共同研究
立 S21-16

軟Ｘ線顕微鏡による染色体の観察
Imaging of chromosomes at nano-meter scale resolution using soft X-ray
microscopy
1

山本章嗣，2 宇野優衣， 2 藤井宏樹, 3 大東琢治, 4 竹本邦子,2 難波秀利, 4 木原 裕
A. Yamamoto1, Y. Uno2, H. Fujii2, T. Ohigashi3, K. Takemoto4, H. Namba2 and H. Kihara4
1

長浜バイオ大学, 2 立命館大学, 3 立命館大学総合理工学研究機構, 4 関西医科大学
1Nagahama Institute of Bio-Science and Technology, 2Ritsumeikan University,
3
Ritsumeikan University Research Organization of Science and Engineering, 4Kansai Medical University
今回，クロマチン凝縮過程を解析することを目的として，細胞分裂前期の NIH3T3 細胞を X 線顕微鏡で観察した。その結果，細胞分裂前期の核内に約 500nm の太さの染色体を確認できた。
To observe the condensation process, we examined chromosomes at the prophase of mouse fibroblast cell line
NIH3T3 under a soft X-ray

microscope. Chromosomes in the nucleus are clearly observed by X-ray microscope.

Minimum thickness of the chromosomes is ~500 nm. It is difficult to observe chromosomes less than 500 nm inthickness under the soft X-ray microscope.
背景と研究目的：我々は，染色体の凝縮・分配強い固定を行うことによって染色体構造の保存の過程を，X 線顕微鏡を用い，50 nm の分解能で性が高めていることから，無染色の染色体の観描き出すことを目的としている。

察で確認された 150 nm から 500 nm の繊維状

平成 18 年度および 20 年度のナノテクノロジの構造は，凝集途中のクロマチンではなく，試ー総合支援プロジェクトの支援を受け，マウス料調整中に染色体が解れ出現したクロマチンと胎児繊維芽細胞由来の株化培養細胞であるいう可能性もでてきた。

NIH3T3 細胞の染色体の微細構造を軟 X 線顕微鏡で観察してきた。
平成 18 年度には，染色体が形成される分裂前今回，クロマチン凝縮過程を解析することを目的として，細胞分裂前期の NIH3T3 細胞を X線顕微鏡で観察した。

中期の細胞において, 太さ 750 nm の染色体と，染色体よりさらに細いクロマチン繊維凝集体と実験：NIH3T3 細胞(マウス線維芽細胞由来株化考えられる太さ 150 nm から 500 nm の繊維状細胞)を，DMEM 培地を用い，37℃，CO2 濃度 5%の構造を確認した[1]。

で培養した。X 線顕微鏡用試料セルのポリイミド薄平成 20 年には，度染色体のコントラスト増強

膜上で NIH3T3 細胞を１日培養した。細胞を 2%パを 目 指 し ， ア ン モ ニ ア 銀 反 応 (Ammoniacal

ラフォルムアルデヒドを含む固定液で 10 分固定した

Silver Reaction, ASR) [2]を用いた染色体の銀後，0.1 M リン酸緩衝液 pH7.4（PB）で洗浄した。

染色でも，前中期の細胞において，太さ 700 nm

0.1% Triton X-100 で 30 分間処理をした後，光学顕の染色体を明確に確認することができた。しか微鏡で染色体を観察するため酢酸オルセイン染し，クロマチンに対応する 500nm 以下の繊維構色を行った。オルセイン染料は軽元素からなっ造を確認することはできなかった[1]。ており，X 線観察ではコントラスト増強効果は

銀染色では，グルタールアルデヒドを用いたない。試料を風乾した後，光学顕微鏡で有糸分裂細胞期の前期の細胞を選び，X 線顕微鏡で観キーワード察を行った。比較のため，前中期の細胞の観察

軟 X 線顕微鏡，NIH3T3 細胞，染色体，クロマも行った。X 線顕微鏡による観察は，立命館大

チン，細胞分裂前期

学 SR センター軟 X 線顕微鏡ビームライン（BL12）で行った。観察波長は，2.3nm を用い(a)た。
結果および考察： Fig.1 に，前中期の NIH3T3細胞の光学顕微鏡写真(a)と X 線顕微鏡写真(b)(b)

を示す。光学顕微鏡で確認できる全ての染色体Fig.1 Light and X-ray
microscopic images ofa NIH3T3 cell inprometaphase.
(a) Light microscopic
image and (b) X-ray
microscopic image at
2.3 nm. Exposure timewas 60 s. An arrowhead
indicates chromosome of
490 nm in thickness.

を X 線顕微鏡でも確認できる。今回も，染色体700 nm 以下のクロマチン凝集体と思われる構造が確認できた。
Fig.2 に，前期の NIH3T3 細胞の光学顕微鏡写
真(a)と X 線顕微鏡写真(b)を示す。細胞中に核が(a-1)

(b-1)

(a-2)

(b-2)

はっきりと確認でき，核内に染色体が見られる。
核の中には，細い染色体もみられ，その厚みは最小のもので約 500nm であった。500nm 以下の染色体を確認することは困難であった。
今後の課題：核内のクロマチン凝集体を X 線吸収像で捉えることができたが，500nm 以下の凝集中の染色体を確認することは困難であった。
光軸方向にクロマチン凝集体が重なり合っているのが原因と考えられる。この問題を解決するため試料調整法の検討を行う必要がある。また，クロマチンのコントラストも上げるため，細胞内のタンパク質を減らすことが有効であることから，この方法も検討したい。ただし，この時の染色質（体）の構造変化の影響についても調べる必要があるので，電子顕微鏡観察なども利用していく予定である。
参考文献
1. Yamamoto A, Takemoto K, Komura I, Namba H,Kihara H, Imaging of Chromosomes atNanometer-Scale Resolution Using Soft X-Ray
Microscope at Ritsumeikan University SR
Center Journal of Physics: Conference Series
186 (2009) 012098
2. O. R. Vidal, T. Aya and A. A. Sandberg, Stain
Technol. 46 (1971) 89

10µm
Fig.2 Light and X-ray microscopic images of a
NIH3T3 cell in proaphase.
(a) Light
microscopic image and (b) X-ray microscopic
image at 2.3 nm. Exposure time was 100 s.