別冊 参考資料（CUGA® 7 gRNA Synthesis Kit）改訂版 R302

ガイド RNA 合成キット

CUGA® 7 gRNA Synthesis Kit
別冊 参考資料
Code No. 314-08691

はじめに転写開始効率に影響する鋳型 DNA 配列について
実験例 1：sgRNA 用鋳型 DNA 調製（PCR 法）
実験例 2：sgRNA 用鋳型 DNA 調製（Klenow Fragment を用いた伸長反応）
実験例 3：crRNA、tracrRNA 用鋳型 DNA 調製（アニール法）
実験例 4：in vitro 切断チェック

NIPPON GENE CO., LTD.

別冊 参考資料（CUGA® 7 gRNA Synthesis Kit）改訂版 R302

はじめにCUGA® 7 gRNA Synthesis Kit は、ゲノム編集に必要なガイド RNA（guide RNA, gRNA）等の短鎖 RNA を合成・精製するためのキットです。in vitro 転写反応に、株式会社ニッポンジーンテクが独自に開発した CUGA® 7 RNA ポリメラーゼ（変異導入により非特異的な塩基伸長が顕著に減少する特性を獲得した大腸菌ファージ T7 RNA Polymerase）を用いることで、目的のガイド RNAを正確かつ大量に合成することができます。
本キットには、in vitro 転写反応用試薬およびスピンカラムを用いたガイド RNA 精製用試薬が含まれています。詳しくは製品に添付のマニュアルをご参照ください。
本紙「別冊 参考資料」では、本キットを用いる前に用意していただく鋳型 DNA の調製方法と、合成した gRNA の切断効率を確認する in vitro 切断チェックについて実験例をご紹介しています。

【ガイド RNA 標的配列の選択】
本参考資料は、Streptococcus pyogenes の Cas9 nuclease のガイド RNA について記載しています。ガイド RNA 設計の際には、PAM 配列（5’-NGG）上流に隣接した 20 塩基の標的配列を選択します。
標的配列（20 塩基）

PAM 配列5’- ----------NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN NGG--------- -3’
3’- ----------NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN NCC---------- -5’
標的配列（相補鎖）1

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転写開始効率に影響する鋳型 DNA 配列について【鋳型 DNA の T7 プロモーター配列】
in vitro 転写反応では転写開始点(+1)から下流のアンチセンス鎖を鋳型 DNA として RNA を合成するため、転写開始点の G (+1)までの T7 プロモーター配列部分が完全に二本鎖を形成している鋳型 DNA を用意する必要があります。
T7 プロモーター+1(転写開始点)

5’- CTAATACGACTCACTATAGNNN-3’ センス鋳型 DNA

3’- GATTATGCTGAGTGATATCNNNNNNNNNNNNNN…NNNNN -5’ アンチセンス鋳型 DNA↓ in vitro 転写
5’-GNNNNNNNNNNNNNN…NNNNN -3’ 合成 RNA

Tips!
・ 四角で囲んだ T7 プロモーター配列は転写反応に必須となる配列を示しています。PCR 産物を鋳型 DNA にする場合、プロモーターの 5’末端に欠損が発生した場合を考慮して、塩基を付加して下さい（図では、C を付加しています）。
・ RNA 収量を増やしたい場合には、T7 プロモーター配列部分のみでなく、鋳型 DNA 領域を完全に二本鎖にした鋳型 DNA を使用した方が転写効率を良くすることができます。

【配列依存的な転写開始効率の低下を回避するための対処方法】
転写開始点 G の直下(+2 から下流)に T が連続する鋳型 DNA を使用した場合、in vitro 転写反応産物の配列が GUU---となり、一般的な T7 RNA ポリメラーゼの特性から転写開始の効率が著しく低下することが知られています。
ガイド RNA 設計時に転写開始点直下にプリン塩基（G、A）が多い配列を選択すると、上記の問題が大幅に改善され安定な転写開始が期待できます。
T7 プロモーター+1(転写開始点)

5’- CTAATACGACTCACTATAGTTNN…N -3’

5’-GUUNN…N

合成 RNA

3’- GATTATGCTGAGTGATATCAANN…N -5’ 鋳型 DNA
転写開始点直下にプリン塩基が多い配列を選択
5’- CTAATACGACTCACTATAGGGTTNN…N -3’
3’- GATTATGCTGAGTGATATCCCAANN…N -5’ 鋳型 DNA

25’-GGGUUNN…N

合成 RNA

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実験例 1：sgRNA 用鋳型 DNA の調製（PCR 法）【実験の流れ】標的配列を選択し、3 本の DNA オリゴヌクレオチドを用意↓PCR により二本鎖鋳型 DNA を調製↓↓
in vitro 転写反応で sgRNA を合成【準備】
・ 化学合成オリゴヌクレオチド（カートリッジ精製または PAGE 精製、ニッポンジーン）
・ 高正確性 PCR 酵素：Go-to DNA Polymerase（Code No. 313-08661、319-08663）
・ ddWater (RNase free)（Code No. 316-90101、312-90103、318-90105）
・ スピンカラム PCR 産物精製キット：ISOSPIN PCR Product（Code No. 315-08001）

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【プロトコル】実験例 1：sgRNA 用鋳型 DNA の調製（PCR 法）① 標的配列を選択し、下記の通り、a（60 塩基）、b（80 塩基）、c（20 塩基）のオリゴ DNA を化学合成します。

a：標的配列を含む DNA
T7 プロモーター配列

crRNA/tracrRNA 配列

標的配列（20 塩基）

5’-CTAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’
b：crRNA/tracrRNA 配列（下線部は a の下線配列の相補鎖、点線部は c と相同の配列）
5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’

c：crRNA/tracrRNA 配列の一部
5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’② PCR チューブに以下の組成で試薬を調製します。
10×Go-to Buffer

5 μl

2.5 mM dNTP

4 μl

a のオリゴ DNA(10 μM)

2 μl

b のオリゴ DNA (0.1 μM)

2 μl

c のオリゴ DNA (10 μM)

2 μl

Go-to DNA Polymerase

1 μl

ddWater (RNase free)

34 μl

Total

50 μl

③ 下記の条件で PCR を行います。
95℃

2 分間× 1 サイクル

↓95℃

15 秒間55℃

15 秒間

72℃

30 秒間

× 35 サイクル

↓72℃

5 分間

× 1 サイクル④ 反応液を精製キット「ISOSPIN PCR Product」を用いて精製し、鋳型 DNA を調製します。

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実験例 2：sgRNA 用鋳型 DNA の調製（Klenow Fragment を用いた伸長反応）【実験の流れ】標的配列を選択し、2 本の DNA オリゴヌクレオチドを用意↓
伸長反応により二本鎖鋳型 DNA を調製↓↓
in vitro 転写反応で sgRNA を合成【準備】
・ 化学合成オリゴヌクレオチド（カートリッジ精製または PAGE 精製、ニッポンジーン）
・ DNA ポリメラーゼ：Klenow Fragment（Code No. 312-00814、318-00816）
・ ddWater (RNase free)（Code No. 316-90101、312-90103、318-90105）・ スピンカラム PCR 産物精製キット：ISOSPIN PCR Product（Code No. 315-08001）

5別冊 参考資料（CUGA® 7 gRNA Synthesis Kit）改訂版 R302

【プロトコル】実験例 2：sgRNA 用鋳型 DNA の調製（Klenow Fragment を用いた伸長反応）① 標的配列を選択し、下記の通り、a（60 塩基）、b（80 塩基）のオリゴ DNA を化学合成します。

a：標的配列を含む DNA
T7 プロモーター配列

crRNA/tracrRNA 配列の一部

標的配列（20 塩基）

5’-CTAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’
b：crRNA/tracrRNA 配列（下線部は a の下線配列の相補鎖）
5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’② PCR チューブに以下の組成で試薬を調製します。
10×Klenow Fragment Buffer

5 μl

2.5 mM dNTP

4 μl

a のオリゴ DNA(10 μM)

5 μl

b のオリゴ DNA (10 μM)

5 μl

ddWater (RNase free)

30 μl

Total

49 μl

② 95℃で 2 分間熱処理し、室温に 5 分間放置します。
③ Klenow Fragment (1 U/μl) を 1 μl 添加します。
④ 37℃で 30 分間反応させます。
⑤ 反応液を精製キット「ISOSPIN PCR Product」を用いて精製し、鋳型 DNA を調製します。

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実験例 3：crRNA、tracrRNA 用鋳型 DNA の調製（アニール法）【実験の流れ】標的配列を選択し、3 本の DNA オリゴヌクレオチドを用意↓アニールにより二本鎖鋳型 DNA（crRNA 用鋳型 DNA と tracrRNA 用鋳型 DNA）をそれぞれ調製↓in vitro 転写反応で crRNA と tracrRNA をそれぞれ合成【準備】・ 化学合成オリゴヌクレオチド（カートリッジ精製または PAGE 精製、ニッポンジーン）
・ ddWater (RNase free)（Code No. 316-90101、312-90103、318-90105）
・ アニーリングバッファー（20 mM Tris-HCl、2 mM EDTA、200 mM NaCl）

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【プロトコル】実験例 3：crRNA、tracrRNA 用鋳型 DNA の調製（アニール法）① 標的配列を選択し、下記の通り、a（19 塩基）、b（60 塩基）、c（91 塩基）のオリゴ DNA を化学合成します。

a：T7 プロモーター配列（crRNA 鋳型用、tracrRNA 鋳型用）
T7 プロモーター配列
5’-CTAATACGACTCACTATAG-3’

b：標的配列を含む DNA（crRNA 鋳型用）
tracrRNA 配列の一部

標的配列の相補鎖（20 塩基）

T7 プロモーター配列の相補鎖

5’-CAAAACAGCATAGCTCTAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
c：tracrRNA 配列（tracraRNA 鋳型用）
5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATG
CTGTTTTGACTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
T7 プロモーター配列の相補鎖② a のオリゴ DNA と b のオリゴ DNA をアニーリングして、crRNA 用鋳型 DNA を調製します。
③ a のオリゴ DNA と c のオリゴ DNA をアニーリングして、tracrRNA 用鋳型 DNA を調製します。

＊アニーリングは、化学合成したオリゴヌクレオチドを等量モルずつ同一のチューブに加え、この混合液と等量のアニーリングバッファー（20 mM Tris-HCl、2 mM EDTA、200 mM NaCl）と混和して 75℃で 5 分間加熱し、穏やかに室温（15～25℃）に戻すことにより二本鎖にします。

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実験例 4：in vitro 切断チェック【実験の流れ】精製した gRNA と Cas9 タンパク質を用いて標的配列を含む DNA 断片を in vitro で切断

基質 DNA基質 DNA↓
アガロースゲル電気泳動にて DNA 断片が目的のサイズに切断されていることを確認【準備】・ 本キットで合成・精製したガイド RNA（sgRNA、あるいは crRNA と tracrRNA）
・ Cas9 タンパク質：Cas9 Nuclease protein NLS（Code No. 319-08641、316-08651）
・ 標的配列を含む DNA 断片（基質 DNA）
・ 10×H Buffer（ニッポンジーンの制限酵素に添付）＊
・ Loading Buffer（Code No. 313-90111）＊＊・ アガロースゲル電気泳動用試薬（Gene Ladder、Agarose S、TAE など）＊10×H Buffer 組成：500 mM Tris-HCl（pH 7.9）、1M NaCl、100 mM MgCl2、10 mM DTT＊＊正確な泳動結果を得るため、SDS を含む Loading Buffer を使用して下さい。

9別冊 参考資料（CUGA® 7 gRNA Synthesis Kit）改訂版 R302

【プロトコル】実験例 4：in vitro 切断チェック① 本キットで合成・精製したガイド RNA と Cas9 Nuclease protein NLS 0.5 μg を混合し、室温で 5 分間反応させます。
sgRNA の場合：50 ng
crRNA, tracrRNA の場合：crRNA 25 ng、tracrRNA 45 ng② 反応液に以下の試薬を追加します。
X μl①の反応液（gRNA+Cas9 タンパク質）

100 ng標的配列を含む DNA 断片

2 μl

10×H Buffer
ddWater (RNase free)

up to 20 μl② 37℃で 60 分間反応させます。
③ SDS を含む Loading Buffer を加え、65℃で 5 分間反応させます。
④ アガロースゲル電気泳動を行い、DNA が目的のサイズに切断されていることを確認します。

＊DNA 断片が目的サイズに切断されていない場合、ガイド RNA の配列が適していないことが考えられます。その場合は、標的配列を変えてガイド RNA を設計して下さい。

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お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課
TELURL076 - 451 - 6548
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