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ガスセンサータンパク質 CooA の一酸化炭素脱離に伴う構造ダイナミクスの観測（阪大院理 1, 岡崎統合バイオ 2）大友章裕 1, 石川春人 1, 水野操 1, 青野重利 2, 水谷泰久 1

Protein Dynamics of CooA upon Carbon Monoxide Dissociation

DNA 結合ドメイン

センサードメイン(Osaka Univ.1, Okazaki Institute2) Akihiro Otomo1, Haruto Ishikawa1, Misao Mizuno1,Shigetoshi Aono2, Yasuhisa Mizutani1【序】CooAは光合成細菌に含まれるガスセンサータン
Trp110(a)
パク質であり、一酸化炭素(CO)を感知し、COの代謝に関与する酵素群の転写を制御している。図1にCooAの、His77
不活性形である還元形の結晶構造(a)と、反応スキーム
His77(b)を示す。CooAは2つのサブユニットから成るホモダイマーである。各サブユニットはヘムを含み、COを感Pro2知するセンサードメインと、DNA結合ドメインで構成されている。ヘムに結合したCOが近傍のPro残基と置換することで、CooA全体の構造変化が誘起され、DNAとの親和性が変化すると考えられている。しかし、そC ヘリックスの構造変化の機構は明らかになっていない。本研究では、時間分解共鳴ラマン分光法によって、ヘム-近位ヒスチジン（His77）部位と、Cへリックスに存在するTrp(b)残基（Trp110）の構造変化の関連を調べた。
【実験】CooA は大腸菌中で発現し、陰イオン交換カラムを用いて精製した。この試料に還元剤としてハイドロサルファイトナトリウムを加え、CO 雰囲気下にすることで、CO 結合形 CooA（CO-CooA）を得た。試料のバッファーには、
pH 8.0 の 50 mM Tris-HCl を用いた。
図 1. (a) 還元形 CooA の結晶構造。(b)紫外共鳴ラマンスペクトルの測定試料には、内部強度
CooA の CO 脱離に伴うヘムと軸配位子標準として、硫酸イオンを 180 mM 加えた。時間分解の変化。
共鳴ラマンスペクトルの測定は、ポンプ－プローブ法によって行った。CO の光解離を引き起こすポンプ光には、波長 532 nm のパルス光（パルス幅 20 ns）を用いた。ヘムに由来するスペクトルの観測には波長 436 nmのプローブ光（パルス幅 30 ns）を用い、Trp 残基のスペクトルの観測には波長 233 nm のプローブ光（パルス幅 20 ns）を用いた。
【結果】図 2 に CO-CooA の時間分解可視共鳴ラマンスペクトルを示す。図 1(b)に示すように、CO-CooA の光解離後、ヘムには CO の再結合もしくは Pro 残基の配位が生じる。そのため、各遅延時間におけるスペクトルは、それら再結合および Pro 残基が配位した成分の寄与を引いた、差スペクトルとして示している。215
cm-1 に 5 配位のヘム由来の振動バンドである、鉄-ヒスチジン伸縮振動[(Fe-His)]バンドが観測されたため、図 2. CO-CooA の時間分解可視共鳴ラマン
時間分解スペクトルは解離形 CooA の寄与を示していスペクトル。解離形 CooA のスペクトルは、CO の再結合および、Pro 残基の配位によるることがわかる。この測定から、CO 脱離後 10 ns から寄与を差し引くことで算出した。
1 μs の間に、(Fe-His)バンドは波数シフトや強度変化をほとんど示さないことがわかった。過去の研究で、

ピコ秒領域の時間分解共鳴ラマンスペクトルは報告されているが、CO の光解離後、数百ピコ秒以内に約 90%が再結合してしまうため、ナノ秒以降の解離形の構造は不明であった 1。10 ns での(Fe-His)振動数はピコ秒領域で観測された振動数と一致することから、CO 脱離後、(Fe-His)振動数は 1 μs に至るまで変化していないことが明らかになった。
図 3 に芳香族アミノ酸水溶液、CO-CooA および還元形 CooA の紫外共鳴ラマンスペクトルを示す。(a)、(b)のスペクトルと(c)、(d)のスペクトルとの比較からわかるように、CO-CooA と還元形 CooA には、Trp 残基やTyr 残基由来のラマンバンドが観測された。また、(e)は CO-CooA と還元形 CooA の差スペクトルである。
W3,W16,W18 に強度増大が、Y8a バンド強度減少がみられ、CO-CooA と還元形 CooA との間では、Trp 残基
図 3. 芳香族アミノ酸水溶液および CooA
および Tyr 残基の環境が異なることがわかる。そこで、 の紫外共鳴ラマンスペクトル。（プローブ
光 233 nm、*は内部強度標準の硫酸イオ
CO-CooA と解離形 CooA との間で、Trp 残基がどの時ンによるバンド）間帯で変化するのかを調べるために時間分解測定を行(a)Tyr 水溶液 (b)Trp 水溶液 (c)CO-CooAった。その結果を図 4 に示す。時間分解スペクトルで(d)還元形 CooA (e)[(c)-(d)]×5は、100 ns から 100 μs の間で、Trp 残基のスペクトル変化はみられず、Trp110 の環境変化はこの時間領域では起きていないことがわかった。
【考察】過去の研究と合わせて、(Fe-His)振動数はピコ秒領域から 1 μs まで変化していないことがわかった。
(Fe-His)振動数は、ヘム周辺の構造変化を敏感に反映することが知られている。したがって、ヘム-His77 部位の構造変化は、ピコ秒領域で完了し、その後 1 μs に至るまで構造変化は起きないことが明らかになった。
CooA の各サブユニットには Trp 残基は 1 つ存在し、センサードメインと DNA 結合ドメイン間の C へリックスに位置する。過去の研究から、還元形 CooA とCO-CooA では、Trp 残基のラマンバンドに変化があることがわかっており 2、プローブ波長が異なる本実験でも同様の変化が再現された。したがって、CO 脱離後、
図 4. CO-CooA の時間分解紫外共鳴ラマ
還元形に至る過程のどこかの段階で Trp 残基周辺の構ンスペクトル。CO-CooA と解離形 CooA造が変化すると考えられる。この変化は、Trp110 の位との間の構造変化の寄与を示した差スペクトルである。
置から、CO 脱離後ヘム周辺に起きる構造変化が、DNA結合部位まで伝幡する中間状態の変化であると推測される。今回の時間分解測定において、100 s までに Trp のバンドがみられなかったことから、Trp110 近傍の構造変化は、ヘム構造が CO-CooA から解離形に変わったことによって起きているのではなく、解離形から還元形に変わったことによって起きる可能性が高いと考えられる。
【参考文献】1. Uchida, T., Ishikawa, H., Ishimori, K., Morishima, I., Nakajima, H., Aono, S.,
Mizutani, Y., and Kitagawa, T. (2000) Biochemistry 39, 12747-12752
2. Kubo, M., Inagaki, S., Yoshioka, S., Uchida, T., Mizutani, Y., Aono, S., and Kitagawa, T. (2006)
J. Biol. Chem 281, 11271-11278