ISSN 1347-3948

フィールドサイエンス
Journal of Field ScienceNo. 14

東京農工大学農学部附属広域都市圏
フィールドサイエンス教育研究センター
平成28年 3 月

2016

フィールドサイエンス
目
総
1

論
5

次

説
ウシ体外受精胚移植技術に関する研究／杉村智史

文
シリアンハムスター（Mesocricetus auratus）における唾液 α‒アミラーゼ測定によるストレス評価
法の検討／塩澤13

第 １4 号

望・鈴木馨

牛糞便からの新規ウシエンテロウイルスの検出と遺伝子解析／岡田貴志・土赤
大松

勉・長井

誠・押谷

仁・水谷哲也忍・増田恒幸・フィールドサイエンス（J. Field Science）14： 1 ‒ 4 ，2016

総

1

説

ウシ体外受精胚移植技術に関する研究
杉村智史

Study of in vitro produced embryo transfer in cattle
Satoshi SUGIMURA

はじめに
現在，我が国で生産されている肉用牛および乳用

授精できない，適期に授精できない，排卵しない，あるいは受精しても体内で胚が正常に発育できないといった問題が生じていることが推察される。

牛のほぼ100% が人工授精（AI）あるいは受精胚移

これらの問題を克服する手段として，体外で受精植技術に由来する。雌雄の優れた資質を受け継いだ胚を作製し，それらをレシピエント牛へ移植する技

子牛を生産する技術として AI が一般的に利用され術，“体外受精胚移植技術” が注目されている。体外ているが，妊娠期間が280日にもおよぶ単胎動物の受精胚移植技術は，食肉処理場由来卵巣あるいは経ウシでは通常一年一産が限度である。一方，受精胚

腟採卵（OPU）技術により卵胞から卵丘細胞 - 卵子

移植技術は，過排卵処理を施したドナー牛に精液を複合体（COCs）を取り出し，体外成熟培養（IVM），

交配させた後，複数の胚を採取し，得られた胚を他

体外受精（IVF），体外発生培養（IVC）により体の 仮 親（レシピエント 牛）に 移 植 することで，AI外受精胚を作製，得られた胚をレシピエント牛へ移に比べより多くの産子獲得が期待できる。

植することで，優れた資質を受け継いだ子牛を多数

近年，世界的に育種改良が進み 1 個体あたりの乳獲得する技術である。しかしながら，体外受精胚は量が年々増加している。その一方で，繁殖性の低下

新鮮胚，凍結胚共に体内生産胚に比べ生育性が低が問題視され，1992年から2012年の20年間で我が国く，また妊娠期間の延長，過大子，産後直死といっの乳用牛初回 AI 受胎率は66.8% から44.7% にまで減た異常が認められる。つまり，体外受精胚移植技術

少している。乳量と繁殖性の直接的な因果関係は明の発展および改良が今後の『安定的かつ効率的なウ

らかになっていないが，高泌乳性と繁殖性低下の関

シ産子の生産』を左右すると言える。

係が示唆されている。この原因として，泌乳量増加に 伴 う 負 のエネルギーバランス（NEB）が 指 摘 さ

胚の個別管理培養

れている。NEB は生乳生産に必要なエネルギー要

ウシ体外受精胚の作製において，体外授精後の受求量がエネルギー摂取量を超えることが引き金とな

精胚は微小滴内で集団で培養するのが一般的である。これを補うため体脂肪や筋肉の動員が亢進し，る。これは，胚個々のオートクライン，あるいは隣結 果 としてインスリン， グルコースおよび IGF-I

接 胚 からのパラクライン 効 果 が 得 られるためであの低下，さらには遊離脂肪酸（NEFA）やβ-ヒドロる。しかしながら，OPU 技 術 により 乳 用 牛 から

キシ酪酸（BHBA）の増加といった代謝・ホルモン

COCs を採取した場合，一個体から得られる培養可プロファイルの異常が生じる。この NEB によって能胚数は 7 から11個と少数である。さらに，個体間引き起こされる代謝・ホルモンプロファイルの異常ごとに生産できる培養可能胚数にばらつきがある。

は発情，排卵，受精および胚発育といった様々な繁また，胚の生育評価マーカーの探索，あるいは品質

殖 現 象 に 影 響 を 与 えることが 報 告 されている評価を目的として胚の発生過程を追跡する場合，胚（Butler & Smith 1989）。すなわち，NEB の結果，を個別に管理できるような培養システムが必要とな

２０１5．1 ．9 受付；２０１6．2 ．1 受理
東京農工大学大学院農学研究院生物生産科学部門 〒183‒8509 東京都府中市幸町 3 - 5 - 8 ：Institute of Agriculture,
Department of Biological Production, 3 - 5 -8, Saiwai-cho, Fuchu, Tokyo 183-8509, Japan
連絡担当著者：杉村 智史

フィールドサイエンス

2

14号

るが，単独，少数あるいは低密度での培養では胚盤ライン効果ではなく，オートクライン効果に起因す

胞形成率の低下，胚盤胞細胞数の減少，インターることが示唆された（Sugimura et al. 2013）。以上，

フェロンタウの分泌量低下といった異常が報告さて開発した個別管理培養システムは TLC に対応可能

いる（Larson & Kubisch 1999）。これらは，胚の発なだけでなく，得られる胚の品質も高いこと，さら生に重要となるオートクライン，あるいはパラクラに，少数の培養でも胚発生に負の影響を与えないこ

イン効果が十分得られていないためであると示唆さとなど，様々な有用性が確認された。

れている。一方，少量微小滴の培養では胚発生に影響を与えるアンモニウムや活性酸素種の蓄積量が増

ウシ IVP 胚生育成否予測マーカーの探索

加する（Gardner & Lane 1993）。培地交換により，一般的にウシ体外受精胚の選別は国際胚移植学会

培地中の有毒物質は除去されるが，同時に発生に重（IETS）が 推 奨 する 胚 盤 胞 の 形 態 学 的 品 質 評 価

要な他のオートクライン・パラクライン因子を除去（Code1-3）に基づきオペレーターの主観的判断にしてしまう。

より行われる。しかしながら，この選択方法を用いこれらの問題を克服するため， 4 穴培養皿あるいて体外受精胚を移植した場合の受胎率は35-50% とは微小滴中にマイクロウェルを持つ well-of-the-well

低率である。そのため，客観的かつより高受胎性が（WOW）が 開 発 された（Vajta et al. 2000）。WOW

期待できる胚の選択技術の開発が望まれている。

は胚の発生を支持するオートクライン / パラクライ

胚盤胞の形態学的評価以外に，胚の内部細胞塊

ン因子の蓄積，さらには胚の発生を阻害する有毒物（ICM）および栄養外胚葉（TE）細胞数，アポトー

質を拡散させる効果があると考えられている。しかシス細胞数，透明帯からの脱出能，染色体異常，遺しながら，従 来 の WOW は 針 やシリンダーを 用 い

伝子発現解析がある。しかしながら，このような品て手製でマイクロウェルを作製していたため，マイ質評価方法の多くは侵襲的であるため，移植用の胚クロウェルの深さや直径が不均一であり，さらに顕には適用できない。そこで，生育可能胚をより高精

微鏡下での胚の視覚性が極めて低かった。

度に選択可能な非侵襲的な胚の品質評価マーカーのTime-lapse cinematography（TLC）は 継 時 的 に探索が望まれている。そこで，開発した個別管理培

胚の発生過程を観察することができ，発生速度や卵養 システム，TLC そして 胚 のエネルギー代 謝 活 性

割様式等の発生カイネティクス解析を可能とする。

（酸素消費）が解析可能な走査型電気化学顕微鏡

しかしながら，手製の WOW を用いて TLC 観察を（SECM）を用いて体外受精胚の生育成否予測マー行った場合，胚の視覚性は極めて低く，発生カイネ

カーの探索を行った。その結果，新規の予測マー

ティクス解析は困難であった。一方，従来の集合培カーとして， 1 ）第一卵割のタイミング， 2 ）第一養では胚が動いてしまい発生過程を追跡できないと

卵割終了時の割球数， 3 ）第一卵割終了時の細胞断

いった問題があった。

片化（フラグメンテーション）の有無， 4 ）胚の一そこで，我々は射出成型技術を用いた TLC 対応

時休止期（ラグフェイス）での割球数， 5 ）酸素消型のポリスチレン製マイクロウェル培養システムを

費 量 が 同 定 された（Sugimura et al. 2012）。予 測開発した（Sugimura et al. 2010）。開発した培養シマーカー 1 は染色体数，妊娠認識関連遺伝子 IFN-

ステムの有効性を解析したところ，従来の集合培養

tau の 発 現 およびインプリント 遺 伝 子 IGF2R の 発と比較し胚盤胞形成率に違いは認められなかった

現と相関があること，予測マーカー 2 は染色体数おが，従来の集合培養によって得られた受精胚を移植

よび IFN-tau の 発 現 と 相 関 があること，予 測 マー

した場合に比べ，開発した個別管理培養システムでカー 3 は aldo-keto 還元酵素関連遺伝子 AKR1 B1 の得 られた 胚 を 移 植 した 場 合 で 受 胎 率 が 増 加 した発現と相関があること，予測マーカー 4 はアポトー（21.9% vs. 51.7%）。また，低 密 度（ 5 個／培 養）で

シス 細 胞 数 と 相 関 があること，予 測 マーカー 5 は胚を培養した場合，従来の集合培養では胚盤胞形成

ICM・TE 細胞数，透明帯からの脱出能および胎盤率が低下したのに対し，個別管理培養システムでは関連遺伝子 PLAC8 の発現と相関があることを明ら

胚盤胞形成率の低下は認められなかった。さらに，かにした。これら 5 つの予測マーカーの組み合わせ

隣接胚の培養間隔を伸ばしても胚盤胞形成が低下しにより体外受精胚を選別し移植したところ，78.9%

なかったことから，低密度の培養においても胚の胚と高い受胎率が得られた。従来の選別方法により胚盤胞形成率が低下しなかったのは，隣接胚のパラクを選び移植した場合の受胎率が40.4% であったこと

ウシ胚の体外生産（杉村）3から，新たに同定したウシ体外受精胚の発育成否予能獲得機構” は詳細になっていない。最近，我々は測マーカーが高受胎性が期待できる胚の高精度かつEGF-like factorsであるAREGとOSFsである BMP15

客観的な選別に有効であることが示された。

が協調的にウシ卵子の発生能を向上させることを明

ウシ卵子の発生能獲得機構

らかにした（Sugimura et al. 2014）。これは AREGによる卵丘細胞での解糖系の亢進と BMP15による体外受精胚の生産において、最初のステップとな

ギャップ結合の維持が卵子の発生能獲得に重要な代るのが 体 外 成 熟（In Vitro Maturation: IVM）であ

謝産物を効率的に卵丘細胞から卵子へ移行させたた

り，その後の胚発育を大きく左右する。IVM に供めである。これは，ウシ卵子の発生能獲得機構を理する未成熟卵子は食肉処理場卵巣あるいは OPU に解するうえで極めて重要な知見であると言える。今より 2 - 6 mm の小あるいは中卵胞より採取する。

後，さらにウシ卵子の発生能獲得機構の全容を明ら

しかしながら，現行の IVM 技術で得られたウシ卵

かにすることで，生育可能な IVM 卵子の効率的か

子は体内成熟由来に比べ発育性が劣る（Matoba et

つ安定的生産が可能になると考えられる。

al. 2014）。

おわりに生体内において卵子成熟は顆粒層細胞や卵丘細胞といった卵胞細胞によって制御されている。この反

体外受精胚は2012年において全世界で凍結胚が応は黄体形成ホルモン（LH）や卵胞刺激ホルモン

36,761頭，新鮮胚が348,238頭に移植され，その80%（FSH）といった性腺刺激ホルモン，および骨形成はブラジルによるものである。国内での普及率は依タンパク質（BMP）15や成長分化因子（GDF）9 といっ然として低いものの，OPU 技術の普及に伴い徐々た 卵 子 分 泌 因 子（oocyte secret factors: OSFs）にに 現 場 レベルで 利 用 され2011年 に 体 外 受 精 胚 を依存する。

10,198頭に移植し2,251頭が誕生している。現在，体LH や FSH は amphireglin（AREG），epireglin

外受精胚の受胎率は新鮮胚で42-44%，凍結胚で36-（EREG），betacellulin（BTC）と い っ た EGF-like

39% と低率である。体外受精胚移植技術の更なるfactors の発現を誘導する（Hsieh et al. 2007）。これ

普及には，受胎率の向上が必須である。したがって，ら EGF-like factors はプロテインキナーゼ A（PKA）

現在，研究対象としている高受胎率が期待できる胚を介して発現が誘導され EGF 受容体（EGFR）にの選別技術や体外成熟・発生培養技術の開発に加結合する。その後，EGFR シグナルはその下流因子，

え，飼養管理と卵子の品質，受胚牛の飼養管理と移ERK1/2，PI3K/AKT および p38MAPK を 活 性 化

植後の受胎性との関係を詳細にすることで，より現することで 卵 丘 膨 化 関 連 遺 伝 子 である HAS2 ，場レベルで求められる技術へと発展するものと考え

TFNAIP6 ，PTX3 および PTGS2 の発現を誘導すられる。

る（Shimada et al. 2006）。ギャップ結合を介する顆
粒層細胞／卵丘細胞からの cGMP あるいは cAMP

引用文献の卵子内への流入が停止することで PDE3A が活性

Butler, W. R. and Smith, R. D. (1989): Interrelation-

化され cAMP 濃度の減少により減数分裂が誘導さ

ships between energy balance and postpar-

れる（Norris et al. 2009）。

tum reproductive function in dairy cattle.

一方，TGF-βsuperfamilyに属するBMP15やGDF9Journal of Dairy Science, 72 : 767-783.

といった OSFs は卵成熟に重要な卵丘細胞の分化誘

Eppig, J. J. (2001): Oocyte control of ovarian follicu-

導に必須である（Eppig 2001）。OSFs は SMAD2/3

lar development and function in mammals.

あるいは SMAD 1 / 5 / 8 を介し卵丘細胞の増殖，

Reproduction, 122 : 829-838.

遺伝子発現，あるいはアポトーシスおよび膨化を制Gardner, D. K. and Lane, M. (1993): Amino acids

御 す る。 こ れ ま で に，BMP15 お よ び GDF 9 がand ammonium regulate mouse embryo

EGFR の発現を制御すること，また ERK1/2の活性化

development in culture. Biology of Reproduc-を刺激することが報告されている（Su et al. 2010）。

tion, 48 : 377-385.

このように，卵丘膨化や卵子の減数分裂再開の機

Hsieh, M., Lee, D., Panigone, S., Horner, K., Chen, R.,

序は徐々に明らかになってきているが，効率的かつTheologis, A., Lee, D. C., Threadgill, D. W. and

安定的な胚生産と産子獲得に直結する “卵子の発生

Conti, M. (2007): Luteinizing hormone-depen-フィールドサイエンス

414号

dent activation of the epidermal growth fac-

Sugimura, S., Akai, T., Hashiyada, Y., Aikawa, Y.,

tor network is essential for ovulation. Molecu-

Ohtake, M., Matsuda, H., Kobayashi, S., Ko-

lar and Cellular Biology, 27 : 1914-1924.

bayashi, E., Konishi, K. and Imai, K. (2013) :Larson, M. A. and Kubisch, H. M. (1999) : The

Effect of embryo density on in vitro develop-

effects of group size on development and in-ment and gene expression in bovine in vitro-

terferon-tau secretion by in-vitro fertilized

fertilized embryos cultured in a microwelland cultured bovine blastocysts. Humansystem. Journal of Reproduction and Develop-

Reproduction, 14 : 2075-2079.

ment, 59 : 115-122.

Matoba, S., Yoshioka, H., Matsuda, H., Sugimura, S.,

Sugimura, S., Akai, T., Hashiyada, Y., Somfai, T.,

Aikawa, Y., Ohtake, M., Hashiyada, Y., Seta, T.,

Inaba, Y., Hirayama, M., Yamanouchi, T.,

Nakagawa, K., Lonergan, P. and Imai, K.

Matsuda, H., Kobayashi, S., Aikawa, Y.,(2014): Optimizing production of in vivo-ma-

Ohtake, M., Kobayashi, E., Konishi, K. andtured oocytes from superstimulated HolsteinImai, K. (2012) : Promising system for select-cows for in vitro production of embryos using

ing healthy in vitro-fertilized embryos in

X-sorted sperm. Journal of Dairy Science, 97 :cattle. PloS One, 7 : e36627.

743-753.

Sugimura, S., Akai, T., Somfai, T., Hirayama, M.,

Norris, R. P., Ratzan, W. J., Freudzon, M., Mehl-

Aikawa, Y., Ohtake, M., Hattori, H., Kobayashi,mann, L. M., Krall, J., Movsesian, M. A., Wang,

S., Hashiyada, Y., Konishi, K. and Imai, K.

H., Ke, H., Nikolaev, V. O. and Jaffe, L. A.

(2010) : Time-lapse cinematography-compati-(2009): Cyclic GMP from the surrounding

ble polystyrene-based microwell culture

somatic cells regulates cyclic AMP and meio-

system: a novel tool for tracking the develop-

sis in the mouse oocyte. Development, 136 :ment of individual bovine embryos. Biology of

1869-1878.

Reproduction, 83 : 970-978.

Shimada, M., Hernandez-Gonzalez, I., Gonzalez-

Sugimura, S., Ritter, L. J., Sutton-McDowall, M. L.,

Robayna, I. and Richards, J. S. (2006): Para-

Mottershead, D. G., Thompson, J. G. andcrine and autocrine regulation of epidermal

Gilchrist, R. B. (2014): Amphiregulin co-operates

growth factor-like factors in cumulus oocyte

with bone morphogenetic protein 15 tocomplexes and granulosa cells: key roles forincrease bovine oocyte developmental compe-

prostaglandin synthase 2 and progesterone

tence: effects on gap junction-mediated me-

receptor. Molecular Endocrinology, 20 : 1352-

tabolite supply. Molecular Human Reproduc-

1365.

tion, 20 : 499-513.

Su, Y. Q., Sugiura, K., Li, Q., Wigglesworth, K.,

Vajta, G., Peura, T. T., Holm, P., Paldi, A., Greve, T.,

Matzuk, M. M. and Eppig, J. J. (2010) : Mouse

Trounson, A. O. and Callesen, H. (2000): New

oocytes enable LH-induced maturation of themethod for culture of zona-included or zona-

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free embryos: the Well of the Well (WOW)receptor-dependent signaling. Molecularsystem. Molecular Reproduction and Develop-

Endocrinology, 24 : 1230-1239.

met, 55 : 256-264.

フィールドサイエンス（J. Field Science）14： 5 ‒11，2016

論

5

文

シリアンハムスター（Mesocricetus auratus）における
唾液 α-アミラーゼ測定によるストレス評価法の検討
塩澤

望・鈴木

馨†

Validation of a stress evaluation method by means of the salivary α-amylase
measurement in Syrian hamsters (Mesocricetus auratus)
Nozomu SHIOZAWA，Kaoru SUZUKI†
マウスやハムスターといった小型げっ歯類の実験動物では反復測定に優れたストレスマーカーは確立されていない。先行研究からハムスターにおいて唾液 α-アミラーゼによるストレス評価の可能性が示された。
しかし，ハムスターは唾液量が少なく，個体によって測定に必要な唾液量を採取できない場合がある。本研
究ではこうした欠点を補うため，麻酔下で生理食塩水をハムスターの頬袋に入れ再度回収することで唾液を含む測定用のサンプルとして使用できると考えた。測定の精度や安定性についてストレス反応性，同時再現性，希釈直線性および冷凍保存性で検討を行った。ストレスを負荷した際のサンプルは負荷しなかった際のサンプルに比べ有意に高い活性値を示し本測定法でストレス反応を捕捉することが出来た。同時再現性では全てのサンプルで変動係数が 5 ％未満と高い精度を示し，直線性においても全てのサンプルで決定係数が0.97以上と安定的な直線回帰が認められた。冷凍保存性の結果から， 1 ヶ月程度であれば冷凍することで安定的な保存が可能であることが分かった。以上から本測定法は精度・安定性に優れたハムスターにおける新
たなストレス評価方法となる可能性が示唆された。
キーワード：ストレス評価，ハムスター，ストレスマーカー，唾液 α-アミラーゼ

緒言

でも反応は異なる。クロモグラニン A という物質は 精 神 的 ストレスのみに 反 応 するといわれている

ストレス評価は行動学や医学分野の研究で多くな（中 根 1999, 井 澤 ら 2007）。このように，ストレスされている。ストレスには急性や慢性ストレス，身を評価する上で重要になるのは，ストレスの種類や体的や精神的ストレスなどの種類があり，その特徴

生物種の特性に合った測定法でストレスを評価するは様々である。そのため，ストレスの種類によってことである。

生体内での反応も変わってくる。さらに，生物種が現在，実験動物におけるバイオマーカーを用いた

違えばその違いはさらに大きくなる。例えば，急性ストレス 評 価 法 で 主 流 となっているものにコルチ

ストレスにより 副 腎 皮 質 ホルモンの 分 泌 は増える

ゾールやコルチコステロンといった副腎皮質ホルモが，この副腎皮質ホルモンはヒトではコルチゾール

ンの血中濃度の測定がある。しかし，マウスやハムがその多くを占めるのに対し，げっ歯類ではコルチ

スターといった小型げっ歯類においては測定に必要コステロンの方が主要である。また，慢性ストレスな血液量を得るためには心臓穿刺や断頭処理などがの反応としては免疫系の機能低下がある。そのた必要であり，同一個体を用いた反復測定が不可能でめ，慢性ストレス評価のバイオマーカーとしてサイある（Head et al. 1985）。また，侵襲性が高く動物福トカイン類の可能性が示唆されている（田中・脇田

祉的な観点からも代替的な方法の開発が求められて2011）。また，精神的ストレスか身体的ストレスかいる。

２０１5．2 ．16受付；２０１5．2 ．24受理
東京農工大学農学部附属広域都市圏フィールドサイエンス教育研究センター 〒183‒8509 東京都府中市幸町 3 ‒ 5 ‒ 8†
連絡担当著者：鈴木 馨 メール；kaoru@cc.tuat.ac.jp

フィールドサイエンス

614号

近年，ヒトにおいて侵襲性の低いストレス評価法

た。飼 育 方 法 は， 1 ケージ（W: 396×H: 297×D:として唾液 α-アミラーゼを用いた測定が注目され，240mm）ごと 1 匹 あるいは 2 匹 で 飼 育 した。飼 料

研 究 がなされている（Nater and Rohleder 2009）。

は一般的な実験動物用固形飼料である MF（オリエまた，この唾液 α-アミラーゼを用いて簡易的にスンタル酵母工業株式会社，東京）を使用し，朝と夕トレスを評価できるよう，医療用簡易測定器が商業の 1 日 2 回給餌した。飲み水は水道水を使用した。

用に開発され販売もなされた（山口・吉田 2005）。

飼育中飼料と水は自由摂取させた。温度16～25℃，

唾液 α-アミラーゼの分泌はストレス負荷により促

湿度は自然状態，明期12時間（ 6 ：00-18：00）の進されることが知られている。これはストレスによ環境で飼育した。全ての実験は10：00～15：00時のり交感神経系が活性化することに起因している。交間に行った。動物実験は国立大学法人東京農工大学

感神経系反応は副腎皮質ホルモンの分泌を促すホル

動物実験等に関する規定に則り，動物実験小委員会

モン系作用に比べ反応が速いといった特徴があり，の承認を得て実施した。

急性ストレスのマーカーとして期待されている。最
近では，ウシ（Kitagawa et al. 2011）やブタ（Muneta

ストレス負荷et al. 2010, Fuentes et al. 2011, 江原ら2012）といっ

ストレス負荷の方法は，負荷により交感神経系がた家畜動物， またラット（Matsuura et al. 2012）

活性化することが報告されている強制水泳ストレスやマウス（井上ら2009, Tsuchiya et al. 2014）といっを選択した（Mabry et al. 1995）。強制水泳では，た実験動物を対象として，唾液 α-アミラーゼを指水槽（W: 360×H: 210×D: 215mm）に深さ150mm，標としたストレス評価に関する報告もされている。

25± 1 ℃の水を張り泳がせた。ストレス負荷の時間

先行研究からシリアンハムスターにおいても唾液

は 1 ～ 3 分を各試験に合わせて適宜選択した。水泳

α-アミラーゼによるストレス評価の可能性が示唆をさせた個体は水泳後にタオルで水分を拭き取ってされている（津 村・鈴 木2014）。しかし，この 研 究から，麻酔薬を投与しサンプル採取を行った。サンでは測定に必要なだけの唾液を採取できない個体もプル採取終了後，ドライヤーで十分に身体を乾かし存在した。小型の動物では唾液量が少なく，またハてからそれぞれのケージに戻した。

ムスターは唾液採取時の保定もマウスなどに比べ難しいため，唾液採取がうまく行えなかったと考えら

麻酔れる。そこで本研究はこうした問題を補完するため麻酔は斉藤の方法（2000）に従いケタミン（50～の測定法の開発および正確性の検討を目的に行った。

100mg/kg）およびジアゼパム（ 3 ～ 5 mg/kg）の本研究では全身麻酔によりハムスターを不動化さ腹腔内投与で行った。麻酔は初めにケタミン50mg/

せることで保定を容易に行えるようにした。ハムス

kg およびジアゼパム 3 mg/kg を投与し麻酔深度にターの形態的な特徴の一つに頬袋があり，サンプルより必要に応じて上記の範囲内で追加投与を行っ量の確保はこの頬袋を利用することで可能になるとた。その後，麻酔による不動化を確認でき次第サン考えた。麻酔下のハムスターの頬袋に生理食塩水をプルの採取に取りかかった。各個体において不動化

注入し再度回収することで唾液を含む十分量のサンまでは 5 ～20分の時間を要した。サンプル採取は保プルを得ることに成功した。この方法で採取したサ温マットにより体温の低下を防ぐ処置を行い，サンンプルにより正確な唾液 α-アミラーゼ測定が可能

プル採取後ケージに戻し覚醒するまでの間はライト

か否か，ストレス反応性，同時再現性，希釈直線性による保温を行った。前回の麻酔の影響を受けない

および冷凍保存性に関する試験を行いその結果からように実験は 2 週間以上の回復期間を設けて行った。

検討を行った。
材料および方法
使用動物

サンプル採取サンプル採取は全て麻酔によって不動化した状態で行った。まず初めに，ハムスターを横臥させ，誤シリアンハムスター（Mesocricetus auratus） は嚥を防ぐため下側の頬袋に0.5ml の生理食塩水を注

日本エスエルシー株式会社（静岡，浜松）から購入入した。その後，30秒間スパーテルを用い生理食塩

した Slc: Syrian を使用した。実験は 2 ～ 8 ヶ月齢の水を頬袋内の口腔粘膜に沿うようにかき混ぜ，唾液

性 成 熟 したオス 8 個 体（体 重：77～131g）で 行っを含む生理食塩水を回収した。生理食塩水の注入おシリアンハムスターにおける唾液α-アミラーゼ測定によるストレス評価法の検討（塩澤・鈴木）

7

よび回収は 1 ml シリンジに針を付けずに使用した。

測定を行い，各サンプルで平均値を算出した。群間生理食塩水は全ての実験で70% 以上の回収が可能の比較は対応のある t 検定で行い，P 値 <0.05を有であった。回収した生理食塩水は遠心分離（ 1 分，

意差ありと判断した。

3600G）を行い，沈下物を取り除きサンプルとし測定に使用した。

同時再現性試験では 4 個体を使用し各個体から活性値の異なるサンプルを採取した。活性値の異なるサンプルを得るため，個体により負荷するストレス

測

定強度を変えた。ストレス負荷をしなかった個体から

唾液 α-アミラーゼの測定はレート法により行っ採取したサンプル，ストレス 1 分間負荷した個体かた。測 定 は Gal-G2-CNP（2-クロロ-4-ニトロフェニら採取したもの， 2 分間負荷から採取したもの， 3

ル4-0-α-D-ガラクトピラノシルマルトサイド）を 基

分間負荷から採取したものを使用し試験した。各サ

質として，唾液α-アミラーゼによる酵素反応の加水ンプルで連続 5 回の測定を行った。測定から各サン分解で生成する発色物質の CNP（2-クロロ-4-ニト

プルで平均値，標準偏差および変動係数（CV）をロフェノール）（式⑴）の主波長である405nm の光算出した。

の反射率を測定し，アミラーゼ活性値に変換した

希釈直線性試験では 6 個体を使用し，活性値の異（馬島ら 1997）。基質の構造式は次に示す通りであなる 3 つのサンプルを調製した。一つ目のサンプルる。

は水泳ストレスを負荷しなかった 2 個体分のサンプ
AMY

Gal-G2-CNP → Gal-G2+CNP（白→黄）（ 式⑴）基質の構造式：

ルを混合し調製した（サンプル①）。同様に，二つ目のサンプルでは水泳ストレスを負荷しなかった 1
個体分および 2 分の水泳ストレスを負荷した 1 個体
分のサンプルの混合により（サンプル②），三つ目
では 2 分の水泳ストレスを負荷した 2 個体分のサンプルを混合することで調製した（サンプル③）。調製 したサンプルはそれぞれ 生 理 食 塩 水 により75，

測定機器は，市販されている携帯型唾液アミラー

50，25，12.5% の希釈系列を作成した。測定はそれ

ゼモニター（酵 素 分 析 装 置 唾 液 アミラーゼモニ

ぞれの希釈系列で三重測定を行った。それぞれのサ

ター，ニプロ株式会社，大阪）を使用した。山口らンプルで回帰式を求め決定係数（R 2 ）を算出した。

（2007）の研究方法に従い，専用のチップに完全に

冷凍保存性試験におけるサンプルは希釈性試験と飽和する検体量28μ l をマイクロピペットで定量お同様の手順により調製し， 3 つのサンプルを用意しよび滴下した。その後，速やかに説明書に従い唾液た（サンプル①～③）。調製したサンプルは複数回アミラーゼモニターにより 唾 液 α-アミラーゼの 活の凍結融解を避けるため，それぞれ分注し冷凍保存性値を測定した。

した。測定は採取直後および採取後 1 ～ 4 週まで毎週行った。測定までの間サンプルは -20℃で冷凍保試験項目存した。解凍は測定の直前に行い，自然解凍で室温

本 研 究 ではシリアンハムスターにおいて 唾 液 α-まで戻した。測定は解凍後に三重測定を行った。統アミラーゼ測定がストレス評価法として機能するか計はそれぞれのサンプルにおいて，測定週を独立変調査するためにストレス反応性，測定の精度および数とした一元配置分散分析を行い，P 値 <0.05を有安定性，サンプルの保存性に関しての試験を実施し意差ありと判断した。

た。ストレス反応を評価することができるか検討するためにストレス検知試験，測定の精度および安定結

果性を検討するために同時再現性試験および希釈直線

ストレス検知試験において，ストレスを負荷しな性試験，サンプルの保存性を検討するために冷凍保かった際の 3 個体の平均値は57±12KIU/L（MEAN存性試験を行った。

±SD）であった。また，ストレスを 負 荷 した 際 のまず初めにストレス検知試験では 3 個体を使用

平均値は88±9.3KIU/L であった。t 検定の結果は P

し，ストレスを 2 分間負荷した条件と負荷しなかっ= 0.026であり，P < 0.05となり，ストレスを負荷した条件でサンプル採取し測定を行った。測定は三重た際の有意に高い活性値を確認した（図 1 ）。このフィールドサイエンス

814号

図 1 ．ストレス検知試験

ことから 強 制 水 泳 ストレスを 負 荷 することで唾液
α-アミラーゼ活性の有意な上昇がみられることを

図 2 ．希釈直線性
サンプル①：N×2,
サンプル③：S× 2（N：非ストレス個体 ,確認した。
同時再現性試験の結果を表 1 に示す。水泳無しおサンプルにおいて変動係数は 5 % 未満の値を示した。
希釈直線性試験では全てのサンプルにおいて高い
直 線 回 帰 がみられた（図 2 ）。希 釈 前 の 活 性 値 が63KIU/L であるサンプル ② および79KIU/L である
サンプル③においては，ともに決定係数0.99以上の結 果 を 示 した。また，38KIU/L のサンプル ① においても決定係数0.97以上の値を示した。

活性値（KIU/L）

る活性値の異なるサンプルを得た。全ての活性値のS：ストレス個体）

120.0

よび水泳時間 1 ～ 3 分とストレス強度を変えることにより，平 均 値 で42.6～148.8KIU/L の 範 囲 に 値 す

サンプル②：N× 1 ＋S×1,

100.0
80.0
①
②
③

60.0
40.0
20.0
0.0

0

1

2

3

週（WEEK）

4

図 3 ．冷凍保存性
サンプル①：N×2, サンプル②：N× 1 ＋S×1,
サンプル③：S× 2（N：非ストレス個体, S：ストレス個体）

冷凍保存性試験の結果を図 3 に示す。 3 サンプルの採取直後の活性値はそれぞれ，42±1.7KIU/L，
60±4.9KIU/L，79±1.4KIU/L であった。測 定 週 を

考察

独立変数とした一元配置分散分析の結果，全てのサ

交感神経はストレス刺激により活性化する。このンプルで週ごとの活性値平均の差に有意差はない

交感神経の活動を測定することでストレスを評価すという結果が示された（Sample ①：F（4,10）=0.64

ることが出来る。交感神経が活性化すると副腎髄質

P>0.05,におけるカテコールアミンの分泌が促進される。カ

Sample ②：F（4,10）=0.45

P>0.05,

Sample ③：F（4,10）=3.39 P>0.05）。

テコールアミンの一種であるノルエピネフリンは以前から交感神経活動のマーカーとして研究されており，現在では確立したマーカーとして使われている

表 1 ．同時再現性（単位：KIU/L）
Samplen

MEAN MAX

0 min

5

42.6

1 min

5

2 min
3 min

（Mabry et al. 1995）。この血漿由来のノルエピネフ

MIN

SD

CV（%）

46

40

1.96

4.6

られ，唾 液 α-アミラーゼも 交 感 神 経 活 性 のマー

57.8

60

53

2.56

4.4

カーとしての 可 能 性 が 示 唆 されるようになった

5

82.2

85

79

1.94

2.4

（Chatterton Jr. et al 1996）。

5

148.8

153

141

4.66

3.1

（Sample：ストレス負荷時間, n：標本数, MEAN：平均,
MAX：最大値，MIN：最小値，SD：標準偏差，CV：変動係数）

リン濃度と唾液 α-アミラーゼ濃度には相関性がみ唾液アミラーゼ測定でストレスを評価することには多くの利点がある。従来の方法では採血によるサンプル採取は侵襲性が高く，小型げっ歯類においては同一個体での反復測定が困難であった。唾液によシリアンハムスターにおける唾液α-アミラーゼ測定によるストレス評価法の検討（塩澤・鈴木）

9

るストレス評価はこれらの欠点を補うものとして大では唾液の溶液を使用しており，直接唾液をサンプ

きな可能性を持っている。こうした唾液アミラーゼ

ルとしたものに比べ活性値は低値を示すとことが予とストレスの関係についての研究はヒトにおいて展測されていた。そこで，この要因として麻酔の関与

開されてきた。数年前に簡易測定が可能な携帯式のが疑われる。今回使用した麻酔薬にケタミンがあ測定器も販売され唾液アミラーゼ測定は一般的なスる。ケタミンにより麻酔をかけると，心拍数や動脈トレス評価系になりつつあるといえる。また，近年

圧，心拍出量の上昇がみられる。これは，ケタミン

ではウシやブタといった家畜動物を中心に動物へのによる中枢の交感神経の興奮あるいは交感神経末端

応用も報告がなされるようになった。一方で，イヌでのノルエピネフリンの再取り込みの阻害によるもやネコといった愛玩動物に対しては唾液アミラーゼのである。また，血漿中のノルエピネフリンの上昇によるストレス評価はなされてきていない。これはがケタミン注入後の 2 ～ 4 分後に起こり，15分後にイヌやネコといった肉食動物ではデンプン分解酵素

元に戻ることが報告されている（柳澤ら 2009）。さである唾液アミラーゼの分泌がほとんど無く測定がらに，ノルエピネフリンと 唾 液 α-アミラーゼは 正困難であるためと考えられる。また，マウスやハムの相関を示すことを考慮すると，ケタミンを使用しスターといった小型げっ歯類の実験動物では，唾液

たことにより唾液 α-アミラーゼの活性値の上昇がアミラーゼの分泌は十分にあるが唾液そのものが少起きたのだと考えられる。麻酔によりアミラーゼ活量で測定に必要な量を確保するのが困難であった。

性が上昇する可能性があるため，無麻酔下および麻そのためハムスターにおいて，本研究では頬袋と生酔下でのストレス評価の結果を比較する際には注意

理食塩水を利用したサンプル採取法で，測定に必要する必要があるだろう。ストレス評価の中には外科な十分量のサンプル量の確保を試みた。

手術によるストレスの評価などの麻酔使用を前提とストレス検知試験では，唾液を含む生理食塩水のしたものも含まれる。こうした条件のストレス評価

サンプルを用いた測定でストレス反応を評価できるをより正確に行うためには，今後麻酔と唾液アミか検討した。試験の結果はストレスを負荷した際のラーゼ分泌との関係に関する研究を進めていく必要

活性値がストレスを負荷しなかった際のそれと比べがあるだろう。

有意に高い値をとった。これは，ストレス負荷によ測定の精度および安定性を検討するための同時再る唾液酵素の分泌促進反応，つまり交感神経系の活現性試験では， 4 つの濃度のサンプルで2.4～4.6％

性化としてみられるストレス反応を本測定法によりの変動係数を示し，高い再現性を確認することが出捉えることが可能であることを示している。先行研来た。再現性10％というのが一般的に許容される統究（津村・鈴木 2014）からハムスター唾液によるス

計的判定の正確性であり，結果は全てこの10% 以

トレス評価の可能性は示唆されており，本研究結果内のものであった。このことからも十分に精度の高は予測していたものとなった。しかし，本研究と先い測定が可能であることが確認された。また，正確

行研究とで示された活性値に大きな違いがみられ性のもう一つの指標として行った希釈直線性試験のた。違いがみられたのはストレスを負荷しなかった

結果は，全ての濃度で R 2 >0.97という高い直線回帰際の値で，先行研究では平均値が17±3.1KIU/L でがみられた。以上のことからハムスター唾液を生理あったのに 対 し，本 研 究 の 結 果 では57±12KIU/L

食塩水で希釈しても高い正確性を保つことができ，であった。本研究と先行研究の違いは三つあり，一高い精度の予測値を求めることも可能であることがつは本研究では麻酔下でサンプルの採取を行ったこ分かった。今回使用した測定機器はヒト唾液用に開と，二つ目は，本研究ではサンプルとして生理食塩

発されており，他の動物種に応用された報告はな

水に唾液を含ませたものを使用したのに対し，先行い。著者らの研究はこの機器の測定系に初めてハム

研究では測定用のチップを直接頬袋に挿入し唾液をスター唾液を使用したものである。結果からこの測採取し測定したことである。また，三つ目は負荷し定系へのハムスター唾液の交差性がみられ，精度のたストレスが異なり，今回は強制水泳ストレスを負高い安定した測定が可能であることが分かった。

荷したのに対し，先行研究では自転車輸送による輸冷凍保存性試験の結果から活性値に影響を与えな

送ストレスを負荷した。違いがみられたのは平常時い安定した保存性も確認された。採取直後に測定をの活性値であるためストレスの負荷方法はここでは行えない場合にサンプルを冷凍保存することは一般関係がない。また，サンプルの採取法では，本研究的な方法であるとされている。また，ヒト唾液ではフィールドサイエンス

10

14号

24時間以内であれば室温や冷蔵（ 4 ℃）条件での保引用文献

存 も 可 能 であると 報 告 されている（Granger et al.
2007）。今回の実験では複数回の凍結融解を避ける

1 ）Chatterton Jr., R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. C.,

ためにサンプルを分注し保存したが，上述の報告にEllman, A. B. and Hudgens, G. A. (1996): Sali-

よれば複数回の凍結融解は唾液 α-アミラーゼアッvary α-amylase as a measure of endogenous

セイに有意な影響を与えないとされている。このよ

adrenergic activity. Clinical Physiology, 16:

うなことから唾液は保存性に優れた試料であるとい

433-448.

える。こうした点にも唾液を試料とするストレス評
価の利点がみてとれる。
本研究では急性ストレス反応に限定し，その反応性および測定精度の検討を行った。シリアンハムス

2 ）江 原史雄・塩見宜久・尾野喜孝（2012）： ブタ
における唾液アミラーゼ活性のストレス指標としての 有 効 性 . Coastal Bioenvironment, 19：
49-53.

ターにおける 唾 液 α-アミラーゼ 測 定 では，ストレ3 ）Fuentes, M., Tecles, F., Gutie′rrez, A., Otal, J.,

スを検知することが可能であり，高い精度と安定性

Martı′nez-Subiela, S. and Cero′n, J.J. (2011):を確認した。また，サンプル凍結による安定的な保Validation of an automated method for sali-

存 法 も 確 認 できた。これらから，シリアンハムス

vary alpha-amylase measurements in pigs (Sus

ターにおける急性ストレス反応では，唾液 α-アミscrofa domesticus) and its application as a

ラーゼ測定によるストレス評価が十分に可能である

stress biomarker. Journal of Veterinary Diag-と考えられる。

nostic Investigation, 23: 282-287.

今後のストレス評価研究の課題として慢性ストレ4 ）G ranger, D. A., Kivlighan, K. T., Mona, El-スの評価があげられる。本測定法のような唾液試料

Sheikh, Godis, E. B. and Stroud, L. R. (2007):を用いたストレス評価法は反復性に優れた方法であSalivary α-amylase in biobehavioral research

るため，継続的に慢性ストレスをモニターするのに－recent developments and applications－.

適していると考えられる。しかし，慢性ストレスは

Annals of the New York Academy of Sciences,

急性ストレスに比べその研究報告は少なく，評価に1098: 122-144.

使 用 できる 確 立 されたマーカーも 数 少 ない。唾 液5 ）Head, R. J., Jarrott, B., Libys, J., Robinson, R. L.,

α-アミラーゼにおいても 同 様 に 慢 性 ストレスマー

Stitzel, R. E. and Zavisca, F. (1985): Influence

カーとしての研究報告は少ないが，近年唾液 α-アof blood sampling conditions upon histamine

ミラーゼの慢性ストレスマーカーとしての可能性がconcentrations in rat plasma: a study of a

示唆された。Matsuura ら（2012）の報告によれば，complex relationship with plasma epinephrine.

標準状態の唾液 α-アミラーゼの活性値と比較した

Neurochemistry International, 7 : 473-479.

際に，急性ストレス条件では有意に高い値を示すの

6 ）井上毅彦・槌谷和義・木村穣・梶原景正（2009）：

に対し，慢性ストレス条件では有意に低い値を示す

唾 液 中 α アミラーゼ 量 変 動 を 用 いたマイクロ傾向にあることが示され，慢性ストレスによる交感

無痛針最大許容外径の探索．2009年度精密工学

神経活性の減弱が示唆された。しかしその一方で，会春季大会学術講演会講演論文集 , 49-50.

他の研究ではクロモグラニン A の分泌動態から慢

7 ）井澤修平・城月健太郎・菅谷渚・小川奈美子・性ストレスによる交感神経活性の増進が確認されて鈴木克彦・野村忍（2007）： 唾液を用いたストいる（米山ら 2013）。このような違いは負荷していレス評価─採取及び測定手順と各唾液中物質のる慢性ストレスのかけ方や実験動物対象種の違いな特徴─．日本補完代替医療学会誌 , 4 ：91-101.

どに起因していると考えられる。しかし，慢性スト8 ）Kitagawa, A., Akasaka, C., Ninomiya, S. (2011):

レスに関する研究が少ないためこうした議論を十分

The validity of salivary-amylase as stress-にするのは難しい。そのため，慢性ストレスによる

marker of cattle. Journal of Integrated Field

生理的な反応に関する研究の積み上げが課題となっScience, 8 : 114.

ている。慢性ストレスマーカーを確立し，こうした9 ）Mabry, T. R., Gold, P. E. and McCarty, R. (1995):

研究の積み上げをすることによって，今後のストレAge-related changes in plasma catecholamine

ス関連疾患の研究の進展に期待が出来る。

responses to acute swim stress. Neurobiology

シリアンハムスターにおける唾液α-アミラーゼ測定によるストレス評価法の検討（塩澤・鈴木）

of Learning and Memory, 63: 260-268.
10）馬 島肇一・浅野茂樹・川村良久（1997）： 2-ク

11のバイオマーカー．日本薬理学雑誌，137：185188.

ロロ-4-ニトロフェニル 4 -0-α-D-ガラクトピ

17）T suchiya, K., Saidin, M.Y.B., Inoue, T. andラノシルマルトサイド（Gal G 2 CNP）を用い

Kajiwara, K. (2014): Qualitative measurement

たアミラーゼ測定法．臨床化学，26：63.

of pain by analyzing the salivary alpha amy-11）Matsuura, T., Takiimura, R., Yamaguchi, M.

lase. Precision Engineering, 38: 257-260.

and Ichinose, M. (2012): Estimation of restraint18）津村遼・鈴木馨（2014）： ゴールデンハムスター

stress in rats using salivary amylase activity.

における 唾 液 α-アミラーゼのストレスマー

Journal of Physiological Sciences, 62: 421-427.

カーとしての利用可能性．フィールドサイエン

12）M uneta, Y., Yoshikawa, T., Mitagawa, Y.,ス，12： 7 -10.

Shibahara, T. and Maeda, R. (2010): Salivary19）山 口昌樹・吉田博（2005）： 唾液アミラーゼ活

IgA as a useful non-invasive marker for re-

性による交感神経モニタの実用化．Chemicalstraint stress in pigs. Journal of Veterinary

Sensors, 21: 92-98.

Medical Science, 72: 1295-1300.
13）中 根英雄（1999）： 新規精神的ストレス指標としての唾液中クロモグラニン A. 豊田中央研究
所 R & D レビュー，34：17-22.
14）Nater, U. M. and Rohleder, N. (2009): Salivaryalpha amylase as a non-invasive biomarker for20）山 口昌樹・花輪尚子・吉田博（2007）： 唾液ア
ミラーゼ式交感神経モニタの基礎的性能．生体医工学，45：161-168.
21）柳澤輝行・飯野正光・丸山敬・三澤美和

監訳（2009）： 全 身 麻 酔 薬．カッツング 薬 理 学 [原書10版], 443，丸善株式会社，東京 .

the sympathetic nervous system: current22）米山早苗・砂川正隆・本田豊・池本英志・須賀state of research. Psychoneuroendocrinology.

大樹・岩本泰斗・石川慎太郎・中西孝子・久光

34: 486-496.

正・岡田まゆみ（2013）： 急性および慢性痛発15）斉 藤久美子（2000）： 麻酔と手術 . ハムスター
学入門，75-82，インターズー，東京 .
16）田 中喜秀・脇田慎一（2011）： ストレスと疲労

生時のストレスマーカーとしての唾液クロモグ
ラニンA の分泌動態．昭和学士会雑誌，73： 8590.

フィールドサイエンス（J. Field Science）14：13‒18，2016

論

13

文

牛糞便からの新規ウシエンテロウイルスの検出と遺伝子解析
岡田貴志＊1,2・土赤忍＊1,3・増田 恒幸＊4・大松
長井
誠＊1,5・押谷仁＊2・水谷 哲也＊1

勉＊1

Detection and molecular analysis of novel bovine enterovirus from bovine feces
Takashi OKADA＊1,2, Shinobu TSUCHIAKA＊1,3 Tsuneyuki MASUDA＊4, Tsutomu OMATSU＊1
Makoto NAGAI＊1,5, Hitoshi OSHITANI＊2, Tetsuya MIZUTANI＊1
Bovine enteroviruses (BEVs) are usually isolated from asymptomatic cattle. However, several studies havedetected BEV in cattle with diarrhea suggesting that some BEVs may have ability to cause disease in cattle.
Data on molecular analysis of BEVs are limited in Japan. In this study, we performed complete genome
analysis of a BEV strain detected in Japan, designated as Tottori-U31. The complete genome of Tottori-U31
comprises 7,411 nucleotides, including a large open reading frame with three sub-genomic regions, P1, P2 andP3, which encodes 2,167 amino acids. The nucleotide identities of Tottori-U31 with those of other BEVs were56.3‒74.8% in VP1, 60.5‒74.9% in P1, 66.7‒79.9% in P2 and 68.7‒84.7% in P3. Phylogenetic analysis of P1
region suggests that Tottori-U31 may fall into a novel BEV under Enterovirus species F. We tentatively
named this novel genotype as F7. Further studies are required to understand prevalence and pathogenesisof that novel BEV strain.
Keywords：bovine entrovirus, cattle, next generation sequencing, Tottori-U31
ウシエンテロウイルス（BEVs）は，通常，無症状のウシから分離される。ウシエンテロウイルスは下痢症状を示すウシからも検出され，病気を引き起す可能性を示唆する研究結果もある。しかしながら日本でのウシエンテロウイルスの分子解析の知見はほとんどない。
そこで，我々は本研究において日本国内で検出されたウシエンテロウイルス Tottori-U31株の全塩基配列の 解 析 をおこなった。Tottori-U31株 の 全 塩 基 配 列 は7,411塩 基 で，2,167のアミノ 酸 からなる 1 つの Openreading frame をコードし，その中に 3 つのサブゲノム領域（P 1 ，P 2 ，P 3 ）を含む。Tottori-U31株と他の BEVs 株との塩基レベルでの相同性は，VP 1 は56.3‒74.8 %，P 1 は60.5‒74.9 %，P 2 は66.7‒79.9 %，P 3
は68.7‒84.7 % であった。P 1 領域を対象とした系統解析の結果，Tottori-U31株はエンテロウイルス F 型に
２０１5．11．4 受付；２０１6．3 ．16受理＊1
	東京農工大学農学部附属国際家畜感染症防疫研究教育センター Research and Education Center for Preventionof Global Infectious Diseases of Animal, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3-5-8 Saiwai-cho, Fuchu,
Tokyo 183-8509, Japan＊2東北大学大学院医学系研究科微生物学分野 Department of Virology, Tohoku University Graduate School of
Medicine, 2-1 Seiryo-machi, Aoba-ku, Sendai, Miyagi 980-8575, Japan＊3
岐阜大学大学院連合獣医学研究科 The United Graduate School of Veterinary Sciences, Gifu University, 1-1
Yanagito, Gifu, Gifu 501-1193, Japan＊4
鳥取県倉吉家畜保健衛生所 Tottori Prefecture Kurayoshi Livestock Hygiene Service Center, 2 -132 Seidanichou, Kurayoshi, Tottori 680-1132, Japan＊5
東京農工大学農学部共同獣医学科獣医伝染病学教室 Laboratory of Epizootiology, Department of Veterinary
Medicine, Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3-5-8 Saiwai-cho, Fuchu,
Tokyo 183-8509, Japan†	
連絡担当著者：水谷哲也 東京農工大学農学部附属国際家畜感染症防疫研究教育センター〒183-8509 東京都府中市幸町 ３ - ５ - ８ Tel：042-367-5749 Fax：042-367-5742
e-mail：tmizutan@cc.tuat.ac.jp

フィールドサイエンス

14

14号

属する新規ウシエンテロウイルスである可能性が示唆された。そのため，我々は Tottori‒U31株を暫定的に新しい遺伝子型である F 7 とした。今後，この新規ウシエンテロウイルスの感染状況と病原性についてさらなる研究が必要である。
キーワード：ウシエンテロウイルス , ウシ , 次世代シーケンス , Tottori-U31

1. Introduction

Center during December, 2012 to August, 2014 andvirus isolation was performed using MDBK cells.

The genus Enterovirus, belonging to the family
Picornaviridae, is a non-enveloped small virus with

Whole genome analysis by the next generation se-

positive single-stranded genomic RNA and com-quencing

prises of 12 species: Enterovirus A-J and Rhinovi-

Viral RNA was extracted from cell culture su-

rus A-C (http://www.picornaviridae.com]. The spe-

pernatant using the TRIzol LS Reagent (Life Tech-cies Enterovirus E and F were formerly classified

nologies, Carlsbad, CA, USA). Complementary DNA

as group A and B of bovine enteroviruses (BEVs)

library for the next generation sequencing was(Kunin and Minuse, 1985; Moscovici and La Placa,

constructed using the NEBNext Ultra RNA Li-

1962). Enterovirus E and F, i. e. BEV-A and BEV-B

brary Prep Kit for Illumina (New England Biolabs,

are further subdivided into 10 serotypes (including

Ipswich, MA, USA) according to the manufacture’s

EV-E1-4 and EV-F1-6) based on their molecular

protocol. The next generation sequencing was con-characteristics (Huck and Cartwright, 1964; Knowles

ducted using a MiSeq bench-top sequencer (Illumi-

and Barnett, 1985, Zell et al., 2006). BEVs were firstna, San Diego, CA, USA) using 51 nucleotide (nt)isolated in the late 1950s (Kunin and Minuse, 1958;

single reads. Sequence analysis was performed us-

Moll and Finlayson, 1957). BEVs are widely circu-

ing the MiSeq Reporter v1 (Illumina) to generate

lating among livestock, particularly in cattle (Ley et

FASTQ formatted sequence data. Trimmed readsal., 2002). However their pathogenicity in cattle iswere assembled into contigs using de novo assem-

still unclear. Since BEVs are usually isolated frombly in CLC Genomics Workbench 6.0 (CLC bio,

asymptomatic cattle and calves, the viruses are

Aarhus, Denmark). Pairwise sequence identity was

therefore not considered to be associated with dis-determined using CLC Genomics Workbench 6.0

ease in cattle. However, some studies reported sig-

(CLC bio). Phylogenetic tree was constructed usingnificant symptoms including fever, diarrhea, myo-

the maximum likelihood method in Molecular Evo-carditis, and abortion after experimental inoculations

lutionary Genetics Analysis software ver. 6 (MEGA)

of BEVs in cattle (Blas-Machado et al., 2007). There

including the nucleotide sequences of the coding P1

is limited information on BEV in cattle in Japan,

region (2,499 bp) of Tottori-U31 and other BEV se-

and to our best knowledge, no molecular study ofquences obtained from the GenBank.

BEV has been conducted in Japan so far. In thisstudy, we detected a novel BEV strain from a bovine in Japan and also performed complete genome
analysis of this novel BEV strain.
2. Materials and methods
Sampling of fecal sample
We collected 10 bovine fecal samples fromasymptomatic or diarrheal cattle from the Tottori
Prefecture Kurayoshi Livestock Hygiene Service

3. Results
Detection of a novel BEV strain
We first detected a novel BEV strain, TottoriU31 by next generation sequencing from bovine
feces of a total of 10 collected fecal samples. The
complete genomic sequence of the BEV strain was
deposited in the Gen Bank database under the accession number LC081216.

Detection of novel bovine enterovirus（OKADA）

15

Whole genome sequencing of the novel strain, Tot-ent lineage (Fig.1). The representative stains used

tori-U31

for the analysis are shown in Table 1. Pair-wise

We then performed the whole genome sequenc-

alignment of the nucleotide sequence of Tottori-

ing of the detected novel strain, Tottori-U31. The

U31 with those of BEVs also found in close agree-

result revealed that the genome of Tottori-U31 hasment with the results of the phylogenetic analysis.

7,411 nt long excluding the poly (A) tail. It includes

The enterovirus VP1 gene sequencing provides

a single large open reading frame containing 6,501

an important source of information for classifica-

nt, which encodes a polyprotein precursor of 2,167

tion of serotypes (Caro et al., 2001; Casas et al., 2001;

amino acids (aa), flanked by the 5ʼ untranslated re-Moll and Davis, 1959; Minor, 1990) (Shahzad Shau-gion (UTR) (836 nt) and the 3ʼ UTR (71 nt).

kat et al., 2012). Serotypes of enteroviruses used to

Phylogenetic tree was constructed from the nu-

be determined by serological testing including

cleotide sequence of the P1 coding region of Tot-

identification of the new serotype. For identifica-

tori-U31 together with representative strains oftion of a new serotype, cut-off values of <75% of

BEVs. In the phylogenetic tree, Tottori-U31 was

nucleotide identity and <88% amino acid identity inincluded in the same cluster with other Enterovirus

VP1 gene sequence with any known genotypes

species F (BEV-B), however it formed an independ-

have been proposed (Oberste et al., 1999; Shahzad

26 Bovine enterovirus strain PAK NIH 92E1 capsid protein gene partial cds.
56
100

Bovine enterovirus strain PAK NIH 68E2 capsid protein gene partial cds.
Bovine enterovirus strain PAK NIH 123E1 capsid protein gene partial cds.
Bovine enterovirus strain PAK NIH 48E3 capsid protein gene partial cds.

100

Bovine enterovirus strain PAK-NIH-21E5 capsid protein gene partial cds.
Bovine enterovirus strain PAK NIH 67E2 capsid protein gene partial cds.

100

76

Bovine enterovirus strain PAK NIH 59E1 capsid protein gene partial cds.

71

Enterovirus E isolate HLJ-3531/2013 VP1 gene partial cds.
100

Bovine enterovirus isolate SL305 complete genome.

99

E2

Bovine enterovirus isolate K2577 complete genome.

96

EV-E

Enterovirus E strain PA12-24791 complete genome.
Enterovirus E strain LC-R4 polyprotein gene complete cds.

99

Bovine enterovirus genomic RNA complete genome.

44

100 Bovine enterovirus complete genome.

E1

Possum enterovirus W1 complete genome.

100

F4

Enterovirus F strain PS87/Belfast polyprotein gene complete cds.

F3

Enterovirus F strain IL/alpaca complete genome.

100
97Enterovirus F strain BEV-261 polyprotein gene complete cds.
Tottori-U31

F7
F5

Bovine enterovirus type 2 strain BJ50 complete genome.

99

99

F1

EV-F

Bovine enterovirus type 2 strain BHM26 complete genome
Enterovirus E isolate BEV/Egypt/2014 complete genome.

100

Bovine enterovirus type 2 strain BJ001 complete genome.

73

Bovine enterovirus type 2 strain 3A complete genome.

60
99

Enterovirus F strain PS 89 polyprotein gene complete cds.

F2

100 Bovine enterovirus type 2 strain PS87 complete genome.

0.1

Figure 1. Phylogenetic tree constructed through the maximum likelihood method in MEGA 6.0 using
complete P1 nucleotide sequences of Tottri-U31 strain (labeled ● ) with reference BEV
sequences from GenBank. The bootstrapping was performed with 1,000 times repetition

フィールドサイエンス

16

14号

Table 1. Accession no. and Strain name from GenBank used in phylogenetic tree.
Species Serotype Accession no.
E

1

Date

NC001859

Bovine enterovirus, complete genome

1987

Host

E

1

D00214

Bovine enterovirus genomic RNA, complete genome

1988

E

2

AF123433

Bovine enterovirus isolate SL305, complete genome

1999

Australia

E

2

AF123432

Bovine enterovirus isolate K2577, complete genome

1999

Australia

CountryE

JQ690746

Bovine enterovirus strain PAK_NIH_92E 1 capsid protein gene partial cds. 2010 sewage sample

PakistanE

JQ690745

Bovine enterovirus strain PAK_NIH_68E 2 capsid protein gene partial cds. 2010 sewage sample

PakistanE

JQ690744

Bovine enterovirus strain PAK_NIH_67E 2 capsid protein gene partial cds. 2010 sewage sample

PakistanE

JQ690743

Bovine enterovirus strain PAK_NIH_59E 1 capsid protein gene partial cds. 2010 sewage sample

PakistanE

JQ690742

Bovine enterovirus strain PAK_NIH_48E 3 capsid protein gene partial cds. 2011 sewage sample

PakistanE

JQ690747

Bovine enterovirus strain PAK_NIH_123E 1 capsid protein gene partial cds. 2010 sewage sample

PakistanE

JQ690741

Bovine enterovirus strain PAK-NIH-21E 5 capsid protein gene partial cds.

Pakistan2009 sewage sample

E

1

KC667561

Enterovirus E strain PA12-24791 complete genome.

E

1

DQ092769

Enterovirus E strain LC-R 4 polyprotein gene complete cds.

2006

USA

KJ956699

Enterovirus E isolate HLJ-3531/2013 VP 1 gene partial cds.

2014

bovineChina

alpaca

USA

E

2013

F

1

DQ092770

Enterovirus F strain BEV-261 polyprotein gene, complete cds

2006

F

1

KC748420

Enterovirus F strain IL/alpaca complete genome.

2007

bovine lung

USA

F

2

AY508696

Bovine enterovirus type 2 strain PS87, complete genome

2004

bovineUnited Kingdom

F

2

AY508696

Enterovirus F strain PS 89 polyprotein gene, complete cds

2006

bovineUnited Kingdom

F

2

AY508697

Bovine enterovirus type 2 strain 3 A, complete genome

2004

bovineUSA

F

3

DQ092794

Enterovirus F strain PS87/Belfast polyprotein gene, complete cds 2006

USA

F

4

AY462106

Possum enterovirus W1, complete genome

2007

F

2

KM667941

Enterovirus E isolate BEV/Egypt/2014 complete genome.

2014

bovineEgypt

F

HQ917061

Bovine enterovirus type 2 strain BJ50 complete genome.

2008

bovineChina

F

HQ663846

Bovine enterovirus type 2 strain BJ001 complete genome.

2009

bovineChina

F

HQ917060

Bovine enterovirus type 2 strain BHM26 complete genome

2008

bovineChina

Table 2. Pairwise nucleotide sequence identity (%) comparisons of Tottori-U31 to other bovine enteroviruses
Species

Serotype

Strain name

Accession no.

E

2

K2577

E

2

SL305

F

1

F

1

Pairwise nucleotide identity (%)
VP 1

P1

P2

P3

AF123432

59.2

61.0

67.1

69.1

AF123433

56.3

60.5

66.7

68.7

IL/alpaca

KC748420

74.2

74.9

79.9

83.4

BEV-261

DQ092770

74.8

74.7

78.9

84.7

F

BJ50

HQ917061

71.2

72.2

77.2

83.9

F

BJ001

HQ663846

71.1

71.9

78.4

81.6

F

BHM26

HQ917060

71.0

71.5

77.6

80.3

F

2

PS89

DQ092795

72.5

71.5

76.6

84.6

F

2

3A

AY508697

71.4

71.4

77.6

83.5

F

3

PS87/Belfast

DQ092794

64.1

70.1

79.6

84.2

Shaukat et al., 2012). Pair-wise alignment of the nu-

were from 64.1-74.8% for VP1, 70.1-74.9% for P1,

cleotide sequence of Tottori-U31 with other Entero-

76.6-79.9% for P2 and 80.3-84.7% for P3 (Table 2).

viruses species E strains were ranging from 56.3-

Pair-wise alignment of the amino acid sequence of

59.2% for VP1, 60.5-61.0% for P1, 66.7-67.1% for P2

Tottori-U31 with those of BEVs revealed that ami-

and 68.7-69.1% for P3 and those with species F

no acid identities of Tottori-U31 with species E

Detection of novel bovine enterovirus（OKADA）

17

Table 3. Pairwise amino acid identity (%) comparisons of Tottori-U31 to other bovine enteroviruses
Species

Serotype

Strain name

Accession no.

E

2

K2577

E

2

SL305

F

1

F

1

F

Pairwise amino acid identity (%)
VP 1

P1

P2

P3

AF123432

32.4

65.8

77.3

79.7

AF123433

28.4

65.3

77.2

79.2

IL/alpaca

KC748420

43.1

90.6

96.8

97.8

BEV-261

DQ092770

45.3

90.4

93.6

98.2

BJ50

HQ917061

38.3

F

BJ001

HQ663846

39.8

85.4

92.7

94.8

F

BHM26

HQ917060

38.0

86.3

92.9

94.8

F

2

PS89

DQ092795

43.5

85.4

93.0

98.1

F

2

3A

AY508697

39.4

85.7

92.5

98.2

F

3

PS87/Belfast

DQ092794

35.0

79.1

96.0

98.4

strains were ranging from 28.4-32.4% for VP1, 65.3-

symptoms including fever, diarrhea, myocarditis,

65.8% for P1, 77.2-77. 3% for P2 and 79.2-79.7% forand abortion after experimental inoculations of

P3 and those with species F were ranging from

BEVs to cattle (Blas-Machado et al., 2007). Patho-

35.0-45.3% for VP1, 79.1-90.6% for P1, 92.5-96.8%

genesis of BEV in cattle is yet to be meticulously

for P2, 94.8-98.4% for P3 (Table 3). Tottori-U31 ex-studied. Despite a lot of information available for

hibited sequence variations with other BEVs inhuman enteroviruses, there is insufficient informa-

pairwise identity and phylogenetic tree suggestingtion about BEV in cattle including its pathogenesis.

that it may fall into novel BEV-B that we tenta-

The data on BEVs is also limited in Japan.

tively classify Tottori U31 as a member of the gen-

Recently a novel BEV in species E was identified
from cattle with severe clinical symptoms (Zhang

otype F7.
4. Discussion
We identified a BEV stain from a bovine in Tot-

et al., 2014). Although Tottori-U31 strain was detected from an asymptomatic bovine, pathogenicityof the virus is yet to be defined.

tori Prefecture in Japan designated as Tottori-U31,

Further studies are needed to understand thewhich may be a new genotype under Enterovirus

molecular epidemiology and pathogenesis of BEV

species F. The maximum nucleotide and amino

and its inter-species transmission to other domestic

acid identities of Tottori-U31 with representative

animals and humans.

strains of known serotypes were 74.8% and 45.3%,

Acknowledgments

respectively. The phylogenetic tree (Fig.1) also
showed that Tottori-U31 formed a separate cluster

This work was supported by the Research Pro-

from other known serotypes. The most closely

ject for Improving Food Safety and Animal Healthrelated serotype is F1 in species F, but the boot-of the Ministry of Agriculture, Forestry and Fish-strap value of the common node for F1 and Totorri-eries of Japan.

U31 was 97. F5 and F6 were reported though their

References

sequence data are not published in the databases(Shahzad Shaukat et al., 2012). Therefore, we con-Blas-Machado U, Saliki JT, Boileau MJ, Goens SD,

sider Tottori-U31 as a new genotype of Entrovirus

Caseltine SL, Duffy JC, Welsh RD. (2007): Fatal

species F, tentatively designated as genotype F7.

ulcerative and hemorrhagic typhlocolitis in a

BEVs are generally non-pathogenic and result in

pregnant heifer associated with natural bovine

subclinical infections in cattle and calves (Ley et al.,enterovirus type-1 infection. Vet Pathol, 44 :2002). However, some studies reported significant

110 ‒115.

フィールドサイエンス

18

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19

投

稿

規

程

「 フ ィ ー ル ド サ イ エ ン ス」
（英 文 名：Journal of
Field Science）は，東京農工大学農学部附属広域都
市圏フィールドサイエンス教育研究センターの年報（２） 編集委員長は，原稿の採否に関して，編集委員ほか，しかるべき査読者から意見を求めることがある。
（３） 編集委員長は，必要に応じて著者に原稿の修正を求めることがある。

誌で，原則として年 １ 回発行される。
本誌には，広くフィールドサイエンスに関する研究成果などを掲載する。

７ ．その他（１） 英語原稿は，あらかじめ英文校閲を行うこ
ととする。

１ ．目的
フィールドサイエンスに関する研究成果などを公表し，その発展に寄与する。

（２） 著者は，原稿の採用決定後，最終原稿の編集ができない状態にした電子媒体と編集可能な電子媒体を編集幹事に提出する。
（３） 別刷は，５０部を無料とし，希望部数の５０部

２ ．投稿者を超える部分は著者の実費負担とする。

東京農工大学に所属する者およびフィールドサ
イエンスに関心をもつ者。

執

筆

要

領

３ ．原稿の種類と内容

１ ．論文（１） 論文：研究報告で他誌に未発表のもの。

（１） 日 本 語 原 稿： １ ）～ ３ ）を １ ページ， ４ ）（２） 資料：測定・観察記録などで，他誌に同一形態・形式で発表したものを除く。
（３）
 総 説・解 説：フィールドサイエンスに 関 するレビュー，実験・調査方法の解説など。
（４）
 その他：編集委員長の依頼にもとづく記事など。

を ２ ページ， ５ ）を ３ ページ 以 降 とし， ６ ）は ５ ）と区分する。なお， ７ ）は後述のとおり １ 枚ずつ別葉とする。
１ ）表題
２）著者（ふりがな）・所属機関・所在地・連絡担当著者と連絡先
３ ）ランニングタイトル（日本語）

４ ．原稿の使用言語と長さ４ ）要旨・キーワード（日本語）（１） 原稿に使用する言語は日本語または英語と５）本文（はじめに，材料と方法，結果，考察する。
（２）
 原稿は，別に定める執筆要領に従って作成
し，刷り上がり２０ページ以内とする。

などに原則として区分する）
６ ）引用文献
７ ）図，表および写真（２） 英 語 原 稿： １ ）～ ３ ）を １ ページ， ４ ）を

５ ．投稿手続き
原稿は，編集ができない状態にした電子媒体に

２ ページ， ５ ）を ３ ページ 以 降 とし， ６ ）は５ ）と区分する。なお， ７ ）は後述のとおり

次の項目を記した送り状を添えて，編集幹事に提１ 枚ずつ別葉とする。

出する。

１ ）表題

（１）
 著者・所属機関・所在地・連絡担当著者と２）著者・所属機関・所在地・連絡担当著者と

連絡先

連絡先

（２） 表題３ ）ランニングタイトル（英語）（３） 原稿枚数（図，表および写真を含む）

４ ）要旨・キーワード（英語）（４） 原稿の種類

５）本文（Introduction, Materials and Methods,（５） 別刷希望部数

Results, Discussion などに原則として区分する）

６ ．原稿の採否

６ ）引用文献（１） 原稿の採否は編集委員長が決定する。

７ ）図，表および写真

20

２ ．資料，総説・解説およびその他

引用文献の書き方（例）
文献は本文中に引用されたものすべてを記載す

本文の区分などについては，必ずしも論文の形式に準じなくてもよい。

る。雑誌名は原則として，省略しないで表記する。
（a） 雑誌

３ ．用語等

田中阿歌麿・星野隆一（１９３３）：択捉島湖沼踏査
概況及其の湖沼形態，水の理化学的所見．陸（１） 日本語原稿は，横書きとし，編集可能な電水学雑誌， ３ ： １ －１９．

子 媒 体 で １ ページあたりおおむね４０字 ×２５行

Birge, E. A. and Juday, C. (1934): Particulate andで作成する。

dissolved organic matter in inland lakes. Eco-（２）
 英語原稿は，編集可能な電子媒体で １ ペー

logical Monograph, 4 : 440-474.

ジあたりおおむねアルファベット６０字 ×２５ 行で作成する。

（b） 単行本（３）
 動物・植物等の日本名，外来語および原語

小林繁男（１９９３）：熱帯林土壌のせき悪化．熱帯によらない外国の地名・人名はカタカナとす林土壌，真下育久（編），２８０－３３３，勝美堂，る。学名は国際表記にしたがうこととする。

東京．

（４）
 用語は，原則として文部省（文部科学省）

Syrett, P. J. (1962): Nitrogen assimilation. Physiol-

編「学術用語集」に使われているものを用い

ogy and Biochemistry of Algae, Lewin, R. A.

る。

(ed.), 171-188, Academic Press, New York.

（５） 単位は国際単位系（SI）を用いることが望ましい。

６ ．図，表および写真（１） 図（写真は図として取り扱う）

４ ．要旨・キーワード１）図（写真）の題名および注は図（写真）の
下に書く。

（１）
 日本語要旨はおおむね５００字以内に，英語要２）図（写真）は １ 枚ごとに別葉とし，図（写旨はおおむね３００語以内にまとめる。

真）番号の表示は，図 １ ．または Fig. １．の（２） キーワードは日本語，英語とも ５ 個以内とようにする。本文中で図（写真）番号を示すする。

ときも同様とする。
５ ．引用文献（２） 表
１）表の題名は表の上に，注は表の下にそれぞ（１）
 引用文献は著者名のアルファベット順に記れ記載する。

載し，本文の該当箇所に（著者，年号）また２）表 は １ 枚 ごとに 別 葉 とし，表 番 号 の表示

は著者（年号）のように明示する。

は，表 １ ．または Table １ ．のようにする。

（２）
 雑誌の場合は，著者（年号）：表題．雑誌

本文中で表番号を示すときも同様とする。

名，巻 または 号（通 巻 ページでないものは巻号）：引用ページとする。
（３）
 単行本の場合は，著者（年号）：引用箇所
表題．書名，編者名（編），引用ページ，発行所，所在地とする。

附則
この規程は、平成２５年 ４ 月 １ 日から施行する。

フィールドサイエンス編集委員会
編集委員長

横山

編集委員

松田 和秀
渡辺 直明
鈴木
馨
伴
琢也
本林
隆
千年
篤
夏目 雅裕
伊豆田 猛
酒井 憲司
田中 知己

FS センター准教授
FS センター助教
FS センター准教授
FS センター准教授（編集幹事，tban@cc.tuat.ac.jp）
FS センター講師
生物生産学科教授
応用生物科学科教授
環境資源科学科教授
地域生態システム学科教授
共同獣医学科准教授事

五十嵐

府中地区事務部事務長補佐（FS 担当）

務

局

正

明

東京農工大学農学部 FS センター長，教授

Editorial Committee of Journal of Field Science
Editor-in-Chief
Tadashi YOKOYAMA

Director of Field Science Center, Professor of Tokyo University of Agriculture andTechnology

Editorial Board
Kazuhide MATSUDA
Naoaki WATANABE
Kaoru SUZUKI
Takuya BAN
Takashi MOTOBAYASHIAtsushi CHITOSE
Masahiro NATSUME
Takeshi IZUTA
Kenji SAKAI
Tomomi TANAKA

Associate Professor of Field Science Center
Assistant Professor of Field Science Center
Associate Professor of Field Science Center
Associate Professor of Field Science Center（Managing Editor, tban@cc.tuat.ac.jp）
Lecturer of Field Science Center
Professor, Dept. of Biological Production
Professor, Dept. of Applied Biological Science
Professor, Dept. of Environmental and Natural Resource Sciences
Professor, Dept. of Ecoregion Science
Associate Professor, Cooperative Dept. of Veterinary Medicine

Management Office
Akira IGARASHI

Chief of Field Science Center Office

平成２8年 3 月25日

印刷

平成２8年 3 月30日

発行

発 行 所

東京農工大学農学部附属 FS センター

印 刷 所

電

〠１８３–８５０９算〠３９０–０８２１

府中市幸町 ３ – ５ – ８

印

刷

株

式

松本市筑摩 １ –１１–３０☎０４２–３６７–５７９８

会社☎０２６３–２５–４３２９

ISSN 1347-3948

Journal of Field Science
No.14

Mar, 2016

目
総
1

論
5

説
ウシ体外受精胚移植技術に関する研究／杉村智史

文
シリアンハムスター（Mesocricetus auratus）における唾液 α‒アミラーゼ測定によるストレス評価法の
検討／塩澤

13

次

望・鈴木

馨

牛糞便からの新規ウシエンテロウイルスの検出と遺伝子解析／岡田貴志・土赤
勉・長井

誠・押谷

忍・増田恒幸・大松仁・水谷哲也FIELD SCIENCE CENTER, TOKYO UNIVERSITY OF
AGRICULTURE AND TECHNOLOGY
Fuchu, Tokyo 183-8509, Japan