臼蓋形成不全症のゲノムコピー数多型解析
宮崎大学医学部感覚運動医学講座 整形外科学分野
関本朝久、帖佐悦男
関本朝久、帖佐悦男
DNA チップ研究所 ゲノム医学グループ
石井美穂、江見充
石井美穂、江見充
患者に高頻度に認め再現性のあるゲノ

要旨

ム構造多型として、Semaphorin4D 遺伝子
臼蓋形成不全症は、遺伝的要因と環境を含む 9q22.2 の 472kb 領域 (18/64 vs的要因が影響する多因子疾患であり、そ
0/32, p=4.81x10-4, OR=25.86）など複数の病因は未だ不明である。近年、ヒトゲの CNV 領域を認めた。これらのゲノムコ
ノム上の様々な遺伝子および制御領域
ピー数変化は健常者ではほとんど認めのユニット数の多様性を示す新たな構られなかった。これら CNV 領域の遺伝子造異常としてゲノムコピー数多型（Copy
は臼蓋形成不全症の発症に関与するこ
Number Variation; CNV）の存在が注目とが示唆された。今回の CNV 解析は臼蓋され、ゲノム上の多くの遺伝子機能制御形成不全症の病態解明に寄与し、将来のに影響を与えている事実が報告されて早期診断法の確立にも貢献できると考いる。これまで臼蓋形成不全症の感受性える。
遺伝子の解析において、この CNV に着目した研究は行われていないので、本研究はじめにでは臼蓋形成不全症と CNV の関連を解析
ロコモティブシンドロームは本邦ではした。1 次スクリーニングとして、臼蓋
現在 4700 万人以上の罹患が推定されて形成不全症患者 20 名と健常者 131 名をおり、高齢化社会が進むにつれてその数対象に、ゲノム不安定領域に特化した Cは増加の一途をたどると予想されていNV 検出プローブを搭載したゲノムワイる。その中で変形性股関節症は本邦におド CNV ビーズチップ（deCODE/Illumina
いてそのほとんどは臼蓋形成不全症に
CNV Bead Chip）を用いて CNV タイピン
起因している。臼蓋形成不全症は女性にグをゲノムワイドに行い、候補ゲノム構頻度の高い非メンデル遺伝性の疾患で造変異領域を 19 領域検出した。続いてあり、罹患率は 1000 人中 8.6 人から 11.
２次スクリーニングにおいては、1 次候
5 人である 1。その病因は未だ不明である
補 19 領域に特化したカスタム高密度オが、中胚葉系の分化発育異常を発病素因
リゴヌクレオチドタイリングマイクロとし、病型修飾に複数の遺伝的および環
アレイ（Agilent custom CNV array）を境的因子が関与している疾患と推定さ作製し、患者 64 名、健常者 32 名についれる。現在の臼蓋形成不全症の治療の目て CNV タイピングを行い、moving avera
的は、観血的、保存的治療のいずれも正ge 法により検証解析を行った。結果は、常な股関節形態を獲得し、将来の 2 次性25

股関節症の発症を予防することである。 の解析において、この CNV に着目した研しかしながら臼蓋形成不全症の診断が究は行われていない。孤発性疾患におけついた時点でその症例の予後や手術のる CNV の関与を考慮すると、臼蓋形成不適応を判断するまでには至っていない。 全症の発症と CNV の関連を解析すること
さらに変形性股関節症、先天性股関節脱は非常に有用である。本研究では臼蓋形

臼、臼蓋形成不全症の相互関係や病型移成不全症の発症リスクに関与する新た

行、また各疾患と遺伝子との関連などはなゲノム異常を明らかにすることを目十分に解明されていない。変形性股関節的として、臼蓋形成不全症と CNV の関連症は主に中年期に発症する孤発性疾患を解析した。

ではあるが、稀に家族内発症が報告され対象と方法ている 2。また臨床病型の面では、欧米本研究は、本邦の「臨床研究に関するでは 1 次性股関節症が多いのに対し、日倫理指針」および「ヒトゲノム・遺伝子
本では臼蓋形成不全症に起因する 2 次性解析研究に関する倫理指針」に則ってお股関節症が多いなどの差異が知られてり、当大学の「医の倫理委員会」の承認いる。近年、変形性関節症に対して、GD
3

4

を受けた。

F5 、ASPN など複数の遺伝子、および 13番染色体 2 などのゲノム領域が解析さ対象は、1 次スクリーニングにおいては、
臼蓋形成不全症患者群 20 例（全例女性、れてきたが、未だ臼蓋形成不全症におい平均 Sharp 角 52.2°、
平均年齢 47.2 歳）、ては原因タンパクならびにゲノム遺伝
健常コントロール群 131 例（股関節疾患
子の異常については明らかではない。
の既往のない者）とした。2 次スクリー
最新の遺伝子工学・分子生物学的解析
ニングにおいては、臼蓋形成不全症患者
手法による新たな知見は、臼蓋形成不全
群 64 例（全例女性、平均 Sharp 角 51.6°、症の病因病態解明の一助となり、診断と平均年齢 47.3 歳）、健常コントロール群
治療の新しいアプローチになりうると
32 例（全例女性、平均 Sharp 角 39.5°、期待される。近年、ヒトゲノム上の様々
平均年齢 31.5 歳）とした。Sharp 角はな遺伝子および制御領域のユニット数
より悪い側を採用した。
の多様性を示す新たな構造異常として方法は、まず十分なインフォームドコ
ゲノムコピー数多型（Copy Number Vari
ンセント後に被験者を採血し g e n o m i cation; CNV）の存在が注目され、ゲノム
DNA サンプルを調製した。
上の多くの遺伝子機能制御に関与して5,6

ゲノムワイドゲノムワイド CNV ビーズチップスクリー
域の欠失または増幅（重複、三重複など） ニング解析と統計解析
対象者の全ゲノム領域に対して deCODEの CNV は個人間の遺伝子多型として認識/ Illumina CNV ビーズチップ（57K, i
され 5、実際にいくつかの CNV は孤発性いる事実が報告されている。ゲノム領-select format, Illumina Infinum sy
および遺伝性疾患の病因として大きな
stem, deCODE genetics Inc., Iceland）

影響を及ぼしている 6。しかしながらこを用いて CNV スクリーニング解析を施れまで臼蓋形成不全症の感受性遺伝子26

行した（図 1）。deCODE / Illumina CNVた。複雑なマルチコピー多型領域におけ

ビーズチップから得られたデータの解る欠失や増幅のコピー数異常は、プロー

析は、deCODE genetics 社の Dosage Min

ブ log2 比が平均値から 1.5SD より外れ

er ソフトウェアを用いて行い、CNV の欠た値を採用した 9。データ解析において失および増幅の判定を行った。シグナル

log2 比が 0.15 以下で検出された CNV に強度の逸脱を検出するために、まずは蛍

ついては偽陽性として除外した。

光強度の偏位を標準化した。CNV 領域に

結果あるプローブのシグナル強度は、周辺の臼蓋形成不全症患者を対象としたゲノ
ムワイド CNV ビーズチップスクリーニン
グ
臼蓋形成不全症と関連する CNV 探索の

CNV 領域ではないプローブの信号より相対的に低下、または増加しているという形で表れ、1 つもしくはそれ以上のマーカーが他の連続した領域と比べてコピための 1 次スクリーニングとして、臼蓋ー数変化を示す領域をゲノムの欠失あ形成不全症患者 20 名と健常者 131 名をるいは増幅として捉えた。臨床データの
対 象 に

CNV

ビ ー ズ チ ッ プ

統計解析は、Fisher 直接確率検定・（deCODE/Illumina CNV Bead Chip：図 1）
Bonferroni 補正 7 にて解析した。
を用いて解析し、候補ゲノム構造変異領
カスタム高密度オリゴヌクレオチドタ
イリングマイクロアレイによる解析と統計解析
第 9 番染色体長腕（9q22.2）に存在す域を 19 領域検出した（表 1）。表１の第9 番染色体長腕や第 4 番染色体長腕などの CNV マーカーは検出基準を満たしていた。すなわち、CNV 保持者の頻度が患者る Semaphorin4D 遺伝子（Sema4D）を含症例数の 10%より多く、かつ Fisher 直接む領域（chr9: 91,058,000-91,530,000
確率検定・Bonferroni 補正で有意であっ[ NCBI Build 36.1, hg18 ]、472kb）なた。その中で、隣接するマーカー
ど、表 1 に示す 1 次候補 19 領域に特化
rs7469438、rs28402866、rs6559349 およ
した Agilent カスタム高密度オリゴヌク
び rs3892362 は、第 9 番染色体長腕
レオチドタイリングマイクロアレイを（9q22.2）の Sema4D 遺伝子上に位置し作製し CNV を解析した 8。カスタムマイていた（図 2）
。サンプル解析の結果、こクロアレイ作製においては、コピー数がの Sema4D 領域における CNV マーカーの不変領域のプローブを１アレイ中に 10%
コピー数欠失は患者 20 名中 5 名に認め以上含めて作製し、スキャン画像から数られた。対照的に健常者では 131 名中 1値化を行う際にはコピー数が不変領域名であった（p=1.39×10-4、OR=43.33、のプローブを用いて Dye normalization
95％信頼区間=4.74‐396.02 ：Fisherを行った。カスタムマイクロアレイの統検定・Bonferroni 補正 p＜0.05）。図 2
計解析は、Agilent 社が開発した統合
は Sema4D 遺 伝 子 と rs7469438 、log2 比 を 基 に し た ア ル ゴ リ ズ ム
rs28402866、rs6559349 および rs3892362
Aberration

Detection

Method-2の位置を示す。図 2 下は Sema4D 遺伝子（ADM-2）、Threshold＝5 の条件で施行し27

周辺における複雑な繰り返し配列構造

続いて 2 次スクリーニングとして Agileを示す。

nt カスタム高密度オリゴヌクレオチド

臼蓋形成不全症患者を対象としたカス
臼蓋形成不 全症患者を対象としたカス
タム高密度タイリングマイクロアレイ
解析
続いて 2 次スクリーニングにおいては、

タイリングマイクロアレイにて、その 1

表 1 に示す 1 次候補 19 領域に特化した

いては、患者 64 名中 18 名にコピー数欠

カスタム高密度オリゴヌクレオチドタ失が認められ、健常者では 32 名中 0 名

イ リ ン グ マ イ ク ロ ア レ イ （ Agilentであった（p=4.81×10-4、OR=25.86、95%

custom CNV array）を作製した。患者 64

信頼区間=1.50‐444.63）。

名と健常者 32 名を対象に CNV タイピン

ゲノム構造の欠失や増幅のコピー数多グを行い、moving average 法により検証

型は、ヒトゲノム個体間の遺伝子多型と解析を施行した。第 9 番染色体長腕

して重要なものと認識されつつあり、SN（9q22.2）472kb の Sema4D 遺伝子を含む

P よりも CNV の方がより多く存在してい領域においては、患者 64 名中 18 名にコる 6。分節重複や低頻度反復配列（lowピー数欠失が認められ、健常者では 32

copy repeat）のようなマルチコピー領

次候補 19 領域の CNV の検証解析を施行した。今回第 9 番染色体長腕（9q22.2）
472kb の Sema4D 遺伝子を含む領域にお名 中 0 名 で あ っ た （ p=4.81 × 10-4 、域は、ゲノム再修復のホットスポットとOR=25.86、95%信頼区間=1.50‐444.63）。 して注目され、コピー数欠失および増幅
図 3 はこの 472kb 領域における代表的な が生じやすい領域でもある 10。この様な患者 4 名および健常者 2 名の詳細な分節

リピート配列に富む領域は、これまでの欠失のプロットを示す（患者：図 3a-3d、

報告よりも 13 倍以上も CNV が存在する

健常者：3e, 3f）。図 4 はゲノム構造異と近年の研究で判明した 11。それゆえ、常が認められた臼蓋形成不全症患者 18

コピー数多型もしくは構造多型はヒト

名の Sema4D 遺伝子領域のコピー数欠失遺伝病や疾患感受性のトリガー的な要の 概 略 図 を 示 す 。 そ の 中 で 15 名 は因として認識され始めている 5。現在のSema4D 遺伝子を含む領域に分節欠失を

既存データベース上のヒトゲノム CNV 地認め、その他 3 名は Sema4D 遺伝子の上図は決して完全ではないが、近年 CNV の流領域に欠失を認めた。

検出数は増加し、これらは反復配列近傍で確認されている。 CNV の遺伝子座特異考察
的変異率が 10-6 から 10-4 と見積もられた本研究においては、まず 1 次スクリー
点に注目することは興味深く、塩基置換
ニングとして deCODE / Illumina CNV ゲ

または点変異の確率より 2～4 桁高い 6。

ノムワイドビーズチップ（図 1）を用い今回使用した deCODE ゲノムワイド CNVて臼蓋形成不全症と CNV の関連を解析しビーズチップアレイはヒト全ゲノムの C
た。表 1 に示す様に第 9 番染色体長腕（9NV に富む領域に対するプローブが網羅
q22.2）の Sema4D 遺伝子領域など 19 ヶ的に設定されている。これまでの SNP マ
所の複数領域に新たな CNV を検出した。
ーカーでは含まれていなかった megasat

28

ellite（500bp 以上の縦列反復配列）やなる可能性があり、その中でも Sema4D

duplicon（1kb 以上にわたり非常に相同は最も有力な候補である。

性の高い分節重複と隣接する領域）、unS

熊ノ郷らは、免疫応答に必須の CD40 シ

NPable 領域（HapMap SNP 地図で 15kb

グナルの関連遺伝子を探索する過程で以上の空白、または 2 ヶ所以上の SNP がサブトラクションを行い、セマフォリン

Hardy-Weinberg 平衡になく、5～15kb のファミリーに属する Semaphorin4D（Sem

間隔が空いている領域）などの領域に対

a4D/CD100）の cDNA を単離した 13。当時するプローブがおよそ 57,000 個含まれセマフォリンファミリーは神経発生にている。これらのプローブは 15,559 ヶおける神経軸索伸長のガイダンス因子

所の CNV 領域、全長はヒトゲノムの 6%、 として認識されており、免疫の分野にお190Mb をカバーしている。この領域は平いては未知の分子群であったが、T 細胞

均的なヒトゲノムと比べると 18 倍多くに高発現する Sema4D が B 細胞及び樹状CNV 領域が存在している。さらに今回

細胞の活性化を促進する事が解明され

我々は Agilent カスタム高密度オリゴヌ

たととともに 13,14、Sema4D 欠損マウス及クレオチドアレイを用いても解析を施

び Sema4D トランスジェニックマウス

行した。それは 60mer からなる合成オリの作製・解析から、Sema4D が免疫応答

ゴヌクレオチドプローブがゲノム領域においても重要な役割を果たしているにおいて 100～500bp 間隔で配置されてことが証明された 15,16。さらに 2011 年根いる。この測定プラットフォームは大き

岸らは、破骨細胞が Sema4D を発現し、い CNV だけでなく小さな CNV も判別でき

これが骨形成を強力に抑制することをるように設計されており、CNV の詳細な報告した 17。骨芽細胞上の受容体プレキ分布の体系的研究を可能にした。本研究

シン B1 に Sema4D が結合すると、低分子においては第 9 番染色体長腕（9q22.2） 量 GTP アーゼ RhoA が活性化され、それの Sema4D 遺伝子を含む領域に新たな CN

がインスリン様増殖因子 1（IGF-1）シグV を検出したが、この CNV 領域はゲノム

ナル伝達抑制および骨芽細胞の運動性の狭い範囲に多数の低頻度反復配列（制御により骨形成を抑制した。 Sema4D

low copy repeat）を含んでいる。それ欠損マウス、PlxnB1 欠損マウス、およびらはこの領域のゲノム不安定化をもた

優性ネガティブ型 RhoA を骨芽細胞特異らす可能性があり、不等交叉または末端的に発現するマウスでは、骨形成増加の再結合による分節欠失を起こすきっかため骨硬化の表現型を呈した 17。著明な

10,12

けとなっているかもしれない。今回

臼蓋形成不全症は、将来的に骨硬化を伴の結果は、臼蓋形成不全症患者の de no

った変形性股関節症に進展する。Sema4D

vo な分節欠失発生の可能性を示唆し、疾の臼蓋形成不全症に関与する機能は明

患の散発性発症のメカニズムとしてこらかではないが、Sema4D 領域のゲノムコの CNV が関与している可能性が考えられ

ピー数欠失は、その遺伝子機能に影響をた。したがって、図 2 に示す領域に存在及ぼして臼蓋形成不全症の発症に関与する遺伝子が臼蓋形成不全症の病因としている可能性が考えられる。

29

2010 年加藤らは、コピー数多型の全ゲることが可能となるかもしれない。今後

ノムスクリーニングを通して、孤発性筋は他の CNV 候補領域を検証するとともに、萎縮性側索硬化症（SALS）患者の第 10さらに症例数を増やしてより詳細な解番染色体短腕サブテロメア領域（10p15.

析を進める予定である。この研究を発展

3）の 40kb 領域に分節するコピー数増幅させ、臼蓋形成不全症における CNV 診断を報告した。SALS 患者 83 名中 46 名にコ法が確立されれば、疾患の病因究明、さピー数の増幅を認め、対照的にコントロらに将来のテーラーメイド医療の実現ール検体では 99 名中 10 名に認めた。こに向けて、変形性股関節症の早期診断、のコピー数増幅領域には Isopentenyl

予防法の確立、早期の予後予測や手術適

diphosphate isomerase 1（IDI1）と ID

応の判断などにも応用展開できる可能I2 の 2 つの遺伝子を含んでいた。加藤ら性が広がると考える。

はこれらの遺伝子領域のコピー数増幅

まとめが SALS の病因に重要な役割を果たす可能性を示唆した 12。原因不明の孤発性疾本研究において臼蓋形成不全症と CNVの関連を解析した。1 次スクリーニング

患の症例における頻繁な CNV という点でのゲノムワイド CNV ビーズチップタイ
は、本研究と類似した結果である。したがって、Sema4D 遺伝子領域においても、 ピングでは、候補ゲノム構造変異領域を
コピー数欠失に起因して臼蓋形成不全 19 領域検出した。続いて 2 次スクリーニ
ングにおいては、カスタム高密度オリゴ症の発症に関与している可能性が考えヌクレオチドタイリングマイクロアレられる。
イを作製し CNV タイピングを施行した。
結論として今回の研究では、複数の臼
今回は患者に高頻度に認め再現性のあ蓋形成不全症患者において Sema4D 遺伝
るゲノム構造変化として、Semaphorin4D
子を含む領域で分節コピー数欠失を認
遺伝子を含む領域など複数の CNV 領域をめた。 この Sema4D 遺伝子領域のコピー認めた。これらのゲノムコピー数多型は
数欠失は、臼蓋形成不全症の独立した危健常者ではほとんど認められなかった。
険因子の可能性がある。しかしながらここれら CNV 領域における遺伝子は臼蓋形の関連は全ての人種において相関する
成不全症の病因に関与する可能性が示ものではなく、さらに異なる人種集団の唆された。
多くのサンプルで解析を行う必要がある。今後の臼蓋形成ひいては骨格形成に謝辞
おける Sema4D 遺伝子機能の更なる解析
本研究は平成 23 年度公益財団法人日本は、将来の変形性股関節症の病因病態の股関節研究振興財団の研究助成により解明だけでなく、新たな治療標的の確立行いました。公益財団法人日本股関節研にも貢献すると考える。本研究により、
究振興財団に深謝致します。
Sema4D 遺伝子の CNV 解析は臼蓋形成不全症の新たな診断ツールとなる可能性があり、末期股関節症への進展を予防す30

f copy number variation identif
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表 1 deCODE / Illumina
Illumina ゲノムワイド CNV ビーズチップ 解析結果

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

染色体
9q
4q
1p
1q
9q
21q
5p
10q
7q
14q
1p
21q
2p
5q
7q
7q
7q
8p
9q

Size (kb)
472
450
474
384
319
351
309
504
435
554
394
520
1293
157
489
360
520
1548
284

p-val (Fisher)
0.00010.00010.00040.00040.00290.00590.00590.00620.00740.01680.01680.01680.01680.01680.01680.01680.01680.01680.0168

32

OR
43.3
8.9
13.2
5.9
15.6
5.7
5.7
10.4
22.0
35.5
35.5
35.5
35.5
35.5
35.5
35.5
35.5
6.7
6.7

図1
deCODE / Illumina ゲノムワイド CNV ビーズチップ
ヒト全ゲノムの CNV に富む領域 15,000 以上の CNV セグメント(megasatellite、dupli
con、unSNPable 領域)を、およそ 57,000 個の CNV プローブで高感度に検出可能。これまでの SNP アレイではカバーできていなかった領域にプローブが配置されている。

図 2 第 9 番染色体長腕（9q22.2番染色体長腕（9q22.2）領域の9q22.2）領域の Sema4D 遺伝子の局在
上部パネルは第 9 番染色体のイデオグラムと Sema4D 遺伝子および隣接した遺伝子の位置を示す。矢印は CNV マーカーの位置を示す（rs7469438、rs28402866、rs655
9349 および rs3892362）。Tandem repeats（縦列型反復配列）、Chained self alignments（ゲノム内での重複領域）、Repeat masker ツールで検出された繰り返し配列の複雑な構造が Sema4D 遺伝子領域には多数存在する。

33

図 3 Agilent カスタム高密度タイリングマイクロアレイによるカスタム高密度タイリングマイクロアレイによる Sema4D 遺伝子を含む第 9 番染色長腕領域（9q22.2番染色長腕領域（9q22.2）
9q22.2）472kb のコピー数欠失構造の検証解析
図はゲノム位置（x 軸）に沿った moving average 法による log2 比（y 軸）を示す。
図 3（a）、3（b）、3（c）および 3（d）は代表的な臼蓋形成不全症患者 4 例のパターンを示し（ID：Case6、10、12 および 49）、図 3（e）および 3（f）は 2 例の健常者を示す。上部のゲノム地図はゲノムポジション 91,058,000 から 91,530,000 の領域において存在が推定される遺伝子の位置を表示している。黒塗りの部分は「コピー数欠失」と判定された領域を示す。

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図 4 臼蓋形成不全症患者 18 例における第 9 番染色体長腕（9q22.2番染色体長腕（9q22.2）に位置する
9q22.2）に位置する

Sema4D 遺伝子周辺 472kb 領域のコピー数欠失の概略図
黒塗りの領域はゲノムポジション 91,058,000 から 91,530,000 のコピー数欠失の範囲を示す。上部のゲノム地図はこの領域において存在が推定される遺伝子の位置を
示す。

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平成２３年度研究助成金による研究成果報告書

平成２６年３月 発行

発行・制作

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