2023年度 照明学会全国大会
2023年 9月 5日（火）@ 東京理科大学 葛飾キャンパス

吸収線量の概念を用いた
紫外線照射量の評価○秋吉 優史、古田 雅一
大阪公立大学 工学研究科 量子放射線系専攻、放射線研究センター、大阪国際感染症研究センター兼担
E-Mail: akiyoshi-masafumi@omu.ac.jp
http://anticovid19.starfree.jp/

紫外線照度評価標準化の重要性について
・現在感染症対策として紫外線消毒が注目されており、様々な UV-C 紫外線照射機器が販売されている。
・個々の微生物に対する効果を広告などで表示することは出来ないが、○秒で99%除菌などと言う広告があふれている（実測の結果ほとんどがパチ物）。信頼できる機器の普及のため、客観的な効果を示すために物理的な紫外放射照度の表示義務化が望ましい。また研究者レベルでも生物系の専門家は紫外測光には疎く、校正した波長と異なる波長の光源の測定や、斜め入射や反射光、酷い場合は影になる部分が出るなどで得られた生残曲線の積算照度の信頼性に問題がある。
・内閣官房新型コロナウイルス感染症対策推進室と2020年9月から現状について意見交換し、照度測定について標準化がされておらず、測定の信頼性が担保できないことが紫外線照射技術を普及する上で最大のネックとなっていることが確認された。
・紫外放射照度計に関する製品規格が存在しないことは東海大学竹下先生などから以前から問題提起されており(*)、実際に様々な照度計について調査を行い機器間での大きなばらつきと、斜入射特性の悪さが問題視されている(**)。現在照明学会 UV-C領域
殺菌用途の紫外放射研究調査委員会で議論されている。また、照射系については日本防菌防黴学会の第50回年次大会 シンポジウム6: 光殺菌法の標準化の必要性に於いて徳島大学の高橋先生のグループから標準化の提案が行われている。
(*)照明ハンドブック（第3版）、照明学会、オーム社、2020年.
(**) 紫外放射の産業界における使用例とその実用測定機器・方法の現状、照明学会、JIEG-007-a、1994.

吸収線量とは吸収線量 (Gy) =吸収された放射線のエネルギー (J)
対象とする系の質量 (kg)ある体系に於いて吸収した放射線の電離エネルギーをその体系の質量で割った量が吸収線量(J/kg)。不均一な照射の場合系の取り方（分母の大きさ）によって値が異なってくる。
吸収線量(Gy) は電離放射線に対して定義された量で、紫外線については相当する量が定義されていないため、質量吸収光量(J/kg)と言う用語を暫定的に提案する。
強透過性放射線

弱透過性放射線

Hp(0.07) ≦ 10 Hp(10)Hp(0.07) > 10 Hp(10)260nm付近では吸収が大きい

同じ積算照度でも「系」に吸収されるエネルギーは異なる
長波長側では吸収は小さくなる

整列拡張場

ほとんど素通りでほぼ均一にエネルギーを与え、表面から1cm の微小体積に対する吸収線量（ 1cm線量当量）が人体全体の実効線量を代表すると見なす。

整列拡張場

表面近傍にのみ局所的にエネルギーを与え、深さ70μmでの点での吸収線量（70μm線量当量）が皮膚の等価線量を代表する。

積算照度には系を素通りする光子のエネルギーも含まれている吸光度から求める質量吸収光量(1)
吸収された紫外線のエネルギー (J)

質量吸収光量 (J/kg) =対象とする系の質量 (kg)I0
吸収

ランベルト・ベールの法則
厚さ l

I0 - I1

吸光度 A = -log10( I1 / I0 ) = εc l
(ε: 吸光係数、c : 媒質濃度、l : 光路長)から、系に吸収されるエネルギー I0 - I1 はI1

途中でほぼ全量が吸収される系を薄めているだけ

I0 (1-10-εcl ) と表わすことが出来、吸光度が 1だと 90%､2 だと 99% 吸収されたことになる。系が厚いほど、媒質濃度が高いほど、吸収されるエネルギー自体は大きくなる。

しかしながら、あまりに厚かったり、媒質濃度が高くなると、途中でほぼ紫外線の全量が吸収されそれ以上吸収されるエネルギーは増えず、媒質の量が増えるに従い媒質の単位質量あたりに吸収されるエネルギーは小さくなる。

吸光度から求める質量吸収光量(2)バクテリオファージQβ のファージストック（原液、3.0×109 PFU/ml）を 5, 10, 20, 50倍に希釈していき、初期濃度の異なるファージ液を調整した。これを光路長1mm(原液) もしくは 2mm の石英セルに入れて紫外可視光分光光度計（アズワン ASUV-6300PC, ダブルビーム、石英セル使用）により吸光度スペクトルを測定した。
低圧水銀ランプからの紫外線の波長である 254nm における吸光度をファージ濃度で整理し、ファージ濃度(PFU/ml)あたりの吸光係数(ml/PFU・mm) を求め、
φ60mm のシャーレに 5ml のファージ液を入れて1mJ/cm2 を照射した際の 吸収エネルギー を求めた。

54.543.5

生理食塩水
x1 光路長2mmx1 光路長1mmx5x10x20x50

Absorbance

32.52

1.5

10.5

0200220240260280300320
Wave length / nm

340360380400

1.E+003.5
3吸収エネルギー / mJ/cm^2

光路長2mmでの吸光度 @ 254nm

42.52y = 1.04640 x
2

R = 0.99994

1.5
10.5
0
0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

1.E-01

1.E-02

1.E-033.50

ファージ液の濃度 10^9 PFU/ml
1.E-04
1.E+05

吸光係数 = 5.232×10-9 ml/PFU・mm

1.E+06

1.E+07

1.E+08

ファージ濃度 / PFU/ml

1.E+091.E+10吸光度から求める質量吸収光量(3)質量吸収光量を求める際の分母として ファージの質量を求めた。バクテリオファージQβを直径28nm、密度1.2g/cm3 の球体と簡略化して計算すると、1つあたりの質量は1.38×10-17 g となった。ファージ1つで 1 PFU と仮定すると、1cm2 のファージ液（厚さ1.77mm*）中に存在するファージの質量は、ファージ液の濃度 c(PFU/ml) を用いて 1.38×10-17×0.177 c と表わされる。
これを分母として、前ページで求めた 1cm2 あたりの吸収エネルギーを割ると、質量吸収光量 (J/kg) が求まる。
* φ60mm のシャーレに 5ml のファージ液を入れて照射した

質量吸収光量 / J/kg

1.E+10

1.E+09

計算した質量吸収光量は、わずか1mJ/cm2 の照射で 1G J/kg にも達するという巨大な値となった。ファー
ジ1つで 1 PFUという仮定や、実際の構造から質量を求めていない点、さらに散乱による透過光強度の低下など考慮すべき点は有るが、放射線での滅菌は数10 kGy 程度の照射で十分であるのとあまりにも大きく乖離している。
ただし、傾向として1×108 PFU/mlを境に吸収線量の低下が見られるという結果が得られた。

1.E+081.E+07
1.E+06

なお、ファージを分散させている生理食塩水による紫外線の吸収は無視可能であり、ここで求めた吸収線量は系全体を平均化した場合の値である点に注意を要する。

1.E+07

1.E+08

ファージ液濃度 / PFU/ml

1.E+091.E+10生残曲線の初期濃度依存性(1)
実際にバクテリオファージQβ液に紫外線照射（低圧水銀灯からの254nm）を行った際の生残曲線が、初期濃度によってどのように変化するのかを検証した。
照射はφ60mmのシャーレに 5 ml のファージ液を入れて行い、0.13mW/cm2 程度に調整した照射器によって10分(78mJ/cm2 程度)まで照射した。各回の照射前後で波長254 nmの紫外線に対して校正されている放射照度計（ケニス YK-37UVSD ）により照度測定を行い平均を求めた。
途中 0, 2.5, 5, 7.5, 10分で二段シャッター装置を使用して紫外線を遮光して照射を中断し、 0.1ml ずつサンプリングした。サンプリング後はシャーレのファージ液に対して照射を継続した。 サンプリングしたファージ液は生残率に応じて10倍希釈をn回行った後に0.01mlを分取して大腸菌（NBRC13965）に加え、寒天培地に播種してプラーク数(P)を確認する事により、P×10n/0.01 PFU/ml として感染価を求めた。

生残曲線の初期濃度依存性(2)バクテリオファージQβ及び大腸菌の取扱いは、JIS R1706 （光触媒材料の抗ウイルス性試験方法 - バクテリオファージQβを用いる方法）に準拠する。
① ファージ専用の宿主菌である大腸菌（NBRC13965）を37℃で20時間前培養する。
② 前培養した大腸菌を本培養（JIS LB 5 ml：前培養 E.coli 5 μL）する。
濁度を分光光度計により測定し、おおよその菌濃度を確認する。
③ 凍結保存されていたファージストック（NBRC 20012）を解凍する。（4℃ で保存し、2週間以内に使用する）
解凍したファージストックをペプトン加生理食塩水で希釈して異なる濃度のファージ液を調整する。希釈率は1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍とした。（使用するファージストックの濃度が時期により異なるため、ファージストック及び希釈後照射前の感染価をその都度評価した）④ 60 mm シャーレに希釈したファージを 5 ml 入れ、低圧水銀ランプ (NEC GL-6 + ノーベル照明器具 FT-6) からの 254nm UV-C で照射する。（放射照度：約 0.13 mW/cm^2、点灯後 30分以上経過後に波長 254 nmの紫外線に対して校正されている放射照度計（ケニス YK-37UVSD ）により照度を確認後照射を開始）⑤ UV 照射 2.5分、5分、7.5分、10分経過した時点で一旦照射をシャッター装置により中断し（低圧水銀ランプは点灯したまま）、ファージ液を 0.1ml サンプリングする。
⑥ サンプリングしたファージ液を予備実験などで予想されるプラーク数をカウント可能な濃度まで希釈する（10倍希釈を n回行う）。
希釈したファージ液 0.01ml を本培養した大腸菌液 0.1ml を 5ml マイクロチューブに入れ、37℃ 15分間加温する。あらかじめ 45℃で加温しておいた NBRC トップアガー 2ml を入れ、手で振って撹拌し、カルシウム添加 LB寒天培地に重層する。
⑦37℃で一晩培養し、プラーク数(P) をカウントする事により、P×10n/0.01 PFU/ml として感染価を求めた。

生残曲線の初期濃度依存性(3)サンプリングしたファージによるプラーク数の測定は2枚のJIS LB平板培地で実施し、平均を取った。照射試験は同じ日に3回行い、平均を取っている。
初期濃度は、ファージストック（原液）を m倍希釈して変化させているが、ファージストックの感染価は実験を行った日によって異なっており、 m倍希釈というのは整理する上での指標に過ぎない。実際の初期感染価は照射前に実測をしている。
結果は、初期感染価が高くファージ濃度が高いほど反応速度定数が小さく、不活化されにくくなった。
1.E+001.E+10
1.E+09y = 1E+09e-0.0211x

1.E-01
1.E+08y = 5E+08e-0.0443x

1.E-02

1.E+06y = 2E+08e-0.094x

1倍希釈
2倍希釈
5倍希釈
10倍希釈
20倍希釈
50倍希釈
100倍希釈200倍希釈指数 (1倍希釈)指数 (2倍希釈)指数 (5倍希釈)指数 (10倍希釈)
指数 (20倍希釈)指数 (50倍希釈)指数 (100倍希釈)
指数 (200倍希釈)

1.E+05
1.E+04
1.E+031.E+02
1.E+01
1.E+00010y = 2E+08e-0.1298x

y = 1E+08e-0.1533x

相対感染価

感染価濃度 / PFU/ml

1.E+07

1.E-03

1倍希釈
2倍希釈
5倍希釈
10倍希釈
20倍希釈
50倍希釈
100倍希釈200倍希釈指数 (1倍希釈)指数 (2倍希釈)指数 (5倍希釈)指数 (10倍希釈)
指数 (20倍希釈)指数 (50倍希釈)指数 (100倍希釈)
指数 (200倍希釈)

1.E-04

1.E-05y = 5E+07e-0.1792x

1.E-06y = 1E+07e-0.1839xy = 6E+06e-0.1849x
20304050
積算照度 / mJ/cm^2607080

1.E-0701020304050
積算照度 / mJ/cm^2607080生残曲線の初期濃度依存性(4)縦軸に感染価濃度を対数プロットした際の傾きである、反応定数を初期ファージ液濃度に対してプロットした。
その結果、吸光度から求めた吸収線量のファージ液濃度依存性と非常に良く似た傾向を示し、1×108 PFU/ml 程度を境に、ファージ液が濃くなると不活化されにくくなることが明らかとなった。
1

質量吸収光量 / J/kg

反応定数 / (mJ/cm )2 -1

1.E+100.1

0.01
1.E+06

1.E+07

1.E+08初期ファージ液濃度 / PFU/ml

1.E+091.E+10

1.E+09

1.E+081.E+07
1.E+06

1.E+07

1.E+08

ファージ液濃度 / PFU/ml

1.E+091.E+10質量吸収光量を用いた生残曲線の整理(1)
生残曲線の横軸をエネルギーフルエンスである積算照度ではなく、ファージが吸収したエネルギーとして質量吸収光量を用いて整理した。
1×108 PFU/ml よりも低濃度の領域では規格化した生残曲線がほぼ完全に一致しており、質量吸収光量で整理することでより信頼性の高いデータを取得できているが、高濃度域では依然として初期濃度により生残曲線の傾きが変化している。

1.E+001.E+10
1.E+09

1.E-01
1.E+08

1.E-02

1.E+06

相対感染価

感染価濃度 / PFU/ml

1.E+07

1倍希釈

1.E+05
1.E+04
1.E+03
1.E+02
1.E+01

2倍希釈
5倍希釈
10倍希釈(2nd)
20倍希釈
50倍希釈
100倍希釈1.E-032倍希釈
5倍希釈

1.E-0410倍希釈(2nd)
20倍希釈
50倍希釈
100倍希釈200倍希釈指数 (1倍希釈)

1.E-05指数 (2倍希釈)

200倍希釈指数 (1倍希釈)指数 (2倍希釈)指数 (5倍希釈)指数 (5倍希釈)指数 (10倍希釈(2nd))

指数 (10倍希釈(2nd))

1.E-06

指数 (20倍希釈)指数 (50倍希釈)指数 (100倍希釈)

指数 (200倍希釈)
1.E+000.E+001.E+101倍希釈

指数 (20倍希釈)指数 (50倍希釈)指数 (100倍希釈)
指数 (200倍希釈)

2.E+103.E+104.E+10質量吸収光量 / J/kg

5.E+106.E+10

7.E+10

1.E-070.E+001.E+102.E+103.E+104.E+10質量吸収光量 / J/kg

5.E+106.E+107.E+10質量吸収光量を用いた生残曲線の整理(2)
生残曲線の横軸を吸収線量とした場合の生残曲線の反応定数を初期感染価濃度に対してプロットした。積算照度で整理した場合と同様であるが、低濃度域での傾きがほぼ無くなり、2×108 PFU/ml 程度まで信頼できる測定が可能である。

反応定数 / (J/kg)-1

1.E-09

1.E-101.E-11
1.E+06

1.E+07

1.E+08

初期感染価 / PFU/ml

1.E+091.E+10質量吸収光量を用いても完全に補正できない原因
本来吸収線量を用いれば、初期濃度の違いによる系全体へ吸収されるエネルギーの違いを補正できるはずであるが、高濃度域で補正しきれなかったのは、ファージ液の上層部で紫外線が吸収され下層に到達せず、既に不活化されたファージに照射し続けているためであると考えられる。照射中に撹拌するなど均一化を行えば、ある程度改善されると考えられるが既に不活化されたファージがエネルギーを吸収し続けるオーバーキルは避けられず、完全に補正することは困難で有ると考えられる。
なお、ファージ1つの投影断面積はφ28nmの球体と考えると 6.16×10-12 cm2 であり、1cm2 あたりのファージの数は1×108 PFU/ml の場合で 1.77×107 個 （1個で1PFU と考えた場合）に過ぎず、全く重なりが無かった場合でも 1.09×10-4 cm2 とわずか 0.01% 程度を覆っているに過ぎない。

不活化されていないファージ
不活化されたファージ
このあたりでほぼ完全に紫外線が吸収されてしまう
いくら照射しても撹拌されない限り下層のファージは不活化されない波長が異なる場合の質量吸収光量の違い
254 nm の場合と同様に、222 nm の遠紫外線を照射した場合のバクテリオファー
ジQβに対する質量吸収光量を計算した。254 nm の場合よりも吸光度が大きい分、同じ積算照度であっても一桁程度質量吸収光量は大きくなった。また、254 nmでの場合よりも低い濃度から質量吸収光量の低下が見られた。
265 nm では 254 nm とほぼ同等であったが、280 nm では吸光度が下がり、質量吸収光量も低下している。ただしこれらはいずれも厚さが1.77mmの系に対する場合の計算結果である。
同じ積算照度で照射しても吸収するエネ
ルギーは波長により異なるため、効果が異なる。質量吸収光量を物差しにして評価することで、初めて光子のエネルギーによる効果の違いが見えてくる。

1.E+10

1.E+0954Absorbance

質量吸収光量 / J/kg

222nm
254nm
265nm
280nm

1.E+0832
11.E+07
1.E+050

1.E+06

1.E+07

1.E+08

ファージ液濃度 / PFU/ml

1.E+091.E+10

230

260

290
320350
Wave length / nm

380

大腸菌に対する質量吸収光量
3.5

32.5
原液
2倍希釈
5倍希釈
10倍希釈
100倍希釈1000倍希釈
10^7倍希釈2

Absorbance

質量吸収光量を求めるために、大腸菌の質量 を求めた。大腸菌を直径1 μm、長さ2μm、密度1 g/cm3 の円柱として計算すると、体積は約1μm3で質量は1×10-12g となった(*)。大腸菌1つで 1 CFU と仮定して、ファージの場合と同様に質量吸収光量 (J/kg) を求めた。その結果数十 kJ/kg 程度の値となり、放射線滅菌の際の吸収線量と比較できる程度の値となった。254 nm の場合
で 108 CFU/ml 程度から質量吸収光量は低下し始めているが、それ以降吸光度も低下するため、実際にはより低下は大きくなる。

1.5

10.5

0200

250300350400450500-0.5

Wave length / nm(*) https://biomedicalhacks.com/2020-11-25/ecoli-size/
1.00E+05

3.5

222nm
254nm

32.5

2222nm254nm
1.5

質量吸収光量 / J/kg

吸光度1.00E+04

1.00E+03

1

直線性を保つ領域で吸光係数を求めた

0.5

00.00E+00

5.00E+08

1.00E+09

1.50E+09

2.00E+09

大腸菌液濃度 / CFU/ml

2.50E+09

3.00E+09

1.00E+02
1.0E+05

1.0E+06

1.0E+07

1.0E+08

大腸菌液濃度 / CFU/ml

1.0E+09

1.0E+10