牛乳摂取後の postprandialhyperlipidemiaに対して、アポ蛋白 E多型が及ぼす影響の遭伝子学的、代謝学的解析

東京大学第一内科

塚田辺白

沢浩

本和彦樹香子久筑波大学医学研究科

島照秀

筑波大学医科学研究科

松袴渡富

筑波大学臨床医学系【序 論】

アポ蛋白 Eはリポ蛋白の構成アポ蛋白成分として共通にみられる脂質結合能の他、リポ蛋白リバーゼ、肝性トリグリセリドリバーゼの活性化作用、さらに LDL受容体、を果たしている。
及びレムナント受容体への結合能を有し、リポ蛋白代謝上重要な役割l
特に、アポ蛋白 Eはカイロミクロンの残遺体であるカイロミクロンレムナント上に多〈存在し、そのレムナント受容体を介しての肝への取り込みを引き起こし、食事性リポ蛋白の代謝を決定している。
アポ蛋白 Eはその成熟蛋白が299アミノ酸残基からなる糖蛋白であるが、アミノ酸配列の変化によりい〈つかの多型が存在している。すなわち、野生型と考えられるアポ蛋白 E3に対し、その第 112番目のアミノ酸残基である CysがArgに変わった多型が58番目の ArgがCysに変わったものがアポ蛋白 E2である。いアポ蛋白 E4であり、 1ずれも荷電アミノ酸の変異であるので、蛋白の等電点の変化をきたし、アポ蛋白 E 4は塩基性の、アポ蛋白 E2はより酸性の性格を有している。この多型は遺伝的に決定され、遺伝子上の塩基の変異によるものであることが知られており、本邦ではアポ蛋
白E2、E4の対立遺伝子 ε2、 8 4はそれぞれ遺伝子頻度として約 10%、5%程度で存在していると考えられている。現在、アポ蛋白 Eには他にも異なる等電点、アミノ酸配列を有する稀な変異が発見され、約 10種類のイソ蛋白が報告されている O
これらアポ蛋白 Eの多型の内、アポ蛋白 E2を有するものの一部には盟型高脂血症
165を呈するものがあることが知られている。これはその変異の存在する第 140から 160残基がLDL受容体への結合部位であり、その付近に近い陽性荷電アミノ酸が結合に重要であるので、アポ蛋白 E2は結合能を失い異常リポ蛋白が蓄積するのであろうと考えられている。しかし、 E型高脂血症を発症しない限りアポ蛋白 E2を有するものはLDLの産生がむしろ悪いために血清コレステロール値はむしろ低いことが知られている。一方、アポ蛋白 E4を有するものは受容体への結合能はアポ蛋白 E3と差がないが、未だ不明の原因よりリポ蛋白の代謝回転が速く、血清コレステロール値はより高値をとることが認められている。
一方、牛乳は高脂肪食品であるが、飲用後および長期飲用を行っても血清脂質、血清コレステロール値の上昇は少ないことが知られ、それには牛乳の非脂肪成分(乳清)の働きが関与している可能性が示唆されている。我々はこの度、この牛乳摂取後の血清脂質の変化がアポ蛋白 Eの多型により違いがあるかどうかを知る目的で、食事性リポ蛋白であるカイロミクロンとカイロミクロンの代謝残遺体であるカイロミクロンレムナントの代謝を観察した。レチノールはビタミンAの前駆体であるがそのエステルは経口投与すると非極性脂質としてカイロミクロンの中核部を構成して運搬されるが、トリグリセリドと異なりリポ蛋白リバーゼによる水解を受けないため、カイロミクロンの異化が進行しカイロミクロンレムナントとなって肝臓に取り込まれるまでその粒子上に留まっている。本研究でレチノールパルミテートを牛乳飲用と共に経口負荷してカイロミクロンを体内標識し、レムナントの異化の観察を試みた。

【方法】
1.アポ蛋白 E多型の分析

β
2歳から 3
7歳の健常男女30名から抗凝血剤入り容器に採血を行い、白血球層を分離した。白血球を洗浄し、 SDS、プロナーゼKにて細胞を溶解後、穏やかにフェノー

12、146アミノ酸をコードするル抽出を行い染色体DNAを得た。既報に従い、第 1法にて増幅し、①制限酵素HhaIにて消化後の断片を 1%アガロー領域付近を PCRitespecificoligonuleotideをス電気泳動にて分離して断片長を分析し、または② sブローべとしてドットブロットを行いアポ蛋白 Eの遺伝子型を判定した。
‑166ーアポ蛋白 Eの表現型の判定には、全血清、または、血清から Have!らの方法に従を用いた O 試料を脱脂後、等電点電気泳動法によい超遠心法により分離した VLDLり蛋白を分離し、抗アポ蛋白 E抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりアポ蛋白 Eのイソ蛋白を分析した。

2. 牛乳摂取後のカイロミクロンレムナントの代謝と解析、 E3
アポ蛋白 Eの多型 E4/E3 (ε4/63) 、E3/E3 (ε3/ε3)/ E2 (ε3/62)型の各 3名について、牛乳レチノール負荷試験を行った。

2
時間以上の絶食の後、空腹時採血を行い、 3.5%乳脂肪を含む牛乳500m!
1
被検者は 17.
5gに相当)とチョコラ A6錠(レチノールパルミテートとして 6000単位)(脂肪 1を摂取し、以降 2時間毎に採血を行った。 4時間目の採血の後はレチノール含量の0，鵬少ない食品に限って摂食を許可した。血液より血清を分離し、超遠心法により 2
rpmx30minの分画をカイロミクロン、 40，OOOrpmx16hrsの分画をカイロミクロンレムナントとした。血清、およびリポ蛋白分画中のコレステロール、中性脂肪濃度

PLCを用いて測定しは酵素法を用いて測定した。レチノールパルミテート濃度は Hた。レチノールの血清中で最高値をとる時を頂値として、その半値にいたる時間をもって、カイロミクロンレムナントの半減期とした。

【結果】

アポ蛋白 E多型を分析した 25名の被検者の内、遺伝子型 63/ε4型は 5名、

ι3/ε3型は 15名、 62/ε3型が 5名がそれぞれ同定された。血清蛋白のウエス
タンプロッティング法により解析したアポ蛋白 Eの表現型は全例において遺伝子型と一致していた。このうち、各 3名を無作為に選んで牛乳ーレチノール負荷試験を行った。
負荷前空腹時の血清脂質の値はコレステロール値は 63/64型、 63/ε3型、ε2/63型がそれぞれ平均 157.
0、139.
1、 152.3mg/dO、中性脂肪値は同じくそれぞ2.
6、77.
0、72.6mg/d1!で、あり何れも 3群間で差はなかった。牛乳摂取後 2時間のれ78.
7土 55.
3、83.
9::
t2
6.
3、71.6土 37.0mg/必で、何れ血清中性脂肪値は 3群でそれぞれ8の群も前値と比べて変化を認めなかった(表 1)。牛乳摂取後 2時間のカイロミクロ‑167‑

ン中性脂肪値の摂取前値に対する増加分は、 83/84型、 ε3/ε3型、 82/ε.
8+3.
3、9.
5土 6.
6、6.
2i:5.
4mg/dsであり、 83/ε4型に低い傾向3型でそれぞれ0がみられた。
カイロミクロンレムナント分画のレチノールパルミテート濃度は全例において摂取後 6時間目に頂値に達した。レチノール代謝速度より得たカイロミクロンレムナントの半減期は ε3/84型、 83/ε3型、 82/83型でそれぞれ0.
3
9土 0.
11、0.
40
土0.
01、0.
4
8土 0.
10(時間)であり、 ε2/83型において延長がみられた。(表 2、図)【考察】

レチノールエステルの血中での非水解性を利用して、牛乳ーレチノール負荷試験を行った。 HPLCを用いたレチノールパルミテートの定量は十分に鋭敏で、典型的な代謝曲線を得ることが出来た。これまでの負荷試験が、大量のレチノールエステルおよび脂肪を摂取し、不快な検査であったのに比し、本法は牛乳の飲用が快適であり、レチノールの摂取量が少ないのでそれによる中毒を起こす危険性が少な〈、安全かっ有用性に富む検査法と考えられた。
アポ蛋白 Eの遺伝子型(表現型も同じであるが)による牛乳摂取後のカイロミクロン中性脂肪の増加率には差異は無く、アポ蛋白 Eの多型は脂肪の腸管からの吸収には大きな影響を与えていないと考えられた。レチノールの血中レベルには被検者により約10倍の開きがありその吸収に差があると考えられたが、アポ蛋白 Eの多型との問には一定の関係はみられなかった O
カイロミクロンレムナントの異化速度としての半減期を検討したところ、 ε2/ε3型を有するものは ε3/ε3型、 83/ε4型を有するものに比べ半減期の延長がみられた。これは、アポ蛋白 E2を有するリポ蛋白粒子が受容体に対する結合能が低〈、肝臓に取り込まれるのにより長時間を要するためと考えられる。また、アポ蛋白83/ε4型を有するものには半減期の短いものが多かったが、平均では差がなかった。いずれも例数を増やしての統計学的検討が必要であると考えられた。
牛乳を摂取しても血清中性脂肪値には大きな変化はみられなかったが、摂取されたカイロミクロンレムナントの代謝に牛乳はどのような影響を与えるのであろうか、今‑168

後、純脂肪の摂取を行つてのレチノール負荷試験を行って、牛乳を摂取したときのカイロミクロンレムナントの代謝速度との比較検討を行う必要があると考えられた。カ
イロミクロンレムナントは中性脂肪に富むカイロミクロンの代謝残遺体であると共にHDLで形成されたコレステロールエステルを転送蛋白 CCETP) を介して受け取り、コレステロールに富んだリポ蛋白粒子である。カイロミクロンレムナントの蓄積した状態が E型高脂血症であり、その予後からもカイロミクロンレムナントは強い動脈硬化惹起性があると考えられている。現在、空腹時血清中性脂肪値それ自体は有意の動脈硬化の危険因子とはならないという風に広く受け入れられているが、食事後に出現するカイロミクロンレムナントの代謝を考えると空腹時のデータのみではリスクを論じることは難しいと考えられる。本研究において、個々の例についてカイロミクロン
レムナントの代謝を評価することが出来たが、この意味においてはレムナントの代謝の延長した個体はリスクの大きい群に属すると言うことができる。さらにこのレムナ
ント代謝に及ぼす、牛乳の影響を見ることは大変興味深いと考えられる。

参考文献1) PCR‑RFLP法によるアポ蛋白 E多型の検討.塚本和久ら.動脈硬化 18(11)1012，19902) Kineticsofchy
1omicronremnantc
lear
ancei
nnormalandi
nhyperli
popr
o‑.Cortner，etal.J.
LipidRes.28・195，1987.
teinemicsubjects. JeanA‑169ー表 1 牛乳摂取後の血清中性脂肪値の推移(mg/dl)
症例

アポE

時間。

24

38.4

30.9

79.6

l2134.2

126.8

153.0

3

42.5

29.8

32.4

4

69.6

78.9

34.7

66.8

45.3

56.6

自

75.5

118.2

136.8

7

140.1

165.3

172.1

73.2

64.0

71.2

53.9

36.9

90.9

58

ε2/3

ε3/3

ε3/49

表 2 牛乳摂取後のカイロミクロンレムナント分画のレチノールパルミテート濃度の変化 (μg/dl)

症例

122

4

68

10

12

t
1/2 IN

N

17.
6

2
4.
6

14.
2

6.
3

2.
90.
5
91.21.4

23.
6

1
36.
1

50.
723.
9

17.
90.
3
9NN

3.
45.
92.
80.
9N日.
4
7

アボ E 時間。

ε2/3

3NN

12.
3

2
9.
9

11.
1

7.
4

4.
10.
3
9N

N

5.
3

20.
3

7.
3

4.
92.
70.
3
98N

N

2
7.
7

3
3.
1

12.
7

5.
8

4.
10.
4
0

7目

1.1

13.
8

3
5.
1

18.
3

12.
78.
70.
52N

N

7.
738.
38.
65.
14.
10.
32N目

12.
025.
05.
64.
5N0.
324589ε3/3

ε3/4

自:検出感度以下‑170‑牛乳摂取後のカイロミクロンレムナント分画のレチノールパルミテート濃度の変化
40μ91ds

30

伊一‑‑‑0.3/ε4型

任 官.3/ε3型。
一‑‑‑0ε2/ε3型

2010246810

12(時間)~171~