アルファベット

αlphaVET™ ウシ A1A2 ジェノタイピング qPCR Kit -RUO- マニュアル（第 1 版）

ウシ β-カゼイン A1A2 遺伝子多型キット
アルファベット

αlphaVET™
ウシ A1A2 ジェノタイピング qPCR Kit -RUOマニュアル（第 1 版）

品番 D001

株式会社ニッポンジーン

I製品説明アルファベット

αlphaVET™ ウシ A1A2 ジェノタイピング qPCR Kit -RUO-は、加水分解プローブ法を利用して、ウシ β-カゼイン遺伝子（CSN2）の A1A2 型判定を行うためのキットです。増幅試薬、Primer/Probe、Positive Control、ddWater を含むオールインワンのキットであり、検体 DNAを準備するだけで Genotyping 実験が可能です。本品はパッシブリファレンス色素が予め混合されているため、ROX 補正が必要な機種においても追加で添加いただく必要はございません。

II 製品内容
アルファベット

αlphaVET™ ウシ A1A2 ジェノタイピング qPCR Kit -RUO- （品番 D001）
キット構成品

容量（50 反応用）

備考

2X Genotyping Mix

500 μL × 1 本酵素、基質、パッシブリファレンス色素等を含む

10X Primer/Probe Mix

100 μL × 1 本

蛍光標識プローブを含む

Positive Control A150 μL × 1 本

Positive Control A2

50 μL × 1 本

Positive Control A1A250 μL × 1 本

ddWater

500 μL × 1 本

III

脱イオン蒸留水（ヌクレアーゼフリー）

保存

輸送・保管温度：-20℃、遮光（キット開封後は必ず遮光して保存ください）IV 使用上又は取扱い上の注意
・ 本品は、動物用研究用試薬ですので、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は使用しないでください。
・ 本品の取り扱いは、本マニュアル記載内容通りに行ってください。
・ 本マニュアル記載内容と異なった使用方法によるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
・ 製品安全データシート（SDS）は、ニッポンジーン Web サイト（www.nippongene.com）
よりご覧いただけます。
本キット構成品の「2X Genotyping Mix」は危険有害性のあるアセトアミドを含んでおります。使用後は必ず付属のアルミ袋に入れて保管ください。
1

V プロトコール＜キット以外に必要な器具、機器など＞
器

具： ・マイクロピペット
・ピペットチップ・マイクロチューブ・PCR チューブ、プレート、シール機

器： ・遠心分離機
・ボルテックスミキサー
・リアルタイム PCR 装置（FAM および VIC チャンネルを検出可能な機種）＜操作＞
V-1. 検体 DNA の調製
血液や組織等より市販の DNA 抽出キットを使用して検体 DNA を抽出します。血液よりDNA 抽出を実施する場合、CoCoMo-BLV™ DNA Pure SPIN（A001）を推奨します。
CoCoMo-BLV™ DNA Pure SPIN（A001）を使用して新鮮なウシ全血から検体 DNA を抽出した場合、約 100 - 200 ng/μL の濃度で検体 DNA を抽出できます。
V-2. リアルタイム PCR 反応液の調製
下記の表に従い PCR 反応液を調製します。検体 DNA 以外の試薬を必要量+1 反応分をまとめて調製後、分注し Total Volume が 20 µL となるように検体 DNA を添加することを推奨します。
1 反応あたりの組成
2X Genotyping Mix

10 μL

10X Primer/Probe Mix

2 μL

検体 DNA（1 μg 以下）*_ μL

ddWater_ μL

Total Volume20 μL* 検体 DNA は 5 - 500 ng の範囲で添加することを推奨しております。Positive Controlを添加する場合は、2 µL を添加します。

反応液および検体 DNA を添加後、PCR チューブ/プレートにしっかりと蓋/シールをして、遠心分離を行い、下記 V-3 の条件に従ってリアルタイム PCR 装置で反応を開始します。

2V-3. リアルタイム PCR 条件
下記のリアルタイム PCR 条件で反応を開始します。Run mode は Standard で実施し、ジェノタイピング用の設定がある機種はジェノタイピング用設定で Run することを推奨します（PCR サイクルは下記を遵守ください）。
【リアルタイム PCR 条件（Run mode：Standard）】
ステップ

サイクル数

温度

反応時間

蛍光検出

1195℃

10 分

OFF

24595℃

15 秒

OFF62℃

40 秒

ON

3

* ROX 補正が必要な機種の場合、ROX 補正を ON にしてご利用ください。
【Run 設定の例（QuantStudio™ Design & analysis Software v1.5.2 （Thermo Fisher 社）の場合）】
1.

起動後、「Create New Experiment」を選択ください。

2.

Instrument type、Block type はご使用の機器に応じた設定をしてください。

3.

Experiment type は「Genotyping」を、Chemistry は「TaqMan® Reagents」を、Run modeは「Standard」を選択してください。選択後、「Next」を選択ください。

4.

Volume を「20 μL」に設定してください。

5.

「Genotyping」のモードでは、Pre-Read Stage と Post-Read Stage がありますので、そのまま PCR サイクルを設定ください。実際のサイクルは下記のようになります。
ステップ 1 と 5 が Pre-Read Stage と Post-Read Stage になります。設定後は「Next」を選択ください。
ステップ

サイクル数

温度

反応時間

蛍光検出

1

160℃

30 秒

ON

2

195℃

10 分

OFF

3

4595℃

15 秒

OFF62℃

40 秒

ON60℃

30 秒

ON

4
5

6.

1

Passive Reference は「ROX」を設定ください。
Reporter は「VIC」と「FAM」をご選択ください。Quencher は「NFQ-MGB」をご選択ください。サンプル設定後は「Next」を選択ください。

7.

Run を開始してください。

3V-4. 判定【検出チャンネル】
検出対象遺伝子

蛍光フィルター

クエンチャー

β-カゼイン（CSN2）_A1 型

VIC

Dark Quencher

β-カゼイン（CSN2）_A2 型

FAM

Dark Quencher

【判定】

VI

増幅色素

判定

VIC のみA1 型

FAM のみA2 型

VIC および FAM

A1A2 型

検出領域について下記にウシ β-カゼイン遺伝子（CSN2）の配列を示します（一部抜粋）。
Chromosome 6, exon 7-TCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATCC（A/C）TAACAGCCTCCCACAAAACATCCCTCCT -上記の配列に赤字で記載の箇所が本キットで検出可能な一塩基多型の箇所になります。遺伝
子配列が CAT の場合、67 番目のアミノ酸がヒスチジンをコードする配列となり、β-カゼインは A1 型と判定されます。遺伝子配列が CCT の場合、67 番目のアミノ酸がプロリンをコードする配列となり、β-カゼインは A2 型と判定されます。

4

VII 反応例
CoCoMo-BLV™ DNA Pure SPIN（A001）を使用して、65 検体のウシ全血より検体 DNAを抽出した。
抽出プロトコールはキットの取扱い説明書の通りに行った。
1 反応あたり 100 ngの検体 DNA を使用して、本キットを用いてβ-カゼイン遺伝子のジェノタイピングを実施した。その結果、遺伝子型特異的な結果が得られた。

5

VIII トラブルシューティング
トラブル

予想される原因

対 策

FAM チャンネル増幅時

qPCR 反応中の蛍光ノイ正常な反応ですのでそのままご利用くだに VIC チャンネルで微弱ズ。

さい。本キットは加水分解プローブを利用なシグナルがある。もしして Allele 特異的に検出する反応系です。

くは、VIC チャンネル増高感度な検出機器を使用した場合、蛍光ノ幅時に FAM チャンネルイズとして微弱な蛍光シグナルが観察さで 微 弱 な シ グ ナ ル があれる場合がありますが、品質に問題はござる。

いません。

検体 DNA を添加してい抽出した検体 DNA に阻吸光度法により検体 DNA の品質を確認するが反応しない。

害物質が残存している。

ることを推奨します。

試薬の調製方法を間違っ本マニュアルに記載した方法で調製し、再ている。

度試験してください。

検体 DNA の添加量が過吸光度法、蛍光法などにより検体 DNA に剰もしくは不足してい含まれる DNA 量を確認することを推奨しる。

ます。一般的な DNA 抽出キットのプロトコールに従って抽出した DNA をそのまま添加可能ですが、検体 DNA 量の目安としては 1 反応あたり 5 – 500 ng 添加することを推奨します。

ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロー

検 体 DNA も し く は

検体 DNA および Positive Control の添加前

ル の ウ ェ ル に 増 幅 が見

Positive Control がコンタにネガティブウェルを調製し、蓋をしておられる。

ミネーションしている。

くことでコンタミネーションを防止できます。

IX 関連製品
Code No.

製品名

包装単位

A001

CoCoMo™-BLV DNA Pure SPIN

100 回用6マニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
診断試薬部 動物用研究用試薬 販売窓口
〒930-0982 富山県富山市荒川 1 丁目 1 番 25 号

TEL
076 - 442 - 3611
E-Mail info-dd@nippongene.com
受付時間：平日 9:00－12:00、13:00－17:00

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