濁度を用いた新しい二酸化炭素濃度測定法
大阪府立高津高等学校化学部
藤田 雅輝
指導教員：藤村直哉

１．はじめにリカゲル（ワコーゲル C-300）と石油エーテル：

地球温暖化によるプランクトンの異常発生が頻繁に報道されている。その原因となっている植2-プロパノール＝25：1 よりなる展開溶媒を用いた 2)。

物プランクトン量の測定は，ふつう顕微鏡を用いた個体数の計数により行われているが，操作が煩雑なこともあり，簡易な方法としてクロロフィル量を蛍光光度計で測定する方法が実用化されている。しかし，装置は高価なため，利用は大学や研究機関などに限られている。簡易な方法として
紫外線 LED と光センサーを利用する方法が提案されている 1)。しかし、微弱な光を測定するなど技術的に難しい点も多い。学校の理科クラブなどで、この安価で簡単な簡易蛍光光度計の利用を進めるため、その基礎な研究を行った。

図 1 ホウレンソウ

図 2 ｶﾗﾑでの分離

このカラムで分取したクロロフィルａ、ｂそれぞれの溶液を以下の実験に利用した。
２－２ 光源の構造
励起光源として市販されていた実験用青色レーザー（波長 405nm）を利用した装置（図 3）を製作したが、光線の幅が細く、生じた蛍光が周囲２．装置の製作のクロロフィル溶液に再び吸収されてしまうた植物は過剰な光の受光による障害を防ぐため、め 、 紫 外 線 LED （ 波 長 395nm ， SANDER 社

クロロフィルの吸収したエネルギーの一部を、赤SDL-5N3CUV-A）の光を四面透過の角型セル（光路色の蛍光（ピーク波長 670～680nm）で放出してい長 1cm）の両側から当てる装置に変更した。
（図 4）る。この蛍光の強さから、溶液中のクロロフィル濃度を測定することができる。
励起状態２
無輻射遷移
励起状態１

図 3 レーザー式（黒い部分がセルケース、センサーおよびフィルターはケース内）
赤色発光

基底状態

クロロフィルの蛍光２－１ クロロフィルの抽出実験に用いたクロロフィルは、ホウレンソウの葉から抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフ

図 4 発光ダイオード式 （右はセルガイドを付ィーを利用して精製した。色素成分の分離にはシけた状態、測定時には全体を黒いケースで覆う）- 1 -また、検出は可視光検出用高感度 PIN フォトダ

クロロフィルa溶液の希釈回数と出力電圧イオード（浜松ホトニクス S6775）を用い、蛍光12以外の光が検出されることを防ぐため、ロングパ10スフィルター（シグマ光機 SCF-50S-58O，透過波8出力電圧長＞580nm）をセンサー前面に取り付けた。
２－３ 検出方法

10M
2M
1M
500k
100k
10k

642

フォトダイオードをセンサーとして用いる場

0合、光量とのセンサーの出力との比例関係が最も-2

123456789 10 11 12

クロロフィル溶液の希釈回数良いのはダイオードの両端に直接電流計や電圧計を接続する「短絡電流」や「開放電圧」の測定

図 6 抵抗値と出力電圧であると言われている 3)。これには高感度の電流計、電圧計が必要である。今回は、市販の安価なテスターでも十分に大きな電圧変化として検出できるよう、フォトダイオードに抵抗を直列に接続し、ダイオードに逆方向の電圧を加える「バイアス型回路」を用いた。
（図 5）

図７ 測定装置の全体像
３．測定方法３－１ 検量線の作成
バイアス電圧型回路完成した装置がどの程度のクロロフィル濃図５

度範囲で利用できるのかを調べるため、分取し「バイアス型回路」での光量と出力電圧の直線性

たクロロフィルａ溶液を溶媒で 1/2 に希釈するを確保するため、非線形抵抗であるフォトダイオ操作を続けながら、蛍光強度を調べた。溶液のードに直列接続する抵抗値を、様々な値に変えてクロロフィル濃度は、市販の分光光度計を用出力電圧を検討した。実験はクロロフィルａ溶液

い、吸光度を測定する Arnon の方法 4) を用いを 1/2 に希釈する操作を繰り返しながら、装置のて調べた。

出力電圧を測定することで行った。フォトダイオードに直列接続した抵抗値が 500ｋΩのとき、広Chlａ（μg／mL）＝12.7A663－2.69A645いクロロフィル濃度範囲（広い蛍光光量範囲におChlｂ（μg／mL）＝22.9A645－4.68A663

いて）で、大きな電圧変化が測定できることが確（A663、A645 は、それぞれ 663nm、645nm

認できた（図６）。

における溶液の吸光度）- 2 -３－２ 抽出方法

クロロフィルa濃度と蛍光強度

植物プランクトンに含まれるクロロフィル12の抽出は、通常試験水をろ過したガラスろ紙

蛍光強度［V］108（ワットマン GF/C、GF/F など）を抽出溶媒を6加えてすりつぶす方法で行われる。その後、遠42心分離を行い、その上澄み液を吸光度測定に用

005

10152025

いる 5)。この操作には 90％アセトンが用いられ、

30

クロロフィルa濃度［μg/mL］

また蛍光測定には、DMF（ジメチルホルムアミ
図 8 クロロフィル a 濃度と蛍光強度ド）が用いられることが多い。しかし、DMF は人体への有害性も指摘されているので、今回、吸光度の測定から、分取したクロロフィルａ

学校で利用しやすい各種の溶媒を用い、そのク溶液中にクロロフィルｂは含まれず、またクロロロフィル抽出能力を蛍光強度を測定しながロフィルｂ溶液中には、1/5 程度のクロロフィら、比較し検討してみた。実験は、1mL のクロルａが含まれることがわかったので、クロロフ

レラ培養液をグラスフィルターGF/C でろ過しィルａと蛍光強度の関係を用いて、クロロフィルた後、抽出をすりつぶし法、浸漬法（3ｈ）のａの値を差し引いて、クロロフィルｂと蛍光の異なる方法で行い（図 11）比較してみた。

関係を計算した。
（図 10）また、蛍光強度との結果は、図 12 に見られるように、すりつぶ係数を比較することにより、クロロフィルａ

し法では、ヘキサンを除き、水と親和性の高い（係数 2.062）はクロロフィルｂ（係数 0.269

溶媒はすべて高い抽出力を持ち、浸漬法では、）の 7.6 倍の蛍光強度を持つことが確認できた。

アルコール、特にメタノールは抽出力が高く、すりつぶしを行わなくとも十分抽出できると予想できた。

クロロフィルa濃度と蛍光強度
4蛍光強度［V］

3.5

y = 2.0617x
2
R = 0.9969

32.521.5
10.5000.5

11.52

クロロフィルa濃度［μg/ｍL］

図 11 すりつぶし法（左）と浸漬法（右）図 9 クロロフィルａ濃度と蛍光強度抽出力の比較
クロロフィルｂ濃度と蛍光強度

1.21.4蛍光強度［V］

蛍光強度［V］

1y = 0.2686x
R2 = 0.9139

1.2
10.80.80.4

0.60.20.4

00.20012345メ6

クロロフィルｂ濃度［μg/ｍL］

図 10 クロロフィルｂ濃度と蛍光強度

すりつぶし法浸漬法

0.6ノタルータエノルー

90トン
セ010トン
セアアクロロフィル抽出溶媒

ン

キヘサ

図 12 クロロフィル抽出方法の比較

- 3 -

４

吸光測定法と蛍光測定法の比較

5.まとめ

今回製作した簡易蛍光光度計が、実際に環境水中のクロロフィルａ濃度を調べるための簡中のクロロフィル濃度測定に利用できるかを、さ易蛍光光度計を製作した。この装置を用いて測定まざまな濃度のクロレラ培養液をつくり、吸光測した結果と市販の分光光度計を用いた測定結果

定法と蛍光測定の二つの方法で測定し，比較しはよく一致しており，また，蛍光法では低濃度でてみた。

も比較的高い精度で測定できることが確認できた。さらに、クロロフィル抽出方法を検討し、ろ紙乳鉢ですりつぶさなくても、溶媒に一定時間浸漬する方法で十分に抽出できること、また、その抽出溶媒としてはメタノールが適していることなどがわかった。
蛍光強度に対するクロロフィルｂやクロロフ
ィルが分解して生じるフェオフィチンの影響に

図 12 さまざまな濃度のクロレラ培養液ついては検討できていいないため，今後実験を行い検討していきたい。

実験は、0.1～5mL のクロレラ培養液を含む試
験水をガラスろ紙 GF/C でろ過し、浸漬法）で抽出（24h）してから，セルに入れた同じ溶液

参考文献

を分光光度計と今回製作した簡易蛍光光度計

１．松村 隆・早坂知恵・安達菜央，湖沼の富で測定し比較した。

養状態の把握を目的としたクロロフィル定量－蛍光光度計の試作とその利用，宮城教育大学
環境教育研究紀要第 7 巻，2004
２．日本化学会編，楽しい化学の実験室，15 章 光
合成色素を分け取る，渡辺正ほか，1993

３．谷腰欣司，ビギナーのためのセンサ回路集，
日刊工業新聞社，2003
４．D. Arnon Plant Physiology 24: 1･15, 1949
５．西條八束・三田村緒佐武，新編湖沼調査法，
講談社，2002
６．SCOR/UESCO：Determination of photosynthetic

図 13 吸光法と蛍光法の測定値の比較

pigments
クロロフィルａ量の計算は，吸光法では環境
6)

inoceanographic

水の測定でよく用いられるユネスコ法 で，蛍光seawater.

圧の係数（図９）を用いて行った。
２つの異なった方法で行ったクロロフィルａ
濃度はほぼ一致しており，低濃度では，蛍光法の方がよい比例関係を示している。

- 4 -Monographs

methodlogy, UNESCO publishingcenter, New York, 1966

法では今回決定した，クロロフィルａ－出力電IN,on