動物組織、魚介類、昆虫からの DNA 抽出キット
アイソス

ピン

ISOSPIN Tissue DNA
マニュアル（第 2 版）

Code No. 316-08891

NIPPON GENE CO., LTD.

I 製品説明ISOSPIN Tissue DNA は、動物組織、魚介類、昆虫などから高純度なゲノム DNA を抽出・精製するためのキットです。
本キットでは、Proteinase K と界面活性剤存在下での加熱処理により試料を溶解させ、DNA以外のタンパク質や多糖類等の夾雑物を遠心分離により除去してから、スピンカラム法でDNA を精製します。そのため、効率的に組織から DNA を回収することができ、特に今まで抽出困難であった粘性物質（多糖類）等を多く含む魚介類などから高純度の DNA を抽出することができます。
本キットは、カオトロピックイオン存在下で DNA がシリカへ吸着する原理を応用したスピンカラムによる DNA 精製方法を採用しており、人体に有害なフェノールやクロロホルム等の毒性有機溶媒を使用しません。また、使用するスピンカラムに内封されたシリカメンブレ
ンは、充分な DNA 吸着容量と高い溶出効率を確保しています。

II キット内容
輸送・保管温度：
キット内容：

室温（到着後、Proteinase K は－20℃保存）ISOSPIN Tissue DNA（50 回用）

キット内容品

容量

備考

Ti Extraction1 Buffer

22.5 ml × 1 本

Ti Extraction2 Buffer

2.5 ml × 1 本

Ti Binding Buffer

30 ml × 1 本

エタノール含有*1, *2

Ti Wash1 Buffer

40 ml × 1 本

エタノール含有*1, *2

Ti Wash2 Buffer

45 ml × 1 本

エタノール含有*2

RNase A (100 mg/ml)

250 μl × 1 本

長期保存の場合、冷蔵/冷凍*3

Proteinase K (20 mg/ml)

1 ml × 1 本

Elution Buffer

3 ml × 1 本

Spin Column50 本 × 1 袋

*1

冷凍保存
上部パーツ：カラム
下部パーツ：Collection Tube

Ti Binding Buffer および Ti Wash1 Buffer は、ボトルの蓋を開ける際の湿度の変化により、ボトルの口まわりに白い結晶が生じる場合があります。蓋を閉めた後、さらにチャック付き袋等に入れて保管することをおすすめします。DNA 抽出操作には影響ありません。

*2

Ti Binding Buffer、Ti Wash1 Buffer、Ti Wash2 Buffer にはエタノールが含まれています。ご使用後は蒸発を防ぐため速やかに蓋を閉め、保管して下さい。

*3

RNase A は室温保存が可能ですが、長期間ご使用にならない場合には、冷蔵（2～10℃）もしくは冷凍（－20℃）保存して下さい。

1

III 使用上の注意・ 本品は、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。
・ 本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。
・ マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
・ 製品安全データシート（SDS）につきましては、ニッポンジーンのウェブページ（https://www.nippongene.com/siyaku/list.html）よりご覧になれます。

IV プロトコール＜プロトコールの選択＞
プロトコール B *標準プロトコールペッスルを使用してホモジナイズし、56℃で 45 分間～180 分間 **65℃で 15 分間加温して試料を溶解試料が溶解するまで加温（オプション操作：90℃ 10 分間加温を追加）* 試料が少量（25 mg 以下）の場合、ペッスルを使用したホモジナイズ処理を省略したプロトコール B を選択できます。
** 組織片の重量により溶解にかかる時間は変わります（VI. データ, p.8）。

↓夾雑物を遠心分離により除去↓
スピンカラム精製

標準プロトコール（オプション操作なし）の場合、約 90 分間で DNA を回収できます。

＜キット以外に必要なもの＞
・ボルテックスミキサー・マイクロピペット
・ピペットチップ・ペッスル
・1.5 ml マイクロチューブ
・遠心分離機（4℃）
・ヒートブロック（65℃または 56℃、必要に応じて 90℃）
＜必要に応じて別途用意するもの＞
・ハサミ（またはメス、カッターなど）
・液体窒素、乳鉢、乳棒

2

＜標準プロトコール＞
効率よく組織を破砕するため、チューブの形状に合わせたペッスルを使用して下さい。
試料の溶解① 細断した 5-100 mg の組織（試料）を 1.5 ml マイクロチューブに入れる。
注）あらかじめ、組織を滅菌処理したはさみなどで細かく刻むか、液体窒素中で粉砕する。
注）試料の量が多すぎると、試料の溶解が不十分となり DNA の分解が進んだり、カラムが目詰まりしたりするため、少量の試料から検討を始め、段階的に試料の量を増やす。

② 試料に 450μl の Ti Extraction1 Buffer を加え、ペッスルですり潰す。
注）懸濁液中に試料の塊が残っていると塊の中の DNA が抽出できず、収量低下の原因となるため、念入りにすり潰す。チューブを光にかざすと懸濁液中の塊が確認しやすい。

③ オプション：90℃で 10 分間加温する（静置）。加温後、室温で 5 分間冷ます。
注）粘性物質などでカラムが目詰まりする、試料の色素が最終溶液に残る場合は、本操作③（オプション）を行う。夾雑物が少ない試料の場合、本操作を省略できる。

④ 5μl の RNase A、20μl の Proteinase K を加え、ボルテックスでよく撹拌する。
65℃で 15 分間加温する。加温中、5 分おきに 10 秒間ボルテックスで撹拌する。
↓
夾雑物を遠心分離により除去⑤ 50μl の Ti Extraction2 Buffer を加え、20 秒間ボルテックスで撹拌する。
遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、上清を新しいマイクロチューブに回収する。
注）沈殿物や液表面の膜上の析出物をなるべく取らないように上清を回収する。
注）回収した上清に析出物が多く入ってしまった場合、再度遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、析出物をペレットにしてから上清を回収する。

⑥ 上清に対して等量の Ti Binding Buffer を加え、均質になるまで転倒混和する。
遠心（13,000×g、30 秒間、4℃）し、上清（混合液）を新しいマイクロチューブに回収する。
例）上清 450μl の場合は、Ti Binding Buffer 450μl を添加するため、混合液は 900μl になる。

↓スピンカラム精製⑦ メンブレンに DNA を吸着させるため、900μl の混合液を Spin Column に添加する。
注）混合液量が 900μl より多い場合はステップ⑦～⑧を繰り返して、1 本の Spin Column に全量を添加する。

⑧ 遠心（13,000×g、1 分間、4℃）し、ろ液を捨てて、カラムを Collection Tube の上に再度戻す。
⑨ 700μl の Ti Wash1 Buffer を Spin Column に添加し、遠心（13,000×g、1 分間、4℃）3

する。ろ液を捨てて、カラムを Collection Tube に再度戻す。
⑩ 500μl の Ti Wash2 Buffer を Spin Column に添加し、遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。
⑪ 300μl の Ti Wash2 Buffer を Spin Column に添加し、遠心（13,000×g、2 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
注）Ti Wash2 Buffer による 2 回目の洗浄では、添加量と遠心時間が異なる。

⑫ Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上にのせる。
⑬ DNA を溶出させるため、50μl の Elution Buffer をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。
注）Elution Buffer（10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA）の代わりに Nuclease フリー水も溶出液として使用できる。

⑭ 遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。
⑮ DNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される。

＜プロトコール B＞
ペッスルを使用しない場合、以下の手順で試料を溶解して下さい。
試料の溶解① 5-25 mg の組織（試料）を 1.5 ml マイクロチューブに入れる。
注）あらかじめ、組織をはさみなどで細かく刻むか、液体窒素中で粉砕する。
注）少量の試料（5 mg）から検討を始め、段階的に試料の量を増やす。

② 試料に 450μl の Ti Extraction1 Buffer を加え、ボルテックスでよく撹拌する。
20μl の Proteinase K を加え、ボルテックスでよく撹拌する。
③ 56℃で試料が溶解するまで加温する。加温中、5～15 分おきに 10 秒間ボルテックスで撹拌する。
注）組織片の重量により溶解にかかる時間は変わるため、データ VI（p.8）を参照する。

④ 5μl の RNase A を加え、ボルテックスでよく撹拌する。室温で 5 分間冷ます。
↓ステップ⑤以降（夾雑物除去とスピンカラム精製）は、＜標準プロトコール＞と同じ

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■ 標準プロトコール（簡易版）
効率よく組織を破砕するため、チューブの形状に合わせたペッスルを使用して下さい。
5-100 mg の細断した動物組織（試料）を 1.5 ml マイクロチューブに入れる
450μl の Ti Extraction1 Buffer を加え、塊がなくなるまでペッスルですり潰す
オプション：90℃で 10 分間加温（静置）し、そのあと室温で 5 分間冷ます（夾雑物が少ない試料の場合、省略可能）

5μl の RNase A、20μl の Proteinase K を加え、ボルテックスでよく撹拌
65℃で 15 分間加温（5 分おきに 10 秒間以上ボルテックスで撹拌）50μl の Ti Extraction2 Buffer を加え、20 秒間以上ボルテックスで撹拌遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、析出物をペレットにする
析出物をなるべく取らないように上清を新しいマイクロチューブに回収
上清に対して等量の Ti Binding Buffer を加え、均質になるまで転倒撹拌遠心（13,000×g、30 秒間、4℃）
上清（混合液）を新しいマイクロチューブに回収
Spin Column に 900μl の混合液を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）、ろ液を捨てる
混合液の残り（全量）をカラムに添加し、同様に遠心してろ液を捨てる
700μl の Ti Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）、ろ液を捨てる500μl の Ti Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
300μl の Ti Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g、2 分間、4℃）、ろ液を捨てる
Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブに付け替える
50μl の Elution Buffer をメンブレン中央に滴下
室温で 3 分間静置
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
DNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される

5■ プロトコール B（簡易版）
ペッスルを使用しない場合、加温（56℃で最長 180 分間）して試料を溶解して下さい。
5-25 mg の細断した動物組織（試料）を 1.5 ml マイクロチューブに入れる
450μl の Ti Extraction1 Buffer を加え、ボルテックスでよく撹拌
20μl の Proteinase K を加え、ボルテックスでよく撹拌
56℃で試料が溶解するまで加温（5～15 分おきに 10 秒間以上ボルテックスで撹拌）5μl の RNase A を加え、ボルテックスでよく撹拌
室温で 5 分間冷ます
50μl の Ti Extraction2 Buffer を加え、ボルテックスで 20 秒間以上撹拌
遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、析出物をペレットにする
析出物をなるべく取らないように上清を新しいマイクロチューブに回収
上清に対して等量の Ti Binding Buffer を加え、均質になるまで転倒撹拌
遠心（13,000×g、30 秒間、4℃）
上清（混合液）を新しいマイクロチューブに回収
Spin Column に 900μl の混合液を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）、ろ液を捨てる
混合液の残り（全量）をカラムに添加し、同様に遠心してろ液を捨てる
700μl の Ti Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）、ろ液を捨てる500μl の Ti Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
300μl の Ti Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g、2 分間、4℃）、ろ液を捨てる
Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブに付け替える
50μl の Elution Buffer をメンブレン中央に滴下
室温で 3 分間静置
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
DNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される

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V トラブルシューティング
トラブル

予想される原因

対策

低収量

DNA が分解して・ 新鮮な試料を用いる。

いる。

・ すぐに DNA 抽出できない場合は、速やかに凍結させる。
・ 保存状態が悪い試料の場合、オプション操作の 90℃加温（標準プロトコールのステップ③）をやめる。

Ti Extraction1

・ Ti Extraction1 Buffer 中で試料の塊がなくなり、均一な懸Buffer 中 の 試 料濁液となるまで、ペッスルを用いて念入りにすり潰す。のホモジナイズ

・ チューブ形状に適したペッスルを用いる。例えば、丸底が不十分。

チューブには丸底チューブ用のペッスルを使用する。事前に空のチューブにペッスルをはめて、隙間がないか確認する。

低純度

粘性物質を含む多糖類などの夾・ オプション操作（標準プロトコールのステップ③）を行う。

雑物が多い試料である。
Spin Column に、 ・ ステップ⑥で、試料によっては目視で分かりづらいゲル状
Ti Binding Bufferの沈殿物を形成することがある。上の方から慎重に上清を添加後の遠心で800μl 取って新しいチューブに移し、残りの上清を先の細生じた沈殿（夾雑いチップで回収する。沈殿があるとチップ内で液が詰まり物）が持ち込まれ吸引しにくくなるので、上清と沈殿の判別ができる。

た。
洗浄が不十分。

・ Ti Wash1 Buffer による洗浄（ステップ⑨）を 400μl と300μl に分けて 2 回行う。
・ ステップ①で、試料量を半分以上減らす。

Spin Column の夾雑物が取り除・ 上記「低純度」の対策を行う。

目詰まりかれていない。

・ そのまま操作を続けたい場合は、遠心時間を 2 倍程度に延長し、カラムから Buffer が抜けたら次工程へ進む。しかしこの場合、抽出物の純度は低くなる可能性がある。

吸光度値のばらつき低収量である。

・ 上記「低収量」の対策を行う。

低純度である。

・ 上記「低純度」の対策を行う。

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VI データ
１．標準プロトコールとプロトコール B の比較
標準プロトコールではペッスルを使用して試料のホモジナイズを行っているのに対し、プロトコール B では、ペッスルを使用しないで 56℃での加温により試料を溶解しています。このとき、組織片の重量により溶解にかかる時間は変わります。

＜プロトコール B で組織片の溶解にかかる加温時間＞（各重量の組織片を 56℃で加温中、15 分おきにボルテックスした場合）
組織5 mg

10 mg

15 mg

20 mg

25 mg

マウス肝臓

60 分

90 分

120 分

150 分

180 分

トリ肝臓

45 分

75 分

75 分

105 分

120 分

アサリ外套膜

45 分

45 分

60 分

60 分

60 分

＜プロトコール B で抽出した場合の DNA 収量＞（標準プロトコールで抽出した場合の DNA 収量を 100％とした場合の相対比）
組織5 mg

10 mg

15 mg

20 mg

25 mg

マウス肝臓

100%

75%

42%

32%

25%

トリ肝臓

100%

100%

42%

31%

28%

アサリ外套膜

100%

100%

100%

100%

100%

8２．各種試料からの DNA 抽出例
標準プロトコール（90℃加温のオプション操作なし）で抽出した DNA 収量の目安です。
生物種

部位

収量

足100 ng/mg tissue

外套膜

160 ng/mg tissue

水管180 ng/mg tissue

中腸腺

350 ng/mg tissue

エラ

500 ng/mg tissue

閉殻筋

100 ng/mg tissue

エラ

124 ng/mg tissue

角膜

10 ng/mg tissue

水晶体

0.5 ng/mg tissue

ガラス体4 ng/mg tissue

網膜

110 ng/mg tissue

脚380 ng/mg tissue

個体

350 ng/mg tissue

脚450 ng/mg tissue

個体

250 ng/mg tissue

アリ個体

73 ng/mg tissue

ヒメグモ

個体

177 ng/mg tissue

トリ

肝臓

700 ng/mg tissue

マウス

脳

110 ng/mg tissue

肝臓660 ng/mg tissue

腎臓320 ng/mg tissue

尾400 ng/mg tissue

口腔粘膜

10 ng/mg tissue

アサリ

サバ

イエバエ
チャバネゴキブリ

ヒトHeLa 細胞（参考 1）

毛根18 ng/本爪

5 ng/mg tissue

培養細胞4,000 ng/106 cells（参考 1） 培養細胞から DNA を抽出する場合、より短時間（約 30 分間）で効率よく回収できる「ISOSPIN Blood & Plasma DNA」
（Code No. 312-08131）をお勧めします。

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３．スピンカラム製品性能
DNA 吸着容量20μg

最低溶出液量10μl

回収効率60-95%（100 bp – 20 kbp）
（参考 2）

カラム容量900μl＜溶出液量による回収効率の変動と精製産物の濃度変動（参考 2）＞（濃度比率：50μl 溶出時の濃度を 100％とした場合の相対比）＜DNA 断片サイズによる回収効率の変動（参考 2）＞（参考 2） 「ISOSPIN PCR Product」（Code No. 315-08001）データより抜粋。

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マニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課
TEL
URL076 - 451 - 6548
https://www.nippongene.com/siyaku/

お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております。

ISOSPIN Tissue DNA マニュアル（第 2 版）R109doi-R209

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