−報文−

大腸菌を用いたトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素生産技術の開発
野牧佐井口野藤出

惇＊ 1友 理 子＊ 2
寛＊ 3輝彦＊ 4

Production of Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase
in Escherichia coli
Atsushi NOGUCHI
Yuriko MAKINO
Hiroshi SATO
Teruhiko IDE

Avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase, one of the important enzymes in biotechnology, is used
for diagnostics of infectious disease such as COVID-19 and tuberculosis, as well as for research use. The matureform of AMV reverse transcriptase is α β heterodimer, and consists of a β subunit and an α subunit that is a cleavage
product of the β subunit. In this study, we have developed a new and unique production method of AMV reverse

transcriptase α β heterodimer, using the recombinant Escherichia coli transformed by the plasmid containing the βsubunit gene without the α subunit gene.

The AMV reverse transcriptase β subunit gene was optimized for codon-usage of E. coli , and expressed in E.

coli W3110 strain without co-expression of the gene coding chaperon protein. Long-time cultivation over 70 hours
promoted the formation of the α subunit from the β subunit, and the production of the α β heterodimer. The α βheterodimer produced in the recombinant E. coli was highly purified by two-step column chromatography. The
activity of the purified α β heterodimer was similar to that of the native one in a diagnostic test for infectious disease.
Our method can effectively produce the active-form AMV reverse transcriptase, and will contribute to humanhealth by a stable supply of diagnostic reagents.

1． 諸言て DNA を合成する逆転写酵素の一種であり、バイオテクノロジーの分野において重要なツールとなっていト リ 骨 髄 芽 球 症 ウ イ ル ス（Avian Myeloblastosisる。当社では、AMV 逆転写酵素を用いてウイルスやVirus、以下 AMV）逆転写酵素は、RNA を鋳型とし細菌の RNA を迅速・簡便・高感度に検出する TRC 法 1）

＊1
＊2
＊3

ライフサイエンス研究所 バイオプロセスグループ
ライフサイエンス研究所 生物機能工学グループ
バイオサイエンス事業部 第二開発部 遺伝子グループ
兼 ライフサイエンス研究所 装置開発グループ＊ 4 ライフサイエンス研究所を開発し、新型コロナウイルスや結核菌などの感染症検査に貢献している。
TRC 法は、AMV 逆転写酵素と T7 RNA ポリメラーゼ（RNA 合成酵素）によって標的 RNA を増幅する
11

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

TRC（Transcription − Reverse transcription −AMV 逆転写酵素の α 体をコードする遺伝子および βConcerted）反応と、増幅 RNA へ特異的に結合するこ体をコードする遺伝子を同一の宿主大腸菌へ導入し、とにより蛍光を発する INAF（INtercalation Activating

各遺伝子から α 体ポリペプチド・β 体ポリペプチドをFluorescence）プローブを組み合わせた方法であり、それぞれ発現させて α β 体を形成させる。しかしなが標的 RNA の増幅と検出を 1 つの容器内で同時に行う

ら、大腸菌での生産では、発現した AMV 逆転写酵素ことが可能である（Fig. １）。同様の用途で用いられの約 90％が正しい立体構造を形成できずに不溶化しる PCR 法は、反応温度の昇降を繰り返す必要があるてしまう 6）。また、立体構造の形成を補助するシャペのに対し、TRC 法は一定温度（46℃）で反応を進めロンタンパク質との共発現により、活性型 AMV 逆転ることができ、迅速・簡便な検査を可能としている。

写酵素の生産性を向上させることができるが、シャペ

AMV 逆転写酵素には、95 kDa の β サブユニットとロンタンパク質は AMV 逆転写酵素との分離精製が難65 kDa の α サブユニット（β サブユニットの N 末端

しく、精製 AMV 逆転写酵素へのコンタミネーション側の配列と相同）の 2 種類のサブユニットが存在し、が懸念される。

α β ヘテロ二量体（α β 体）や ββ ホモ二量体（ββ 体）などを形成する

2）が、TRC 反応には α β 体が適してい

そこで、我々は新たに、大腸菌を用いたシャペロン
タンパク質不要の AMV 逆転写酵素生産技術を開発し3）たので報告する 7）。驚くべきことに、我々の方法では、AMV 逆転写酵素 α β 体の生産方法として、トリにAMV 逆転写酵素 β 体をコードする遺伝子のみで、遺る 。
AMV を感染させてウイルスを増殖させ、ウイルス粒伝子組換え大腸菌体内で α β 体を効率的に生産するこ子から AMV 逆転写酵素を抽出する方法が知られていとが可能であった。本技術により、AMV 逆転写酵素

る 。AMV のゲノム上には AMV 逆転写酵素 α 体のの大量生産を可能とし、感染症検査試薬の安定供給をみをコードする遺伝子領域は存在せず、β 体をコード通じて、すべての人の健康と福祉に貢献することを目する遺伝子領域が翻訳されて β β 体が生産された後、指している。

4）

部分的な開裂によって α β 体が形成される 。前述の
2）

ウイルスを用いた生産方法では、ウイルス本来の仕組みを用いて AMV 逆転写酵素 α β 体を効率的に取得す2．方法

ることができるが、ウイルスの複製機構は正確性が低［1］発現用プラスミドベクターの構築

く AMV 逆転写酵素遺伝子に突然変異が生じるリスク

AMV 逆転写酵素 β 体のアミノ酸配列情報を元に、があり、工業的に均質な AMV 逆転写酵素を大量に生大腸菌のコドン使用頻度に合わせて最適化した AMV産するには不向きである。

逆転写酵素 β 体をコードするポリヌクレオチド配列

一方、遺伝子を安定的に保持可能な大腸菌を用いて、AMV 逆転写酵素 α β 体を生産する方法も報告されている 5）。この方法では、遺伝子組換え技術を用いて、（AMV 逆転写酵素 β 体遺伝子）を設計した。設計に基づき、DNAWorks 法 8） を用いて、120 種類のプライマーから全長の AMV 逆転写酵素 β 体遺伝子を作製し［1］DNA Synthesis from RNA
by AMV Reverse Transcriptase（AMV－RT）

AMV－RTRNADNADNARNA［2］RNA Synthesis from DNA
by T7 RNA Polymerase［3］RNA Detection by INAF probeRNA

T7 RNA Polymerase

Fig.１

12TRC method

東ソー研究・技術報告第 66 巻（2022）

た。作製した AMV 逆転写酵素 β 体遺伝子を、プラスプライし、塩化ナトリウム濃度 0 M から 1.0 M へのミドベクター pTrc99A の trc プロモーター下流に挿入

リニアグラジエントで溶出した。溶出画分を SDS −し、発現用プラスミドベクター pTrcAMVB を構築しPAGE 法で分析し、AMV 逆転写酵素 α β 体が含まれた。同様に、コドン最適化を行わない天然型 AMV 逆る画分を回収した。回収した精製 AMV 酵素は、適宜転写酵素 β 体遺伝子を挿入した発現用プラスミドベクバッファー交換や濃縮を行い、各種分析へ供した。

ター pTrcAMVBwild も構築した。
構築した発現用プラスミドベクターを用いて大腸菌
JM109 株を形質転換し、LB 培地での AMV 逆転写酵素の生産性を評価した。

［5］TRC 法による AMV 逆転写酵素の活性評価
AMV 逆転写酵素の活性評価は、TRC 法によるノロウイルス RNA 検出試薬を用いて、陽性標準 RNA（invitro で合成・精製した濃度既知のノロウイルス RNA）
［2］宿主大腸菌の検討を測定することで行った。測定は、温調機能付き蛍光発現用プラスミドベクター pTrcAMVB を用いて、分光光度計 TRCRapid® − 160（東ソー製）を用いて蛍種々の大腸菌株を形質転換することで、AMV 逆転写

光強度の変化を 20 ～ 30 分間モニタリングすることで酵素生産大腸菌を作製した。得られた形質転換体を、行い、蛍光測定値が初期蛍光値の 1.2 倍になった時間カルベニシリンナトリウムを含む 2 × YT 培地に植菌を検出時間とした。

し、37℃で振とう培養した。光学密度（OD）が約 0.5になるまで大腸菌を増殖させた後、終濃度 5 mM となるように IPTG を添加し、25℃で 45 時間培養を継続した。その後、遠心分離により菌体を回収し、湿3．結果と考察［1］発現用プラスミドベクターの構築

菌体量の 5 倍の破砕バッファー（20 mM Tris − HCl、

DNAWorks 法を用いて、AMV 逆転写酵素 β 体のア10％ グリセロール、1 mM ジチオトレイトール、0.2％

ミノ酸配列情報を元に、大腸菌でのコドン使用頻度に®

Triton X − 100、pH7.4）に懸濁して超音波破砕を行っ合わせて最適化したポリヌクレオチド配列を合成した。遠心分離により菌体残渣を除去して抽出液を調製た 9）。AMV 逆転写酵素 β 体のアミノ酸配列は、天然し、抽出液中の AMV 逆転写酵素の活性を TRC 法に型バリアントとして GenBank No. AAB31929 や特開よって測定した。

2002 − 315584 号公報の配列番号 7 が知られている。両者では 3 ヶ所のアミノ酸が異なっているが、本研究で［3］AMV 逆転写酵素生産大腸菌の培養発現用プラスミドベクター pTrcAMVB で形質転換した大腸菌 W3110 株を、カルベニシリンナトリウムは後者のアミノ酸配列を用いた。大腸菌のコドン使用頻度に最適化したポリヌクレオチド配列と天然型ポリヌクレオチド配列の相同性は、74％であった 10）。

を含む 2 × YT 培地へ植菌し、37℃で 1 晩前培養した。

合成した AMV 逆転写酵素 β 体遺伝子をプラスミド前培養液 35 mL を、5 L 培養槽（サクラ精機製）に調ベクター pTrc99A に挿入し、発現用プラスミドベク製したカルベニシリンナトリウムを含む生産用培地

ター pTrcAMVB を作製した。DNA シーケンス解析に3.5 L へ植菌し、37℃で培養した。培養開始から 3 時より、pTrcAMVB の塩基配列が設計通りであること間後、培養温度を 25℃に下げ、終濃度 5 mM となるを確認した。

ように IPTG を添加した。なお、培養中は適宜 pH や通気撹拌などの制御を行った。

得られた発現用プラスミドベクターを用いて大腸菌
JM109 株を形質転換し、SDS − PAGE 法で AMV 逆転写酵素の発現量を評価した。天然型コドンの AMV 逆［4］AMV 逆転写酵素αβ体の精製

転写酵素 β 体遺伝子からはほとんど発現が認められな培養槽を用いて調製した菌体を超音波破砕し、遠心かったのに対し、大腸菌型コドンに最適化した AMV分離により菌体残渣を除去して抽出液を調製した。抽逆転写酵素 β 体遺伝子では顕著な AMV 逆転写酵素 β出液にストレプトマイシンを添加し、得られた沈殿を体の発現を確認することができた。

再溶解することで粗精製を行った。粗精製液へ硫酸ナトリウムを添加後、TOYOPEARL® PPG − 600M（東［2］宿主大腸菌の検討ソー製）を充填したカラムを用いて精製し、透析に

発 現 用 プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー pTrcAMVB を 用 い てより脱塩を行った。続いて、回収したサンプルを P11

種々の大腸菌株を形質転換し、AMV 逆転写酵素の生phosphocellulose（Cytiva 製）を充填したカラムへア産性を評価した 11）。大腸菌抽出物を用いて TRC 法で13

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

陽性標準 RNA を測定したところ、大腸菌 W3110 株、ロマトグラフィーでは、3 つの溶出ピークが確認されJM101 株、GM31 株、HB101 株、MV1184 株などを宿た（Fig. ３a）。各ピークに対応するフラクションを主として用いた場合に、比較的短時間で検出を行うこSDS − PAGE で分析したところ、ピーク 1、2、3 はそとができ、良好に AMV 逆転写酵素を発現しているこ

れぞれ α 体、α β 体、β 体に対応していることが分かっとが確認できた（Fig. ２）。一方、タンパク質生産用た（Fig. ３b）。各フラクションの活性を TRC 法で測途で汎用される、タンパク質分解酵素が欠損した大腸

定したところ、ピーク 2 が最も高い活性を示した（Fig.

菌 BL21 株を用いた場合は、抽出物を用いた TRC 法３c）。以上の結果から、本技術では、大腸菌の菌体内で陽性標準 RNA を検出できず、AMV 逆転写酵素の生において AMV 逆転写酵素 β 体が部分的に分解されてα 体となり、活性型の α β 体を形成していることが示産性が低いことが示された。

された。
続いて、得られた AMV 逆転写酵素 α 体および β 体［3］AMV 逆転写酵素生産大腸菌の培養発現用プラスミドベクター pTrcAMVB により形質のアミノ酸配列解析を実施した。N 末端側のアミノ酸転換した大腸菌 W3110 株（AMV 逆転写酵素生産菌）

配列は α 体と β 体で同一であり、遺伝子配列から予測を用いて、5 L 培養槽での AMV 逆転写酵素の培養生されるものと一致することが確認された。一方、α 体産を行った。前培養液を植菌後、37℃で 3 時間培養しの C 末端アミノ酸配列を LC ／ MS ／ MS 法で分析するた後、培養温度を 25℃に下げて IPTG を添加することと、β 体の 572 位のアラニン（開始コドンのメチオニで AMV 逆転写酵素の発現を誘導した。AMV 逆転写ンを 1 位とする、以下同様）と 573 位のチロシンの間酵素生産菌の生育は、培養開始から 24 時間以内に定で切断されてα体が形成されていることが判明した。

常期に達し、その後培養開始から 90 時間以上経過し天然型の AMV 逆転写酵素 α 体は、β 体の 573 位のチても同等の菌体濃度が維持された12）。一方、TRC 法ロシンと 574 位のプロリンとの間で切断されて形成さ後以降に徐々に活性が増加し、70 時間以上培養を継続することで顕著な活性の増加が確認された。一般的（a）

な大腸菌の培養時間（24 時間以内）と比べて長時間の培養を行うことで、AMV 逆転写酵素 β 体から α 体への分解が促進され、活性が向上したものと考察している。

UV intensity［mAu］

による菌体抽出物の分析では、培養開始から 20 時間
100（2）80（3）60（1）40200010203040

Elution time［min］［4］AMV 逆転写酵素αβ体の精製
約 100 時 間 の 培 養 を 行 っ た 菌 体 か ら AMV 逆 転（b） ［kDa］

（1）

（2）

（3）

97写 酵 素 を 抽 出 し、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン 沈 殿 法 に よβ subunit

66

α subunit

る 粗 精 製、TOYOPEARL® PPG − 600M お よ び P1145

phosphocellulose によるカラムクロマトグラフィー精製を行った。P11 phosphocellulose を用いたカラムク

2,000

500
RB791

CC118

DH5SK383

DH5aJM109

TG1JM110

C600

MV1184

MC4110

GM31

HB101

JM101

0

BL211,000

KY1436

Not Detected
Not Detected

1,500

Host E. coli strain

Fig.２

14

Detection time of the TRC reaction using the extracts
from the various host E. coli strains

Relativefluorescence intensity

2,500

W3110

TRC detection time［sec］（c）

3.0（2）

2.5
2.0（3）

1.5
1.00.5（1）051015202530

Incubation time［min］

Fig.３

Purification of AMV reverse transcriptase by P11
phosphocellulose column chromatgraphy(a) Elution profile of AMV reverse transcriptase from P11
phosphocellulose column chromatgraphy(b) SDS-PAGE analysis of each fraction corresponding to the peak 1, 2and 3(c) RNA amplification activity of the fractions analyzed by TRC method

東ソー研究・技術報告れることが知られている 6）。作用するプロテアーゼの相違などによって切断部位が若干変化したものと考察

第 66 巻（2022）

5．参考文献１）T. Ishiguro et al., Anal. Biochem ., 314（1）,77

している。
最後に、本技術に従い大腸菌で生産した AMV 逆転
写酵素 α β 体と、ウイルスから抽出した天然型 AMV 逆（2003）
２）B. Perbal, Retrovirology , 5, 49（2008）

転写酵素 α β 体（Life Sciences Advanced Technologies

３）特許第 4329365 号製）の活性を比較した。TRC 法による陽性標準 RNA

４）G. E. Houts, et al., J. Virol. , 29（2）,517（1979）の測定において、両者でほぼ同等の活性を確認するこ

５）特開 2002 − 315584 号公報とができ、AMV 逆転写酵素 β 体遺伝子のみを導入し

６）D. A. Soltis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 85,

た遺伝子組換え大腸菌を用いて、天然型と同等の活性を持つ AMV 逆転写酵素 α β 体を生産できることが示された（Fig. ４）。

3372（1988）
７）Y. Makino, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem .,85（6）,1464（2021）
８）D. M. Hoover., et al., Nucleic Acids Res ., 30（10）,e43（2002）

4．まとめ

９）特開 2012 − 120506 号公報

以上のとおり、遺伝子組換え大腸菌を用いた新規なAMV 逆転写酵素の生産技術を開発した。我々の方法

10）F. Madeira et al., Nucleic Acids Res ., 50, W279
（2022）

では、AMV 逆転写酵素遺伝子のコドン最適化や宿主

11）特開 2013 − 146235 号公報

大腸菌株の最適化により AMV 逆転写酵素の生産性を12）特許第 6107101 号向上させているため、AMV 逆転写酵素との分離精製が難しいシャペロンタンパク質との共発現は不要である。また、AMV 逆転写酵素 β 体遺伝子のみを導入した遺伝子組換え大腸菌を比較的長期間培養することで、β 体から α 体への分解を促進し、AMV 逆転写酵素 α βTOYOPEARL®、TRCRapid® は東ソー株式会社の商標です。
Triton® はザ・ダウ・ケミカル・カンパニー（Dow）
またはダウの関連会社の商標です。

体の生産性を向上させている。そのため、比較的簡便な培養・精製プロセスにより、高純度な AMV 逆転写酵素 α β 体を効率的に生産することが可能である。
本技術により得られた遺伝子組換え AMV 逆転写酵素は、ウイルス粒子から抽出・精製される天然型AMV 逆転写酵素と同等の活性を有し、TRC 法による感染症検査へ利用できる。AMV 逆転写酵素の効率的な生産を通じて、感染症検査試薬の普及や安定供給へ寄与することが期待される。

Relativefluorescence intensity

3.02.52.01.51.00.505101520

Incubation time［min］

Fig.４

RNA amplification activity of the recombinant and nativeAMV reverse transcriptase analyzed by TRC method

Open circle: recombinant AMV reverse transcriptase α β heterodimer,
closed circle: native AMV reverse transcriptase

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