新規タンパク質分解酵素の機能を発見！
大阪府立高津高校	 
木村祐実・佐々木大輔	 
指導教員：小野格	 	 

１．は じめ に	  私達の遺伝子から作られるタンパク質は約２万種類あるが、そのうちの約半分は化学的な分子機能がまだよくわかっていないらしい。しかし意外なことに、「その機能を発見する研究を、現代の研究者が行なうことは難しい」と聞いた。
なぜなら、どれだけの時間を使えば「機能の発見ができるか」、その予定が立たないので、プロジェクトの目標にすることは難しいらしい。ならば、高校生の私達が挑戦してみようと思った。	 	 	  興味をもったのは、タンパク質分解酵素である。エビやカニの甲殻類や、昆虫などの外骨格を持つ生物は、脱皮という大きな変化を返しつつ大きくなる。しかし、我々ヒトは、そのような劇的な変化ではなく、少しずつ組織が新しくなって成長して行く。その成長のため、我々ヒトの身体を作っている分子は、３ヶ月でほとんどが入れ替わるらしい。すなわち、３ヶ月経つと、以前の自分は新しい自分と入れ替わっているということになる。	 	  その中でも、タンパク質は食物として摂取する以外に、自分の身体を構成するタンパク質をアミノ酸にまで分解して、再利用していることが知られている。それらの時にも、タンパク質分解酵素が重要な働きをしているはずである。	 	  そこで、「多くの生物が共通に持っているにもかかわらず機能が未知のタンパク質分解酵素」のうちから２種類（図１Ａ, １Ｂ）を選び、化学的な機能の発見を試みた。	 	 

Ａ

B	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 図１ タンパク質分解酵素（Ａと B）の立体構造	 	 a	 

２．方 法 	 	  ２種類のタンパク質分解酵素（ＡとＢ）いずれも、	 b−	 

ウシの血清アルブミンを基質として加水分解し、	 その反応過程を電気泳動で追跡した。	 得られたペプ	 チド混合物を精製後（図２a）、微量液体クロマト	 グラフィーで分離しつつ、オンラインの質量分析	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 装置（図２b）でアミノ酸配列を測定し（図３）、	 	 	 	 図２ 得られたペプチド断片の精製（a）と、液体プロテアーゼによる切断部位を決定した（図４,５）。

クロマトグラフィーを接続した質量分析装置（b）

３．結 果	  タンパク質分解酵素によってペプチドに分解された「ウシ血清アルブミン基質のペプチド断片」や、「タンパク質分解酵素自身が自己消化したペプチド断片」が微量液体クロマトグラフィ
ーで分離され（図３a）、各時間に溶出したペプチドを、質量分析装置の中でさらに部分分解することによって、ペプチド断片のアミノ酸配列を決定した（図３b,c）。そのペプチド断片の両端（図４は、アミノ酸配列のリストの一部）が、タンパ
ク質分解酵素によって切断された箇所であるので、２種類のタンパク質分解酵素（ＡとＢ）の結果をまとめたものが、図５である。

ab-1
b-2
b-3b-4ca
図３ ペプチド断片のアミノ酸配列決定。 図３a．微量液体クロマトグラフィー（C18）によるペプチド断片の分離。	  	  一例として、43.5 分のペプチド（b-1）の大きいピーク３つを選び、さらに部分分解（MS/MS	 分析）	 	  	  したものが、図３b-2,	 b-3,	 b-4。図３c は、b-2 の縦軸を拡大図。横軸の質量電荷比（m/z）の	 	  	  差から、アミノ酸配列を決定した。	 	 	 	 	 図４ アミノ酸配列が解析されたペプチド断片のリスト（一部分を表示）
図３c は、矢印の行に記載されている。

	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 図５ タンパク質分解酵素 Ａ（\） および Ｂ（/） による基質（ウシ血清アルブミン）の切断箇所
アルファベットは、タンパク質を構成するアミノ酸残基の１文字表記。G,	 グリシン；	 A,	 アラニン；	 	 
V,	 バリン；	 L,	 ロイシン；	 I,	 イソロイシン；	 S,	 セリン；	 T,	 トレオニン；	 C,	 システイン；	 	 
M,	 メチオニン；	 D,	 アスパラギン酸；	 N,	 アスパラギン；	 E,	 グルタミン酸；	 Q,	 グルタミン；	 	 
R,	 アルギニン；	 K,	 リシン；	 H,	 ヒスチジン；	 F,	 フェニルアラニン；	 Y,	 チロシン；	 W,	 トリプトファン；	 
P,	 プロリン。	 	 	  タンパク質分解酵素によって切断される時に10 アミノ酸残基の各ポケットについて、アミノは、「ウシの血清アルブミン基質」の各アミノ酸酸残基の出現数をカウントした。そして、その残基は酵素（ＡまたはＢ）のポケットに結合して数字を、「ウシの血清アルブミン基質」を構成すいるはずである。そこで、基質結合ポケットのる各アミノ酸残基の出現確率で割って、アミノ特徴を調べるために、図５をもとにして、切断部酸残基に不公平がないようにした。（図６）。	 

位から N 末端側へ 10 アミノ酸残基、C 末端側へ	 	 	 	 	 	 	 	 図６ タンパク質分解酵素 Ａ および Ｂ の切断箇所のサブサイト特異性	  	  	  	  	  図５をもとにして、切断箇所から N 末端側および C 末端側に 10 残基の範囲のサブサイトに	 	  	  	  	  	  ついて、基質側のアミノ酸残基の出現頻度を計算した。矢印は切断箇所。	 

４．考 察 	 	  図６の結果から、新規タンパク質分解酵素 A とＢのいずれも、基質特異性が広いことがわかったが、両酵素の基質特異性は異なっていた。	 	  図７に示すように、タンパク質分解酵素Ａは、基質のアミノ酸配列が	 -N-Q-C↓ I-Q-H-W-P-	 の場合に↓印の間の結合を効率良く切断すると考えられる。基質の各アミノ酸残基は、比較的大きく、おもに疎水性と中性のアミノ酸残基からできている。そのような基質を結合するために、酵素Ａの基質結合ポケットは、比較的大きく、疎水性のアミノ酸残基からできていると推測される。	 	  一方、タンパク質分解酵素Ｂ の場合には	 -S-H-C-C-N↓ Q-D-Q-P-	 の配列で、比較的小さな親水性のアミノ酸残基からなる基質を効率良く切断するので、その基質を結合する酵素Ｂのポケットは、比較的狭くて、親水性のアミノ酸残基からできていると推測される。	 	 	 	 	 	 酵素 A

酵素 B	 	 	 	 	 	 	 	 	  	 	  ↓	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 ↓	 	 	 	 	 	 -X-X-N-Q-C-I-Q-H-W-P-X-X-X-X-S-H-C-C-N-Q-D-Q-P-X-X	 	 	 	 	 	 	 	 	  	  	  	 図７ 酵素 A および 酵 素 Ｂ の基質結合部位に、基質として最適と思われるアミノ酸配列のペプチドが結合した場合の模式図 楕円は酵素分子全体を表す。その溝に、	 	  	  	  	  図６で最適のアミノ酸配列の基質が結合した模式図。↓は切断部位。

５．まとめ と今 後 の 課 題	  ２種類の新規なタンパク質分解酵素 A と Ｂ は、ともできるらしい。そのための基質群もすでにいずれも、幅広い基質に働くが、その基質特異市販されているようなので、実験可能である。	 

性は異なっていた。	 	  本来、生物はタンパク質でできているので、	  これらの酵素は、すでに立体構造がわかって働く場所を間違うと、ヒトの場合の膵炎などのいるようなので、今後、その立体構造の情報をように不都合が生じる。そのため、タンパク質利用して、私達の実験結果を化学的に説明する

分解酵素は「必要な時」に、「必要な場所」で作ことに挑戦してみたい。	 

られ、さまざまな調節を受けながら、それぞれ	  また将来、発色団を末端に持つ合成基質を利の酵素の役割を果たしていると考えられる。今用して、その加水分解速度を分光学的に測定す回研究した新規なタンパク質分解酵素が、どのよる「サブサイトマッピング法」を用いれば、サうな時に、どのような場所で、働いているのかブサイト毎の基質特異性を定量的に解析するこを知りたい。	  	  	 	 	 ６．参 考 文 献
加藤久夫 (1971)「タンパク質分解酵素の特異性」, 生化学データブック p. 341-414, 東京化学同人
桑島邦博他訳 (2006)「タンパク質の構造と機構」医学出版
質量分析ベーシックトレーニングテキスト version 4.0.2 (2011) Bruker Daltonics