課題番号 ０５Ｂ－２２

研究題目 細胞膜におけるリン脂質の非対称分布とその崩壊

研究組織研究代表者：長田 重一（大阪大学免疫学フロンティア研究センター）
共同研究者：小迫 英尊（徳島大学先端酵素学研究所）
研究分担者：櫻木 崇晴（大阪大学免疫学フロンティア研究センター）【1】研究の概要[1-1]本研究の目的・概要
動物の細胞膜は脂質二重層から成り立っているが、それを構成するリン脂質は外膜と内膜で非対称的に分布している。この非対称的分布は、アポトーシスを起こした細胞や、活性化された血小板等において崩壊する。私達は細胞膜の非対称性の維持、崩壊に関与する 3 種類の膜タンパク質を世界に先駆けて同定した。本研究はこれら分子の作用機構を明らかにすることを目的としている。
[1-2]研究の方法・経過
XKR family に属する膜タンパク質(XKR4,XKR8 および XKR9)はアポトーシス時にカスパーゼによって活性化され、スクランブラーゼとして作用する (Suzuki et al. Science 2013、J.Biol.
Chem. 2014)。一方、マウス Ba/F3 細胞でマウス XKR8 や XKR9 を発現させるとカスパーゼ刺激によらない活性化が認められる。この活性化はキナーゼの阻害剤で抑制されることから、
XKR8 や XKR9 のスクランブラーゼ活性はリン酸化によって制御される可能性が考えられた。
2019 年度の本共同研究においてマウス XKR8の C-末端領域に存在する 3 個のThreonine/Serine 残基がリン酸化されることを見出した。一方、最近 XKR9 の細胞質領域に存在するする 12 個の Ser, Thr, Tyr 残基に変異を導入、2 個の残基がリン酸化されることを見いだした。そこで本研究は、XKR8 や XKR9 のリン酸化がタンパク質への構造、活性へ及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。

【2】研究成果[2-1]本共同研究で明らかになった研究成果
2022 年に私達が決定した XKR8 の構造によると XKR8 の底部、細胞質側には窪みが存在し、その窪みに C-末端部位が疏水結合、イオン結合などにより結合している。構造をもとに、これらの結合に関与しているアミノ酸に変異を導入すると XKR8 の scramblase 活性は顕著に増大した。このことは XKR8 の C-末端部位が Plugとして分子の底面に結合、分子の機能を制御していることを示唆している。
[2-2]本共同研究による波及効果及び今後の発展性
スクランブラーゼやフリッパーゼは両親媒性を持つリン脂質を疎水性の脂質二重層からなる細胞膜上で反転させるトランスポーターであり、その分子機構はこれまで全く不明であった。これまでに私達は XKR8 の分子表面にリン脂質の入り口と考えられる疎水性の溝と分子内に親水性の洞窟を同定した。今回、XKR8 のリン酸化部位の同定からその C-末端部位が活性制御に重要な役割を担うことが示された。今回樹立した
XKR8 の構成的活性型は活性型 XKR8 の三次構造を明らかにするうえで有用であろう。
【3】主な発表論文等[3-1]論文発表
1. Sakuragi, T., Kanai, R., Tsutsumi, A., Narita, H.,Onishi, E., Nishino, K., Miyazaki, T., Baba, T.,
Kosako, H., Nakagawa, A., Kikkawa, M.,
Toyoshima, C., and Nagata, S.: The tertiary
structure of the human Xkr8-Basigin complex
that scrambles phospholipids at plasmamembranes. Nat. Struct. Mol. Biol. 28: 825834, 2021
2. Segawa, K., Kikuchi, A., Noji, T., Sugiura, Y.,
Hiraga, K., Suzuki, C., Haginoya, K.,
Kobayashi, Y., Matsunaga, M., Ochiai, Y.,Yamada, K., Nishimura, T., Iwasawa, S., Shoji,W., Sugihara, F., Nishino, K., Kosako, H.,
Ikawa, M., Uchiyama, Y., Suematsu, M.,
Ishikita, H., Kure, S., and Nagata, S.: A
sublethal ATP11A mutation associated withneurological deterioration causes aberrant
phosphatidylcholine flipping in plasma
membranes. J. Clin. Invest. 131: e148005, 2021
3. Nagata, S. and Sakuragi, T.: Regulation ofphospholipid distribution in the lipid bilayer byflippases and scramblases. Nat. Rev. Mol. CellBiol. 24: 576-596, 2023
4. Sakuragi, T.,Kanai, R., Otani, M., Kikkawa, M.,
Toyoshima, C., and Nagata, S.: The role of theC-terminal tail region as a plug to regulate
XKR8 lipid scramblase. J. Biol. Chem. 300,105755, 2024[3-2]学会発表
1. 櫻木崇晴, 金井隆太, 包明久, 成田宏隆, 大西映里子, 西野耕平, 宮﨑拓也, 馬場威, 小迫英尊, 中川敦史, 吉川雅英, 豊島近, 長田重一：「細胞膜リン脂質スクランブラーゼであるヒト XKR8-Basigin 複合体の立体構造」第 44 回日本分子生物学会年会、口頭発表 横浜（令和 3 年 12 月 2 日）
2. 櫻木崇晴、長田重一: 「細胞膜リン脂質スクランブラーゼ XKR8-Basigin 複合体の構造解析」、第 95 回日本生化学会大会 シンポジウム招待講演 名古屋（令和 4 年11 月 9 日）
3. Shigekazu Nagata “Regulation ofphospholipid distribution by flippase andscramblase” The 3rd Japan and Australia
Meeting on Cell Death 2023, Special Lecture
Melbourne, Australia（令和 5 年 8 月 17日）
4. Shigekazu Nagata “Regulation ofphospholipid distribution in the lipid bilayer byflippases and scramblases” The 18thInternational Symposium of the InstituteNetwork for Biomedical Sciences 東京医科歯科大学 シンポジウム招待講演 東京（令和 5 年 10 月 5 日）

【4】今後の課題等
今後はどのような生理条件下でこれら分子がリン酸化によって活性化されるか示す必要がある。その目的のためには、これら分子をリン酸化するキナーゼの同定が必須であろう。