TA-Blunt Ligation Kit Manual （第 4 版）
Code No. 311-06543

50 回分～解説～
ニッポンジーンでは、長時間の反応が必要な T4 DNA Ligase 単独による従来のライゲーションに代わり、手軽に効率良く DNA のライゲーション反応を行うことのできる「Ligation-Convenience Kit」を発売しております。しかし、一般的に DNA の末端形状によってライゲーションの効率には差があります。
「 TA-Blunt Ligation Kit 」は、ニッポンジーン独自のバッファー組成で、T ベクターへの PCR 産物のライゲーション(TA ライゲーション)、および平滑末端ライゲーションに特化したライゲーションキットです。これらのライゲーションにおいては、Ligation-Convenience Kit よりも更に高効率に、DNA をライゲーションすることができます。

Ⅰ.特長● これまで効率が低いとされてきた TA クローニングや平滑末端ライゲーションを 30 分で高効率に行うことができます。
● 5×Ligation Mix には、DNA のライゲーションに必要な反応バッファー、 ATP、DTT、T4 DNA Ligase などが含まれています。使用時は、反応系の 1/5 量の 5×Ligation Mix と 1/10 量の 10×Enhancer solution を加えることで高効率な DNA ライゲーション反応を行うことができます。
● 5×Ligation Mix、10×Enhancer soｌution は-20℃では凍結しませんので、面倒な融解操作がなく、冷凍庫から出してすぐに使用できます。
● ライゲーション反応終了後は、そのまま形質転換に用いることができます。

Ⅱ.キット内容
試 薬50 回分*

5×Ligation Mix

100μl×2 本

10×Enhancer solution

50μl×2 本*20μl の反応系で使用した場合の回数です。
本キットにベクターDNA は含まれておりません。

Ⅲ.保存方法
－20℃保存・ 本製品は-20℃保存では凍結しませんので、凍結融解による安定性低下の心配がなく、面倒な融解操作の必要もありません。
・ 使用時は、氷上で操作して下さい。

- 1 -Ⅳ.プロトコールおよび実験例
１．プロトコール(1) DNA 溶液の調製

ベクターDNA

適切なモル比のべクターDNA（約 0.025pmol）とインサート DNA 断片を合わせて 14μl の DNA 溶液を調製する。*1(2) ライゲーション反応液の調製
2μl の 10×Enhancer solution と 4μl の 5×Ligation Mixを添加し混和する。*2

インサート DNAup to 14μl

ddH2O または TE *110×Enhancer solution

2μl

5×Ligation Mix4μl

Total20μl↓
16℃で 30 分間反応させる*3(3) ライゲーション反応↓16℃で 30 分間反応させる。*3

形質転換*4～6(4) 形質転換
反応液をそのまま形質転換に用いる。*4～6＊ベクター量と 10×Enhancer solution の割合は非常に重要です。
20μl の反応系では約 0.025pmol のベクターを使用して下さい（3kbp のベクターサイズの場合、約 50ng量です）。
＊10μl の反応系でライゲーション反応を行う場合は、DNA、10×Enhancer solution、5×Ligation Mix の使用量を 20μl の反応系の半量にして下さい。

２．ベクターとインサートのモル比の検討
ライゲーションの際の ベクター：インサート のモル比は、ライゲーション効率に大きく影響します。以下は、ニッポンジーンで様々な長さのインサート DNA をライゲーション、形質転換した結果、それぞれ下記の特定の条件で最も良い結果が得られたモル比を示した表です。＊3１．プラスミドベクターライゲーション（1）平滑末端ライゲーション
インサートサイズ

200bp

500bp

1kbp

3kbp

ベクター
インサート

16～10

13～6

13

10.5～1

インサートサイズ

200bp

500bp

1kbp

3kbp

ベクター
インサート16～101
3～61
1～61
0.5～1

ベクター ：EcoR V で切断した pBluescript II SK(+)
Stratagene 社 ( 0.025pmol )インサート ：EcoR V で切断したインサート DNA( 0.0125pmol , 0.025pmol , 0.0375pmol , 0.15pmol , 0.25pmol )ライゲーション反応：16℃, 30 分間（2）ＴＡクローニング
ベクター ：pGEMⓇ-T Promega 社 ( 0.025pmol )インサート：Gene Taq NT(Code No. 318-03231)で増幅した PCR
産物( 0.0125pmol , 0.025pmol , 0.0375pmol , 0.15pmol , 0.25pmol )ライゲーション反応：16℃, 30 分間

２．リンカーライゲーション
インサートサイズ
ベクター
インサート

ベクター ：Hinc II で切断した pUC19 ( 0.03pmol )インサート ：Linker EcoR V (Code No. 318-02251)(0.09pmol , 0.3pmol , 1.5pmol , 3pmol , 6pmol, 15pmol,21pmol, 30pmol)
ライゲーション反応：16℃, 30 分間

8bp
1700～1000- 2 -３．実験例＜ 実験例 1：TA クローニング ＞
T4 DNA Ligase との比較
（1）

ラムダ DNA 由来の DNA 断片 500bp を Taq DNA Polymerase で PCR 増幅した。

（2）pGEMⓇ-T vector 50ng（0.025pmol）とインサート DNA 断片 25ng（インサート／ベクターモル比≒3）を含む DNA 溶液 14μl を調製した。*1（3）

DNA 溶液 14μl に 10×Enhancer solution を 2μl、5×Ligation Mix を 4μl 添加し、混和した。

（4）

16℃で 5 分～16 時間反応させた。

（5）

反応後、JM109 コンピテントセル 30μl を反応液 1μl で形質転換し、生じたコロニー数を計測した。また、コントロールとして T4 DNA Ligase 単体を用いて同様にライゲーション反応を行った。なお、本実験に使用した JM109 コンピテントセルの形質転換効率は、1.41×108 cfu/μg （pBR322 DNA）である。*4, 5TA クローニングにおける反応時間の影響
400

100350300

白コロニー90

青コロニー

80

白コロニー率（％）

60200

5040150

白コロニー率（％）

コロニー数(個）70250301002050

100016hr

3hr

1hr

30min

5min

16hr

3hr

1hr

30min

5min

Ｔ4 ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ

TA-Blunt Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ

ライゲーション反応時間と得られた白コロニー数（個）
反応時間TA-Blunt Ligation Kit
T4 DNA Ligase

5min
99
130min207
21hr
15403hr
176
016hr
171
7

「結果」
TA-Blunt Ligation Kit を使用した場合、30 分間の反応時間で十分にライゲーションが完了していることがわかる。

- 3 -＜ 実験例 2：平滑末端ライゲーション ＞
T4 DNA Ligase との比較
pBluescript II SK(+)を EcoR V で切断し、脱リン酸化、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽（1）出、エタノール沈殿後に TE バッファーに溶解した。*1（2）

ラムダ DNA 由来の DNA 断片 1000bp を EcoR V で切断した。

（3）

pBluescript II SK(+)50ng とインサート DNA 断片 50ng（インサート／ベクターモル比≒3）を含む DNA溶液 14μl を調製した。*1（4）

DNA 溶液 14μl に 10×Enhancer solution を 2μl、5×Ligation Mix を 4μl 添加し、混和した。

（5）

16℃で 5 分～16 時間反応させた。

（6）

反応後、JM109 コンピテントセル 30μl を反応液 1μl で形質転換し、生じたコロニー数を計測した。また、コントロールとして T4 DNA Ligase 単体を用いて同様にライゲーション反応を行った。なお、本実験に使用した JM109 コンピテントセルの形質転換効率は、1.41×108 cfu/μg （pBR322 DNA）である。*4, 5

平滑末端ライゲーションにおける反応時間の影響
青コロニー

100180

白コロニー率（％）

9016080140701206010050804060304020201000

白コロニー率（％）

コロニー数(個）白コロニー

20016hr

3hr

1hr30min

5min

16hr

3hr

1hr30min5min

TA-Blunt Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ

Ｔ4 ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ

ライゲーション反応時間と得られた白コロニー数（個）
反応時間

5min

30min

1hr

3hr

16hr

TA-Blunt Ligation Kit
T4 DNA Ligase

129
5143
22116
16155
50

129
102

「結果」
TA-Blunt Ligation Kit を使用した場合、30 分間の反応時間で十分にライゲーションが完了していることがわかる。

- 4 -＜ 実験例 3：室温 25℃におけるライゲーション反応＞
16℃と 25℃との比較（1）

pBluescript II SK(+)を EcoR V で切断し、脱リン酸化、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出、エタノール沈殿後に TE バッファーに溶解した。*1（2）

ラムダ DNA 由来の DNA 断片 1000bp を EcoR V で切断した。

（3）

pBluescript II SK(+)50ng とインサート DNA 断片 50ng（インサート／ベクターモル比≒3）を含む DNA溶液 14μl を調製した。*1（4）DNA 溶液 14μl に 10×Enhancer solution を 2μl、5×Ligation Mix を 4μl 添加し、混和した。

（5）25℃または 16℃で 5~30 分間反応させた。

（6）

反応後、JM109 コンピテントセル 30μl を反応液 1μl で形質転換し、生じたコロニー数を計測した。また、コントロールとして T4 DNA Ligase 単体を用いて同様にライゲーション反応を行った。なお、本実験に使用した JM109 コンピテントセルの形質転換効率は、1.41×108 cfu/μg （pBR322 DNA）である。*4, 516℃と 25℃におけるライゲーション効率の比較
800

1009070080600

500605040040300

白コロニー率（％）

コロニー数（個）70302002010010
白コロニー0016℃ 5min「結果」

25℃ 5min

16℃ 30min

25℃ 30min

青コロニー
白コロニー率（％）

25℃においても 16℃と同等のライゲーション効率でライゲーションが可能である。

- 5 -Ⅴ．注意点*1

ライゲーション反応に使用するベクター量は、約 0.025pmol にして下さい。
また、高塩濃度のバッファーおよび EDTA が高濃度に含まれたバッファーに DNA を溶解させると、ライゲーション効率が著しく低下します。DNA 溶液は ddH2O または TE buffer（pH8.0）にて調製して下さい。

*2

添加する 10×Enhancer solution の量は正確に測りとって下さい。指定量より多く添加したり、少なく添加するとライゲーション効率が著しく低下する場合があります。

*3

ライゲーション反応に用いる DNA の精製度、使用する制限酵素の違いによってライゲーション効率が異なる場合があります。

*4

形質転換に用いる反応液の量はコンピテントセルの 1/10 量以下にして下さい。多量の反応液を使用すると、形質転換効率が低下することがあります。

*5

反応液の量がコンピテントセルの 1/10 量以上になってしまう場合は、ライゲーション反応後、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）処理、クロロホルム/イソアミルアルコール（24：1）処理を行い、エタノール沈殿法によって DNA を回収し、その DNA をコンピテントセルの 1/10 量以下になるように ddH2Oまたは TE buffer（pH8.0）に溶解してから形質転換を行って下さい。

*6

エレクトロポレーション法を用いて形質転換する場合は、ライゲーション産物をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）処理、クロロホルム/イソアミルアルコール（24：1）処理後、エタノール沈殿法により DNA を回収し、ddH2O または TE buffer（pH8.0）に溶解してから形質転換を行って下さい。

Q＆A
Q: ライゲーション産物を保存する場合はどうしたら良いですか？
A: -20℃で凍結保存して下さい。融解後は、そのまま形質転換実験に用いることができます。
Q: サンプル数が多いのですが、あらかじめ 10×Enhancer solution と 5×Ligation Mix を混ぜたプレミックスを作製してから使用することはできますか？
A: プレミックスを作製して使用できます。ただし、ミックスは使用直前に調整し、調整後すぐに使用して下さい。
Q: ライゲーション反応を 4℃オーバーナイトで行うことはできますか？
A: 4℃オーバーナイト（16 時間）でもライゲーション可能です。
Q: ライゲーション産物を熱処理してもよいですか？
A: 70℃、10 分間で熱処理を行うことができます。
Q: ライゲーション産物をそのままエタノール沈殿してもよいですか？
A: ライゲーション産物をそのままエタノール沈殿するとコロニー数が著しく減少します。マニュアル（＊5）記載の方法に従ってフェノール/クロロホルム精製してからエタノール沈殿して下さい。また、Ethachinmate を使用してエタノール沈殿を行うと、効率よく DNA を回収することができます。

- 6 -Q: Ethachinmate を使用してエタノール沈殿を行った DNA を用いて、ライゲーション反応を行うことはできますか？
A: できます。

Ⅵ.トラブルシューティング
トラブル

予想される原因
末端の不一致全くライゲーションしない（コロニーが生じない）

対策
末端を確認する

エレクトロポレーションで形質転換を行う際 ライゲーション産物をフェノール/クロロホに、ライゲーション産物の精製を行っていな ルム/イソアミルアルコール（25：24：1）処理、クロロホルム・イソアミルアルコールい（24：1）処理後、エタノール沈殿法によりライゲーション産物をそのままエタノール沈 DNA を回収し、ddH2O または TE buffer
殿した（pH8.0）に溶解してから形質転換を行う
ベクター量が少なすぎる、または、多すぎるベクター量は 20μl 反応系で約 0.025pmolにする使用する Enhancer solution の量が過剰、 Enhancer solution 添加量は反応系のあるいは少なすぎる1/10 量にする
反応系の 1/10 量の Enhancer solution をEnhancer solution を添加していない添加する
キレート剤を含まない水または TE buffer
EDTA 等のキレート剤濃度が高いで DNA を溶解し、ライゲーション反応を行う
ライゲーション効率が低い

DNA 溶液が高塩濃度である塩を含まない水、または TE buffer でDNA を溶解しライゲーション反応を行なう

ライゲーション時間が短い

ライゲーション時間を延ばしてみる

インサート：ベクター比率が不適マニュアルに載っているインサート：ベクター比を参考に、至適モル比でライゲーションする
粘着末端のライゲーションには使用できません。
Ligation-Convenience Kit のご利用をお勧めします
形質転換に用いる反応液量はコンピテントセルに対して 1/10 量にする。
ECOS™ Competent E. coli を使用する場
合は、添加する反応液量をコンピテントセ
ルに対して 5％以下にする

粘着末端ベクターである

トランスフォーメーシ
ョン効率が低い

青コロニー率が高い

多量の反応液を使用した

コンピテントセルの形質転換効率が低い

形質転換効率が 1ｘ107 cfu/μg 以上のものを使用する

平滑末端ベクターの脱リン酸化が不十分

セルフライゲーションの有無をあらかじめ確認しておく- 7 -株式会社 ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課
TEL 076-451-6548
URL : http://www.nippongene.com

TA-Blunt Ligation Kit Manual ver.4 201512HT-2305- 8 -