植物組織からの RNA 抽出キット

ISOSPIN Plant RNA
マニュアル（WEB 版）
Ver.1-2409

Code No. 310-08171

NIPPON GENE CO., LTD.

I

製品説明

ISOSPIN Plant RNA（アイソスピン プラント アールエヌエー）は、植物組織から RNA を抽出・精製するためのキットです。
本キットは、カオトロピックイオン存在下で RNA がシリカへ吸着する原理を応用しており、フェノールやクロロホルムを使用しません。使用するスピンカラムは、カラム容積を最大限確保しており、内封されたシリカゲル膜は、充分な RNA 吸着容量と高い溶出効率を確保しています。
本キットでは、夾雑物を遠心分離により除去する方法とシリカゲル膜上での DNase I 処理を採用しており、約 1 時間で高純度の RNA を抽出・精製できます。

II キット内容
キット内容品

容量（50 回用）

備考

PT Extraction Buffer (植物用)

30 ml × 1 本

PT Binding Buffer (植物用)

40 ml × 1 本

エタノール含有PT Wash1 Buffer

40 ml × 1 本

エタノール含有（洗浄液）

PT Wash2 Buffer

40 ml × 1 本

エタノール含有（洗浄液）

DNase I (RNase free)

2,000 units × 1 本

10×DNase I Buffer

1 ml × 1 本

ddWater (RNase free)

1 ml × 8 本

Spin Column

50 本 × 1 袋

III

DNase I 溶液調製用・溶出用
上部パーツ：カラム
下部パーツ：Collection Tube

保存・ DNase I (RNase free)

冷凍保存（－20℃）

・ 上記以外の試薬と Spin Column

室温保存※エタノール含有の PT Binding Buffer (植物用)、PT Wash1 Buffer、PT Wash2 Buffer をご使
用後は、蒸発を防ぐため速やかに蓋を閉め、保管して下さい。

1

IV 使用上の注意・ 本品は、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。
・ 本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。
・ マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
・ 安全性データシート（SDS）は、ニッポンジーンホームページよりご覧になれます。
https://www.nippongene.com/siyaku/list.html

V プロトコール＜キット以外に必要なもの＞
・マイクロピペット
・ピペットチップ・ペッスル注）・1.5 ml マイクロチューブ注）・遠心分離機（4℃）
注）効率よく組織を破砕できるようにチューブの形状に応じたペッスルをご使用ください。

＜必要に応じて別途用意するもの＞
・液体窒素
・Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA（Code No.315-08501）*オプションプロトコール用

2

＜標準プロトコール＞①20 - 100 mg の新鮮な植物組織または凍結組織を 1.5 ml マイクロチューブに採取する。
注）
・採取した組織は速やかに液体窒素中で凍結させるか、すぐに②の処理に進む。
・RNase の活性を抑制するため、秤量は氷冷しながら速やかに行うか、マイクロチューブにあらかじめ PT Extraction Buffer (植物用) を入れておく。

↓試料に 600 μl の PT Extraction Buffer (植物用) を加え、直ちにペッスルです②り潰す。試料が液中で浮遊する場合、スピンダウンするとすり潰しやすくなる。
注）・ホモジナイズの不足は低収量につながるので念入りにすり潰す。
・断片化したゲノム DNA が混入しやすくなるためボルテックスは行わない。
・よくすり潰した状態であれば、-70℃で一晩保存できる。

③

遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、上清を新しいマイクロチューブに回収する。
注）・種子などの油分を多く含む試料は液表面に油分が浮遊していることがあるのでなるべく採取しないようにする。
・析出物を多く含む場合は回収した上清を再度、遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、上清を回収する。

④

上清に等量の PT Binding Buffer (植物用) を加えて、数回転倒混和する。軽くスピンダウンする。
例）上清 550 μl の場合は、PT Binding Buffer (植物用) 550 μl を添加する。

↓⑤

メンブレンに RNA を吸着させるため、600μl の④の混合液を Spin Columnに添加し、遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
注）・遠心後、スピンカラム上に溶液が残っている場合は、追加で 1 分間遠心する。
それでも溶液が残る場合は、抽出する植物試料の量を減らす。
・Spin Column のカラムを外し、Collection Tube の中のろ液を捨てた後、カラムを同じCollection Tube の上に戻す。
（以降、「ろ液を捨てる」は同様）⑥

残りの④の混合液を Spin Column に全量添加し、遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
↓3

500 μl の PT Wash1 Buffer を Spin Column に添加する。

⑦遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
↓1.5 ml マイクロチューブに以下の試薬を加えて、DNase I 溶液 100 μl を調⑧製する（用時調製）。
10×DNase I Buffer

10 μl

DNase I (RNase free)

30 units

ddWater (RNase free)

up to 100 μl↓
用事調製した 100 μl の DNase I 溶液を Spin Column に添加し、静置（15 分間、室温）する。
注）
・抽出する植物試料が多いとき、DNase I 溶液が浸透しない場合がある。
その場合は、抽出する植物試料の量を減らす。

↓300 μl の PT Wash1 Buffer を Spin Column に添加する。

⑨遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
↓洗浄のため 600 μl の PT Wash2 Buffer を Spin Column に添加する。

⑩

遠心（13,000×g、2 分間、4℃）する。ろ液と Collection Tube を捨てる。
↓⑪Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上にのせる。
RNA を溶出させるため、50 μl の ddWater (RNase free)をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。
RNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される。

4

＜簡易・標準プロトコール＞
植物試料（20 - 100 mg）
600 μl の PT Extraction Buffer (植物用) を添加
PT Extraction Buffer (植物用) 中でペッスルを用いて試料をよくすり潰す
遠心（13,000×g、10 分間、4℃）
上清を回収
上清と等量の PT Binding Buffer (植物用) を添加し、転倒混和混合液 600 μl を Spin Column に添加（2 回に分けて全量添加）
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる
残りの混合液を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる
DNase I 溶液（用時調製）全量 100 μl
500 μl の PT Wash1 Buffer を添加

・ ddWater (RNase free)

遠心（13,000×g、1 分間、4℃）

・ 10×DNase I Buffer

10 μl

ろ液を捨てる・ DNase I (RNase free)

30 units

用事調製した 100 μl の DNase I 溶液を添加
室温静置 15 分間
300 μl の PT Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる600 μl の PT Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g、2 分間、4℃）
Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に移す
50 μl の ddWater (RNase free)をメンブレン中央に滴下
室温静置 3 分間
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
RNA 溶液5＜オプションプロトコール＞
標準プロトコールでは RNA 抽出が困難な植物試料の場合、別売りの「Assist Buffer for
ISOSPIN Plant RNA」（Code No. 315-08501）を添加するオプションプロトコールをお試しください。
①5-100 mg の新鮮な植物組織または凍結組織を 1.5 ml マイクロチューブに採取する。
注）
・少量の植物試料から検討を始め、段階的に植物試料の量を増やす。
・夾雑物が多い試料は洗浄等の前処理を行うと有効な場合がある。
前処理例：植物試料に 300 μl の TE を加え、1 分以内に軽くペッスルですり潰し、遠心（13,000×g、10 分間、4℃）した後、上清を取り除く。
・採取した組織は速やかに液体窒素中で凍結させるか、すぐに②の処理に進む。
・RNase の活性を抑制するため、秤量は氷冷しながら速やかに行うか、マイクロチューブにあらかじめ②の抽出液を入れておく。

↓500 μl の PT Extraction Buffer (植物用) に 60 μl の Assist Buffer 1 と 40 μl②の Assist Buffer 2 を加えて混和し、600 μl の抽出液を調製する。
注）・「Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA」の Assist Buffer 1 と Assist Buffer 2 は、混合した状態で保存できません（再溶解が困難な析出物を生じる場合があります）。
・調製した抽出液を長期間放置せず、使用する直前に調製するようにしてください。

↓
試料に用事調製した抽出液を 600 μl 加え、直ちにペッスルですり潰す。試料が液中で浮遊する場合、スピンダウンするとすり潰しやすくなる。
注）・ホモジナイズの不足は低収量につながるので念入りにすり潰す。
・断片化したゲノム DNA が混入しやすくなるためボルテックスは行わない。

↓③

遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、上清を新しいマイクロチューブに回収する。
回収した上清を再度、遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、上清を新しいマイクロチューブに回収する。

④

上清に等量の PT Binding Buffer (植物用) を加えて、均質になるまで数回転倒混和する。
混合溶液を遠心（13,000×g、30 秒間、4℃）し、上清を新しいマイクロチューブに回収する。

6

↓
メンブレンに RNA を吸着させるため、600 μl の④で調製した混合液（上清）⑤を Spin Column に添加する。
（残りは⑥で全量添加）
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
注）・遠心後、スピンカラム上に溶液が残っている場合は、追加で 1 分間遠心する。
それでも溶液が残る場合は、抽出する植物試料の量を減らす。
・Spin Column のカラムを外し、Collection Tube の中のろ液を捨てた後、カラムを同じCollection Tube の上に戻す。
（以降、「ろ液を捨てる」は同様）⑥

残りの④の混合液（上清）を Spin Column に全量添加し、遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
↓500 μl の PT Wash1 Buffer を Spin Column に添加する。

⑦

遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
↓1.5 ml マイクロチューブに以下の試薬を加えて、DNase I 溶液 100 μl を調⑧製する（用時調製）。
10×DNase I Buffer

10 μl

DNase I (RNase free)

30 units

ddWater (RNase free)

up to 100 μl↓
用事調製した 100 μl の DNase I 溶液を Spin Column に添加し、静置（15 分間、室温）する。
注）
・抽出する植物試料が多いとき、DNase I 溶液が浸透しない場合がある。
その場合は、抽出する植物試料の量を減らす。

↓300 μl の PT Wash1 Buffer を Spin Column に添加する。

⑨

遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
↓⑩

洗浄のため 600 μl の PT Wash2 Buffer を Spin Column に添加する。
遠心（13,000×g、2 分間、4℃）する。ろ液と Collection Tube を捨てる。

7↓⑪Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上にのせる。
RNA を溶出させるため、50 μl の ddWater (RNase free)をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。
RNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される。

8

＜簡易・オプションプロトコール＞
別売りの Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA を抽出液（用時調製）全量 600 μl用意する。

・ PT Extraction Buffer (植物用) 500 μl
植物試料（5 - 100 mg）
600 μl の調製した抽出液を添加

・ Assist Buffer 1060 μl

・ Assist Buffer 2040 μl

抽出液中でペッスルを用いて試料をよくすり潰す
遠心（13,000×g、10 分間、4℃）
上清を回収
遠心（13,000×g、10 分間、4℃）
上清を回収
上清と等量の PT Binding Buffer (植物用) を添加し、均質になるまで転倒混和
遠心（13,000×g、30 秒間、4℃）
上清 600 μl を Spin Column に添加（2 回に分けて全量添加）
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる
残りの混合液を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる500 μl の PT Wash1 Buffer を添加

DNase I 溶液（用時調製）全量 100 μl

遠心（13,000×g、1 分間、4℃）

・ ddWater (RNase free)

ろ液を捨てる・ 10×DNase I Buffer

10 μl

100 μl の DNase I 溶液を添加

・ DNase I (RNase free)

30 units

室温静置 15 分間
300 μl の PT Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる600 μl の PT Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g、2 分間、4℃）
Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に移す
50 μl の ddWater (RNase free)をメンブレン中央に滴下
室温静置 3 分間
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
RNA 溶液9VI

トラブルシューティング

トラブル

原因と対策

低収量サンプルのホモジナイゼーションまたは溶解が不十分だと、PT Extraction
Buffer (植物用) に触れていない細胞内部での RNA 分解が進む。組織の摘出を素早くすることと効果的にホモジナイズすることが重要である。

RNA の分解

新鮮な試料を採取後、すぐに PT Extraction Buffer (植物用) 中でホモジナイズする。または速やかに液体窒素で凍結させる。
凍結試料は－70℃以下で保存する。
RNA 溶解用の溶液やチューブは、RNase フリーのものを使用する。

DNA の混入

最終産物の DNase 処理を行う。DNase 処理を行ったサンプルはプロトコー
ルの最初から行うことで精製することができる（この時メンブレン上でのDNase 処理 ⑧ は必要ありません）。

吸光値のばらつき

低純度である。多糖類などの夾雑物が混入している。トラブル「低純度」および「夾雑物の混入」の対策を参照。

低純度

PT Extraction Buffer (植物用) に対してサンプルが多すぎると溶液の粘性が増し夾雑物の沈殿が不十分となるので、サンプル量を半分に減らすか、または添加する PT Extraction Buffer (植物用) の量を 2 倍に増やす。

夾雑物の混入上清を再度、遠心（13,000 x g、10 分間、4℃）して、油分や不溶物を除去する。

上記の対策を行っ別売りの「Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA」を用いたオプションプロても解決しないトコールを試してみる。

【補足】イチゴ葉からの RNA 抽出について
イチゴ葉の場合、オプションプロトコールで調製する抽出液の比率を変更すると、より高純度な RNA を抽出できます。
イチゴ葉用抽出液（用時調製）全量 550 μl
・ PT Extraction Buffer (植物用)500 μl・ Assist Buffer 1010 μl

・ Assist Buffer 2040 μl

10VII データ＜製品性能＞RNA 吸着容量100 μg

カラム容量900 μl＜RNA の収量の目安＞
試料

標準プロトコール収量の目安

シロイヌナズナ(芽生え)

0.1 µg RNA/mg tissue

イネ(芽生え)0.2 µg RNA/mg tissue

ホウレンソウ (葉)0.5 µg RNA/mg tissue

ブロッコリー (芽生え)

1.0 µg RNA/mg tissue

キャベツ (種子)1.3 µg RNA/mg tissue

キャベツ (芽生え)

1.4 µg RNA/mg tissue

キャベツ (葉)0.1 µg RNA/mg tissue

タケ (葉)

0.3 µg RNA/mg tissue

チューリップ (球根)0.2 µg RNA/mg tissue

イチゴ(果実)15 ng RNA/mg tissue

コチョウラン(葉)15 ng RNA/mg tissue

ミカン(砂じょう)

10 ng RNA/mg tissue

キウイ(果実)50 ng RNA/mg tissue

キウイ(種子)80 ng RNA/mg tissue

ジャガイモ(根茎)0.1 µg RNA/mg tissue

ネギ(葉)0.1 µg RNA/mg tissue

トマト(果肉)10 ng RNA/mg tissue

トマト(種子)40 ng RNA/mg tissue

チャ(葉)0.4 µg RNA/mg tissue

キク(葉)0.2 µg RNA/mg tissue11

＜RNA の収量の目安＞
試料

オプションプロトコール
収量の目安

マツ(葉)

††

0.1 µg RNA/mg tissue

バラ(葉)

††

50 ng RNA/mg tissue

バラ(花弁) ††80 ng RNA/mg tissue††

70 ng RNA/mg tissue

ツバキ(葉)

ミカン(外皮)カキ(果肉)††

80 ng RNA/mg tissue††

30 ng RNA/mg tissue

ブドウ(果肉)††10 ng RNA/mg tissue

ブドウ(外皮)††50 ng RNA/mg tissue

バナナ(果肉)††コチョウラン(葉)15 ng RNA/mg tissue††シクラメン(葉) ††イチゴ(葉)††20 ng RNA/mg tissue
0.1 µg RNA/mg tissue
0.1 µg RNA/mg tissue

ジャガイモ(根茎)0.1 µg RNA/mg tissue

ネギ(葉)0.1 µg RNA/mg tissue

トマト(果肉)25 ng RNA/mg tissue

トマト(種子)60 ng RNA/mg tissue

チャ(葉)0.6 µg RNA/mg tissue††：標準プロトコールでは抽出が極めて困難な植物試料

12＜RNA の吸光スペクトル＞

標準プロトコール

各 試 料 か ら 抽 出 し た RNA 溶 液 を 濃 度 6 ng/µl に な る よ う に 調 整 し て DU 800
Spectrophotometer で測定した。

0.16

Abs0.14

キャベツ葉

0.12

キャベツ芽生え0.1

キャベツ種子

0.08

0.06
0.040.020220240＜RNA の吸光スペクトル＞

260280
Wavelength (nm)300320

オプションプロトコール

各試料から抽出した RNA 溶液を濃度 40 ng/µl になるように調整して NanoDrop2000 で測定した。

13VIII 関連製品
製品名Code No.

包装単位

318-90105

Distilled Water, Deionized, Sterile314-08071

DNase I (RNase free)

2,000 units

315-08121

RNase Inhibitor

2,000 units

315-08501

Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA

50 回用

14500 mlマニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課
TEL
URL

076 - 451 – 6548
http://www.nippongene.com/siyaku/

お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております。

ISOSPIN Plant RNA マニュアル（WEB 版）Ver.1-2409_6th edition:201504-201706

15