P1-064L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞

使用ステーション／BL-5A, NE3A

容易な結晶構造決定を目指した改変 TOP7 蛋白質の構築
Construction of TOP7 variants aiming for easy
structure determination
伊東由貴、志賀翔太、真壁幸樹
山形大学工学部バイオ科学工学科
Top７は 2003 年に David Baker らがゼロから人工的に設計した蛋白質である。
天然のアミノ酸配列と全く相同性がないため、蛋白質の純粋な分子特性を理解するためのモデル蛋白質として魅力的である。しかし，我々のグループにおいて Top７の結晶化，X 線回析実験を試行したところ、分解能が低く構造解析に至らなかった。モデル蛋白質として様々な研究に応用するためには、容易に結晶化して分子構造を決定できる必要がある。
そこで本研究では、容易に結晶化させるための蛋白質改変技術として、広く用いられている“表面残基エントロピー減少法”を TOP7 に対して行なった。これはリシンやグルタミン酸などのコンフォメーションの自由度が高い残基をより小さなセリンやアラニンに置換することで結晶化を促す方法である。
Top7 表面残基変異体として、Top7SuMu1 (K44A，Q45A，K48A)とTop7SuMu2 (K44A, Q45A，K48A，K59S，K60S)を作製した。この 2 つの変異体の結晶化に成功し，PF にて X 線結晶回折測定を行なった。得られた分解能は
SuMu1 で 1.7 Å，SuMu2 で 1.6 Å であり、TOP7 の報告されている分解能 2.5Å
より改善した。得られた結晶構造から、分解能改善の分子基盤を議論する。

P1-065L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL5A

過酸化水素分解酵素 Rubperoxin の結晶構造解析
Crystal structure analysis of peroxidase Rubperoxin
伊藤拓未１、庄村康人 1１ 茨城大学 大学院理工学研究科【目的】 Rubperoxin(Rpr)は 181 アミノ酸残基からなる分子量約 20,000 の過酸
化水素分解酵素で、偏性嫌気性細菌 Clostridium acetobutylicum を低酸素濃度下で生育させた時に発現が誘導されるタンパク質として同定された。そのア
ミノ酸配列は、同じく過酸化水素分解酵素として知られる Rubrerythrin(Rbr)と高い相同性を示すが、Rbr は N 末端側に ferritin 様ドメインを、C 末端側に
rubredoxin(Rd)ドメインを持つのに対し、Rpr はこれらのドメインの順序が逆になっている点が異なる。本研究では、このドメインの配向の違いが与える立体構造への影響について検証した。
【方法・結果】 Rpr の産生には大腸菌の発現系を用い、N 末端側に挿入した
Strep タグを利用したアフィニティーカラムおよびゲルろ過カラムによる精製を行い、最終精製標品とした。結晶化条件の探索の結果、沈殿剤に亜鉛を含む
条件でのみ結晶が得られ、その X 線回折データを Photon Factory の BL-5Aで収集した。
構造解析の結果、Rbr は 2 量体を生理的会合状態とするのに対し、Rpr は結晶中で trimer of dimer の 6 量体を形成しており、2 量体同士の界面には亜鉛イオンが配位していた。また、3 量体化により生じた立体障害の影響で Rbr と同じような配向で Rd ドメインが存在することができなくなっており、Rd ドメインに由来する電子密度は見られなかった。
そこで、亜鉛が会合状態に与える影響を検討するために、その配位に関与
する 2 つのヒスチジンをセリンに置換した 2 点変異体(Rpr(H155S/H159S)を調製し、その結晶化を行った。2 点変異体の結晶は亜鉛を含まない沈殿剤を用いた条件で析出し、その構造解析の結果、2 点変異体は野生体同様に結晶中
で 6 量体をとっていた。また、2 量体間の界面には金属の結合は見られなかったことから、6 量体形成には亜鉛イオンが関与しないことが示唆された。さらに、Rd ドメインの電子密度は野生体同様に観測されなかった。
【考察】 2 点変異体の過酸化水素分解反応の比活性は野生体と同様であり、
X 線小角散乱の散乱曲線も両者にほとんど違いがないことから、変異導入による立体構造への影響は非常に小さいと考えられる。Rd ドメインの電子密度が確認されなかった理由は不明であるが、X 線小角散乱の解析結果を考慮す
ると、溶液中でも Rd ドメインは特定の位置に配向していない可能性が高い。
【参考文献】[1] Kawasaki. S et al. AEM. 2009. 75. pp. 1021-1029

P1-066L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF BL-1A

S-SAD 法を利用した海洋生物由来タンパク質の構造解析
Structure analysis of protein extracted from marineorganism by S-SAD method
影山大夢 1，小野寺かこ 2，松井崇 3，小川智久 1,2，田中良和 1,2
1
東北大・農，2 東北大院・生命科学，3 北里大・理
天然のタンパク質には有用な機能を有する分子が存在する．しかし，それらのタンパク質は微量しか存在しないことが多く，X 線結晶構造解析法により構造決定するのが難しい場合がある．本研究では，海洋生物から単離された生
理活性を有する新規タンパク質（THK1）の構造解析に取り組んだ．海洋生物から単離・精製した THK1（海洋 THK1）の結晶および Native データはすでに得られており，構造類似タンパク質の立体構造をサーチモデルに用いた分子置換法での構造解析に取り組んでいたが，その構造は決定できていなかった．
そこで本研究では，大腸菌発現系をもちいて THK1 を大量調製し（rTHK1），その結晶構造を S-SAD 法によって決定し，さらに，rTHK1 の構造を用いた分子置換法により海洋 THK1 の構造を決定した．
rTHK1 の結晶は，長波長の X 線を用いてデータ収集する際に問題となる溶媒による吸収の影響を抑えるために，NW12 のレーザー加工装置を用いて整形した（図 1）．その後，BL-1A にて 2.7 Å の波長の X 線を用いて，分解能 3.0 Åの X 線回折データを収集した．プログラム SHELX により非対称単位中の 6 つの硫黄原子のうち 4 つの位置が決定され，これをもとにプログラム phenix により 245 残基のモデルが構築された．さらに，構造精密化用に 1.1 Å の波長を用いて収集した分解能 1.4 Å の X 線回折データを用いて構造精密化を行った．
最後に，得られた rTHK1 の構造を用いて海洋 THK1 の構造を決定した．
構造類似タンパク質の立体構造をサーチモデルとした分子置換法により海洋 THK1 の構造が決定できなかった理由を考察するために，最終的に得られた海洋 THK1 と，構造類似タンパク質の構造を比較すると，これらは非常に類似していた．しかし，一部のβシートの向きに微細な違いがみられたため，構造類似タンパク質のこの部分を切除したモデルを用いて分子置換法を行った
ところ，容易に海洋 THK1 の構造を決定することができた．これらの結果から，
βシートの向きの微細な違いにより，分子置換法
による計算の過程で隣接する分子同士の立体障害が発生したため，解が得られなかったと考えられる．
図 1 レーザーによる結晶の加工

P1-067L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL17A

9-1-1 と 5’末端のフラップ DNA を切断する FEN1 との複合体の結晶化
Crystallization of 9-1-1 in complex with FEN1
removing 5’ overhanging DNA flaps
永田季穂、原幸大、菱木麻美、橋本博
静岡県立大学薬学部【目的】 9-1-1 は RAD9、RAD1、HUS1 で構成されるドーナツ状の DNA クラン
プであり、DNA 二本鎖切断などにより生じた損傷部位に結合する DNA 損傷センサーである。9-1-1 は DNA 損傷チェックポイントを活性化することで細胞周期 を 停 止 さ せ 、 DNA 損 傷 を 修 復 す る た め の 時 間 を 稼 ぐ 。 FEN1 (Flapstructure-specific endonuclease 1) は 9-1-1 と相互作用するエンドヌクレアー
ゼの一つであり、9-1-1 と相互作用し、DNA 損傷により生じた 5’末端のフラッ
プ DNA を切断すると考えられているが、詳細なメカニズムは不明である。
9-1-1 は修復やチェックポイントに関わる様々なタンパク質と相互作用することが知られている。しかし、これまでに解明された複合体構造は、チェックポイ
ントの活性化に関わる RHINO ペプチドとの複合体のみであり（Hara et al., JBC,2019）、9-1-1 のタンパク質間相互作用に関する知見は限定的である。本研究では、9-1-1 と FEN1 の複合体の立体構造とタンパク質間相互作用を明らかにすることを目的とし、9-1-1 と FEN1 ペプチドとの複合体の調製と結晶化、X 線回折実験を行った。
【方法】 9-1-1 は既報に従い大腸菌を用いた組換えタンパク質として調製した（Hara et al., JBC, 2019）。得られた組み換えタンパク質と FEN1 ペプチドをモル比 1:10 で混合し、シッティングドロップ蒸気拡散法にて 20 ℃で結晶化条件の探索を行った。得られた結晶をエチレングリコールを含むクライオプロテクタン
トに浸漬させたのち、液体窒素で凍結した。その後、PF-BL17A にて X 線回折実験を行った。
【結果および考察】 結晶化条件を探索した結果、ポリエチレングリコールを沈殿剤とする条件で板状のクラスター結晶が得られた。X 線回折実験を行ったと
ころ、タンパク質結晶特有の回折点が見られた（3.4 Å 分解能）。その後、X 線
回折データ収集を行い、プログラム XDS により、反射の指数付けと積分処理を試みた。しかし、晶系や格子定数の決定には至らなかった。その原因として、結晶が多結晶であったことが考えられる。今後、回折データ収集に適した良質な単結晶を得るために結晶化条件の最適化、及びクライオプロテクタントの検討による分解能の向上を行い、分子置換法による複合体の構造決定を目指す。また、マイクロフォーカスビームを用いた X 線回折実験も検討したい。

P1-068L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL1A、PF-BL5A、PF-BL17A

Elucidation of PLP binding and substrate recognition
mechanism of plant tyrosine decarboxylase
Hang Wang1, Yusuke Nakagawa1, Yasuharu Satoh2, Jian Yu1, Toyoyuki Ose1 and
Min Yao1(1 Graduate School of Life Science, Hokkaido University, 2 Faculty ofEngineering, Hokkaido University)
Plant tyrosine decarboxylase (TyrDC) is a group II pyridoxal 5’-phosphate(PLP)-dependent decarboxylase that mainly catalyzes the decarboxylation oftyrosine to tyramine. This is biologically important for diverting essential
primary metabolites into secondary metabolic pathways. Intensive studies havecharacterized the effective of PLP-binding and the substrate specificity of
mammalian 3,4- dihydroxyphenyl-L-alanine (Dopa) decarboxylases, a memberof group II PLP-dependent decarboxylase. However, the characteristics of PLP
binding and substrate specificity of plant TyrDCs remain unknown.
In this study, we focus on the PLP binding manner and substrate recognition
mechanism. We determined the crystal structures of the apo and PLP binding
form of type II TyrDC from Papaver somniferum (PsTyrDCII and
PsTyrDCII-PLP).
We
alsodeterminedthestructuresof
PsTyrDCII-PLP-inhibitor (Carbidopa) and H203F of PsTyrDCII with PLP and
p-tyrosine. The apo and PLP binding form structures of PsTyrDCII showed that,
unlike mammalian Dopa decarboxylase, the binding of PLP does not induce
distinct conformational changes regarding the overall structure, but the PLPbinding pocket displays conformational changes at Phe124, His203 and Thr262.
Meanwhile, combining structural comparation and the biochemical results,
H203 not only stabilize the PLP binding but also related to the rotation ofsubstrate carboxyl group which facilities the formation of Schiff base of
substrate and PLP. Our study demonstrated that PsTyrDCII does not binds PLP
tightly. Such characteristics of PLP binding may be required by its catalytic
reaction and substrate binding.

P1-069L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
KEK-PF/AR-NW12A, BL5A

キナーゼ DAPK のリン酸転移反応の考察
Consideration of the phosphoryl transfer reaction ofkinase DAPK加藤康平 1・松尾悠平 2・田中伊知朗 1,3
1 茨城大院理工, 2 秋田大医, 3 茨城大フロンティアセンター
プロテインキナーゼは、代謝、細胞分裂など多くの重要な生体内メカニズムに関与し、調節する役割を担う。プロテインキナーゼによる調節が失われると癌、糖尿病、神経障害などを含む多くの疾患のトリガーとなるため、主要な治療標的となっている。Death-Associated Protein Kinase 1(DAPK1)は Ca2+/CaM
依存性プロテインキナーゼサブファミリーに属する Ser/Thr キナーゼである。
生体内で脱リン酸化されることで活性化し、細胞死を促進する。DAPK1 は急性虚血性心疾患、および子宮内膜線癌の治療標的となっている。現在、プロテインキナーゼの構造の多くは解明されているが、キナーゼにおけるリン酸転移反応については疑問が残っている。特に、触媒残基のプロトン化状態や保存された水分子の配向などである。そこでＸ線結晶構造解析による結果とキ
ナーゼ活性測定の結果を用いて、リン酸転移機構について調べた。。
活性部位における ATP との相互作用を観察するため、リガンドに ATP を含む計 5 種類の ATP 類似体(ATP、AMP-PnP（ANP）、ATP-γS（AGS）、
AMP-PCP（ACP）、ADP)を用いて比較する。金属には Mg を用いた。リン酸転移に関与する残基、配位する金属と水分子に注目し、プロテインキナーゼとしてテンプレートな存在である cAMP-dependent protein kinase (PKA-C)と比較し、考察した。また、キナーゼのリン酸転移反応を観察する方法として 2 種のキナーゼアッセイキットを用いた。これらのキナーゼアッセイキットでは、いずれもリン酸化によって特定波長の蛍光が発せられ、測定機器にマルチグレー
ティングマイクロプレートリーダー SH-9000Lab を用いた。結晶化条件におけるリン酸転移反応について比較を行い、考察した。これらの結果をまとめ、ポスターにて報告する。

P1-070L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞

新規メタロ-β-ラクタマーゼ阻害剤の結晶構造解析
The structural analysis of inhibitory compound formetallo-β-lactamase (MBL)
加茂大知 1、黒田圭一 1、米田友貴 2、高屋明子 1、
額賀路嘉 3、西田紀貴 1、星野忠次 1（1 千葉大院薬、2 北大院工、3 城西国際大薬）【背景・目的】新たな抗菌薬が開発されるたび、細菌はそれに対する耐性を獲得する。近年、その脅威を広げているのが、メタロ-β-ラクタマーゼ(MBL)を産生する薬剤耐性菌である。代表的な抗菌薬であるβ-ラクタム剤を加水分解するβ-ラクタマーゼのうち、活性中心に亜鉛原子を持つことから MBL と呼称される。MBL 産生菌はペニシリン系やセフェム系だけでなく、カルバペネム系の抗菌薬への耐性も持つため、非常に危険視されている。しかし現在、臨床レベルの MBL
阻害剤はなく、その開発が急務となっている。本研究では、MBL 阻害活性を有する化合物の、計算機設計とその合成、MBL 阻害活性の評価を行う。
【方法・結果】
MBL のうち特に危険視されている IMP-1(Imipenemate)、NDM-1(NewDelhi MBL)に対し阻害活性を有する化合物 1 を同定した。
構造改変①：化合物 1 は IMP-1 との共結晶中において、一部がδ-ラクタム環の開裂した構造(化合物 2)を取ることが示された(Figure 1)。MD シミュレーショ
ンの結果、化合物 2 はより強い IMP-1 阻害活性を示すと示唆された。δ-ラクタ
ム環の開裂で生じたカルボキシ基が、亜鉛原子と相互作用することが予測される。現在、化合物 2 の合成を進めている。
構造改変②：化合物 1 のフェニル基周辺には空隙があり、置換基導入により空隙を埋めることで、タンパク質との親和性向上が期待できる。当グループで独自に開発した Orientation プログラムを用いてドッキングシミュレーションを行い、その結果をもとに化合物 1 の構造類縁体を合成した。それら類縁体のMBL 阻害活性についての評価も行った。
本発表では、計算機を用いた構造改変 案の 検討、 構造
類縁体の合成とIMP-1 阻害活性の評価について発表する。

P1-071L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
Effect of electrostatic potential on protein crystallization
Aim: X-ray crystallography is a major experimental method for determining high-resolution structuresof biological macromolecules. The crystal growth of protein molecules is, however, a critical step for
successful analysis of this method. Ammonium sulfate (AS) and polyethylene glycol (PEG) are themost popular precipitants to induce protein crystallization. Some proteins are readily crystallized by AS,
while others are by PEGs. The reason why favorable crystallization conditions are different amongproteins is not clear. In this work, we picked up more than 100 crystal structures that were crystallized
by AS. The electrostatic potentials were contrasted to those of the proteins that were crystallized by
PEGs. The aim of this study is to clarify the reason of favorite for precipitants in protein crystal growth.
Materials and Methods: 140 crystal structures were downloaded from Protein Data Bank (PDB).Outof 140, 100 crystals were obtained by AS at the concentrations above 2.0 M, and 10 were by AS at theconcentrations below 2.0 M. 20 crystals were grown by PEGs, 6 were by high concentrations of NaClor LiCl, and the rest 4 were by glycerol. The missing residues in the crystal structures were added byhomology modeling using MODELLER. The pKa calculation was carried out using PROPKA for all thetitratable residues. The protonation states for the titratable residues were determined so that the total
charge of protein became zero at a certain pH condition. For the residue types used in AMBER, GLU
and ASP were renamed into GLH and ASH for protonation when the total charge was negative. In
contrast, ARG and LYS were renamed to ARN and LYN for deprotonation when the total charge waspositive. The hydrogen-generated protein models were created, making use of the tLEaP module of
AMBER tools. Electrostatic potentials around the proteins were obtained by the continuum calculation
method using DelPhi, and the potential map was visualized by Chimera.
Results: For the proteins that were crystallized in high concentrations of AS, the positive and negative
areas of electrostatic potential were almost equally separated. The pH values that made the total
protein charge zero in pKa calculation were close to the pH in which protein crystals were grown up in
experiments. These findings suggested that the alteration of the protonation states of the surface
amino acid residues is one of the techniques to promote protein crystallization.

P1-072L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL5A

超好熱性古細菌由来 MTAP の精製および結晶化
Purification and crystallization of methylthioadenosine
phosphorylase
菊池槙子 1、山内崇浩 2、柳田裕香 2、船木明日香 2、長谷川さとみ 2、
飯塚康人 2、角田大 1,2
１ 医療創生大院理工、2 医療創生大薬
5’-Deoxy-5’-methylthioadenosine phosphorylase(MTAP)はプリンサルベー
ジ経路中で働き、可逆的な 5’-Deoxy-5’-methylthioadenosine の可逆的な加リ ン 酸 分 解 を 触 媒 し 、 生 成 物 は フ リ ー の ア デ ニ ン と
5-methylthioribose-1-phosphate(MTR-1-P)である。アデニンは続いてホスホ
リボシル転移酵素の反応を通してヌクレオチドに再利用され、一方でMTR-1-P はメチオニン生合成に用いられる。MTAP の活性は細胞中で生産されるフリーのアデニンのすべてに原則的に関与しており、この酵素はプリンサ
ルベージ経路において重要な機能を果たしていることを示している。
超好熱性古細菌 Aeropyrum pernix 由来の MTAP をコードするプラスミドを大腸菌 Rosetta-gami(DE3)に形質転換し、大量培養を行った。集菌後、超音波破砕を行い、80℃で 30 分熱処理し、目的タンパク質が生体内と同様に折り畳まれるようにした。その後 40％飽和の硫安分画を行い、目的タンパク質を沈殿させた。緩衝液で透析し、硫安を取り除いた後、陰イオン交換カラムにアプライした。SDS-PAGE にて単一バントになることを確認した。結晶化はハンギ
ングドロップ蒸気平衡拡散法を用いて行った。

P1-073L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL17A／BL1A

ATR-CHK1 チェックポイント経路の活性化に関わる
9-1-1 と RHINO の相互作用解析
Interaction analysis between 9-1-1 and RHINO
in ATR-CHK1 checkpoint pathway
玉舟亮太 1、飯田奈央 2、原幸大 1,2、櫻井ひとみ 2、石川吉伸 1,2、大橋英治 3、
菱木麻美 1,2、橋本博 1,2
１ 静岡県大院薬、２ 静岡県大薬、３ 九大院理【目的】
ATR-CHK1 経路は主に S 期および G2/M 期で働く DNA 損傷チェックポイン
トである。DNA 損傷チェックポイントは、DNA 損傷に応じて細胞周期を遅延させることで損傷を修復するための時間を稼いでいる。9-1-1 および RHINO は
ATR-CHK1 経路において重要な役割を担っている。9-1-1 は RAD9、RAD1、
HUS1 からなる環状構造をもつ三量体であり、DNA 損傷センサーとしてはたらいている。RHINO は 9-1-1 および TOPBP1 に結合し、ATR キナーゼおよびCHK1 キナーゼの活性化に関わる。最近、我々は 9-1-1 と RHINO ペプチドの複合体の X 線結晶構造解析を行い、RHINO (55-64) が 9-1-1 の RAD1 サブ
ユニットに結合することを明らかとした （Hara et al., JBC, 2019） 。本研究では結晶構造で観測された相互作用を検証することを目的とし、RAD1 に変異を導入した 9-1-1 と RHINO との相互作用解析を行った。
【方法】
9-1-1 と RHINO の複合体の X 線結晶構造解析により RHINO は RAD1 の極性アミノ酸 (K155、R244、Q254) とイオン結合や水素結合を、疎水性アミノ酸
残基 (F64、M256、F266) とファンデルワールス相互作用を形成していることが明らかとなっている。RAD1 を介したこれらの相互作用が 9-1-1-RHINO 複合体の形成に及ぼす影響を調べるため、RAD1 に K155A/R244A/Q254A 変異あるいは F64A/M254A/F266A 変異を導入した 2 つの 9-1-1 変異体を調製した。また、RHINO (45-64） を GST 融合タンパク質として調製した。
【結果・考察】野生型 RAD1 で構成された 9-1-1 と GST-RHINO (45-64) を等量混合し、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに供した結果、9-1-1 と RHINO は共溶出し、
9-1-1 と RHINO との相互作用を検出することができた。一方、RAD1 に変異を導入した 2 種の 9-1-1 変異体を用い、同様に RHINO と共にゲル濾過クロマト
グラフィーに供したところ、RHINO との共溶出は確認されなかった。このことより、結晶構造で観測された RAD1-RHINO 相互作用は 9-1-1-RHINO 複合体の形成に重要であることが示された。

P1-074L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-AR NE3A, PF BL-5A

アンタゴニストによる TLR8 不活性化機構の構造科学的解明
Antagonist-inactivation mechanism of innate immune
receptor TLR8 revealed by X-ray crystal structure analysis
Kentaro Sakaniwa1; Hiromi Tanji1; Shuting Zhang2; Zhenyi Hu3; Hang
Yin2; Umeharu Ohto1; Toshiyuki Shimizu1
1: The University of Tokyo, 2: Tsinghua University, 3: Yale University[背景]Toll 様受容体 (TLR) は，病原体関連分子パターン (PAMPs) を認識し，サイトカインやインターフェロンの産生を誘導する I 型膜タンパク質である。
TLR は PAMPs の認識に関わる細胞外 LRR ドメイン，1 回膜貫通ヘリックス，
下流へのシグナル伝達を担う細胞内 TIR ドメインからなる。TLR8 が不活性化型二量体を形成し，アゴニスト結合により活性化型二量体を形成することは既に構造科学的に明らかにされているが，アンタゴニストとの結合様式については知られていなかった。今回我々は，TLR8-アンタゴニスト複合体の構造解析を行い，アンタゴニストによる TLR8 の不活性化メカニズムの解明を行った。
[方法]
清華大学 Yin 教授らにより開発された TLR8 に特異的なアンタゴニストである CU-CPT 化合物を用いて等温滴定型カロリメトリー (ITC) を行い， TLR8へのアゴニスト結合に対する影響を評価した。また，TLR8 と CU-CPT 化合物とを混合した上で結晶化を行い，TLR8-CU-CPT 複合体の X 線結晶構造解析を行った 1, 2。
[結果・考察]ITC の結果，CU-CPT 化合物は TLR8への低分子アゴニストの結合を阻害す
ることが確認された。また，X 線結晶構
造解析から，アンタゴニスト複合体は C
末端領域が互いに離れたリガンド非結合型と類似した全体構造を取っており，
不活性化型構造であることが確認された。アンタゴニストの TLR8 との結合様
式はアゴニストとは異なっており，アンタ 図 1: TLR8 結晶構造 (左: アゴニスト結合型，中央: リガンド非結合型，右: アンタゴ
ゴニストによって不活性化型構造が安定 ニスト結合型)
化され，アゴニストの結合が阻害されていると結論付けられる。
1. Zhang, Hu, Tanji and Sakaniwa et al. (2018). Nature chemical biology, 14, 58-64.
2. Hu, Tanji and Sakaniwa et al. (2018). Cell chemical biology, 25, 1286-1291.

P1-075L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
MLF BL20

７T マグネットによるタンパク質核偏極実験
Protein dynamic nuclear polarization experiment by
7T magnet
山内秀輝 1・能田洋平 2,3・前田知貴 3・小泉智 2,3・田中伊知朗 2,3
1 茨城大工，2 茨城大院理工，3 茨城大フロンティアセンター【緒言】
中性子回折実験における水素の検出感度向上の方法として、動的核偏極（DNP）がある。この手法を用いることにより、水素からの散乱長が従来の約 8倍となり、更に軽水素試料でもバックグラウンドが低減できるという利点がある。
この技術の実現には一般に、試料結晶中にラジカルを導入し、高磁場（3T）かつ極低温（1K）の条件を揃える必要がある。本研究では、以前山形大学にて、
ラジカル TEMPOL をリゾチーム結晶に高濃度で導入し、DNP 実験を行い偏極率の測定を行い、22.3%の偏極率を達成した。さらに高偏極率を実現するために MLF BL20 に設置されている７T マグネットを用いて、中性子ビームが出ていない条件でのタンパク質単結晶の各偏極実験を試みた。
【実験】
Sigma-Aldrich 社より購入したリゾチームとラジカル TEMPOL を、TEMPOL が50mM になるようバッチ法にて共結晶化し、NMR 感度の関係から、300mg 超の単結晶を複数 FEP チューブにセットして、磁場 7T、温度約 4K、マイクロ波としては 188GHz の条件で DNP 実験を行った。
【結果】
DNP 実験の結果、リゾチーム結晶の偏極に成功し、最大偏極率は正負で約40%を達成した。正偏極は、約 15 分で+40.3%、負偏極は、切り替え後、約 35 分
で-39.8%の核偏極率に到達した。山形大の 2.5T の常伝導マグネットに比べ、非常に早く（1/3 以下）、より高偏極化(約２倍)することができた。今後は中性子を用いた低角の回折パウダーパターンにより、散乱長の変化を確かめたい。

P1-076L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
MLF-BL15

スピンコントラスト粉末結晶回折法の開発
Development spin contrast variation diffraction
for powder crystal
三浦大輔 1,2, 岩田高広 1, 宮地義之 1, 元川竜平 2, 中川洋 2,
大場洋次郎 2, 関根由莉奈 2, 大原高志 2, 高田慎一 2, 廣井孝介 2,
森川利明 3, 河村幸彦 3, 大石一城 3, 熊田高之 2
1 山形大理, 2 日本原子力研究開発機構, 3 CROSS
中性子は X 線と比べ軽元素, 特に水素に対して大きな散乱能を持つことから、 ソフトマターの構造解析に有用である。 偏極中性子の水素核に対する
干渉性散乱長は特異的に核偏極度に強く依存する。 この性質を利用した構造解析手法がスピンコントラスト法[1, 2]である。 スピンコントラスト回折法は,水素核偏極度に応じて変化する回折ピーク強度から結晶中の水素位置を高感度で決定できると期待される。
磁気モーメントが小さい核を熱平衡下で偏極させることはほぼほぼ不可能である。 しかし、 動的核偏極 (DNP) と呼ばれる手法により、 数十%の核偏極度が実現する。 本手法は、試料に不対電子を持つフリーラジカルを添加し、熱平衡状態で実現する不対電子の高偏極度をマイクロ波共鳴により、 原子
核偏極度に移す手法である。 DNP 法はフリーラジカルが均一分散する非晶試料に対してのみ有効であるとされ、 スピンコントラスト回折法の実現は不可能とされていた。 筆者はフリーラジカルを溶解した非結晶溶媒に微粒子化した結晶試料を含浸させることで、 結晶試料の核偏極を可能とする技術を開発した[3]。
開発した結晶試料の偏極技術を用い、 スピンコントラスト回折法の実現を目指している。 粉末グルタミン酸に DNP による水素核偏極を施し、 J-PARC
MLF BL15 で偏極中性子回折実験を行った。 水素核偏極度に応じて最大数倍程度に散乱強度が変化することを確認した。 得られた散乱ピークの変化は数値計算で予想されるものと一致し、 スピンコントラスト回折法の原理実証に成功した。 本講演ではこの結果を中心に報告する。

[1] W. Knop, et al., J. Appl. Crystallogr. , 22, 1989, 352.
[2] T. Kumada et al., J. Appl. Crystallogr. , 52, 2019, 1054.
[3] D.Miura et al., PTEP, 2019, Issue 3.

P1-077L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞

MLF/S1
ミュオンによるセリンプロテアーゼ加水分解反応の追跡
Study of serine protease hydrolysis by muon
小柳文哉 1、清谷多美子 2、新村信雄 3、田中伊知朗 3,4
1 茨城大工、2 昭和薬科大、3 茨城大フロンティア、4 茨城大院理工
セリンプロテアーゼタンパク質の加水分解反応について、触媒基トリオ
Ser195、His57、Asp102 の触媒機構において電子・プロトン移動が起きているとみられている。また、セリンプロテアーゼの阻害剤について、一例としてウシ
膵臓トリプシンインヒビター（BPTI）がある。これはトリプシンの活性部位領域に結合し、境界面が水素結合のネットワークでしっかりくっついた複合体をつくる。BPTI は触媒反応によって一度切断されるが、そこから離れていかず、トリ
プシンの持つ触媒機構の逆のプロセスをたどることで一度開裂された結合が再結合することが明らかにされている［1］。
µSR（ミュオンスピン回転）実験は、物質中で生じる内部磁場の大きさの測定を、ミュオンを利用しておこなっている。触媒機構による電子・プロトン移動、
すなわちそれらの電流から生じる磁場を観察するために、正ミュオンを用いたµSR 実験を用いた。
今回はトリプシンおよびキモトリプシンに、阻害剤として BPTI と同様の阻害様式を見せると考えられるリマ豆（lima bean）由来トリプシンインヒビター（LBTI）
を、モル比を 1：1 で混合し、純水に溶かしたものを凍結乾燥により脱水後、重量比で水分含量 20%に調整した粉末を試料とした。
まず酵素活性測定ではキモトリプシンに対して LBTI が阻害していることを確認した。
µSR 実験の条件は、トリプシン-LBTI 複合体およびキモトリプシン-LBTI 複合体の二つの試料に対して、種々の温度および LF・TF（磁場）の測定を
MLF/S1 で行った。解析は musrfit を使い、関数として主に指数関数を用いてfitting を行った。
実験により得られたデータを用いて比較検討を行い、水の影響をある程度確認することができた。

［1］K. Kawamura, et al., Acta Cryst. D67 (2011) 140-148.

P1-078L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
BL-5A

PcyA D105N-BV 中性子結晶構造解析に向けた研究
Research for PcyA D105N-BV Neutron Crystal Structure
Analysis
七澤諒太 1, 堀江和輝 1, 池田篤史 1, 萩原義徳 2, 杉島正一 3, 和田啓 4,福山恵一 5 海野昌喜 1
1 茨城大学, 2 久留米高専, 3 久留米大学, 4 宮崎大学, 5 大阪大学

フェレドキシン依存性ビリン還元酵素 PcyA はヘム分解産物であるビリベ
ルジン(BV)を出発物質として２段階の還元反応によりビリン色素の１つである
フィコシアノビリン(PCB)を生合成する反応を触媒する。この反応の特徴は
PcyA が基質 BV の異なる２つの部位を一定の順序で特異的に還元することである。我々は野生型(WT)PcyA-BV 複合体の中性子結晶構造解析により、BVの中心付近に存在する Asp105 がプロトン化、脱プロトン化した 2 つの状態が混在し、それぞれが別のコンホメーションをとっていることや BV とプロトン化した BVH＋が混在していることを見出した[1]。この BV の 2 つのプロトン化状態は以前より報告されていた PcyA-BV 複合体の吸収スペクトルとの相関関係と一致する結果であった[2]。また、Asp105Asn(D105N)変異体と BV の複合体の吸収スペクトルでは、WT では見られたピークが消滅している。本研究の目的は、
D105N-BV 複合体の中性子構造解析を行い、Asn105 と BV のプロトン化状態を明らかにし、吸収スペクトルとの相関関係を証明することである。
本研究室では PcyA D105N-BV 複合体の中性子構造解析を行ったが、分解能やデータの質が悪く、BV のプロトン化状態について決定することができなかった。そこでより高分解能の回折データを得るために再度結晶化を行った。
現段階では 1 辺が 2 mm を超える結晶が得られているが、再現性が悪く、形がいびつなものがほとんどである。そこで再現性が良く、良質な結晶を得るために PcyA D105N-BV 複合体の結晶化条件の最適化を試みている。
本シンポジウムでは PcyA D105N-BV 複合体の結晶化相図と大型結晶育成について報告する。

[1]Unno, M., et al., (2015)J.A.C.S., 137, 5455-5458[2]Hagiwara, Y., et al.,(2016)FEBS Lett., 590, 3425-3434

P1-079L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL5A、PF-BL17A

カルボニルストレスを伴う統合失調症におけるCRMP2 タンパク質の機能異常解析
Enhanced carbonyl stress induces irreversible
multimerization of CRMP2 in schizophrenia
pathogenesis
1*

2*

1

2§

1§

蒋 緒光 ・豊島 学 ・小川 覚之 ・吉川 武男 ・廣川 信隆
1 東京大学大学院医学系研究科 細胞生物・解剖学教室 2 理化学研究所脳神経科学研究センター 分子精神遺伝研究チーム ＊筆頭著者§責任著者
カルボニルストレスは生体内で反応性カルボニル化合物がタンパク質を非酵
素的に修飾し、終末糖化産物(Advanced Glycation End products： AGEs)の蓄積を促進する。近年およそ 2 割の統合失調症患者においてカルボニルストレ
スの亢進が報告され、カルボニルストレスの除去機構に関わる酵素 GLO1 遺伝子の変異が統合失調症患者で見つかっている。しかし、カルボニルストレス
がどのようなメカニズムで統合失調症に関わるのかは不明のままであった。
本研究は iPS 細胞を用いてカルボニルストレスの影響を分子レベルまで詳細に調べ、カルボニルストレスの分子病態を明らかにした。まず、カルボニルスト
レスを伴う統合失調症患者で変異が確認された GLO1 遺伝子に着目し、患者
由来 GLO1 変異 iPS 細胞と、GLO1 KO iPS 細胞を作製した。これらの iPS 細胞を用いてニューロスフィアや神経細胞を作製すると、GLO1 遺伝子の異常によりニューロスフィアの生育が悪く、神経細胞の突起伸長も低下し、カルボニ
ルストレスを軽減するピリドキサミン（ビタミン B6 の一種）により改善した。カルボニルストレスは細胞内のタンパク質にカルボニル化修飾（AGE 修飾）を起こすため、GLO1 KO iPS 細胞において強くカルボニル化修飾を受ける主要なタ
ンパク質を探索し、神経突起の伸長に関わる CRMP2 を同定した。さらに質量分析により iPS 細胞内の CRMP2 タンパク質の 60 箇所に及ぶカルボニル化修飾の位置を決定した。このカルボニル化修飾は CRMP2 の (1) 表面電荷を大きく変化させること、(2)複合体形成に重要な部位 D フック（2 量体化に重要な部位）・Ｔサイト（4 量体化に重要な部位）に密集し、カルボニル化 CRMP2 では微小管との結合や微小管を束ねる活性が失われていた。このカルボニル化
CRMP2 複合体の構造を X 線結晶解析によって詳細に調べると、AGE 修飾によって CRMP2 複合体内部で不可逆的に架橋が形成されており、CRMP2 のダ
イナミックな動きの喪失が示唆された。サイズ排除クロマトグラフィーによってCRMP2 複合体のサイズを解析すると、修飾のない CRMP2 が 4 量体を形成するのに対し、カルボニル化 CRMP2 は大きな不可逆的多量体を示した。この多量体は GLO1 KO iPS 細胞においても検出され、更にピリドキサミン添加により多量体が軽減した。これらの結果から、カルボニルストレスを伴う統合失調症の患者細胞内では、カルボニル化修飾を強く受けた CRMP2 が不可逆的に多量体化して微小管の束化機能が失われ、神経の形態形成を正常に行えないという分子病態が明らかとなった。この成果は統合失調症治療薬の創薬ター
ゲットやカルボニルストレス阻害薬の開発の基盤となる。
Carbonyl stress, a subtype of oxidative stress, is an abnormal metabolic state
resulting from either an accumulation of reactive carbonyl compounds (RCOs) or
diminished detoxification of RCOs. The accumulation of RCOs results innonenzymatic modifications of protein and production of advanced glycation end
products (AGEs). It has been recently reported that about 20% schizophrenia patients
exhibit enhanced carbonyl stress and dysfunctional mutations of GLO1, a glyoxalasethat plays an enzymatically central role in the removal of AGEs, have been found inschizophrenia patients. However, its casual effects and the underlying mechanism
remain elusive. Therefore, we set out to analyze iPS cells with GLO1 disruption as acellular model to uncover the missing link between enhanced carbonyl stress and thedevelopment of schizophrenia. To this end, we analyzed the effects of hyper-carbonyl(AGE) modification in iPS cells from a schizophrenia patient through multiple
biological approaches.
We first constructed patient-derived iPS cells with GLO1 mutation and GLO1
knockout iPS cells and found that the GLO1-deficient iPS cells exhibited significant
cellular and developmental deficits, which can be rescued by treatment ofpyridoxamine, one type of vitamine B6 that is able to relieve carbonyl stress. Besides,
CRMP2 that is related to neurite outgrowth was identified to be the major target ofcarbonylation (AGE modification) and about 60 AGE modification sites of
iPS-derived CRMP2 were subsequently determined using LC/MS technique. The
AGE-sites were found to distributed on both the conventional functional domains andthe two self-assembly sites (D-hook for dimerization and T-site for tetramerization)and lead to significant change of protein surface charges, suggesting that it may
influence the function of CRMP2.
Next, we investigated how AGE-modifications affect the MT-associating activities of
CRMP2 using TIRF microscopy and other biochemical assays. As a result,AGE-modified CRMP2 was found to lose MT-binding and MT-bundling activities invitro. Consistently, reductions of MT bundles and MT stability were observed in
GLO1 KO iPS cells that is under enhanced carbonyl stress. Moreover, the crystal
structure of carbonylated CRMP2 was determined using X-ray crystallography, andthe structures indicated that AGE modifications probably lead to generation ofirreversible intramolecular and intermolecular crosslinks among CRMP2 molecules. It
was further revealed by Highres-SEC assays that AGE-modified CRMP2 tends toirreversibly form large multimers that blocks the normal conformational transition
dynamic. Overall, this study elaborated the molecular pathogenesis of schizophrenia
under carbonyl stress and pointed to inhibition and clearance of carbonylation of
CRMP2 as potential therapeutic target for schizophrenia.

P1-080L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
BL17A

オフライン観察系を用いた in-situ データ測定の半自動化
Semi-automated in situ data collection with an offline
observation system
菅原隆広 1,2、山田悠介 2,3、田辺幹雄 2,3、加藤龍一 2,3、千田俊哉 2,3
１．東京電機大学大学院工学研究科 ２．KEK・IMSS・構造生物学研究センタ
ー ３．総合研究大学院大学高エネルギー加速器科学研究科
X 線結晶構造解析はタンパク質の 3 次元構造を原子レベルで解析することができる手法のひとつであり、構造生物学において重要な解析方法である。X
線結晶構造解析では結晶からの X 線回折強度データを収集する必要があるが、この際は次の手順で示されるようなクライオ測定を行うことが一般的である。(1)結晶化プレート内でタンパク質の結晶化、(2)結晶化プレートからの単一の結晶の取り出しと液体窒素を用いた凍結、(3)凍結した結晶の X 線回折計へのマウントと、低温冷却下での必要角度分の X 線回折強度収集、(4)位相決定、
電子密度図計算と分子モデル構築。この手順においてはいくつかの課題がある。まず(2)の結晶の取り出しによる物理的接触と凍結により結晶性が変化し、得られる回折像に影響を与えるおそれがある。加えて、膜タンパク質の LCP法による結晶化など結晶の取り出しが困難な結晶化法もあるため、その場合測定が困難となってしまう。また、結晶を一つずつ回折計にセットしていくため、大量の結晶の結晶性を調査したい場合には大きな律速となる。そこで、我々はこれらの課題を解消するため、結晶をプレートから取り出さずに X 線照射実験を行う手法（in-situ データ測定）を開発している。現在開発中の in-situ デー
タ測定では、室温状態で結晶化プレートを専用の X 線回折計に設置し X 線照射を行うが、この際、プレート内の X 線を照射したい位置を選択しておくことで、異なる複数の位置への X 線照射を連続で行うことができる。そして、この照射位置の選択をビームラインに併設するインキュベータ内のオフライン観察系で予め行うことで、X 線回折計にプレートを設置すればすぐに X 線照射を自動で行うことができるシステムを開発した。また、in-situ データ測定ではプレートからの X 線散乱による回折像バックグラウンドノイズの増加や、複数の結晶からのデータをマージして処理しなければならない等の解決すべき課題があるため、in-situ データ測定で構造解析に耐えうるデータが取得できるか検証する必要がある。そこで、複数のタンパク質について X 線照射実験を行い、得られたデータの処理結果について検討した。

P1-081L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-AR NW12A,BL5A; MLF-BL3

リゾチーム反応機構の再解明に向けて
Towards to re-elucidation of lysozyme reaction
mechanism西野宮良太 1,斎藤るりあ 2,田中伊知朗 1,3
1 茨城大院理工,2 茨城大工,3 茨城大フロンティアセンター

リゾチームは細菌の細胞壁ペプチドグリカンの N-アセチルムラミ
ン酸と N-アセチルグルコサミン間のグリコシド結合を切断する酵素
で、50 年以上前に構造が決定されたものであり、これまで様々な触媒機構が提案されている。代表的な反応として、共有結合中間体を作成し反応が進む Koshland 機構という反応があるが、これはリゾチ
ームと共有結合を作りやすいリガンドで行った不自然な条件下での結果によるものである[1]。そこで本研究では、リゾチームの反応が生体内で進む際、より自然な系で観察するため、N-アセチルグルコ
サミンの 4 量体((NAG)4)と 3 量体((NAG3))を基質に用いた条件で、酵素反応に関係する水和水の位置情報や触媒基の水素結合等を,高分解能Ｘ線解析および中性子回折実験を計画した。
実験に用いたリゾチームは SIGMA-ALDRICH 社のニワトリ卵白リゾチームを使用し、糖は(NAG)4、(NAG)3 であり、購入したものをそのまま共結晶化した。X 線回折実験は、PF-AR NW12A、5A にて行い、温度は 100Kで測定した。中性子回折 BL-03 (iBIX)にて室温でのを用いたテスト測定を行った。
X 線解析では、(NAG)4,(NAG)3 それぞれ 1.07, 1.06Åと高分解能データ解析ができ、問題の触媒反応機構に関係する基質とアミノ酸との相互作用が、水素情報抜きで類推できた。中性子回折実験のテスト測定では(NAG)4 では目視による分解能が 1.86Å(500kW 出力)、(NAG)3 では 1.89Å(400kW 出力)の反射を確認でき、上記の水素結合情報を直接得られる可能性が確認できた。

[1]D.J.Vocadlo et al., Nature 412 (2001) 835

P1-082L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL10C、PF-BL17A、PF-BL1A

Endo-β-N -acetylglucosaminidase HS の立体構造解析
Structure analysis of
Endo-β-N -acetylglucosaminidase HS
大倉和貴 1,森真司 2,伊藤和央 2,米澤健人 3,清水伸隆 3,神谷信夫 1,宮原郁子 1(1 大阪市大院理・物質分子, 2 大阪市大院理・生物地球, 3KEK 物構研)
【背景】
タンパク質の表面に結合した糖鎖は細胞間の認識に関わっており、生体内に必須の高分子である。1993 年に伊藤らが見出した 、ヒト唾液中に存在する
Endo-β-N -acetylglucosaminidase(Endo HS)は、複合型糖鎖のみを特異的に遊離、あるいは水酸基をもった適当な化合物に転移するという機能を持つ[1]。
この特異的な糖鎖転移反応は、抗体などバイオ医薬品の合成への応用が期待される。Endo HS は、1009 アミノ酸残基からなるモノマーで機能することが分かっており、近年水銀イオンで可逆的に阻害されることが明らかになった。しかし、PDB には本酵素とアミノ酸相同性が高い構造は存在しておらず、立体構造に関する知見がない。本研究では、Endo HS の立体構造を原子レベルで明らかにすることにより、水銀イオンによる不活性化機構や複合糖鎖の認識機構の解明を目指す。
【方法・結果】
N 末端の膜貫通領域を除いた Se-Met 置換体 Endo HS を大腸菌により大量発現し、SDS-PEGE で単一バンドになるまでカラムクロマトグラフィーを用いて精製を行った。この酵素を用いて SEC-MALS 実験を行った結果、溶液中ではモノマーで存在していることが明らかになった。また、SAXS 実験によって得られた散乱曲線の Kratky plot や溶液構造から、溶液中ではコンパクトな構造となっていることが明らかになった。塩化水銀を加えた実験では、水銀イオンの濃度依存的に凝集体を作るような構造変化が起こった。
結晶化は、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて、スクリーニングを行った。様々な条件を検討したところ、緩衝剤に Bis-Tris、沈殿剤に硫酸アンモニ
ウムを用い、ミクロシーディングを行うことで、0.1ｘ0.1ｘ0.02 ｍｍ程度の板状の単結晶が再現性よく得られた。この結晶を用いて回折データを収集し、SAD 法
により位相を決定した。現在、2.6Å分解能で構造を精密化途中であるが、5-980 残基までモデルを構築できている。また、Endo HS の 5-680 残基までの構造は、同じ糖質加水分解酵素ファミリー85 に属する Endo A（2-615 残基）の構造とよく似ていることが判明した。
［1］Ito K.., et al., J Biol Chem ,(1993). 268, 16074-16081

P1-083L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL5A

Aspergillus sojae α-グルコシダーゼの結晶化と構造解析
Crystallization and structure determination of
α-glucosidase from Aspergillus sojae
大八木彩子 1、堤賢太 1、西河淳 1、松本雄治 2、
安武望 2、殿塚隆史 1
1 東京農工大学大学院農学府応用生命化学専攻、
2 昭和産業㈱基盤技術研究所
オリゴ糖は整腸作用や免疫力向上など様々な機能が報告されており、オリゴ糖製造酵素の取得・解析が嘱望されている。Aspergillus sojae 由来の糖質
加水分解酵素ファミリー31（GH31）に属するα-グルコシダーゼ（AsojAgdL）は、高い糖転移活性を持ち、α-1,6-グルコシド結合を有するオリゴ糖を生成させる性質を示す。AsojAgdL は成熟の過程でプロテアーゼによるプロセシングを受け、約 100 アミノ酸残基が切り出され、二つのポリペプチドから成る複合体として機能することが判明している。本研究では、AsojAgdL の構造機能相関を解明する目的で、結晶化および構造解析を行った。
AsojAgdL は、Pichia pastoris を宿主とした発現系にて His-tag 融合タンパク質として発現させ、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。マル
トースを基質とし活性を測定したところ、グルコースを遊離する活性があることが分かった。SDS-PAGE の結果、二本のバンドが得られたことから、A. sojaeで発現する時と同様のプロセシングを受けると考えられた。Ni-NTA カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製し、Endo Hf によって糖鎖を切断した後、結晶化した。
X 線回折データを収集し、構造解析を行った。空間群は P21 で、結晶学的非対称単位中に 4 つの AsojAgdL が存在した。構造はテンサイα-グルコシダー
ゼ（PDB 3W37）を鋳型とした分子置換法で決定した。しかしながら、プロテアー
ゼによるプロセシングを受ける付近および C 末端側の構造は不明瞭であった。

P1-084L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
X06SA in SLS

タンパク質脱イミノ化酵素 PAD3 の
基質認識機構解明に向けた研究
Research for elucidation of substrate recognition
mechanism of protein arginine deiminase PAD3
沢田瑞季 1、舟橋一真 2、大和田哲也 2、高原英成 3,4、海野昌喜 2,4
1 茨城大工、2 茨城大院理工、3 茨城大農、4 茨城大フロンティア
タンパク質脱イミノ化酵素（PAD）は、Ca2+依存的に、タンパク質中のアルギ
ニン残基をシトルリン残基に変換する反応を触媒する酵素の総称である。
PAD には 5 つのアイソザイムがあり、その中でも PAD のⅢ型アイソザイムである PAD3 に着目して研究を行っている。PAD3 は PAD1、PAD2 と共に毛包に存在しているが、PAD1, PAD2 が基質 S100A3 の 4 つアルギニンをシトルリン
化するのに対し、PAD3 は Arg51 を選択的に認識しシトルリン化することが知られている。この反応は毛髪キューティクルの角化に関与することが示唆されており、この認識機構を解明することは毛髪角化の機構をより深く理解するために重要である。
発表者の所属する研究室では野生型 PAD3（WT）と Ca2+結合型 PAD3 と阻害剤結合型 PAD3 の X 線結晶構造が解明されている。しかし、それらの Ca2+結合部位が異なっており、Ca2+結合型 PAD3 が活性型になっていなかった。そこで、本研究では活性型 Ca2+結合 PAD3 の真の結晶構造の解明を試みた。
今までに得られていた Ca2+結合型 PAD3 の構造が不活性型であった原因として、結晶化した際の Ca2+濃度が生理状態よりも高すぎたため、構造変化を起こしたのではないかと考えた。そこで、本研究では Ca2+を結晶に後から組み込
むことにより、この問題を解決した。分解能 2.8Åの X 線回折強度データを得る
ことが出来た。その結果、本研究室で以前に得られた 2 つの Ca2+ 結合型
PAD3 構造の正誤を確認することが出来た。また、Ca2+濃度が高い場合、PADのⅣ型アイソザイムで自己シトルリン化することが報告されている[1]。このことも構造変化をもたらした一端であると考えられたので、PAD3 が Ca2+存在下で自己シトルリン化するかどうかも検証した。PAD3WT、PAD3C646A、S100A3をそれぞれシトルリン化させ、ウエスタンブロットを行い確認した。その結果、
PAD3 の自己シトルリン化が確認され、高濃度の Ca2+存在下での不活性型の構造は、自己シトルリン化を受けたアーティファクトであることが示唆された。

[1] F. Andrade, et al. 2010. Arthritis Rheum. 62(6). 1630–1640.

P1-085L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL5A、AR-NW12A、AR-NE3、

マウス IFNα の構造と受容体相互作用部位の探索
Search for mouse IFNα structure
and receptor interaction site
○渡邊 ほのか 1, 2、田中美葵 1, 2、和田 俊樹 3、海野 昌喜 1, 2
１茨城大院理工、2 茨城大 iFRC、3 金沢医科大免疫学
抗ウイルス免疫に関与する形質細胞様樹状細胞(pDC)の過剰反応によるインターフェロン(IFN)α の異常な分泌は、自己免疫疾患の増悪化に関与することが知られている。近年、pDC における IFNα 分泌に関わる分子としてSortilin が同定 1 され、pH に依存した二量体化がサイトカイン輸送活性において重要であることも明らかにされた 2。しかし、各種サイトカインを認識する機構の詳細に関しては依然として不明である。本研究では、IFNα とそのキャリア分子である Sortilin の相互作用様式をマウス由来 Sortilin-IFNα 複合体の X
線結晶構造解析よって原子レベルで解明することを目的としている。
まず、X 線結晶構造解析によって、未知であるマウス IFNα(mIFNα)の構造を決定した。mIFNα 遺伝子の発現・精製条件の確立後、ハンギングドロップ蒸
気拡散法による結晶化を行い、空間群 P412121、格子定数 a = b = 42.73 Å,
c = 180.71 Å (α, β, γ = 90°)、最高分解能 2.1 Åの回折データを得ることができた。位相はヒト IFNα の NMR 構造(PDB ID:1ITF)をモデルとした分子置換法により決定し、現在 R=19.4%、Rfree=22.0%である（精密化中）。得られた構造を基に、各種 IFNα との構造比較を行った。さらに、マウス由来 Sortilin とIFNα の共存下で結晶化条件を探索し、スクリーニングキットにより複数の条
件で結晶を得ることができた。
今後は、Sortilin-IFNα 複合体の結晶化条件や凍結法の最適化を進め、高分解能の X 線回折データ収集および構造解析を目指す。本発表では、複合体の X 線結晶構造解析による相互作用様式解明に向けてこれまで行った研究の成果を報告する。

左図：mIFNα 構造と電子密度、右図：Sortilin, IFNα 共存化で得られた結晶【参考文献】
1. Yabe-Wada T.et al., Sci.,Rep 6, 26566 (2016)
2. Yabe-Wada T., et al.,FEBS Lett 592, 2647–2657 (2018)

P1-086L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
使用ステーション／BL-5A, NE3A

デザインされたβシートモデルタンパク質の結晶構造から明らかにするアミロイドへの構造転移機構
Structural conversion mechanism toward amyloid
revealed by redesigned β-rich model protein
木谷美思、真壁幸樹
山形大学工学部バイオ科学工学科
神経変性疾患などの疾病との関連が指摘されているアミロイドは、蛋白質
やペプチドが天然構造から構造転換してβシートに富んだ線維へと自己組織化したものである。つまり、アミロイドの形成には、天然構造からの構造転換が重要なステップとなるが、その過程については測定方法の限界から詳細はわかっていない。
我々はこれまでにアミロイドの構造を可溶性蛋白質中に模倣したモデル蛋
白質の構築を行ってきた。本研究では、βターン再設計変異体の構造解析過程において偶然に見つかった、ドメインスワッピング二量体の分子構造とその形成過程から、アミロイド構造への構造転移について考察した知見を報告する。
最初に、モデル蛋白質中の単層βシート領域に存在するβターン/ヘアピン
領域をシンプルなβターンに改変した変異体を作製し、立体構造を決定した。
これらは設計通りの構造を有していた。さらに、この変異体のβストランドを短くしたところ、同じ結晶化条件下で異なる空間群に属する二種類の結晶が得られた。構造解析の結果、一方の結晶においては蛋白質分子がβシートを介したドメインスワッピングにより二量化しており、もう一方の結晶では設計通りの単量体として存在することが分かった。溶液中では単量体で存在していることから、結晶化で固体に転換される時にドメインスワッピングが起こっていることが示唆される。構造転換の詳細についてポスターにて議論する。

P1-087L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
KEK-PF/BL1A,5A,17A

加水分解酵素複合体に関する研究
Study of hydrolase complexes齊藤るりあ 田中伊知朗
茨城大工 茨城大院理工 茨城大フロンティア

タンパク質は生体機能を支える重要な成分であり、そのうちの一つである酵
素は生体内の反応である細胞代謝や情報伝達などの触媒作用を担っている。
また構造によって様々な機能を持つことができるタンパク質の働きを解明するために現在立体構造解析が進んでいるが明確な根拠は明らかになっていない。そこで本研究では生体内で血圧値の調整を行う酵素レニン、細胞壁の加水分解に関わる酵素リゾチームの二つの反応機構の不明点に関して明らかにすることを目的とする。
レニンは体内の水分やナトリウムのバランスを調整するとともに現代では高血圧症の原因であるレニン-アンジオテンシン系の初段階酵素で、アンジオテ
ンシノーゲンを加水分解する触媒作用を持つ。現在までに X 線解析は複数行われているが(例えば［1］など)、反応機構での水分子の位置や水素結合については解明されていない。そこで本研究ではレニンのまだ行われていない中
性子回折実験を行う事を目標とした。中性子解析を行う事で、本来の水分子の位置や結合様式を新たに確認することができるからである。今回は、レニン
タンパク質受託精製の申請準備のみであるが、現在までの研究をもとにレニ
ン－アンジオテンシン系について機構や本質について中性子解析の意義をまとめた。
リゾチームは細胞壁ペプチドグリカンを構成する多糖成分の N-アセチルム
ラミン酸と N-アセチルグルコサミンの間のグリコシド結合を加水分解する酵素である。現在提唱されている反応機構によれば加水分解された多糖がリゾチームから離れ新たな多糖の加水分解に進むはずであるが、先行研究では糖が反応後も存在し続けていることが確認されている。この疑問点の解明のた
め糖とリゾチームの複合体結晶を多糖の割合を変えた結晶化溶液でソーキングすることで反応後の糖の状態を確認した。
以上二種類の加水分解酵素の基質複合体の調査、リゾチームに関しては
X 線実験と解析を行った。

［1］J .Rahuel et al., Chem. Biol., 7(2000)493-504.

P1-088L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
KEK PF-BL1A, BL17A

Sphingobium sp. SYK-6 由来メチレンテトラヒドロ還元酵
素（MTHFR）の機能解析
Structural analysis of methylenetetrahydrofolate
reductase (MTHFR) from Sphingobium sp. SYK-6
于 宏洋 1,2、桑原直之 1、千田俊哉 1,2
1, KEK, IMSS, SBRC、2, SOKENDAI
メチレンテトラヒドロ葉酸(CH2-THF)及びメチルテトラヒドロ葉酸(CH3-THF)は
生体内で核酸とアミン酸の合成に必須な代謝物である。そのため、NAD(P)Hを利用し CH2-THF を CH3-THF に触媒するメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MTHFR) は 極 め て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 。 し か し 細 胞 内 に お い て 、CH2-THF から CH3-THF へ代謝する MTHFR に対し、リグニン低分子を栄養源として生育する Sphingobium sp. SYK-6 株由来 MTHFR は異なる性質があると
報 告 さ れ た (E. Masai, et al, 2007) 。 具 体 的 に は 、 SYK-6 の 中 に お い て
S6MTHFR は CH3-THF から CH2-THF に非可逆的反応することが示唆された。
シークエンス上では一定な類似性があることにも関わらず、このような違いを生じさせたのは S6MTHFR の立体構造に原因があると推測し、構造生物学及び生化学的実験を通して S6MTHFR のユニークな触媒メカニズムを明らかにすることを試みた。
S6MTHFR を His-tag との融合タンパク質として E.coli で発現させ、Ni アフィ
ニティ、イオン交換、ゲル濾過カラムを用いて３段階精製を行った結果、最終的に 4L 培養から 50mg 以上の S6MTHFR を精製できた。S6MTHFR の結晶化に成功し、KEK Photon Factory BL-1A/17A にて回折データの収集を行い、
native-SAD により 1.5Å 分解能の native 構造及び、分子置換により 1.85Å 分
解能の基質(CH3-THF)複合体の構造解析に成功した。立体構造上で可逆的反応を行う E.coli MTHFR(1zp4)と重ね合わせした結果、S6MTHFR の活性中心には EcMTHFR にない、CH3-THF と相互作用しそうな残基 C219 を発見した。
さらに、S6MTHFR・CH3-THF 複合体と EcMTHFR・NADH (1zpq)複合体を重ね合わせした結果、C219 は一般的な MTHFR の基質である NADH の結合を阻害しているように見られた。また、C219A の酵素活性では、C219A の活性はWT より 2 倍増えた結果が得られた。しかし、CH2/CH3-THF との反応が律速になっている一般的な MTHFR と比べ、我々の初期データから S6MTHFR はNADH との反応が律速になっていることが示唆された。その原因は SYK-6 の独特な生育環境によるものと考えられ、より正確なデータを得るために現在酵
素活性の測定を行っている。

P2-055L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-AR NW12, PF-AR NE3A

シュウドアズリン Met16 変異体の精密構造解析
Accurate Structural Analyses of Met16 Pseudoazurin
Taborosi Attila、山口 峻英、森 聖治 、高妻 孝光
茨城大学
The effect of weak interactions at the second coordination sphere of protein
molecule were studied for Pseudoazurin (PAz) and its Met16X (X = Phe, Leu,
Val, Ile) variants by high resolution X-ray crystallography and computational
chemistry. The X-ray crystal structure analyses showed the active site
geometry were changed depending on the substituted amino acid of Met16X
PAz. The side chain of Met16Phe, Met16Leu, Met16Val and Met16Ile variants
were found within van der Waals distance from the copper coordinated His81
imidazole ring. The existence of S-π, π-π and CH-π interactions in thesecond coordination sphere were indicated. The combined X-ray andcomputational analyses identified the S-π/CH-π (Wild Type), face-to-face
or face-to-edge π-π (Met16Phe), double CH-π (Met16Leu) and single
CH-π (Met16Val and Met16Ile) interactions. The theoretically calculated
interaction energies for each noncovalent weak interaction were wellcorrelated with the previously reported spectroscopic and electrochemical
properties of Met16X PAz.

P2-056L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
BL-1A, BL-5A, BL-17A, AR-NW12A, AR-NE3A

PF タンパク質 X 線結晶構造解析ビームラインにおける自動解析パイプライン
Automated data analysis pipelines in PF
macromolecular crystallography beamlines
山田悠介 1,2、小祝孝太郎 1、篠田晃 1、松垣直宏 1,2、引田理英 1,2、千田俊哉 1,2
1
KEK-IMSS-SBRC/PF, 2 総研大高エネ
KEK 構造生物学研究センターでは、タンパク質 X 線結晶構造解析実験の自動化を進めている。特に X 線結晶構造解析ビームラインにおいては、回折データ収集の自動化を進めており、現在では 1 日あたり 200 個程度の試料について人の手を介することなく測定することが可能となっている。これにより、利用者は多量な回折データを簡便に得ることとなる。利用者はその後、解析を進めて構造モデルを得て、それを自身の研究へと活用することとなるが、この解析のステップが研究を進めるうえでの律速となってきている。そこで、回折データ収集後に得られたデータセットを自動で解析し、構造モデルまで出力するパイプラインの整備を進めている。
パイプラインは回折データから指数付け、強度積分を経て、回折強度デー
タを出力する過程(process)と、その回折強度データを用いて位相決定から構
造モデル構築、精密化を行う過程(analysis)とに分けられる。それぞれの過程
において、すでに様々な全自動解析ソフトウェアが開発されている。そこで、我々はこれまで開発を行ってきた実験データ管理システム PReMo に解析パイ
プライン制御機能を追加した。この機能では、様々な自動解析ソフトウェアをプラグインとして PReMo に登録し、さらに利用者毎にプラグインの実行やパラメータをカスタマイズすることが可能である。これにより利用者の研究内容に応じた解析ソフトウェアで自動解析を行うことが出来る。現在利用可能なプラグインを表 1 に示す。
表 1. PReMo で利用可能な自動解析ソフトウェア
解析過程
ソフトウェアProcess

AnalysisXDS
DIALS
XIA2（XDS, DIALS）
DIMPLE
COMPASSSHELXC/D/E

P2-057L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
BL-5A

アミロイド伸長端を模倣したモデル蛋白質によるβシート末端の分子構造の解析
The molecular structural analysis of a β-sheet edge
using an amyloid-mimicking protein○志賀翔多 1, 真壁幸樹 1
1 山形大・院理工・バイオ
アミロイド線維はアルツハイマー病を始めとする神経変性疾患の病変部位に見られる蛋白質凝集体である。アミロイドに特徴的なクロスβ構
造は、βストランドが線維の伸長方向に対して直角に繰り返し並んだ構造を持つ。アミロイド線維の成長はこのβシート末端でのペプチド・蛋
白質分子の会合により進行する。そのため、βシート末端の分子レベルでの構造評価は、アミロイド線維の形成メカニズムの解明に加え、アミ
ロイド形成阻害薬や検出試薬の合理的設計にも繋がるだろう。しかし、
βシート末端は他分子のβシート末端と会合しやすいため、溶媒に露出したβシート末端の構造評価は困難である。
この課題を乗り越えるため、本研究では、我々が以前に構築したクロスβ構造を模倣したモデル蛋白質を改変し、溶媒に露出したβシート末端の構造をモデル蛋白質中に設計した。この設計した蛋白質はβシートの末端が露出しているにもかかわらず、単量体として安定に調製することができた。X 線結晶構造解析によって決定した構造から、非対称単位中に 4 分子が存在しており、これらの分子の比較から末端のβストランド
領域において電子密度の明確さに違いがあることがわかった。これは末端のβストランドの構造揺らぎに起因していると考えられる。分子動力学計算の結果と合わせて、詳細をポスターにて議論する。

P2-058L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-1A、PF-5A, PF-17A, PFAR-NE3A, PFAR-NW12

KEK におけるタンパク質 X 線結晶構造解析用全自動測定シ
ステムの現状と高度化
Resent status of fully-automated measurement for
X-ray crystallography at KEK
篠田 晃 1，山田 悠介 1，平木 雅彦 2，松垣 直宏 1，千田 俊哉 1
１ KEK-物構研、２ KEK-素核研結晶が出たその週のうちに測定を行えると結晶化と最適化のサイクル
をテンポよく回して研究出来る．KEK では 2018 年 5-6 月期から，全自動測定ビームタイムを開始した．このビームタイムは G，P，T 型課
題を対象に，利用者がビームタイムの 4 日前までに利用申請を行い，ビームタイム当日までに試料を PF に送付することで，ビームラインスタ
ッフが全自動測定システムによってデータ測定を行うものである．
全自動測定システムでは PAM による自動結晶交換，自動センタリン
グ，そしてデータ測定を行う．自動センタリングはユーザーの持ち込む様々な種類のループや霜などの影響に左右されない様にループ形状を 3
次元的に認識してロバストにループを検出する高速なアルゴリズムを開発し運用している．本アルゴリズムは Nylon loop や Litholoop のみならずユーザーの独自開発したループ(Hokudai loop)も特別な調整を必要とせず自動認識する．更に認識したループ全体に X 線を用いたグリッドス
キャンを行い，反射のあるセルの重心位置にセンタリングする事で結晶の中心位置でデータ測定し確実な自動測定を実現している．
本システムを用いて 2019 年 12 月までに 9,000 を超えるサンプルのセ
ンタリング及び測定を行っており利用ユーザー数も拡大してきている.

図 1 全自動測定ビームタイムの流れP2-059L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF BL-17A, SLS X06SAMR Native-SAD による 3.7Å低分解能回折データの構造決定
Structural determination of 3.7Å low resolution data set by
MR Native-SAD
小林淳、千田美紀、千田俊哉、加藤龍一
KEK・物構研・構造生物学研究センター
MR Native-SAD は、分子置換法により得られた初期位相と、タンパク質の構
成原子である硫黄原子からの異常分散シグナルの両方を利用した位相決定法である。本方法は (1) 位相決定のための重原子置換体を調製する必要が無い、(2) 分子置換法単独利用の際に見られる精密化時のモデルバイアスを解消できる、という重要な利点を有している。PF では BL-1A を Native-SAD デ
ータ収集用に特化させた開発を行っており、BL-17A においても当該データ収集が可能である。
我々は創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム (BINDS) を経由して依頼されたサンプルについて、その立体構造決定を進めている。結晶化が困難であったそのサンプルについて、精製方法を改良し、結晶化ロボットにより約800 の結晶化条件を迅速に探索して結晶を得た。次いで結晶化条件と凍結条
件を最適化することにより、全く X 線回折が見られなかった結晶を 3.2Å分解能のデータが収集できるまでに改善させた。本データは PHASER により初期位相を決定できたが (TFZ = 25.2)、やはりモデルバイアスにより構造を決定することができなかった (Rwork/Rfree = 0.3977/0.4726)。
そこで空間群 P43212、c 軸約 370Å、約 1600 アミノ酸残基・72 硫黄原子/ASUの本サンプル結晶について、BL-17A で波長 1.9Åで 16 個の Native-SAD データセットを収集した。それらを CCP4 の BLEND により 15 個のグループに分け、逐次 CRANK2 により MR Native-SAD を行った。その結果、16 個全て、11個、2 個のデータをマージしたグループで良好なモデルが得られ、精密化とCRANK2 を繰り返すことで 3.7Å分解能の構造が決定できた (Rwork/Rfree =0.2548/0.2996)。現在、その後取得した 3.1Å分解能データセットの精密化を行っている。

P2-060L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF BL-1A

BL-1A における Native SAD 構造決定の進展
Progress of the structure determination by native
SAD phasing at BL-1A
松垣直宏 1、山田悠介 1、引田理英 1、原田彩佳 1、
平木雅彦 2、千田美紀 1、千田俊哉 1
1
KEK 構造生物学研究センター、2KEK 機械工作センター
Native SAD（Single Anomalous Dispersion）法は、試料中のタンパク質にもともと含まれているイオウなど軽原子の異常分散シグナルを利用して位相決定を行う結晶構造解析の手法である。新規タンパク質の構造決定で必要となる結晶への重原子導入が不要となるため、構造解析の簡略化、迅速化が期待できる。しかし、軽原子から大きな異常散乱シグナルを得られる低エネルギーX
線領域でのタンパク質結晶回折実験には、X 線の吸収をはじめとした困難があり、native SAD 法の利用は制限を受けてきた。
PF BL-1A では、高輝度低エネルギー（3.7 - 4.6 keV ）X 線とヘリウム環境を利用した高精度回折データ測定が日常的に可能となっている。さらに、深紫外レーザーアブレーションを利用した試料加工技術を導入した。加工装置は理研播磨で開発された後 PF－AR 北西棟に設置され、整備と高度化を行っている。この技術により、結晶周辺の溶媒部分を除去、あるいは結晶自身を球状に加工し、X 線吸収に起因する系統誤差の小さい回折データを得ることが可能となる。また、ほぼすべてのタンパク質結晶試料に適用できる一般的な技術であることも大きな特徴である。ビームラインでの理想的な測定環境と試料の最適化処理を組み合わせることで、より広範な、そしてより困難なタンパ
ク質結晶に対して native SAD 構造決定の可能性が広がる。ビームラインや加工装置の現状、ユーザー利用環境、および構造解析例について発表する。

P2-061L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL1A, BL5A, BL17A; PF-AR-NE3A, NE12A

サナギタケ由来糖鎖切断酵素の結晶構造解析
Crystallography of endoglycosidasefrom Cordyceps militaris
関陽香 1、黄一博 2、荒川孝俊 1,3、山田千早 1,3、木下崇司 4、岩本将吾 4、
樋口裕次郎 2、竹川薫 2、○伏信進矢 1,3
1 東京大学大学院農学生命科学研究科、2 九州大学大学院農学研究院、3 東京大学微生物科学イノベーション連携研究機構、4 株式会社伏見製薬所

N-結合型糖鎖はタンパク質の Asn（アスパラギン）残基に結合した糖鎖であり、哺乳動物においてはしばしばそのコア部分にフコースが結合している。エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)はコア部分のキトビオース(GlcNAc-β1,4-GlcNAc)の結合を切断して N-結合型糖鎖の大部分を遊離する酵素である。ENGase は糖鎖を切り離すだけでなく、糖転移活性を付与した変異体と活性化した修飾糖鎖を用いることにより高い収率で糖鎖を「すげかえる」ことができるため、抗体などの糖タンパク質の糖鎖を均一化することができるため注目されている。我々は冬虫夏草の１種であるサナギタケ(Cordyceps
militaris)より得られたコアフコース特異的な ENGase(Endo-CoM)の結晶構造解析を行った。PF および PF-AR の構造生物学ビームラインを利用して、アポ状態（分解能 1.75 Å）、フコース(Fuc)結合状態（分解能 1.80 Å）、Fuc-GlcNAc
結合状態（分解能 2.10 Å）、Fuc-GlcNAc-Asn 結合状態（分解能 2.35 Å）の立体構造を決定することに成功した（図参照）。その結果、Endo-CoM がコアフコースを特異的に認識して切断する分子機構の詳細が明らかになった。近年、多数の抗体医薬（バイオ医薬品）が承認されているが、それらの大部分の糖鎖がコアフコース化されていることが分かっている。ENGase により糖鎖が均一化された抗体は機能向上することが認められているため、本研究により明らかになった ENGase のコアフコース認識機
構は、バイオ医薬品の品質管理に向けた、今後のタンパク質工学による機能向上の基盤になると期待される。
文献： H. Seki, Y. Huang, T. Arakawa, C. Yamada, T. Kinoshita, S. Iwamoto, Y.
Higuchi, K. Takegawa, and Fushinobu S. Structural basis for the specificcleavage of core-fucosylated N-glycans by endo-β-N-acetylglucosaminidasefrom the fungus Cordyceps militaris. J. Biol. Chem. 294, 17143-17154, 2019.

P2-062L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
KEK-PF/BL1A, 17A, 5A

X 線マイクロビームによる大型タンパク質単結晶の品質評価の考察
Consideration of quality evaluation of large protein single
crystal by X-ray microbeam
新井隆介 1、田中伊知朗 1,2
1 茨城大院理工、2 茨城大フロンティア【緒言】
タンパク質単結晶構造解析のために収集した X 線回折実験のデータの質
は実験条件（ビーム強度、径、照射時間）と結晶品質に依存し、主に前者の影響が大きいといわれている。しかし、測定を行う結晶は 1 つ 1 つ結晶性や照射体積が異なるため後者の影響も大きいのではと考えた。そこで本研究では大型タンパク質結晶に対して径の小さいマイクロビームを用い、場所依存による結晶品質の差の観察を行うことで得られるデータにどの程度影響を与えるのかの考察を目的とした。
また、結晶品質を評価する際に分解能とモザイシティに注目することが多い。
しかしこれら以外にも Wilson B といった様々なパラメーターからも評価することが可能である。そこで場所依存による結晶品質を観察すると共に、実験条件を変化させることで各パラメーターの相関の考察も行った。
【実験】
本実験では標準タンパク質であり、比較的容易に結晶を得られるという点
から Lysozyme, Glucose Isomerase, Thaumatin の 3 種を用いた。1 つの結晶に対して複数個所ビームを照射、またビームの強度を変化させデータを収集した。そのデータから結晶内の場所依存による品質の差、分解能やモザイシテ
ィ、Wilson B といったパラメーターの相関を考察した。
【結果・考察】昨年の研究では、分解能、Wilson B に注目し、結晶内での場所依存による品質に大きな差は確認できなかった[1]。ポスターでは場所依存について分解
能、Wilson B 以外のパラメーターを用いてより多方面から考察すると共に、各パラメーターの相関においての考察を報告する。

[1]新井隆介, 第 36 回 PF シンポジウムポスター(2018)

P2-063L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
μSR in Biologyの展望

Prospective onμSR in Biology
新村信雄 1、清谷多美子 2、田中伊知朗３
1
茨城大フロンティア、 2 昭和薬科大、３茨城大院理工
１）原子レベルでの生化学反応（酵素反応、光駆動生化学反応等）のエッセン
スはミリ〜マイクロ秒でのプロトン及び電子移動である。これを観測する
従来の方法としては（X 線や中性子）回折実験法があるが、得られる結果
は時間空間の平均構造である。
２）一方、正ミューオンは生体活性部位近傍に停まり、プロトン及び電子移動により生成される内部磁場を観測するので、μSR 実験法は実空間実時間の構造を直接観測出来る素晴らしい特徴を有する。
３）しかし、生化学反応（酵素反応、光駆動生化学反応等）は試料系で無秩序に生じているので、μSR in Biology に関する実験を J-PARC μ−on 施設で実施しようとすると、入射μ−on と生化学反応を同期させないと、効率が非常に悪い。
４）しかし、μSR in Biology に関する実験を J-PARC μ−on 施設で実施しようとすると、克服せねばならない課題がある。
i) 生化学反応（酵素反応、光駆動生化学反応等）は試料系で無秩序に生じているので、入射μ−on と生化学反応を同期させないと効率が非常に悪い。
ii)生体系では生化学反応により生ずる以外に内部磁場が沢山生じている。
例えば、水素原子核磁気モーメント、共役二重結合、電気双極子等々で、これらの評価は必須である。
５）以上を一つずつ解決することで、μSR in Biology でしかえられない、生化
学反応におけるプロトン及び電子移動の直接観測が可能となる。

P2-064L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
KEK-PF/BL1A, 17A, 5A

大型タンパク質単結晶の高圧凍結成功率向上に向けて
Improving the successful high-pressure cooling ofprotein large single crystals
青木晃次 1・田中伊知朗 2,3
茨城大院理工 1・茨城大工 2・茨城大フロンティアセンター3
X 線回折測定では放射線損傷を防ぐために極低温での測定が一般的である。
凍結する際に重要となるのは水をアモルファス状に凍らせ、氷晶からの散乱を防ぐことである。その際に必要な要件は小型結晶、瞬間凍結、溶液の粘度が高いことである。通常クライオプロテクタントを用いて常圧下で瞬間凍結を行うが、クライオプロテクタントの添加によって結晶性が損なわれてしまうこと
や、クライオプロテクタント自身が基質と競合する場合もあり[2]、適当なクライ
オプロテクタントの探索は時間と労力を要する。そこで本研究では水の粘度が上昇する 200MPa での高圧凍結をすることで、クライオプロテクタントフリーまたは低濃度での凍結を試行している[3]。高圧凍結では結晶内の水は高密度
アモルファス氷（ＨＤＡ）となり、常圧凍結でできる低密度アモルファス氷（ＬＤＡ）よりも密度が高く分子あたりの体積が小さいため体積膨張がなく、結晶へのダメージが少なくなる。この手法の改良としてはクライオループやクライオピ
ン、ステージへの固定法を改良した。改良の結果、高圧凍結実験の成功率が上がり、一辺が 1mm 程度の比較的大きな Lysozｙme と Glucose isomerase
結晶を高圧凍結し、X 線回折実験まで成功することができた。今後、X 線回折測定したタンパク質の構造解析をし、常圧凍結との構造比較をしていく予定である。

[1] 東浦彰史ら 日本結晶学会平成 30 年度年会ポスター(2018)[2] I. Tanaka., et al., Acta Cryst. D 74 (2018) 787[3] Kim. et al., Acta Cryst. (2005). D61, 881–890

P2-065L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞

DNA 酸化損傷修復酵素 hOGG1 の中性子結晶構造解析に向けた結晶の大型化
Crystal growth for neutron crystal structure analysis
of human 8-oxoguanine glycosylase 1
石井利樹 1 , 小室智稀 2 , 服部良一 3 , 田中好幸 3 , 海野昌喜 1,2,4
1 茨城大学工学部, 2 茨城大学院理工学研究科, 3 徳島文理大学薬学部,
4 茨城大学フロンティア応用原子科学研究センター
ヒト 8-oxoguanine glycosylase 1（hOGG1）は酸化損傷塩基である
8-oxoguanine （8-oxoG）を除去・修復する酵素である。hOGG1 は 8-oxoG の脱塩基反応（グリコシラーゼ反応）と、脱塩基部位の DNA 鎖切断反応（βリアーゼ反応）の２つの反応を触媒する。これまでに、hOGG1 の触媒残基としてLys 249 と Asp 268 が同定されている。Lys 249 は基質との共有結合中間体の構造の観測から、βリアーゼ反応の触媒残基であることが示されている［1］。
近年、Asp 268 がグリコシラーゼ反応の触媒残基であることを見出したが、Asp 268 の触媒機構における役割は未知である［2］。これらの機能を明らかにするためには、Lys 249 と Asp 268 のプロトン化状態や周辺の水との相互作
用を水素原子レベルで解明することが必須である。
そこで本研究では、hOGG1 の大型結晶を作製し、中性子結晶構造解析を行い、Asp 268 の触媒機構上の役割を解明することを目的とする。
hOGG1 は結晶が最大でもまだ 1 mm3 程度であるが、比較的安定した柱状結晶であるため、容量の増加など様々な方法で結晶の大型化を図り、中性子回折実験を行うことを目標に研究を進めている。
中でも、タンパク質の濃度を変えていきながら結晶化を行った結果、タンパ
ク質の濃度が上昇するにつれて、少ない容量でも結晶のサイズが大きく、比較的安定した柱状結晶が出来ることが分かった。今後も最適条件を探索し、容量の増加や seeding 法などを用いることで、さらなる大型化を図り、中性子
結晶構造解析を行っていきたい。
本シンポジウムでは、中性子構造解析に向けた結晶の大型化で用いた方法と結晶化の結果について報告する。
［1］Verdine et al., Nat. Struct. Biol. 2003, 10, 204［2］Nucleic Acids Res. 2017, 45, 5231

P2-066L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-AR NW12A, NE3A

シュウドアズリンの構造安定性と CH-π 相互作用の効果
Effect of CH-π Interaction on Stability of
Pseudoazurin, Met16Leu Variant
赤津 美結、山口 峻英、高妻 孝光
茨城大学
シュウドアズリン(PAz)は、システインチオラート S-(Cys78)から銅イオンへの電荷移動に由来する特徴的な吸収帯を 600nm 付近に有するブルー銅タンパ
ク質であり、脱窒菌において亜硝酸還元酵素と亜酸化窒素還元酵素への電子供与体として機能する。PAz の活性中心は、銅イオンに His40, Cys78, His81,
Met86 が配位した歪んだ四面体構造をとっている。PAz の活性中心近傍には配位に関与しない Met16 が存在しており、His81 との S-π 相互作用を通してタンパク質の構造安定性に寄与することが報告されている[1]。さらに近年、シュウドアズリンの精密 X 線構造解析および量子化学計算によって、Met16Lue
変異体の Leu16 と His81 の間に CH-π 相互作用が確かめられた[2]。本研究では、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)を用いて Met16Leu 変異体の構造安定性を調べ、第二配位圏における CH-π 相互作用の効果を明らかにした。

1. T. Yamaguchi et al., Protein Sci. 2017, 26, 1921-1931.
2. T. Yamaguchi et al., unpublished results

P2-067L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL1A、PF-BL5A、PF-BL17A、PFAR-NW12A、PFAR-NE3A

迅速に結晶構造を得るための戦略
A comprehensive strategy for efficient crystal
structure determination
千田美紀、千田俊哉
高エネ機構・物構研・構造生物学研究センター
我々のグループでは、BINDS プロジェクトをはじめとする共同研究を通じて様々なタンパク質の結晶構造解析を進めている。X 線結晶構造解析のメリット
は迅速に高分解能の構造が決定できる点であるが、そのメリットを最大限に活かすためには迅速に良質な結晶や回折データを得ることが必要である。本
発表では、結晶化スクリーニング、結晶化条件やクライオ条件の最適化、X 線
回折データ収集で行っている工夫や共同研究者との協力体制作りについて、最近の成功例を示しながら紹介したい。
結晶化スクリーニングは、我々の研究室の結晶化ロボットを用いて数百種類の条件について行うが、観察には膨大な時間がかかるため、VPN 接続を通して外部の共同研究者に行っていただいている。いくつかの条件で結晶が得られた場合には、形や大きさに捉われず X 線を当て回折イメージを確認し、出来るだけ良い性質のものを選択する。結晶の性質が見た目に依存しないことが経験的にわかっているためである。
次に、結晶化条件の最適化を行い、再現性良く結晶が得られる条件を探索する。クライオ条件の最適化や化合物へのソーキング実験を行うためには多くの結晶が必要となるため、結晶化の再現性は実験を円滑に進める上で非常に重要である。最も一般的なクライオプロテクタントであるグリセロールを用いて目標とする分解能までの回折が得られない場合には 10 種類程度のクライ
オプロテクタントから各々のタンパク質結晶に最適なものを探索することにしているが、それによりほとんどの場合で分解能を改善することができた(1, 2)。また、分子置換法で部分構造が決定できる場合には、MR 法と native SAD 法を組み合わせた MR-native SAD 法が迅速な構造決定に有効であった。
References
1. M. Senda & T. Senda (2016) Screening of cryoprotectants and the multistep
soaking method. Advanced methods in Structural Biology. Springer,
pp.139–152.
2. M. Senda et al., Use of multiple cryoprotectants to improve diffraction
quality for protein crystals. (2016) Crystal growth & Design 16, 1565–1571.

P2-068L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
AR-NW12A

C11orf95-RelA の精製と X 線結晶構造解析
Purification and X-ray crystal structural analysis of
C11orf95-RelA
大盛隼人、星野忠次
千葉大院薬【目的】RelA は NF-κB ファミリーの一つで、転写制御に関係する因子である。
RelA(p65)は p50 とヘテロダイマーを形成して、さらに IκBαが結合することで不活化状態が保たれている。しかし、一部のがん細胞では、RelA 遺伝子の上流にコードされた C11orf95 という遺伝子と融合した RelA タンパク質が産生される。この融合タンパク質は NF-κB 経路を異常に活性化させることが明らかになっており、上衣腫という特に小児に多く発症するがんでは、その原因の一つになるとされている。今回、この融合タンパク質の構造を解明するため、タン
パク質の発現、精製を行った。さらに結晶化をして、X 線結晶構造解析を行った。
【方法】C11orf95-RelA 融合体をコードする DNA プラスミドをシャペロンプラス
ミドを導入してある大腸菌に導入し、オートインダクションで培養することでタン
パク質をシャペロンと共発現させた。次に発現した融合タンパク質を超音波破砕により抽出し、His タグを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。さらに結晶を作出し、X 線回折データを取得し、構造の解析を行った。
【結果・考察】目的の C11orf95-RelA 融合タンパク質のみで発現を試みたとこ
ろ、大腸菌は封入体を形成し、目的タンパク質が可溶性画分には得られなかった。一方
オートインダクションを用いてシャペロンと共発現した場合には目的のタンパク質を精製することに成功した。また、精製したタンパク質の結晶化に成功し、2.6Åの分解能で X 線
回折像を得ることができ、結晶構造解析を試みている。

P2-069L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞

リボソーム上での開始 tRNA による非 AUG コドンの解読
Decoding of non-AUG codons by initiator tRNA on
the ribosome〇丹澤豪人 1，Matthieu G. Gagnon1, 2
1
テキサス大・医，2 テキサス大・構造生物学/分子生物物理学センター
真正細菌では，翻訳は mRNA および翻訳開始因子 IF1, IF2 および IF3がリボソームの 30S 小サブユニットに結合することによって開始される．
続いて，開始 tRNA である fMet-tRNA fMet が P-site に導入され，そこでAUG 開始コドンを認識することで，30S 翻訳開始複合体（30S initiation
complex, 30S-IC）を形成する．50S 大サブユニットの会合が，IF2 の GTP
加水分解を伴うリボソームからの開始因子の解離を促し，最終的に 70S
開始複合体（70S initiation complex, 70S-IC）が形成される．これにより翻訳伸長段階への準備が整う．
全ての生物において，開始 tRNA は P-site の AUG 開始コドンを認識し相互作用して，タンパク質合成を開始する．しかしながら，開始 tRNA は
非 AUG コドンからも翻訳を開始することができる．真正細菌では，GUG とUUG は近同族（near-cognate）開始コドンとして存在し，全遺伝子の 1 割
以上で使用されている．これら 3 種類の開始コドンに加えて，CUG, AUU,
AUC, AUA も非同族（non-cognate/non-favorable）開始コドンとして知られている．しかしながら，P-site 上における AUC 開始コドン認識の X 線結晶構造解析がこれまでに報告されているただ一つの先行研究であるため，
開始 tRNA による非 AUG 開始コドンの認識に対する理解は充分とは言えない．
そ こ で 本 研 究 で は ， Thermus thermophilus 70S リ ボ ソ ー ム ・ 非 AUG
mRNA・tRNA fMet 複合体の一連の X 線結晶構造解析を行い，翻訳開始段
階におけるリボソームの P-site 上での非 AUG 開始コドン解読メカニズムへの洞察を提供する．本発表では，構造解析により明らかになった非AUG 開始コドン–アンチコドン相互作用の詳細について紹介する．

P2-070L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL1A

Human tRNAHis guanylyltransferase のRNA 複合体構造解析
Crystal structure ofhuman tRNAHis guanylyltransferase complexed with
tRNA
中村彰良
産業技術総合研究所 生物プロセス研究部門
tRNAHis guanylyltransferase (Thg1)は、真核生物に共通して存在し、細胞質
tRNAHis 前駆体の 5’末端に GTP を基質としてグアニン塩基(G-1)を付加する酵素として同定された。この G-1 は、ヒスチジル tRNA 合成酵素による認識に必須であり、翻訳に欠かせない。近年、Human Thg1 (hThg1)はミトコンドリア
tRNAHis (mtRNAHis) も基質として認識し、G-1 を付加することが明らかになった(1), (2)。mtRNAHis は通常の tRNA とは大きく異なる 2 次構造を形成することが予測されており、どのように hThg1 は mtRNAHis を認識するのか、その詳細は明らかになっていない。
我々は hThg1 の mtRNAHis の認識機構を解明すべく、hThg1-mtRNAHis 複合体の結晶化を試みたが、結果として mtRNAHis の一部を含む hThg1 の立体構
造を 3.7 Å 分解能で決定することに成功した。得られた hThg1 の立体構造はこれまでに報告されている hThg1 とは全く異なる空間群 P3(1)21 に属し、4 量体を形成していた。さらに、既知構造の hThg1 ではディスオーダーしていた領域が、本構造では長いβシートを形成していた。興味深いことに、確認された
mtRNAHis の一部と思われる電子密度はこのβシート近傍に位置していた。このβシート領域は古細菌由来 Thg1 ホモログタンパク質では tRNA の D-loopと T-loop の相互作用部位を認識している。このことから、hThg1 においてもmtRNAHis 認識にβシート領域が関与する可能性が示唆された。さらに生化学実験から、これまで真核生物の Thg1 は全て共通だと考えられてきたが、細胞質のみで機能する真菌由来 Thg1 と、細胞質とミトコンドリア両方で機能する
hThg1 では tRNA および GTP 認識機構が大きく異なることが示唆された。
(1)(2)

Nakamura A., Wang D., Komatsu Y., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2018) 503 2015
Nakamura A., Wang D., Komatsu Y., RNA (2018) 24 1583

P2-071L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF-BL5, AR-NW12, NE-3

機能獲得型変異を持つ YabJ タンパク質の多量化構造
Oligomeric structure of the YabJ mutant protein
藤本 瑞、岸根 尚美、ル ティ テゥ ホン、木村 啓太郎
農研機構・解析セ/農研機構・食品研
納豆菌 Bacillus subtilis (natto)の生産するポリ-γ-グルタミン酸（poly-γ-glutamate; γPGA）は、グルタミン酸がγ-カルボキシル基とα-アミノ基の間で重合した分子量約 200 万ダルトン（2MDa）にも及ぶポリペプチドであり，納豆の糸の粘質物の主成分である．
この納豆菌によるγPGA 生産はクオーラムセンシング（QS）と，その後の複雑なカスケード機構により制御される．γPGA 合成酵素遺伝子の発現は，受容体型 2 成分制御系（ComP-ComA）への菌体外低分子ペプチド（ComX）の結合によって定常期に誘導され，comP-comA 遺伝子および転写因子 ComA が直接発現を制御する degQ 遺伝子の破壊株はγPGA 非生産となる．γPGA
生産制御に関わる新たな因子を探索するため，degQ 遺伝子破壊株のγPGA生産を回復させる復帰抑制変異のスクリーニングを試みたところ，得られた抑制変異株では yabJ 遺伝子に１アミノ酸置換変異が存在した．変異型 yabJ 遺伝子を親株（degQ 遺伝子破壊株）に導入し，γPGA 生産とγPGA 合成遺伝子
発現の回復が確認された．
YabJ タンパク質は高度に保存された YjｇF/YER057ｃ/UK114 ファミリーに属するエナミン・イミン化合物の解毒（脱アミノ化）酵素であると報告されている．
しかし，異説も多く，その機能には不明な点が多く残されている．納豆菌においては，YabJ タンパク質のアミノ酸置換変異により yabJ 遺伝子産物が脱アミノ反応以外の何らかの機能を獲得してγPGA 合成を直接制御する転写因子
DegU の発現量を増加させたと推定された．
枯草菌 Bacillus subtilis の YabJ は、1999 年に結晶構造が決定されている．
YabJ はホモ 3 量体を形成しており，そのサブユニット間に形成される空隙内で脱アミノ反応を行う酵素であることが後に報告されている．見出された変異体を作成し大腸菌で発現したところ、脱アミノ反応活性については確認されなかったが、Native 電気泳動およびゲル濾過クロマトグラフィーでは、変異体タン
パク質は野生型タンパク質よりも大きな見かけの分子量を有することが明らかになり、変異が入ることによってその立体構造や多量化機構に変化が生じた可能性が示唆された．そこで、１アミノ酸変異によりどのような立体構造変化が起き、γPGA の生産回復が引き起こされるのかを明らかにするために、機能獲得変異型 YabJ の立体構造解析を行なった．機能獲得変異型 YabJ は野
生型 YabJ とは異なる多量化構造をとっていることが明らかとなった．

P2-072L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
MLF-BL03, PF-BL05

茨城県生命物質構造解析装置 iBIX によるトランスサイレチ
ン変異体の中性子回折実験
Title Neutron diffraction study of transthyretin variant
by using iBIX
日下勝弘 1、横山武司 2、山田太郎 1、矢野直峰 1、田中伊知朗 1、水口峰之 2
1 茨城大 iFRC、2 富山大 薬学部

トランスサイレチン(TTR)は線維化し組織に沈着することでアミロイドーシスを引き起こすタンパク質である。TTR 野生型のアミノ酸残基 Tyr116 を Val に置き換えた変異体は野生型より安定であり、Tyr116 を Ser に置き換えた変異体は野生型より不安定で線維化しやすい。特に Tyr116Ser 変異体は難病である家族性アミロイド神経症(FAP)を引き起こす。本研究では野生型とは安定性の異なる Try116Ser 変異体の安定性変化（=線維化）のメカニズムを解明し、FAP発症を抑制する新たな知見を得ることを目的とし、中性子回折実験を試みた。
精製した TTR 変異体 Tyr116Ser を用い大型単結晶育成の条件検索を行い、重水溶液下でシッティングドロップ法により、中性子回折実験に適用可能な
2.4mm3 の大型単結晶を得ることに成功した(Fig. 1)。中性子回折計である
J-PARC、物質生命科学実験施設に設置された茨城県生命物質構造解析装
置 iBIX を用いて中性子構造解析用の TOF 回折データの測定を試みた。得られた単結晶は、非常にシャープな回折パターンを示し(Fig. 2)、分解能で 1.9Å程度の中性子構造解析可能なデータの取得に成功した。同時に X-N Joint
refinement 用の X 線回折データ(分解能:1.4Å)も取得することができた。本報
告では、データの統計精度、データ処理・解析の状況を報告する。

Fig.1 Try116Ser 変異体の大型結晶

Fig. 2 得られた回折パターン

P2-073L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
BL-5A

Duvenhage ウイルス P 蛋白質 C 末端ドメインの構造解析
Crystal structure analysis of the C-terminal domainof Duvenhage virus P protein
杉山葵 1,

蒋欣欣 2, 前仲勝実 2, 姚閔 1，尾瀬農之 1,2
1 北大院生命，2 北大院薬，

多くのウイルスは，宿主を支配するために宿主の免疫機構を阻害し，自身の 増 殖 に 有 利 な 環 境 を 作 り 出 す ”Counteraction” 機 構 を 持 つ 。
Counteraction の標的の一つは STAT である。STAT は代表的な抗ウイルス免
疫経路であるインターフェロン (IFN) 経路の中心的役割を担う。STAT 不活化の報告は，麻疹ウイルス等のパラミクソウイルス科のウイルスによるものが多いが，ラブドウイルス科の狂犬病ウイルス (Rabies Virus, RV) についても報告されている。
狂犬病は，狂犬病ウイルス (RABV) が引き起こす人獣共通感染症である。
RABV は，ラブドウイルス科リッサウイルス属に分類される (-)一本鎖 RNA ウ
イルスである。すべての食肉目に感染する非常に広い宿主域を持つうえ，発症後の治療法は確立されておらず，発症すればほぼ 100％が死に至る。そのため，すべての大陸に渡って年間 55,000 人の死者を出している。RABV の感染を感知した宿主細胞は，JAK-STAT 経路を活性化させ，RABV の排除を試みる。一方，RABV ゲノム中にコードされる P 蛋白質は，STAT 分子との相互作用により JAK-STAT 経路を不活化し，免疫逃避により自らの増殖に有利な環境へと誘導する。しかし，STAT 分子と P 蛋白質の詳細な結合構造は明らかになっておらず，STAT 分子を P 蛋白質が認識，不活化する機構は不明である。
私達は RABV が宿主の JAK-STAT 経路を阻害する仕組みを解明するため，
STAT 分子や P 蛋白質を高純度で精製し，相互作用解析を始めとした分子レベルでの研究をおこなってきた。Duvenhage ウイルス(DUVV)は同じリッサウイ
ルス属の弱毒性ウイルスであり，STAT 分子の不活化能力が低い。不活化を担っている P 蛋白質を RABV と DUVV で比較するため，DUVV の P 蛋白質 C
末端ドメインの結晶構造解析をおこなった。

P2-074L ＜生物物理, 生物化学（結晶構造解析)＞
PF BL17A, SPring-8 BL38B1

高度好塩菌 H. salinarum 由来チオレドキシンの立体構造と高塩濃度適合機構
Tertiary structure and haloadaptation mechanism ofthioredoxin from extreme halophile H. salinarum
新井栄揮 1、柴崎千枝 1、清水瑠美 1、安達基泰 1、
石橋松二郎 2、徳永廣子 2、徳永正雄 2
1 量研・量子生命科学領域、2 鹿児島大・農学部
塩湖や塩田などの高塩濃度環境に生息する極限環境生物・高度好塩菌は外界との浸透圧調整のために細胞内に飽和濃度の塩(～35% K+)を保有する。
高度好塩菌が産生する蛋白質（以下、好塩菌蛋白質）はそのような高塩濃度
環境においても機能を保持する。好塩菌蛋白質の高塩濃度適合機構は、高含量の酸性アミノ酸による高い可溶性と、低含量の疎水性アミノ酸(Val, Leu,
Ile, Phe)による構造の可塑性（塩析の効果によるコア構造の安定化）などの特徴に基づくことが知られる。しかし、それらの特徴は必ずしも普遍的ではない[1]。また、好塩菌蛋白質の高塩濃度適合機構は、例えば有機溶媒中のような低水分活性環境下でも機能する酵素触媒システムなど、新たなバイオテクノ
ロジーの開発に応用できると期待される。これらの背景から、様々な好塩菌蛋
白質について更なる構造・機能研究が求められている[1]。
我々は当該研究の一環として、既知の好塩菌蛋白質の中でも特に酸性アミノ酸含量が高い[（Asp + Glu）/（Arg + Lys + His）= 9.0] 高度好塩性古細菌
Halobacterium salinarum NRC-1 由来チオレドキシン（以下、HsTRX-A）について X 線結晶解析及び円偏光二色性解析により立体構造・溶液構造を明らかにし、高塩濃度適合機構の解明を試みた[2]。PF BL17A および SPring-8
BL38B1 を利用して決定した HsTRX-A の立体構造（PDB ID: 6KIL、分解能
1.6Å）を相同性のチオレドキシンと比較した結果、HsTRX-A の活性残基（Cys45 および Cys48）の周辺には他の TRX には見られない水和水ネットワー
クが存在することが明らかになった。この水和水ネットワークは触媒反応に必要なプロトン輸送を効率化し、高塩濃度・低水分活性環境での機能発現に寄与すると推察された。また、HsTRX-A は長く柔軟な N 末端領域（Ala2-Pro17）を有し、この領域が酸性アミノ酸含量の増大や高塩濃度下における構造安定性・可溶性・酵素活性の向上に寄与することが明らかになった。更に、この N
末端領域は活性部位を阻害しない位置に伸長しており、HsTRX-A は高塩濃度適合のために合理的な分子進化を遂げたことが示唆された。
[1] Karan R et al., (2012) Aquat. Biosyst. 8, 4
[2] Arai S et al., (2020) Acta Cryst. D76, 73