極微量ウイルスの高感度・高精度PCR検出技術
国立研究開発法人 産業技術総合研究所
化学プロセス研究部門 有機物質変換グループ
主任研究員 松浦 俊一
2023年1月20日
1ナノ空間材料のバイオ分野への新利用
生体触媒（酵素）

酵素ｰメソポーラスシリカ複合体

固定化担体

メソポーラスシリカ

酵素A（細孔径：2~25 nm）

基質（原料）

酵素B

生成物

本技術の特徴10 nm

複合化

凝集体の形成を抑制 → 酵素の安定性を向上（長寿命化）, 分離･回収（再利用可能）
細孔サイズの最適化 → 酵素活性を制御可能に適用技術・用途
研究領域「コロナ基盤」（R2~R5）

医薬中間体（光学活性アルコール）, 機能性アミノ酸・ペプチド

極微量の核酸（RNA, DNA）

高感度・高精度PCR法の開発 → 現行法に対して約100倍の高感度化を達成

プラスチック（PET）, 化学染料
2

メソポーラスシリカの電子顕微鏡像

特徴
極めて大きな比表面積（~1000 m2/g）と細孔容積（~2 cm3/g）
酵素サイズに合わせた細孔サイズの制御が可能（2~25 nm）
シリカ表面の親疎水性制御による反応の最適化
3

メソポーラスシリカの細孔径制御
SEM像

細孔径分布
微分細孔容積 （cm3g-1nm-1）

350300250200
SEM像

15010050015102030100

細孔径 （nm）4極微量DNAの高感度増幅
Mesoporous Silica-Enhanced PCR（MSE-PCR法）
プライマー

特許第6714251号
Matsuura, S. et al. ACS Appl. Mater. Interfaces 14, 26, 29483−29490（2022）（国立遺伝学研究所 馬場知哉先生）との共同研究
5従来技術とその問題点
新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）の構造【粒径：約100 nm】

課題： 新型コロナウイルス感染症の診断において、感染初期の患者からは、極めて微量の検体しかウイルスの粒子形成に関与得られないことが多く、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲウイルス遺伝子の増殖に関与法）による検査を行ったとしても偽陰性（または偽陽性）と判定されるケースが頻発している。
（※ 標的RNAが10コピー以下では感度が不十分）
出典: 神戸大学 新型コロナウイルスに対する安全な創薬スクリーニング系の構築

SARS-CoV-2（一本鎖RNAウイルス, 全長29.9 kb）の遺伝子構造

https://www.kobe-u.ac.jp/research_at_kobe/NEWS/news/2020_09_02_02→ より微量の検体に対する高感度かつ高精度なPCR
PCR装置
ゲル電気泳動装置法の確立が急務な状況
出典: 城西国際大学 コロナウイルスの構造と複製サイクル（ライフサイクル）
https://www.jiu.ac.jp/features/detail/id=6822【定性PCR】 Nested RT-PCR法
逆転写酵素

RNA

DNA増幅
酵素

cDNA

RT-PCR法
DNA増幅産物

定性的

定量的（相対定量）
リアルタイム
PCR装置【定量PCR】リアルタイムone-step RT-PCR法
6

新技術の特徴・従来技術との比較
新技術の概要新型コロナウイルスを対象とした現行のPCR技術では、標的のウイルスRNAが10コピー以下
では検出感度が不十分である。本研究では、メソポーラスシリカの規則性細孔にDNA増幅酵素を固定化し、酵素周辺の反応環境を最適化することによって非特異的DNA増幅（副反応）を抑制し、現行法に対して約100倍の高感度化を達成した。１分子レベルでの高感度増幅を可能にするため、現行法では検出が困難であった環境中の希薄なサンプル（下水、空気・エアロゾルなど）からの新興ウイルス感染症の検査、さらには全ゲノム増幅・解析にも応用可能である。
逆転写反応

メソポーラスシリカ粉末

RNA

DNA増幅反応cDNA

RT-PCR法

PCR装置

DNA増幅産物

10 nm

固定化
酵素−メソポーラスシリカ複合体

逆転写酵素

DNA増幅酵素7

新技術の特徴・従来技術との比較
新技術の特徴非特異的DNA増幅（副反応）を抑制することで標的の極微量ウイルスRNAからのPCR増幅検出を実現
既存のPCR装置をそのまま利用可能（高汎用性）
固定化酵素サンプルの冷凍・冷蔵・常温での長期安定保管・輸送も可能

DNA増幅反応におけるメソポーラスシリカの効果

従来技術との比較
過剰量のプライマー等に起因する非特異的DNA増幅を極力抑制する

１分子レベルの精確なウイルスRNA検出法として、Droplet Digital PCR（ddPCR）等の酵素周辺における反応基質濃度の至適化を極限まで高める開発が進展しているが、専用のPCR試薬が高コスト、高価な装置の導入、一般的なPCRよ（酵素と基質［RNA, DNA］との1:1の精確な相互作用を促進）
り反応時間が長い等の課題がある。一方、本開発技術では、既存のPCR装置をそのまま使プライマー用でき（高汎用性）、ウイルスRNAの高感度・高精度でのPCR増幅検出が可能である。また、現在の新型コロナウイルスのゲノム解析に適用されているマルチプレックスPCR法では増幅DNA増幅酵素 数分子レベルの極微量電荷が困難な領域に対しても１分子レベルでの増幅を可能にするため、ゲノム解析における高感DNAを増幅可能に電荷度化・高精度化にも寄与できる。
基質RNA・cDNA,鋳型DNAの分子数
プライマー, dNTPs
200 202
メソポーラスシリカ
静電反発によるPCR産物
過剰反応の抑制電荷⊝⊕⊝8新技術の特徴・従来技術との比較
定性PCR

ウイルス

RNA抽出

逆転写反応（RT反応）

PCR

標的DNA（又はRNA）
非標的DNA（又はRNA）

PCR
コスト

新技術の効果¥300（大） + ¥10¥500（中） + ¥10
最適化中

¥1,500未知数（要検討）

定量PCR【相対定量】（qPCR, リアルタイムPCR）

デジタルPCR【絶対定量】 （dPCR）

ポジティブ“１”PCR
ネガティブ“０”
約20,000個のDroplet（微小区画）に分割

蛍光の有無より、ポジティブ“１” 、ネガティブ“０” を直接カウント

Droplet Digital PCR
QX200（Bio-Rad社）

9

新技術の特徴・従来技術との比較①感度・精度②反応時間③コスト④反応安定性⑤保存安定性【新技術】【従来技術】

DNA増幅酵素－メソポーラス
シリカ複合体遊離のDNA増幅酵素
（※1）

定性PCR

定量PCR
(qPCR)◎◎○◎◎◎○△○○

デジタルPCR(dPCR)

定性PCR

（要検討）

△△○○○

定量PCR デジタルPCR(qPCR)(dPCR)

○○△○○

◎✕✕○○

（※1） 国立感染症研究所 病原体検出マニュアル（2019-nCoV Ver.2.9.1）

10

メソポーラスシリカとDNA増幅酵素の複合化
本提案技術 メソポーラスシリカに固定化したDNA増幅酵素（KOD）をRT-PCRに適用（実験手順）

メソポーラスシリカ（0.5 mg）

簡便な操作により酵素の吸着が可能

酵素固定化

回収・洗浄

KOD DNA
polymeraseを含んだPCR
用Buffer（50酵素溶液mL）を加え、（50 mL）
Vortex

上清を除去した後、PCR用Buffer（100mL）を加え、Vortex、上清除去

20~
50 μL

反応開始
基質RNA、cDNA、プライマー等を含んだRT-PCR試薬（20~50 mL）を加え、反応溶液
Vortex20 μL（20~50 mL）【定性PCR】 Nested RT-PCR法【定量PCR】 リアルタイムone-step RT-PCR法

11定性PCR 【標的: S領域】
KOD(未固定)
100101

KOD-SBA5.40.1

100101

KOD-SBA7.10.1

100101

KOD-SBA10.60.1

1001010.1

１段階目PCR反応産物 (547 bp)（標的: SARS-CoV-2のS領域）

１段階目のPCR反応で検出可能な感度を実現
現行法： 40サイクル、２段階PCR

95℃, 1 min
98℃, 15 s
56℃, 30 s
74℃, 30 s

40サイクルPCR product (ng/µL)

反応条件

20

現行法に対して約100倍の高感度化を達成
PC 【未固定】
SBA5.4
SBA7.1
SBA10.6

15105（N=3~20）

74℃, 1 min

反応時間： 1 h 30 min0コピー数 → 100

1010.112定量PCR 【標的: N領域】
【リアルタイムPCR試薬】 Reliance One-Step Multiplex RT-qPCR Supermix（Bio-Rad社製）

固定化KOD（100倍希釈）を導入
4000

42

Cq値（PCRサイクル数）

Amplification

3500― PC (固定化KOD添加なし)― KOD-SBA5.4 (粉末)― KOD-SBA5.4 (Tris-HCl処理)

3000

蛍光強度

検量線が平行移動（Cq値が1.5サイクル減少）

2500
2000
1500
1000

DNA増幅の閾値

500

38Standard Curve(8/12)(4/7)

40

高感度化を示唆(12/12)
(7/7)
(5/8)

信頼限界
(12/12)(7/7)

36(8/8)34(12/12)
(7/7)

32

検出限界
(8/8)

30(8/8)28005101520253035

PCRサイクル数01110

低濃度領域での検出／定量精度の向上

210031000

コピー数― PC (固定化KOD添加なし) E=103.8%, R2=0.9987, Slope= -3.2334― KODｰSBA5.4 (粉末)
E=107.3%, R2=0.9996, Slope= -3.1578― KODｰSBA5.4 (Tris-HCl) E=104.5%, R2=0.9894, Slope= -3.2166

反応条件 50℃, 10 min【Cq値（平均）】

95℃, 10 min
95℃, 15 s
60℃, 60 s

4045サイクル（N=7~12）target/コピー数110100 1000PC (固定化KOD添加なし) 40.04 37.13 33.80 30.37
KOD-SBA5.4 (粉末)39.65 36.65 33.46 30.18
KOD-SBA5.4 (Tris-HCl) 38.39 35.80 32.74 28.6813従来技術とその問題点（その２）
SARS-CoV-2ゲノム（29,903 nt）の解析におけるマルチプレックスPCRの増幅の偏りと精度の低下（例）課題

現行法では、1本のPCRチューブ内で多数のゲノム領域のRT-PCRを行うため、領域によってcDNA増幅に偏りが生じ、ゲノム解析の精度が低下する

精度の高いゲノム解析には、5,000コピー以上のウイルスRNAが必要
解析精度の低下が問題となる箇所

010

現行法：ゲノム全長を98の領域に分割
49領域を1本のPCRチューブ内で増幅増幅に偏りが生じやすいcDNA領域

20

Spike（S）

30 kb（3,822 nt）
No.76 ［←増幅が困難な領域］

Omicron BA.1

BA.2
BA.5
Sタンパク質領域のオミクロン系統における新規の変異箇所（実線［赤］）と、これまでの系統と共通の変異箇所（実線［黒］）（PLoS One. 2020 Sep 18;15(9):e0239403を一部改変）

14長鎖cDNAの高感度増幅検証
SARS-CoV-2ゲノム（29,903 nt）

Delta株, Omicron株の変異箇所と各標的領域の位置関係

Spike（S）（3,822 nt）

Delta
Omicron BA.1
BA.2

ORF3a

BA.5
No.76

cDNA
標的領域 1（1,245 nt）

S遺伝子
特異的プライマー－１

標的領域 2（1,670 nt ）No.72_L ～ No.75_R
No.76_L ～ No.80_R

標的領域 3（998 nt ）PCR条件: 2-step98℃, 30 s

No.80_L ～No.82_R

98℃, SARS-CoV-2の感染性にはスパイク(S)タンパク質領域が関与しており、Omicron系統で
15 s
40サイクル
65℃, はS遺伝子に30ヵ所以上の変異が報告されている。現在、最も広く用いられているSARS90 s
遊離のDNA増幅酵素
DNA増幅酵素－メソポーラスシリカ複合体（KOD–SBA5.4）

CoV-2ゲノムの配列決定は、全ゲノムをカバーするARTIC
標的領域1 標的領域2 標的領域3
標的領域1 Networkのプライマーセットを標的領域2 標的領域3用いたRT-PCR法に基づいており、それぞれ約400cDNAコピー数
bp
100 101001010010100 ntの98断片のcDNAを増幅するように
101001010010設計されているが、変異箇所によっては一部プライマーの再設計が必要となる。
目的: S遺伝子の多重変異部位を迅速かつ高感度に解析する。

標的のPCR反応産物S遺伝子(3822 nt)を標的とした3分割でのPCRを設計し、MSE-PCR法による1000 ntを超える長鎖cDNA増幅の実行可能性について検証した。

15長鎖cDNAの高感度増幅検証
標的領域 1KOD（未固定）bp

M 100 10

標的領域 2標的領域 34

1100 1041100 1041

PCR産物濃度（ng/µL）−−−−−−−−−−−−

検出回数0/30/30/30/30/30/30/30/30/30/30/30/3

標的領域 1

KOD–SBA5.4bpM 100 1041

標的領域 2100 1041cDNAコピー数

標的領域 3100 1041cDNAコピー数

標的のPCR反応産物

PCR産物濃度11.2 4.1（ng/µL）
検出回数

3/3

3/3

4.6

4.6

4.2

0.9

−−4.2

4.0

1.0

1.2

1/3

1/3

3/3

1/3

0/3

0/3

3/3

3/3

1/3

2/316

長鎖cDNAの高感度増幅検証
SARS-CoV-2ゲノム（29,903 nt）
Spike（S）

Spike（S）（3,822 nt）

ORF3acDNA
標的領域 2（1,670 nt ）KOD（未固定）
bp M 100 104S遺伝子
S遺伝子
特異的プラ 特異的プラ
イマー－２ イマー－１

KOD–SBA5.4

1 100 1041cDNAコピー数
標的領域 2

PCR産物濃度（ng/µL）
検出回数−−−− 7.3 3.2 4.3−

0/3 0/3 0/3 0/3 3/3 3/3 2/3 0/3

KOD－メソポーラスシリカ複合体を用いたMSE-PCR法により4～100コピー程度の微量cDNAから（感染研法では5,000コピー以上が必要）1,500 bp以上の長鎖cDNAの増幅に成功
変異が入りやすい領域の影響を最小限にすることが可能
17

長鎖cDNAの高感度増幅検証
不活化ウイルス（Delta株, 完全長RNA）での検証
SARS-CoV-2ゲノム（29,903 nt）
Spike（S）

Spike（S）（3,822 nt）

ORF3acDNA
標的領域 1（1,245 nt）

KOD
KOD–
KOD
KOD–
（未固定） SBA5.4 （未固定） SBA5.4bp M

93939393 コピー数

標的領域 1

冷凍保管 at －30℃
（0~21 days）
12PCR product (ng/µL)（a）Ｓ遺伝子特異的 （b）Ｓ遺伝子特異的
プライマー－１
プライマー－２

S遺伝子
S遺伝子
特異的プラ 特異的プライマー－２ イマー－１

108642（N=3）

0
PCR産物濃度（ng/µL）
検出回数−− 0.4 0.9 −− 5.5 2.60/5 0/5 1/5 1/5 0/5 0/5 4/5 2/50714Days

2128

21日間の冷凍保管によっても0日目と同等のＰＣＲ産物濃度が示された
18

想定される用途
・ 既存のPCR装置を利用した１分子レベルのウイルスRNAからの高感度・高精度PCR増幅検出および検査キット
・ マルチプレックスPCR法では増幅が困難な領域での１分子レベルでのPCR増幅および希薄な環境サンプル等のゲノム解析への応用
・ 固定化酵素サンプルの常温での長期安定保管・輸送によるフィールドワークでの環境DNA等のPCR検出への活用
社会データ
基盤モデル構築

協力⾃治体との連携
データ収集の拡大

倫理⾯など⾃治体との丁寧なコミュニケーション
公的データポータル

公的データベース
国際連携

米国
欧州

国際連携
ゲノム情報

制限公開
リポジトリ

下水

公共スペース

都市環境

超高感度ウイルス計測に基づく感染症
対策データ基盤（研究期間 2021年2月～2024年3月）
研究代表者 有田正規（国立遺伝学研究所
生命情報・DDBJセンター センター長）

検出データ

数理モデル
解析

ウイルスの検出

ゲノム解析

ゲノム解析による感染性予測

情報
集約

欧州

研究領域「コロナ基盤」

医療空気

数理モデル解析
空気中からのウイルス検出

各種の環境サンプルにおけるウイルス検出系の確立• 下水• 都市構造物の表⾯• 空気・エアロゾル

超高感度
ゲノム増幅技術1分子レベルの極微量核酸からの増幅19実用化に向けた課題
社会実装に向けて越えなければならない技術的ハードル
PCR阻害物質を含んだ実サンプルでの検証（夾雑物に対する耐性）
冷凍条件下での長期保存安定性（目標： ～6ヶ月）
DNA増幅酵素－メソポーラスシリカ複合体の量産化
DNA増幅酵素（KOD）－メソポーラスシリカ複合体（冷凍保管［－30℃及び－80℃］）（標的: S領域［547 nt］, 100コピー）30

反応基質（20 µL）
を添加

PCR product (ng/µL)

25
201510－80℃－30℃

5

液量： 0 μL

液量： 20 μL

未固定KOD（0.22 ng/µL）（N=3）

007142128354249566370

Days

KOD－メソポーラスシリカ複合体の長期冷凍保存の実行可能性が示唆された。

20

実用化に向けた課題
冷凍条件下での長期保存安定性

冷蔵・常温条件下で検証
DNA増幅酵素（KOD）－メソポーラスシリカ複合体（冷蔵保管［4℃］, 常温保管［20℃］ ）

－80℃
－30℃
4℃
4℃（※保管時に洗浄Bufferに浸漬）20℃

冷凍冷蔵
常温

（標的: S領域［547 nt］, 100コピー）
（N=3）

30

PCR product (ng/µL)25

液量: 0 μLにして保管

2015105007142128354249566370

洗浄Buffer（100 μL）に浸漬した状態で4℃保管

Days

KOD－メソポーラスシリカ複合体の長期冷蔵・常温保存の実行可能性が示唆された。 21

実用化に向けた課題
DNA増幅酵素－メソポーラスシリカ複合体の量産化
課題: 微量（0.5 mg）のメソポーラスシリカの取り扱い・秤量が難しい

PCR反応液（20~50 mL）

自動分注システムの導入

epMotion（エッペンドルフ製）

シリカ粉末（0.5 mg）

22

実用化に向けた課題
シリカ粉末（25 mg [50本分]）を含んだ緩衝液（5 mL）
100 mLずつ分注【0.5 mg / 100 mL】

上清除去

DNA増幅酵素–メソポーラスシリカ複合体

洗浄Buffer（100 µL）
チップの先端（1.5倍速）
23

企業への期待
新技術の特徴非特異的DNA増幅（副反応）を抑制することで標的の極微量ウイルスRNAからのPCR増幅検出を実現
既存のPCR装置をそのまま利用可能（高汎用性）
固定化酵素サンプルの冷凍・冷蔵・常温での長期安定保管・輸送も可能
次のようなことが可能な企業パートナーを求めています！

① 環境サンプル等を対象としたPCR検出キットの製品化（技術移転）および全ゲノム増幅・解析技術の開発に向けた研究開発パートナー（DNA増幅酵素－メソポーラスシリカ複合体の量産化、長期保存安定性の評価などに関する技術協力も）② PCR以外の核酸増幅技術、例えば、LAMP法（等温遺伝子増幅法）等による新興ウイルス感染症の高感度検出に向けた研究開発パートナー
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本技術に関する知的財産権••••

発明の名称 ：高感度・高精度ＲＴ－ＰＣＲ法
出願番号：特願2022-106718
出願人：産業技術総合研究所、情報・システム研究機構
発明者：松浦俊一、池田拓史、山口有朋、馬場知哉••••

発明の名称 ：極微量核酸の増幅方法
登録番号：特許第6714251号
出願人：産業技術総合研究所、情報・システム研究機構
発明者：松浦俊一、千葉真奈美、角田達朗、馬場知哉

25

お問い合わせ先
国立研究開発法人 産業技術総合研究所
東北センター 産学官連携推進室
TEL
FAX
e-mail022-237-5218
022-231-1263
tohoku-counselors-ml@aist.go.jp

26