IV 使用方法
1. ヒラメ組織からの DNA 抽出
重要 試験環境の汚染を避けるため DNA 抽出は本製品を使用する区域とは隔離された場所で行ってください。
1-1. EasyPrep DNA Extraction Reagent （別売） を使用したプロトコール
1） 1.5 mL マイクロチューブにヒラメ組織 50 mg を採取する。
2） EasyPrep DNA Extraction Reagent 300 µL を添加し、ペッスルで磨り潰した後、ボルテックスミキサーにてよく撹拌する。
3） ヒートブロックにて 95˚C、10 分間保温する。
4） 氷上にて 1 分間氷冷する。
5） 15,000×g、5 分間、室温にて遠心する。
6） 新たな 1.5 mL マイクロチューブに上清を分取し、滅菌水で 100 倍に希釈する。
例: 上清 5 µL に滅菌水 495 µL を加え、よく混合した溶液を鋳型として用いる。

2. LAMP 反応液の調製
2-1. 試薬の準備本製品に含まれる試薬を室温で完全に融解し、ボルテックスミキサーにて混合して均一にした後、スピンダウンを行い、試薬を氷上に静置する。
2-2. LAMP 反応液の調製
1） 下記の通りプレミックスを調製する。
試 薬
1 テスト分
8+1 テスト分
2×LAMP Master Mix
12.5 µL
112.5 µL
Kudoa Primer Mix
7.5 µL67.5 µL
180.0 µL
プレミックス合計
20.0 µL
2） プレミックスの分注を 20.0 µL ずつ分注する。
3） DNA 溶液の添加
まず、陰性コントロール用のチューブに陰性コントロール （滅菌蒸留水等） を 5.0 µL 添加してキャップを閉じる。次に、検査対象用のチューブに 1-1.で調製した DNA 溶液を 5.0 µL 添加してキャップを閉じる。最後に、陽性コントロール用のウェルに Kudoa 陽性コントロールを 5.0 µL 添加してキャップを閉じる。
3. LAMP 反応と測定
LAMP 反応液を転倒混和により混合した後、スピンダウンを行い、温調可能な蛍光検出装置にセットして測定（遺伝子増幅モニタリング及び会合曲線解析もしくは融解曲線解析） を開始する。
蛍光検出装置の詳細な設定方法は、各蛍光検出装置のマニュアルに従う。主要な装置に関しては、弊社ホームページ （https://nippongene-analysis.com） の設定方法例を参考にする。
3-1. LAMP 反応
63˚C、30 分間 LAMP 反応を行った後、会合曲線解析もしくは融解曲線解析を行う。
3-2. 測定方法
リアルタイム PCR 装置を使用する場合は、蛍光波長の設定を ResoLight Dye もしくは SYBRTM Green Iを測定する波長に設定する。
4. 結果の判定
以下の全ての要件を満たす場合に検査が成立したとする。
・ 陰性コントロールで増幅が認められない。
・ Kudoa 陽性コントロールで増幅が認められる。
以下の全ての要件を満たす場合に検査陽性と判定する。
・ 増幅が認められる。
・ 会合曲線もしくは融解曲線解析の結果が Kudoa 陽性コントロールの結果に対し±1˚C の範囲である。

V 参考文献・資料1. Onishi T, Lim B, Nojima N, Ogasawara K, Inagaki S, Makitsuru K, Sasaki M, Nakane K, Tsuchioka H,Horikawa K, Kawabe M, Minegishi Y, Miyazaki N, Sugita-Konishi Y: Inter-laboratory study to validate new
rapid screening methods for Kudoa septempunctata. Biocontrol Science, 21, 135-138 (2016)
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IV Protocol
1. Extraction of DNA from flounder muscle
important To prevent the contamination of test environment, please extract DNA in isolated place from theplace this product is used.
1-1. Protocol using EasyPrep DNA Extraction Reagent (separately sold)1) Weigh 50 mg of flounder muscle to 1.5 mL tube
2) Add 300 µL of EasyPrep DNA Extraction Reagent and grind and mix with pestle, and then vortex well.
3) Incubate for 10 min at 95˚C.
4) Incubate for 1 min on ice.
5) Centrifuge at 15,000xg for 5 min at room temperature.
6) To prepare template DNA, transfer supernatant into a new 1.5 mL tube and dilute to 100 times bysterilized water.
example：Transfer 5 µL of supernatant into a new 1.5 mL tube contained 495 µL of sterilized water.

2. Preparation of LAMP reaction solution
2-1. Preparation of reagents
Melt the reagents completely at room temperature. Vortex the reagents to dissolve uniformly and thenspin down and leave them to stand on ice.
2-2. Preparation of LAMP reaction solution
1) Prepare Pre Mix .
Reagents
1 reaction
8+1 reactions
2xLAMP Master Mix
12.5 µL
112.5 µL
Kudoa Primer Mix
7.5 µL67.5 µL
Total
20.0 µL
180.0 µL2) Dispense the 20 µL of Pre Mix.
3) Add template DNA to the Pre Mix.
Add 5 µL of negative control (sterilized water) and close the cap of the tube. Same as negative control
add 5 µL of template DNA (see 1-1) and close the cap of the tube. At last, add 5 µL of positive control
and close the cap of the tube.
3. LAMP reaction and measuring
Mix the LAMP reaction solution by inverting and spin down. Set to the fluorescence detecting device.
Start measuring (DNA amplification monitoring and Annealing curve analysis or Melting curve analysis).
Follow the setting method of the device’s manual.
3-1. LAMP reaction
63˚C for 30 min → Annealing curve analysis or Melting curve analysis
3-2. Measuring method
Set Fluorescent wavelength to ResoLight Dye or SYBRTM Green I when using Real-time PCR device.
4. Determination result
Test for detection of Kudoa septempunctata is accepted when all of the following requirements are satisfied.
・ Amplification of negative control is not detected.
・ Amplification of positive control is detected.
The result is determined positive when all of the following requirements are satisfied.
・ Amplification of template DNA is detected.
・ In Annealing curve analysis or Melting curve analysis, the temperature of template DNA is within ±1˚Cof the temperature of positive control.

V Reference
1.

Onishi T, Lim B, Nojima N, Ogasawara K, Inagaki S, Makitsuru K, Sasaki M, Nakane K, Tsuchioka H,Horikawa K, Kawabe M, Minegishi Y, Miyazaki N, Sugita-Konishi Y: Inter-laboratory study to validate new
rapid screening methods for Kudoa septempunctata. Biocontrol Science, 21, 135-138 (2016)

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