「様式３」課題番号 27

新規ユビキチンリガーゼによる Ku70/Ku86 複合体
ユビキチン化の DNA 損傷応答における役割【１】組織代表者：石田 典子（東北大学大学院医学系研究科）
対応者：安井 明（東北大学加齢医学研究所）
分担者：中山 啓子（東北大学大学院医学系研究科）
研究費：物件費 13 万円【２】研究経過
DNA損傷応答メカニズムに関する研究は，国内外を問わず非常に注目度が高い領域であるが、近年ではユビキチン化の役割についても、その重要性が示されている。私たちは、ヒストンシャペロンNAP1L1をユビキチン化し、タンパク質分解を促進する新規ユビキチンリガーゼRNFが、DNA損傷応答タンパク質であるKu70/Ku86と結合して三者複合体を形成し、Ku86をユビキチン化する（in vitro, in vivo）ことを発見した。Ku70/Ku86複合体は二重鎖切断における非相同組換え末端結合修復（NHEJ）経路で働く重要な因子である。そこで本共同研究では、DNA損傷応答におけるRNFユビキチンリガーゼによるKu70/Ku86複合体ユビキチン化の役割を明らかにすることを目的とし、研究を行った。
これまでに本共同研究では ① GFP-RNFタンパク質のリアルタイム解析を行い、DNA損傷時（504nmレーザー照射）にGFP-RNF（ユビキチンリガーゼ）が損傷部位へ集積すること ② 特異的抗体を用いた検出により、内在性RNFタンパク質もDNA損傷時に損傷部位へ集積し、Ku70/Ku86と共局在すること ③
その損傷部位への集積はKu86に依存すること ④ ガ
ンマ線照射、及びシスプラチン処理によるDNA損傷修復において、siRNAによりRNFユビキチンリガーゼを減少させると、感受性が高まり、修復に対する阻害効果がみられること ⑤ RNFの減少、及びRNF変異体の過剰発現はガンマ線照射後に形成されるγ-H2AX
foci 除去も遅延させることを明らかにし、RNFによるユビキチン化がガンマ線照射やシスプラチン処理によるDNA損傷修復のNHEJ経路で機能し、Ku86を分解している可能性を示唆するデータを得てきた。そこで今年度はNHEJ経路において、RNFがKu86を分解して生理的な機能を果たしていることを検証する、より詳細な解析を行った。
以下、具体的な解析方法と研究活動状況の概要を記す。
［１］ RNF タンパク質が機能する DNA 損傷修復経路の同定： HR アッセイや NHEJ アッセイ、コメットアッセイなど複数のアッセイ方法を用いて、NHEJ 修復経路で RNF が機能するかを検討［２］リアルタイム解析や DSB アッセイによるRNF 発現量低下が GFP-Ku86 の DNA 損傷部位への集積や解離に与える影響［３］DNA 損傷依存的な内在性 Ku86 のユビキチン化の検出[４]質量分析計（LC-MS/MS）を用いた Ku86 のユビキチン化部位の同定
上記の研究活動を遂行するために、以下 3 回の研究打ち合わせを行い、それ以外にも直接、あるいは電子メールを用いてディスカッション等を随時行った。
第１回研究打ち合わせ：平成 22 年 3 月 6 日
第２回研究打ち合わせ：平成 22 年 4 月 28 日
第３回研究打ち合わせ：平成 22 年 11 月 8 日【３】成果（３-１）研究成果
本年度は、以下に示す研究成果を得た。
まず第１に、HR アッセイ、NHEJ アッセイ（図1 参照）、コメットアッセイ（図 2 参照）により RNFが NHEJ 経路で機能していることを明らかにした。

における RNF による Ku70/Ku86 制御メカニズムを明らかにすることが期待される。
（３－２）波及効果と発展性など
本共同研究で明らかになった RNF ユビキチンリ
ガーゼによる Ku70/Ku86 複合体ユビキチン化の役割に関する成果は、タンパク分解による転写制御とDNA 修復の協調的な制御、という新しい研究プロ
ジェクト、コンディショナルノックアウトマウスを用いた個体における機能解析、という研究の発展に結びつき、今後の発展が期待される。
第２に、RNF 発現量の低下は DNA 損傷部位へのKu86 の集積には影響しないが、損傷部位からの解離が遅延する傾向がリアルタイム解析より得られた。
しかしインキュベーターがないため、長時間（５時間以上）のリアルタイム解析を安定して行い、データ数を増やすことが困難であった。そこで DSB 部位に集積する GFP-Ku86 を検出可能な新しい検出方法を用いて、GFP-Ku86 の解離を解析した。その結果、RNF の発現量低下により Ku86 の DSB 部位からの解離が遅れることが示唆された。現在、まだデータを解析中であり、統計処理を行うためにデータ数を増やしている。
第３に、内在性 Ku86 の DNA 損傷依存的なユビキチン化の検出を試みた。これまで従来の免疫沈降法を用いた検出を行ったが、成功していなかった。
そこで今回はマルチユビキチン結合ドメインタンパク質を用いたアフィニティー精製を行い、その後抗Ku86 抗体でユビキチン化 Ku86 を免疫沈降するタンデム精製法により、検出を行った。その結果、まだ改良の余地はあるものの、初めて内在性 Ku86 のDNA 損傷依存的なユビキチン化の検出に成功した。
第４に、RNF による Ku86 ユビキチン化部位の同定を LC-MS/MS を用いて行った。ユビキチン、Ku86、RNF を発現させた HEK293T 細胞から最初に変性条件化でユビキチン化タンパク質、次にユビキチン化 Ku86 をタンデム精製し、最終的にLC-MS/MS 解析により、ユビキチン化された 8 ヶ所のリジン残基を同定した。現在異なる手法による
LC-MS/MS 解析を行うと同時に、同定されたリジン残基をアルギニンに置換したKu86 変異体を作製し、この変異体が RNF によるユビキチン化を受けないか解析中である。
以上の得られた研究結果より、RNF ユビキチンリガーゼは DNA 損傷依存的に Ku70/Ku86 複合体と結合・ユビキチン化し、NHEJ 経路の修復反応終了時に Ku70/Ku86 を分解し、DNA 切断部位より除去している可能性が示された。現在進行中の解析を行うことにより、この仮説を検証し、DNA 修復【４】成果資料
本共同研究の研究成果は現在論文投稿準備中であり、直接掲載された論文はまだないため、関連論文を掲載する。
1. Onoyama I, Suzuki A, Matsumoto A, Tomita K,
Katagiri H, Oike Y, Nakayama K, Nakayama KI. Fbxw7controls lipid metabolism and cell fate decisionin the liver in mice. J. Cli.n Invest. 121, 342-54(2011)
2. Matsumoto A, Tateishi Y, Onoyama I, Okita Y,Nakayama K, Nakayama KI. Fbxw7β resides in theendoplasmic reticulum membrane and protects
cells from oxidative stress.

Cancer Sci. 102, 749-55 (2011)
3. Wang H, Bauzon F, Ji P, Xu X, Sun D, Locker J,Sellers RS, Nakayama K, Nakayama KI, Cobrinik D& Zhu L. Skp2 is required for survival ofaberrantly proliferating Rb1-deficient cells andfor tumorigenesis in Rb1(+/-) mice. Nat. Genet.
42, 83-88 (2010).
4. Tsuchiya Y, Asano T, Nakayama K, Kato T, Jr KarinM & Kamata H. Nuclear IKKbeta is an adaptor
protein for IkappaBalpha ubiquitination anddegradation in UV-induced NF-kappaB activation.
Mol. Cell 39, 570-582 (2010).
5. Masuda K, Ishikawa Y, Onoyama I, Unno M, deAlboran IM, Nakayama KI & * Nakayama K. Complex
regulation of cell-cycle inhibitors by Fbxw7 inmouse embryonic fibroblasts. Oncogene 29,1798-1809 (2010).