(57)【要約】  改変型親水性カーボンクラスター（ＨＣＣ）、ポリ（エチレングリコール）−親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）、並びにグラフェン量子ドット（ＧＱＤ）、ＰＥＧ化ＧＱＤ、低分子抗酸化物質、及びＰＥＧ化低分子抗酸化物質のような類似構造物質を開示する。これらの物質は鉄キレート化部分、デフェロキサミン、又は類似のキレート化部分で修飾されている。前記カーボンナノ構造体は共通の結合部位を利用することによりミトコンドリア内の伝達を含む細胞内伝達を促進し、処理前の前記キレート剤部分の酸化的破損を抑制し、且つ、体内での金属誘導性酸化ストレスの原因と結果を減少させることで一連の酸素中毒及び金属関連中毒向けの新しい形の治療法を提供する。グラフェン材料は急性及び慢性のミトコンドリア電子伝達系機能障害の治療に使用可能である。【選択図】図２３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キレート化部分で共有結合により修飾された抗酸化性ナノ粒子を含む治療用組成物であって、
（ａ）前記抗酸化性ナノ粒子が酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有し、
（ｂ）前記治療用組成物が対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元し、且つ
（ｃ）前記治療用組成物が、前記抗酸化性ナノ粒子を含まない同量の前記キレート化部分と比較して少なくとも１０倍高いキレート化効力を有する、
治療用組成物。
【請求項２】
前記治療用組成物が、前記抗酸化性ナノ粒子を含まない同量の前記キレート化部分と比較して少なくとも１００倍高いキレート化効力を有する、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３】
前記キレート化部分が金属キレート化部分である、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項４】
前記金属キレート化部分がアルミニウム、アメリシウム、ヒ素、カドミウム、セシウム、クロム、銅、キュリウム、鉄、鉛、水銀、プルトニウム、タリウム、ウラン、及び亜鉛からなる群より選択される金属のキレート剤である、請求項３に記載の治療用組成物。
【請求項５】
前記金属がヒ素、カドミウム、銅、鉄、鉛、セレン、亜鉛、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項４に記載の治療用組成物。
【請求項６】
前記キレート化部分がＤＥＦである、請求項３に記載の治療用組成物。
【請求項７】
前記抗酸化性ナノ粒子がＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択される、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項８】
前記治療用組成物がＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣである、請求項７に記載の治療用組成物。
【請求項９】
前記治療用組成物がＤＥＦ−ＰＥＧ−ＧＱＤである、請求項７に記載の治療用組成物。
【請求項１０】
ＰＥＧ：キレート化部分の比率が１：３〜３：１である、請求項７に記載の治療用組成物。
【請求項１１】
ＰＥＧ：キレート化部分の比率が１：１未満である、請求項１０に記載の治療用組成物。
【請求項１２】
前記治療用組成物がミトコンドリア損傷を治療、抑制、又は予防するように作用可能である、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１３】
前記キレート化部分がＤＥＦ、ＤＴＰＡ、ジメルカプロール、サクシマー、ユニチオール、プルシアンブルー、Ｄ−ペニシラミン、トリエンチン、デフェラシロクス、デフェリプロン、エデト酸二ナトリウムカルシウム（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシピリドネート、テトラチオモリブデート、ペンテト酸、及びトリエンチンからなる群より選択される、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１４】
（ａ）請求項１〜請求項１２までのいずれか一項、又は請求項１３に記載の治療用組成物を選択すること、及び
（ｂ）前記治療用組成物を対象に投与すること、
を含む方法であって、
（ｉ）投与された前記治療用組成物中のキレート剤部分の量が、前記抗酸化性ナノ粒子を含まない前記キレート剤部分が同程度のキレート化効力を得るために投与されることが必要な前記キレート剤部分の量の多くとも１０％にまで減少し、且つ
（ｉｉ）前記治療用組成物が前記対象に投与されると高力価の酸化体として機能し、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する、
方法。
【請求項１５】
投与された前記治療用組成物中のキレート剤部分の量が、前記抗酸化性ナノ粒子を含まない前記キレート剤部分が同程度のキレート化効力を得るために投与されることが必要な前記キレート剤部分の量の多くとも１％にまで減少する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療用組成物を投与する前記工程がミトコンドリア損傷を治療、抑制、又は予防するための工程である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程により前記対象における金属誘導性酸化ストレスが低減する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程により前記対象の組織損傷が治療される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織損傷が脳損傷である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記脳損傷が脳内出血である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織損傷が中枢神経系の一部である組織の損傷である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程によりフェロトーシスが抑制される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程により前記対象における金属中毒が治療される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象における前記金属中毒がアルミニウム、アメリシウム、ヒ素、カドミウム、セシウム、銅、クロム、銅、キュリウム、鉄、鉛、水銀、プルトニウム、タリウム、ウラン、及び亜鉛からなる群より選択される金属を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程により前記対象における酸素（Ｏ２）化された血流が改善する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程により前記対象の虚血及び再灌流傷害が治療、抑制、又は予防される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有する抗酸化性ナノ粒子を選択すること、及び
（ｂ）共有結合によりキレート化部分で前記抗酸化性ナノ粒子を修飾すること、を含む治療用組成物を作製する方法であって、
（ｉ）対象に投与されると高性能の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する前記治療用組成物であり、且つ
（ｉｉ）前記抗酸化性ナノ粒子を含まない同量の前記キレート化部分と比較して少なくとも１０倍高いキレート化効力を有する前記治療用組成物、
を作製する方法。
【請求項２８】
前記治療用組成物が、前記抗酸化性ナノ粒子を含まない同量の前記キレート化部分と比較して少なくとも１００倍高いキレート化効力を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記キレート化部分が金属キレート化部分である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記金属キレート化部分が、アルミニウム、アメリシウム、ヒ素、カドミウム、セシウム、クロム、銅、キュリウム、鉄、鉛、水銀、プルトニウム、タリウム、ウラン、又は亜鉛の金属キレート剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記金属がヒ素、カドミウム、銅、鉄、鉛、セレン、亜鉛、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記キレート化部分がＤＥＦである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗酸化性ナノ粒子がＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療用組成物がＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記治療用組成物がＤＥＦ−ＰＥＧ−ＧＱＤである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＥＧ：キレート化部分の比率が１：３〜３：１である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＥＧ：キレート化部分の比率が１：１未満である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療用組成物がミトコンドリア損傷を治療、抑制、又は予防するように作用可能である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記キレート化部分がＤＥＦ、ＤＴＰＡ、ジメルカプロール、サクシマー、ユニチオール、プルシアンブルー、Ｄ−ペニシラミン、トリエンチン、デフェラシロクス、デフェリプロン、エデト酸二ナトリウムカルシウム（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシピリドネート、テトラチオモリブデート、ペンテト酸、及びトリエンチンからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
共有結合によりキレート化部分で修飾された抗酸化性ナノ粒子を含む治療用組成物であって、
（ａ）前記抗酸化性ナノ粒子が酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有し、
（ｂ）前記キレート化部分が鉄キレート化部分であり、且つ
（ｃ）前記治療用組成物は対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する、
治療用組成物。
【請求項４１】
前記鉄キレート化部分がＤＥＦである、請求項４０に記載の治療用組成物。
【請求項４２】
前記抗酸化性ナノ粒子がＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択される、請求項４０に記載の治療用組成物。
【請求項４３】
（ａ）請求項４０〜請求項４１、又は請求項４２に記載の治療用組成物を選択すること、及び
（ｂ）前記治療用組成物を対象に投与することを含む方法であって、
前記治療用組成物が前記対象に投与されると高力価の酸化体として機能し、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する方法。
【請求項４４】
（ａ）酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有する抗酸化性ナノ粒子を選択すること、及び
（ｂ）共有結合によりキレート化部分で前記抗酸化性ナノ粒子を修飾すること、を含む治療用組成物を作製する方法であって、
（ｉ）前記キレート化部分が鉄キレート化部分であり、且つ
（ｉｉ）対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する前記治療用組成物、
を作製する方法。
【請求項４５】
前記鉄キレート化部分がＤＥＦである、請求項４４に記載の治療用組成物。
【請求項４６】
前記抗酸化性ナノ粒子がＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択される、請求項４４に記載の治療用組成物。
【請求項４７】
共有結合によりキレート化部分で修飾された抗酸化性ナノ粒子を含む治療用組成物であって、
（ａ）前記抗酸化性ナノ粒子が酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有し、
（ｂ）前記キレート化部分が前記キレート化部分によるキレート化のための活性部位ではない第１部分を有し、
（ｃ）前記キレート化部分が前記第１部分において前記抗酸化性ナノ粒子に共有結合しており、且つ
（ｄ）前記治療用組成物が対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する、
治療用組成物。
【請求項４８】
前記抗酸化性ナノ粒子がＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択される、請求項４７に記載の治療用組成物。
【請求項４９】
（ａ）請求項４７又は請求項４８に記載の治療用組成物を選択すること、及び
（ｂ）前記治療用組成物を対象に投与すること、
を含む方法であって、
前記治療用組成物が前記対象に投与されると高力価の酸化体として機能し、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する方法。
【請求項５０】
（ａ）酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有する抗酸化性ナノ粒子を選択すること、及び
（ｂ）キレート化部分で共有結合により前記抗酸化性ナノ粒子を修飾すること、を含む治療用組成物を作製する方法であって、
（ｉ）前記キレート化部分が前記キレート化部分によるキレート化のための活性部位ではない第１部分を有し、
（ｉｉ）前記キレート化部分が前記第１部分において前記抗酸化性ナノ粒子に共有結合しており、且つ
（ｉｉｉ）対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する前記治療用組成物、
を作製する方法。
【請求項５１】
前記抗酸化性ナノ粒子がＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択される、請求項５０に記載の治療用組成物。
【請求項５２】
対象における電子伝達の障害を治療する方法であって、
（ａ）電子伝達系のミトコンドリア複合体からの電子の漏出を含む電子伝達の障害を治療する必要がある対象を特定すること、
（ｂ）酸化抑制特性と酸化促進特性を有する炭素材料を含む治療用組成物を前記対象に投与すること、
（ｃ）前記治療用組成物を利用して前記対象内の活性酸素種（ＲＯＳ）上のフリーラジカルを消滅させること、及び
（ｄ）前記治療用組成物を利用して前記対象の細胞のミトコンドリア膜内で電子を伝達すること、
を含む方法。
【請求項５３】
生成した活性酸素種（ＲＯＳ）又は生成した活性窒素種（ＲＮＳ）を除去することにより電子伝達系のミトコンドリア複合体からの電子の漏出に直接的に対処するために前記治療用組成物を利用することがさらに含まれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記活性酸素種（ＲＯＳ）が超酸化物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記活性酸素種（ＲＯＳ）がヒドロキシラジカルである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
活性窒素種のフリーラジカルを消滅させるために前記治療用組成物を利用することがさらに含まれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
電子シャトルと電子伝達を回復させるために前記治療用組成物を利用することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
電子シャトルと電子伝達を回復させるために前記治療用組成物を利用する前記工程が前記対象の内在性電子シャトル能の機能不全からの保護を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象においてプロトン濃度勾配の喪失、活性酸素種レベルの上昇、及び細胞損傷を引き起こす前記電子漏出を抑制することにより重要な細胞システムに対する損傷を治療する、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記電子漏出が電子伝達タンパク質及びそれらのタンパク質の中間物に対する傷害から生じる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記電子タンパク質及びそれらのタンパク質の中間物がＮＡＤＰＨ、フラビン、シトクロムｃ、ミトコンドリア酵素、オルガネラ酵素、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
電子シャトルと電子伝達の回復能が細胞のミトコンドリア膜、オルガネラ、又はそれらの組合せにおいて生じる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
細胞のミトコンドリア膜内で電子を伝達するために前記治療用組成物を利用することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象が哺乳類動物である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６５】
前記哺乳類動物がヒトである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記治療用組成物の前記投与が静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、経口経路、皮膚経路、又は経鼻経路を介した投与を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６７】
前記電子伝達の障害が、先天性及び後天性のミトコンドリア損傷、神経系に対する急性損傷、末梢性損傷、全身性損傷、神経変性障害、全身性臓器障害、炎症性疾患、臓器移植、血流再開を伴う臓器移植、外傷、出血性ショックと血流再開を伴う外傷、脳卒中、脳への血流再開を伴う脳卒中、及びそれらの組合せからなる群より選択される症状に関連する、請求項５２に記載の方法。
【請求項６８】
（ａ）前記先天性及び後天性のミトコンドリア損傷がミトコンドリア遺伝子変異疾患、ウィルソン病、金属代謝遺伝子疾患、シアン化物又はヒ素を例とするミトコンドリア毒素による急性及び慢性の中毒、及びそれらの組合せからなる群より選択され、
（ｂ）前記神経系に対する急性損傷が外傷性脳損傷、虚血、出血、無酸素性脳症、低酸素性又は虚血性脳症、再灌流、血流再開、脳卒中、脳血管機能不全、脊髄損傷、中枢神経系損傷、及びそれらの組合せからなる群より選択され、
（ｃ）前記末梢性損傷がニューロパチーからなる群より選択され、
（ｄ）前記全身性損傷が出血性ショック、低酸素症、低血圧、心筋梗塞と心筋損傷、肺損傷、及びそれらの組合せからなる群より選択され、
（ｅ）前記神経変性障害がアルツハイマー病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、自閉症、ウィルソン病及びそれらの組合せからなる群より選択され、
（ｆ）前記全身性臓器障害が肝臓疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、糖尿病、心筋梗塞と心筋損傷、肺損傷、及びそれらの組合せからなる群より選択され、且つ
（ｇ）前記炎症性疾患が炎症性腸疾患からなる群より選択される、
請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記電子伝達の障害が外傷性脳損傷後の脳血管機能不全に関連する、請求項５２に記載の方法。
【請求項７０】
前記炭素材料が単層ナノチューブ、二層ナノチューブ、三層ナノチューブ、多層ナノチューブ、超短ナノチューブ、グラフェン、グラフェンナノリボン、グラファイト、グラフェンオキシド、グラフェンオキシドナノリボン、カーボンブラック、酸化カーボンブラック、親水性カーボンクラスター、グラフェン量子ドット、カーボンドット、石炭、コークス、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項７１】
前記炭素材料にヘテロ原子がドープされている、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｂ、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記炭素材料に複数の可溶化基で官能化する、請求項５２に記載の方法。
【請求項７４】
前記可溶化基がポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ｐ−フェニレンオキシド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニルアミン）、ビニルポリマー、連鎖成長ポリマー、逐次成長ポリマー、縮合重合体、開環重合体、開環メタセシス重合体、リビングポリマー、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記炭素材料が官能化されたペリレンジイミド、又は官能化された多環式芳香族コアを含む小分子である、請求項５２に記載の方法。
【請求項７６】
前記小分子が、ヒドロキシル基、カルボキシル基、キノン基、エポキシ基、アミノ基、トリフルオロメチル基、スルホン基、ヒドラジン基、イミン基、ヒドロキシイミン基、又はそれらの組合せの部分を有する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記治療用組成物が標的薬剤をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項７８】
前記標的薬剤がオルガネラ、臓器、又は細胞種に対する標的薬剤である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記標的薬剤が酸化ストレスに応答して上方制御される細胞表面部分を標的とするタンパク質である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記標的薬剤がｐ−セレクチン、トランスフェリン受容体、アンギオテンシン受容体、カンナビノイド受容体、上皮成長因子受容体、接着分子、チャネルタンパク質、及びそれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記標的薬剤が抗体、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー、小分子、デンドリマー、炭水化物、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記標的薬剤がキレート剤である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
前記キレート剤がＤＥＦ、ＤＴＰＡ、ジメルカプロール、サクシマー、ユニチオール、プルシアンブルー、Ｄ−ペニシラミン、トリエンチン、デフェラシロクス、デフェリプロン、エデト酸二ナトリウムカルシウム（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシピリドネート、テトラチオモリブデート、ペンテト酸、及びトリエンチンからなる群より選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記標的薬剤が前記炭素材料と共有結合している、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
（ａ）前記炭素材料が輸送体部分と結合しており、且つ
（ｂ）前記輸送体部分により関門を通過する前記炭素材料の輸送が促進される
請求項５２に記載の方法。
【請求項８６】
前記関門が血液脳関門、血液脊髄関門、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記輸送体部分がアダマンタン分子、アダマンタン分子誘導体、カンナビノイド分子、カンナビノイド分子誘導体、ＨＵ−２１０、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記輸送体部分が非天然エナンチオマーからなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記炭素材料が抗酸化活性と併せて電子シャトルと電子伝達の修復能を有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項９０】
前記抗酸化活性が活性酸素種、活性窒素種、又はそれらの組合せに対しての活性である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記活性酸素種が超酸化物、又はヒドロキシラジカル、又はそれらの組合せを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記抗酸化薬が一酸化窒素に対して非反応性である、請求項８９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許及び特許出願
本出願は（ａ）２０１７年４月２８日に出願された「付属キレート化部分を有する抗酸化性ナノ粒子並びに同抗酸化性ナノ粒子の作製方法及び使用方法（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ａｔｔａｃｈｅｄ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｍｏｉｅｔｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓａｍｅ）」という標題の米国特許出願第６２／４９１，９９５号、及び（ｂ）２０１７年９月１１日に出願された「急性及び慢性ミトコンドリア電子伝達系機能障害の治療向けのグラフェン材料（Ｇｒａｐｈｅｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）」という標題の米国特許出願第６２／５５６，７１９号という仮特許出願の優先権を請求するものである。それらの出願は共通して本発明の出願人に属するものであり、ここで参照によりそれらの出願の全体を全ての目的のために本明細書に援用する。
【０００２】
政府の利害
本発明は助成番号第ＮＳ０９４５３５号、第ＮＳ０８４２９０号、及び第ＮＳ０８８６４５号の米国国立衛生研究所の研究助成を受けて行われた。米国政府は本発明についてある一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は概して急性及び慢性のミトコンドリア電子伝達系機能障害の治療法及び同治療法に使用されるグラフェン材料、例えば、相乗活性のために付着したキレート化部分を有する抗酸化性ナノ粒子をはじめとする修飾型抗酸化性ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００４】
米国では外傷性脳損傷（ＴＢＩ）が主要な死亡及び身体障碍の原因である。毎年推定１７０万人がＴＢＩの被害を受けており、５２，０００人が死亡し、２７５，０００人が入院している。ＴＢＩは軽度、中程度、及び重度の損傷に分類され、毎年ＴＢＩによる損傷の約７５％が脳震盪又は軽度外傷性脳損傷（ＭＴＢＩ）に分類されている。同時に起きた損傷からの出血に起因することが多い低血圧のために全ての重症度レベルのＴＢＩが悪化する。特に出血性低血圧などの副次的外傷によって悪化するときには酸化ストレスがＴＢＩの顕著な特徴である。
【０００５】
酸化ストレスが虚血及び再灌流傷害の主要な病態生理学的因子であることは多数の証拠に基づいている。この証拠は、遺伝子導入された抗酸化物質を過剰発現する複数の虚血再灌流モデルにおける強固な神経保護によって示されている。しかしながら、あらゆる形態の脳損傷の抗酸化療法のうち治験で利益を示したものはない。２つの主要な要因のためにこのように不成功に終わったと考えられている。それらの要因とは、（１）現在利用可能な抗酸化薬には事前処理と対照的に虚血の後に用いられると有効性を減じる重大な限界が存在すること、及び（２）酸化ストレス損傷は特定の臨床状況下では量的に大きくなるため、最も適切な条件で検査されないと利益を見落とす可能性があることである。脳卒中ではそれらの条件は、典型的には、再灌流療法で治療されるときの脳卒中時の最悪の転帰、例えば高血糖症を有する条件である（６）。より具体的には、動物モデルはＴＢＩの直後に抗酸化薬で試験されることが多かった。一方、クリニカルシナリオでは損傷の時点と根本治療の時点との間に遅れがあることが多い。したがって、より正確な動物モデルは損傷してから患者が救急施設で処置され得る時点までの典型的な時間をシミュレートするために６０〜９０分の時間だけ治療レジメを遅らせるべきである。
【０００６】
幾つかの保護機構が正常な生理機能の間に生成される酸化的ラジカルに対処するために存在する。これらの機構は、最終的には水に至る一連の工程においてラジカル種を修飾する酵素と他のタンパク質から構成されている。スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）によって触媒される不均化により２分子のＳＯが反応して１分子のＯ２と１分子の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を形成する超酸化物ラジカル（Ｏ２・−、又はＳＯと略称される）の運命が例として挙げられる。そのＨ２Ｏ２が遊離状態の鉄と出会うとその鉄はＨ２Ｏ２がヒドロキシラジカル（ＨＯ・）を生成するフェントン反応を触媒する。正常な状態ではこの過剰な遊離状態の鉄を除去することにより反応性の高いヒドロキシラジカルの形成を抑制する解毒作用のための充分なレベルの防御タンパク質が存在する。しかしながら病的状況下ではこれらの防御因子が失われている。急性損傷の後ではそれらの防御因子は充分に早く発現上昇することができない。その結果、多種多様な生命機能の損傷と破綻につながるラジカルカスケードの一部になる不安定な中間物が形成される。
【０００７】
これらを考慮すると、一旦ラジカルカスケードが開始すると、以下の事項を含むものとして現在の抗酸化薬の限界をまとめることができる。
【０００８】
（Ａ）作用機序：
多くの抗酸化薬がラジカルを別の不安定な種に「伝達」する。ＳＯＤはＨ２Ｏ２を生成し、その過酸化水素は後に・ＯＨを生成することができる。正常な状況下ではその結果生じたラジカルを除去するために充分な量のカタラーゼとグルタチオンが存在する。病的状態下ではこのようにいかない可能性があり、実際にはＳＯＤがより有害な種を生成する可能性がある。
【０００９】
（Ｂ）再生の必要性：
ビタミンＥ及びビタミンＣなどの多くの抗酸化薬は再生される必要があり、且つ、酸化的環境で消費される因子（グルタチオン）を必要とする。
【００１０】
（Ｃ）能力の限界：
最も新しい抗酸化薬が限られた能力しか持たず、ラジカルとそれらのその後の不安定な生成物の爆発的増加が始まった後に投与されるとそれらの抗酸化薬はその爆発的増加に対処できそうにない。高用量アルブミンは脳卒中における抗酸化薬として利益を示すことに最近失敗しており、その高用量アルブミンではラジカルを除去するチオール部分の数が限定されている。
【００１１】
（Ｄ）選択性：
抗酸化薬の機序がラジカル伝達を含み、新規に形成されたラジカルに対処するために下流酵素に依存する場合に高い選択性は不利である。
【００１２】
ほぼ全ての現在の抗酸化薬がこれらの限界のうちの１又は複数の限界を共有している。したがって、改良型の抗酸化薬が依然として必要である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は改変型親水性カーボンクラスター（ＨＣＣ）、ポリ（エチレングリコール）−親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）、並びにグラフェン量子ドット（ＧＱＤ）、ＰＥＧ化ＧＱＤ（ＰＥＧ−ＧＱＤ）、低分子抗酸化物質、及びＰＥＧ化低分子抗酸化物質のような類似構造物質を含む。具体的には、これらの物質は鉄キレート化部分、デフェロキサミン、又は類似のキレート化部分で修飾されている。カーボンナノ構造体は共通の結合部位を利用することによりミトコンドリア内の伝達を含む細胞内伝達を促進し、処理前の前記キレート剤部分の酸化的破損を抑制し、且つ、体内での金属誘導性酸化ストレスの原因と結果を減少させることで一連の酸素中毒及び金属関連中毒向けの新しい形の治療法を提供する。
【００１４】
さらに本発明はミトコンドリア損傷時の電子伝達系「バイパス」機構としての新しい用途に合うグラフェン材料の新しく発見された機能に関し、その機能でグラフェン材料は既存の電子伝達系メンバーと直接的に置き換わらずに、又は既存の電子伝達系メンバーの代わりをせずに電子伝達系において超酸化物から電子を捕捉し、酸化種を還元する。これは本出願人が高力価抗酸化薬として機能することを以前に示した材料の新しい用途であり、ミトコンドリア損傷を含む症状にまでこれらの薬剤の潜在的な用途を拡大する。重要な代用物質とミトコンドリア電子伝達系のタンパク質との間で電子を伝達する新しいメカニズムが発見された。この新しいメカニズムの電子伝達シャトル（ＥＴＳ）はケント電子伝達シャトル（ＫＥＴＳ）と呼ばれている。
【００１５】
概して、１つの実施形態では本発明は共有結合によりキレート化部分で修飾された抗酸化性ナノ粒子を含む治療用組成物を特徴とする。この抗酸化性ナノ粒子は酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有する。この治療用組成物は対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する。この治療用組成物は前記抗酸化性ナノ粒子を含まない同量の前記キレート化部分と比較して少なくとも１０倍高いキレート化効力を有する。
【００１６】
本発明の実施態様は以下の特徴のうちの１又は複数の特徴を含み得る。
【００１７】
前記治療用組成物は前記抗酸化性ナノ粒子を含まない同量の前記キレート化部分と比較して少なくとも１００倍高いキレート化効力を有し得る。
【００１８】
前記キレート化部分は金属キレート化部分であり得る。
【００１９】
前記金属キレート化部分はアルミニウム、アメリシウム、ヒ素、カドミウム、セシウム、クロム、銅、キュリウム、鉄、鉛、水銀、プルトニウム、タリウム、ウラン、及び亜鉛からなる群より選択される金属のキレート剤であり得る。
【００２０】
前記金属はヒ素、カドミウム、銅、鉄、鉛、セレン、亜鉛、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【００２１】
前記キレート化部分はＤＥＦであり得る。
【００２２】
前記抗酸化性ナノ粒子はＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択され得る。
【００２３】
前記治療用組成物はＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣであり得る。
【００２４】
前記治療用組成物はＤＥＦ−ＰＥＧ−ＧＱＤであり得る。
【００２５】
ＰＥＧ：キレート化部分の比率は１：３〜３：１であり得る。
【００２６】
ＰＥＧ：キレート化部分の比率は１：１未満であり得る。
【００２７】
前記治療用組成物はミトコンドリア損傷を治療、抑制、又は予防するように作用可能であり得る。
【００２８】
前記キレート化部分はＤＥＦ、ＤＴＰＡ、ジメルカプロール、サクシマー、ユニチオール、プルシアンブルー、Ｄ−ペニシラミン、トリエンチン、デフェラシロクス、デフェリプロン、エデト酸二ナトリウムカルシウム（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシピリドネート、テトラチオモリブデート、ペンテト酸、及びトリエンチンからなる群より選択され得る。
【００２９】
概して、別の実施形態では本発明は上記治療用組成物のうちの１つを選択することを含む方法を特徴とする。その方法は対象にこの治療用組成物を投与することをさらに含む。投与されるこの治療用組成物中のキレート剤部分の量は、前記抗酸化性ナノ粒子を含まない前記キレート剤部分が同程度のキレート化効力を得るために投与されることが必要な前記キレート剤部分の量の多くとも１０％にまで減少する。この治療用組成物は前記対象に投与されると高力価の酸化体として機能し、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する。
【００３０】
本発明の実施態様は以下の特徴のうちの１又は複数の特徴を含み得る。
【００３１】
投与される前記治療用組成物中のキレート剤部分の量は、前記抗酸化性ナノ粒子を含まない前記キレート剤部分が同程度のキレート化効力を得るために投与されることが必要な前記キレート剤部分の量の多くとも１％にまで減少し得る。
【００３２】
前記治療用組成物を投与する前記方法ステップはミトコンドリア損傷を治療、抑制、又は予防することであり得る。
【００３３】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程により前記対象における金属誘導性酸化ストレスが低減し得る。
【００３４】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程により前記対象の組織損傷が治療され得る。
【００３５】
前記組織損傷は脳損傷であり得る。
【００３６】
前記脳損傷は脳内出血であり得る。
【００３７】
前記組織損傷は中枢神経系の一部である組織の損傷であり得る。
【００３８】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程によりフェロトーシスが抑制され得る。
【００３９】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程により前記対象における金属中毒が治療され得る。
【００４０】
前記対象における前記金属中毒はアルミニウム、アメリシウム、ヒ素、カドミウム、セシウム、銅、クロム、銅、キュリウム、鉄、鉛、水銀、プルトニウム、タリウム、ウラン、及び亜鉛からなる群より選択される金属を含み得る。
【００４１】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程により前記対象における酸素（Ｏ２）化された血流が改善され得る。
【００４２】
前記対象に前記治療用組成物を投与する前記工程により前記対象の虚血及び再灌流傷害が治療、抑制、又は予防され得る。
【００４３】
概して、別の実施形態では本発明は治療用組成物の作製方法を特徴とする。その方法は抗酸化性ナノ粒子を選択する工程を含む。この抗酸化性ナノ粒子は酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有する。この方法は共有結合によりキレート化部分で前記抗酸化性ナノ粒子を修飾する工程をさらに含む。この治療用組成物は対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する。この治療用組成物は前記抗酸化性ナノ粒子を含まない同量の前記キレート化部分と比較して少なくとも１０倍高いキレート化効力を有する。
【００４４】
本発明の実施態様は以下の特徴のうちの１又は複数の特徴を含み得る。
【００４５】
前記治療用組成物は前記抗酸化性ナノ粒子を含まない同量の前記キレート化部分と比較して少なくとも１００倍高いキレート化効力を有し得る。
【００４６】
前記キレート化部分は金属キレート化部分であり得る。
【００４７】
前記金属キレート化部分は、金属のキレート剤、例えば、アルミニウムキレート化部分、アメリシウムキレート化部分、ヒ素キレート化部分、カドミウムキレート化部分、セシウムキレート化部分、クロムキレート化部分、銅キレート化部分、キュリウムキレート化部分、鉄キレート化部分、鉛キレート化部分、水銀キレート化部分、プルトニウムキレート化部分、タリウムキレート化部分、ウランキレート化部分、又は亜鉛キレート化部分であり得る。
【００４８】
前記金属はヒ素、カドミウム、銅、鉄、鉛、セレン、亜鉛、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【００４９】
前記キレート化部分はＤＥＦであり得る。
【００５０】
前記抗酸化性ナノ粒子はＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択され得る。
【００５１】
前記治療用組成物はＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣであり得る。
【００５２】
前記治療用組成物はＤＥＦ−ＰＥＧ−ＧＱＤであり得る。
【００５３】
ＰＥＧ：キレート化部分の比率は１：３〜３：１であり得る。
【００５４】
ＰＥＧ：キレート化部分の比率は１：１未満であり得る。
【００５５】
前記治療用組成物はミトコンドリア損傷を治療、抑制、又は予防するように作用可能であり得る。
【００５６】
前記キレート化部分はＤＥＦ、ＤＴＰＡ、ジメルカプロール、サクシマー、ユニチオール、プルシアンブルー、Ｄ−ペニシラミン、トリエンチン、デフェラシロクス、デフェリプロン、エデト酸二ナトリウムカルシウム（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシピリドネート、テトラチオモリブデート、ペンテト酸、及びトリエンチンからなる群より選択され得る。
【００５７】
概して、別の実施形態では本発明は共有結合によりキレート化部分で修飾された抗酸化性ナノ粒子を含む治療用組成物を特徴とする。この抗酸化性ナノ粒子は酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有する。このキレート化部分は鉄キレート化部分である。この治療用組成物は対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する。
【００５８】
本発明の実施態様は以下の特徴のうちの１又は複数の特徴を含み得る。
【００５９】
前記鉄キレート化部分はＤＥＦであり得る。
【００６０】
前記抗酸化性ナノ粒子はＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択され得る。
【００６１】
概して、別の実施形態では本発明は上記治療用組成物のうちの１つを選択することを含む方法を特徴とする。その方法は対象にこの治療用組成物を投与することをさらに含む。この治療用組成物は前記対象に投与されると高力価の酸化体として機能し、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する。
【００６２】
概して、別の実施形態では本発明は治療用組成物の作製方法を特徴とする。その方法は抗酸化性ナノ粒子を選択する工程を含む。この抗酸化性ナノ粒子は酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有する。この方法は共有結合によりキレート化部分で前記抗酸化性ナノ粒子を修飾する工程をさらに含む。このキレート化部分は鉄キレート化部分である。この治療用組成物は対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する。
【００６３】
本発明の実施態様は以下の特徴のうちの１又は複数の特徴を含み得る。
【００６４】
前記鉄キレート化部分はＤＥＦであり得る。
【００６５】
前記抗酸化性ナノ粒子はＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択され得る。
【００６６】
概して、別の実施形態では本発明は共有結合によりキレート化部分で修飾された抗酸化性ナノ粒子を含む治療用組成物を特徴とする。この抗酸化性ナノ粒子は酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有する。このキレート化部分はこのキレート化部分によるキレート化のための活性部位ではない第１部分を有する。このキレート化部分はその第１部分において前記抗酸化性ナノ粒子に共有結合している。この治療用組成物は対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する。
【００６７】
本発明の実施態様は以下の特徴のうちの１又は複数の特徴を含み得る。
【００６８】
前記抗酸化性ナノ粒子はＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択され得る。
【００６９】
概して、別の実施形態では本発明は上記治療用組成物のうちの１つを選択することを含む方法を特徴とする。その方法は対象にこの治療用組成物を投与することをさらに含む。この治療用組成物は前記対象に投与されると高力価の酸化体として機能し、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する。
【００７０】
概して、別の実施形態では本発明は治療用組成物の作製方法を特徴とする。その方法は抗酸化性ナノ粒子を選択する工程を含む。この抗酸化性ナノ粒子は酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有する。この方法は共有結合によりキレート化部分で前記抗酸化性ナノ粒子を修飾する工程を含む。このキレート化部分はこのキレート化部分によるキレート化のための活性部位ではない第１部分を有する。このキレート化部分はその第１部分において前記抗酸化性ナノ粒子に共有結合している。この治療用組成物は対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する。
【００７１】
本発明の実施態様は以下の特徴のうちの１又は複数の特徴を含み得る。
【００７２】
前記抗酸化性ナノ粒子はＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ、及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択され得る。
【００７３】
概して、別の実施形態では本発明は対象における電子伝達の障害を治療する方法を特徴とする。その方法は電子伝達の障害を治療する必要がある対象を特定することを含む。その電子伝達の障害は電子伝達系のミトコンドリア複合体からの電子の漏出を含む。この方法はその対象に治療用組成物を投与することをさらに含む。この治療用組成物は酸化抑制特性と酸化促進特性を有する炭素材料を含む。この方法は、この治療用組成物を利用して前記対象内の活性酸素種（ＲＯＳ）上のフリーラジカルを消滅させることをさらに含む。この方法は、この治療用組成物を利用して前記対象内の細胞のミトコンドリア膜内で電子を伝達することをさらに含む。
【００７４】
本発明の実施態様は以下の特徴のうちの１又は複数の特徴を含み得る。
【００７５】
前記方法は、生成した活性酸素種（ＲＯＳ）又は生成した活性窒素種（ＲＮＳ）を除去することにより電子伝達系のミトコンドリア複合体からの電子の漏出に直接的に対処するために前記治療用組成物を利用することをさらに含み得る。
【００７６】
前記活性酸素種（ＲＯＳ）は超酸化物を含み得る。
【００７７】
前記活性酸素種（ＲＯＳ）はヒドロキシラジカルを含み得る。
【００７８】
前記方法は、活性窒素種上のフリーラジカルを消滅させるために前記治療用組成物を利用することをさらに含み得る。
【００７９】
前記方法は、電子シャトルと電子伝達を回復させるために前記治療用組成物を利用することをさらに含み得る。
【００８０】
電子シャトルと電子伝達を回復させるために前記治療用組成物を利用する前記工程は、前記対象の内在性電子シャトル能の機能不全からの保護を含み得る。
【００８１】
前記対象においてプロトン濃度勾配の喪失、活性酸素種レベルの上昇、及び細胞損傷を引き起こす前記電子漏出を抑制することにより重要な細胞システムに対する損傷を治療することができる。
【００８２】
前記電子の漏出は電子伝達タンパク質及びそれらのタンパク質の中間物に対する傷害から生じ得る。
【００８３】
前記電子タンパク質及びそれらのタンパク質の中間物はＮＡＤＰＨ、フラビン、シトクロムｃ、ミトコンドリア酵素、オルガネラ酵素、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【００８４】
電子シャトルと電子伝達の回復能は細胞のミトコンドリア膜、オルガネラ、又はそれらの組合せにおいて生じ得る。
【００８５】
前記方法は、細胞のミトコンドリア膜内で電子を伝達するために前記治療用組成物を利用することをさらに含み得る。
【００８６】
前記対象は哺乳類動物であり得る。
【００８７】
前記哺乳類動物はヒトであり得る。
【００８８】
前記治療用組成物の前記投与は静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、経口経路、皮膚経路、又は経鼻経路を介した投与を含み得る。
【００８９】
前記電子伝達の方法障害は、先天性及び後天性のミトコンドリア損傷、神経系に対する急性損傷、末梢性損傷、全身性損傷、神経変性障害、全身性臓器障害、炎症性疾患、臓器移植、血流再開を伴う臓器移植、外傷、出血性ショックと血流再開を伴う外傷、脳卒中、脳への血流再開を伴う脳卒中、及びそれらの組合せからなる群より選択される症状に関連し得る。
【００９０】
前記先天性及び後天性のミトコンドリア損傷はミトコンドリア遺伝子変異疾患、ウィルソン病、金属代謝遺伝子疾患、シアン化物又はヒ素を例とするミトコンドリア毒素による急性及び慢性の中毒、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。前記神経系に対する急性損傷は外傷性脳損傷、虚血、出血、無酸素性脳症、低酸素性又は虚血性脳症、再灌流、血流再開、脳卒中、脳血管機能不全、脊髄損傷、中枢神経系損傷、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。前記末梢性損傷はニューロパチーからなる群より選択され得る。前記全身性損傷は出血性ショック、低酸素症、低血圧、心筋梗塞と心筋損傷、肺損傷、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。前記神経変性障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、自閉症、ウィルソン病及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。前記全身性臓器障害は肝臓疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、糖尿病、心筋梗塞と心筋損傷、肺損傷、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。前記炎症性疾患は炎症性腸疾患からなる群より選択され得る。
【００９１】
前記電子伝達の障害は外傷性脳損傷後の脳血管機能不全に関連し得る。
【００９２】
前記炭素材料は単層ナノチューブ、二層ナノチューブ、三層ナノチューブ、多層ナノチューブ、超短ナノチューブ、グラフェン、グラフェンナノリボン、グラファイト、グラフェンオキシド、グラフェンオキシドナノリボン、カーボンブラック、酸化カーボンブラック、親水性カーボンクラスター、グラフェン量子ドット、カーボンドット、石炭、コークス、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【００９３】
前記炭素材料にはヘテロ原子をドープすることができる。
【００９４】
前記ヘテロ原子はＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｂ、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【００９５】
前記炭素材料に複数の可溶化基を持たせることができる。
【００９６】
前記可溶化基はポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ｐ−フェニレンオキシド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニルアミン）、ビニルポリマー、連鎖成長ポリマー、逐次成長ポリマー、縮合重合体、開環重合体、開環メタセシス重合体、リビングポリマー、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【００９７】
前記炭素材料は官能基を持たせたペリレンジイミド、又は官能基を持たせている多環式芳香族コアを含む小分子であり得る。
【００９８】
前記小分子はヒドロキシル基、カルボキシル基、キノン基、エポキシ基、アミノ基、トリフルオロメチル基、スルホン基、ヒドラジン基、イミン基、ヒドロキシイミン基の部分、又はそれらの組合せを有し得る。
【００９９】
前記治療用組成物は標的薬剤をさらに含み得る。
【０１００】
前記標的薬剤はオルガネラ、臓器、又は細胞種に対する標的薬剤であり得る。
【０１０１】
前記標的薬剤は、酸化ストレスに応答して上方制御される細胞表面部分を標的とするタンパク質であり得る。
【０１０２】
前記標的薬剤はｐ−セレクチン、トランスフェリン受容体、アンギオテンシン受容体、カンナビノイド受容体、上皮成長因子受容体、接着分子、チャネルタンパク質、及びそれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質であり得る。
【０１０３】
前記標的薬剤は抗体、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー、小分子、デンドリマー、炭水化物、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【０１０４】
前記標的薬剤はキレート剤であり得る。
【０１０５】
前記キレート剤はＤＥＦ、ＤＴＰＡ、ジメルカプロール、サクシマー、ユニチオール、プルシアンブルー、Ｄ−ペニシラミン、トリエンチン、デフェラシロクス、デフェリプロン、エデト酸二ナトリウムカルシウム（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシピリドネート、テトラチオモリブデート、ペンテト酸、及びトリエンチンからなる群より選択され得る。
【０１０６】
前記標的薬剤は前記炭素材料と共有結合し得る。
【０１０７】
前記炭素材料は輸送体部分と結合し得る。この輸送体部分は関門を通過する前記炭素材料の輸送を容易にし得る。
【０１０８】
前記関門は血液脳関門、血液脊髄関門、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【０１０９】
前記輸送体部分はアダマンタン分子、アダマンタン分子誘導体、カンナビノイド分子、カンナビノイド分子誘導体、ＨＵ−２１０、及びそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【０１１０】
前記輸送体部分は非天然エナンチオマーからなる群より選択され得る。
【０１１１】
前記炭素材料は抗酸化活性と併せて、電子シャトル及び電子伝達の修復能を有し得る。
【０１１２】
前記抗酸化活性は活性酸素種、活性窒素種、又はそれらの組合せに対しての活性であり得る。
【０１１３】
前記活性酸素種は超酸化物、又はヒドロキシラジカル、又はそれらの組合せを含み得る。
【０１１４】
前記抗酸化薬は一酸化窒素に対して非反応性であり得る。
【０１１５】
以下の発明を実施するための形態をより良く理解することができるように本発明の特徴と技術上の利点をこれまでにやや広範に概説してきた。本発明の請求項の主題を形成する本発明の追加の特徴と利点を本明細書においてこれより説明する。当業者は開示される概念と具体的な実施形態が本発明の同じ目的を改変するための基礎として、又は本発明の同じ目的を実施するための他の構成を設計するための基礎として容易に利用可能であることを理解する。当業者は添付されている特許請求の範囲において示されている本発明の主旨と範囲からそのような等価の構成が逸脱しないことも理解する。
【０１１６】
本発明の適用に際し、以下の説明で述べられる、又は図面において例示される詳細な構成及び要素の配置に本発明が限定されないことも理解される。本発明は他の実施形態を受け入れる余地を有し、様々な方法で実施実行され得る。また、本明細書において使用される表現と用語は説明を目的としたものであり、限定的であるとみなされるべきではないことも理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
添付図面に例示されている以下の実施形態の説明から本発明の前述の目的、特徴、及び利点、並びに他の目的、特徴、及び利点が明らかになる。これらの図面では参照文字は様々な図の中で同じ部分を指し示す。これらの図面は必ずしも正寸ではなく、代わりに本発明の原理を例示することに主眼が置かれている。
【図１】発煙硫酸と発煙硝酸の１：１混合物を使用した無煙炭又は瀝青炭のどちらかからのグラフェン量子ドット（ＧＱＤ）の合成を示す図である。
【図２】デフェロキサミン（ＤＥＦ）が末端アミンを介して結合して新しいアミド結合を形成しているデフェロキサミン−ＰＥＧ−ＨＣＣ（ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ）又はデフェロキサミン−ＰＥＧ−ＧＱＤ（ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＧＱＤ）の合成を示す図である。
【図３】ＲＯＳ及び酸化ストレスを介したゲノム損傷の媒介における鉄／ヘミンの役割を示す図である。ナノ粒子（キレート剤及び抗酸化薬と組み合わさっている）を使用する処置が脳卒中時にゲノムを損傷から守ると考えている。
【図４Ａ】培養血管内皮細胞における活性酸素種のレベルを反映しているＣｅｌｌＲＯＸ（商標）蛍光を示す図である。
【図４Ｂ】同上
【図４Ｃ】同上
【図５Ａ】ＰＥＧ−ＨＣＣに結合している親水性カーボンクラスターにより初代マウス皮質ニューロンにおける過酸化水素によるＣｅｌｌＲＯＸ蛍光色素の酸化が低減することを示す図である。
【図５Ｂ】同上
【図５Ｃ】同上
【図５Ｄ】同上
【図５Ｅ】図５Ａ〜図５ＤのＰＥＧ−ＨＣＣに関した酸化型ＣｅｌｌＲＯＸ色素の未処理対照に対して正規化された蛍光を示すグラフである。
【図６Ａ】鉄と活性酸素毒性に対するＤＮＡ損傷応答の改善に関与する作用機序に関連する追加のインビトロデータ及びインビボデータを示す図である。図６Ａ〜図６Ｂは神経細胞の鉄曝露から１５分以内（図６Ａは０分、図６Ｂは１５分）のミトコンドリア特異的Ｈ２Ｏ２センサーｐＨｙｐｅｒの蛍光を示している。図６Ａ〜図６Ｂはミトコンドリアでの活性酸素種の生成における培養神経細胞への鉄の添加の急速な作用を示している。
【図６Ｂ】同上
【図６Ｃ】ＤＮＡがヘモグロビンの分解生成物であるヘミンによってミトコンドリアと核の両方で損傷を受けている（レーン２）ことを示している図である。
【図６Ｄ】マウスでの実験的脳内出血（ＩＣＨ）の後のその脳の出血周辺領域にＤＮＡ損傷の証拠があることを示している図である。
【図６Ｅ】そのＩＣＨの後にＰＥＧ−ＨＣＣ又はデフェロキサミンで個々に処置されるときよりもＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣで処置されるときの方がこのＤＮＡ損傷が低減することを示している図である。
【図７】ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ（７０１）、ＰＥＧ−ＨＣＣ（７０２）又はＰＥＧ−ＰＤＩ（７０３）の添加から２４時間後に測定された、１００ｍＭの過酸化水素で処理され、且つ、ＰＥＧ−ＨＣＣ、ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ、又はＰＥＧ化ペリレンジイミド（ＰＥＧ−ＰＤＩ）のいずれかでレスキューされた培養血管内皮細胞の生存度を示す図である。ＰＥＧ−ＰＤＩはＰＥＧ化ペリレンジイミドのことである。過酸化水素の添加からの時間がＸ軸に示されている。過酸化水素と同時に添加されたときにＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣの優れた保護能力が特に顕著である。
【図８Ａ】１０μＭのヘミンへの曝露によるＤＮＡ損傷後のアルカリＤＮＡコメットアッセイと中性ＤＮＡコメットアッセイの撮影された画像である。
【図８Ｂ】図８Ａに示されているこれらのアッセイのＤＮＡ損傷の時間動特性を示すグラフである。
【図９】ヘミン曝露後に二本鎖切断（ＤＳＢ）マーカーがＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣにより減少することを示す図である。
【図１０】ミトコンドリア膜電位に対するヘミンの効果、及びレスキュー処置としてのＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣによるベースラインまでの回復作用を示すグラフである。
【図１１Ａ】ヘミンとトリニトリロ三酢酸鉄の両方で処理したＳＨＳＹ−５Ｙ細胞への鉄（Ｆｅ）又はヘミンの添加後のＤＮＡ損傷タンパク質に対するＰＥＧ−ＨＣＣの効果をＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣの効果に対して比較する図である。
【図１１Ｂ】同上
【図１１Ｃ】細胞培養物へのヘミンの添加後のＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ細胞生存度アッセイを用いる処理に対する細胞死のパーセンテージをＰＥＧ−ＨＣＣ、ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ、及びデフェロキサミン単独と比較して示すグラフである。
【図１２】Ｙ軸がＵＶ分光学による２６２ｎｍの吸光度のモニタリングを通して明らかになった溶液中の残存デフェロキサミンのユニット数を表すグラフである。近似直線１２０３はＰＢＳ溶液中でのデフェロキサミン分解（ＤＥＦ／ＰＢＳ）を示す。近似直線１２０１はＰＢＳと希釈ＰＥＧ−ＨＣＣの溶液中でのデフェロキサミンの分解（ＤＥＦ／ＰＥＧ）を示す。近似直線１２０２は窒素ガスを泡立たせたＰＢＳ中でのデフェロキサミンの分解（ＤＥＦ／Ｎ２）を示す。ＤＥＦ／ＰＥＧ及びＤＥＦ／Ｎ２の傾きは、Ｎ２パージされたとき、又は抗酸化薬ＰＥＧ−ＨＣＣが存在するときのどちらかで溶液中に溶解してるデフェロキサミンの分解が検出できなかったことを示している。このＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣはＰＢＳ溶液中ではＤＥＦ単独よりもかなり安定性が高いはずである。
【図１３Ａ】溶血血液を注入されたマウスの脳半球に注入された溶血血液を示す写真である。
【図１３Ｂ】図１３Ａの溶血血液を注入されたマウスにおいてＤＮＡ損傷ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ関連タンパク質という存在で処理された、又は処理されていないマウス脳のホモジェナイズされた組織におけるＤＮＡ損傷マーカーであるγＨ２Ａ．Ｘの発現を示す図である。
【図１４Ａ】９０分の虚血再灌流に続くＰＢＳ対照処置及びＰＥＧ−ＨＣＣに結合している親水性カーボンクラスターによる処置を経た梗塞体積を示す代表的なテトラゾリウムクロリド切片の図である。図１４Ａは全中大脳動脈（ＭＣＡ）領域の梗塞を示しているＰＢＳ対照の図である。図１４ＢはＰＥＧ−ＨＣＣによる処置後の図であって、かなり温存された皮質を示す図である。組織切片群は複数のラット個体に由来した。スケールバーは１ｃｍである。
【図１４Ｂ】同上
【図１５】フェロトーシス経路、及びこの経路においてＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣがどのように複数の効果を有し得るのかを示す図である。
【図１６】還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）（０〜５ｍＭ）によるフェリシトクロムＣ（酸化型シトクロムＣ）（４０μＭ）の還元に対する４ｍｇ／Ｌの濃度のＰＥＧ−ＨＣＣ及びメチレンブルー（ＭＢ）の比較を示すグラフである。
【図１７Ａ】ＰＥＧ−ＨＣＣが過酸化水素の毒性からｂＥｎｄ．３細胞をレスキューすることを示すグラフである。
【図１７Ｂ】ＭＢが本質的に有毒であることを示すグラフである。
【図１８】培養脳内皮細胞（ｂ．Ｅｎｄ３）への過酸化水素の添加後の細胞生存度のグラフである。
【図１９】ポリ（エチレングリコール）結合親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）が処理したマウス皮質ニューロン（ＭＣＮ）に対するＨ２Ｏ２の細胞毒性を低下させることを示すグラフである。
【図２０Ａ】プロトコルに従う２種類の処置に関する経時的脳血流（％）を示すグラフである。ライン２００１とライン２００５は脳血流に対する陰性ベヒクル対照（ＰＢＳ）の効果を示している。ライン２００２とライン２００６は脳血流に対するＰＥＧ−ＨＣＣの効果を示している。ライン２００３とライン２００７は脳血流に対するＰＥＧ−ＧＱＤの効果を示している。矢印２００４と矢印２００８はベヒクル、ＰＥＧ−ＨＣＣ、又はＰＥＧ−ＧＱＤの注射間隔を表している。
【図２０Ｂ】同上
【図２１】代表的なキレート剤の構造の例とそれらのキレート剤の本記載のナノ材料への連結機構を示す図である。
【図２２】複合体Ｉ及びＩＩＩにおける電子の漏出の起源を示す図である。
【図２３Ａ】電子シャトル及びスーパーオキシドディスムターゼ模倣物としてのＰＥＧ−ＨＣＣの電子伝達系における役割を示す図である。ＫＥＴＳ機構を示している。
【図２３Ｂ】モデル実験において利用される種であるレサズリンとレゾルフィンの構造と還元反応を示す図である。
【図２３Ｃ】ＰＥＧ−ＨＣＣを介したレサズリンのフラビンモノヌクレオチド（リボフラビン、ＦＭＮ）媒介性還元の作用機序を示す図である。
【図２４】レサズリン、ＰＥＧ−ＨＣＣ（図中でＨＣＣとして示されている）、及びリボフラビン−５’−リン酸を含む溶液に対する４６０ｎｍ光への１０分の曝露の効果を示すグラフである。
【図２５】ＰＥＧ−ＨＣＣ（図中でＨＣＣとして示されている）とＳＯＤとの間での競合実験の模式図である。
【図２６】ＰＥＧ−ＨＣＣ（図中でＨＣＣとして示されている）、レサズリン、及びＦＭＮを含む溶液へのスーパーオキシドディスムターゼの添加を示すグラフである。
【図２７】リボフラビンによるシトクロムＣの還元に対するＰＥＧ−ＨＣＣ（図中でＨＣＣとして示されている）濃度の効果を示すグラフである。
【図２８】５５０ｎｍの光の吸収の増加として示されるレサズリンのレゾルフィンへの還元を示すグラフである。この実験ではＰＥＧ−ＨＣＣ、レサズリン、及びＮＡＤＰＨを含む試料において５５０ｎｍの吸収の強度を追跡し、後に元の吸収の強度と比較して変化のパーセント値を得た。
【図２９】一定の濃度のＮＡＤＰＨ−キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ）及びＮＡＤＰＨによる時間の関数としてのＵＶ可視光の吸光度の変化を示すグラフである。
【図３０Ａ】ＰＥＧ−ＨＣＣ及びレサズリンとのＮＡＤＨの反応を示す模式図である。
【図３０Ｂ】ＮＡＤＨによるレサズリンのレゾルフィンへの還元とフェリシトクロムＣのフェロシトクロムＣへの還元に関するＰＥＧ−ＨＣＣの触媒飽和キネティクスを示すグラフである。
【図３１Ａ】ＰＥＧ−ＨＣＣによるＰＥＧ−ＨＣＣ触媒性レサズリン還元の基質と生成物を示す模式図である。
【図３１Ｂ】レサズリン及びＮＡＤＨに関するＰＥＧ−ＨＣＣの飽和キネティクスを示すグラフである。
【図３２】培養マウス脳内皮細胞へのシアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）の添加後の細胞死からのＰＥＧ−ＨＣＣによる保護を示すグラフである。
【図３３】培養ヒト神経芽細胞腫ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞におけるヘミン誘導性ミトコンドリア膜電位低下からのＰＥＧ−ＨＣＣによる保護を示すグラフである。
【図３４Ａ】ヒトシトクロムｃのサブユニットＶＩＩＩ由来のミトコンドリア標的配列を含む光励起可能ＧＦＰを発現するＳＨＳＹ−５Ｙ細胞のデコンボリューション顕微鏡法Ｚ軸投影像を示す図である。ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣがマウス抗ＰＥＧ一次抗体に対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７標識二次抗体として示されている。ミトコンドリア及び核に由来する蛍光シグナルも示されている。
【図３４Ｂ】ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣがＳＨＳＹ−５Ｙ細胞によって内部に取り込まれていることを示す図３２Ａの顕微鏡写真内の焦点面を示す図である。
【図３５】生理食塩水で処置された損傷ラット（ベヒクル処置、陰性対照）とＰＥＧ−ＨＣＣで処置された損傷ラットの試験群の平均台歩行試験での成績を示すグラフである。
【図３６】生理食塩水で処置された損傷ラット（ベヒクル処置、陰性対照）とＰＥＧ−ＨＣＣで処置された損傷ラットの試験群の平均台バランス試験での成績を示すグラフである。
【図３７】生理食塩水で処置された損傷ラット（ベヒクル処置、陰性対照）とＰＥＧ−ＨＣＣで処置された損傷ラットの試験群のモリス水迷路試験での成績を示すグラフである。
【図３８】生理食塩水で処置されたラット（ベヒクル処置、陰性対照）とＰＥＧ−ＨＣＣで処置されたラットの試験群の損傷２週間後の脳挫傷の体積を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１１８】
本発明は組織損傷、例えば分解したヘモグロビンから遊離状態の鉄が放出されている出血後の組織損傷、特に脳損傷を治療するための新規療法である。この損傷の一例は、鉄、並びにヘモグロビンの酸化的分解生成物によりＤＮＡ損傷修復（ＤＤＲ）応答、細胞死、及び細胞機能不全などの細胞傷害が誘導される脳内出血（ＩＣＨ）である。鉄は多数の有害作用、特にヒドロキシラジカル形成に起因する酸化ストレスを触媒する。鉄及び他の重金属は、鉄及び他の金属の過剰結合にも関係するアルツハイマー病毒性タンパク質の蓄積に起因する神経変性など、神経変性を含む多くの形態の損傷にも関係する。しかしながら、未だにこれらの知見は機能的転帰を改善する効果的な治療法につながっていない。
【０１１９】
この酸化ストレスの結果として酸化的ＤＮＡ損傷とＤＮＡ修復阻害の両方が発生し、それらの両方が遺伝的完全性にとって重大な有害作用を有する。ＩＣＨの治療に関し、血液分解活性酸素種（ＲＯＳ）に起因する神経細胞に対するＤＮＡ損傷の修復はＩＣＨ後に存在することが予測される低濃度の鉄によって阻害される。神経細胞及び（血管）内皮細胞には不完全なＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）の他、複雑だが、それでも測定可能なヘム／鉄毒性、ＲＯＳ、及びゲノム損傷蓄積の間での相互干渉が存在することが本発明に基づいて発見されている。これらの因子は治療介入を受け入れることができる共通の病因を有している。このため、驚異的なＲＯＳ除去能をキレート化と組み合わせこれらの能力を不良転帰に対する新規炭素粒子薬を使用してＲＯＳを抑制し、且つ、ＤＤＲを回復する新しい薬理学的アプローチを提供する。
【０１２０】
重要な代用物質とミトコンドリア電子伝達系のタンパク質との間で電子を伝達する新しいメカニズムであるＫＥＴＳ機構が発見されている。抗酸化薬（ＰＥＧ−ＨＣＣ等）の還元電位はユビキノンの還元電位に似ており、抗酸化薬がＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨなどの低還元電位種からより高い電位の還元電子伝達系構成要素へ電子を伝達することを可能にする。ＰＥＧ−ＨＣＣは溶液中のＮＡＤＨ及びアスコルビン酸によるレサズリン（ミトコンドリア生存度の試験指示薬）及びシトクロムｃの還元を促進することを示した。ＰＥＧ−ＨＣＣは、ピンポン様の機序と対照的な一時的な三次複合体を介してＮＡＤＨ及びアスコルビン酸の酸化とレサズリン及びシトクロムＣの還元を触媒することがキネティクスから示された。ＰＥＧ−ＨＣＣは培養内皮細胞及び培養神経細胞との短時間のインキュベーションの後にデコンボリューション蛍光顕微鏡観察によりミトコンドリアのすぐ近くに特定された。細胞培養ではＰＥＧ−ＨＣＣは過酸化水素とミトコンドリア毒素であるシアン化ナトリウムからの保護を行うことができた。原型の小分子電子伝達シャトル（ＥＴＳ）であるＰＥＧ−ＨＣＣはメチレンブルーと比較して同じ質量濃度で１０倍低いＫｍを示し、これにより正常なミトコンドリア機能を妨げないこと、及び過酸化水素とＭＢとの間に観察される毒性を有しない比較的に良好な保護を示すことが明らかになった。この新たに記載されるＫＥＴＳ機構が既に強力な酸化抑制特性に寄与し、且つ、一連の酸化ストレスモデルにおけるＰＥＧ−ＨＣＣの顕著なインビボ効力を規定する。このＫＥＴＳ機構は抗酸化薬物質（例えばＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ等）の潜在的な用途を一連のミトコンドリア障害まで拡大するために使用可能である。すなわち、抗酸化薬物質がミトコンドリアの酸化的リン酸化の破綻に関連する状態で具体的には電子伝達シャトル（ＥＴＳ）として生化学的に適切な経路で利用可能である。
【０１２１】
電子シャトルは細胞の呼吸において重要である。電子伝達系の構成要素はミトコンドリアの内膜内で空間的に分かれているため、電子の伝達を促進するために担体小分子が必要である。例えば、ユビキノンは０Ｖに近い還元電位を有し、複合体Ｉから複合体ＩＩＩまで電子を伝達する。シトクロムＣはシトクロムｃ１（＋２５０ｍＶ、複合体ＩＩＩレダクターゼサブユニット）の還元電位とシトクロムｂ１（＋２９０ｍｖ、複合体ＩＶオキシダーゼサブユニット）の還元電位との間である＋２８０ｍＶの還元電位を有する。
【０１２２】
（付着されたキレート化部分を有する抗酸化性ナノ粒子）
本発明の治療法は共有結合により鉄キレート化部分で修飾されたカーボンナノ粒子を含む。これらの粒子はＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ（デフェロキサミン−ＰＥＧ化−親水性カーボンクラスター）と呼ばれ、ＰＥＧ−ＨＣＣの巨大な酸化抑制能及び用途を範囲とする本出願人の以前の研究から拡張したものである。
【０１２３】
（合成）
本発明の実施形態ではＰＥＧ−ＨＣＣは、Ｓａｍｕｅｌら著、「Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｔｏ  ｏｘｙｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｃａｒｂｏｎ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、２０１５年、第１１２巻（第８号）：２３４３〜８頁（「Ｓａｍｕｅｌ  ２０１５」）、及びＢｉｔｎｅｒら著、「Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｃａｒｂｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ」、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．誌、２０１２年、第６巻（第９号）：８００７〜１４頁など、以前に説明されたように合成される。
【０１２４】
例えば、ＰＥＧ−ＨＣＣのカーボンコアは発煙硫酸（過剰ＳＯ３、オレウム）と硝酸を使用する過酷な酸化方法に精製済みの（外来性カーボンブラック及び金属混入汚染物質全体を除去した）単層カーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）を適用することにより調製可能である。ＳＷＣＮＴを約３５〜４０ｎｍまで短くし、分断する切断及び酸化の過程が硝酸により開始され、そうして短くなった酸化ＨＣＣが生成する。過酷な酸性条件によって誘導結合プラズマ質量分析により測定されるような微量の金属汚染混入物質すら溶解及び除去される。ＨＣＣの表面がアルコール、ケトン、及びカルボン酸などの様々な酸素含有部分を官能基として持たされ、それらのＨＣＣは多くの疎水性ドメインが残っているにもかかわらず水に不溶性となる。
【０１２５】
グラフェン量子ドット（ＧＱＤ）は発煙硫酸と発煙硝酸の１：１混合物を使用して無煙炭又は瀝青炭のどちらかから合成される（図１）。これは発表されたものと比べてずっと過酷な酸化条件セットに類似しており、単なる濃酸ではなく発煙酸が使用されている。Ｙｅ，  Ｒ．ら著、「Ｂａｎｄｇａｐ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏａｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒａｐｈｅｎｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ」、ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ誌、  ２０１５年、第７巻、７０４１〜７０４８頁、Ｙｅ，  Ｒ．ら著、「Ｃｏａｌ  ａｓ  ａｎ  Ａｂｕｎｄａｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｇｒａｐｈｅｎｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ．誌、２０１３年、第４巻、第２９４３号、１〜６頁を参照されたい。
【０１２６】
デフェロキサミンはその一級アミン基を用い、アミド結合を介してデフェロキサミンと結合しているＤＩＣと連結するカルボジイミド架橋剤によってＨＣＣ及びＧＱＤに結合する。同様にメトキシ−ＰＥＧ−アミンが結合し、図２に示されているようにアミノ−ＰＥＧとデフェロキサミンの両方とＨＣＣ又はＧＱＤが共反応することによりデフェロキサミン−ＰＥＧ−ＨＣＣが合成される。ＰＥＧ：デフェロキサミンの比率は様々であり得、必要であれば最初の生物活性の結果に基づいて最適化され得る。例えば、ＰＥＧ：ＤＥＦの比率は１：３〜３：１であり得、たいてい１：１未満である。ＰＥＧ−ＨＣＣと同様にクロスフロー（ＫｒｏｓＦｌｏｗ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）接線流濾過又は透析により精製が行われる。
【０１２７】
（特徴）
ＰＥＧ−ＨＣＣは超酸化物に対する巨大な触媒能活性を有することで現行の抗酸化薬の大きな限界を克服している新規カーボンナノ粒子であり、ヒドロキシラジカルに対して同等に有効であり、一方で血管保護性分子である一酸化窒素には影響しない。これらの粒子はラットにおいて静脈内注射後に脳の自己調節機能喪失の回復、及び脳外傷に起因する転帰の改善に顕著な効力を示している。
【０１２８】
ＰＥＧ−ＨＣＣはＲＯＳを除去しつつＳＯラジカルの消費と１：１の化学量論性で酸素を放出することが発見されており、それは酸化損傷、及び虚血と呼ばれる正常な血液供給の喪失という背景では特に有益である特性である。最後に説明すると、ＰＥＧ−ＨＣＣ上の利用可能な官能基により様々な部分の共有結合が可能になる。これらのナノ粒子は、ＩＣＨ後の患者の治療において必要となるように、培養状態の神経細胞及び血管内皮細胞をヘム／鉄の致死性作用から、又は過酸化水素の直接適用の致死性作用からレスキューすることができることが結果から示された。ヘモグロビン及びその副生成物の存在による酸化的損傷が患者において進行するので、ＰＥＧ−ＨＣＣの急性保護能にキレート化を加えることによる相乗的な利益が提供される（図３）。ＩＣＨ又はくも膜下出血（ＳＡＨ）の分解生成物は神経細胞、星状細胞、及び内皮細胞において特定の種類の酸化的ＤＮＡ損傷とＤＮＡ修復阻害を引き起こすと考えられている。ＰＥＧ−ＨＣＣ及び金属のキレート化の組合せによってこれらの事象が改善されるとさらに考えられている。
【０１２９】
（ＣｅｌｌＲＯＸ  ＲＯＳのＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ還元）
ＣｅｌｌＲＯＸ  ＲＯＳ蓄積アッセイ（トリニトリロ三酢酸鉄（ＩＩＩ）を使用する）を使用してマウス脳内皮細胞においてＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣをヘミンに対して試験した。結果が図４Ａ〜図４Ｃに示されている。図４Ａは対照である。図４Ｂは鉄の投与がＲＯＳを上昇させることを追跡している細胞蛍光であり、その細胞蛍光は（図４Ｃでは）鉄投与後にインビボで達成可能な濃度（４ｍｇ／ｍｌ）でのＰＥＧ−ＨＣＣの添加により完全に元に戻っている（細胞をヘミンで処理し、１時間後にＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣで処理し、２４時間の時点でアッセイした）。
【０１３０】
図４Ａ〜図４Ｃに示されているように、ＰＥＧ−ＨＣＣは静脈内注射の後にインビボで達成可能である濃度で培養内皮細胞（及び示していないが培養神経細胞）への鉄の直接適用により誘導されるＲＯＳの増加を元に戻すことができ、毒性の証拠はなかった。これらの結果はデフェロキサミンの共有結合によるＰＥＧ−ＨＣＣの新しいバリエーションの利用、及びマウスＳＡＨにおけるそのバリエーションの使用を後押しする。
【０１３１】
（マウス皮質Ｅ１７神経細胞におけるＣｅｌｌＲＯＸ  ＲＯＳアッセイ）
培養マウス神経細胞においてＣｅｌｌＲＯＸアッセイを用いてＲＯＳの形成を測定した。図５Ａ〜図５Ｄはポリ（エチレングリコール）結合親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）が初代マウス皮質ニューロンにおける過酸化水素によるＣｅｌｌＲＯＸ蛍光色素の酸化を減少させることを示している。図５Ａは未処理のＭＣＮ（５０，０００細胞／ウェル）を示している。図５Ｂは５０μＭのＨ２Ｏ２で４５分間にわたって処理されたＭＣＮを示している。図５Ｃは８ｍｇ／ＬのＰＥＧ−ＨＣＣで４５分間にわたって処理されたＭＣＮを示している。図５Ｄは５０μＭのＨ２Ｏ２で１５分間にわたって処理し、続いて８ｍｇ／ＬのＰＥＧ−ＨＣＣを添加してさらに３０分にわたって曝露させたＭＣＮを示している。図５Ｅは図５Ａ〜図５Ｄの親水性カーボンクラスターに関した酸化型ＣｅｌｌＲＯＸ色素の未処理対照に対して正規化された蛍光を示すグラフである。条件ごとの総細胞数は次の通り。未処理（ｎ＝１３７）、５０μＭ  Ｈ２Ｏ２（ｎ＝１５８）、８ｍｇ／ＬのＰＥＧ−ＨＣＣ（ｎ＝１５０）、及びＨ２Ｏ２＋ＰＥＧ−ＨＣＣ（ｎ＝１３９）。
【０１３２】
ＰＥＧ−ＨＣＣで処理されたＥ１７細胞は未処理対照と比べたＣｅｌｌＲＯＸ蛍光の増加を示さなかった（１００．１±８．８％）。５０μＭのＨ２Ｏ２で１５分間にわたって処理された細胞はＣｅｌｌＲＯＸ蛍光の顕著な増加を示した（２００±２６．５％）。１５分のＨ２Ｏ２曝露後の３０分間にわたる８ｍｇ／ＬのＰＥＧ−ＨＣＣでのＭＣＮの処理は１２９±３．４％のＣｅｌｌＲＯＸ蛍光の増加を示したが、Ｈ２Ｏ２のみでの処理よりも小さい値であった。細胞生存度は５０μＭのＨ２Ｏ２の投与後に２０％低下し、そしてＰＥＧ−ＨＣＣ処理によって充分に回復した。
【０１３３】
（ＤＮＡ損傷マーカーに対するＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣの効果）
図６Ａ〜図６Ｅは鉄と活性酸素毒性に対するＤＮＡ損傷応答の改善に関与する作用機序に関連する追加のインビトロデータ及びインビボデータを示している。図６Ａと図６Ｂは神経細胞の鉄曝露から１５分以内（図６Ａは０分、図６Ｂは１５分）のミトコンドリア特異的Ｈ２Ｏ２センサーｐＨｙｐｅｒの蛍光を示している。図６Ａと図６Ｂはミトコンドリアでの活性酸素種の生成における培養神経細胞への鉄の添加の急速作用を示している。
【０１３４】
図６ＣはＤＮＡがヘモグロビンの分解生成物であるヘミンによってミトコンドリアと核の両方で損傷を受けている（レーン２）ことを示している。図６Ｄはマウスでの実験的脳内出血（ＩＣＨ）の後のその脳の出血周辺領域にＤＮＡ損傷の証拠があることを示している。図６ＥはそのＩＣＨの後にＰＥＧ−ＨＣＣ又はデフェロキサミンで個々に処置されるときよりもＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣで処置されるときの方がこのＤＮＡ損傷が低減することを示している。
【０１３５】
図７は培養ｂＥｎｄ．３マウス内皮腫細胞における１００ｍＭの過酸化水素に対して比較され、且つ、２４時間後に測定された細胞生存度を示している。Ｙ軸は過酸化水素単独と比較した生存率であり、Ｘ軸は過酸化水素に対する処理時間である。ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ（７０１）はＰＥＧ−ＨＣＣ単独（７０２）及びＰＥＧ−ＰＤＩ小分子（７０３）よりも優れており、過酸化水素と同時に添加されたとき（０時点）に明らかに保護が最大であった。３時間に添加されたときまで幾らか保護が証明された。
【０１３６】
図７は、過酸化水素が投与されてから２４時間後の時点で培養脳内皮細胞（ｂ．Ｅｎｄ３細胞）に適用されるとＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣが過酸化水素の致死性作用に対する保護についてＰＥＧ−ＨＣＣ単独又はＰＥＧ−ＰＤＩグラフェン様小分子のどちらよりも優れていることを示している。過酸化水素と同時に添加されたとき（０時点）にこの保護は完璧であり（Ｙ軸は過酸化水素で処理された細胞と比較した生存率）、過酸化水素の後に添加されたときでも幾らかの保護が続いており、このことにより治療を遅らせることができ、虚血性脳卒中などのある特定の損傷についての現実的な臨床時間ウインドウが提供されることが裏付けられた。
【０１３７】
分化したＳＨＳＹ−５Ｙ神経細胞において１０μＭのヘミンを使用するとＤＮＡ損傷が生じる。図８Ａは１０μＭのヘミンを使用してアルカリＤＮＡコメットアッセイと中性ＤＮＡコメットアッセイのために生じたＤＮＡ損傷を１２時間にわたって撮影した画像である。図８ＢはこれらのアッセイのＤＮＡ損傷の時間動特性を示す（アルカリアッセイ及び中性アッセイについての曲線８０１と曲線８０２を含む）グラフである。
【０１３８】
ヘミン処理細胞のアルカリＤＮＡコメットアッセイと中性ＤＮＡコメットアッセイは顕著な類似性を示し、ヘミンにより生じるＤＮＡ損傷の大半が二本鎖切断種であることを示唆した。ヘミン曝露の後に生じるＤＮＡ損傷は最初の傷害から少なくとも１２時間にわたって維持された。これはＤＮＡ修復機構に障害があることを示唆している。ＤＳＢだけを示す傾向がある中性コメットアッセイよりも感度が高いアルカリコメットアッセイによりＳＳＢとＤＳＢの両方がＤＮＡ中に示された。
【０１３９】
図９もヘミン曝露後の二本鎖切断マーカーがＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣにより減少することを示している。ＤＳＢの２つのマーカーであるｐ５３ＢＰ１とリン酸化γ−Ｈ２Ａ．Ｘを未処理細胞、ヘミン処理細胞、及びヘミン−ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ処理細胞において測定した。ヘミンによる処理の後にそれらのＤＳＢマーカーの発現が対照と比べて上昇している。ヘミン及びＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣで処理された細胞ではｐ５３ＢＰ１及びγ−Ｈ２Ａ．Ｘの発現が抑制されており、ＤＳＢ形成の減少を示している。ｄｓＤＮＡ鎖切断が起こるとＨ２Ａ．Ｘがリン酸化される。５３ＢＰ１はｄｓＤＮＡの切離を抑制し、且つ、誤りがちであるが短時間で済む非相動性末端結合を促進する。相同組換えに好都合であるようにするにはｐ５３ＢＰ１の減少が必要である。
【０１４０】
図１０に示されているようにミトコンドリア膜電位に対するヘミンの効果を測定した。化学的酸化体はミトコンドリア膜電位の低下を引き起こすことが多く、その低下がＡＴＰ合成の減少及びエネルギー飢餓につながる。ヘミンで処理された細胞はＭＭＰの顕著な低下によりこの作用を示した。この作用はヘミン処理細胞をＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣで処理することにより軽減可能であり、ヘミンへの曝露から１時間後に処理された場合には未処理細胞と比較して顕著な差が無い。
【０１４１】
２種類のアッセイにおいてヘミンとトリニトリロ三酢酸鉄、ＰＥＧ−ＨＣＣとデフェロキサミンで処理された培養ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞においてＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ及びＰＥＧ−ＨＣＣによるＤＮＡ損傷マーカーの減少を検査した。図１１Ａと図１１Ｂではγ−Ｈ２Ａ．Ｘ及びｐＡＴＭ（細胞老化促進因子）についてＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣがＰＥＧ−ＨＣＣ単独よりも鉄に関して特に良好（及びヘミンに関しても同等に良好）であることが見られる。図１１Ｃに示されているように細胞死アッセイではヘミンが細胞死を促進すること、及びＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣがＰＥＧ−ＨＣＣ又はＤＥＦ単独のどちらよりも良好であることがわかった。ＤＥＦ及びＰＥＧ−ＨＣＣの最大保護濃度ではＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣは細胞死の阻止の点でより良好である。
【０１４２】
この製剤がおそらくは親ナノ材料の酸化抑制能との相互作用によりデフェロキサミン分子の酸化的破損を防止することがこの製剤のその他の利点である（図１２）。現在のデフェロキサミンは静脈内投与向けに調製されると短い有効期間しか持たないのでこのことは臨床的に大きな利点であり、この製剤により有効期間を劇的に延ばすことができ、それによって病院以外の設定、例えば戦地での設定、自動車事故での外傷、又は組織損傷を直ぐに治療する必要がある他の設定に有用であり得る。
【０１４３】
（脳Ｈ２Ａ．Ｘリン酸化（γＨ２Ａ．Ｘ）のＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣによる減少）
インビボではＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣはマウス内で溶血血液の脳注入から１時間後に投与されると２４時間の時点で脳Ｈ２Ａ．Ｘリン酸化（γＨ２Ａ．Ｘ）を減少させることがわかった。脳の半球に溶血血液を定位的に注入されたマウス（図１３Ａ参照）を使用してインビボのＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ及びγＨ２Ａ．Ｘの発現を検査した。この実験ではヘモグロビンの分解生成物を比較的に短時間で模倣するために溶血血液を使用した。
【０１４４】
溶血血液の注入から１時間後にＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣの腹膜内投与でマウスを処置した。２４時間の時点で注射部位の周りの領域のγＨ２Ａ．Ｘを見るためにその脳を試料とした。図１３Ｂに示されているようにＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣを受けなかったマウスと比較してＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣを受けたマウスに二本鎖切断マーカーの減少が存在する。
【０１４５】
（インビボｔＭＣＡＯ）
７２匹のラットがこの処置を受けた。５８匹がアウトカム分析のための評価基準に合致した。主に結果の評価前に実施者によって特定された早期の病気／死亡又は実験上の問題のために９０分閉塞群では４匹のＰＢＳ処置ラットと１匹のＰＥＧ−ＨＣＣ処置ラットを除外し、１２０分閉塞群では７匹のＰＢＳ処置ラットと２匹のＰＥＧ−ＨＣＣ処置ラットを除外した。
【０１４６】
９０分群では３００ｍｇ／ｄＬの術前血糖値という目標が達成された。ＰＢＳ処置ラットは全ＭＣＡ領域の梗塞（図１４Ａ）を示し、一方でＰＥＧ−ＨＣＣ処置ラットは大部分が皮質下梗塞（図１４Ｂ）を示した。ＰＥＧ−ＨＣＣ処置により梗塞体積、出血性転換、半球腫脹、及びベダーソンスコアが改善すること、及びそれと共に死亡率が低下する傾向があることが評価項目の（表１に示される）定量から示された。
【表１】
2020519682.tif 000003
平均全生存期間は２．８日であった。各群の試料から測定されたｔＭＣＡＯ直前のベースライン血糖値又は血中ガスパラメーターに関して群間で差がなかった。対照と比較してＰＥＧ−ＨＣＣ処置により全ての結果が改善に向かった。＊Ｐ＜０．０５
【０１４７】
ＰＢＳ処置対照では１２０分の時点で生存率が顕著に低下し、元の目標血糖値（３００ｍｇ／ｄＬ）では処置日を越えて生き残るラットがいなかった。その後、ｔＭＣＡＯ処置の開始時点で２００ｍｇ／ｄＬの血糖値という目標が達成されるまでストレプトゾトシンを投与した。ＰＢＳ処置対照では少なくとも２４時間まで明らかに不快な様子を見せずに生存率がほんのわずかに改善した。しかしながら、これにより対照群から得ることができる情報が限定された。したがって、完全達成のためにこの時点を追求することをしなかった。術後１２時間の前に殺処理を必要としたラットは信頼できないと考えられたので梗塞の特徴について評価されなかった。表２に示されるようにこの時点において全ての測定項目について正の傾向が観察され、梗塞体積について有意性が達成された。
【表２】
2020519682.tif 000004
平均全生存期間は２．１日であった。本処置の生存性を改善するために目標血糖値を低くした。ＰＢＳ群においてより低いｐＨに向かう傾向を除き、代表的な試料のｔＭＣＡＯ直前のベースライン血糖値又は血中ガスパラメーターに関して群間で差がなかった。対照と比較してＰＥＧ−ＨＣＣ処置により全ての結果が改善に向かい、改変型ベダーソンスコアについて有意性が達成された。ＮＤは実験の中途での停止のための未決を表す（本文参照）。＊Ｐ＜０．０５
【０１４８】
（フェロトーシスにおけるＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣの作用）
ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣは触媒作用的に超酸化物を不均化することができ、ヒドロキシラジカルを根絶することができ、ミトコンドリア分極を防護することができ、且つ、鉄をキレートすることができるのでＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣは曝露に続く後の段階でフェロトーシスを抑制することがある。図１５に示されているようにＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣはフェロトーシス経路に対して複数の作用、すなわち（ａ）超酸化物の不均化、（ｂ）ヒドロキシラジカルの根絶、（ｃ）、ミトコンドリア分極の保護、及び（ｄ）鉄のキレート化を有し得る。
【０１４９】
（ＭＢ及びＰＥＧ−ＨＣＣのＥＴＳキネティクスの比較とＨ２Ｏ２保護アッセイにおける効力）
メチレンブルー（ＭＢ）は原型的電子シャトルであり、メトヘモグロビンをヘモグロビンに還元するために赤血球中でＮＡＤＰＨを酸化することによりメトヘモグロビン血症を治療するという点で臨床効果が示されている。ＰＥＧ−ＨＣＣはずっと広い還元電位の幅を有しているがＰＥＧ−ＨＣＣ及びＭＢはそれぞれ＋１１ｍＶ及び約０ｍＶという中間還元電位を有している点で電気化学的に似ている。ＰＥＧ−ＨＣＣはＭＢについて述べられているように類似の作用を電子伝達系に対して有しているようである。
【０１５０】
より直接的にＭＢをＰＥＧ−ＨＣＣと比較するために固定濃度のＭＢ（４ｍｇ／Ｌ、１２．５μＭ）と酸化型シトクロムＣ（４０μＭ）を使用してＮＡＤＨと酸化型シトクロムＣに関してＭＢのミカエリス・メンテンパラメーターを収集した。
【０１５１】
図１６に示されているように０〜５ｍＭの間のＮＡＤＨ濃度を用いてＰＥＧ−ＨＣＣ及びＭＢの別個の飽和曲線１６０１と１６０２をそれぞれ得た。ＭＢのＶｍａｘの計算値はＰＥＧ−ＨＣＣのＶｍａｘよりも有意に高く（１．４３２×１０−７Ｍ／秒対２．２７×１０−８Ｍ／秒）、ＫＭはＰＥＧ−ＨＣＣのものよりも１桁近く低かった（３．７８×１０−４Ｍ対３．３５×１０−３Ｍ）。質量濃度基準ではメチレンブルーはＰＥＧ−ＨＣＣよりも１桁近く高いＶｍａｘを有している。ＮＡＤＨが無いときはＰＥＧ−ＨＣＣもメチレンブルーもシトクロムＣを還元していない。
【０１５２】
ＭＢの前記電気化学的特性から質量濃度基準における比較的に高い親和性と電子伝達速度が示された。しかしながら、これらの特性が細胞損傷に対するより高い効力につながるかどうかは明らかではない。より高い親和性が通常のミトコンドリア呼吸と競合する場合もあり得る。メトヘモグロビン血症のエピソード時にそれらの活性は有益であり得るが、そのことが過剰な活性酸素種の生成を伴う症状などの他の症状につながらない場合もある。ＭＢは超酸化物又はヒドロキシラジカル除去機能性を有しない。他方、ＰＥＧ−ＨＣＣは比較的に時間がかかる電子シャトルであるようだが、それらは超酸化物及びヒドロキシラジカルを除去する。
【０１５３】
過酸化水素曝露アッセイを培養細胞に用いることでＭＢ及びＰＥＧ−ＨＣＣの特性の差を検討した。過酸化水素は少なくとも４種類の経路、すなわち還元種との反応によるヒドロキシラジカルと超酸化物ラジカルの形成、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）とＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）の刺激と非共役化、ミトコンドリア透過性の調節、及びフェントン反応を介して内皮細胞に対して中毒作用を発揮する。受傷後の状況下での効力が臨床応用に重要であるのでこのアッセイは過酸化水素の後の試験薬剤の投与を用いる。
【０１５４】
２種類の標準的な過酸化水素曝露アッセイでＰＥＧ−ＨＣＣとＭＢを比較した。１番目の実験ではｂＥｎｄ．３マウス脳血管内皮細胞を８ｍｇ／ＬのＰＥＧ−ＨＣＣ、１００μＭのＨ２Ｏ２、及びそれらの濃度の過酸化水素とＰＥＧ−ＨＣＣで処理した。それらの細胞を一晩にわたって培養し、その後で細胞を剥離し、血球計算板と生細胞を標識するためのカルセインＡＭを使用して計数した（生存細胞数ｎ＝３２）。図１７Ａに示されているように、ＰＥＧ−ＨＣＣのみで処理された細胞は生存率が９４．８％になり、１００μＭのＨ２Ｏ２では６１．５％の細胞が生存し、８ｍｇ／ＬのＰＥＧ−ＨＣＣとの共処理では９３．８％の生存率になった。
【０１５５】
最初の１００μＭのＨ２Ｏ２への曝露の１５分間後にＭＢを０μＭ、５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭで使用して類似のアッセイを実施した。図１７Ｂに示されているようにこの２番目の曝露アッセイでは細胞生存率の用量依存的な低下があった。１００μＭのＨ２Ｏ２を含むことにより生存率がさらに低下した。
【０１５６】
このアッセイにおけるＭＢの細胞毒性は他の条件下で報告されている作用と一致した。ミトコンドリア膜電位と活性酸素種生成に対する作用によって毒性が説明されている。第１に、ＭＢはＮＡＤＰＨによってＭＢＨ２に還元されるのでそれにより生じるＭＢＨ２は二酸素によって酸化されてその場で超酸化物を生じることができる。第２に、ＭＢは共役が密なミトコンドリアにおいて電子伝達系を脱共役し、且つ、酸化的リン酸化の低下を引き起こすことができる場合がある。第３に、ＭＢは過酸化水素中間物無しで直接的にグルタチオンをグルタチオンジスルフィドに酸化することが知られている。最後に、第４の経路が存在する場合もあり、ＭＢはＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化し、ＮＡＤＨはトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの阻害剤であるためＭＢが間接的に解糖を促進し、且つ、細胞内のグルコースとグリコーゲンの枯渇を導く場合がある。この特性の臨床的に見られる１つの作用は、溶血発作につながり得るグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損を有する個体における後期解糖生成物の枯渇である。さらに、貯蔵グルコースの枯渇は最終的にＲＯＳ誘導性細胞毒性を介した細胞死につながる。
【０１５７】
ＰＥＧ−ＨＣＣ及びＭＢが無細胞系において類似の電子伝達特性を有しているにもかかわらず２つの重要な差異がＰＥＧ−ＨＣＣとＭＢとの間に存在する。第１に、ＰＥＧ−ＨＣＣは超酸化物と反応して過酸化水素を生成し、一方でＭＢはその還元状態で二酸素から活性酸素種を生成する傾向がある。第２に、ＰＥＧ−ＨＣＣはＭＢと同じ質量濃度でそのＶｍａｘの概ね０．１倍を有するのでそれほど強力な電子伝達系脱共役剤ではない。
【０１５８】
（Ｈ２Ｏ２からのインビボ保護）
培養マウス皮質内皮ｂＥｎｄ．３細胞と培養初代マウス皮質Ｅ１７神経細胞の両方の細胞においてＰＥＧ−ＨＣＣによる過酸化水素からの保護を測定した。生細胞／死細胞アッセイによって明らかにされる場合、図１８に示されるように１００μＭのＨ２Ｏ２により２４時間の時点でｂＥｎｄ．３細胞の細胞生存度が約５０％低下することが観察された。この図１８ではウェル当たりの生存細胞数（生細胞／死細胞細胞生存アッセイ）が複製実験の平均値とＳＤとしてＹ軸に提示されている。１００μＭのＨ２Ｏ２を添加し、１５分後に培地又はポリ（エチレングリコール）結合親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）（８ｍｇ／ｍＬ）のどちらかを添加し、そして翌日にウェル当たりの生細胞数を評価した。Ｈ２Ｏ２により細胞生存度が５０％低下したがそれはＰＥＧ−ＨＣＣによって完全に回復した。
【０１５９】
１５分後のＰＥＧ−ＨＣＣの添加により細胞数がベースラインまで回復した（Ｈ２Ｏ２に対してｐ＜０．００１）。Ｅ１７神経細胞では１００μＭのＨ２Ｏ２の致死性がｂ．Ｅｎｄ３細胞よりも神経細胞において高く、それにもかかわらずＰＥＧ−ＨＣＣでの後処理により部分的な回復が達成されることがわかった。図１９を参照されたい。図１９では曝露及び一晩の培養後直ぐに処置された８ｍｇ／Ｌの濃度で投与されたＰＥＧ−ＨＣＣが５０μＭのＨ２Ｏ２の後ではベースラインまで細胞数を回復し、ずっと毒性が高い１００μＭの後では細胞数を二倍にして細胞死を低下させる。
【０１６０】
（脳血流）
以下の（ａ）５０分の低血圧／出血性ショック期、（ｂ）３０分の乳酸リンゲル液（蘇生期）、及び最後に（ｃ）最終入院期というプロトコルに従った。軽いＴＢＩ衝突損傷の後の８０分と２００分の時点でこのプロトコルに基づいて投薬を行った。図２０Ａと図２０Ｂはプロトコルに従う２種類の処置に関する経時的脳血流（％）を示すグラフである。
【０１６１】
図２０Ａでは曲線２００１〜曲線２００３はそれぞれＰＢＳ（ｎ＝１０）、ＰＥＧ−ＨＣＣ（ｎ＝１０）、及びＰＥＧ−ＧＱＤ（ｎ＝１）に関するものである。図２０Ａに反映される処置ではＰＥＧ−ＧＱＤで処置された１匹の動物が（ＰＢＳ処置動物と比較したときに）ベースラインレベルの脳血液灌流への復帰と回復を示した。矢印２００４は動物にＰＥＧ−ＧＱＤを投与した２回の投与時間を示している（１回目の投与は８０分であり、２回目の投与は２００分である）。投与量は（８０分での）１回目の投与には４ｍｇ／ｋｇであり、（２００分での）２回目の投与には２ｍｇ／ｋｇであった。ＰＥＧ−ＱＧＤを与えられた１匹の動物はＰＢＳ又はＰＥＧ−ＨＣＣで処置された他の動物よりも高い回復度を示した。
【０１６２】
図２０Ｂでは曲線２００５〜曲線２００７はそれぞれＰＢＳ（ｎ＝１０）、ＰＥＧ−ＨＣＣ（ｎ＝１０）、及びＰＥＧ−ＧＱＤ（ｎ＝６）に関するものである。図２０Ｂに反映される処置では６匹の動物をＰＥＧ−ＧＱＤで処置した。矢印２００８はラットにＰＥＧ−ＧＱＤを投与した２回の投与時間を示している（これも１回目の投与は８０分であり、２回目の投与は２００分である）。両方の投薬で投与量は２ｍｇ／ｋｇであった。ＰＥＧ−ＧＱＤを与えられた６匹の動物はＰＥＧ−ＨＣＣで処理された動物に等しいレベルにまで脳血液灌流を回復していることを示した。
【０１６３】
（バリエーション）
金属中毒は体全体で様々な病気に関与しており、その主要な有害作用は過剰な酸化的ラジカルの刺激を介したものである。しかしながら、細胞又は組織への浸透の低さ、高い治療用量、及び短い半減期がキレート剤を使用することの妨げになっている。静脈内経路又は他の何らかの経路により体内に投与された後に本発明の新規製剤はそのキレート剤を重要な作用部位まで送達する活発な細胞取り込み、並びに親ナノ材料の複合作用を介した酸化的損傷への対処を兼ね備える。これらの様々な状況下で効用の違いを生じさせるために特定の組織又はミトコンドリアなどの細胞内オルガネラへの標的化が追加で用いられる。虚血性損傷に使用されるとき、これらのナノ粒子はＯ２・−をＯ２に変換し、これによりこれらのナノ粒子がスーパーオキシド酸素ジェネレーター（ＳＯＧ）になる。この挙動は、Ｏ２・−が体の生来の酸化抑制防御系を圧倒している虚血組織を治療するときに非常に有益であり得る。Ｓａｍｕｅｌ  ２０１５を参照されたい。
【０１６４】
本発明の製剤は多くが過剰な遊離金属を伴っている種々の急性損傷及び慢性損傷に対する新しいアプローチであり得る。アルツハイマー病のｔａｕなどの高リン酸化タンパク質への鉄及び銅の結合の増加が例に挙げられる。
【０１６５】
全身性ショックは酸化的反応、特に蘇生時の酸化的反応であって、院外で利用可能な複合薬によって軽減可能な酸化的反応を伴う。この製剤は、デフェロキサミンの分解を低下させ、それにより有効期間を延ばし、且つ、現時点では実現できていない新しい設定でその潜在的有用性を増加させることが示されている。
【０１６６】
本明細書において記載及び教示されているナノ粒子の細胞内酸化抑制能とキレート化を組み合わせるための方法は既存の文献の中には存在しない。細胞取り込みを向上させるために使用されているキレート剤の製剤、例えば脳への取り込みを向上させるための付着ポリマー並びに内因的に細胞取り込みを向上させた分子が存在するが、これらのバリエーションのうちで酸化的反応に対処するものもなければ、これらのキレート剤の潜在的な毒性がこれらの製剤によって対処されていることもない。その毒性は、関係する作用部位で作用する単一分子の中のその組み合わせの抗酸化性ナノ材料とキレート剤を介して金属の存在とその金属の有害な作用の両方に対処することによって軽減され得る。従来のキレート化方法を超える幾つかの大きな利点が本発明には存在する。第１に、細胞取り込みが向上しているので比較的に少ない用量のキレート剤が有効であり、それにより肝毒性などの有害作用を有するキレート剤の高血中レベルの必要性が最低限になる。特に静脈内に投与されるＤＥＦは非常に高い用量（５０ｍｇ／ｋｇ）で使用されなければならず、且つ、循環中で短い半減期（ｔ１／２＝約０．３時間）を有し、それにより望まれない毒性が生じる可能性がある。第２に、この新規組合せはＤＥＦの主要な限界のうちの１つである有効期間の向上を示す。第３に、本発明はミトコンドリア膜などの重要な構造体へのＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣの局在が細胞取り込みの結果として起こることを示すことができている。また、酸化ストレスの触媒におけるＦｅの重要な役割を考慮するとキレート剤とＨＣＣの内在性抗酸化能の共局在によってどちらか単独よりも良好な細胞保護が示されている。キレート剤をカーボンナノ材料骨格と組み合わせる他の利点には特定の治療部分を標的とする能力が挙げられ、その能力により本材料の用途は有害転帰に酸化ストレスと重金属の両方が寄与している多数の症状にまで拡大する。
【０１６７】
本発明では様々なキレート剤が利用可能である。特に金属イオン当たりわずか１分子のデフェロキサミンしか必要とされないのでデフェロキサミンの使用には一定の利点があり、様々な金属に対する様々なキレート能により他の金属を優先的に標的とすることができる他のキレート剤が利用可能である。
【０１６８】
キレート剤としてのデフェロキサミンと標的としての鉄に加えて様々な金属及びイオンに対して親和性を有する複数の他のキレート剤が本発明に適している。例えば、ヒト及び動物が汚染された環境から鉛及び水銀などの金属を摂取することがあり得る。金属銅は体の中で過剰であると有毒であり得、ウィルソン病などの病気を起こす。これらの中毒の多くに共通していることは、反応性種が生成し、次にそれらの反応性種が膜、ＤＮＡ、ミトコンドリア、及び他の生命維持に必要な細胞構造体に損傷を与えることである。現在のところこれらの中毒はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＤ−ペニシラミンなどの様々なキレート剤を高用量で経口投与、腹腔内投与、又は静脈内投与することを必要とするアプローチによって治療されなければならない。これらの薬剤の多くが低調な細胞内取り込み、又は非効率的な細胞内取り込みのために高用量を必要とすることが多い。損傷の重要なメカニズムに対処しつつ細胞取り込みを促進する新しいアプローチであることが大きく進歩したところである。
【０１６９】
本発明は、原料カーボンナノ材料とＥＤＴＡなどのキレート剤との複合体化について説明する。この新規アプローチは、ＰＥＧ−ＨＣＣ又はＰＥＧ−ＧＱＤの短時間での取り込みに起因して必要な作用部位への細胞内輸送が促進されること、比較的に低い全用量（したがって全身性毒性が低い）での使用を可能にすること、一方で同時に電子伝達の重要なミトコンドリア機能を支援すること、及びカーボンナノ材料の電子伝達シャトル特性並びにその抗酸化薬に起因して酸化的ラジカルを除去することという明瞭でユニークな利点を有している。重要な細胞内作用部位でのこの構造体のこのユニークな作用のためにこの構造体は金属中毒の複数の重要な面に対処する全く新しいアプローチになっている。これらのカーボン粒子はこれらのキレート剤を目的のミトコンドリア部位まで送達するのでそれらのキレート剤の各々を通常よりもずっと低い投与量で使用することができる。
【０１７０】
ナノ材料に結合される代表的なキレート剤の構造の例が図２１に示されている。
【０１７１】
表３は様々な金属中毒に対して臨床的に有用と報告されているキレート剤のリストを提供する。Ｗａｘ，  Ｐ．著、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ」、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．誌、２０１３年、第９巻：３０３〜３０７頁も参照されたい。
【表３】
2020519682.tif 000005
【０１７２】
このようなキレート剤を本発明の実施形態において使用することができる。
【０１７３】
幾つかの実施形態ではＰＥＧ：キレート剤（例えばＰＥＧ：ＤＥＦ）の比率は１：３〜３：１の範囲内であり、たいてい１：１未満である。
【０１７４】
（急性及び慢性ミトコンドリア電子伝達系機能障害の治療用のグラフェン材料）
プロトン共役電子伝達は酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）にとって重要であり、様々な障害が酸化的リン酸化機能の破綻を伴っている。多くの形態のミトコンドリア損傷で電子伝達が破綻しており、そして超酸化物アニオン（Ｏ２−・）及びヒドロキシラジカル（・ＯＨ）を含むフリーラジカルの生成を引き起こし、内在性抗酸化因子の枯渇が細胞損傷及び最終的には細胞死を引き起こす。合成グラフェン材料がシアン化物中毒及びヒ素中毒を含む急性ミトコンドリア損傷からの保護を実施できることが発見された。この発見にはこれらの材料がフラビン含有ミトコンドリア複合体（複合体Ｉ及びＩＩＩ）の阻害後に電子伝達系における電子伝達の代替経路又はバイパスとして機能し、そうして活性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は活性窒素種（ＲＮＳ）の形成を最小限にするという機構的な証拠が含まれる。
【０１７５】
これらの材料はミトコンドリア内の内在性還元性因子に対しては活性が弱い。しかしながら細胞損傷時にはこれらの材料は、重要なことに、生じた超酸化物を電子供与源として利用して超酸化物を過酸化水素に変換するだけでなく、シトクロムＣなどの電位がより高い酸化性物質へ電子を伝達することもできる。本発明の目的は欠陥のあるミトコンドリア複合体を取り換えることではなく、フラビン含有電子伝達系メンバーにより放出された電子のための代替経路又はバイパスを提供することである。
【０１７６】
グラフェン材料は電子伝達の破綻を伴う急性又は慢性のミトコンドリア障害を単独で、又は複合療法の一部として治療することができる。これらの材料は電子伝達の代替経路を提供し、且つ、同時にそれらの優れた酸化抑制特性及び活性酸素種や活性窒素種の除去を介して重要なミトコンドリア機能を維持する。
【０１７７】
本発明はグラフェン材料の使用についてであり、急性シアン化物中毒（及びヒ素中毒）を典型とする電子伝達の破綻の治療におけるポリ（エチレングリコール）官能化親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）として原型になる。これらの特性はサイズに関係なくグラフェン構造物質に当てはまるが、ミトコンドリア構造体及び電子と相互作用する官能基に左右される可能性があると考えられている。高力価の触媒性スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）模倣物であることが以前に示されており、且つ、ヒドロキシラジカルの除去にほぼ有効である原型のグラフェン材料であるポリ（エチレングリコール）官能化親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）の活性に関してデータが示されている［２０１７年２月２１日に登録された「酸化ストレス治療のための酸化抑制特性を有するカーボンナノ材料の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ）」という標題のＴｏｕｒらの米国特許第９５７２８３４号（「Ｔｏｕｒ  ’８３４特許」）］。Ｔｏｕｒ  ’８３４特許の全体が参照により本明細書に援用される。（ＰＥＧ−ＨＣＣを使用するＳＯ不均化のメカニズムを示している）Ｓａｍｕｅｌ  ２０１５も参照されたい。
【０１７８】
ＰＥＧ−ＨＣＣは外傷性脳損傷の動物モデルにおいて再灌流傷害を減少させる。ここでＰＥＧ−ＨＣＣは超酸化物（Ｏ２−）と還元型ニコチンアミドジヌクレオチド（リン酸）（ＮＡＤＰＨ）の両方からレサズリン又はシトクロムＣなどのより高位の還元電位種へ電子を伝達することができることが示されている。
【０１７９】
電子伝達系（ＥＴＣ）では幾つかの構成要素がＲＯＳの生成による「電子の漏出」を介して超酸化物の生成を促進することが知られている。例えば、複合体ＩではフラビンモノヌクレオチドがＮＡＤＰＨにより二電子還元を介して還元されてＩＦ結合部位においてＦＭＮＨ２を形成する。通常条件下ではユビキノンがミトコンドリア内膜（ＭＩＭ）近くのＩＱ結合部位に結合し、ＦＭＮＨ２により供与される電子を使用して七員鎖の末端でＮ２  Ｆｅ２Ｓ４鉄硫黄クラスターにより実行される２回の一電子還元を受ける（図２２Ａ）。図２２Ａは生理的条件下の複合体Ｉを示している。電子が還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）からフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）へ伝達され、そして鉄硫黄ブリッジ上を経て複合体Ｉのキノン結合部位（ＩＱ）部位まで伝達され、そこで電子がユビキノンに供与される。
【０１８０】
典型的には病的状態はロテノンなどの阻害剤によるＩＱ部位の封鎖（図２２Ｃ）として現れるか、又は後期ミトコンドリア複合体での下流封鎖によって現れるかのどちらかであり、その下流封鎖はフェロシトクロムＣ、ユビキノール、還元型フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ２）、若しくは還元型フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤＨ２）などの還元型電子シャトルの過剰につながる。超酸化物又はヒドロキシラジカルによるＦｅ２Ｓ４クラスターの酸化が第３の可能性である。図２２ＣはＦＭＮＨ２の蓄積及び活性酸素種（ＲＯＳ）の生成につながるＩＱ部位の封鎖がロテノンなどの阻害剤によって可能であることを示している。これらのタイプのミトコンドリア損傷は膜間腔へのプロトン移動の喪失によるミトコンドリア膜電位及びＡＴＰ合成の低下も引き起こす。
【０１８１】
図２２Ｂは前記鉄硫黄鎖の酸化により還元型フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ２）が通常よりも長く複合体Ｉフラビン部位（ＩＦ）に留まる原因となる封鎖が生じ、且つ、ＲＯＳが生成されることを示している。Ｆｅ２Ｓ４鎖の連続性の喪失により電子がＩＦ部位からＩＱ部位へ移動することができず、ＩＦ部位において過剰還元状態が生じる（図２２Ｂ）。ＩＱ封鎖の例では還元型ＦＭＮＨ２は二酸素の一電子還元を実施して超酸化物を形成することができる。
【０１８２】
正しい阻害剤が使用される場合には、ミトコンドリア内膜の両側で両方のキノン部位からＲＯＳが生成可能であるのでＲＯＳ生成における複合体ＩＩＩの役割も重要である（図２２Ｄ〜図２２Ｆ）。図２２Ｄは通常条件下ではユビキノールが複合体ＩＩＩ中の２つのシトクロム鉄複合体を介してユビキノンを還元すること、及びプロトンがミトコンドリア内膜を横断して移送されることを示している。図２２Ｅは阻害剤を使用するより高い電位のキノン部位の阻害によりＲＯＳの形成がミトコンドリア内膜の両側で起こることを示している。図２２ＦはシトクロムＣ部位の阻害がより低い電位のキノン部位からの電子の漏出につながり得ることを示している。
【０１８３】
フラビン介在性の超酸化物生成のモデルを作り、且つ、ＰＥＧ−ＨＣＣがどのようにそのようなシナリオの裏をかくのか示すために無細胞環境において超酸化物を生成させるリボフラビンの光励起を利用した（図２３Ｃ）。図２３Ｃに示されているように光励起を受けるとＦＭＮは超酸化物を生成し、次にＰＥＧ−ＨＣＣが未知の過程を介して超酸化物からレサズリンへ電子を伝達してレゾルフィンを生成する可能性がある。レサズリンからレゾルフィンを生成するためにＮＡＤＰＨも使用可能であり、ＦＭＮの反応のような二段階反応を伴うことが予測されている。
【０１８４】
４６０ｎｍの光源（この事例では発光ダイオードアレイ）によるフラビンモノヌクレオチド（リボフラビン−５’−リン酸、ＦＭＮ）の励起により一重項酸素と超酸化物が結果として生成される。ＵＶ可視光による５７０ｎｍの吸光度の変化から明らかなように、光励起を受けたリボフラビンは親水性カーボンクラスターの存在下でレサズリンをレゾルフィンに還元可能であることが観察された。
【０１８５】
図２４に示されているように親水性カーボンクラスター、ＦＭＮ、及びレサズリンを含む溶液はレゾルフィンの形成を表す５７０ｎｍの吸光度の変化がある。５７０ｎｍで測定される吸光度の上昇によって示されるように、ＰＥＧ−ＨＣＣ（図中でＨＣＣとして示されている）を含む溶液中においてのみレサズリンがレゾルフィンに還元される。レサズリンはＦＭＮによってジヒドロレゾルフィンに直接還元される場合もあるが、しかしながら分光学的な証拠は現在のところ存在しない。ＰＥＧ−ＨＣＣが存在しないときにＦＭＮはレサズリンを無色の種、おそらくはジヒドロレゾルフィン（図２３Ｂ）又はペルオキソ化合物に変換するようである。図２３Ｂはモデル実験において利用される種であるレサズリンとレゾルフィンの構造と還元反応を示す図である。
【０１８６】
超酸化物は電子をＰＥＧ−ＨＣＣに供与することができ、次に還元されたＰＥＧ−ＨＣＣがそれらの電子をレサズリンに伝達し、それが還元されたレゾルフィンの形成につながる（図２３Ｂに示されている構造体）と考えられている。この過程に関する理論的根拠の基礎は２つの重要な実験／観察を含んでいる。第１に、光励起を受けたＦＭＮの存在下でＰＥＧ−ＨＣＣはレサズリンをレゾルフィンに還元可能であることが観察された（図２４）。
【０１８７】
次に図２５に示されるようにＰＥＧ−ＨＣＣとスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）との間で競合実験を実施した。図２５はＰＥＧ−ＨＣＣ（図中でＨＣＣとして示されている）とＳＯＤとの間での競合実験の模式図である。ＳＯＤは超酸化物に関してＰＥＧ−ＨＣＣと競合する。超酸化物の利用可能な供給を減らすことによりレサズリン還元の速度低下が引き起こされる。ＳＯＤはレサズリンの結合ポケットを有していないので電子をＰＥＧ−ＨＣＣに、さらにレサズリンに供与する代わりにＳＯがＨ２Ｏ２に変換される。図２５の実験ではスーパーオキシドディスムターゼ及び親水性カーボンクラスターがレサズリン及びＦＭＮを含む溶液の中に存在した。ＳＯＤはキノン又はキノン様種向けの正規の結合部位を有しておらず、したがってレサズリンはＳＯＤ不均化サイクルに関係することができないはずである。
【０１８８】
ＳＯＤとＰＥＧ−ＨＣＣの両方がＳＯを二酸素と過酸化水素に不均化することができるがＰＥＧ−ＨＣＣだけがレサズリンをレゾルフィンに還元することができるため、反応混合物へのＳＯＤの添加によってより多くのＳＯ不均化触媒（ＳＯＤ及びＰＥＧ−ＨＣＣ）が存在するが、同量の超酸化物がＦＭＮによって生成されるのでレサズリン還元の速度が遅くなる。したがって、ＰＥＧ−ＨＣＣが電子源として使用するために利用可能な超酸化物の濃度が比較的に低く、且つ、レサズリンのレゾルフィンへの還元が比較的に遅い（図２６）。図２６はＰＥＧ−ＨＣＣ（グラフ中でＨＣＣとして示されている）、レサズリン、及びＦＭＮを含む溶液へのスーパーオキシドディスムターゼの添加により５７０ｎｍでの吸収が減少し、且つ、４６０ｎｍの光への１０分間にわたる曝露の後に６００ｎｍでの酸化レサズリンからの吸収が比例して増加することを示している。未反応のレサズリンの量がＳＯＤの濃度と直接的に増加する。
【０１８９】
ＰＥＧ−ＨＣＣが存在しないときよりも低濃度（４ｍｇ／Ｌ）のＰＥＧ−ＨＣＣが存在するときにフェリシトクロムＣが速い速度で還元し得ることも示されている。フェリシトクロムＣ（Ｆｅ３＋）は＋２５０ｍＶの還元電位を有し、一電子還元を経てフェロシトクロムＣ（Ｆｅ２＋）を形成することができる。フェロシトクロムＣはその電子を複合体ＩＶに供与し、且つ、電子が複合体ＩＩＩから離れるときの電子を伝達するためのシャトルとして作用する（図２２Ａ）。超酸化物はシトクロムＣを還元することができるがＰＥＧ−ＨＣＣの添加によってこの反応がより速く進むようになることが分かっている。
【０１９０】
しかしながら、この効果は濃度依存的であり、４ｍｇ／Ｌを超える濃度ではこの促進効果があまり顕著ではなくなることも分かっている（図２７）。図２７はＦＭＮが光曝露下で超酸化物の生成を介してシトクロムＣを還元することを示している。シトクロムＣ還元の速度は溶液中に存在しているＰＥＧ−ＨＣＣ（図中でＨＣＣとして示されている）の濃度に依存する。最大速度が４ｍｇ／Ｌのときに繰り返し現れており、濃度が高くても低くてもその速度が遅くなる。
【０１９１】
ある濃度より低いときにＰＥＧ−ＨＣＣは、それらが電子シャトルであるのと同じくらい効率的なＳＯＤ模倣物であるわけではないと考えられている。しかしながら、ＰＥＧ−ＨＣＣは光を吸収するので溶液中のリボフラビンを励起する光の量を減らすことができ、そうして速度が低いように見せている。低濃度ではこの効果は明らかに優勢ではなく、しかしながら４ｍｇ／Ｌより高い濃度ではこの効果はより重要になる可能性があり、さらに調査されることを必要とする。この発見は複合体ＩのＦＭＮ又は複合体Ｉ、ＩＩ、若しくはＩＩＩのセミユビキノンが生成した超酸化物からフェリシトクロムＣの間を電子が伝達され得ることを示している（図２２Ａ）。
【０１９２】
ＰＥＧ−ＨＣＣは電子源として超酸化物を使用することに加えてＮＡＤＰＨを使用してレサズリンを還元することができることが示されている。この効果は図２８に示されるようにＮＡＤＰＨを還元剤として使用し、且つ、ユビキノンに代わってレサズリンを最終的な電子受容体として使用することにより親水性カーボンクラスターと共に複合体Ｉ中のＮＡＤＰＨ−鉄硫黄クラスター経路のモデルを大まかに作っている。
【０１９３】
この２番目のモデルでは電子がおそらくは一電子ずつ親水性カーボンクラスターに供与され、続いて水素原子（Ｈ・）が供与されて、その後で第２段階として２回の一電子還元を介してレサズリンを還元してレゾルフィンを形成する。ＰＥＧ−ＨＣＣがフラビン又はＦｅ２Ｓ４鎖を介する代わりにミトコンドリアのＮＡＤＰＨにより直接的にＭＩＭに沿ってユビキノンを還元することで複合体Ｉ伝達系のＦＭＮＨ２−Ｆｅ２Ｓ４部分の役割を果たすことが可能であり得ると考えられている。
【０１９４】
ＮＱＯによるレサズリン還元の速度はＨＣＣよりもずっと速いようである（図２９）。図２９は一定の濃度のＮＡＤＰＨ−キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ）（０．００５Ｕ／ｍＬ）及びＮＡＤＰＨ（５．０×１０−４Ｍ）による時間の関数としてのＵＶ可視光の吸光度の変化を示している。５７０ｎｍでの吸収の増加はレゾルフィン濃度の上昇に起因する。ＮＱＯがキノン結合ポケットを有しているのでレサズリンはそのポケットに結合し、その部位で還元を受けるようである。ＮＱＯ又は複合体Ｉと異なり親水性カーボンクラスターはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下でユビキノン−１をユビキノールに還元することができない。これはＰＥＧ−ＨＣＣ及びユビキノンの還元電位の類似性を原因とするエネルギー障壁に起因すると考えられている。この反応が起こるためには比較的に高い還元電位が必要な場合があり、このことが自発的なレサズリンの還元を説明している。しかしながら、酸化されたグルタチオンジスルフィドなどの抗酸化薬の還元に必要であることが典型的なミトコンドリアの内在性ＮＡＤＰＨの供給をミトコンドリアから取り尽くすことがないため、ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨの酸化に時間がかかることが有益であり得る。
【０１９５】
ミトコンドリアに対する酸化的損傷の場合では複合体Ｉ、複合体ＩＩＩ、及びアコニターゼ中のＦｅ２Ｓ４クラスター内の鉄がＦｅ２＋からＦｅ３＋に酸化し、そうしてそれらの酵素を介して電子を伝達するそれらのクラスターの仕事を実施できなくすることができる。親水性カーボンクラスターはこれらの複合体の外側で必要な電子伝達を行うことによりこれらのＦｅＳ鎖の喪失をバイパスすることができると考えられる。これまでに示されたように、ＦＭＮが生成した超酸化物、及び複合体ＩのＮＡＤＰＨからシトクロムＣに電子が供与され得る。まとめると、親水性カーボンクラスターはＮＡＤＰＨ、又はフラビンが生成した超酸化物のどちらかを電子源として使用することにより電子の漏出に対するバイパス機構として機能することが可能であり得る。
【０１９６】
（レサズリンに対するＰＥＧ−ＨＣＣの化学的作用機序）
最初の機械論は前記還元剤の還元電位に集中していた。しかしながら、エタノールによるレサズリンの還元（エタノール→アセチルアルデヒド、Ｅ０＝−１９７ｍＶ；ΔＥ０＝＋１８３ｍＶ）もＰＥＧ−ＨＣＣを使用して、及び使用せずに検討されており、正のΔＥ０を有しているにもかかわらず還元が２５℃で起こらないことがわかった。エタノールの酸化は２回の連続した一電子酸化と対照的な二電子過程を介している。
【０１９７】
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは典型的には一電子還元を行うと考えられていないが、これはいつも事実であるわけではないことが少数の文献により示唆されている。Ｇｅｂｉｃｋｉらによって概説されているように、一段階ヒドリド移動、二段階電子−水素原子移動、及び三段階電子−プロトン−電子移動を含む復習の酸化機構がＮＡＤＨについて存在する［Ｇｅｂｉｃｋｉ，  Ｊ．ら著、「Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  Ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤＨ  ａｎｄ  ＮＡＤ＋」、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．誌、２００４年、第３７巻、３７９〜３８６頁］。ＮＡＤＰＨの一電子酸化はまれであるが前代未聞ではなく、例えばＡｌｍａｒｓｓｏｎらによってＮＡＤＰＨはカタラーゼ中の化合物ＩＩの電子−プロトン−電子還元を行うことが示された［Ａｌｍａｒｓｓｏｎ，  Ｏ．ら著、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｏｎｅ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤＰＨ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｃａｔａｌａｓｅ」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．誌、１９９３年、第１１５巻、７０９３〜７１０２頁］。Ｇｒｏｄｋｏｗｓｋｉらは一電子還元を介してＮＡＤＨにより１０４〜１０５の間の速度定数で数種類の有機ラジカルが還元されることを示した［Ｇｒｏｄｋｏｗｓｋｌ，  Ｊ．ら著、「Ｏｎｅ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｕｐｌｅ  ＮＡＤ／ＮＡＤＨ」、Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．誌、１９８３年、第８７巻、３１３５〜３１３８頁］。Ｇｒｏｄｋｏｗｓｋｉらによると、最初の一電子酸化に律速段階があるが後の段階はそれより著しく速い。
【０１９８】
ＰＥＧ−ＨＣＣは安定なラジカルを有しているので、ＰＥＧ−ＨＣＣが最初の一電子移動を介してＮＡＤＰＨにより還元されることはありそうにない。Ｓａｍｕｅｌらによって考察されている主張されたスーパーオキシドディスムターゼ機構は超酸化物によるＰＥＧ−ＨＣＣの最初の一電子還元とそれに続く超酸化物によるＰＥＧ−ＨＣＣの一電子酸化を含むことで過酸化水素を形成する（図２７）［Ｓａｍｕｅｌ  ２０１５］。ＮＡＤＰＨは一電子をＰＥＧ−ＨＣＣに供与し、次に酸化された基質に供与することがあり得る。
【０１９９】
レサズリンの場合では第１段階がレサズリンのアニオン性ラジカルへの還元であり、このラジカルをレゾルフィンアニオンに還元する２回目の電子供与がこれに続く。これまでにＫｈａｚａｌｐｏｕｒ及びＮｅｍａｔｏｌｌａｈｉによりガラス状の炭素電極を使用してこの二段階還元が観察されている［Ｋｈａｚａｌｐｏｕｒ，  Ｓ．ら著、「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  （ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｏｏｍ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｉｏｎｉｃ  ｌｉｑｕｉｄ  １−ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ  ａｔ  ａ  ｇｌａｓｓｙ  ｃａｒｂｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ」、ＲＳＣ  Ａｄｖ．誌、２００４年、第４巻、８４３１頁］。さらに、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは光が存在しないと容易にレサズリンをレゾルフィンに還元しない。Ｃａｎｄｅｉａｓらは一電子移動を行うことができる触媒として機能するＮ−メチルフェナジニウムメトサルフェート（ＰＭＳ）がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを用いたレサズリンのレゾルフィンへの還元のために必要であることを示した［Ｃａｎｄｅｉａｓ，  Ｌ．Ｐ．ら著、「Ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｓｅｄ  ＮＡＤＨ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓａｚｕｒｉｎ  ｔｏ  ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ」、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．誌、１９９８年、第２巻、２３３３〜２３３４頁］。したがって、ＰＥＧ−ＨＣＣの２回の一電子還元によりレサズリンの２回の一電子還元が生じてレゾルフィンが形成されることが予測される。ＰＥＧ−ＨＣＣの延長芳香族ドメインが粒子上の遠位の反応性部位への電子移動を容易にする場合があるように見える。先に述べたように超酸化物もリボフラビンとの光化学反応において寄与する場合がある（図２７）。ＰＥＧ−ＨＣＣはＰＢＳ中のＮＡＤＨによるレサズリンの還元を触媒してＮＡＤ＋とレゾルフィンを生成する（図３０Ａ）。ＰＥＧ−ＨＣＣはＮＡＤＨによるレサズリンとシトクロムＣの還元に関して酵素様キネティクスを有する飽和触媒として機能する（図３０Ｂ；レサズリン及びシトクロムＣに関してそれぞれ曲線３００１と曲線３００２）。さらに、ＰＥＧ−ＨＣＣがアスコルビン酸によるレサズリンの還元の飽和触媒としても機能することが観察された（図３１Ａ〜図３１Ｂ；４０μＭ、２０μＭ、及び１０μＭの濃度に関してそれぞれ曲線３１０１〜曲線３１０２）。
【０２００】
（組織培養におけるシアン化物の毒性作用に対するＰＥＧ−ＨＣＣの有効性）
ＰＥＧ−ＨＣＣは急性シアン化物中毒からの保護を行うことができるように見える。複数の毒性レベルのシアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）を培養脳内皮細胞（ｂＥｎｄ．３）に添加し、ＮａＣＮの添加から２４時間後に評価した。ＰＥＧ−ＨＣＣの濃度は中毒を示しておらず、且つ、よく忍容したマウス及びラットでの先行データに基づいている。
【０２０１】
図３２は培養マウス脳内皮細胞へのシアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）の添加後の細胞死からのＰＥＧ−ＨＣＣによる保護を示している。ＮａＣＮの添加から２４時間後に細胞生存を評価している。Ｙ軸中に生き残っている細胞の割合（（ＮａＣＮが存在しない状態での）ベースラインに対して２４時間で比較した生細胞の割合）が示されている。Ｘ軸はＰＥＧ−ＨＣＣ処理か無処理を示している。０時点はＮａＣＮ添加直後のＮａＣＮの結果を示している。１５分はＮａＣＮの１５分後に添加されたＰＥＧ−ＨＣＣの結果を示している。３０分はＰＥＧ−ＨＣＣの３０分後に添加されたＰＥＧ−ＨＣＣの結果を示している。ライン３２０１〜ライン３２０３は１ｍＭ、５ｍＭ、及び１０ｍＭのＮａＣＮの濃度のラインである。これらの結果は１ｍＭでの処理後の長い時間ウインドウ、５ｍＭでの処理後のそれより短い時間ウインドウ、及び１０ｍＭで同時に処理されたときの有効性を示している。
【０２０２】
前記データよりＰＥＧ−ＨＣＣが急性シアン化物中毒保護性であることが示されており、且つ、シアン化物濃度が高くなるほど早期のＰＥＧ−ＨＣＣ投与が必要になる用量応答曲線が示されている。これらの実験では１ｍＭのＣＮ−がヒトにおけるＣＮ−曝露のＬＤ５０に近いのでこの濃度を最小用量として利用した。３０分の時点で保護が続いていた結果から時間ウインドウがＬＤ５０近くのＣＮ−に対する実験の範囲から外れている可能性があることが示唆される。ＮａＣＮが５ｍＭのときに最大で１５分間にわたってＬＤ５０の５倍近くのものに対して部分的な保護がなお存在している。ＮａＣＮの直後に投与されるときには部分的な保護が１０ｍＭのＮａＣＮに対して存在する。ＮａＣＮの後に投与されるときにこの高用量に対する保護が非常に顕著である。
【０２０３】
複合療法により、例えばＰＥＧ−ＨＣＣと併せてＣＮ−結合剤（例えばコバラミン誘導体）を利用する場合に比較的に高用量のＮａＣＮでの有効性と保護のウインドウが延長可能であると考えられている。
【０２０４】
（組織培養におけるヘミンの毒性作用に対するミトコンドリア膜電位のレスキューに関するＰＥＧ−ＨＣＣの有効性）
出血性卒中における主要な毒性物質は血中ヘモグロビン由来生成物であるヘミンであり、それは酸化促進性ヘム鉄複合体である。図３３は培養ヒト神経芽細胞腫ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞におけるヘミン誘導性ミトコンドリア膜電位低下からのＰＥＧ−ＨＣＣによる保護を示している。細胞を９６ウェルプレート中に播種し、１０μＭのヘミンで１時間にわたって処理し、続いて２４時間にわたってＰＥＧ−ＨＣＣと共に、又はＰＥＧ−ＨＣＣ無しで培養した。製造業者のプロトコルに従ってＴＭＲＥミトコンドリア膜電位アッセイキット（カタログ番号ａｂ１１３８５２、Ａｂｃａｍ社）を使用する蛍光分光学により膜電位を測定した。エラーバーは３回の独立した測定に由来するＳＤを表し、＊はｐ＜０．０１を表す。
【０２０５】
図３３に示されているように、ヘミンは５分の曝露で神経細胞のミトコンドリアにおける急速なＲＯＳストレスの原因となり、ヘミン介在性神経細胞毒性の重要な病理過程であるミトコンドリア膜電位の著しい低下を引き起こす。ここでＰＥＧ−ＨＣＣは２４時間の時点でのヘミン介在性ミトコンドリア膜電位の低下をほぼベースレベルまでレスキューすることができた。
【０２０６】
（ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞によるＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣの取り込み）
ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣの取り込みが図３４Ａ〜図３４Ｂに示されている。シトクロムＣ標的配列を有するＧＦＰを発現するＳＨＳＹ−５Ｙ細胞が蛍光ミトコンドリア３４０２を有しており、既知の標的においてマーカーを有するミトコンドリア３４０２の構造を示すためにそれらの細胞を使用することができる。これらの細胞をＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ３４０１で処理し、細胞内及び細胞外のＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ３４０１の位置を示すためにそれらの粒子を抗ポリエチレングリコール［ＰＥＧ−Ｂ−４７］ウサギモノクローナル抗体、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７結合抗ウサギ二次抗体ラベルで標識した。図３４Ａはデコンボリューション顕微鏡を使用した１００倍の倍率でのそれらの細胞のＺ投影像を示している。ミトコンドリア３４０１、ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ３４０２、及び核３４０３が示されている。図３４Ｂは細胞体を横断している焦点面の切片を示しており、取り込みを表すＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ３４０１シグナルがその細胞体の中から発生し得ることを示している。
【０２０７】
ＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ３４０１粒子が前記細胞によって食されていることを示していることに加え、前記粒子のミトコンドリア３４０２との共局在からそれらの粒子がミトコンドリア３４０２と同じ容積内に存在し、したがってＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣ３４０１がおそらくはミトコンドリア３４０２により内部に取り込まれていることが示唆され、図２３Ａに示される機構を裏付けている。
【０２０８】
図２３ＡはＫＥＴＳ機構を例示している。電子伝達系（ＥＴＣ）における病的な電子の漏出源が破線矢印２３０１に示されている。ＰＥＧ−ＨＣＣ２３０２はミトコンドリア２３０４内でのそれらの位置といった要因に応じて電子シャトル（実線矢印２３０３により示されている）としてもスーパーオキシドディスムターゼ２３１５の模倣物（２３０３）としても機能し得るようである。超酸化物２３０５は複合体Ｉ、複合体ＩＩ、及び複合体ＩＩＩ（それぞれ２３１０〜２３１２）によって生成され、ミトコンドリアマトリックス２３０６及び膜間腔２３０７の中に放出される。ＰＥＧ−ＨＣＣ２３０２は超酸化物２３０５から電子を受領し、そして（ａ）その他の超酸化物２３０５を不均化するか、又は（ｂ）膜間腔２３０６内に存在するときには電子をシトクロムＣ２３０８に伝達するかのどちらかを行うことができる。ＰＥＧ−ＨＣＣ２３０２は、複合体Ｉ２３０１よりもずっと遅い速度ではあるが、マトリックス内でＮＡＤＰＨ２３０９により電子を受領することもできる。ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、超酸化物、又はユビキノン、から電子を受領した後にＰＥＧ−ＨＣＣ２３０２は電子をシトクロム２３０８に伝達する場合があり、又は複合体ＩＶ２３１２に伝達する可能性もある。別の電子源はアスコルビン酸であり、それは膜間腔２３０７内に見られる。アスコルビン酸はＰＥＧ−ＨＣＣが超酸化物を過酸化水素２３１６に還元するために電子源として使用可能である。
【０２０９】
（実用性）
高力価抗酸化薬として作用するだけでなく直接的に電子を伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元することができる本発明の材料の実用性にはまれなミトコンドリア障害、ミトコンドリア内の複合体を害する毒素への偶然又は故意の曝露、並びに虚血性及び再灌流性の傷害及び出血などの非常に一般的な症状といった広範囲の症状であって、全てがミトコンドリア損傷を生じさせるこれらの症状について潜在的な治療上の利点がある。
【０２１０】
米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）はシアン化物中毒を孤立した障害と考えている。シアン化物はミトコンドリア電子伝達系タンパク質であるシトクロムＣオキシダーゼを阻害する。したがって、シトクロムｃを直接的に還元することができる治療法により治療が実現する可能性がある原則状態の証拠としてシアン化物中毒が選択された。上で考察及び教示されているように、シアン化物中毒に関して、及びヘミンなどの有毒なヘモグロビンの分解生成物を生成する脳出血における潜在的な利益に関して証拠が示されている。
【０２１１】
米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）はシアン化物中毒を孤立した障害と考えている。シアン化物中毒は自殺と他殺の両方で故意に起こるが、住宅又は工場の火災からの、金の採鉱作業の近くで見られる水などの汚染水からの、及び食物からの致死量以下の曝露でもシアン化物中毒が起こる。シアン化物中毒の生存者はパーキンソン病を思わせる重い神経障害を発症し、且つ、同じく他の全身性障害も発症することが多い。本発明の実施形態ではグラフェン材料は、電子がミトコンドリア複合体間を流れること、及び電子シャトル又はミトコンドリア複合体内の補欠分子族のどちらかとして見られるフラビン及びキノールにより生成される超酸化物及びヒドロキシラジカルを除去することの両方を可能にする電子伝達系のバイパスとして機能する。
【０２１２】
本発明は恒久的な細胞損傷を減らすための代替的な電子伝達源を提供することによりシアン化物中毒を治療するための現行の治療方法の短所のうちの１つに対処する。さらに、酸化的リン酸化を介した電子伝達の代替経路を提供することにより他の慢性ミトコンドリア障害もこれらの材料で治療可能な場合がある。
【０２１３】
通常の電子伝達経路をバイパスする能力は、高力価の超酸化物及びヒドロキシラジカルの除去能力を有していることがこれまでに明らかになっている本発明の材料の全く新しい特性である。しかしながら、本発明の材料がこの追加の機能を有していることは知られていなかった。この新発見は一次的損傷とこの一次的損傷のフリーラジカル損傷の結果の両方に対処するのでこの新発見はＯＸＰＨＯＳ機能不全が障害の中心である症状の治療にとって重大な意味を有する。
【０２１４】
これらの材料の電子バイパス特性が電子を捕捉するための、又は酸化された抗酸化性種に電子を伝達するための代替源を実現し、一方でそれらの材料の内在的な酸化抑制特性のためにミトコンドリアは内在性の抗酸化性の補因子、タンパク質、及び酵素を補充することができるまで維持される。この発見によりミトコンドリア障害の治療における新しい刺激的なツールが提供される。
【０２１５】
現在のシアン化物中毒の治療技術は主としてシアン化物を直接結合すること、又はシアン化物の鉄への親和性を低下させることに焦点を当てている。ヒドロキソコバラミンがシアン化物の結合のために使用されるがヒドロキソコバラミン自体はフリーラジカル除去特性を有していない。本明細書において記載及び教示されているアプローチは不可避的に生成されるＲＯＳの除去により電子伝達系のミトコンドリア複合体からの電子の漏出に直接的に対処するので現在の技術より改善されている。
【０２１６】
本発明の実施形態の１つの新しい点は、ヒドロキソコバラミンと共に用いられる従来のリガンド親和性法と対照的に、ＲＯＳを除去し、且つ、電子向けの二次経路を提供することによりシアン化物の毒性を低下させることである。さらに、シアン化物を結合するためであり、且つ、それにより生じる活性酸素種を除去するための二分岐型防御においてシアン化物中毒を単独で治療するためにも、ヒドロキソコバラミン誘導体などの現行の治療法との併用により治療するためにも本グラフェン炭素材料を急性に使用することができる。このカクテルアプローチは単一の治療段階で複数の原因に対処することにより非常に有効な抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の歩みをたどっており、そのため優れた併用療法であり得る。
【０２１７】
現在の慢性ミトコンドリア障害の治療技術はユビキノン若しくはカルジオリピンなどの必須の補因子、又はメチレンブルー及びその誘導体などの電子伝達メディエーターによりミトコンドリア機能を補うことである。
【０２１８】
（工程とバリエーション）
シアン化物曝露の治療の最も典型的な適用例ではヒト、動物、又は培養細胞が最初にいずれかの送達機構により故意又は偶然にシアン化物含有又はシアン化物生成物質に曝露される。曝露後、本グラフェン材料が中毒の個体に可能であれば静脈内投与され、静脈内投与が利用可能でなければ筋肉内投与される。遺伝性又は他の獲得性慢性ミトコンドリア障害の場合ではその個体にはグラフェン材料が限定的に、且つ、好都合な慢性形態を提供するために側鎖の操作とＰＥＧ化により最適化して投与されることになる。
【０２１９】
前記電子伝達シャトル自体はミトコンドリア機能に必要なプロトン濃度勾配を生成しない。しかしながら、本発明の材料はこのような優れた有効性を示すので本発明の材料がプロトン生成種と相互作用することができないのか不確かである。本発明の材料自体がミトコンドリア内でプロトン濃度勾配を回復しないとしてもミトコンドリア生存の長期化により内在性の複合体、因子及び抗酸化因子が回復し、それによりプロトン濃度勾配を徐々に回復すると考えられている。
【０２２０】
中毒の治療ではシアン化物は速効性の毒なので治療期間が短い。しかしながら、致死量以下による中毒でも恒久的な損傷が生じるのでこの介入により多くの生命が救われ、転帰が改善される。
【０２２１】
ＰＥＧ−ＨＣＣはミトコンドリアを含む細胞内に（且つ／又はその近傍に）広く分布していることが顕微鏡観察から示されている。おそらく最終的に必要な濃度よりも高い濃度が使用された。この濃度は有効なミトコンドリア標的を用いて低下させることができただろう。ミトコンドリア標的化リガンドを含むバリエーションのグラフェン材料を開発し、検査する。
【０２２２】
様々な物質がＰＥＧ−ＨＣＣと同じ役割を果たすことができるかもしれないと予測されている。
【０２２３】
グラフェン材料、又はＳＯＤ様の挙動と２００〜５００，０００ダルトンの分子量を有する材料が本発明において有用であり得ることがさらに予測されている。
【０２２４】
本グラフェン材料は単層ナノチューブ、二層ナノチューブ、三層ナノチューブ、多層ナノチューブ、超短ナノチューブ、グラフェン、グラフェンナノリボン、グラファイト、グラフェンオキシド、グラフェンオキシドナノリボン、カーボンブラック、酸化カーボンブラック、親水性カーボンクラスター、グラフェン量子ドット、カーボンドット、石炭、コークス、又はそれらの組合せの形態の材料であり得る。そのようなグラフェン材料にはヘテロ原子をドープすることができる。それらのヘテロ原子はＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｂ、及びそれらの組合せであり得る。
【０２２５】
これらの材料はこれらの材料の還元酸化電位を調整する官能基を含むように合成後の修飾を受けることがさらに予測されている。
【０２２６】
合成後修飾にはキノン、安定ラジカル、ハライド、ニトラート、ジヒドリド、水素原子供与体、硫黄含有基、リン含有基、アミン、芳香族基、及びカルボニル含有基を含めることが挙げられ得るがこれらに限定されない。
【０２２７】
血清中での溶解性と安定性を修飾するためにポリ（エチレングリコール）を他の重合体と置き換えることができる。ＰＥＧ−ＨＣＣ及びＧＱＤの追加の機能性を単純なアミド結合化学により達成することができる。小分子キノン及びペリレンジイミド（ＰＤＩ）はこれらのＰＥＧ−ＨＣＣと同じことをすることが可能である。
【０２２８】
それらの小分子系の混合物は０Ｖ近く〜−１Ｖまでの広範囲の還元電位に対処するために有利である可能性がある。
【０２２９】
より高いレベルの標的特異性を得るためにミトコンドリア標的標識を使用してミトコンドリアによるこれらの化合物の選択的取り込みを向上させることができる。さらに、発現した受容体に応じた特定の細胞種の指向性標的化が追加の標的化部分により可能になってこれらの材料の効果が特定の組織に限定される場合がある。
【０２３０】
細胞及び無細胞培養物内において電子を伝達する能力が示されている。インビトロでのシアン化物毒性からの培養マウスｂＥｎｄ．３内皮腫細胞のレスキューも示されている（実験室スケールの適用）。
【０２３１】
プロトン濃度勾配についての効果に関し、単離されたミトコンドリア（又は亜ミトコンドリア粒子）について特定の阻害剤を含めて、又は含めずにステージＩ〜ＩＶ呼吸における酸素消費とＡＴＰ形成活性を測定すること、及び電子伝達をバイパスし、且つ、部分的なＡＴＰ形成活性を維持する本ナノ材料の潜在的な役割を評価すること、及びミトコンドリア病を治療するために使用される他の薬剤と比べて本発明のナノ抗酸化薬の効力を示すことが重要であり得る。
【０２３２】
（軽度の実験的外傷性脳損傷における触媒性カーボンナノ抗酸化薬）
潜在的な貢献因子である脳の自己調節機能喪失により全ての重症度の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の後の転帰が低血圧のために悪化する。最初の損傷に伴う活性酸素種の発生には複数の段階が存在し、最初は低血圧ショックの時であり、その後では輸血したときの蘇生時である。これも現実的には薬物治療を行うことができる時期であることを考えるとその後の超酸化物ラジカルの爆発的増加は治療的に適切な時期に生じている。低血圧により悪化するこの軽度ＴＢＩモデルで誘導された神経損傷の大部分が臨床的に現実的な時点で処置されるカーボンナノ材料、すなわちポリ（エチレン）グリコール結合親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）により予防されることがわかった。したがって、臨床的に妥当性の高いこの例においてＰＥＧ−ＨＣＣを使用して転帰を改善することにより先行抗酸化戦略の限界の多くを克服することができる。
【０２３３】
（作業手順）
体重３００〜３５０ｇの合計３８匹のロングエバンス・ラットを使用した。使用したＴＢＩモデルは軽度の皮質衝突損傷（３Ｍ／秒、２．５ｍｍの変形）とその後の５０分の出血性低血圧であった。ＰＥＧ−ＨＣＣ（２ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２１）又はプラセボとしての生理食塩水（ｎ＝１７）のどちらかを受けるようにそれらのラットを無作為に割り当てた。割り当てられた被検薬は蘇生開始時に静脈内投与され、最初の投与から２時間後に再び静脈内投与された。
【０２３４】
前記ラットを約３〜５分間にわたって通気麻酔箱に入れて１００％酸素中に５％のイソフルランを使用して全身麻酔を誘導した。麻酔誘導後に１４ゲージのアンジオカットをそれらの動物に挿管し、体積制御式人工呼吸器を使用して機械的に換気を行った。２％イソフルランを使用して衝突損傷と低血圧期を通して外科的麻酔水準を維持した。
【０２３５】
無菌操作下で血管内留置カテーテルを尾動脈と大腿静脈に留置した。尾の近位部分に２〜４ｍｍの長さの切れ込みを入れて尾動脈を解剖し、血圧をモニターするために２２ゲージのアンジオカットテフロンカテーテルを使用してカニューレ処置を行った。左鼠径部に５〜８ｍｍの長さの切れ込みを入れて大腿静脈を切開し、乳酸リンゲル液又は脱血血液を使用して出血性ショックと蘇生を制御するために２２ゲージのアンジオカットテフロンカテーテルを使用してカニューレ処置を行った。それらのカテーテルはナイロン縫合糸で皮膚に固定された。カテーテル留置の後に外耳棒と切歯棒により頭部を固定して前記動物を伏臥位で定位固定フレームに固定した。体温をモニターし、直腸プローブにより制御された加熱パッドにより体温を３６〜３７℃に保った。
【０２３６】
頭皮を毛刈りし、ヨウ素ベースの溶液を使用して清潔にした。手術する部分を滅菌したリネンで覆った。中間矢状皮膚切開を行い、頭皮（骨膜を含む）と側頭筋を反転させた。衝突損傷用に脳を露出させるために歯科ドリルを使用してブレグマとラムダとの間の右頭頂皮質に対して１０ｍｍの直径の骨切除開頭術を実施した。硬膜表面を傷つけないように注意した。熱による脳組織の損傷を防ぐためにドリルしている部位に少量の生理食塩水溶液を向けた。延伸した位置でインパクターロッドを固定してインパクターの先端を垂直に対して約４５°の角度の脳の露出した表面に対し直角に位置する骨切除開頭部位の中央に置き、その後でその先端が硬膜表面に触れるまでその先端を下げた。その後、そのインパクターロッドを引き戻し、衝突時に２．５ｍｍの脳変形が生じるように先端をさらに進めた。その制御皮質衝突装置を約３Ｍ／秒の衝突速度を生じる３０ｐｓｉに調節して軽いレベルの外傷性損傷を誘導した。動物の頭部に狙いを定めたヒーティングランプの助けを借りて側頭筋に配置された温度プローブを使用して脳の温度を３６〜３７℃の間に保った。皮質損傷後に脳組織が押し出されることを回避するために歯科用アクリルから構成される人口骨片を使用することにより頭蓋骨の欠損を閉じた。
【０２３７】
機械式の標準的な注入／回収ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｐｕｍｐ  Ｄｕａｌ  ＲＳ−２３２）を使用して５０分の期間にわたって平均動脈圧（ＭＡＰ）を約４０ｍｍＨｇまで低下させるために採血した。そのようなレベルにまでＭＡＰを低下させるために必要な血液の体積は体重１００ｇ当たり約２ｍＬであった。最初の５分間にこの体積の半分を採血し、さらに２５％を次の５分間に採血し、そして最後の２５％を次の５分間に採血した。この減速性血液喪失率は外傷性の血液喪失の臨床状況を模倣している。必要であれば断続的な出血を続けることで残りの低血圧期にわたって動物を低血圧に保った。その脱血血液をクエン酸リン酸デキストロース溶液中に収集し、低血圧期と輸液による蘇生期の間に４℃で保存した。その脱血血液を再注入の直線に体温（３６〜３７℃）まで温めなおした。指定された低血圧期の後に少なくとも５０ｍｍＨｇというＭＡＰが得られるまで１ｍＬ／分という一定の注入速度を維持するための輸液ポンプを使用して乳酸リンゲル液で動物を最初に蘇生した。脱血血液の再注入と１００％酸素の換気の提供により最終的な蘇生を達成した。
【０２３８】
最終的な蘇生の後に麻酔を停止して動物を回復させた。ラットが麻酔停止の後に抜管され、自発的に呼吸するようになったところで３０分間にわたって１分毎に回避反射、立ち直り反射、頭部支持反射、角膜反射、耳介反射、四肢引っ込め反射、及び尾部反射を評価した。それらの動物が完全に目覚めたところでそれらの動物をケージに戻し、自由に飲食させた。損傷後の最初の３日間にわたって鎮痛のためにそれらの動物にブプレノルフィンを０．１ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回筋肉内投与し、術後感染症を予防するためにエンロフロキサシンを５ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回筋肉内投与した。
【０２３９】
デジタル式天秤を使用して平均台歩行事前トレーニングの当日、手術の当日、術後１〜５日目、及び術後１１〜１５日目に各ラットの体重を量った。術後１〜５日目に平均台歩行試験と平均台バランス試験で動物を試験した。術後１１〜１５日目にモリス水迷路試験で動物を試験した。最後の行動評価の後に動物を安楽死処理し、組織学的検査のために脳を取り出した。
【０２４０】
（運動試験）
平均台歩行試験
各ラットを、１ｍの長さ、２．５ｃｍの幅、及び地上から１ｍ上の平均台上を歩いて薄暗くしたゴールの箱の中に入って９０ｄｂのホワイトノイズを避けるように手術の２日前に事前トレーニングさせた。各トレーニング試行と検査試行の開始時に３０秒間にわたってゴールの箱の中にラットを座らせた。トレーニング試行の間にラットが平均台全体を歩行することを学ぶまでゴールの箱から徐々に距離を長くしてラットを配置した。ラットが平均台をゴールの箱の中まで歩かないどの距離でもラットがゴールの箱の中まで歩くまで反復して練習した。ラットには試行と試行の間に３０秒間の休憩時間が与えられた。ラットが連続して３回の試行で５秒以内に平均台を移動した後に端から端まで交互に約２０ｃｍの間隔で平均台の端から５ｍｍ内側にある平均台の穴に４本のプラスチックペグ（７．５ｃｍの高さ）を配置した。その後、３回連続の試行で１０秒以内に完了という別の基準に合わせてラットをトレーニングした。３０回の試行までのこれらの基準の両方が満たされなかった場合、そのラットは失格と判断された。本試験に含めるための最終的な基準は、手術当日にペグが存在する状態で１５回の試行以内の３回の連続した試行で５秒以内という平均台歩行時間であった。ペグが存在する状態での平均台歩行を術後１〜５日目に評価した。
【０２４１】
平均台バランス試験
各動物を１．５ｃｍの幅、１ｍの長さ、及び地上から１ｍ上の平均台の中央に沿って長さ方向に配置した。ラットは手術の当日と術後１〜５日目の３回の試験の各々において最大で６０秒間にわたって平均台上でバランスを取ろうと試みた。試験と試験の間にラットを平均台から取り除き、ゴールの箱の中に３０秒間にわたって入れた。
【０２４２】
（組織学）
衝突から２週間後の時点で前記動物に深麻酔を施し、そして０．９％生理食塩水、続いて１０％リン酸緩衝ホルムアルデヒドを使用する経心腔的灌流を施した。脳全体を取り出し、４％ホルマリン中で固定した。固定した脳を挫傷、血種、及びヘルニア形成の存在について肉眼で検討した。それらの脳を写真撮影し、２ｍｍの間隔の薄片に切り分け、その後でパラフィン中に包埋した。ヘマトキシリンエオシン染色した切片を０．９％生理食塩水で洗浄し、続いて１０％リン酸緩衝ホルムアルデヒドで洗浄した。ＰａｔｈＳｃａｎ  Ｅｎａｂｌｅｒ（Ｍｅｙｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ヒューストン、テキサス州）を搭載した切片スキャナー（Ｐｏｌａｒｏｉｄ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用してそれらの脳切片を写真撮影した。各冠状画像中の損傷部分の断面積を決定し、スライスとスライスとの間の組織の厚さを掛けることにより損傷の体積を測定した。この平板体積法を画像処理プログラムＯｐｔｉｍａｓ  ５．２（Ｏｐｔｉｍａｓ社、シアトル、ワシントン州）に実装した。
【０２４３】
海馬のＣＡ１領域とＣＡ３領域の中央部の１ｍｍ厚のセグメント中に存在する神経細胞の数を２００倍の倍率で計数した。核と細胞質の形態から神経細胞を特定し、個々の細胞を正常細胞又は損傷細胞として計数した。細胞質の縮小、好塩基球増加、又は好酸球増加を有する神経細胞、又は核の細部が失われた神経細胞を損傷細胞と見なした。測定した領域は１ｍｍの長さで１ｍｍの幅（その区域の長軸の両側に０．５ｍｍの幅）であった。ミリメートル正方当たりの神経細胞数として神経細胞の総数と正常に見える神経細胞の数を表した。
【０２４４】
（結果）
これらの結果は低血圧と蘇生を組み合わせた軽度ＴＢＩモデルにおいて「根本蘇生」時のＰＥＧ−ＨＣＣ処置により機能的転帰と脳構造が改善されることを反映している。
【０２４５】
図３５は検査群のラットの平均台歩行試験での成績をグラフ表示している（対照とＰＥＧ−ＨＣＣで処理されたラットをそれぞれ（ＴＢＩ）３５０１と３５０２によりグラフ表示している）。平均台歩行試験の成績はＰＥＧ−ＨＣＣ処置群において有意に良好であった（治療効果、ｐ＝０．００７；治療と日数の交互作用、ｐ＜０．００１）。図３５上の星印は対照群と有意に異なる値を表している（ｐ＜０．０５、ホルム・シダック法）。
【０２４６】
図３６は検査群のラットの平均台バランス試験での成績をグラフ表示している（対照とＰＥＧ−ＨＣＣで処理されたラットをそれぞれ３６０１と３６０２によりグラフ表示している）。平均台バランス試験の成績はＰＥＧ−ＨＣＣ処置群において有意に良好であった（治療効果、ｐ＜０．００１；治療と日数の交互作用、ｐ＜０．００１）。図３６上の星印は対照群と有意に異なる値を表している（ｐ＜０．０５、ホルム・シダック法）。
【０２４７】
図３７は検査群のラットのモリス水迷路試験での成績をグラフ表示している（対照とＰＥＧ−ＨＣＣで処理されたラットをそれぞれ３７０１と３７０２によりグラフ表示している）。モリス水迷路試験の成績は早期の検査期間ではＰＥＧ−ＨＣＣ処置群において有意に良好であった（治療効果、ｐ＝０．０１０；治療と日数の交互作用、ｐ＜０．００１）。図３５上の星印は対照群と有意に異なる値を表している（ｐ＜０．０５、ホルム・シダック法）。
【０２４８】
図３８は検査群のラットの損傷２週間後での脳挫傷の体積をグラフ表示している。脳挫傷の体積はＰＥＧ−ＨＣＣ処置群においてずっと小さかった（したがって有意に良好であった）。
【０２４９】
これらの結果が示すように、ＰＥＧ−ＨＣＣが根本蘇生の開始時に投与され、２時間後に投与が繰り返されると機能的転帰の測定値が改善し、病変のサイズが減少した。低血圧によって引き出されるＴＢＩに対する重大な血管性の要素が存在することが症状を悪化させる低血圧の効果から明らかになった。軽度のＴＢＩでもそれによる脳の自己調節機能の喪失がおそらく一つの要因であり、酸化ストレスがこの現象に寄与することが抗酸化薬の事前処置を介して証明されている。「根本」蘇生時に処置されるとその処置は構造的にも機能的にも非常に有効であることが示されており、このことは生存組織がレスキュー可能であることを示している。
【０２５０】
本発明の実施形態を示し、説明してきたが、当業者は本発明の主旨と教示から逸脱することなくそれらの実施形態の改変を行うことができる。本明細書の中で説明した実施形態と提供した例は例示のみを目的としており、限定を意図したものではない。本明細書において開示された本発明の多くの変形と改変が可能であり、且つ、本発明の範囲内である。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。保護の範囲は上で述べた説明によって限定されない。
【０２５１】
本明細書において引用した全ての特許、特許出願、及び刊行物の開示は、本明細書において明らかにされた詳細を補う実施例の詳細、手順の詳細、又は他の詳細を提供する限りにおいて全体がここに参照により本明細書に援用される。
【０２５２】
特定の系の要素を指すために様々な用語が使用されている。異なる会社が一つの要素を異なる名前で呼ぶこともある。この文書は名前が異なるが機能は異ならない要素を区別することを意図していない。以下に続く考察と特許請求の範囲の中では「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語と「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語はオープンエンド様式でしようされ、したがって「を含むが限定されない」という意味であると解釈されるべきである。また、「対（ｃｏｕｐｌｅ）」又は「連結する（ｃｏｕｐｌｅｓ）」という用語は間接的であるか、又は直接的であるかどちらかでの接続を意味するものとする。したがって、第１の装置が第２の装置に連結している場合、その接続は直接的な接続と考えられても他の装置及び他の接続を介した間接的な接続と考えられてもよい。
【０２５３】
本明細書において使用される場合、値、又は質量、重量、時間、体積、濃度、若しくはパーセンテージを指すときの「約」という用語は特定の量からの変化を包含するという意味であり、それはそのような変化が本開示の方法を実施するために適切であるからであり、その変化は幾つかの実施形態では±２０％の変化、幾つかの実施形態では±１０％の変化、幾つかの実施形態では±５％の変化、幾つかの実施形態では±１％の変化、幾つかの実施形態では±０．５％の変化、及び幾つかの実施形態では±０．１％の変化である。
【０２５４】
本明細書において使用される場合、実在物のリストという文脈の中で使用されるときの「及び／又は」という用語は個々に、又は組み合わせて存在している実在物を指す。したがって、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という言い回しにはＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤが個々に含まれるが、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤのありとあらゆる組合せと部分組合せも含まれる。
【０２５５】
範囲形式で濃度、量、及び他の数値データが本明細書において提示される場合がある。そのような範囲形式は単に利便性と簡潔性のために使用されており、且つ、そのような範囲形式にはその範囲の境界として明白に列挙されている数値が含まれるだけでなく、その範囲内に含まれる個々の数値又は部分範囲があたかも明白に列挙されているかのようにその各数値と部分範囲の全てが含まれると柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。例えば、約１〜約４．５という数値範囲は明白に列挙されている１〜約４．５という境界を含むだけでなく、２、３、４などの個々の数値、及び１〜３、２〜４、等のような部分範囲も含むと解釈されるべきである。１つの数値だけを挙げている範囲、例えば「約４．５未満」にも同じ原則が当てはまり、その範囲は先に挙げた値と範囲の全てを含むと解釈されるべきである。さらに、範囲の広がり、又は記載されている特性に関わらずそのような解釈が当てはまるべきである。
【０２５６】
昔からの特許法の慣習に従い、「単数（ａ）」という用語と「単数（ａｎ）」という用語は特許請求の範囲を含む本出願において使用されるときは「１又は複数の」を意味する。
【０２５７】
別段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用されている成分、反応条件等の量を表す全ての数は全ての場合に「約」という用語で修飾されているものと理解されたい。したがって、異なるという指摘が無い限り、本明細書及び添付されている特許請求の範囲において示されている数値パラメーターは、本開示の内容によって得ることが求められている所望の特性に応じて変化し得る近似値である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
2020519682.tif 000061
【図３５】
2020519682.tif 000062
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月7日(2020.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キレート化部分で共有結合により修飾された抗酸化性ナノ粒子を含む治療用組成物であって、
（ａ）前記抗酸化性ナノ粒子が酸化抑制特性と酸化促進特性の両方を有し、
（ｂ）前記治療用組成物が対象に投与されると高力価の酸化体として機能するように作用可能であり、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元し、
（ｃ）前記治療用組成物が、前記抗酸化性ナノ粒子を含まない同量の前記キレート化部分と比較して少なくとも１０倍高いキレート化効力を有し、
（ｄ）前記キレート化部分がアルミニウム、アメリシウム、ヒ素、カドミウム、セシウム、クロム、銅、キュリウム、鉄、鉛、水銀、プルトニウム、タリウム、ウラン、及び亜鉛からなる群より選択される金属のキレート剤であり、且つ、
（ｅ）前記金属がヒ素、カドミウム、銅、鉄、鉛、セレン、亜鉛、及びそれらの組合せからなる群より選択される、
治療用組成物。
【請求項２】
前記キレート化部分がＤＥＦである、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３】
前記治療用組成物がＤＥＦ−ＰＥＧ−ＨＣＣである、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項４】
前記治療用組成物がＤＥＦ−ＰＥＧ−ＧＱＤである、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項５】
（ａ）前記抗酸化性ナノ粒子が、ＰＥＧ−ＨＣＣ、ＰＥＧ−ＧＱＤ及びＰＥＧ−ＰＤＩからなる群より選択され、且つ、
（ｂ）ＰＥＧ：キレート化部分の比率が１：３〜３：１である、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項６】
ＰＥＧ：キレート化部分の比率が１：１未満である、請求項５に記載の治療用組成物。
【請求項７】
前記治療用組成物がミトコンドリア損傷を治療、抑制、又は予防するように作用可能である、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項８】
（ａ）請求項１〜請求項６までのいずれか一項、又は請求項７に記載の治療用組成物を選択すること、及び
（ｂ）前記治療用組成物を対象に投与すること、
を含む方法であって、
（ｉ）投与された前記治療用組成物中のキレート剤部分の量が、前記抗酸化性ナノ粒子を含まない前記キレート剤部分が同程度のキレート化効力を得るために投与されることが必要な前記キレート剤部分の量の多くとも１０％にまで減少し、且つ
（ｉｉ）前記治療用組成物が前記対象に投与されると高力価の酸化体として機能し、且つ、電子を直接伝達し、且つ、重要なミトコンドリア酵素を還元する、
方法。
【請求項９】
前記治療用組成物を投与することが、ミトコンドリア損傷を治療、抑制、又は予防するための工程である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象に前記治療用組成物を投与することにより前記対象における金属誘導性酸化ストレスが低減する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象に前記治療用組成物を投与することにより前記対象の組織損傷が治療される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織損傷が脳損傷である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象に前記治療用組成物を投与することによりフェロトーシスが抑制される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象に前記治療用組成物を投与することにより前記対象における金属中毒が治療される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象に前記治療用組成物を投与することにより前記対象における酸素（Ｏ２）化された血流が改善する、請求項８に記載の方法。
【国際調査報告】
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