様式３R1370

3 次元細胞システム構築用マイクロチャンバアレイの開発
Development of PMMA Micro-chambers for 3D cell tissues
洞出 光洋
Mitsuhiro Horade
大阪大学大学院基礎工学研究科
Graduate School of Engineering Science, Osaka University
近年、in vitro 環境における 3 次元細胞システムを構築し、再生医療への応用を目指した研究が行われてきている。3 次元細胞システムを構築するための手法の１つとして、本研究では細胞を培養するための型そのものを形状自由度の高い状態で製作し、細胞をモールディングする方法を採用した。実際に PMMA 製のマイクロチャンバアレイを製作し、細胞をマイクロチャンバ上で培養し、チャンバの形状に沿って形状が製作される過程を確認することができた。
In recent years, researches on construction of 3D tissues in vitro are reported and we aim to constructthree-dimensional cellular systems and apply in regeneration medicine. In this time, we focused theshape of micro-chamber for cell culture. First, we established the development of a method offabricating three-dimensional micro-structures, micro-chamber arrays with various 3D surface a werefabricated. Finally, constructions of three-dimensional cell tissues were succeeded.
Keywords: microscale fabrication, tissue engineering, cell tissue, X-ray lithography
背景と研究目的： 近年、in vitro環境における 3 次元細胞システムを構築し、再生医療への応用を目指した研究が行われてきている。
また、3 次元細胞システムを構築するための手法が数多く報告されている[1][2]。本研究では、機械パーツの成形加工技術と同様に、細胞培養を行うための型を高精度に 3 次元加工する手法を確立し、細胞パーツを製作することを目的とした。培養用の 3 次元形状を有するマイクロチャンバは、自由曲面や側壁傾斜等を有するマイクロスケールの微細構造体の製作が可能な 3 次元リソグラフィ技術を用いることで実現可能である。
まず、Ｘ線リソグラフィを用いて、側壁傾斜を有する Poly methyl methacrylate（PMMA）製のマイクロチャンバアレイを製作する。次に細胞をチャンバ上に撒く。一定時間培養することで 3 次元形状を有する細胞パーツの製作が可能となる（Fig.1）。
実験： マイクロチャンバアレイの製作について述べる。露光には立命館大学SRセンターに設置された、超電導小型SR光源AURORAのBL-6 を利用し、被加工材には日東樹脂工業株式会社製の 0.5mm厚のバルクPMMAを用いた。現像には、GG現像液を用いて、37℃で3h行った。また露光量の上限は現像後最大加工深さが約 300μmになるように与えた。

Fig. 1 Process flow of construction of 3D celltissues in vitro (a) Fabrication of 3D micro
structure with flexibility surface afterdevelopment. (b) Cells are seeded on to the 3D
micro-chamber. (c) Construction of 3D celltissues after cell culture.
次に、細胞培養について述べる。製作したPMMA 製マイクロチャンバを、エタノール、イソプロピルアルコールを用いて十分に洗浄し、その後 UV light 環境下で 5h 処理した。
マウス由来の NIH 3T3 細胞を含む細胞懸濁液をマイクロチャンバ上へ塗布し、細胞培養を様式３行った。なお、細胞培養液は NIH 3T3 を7.0×102[cell/ml]の濃度にしたものであり、培養はインキュベータ内で行った。
結果、および、考察： 露光条件として、Fig.
2(A) (B) (C) それぞれに示すような 3 種類の露 光 量 分 布 を 与 え た 。 最 大 の Dose 量 は0.025A·hとなっている。被加工材を露光後、90°回転させて再度同じ露光量分布を与えた。
この 2 度目の露光により、1 軸方向のみならず 2 軸方向への照射量分布を与えた。Fig. 3(A)(B) (C) に製作後のPMMA製マイクロチャンバの上部側からの顕微鏡図を示す。なお、Fig.
3(A) (B) (C) それぞれはFig.2 (A) (B) (C) に対応している。図のように等間隔で傾斜を有するピラー形状を持つマイクロチャンバアレイが製作できた。これらの形状は露光量分布と同様、すなわち露光量の大小と加工深さの大小に相関関係を持つような加工深さを有する3 次元マイクロチャンバアレイの製作に成功した。
また、これらのマイクロチャンバアレイ上に細胞懸濁液を塗布した。一定時間の培養後製作したマイクロチャンバの 3 次元形状面に沿って細胞が集まっていることを確認した。
以上の結果より、これまで製作が困難であった細胞パーツに製作に期待できる。製作要求の高いトロイダル形状用チャンバ等を 3 次元リソグラフィにより製作し、それに細胞培養することで、人工血管の構造等も製作可能と思われる。今後はこれらのアプリケーションを視野に入れた研究展開を行っていく予定である。

Fig. 2 The relationships between position (X, Y)
and energy dosage amount (A·h),

文 献[1] Tao Yue, Masahiro Nakajima, Masaru
Takeuchi, Chengzhi Hu, Qiang Huang and Toshio
Fukuda, Lab on Chip. 14 (2014) 1151
[2] Puwanan Chumtong, Masaru Kojima, Kenichi
Ohara,Yasushi Mae, Mitsuhiro Horade,Yoshikatsu Akiyama, Masayuki Yamato andTatsuo Arai, Journal of Robotics andMechatronics 25 (2013) 665[3] Mitsuhiro Horade and Susumu Sugiyama,Recent Advances in Nanofabrication Techniquesand Applications, InTech 16 (2011) 315
論文・学会等発表（予定）[1]洞出 光洋, 小嶋 勝, プワナン
チュムトン, 神山 和人, 前 泰志, 新井健生, ロボティクス・メカトロニクス講演会
2014 in Toyama (ポスター発表)

Fig. 3 microscope views of micro-chamberarrays.