86

肥料研究報告 Vol. 11 （2018）8

高速液体クロマトグラフ（HPLC）法による肥料中の尿酸の測定
船木紀夫 1

キーワード

尿酸，高速液体クロマトグラフィー，りん酸緩衝液，家きん由来原料

1. はじめに尿酸は，家きん由来の肥料中に含まれる窒素の主要形態であり，ウリカーゼ等の作用により土壌中でアラント
イン，アラントイン酸及び尿素を経由して速やかに分解する（Fig. 1）ことから，有効態の窒素として評価されている．このことから，肥料中の尿酸を定量することは，肥料の特性や肥効発現の様相を知る上で重要であるだけでなく，肥料中の家きん由来原料の含有量を判断する指標になると考えられる．
従来，肥料及び堆肥中の尿酸の分析法としては，吸光光度法により測定する方法が，詳解肥料分析法 １）に記載がある他，多く報告されている２ ～ １ ０ ）が，どの分析法も，前処理工程が長く分析操作に習熟を要する，妥当性が確認されていない，等の問題がある．そこで，肥料中の尿酸の含有量を簡便に確認することを目的に，高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による肥料中の尿酸分析時における選択性，真度，精度，定量下限，添加回収率，中間精度及び併行精度等の検討を行ったので，それらの概要を報告する．

Volatilization（Ammonia Gas）

Uric acid

Allantoin

Allantoic acid

Urea

Ammonia

Ammonium ion
1.5 O2

2 H+
Nitrous acid ion

Nitrification（in soil）

0.5 O2
Nitric acid

Fig. 1 The pathway of uric acid metabolism
2． 材料及び方法
1） 供試試料
供試試料として市販の流通肥料 24 点（化成肥料，汚泥発酵肥料，混合堆肥複合肥料，堆肥及び動物の排
せつ物（うずらふん））を供試した．汚泥発酵肥料，堆肥及び動物の排せつ物は 65 °C の恒温乾燥器にて 10 時
間乾燥した後に，他の種類の肥料は乾燥せずに，それぞれ超遠心粉砕機を用いて 500 μm 以下に粉砕した．
1

独立行政法人農林水産消費安全技術センター神戸センター

HPLC法による肥料中の尿酸の測定

872） 試薬等の調製（1） 水： JIS K 0557 に規定する A3 の水．
（2） pH 7, pH 8 及び pH 9 の 1/15 mol/L りん酸緩衝液： JIS K 9007 に規定するりん酸二水素カリウム（KH2PO4）9.073 g を水に溶かして 1000 mL としたもの，及び JIS K 9020 に規定するりん酸水素二ナトリウム（Na2HPO4）9.464 g を水に溶かして 1000 mL としたものを，pH がそれぞれ 7.0 ± 0.1, 8.0 ± 0.1 及び 9.0 ± 0.1 になるよう混合して使用した．
（3） 0.1 mol/L ピロりん酸ナトリウム溶液： ピロりん酸ナトリウム（Na4P2O7）26.6 g を水に溶かして 1000 mL とした．
（4） 0.4 % 炭酸リチウム溶液： 純度 99 %（質量分率）以上の炭酸リチウム（Li2CO3）4 g を水に溶かして 1000mL とした．
（5） 0.1 mol/L 水酸化ナトリウム溶液： JIS K 8576 に規定する水酸化ナトリウム（NaOH）4 g を水に溶かして1000 mL としたもの．
（6） 0.01 mol/L 炭酸リチウム溶液： 純度 99 %（質量分率）以上の炭酸リチウム（Li2CO3）0.74 g を水に溶かして 1000 mL とした．
（7） 尿酸標準液（1000 µg/L）： 尿酸［C5H4N4O3］（和光純薬工業，特級）を 0.100 g はかりとり，0.01 mol/L
炭酸リチウム溶液に溶かして 100 mL とした．
（8） アラントイン標準液（1000 µg/L）： アラントイン［C4H6N4O3］（関東化学，特級）を 0.100 g はかりとり，水に溶かして 100 mL とした．
（9） アラントイン酸標準液（1000 µg/L）： アラントイン酸［C4H8N4O5］（和光純薬工業）を 0.100 g はかりとり，
0.01 mol/L 炭酸リチウム溶液に溶かして 100 mL とした．
（10） 検量線用混合標準液（0.1 µg/mL～100 µg/mL）： 尿酸標準液，アラントイン標準液及びアラントイン
酸標準液の一定量を混合し，抽出液で順次希釈して 0.1 µg/mL，0.25 µg/mL，0.5 µg/mL，1 µg/mL， 2.5µg/mL，5 µg/mL，10 µg/mL，25 µg/mL，50 µg/mL 及び 100 µg /mL の検量線用混合標準液をそれぞれ調製した．
(11) 20 mmol/L 酢酸アンモニウム溶液： JIS K 8359 に規定する酢酸アンモニウム（CH3COONH4）を 1.54 g
はかりとり，水に溶かして 1000 mL とした．
(12) メタノール： HPLC 用
3） 器具及び装置（1） 高速液体クロマトグラフ： Waters 2695 Separation module，2996 photo diode Array Detecter（2） カラム： Scherzo SS-C18： 長さ 250 mm L×内径 4.6 mm I.D.，粒径 3 µm
（3） マグネチックスターラー： 東京硝子器械 F-626N（4） 遠心分離機： 日立工機 himac SCT 5BA（5） 超遠心分離機： KUBOTA 6800
（6） 超遠心粉砕機： ZM-200 Retsch4） 試験操作88

肥料研究報告 Vol. 11 （2018）（1） 抽 出粉状にした分析用試料 1.00 g を共栓三角フラスコ 200 mL にはかり取り，1/15 mol/L りん酸緩衝液（pH 8.0 ±
0.1，以下 pH 8）を 100 mL 加え，軽くシリコン栓をし，60 ± 2 °C になるよう設定したウォーターバスで約 30 分間加温（10 分ごとに軽く振とう）後，直ちにマグネチックスターラーを用いて約 10 分間かき混ぜた．抽出液を 15 mL ま
たは 50 mL の遠心沈殿管にとり，1700×g で 10 分間遠心分離した後，さらに 8000×g で 5 分間遠心分離したものを，HPLC 測定用試料溶液とした（Scheme 1）．

1.00 g analytical sample（powdery）

200-mL ground-in stopper Erlenmeyer flask← 1/15 mol/L phosphonic acid buffer （pH 8） 100 mL
Extraction 1

Heating in water bath（60 °C）, 30 minutes

Extraction 2

Stir to mix,10 minites

Centrifugal separation 1

Ground-in stopper centrifugal precipitate tube,
1700×g, 10 minutes（Dilution）（1/15 mol/L phosphonic acid buffer （pH8））

Centrifugal separation 2

Ground-in stopper centrifugal precipitate tube,
8000×g, 5 minutes

Measurement
Scheme 1

HPLC
Method flow sheet of uric acid in fertilizers（2） HPLC による測定
各検量線用混合標準液 10 μL を HPLC に注入し，Table 1 の測定条件で測定して得られたピーク高さから検量線を作成した．試料溶液 10 μL を HPLC に注入し，ピーク高さから検量線により試料液中の尿酸の量を求め，分析試料中の濃度を算出した．なお，測定時間については，妨害ピークが 25～28 分頃に出る試料があったた
め，30 分とした．

89

HPLC法による肥料中の尿酸の測定

Table 1 HPLC Conditions
HPLC
Detector system
Wavelength
ColumnColumn temperature
Mobile phase
Flow rate
Injection volume
Measurement time

Waters 2695 separation module2996 photo diode array detector
290 nm （uric acid）
210 nm （allantoin and allantoic acid）
Scherzo SS-C18 （250 mm L×4.6 mm I.D., 3 µm particle size）
40 °C
20 mmol/L ammonium acetate - metanol （9+1）
0.4 mL/min
10 μL
30 min3. 結果及び考察
1） 測定条件の検討（1） HPLCの分離モード及び検出方法の選択
尿酸と，その代謝物質であるアラントイン及びアラントイン酸の HPLC または LC-MS による測定法として，血清の勧告法，ジーエルサイエンス社のカラムアプリケーション，及びインタクト社のカラムアプリケーション等の報告がある１１～１５）（Table 2）．これらのうち，インタクト社の方法１５）は，測定波長を 210 nm とすることで，尿酸，アラント
イン及びアラントイン酸を同時に分析することができるが，他の方法ではアラントインとアラントイン酸を分離できず，また，HILIC カラムでは尿酸とアラントインをも分離できないことを確認した．
肥料の種類によっては，家きん由来原料から生じる尿酸が，代謝物質であるアラントインまたはアラントイン酸の形で検出する可能性もあると考え，今後 3 成分の同時分析が必要となったときにも対応できるよう，本検討ではインタクト社の条件を改良して採用することした．なお，改良した点は，測定波長，カラム内径及びカラム温度である．改良法によるクロマトグラムの一例を Fig. 2 に示す．

（Wavelength: 290 nm）（Wavelength: 210 nm）（Peak 1：allantoin，Peak 2：allantoic acid，Peak 3：uric acid）
Fig. 2HPLC chromatogram of mixed standard solution（50 µg/mL） using Scherzo SS-C18（The solution is diluted with 1/15 mol/L phosphate buffer（pH 8）.）90

肥料研究報告 Vol. 11 （2018）

Table 2 The measuring method for uric acid and its metabolite, using HPLC or LC-MS
The name ofanalytical method or
testing organization

Substance

The nameof column

Columna)size

Mobile phase

Flow
Wavelength
rate
m/z
(nm)
(mL/min)

74 mmol/L phosphate buffer
Japanese
recommendation
method for serum

Uric acid

Niigata Univ., Japan

Allantoin
Allantoic Acid

Symmetry
C8

GL Science Corp.

Uric acid
Allantoin

Inertsil
HILIC

Ehime Pref., Japan

Allantoin

HILIC
SilicaInertsil
ODS-4

4.6 mm φ
250 mm L
5 μm (P)b)(pH 2.2)74 mmol/L phosphate buffer

1.0

284

0.8

210

-

b)

(pH 2.2) - Methanol (98+2)

4.6 mm φMethanol-Water (9+1),
150 mm L
added monoethanolamine
5 μm (P)(0.01 %)
2.1 mm φ
Acetonitrile - 2 mmol/L
150 mm L
ammonium acetate (9+1)
5 μm (P)
4.6 mm φ
150 mm L Acetonitrile - water (95+5)
Unknown (P)3.0 mm φ
20 mmol/L ammonium
250 mm L
acetate - methanol (9+1)
3 μm (P)

c)

169.9
157.9

0.3

1.0

c)

157
175

195

Uric acidScherzo
Imtakt Corp.
Allantoin
0.4
210
SS-C18
Allantoic acida) φ：Inner diameter, L：Length, (P)：Particle sizeb) 0.2 mol/L disodium hydrogen phosphate 12-water and 0.5 mol/L phosphoric acid are mixedc) Measured by LC-MS（Ionization mode: APCI） because of no dividing peaks with allantoin and allantoic acid--（2） 測定波長
溶液中の尿酸等の吸光度曲線を Fig. 3 に示す．インタクト社の方法１５）では，測定波長を 210 nm としているが，尿酸は 290 nm 及び 235 nm 付近に特異的な吸収をもち，特に 290 nm では 210 nm よりも高いピーク高さを得られること，また 290 nm においては尿酸の保持時間付近に肥料中の妨害ピークが少なかったことから，尿酸については測定波長を 290 nm とした．
（3） カラム内径
インタクト社の方法１５）では 3.0 mm とされていたが，流速 0.4 mL/min の条件では HPLC システムで使用する検出器について，流路内圧力がメーカー推奨範囲を大幅に超えたため，それを超えないようカラム内径をより大きな 4.6 mm のものに変更した．
（4） カラム温度
インタクト社の方法１５）では 50 °C とされていたが，溶離液中メタノールのカラム内での膨張に由来すると考えられる，流路内圧力の急激な増加がみられたことから，カラム温度は 40 °C とした．

HPLC法による肥料中の尿酸の測定

Uric acid91

Allantoin

Allantoic acid
Fig. 3

Absorbance curves of uric acid, allantoin and allantoic acid（50 µg/mL）2） 検量線の直線性の検討
各検量線用混合標準液（0.1 µg/mL～100 µg/mL）を本法に従って HPLC に注入し，得られたクロマトグラムのピーク高さから検量線を作成した（Fig. 4）．尿酸は 0.1 μg/mL～100 µg/mL 相当量の範囲で高い直線性が得られた．なお，アラントインは 2.5 μg/mL～100 μg/mL 相当量の範囲，アラントイン酸は 5 μg/mL～100 μg/mL 相当
量の範囲で高い直線性が得られた．

92

肥料研究報告 Vol. 11 （2018）

250000750000y = 6570.2x + 218.94
r² = 0.9999

200000Peak height

Peak height

600000y = 2051.2x - 742.81
r² = 1.000

45000030000015000010000050000

150000

0

0
0

20
40
60
80
Concentration (μg/mL)

Uric acid（Wavelength: 290 nm）

25000

20
40
60
80
Concentration (μg/mL)

100

Allantoin（Wavelength: 210 nm）

y = 229.04x - 199.38
r² = 0.9986

20000

Peak height

0

100

15000
10000
5000
0
0

20
40
60
80
Concentration (μg/mL)

100

Allantoic acid（Wavelength: 210 nm）
Fig. 4

Calibration curves of uric acid, allantoin, allantoic acid using Scherzo SS-C18

3） 抽出条件の最適化 1： pH に着目した，抽出液の種類の検討
これまでに報告されている，肥料及び堆肥中の尿酸分析法においては，抽出液としてりん酸二水素カリウム
溶液及びりん酸水素二ナトリウム溶液を混合して調製した 1/15 mol/L りん酸緩衝液（pH7.0 ± 0.1，以下 pH 7）９，１
０），0.1 mol/L ピロりん酸ナトリウム溶液６～８），及び 0.4 %（または 0.6 %）炭酸リチウム溶液２～５）が用いられている．

これらの溶液の pH はそれぞれ概ね 7, 10 及び 11 であることと，尿酸は冷水には難溶だがアルカリに可溶である
９）こと等を踏まえ，これらの溶液に加えて，1/15 mol/L りん酸緩衝液（pH 8）及び 0.1 mol/L 水酸化ナトリウム溶液（pH は約 12.5）について，次の方法で尿酸の抽出力を比較検討することとした．なお，0.6 %炭酸リチウム溶液については検討しなかった．
尿酸を検出することを確認した市販の化成肥料，汚泥発酵肥料，混合堆肥複合肥料及び堆肥各 1 点を供試

93

HPLC法による肥料中の尿酸の測定

し，200 mL 三角フラスコに各試料 1.00 g を採取し，各抽出液 100 mL を加え，マグネチックスターラーで 10 分間
撹拌し，遠心分離した試料溶液を HPLC にて分析した．
結果を Table 3 に，また一例として，汚泥発酵肥料試料における HPLC 測定のクロマトグラムを Fig. 5 に，それぞれ示す．混合堆肥複合肥料を除く 3 肥料について，0.1 mol/L ピロりん酸ナトリウム溶液，0.4 %炭酸リチウム溶液及び 0.1 mol/L 水酸化ナトリウム水溶液で抽出した各試料溶液は，尿酸濃度が pH 7 及び pH 8 のりん酸緩衝液に比べて低かった．この理由として，溶液中の pH が高くなりすぎると肥料中の尿酸の溶解度が小さくなった，または尿酸の分解に伴うアンモニアの生成・揮発が促進された，等が考えられる．
クロマトグラムを比較すると，0.1 mol/L ピロりん酸ナトリウム溶液抽出の方が，1/15 mol/L りん酸緩衝液（pH 8）抽出よりも濃度が低いにもかかわらず，ピーク高さは上回り，高感度検出が期待できることが示唆されたが，一方で，0.1 mol/L ピロりん酸ナトリウム溶液抽出では他の 4 溶液に比べて，尿酸の保持時間が極端に早まる傾向があった．
各抽出液の pH を比較すると（Fig. 6），pH 7 及び pH 8 の 1/15 mol/L りん酸緩衝液は，緩衝能により試料の種類が変わっても抽出液の pH 変動は小さいが，0.1 mol/L ピロりん酸ナトリウムの場合は変動が大きかったことから，試料の種類による抽出力の変動も大きくなることが考えられた．
以上のことから，この後の抽出条件の検討については，緩衝能により試料の種類にかかわらず尿酸の抽出力が安定し易いと考えられる，1/15 mol/L りん酸緩衝液に絞って行うこととした．
なお，この検討の段階では，HPLC 測定時に内径が 3.0 mm のカラムを使用していたので，Fig 5 のクロマトグ
ラムにおける尿酸の保持時間（4.0 分～5.4 分）は，Fig. 3 のクロマトグラムにおけるそれよりも早くなっている．
Table 3

Contentsa) of uric acid by extractive solution (mass fraction (%))

1/15 mol/L
1/15 mol/L
phosphate buffer phosphate buffer(pH 7)(pH 8)
Compoundfertilizer
Composted sludge
fertilizer
Compost mixed
fertilizer

0.822

Compost0.896

0.1 mol/L
sodiumdiphosphate

0.4 %lithium carbonate

0.1 mol/L
sodiumhydroxide

0.00298

0.227

0.0427

b)

0.315

0.423

c)

0.975

c)

0.924

c)

0.536

c)

0.0390

0.203

0.207

0.290

0.298

0.243

c)

0.967

c)

0.774

c)

0.309

c)

1.15

a) Sampling amount: 1.00 g, extractive solution volume: 100 mL and stirring time: 10 minutesb) Mass fractionc) Dry wt. ：The same applies to the following, for composted sludge fertilizer and Compost.

c)

c)

94

肥料研究報告 Vol. 11 （2018）(1) 1/15 mol/L phosphate buffer (pH 7)a)(2) 1/15 mol/L phosphate buffer (pH 8)a)(3) 0.1 mol/L sodium diphosphatea)(4) 0.4 % lithium carbonate
Fig. 5(5) 0.1 mol/L sodium hydroxide

HPLC chromatogram of composted sludge fertilizer sample solution by extractive solution

Injected sample solution: (1)~(3) Diluted in 5 times the volume by extractive solution(4)~(5) No dilution
Wavelength: 290 nm

95HPLC法による肥料中の尿酸の測定

13
12
11

pH

10
9
8
7
6

1/15 mol/L
phosphate buffer(pH 7)

1/15 mol/L
phosphate buffer(pH 8)

0.1 mol/L
sodium diphosphate

extractive solution

Compound fertilizer

Compost mixed fertilizer

CompostFig. 60.4 %lithium carbonate

0.1 mol/L
sodium hydroxide

Composted sludge fertilizer

Change of pH values of all sample solution by extractive solution

4） 抽出条件の最適化 2：抽出に用いるりん酸緩衝液の pH 及び抽出時間の検討
りん酸緩衝液について，中性～弱アルカリ性領域での pH の最適化を検討することとした．同時に，抽出時間についても検討した．pH については前項で検討した pH 7 及び pH 8 の他に pH 9.0 ± 0.1（以下 pH 9）を，また，
撹拌時間については 10 分間，30 分間，60 分間及び 120 分間の 4 段階を，それぞれ検討した．結果を Fig. 7に示す．
同じ撹拌時間で比較すると，各試料溶液中の尿酸濃度は，化成肥料の 10 分撹拌を除いて，概ね pH7 < pH
8 ≤ pH 9 であった．この結果から，3 種類のりん酸緩衝液のうち pH 9 のものが最も，尿酸の抽出力が優れている
ことが示唆された．しかしながら，高 pH の溶液を注入することによる HPLC 測定カラムへの負荷も考慮し，この後の検討で使用する 1/15 mol/L りん酸緩衝溶液の pH は 8 とし，次の抽出温度検討により，pH 8 の緩衝液でも pH
9 の緩衝液に匹敵する抽出力を得ることを目指した．また，どの緩衝液についても，撹拌時間が 10 分及び 30 分
では抽出が不十分で，60 分または 120 分は必要であることが示唆された．

96

肥料研究報告 Vol. 11 （2018）

0.70

1.40

0.60

1.20

0.50

1.00

0.40

0.80

0.30

0.60

0.20

0.40

0.10

0.20

0.00

0.00

10 minutes

30 minutes
pH 7

pH 8

60 minutes 120 minutes

10 minutes

pH 9

30 minutes
pH 7

Compound fertilizer

60 minutes 120 minutes

pH 8

pH 9

Composted sludge fertilizer

0.60

1.40

0.50

1.20
1.00

0.40

0.80

0.30

0.60

0.20

0.40

0.10

0.20

0.00
10 minutes

30 minutes
pH 7

pH 8

60 minutes 120 minutes

0.00

pH 9

Compost mixed fertilizer
Fig. 7

10 minutes

30 minutes
pH 7

60 minutes 120 minutes

pH 8

pH 9

CompostThe varialation of content of uric acid by changing pH values of 1/15 mol/L phosphate bufferand stirring time (mass fraction (%))
5） 抽出条件の最適化 3：抽出温度及び抽出時間の検討
1/15 mol/L りん酸緩衝液(pH 8)抽出での抽出時間の検討においては，どの試料についても撹拌時間を 60 分
または 120 分とした際に，最も尿酸濃度が高くなっていたが（Fig. 7），より短時間での抽出が可能になるよう，加温工程を検討することとした．りん酸緩衝液(pH 8)抽出について，常温で 60 分または 120 分撹拌するのみの方
法と，40 °C または 60 °C で 30 分加温後に 10 分または 30 分撹拌する方法とで，尿酸濃度を比較した．さらにそれらの結果と，りん酸緩衝液(pH 9)抽出について常温で 60 分または 120 分撹拌するのみの方法による結果を比較した．それらの結果を Fig. 8 に示す．
どの試料についても，加温条件については加温工程なし < 40 °C 加温工程あり < 60 °C 加温工程ありの順に尿酸濃度が高くなる傾向が見られ，特に 60 °C 加温では，りん酸緩衝液(pH 9)で常温抽出した際と同等また
はそれを上回る結果となった．一方で，全ての加温条件において，撹拌時間を 10 分から 30 分に延ばしても尿酸濃度に大きな変動は認められなかった．
以上のことから，今後の検討での抽出温度及び抽出時間は，60 °C で 30 分加温後 10 分撹拌とした．

97

0.70

1.40

0.60

1.20

0.50

1.00

0.40

0.80

%

%

HPLC法による肥料中の尿酸の測定

0.30

0.60

0.20

0.40

0.10

0.20

0.00
a

b

c

d
e
f
Stirring Condition

g

0.00

h

a

Compound fertilizerdef
Stirring Condition

g

h

g

h

1.40
1.20

0.50

1.00

%

0.40
0.30

0.80
0.60

0.20

0.40

0.10

0.20

0.00
a

b

c

d
e
f
Stirring Condition

g

h

0.00
a

Compost mixed fertilizer
Fig. 8cComposted sludge fertilizer

0.60

%

b

b

c

d
e
f
Stirring Condition

CompostThe varialation of content of uric acid by changing heating temperature, stirring time and pH valuesof 1/15 mol/L phosphate buffer (mass fraction (%))
a: No heating, 60 minutes (pH 8)
b: No heating, 120 minutes (pH8 )c: Heating in water bath (40 °C), 10 minutes (pH 8)
d: Heating in water bath (40 °C), 30 minutes (pH 8)
e: Heating in water bath (60 °C), 10 minutes (pH 8)
f: Heating in water bath (60 °C), 30 minutes (pH 8)
g: No heating, 60 minutes (pH 9)
h: No heating, 120 minutes (pH 9)6） 流通肥料の測定
流通肥料 24 点（家きん由来原料が使用されているもの 22 点，及び使用されていないもの 2 点）について，本法に従って尿酸の含有量を測定した結果を Fig. 9 及び Table 4 に示す．
家きん由来原料として加工家きんふん肥料，発酵鶏ふん，鶏ふん，うずらふんまたは家きん加工くず肥料を

98

肥料研究報告 Vol. 11 （2018）

含む肥料については，一部のものを除いて尿酸が検出されたが，家きん由来原料として鶏ふん燃焼灰のみを含む肥料については，尿酸が検出されたものはなかった．また，各抽出液の pH を測定したところ，りん酸緩衝液（pH 8）の緩衝作用が弱いためか抽出液の pH の範囲は 7.3～10.1 と試料によって大きな変動が見られたものの，尿酸が検出されたものについては全て 7.5～8.5 の範囲にあった（Fig. 9）．このことから，本法では抽出液の pHが 8 前後になることが，尿酸が安定して抽出されるための条件の一つであると考えられる．
なお，原料の種類がほぼ共通の肥料（化成肥料 9 及び 10）について，抽出液の pH には差が見られなかったが，尿酸の定量値には差が見られ，値が小さかった方（Compound fertilizer 10）については，アラントインも検出された，という事例があった（Fig. 10）．このことから，尿酸の含有量を元に肥料中の家きん由来原料の含有の有無を確認する際，肥料の種類によってはアラントインの含有量についても確認する必要があると考えられる．

Fig. 9 pH values and content of uric acid of sample solutionsa) Mass fractionb) Extractive solution (1/15 mol/L phosphate buffer (pH 8))

HPLC法による肥料中の尿酸の測定

Table 4

Fertilizer

Compoundfertilizer

Compostedsludge fertilizer

Compost mixed
fertilizer

CompostAnimal manurea) Mass fractionb) Dry wt.

Poultry origin materials used and content of uric acid in samples

Content ofSampleNumber
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

uric acid(%)
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
0.572
0.293
0.0249
0.398

13

1.12

Poultry origin mterialsa)Calcined manure
Calcined manure
Calcined manure
Calcined manure
Calcined manure
Calcined manure
Calcined manure
Calcined manure
Calcined manure, Processed manure fertilizer, Composted manure
Calcined manure, Processed manure fertilizer, Composted manure

Processed manure fertilizer
Calcined manure, Composted manureb)

Manureb)

Manureb)

Manure

16

b)

0.157

Manure, Processed waste fertilizer

17b)

Manure, Feather meal

14
15

3.35

N.D.

18
19
20

N.D.
N.D.
0.533
N.D.

21

1.16

ManureCalcined manureb)

Manure

22

N.D.

b)

-

23

b)

Composted quail manureb)

Quail manure

24

99

2.29

0.0249100

肥料研究報告 Vol. 11 （2018）

Compound fertilizer 10: detected to uric acid and allantoin

Standard solution (50 µg/mL): equal to 0.05 % (mass fraction) in fertilizer(1) Allantoin (2) Allantoic Acid (3) Uric Acid
Fig. 10HPLC Chromatogram of solution of compound fertilizer detected on uric acid and allantoin(Wavelength: 210 nm)

7） 添加回収試験による真度の評価
添加回収試験は，本法で尿酸が検出されなかった化成肥料，汚泥発酵肥料，混合堆肥複合肥料及び堆肥各

101

HPLC法による肥料中の尿酸の測定

1 点を供試した．添加用溶液は，血清の勧告法１１）における HPLC 測定用標準液と同様に，尿酸を 0.01 mol/L 炭酸リチウム溶液に溶解して調製したものを用いた．添加濃度は，尿酸の 0.01 mol/L 炭酸リチウム溶液に対する溶解度が概ね 1000 μg/mL であったことから，この濃度（質量分率で 0.1 %）を最大とし，3 段階の濃度を添加して計
12 通りを 3 点併行分析した．平均回収率は 85.5 %～114.1 %，併行相対標準偏差（RSDr）は 0.3 %～2.1 %であり，すべて肥料等試験法１６）における各濃度レベルの回収率の許容範囲を満たした(Table 5)．
Table 5 Results of recovery test

Samples

SampleContenta)Compoundfertilizer
Composted sludge
fertilizer
Compost mixed
fertilizer
Compost

(%)
0.005
0.01
0.10
0.005
0.01
0.10
0.005
0.01
0.10
0.005
0.01
0.10

Recovery
(%)
114.1
105.0
100.2
104.4
90.1
93.3
97.4
85.5
92.4
92.5
85.3
101.8

b)

RSD r
(%)
2.1
0.6
1.0
1.0
1.3
0.2
1.5
1.7
0.4
1.0
1.1
0.3

c)

Criteria of
the trueness(%)
70 ~12080 ~11585 ~11070 ~12080 ~11585 ~11070 ~12080 ~11585 ~11070 ~12080 ~11585 ~110d)a) Mass fractionb) Mean recovery (n =3)c) Repeatability relative standerd deviationd) Criteria of trueness (recovery) show in Testing Methods for Fertilizers (2018)8） 併行精度及び中間精度
本法で尿酸が検出されなかった化成肥料，汚泥発酵肥料，混合堆肥複合肥料及び堆肥各 1 点に 2 濃度（質量分率で 0.1 %及び 0.01 %）の尿酸溶液を添加して，本法の併行精度及び中間精度を確認した．2 点併行で日を変えて 5 回分析を行った結果を Table 6 に，それを基に一元配置分散分析を行って得られた統計解析結果をTable 7 に，それぞれ示す．いずれの相対標準偏差も肥料等試験法１６）に示されている併行精度（併行相対標準偏差）及び中間精度（中間相対標準偏差）の目安内であったことから，本法は十分な精度を有していることが確
認された．

102

肥料研究報告 Vol. 11 （2018）

Table 6

Test day
1
2
3
4
5
Test day1
2
3
4
5

Repeatability test results on different days (mass fraction (%))

Compound fertilizer
0.1 %0.01 %
0.09940.09980.01050.01070.100
0.09960.01030.0102
0.0982
0.09720.01020.01030.100
0.100
0.01020.0102
0.09630.09750.00943 0.00953
Compost mixed fertilizer
0.1 %0.01 %
0.09190.09260.00946 0.00953
0.0935
0.09370.00948 0.00945
0.09030.09000.00917 0.00925
0.09250.09170.00875 0.00866
0.0941
0.09400.00912 0.00922

Table 7

Composted sludge fertilizer
0.1 %0.01 %
0.0922
0.09200.00947 0.00948
0.0946
0.09430.00961 0.00953
0.09180.09050.00945 0.00934
0.09500.09460.00876 0.00896
0.0936
0.09340.00956 0.00967
Compost0.1 %0.01 %
0.100
0.09830.00976 0.00980
0.103
0.102
0.01010.01000.0984
0.09760.00952 0.00941
0.0957
0.09390.00862 0.00860
0.102
0.102
0.00871 0.00917

Repeatability and intermediate precision
Repeatability

Samples

Spiked Level Total Meanb)

Compoundfertilizer
Composted sludge
fertilizer
Compost mixed
fertilizer
Compost

b)

a)

c)
sr
b)

(%)
0.1

(%)
0.0989(%)
0.00060.01

0.0102

0.1

RSD r
(%)

d)

Intermediate precisione)
CRSD rs I(T)

f)

(%)

b)

0.6

4

(%)
0.00150.00010.7

40.09320.00040.5

0.01

0.009380.000090.1

0.0924

0.01

g)

h)

RSD I(T) CRSD I(T)
(%)
(%)
1.6

6.5

0.00042

4.2

6.5

4

0.0016

1.7

6.5

0.9

4

0.000313.3

6.5

0.00040.4

40.00151.7

6.5

0.009210.000050.6

40.00032

3.5

6.5

0.1

0.101

0.001

1.3

4

0.0029

2.8

6.5

0.01

0.00966

0.000181.8

40.00049

5.0

6.5a) n =10（2 repetition×5 days）e) Criteria of repeatability relative standard deviationb) Mass fractionf) Intermediate standard deviationc) Repeatability standard deviationg) Intermediate relative standard deviationd) Repeatability relative standard deviationh) Criteria of intermediate relative standard deviation

9） 検出下限及び定量下限の確認
定量下限を確認するため，対象成分を含まない汚泥発酵肥料を用い，試料中濃度が 0.002 %となるよう尿酸を添加した試料を調製して 7 回繰り返し分析を行い，求めた回収率を Table 8 に示した．肥料等試験法が示す真度（回収率）を満たしており，本法の定量下限は 0.0008 %程度，検出下限は 0.0003 %程度，とそれぞれ確認され
た．

103

HPLC法による肥料中の尿酸の測定

Table 8Spiking and recovery test （minimum limit of quantification and detectification）

SampleSpiked Levela(%) ）Composted sludge
fertilizer

0.002

Confirmation by recovery testbc)Mean Value ） Recovery RSD
a
a
(%)
(%) ）
(%) ）
0.002131060.00008

Criteria of
the trueness ）

(%) ）

a

(%) ）

0.000370 ~ 120

LOD

(%) ）

a

0.0008

LOQ

f

e)

d)

a

a） Mass Fractionb） n =7c) Relative standard deviationd） Minimum limit of quantificatione） Minimum limit of detectificationf） Criteria of trueness (recovery) show in Testing method of Fertilizers

4． まとめHPLC を用いて肥料中の尿酸の分析について検討したところ，次のことを明らかにした．
1） 試料溶液は，試料 1.00 g を採取して 1/15 mol/L りん酸緩衝溶液（pH 8）100 mL を加えて 60 °C で 30 分加
温してからマグネチックスターラーで 10 分間攪拌後，遠心分離した溶液が最適であった．HPLC の使用カラムをScherzo SS-C18，移動相を 20 mmol/L りん酸緩衝液+メタノール（9+1）とすることで，尿酸及びその代謝体である
2 物質（アラントイン及びアラントイン酸）は完全に分離し，約 13 分までに対象成分はすべて検出された.
2） 検量線の直線性は，尿酸は 0.1 μg/mL～100 μg/mL の範囲で直線性（決定係数 r2=0.999 以上）を示した．
アラントインは 2.5 μg/mL～100 μg/mL，アラントイン酸は 5 μg/mL～100 μg/mL で，いずれも決定係数 r2 = 0.999以上の直線性を示した．
3） 24 点の流通肥料を本法により測定したところ，加工家きんふん肥料，発酵鶏ふん，鶏ふん，うずらふんまたは家きん加工くず肥料を含む肥料について，一部を除いて尿酸またはアラントインが検出された．また，各抽出
液の pH を確認したところ，尿酸を検出したものについては全て 7.5～8.5 の範囲にあった．
4） 添加回収試験は，4 種類の肥料に，3 段階の濃度の尿酸を添加した計 12 通りを 3 点併行分析した．平均回収率は 85.3 %～114.1 %，併行相対標準偏差（RSD）は 0.3 %～2.1 %であり，肥料等試験法における各濃度レベルの回収率の許容範囲をすべて満たした．
5） 同一濃度を添加した試料を毎回調製して 5 日間の反復試験を行ったところ，測定値は安定しており良好な成績であった．
6） 本法における尿酸の定量下限は 0.0008 %程度，検出下限は 0.0003 %程度，とそれぞれ確認された．
以上の結果より，本試験法は，化成肥料，汚泥発酵肥料，混合堆肥複合肥料及び堆肥中の尿酸を測定するために十分な性能を有していることを確認した．

104

肥料研究報告 Vol. 11 （2018）参考文献
1) 越野正義：第二改訂詳解肥料分析法，p.93~96，養賢堂，東京（1988）
2) 三重科技・農業研究部・生物機能開発グループ：鶏ふん堆肥における尿酸分析による可給態窒素量の迅
速推定法，三重県農業研究所平成13年度研究成果情報（2001）<http://www.pref.mie.lg.jp/common/content/000396817.pdf>
3) 三重科技・農業研究部・生物機能開発グループ：鶏ふん堆肥における尿酸態窒素の簡易定量法，三重県
農業研究所平成14年度研究成果情報（2002）<http://www.pref.mie.lg.jp/common/content/000396799.pdf>
4) 原正之，村上圭一：高窒素鶏ふんペレット堆肥の生産と還元技術の開発，畜産環境情報（24）, 26-29（2004）
5) 中谷洋，市川明，伊藤裕和：鶏ふん堆肥の窒素肥効特性に対する処理日数及び季節の影響，愛知農総試研報，34，239-243（2002）
6) 橘田安正，茂角正延，水落勁美：採卵鶏由来鶏糞の窒素成分と窒素無機化率との関係，日本土壌肥科学
雑誌，73（3），263-269（2002）7) 藤原俊六郎：おが屑混合鶏ふん堆積物の腐熟度と施用方法について，神奈川園試研報，36，1-100（1988）
8) 大羽裕：弘法・大羽法，ペトロジスト，8 (2)，108-116（1964）9) 日高秀俊，新妻成一，大澤元成，久保省三：各種鶏ふんの窒素無機化量の簡易評価法，日本土壌肥科学
雑誌，75（1），21-28 (2004)
10) 樋口太重：土壌中における施用窒素の有機化と再無機化，農業技術研究所報告B，34，1-81（1983）
11) 日本臨床化学会試薬専門委員会：HPLCを用いる血清尿酸測定の勧告法，臨床化学，22（4），300-307（1993）
12) Noriyuki Ohtake et al.：Quantitative and Isotopic Analysis of Amino Acids, Allantoin, and Allantoic Acid in
Soybeans by LC-MS Using the Atmospheric Pressure Chemical Ionization Method，Soil Sci. Plant Nutr.，50，
241-248（2004）
13) GL Sciences: Analysis of purine derivatives by LC/MS/MS, InertSearchTM for LC, Inertsil® Applications,LA621-0696 (2018)<http://www.gls.co.jp/technique/inertsearch_lc/pdf/LA621.pdf>
14) 宮本紫織，井上智，小笠原光憲，金本昭，大瀬戸光明，井上博雄：親水性相互クロマトグラフ（HILIC）によるアラントインの分析，平成16年度愛媛衛環研年報，7（2004）
15) Imtakt: Allantoin, allantoic acid and uric acid, Technical Information, T701E (2018)< http://www.imtakt.com/TecInfo/TI701E.pdf>
16) 独立行政法人農林水産消費安全技術センター（FAMIC）：肥料等試験法（2018）<http://www.famic.go.jp/ffis/fert/obj/shikenho_2018.pdf>

HPLC法による肥料中の尿酸の測定

105

Determination of Uric Acid in Fertilizer by High Performance Liquid Chromatography
Norio FUNAKI1
1

Food and Agricultural Materials Inspection Center, Kobe Regional Center
A High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for simultaneous determination of uric acid in fertilizer

was developed and validated as a single-laboratory validation. Samples were extracted by heating in water bath
(60 °C), shaking and diluted with 1/15 mol/L phosphate buffer (pH 8). After centrifugation, sample solution was
analyzed by HPLC, on malti-mode ODS column with UV detection at 290 nm. As a result of 3 replicate analysisof 4 fertilizer samples spiked with uric acid, the mean recoveries were 85.3 %～114.1 %. Repeatability standard
deviation of uric acid were 0.3 % ~ 2.1 %. Intermediate relative standard deviations of there were 1.6 % ~ 5.0 %.
The limits of quantification of there were 0.0008 %. Those results indicated that the developed method was valid
for the determination of uric acid in a fertilizer.
Key words

uric acid, HPLC, phosphate buffer, poultry origin material(Research Report of Fertilizer, 11, 86~105, 2018)