30

飼料研究報告 Vol.32 (2007)5

飼料中のカルベンダジム，チオファネート，チオファネートメチル
及びベノミルの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法
堀米 明日香 *1，野崎 友春 *2

Determination of Carbendazim, Thiophanate, Thiophanate-methyl and Benomyl in Feed by LC-MS
Asuka HORIGOME *1 and Tomoharu NOZAKI*2( *1 I.A.A. Fertilizer and Feed Inspection Services, Headquarters(Now the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of Japan),*2

Food and Agricultural Materials Inspection Center (I.A.A.),
Fertilizer and Feed Inspection Department)

An analytical method to determine carbendazim, benomyl and thiophanate-methyl in feed byliquidchromatography-mass

spectrometry(LC-MS)wasdeveloped.

Benomylandthiophanate-methyl are transformed to carbendazim during analytical procedure and carbendazim,
benomyl and thiophanate-methyl are determined as total quantity of carbendazim.

Thiophanate

in feed was also transformed to ethyl-2-benzimidazole carbamate (EBC) and could be detected inthis method.
A spike test resulted in the mean recovery of carbendazim, benomyl, thiophanate-methyl andthiophanate of 94.6~98.3%, 101.4~105.8%, 82.1~84.4% and 57.9~64.2%, respectively.
A collaborative study was conducted with corn spiked with thiophanate-methyl andthiophanate at 1.3 mg/kg respectively, and with timothy spiked with thiophanate-methyl andthiophanate at 20 mg/kg respectively.

For corn, the mean recovery of thiophanate-methyl was

87.8%, and the repeatability and reproducibility as the relative standard deviation (RSDr and
RSDR) were 3.2% and 15% respectively, and the mean recovery of thiophanate was 53.5%. For
timothy, these values of thiophanate-methyl were 83.1%, 4.6% and 19% respectively, and those of
thiophanate were 41.6%, 4.3% and 26% respectively.
Key words: カ ル ベ ン ダ ジ ム carbendazim ; ベ ノ ミ ル benomyl ; チ オ フ ァ ネ ー ト
thiophanate ; チオファネートメチル thiophanate-methyl ; 高速液体クロマトグラフ質量分析 計 liquid chromatograph-mass spectrometer (LC-MS) ; 飼料 feed ; 共同試験
collaborative study
1緒言

ベノミルはデュポン社が開発した浸透性殺菌剤で，菌核病，灰色かび病，フザリウム病害などに対して効果がある．チオファネートメチルは日本曹達が開発した殺菌剤で灰色かび病，菌核病，褐
斑病，炭そ病，青かび病，緑かび病などに効果がある．カルベンダジムはベノミル及びチオファネ
ートメチルの代謝分解物であり，日本では 1999 年に農薬登録が失効している．また，チオファネー*1

独立行政法人肥飼料検査所本部，現*2（独）農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部

農林水産省消費・安全局畜水産安全管理課

飼料中のカルベンダジム，チオファネート，チオファネートメチル及びベノミルの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

31

ト（チオファネートエチル）は子のう菌，不完全菌などに効果があるが，現在日本での登録はされていない．
平成 18 年 5 月 29 日付けで飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令（昭和 51 年農林省令第35 号）の一部が改正され，これらの農薬については，カルベンダジム，ベノミルをカルベンダジムに換算したもの，チオファネートをカルベンダジムに換算したもの及びチオファネートメチルをカ
ルベンダジムに換算したもの，の総和として基準値が定められた．
本法の検討に先立ち，（財）日本食品分析センターが検討した液体クロマトグラフ質量分析計によるチオファネートメチル，カルベンダジム及びベノミルの残留分析法 1)（以下「センター法」）に基
づき，最も回収が困難なチオファネートメチルについて共同試験を行った．しかしその結果，必要十分な回収率が得られなかったことから，厚生労働省の分析法 2)を参考に標準液について次の 2 点について追加検討した．
（１）標準液も閉環反応に供すること（２）チオファネートメチルの測定にはチオファネートメチル標準液を使用すること
試料の定量操作についてはセンター法をそのまま踏襲した．また，センター法では分析対象となっていないチオファネートについても，省令中の基準値に含まれているため，同一操作でのチオフ
ァネートの添加回収試験及び共同試験を行い，本法でチオファネートの定量が可能かあわせて検討した．
なお，本法では操作中に，チオファネートメチル及びベノミルはカルベンダジムに変換されるため，カルベンダジム，チオファネートメチル及びベノミルの三成分をカルベンダジムとして LC-MS
で定量した．チオファネートは操作中にエチル-2-ベンゾイミダゾールカルバマート（以下「EBC」）に変換されるため EBC として定量し，厚生労働省の分析法と同様に EBC 量に係数 0.52 を乗じてカルベンダジム量に換算した．

H
N
N

NHCSNHCO C H
2 2

NHCO2CH3(a) Carbendazim(C9H9N3O2:191.2)

NHCSNHCO2CH3

5

NHCSNHCO C H522(b) Thiophanate(C14H18N4O4S2:370.5)

CONH(CH2)3CH3
N

NHCSNHCO2CH3(c) Thiophanate-methyl(C12H14N4O4S2:342.4)
Fig. 1N

NHCO2CH3(d) Benomyl(C14H18N4O3:290.3)

Structure of carbendazim, thiophanate-ethyl, thiophanate-methyl and benomyl

32

飼料研究報告 Vol.32 (2007)

2
2.1

試

分析方法

料

市販の飼料原料（とうもろこし）及び乾牧草（チモシー）をそれぞれ 1 mm の網ふるいを通過するまで粉砕し，供試試料とした．
2.2
1)

試

薬

カルベンダジム標準液
カルベンダジム〔C9H9N3O2〕（Dr. Ehrenstorfer 製，純度 99.0%）10 mg を正確に量って 100 mLの全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線までメタノールを加えてカルベ
ンダジム標準原液を調製した（この液 1 mL は，カルベンダジムとして 0.1 mg を含有する．）．
使用に際して，この原液の一定量をメタノールで正確に希釈し，1 mL 中に 20 µg を含有する
カルベンダジム標準液を調製した．

2)

チオファネートメチル標準液
チオファネートメチル〔C12H14N4O4S2〕（和光純薬工業製，純度 99.9%）10 mg を正確に量って 100 mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線までメタノールを加えてチオファネートメチル標準原液を調製した（この液 1 mL は，チオファネートメチルとして 0.1 mg を含有する．）．
使用に際して，この原液の一定量をメタノールで正確に希釈し，1 mL 中に 20 µg を含有する
チオファネートメチル標準液を調製した．

3)

チオファネート標準液
チオファネート〔C14H18N4O4S2〕（Dr. Ehrenstorfer 製，純度 99.0%）10 mg を正確に量って 100
mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線までメタノールを加えてチオファネート標準原液を調製した（この液 1 mL は，チオファネートとして 0.1 mg を含有する．）．
使用に際して，この原液の一定量をメタノールで正確に希釈し，1 mL 中に 20 µg を含有する
チオファネート標準液を調製した．

4)

ベノミル〔C14H18N4O3〕標準品
Dr. Ehrenstorfer 製，純度 97.5%のものを用いた．

5)

メタノール，ジクロロメタン，ヘキサン，酢酸エチル及び硫酸ナトリウム（無水）は残留農
薬分析用試薬を用いた．特記している以外の試薬については特級を用いた．

2.3

装置及び器具1)

液体クロマトグラフ質量分析計：Agilent Technologies 製

2)

振とう機：タイテック製

3)

エバポレーター：BÜCHI 製

4)

高速遠心分離機：久保田商事製

5)

ミニカラム：Varian 製 Bond Elut Jr. PSA

2.4
1)

1100 Series

レシプロシェーカーSR-2W
R-200
KM-15200

定量方法
抽

出

分析試料 10.0 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ，L-アスコルビン酸 0.4 g 及び水15 mL（乾牧草は 30 mL）を加え，30 分間放置した後，メタノール 100 mL（乾牧草は 120 mL）
を加え，30 分間振り混ぜて抽出した．300 mL のトールビーカーをブフナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種 B）で吸引ろ過した後，先の三角フラスコ及び残さをメタノール 50 mL で

飼料中のカルベンダジム，チオファネート，チオファネートメチル及びベノミルの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

33

洗浄し，洗液をろ液に合わせた．ろ液を 200 mL の全量フラスコに入れ，更に全量フラスコの標線までメタノールを加えて液液分配Ⅰに供する試料溶液とした．
2)

液液分配Ⅰ
試料溶液 10 mL（乾牧草にあっては試料溶液 20 mL）を正確に 500 mL の分液漏斗 A に入れ，
L-アスコルビン酸 3 g，塩化ナトリウム溶液（10 w/v%）150 mL 及びヘキサン 100 mL を加え，
5 分間振り混ぜた後静置した．
水層（下層）を 200 mL のトールビーカーに入れ，水酸化ナトリウム溶液（4 mol/L 及び 0.4
mol/L）を用いて pH を 6.7~7.1 に調整した．
pH 調整後の水層を 500 mL の分液漏斗 B に移し，ジクロロメタン 100 mL を加え，5 分間振り混ぜた後静置し，ジクロロメタン層（下層）を 300 mL の共栓三角フラスコに入れた．分液
漏斗 B にジクロロメタン 100 mL を加え，5 分間振り混ぜた後静置し，ジクロロメタン層を先の三角フラスコに合わせた．ジクロロメタン層に適量の硫酸ナトリウム（無水）を加えて脱水
し，300 mL のなす形フラスコにろ紙（5 種 B）でろ過した後，先の三角フラスコを少量のジク
ロロメタンで洗浄し，洗液をろ液に合わせた．
ろ液に酢酸 0.5 mL を加え，40°C 以下の水浴上で約 0.5 mL まで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．メタノール 2 mL を加えて残留物を溶かし，閉環反応に供する試料溶液とし
た．

3)

閉環反応
試料溶液に酢酸（1+1）10 mL，酢酸銅 0.2 g 及び沸石 2~3 個を加え，なす形フラスコに還流冷却器を接続した後，120°C の油浴上で 30 分間加熱した．放冷後，塩酸（1 mol/L）10 mL を還流冷却器の上部から加えて管壁を洗浄し，試料溶液に合わせ，液液分配Ⅱに供する試料溶液と
した．

4)

液液分配Ⅱ
試料溶液を 100 mL の分液漏斗 C に移し，試料溶液の入っていたなす形フラスコを塩酸（1mol/L）20 mL で洗浄し，洗液を試料溶液に合わせた．更に塩化ナトリウム 5 g 及びヘキサン 20
mL を加え，5 分間振り混ぜた後静置し，水層（下層）を 100 mL の分液漏斗 D に移した．
分液漏斗 D にヘキサン 20 mL を加え，5 分間振り混ぜた後静置した．水層を 100 mL のトー
ルビーカーに入れ，水酸化ナトリウム溶液（10 mol/L 及び 1 mol/L）を用いて pH を 6.8~6.9 に調整した後，300 mL の分液漏斗 E に移した．
分液漏斗 E に酢酸エチル 50 mL を加え，5 分間振り混ぜた後静置し，水層（下層）を 300 mLの分液漏斗 F に入れ，酢酸エチル層（上層）を 200 mL の三角フラスコに入れた．分液漏斗 Fに酢酸エチル 50 mL を加え，5 分間振り混ぜた後静置し，水層を捨てた．酢酸エチル層を先の三角フラスコに合わせ，適量の硫酸ナトリウム（無水）で脱水し，200 mL のなす形フラスコにろ紙（5 種 B）でろ過した．
ろ液を 40°C 以下の水浴上で約 1 mL まで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．酢酸
エチル－メタノール（19+1）5 mL を加えて残留物を溶かし，カラム処理に供する試料溶液とし
た．

5)

カラム処理
ミニカラムを注射筒に連結し，酢酸エチル 5 mL で洗浄した．50 mL のなす形フラスコをミ
ニカラムの下に置き，試料溶液を注射筒に入れ，液面がカラムの上端に達するまで流出させた．

34

飼料研究報告 Vol.32 (2007)

試料溶液の入っていたなす形フラスコを酢酸エチル－メタノール（19+1）5 mL ずつで 2 回洗浄し，洗液を順次ミニカラムに加え，液面がカラムの上端に達するまで流出させた．更に酢酸エ
チル－メタノール（19+1）10 mL をミニカラムに加えて，カルベンダジム及び EBC を同様に溶出させた．（この時点までに，チオファネートメチル及びベノミルはカルベンダジムに，チオ
ファネートは EBC に変換されている．）
溶出液を 40°C 以下の水浴上で約 1 mL まで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．水－メタノール（1+1）2 mL を正確に加えて残留物を溶かし，5,000×g で 5 分間遠心分離し，上澄み液を液体クロマトグラフ質量分析に供する試料溶液とした．
6)

標準液の閉環反応
カルベンダジム標準液又はチオファネートメチル標準液 1 mL を 200 mL なす形フラスコに正確に入れ閉環反応に供する標準液とした．更に，今回チオファネートについても同一操作での測定が可能か検討するため，チオファネート標準液 1 mL を正確に加え，同時に閉環反応に供した．
閉環反応後，試料と同様に液液分配 II 及びミニカラムから溶出させ，減圧濃縮，乾固したの
ち水－メタノール（1+1）20 mL を正確に加えて溶解した．この液の一定量を水－メタノール（1+1）で正確に希釈し，1 mL 中にカルベンダジム又はチオファネートメチル及びチオファネートとして各々5 ng，10 ng，20 ng，50 ng，100 ng 及び 200 ng 相当量を含有する各標準液を調製し，5,000×g で 5 分間遠心分離し，上澄み液を液体クロマトグラフ質量分析計による測定に供する標準液とした．

7)

液体クロマトグラフ質量分析計による測定
試料溶液，各標準液各 2 µL を液体クロマトグラフ質量分析計に注入し，Table 1 の測定条件に従い選択イオン検出（以下「SIM」）クロマトグラムを得た．

ColumnMobile phase
Flow rate
Column temp.
Ionization
Mode
Fragmentor
Nebulizer
Drying gas
Capillary voltage
Monitor ion

8)計

Table 1
Operating conditions for LC-MS
Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1 mm i.d.×150 mm, 3.5 µm)
A: 2 mmol/L Ammonium acetate solution B: Methanol
B(%) 25%→15 min→60%→0.1 min→90%(7 min)→0.1 min→25%(8 min)
0.2 mL/min
40°C
Electrospray ionization (ESI)
Positive
100 V
N2 (50 psi)
N2 (10 L/min, 350°C)
4,000 Vm/z 192 (Carbendazim), 206 (EBC)

算

得られた選択イオン検出クロマトグラムからピーク面積を求めて検量線を作成し，試料中のカルベンダジム量（チオファネートメチル及びベノミルをカルベンダジムに変換したものを含
む．）及び EBC 量（チオファネートを EBC に変換したもの）を算出した．なお，カルベンダ

飼料中のカルベンダジム，チオファネート，チオファネートメチル及びベノミルの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

35

ジムとしての合量を求める際には，EBC 量に係数 0.52 を乗じてカルベンダジム量へ換算した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．
Sample 10 g
add 0.4 g of ascorbic acid and 15 mL (30 mL for grass hay) of water
stand for 30 min
add 100 mL (120 mL for grass hay) of methanol and shake for 30 min
filtrate through the suction filter (No.5B)
wash with methanol
fill up to 200 mL with methanol (grass hay; then dilute with methanol 20 times)
500 mL separating funnel A
10 mL of sample solution
add 3 g of ascorbic acid, 150 mL of 10% NaCl solution and 100 mL of hexane
shake for 5 min
Upper (hexane) layer (waste)

Lower (water) layer
adjust pH to 6.7~7.1 with 4 mol/L NaOH solution(approximately 4 mL needed)
500 mL separating funnel B
add 100 mL of dichloromethane and shake for 5 min

Upper (water) layer
add 100 mL of dichloromethane

Lower (dichloromethane) layer

shake for 5 min
Upper layer (waste)

Lower layer
dehydrate with Na2SO4 anhydrateStandard solution

filtrate through filter paper (No.5B)

1 mL of 20 µg/mL carbendazim solution or
20 µg/mL thiophanate-methyl solution
1 mL of 20 µg/mL thiophanate solution

add 0.5 mL of acetic acidevaporate to dryness under 40°C
add 2 mL of methanol

add 10 mL of acetic acid-water (1+1),
0.2g of copper acetate and boiling stones
Ring closure reaction
reflux in oil bath (120°C) for 30 min
wash with 30 mL of 1 mol/L hydrochloric acid
100 mL separating funnel C(To be continued to next page.)

36

飼料研究報告 Vol.32 (2007)

add 5 g of NaCl and 20 mL of hexane and shake for 5min
Upper (hexane) layer (waste)

Lower (water) layer
100 mL separating funnel D
add 20 mL of hexane and shake for 5min

Upper layer (waste)

Lower layer
adjust pH to 6.8~6.9 with 10 mol/L NaOH solution(approximately 14 mL needed)
300 mL separating funnel E
add 50 mL of ethyl acetate and shake for 5 min

Upper (ethyl acetate) layer

Lower (water) layer
300 mL separating funnel F
add 50 mL of ethyl acetate and shake for 5 min

Upper layer

Lower layer (waste)

dehydrate with Na2SO4 anhydrate
filtrate through filter paper (No.5B)
evaporate to dryness under 40°C
add 5 mL of ethyl acetate-methanol (19+1)
Bond Elut Jr. PSA cartridge (prewash with 5mL of ethyl acetate)
wash with 5mL of ethyl acetate-methanol (19+1) (twice)elute with 10mL of acetate-methanol (19+1)
evaporate to dryness under 40°C
add 2 mL of methanol-water (1+1) (standard solution; then dilute stepwisely)
centrifuge (5,000×g , 5min)
LC-MS
Scheme 1

Analytical procedure for carbendazim, benomyl, thiophanate and thiophanate-methyl
33.1

結果及び考察標準液の操作について
本法では閉環反応における回収率が低いことが知られており，厚生労働省の分析法 2)によれば

閉環反応（その後の転溶操作も含む）における回収率が，カルベンダジムでは約 73%，チオファ
ネートメチルでは約 60%である．そのため，厚生労働省の分析法では標準液も閉環反応とその後の転溶操作を試料溶液と同様に行うこととしている．
厚生労働省の分析法とセンター法では用いる溶媒などに若干違いがあるため，センター法において閉環反応後の操作での回収率を確認した．閉環反応のみに供した標準液を 100%として，そ飼料中のカルベンダジム，チオファネート，チオファネートメチル及びベノミルの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

37の後の操作での回収率を比較したところ，Table2 のとおり閉環反応後の操作で回収率が 76％程度まで下がることがわかったので，標準液についても閉環反応以降，試料溶液と同様の操作を行うこととした．
Table 2
Recovery after each procedure
Procedure
Carbendazim

3.2

EBC

ring closure reaction

100%

100%

ring closure reaction and washing with hexane

96%

100%

ring closure reaction, washing with hexaneand ethyl acetate extraction

83%

84%

ring closure reaction, washing with hexane, ethyl acetate
extraction and PSA cartridge

76%

76%

チオファネートメチル標準液の使用について
本法では，チオファネートメチル及びベノミルは分析操作中にカルベンダジムに変換されるため，カルベンダジム，チオファネートメチル及びベノミルの三成分をカルベンダジムとして定量する．そのため，センター法では上記三成分の測定にはカルベンダジム標準液を希釈して検量線を作成することとなっている．
しかし，（財）日本食品分析センターの検討 1) において，閉環反応でのチオファネートメチルからカルベンダジムへの反応率は 80%程度であることがわかっている．また，厚生労働省の分析法においても，チオファネートメチルは閉環反応の回収率が特に低いので，チオファネートメチルを定量する場合はチオファネートメチル標準液を閉環反応に供し，生成したカルベンダジムを標準液として用いることとなっている．以上のことから，本法においても，チオファネートメチルを定量する場合にはチオファネートメチル標準品を閉環反応に供し，生成したカルベンダジムを標準液とするべきと考えられた．
なお，ベノミルについては（財）日本食品分析センターの検討の中で，ベノミルの添加回収試
験（ベノミルを添加しカルベンダジム標準液を用いて検量線を引くセンター法で実施）の結果は平均回収率 93%で，カルベンダジムの添加回収試験の平均回収率 93%と同等であった．このことから，ベノミルからカルベンダジムへの変換はほぼ 100%行われていると考えられ，ベノミルを定量する際にはカルベンダジムの標準品を用いて問題ないと考えられる．
以上のことから，厚生労働省の分析法と同様に，カルベンダジム及びベノミルを定量する場合
はカルベンダジム標準液を用い，チオファネートメチルを定量する場合にはチオファネートメチ
ル標準液を閉環反応に供し，生成したカルベンダジムを標準液として用いるべきと考えられた．
よって，本法を用いる時には，農薬の使用状況からカルベンダジム及びベノミルの残留が考えられる場合はカルベンダジム標準液を用い，チオファネートメチルの残留が考えられる場合にはチオファネートメチル標準液を用いることとした．
また，チオファネートについては，閉環反応により EBC に変換されるため，チオファネート標
準液を閉環反応に供し，生成した EBC を標準液として用いることとした．
3.3

検量線の作成カルベンダジム標準液又はチオファネートメチル標準液及びチオファネート標準液 1 mL を試38

飼料研究報告 Vol.32 (2007)

料と同様に閉環反応，液液分配 II 及びミニカラムの操作を行った．ミニカラムから溶出後，減圧
濃縮，乾固したのち水－メタノール（1+1）20 mL を正確に加えて溶解した．さらに水－メタノー
ル（1+1）で希釈し，1 mL 中にカルベンダジム又はチオファネートメチル及びチオファネートとしてそれぞれ 5，10，20，50，100，200 ng 相当量を含有する標準液を作成した．各 2 µL を液体
クロマトグラフ質量分析計に注入し得られたクロマトグラムのピーク面積から検量線を作成した．
その結果いずれの検量線とも 5~200 ng 相当量の範囲で直線性を示した．
3.4

妨害物質の検討（財）日本食品分析センターの検討の中で，飼料 13 種について定量を妨害するピークが検出されないことが確認されている．試料の定量操作はセンター法から変更がないことから，確認は省
略した．
3.5

添加回収試験
とうもろこしにカルベンダジムとして 0.70 mg/kg，乾牧草（チモシー）にカルベンダジムとして 10 mg/kg 相当量を添加した試料を用いて回収率及び分析精度を検討した．その結果，Table 3のとおり平均回収率 94.6~98.3%，繰返し精度は相対標準偏差（RSD）として 6.8%以下であった．
Table 3

Spike test of carbendazim(%)

Spiked levelCorn(mg/kg)94.6 a) (6.8) b)
---

0.70
10

Timothy--a)98.3 (0.75)b)a) Mean recovery (n=3)b) Relative standard deviation (RSD)
更に，とうもろこしにベノミルとして 1.0 mg/kg，チモシーにベノミルとして 15 mg/kg 相当量を添加した試料を用いて回収率及び分析精度を検討した．その結果，Table 4 のとおり平均回収率
101.4~105.8%，繰返し精度は RSD として 5.0%以下であった．
Table 4

Spike test of benomyl(%)

Spiked level(mg/kg)
1.0
15

Corn
101.4 a) (3.2) b)---

Timothy--a)105.8 (5.0) b)a) Mean recovery (n=3)b) Relative standard deviation (RSD)
更に，とうもろこしにチオファネートメチルとして 0.70 mg/kg 及びチモシーに 10 mg/kg を添加した試料を用いて回収率及び分析精度を検討した．その結果，Table 5 のとおり平均回収率
82.1~84.4%，繰返し精度は RSD として 9.5%以下であった．
また，チオファネートについても，チオファネートメチルの添加回収試験と同時にチオファネ

飼料中のカルベンダジム，チオファネート，チオファネートメチル及びベノミルの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

39

ートとして 0.70 mg/kg 及びチモシーに 10 mg/kg を添加した試料を用いて回収率及び分析精度を検討した．その結果，Table 6 のとおり平均回収率 57.9~64.2%で，定量法の確立に十分な回収率が得られなかった．なお，繰返し精度は RSD として 8.1%以下であった．
なお，添加回収試験で得られたクロマトグラムの一例を Fig.2 に示した．
Table 5

Spike test of thiophanate-methyl(%)

Spiked level(mg/kg)
0.70
10

Corn

Timothy84.4 a) (9.5) b)
---

--c)

82.1 (6.1) b)a) Mean recovery (n=5)b) Relative standard deviation (RSD)c) Mean recovery (n=3)
Table 6

Spike test of thiophanate-ethyl(%)

Spiked level(mg/kg)
0.70
10

Corn
a)

57.9 (4.4)---

Timothyb)--c)64.2 (8.1) b)a) Mean recovery (n=5)b) Relative standard deviation (RSD)c) Mean recovery (n=3)

Fig.2

SIM chromatogram of carbendazim (m/z 192) and EBC (m/z 206)
LC/MS conditions are shown in Table 1.

40

飼料研究報告 Vol.32 (2007)

3.6

定量下限及び検出下限
本法の定量下限を確認するために，とうもろこしにカルベンダジム，ベノミル及びチオファネ

ートメチルそれぞれを添加し，本法に従って分析を 3 回実施し，得られたピークの SN 比からそれぞれの定量下限及び検出下限を求めた．チオファネートについては，添加回収試験で十分な回収率が得られなかったため，定量下限及び検出下限は求めなかった．
とうもろこしにカルベンダジムとして 50 µg/kg 及び 100 µg/kg 相当量を添加した試料を用いて本法に従って分析を 3 回実施した結果，SN 比が 10 となる濃度は 50 µg/kg であり，カルベンダジ
ムの定量下限は 50 µg/kg と考えられた．添加量 50 µg/kg における平均回収率は Table 7 のとおり
115.0%，繰返し精度は RSD として 12%であった．また，カルベンダジムの検出限界は SN 比が 3となる濃度から 15 µg/kg と見積もられた．
Table 7

Spike test of carbendazim to define the limit of quantification(%)
Spiked levelCorn(µg/kg)

a)

b)

50

115.0 (12)100

104.6 a) (3.6) b)a) Mean recovery (n=3)b) Relative standard deviation (RSD)
同様にベノミルの定量下限は，SN 比が 10 となる濃度からベノミルとしての添加濃度が 60 µg/kg
であり，添加量 60 µg/kg における平均回収率は Table 8 のとおり 113.3%，繰返し精度は RSD として 12%であった．また，ベノミルの検出限界は SN 比が 3 となる濃度から 18 µg/kg と見積もられた．
Table 8Spike test of benomyl to define the limit of quantification(%)

Spiked level(µg/kg)Corn

113.3 a) (12) b)a) Mean recovery (n=3)b) Relative standard deviation (RSD)
60

同様にチオファネートメチルの定量下限は，SN 比が 10 となる濃度から，チオファネートメチ
ルとしての添加濃度が 40 µg/kg であり，添加量 40 µg/kg における平均回収率は Table 9 のとおり
72.4%，繰返し精度は RSD として 3.2%であった．また，チオファネートメチルの検出限界は SN
比が 3 となる濃度から 12 µg/kg と見積もられた．

飼料中のカルベンダジム，チオファネート，チオファネートメチル及びベノミルの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

Table 941

Spike test of thiophanate-methyl to define the limit of quantification(%)
Spiked level(µg/kg)Corn

40

72.4 a) (3.2) b)80

72.3 (0.86)a)b)a) Mean recovery (n=3)b) Relative standard deviation (RSD)
3.6

チオファネートメチル及びチオファネートの共同試験
本法の再現精度を確認するため，カルベンダジム，チオファネートメチル及びベノミルの中で，十分な回収率を得るのがもっとも困難と思われるチオファネートメチルについて共同試験を行った．
また，参考までにチオファネートについても同時に試験を実施した．
チオファネートメチル及びチオファネートとしてそれぞれ 1.3 mg/kg 相当量を添加したとうもろこし並びにチオファネートメチル及びチオファネートとしてそれぞれ 20 mg/kg 相当量を添加した乾牧草（チモシー）を用いて，株式会社島津製作所京都カスタマサポートセンター，社団法人日本科学飼料協会科学飼料研究センター，財団法人日本食品分析センター多摩研究所，全国酪農業協同組合連合会分析センター，独立行政法人肥飼料検査所（現術センター）本部及び同仙台事務所（現（独）農林水産消費安全技

同仙台センター）の 7 試験室において，本法に従って共同試験を実施した．
チオファネートメチルの結果は Table 10 のとおりであり，とうもろこしでは平均回収率は 87.8%，
室内繰返し精度及び室間再現精度は相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 3.2%及び 15%であり，HorRat は 0.95 であった．また，チモシーでは平均回収率は 83.1%，室内繰返し精度及び室間再現
精度は RSDr 及び RSDR として 4.6%及び 19%であり，HorRat は 1.8 であった．
チオファネートの結果は Table 11 のとおりであり，とうもろこしでは平均回収率は 53.5%，室内繰返し精度及び室間再現精度は RSDr 及び RSDR として 4.6%及び 14%であり，HorRat は 0.85 であった．また，チモシーでは平均回収率は 41.6%，室内繰返し精度及び室間再現精度は RSDr 及び
RSDR として 4.3%及び 26%であり，HorRat は 2.2 であった．乾牧草の HorRat が 2.0 を超えているが，これは添加が高濃度のため HorRat を求める際の分母の予想室間再現精度 PRSDR（Horwitz 式
から求める）が小さくなったことも寄与していると考えられた．
なお，参考のため，各試験室で使用した液体クロマトグラフ質量分析計の機種等を Table 12 に
示した．

42

飼料研究報告 Vol.32 (2007)

Table 10

Collaborative study of thiophanate-methyl(mg/kg)SampleLaboratory
1

Corn

Timothy
0.911

2

0.923
2.58 f)

3

1.20

4

13.2
39.4 e)13.7
46.8 e)

1.21

18.1

16.5

1.03

1.05

17.9

17.1

5

1.37

1.45

21.5

21.9

6

1.20

12.8

14.6

7

1.04

1.18
1.13

16.3

15.8

Spiked level（mg/kg）
a)

2.68

f)

1.30

20.0

Mean value (mg/kg)
Recovery (%)

1.14

16.6

87.8

83.1

RSDr b) (%)

3.2

4.6

RSDR c) (%)

15

19

PRSDR d) (%)

16

10

0.95

1.8

HorRata) n=12 (excluding Laboratory 2)b) Repeatability relative standard deviation within same laboratoryc) Reproducibility relative standard deviationd) Predicted reproducibility relative standard deviation calculated by
the modified Horwitz equatione) Removed by Cochran testf) Removed by single Grubbs test

飼料中のカルベンダジム，チオファネート，チオファネートメチル及びベノミルの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

Table 11

Collaborative study of thiophanate-ethyl(mg/kg)SampleLaboratory
1

Corn

Timothy
0.634

2

0.629
1.31 f)

3

0.810

4

8.64
18.2 e)8.69
2.07 e)

0.840

10.9

10.8

0.586

0.623

8.48

7.97

5

0.220

0.782

9.12

8.40

6

0.592

4.00

4.64

7

0.728

0.600
0.806

9.35

8.79

Spiked level (mg/kg)
a)

1.42

f)

1.30

20.0

Mean value (mg/kg)
Recovery (%)

0.696

8.32

53.5

41.6

RSDr b) (%)

4.6

4.3

RSDR c) (%)

14

26

PRSDR d) (%)

17

12

0.85

2.2

HorRata) n=12 (excluding Laboratory 2)b) Repeatability relative standard deviation within same laboratoryc) Reproducibility relative standard deviationd) Predicted reproducibility relative standard deviation calculated by
the modified Horwitz equatione) Removed by Cochran testf) Removed by single Grubbs test
Table 12Instruments used in the collaborative study
ColumnLab No.
LC-MS(i.d.×length, particle size)
LC: Shimadzu LC-20AD
GL Sciences Inertsil ODS-3
1
MS: Shimadzu LCMS-2010EV(2.1 mm×150 mm)
Agilent ZORBAX XDB-C18
2
Agilent LC/MS/MS 6410
(4.6mm×50 mm, 1.8 µm)
LC: Agilent 1100 series
Agilent ZORBAX XDB-C18
3
MS: Agilent G1946D(2.1 mm×150 mm, 3.5 µm)
Agilent ZORBAX XDB-C18
4
Shimadzu LCMS-2010EV(2.0 mm×150 mm, 5 µm)
Waters Quattro micro API Mass
Agilent ZORBAX XDB-C18
5
Analyzer(2.1 mm×150 mm, 3.5 µm)
Phenomenex Gemini 5u C18 110A
6
Shimadzu LCMS-2010EV(2.0 mm×150 mm, 5 µm)
LC: Waters alliance 2695
GL Sciences Inertsil ODS-3
7
MS: Waters Micromass Quattro micro(2.1 mm×150 mm, 5 µm)

43

44

飼料研究報告 Vol.32 (2007)

4まとめ（財）日本食品分析センターが検討したチオファネートメチル，カルベンダジム及びベノミルの液体クロマトグラフ質量分析計による残留分析法をもとに，飼料中のカルベンダジム，チオファネート，チオファネートメチル及びベノミルの定量法を検討したところ次の結果を得た．
1)

標準液については，閉環反応以降，試料液と同様の操作を行うべきと考えられた．また，チオ
ファネートメチルを定量する場合はチオファネートメチル標準液を用いるべきと考えられた．

2)

閉環反応以降の操作を試料液と同様に行った標準液について，ピーク面積を用いて検量線を作成したところカルベンダジム，チオファネートメチル及びチオファネートとも 5~200ng の範囲で直線性を示した．

3)

カルベンダジムをとうもろこしに 0.70 mg/kg ，乾牧草（チモシー）に 10 mg/kg 添加し，添加回収試験を実施した結果，平均回収率は 96.5%，繰返し精度は相対標準偏差（RSD）として 6.8%
以下の成績が得られた．

4)

ベノミルをとうもろこしに 1.0 mg/kg，チモシーに 15 mg/kg 添加し，添加回収試験を実施した
結果，平均回収率は 103.6%，繰返し精度は RSD として 5.0%以下の成績が得られた．

5)

チオファネートメチルをとうもろこしに 0.70 mg/kg，チモシーに 10 mg/kg 添加し，添加回収試験を実施した結果，平均回収率は 83.3%，繰返し精度は RSD として 9.5%以下の成績が得られ
た．

6)

定量下限は試料中で，カルベンダジムとして 50 µg/kg，またはベノミルとして 60 µg/kg 及びチオファネートメチルとして 40 µg/kg 相当量と考えられた．

7)

チオファネートメチルとしてとうもろこしに 1.3 mg/kg，及びチモシーに 20 mg/kg 相当量を添加した試料を用いた共同試験の結果，平均回収率 85.5%，室内繰返し精度及び室間再現精度は相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 4.6%以下及び 19%以下であった．

8)

同一操作での定量が可能か検討したチオファネートについては，その回収率が 70%未満であり，定量法の確立には至らなかった．
謝

辞共同試験に参加して頂いた株式会社島津製作所，社団法人日本科学飼料協会，財団法人日本食品
分析センター及び全国酪農業協同組合連合会の試験室の各位に感謝の意を表します。
文献1) 日本食品分析センター：平成 17 年度 飼料の有害物質等残留基準設定等委託事業（分析法の開発）
飼料中の有害物質等の分析法の開発 (2006).
2) 厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知：“食品に残留する農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法”，平成 17 年 1 月 24 日，食安発第 0124001 号 (2005).