<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P1-092L

PF-BL1A、PF-BL17A

全長の LysR 型転写調節因子 CbnR-DNA 複合体のX 線結晶構造解析と転写活性化機構の解明
Crystal structure of the full-length LysR-typetranscription regulator CbnR-DNA complex
千田美紀１、Evdokia-Anastasia Giannopoulou１、Maharani Pertiwi Koentjro1,2、安達成彦１、小川直人 2,3、千田俊哉１
1 高エネ機構・物構研・構造生物学研究センター、2 岐阜大学、3 静岡大学
細菌の転写調節因子の一つである LysR 型転写因子（LTTR）は、アミノ酸生
合成・芳香族化合物分解・病原性関連因子産生・酸化ストレスへの応答など、様々な遺伝子群の発現制御を担っている。我々のグループでは、芳香族塩素化合物分解菌のクロロカテコール分解酵素遺伝子群の転写調節因子である
CbnR を研究ターゲットとして LTTR の研究を続けており、全長での LTTR としては世界で初めて結晶構造を決定した(1)。さらに、CbnR の DNA 結合ドメイン(CbnR_DBD)と認識配列 DNA（RBS）との共結晶構造を決定した（2）。これらの結果から LTTR 四量体の４つの DNA 結合部位が V 字型に配置することが示され、その V 字型構造により DNA を大きく折り曲げると考えられたが、全長LTTR と DNA との安定な複合体の共結晶構造解析の成功例はなく、LTTR がプロモーターDNA を認識し転写を活性化する機構については不明な点が多く残されていた。
そこで我々は全長 CbnR 四量体（1176 残基）とプロモーターDNA（RBS-ABSからなる 56 塩基対の DNA）との複合体の結晶構造を解明し、LTTR による転写制御の分子機構を明らかにすることを目指して研究を進めてきた。全長
CbnR-DNA 複合体の結晶の格子定数は長軸方向が 600 Å もある上に結晶が得られた当初は 6.9 Å 分解能のデータしか得られなかったが、分子置換法による解析で確かに DNA が結合していることを確認できた。その後クライオ条件の最適化により最終的には 3.6 Å 分解能での構造決定に成功した。得られた結晶構造からプロモーターDNA が約 70 度曲がった状態で結合していること、DNA の結合に伴い四量体を形成するドメイン(RD-I, RD-II, DBD)の相対的な位置が変化することが明らかになった。
References
1. Muraoka, S. Okumura, R., Ogawa, N., Nonaka, T., Miyashita, K., Senda, T.
(2003). J Mol Biol 328, 555-566.
2. Koentjoro, M. P., Adachi, N., Senda, M., Ogawa, N. & Senda, T. (2018).
FEBS Journal, 285, 977-989, doi: 10.1111/febs.14429

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P1-094L

PF-BL1A

ヒト由来 tRNAHis guanylyltransferase のヌクレオチド認識機構
Nucleotide recognition mechanism of
human tRNAHis guanylyltransferase
中村彰良
産業技術総合研究所 生物プロセス研究部門
tRNAHis guanylyltransferase (Thg1)は、真核生物に共通して存在し、細胞質
tRNAHis 前駆体の 5’末端に GTP を基質としてグアニン塩基(G-1)を付加する酵素として同定された。この G-1 は、ヒスチジル tRNA 合成酵素による認識に必須であり、翻訳に欠かせない。近年、Human Thg1 (hThg1)はミトコンドリア
tRNAHis (mtRNAHis) も基質として認識し、G-1 を付加することが明らかになった(1), (2)。興味深いことに、細胞質の tRNAHis は G-1 の反対側の鋳型塩基がアデノシン(A73)であるのに対し、mtRNAHis はシトシン(C73)である。しかし、hThg1
が鋳型塩基の異なる２種類の tRNAHis に対し、どのように GTP を付加するかは不明である。
我々の生化学実験から、細胞質のみで機能する真菌由来 Thg1 と、細胞質とミトコンドリア両方で機能する hThg1 では tRNA および GTP 認識機構が大きく異なることが示唆された。次に、未だ構造情報が得られていない hThg1 のmtRNAHis の認識機構を解明すべく、hThg1-mtRNAHis 複合体の結晶化を試み、
mtRNAHis の一部を含む hThg1 の立体構造を 4.0 Å 分解能で決定することに成功した。得られた hThg1 の立体構造はこれまでに報告されている hThg1 とは全く異なる空間群 P3(1)21 に属し、4 量体を形成していた。さらに、既知構造の
hThg1 ではディスオーダーしていた領域が、本構造では長いβシートを形成していた。興味深いことに、確認された mtRNAHis の一部と思われる電子密度は
このβシート近傍に位置していた。このβシート領域は古細菌由来 Thg1 ホモ
ログタンパク質では tRNA の D-loop と T-loop の相互作用部位を認識している。このことから、hThg1 においても mtRNAHis 認識にβシート領域が関与する可能性が示唆された。得られた生化学実験と立体構造情報の結果を統合することで、hThg1 には鋳型塩基に応じた２種類のヌクレオチド認識機構が存在することを提唱した。
(1)(2)

Nakamura A., Wang D., Komatsu Y., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2018) 503 2015
Nakamura A., Wang D., Komatsu Y., RNA (2018) 24 1583

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P1-095L

BL-1A, BL-5A, BL-17A, AR-NW12A, AR-NE3A

PF タンパク質結晶構造解析ビームラインでの全自動測定とリモート実験
An automated unattended experiment and a remoteinteractive experiment at PF macromolecular
crystallography beamlines
山田悠介 1,2、篠田晃 1、松垣直宏 1,2、引田理英 1,2、平木雅彦 2,3、千田俊哉 1,2
1
KEK, IMSS, SBRC, 2 総研大高エネ研究科, 3KEK, MEC
PF には 5 本のタンパク質結晶構造解析(MX)ビームラインがあり、学術研究や民間企業による研究に利用されている。各ビームラインが特色を持つことで多様な MX 実験をカバーする一方で、全てのビームラインが結晶交換ロボットを備え、同一のソフトウェアで制御されるなど、利用者の使用感は統一されている。ビームラインの測定技術開発は継続して続けられ、現在では全てのビームラインにおいて全自動測定やリモート実験が可能となっている。
MX ビームラインにおける実験の全自動化、およびリモート化はこれまでも段階的に進めてきたが、新型コロナウィルス感染症拡大の影響もありその重要性・必要性が 2020 年度一層高まった。そこでビームラインの運用体制を見直し、全ての実験課題において全自動測定やリモート実験といった実験スタイ
ルを利用者が必要に応じて選択できるよう制度変更を行った。その結果、現在ではユーザーが来所をしない全自動測定とリモート実験の実験スタイルが
約 75 %のビームタイムを占めるようになった。
全自動化、リモート化を行う上では実験装置の整備はもとより、ユーザーから送付されてくる試料や測定後のデータを適切かつ正確に取り扱うことも重要であり、このための荷物の流通管理システムやデータバックアップ体制の整備を行い、2020 年 10 月の運転よりユーザーへと供している。本発表では、現在の PF タンパク質結晶構造解析ビームラインにおける全自動測定とリモート実
験についての現状と、今後の開発計画について紹介する。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P1-096L

KEK-PF/BL5A

タンパク質結晶核生成を制御可能とする
結晶育成装置の開発
Development of a crystal growth system for controlling
protein crystal nucleation
長谷川智紀 1, 斉藤洋也 2, 田中伊知朗 1,3, 新村信雄 2, 山田貢 4,
石田卓也 4, 吉崎泉 4,皆川由貴 5, 根本忠洋 5, 真栄城正寿 6
1 茨城大院理工, 2 茨城大工, 3 茨城大フロンティア, 4 JAXA,
5 株式会社化研, 6 北海道大学
タンパク質の構造解析の手法の一つに中性子構造解析がある。これは X
線構造解析に比べ、水素原子の観察が容易になり結晶内のタンパク質の分子構造が崩れることもない。しかしながら、中性子は X 線に比べて強度が小さいので大形良質結晶が必要となる。
ここで結晶化相図を用いれば原理的に大形良質タンパク質結晶を作製することが先行研究で見出されている[1]。しかし、そのために必要な結晶や結晶化の制御が必要となる。そこで、株式会社化研の先行研究においてマイクロ流路内で結晶が離散的に形成されたことを応用し結晶化制御を可能にすることを見出した。これらを踏まえて 1 次元の微小空間内でタンパク質結晶育成を行い、マイクロ流路内における結晶間隔の再現性の確認、また結晶間距離と流路との関係と法則の解明に向けて実験を行い、大形良質タンパク質結晶作製に必要な少数の結晶核生成手法の確立を目指した。
本研究の実験で用い1mm
たマイクロ流路はポリジメチルシロキサン
リゾチーム:40[mg/ml] NaCl:0.8[M] 流路深さ 67μm 幅 63μm
(PDMS)とスライドガ
ラスで構成された流路1mmでそれぞれ深さ20~95µm、幅
リゾチーム:20[mg/ml] NaCl:0.8[M] 流路深さ 67μm 幅 100μm
20~100µm の組み合わ
1mm
せになるように作製した。これらの一部の流リゾチーム:15[mg/ml] NaCl:0.8[M] 流路深さ 67μm 幅 100μm
路の中にリゾチームの結晶化相図に基づいた条件のリゾチームと結晶化剤 NaCl を含んだ溶液
を加えて数日静置し、流路中に生成した結晶の様子の観察を行った。
本研究の実験の結果、先行研究で観察された離散的に結晶が形成される現象を今回用いたマイクロ流路においても同じ現象が見られた。また
マイクロ流路内で形成した結晶数とマイクロ流路内の溶液体積、タンパ
ク質濃度に相関が見られた。上記で見られた現象や統計処理の結果を報告する。[2][1] Niimura et al.2011., “Neutron Protein Crystallography Hydrogen, Protons,
and Hydration in Bio-macromolecules.” Oxford University Press (2011), p.52
[2]田中ら, 「マイクロ流路デバイスを用いた結晶製造方法及び装置」.
特願 2020-198815.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P1-097L

リゾチームの糖加水分解速度の制御
Control of sugar hydrolysis rate of lysozyme
梅田 翔希１、田中 伊知朗 2,3
１ 茨城大工，２ 茨城大院理工，３ 茨城大フロンティアセンター
リゾチームは細菌の細胞壁ペプチドグリカンの N-アセチルムラミン酸とN-アセチルグルコサミンの間のグリコシド結合を切断する酵素である。しかし,50 年以上前からリゾチームの加水分解反応機構は提案されているが,いまだに様々な反応機構が議論されている[1]。現在,最も強く提唱されている反応機構は,リゾチームの中間体は共有結合を作成し反応が進むというものであるが,これはリゾチームと共有結合を作りやすいリガンドで行った不自然な条件下での結果によるものである[2]。X 線自由電子レーザー（XFEL）での高速動画技術を駆使できた場合、上述のような加水分解反応の一瞬を何とかとらえるだけでなく、この反応の最初から最後までをスローモーションのように追跡することが可能となる。最初の反応は 10-12 秒程度と大変早く、ゆがんだ D 鎖の環（オキソカルベニウムイオン）の観測はいまだ誰も成功していない。高速動画撮影によって、どこまで明らかにできるかは、回折分解能に依存するのはもちろん、加水分解
反応の微小結晶全体での制御により反応の進行を十分ゆっくりにして、試料（結晶）全体で加水分解反応が同時進行できるようにするところが重要である。加水分解反応速度を低下する条件を検索するために、低ｐH
条件,抗凍結剤の混合、重水の使用などを試みた。
実験に用いたリゾチームは SIGMA 社の HEWL(ニワトリ卵白リゾチーム)
を使用し,糖は SIGMA 社の Micrococcus lysodeikticus を用いて、吸光度計による濁度測定を行った。
pH を変えての濁度測定の結果低 pH 側での加水分解反応速度の低下を確認できた。また抗凍結剤については、グリセリン、スクロース、PEG を混ぜての実験を行い加水分解反応速度の低下がみられた。
Reference[1] Y. Abe et al., Prot. Sci., 25 (2016) 1637-1647[2] D. J. Vocadlo et al., Nature 412 (2001) 835-838

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P1-098L

PF-BL-5A

還元型 Cytochrome c’の X 線結晶構造解析
X-ray crystal structure analysis of Reduced Cyt c’
鶴野湧也 1、山口峻英 1，２、高妻孝光 1，2
1 茨城大学、2 IFRC
Cytochrome c’(Cyt c’)は脱窒菌や好色光合成細菌などのペリプラズムに見出される c 型ヘムタンパク質である。その単量体の構造は４本のαヘリックス
バンドル構造を有しており、活性部位の構造は Hｉｓ120 を軸配位子とする 5 配位構造をとっている。その生理的機能は、NO リザーバー、電子伝達体と考えられている。酸化型 Cyt c’の電子状態は、中性 pH 条件においては、中間ス
ピン状態(IS: S = 3/2)と高スピン状態(HS: S = 5/2)の量子力学的混合状態であると解釈されている。これまで、アルカリ条件(8<pH<12)においてヘリックス C、
D 間の水素結合ネットワークが変化し、ヘム鉄は HS 状態に転移することを明らかにしてきた。さらに、pH 13 付近において Cyt c’は Open-bundle 型構造をとり、ヘム鉄の電子状態が 6 配位低スピン状態(6c-LS)に変化することを、X 線
結晶構造解析、ESI-MS、MCD、CD、SANS によって明らかにしてきた[1-3]。
本研究では、還元型 Cyt c’における詳細な構造を X 線結晶構造解析によって検討した。
pH 6.0 に調製した Cyt c’を含む母液とリザーバー溶液に、還元剤として 2-メ
ルカプトエタノール、沈殿剤に硫酸アンモニウムを加え、ハンギングドロップ蒸気拡散法で結晶を作成した。Pｈｏｔｏｎ Fａｃｔｏｒｙ BL-5A を用いて X 線回析実験を行ったところ、得られた結晶は空間群 P6₅２２に属し、格子定数 a = b =52.67Å, c = 182.67Å (α=β=90 ﾟ，γ=120 ﾟ)であった。また、最分解能 1.24Åで構造を決定し、現在の R 値は 15.8％、Rfree は 18.7%である。
参考文献
1: A. Takashina et al., Bull Chem Soc. Jpn, 2017, 90, 169-177
2: A. Takashina et al., Chem Lett, 2015, 44, 268-270
3: T. Yamaguchi et al., unpublished results.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P1-099L

PF-BL5A, PF-BL17A, PF-NW12A

高度好熱菌由来 CoA transferase の制御タンパク質の構造
機能解析
Structural and functional analyses of regulatory
protein for CoA transferase from T. thermophilus
吉田彩子 1,2、山本寛之 1、富田武郎 1,2、西山真 1,2
1 東大 BRC、2 東大 CRIIM
タンパク質翻訳後修飾の一つであるリジンアセチル化は近年バクテリアにおいても代謝酵素等にその存在が見いだされており、タンパク質アセチル化と
代 謝 調 節 と の 関 連 が 示 唆 さ れ て い る 。 我 々 は 高 度 好 熱 菌 Thermus
thermophilus において高度にアセチル化されているタンパク質として、CoAtransferase（CoAT）を同定している。CoAT は、1 分子のアシル CoA を CoA
donor として消費し、短鎖脂肪酸から短鎖アシル CoA を ATP などのエネルギ
ー非依存的に合成する反応を可逆的に触媒する酵素である。これまでに T.
thermophilus の CoAT が ア セ チ ル 化 修 飾 を 受 け る だ け で な く 、 alanine
dehydrogenase（AlaDH）と相同性を持つもののその活性は示さない alanine
dehydrogenase-like protein（ADLP）と相互作用し、NAD+依存的に活性阻害を受けることを明らかにしている。CoAT 活性は ADLP·NAD+によって阻害される
ものの ADLP·NADH によっては影響を受けないことから、ADLP が細胞内のNAD+/NADH 比のセンサーとして働くことが示唆された。そこで、我々は ADLPの機能を詳細に明らかにするため、NAD+や NADH に対する結合様式や ADLPの X 線結晶構造解析について解析を行った。
CoAT·ADLP の複合体に対しての NAD(H)の結合親和性を ITC（isothermal
titration calorimetry）を用いて測定した。その結果、NAD+の CoAT·ADLP に対する Kd が 3.1 μM であるのに対し、NADH の Kd は 0.34 μM であり、NADH に対する親和性が高いことが分かった。これと一致して、ADLP 存在下で 1 mM
NAD+添加によって低下した CoAT 活性が、10 μM の NADH 添加によって阻害が一部解除され、0.1 mM の NADH によって完全に阻害が見られなくなった。
このことから、ADLP が NAD+/NADH 比に応答して CoAT 活性を制御することが明らかとなった。また、ADLP と apo 型及び NAD+結合型での結晶構造を決定することに成功した。ADLP は hexamer 構造をとっており、その fold は典型的な AlaDH のものとよく似ており、NAD+の結合様式についても同様であった。
構造比較を行ったところ、NAD+結合により apo 型に比べ閉じた構造をとることが明らかとなった。NAD+結合による ADLP の構造変化が CoAT·ADLP 複合体において CoAT の構造変化が誘起され、CoAT 活性の阻害が生じることが示唆された。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P1-100L
BL-1A

CENP-SX 複合体による新規クロマチン形成
Novel chromosomal architecture'CENP-SX chromatin'
伊藤翔１、西野達哉 1
１ 東京理科大学大学院基礎工学研究科生物工学専攻
セントロメア局在タンパク質 CENP-SX 複合体(CENP-SX)はヒストンフォールドを有し，キネトコア形成および DNA 修復で相互作用相手を変えて機能する。
キネトコアは染色体セントロメア領域に形成され，細胞分裂時に微小管と染色体をつなぐインターフェースとして機能する。CENP-SX は CENP-TW と CENPTWSX 複合体を形成し，正常なキネトコア形成に重要である。一方，DNA 修復
経路においては FANC 遺伝子(Fanconi Anemia 修復経路と呼ばれる二重鎖切断修復経路で機能する遺伝子)のひとつである FANCM と相互作用して機能していることが知られている。FANCM と CENP-SX の相互作用が失われると正常な DNA 修復経路の活性化が行われない。CENP-SX の変異体解析より，
CENP-SX の DNA 結合が重要な役割を担っているが詳細な DNA 認識機構は不明である。本研究では、先行研究のゲルシフトアッセイで明らかとなった
CENP-SX による規則的な DNA 結合を詳細に解析し、CENP-SX の DNA 認識
機構解明のため DNA との共結晶構造解析を試みた。PF-BL1A にて X 線回折データを取得し，構造決定は CENP-SX と DNA を使って分子置換法により行なった。結晶構造中では 3 分子の CENP-SX が一本の直線的な二重鎖 DNA
に対して規則的に結合していた。規則的な DNA 結合には、(1)CENP-S の天然
変性領域、(2)CENP-SX 4 量体による DNA 結合界面の正電荷アミノ酸、(3)３分子の CENP-SX 間に生じる静電相互作用が重要であることがわかった。
CENP-SX と DNA によって形成される非対称的なユニットは DNA 修復やキネ
トコア形成に重要な相互作用因子のリクルートにおいて重要であると考えられ、カノニカルなヌクレオソームとは異なる新規なクロマチン形成を示唆する。今後は規則的な DNA 結合が CENP-TW や FANCM との相互作用にどう影響するかを検証していく。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P1-101L
PF-AR_NE3A, PF-BL5A, PF-BL1A

Class IB 大型テルペン合成酵素の基質-金属イオン複合体の結晶構造解析
Crystal structure of the class IB large terpene
synthase in complex with ligand and metal ion
金本壮平 1、佐藤努 2, 品田哲朗 3, 三木邦夫 1, 深井周也 1, 藤橋雅宏 1(1 京大・院理, 2 新潟大・農, 3 阪市大・院理)
テルペン合成酵素は反応開始様式や motif 配列の違いにより 2 つのクラスに分類される。大型テルペン(C25 以上)の合成を触媒する BsuTS1 は Class I型の反応開始様式を示すが、Class I に共通する motif 配列が見られないた
め新たなサブクラス Class IB に分類される。この BsuTS のホモログである
BalTS も Class IB に分類され、C35 テルペンの反応を触媒する。我々のグループは BalTS の基質非結合型構造 2 及び基質結合型構造 3 を決定したが、その基質結合型構造において反応に必須な Mg2+を同定できていない点が問題となっていた。

図 1. BalTS の基質認識部位
左：金属イオン非結合型 3, 右：金属イオン結合型。灰色は Fo-Fc omit 電子密度図(左 3.0σ, 右 3.5σ)、水色は異常分散差フーリエ図(3.0σ)を示している。
図 1 右は、新たに得た結晶の基質認識部位であるが、図 1 左には存在しない金属イオンと考えられる電子密度が見られた。異常分散差フーリエ図を通してこの金属イオンのイオン種の同定を行った上で構造精密化を行い、Class
IB 酵素における反応機構の決定に繋げたいと考えている。
文献
1. Sato, T. et al., J. Am. Chem. Soc.(2011), 133, 9734-7.
2. Fujihashi, M. et al., Chem. Sci. (2018), 9, 3754-8.
3. Stepanova, R. et al., ACS Chem. Biol. (2020), 15, 1517-25.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P2-102L

PF-BL5, AR-NW12, NE-3

納豆菌由来 YabJ タンパク質の１アミノ酸変異による四次構造変化
Alteration of the quaternary structure of Bacillus
subtilis YabJ protein by one amino acid mutation
藤本 瑞、岸根 尚美、ル ティ テゥ ホン、木村 啓太郎
農研機構・解析セ/農研機構・食品研
納豆菌 Bacillus subtilis (natto)の生産するポリ-γ-グルタミン酸（poly-γ-glutamate; γPGA）は，グルタミン酸がγ-カルボキシル基とα-アミノ基の間で重合した分子量約 200 万ダルトン（2MDa）にも及ぶポリペプチドであり，その生産はクオーラムセンシングとその後の複雑なカスケード機構により制御されている．degQ 遺伝子はγPGA 合成に関わる１因子でありその破壊株はγ
PGA 生産能を失う．γPGA 生産制御に関わる新たな因子を探索するため
degQ 遺伝子破壊株のγPGA 生産を回復させる復帰抑制変異のスクリーニン
グを試みたところ，得られた抑制変異株では yabJ 遺伝子に１アミノ酸置換変異が存在した．変異型 yabJ 遺伝子を親株（degQ 遺伝子破壊株）に導入したと
ころ，γPGA 生産とγPGA 合成遺伝子発現の回復が確認された．
YabJ タンパク質は高度に保存された YjｇF/YER057ｃ/UK114 ファミリーに属するエナミン・イミン化合物の解毒（脱アミノ化）酵素であると報告されている．
納豆菌においては，YabJ タンパク質は酵素ではなく, シグナル伝達のカスケード機構内の位置役割を担うと考えられているが, YabJ タンパク質のアミノ酸置換変異により yabJ 遺伝子産物が活性型となり, γPGA 合成を直接制御す
る下流の転写因子である DegU の発現量を増加させたと推定された．
1999 年に決定された結晶構造によると YabJ はホモ 3 量体を形成しており，
そのサブユニット間に形成される空隙内で脱アミノ反応を行う酵素であること
が後に報告されている．見出された変異体を作成し大腸菌で発現したところ，
脱アミノ反応活性については確認されなかったが，Native 電気泳動およびゲ
ル濾過クロマトグラフィーでは変異体タンパク質は野生型タンパク質よりも大きな分子量を有することが示され，変異が入ることによってその立体構造や多量化機構に変化が生じた可能性が示唆された．１アミノ酸変異によりどのような立体構造変化が起こり，γPGA の生産回復が引き起こされるのかを明らかにするために，機能獲得変異型 YabJ の立体構造解析を行なった．１アミノ酸
変異により異なる多量化構造となるメカニズムを立体構造により考察する。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P2-103L

PF-BL5A、AR-NW12A

新規祖先型 L-アミノ酸酸化酵素の構造機能解析
Structural and functional analysis of ancestral
L-amino acid oxidase
中野祥吾 1,2、小塚康平 1、南野優季 1、烏田裕香 1、長谷部文人 1、伊藤創平 11 静岡県大食栄、2 JST さきがけ
近年、ペプチド医薬品に代表される中分子医薬品が注目されており、その前駆体となる光学純度の高いアミノ酸誘導体の合成法の確立が求められている。中でも D-アミノ酸酸化酵素と還元剤を組み合わせた化学-酵素反応系による動的光学分割法は、ラセミ体のアミノ酸誘導体から L-体を高い光学純度で合成可能な手法として、広く利用されてきた。D-体のアミノ酸誘導体の合成に関して、酵素を L-アミノ酸酸化酵素 (LAAO) に変えて同様の反応を適用する
ことで可能となる。しかし LAAO は大腸菌発現系を用いた大量発現が難しく、今日までその応用が停滞していた。
我々は先行研究により、独自のアミノ酸配列解析手法を用いて、配列デー
タベース上より新規 LAAO を発見、祖先型設計により大腸菌発現系にて大量
発 現 可 能 か つ D- 体 の ア ミ ノ 酸 誘 導 体 の 光 学 分 割 に 適 用 可 能 な LAAO
(AncLAAO) の設計に成功した (1)。AncLAAO の反応機構に興味が持たれたが、Blastp 解析の結果、AncLAAO と E 値が 0.001 未満で一致する PDB
データは存在せず、新規な活性中心構造を有することが示唆された。しかしAncLAAO の結晶を得ることはできず、その構造は未決定のままであった。
AncLAAO の立体構造を決定するため、祖先型設計を用いて系統樹上に存在する計 5 つの AncLAAO を復元・発現させ、結晶化実験を行った。結果、AncLAAO-N5 と名付けた祖先型酵素について良質な結晶を得ることができ、かつヨウ素 SAD 法による位相決定に成功した。L-Trp や L-Phe 複合体も含めて 2.2-2.6Å 分解能で立体構造を決定した (図 1)。AncLAAO-N5 の立体構造から活性中心を同定、その情報を基に合理的設計を行い、本酵素の基質選択性を変換することに成功した (2)。本研究により、AncLAAO を用いた D-アミノ酸誘導体の合成法開発への貢献が期待される。
参考文献[1] S. Nakano et al., ACS Catalysis,(2019), 9, 10152-10158,[2] S. Nakano et al., Communications 図 1, AncLAAO-N5 の全体構造。活性中心に
FAD を有する。
Chemmistry, (2020), 3, 181

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P2-104L

PF-BL1A

全自動多点測定システムと MR Native-SAD 法を用いた構造決定
Structure determination using
full-automated small-wedge data collection system and
MR Native-SAD phasing method
小林 淳、山田 悠介、篠田 晃、
松垣 直宏、引田 理英、千田 俊哉、加藤 龍一
KEK・物構研・構造生物
X 線結晶構造解析で生体高分子の立体構造を決定する場合、一定の大きさの単結晶１つから 1 つの完全なデータを収集する手法が長らく主流であった。しかしながら、近年我々が立体構造を決定したターゲットの中には、結晶成長が困難なケースも多々あり、１つの結晶から１つの完全なデータを収集することが難しい微結晶しか得られないものが複数あった。このようなサンプルについては、SPring-8/ZOO 全自動測定システムを用いて多数の微結晶 (露光点) から少しずつデータを収集し、それらをマージすることによって構造決定を行うことができた。
このような背景のもと、(1) PF のタンパク質結晶構造解析ビームラインにも全自動多点測定システムを導入すること、(2) PF のビームライン、特に BL-1A の強みである、微弱な異常分散シグナルを高精度に収集し、より迅速かつ簡単に構造決定を行えるようにすること、を目的としたシステムの開発を進めている。
本発表では、そのシステムの評価を行った結果について報告する。評価用のサンプ
ルは、SPring-8/ZOO システムで既に構造決定済みの微結晶とした（抗体 L 鎖のみ、P6322、8 硫黄原子/227 アミノ酸、1 分子/ASU）。微結晶サンプルは複数個をループでラフに拾い、液体窒素で凍結した。ループ上の微結晶の位置を 2D スキャンで確認し、一定分解能以上の各露光点について、波長: 1.9 Å、ビームサイズ: 13×
13 µm2、Total f: 40o（osc. 0.1o）、Dose: 5 MGy としてデータ収集を行った。得られた各データは KAMO によりマージし、統計値から 3.0 Å 分解能のクラスターを 1 つ選
び、解析データとした。
上記データをアミノ酸配列相同性 40％の別の抗体 L 鎖を template として、(1)Phaser + AutoBuild を用いた MR 単独、(2) CRANK2 を用いた MR-SAD、(3)Phaser-EP + AutoBuild を用いた MR-SAD を行い、構築されたモデルの質を Rfreeで評価した。結果として、CRANK2 で MR-SAD を行った場合に、MR 単独と比べてRfree が 10％以上低い良好なモデルを構築することができた。当該モデルは問題なく
精密化・最終化できた。位相の改善には Met95 の硫黄原子を使用していた。
これらの結果から PF における全自動多点測定システムにより、MR Native-SAD による構造決定の迅速化/簡便化が達成できることを示せた。まもなく外部ユーザーへの供用を開始する予定である。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P2-105L

PF-BL5A, BL6A

Clostridium acetobutylicum 由来 Rubrerythrin の構造解析
Structure analyses of Rubrerythrin from Clostridium
acetobutylicum
伊藤拓未１、川崎信治 2、庄村康人 1１ 茨城大学 大学院 理工学研究科、２ 東京農業大学 生命科学部【目的】 Rubrerythrin(Rbr)は分子量約 20,000 の過酸化水素分解能を持つ非ヘム鉄タンパク質である。N 末端側に 2 核鉄部位を含む Ferritin 様ドメインを、
C 末端側に Rubredoxin(Rd)様ドメインを持ち、生理的に 2 量体を形成する。一方で偏性嫌気性細菌 Clostridium acetobutylicum(Ca)を低酸素濃度条件下で生育させた時に酸素によって誘導される Rbr[1]は、N 末端側に Rd 様ドメイン、C 末端側に Ferritin 様ドメインと順序が逆に配置されている。本研究では、CaRbr の構造を解析し、既知の Rbr(硫酸還元菌 Desulfovibrio vulgaris(Dv)由来と超好熱菌 Pyrococcus furiosus (Pf)由来)との比較を行った。
【方法】 タンパク質の産生には大腸菌の発現系を用い、N 末端側に挿入した
Strep タグを利用したアフィニティーカラムおよびゲルろ過カラムによる精製を行い、最終精製標品とした。その後得られた精製標品を用いて結晶調製、X
線結晶構造解析、および X 線小角散乱測定を行った。
【結果・考察】 結晶構造解析の結果、 Ca-Rbr 野生体は結晶中で Trimer ofdimers の 6 量体を形成し、2 量体同士の界面に亜鉛イオンが配位していた。しかし亜鉛結合部位に変異を入れた 2 点変異体(Rbr(H155S/H159S))では、野生体と同様に 6 量体を形成していたが、2 量体界面に亜鉛は結合しておらず、
6 量体形成に亜鉛イオンが関与しないことが示唆された。また両構造は活性部位や Ferritin 様ドメインのα-helix の歪みなどの違いがみられ、生理的な環境を考慮すると 2 点変異体の構造が本来の構造に近いと考えられる。
Ca-Rbr と既知の構造との比較では、2 量体形成時に Ca-Rbr に見られるドメ
インスワッピング構造は、Pf-Rbr と同様であった。一方で RMSD 値は Dv-Rbrの構造と近いことを示唆し、これらの活性部位は 1 箇所の Glu-Ala 間の位置の反転を除いてほぼ同じ配位様式を取っていた。
Ca-Rbr の結晶構造からは Rd ドメインの電子密度が観測されなかったが、これは Ca-Rbr の 6 量体形成によって Dv-Rbr の Rd ドメインの位置では立体障害が生じ、同様の構造を取れないことが関係していると考えられる。小角散乱測定の結果と散乱曲線に対応した Rd ドメイン予測モデルの計算により Rd ド
メインの位置に関するアンサンブルが得られたことから、Ca-Rbr の Rd ドメインは溶液中で特定の位置に配向していないことが示唆された。
【参考文献】[1] Kawasaki. S et al. AEM. 2009. 75. pp. 1021-1029

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P2-106L

PF-BL1A

ヒト VASH1/SVBP 複合体の構造解析
The structural analysis of human VASH1/SVBP
池田聡人 1、浦田せいあ 1、安藤格士 2、鈴木康弘 3、佐藤靖史 3、西野達也 1
1 東京理科大学 基礎工学部 生物工学科 西野研究室
2 東京理科大学 基礎工学部 電子工学科 安藤研究室
3 東北大学未来科学技術共同研究センター(NICHe)および東北大学加齢医学研究所腫瘍循環研究分野
vasohibin は血管内皮細胞が産生する血管新生因子として同定された。ヒト
において２つのサブタイプ vasohibin1(VASH1) と vasohibin2(VASH2) が存在
し、どちらも small vasohibin binding protein(SVBP) と安定に複合体を形成し、細胞外へと分泌される。特に発生初期段階の血管内皮細胞で血管内皮細胞
増殖因子(VEGF)によって誘導され、VASH1 は血管新生に抑制的、VASH2
は亢進的に働くことが知られている。特にがんにおいては細胞増殖と共に血管新生は重要な役割を果たしており、多くのがん細胞で VASH2 の発現量の向上がみられた。
近年、血管新生やがんとは別に神経細胞伸長の領域において、vasohibin は
-チューブリンの脱チロシン化酵素として同定された。この報告を皮切りに、複数の結晶構造が報告された。結晶構造の決定により、SVBP との複合体形
成や基質の認識、酵素活性の分子機構が明らかとなった。創薬ターゲットとしてより現実的な議論が可能になった一方で、vasohibin 酵素活性の制御や他の協働する因子との関係性、細胞外への分泌経路など不明な点が多く残っている。
本稿で明らかにした vasohibin の結晶構造は、報告された複数の結晶構造と全体的な構造は一致していたが、N 末端領域に大きな差異があった。そこで、詳細に比較して結果、本結晶構造においては、結晶中の 2 回転対称軸の隣接 VASH1 分子と N 末端領域を介してヘテロ四量体を形成していることが明らかとなった。ヘテロ四量体は 56 番目から 67 番目のアミノ酸残基から成る N 末
端領域を相互に交換し合うことで安定化していた。N 末端領域の水素結合および疎水性結合のパターンは、ヘテロ二量体を形成する他の構造と異なることも明らかになった。さらに、分子動力学シミュレーションを行ったところ、ヘテ
ロ四量体は全体構造の安定性が示唆されたことに加え、ヘテロ二量体に比べて N 末端領域の変動が抑制されていた。
本研究より、VASH1/SVBP 複合体において新規なヘテロ四量体の形成と N
末端領域の可動性が発見されたことで、酵素活性の制御機構ならびに細胞
外分泌経路に関する新たな可能性が示唆された。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P2-107L

ヒトリゾチームの原子分解能構造解析に向けた結晶化条件の探索
Screening of crystallization condition
for atomic resolution structural analysis
of human lysozyme○中屋 美咲 1、菊池 愛 1、吉田 裕貴 1、菅野 晴香 1,
阪本 泰光 1、野中 孝昌 1
○Misaki Nakaya1 , Ai Kikuchi1 ,Yuuki Yoshida1 , Haruka Kanno1 ,Yasumitsu Sakamoto1 , Takamasa Nonaka1
1. 岩手医科大学薬学部構造生物分野
1. Sch. Pharm, Iwate Med. Univ.
リゾチームは、ムラミダーゼとも呼ばれ、グラム陽性細菌の β-1,4'グリコシド結合で交互につながった N-アセチルムラミン酸(NAM)と N-アセチルグルコ
サミン(NAG)からなる細胞壁のペプチドグリカンを分解し溶菌する加水分解酵素である。リゾチームは、ニワトリの卵白, ヒトの涙, 唾液, 痰や鼻汁に含まれており、ヒトでは 130 個、ニワトリでは 129 個のアミノ酸残基からなる。
ヒトリゾチームの結晶構造解析の最高分解能は、1.04Å(PDBID 2NWD)であり、1Å分解能を超えるヒトリゾチームの構造解析によるヒトリゾチームの反応機構および基質認識機構の原子分解能での理解を目指し、コメ発現リコンビ
ナント ヒトリゾチームを用いて、結晶化条件のスクリーニングおよび結晶化条
件の最適化をハンギングドロップ蒸気平衡拡散法で実施した。得られた結晶を用いて、放射光施設 SPring-8 BL44XU にて回折強度データを収集し、1Åを超える原子分解能でのデータ収集に成功した。現在、構造精密化と多糖との複合体構造解析に加えて、さらに高分解能の回折強度データの収集を目指している。ハンギングドロップ法ではドロップの液量が少量(数～数 10μl 程度)に限られてしまう。現在は結晶の大型化を目指し、ドロップの液量が数～数 100
μl 程度に設定できるシッティングドロップ蒸気平衡拡散法を用いて試みている。シッティングドロップ蒸気平衡拡散法では、プレートがポリスチレン製で水との接触角が 68°であり、結晶を取り出す際に結晶が中央のくぼみ(→)に付
着してしまう可能性があるため、水との接触角が 170°となる超撥水性バイオミメティック素材であるトーヤル
ロータスをくぼみに貼ることで結晶のくぼみへの付着の改善を試みている。今後は、得られた結晶を放射光施設
にて測定を行い、解析をしていく予定である。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P2-108L

SLS／X06SA

蛋白質脱イミノ化酵素 PAD3 の構造機能相関解明
Elucidation of the structure-function relationship of
peptidyl arginine deiminase type 3
澤田瑞季 1、舟橋一真 1、高原英成 2,3、海野昌喜 1,3
1 茨城大院理工、2 茨城大農、3 茨城大フロンティア【緒言】タンパク質脱イミノ化酵素（PAD）は、Ca2+依存的に、タンパク質中のアルギニン残基をシトルリン残基に変換する反応（シトルリン化）を触媒する酵素の総称である。哺乳類の PAD には 5 つのアイソザイムが存在し、それらの中には関節リウマチや多発性硬化症等の様々な病気の発生に関与しているものもある。そのため、アイソザイム選択的阻害剤の設計が強く望まれる。また、
PAD4 は自身もシトルリン化することが以前に報告されているが［1］、PAD3 が自己シトルリン化反応を触媒するかは報告されていない。Ca2+結合型 PAD3 の構造を明らかにし、PAD3 に関する機能を調査することで、構造と機能の相関を解明し、アイソザイム選択的阻害剤に関する新たな洞察を与える。
【実験】大腸菌発現系で遺伝子を発現し、PAD3 を 3 種類のクロマトグラフィーで精製し、蒸気拡散法で結晶化した。前任者が構造解析した Ca2+結合型のPAD3 は高濃度 Ca2+との共結晶化で得られ、アーティファクトであると考えられたため、本研究では結晶に低濃度 Ca2+をソーキングすることで改善を試みた。
SLS での全自動測定で得た回折データをもとに X 線結晶構造解析を行った。
また、PAD3 の機能を調べるために活性測定を様々な条件下で行い、自己シ
トルリン化の有無を調べるためにウエスタンブロットを行った。
【結果と考察】X 線結晶構造解析の結果、Ca2+結合型 PAD3 の構造を分解能
2.82Åで得ることに成功した。低濃度 Ca2+存在下で得られた構造では、高濃度
Ca2+存在下での構造とは異なり、Ca2+が他の PAD アイソザイムと同じ位置に結合し、活性部位が形成されることが分かった。この構造と PAD アイソザイムの構造や活性部位の大きさや電荷について比較することで、PAD3 選択的阻害剤設計に新たな洞察を与えた。また、Ca2+濃度と反応時間に依存して自己シトルリン化が起こることを確認した。さらに、自己シトルリン化した PAD3 の活性が野生型 PAD3 と比較して約 4 割減少することや阻害剤 Cl-amidine を添加した場合、以前報告された PAD3 に対する Cl-amidine の IC50 値［2］と概ね一致することが分かった。
【参考文献】[1] F. Andrade, et al. 2010. Arthritis Rheum. 62(6). 1630–1640.
[2] J. E. Jones, et al. 2012. ACS Chem Biol. 7(1). 160-165.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P2-109L

PF-BL1A

DNA 酸化損傷修復酵素 hOGG1 の塩基除去機構の解明に向けた構造生物学的研究
Structural Biology for elucidation base excision mechanismof DNA oxidative damage repair enzyme, hOGG1
箕輪希海 1, 小室智稀 1, 田中好幸 2, 海野昌喜 1
茨城大 1,徳島文理大 2【緒言】ヒト 8-オキソグアニン DNA グリコシラーゼ(hOGG1)は DNA の酸化損
傷塩基である 8-オキソグアニンの除去を行うグリコシラーゼ反応に加え、この反応によって生じる脱塩基部位の 3’末端側を切断するβリアーゼ反応を行う
二機能グリコシラーゼである。このうちβリアーゼ反応については Lys249 が関与する触媒機構が明らかとなっている [1]。それに対してグリコシラーゼ反応については、Lys249 及び Asp268 が触媒残基として同定されているが、その触媒機構は未だ不明である。本研究ではグリコシラーゼ反応において脱離する 8-オキソグアニンに対しプロトン供与を行うと推察されている Lys249 をヒスチジンに変異し、活性を pH 依存的なものとした K249H 変異体を用いること
で、グリコシラーゼ反応中間体を X 線構造解析で直接観察し、グリコシラーゼ
反応触媒機構を解明することを目的として hOGG1K249H の精製を行った。
【実験】形質転換した大腸菌を培養したのち、His-tag アフィニティクロマトグラ
フィー、HRV3C プロテアーゼによる His-tag の切断、His-tag アフィニティ-イオ
ン交換連結クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を行い、hOGG1K294H の試料を得た。
【結果と考察】培養培地 1 L あたりおよそ 4.15 mg の hOGG1K249H 精製試料が得られた。吸光度測定の結果 A260/A280 比は 0.528 であった。hOGG1WT（野生型）の精製時(収量 7.4 mg/L、A260/A280 比 0.514)と比較して収量はおよそ 6 割ほどであった。また、A260/A280 比は上昇したが両者ともに純度の指標である 0.55 を下回っており、精製中にタンパク試料に結合する DNA を十分に取り除けていると判断した。又、ゲル濾過クロマトグラフィー前後で A260
/A280 比が低下していたことから本タンパクの精製におけるゲル濾過クロマト
グラフィーのステップは DNA 複合体の調製を目的としたこの精製に必要であることが分かった。今後は今回精製した試料を用いて 8-オキソグアニン含有
DNA との複合体を調製し、結晶化条件[2]の最適化及び X 線構造解析とともに野生型と阻害剤複合体の結晶化条件の探索を行う予定である。
【参考文献】[1] Fromme,J.C.et al.Nat.Struct.Biol. 10,204-211(2003)[2] 小室智稀,修士論文,茨城大学(2019)

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
欠番
P2-110L<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P2-111L

PF-BL-1A

30K 付近でのタンパク質結晶回折実験の実用化
Practical operation of MX experiment at around 30K
松垣直宏、引田理英、山田悠介、千田美紀、千田俊哉
KEK-PF SBRC
ガス吹き付け法は、試料の温度を制御する簡便な方法として広く利用されてきた。放射光によるタンパク質結晶回折データ収集は、高輝度ビームによる放射線損傷を低減する目的で、試料を低温にした状態で行われる。試料回りの自由度の高さや簡便性から、ほぼすべてのタンパク質結晶構造解析用ビーム
ラインにおいて 100K 付近に冷却した窒素ガスを試料に吹き付ける方式が採用されている。
試料をさらに低い温度に冷却するためにはヘリウムガスを用いる必要がある。しかし、ガス吹き付けが解放空間で行われるため、高価なヘリウムガスを大量に消費することになる。30～50K でのデータ収集が放射線損傷に対してより有効であるとの結果も報告されたが、費用対コストの観点から実際の利用は限定的なものにとどまってきた。
KEK‐PF の BL‐1A では、4keV 近傍での低エネルギー回折実験を精度良く行うため、試料を含む回折計全体が常時ヘリウムガスを満たした閉空間内に置かれている。経済的な運転のため、試料に吹き付けられた低温ヘリウムガ
スは循環・再利用される。循環するヘリウムガスに不純物（主に窒素・酸素）が含まれるため、これまで試料への吹き付けガス温度は 100K 付近とする必要があったが、循環経路にガス純化装置を導入することで、30K 付近までの低温測定が可能となった。さらに、純化装置の再生が必要となる約 10 時間、連続して測定が可能である。一方、純化装置の再生のためには 2～3 時間を要し、その間は 30K での低温測定は中断される。運転と再生の切り替えは自動で安全に行われるよう、システムを構築した。
発表では、30K での吹き付けガス運転の詳細および、実際のタンパク質結晶構造解析における放射線損傷への効果について、報告したい。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P2-112LMLF BL20、PF/AR-NE3A

タンパク質の核偏極中性子回折実験
Protein diffraction experiment with dynamic nuclear
polarization
西野妃香 1・山内秀輝 2・能田洋平 2,3・前田知貴 3・小泉智 2,3・田中伊知
朗 2,3
1 茨城大工，2 茨城大院理工，3 茨城大フロンティアセンター【緒言】中性子回折実験における、水素のさらなる検出感度向上法として、動的核偏極（DNP）法がある。これにより、水素からの散乱長が従来の最大約 8倍となり、軽水素試料でも高 S/N 比のデータが得られる。このためには、試料結晶中にラジカルを導入し、高磁場（数 T）かつ極低温（1K 程度）の条件にする必要がある。本研究では、以前常伝導マグネット（2.5T）で TEMPOL50mM のリゾチーム多結晶にて DNP 実験を行い、22.3%の偏極率を達成している[1]。さらに高偏極率を実現するために MLF BL20 に設置されている７T マグネットを用いて、中性子ビームが出ていない条件でのタンパク質多結晶の核偏極実験を行い、50mM TEMPOL 濃度で最大偏極率は正負で約 40%を達成した。今回
は、中性子ビームを用いて回折実験を行い、粉末ピークの強度変化がみられるかを試した。
【実験】Sigma-Aldrich 社より購入したリゾチームとラジカル TEMPOL を、
TEMPOL が 100mM、50mM 酢酸ナトリウム緩衝液ｐH4.5、NaCl9％、リゾチーム
60mg の 1.5mL スケールでの室温バッチ法にて共結晶化し、沈殿部の約100mg の多結晶に対して抗凍結剤としてグリセロールを 30%（w/v）混合し、テフロンと石英窓のセルに封入した。MLF 出力は 600kW、入射中性子-93％、試料+68%(4h)、-59％(2.5h)、0%（1h;無偏極；4.2K 平衡状態）の偏極率で BL20 にて中性子回折実験を行い、磁場 7T、温度約 1.2K、マイクロ波 188GHz の DNP条件であった。なお、この試料は、PF 実験で粉末パターンが確認されている。
【結果】動径方向の中性子強度グラフ（I(q)）から、q=0.1～0.2Å-1 付近に粉末ピークが数本確認できた。また、試料偏極率によって、バックグラウンドと各粉末
ピーク強度に違いが出ており、非干渉性散乱の変化によるバックグラウンドの変化及び特に水素の中性子散乱長の変化による回折ピーク強度の変化から、偏極度を解析する予定である。また、リゾチーム結晶が正方晶（P43212；a=b=
約 80Å, c=約 40Å）だとすると、q=0.1Å-1 の最大ピークは（110）反射に相当し、
約 60Åの面間隔に相当する。
参考文献[1] Tanaka et al., Acta Cryst. D74 (2018) 787-791.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-093L

AR-NE3A

TGF-βシグナル伝達系にみられる
転写因子複合体の構造多様性
Structural diversity of transcriptional factor
complexes in TGF-β signaling.
宮園健一１、和田ひかる１、森脇沙帆１、大野陽介１、伊藤友子１、深津由衣２、栗崎晃 2,3、浅島誠 2、田之倉優１
１
東大院・農生科、２奈良先端大・先端科学技術、３産総研
TGF-βは、細胞の増殖・分化、細胞死、免疫応答、細胞外マトリックス産生等の制御を担う多機能性のサイトカインである。TGF-βのシグナルは、細胞表層において、SMAD2 および SMAD3（SMAD2/3）のリン酸化へと変換される。
リン酸化を受け活性型となった SMAD2/3 は、別の転写因子 SMAD4 とヘテロ複合体を形成し、シグナル依存的な遺伝子発現の制御を行う。
SMAD2/3 の機能は、多様な別のタンパク質（SMAD2/3 補因子）によって厳密に制御されている。SMAD2/3 に対し特異的に結合する補因子は 300 種以上存在することが知られているが、それら補因子には共通する SMAD2/3 結合モチーフがほとんど存在せず、なぜ多数の補因子が SMAD2/3 に対して特異的に結合できるかは不明であった。
本研究では、SMAD2/3 を中心とする多様な転写因子複合体（転写因子
FOXH1 複合体、転写抑制因子 SKI 複合体、転写活性化因子 CBP 複合体、脱リン酸化促進因子 MAN1 複合体）の構造を決定した（下図）。得られた複合体
構造を精査すると、SMAD2/3 の分子表面上には補因子結合性の疎水性小領域が複数存在しており、各補因子はそれらの 1 つないし複数を利用することによって、SMAD2/3 に対して結合するという新たな機構が明らかになった。
TGF-βシグナルの異常は、がんや線維症などの重篤な疾病へとつながる。
SMAD2/3 を 中心とした転写因子複合体のネットワークが明らかになれば、疾病の治療につな
がる新たな知見が得られることが期待される。

図：SMAD2/3-補因子複合体の立体構造とそのモデル図

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-113 L
BL-5A, AR-NW12A

カナマイシン生合成酵素 KanD2 と KanJ の結晶構造解析
Structural analysis of kanamycin biosynthetic
enzymes KanD2 and KanJ
宮永顕正 1、北山幸延 1、工藤史貴 1、江口正 1
1 東京工業大学理学院
アミノグリコシド抗生物質は、カナマイシンやストレプトマイシンなどが知られており、古くから重要な抗生物質として使用されてきた。その化学構造は、アミノサイクリトー
ル骨格にアミノ糖やデオキシ糖が複数連結した擬似オリゴアミノ糖であり、組み合わせにより多種多様なアミノグリコシド抗生物質が知られている。アミノグリコシド抗生物質の大多数は、アミノサイクリトール部位に 2-デオキシストレプタミン (2-DOS) を有している。これら 2-DOS 含有型アミノグリコシド抗生物質の生合成においては、パロマミンを共通中間体として生成した後、糖転移やアミノ化などそれぞれの生合成経路に特徴的な修飾反応を受け、多種多様な構造を有するアミノグリコシド抗生物質が構築されると考えられている。
当研究グループでは、これまでに放線菌 Streptomyces kanamyceticus が生産するカナマイシンの生合成研究を進めてきた。その結果、以下の生合成経路を明らかにした (図)。すなわち、糖転移酵素 KanM2 が UDP-グルコースを糖供与体として、パロマミンを配糖化し擬似三糖骨格を形成する。次に、酸化酵素 KanD2 とアミノ基転移酵素 KanS2 が、導入されたグルコース部位 (ring III) の 3''位水酸基をアミノ基へと変換する。酸化酵素 KanQ とアミノ基転移酵素 KanB が ring II の 6'位水酸基をアミノ基へと変換し、最後にジオキシゲナーゼ KanJ と還元酵素 KanK が ring IIの 2'位アミノ基を水酸基へと変換することによってカナマイシン A が生成する。
KanD2 は単糖類であるグルコースには作用しないことから擬似三糖骨格を認識していると考えられるが、その認識機構は不明であった。また、KanJ は ring II の 6'位にアミノ基を有する基質を好んで認識することが明らかになっているが、その認識機構は不明であった。そこで、KanD2 と KanJ の基質認識機構を明らかにすることを目的
として結晶構造解析を行った。本発表ではその詳細について議論する。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-114 L

PF-AR NE3A, NW12A

シュウドアズリン Met16 変異体の X 線結晶構造解析および
QM/MM 計算
X-ray Crystal Structure Analyses and QM/MM
Calculations of Pseudoazruin Met16 Variants
山口峻英 1、タボロシ アティラ 1、森 聖治 1、高妻孝光 11 茨城大学
The effects on the structure and function of non-covalent weak interactions
at the second coordination sphere of blue copper protein, Pseudoazurin (PAz)
WT and Met16 (Phe, Leu, Val, Ile) variants were studied (Figure 1). The X-ray
crystallographic analyses combined with quantum mechanical calculations
allowed us to identify the S-π/CH-π (Wild Type), face-to-face or face-toedge π-π (Met16Phe), double
CH-π (Met16Leu) and single
CH-π (Met16Val and Met16Ile)interactions in the second
coordination sphere of Met16X
PAz. Definite correlation between
thecalculated
interactionenergies and the previously
reported
spectroscopic/electrochemical
properties [1,2] clarified thetuning of the Cu active site andthe protein stability through these
Figure 1. Integrative studies of nonnon-covalent weak interactions.
covalent weak interaction in blue copper
protein, pseudoazurin.
References[1] R. F. Abdelhamid, et al., J. Bio. Inorg. Chem. 2007, 12, 165-173.
[2] T. Yamaguchi, et al., Protein Science, 2017, 26, 1921-1931.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-115 L

PF-AR-NW12A, PF-BL5A

糖転移反応を触媒する glycoside hydrolase family 35 酵素の機能構造解析
Structural and functional analysis of a glycosidehydrolase family 35 enzyme catalyzing
transglycosylation
小林海渡 1、田口速男 1、中井博之 2、中島将博 1
１ 東京理科大学 理工学部、２ 新潟大学 農学部（目的、方法）β-1,2-グルカンは天然に存在する希少な糖鎖であり、それゆえにβ-1,2-グルカンの合成や分解に関わる酵素に関する報告は少ない。近年、
β-1,2-グルカンをエンド型で分解するβ-1,2-グルカナーゼ(SGL)遺伝子が同定されたことにより、β-1,2-グルカン関連酵素探索が容易になった。グラム陰性菌 Ignavibacterium はゲノム上に SGL 遺伝子をもち、その周辺が遺伝子クラスターを形成している。その遺伝子群には glycoside hydrolase family 35 に属する遺伝子（SGT）が含まれているが、その大半はβ-ガラクトシダーゼであり、グルコシドに作用する酵素は報告されていない。そこで、この SGT 遺伝子
産物を大腸菌を宿主として生産し、その機能と構造の解析を行った。
（結果）SGT の各種グルコオリゴ糖に対する活性を調べたところ、β-1,2-グル
コオリゴ糖に対してグルコシドを糖転移する活性を示し、他の基質に対して活性を示さなかった。そこで、β-1,2-グルコオリゴ糖に対する酵素反応速度論
量を調べたところ、糖質関連酵素としては低い活性を示したため、ソホロース（β-1,2-グルコ二糖）を糖供与体として各種グルコシドを用いて糖受容体の探索を行った。その結果、芳香環を有するグルコシドに対して高い活性を示した。
次にこの酵素の X 線結晶構造解析を行い、2.0 Åの分解能で立体構造を得ることに成功した。SGT 結晶にグルコースをソーキングしたところ、サブサイト+1 のみにグルコースが明確に観察された。また、活性を欠失した変異体にソホロースをソーキングしたところ、サブサイト−1 と+1 にソホロースが明確に観察された。しかし、β-1,2-グルコ三糖との複合体ではサブサイト+2 のグルコー
ス部分は基質ポケットとやや立体障害になる位置に存在しており、これが糖転移活性を低くする構造的要因と考えられる。芳香環を有するグルコシドとの複合体構造を取得したところ、グルコシド結合のアノマーにかかわらず、グル
コース部分はサブサイト+1 に結合していた。また、アグリコン部分は疎水性残基で囲まれた領域に結合していた。以上より、SGT がβ-1,2-グルコオリゴ糖を基質として、芳香環を有するグルコシドにグルコースを転移する酵素である
ことが明らかとなった。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-116 L

PF-BL1A, PF-BL17A, AR-NE3A

Burkholderia stabilis 由来
コレステロールエステラーゼの結晶構造
Crystal structure analysis of Burkholderia stabilischolesterol esterase
安武義晃 1,2，小西健司 3,4，村松周治 3，吉田圭太朗 1,油谷幸代 1,2,5，
酒瀬川信一 3，田村具博 1,2,4
1 産総研・生物プロセス、2 CBBD-OIL、3 旭化成ファーマ（株）、4 北大院農、
5 産総研・細胞分子工学
グラム陰性細菌 Burkholderia stabilis が細胞外に分泌するコレステロールエス
テラーゼ（BsChe）は、よく知られた細菌トリアシルグリセロールリパーゼ（Lip）のホモログである。BsChe は、高い安定性と実用的な Che 活性を示す希少な
Lip の一種であり、現在、総血清コレステロール値を測定するための臨床診断用酵素として使用されている。BsChe がなぜ Che 活性を発露できるのかを構
造学的側面から詳細に調べるため、BsChe の X 線結晶構造解析を行った。その結果、既知 Lip 構造では報告例のない活性部位のクレフトに局所的な構造変化が見られ、これは基質結合と生成物の放出に関係している可能性が示唆された。一方、基質あるいは生成物との複合体結晶の取得が困難であった
ため、解析した BsChe 構造と基質であるリノール酸コレステロールエステル（CLL）の分子ドッキング計算を行った。その結果、CLL のエステル結合の炭素原子が BsChe の触媒残基 Ser87 に隣接するように結合したドッキングポーズ
は全て、ステロール部位が Leu266 と Ile287 によって形成される特定の活性部
位クレフト表面に集まる様子が観察された。これらアミノ酸に変異導入を行ったところ、Che 活性が消失したことから、これら２アミノ酸が Che 活性の決定因子であることが示された。またこれらの Leu/Ile 残基を近縁の Lip ホモログに導入したところ、特に Burkholderia cepacia および Burkholderia ubonensis のLip は、野生型酵素と比較して、それぞれ 50 倍、500 倍高い Che 活性を示した。これらの結果は、Burkholderia が持つ Lip 酵素群の基質結合機構と選択性についての新たな知見を与えるものである。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-117 L
MLF-BL03, BL-5A

PcyA D105N-BV 中性子結晶構造解析に向けた結晶大型化
Crystal growth for PcyA D105N-BV Neutron Crystal
Structure Analysis
茨城大学 1・久留米高専 2・久留米大学 3・宮崎大学 4・大阪大学 5七澤諒太 1, 堀江和輝 1, 萩原義徳 2, 杉島正一 3, 和田啓 4,福山恵一 5 , 海野昌喜 1
フェレドキシン依存性ビリン還元酵素 PcyA はヘム分解産物であるビリベ
ルジン(BV)を出発物質として２段階の還元反応によりビリン色素の１つである
フィコシアノビリン(PCB)の生合成反応を触媒する。この反応の特徴は PcyA が
基質 BV の異なる２つの部位を一定の順序で特異的に還元することである。
我々は野生型(WT)PcyA-BV 複合体の中性子結晶構造解析により、BV とプロトン化した BVH＋が混在し、その付近に存在する Asp105 もプロトン化、脱プロ
トン化しそれぞれが別のコンホメーションをとっていることを見出した[1]。BV の2 つのプロトン化状態は計算科学的に予測されていた PcyA-BV 複合体の吸収スペクトルとの相関関係と一致する結果であった [2] 。また、 Asp105Asn(D105N)変異体および Ile86Asp(I86D)変異体と BV との複合体の吸収スペクト
ルでは、WT で見られた長波長側のピークがそれぞれ消滅および増大していた。本研究の目的は、D105N-BV 複合体の中性子構造解析を行い BV や周辺
アミノ酸残基のプロトン化状態を明らかにし、PcyA-BV や I86D-BV との比較
により、吸収スペクトルとの相関関係を証明することである。
本研究室では PcyA D105N-BV 複合体の中性子構造解析を行ったが、分解能やデータの質が悪く、BV のプロトン化状態について決定することができなかった。そこでより高分解能の回折データを得るために結晶化の検討を行い、測定に十分な大きさの良質結晶が複数得られた。本発表では中性子回折強度データ収集に向けた良質な大型結晶の作製および中性子回折実験の結果について報告する。
【参考文献】[1] Unno, M., et al., (2015) J.A.C.S., 137, 5455-5458[2] Hagiwara, Y., et al., (2016) FEBS Lett., 590, 3425-3434

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-118 L

PF-AR NW12A, NE3A, BL5A; MLF-BL03

高分解能 X 線解析によるリゾチーム加水分解機構の再検討
Re-examination of lysozyme hydrolysis mechanismby high-resolution X-ray structural analysis
西野宮良太 1,田中伊知朗 1,2, 茶竹俊行 3
1 茨城大院理工，2 茨城大フロンティアセンター，3 京都大複合研
リゾチームは細菌の細胞壁ペプチドグリカンの N-アセチルムラミン酸と Nアセチルグルコサミン間のグリコシド結合を切断する酵素で、50 年以上前に構造が決定されたものであり、これまで様々な触媒機構が提案されている。代表的な反応として、共有結合中間体を作成し反応が進む Koshland 機構という反応があるが、これはリゾチームと共有結合を作りやすいリガンドで行った不自然な条件下での結果によるものである[1]。そこで本研究では、リゾチームの反応が生体内で進む際、より自然な系で観察するため、N-アセチルグルコ
サミンの 4 量体((NAG)4 を基質に用いた条件で、酵素反応に関係する水和水の位置情報や触媒基の水素結合等を,Ｘ線回折実験を行い解析した。
実験に用いたリゾチームは SIGMA-ALDRICH 社のニワトリ卵白リゾチーム、糖は Megazyme 社の(NAG)4 をそれぞれ使用した。50mM 酢酸ナトリウム緩衝液ｐD4.5（重水を使用）、NaCl0.7M、リゾチーム 40mg の 5+5μL スケールでの室温ハンギングドロップ法にて共結晶化し、抗凍結剤としてグリセロールを30%（w/v）混合した。X 線回折実験は、PF-AR NW12A、5A, NE3A にて行い、温度は 100K で測定した。また、中性子回折 BL-03 (iBIX)にて室温でのテスト測定も行った。
X 線解析では、1.03Å高分解能データ解析ができ、問題の触媒反応機構に関係する基質とアミノ酸との相互作用が明らかになった。リゾチームの触媒残基 Asp52 の側鎖と(NAG)4 の C1 の距離は結合するには長すぎると考えられる
こと、Asp52 側鎖に対して周辺の水素結合が比較的強く形成されているので、C1 との共有結合に必要な Asp52 側鎖の回転が起こりにくいことが推測できた[2]。今後、中性子解析にて、これらの水素結合等を詳細に明らかにする予定
である。

参考文献

[1] D. J. Vocadlo et al., Nature 412 (2001) 835.
[2] I. Tanaka et al., Acta Cryst. D (2021) in press.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-119 L

PF-BL5A、PF-BL17A

カルボニルストレスを伴う統合失調症におけるCRMP2 タンパク質の機能異常解析
Enhanced carbonyl stress induces irreversible
multimerization of CRMP2 in schizophrenia
pathogenesis
1*

2*

1

2§

1§

蒋 緒光 ・豊島 学 ・小川 覚之 ・吉川 武男 ・廣川 信隆
1 東京大学大学院医学系研究科 細胞生物・解剖学教室 2 理化学研究所脳神経科学研究センター 分子精神遺伝研究チーム ＊筆頭著者§責任著者
カルボニルストレスは生体内で反応性カルボニル化合物がタンパク質を非酵
素的に修飾し、終末糖化産物(AGEs)の蓄積を促進する。近年およそ 2 割の統合失調症患者においてカルボニルストレスの亢進が報告され、カルボニルス
トレスの除去機構に関わる酵素 GLO1 遺伝子の変異が統合失調症患者で見つかっている。しかし、カルボニルストレスがどのようなメカニズムで統合失調症に関わるのかは不明のままであった。本研究は iPS 細胞を用いてカルボニ
ルストレスの影響を分子レベルまで詳細に調べ、カルボニルストレスの分子病態を明らかにした。まず、カルボニルストレスを伴う統合失調症患者で変異が確認された GLO1 遺伝子に着目し、患者由来 GLO1 変異 iPS 細胞と、GLO1
KO iPS 細胞を作製した。これらの iPS 細胞を用いてニューロスフィアや神経細胞を作製すると、GLO1 遺伝子の異常によりニューロスフィアの生育が悪く、神経細胞の突起伸長も低下した。GLO1 KO iPS 細胞において強くカルボニル化
修飾を受ける主要なタンパク質を探索し、神経突起の伸長に関わる CRMP2 を同定した。さらに質量分析により iPS 細胞内の CRMP2 タンパク質の 60 箇所に及ぶカルボニル化修飾の位置を決定した。このカルボニル化修飾は CRMP2の (1) 表面電荷を大きく変化させること、(2)複合体形成に重要な部位に密集し、カルボニル化 CRMP2 では微小管との結合や微小管を束ねる活性が失われていた。このカルボニル化 CRMP2 複合体の構造を X 線結晶解析によって詳細に調べると、AGE 修飾によって CRMP2 複合体内部で不可逆的に架橋が形成されており、CRMP2 のダイナミックな動きの喪失が示唆された。サイズ排除クロマトグラフィーによって CRMP2 複合体のサイズを解析すると、修飾のな
い CRMP2 が 4 量体を形成するのに対し、カルボニル化 CRMP2 は大きな不可
逆的多量体を示した。この多量体は GLO1 KO iPS 細胞においても検出され、更にピリドキサミン添加により多量体が軽減した。これらの結果から、カルボ
ニルストレスを伴う統合失調症の患者細胞内では、カルボニル化修飾を強く受けた CRMP2 が不可逆的に多量体化して微小管の束化機能が失われ、神経の形態形成を正常に行えないという分子病態が明らかとなった。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-120 L

Crystal structure analysis on the binding modes of inhibitors for HIV-1 RNase H
activity
Huiyan Lu, Koto Usami, Tyuji Hoshino
Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba University

Reverse transcriptase of HIV-1 converts viral RNA into DNA in host cell. WhenRNA is no longer needed, it is degraded by a nuclease active domain that is inherent inreverse transcriptase. The nuclease active domain contains two bivalent metals and iscentral to the catalytic function of cleaving nucleic acids. The action caused by the
nuclease active domain of HIV-1 is called RNase H activity because it cleaves only
RNA in a complex of single-stranded DNA and RNA.
To search for inhibitory molecules, reverse transcriptase recombinant proteins wereexpressed in E. coli. and purified by column chromatography. Chemical screening was
performed by fluorescence resonance energy transfer (FRET) method, using a probewith a fluorochrome conjugated to the RNA and with a light absorber added to the DNA.
From the screening, it was found that a compound having a nitro-furan skeleton
structure has an activity inhibiting effect. Analogues were obtained by organic synthesis
and structure-activity relationships of the identified active compounds were examined.
Nitro-thiophene was also found to have RNase H inhibitory activity.
In order to carry out a drug modification design for improving the inhibitory
activity, a nuclease activity domain was expressed and purified to produce a single
crystal, and then an inhibitory compound was introduced by soaking to obtain a binding
structure with the X-ray crystal analysis. The protein crystal was also produced under
the condition of the coexistence of the inhibitory compound. The crystal structure
revealed that the nitro group and its adjacent carbonyl oxygen were chelated with two
divalent metals in the active domain and attached to the metal site. Furthermore, somesynthetic compounds do not inhibit human RNase H, but block the viral RHase H
activity. The structure-activity relationship and X-ray crystallographic analysis provided
a guide for the development of compounds that inhibit only viral RNase H.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-121 L
PF-BL17A、PF-BL1A

Endo-β-N -acetylglucosaminidase PMαの構造と機能
Structure and function ofEndo-β-N-acetylglucosaminidase PMα
大倉和貴 1,森真司 2,伊藤和央 2,米澤健人 3,清水伸隆 3,神谷信夫 4,宮原郁子 1(1 大阪市大院理・物質分子, 2 大阪市大院理・生物地球,
3
KEK 物構研,4 大阪市大・人工光合成セ)
我々は、native な糖タンパク質からアスパラギン結合型糖鎖を遊離する
Endo-β-N- acetylglucosaminidase の探索、機能・構造解析を行っている。
P.melaninogenica の 産 生 す る Endo- β -N- acetylglucosaminidase PM α
（Endo PMα）は、アスパラギン結合型糖鎖のうち複合型糖鎖に特異的に作用
し 、 糖 鎖転 移 活 性を 示 す。 Endo PMα は 、 糖 質 加水 分解 酵 素 ファ ミリー
85(GHF85)に分類され、1009 アミノ酸残基から構成されるモノマー酵素である。
今回、Endo PMαの結晶構造を、2.1 Å 分解能で N 末端の膜貫通ドメインを除
く 28～1008 残基について決定したので報告する。
Endo PMαは、５つのドメインから構成されており、Ｎ末端側からドメイン I～
V とした。ドメイン I は、触媒ドメインとされる(α/β)8 バレルで構成されており、さらにβドメインであるドメインＩＩ，ＩＩＩがドメインＩのバレルの側面に配置していた。
ドメイン I～III を含む構造は、GHF85 に属する EndoA とドメイン間の相対配置を含め非常に良く似ていることが明らかとなった。また、EndoA で酸塩基触媒と想定されている Glu と Asn の空間配置も一致していたことから、EndoPMα
でも同じ部分が触媒部位と考えられた。C 末端の 50 アミノ酸残基からなるドメ
イン V は、独立した１つのβドメインを構成しており、この領域を欠損しても活性に関与しないことや、アミノ酸配列の相同性から外膜移行シグナルとして働く領域と推測された。ドメイン IV は、これまでに明らかとなっている GHF85 に属する酵素には存在しない、約 170 アミノ酸残基から構成されるβバレル構造である。ドメイン III と IV の間には約 30 アミノ酸残基ならなる長いループ構造が存在し、ドメインＩＶは触媒部位を覆うように、ドメインＩの上側に存在していた。ドメインＩＶを欠損させると活性が消失することから、ドメインＩＶは糖鎖の基質認識にかかわると考えられた。Autodock Vina を用いて、今回得られた構造の糖鎖結合モデルを作成し、基質特異性について考察をおこなった。複合型
糖鎖の五糖母核構造部分は、推測される触媒残基で反応が進行するように触媒部位にドッキングすることが出来、ドメインＩに存在する残基との相互作用を明らかにすることが出来た。しかし、糖鎖の側鎖部分がドメイン IV と衝突してしまうことが分かった。一方、SAXS 実験で得られた EndoPMαの構造は、結晶構造とは異なっており、溶液状態ではドメイン IV の位置が結晶構造とは異なっていると考えられた。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-122 L

PF-AR/NE-3A、PF/ BL-5A、BL17A

昆虫グルタチオン S-転移酵素 Noppera-bo を標的とした阻害剤の構造活性相関解析
Structure-activity relationship analysis of inhibitors
targeting mosquito glutathione S-transferase
Noppera-bo
稲葉和恵 1、海老原佳奈 1、小祝孝太郎 2、吉野龍ノ介 3、広川貴次 4、
今村理世 5、小島宏建 5、岡部隆義 5、長野哲雄 5、井上英史 6、藤川雄太 6
佐久間知佐子 7、嘉糠洋陸 7、湯本史明 2、千田俊哉 2、丹羽隆介 8
1 筑波大・生命環境、2 高エネ研・物構研・構造生物、 3 筑波大・医学医療、
4 産総研・創薬分子プロファイリング研究セ、5 東大・創薬機構、
6 東京薬大・生命科学、7 慈恵医大・熱帯医学、8 筑波大・TARA セ
ネッタイシマカ Aedes aegypti はデング熱や黄熱などの感染症媒介虫として問題となっており、ネッタイシマカ駆除に用いることができる殺虫剤の開発は世界的に強く求められている。本研究では、こうした殺虫剤開発のターゲットとして、昆虫の脱皮と変態の誘導に必須の脱皮ホルモンであるエクジステロイドの生合成に着目した。エクジステロイドは節足動物特異的なステロイドホルモンであり、食餌由来のコレステロールを出発点として生合成される。本研究ではエクジステロイド生合成制御酵素の中で、2014 年同定されたグルタチオン
S-転移酵素(GST)である Noppera-bo (Nobo) (Enya et al. Sci. Rep. 2014)を新規殺虫剤開発の標的として、阻害剤との相互作用の解明を試みた。
まず、in vitro の酵素活性測定系にてハイスループットスクルーニングを行い、Nobo を阻害する化合物が複数得られた。それらの中で、フラボノイド骨格を持つ化合物に注目したスクリーニングを行い、最終的に 11 種のフラボノイド阻害化合物を得た。次に、これら阻害化合物の Nobo に対する結合様式を明らかにするために X 線結晶構造解析を行った。その結果、2 つの阻害化合物との複合体構造を、それぞれ 1.95Å と 1.75Å の最大分解能で決定することに成功した。これらの構造情報を基に構造活性相関解析を行い、阻害において重要な Nobo のアミノ酸残基および阻害化合物の構造的特徴を明らかにした。さらに、これらの阻害化合物が、10 ppm の濃度でネッタイシマカの幼虫に対して殺虫効果を発揮することが明らかになった。
今回得られた Nobo と阻害化合物の相互作用に関する化学的知見は、人や環境に影響の少ない昆虫発育阻害剤の探索・創出の基礎となると考えられる。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-123 L

PF-AR-NW12A、BL5A

糖質加水分解酵素ファミリー65 に属する
α-1,2-グルコシダーゼの基質認識機構の解明
Structural analysis of substrate recognition
mechanism in α-1,2-glucosidase
中村駿太郎 1、宮崎剛亜 1,2
1 静大院・総合科技・農、2 静大グリーン科技研[目的] 糖質加水分解酵素ファミリー65 (GH65) は加リン酸分解酵素と加水分解酵素の両方が分類されているファミリーであるが、既報のバクテリア由来 GH65 酵素は全て加リン酸分解酵素であった。我々はこれまでに GH65 に属する Flavobacterium johnsoniae 由来のタンパク質 (FjGH65A)
が天然に希少であるコージビオースを特異的に加水分解する α-1,2-グルコシダーゼであることを明らかにした [1]。本研究では FjGH65A の X 線
結晶構造解析によって、その基質認識や反応機構を立体構造から明らかにすることを目的とした。
[方法・結果] N 末端側に His-tag を融合させた組換え FjGH65A の結晶をハンギングドロップ蒸気拡散法により作製し、PF AR-NW12A および
BL5A ビームラインにおいて X 線回析強度測定を行った。位相の決定は
KAuCl4 にソーキングした単結晶を用いた単波長異常分散法により行い、
FjGH65A のアポ構造とグルコースとの複合体構造をそれぞれ 1.8 Å と 1.4Å 分解能で決定した。FjGH65A の全体構造は他の GH65 酵素と共通しており、N 末端側に β-サンドイッチ構造の N-ドメイン、(α/α)6 バレルの触媒ドメインおよび C 末端側の β-シートドメインで構成されていた。FjGH65Aのアポ構造とグルコース複合体構造の RMSD は 0.172 Å であり、主鎖に大きな差異は認められなかった。グルコース複合体では、FjGH65A 1 分子につき β-グルコースが 4 分子結合しており、そのうちの 3 分子は活性部位に結合していた。サブサイト−1 の β-グルコースの 1 位の炭素原子とサブサイト+1 の β-グルコースの 2 位の酸素原子が最も近接していた。サブ
サイト+1 の β-グルコースと水素結合をとる Glu472 とサブサイト−1 の βグルコースと水素結合をとる Gln539 はアポ構造と比較するとコンフォメーションが変化していた。
参考文献[1] 中村駿太郎、宮崎剛亜、朴龍洙、日本応用糖質科学会 2020 年度大会
要旨集、2020 年

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-124 L

PF-BL1A、BL5A、BL17A、PF-AR-NE3A、NW12A

阻害剤を用いたβ-L-アラビノフラノシダーゼの研究
Inhibitor-based studies on β-L-arabinofuranosidase
味木 智子 1、澤野 孝太 1、成田 覚 2,3、鈴木 健裕 3、荒川 孝俊 1,4、山田
千早 1,4、堂前 直 3、藤田 清貴 5、石渡 明弘 3、伊藤 幸成 3,6、伏信 進矢
1,4 1（ 東大院・農生科・応生工，2 芝浦工大院理工、3 理研、4 東大・微生物連携機構、5 鹿児島大院農、6 阪大院理）ビフィズス菌は植物細胞壁を構成する糖タンパク質である β-L-アラビ
ノオリゴ糖を分解する酵素群を有する。そのうち、GH127 に属する β-Lアラビノフラノシダーゼ（HypBA1）は、その立体構造から Cys417 を求核性触媒残基とした糖質加水分解酵素初のシステイングリコシダーゼであると提唱された。この仮説の検証を行うため、活性中心の Cys と共有結合を形成する不可逆的阻害剤（ブロモアセトアミド基を有する α/β-Lアラビノフラノシルアミン誘導体、α/β-Br amide）を合成した。先行研究
において、α/β-Br amide との複合体の結晶構造解析が行われ、β 体はCys417 と共有結合していたのに対し、α 体は隣接する Cys415 と共有結合していた。なお、Cys415 は保存されておらず C415S/A 変異体は完全には活性を失わない。今回は、質量分析と変異体を用いた複合体の結晶構
造解析を行い、さらなる検証を行った。
LC-MS/MS を用いて、阻害剤が結合したアミノ酸残基を特定し比率を調べた結果、野生型酵素では α 体、β 体ともに主に Cys415 がラベルされていたが、Cys417 へのラベルも観測された。変異体を用いた場合、C415S
では 50％以上の Cys417 がラベルされており、C417S では 20〜30%程
度の Cys415 がラベルされていた。変異体との複合体構造では、活性中心に Br amide の電子密度マップは確認されなかった。また、リガンドが結合していない HypBA1 の構造と同様に、活性中心部分とそれを覆うループがディスオーダーしていたことから、結晶化したのは Br amide が結合していない一部の変異体 HypBA1 である可能性が高いと考えられる。
加えて、同様の阻害形式を取ると考えられる β-L-アラビノフラノシル型シクロフェリトール阻害剤との複合体構造を 1.75 Å の分解能で決定した。活性中心にこの阻害剤と考えられる電子密度が存在し、阻害剤の 1 位の炭素と Cys417 が共有結合していることを確認した。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-125 L

PF-BL5A、AR-NW12、ＰＦ-BL1A

新規レクチン様タンパク質の結晶構造解析と糖との結合解析
Crystal structure analysis and sugar binding
analysis of a novel lectin like protein
影山大夢 1、小野寺かこ 1、松井崇 1,3、小川智久 1,2、横山武司 1、田中良和 1
1 東北大院・生命、2 東北大院・農、3 北里大・理
本研究では、熱帯地方の海綿抽出物中に見出された新規レクチン様タンパ
ク質の構造と機能の解析に取り組んだ。まず、大腸菌発現系を用いて調製したレクチン様タンパク質を結晶化し、PF-BL5A にて X 線回折データを収集した。
既知のレクチンの構造を用いた分子置換法による構造決定を試みたが、位相決定できなかったため、AR-NW12 に併設された結晶加工装置にて結晶を円柱状に加工し、これを用いて PF-BL1A にて 2.7 Å の波長の X 線回折データを収集した。硫黄の異常散乱効果を利用した SAD 法により位相決定し、その構造を 1.4 Å の分解能で決定した。得られた構造は既知のレクチンと類似した構造を有していたが、ベータシートの一部の向きが異なっていたことから、分子置換法の並進関数の計算において隣接分子と立体障害が起きるために、分子置換法では構造決定できなかったと考えられる。次に、生化学的解析により糖結合活性を評価した。糖結合カラムを用いた実験からフコース、マンノースと結合することが確認できた。そこで、これらの糖との複合体の結晶構造解析を行い、糖の結合様式を明らかにした（図）。いずれの糖も 3 つの水酸基がCa2＋イオンを介して認識されており、このレクチン様タンパク質の糖鎖特異性を明らかにできた。さらに、等温滴定型熱量測定（ITC）および表面プラズモン
共鳴（SPR）によりフコース、マンノースとの結合の詳細を評価したところ、フコースには KD=4M 程度の強さで結合するものの、マンノースに対する結合性はフコースに比べて著しく低いことがわかった。糖結合カラムや結晶構造解析
では 2 つの糖鎖の結合に差異は確認されなかったのに対し、ITC や SPR による精密相互作用解析では大きな違いが確認されたことは注目すべき点である。
これらの結果は、高濃度の試料を用いて行う生化学実験や結晶構造解析で得られる結果が、必ずしも正しい分子特性を示さないことがあることを意味しており、構造解析と精密な物理化学解析を並行し
図 レクチン様タンパク質とフコース（左）及びて実施することの重要性が改
マンノース（右）の複合体結晶構造
めて示された。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P3-126 L
PF-BL1A, PF-BL5A

高度好熱菌由来 Mn-カタラーゼの結晶構造解析
Crystal structure analysis of Mn-catalase from
Thermus thermophilus HB27
高木 夕里圭 1，高野 紗和 2，高橋 果林 1，山田 太郎 3，庄村 康人 1,2,3

1 茨大•工•生体分子機能工, 2 茨大•院理工•量子線科学,
3 茨大•フロンティアセンター【背景】 過酸化水素がもつ殺菌・漂白等の作用は，廃水処理や半導体の洗浄など幅広い分野で工業的に利用されている．Mn-カタラーゼは活性部位に二核 Mn クラスターをもつ過酸化水素分解酵素で，廃水中に含まれる過酸化水素を分解する触媒としての利用が期待されているが，その触媒機構の詳細は解明されていない．本発表では，X 線・中性子結晶構造解析による Mn-カタラーゼ触媒作用の反応機構の解明に向けた発現系の構築，培養条件の最適化，および X 線結晶構造解析の結果について報告する．
【実験方法】 高度好熱菌 Thermus thermophilus HB27 由来カタラーゼ遺伝子
発現ベクターにより形質転換した同株を TB 培地で培養し，タンパク質を産生させた．目的タンパク質の精製は Strep-tactin アフィニティーカラムおよび陰イ
オン交換カラムにより行い，結晶化標品とした．得られた結晶の X 線回折デー
タ測定は Photon Factory にて，中性子回折予備実験は J-PARC BL03 にて行った。
【結果・考察】 まず宿主である HB27 株野生体のゲノム中の Mn-カタラーゼ遺伝子をカナマイシン耐性マーカーで破壊し，さらにマーカーレス破壊株とした．
Mn-カタラーゼの発現はカナマイシン耐性遺伝子をもつシャトルベクター
pMKE2 にて行った．精製を簡便にするために Strep-tag をループ領域に挿入した 2 種と，C 末端に挿入した合計 3 種のベクターを作製し，それぞれについて結晶化まで行ったところ，256 番目の残基の後に Strep-tag を挿入したタン
パク質からのみ，良質な結晶が得られた．すでに報告されている中性子結晶
構造解析では，Mn の占有率が低いという問題が見られたため 1)，培養条件の最適化を行ったところ，誘導時の温度を下げることによってこの問題は改善された．また，他のグループによって報告されている X 線結晶構造解析の結果
では，放射線損傷によると考えられる構造変化が見られていたが 2)，データ測
定中の吸収線量を数百 kGy に抑えることによって X 線照射による構造への影響は見られないことが分かった．一方，中性子結晶構造解析に向けた予備実
験では，3.3 分解能までの回折点を観測することができた．
1) Yamada, T., et al. (2019) J. Appl. Crystallogr..
2) Antonyuk, S. V., et al. (2000) Crystallogr. Reports

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-127L

PF BL17A, PF BL10C, SPring-8 BL38B1

高度好塩菌 H. salinarum 由来チオレドキシンの立体構造と高塩濃度適合機構
Tertiary structure and haloadaptation mechanism ofthioredoxin from extreme halophile H. salinarum
新井栄揮 1、柴崎千枝 1、清水瑠美 1、安達基泰 1、
石橋松二郎 2、徳永廣子 2、徳永正雄 2
1 量研・量子生命科学領域、2 鹿児島大・農学部
塩湖や塩田などの高塩濃度環境に生息する極限環境生物・高度好塩菌は外界との浸透圧調整のために細胞内に飽和濃度の塩(～35% K+)を保有する。
高度好塩菌が産生する蛋白質（以下、好塩菌蛋白質）はそのような高塩濃度
環境においても機能を保持する。好塩菌蛋白質の高塩濃度適合機構は、高含量の酸性アミノ酸による高い可溶性と、低含量の疎水性アミノ酸(Val, Leu,
Ile, Phe)による構造の可塑性（塩析の効果によるコア構造の安定化）などの特徴に基づくことが知られる。しかし、それらの特徴は必ずしも普遍的ではない[1]。また、好塩菌蛋白質の高塩濃度適合機構は、例えば有機溶媒中のような低水分活性環境下でも機能する酵素触媒システムなど、新たなバイオテクノ
ロジーの開発に応用できると期待される。これらの背景から、様々な好塩菌蛋
白質について更なる構造・機能研究が求められている[1]。
我々は当該研究の一環として、既知の好塩菌蛋白質の中でも特に酸性アミノ酸含量が高い[（Asp + Glu）/（Arg + Lys + His）= 9.0] 高度好塩性古細菌
Halobacterium salinarum NRC-1 由来チオレドキシン（以下、HsTRX-A）について X 線結晶解析及び円偏光二色性解析により立体構造・溶液構造を明らかにし、高塩濃度適合機構の解明を試みた[2]。PF BL17A および SPring-8
BL38B1 を利用して決定した HsTRX-A の立体構造（PDB ID: 6KIL、分解能
1.6Å）を相同性のチオレドキシンと比較した結果、 HsTRX-A の活性残基（Cys45 および Cys48）の周辺には他の TRX には見られない水和水ネットワー
クが存在することが明らかになった。この水和水ネットワークは触媒反応に必要なプロトン輸送を効率化し、高塩濃度・低水分活性環境での機能発現に寄与すると推察された。また、HsTRX-A は長く柔軟な N 末端領域（Ala2-Pro17）を有し、この領域が酸性アミノ酸含量の増大や高塩濃度下における構造安定性・可溶性・酵素活性の向上に寄与することが明らかになった。更に、この N
末端領域は活性部位を阻害しない位置に伸長しており、HsTRX-A は高塩濃度適合のために合理的な分子進化を遂げたことが示唆された。
[1] Karan R et al., (2012) Aquat. Biosyst. 8, 4
[2] Arai S et al., (2020) Acta Cryst. D76, 73

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-128L

PF-BL1A, PF-BL17A

互いに光学異性体関係にある二つの主要な B 型肝炎ウイ
ルス逆転写酵素阻害剤に対する共通の薬剤耐性機構
Common structural basis for the resistance ofreverse transcriptase against chirally distinct antiHBV nucleoside analogues
安武義晃 1,2・服部真一朗 3・田村範子 1・松田幸樹 3・向後悟 3・
前田賢次 3・満屋裕明 3,4
1 産総研・生物プロセス、2 CBBD-OIL、3 国立国際医療研究センター・研究所、4 National Cancer Institute, National Institutes of Health
逆転写酵素（RT）は抗ウイルス薬が作用する重要な標的タンパク質であり、薬剤結合機構、薬剤耐性機構を詳細に理解するため、さらには新規薬剤設計を行うために RT の立体構造情報は重要な役割を担う。B 型肝炎ウイルス（HBV）
は世界で２億人以上に持続感染し、年間約 100 万人が死亡している。現在治療に使用されている抗 HBV 薬は全て RT をターゲットとした核酸アナログ製剤
であるが、HBV RT は著しく不安定な酵素で、その立体構造解析は遅々として進んでいない。一方、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）RT は結晶解析により酵
素と薬剤の相互作用の詳細が広く調べられており、RT 構造研究を行うための現実的な材料である。私たちは HBV RT と HIV-1 RT の配列を比較し、HIV-1
RT の活性部位（薬剤結合部位）を形成するアミノ酸を HBV RT のアミノ酸に置換した様々なキメラ酵素を作成し、抗 HBV 薬であるエンテカビル（ETV）やラミブジン（3TC）に対して薬剤感受性を示す HIV-1 RT キメラを見出すことに成功した。このキメラをコードする HIV-1 にすでに知られている HBV RT の薬剤耐性変異を導入することで、これら二剤に対し HIV-1 が耐性化することを見出した。ETV（D 体）と 3TC（L 体）は互いに光学異性の関係にある核酸アナログであり、これまで L-核酸アナログが結合した RT の結晶構造は報告されていなかった。本研究では、HBV 型 HIV-1 RT キメラに 3TC 三リン酸が結合した状態の結晶解析を行い、L-核酸アナログの活性ポケットへの結合様式を初めて明らかにした。解析の結果、ETV/3TC はともに、ポケット底部のメチオニン（Met184）側鎖を押し込み、移動させるように結合する様子が観察された。このような特殊な結合様式は、なぜ M184V が両剤に対してウイルスの感受性が大きく低下するのかを合理的に説明する。これら構造情報は、薬剤耐性を克服する新規抗 HBV 薬設計に重要な役割を果たす。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-129L

PF-AR NE3A

サリドマイドの水酸化代謝物による C2H2 型
ジンクフィンガー分解選択性の構造基盤
Structural bases for the degradation selectivity ofC2H2 zinc finger by thalidomide metabolite○降旗 大岳 1、山中 聡士 2、本田 敏章 3、柴田 哲男 3、田之倉 優 1、澤崎 達也 2、宮川 拓也 1
（1 東大院農生科、2 愛媛大 PROS、3 名工大院工）サリドマイド（Thal）は、催奇性などの副作用を示すものの、免疫調節薬（IMiD）
として再発難治性の多発性骨髄腫の治療に使用されている。Thal の生体内における受容体 CRBN は E3 ユビキチンリガーゼの構成要素の 1 つであり、Thal
依存的に標的タンパク質（ネオ基質）を結合して分解に導く。C2H2 ZF 型転写因子の SALL4 と IKZF1 が Thal による催奇性と免疫調節作用にそれぞれ関わるが、最近、生体内で Thal のフタルイミド環の 5 位が水酸化された代謝物（5HT）が SALL4 の分解のみを引き起こすことが見出された。本研究では、ネオ基質に対する Thal の選択性が体内代謝で変化する仕組みに着目し解析を行った。
Thal と 5HT は鏡像異性体（R 体及び S 体）をとるため、まず各鏡像異性体がSALL4 と CRBN の相互作用を誘導する効果を評価したところ、S 体が低濃度で作用することが示された。次に S 体の Thal 及び 5HT の存在下で SALL4 の
2 番目の zinc finger ドメイン（ZF2）と CRBN のサリドマイド結合ドメイン（TBD）の複合体を形成させ、それらの立体構造を X 線結晶構造解析により決定した。
その結果、どちらの化合物も SALL4 ZF2 と CRBN TBD をつなぎとめる“分子のり”の役割を果たしていた。複合体構造において、Thal と 5HT の結合位置は同じであったが、5HT の 5 位水酸基が CRBN TBD と水を介した水素結合を形成し、複合体形成を促進する要因であることがわかった。一方、5HT の 5 位
水酸基は複合体構造中で SALL4 ZF2 のβヘアピンの 2 番目（P2）と 9 番目
（P9）のアミノ酸残基の近くに位置しており、IKZF1 ではこれら残基の種類が異なることが見出された。実際に SALL4 と IKZF1 の残基を入れ替えると 5HT は
SALL4 ではなく IKZF1 に作用できるようになり、特に P2 がネオ基質に対する
5HT の選択性の鍵となる構造であることが明らかになった。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-130L

BL5A

フラクトオリゴ糖を分解する GH32 酵素とフルクトースとの複合体の立体構造解析
Crystal structure of a GH32 fructooligosaccharidehydrolyzing enzyme in complex with fructose
窪田有紗 1、川合礼華 1、松浦明香 1、藤井匡 2、栃尾巧 2、
西河淳 1、殿塚隆史 1
1
東京農工大院農、2 物産フードサイエンス研究開発センター[緒言] フラクトオリゴ糖は、三糖 1-ケストースや四糖ニストースなどのフルクトースを構成糖とするオリゴ糖の総称である。このうち、1-ケストースは特にプ
レバイオティクスの機能が高いことが報告されている。我々は、1-ケストースを生産する過程で一緒に生成するニストースについて、これを分解する酵素を探索した。その結果、ミツバチの腸内細菌 Frischella perrara 由来の糖質加水分解酵素ファミリー（GH）32 に属するβ-フルクトフラノシダーゼ（以下FperFFase）が、ニストースおよびスクロースに対する分解活性が大きく、かつ
1-ケストースに対する分解活性が小さいことを見出した。GH32 に分類される酵素の多くは、二糖スクロースを加水分解する酵素である。FperFFase がどのような機構で、三糖 1-ケストースよりも四糖ニストースや二糖スクロースに対し高い分解活性を示すのか解析するため、フルクトースとの複合体の立体構造を決定した。
[方法] FperFFase の遺伝子を PCR で増幅し、pET44a を用いてプラスミドを構築し、大腸菌 BL21(DE3)株を用いて Nus タグ融合タンパク質として発現させた。Ni-NTA アガロースにより精製し、スロンビン処理によってタグを切断後、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製 FperFFase を得た。ハンギングドロ
ップ蒸気拡散法により結晶化し、フルクトースを含む溶液にソーキングした結晶を用いて、Ｘ線回折強度測定を行った。
[結果] FperFFase とフルクトースとの複合体の立体構造を 2.0-Å分解能で決定した。FperFFase は、他の GH32 酵素と同様、N 末端側のβ-プロペラドメ
インおよび C 末端側のβ-サンドイッチドメインから構成されていた。また、フルクトースは活性中心に 1 分子結合していることが分かった。FperFFase の活性中心には、他の酵素では見られないトリプトファン残基が存在し、1-ケストー
スは結合しにくいような構造であることが判明した。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-131LSLS-X06SA

緑膿菌由来の酸素結合タンパク質
マイクロヘムエリスリンの構造解析
Structural analysis of microhemerythrin, an oxygenbinding protein from Pseudomonas aeruginosa
南本晃希 1, 北西健一 2, 海野昌喜 3
1 茨城大工、2 東京理科大理、3 茨城大フロンティア【緒言】 タンパク質ヘムエリスリン(Hr)は、海洋無脊椎動物や一部の環形動物がもつ酸素運搬タンパク質である。この Hr の単量体は X 線結晶構造解析
により 4 つのαヘリックスの中心に二鉄が酸素に架橋された構造[1]をもち、還元型、酸素結合型、酸化型の酸素結合様式[2]が提唱されている。しかし、X 線構造解析では水素原子の可視化が難しくこの結合様式を実験的に見ることは難しい。そこで、我々は T. dyscrita 由来の Hr を用いて水素原子可視化が可能な中性子構造解析を目指した。しかし、実験等からこの Hr は中性子構造解
析に向かないと判断した。
そこで、最近になり発見された緑膿菌由来のヘムエリスリン（マイクロヘムエ
リスリン：Mhr）で中性子構造解析を行うことにした。Mhr の構造を明らかにすることは Hr の酸素結合様式を明らかにし、同時に緑膿菌の増殖を抑えるのに新
たな抗菌薬に変わる酸素結合阻害剤の開発などにつながることが期待される。
この Mhr については X 線結晶構造さえも未報告であることから本研究では、
そこから取り掛かかった。
【実験】大腸菌発現系で Mhr の遺伝子を発現し、Ni アフィニティ及びゲル濾過
カラムクロマトグラフィーによって精製し、PEG を組成に含むリザーバーを用いてシッティングドロップ蒸気拡散法で結晶化した。得られた結晶からスイスのSLS での X 線回折データをもとに X 線結晶構造解析を行った。
【結果】結晶化スクリーニングとその条件の最適化の結果、酸化型及び azide
結合型 Mhr の結晶を得ることができた。、酸化型 Mhr の結晶から最高分解能
2.47Åの X 線回折データを得ることに成功し、鉄の異常散乱を用いた方法で構造を決定した。 Mhr はゲル濾過分析により単量体と予測されており、非対称単位には 2 分子が存在した。得られた構造は他の Hr と同様に 4 つのαヘリックスに鉄二核中心の構造をもち、二鉄は 5 つのヒスチジン、グルタミン酸とアスパラギン酸と配位していることを確認した。
[1] Margaret A. H., et al. (1991) J. Mol. Biol., 218, 583-593[2] Kelvin H.-C. C. et al. (2015) J. Inorg. Biochem., 150, 81–89

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-132L

BL-1A, BL-5A, BL-17A, PFAR NE-3A, PFAR NW12KEK における日常的な全自動測定システムの利用
Daily use of full automated measurement system inKEK篠田 晃 1，山田 悠介 1，平木 雅彦 2，松垣 直宏 1，千田 俊哉 1
1 KEK・物構研, 2 KEK・機械工学センター
全自動測定システムではサンプルを結晶交換ロボット(PAM)で次々と交換し、自動でセンタリング、スナップショットを測定し反射を評価し一定以上の分解能があればデータセットの測定を行う。KEK では 2018 年度から全自動シス
テム（SIROCC）を一般ユーザーに公開し運用してきた。公開当初こそは全自動測定用ビームタイムでのみ全自動測定を受け付けていたが、現在では来所
実験、リモート実験、ラピッド測定(全自動測定用ビームタイム)のいずれでも全自動測定を利用する事が可能となっている。また、2020 年はコロナ禍で来所実験が減り、全自動測定を利用するユーザーが増加した。特にラピッド測定を利用するユーザーが増加したことで 1 つのビームタイム内に複数のユーザーのサンプルを連続して測定可能となり、ビームタイムの利用効率が改善された。自動測定に持ち込まれる多数のドライシッパーや測定データを保存する
HDD を効率よく、また間違いなく扱うためにユーザー毎の測定とドライシッパ
ー及び HDD を QR タグで紐付けを行っている。
自動測定システムはユーザーからの要望に応じてアップデートを繰り返している。これまでにループ位置が画面外に大きくズレている場合にセンタリングが失敗する事例が一日に数例発生していたが、2020 年冬のアップデートで画面外に外れたループに対しても画面の中心付近に移動させるシステムを導入して改善している。また、複数の要望があった１つのループ内に複数の結晶がある場合にも反射の出る複数結晶からデータセットを取得する測定システムを開発しており 2021 年から利用可能となっている。同時期に small wedge 測定にも対応し、特に BL-1A の長波長と小さなビームを利用した実験に特に有効であると考えられる。
今後ともより使いやすい自動測定システムを提供出来るよう開発を進めていく予定である。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-133L

リボソーム A サイトは tRNA をどう正確に受け入れるのか
How does A site of ribosome accept tRNA precisely?
〇丹澤豪人 1,2，Matthieu G. Gagnon2
1
大阪大学蛋白質研究所，2 テキサス州立大学医学部
全 て の 生 物 で の 翻 訳 開 始 段 階 に お い て ，開 始 tRNA の ア ン チ コ
ド ン UAC は 原 則 P site の AUG 開 始 コ ド ン を 認 識 し 相 互 作 用 し て ，
タ ン パ ク 質 合 成 を 開 始 す る ． し か し な が ら ， 開 始 tRNA は 非 AUG
コ ド ン か ら も 翻 訳 を 開 始 す る こ と が で き る ． 真 正 細 菌 で は ， GUGと UUG は 近 同 族（ near-cognate）開 始 コ ド ン と し て 存 在 し ，全 遺伝子の 1 割以上で使用されている．これら 3 種類の開始コドンに
加 え て ，存 在 数 が 少 な い な が ら も CUG, AUU, AUC, AUA も 非 同 族（ non-cognate） 開 始 コ ド ン と し て 知 ら れ て い る ． し か し な が ら ，
P-site 上 に お け る AUC 開 始 コ ド ン 認 識 の X 線 結 晶 構 造 解 析 が こ れ
ま で に 報 告 さ れ て い る 唯 一 の 先 行 研 究 で あ る た め ，非 AUG 開 始 コ
ドン認識に対する理解は充分とは言えない．
近 年 の リ ボ ソ ー ム の 生 化 学 解 析 に よ り ， mRNA の A/P site の コ
ド ン の ね じ れ （ kink） に 配 位 し た Mg 2+ イ オ ン が A site の コ ド ン 位置を安定化させることが示唆されたが，その詳細な機能については未だ明らかにされていない．
本 研 究 で は Thermus thermophilus 由 来 の 70S リ ボ ソ ー ム・AUG/
非 AUG mRNA・tRNA fMet 複 合 体 を X 線 結 晶 構 造 解 析 を 用 い て 明 ら
か に し ，翻 訳 開 始 段 階 に お け る P site 上 で の 非 AUG 開 始 コ ド ン の解 読 メ カ ニ ズ ム の 洞 察 を 提 供 す る ．本 発 表 で は 特 に 非 AUG コ ド ン
ー ア ン チ コ ド ン 相 互 作 用 の 詳 細 を 紹 介 す る と と も に ，非 AUG コ ド
ン と kink-Mg 2+ の 関 係 か ら ， A site コ ド ン の 構 造 的 安 定 性 に 対 す る
P site が も た ら す 影 響 に つ い て 議 論 す る ．

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-134L

硫酸アンモニウムによるタンパク質の結晶化に対する静電ポテンシャルの影響
Influence of Electrostatic Potentials on the Proteins
Crystallization by Ammonium Sulfate
郭 艶 1、瞿 良 1、西田 紀貴 1、星野 忠次 1
1 千葉大学大学院薬学研究院 薬品物理化学研究室
Aim: Ammonium sulfate (AS) and polyethylene glycol (PEG) are popularprecipitants in protein crystal growth. Some proteins are easily crystallized by
AS, while others are not. In this work, we examined the electrostatic potentials
for 140 kinds of protein structures to clarify the reason for precipitantpreference in protein crystallization. Among the 140 structures, 100 weregrown by AS at high concentrations, and 10 were by AS at low concentrations.
For comparison, 20 structures were crystallized by PEGs, 6 were by highconcentrations of sodium formate, and the rest 4 were by glycerol, ethylene
glycol, and sodium chloride. The difference in the shape of electrostatic
potential was quantitatively evaluated. Based on the information of theelectrostatic potential on crystal growth, we attempted the AS crystallization
for a protein whose crystal structure was obtained by the PEG-growth in aprevious report. Furthermore, the molecular arrangement in the crystal packing
was contrasted to the iso-surfaces of electrostatic potentials.
Results: For the proteins preferably crystallized by AS at high concentrations,the iso-surfaces of the electrostatic potentials displayed a common shape thatthe positive and negative areas were distinctly separated and their contact
area was neat. On the contrary, the separation between the positive andnegative areas was unclear for the proteins that are preferably crystallized by
PEGs. These findings suggested that AS-crystallization was possible even fora PEG-crystallized protein when the electrostatic potential exhibited a clear
separation between the positive and negative areas. The relationship between
the electrostatic potential and the molecular packing in the crystal indicatedno overlap between the large value areas of electrostatic potential and thecontact sites of protein molecules. AS ions tended to gather at the areas
where the absolute values of the electrostatic potential were high. Protein
molecules made contact with the surrounding molecules in the areas where
the electrostatic potential were low. Hence, the shape of the electrostatic
potential was highly responsible for the molecular arrangement in crystal andthe preference of precipitant in the crystal growth. Further, we attempted to<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-134L

estimate the shape of the electrostatic potentials quantitatively. The
estimation indicated that the amplitude of the averaged separation of theelectrostatic potential was high for the proteins that are preferably crystallized
by the strongly hydrated ions like AS.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-135L

PF-BL1A、PF-BL5A、PF-BL17A、AR-NW12A、AR-NE3

マウス IFNα 結晶構造と受容体相互作用残基の同定
Crystal structure of mouse IFNα andidentification of a receptor-interacting residue○渡邊 ほのか 1, 2、和田 俊樹 3、小内 伸幸 3、海野 昌喜 1, 2
１茨城大院理工、2 茨城大 iFRC、3 金沢医科大免疫学
抗ウイルス免疫に関与する形質細胞様樹状細胞(pDC)の過剰反応によるインターフェロン(IFN)α の異常な分泌は、自己免疫疾患の増悪化に影響する。
近年、pDC における IFNα 分泌に関わるキャリア分子として Sortilin が同定され 1、Sortilin の pH 依存的二量体化が IFNα 分泌に何らかの形で関わっていることが明らかになった 2。我々はこれまでにマウス Sortilin (mSortilin)二量体の結晶構造解析に成功した 2 が、Sortilin の pH 依存的な構造変化や IFNα の分泌機構との相関には不明な点が残る。そこで、本研究ではマウス SortilinIFNα (mSortilin-IFNα)複合体の X 線結晶構造解析によって IFNα の分泌機
構を原子レベルで解明することを目的としている。
まず、マウス IFNα (mIFNα)の結晶構造を 2.1Å 分解能で決定し、ヒト IFNα
や IFNβ との構造的差異やシグナル伝達時の構造変化を明らかにした。次に、
mSortilin と mIFNα の共結晶化を行い、酸性条件下で得られた結晶の電気泳動により複合体が形成されていることを示唆する結果を得た。その結晶化条
件を精密化し、3.0 Å 程度の X 線回折強度データを収集することが出来たが、構造解析の結果、ほぼ同一条件下で mSortilin と mIFNα がそれぞれ単独で結晶化していることが明らかになった。その後、新たな条件を探索しても同様の条件でしか結晶は得られず、複合体の構造は未だ得られていない。そこでドッキングシミュレーションにより mSortilin と mIFNα の相互作用部位や様式を予測した結果、mIFNα は二量体 mSortilin とは相互作用しにくく、単量体
mSortilin と相互作用することが示唆された。特に mIFNα の Arg22 が重要な残基であることが示唆され、この残基を欠損させた変異体の細胞内分泌をフ
ローサイトメトリーで解析した。その結果、R22A 変異体の細胞内分泌量が野生型と比較して明らかに増加し、mIFNα の Arg22 が mSortilin との相互作用に寄与していることが示唆された。
今後、Arg22 の相互作用との相関を解析することで親和性を増大した
mSortilin-IFNα 複合体の X 線結晶構造解析が期待できる。
本発表では、分泌に重要なアミノ酸残基の同定に至るまでの研究成果を報告する。
【参考文献】
1. Yabe-Wada T., et al., Sci. Rep. 6, 26566 (2016)
2. Yabe-Wada T., et al., FEBS. Lett. 592, 2647–2657 (2018)

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-136L

PF/NE3A

安定保存型グルコースイソメラーゼのソーキングによる基質
交換
Substrate exchange by soaking of stable-preserved
glucose isomerase
石黒陽香 1・田中伊知朗 2, 3
1 茨城大工，2 茨城大院理工, 3 茨城大フロンティア[緒言]
グルコースイソメラーゼはアルドース―ケトース間の異性化を触媒する金属酵素であり，商業的には，甘味料やバイオ燃料の生産に重要な役割を果たしている．また，グルコースイソメラーゼは，X 線や性子回折実験などにおいて，
標準タンパク質として使用されている．しかし，現在容易に入手できるグルコ
ースイソメラーゼには，安定化阻害剤のソルビトールが導入されており，そのままで自由には使用できない．本研究で用いた，ＮａｇａｓｅＣｈｅｍｔｅＸ社の
SPEZYME ＧＩｐｆのグルコースイソメラーゼ溶液にもソルビトールが入っている．
そこでまずは、グルコースをソーキングすることで，基質であるソルビトールとグルコースの基質交換を目指した．
[実験方法]
ＮａｇａｓｅＣｈｅｍｔｅＸ社から入手した SPEZYME ＧＩｐｆを用いて作成したグル
コースイソメラーゼ結晶を含むドロップ 14µL に，最終糖濃度が 500mM となる
ように，2.5M のグルコース溶液を 2.8µL 加えた．ソーキングをしていない GI 結晶(ＧＩ-original）と，グルコースをソーキングした GI-Glo 複合体結晶(GI-Ｇｌo)の
低温Ｘ線回折実験を PF/AR-NE3A にて自動測定で行った．
[実験結果]
ＧＩ-original の基質であるソルビトールは，アルデヒド基を持たないため，直鎖状構造しかとりえない．一方で，ソーキングしたグルコースはアルデヒド基を持つため，環状構造も直鎖状構造もとりうるが，Ｘ線回折実験によって得られた差フーリエマップより，直鎖状構造であると推測された．また、直鎖状グルコース(PDB ID;3KCO)とソルビトール(PDB ID;4DVO)のグルコースイソメラーゼ複合体中性子モデルに対して今回測定した GI-Ｇｌo の差フーリエマップを比べた
ところ，グルコースのアルデヒド基の C1 付近の電子密度が認められたため，グルコースに交換された可能性が示唆された．

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-137L

PF-BL17A

In situ データ測定によって得られたタンパク質 X 線回折データの解析
Structure determination from datasets collected with
the in situ data collection system at BL-17A
菅原隆広 1,2、山田悠介 1,2、田辺幹雄 1,2、加藤龍一 1,2、千田俊哉 1,2
1. 総研大・高エネルギー加速器科学研究科、2. KEK ・ IMSS ・構造生物学
研究センターE-mail: tsugawa@post.kek.jp
X 線結晶構造解析はタンパク質の 3 次元構造を原子レベルで解析することができる手法のひとつであり、構造生物学において重要な解析方法である。
典型的な X 線結晶構造解析の流れは以下の通りである。(1)結晶化プレート
内でタンパク質を結晶化する、(2)結晶化プレートから単一の結晶を取り出し凍結する、(3)凍結結晶を X 線回折計へマウントし、低温冷却下で X 線回折デー
タ収集を行う、(4)位相決定、電子密度図計算と分子モデル構築などのデータ解析を行う。この流れにおいてはいくつかの課題が挙げられる。まず(2)の結晶の取り出しと凍結では結晶に負担をかけ、得られる回折像に影響を与える
おそれがある。加えて、結晶の取り出しが困難な結晶化法もあるため、その場合測定が困難となってしまう。また、結晶を一つずつ回折計にセットしていくた
め、大量の結晶の結晶性を調査したい場合には大きな律速となる。そこで、我々はこれらの課題を解消するため、結晶をプレートから取り出さずに X 線照射実験を行う in situ データ測定法の開発を行っている。通常回折データ収集
は低温下で行われるのに対して、この in situ データ測定では室温下で行われる。この影響を調べるため、複数のタンパク結晶の in situ データ測定で得られたデータを解析し、低温下の測定で得られた構造との比較を行った。回折データの処理に KAMO を用いた結果、タンパク質 A では最外殻 2.12~2.0 Å で
I/σ＝1.12、Rmeas=155.5、CC1/2=55.6 となる強度データを得ることが出来た。
一方、タンパク質 B では、最外殻 2.12~2.0 Å で I/σ=2.51、Rmeas=116.5、
CC1/2=90.6 となる強度データを得ることが出来た。さらに構造比較の結果、全体構造に違いはないものの、いくつかのアミノ酸残基の側鎖でコンフォメーショ
ンに違いが見られた。

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-138L

PF-BL1A, PF-BL5A

ディープラーニングを用いたリガンドとタンパク質の結合解析
Analyzing ligand-binding of protein with deeplearning○Zhizhen Xu1, Jian Yu1, Toyoyuki Ose1, Min Yao1
1 Graduate School of Life Science, Hokkaido University
The binding mechanisms between proteins and ligand are central to clarifying
the function of proteins, allowing cells to sense their surroundings and respond
appropriately. Thus, the recognition of binding possibility is of great importanceto many different fields, such as drug discovery and enzyme design.
The experimental assay is the approach for analyzing the characterization ofligand-protein interactions of a possible ligand. However, it is daunting due tothe enormous costs and time involved. The method of machine-learning-based
binding-analysis in silicon is rapidly evolving to alleviate those pressures withthe recent increase in protein-ligand interaction and structure datasets. Deeplearning architectures such as deep neural network, can learn some
low-level-simple features in the shallow layers. Then the low-level features
will be moved to higher-level features in the deeper layers. This characteristic
allows them to perform better feature extraction and pattern recognition. By
now, deep learning has shown performance matching or even exceeding theother machine learning methods.
Here, we developed a tool by using deep learning to analyze the ligand-bindingof protein. We have completed the construction of neural network andobtained good prediction performance of binding ability (Figure).

Figure. The sketch of analyzing the ligand-binding with deep learning.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-139L
PF BL-5A

マクロラクタム抗生物質ヒタチマイシン生合成におけるアデニル化酵素とキャリアタンパク質間相互認識機構
Recognition between adenylation enzyme andcarrier protein in the biosynthesis of macrolactam
antibiotic hitachimycin
千菅太一 1、宮永顕正 1、栗原将平 1、安達成彦 2、川崎政人 2、守屋俊夫 2、
千田俊哉 2、工藤史貴 1、江口正 1
1 東工大・理学院 2 KEK・物構研・構造生物
OH
O
H 2N

アデニル化酵素

HitD

HitB

S

HitD

+

O

O

SH

キャリア
タンパク質

(S)-β-フェニルアラニン

H
N

ATP

PPi, AMP

H 2N

MeO
OH

O

OH

ヒタチマイシンヒタチマイシンは放線菌 Streptomyces scabrisporus KM-4927 が生産する
マクロラクタム抗生物質であり、HeLa 細胞に対する細胞毒性やグラム陽性菌・真菌への生物活性を示す。ヒタチマイシンの生合成では、アデニル化酵素
HitB が生合成開始基質である(S)-β-フェニルアラニンを選択し、キャリアプロ
テイン (CP) HitD へと受け渡す反応を触媒する。細胞内という複雑系においてヒタチマイシンが生合成されるには共存する様々な CP のうちから HitD のみを HitB が選び取る必要があるが、このタンパク質間の相互認識機構は明らかとなっていなかった。
HitB-HitD 間の相互認識は両タンパク質間の表面相互作用によると予想されるが、生合成開始基質受け渡しの瞬間にのみタンパク質同士の接触がなされる性質上、その相互作用は非常に弱く解析は困難と考えられた。そこで、本研究では、HitB-HitD が相互作用した瞬間を捉えるため、タンパク質間を共有結合で結ぶクロスリンク反応により HitB-HitD 複合体を調製、その構造解析を基に相互認識機構の解明を目指した。
まず、反応性官能基を有する合成プローブを結合させた修飾 HitD を調製し、HitB と反応させることによりクロスリンク複合体を得た。このクロスリンク複合体について X 線結晶構造解析 1 およびクライオ電子顕微鏡での単粒子解析を行い、HitB-HitD 間の相互認識機構を明らかとすることに成功した。

[1] A. Miyanaga, et al., ACS Chem Biol., 2020, 15, 1808-1812.

<L. 生物物理、生物化学（結晶構造解析）>
P4-140L

PF-BL17A

脂質抗原提示分子 CD1b の X 線結晶構造解析
X-ray crystal structure analysis oflipid antigen presenting molecule CD1b
Cong Tian1、Hiroki Kusaka1、Takashi Tadokoro1、Shunsuke Kita1 and Katsumi
Maenaka1
1 Hokkaido University, Faculty of Pharmaceutical ScienceCD1b is one of glycoproteins expressed on surfaces of various antigenpresenting cells. CD1b is related to Major Histocompatibility Complex (MHC)class I molecules, and is involved in the presentation of lipid and lipid-based
molecules to activate T cells. Classical MHC class I molecules can present
peptide antigens and trigger adaptive immunity. On the other hand, MHCindependent adaptive immune system is also necessary for effective hostdefense, therefore, human CD1b molecule is responsible for such an immune
response. In this presentation, we will report the method for preparing CD1bproteins, and the X-ray crystallographic analysis of CD1b.
Human CD1b ectodomain was prepared using the silkworm-baculovirus
expression system. CD1b forms a heterodimer with β-2-microglobulin (β2m),
which is essential for proper folding and stability of CD1 proteins. To makestable CD1b proteins, the C-terminal residue of CD1b was fused with the Nterminal residue of β2m to form a single chain CD1b (scCD1b). The purified
scCD1b protein was successfully crystallized using commercially available
crystallization screening kit. The X-ray diffraction experiment was performed
at BL-17A at Photon Factory in Tsukuba. The X-ray diffraction dataset up to
2.5Å was collected and the structure of scCD1b was solved by molecularreplacement method. The electron density map of scCD1b showed thepresence of endogenous ligand in binding pocket, which was co-purified fromsilkworm hemolymph. The details of scCD1b structure are discussed in theposter presentation.