J Life Sci Res 2012; 10:1-4Ⓒ 2012 Osaka Prefecture University

原Journal of Life Science Research
Online ISSN 2186-5809

著

糖尿病モデルラットの膵臓β細胞のアポトーシスにともなうガングリオシド GM3 の発現について
山野眞利子†１，城尾恵里奈２
１

大阪府立大学 総合リハビリテーション学部 栄養療法学専攻
583-8555 大阪府羽曳野市はびきの3-7-30
２京都大学 大学院人間・環境学研究科 共生人間学専攻
606-8501 京都府京都市左京区二本松町
受付：2012年10月2日, 受理：2012年11月30日

Expression of ganglioside GM3 during apoptosis of pancreatic β cells in diabetic rat model
Mariko YAMANO†１ and Erina JOO２
１

Department of Clinical Nutrition, School of Comprehensive Rehabilitation, Osaka Prefecture University, 3-7-30 Habikino, Habikino
City, Osaka 583-8555, Japan; ２Laboratory of Sports and Exercise Medicine, Graduate School of Human and Environmental Studies,
Kyoto University, Kyoto, 606-8501, Japan
Received 2 October 2012; accepted 30 November 2012

Found on cell membranes, ganglioside GM3 has a simple chain structure composed of glucose, galactose,and sialic acid. We used an animal model of diabetes mellitus (Kob rat) to examine whether GM3 appears
on β cells in the islet of Langerhans, and whether GM3 is associated with insulin secretion. On pancreatic βcells, hyperglycemic Kob rats showed substantially reduced insulin immunoreactive (IR) secretory sites, but
increased GM3-IR expression. Furthermore, GM3-IR β cells showed apoptotic morphology, namely,nuclear fragmentation and activation of apoptosis marker caspase-3. These findings suggest that gangliosideGM3 mediates apoptosis of pancreatic β cells.
Key words : diabetic rat (糖尿病モデルラット); insulinβcells (インスリン膵臓β細胞); GM3, apoptosis (アポトーシス)

１

はじめに泌が低下してくる．このインスリン抵抗性の一因として肥

近年食生活の洋風化の影響で糖尿病は年々増加し，わが満や内臓脂肪の過剰蓄積に伴い，脂肪細胞より炎症性サイ

国ではその予備軍も含め2000万人に達するといわれていトカイン TNFαが過剰分泌されるなどがインスリン抵抗る．また放置すれば，心臓疾患，脳卒中，神経疾患等を併性を起こすと考えられている1．

発することも多いことより，国家的対策が必要である．特糖脂質に分類されるスフィンゴ糖脂質は，スフィンゴシンに２型糖尿病は，多食や運動不足など，日常のカロリー過（長鎖塩基）と脂肪酸からなるセラミドに糖鎖を結合した剰の生活習慣により起因する「生活習慣病」といわれ誰にもので，高等動物に多くみられる．この一員であるガングリ

1でも起こりうる病気である ．２型糖尿病はインスリン抵抗

オシドは，糖鎖部分にシアル酸を含むものの総称であり，性（細胞のインスリンに対する反応性が低下）がおこり，膵

ほとんどは細胞膜上に存在する物質であるが，二重膜の外臓のインスリン分泌細胞（β細胞）の分泌が異常となり，進側にのみ存在するため，膜が波打つ構造になり，細胞どう2行するとβ細胞のアポトーシス とβ細胞のインスリン分しの接着部や神経系のシナプス部に多いとされる3．GM3は糖鎖部分にグルコース，ガラクトースとシアル酸を一分†

連絡著者

E-mail: myamano@rehab.osakafu-u.ac.jp

子含む単純な構造で（Fig. 1），ラット，マウス，ヒトの種を

2

厚さ 12μm の凍結切片を作成し，ゼラチンスライドに貼り付け，ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色と，その隣の切片においてインスリン及び GM3，または GM3 及びアポトーシス時に出現する活性化 Caspase-3 の二重免疫染色を行った．使用した抗体は，インスリンは第一抗体（Serotec社，mouse IgG），第二抗体（Molecular Probes 社，mouseIgG- Alexafluoro 594）を，GM3 は第一抗体（日本バイオテスト社，mouse IgM），第二抗体（biotin 化 抗 mouse IgM），第三抗体（streptavidin FITC）を用いた．活性化 Caspase-3は第一抗体（Cell Signaling 社，rabbit IgG），第二抗体（rabbit
IgG -Alexafluoro 594）で染色した．二重免疫した標本はオリンパス蛍光顕微鏡で同一視野を G 励起（Alexafluoro 594 赤蛍光），と F 励起（FITC 緑蛍光）波長で交互に観察し，オFig. 1

ガングリオシド GM3 の構造模式図

リンパスの顕微鏡計測ソフト（Cell Sense）で画像を取り込み二重標識画像にして検討した．

超えて脂肪組織に多く存在するガングリオシドである3．
最近の報告で，肥満動物及び糖尿病モデル動物の脂肪細4３ 結果

胞に GM3 の発現が著しく増加すること ，また，GM3 合成最終日のコントロールラットの体重は平均 421 g，血糖は遺伝子を欠損させたマウスではインスリン感受性が増加

平均 145 mg/dl，一方高い尿糖を示した Kob ラットの体重4していると報告されている ．それらの研究から，GM3 が細は平均 330 g，血糖は平均 435 mg/dl であり，Kob ラットは胞膜におけるインスリンシグナル伝達を抑制しているの高血糖を示し，糖尿病を発症していると考えられた．

5ではないかという仮説もある ．
そこで本研究は，糖尿病モデル動物 Komeda diabetes6

また Kob ラットの膵臓表面からの観察では，出血や炎症等による色調や形の変化は殆ど認められなかった．

prone (Kob) ラット を用い，GM3 が膵臓β細胞において発膵臓組織をインスリンと GM3 の二重免疫反応後，蛍光顕7現するか，さらにアポトーシス との関連やインスリン分泌低微鏡観察した結果，Fig. 2 に示すようにコントロールラッ下に関与している可能性があるかを形態学的に検討した．

トの膵臓ではインスリン免疫陽性細胞群が多数認められた．しかしそのβ細胞には GM3 の免疫反応は殆ど認めら２方法れなかった．また腺細胞にも GM3 は認められず，H&E 染

糖尿病モデル動物として，慢性膵炎により徐々にランゲルハンス島β細胞の破壊が起こり，糖尿病を発症するとさ6

色でも変性像は認められなかった．
一方 Kob ラットの膵臓では，Fig. 3 で示すようにインスれる Kob ラット の雄５匹を用いた．Kob ラットは飼育中リン蛍光を示す細胞は少なく，散在し，β細胞の大幅な数ウロペーパー（エームス社）を用いて適宜尿糖を測定し，糖の減少が確認できた．また２重免疫染色と H&E 染色によ尿病の発症を待った．尿糖が 3+（500 mg/dl）となり，尾動る形態学的検査により Kob ラットの膵臓では，次の３種類脈からの血糖が HI（500 mg/dl 以上）となった59週齢時にのタイプが混在して認められた．１つはインスリンが陽性５匹を犠牲死させ検体を採取した．コントロールとして同（β細胞）であるが，GM3 の蛍光が認められなく，H&E 染等週齢（55〜60 週齢）SD 系ラット（雄）５匹を用いた．飼色では，アポトーシス様構造は見られないもの（Fig. 3 ①），育条件は，12時間オン・オフの日照サイクル，室温 22℃，自２つめはインスリン蛍光がみられたβ細胞に GM3 の顕著

由飲水・飲食で飼育し，実験はすべて大阪府立大学動物実な蛍光が見られ，さらに H&E 染色において，アポトーシス

験指針に従い行った．

特有像―細胞質は酸性傾向で赤くなり，核は多数に分断さ最終日にネンブタール（150 mg/kg）で深麻酔し，心臓かれ，濃染している様子（アポトーシス小体）―が観察されたら血液を採取し，二プロフリースタイル（ニプロ社）を用もの（Fig. 3 ②），３つめは 反対にインスリン蛍光は見られい電極法にて血糖値を測定した．ラットは続いてザンボニず，しかし GM3 免疫蛍光が強く，H&E 染色でアポトーシ固定液で還流固定し，取り出した膵臓を 30％ スクロース

ス特有の細胞質の赤変，核が分断されたアポトーシス小体（0.1 mol/l リン酸緩衝液含む）で浸漬後，クリオスタットでが多数見られたもの（Fig. 3 ③）に分けられ，アポトーシス

3

コントロールラットの膵臓β細胞（islet）の顕微鏡写真；β細胞には強い Insulin 陽性蛍光（左，赤蛍光）が見られたが，同一細胞上に GM3 陽性構造（中，黄緑蛍光）はほとんど出現しなかった．右は隣接する部のH&E 染色；ホルモン分泌細胞は丸く，核は中心にあり，丸く大きいのが特徴である．Scale bar= 50μm．

Fig. 2①②③Fig. 3

Kob ラットの膵臓の顕微鏡写真：左列；インスリン免疫陽性，赤蛍光，中列；GM3 免疫陽性，黄緑蛍光，右列；H&E 染色．Kob ラットの膵臓では，インスリン免疫陽性を示すβ細胞の数は大幅に減少し，二重免疫染色したGM3 陽性構造の出現様式，H&E 染色での形態の変化より①，②，③の３種の異なった標識形態が認められた．acini；腺細胞．Scale bar= 50μm．

Fig. 4

Kob ラット膵臓β細胞の蛍光顕微鏡写真：GM3 免疫陽性細胞（左）は同時に活性化 Caspase-3 陽性（中）の出現が認められ，これらの細胞がアポトーシスを起こしていることが示された．Scale bar= 50μm．

4様構造を示す細胞には必ず GM3 が出現した．

β細胞に過剰に働き，β細胞の中で GM3 が発現し，GM3 がアポトーシス細胞には細胞内に Caspase-3 が活性化する
7

多量に膜に移行し，膜の異常が起こり，最終的にアポトーことが知られている ．そこで次に膵臓β細胞に出現したシスにむかう可能性が考えられ，今後の研究が待たれる．

GM3 免疫陽性細胞が，アポトーシスを起こしているかどう

脂質は栄養面だけでなく細胞への伝達シグナル（良い方か，活性化 Caspase-3 抗体を用い二重染色した結果，Fig. 4向または悪い方向）としても重要に働き，インスリン抵抗に示すように GM3 陽性の細胞質に活性化 Caspase-3 免疫性（インスリンの働きの低下）の一因として働くことも知

陽性構造が多数認められ，これらのβ細胞がアポトーシスられている11．今後，糖尿病モデル動物を用いて何らかの方を起こしていることが証明された．

法でガングリオシド GM3 の発現を抑えることにより，β細胞のアポトーシスの抑制や，インスリン抵抗性の軽減等

４考察の成果に発展させたいと考えている．

高血糖を示す Kob ラットの膵臓ランゲルハンス島β細胞では，インシスリンの分泌細胞数が大幅に減少していた．

文献

さらに，Kob ラットのβ細胞では①インスリン陽性・GM3１赤坂憲（2007）インスリン抵抗性, メタボリックシン

陰性・アポトーシス陰性，②インスリン陽性・GM3 陽性・

ドロームと生活習慣病 （島本和明編），診断と治療社，アポトーシス陽性，③インスリン陰性・GM3 陽性・アポト

東京，pp. 45-65．

ーシス陽性という異なった形態と免疫反応を示す３群が２認められ，アポトーシスと GM3 の相関が強く示唆された．
培養胸腺細胞において GM3 を処置するとアポトーシスを

life death? Science, 307: 380-383.
３8促進したという報告より ，GM3 の発現が，β細胞に何らかの機序でアポトーシスを促進し，β細胞の細胞死を起こ

Rhodes CJ (2005) Type 2 diabetes - a matter of β-cell安藤進（1997） 脳機能とガングリオシド−新たに登場したニューロンの活性物質 ，共立出版，東京，pp. 1-83.

４Tagami S, Inokuchi J, Kabayama K, et al. (2002)

し，結果インスリン分泌が低下し，糖尿病を発症している

Ganglioside GM3 participates in the pathological

ことが示唆される．細胞死の一つであるアポトーシスは，

conditions of insulin resistance. J Biol Chem, 277: 3085-

壊死と異なり細胞の内容物は殆ど漏出せず，炎症反応が見3092.

られないのが特徴である．さらにアポトーシスを起こした

５

Enhanced insulin sensitivity in mice lacking ganglio-

細胞は数時間のうちにマクロファージによって処理され7るとされる ．今回 Kob ラットの膵臓では組織像から出血や白血球等の炎症細胞が顕著でなく，β細胞の数が大幅にYamashita T, Hashiramoto A, Haluzik M, et al. (2003)

side GM3. Proc Nat Acad Sci USA, 100: 3445-3449.
６Tsuchitani M, Saegusa T, Narama I, et al. (1985) A new

減少していたことは，かなり多くのβ細胞でアポトーシス

diabetic strain of rat (WBN/Kob) Labo Animals, 19:による細胞死が起こり，消滅していることが示唆される．

200-207.

GM3 の発現を誘発するものは 炎症性サイトカインの７4

田沼靖一（1998）アポトーシスの細胞生物学，アポト

Fas リガンドや TNF などが考えられる ．Fas や TNF はーシスの分子機構

death factor とも呼ばれ，細胞死を起こすことで知られてい（田沼靖一監修）秀潤社，東京，pp. 14-27.

9る ．肥満により肥大化した脂肪細胞からアディポネクチン８の分泌低下や TNFαの過剰分泌がおこり，インスリン抵抗Zhou J, Shao H, Cox NR, et al. (1998) Gangliosides
enhance apoptosis of thymocytes. Cell Immunol, 183:5性になることも知られている ．事実 TNFαで刺激した脂肪細胞や典型的な肥満糖尿病モデル動物の脂肪細胞では，ガアポトーシス実験プロトコール

90-98.
９ングリオシド GM3 およびその合成酵素遺伝子の発現が著

長田重一（1996）Fas を介したアポトーシスの分子機構
生命体システムにおけるアポトーシス （勝木元也，長10田重一編）講談社サイエンティフィク，東京，pp. 108-126．

しく増加している ．
ヒトでは２型糖尿病の発症と同時に膵臓ランゲルハンス

10Kabayama K, Sato T, Inokuchi J, et al. (2007)

島β細胞集団で，最初はやや大きくなり活発化するが，そのDissociation of the insulin receptor and caveolin-1

後年を経るごとに細胞集団は徐々に小さくなり，同時にアcomplex by ganglioside GM3 in the state of insulin

2resistance. Proc Nat Acad Sci USA, 104: 13678-13683.

ポトーシス細胞が増加していくことが報告されている ．本
研究結果から，ヒトでも肥満等により脂肪細胞が肥大・増加し，これらの脂肪細胞から TNFαが過剰に分泌され，膵臓

11

野澤義則（2001）膜脂質と情報伝達， 糖と脂質の生物学 （川嵜敏裕，井上圭三編）pp. 174-185.