Liquid Biopsy Technical Sheet

デジタルシークエンスを用いたctDNA＊解析＊：循環腫瘍DNA

セルフリーDNA（cfDNA）の発見からその後の多くの研究を経て、リキッドバイオプシーが臨床現場で本格的に利用されるようになりました。ガーダントヘルスは、がん治療における血液検査のリーディングカンパニーとして、リキッドバイオプシーから遺伝子異常を検出する独自の技術と解析パイプラインを開発しています。高精度なリキッドバイオプシーを支えるテクノロジーを紹介します。

デジタルシークエンシングを用いたctDNA解析のプロセス
末梢血（全血）からcfDNAを抽出後（A）、多種類の既知配列のオリゴヌクレオチドアダプター（分子バーコード）を両末端に高効率で付与することで、1分子ごとに固有の標識をし（B）、シークエンスライブラリーを構築します（C）。ハイブリッドキャプチャーによりシークエンスライブラリーを濃縮後、平均深度約15,000×でシークエンシングします（D）。シークエンス情報をリファレンスゲノムにマッピングします。バイオインフォマティクスにて、一本鎖ごとに識別された分子バーコード情報を使ってエラーを排除します（E）。体細胞系列の遺伝子異常を生殖細胞系列の変異から切り分けて同定し、臨床的意義・治療オプションとともに最終報告書が作成されます（F）。

AB
cfDNAの単離：5-30 ng使用

分子バーコードによる標識
効率：80-90％

3/6,000＝0.05％ MAF

E

ハイブリッドキャプチャー
による濃縮

分子数

ノイズフィルタリング
分子トラッキング

6,000
4,000

平均シークエンス深度：
15,000×

2,000
0150 kb

遺伝子パネルD

パネル内の位置8,000

C050,000
100,000
パネル内の位置

150,000

Tumor Response Mapと塩基置換、遺伝子増幅、遺伝子融合、治療に関する最終報告書の作成
挿入・欠失変異の検出

F Guardant360®Tumor Response Map
Somatic Alteration
Burden
25.2％

0.3％

15.0％

遺伝子異常の概要と関連する治療オプション
Exon 19
EGFR

JUN-11-14

NOV-11-14

欠失T790M

10050
50.5
01005050.50

15.0

12.5

Afatinib
Erlotinib
Gefitinib

臨床試験が利用可能

Osimeritinib

臨床試験が利用可能

無反応：

Erlotinib
Gefitinib

FEB-11-15

MAF：Mutant Allele Fraction

Reprinted from Clin Cancer Res. 2018; 24(15): 3539-3549, Odegaard JI, et al., Validation of a Plasma-Based Comprehensive Cancer Genotyping Assay
Utilizing Orthogonal Tissue- and Plasma-Based Methodologies, copyright 2018, with permission from AACR.

著者にガーダントヘルスの株式を所有する者、同社から研究助成金を受領している者および同社の従業員等が含まれる。

＊Guardant360® CDxの保険適用：算定要件をご参照の上、ご使用を判断してください。
高度管理医療機器販 売 名：Guardant360 CDx がん遺伝子パネル
一般的名称：遺伝子変異解析プログラム（がんゲノムプロファイリング検査用）
体細胞遺伝子変異解析プログラム（抗悪性腫瘍薬適応判定用）
承 認 番 号：30300BZX00345000

ctDNA解析の技術的な性能特性
デジタルシークエンシングを用いた解析方法

は、シングルエンド解析と比較して、次世代シークエンシングのプロセスに内在する塩基置換お上抑制しました（塩基あたり約10−3.5から10−6.5まで抑制、A）。それにより、正確な遺伝子異常の−4.0−4.5−5.0

Log10検出が可能になりました。

−3.5

エラー率︑よび挿入・欠失変異の読み取りエラーを3桁以A−5.5−6.0−6.5SE＊Guardant360 CDxの分析性能については「Guardant360 CDx がん遺を参照ください。
伝子パネル 製品リーフレット」

PEMOL

DS

従来法のSE、PE、MOLと比較したDSのエラー率。
SE：シングルエンドリード、PE：ペアエンドリード、MOL：分子バーコーディング、
DS：デジタルシークエンシング

Adapted from Clin Cancer Res. 2018; 24(15): 3539-3549, Odegaard JI, et al., Validation of a Plasma-Based Comprehensive Cancer Genotyping Assay
Utilizing Orthogonal Tissue- and Plasma-Based Methodologies, copyright 2018, with permission from AACR.

解説 デジタルシークエンスとはcfDNA 分子の両末端に分子バーコードを付与することで、各々の cfDNA 分子を識別できるデジタルシークエンスライブラリーを構築します。ライブラリーをセンス・アンチセンス鎖から読み取り、分子バーコード情報をもとにライブラリー構築に伴う転写エラーノイズを低減し、元のcfDNA分子の遺伝子配列を同定します。これにより、1 分子レベルでの遺伝子配列読み取りを実現しました。デジタル通信でエラー低減に用いられる差動伝送になぞらえ、デジタルシークエンシングと呼ばれています1）。

このライブラリー構築では、使用したcfDNA分子への分子バーコードの付与効率が80-90％、ライブラリーへの変換効率が60-85％と、プロトコルの最適化が行われています2）。この変換効率は、既存の方法の2-10倍以上に向上しました3,4,5）。高い変換効率は感度に直結し、非常に重要です。

3’5’

3’5’
5’

3’ii++αiβi

α'iβ'i3’5’++GUARDANT
Bioinformatics
Module3’5’GUARDANT
Bioinformatics
Module3’5’• 塩基置換• 遺伝子増幅• 遺伝子融合• 挿入・欠失変異

Lanman RB, et al. PLoS One. 2015;10:e0140712.

本研究はガーダントヘルスから資金提供を受けている。著者に同社から給与を受領している者が含まれる。

1）Lanman RB, et al. PLoS One. 2015;10:e0140712.
2）Odegaard JI, et al. Clin Cancer Res. 2018;24:3539-3549.
3）Norton SE, et al. Clin Biochem. 2013;46:1561-1565.
4）Diehl F, et al. Nat Methods. 2006;3:551-559.
5）Forshew T, et al. Sci Transl Med. 2012;4:136ra68.

臨床への応用
成人進行性固形がん患者10,593例から採取した血液検体を用いた試験では、高い解析成功率（99.6％）および感度（ctDNA検出率：85.3％）が示されました（A、B）。FDA承認された適応治療オプションがある遺伝子異常は16.7％（A）、治療法があるか臨床試験に関連する遺伝子異常は72.0％に認められ、高い潜在的治療可能性が示されました。
多くの遺伝子異常がごく少量でしか検出されないため（MAF中央値：0.46％）（C）、高感度の診断法の必要性が示されました。
検出された遺伝子異常は、以前の報告とほぼ一致していました（D）。
大腸がん患者の66.7％が抗EGFR抗体療法への耐性に関連する遺伝子異常を有し、そのうち54.9％のみが一般的なKRAS検査で検出可能でした（E）。非小細胞肺がんでは、薬剤の標的となる1つ以上の遺伝子異常が認められた割合

A 全検体数B

n＝10,593

ctDNAが検出できた検体の割合

85.3％（n＝9,000）

各検体の最大MAF値［中央値（範囲）］

1.6％（0.01-97.7％）

各遺伝子異常のMAF値［中央値（範囲）］

0.46％（0.01-97.7％）

塩基置換/挿入・欠失変異/遺伝子増幅
検体あたりの変異数［中央値（範囲）］

3.6/0.5/0.8（0-102）

FDAで承認された適応治療のあるコピー数中央値

2.56

ctDNA量

8,000
7,000
6,000
5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
01.0D1000.880

0.60.20.460400

MAF中央値
0.46％

2000.20.10Eシノニマス変異
ナンセンス変異
欠失変異
挿入変異

1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

スプライス部位変異
ミスセンス変異
遺伝子融合
遺伝子増幅

TP53
EGFR
KRAS
APC
PIK3CA
NF1
MET
MYC
BRAF
ERBB2
AR
BRCA2
KIT
TERT
FGFR1
PDGFRA
BRCA1
RB1
FGFR2
CCNE1
SMAD4
CDKN2A
PTEN
ESR1
STK11
MTOR
CDK6
RAF1
CCND1
ALK
NOTCH1
GNAS
ATM
NTRK1
CDK4
CTNNB1
RET
NRAS
FBXW7
GATA3
JAK2
DDR2
IDH1
ROS164
128
256
3.1

32

2.9

162.7

8

2.5

42.3

2

血液中のコピー数

MAF（％）

0.3

検出された遺伝子異常の数

C

0.4

16.7％（n＝1,766）

遺伝子異常の割合

0.5

中皮腫
甲状腺がん
肝がん
神経内分泌がん
原発性中枢神経系がん
軟部組織がん頭頚部がん
尿路上皮がん腎がん
小細胞肺がん
胆管がん
原発不明がん
その他
黒色腫
婦人科がん
胃食道がん
膵がん
前立腺がん
大腸がん
乳がん
非小細胞肺がん99.6％（n＝10,547）

臨床検体の割合

解析成功率

ctDNA検出率は34.5％でした（F）。

F
BRAF V600E、7.2％
KRAS G12/13
36.8％

KRAS その他 NRAS
10.6％ 7.1％
ERBB2 増幅、4.6％
HRAS、0.7％

薬剤の薬剤の標的となる標的となる
1つ以上の遺伝子異常無し 遺伝子異常有り ERBB2 挿入・欠失変異、1.6％
65.5％
34.5％
MET ex14、1.5％

BRAF V600E、1.1％

EGFR driver、27.8％（EGFR T790M、7.4％）ALK/ROS1、2.5％（A）本試験の各種統計量、（B）
がん種別の臨床検体の割合（青棒）およびctDNA検出率（ ）、（C）体細胞系列の遺伝子異常の最大MAF値（下横軸）またはコピー数（D）遺伝子別に示した体細胞系列の遺伝子異常の検出数、（E）抗EGFRモノクローナル抗体療法への耐性に関連した遺（上横軸）で表した腫瘍ctDNA量の分布、伝子異常の頻度、（F）非扁平上皮非小細胞肺がん患者4,521例における治療標的となる遺伝子異常の頻度。

Reprinted from Clin Cancer Res. 2018; 24(15): 3539-3549, Odegaard JI, et al., Validation of a Plasma-Based Comprehensive Cancer Genotyping Assay
Utilizing Orthogonal Tissue- and Plasma-Based Methodologies, copyright 2018, with permission from AACR.

まとめ●デジタルシークエンシングによるctDNA 解析では、末梢血から抽出したcfDNAを分子バーコードにより標識し、シークエンスライブラリーを高効率に構築します。
●

平均深度約 15,000×でペアエンドリードにて一本鎖ごとにシークエンスを行い、リファレンスゲノムにマッピングします。バイオインフォマティクスにて、一本鎖ごとに識別された分子バーコード情報を使ってエラーを排除します。

●

成人進行性固形がん患者10,593例の試験では、デジタルシークエンシングの高い感度と解析成功率、治療標的となる遺伝子異常が組織を用いた解析と同等に検出されたことが確認されました。

＊Guardant360® CDxの保険適用：算定要件をご参照の上、ご使用を判断してください。

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MKT-000240 R2
2024年5月作成