「様式３－A」

課題番号 １３

Roles of vasohibins - CCN2/CTGF interactions inangiogenesis and cartilage/bone-related tumors［１］組織代表者：村瀬 友里香（岡山大学大学院医歯薬学総合研究科）
対応者：佐藤 靖史（東北大学加齢医学研究所）
分担者：滝川 正春（岡山大学大学院医歯薬学総合研究科/歯学部先端領域研究センター）
青山 絵理子（岡山大学大学院医歯薬学総合研究科/歯学部先端領域研究センター）
Tarek Abd El Kader（岡山大学歯学部先端領域研究センター）
久保田 聡（岡山大学大学院医歯薬学総合研究科/）
佐々木 朗（岡山大学大学院医歯薬学総合研究科/）
研究費：物件費２５万円［２］研究経過血管新生は固形腫瘍の増殖や内軟骨性骨化などの種々の病的・生理的過程で重要な役割を果たしており、局所の血管新生因子とその阻害因子のバランスにより絶妙に調節されていると考えられている。佐藤教授は vasohibin-1 (VASH1) を発見し、血管内皮細胞(ECs)により産生される血管新生阻害因子であることを報告し、続いて VASH1 のホモローグとして vasohibin-2 (VASH2) を発見した。マウスの血管新生モデルを用いた研究から、現在、VASH1 は血管新生の起こっている先端の ECs から産生され血管新生を終結させ、一方 VASH2 は血管内皮細胞以外の細胞から産生される血管新生因子であると考えられている。
内軟骨性骨化の過程では､軟骨細胞は増殖、分化し、成熟して肥大軟骨細胞になり、この肥大軟骨細胞層に、血管が侵入して無血管組織である軟骨が血管に富む骨に置換する。本申請の指導教員である、滝川は肥大軟骨細胞に高発現する hcs24 (hypertrophicchondrocyte specific gene 24)をクローニングし、この遺伝子が活発に増殖・遊走する ECs にも発現することを報告した。
さらにその遺伝子産物 Hcs24(結合組織成長因子:CTGF と同じで最近 CCN2 と名前が統一された)が、ECs, 軟骨細胞、骨芽細胞の増殖、分化を促進し、in vivo で血管新生を促進することを報告した。また、CCN2 が腫瘍血管新生や浸潤にも関与することを明らかにした。 さらに、CCN2 が破骨細胞形成を促進し、乳がんのような癌の骨吸収性骨転移にも関与することを明らかにした。CCN2はその 4 つのドメインを介して、種々の成長因子や､細胞外マトリックス、細胞膜受容体と結合して、細胞外微小環境を飛び交うシグナル分子のシグナル伝達系を指揮する分子ではないかと考えられ、その多機能生は、細胞種や同種細胞でも分化段階の違いによる微小環境の違いによってもたらされるものと考えられる。さらに、悪性腫瘍はその指揮機能の乱れによってもたらされる可能性が示唆される。
そこで、本研究では、VASHs と CCN2 相互の遺伝子発現制御とその腫瘍増殖や内軟骨性骨化での意義、骨、軟骨およびそれらの腫瘍での VASHs とCCN2 の共発現と共局在、CCN2 と VASHs の血管新生における共同作用、CCN2 と VASHs の物理的相互作用の有無を調べ、骨・軟骨形成とそれらの腫瘍化におけるCCN2 とVASHs の相互作用の役割とその分子機構を明らかにすることを目的として研究を行った。

なお、本研究遂行のため頻回（H28 年 2 月 10, 15日、3 月 24 日、11 月 18，21，30，12 月 2，9，27

日、H29 年 1 月 6，12、19, 25, 30 日、2 月 1，6，7，10，13，14 日）にわたりメールでの研究打ち合わせを行った。
［３］成果（３－１）研究成果
昨年度、血管新生のネガティブフィードバックを司る VASH1 mRNA が、軟骨前駆細胞株 ATDC5を用いた軟骨細胞分化誘導培養系において CCN2mRNA と同様の経日的発現パターンで分化の進行に伴って上昇することを報告した。そこで本研究では、軟骨細胞における VASH1 と CCN2 との相互作用を解析した。
ヒト軟骨細胞様細胞株 HCS-2/8 細胞においてCCN2 の発現を siRNA でノックダウンすると、VASH1 mRNA の発現が低下した。ところが、同細胞にヒトVASH1 発現vector をトランスフェクトしVASH1 を過剰発現させても、CCN2 mRNA の発現に大きな変動は認められなかった。一方で興味深いことに、同細胞で VASH1 を過剰発現させると、活性酸素分解酵素 Superoxide dismutase 2 (SOD2)mRNA の発現が増加した。
以上の結果は、軟骨細胞において VASH1 は、CCN2 の下流に位置し、SOD2 の上流に位置することを示している。
血管内皮細胞において VASH1 は、SOD2 を誘導し ROS のレベルを低下させることが知られている。内軟骨性骨形成過程においては、
NAPDH オキシダーゼによる ROS の産生が軟骨細胞分化を促進し、肥大化、アポトーシスを誘導するという報告がある。そのため、肥大軟骨細胞において SOD2 は、上流の CCN2 による VASH1 の発現亢進を介して誘導され、ROS のレベルの上昇を抑制し、軟骨細胞分化の最終段階である細胞死を分化終末期まで防いでいる可能性が推測される。また以前に我々は、軟骨細胞分化終末期には CCN2 mRNA発現が低下することを明らかにしている。したがって、同時期には下流の VASH1-SOD2 mRNA 発現も低下し、その結果 ROS のレベルが上昇して、肥大軟骨細胞がアポトーシス等による細胞死へと導かれることが示唆される。
（３－２）波及効果と発展性など
Vasohibins と軟骨代謝の関連については過去に全く報告がなく、また、CCN タンパク質による VASH遺伝子発現制御に関する報告も過去に全く見られない。即ち、東北大の佐藤研究室と滝川研究室とが共同研究することにより、誰も予想もしなかった
Vasohibins とCCN タンパク質の連関という新知見が得られた。この知見は Vashohibin 研究の研究領域を大きく拡げることに繋がると共に、CCN タンパク研究者や軟骨代謝研究者にも Vasohibins に注目する機会を与え、軟骨代謝におけるCCN2-Vasohibin 連関の役割という新しい研究領域の開拓に結びつき、今後の発展が期待される。
［４］成果資料
本研究は全くの新研究領域の研究のため、未だ端緒についたばかりと言える状況で､論文を発表するまでには未だ至っていない。関連論文としては以下の編著本と原著論文がある。なお、学会発表はすでに行っている。
1) Takigawa M. (ed): CCN Proteins: Methods andProtocols, Methods in Molecular Biology vol. 1489,
2017.
全 46 章中下記 3 章を含め 23 章を執筆
①Takigawa M. (ed)：The CCN Proteins: AnOverview. Methods Mol Biol. 2017;1489:1-8.
②Shimo T, Takigawa M.：Cell Biological Assaysfor Measuring Angiogenic Activities of CCNProteins.
Methods Mol Biol. 2017;1489:239-249.
③Shimo T, Yoshioka N, Takigawa M, Sasaki A.：
Analysis of Pathological Activities of CCN
Proteins in Bone Metastasis.
Methods Mol Biol. 2017;1489:505-512.
（２）Murase Y, Hattori T, Aoyama E, Nishida T,
Maeda-Uematsu A, Kawaki H, Lyons KM, Sasaki
A, Takigawa M, Kubota S.: Role of CCN2 in
Amino Acid Metabolism of Chondrocytes. J Cell
Biochem. 117(4):927-37, 2016.
（３）Nishida T, Kubota S, Aoyama E, Yamanaka
N, Lyons KM, Takigawa M.：Low-intensity pulsed
ultrasound (LIPUS) treatment of cultured
chondrocytes stimulates production of CCN
family protein 2 (CCN2), a protein involved in theregeneration of articular cartilage: Mechanism
underlying this stimulation.
Osteoarthritis
Cartilage. S1063-4584(16)30311-9, 2016.
＜学会発表＞
１）村瀬友里香、青山絵理子、Kattab Hany, Tarek
Abd Elkader、鈴木康弘、佐々木朗、久保田聡、佐藤靖史、滝川正春：内軟骨性骨形成過程におけるvasohibin と CCN2 の相互作用。 第 12 回
Vasohibin 研究会、蔵王、2017.2.4-5.
２）村瀬友里香、滝川正春、佐々木 朗：血管新生因子CCN2と血管新生抑制因子VASH1の内軟骨性骨化における役割。第 71 回日本口腔科学会、松山、
2017.4.26-28 (予定)