2022 年 11 月
日本生殖発生毒性フォーラム

第 4 回⽇本⽣殖発⽣毒性フォーラム案内（2）
早秋の候、時下ますますご清祥のこととお慶び申し上げます。
第４回⽇本⽣殖発⽣毒性フォーラムのご案内を下記の通りご連絡申し上げます。本年も、新型コロナウイルス感染を考慮し、Web 開催することに決定いたしました。今回は「環境要因と仔の発達」「代替法を⽤いた発⽣毒性の予測」を企画しており、興味ある内容になると思いますので、是⾮ご参加下さい。また、同施設、同企業の⽅にもお知らせいただければ幸いです。
なお、Web へのアクセスは事前参加登録が必須となります。
⽇時： 2022 年 11 ⽉ 12 ⽇（⼟）13 時〜17 時
会場： Web 開催（Zoom）
会費： ２０００円（学⽣無料）
参加⽅法：参加をご希望の⽅は 11 ⽉ 4 ⽇（⾦）までに本案内をお送りしている担当者（⽇本⽣殖発⽣毒性フォーラム幹事）⼜は⽇本⽣殖発⽣毒性フォーラム代表幹事・千原（kazuhiro.chihara@sumitomo-pharma.co.jp）宛へ電⼦メールにて、①⽒名、②企業名・団体名、③メールアドレスのご連絡及び下記⼝座へ参加費の⼊⾦をお願い致します。⼊⾦確認後、接続先 URL、ログイン ID、パスワードをお知らせします。
参加者お⼀⼈ごとにログイン ID とパスワードを発⾏しますので、参加者全員のメールアドレスのご連絡をお願いします。
➢振込⼝座＜ゆうちょ銀⾏からお振込みの場合＞
記号 14030、番号 56566431
名前：ニホンセイショクハッセイドクセイフォーラム➢＜他⾦融機関からのお振込みの場合＞
店名 408、店番 408、普通、⼝座番号 5656643
⼊⾦の際は下記の点にご注意いただきますよう、よろしくお願い致します。
＊振込⼿数料はご負担ください。
＊振込は個⼈名でお振込ください。
＊ご所属名でお振込みの際は、担当幹事⼜は代表幹事までメールでご⽒名、ご所属、振込⽇、振込⾦額をご連絡下さい。

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日本生殖発生毒性フォーラム

プログラム
１．基礎教育講演（1）「⺟胎の環境要因と仔の脳機能の発達の関わりを紐解く神経発⽣毒性学的アプローチ」
駒⽥ 致和 先⽣（近畿⼤学理⼯学部⽣命科学科）

２．基礎教育講演（2）「発⽣毒性試験代替法−催奇形性発現機序に基づくゼブラフィッシュ胚の利⽤と応⽤」
⽥崎 純⼀ 先⽣（花王株式会社安全性科学研究所）

３．話題提供(1)「幼若ラットを⽤いた⽣後早期の医薬品曝露が及ぼす社会性⾏動変化について」
服部 篤紀 先⽣（塩野義製薬株式会社）(2)「Implementation of New Alternative Methods into regulated toxicology assays.
-Increasing predictivity of compound teratogenicity and endocrine disruption throughthe zebrafish model.-」Carles Cornet Bartolomé, PhD（ZeClinics）

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2022 年 11 月
日本生殖発生毒性フォーラム

基礎教育講演（1）
⺟胎の環境要因と仔の脳機能の発達の関わりを紐解く神経発⽣毒性学的アプローチ近畿⼤学 理⼯学部⽣命科学科

駒⽥ 致和

細胞の増殖や分化、移動などが盛んにおこなわれる胎⽣期の脳神経系は、化学物質やストレス曝露、感染症の罹患などの環境要因に対して⾼感受性です。この時期の分化や成熟、投射などの神経細胞の細胞動態へ影響は、先天奇形や脳機能異常の原因となりえます。
例えばエタノールやバルプロ酸の胎児期曝露は、様々な臓器の奇形、活動量の亢進や社会的相互作⽤の異常、学習障害などの発達障害を誘発します。⼤脳⽪質の形態形成異常が発達障害の原因の⼀つだと考えられており、同時に脳内において免疫担当細胞であるミクログリアの異常な活性化を伴なう神経炎症が引き起こされています。この脳内炎症は直接、あるいは間接的に神経細胞の増殖や分化、投射に異常を誘発する可能性があります。さらにこの脳内炎症は化学物質の胎児期曝露特有のものではなく、胎児期の様々なストレス曝露、さらには感染症への罹患によって幅広く起きている現象であることが⽰唆されています。つまり、⼤脳⽪質の形態形成や機能成熟が脳内炎症によって妨げられ、それが⾃閉症などの発達障害の原因となっている可能性があります。ミクログリアはシナプス可塑性に関与しており、発達時期の神経回路の構築にも関与していることから、その機能的異常が⾃閉症の発症原因の⼀つであることがわかっています。ただ、これらの疾患への関与は⽣後から成熟後にかけてであり、胎児期のミクログリアの異常と先天奇形や脳機能障害との相関についてはまだわかっていません。
そこで今回のセミナーでは、発⽣、発達期の環境が脳神経系の形態形成や機能発達に及ぼす影響について、⼤脳⽪質の形成や、細胞増殖、神経新⽣、移動や神経投射といった組織構築における重要な現象に重点を置きながら説明します。さらに、その際に環境因⼦による影響を受ける、ミクログリアの異常な活性化を伴う神経炎症について着⽬し、胎児期のミクログリアの異常が先天異常や発達障害に関連する可能性や、脳内炎症とミクログリアは先天異常や発達障害の予防法のターゲットになりうるか、について考察します。
さらに、⾼次脳機能の異常の最終表現型である⾏動異常について、発達期から成熟期にかけて⾃発的活動量の亢進や、社会的相互作⽤の異常など発達障害様の⾏動異常について解析を⾏っています。従来の解析に加え、⾮侵襲性の記憶・学習試験、集団環境下での⾏動異常について、最新の研究成果と合わせてその特徴について概説します。

Keywords

⼤脳⽪質、発達障害、神経炎症、ミクログリア、⾏動異常3

2022 年 11 月
日本生殖発生毒性フォーラム

基礎教育講演（2）発⽣毒性試験代替法−催奇形性発現機序に基づくゼブラフィッシュ胚の利⽤と応⽤
花王株式会社 安全性科学研究所
⽥崎 純⼀
近年、動物を⽤いない⽣殖発⽣毒性試験代替法の開発が世界的に進められており、発現機序が複雑な催奇形性評価代替法の開発が望まれている。催奇形性試験代替を実現する上では、催奇形性発現機序に基づいた催奇形性発現ポテンシャルの精緻な評価が不可⽋である。
我々はゼブラフィッシュ胚をモデルに⼝蓋裂や⼩顎症などの頭蓋顔⾯奇形の催奇形性評価を⾏うべく、頭蓋顔⾯奇形発症機序を解析してきた。哺乳類で頭蓋顔⾯奇形を誘発する 12 種の化学物質を暴露すると、ゼブラフィッシュ胚の神経頭蓋と顔⾯頭蓋に形態異常（⼝蓋裂や⼩顎症など）が⾒られ、これらは頭蓋の軟⾻細胞数の減少と分化・成熟異常に起因していた。
さらに頭部神経堤細胞マーカーの発現変動が顕著に⾒られた。つまりゼブラフィッシュ胚の頭蓋顔⾯奇形は、頭部神経堤細胞の発⽣・分化異常という哺乳類と同じ機序で発現することが⽰唆された（Liu et al., 2020; Narumi et al., 2020）。そこで神経堤細胞の発⽣動態を指標にした頭蓋顔⾯奇形の予測・評価が可能だと考えた。
本発表では頭蓋顔⾯奇形の精緻な予測・評価を実現するため、神経堤細胞を可視化したト
ランスジェニックゼブラフィッシュを作製し、「頭部神経堤細胞の発⽣・分化異常」を指標にした頭蓋顔⾯奇形評価の結果を紹介する。催奇形性物質を暴露したゼブラフィッシュ胚を継時的に蛍光観察すると、いずれの催奇形性物質においても神経堤細胞の遊⾛が阻害され、⼝蓋と上顎・下顎⾻格の由来となる第⼀咽頭⼸に形態異常が⽣じた。さらに神経堤細胞の細胞分裂が抑制され細胞死が亢進しており、これらの個体では頭蓋顔⾯奇形が⽣じた。つまり神経堤細胞の発⽣・分化異常により頭蓋顔⾯奇形が誘発されるという直接的な証拠を⽰すと共に、神経堤細胞の発⽣動態を指標にした頭蓋顔⾯奇形ポテンシャルの予測・評価が本評価系で可能であることが分かった。
最後にゼブラフィッシュ胚モデルの応⽤の⼀つとして、疾患モデルとしてのゼブラフィッ
シュを、頭蓋顔⾯奇形を伴う疾患に着⽬し、疾患の再現とその病態解析を検討したため紹介する。
今後は臨床情報や他のモデル⽣物の情報を統合し、ゼブラフィッシュ胚を⽤いた催奇形性評価や疾患モデルの確⽴に繋げる。

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日本生殖発生毒性フォーラム

話題提供（1）
幼若ラットを⽤いた⽣後早期の医薬品曝露が及ぼす社会性⾏動変化について
塩野義製薬株式会社服部 篤紀

幼若期は成⻑に伴い急速な⾻格の成⻑や神経回路等の機能の発達を遂げるため，この時期に医薬品の曝露を受けると⾏動に障害が⽣じる可能性がある．ヒトは 3 歳までに複数回の全⾝⿇酔を経験すると，その後学習障害や注意⽋陥多動性障害の発症リスクが上昇すると報告されている．また，妊娠期においても抗てんかん薬の胎内曝露により出⽣児の精神疾患罹患率が増加することも報告されている．このように臨床において，発達段階における医薬品の曝露と精神疾患との関係性が明らかになりつつある．⼀⽅，医薬品は承認申請の過程において，幼若試験や中枢試験を含む各種試験を実施しており，懸念がないあるいは軽微なものが臨床試験に進むことができる．しかし，⼀般的に実施されている幼若動物を⽤いた毒性試験において，上記に挙げたような臨床における副作⽤を⼗分評価できているとは⾔い難い．精神疾患には不安，多動，社会性の⽋如，学習障害といった様々な表現型が認められる．このうち，臨床でのみ確認されるが，⾮臨床試験では評価されていない社会性の⽋如に着⽬した．
本話題提供では，複数化合物に関して社会性⾏動に及ぼす影響を調べるため実施したReciprocal social interaction test や Open field test といった⾏動評価⽅法の紹介やその⽅法を⽤いた実例について紹介させていただく．

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2022 年 11 月
日本生殖発生毒性フォーラム

話題提供（2）
Implementation of New Alternative Methods into regulated toxicology assays.
-Increasing predictivity of compound teratogenicity and endocrine disruption through the zebrafish model.-ZeClinics, Head of Toxicology Area
Carles Cornet Bartolomé, PhD
Acute and long-term exposure to environmental chemicals is a risk not only for the environment but also forhuman health. Exposure to chemicals during embryonic development may result in drastic effects ranging fromabnormal growth of anatomical structures to lifelong mental disabilities. Furthermore, humans are also at risk
at their adulthood as growing evidence suggests that alterations of the endocrine system induced by theexposure to such environmental chemicals severely compromise human health. The establishment of rapid,
reliable and cost-effective methodologies for detecting developmental toxicity of chemical substances, as well as
the so-called endocrine-disrupting (ED) compounds and the effects associated with their exposure, is apressing need for both the scientific community and regulatory agencies.
In the era of the 3Rs principles implementation there is a strong interesting in the seek for new experimental
methods to reduce animal testing. Small fish like zebrafish has proven an excellent experimental system andsuitable alternative model to animal testing because of the large degree of conservation with higher vertebrates.
Additionally, zebrafish have several experimental advantages, namely ex utero rapid development, embryotransparency, and large progenies. All these make zebrafish a competitive model for high-throughput screeningof potential teratogenic and ED compounds in a fast and cost-effective manner.
Here, we will present the last developments on the use of zebrafish larvae in predicting teratogenic and ED
compounds in humans. In a first section, we will present the establishment of an innovative automated highthroughput screening platform for teratogenic drugs. The platform was validated by testing on zebrafish larvae
a library of 31 known compounds classified as teratogens and non-teratogens in mammals and by assessing 16
phenotypical parameters related to embryo development. Our results show a high correlation with humans:
87.50% sensitivity, 81.82% specificity and 74.19% accuracy, increasing the prediction level reported inrodents. Importantly, based on the results obtained in this validation study, we have developed a deep learningalgorithm, able to discriminate all the defined phenotypic parameters, sort larvae as positive or negative for
qualitative phenotypes and extract values from quantitative ones. In a second section, we will present a robust
high-throughput assay to detect potential ED compounds. Changes at the transcriptomic level (messengerRNA content, mRNA) have been identified as biomarkers of ED exposure. In this study, we exposed embryoniczebrafish to the natural ligands 17 β-estradiol, testosterone, and 3,3′,5-triiodo-L-thyronine (T3), andidentified eight genes representing the three major endocrine axes ‒ estrogenic, androgenic and thyroid. The
identified genes were subsequently validated using six previously reported ED compounds.
The results obtained pave the way for the integration of zebrafish in novel regulatory guidance documents asa reliable alternative model for the improvement of human teratogenicity and ED compounds prediction.
Keywords: zebrafish, endocrine disruption, Developmental toxicity, Artificial intelligence, NAMs6