受賞者講演要旨《農芸化学技術賞》

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PCR による食物アレルゲン検査法の開発、公定法化、市販キット化

ハウス食品グループ本社株式会社
はじめにの中で使用できるようにした．他にも推奨表示品目「キウイフ食物アレルギーは重要な社会課題の一つである．症状を誘発ルーツ」「もも」「りんご」の PCR 法開発と市販キット化，現在する抗原量は総タンパク質として数 ppm（μg/g･mL）濃度レベは特定原材料に追加検討中の「カシューナッツ」の検査法開発

ルとされ，患者がアナフィラキシーショックで死に至る危険性を進めている．以下，我々の PCR 検査法開発のキーとなる設もある．1999 年に CODEX 規格に食物アレルギーに関する表計思想と判定技術を中心に解説する．

示が収載されて以降，患者の健康危害発生防止の観点から日本

表 1.

や諸外国で食物アレルギー表示制度が施行されてきた．施行に食物アレルゲン検査法（公定法とハウス開発検査法）

より患者 ･ 家族は加工食品中のアレルゲンの種類を把握可能となり，過度に食の選択の幅を狭めることなく発症原因となるアレルゲンを含まない食品を選択可能となった．適正な表示には，食品企業によるトレーサビリティ管理や自主検査による検証，都道府県によるモニタリング検査と製造記録の確認による表示の妥当性監視などが必要となり，検査法の整備が不可欠となる．ここでは，ハウス食品グループの食物アレルギーへの取り組みの一つ「PCR による食物アレルゲン検査法の開発 ･ 公定法化 ･ 市販キット化」と今後の展望を述べる．
1.

ハウス食品グループの食物アレルギーへの取り組み

2.

PCR による食物アレルゲン検査法の開発
2‒1.

検査法の設計思想（PCR 標的分子選定）

食物アレルゲン検査法の標的分子として「発症原因となるアレルゲンタンパク質」や「それをコードする DNA 配列」を選定する思想には納得性があり，受入れやすい．一方，発症原因と我々は，グループ理念「食を通じて人とつながり、笑顔あるなるタンパク質は一人の患者 ･ 一つの食品で一種類だけとは限暮らしを共につくるグッドパートナーをめざします。」のもと，らず，患者により異なることも知られている．そこで我々はこ

食物アレルギーへの取り組みとして，患者に寄り添う「食物アれら標的分子にこだわらず，「アレルギーを誘発する食品に特レルギー配慮製品の製造 ･ 販売」，診療現場における必要最小徴的な DNA 配列」＝「その食品の存在を示すマーカー分子」と限の原因食物の除去に基づく食事指導のための「加工食品のアいう思想で，「系統分類に用いられており生物種広範に報告さレルゲン含有量早見表を通じた医師への自社製品中のアレルゲれている配列」かつ「マルチコピー配列」として知られる inter-ン量の情報提供」，原料 ･ 製品の安全性検証のための「アレルゲnal transcribed spacer（ITS）や 16S rRNA gene 領域の特徴的ン検査法開発」などを行なっている．検査法開発については，な DNA 配列を PCR 標的分子とした．これら領域の選定は，日本の表示制度施行前から PCR に着目した技術開発に着手し表示制度で求められる「特異性」と「感度」を満たす PCR 検査て，自社だけでなく世の中で活用できる信頼性の高い検査法開法を開発する上でのキーとなる．例えば，確立した検査法の発 ･ 公定法化 ･ 市販キット化を進めてきた．具体的には ①日本「特異性」は，検出対象とした生物種 ･ その近縁種 ･ 各種食品マで義務表示となる特定原材料 8 品目のうち PCR 確認検査の対トリクスなど実試料での検証が必要である．一方で，それら全象全 6 品目「えび」「かに」「小麦」「そば」「落花生」「くるみ」のてを入手しての検証は現実不可能である．今回 我々が標的分検査法を開発，②これら検査法が国のガイドライン記載の性能子とした系統分類に用いられる領域は，検出対象生物種（例：を有することを国立医薬品食品衛生研究所ならびに参画機関とえび 300 属以上，かに 40 属以上，小麦の食用栽培種 ･ 古代種 ･の多機関バリデーションにより検証，日本の公定法として消費交雑種など）だけでなく，それらの近縁野生種を含めた配列情者庁通知に収載（2009 年 えび ･ かに PCR 法，2023 年 小麦 ･ そ報も報告されている．これら情報を検査法開発の初期段階から

ば ･ 落花生 ･ くるみリアルタイム PCR 法），③ライセンス先の活用することで，表示対象の生物種に加えて，収穫時の近縁野株式会社ファスマックにてこれら検査法を市販キット化して世
表 2.

図 1.

ハウス食品グループの食物アレルギーへの取り組み

PCR による食物アレルゲン検査法の標的 DNA 配列

12《農芸化学技術賞》
表 3.

各種リアルタイム PCR の標的生物種受賞者講演要旨

開発を進めてきた．開発した検査法は多機関バリデーションに
より消費者庁「食品表示基準について－アレルゲンを含む食品の検査方法－別添 4 アレルゲンを含む食品を評価するガイドライン」に記載の性能を有することを確認して，公定法化した．
また，市販キット化により検査用試薬の品質安定化を図り，広く世の中で使える技術とした．我々の技術が，えび ･ かにを区別した表示や 2023 年 3 月のくるみ表示の法制化，食物アレルゲン検査の公定法へのリアルタイム PCR 導入など，日本の食物アレルギー表示制度と公定法の進展の一助となり，患者 ･ 家族の食の選択の幅を広げることに繋がるものと信じている．
表示制度施行から 20 年以上が経過した現在，臨床における食事指導もアレルゲンの完全除去（食べない）から必要最小限の除生種の混入リスクも踏まえて設定した検出対象とすべき生物種去（食べられる量は食べる）へと変遷している．医師や患者･家に柔軟に対応した PCR プライマー設計が可能となる．また「感族が求める情報も，アレルゲンの有無から含有量へと変わるこ度」には標的配列のコピー数が影響する．今回マルチコピー配とも想定される．事実，医師向け「加工食品中のアレルゲン含有列を PCR 標的分子としたことで，アレルゲンタンパク質を量早見表」では ppm から % レベルの測定値が求められており，コードする DNA 配列を標的分子とした場合と比べて 10～100

今後も世の中の変化に対応した技術開発を進めたい．

倍高感度となった．これにより，例えば従来の小麦 PCR 検査（引用文献）

法 で 検 出 困 難 な， 加 圧 加 熱 処 理 を 経 た「レ ト ル ト 食 品 中 の1）Hirao T., Imai S., Sawada H., Shiomi N., Hachimura S., Kato H.
PCR method for detecting trace amounts of buckwheat(Fagopyrum spp.) in food. Biosci. Biotechnol. Biochem., 69,724–731 (2005).
2）Hirao T., Hiramoto M., Imai S., Kato H. A novel PCR methodfor quantification of buckwheat by using a unique internal
standard material. J. Food Prot., 69, 2478–2486 (2006)
3）Taguchi H., Watanabe S., Hirao T., Akiyama H., Sakai S., Watanabe T., Matsuda R., Urisu A., Maitani T. Specific detection ofpotentially allergenic kiwifruit in foods using polymerase chain
reaction. J. Agric. Food Chem., 55, 1649–1655 (2007)
4）Hirao T., Watanabe S., Temmei Y., Hiramoto M., Kato H.
Qualitative PCR methods for detecting major food allergens(peanut, soybean, and wheat) by using internal transcribedspacer region. J. AOAC Int., 92, 1464–71 (2009)5）Taguchi H., Watanabe S., Temmei Y., Hirao T., Akiyama H.,
Sakai S., Adachi R., Sakata K., Urisu A., Teshima R. Differential detection of shrimp and crab for the food labeling using
polymerase chain reaction. J. Agric. Food Chem., 59, 3510–3519 (2011)6）Watanabe S., Taguchi H., Temmei Y., Hirao T., Akiyama H.,
Sakai S., Adachi R., Urisu A., Teshima R. Specific detection of potentially allergenic peach and apple in foods using polymerase
chain reaction. J. Agric. Food Chem., 60, 2108–2115 (2012)7) 田口大夢，永富靖章，菊池亮，平尾宜司 特定原材料えび ･ かにの PCR 確認検査法の適用性．食品衛生学雑誌，55, 1–12 (2014)8) Miyazaki A., Watanabe S., Ogata K., Nagatomi Y., Kokutani R.,
Minegishi Y., Tamehiro N., Sakai S., Adachi R., Hirao T. Realtime PCR detection methods for food allergens (wheat, buckwheat, and peanuts) using reference plasmids. J. Agric. FoodChem., 67, 5680–5686 (2019)9) 宮﨑明子，田口大夢，渡辺聡，緒方京子，永富靖章，上田涼太，清水賢，平尾宜司 小麦・そば・落花生の定性リアルタイ
ム PCR 検査法に関する適用性評価．食品衛生学雑誌，64, 34–
46 (2023)
10) 平尾宜司 PCR によるアレルギー原因食品の検出技術．化学と生物，47, 853–860 (2009)11) 田口大夢，永富靖章 特定原材料「えび」･「かに」の PCR 確認
試験法．食品衛生学雑誌，52, J349-J354 (2011)

10 ppm タンパク質濃度（表示基準閾値）の小麦」を検出可能となった．
2‒2.

リアルタイム PCR の判定技術（基準プラスミド開発）

リアルタイム PCR は遺伝子組換え作物検査法などで採用されているが，装置特性の違いにより「使用できるリアルタイムPCR 装置の機種は限定」されていた．また 10 ppm 未満に相当する PCR サイクル後半で稀に観察される「検査環境などに存在するアレルゲン由来の微弱な増幅シグナル」が結果判定を困難にしていた．これら課題の解決のため，我々は試料の陽性／陰性を明確に判定する基準を開発し，小麦 ･ そば ･ 落花生 ･ く
るみリアルタイム PCR に採用した．具体的には，PCR 標的分子とした DNA 配列を含むプラスミドを作製，加圧加熱モデル
食品中の 10 ppm 相当量のアレルゲンを確実に陽性と判定する
基準プラスミド量が 50 コピー／反応液となることを検証，同時測定した「試料 DNA 50 ng」と「基準プラスミド 50 コピー」の Cq 値（quantification cycle）を比較して試料の陽性／陰性を判定した．これにより，リアルタイム PCR 装置の機種を限定することなく、微弱な増幅シグナルを陰性と判定した上で明確な結果を得ることのできる、実用的な検査が可能となった．

図 2.

基準プラスミドを用いたリアルタイム PCR 判定

おわりに我々は「特異性と感度を確保するための PCR 検査法の設計

謝辞

本賞にご推薦いただきました女子栄養大学 加藤久思想」，「実用的検査法とするための基準プラスミドを用いたリ典先生，検査法開発 ･ 多機関バリデーション ･ 公定法化 ･ キッ

アルタイム PCR 判定技術」により，食物アレルゲン検査法のト化でご指導 ･ 共創いただいた皆様方に心より感謝いたします．