様式３立 S22-14

軟 X 線顕微鏡による Deinococcus radiodurans の観察
Soft X-ray microscopy observation of Deinococcus radiodurans
鳴海一成 a, 佐藤勝也 a, 大東琢治 b, 竹本邦子 c, 難波秀利 d, 木原 裕 cIssay Narumi a, Katsuya Satoh a, Takuji Ohigashi b, Kuniko Takemoto c, Hidetoshi Namba b, Hiroshi
Kihara caa

日本原子力研究開発機構, b 立命館大学総合理工学研究機構, c 関西医科大学, d 立命館大学,
Japan Atomic Energy Agency, bRitsumeikan University Research Organization of Science and Engineering,cKansai Medical University, dRitsumeikan University

放射線抵抗性細菌 Deinococcus radiodurans の細胞内におけるテルル元素の蓄積状態を明らかにするために、テルルの L 吸収端の前後の波長を用いて、テルル含有及び非含有培地で培養した菌体を非浸襲・非破壊的に軟 X 線顕微鏡で観察した。その結果、テルルは D. radiodurans の細胞質中で特異的な顆粒状構造体あるいはポリリン酸に捕捉された状態で存在することが示唆された。
In an effort to elucidate the intracellular accumulation state of tellurium in the radioresistant bacterium
Deinococcus radiodurans, cells cultured with and without potassium tellurite were observed noninvasively
and nondestructive by soft X-ray microscope at wavelengths near tellurium L-edge. It was suggested thataccumulated tellurium is present as specific granules and/or trapped by polyphophate in the cytoplasm of D.
radiodurans.
Keywords: Deinococcus radiodurans, Soft X-ray microscopy, tellurite, intracellular accumulation
こで、本研究課題では、テルル元素（L 吸収
背景と研究目的： 軟X線顕微鏡は、光学顕
端: 2.1 nm）の D. radiodurans 細胞内での蓄微鏡より高い分解能 (50 nm) で、細胞を観積状態を明らかにするために、2 nm 前後の察することができる。しかし、50nmの分解波長の軟 X 線を用いた顕微鏡観察を実施した。
能で細胞を観察するのに必要なドーズ量は、
実験： D. radiodurans R1株（ATCC13939T:水との相互作用の小さい水の窓領域（2.3 nm
American Type Strain Collectionから購入した～ 4.4 nm）でも 105～106 Gyと非常に高い。
標準株）を、30μg/ml亜テルル酸カリウム含このため、ほとんどの生物において細胞は放有及び非含有TGY寒天培地（0.5% Bacto
射線損傷のために死んでしまい、生きた細胞
tryptone, 0.3% Bacto yeast extract, 0.1% glucose,を観察することはできない。そこで我々は、
1.5% Bacto agar）で30℃、5日間培養した。培生物の中でも最も放射線に強い微生物である
地上の1コロニーを1 mLの滅菌蒸留水に懸濁D. radiodurans[1]を観察対象として、細胞のし、そのうちの1 μLをフォルムバール支持膜
内部構造を軟X線顕微鏡で非侵襲・非破壊的付き電顕グリット上に添加後、風乾したものに観察する実験を行っている。
を観察試料とした。
テルル元素は生物の生存に必須ではなく、立命館大学SRセンターのBL-12に設置されむしろ細胞内で酸化損傷を引き起こすため、た軟X線顕微鏡を用いて、波長2nm及び2.4
細胞毒性があるが、大腸菌、枯草菌、超好熱nmにて観察を行った。
古細菌、細胞性粘菌、シロイヌナズナなど、多様な生物がテルル蓄積に関わる遺伝子を持結果、および、考察： Fig. 1 に、 30μg/mlっている[2]。D. radiodurans のゲノムにも、亜テルル酸カリウム含有TGY培地で培養しテルル蓄積に関わる遺伝子クラスター領域
たD. radiodurans菌体のX線顕微鏡像を示す。
（ terE, terB, terD1, terA, terZ, terD2,
Fig.
1Aは波長 2 nmで観察したもの、Fig. 1BterC）が存在し、実際に D. radiodurans ははFig. 1Aと同じ視野を波長 2.4 nmで観察した細胞内にテルルを蓄積しつつ生育できることものである。波長 2 nmでは、細胞中に大きさが分かっている。しかし、細胞内におけるテの異なる複数の顆粒状の濃密構造体が認めらルル元素の蓄積状態は不明のままである。そ様式３れた。一方、テルル元素のL吸収端より長い
波長 2.4 nmでは、観察波長 2 nmで見られた顆粒状濃密構造体と同一位置に一部、コントラストが著しく不鮮明な顆粒状構造体が認められた。
また、Fig. 2 に示すように、亜テルル酸カリウムを含まない TGY 培地で培養した D.
radiodurans 菌体においても、観察波長 2 nmで複数の顆粒状構造体が認められた。この顆
粒状構造体は、D. radiodurans 菌体の透過型電子顕微鏡観察で見られるポリリン酸の存在形状(Fig. 3)に酷似していた。ポリリン酸は、細胞中で負の電荷を持ち、正の電荷を持つ有害金属元素を捕捉し、細胞毒性の少ない形で蓄積することが示唆されている[3]。
以上の結果から、D. radiodurans の菌体に取り込まれたテルル元素は、細胞質中で特異的な凝集構造体あるいはポリリン酸に捕捉された状態で存在することが示唆された。
今後の課題として、テルルの凝集構造体がポリリン酸に依存するのかどうかを明らかにす る こ と が 必 要 で あ る 。 そ こ で 、 D.
radiodurans の ポ リ リ ン 酸 合 成 酵 素
polyphosphate kinase [EC:2.7.4.1]をコードする
遺伝子 DR_1939 を破壊することで、ポリリン酸欠損変異体を作製し、亜テルル酸カリウム有り無しで培養したものを用いて、軟 X 線顕微鏡観察を行うことを予定している。
文 献[1] I. Narumi, Trends Microbiol. 11 (2003) 422[2] D. E. Taylor, Trends Microbiol. 7 (1999) 111[3] C. Kuwahara, A. Fukumoto, M. Nishida, H.
Sugiyama, Y. Anzai, F. Kato, J. Environ.
Radioact. 102 (2011) 138

Fig. 1.
X-ray microscopic image of D.
radiodurans grown on TGY agar supplemented by
30 μg/ml of potassium tellurite. (A) Observation
wavelength was 2.0 nm. Exposure time was 300 s.
(B) Observation wavelength was 2.4 nm. Exposure
time was 300 s.

Fig. 2.
X-ray microscopic image of D.
radiodurans grown on TGY agar without potassium
tellurite. Observation wavelength was 2.0 nm.
Exposure time was 360 s.

論文・学会等発表（予定）[1] I. Narumi, K. Satoh, T. Ohigashi, K.
Takemoto, T. Namba, and H. Kihara, 11thInternational Conference on X-Ray Microscopy:
XRM2012 (ポスター発表)

Fig. 3. Transmission electron microscopic imageof D. radiodurans grown on TGY agar without
potassium tellurite. Large dense bodies wereconsidered to be accumulated polyphosphates.