ケーススタディ：Fragment Analyzer System

イリノイ大学におけるロングリードシーケンスのための植物組織からの新しい DNA 抽出メソッド

植物の新規ゲノムアセンブリ

イリノイ大学アーバナ・ シャンペーン校の研究者の Dessireé Zerpa-Catanho 博士、RayMing 博士、Alvaro Hernandez 博士は、先日、研究チームの他のメンバーとともに独自のDNA 抽出メソッドを発表しました。これは、Oxford-Nanopore 社のロングリード次世代シーケンシング（NGS）に適した、高純度かつ高分子量（High Molecular Weight：HMW）の植物 DNA の抽出用に開発されました。1。

このメソッドは、パパイヤ科（パパイヤなどの食用果実を含む熱帯顕花植物の科の 1 つ）の植物の新規ゲノムアセンブリを目的としたロングリードおよびウルトラロングリードシーケンスに用いられ、この経済的に重要な植物の科の性決定経路とその進化の歴史に関する研究の進展が期待されます。

植物組織から得られる長い DNA フラグメントは 新しいゲノムアセンブリの生成 に欠かせません。
「植物の de novo ゲノムアセンブリに関 わる問題として、反復配列が多く含まれることが挙げられますが、長い DNA フラグメントを得ることでその問題を解決することができます。一方、短いフラグメントでは良いアセンブリを得ることは基本的に不可能です」と Zerpa-Catanho 博士は話します。

植物組織から得られる高分子量 DNA

これまでの方法では、ロングリードシーケンスに最適な品質と量の DNA を抽出することは困難であったため、研究チームは長い DNA フラグメントを得るために、植物組織専用の手法を開発する必要がありました。重要なポイントの 1 つが、植物の新鮮な葉を使用することでした。研究チームは若い植物組織を使うことで、HMW DNA の純度が向上することに気づきました。
「病気の兆候がない、新鮮な若い葉を好んで使用しました。というのも、成長した植物の葉には、多糖やポリフェノールなどの夾雑物が高濃度で含まれていることがあるためです」と Zerpa-Catanho 博士 は 述 べています。研究チームはサンプリングに新鮮 な葉を使うことに加えて、タンパク質やフェノールといった有機化合物などの残留不純物に対処するためにシーケンシングの前に精製ステップを実施しました。

Dessireé Zerpa-Catanho 博士
研究員

イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校

USADNA の品質と量はロングリード NGS の成功を左右するもう 1 つの重要な要素です。
「最初の抽出で十分な核を採取できなければ、おそらく十分な DNA を得られないでしょう」と Zerpa-Catanho 博士は述 べます。高品質のフラグメントを大量に抽出するためには、ワークフロー全体を通して、サンプルを丁寧に扱い、ワイドボアピペットチップといった特殊な器具を使用することが重要です。
「抽出する間はサンプルを丁寧に扱うことが大切です。ロングリードまたはウルトラロングリード DNA シーケンシングを行う場合は、DNA すべてを断片化したくないからです」と Zerpa-Catanho 博士は述べます。そこで、抽出した DNA の品質と量をさまざまな品質評価を用いて検証しました。

さまざまな品質評価方法

研究チームは、さまざまなサンプル品質評価法を選択することで、DNA抽出物に含まれる DNA フラグメントの純度が高く、ロングリードおよびウルトラロングリードシーケンシングに適した長さを備えていることを確

植物のゲノムアセンブリ研究の始まり

この研究チームが開発した抽出メソッドにより、平均 25 kb のリード分布が得られる高純度のサンプルが作製でき、得られたリードはパパイヤ科のさまざまな種の新規ゲノムアセンブリに使用されます。さらに、このメソッドにより、HMW DNA を抽出する際のリソースを節約することができます。
「私たちは HMW DNA をより経済的な方法で抽出することができました。もし受託ラボにサンプルを依頼すると、抽出のために多額の費用を支払わなくてはいけないでしょう」と Zerpa-Catanho 博士は話します。

Zerpa-Catanho 博士と研究チームは、植物組織から適切な DNA を採取し Oxford-Nanopore ロングリードシーケンシングを行うために、この抽出メソッドを確立しましたが、今後は PacBio や Illumina シーケンシ

ング技術 など別のアプリケーションにこのメソッドを使用することを考えています。また、研究チームは、このメソッドはパパイヤ科以外の植物の解析にもうまく利用できるのではないかと期待しています。ゲノムアセン

認することができました。まず、DNA 量の測定と純度評価には UV-Visブリが行われていない種がまだ多い状況ですが、「植物においては、多くアガロースゲル電気泳動を行うことで、サンプル中の長い DNA フラグメ博士は話します。

分光光度法や蛍光光度法を用いました。つぎに Zerpa-Catanho 博士はントの存在を確認しました。アガロースゲルでは、長い DNA フラグメントのゲノムアセンブリが日々、着々と行 われています」と Zerpa-Catanhoと、多量であれば短い DNA フラグメントを検出することはできましたが、結論

DNA サンプル 内 の 短 いフラグメントの 有無 の 判定 を向上 させるため、コスト効率の高い DNA 抽出メソッドの開発に成功しました。このメソッド

少量の短い DNA フラグメント（<50 kb）の確認は困難でした。

Zerpa-Catanho 博士はイリノイ大学アーバナ・シャンペーン校 DNA サー

ビス機関のディレクタ Alvaro Hernandez 博士と協力して作業を行いました。Hernandez 博 士 により、Agilent Fragment Analyzer Systemの 使用 が 提案 されました。
「DNA の 断片化 や 分解 が 起こっていないことを確認するために、Hernandez 博士から Fragment Analyzer の使用 が 提案 されました。Fragment Analyzer を使うことで 短 いフラグメントを確認することができました」と Zerpa-Catanho 博士 は 話します。

Fragment Analyzer System で得られたデータはエレクトロフェログラ

ムで示されるため、たとえ少量の短いフラグメントが広がっていても容易に確認できます。Fragment Analyzer System による客観的データはレポートとして表示され、これにより研究チームはサンプルの品質と長さがロングリードシーケンシングに適切かどうかを確かめることができました。

このようにして得られた結果から、DNA 抽出メソッドが目的どおり機能していることが確認できました。

Agilent Fragment Analyzer System の詳細については、

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Printed in Japan, January 1, 2022
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研究チームは、いくつもの技術的な課題を克服し、植物組織用の確実でにより、Oxford-Nanopore ロングリードおよびウルトラロングリードシー

ケンシングのための高純度の HMW DNA を得ることができ、得られたデータはパパイヤ科の植物の新規ゲノムアセンブリに使用されます。シー

ケンシングを行う前には DNA の品質と量をさまざまな手法で評価する必要があります。Agilent Fragment Analyzer System を用いることでHMW DNA のサイズや短い DNA フラグメントの有無を評価することができます。

参考文献
1.

Zerpa-Catanho, D; Zhang, X; Song, J; Hernandez, AG; Ming,
R. Ultra-Long DNA Molecule Isolation from Plant Nuclei for
Ultra-Long Read Genome Sequencing. Cell 2021, 183, 875889.e117. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100343