様式３
立 S23-28
金コロイドナノ粒子を投与した実験腫瘍モデルの凍結切片組織内赤外分光顕微画像の計測と構築

Measurement and imaging of infrared microscopy for the cryo-section tissue
of a tumor model administrated with gold nano-colloid particle
三好憲雄 a, 木下英莊 a、アンドリアーナ ビビン a, 片山寛次 a、家路豊成 b, 太田俊明 b
Norio Miyoshia, Hidetaka Kinositaa, A.B. Bibina, Kanji Katayamaa, Toyonari Yajib, Toshiaki Ohtabaa

福井大学医学部, b 立命館大学 SR センター
Faculty of Medicine, University of Fukui, bThe SR Center, Ritsumeikan University

実験腫瘍モデルである扁平上皮癌の凍結切片組織を作成し、立命館大学 SR センタのビームライ
ン-15 番に設置の FT-IR 顕微鏡にて計測した。次の連続切片を固定後、ヘマトキシリン・エオジン(H.&E.)染色組織像を作成しマッピング像の解釈を試みた。その結果、オパール様癌部には癌細胞の核がなく、その周辺にはリン酸(対称性 P=O)基伸縮振動成分が多く存在している事を確認し、H.&E.染色像からも癌細胞核の存在を確認できた。また、それらの左上隅には脂質(非対称性 CH3+CH2)の CH伸縮振動成分が多く存在している事が分かり、H.&E.染色像のピンク色壊死部に対応した。従って
FT-IR 顕微マッピング像からは H.& E.染色像の組織形態との相関性が得られた。
Experimental skin tumor model was examined by the explanted the squamous cell carcinoma (SCC)
cultivated cells under the skin of a nude mouse. The sliced tissue of the tumor model was measured by theFT-IR microscope on the SR center beam line (BL-15). The histological H.& E. stained image was comparedwith the mapping image of FT-IR microscopy. It was resulted that the symmetrical stretching P=O
component were presented the around the opal cancer as same as the cancer nucleus distribution in H.& E.
staining image. There were presented of the anti-symmetrical stretching C-H vibration components of CH3
and CH2 at the left-up area of the 2D FT-IRM mapping image related with the pink color part, that is necrotic
area in H.& E. stained image. Accordingly, these components of lipid (C-H) and phosphate oxide (P=O) were
nice related with the histo-chemical meaning in H.& E. staining image in this study.
Keywords: FT-IRM, 鮮度保持セルホルダー、ヘマトキシリン・エオジン(H.&E.)染色組織像

背景と研究目的： 平成２１年１０月より
JST 委託(機器開発事業)で開発した鮮度保持セルホルダーを搭載したリニヤーアレー型検出器の赤外顕微装置(FT-IRM)を使用して、臨床生検肺腺癌のサンプルを約５０症例計測し、FT-IRM 癌診断画像として構築すべく計測データーを解析してきた。特に①癌組織特有の蛋白質２次構造成分比率(Amide-I ピークの解析)、②脂質(非対称性 C-H 伸縮振動成分の解析)や③癌細胞核 DNA 量に相関性のあるリン酸(対称性 P=O 伸縮振動成分の解析)を中心に着目して、従来の組織診断画像として用いられているヘマトキシリン・エオジン(H.& E.)
染色を行い、その形態学的検証と合わせて、主成分回帰分析(PCR)法を用いた癌悪性度に相関した検量線の作成から FT-IRM 癌診断画像を構築してきた。
目的は言うまでも無く信頼おける癌診断画像の構築で有り、癌組織内に特有の生体成分を赤外分光学的に抽出し、その癌成分を非癌部とコントラスト良くイメージ化する事である。上記の目的のために、SR センターではより高輝度なビームラインを活かした高分解能
FT-IRM スペクトの計測を主眼として意義ある実験研究を目指す事にした。
実験：(1) 計測サンプルの作成と移動方法：ヒト扁平上皮癌(SCC)由来培養細胞を用いて皮膚癌実験腫瘍モデルを作成後、その腫瘍組織を-20℃の凍結薄切切片作製機にて、
10m の 厚 み で 作 成 し 、 透 過 剤 で あ る
BaF2(直径10mmの円形、厚み1mm)の板の

様式３

Figure 1: Transmitted Image and H.& E. stain

測定されたスペクトル(一例)
2.5 C:\My Documents\OMNIC\atlus\2012-3-27\scc2.map - スペクトル #28 位置 (X,Y): -19145.00, -749.00 Tue Mar 27 15:50:04 2012 (GMT+09:00)
2.0

Abs

1.5

1.0

今回の測定

0.5

2.5 C:\My Documents\OMNIC\atlus\2012-3-27\scc.map - スペクトル #17 位置 (X,Y): -19167.00, -746.00 Tue Mar 27 14:11:15 2012 (GMT+09:00)
2.0

1.5

前回の測定

1.0

0.5

symPO
3500

3000

2500
Wavenumbers (cm-1)

2000

1500

1200cm -1• SCC試料の測定により得られた赤外吸収スペクトルのうちtypicalなスペクトルを示す2600cm-1付近に光源由来のスパイクノイズがあるが、CO2の吸収部分と重なっている。しかし、今回の議論においては問題ないと判断できる。
• 今回測定されたスペクトル(上側)は前回の同試料によるスペクトル(下側)に比べ、アパーチャサイズが小さい(15µm→7μm)ため、低波数側のSN比が悪くなった。1080cm -1付近のsymPOなどのピークが判りにくくなっている。また、1200cm -1付近の吸収の落込みがほとんどない。

Figure 2: FT-IRM Spectra of Tumor Tissue

AntisymCH3CH2-19122-19136-19150-19164-639-646-653-660-667-674-681-688-695-702-709-716-723-730-737-744-751-758-765-772

0.4-0.5
0.3-0.4
0.2-0.3
0.1-0.2
0-0.1• ほぼ全体に一様に分布しているが、左上部の領域(仮定上ではNormal領域に近い)に少ない領域がある。

Figure 3: H.& E. stain and FT-IRM Mapping
Image of Sntisym CH2CH3.

SymPO-19122-19136-19150-19164-639-646-653-660-667-674-681-688-695-702-709-716-723-730-737-744-751-758-765-772-19178-19192

論文・学会等発表（予定）[1] N. Miyoshi, T. Yaji, and T. Ohta, 14th
International Congress of Histochemistry andCytochemistry : 14-ICHC (ポスター発表)

H-E染 色 像

赤枠内のほぼ中心に、数十µm程度の大きさのオパール様癌と思われるコントラストが確認されるが、その周囲の輪郭が染色像とは異なる。他に判断できる箇所が特定できなかったため、測定方向が同じと仮定すると、左上の領域がNormal領域の可能性がある(右図青四角枠)。

-19178

文 献[1] N. Miyoshi, et al., ACS Symposium Series,
963 (2007) 41-51.
[2] 三 好 憲 雄 ： ぶ ん せ き 、 2011 (3) (2011)270-272.

今 回 測 定 し た 領 域 の 可 視 光 像 (赤 枠 が 測定領 域 )-19192

結果、および、考察：(1) 今回計測した凍結薄切切片組織の可視透過像と H.& E.染色像を対比させて Figure 1に表示した。
(2) ２回のマシンタイム計測のスペクトルの１例を Figure 2.に示した。
(3) 組織内脂質成分に由来する非対称性 C-H
伸縮振動成分のマッピング像を H.& E.染色像と共に Figure 3.に示した。これから壊死部に脂質成分が多い事が分かった。
(4) 対称性 P=O 伸縮振動成分(Figure 4)は、癌部内癌細胞核の多い部分に局在している事が、H.& E.染色組織像の対比で明らかになり、従来の癌組織像の特長を表示できた。

可視光像と染色像との対応

Abs

上に載せてプラステイックのシャーレ内に密封してSRセンターに移動し、測定サンプルとした。
(2) 計測機器：BL-15放射光赤外顕微鏡(分光器、顕微鏡はそれぞれThermo Scientific社
製 の Nicolet-6700 型 及 び ContinumXL 型 )を用いた。
(3) 測定条件：透過モード、３２ｘカセグレン鏡、顕微アパーチヤサイズ=7mx7m、測定間隔=7m、２５回積算による２次元マッピング測定を行った。Ｘ軸方向=11ポイント、Ｙ軸方向=20ポイント、合計220本のスペクトルを測定した。測定波数範囲=11,000～750cm-1、カーブフィッテイン
グ中赤外領域=4,000～1,000cm-1 での殻吸収ピークの分離とそのピーク面積値をマッピング２次元領域に対して、色を変えて表示した。
(4) 解析方法：各スペクトルをカーブフィッ
テイングにより以下の条件でピークを分離した。その殻吸収のピーク面積を求め
Amide-Iと-IIの合計面積で割った比率をエクセルでマップを作成し、H.&E.染色像と対応させた。また、必要に応じてベースライン補正を施した。

0.1-0.15
0.05-0.1
0-0.05• 逆対称POと同様に癌の中心よりは周囲の方が多いが、下部の方がより多く分布している。

Figure 4. H. & E. stain and FT-IR Mapping
Image of symP=O Compo.