P1-089M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞

PF-AR NW14A

生細胞上 GPCR のリガンド誘導性 1 分子内部運動計測
Detecting Ligand-Induced Intramolecular Motionof Single GPCR in Living Cells
三尾和弘１、２、石原正輝１，２、一柳光平３，４、野澤俊介３、足立伸一３、深谷亮３
倉持昌弘１，２、関口博史５、佐々木裕次１，２
１ 東大院新領域、２ 産総研-東大 OIL、３ KEK、４ 自治医大、５ JASRIGPCR（G タンパク質共役受容体）には細胞外のリガンドと結合し、G タンパ
ク質を介すことでシグナルを細胞内に伝達し、細胞の興奮状態や生理機能の調整を行っている。そのため、創薬の約半数は、直接的もしくは間接的に
GPCR をターゲットとしており、生命活動にとって非常に重要なタンパク質分子群と言える。しかし、GPCR の活性や構造の研究とは対照的に、シグナル伝達時の分子内部動態についてはほとんど知見がない。
本研究では DXT (Diffracted X-ray Tracking)および、DXB (Diffracted
X-ray Blinking)という手法を用いて、生きた細胞上の GPCR1 分子の内部運
動計測を行った。DXT 法は金ナノ結晶を標識したタンパク質分子に白色 X 線を照射し、得られる回折点の動きをトラッキングすることで、分子内部運動を測定する１分子計測法である。特にマイクロ秒域の時間分解能での測定に使用される。一方で DXB 法は単色 X 線を使用するため、回折点のトラッキングはできないが、ピクセルごとの輝度の揺らぎから分子内部運動の評価を行う手法である。DXB 法ではサンプルへのダメージを抑えられるため、長時間の測定が可能となる。本研究では異なる 2 つの時間軸で測定した。短い時間ス
ケールでの実験（100 μs/frame）として DXT を SPring-8 (BL40XU)で行い、長い時間スケールでの実験（100 ms/frame）として DXB を KEK（PF-AR
NW14A）にて行った。測定試料は、HEK293F 細胞に発現させたセロトニン受
容体 (5-HT2A)とし、金ナノ結晶は、セロトニン受容体の N 末端に挿入した
FLAG タグに対する抗体に結合させた。
サブミリ秒領域の短い時間スケールでは、リガンドの存在下において
GPCR の分子内部運動が遅くなり、分子が安定化することが示された。一方
で、サブ秒領域での長い時間スケールでは、逆にリガンド存在下において
GPCR の分子内部運動が激しくなるという結果が得られた。異なる時間軸で運動が逆転するという興味深い現象は、GPCR とリガンドの会合、及びGPCR と G タンパク質に代表される細胞内分子との相互作用を反映しているものと考えられた。

P1-090M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
PF-BL10C

ヒト S100A3 蛋白質の Ca2+/Zn2+結合親和性と溶液構造特性
The binding affinities for Ca2+ and Zn2+ and solution
structural properties of human S100A3 protein.
井手賢司 1, 2、米澤健人 3、木澤謙司 4、北西健一 5、清水伸隆 3、海野昌喜 1, 2
1 茨城大院理工、2 茨城大 iFRC 、3 KEK 物構研、4 (株）花王、5 東京理科大理

S100A3 蛋白質（S100A3）は、毛髪キューティクル細胞で特異的に存在しており、共発現している蛋白質脱イミノ化酵素のⅢ型アイソザイム（PAD3）により、Arg51 が選択的にシトルリン化される[1]。この選択的なシトルリン化に伴い、S100A3 は、Ca2+と Zn2+への結合親和性が協同的に上昇し、Ca2+/Zn2+依存的に構造変化する。S100A3 のシトルリン化と毛髪の耐性には相関があり、シトルリン化に伴う構造変化が、毛髪の成熟化過程に重要な役割を担っていることが示唆されている [2] 。この
S100A3 のシトルリン化と毛髪の成熟化の関係をより詳細に理解するた
めに、Ca2+/Zn2+結合型 S100A3 の構造を明らかにすることを考えた。
Ca2+/Zn2+結合型 S100A3 の構造を解明するためには、PAD3 によってシトルリン化した S100A3（R51Z）を必要としたが、調製が困難であるな
どの問題があった。この問題を解決するため、Arg51 を他のアミノ酸に置換した変異体を作製し、シトルリン化した S100A3 のモデル探索を行った。その結果、Arg51 をグルタミンに置換した R51Q が R51Z の適したモデル変異体であることがわかった。
R51Q の Ca2+と Zn2+の結合親和性と、Ca2+/Zn2+依存的な構造変化を評価するため、トリプトファン（Trp）蛍光分析、円偏光二色性（CD）ス
ペクトル分析と X 線小角散乱（SAXS）を行った。Trp 蛍光分析と CD ス
ペクトル分析から、R51Q は R51Z と同等の Ca2+/Zn2+結合親和性を持っていることを確認した。また、S100A3 に対して、Zn2+の存在比が多くな
ると、α-ヘリックスが崩壊することがわかった。SAXS では、金属が存在しない条件において、WT と R51Q の散乱曲線は、ほとんど重なった。
この結果から、S100A3 はシトルリン化が生じただけでは分子概形が変化しないことを示唆した。さらに、5 モル当量の Ca2+と 1 モル当量の Zn2+が存在する条件において、WT の散乱曲線は、金属が存在しない条件のものと一致し、分子概形が変化していないことを示した。それに対し、R51Q
は Ca2+と Zn2+の存在により、散乱曲線に変化が生じ、分子概形が大きくなっていることを示した。また、Zn2+の存在量が 2 モル当量に増えることで、分子がさらに大きくなっていることが示唆された。
[1] Kizawa, K., et al., J. Biol. Chem., 208 (8), 5004-5013 (2008)[2] Takahashi, T., et al., J. Cosmet. Dermatol., 15, 211-218 (2015)

P1-091M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
PF/BL-10C

超遠心分析-小角散乱 (AUC-SAS) 法の高濃度凝集含有溶液への適用法の考察
Consideration on analytical ultracentrifugation andsmall angle scattering (AUC-SAS) method forsolution with higher amount of aggregates
宮本洋佑 1、守島健 2、井上倫太郎 2、佐藤信浩 2、奥田綾 2、裏出令子 2、杉山正明 21
京都大学大学院理学研究科、2 京都大学複合原子力科学研究所
小角散乱 （SAS）は生理条件に近い溶液中での生体高分子の構造解析を行える強力な手法である。SAS による構造解析のためには目的とする成分（例えば単量体成分）の正確な散乱プロファイルが必要である。しかし、生体高分子によっては精製直後でも再凝集を生じ、溶液は目的成分と凝集成分からなる多成分系となり、その測定散乱プロファイルは多成分の散乱プロファイ
ルの集合となってしまう。この場合、凝集成分はギニエ解析をはじめとした構
造解析の妨げとなるため、長年に渡り単一成分のみの散乱プロファイルの取得は溶液小角散乱の課題の一つとして位置づけられてきた。
この課題解決のために我々は超遠心分析 (AUC)に注目した。AUC では分子量や形状の相違により沈降係数が異なることを利用して、溶液中に存在する各成分を分離し、それぞれの重量濃度を求めることが可能である。一方、多成分系の散乱プロファイルは各成分の重量濃度と単位濃度当たりの散乱プロ
ファイルの積の総和である。そこで、溶液中の各成分の重量濃度を AUC より求め、多成分系の散乱プロファイル
から目的成分の散乱プロファイルを抽出する AUC-SAS 法を開発した。
これまでに AUC-SAS 法では少量の凝集（重量分率で 5%程度以下）を含む溶液に対して単量体の散乱成分の抽出に成功している（図 1）。一方、本手法を多くの生体高分子の溶液に適用するためには溶液中の凝集量の上限を明らかにする必要がある。そこで、本研究では凝集の重量
分率を系統的に変化させたタンパク
図 1: (a) Ovalbumin の溶液中の重質溶液を用いて、AUC-SAS 法の限量濃度分布（AUC）。(b) Ovalbumin
界についての検討を行った。更に、 溶液の SAXS プロファイル(赤丸)と、適用上限を広げるためのデータ処理 AUC-SAS により得られた単量体成分の散乱プロファイル(緑丸)。
法の改良についても発表を行う。

P1-092M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
ANSTO EMUQENS によるシュウドアズリンの構造ダイナミクス
Structural Dynamics of Pseudoazurin by QENS
橋本将太 1、山口 峻英 1、Attila Taborosi1、Kathleen Wood2、Alice Klapproth2、
高妻 孝光 1
1 茨城大学、２ ANSTO

Achromobacter cycloclastes 由来の Pseudoazurin(PAz)は、脱窒過程において亜硝酸還元酵素と亜酸化窒素還元酵素への電子供与体である。PAz は銅イオンに His40, Cys78, His81, Met86 が配位したタイプ１銅を有しており、第二配位圏の Met16 が His81 と弱く相互作用している。これまで、Met16 を芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)、脂肪族アミノ酸(Ile, Val, Ala、Leu)に置換することで、タイプ１銅の分光学的と酸化還元電位が顕著に変化することを報告した[1, 2]。
近年、Met16 変異体の高分解能 X 線結晶構造解析[3]をおこなったところ、活性中心近傍ループの温度因子が顕著に変化することを新たに見出した。本研
究では、ループの動的性質と弱い相互作用の相関を明らかにするために、
ANSTO の EMU 中性子準弾性散乱法(QENS)によってシュウドアズリンの構造
ダイナミクスを測定した。
中性子準弾性散乱(QENS)の測定は、オーストラリアの ANSTO に設置されている高分解能中性子後方散乱分光器である Emu を用いて行った。
野生型および Met16Ile の QENS からシュウドアズリンの構造ダイナミクスを解析したところ、Met16Ile 変異体の構造ダイナミクスが増大することが確認された。
1. R.F.Abdelhamid, Y.Obata, Y.Uchida, T.Kohzuma, D.M.Dooley, D.E.Brown,
H.Hori, J.Biol.Inorg.Chem.2007, 12, 165-173
2. M.B.Fizpatrick, Y.Obata, K.Fujita, D.E.Brown, D.M.Dooley, T.Kohzuma,
R.S.Czernuszewicz, J.Biol.Inorg.Chem.2010, 104, 250-260
3. T. Yamaguchi, T. Attila, C. Sakai, K. Akao, T. Kohzuma.manuscript in

preparation.

P1-093M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
PF BL10C

超遠心分析-小角散乱 (AUC-SAS) 法を用いた解離会合平衡下にあるタンパク質複合体の構造解析
Structural analysis of protein complex under
dissociation-association equilibrium with analyticalultracentrifugation and small angle scattering(AUC-SAS) method
守島健 1、矢木真穂 2,3,4、井上倫太郎 1、佐藤信浩 1、
奥田綾 1、裏出令子 1、加藤晃一 2,3,4、杉山正明 1
1 京大複合研、2 分子研、3 ExCELLS、4 名市大院薬I(q) / cm-1

I(q) / cm-1

生体高分子が形成する複合体の構造解析は生体機能の理解に重要である。
小角散乱（SAS）は生理条件に近い「溶液中」の生体高分子複合体の構造を解析できる強力な手法である。しかし、解離会合平衡下などの多成分系において得られる散乱プロファイルは溶液中に共存する全成分の時間・集団平均で与えられるため、複合体の構造解析には複合体成分の散乱プロファイルを選択的に得ることが必要である。近年、多成分系の生体高分子溶液から目的成分のみを分離・測定するサイズ排除クロマトグラフィー （SEC）-SAS 法が注目を集めている。しかし、構成分子間の相互作用が弱く（解離定数 KD >102 μM） SEC カラム内で複合体が分解してしまう系やカラム担体と生体高分子が相互作用する系においては、SEC-SAS 法により目的の複合体の選択的測定を行うことができない。一方、超遠心分析（AUC）法は分子量や形状の相違に
より沈降係数が異なることを利用して、溶液中に存在する各成分を分離しそれぞれの重量濃度を求める手法である。特に、沈降と拡散の平衡状態を測定する沈降平衡法は、広範囲で KD を求
-2
(a)
2
10
めることが可能なため（103-10-2μM）、
弱結合複合体（KD >102μM）でも解離会-310合平衡溶液中での濃度を決定できる。
3-4
そこで我々は、複合体を含む解離会合
10 3 4 5 6 7 823
4 5 6 7
-2
-1
(b)
10
10
平衡下の溶液の SAS プロファイルを測-1q/Å
定し、更に AUC 法によりその溶液中で-310の複合体の濃度を求め、両者より複合-4
体の SAS プロファイルを求める手法
10 3 4 5 6 7 823
4 5 6 7-1
（AUC-SAS 法）を開発した。当日は、
10
-1
q/Å
AUC-SAS 法のプロトコル及び大きな解
図 1 (a) HR23-UBL と PNGase-PUB
離定数で解離会合平衡にある HR23- の単体とそれらの混合溶液の X 線
UBL と PNGase-PUB の系[1]への適用 小 角 散 乱 プ ロ フ ァ イ ル (b) AUC結果を報告する。[1] Y. Kamiya, et al., SAS 法により分離した複合体の X
線小角散乱プロファイル
FEBS letters 586 (2012) 1141-1146.

P1-094M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
ANSTO Quokka, Bilby

SANS によるシュウドアズリンの pH 構造転移の解明
pH Structural Transition of Pseudoazurin elucidatedby SANS
津金 聖和 1、山口 峻英 1、Attila Taborosi1、Kathleen Wood2、Andrew
Whitten2、高妻 孝光 1
１ 茨城大学、 ２ ANSTO
非共有結合性の弱い相互作用は、タンパク質の機能発現や構造安定化において重要な役割を演じている。シュウドアズリン(PAz)は、脱窒菌において亜硝酸還元酵素(NiR)と亜酸化窒素還元酵素(N2OR)への電子供与体として機能している。シュウドアズリンの活性中心には、銅イオンに His40、Cys78、His81、Met86 が配位し、歪んだ四面体構造を有している。これまで、活性中心の第二配位圏において His81 に弱く相互作用する Met16 が、活性中心の分光学的・
電気化学的性質や構造安定性に寄与することを報告してきた[1, 2]。本研究では、野生型 PAz および Met16 変異体（Met16Phe、Met16Ile）の酸性における構造転移の詳細を中性子小角散乱（SANS）によって検討した。SANS の測定
は、ANSTO のビームラインである Quokka、Bilby を用いて行った。
野生型 PAz の SANS 曲線から、pD 7.4、3.0、1.9 における慣性半径(Rg)を求めたところ 13.9±0.2 Å、16.6±0.3 Å、32.0±1.2 Å であった。さらに ab initio 解析によって得られた Bead model の形状から、pD 7.4 において野生型 PAz
は”Barrel”型構造を有しており、pD 3.0 では C 末端側のヘッリックスドメインが開いた”Open Domain”型の変性中間体構造をとることが判明した。さらに、pD
1.9 では SANS 曲線が Debye 関数に従う”Random” 構造であることが判明した。

1. R. F. Abdelhamid, Y. Obara, Y. Uchida, T. Kohzuma, D. M. Dooley,
D. E. Brown, H. Hori, J. Biol. Inorg. Chem. 2007, 12, 165-173
2. M. B. Fitzpatrick, Y. Obara, K. Fujita, D. E. Brown, D. M. Dooley,
T. Kohzuma, R. S. Czernuszewicz, J. Inorg. Biochem. 2010, 104,250-260

P1-095M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
SPring-8 BL40XU

生きた線虫Ｃ．エレガンス体内の不凍タンパク質と氷結晶の動的観測
Dynamical observations of antifreeze protein andice-crystals in living Caenorhabditis elegans
倉持昌弘 1,2,3、董芸格 1、関口博史 4、青山光輝 4、戸井基道 3、三尾和弘 2、津田栄 2,3、佐々木裕次 1,2,4
1 東大新領域、2 産総研・東大 OIL、3 産総研・生命工、4 JASRI/SPring-8
不凍タンパク質（AntiFreeze Protein, AFP）は、氷結晶に結合し、結晶成長を防ぐユニークな機能をもつ。AFP の立体構造や物性に関する詳細な解析が行われているが、動的な AFP-氷抑制の作用機序については未だ不明な点が多い。特に、生きた個体生物の中で、AFP や AFP により抑制される氷結晶の動態を実測した例は皆無に等しい。そこで我々は、AFP を線虫Ｃ．エレガンスの腸細胞に発現させ、X 線１分子明滅法(Diffracted X-ray Blinking, DXB)と X 線
１分子追跡法（Diffracted X-ray Tracking, DXT)により、線虫体内の AFP と氷結晶の動態を観察した（右図）。今回、野生型 AFP と、AFP の氷結合サイトに変異を導入した機能欠損 AFP の、線虫
χ
体内における分子動態を観察した。実θX験室 X 線（Rigaku FR-D）を利用して、
χ
線虫体内の AFP 分子動態を計測したとθ
ころ、-5 度、-10 度において、野生型
AFP は温度低下によって、その動態が緩やかに安定する方向に運動が低下していった。一方、機能欠損 AFP は温度
Fig. X 線１分子計測法による線虫体内低下とともに、その動態が激しくなるといのタンパク質分子動態の計測法
う興味深い結果を得た。分子動力学計
算から、氷結晶が発生する温度では、AFP が氷と安定結合して、運動性が低下する、機能欠損 AFP は氷と安定結合できず、AFP が激しく揺らぐ挙動を示すと考えられており、今回の生体内計測の結果とも一致する。また、－20℃以下の測定では、生体内の氷結晶の回折像を観察することができた。この氷結晶の回折像から、結晶サイズやその動的挙動を解析したところ、AFP 有無、
AFP 種類によって氷の性質が異なることが示唆された。SPring-8 BL40XU ビー
ムラインでも同様の計測を行い、準白色光を利用することで、より精細に生体
内 AFP 分子動態検出を試みている。本発表では、生体内の AFP と氷結晶の動態計測から、AFP による氷結晶成長抑制の作用機序について議論したい。

P2-075M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
PF BL10C, SPring-8 BL45XU ほか

磁気受容蛋白質候補 ISCA1 の SAXS 解析
SAXS analysis of the magnetorecepter candidate
protein ISCA1
新井栄揮 1、清水瑠美 1、安達基泰 1、味戸聡志 2、平井光博 2
1 量研・量子生命科学領域、2 群馬大・院理工
多くの動物種は蛋白質を利用した磁覚（磁場の方位や強さを知覚する感覚）を備えている。青色光によって網膜細胞内の蛋白質クリプトクロム(Cry)が含有するフラビン補酵素(FAD)が励起されると、Trp から FAD へ電子が移動し、FAD と Trp で構成されるラジカル対を生じる。このラジカル対の電子ペアが磁場の影響を受けることで電子スピン選択的な化学反応を誘導し、その化学反応性の変化が磁覚に寄与すると推測されている [1,2]。実際、Cry を失活した
ショウジョウバエは磁覚を喪失する[3]。しかし、Cry が受容した磁気情報を何処へどのような機構で伝達するのか解明されていない。量子磁気センサーを有していても、得られた情報を神経系へ伝達する機構が無ければ脳での認知処理が出来ず、受容した情報を主観的に知覚できるとは限らない。一方、
2016 年、Cry と相互作用する蛋白質 ISCA1（別名 MagR）が発見された[4]。
Cry/ISCA1 複合体は地磁気程度の弱磁場(0.4 G)に対しても配向する極めて稀な性質を有する。この性質から、ISCA1 は Cry の磁気受容の反応場もしくはCry が受容した磁気情報を神経系へ伝達する仲介分子として機能する可能性が示唆される[4]。本研究では、ISCA1 の構造・機能解明を目標とし、予備的な検討として SAXS 測定による ISCA1 の溶液構造の解析を行った。その結果、磁覚保有種であるカワラバト由来 ISCA1 は 2 種類の構造異性体（棒状の Type
A と球状の Type B）を形成し、Type B は 8 量体以上の自己会合体を形成する
ことが明らかになった。更に、SAXS データと相同蛋白質の結晶構造（PDB：
2D2A、1R94、1X0G）に基づいた ISCA1 の分子モデリングから、Type B のISCA1 分子間の界面に Fe-S クラスター結合部位が形成されることが示唆された。Type A から Type B への構造変化と、それに伴う ISCA1 の自己会合は、起磁力向上の要因となり得る多くの Fe-S クラスターの結合を可能にすると考えられる。
[1] Ritz T, et al., Biophys J. (2000) 78, 707; [2] Maeda K, et al., PNAS. (2012)
109, 4774; [3] Gegear RJ, et al., Nature (2008) 454, 1014; [4] Qin S, et al., Nat
Mater. (2016) 15, 217

P2-076M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
PF-BL6A

細胞毒性を有する酸化コレステロールによるリン脂質膜の相転移挙動と膜構造への影響
Influence of cytotoxic oxysterol on the phasebehavior and structure of phospholipid bilayers
高橋 浩、星野達也
群馬大学 理工学府 理工学基盤部門
コレステロールは、生体膜がその機能を発揮するのに最適な膜状態にする
調整役として、生体にとって欠くことができない重要な生体分子である。コレス
テロールが酵素の働きによって酸化されて生じる酸化コレステロールには、ホルモンとして作用するものがある。一方、活性酸素の存在によって生じる酸化
コレステロールは、多くの場合、細胞毒性を持つなど生体にとっては、ありがたくない存在である。さらに、酵素由来でない酸化コレステロールは、動脈硬化症、癌、神経症など疾病に関係するとも指摘されている。ただ、その細胞毒性や、疾病を生じさせる分子メカニズムの詳細は、不明である。
生体膜中のコレステロールが、酸化コレステロールに置き換わることで、脂質膜部分の物性が変化し、生体機能が阻害されるのでは、と予想されている。
そのため、モデル生体膜に対する、各種の酸化コレステロールの影響が検討されてきている。細胞毒性が特に強い 7β-hydroxycholesterol(7βOH)と、
25-hydroxycholesterol(25OH)を用いて、これまで主に研究されてきているが、互いに相反する結果が、報告されるなど、まだまだ研究は十分でない。
本研究では、モデル生体膜の研究で、最も多く用いられているリン脂質ジパ
ルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）の膜構造に対する 7βOH と 25OH の影響を、Ｘ線回折で調べ、その結果をコレステロールの場合と比較した[1]。
7βOH、25OH ともに Chol と比較すると、１つの余分な酸素原子を含む。
回折強度データから電子密度分布を再構成し、膜厚を求めた。この値を、重水を用いた浮沈法で求めた質量密度から見積もった見かけ上の分子体積を組み合わせた、膜面の占有面積を算出した。その結果、コレステロールの場合が占有面積は最も小さくなり、7βOH が最大の値を与えた。コレステロー
ルのリン脂質膜に対する凝集効果（分子パッキングを密にする効果）は、良く知られているが、酸化コレステロールでは、その効果が弱くなり、また、その程
度は、酸化部位によることが分かった。さらに、Chol、7βOH、25OH の膜内における分子配向に関しても議論する予定である。
[1] Takahashi & Hoshino, Chem. Phys. Lipids 227(220)104872(doi.org/10.1016/j.chemphyslip.2020.104872)

P2-077M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
KWS-1(FRM-II, JCNS)

中性子小角散乱によるシトクロム c’構造転移機構の解明
SANS study of pH Induced Structural Transition of
Cytochrome c’山口 峻英 1、Alexandros Koutsioubas2、Henrich Frielinghaus2、高妻孝光 11 茨城大学、 2 JCNSThe functional protein structure is achieved by the exact folding ofpolypeptide chains. Cytochrome c’ (Cyt c’) has a four α-helices bundle
structure. The unusual magnetic/spectroscopic properties and pH dependentunique spin species of Cyt c’ have been reported.[1, 2] Here, pH dependent
structural transition of Cyt c’was determined by small angle neutron
scattering (SANS), and the unfolding intermediate structure at pD ⋍ 13 isrevealed to be “open-bundle” form with the four helices like joint-clubs. The
low-resolution bead model created from SANS data of Cyt c’ also
demonstrated that the structure is surprisingly compactly folded (Rg =18-19 Å)
and forms dimer at the neutral pH region. The first structure for unfolding
intermediate of Cyt c’ at pD ⋍ 13 was determined, and the structures at pD
6.4, pD 9.4 and pD ⋍ 13 gave a mechanism of protein unfolding of Cyt c’. The
size of intermediate structure (Rg =ca. 26 Å) is extremely larger than the native
four α-helix bundle structure.

P2-078M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
BL-6A

X 線小角散乱溶液と分子動力学シミュレーションによる数種のシゾフィラン単量体構造観測の試み
Attempt to observe the structure of several kinds ofschizophyllan monomer by Small Angle X-ray
Scattering and Molecular Dynamics simulation
松村義隆、小島正樹
東京薬科大学生命科学部
Yoshitaka Matsumura and Masaki KojimaSch. of Life Sci., Tokyo Univ. of Pharm. and Life Sci.
-glucan is a major component of the pathogenic fungal cell walls. Dependingon their composition and structure, it is related to diseases like mycoses andshows good effects as health promotion such as anti-tumor effect etc. Since
-glucan is a target molecule for candin antifungal drugs, it is an important
molecule from the viewpoint of structure-activity relationship of antibacterial
drugs. Dectin-1 and the like have been found as receptors for -glucan, and are
positioned as important molecules also from the viewpoint of infectious
immunity and innate immunity.
Schizophyllan, which is a -glucan derived from Schizophyllum commune,
has been approved as an anticancer agent because it exhibits antitumor activity,and it has been clarified by X-ray crystal structure analysis that it dissolves inwater to form a triple helix structure (Takahashi, Y., et al. 1984, Kony, D. B., etal., 2007). In contrast, it is known that sonication of schizophyllan reduces themolecular weight and causes a structural change from trimer to monomer,
resulting in loss of anticancer activity (Yanaki, T., et al. 1983). However, it has
been found that the monomeric schizophyllan exhibits activity in the horseshoe
crab fluid coagulation reaction (Limulus test, Nagi, N., et al. 1993). The
Limulus test has been used since 1980's to determine mycosis, a major humandisease. However, there is no example in which the structure directly wasobserved in the solution.
So, in the present study, we attempted to observe and visualize thethree-dimensional structure of the monomeric schizophyllan molecule treatedwith sonication by SAXS and MD simulation. By SAXS analyses showed thatschizophyllan treated with sonication was multi-dispersed state, and the shape
was globule. The Rg of major component of the schizophyllan at several
concentrations were almost 10 Å. MD simulation of the schizophyllan suggested
that the shape was helical structure. Besides, we have measured monomericschizophyllan at alkaline pH by SAXS. The details are discussed in the poster.

P2-079M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
PF-BL6A

コレステロールとラノステロールによるリン脂質膜構造への影響の比較：中性・酸性リン脂質 2 成分系での検討
Comparative study of the effects of cholesterol andlanosterol on phospholipid membrane structureusing neutral and acidic lipid binary systems
松本 旺、高橋 浩
群馬大学 理工学府 理工学基盤部門
生体膜の物理的状態（流動性や透過性等）は、生体機能を発揮するのに最適なものになっている必要がある。その調整を行っているのは、高等生物においては、主にコレステロールである。その生合成には、分子状酸素が必要であり、地球大気の酸素濃度が上昇した後に、コレステロール分子は生物界に登場したと提唱されている[1]。生合成経路においてコレステロールの前駆体であるラノステロールは、分子進化的にもコレステロールの祖先分子であると考えられている[2]。下等生物の一部は、ラノステロールを利用している。そのため、膜の物性の調整役として、ラノステロールよりもコレステロールの方が実際に優れているかが、検討されてきた。しかし、従来の研究は、主に、脂質一種からなるモデル膜に、それらのステロールを加えて影響を調べるだけで、実際の生体膜が、様々な脂質種からなることを考慮すると、不十分である。
本研究では、酸性リン脂質 ジミリシトイルホスファチジルグリセロール(DMPG)と中性リン脂質ジミリシトイルホスファチジルコリン(DMPC)を用いた、
脂質 2 成分系モデル生体膜において、コレステロールとラノステロールが、その膜構造にどう影響するかを、小角 X 線散乱を用いて比較検討した。試料は、ステロール含有量が、0 から 40mol%の範囲のものを用意した。
散乱データから、膜厚を求めたところ、以下の結果を得た。転移温度以下の 5℃（ゲル相）では、高い濃度でステロールが含まれる場合、ラノステロールがより膜厚を増大させた。一方、転移温度以上の 38℃（流動相）では、広い濃度範囲においてコレステロールの方がより膜厚を増大させた。
コレステロールがリン脂質膜の分子パッキングを密にする効果はよく知られているが、ラノステロールの場合、流動相では、膜厚から考えると、その効果が弱くなることが分かった。ゲル相では、流動相とは反対に見かけ上、その効
果は強くなったが、リン脂質分子の膜面に対する傾きの効果も寄与するため、より詳細な検討が必要である。さらに、膜厚だけでなく、膜の流動性の観点からも議論する計画である。
[1] K. Bloch, CRC Crit. Rev. 14 (1983), 47-92.
[2] O.G. Mouritsen & L. A. Bagatolli, Life-As Matter of Fat: Lipids in a Membrane
Biophysics Perspective, Ch. 14, (2016) Berlin, Springer-Verlag.

P2-080M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
AR-NW12A

AR-NW12A におけるオフライン・オンライン顕微分光装置の現状と今後の高度化について
The Development of Spectroscopic System
at AR-NW12A
引田理英 1,2、山田悠介 1,2、松垣直宏 1,2、平木雅彦 2,3、千田俊哉 1,2
1
高エネ機構 物構研 フォトンファクトリー
2
総研大 高エネルギー加速器研究科
3
高エネ機構 共通 機械工学センター
タンパク質の機能メカニズム解析研究において、タンパク質の分子・原子レベルでの立体構造は不可欠であり、高輝度放射光源を利用した X 線結晶構
造解析法は、タンパク質の立体構造を原子レベルで解明するための強力なツールとして利用されている。一方、振動分光学的方法によれば、タンパク質を構成する原子の化学的諸性質を決定する化学結合を精密に解析することができる。近年では、X 線結晶構造解析法と振動分光法を組み合わせ、これら 2つの相補性を利用した研究が展開されるようになってきている。そこで
KEK-PF のタンパク質結晶構造解析用ビームラインである AR-NW12A では、
これまでに行っていたタンパク質結晶の X 線回折実験と併せて、レーザー光
や白色光を光源としたタンパク質結晶の分光実験が可能な装置開発及び環境整備を行っている。これまでに、AR-NW12A のコントロールキャビンに分光実験専用のレーザーブースが建設され、レーザーや分光器が導入されている。
オフライン顕微分光装置については開発が終了し、ユーザー利用が始まっている。紫外・可視吸収測定装置では、結晶に照射する白色光は 100μm 程度まで集光できており、室温・低温どちらでも測定が可能となっている。また、ラマン分光装置についても、100μm 程度のビームサイズでの測定が可能となっている。本ポスターでは、オフライン顕微分光装置の利用について紹介する。
さらに、現在行っているオンライン顕微分光装置の現状についても紹介する。

P2-081M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
PF-BL27A、PF-BL27B

細胞の放射線感受性を決定する情報伝達機構の解明
Analysis of Signal Transduction Mechanism
Deciding Cellular Radiosensitivity
前田宗利 1、前田未佳 1、宇佐美徳子 2、小林克己 2、冨田雅典 31
若狭湾エネ研セ・研究開発・粒子線医療、2KEK-放射光、
3
電中研・原技研・放射線安全研セ

BL-27B の放射光 X 線マイクロビーム照射装置は、5 keV の単色軟 X 線マイクロビームを下流の 4 象限スリットの開放度を変えることにより、細胞核よりも小さなビームで細胞内小器官を狙い撃ちするだけでなく、細胞全体や細胞集団、さらには細胞核と同じ大きさのマスクを置くことにより細胞核を除く細胞質全体を照射することも可能な、世界唯一の生物試料用照射装置である。
我々のグループは、軟 X 線マイクロビームを用いて細胞局所を照射することにより、照射部位と細胞応答および細胞内の分子応答、細胞間情報伝達（バイスタンダー応答）の関係について解析を進めている。
ヒト胎児肺由来正常細胞（WI-38）の細胞核あるいは細胞全体を X 線マイク
ロビームで照射し、DNA 損傷応答のトリガーである ATM（毛細血管拡張運動失調症の原因遺伝子産物）依存的に誘導される DNA2 本鎖切断（DSB）のsurrogate marker であるリン酸化ヒストン H2AX（γ-H2AX）のフォーカス形成を、
免疫蛍光染色により可視化解析した。その結果、5 ミクロン角の X 線マイクロビームを用いて細胞核のみを照射した場合、γ-H2AX のフォーカス形成は 1
Gy では認められず、10 Gy でのみ観察された。その一方、200 ミクロン角の X
線マイクロビームを用いて細胞の全体を照射した場合、γ-H2AX のフォーカ
スは 1 Gy、10 Gy ともに観察された。このフォーカス形成は、ATM 特異的阻害剤である KU55933 を予め培養液に添加することにより抑制されたことから、
ATM 依存的であることを確認した。
細胞質への照射が無い場合に、低線量域（≤ 2 Gy）における H2AX のリン酸化が生じないことから、この線量域では ATM 依存的な DNA 損傷応答が十分に誘導されていないことが確認された。細胞核に加えて細胞質を照射することによって生じる ATM の核内移行が、細胞核内における ATM を介したシグナル伝達機構の活性化に重要な役割を果たしていると考えられる。
細胞質へ放射線のエネルギーが与えられることによって開始される細胞内
情報伝達によって、細胞の放射線感受性や細胞間情報伝達因子の生成や放出を司るメカニズムが制御あるいは修飾されていることから、低線量域における放射線生物応答のターゲットとしての細胞質の重要性が明らかになった。

P2-082M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
PF-BL-6A,10C

溶質の形と大きさを決定するプログラムの高速化の試み
Challenge to Speed Up Software for Determining
Shape and Sizes of Solute相澤秀樹
摂南大（薬）
小角散乱で溶液中のコロイド粒子やタンパク質などの溶質の構造と大きさの情報を得るための解析手法の一つに、幾何学図形の半径、高さなどのパラメータの値を変化させて、球、楕円体、円柱などの幾何学図形のモデルから算出した値と小角散乱測定結果の一致度合を示す値χｒ2 が１になるまで、ある
いは、任意に設定した回数（以降、試行回数とする。）になるまで、試行を繰り返す方法（以降、試行手法とする。）がある。ユーザーがこの試行手法を具現化するプログラムを使用する際に、経済的および操作上の負担をかけないよ
うにするため、発表者は、MS-Excel. VBA を用いて開発し、小角散乱測定結果を解析してきた。しかし、幾何学図形のモデルが複雑になるにつれて試行
手法を処理する時間が著しく増加していき、研究遂行上問題が生じてきており、試行手法の処理の高速化を図る必要性が生じた。
本研究において、Core-shell sphere、Core-shell oblate ellipsoid、Core-shell
circular cylinder のそれぞれ幾何学図形のモデルについて、MS-Excel. VBA
プログラム、MS-Excel と外部のプログラムを連携させ試行手法の計算をコン
ピュータ上の CPU1 個だけで計算をするプログラム（以降、MS-Excel 連携
CPU 単独処理プログラムとする。）、MS-Excel と外部のプログラムを連携させ試行手法の計算をコンピュータ上にあるすべての CPU で計算するプログラム（以降、MS-Excel 連携 CPU 並列処理プログラムとする。）をそれぞれ Visual
Studio2019 で作成し、処理時間 1 秒あたりの試行回数（以降、処理速度とする。）求めて比較検討した。
その結果、幾何学モデルが、Core-shell sphere、Core-shell oblate ellipsoid、Core-shell circular cylinder へと幾何学図形のモデル自体が複雑になるにつれて処理速度が減少していく傾向にあった。しかし、MS-Excel. VBA プログラム＜MS-Excel 連携 CPU 単独処理プログラム＜MS-Excel 連携 CPU 並列処理プ
ログラムと、処理速度が格段に速くなる傾向になった。これにより、試行手法の処理速度を向上させるには MS-Excel 連携 CPU 並列処理が有効であることが見いだされた。
今後は、さらなる MS-Excel 連携 CPU 並列プログラムの精錬化および GPU
による汎用並列計算処理を導入して、ユーザーに対して経済的で利便性の高いプログラムを作成し、普及させていきたいと考えている。

P2-083M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
PF-BL27B

がん細胞への X 線照射後に放出される細胞外小胞解析
Analysis of extracellular vesicles on X-rays irradiatedcancer cells
大原 麻希 1、宇佐美 徳子 1、小野 健治 2、鈴木 弘美 2、澤田 誠 2
1 KEK-IMSS-PF, 2 名古屋大学環境医学研究所
細胞から分泌される細胞外小胞（extracellular vesicles; EVs）は核酸、タンパ
ク質、糖質、脂質などから構成され、内包されている機能性タンパク質やmiRNAなどにより細胞間の情報伝達を行い、抗原提示、アポトーシス、血管形成、炎症などの様々な生物学的プロセスに関与する。EVsは大きさや産生機構からエクソソーム(exosomes)、微小小胞体(microvesicles; MV)、アポト
ーシス小体(apoptotic bodies)に分類される。EVsはがん細胞における細胞間情報伝達にも活用されており、がん細胞由来EVs中にはがん特異的な核酸やタンパク質が存在し、血管新生や細胞浸潤・転移などのがん悪性化を促進することが報告されている。また、生物の放射線応答においてはバイスタンダ
ー効果の誘導に多数のEVs内包物が関与することが報告されているが、EVsにより運搬される機能分子は多種多様であり、EVsによる細胞間情報伝達ががん悪性化や放射線応答にどのように関係しているのかは明らかにされていない。
本研究では、がんの放射線抵抗性メカニズムとEVsの細胞間情報伝達の関係を明らかにするため、がん細胞から放射線照射後に分泌されるEVsを解析した。使用細胞は放射線抵抗性がんの悪性黒色腫細胞を用い、EVsを超遠心により分画し、粒径と粒子濃度を測定した。X線照射によりEVsの粒径、粒子数ともに増加傾向を示した。今後、放射線照射後のがん細胞から単離した
各EVsに含まれるシグナルペプチドの質量分析など、内包物の解析を行う予定である。放射線照射されたがん細胞のEVsの動態や細胞間情報伝達によるがん悪性化の機構が解明されることにより放射線がん治療への貢献が期待される。

謝辞：本研究は JST, CREST, JPMJCR17H3 の支援を受けて実施しましたP2-084M ＜生物物理, 生物化学（小角散乱等, L以外)＞
PF-BL-10C

連続滴定 X 線溶液散乱測定を利用した分子複合系における多成分平衡状態の解析
Analysis for the multi-component equilibrium incomplex molecular systems by using continuous
titration SAXS
米澤健人１、林有吾２、吉田桂人２、天野真治２、岡部龍二２、
清水伸隆 1、上久保裕生 1,2
１ KEK・物構研、２ NAIST・物質
蛋白質等の生体高分子は生体内において、複数の分子間で相互に連携することで高度な反応制御を行っている。このような分子ネットワーク内の反応制御機構を明らかにするためには、反応に関与する一連の生体高分子を含む混合溶液系に適用可能な分析法が必要となってくる。ITC や SPR 等の分子間相互作用解析は基本的には滴定実験によって行われる。対象が多対多になる場合も、原理的には滴定実験によって解析可能であるが、分子の存在比率が異なる多数の条件で実験する、すなわち、多次元の滴定実験を行う必要がある。本研究では溶液中における分子の構造情報を抽出することが可能な
X 線溶液散乱(SAXS)と滴定実験を組み合わせた測定手法(連続滴定 X 線溶
液散乱測定, Tit-SAXS)を用いて、複合体の形成反応の特徴と溶液構造の両方を明らかにする実験系の構築を目的とした。正確な Tit-SAXS を行うためには反応物の様々な濃度条件における状態変化を観測する必要があるため、高精度な濃度の見積もりと多点測定が要求される。この高精度な連続測定を実現するために、本研究ではμ流路型自動サンプリングシステムの開発を行い、Photon Factory の BL-10C への導入に成功した。ポスターでは本システムについて紹介する。