライマーは参考文献で用いられていた９つのプライマーを使用した（図４）。フラグメント解析は Macrogen 社に依頼し、測定結果は Peak Scanner™ Software v2.0 で解析した。

図３ PCR 温度サイクル

図４ PCR 法に用いたプライマーの蛍光標識、塩基配列、繰り返し数­- 47 -３ 結果増幅された DNA の長さをフラグメント解析データから読み取り、整理した後、系統樹を作成した(図５)。系統樹は POPTREE２を用いて、NJ 法で作成した。なお、group３，４にある台湾の茶については、日本と同じ方法で台北市立建國高級中學が解析したものである。分析機器の誤差については、双方で同じ基準木の茶葉を分析することで修正した。しかし、９つの対象 SSR 座のうち１つ（MSG0800）については台湾の品種でピークを確認できないものがあったため、系統樹の作成には８つの SSR 座を用いた。

図５ 作成した系統樹­- 48 -＊は栽培品種を示している。

４ 考察
図５に示したように、今回分析した茶については、大きく４つの group に分類できると考えた。
group１、group２は中国から直接日本に伝来したグループで、group３、group４は中国から台湾に伝来したグループであることが考えられた。1900 年代、日本と台湾は交流が盛んだったため、茶についても何らかのやりとりがあり、遺伝子が同じである可能性も予想したが、それぞれの国で本来の系統が残っていることが今回の結果からは推測された。また、日本国内と台湾内で大きく異なる系統が存在し、それらは両国とも栽培品種と在来種で大きく系統が分かれていることが確認できた。
各 group の考察を以下に示す。
・group１・・・日本国内で品種改良が行われ、その系統とこれらの系統間の交配により生じた「実生個体」と考えられる。
・group２・・・ 中国から日本に伝来したものが、それぞれの地域で受け継がれた在来種と考えられる。また、九州産の茶が系統樹で独立していることから、中国から九州への伝搬ルートと京都・静岡への伝搬ルートが異なっている可能性が考えられる。
・group３・・・古い時代に台湾に伝来した系統が残ったものと考えられる。
・group４・・・日本より古い時代に、台湾あるいは中国で品種改良が行われた系統と、これらの系統間の交配により生じた「実生個体」の可能性がある。
これらの結果をより確かにするために、今後は試料数と採取地点を増やしていく必要がある。特に在来種は一つの茶畑で複数種が混在しているため、試料数をよく検討しなければならない。また、採取地点については日本国内における茶の伝搬ルートを推測しながら決定していき、同時に中国本土でも同様の分析を行うことで、さらなる調査を進めていきたい。
５ 謝辞・参考文献
本研究に協力してくださった京都府立大学の久保中央教授、静岡大学農学部の一家嵩志准教授、静岡県立大学の河原崎泰昌准教授、静岡県農林技術研究所茶業研究センター、京都府茶業研究所、京都府茶協同組合茶業センター、JA 福岡八女、宮崎県総合農業試験場茶業市場、茶農家の皆様に感謝申し上げます。本研究は、公益財団法人はごろも教育研究奨励会の助成を得て行っております。また、本研究は台湾・台北市立建國高級中學との共同研究として行っております。
(１)Kubo, N et al. (2019). Classification of tea（Camellia sinensis） landraces and cultivars
in Kyoto, Japan and restriction site-associated DNA sequencing analysis. GeneticResources and Crop Evolution.66(２):441-451(２)Taniguchi,F et al. (2012). Construction of a high-density reference linkage map of tea(Camellia sinensis). Breeding Science 62(３):263-273(３)加藤 史子ほか (2008).単純反復配列（SSR）マーカーを利用したチャの品種識別、日本食品科学工学会誌、55(２):49-55­- 49 -

補足資料：フラグメント解析について
PCR 法により DNA 増幅に成功した試料は、Macrogen 社に依頼し、フラグメント解析した。測定結果
は DNA 長(bp)を横軸に、検出強度を縦軸にとったグラフで送られる。これを、Peak Scanner™ Software
v2.0 というソフトで解析し、DNA 長を測定した。図５の系統樹のもととなった、各茶葉の DNA 長を以下の補足Ⅰ～Ⅳに示す。
補足-Ⅰ 日本国内の品種のフラグメント解析結果

補足-Ⅱ 静岡県内の在来種のフラグメント解析結果

補足-Ⅲ 日本国内各地の在来種のフラグメント解析結果

補足-Ⅳ 台湾茶のフラグメント解析結果­- 50 -