高分子科学最近の進歩

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生体親和性高分子のハイスループットスクリーニング―バイオ界面水の役割と中間水コンセプトによる材料設計―
田中賢

山形大学大学院理工学研究科バイオ化学工学専攻［992-8510］米沢市城南 4-3-16
教授，博士（理学）．
専門はバイオマテリアル設計工学．
tanaka@yz.yamagata-u.ac.jp
www.bio-material.jp/

1．はじめに
1.1 医療現場のニーズが不明であるため、副作用の予測が困難であった。このような材料開発の現状から、医療現場が必要としている“血栓が形成されない”、“感染しない”、“副作用がない”デバイスの開発が遅れていた。生体親和性合成高分子材料の開発分野において、生体成分の接触界面：バイオ界面で起こるイベント（図 1）の高感度解析技術と分子設計技術を連結することで、精度の高いスクリーニング手法の確立が期待されている。
本稿では、医療高分子材料設計におけるバイオ界面水の役割および精度の高いスクリーニング手法に関連した研究について紹介する。

日本人の 3 大死因である「がん、心疾患、脳血管疾患」の増加にともない、健康で安心して暮らせる社会の構築が急務である。国際的に高齢社会が急速に進み、病気の超早期診断機器や生体接触型のフレキシブル医療材料・デバイスが求められている 1）。しかし、材料が生体成分と接触すると、炎症反応、免疫反応、アレルギー反応、血栓形成反応、感染などの異物反応が引き起こされる 1）。したがって、超早期診断ヘルスケアセンサ・治療技術の開発のためには、生体から異物と認識されず、生体を損傷しない性質を有する副作用のない生体適合
2．生体親和性合成高分子表面性・血液適合性を有する生体親和性高分子の開発が望まれている 1）。しかし、精度が高く簡便な高分子設計・これまでに、生体親和性合成高分子の表面 2）としては、スクリーニング技術は確立されていない。
ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルピロリド
医療現場での喫緊の課題である診断・治療技術の高ン（PVP）、ポリ（2 -ヒドロキシエチルメタクリレート）度化に必要な高分子材料の開発には、バイオ界面にお （PHEMA）などの親水性表面、親水・疎水、ソフト・ハー
ける生体側および高分子側における、マクロから分子ド、結晶・非晶などの相分離表面、ポリ（2 -メトキシエレベルまでの多種多様な情報の統合が必要である。また、 チルアクリレート）（PMEA）3）および類似体の表面な高付加価値な医療分野においても国際競争力が問題とどが報告されている。近年、ノニオン性の PEG 誘導体なっており、材料やプロセスコストを考慮した研究開で水酸基を多く含むポリグリセロール 4）、ホスホベタ発が課題である。
イン・スルホベタイン・カルボキシベタイン（図 2）な1.2 医療材料のスクリーニング方法
どの 1 分子中にプラス荷電とマイナス荷電の両方の官
これまでの医療材料の開発は、無限の候補材料の中能基を有する両性イオン性高分子表面のタンパク質吸から、開発者の経験と勘に頼って一次スクリーニング
着や血球細胞の粘着の抑制についての報告 5）が相次いを行うことで、リード材料を抽出し、動物実験・臨床でいる。生体親和性発現の機構として、表面自由エネ試験を経て行われてきた。したがって、スクリーニンルギー、分子運動性、粘弾性などのファクターの影響グの精度が低く、開発に時間とコストがかかっていた。 が指摘されている 1）。表面の微細形状、親水・疎水性、また、最終候補材料の生体親和性などの機能発現機構
粘弾性などを組み合わせたスクリーニング技術も報告されている 6）。しかし、生体親和性を規定するタンパ(a)接着した細胞
バイオ界面水(b)CH3nnO

バイオ界面水吸着タンパク質

図1542

含水状態の高分子鎖

バイオ界面の模式図©2014 The Society of Polymer Science, Japan

(c)

CH3

図2OOOOPOON

CH3nO
NOSOOOOONO

双性イオン型メタクリレート高分子の化学構造例（a）
ホスホベタイン（b）スルホベタイン（c）カルボキシベタイン
高分子

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ク質の吸着や細胞の接着性、増殖性に対しては必ずしも明確な相関性が見られず、生体側、材料側のさまざまな因子が複合的に影響する生体親和性の発現機構は十分に解明されていない。一般に、材料のバルクと表面の特性は、乾燥状態もしくは真空状態での解析結果を元に議論される。しかし、ほとんどの医療製品は滅菌された乾燥状態から含水状態へ環境が変化する。したがって、高分子材料の表面特性と生体親和性との相関を明らかにし、優れた医療材料を開発するためには、上述のパラメーターに加え、材料に水が吸着した含水状態での物性解析が重要である。

3．バイオ界面の水和状態
ヒト血液中には、血小板、白血球、赤血球などの細胞成分と血漿タンパク質成分が、緩衝溶液（37 ℃、pH 約7.4、塩濃度約 0.16 M）に分散、溶解している。医療製品を構成する合成高分子表面に血液が接触すると、血液に存在する水分子やイオンが材料表面にただちに吸着し、材料の表面近傍は数秒から数分のうちに飽和含水状態になる。ついで、血液中に存在するタンパク質が吸着、変性し、これにより生体防御系の活性化が起き、血栓形成などが引き起こされる。したがって、材料に吸着した水分子の状態が医療製品の性能に大きな影響を与えると考えられる。
水和状態の議論の際には、言葉の定義の統一化が図られていないので注意が必要 2）であるが、細胞生物学や医療材料における水和状態の重要性は古くから指摘 されてきた 7）。Bruck ら 8） は、PHEMA や ポリアクリルアミドハイドロゲルの血液適合性発現のためには適切な含水量が存在することを示した。Andrade9）やRatner ら 10）は、血液適合性発現には表面に吸着した水の量だけでなく吸着した水の構造も重要因子であると 提 案 している。 丹 沢 ら 11）は、poly（ ethyleneglycolmethacrylate）ハイドロゲル中の水や高分子鎖の分子運動性の重要性を指摘している。Lu ら 12）は、高分子表面の水とタンパク質表面の水の交換がタンパク質吸着に影響することを述べている。Israelachvili ら 13）は材料表面の水の安定性、密度、配向がタンパク質吸着や細胞接着に対する材料の能力の違いをもたらすと報告している。 また、Grunze ら 14）は、PEG の 薄 膜 界 面 に存在する水の層の安定性がタンパク質吸着を抑制する因子の一つであることを予測している。Kataoka ら 15）は、飽和含水量から不凍水量を引いた水の量が血液適合性発現にとって重要であると提案している。Ishiharaら 16）は、リン脂質に類似したメタクリロイルホスファチジルコリン（MPC）とブチルメタクリルレートの共重合体がタンパク質の吸着が少なく、吸着タンパク質の二次構造が維持され、血小板適合性に優れる理由として、この共重合体中の自由水の割合が多いことを理高分子

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由に挙げている。MPC ポリマーの結合水の割合に注目した報告例もある 17）。Yui らは、ポリロタキサンブロッ
ク共重合体の水和状態での分子運動性と細胞接着や幹細胞分化挙動との相関について明らかにしている 18）。

4．水和状態の解析と材料スクリーニング
高分子材料に吸着した水の構造の評価法 19）として、核磁気共鳴法、誘電緩和法、振動分光法（赤外、ラマン、和周波発生（SFG））、示差走査熱量法（DSC）、X 線回折法、中性子散乱法などが知られている。たとえば、
DSC、固体 NMR、時間分解能に優れたその場全反射赤外分光（in situ ATR-IR）測定により、材料に吸着した水分子の構造を分類することができる。含水した状態の天然高分子および生体親和性を有する合成高分子のDSC 測定を行った結果、昇温過程において水の低温結晶形成に由来する発熱ピークおよび水の低温融解に由来する吸熱ピークが共通して観測された 2），3）（図 3）。含水量と DSC による各転移における熱量から、高分子材料に吸着した水を 1）自由水、2）不凍水、3）中間水に分類した（表 1）。純水のみを測定した場合、0 ℃に融解ピークが観測される。1）自由水は、高分子に吸着しているもののバルク水に近い性質で、高分子材料と弱い相互作用をしている水であり、0 ℃付近で融解する水、
2）不凍水は、高分子材料と強く相互作用し、－ 100 ℃においても凍結しない水、3）中間水は、自由水でも不凍水でもなく、高分子材料と中間的な相互作用をしている水であり、0 ℃よりも低い温度で低温結晶形成し、かつ 0 ℃よりも低い温度で低温融解する水、とそれぞれ定義した（表 1）。図 3 に示したように、含水 PMEAに存在する中間水は、－ 50 ℃以下では、氷を形成していないが、－ 50 ～－ 20 ℃付近で発熱をともなって結晶形成を示し、その後吸熱をともなって融解する水であることが XRD-DSC 同時測定により証明されている19）。
In situ ATR-IR 法により、材料の官能基レベルで吸表1高分子材料に含水した水の分類と特徴
不凍水

水の分類

中間水

自由水

Tightly bound water/
Loosely bound water/ Scarcely bound water/Freezing water/
Non-freezing bound water Freezing bound water/Free waterIntermediate water

天然高分子

○○

○

生体親和性あり○○○

生体親和性なし○－○

温度変化による相転移特性

0℃以下で凍結しない

0℃以下で凍結する

0℃で融解する

固体NMR 測定による水分子の緩和時間 τc (s)10-8～10-6

10-10～10-9

10-12～10-11

ATR-IR測定による水分子のOH伸縮振動 (cm-1)

3600

3400

3200

高分子鎖への結合力

強中弱（タンパク質、糖類、核酸など）

合成高分子©2014 The Society of Polymer Science, Japan543

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水の低温結晶形成

吸熱 発熱

昇温時に低温結晶形成を示した氷の低温融解

nOOO

降温時に結晶形成
した氷の融解Poly(2-methoxyethyl acrylate)(PMEA)-60

図3-40-20

温度 [°C ]0

飽和含水状態の PMEA の DSC 昇温カーブ

着した水の構造が明らかになっている 2）。赤外スペク
トルは水素結合による水の構造を反映してその形が変わるので、得られたスペクトル形状から吸着した水の構造を分子レベルで予測することができる。生体親和性材料の飽和含水状態を示す水の吸着後期では、バルク水と類似した水素結合構造をもつ水が吸着していた。
また、吸着中期では、自由水ほど大きなクラスターではないが、不凍水ほど孤立していない中間的な大きさの水和構造が示された。
固体 NMR の温度可変測定の結果 2）、含水した生体親和性高分子の DSC 測定により観測された低温結晶形成を示す中間水が検出された。この水は、分子運動性が高いことがわかった。一方、生体親和性に劣る高分子材料に吸着した水の分子運動性は、含水率や温度に依存して大きく変化し、含水率が低く、測定温度が低いほど吸着水の分子運動性が低いことがわかった。また、水の分子運動性を支配する駆動力の一つは高分子の主鎖と側鎖の分子運動であり、これに吸着した水は高分子との協同運動をしていると考えられる。すなわち、生体親和性発現には高分子の主鎖と側鎖そのものの運動性も大きくかかわっていることが示唆された。
NMR、IR、SFG、表面自由エネルギーなどの測定の結果、（1）高い分子運動性を有する高分子鎖に弱く束縛され、低温下でも分子運動性の高い中間水の存在、（ 2）
中間水は自由水と不凍水の中間の物性、（3）中間水は高分子表面にも安定に存在することが示された。つまり、
中間水は、生体親和性を有する合成高分子と天然高分子に共通して観測される、自由水と不凍水の中間の性質を示す水であると定義できる。
原子間力顕微鏡（AFM）探針にタンパク質を固定し、高分子との相互作用を検討した結果、生体親和性高分子とタンパク質の相互作用が小さいことが明らかになった。
高分子－タンパク質間に作用する接着力の測定をさまざまな pH、イオン濃度の溶液条件で行ったところ、高分子－タンパク質間の弱い相互作用は、疎水性相互作用・親水性相互作用、水素結合や静電的相互作用では説明できず、高分子およびタンパク質表面の中間水が物理的544©2014 The Society of Polymer Science, Japanなバリアーとして重要な役割を果たしていることが示唆された 1）,2）。なお、生理環境下において、高分子表面での中間水の存在は、各種表面・界面解析・計算によって示されている 1）,2）。
以上の結果より、これまで報告されてきた各種物性では説明がつかなかった生体親和性のより上位の指標として、中間水が位置づけられる可能性が考えられる。

5．中間水を有する高分子
上述のような特徴を有する中間水は、以下に示す高分子に共通して観測された（表 1）。
天然高分子としては、ヒアルロン酸、コンドロイチ
ン硫酸、ヘパリンなどの多糖、ゼラチン、アルブミン、チトクローム C などのタンパク質、デオキシリボ核酸、リボ核酸などの核酸などに観測されている。
合 成 高 分 子としては、PEG、PVP、PMEA、ポリメチルビニルエーテル、ポリテトラヒドロフルフリルアクリレート、図 2 に示した両性イオン型高分子などに共通して観測された。一方、生体親和性が劣る高分子には、親水性、疎水性にかかわらず中間水は認められなかった。
また、中間水が形成されるためには、含水状態でのガラス転移温度、水和力、分子運動性の組み合わせが重要であることがわかった。中間水は、天然高分子と生体親和性合成高分子の共通点であることから、優れた高分子材料の簡便なスクリーニング方法としても有用である。
共重合体の場合、水のプライミング効果により最表面とバルク物性が大きく異なるケースに注意が必要であるが、HEMA をベースとするアミン系モノマーとの共重合体および長崎らにより合成された HEMA グラフト共重合体 2）にも中間水が観測され、HEMA ホモポリマーに比べて優れた血液適合性を示した。これは、少量のアミンや高分子鎖の分子運動性により、不凍水を形成している水素結合が破壊され、中間水が形成されやすくなったためと考えられる 2）。
最近、水と高分子の界面の分子構造と配向を解析できる SFG 装置が開発されつつあるので、バイオ界面の水の配向構造の解析への期待が高まっている 20）。

6．材料の中間水量と細胞選別
超早期診断用ヘルスケアセンサの実現のためには、生体接触面での炎症の回避やシグナル／ノイズ（S/N）
比の向上が必要不可欠である。この S/N 比向上のためには、目的以外のタンパク質の基板への吸着、構造変化および目的以外の細胞の接着を抑制する必要がある。
これまでに知られている生体親和性材料の中でもとりわけ 血 液 適 合 性 高 分 子 は、 タンパク 質 の 吸 着・ 変性や細胞接着が引き起こされない性質を示すもので
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図4

血液適合性と癌細胞接着性を併せもつ高分子材料による早期癌診断・薬剤スクリーニングシステム

あった。PMEA およびその類似体は、血球細胞は接着しないが、 癌 細 胞 は 接 着 する 現 象 が 見 いだされた 21）（図 4）。高分子材料に吸着するタンパク質の量および細胞接着を誘起する構造変化が、血球細胞が接着するためのリガンドであるフィブリノーゲンと癌細胞が接着するためのフィブロネクチンでは異なることが機構の一つであることがわかった 21）。さらに、高分子へのタンパク 質 の 吸 着 とそれにともなう 構 造 変 化 は、 中間 水 の 量 によ っ て 制 御 できることが 見 出 された。 この中間水の量は、高分子側鎖の化学構造および側鎖間隔 22）により制御できることが明らかにされている。
近年、国民の 2 人に 1 人が罹患する癌の早期診断技術として、血中循環癌細胞（CTC）が注目されている。これまでに検討されてきた CTC の検出方法としては、上皮細胞接着分子（EpCAM）に対する抗体を用いた方法が知られている 23）。しかし、EpCAM を喪失した癌細胞が多く、すべての種類の CTC が検出できない問題がある。
また、CTC を生体外で増殖後に、抗癌剤の評価を行う
場合、抗体との反応により、細胞の薬剤への応答が変化することが問題となっている。これらの課題を克服する手法として、細胞の基材への接着強度の差を利用したハイスループットな細胞選別の可能性が提案されている 21），24）。最近、バイオ界面での現象を光の回折現象をはるかに超える空間分解能を有するハイスループッ
ト三次元超解像顕微鏡 25）が登場しており、含水状態でのバイオナノ空間の高解像解析が進められている。
バイオ界面水：中間水コンセプトによる材料スクリーニ
ング技術は、医療・ヘルスケア分野のみならず、環境・エネルギー分野における汚れの付着防止技術、安全な抗菌性・抗感染性材料の設計 26）にもつながる可能性が考えられる。

7．おわりに
以上本稿では、生体親和性材料に形成される水和状態に着目したスクリーニングの例などを紹介した。優れた材料に普遍的な特徴を明らかにするためには、理論科学と実験科学を有機的につなぐ必要がある。最後に、文部科学省学術調査官の立場からの宣伝として、高分子材料に関する最近の文部科学省新学術領域には、ソフト界面（前田瑞夫領域代表 H20 ～ H24）、融合マテリアル（加藤隆史領域代表 H22 ～ H26）、ナノメディシン分子科学（石原一彦領域代表 H23 ～ H27）、元素ブロック（中條善高分子63 巻

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樹領域代表 H24 ～ H28）、生物規範工学（下村政嗣領域
代表 H24 ～ H28）、柔らかな分子系（田原太平領域代表
H26 ～ H30）など、いずれの領域に関しても、材料設計に関する新しい学理の追及が行われている。材料開発における上位パラメーターに関して基礎研究が進むことにより、わが国のものづくりへの波及効果が期待できる。
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