レーザ誘起ナノ周期構造の表面形状制御による高付加価値生体材料の創成
岡山大学 大学院自然科学研究科助教 篠永 東吾（平成 29 年度 奨励研究助成 A AF-2017239）
キーワード：超短パルスレーザ，ナノ周期構造，細胞伸展方向制御

１．研究の背景と目的や半導体 6)などの様々な材料に形成することができる．さチタン（Ti）や Ti 合金などの Ti 系金属材料は耐食性やらに，形成される溝方向は，レーザの偏光に対して垂直な機械的性質に優れることから人工関節などの生体用イン方向に形成される場合が多いことから，集光スポットの走プラント材料として最も広く用いられている．しかしなが査中に偏光方向を制御することで溝方向の制御も比較的ら，Ti は金属材料であるがゆえに，材料表面へ自発的に骨容易に行うことができる．

成分を形成することができない生体不活性な材料であるレーザによりナノ周期構造が形成されることが発見さため，人工関節を人体に埋入した際，骨が完全に固定されれて以来，その形成メカニズムについては現在も多くの議るまでには数ヶ月以上を要する．高齢化社会が問題視され論がなされている．金属に対するナノ周期構造の形成メカている我が国にとって，早期の骨再生は必須の課題であり，ニズムの１つにレーザ誘起表面プラズマ波に起因するとTi 表面への新機能付与が必要である 1)．

いった報告がある 7)．レーザ誘起表面プラズマ波はレーザ

ここで．Ti 表面への早期骨形成を実現するための新機

波長，パルス幅，レーザ強度などのレーザ照射パラメー能付与の一種に，骨芽細胞が伸展する方向を一方向に制御ターによって変化すると予想されるため，適切なレーザ照する細胞伸展方向制御（細胞配向性の付与）がある 2)．骨射パラメーターによりナノ周期構造の表面形状を制御で折時における人工関節上での骨再生過程について着目すきる可能性がある．一方で，実際のインプラント表面では，ると，最初の数週間で人工関節上において骨密度が増加し，電解研磨を行った鏡面だけではなく，機械研磨面などを使

その後，数週間で生体骨の強度が必要な方向に骨配向性が用している場合がある．すなわち，生体材料表面の加工面生じ，骨再生が完了する 2)．ここで，人工関節に対して予性状は用途に応じて様々であり，それらの加工面は形成す

め骨配向性を付与することができれば，骨密度が増加したるナノ周期構造の形状に影響を及ぼすと考えられる．

段階で骨配向性の付与が完了していることになるため，早期の骨再生が実現可能となる．

本研究では．レーザ誘起ナノ周期構造による高付加価値生体材料の創成を目指し，超短パルスレーザ光により Ti

Ti 系金属材料表面で細胞伸展方向制御を行うためには，基板上へ形成されるナノ周期構造の表面形状制御を試み材料表面へ周期的な溝形状を形成することが有効な手段た．そして，細胞配向性の向上に有効な表面形状としてナの一種である．ここで，細胞伸展には，細胞の接着斑と基ノ周期構造の周期，深さおよび連続性に着目し，それらが板の表面形状との関係が重要であると考えられている．一
般的に細胞の大きさは数 10 µm 程度であるのに対して，接着斑の大きさや幅は数 10 nm から数 100 nm 程度である3)．すなわち，図 1 に示すように，優れた配向性を有する細胞伸展方向制御を実現するためには周期や深さのスケールが数 10 nm から数 100 nm である周期的微細構造（ナノ周期構造）の形成が有効である可能性がある． J. lu
ら 4)は，プラズマドライエッチングにより Ti 表面にナノ周期構造を形成できることを示している．本手法においては周期 750 nm～10µm を有する表面形状を得ることができるが，エッチング処理を行う上で複数の工程を要する．
また，骨芽細胞の細胞伸展方向性制御に有効な表面形状については未だ明らかになっていない．
筆者らは，ナノ周期構造の形成には超短パルスレーザが有効であると着想した．超短パルスレーザ光を材料表面に集光照射すると，レーザ照射スポット内部に自己組織的にナノ周期構造の形成が可能である．ナノ周期構造は金属 5)

図１

細胞伸展方向制御とナノ周期構造の表面形状

細胞伸展に与える影響について実験的に調べた．最後に．
Ti の初期表面形状がナノ周期構造の表面形状に及ぼす影2・2細胞試験

ナノ周期構造を形成した Ti 基板上において，ヒト骨芽響について調べた．

細胞（MG-63）を 37℃，5%CO2 濃度のインキュベーター

２．実験方法定し，免疫染色を行うことで細胞のアクチンを赤色，核を内で 3 時間培養した．その後，細胞を Ti 基板上で組織固2・1

ナノ周期構造形成青色となるように染色し，細胞伸展の様子を蛍光顕微鏡でナノ周期構造形成のための実験試料として，8×8×0.5観察できるようにした．そして蛍光顕微鏡観察画像から，mm の純 Ti 基板を用いた．Ti 表面には電解研磨を施し，溝の方向に対する伸展角度および細胞数を計測することその表面粗さを Ra=0.01 μm，Rz=0.06 μm とした．図 2 に，で，細胞配向性を評価した．ここで，細胞伸展角度 θcell は，ナノ周期構造形成のための超短パルスレーザ光照射セッ

図 3 に示すように，溝の方向に対して垂直な方向に対するトアップ概略図を示す．中心波長 λ=790 nm および繰り返角度として定義し，細胞伸展角度 θcell が 90°の場合，溝のし周波数 Rp=1.0 kHz の超短パルスレーザ光を用いた．ビー方向に沿った細胞伸展を示し，細胞の伸展方向が定義できムスポット内で均一な形状を有するナノ周期構造を形成ないランダムな方向に進展している細胞は θcell=Randomするため，矩形の穴（1.5 mm×1.5 mm）を有する厚さ 0.08とした．

mm のマスクを用い，Ti 基板表面で図 2(c)のようなトップハット型のビームプロファイルが得られるようにした．この際，マスクとレンズ間の距離 L1=2790 mm およびマスクから試料間の距離 L2=159 mm とし，ビームスポットサイズ約 82×82 µm を得た．図 2(b)のように XYZ ステージを用いて集光ビームスポットを Ti 基板表面で走査し，走査速度を Vs=5.47 mm/s とすることでビームスポットあたりの照射回数が N=15 shots で一定となるようにした．
はじめに，レーザフルエンスを一定としパルス幅 tp を0.2 ps から 5.0 ps へと変化させ，ナノ周期構造の表面形状（周期 Dp および深さ Hp）の変化を調べた．レーザ照射前

図３

細胞伸展角度の定義

後の表面形状はプローブ顕微鏡で測定し，アスペクト比α= Hp/Dp を算出した．次に，パルス幅を一定とし，レーザフルエンスがナノ周期構造の連続性に与える影響を調べた．不連続点は走査型電子顕微鏡（SEM）観察像から計測

３．実験結果および考察
3・1

ナノ周期構造の表面形状制御した．ここで，細胞の接着斑のサイズより 100 nm 以上断図 4 にレーザフルエンスおよび照射回数を一定とし，パ続している箇所を不連続点として定義し，溝長さ 1 µm あルス幅 tp を 0.2 ps から 5.0 ps へと変化させて，超短パルスたりの不連続点の数を算出することで連続性を評価した．

レーザ光を照射した場合における Ti 基板表面のプローブ
顕微鏡観察画像および表面プロファイルを示す．図より超短パルスレーザ光を照射することで，レーザの偏光 E に対して垂直な方向に溝を有するナノ周期構造が Ti 基板上に形成されていることがわかる．表面プロファイルよりパルス幅の増加にともない，形成されるナノ周期構造の周期は減少し，深さは増加している．すなわち，パルス幅の長い場合は凸部と凹部の高低差が比較的大きな構造が得られ，パルス幅の短い場合は凸部と凹部の高低差が比較的小さな構造が得られている．表面プロファイルよりアスペクト比 α を算出すると，図中に示すようにパルス幅の増加にともない，アスペクト比が増加することが明らかになった．
パルス幅が 5.0 ps の場合，0.2 ps と比較して約 1.6 倍のアスペクト比が得られている．本結果は，パルス幅によってレーザ強度が変化することに起因していると考えられる．
実験ではレーザフルエンスを統一してパルス幅を変化させているので，パルス幅 0.2 ps のレーザ強度は 5.0 ps のパルス幅と比較して 25 倍レーザ強度が高い．超短パルス

図２超短パルスレーザ光照射方法

レーザ光は凸部において電界集中が生じることが知られている 8)．よって，高いレーザ強度を有するフェムト秒の化させるとアスペクト比 α は 5.0 程度に維持されるが，単パルス幅では凸部の優先的な除去を引き起こしアスペク位長さあたりの不連続点の数 Pd が 0.13 から 0.36 µmト比の小さな表面形状となったと考えられる．

points/µm へと増加することがわかる．すなわち，レーザ次に，パルス幅を高アスペクト比が得られるパルス幅tp=5.0 ps で一定とし，レーザフルエンス F を 0.25-0.45 J/cm2

フルエンスの増加によりナノ周期構造の連続性が低下することが示された．

へと変化させた場合における，ナノ周期構造の単位長さあ3・2たりの不連続点の数とアスペクト比の関係性を図 5 に示る影響

す．レーザフルエンスを 0.25 J/cm2 から 0.45 J/cm2 へと変ナノ周期構造のアスペクト比が細胞配向性に与えパルス幅 tp を 0.2 から 5.0ps へと変化させることでアスペクト比を変化させたナノ周期構造形成領域をそれぞれTi 基板表面に形成し，細胞試験を行った．レーザ未照射部
および各アスペクト比を有するナノ周期構造上において，細胞配向性を評価した結果を図 6 に示す．レーザ光を照射していない場合，θcell=Random における細胞数が約 60%となり，θcell=0°-90°においては約 5%と一様である．すなわ
ち，レーザ未照射面ではランダムに細胞が伸展しており細胞配向性がないことがわかる．一方で，ナノ周期構造上では，どのアスペクト比の場合でも θcell=Random における細胞数は 20%以下に減少し θcell=0°-90°にかけて細胞数が増加する傾向が得られており，細胞配向性が生じている．
θcell=75°以上の細胞数の割合を合計すると α=0.34 および0.44 では約 70%であるのに対し，α=0.57 のときは約 80%以上の細胞配向性が得られている．以上より，高アスペクト比を有するナノ周期構造によって，細胞配向性が向上することが明らかとなった．

図４

ナノ周期構造のアスペクト比制御
図６3・3

高アスペクト比による細胞配向性の向上

ナノ周期構造の連続性による細胞配向性変化

各レーザフルエンスにより連続性を変化させたナノ周期構造において，前項と同様にヒト骨芽細胞による細胞試験を行った．θcell=75°以上に配向した細胞数の割合を測定し，単位長さあたりの不連続点の数 Pd と細胞配向性との関係性をまとめた結果を図 7 に示す．図より，単位長さあたりの不連続点の数が 0.14 から 0.36 µm points/µm へと増加すると細胞配向性が約 80%から約 50%へと低下することがわかる．これまでに得られた結果より，細胞配向性の
図５

レーザフルエンスによるナノ周期構造の連続性変化向上には 5.0 ps 程度のパルス幅で高アスペクト比のナノ周期構造を形成し，適切なレーザフルエンスにより連続性させた．また，初期表面粗さを有した試料の研磨方向に対の良い表面形状とすることが有効であることが示唆されして，レーザ光の走査方向は約 15°変化させた．
図 10 にレーザ未照射およびレーザ照射後の SEM 観察た．

画像を示す．図より走査回数 1 scan の場合，機械研磨面上では電解研磨面に形成したナノ周期構造よりも幅および周期が短く，また形成される溝構造の方向は走査方向に対して右に約 15°傾いた形状が形成されていることがわかる．
20 scans の条件では溝構造の連続性に違いはあるが，電解研磨面に形成したナノ周期構造に近い幅と周期，かつレーザ光走査方向に沿ったナノ周期構造が形成されている．
図 11 にプローブ顕微鏡を用いた表面形状測定結果を示す．図より超短パルスレーザ光を 1scan 走査することで形成されたナノ周期構造は凸部高さ 220 nm，周期間隔 470nm となっている．一方，走査回数を 20 scans とした場合，凸部高さは 240 nm，周期間隔は 540 nm となり，電解研磨
図７3・4

ナノ周期構造の連続性と細胞配向性の関係面に形成したときに近い形状(凸部高さ 260 nm, 周期 580

初期表面形状がナノ周期構造へ及ぼす影響

前項までに示したとおり，純 Ti 基板表面に形成した
レーザ誘起ナノ周期構造は細胞配向性の付与に有効であることが明らかになった．ここで，インプラント表面の加工面性状は様々であり，それらの初期表面形状に対してナノ周期構造を形成した場合，ナノ周期構造の表面形状に影響を及ぼすと考えられる．本項では機械研磨を行った Ti基板の初期表面粗さがナノ周期構造の形状に及ぼす影響について実験的に調べた．さらに，その影響を低減させる方法について検討した．
はじめに，電解研磨を行った純 Ti 基板表面に超短パルスレーザ光を照射することで試料の除去深さを調べた．図2 で示したレーザ照射セットアップを用い，4×8 mm の領域にナノ周期構造を形成した．ここで，1 回の走査でナノ周期構造形成領域を形成した場合を走査面回数 1scan と定義し，同一箇所を 1scan から 20scans まで走査した．図 8に示すように，レーザ光未照射領域からナノ周期構造形成領域までを触針式表面粗さ計を用いてプローブを走査し，
図８

断面プロファイルを測定した．ここで，プローブの走査方除去深さの測定方法

向はナノ周期構造の溝方向に対して垂直方向とした．得られた断面プロファイルより，レーザ光未照射および照射領域の平均高さの差を除去深さ Drem と定義した．
図 9 に除去深さとレーザ光走査面回数の関係を示す． 1scan 時の照射回数は 15shots としている．図より 1 scan 時の除去深さは約 60 nm であり，走査面回数を増加させるほどその除去深さは線形的に増加している．走査面回数 20scans 時においては約 1.1 µm の除去厚さが得られている．
初期表面粗さがナノ周期構造に及ぼす影響を検討するため，1 scan 時の除去深さより大きな 0.72 µmRz の初期表面粗さを有し，研磨痕が一定方向のチタン試料表面に対してレーザ光を同一箇所に多数回走査する実験を行った．この際，レーザ光照射セットアップおよび条件は図 2 で示した通りで，レーザ走査回数は 1 scan から 20 scans へと変化

図９

走査面回数による除去厚さの変化nm)になっている．以上の結果より，走査回数の増加によ(1) 同一レーザフルエンスの場合，フェムト秒と比較してり，ナノ周期構造表面形状が初期表面粗さから受ける影響レーザ強度の低いピコ秒程度のパルス幅を用いるこを低減できることが明らかとなった．とで凸部と凹部の高低差のある高アスペクト比を有するナノ周期構造が得られる．
(2) 同一パルス幅の場合，レーザフルエンスが増加すると連続性が低いナノ周期構造となる．
(3) 細胞配向性の向上には高アスペクト比のナノ周期構造を形成し，適切なレーザフルエンスにより連続性の良い表面形状とすることが有効である．
(4) ナノ周期構造の表面形状は初期表面粗さの影響を受けるが走査回数を増加させることで初期表面の影響を低減することが可能であり，電解研磨面に形成したときと同等の溝幅と周期で形成することができる．

謝辞

本研究の一部は公益財団法人 天田財団（平成２９年度奨励研究助成 A, AF-2017239）より助成を受けたものである．細胞試験では大阪大学接合科学研究所の塚本雅裕教授，東京医科歯科大学生体材料工学研究所の塙隆夫教授，陳鵬助教にご協力を頂いた．ここに記して感謝の意を表する．
図１０

初期表面によるナノ周期構造の形状変化

参考文献
1)

T. Hanawa: Biofunctionalization of titanium for dental
implant, J. Dent Sci. Rev., (2010), 46, 93.

2)中野貴由，馬越佑吉：骨組織における生体アパタイト

3)

M. Goto, T. Tsukahara, K. Sato, T. Kitamori: Micro- and結晶とその力学機能，生体医工学，(2006)，44，4，503．
nanometer-scale patterned surface in a microchannel forcell culture in microfluidic devices, Anal Bioanal Chem.,(2008), 390, 93, 817.
4)

J. Lu, M.P. Rao, N.C. MacDonald, D. Khang, T.J. Webster:
Improved endothelial cell adhesion and proliferation on
patterned titanium surfaces with rationally designed,
micrometer to nanometer features, Acta Biomater., 4,(2008), 192.

5)

T. Shinonaga, M. Tsukamoto, T. Kawa, P. Chen, A. Nagai,
T. Hanawa: Formation of periodic nanostructures using afemtosecond laser to control cell spreading on titanium,Appl. Phys. B: Lase. and Opt., (2015), 119, 493.

図１１

走査回数の増加による初期表面形状に影響を6)受けたナノ周期構造の表面形状改善

T. Shinonaga, M. Tsukamoto and G. Miyaji, Periodic
nanostructures on titanium dioxide film produced using
femtosecond laser with wavelengths of 388 and 775 nm:

４．まとめ
本研究ではレーザ誘起ナノ周期構造の形成による高付

Opt. Express., (2014), 22, 12, 14696.
7)

M. Hashida, T. Nishii, Y. Miyasaka, H. Sakagami, M.

加価値生体材料の創成を目指し，ナノ周期構造の表面形状

Shimizu, S. Inoue, S. Sakabe: Orientation of periodic制御を試みた．さらに，細胞配向性の向上に有効なナノ周

grating structures controlled by double-pulse irradiation,期構造の表面形状を明らかにすると伴に，Ti の初期表面

Appl. Phys. A: Mater. Sci. Process., (2016), 122, 484.

形状がナノ周期構造に及ぼす影響について示した．本研究で得られた主な成果は以下のとおりである．

8)

K. Miyazaki, G Miyaji: Nanograting formation throughsurface plasmon fields induced by femtosecond laser pulses,J. Appl. Phys., (2013), 114, 153108.