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日本生物学的精神医学会誌 34 巻 2 号（2023）/Japanese Journal of Biological Psychiatry Vol.34, No.2, 2023

特集 2

精神疾患研究におけるヒト iPSC 研究最前線

1 ．bHLH 型転写因子による神経分化プラットホームを用いた神経疾患解析へのアプローチ石川充＊

抄録：ヒト人工多能性幹細胞（induced‑Pluripotent Stem：iPS）細胞を利用した in vitro での細胞分化技術を用いた研究は，疾患患者特異的な細胞を観察・操作できる点から，中枢神経系研究においては有用性の高い手段といえる。しかし，in vitro での神経疾患のモデル化には未だ課題が多い。その理由のひとつとして，ヒト多能性幹細胞からのサブタイプ特異的な神経細胞分化誘導の技術が未だ発展途上なためでもある。本研究では NEUROG2 や ASCL1 といった basic‑Helix‑Loop‑Helix（bHLH）型転写因子に代表される分化マスター因子の遺伝子導入による神経細胞分化を行うことで，精神疾患の病態や創薬スクリーニングを加速する研究プラットホームを紹介し，その有用性と今後の課題について述べる。
日本生物学的精神医学会誌 34（2）：72‑74, 2023
Key words：bHLH transcription factor，Tet‑On，NEUROG2，ASCL1，scRNA‑seq

1．ヒト ES/iPS 細胞からの神経分化技術の概観と精神疾患モデリングの試み
脳を構成する細胞は，いくつかの例外を除き，発生学的には外胚葉由来である。培養皿内でヒト ES/iPS 細胞から神経外胚葉へ分化させる方法としてもっとも一般的なものが，2 経路の SMAD（Dual‑SMAD：1．Activin/Nordal お よ び 2．BMP） シ グ
1）ナル阻害法である 。一方，創薬スクリーニングの現場では，標的神経サブタイプへ迅速な分化誘導を促す方法も利用されている。bHLH 型転写因子に代表される分化マスター遺伝子を導入する方法はこの典型といえる。
ここ 10 年ほどの間，統合失調症患者由来 iPS 細胞を用いた実験では，神経幹細胞から神経細胞への終末分化が十分に進まないという報告が複数なされている。すなわち健常者と比較すると，神経細胞数の存在割合が低かったり，神経突起の進展が不十分
2）であったりする 。実際に筆者らも Reelin（RELN）遺伝子のコピー数異常の統合失調症患者，およびprotocadherin 15（PCDH15）遺伝子のコピー数異常の双極性障害患者由来の iPS 細胞を用いて，Dual‑SMAD シグナル阻害の神経分化を行ったところ，
3）神経細胞の突起進展が不十分であった 。
この結果は精神疾患が神経発達の過程で生じる表現型をもつという意味で重要である一方，実際に脳の中でそのように劇的に神経突起の進展異常があるという明確な剖検報告は見当たらない（一方で，スパイン形態に関する所見は存在する）。そのため，実質的にこの表現型だけを指標に病態研究や治療法開発に臨むのは難しい。さらに，この状態のままでは，スパイン形態やネットワーク解析など，まさに対象としたい表現型へのアプローチが困難である。
そこで ES/iPS 細胞から体性 “ 幹 ” 細胞培養を介さずに直接的に標的終末分化細胞に転換させる分化法
として bHLH 型転写因子の遺伝子導入が効力を発揮する。ここでは，neurogenin2/ngn2（NEUROG2）についての活用例を述べる。

2．bHLH 型転写因子導入による神経細胞分化誘導
神経細胞の初期分化時に高発現する NEUROG2などの bHLH 型転写因子を遺伝子導入することで，Analysis of Psychiatric Diseases Using Neuronal Cell Induction Technology with bHLH‑type Transcription Factors＊慶應義塾大学医学部生理学教室（〒 160‑8582 東京都新宿区信濃町 35）Mitsuru Ishikawa：Department of Physiology, Keio
University School of Medicine. 35 Shinanomachi, Shinjuku‑ku, Tokyo 160‑8582, Japan【石川充 E ─ mail：ishimi@keio.jp】

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Dual‒SMAD シグナル阻害

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それぞれの誘導方法の特徴■さまざまな細胞腫を構成し生理的環境に近い

vs
神経幹細胞
iPS 細胞

健常対照群

精神疾患患者群
1. Reelin CNV（統合失調症）
2. Pcdh15 CNV（双極性障害）

健常対照群■数 10 日～数 100 日間の培養で様子をみる
疾患群■オルガノイド用構造作出に応用できる

突起進展が不十分■均一性の高い細胞腫のため生化学の精度が高い

vs健常対照群■遺伝子導入などの作業は不要■数日～数 10 日間の培養で神経細胞になる疾患群

網羅的遺伝子発現解析で神経形態・移動・接着群の遺伝子変動。シナプ
スマーカ斑点密度や近接率の低下■薬剤選抜後は，Tet 誘導株として保存可能■細胞腫特異な健常一疾患の共培養が可能

Tet‒On‒NEUROG2，ASCL1＋DLX2 導入

図 1 精神疾患 iPS 細胞を用いた 2 パターンの神経分化誘導方法
Dual‑SMAD シグナル阻害法では神経突起進展の不全が認められた。一方，bHLH 型転写因子による迅速な神経細胞分化法では，シナプス関連の機能的異常が示唆された。また，それぞれの分化誘導には個別の長所がある。（文献 3 をもとに作成）

神経細胞分化が促進することは以前より知られていた。実際，スタンフォード大 Wernig M らのグルー
プは，テトラサイクリン依存性転写（Tet）駆動的に NEUROG2 遺伝子発現させる手法をヒト iPS 細胞に適用し，これまで最低でも 1 カ月程度培養にかかっていた時間を僅か 10 日足らずでグルタミン7）酸作動性神経細胞に分化させた 。同様に，bHLH型転写因子 ASCL1 とホメオボックス遺伝子 DLX2を共発現させることで GABA 作動性神経細胞を分5）化誘導させていた 。
そこで筆者らは前述の精神疾患 iPS 細胞に対してNEUROG2 と ASCL1 ＋DLX2 を導入し分化誘導させた。その結果，MAP2 陽性の神経突起を十分に有する細胞が得られた。興味深いことに，ここでの突起進展は，疾患株と健常株とでほぼ差異がなかった。
いずれにせよ，これによりスパイン形態を含む，微細な神経細胞の表現型解析に臨むことができた。
また本法は，純度の高いサブタイプ特異的な神経細胞が産出されるため，その生化学実験の確度が高まる。この利点を活かし，グルタミン酸・GABA 作
動性神経細胞おのおのについて網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果，各疾患のいずれの神経細胞についても細胞形態・移動・接着・シナプス関連の遺伝子群変動が大きいことが明らかとなった。この点は過去のげっ歯類モデルなどの結果に相反しない。実際，シナプス関連のマーカー染色を行い，ハイコンテンツセルイメージャーでの定量評価を行ったところ，疾患株では共通して，プレシナプス，ポストシナプスの斑点状シグナルが健常に比べて少な
く，プレ ‑ ポストマーカー斑点の近接率も低下して7）いた 。

本結果が精神疾患を代表するものであるかは不明
だが，少なくとも他モデルで提唱されていた結果の一部を iPS 細胞を用いて再現できたと考えられる。
また，本法のように Tet システムを搭載した細胞の薬剤選抜を行えば，iPS 細胞として増殖・凍結保存しつつ，いざ分化誘導させたいときにドキシサイクリン処理で安価かつ容易に分化できる。このことは多機関での再現性や共同研究の促進につながる（図1）。

3．神経成熟性獲得とサブタイプ特異的分化誘導法確立へのアプローチ
ところで，ヒト iPS 細胞由来神経細胞はその機能的な成熟性の獲得に，数 100 日の培養など長期間かかると言われる。そこで筆者らは，成熟加速をめざし，線維芽細胞から神経細胞へのダイレクトリプ
ログラミング法のひとつとして知られている miR‑
6）
9,124 導入法 に着目し，iPS 細胞に適用した。これはクロマチンレベルの DNA 立体構造の再構成によって分化に必要な転写因子のリクルートや神経突起伸長が促進するためと考えられている。実際に，
Tet‑On‑NEUROG2 にこの技術を付与したところ，自発的で高頻度のカルシウム活動が現れ，多点電極アレイでも神経ネットワークバーストの亢進が確認
4）できた 。
本誘導技術は，さらに多くの転写因子を導入することで詳細な標的細胞サブタイプへの分化が可能になると考えられる。実際に筆者らは，
1 細胞 RNA シー
ケンス解析から導き出された種々の転写因子を導入して，ドパミン神経細胞，運動神経細胞，パルブア

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ルブミン GABA 神経細胞，ソマトスタチン GABA神経細胞などの作出を継続して試みている。これを2 ）Dubonyte U, Asenjo‑Mar tinez A, Werge T, et al

応用すると，健常と疾患とで異なる細胞種ごとの共培養を行うことで，どの神経サブタイプに精神疾患の病態中心があるのかを見いだす手がかりにもなる

phrenia using patient‑derived induced pluripotent＋＋（2022）Current advancements of modelling schizostem cells. Acta Neuropathol Commun, 10（1）：183.
3 ）Ishii T, Ishikawa M, Fujimori K, et al（2019）In vitroかもしれない。一方，実際の脳機能を再現するにはそれらの細胞の適切な組み合わせからなる複雑なネットワークにまで拡大する必要がある。また，エmodeling of the bipolar disorder and schizophrenia

ピジェネティック制御や外部入力依存的な神経発生機構，さらにはグリア・血管系細胞の関与も考慮する必要はある。今後は遺伝子導入法をさらに応用して，脳オルガノイドや，動物脳への移植実験も組み

eNeuro, 6（5）：ENEURO. 0403‑18. 2019.

using patient‑derived induced pluripotent stem cellswith copy number variations of PCDH15 and RELN.
4 ）Ishikawa M, Aoyama T, Shibata S, et al,（2020）
miRNA‑based rapid differentiation of purified neurons from hPSCs advancestowards quick screening

合わせるべきであろう。
本論文の研究は主に慶應義塾大学医学部生理学教

for neuronal disease phenotypes in vitro. Cells, 9（3）：室（岡野栄之研究室）で行われた。また，筆者らの研究に関してすべて倫理的配慮を行っている。開示すべき利益相反は存在しない。

5 ）Yang N, Chanda S, Marro S, et al（2017）Generation

532.
of pure GABAergic neurons by transcription factor
programming. Nat Methods, 14（6）：621‑628.
6 ）Yoo AS, Sun AX, Li L, et al（2011）MicroRNA‑medi-

文

献ated conversion of human fibroblasts to neurons. Na-1 ）Chambers SM, Fasano CA, Papapetrou EP, et al

ture, 476（7359）：228‑231.

（2009）Highly efficient neural conversion of human7 ）Zhang Y, Pak C, Han Y, et al（2013）Rapid single‑

ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signal-

step induction of functional neurons from human plu-ing. Nat Biotechnol, 27（3）：275‑280.

ripotent stem cells. Neuron, 78（5）：785‑798.

■ ABSTRACT
Analysis of Psychiatric Diseases Using Neuronal Cell Induction Technology withbHLH‑type Transcription Factors

Mitsuru Ishikawa
Department of Physiology, Keio University School of Medicine
In vitro neuronal differentiation from induced pluripotent stem（iPS）cells is a highly useful technology in neuronaldisease research since it allows obser vation and manipulation of patient‑specific cells. However, there are still many
challenges in disease modeling in vitro. One of the major reasons is that the technology for inducing subtype‑specificneuronal differentiation from iPS cells still needs to be improved. In this study, we introduce a research platform forpathophysiology of psychiatric disorders and drug screening by using gene transfer of bHLH（basic‑Helix‑Loop‑Helix）
type transcription factors such as NEUROG2 and ASCL1, and discuss its usefulness and future challenges.
（Japanese Journal of Biological Psychiatry 34（2）：72 ─ 74, 2023）