呼吸器系 おける樹状細胞の機能とその制御呼吸器系における樹状細胞の機能とその制御
第40回日本免疫学会学術大会
クリニカルセミナー3(平成23年11月27日)

東京大学大学院医学系研究科
アレルギーリウマチ内科学
土肥 眞Ralf M. Steinman (1943.1.14~2011.9.30)
Steinman RM and Cohn ZA.
Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organ tissue of mice.
J Exp Med 137:1142-1162, 1973.

講演内容
 DC総論
分化、サブセット 肺のDCについて
 呼吸器疾患におけるDCの関与
 DCの制御による病態の実験的制御制御による病態 実験的制御（アレルギー性気道炎症を例に）
 難治性呼吸器疾患の制御に向けての実験的検討

講演内容
 DC総論
分化、サブセット 肺のDCについて
 呼吸器疾患におけるDCの関与
 DCの制御による病態の実験的制御制御による病態 実験的制御（アレルギー性気道炎症を例に）
 難治性呼吸器疾患の制御に向けての実験的検討

樹状細胞(dendritic cells: DC)とは
 骨髄由来で、全身の組織に分布する細胞である
 樹状突起(dendrite)を有する
樹状突起(d d i )を有する
 最も強
最も強い抗原呈示能を持つ
抗原 示能を持
即ち、naive T cellに抗原を提示する
 単一の細胞ではなく、起原や機能の異なるサブセット
よりなる 自然免疫と獲得免疫との橋渡しをする

DCの機能、意義 抗原特異的免疫応答の開始と増幅（抗原提⽰）
 免疫寛容の誘導 Th1/Th2/Th17/Treg細胞の分化に関与
 それ⾃⾝がサイトカインを産⽣して免疫応答を修飾 (効果相/炎症相にも関与)()

DCのライフサイクル(migratory DC)
末梢血

皮膚・粘膜組織
CCR6

Pre-DC

Immature
DC

ImmatureDC

PAMP/DAMP
PathogenAllergen
CD86

MHCⅡ

maturation

MatureMtDC

immature
骨髄

CD80

CD40

成熟DC

Ag
OX40L
CCR7

IL-12

CCL17,22

所属リン 節所属リンパ節（二次リンパ節）
アポトーシスor
生存(IL-12産生停止）

T

抗原特異的免疫応答
Tolerance(Dohi M. University of Tokyo)

DCの機能に影響する因⼦ Subset Maturation status Location
L ti (migratory/resident)( i t / id t)
 environmental conditions
cytokine/chemokine (GM-CSF,PGs, LTs,IL-12)
other cells (alveolar macrophage,
macrophage Treg,
Treg
NK cell, NKT cell, Mast cell) presence/absence of inflammatory stimuli
virus (via TLR7,9)
bacteria (via TLR4)

DC上の様々なレセプタ
DC上の様々なレセプター
Recognition of microbial motifs
Toll like receptors 11-11
11Intracellular receptors
NOD1/2
NALPs
TLR7, 9PKB

Recognition of inflammation
Protease activatedreceptors
Complement receptors
Prostanoid receptors
DP1 EP4,
DP1,
EP4 IP

Neuropeptide receptors
NK1, CGRPR

Recognition of cell death/stress
Self/non-self discrimination

Purinergic receptors

C-type lectin receptors

P2X, P2Y

Dectinmacrophage mannose receptor
DEC205
BDCA-2

Receptors for death(Lambrecht: Curr Mol Med 8: 2008)

NALP3
RAGE
heat shock proteins-R

DC development and homeostasis(mouse)
様々なフェノタイプのDCへ分化
例：CD103+ cDC（上⽪内）安静時

Lung DCへ分化
DC 分化(CD11b+ cDC：粘膜固有層)などの炎症性DCs

macrophage

Lung
MP:myeloidypprecursor,,
MDP:macrophage and DC precursor,
CDP:common DC precursor,(Modified from Liu K. et al, EJI 40;2-85,2010)

Conventional DC : cDC
 CD11chigh, CD11b + or  サブセットによって、表⾯マーカーなどが微妙に異なる。
 抗原を取り込み、maturationを起こしながら抗原を取り込みを起 しながら
所属（⼆次）リンパ節へ遊⾛し 抗原を提⽰所属（⼆次）リンパ節へ遊⾛し、抗原を提⽰
 末梢⾎単核球
末梢⾎単核球の0.5-1.0%

Pl
Plasmacytoid
t id DCs
DC ((pDCs)
DC ) CD133low, CD11clow/med, B220+ (マウス)BDAC2+(ヒト） TypeT pe I interferon (IFN-/など)を産生(IFN /など)を産生
 Tolerance
 Anti-virus
 Anti-tumor
A i Autoimmune
 末梢⾎中単核球の0.5%以下

pDCはウイルスの核酸を認識する
 エンドゾームに局在する2種のTLRによる 人のpDCはTLR7とTLR9のみを発現する
 TLR7ssRNA virus:influenza,virus:influenza RSV,RSV VSV
VSV, sendai V TLR9DNA virus:HSV-1,HSV-2,CMVi
HSV 1 HSV 2 CMVLangerhans Cell (LC) 表⽪組織に分布（特に⽪膚 epidermis)
 CD1a, E-cadherin, Birbeck顆粒, Langerinを発現
 分化にTGF-が関与+cDC)
 気道上⽪組織でも類似の細胞が存在(CD103
気道上⽪組織類似 細胞が存在

Myeloid DC
 Monocyte/macrophage と類縁関係
 Granulocyte macrophage colony stimulating
factor (GM-CSF)が維持に必要
 Myeloid surface marker を発現(CD11c, CD33, CD13)
 末梢⾎単核球の0.5-1.0%

マウスと⼈のDCの種々のマーカー(Condon et al. J Leukoc Biol 90:883, 2011)

講演内容
 DC総論
分化、サブセット 肺のDCについて
 呼吸器疾患におけるDCの関与
 DCの制御による病態の実験的制御（ レルギ 性気道炎症を例に）（アレルギー性気道炎症を例に）
 難治性呼吸器疾患の制御に向けての実験的検討

DC development and homeostasis(mouse)
様々なフェノタイプのDCへ分化
例：CD103+ cDC（上皮内）

安静時

Lung DCへ分化(CD11b+ cDC：粘膜固有層)などの炎症性DCs
macrophage

MP:myeloidypprecursor,,
MDP:macrophage and DC precursor,
CDP:common DC precursor,

Lung(Modified from Liu K. et al, EJI 40;2-85,2010)

Distribution of DCs in the respiratorypy tract
 中枢気道では24～36時間で 85%近くが入れ代わるのに対して、肺末梢では半減期が 7～10日と長長い(サブセ トによる違 あり）(サブセットによる違いあり）
 気道上皮内のDCはsemimature
肺末梢のDCは基本的にi
肺末梢のDCは基本的にimmaturet 通常はmaturationを抑制する機構がはたらく
肺胞マクロファ ジ IL-10,
肺胞マクロファージ：
IL 10 NO
NO,PGD
PGD2, PGI2
気道上皮細胞： NO, TGF- 無害な抗原に対しては、anergy/toleranceを誘導して過剰な反応を抑制(Condon, et al. JLB 90;883, 2010)

DC subsets in the lung and MLN in steady state

Resident DCs

Intra-epithelial
CD11c+
CD11bLangerin+

Immunity/Tolerance
Interstitium

Tolerance
Cross presentation

Lamina propria
CD11c+CD11
SIRP-1+Immunity/Tolerance

Al l wall
AlveolarllpDC

CD11c+
CD11bF4/80+

Antigen presentation(modified from Condon, et al. JLB 90;883, 2010)

Lung DC subsets in the inflammation((Modifiedfrom Plantinga et al. EJI 40;2085, 2010))

Immune responses

Immune responses

Immune responses
Cross presentation
to CD8+ T cells
monocyte
IFN↑CD8 CTL priming

気道・肺組織のDCに関する疑問点
 気道と肺実質とで質的にどのように異なるのか
Flt3L-/-マウス:肺の実質ではcDC、pDC共に↓↓
気道では減らない CD11b+cDCとCD11b-CD103+cDCの由来はそれぞれ
単⼀か？
CD103+cDCでも、monocyte由来の可能性がある（Jakubzick JEM 205:2008)（Jakubzick, Precursorはどこで分化するのか（肺の前・中？） 半減期は？
従来：肺末梢では7~10⽇
最近の報告： CD103+cDCで30⽇、CD11b+cDCで15⽇

講演内容
 DC総論
分化、サブセット 肺のDCについて
 呼吸器疾患におけるDCの関与
 DCの制御による病態の実験的制御（ レルギ 性気道炎症を例に）（アレルギー性気道炎症を例に）
 難治性呼吸器疾患の制御に向けての実験的検討

Role of DCs in sensitization to antigen
AntigenBronchial
mucosaImmatureDCmaturation

MatureDC

Lymphnodey p
BhelperT

Effector
Th
Naive
T

CentralmemoryTh

B

IgE

Role of DCs in the effector phase of allergic airway inflammation
Bronchial epithelial cell

BronchialBhi lmucosaAntigen
TSLP, GM-CSF

FcRI
Mast
cell

Immature
DC

Immature
DC

MDC

IL-16

CCL17/22

histamine

Ag uptakematuration

matureDC

Naive T

MemoryTh2

Effector
Th2
Effector
Th2

IL-4
5
9
12
23

IL-16
MDC
TARC

Eosinophil

clonal expansion(Dohi M. University of Tokyo)

気管⽀喘息と⾃然免疫・獲得免疫(Brusselle and Bracke: Lancet 378:2011)

気管⽀喘息とDC (1)Asthma 気道粘膜：気道粘膜
mDC の数pDCの数 末梢⾎ ：
alloMLRll MLR
HLA-DR
allo MLR,, HLA-DR,,
IL-12産⽣能

Normal＞＝(Upham, Clin Exp Allergy, 2002)＞＞((van dden H
Heuvel,l JACI,JACI 1998)(Reider, JACI, 2002)＜(Reider, JACI, 2002)
or ＝ (Bellinghausen,JACI, 2002)

気管⽀喘息とDC (2)気管⽀喘息
抗原吸⼊チャレンジ4〜5時間後に、気管⽀粘膜でDC(CD1c+HLA-DR+) が増加した (Jahnsen, Thorax, 2001)



抗原吸⼊チャレンジで、末梢⾎中のDC(CD33+CD14-CD16- HLADR+)が３時間後より減少し、24時間後にも減少したままであった(Upham, Clin Exp Allergy 32:818,2002)

BAではNCと⽐較して、末梢⾎より誘導したDCをLPS+IFN-で刺激した場合 PGE2とIL-10の産⽣が亢進する
刺激した場合、PGE2とIL-10の産⽣が亢進する(Long, AJRCCM 170:483, 2004)

抗原吸⼊誘発後の気道粘膜へのDCの浸潤(Jahnsen et al. Thorax 56: 823, 2001)

気管⽀喘息とDC (３)

喘息患者 は健常者と比べ喘息患者では健常者と比べて、DCの細胞膜上に高親和性IgE受容体のDC 細胞膜上に高親和性I E受容体発現が増加している (Foster, JACI 2003)



抗IgE抗体 (Omalizumab)を投与すると、発現レベルは低下する(Prussin, JACI, 2003)アレルギー性鼻炎あるいは気管支喘息の小児では、末梢血単球から樹立した DCではIL
DCではIL-10産生が、あるいはさらにIL-12産生も低下して10産生が、あるいはさらにIL 12産生も低下していた(Gentile , Ann Allergy Asthma Immunol 2004, Hagendorens,
Cytokine 2004))



成人喘息症例でも、3)と同様の結果が得られた(Chen, Respiration 2006)

気管⽀喘息と DC (4)吸⼊ステロイドの効果

 気管⽀喘息患者(BA)の気管⽀粘膜では、健常者(NC)に⽐べて、( )( )DCの数とHLA-DRの発現が増えている。２年間吸⼊ステロイドを使⽤してコントロールが良好な症例では、DCの数は減少した(Moller, Clin Exp Allergy, 26:517,1996)
 BAの気管⽀粘膜では CD1a陽性のDCの数がNCと⽐べて増えており、6週間のフルチカゾン(1⽇500g)の投与でその数は有意に減少した。
有意に減少した（Bocchino, Pul Pharm Therapeu 10:253, 1997)

吸⼊ステロイド (FP 500g/day)による気道DC数の減少
上⽪内

粘膜固有層

(Bucchino et al. Pul Pharm & Ther 10: 253, 1997)

気管⽀喘息と管
DC ((5))omalizumabの効果:気道過敏性（Chand HS, et al. JACI 125:1157,2010)

気管⽀喘息と DC (5)omalizumabの効果：DCの数（Chand HS, et al. JACI 125:1157,2010)

疾患による相違の可能性(BALF)
Lommatzsch et al. (Eur Respir J 30:2007)
 正常の免疫状態の肺炎
pDC増加
 免疫抑制状態の肺炎
pDC減少
DC減少
 IPF
DCの増減は無いが、maturation低下
 サルコイド
サルコイドーシス
シス
CD1a-のDCが検出
副刺激分子(CD80 86)の発現は亢進
副刺激分子(CD80,86)の発現は亢進COPDと⾃然免疫・獲得免疫(Brusselle and Bracke: Lancet 378:2011)

COPDと樹状細胞動物モデルでの知見 1
現状では、喫煙マウスモデルの報告のみ
喫煙はDCの数とmaturationに影響する

急性期（１カ月）では、縦隔リンパ節でのDCの抗原提示能と副刺激分子の発現が亢進している (Robbins(R bbiJJ: ImmunolI
l 180:2008)
180 2008)
 慢性期（６カ月）でも、肺でのDCの抗原提示能と副刺激分子の発現が亢進している(D’Hulst:(D
Hulst: Eur Respir J 26:2005)

 低用量では、肺でのDCの数は減少している(R bbi(Robbins:AJRCMB
AJRCMB 30:2004)
30 2004)

COPDと樹状細胞と樹状細胞
動物モデルでの知見 2
 SCIDマウスではDCの数が増加し、肺気腫になりやすい (D’Hulst: Respir Res 6:2005)
 肺胞
肺胞マクロファージとDCでMMP12の発現が
ク
ァ ジ
で
の発現
亢進している (Bracke:Int Arch Allergy
Immunol 138:2005)

 CCR6を欠損したマウスでは、肺気腫の形成が弱い (Bracke: JImmunol 177:2006)

エラスタ ゼ誘導肺気腫モデル(マウス）エラスターゼ誘導肺気腫モデル(マウス）

d0

d2

d7

容積（

圧ー容積関係
d14

.8

day
d0 0
day
d2 02
d7 07
day
dd14 14
day

*

.4

80
μm
)

*

**

**

60

* p < 0.05** p < 0
0.01
01

40

.2

20

d0

d2

d7

d14

ay 14

d0

ay 07

P=20
0

P=15

10 15 20 (cmH2O)

ay 02

5

0

day 0

0

P=10
0

P=5

0
P=0
0

ml)

*

.6

Lmの推移

*

*

d14

エラスラーゼ投与肺におけるDCの機能：
ゼ投与肺 おけるDC 機能
Ｔ細胞増殖能(Harada et al, 2010)

COPDと樹状細胞（DC)
臨床例での知見 COPD症例の気道上皮内と外層ではDCの数が増えている(Demedts AJRCCM:175:2007)


COPD症例から得られた気管支平滑筋ではCOPD症例から得られた気管支平滑筋では、TSLPの発現が健常人よりも亢進している(Zhang AJPLMP 293:2007)

Sarcoidosisと樹状細胞(DC)T健常人および肺サルコイドーシス症例におけるT細胞
クローナリティの解析
クロ
ナリティの解析 （TCR
（TCR-SSCP
SSCP analyses of V genes)

T細胞のクローナリティの増加

DCによる抗原提示(Dohi M. J Immunol 152:1983, 1994)

SarcoidosisとDC（Zaba L, AJRCMB 42:32, 2010)

SarcoidosisとDCと1
Mathewらの報告(JI 181:746;2008)
 未治療の肺サルコイドーシス患者では、末梢血mDCのT細胞刺激能(MLR)とDTH反応)が低下している（副刺激分子の発現は亢進していても）
 DC機能の低下が、抗原を排除できずに慢性の炎
DC機能の低下が 抗原を排除できずに慢性の炎症に結びついているのでは？

SarcoidosisとDC 2
Otaらの報告(Thorax 59:408;2004)
 肺サルコイドーシス患者では、末梢血mDCとpDCの数がいずれも減少している 肉芽腫組織では、成熟したDCがみられる
肉芽腫組織では 成熟したDCがみられる
 肉芽腫組織では、IFNを産生するDCの数が減少
している肺非小細胞癌とDC
Perrotらの報告(JI 178:2763;2007)
 未治療のNSCLCの肺手術標本をFACS解析
 三種類のDC:末梢血とくらべてmDC(CD11chigh):semimaturepDC(CD11c-) :immature
第三のDCs (CD11cint):immature 全体として抗原提示能は低下している
 mDC,pDCともにリンパ節への遊走能は保持

肺癌の局所では、DCの機能が抑制されている

局所 DC 抗腫瘍免疫を高める戦略
局所のDCの抗腫瘍免疫を高める戦略
Anti-DEC205 Ab(pDC)
A ti DC SIGN Ab(iAnti-DC-SIGN
Ab(interstitialttiti l DC)
GMP adjuvantsj
TLR ligands (TLR3L)
I
Immatinib
i ib
Blocking immunosuppressant (IDO,TGF,
B7-H1,CTLA4) by all-trans retinoic acid

肺のDC研究：今後の課題
 Subsetの多様性に応じた解析
S bsetの多様性に応じた解析 Multi-parameter flow cytometry
特に、DCとalveolar macrophageの分別 イメ
イメージングによる動態の観察
ジングによる動態の観察
 ⼤動物・⼈での解析
適切なマーカー、抗体の開発(例：PET）
 分化
分化・分布の追跡
分布の追跡
lineage tracing system講演内容
 DC総論
分化、サブセット 肺のDCについて
 呼吸器疾患におけるDCの関与
 DCの制御による病態の実験的制御（ レルギ 性気道炎症を例に）（アレルギー性気道炎症を例に）
 難治性呼吸器疾患の制御に向けての実験的検討

樹状細胞機能の制御
実験レベルの物質
 TGF- CpG ODN imidazoquinoline
 Cholera toxin
 抗CD86(B7)抗体 1, 25-dihydroxy vitamin D3
 Fit3L (Fetal(F t l liverlittyrosine
i kinaseki
3
ligand) suppression of osteopontin(OPN)(,yg)
 IDO (indoleamine-2,3-dioxygenase)樹状細胞の機能制御によるアレルギー性気道炎症の実験的制御（演者らの検討）


免疫調節性のサイトカイン・増殖因⼦を⽤いた制御
IL-10
肝細胞増殖因⼦ (HGF)(Okunishi K. 2005)

IFN-




(Nakagome K. 2005)(Nakagome K. 2009)

経⼝免疫寛容 (oral tolerance) による制御(Nagatani K. 2006)

既存の薬剤を⽤いた制御

ロイコトリエン受容体拮抗薬
スタチン製剤(Okunishi K. 2004)

ビスホスホネート（Imamuraa u a M. 2008)008)(Sasaki O. 投稿準備中）

IL-10を用いた制御マウス実験モデルのプロトコール
OVA/Alum ii.p
p.

Day 0
Saline i.p.

OVA inhalation

Day11

18 19 20 21

PBS inhalation

Measurement of AHR
gy
BAL,, Histology

pCAGGS-plasmidpCAGGS
plasmid vector(by Miyazaki J)
CMV-IE
Enhancer

Chicken -actin
promoterAmp
intronpCAGGSp

ECoRI

7.1 kbRat IL-10cDNA

ori
SV40
SV

ECoRI

Rabbit-globulin poly A

Hydrodynamic-based delivery of plasmid vector

Plasmid iv
Lung
Liver

Time course of IL-10 expressionp方法（前投与 p
（前投
pre）
）
day-3

day0

day11

day18-20

day21

Plasmid iv

OVA/alum ip

OVA吸入

気道過敏性
BALF
病理組織

day0

day11

(後投与
post)
OVA/ lOVA/alum
iip

day17

day18-20
day21

Pl
Plasmid
id iv
i

OVA吸入

病理組織
SA

preCONTOVA

preIL-10
preIL
10

ble
o/l
ac

postCONT

postIL-10
postIL10

BALF 総細胞数/細胞分画
総細胞数 細胞分画
cell(/ml)

BALF

700000###: p<0.001 vs preCONT **: p<0.01 vs postCONT

TOTAL

M

Ly

Neu

Eos

600000500000400000300000**###200000###100000

**

0
SA

OA

preCO NT

preIL-10

postCO NT

postIL-10

気道過敏性(g/ml)

PC200Mch##: p<0.01 vs preCONT*: p<0.05 vs postCONT

10000
8000

##

*

6000
4000
2000
v

0
SA

OA

preCO NT preIL-10 postCO NT postIL-10

Cytokine 産生(IL-13)
Lungg cell + OVA

IL 13
IL-13

(pg/ml)8000###: p<0.001 vs preCONT**: p<0.01 vs postCONT

6000
4000

**
###

2000
0
SA

OA

pre CO NT

pre IL-10 postCO NT postIL-10

肺CD11c 陽性細胞の内訳
F4/80 (マクロファ(マクロファージ）:ジ） 1~2%
1 2%
Gr-1（顆粒球）: 1~2%
CD4
C
4
CD8
CD19 (B細胞）< 1%

MHC II: 70%
主に樹状細胞と考えられるが、完全ではない
それ以上のサブタイプの検討はしていない
れ以上 サブタイプ 検討
cDC以外に、pDC・Macrophageの⼀部を含む集団についての解析Lungg CD11c+ APC function
Lungg CD11c+ cell + spleenpCD4+ cell ((DO11.10))

OVA
OVA-presenting
ti capacityit#: p<0.05 vs preCONT*: p<0.05 vs postCONT

0.4
0.3

#

02
0.2

*

0.1
0
SA

OA

pre CO NT

pre IL-10

postCO NT postIL-10

Spleenp
CD11c+APC function
Spleen CD11c+ cell + spleen CD4+ cell (BALB/c) + OVA

OVA
OVA-presenting
ti capacityit#: p<0.05 vs preCONT

1
#

0.8
0.6
0.4
02
0.2
0
OA

pre CO NT

pre IL-10

postCO NT

postIL-10

病理組織(所属リンパ節)
FITC-OVA it
OVA/CONT/OVA

OVA/IL-10/
OVA/IL
10/
OVA

まとめ (1)•IL-10の遺伝⼦導⼊は、感作前でも感作後の吸⼊期（炎症期）でも、アレルギー性気道炎症と気道過敏性の亢進を抑制した。

•

IL-10は、DCの機能を抑制した。

•

炎症期に投与した場合、IL-10のDCに対する抑制効果は肺で強く発揮された。

•

従って、IL-10は、抗原の存在する場所で、全⾝の免疫に影響を及ぼさずにDCの機能を抑制し 抗原特異的免疫反応を制御し得及ぼさずにDCの機能を抑制し、抗原特異的免疫反応を制御し得る可能性が⽰唆された。
(Nakagome K, et al. J Immunol 174:6955, 2005)

ロイコトリエンの受容体拮抗薬を用いた制御

Potential role of cysLTs in allergic airway inflammation( difi d ffrom H(modified
Hamid
id Q
Q, ett al.
l JACI 111:
111 S5,S5 2003)

気道の抗原誘発免疫応答におけるcysLTの関与
ProtocolMice: BALB/c 7 wks

d11

d0

d17

d18

saline i.p.
Pranlukast (Prl) 50 mg/kg i.g.

OVA/Alumi.p.
carboxymethylcellulose (CMC)
Prl low (5 mg/kg)/ high (50 mg/kg)
Montelukast (Mk) (1 mg/kg)

AHR
BALF

LTRAはサイトカイン産生を抑制する
cysLTsLT (pg/ml)( / l)
IL 4 (pg/ml)
IL-4( / l)

IL-5 (pg/ml)

IFN- (pg/ml)

LTRAのT細胞プライミングの抑制効果(ex vivo analyses)
Protocold11

d0

Salinesaline i.p.

OVA

OVA/Alum i.p.
pCollection of spleens

Stimulate with OVA

OVA/Prl
Prl (50 mg/kg i.g.)

OVA/Prl/Ind

AnalysesPrl (50 mg/kg i.g.)+ Ind (4 mg/kg i.p.)

LTRA の投与はＴ細胞のプライミングを抑制する(in vivo)
Cell proliferation

IL-2

Mice treated with:IFN 
IFN-

IL-5
Stimulation:
OVA 100 mg/ml

CD11c+ 樹状細胞はcysLT1受容体を発現する
mouse splenic CD11c+ DCs

CysLT1R

LTRAのDCの機能に及ぼす効果(ex vivo での解析)
Protocold11

d0

Salinesaline i.p.

OVA

OVA/Alum i.p.
pCollection of spleens(CD11c+ selection)

Dendritic cells (DCs)

OVA/Prl
Prl (50 mg/kg i.g.)

OVA/Prl/Ind

AnalysesPrl (50 mg/kg i.g.)+ Ind (4 mg/kg i.p.)

LTRA はDCからのサイトカイン産生を抑制する

IL-10( / l)(pg/ml)IL-12p70(pg )(pg/ml)LTRAはDCの抗原提示能を抑制する
Antigen presenting capacity
DCs were obtained from the OVAsensitized BALB/c mice.

MMC-treated DCs(BALB/c; H-2Dd):
1 x 105 cells/ml
CD4+ T cells(C57BL/6; H-2Db):
1 x 106 cells/ml

アレルギー性気道炎症におけるcysLTsの役割

Dendritic cells( difi d ffrom H(modified
Hamid
id Q
Q, ett al.
l JACI 111:
111 S5,S5 2003)

感作早期のLTRA投与がアレルギ 性気道炎症発症に及ぼす影響
アレルギー性気道炎症発症に及ぼす影響
day 0

11

salinesaline i.p.

OVA/OVA

OVA/Alum i.p.

OVA/Prl/OVA

17 18 19 20 21
PBS aerosol

OVA/Alum i.p.

OVA/Prl/Ind
OVA
OVA/Al
OVA/Alum
i
i.p.

Prl

Prl + Ind

3% OVAaerosol
AHR, BALF,
AHR
BALF P
PathohLung DCs

感作早期のLTRA投与は好酸球性気道炎症を抑制する

BALF Cell differentials

P l
Prl

感作早期のLTRA投与は好酸球性気道炎症を抑制する

気道過敏性(Penh法）
OVA/OVA
OVA/Prl/Ind/OVA

OVA/P l/OVA
OVA/Prl/OVA
saline/PBS

感作早期のLTRA投与は好酸球性気道炎症を抑制する

病理所⾒ (H( & E 染⾊)
saline/PBS

OVA/OVA

OVA/Prl/OVA OVA/Prl/Ind/OVA

感作早期のLTRA投与は炎症期の肺CD11c陽性細胞の抗原提示細胞を抑制する• LTRA was given during earlystage (sensitization)• Lung sample was obtained in theeffector phase• Antigen-presentation
A ti
t ti byb lungl
CD11c+ DCs were analyzed bymeasureing CD4+ T cellproliferation.

抗原特異的制御の可能性
Fujita S, Sato K, et al.(JACI 121:2008)
Tolerogenic DC that induces Treg in an
antigen specific manner

抗原特異的制御性DC
BALB/c or C57BL6
Bone marrow cells
GM-CSF for 8days,then LPS for 1day [maDCs]* DNP-OVA for 3days:[DNP-OVA/maDCs]
GM CSF/IL 10/TGF
GM-CSF/IL-10/TGF-
f 8days,then
for
8d
h LPS
for 1day [DCregs]* DNP-OVA for 3days:[DNP-OVA/DCregs]

Experimental protocol
DNP-OVA; days 0 and 42
y 43-49
OVA inhalation: days
* therapeutic intervention:
IV injection of unpulsed/pulsed DC: 106/mouse
Preventive: on day -7pon days
y 21,28,and, ,35
Therapeutic:
Evaluation: days 50

結果
抗原パルスで誘導した制御性DCは予防的投与 治療的投与のいずれにおいても DNP
予防的投与・治療的投与のいずれにおいても、DNPOVA抗原により惹起される気道のTh2反応（病理所見・
BALF・気道過敏性・抗体産生）をいずれも抑制した。
気敏性 抗体産 ）を ず
抑制。
(Fujita S, Sato K, et al. JACI 121;95, 2008)→人への臨床応用が可能かもしれない

抗原誘導制御性DCの抑制効果
予防的投与

治療的投与

(Fujita S, et al. JACI 121:95-104, 2008)

RAの病因論についての仮説

抗シトルリン化蛋白質抗体

DCreg/Tregによる制御？

(Klareskog L, et al. Lancet 373:659-72, 2009)

講演内容
 DC総論
分化、サブセット 肺のDCについて
 呼吸器疾患におけるDCの関与
 DCの制御による病態の実験的制御制御による病態 実験的制御（アレルギー性気道炎症を例に）
 難治性呼吸器疾患の制御に向けての実験的検討

喘息難治化における、上⽪細胞ー免疫担当細胞間相互作⽤
PAMPs

Allergen

Genetic
background

Air pollution
Oxidant stress

Virus
Bacteria
Fungus(protease)

BEC

DAMPs(Alarmins)

HMGB‐1
UA, ATPDCC

Th1

FGF, PDGFTGF EGF

B

Eo

Histamine, TGF‐cysLTs
LTs,PGs

IgE

LTB4拮抗薬
マクロライド
免疫抑制薬
生物学的製剤

EMTU

FB
SMC

Treg

Th17

cMC

MC

？

TGF IL‐10
IL 10
IL 17 TGF,
IL‐17

IFN
IFN

Th2

EGFR

TLR4

TSLP, GM‐CSF

既存の薬剤(ICS, LTRAなど）

Susceptibility

Neu

CD8



Eo

cysLTs TGF‐Remodeling
e ode gBaso

NKT

IFN,TNF,IFN
TNF IL‐17,
IL 17 IL
IL‐21,
21
LTB4

気管⽀喘息の難治化の機序に関する仮説
PAMPs
Virus
Bacteria
FungusAllergen

Genetic
background(protease)

BEC

DAMPs(Alarmins)
TLR4
HMGB‐1
UA, ATPFGF, PDGF
TSLP, GM‐CSF


DC
C
既存の薬剤
(ICS, LTRAなど）

Th1

Susceptibility
EGFR

TGF EGF

B

Eo

Histamine, TGF‐cysLTs
LTs,PGs

IgE

LTB4拮抗薬
マクロライド
免疫抑制薬
生物学的製剤

EMTU
FB
SMC

Treg

Th17

cMC

MC

？

TGF IL‐10
IL 10
IL 17 TGF,
IL‐17

IFN
IFN

Th2

Air pollution
Oxidant stress

Neu

CD8

Baso



NKT

IFN,TNF,IFN
TNF IL‐17,
IL 17 IL
IL‐21,
21
LTB4

Eo

cysLTs TGF‐Remodeling

治療戦略の⽅向性
 免疫応答の抑制作⽤
 抗線維化作⽤
 上⽪細胞の修復促進作⽤を併せ持つ因⼦は？

Hepatocyte growth factor: HGF◆

identified in primary culture of hepatocyte◆

promotes proliferation of hepatocytes◆

found and DNA sequence determined inlate1980s

Structure of HGF
Inactive single chain

Activated double chain(69kDa)
K1

K2

K3

K4

Processing

Arg

Val

S

αchainactivation

Arg
V l
Val

S
S

S
Ser

Ser

HGF activator
u-PA, t-PA,
Matriptase

βchain(34kDa)Bioactivity of HGF◆ promotes proliferation of various epithelial cells◆ anti-fibrosis◆ anti-apoptosis◆ angiogenesis (enhances tissue repair)◆ promotes chemotaxis of various epithelial cells◆ angiogenesis (enhance metastasis of cancer cells)◆ oncogenesisi ?

HGF induces epithelial cell proliferation
rhHGF
hHGF 100g
100
IT, Day2
D 2

Bronchial tissue

Alveolar wall

HGF enhances epithelial cell proliferation

Prolifeeration rate (%)

Pro
oliferation rate (%)

A

10
8
6
4
2
0
0
5 B
4
3
2
1
0
0

Counted based on PCNA staining*

HGF
SalineBronchial epithelial cell*

1

2 Day 3nn=44, *p<0
p<0.05
05

4

5

HGF
Saline*Alveolar epithelial cell*

(D hi M.
(Dohi
M AJRCCM 162:2000)
162 2000)

1

2

Day

3

4

5

HGF promotes migration of alveolar
epithelial
ith li l cell
ll
HGF

0

(ng/ml)

10

*

30

***

100

**
*p<0.05**p<0 01**p<0.01***p<0.001

30+Ab
30
Ab
FN

10
0

10

20

30

40

50

cell number / 10 fields(Dohi M: AJRCCM 162:2007)

PA/Plasmin fibrinolytic system on cell surface

Latent TGF

PgR

u-PAR
Pl
Plasminogeni

A ti TGF
ActivePro-MMPs

Plasmin

PAI-1,2Pro-u-PA

u-PA

MMPs

Activation of HGF

FibrinFibronectin
Laminin

TIMP

PeptidesCollagenHGF enhances u-PA activity (surface plasmin
generation)) of alveolar epithelial
g
p
cell

u-PA A
Activityy (mU/w
well)

400

**
300

*

*p<0.05**p<0.01

200

100

0

control

HGF10

HGF100

KGF10

KGF100(Dohi M. AJRCCM 162:2002)

HGF attenuates bleomycin-induced
ylungg fibrosis
160

H
Hydroxypprolone (g/left lu
ung)

*
120

**
80

40
*p<0.001 vs Saline** p<0.001 vs Bleomycin

0

SalineBleomycin Bleomycin
Bleomycin‐HGF
HGF(Dohi M. AJRCCM 162:2002)

OVA-induced allergic
g airwayy inflammation
Expression of endogenous HGF
day 0

11

OVA/alumi p
i.p.

(Male BALB/c mice)

18 19 20 21 22

26 27

3% OVA inhalation

BAL, serum, IHCExpression of endogenous HGF during development of inflammation###, p < 0.001 (vs saline mice).

Effect of HGF neutralizingg Ab
day 0

11

OVA/ lOVA/alum
i
i.p.

18

19

20

3% OVA inhalation

Anti-HGF neutralizing Ab (250g)/control IgG(before each OVA inhalation)

Analyses (AHR, BALF, Pathology)

21

Neutralization of end.HGF deteriorates airway inflammation#, p< 0.05; ##, p < 0.01; ###, p < 0.001 (vs saline/PBS mice). *, p < 0.05; **, p < 0.01 (vs mice treated with control IgG).

% OF INJJECTED
D RADIO
OACTIV
VITY
0%*S,M,B
B

BLOOD
D

BRAIN
N

SALIVARYY

120minTHYMUS
S

40%

HEART
T

60min

LUNGS
S

50%

DUO
ODENUMM

AD
DRENALS
S

URINE
E

60%

KIDNIESSSPLEENN

LIVERR

HGF rapidly
p y vanishes from organs
g
70%

15min

30min

30%

20%

10%

(Michalopoulos 1993)

pCAGGS-plasmidpCAGGS
plasmid vector
CMV-IE
CMV
IE
Enhancer

Chicken -actin
promoterAmp
intronpCAGGS

ECoRI

7.1 kbori

Rat HGFcDNA

SV40

ECoRI

Rabbit-globulin poly A

Hydrodynamic-based
Hydrodynamic
based delivery of plasmid
vectorPlasmid iv
Lung
Liver

Se
erum
HG
GF (ngg/ml)

Time course of HGF expression
60
40
#

20
0

Lu
ung
HG
GF (ng/right lung)

HGF expression plasmid
control plasmid

###

d0

d1

30

d3

d5

d7

HGF expressionppplasmidcontrol plasmid##p<0.05#p<0
05###p<0.001

20
10 d0

d1

d3

d5

d7

HGF suppresses DC functions ex vivo
DCs were cococultured with CD4+ T
cells derived from
OVA-sensitized mice(A) or from naïve
DO11.10 mice (B)with OVA in medium.
After 3 days of co
coculture, cellproliferation wasmeasured.

IL‐12p70

IL‐10

DCs were stimulatedwith LPS for 2 days.
Then IL-12p70 (C) and
IL-10 (D) concentrations
were
ere measured.
meas redExogenous HGF attenuates allergic airway inflammation(Okunishi K et al, J Immunol,2005)

HGF suppresses DC function in the lung
Lung DCs were obtained from each group of mice on day 21.
Th
Then,
OVA
OVA-antigenipresentingicapacityi
off DCs
DC were examinedi d bbyco-culture with CD4+ T cells obtained from naïve DO11.10 mice.

A i
Antigenpresentingicapacityi
off lunglDCsDCAnti-HGFAnti
HGF neutralizing Ab

Exogenous delivery of HGF

HGF suppresses airway remodeling(Ito W, et al. AJRCMB 32, 2005)

Masson’s trichrome staining

neg. control
IHC withith -SMA
SMA Abwithout HGF

HGF

気管支喘息の難治化の機序に関する仮説
PAMPs
Virus
Bacteria
FungusAllergen

Genetic
background(protease)

Alarmins

HMGB‐1
UA, ATPDCC

Air pollution
Oxidant stress

BEC

FGF, PDGFTh1TGF EGF

HGF

B

Eo

Histamine, TGF‐cysLTs
LTs,PGs

IgE

LTB4拮抗薬
マクロライド
免疫抑制薬
生物学的製剤

EMTU
FB
SMC

Treg

Th17

cMC

MC

HGF

TGF IL‐10
IL 10
IL 17 TGF,
IL‐17

IFN
IFN

Th2

EGFR

TLR4

TSLP, GM‐CSF

既存の薬剤(ICS, LTRAなど）

Susceptibility

Neu

CD8

Baso



NKT

IFN,TNF,IFN
TNF IL‐17,
IL 17 IL
IL‐21,
21
LTB4

Eo

cysLTs TGF‐Remodeling71歳女性：全身性硬化症 (SSc)：慢性呼吸不全

膠原病の肺病変：免疫反応＋線維化→時に難治化

Is HGF therapy applicable forhumans?

Problems in the application of
HGF for patients
1 HGF vanishes
ni h rapidly
pidl fromf m organsn
2 Recombinant HGF is very expensive
3 H
HGF
F may
m y promote
p m
tumor
um growthg w

% OF INJJECTED
D RADIO
OACTIV
VITY
0%*S,M,B
B

BLOOD
D

BRAIN
N

SALIVARYY

120minTHYMUS
S

40%

HEART
T

60min

LUNGS
S

50%

DUO
ODENUMM

AD
DRENALS
S

URINE
E

60%

KIDNIESSSPLEEN
N

LIVER
R

Problem 1
HGF rapidly vanishes from organs
70%

15min

30min

30%

20%

10%

(Michalopoulos 1993)

Gelatin/HGF significantly suppresses the CIA
severityii id
incidenceA h i i
Arthritis

ControlgelatinGelatin/HGF(Okunishi et al. JI 179:2007)

IT administration of rhHGF/gelatin complex
p
d 0
day

11

OVA/alum i.p.

17

18

19

20 21

3% OVA 吸入

HGF(0/0.3μg) /gelatin 6μg (it)Sacrifice→BAL, lung pathology

Fig. 2

HGF/gelatin attenuates airway inflammation

BALF

BALF cells(x105)

5
4
3

#
#

2

Control(gelatin)
gelatin + HGF 0.3μg

1

#

#
0

total cells

mφ

lym

neu

eos

#, p<0.05

Pathology
control (gelatin)

gelatin + HGF 0.3μg

Fig. 3Galatin/HGF suppresses cytokine production in TLN
*
1500

*

*
8000

*

*

*
6000

IL--5(pg/ml)

IL-44(pg/ml)

IL-4

1000

500

2000

0

0

GelatinGelatin+ HGF

Gelatin

PBS
+ HGF

PBS

Gelatin+
HGF

PBS
+ HGF

#

4000

#

*
IFN-γ(pg/ml)

IL-10(ng//ml)

8000

PBS

*

*

IL 10
IL-10

IL-5

4000

6000

4000

3000

#

IFN 
IFN-

2000

1000
2000

0

0
Gelatin Gelatin
+ HGF

PBS

PBS
+ HGF

Gelatin Gelatin
+ HGF

PBS

PBS
+ HGF

Gelatin/HGF suppresses antigen
presenting capacity of lung DCs
day 0

11

17

OVA/ lOVA/alum
i
i.p.

18

19

20

21

3% OVA inhalation

HGF(0/0.3μg) + gelatin 6μg (it)
Antigen presenting capacity***％ control response

Fig. 4p<0.001

Lung CD11c+DC+
CD4+ T cells from D11
D11.10
10

100
80
60
40
20
0
Control(gelatin)gelatin +HGF（Okunishi and Sasaki, 2010)

Problem 2
R
Recombinantbit HGF isi very expensiveirhHGF: ≒100$/g
Bleomycin-induced
ylungg fibrosis
rhHGF: 100g x 2 (Dohi: AJRCCM 2000)
app. 1/600

OVA-induced
OVA
induced allergic airway inflammation
rhHGF(/gelatin): 0.3g x （Okunishi:2010)

Problem３
HGF is an angiogenic growth factor
 Carcinogenesis is a multi-step process.

 HGF is not a carcinogen.
 Injection of HGF plasmid did notaffect tumor growth.
(Matsuki et al. BBRC

315:2004)

HGF does not acceralate tumor progression

A: HGF plasmid

B: control plasmid(A431 cell: human epidermoid cancer cell line)

Tumor volume(Matsuki,BBRC 315:2004)

結語
 呼吸器系には複数のサブセットの樹状細胞が存在し異なる機能を発揮している 疾患ごとに関与するDCに特徴がある可能性がある サブセットごとの機能を詳細に解析するためには今後の技術的進歩が不可欠である DCの機能を制御することで、肺における免疫応答
DCの機能を制御することで 肺における免疫応答を制御できる可能性がある
 難治性の呼吸器病態の克服には、複数の作用を同時に併せ持つ因子の活用が必要かもしれない

共同研究者 • 研究協力者
東京大学医学部

大阪大学医学部大学院

アレルギーリウマチ内科

遺伝子治療学中込 之（現:ウイスコンシン大学）
中込一之
（現 ウイ
シ 大学）
奥西勝秀（現:ミシガン大学）
今村充
原田広彰
佐々木欧
田中良 （現：田中内科クリニック）
田中良一（現 田中内科クリ
ク）
山本一彦

宮崎純
宮崎純一
腫瘍生化学
中村敏一
京都大学再生医科学研究所
田畑泰彦

ご清聴ありがとうございました