表面科学 Vol. 34, No. 9, pp. 488-493, 2013
特集「生体材料，細胞表面の SPM 評価」

研究紹介

マイクロナノ電極システムを用いたバイオセンシングとバイオイメージング
高橋康史 1・珠玖

仁 2・末永智一 1, 2

1

東北大学原子分子材料科学高等研究機構 〠 980-8577
2
東北大学 大学院環境科学研究科 〠 980-8579

宮城県仙台市青葉区片平 2 丁目 1-1
宮城県仙台市青葉区荒巻字青葉 6-6-11（2013 年 4 月 30 日受付；2013 年 6 月 4 日掲載決定）

Bio Sensing and Imaging by Using Mirco/Nano Electrode System
Yasufumi TAKAHASHI 1, Hitoshi SHIKU 2 and Tomokazu MATSUE 1, 2
1

WPI Advanced Institute of Materials Research, Tohoku University, 2-1-1 Katahira, Aoba, Sendai, Miyagi 980-8577
2
Graduate School of Environmental Studies, Tohoku University, 6-6-11 Aramaki, Aoba, Sendai, Miyagi 980-8579(Received April 30, 2013 ; Accepted June 4, 2013)

The micro/nanoelectrode has unique characteristics, which are not expected for conventional electrodes, such as thecapability to perform localized measurements, low double layer charging currents, low ohmic drops, and fast masstransport. Scanning electrochemical microscopy (SECM) with a micro/nanoelectrode for detecting electroactive
chemical species and is an effective tool for the investigation of the localized chemical properties of sample surfaces andinterfaces. Because SECM has high temporal resolution under physiological conditions, it is particularly well suited forquantitative measurements of chemicals like neurotransmitters, nitric oxide, reactive oxygen species, and oxygen, which
are released/consumed by living cells. This article presents an overview of the recent progress of SECM.
KEYWORDS : micro electrode, nano electrode, scanning electrochemical microscopy

1．は

じ

め

に

電極半径が 50 µm 以下のマイクロ・ナノ電極を利用

3．ボルタンメトリーにおいて定常電流となるため解析が容易である。電子移動が十分速い速度で起きているときには，直ちに球面拡散に起因する定常電流値した電気化学計測では，通常の電極と比べ非常に面白いに到達する。次式に定常電流値の理論式を示す。

特徴を有する 1, 2)。下記にその特徴を列挙する。

I s＝4nFc ＊Da

1．電流が小さいため IR 効果が少ない。有機溶媒中や支（ガラスの厚さが電極半径の 10 倍以上の場合）3, 4)

持塩を加えずに測定を行うことができる。
2．高速で物質移動を捉えることができる。物質移動速a

電極半径（cm）

D＊

拡散係数（cm 2/s）
バルクでの反応物の濃度（mol/cm 3）度は，次式で表される。

c

m＝D/a

n

m

物質移動速度（cm/s）

電子移動が律速となる（準可逆な定常電流）のサイa

電極半径（cm）

クリックボルタンメトリーでは，電極-電気化学反応

D

拡散係数（cm 2/s）

種間での電子移動速度を，波形から見積もることが電極が小さくなるほど，より速い物質移動速度の測定が可能となる。

反応電子数

できる 5, 6)。
4．充 電 電 流 が 小 さ い た め 高 速 で 電 位 を 掃 引 で き る。
Wightman らは，神経伝達物質の検出において，2400
V/s ほどの高速 CV 測定により，ドーパミンを高感高橋康史・珠玖

度に測定することに成功している 7, 8)。

2．走査型電気化学顕微鏡

仁・末永智一489が減少する。これは，電極表面への電気化学活性種の輸送が阻害されるためであり，ネガティブフィードバック効果と呼ばれている。この電流変化は，試料の形状と電走査型電気化学顕微鏡（SECM）は，マイクロ・ナノ

極をシールしているガラス部分の厚さ（RG）に依存す

電極を探針として用いて試料表面を走査しながら電気化る（Fig. 1（b））。ネガティブフィードバック効果から，学活性種を酸化/還元し，電極の位置情報と得られた電試料の高さを見積もることができるため，試料表面を電流値から試料表面での化学物質の濃度プロファイルを取

極により走査し，各測定点での電流値から試料の凹凸を

得できる

9〜11)

。ここでは，SECM の測定手法，システ

知ることが可能である。

ム，生体センシングの応用例，さらに近年活発に行われ生体試料への応用として，ネガティブフィードバックている高解像度 SECM の開発状況に関して紹介する。

効果を利用した細胞の形状測定が行われた。細胞膜を透2. 1 測定手法

過しづらい電気化学メディエータを利用すると，細胞表

SECM による微小電流の測定手法として，フィードバ

面において絶縁性基板と同様に拡散を阻害するため，電ック（FB）モード，ジェネレーション-コレクション

流値の減少から細胞の高さを見積もることができる。一（GC）モードに大別される（Fig. 1）。

般的に，Fe(CN) 6 3−/4−，Ru(NH3) 6 3＋/2＋ のような金属錯

フィードバックモードは，試料との電子の授受を仲介

体メディエータは，電荷を有して親水性が高いため細胞する電気化学メディエータを溶液に加え，電極-試料間膜の透過性が低い。これらのメディエータを利用するこで行われる電気化学メディエータの酸化/還元反応を定とで，細胞に対して非接触で，電極を細胞に近接させる

3, 4)（Fig. 1（a））。マイクロ・ナ

こ と が で き る。こ れ ま で，神 経 伝 達 物 質 を 放 出 す る

ノ電極を絶縁性の試料表面に近接させていくと定常電流

PC12 細胞の形状測定が行われた。細胞に電極が接触す

量的に捉えるものである

ると，物理的な刺激により細胞からの神経伝達物質の放出が誘導されてしまう。そのため，電気化学メディエー
タとして Ru(NH3) 6 3＋/2＋ を用い，ネガティブフィードバ
ックを利用した PC12 細胞の形状測定と神経伝達物質の検出が行われた 12〜14)。
一方，電極を導電性試料表面へと近接させていくと，電極により酸化/還元された反応物が，導電性基板表面
で還元/酸化される。導電性基板がマイクロ・ナノ電極
よりも十分に大きい場合には電極を近接させると電流値が増加するため，ポジティブフィードバック効果と呼ばれている。この電流の増幅率は，電極-試料間での電気化学メディエータの移動時間に依存する。そのため，電極-試料間距離を近接させることで，酸化還元サイクルの回転効率を高めることができる。これまで，Bard ら
は，ナノ電極（直径 15 nm）を用いて，ナノ電極-試料間距離を 10 nm まで近接させ，単一のフェロセン（Fc）
誘導体の酸化還元サイクルに伴う電流を観察した。この
場合，Fc が電極-試料間を移動する時間は，0.1 µs となり，単一の Fc が毎秒 10 7 回電極と反応していることとなる 15)。ごく最近，デバイス型ナノ電極においても，同様の原理で単一分子の検出が行われ注目を集めている 16)。
生体試料への応用として，基板に固定化した酵素につFig. 1. Schematic illustration of the (a) feedback mode. (b)Approach curves toward conducting (top curves) andinsulating (bottom curves) substrates. RG is defined as theratio between the insulator thickness and the radius of the
microdisk electrode. (c) Generation collection mode.

いてポジティブフィードバック効果を利用した測定が行われている。ここでは，電気化学メディエータとして
Fc，固定化酵素としてグルコースオキシダーゼ（GOx）
を用いたものを紹介する 17)。グルコースオキシダーゼ

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は，グルコースを酸化し，グルコノラクトンを生成する。この反応の際に，マイクロ・ナノ電極により Fc が酸化されて生成した Fc ＋ が還元される。GOx により再生された Fc が再び電極上で酸化される。電極-GOx 間において Fc が酸化還元を繰り返すことで，GOx 上において電流の増加がみられる。固定化された酵素の表面密度がわかっている場合には，酵素のターンオーバーを定量的に評価可能である。Mirkin らは同様の原理を細胞内での酸化/還元反応の検出に応用し，異種類の細胞種の識別を行った 18)。
ジェネレーション-コレクション（GC）モードは，試料から生成される電気化学活性種を電極により検出する（Fig. 1（c））。電気化学メディエータが測定溶液中に存在しないため，バックグラウンドの電流が非常に低くなり，高感度に電気化学活性種を検出できる。これまでゼプト（10 −21）モルレベルで，神経伝達物質の検出が行Fig. 2. SECM setup.

われた 19)。また，試料表面から一定速度で放出される化学物質の流速を見積もることができる。Bard らは，生細胞に関してメナジオンの解毒代謝速度を見積もること

Axon などから販売されているパッチクランプ用の微小に成功している 20)。この原理は試料から生成される化学

電流増幅器も利用できる。この場合には，参照電極を対物質だけでなく，消費される化学物質にも適用すること極とした 2 電極方式が用いられる。電流そのものが小さが可能である。我々のグループでは，1990 年代の後半

いために，IR ドロップの影響がほぼ無視できるためでから細胞の呼吸に伴う酸素消費量を定量的に測定する研ある。

究を続けており，薬剤スクリーニングや，牛の受精卵の21〜23)

AD/DA ボードについては，Windows などの OS を利。SECM は，スループットが用した場合には，システムタイマーの分解能が 1 ms ほ

必ずしも高いとはいえないが，受精卵のようなかけがえどであり，電極-試料間距離の制御には時間分解能が十のない試料を，非侵襲的に測定するには非常に有効であ分でない。そのため，一般的に走査型プローブ顕微鏡のる。

コントローラに用いられているデジタルシグナルプロセ

評価に利用されている

2. 2

測定システムSECM は，微小電流を検出するための微小電流増幅器と，プローブの位置を制御するポジショナー，データの取得や機器との通信を行う AD/DA ボード，PC から構ッ サ（Digital Signal Processor : DSP）や FPGA（fieldprogrammable gate array）など PC を介さずに制御が可能なボードを，PC に搭載することが望まれる。
2. 3

SECM による生体センシング

成されている。ナノ電極を利用し，電極-試料間距離制

電気化学測定は，溶液中の化学物質の濃度を非侵襲か御が可能な SECM に関してブロック図を Fig. 2 に示す。

つ定量的に捉えることができるため，細胞，微生物，酵一般的な SECM の微小電極の位置は，ステッピング
モータによりコントロールされている。この場合には，素などの評価に有効である。
細胞に関しては，酸素，一酸化窒素，神経伝達物質，

ステッピングモータのコントローラに対して，PC から

過酸化水素など生体機能の維持や調整と関連の深い分子

シリアル通信によりコマンドを送ることで，コントローの直接酸化/還元が可能であり，前述したように SECMルが行われる。ナノ電極を利用する場合には，より精密を用いることで単一細胞から生成/消費される化学物質

な位置制御が必要となるため，ピエゾ駆動のポジショナの流速を定量的に捉えられる。また，電極に酵素を修飾ーが利用される。ピエゾ駆動のポジショナー用コントロ

すると，グルコースや ATP なども測定することが可能ーラに対して，DA ボードから電圧シグナルを送ることである 24, 25)。

で，プローブの位置を制御する。

SECM では，局所的に電極反応を誘起することで，化電気化学測定において一般的に使用されている 3 極方

学物質の濃度勾配を形成することができるため，生体膜

式のポテンシオスタッドも微小電流の計測に利用できるや脂質二分子膜（BLM）の透過性評価にも応用されてが，Keithley などから販売されている微小電流増幅器やいる。膜の透過性を評価する電気化学メディエータを溶高橋康史・珠玖仁・末永智一491て利用するものの二つに大別することができる。
細胞由来の酵素の検出に関する応用例としては，再生医療の材料として注目されている ES 細胞の分化状態の評価や 28)，レポータータンパク質を利用した細胞センサ
ーの開発が行われた 29, 30)。ES 細胞に発現しているアル
カリフォスファターゼ（ALP）は，細胞の分化が進むにつれて発現量が減少する。この ALP の発現の減少を
SECM により捉えることで，ES 細胞の分化状態を評価した。また，細胞センサーでは，ネクローシスを誘導す
る TNF-α に応答して細胞外に ALP を放出するように細胞に遺伝子操作を施し，ALP の放出量を指標として，
TNF-α を検出する（Fig. 3（b））。細胞の酵素発現状態
は，数 日 単 位 で 変 化 す る た め，非 侵 襲 測 定 が 可 能 な
SECM が有効である。
生体分子の標識として利用される酵素には，西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（HRP）などがある。これまで，
HRP を標識酵素としたサンドイッチ型イムノアッセイにより検出する際に，抗原の電気化学的な検出が行われた 31)。さらに，細胞表面の膜タンパク質に酵素を標識し，特定の膜タンパク質の発現状態の評価が行われた（Fig. 3（c））。これまで，癌細胞の増殖と関連の深い上皮成長因子受容体（EGFR）に関して，SECM により単一細胞レベルでの発現状態の評価が行われ，膜タンパク
質の発現状態を評価する際に一般的に用いられているフローサイトメトリーと良好な相関が得られた 32, 33)。本手法では，細胞内外を明瞭に識別可能なため，膜タンパク
質の膜界面での動きをリアルタイムで観察可能である．
2. 4

高解像度システムの開発

SECM の解像度は，ほかの SPM と比べ非常に低い。
Fig. 3. Schematic diagram of SECM bio-sensing applications. (a) Ionic and redox current simultaneous measurementsof transport across a BLM. (b) Characterization of a reporter
system using SECM. The expression of the secreted ALP ismonitored electrochemically. (c) Membrane protein (EGFR :epidermal growth factor receptor) detection using SECM
generation-collection mode.

その原因は，マイクロメートルスケールの電極を用いて，溶液中を拡散する化学物質を検出するためである。
そのため，解像度の向上を目指したナノ電極の開発が盛んに行われている。その手法は三つに大別できる。一つは，ガラス管内に Pt あるいは Au の細線（約 10 µm）を封止した状態で，CO 2 レーザープラーを利用して伸長する手法である。この手法は，ナノ電極の作製において最も一般的に行われている。集光イオンビームなどを利用

液中に加え，電極を細胞膜表面に近接させた際の電流変し，先端を切断することで，比較的簡便にナノ電極を作化から，細胞膜の透過性を評価する。これまで，イオン製できる 34, 35)。二つ目は，Pt あるいは Au の細線（約 10チャネル，動物細胞膜，細胞の核周囲に形成されているµm）を電解エッチングする手法である。この手法は比26, 27)（Fig. 3較的古くから行われているが，ナノ電極を作製するたび（a））
。マイクロ・ナノ電極では，高速で物質移動を評価に，金属細線のエッチングやエッチングを行った細線をできるため，核膜孔のような比較的大きな孔（直径 120ガラス管で封止し，研磨を行う必要があるため職人技がnm）の透過性評価に有効である。

要求される 36)。三つ目の手法として，焼成カーボン電極

孔（核 膜 孔）の 透 過 性 が 評 価 さ れ て い る

SECM による酵素の測定では，細胞内や細胞表面などが挙げられる。この手法は非常に簡便であり，比較的簡細胞由来の酵素を検出するものと，生体分子の標識とし単に電極を作製できる。ブタンガスを先端を尖らせた石

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英管に充填し，先端部を加熱することで，焼成カーボン

SICM は，電解質溶液を充填したピペットに塩化銀線を層を形成する。これまで 10 nm 以下の電極が作製され挿入し，バスに存在する塩化銀線との間に電圧を印加している

14, 37, 38)。

これらのナノ電極の作製法の開発により，ナノ電極がた際に得られるイオン電流を利用し，ピペットと試料との距離を制御する手法である 43, 44)。この技術を SECM の比較的容易に作製可能となったが，ナノ電極を SECM

電極の位置制御に利用して（Fig. 4（a））
，基板上にスポに利用する場合には，その検出範囲が非常に短いため，

ット固定した GOx の活性を電気化学的に捉えた。スポ

電極半径と同等の距離に電極と試料を近接させながら電ット固定した GOx の縁部分において，ドーナツ状に高極の走査を行う必要がある。このため，電極を試料に近い 酵 素活 性 を 示 す こ と が，マ イ ク ロ 電 極 を 利 用 し た

接させる電極-試料間距離制御システムの導入が進めら

SECM により観察されていた 45)（Fig. 4（b，c））。我々

れてきた。これまで，シアフォース 39, 40)，原子間力顕微の開発した SECM-SICM では，光学顕微鏡では識別が

41)

鏡（AFM） ，インピーダンスを利用した距離制御シス
13)

困難な縁部分に形成された規則正しい窪みが確認でき

テムが ，SECM に搭載された。しかし，これらの手法

た。SICM の距離制御システムにより，SECM の解像度

は，電極と試料との接触や解像度の問題があり，生細胞を飛躍的に向上させることができたが，イオン電流とフに適用した場合には，細胞の微小器官などの細部を明瞭

ァラデー電流を同時に測定できるための複合電極が必要に識別しながら測定を行うことは厳しい。我々は，走査であり，小型化に限界がある。そこで，ナノ電極への印型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）の距離制御シ

加電圧を切り替え，電極の位置制御のための電流と，試ステムを SECM に搭載し，光学顕微鏡の分解能の回折料表面での電気化学測定のための電流を分 離した 14)

限界を超えた解像度での電気化学測定に成功した 37, 42)。

（Fig. 4（c））
。半径が 100 nm 以下のナノ電極では，定常電流に達するまでの時間が 20 ms 以下と非常に短く，印加電圧の切り替えの際の待ち時間を劇的に短縮することができた。この手法により，高解像度な形状と電気化学
同時イメージングに成功した。このような技術革新により，神経伝達物質の放出サイトのマッピングなど，細胞表面における不均一な化学物質の濃度プロファイルの取得が期待できる。

文

Fig. 4. (color online). (a) Schematic of SECM-SICM. (b)GOx images of conventional SECM and SECM-SICM. (c)Schematic of voltage-switching mode SECM. Topography(Left) and electrochemical (Right) images of A431 cells.

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