Year in Review
Year-in-Review
気管⽀喘息：病態
第25回⽇本アレルギー学会春季臨床集会
教育セミナー11(平成25年5⽉12⽇）

東京⼤学医学部
アレルギーリウマチ内科
ギウ内科
⼟肥 眞

気管⽀喘息:病態：近年の知⾒の進歩•

疫学レベルでの知⾒: 肥満・喫煙・性差など•

遺伝⼦レベルでの知⾒GWAS解析、ネットワーク解析、エピジェネティック制御（例：Th2サイトカイン発現）•

分⼦レベルでの知⾒IL-13-periostin, IL-23-Th17 axis, IL-33/IL-25/TSLP/GM-CSF, ヒスタミンH1受容体 l k i の網羅的解析
受容体、leukotrieneの網羅的解析•

細胞レベルでの知⾒M1/2マクロファ ジM1/2マクロファージ
新しいhelper T 細胞の関与（Th9, TFHなど）
Innate lymphoid cells（nuocyte,cells（nuocyte natural Th 細胞,細胞 ILC2）
好塩基球、樹状細胞研究の進歩

•体内時計

•

その他

発表概要
 樹状細胞についての知⾒の進歩
 Innate type lymphoid cells (ILCs)について
 マクロファージの可能性
能性（病態への関与・治療の標的）

発表概要
 樹状細胞についての知⾒の進歩
 Innate type lymphoid cells (ILCs)について
 マクロファージの可能性
能性（病態への関与・治療の標的）

Ralf M. Steinman (1943.1.14~2011.9.30)
Steinman RM and Cohn ZA.
Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organ tissue of mice.
J Exp Med 137:1142-1162, 1973.

樹状細胞(dendritic cells: DC)とは
 骨髄由来で、全身の組織に分布する細胞である
 樹状突起(dendrite)を有する樹状突起(d d i )を有する
 最も強最も強い抗原呈示能を持つ
抗原 示能を持
即ち、naive T cellに抗原を提示する
 単一の細胞ではなく、起原や機能の異なるサブセットよりなる 自然免疫と獲得免疫との橋渡しをする

DCの機能、意義 抗原特異的免疫応答の開始と増幅（抗原提⽰）
 免疫寛容の誘導 Th1/Th2/Th17/Treg細胞の分化に関与
 それ⾃⾝がサイトカインを産⽣して免疫応答を修飾 (効果相/炎症相にも関与)()

Conventional DC : cDC
 CD11chigh, CD11b + or  サブセットによって、表⾯マーカーなどが微妙に異なる。
 抗原を取り込み、maturationを起こしながら抗原を取り込みを起 しながら所属（⼆次）リンパ節へ遊⾛し 抗原を提⽰所属（⼆次）リンパ節へ遊⾛し、抗原を提⽰
 末梢⾎単核球
末梢⾎単核球の0.5-1.0%

PlPlasmacytoid
t id DCs
DC ((pDCs)
DC ) CD133low, CD11clow/med, B220+ (マウス)BDAC2+(ヒト） TypeT pe I interferon (IFN-/など)を産生(IFN /など)を産生
 Tolerance
 Anti-virus
 Anti-tumor
A i Autoimmune
 末梢⾎中単核球の0.5%以下

DCのライフサイクル(migratory DC)
末梢血

皮膚・粘膜組織
CCR6

Pre-DC

Immature
DCImmature
DCPAMP/DAMP
PathogenAllergen
CD86

CD80
MHCⅡ

maturation
MatureM
tDC

immature
骨髄CD40

成熟DCAg
OX40L
CCR7

IL-12

CCL17,22

所属リン 節所属リンパ節（二次リンパ節）
アポトーシスor
生存(IL-12産生停止）

T

抗原特異的免疫応答Tolerance(Dohi M. University of Tokyo)

DC上の様々なレセプタ
DC上の様々なレセプターRecognition of microbial motifs
Toll like receptors 11-11
11Intracellular receptors
NOD1/2
NALPs
TLR7, 9PKB

Recognition of inflammation
Protease activatedreceptors
Complement receptors
Prostanoid receptors
DP1 EP4,DP1,EP4 IP

Neuropeptide receptors
NK1, CGRPR

Recognition of cell death/stress
Self/non-self discrimination

Purinergic receptors

C-type lectin receptors

P2X, P2Y

Dectinmacrophage mannose receptor
DEC205
BDCA-2

Receptors for death(Lambrecht: Curr Mol Med 8: 2008)

NALP3RAGE
heat shock proteins-R

Role of DCs in the effector phase of allergic airway inflammation
Bronchial epithelial cellBronchial
Bhi lmucosa

Antigen
TSLP, GM-CSFFcRI
MastcellImmature
DCImmature
DCMDC

IL-16

CCL17/22

histamine

Ag uptakematuration

matureDC

Naive T

MemoryTh2

Effector
Th2Effector
Th2

IL-4
5
9
1223

IL-16
MDC
TARC

Eosinophil

clonal expansion(Dohi M. University of Tokyo)

Distribution of DCs in the respiratory
py tract 中枢気道では24～36時間で 85%近くが入れ代わるのに対して、肺末梢では半減期が 7～10日と長長い(サブセ トによる違 あり）(サブセットによる違いあり）
 気道上皮内のDCはsemimature
肺末梢のDCは基本的にi
肺末梢のDCは基本的にimmaturet 通常はmaturationを抑制する機構がはたらく
肺胞マクロファ ジ IL-10,
肺胞マクロファージ：
IL 10 NO
NO,PGD
PGD2, PGI2
気道上皮細胞： NO, TGF- 無害な抗原に対しては、anergy/toleranceを誘導して過剰な反応を抑制(Condon, et al. JLB 90;883, 2010)マウスと⼈のDCの種々のマーカー(Condon et al. J Leukoc Biol 90:883, 2011)DC development and homeostasis(mouse)
様々なフェノタイプのDCへ分化
例：CD103+ cDC（上皮内）

安静時

Lung DCへ分化(CD11b+ cDC：粘膜固有層)などの炎症性DCs
macrophage

MP:myeloidypprecursor,,
MDP:macrophage and DC precursor,
CDP:common DC precursor,

Lung(Modified from Liu K. et al, EJI 40;2-85,2010)

DC subsets in the lung and MLN in steady state

Resident DCs

Intra-epithelial
CD11c+
CD11bLangerin+

Immunity/Tolerance
InterstitiumTolerance
Cross presentation

Lamina propria
CD11c+CD11
SIRP-1+Immunity/Tolerance

Al l wall
AlveolarllpDC

CD11c+
CD11bF4/80+

Antigen presentation(modified from Condon, et al. JLB 90;883, 2010)

Lung DC subsets in the inflammation((Modifiedfrom Plantinga et al. EJI 40;2085, 2010))

Immune responses

Immune responses

Immune responses
Cross presentation
to CD8+ T cells
monocyteIFN↑

CD8 CTL priming

気管⽀喘息と管DC ((5))

omalizumabの効果:気道過敏性（Chand HS, et al. JACI 125:1157,2010)

気管⽀喘息と DC (5)omalizumabの効果：DCの数（Chand HS, et al. JACI 125:1157,2010)

気道・肺組織のDCに関する疑問点
 気道と肺実質とで質的にどのように異なるのか
Flt3L-/-マウス:肺の実質ではcDC、pDC共に↓↓
気道では減らない CD11b+cDCとCD11b-CD103+cDCの由来はそれぞれ単⼀か？
CD103+cDCでも、monocyte由来の可能性がある（Jakubzick JEM 205:2008)（Jakubzick, Precursorはどこで分化するのか（肺の前・中？） 半減期は？
従来：肺末梢では7~10⽇
最近の報告： CD103+cDCで30⽇、CD11b+cDCで15⽇

発表概要
 樹状細胞についての知⾒の進歩
 Innate type lymphoid cells (ILCs)について
 マクロファージの可能性
能性（病態への関与・治療の標的）

アレルギ 性炎症に関与するリンパ系細胞の多様性
アレルギー性炎症に関与するリンパ系細胞の多様性• 獲得免疫に関与
獲得免疫
与CD4陽性helper T cells
CD8陽性helper T cells
B cells• ⾃然免疫に関与
NK cells, NKT cells
Innate lymphoid cells (ILCs)

獲得免疫に関与するヘルパーT細胞
 TCRを発現
発現 CD4を発現
 病態を促進する⽅向に作⽤• Th1: IFN, IL-12を産⽣、細胞内細菌、ウイルス、⾃⼰免疫• Th2:
Th2 IL-4,5,13を産⽣、アレルギー病態
IL 4 5 13を産⽣ アレルギ 病態• Th17: IL-17Aを産⽣、⾃⼰免疫、細胞外細菌、真菌、アレルギー• Th9: IL-9を産⽣、寄⽣⾍免疫、アレルギー• Tfh:Tfh CXCR5発現、2次リンパ節の濾胞胚中⼼、抗体先⽣CXCR5発現 2次リンパ節の濾胞胚中⼼ 抗体先⽣

 病態を制御する⽅向に作⽤• Treg：Thの作⽤を抑制・制御
作抑御Eosinophilp

Mast cell
IL-4
IL-9
IL-13
IL-13

Mucus

GM-CSF
Basophil
IL-3
IL-5 GM-CSF
IL-3

IL-5

Nuocyte

Mucus
33
IL-33
IL-25
NKT

Thymus
IL-21
IL-15
IL
15

IL-17A

TH17

IL-17A
IL-17AIL 17F
IL-17F
IL-22

IL-9
IL-4

T H0

TGF-βIL-6

Smooth muscle

IL-4
IL-13

T H2

IL-4
TGF-βT H9IL-9

IL-10
IL10TGF-βIL-10
IL-12 TGF-βIL-18

iTregIFNγ
T H1

TNF-αIFN-γ

Neutrophil

気管支喘息の病態におけるリンパ球の多様性(Holgate ST. Nat Med 18:673, 2012)

⾃然免疫に関与するリンパ球様細胞
⾃然免疫
関与するリン 球様細胞
innate lymphoid cells : ILCs
 CD3/4/8をいずれも発現していない
 種々のlineage
g markers ((F4/80,, CD11c,, FcRI,, Gr1,, B220,,
TCR鎖）が全て陰性
 IL
IL-33受容体(ST2)33受容体(ST2), IL
IL-7受容体(CD127)
7受容体(CD127), IL-2R(CD25)
IL 2R(CD25),
c- kit受容体(CD117), Thy1 (CD90), ICOSを膜表⾯に発現
 分化にはIL-2とIL-7の刺激が必要
分化にはIL 2とIL 7の刺激が必要
ILCsとは、リンパ球以外のいずれの⾎球系統にも属さないがパずが抗原受容体を発現していない、⾃然免疫系に属するリンパ球に類似した形態と機能を有する細胞群である

ILCsの分化と機能
ConventionalNK

E4BP4/NF-IL3

CLPId2ddependent
d tprecursor

IFNγ
Cytotoxicity

RORγtdependent
precursor

RORγt

炎症を促進
ILC17

IL-17
IL
17

ILC22

IL-22

IL-23

LTi

RORα
IL-25, IL-33

CLP: common lymphoid progenitor
Lti: lymphoid tissue inducer
ROR: retinoic acid-related orphan receptor

Type-2ILC(ILC2)

炎症を促進/制御
IL-13
IL-5, IL-9
amphiregulin(Nuocytes, NHC, Ih2)
（Jennifer A, et al. Eur J Immunol 42：1368, 2012)

炎症を制御喘息の病態へのILCsの関与
Virus
AllergengHelminth

Epithelium

ILC22IL 25
IL-25

RORγ
ROR
ILCMΦ

IL 33
IL-33

ILC2IL-33

IL-22
IL22
B
ILC2

IL-6

EΦ

IL-13
IL-9

IL-5

IL-13

Amphiregulin• AHR• Mucus secretion• SM hypertrophy • Airway remodeling(Scanlon S, et al. Cur Opin Immunol 24:1,2012)aaMΦ

Tissuep
RepairFibrosis

PAMPs細菌
ウイルス
真菌

アレルギー性気道炎症の免疫学的機序（現在の知見）

アレルゲン
PAMPs

PRRs

PAMPs
酸化ストレス（タバコなど）
大気汚染物質気象条件の変化（気圧、温度、湿度）など
上皮障害

（侵入）
気道上皮細胞肺胞マクロ Ⅱ型肺胞
ファージ 上皮細胞

活性化

DAMPs/Alarmin
iDC

CCL19 CCL20 CCL27（未熟樹状細胞）

CCR7 CCR6
CCR10

CD40
骨髄IL-22
ILC22LTi

抗原呈示

CD80
CD86

T

縦隔（肺内）リンパ節

Th2

抗原特異的
免疫応答

OX40L
or
免疫寛容

獲得免疫

IL-25
IL-33
TSLP
GM-CSF

抗原の取り込み

成熟化

粘膜への遊走

MΦ

活性化

ILC17
IL-17

Th1

Th17(制御)

9Th9Tfh

MCEoNeu

B

IL-17IgE

Baso CD8NKT

自然免疫

Iα-2依存性前駆細胞

γδ

さまざまな免疫担当細胞・メディエーター

NK

IL-2/7
IFNα
ILC2

IL-4/5/9/13

Treg

IL-33

IL-5/9/13

Amphiregulin
上皮修復

気道アレルギー性炎症
気管支粘膜損傷
粘膜分泌
好酸球/好中球・浸潤平筋滑収縮/増殖
線維芽細胞増殖
気道過敏性(土肥眞 2013)

発表概要
 樹状細胞についての知⾒の進歩
 Innate type lymphoid cells (ILCs)について
 マクロファージの可能性
能性（病態への関与・治療の標的）

M1/M2マクロファージ

M-CSF

Differentiation

monocytes

Priming

IMφAMφφ

Allergic milieu severe asthmatic lungsIL-4/IL-13

Activation YM1



IL-33

M2

LPS/IFNγ

M1

IL-6
IL
6
IL-1β
TNF-α

YM2
FIZZ1
Antigen
Persistence
bacteria
virus
fungusContact with
apoptotic cells
Resolution program

Fibrosis
Inflammation
Phagocytosis of
apoptotic cells
Clearance ofi di pathogens
invadingthResolution

Inflammation
Apoptosis
Lung injury
Control of invading
pathogens

Remodeling

Apoptosis

TGFβIL-10


Activation of regulatory T cells
Inhibition of inflammatory response
Inhibition of fibrosis (?)(Moreira AP, et al. J Inter and Cyto Res
38:485, 2011)

疑問マクロファージの機能を制御することでアレルギー性気道炎症を修飾できるか？
ギマウスアレルギー性気道炎症モデルにおけるアレンドロン酸の効果を検証背景１
近年、スタチンの免疫修飾作用について様々な報告がなされている
McKay
M
K A et al.l : J Immunol
Il 2004
2004; 172
172: 2903‐8.
2903 8Yeh Y et al.: J Biomed Sci 2004; 11: 599‐606.
Kim D et al. : Eur J Pharmacol 2007; 557:76‐86.
Imamura M et al.: Thorax 2009; 64:44‐9.

スタチンは、メバロン酸/コレステロール合成阻害作用を有し、低分子量G蛋白の機能修飾などにより免疫修飾作用を発揮する
一方で、骨粗鬆症の治療薬である、窒素含有ビスフォスフォネート(N BP)も 同じ代謝経路を阻害する(N‐BP)も、同じ代謝経路を阻害する↓
N‐BP も、免疫修飾作用を有する可能性があるのでは？

背景 一般的に、Bisphoshpnate(BP)は細胞膜の透過性に乏しく、破骨細胞をはじめとした食作用をもつ単球系細胞に選択的に取り込まれて効果を発揮する
 他の食細胞系であるマクロファージにも効果を発揮する可他 食細胞系 あジ も効 を 揮す
能性がある。一例としてBPがマクロファージにアポトーシスを誘導するとの報告がある
 これまでBP製剤の骨以外
これまでBP製剤の骨以外への分布に関する報告は極めての分布に関する報告は極めて少ないが、窒素含有BPの一つであるalendronateは、経口投
与後72時間 気道に血清の4～20倍の濃度で留まるとの与後72時間、気道に血清の4～20倍の濃度で留まるとの報告がある(Hisaka A, et al. Drug Metabolism and Pharmacokinetics 13:252, 1998)

仮説：
Alendronateは、気道・肺局所のマクロファージの機能に影響を与えることで、アレルギー性気道炎症を修飾する

仮説の検証：
マウスアレルギー性気道炎症モデルを用い、alendronateの及ぼす効果を検証する

<方法>Balb/c, 雄,
Balb/c雄 7週令,7週令 各群n=4
各群n=4~66
day 011saline i.p.

18192022

Control CMC i.g. + PBS 吸入; NC(n=4)

OVA/alum i.p.
吸入60分前 Control CMC i.g.+3% OVA吸入;PC(n=6)
Alendronate 8mg/kg i.g. +3%OVA吸入; A8(n=6)
Alendronate 25mg/kg i.g. +3%OVA吸入;A25(n=6)
BALF(細胞分画), 採血(血清IgE濃度),肺組織(HE染色),
肺homogenate(サイトカイン計測),
Thorathic L/N OVA再刺激(1μg/ml)→(48h後)上清中サイトカイン計測

＜BALF中細胞分画＞<血清総IgE値>

Alendronate投与は、
1 BALF中の好酸球数を抑制した
1.
BALF中の好酸球数を抑制した。
2. OVA３日間吸入による、短期間で誘導される血清総IgE値に影響を及ぼさなかった。
れる血清総IgE値に影響を及ぼさなかった

PC

<肺組織>

Alendronate(A25)

H&E

PAS

100m


＜肺ホモジネート中サイトカイン濃度＞

IL-4

IL-5

IL-13

IFN-

IL-17

Alendronate投与は、肺ホモジネート中の1 Th2,1.
Th2 Th17サイトカイン濃度を抑制した。
Th17サイトカイン濃度を抑制した
2. Th1サイトカイン濃度には、影響を及ぼさなかった。

＜リンパ節OVA再刺激後上清中サイトカイン濃度＞

IL-4

IL-5

IL-13IFN-

IL-17

Alendronate投与は、リンパ節OVA再刺激後の1. Th2, Th17サイトカイン産生を抑制した。
2. Th1サイトカイン濃度には、影響を及ぼさなかった。

＜肺でのEotaxin‐1/2 発現：qPCR, 蛋白濃度＞

Alendronate投与は、肺でのAlendronate投与は肺での1. Eotaxin‐2のmRNA及び蛋白量を抑制した。
2 Eotaxin‐1のmRNA及び蛋白量には、影響を及ぼさな
2.
Eotaxin 1のmRNA及び蛋白量には 影響を及ぼさなかった。

<免疫染⾊によるEotaxin-2産⽣細胞の同定>
NC

PC

Alendronate

100m

100m

気道周囲・間質に浸潤した炎症細胞からのEotaxin‐2産生が示唆された(DAB‐Ni染色。黒がEotaxin‐2陽性細胞)

Eotaxin-2の主要な産⽣細胞は気道周囲・間質のマクロファージである<免疫蛍光染⾊>免疫蛍光染＜FCMでのEotaxin‐2産生マクロファージの解析＞

Eotaxin-2産生細胞はi-macrophages?

＜FCMでのEotaxin‐1/2産生マクロファージの集計＞

Alendronate投与は、1. Eotaxin‐2産生マクロファージの数を抑制した
2.肺胞マクロファージ(BALF)よりも、肺組織内マクロファージにおけるEotasin‐2産生を抑制した
3. Eotaxin‐1産生マクロファージへの影響はみられなかった

<肺CD11c+細胞の抗原提示能>

Alendronateは、肺CD11c+抗原提示細胞(主として樹状細胞 一部マクロファージ)の(主として樹状細胞、部マクロファ ジ)の抗原提示能に有意な影響を与えなかった<脾細胞を用いた、ex vivo でのアレンドロン酸の効果の検討>
Balb/c, 雄, 7週令day 0OVA/alum i.p.

14抑制傾向は確認できず

Control CMC or
Alendronate i.g.
Sacrifice→Spleen single cell,
OVA再刺激72h

96h

72h後; 細胞増殖(BrdU)
96h後;cytokines(ELISA)

いずれも抑制傾向なし

<脾細胞を用いた、in vitro でのアレンドロン酸の効果の検討>
Balb/c, 雄, 7週令
day 0
OVA/alum i.p.
SacrificeSpleenpsingleg cell
OVA再刺激Alendromate 0‐10M14抑制傾向は確認できず

96h

120h

96h後; 細胞増殖(BrdU)
120h後;cytokines(ELISA); y()

いずれも抑制傾向なし

<結果のまとめ>アレルギー性気道炎症モデルにおいて、Alendronateの投与により1. 好酸球性気道炎症が抑制された
酸球性気道炎症が抑制され
2. 肺や胸腔リンパ節でのTh2, Th17サイトカイン産生が抑制された
3. 肺でのEotaxin‐2産生抑制が確認された （主要産生細胞はマクロファージ、特に間質マク ファ ジと考えられた）
特に間質マクロファージと考えられた）
4. 肺CD11c+抗原提示細胞（主として樹状細胞）の、抗原提示能に有意な影響を与えなかった
5. Ex vivoおよび、In vitroの脾細胞を用いた系では、Alendronateの免疫修飾作用は確認されなかった（Sasaki OO, et al
al. J Immunology： under revision)

本検討の意義 アレルギー性気道炎症に対する効果が⼈でも実証できれば、⾻粗鬆症の予防・治療薬であるALNは⾼齢喘息に対して治療 効率化や医療経済上 節約効果をもたらす とが期治療の効率化や医療経済上の節約効果をもたらすことが期待できる マクロファージとその機能を制御することが、アレルギー性気道炎症の治療標的の⼀つとなりうる可能性が⽰唆される

結語：病態研究の進歩
 研究の進歩により、アレルギー性気道炎症に関与する新たな細胞とその意義が次々と明らかにされている
 このことは、アレルギー性気道炎症の病態の複雑さを⽰すと同時に 新たな視点から治療戦略を開発できる⽰すと同時に、新たな視点から治療戦略を開発できる可能性を⽰しているご清聴ありがとうございました