3Tp01
ヘム蛋白࠽の動的挙動と分子間、分子内ஏ子移動反応
京ஞ大学大学院工学研究科分子工学専攻

森島績

はじめに蛋白࠽におけるஏ子移動（ET）反応を検討する際、蛋白࠽構造は結晶構造に見られるようなহ的なものではなく、その構造を変化させうる動的なものであることは、ET 反応の研究においてあまり注目されていない。また、ET 速度はஏ子ドナーとアクセプター間の‫ס‬離（D-A ‫ס‬離）に敏感であるため、蛋白࠽間ならびに蛋白࠽内の動的構造変化が ET 反応を制御することは充分考えられる。演者らはいくつかのヘム蛋白࠽について、分子間、分子内の動的構造変化による ET 反応の制御機構を種々の分光法を用い、加圧効果や浸透圧の効果を考慮することによって検討を行った。
また、一分子測定法による検討も行った。
1

クロスリンクを利用した亜鉛置換ミオグロビンとシトクロム b5 間でのஏ子移動反応機構のӂ明 １）
これまでの研究からこれらのヘム蛋白࠽は様々な配向で複合体を形成することが示唆されてきたが、その配向と ET 反応との関連は明らかでなかった。そこで、両蛋白࠽が形成する複合体に化学的なクロスリンクを施すことで、複合体としての構造変化を制御し、ET 反応過程を分光学的にଵোした。その結果、ET 反応は単分子反応に見られる一相の指数関数では説明できず、その速度は、106~102s-1 にわたり分布していた。そこで、ET 速度と D-A 間‫ס‬離の関係を示す Marcus の式を用い、観測された速度をӂ析したところ、Cyt b5 と Mb は 13~40Åの D-A ‫ס‬離をもつ様々な複合体がクロスリンクされていることが考えられた。さらに、Cyt b5・Mb 間での ET速度は、13~20Åの D-A ‫ס‬離をもつ複合体によってほぼ説明されるが、それらは形成される複合体のうち約 30％しか存在しないことも分かった。この結果は蛋白࠽は様々な配向で複合体を形成しうるが、ET 反応を制御する D-A ‫ס‬離の短い複合体は全体の少数派であることを示唆している。
２ 圧力効果を利用した亜鉛置換シトクロム c とシトクロム b5 会合体の研究 ２）
ここでは蛋白࠽がどのように ET 反応に重要な配向を認࠭するかを検討した。その際、会合定数の圧力依存性から算出される体積変化が、会合・ӂ離に伴う相互作用（塩橋・水素結合・疎水的相互作用）の種໸に大きく依存することに着目した。
その結果、ET 複合体には non-ET 複合体にない疎水的相互作用が働いており、これはஏ子移動前後における蛋白࠽の特定のアミノ酸残基の配向の変化によるとӂ釈された。
３

ル テニウ ム修 飾 亜鉛 置 換 ミオ グロ ビ ンならび にルテニ ウム修飾 シ トクロ

ム b5 における蛋白࠽構造揺らぎがஏ子移動に与える効果 ３）
蛋白࠽表面に存在する特定のヒスチジン残基にルテニウム錯体を配位させ、ヘムとの ET 反応の圧力依存性を検討したところ、ET 速度は加圧に伴い加速され、その変化量は D-A 間に水素結合や、あるいは共有結合などのない空間ശ分が多く含まれている方が大きかった。これは圧力により動的構造が抑制され、水素結合などの‫ס‬離が短くなったためと考えられる。
４

シ ト クロ ム P450cam とプ チ ダレ ドキシン （Pdx）間 ஏ子移動反 応における水分子の役割 ４、５）
蛋白࠽が特定の相手蛋白࠽を認࠭するために会合過程で݄い結合定数が要求される一方、ET 後は新たなܼ素サイクルを回転させるために、各々の蛋白࠽はӂ離する必要がある。ET 反応では蛋白࠽間での会合定数を調節する分子認࠭が必要となる。
P450cam／Pdx の会合は、グリセロールなどを加えることで溶液の浸透圧を増加させると、弱まり、浸透圧の増加のよって蛋白࠽周囲の水分子が取り去られた効果であると考えられる。両蛋白࠽間の会合では水分子がいわば「接着剤」にように働き、水分子を介した水素結合が両蛋白࠽界面において形成され、これがহஏ的相互作用とともに蛋白࠽間の特異な認࠭を制御していると思われる。
５

一分子測定によるシトクロム b5 の揺らぎと分子内ஏ子移動反応 ６）蛋白࠽構造の変化は確率論的な事象であるため、莫大な分子数を扱う通常の測定方法では平均化されたものしか観測されない。本研究ではシトクロム b5 に蛍光標࠭を施し、蛋白࠽構造の変化を一分子ごとに観測し、これが ET 反応に影؉を与える効果を全反射蛍光顕微؈を用いて研究した。その結果、conformational heterogeneity がET に影؉を及ぼしていることが分かった。
（文献）(1) Y. Furukawa, F. Matsuda, K. Ishimori, I. Morishima, JACS, 2002, 124, 4008-4019.
(2) Y. Furukawa, K. Ishimori, I. Morishima, Biochemistry, 2002, 41, 9824-9832.
(3) Y. Furukawa, K. Ishimori, I. Morishima, J. Phys. Chem.B,2000,104, 1817-1825.
(4) Y. Furukawa, I. Morishima, J. Biol. Chem., 2001, 276, 12983-12990.
(5) Y. Furukawa, K. Ishimori, I. Morishima, Biochemistry, 2000, 39, 10996-11004.
(6) Y, Furukawa, K. Ishimori, I. Morishima, et al, submitted for publication.

3Tp02

蛋白質の機能と水和構造の相関を探る（慶應義塾大学 理工学部 物理学科） ○中迫雅由
蛋白質やその複合体は、生命活動の素過程を担う精緻な分子機械であり、20 種類のアミノ酸からなるポリペプチド鎖と少数の低分子や金属イオンによって構成されている。その大きさは様々であり、分子量は数万から数百万にもおよぶ。このような巨大な分子が、“どのようにして立体構造形成し、また、その機能を誤りなく発揮できるのか？”というありふれた疑問に答えることは依然困難である。蛋白質の動作原理や複雑な立体構造の構築原理を解明し、その巧みさを学び取ることを目的として、網羅的な蛋白質立体構造解析が世界中で開始された。しかし、既に蓄積された２００００種以上の膨大な立体構造を元にしても、それら原理の解明にはまだ遠い状態にある。世界的趨勢となっている構造ゲノミクスによる立体構造情報の蓄積を行う一方で、現在の潮流とは異なる視点からのアプローチが必要なのかもしれない。
蛋白質機能発現の仕組みを真に理解するためには、分子内ドメイン、アミノ酸側鎖、水和構造のダイナミクスを時間・空間相関の立場から眺める必要がある。しかし、蛋白質のような膨大な原子からなる非線形振動子集団が織り成す広大な時・空間スケールでの相関関数の測定や解釈は容易でない。そのため、蛋白質に共通な物性に着目し、その理解を通じて蛋白質の機能発現原理へ向かうアプローチもあろう。ここでは、蛋白質がなぜ水の中でのみ立体構造形成しうるのか、蛋白質の反応場である水が、蛋白質ダイナミクスにどのような影響を及ぼすのかといった点に着目した研究の現状を紹介したい。水分子間で形成される水素結合や水分子の双極子などによって生じる集団運動は蛋白質ダイナミクスに大きな寄与をするものと考えられ、その重要性は古くから指摘されてきた。我々は、蛋白質の静的水和構造を探る手段として低温Ｘ線結晶構造解析を、動的側面を探るものとして分子動力学計算を行い、それら結果を相互補完的に検討することで蛋白質の立体構造形成や機能発現における水和構造の物理化学的寄与を考えると共に、生物学的な意義についても検討している。
極低温下蛋白質結晶構造解析技術は、大型放射光での放射線損傷低減を目指して開発された。水を多量に含んでいる蛋白質結晶（体積の３５～９０％）の急速凍結技術と実験手順が確立され、現在では、３５～１９０Ｋの温度範囲で簡便な低温実験が可能となっている。蛋白質結晶を液体窒素温度程度に急速冷却すれば、運動性の高い蛋白質表面近傍の水分子の運動が抑制され、室温下に比べて遥かに多くの水分子を観測可能である。水分子は、正四面体型の水素結合を形成するが、蛋白質表面でもこの性質は保持されており、水和水分子同士あるいは水和水分子と蛋白質表面原子が形成する水素結合は、相互にリンクして、構造上遠く離れた蛋白質の２次構造や構造ドメインを連結する巨大な水素結合のネットワークを形成する。室温溶液中でも、このようなネットワークが蛋白質分子周辺に形成され、その形や規模を活発に変化させながら蛋白質全体の協同的な動きに影響を及ぼしていると予想される。蛋白質水和構造の静的な側面の研究に加えて、蛋白質の運動に付随した水分子の動きが可視化されるようになってきた。構造ドメインを有する蛋白質分子は、その機能発現時にドメイン運動によって基質の捕捉や分子認識を行うと考えられているが、その運動には、蛋白質周辺の水分子は邪魔であり、蛋白質の運動と協奏した水和構造変化が不可欠である。最近、我々は、グルタミン酸脱水素酵素におけるドメイン運動中間状態およびその水和構造の立体構造解析に成功し、ドメイン運動と協奏しながら、蛋白質表面の水和サイトを水和水分子が移動してゆくことが明らかになっている。
結晶構造解析で得られる立体構造モデルからは、蛋白質およびその水和構造が剛直なものである印象を受けるが、水溶液中の蛋白質は水分子と相互作用しながら運動をしている。その時空挙動は、分子動力学計算によって追跡することができるが、特に、蛋白質に固定した座標系から眺めることで、蛋白質周辺の水分子の特徴的が明らかにされ始めた。
蛋白質周辺に固定した観測点ごとの水分子の存在確率（溶媒密度分布）は、結晶構造解
析で得られる電子密度に対応しているが、ヒトリゾチームの１ナノ秒分子動力学計算から得た溶媒密度分布と結晶解析で同定された水和サイトは高い相関を示した。各観測点での水分子の双極子モーメントの配向確立は、空間的協調性に富むパターンを示し、結晶解析で見出された水和サイト周辺で特に顕著であった。また、活性に関わる部位周辺での溶媒双極子場の特徴的パターンは、蛋白質の分子認識を考える上で非常に興味深いものである。
蛋白質の水和構造に関する洞察をさらに深めるためには、蛋白質の動的運動に伴う水和構造の協奏的変化、酵素反応中間状態における水分子運動の追跡、水和構造の分類、データベース化、水和構造予測等について、更なる実験的・計算科学的な研究の展開と連携が必要である。蛋白質、核酸、脂質、糖鎖の活動場を与える生体物質“水”の新しいパラダイムの展開を目指したい。
参考文献中迫、肥後 (2002) 現代化学 No. 374, 24-30.
Nakasako et al. (2002) Biophys. Chem. 95, 211-225.
Higo and Nakasako (2002) J. Comp. Chem., 23, 1323-1336.
Nakasako et al. (2002) Rev. Sci. Instrum. 73, 1318-1320.
Nakasako (2001) Cell. Mol. Biol. 47, 767-790.
Nakasako et al. (2001) Biochemistry 40, 3069-3079.
中迫 (1999) 結晶学会誌 41, 47-56.
Nakasako (1999) J. Mol. Biol. 289, 547-564.
Nakasako et al. (1999) Biochemistry 38, 9887-9898.
Nakasako et al. (1999) J. Mol. Biol. 291, 117-134 (1999).

3Tp03時間分解共鳴ラマン分光法で観たミオグロビンおよびヘモグロビンの構造ダイナミクス（神戸大 分子フォト、科技団 さきがけ研究 21）○水谷泰久

いくつかのヘムタンパク質においては、ヘムでのリガンド脱着がタンパク質構造の変化を誘起し、それが機能発現の源となっている。ヘモグロビン(Hb A)の協同的な酸素脱着はその典型例である。われわれはこの機構を理解するために、構造変化のスタート地点であるヘムとタンパク部分との結合に着目して構造ダイナミクスを調べている。本講演では、Hb A の構造ダイナミクス
および Hb A のサブユニットに構造が似るミオグロビン(Mb)について構造ダイナミクスを比較して議論する。一酸化炭素（CO）結合形のヘムタンパク質に可視光を照射すると高収率（≈1.0）でCO が光解離する。この性質を利用して、リガンド脱離に伴うタンパク質の構造変化を調べることができる。Mb および Hb A のヘムにはヒスチジン側鎖（近位ヒスチジン）が配位しており、鉄－ヒスチジン結合はヘムとタンパク質とを繋ぐ唯一の共有結合である。そのため、鉄－ヒスチジン伸縮振動[ν(Fe-His)]はタンパク質構造を反映する1。そこで、ν(Fe-His)を構造プローブとして、CO 脱離後のタンパク質構造の変化を追跡した。
ミオグロビンの構造ダイナミクス

図 1 は CO 結合形 Mb のピコ秒時間分解共鳴ラマンスペ

クトルで、ポンプ光の波長は 540 nm、プローブ光のそれは 442 nm、相互相関幅は 2.2 ps であった。ここでは共鳴効果によってヘム由来の振動バンドが選択的に観測されている。過渡共鳴ラマンスペクトルは実測スペクトルから未反応分の CO 結合形のスペクトルを差し引いた差スペクトルとして表してあり、左側の数字は遅延時間を表す。また、デオキシ形と CO 結合形のスペクトルを比較のため下に示してある。遅延時間 1000 ps のスペクトルではポルフィリン環の振動に由来する 3 本の強いバンド[ν7, 671 cm-1; ν(CβCcCd), 369 cm-1; γ7, 301 cm-1]が観測され、これらの振動数はデオキシ形のものと全く一致した。これらのバンドは 0 ps から現れており、ポルフィリン環の構造変化のほとんどが装置の応答時間（2.2 ps）以内で速く起っていることを示している。
ν(Fe-His)ラマンバンドは 220 cm-1 付近に観測された。ν(Fe-His)振動数は遅延時間 1 ps では222 cm-1 であったが、約 100 ps の時定数で 2 cm-1 低波数シフトし平衡状態（デオキシ形）の値へと近づいた（図 2）。このような 103±7 ps の時定数をもつ振動数シフトは、ポルフィリン環に由来するいずれのラマンバンドにもみられなかった。また、タンパク部分のないヘムのモデル化合物ではν(Fe-His)の低波数シフトは観測されなかった。したがって、この低波数シフトは CO 脱離後のタンパク質構造の緩和によるものと帰属した2。
ヒスチジン側鎖と主鎖との間の共有結合を切断した場合にこのようなタンパク質構造緩和がどのように影響を受けるかを調べるために、近位ヒスチジンをグリシンで置換し外部からイミダゾールを加えた人工変異体[H93G(Im)]で同様の測定を行った。興味深いことに、野生型と同様ν(Fe-His)振動数は約 100 ps の時定数で低波数シフトしデオキシ形の値へと近づいた。近位ヒスチジンは Ser92 および Leu89 と水素結合を形成していることが知られている3。例えば、Ser92あるいは Leu89 を置換し水素結合ができないようにすると、ν(Fe-His)振動数は 3 cm-1 高波数シフトする。ヒスチジン側鎖と主鎖との間の共有結合を切断してもν(Fe-His)バンドが振動数シフトを示すことは、近位ヒスチジンと周囲との水素結合がリガンド脱離に伴うタンパク質構造変化に重要な役割を果たしていることを示唆している。

ヘモグロビンの構造ダイナミクス

CO 結合形 Hb A について Mb と同様の測定・解析を行った。Hb A の構造ダイナミクスは Mb のそれと似ていたものの、以下の相違点を示した。①
ν(Fe-His)バンドについて、シフトの時定数が284±38 ps と Mb に比べ大きかった（図 2）、②ν(Fe-His)バンドについて、1000 ps での振動数（231 cm-1）はデオキシ形の値（215 cm-1）とは一致しなかった、③γ7 バンドについて、1000 psでの振動数（305 cm-1）はデオキシ形の値（300cm-1）とは一致しなかった、④デオキシ形ではν8バンド（341 cm-1）の存在が認められるが、1000ps ではまだ現れていなかった。これらの結果は、Hb A ではヘムの構造緩和およびヘム周辺のタンパク構造変化が 1000 ps ではまだ完了していないことを意味している。
Hb A と Mb とのこれらの違いが、Hb A の

図 1.

Mb の時間分解共鳴ラマンスペクトル

四量体形成や協同性に直接関係する相互作用によるものなのか、それとも Mb と Hb サブユニッ
ト固有の性質の違いによるものかを調べるために、単離α鎖、単離β鎖について時間分解共鳴ラマン測定を行った。その結果、上に挙げた 4 つの相違点は、単離鎖と Mb との比較においても同様にみられることがわかった（図 2）。したがって、上記の相違点は、Hb A の四量体形成や協同性に直接関係する相互作用によるものではなく、Mbと Hb サブユニット固有の性質の違いによるものであると考えられる。すなわち、Hb A はサブユニットの段階ですでに、Mb とは異なる動的性質を持っている。そのような性質が Hb A の協同性発現にどのように関わっているかを明らかにすることが今後の課題である。
謝辞

本研究は、Biswajit Pal 博士、北川禎三教授（統合バイオサイエンスセンター）および長井雅子教授（金沢大医）との共同研究である。
123

図 2. Mb、Hb A およびその単離鎖のν(Fe-His)
バンドの振動数シフト。対応するデオキシ形の値を破線で示す。

T. Kitagawa, Biological Applications of Raman Spectroscopy, T. G. Spiro Ed., John Wiley & Sons, 1987;
Vol. III; p 97.
Y. Mizutani and T. Kitagawa, J. Phys. Chem. B, 105, 10992 (2001).
E. S. Peterson, J. M. Friedman, E. Y. T. Chien, S. G. Sligar, Biochemistry 37, 12301 (1998).

3Tp04
Protein-Driven Photoisomerization Reaction of Proteins(Nagoya University) ○T. Yamato,

A. Yamada,T. Ishikura

Introduction
The photoactive yellow protein (PYP) was discovered in 1985 and its X-ray
structure was reported in 1995. There has been a growing interest in PYP, which
is a small water-soluble globular protein containing 125 amino acid residues.
The photoisomerization of PYP triggers the photocycle, which is essential for thenegative phototactic response to blue light. The photoisomerization reaction of
PYP is a good model system for the study of the structure-function relationship of
the protein for the following reasons: (1) the 3D structure of PYP is determinedat a high atomic resolution. (2) and its ultrafast reaction process can becompletely traced by a computer simulation.
(3) the features of thephotoisomerization in the native PYP are strikingly different from the reaction of
the p-coumaric acid chromophore in solution environments. This means that themicroenvironment of the p-coumaric acid in the native PYP plays a significant
role in the efficient photoisomerization reaction.
To elucidate thestructure-function relationship of PYP as an efficient photosensory protein, weused computational methods. The contribution of each atom, namely, the partial
atomic driving force, was quantitatively evaluated by the atom-by-atom
separation of the driving force for the reaction. With the aid of computer
graphics, the constituent atoms are labeled in different colors
PYP chromophore structure
The photoisomerization reaction of the chromophore takes place at the C7=C8bond. Then, how does the protein environment control the photoreaction of PYP?
To study this problem, we calculated the bond-twisting force using a hybrid
Quantum Mechanical/Molecular Mechanics method. We found that the force
was largest at the C7=C8 bond among all of the backbone bonds of the p-coumaricacid. Furthermore, we separated the force, which is acting immediately after
light illumination, into different contributions from (1) the internal component of
the chromophore itself, and the chromophore-protein interaction. As a result, wefound that the latter was much greater than the former. These observations
imply that the ultrafast, bond-selective photoisomerization of PYP is driven by theprotein-chromophore interaction during the initial stage of the reaction.

Partial atomic driving force
To understand the photoisomerization mechanism of PYP, we separated thebond-twisting force at the C7=C8 bond into different contributions from theconstituent atoms of PYP. It should be noted that the ten different conformationsof PYP taken from the molecular dynamics trajectory exhibit force profiles
strikingly similar to each other.
This observation implies that thephotoisomerization mechanism of PYP is strongly conserved during the thermal
fluctuation of the protein.
Structure-function relationship at a glance
To understand the photoisomerization mechanism of PYP, we drew a color pictureof the molecule. Each atom is shown in different colors depending on theirdifferent contributions to the bond-twisting force at the C7=C8 bond. We
observed that the functionally important atoms are localized around thechromophore. As a result of this analysis, we revealed the reaction mechanism ofPYP.

Functional atoms hunt. To find functionally important atoms, the constituent
atoms are shown in different colors depending on their partial atomic driving
forces for the photoisomerization reaction. The functionally important atoms
with a large positive (negative) partial atomic driving force are shown in blue(red), while atoms with small partial atomic driving force are shown in green.

3Tp05

レチナール蛋白質の反応速度分布（北陸先端大・材料） ○水上卓
生体高分子は，水素結合や疎水結合などのゆるい結合力で複雑な構造を保っており，分子シミュレーション，NMR，１分子計測などの成果から，蛋白質が構造的に揺らぎつつ反応している描像が得られている．また蛋白質 folding の分野において揺らぎの重要性が注目されつつある．最近では，蛋白の揺らぎの特別な性質を解明しようとする動きもある．蛋白質の揺らぎが機能発現とどのような関係を持っているかについての研究の必要性が増している．
蛋白構造が揺らいでいるとするとそれが反応性に影響することが，当然考えられる．実験家の間では，蛋白の反応が，単純なモデルに合わない場合があることが暗に知られてきた．
今回，蛋白質の時間分解分光法によるデータから，蛋白の機能発現における構造揺らぎの効果を抽出することを試みた．
レチナール蛋白質は，細胞膜貫通型の 7 本へリックス構造をもち，ビタミン A アルデヒド=レチナールが分子の中心部に結合している．近年の遺伝子解析により，この蛋白はホルモン受容体などとともにロドプシンファミリーと呼ばれる非常に大きなグループを成していることがわかってきた．細胞膜内外の物質移動・情報伝達のメッセンジャーなどの点で，構造・反応・機能における普遍性が着目されている．
レチナール蛋白質は発色団の光異性化をトリガーとし，それに誘起された蛋白質の構造変化により，フェムト秒から秒の時間スケールにおいて複数個の反応中間体をシーケンシャルに経て(熱崩壊過程)，蛋白としての機能を発現する．以下に，その一種である光駆動プロトンポンプ・バクテリオロドプシン(bR)の反応スキームを示す．
BR ⇒hν

I* → J → K → L → M1 → M2 → N → O (→ BR )∆各大文字は中間体を示す．構造変化とともに発色団-蛋白質間の相互作用が変化するので，反応中間体はそれぞれ固有の可視吸収スペクトルを示す．この性質を利用し，低温分光法や時間分解分光法によって，詳細な反応解析が進んできた．
これまで行われてきた，バクテリオロドプシンの反応解析の戦略は，・広い時間レンジ（10-9～101sec）での時間分解吸収分光
・first order kinetics を仮定し，multi-exponential での近似・exponential の個数と同数の中間体を想定，スペクトル成分を考慮して中間体の同定であった．しかしこの方法では，観測されたスペクトル成分の個数よりも，近似に必要なexponential 関数の個数が多くなってしまう状況が頻繁に生じ，それはおもに，・silent-intermediate（スペクトルが同じで時定数が異なる中間体）の問題としてとらえられてきた．
今回，蛋白質の構造揺らぎの効果を考慮し，反応速度がδ関数型ではなくある程度分布した形を考えた上で，
1) SVD（特異値分解）による V スペクトルの Gaussian 速度分布近似
2) MEM（最大エントロピー法）による速度分布の算出という二つの手法で解析した．
バクテリオロドプシンが含まれている紫膜の水和フィルム試料をそれぞれ245,250,255,260K に冷却し，長波長領域で励起後，740～300 nm(17 波長),0～360 sec(1 data/0.1 sec)の吸収変化を測定した．得られたデータは 17 波長×3600 点=61200 点である．このデータマトリクスに特異値分解（SVD: Singular Value Decomposition）をほどこした．
SVD とは時間分解スペクトルデータを，波長×時刻の行列として用意し，その行列を対角化することによって，データ全体が持つ線形独立な次元の数（有効 rank 数），および基底スペクトル（b-スペクトル）を算出する方法である．全波長の測定点が等価に扱われ，異なった波長でも同期した変化の成分が抽出されるために，非常に微細なスペクトル変化を見逃さずに扱うことが出来る．また，有効 rank 数によって，測定データから一意的に，独立したスペクトル変化の個数を決定することが出来る．このアプローチによって，実験データから，有効rank 数 2～3 のスペクトル独立変化が得られた．これらの独立変化は，b-スペクトルから判断して M→N→O→BR の遷移に対応すると考えられた．つぎに時間変化に相当する V スペクトルを，有効 rank 数と同数の Gauss 分布した速度定数を仮定し,近似した．近似値の Gauss分布は大きくオーバーラップし，分布のピーク位置は温度によってアレニウス的な挙動を示した．
ここで問題になるのが，速度分布を恣意的に Gauss 関数で近似してよいのかということである．そこで分布関数を仮定しなくてもよい方法はないかと考え，天文学等で画像解析に使われる最大エントロピー法（MEM; Maximum Entropy Method）に着目した．これは，測定系に見込まれるノイズの標準偏差σをあらかじめ算出し，その標準偏差程度の誤差を許しつつ，速度分布の情報エントロピーを最大にするものを近似解とする方法である．情報エントロピ
ー最大とは，その分布プロファイルが，標準偏差σの許す範囲で取りうる確率が最も高いことを示す．MEM では，400nm 単一波長での吸収変化から速度分布を求めた．得られた分布は大きくやはりオーバーラップした３つの Gauss 型関数によって良く近似された．また，
SVD による結果と一応の consistency を示した．
これらの速度分布を，中間体の間に存在するエンタルピーバリアの分布によるものと考え，簡単なモデルによって計算すると，分布の半値巾はバリアの 2 割近い値を示した．このことはバクテリオロドプシンの反応において蛋白質が，同じ中間体の間でも異なった構造を（分布的に）取り，ひとつの中間体から次の中間体へ異なったそれぞれエンタルピーバリアを越えながら遷移していることを示唆している．
今回測定したキネティクスを従来どおり multi-exponential によって近似するには，有効 rank数より多くの exponential 関数が必要であった．この結果に従来の手法を用いると同様にsilent-intermediate が算出される．しかし今回の結果から，従来の silent-intermediate はdiscrete な速度=first order kinetics を仮定した事によるアーティファクトの可能性がある．
このアプローチによって，より少ない中間体の数で反応を説明できる可能性を示すとともに，中間体というカテゴリーについて，その境界分けの方法を提示することが出来るのではないかと考えている．