遺伝子工学的改良が可能な短鎖炭化水素化合物酸化生体触媒

京都大学 大学院農学研究科 応用生命科学専攻
教授 阪井 康能
2019年5月16日
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夢の反応：メタン → メタノール(C-H結合 104kcal mol-1)

触媒性能
固体触媒

低触媒活性
(<0.0004s-1)反応機構の解析

安定困難

低収率(<9%)
分子触媒

低触媒活性
(<0.01 s-1)

安定性と材質

反応機構
は明らか

不均一系

設計と合成法

合理的な設計は不可
材料の選択は経験に負う材料を処理・混合し加熱
反応機構が知られていないと設計できない

均一系

合理的な設計は可均一系

遺伝子合成と改変により合理的な設計は可低ターンオーバー数(多くが<1)
生体触媒は既存の分子触媒に比較して様々な化学合成法数百〜数千倍の触媒活性！
生体触媒

高触媒活性
(室温で4 s-1)
高反応特異性

構造機能相関 タンパク質の解析が可不安定

活性発現できていないメタンモノオキシゲナーゼ (MMO)
CH4メタン酸化菌NAD(P)H + H+quinol (?)
O2O2

2

H2O

pMMO H O
quinone (?)

sMMO

NAD(P)+

M. trichosporium OB3bCH3OH
ΔGo´ = 111 kJ/mol

pMMOの構造と活性中心

sMMOの構造と活性中心

MMOの基質となる多様な炭化水素化合物｢バイオ コンバージョン｣
谷、児玉、倉根 監修,JBA編集
医学出版センター(1993) より引用

superMOB メタノール資化性菌への導入による細胞触媒の創製

superMOB
細胞触媒

CH4

メタンを原料とする微生物生産
・多段階反応を細胞内に集積・エネルギーと還元力の供給
・生成メタノールによるMOB阻害の回避

バイオ製品
高密度細胞リアクター

superMOB

物質生産代謝改変

superMOB発現

効率的なC1代謝

MOB発現メタノール菌 CH3OH

HCHO

superMOB性能評価

CO2

想定される用途• 従来、困難であった炭化水素の常温常圧条件における酸化反応• メタンを炭素資源とした微生物生産• 環境浄化 (トリクロロエチレン など)

6従来技術とその問題点
メタン酸化菌のもつメタン酸化酵素(MMO)については、メタン以外にも様々な炭化水素化合物の酸化が可能である。しかし基質特異性や生産性向上を目的として、細胞内で活性型としてMMOを発現することができず、触媒活性の評価・育種・遺伝子工学的な改変ができなかった。
その理由：
1) メタン酸化菌はメタンしか炭素源として生育することができず育種ができない。
2) 大腸菌・酵母などの異宿主でMMOの活性発現例の報告は無く困難で、大腸菌から得た凝集体を in vitroでフォールディングする必要がある。従って、細胞レベルでMMO活性を指標とした検定・評価ができない。
3) MMOの基質であるメタンは気体のため、酵素活性の測定が煩雑かつ困難で、ハイスループットな活性スクリーニングがない。
7

大腸菌を宿主とした不活性な凝集体としての発現とin vitro リフォールディング

Nature 465, 115-119 (2010)
Crit. Review. Biochem. Mol. Biol. 47, 483-492（2012）

メタン酸化菌 (メタンしか炭素源として利用できず、生育が遅い)
NH2-

MMO geneActive?

• シャペロン?
• Fe, Cu, other factors?

異宿主細胞

活性型MMO

メタン酸化菌における総pMMO (100%)
不活性型MMO10％構造形成せず

0.89％
低効率

DNA

不活性型MMO

MMO

9.11％

大腸菌

試験管内 リフォールディング

新技術の特徴・従来技術との比較“高性能酸化生体触媒の新しいプラットフォーム”= 基本特許• FACSを用いた一細胞解析による、メタノール生成活性を指標としたハイスループットスクリーニング系を構築• 上記技術により、異宿主酵母細胞内でのMOB活性発現に成功• 遺伝子工学的改変により、触媒活性ならびに折りたたみ効率の高いsuperMOBを開発

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スーパーメタン酸化生体触媒：
superMOB (Methane-oxidizing biocatalyst) のもつ３つの特徴
superMOB のもつ３つの特徴① superactive：
高活性触媒構造

生合成
superMOB遺伝子② superfolder：

誤った構造形成しやすく折りたたみ③ unique sequence：

活性型で大量生産

自然界にない新しいアミノ酸配列
折りたたみ促進 触媒部位 触媒部位* MOB断片 触媒活性化

10superMOB の開発戦略★ 細胞を用いたスクリーング
メタノール資化性菌

MOB 活性検出系
高感度HTS*MOB活性（メタン消費）の定量は面倒、かつ, 不正確で測定しにくい★ 蛍光を用いた検出• superMOB候補 DNAFeedback

C1 酵母 メタノールセンサー宿主細胞
CH3OH

PDAS2
Venus-PTS1
Methanol

0 μM

2.5 μM

25 μM

Pichia pastoris
250 μM

2.5 mM

DIC
VenusPTS1(YPD (glucose medium) → methanol medium for 4 h)

Takeya et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 2018

一細胞レベルでの触媒活性評価とハイスループットスクリーニング
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

DNA library“細胞触媒”
1種類のDNA配列をもつ1細胞が1本の試験管
1細胞触媒活性 (蛍光強度)=
MOB (触媒活性) x (生産量)(superactive)x (superfolder)

FACS導入により・ハイスループット
・MeOH検出感度 (μMレベル)

superMOB

・散乱光
FSC：細胞の大きさ
SSC：細胞の形状
・蛍光 (2波長)

メタノール資化性菌蛍光細胞の一細胞FACS解析による
MOB活性を指標としたハイスループットスクリーニング

MOB

MeOＨ微生物
宿主

MOB

MOB遺伝子断片ライブラリー

蛍光光らないセルソーターで高活性MOB発現株を回収！

高活性MOB

MOB活性＝生成メタノールに応答したGFP蛍光

CH４

MOB

CH3OH

GFP蛍光↑

メタノール資化性菌

MOB活性↑
MeOH誘導性プロモーター

HCHO

CO2
GFP

GFP遺伝子9／25

C1酵母メタノールセンサーの感度

FACS analysis

2.5μMTakeya et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 201815

メタン酸化生体触媒組換え体の活性評価と高活性細胞の選別
酵素生産

生成MeOHによる蛍光タンパクの誘導

メタン添加による反応

(4h)

FACS

高活性細胞の選抜

Takeya et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 201816

メタノールセンサー細胞を宿主として創製したsuperMOB
Methylovulum miyakonense HT12(20-30℃)
Methylococcus capsulatus Bath

MOB:
Methane-oxidizing biocatalyst(45-60℃)

V168I
spmoBd1

spmoBd2

spmoB

spmoBd1

spmoBd2

spmoBd1

MAAD

superMOB prototype

MAAD:
MOB-activating pmoA domain

spmoBd2

MAAD

superMOB

Improving
activity
Activeexpression17

メタン酸化活性評価（FACS)CH4依存
Cu2+依存
acetyleneで阻害+ folder

superMOB prototype
18

superMOB prototype メタン酸化活性評価（FACS)
1. M. miyakonense HT12
2. M. capsulatus (Bath)HT12BathMAAD 配列 触媒部位に近い Val168の変異

20superMOBプロトイプ変異体 メタン酸化活性評価（FACS)
30000

Mean FITC-A/FSC-A (CH4-N2)

25000

20000

15000

10000

5000

0
WT

V168A

V168G

V168F

V168I

V168L

H48N

H137_139A-5000

superMOB prototype

Western(Anti-His)

V168I変異によりメタン酸化活性が顕著に上昇
V168A, V168G, H137_139A 変異 では、メタン酸化活性が消失superMOB細胞触媒プロピレン酸化活性

superMOB

菌体量 (OD610)

生成プロピレンオキサイド (μＭ)

生成プロピレンオキサイド (μＭ)

spmoB

prototype superMOB

superMOB

反応時間 (分)22実用化に向けた課題• C1酵母を用いてFACSによる一細胞解析を用いた高活性メタン酸化生体触媒のスクリーニング系を確立、直接活性発現が可能なsuperMOBを開発済み。これまで確立した一細胞解析とFACSを利用した、高活性・高生産性をもつsuperMOBの探索が可能となった• 実用化に向けて、さらなる触媒活性の高活性化と発現量が向上するた
めの菌体調製法および培養技術を確立する必要がある• メタン・プロピレン以外の炭化水素化合物を対象にした有用な酸化反応についての実証が必要

23

メタノールセンサー細胞を宿主としたsuperMOBの開発

24superMOBの創製 (1)○Methylococcus capsulatus Bath ○Methylovulum(45-60℃)
miyakonense HT12(20-30℃)
spmoBd1 Transmembrane spmoBd2
spmoB

spmoB

spmoBd1 spmoBd2

Not detected

Balasubramanian R, et al. (2010)
Nature 465:115–119.

myc -His tag 23 a.aspmoBd1 spmoBd2
GKLGGG linker

superMOB prototype

spmoB7 (527 a.a. (含む37 a.a 可溶化配列) )a.a.相同性(326 a.a.)spmoBd1

72% (<80%)

spmoBd2

pmoA linker
Rosenzweig US Patent (2018.6)

activespmoBd1

pmoA linker

サイズ100% : 62%superMOB

細胞触媒性能superactive spmoBd1<spmoBd2

spmoBd2

pmoA linker*

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企業への期待• 化学プロセスの中でも、特に炭化水素酸化反応について興味、技術を持つ、企業との共同研究を希望• アルカン・芳香族など、炭化水素化合物 のアルコール、オキサイドへの精密な酸化反応について、検討が可能な企業への本技術の導入が有効と思われる• 共同研究で各企業で興味ある基質を試します！
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称• 出願番号• 出願人• 発明者：活性発現する炭化水素酸化生体触媒：特願 2019-036229：京都大学、北海道大学：阪井康能、由里本博也、寳関 淳、
緒方英明

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産学連携の経歴• 2015.12月 〜 JST CREST 事業 に採択 (〜2021.3.)
多様な天然炭素資源の活用に資する革新的触媒と創出技術(革新的触媒])
研究総括：上田渉“合成生物学によるメタン酸化生体触媒の創製”研究代表者： 阪井康能

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問い合わせ先
国立大学法人京都大学内
関西ティー・エル・オー株式会社
京大事業部門 技術移転チーム
井下 陽平（いのした ようへい）
ＴＥＬＦＡＸe-mail075-753-9150
075-753-9169
inoshita@kansai-tlo.co.jp

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