課題番号：25指108
研究課題名 ：ＤＮＡ損傷によって増加するマクロファージへのＨＩＶ-1感染機序の解明と応用
主任研究者名 ：石坂幸人
分担研究者名 ：なし
キーワード：HIV-1、インテグラーゼ、マクロファージ、DNA 損傷、新規抗エイズ薬
研究成果：
１：インテグラーゼの DNA 損傷部へのリクルートメントに関与する宿主細胞側因子の同定[背景] 先行研究で、HIV-1 インテグラーゼが不活化された状態でも、低い頻度ながら感染性を示すことや、このインテグラーゼ活性非依存的なウィルス感染は特に静止マクロファージにおいて、DNA 損傷で促進されることが報告された。また、HIV-DNA は DNA 二重鎖切断(DSB:DNAdouble-strands break)部位へ挿入されることも明らかとなっている（Koyama et al. 2013）。
本研究では、DSB 誘導活性を示す HIV 蛋白質である Vpr が、どのような機序で静止マクロファージへのウィルス感染に関与するのかについて、DSB 誘導機序から理解する。
[結果] A.インテグラーゼ結合タンパクの同定：当研究室で樹立したインテグラーゼ発現誘導細胞を用いて、インテグラーゼに結合性を示す宿主側因子の同定を試みた。まず、①インテグラーゼに付加した FLAG タグに対する抗体による精製、並びに、②インテグラーゼに対する抗体を用いた 2 段階精製の二種類のアプローチで、結合蛋白質の同定を試みた(図 1-A)。しかし、抗インテグラーゼ抗体による精製と抗原ペプチドによる競合溶出を行ったところ、大部分は抗原ペプチド存在下においてもビーズ上に結合したまま保持された。これは使用した抗インテグラーゼ抗体がポリクローナル抗体であるため、抗原ペプチドの添加では抗体に結合したインテグラーゼを全て遊離することができないためであると考えられた。そこで、現在、抗原ペプチドによるアフィニティー精製後のインテグラーゼ抗体を調整中である。今後、この精製抗体を用いて、インテグラーゼ結合タンパクの同定の準備を行う。B. インテグラー
ゼの DSB 部位への集積：図 1B 上図は、ホーミングエンドヌクレアーゼである I-PpoI によりDAB1 遺伝子座位を切断した際の、インテグラーゼの同 DSB 部位へのリクルートを ChIP アッセイで評価した結果を示す。EGFP-IN と Cherry-LacR-Vpr を用いた FRAP 法を用いた解析により Vpr 存在下においてインテグラーゼが Micro-irradiation により誘導した DSB 部位へと迅速に集積することが明らかとなった(図 1B 下図)。
２：Vpr と Topo-I の機能的関連性の証明[背景] Vpr を培養細胞で発現させると、DNA 二重鎖切断が誘導される。しかし、Vpr 自身にはヌクレアーゼ活性が無いことから、宿主蛋白質機能を介して DSB を誘導していることが示唆される。一方、昨年度の解析で、Vpr 結合因子として、DNA のトポロジーを変化させるTopoisomerase1（以下 Topo1）を同定し、両者が直接的に結合することや、Topo1 の発現をのウィルス感染における意義を解析した。
[結果] A. HIV 感染者の中には、感染後長期間に亘ってエイズを発症しない、所謂、Long-termnon-progressor(LTNP)が認められる。LTNP の一つの原因として、Vpr の 77 番目のアルギニンがグルタミンに変異した R77Q 変異ウィルスの関与が報告されている。今回の解析で、R77Q変異体 Vpr(Vpr/R77Q)は Topo1 との結合性を示さないこと、また、Vpr/R77Q を細胞に発現させた場合、DSB 自体の生成は野生型 Vpr と同程度に認められるが、野生型 Vpr と比較して DSBシグナルの誘発が低下することを認めた。即ち、Vpr は Topo1 非依存的に DSB 自身を誘導していることが示唆された。B. Topo1 の HIV 感染における役割：Topo1 に対する siRNA 導入下でのウイルス感染効率を評価した結果、有意に感染効率が減少した(図 2 右図)。また、Vprによる DSB 誘発に伴って惹起される Topo1 の分解に関与する宿主側因子を siRNA を用いて抑制すると、顕著なウィルス感染効率の低下が認められた。即ち、Vpr/Topo1 を介した DSB 誘導はウィルス感染において重要な役割を示す持つことが強く示唆された。

Subject No.

：25A108

Title：The mechanism of DNA damage induced HIV-1 infection and its application

Researchers ：Yukihito Ishizaka
Key word：HIV-1, Integrase, Macrophage, DNA damage, novel AIDS drug

Abstract：

1. Identification of cellular factor(s) which involved in recruitment of IN to DSB site.
[Background] We focus on the mechanism of integrase (IN) catalytic activity independent HIV
infection, which is stimulated by DNA damage induction. Previously, we reported that proviral
DNA integrated at site of DNA double strand break (DSB site), implying that the cellularmachinery directing HIV DNA to the DSB sites. Here, we decided to identify the cellular factor(s)regulating the recruitment of HIV DNA at DNA damage site. The finding from this study will
provide the novel target for anti-HIV drug development.
[Results] A. To identify the DNA damage induced IN associating factors, we first performed
anti-FLAG purification in which FLAG tag is added to IN of its Dox inducible cell line. Secondary,tandem purification with anti-IN antibody (Ab) was conducted to reduce the non-specificassociation. However, the use of polyclonal Ab to IN hampered recovery of anti-IN Ab boundproteins through IN-peptide competitive elution. Thus, we are now preparing the IN-peptide
affinity purified antibody for tandem purification of IN associated factors. B. Utilizing the FRAP
(Fluorescence recovery after photo-bleaching) method with EGFP-IN and Cherry-LacR-Vpr, wefound that IN was quickly accumulated to the micro-irradiation created DSB tracks in a Vpr
dependent manner. Data suggested that Vpr promoted quick recruitment of IN to DSB site.
2. Functional association of Vpr and Topo1[Background] Vpr induces DSB on cellular genomic DNA. Because Vpr protein itself has nonuclease activity, it is plausible that Vpr induced DSB depends on the cellular machinery. We
identified Topoisomerase1 (Topo1), which induces the topological changes on dsDNA, as a novel
Vpr associating factor. We found that Vpr directly associated with Topo1, and significant decreaseof Vpr induced DSB under the Topo1 downregulated condition. Here we investigated role of Topo1
for viral integration.
[Results] A. By analyzing the mode of association between Vpr and Topo1, we identified that
Vpr/R77Q mutant, the mutation of which was identified in virus in long term non-progressor ofHIV-positive patients, did not bind Topo1. Although the similar level of DSB was observed in cells
that expressed Vpr/R77Q and wild-type Vpr, Vpr/R77Q was less potent for triggering cellular DSB
signals. Data suggest that Vpr induces DSB in Topo1-association independent manner. B. For
investigating the importance of Topo1-Vpr interaction on HIV infection, we analyzed the viral
infectivity with siRNA application. By downregulation of Topo1 and Topo1-induced DSB signal
associated factors, the viral infectivity was significantly reduced, strongly suggesting the criticalrole of Topo1 mediated Vpr-induced DSB on the viral infection.

Researchers には、分担研究者を記載する。

図1.インテグラーゼのDNA損傷部へのリクルートメントに関与する宿主細胞側遺伝子産物の同定(FLAG‐IN αFLAG‐Ab 精製泳動像)

EGFP‐IN

A. IN結合タンパクの解析

B. INはDSB部位に集積する（ChIP assay： 上, Microirradiation:下）: DSB track

図2. VprとTopo-Iの機能的関連性の証明
A. Topo1はVpr(+)ウィルス感染時のDSB誘導に要求される（Neutral Comet assay)

B. Topo1はHIV感染に重要である（Luciferase assay）

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：25指108
研究課題名：膠原病における、ＡＣＥ2阻害病態の分析と治療法開発、および抗ＧＡＢＡ受容体抗体による診断法の開発
主任研究者名：石坂 幸人

論文発表
論文タイトル

掲載誌

掲載号

年

Tsuchiya H, Haga
Identification of novel autoantibodies to GABABS, Takahashi Y,
receptors in patients with neuropsychiatricKano T, Ishizaka
systemic lupus erythematosus.
Y, Akio Mimori A

Rheumatolog

53:1219-28

2014

Deng A. Chen C.
Ishizaka Y, Chen
X, Sun B, YangR.

Virus Res.

184:93-102

2014

3. Sato K,
Misawa N, Iwami
HIV-1 Vpr accelerates viral replication during
S, Satou Y,acute infection by exploiting proliferating CD4+ Matsuika M,
T cells in vivo.
Ishizaka Y, Ito M,
Aihara K, An DS, Koyanagi Y.

PloS Pathogen,

9:e1003812

2013

Iijima K,
Okudaira N,Tamura M, Saito
Y, Shimura M,
Goto M,
Matsunaga A,
Retrotransposition of long interspersed element-1
Hoshino S, Kano
in the kidney by human immunodeficiency virus
S, Hagiwara S,
type-1 Vpr.
Tanuma J,
Gatanaga H, Baba
M, Iguchi T,
Yanagita M, OkaS, Okamura T andIshizaka Y.

Retrovirology

0.474305556

2013

DNA damage aids human immunodeficiency
virus type 1 infection by overcoming integrase
inhibition.

Koyama T, Sun B,
Tokunaga K,
Tatsumi M andIshizaka Y.

Retrovirology

10:21

2013

DNA methylation profiling can classify HIVassociated lymphomas.

Matsunaga A,
Hishima T,
Tanaka N,
Yamazak M,
Mochizuki M,
Tanuma J, Oka S,
Ishizaka Y,
Shimura M andHagiwara S.

AIDS

28:503-10,

2013

Human immundeficiency virus type 1 Vpr
increases hepatitis C virus RNA replication incell cuture.

著者

研究発表及び特許取得報告について

学会発表
タイトル
The functional analysis of DNA damage
induced LINE-1 retrotranspositon

発表者

学会名

場所

年月

第29回放生研・放飯島健太、石坂
医研国際シンポジ コープイン京都 2013, 11/28
幸人
ウム

レトロトランスポジションの制御異常による 石坂幸人、岡村 第３６回阿蘇シン熊本
疾病の発症
匡史
ポジウム

2013/8/3

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国