放射性同位体を用いないバクテリア生産速度測定法の開発と応用
Development and application of methods formeasuring bacterial production as an alternative to radioisotopes
土屋 健司

＊

Kenji TSUCHIYA＊

国立環境研究所 地域環境研究センター
Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies

摘要バクテリア生産速度（BP）の定量には放射性同位体を用いたチミジン法やロイシン法が一般的に用いられており，放射性同位体の使用が厳しい国・地域においては実測例が限られ，生産動態を知る上で障壁となっていた。そこで我々は放射性同位体を用いない BP 測定法を開発した。本手法では 15N で標識したデオキシアデノシン（15N-dA）をバクテリアに取り込ませ，DNA 抽出，酵素加水分解後に液体クロマトグラフィー
質量分析計によって 15N-dA 取り込み速度を定量し，BP を見積もる。15N-dA 取り込
み速度は湖沼及び海洋において既存の 3H- チミジン取り込み速度と有意な正の相関を示し，本手法の妥当性が示された。この 15N- デオキシアデノシン法は化合物レベルで定量を行うため，既存の手法では成し得なかった純粋な DNA 合成速度の定量を可能とした。本稿では 15N-dA 法の開発過程とともに，琵琶湖における応用例を紹介し，最後に今後の課題や展開について議論する。

キーワード：安定同位体，液体クロマトグラフィー質量分析計，長期変動，
デオキシアデノシン，琵琶湖，ロイシン

Key words：stable isotope, liquid chromatography mass spectrometry,long-term variation, Deoxyadenosine, Lake Biwa, Leucine

1．はじめに水圏生態系におけるバクテリアは物質やエネル
ギー循環において重要な役割を果たしている（Azam,
1998）。バクテリアは多くの生物が直接利用できない
溶存態有機炭素（孔径が概ね 0.1～1 µm のフィルターを通過するもの）を主に利用して増殖し，微生物食
物連鎖や生食食物連鎖へと物質循環を駆動させる役割を担っている（Wylie and Currie, 1991）。特に溶存
態有機炭素は地球上における主要な炭素リザーバー
であり（海洋では 662 PgC, Hansell et al., 2009），その量は陸域の植生（550～650 PgC）
や大気中の二酸化炭
素量（700 PgC）とほぼ同等である。また，ほとんどの有機炭素は溶存態の形態で存在し，海洋バイオマ
スの 200 倍以上の量を示す（Hansell et al., 2009）。そのため，溶存態有機炭素を利用するバクテリアの生産動態を把握することは生物地球化学循環を理解する上で重要であり，水圏生態学における主要なテー
マの 1 つである。
バクテリア生産速度（Bacterial production; BP）とは，単位時間，単位体積（面積）当たりのバクテリア
バイオマスの増加量を表すものである。これまで
BP は，主にチミジン（TdR）法（Fuhrman and Azam,
1980; Fuhrman and Azam, 1982）やロイシン（Leu）法（Kirchman et al., 1985）によって測定されてきた。
TdR 法ではデオキシリボ核酸（DNA）を構成するヌク
レオシドの一種である TdR をバクテリアに取り込ま
せ，DNA 合成速度から BP を見積もる（図 1）。TdRの塩基（チミン）は他のヌクレオシドの塩基（アデニ
ン，グアニン，シトシン）と異なり，直接的にリボ核酸（RNA）合成に利用されないため，DNA 合成速度測定のトレーサーとして用いられている。TdR 取
り込み量から細胞増殖への変換係数，1 細胞当たりの炭素量を乗ずることによって BP が求められる。
18
前者の変換係数は，外洋では一般に 2±2×10 cells－1mol-TdR （Ducklow and Carlson, 1992）が用いられ，－1
後者は一般に 20 fgC cell （Lee and Fuhrman, 1987）が用いられる。Leu 法ではタンパク質を構成するアミノ酸の一種である Leu をバクテリアに取り込ま
せ，タンパク質合成速度から BP を見積もる。Leu

受付：2020 年 8 月 31 日，受理：2020 年 10 月 26 日＊
〒 305 - 8506 茨城県つくば市小野川 16 - 2，E-mail：tsuchiya.kenji@nies.go.jp, ktsuchiya@soka.gr.jp
2020 AIRIES43

土屋：放射性同位体を用いないバクテリア生産測定

図13
H- チミジン法で使用される［メチル -3H］- チミジと，15N- デオキシアデノシン法でン（3H-TdR，左）- デオキシアデノシン（15N-dA，使用される［15N5］右）．＊ 印で示した箇所がそれぞれ 3H または 15Nで標識されている．

はバクテリアに取り込まれた後に他のアミノ酸に形を変えることはなく，バクテリアのタンパク質の中で極めて安定な割合で存在することから（Kirchman
et al., 1985; Simon and Azam, 1989），タンパク質合成
速度測定のトレーサーとして用いられている。Leu
取り込み速度に，Leu の式量，細胞炭素量とタンパ
ク質の比，同位体希釈率を乗じ，タンパク質中のLeu の割合で除して BP は求められる。Leu の式量を 131.2，細胞炭素量とタンパク質の比を 0.86，同位体希釈率を 2，タンパク質中の Leu の割合を 0.073－1とした，3.1 kgC mol-Leu という換算係数がよく用いられる（Kirchman, 1993）。
TdR や Leu は，もともと細胞内に存在するため，取り込まれた TdR や Leu を区別するために，放射3
14
性 同 位 体 で 標 識 さ れ る（ H や C が よ く 用 い ら れる）。これらのアプローチは方法論的にシンプルで感度が高いことから，水圏生態学の研究分野でスタンダードな測定法として広く用いられてきた。しかし，これらの手法は放射性同位体を使用するため，
現地調査での使用には重大な，時には乗り越えられないような物流上の困難や制約があり（Steward andAzam, 1999），任意の場所での測定を難しくしている。特に我が国においては放射性同位体の使用に関して強い制限がある。海洋の大型調査船などでは放射性同位体専用の実験室を積み込むことにより，船上での BP 測定が可能だが，陸水環境においてはそのような設備を搭載する（できる）船はほとんど存在しない。このような事情から，我が国の陸水環境における BP 実測例は極めて限られているのが現状で
あ り， 湖 沼 に お い て は 諏 訪 湖（Watanabe, 1996），
琵琶湖（e.g. Nagata 1987; Ram et al. 2010），霞ヶ浦（Kawasaki et al. 2013）などに限られる。
DNA 合成速度に基づいた放射性同位体を用いない BP 測定方法として，1999 年にブロモデオキシ
ウリジン（BrdU）
法が開発された（Steward and Azam,
1999）。この手法は TdR のアナログである BrdU をバ
クテリアに取り込ませ，抗原抗体反応によって取り込まれた BrdU を定量するというものである。BrdU
44は抗体検出ができるため，細胞レベルでの検出（e.g.
Tada et al. 2010）や，免疫分取によるシーケンスによる増殖細胞の判別や特定（e.g. Tada and Grossart
2014; Hamasaki et al., 2016; Malayil et al., 2020）な どが可能といった利点がある。しかし，抗原抗体反応
によって得られた化学発光強度と BrdU 量との変換係数を得るためには，放射性同位体で標識した物質
33（例えば H-TdR や H-BrdU など）を使用する必要があり，真に放射性同位体フリーの手法はこれまで開発されてこなかった。
そこで我々は，任意の場所で測定可能な，放射性同位体を全く用いない BP 測定手法の開発を行い，水圏環境におけるバクテリアの生産動態を明らかにしてきた。本稿では，新手法の開発過程と，琵琶湖における実測例，そして最後に今後の課題や展開について紹介したい。
2．放射性同位体を用いないバクテリア生産速度測定法の開発：15N- デオキシアデノシン法
N- デオキシアデノシン（ N-dA）法では，TdR と塩基対をなすデオキシアデノシンに着目し，アデ15
ニンの 5 つの窒素原子をすべて安定同位体 N で15標識したものをトレーサーとして用いた（ N-dA,
NLM-3895-PK, Cambridge Isotope Laboratories，図 1）。
15
N-dA 取り込み量は以下の（1）～（5）の工程で定量す
15（最終濃度～50 nM），
る：（1）N-dA を添加・培養しバクテリアに取り込ませる。（2）培養終了後に孔径0.2-µm ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）メンブ
レンフィルター（Omnipore, Millipore）に試水を濾過し，冷凍保存する。
（3）
フィルター試料に捕集されたバクテリア群集から DNA を抽出する。
（4）
抽出した
DNA を 3 つの酵素
（Nuclease P1, Phosphodiesterase I,
Alkaline Phosphatase）を用いてヌクレオシドまで加水分解する。（5）液体クロマトグラフィー質量分析
15
計（LC-MS/MS）
を用いて N-dA 取り込み量を定量する。デオキシアデノシンの塩基（アデニン）は RNAにも用いられるが，LC-MS/MS によって RNA 構成
要素であるアデノシンと DNA 構成要素であるデオ
キシアデノシンは分けて測定することが可能である
ため，RNA やアデノシン三リン酸
（ATP）
などに用い
られたとしても定量結果は影響を受けない。
本手法の開発において，DNA 抽出方法や回収
15率， N-dA 添加濃度など，各工程の課題に関して検討 し た。 ま ず，DNA 抽 出 方 法 と し て，DNA の 吸
着・精製過程が異なる，FastDNA SPIN Kit for Soil
（MP-Biomedicals）と Extrap Soil DNA Kit Plus ver.2（Nippon Steel & Sumikin Eco-Tech Corporation）の
2 つのキットを検討した。前者はガラスビーズに
DNA を吸着させ，塩濃度の変化により溶出させるが，後者は磁性ビーズに DNA を吸着させ，加熱に17より溶出させる方法を採用している。その結果，前15

15

地球環境 Vol.25 No.1&2

200(a）相模湾

150
100
50
0
15N-dA取り込み速度 (pmol L-1 h-1)

者の DNA 抽出方法では後段の酵素加水分解反応が15進まず， N-dA 取り込み量の定量ができなかった（Tsuchiya et al., 2015）。前者の DNA 抽出キットには，本研究で用いた酵素による加水分解反応を阻害する物質が含まれていた可能性が考えられる。一方，後者の DNA 抽出キットを用いたところ，酵素
15
加水分解反応に阻害は見られず， N-dA 取り込み量の定量が可能であったため，DNA 抽出法としてこの方法を採用した。
次に Extrap Soil DNA Kit Plus ver.2 による DNA 回
収率を調べるため，霞ヶ浦の高浜入り，土浦入り，
湖心の 3 地点より採水し，それぞれ 1 または 5 mLずつ孔径 0.2-µm PTFE メンブレンフィルターに濾過した。同時に湖水を濾過しないコントロールも作成した。DNA 抽出時にフィルター試料とともに既知
6
量 の nec1 遺 伝 子（PCR 増 副 産 物，1.0×10 copies/tube）を添加し，抽出後の同遺伝子数をリアルタイ
ム PCR 法により定量した。その結果，nec1 遺伝子の回収率は 102±9％（n＝7）を示し，DNA 抽出・精製過程におけるロスはほとんど見られないことが確認された。一方で本抽出キットによるバクテリアの溶菌効率は明らかではなく，DNA 抽出効率は不明である。しかし，2016 年 1 月に霞ヶ浦 2 地点（高浜
入り，湖心），相模湾 1 地点（真鶴沖定点）における15
N-dA 取り込み速度を 3 回反復で測定したところ，それぞれ 11.59±0.37，11.65±0.95，2.53±0.09 pmol
－1
－1
（CV）
は 3.2％，
L h を示した。それぞれの変動係数
8.2％，3.4％と比較的小さく，高い精度で測定されていた。もし DNA 抽出効率
（細胞破砕効率）が低いのであれば，測定結果はよりばらつくと考えられるが，このような高い精度での測定結果は，間接的ではあるが比較的高い DNA 抽出効率が得られていた可能性を示唆するものであると考えられる。
15
N-dA 添加濃度と取り込み量の関係を調べた。試15
水は相模湾真鶴港より採水し， N-dA を最終濃度
5，20，50，100 nM となるように添加後，6，12，
24，48 時間，暗所，現場水温（21℃）下で培養した。
その結果，添加濃度が低く，培養時間が長くなるほど取り込み量は低下する傾向を示したが，最終
濃度 50，100 nM，培養時間 6，12 時間のサンプルにおいては統計的な有意差は見られなかったこと
15から（Bonferroniʼs test, p＞0.05）， N-dA 添加濃度は50 nM，培養時間は 12 時間以内が望ましいと考えられた。
15
N-dA 法の妥当性を確認するため，海洋（相模湾）
及び湖沼（霞ヶ浦，琵琶湖）において，従来法である
3
15
H-TdR 法と比較を行った。その結果， N-dA 取り込
み速度は，いずれの水圏においても有意な正の相関を示し，本手法の妥当性が示された（図 2）。
一方，それぞれの水圏における取り込み速度の直線回帰の傾きは 1 を下回り（相模湾 0.55，霞ヶ浦
3150.28，琵琶湖 0.61）， H-TdR 取り込み速度が N-dA

43 - 52（2020）

0

160

100

200

300

400

(b）霞ヶ浦

120
80
40
0

0

20

100

200

300

400

500

(c) 琵琶湖

15
10
5
0

0

10

20

30

3H-TdR取り込み速度 (pmol L-1 h-1)

図2

15
N- デオキシアデノシン（15N-dA）及び 3H- チミジ
取り込み速度の比較結果．
ン（3H-TdR）

図中の直線は Standard Major Axis（SMA）II 型直線回帰モ
デ ル を 示 す．（a）相 模 湾［15N-dA］＝0.55×［3H-TdR］－4.1（n ＝20, r ＝0.99, p ＜0.001），（b）霞ヶ浦［15N-dA］＝0.28×［3H-TdR］－4.6（n ＝20, r ＝0.91, p ＜0.001），（c）琵 琶 湖［ 15N-dA］＝0.61×［ 3H-TdR］－0.64（n ＝17, r ＝0.94, p ＜0.001）．（Tsuchiya et al . 2015; Tsuchiya et al . 2020a より引用）

取り込み速度と比較して高い結果となった。この理
由として，
（1）
DNA 抽出効率，（2）
細胞外ヌクレオシ
ド（dA と TdR）の DNA 合成に用いる能力の違い，（3）15
放射性同位元素の非特異標識が考えられる。 N-dA
法では DNA 抽出過程を経るため，抽出効率が低い
153と過小評価につながる。また， N-dA 法と H-TdR 法の取り込み速度比が霞ヶ浦，相模湾で異なる理由として，バクテリア種組成の違いによる溶菌効率（抽出効率）が異なる可能性も考えられる。しかし，本抽出キットの DNA 抽出効率は上述したように定量はされていないが，高い測定精度が得られたことか
ら，比較的高い抽出効率が得られている可能性は高く，傾きを大きく下げる主要な要因とは考えにくい。細胞外ヌクレオシド（dA と TdR）
を DNA 合成に用いる能力の違いに関しては，dA や TdR が DNA に取り込まれる際に，ヌクレオシドにリン酸を付加するためのデオキシアデノシンキナーゼ，チミジンキ
45土屋：放射性同位体を用いないバクテリア生産測定

ナーゼといった酵素が必要であるとされ，これらの酵素の有無はバクテリア分類群によって異なる（e.g.
Tinta et al., 2012）。実際に dA と TdR の DNA への取り込み速度がどの程度異なるのかを明らかにするた
15
15
15
め， N-dA と， N で 標 識 し た TdR（ N-TdR, NLM3901-25, Cambridge Isotope Laboratories）
を用いて相模湾，霞ヶ浦において取り込み速度を比較した。そ15
15の結果， N-dA 取り込み速度は， N-TdR 取り込み
速度のおよそ 87％であることがわかり（Tsuchiya etal., 2020b，図 3），細胞外ヌクレオシドの DNA への15
3
取り込み能の違いだけでは， N-dA 及び H-TdR 取
り込み速度の違いを説明するには不十分であった。
15
15
また，両水域における N-dA と N-TdR 取り込み速
度比はおおむね同程度であり，傾きの違い（0.55 vs0.28）
は他の理由によって説明されうるものであると3推察された。一方， H-TdR は細胞内に取り込まれた
3
のち，DNA だけでなく，RNA やタンパク質も H が標識してしまう非特異標識の問題が指摘されている（e.g. Brittain and Karl, 1990; Chin-Leo and Kirchman,
3
1990）。 H-TdR 法では冷トリクロロ酢酸によって得られた不溶性画分中の放射線強度を測定するが，不溶性画分中には RNA やタンパク質も含まれており，非特異標識によって取り込み量の過大評価が引き起こされる。実際に，不溶性画分中における DNA
3
画分の H 標識率は 0％～103％と大きく変動することが知られている（reviewed in Brittain and Karl,
15
15
1990）
。一方， N-dA 法では化合物レベルで N-dA
取り込み量を定量するため，非特異標識による取り込み量のバイアスは発生しないと考えられる。こういったことから，取り込み速度の傾きが 1 を下回る
3
原因として， H-TdR 法における非特異標識に起因する取り込み速度の過大評価が大きく影響していた15と考えられる。以上のことから， N-dA 法は化合物レベルで定量を行うため，既存の手法では成し得なかった純粋な DNA 合成速度の定量を可能とし，水(pmol L-1 h-1)

15N-dA取り込み速度100

琵琶湖は日本最大の湖であり（面積 670 km ，貯3
水量 275 億 m ），京阪神の約 1,400 万人の飲料水等として利用されている。琵琶湖では高度成長に伴い富栄養化が進行し，淡水赤潮が頻発したが，負荷削減努力により 1980 年代以降栄養塩濃度は減少した（Hsieh et al., 2010）。その結果，クロロフィル濃度は低下し，植物プランクトン種組成の遷移が見られるなど（Kishimoto et al. 2013），生態系の変化が顕在化している。系外からの栄養塩・有機物負荷量や水質，植物プランクトンなどに関する長期変動はこれまでよく記述されてきたが（e.g. 佐藤ら，2016），BPの長期変動は明らかとなっていない。水圏生態系においてバクテリアは溶存態有機物を懸濁態化させ，微生物食物連鎖を駆動させる役割を担っている。そのため BP の測定は系外から流入する溶存態有機物
が水圏食物網に取り込まれているかどうかを考慮する際に重要であり，これらの長期変動を把握することは湖沼生態系における物質収支を把握する上で重要である。
琵琶湖における BP 測定に関しては，1986 年 4 月から 10 月，琵琶湖北湖の南比良沖の定点（Ie-1，図 4）
3において， H-TdR 法を用いて最初の BP が測定された（Nagata, 1987）。 そ の 後，1997 年 か ら 1998 年 には捕食者を除いた環境下でバクテリアを培養し，現存量の変化から見積もる方法（Gurung et al. 2000），
32005 年から 2006 年には H-Leu 法（Ram et al., 2010）
を用いて，同定点において BP が測定された。2016年から 2017 年にかけて，筆者らも琵琶湖北湖にお
2

1:1

60
40
20
0

20
40
60
80
15N-TdR取り込み速度(pmol L-1 h-1)

100

15
N- デオキシアデノシン（15N-dA）
及び 15N- チミジ
取り込み速度の比較結果．
ン（15N-TdR）

図中の直線は Standard Major Axis（SMA）II 型直線回帰モ＝0.87×
［15N-TdR］－2.3, r ＝0.98, n ＝デルを示す（［15N-dA］．白丸と黒丸はそれぞれ相模湾，霞ヶ浦を示13, p ＜0.001）
す．破線は取り込み速度が 1:1 の直線を示す．（Tsuchiya
et al . 2020b より引用）

46

3．湖沼生態系におけるバクテリア生産速度の実測：
琵琶湖

80

0

図3

圏生態系における BP のより正確な見積もりを可能とすることが示された。

図4

琵琶湖北湖における調査定点．

地球環境 Vol.25 No.1&2

いて N-dA 法を用いて BP を測定した（Tsuchiya et3
al. 2020a）。これらの測定手法のうち， H-TdR 法と
15
N-dA 法は DNA 合成速度に基づくものであり，細胞数の増加と強く関連している。また，捕食者を除いた状態での培養法（Gurung et al., 2000）
も同様に細胞数の変化に着目している。そのため，これらの手法の理論的背景は同じであり，直接比較可能であ3る。一方， H-Leu 法はタンパク質合成速度を測定するものであり，DNA 合成速度とタンパク質合成速度はバクテリアの生理状態や環境条件によって変化することが知られている（Kirchman, 1992）。そのた
15
3め， N-dA 法と H-Leu 法は同じサンプルで測定しな
い限り，直接の比較は難しい。そこで，本研究では15
2016～2017 年にかけて， N-dA 法を用いて BP の季
節変動を明らかにするとともに，1986 年（Nagata,
1987），1997～1998 年（Gurung et al., 2000）の BP と比較することにより，琵琶湖北湖における 30 年間の BP の変化を明らかにすることを目的とした。
2016～2017 年の調査は，滋賀県琵琶湖環境科学
研究センターの調査船「びわかぜ」と京都大学生態学研究センターの調査船「はす」を用いて，北湖
南部に位置する調査定点南比良沖中央（12B，水深約 60 m，図 4）で実施した。この地点はこれまで BP測定がされてきた調査定点 Ie-1 の近くに位置している。水深 0，5，10，15，20，40，60 m より採水し，
3
BP・バクテリア現存量を測定した。 H-TdR 法で測15定された BP（1986 年）と比較を行うため， N-dA 取
3
り込み速度から H-TdR 取り込み速度への変換係
315数を実験的に求めた（［ H-TdR］＝1.64×［ N-dA］，
3
図 2c）。Nagata（1987）で は， H-TdR 取 り 込 み 速 度はフィルターを用いてバクテリアを捕集し，酢酸エチルで溶解させる手法（Fuhrman and Azam, 1982）
を用いて測定していた。本研究における比較実験にお3
いても，2018 年 6 月にフィルター法によって H-TdR
速度を測定したところ，取り込み速度が低いためにコントロールのブランクが相対的に高くなり，定量できなかった（Tsuchiya et al., 2020a）。そのため，2018 年 7 月にブランクが低く抑えられるフィルターを用いない遠心法（Smith and Azam, 1992）によって
3
3
H-TdR 取り込み速度を測定した。既知濃度の H-TdRを使用して，フィルター法と遠心法間での計数効率の違いを比較したところ，フィルター法の毎分崩壊
数（DPM）は遠心法の 92.9％であった。そのため，Nagata et al.（1987）で使用したフィルター法に合わせるため，遠心法で得られた DPM に 0.929 を乗じ15て補正した。以上から， N-dA 取り込み速度から
3
H-TdR 取 り 込 み 速 度 へ の 変 換 は， 上 述 し た 2 つ
15の 係 数 を 乗 じ て 行 っ た（1.64×0.929×［ N-dA］）。
3（5～6 nM）がNagata（1987）で は， H-TdR 添 加 濃 度
低く，取り込み速度は飽和していなかったため，
15
3
N-dA 法と同じ添加濃度（50 nM）で H-TdR を添加3したと仮定し， H-TdR 取り込み速度の補正を行っ
1543 - 52（2020）た。 す な わ ち，1986 年 4 月 か ら 7 月 は 1.56，8 月
か ら 9 月 は 1.88，10 月 は 2.00 を 乗 じ， 補 正 済 み
3H-TdR 取 り 込 み 速 度 とし た。1997～1998 年 の BP
15
（Gurung et al., 2000）と比較するため， N-dA 取り込
み速度とバクテリア細胞数増殖の関係を求めた
（1.83
6
15
－1
×10 cells pmol- N-dA , Tsuchiya et al., 2020a）。 この変換係数を用いてバクテリアの比増殖速度（µ）を算出し，水温と µ の関係を比較した。
15
2016～2017 年の N-dA 取り込み速度は 0.13 pmol
－1
－1
－1
－1
から 30.7 pmol L h
L h （2016 年 8 月，水深 40 m）（2016 年 7 月，水深 5 m）の範囲で変動した。1986 年
4 月 か ら 10 月 に お け る 水 深 0～10 m の 補 正 済 み
3－1－1
H-TdR 取り込み速度は 27.7～145 pmol L h （87.2±36.7）を示した。2016～2017 年における同月（4～1510 月），同深度（0～10 m）における N-dA 取り込み3
速度から見積もられた H-TdR 取り込み速度は 6.93
－1
－1
～41.4 pmol L h （18.9±11.5）で あ り，1986 年 の取り込み速度と比較して有意に低かった（Studentʼs
3。1986 年の H-TdR 取り込み速度は，
t-test, p＜0.001）
2016～2017 年と比較して 4.6 倍高く，BP はこの 30
年間で 22％にまで低下したことが示唆された。
－1
2016～2017 年 の µ は 0.0086～0.70 d を 示 し，
－1
有意に
1997～1998 年の µ と比較して（0.072～1.0 d ）低かった（Studentʼs t-test, p＜0.001）。2016～2017 年
及び 1997～1998 年の両期間において，µ は水温と有意な関係を示し，その直線回帰式はそれぞれ［µ］＝20.017×［水 温 ］－0.092（n＝56, r ＝0.59, p＜0.001），2［µ］＝0.035×［水温］－0.044（n＝17, r ＝0.68, p＜0.001）であった。1997～1998 年の直線回帰式の傾きは 2016～2017 年と比較して 2.1 倍の値を示し，BP はこの
20 年間でおよそ半分にまで低下したことが示唆された。
BP の経年変化をもたらした原因として，外部要
因（有機物・栄養塩負荷）と内部要因（水質）が考えられる。系外からの負荷量と水質の相対変化量を図 5に示した。上述したように，BP は 2016～2017 年の値 と 比 較 し て，1986 年 は 4.6 倍，1997～1998 年 は2.1 倍の値を示した。滋賀県における下水道普及率
は，1986 年 当 時 は 非 常 に 低 く 20 ％ 以 下 で あったが，その後急速に拡大し，2015 年には 89％に達している。その結果，有機炭素（TOC），易分解性 TOC
や全リン（TP）負荷量は，1985 年と比較してそれぞ
れ 56％，42％，51％にまで低下した。このことか
ら，人為的な流入負荷削減に伴い BP は低下したと考えられる。しかし，これら TOC や TP 負荷量の低下率は BP 低下率より小さく，他の直接的な要因も考慮する必要がある。
水質に関しては，1986 年の生物化学的酸素要求量（BOD）は 2016～2017 年と比較して 1.3 倍と，BP の変動率より大幅に低く，BP 変動を説明できないと考えられた。BOD は易分解性有機物の指標の 1 つであり（Jonas, 1997），季節によっては BOD と BP に47

土屋：放射性同位体を用いないバクテリア生産測定

3

80
60

2

40

1

20
1990

2000

2010

9

相対値（⽐最近年値）

易分解性TOC負荷量
TOC負荷量
TP負荷量
下⽔道未普及率

4

0
1980

図5

100

BP

下⽔道未普及率（%）

相対値（⽐最近年値）

5

BP
BOD
PO4

6

TP

3

0
1980

0
2020

1990

2000

2010

2020

琵琶湖北湖調査定点 12B（南比良沖中央）におけるバクテリア生産速度（BP），有機物・栄養塩負荷量
及び下水道未普及率
（左）
，水質
（右）
の経年変化．

図中の下水道未給率以外は，最近年値との相対値で示している．全有機炭素（TOC）と易分解性 TOC 負荷量は佐藤ら（2016），全リン（TP）
負荷量は滋賀県・京都府（2017），下水道未普及率は滋賀県（2020），生物化学的酸素要求量（BOD），PO4，TP は滋賀県（2017）より得た．

12B (南⽐良沖中央)

1.3

1.2

BP変化率

BP変化率

1.2
1.1
1

1.1
1
0.9

0.9
0.8

0

1

2

3

0.8

添加PO4濃度 (µM)

図617B (今津沖中央)

1.3〇 PO4のみ添加● グルコース添加(50 µM)
0

1

2

3

添加PO4濃度 (µM)

 琶湖北湖調査定点 12B
琵（南比良沖中央，左図），17B（今津沖中央，右図）における PO4 及びグルコース添加に伴うバクテリア生産速度（BP）変化率（何も添加しないコントロールを 1 とした）．

2018 年 11 月に水深 5 m より採水し，孔径 1.0-µm ポリカーボネートメンブレンフィルター（Nuclepore, Whatman）
で濾過後，PO（0～2.5µM）
4及びグルコース（50 µM）を添加し，現場水温，暗所下で数時間培養した．

は有意な関係があると報告されているが（Jonas and今 井 ら，2019）と 比 較 し て 有 意 に 高 か っ た（SteelTuttle, 1990），本研究では有意な関係は認められな
Dwassʼs test, p＜0.01）。以上のことから，1986 年はかった。
高い有機物や栄養塩の流入負荷によって BP が維持
TP に減少傾向は認められなかったが，PO4 濃度はされていたが，1997～1998 年には一次生産は高く
明確な減少傾向が認められ，BP の減少傾向と類似し保たれていたものの，流入負荷削減によって BP はた
（図 5）
。琵琶湖ではバクテリアは強い PO4 律速で強いリン制限になっていたと考えられる。2016～
あることが指摘されており（Gurung and Urabe, 1999;2017 年にかけて更に生態系に変化が起こり，これKishimoto and Ueno, 2011）， 特 に 1996～1997 年 のまでのリン制限に加え，一次生産量の低下による炭栄養塩添加実験では，表層湖水のバクテリア群集は素制限も示唆された（図 6）。このように琵琶湖の生PO4 添加に対して全ての実験において有意に増殖速態系は年々変化を続けており，これまでの流入負荷度が増加したが，グルコースやアンモニウム添加 20削減などによる影響とともに，これからは気候変動に対する応答は全く見られなかった（Gurung andによる変化も予想されるため，今後も継続して琵琶Urabe, 1999）。 そ こ で， 筆 者 ら も 2018 年 11 月 に湖内外の変化を捉え，注視していく必要があるだろPO4 とグルコース添加に対する BP の応答を調べたう。
（図 6）。その結果，北湖北部に位置する調査定点今
津沖中央（17B）では PO4 添加によって BP 増加が見
4．今後の課題・展望
られたのに対し，12B では PO4 添加では BP は増加
15
せず，グルコース添加によって増加した。このこと
我々が開発した N-dA 法は DNA 抽出や酵素加水
分解，LC-MS/MS による分析などの工程が必要であから，12B ではリン律速ではなく炭素律速が起こっ
り，測定にかかるバイアスは非常に低く抑えられてていたことが示唆された。ここで，北湖における一いるものの，従来法と比較して簡便かつハイスルー
次生産量の長期変動を見てみると，1996～1997 年の
－2
－1
一次生産量
（1.2±0.6 gC m d ; Urabe et al., 2005） プットな分析法ではないことが普及の課題となって－2－1
は，1985～1987 年（0.67±0.37 gC m d ; Takahashi,
いる。DNA 抽出の工程では，FastDNA SPIN Kit for－2－1
et al. 1995），2016～2018 年（0.48±0.37 gC m d ;Soil などの簡便な抽出法を用いた際には後段の酵素
2148

地球環境 Vol.25 No.1&2

43 - 52（2020）(pmol L-1 h-1)

3H-Leu取り込み速度

800
600
400
200
0

図8

0

200
400
600
800
D10+D9+D8-Leu取り込み速度(pmol L-1 h-1)

D10＋D9＋D8- ロイシン（Leu）と 3H-Leu 取り込み速度の関係．

図中の直線は Standard Major Axis（SMA）II 型直線回帰モ
デ ル を 示 す（［3H-Leu］＝0.95×［D10＋D9＋D8-Leu］－20, n＝36, r ＝0.93, p ＜0.001）．（Tsuchiya et al . 2020c よ り 引用）．

図7

D10-Leu 取り込み後の推定反応経路（Tsuchiya et
al . 2020c より引用）．

加水分解が阻害される可能性もあり，簡略化を行う
際は慎重に手法の選定を行う必要がある。また，酵
素加水分解に関しては，現在は 3 つの酵素を順番に添加する手法を実施しているが（Nohara et al. 2011），
一種類の酵素の添加だけで DNA からヌクレオシ
ドまで分解する方法も報告されている（Quinlivan
and Gregory, 2008）。我々はそのうちの 1 つである
Benzonase について実際に湖のサンプルを用いて加水分解を試みた。しかし，Benzonase を用いたサン
15
プルでは酵素加水分解が進まず， N-dA は定量できなかった（土屋，未発表）。今後，このような工程の簡略化が進めば，よりハイスループットな測定法として用いることができると考えられる。
現在筆者らはタンパク質合成速度測定法の安定同位体法を開発中である（Tsuchiya et al. 2020c）。 この手法では，ロイシン（Leu）のアミノ基とカルボ22キシル基を除く 10 個の H を安定同位体である重水素 D で標識したものを用いる（D10-Leu,（CD3）2CD
CD2CD（NH2）COOH, DLM-567, Cambridge Isotope
Laboratories, Inc., 図 7）。D10-Leu を バ ク テ リ ア に－1
取 り 込 ま せ た 後，6 mol L 塩 酸（110 ℃，20 時間）でタンパク質をアミノ酸まで分解する。その後，塩酸をロータリーエバポレーターで飛ばし，
13
内部標準（ C6-L-Leu, CLM-2262-H, Cambridge Isotope－1
Laboratories, Inc.）を加えた 0.3 mol L 塩酸に再溶
解させ，最後に LC-MS/MS によって定量するという手順を経る。実際に霞ヶ浦や琵琶湖のサンプルを用いて D10-Leu 取り込み速度を測定したところ，
興味深いことに D10-Leu（m/z 142.10）のみならず，
D9-Leu（m/z 141.10）や D8-Leu（m/z 140.10）も 検 出 された。Leu は細胞内に取り込まれた後，アミノ基
転 移 反 応 な ど に よ り 4-methyl-2-oxopentanoate と23
な る が（Rudman and Meister 1953; Sanwal
and Zink
1961）， そ の 際 に 2 位 の D が 外 れ，D9-4-methyl-2oxopentanoate となる（図 7）。その後，アミノ基付加反応が起こり Leu に戻る際には，2 位に D では
な く H が 付 加 さ れ る こ と に よ り，D9-Leu と し て
検 出 さ れ た と 考 え ら れ る。 ま た，D9-4-methyl-2oxopentanoate の 3 位 の D が H に 置 換 さ れ る こ とにより，D8-4-methyl-2-oxopentanoate となる。これに ア ミ ノ 基 が 付 加 さ れ， 再 び Leu に 戻 っ た も のが D8-Leu として検出されたと考えられる。一方，
D7-Leu は検出されなかった。このことから，タンパク質合成へ使用された細胞外 Leu の量は，D10-，
D9-，D8-Leu を測定することにより，過不足なく定量できると考えられる。実際に，琵琶湖，霞ヶ浦に3おいて H-Leu 法と D10-Leu 法の取り込み速度を比較したところ，両者間で有意な正の相関を示すとと
3
もに，傾きもほぼ 1 を示した（［ H-Leu］＝0.95×［D10＋D9＋D8-Leu］－20, n＝36, r＝0.93, p＜0.001; 図 8）。
3
このことから，D10-Leu 法は H-Leu 法の放射性同位体フリーな代替法として用いることが可能であるこ49

土屋：放射性同位体を用いないバクテリア生産測定とが示された。
一方，D9-Leu と D8-Leu の合計取り込み速度は，
D10-Leu 取 り 込 み 速 度 の 3～19 倍 も の 値 を 示 し た（Tsuchiya et al., 2020c）。このことは，細胞外 Leu はバクテリアによって取り込まれた後，直接タンパク
質合成へ利用される画分は比較的小さく（D10-Leu として検出），速やかにアミノ基転移反応が起こり，
一度 4-methyl-2-oxopentanoate になった画分がタン
パク質合成へ使われる割合が大きいことが本研究によって初めて明らかとなった（D9＋D8-Leu として検出）
。 す な わ ち，Leu→4-methyl-2-oxopentanoate→
Leu→タンパク質という代謝回転は，単なる受動的な化学平衡反応というよりも何らかの生理学的意義があるものと考えられる。Leu は細胞内でさまざまな代謝系の基質や制御因子としても重要な役割を果たしているため，その細胞内濃度は適正に制御されている必要がある。そのため，上述した反応は細胞外から取り込んだ過剰な Leu を 4-methyl2-oxopentanoate の 形 で プ ー ル し， 必 要 に 応 じ てLeu に再生して利用していた可能性が考えられる。
このような代謝反応が生理学的，生態学的にどのような意味をもつのか，今後の研究が待たれる。
謝辞

本研究は JSPS 科研（2550019，15K21449，JP17K
12814，JP17J11577），環境省及び（独）環境再生保全機構環境研究総合推進費（5-1607），地方創生交付金
共同研究「健全な水環境保全のための水質・湖底環
境に関する研究」，笹川研究科学助成（25-716）の助成を受けたものである。琵琶湖における調査では京都大学生態学研究センターの研究船「はす」，滋賀県
琵琶湖環境科学研究センターの研究船「びわかぜ」
を利用した。ここに記して謝意を表する。
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土屋健司／Kenji TSUCHIYA

1986 年広島県生まれ。2014 年創価大学大学院工学研究科環境共生工学専攻博士後期課程修了。博士
（工学）
。専門は水
圏生態学，
生物地球化学。創価大学助教，
JSPS 特別研究員 PD を経て，2020 年 4 月
より国立環境研究所特別研究員。相模湾
や霞ヶ浦，琵琶湖などのフィールドにおいて植物プランクト
ンやバクテリアなどの低次栄養段階生物群集の生産生態に関する研究を実施してきた。また，湖沼の底生動物や河床のバ
イオフィルムなど，陸水の底生環境を通じた物質循環に着目した研究も進めている。