パイプラインの概要、および、新手法（RoomD, RoomE）の要約

・NGSによって決定されたゲノム配列の精度に関する課題
出力配列に含まれる特有のエラー（欠失や挿入）への対処
・正確なアノテーションの決定に考慮するべき問題
遺伝子クラスター(やCNV)の正確なアノテーション
我々が運用している「真核生物用アノテーションパイプライン」、関連する新規開発中のソフトウェア :「kmer-based ポリッシュプログラム」「リピートマスク手法」「RNA-seqアセンブラ」について紹介する。

【ゲノムアノテーションパイプラインの概要、および関連するソフトウェア】

・ ロングリードを出力するNGS (PacBioやNanopore) を用いた配列決定が一般化
・ これらNGSには、特有のシーケンスエラーがある⇒ アセンブル後のコンティグに含まれるエラーをショートリード配列により修正= Polish (ポリッシュ) は高精度な配列決定に重要・既存のプログラムには、その精度や計算時間において課題が残されている
Ⅱ kmer頻度

Ⅰ ショートリード
配列>read1
AGAG…CGAA>

Kmer
DB

End ( ) を繋ぐ
高頻度 Kmer ( )を探索

塩基置換

2,036

1,693

789

3,432

2. A2R : Making RGN-data.

de novo transcriptome
assembly(trinity)
get longest-orf
新規ゲノムガイド型(TransDecoder)RNA-seq assembler(kassemble)

Protein evidence

3. R2G : Making gene models(“SPALN”-based customprogram).

PGA.gff

kassemble.gff

Integration of gene models :gMerge ( In-house program ) → final.gff: kpolish < pilon
618,193 19,033 18,173

9,568

爬虫類

Total
[Repeat%]#gene(BUSCO=C+F%)

Total[Repeat%]#gene(BUSCO=C+F%)= 667M [32.6]#15,373 ( 99.0% )近縁種A = 908M [42.1]#14,284 ( 92.9% )Target2 = 1.404G [39.9]
Target3 = 1.467G [40.1]#20,356 ( 96.2% )#20,047 ( 96.3% )近縁種B = 471M [32.7]#15,773 ( 95.7% )近縁種C = 1.413G [41.3]#25,134 ( 88.0% )近縁種C = 843M [33.7]#27,558 ( 96.5% )近縁種D = 1.591G [34.6]#18,445 ( 69.9% )0リピートライブラリ

マスクする際の 反復配列ライブラリ の作成に広く用いられている
・しかしながら、遺伝子に類似した配列が同ライブラリに混入する可能性がある>Rep1
AAAAAGAGA…
>gB-like
AGAG…
>…

Ⅰ. 単純反復配列 ⇒ マスクⅢ. 散在率 “c” の評価

Ⅱ. 出現数 f の評価

c ≳ 0.5 → マスク (散在性リピート）
c < 0.5 ⇒ step.Ⅳ<10 → アンマスク≳ f → マスク

散在性反復配列

C. elegans
8.61

76.8

90.0

RepeatModeler1234

c = 5 /10= 0.2

594.0

88.9

A. thaliana

86.2

4.00

3.65

RM

RM+F

76.3
5.76

6

2.92

1.53
WM

RM

839.7

3.21

1.15
WM

RM+F

5.12

RM+F

Maskedrepeat(%)

1081.4MaskedCDS(%)

42

WM

RM

RM+F0

【マッピング非依存的なゲノムガイド型RNA-seqアセンブラの開発; kassemble 】
必要データ精度

主な処理例

de novo型

リード配列▲グラフ探索ゲノムガイド型

リード配列＋参照配列〇 精度に依存）マッピング→ グラフ探索trinitystringtie（参照配列の両タイプの利点を有する新規ゲノムガイド型RNA-seqアセンブラ: kassemble⇒ ・従来のゲノムガイド型より高速な動作
・参照配列を利用することによる高精度化
・一方で、de novo型のような参照配列への低依存性

Step1: cEXONの探索

k-mer DB
from shortreads

DBに存在する
k-mer

cEXON

start
k-mer

cEXON-jへ到達
end
k-mer

cEXON-icEXON-j

同一転写産物と見なす
cEXONペア（exon-chain）の探索

C. elegans ゲノムを用いたベンチマークによる Precision の評価

程度が正しい<number of total repeat>

D. melanogaster

0.82
WindowMasker<number of repeat-island>

c=52.23.76

0gC1

真の遺伝子 gB1～gB4 の領域がリピート配列としてマスクされる⇒ アノテーションの作成時に問題

67.5

57.9
5.34

20gB2 gB3 gB4Simple-repeat, Low-complexity の含有率

100

60gB1

Ⅳ. 単純反復配列の含有率 s の評価
if. 末端にあるリピート配列間領域: s < 95% ⇒ アンマスク（遺伝子クラスター）(ex: ヒト = 3,088)

77.7

gA1

距離 <d で隣接

f = GenomeSize / 1Mb

80

RepeatMasker

遺伝子クラスター

Step2: パス探索/アラインメント

されたエクソンの 96%⇒ 性質の異なる手法を組み合わせ、精度の向上が可能

1,603

cEXON (エクソン候補)

配列がDBにある時、予測

kpolish （kmer-based）+ pilon (mapping-based)

355,685

Genome90%程度の相同性を持つ

10,617
9,527

RoomE・For Funannotate pipeline : Busco-DB name and/or Augustus pre-traning parameter,
if RNA-seq is not entered.

相同性10,482

8,623

Required: Genome assembly, maximum intron size only.

Target1

1,612

誤修正は最も少ない

2,702

40

ノイズ除去 / 代表遺伝子の抽出（Dynamic programing） / ヴァリアントの追加

昆虫: kpolish < 他手法

522657・RepeatModeler (RM) はゲノム配列をAugustus training→ PASA.gff, Augustus parameter

Integration of gene models :EvidenceModeler → Fun_evm.gff

224

136

9H. sapiens

PGAP_prot.gff, PGAP_rnaseq.gff,PASA.gff, Ab-initio.gff,
kassemble.gff

1,571366【新規リピートマスク手法（RepeatModler&Maskerによるリピートマスク修正; RM+F）】

Ab-inito gene prediction(using Funannotate pipeline ; v1.8.7)

Gene prediction step→ Ab-initio.gff

498

562

17,151583

UniRef90 / Pre-selected DB / User-customized DB (特定の分類階層（taxid）を指定)

1. P2A : Making alignments.

5725ex) Eukaryota (n = 33,931,931 )Metazoa (n = 15,049,121 )Insecta (n= 3,203,208 )Trinitiy.fa

1,680

12475

15

10 19,853

Protein database の選定

展望 : cEXON
exon-chain
情報の利用

210820

3,963

6,216

＋近縁種のタンパク配列＋Longest-orf

684

1,413

1,025

8,191

Genomeassembly752636

誤修正
未修正
修正

欠失

x1000

3,543

カスタムリピートライブラリの作成（RepeatModeler & RepeatMasker）

Protein database

エラーが含まれる箇所から得られたkmer配列の出現頻度はエラーを含まない場合に比べて、相対的に低くなる

挿入

x1000

1,457

Protein-based Genome annotation (PGA)

End

酵母のPacBio配列 (x68) ⇒ wtdbg2 → Arrow [polish (long-read)]⇒ Polish (short-read ; MiSeq ≒ x83) : ntEdit, NextPolish, Pilon (x4), kpolish

104.

Start

Ⅳ 得られたkmer配列 ( )を用いて Contig を修正

ロングリードを用いて決定された配列に含まれるエラー修正（ポリッシュ ; kpolish）

1. ribosomal rna の予測 (using SILVA)
2. ターゲット種の分類階層を同定
3. 使用するDB の選択

kmer・・・AGAGCGACAAGCTAACG・・・ : Long-read 由来のcontig（A : エラー箇所）

20⇒ マスク済みゲノム配列におけるCDS領域の誤マスク修正 (RM+F)

高頻度 kmer ()(エラーが含まれない配列由来）
低頻度 kmer （）(エラーが含まれる配列由来）

・・・の照合Ⅲ Start ( ) から

x1000

新規ゲノム配列決定（PacBio, Nanopore）

RoomD【Kmer-based 新規ポリッシュ手法の開発; kpolish 】

Kmer頻度NGSの劇的な進化によってゲノム配列決定はより身近なものになってきた。一方で、正確なゲノムアノテーションはすべてのゲノム解析研究を円滑に進めるために重要だが、真核生物に対して正確なゲノムアノテーションを簡潔に構築するパッケージの配備は不十分である。

2

Step3: 後処理（開発中）/出力
候補転写産物
cE1

cE2

cE3

リードPaired-end 配列を利用し、cEXONペアを厳選する

ベンチマーク（マウスのRNA-seqデータを使用）
発現量を基準にしたtranscript配列のデータセット

kssemble(k=25)
Sensitivity

stringtie
Sensitivity

低発現 (≳1 ; n=3,688)

97.3%

96.7%

中発現（≳5 ; n=626）

99.4%

98.2%

高発現（≳10 ; n=624）

99.7%

98.9%

・ 大部分の exon-chain を捕捉
・ Stringtie (ゲノムガイド型)よりも高感度
Min read
Sensitivity
support (MRS) (exon chain)Precision(exon chain)

1

98.6%

90.4%

398.5%

92.3%

1098.1%

94.3%

・ Paired-end リードを用いて、 exon-chainを評価することで、偽のcEXONへの exon-chain を削減
・ Transcriptの精度向上に活用できる
MRS=5

MRS=10
MRS=1