Application NoteGenomics

ハイブリダイゼーションキャプチャ法による
SARS-CoV-2 ウイルスゲノムのシーケンス解析
著者

元岡 大祐
大阪大学微生物病研究所
遺伝情報研究センター
ゲノム解析室石井 善幸、吉崎 史子
アジレント・テクノロジー
診断・ゲノミクス部門

概要

本アプリケーションノートでは、SARS-CoV-2 ウイルスの全ゲノムシーケンスを SureSelectXT Low Input およびカスタムキャプチャパネルを用いて実施した例を紹介しています。
Bravo NGS 自動化システムによりサンプル調製を行い Illumina MiSeq でシーケンスを行ったところ、SARS-CoV-2 ウイルスゲノムをカバーするリードが得られアルファ株、デルタ株、オミクロン株ともに検出可能でした。ハイブリダイゼーション法による方法であるため武漢で発見された SARS-Cov-2 レファレンスゲノムから塩基が変異した様々なタイプの変異株にも同じ手法で検出可能となることが期待されます。

方法

キャプチャパネルのデザイン

SARS-CoV-2 ウイルスの 全 ゲノム 配 列（NCBI Accession: NC_045512.2）に対し、120 bp のプローブを 20 bp ずつずらしながらタイリングし、6x 相当のタイリングとしました。アジレント社の SureDesignに配列を Upload する際に、Optimized
Performance XT HS/XT HS2/XT LI/
QXT boosting（90 min hyb）オプションを選択し GC 含量によるキャプチャバイア

スを最適化しました。キャプチャパネルの情報はアジレント社から共有可能です。

cDNA 合成と精製

抽 出 済 み RNA 15 µL を用 いて、Proto

Script II First Strand cDNA Synthesis
K i t（ N E B ; p a r t n u m b e r E 6 5 6 0 ）、
Random Primer（ hexadeoxyribo（タカラnucleotide mixture; pd（N）6）
バイオ ; part number 3801）によりプロトコルの 2.5 倍量（Total volume 50 µL）
で 1st strand cDNA 合成を行いました。
RNA 抽出は外部施設で行われているサンプ ル も 多 い た め、RNA 重 量 で は なくRNA 溶液の容量でスタート量を決定しました。

2

続けて NEBNext Ultra II NonDirectional
RNA Second Strand Synthesis Module（NEB; part number E6111）により 2nd
strand cDNA を 合 成 し ま し た。2nd
strand cDNA 合 成 のプ ロトコ ル で 1st
strand cDNA の持ち込量はプロトコル上
20 µL のところ、50 µL の全量を持ち込み、
Nuclease water 量 で 調 整 す るこ とで80 µL の 反 応 液 量 と し ま し た。2nd
strand cDNA 合成後の反応液 80 µL に対して 96 µL の Agencourt AMPure XP（ Beckman Coulter; part numberA63880）を用いて精製を行い、8 µL のNuclease free water で 溶 出しました。
溶出したサンプルの 1 µL を用いて Qubit
4 Fluorometer で Qubit dsDNA HSAssay を用いて定量しました。

SureSelect XT Low Input によるライブラリ調製とターゲットエンリッチメント

精製した 2 本鎖 cDNA の全量（7 µL）を用い、SureSelect XT Low Input キット
および SureSelect XT HS and XT Low
Input Enzymatic Fragmentation キット
を用い、プロトコルの Pre Capture PCR
サイクル数を改変しライブラリ調製を行いました。PCR サイクル数は Table 1 に記載されています。

ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー ショ ン の 条 件 は� Utilization of Agilent SureSelectTarget Enrichment for Whole Genome
Sequencing of Viruses and Bacteria�
に従い、アダプタ付きライブラリ 1000 ngをインプットとしました。キャプチャプロー
ブ を 1：10 で 希 釈 し て 使 用 し、PostCapture PCR は 21 サイクルとしました。
SureSelect XT Low Input によるライブ
ラリ調製とターゲットエンリッチメントのス
テップは、Bravo NGS 自動化システムで行いました。 最 終ライブラリは Agilent
4200 TapeStation で High Sensitivity
D1000 ScreenTape キットを用いてサイズ分布を分析し、Qubit 4 Fluorometer
で Qubit dsDNA HS Assay を用 いて定量しました。定量結果により等重量ずつ混 合し、 最 終 濃 度 を PCRmax Eco 48
real time PCR system で KAPA Library
Q u a n t i f i c a t i o n k i t s（ R o c h e , p / n07960140001）を用いて決定し、MiSeqで 150 bp ペアエンドのシーケンスを行いました。

データ解析

得られた FASTQ ファイルは AGeNT によりアダプタ配列を除去後に BWA-mem を用いてレファレンスゲノム NC_045512.2にマッピングし、Picard でソート後 にDuplicate を判定しインデックスを作成しました。

結果

2 本鎖 cDNA およびライブラリの収量

２本鎖 cDNA の収量は 0.5 ng 以下のサンプルから、200 ng 以上のサンプルまで大きなばらつきがありました。2 本鎖 cDNAはすべてライブラリ調製に用い、cDNA収量にあわせて PCR サイクル数を増やすことにより全サンプルでハイブリダイゼーションに必要な 1000 ng を超える収量のアダプタ付きライブラリが得られました（Table 1）。ハイブリダイゼーション後、全サンプルでシーケンスに十分な収量が得られました。TapeStation によるサイズ確認の一例を Fig.1 に示します。

Table 1. 各サンプルの収量および適用した PCR サイクル数

Ct 値cDNA 収量（ng）

Cycle 数アダプタ付きライブラリ収量（ng）

233.3

1.015

182028

61.3

3

26.7

0.742

181788

50.1

4

30.7

0.497

182052

49.1

529.6

3.304

16

1968

49.5
61.5

Sample
127.6

5.306

161932

ハイブリダイゼーション後ライブラリ濃度（ng/µL）

59.3

6

23.3

140.7

121212

7

22.6

46.69

121416

638

26.7

241.5

121236

20.2

922.6

15.47

16136854.4

1024.412.2516148851.6

Fig.1 ハイブリダイゼーション後の最終ライブラリを Agilent 4200 TapeStation で High-Sensitivity D1000
キットによりの泳動した例

3リード数と平均カバレッジ
Read counts
and average coverage

1400000

4000

1200000

3500
3000

1000000
Read counts

インプットとして用いた cDNA の量や、Ct値から予想されるウイルス量には広い範囲のばらつきがありましたが、最終的にシーケンスを行い得られたリード数は最大 2.3 倍の範囲となりました（Fig.2）。Ct値が 33.3 と 10 サンプルの中で最も高く、ウイルス量 が最 も少 ないと予 想されるサンプル 2 については Duplicate% が高く（Fig.3）そのため平均カバレッジはほかのサンプルより低くなりましたが、100x 以上カバーされている領域は 99.8％であり変異解析には十分なシーケンス量が得られました。On Target % は全サンプルで95% を超えており、ヒトゲノム DNA が混入する可能性があるサンプルであってもターゲットエンリッチメントを行うことで効率よくシーケンスを行えることが示されました。SARS-CoV-2 ゲノムの全域にわたってリードが得られ（Fig.4）、デルタ型の特徴的な変異 L452R やアルファ型の特徴的 な 変 異 N501Y も検 出 が 可 能でした（Fig.5）。

2500

8000002000

6000001500

4000001000

200000

Average coverage

シーケンス結果

500

00
12345

リード数
Read counts

67

8910

平均カバレッジ
Averagecoverage

Fig.2 各サンプルのリード数と平均カバレッジ
各サンプルのリード数（左軸）および平均カバレッジ（右軸）シーケンスメトリクス
SequencingMetrics

100806040
200123On Target
OnTarget%%

456

Duplicate %%Duplicate78910100x cov
100xcov

Fig.3 シーケンスメトリクス
SARS-CoV-2 レファレンスゲノムにマップされたリードのパーセンテージ（On Target ％）、Duplication のパーセンテージ（Duplicate %）、および 100x 以上の Depth が得られた塩基のパーセンテージ（100x cov）をPicard で算出しました。

4ハイスループット化

プレート単位でのサンプル調製を効率化するために、プレキャプチャ PCR のサイ
クル数を 18 サイクル、ハイブリダイゼー
ションの持ち込 み量 は 濃 度に関 わらず
12 µL で統一、と２つのパラメータを固定して実施しても安定して同様の結果が得られています。本プロトコルの確立後、6000 サンプル以上でライブラリ調製を行い、オミクロン株の同定も可能であることが確認され、また解析不能サンプルは 10サンプル未満（いずれも Ct 値 35 前後のサンプル）でした。

Fig.4 SARS-CoV-2 レファレンスゲノムに対するカバレッジ

Fig.5 検出された変異の例（A）デルタ型の特徴的な変異 L452R（B）アルファ型の特徴的な変異 N501Y

5結語

本アプリケーションノートで紹介したプロトコルは、広い範囲の Ct 値や二本鎖 cDNA 収量のサンプルに対して安定して使用可能であることが示されました。また、プロトコルの自動化によりハイスループットなウイルスゲノム解析が可能となり、大規模な疫学調査やウイルスの伝播・ゲノム進化などに関する基礎研究に貢献できるものと期待されます。

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