本記事は , 文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム事業 秀でた利用成果について紹介するものです .

文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム平成 29 年度秀でた利用成果

塩ストレス下におけるイネ葉の葉緑体の三次元構造解析～ FIB-SEM 微細構造解析でイネ生育阻害要因を探る～
近畿大学 農学部 山根 浩二氏に聞く

近大奈良キャンパスの山根氏（左），名大 FIB-SEM の前で大井氏を中央に中尾氏・榎本氏，後に荒井氏（右）文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム（NPJ）
事業は，最先端研究設備の利用機会を広く提供してイノ

１．
１ 名古屋大学 微細構造解析プラットフォーム [2]ベーションを促すことを目指している．微細構造解析，名古屋大学（名大）は，ナノテクノロジープラットフォー

微細加工，分子・物質合成の 3 つのプラットフォーム（PF）

ムの微細構造解析，微細加工，分子・物質合成の 3 つのから構成され，1,000 を超える最先端のナノテクノロジープラットフォームのすべてに参画している．その中で，設備を提供し，産官学の連携，技術の融合により，革新

本利用成果は微細構造解析プラットフォームを利用して的な研究成果が数多く生み出されてきた．利用件数は年得られたものである．

間 3,000 件を超える．その中から，NPJ は毎年，特に優名大 微細構造解析 PF は「高性能電子顕微鏡による反れた成果を上げた数件の研究課題を「秀でた利用成果」応科学・ナノ材料科学研究支援拠点」と呼称し，名大のとして表彰してきた．平成 29 年度の 6 件の表彰 [1] の一超高圧電子顕微鏡施設で事業を行っている．百万ボルト

つに，「塩ストレス下におけるイネ葉の葉緑体の三次元構の超高圧電子線により様々な環境下の試料を観察できる造解析」が選ばれた．ユーザーは，近畿大学農学部農業反応科学超高圧電子顕微鏡による支援を中心に，下表の生産科学科 作物学研究室

山根 浩二氏および名古屋大学高性能電子顕微鏡群（クラスター）を配置している．電

農学部／大学院生命農学研究科 植物生理形態学研究室の子顕微鏡のクラスターは，4 台の走査透過電子顕微鏡

大井 崇生氏と谷口 光隆氏，支援機関担当者は，名古屋大（STEM），透過電子顕微鏡（TEM）と走査電子顕微鏡（SEM）

学 微細構造解析プラットフォームの中尾 知代・榎本 早希の各 1 台で構成される．これに加えて，電子顕微鏡観察子・中野 美恵子・荒井 重勇・山本 剛久の諸氏であった．に用いる試料の作製装置を用意している．これらを総合

作物学研究において，どのように微細構造解析 PF を利用して，極微小元素分析，三次元立体観察，ガス中その場して，どのような成果が挙げられたかを知るべく，近畿観察，極低温観察を可能とし，支援項目の多様化による大学（近大）奈良キャンパスに，山根 浩二（やまね こうじ）PF 利用拡大が可能となった．この PF の設備利用は，名氏を訪ねた．

大の電子顕微鏡グループが総合的に支援している．

１．名古屋大学 微細構造解析プラット
フォームの FIB-SEM 装置を活用

NanotechJapan Bulletin Vol. 11, No. 4, 2018

１．２

活用した FIB-SEM 装置

電子顕微鏡群の装置は微細構造の観察の役割を担う．

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を切削しながら深度を変えて観察できる．また，加工表面のイオン照射による損傷が少ない．この特徴は，本利用成果のような植物細胞の観察には特に望ましいものであった（図 7 で記述）．
塩ストレス下におけるイネ葉の葉緑体の構造解析は，山根氏が名大の谷口 光隆氏をスーパーバイザーとし，同じ研究室の大井 崇生氏と共同で行ってきた研究である．
大井氏が名大 PF の FIB-SEM を紹介するセミナーに出席したのが利用のきっかけになったという．名大 PF では，高度の装置の操作は PF のスタッフが行い，利用者は立ち会って，共同で実験・観察を行う．本利用成果では，装置の操作を中尾 知代，橋本 早希子の両氏が行い，荒井重勇氏がアドバイザーであった．

図1

２．TEM を用いてイネの塩ストレス障害を探る

名大 PF の FIB-SEM

これに対し，試料作製装置の多くは電子顕微鏡で観察できるよう試料を加工する装置である．その中で，高速加２．１

植物の塩害の発生工観察分析装置（FIB-SEM，図 1）は観察と加工の両機能

河口近くの水田に海水が混入すると，イネは葉色が薄を備え，真空中の試料台に固定した試料表面を集束イオくなり，葉の内巻き現象を生じて下位葉から枯死する．

ンビーム（FIB）で切削加工し，露出した表面を走査電子

東日本大震災では，津波によって海水が流入し，水田土顕微鏡（SEM）でその場観察することができる [3]．FIB は，壌に高濃度の塩類が集積した．日本での土壌への塩類集イオンビーム照射によって試料表面から放出される二次積は，台風，津波などによって突発的に起こるが，世界電子を用いて試料表面を観察することもできるが，高分に目を向けると，塩類集積土壌は中央アジアを中心に広解能の観察は SEM の受け持ちである．FIB で数 nm ずつく分布している．

削って，SEM で観察して得られた画像を集積して画像処理すれば，三次元画像を構成できる．

イネが塩ストレスに曝されると，イネの葉の葉肉細胞内の葉緑体構造が崩壊し，光合成活性の低下をもたらす

FIB-SEM 装置はイオンビームと電子ビームの二つの鏡筒を備え，二つのビームが交差するように配置される．
従来機では，FIB 鏡体は SEM 鏡体に対して 50 ～ 55°の角度で設置されており，FIB によって斜めに切削された傾斜断面を SEM で観察していた [4]．これに対し，名大 PFの FIB-SEM は，FIB 鏡筒と SEM 鏡筒が直交するように配置されており，横から薄紙をはがすように FIB で試料表面を削り，新しい表面が作出されたら SEM で観察する．
SEM に対して常に正対するので試料断面は傾斜せず，観察位置が画面内で変わることがないため，同じ観察領域

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図2

種子植物の葉緑体の構造

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とされるが，その障害発現機構は未だに解明されていなからは，塩ストレスによる障害発現が起こる前の生理・い．種子植物の葉緑体は，図 2 のように二枚の包膜に囲形態変化を探っており，塩ストレス下で形成される葉緑まれ，さらに内部はストロマやチラコイド・グラナとよ

体突起構造に着目して研究を進めている．

ばれる内部構造から成り立っている．
図 3 に示すように，細胞周囲の塩分濃度が上がると，浸透圧によるストレスが生じるとともに，ナトリウムイ

２．
２ TEM 観察によるイネの塩ストレス障害発現機構オンが過剰になるのでイオンストレスが起こる．また，山根氏らは，塩ストレス障害発現機構を解明しようと，活性酸素が発生し，酸化ストレスを受ける．これらのス

塩ストレスを与えたイネ葉の葉緑体の微細構造を TEM でトレスによって生理・形態変化が引き起こされ，最終的観察し，塩ストレスを与えていない対照区と比較した．に障害が引き起こされる．山根氏らは，傷害観察とその名古屋大学生命農学研究科の資源植物環境学研究室（現，要因を 2003 ～ 2012 年に調べ，葉緑体の内部にあって植物生理形態学研究室）に在籍していた当時は，研究室光エネルギーを吸収・利用する場所となっているチラコ

所有の TEM を自由に使うことができた．イネは，人工気イドにおいて，その膜構造の膨潤という傷害と，その傷象器の中で，光を当てた通常の生育条件で 3 週間育てる．

害には活性酸素が関与することを見出した [5]．2010 年

イネの最上位展開葉は長さ 30cm 程度，葉内にある葉肉細胞一つは，直径が 15 ～ 20μm 程度の大きさになる．
このイネ葉から試料片を切り出し，化学固定法によって細胞内構造を保持させ，樹脂に包埋する．従来の TEM 観
察では，二次元画像しか得られないが，連続的に切り出した薄片の二次元画像を積み上げることによって，三次元構造を構築することができる．
75mM の NaCl を含む栄養液で 14 日間の塩ストレス処理をしたイネ葉を用いて，チラコイドの膨潤が生じる前の変化を TEM で観察したところ，葉肉細胞の葉緑体には短い突起構造 [5]（図 4b，矢印）や比較的長い突起構造（図 4c，矢印）が形成されていた．比較的長い突起構造は，ミトコンドリアを取り囲むように伸びているものもあっ

図3

塩ストレス障害発現機構

た（図 4d，矢印）．

図 4 葉緑体突起構造の形成．a：対照区，b ～ d：14 日間の 75mM NaCl 処理区．
M：ミトコンドリア．P：ペルオキシソーム．Bar=0.5μm（a ～ c）．Bar=0.1μm（d）．

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図 5 葉緑体ポケット構造の形成．a：対照区，b ～ c：4 日間の 100mM NaCl 処理区．
図 b ～ d 中の赤矢印はポケット構造を示し，図 b の緑と赤色部分は，それぞれ葉緑体本体と葉緑体から伸びたミトコンドリアを取り囲む細長い構造を示す．M：ミトコンドリア，P：ペルオキシソーム．Bar=0.5μm．

図6

葉緑体ポケット形成の仮説

さらに，100mM の NaCl を含む栄養液で 4 日間の塩ス

この仮説を論文にして国際誌に投稿したところ，採択

トレス処理をした後に葉緑体構造を調べたところ，イネされなかった．不採択の理由は，とびとびの二次元画像

葉の葉緑体にはポケット構造が形成されていた（図 5b ～の積み重ねでなく，連続画像を用いた三次元構造解析でd，矢印）．葉緑体ポケット構造とは，図 5b の赤色部分で裏付けるべきだ，というものであった．葉緑体の三次元示されるような葉緑体から伸びている細長い構造に取り構造解析が求められた．

囲まれた領域を示し，ミトコンドリアやペルオキシソームなど他の細胞小器官が取り囲まれている場合が多い．
複数の細胞小器官が一つのポケット内に一緒に取り囲ま

３．塩ストレス障害発現機構解明に向けた
FIB-SEM によるイネ葉緑体三次元構造解析れる場合や（図 5c），一つの葉緑体に複数のポケット構造が観察される場合もあった（図 5d）．
図 4d で観察されたミトコンドリアを取り囲む細長い構造や，ポケットを構成する細長い構造（図 5b，赤色部分）を合わせて考慮すると，葉緑体が作る細長いチューブ状

３．１
検討FIB-SEM を用いたイネ葉の観察のための条件の突起構造が，他のオルガネラ（例えばミトコンドリア）論文が不採択された頃，2014 年 6 月に名古屋大学にを取り囲み，最後には先端と本体がくっついて葉緑体ポFIB-SEM が導入され，その説明会に大井氏が参加した．

ケットが形成されるという，図 6 のような仮説が考えら

FIB-SEM を用いれば三次元構造解析が可能となり，論文れた．

採択の可能性が高まると，山根氏らは考えた．

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文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム平成 29 年度秀でた利用成果 -4イネ葉の葉緑体の三次元構造解析は次のように行われた．前述の TEM 観察に用いた葉切片を固定・包埋した樹３．２[7]

塩ストレスによる葉緑体ポケット構造の解明

脂ブロックを 3mm 角に切り出し，図 7 に示したようにFIB からのイオンビームと SEM からの電子ビームが直角

植物細胞の FIB-SEM 観察条件が整ったので，塩ストに交わる領域に観察したい葉組織の断面が位置するようレスによりポケットを持った葉緑体の立体構造の観察をに設置し，FIB で側方から削り取った新鮮な面を SEM で行った（図 9）．図 9（a）は，FIB-SEM による連続断面観観察する [6]．この FIB 切削と SEM 観察を反復して，厚察で得られた約 100 枚の写真の一部である．なお，試料さ方向の二次元画像スタックを得る．FIB による切削厚さを手動で切り出して観察を行う TEM の場合では，連続写は 50nm としたので 15 ～ 20μm の葉肉細胞を観察するには，300 ～ 400 枚の写真を撮ることになる．この画像

真は 30 枚程度にとどまる．図 9（a）で示した FIB-SEMスタックから，三次元像構築ソフト（AVIZO）により三次立体構造が構築された．図 9（c）は塩ストレスを与えな元画像を構築する．

い対照区における葉緑体の三次元再構築像である．図中によって得られた二次元画像のスタックから図 9（b）の植物組織は細胞間隙や液胞に多く占められているので，では，葉緑体を緑，今回見出されたシート構造を紫色，FIB-SEM 観察を始めたところ，観察断面の大部分を占め葉緑体近傍に存在し，ミトコンドリアとともに光呼吸のる樹脂によるチャージアップで輝度ムラが生じるなどの代謝を担っているペルオキシソームを橙色で示した．

問題が起こった．また，試料表面のわずかな凹凸や樹脂

図 9（b）において，白文字で示された番号は FIB によと細胞の硬度の違いによっても FIB 加工で縦縞の切削ムる切削（セクション）数を表し，図 9（a）の番号に対応する．

ラが生じる（図 8 左）．これらの問題に対し，名大 PF の対照区における葉緑体の構造は平坦で，突起構造は観察支援者は鮮明な像を得ることができる加工・観察条件のされなかった（図 9（c））
．しかし，塩ストレスを与えた検討を行い，鮮明な画像取得に成功した（図 8 右）．

葉緑体では，突起したシート構造が観察された（図 9（b），紫色）．突起構造を持った葉緑体を図 9（a）で追跡すると，紫色で塗られた突起構造はセクション 59 から現れた．セクション 77 では，橙色のペルオキシソームが突起構造の近くに現れ，突起構造とペルオキシソームは次第に近づき（セクション 90），ペルオキシソームが突起構造に取り囲まれることで葉緑体ポケットが形成されていた（セクション 93）．これらの結果から，葉緑体ポケット構造は，シート状に突起した構造の一部がペルオキシソームを取り囲むことで形成されることが示された．
細長い突起構造が，他のオルガネラを取り囲むことでポケット構造が構築されるという二次元像から推測されたモデル（図 6）は誤りであり，実際には，葉緑体からシート状の突起構造が作られ，それが他のオルガネラを取り囲むことで葉緑体ポケット構造は構築されること（図 9）

図7

FIB-SEM による加工と観察

図8

NanotechJapan Bulletin Vol. 11, No. 4, 2018が示された．FIB-SEM によって得られた連続画像を用い植物細胞の FIB-SEM 観察における観察条件の最適化

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図9

FIB-SEM による葉緑体の三次元構造解析て立体像を構築することでポケット構造を追跡し，不採る．これにより，葉緑体が細胞壁のくびれに沿って全体択された論文のモデルを検証したことになる .

を内側から覆い，効率的な CO2 吸収を可能にしているこ

FIB-SEM を用いて三次元構造解析を行うことにより，とが分かった．

塩ストレスを与えると，シート状の構造が葉緑体に形成

次に，塩ストレスのイネ葉肉細胞への影響を調べた．

されてペルオキシソームを取り囲んでいることがわかっ

二次元観察では，葉緑体の断面積が塩ストレス処理区のた．葉緑体が非常に大きいシート構造を作るということ方で増加したように見える（図 11）．ところが，FIB-SEM

は，世界で初の観察結果であり，三次元構造解析を行っで切削・観察し，三次元構築をして葉緑体の総体積を比たことによって，初めて発見が可能となったものである．

較すると（図 12），塩処理したイネ葉肉細胞の体積は，また，塩ストレス下で葉緑体は他のオルガネラを取り対照区と比較して有意な差は無かった．個々の葉緑体は囲み，協調関係を強化していることが推測された．この色を変えて示しているが，塩ストレス下では，多くの葉ことは，シート構造を有する葉緑体が細胞内に多くあれば，植物の耐塩性向上に貢献できることを示唆し，耐塩性品種開発の一つの指針となることが期待された．

３．
３

イネ葉肉細胞の三次元構造解析 [6]個々の葉緑体のみではなく，イネ葉肉細胞全体の三次元構造解析にも挑戦した．イネの葉肉細胞の厚さは 15 ～20μm あり，50nm ずつ切削して観察するので，数百枚の写真を撮ることになり，1 回の FIB-SEM 観察は 24 時間以上にも及ぶ．この長時間観察は，名大 PF による長時間の使用容認により可能となった．また，長期間の使用容認によって，複数の葉肉細胞を観察して反復を得ることが可能となった．
この結果，イネ葉肉細胞の全体像を世界で初めて三次元的に観察することに成功した．図 10 は，対照区の連続画像群より作成したイネ葉肉細胞の三次元再構築像であNanotechJapan Bulletin Vol. 11, No. 4, 2018

図 10 イネ葉肉細胞の立体像
緑：葉緑体，紫：核，黄：細胞壁

文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム平成 29 年度秀でた利用成果 -6図 11

塩処理したイネ葉肉細胞の二次元的観察（c：葉緑体，ic：細胞間膜，n：核）

図 12

対照区と塩処理区のイネ葉肉細胞の三次元構造解析による比較

緑体がシート構造や突起構造などを形成するため，二次起こるのか，三次元的な解析例は無い．今後は，様々な元観察では面積が広がって見えることが明らかとなった．

細胞や環境下におけるオルガネラの配置変化を三次元的に明らかにし，代謝効率との関係性を明らかにすること

３．４ オルガネラの細胞内配置解明から作物生産性向上へ

で，作物の環境ストレス耐性や生産力の向上につながる研究を行っていこうとしている．

秀でた利用成果の「塩ストレス下におけるイネ葉の葉緑体の三次元構造解析」において，葉緑体ポケット構造，さらに葉肉細胞全体の構造を世界で初めて三次元的に明４．おわりにらかにできた．この成果を記述する 2 報の投稿論文が国

かつて米の作況は日本の景気を左右し，現在は世界人際誌に採択され [6][7]，学会発表では 4 件の優秀発表賞を口増大に伴う食糧不足が懸念される中，農作物の生産性受賞した．

向上が求められている．そのための農学の研究は，旧来今後の新たな展開としては，オルガネラの細胞内配置の育種・改良に加え，育成あるいは育成阻害過程の分析・を三次元的に明らかにし，その配置を可能にしている要解明をもとに，新たな展開を図るようになってきた．こ因を明らかにすることである．細胞内のオルガネラ配置のため，工業分野で開発・活用されてきた解析・評価装は，効率的な代謝に重要であることが予想され，作物生置が農学を含むライフサイエンス分野で重用されるよう産にも大きな影響を及ぼすと考えられている．しかし，になっている．ナノテクノロジープラットフォームと類細胞内のオルガネラ配置を三次元的に解析した研究例は似の米国ナノテクノロジー共用施設ネットワーク（NNCI）無い．さらに，ストレスなどの環境変化に伴って配置変において，ユーザーが増加している分野は，これまでマ化することが予想されているが，どのような配置変化が

イクロ / ナノ設備を使ってこなかったライフ，環境，地NanotechJapan Bulletin Vol. 11, No. 4, 2018

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球科学であるという [8]．本利用成果は，このような農[5] Koji Yamane，Shiro Mitsuya，Mitsutaka Taniguchi

学の流れに応える山根氏らの研究意欲が，名古屋大学微and Hiroshi Miyake，”Salt-induced chloroplast

細構造解析プラットフォームの設備や手厚い支援と結び

protrusion is the process of exclusion of ribulose-

つくことによって得られた．ナノテクノロジープラット

1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from

フォーム供用設備の利用分野が拡大し，新たな利用分野

chloroplasts into cytoplasm in leaves of rice”, Plant，の研究が新しい発展を遂げることを期待したい．

Cell and Environment．Vol．35，Issue 9, pp．16631671 (2012)[6] Takao Oi，Sakiko Enomoto，Tomoyo Nakao，Shigeo
Arai，Koji Yamane and Mitsutaka Taniguchi，“Three-参考文献[1] NanotechJapan 利用成果セレクション

dimensional intracellular structure of a whole rice
秀でた利用

mesophyll cell observed with FIB-SEM”，Annals of
Botany，Vol．120，Issue 1，pp．21–28 (2017)

成果（nano tech 2018 展示）http://nanonet.mext.

[7] Koji Yamane，Takao Oi，Sakiko Enomoto，Hiroshi

go.jp/selection/

Miyake，and Mitsutaka Taniguchi，“Three ‐[2] 高性能電子顕微鏡による反応科学・ナノ材料科学研究支援拠点

dimensional ultrastructure of chloroplast pockets

http://nanonet.mext.go.jp/insti/nagoya-u/nc/

formed under salinity stress”，Plant Cell andEnvironment，Vol．41，Issue 3，pp．563–575 (2018).

http://nanoplat.nagoya-microscopy.jp[8] 第 16 回ナノテクノロジー総合シンポジウム（JAPAN[3] 高速加工観察分析装置
http://nanoplat.nagoya-microscopy.jp/equipment10.

NANO 2018）開催報告

html

ntjb_pdf/v11n2_JAPANNANO2018.pdf

http://nanonet.mext.go.jp/[4] 日立ハイテクノロジーズ集束イオンビーム（FIB/（図はすべて山根氏と大井氏から提供された）

FIB-SEM） https://www.hitachi-hightech.com/jp/
science/products/microscopes/focused-ion-beam-（古寺 博）

systems/nx9000.html【お問い合わせ】
微細構造解析プラットフォーム
名古屋大学☎ 052-789-3632
E-mail nanoplat@nagoya.microscopy.jp

ホームページ
http://nanoplat.nagoya-microscopy.jp/

NanotechJapan Bulletin Vol. 11, No. 4, 2018

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