3D16
フェムト秒過渡吸収測定にもとづく BLUF タンパク質活性化機構の検討〇藤澤知績 1、竹内佐年 1、増田真二 2、田原太平 1（理研田原分子分光 1・東工大バイオ研究基盤支援総合セ 2）
Femtosecond time-resolved absorption study of photoactivation mechanism of BLUF proteins
1121〇Tomotsumi Fujisawa , Satoshi Takeuchi , Shinji Masuda , Tahara Tahei(Molecular Spectroscopy Lab., RIKEN1, Center for Biological Resources and Informatics andEarth-Life Science Institute, Tokyo Institute of Technology2)【序】BLUF(Blue Light sensing Using FAD)タンパク質は FAD(flavin adenine dinucleotide)を発色団とする生体の青色光センサーである。BLUF タンパク質内で FAD が光を受けると、FAD の光サイクル反応とタンパク質構造変化が結びついてタンパク質の活性化が起こる。この活性化状態のタンパク質構造変化が生体の青色光感知のシグナルである。
BLUF タンパク質の活性化状態は、光受容前の暗状態に対して 10nm ほど赤方シフトした吸収バンドを持つのが特徴である。BLUF タンパク質活性化に伴うこの吸収スペクトルシフトは、発色団 FAD 周辺の水素結合構造変化が原因であると考えられてきた。しかし、そのメカニズムは不明である。また BLUF タンパク質の活性化状態の生成プロセスにも現在のところ2 種類の報告があり、BLUF タンパク質の多様な光サイクルの原因と活性化機構の双方の解明が必要とされている。本研究では、新たに BLUF タンパク質 PapB(紅色細菌 Rhodopseudomonas
palustris 由来)を対象としてフェムト秒過渡吸収測定を行い、BLUF タンパク質の光サイクルとその活性化機構について検討した。

0.006
S1 S0 absorption【実験】PapB のフェムト秒過渡吸収測定

0.004(時間分解能:0.1ps)には励起光 450nm を用
0.000ファー、pH 8.0)に調整し、長寿命の活性化状態の蓄積を避けるため十分に速いフロ-0.002ー速度で測定を行った。

-0.004【結果と考察】図 1 に得られた PapB の過-0.006

FAD73∆ O.D.

渡吸収スペクトルを示す。励起直後に現れDelay (ps)9757332013

Excitation

0.002

いた。サンプル濃度は約 0.3mM(Tris バッ

るスペクトル (赤)は第一励起状態(S1 状態)に由来し、暗状態のブリーチ(~450nm)

0.7
Delay (ps)97113
153193313473

0.0040.002と誘導放出(~550nm)による 2 つの負のバンドが観測される。S1 状態の減衰に伴って、600nm 付近に反応中間体の生成による吸0.000(Tris buffer, pH = 8.0)
-0.002

収バンド(青)が現れた後、最終的に長寿命の分散型のスペクトル(緑)が残る。このスペクトル形状は暗状態からのスペクトルシフトによるものであり、活性化状態に帰属できる。

-0.004-0.006400450500550600650

Wavelength (nm)Figure 1. Transient absorption spectra of PapB700

図 2 は特異値分解を利用して行った遅延時FADH•

間 73ps でのスペクトル分割の例である。図 2
1 mO.D. / div.と同様に、どの遅延時間においても過渡吸収スペクトルは S1 状態、反応中間体、および活性化状態の 3 つのスペクトルで構成すること

Activated state
S1 stateができ、得られたスペクトル形状から反応中間体は FADH ラジカル(FADH•)に同定された。

TA spectrum at 73 ps
Reconstrcuted spectrum

このことは、PapB の光活性化において発色団
400

FAD にプロトン共役電子移動が起こることを意味する。

450500550600
Wavelength (nm)

650

700

Figure 2. Decomposition of transient absorption spectrum

スペクトル分割から得られた S1 状態、FADH•および活性化状態の時間プロファイル(軽水および重水中)を図 3A に示す。これまで BLUF タンパク質の光活性化過程には、FADH•を経由する活性化(FADH• → 活性化)と S1 状態から直接に活性化(S1 → 活性化)する 2 種類のプロセスが報告されており、前者はプロトン移動、後者には電子移動が重要となると考えられてきた。PapB の活性化状態の生成速度には顕著な重水素置換効果が現れており、これは PapB の光活性化にプロトン移動が関与することを示している。
PapB の S1 状態は 2 段階で減衰するため、PapB の反応プロセスの解析には FADH• → 活性化に基づいた 2 状態モデル(図 3B)を用いた。FADH•を生成して活性化する状態(a%)と活性化せずに暗状態に戻る状態(b%)を考慮した 2 状態反応モデルは、PapB の光反応プロセスをよく再現できる(図 3A)。また、活性化する状態は速い S1 状態の減衰定数 (τa,下表)を持つため、近距離のプロトン共役電子移動が活性化状態の生成に効果的になることを示唆する。講演では FADH• → 活性化が報告された Slr1694(シアノバクテリア Synechocystis 由来)と比較し、PapB の光サイクルと活性化機構の詳細を議論する予定である。
(B)

(A)

kIC

1.0
0.8
0.6

a%

S1 state

Dark

hv

k1

S1FADH•

k2

Activated

k3

0.4
0.2

k4

Amplitude (a.u.)

0.0b%

1.2

Dark

hv

S1FADH•0.8

Fit parameters
0.4

a:0.00.64 (H2O) / 0.5 (D2O)

b=1-a :

0.36 / 0.5

S1-state lifetime

1.00.8τa=(k1+kIC)-10.6

Activated state

0.4

29 ps (H2O)
36 ps (D2O)

τb=(k4)-1114 ps
157 ps

FADH• lifetime

0.2

open: H2O, closed: D2O

0.0
0100

200300400 500 600
Delay (ps)

700

800

900

τFADH =(k2+k3)-1119 ps (H2O)
197 ps (D2O)

Figure 3. Kinetic analysis of PapB. (A): Temporal profiles (○ in H2O, ● in D2O) of S1 state, FADH• and activated statewith the fitting curves based on the reaction model (B).

Fit parameters are listed on the table.