NGSデータを用いたコピー数多型（CNV）解析

フィルジェン株式会社 バイオサイエンス部(biosupport@filgen.jp)
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はじめに ゲノムワイドのCNV解析には、従来からマイクロアレイが使用されているが、基本的にサイズの大きい領域の検出に制限される。
 SNPや小サイズのInsertion/Deletionのような、ゲノム上の変異の検出については、すでに次世代シークエンサーを使用した疾患遺伝子パネ
ル解析、全エクソーム解析や全ゲノム解析が主流になっている。
 Golden Helix社VarSeq®のCNV Caller機
能では、このような次世代シークエンサーの変異解析パイプラインのデータをそのまま用いて、1エクソンの小サイズから、1遺伝子あるいは染色体全体のような大サイズのCNVを検出することができる。
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Golden Helix ソフトウェア製品ラインナップ
SNP & Variation Suite•••••GWAS & SNP Analysis
Large-N DNA-Seq Analysis
Genomic Prediction
Copy Number Analysis
RNA-Seq Analysis

VarSeq®

•••••Variant Interpretation
Cancer Diagnostics
CNV Calling
Clinical Reporting
High-throughput NGS Testing

VSWarehouse

••
•
•
•

Fully Integrated with VarSeq Workflows
Scalable Technology
Organize Samples into Projects
Centralized Clinical Report Hosting
Create Variant Assessment Catalogs
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VarSeq®
 キュレーションされた様々なデータリソースを使用し、変異データへアノテーション付けを実行• dbSNP• RefSeq Genes• COSMIC• 1000 Genome• NHLBI 6500 Exomes• ExAC Variant• gnomAD Exomes• SIFT and PolyPhen• dbNSFP Functional Predictions• ClinVar• CIVic• ICGC Simple Somatic Mutation• 各種遺伝子パネルのターゲットデータ...など

 VCFファイルに含まれる変異データから、任意の検索条件でデータのフィルタリングを行うワークフローを作成
 HGVDなどの独自定義ファイルもアノテーションデータとして利用可能
 カバレッジ計算やトリオ解析、表現型情報に基づく遺伝子ランキングなどの解析アルゴリズムを搭載
 ゲノムブラウザーを搭載し、BAMファイルデータや各種アノテーションデータをグラフ表示
 無償提供のビューワーソフトウェアが利用でき、解析結果4を容易にシェアすることが可能

CNV Caller VarSeq®専用の、機能追加用の有償アドオン
 遺伝子パネルや全エクソーム、全ゲノムシークエンスデータを使用した、CNV領域の検出 検出されたCNVは、ゲノムブラウザーでグラフィカルに表示が可能
 LoH (Loss of Heterozygosity) 検出も可能

5解析使用データ

次世代シークエンサーの変異解析用パイプラインで出力された、変異データ（VCFファイル）とリード配列のアライメントデータ（BAMファイル）を使用



遺伝子パネルやエクソーム解析の場合は、ゲノム上のターゲットキャプチャー領域データ（BEDファイル）が必要

VCF

FASTQ
BAM

BED
*遺伝子パネル、エクソーム解析の場合のみ
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CNV解析ワークフロー

Create Sample ProjectCompute Sample Coverage

Call CNVs

Plot on Genome Browser
7ワークフロー詳細

8カバレッジ計算

 リードアライメントデータとターゲット領域データを使用し、各ターゲット領域ごとのカバレッジを計算 全ゲノムシークエンスの場合は、ゲノム全体を一定の間隔で分割し、分割された各領域ごとのカバレッジを計算する

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CNV検出とプロット

 カバレッジデータのサンプル間の正規化を行った後、各サンプルごとに、リファレンスサンプルセットとカバレッジを比較して、各ターゲット領域ごとのRatioとZ-scoreを計算する- Z-Score: サンプルカバレッジが、リファレンスサンプルの平均カバレッジから、標準偏差の何倍離れているか- Ratio: サンプルカバレッジと、リファレンスサンプルの平均カバレッジとの比率

 同時にDeletionやDuplicationなどの、ゲノム上でコピー数異常が検出された領域を示すデータ（CNV State）
が出力される 計算されたRatioやZ score、CNV Stateなどのデータは、そのままゲノムブラウザーにプロットすることができる

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サンプル条件
 カバレッジ
 遺伝子パネル、エクソーム解析の場合は、100 x が必要 サンプル リファレンスサンプルセットに、最低10サンプル、できれば30サンプル以上が望ましい すべて同一の解析プラットフォーム（パネルの種類、サンプル調整の条件、シークエンスデータ量など）である
 性染色体の解析を行う場合は、サンプルの性別も合わせる必要がある

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計算用アルゴリズム
 カバレッジ計算
 Targeted Region Coverage（遺伝子パネル、エクソーム解析用）- Bedファイルなどで指定されたターゲット領域ごとにカバレッジを計算

 Binned Region Coverage （全ゲノム解析用）- ゲノム全体を任意の間隔で分割した領域ごとにカバレッジを計算

 CNV検出 CNV Caller on Target Regions（遺伝子パネル、エクソーム解析用）- Targeted Region Coverageで計算されたカバレッジデータを使用した
CNV検出
 CNV Caller on Binned Regions （全ゲノム解析用）- Binned Region Coverageで計算されたカバレッジデータを使用した
CNV検出

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ビジュアライゼーション
 ゲノムブラウザー
 検出されたCNV State、さらに各領域ごとのZ-ScoreやRatioをプロットすることで、ゲノム上のコピー数異常領域をビジュアル表示できる リードアライメントデータや、各種データリソースの情報も、プロットが可能

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解析例

遺伝子パネル：Illumina TruSight Cancer panel

解析サンプル：腫瘍細胞（48サンプル）

48サンプルの腫瘍細胞を、Illumina社のがん遺伝子パネルとシークエンサーを用いてターゲットシークエンスを行い、得られた48サンプル分のFASTQファイルから、アライメントデータのBAMファイルと、変異コールデータのVCFファイルを、それぞれのサンプルに対して取得した。

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サンプルデータのインポート

 各サンプルのVCFファイルと同時に、BAMファイルもインポートを行う

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サンプルデータのインポート インポートした変異データ（VCFファイル）と、リードアライメントデータ（BAMファイル）を表示

 変異データ アライメントデータ

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ターゲット領域データの取得

 Illumina社、Thermo Fisher Scientific社の遺伝子パネル、エクソーム解析用のターゲット領域データは、VarSeq®のダウンロードツールより、ダウンロードが可能
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ターゲット領域データの取得

 ダウンロードツールにないターゲット領域データを使用する場合は、BEDファイルをインポートして使用する
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カバレッジデータの計算

 Targeted Region Coverageを起動し、ダウンロードしておいたターゲット領域データを指定する

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カバレッジデータの計算 パネルに含まれている、各ターゲット領域ごとのカバレッジデータがテーブル形式で出力される
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CNVの検出 CNV Caller on Target Regionsを起動し、リファレンスサンプルやQCチェックのパラメータなどを指定する
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CNV出力データ
 Sample Table 各サンプルごとのQCチェックデータ（平均カバレッジや低カバレッジフラグなど）

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CNV出力データ
 Coverage Region Table 各ターゲット領域ごとのコピー数状態（Diploid、Deletion、Duplicationなど）とRatio、Z-scoreなど

23CNV出力データ
 CNVs Table ゲノム全体のコピー数異常領域とその状態（Diploid、Deletion、Duplicationなど）、さらにP-valueなど

24ゲノムブラウザーへのプロット

Coverage Region
TableのZ-Score

Coverage Region
TableのP-value

CNVs TableのCNV State 出力テーブルの各データを、ゲノムブラウザーにプロットする
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ゲノムブラウザーへのプロット

1000 Genome
CNVデータCOSMICデータ

 Ratioなどの数値データを、変化が分かりやすいように線でつなげたり、各データリソースのSNVやCNVデータを、プロットに加えることができる26

お問い合わせ先：フィルジェン株式会社

TEL: 052-624-4388 (9:00～17：00）
FAX: 052-624-4389
E-mail: biosupport@filgen.jp

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