共同研究
立 S21-17大脳皮質シナプスの３次元観察に最適な軟Ｘ線光学系と試料サイズの検討
Optimization of Soft X-ray Microscopy System for 3-dimensional Imaging of theCerebral Cortex and Investigation of Size of the Sample
水谷 治央 a，大東 琢治 b，難波 秀利 c，竹本 邦子 d，木原 裕 d，高木 利久 aHaruo Mizutania, Takuji Ohigashib, Hidetoshi Nambac, Kuniko Takemotod, Hiroshi Kiharad, Toshihisa Takagiaa東京大学 学術統合化プロジェクト，b 立命館大学 総合理工学研究機構，c 立命館大学 理工学部，d 関西医科大学

aScience Integration Program, University of Tokyo, bResearch Organization of Science & Engineering, Ritsumeikan University,cDepartment of Physical Science, Ritsumeikan University, dKansai Medical University

軟 X 線顕微鏡を用いてマウス大脳皮質に含まれるシナプスの３次元構造を観察するため、光学系のエネルギー分解能を 300 から 225 へ低下させることで焦点深度を深くし、より多くのフォトンフラックスを利用できるシステムを構築した。X 線の波長 1.7 nm を使用するときの適切な試料厚さは 1.6 µm 程度であった。これらの条件の下に、収束イオンビームを用いて、大脳の円柱状試料を削り出し、Computed Tomography による３次元観察を行なった。
For 3-dimensional imaging of the synapses in the mouse cerebral cortex by using a soft x-ray microscope, the optical system wasoptimized to take advantage of more photon flux and deeper focal depth by the introduction of the energy resolution decreased
from 300 to 225. In case that the x-ray wavelength was 1.7 nm, appropriate sample thickness was 1.6 µm. Under these conditions,computed tomography of the cylindrical brain sample fabricated by focused ion beam was performed.
背景と研究目的： 脳の高次機能は、神経ネットワロセスである上に、時間が掛かり、作業手順の膨大さークを基礎的土台として構築されていると考えられてからミスが多くなる欠点がある。そこで、電子顕微鏡いる。そのため、神経ネットワークの配線構造を明らに代わる観察手法として着目したのが、Ｘ線顕微鏡でかにすることによって、脳高次機能の動作原理を解明ある。近年、超微細加工技術の発展に伴って高分解能する端緒となることが期待されている。そこで神経回の光学素子の製作が可能になってきたため、Ｘ線顕微路の配線図をいかにして観察し、再構築するかという鏡はシナプスを観察できる分解能にまで達してきてい方法論の議論がさかんに行われている。その実現のたる。また、Ｘ線は、電子線に比べて透過力が高いため、めには、神経細胞の接合部位であるシナプスを可視化より厚い試料を観察できることが利点である。この利できるのに充分な高分解能の観察手法が必要であり、点は、Computed Tomography (CT)の手法を適用することそこで得られた観察画像から、３次元配線構造へと可によって、非破壊で２次元画像である投影像群から３視化し、神経ネットワークを解析する手段も必要とな次元画像を再構成する事を可能とする。そこで本研究る。そこで近年、有効な手段として行なわれているのでは、
顕微 CT による神経ネットワークの高分解能３次が、膨大な数の電子顕微鏡スライス画像を一枚ずつ取元イメージングの実現を目指し、立命館大学 SR センタ

り込んでスタック化し、神経ネットワークの立体構築

ーの BL-12 に設置されている結像型軟Ｘ線顕微鏡[2,3]を行なう方法である[1]。しかし、この手法は破壊的プを用いて、光学系の最適化と、適切な試料サイズを検討する事を目的とした。

Filtered Back-Projection 法で再構成を行なった。Fig. 1 に再構成を行なった試料の１断面を示す。内部に明確な実験：試料として、C57BL/6J マウスの大脳皮質を用構造が観察できない上に、再構成像周囲のエッヂが大いた。大脳皮質は、2.5%グルタルアルデヒド・2%パラきくぼけているのは、試料のドリフト以上にＸ線照射

ホルムアルデヒド溶液を用いて灌流固定を行なった後、に因る試料の収縮が原因であることが測定開始時と終同溶液にて一晩浸漬固定した。これを 1%四酸化オスミ了後の投影像の比較から判明した。この収縮は、試料ウム溶液にて後固定し、クエン酸鉛を用いてブロックの脱水不足か樹脂の重合不良が原因である可能性があ染色を行った。脱水処理はエタノール・プロピレンオる。

キサイドを用いて行い、エポン樹脂に包埋し、70℃・2Table: Relationship between transmittance, contrast and wavelength

昼夜で樹脂を硬化させた。この樹脂ブロックをウルト

Wavelength [nm]2.31.91.7

ラミクロトームで超薄片に切り出して電顕メッシュ上Transmittance

0.360.360.44に乗せ、電子染色を行ったものの観察を行なった。まContrast

0.190.200.25

た、CT 計測においては、収束イオンビーム (FIB)を用いて、試料を直径約 1µm の円筒状に加工したものを観察した。
光学系の最適化として、最終的に CT を行なうことを前提に、分光用ピンホールを従来の 15 µm から 20 µmに変更した。これにより、エネルギー分解能は計算値で 300 から 225 へと低下するが、空間分解能をさほど低下させずにより多くのフォトンフラックスを得られ、また光学系の焦点深度を 12 µm 程度まで深くすることが出来た。本研究ではこのセットアップで観察を行なった。

2 µm
Fig. 1: Cross section of the cerebral cortex of a mouse

結果及び考察：波長 1.7、1.9、2.3 nm の３種類を用いて 1 µm 厚切片の観察を行ない、そこから平均的な透過今後の課題：包埋樹脂の選定及び包埋方法の再検討を率とコントラストを求めた (Table)。この表より、1.7 nm行なう必要がある。の時が最も透過率が高い上にコントラストが高くなっているのは、波長を短くすることで包埋樹脂の透過率

参考文献が高くなるのに対して、染色に使用した重金属の吸収[1] J. W. Lichtman and J. R. Sanes, Curr. Opin. Neurobiol., 18,率はさほど変化しないためと考えられる。ここで透過(2008), 346-353.

率を0.44 として波長1.7 nm の時の厚さに対する透過率[2] A. Hirai et al., J. Synchrotron Rad. 5, (1998), 1102-1104.

曲線を描くと、およそ 1.6 µm 厚で透過率は 0.2 以下と[3] A. Hirai et al., Jpn. J. Appl. Phys. 38, (1999), 274-278.

なる。この厚さを、CT を行なう為に充分な透過率のしきい値であると仮定し、FIB 加工で樹脂包埋ブロックの削り出しを行なって微細な試料を作成し、CT を行なった。このとき波長 1.8 nm を用い、投影像取得は 3.6°毎に 50 投影行なった。この際ひとつの投影角あたりに、露光時間60 秒で得られた投影像を3 枚積算したものを１枚の投影像として用いることで、画像の統計量の向上を図った。こうして得られた一連の測定データに対し、試料及び光学系のドリフトを手動で補正した上でキーワード・シナプス
神経細胞間に形成される情報伝達に関わる接合部位とその構造。主に小胞（直径は約 40 nm）を持つ化学シナプスである。情報を伝える方の細胞をシナプス前細胞、伝えられる方の細胞をシナプス後細胞という。神経細胞はシナプスを介して結合し、複雑なネットワークを構築している。