(57)【要約】  磁気抵抗（ＭＲ）センサアレイのための改善された温度測定と補正手段を提供する。温度に対する線形抵抗係数をアレイ内の１つ以上の基準センサから既知の温度で基準センサの抵抗を測定することにより決定し、これにより抵抗測定値を使用して、アレイのすべてのセンサの未知の温度を決定することが可能となる。二重変調は、センタートーンを有するＭＲセンサ出力をもたらし、このセンタートーンをサイドトーンＭＲ信号の温度依存性を補正するために使用できる。この補正は、線形近似または多項式近似によって行うことができる。用途としては、ＤＮＡ融解曲線の正確な決定など、正確な温度データを必要とする生物学的アッセイなどが挙げられる。【選択図】図１
2020519249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気抵抗センサのアレイの温度測定のための方法であって、
磁気抵抗センサのアレイを提供するステップであって、前記磁気抵抗センサのアレイは、少なくとも１つの基準磁気抵抗センサを含み、Ｒ０を、基準温度Ｔ０でのゼロ電界抵抗、Ｔを温度、αを前記磁気抵抗センサの材料パラメータとしたとき、前記磁気抵抗センサのゼロ磁場抵抗率Ｒは、Ｒ＝Ｒ０（１＋α（Ｔ−Ｔ０））である、該ステップと、
２つ以上の既知の温度で少なくとも１つの基準磁気抵抗センサのゼロ磁場抵抗率を測定し、αを決定するステップと、
前記磁気抵抗センサのアレイの１つ以上の磁気抵抗センサのゼロ磁場抵抗を測定して、測定されたＲと既知のαから前記１つ以上の磁気抵抗センサのそれぞれの対応する温度Ｔを決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
２つ以上の基準磁気抵抗センサが存在し、前記αを決定するステップが、前記２つ以上の基準磁気抵抗センサのα値を平均するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記磁気抵抗センサのアレイを、変調周波数ｆｈを有するティックリング（tickling）磁場に配置するステップと、
変調周波数ｆｖを有する前記磁気抵抗センサのアレイに電気励起を提供するステップであって、ｆｈとｆｖとは異なり、前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサの出力スペクトルには、周波数ｆｖのキャリアトーン（ＣＴ）と周波数ｆｖ±ｆｈのサイドトーン（ＳＴ）とが含まれ、前記キャリアトーンはＣＴ振幅を有し、前記サイドトーンはＳＴ振幅を有する、該ステップと、
前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサについて、前記出力スペクトルの前記ＣＴ振幅および前記ＳＴ振幅のベースライン関係を個別に求めるステップと、
前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサについて、サンプルが存在するときに対応するＣＴ振幅およびＳＴ振幅を個別に測定して、入力ＣＴ測定値および入力ＳＴ測定値を提供するステップと、
前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサについて、対応する前記ベースライン関係と対応する前記入力ＣＴ測定値を使用して前記入力ＳＴ測定値を個別に補正して、対応する補正されたＳＴ測定値を提供するステップと、
前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサについて、前記補正されたＳＴ測定値を個別に出力として提供するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
前記ＣＴ振幅および前記ＳＴ振幅のベースライン関係を個別に求めるステップが、
前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサのＳＴ対ＣＴデータを収集した後、前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサについてベースラインＳＴ振幅のベースラインＣＴ振幅に対する曲線近似の関係を求めるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記磁気抵抗センサのアレイ内の１つ以上の磁気抵抗センサについて、前記曲線近似は線形近似であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、
前記磁気抵抗センサのアレイ内の１つ以上の磁気抵抗センサについて、前記曲線近似は多項式近似であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記サンプルは、磁性ナノ粒子で標識された分析物を含み、
１つ以上の磁気抵抗センサは、前記分析物に対応する捕獲試薬を有し、前記対応する捕獲試薬は、前記１つ以上の磁気抵抗センサの上に配置され、前記分析物を対応する捕獲試薬と結合させ、固定化させることによって、磁気抵抗アッセイを提供することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記磁気抵抗アッセイのアッセイシグナルを前記対応する磁気抵抗センサ温度Ｔと組み合わせて、各磁気抵抗センサの正確なアッセイ曲線を個別に提供するステップを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記アッセイシグナルはＤＮＡ変性シグナルであり、前記アッセイ曲線はＤＮＡ融解曲線であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の方法であって、
前記サンプルは、磁性ナノ粒子で標識された分析物を含み、
１つ以上の磁気抵抗センサは、前記分析物に対応する捕獲試薬を有し、前記分析物に対応する捕獲試薬は前記１つ以上の磁気抵抗センサの上に配置され、前記分析物を対応する捕獲試薬と結合させ、固定化させることによって、磁気抵抗アッセイを提供することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記磁気抵抗アッセイのアッセイシグナルを前記対応する磁気抵抗センサ温度Ｔと組み合わせて、各磁気抵抗センサの正確なアッセイ曲線を個別に提供するステップを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記アッセイシグナルはＤＮＡ変性シグナルであり、前記アッセイ曲線はＤＮＡ融解曲線であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気抵抗（ＭＲ）バイオセンシング用の改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的相互作用の温度依存特性（例：ＤＮＡ融解温度、親和性、結合力、吸着および脱着速度など）を正確に測定するには、反応条件を正確に知っていることが必要である。ＧＭＲ（巨大磁気抵抗）バイオセンサアレイの特定のケースでは、チップ領域全体で温度が均一であるという動作に関する仮定は、室温で熱平衡にあるシステムでしか当てはまらない。他のすべての状況では、チップ固有の形状と温度制御方法の詳細に応じて、チップ表面全体に温度勾配が生じる。従って、磁気抵抗センサアレイの温度測定および／または較正を行うための改善された方法を提供することは、当技術分野における進歩であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明の例示的実施形態によれば、ＧＭＲバイオセンサチップには、約４００μｍのピッチで正方形のアレイに分布した８０を超えるＧＭＲ抵抗器が含まれる。ＧＭＲ材料の抵抗率は、動作範囲０〜１００°Ｃでは温度に線形に依存する。アレイ上の各センサの抵抗を測定することにより、チップ全体の温度勾配を特性化し、後続のデータ分析でそれを補正することができる。
【０００４】
本出願人は、磁性ナノ粒子結合イベント（バイオセンシング）と温度による抵抗率の変動の同期をとった測定を可能にする二重変調センシングプロトコルにより、各センサの温度を測定する方法を提供する。この方法は各センサに個別に適用できるため、チップ全体の温度を２次元で定量化できる。更に、磁性ナノ粒子の検出に影響を与える磁場に対するセンサの感度の温度依存性を補正する方法について説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、本発明の実施形態を示す図である。
【図２】図２は、二重変調検出システムの理想的な出力信号を示す図である。
【図３】図３は、例示的な磁気抵抗センサアレイからの測定された温度を示す表である。
【図４】図４は、チップ上のいくつかのＭＲセンサについて測定されたΔＳＴ／ＳＴ０対ΔＣＴ／ＣＴ０曲線を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、チップ上のいくつかのＭＲセンサの０．０５℃／秒での温度上昇中のＤＮＡシグナル対時間を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、融解するチップ上の最初のセンサ（５行、６列）を基準にした、アレイ内の各センサの融解の遅延を分単位で示す表である。
【図６Ａ】図６Ａは、温度較正後の２〜４行のセンサの融解曲線を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、温度較正後に各センサで測定された融解温度の表である。
【図７】図７は、本発明の実施形態に関連する実施に適したアッセイの流れ図である。
【図８】図８は、図７のアッセイを実施するための例示的な装置を示す図である。
【図９】図９は、ＡおよびＢからなり、図７のアッセイに関する詳細を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（Ａ）例示的なハードウェア構成
【０００７】
図１は、本発明の実施形態で動作する例示的な磁気抵抗センサアレイを示す図である。この実施形態では、磁気抵抗センサのアレイ１０２が基板１００上に配置され、基板１００は温度制御部材１０４上に配置されている。図１の平面図では、温度制御部材１０４は、基板１００の裏側と接触しており、従って上面図では見えないため、点線で示されている。図１に示すように、通常、アレイ１０２の磁気抵抗センサのいくつかが、他の磁気抵抗センサよりも温度制御部材１０４との熱接触が良好になるように配置される場合が多い。説明の便宜上、これらの１つ以上のＭＲセンサを基準ＭＲセンサと称する。図１において基準ＭＲセンサは、網掛けで示されている。簡単に説明すると、本発明の基本的なアイデアは、１つ以上の基準センサを使用して、２つ以上の既知の温度Ｔでの抵抗率Ｒを測定することにより、ゼロ磁場抵抗の線形温度係数αを決定する（図１の１０６）、というものである。αがわかれば、アレイ内のセンサの抵抗から温度を決定できる（図１の１０８）。この温度測定方法の詳細を説明する前に、説明の便宜上、最初に二重変調検出の影響について考慮する。
【０００８】
（Ｂ）二重変調センシング
【０００９】
ＧＭＲセンサは、周波数ｆｖの電圧Ｖのバイアスが印加されている。外部磁場Ｈは周波数ｆｈで印加される。出力信号（即ち、センサ内の電流）は、図２に示されるように、理想的には４つの主要信号成分を有する。即ち周波数ｆｖのセンタートーン（ＣＴ）成分、ｆｖ±ｆｈの２つの同一のサイドトーン（ＳＴ）成分、およびｆｈの磁場によって誘導される磁気ピックアップノイズ成分の４つである。ｆｖ＞＞ｆｈを使用すると、ｆｈのノイズおよび１／ｆのノイズから信号を分離できる。ＣＴおよびＳＴ成分は、スペクトル分析によって検出される。これらの成分は次のとおりである。
2020519249.tif 000003
2020519249.tif 000004
式中、Ｖはバイアス電圧、Ｒ０はセンサのゼロ磁場抵抗、ΔＲ０は磁場Ｈが印加されたときの抵抗の変化である。磁気抵抗センサの性能指数は、ＭＲ＝ΔＲ０／Ｒ０として定義される磁気抵抗比である。二重変調センシングでは、適切な性能指数はＭＲ＝４ＳＴ／ＣＴとなる。磁気抵抗比は、センサ表面またはその近傍の磁性ナノ粒子の存在により影響を受けるので、バイオセンシングが可能となる。
【００１０】
（Ｃ）温度測定
【００１１】
ＧＭＲセンサの抵抗率は温度に依存するため、二重変調方式では次のようになる。
2020519249.tif 000005
2020519249.tif 000006
式中、αは、ＧＭＲ材料に依存する熱係数であるが、チップ全体で一定と見なすことができる。係数αは、温度調整システムとの熱接触が良好な１つ以上の基準センサの抵抗を、２つの既知の温度で測定することで取得できる。複数のセンサを使用する場合、個々のα値を平均化できる。
【００１２】
熱係数αがわかれば、チップ上の各センサの温度を測定できる。より明確には、磁気抵抗センサのアレイの温度測定方法は、次のステップ、即ち
（１）磁気抵抗センサのアレイを提供するステップであって、前記磁気抵抗センサのアレイは、少なくとも１つの基準磁気抵抗センサを含み、
（２）Ｒ０を、基準温度Ｔ０でのゼロ電界抵抗、Ｔを温度、αを前記磁気抵抗センサの材料パラメータとしたとき、前記磁気抵抗センサのゼロ磁場抵抗率Ｒは、Ｒ＝Ｒ０（１＋α（Ｔ−Ｔ０））である、該ステップと、
（３）２つ以上の既知の温度で少なくとも１つの基準磁気抵抗センサのゼロ磁場抵抗率を測定し、αを決定するステップと、
（４）磁気抵抗センサのアレイの１つ以上の磁気抵抗センサのゼロ磁場抵抗を測定して、測定されたＲと既知のαから前記１つ以上の磁気抵抗センサのそれぞれの対応する温度Ｔを決定するステップとを含む。
【００１３】
複数の基準磁気抵抗センサを使用する場合、２つ以上の基準磁気抵抗センサーのα値を平均することにより、αを決定できる。αがわかれば、αを求めるための基準センサとして使用されたか否かにかかわらず、アレイ内のセンサのゼロ磁場抵抗から温度を決定できる。
【００１４】
本発明の一実施形態で使用される温度制御カートリッジは、図１と同様の構成を有していた。カートリッジは、ＧＭＲチップダイの裏側（即ち、基板１００）が温度制御カートリッジ（即ち、温度制御部材１０４）と熱接触するように組み立てられた。本実施例での接触領域は直径１〜２ｍｍの円形であった。接触面積が限られているため、チップ表面に温度勾配が生じる。図３は、上述の方法により決定される、この実施例のチップ全体の温度分布を示す。温度は、チップの中心から端までの間で約１．５℃異なる。本明細書で説明する手順により、各センサの正確な温度測定と、ＧＭＲチップ全体の温度勾配の補正が可能になる。
【００１５】
（Ｄ）二重変調のための温度補正
【００１６】
ＧＭＲセンサの抵抗率と磁気抵抗の両方が温度に依存するため、サイドトーン（ＳＴ）も温度に依存する。これは通常、小さな温度変動に対して線形であると想定される。従って、
2020519249.tif 000007
2020519249.tif 000008
ＣＴおよびＳＴを初期値によって正規化し、
2020519249.tif 000009
2020519249.tif 000010
とする。ここから、
2020519249.tif 000011
を得た。従って、以下のように、ＣＴを内部温度測定値として用いてＳＴの温度依存性を特性化し、補正できる。
2020519249.tif 000012
2020519249.tif 000013
式中、図４に示すように係数Ｋはチップ全体で変化する。Ｋの１０％以上の変化を観察された。従って、ＳＴからＣＴへの較正は、個々のセンサごとに実行する必要がある。
【００１７】
温度変動が±１０℃の小さな温度変動の場合、ΔＳＴ／ＳＴ０対ΔＣＴ／ＣＴ０は線形と見なすことができるため、ＳＴを補正するには上記の方法で十分である。温度変動の温度範囲が大きい場合、ΔＳＴ／ＳＴ０対ΔＣＴ／ＣＴ０の関係は非線形であることがわかった。ＳＴの温度依存性を完全に補正するには、曲線を高次多項式（Ｐｎ）に近似させる必要がある。
2020519249.tif 000014
温度の影響による変化の正確な補正が必要な用途は、３次以上の多項式を使用する必要がある。ある特定の場合では、５次の多項式が最適なモデルとして特定された。
【００１８】
これらの原理によれば、上記の温度補正方法は、二重変調を更に含むことができ、次のステップ、即ち
（１）前記磁気抵抗センサのアレイを、変調周波数ｆｈを有するティックリング（tickling）磁場に配置するステップと、
（２）変調周波数ｆｖを有する前記磁気抵抗センサのアレイに電気励起を提供するステップであって、ｆｈとｆｖとは異なり、前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサの出力スペクトルには、周波数ｆｖのキャリアトーン（ＣＴ）と周波数ｆｖ±ｆｈのサイドトーン（ＳＴ）とが含まれ、前記キャリアトーンはＣＴ振幅を有し、前記サイドトーンはＳＴ振幅を有する、該ステップと、
（３）前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサについて、前記出力スペクトルの前記ＣＴ振幅および前記ＳＴ振幅のベースライン関係を個別に求めるステップと、
（４）前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサについて、サンプルが存在するときに対応するＣＴ振幅およびＳＴ振幅を個別に測定して、入力ＣＴ測定値および入力ＳＴ測定値を提供するステップと、
（５）前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサについて、対応する前記ベースライン関係と対応する前記入力ＣＴ測定値を使用して前記入力ＳＴ測定値を個別に補正して、対応する補正されたＳＴ測定値を提供するステップと、
（６）前記磁気抵抗センサのアレイ内の各磁気抵抗センサについて、前記補正されたＳＴ測定値を個別に出力として提供するステップとを含む。
【００１９】
前記ＣＴ振幅および前記ＳＴ振幅のベースライン関係は、前記アレイ内の各磁気抵抗センサのＳＴ対ＣＴデータを収集し、そのＳＴ対ＣＴデータに対する曲線近似を求めることによって、個別に求めることができる。得られる結果は、前記アレイ内の各センサに個別に対応する曲線近似である。上記のように、これらの曲線近似は、線形近似および／または高次の多項式曲線近似である。
【００２０】
（Ｅ）生物学的アッセイへの応用
【００２１】
生物学的アッセイは、本方法の重要な用途である。ここでは、温度に敏感な生物学的アッセイの例として、ＤＮＡ融解曲線測定を検討する。この実施例では、磁気標識された一本鎖ＤＮＡ標的を、表面に繋がれた一本鎖ＤＮＡプローブにハイブリダイズする。結合後、温度を上げて、温度を上昇時の融解曲線を測定する。
【００２２】
図５Ａは、そのような融解の時系列を示している。シグモイド近似を曲線に適用して、各センサの融解時間を計算した。相対的な時間遅延の結果は、図５Ｂの表に示されている。図５Ｂの中央のセンサは比較的高温となり、従ってＤＮＡハイブリッドをより早く融解する。０．７分の融解時間の差は２．１℃の温度差に対応し、この温度差は考慮しなければならない。
【００２３】
図６Ａおよび図６Ｂに示すように、上記の各センサで測定された温度を使用することで、この補正を提供できる。図６Ａでは、この温度補正と較正の後、測定された融解曲線は互いに類似している。図６Ｂは、シグモイド近似よって得られた融解温度を示す。例１〜５ｍの測定融解温度は１℃未満である。この特定の場合では、他の列は配線とエポキシ樹脂ポッティングの影響を受ける。
【００２４】
これらの原理によれば、上記の温度補正および二重変調の方法は、下記のような生物学的アッセイを含むことができる。即ち、前記生物学的アッセイにおいて、サンプルには、磁性ナノ粒子で標識された分析物が含まれ、１つ以上の磁気抵抗センサには、前記分析物に対応する捕獲試薬が配置されており、そのため分析物と対応する捕獲試薬との結合および固定化により、磁気抵抗アッセイを実施できる。
【００２５】
より具体的には、このアプローチによる例示的なアッセイは、相補的なＤＮＡ鎖である分析物および捕獲種が用いられ、以下のステップ、即ち
（１）メチル化および非メチル化部位を含むＤＮＡ鎖の重亜硫酸変換を実行して、ミスマッチ塩基対を有する変換ＤＮＡ鎖を作成するステップと、
（２）前記変換ＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅を実行するステップと、
（３）ＰＣＲ増幅された前記変換ＤＮＡ鎖の中の一本鎖標的ＤＮＡ鎖を磁気標識するステップと、
（４）磁気標識された前記一本鎖標的ＤＮＡ鎖と、磁気標識（ＭＲ）センサアレイに固定化された相補的ＤＮＡ鎖とをハイブリダイズするステップと、
（５）磁気抵抗（ＭＲ）センサアレイに固定された相補的ＤＮＡ鎖から磁気標識された前記一本鎖標的ＤＮＡ鎖が変性されるストリンジェンシー条件を高くしてゆくステップと、
（６）前記ストリンジェンシー条件を高くしている間にリアルタイムで、変性された磁気標識された前記一本鎖標的ＤＮＡ鎖から生じる変性シグナルを読み出すステップと、
（７）変性シグナルからメチル化および非メチル化ＤＮＡ鎖のストリンジェンシー条件を決定するステップとを含む。
【００２６】
このアプローチでは、図６Ａおよび図６Ｂに示す実施例のように、変性シグナルを対応する磁気抵抗センサ温度Ｔと組み合わせて、各磁気抵抗センサの正確なＤＮＡ融解曲線を個別に提供できる。
【００２７】
（Ｅ１）生物学的アッセイへの応用の詳細
【００２８】
図７は、ＤＮＡ鎖のメチル化密度の定量的説明を提供するメチル化検出の方法の概要を示す流れ図である。ステップ７００では、メチル化および非メチル化部位を含むＤＮＡ鎖の重亜硫酸変換を実行して、ミスマッチ塩基対を有する変換ＤＮＡ鎖を作成する。ステップ７０２では、ミスマッチ塩基対を有する変換ＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅を実行する。ステップ７０４では、ＰＣＲ増幅された変換ＤＮＡ鎖の中の一本鎖標的ＤＮＡ鎖を磁気標識する。ステップ７０６では、磁気標識された一本鎖標的ＤＮＡ鎖と、磁気標識（ＭＲ）センサアレイに固定された相補的ＤＮＡ鎖とをハイブリダイズすする。一部の実施形態では、ハイブリダイズの間にリアルタイムで結合シグナルを読み出す。
【００２９】
ステップ７０８では、磁気抵抗（ＭＲ）センサアレイに固定された相補的ＤＮＡ鎖から磁気標識された一本鎖標的ＤＮＡ鎖が変性されるストリンジェンシー条件を高くする。ステップ７１０では、ストリンジェンシー条件を高くしている間にリアルタイムで、変性された磁気標識一本鎖標的ＤＮＡ鎖から生じる変性シグナルを読み出す。ステップ７１２では、変性シグナルからメチル化および非メチル化ＤＮＡ鎖のストリンジェンシー条件を決定する。
【００３０】
ストリンジェンシー条件は温度であってもよく、その場合、ストリンジェンシー条件を高くすることは、塩濃度が一定に保たれている間に温度を上げることを含む。この場合のメチル化および非メチル化ＤＮＡ鎖のストリンジェンシー条件の決定には、メチル化および非メチル化ＤＮＡ鎖の融解温度の決定が含まれる。あるいは、ストリンジェンシー条件は塩濃度であってもよく、その場合、ストリンジェンシー条件を高めることは、温度を一定に保ちながら塩濃度を低下させることを含む。この場合のメチル化および非メチル化ＤＮＡ鎖のストリンジェンシー条件の決定には、メチル化および非メチル化ＤＮＡ鎖の融解塩濃度の決定が含まれる。
【００３１】
一部の実施形態において、この方法は、メチル化部位と同時に突然変異部位を決定するために使用され得る。この場合、メチル化および非メチル化部位を含むＤＮＡ鎖の重亜硫酸変換の実行には、メチル化および非メチル化部位および野生型遺伝子および変異遺伝子を含むＤＮＡ鎖の重亜硫酸変換の実行が含まれる。更に、この場合には、変性シグナルからのメチル化および非メチル化ＤＮＡ鎖のストリンジェンシー条件の決定には、変性シグナルからの、メチル化および非メチル化ＤＮＡ鎖および野生型遺伝子および変異型遺伝子のストリンジェンシー条件の決定が含まれる。
【００３２】
図８は、ＧＭＲバイオセンサ装置８００を使用して磁気標識されたＤＮＡを検出するためのプロトコル８０２の概略図である。逆鎖の変性と標識化の後、ＰＣＲ産物をチップ８０４の反応ウェルに注入する。ハイブリダイゼーションステップ８１２では、ＭＮＰ（磁性ナノ粒子）８０６で標識されたＤＮＡを、３７℃で１時間、相補的な表面結合プローブとハイブリダイズし、ＭＮＰ８０８で標識されたハイブリダイズしたＤＮＡを作り出す。未結合のサンプルは洗浄により除去する。融解ステップ８１４において、温度を２０℃から６５℃まで連続的に変化させて、プローブ８１０からのＤＮＡの変性を引き起こし、融解温度Ｔｍを測定する。
【００３３】
ＤＮＡ変異を検出するために、非差別的プライマーを使用して目的のゲノム領域をＰＣＲ増幅した。次に、ビオチン化プライマーとストレプトアビジン被覆した磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）を使用して、ＰＣＲ産物を磁気標識した。磁気カラム分離と二本鎖ＰＣＲ産物の変性後、ＭＮＰに結合したｓｓＤＮＡ（ＭＮＰ−ｓｓＤＮＡ）をＧＭＲバイオセンサのアレイに導入し、複数のＤＮＡプローブを各センサの表面に別々に繋げた。導入されたＭＮＰ−ｓｓＤＮＡを表面に繋がれた相補的プローブにハイブリダイズすると、ＧＭＲバイオセンサは、結合したＭＮＰに比例するセンサー磁気抵抗比（ΔＭＲ）の変化を生じた。
突然変異の遺伝子型を決定するために、サンプルの野生型（ＷＴ）および突然変異型（ＭＴ）配列に相補的な２つのプローブのセットを使用した。低ストリンジェンシーでのハイブリダイズの実施中には、アンプリコンは類似の親和性でＷＴおよびＭＴプローブの両方にハイブリダイズした。単一の塩基特異性を得るには、通常は、ＤＮＡマイクロアレイでハイブリダイズさせた後にストリンジェントな洗浄を利用する。一塩基変異を検出するためのより柔軟なシステムを実現するために、本発明者らは、温度を上げ、ＧＭＲバイオセンサアレイ上のすべてのプローブのＤＮＡ融解を連続的に同時に測定することにより、ハイブリッドにチャレンジした。
【００３４】
図９（図９Ａおよび図９Ｂ）は、重亜硫酸変換プロセスの概略図である。重亜硫酸塩処理９０２、９１２では、ＤＮＡ９１０の非メチル化シトシンはＤＮＡ９１４のウラシルに変換され（図９Ｂ）、ＤＮＡ９００の５−メチルシトシンはＤＮＡ９０４に保持される（図９Ａ）。生成物９０８、９１８を生成する後続のＰＣＲ９０６、９１６では、９１４のウラシルはチミンで置換される。従って、メチル化シトシンはアンプリコンの単一塩基変化（Ｃ＞Ｔ）にマップされる。
【図１】
2020519249.tif 000015
【図２】
2020519249.tif 000016
【図３】
2020519249.tif 000017
【図４】
2020519249.tif 000018
【図５Ａ】
2020519249.tif 000019
【図５Ｂ】
2020519249.tif 000020
【図６Ａ】
2020519249.tif 000021
【図６Ｂ】
2020519249.tif 000022
【図７】
2020519249.tif 000023
【図８】
2020519249.tif 000024
【図９】
2020519249.tif 000025
【国際調査報告】
2020519249.tif 000026