(57)【要約】  ウイルスを含む内部コア；および細胞由来の細胞膜を含む外部表面を含むナノ粒子、およびそれらを作製するプロセスが開示される。ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスであり、細胞膜は例えば赤血球に由来する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを含む内部コア；および、細胞に由来する細胞膜を含む外部表面を含む、ナノ粒子。
【請求項２】
前記ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記腫瘍溶解性ウイルスがヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記細胞が、血球、脂肪細胞、幹細胞、内皮細胞、エキソソーム、分泌小胞、またはシナプス小胞である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記血球が赤血球、白血球、または血小板である、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記血球は赤血球である、請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
ナノ粒子を作製するプロセスであって、該プロセスは、ウイルスを含む内部コアおよび細胞に由来する細胞膜を含む外部表面を無塩水溶液中で混合する工程と、前記外部表面で被覆した前記内部コアを含むナノ粒子を形成するために前記混合物の溶液に超音波処理を適用する工程とを含む、プロセス。
【請求項９】
前記無塩水溶液は、水溶液中にて、砂糖、または砂糖の類似する性質を備えた成分を含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記無塩水溶液は糖溶液である、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記糖溶液はスクロース、またはデキストロースを含む溶液である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスである、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記腫瘍溶解性ウイルスはヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、またはそれらの組み合わせである、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記ウイルスはアデノウイルスである、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記細胞は、血球、脂肪細胞、幹細胞、内皮細胞、エキソソーム、分泌小胞またはシナプス小胞である、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記血球は赤血球、白血球、または血小板である、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記血球は赤血球である、請求項１６に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年４月２１日に出願された米国仮出願第６２／４８８，６８５の利益を主張するものであり、当該文献は引用により全体として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は癌細胞に優先的に感染し、これを殺傷するウイルスである。ウイルスが増殖し、癌細胞の溶解（腫瘍溶解）を引き起こすか、または癌免疫抑制の微小環境を妨害し、癌細胞を取り除くために身体の免疫応答をトリガーする他のメカニズムを引き起こす。最近の首尾よい臨床データおよび薬物の認可は、腫瘍溶解性ウイルス療法の世間に対する関心を増加させた。腫瘍溶解性ウイルス療法の使用は、癌患者のための転帰を改善するために、他の薬剤、免疫チェックポイント阻害剤、およびＴ細胞療法と組み合わせることができる。
【０００３】
ＯＶの送達経路は、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射、静脈内（ｉ．ｖ．）送達、および腫瘍内注射が主に適用される腹腔内送達を含む。
【発明の概要】
【０００４】
本発明によれば、本発明はウイルスまたは同様のものを含む内部コアと、細胞に由来する細胞膜を含む外部表面を無塩水溶液中で混合する工程と；前記外部表面で被覆した前記内部コアを含むナノ粒子を形成するために前記溶液を超音波処理する工程とを含む、特定のナノ粒子の製造プロセスを提供する。
【０００５】
一態様では、ウイルスを含む内部コアおよび細胞由来の細胞膜を含む外部表面を含むナノ粒子が本明細書で提供される。
【０００６】
（引用による組み込み）
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも各々の個別の刊行物、特許または特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示されるかのような同じ程度、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本発明の新規な特徴はとりわけ添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が用いられる例証的な実施形態を説明する以下の詳細な説明と、添付図面とを引用することによって得られる。
【図１】裸のウイルスに対して、それぞれ４分、６分、８分の様々な超音波処理時間を適用することにより調製した異なるサンプルバッチのウイルス検出アッセイの例示的な結果を示す。
【図２】ナノ粒子を調製するプロセスの様々な溶液でのウイルスのコアとＲＢＣ膜を組み合わせることにより調製した様々なサンプルバッチのウイルス検出アッセイの例示的な結果を示す。４つのサンプルバッチ（ＲＢＣ膜と、生理食塩水、スクロース、デキストロースおよびリジン−デキストロースの溶液それぞれのウイルス貯蔵溶液を混合する）および１つのコントロールバッチ（裸のウイルス）が存在する。
【図３】裸のウイルスおよび被覆ウイルスのＴＥＭ画像を示す。
【図４】動的光散乱法によって測定された裸のウイルスおよび被覆ウイルスのサイズを示す。
【図５】被覆されたウイルスは、４５０ｎｍで非常に低い吸光度を示したのに対し、裸のウイルスの１つははるかに高い吸光度を示す、例示的なウイルス検出アッセイの結果を示す。
【図６】被覆ウイルスと比較して、裸のウイルスをもたらす被覆ウイルスナノ粒子が脱被覆プロセスを経た後のフォローアップウイルスの検出アッセイを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
現在、ほとんどの腫瘍溶解性ウイルス療法は局所注射に制限されており（腫瘍内、ｉ．ｔなど）、１回の注射で治療効果を達成するのに十分かどうかはまだ調査中である。また、いくつかのＯＶは急性の一過性の毒性プロフィールを有することが示され、したがって、ウイルスの注入は、腫瘍細胞に対するよりもウイルスに対する競合的な免疫応答を誘発する場合がある。また、ＯＶが血流から急速に除去される可能性があるＯＶの静脈内送達には問題があり、したがって、頻繁なまたは高用量の投与を必要とし、治療コストの増加と潜在的な安全性の問題につながる。したがって、標的細胞への治療薬の最終的な送達のために、長期間、循環に投与でき、かつとどまることができる、ＯＶを含む組成物を提供することが必要である。
【０００９】
ナノ粒子上でステルス部分を達成するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の採用が用いられることが、当技術分野で知られている。しかしながら、抗ＰＥＧ免疫反応がトリガーされる場合があり、したがって、このようなアプローチには問題がある。両性イオン材料（例えばポリ（カルボキシベタイン）およびポリ（スルホベタイン））を利用するなどの代替アプローチが提案されている。
【００１０】
最近、膜脂質と関連する膜タンパク質の両方を含む天然の赤血球膜を用いて被覆することにより、機能化されたナノ粒子を提供するトップダウンの生物模倣アプローチが実現され、長期循環の荷送達を提供する。Ｃ−Ｍ．  Ｊ．  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｃａｍｏｕｆｌａｇｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２０１１，  Ｊｕｌｙ  ５；  １０８（２７）：  １０９８０−１０９８５．を参照。特に、血液細胞（例えば赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）あるいは血小板）に由来する膜脂質は、腫瘍溶解性ウイルスまたは同様のものではなく、様々な材料を被覆するために特に重要である。
【００１１】
ＲＢＣで被覆した腫瘍溶解性ウイルスを用いてナノ粒子を調製する様々な試みが行われたが、既知の方法に従って成功することはなかった。腫瘍溶解性ウイルスまたは同様のものが、ＲＢＣ膜で被覆されたのは今回が初めてである。本発明の実施によれば、驚くべきことに、本明細書に開示される本発明のナノ粒子を調製するために特定の条件を用いなければならないことが見い出された。
【００１２】
本明細書で言及される用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルスまたはそれらの組み合わせの非制限的な例を含む。
【００１３】
ウイルスは、別個に投与された非毒性プロドラッグを、拡散して隣接細胞を殺すことができる強力な細胞毒素に代謝できる酵素をコードする、自殺遺伝子の送達のためのベクターとして使用できることが技術的に知られている。したがって、本明細書に開示される治療薬は、このようなベクター、自殺遺伝子、またはコードする酵素などを含む。
【００１４】
本発明によれば、驚くべきことに、ウイルス（治療薬）を含む内部コアと、無塩水溶液中の細胞に由来する細胞膜を含む外部表面とを組み合わせる工程と、前記外部表面で被覆した前記内部コアを含むナノ粒子を形成するために前記溶液に超音波処理を適用する工程と、を含むナノ粒子を製造するプロセスが見い出された。内部コアの細胞膜を被覆するプロセスにおいて、生理食塩水およびＰＢＳ溶液などの塩溶液が必要とされる既知の方法とは反対に、無塩水溶液（例えば、糖含有溶液）または同様のもの（水溶液中で糖に類似する特性を有する成分など）が、腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルスを被覆するために必要とされる。ウイルスを含む内部コアと、細胞に由来する細胞膜を含む外部表面とを含むナノ粒子が、本発明の実施に従って初めて調製される。驚くべきことに、ウイルスのコアまたは同様のものを含むナノ粒子を調製するプロセスで使用される、５％から１５％、７％から１４％、９％から１１％の無塩水溶液（糖含有溶液など）  が必要であることが見い出された。いくつかの実施形態では、ウイルスのコアまたは同様のものを含むナノ粒子を製造するプロセスにおいて、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％の無塩水溶液（糖含有溶液など）が必要とされる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ウイルスを含む内部コアと、細胞に由来する細胞膜を含む外部表面とを含むナノ粒子を提供する。ある実施形態では、前記ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスである。ある実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、またはそれらの組み合わせである。ある実施形態では、前記ウイルスはアデノウイルスである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、血球、脂肪細胞、幹細胞、内皮細胞、エキソソーム、分泌小胞またはシナプス小胞である。ある実施形態では、前記血球は赤血球、白血球または血小板である。ある実施形態では、前記血球は赤血球である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ウイルスを含む内部コアおよび細胞に由来する細胞膜を含む外部表面を無塩水溶液中で混合する工程と、前記外部表面で被覆した前記内部コアを含むナノ粒子を形成するために前記溶液に超音波処理を適用する工程とを含むナノ粒子を製造するプロセスが提供される。ある実施形態では、前記無塩水溶液は、砂糖またはそのようなもの（水溶液中で砂糖に類似する性質を備えた成分など）を含む。ある実施形態では、前記無塩水溶液は糖溶液である。ある実施形態では、前記糖溶液はスクロースまたはデキストロースを含有する溶液である。いくつかの実施形態において、前記ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスである。ある実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、またはそれらの組み合わせである。ある実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルスである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、血球、脂肪細胞、幹細胞、内皮細胞、エキソソーム、分泌小胞またはシナプス小胞である。ある実施形態では、前記血球は、赤血球、白血球または血小板である。ある実施形態では、前記血球は赤血球である。
【００１８】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスなどの治療薬を送達するための細胞膜から誘導されたナノ粒子を提供する。薬剤は、腫瘍溶解性ウイルスなどの治療薬を細胞膜脂質を用いて被覆することにより本質的に偽装される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスなどの治療薬は、被験者（例えば、患者）の血流内の循環に適合する脂質により被覆される。これにより、特定の分子が正常組織よりも腫瘍組織に蓄積する傾向があるＥＰＲ（透過性および保持の増加、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を経て、腫瘍の血管系への薬剤の送達を可能にする。ＥＰＲ効果は、癌組織へのナノ粒子およびリポソーム送達を説明するために通常用いられる。多くの実施例のうちの１つは、金ナノ粒子を用いる熱アブレーションに関する研究である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子は腫瘍の血管系の近くに蓄積し、治療薬（例えば、ＯＶ）は癌細胞と接触する。次に、ＯＶは細胞に感染し、細胞の溶解、死滅、または除去の結果をもたらす。
【００２０】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスおよび同様のものを含む内部コア、および血球（例えば赤血球（ＲＢＣまたは赤血球）、白血球または血小板）、脂肪細胞、幹細胞、内皮細胞などの細胞に由来する細胞膜を含む外部表面を含むナノ粒子が本明細書で提供される。ある実施形態では、細胞膜は赤血球などの血球に由来する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子の調製方法を提供する。例えば、血球は、全血または血液供給業者から入手した処理済み赤血球から精製することができる。人間の血液におけるＲＢＣの豊富さ、および個々のドナーからの採血の容易さのため、ＲＢＣは膜源として特に有用である。ＲＢＣは、赤血球ゴースト（またはＲＢＣゴースト）の形態として提供でき、この場合、内部タンパク質が枯渇しており、膜成分は本質的に無傷のままである。ＲＢＣゴーストの使用はまた、被覆プロセスの間で干渉する可能性があるＲＢＣ細胞タンパク質の存在も減少させる。いくつかの実施形態において、ＲＢＣは、Ｏ型陰性血球（すなわち、「ユニバーサルドナー」）である。より多くの被験者に治療薬（例えば、ＯＶ）を送達するために、ナノ粒子の調製においてそのような膜源が使用される場合がある。ある実施形態では、個人化されたナノ粒子のバッチのために同じ患者に由来する細胞膜を使用することができる。
【００２２】
他のプラットフォーム、例えばＰＥＧ被覆ナノ粒子と比較して、ＲＢＣ膜由来のナノ粒子は、ＣＤ４７、ＣＤ５９（ＭＡＣ阻害タンパク質、補体細胞溶解を回避する）、ＣＤ５５（ＤＡＦ）、ＣＤ３５（ＣＲ１）、および身体クリアランスから自身を保護するための免疫グロブリンスーパーファミリーにおける他のメンバーなどの多くの表面マーカーを有する。いくつかの実施形態において、本明細書において被覆するために使用される細胞膜は、細胞表面マーカー、ＭＨＣ分子、および糖タンパク質などの非脂質成分をさらに包含できる。他の実施形態では、細胞膜はＰＥＧなどの親水性成分をさらに包含できる。
【００２３】
本明細書で使用される「細胞膜」という用語は、細胞または出現ウイルス粒子（ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）内または周囲の選択的障壁として働く構造を封入するか、または分離する生体膜を指す。細胞膜は、イオンと有機分子に対して選択的に透過性であり、細胞内および細胞外の基質の動きを制御する。細胞膜は、リン脂質単層または二重層、および随意に付随するタンパク質および炭水化物を含む。本明細書で使用されるように、細胞膜は、細胞または細胞小器官の天然に存在する生体膜から得られた膜、またはそれに由来する膜を指す。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用語「天然に存在する」は自然界に存在するものを指す。
【００２５】
本明細書で使用されるように、用語「それに由来する」は、細胞膜の単離、膜の部分または断片の作成、細胞または細胞小器官から採取された膜からまたは膜内の、脂質、タンパク質または炭水化物などの特定の成分の除去および／または添加などの、天然膜のその後の修飾を指す。膜は、任意の適切な方法によって天然に存在する膜から誘導可能である。例えば、膜は細胞から調製または単離することができ、調製したまたは単離した膜は、誘導した膜を形成するために他の物質または材料と組み合わせることができる。別の実施例では、ｉｎ  ｖｉｖｏで膜に組み込まれる「非天然の」または「天然の」物質を産生するために細胞を組み換え操作することができ、誘導した膜を形成するために細胞またはウイルス膜は細胞から調製または単離することができる。
【００２６】
細胞膜は既知の方法によって調製することができる。例えば、マイクロフルイダイザー（ＭＦ）または水などの低張液を使用して細胞を破壊し、その後に生理食塩水またはＰＢＳを用いる限外濾過または透析濾過を行うことができる。場合によっては、イオン強度の高い溶液が豚の肝臓から血液を除去するのに役立ち、そのため、ＰＢＳまたはＮａＣｌ溶液は、濾過プロセスを通じて細胞内塊を除去するのに役立つ。ＥＤＴＡなどの抗凝固剤も、例えば不純物を除去するために透析濾過中に使用することができる。いくつかの実施形態では、膜を精製するために、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）デバイスまたは遠心分離を使用することができる。精製された膜成分は、ＢＣＡタンパク質試験などにより、細胞タンパク質の存在について試験することができる。好ましくは、ほとんどの非膜成分は被覆の前に除去される。
【００２７】
多くの努力にもかかわらず、ＵＳ２０１３／０３３  ７０６６の手順などの既知の方法に従って、腫瘍溶解性ウイルスまたはＣＲＩＳＰＲなどのウイルス、ウイルスからのＤＮＡ配列は、細胞膜（例えば、ＲＢＣ膜）によって被覆またはカプセル化できないことが見い出された  。驚くべきことに、細胞膜（例えば、ＲＢＣゴースト）は、特定の条件でのみウイルスまたはそのようなものを被覆することが見い出された。本明細書に開示されるナノ粒子を調製するプロセスは、（１）ＲＢＣゴーストおよびＯＶの混合物の超音波処理（２）スクロース溶液などの無塩溶液、を必要とする。
【００２８】
本発明の実施によれば、被覆に適したウイルスには、腫瘍溶解性ウイルスおよび癌細胞に感染し得る他のウイルスを含む。ウイルスは、エンベロープありまたはエンベロープなしの形態であり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが好ましい。ウイルスベクターは癌細胞に感染して複製（複製能力）できるからである。
【００２９】
（特定の薬学および医学の用語）
本明細書で使用されるような、製剤、組成物、または成分に関する用語「許容可能な」とは、処置されている被験体の一般的な健康状態に対して持続的な有害効果がないことを意味する。
【００３０】
用語「担体」は、本明細書で使用されるように、細胞または組織への化合物の取り込みを促す比較的無毒な化学化合物または薬剤を指す。
【００３１】
用語「同時投与」などは、本明細書で使用されるように、一人の患者に対する選択された治療薬の投与を包含することを意味しており、同じあるいは異なる投与経路によって、または同じあるいは異なると時点で薬剤が投与される治療レジメンを含むことを意図している。
【００３２】
用語「希釈剤」は、送達の前に所望の化合物を希釈するために使用される化学化合物を指す。希釈剤はまた、より安定した環境を提供できるので、化合物を安定させるために用いられることもある。緩衝液（ｐＨの制御または維持もまたもたらすことができる）中に溶解した塩は、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩溶液を含む当該技術分野の希釈剤として利用される。
【００３３】
「有効な量」または「治療上有効な量」という用語は、本明細書で使用されるように、処置されている疾患または疾病の症状の１つ以上をある程度まで軽減する、投与されている薬剤または化合物の十分な量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状、または原因の減少および／または軽減であり得るか、あるいは、生物系の任意の他の所望の変化であり得る。例えば、治療用途のための「有効な量」は、疾患症状の臨床的に有意な減少を提供するために必要とされる、本明細書に開示されるような化合物を含む組成物の量である。任意の個々の場合における適切な「有効な」量は、用量増加試験などの技術を使用して定められてもよい。
【００３４】
「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」あるいは「増強すること（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用されるように、効能または持続時間のいずれかにおいて所望の効果を増加させるか延長することを意味する。したがって、治療薬の効果を増強することに関して、「増強する」という用語は、効能または持続時間のいずれかにおいて、系に対する他の治療薬の効果を増大させるかまたは延長する能力を指す。本明細書で使用されるような「増強有効量」は、望ましい系において別の治療薬の効果を増強するのに十分な量を指す。
【００３５】
「医薬組成物」という用語は、ナノ粒子（すなわち、本明細書に記載されるナノ粒子）と、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、および／または賦形剤などの他の化学成分との混合物を指す。医薬組成物は、有機体への化合物の投与を促進する。化合物を投与する複数の技術が当該技術分野に存在し、これらは以下を含む：静脈内、経口、エアロゾル、非経口、経眼、肺、および局所的な投与。
【００３６】
「被験体」または「患者」という用語は、哺乳動物を包含する。哺乳動物の例は、限定されないが、以下の哺乳動物のクラスの任意のメンバーを含む：ヒト、チンパンジーなどの非ヒトおよび霊長類、ならびに他の類人猿およびサル種、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜、ウサギ、イヌ、およびネコなどの飼育動物、ラット、マウスおよびモルモットなどの、げっ歯類を含む実験甲動物。１つの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００３７】
用語「処置する」、「処置すること」、あるいは、「処置」は、本明細書で使用されるように、疾患または状態の少なくとも１つの症状を緩和するか、軽減するか、あるいは改善すること、追加の症状を予防すること、疾患または状態を阻害すること、例えば、疾患または状態の進行を抑えること、疾患または状態を軽減すること、疾患または疾病の退行を引き起こすこと、疾患または疾病によって引き起こされた状態を軽減すること、あるいは疾患または状態の症状を予防的におよび／または治療的にのいずれかで止めることを含む。
【００３８】
本明細書で説明される様々な実施形態またはオプションのすべては、任意のおよび全てのバリエーションで組み合わせることができる。以下の実施例は、本発明を例証するためにのみ役立つものであり、本発明を限定するものと決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１：細胞膜調製の例示的な調製
細胞膜調製（例えば、ＲＢＣゴースト調製）は、当該技術分野で知られている。ここで、本発明のナノ粒子調製のための例示的な細胞膜を提供するための、細胞膜を調製する非限定的な例であるＲＢＣ細胞膜は以下の通りである。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
手順：
１．パックされた赤血球バッグを−８０℃の冷蔵庫に入れ、一晩凍結させる。翌朝４℃の冷蔵庫でパックされた赤血球を解凍させる。
２．０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ３６０ｍＬを培地ボトルに注ぎ、冷蔵庫で一晩保存する。
３．ｐＲＢＣから４０ｍＬの血液を培地ボトルに加え、振とうさせてよく混合する。冷蔵庫で３０分間穏やかに混合する。
４．４００ｍＬのＷＦＩ水をＴＦＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＬａｂｓｃａｌｅ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ）プロセスリザーバーに入れ、リザーバーを閉じる。ＴＦＦシステムを起動し、流量ノブをレベル４に回す。このシステムを５分間再循環させ、すべての水を浸透ラインに押し込み、フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製の  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  ｍｉｎｉ  ＴＦＦ  ｆｉｌｔｅｒ、ＰＸＤＶＰＰＣ５０）を事前に湿らせる。システムを一時停止する。
５．ステップ３の混合物をＴＦＦプロセスリザーバーに注ぐ。
６．この混合物を１００ｍＬに濃縮する。
７．４００ｍＬ  ＰＢＳを用いて透析濾過する。ＰＢＳをリザーバーにゆっくりと注ぎ、リザーバー内の溶液を１００±５０ｍＬに保つ。
８．２００ｍＬ  ０．５ｍＭ  ＥＤＴＡにて透析濾過する。ＥＤＴＡ溶液をリザーバーにゆっくりと注ぎ、リザーバー内の溶液を１００±５０ｍＬに保つ。
９．４０ｍＬまで最後の濃縮を行う。圧力を監視し、ポンプ速度を下げて圧力を４０ｐｓｉ未満に保つ。
１０．脂質を５０ｍＬコニカルチューブに送り出し、さらに分析するために−８０℃の冷凍庫に保存し、細胞膜の調製および／またはプロセスを確認する。
【００４２】
実施例２：様々な超音波処理時間の研究を用いて既知の方法に従ってウイルスコアを含むナノ粒子の調製の失敗
この手順は、プローブ超音波処理を使用した、１ｍＬの被覆したウイルス（１０＾１０ＶＰ／ｍＬ）の実験室規模のプロセスについて説明している。このプロセスで使用される賦形剤の細胞膜（例えば、赤血球膜）は、原材料として０．１ｍＬのパックされた赤血球と等価である。以下は、既知の方法に従ってウイルスコアを含むナノ粒子の調製を試みる詳細な説明である。
【００４３】
米国公開番号２０１３／０３３７０６６におけるもののような既知の方法に従ってウイルスのコアを含むナノ粒子を調製する最初のいくつかの試みは成功しなかったため、例示的なウイルス（すなわち、ヒト５型アデノウイルス）のコアを含むナノ粒子を調製することを望み、様々な超音波処理時間（４分、６分、および８分）を適用することにより、エネルギー状態を調査することが決定された。
【００４４】
装置および材料：以下は、１ｍＬ被覆ウイルスの合成に使用される装置とおよび材料の簡潔な説明である：
【００４５】
プローブ超音波発生装置：Ｑｓｏｎｉｃａ  ＸＬ２０００
【００４６】
【表２】
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【００４７】
手順
１．１．５ｍＬ微量遠心チューブに８００ｕＬの生理食塩水を加える。
２．２００μＬのＲＢＣ膜（１．５ｍｇ／ｍＬ）をこのチューブに加え、よく混合する。これにより、０．３ｍｇ／ｍＬ膜のプロセス混合物が作成される。
３．プローブ超音波発生装置の電源を入れ、７０％エタノールでプローブを拭き、プローブのみをバイオフードに移動させる。
４．超音波破砕機の出力をレベル２に調整する（出力〜３Ｗ）。
５．プロセス温度を４℃未満に保つために、冷水のアイスボックスを準備する。
６．１０ｕＬのアデノウイルス貯蔵溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｂｉｏｌａｂｓ、Ｌｏｔ＃２０１７０９２２）をプロセス混合物に追加する。
７．チューブをアイスボックスに入れる。プローブをチューブに浸す。プローブが底に触れないようにする。
８．１秒の超音波処理および各超音波処理の間隔を１秒にして、混合物を手動で超音波処理する。このステップを４、６、および８分間維持して、３つのサンプルバッチを作成する。
９．裸のウイルスの場合は、ステップ１〜８に従うが、２．で分子グレード水に溶液を変更する。
１０．ベンダーの手順（Ｖｉｒｕｓｙｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡＫ２９０−２）に従って、各バッチのサンドイッチＥＬＩＳＡデータを取得する。
【００４８】
被覆ウイルスのナノ粒子は、ウイルス検出アッセイによって確認された。アッセイは、サンプルから抗原を捕捉するためにモノクローナル抗アデノウイルス抗体を利用する二重抗体（サンドイッチ）ＥＬＩＳＡである。サンプルのインキュベーション後、ビオチン化検出抗体を添加し、このステップの後にＨＲＰ−ストレプトアビジンを添加する。ヘキソン抗原の存在は、ＨＲＰ基質の添加とそれに続く停止試薬の添加により視覚化される。ウェル内の発色は、サンプル中のアデノウイルスヘキソン抗原の存在を示している。定量的な目的のために、Ｖｉｒｕｓｙｓは、定量測定用の標準曲線を作成するためにこの製品とともに使用できる個別のキャリブレーションキット（ＡＫ２９１、アデノウイルス抗原キャリブレーションキット）を提供する。
【００４９】
結果は、４分間の超音波処理時間を適用すると、ウイルス検出アッセイに基づいてより良い結果が得られることを示している（図１を参照）。しかしながら、すべてのバッチとコントロールサンプル（つまり、裸のウイルスサンプル）の間でエッセイの結果を比較する場合、吸光度の差はウイルスの被覆の成功の根拠になるほど十分に大きくない。したがって、他の条件の変更が必要である。
【００５０】
実施例３：高せん断ホモジナイザーによる既知の方法に従ったウイルスコアを含むナノ粒子の調製の失敗
使用した装置および材料は、ＲＢＣ膜とウイルス貯蔵溶液との混合物のためにＰＢＳ溶液を使用したことを除いて、実施例２と同じである。次に、以下に詳述するように、混合物を高せん断ホモジナイザープロセスにかけた。
【００５１】
手順：
１．ＬＭ１０高せん断ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）の冷却ボックスに冷水を注ぐ。圧縮空気を機械に接続し、空気圧を約１２０ｐｓｉに調整する。
２．１００ｍＬの脱イオン水でリザーバーを満たし、処理圧力を１０Ｋｐｓｉに設定する。システムを脱イオン水で２回、ＰＢＳで２回洗浄する。
３．１４ｍＬのＰＢＳと１ｍＬの細胞脂質（１．５ｍｇ／ｍＬ）および５０ｕＬアデノウイルス（１０＾１２ｖｐ／ｍＬ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を混合し、混合物をリザーバーに注ぐ。
４．機械を始動し、高せん断ストロークを５回繰り返す。
５．製品コンテナからサンプルを収集する。
【００５２】
実験は成功せず、ウイルス検出アッセイを使用してもウイルスは検出されなかった。ウイルスは、装置によって生成される高いせん断力によって潜在的に破壊された。したがって、非ウイルス材料を含むコアへのＲＢＣ膜の適用に成功したにもかかわらず、本明細書に開示される例示的なウイルスのコアを含む成功したナノ粒子をもたらす条件はまだ疑問の余地があった。
【００５３】
実施例４：様々な混合溶液の変化を伴うウイルスコアを含むナノ粒子の調製の試み
既知の方法と科学的原理に基づいて、ＲＢＣゴーストを調製するためにこれらの溶液が使用されたため、ＲＢＣの生理食塩水またはＰＢＳ溶液の膜での被覆またはカプセル化のプロセスが必要とされる。既知の手順とは異なり、「非伝統的な」手順を検討するために、いくつかの無塩溶液が使用された。
１．１．５ｍＬの微量遠心チューブに８００ｕＬの様々な溶液（例えば、生理食塩水、スクロース、デキストロース、リジンデキストロース）を加える。
２．２００μＬのＲＢＣ膜（１．５ｍｇ  ／  ｍＬ）をチューブに加え、よく混合する。これにより、０．３ｍｇ／ｍＬ膜を伴うプロセス混合物が作成される。
３．プローブ超音波発生装置の電源を入れ、７０％エタノールでプローブを拭き、プローブのみをバイオフードに移動させる。
４．超音波破砕機の出力をレベル２に調整する（出力〜３Ｗ）。
５．プロセス温度を４℃未満に保つために、冷水のアイスボックスを準備する。
６．１０ｕＬのアデノウイルス貯蔵溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｂｉｏｌａｂｓ、Ｌｏｔ＃２０１７０９２２）をプロセス混合物に追加する。
７．チューブをアイスボックスに入れる。プローブをチューブに浸す。プローブが底に触れないようにする。
８．１秒の超音波処理および各超音波処理の間隔を１秒にして、混合物を手動で超音波処理する。このステップを４分間維持して、様々なバッチを作製する。
９．調製したバッチの確認および比較のために、ベンダーの手順（Ｖｉｒｕｓｙｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡＫ２９０−２）に従って、サンドイッチＥＬＩＳＡデータを取得する。
【００５４】
米国２０１３／０３３  ７０６６に記載されている既知の手順に基づいて、生理食塩水またはＰＢＳはナノ粒子を調製するために使用されるべきである。しかしながら、図２に明確に示されるように、ＥＬＩＳＡアッセイは、被覆されていないウイルス（コントロール）と比較してほぼ同じ吸光度を示したため、生理食塩水バッチは、カプセル化された（または被覆された）ナノ粒子の非常に悪い結果をもたらした。一方で、予想外かつ驚くべきことに、糖含有溶液バッチ（例えば、スクロース、デキストロース、およびリジンデキストロース）のような無塩溶液バッチは、はるかに低い吸光度を示し、ウイルスコア上のＲＢＣ膜のより良い被覆を示している。
【００５５】
実施例５：例示的な条件下での腫瘍溶解性ウイルスを伴うＲＢＣ膜の被覆：
ウイルス貯蔵溶液とＲＢＣ膜の混合物に無塩溶液を使用して予想外に見つかった結果を確認するため、ウイルスコアを含むナノ粒子を調製するために以下に示す例示的な本発明の手順が使用された。
【００５６】
装置、材料は、ＲＢＣ膜とウイルス貯蔵溶液の混合に１１％のスクロース溶液を使用したことを除いて、実施例２のものと同様である。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
【表４】
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【００５９】
手順：
１．１．５ｍＬ微量遠心チューブに８００ｕＬの１１％スクロース溶液を加える。
２．２００μＬのＲＢＣ膜（１．５ｍｇ／ｍＬ）をチューブに加え、よく混合する。これにより、０．３ｍｇ／ｍＬ膜を伴うプロセス混合物ができる。
３．プローブ超音波発生装置の電源を入れ、７０％エタノールでプローブを拭き、プローブのみをバイオフードに移動させる。
４．超音波破砕機の出力をレベル２に調整する（出力〜３Ｗ）。
５．プロセス温度を４℃未満に保つために、冷水のアイスボックスを準備する。
６．２．５μＬの例示的な腫瘍溶解性ウイルス（例えば、アデノウイルス貯蔵溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｂｉｏｌａｂｓ、Ｌｏｔ＃２０１７０７２１．２））を処理混合物に加え、混合物の約９％のスクロース溶液を結果としてもたらす。５％から１５％の糖溶液が同様の条件で機能することが当業者によって予想される。
７．チューブをアイスボックスに入れる。プローブをチューブに浸す。プローブが底に触れないようにする。
８．１秒の超音波処理および各超音波処理の間隔を１秒にして、混合物を手動で超音波処理する。このステップを４分間維持して、ウイルスのコアを含むナノ粒子を調製する。
９．裸のウイルスの場合には、手順１〜９に従うが、２．で溶液を分子グレード水に変更する。
【００６０】
結果的に得た被覆されたナノ粒子は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で画像化された。図３は、裸のウイルスとＲＢＣ膜被覆ウイルスとの間の画像比較を示す。粒子サイズの比較を図４に示し、これは被覆層が約１０ｎｍであることを示唆している。ＴＥＭ画像は、ナノ粒子のサイズが１１０ｎｍから１２０ｎｍ（約１１８ｎｍ）の範囲にあることを示している。
【００６１】
図５は、ＲＢＣ膜被覆ウイルスは検出抗体から保護され、一方で裸のウイルスは明確に示され；吸光度差が非常に十分であり、ＲＢＣ膜被覆の結果が非常に良好であることを示している。次に、被覆されたナノ粒子はＲＢＣ膜を除去するプロセスを経て、その後、同じＥＬＩＳＡ試験を受けて被覆結果をさらに確認した。
【００６２】
被覆除去のために、ＥＬＩＳＡプロセスの前に、２００ｕＬの被覆ウイルスと５０ｕＬのサンプル調製バッファー（Ｖｉｒｕｓｙｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、界面活性剤を含む）を混合する。図６は、ＲＢＣ膜の除去後にウイルスが再び検出されたことを示しており、先の被覆ウイルスを確認している。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されてきたが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多くのバリエーション、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者の心に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月25日(2020.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを含む内部コア；および、細胞に由来する細胞膜を含む外部表面を含む、ナノ粒子。
【請求項２】
前記ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記腫瘍溶解性ウイルスがヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記細胞が、血球、脂肪細胞、幹細胞、内皮細胞、エキソソーム、分泌小胞、またはシナプス小胞である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項６】
ナノ粒子を作製するプロセスであって、該プロセスは、ウイルスを含む内部コアおよび細胞に由来する細胞膜を含む外部表面を無塩水溶液中で混合する工程と、前記外部表面で被覆した前記内部コアを含むナノ粒子を形成するために混合物の溶液に超音波処理を適用する工程とを含む、プロセス。
【請求項７】
前記無塩水溶液は、水溶液中にて、砂糖、または砂糖の類似する性質を備えた成分を含む、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記無塩水溶液は糖溶液である、請求項６に記載のプロセス。
【請求項９】
前記糖溶液はスクロース、またはデキストロースを含む溶液である、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスである、請求項６に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記腫瘍溶解性ウイルスはヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、パルボウイルス、またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記ウイルスはアデノウイルスである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記細胞は、血球、脂肪細胞、幹細胞、内皮細胞、エキソソーム、分泌小胞またはシナプス小胞である、請求項６に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記血球は赤血球、白血球、または血小板である、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記血球は赤血球である、請求項１４に記載のプロセス。
【国際調査報告】
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