(57)【要約】  ＭＶＡではないエンベロープウイルス、約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩及びバッファーを含む組成物であって、約６．０〜約８．５のｐＨを有する組成物について記載する。さらに、前記ウイルス製剤を調製することによりエンベロープウイルス組成物を安定化させるための方法もまた開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）エンベロープウイルス；ｂ）バッファー；及びｃ）約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩を含む組成物であって、前記組成物が約６．０〜約８．５のｐＨを有し、及び前記エンベロープウイルスがフィロウイルス抗原を発現するＭＶＡウイルスではない組成物。
【請求項２】
前記エンベロープウイルスは、ＭＶＡウイルスではない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記エンベロープウイルスは、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）及び単純ヘルペスウイルスからなる群から選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
前記エンベロープウイルスは、組み換えエンベロープウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、液体組成物若しくは冷凍液体、好ましくは約２℃〜約８℃の間で保管された液体組成物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記バッファーは、トリスバッファー、リン酸バッファー、ヒスチジン、クエン酸バッファー及びクエン酸／リン酸バッファーからなる群から選択される１種以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記バッファーは、約５〜約４０ｍＭの間の濃度にある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記バッファーは、約５〜約２５ｍＭの間の濃度にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記バッファーは、約６．５〜約８．５の間のｐＨにあるトリスバッファーである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記バッファーは、約７．５〜８．５の間のｐＨ、好ましくは８のｐＨを備えるトリスバッファーである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記バッファーは、約６．５〜約８．５の間のｐＨにあるリン酸バッファーである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記バッファーは、約６．８〜７．８の間のｐＨにある、好ましくは７．０又は７．５のｐＨを備えるリン酸バッファーである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記硫酸塩は、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウムからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記硫酸塩は、硫酸ナトリウム及び／又は硫酸アンモニウム、好ましくは硫酸ナトリウムである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記硫酸塩濃度は、約５ｍＭ〜約１５０ｍＭである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
約１０ｍＭの濃度のトリスバッファー、約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含む請求項１〜１１又は１４〜１６のいずれか一項に記載の組成物であって、約８のｐＨを有する組成物。
【請求項１７】
約１０ｍＭの濃度のリン酸バッファー、約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含む請求項１〜９又は１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物であって、約７．５のｐＨを有する組成物。
【請求項１８】
塩化ナトリウムをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
１０ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度で塩化ナトリウムを含む、請求項１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、糖、糖アルコール及び／又はポリオールをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ポリオールは、グリセロールである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記グリセロールの濃度が、約１（重量／重量）％〜６（重量／重量）％の範囲内にある、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記グリセロールの濃度は、約５（重量／重量）％の範囲内である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記糖は、スクロースである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記糖の濃度は、約１（重量／重量）％〜１０（重量／重量）％の範囲内にある、請求項２１又は２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項２７】
組成物中でａ）エンベロープウイルス；ｂ）バッファー；及びｃ）約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩を混合する工程を含み、前記組成物が、約６．０〜約８．５のｐＨを有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法。
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物を調製する工程を含む、エンベロープウイルス組成物を安定化させる方法。
【請求項２９】
前記組成物を摂氏２度〜摂氏８度の温度で保管する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援に関する陳述
本発明は、米国保健福祉省事前準備対応担当次官補局；生物医学先端研究開発局により授与された契約書番号第ＨＨＳＯ１００２０１５００００８Ｃ号の下で政府による支援を受けた。米国連邦政府は、本発明において所定の権利を有している。
【０００２】
本発明は、エンベロープウイルス含有組成物及び保管のために好適な関連医薬製品の分野に関する。本明細書に開示する好ましい組成物は、エンベロープウイルス、例えばインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）若しくは単純ヘルペスウイルス；硫酸塩；及び長期保管において使用するためのバッファー、例えばリン酸バッファー若しくはトリスバッファーを含む組成物である。本組成物は、特別には、様々な病原体若しくは疾患に対するワクチン又は治療薬として使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
エンベロープウイルス、例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス及びポックスウイルスは、予防用ワクチンとして使用される。さらに、エンベロープウイルスは、現在は、癌を含む多数の病原体若しくは標的に対する予防的又は治療的ワクチン接種についての多数の臨床試験において使用されている。他の生ウイルスワクチン若しくは不活化ウイルスワクチンと同様に、予防的又は治療的エンベロープウイルスベースの医薬品は、それらがレシピエント若しくは患者に適用される前は保管される必要があり、したがって数日間、数週間若しくは数カ月間から数年間までにわたってそれらの効力を失うことなく保管される必要がある。エンベロープウイルスのエンベロープは、細胞への侵入並びに被験者における所望の免疫応答を刺激するための組み換え抗原の複製若しくは発現のための前提条件に関与しているので、ウイルス力価の減少は、感染性の変化、したがって製品の有効性と連動している。
【０００４】
エンベロープウイルスは、感温性が非エンベロープウイルスよりも高いことで有名である（Ｗａｌｌｉｓ  Ｃ．ａｎｄ  Ｍｅｌｎｉｃｋ  ＪＬ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９６８；２：９５３−４）。ウイルスにコードされた膜タンパク質を含有する細胞外小胞は、組み換えエンベロープウイルス生成の副生成物であるので、エンベロープウイルス（例えば、ＲＳＶ、インフルエンザ、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス若しくはＨＳＶ）の調製は、いっそうさらに複雑であり、ウイルス感染性に影響を及ぼす多数の変量を考慮に入れた、状況に合わせたアプローチを必要とする。
【０００５】
少数の例外を除いて、ワクチン活性が消失する理由は、明確には理解されていない（Ｒｅｘｒｏａｄ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，２００４，１（２）：９１−１０４）。エンベロープウイルスを安定化させることは、極めて困難だが取り組みがいがある。熱安定性を増加させるために、エンベロープウイルスのフリーズドライ製剤が開発されてきた。例えば、ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｎ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｉｎｅ，ｉｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ａ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，Ｆｌｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１６，１１（１１）：ｅ０１６４６９２を参照されたい。しかし、フリーズドライプロセスは、より時間を消費し、活性の損失を回避するために乾燥プロセス中のウイルスの生物活性を保存するための添加物を必要とする。さらに、投与の前には再構成工程が必要とされるが、これは投与手技を複雑にする。
【０００６】
ワクチン製剤を安定化させるためには、効率的なコールド・チェーン（製造、配給、保管及び投与）の維持と結び付けられた製剤アプローチの組み合わせが使用されてきた。しかし、多くの発展途上国では、コールド・チェーンのインフラストラクチャーが不完全であるか、又は信頼できず、安定性が減少した、及びこのため有効性が減少したワクチンが生じ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当分野においては、製薬用途において使用することができ、製品の生物活性に影響を及ぼすことなく長期間にわたって保存され得る安定性のエンベロープウイルスをベースとするワクチン製剤を開発する必要が依然としてある。より詳細には、ウイルス力価の消失及び／又は潜在的に増加した毒性若しくは変化した免疫原性を備える副生成物の生成は、最小限に制限されなければならない。エンベロープウイルスは、さらに投与及び臨床使用中には剪断力から保護されなければならず、特に輸送時の様々な気候状況に左右される高温から、又はコールド・チェーンの不適正な監視若しくは中断に起因する効力の損失を回避するために保護されなければならない。さらに、製品の製造、保管及び輸送中の１回以上の冷凍及び解凍サイクル後の活性を維持する必要がある。
【０００８】
本発明のこれらやその他の目的については、本発明の詳細な説明と結び付けてより詳細に記載するものとする。Ｓｅｄｉｑ  ｅｔ  ａｌ．による関連する同時係属特許出願は、本出願と同一日に出願され、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これらやその他の必要を満たすために、本明細書では、以前に開示された製剤と比較して、改良された熱安定性及び撹拌ストレスに対する改良された安定性を備える、ポックスウイルスを含む組成物について記載する。前記組成物に含有されるポックスウイルスは、それらの効力及び感染性を保持している。これは、約６．０〜約８．５の範囲内のｐＨを有するバッファー中のエンベロープウイルスへの硫酸塩、好ましくは約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムの添加によって達成された。これらの組成物は、ウイルスの低い凝集変化及び立体構造変化、保管時の低いｐＨ変化及び／又は例えば室温、−２０℃の保管温度で保管した場合、又は加速ストレス後に濁度の少ない変化を示すことによって当分野において公知の従来型組成物を改良する。詳細には、本発明は、数週間若しくは数カ月間にわたり約２５℃で、又は長期間にわたって、及び冷凍状態を除いて約２℃〜約８℃で保管寿命の標的製品プロファイル特性を満たすと期待されている。本発明は、さらに０℃未満、詳細には−２０℃での数週間若しくは数カ月間又はより長期間にわたる保管寿命を提供する。
【００１０】
１つの一般的態様では、本発明は、ａ）エンベロープウイルス；ｂ）バッファー；及びｃ）約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩を含む組成物、好ましくは液体組成物であって、前記エンベロープウイルスがフィロウイルス抗原をコードするＭＶＡウイルスではないことを前提に、約６．０〜約８．５のｐＨを有する組成物を提供する。
【００１１】
一部の態様では、本発明は、ａ）エンベロープウイルス；ｂ）バッファー；及びｃ）約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩を含む医薬組成物であって、前記エンベロープウイルスがフィロウイルス抗原をコードするＭＶＡウイルスではないことを前提に、約６．０〜約８．５のｐＨを有する医薬組成物に関する。
【００１２】
１つの実施形態では、本発明の１つの実施形態による組成物若しくは医薬組成物中のエンベロープウイルスは、ＭＶＡウイルスではない。
【００１３】
また別の実施形態では、本発明の１つの実施形態による組成物若しくは医薬組成物中のエンベロープウイルスは、ポックスウイルスではない。
【００１４】
一部の実施形態では、本組成物若しくは医薬組成物は、注射による、例えば、筋肉内、皮下、静脈内又は鼻腔内投与による投与のために好適である。例えば、本医薬組成物は、病原体又は癌に対して治療又は予防するために使用できる。
【００１５】
また別の一般的態様では、本発明は、エンベロープウイルス組成物を安定化させる方法であって、前記エンベロープウイルスがフィロウイルス抗原をコードするＭＶＡウイルスではないことを前提に、ａ）エンベロープウイルス；ｂ）バッファー；及びｃ）約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩を含む組成物であって、約６．０〜約８．５のｐＨを有する組成物を調製する工程を含む方法に関する。
【００１６】
一部の態様では、本発明は、エンベロープウイルス組成物を安定化させる方法であって、前記エンベロープウイルスがフィロウイルス抗原をコードするＭＶＡウイルスではないことを前提に、（１）エンベロープウイルス；ｂ）バッファー；及びｃ）約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩を含む組成物であって、約６．０〜約８．５のｐＨを有する組成物を調製する工程、及び（２）前記組成物を２℃〜８℃の範囲内の温度で保管する工程を含む方法に関する。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明は、エンベロープウイルス組成物を安定化させる方法であって、前記エンベロープウイルス組成物が、フィロウイルス抗原ポックスウイルスをコードするＭＶＡウイルスではないエンベロープウイルスを含むことを前提に、約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩を前記エンベロープウイルス組成物に添加する工程を含む方法に関する。
【００１８】
１つの実施形態では、本発明の１つの実施形態による方法におけるエンベロープウイルスは、ＭＶＡウイルスではない。
【００１９】
また別の実施形態では、本発明の１つの実施形態による方法におけるエンベロープウイルスは、ポックスウイルスではない。
【００２０】
本明細書に組み込まれていて本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示の数例の実施形態を例示し、上述の説明とともに、本発明の原理を説明するために役立つ。本発明は、図面に示す明確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ｎａ２ＳＯ４を含まない（Ａ１〜Ａ４、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５、８．０、８．５及び９．０）、及び１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４を含む（Ｂ１〜Ｂ４、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５、８．０、８．５及び９．０）、１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４）様々な製剤についてＦｌｕｏｒｏｍａｘ  ４を使用して得られた異方性解析の結果を示す図である。黒線（＊を付けて指示）は加速ストレス（１週間、２５℃）前、及び灰色線はストレス後に得られたスキャンを示している。
【図２】上から下へ：適用された加速ストレス（１週間、２５℃）後のｐＨの変化、発光ピークのシフト、発光強度の変化、Ｚ平均径における変化及び多分散性指数（ＰＤＩ）の変化は、Ｎａ２ＳＯ４を含まない（Ａ１〜Ａ４、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５、８．０、８．５及び９．０）、及び１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４を含む（Ｂ１〜Ｂ４、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５、８．０、８．５及び９．０）、１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４）様々な製剤について示している図である。
【図３】左から右へ、グラフの各列が、適用された加速ストレス（１日間、３７℃）後の濁度、Ｚ平均径及び多分散性指数（ＰＤＩ）の変化を示している図である。様々な群の製剤は、垂直面で、つまり上から下に配列されている：塩を含有しない製剤（製剤Ａ１〜Ａ４）、１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４を含有する製剤（製剤Ｂ１〜Ｂ４）、１００ｍＭのＣａＣｌ２を含有する製剤（製剤Ｃ１〜Ｃ４）、１００ｍＭのＭｇＳＯ４を含有する製剤（製剤Ｄ１〜Ｄ４）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する製剤（製剤Ｅ１〜Ｅ４）及び１４０ｍＭのＮａＣｌを含有する製剤（製剤Ｆ１〜Ｆ４）。これらの製剤については、実施例３で十分に説明する。
【図４】左から右へ、グラフの各列が、適用された加速ストレス（１日間、３７℃）後の濁度、Ｚ平均径及び多分散性指数（ＰＤＩ）の変化を示している図である。様々な群の製剤は、垂直面で、つまり上から下に配列されている：塩を含有しない製剤（製剤Ａ１〜Ａ４）、１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４を含有する製剤（製剤Ｂ１〜Ｂ４）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する製剤（製剤Ｃ１〜Ｃ４）、及び１００ｍＭのＮａＣｌを含有する製剤（製剤Ｄ１〜Ｄ４）。製剤については、実施例４で十分に説明する。
【図５】４種の異なる製剤（コントロールＡ、１、コントロールＢ及び３）についてＦｌｕｏｒｏｍａｘ  ４を使用して得られた異方性、蛍光発光及び９０度光散乱法の結果を示す図である。＊を付けて示した黒色線は、Ｔ０でのスキャンを表すが、他方＊を伴わない線は、５℃での３カ月間の保管の形態でのストレスの適用後のスキャンを表す。製剤については、実施例６で十分に説明する。
【図６】４種の異なる製剤（コントロールＡ、１、コントロールＢ及び３）についてＦｌｕｏｒｏｍａｘ  ４を使用して得られた異方性、蛍光発光及び９０度光散乱法の結果を示す図である。＊を付けて示した黒色線は、Ｔ０でのスキャンを表すが、他方＊を伴わない線は、−２０℃での３カ月間の保管の形態でのストレスの適用後のスキャンを表す。製剤については、実施例６で十分に説明する。
【図７】４種の異なる製剤（コントロールＡ、１、コントロールＢ及び３）についてＦｌｕｏｒｏｍａｘ  ４を使用して得られた異方性、蛍光発光及び９０度光散乱法の結果を示す図である。＊を付けて示した黒色線は、Ｔ０でのスキャンを表すが、他方＊を伴わない線は、２０回の冷凍−解凍サイクルの形態での加速ストレスの適用後のスキャンを表す。製剤については、実施例６で十分に説明する。
【図８】５種の製剤（コントロールＡ、１、コントロールＢ、３及び７）についてＦｌｕｏｒｏｍａｘ  ４を使用して得られた異方性、蛍光発光及び９０度光散乱法の結果を示す図である。＊を付けて示した黒色線は、Ｔ０でのスキャンを表すが、他方＊を伴わない線は、２００ｒｐｍで１日間（２４時間）にわたる撹拌の形態での加速ストレスの適用後のスキャンを表す。製剤については、実施例６で十分に説明する。
【図９】左から右へ、グラフの各列が、濁度、Ｚ平均径及び多分散性指数（ＰＤＩ）を示している図である。上から下へ、グラフは、調製後（Ｔ０）、５℃での３カ月後（３Ｍ５Ｃ）、−２０℃での３カ月後（３Ｍ−２０℃）、２０回の冷凍−解凍サイクル後（２０ＦＴ）及び１日間の撹拌後（ＡＧ）の数値を示す図である。製剤は、これらのグラフのｘ軸上に配列した（コントロールＡ、１、コントロールＢ、３及び７）。製剤については、実施例６で十分に説明する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書は、本発明の特徴を組み込んでいる１つ以上の実施形態を開示する。開示した実施形態は、本発明を単に例示するものである。本発明の範囲は、開示した実施形態には限定されない。
【００２３】
背景技術において、及び本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文、特許出願及び特許が引用又は記載されている；これらの参考文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた材料が本明細書と矛盾する、又は不一致である程度まで、本明細書は、任意のそのような材料に優先されるものとする。本明細書に含まれている文献、行為、材料、装置、物品などの議論は、本発明に関する文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの内容のいずれか又は全てが、開示されている、又は特許請求されているあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
【００２４】
本明細書に記載した特定の方法、プロトコール及び試薬は変動する可能性があるので、本発明はそれらに限定されないと理解すべきである。さらに、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のために過ぎず、本発明の範囲を限定することが意図されていないことも理解すべきである。別途定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。さもなければ、本明細書で使用するある特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、及び添付した特許請求の範囲においては、単数形「１つの」及び「その」は、別途文脈が明白に規定していない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「核酸」についての言及は、１つ以上の核酸配列を含み、「方法」についての言及は、本明細書に記載した方法について修飾若しくは置換され得る当業者には公知の同等の工程及び方法についての言及を含んでいる。
【００２６】
他に特に指示されない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の各要素に関すると理解すべきである。他に特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などの任意の数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきであることも留意しなければならない。本明細書の全体を通して、任意の量若しくは濃度に関する用語「約」は、その量を含むことが企図されている。例えば、「約５ｍＭ」は、本明細書では５ｍＭ並びに記載された実体に関しておよそ５ｍＭであると理解される数値を含むことが企図されている。数値は、典型的には、列挙された値の±１０％を含む。例えば、濃度１ｍｇ／ｍＬは、０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％〜１０（重量／容積）％の濃度範囲は、０．９（重量／容積）％〜１１（重量／容積）％を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、全ての可能な部分的範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含み、文脈に明らかに別段の指示がない限り、そのような範囲内の整数及び値の分数を含む。同様に、本発明の状況において本明細書で使用する任意の数値に先行する用語「約」は、削除する、及び余り好ましくなくても用語「約」を伴わない数値と置換することができる。
【００２７】
本明細書で使用する、多数の列挙された要素間の連結用語「及び／又は」は、個々の選択肢及び結合選択肢の両方を含むと理解されている。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって結合される場合、第１選択肢は第２を伴わない第１要素の適合性を意味する。第２選択肢は、第１要素を伴わない第２要素の適合性を意味する。第３選択肢は、第１及び第２要素一緒の適合性を意味する。これらの選択肢のいずれか１つは、本明細書で使用する用語「及び／又は」の意味の範囲内に含まれ、このため用語「及び／又は」の要件を満たすと理解されている。２つ以上の選択肢の同時の適合性は、さらに用語「及び／又は」の意味の範囲内に含まれ、このため用語「及び／又は」の要件を満たすと理解されている。
【００２８】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、状況が他のことを要求しない限り、用語「含む」、並びに「含む」及び「含んでいる」などの変形は、規定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を排除しないことを意味すると理解されるであろう。本明細書で使用する場合、用語「含んでいる」は、用語「含有している」若しくは「包含している」と、又は本明細書で使用する場合は用語「有する」と置換することができる。上記の用語（含んでいる、含有している、包含している、有する）のいずれも、本明細書において使用する場合は常に、本発明の態様若しくは実施形態の状況においては、余り好ましくはないが、用語「〜からなる」又は「本質的に〜からなる」と置換され得る。
【００２９】
本明細書で使用する「からなる」は、特許請求項の要素において規定されていない任意の要素、工程又は成分を排除する。本明細書で使用する「本質的に〜からなる」は、特許請求項の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を排除しない。
【００３０】
本明細書で使用する用語「凝集」は、２つ以上のタンパク質若しくはウイルスが一緒に蓄積及び／又は凝集する工程を意味する。凝集は、無傷の天然タンパク質並びに変性したタンパク質について発生することがある。タンパク質凝集は、その後に蓄積するタンパク質の疎水基の曝露によって引き起こされることが多い。ウイルス凝集は、ウイルスエンベロープ上で発現したタンパク質の修飾に起因して発生し得る。
【００３１】
用語「核酸」、「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用することができ、直鎖若しくは分岐鎖の一本鎖若しくは二本鎖又はそれらのハイブリッドであるＲＮＡ若しくはＤＮＡを意味する。この用語は、さらにＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも含む。ポリヌクレオチドは、化学合成によって得ることができる、又は微生物に由来してよい。用語「外生」核酸配列は、組み換えウイルスと結び付けて使用される場合は、組み換えウイルスを生成するため、又は組み換えウイルスを生成しながらウイルスゲノム内に挿入されるために使用される非組み換えウイルス内に含有されない核酸配列である外来核酸配列を意味する。
【００３２】
用語「医薬の」、「医薬組成物」及び「医薬品」は、本明細書では互換的に使用され、疾患の予防又は治療のために使用される物質及び／又は物質の組み合わせを意味する。
【００３３】
「医薬上許容される」という用語は、担体、添加物、抗生物質、保存料、アジュバント、希釈剤、安定剤又は賦形剤が、使用される用量及び濃度において、それらが投与される対象において望ましくない、又は有害な影響を引き起こさないことを意味する。
【００３４】
用語「対象」及び「患者」は、互換的に使用される。本明細書で使用する「対象」は、典型的には哺乳類、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えば、サル及びヒト）であり、一部の好ましい実施形態では、ヒトである。
【００３５】
本発明によると、「ウイルス」は、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスベクター及びウイルスワクチンを意味する。これらの用語は、互換的に使用され得る。この用語には、野生型ウイルス、組み換えウイルス及び非組み換えウイルス、生ウイルス及び生弱毒化ウイルスが含まれる。
【００３６】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、分析学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組み換えＤＮＡの従来の手法が使用されるが、それらの手法は当該技術の範囲内に含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ、１９８７；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ，Ｈａｍｓ  ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ  ＧＲ，ｅｄｓ，１９９５；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ，１９８８を参照されたい。
【００３７】
本明細書の全体を通して、他に特に明記した場合を除いて、例えばｐＨなどの物理的パラメーターの数値は、２５℃で測定された数値である。
【００３８】
本発明は、エンベロープウイルスがフィロウイルス抗原をコードするＭＶＡウイルスではないことを前提に、前記エンベロープウイルス、約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩及び約６．０〜約８．５の範囲内のｐＨを有するバッファーを含む組成物に向けられる。
【００３９】
用語「組成物」は、１種以上の追加の成分と一緒に、活性医薬成分若しくは生物学的成分、例えばインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）若しくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含むがそれらに限定されないエンベロープウイルスを含有する製剤を意味する。用語「組成物」及び「製剤」は、本明細書では、「医薬組成物」、「ワクチン組成物」、「ワクチン」及び「ワクチン製剤」と互換的に使用される。
【００４０】
所定の実施形態では、製剤、組成物、医薬組成物、ワクチン組成物、ワクチン又はワクチン製剤は、安定性又は安定化組成物である。
【００４１】
全てが互換的に使用され得る「安定性の」、「安定化（された）」、「安定性」若しくは「安定化させること」によって、本発明の組成物中に含有されたエンベロープウイルスは、医薬組成物の保管寿命のために必要とされる保管上のその物理的安定性、同一性、完全性及び／又は化学的安定性、同一性、完全性、粒子形態及び／又は生物活性又は効力を本質的に維持すると理解されている。
【００４２】
安定性を測定するための様々な分析技術は、当業者には公知であり、安定性を決定する前記特徴は、より詳細には実施例において記載するように、３５０ｎｍ及び９０度での光散乱での内部蛍光、異方性、動的光散乱、ｐＨ測定及び濁度測定からなる群から選択される方法の少なくとも１つによって決定され得る。安定性は、選択された温度で、及び選択された期間にわたる他の保管条件で測定され得る。
【００４３】
粒子形態を決定するための方法は、当業者には周知である。例えば、粒子形態は、Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２  Ｍａｒｃｈ  ２０１７に記載されているような方法、例えばそれに類似する方法を使用して、透過型電子顕微鏡及び免疫電子顕微鏡（ｉｍｍｕｎｅ−ＥＭ）を使用して決定することができる。粒子形態を決定するための代替方法には、例えば、Ｖａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＮＴＡ）ｂｙ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２７：７９６−８１０に記載されたナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）が含まれる。ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）は、粒径分布及び液体中の凝集を直接的及びリアルタイム可視化及び分析するための方法である。レーザー照射顕微鏡技術に基づいて、ナノ粒子のブラウン運動は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによってリアルタイムによって分析されるが、各粒子は、専用粒子追跡画像解析プログラムによって同時しかし個別に可視化及び追跡される。ＮＴＡが粒径及び粒子散乱強度を同時に測定する能力は、不均質粒子混合物が分解され、粒子濃度が直接的に推定されることを可能にする。
【００４４】
本明細書で使用する用語「効力」若しくは「感染性」は、通常はＩｎｆＵ／ｍＬとして与えられる感染性単位（ＩｎｆＵ）、プラーク形成単位（ｐｆｕ）若しくはｐｆｕ／用量又はＴＣＩＤ５０／ｍＬとして与えられる組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）として表示されるエンベロープウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、ＲＳＶ、ポックスウイルス若しくはＨＳＶ）の活性を表す。両方の用語「効力」及び「感染性」は、本発明では互換的に使用され得る。例えばポックスウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳＶ、ポックスウイルス若しくはＨＳＶなどのエンベロープウイルスの効力は、例えば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）アッセイ又は組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）アッセイなどによって、当業者には公知の様々な方法を使用して決定することができる。本発明において使用される典型的なＦＡＣＳアッセイ及びＴＣＩＤ５０アッセイについては、実施例において記載する。
【００４５】
本明細書で使用する用語「保管寿命」は、特定の保管条件（例えば、２℃〜８℃での保管）下で、生成物が生成物の特徴に従って、ヒト用医薬品として使用するための活性及び／又は安定性を維持している期間を意味する。保管寿命は、規定の仕様の下限又は上限が超えられる時点に対応する。
【００４６】
所定の実施形態では、本発明の実施形態のいずれかの組成物は、４℃で６カ月間保管された場合に、出発時感染性（第０日）の少なくとも５０％、６０％、７９％、８０％若しくは９０％の感染性を有するとさらに規定されている。
【００４７】
所定の実施形態では、本発明の実施形態のいずれかの組成物は、２５℃で３カ月間保管された場合に、出発時感染性（第０日）の少なくとも５０％、６０％、７９％、８０％若しくは９０％の感染性を有するとさらに規定されている。
【００４８】
所定の実施形態では、本発明の実施形態のいずれかの組成物は、−２０℃で３カ月間、好ましくは６カ月間保管された場合に、出発時感染性（第０日）の少なくとも５０％、６０％、７９％、８０％若しくは９０％の感染性を有するとさらに規定されている。
【００４９】
所定の実施形態では、本発明の実施形態のいずれかの組成物は、４℃で６カ月間保管された場合に、出発時感染性（第０日）の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％若しくは５％以下の感染性の減少を有する。
【００５０】
所定の実施形態では、本発明の実施形態のいずれかの組成物は、２５℃で３カ月間保管された場合に、出発時感染性（第０日）の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％若しくは５％以下の感染性の減少を有する。
【００５１】
所定の実施形態では、本発明の実施形態のいずれかの組成物は、−２０℃で３カ月間、好ましくは６カ月間保管された場合に、出発時感染性（第０日）の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％若しくは５％以下の感染性の減少を有する。
【００５２】
特定の実施形態によると、本発明の組成物は、３週間（好ましくは３カ月間、６カ月間又は少なくとも１年間）にわたる２５℃（±５℃）でのウイルス力価の全体的損失が０．５ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満、好ましくは０．４ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満、より好ましくは０．３ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満である場合に安定性である。
【００５３】
本発明による「ウイルス力価の全体的損失」は、指示温度ｎ（例えば、３７℃）及び時間ｔ（例えば、１週間）での組成物の保管中に測定されたウイルス力価における、ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬとして与えられる蓄積損失であると規定されている。又は、ウイルス力価の全体的損失は、ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬとして示すことができる。ウイルス力価の全体的損失は、ｘｌｏｇ１０（例えば、３７℃で１週間にわたる０．５ｌｏｇ１０）として与えられる。
【００５４】
様々な実施形態では、加速ストレスは、組成物の安定性評価を短縮するために例えば３７℃で１週間にわたり高温で実施される加速安定性試験を使用して測定することができる。そのような加速安定性試験は、リアルデータを待つ必要を伴わずに高温での安定性を予測することを可能にする。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態では、保管中のウイルス力価の損失は、少なくとも３カ月間にわたり５℃＋／−３℃で０．４ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満、好ましくは少なくとも３カ月間にわたり５℃＋／−３℃で０．３ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満、より好ましくは少なくとも３カ月間にわたり５℃＋／−３℃で０．２ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満である。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、保管中のウイルス力価の損失は、少なくとも３カ月間にわたり−２０℃＋／−３℃で０．４ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満、好ましくは少なくとも３カ月間にわたり−２０℃＋／−３℃で０．３ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満、より好ましくは少なくとも３カ月間にわたり−２０℃＋／−３℃で０．２ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満である。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態では、保管中のウイルス力価の損失は、少なくとも３カ月間にわたり−５０℃＋／−３℃で０．４ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満、好ましくは少なくとも３カ月間にわたり−５０℃＋／−３℃で０．３ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満、より好ましくは少なくとも３カ月間にわたり−５０℃＋／−３℃で０．２ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満である。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態では、保管中のウイルス力価の損失は、少なくとも３カ月間にわたり−８０℃＋／−３℃で０．４ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満、好ましくは少なくとも３カ月間にわたり−８０℃＋／−３℃で０．３ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満、より好ましくは少なくとも３カ月間にわたり−８０℃＋／−３℃で０．２ｌｏｇ１０ＩｎｆＵ／ｍＬ若しくはＴＣＩＤ５０／ｍＬ未満である。
【００５９】
エンベロープウイルス力価を決定するためのアッセイは、例えば、Ｋａｕｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｋａｂｅｌｉｔｚ（２００２），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３２：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０１２５２１５３２０に記載されている。このアッセイからの力価は、１ｍＬ（ミリリットル）当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）として報告される。本発明のために使用されるＦＡＣＳアッセイ及びＴＣＩＤ５０アッセイは、実施例に記載されている、又は任意の他の好適な方法に加えて使用され得る。
【００６０】
好ましい実施形態によると、本発明の組成物は，水性組成物である。所定の実施形態では、本組成物は、−２０℃〜２５℃の間、約−２０℃〜４℃の間、約２℃〜２５℃又は約２℃〜８℃の間の室温（例えば、周囲温度）での保管のために好適である。これらの実施形態のいずれかに記載の組成物は、液体又は冷凍液体であってよい。本発明の組成物は、−２０℃〜２５℃の間、約−２０℃〜４℃の間、約２℃〜２５℃の間又は約２℃〜８℃の間の各規定温度範囲での３カ月間超、６カ月間超、９カ月間超、１２カ月間超、２４カ月間以上の長期間の保管のために適する。本発明の好ましい実施形態では、エンベロープウイルスを含む組成物は、２℃〜８℃での６カ月間超、９カ月間超、１２カ月間超、２４カ月間以上の長期間の保管のために適する。
【００６１】
本明細書で使用する「室温」若しくは周囲「温度」は、２５℃±３℃の温度である。
【００６２】
エンベロープウイルス
本発明によるエンベロープウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス及び改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスを含むがそれらに限定されない、ヒトに感染し得るエンベロープウイルス属のいずれかを指す。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態では、エンベロープウイルスは、ＲＳＶ、インフルエンザウイルス及びＨＳＶからなる群から選択される。
【００６４】
ＲＳＶウイルス
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科（ｆａｍｉｌｙ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（さらに麻疹及び流行性耳下腺炎を誘発するウイルスなどの一般的呼吸器系ウイルスも含む）、ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属内のエンベロープ非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。２つの主要なＲＳＶ亜型：亜型Ａ及び亜型Ｂが存在する。世界中では、毎年６，４００万例のＲＳＶ感染症が発生し、１６０，０００例の死亡が生じている（ＷＨＯ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｕｐｄａｔｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００９）と推定されている。ＲＳＶは、乳児及び幼児における重症呼吸器系疾患の主要な原因であり、小児細気管支炎の主因である（Ｗｅｌｌｉｖｅｒ（２００３）Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  １４３：Ｓ１１２）。最も重篤な疾患が生じるのは、特に未熟児、高齢者及び免疫機能が低下した個人である。２歳未満の小児では、ＲＳＶが最も一般的な呼吸器系病原体であり、呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピークは２〜４カ月齢で生じる。小児のほぼ全てが２歳までにＲＳＶに感染したことがあるとの報告がある。生涯にわたり繰り返し感染することは、自然免疫が効果を有さないことに起因する。高齢者におけるＲＳＶ疾患の負担、死亡率及び罹患率のレベルは、非パンデミックなインフルエンザＡ型感染症を原因とするものにまさに次ぐものである。ＲＳＶ感染症はまた、慢性肺疾患を有する個人、及び例えば骨髄移植レシピエントなどの免疫機能が低下した成人においても重病を引き起こし得る。ＲＳＶは、上気道において複製し、次いで、より下の気道に広がり、細気管支炎又は肺炎に至る。ウイルスは、炎症、気道の浮腫、粘液産生の増加及び呼吸上皮の衰弱を引き起こす。
【００６５】
宿主細胞を感染させるためには、ＲＳＶは、インフルエンザウイルス及びＨＩＶなどの他のエンベロープウイルスと同様に、ウイルス膜と宿主細胞膜との融合を必要とする。ＲＳＶの場合、保存された融合タンパク質（ＲＳＶ  Ｆタンパク質）が、ウイルス膜と宿主細胞の細胞膜とを融合させる。パラミクソウイルス研究に基づく現行のモデルでは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、最初は「融合前」立体構造にフォールディングする。細胞への侵入中に、融合前立体構造は、リフォールディングしてその「融合後」立体構造に構造変化する。そこで、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、最初に準安定性形態（融合前立体構造）にフォールディングし、引き続いて低エネルギー立体構造（融合後立体構造）への個別的／段階的構造変化を受けることによって、不可逆的なタンパク質リフォールディングを膜並置と結合することにより膜融合を駆動する準安定性タンパク質である。したがって、ＲＳＶに対するワクチンを生成する努力は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前形態を含有するワクチンの開発に集中してきた（例えば、国際公開第２０１０１１４９７４５号パンフレット、同第２０１０／１１４９７４３号パンフレット、同第２００９／１０７９７９６号パンフレット、同第２０１２／１５８６１３号パンフレットを参照されたい）。Ｆタンパク質配列は、ＲＳＶ株間でかなり（約９０％）保存されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：２６２３−２６２８）。唯一の市販されているモノクローナル抗体であるパリビズマブは、ＲＳＶのＦタンパク質に対して向けられている。
【００６６】
ＲＳＶのＧタンパク質は、非常にグリコシル化されており、付着タンパク質として機能する表面タンパク質である。Ｆタンパク質とは対照的に、Ｇタンパク質は、ＲＳＶ  Ａ２株のＧタンパク質のアミノ酸残基１５３〜１８４又は他の株における対応するアミノ酸残基を含む中央保存ドメイン（ＣＣＤ）を除いて、株にわたって極めて多様性である。中央保存ドメイン及び隣接領域（残基１４５〜１９３）はどちらも、剛性で重いＯ−グリコシル化ムチン様領域に接している。中央保存ドメインのＮ末端の半分は、７００を超える株間で保存されている小さな領域を含有する。Ｃ末端の半分は、１−４，２−３配置で接続された４つの保存システインを含有し、フォールディングしてシスチンの輪なわ（ｃｙｓｔｉｎｅ  ｎｏｏｓｅ）になる。
【００６７】
ＲＳＶワクチンの候補には、例えば、ＲＳＶ融合タンパク質ワクチン、キメラ融合タンパク質−糖タンパク質ワクチン及び様々な生の弱毒化ＲＳＶワクチンなどが含まれる。ＲＳＶ疾患を予防するためには能動免疫化を使用できるが、ＲＳＶ疾患のために現在利用できるワクチンはない。本発明の実施形態には、亜型Ａ若しくは亜型ＢのＲＳＶ、好ましくは例えばＲＳＶワクチン候補若しくは異種抗原などの１種以上の抗原を発現する改変非病原性組み換えＲＳＶを含有する組成物が含まれる。
【００６８】
インフルエンザウイルス
インフルエンザウイルスは、無症状感染から死亡をもたらし得る原発性ウイルス肺炎まで重症度に幅がある呼吸器疾患（一般に「インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）」又は「流感（ｔｈｅ  ｆｌｕ）」と称される）を引き起こす、主要なヒト病原体である。感染の臨床作用は、インフルエンザ株の病原性並びに宿主の曝露、既往歴、年齢及び免疫状態によって変動する。毎年、世界中で約１０億人の人々がインフルエンザウイルスに感染し、３〜５百万例の重症例及び推定３００，０００例〜５００，０００例のインフルエンザ関連死をもたらすと推定されている。これらの感染の大部分は、Ｈ１又はＨ３ヘマグルチニン亜型を担持するインフルエンザＡウイルスに起因し得、インフルエンザＢウイルスからの寄与は小さく、したがって、３つ全ての代表物は季節性ワクチンに含まれる。現在の予防接種の実施は、効果的な季節性インフルエンザワクチンの適時の生産を可能にするために、循環しているインフルエンザウイルスを早期に同定することに依存している。次のシーズンの間に有力になりうる株を予測する固有の困難さとは別に、抗ウイルス薬抵抗性及び免疫逃避もまた、現在のワクチンが罹患及び死の防止に失敗してしまう一因となっている。これに加え、病原体保有動物から発生し、ヒトからヒトへの拡散を増加させるように再集合した高度に病原性のウイルス株によって引き起こされる世界的流行病となる可能性は、地球規模の保健にとって重大で現実的な脅威をもたらす。
【００６９】
インフルエンザＡウイルスは、天然に広く分布しており、種々の鳥類及び哺乳動物に感染し得る。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属するエンベロープＲＮＡウイルスである。それらのゲノムは、１１種の異なるタンパク質、１種の核タンパク質（ＮＰ）、３種のポリメラーゼタンパク質（ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２）、２種のマトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）、３種の非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２及びＰＢ１−Ｆ２）並びに２種の外部糖タンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする８つの一本鎖ＲＮＡセグメントからなる。ウイルスは、ＨＡ及びＮＡタンパク質の抗原構造の差に基づき分類され、それらの様々な組み合せは、特異的インフルエンザウイルス株にさらに分類される固有のウイルス亜型を表す。全ての公知の亜型は鳥類において見出すことができるが、現在循環しているヒトインフルエンザＡ亜型は、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２である。系統発生分析は、ヘマグルチニンの２つの主要な群への再区分：とりわけ系統発生グループ１におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ９亜型及びとりわけ系統発生グループ２におけるＨ３、Ｈ４及びＨ７亜型を証明した。
【００７０】
インフルエンザＢ型ウイルス株は、厳密には、ヒトである。インフルエンザＢ型ウイルス株内のＨＡにおける抗原変異は、Ａ型株内で観察されるものよりも小さい。２つの遺伝的及び抗原的に区別されるインフルエンザＢウイルスの系統は、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａとも称される）及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）系統によって表わされるように、ヒトにおいて循環している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。インフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患の範囲は一般にインフルエンザＡウイルスにより引き起こされるものよりも軽度であるが、インフルエンザＢ感染について入院を要する重病が依然として頻繁に観察される。本発明の実施形態には、亜型Ａ若しくは亜型Ｂの任意の亜型、好ましくは、例えばインフルエンザ抗原若しくは異種抗原などの１種以上の抗原を発現する改変非病原性組み換えインフルエンザを含有する組成物が含まれる。
【００７１】
単純ヘルペスウイルス
一般にはヘルペスとして公知である単純ヘルペスウイルスへの感染は、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）又は２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２）いずれかに起因する可能性がある。ＨＳＶ−１は、主として口による接触によって感染させられ、ＨＳＶ−２は、ほぼ排他的に性感染させられ、生殖器部若しくは肛門部（陰部ヘルペス）における感染を引き起こす。
【００７２】
ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２に対するワクチンは、単純ヘルペスを予防するために使用できる。本発明において使用したＨＳＶ抗原には、従来より公知である様々なＨＳＶ由来抗原が含まれる。好ましくは、ｇＨ、ｇＬ  ｇＭ  ｇＢ  ｇＣ  ｇＫ  ｇＥ若しくはｇＤ又はそれらの誘導体、好ましくは糖タンパク質ｇＢ、ｇＤ若しくはｇＨ又はそれらの誘導体、及びより好ましくは糖タンパク質ｇＢ若しくはｇＤ又はそれらの誘導体を含むがそれらに限定されない本発明にとって好適なＨＳＶ抗原。好適なＨＳＶ抗原は、本発明の組成物中に含まれるＨＳＶ若しくは改変ＨＳＶによって発現され得る。本発明の実施形態には、ＨＳＶ、ＨＳＶ−１若しくはＨＳＶ−２、好ましくは例えばＨＳＶ抗原若しくは異種抗原などの１種以上の抗原を発現する改変非病原性組み換えＨＳＶを含有する組成物が含まれる。
【００７３】
腫瘍崩壊性ウイルス（ＨＳＶ−１）を用いた１種の腫瘍の治療が治療及び未治療対側性腫瘍の緩解を誘導すると報告された（Ｔｏｄａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．‘‘Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．’’Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９９；１０：３８５−９３を参照されたい）。数種の異なる腫瘍崩壊性単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）株は、第Ｉ相ヒト臨床試験において安全であることが証明された。Ａｇｈｉ  ＆  Ｍａｒｔｕｚａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４：７８０２−７８１６を参照されたい。本発明の実施形態にはさらに、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９６２３０５９号明細書に記載されているものなどの、膀胱癌若しくは黒色腫細胞などの癌細胞において選択的に複製する非病原性改変組み換えＨＳＶ−１若しくはＨＳＶ−２を含有する組成物もまた含まれる。
【００７４】
本発明のポックスウイルス
ポックスウイルスは、ヒトに感染し得るポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓｅ）属（例えば、オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、ヤタポックスウイルス及び軟体動物ポックスウイルス）のいずれかを指す。
【００７５】
ポックスウイルスは、オルトポックスウイルス若しくはアビポックスウイルスであり得る。アビポックスウイルスには、カナリア痘ウイルス（ＣＮＰＶ）及び鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）が含まれるがそれらに限定されない。オルトポックスウイルス（ＯＰＶ）は、例えば、天然痘ウイルス（痘瘡ウイルスとしても公知である）、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス及びサル痘ウイルスを含み得る。
【００７６】
ポックスウイルスは、さらにワクシニアウイルス若しくはＦＷＰＶ又は国際公開第２０１６／０３４６７８号パンフレットに記載されたようなＦＰＶでもあり得る。ＦＷＰＶの例としては、ＦＰ１、ＦＰ５、ＦＰ９、ＦＰＶ  Ｍ、ＦＰＶ  Ｓ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−２２９、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−２５０、ＵＳＤＡ株及びＰＯＸＶＡＣ−ＴＣが挙げられる。ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）の例としては、例えば、アンカラ、ＶＡＣＶウエスタンリザーブ（ＷＲ）、ＶＡＣＶコペンハーゲン（ＶＡＣＶ−ＣＯＰ）、天壇（Ｔｅｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｈｅａｖｅｎ）、パリ、ブダペスト、大連、ガム（Ｇａｍ）、ＭＲＩＶＰ、Ｐｅｒ、タシュケント（Ｔａｓｈｋｅｎｔ）、ＴＢＫ、天壇（Ｔｉａｎ  Ｔａｎ）、Ｔｏｍ、Ｂｅｒｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、ＢＩＥＭ、Ｂ−１５、ＥＭ−６３、ＩＨＤ−Ｊ、ＩＨＤ−Ｗ、Ｉｋｅｄａ、ＤｒｙＶａｘ（例えば、米国特許第７，４１０，６４４号明細書に記載されたＶＡＣＶワイエス若しくはニューヨーク市衛生局［ＮＹＣＢＨ］株としても公知）、ＮＹＶＡＣ、ＡＣＡＭ１０００、ＡＣＡＭ２０００、ワクシニアリスター（Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｌｉｓｔｅｒ）（エルストリーとしても公知）、ＬＣ１６ｍＯ、ＬＣ１６ｍ８、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／０２７０３（国際公開第０１／６８８２０号明細書）の中で特徴付けられたようなＭＶＡ−Ｖｅｒｏ、ＡＣＡＭ３０００  ＭＶＡ及び改変ワクシニアウイルスであるアンカラ・バーバリアン・ノルディック（ＭＶＡ−ＢＮ）が挙げられる。
【００７７】
一部の実施形態では、ＶＡＣＶは、ＤｒｙＶａｘ、ＡＣＡＭ１０００、ＡＣＡＭ２０００、リスター、ＥＭ−６３、ＶＡＣＶ−ＣＯＰ、ＷＲ、ＮＹＣＢＨ、ＮＹＶＡＣ及びＭＶＡからなる群から選択される。
【００７８】
本発明の一部の実施形態では、ポックスウイルスは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスである。
【００７９】
改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）
ＭＶＡは、例えば、ＭＶＡ−５７２、ＭＶＡ−５７５、ＭＶＡ−Ｉ７２１、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１５０８（商標）として寄託されたＭＶＡ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１５６６（商標）として寄託されたＭＶＡ、ＡＣＡＭ３０００  ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ又は任意の同様に弱毒化ＭＶＡ株であり得る。ＭＶＡは、さらにまたＭＶＡ−ＢＮであり得る。ＭＶＡ−５７２は、１９９４年１月２７日に寄託指定番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ９４０１２７０７を備えて欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ、ワクチン研究及び生成研究所、公衆衛生臨床検査サービス、応用微生物学・研究センター、Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ、英国）に寄託された。ＭＶＡ−５７５は、２０００年１２月７日にＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７の下で寄託された。Ａｃａｍ３０００  ＭＶＡは、２００３年３月２７日にアクセッション番号ＰＴＡ−５０９５を付けてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９、米国ＵＳＡ）。ＭＶＡ−Ｉ７２１は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＰａｓｔｅｕｒにＣＮＣＭ  Ｉ７２１として寄託された。ＭＶＡ−ＢＮは、２０００年８月３０日にＥＣＡＣＣに番号Ｖ０００８３００８を付して寄託された。ＭＶＡ−ＢＮは、国際特許出願の国際公開第０２／０４２４８０号パンフレットに記載されている（さらに、例えば、米国特許第６，７６１，８９３号明細書及び同第６，９１３，７５２号明細書も参照されたい）。
【００８０】
ＭＶＡは、さらに本明細書に記載したＭＶＡウイルス又はＭＶＡ−ＢＮのいずれかの誘導体若しくは変異体もまた含み得る。ＭＶＡ又はＭＶＡ−ＢＮの「誘導体」若しくは「変異体」は、それが意味するＭＶＡ又はＭＶＡ−ＢＮと本質的に同一の複製特徴を示すが、それらのゲノムの１つ以上の部分における差を示しているＭＶＡ又はＭＶＡ−ＢＮウイルスを指す。寄託されたウイルスと同一の「複製特徴」を有するウイルスは、ＣＥＦ細胞及び細胞系ウイルスＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．［１９８８］，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０６：７６１−７７１）、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９１１１２５０２）、ヒト胎児腎細胞系２９３（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１２０６０２）及びヒト子宮頸部腺癌細胞系ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）において寄託された株と類似の増幅率で複製するウイルスである。ＭＶＡ、その誘導体及び変異体のこれらの特性を決定するための試験及びアッセイは、例えば国際公開第０２／４２４８０号パンフレットに記載された細胞系許容性アッセイなど、当業者には周知である。典型的な細胞系許容性アッセイでは、哺乳動物細胞系は、非経口及び誘導体若しくは変異ＭＶＡウイルスにより細胞１個当たり低感染多重度、すなわち細胞１個当たり０．０５感染単位（５×１０４ＴＣＩＤ５０）で感染させられる。１時間の吸収後、ウイルス接種材料が取り除かれ、細胞は任意の残留している未吸収ウイルスを除去するために３回洗浄される。３％のＦＣＳが補給された新鮮培地が添加され、感染は、ウイルス抽出物を調製できるようになる計４日間（３７℃、５％のＣＯ２で）にわたり放置される。感染は、３回にわたり−８０℃でプレートを冷凍することによって停止させられる。ウイルス増殖及び細胞変性作用（ＣＰＥ）は、例えばＣａｒｒｏｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ［１９９７］，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３８，１９８−２１１に記載された方法などの当業者には周知の方法を使用して引き続いてＣＥＦ細胞上で決定される。
【００８１】
より詳細には、ＭＶＡ−ＢＮ又はＭＶＡ−ＢＮの誘導体若しくは変異体は、好ましくはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においては生殖複製能力を有するが、ヒトケラチン生成細胞系ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ（１９８８），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６：７６１−７７１）、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｎｏ．９１１１２５０２）、ヒト胎児腎細胞系２９３（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｎｏ．８５１２０６０２）及びヒト子宮頸部腺癌細胞系ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ．ＣＣＬ−２）においては生殖複製能力を有していない。さらに、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体若しくは変異体は、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａＴ細胞系におけるＭＶＡ−５７５より少なくとも２分の１未満、より好ましくは３分の１未満のウイルス増幅率を有する。ＭＶＡ変異体のこれらの特性についての試験及びアッセイは、国際公開第０２／４２４８０号パンフレット又は上述した典型的な細胞系許容性アッセイに記載されている。
【００８２】
用語「生殖複製することができない」又は「生殖複製の能力がない」は、例えば、さらに上記で言及した所望の特性を有するＭＶＡを得る方法についても教示している国際公開第０２／４２４８０号パンフレットに記載されている。この用語は、国際公開第０２／４２４８０号パンフレット又は米国特許第６，７６１，８９３号明細書に記載されたアッセイを使用して、感染４日後に１未満のウイルス増幅率を有するウイルスに当てはまる。
【００８３】
用語「生殖的に複製することに失敗する」は、感染４日後に１未満のウイルス増幅率を有するウイルスを指す。国際公開第０２／４２４８０号パンフレット又は米国特許第６，７６１，８９３号明細書に記載されたアッセイは、ウイルス増幅率を決定するために適用することができる。
【００８４】
ウイルスの増幅若しくは複製は、通常は、感染細胞（アウトプット）から第１の場所（インプット）を感染させるために最初に使用される量へ生成されるウイルスの「増幅率」と呼ばれるウイルスの比率として表示される。「１」の増幅率は、感染細胞から生成されたウイルスの量が細胞を感染させるために最初に使用された量と同一である増幅状態を規定するが、これは感染細胞がウイルス感染及び複製のために許容性であることを意味する。これとは対照的に、１未満の増幅率、すなわちインプットレベルと比較してアウトプットにおける減少は、生殖複製の欠如、このためウイルスの弱毒化を指示する。
【００８５】
所定の実施形態では、本発明の１つの実施形態による組成物中のエンベロープウイルスは、ＭＶＡではなく、好ましくはエンベロープウイルスは、ＭＶＡ−ＢＮではなく、より好ましくは本エンベロープウイルスは、アクセッション番号Ｖ０００８３００８の下で欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）に寄託されているウイルス又はその誘導体ではない。
【００８６】
一部の実施形態では、本発明の１つの実施形態による組成物中のエンベロープウイルスは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）細胞における生殖複製の能力を有するが、ヒトケラチン生成細胞系ＨａＣａｔ、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ヒト胎児腎細胞系２９３及びヒト子宮頸部腺癌細胞系ＨｅＬａにおける生殖複製能力を有していないＭＶＡ−ＢＮウイルス若しくはその誘導体ではない。
【００８７】
一部の実施形態では、本発明の１つの実施形態による組成物中のエンベロープウイルスは、好ましくはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）細胞における生殖複製の能力を有するが、ヒトケラチン生成細胞系ＨａＣａｔ、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ヒト胎児腎細胞系２９３及びヒト子宮頸部腺癌細胞系ＨｅＬａにおける生殖複製能力を有していないアクセッション番号Ｖ０００８３００８の下で欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）に寄託されているウイルスＭＶＡ−ＢＮウイルス若しくはその誘導体ではない。
【００８８】
好ましい実施形態では、本明細書に開示したエンベロープウイルス又は任意の好ましいウイルスは、精製又は部分精製ウイルスである。エンベロープウイルス、例えば、インフルエンザ、ＲＳＶ、ポックスウイルス及びＨＳＶを生成及び精製するための方法は、当業者には公知であり、下記で詳細に説明する。
【００８９】
実施形態のいずれかのエンベロープウイルスは、組み換え若しくは非組み換えエンベロープウイルス、好ましくは組み換えインフルエンザ、ＲＳＶ、ポックスウイルス若しくはＨＳＶワクシニアウイルスであり得る。用語「組み換え」は、自然には親ウイルス内に存在しない、そのゲノム内に挿入された外来性核酸配列を含むウイルス、より特別にはエンベロープウイルスを指す。組み換えウイルス（例えば、限定はされないがインフルエンザ、ＲＳＶ、ポックスウイルス若しくはＨＳＶなどのエンベロープウイルス）は、したがって、自然には発生しない、又は自然には見出されないまた別の核酸に連結している、合成若しくは半合成起源の核酸配列の２つ以上のセグメントの人工的組み合わせによって作成された核酸若しくはウイルスを指す。人工的組み合わせは、最も一般的には、明確に確立された遺伝子工学技術を使用して、核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって実施される。一般に、本明細書で記載した「組み換え」エンベロープウイルスは、標準的遺伝子工学方法によって生成されるエンベロープウイルスを指し、例えば、そこで本発明のエンベロープウイルスは、遺伝子工学により、又は遺伝的に改変されたエンベロープウイルスである。そこで用語「組み換えエンベロープウイルス」には、好ましくはそれらのゲノム内で転写単位の形態にある、安定性に組み込まれた組み換え核酸を有するエンベロープウイルスが含まれる。転写単位は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター及び／又はサイレンサーを含み得る。本発明の組み換えエンベロープウイルスは、調節エレメントの誘導後には異種抗原性決定因子、ポリペプチド若しくはタンパク質（抗原）を発現し得る。
【００９０】
用語「抗原性決定因子」は、細胞応答又は体液性抗体応答のいずれであっても、抗原特異的免疫応答を作成するために宿主の免疫系を刺激する任意の分子を指す。抗原性決定因子は、タンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、抗原及び宿主における免疫応答を引き出して抗原の一部を形成するエピトープ、タンパク質、ポリペプチド及び抗原性タンパク質断片の相同体若しくは変異体、並びに例えば、グリコシル化タンパク質、ポリペプチド、抗原性断片、抗原及びエピトープを含むエピトープ並びにヌクレオチド配列若しくはそのような分子をコードする遺伝子を含み得る。したがって、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片及びエピトープは、特定の天然ヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列に限定されないが、例えば、欠失、付加、挿入及び置換などの天然配列への改変と同一の配列を含む。
【００９１】
用語「誘導体」及び「変異体」は、抗原性決定因子の状況において使用される場合は、好ましくは特定のタンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、抗原及びエピトープ内の参照抗原性決定因子と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％若しくは６５％、少なくとも約７０％若しくは７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％若しくは８９％、より典型的には、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％若しくは９４％及びいっそうより典型的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％、最も典型的には、少なくとも約９９％の同一性のレベルのヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列との同一性を有する。核酸とアミノ酸との間の配列同一性を決定するための技術は、当該技術分野で知られている。２つ以上の配列は、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較され得る。核酸配列であってもアミノ酸配列であっても、２つの配列の同一性パーセントは、アラインした２つの配列間で完全に一致した数をより短い配列の長さで除し、１００を乗じたものである。
【００９２】
用語「エピトープ」は、主要組織適合性複合体（「ＭＨＣ」）タンパク質若しくはＴ細胞受容体などのまた別のタンパク質と結合して、単独又は例えばＢ細胞及び／又はＴ細胞がそれに応答する抗原上の部位を指す。エピトープは、タンパク質の二次及び／又は三次フォールディングによって並列される隣接アミノ酸若しくは非リン説アミノ酸の両方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒に曝露させられても保持されるが、他方三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒を用いた処理で失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的構造内に、少なくとも５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸を含むが、一般には２０個未満のアミノ酸を含む。エピトープの空間的構造を決定する方法には、例えば、ｘ線結晶学及び二次元核磁気共鳴法が含まれる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）内の‘‘Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’’を参照されたい。
【００９３】
所定の実施形態では、本発明の組み換えウイルスは、そのゲノム内に挿入された外来性核酸配列をコードする核酸を含む組み換えウイルスである。
【００９４】
本明細書で使用する用語「外来性」は、参照分子がウイルスゲノム内に導入されることを意味する。この分子は、例えば、ウイルスゲノム内へのコーディング核酸を導入することによって導入することができる。このため、外来性核酸の発現に関連して使用されるこの用語は、ウイルス内に発現し得る形態にあるコーディング核酸の導入を指す。これとは対照的に、用語「内在性」は、宿主内に存在する参照分子を指す。
【００９５】
所定の実施形態では、本発明の組み換えウイルスは、そのゲノム内に挿入された外来性核酸配列を発現する核酸を含む組み換えウイルスである。
【００９６】
本明細書で使用する、互換的に使用できる用語「発現（した）」、「発現する」、「発現している」、「発現」などは、関心対象の配列の転写単独並びに転写及び翻訳の両方を意味する。したがって、ＤＮＡの形態で存在するヌクレオチド配列の発現に関連して、この発現の結果として生じる生成物は、（発現対象の配列の転写単独の結果として生じる）ＲＮＡ又は（発現対象の配列の転写及び翻訳両方の結果として生じる）ポリペプチド配列のいずれかであってよい。したがって用語「発現」には、さらにＲＮＡ及びポリペプチド生成物の両方が前記発現から生じ、同一共有環境内に一緒に残留する可能性も含まれる。例えば、これは、ｍＲＮＡがポリペプチド生成物内への翻訳後に存続する場合に当てはまる。
【００９７】
他の実施形態によると、実施形態のいずれかの外来性核酸配列は、抗原をコードすることができ、この抗原は、好ましくはウイルス抗原若しくは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。
【００９８】
好ましくは、ウイルス抗原は、例えば、フィロウイルス（好ましくは、例えば国際公開第２０１６／０３４６７８号パンフレットに記載されたマールブルクウイルス（ＭＡＲＶ）及び／又はエボラウイルス（ＥＢＯＶ））、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１；例えばｇｐ１２０若しくはｇｐ１６０など）、手足口病（ＦＭＤ）ウイルス（国際公開第２０１６／２０２８２８号パンフレットを参照されたい）、ヒト若しくは動物ヘルペスウイルス、好ましくはＨＳＶ１若しくはＨＳＶ２に由来するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）、又は例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などの肝炎ウイルス、例えばＢ型肝炎表面抗原若しくはそれらの誘導体（国際公開第２０１１／０１５６５６号パンフレット及び同第２０１３／００７７７２号パンフレットを参照されたい）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ；国際公開第０４／１１１０８２号パンフレットを参照されたい；優先的には遺伝子型１ｂ株由来の非構造的ＨＣＶタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ；国際公開第９０／１０４５９号パンフレット、同第９５／０９２４１号パンフレット、同第９８／０４７０５号パンフレット、同第９９／０３８８５号パンフレット及び同第０７／１２１８９４号パンフレット；ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８株由来のＥ６及びＥ７タンパク質が好ましい）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ；国際公開第２０１４／０１９７１８号パンフレットを参照されたい）又はインフルエンザウイルス（国際公開第２０１２／０４８８１７号パンフレット）などのウイルスに由来する。
【００９９】
本発明の所定の実施形態によると、前記抗原は、好ましくはＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ−１、ＨＰＶ、ＲＳＶ、ＥＢＯＶ及び／又はＭＡＲＶ、好ましくはＥＢＯＶ及びＭＡＲＶの抗原から選択される。
【０１００】
所定の実施形態では、本発明の一部の実施形態による組成物は、その出願がこれにより参照して十分に組み込まれる国際公開第２０１６／０３４６７８号パンフレットに記載されたフィロウイルスの膠原性タンパク質若しくは抗原性決定因子をコードする外来性核酸配列を含有する組み換えＭＶＡではないエンベロープウイルスを含む。参照により組み込まれた材料が本明細書と矛盾する、又は不一致である程度まで、本発明の明細書は、上記で既に言及した任意のそのような材料に優先されるものとする。参照による組み込みには、さらに国際公開第２０１６／０３４６７８号パンフレットの配列表もまた含まれる。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明の組み換えウイルスは、１つ以上のフィロウイルスタンパク質（好ましくは、１つ以上のフィロウイルス糖タンパク質）；好ましくは、組み換えウイルスがＭＶＡではないことを前提に、３種のフィロウイルス糖タンパク質をコードする核酸を含む組み換えウイルスである。
【０１０２】
さらに別の実施形態では、フィロウイルス糖タンパク質は、エボラウイルス・スーダン（ＳＥＢＯＶ）、エボラウイルス・ザイール（ＺＥＢＯＶ）及びマールブルクウイルス（ＭＡＲＶ）から選択される。
【０１０３】
さらに別の実施形態では、フィロウイルス糖タンパク質は、エボラウイルス・スーダン（ＳＥＢＯＶ）、エボラウイルス・ザイール−メインガ（ＺＥＢＯＶ−Ｍａｙｉｎｇａ）及びマールブルクウイルス・ムソケから選択される。他の特定の実施形態では、本発明の組み換えウイルスは、組み換えウイルスがＭＶＡではないことを前提に、ＳＥＢＯＶ、ＺＥＢＯＶ−メインガ及びＭＡＲＶ−ムソケのフィロウイルス糖タンパク質をコードする核酸を含む組み換えウイルスである。
【０１０４】
所定の実施形態では、本発明の組み換えウイルスは、フィロウイルス核タンパク質、好ましくはエボラウイルスのフィロウイルス核タンパク質、より好ましくはエボラウイルス象牙海岸（ＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩ）の核タンパク質をさらにコードする核酸を含む。
【０１０５】
所定の好ましい実施形態では、本発明による組成物中で使用される組み換えウイルスは、国際公開第２０１６／０３４６７８号パンフレットに記載されたようなＭＶＡ−ｍＢＮ２２６、ＭＶＡ−ｍＢ２５５、ＭＶＡ−ｍＢＮ２５４と命名された組み換えＭＶＡではない。
【０１０６】
所定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン−１（ＭＵＣ−１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、Ｂ７−１（ＣＤ８０としても公知）、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１、ＣＤ５４としても公知）、リンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３、ＣＤ５８としても公知）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２及びブラキウリ（ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）又はそれらの任意の組み合わせから選択される。好ましくは、ＴＡＡは、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＨＥＲ−２及びブラキウリ（ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）から選択される。そのような組み換え因子のより詳細は、例えば、国際公開第２０１５／１７５３４０号パンフレット及び同第２００８／０４５３４６号パンフレットに記載されている。
【０１０７】
非組み換え及び組み換えエンベロープウイルスを生成するための方法
組み換えエンベロープウイルス（例えば、インフルエンザ、ＲＳＶ、ＨＳＶ、ＶＡＣＶ若しくはＭＶＡ）を得るため、又は外来性コーディング配列をエンベロープウイルスゲノム内に挿入するための方法は、当業者には周知である。例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡ及びＲＮＡの単離、ウエスタンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ増幅法などの標準的な分子生物学的手法のための方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８９））に記載されており、ウイルスの取り扱い及び操作のための技術は、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｂ．Ｗ．Ｊ．Ｍａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））に記載されている。同様に、エンベロープウイルスの取り扱い、操作及び遺伝子操作のための技術及びノウハウは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ａ．Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ  ＆  Ｒ．Ｍ．Ｅｌｌｉｏｔｔ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９３）、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ９：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓを参照）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．（１９９８）、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＶ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒを参照）；及びＧｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｐｐｌｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０１１），Ｄａｎａ  Ｍ．Ｓａｎｔｏｓ、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を参照）に記載されている。組み換えＭＶＡの構築及び単離は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｐｏｘｖｉｒｏｌｏｇｙ，ＩＳＢＮ  ９７８−１−５８８２９−２２９−２（Ｓｔａｉｂ  ｅｔ  ａｌ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００４）（例えばＣｈａｐｔｅｒ  ７を参照）にも記載されている。他の組み換えエンベロープウイルスの生成もまた、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第９４９２５３３号明細書は、Ｕｓ８遺伝子において突然変異を不活性化する工程を含む突然変異ＨＳＶ株の生成について記載しており、米国特許出願公開第２００５０１１８１９２号明細書は、１種以上のヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子中に欠損を有する突然変異ＨＳ���株の生成について記載しており；米国特許出願公開第２０１６０１７６９３２号明細書は、代替三量体化ドメインを備える安定性融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチドの発現について記載しており；米国特許出願公開第２０１６０１３６２６２号明細書は、インフルエンザワクチン及び関連方法について記載している。全ての参考文献は、これにより参照して組み込まれる。
【０１０８】
また別の態様では、本発明は、免疫調節タンパク質を生成する方法であって、感染性ウイルスを生成するために必須である第１遺伝子に関して欠陥があり、免疫調節タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、前記細胞系が前記突然変異ウイルスの複製を支持することができる相補的細胞系である突然変異ウイルスに感染したｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞系を培養する工程、及び任意選択的にその後に前記培養から免疫調節タンパク質を単離する工程を含む方法を提供する。
【０１０９】
特に、組み換えＨＳＶベクターは、真正の哺乳動物細胞由来生成物が必要とされ、従来型安定性細胞発現系では成功しない、又は不適切である場合に、代替発現系として使用できる可能性を有する。この系は、補体化細胞、すなわちＣＲ１細胞（ＨＳＶ１のｇＨを発現する組み換え補体化Ｖｅｒｏ由来細胞系の名称）が標準組織培養系を使用してコンフルエンスまで増殖させられ、細胞が異種遺伝子発現に対するコーディング配列を含有する組み換えウイルスを用いて高力価で感染させられる場合に、従来型バッチ培養系として機能することができる。感染後の適切な時点に、培養上清を採取してプロセッシングし、関連タンパク質を回収することができる。
【０１１０】
本発明をより十分に例証するために、実施形態は、限定するためではなく例示するためだけに記載するものとする。ｇＨ欠損ウイルスの構造及び特性は、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，ｐ３４１、国際公開第９２／０５２６３号パンフレット及び同第９４／２１８０７号パンフレットに記載されている。さらに、全ての遺伝子操作手法は、‘‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ’’Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９に記載された標準方法によって実施することができる。
【０１１１】
例えば、本発明によって使用するウイルスベクター及び／又はウイルスなどのウイルスベースの物質を生成及び精製するための方法は、当業者には公知である。利用可能な方法は、特にＤＦ−１（米国特許第５，８７９，９２４号明細書）におけるＣＥＦ細胞若しくは細胞系、ＥＢｘニワトリ細胞系（国際公開第２００５／００７８４０号パンフレット）、ＥＢ６６アヒル細胞（国際公開第０８／１２９０５８号パンフレット）又はノバリケン（Ｃａｉｒｉｎａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）不死化トリ細胞（国際公開第２００７／０７７２５６号パンフレット若しくは同第２００９／００４０１６号パンフレット）におけるウイルスの複製を含む。それらは、当業者には周知の条件下で培養され得る。ＣＥＦ細胞におけるウイルス培養及びウイルス増幅のための無血清法は、例えば、国際公開第２００４／０２２７２９号パンフレットに記載されている。ウイルス生成のための上流プロセス及び下流プロセスは、国際公開第２０１２／０１０２８０号パンフレット若しくは同第２０１６／０８７４５７号パンフレットから入手することができる。本出願のウイルスを精製するために有用である方法は、国際公開第０３／０５４１７５号パンフレット、同第０７／１４７５２８号パンフレット、同第２００８／１３８５３３号パンフレット、同第２００９／１００５２１号パンフレット及び同第２０１０／１３０７５３号パンフレットに詳細に開示されている。アヒル胚由来細胞における組み換えエンベロープウイルスを増殖及び精製するための典型的な方法は、Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．［２０１６］，Ｔｈｅ  ＥＢ６６  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｖａｌｕａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ＭＶＡ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３４：５８７８−５８８５に記載されている。
【０１１２】
一部の実施形態では、前記組成物は、約１×１０６ＩｎｆＵ／ｍＬ〜約２×１０９ＩｎｆＵ／ｍＬ、好ましくは約１×１０７ＩｎｆＵ／ｍＬ〜約２×１０９ＩｎｆＵ／ｍＬ、より好ましくは約１×１０７ＩｎｆＵ／ｍＬ〜約４×１０８ＩｎｆＵ／ｍＬの範囲内のウイルス力価を含む。所定の他の実施形態では、力価は、約０．１×１０８ＩｎｆＵ／ｍＬ〜約４×１０８ＩｎｆＵ／ｍＬの範囲内にある。
【０１１３】
硫酸塩
所定の実施形態では、硫酸塩は、一価のカチオン塩である。本発明による一価のカチオンは、例えば、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン又はアンモニウムカチオンである。
【０１１４】
所定の実施形態では、本発明の硫酸塩は、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム及び／又は硫酸アンモニウムから選択される。
【０１１５】
好ましい実施形態では、硫酸塩は、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び／又は硫酸アンモニウム、好ましくは硫酸ナトリウムである。所定の実施形態では、硫酸ナトリウム塩は、第一及び／又は第二硫酸塩である。好ましくは、硫酸塩は、硫酸二ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）及び／又は硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）塩であり、好ましくは硫酸塩は、硫酸二ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）塩である。
【０１１６】
所定の実施形態では、硫酸塩（例えば、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム及び／又は硫酸アンモニウム）の濃度は、約５ｍＭ〜３００ｍＭの間、約５ｍＭ〜２５０ｍＭの間、約５ｍＭ〜２２０ｍＭの間、約５ｍＭ〜２００ｍＭの間、約５ｍＭ〜１８０ｍＭの間、約５ｍＭ〜１５０ｍＭの間、約５ｍＭ〜１２０ｍＭの間、約１０ｍＭ〜３００ｍＭの間、約２０ｍＭ〜３００ｍＭの間、約３０ｍＭ〜３００ｍＭの間、約４０ｍＭ〜３００ｍＭの間、約５０ｍＭ〜３００ｍＭの間、約７０ｍＭ〜３００ｍＭの間、約８０ｍＭ〜３００ｍＭの間、約８０ｍＭ〜１５０ｍＭの間、約９０ｍＭ〜１５０ｍＭの間、約９０ｍＭ〜１２０ｍＭの間、約９０ｍＭ〜１１０ｍＭの間、約４８ｍＭ〜１１０ｍＭの間又は約１０ｍＭ〜１１０ｍＭの間である。所定の実施形態では、本発明の組成物は、約１００ｍＭの濃度の硫酸塩、好ましくは硫酸ナトリウム（特にＮａ２ＳＯ４及び／又はＮａＨＳＯ４）、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム及び／又は硫酸アンモニウム、より好ましくは硫酸ナトリウム及び／又は硫酸アンモニウム、最も好ましくは硫酸ナトリウムを含む。
【０１１７】
所定の実施形態では、硫酸ナトリウム（特に、Ｎａ２ＳＯ４及び／又はＮａＨＳＯ４）の濃度は、他の硫酸塩について上述した濃度範囲の１つにあり、好ましくは本明細書に記載した組成物中のＮａ２ＳＯ４及び／又はＮａＨＳＯ４塩は、約５０〜１５０ｍＭの間の濃度、好ましくは約１００ｍＭの濃度で存在する。
【０１１８】
本発明の１つの好ましい実施形態では、本明細書に記載した硫酸塩及び任意の好ましい硫酸塩は、好ましくは無機塩であり、このときこの無機塩は、炭素原子を含有していない。
【０１１９】
ｐＨ及びバッファー
本発明による組成物は、約６．０〜約８．５、好ましくは約６．５〜８．５の間のｐＨを有する。
【０１２０】
所定の実施形態、本発明による組成物は、約６．５〜８．５の間、約６．６〜８．０の間、約６．８〜７．５の間、約６．８〜７．２の間、約６．８〜８．２の間、約６．９〜８．２の間、約７．０〜８．５の間、約７．２〜８．２の間、約７．４〜８．２の間、約７．６〜８．２の間若しくは約７．５〜８．５の間のｐＨを有する。
【０１２１】
このｐＨを維持するために、本発明による組成物は、本組成物のｐＨで緩衝能力をそなえるバッファーを含む。本明細書で使用する用語「バッファー」若しくは「バッファー溶液」は、弱酸及びその共役塩基又はその逆の混合物からなる水溶液を指す。そのｐＨは、少量若しくは中等度の量の強酸若しくは強塩基がそれに添加されてもほとんど変化しないので、したがって溶液のｐＨにおける変化を防止するために使用される。バッファー溶液は、極めて広範囲の用途においてほぼ一定の数値でｐＨを維持する手段として使用される。酸性領域におけるバッファーのためには、ｐＨは、例えば塩酸などの強酸を緩衝剤に添加することによって所望の数値へ調整され得る。アルカリ性バッファーのためには、水酸化ナトリウムなどの強塩基が添加され得る。又は、バッファー混合物は、酸とその共役塩基との混合物から作成され得る。例えば、酢酸バッファーは、酢酸と酢酸ナトリウムとの混合物から作成され得る。同様に、アルカリ性バッファーは、塩基とその共役酸との混合物から作成され得る。好ましくは、バッファーは、医薬上許容されるバッファーである。
【０１２２】
バッファーの例には、リン酸バッファー食塩液（例えば、ＰＢＳ）、リン酸バッファー、クエン酸バッファー（例えば、ＳＳＣ）、クエン酸／リン酸バッファー、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシン、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、トリス−ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ）、トリシン（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル）−メチル］−グリシン）、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＭＥＳ、コハク酸バッファーが含まれるがそれらに限定されない。リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳと省略）は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び一部の組成物では塩化カリウム及びリン酸カリウムを含有する水性塩溶液である。好ましくは、バッファーは、トリス、トリス−ＨＣＬ、トリシン、クエン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、クエン酸／リン酸バッファー及びリン酸バッファーの群から選択される。また別の好ましい実施形態では、バッファーは、トリスバッファー、クエン酸バッファー、ヒスチジン、クエン酸／リン酸バッファー又はリン酸バッファーである。リン酸バッファーは、好ましくはＮａ２ＨＰＯ４及びＫＨ２ＰＯ４の混合物又はＮａ２ＨＰＯ４及びＮａＨ２ＰＯ４の混合物を含む。クエン酸／リン酸バッファーは、好ましくはＮａ２ＨＰＯ４及びクエン酸ナトリウムを含む。所定の実施形態では、バッファーは、トリスバッファー若しくはリン酸バッファーを含む。
【０１２３】
前記バッファーは、好ましくは約５ｍＭ〜４０ｍＭの間の濃度で存在する。所定の実施形態では、前記バッファーは、約５ｍＭ〜２５ｍＭの間、約８ｍＭ〜２２ｍＭの間、約８ｍＭ〜１５ｍＭｍＭの間、又は約５ｍＭ〜１５ｍＭの間の濃度で存在する。所定の実施形態では、前記バッファーは、約１０ｍＭの濃度で存在する。
【０１２４】
また別の好ましい実施形態では、前記バッファーは、約６．５〜８．５、好ましくは約７．５〜８．５の範囲内のｐＨにある、最も好ましくは約８．０のｐＨを備えるトリスバッファーである。
【０１２５】
また別の好ましい実施形態では、前記バッファーは、約６．５〜８．５のｐＨ、約６．５〜７．５の範囲内のｐＨ、約７．０〜８．５の範囲内のｐＨ、約６．９〜７．６の範囲内のｐＨ、約７．３〜７．６の範囲内のｐＨ、約６．９〜７．２の範囲内のｐＨにある、より好ましくは約７．０のｐＨ、より好ましくは約７．５のｐＨを備えるリン酸バッファーである。
【０１２６】
また別の好ましい実施形態では、前記バッファーは、約６．０〜８．０の範囲内、好ましくは約６．５〜７．５の範囲内のｐＨを備えるクエン酸バッファー又はクエン酸／リン酸バッファーである。
【０１２７】
その他の成分
本発明の組成物は、さらに１種以上の医薬上許容される、及び／又は承認された担体、添加物、抗生物質、保存料、アジュバント、酸化防止剤、希釈剤及び／又は安定剤を含み得る。そのような補助物質は、１種以上の糖、糖アルコール、ポリオール、界面活性剤、１種以上のアミノ酸、粘度増強剤、１種以上の追加の塩、酸化防止剤、エタノール、ＥＤＴＡなどであってよいが、それらに限定されない。
【０１２８】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、さらに糖、糖アルコール及び／又はポリオールを含む。
【０１２９】
所定の他の実施形態では、本発明の組成物は、スクロース、ラクトース、マンノース及びトレハロースの群から選択される糖を含む。
【０１３０】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、ソルビトール、グリセロール若しくはマンニトール、好ましくはグリセロール及び／又はソルビトールから選択されるポリオールを含む。所定の実施形態では、本発明の組成物は、ソルビトールを含む。所定の実施形態では、本発明の組成物は、グリセロールを含む。
【０１３１】
所定の実施形態では、本組成物のいずれかにおける前記糖若しくは糖アルコールの濃度は、約１（重量／重量）％〜１０（重量／重量）％の範囲に及ぶ。好ましい実施形態では、前記組成物中の糖若しくは糖アルコールの前記濃度は、約２（重量／重量）％〜１０（重量／重量）％、３（重量／重量）％〜１０（重量／重量）％、４（重量／重量）％〜１０（重量／重量）％、１（重量／重量）％〜９（重量／重量）％、１（重量／重量）％〜８（重量／重量）％、１（重量／重量）％〜７（重量／重量）％、１（重量／重量）％〜６（重量／重量）％、２（重量／重量）％〜６（重量／重量）％、２．５（重量／重量）％〜６（重量／重量）％、４（重量／重量）％〜６（重量／重量）％、５（重量／重量）％〜７（重量／重量）％の範囲内にある、又は約６（重量／重量）％である。所定の実施形態では、前記組成物中のスクロースの濃度は、約６（重量／重量）％である。
【０１３２】
所定の実施形態では、前記組成物中のポリオールの濃度は、約１（重量／重量）％〜６（重量／重量）％の範囲に及ぶ。好ましい実施形態では、前記組成物中のポリオールの前記濃度は、約２（重量／重量）％〜６（重量／重量）％、３（重量／重量）％〜６（重量／重量）％、４（重量／重量）％〜６（重量／重量）％、１（重量／重量）％〜４（重量／重量）％、１（重量／重量）％〜３（重量／重量）％、１（重量／重量）％〜２．５（重量／重量）％の範囲に及ぶ、又は約５（重量／重量）％である。所定の実施形態では、前記組成物中のグリセロールの濃度は、約１（重量／重量）％〜６（重量／重量）％の範囲に及ぶ。好ましい実施形態では、前記組成物中のポリオールの前記濃度は、約２（重量／重量）％〜６（重量／重量）％、３（重量／重量）％〜６（重量／重量）％、４（重量／重量）％〜６（重量／重量）％、１（重量／重量）％〜４（重量／重量）％、１（重量／重量）％〜３（重量／重量）％、１（重量／重量）％〜２．５（重量／重量）％の範囲に及ぶ、又は約５（重量／重量）％である。所定の実施形態では、前記組成物中のグリセロールの濃度は、約１（重量／重量）％〜６（重量／重量）％の範囲に及び、好ましくは５（重量／重量）％である。
【０１３３】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、さらに界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を含む。非イオン性界面活性剤は、例えば、凝集を減少させることによって液体状態において様々なウイルスの安定化を誘導することが証明されている（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．［２００４］，Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９３：２４５８−７５、米国特許第７，４５６，００９号明細書、米国特許出願公開第２００７／０１６１０８５号明細書）、又は容器表面への吸収を減少させるために添加される。
【０１３４】
所定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム及びポロキサマーの群から選択され、好ましくは、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０及びポリソルベート８０の群から選択される。
【０１３５】
所定の実施形態では、ポリソルベート（特に、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０及びポリソルベート８０は、約０．００１（重量／重量）％〜約１（重量／重量）％、好ましくは約０．００１（重量／重量）％〜約０．５（重量／重量）％の濃度範囲を有する。好ましくはポリソルベートは、約０．００１（重量／重量）％〜約０．１（重量／重量）％、約０．００１（重量／重量）％〜約０．００８（重量／重量）％、約０．００１（重量／重量）％〜約０．００５（重量／重量）％の濃度範囲を有する。ポリソルベート濃度は、好ましくは０．００１（重量／重量）％超であるが０．００５（重量／重量）％未満である。
【０１３６】
所定の実施形態では、前記ポロキサマーは、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１２１、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８及び／又はポロキサマー４０７の群から選択される。
【０１３７】
所定の実施形態では、ポロキサマー濃度（特に、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１２１、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８及び／又はポロキサマー４０７）は、約０．００１（重量／重量）％〜１（重量／重量）％、好ましくは約０．００５（重量／重量）％〜０．５（重量／重量）％、約０．０１（重量／重量）％〜０．１（重量／重量）％、約０．０１（重量／重量）％〜０．０５（重量／重量）％、約０．０１５（重量／重量）％〜０．０３（重量／重量）％の範囲に及ぶ、又は約０．０２５（重量／重量）％である。
【０１３８】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、さらにアミノ酸を含み、好ましくはアミノ酸は、アルギニン、グリシン、アラニン、リシン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン酸塩、グルタミン酸及びアスパラギン酸又は任意のそれらの組み合わせの群から選択される。好ましい実施形態では、アミノ酸は、グルタミン酸、アルギニン又はグリシンから選択される。アミノ酸は、好ましくは、Ｌ−異性体、好ましくはＬ−アルギニン、Ｌ−グリシン及びＬ−ヒスチジンである。前記アミノ酸は、本発明の組み換えウイルス若しくは非組み換えウイルスによってコードされるアミノ酸ではない。したがって、アミノ酸は、ウイルス（例えば、ＶＡＣＶ若しくはＭＶＡ）の精製プロセスを通して本組成物中には含有されないが、ワクチンを製造するために本組成物の生成中に添加される。
【０１３９】
アミノ酸は、好ましくは、本組成物中に約０．１（重量／重量）％〜約１０（重量／重量）％の間、好ましくは約０．１（重量／重量）％〜約５（重量／重量）％の間の濃度で存在する。また別の実施形態では、アミノ酸は、好ましくは、本組成物中に約０．１（重量／重量）％〜約２．５（重量／重量）％の間、好ましくは約２．０（重量／重量）％〜約５（重量／重量）％の間の濃度で存在する。
【０１４０】
アミノ酸、及び特にヒスチジン、アルギニン若しくはメチオニンは、液体状態にある様々なウイルスの安定化を誘導することが見出されている（ＥＶＡＮＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００４  Ｏｃｔ，９３（１０）：２４５８−７５、米国特許第７，４５６，００９号明細書、米国特許出願公開第２００７／０１６１０８５号明細書、米国特許第７，９１４，９７９号明細書、国際公開第２０１４／０２９７０２号パンフレット、同第２０１４／０５３５７１号パンフレットを参照されたい）。ヒスチジンが液体組成物中に安定性を改善するために存在する場合は、ヒスチジンは、一般に少なくとも５ｍＭ、及び好ましくは少なくとも１０ｍＭの濃度で存在する（ＥＶＡＮＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００４  Ｏｃｔ，９３（１０）：２４５８−７５、米国特許第７，４５６，００９号明細書、国際公開第２０１４／０２９７０２号パンフレットを参照されたい）。アルギニンが液体組成物中に安定性を改善するために存在する場合は、アルギニンは、一般に少なくとも５０ｍＭ（少なくとも約５７．４ｍＭに対応する少なくとも１（重量／重量）％のアルギニン、米国特許出願公開第２００７／０１６１０８５号明細書を参照されたい）、及び時々は好ましくは少なくとも１５０ｍＭ、及び特別には約３００ｍＭ（国際公開第２０１４／０２９７０２号パンフレット）の濃度で存在する。メチオニンが液体組成物中に安定性を改善するために存在する場合は、メチオニンは、一般に少なくとも２５ｍＭ、及び好ましくは少なくとも約６７ｍＭの濃度で存在する（国際公開第２０１４／０２９７０２号パンフレットを参照されたい）。
【０１４１】
所定の実施形態では、アミノ酸（好ましくはアルギニン、より好ましくはＬ−アルギニン）は、３００ｍＭ未満、好ましくは１５０ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、７５ｍＭ未満又はいっそう５０ｍＭ未満の濃度で存在する。さらに、メチオニンが本発明による液体組成物中に存在する場合は、メチオニンは、好ましくは６０ｍＭ未満、好ましくは５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、又はいっそう２５ｍＭ未満の濃度で存在する。より一般的には、１種以上のアミノ酸が本発明による組成物中に存在する場合、そのアミノ酸又は複数のアミノ酸は、好ましくは３００ｍＭ未満、好ましくは１５０ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、７５ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、９ｍＭ未満、８ｍＭ未満、７．５ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ又はいっそう５ｍＭ未満の濃度で存在する。
【０１４２】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、ヒスチジン、アルギニン及び／又はグルタミン酸を含んでいない。
【０１４３】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、さらに例えば粘度増強剤などの１種以上の追加の医薬添加物を含む。本発明による粘度増強剤には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばメチルセルロース（ＭＣ）若しくはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などのセルロース、ゼラチン、寒天及び／又はアガロース及びその誘導体が含まれるがそれらに限定されない。例えば、粘度増強剤の濃度は、本発明の組成物の約０．１（重量／重量）％〜１０（重量／重量）％、好ましくは約１（重量／重量）％〜５（重量／重量）％の範囲に及び得る。
【０１４４】
さらに、粘度増強剤は、溶液の粘度を増加させることができる。
【０１４５】
本発明の所定の実施形態では、本組成物は、さらにアジュバントを含む。
【０１４６】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、さらに医薬上許容される塩を含む。所定の好ましい実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。塩化ナトリウムは、好ましくは、本発明の組成物中に約１０ｍＭ〜１００ｍＭの間、好ましくは約２０ｍＭ〜１００ｍＭの間、約４０ｍＭ〜１００ｍＭの間又は約５０ｍＭ〜１００ｍＭの間の濃度で存在する。好ましい実施形態では、塩化ナトリウムは、約７０ｍＭの濃度で存在する。
【０１４７】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、さらに１種以上の酸化防止剤を含む。
【０１４８】
所定の実施形態では、酸化防止剤は、メチオニン、アスコルビン酸、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、アノキソマー；ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、クエン酸、クエン酸塩及びｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンの群から選択される。酸化防止性賦形剤は、その間の全ての数値及び範囲を含めて、本エンベロープウイルス組成物の０．０１（重量／重量）％、０．０５（重量／重量）％、０．１（重量／重量）％、０．５（重量／重量）％、１（重量／重量）％、２（重量／重量）％、３（重量／重量）％、４（重量／重量）％、５（重量／重量）％、６（重量／重量）％、７（重量／重量）％、８（重量／重量）％、９（重量／重量）％、１０（重量／重量）％の濃度で存在し得る。
【０１４９】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、さらにキレート剤、好ましくは医薬上許容されるキレート剤を含む。キレート剤は、さらに特に液体状態にある本組成物の安定性を改善することができる。
【０１５０】
所定の実施形態では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、及び２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）から選択され、好ましくは前記キレート剤は、ＥＤＴＡである。
【０１５１】
所定の実施形態では、キレート剤は、少なくとも５０μＭ、好ましくは５０μＭ〜１ｍＭ、５０μＭ〜７５０μＭ、５０μＭ〜５００μＭ、５０μＭ〜２５０μＭ、５０μＭ〜１５０μＭ、５０μＭ〜１００μＭ、５０μＭ〜７５μＭ、１００μＭ〜３００μＭ、１００μＭ〜２５０μＭ、１００μＭ〜２００μＭ、１００μＭ〜１５０μＭ、１５０μＭ〜１ｍＭ、１５０μＭ〜７５０μＭ、１５０μＭ〜５００μＭ又は１５０μＭ〜２５０μＭの濃度で存在するが、好ましくは前記キレート剤は、５０μＭ〜１５０μＭの範囲の濃度で存在し得る。
【０１５２】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、さらにエタノールを含む。所定の実施形態では、本発明の組成物は、さらにエタノールを０．０５（容積／容積）％〜５（容積／容積）％、好ましくは０．０１（容積／容積）％〜５（容積／容積）％、０．０１（容積／容積）％〜２．５（容積／容積）％、０．０１（容積／容積）％〜１．５（容積／容積）％、０．１（容積／容積）％〜５（容積／容積）％、０．１（容積／容積）％〜２．５（容積／容積）％、０．１（容積／容積）％〜１．５（容積／容積）％若しくは０．２５（容積／容積）％〜０．７５（容積／容積）％の範囲に及ぶ濃度で含む。
【０１５３】
オスモル濃度
一部の実施形態では、本発明の組成物は、宿主に生理学的に許容されるイオン強度を有する。本組成物中に塩を包含する目的は、本組成物を安定化させるために望ましいイオン強度若しくはオスモル濃度を達成すること並びにワクチンとしての本組成物の注射部位での副作用若しくは局所反応を減少させることである。一部の実施形態では、本発明の組成物は、約２００ｍＯｓｍ／Ｌ〜約１，０００ｍＯｓｍ／Ｌ、約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約９００ｍＯｓ／Ｌ、約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌ、約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約７００ｍＯｓ／Ｌ、約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約６００ｍＯｓ／Ｌ又は２００ｍＯｓ／Ｌ〜約５００ｍＯｓ／Ｌの範囲内の総オスモル濃度（溶液中の分子の総数）を有する。一部の実施形態では、本発明の組成物は、約２５０ｍＯｓ／Ｌ〜約４５０ｍＯｓ／Ｌの範囲内、好ましくは約３００ｍＯｓ／Ｌの総オスモル濃度を有する。本明細書に記載したオスモル濃度は、さらに本組成物を非経口的に、特に筋肉内若しくは皮下注射のために好適にさせながら、２℃〜８℃以上の温度での長期保管も促進する。イオン強度への寄与は、緩衝性化合物により作られるイオンから、並びに非緩衝性の塩のイオンから生じ得る。好ましくは、本溶液のオスモル濃度及びイオン強度は、ヒト身体のオスモル濃度及びイオン強度と一致する（等張性）。
【０１５４】
また別の好ましい組成物
１つの実施形態では、本発明は、ａ）エンベロープウイルス；ｂ）バッファー；及びｃ）約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩を含む組成物であって、約６．０〜約８．５のｐＨを有し、エンベロープウイルスがフィロウイルス抗原を発現するＭＶＡではない組成物を提供する。
【０１５５】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約５ｍＭ〜２５ｍＭの間の濃度のトリスバッファー若しくはリン酸バッファー、約５〜１５０ｍＭの間の濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約７．０〜８．５の範囲内のｐＨを有する。
【０１５６】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約５ｍＭ〜２５ｍＭの間の濃度のトリスバッファー、約５〜１５０ｍＭの間の濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約７．５〜８．５の範囲内のｐＨを有する。
【０１５７】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約８ｍＭ〜１２ｍＭの濃度のトリスバッファー、及び約８０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約７．７〜８．２の範囲内のｐＨを有する。
【０１５８】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約８ｍＭ〜約１２ｍＭの濃度のトリスバッファー、４（重量／重量）％〜６（重量／重量）％のスクロース若しくはグリセロールを伴う、又は伴わない９０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約７．６〜約８．２の範囲内のｐＨを有する。
【０１５９】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約８ｍＭ〜約１２ｍＭの濃度のトリスバッファー、約４５ｍＭ〜約５５ｍＭの濃度の硫酸ナトリウム及び約６０ｍＭ〜約８０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約７．６〜８．０の範囲内のｐＨを有する。
【０１６０】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のトリスバッファー、約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約８のｐＨを有する。
【０１６１】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のトリスバッファー、４（重量／重量）％〜６（重量／重量）％のスクロース若しくはグリセロールを伴う、又は伴わない約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約８のｐＨを有する。
【０１６２】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のトリスバッファー、約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウム及び約６（重量／重量）％の濃度のスクロースを含み、ここで前記組成物は約８のｐＨを有する。
【０１６３】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のトリスバッファー、約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウム及び約５（重量／重量）％の濃度のグリセロールを含み、ここで前記組成物は約８のｐＨを有する。
【０１６４】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のトリスバッファー、約５０ｍＭの濃度の硫酸ナトリウム及び約７０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約７．７のｐＨを有する。
【０１６５】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約５ｍＭ〜２５ｍＭの間の濃度のリン酸バッファー、約５〜１５０ｍＭの間の濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約６．８〜７．５の範囲内のｐＨを有する。
【０１６６】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約７．５ｍＭ〜１２ｍＭの間の濃度のリン酸バッファー、約９０〜１１０ｍＭの間の濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約６．８〜７．２の範囲内のｐＨを有する。
【０１６７】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のリン酸バッファー、約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約６．８〜７．８の範囲内のｐＨを有する。
【０１６８】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のリン酸バッファー、約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約７のｐＨを有する。
【０１６９】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のリン酸バッファー、約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約７．５のｐＨを有する。
【０１７０】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約７．５ｍＭ〜１２ｍＭの間の濃度のリン酸バッファー、４（重量／重量）％〜６（重量／重量）％のスクロース若しくはグリセロールを伴う、又は伴わない約９０〜１１０ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約６．８〜７．２の範囲内のｐＨを有する。
【０１７１】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のリン酸バッファー、４（重量／重量）％〜６（重量／重量）％のスクロース若しくはグリセロールを伴う、又は伴わない約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約７のｐＨを有する。
【０１７２】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のトリスバッファー、約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウム及び約６（重量／重量）％の濃度のスクロースを含み、ここで前記組成物は約７のｐＨを有する。
【０１７３】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のリン酸バッファー、約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウム及び約５（重量／重量）％の濃度のグリセロールを含み、ここで前記組成物は約７のｐＨを有する。
【０１７４】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のリン酸バッファー、４（重量／重量）％〜６（重量／重量）％のスクロース若しくはグリセロールを伴う、又は伴わない約１００ｍＭの濃度の硫酸ナトリウムを含み、ここで前記組成物は約７．５のｐＨを有する。
【０１７５】
本発明によるまた別の実施形態では、本組成物は、約１０ｍＭの濃度のリン酸バッファー、約１００ｍＭの濃度にある硫酸ナトリウム及び約５（重量／重量）％の濃度にあるグリセロールを含み、ここで前記組成物は約７．５のｐＨを有する。
【０１７６】
本発明によるまた別の実施形態では、エンベロープウイルスは、本明細書に記載した実施形態のいずれかの組成物中のＭＶＡではない。
【０１７７】
本発明によるまた別の実施形態では、エンベロープウイルスは、本明細書に記載した実施形態のいずれかの組成物中のポックスウイルスではない。
【０１７８】
所定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載した実施形態のいずれかの組成物を含む医薬組成物に関する。
【０１７９】
所定の実施形態では、実施形態にいずれかの組成物を含む医薬組成物は、非経口投与のために好適な医薬組成物である。
【０１８０】
本発明の所定の実施形態では、実施形態にいずれかの組成物を含む医薬組成物は、筋肉内、皮下、静脈内又は鼻腔内投与のために好適な医薬組成物である。
【０１８１】
所定の実施形態では、本発明による組成物は、バイアル内に含有される。用語「バイアル」は、例えば本明細書に開示されたウイルスなどの有効医薬成分を保管することができる任意の容器、（液体用）容器、カートリッジ、デバイス、ガラス製アンプル又はシリンジを意味する。用語の「バイアル」、容器、（液体用）容器、カートリッジ、デバイス、ガラス製アンプル又はシリンジは、互換的に使用され得る。バイアルは、通常は、不活性物質、特にガラス（例えば、ＤＩＮ  ２ＲのＩ型ホウケイ酸ガラス製バイアル）又はポリマー物質から製造される。好ましい実施形態では、本組成物は、シリンジ内に含有される。
【０１８２】
本発明の組成物は、当技術分野において公知の任意の手段によって、被験者、好ましくはヒトに投与され得る。投与経路には、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、静脈内投与、鼻腔内投与、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与又は経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与が含まれるがそれらに限定されない。投与様式、用量及び投与回数は、当業者であれば公知の方法で最適化できる。
【０１８３】
所定の実施形態では、本出願の組成物は、１０４〜１０９ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、１０５〜５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、１０６〜１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ又は１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬの用量範囲内のウイルスを含む。被験者（好ましくはヒト）にとって好ましい用量は、１０６ＴＣＩＤ５０、１０７ＴＣＩＤ５０又は１０８ＴＣＩＤ５０の用量を含む１０６〜１０９ＴＣＩＤ５０を含む。好ましくは、ヒトのための用量は、好ましくは０．１ｍＬ〜０．５ｍＬの容積中で、少なくとも２×１０７ＴＣＩＤ５０、少なくとも３×１０７ＴＣＩＤ５０、少なくとも５×１０７ＴＣＩＤ５０、少なくとも１×１０８ＴＣＩＤ５０、少なくとも２×１０８ＴＣＩＤ５０を含む。
【０１８４】
本発明は、さらに疾患を、又は病原体に対して治療及び／又は予防するための実施形態のいずれかの組成物若しくは医薬組成物に関するが、好ましくは、疾患は癌又は感染性疾患から選択される。
【０１８５】
本発明は、さらに疾患若しくは病原体に対して、好ましくは癌若しくは感染性疾患から選択される疾患を治療及び／又は予防するための医薬品を製造するための本発明の実施形態のいずれかの組成物若しくは医薬組成物の使用に関する。
【０１８６】
また別の実施形態は、それを必要とする被験者（好ましくはヒト）に、本発明の実施形態のいずれかの組成物又は医薬組成物によりワクチン接種するための方法に関する。
【０１８７】
また別の実施形態は、疾患若しくは病原体に対して、好ましくは癌若しくは感染性疾患から選択される疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、本明細書に記載した組成物若しくは医薬組成物を、それを必要とする被験者（好ましくはヒト）に投与する工程を含む方法に関する。
【０１８８】
所定の実施形態では、本発明は、実施形態のいずれかの組成物を調製する工程を含む、エンベロープウイルス組成物を安定化させる方法に関する。
【０１８９】
所定の実施形態では、本発明は、エンベロープウイルス組成物を安定化させる方法であって、実施形態のいずれかの組成物を調製する工程及び前記組成物を摂氏２度〜摂氏８度の範囲内の温度で保管する工程を含む方法に関する。
【０１９０】
所定の実施形態では、本発明は、エンベロープウイルス組成物を安定化させる方法であって、エンベロープウイルス組成物に約５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の硫酸塩を添加する工程、好ましくは約１０ｍＭ〜１４０ｍＭの間の濃度の硫酸塩を添加する工程を含む方法に関する。
【０１９１】
所定の実施形態では、本発明は、実施形態のいずれかのエンベロープウイルス組成物を安定化させる方法であって、エンベロープウイルス組成物はバッファーを含み、前記組成物は約６．５〜８．５の間のｐＨを有する方法に関する。
【０１９２】
下記に記載する詳細な実施例は、本発明をよりよく理解することに寄与する。しかし、本発明は、実施例に限定されない。本発明のその他の実施形態は、本明細書に開示した本発明の明細書及び実施を検討することから当業者には明白になるであろう。
【実施例】
【０１９３】
実施例１：
薬剤物質を含有する液体ポックスウイルスの調製
下記の実施例で使用するＭＶＡ−ＢＮ−ＦＩＬＯ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２６６）については、国際公開第２０１６／０３４６７８号パンフレットに詳細に記載されている。ＭＶＡは、３種のフィロウイルス糖タンパク質であるエボラウイルス・スーダン（ＧＰ−ＳＥＢＯＶ）、エボラウイルス・ザイール−メインガ（ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メインガ）及びマールブルクウイルス・ムソケ（ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ）並びにエボラウイルス・象牙海岸（ＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩ）の糖タンパク質をコードする。ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メインガ及びＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケのための発現カセットは、遺伝子間領域ＩＧＲ１４８／１４９内に挿入された。ＧＰ−ＳＥＢＯＶ及びＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩのための発現カセットは、国際公開第２０１６／０３４６７８号パンフレットに記載されたポックスウイルスプロモーター下で遺伝子間領域ＩＧＲ８８／８９内に挿入された。組み換えウイルスは、当業者には公知の標準方法を使用して精製された。５×１０８ＩｎｆＵ／ｍＬのウイルス濃度を備えるＭＶＡ−ＢＮ−ＦＩＬＯバルク薬剤物質（ＢＤＳ）は、ｐＨ７．７にある１４０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス中に保管した。２℃〜８℃での生成物の安定性を改善するために、２００種を超える様々な製剤は、様々な塩、糖添加物、アミノ酸及びバッファーを使用して分析されている。最高の結果は、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）を用いて得られた。
【０１９４】
実施例２：
ｐＨ、バッファー及び硫酸塩の作用
ＭＶＡ−ＢＮ−ＦＩＬＯ  ＢＤＳは、ＭｉｌｌｉＱグレード水への限外濾過／透析濾過を使用してバッファー交換されている。その後、特定容積の濃トリスバッファー（様々なｐＨ）及び硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）溶液は、最終製剤を得るためにスパイクされた。この製剤、製剤Ｂは、１０ｍＭのトリスバッファー及び１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４からなり、各々ｐＨ７．５、８、８．５及び９を備える製剤Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４に分割した。
【０１９５】
１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４（製剤Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４）を含まない同一組成物は、コンパレーターとして一緒に採取した。表１は、調製した製剤の概要を示している。全製剤は、３．７５×１０８ＩｎｆＵ／ｍＬのＭＶＡウイルス力価を有していた。
【０１９６】
【表１】
2020519666.tif 000002
【０１９７】
各製剤に、ＭＶＡの分解をもたらすことが公知であった条件である、２５℃で１週間にわたる加速ストレス条件を受けさせた。試料は、加速ストレスを適用する前後に測定した。異方性（図１）及び内部蛍光（図２において発光ピーク変化及び発光強度変化として示した）の測定は、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ  ４分光蛍光計上で実施した（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｈｏｒｉｂａ，ＵＫ）。動的光散乱測定（図２においてＺ平均径の変化及び多分散性指数（ＰＤＩ）の変化として示した）は、ゼータサイザー上で実施した。さらに、ｐＨについてもまた、加速ストレスを適用する前後に測定した。
【０１９８】
結果及び結論
異方性測定の結果は、図１に示した。全異方性スキャンは、加速ストレスの適用後に変化することが証明された。製剤の全部について、異方性スキャンはストレス後に減少したが、これはＭＶＡのタンパク質内の励起基がより柔軟性になったことを示している。柔軟性におけるこの増加の原因は、タンパク質のそれらの特定の基のアンフォールディング及び／又はタンパク質構築物の解離に帰すことができる。しかし、この変化の程度は、溶液中に硫酸塩が存在した場合はあまり明白ではなかった。さらに、硫酸塩含有製剤中における変化は様々なｐＨで類似であり、これは硫酸塩の強固な安定化作用を示していた。異方性がタンパク質濃度及び光散乱とは無関係であるという事実を前提にすると、これは、この方法を用いて得られた結果が高度に信頼性が高いことを示している。
【０１９９】
図２は、製剤Ａ１〜Ａ４（Ｎａ２ＳＯ４を含まない）及びＢ１〜Ｂ４（Ｎａ２ＳＯ４を含む）の加速ストレス後のｐＨ変化、発光ピーク変化、発光強度の変化、Ｚ平均径及び多分散性指数（ＰＤＩ）における変化の結果を示している。硫酸塩の存在は、コロイド安定性に顕著な作用を有するが、これは硫酸塩含有製剤においてはより低かったＺ平均径及びＰＤＩにおける変化から明らかである。改善されたコロイド安定性は、粒子混合物が容易には凝集又は解離しないことを意味する。ＭＶＡ−ＢＮ−ＦＩＬＯについてのコロイド不安定性とウイルスの減少した効力との間には相関関係があるために、改善されたコロイド安定性は、ウイルスの活性にプラスの影響を及ぼす。ｐＨ及び発光強度において観察された変化は、Ｎａ２ＳＯ４を含有する製剤については、特にｐＨ７．５及び８．０に限定された。発光強度は試料の散乱特性によって影響を受け得るので、発光強度は、試料の散乱特性が増加するという事実に起因して減少し得る。発光強度とは対照的に、ピーク変化は光の散乱には左右されないので、これらの結果は、全硫酸塩製剤についてはピーク変化が少ないことを示している。これは、タンパク質構造における構造変化がこれらの製剤においては制限されること、及び硫酸塩が強固な安定化作用を有することを示している。
【０２００】
実施例３
実験計画及び方法論
硫酸塩がＭＶＡウイルスの安定性に及ぼす作用をさらに調査するために、本発明者らは、異なる塩を備える数種の追加の製剤について試験した。これらの追加の製剤の概要は、表２に示した。
【０２０１】
【表２】
2020519666.tif 000003
【０２０２】
各製剤に、ＭＶＡの分解をもたらすことが公知であった加速ストレス条件（３７℃で１日間）を受けさせた。試料を各製剤から採取し、加速ストレスの適用前後に測定した。濁度の測定は、ＢｉｏＴｅｋ  Ｎｅｏプレートリーダー上で実施した。動的光散乱測定（ＤＬＳ）（Ｚ平均径の変化及びＰＤＩの変化として示した）は、ゼータサイザー上で実施した。
【０２０３】
結果及び結論
この実験で得られた全結果の概要は、図３に示した。各グラフは、様々なｐＨで製剤毎に得られた結果を示している。グラフの各列は、別個のアッセイを用いて得られた測定を示している。
【０２０４】
濁度試験の結果から、濁度における限定された変化を受けていたと思われるＭｇＣｌ２含有製剤（製剤Ｅ１〜４）が加速ストレス後の最少変化を示していることが見て取れ、これにＮａ２ＳＯ４製剤（製剤Ｂ１〜４）及びＭｇＳＯ４製剤（製剤Ｄ１〜４）が続いた。ここで、濁度が溶液中の微粒子の存在を原因とする全体的な光の散乱の結果であることを述べておかなければならない。この散乱又は濁度の程度は、多くの因子、特に粒径、粒子濃度及び粒子の形状に左右される。コロイドに関する追加の情報は、ＤＬＳ結果（Ｚ平均径及びＰＤＩ）によって提供される。
【０２０５】
加速ストレス後のＺ平均径における変化は、ＣａＣｌ２含有製剤（製剤Ｃ１〜４）については最低である。しかし、これらの製剤中の初期Ｚ平均径は９００ｎｍを超えていた。これはＭＶＡ製剤（約２００ｎｍのサイズを有するＭＶＡ）については相当に高く、これは加速ストレスが適用される前の初期凝集の存在を示している。ＣａＣｌ２含有製剤の結果を無視すると、ＮａＣｌ含有製剤（製剤Ｆ１〜４）は、ストレス後のＺ平均系における最小の変化を示した。興味深いことに、Ｎａ２ＳＯ４製剤（製剤Ｂ１〜４）はＮａＣｌ含有製剤と同様に機能し、これにＭｇＳＯ４製剤（製剤Ｄ１〜４）が続くと思われる。この観察は、製剤中の硫酸塩の存在は、コロイド安定性を改善することを示している。ＭｇＳＯ４とは対照的に、ＭｇＣｌ２（Ｅ１〜４）の存在は、試験したｐＨとは無関係に、安定性にマイナスの影響を及ぼすと思われる。ＰＤＩにおける変化を見ると、Ｎａ２ＳＯ４製剤（製剤Ｂ１〜４）は、最小の変化を示し、これにＭｇＳＯ４製剤（製剤Ｄ１〜４）及びＮａＣｌ含有製剤（製剤Ｆ１〜４）が続いた。Ｚ平均径における変化について上述した同一の説明は、さらに硫酸塩の存在が極めて重要であることを示しており、ＰＤＩ結果についてもあてはめることができ、示したデータに基づくと、Ｎａ２ＳＯ４が最も好ましいことを示している。
【０２０６】
実施例４
実験計画及び方法論
本試験では、実施例３と同一の塩が及ぼす作用を様々なｐＨでのリン酸バッファー中で試験した。これらの追加の製剤の概要は、表３に示した。
【０２０７】
【表３】
2020519666.tif 000004
【０２０８】
各製剤に加速ストレス条件（３７℃で１日間）を受けさせた。試料は、加速ストレスを適用する前後に測定した。濁度の測定は、ＢｉｏＴｅｋ  Ｎｅｏプレートリーダー上で実施した。動的光散乱測定（ＤＬＳ）（Ｚ平均径の変化及びＰＤＩの変化として示した）は、ゼータサイザー上で実施した。
【０２０９】
結果及び結論
この実施例において得られた全結果の概要は、図４に示した。各グラフは、様々なｐＨで製剤毎に得られた結果を示している。グラフの各列は、別個のアッセイを用いて得られた測定を示している。
【０２１０】
全体的に見て、濁度試験の結果から、Ｎａ２ＳＯ４含有製剤は、全４種の製剤（Ｂ１〜４）において受けた変化は最小であると結論付けることができる。ＭｇＣｌ２製剤（製剤Ｃ１〜４）は、濁度に関してはＮａ２ＳＯ４製剤より機能が低く、これにＮａＣｌ含有製剤（製剤Ｄ１〜４）が続く。コロイド特性に関する追加の情報を提供する、ＤＬＳによって得られた結果は、試験された全ｐＨ値について観察された、ＭＶＡ−ＢＮ−ＦＩＬＯの安定性にＮａ２ＳＯ４が及ぼす優勢な有益な作用を再び示した。ストレス後のＺ平均径における特に大きく望ましくない増加は、ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２製剤（Ｃ１〜４及びＤ１〜４）について観察されたが、これはＭＶＡ−ＢＮ−ＦＩＬＯのコロイド安定性に塩製剤を含有するコロイド中のＭｇ２＋イオンが及ぼすマイナスの作用を示している。したがって、Ｎａ２ＳＯ４含有製剤の安定化作用は、他の試験した製剤より強固であると結論付けることができる。
【０２１１】
実施例５
実験計画及び方法論
本実験では、以前の試験からの前途有望な製剤並びに新規な製剤及び硫酸塩を含有していないコントロール製剤を調製した。これらの製剤の概要は、表４に示した。
【０２１２】
各製剤は、加速ストレス条件（すなわち、２５℃で２週間；２Ｗ２５Ｃ）を受けさせた。製剤５、６及び８は、追加してまた別の加速ストレス条件、つまり３７℃で１日間（１Ｄ３７Ｃ）に曝露させた。試料は、加速ストレスを適用する前後に効力について測定した。効力測定は、下記に記載したように蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）アッセイによって記載し、相対的効力差として表示した（表５を参照されたい）。
【０２１３】
【表４】
2020519666.tif 000005
【０２１４】
結果及び結論
加速ストレス条件の結果としての効力の損失についての概要は、表５に各試験製剤に対して示した。
【０２１５】
【表５】
2020519666.tif 000006
【０２１６】
全体的に見て、結果は、試験組成物中の硫酸塩の存在は、加速ストレス後の効力の損失にプラスの作用を有することを示している。さらに、硫酸塩と相当に高いｐＨ（＞７．５）の組み合わせは、安定性をさらに改善する（製剤１、２、３、４及び７を参照されたい）。さらに、製剤中のグリセロールの存在は、効力の損失をさらに低下させると思われた。これは、製剤３及び８について観察された効力の損失によって証明される（詳細には、製剤８については１Ｄ３７Ｃ後）。
【０２１７】
実施例６
実験計画及び方法論
本実験では、初期の試験（実施例５、表５：製剤１、３及び７）からの前途有望な硫酸塩含有製剤並びに硫酸塩を含まないコントロール製剤を調製した。ＭＶＡ−ＢＮ−ＦＩＬＯ薬剤物質は、限外濾過／透析濾過を使用してバッファー交換されている。ほぼ所望の薬剤製品濃度の製剤をガラスバイアルに充填し、ストッパーをはめ、キャップをした。これらの製剤の概要は、表６に示した。各製剤は、次のストレス条件：ｉ）５℃で３カ月間、ｉｉ）−２０℃で３カ月間、ｉｉｉ）２０回の冷凍解凍サイクル、ｉｖ）２００ｒｐｍで１日間にわたる撹拌を受けさせた。試料は、様々な分光法（例えば、異方性法、内部蛍光法、９０度光散乱法、リン光法、動的光散乱法及び濁度法）によって、指示したストレス条件の１つの前後に測定した。さらに、試料を効力について測定した。
【０２１８】
濁度の測定は、ＢｉｏＴｅｋ  Ｎｅｏプレートリーダー上で実施した。動的光散乱測定（ＤＬＳ）（Ｚ平均径の変化及びＰＤＩの変化として示した）は、ゼータサイザー上で実施した。異方性、内部蛍光、９０度光散乱及びリン光の測定値は、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ  ４分光蛍光計上の石英製キュベット内で実施した（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｈｏｒｉｂａ，ＵＫ）。効力測定は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）アッセイによって実施し、１ｍＬ当たりの感染単位（表７）並びに相対的効力差（表８）として表示した。
【０２１９】
【表６】
2020519666.tif 000007
【０２２０】
結果及び結論
ストレス条件の適用の前後の製剤の効力は、表７及び８に提示した。図５、６、７及び８は、調製後並びに各々５℃で３カ月間、−２０℃で３カ月間、２０回の冷凍解凍サイクル及び２００ｒｐｍで１日間にわたる撹拌のストレス条件を受けた後のＭＶＡ製剤についての異方性、蛍光発光及び９０度光散乱スペクトルを含有している。図９は、試験試料の濁度、Ｚ平均径及びＰＤＩを含有する。製剤３は、−２０℃で３カ月間後、２０回の冷凍解凍サイクル後及び１日間の撹拌後に効力の損失を全く示さなかった（表７及び８）。測定された変動は、アッセイ変動の範囲内に含まれた。製剤７は１日間の撹拌後に効力の損失を全く示さなかったが、−２０℃で３カ月間後又は２０回の冷凍解凍サイクル後には強度の減少が生じた（表７及び８）。
【０２２１】
ＭＶＡ製剤は、感染性ＭＶＡ粒子（活性物質）並びに様々な宿主細胞タンパク質及び他のプロセス由来不純物の固有の組合せである；全部が一緒になって、平均径法及びＰＤＩ法によって測定されたサイズを備える小粒子及び大粒子を含有する白色がかった懸濁液を形成する。濁度法及び９０度光散乱法は、これらの懸濁液の粒子の性質に関する追加の洞察を提供する。一般に、製剤中の硫酸塩は濁度の減少を生じさせ、これは製剤１について最も顕著であると結論付けることができる（図９）。本実施例では、指示されたストレス条件を受けると、硫酸塩が製剤１中のより大きな粒子を減少させることに及ぼす破壊的作用は、さらに、濁度法、光散乱法、Ｚ平均径法及びＰＤＩ法のいっそう低い数値によって測定されるように、コントロールＡと比較してさらに増加した（図５〜９）。
【０２２２】
硫酸ナトリウム及びグリセロールを含むトリス中のＭＶＡである製剤３は、ストレス条件：ｉ）−２０℃で３カ月間後、ｉｉ）２０回の冷凍解凍サイクル、及びｉｉｉ）２００ｒｐｍで１日間にわたる撹拌を受けた後の異方性スペクトル、蛍光発光スペクトル、９０度光散乱、濁度、Ｚ平均径及びＰＤＩにおいて変化を全く、又はわずかしか示さなかった。これは、効力の損失における変化なし（アッセイ変動の範囲内）の観察所見と一致している。トリス及びグリセロールと組み合わせた硫酸塩は、ＭＶＡ製剤にプラスの影響を及ぼし、懸濁液の粒子の性質及びコロイド特性に関して適正な平衡が確立された；例えば、製剤は、Ｔ０と比較して、ほぼ０．３のＰＤＩによって証明されたように、その濁度並びに一部の不均質性を維持した（図９）。
【０２２３】
硫酸ナトリウムを含むリン酸バッファー中のＭＶＡである製剤７は、多数の小粒子及び大粒子の存在を示す、高ＰｄＩ値及び高Ｚ平均値を有していた（図９）。製剤７は、製剤３と類似の方法でＭＶＡを撹拌誘導性ストレスに対して安定化させた。撹拌は、製剤７の蛍光発光、９０度光散乱又は濁度における変化を誘導しなかったが、異方性値における小さな低下が測定された。これは、平均するとＴｒｐ環境が、ＭＶＡコロイド懸濁液の全体的粒子の性質に影響を及ぼすことなく低剛性（例えば、解離又はアンフォールディング）となることを示している。撹拌は製剤７の効力における変化を誘導しなかった；観察された変化は、非ＭＶＡ関連タンパク質の解離又は分解によって誘発された可能性が高かった。さらに、１日間の撹拌後の製剤７のＰｄＩ及びＺ平均値は５℃で３カ月間後又は−２０℃で３カ月間後の数値と比較して低かったが、これは粒子及びそのサイズ分布が程度の大きな凝集物若しくはクラスターを伴わない精製ＭＶＡ粒子から予想される粒子及びそのサイズ分布とより一致していたことを示している。製剤７は、製剤１と比較して、硫酸塩と組み合わされたリン酸塩の存在が硫酸塩を含むトリスよりも撹拌誘導性ストレスに対してより保護的であることを示している（表７及び８）。
【０２２４】
この実施例では、コントロール製剤Ｂ（トリス、グリセロール及びＮａＣｌ）は、コントロール製剤Ａと比較して類似若しくは不良な効力の損失を有したが、これはグリセロールの存在が硫酸塩を含有していないコントロール製剤の物理的及び生物学的特性を改善しなかったことを示している。しかし、コントロール製剤Ｂの塩化ナトリウムを硫酸ナトリウムと取り替えると（製剤３）、ＭＶＡ製剤の安定化は、効力における極めてわずかな変化から変化なしという結果を示した；−２０℃、２０回の冷凍解凍サイクル及び撹拌条件について表７及び８において示した数値は、アッセイ変動の範囲内に含まれる。
【０２２５】
結論として、ＭＶＡの効力及び物理的安定性は、製剤への硫酸塩の添加によって安定化された。硫酸塩とグリセロールの組み合わせは、冷凍状態及び冷凍−解凍後のどちらにおいてもＭＶＡ粒子を安定化させた。改善されたＭＶＡ安定性は、長期保管、備蓄及び現場での使用を含む、サプライチェーンにとって有益な可能性がある。
【０２２６】
【表７】
2020519666.tif 000008
【０２２７】
【表８】
2020519666.tif 000009
【０２２８】
実施例７
実験計画及び方法論
理論によって拘束されることを望むものではないが、硫酸塩（ＳＯ４２−）は、エンベロープウイルス及びそれらに由来する生成物の安定性にプラスの作用を有すると考えられる。したがって、次の３種のエンベロープウイルス及びワクチン：１）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、２）単純ヘルペスウイルスワクチン（ＨＳＶ）、及び３）インフルエンザワクチンに硫酸塩が及ぼす影響を調査する。
【０２２９】
本試験では、計１０種のｐＨ／バッファーの組み合わせを各エンベロープウイルス／ワクチンに対して調査する（表９を参照されたい）。これらの組み合わせを達成するために、各ウイルス／ワクチンは、ＭｉｌｌｉＱグレード水への限外濾過／透析濾過を使用してバッファー交換される。その後、特定容量の濃ｐＨ／バッファー溶液は、最終製剤中の各々の所望の濃度を達成するためにスパイクされることになる。これらの製剤の各々は、硫酸塩の作用を調査するために、１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４と組み合わされる、又は組み合わされない、及び１００ｍＭのＭｇＳＯ４と組み合わされる、又は組み合わされない。さらに、各製剤は、１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下及び非存在下で調製される。最後に、１５０ｍＭのＮａＣｌしか含まない１種の製剤は、陰性コントロールと一緒に採取される。表１０は、調査対象の組み合わせの概要を示す。
【０２３０】
【表９】
2020519666.tif 000010
【０２３１】
【表１０】
2020519666.tif 000011
【０２３２】
加速ストレス条件は、ウイルスの分解を誘導するためのツールとして使用される。これには、温度誘導ストレス、撹拌ストレス及び冷凍／解凍サイクルが含まれるがこれらに限定されない。加速ストレス条件を適用する前後に物理的／化学的特性を監視するためには、様々な分析方法が使用されるであろう。これには、分光学的アッセイ（内部蛍光、リン光、異方性、ＵＶ）、動的光散乱法、濁度法及びｐＨ測定法が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３３】
安定性を決定するために実施例において使用される方法
内部蛍光アッセイ
ＭＶＡタンパク質は、励起後に光を再び発する芳香族アミノ酸（蛍光体）、特にトリプトファンを含有し、程度は低いがチロシン及びフェニルアラニンも含む。トリプトファンの発光極大及び量子収量は、その環境の極性に強く依存する。（例えば、球状のタンパク質の表面、又は解離及び遊離状態にある）極性水性環境中では、量子収量は比較的低いが、（例えば、凝集物の内部又は親油性ウイルスエンベロープ）極性環境中では量子収量は増加する。この特徴のため、トリプトファン蛍光は、タンパク質の立体構造変化、凝集、分解、解離及び分子相互作用の研究に有用なツールである。
【０２３４】
蛍光強度は、アデノウイルス安定性の高感度の尺度であることが当技術分野において公知である。ストレスを受けると、試料中で発生する変化の性質に依存して、増加か減少のいずれかが観察され得る。タンパク質のアンフォールディング及びカプシドの分離は、内部蛍光の減少をもたらすと予測され、凝集は増加をもたらすと予測される。発光極大の位置における変化は、蛍光体の環境に関する追加の情報を提供する。一般に、レッドシフト（より長い波長に向かう最大強度のシフト）は、より水性の環境に蛍光体が曝露された場合に発生する。蛍光体が水からより遮断された場合は、典型的にはブルーシフト（より短い波長への最大強度のシフト）が発生する。
【０２３５】
ストレスを受けた試料について得られた蛍光は、常にコントロール試料と比較されなければならない。ｔ＝０試料に比較した変化（上昇又は低下）は、安定性の低い製剤を示す。ｔ＝０試料値に近いままである、ストレスを受けた試料は、より安定である。
【０２３６】
２種の異なる蛍光技術であるキュベットをベースとする分光蛍光計及びマイクロプレートをベースとするプレートリーダーを適用した。両方の技術の精度は、使用された範囲内で５％（ＣＶ％）未満である。
【０２３７】
キュベットをベースとする定常状態蛍光測定は、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−４分光蛍光計を使用して実施した（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｈｏｒｉｂａ，ＵＫ）。測定は、サーモスタット付きキュベットホルダーを使用して２５℃で実施した。Ｈｅｌｌｍａ石英製キュベットを使用した。定常状態発光測定のために、試料を２９０ｎｍで励起し、発光は、２ｎｍ（励起）及び４ｎｍ（発光）の帯域及び０．１の積分時間を使用して３００ｎｍ〜４５０ｎｍの間で監視した。
【０２３８】
マイクロプレートをベースとする内部蛍光アッセイは、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｎｅｏ２プレートリーダーを用いて測定した。試料は、３回ずつ、ＵＶ透過平底マイクロプレートに移す。トリプトファン蛍光は、２８０ｎｍでの励起、１０ｎｍの帯域幅及び３１０ｎｍ〜４５０ｎｍの間の発光後に測定する。
【０２３９】
異方性
定常状態蛍光異方性法は、蛍光体が偏光を回転させる能力を測定する。励起波長は、１つの方向に偏光され、引き続いて蛍光体によって発光されると回転させられる。フィルターを使用して励起波長と同一平面における発光波長が測定されるが、これは励起波長と同一平面内の光線だけが検出されることを意味する。偏光がより大きく回転させられると、検出器上の信号はより小さくなる。光線を回転させる能力は、個別蛍光体の平均柔軟性に左右される；蛍光体がより柔軟性であるほど、より多くの光線が回転させられ、検出器上の信号が小さくなる。これが異方性をタンパク質の立体構造変化、凝集、分解、解離及び分子相互作用を研究するための有用なツールにする。
【０２４０】
異方性がタンパク質安定性の高感度の尺度であることは、当技術分野において公知である。ストレスを受けると、試料中で発生する変化の性質に依存して、増加か減少のいずれかが観察され得る。タンパク質のアンフォールディング及びカプシドの解離は異方性の減少をもたらすと予測され、凝集は増加をもたらすと予測される。ストレスを受けた試料に関して得られた異方性は、常にコントロール試料と比較されなければならない。ストレスを加えた後の増加又は低下は分解経路に依存し、各医薬品有効成分（ＡＰＩ）について特異的であるため、それは予測することができない。ｔ＝０試料に比較した変化（上昇又は低下）は、低安定性の製剤であることを示す。ｔ＝０試料値に近いままであるストレスを受けた試料は、より安定が高い。
【０２４１】
定常状態蛍光異方性測定は、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−４分光蛍光計を使用して実施した（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｈｏｒｉｂａ，ＵＫ）。測定は、サーモスタット付きキュベットホルダーを使用して２５℃で実施した。Ｈｅｌｌｍａ石英製キュベットを使用した。定常状態異方性測定は、グラン−トンプソン偏光プリズムを備えるＴフォーマット構成を使用して実施した。異方性は、２９０ｎｍでの励起から生じた発光ピーク範囲（３３３〜３７５ｎｍ）内で測定した。蛍光異方性であるＡは、方程式：
【数１】
2020519666.tif 000012
（式中、Ｇは、補正係数、Ｇ＝Ｉ９０．０／Ｉ９０．９０である）から計算した。Ｉｍ，ｎは所定の波長での蛍光強度であり、下付き文字は、垂直軸に比較した励起（ｍ）及び発光（ｎ）ビームにおける偏光子の位置を指す。スペクトルは、１ｎｍのスペクトル工程に付き１．０ｓの積分時間を用いて記録した。
【０２４２】
９０度光散乱法
キュベットをベースとする９０度光散乱測定は、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−４分光蛍光計を使用して実施した（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｈｏｒｉｂａ，ＵＫ）。測定は、サーモスタット付きキュベットホルダーを使用して２５℃で実施した。Ｈｅｌｌｍａ石英製キュベットを使用した。角度９０度での光散乱は、５００〜７５０ｎｍの間の波長で、最適化された帯域の組み合わせと０．０１ｓの積分時間を用いて励起波長での発光を監視することによって測定した。光散乱スペクトルは、溶液中の粒子の濃度、屈折指数及びサイズに関する情報を提供する。この技術は、生物学的製剤の凝集状態における小さな変化に対して感受性であることが示されている。例えば、光散乱の減少は、粒子濃度の減少若しくは同一数の粒子サイズにおける減少又はそれらの組み合わせのいずれかによって説明することができる。光散乱の増加は、粒子数の増加若しくは同一数の粒子サイズの増加又はそれらの組み合わせに起因する凝集と結び付いていることが多い。
【０２４３】
動的光散乱法
動的光散乱法（ＤＬＳ）は、懸濁液中又は溶液中の粒子のサイズ分布を測定するために使用される技術である。偏光レーザー光は、試料中に侵入し、試料中に存在する粒子によって散乱させられる。散乱光は、引き続いて光電子増倍管によって収集される。このとき、強度の時系列でみた揺らぎが分析される。小さな粒子は大きな粒子よりも迅速に溶液中を移動するので、それらの高いブラウン運動に起因して、小さな粒子の強度の揺らぎはより大きくなる。ＭＶＡは粒子であり、偏光レーザー光を散乱させるので、ＤＬＳを使用すると、ＭＶＡ粒子のサイズの増加（例えば、凝集）及び／又は減少（例えば、解離）を決定することができ、これがＤＬＳを凝集又は解離を検出するための有用な技術にさせる。
【０２４４】
ＤＬＳ中では、試料は、三連で、ＵＶ透過平底マイクロプレートに移した。粒子のサイズ及び分布は、１０ｍＶのＨｅ−Ｎｅレーザー（８３０ｎｍ）を装備し、９０°の角度で作動するＤＬＳ装置ゼータサイザーＡＰＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して測定した。
【０２４５】
ストレスを受けた試料について得られたサイズ分布をコントロール試料と比較した。ｔ＝０試料に比較した変化（上昇又は低下）は、安定性の低い製剤を示す。ｔ＝０試料値に近いままであるストレスを受けた試料は、より安定が高い。
【０２４６】
３５０ｎｍでの濁度測定
濁度測定は、試料中の分子が光を吸収しない波長（例えば、タンパク質が主な発色団である試料では３５０ｎｍ）で検出される、試料中の粒子の散乱による透過光（見かけの吸光度）の強度の損失を測定するものである。分子が凝集するか、又は超分子複合体を形成すると、別々な粒子から来る場合にはランダムであった光散乱がコヒーレントになり、そのため測定される強度が増加する。これにより、光散乱及び濁度測定は、凝集及び複合体の形成又は分離を検出する有用な技法になる。
【０２４７】
濁度アッセイでは、試料は、三連でＵＶ透過平底マイクロプレートに移される。吸光度スペクトルが、２３０ｎｍ〜５００ｎｍの間でマイクロプレートリーダーによって記録され、光路長の差を決定して、おそらくそれに対して補正するために、９７５ｎｍでの吸光度が測定される。ＭＶＡを含まない製剤からなるコントロール試料は、必要であれば散乱若しくは吸収マトリックス成分に対して補正するために、アッセイに含められた。３５０ｎｍでの見かけの吸光度は、濁度の定量的な尺度として使用された。
【０２４８】
濁度アッセイは、ＭＶＡ試料の安定性を示すものである。ＭＶＡの凝集は濁度の上昇をもたらし、カプシドの解離は低下をもたらす。アッセイの精度は、１ＮＴＵを超える濁度値で５％（ＣＶ％）未満である。
【０２４９】
ストレスを受けた試料に関して得られた濁度は、常にコントロール試料と比較されなければならない。ｔ＝０試料に比較した変化（上昇又は低下）は、低安定性の製剤であることを示す。ｔ＝０試料に匹敵するストレスを受けた試料は、より安定であると予測される。
【０２５０】
リン光
リン光とは励起された三重項状態からの発光を指すが、蛍光は励起一重項状態からの発光を指す。リン光は、基本的には蛍光（ｎｓ規模）と類似であるがより長い時間尺度（ｍｓ〜ｍｓ）の方法での放射線の発光であるので、発光は励起が停止した後も継続する。ヤブロンスキー図によると、蛍光体は、光線を吸収して基底状態から一重項状態へ進み、その後に三重項状態への項間交差が続く。三重項状態（リン光）からの発光は、蛍光と比較して低エネルギー、したがってより高い波長にある。リン光信号は医薬品有効成分（ＡＰＩ）の特異的特性であり、減少の場合には、立体構造変化、分解若しくは解離の指標を提供する。リン光発光における増加は、より大きな剛性の構造が形成された場合、例えばタンパク質凝集の場合に発生し得る。
【０２５１】
蛍光測定は、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−４分光蛍光計を使用して実施した（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｈｏｒｉｂａ，ＵＫ）。測定は、サーモスタット付きキュベットホルダーを使用して２５℃で実施した。Ｈｅｌｌｍａ石英製キュベットを使用した。試料を３４３ｎｍで励起し、リン光は、２ｎｍ（励起）及び４ｎｍ（発光）の帯域及び０．５ｓの積分時間を使用して３６０ｎｍ〜５５０ｎｍの間で監視した。
【０２５２】
感染性（効力）を決定するための方法
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）アッセイ
組み換え若しくは非組み換えＭＶＡの力価（ＩｎｆＵ／ｍＬ）は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）アッセイによって決定した。ＭＶＡ感染ベビーハムスター腎細胞２１（ＢＨＫ−２１）細胞は、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）に対して特異的である蛍光色素共役抗体を用いて免疫染色し、引き続いて定量的細胞計数のためのＢＤフローセンサーを装備したＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）機器を使用して採取及び定量した。
【０２５３】
より詳細には、２．５×１０５ＢＨＫ２１細胞（入手源：ＡＴＣＣ）は１２ウエルプレート内のＧＭＥＭ／９％のＦＢＳ／１．８％のＡｌａ−Ｇｌｎ内に播種した。細胞は、翌日に、関心対象のＭＶＡウイルスストックの連続希釈を用いて感染させた。３７℃での１時間のインキュベーション後、リファンピン（ＧＭＥＭ／９％のＦＢＳ／１．８％のＡｌａ−Ｇｌｎ中の１００μｇ／ｍＬ）を加えた。細胞は感染１９±２時間後に採取し、固定し、抗体染色の前にＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）キットを用いて透過化した。固定した細胞は、６０〜９０分間にわたり抗ワクシニアＦＩＴＣ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、製品番号＃６０−ｖ６８）とともにインキュベートした。次に、ウイルス陽性細胞のパーセンテージは、ＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（商標）サイトメーターを使用するサイトメトリーによって決定した。総細胞計数は、並行して固定した未染色細胞上でＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（商標）フローセンサーを使用して決定した。アッセイのＩｎｆＵ／ｍＬの計算は、ウイルス陽性細胞のパーセンテージ、感染中に使用したウイルス希釈倍率、感染時液量及び１ウエル当たりの平均細胞数に基づいた。細胞計数ウエル間変動性に及ぼす作用を限定するために、細胞数は、複数ウエルの細胞計数を平均化することによって確定した。ウイルス試料のＩｎｆＵ／ｍＬを計算するためには、２〜３５％のＶＡＣＶ陽性細胞を含有する希釈倍率だけを含めた。
【０２５４】
１試料の希釈倍率当たりのＩｎｆＵ／ｍＬの計算は、下記の式にしたがって実施した：
【数２】
2020519666.tif 000013
【０２５５】
５０％組織培養感染率（ＴＣＩＤ５０）ＭＶＡ感染性アッセイ
ＴＣＩＤ５０は、国際公開第０３／０５３４６３号パンフレットの実施例２に記載された、９６ウエルフォーマットにおいて１０倍の希釈倍率を使用してＭＶＡの感染性を滴定するための方法である。ＭＶＡの滴定は、９６ウエルフォーマット内での１０倍の希釈倍率を使用したＴＣＩＤ５０に基づくアッセイにおいて実施した。アッセイのエンドポイントでは、感染細胞は、抗ワクチンウイルス抗体及び適切な染色用液を使用して可視化した。２〜３日齢の一次ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）細胞を７％のＲＰＭＩ中で１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。１０倍の希釈は、１希釈当たり８回の反復を用いて実施した。希釈後、９６ウエルプレートの１ウエル当たり１００μＬを播種した。３７℃及び５％ＣＯ２で細胞を一晩インキュベートした。
【０２５６】
ウイルス含有用液の希釈液は、ウシ胎児血清を含まないＲＰＭＩを使用する１０倍工程において作成した。次に、１００μＬの各ウイルス試料を細胞含有ウエルに添加した。９６ウエルプレートは、感染及びウイルス複製を許容するために３７℃で５％のＣＯ２を用いて５日間インキュベートした。細胞は、ワクシニアウイルス特異的抗体を用いた感染の５日後に染色した。特異的抗体を検出するために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体を使用した。ＭＶＡ特異的抗体は、ウサギポリクローナルの抗ワクシニアウイルス抗体、ＩｇＧ分画であった（Ｑｕａｒｔｅｔｔ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ  ＃９５０３−２０５７）。二次抗体は、ＨＲＰ結合ヤギポリクローナルの抗ウサギＩｇＧ抗体であった（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，＃Ｗ４０１１）。呈色反応は、公知の技術にしたがって実施した。呈色反応において陽性であった細胞を含む各ウエルは、ＴＣＩＤ５０の計算に対して陽性であると表示された。力価は、スピアマン・ケルバー計算法を使用して計算した。データはさらに、Ｔ＝０の時点からの任意の所定の時点に対する相対差であるウイルス力価の対数として表示することもできる。
【０２５７】
上記に記載した実施例は単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲及び精神は下記の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
2020519666.tif 000014
【図２】
2020519666.tif 000015
【図３】
2020519666.tif 000016
【図４】
2020519666.tif 000017
【図５】
2020519666.tif 000018
【図６】
2020519666.tif 000019
【図７】
2020519666.tif 000020
【図８】
2020519666.tif 000021
【図９】
2020519666.tif 000022
【国際調査報告】
2020519666.tif 000023
2020519666.tif 000024
2020519666.tif 000025