(57)【要約】  構造修飾されたＤＮＡコード化抗体（ＤＭＡｂ）を含む組成物、ＤＭＡｂの構造修飾方法、および構造修飾されたＤＭＡｂの使用方法が、本明細書に開示される。【選択図】図１Ａ
2020519285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造修飾されたＤＮＡコード化抗体（ＤＭＡｂ）をコードする核酸配列を生成する方法であって、
ａ）第１のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域を同定するステップと、
ｂ）第２のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域を同定するステップと、
ｃ）前記第２のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を前記第１のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域のアミノ酸配列で置換して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、
ｄ）構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記核酸配列を最適化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成する方法であって、
ａ）第１のＤＭＡｂのアミノ酸配列またはアミノ酸配列の断片と、１つ以上の追加のＤＭＡｂ配列に由来するアミノ酸配列またはアミノ酸配列の断片との配列アラインメントを行うステップと、
ｂ）ＣＤＲ領域中の残基ではない、前記第１のＤＭＡｂのアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を、１つ以上の追加のＤＭＡｂ配列のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基で置換して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、
ｄ）構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成するステップと、を含む、方法。
【請求項４】
前記核酸配列を最適化することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成する方法であって、
ａ）可変重鎖および可変軽鎖ドメインの界面での相互作用に関与することが予測されるＤＭＡｂのアミノ酸残基を同定するステップと、
ｂ）前記界面での等電点および表面電荷のうちの少なくとも一方を改変することが予測される、前記同定されたアミノ酸残基の１つ以上のアミノ酸置換を作製して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、
ｄ）構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成するステップと、を含む、方法。
【請求項６】
前記核酸配列を最適化することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成する方法であって、
ａ）ＣＨおよびＣＬドメインのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列から除去するステップと、
ｂ）ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列間のリンカーのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列に付加して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、
ｃ）少なくとも１周回のモデリングを前記生成されたアミノ酸配列に行うステップと、
ｄ）構造修飾されたＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列を生成するステップと、を含む、方法。
【請求項８】
前記核酸配列を最適化することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記モデリングする方法が、リンカーモデリング、ヒンジ修飾モデリング、フレームワークモデリング、およびＣＤＲループ精密化のうちの少なくとも１つを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンカーが、前記ＶＨドメインにＣ末端連結し、前記ＶＬドメインにＮ末端連結する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記リンカーが、前記ＶＨドメインにＮ末端連結し、前記ＶＬドメインにＣ末端連結する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）ＣＨおよびＣＬドメインのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列から除去するステップと、
ｂ）ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列間のリンカーのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列に付加して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、
ｃ）少なくとも１周回のモデリングを前記生成されたアミノ酸配列に行うステップと、をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の方法のうちのいずれかの核酸分子によってコードされた、構造修飾されたＤＭＡｂ。
【請求項１４】
第１のＤＭＡｂに由来する１つ以上のＣＤＲ領域と、第２のＤＭＡｂに由来する１つ以上の定常領域と、を含む、構造修飾されたＤＭＡｂであって、前記構造修飾されたＤＭＡｂが、そのように修飾されていない対応するＤＭＡｂと比較して、より高いインビボ発現およびより高い結合のうちの少なくとも一方を呈する、構造修飾されたＤＭＡｂ。
【請求項１５】
前記構造修飾されたＤＭＡｂが、そのように修飾される前の前記構造修飾されたＤＭＡｂの特異性と比較して、少なくとも同じまたはより高い抗原結合特異性を呈する、請求項１４に記載の構造修飾されたＤＭＡｂ。
【請求項１６】
１つ以上のアミノ酸置換を含む構造修飾されたＤＭＡｂであって、前記構造修飾されたＤＭＡｂが、そのように修飾されていない対応するＤＭＡｂと比較して、より高いインビボ発現およびより高い結合のうちの少なくとも一方を呈する、構造修飾されたＤＭＡｂ。
【請求項１７】
ＣＨ１、ＣＨ２、ヒンジ、ＶＨ、リンカー、およびＶＬドメインを含む、構造修飾されたＤＭＡｂであって、前記構造修飾されたＤＭＡｂが、そのように修飾されていない対応するＤＭＡｂと比較して、より高いインビボ発現およびより高い結合のうちの少なくとも一方を呈する、構造修飾されたＤＭＡｂ。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、組成物。
【請求項１９】
少なくとも１つの構造修飾されたＤＭＡｂが、
ａ）アミノ酸配列であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、および配列番号１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、前記コードされた配列の全長にわたって、少なくとも９０％を有する、アミノ酸配列と、
ｂ）断片であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、および配列番号１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％を構成する断片と、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記核酸分子が、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列が、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１８に記載の少なくとも１つの組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害を有する対象を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月１０日出願の米国仮出願第６２／５０４，４４８号、２０１７年５月１０日出願の米国仮出願第６２／５０４，４６０号、２０１８年１月３１日出願の米国仮出願第６２／６２４，３２０号、および２０１８年１月３１日出願の米国仮出願第６２／６２４，３６７号に対する優先権を主張し、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、核酸抗体構築物を最適化する方法、および最適化された構造修飾された核酸抗体構築物に関する。本発明の組成物は、免疫応答を誘導するため、ならびに抗原に対して個体を予防的および／または治療的に免疫化するための改善された方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリン分子は、システイン残基間のジスルフィド結合（Ｓ−Ｓとして示される）によって共有結合している２つの軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖の各種類を含む。重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインは、抗体分子の結合部位に寄与する。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）と、（可動）ヒンジ領域とからなる。軽鎖も定常ドメイン（ＣＬ）を有する。重鎖および軽鎖の可変領域は、４つのフレームワーク領域（ＦＲ；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む。したがって、これらは、インビボで組み立てるのが困難な非常に複雑な遺伝子系である。
【０００４】
標的化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、過去２５年間で最も重要な医学的治療の進歩のうちの１つである。この種の免疫に基づく治療は、今では、多くの自己免疫疾患、癌治療、および感染疾患に対して日常的に使用されている。悪性腫瘍については、現在使用されている免疫グロブリン（Ｉｇ）に基づく治療の多くは、腫瘍に向けられた細胞傷害性化学療法レジメンと組み合わされる。この組み合わせ手法では、全生存が著しく改善している。非ホジキンリンパ腫の治療用のＣＤ２０を標的とするキメラｍＡｂであるＲｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、ならびにＣＴＬＡ−４を遮断し、黒色腫および他の悪性腫瘍の治療に使用されているヒトｍＡｂであるイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）を含む、多数のｍＡｂ調製物が特定の癌に対する使用に認可されている。加えて、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）は、ＶＥＧＦおよび腫瘍新血管形成を標的とし、大腸癌の治療に使用されている、別の卓越したヒト化ｍＡｂである。悪性腫瘍の治療のための最も注目されているｍＡｂは、患者のサブセットにおいて乳癌に対して多大な効果を有することが実証されているＨｅｒ２／ｎｅｕを標的とするヒト化調製物であるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）であろう。さらに、多くのｍＡｂが、自己免疫疾患および特定の血液障害の治療に使用されている。
【０００５】
癌治療に加えて、ポリクローナルＩｇの受動伝達により、ジフテリア、肝炎ＡおよびＢ、狂犬病、破傷風、水疱瘡、ならびに呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含む、いくつもの感染疾患に対する予防効果が媒介される。実際に、いくつかのポリクローナルＩｇ調製物により、予防的Ｉｇを有効なワクチン接種によって生成する時間が十分にない状況下で疾患流行地域に行く個体において、特定の病原体に対する一時的な保護が提供される。さらに、免疫不全の小児において、ＲＳＶ感染を標的とするｍＡｂであるパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ）は、ＲＳＶから臨床的に保護することが実証されている。
【０００６】
市場に存在する現在利用可能な治療用抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。これらの抗体は、大部分のオリゴ糖がコアフコシル化される抗体定常領域（Ｆｃ）に結合した２つのＮ連結した二分岐の複合体型オリゴ糖を保有する糖タンパク質を含む。これは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）のエフェクター機能を、Ｆｃと白血球受容体（ＦｃγＲｓ）または補体のいずれかとの相互作用によって実行する。治療用抗体の（インビトロに対して）低下したインビボ効果の事象が存在するため、多量、場合により数百ミリグラムの週間用量の治療用抗体が必要とされている。これは主に、血清ＩｇＧと治療用抗体とがナチュラルキラー（ＮＫ）細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａへの結合について競合することに起因する。内因性ヒト血清ＩｇＧは、治療用抗体によって誘導されたＡＤＣＣを阻害する。このため、ヒトにおけるフコシル化されていない治療用抗体の効果が増強され得る。フコシル化されていない治療用抗体は、フコシル化されたヒト血清ＩｇＧよりもかなり高いＦｃγＲＩＩＩａへの結合親和性を有しており、これは、ヒト血漿ＩｇＧによる干渉を打破するために好ましい特徴である。
【０００７】
抗体に基づく治療には、リスクがないわけではない。１つのそのようなリスクは抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）であり、これは、非中和抗ウイルスタンパク質によりウイルスの宿主細胞への進入が促進されて、細胞における感染性の増加が引き起こされるときに生じる。一部の細胞は、その表面に、ウイルスが進入に用いる通常の受容体を有しない。抗ウイルスタンパク質（即ち、抗体）は、これらの細胞のうちのいくつかが細胞膜中に有する抗体Ｆｃ受容体に結合する。ウイルスは、抗体のもう一方の端部で抗原結合部位に結合する。このウイルスは、この機序を使用してヒトマクロファージを感染させることで、通常であれば軽度のウイルス感染を致死的なものにし得る。ＡＤＥの最も広く知られている例は、デングウイルス（ＤＥＮＶ）に感染した状況で生じる。これは、ＤＥＮＶのある血清型に以前に感染したことのある人が何カ月または何年も後に異なる血清型に感染したときに観察される。そのような場合、疾患の臨床経過はより重篤であり、これらの人々は、ＡＤＥが生じていない人々と比較してより高いウイルス血症を有する。このことにより、一次（最初の）感染は小児において大抵は深刻でない疾患（ＤＦ）しか引き起こさない一方、二次感染（後日の再感染）は、小児および成人の両方において重篤な疾患（ＤＨＦおよび／またはＤＳＳ）とより関連付けられる傾向にあるという観察が説明される。抗原性の異なるＤＥＮＶの血清型は４つ（ＤＥＮＶ−１〜ＤＥＮＶ−４）ある。ＤＥＮＶによる感染は、感染性血清型に対する終生免疫を提供する中和同型免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の産生を誘導する。ＤＥＮＶによる感染はまた、他の３つの血清型に対するある程度の交差防御免疫を生じる。中和異型抗体の誘導に加えて、ＤＥＮＶによる感染は、ウイルスを部分的にしかまたは全く中和しない異型抗体も誘導し得る。そのような交差反応性であるが非中和性である抗体の産生が、より重篤な二次感染の理由であり得る。白血球の中に入ると、ウイルスは、検出されずに複製し、最終的に非常に高いウイルス力価を生み、これが重篤な疾患を引き起こす。
【０００８】
ｍＡｂ療法の臨床的影響は目覚ましい。しかしながら、この治療手法の使用および普及を制限する問題が残っている。これらのうちのいくつかには、特にこれらが大きな影響を有し得る発展途上国での、より広範な集団におけるその使用を制限し得るこれらの複雑な生物製剤の製造コストの高さが含まれる。例えば、エボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）を標的とするｍＡｂは、エボラウイルス疾患（ＥＶＤ）に対する重要な治療手法である。個々のｍＡｂおよびｍＡｂカクテルは、小型動物および非ヒト霊長類を致命的なエボラウイルス感染から首尾よく保護し得ることが示されている。ＥＶＤに対するｍＡｂに基づく治療は、抗ＧＰ  ｍＡｂカクテルであるＺＭａｐｐを受けた確認済みのヒトＥＶＤ症例における順調な回復によりさらに支持される。しかしながら、劇的なコスト、遅い開発、およびいくつかの高用量投与（ｍｇ／ｋｇ）に対する必要条件により、特に大流行の可能性があるときに、タンパク質ｍＡｂ送達に対して重大な課題が突き付けられる。
【０００９】
さらに、効果を達成し維持するためにｍＡｂの度重なる投与が頻繁に必要とされることは、ロジスティクスおよび患者コンプライアンスの観点から妨げになり得る。血清ＩｇＧとの競合に起因する治療用抗体のインビボ効果の低さを改善または排除する新たな抗体が必要とされている。ＥＶＤ、デング、ＨＩＶ、ＲＳＶ、および他のウイルスのようなウイルスにおける抗体依存性感染増強を排除し得る新たな抗体が必要とされている。二重特異性抗体、二機能性抗体、および抗体カクテルが、治療的または予防的であることが判明し得るいくつかの機能を行うために必要とされている。本明細書に記載の合成抗体を、ＤＮＡ系ワクチンを含むワクチンによる免疫化を介した宿主系の免疫刺激と共に利用し得る組み合わせ療法も必要とされている。加えて、これらの抗体製剤の長期安定性は、しばしば短く、最善とは言い難い。
【００１０】
よって、安全かつコスト効果的様式で対象に送達することができる最適化された合成抗体分子が、当該技術分野で依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＮＡコード化抗体（ＤＭＡｂ）をコードする核酸配列を生成する方法に関し、本方法は、第１のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域を同定するステップと、第２のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域を同定するステップと、第２のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を、第１のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域のアミノ酸配列で置換して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成するステップと、を含む。一実施形態では、本方法は、核酸配列を最適化することをさらに含む。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成する方法に関し、本方法は、第１のＤＭＡｂのアミノ酸配列またはアミノ酸配列の断片と、１つ以上の追加のＤＭＡｂ配列に由来するアミノ酸配列またはアミノ酸配列の断片との配列アラインメントを行うステップと、ＣＤＲ領域中の残基ではない、第１のＤＭＡｂのアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を、１つ以上の追加のＤＭＡｂ配列のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基で置換して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成するステップと、を含む。一実施形態では、本方法は、核酸配列を最適化することをさらに含む。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成する方法に関し、本方法は、可変重鎖および可変軽鎖ドメインの界面での相互作用に関与することが予測されるＤＭＡｂのアミノ酸残基を同定するステップと、界面での等電点および表面電荷のうちの少なくとも一方を改変することが予測される、同定されたアミノ酸残基の１つ以上のアミノ酸置換を作製して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成するステップと、を含む。一実施形態では、本方法は、核酸配列を最適化することをさらに含む。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成する方法に関し、本方法は、ＣＨおよびＣＬドメインのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列から除去するステップと、ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列間のリンカーのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列に付加して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、少なくとも１周回のモデリングを生成されたアミノ酸配列に行うステップと、構造修飾されたＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列を生成するステップと、を含む。一実施形態では、本方法は、核酸配列を最適化することをさらに含む。
【００１５】
一実施形態では、モデリング方法は、リンカーモデリング、ヒンジ修飾モデリング、フレームワークモデリング、およびＣＤＲループ精密化のうちの少なくとも１つを含む。
【００１６】
一実施形態では、リンカーは、ＶＨドメインにＣ末端連結し、ＶＬドメインにＮ末端連結する。一実施形態では、リンカーは、ＶＨドメインにＮ末端連結し、ＶＬドメインにＣ末端連結する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成する方法に関し、本方法は、第１のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域を同定するステップと、第２のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域を同定するステップと、第２のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を第１のＤＭＡｂの１つ以上のＣＤＲ領域のアミノ酸配列で置換して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、ＣＨおよびＣＬドメインのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列から除去するステップと、ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列間のリンカーのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列に付加して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、少なくとも１周回のモデリングを生成されたアミノ酸配列に行うステップと、構造修飾されたＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列を生成するステップと、を含む。一実施形態では、本方法は、核酸配列を最適化することをさらに含む。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成する方法に関し、本方法は、第１のＤＭＡｂのアミノ酸配列またはアミノ酸配列の断片と、１つ以上の追加のＤＭＡｂ配列に由来するアミノ酸配列またはアミノ酸配列の断片との配列アラインメントを行うステップと、ＣＤＲ領域中の残基ではない、第１のＤＭＡｂのアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を、１つ以上の追加のＤＭＡｂ配列のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基で置換して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、ＣＨおよびＣＬドメインのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列から除去するステップと、ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列間のリンカーのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列に付加して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、少なくとも１周回のモデリングを生成されたアミノ酸配列に行うステップと、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成するステップと、を含む。一実施形態では、本方法は、核酸配列を最適化することをさらに含む。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成する方法に関し、本方法は、可変重鎖および可変軽鎖ドメインの界面での相互作用に関与することが予測されるＤＭＡｂのアミノ酸残基を同定するステップと、界面での等電点および表面電荷のうちの少なくとも一方を改変することが予測される、同定されたアミノ酸残基の１つ以上のアミノ酸置換を作製して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、ＣＨおよびＣＬドメインのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列から除去するステップと、ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列間のリンカーのアミノ酸配列をＤＭＡｂのアミノ酸配列に付加して、構造修飾されたＤＭＡｂのアミノ酸配列を生成するステップと、少なくとも１周回のモデリングを生成されたアミノ酸配列に行うステップと、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を生成するステップと、を含む。一実施形態では、本方法は、核酸配列を最適化することをさらに含む。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、本発明の方法を使用して生成された核酸分子によってコードされた、構造修飾されたＤＭＡｂに関する。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、第１のＤＭＡｂに由来する１つ以上のＣＤＲ領域と、第２のＤＭＡｂに由来する１つ以上の定常領域と、を含む、構造修飾されたＤＭＡｂに関し、本構造修飾されたＤＭＡｂは、そのように修飾されていない対応するＤＭＡｂと比較して、より高いインビボ発現およびより高い結合のうちの少なくとも一方を呈する。
【００２２】
一実施形態では、本構造修飾されたＤＭＡｂは、そのように修飾される前の構造修飾されたＤＭＡｂの特異性と比較して、少なくとも同じまたはより高い抗原結合特異性を呈する。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換を含む構造修飾されたＤＭＡｂに関し、本構造修飾されたＤＭＡｂは、そのように修飾されていない対応するＤＭＡｂと比較して、より高いインビボ発現およびより高い結合のうちの少なくとも一方を呈する。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、ＣＨ１、ＣＨ２、ヒンジ、ＶＨ、リンカー、およびＶＬドメインを含む、構造修飾されたＤＭＡｂに関し、本構造修飾されたＤＭＡｂは、そのように修飾されていない対応するＤＭＡｂと比較して、より高いインビボ発現およびより高い結合のうちの少なくとも一方を呈する。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物に関する。一実施形態では、少なくとも１つの構造修飾されたＤＭＡｂは、ａ）アミノ酸配列であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、もしくは配列番号１１９のアミノ酸配列に対してコードされた配列の全長にわたって少なくとも９０％を有する、アミノ酸配列、またはｂ）断片であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、もしくは配列番号１１９のアミノ酸配列の少なくとも６０％を構成する断片、から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
一実施形態では、本核酸分子は、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、少なくとも２つのヌクレオチド配列の各々は、ａ）アミノ酸配列であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、もしくは配列番号１１９のアミノ酸配列に対してコードされた配列の全長にわたって少なくとも９０％を有する、アミノ酸配列、またはｂ）断片であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、もしくは配列番号１１９のアミノ酸配列の少なくとも６０％を構成する断片、から選択されるアミノ酸配列を含む、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする。
【００２７】
一実施形態では、本核酸分子は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、または配列番号１０６から選択されるアミノ酸配列を含む構造修飾されたＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列と、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む構造修飾されたＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列と、を含む。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害を有する対象を治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｄで構成され、生成され得る様々な構造修飾されたＤＭＡｂの例示的モデルを示す。図１Ａは、完全グラフトＤＭＡｂの図を示す。図１Ｂは、部分グラフトの図を示す。親ＤＭＡｂ（配列番号４７）と比較した、修飾されたＤＭＡｂ（配列番号４８）のＦＲ１およびＦＲ４領域におけるアミノ酸の多数の修飾が、モデリングしたＤＭＡｂの右側に示される。図１Ｃは、骨格修飾の図を示す。ＶＨ  ＶＬ界面に関与する残基の側鎖が示される。軽鎖（上）および重鎖（下）（それぞれ配列番号５０および配列番号５２）の骨格修飾が、修飾された残基をハイライトした状態で示される。親ＤＭＡｂ配列は配列番号４９および配列番号５１である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、完全および部分ＤＭＡｂフレームワークグラフトを示すタンパク質のリボン画像を示す。高発現ＤＭＡｂのＶＨ−ＶＬ（黄色／青色）が左上に示される。低発現ＤＭＡｂのＶＨ−ＶＬ（緑色／赤色）が右上に示される。左下の新たなＤＭＡｂ分子は、低発現に由来するＣＤＲを高発現のフレームワークにグラフトすることによって創出される。右下は、発現不良のＤＭＡｂのＶＬにおける最初の２２個のアミノ酸を、高発現からのアミノ酸で代置する部分グラフトによって創出された新たなＤＭＡｂである。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｂで構成され、ＢＤＢＶ２２３の完全グラフトおよび部分グラフトの効果を明示する例示的な実験結果を示す。図２Ａは、ＢＤＢＶ２２３抗体の発現ならびに完全グラフトおよび部分グラフトを明示する例示的な実験結果を示す。図２Ｂは、ＥＢＯＶ抗原のＢＤＢＶ２２３抗体への結合ならびに完全グラフトおよび部分グラフトを明示する例示的な実験結果を示す。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｂで構成され、Ｚ５Ｄ２の完全グラフトおよび部分グラフトならびに構造修飾の効果を明示する例示的な実験結果を示す。図３Ａは、Ｚ５Ｄ２抗体の発現ならびに完全グラフトおよび部分グラフトを明示する例示的な実験結果を示す。図３Ｂは、ＥＢＯＶ抗原のＺ５Ｄ２抗体への結合ならびに完全グラフトおよび部分グラフトを明示する例示的な実験結果を示す。
【図４】低発現ＤＭＡｂ（配列番号５４〜配列番号５７）に由来する多数の軽鎖の、２つの確認済みの高発現ＤＭＡｂ（配列番号５８〜配列番号５９）に由来する軽鎖とのアラインメントを示す。
【図５】完全なＶＬ、ＣＤＲ領域を除外するＶＬ、ＦＲ１、および図５の各親軽鎖についてのＦＲ４を、確認済みの高発現ＤＭＡｂの各々と比較する同一性マトリックスを示す。
【図６】全長ＩｇＧ  ＤＭＡｂとｓｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＩｇＧ  ＤＭＡｂとの間の構造的差異を示す図を描出する。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｃで構成され、ｓｃＦｖ−ＦｃリンカーがＣＤＲに干渉しないことを明示するタンパク質モデリング画像を示す。図７Ａは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の予測される折畳みのスティックアンドリボン図を示す。ＶＬ（赤色）、ＶＬ  ＣＤＲ（ピンク色）、ＶＨ（緑色）、ＶＨ  ＣＤＲ（紫色）、およびリンカー（ＣＰＫ）が示される。
【図７Ｂ】図７Ｂおよび図７Ｃは、ＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂの空間充填モデルの２つの回転図を示す。
【図７Ｃ】図７Ｂおよび図７Ｃは、ＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂの空間充填モデルの２つの回転図を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜図８Ｄで構成され、ＤＭＡｂ  ＢＤＢＶ２２３のｓｃＦｖ−Ｆｃ変換の効果を明示する例示的な実験結果を示す。図８Ａは、親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの発現レベルを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの血清発現レベルを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの、１９７６エボラウイルス発生株に由来する糖タンパク質抗原への抗原結合を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの、２０１４エボラウイルス発生株に由来する糖タンパク質抗原への抗原結合を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｆで構成され、ＤＭＡｂ  Ｚ５Ｄ２のｓｃＦｖ−Ｆｃ変換の効果を明示する例示的な実験結果を示す。図９Ａは、２１日間にわたる親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの発現レベルを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの血清発現レベルを示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの、１９７６エボラウイルス発生株に由来する糖タンパク質抗原への抗原結合を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの、２０１４エボラウイルス発生株に由来する糖タンパク質抗原への抗原結合を示す。
【図９Ｅ】図９Ｅは、３５日間にわたる親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの発現レベルを示す。
【図９Ｆ】図９Ｆは、３５日間にわたる親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの正規化発現レベルを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｅで構成され、ＤＭＡｂ  Ｚ１Ｈ３のｓｃＦｖ−Ｆｃ変換の効果を明示する例示的な実験結果を示す。図１０Ａは、２１日間にわたる親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの発現レベルを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの、１９７６エボラウイルス発生株に由来する糖タンパク質抗原への抗原結合を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの、２０１４エボラウイルス発生株に由来する糖タンパク質抗原への抗原結合を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、３５日間にわたる親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの発現レベルを示す。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、３５日間にわたる親ＤＭＡｂおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂの正規化発現レベルを示す。
【図１１】ＳｃＦｖ−Ｆｃモデリングプロセス中の異なるステップからの例示的出力を示す。
【図１２】ｐＧＸ９２５６のＦｖ、ＶＨ−ＶＬ、およびＶＬ−ＶＨモデリングの例示的画像を示す。
【図１３】ｐＧＸ９２９０のＦｖ、ＶＨ−ＶＬ、およびＶＬ−ＶＨモデリングの例示的画像を示す。
【図１４】操作されたＤＭＡｂをＤＮＡプラスミドとして合成し、次に抗原結合および発現についてインビトロおよびインビボで評価することを示す流れ図を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｂで構成され、構造再フォーマットされたＤＭＡｂの中和活性を明示する例示的な実験結果を示す。図１５Ａは、グループ１のＥＢＯＭＡｂ−１０の中和率を明示する例示的な実験結果を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＥＢＯＬＡザイール糖タンパク質（ＥＢＯＶ−ＧＰ）でシュードタイピングしたレンチウイルスを使用したグループ２（ＥＢＯＭＡｂ−１４）の中和率を明示する例示的な実験結果を示す。
【図１６】グループ１およびグループ２の構造修飾されたＤＭＡｂの中和活性、ＩＣ５０、およびＩＣ９０の定量化を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜図１７Ｆで構成され、グループ１およびグループ２の構造修飾されたＤＭＡｂの発現および抗原結合を明示する例示的な実験結果を示す。図１７Ａは、グループ１のＤＭＡｂのインビボ発現経時変化を示す。免疫抑制ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１７０μｇのＤＮＡ−プラスミドコードＤＭＡｂを、筋肉内送達、続く電気穿孔（ＩＭ−ＥＰ）によって投与し、ＤＭＡｂの血清レベルを３５日にわたって評定した。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、グループ１のＤＭＡｂについての抗原結合曲線を示す。血清中のＤＭＡｂを、エボラ抗原に対する反応性について評価した。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＥＢＯＶ−ＧＰでシュードタイピングしたレンチウイルスベクターを使用して評価した、グループ１のＤＭＡｂ中和曲線を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、グループ２のＤＭＡｂのインビボ発現経時変化を示す。免疫抑制ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２００μｇのＤＮＡ−プラスミドコードＤＭＡｂを、筋肉内送達、続く電気穿孔（ＩＭ−ＥＰ）によって投与し、ＤＭＡｂの血清レベルを３５日にわたって評定した。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、グループ２のＤＭＡｂについての抗原結合曲線を示す。血清中のＤＭＡｂを、エボラ抗原に対する反応性について評価した。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、ＥＢＯＶ−ＧＰでシュードタイピングしたレンチウイルスベクターを使用して評価した、グループ２のＤＭＡｂ中和曲線を示す。
【図１８Ａ】（原文に記載無し）
【図１８Ｂ】（原文に記載無し）
【図１９Ａ】図１９Ａおよび図１９Ｂで構成され、コドン最適化マウスジカＤＭＡｂ  ＺＫ１９０Ｇ１Ｍ３ＬＡＬＡの遺伝子最適化の分析を示す。図１９Ａは、遺伝子最適化ＤＭＡｂの各々についての発現データを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、遺伝子最適化ＤＭＡｂの各々についての抗原結合を示す。これらの実験は、ＨＥＫ２９３細胞中インビトロで行った。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜図２０Ｂで構成され、遺伝子最適化マウスジカＤＭＡｂ  ＺＫ１９０Ｇ１Ｍ３ＬＡＬＡの発現および結合のインビボ分析を示す。図２０Ａは、遺伝子最適化ＤＭＡｂの各々についてのインビボの７日目の発現データを示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、遺伝子最適化ＤＭＡｂの各々についての抗原結合を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａ〜図２１Ｂで構成され、遺伝子最適化ＺＫ１８５ＬＡＬＡ  ＦＰ２Ａコドン最適化構築物の発現の分析を示す。図２１Ａは、遺伝子最適化ＤＭＡｂの各々についてのインビボの７日目の発現データを示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞における、遺伝子最適化されたＤＭＡｂの各々についてのインビトロ発現データを示す。
【図２２Ａ】図２２Ａおよび図２２Ｂで構成され、遺伝子最適化ＺＫ１８５ＬＡＬＡ  ＦＰ２Ａコドン最適化構築物の結合能力の分析を示す。図２２Ａは、遺伝子最適化ＤＭＡｂの各々についてのインビボの７日目の結合活性を示す。図５Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞における、遺伝子最適化されたＤＭＡｂの各々についてのインビトロ結合活性を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａおよび図２２Ｂで構成され、遺伝子最適化ＺＫ１８５ＬＡＬＡ  ＦＰ２Ａコドン最適化構築物の結合能力の分析を示す。図２２Ａは、遺伝子最適化ＤＭＡｂの各々についてのインビボの７日目の結合活性を示す。図５Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞における、遺伝子最適化されたＤＭＡｂの各々についてのインビトロ結合活性を示す。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂで構成され、コドン最適化マウスジカＤＭＡｂ  ＺＫ１９０Ｇ１Ｍ３ＬＡＬＡのＳｃＦｖ−Ｆｃ変換の分析を示す。図２３Ａは、各ＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂについての発現データを示す。図２３Ｂは、各ＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂについての抗原結合を示す。これらの実験はインビボで行った。
【図２４】ＺＫ１８５ＬＡＬＡ  ＦＰ２Ａコドン最適化ＤＭＡｂのＳｃＦｖ−Ｆｃ変換構築物のインビボ発現の分析を示す。
【図２５Ａ】ＤＭＡｂインビボ送達およびタンパク質操作の概略図を示す。図２５Ａは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ−３Ｐ（登録商標）デバイスを使用する促進された電気穿孔によってＤＭＡｂがインビボで送達されることを明示する概略図を示す。トランスフェクトした筋細胞は、タンパク質ＭＡｂを発現し分泌する。タンパク質ＭＡｂは血液循環に進入する。図２５Ａは、抗ＲＳＶ  抗体をｓｃＦｖ−Ｆｃ発現のために操作したことを明示する概略図を示す。
【図２５Ｂ】ＤＭＡｂインビボ送達およびタンパク質操作の概略図を示す。図２５Ａは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ−３Ｐ（登録商標）デバイスを使用する促進された電気穿孔によってＤＭＡｂがインビボで送達されることを明示する概略図を示す。トランスフェクトした筋細胞は、タンパク質ＭＡｂを発現し分泌する。タンパク質ＭＡｂは血液循環に進入する。図２５Ａは、抗ＲＳＶ  抗体をｓｃＦｖ−Ｆｃ発現のために操作したことを明示する概略図を示す。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜図２６Ｄで構成され、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂの発現を示す。図２６Ａは、ＲＳＶ  ＤＭＡｂの発現動態を明示する実験結果を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ＲＳＶ−ＤＭＡｂのピーク発現を明示する実験結果を示す。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料中のＤＭＡｂの量を明示する実験結果を示す。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、ＲＳＶ−Ｆ結合を明示する実験結果を示す。
【図２７】抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂの中和を明示する実験結果を示す。
【図２８】コットンラット中の抗ＲＳＶ−ＤＭＡｂを明示する実験結果を示す。
【図２９Ａ】図２９Ａ〜図２９Ｄで構成され、免疫応答マウスにおけるヒトｓｃ−Ｆｖ抗ＲＳＶのピーク発現および機能性を明示する例示的な実験結果を示す。マウスに、２００μｇのヒトｓｃ−Ｆｖ抗ＲＳＶ  ｄＭＡｂを、ｂａｌｂ／ｃマウスの脚筋に送達して投薬した。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ−３Ｐ（登録商標）によって送達を支援した。図２９Ａは、１３２００ｎｇ／ｍｌのタンパク質ヒトｓｃ−Ｆｖの平均血清レベル発現が処置から７日後に達成されたことを明示する例示的な実験結果を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、インビボで発現されたヒトｓｃ−ＦｖがＲＳＶ−Ｆ  抗原に結合することを明示する例示的な実験結果を示す。
【図２９Ｃ】図２９Ｃは、処置したマウスの血清が、インビトロのプラーク減少アッセイによって実証して生ＲＳＶ−Ａウイルス中和活性を呈し、平均６．９の対数逆数中和価（ｌｏｇ  ｒｅｃｉｐ．Ｎｅｕｔ．ｔｉｔｅｒ）をもたらすことを明示する例示的な実験結果を示す。
【図２９Ｄ】図２９Ｄは、ヒトｓｃ−Ｆｖが、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中の総タンパク質１μｇあたり１．１ｎｇのヒトｓｃ−Ｆｖの平均濃度で、処理したマウスの肺に存在することを明示する例示的な実験結果を示す。
【図３０】コットンラット中のヒトｓｃ−Ｆｖの維持された発現を明示する例示的な実験結果を示す。１００μｇおよび８００μｇのヒトｓｃ−Ｆｖを、コットンラットのＴＡ筋に送達した。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ−３Ｐ（登録商標）を用いて送達を支援した。７日後に血清中のピーク発現に達する（それぞれ２２６ｎｇ／ｍｌおよび１３５３ｎｇ／ｍｌ）。
【図３１Ａ】図３１Ａおよび図３１Ｂで構成され、コットンラット中のヒトｓｃ−Ｆｖのピーク発現および機能性を明示する例示的な実験結果を示す。図３１Ａは、２．４ｍｇのヒトｓｃ−Ｆｖをコットンラットの脚筋においてＣＥＬＬＥＣＴＲＡ−３Ｐ（登録商標）で支援しながら送達することにより、７日目に７０３０ｎｇ／ｍｌの平均血清発現が生じることを明示する例示的な実験結果を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、処置したコットンラットの血清が、インビトロのプラーク減少アッセイにおいて中和性であり、平均５．４の中和価（ｌｏｇ  Ｒｅｃｉｐ．Ｎｅｕｔ．ｔｉｔｅｒ）をもたらすことを明示する例示的な実験結果を示す。
【図３２Ａ】図３２Ａ〜図３２Ｃで構成され、デングおよびジカｓｃＦｖ−Ｆｃを構造再フォーマットした分子および実験設計の概略図を示す。図３２Ａは、使用した設計アプローチの概略図を示す。ＳｃＦｖ−ＦｃのためのヒトｄＭＡｂ設計戦略。ＶＨおよびＶＬ領域を（Ｇ４Ｓ）３リンカーによって接続し、原型的なヒトＩｇＧ１ヒンジおよびＦｃに融合させた。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、プラスミドをコードするｓｃＦｖ−ＦｃジカおよびデングｄＭＡｂ（Ｚ−ｄＭＡｂ１−ｓｃおよびＤ−ｄＭＡｂ１−ｓｃ）ならびに多価双方向性プロモーター構築物（Ｚ／Ｄ−ｄＭＡｂ１−ｓｃ）の分子組織の図を示す。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、多価カセットと組み合わせたまたは多価カセット内の様々なｄＭＡｂ構築物を各前脛骨筋（ＴＡ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの各々に送達し、続いて電気穿孔し、ｄＭＡｂ発現および抗原結合をＤＮＡ送達から７日目に評価した、実験設計のフローチャートを示す。
【図３３】ジカウイルスとデングウイルスとの間の交差反応性の評価を明示する例示的な実験結果を示す。ジカｄＭＡｂは、ジカ抗原と特異的に反応する。デングｄＭＡｂは、ＤＥＮＶ１抗原およびＤＥＮＶ２抗原と特異的に反応する。プラスミドをコードするｓｃＦｖ−ＦＣ−ｄＭＡｂを、２９３  Ｔ細胞でトランスフェクトした。ｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質を含有するトランスフェクション後２日目の上清を抗原結合に供した。９６ウェルプレートを、１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌのジカまたはデング抗原（ＤＥＮＶ１〜４）でコーティングした。逆数血清希釈（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｓｅｒｕｍ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）３分の１（１／３）連続希釈を、事前希釈した血清試料を用いて９６ウェルプレート上で行った。抗原結合をＥＬＩＳＡによって評定した。データを、平均ＯＤ４５０±ＳＥＭとして表す。
【図３４Ａ】図３４Ａ〜図３４Ｃで構成され、ｓｃＦＶ−Ｆｃ  ｄＭＡｂのインビトロ発現および抗原結合を明示する例示的な実験結果を示す。プラスミドをコードするｓｃＦｖ−ＦＣ−ｄＭＡｂを、２９３  Ｔ細胞でトランスフェクトした。図３４Ａは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｄＭＡｂのトランスフェクション後２日目の発現、ならびに同時トランスフェクションおよび多価Ｚ／Ｄ−ｄＭＡｂ１−ｓｃ構築物へのそれらそれぞれの寄与を評定したことを明示する例示的な実験結果を示す。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｄＭＡｂがデング（ＤＥＮＶ１）に結合する能力を明示する例示的な実験結果を示す。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｄＭＡｂがジカ抗原に結合する能力を明示する例示的な実験結果を示す。
【図３５Ａ】図３５Ａ〜図３５Ｃで構成され、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｄＭＡｂのインビボ発現および抗原結合を明示する例示的な実験結果を示す。図３５Ａは、電気穿孔（ＥＰ）媒介型ｄＭＡｂトランスフェクション後７日目のｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｄＭＡｂ発現を明示する例示的な実験結果を示す。データは、同じ動物においてカクテルで送達された場合または同じ動物において２つの別個の筋肉内部位に個々に送達された場合の、Ｚ−ｄＭＡｂ１−ｓｃおよびＤ−ｄＭＡｂ１−ｓｃについての個々のｄＭＡｂ発現、ならびにそれらそれぞれの寄与を示す。データはまた、単一の多価プラスミド構築物中で発現される場合のデングおよびジカｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｄＭＡｂの寄与も示す。合計１００μｇのプラスミドをコードするｄＭＡｂを、Ｚ−ｄＭＡｂ１−ｓｃ、Ｄ−ｄＭＡｂ１−ｓｃ、およびＺ／Ｄ−ｄＭＡｂ１−ｓｃ群について送達し、２００μｇをカクテル送達群および個別送達群について送達し、ＥＰを続けた。血清を定量ＥＬＩＳＡのために処置後７日目に採取し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｄＭＡｂ発現を評定した。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、様々な構築物がジカ抗原を認識する能力を評価する例示的な抗原結合アッセイを示す。
【図３５Ｃ】図３５Ｃは、様々な構築物がデング抗原を認識する能力を評価する例示的な抗原結合アッセイを示す。
【００３０】
１．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先する。好ましい方法および材料については後述するが、本明細書に記載されるものと類似するまたは均等な方法および材料も、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、例示的であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
【００３１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、およびそれらの変形は、本明細書で使用される場合、さらなる行為または構造の可能性を除外しない、制約のない移行句、用語、または語句であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上、別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。本開示は、明白に記載されているかにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【００３２】
「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥクラスの抗体または断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および一本鎖抗体を含むその断片もしくは誘導体、ならびにその誘導体を意味してもよい。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を呈する、哺乳動物の血清試料から単離した抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製した抗体、またはそれらの混合物であってもよい。
【００３３】
本明細書では同義に使用される「抗体断片」または「抗体の断片」は、抗原結合部位または可変領域を含むインタクトな抗体の一部分を指す。この部分は、インタクトな抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（即ち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）を含まない。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、軽鎖可変ドメインを１つのみ含む一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインのＣＤＲを３つ含む一本鎖ポリペプチド、重鎖可変領域を１つのみ含む一本鎖ポリペプチド、および重鎖可変領域のＣＤＲを３つ含む一本鎖ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
「抗原」は、宿主において免疫応答を生成する能力を有するタンパク質を指す。抗原は、抗体によって認識され、結合され得る。抗原は、体内から生じる場合も外部環境から生じる場合もある。
【００３５】
本明細書で使用される「コード配列」または「コード核酸」は、本明細書に示される抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味してもよい。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞において発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始シグナルおよび終止シグナルをさらに含んでもよい。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含んでもよい。
【００３６】
本明細書で使用される「補体」または「相補的」は、核酸を意味してもよい、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味してもよい。
【００３７】
組織または当該組織を画定する細胞が、その組織に送達される電気パルスの持続時間にわたって受ける、または経験する電流を定義するために本明細書で使用される「定電流」。電気パルスは、本明細書に記載される電気穿孔デバイスから送達される。この電流は、電気パルスの寿命にわたって当該組織内に一定のアンペア数で留まり、これは、本明細書に提供される電気穿孔デバイスが、好ましくは瞬時のフィードバックを有するフィードバック要素を有するためである。フィードバック要素は、パルスの持続時間の全体にわたって組織（または細胞）の抵抗を測定し、同じ組織内の電流が電気パルスの全体にわたって（約数マイクロ秒）、およびパルスごとに一定のままであるように、電気穿孔デバイスにその電気エネルギー出力を変更させる（例えば、電圧を増加させる）ことができる。いくつかの実施形態では、フィードバック要素は、制御装置を含む。
【００３８】
本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」は、同義に使用されてもよく、提供される電気穿孔デバイスの能動的応答を意味してもよく、これは、電極間の組織内の電流を測定すること、およびそれに応じて電流を一定レベルに維持するためにＥＰデバイスによって送達されたエネルギー出力を変化させることを含む。この一定レベルは、パルス系列または電気処理を開始する前に、ユーザによって予め設定される。フィードバックは、電気穿孔デバイスの電気穿孔構成要素、例えば制御装置によって達成されてもよく、これは、その中の電気回路が、電極間の組織内の電流を連続的に監視し、その監視された電流（または組織内の電流）を予め設定された電流と比較して、監視された電流を予め設定されたレベルに維持するためにエネルギー出力調整を連続的に行うことが可能であるためである。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるために瞬時であり得る。
【００３９】
本明細書で使用される「分散電流」は、本明細書に記載される電気穿孔デバイスの様々な針電極配列から送達される電流のパターンを意味してもよく、そのパターンは、電気穿孔されている組織の任意の領域における電気穿孔関連熱応力の発生を最小限に抑えるか、または好ましくは排除する。
【００４０】
本明細書で同義に使用される「電気穿孔」、「電気透過」、または「動電学的強化」（「ＥＰ」）は、生体膜内の微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電界パルスの使用を指してもよく、それらの存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水等の生体分子が細胞膜の一方の側からもう一方の側に通過できるようになる。
【００４１】
本明細書で使用される「内因性抗体」は、ホルモン免疫応答を誘導するために有効量の抗原を投与された対象において生成される抗体を指してもよい。
【００４２】
本明細書で使用される「フィードバック機構」は、ソフトウェアまたはハードウェア（またはファームウェア）のいずれかによって実施されるプロセスを指してもよく、このプロセスは、（エネルギーパルスの送達の前、間、および／または後に）所望の組織のインピーダンスを受信し、現在の値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーのパルスを調整して、予め設定された値を達成する。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実施され得る。
【００４３】
「断片」は、機能的であり、即ち、所望の標的に結合することができ、全長抗体と同じ意図された効果を有する抗体のポリペプチド断片を意味してもよい。抗体の断片は、少なくとも１つのアミノ酸がＮおよび／またはＣ末端から欠如していること（各場合、シグナルペプチドおよび／またはメチオニンを１位に有するまたは有しない）を除き、全長抗体と１００％同一であってもよい。断片は、付加されているいずれの異種シグナルペプチドも除き、特定の全長抗体の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の割合を構成してもよい。断片は、抗体と、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一であるポリペプチドの断片を含んでもよく、また同一性パーセントの計算時には含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドを追加で含んでもよい。断片は、Ｎ末端メチオニン、および／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチド等のシグナルペプチドをさらに含んでもよい。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、抗体の断片に連結してもよい。
【００４４】
抗体をコードする核酸配列の断片は、少なくとも１つのヌクレオチドが５’および／または３’末端から欠如していること（各場合、シグナルペプチドおよび／またはメチオニンをコードする配列を１位に有するまたは有しない）を除き、全長抗体と１００％同一であってもよい。断片は、付加されているいずれの異種シグナルペプチドも除き、特定の全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の割合を構成してもよい。断片は、抗体と、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一であるポリペプチドをコードする断片を含んでもよく、また任意選択で、同一性パーセントの計算時には含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列を追加で含んでもよい。断片は、Ｎ末端メチオニン、および／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチド等のシグナルペプチドのコード配列をさらに含んでもよい。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結してもよい。
【００４５】
本明細書で使用される「遺伝子構築物」は、抗体等、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞において発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始シグナルおよび終止シグナルを含む。本明細書で使用される場合、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結された必要な調節エレメントを含有する遺伝子構築物を指す。
【００４６】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の背景において本明細書で使用される「同一」または「同一性」は、配列が、指定された領域にわたって同じである指定されたパーセンテージの残基を有することを意味し得る。パーセンテージは、２つの配列を最適にアラインメントし、これら２つの配列を指定された領域にわたって比較し、同一の残基が両方の配列中で生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を導き、一致した位置の数を指定された領域中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを導くことによって計算されてもよい。２つの配列が異なる長さの配列であるか、またはアラインメントが１つ以上のねじれ型端部を生じ、かつ比較の指定された領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は、計算の分母には含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡとを比較するとき、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は等価であるとみなされ得る。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０等のコンピュータ配列アルゴリズムを使用して行われてもよい。
【００４７】
本明細書で使用される「インピーダンス」は、フィードバック機構を考察する場合に使用され、オームの法則に従って電流値に変換することができ、したがって、予め設定された電流との比較を可能にする。
【００４８】
本明細書で使用される「免疫応答」は、１つ以上の核酸および／またはペプチドの導入に応答した、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系の活性化を意味してもよい。免疫応答は、細胞性応答もしくは液性応答、または両方の形態であり得る。
【００４９】
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味してもよい。一本鎖の説明は、相補鎖の配列も定義する。このため、核酸は、説明される一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体が所与の核酸と同じ目的で使用され得る。このため、核酸は、実質的に同一の核酸およびその補体も包含する。一本鎖により、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブが提供される。このため、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るプローブも包含する。
【００５０】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖の両方の配列の部分を含有してもよい。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む、塩基の組み合わせを含有してもよい。核酸は、化学合成法または組換え法によって得てもよい。
【００５１】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、遺伝子の発現が空間的につながったプロモーターの制御下にあることを意味してもよい。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置してもよい。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子内でそれが制御する遺伝子との間の距離と、ほぼ同一であってもよい。当業者に公知の通り、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失せずに適合させることができる。
【００５２】
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結した配列を意味し得、天然、合成、または天然および合成の改変もしくは組み合わせであってもよい。
【００５３】
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞内で核酸の発現をもたらす、活性化する、または強化することが可能な、合成または天然由来の分子を意味してもよい。プロモーターは、その発現をさらに増強し、かつ／またはその空間的発現および／もしくは一時的発現を変化させる１つ以上の特定の転写制御配列を含んでもよい。プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはレプレッサ要素も含んでいてもよく、それは転写開始部位から何千もの塩基対に位置し得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来してもよい。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が生じる発達段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤等の外部刺激に応答して、構造的または差次的に遺伝子成分の発現を調節してもよい。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ＡＣＴＡ１プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００５４】
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書では同義に使用され、本明細書に示されるタンパク質のアミノ末端で連結させることができる得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を指揮する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、産生元の細胞からのタンパク質の分泌を促進する。シグナルペプチド／リーダー配列は、多くの場合、細胞からの分泌時に、成熟タンパク質と称されることが多いタンパク質の残部から切断される。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端で連結する。
【００５５】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複合混合物中等、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズするときに基づく条件を意味してもよい。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況においては異なることになる。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度での特定の配列について熱融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択されてもよい。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在するとき、Ｔｍで、プローブの５０％が平衡状態で占有される）温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度下で）であってもよい。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、約１．０Ｍのナトリウムイオン未満、例えば、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）については６０℃である条件であってもよい。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の付加によって達成されてもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であってもよい。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下が含まれる：５０％のホルムアミド、５倍のＳＳＣ、および１％のＳＤＳの４２℃でのインキュベーション、または５倍のＳＳＣ、１％のＳＤＳの６５℃でのインキュベーション、６５℃の０．２倍のＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳ中での洗浄を伴う。
【００５６】
本明細書で同義に使用される「対象」および「患者」は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル等のサル、チンパンジー等）、ならびにヒト）を含むがこれらに限定されない、任意の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトであっても非ヒトであってもよい。対象または患者は、他の形態の治療の受けていてもよい。
【００５７】
本明細書で使用される「実質的に相補的」は、第１の配列が、第２の配列に対して、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味してもよい。
【００５８】
本明細書で使用される「実質的に同一」は、第１の配列と第２の配列とが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって、あるいは第１の配列が第２の配列の補体に対して実質的に相補的である場合には核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを意味してもよい。
【００５９】
本明細書で使用される「合成抗体」は、本明細書に記載の組換え核酸配列によってコードされ、対象において生成される抗体を指す。
【００６０】
本明細書で使用される「治療」または「治療すること」は、疾患を予防する、抑制する、抑圧する、または完全に排除する手段を通した、疾患からの対象の保護を意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症前に、本発明のワクチンを対象に投与することを含む。疾患の制圧は、疾患の誘導後ではあるが、その臨床的出現の前に、本発明のワクチンを対象に投与することを含む。疾患の制圧は、疾患の臨床的出現の後に、本発明のワクチンを対象に投与することを含む。
【００６１】
核酸に関して本明細書で使用される「変異体」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列の補体もしくはその一部分、（ｉｉｉ）参照核酸もしくはその補体と実質的に同一な核酸、または（ｉｖ）参照核酸、その補体、もしくはそれと実質的に同一な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸を意味してもよい。
【００６２】
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」。変異体はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味してもよい。アミノ酸の保存的置換、即ち、１つのアミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）を有する別のアミノ酸と代置することは、典型的に小規模な変更を伴うとして、当該技術分野で認識されている。これらの小規模な変更は、当該技術分野において理解されるように、部分的に、アミノ酸のハイドロパシック（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）インデックスを考慮することによって、特定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシックインデックスは、その疎水性および荷電の考慮に基づく。類似のハイドロパシックインデックスのアミノ酸が、置換することができ、タンパク質の機能を依然として保持できることは、当該技術分野において公知である。一態様では、±２のハイドロパシックインデックスを有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を利用して、生物学的機能を保持したタンパク質を生じる置換を明らかにすることもできる。ペプチドにおいてアミノ酸の親水性を考慮することで、そのペプチドの最大の局所的平均親水性、つまり抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な指標を計算することができる。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号。当該技術分野で理解される通り、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、生物学的活性、例えば免疫原性を保持したペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて実施してもよい。アミノ酸の疎水性インデックスおよび親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、疎水性、親水性、荷電、寸法、および他の性質により明らにされた通り、生物学的機能に適合性のあるアミノ酸置換が、アミノ酸、特にそれらアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することは理解されている。
【００６３】
変異体は、完全な遺伝子配列の全長またはその断片にわたって実質的に同一な核酸配列であってもよい。核酸配列は、遺伝子配列の全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。変異体は、アミノ酸配列の全長またはその断片にわたって実質的に同一なアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。
【００６４】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味してもよい。ベクターは、ナノプラスミドまたは小環状プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体を含む、プラスミドであってもよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノム中に組み入れられるベクターのいずれであってもよい。
【００６５】
本明細書における数値範囲の列挙の場合、それらの間に介在する同程度の正確さを有する各数値が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲では、６および９に加えて、数値７および８が企図され、範囲６．０〜７．０では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が、明示的に企図される。
【００６６】
２．構造修飾されたＤＭＡｂ
本発明は、構造修飾されたＤＮＡコード化合成抗体（ＤＭＡｂ）を含む組成物、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子を含む組成物、構造修飾されたＤＭＡｂの生成方法、および構造修飾されたＤＭＡｂの使用方法に関する。
【００６７】
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、インビボでの、発現、抗原結合、安定性、またはそれらの組み合わせを増加させるための少なくとも１つの修飾を含む。一実施形態では、少なくとも１つの修飾は、低発現ＤＭａｂとして設計されたＤＭＡｂのインビボ発現を増加させることに基づいて行われる。一実施形態では、少なくとも１つの修飾は、ＤＭＡｂのインビボの抗原結合を増加させることに基づいて行われる。
【００６８】
一実施形態では、本発明による構造修飾の候補となるＤＭＡｂは、望ましいインビボの抗原結合を呈するが、発現率が低いＤＭＡｂである。したがって、望ましいＤＭＡｂを生成するための構造修飾は、インビボで、望ましい抗原結合とより高い発現レベルとの両方を呈するＤＭＡｂを生成するために、そのＤＭＡｂの発現を増加させることである。一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、修飾されていないＤＭＡｂの発現レベルを比べて増加した発現をもたらす少なくとも１つの修飾を含む。
【００６９】
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、そのように修飾されていない対応するＤＭＡｂの発現を増加させる１つ以上の修飾を含む。一実施形態では、修飾には、完全グラフト、部分グラフト、骨格修飾、ＳｃＦｖ−Ｆｃ変換等が含まれるが、これらに限定されない。しかしながら、本発明はこれらの種類の修飾に限定されるべきではない。むしろ、本発明は、ＤＭＡｂのインビボ発現または抗原結合を増加させることができるいずれの種類の修飾も含む。一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子に関する。
【００７０】
完全グラフト
一実施形態では、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂは、完全グラフトＤＭＡｂである。一実施形態では、完全グラフトは、ＤＭＡｂ少なくとも１つのＣＤＲ領域をコードする配列を異なるＤＭＡｂの主鎖に移す方法に関する。例えば、一実施形態では、完全グラフトは、インビボ発現が低いＤＭＡｂの少なくとも１つのＣＤＲ領域を同定すること、およびインビボ発現レベルが高いＤＭＡｂの少なくとも１つのＣＤＲ領域を、低発現ＤＭＡｂの少なくとも１つのＣＤＲ配列を有するように修飾することを含む。
【００７１】
一実施形態では、完全グラフトＤＭＡｂは、１つのＤＭＡｂの可変重鎖に由来する少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＣＤＲが、第２のＤＭＡｂの可変重鎖に由来する少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＣＤＲと同一となるように修飾されている、ＤＭＡｂを含む。一実施形態では、完全グラフトＤＭＡｂは、１つのＤＭＡｂの可変重鎖に由来する少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＣＤＲが、第２のＤＭＡｂの可変重鎖に由来する少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＣＤＲと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一となるように修飾されている、ＤＭＡｂを含む。一実施形態では、完全グラフトＤＭＡｂは、１つのＤＭＡｂの可変軽鎖に由来する少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＣＤＲが、第２のＤＭＡｂの可変軽鎖に由来する少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＣＤＲと同一となるように修飾されている、ＤＭＡｂを含む。
【００７２】
本発明の完全グラフトＤＭＡｂの生成に使用するための免疫グロブリン骨格は、いずれの免疫グロブリンアイソタイプにも由来し得る。重鎖免疫グロブリンアイソタイプには、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むＩｇＧ、ならびにＩｇＭが含まれるが、これらに限定されない。軽鎖免疫グロブリンアイソタイプには、カッパおよびラムダが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、完全グラフトＤＭＡｂの生成のための基礎となるＤＭＡｂは、同じ免疫グロブリンアイソタイプのものである。一実施形態では、完全グラフトＤＭＡｂの生成のための基礎となるＤＭＡｂは、異なる免疫グロブリンアイソタイプに由来する。
【００７３】
一実施形態では、本発明の完全グラフトＤＭＡｂは、親ＤＭＡｂと比較して、修飾された発現、安定性、半減期、抗原結合、重鎖−軽鎖対合、組織透過性、またはそれらの組み合わせを有する。
【００７４】
一実施形態では、本発明の完全グラフトＤＭＡｂは、発現が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【００７５】
一実施形態では、本発明の完全グラフトＤＭＡｂは、抗原結合が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【００７６】
一実施形態では、本発明の完全グラフトＤＭＡｂは、半減期が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超長い。
【００７７】
一実施形態では、本発明の完全グラフトＤＭＡｂは、安定性が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【００７８】
一実施形態では、本発明の完全グラフトＤＭＡｂは、組織透過性が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超優れている。
【００７９】
一実施形態では、本発明の完全グラフトＤＭＡｂは、重鎖−軽鎖対合が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超優れている。
【００８０】
部分グラフト
一実施形態では、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂは、部分グラフトＤＭＡｂである。一実施形態では、部分グラフトは、ＤＭＡｂの１つ以上のＦＲ領域またはその断片を、異なるＤＭＡｂの１つ以上のＦＲ領域またはその断片を含むように修飾する方法に関する。例えば、一実施形態では、部分グラフトは、インビボ発現が低いＤＭＡｂのＦＲ領域またはその断片を、インビボ発現が高い第２のＤＭＡｂのものに類似するように修飾することを含む。一実施形態では、少なくとも１つのＦＲ領域の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超の残基が改変される。一実施形態では、多数のＦＲ領域の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超の残基が改変される。一実施形態では、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０超の残基が、互いにごく接近した範囲内で改変される（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０超の残基が、連続する３０残基領域内で改変される）。一実施形態では、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０超の残基が、単一のＦＲ内（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４内）で改変される。一実施形態では、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０超の残基が、多数のＦＲ（例えば、ＦＲ１およびＦＲ４内）で改変される。例示的な実施形態では、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の残基が、可変軽鎖のＮ末端で改変される。
【００８１】
本発明の部分グラフトＤＭＡｂの生成のための基礎となるＤＭＡｂの免疫グロブリン骨格は、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むＩｇＧ、ＩｇＭ、カッパおよびラムダを含むがこれらに限定されない、いずれの免疫グロブリンアイソタイプにも由来し得る。一実施形態では、部分グラフトＤＭＡｂの生成のための基礎となるＤＭＡｂは、同じ免疫グロブリンアイソタイプのものである。一実施形態では、部分グラフトＤＭＡｂの生成のための基礎となるＤＭＡｂは、異なる免疫グロブリンアイソタイプに由来する。
【００８２】
一実施形態では、本発明の部分グラフトＤＭＡｂは、親ＤＭＡｂと比較して、修飾された発現、安定性、半減期、抗原結合、重鎖−軽鎖対合、組織透過性、またはそれらの組み合わせを有する。
【００８３】
一実施形態では、本発明の部分グラフトＤＭＡｂは、発現が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【００８４】
一実施形態では、本発明の部分グラフトＤＭＡｂは、抗原結合が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【００８５】
一実施形態では、本発明の部分グラフトＤＭＡｂは、半減期が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超長い。
【００８６】
一実施形態では、本発明の部分グラフトＤＭＡｂは、安定性が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【００８７】
一実施形態では、本発明の部分グラフトＤＭＡｂは、組織透過性が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超優れている。
【００８８】
一実施形態では、本発明の部分グラフトＤＭＡｂは、重鎖−軽鎖対合が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超優れている。
【００８９】
骨格修飾
一実施形態では、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂは、骨格修飾されたＤＭＡｂである。一実施形態では、骨格修飾は、ＶＨ−ＶＬ界面での安定化相互作用を増加させるように、または等電点を好ましく改変するようにＤＭＡｂの少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾する方法に関する。本発明の方法により修飾することができる残基は、ＶＨ−ＶＬ相互作用に関与する残基を予測するための当該技術分野で既知の任意の方法を使用して（例えば、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，２３（９）：６８９−６９７に記載されているＶＨ−ＶＬ界面に関与する残基を予測するためのバイオインフォマティクス法を使用して）同定することができる。様々な実施形態では、骨格修飾されたＤＭＡｂは、非芳香族側鎖残基を芳香族側鎖残基に改変するように、１つ以上の修飾を含む。一実施形態では、骨格修飾されたＤＭＡｂは、帯電した側鎖を有するＶＨ−ＶＬ界面アミノ酸を、帯電していない側鎖を有するアミノ酸へと改変するように、１つ以上の修飾（例えば、リジン（Ｋ）のグルタミン（Ｑ）への修飾）を含む。一実施形態では、骨格修飾されたＤＭＡｂは、帯電していない側鎖を有するＶＨ−ＶＬ界面アミノ酸を、疎水性の側鎖を有するアミノ酸に改変するように、１つ以上の修飾（例えば、Ｑのチロシン（Ｙ）への修飾）を含む。一実施形態では、骨格修飾されたＤＭＡｂは、ＶＨ−ＶＬ界面アミノ酸を、芳香族側鎖を有するアミノ酸に改変するように、１つ以上の修飾（例えば、Ｑのチロシン（Ｙ）への修飾）を含む。様々な実施形態では、骨格修飾されたＤＭＡｂは、ＦＲ２またはＦＲ３内に１つ以上の修飾を含む。
【００９０】
本発明の構造修飾されたＤＭＡｂの免疫グロブリン骨格は、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むＩｇＧ、ＩｇＭ、カッパおよびラムダを含むがこれらに限定されない、いずれの免疫グロブリンアイソタイプにも由来し得る。
【００９１】
一実施形態では、本発明の骨格修飾されたＤＭＡｂは、親ＤＭＡｂと比較して、修飾された発現、安定性、半減期、抗原結合、重鎖−軽鎖対合、組織透過性、またはそれらの組み合わせを有する。
【００９２】
一実施形態では、本発明の骨格修飾されたＤＭＡｂは、発現が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【００９３】
一実施形態では、本発明の骨格修飾されたＤＭＡｂは、抗原結合が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【００９４】
一実施形態では、本発明の骨格修飾されたＤＭＡｂは、半減期が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超長い。
【００９５】
一実施形態では、本発明の骨格修飾されたＤＭＡｂは、安定性が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【００９６】
一実施形態では、本発明の骨格修飾されたＤＭＡｂは、組織透過性が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超優れている。
【００９７】
一実施形態では、本発明の骨格修飾されたＤＭＡｂは、重鎖−軽鎖対合が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超優れている。
【００９８】
一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ（ＳｃＦｖ−Ｆｃ）変換
一実施形態では、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂは、ＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂである。一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ変換は、ＣＨ１およびＣＬ領域の除去、ならびにＶＨとＶＬとの間のリンカーの付加に関する。したがって、一実施形態では、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂは、ＣＨ１およびＣＬドメインのコード配列を欠き、ＶＨドメインをコードする配列とＶＬドメインをコードする配列との間のリンカーのコード配列を含む核酸分子によってコードされたＤＭＡｂを含む。一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂは、ＶＨ領域のＣ末端をＶＬ領域のＮ末端に結合するリンカーを含んで、ＶＨ−ＶＬ配向にある。一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂは、ＶＬ領域のＣ末端をＶＨ領域のＮ末端に結合するリンカーを含んで、ＶＬ−ＶＨ配向にある。一実施形態では、リンカーは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０超のアミノ酸残基を含む。一実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）に従う配列を有する（Ｇ４Ｓ）３リンカーを含む。別の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１０９）を有するＷｈｉｔｌｏｗリンカーである。
【００９９】
本発明のＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂの免疫グロブリン骨格は、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むＩｇＧ、ＩｇＭ、カッパおよびラムダを含むがこれらに限定されない、いずれの免疫グロブリンアイソタイプにも由来し得る。
【０１００】
一実施形態では、本発明のＳｃＦｖ−Ｆｃ変換された抗体は、親ＤＭＡｂと比較して、修飾された発現、安定性、半減期、抗原結合、重鎖−軽鎖対合、組織透過性、またはそれらの組み合わせを有する。
【０１０１】
一実施形態では、本発明のＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂは、発現が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【０１０２】
一実施形態では、本発明のＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂは、抗原結合が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【０１０３】
一実施形態では、本発明のＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂは、半減期が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超長い。
【０１０４】
一実施形態では、本発明のＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂは、安定性が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【０１０５】
一実施形態では、本発明のＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂは、組織透過性が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超優れている。
【０１０６】
一実施形態では、本発明のＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂは、重鎖−軽鎖対合が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超優れている。
【０１０７】
遺伝子最適化
一実施形態では、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂは、遺伝子最適化された（ＧＯ）ＤＭＡｂである。一実施形態では、遺伝子最適化は、コドン使用、ＧＣ含有量、潜在的スプライス部位、およびｍＲＮＡ二次構造等の、転写および翻訳に影響する多数のパラメータが、多変数回帰アルゴリズムにおいて加重されて、親ＤＭＡｂと比較して修飾された発現、安定性、半減期、抗原結合、またはそれらの組み合わせを有する配列を生成する方法に関する。
【０１０８】
一実施形態では、本発明の遺伝子最適化されたＤＭＡｂは、発現が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【０１０９】
一実施形態では、本発明の遺伝子最適化されたＤＭＡｂは、抗原結合が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【０１１０】
一実施形態では、本発明の遺伝子最適化されたＤＭＡｂは、半減期が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超長い。
【０１１１】
一実施形態では、本発明の遺伝子最適化されたＤＭＡｂは、安定性が、親ＤＭＡｂよりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い。
【０１１２】
構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子
一実施形態では、本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子を含む組成物を提供する。様々な実施形態では、核酸配列は、親ＤＭＡｂよりも増加した発現、安定性、半減期、抗原結合、またはそれらの組み合わせを有するように設計された構造修飾されたＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、核酸配列は、完全グラフトＤＭＡｂ、部分グラフトＤＭＡ、骨格修飾されたＤＭＡｂ、遺伝子最適化されたＤＭＡｂ、またはＳｃＦｖ−Ｆｃ変換されたＤＭＡｂをコードする。
【０１１３】
抗エボラＤＭＡｂ
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、抗エボラＤＭＡｂである。
一実施形態では、完全グラフトの構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、または配列番号１８のアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、完全グラフトの構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１５、または配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。
【０１１４】
一実施形態では、部分グラフトの構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号４、配列番号１４、配列番号３０、または配列番号３４のアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、部分グラフトの構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号３、配列番号１３、配列番号２９、または配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。
【０１１５】
一実施形態では、骨格修飾され構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号２または配列番号１２のアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、骨格修飾され構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号２または配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。
【０１１６】
一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３２、または配列番号３６のアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３２、または配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
【０１１７】
一実施形態では、核酸分子は、構造修飾された抗エボラＤＭＡｂの断片をコードする配列を含む。一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子の断片は、構造修飾されたＤＭＡｂの可変軽鎖領域または可変重鎖領域をコードする。
【０１１８】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６のアミノ酸配列に対して、コードされた配列の全長にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。
【０１１９】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５の核酸配列に対して、核酸配列の全長にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２０】
一実施形態では、核酸分子は、構造修飾された抗エボラＤＭＡｂの断片をコードする配列を含む。一実施形態では、構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子の断片は、構造修飾された抗エボラＤＭＡｂの可変軽鎖領域または可変重鎖領域をコードする。
【０１２１】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６のアミノ酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成する断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２２】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５のヌクレオチド配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成する断片を含む。
【０１２３】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６のアミノ酸配列に対して、コードされた配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２４】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５の核酸配列に対して、核酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗エボラＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、あるいは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列の断片をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１２６】
一実施形態では、抗エボラＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６に示されるアミノ酸配列の断片をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１２７】
一実施形態では、抗エボラＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である１つ以上のＤＮＡ配列、あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ配列の断片から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１２８】
一実施形態では、抗エボラＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５に示される１つ以上のＤＮＡ配列、あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５に示されるＤＮＡ配列の断片から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１２９】
本発明の組成物は、エボラウイルス感染と関連付けられる任意の疾患、障害、または状態を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、ウイルス感染を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、エボラウイルス感染と関連付けられる状態を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。
【０１３０】
抗ジカＤＭＡｂ
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂである。
【０１３１】
一実施形態では、遺伝子最適化された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、または配列番号８６のアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、遺伝子最適化された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、または配列番号８５のヌクレオチド配列を含む。
【０１３２】
一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、または配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５のヌクレオチド配列を含む。
【０１３３】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、または配列番号１０６のアミノ酸配列に対して、コードされた配列の全長にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。
【０１３４】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５の核酸配列に対して、核酸配列の全長にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３５】
一実施形態では、核酸分子は、構造修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂの断片をコードする配列を含む。一実施形態では、構造修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子の断片は、構造修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂの可変軽鎖領域または可変重鎖領域をコードする。
【０１３６】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、または配列番号１０６のアミノ酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成する断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１３７】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５のヌクレオチド配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成する断片を含む。
【０１３８】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、または配列番号１０６のアミノ酸配列に対して、コードされた配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１３９】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５の核酸配列に対して、核酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１４０】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、または配列番号１０６に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、あるいは配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、または配列番号１０６に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるアミノ酸配列の断片をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１４１】
一実施形態では、抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、または配列番号１０６に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、または配列番号１０６に示されるアミノ酸配列の断片をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１４２】
一実施形態では、抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である１つ以上のＤＮＡ配列、あるいは配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ配列の断片から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１４３】
一実施形態では、抗ＺＩＫＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５に示される１つ以上のＤＮＡ配列、あるいは配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５に示されるＤＮＡ配列の断片から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１４４】
本発明の組成物は、ジカウイルス感染と関連付けられる任意の疾患、障害、または状態を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、ウイルス感染を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、ジカウイルス感染と関連付けられる状態を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。
【０１４５】
抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂ
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂである。
【０１４６】
一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ構造修飾抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ構造修飾ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１０７のヌクレオチド配列を含む。
【０１４７】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１０８のアミノ酸配列に対して、コードされた配列の全長にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。
【０１４８】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１０７の核酸配列に対して、核酸配列の全長にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１４９】
一実施形態では、核酸分子は、構造修飾された抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂの断片をコードする配列を含む。一実施形態では、構造修飾された抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子の断片は、構造修飾された抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂの可変軽鎖領域または可変重鎖領域をコードする。
【０１５０】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１０８のアミノ酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成する断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１０７のヌクレオチド配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成する断片を含む。
【０１５２】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１０８のアミノ酸配列に対して、コードされた配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１５３】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１０７の核酸配列に対して、核酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１５４】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０８に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、あるいは配列番号１０８に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列の断片をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１５５】
一実施形態では、抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０８に示されるアミノ酸配列または配列番号１０８に示されるアミノ酸配列の断片をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１５６】
一実施形態では、抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０７に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である１つ以上のＤＮＡ配列、あるいは配列番号１０７に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ配列の断片から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１５７】
一実施形態では、抗ＤＥＮＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０７に示される１つ以上のＤＮＡ配列または配列番号１０７に示されるＤＮＡ配列の断片から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１５８】
本発明の組成物は、ＤＥＮＶウイルス感染と関連付けられる任意の疾患、障害、または状態を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、ウイルス感染を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、ＤＥＮＶウイルス感染と関連付けられる状態を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。
【０１５９】
抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂ
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂである。
【０１６０】
一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ構造修飾抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１１３または配列番号１１７のアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、ＳｃＦｖ−Ｆｃ構造修飾ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１１２または配列番号１１６のヌクレオチド配列を含む。
【０１６１】
一実施形態では、遺伝子最適化された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１１１、配列番号１１５、または配列番号１１９のアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。一実施形態では、遺伝子最適化された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１１０、配列番号１１４、または配列番号１１８のヌクレオチド配列を含む。
【０１６２】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、または配列番号１１９のアミノ酸配列に対して、コードされた配列の全長にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＤＭＡｂをコードする。
【０１６３】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、または配列番号１１８の核酸配列に対して、核酸配列の全長にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１６４】
一実施形態では、核酸分子は、構造修飾された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂの断片をコードする配列を含む。一実施形態では、構造修飾された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子の断片は、構造修飾された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂの可変軽鎖領域または可変重鎖領域をコードする。
【０１６５】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、または配列番号１１９のアミノ酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成する断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１６６】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、または配列番号１１８のヌクレオチド配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成する断片を含む。
【０１６７】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、または配列番号１１９のアミノ酸配列に対して、コードされた配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１６８】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードする核酸分子は、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、または配列番号１１８の核酸配列に対して、核酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１６９】
一実施形態では、１つ以上の構造修飾された抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、または配列番号１１９に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、あるいは配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、または配列番号１１９に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列の断片をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１７０】
一実施形態では、抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、または配列番号１１９に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、または配列番号１１９に示されるアミノ酸配列の断片をコードする１つ以上のＤＮＡ配列から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１７１】
一実施形態では、抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、または配列番号１１８に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である１つ以上のＤＮＡ配列、あるいは配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、または配列番号１１８に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ配列の断片から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１７２】
一実施形態では、抗ＲＳＶ  ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、または配列番号１１８に示される１つ以上のＤＮＡ配列、あるいは配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、または配列番号１１８に示されるＤＮＡ配列の断片から転写された１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１７３】
本発明の組成物は、ＲＳＶウイルス感染と関連付けられる任意の疾患、障害、または状態を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、ウイルス感染を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、ＲＳＶウイルス感染と関連付けられる状態を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。
【０１７４】
３．ＤＮＡコード化抗体
上記のように、本組成物は、組換え核酸配列を含み得る。組換え核酸配列は、構造修飾されたＤＭＡｂ、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードし得る。抗体については、後により詳細に記載する。
【０１７５】
組換え核酸配列は、異種核酸配列であり得る。組換え核酸配列は、少なくとも１つの異種核酸配列または１つ以上の異種核酸配列を含み得る。
【０１７６】
組換え核酸配列は、最適化された核酸配列であり得る。そのような最適化により、抗体の免疫原性が増加し得るかまたは改変され得る。また、最適化により、転写および／または翻訳が改善し得る。最適化には、以下のうちの１つ以上が含まれ得る：転写を増加させるためのＧＣ含有量が低いリーダー配列；ｍＲＮＡ安定性およびコドン最適化；翻訳増加のためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）の付加；シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列の付加；ならびにｃｉｓ作用性配列モチーフ（即ち、内部ＴＡＴＡボックス）の可能な限りの除去。
【０１７７】
ａ．組換え核酸配列構築物
組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含み得る。組換え核酸配列構築物は、後により詳細に記載する１つ以上の構成要素を含み得る。
【０１７８】
組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含み得る。組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含み得る。組換え核酸配列構築物はまた、プロテアーゼまたはペプチダーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含み得る。組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができ、各リーダー配列がシグナルペプチドをコードする。組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーター、１つ以上のイントロン、１つ以上の転写終止領域、１つ以上の開始コドン、１つ以上の終止もしくは停止コドン、および／または１つ以上のポリアデニル化シグナルを含み得る。組換え核酸配列構築物はまた、１つ以上のリンカーまたはタグ配列を含み得る。タグ配列は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードし得る。
【０１７９】
（１）重鎖ポリペプチド
組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードする異種核酸を含み得る。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域および／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含み得る。少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、および定常重鎖領域３（ＣＨ３）、および／またはヒンジ領域を含み得る。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。他の実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。
【０１８１】
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）のセットを含み得る。ＣＤＲセットは、ＶＨ領域の３つの超可変領域を含有し得る。重鎖ポリペプチドのＮ末端から始めて、これらのＣＤＲは、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
【０１８２】
（２）軽鎖ポリペプチド
組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含み得る。軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域および／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含み得る。
【０１８３】
軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）のセットを含み得る。ＣＤＲセットは、ＶＬ領域の３つの超可変領域を含有し得る。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から始めて、これらのＣＤＲは、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
【０１８４】
（３）プロテアーゼ切断部位
組換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含み得る。プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識され得る。プロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼ、例えば、非限定的に、フューリン、エラスターゼ、ＨｔｒＡ、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシン、およびペプシンであり得る。プロテアーゼはフューリンであり得る。他の実施形態では、プロテアーゼは、内部ペプチド結合を切断する（即ち、Ｎ末端またはＣ末端ペプチド結合を切断しない）、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸塩プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または任意のプロテアーゼであり得る。
【０１８５】
プロテアーゼ切断部位は、切断の効率を促進するまたは増加させる１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。１つ以上のアミノ酸配列は、個々のポリペプチドの形成または生成の効率を促進するまたは増加させることができる。１つ以上のアミノ酸配列は、２Ａペプチド配列を含み得る。
【０１８６】
（４）リンカー配列
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカー配列を含み得る。リンカー配列は、本明細書に記載の１つ以上の構成要素を空間的に分離または連結し得る。他の実施形態では、リンカー配列は、２つ以上のポリペプチドを空間的に分離または連結するアミノ酸配列をコードし得る。一実施形態では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー、例えば、非限定的に、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）を有する（Ｇ４Ｓ）３リンカーである。別の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１０９）を有するＷｈｉｔｌｏｗリンカーである。
【０１８７】
（５）プロモーター
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含み得る。１つ以上のプロモーターは、遺伝子発現を駆動し、遺伝子発現を調節することができるいずれのプロモーターであってもよい。そのようなプロモーターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要とされるｃｉｓ作用性配列エレメントである。遺伝子発現を導くために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、その天然環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離だけ組換え核酸配列構築物における転写開始部位から離れて位置してもよい。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失せずに適合させることができる。
【０１８８】
プロモーターは、重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に作動可能に連結されてもよい。プロモーターは、真核細胞中の発現に効果的であることが示されているプロモーターであってもよい。コード配列に作動可能に連結したプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター等のサルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター等のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであってもよい。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトポリヘドリン、またはヒトメタロチオネイン等の、ヒト遺伝子に由来するプロモーターであってもよい。
【０１８９】
プロモーターは、宿主細胞がある特定の外的刺激に曝露されたときにのみ転写を開始する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官または発達段階に特異的であってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の、筋または皮膚特異的プロモーター等の組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、内容全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載されている。
【０１９０】
プロモーターは、エンハンサーに関連し得る。エンハンサーは、コード配列の上流に位置し得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えば、ＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶからのものであってもよい。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、各々の内容が参照により完全に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、および第Ｗ０９４／０１６７３７号に記載されている。
【０１９１】
（６）イントロン
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のイントロンを含み得る。各イントロンは、機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を含み得る。イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含み得る。イントロンは、効率的なスプライシングに必要とされる１つ以上のシグナルを含み得る。
【０１９２】
（７）転写終止領域
組換え核酸配列構築物は、１つ以上の転写終止領域を含み得る。転写終止領域は、効率的な終止を提供するように、コード配列の下流に位置することができる。転写終止領域は、上記のプロモーターと同じ遺伝子から得られてもよく、あるいは１つ以上の異なる遺伝子から得られてもよい。
【０１９３】
（８）開始コドン
組換え核酸配列構築物は、１つ以上の開始コドンを含み得る。開始コドンは、コード配列の上流に位置し得る。開始コドンは、コード配列とインフレームであり得る。開始コドンは、効率的な翻訳開始に必要とされる１つ以上のシグナル、例えば、非限定的に、リボソーム結合部位に関連し得る。
【０１９４】
（９）終止コドン
組換え核酸配列構築物は、１つ以上の終止または停止コドンを含み得る。終止コドンは、コード配列の下流にあり得る。終止コドンは、コード配列とインフレームであり得る。終止コドンは、効率的な翻訳終止に必要とされる１つ以上のシグナルに関連し得る。
【０１９５】
（１０）ポリアデニル化シグナル
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリアデニル化シグナルは、効率的な転写産物のポリアデニル化に必要とされる１つ以上のシグナルを含み得る。ポリアデニル化シグナルは、コード配列の下流に位置付けられ得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロブリンポリアデニル化シグナルであってもよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであってもよい。
【０１９６】
（１１）リーダー配列
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含み得る。リーダー配列は、シグナルペプチドをコードし得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチド、例えば、非限定的に、ＩｇＧシグナルペプチドおよびＩｇＥシグナルペプチドであり得る。
【０１９７】
ｂ．組換え核酸配列構築物の配置
上記のように、組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができ、各組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素を含み得る。１つ以上の構成要素については、上で詳述する。１つ以上の構成要素は、組換え核酸配列構築物に含まれるとき、互いに任意の順序で配置され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の構成要素は、以下で記載するように組換え核酸配列構築物中に配置され得る。
【０１９８】
（１）配置１
ある配置では、第１の組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むことができ、第２の組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むことができる。
【０１９９】
第１の組換え核酸配列構築物は、ベクター中に置くことができる。第２の組換え核酸配列構築物は、第２のまたは別個のベクター中に置くことができる。組換え核酸配列構築物をベクター中に置くことについては、後により詳細に記載する。
【０２００】
第１の組換え核酸配列構築物はまた、プロモーター、イントロン、転写終止領域、開始コドン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。第１の組換え核酸配列構築物は、リーダー配列をさらに含むことができ、ここでは、リーダー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置する。したがって、リーダー配列によってコードされたシグナルペプチドは、ペプチド結合によって重鎖ポリペプチドに連結し得る。
【０２０１】
第２の組換え核酸配列構築物はまた、プロモーター、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルを含み得る。第２の組換え核酸配列構築物は、リーダー配列をさらに含むことができ、ここでは、リーダー配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置する。したがって、リーダー配列によってコードされたシグナルペプチドは、ペプチド結合によって軽鎖ポリペプチドに連結し得る。
【０２０２】
したがって、配置１の一例には、ＶＨおよびＣＨ１を含む重鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター（ひいては第１の組換え核酸配列構築物）と、ＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター（ひいては第２の組換え核酸配列構築物）とが含まれ得る。配置１の第２の例には、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む重鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター（ひいては第１の組換え核酸配列構築物）と、ＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター（ひいては第２の組換え核酸配列構築物）とが含まれ得る。
【０２０３】
（２）配置２
第２の配置では、組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列とを含むことができる。重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置付けられ得る。あるいは、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置付けられ得る。
【０２０４】
組換え核酸配列構築物は、後により詳細に記載するように、ベクター中に置くことができる。
【０２０５】
組換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位および／またはリンカー配列をコードする異種核酸配列を含み得る。組換え核酸配列構築物に含まれる場合、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列が、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられ得る。こうして、プロテアーゼ切断部位により、発現時に、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを個々のポリペプチドへと分離することが可能となる。他の実施形態では、組換え核酸配列構築物に含まれる場合には、リンカー配列が、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられ得る。
【０２０６】
組換え核酸配列構築物はまた、プロモーター、イントロン、転写終止領域、開始コドン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含み得る。組換え核酸配列構築物は、１つのプロモーターが重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に関連することができ、第２のプロモーターが軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に関連することができるように、２つのプロモーターを含み得る。さらに他の実施形態では、組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列とに関連する１つプロモーターを含み得る。
【０２０７】
組換え核酸配列構築物は、２つのリーダー配列をさらに含むことができ、ここでは、第１のリーダー配列が重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置し、第２のリーダー配列が軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流（または５’）に位置する。このため、第１のリーダー配列によってコードされた第１のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって重鎖ポリペプチドに連結することができ、第２のリーダー配列によってコードされた第２のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって軽鎖ポリペプチドに連結することができる。
【０２０８】
したがって、配置２の一例には、ＶＨおよびＣＨ１を含む重鎖ポリペプチドとＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（ひいては組換え核酸配列構築物）が含まれてもよく、ここでは、リンカー配列が、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられる。
【０２０９】
２の配置の第２の例には、ＶＨおよびＣＨ１を含む重鎖ポリペプチドとＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（ひいては組換え核酸配列構築物）が含まれてもよく、ここでは、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列が、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられる。
【０２１０】
配置２の第３の例には、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む重鎖ポリペプチドとＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（ひいては組換え核酸配列構築物）が含まれてもよく、ここでは、リンカー配列が、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられる。
【０２１１】
２の配置の第４の例には、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む軽鎖ポリペプチドとＶＬおよびＣＬを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター（ひいては組換え核酸配列構築物）が含まれてもよく、ここでは、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列が、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置付けられる。
【０２１２】
（３）ＳｃＦｖ−Ｆｃ配置
ＳｃＦｖ−Ｆｃ配置では、組換え核酸配列は、重鎖ポリペプチドのＶＨドメインと軽鎖ポリペプチドのＶＬドメインとをコードする配列、およびさらにＶＨドメインとＶＬドメインとをコードする異種核酸配列間に位置付けられるリンカー配列を含み得る。
【０２１３】
ＳｃＦｖ−Ｆｃ配置の例には、ＶＨ、リンカー、ＶＬ、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３をコードするベクター（ひいては組換え核酸配列構築物）が含まれ得る。ＶＨ領域は、ＶＬ領域にリンカーを介してＮ末端またはＣ末端連結し得る。
【０２１４】
ｃ．組換え核酸配列構築物からの発現
上記のように、組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素の中でも、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み得る。このため、組換え核酸配列構築物により、重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドの発現を促進することができる。
【０２１５】
上記の配置１を利用する場合、第１の組換え核酸配列構築物により、重鎖ポリペプチドの発現を促進することができ、第２の組換え核酸配列構築物により、軽鎖ポリペプチドの発現を促進することができる。上記の配置２を利用する場合、組換え核酸配列構築物により、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの発現を促進することができる。
【０２１６】
例えば、非限定的に、細胞、生命体、または哺乳動物中で発現するとき、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、組み立てられて合成抗体となることができる。具体的には、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、互いに相互作用して、組立てにより、抗原に結合することが可能な合成抗体を生じさせることができる。他の実施形態では、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、互いに相互作用して、組立てにより、本明細書に記載のように組み立てられていない抗体と比較してより免疫原性である合成抗体を生じさせることができる。さらに他の実施形態では、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、互いに相互作用して、組立てにより、抗原に対する免疫応答を励起または誘導することが可能な合成抗体を生じさせることができる。
【０２１７】
ｄ．ベクター
上記の組換え核酸配列構築物は、１つ以上のベクター中に置くことができる。１つ以上のベクターは、複製起点を含有し得る。１つ以上のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。１つ以上のベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノム中に組み入れられるベクターのいずれかであり得る。
【０２１８】
ベクターには、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「裸ＤＮＡ」ベクター等が含まれるが、これらに限定されない。「ベクター」は、細胞を、感染させる、トランスフェクトする、一時的または永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは、裸核酸、またはタンパク質もしくは脂質と複合体化した核酸であり得ることが認識される。ベクターは、任意選択で、ウイルスまたは細菌核酸、および／またはタンパク質、および／または膜（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープ等）を含む。ベクターは、レプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を非限定的に含み、これにＤＮＡの断片が付着し、複製されてもよい。よって、ベクターには、ＲＮＡ、自律的自己複製型の環状または線状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルス等、例えば、米国特許第５，２１７，８７９号参照）が非限定的に含まれ、また発現プラスミドと非発現プラスミドとの両方が含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターには、線状ＤＮＡ、酵素ＤＮＡ、または合成ＤＮＡが含まれる。組換え微生物または細胞培養物が「発現ベクター」を宿していると記載される場合、これは、宿主染色体（複数可）に組み込まれた染色体外環状および線状ＤＮＡおよびＤＮＡの両方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持されている場合、ベクターは、自律的構造体として有糸分裂中に細胞によって安定して複製されるか、または宿主のゲノム内に組み込まれるかのいずれであってもよい。
【０２１９】
１つ以上のベクターは、一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである、異種発現構築物であり得る。発現ベクターが細胞内に入ると、組換え核酸配列構築物によってコードされた重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドが、細胞転写および翻訳機構であるリボソーム複合体によって産生される。１つ以上のベクターは、大量の安定なメッセンジャーＲＮＡ、ひいてはタンパク質を発現することができる。
【０２２０】
（１）発現ベクター
１つ以上のベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であり得る。環状プラスミドおよび線状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる。組換え核酸配列構築物を含む１つ以上のベクターは、キメラであってもよく、即ち、その成分のうちの少なくとも１つが、その他の成分のうちの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。
【０２２１】
（２）プラスミド
１つ以上のベクターはプラスミドであり得る。プラスミドは、細胞を組換え核酸配列構築物でトランスフェクトするのに有用であってもよい。プラスミドは、組換え核酸配列構築物を対象の中に導入するのに有用であってもよい。プラスミドはまた、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に十分適していてもよい調節配列を含んでもよい。
【０２２２】
プラスミドはまた、プラスミドを染色体外に維持し、細胞内でプラスミドの多数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点を含んでもよい。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸＩ、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であってもよく、これらは、エプスタイン−バーウイルスの複製起点、ならびに組み込みなしで高コピーエピソーム複製を生じ得る核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含んでもよい。プラスミドの主鎖はｐＡＶ０２４２であってもよい。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであってもよい。
【０２２３】
プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のタンパク質産生に使用され得るｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよい。プラスミドはまた、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株中のタンパク質産生に使用され得るｐ  ＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよい。プラスミドはまた、昆虫細胞中のタンパク質産生に使用され得るＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよい。プラスミドはまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞中のタンパク質産生に使用され得るｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよい。
【０２２４】
（３）ＲＮＡ
１つ以上のベクターはＲＮＡ分子であってもよい。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、本明細書に記載のＤＮＡ配列から転写される。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、構造修飾されたＤＭＡｂまたはその変異体またはその断片をコードする。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、構造修飾されたＤＭＡｂまたはその変異体またはその断片をコードするＤＮＡ分子から生成された転写産物である。したがって、一実施形態では、本発明は、ＤＭＡｂのうちの１つ以上をコードするＲＮＡ分子を提供する。ＲＮＡはプラス鎖であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、逆転写等のいずれの介在する複製ステップも必要とせずに、細胞によって翻訳されることができる。本発明で有用なＲＮＡ分子は、５′キャップを有してもよい（例えば、７−メチルグアノシン）。このキャップにより、ＲＮＡのインビボ翻訳を強化することができる。本発明で有用なＲＮＡ分子の５′ヌクレオチドは、５′三リン酸塩基を有してもよい。キャップされたＲＮＡにおいて、これは、７−メチルグアノシンに、５′から５′への橋を介して連結してもよい。ＲＮＡ分子は、３′ポリＡ尾部を有してもよい。これはまた、ポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を、その３′末端付近に含んでもよい。本発明で有用なＲＮＡ分子は、一本鎖であってもよい。本発明で有用なＲＮＡ分子は、合成ＲＮＡを含んでもよい。
【０２２５】
（４）環状および線状ベクター
１つ以上のベクターは、細胞ゲノムへの取り込みによって標的細胞を形質転換し得るか、または染色体外に存在し得る、環状プラスミドであってもよい（例えば、複製起点を有するプラスミドの自律増殖）。ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または組換え核酸配列構築物によってコードされた重鎖ポリペプチドおよび／もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することが可能な任意の他の発現ベクターであり得る。
【０２２６】
また、電気穿孔を介して対象に効率的に送達され、かつ組換え核酸配列構築物によってコードされた重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することが可能な線状核酸または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）が本明細書で提供される。ＬＥＣは、いずれのリン酸主鎖も持たないいずれの線状ＤＮＡであってもよい。ＬＥＣは、いずれの抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸主鎖も含有しない場合がある。ＬＥＣは、所望の遺伝子発現と無関係の他の核酸配列を含有しない場合がある。
【０２２７】
ＬＥＣは、直線化が可能ないずれのプラスミドに由来してもよい。プラスミドは、組換え核酸配列構築物によってコードされた重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することが可能であってもよい。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または組換え核酸配列構築物によってコードされた重鎖ポリペプチドおよび／もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することが可能な任意の他の発現ベクターであり得る。
【０２２８】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
【０２２９】
（５）双方向性発現ベクター
１つ以上のベクターは、双方向性発現ベクターであってもよい。双方向性ベクターは、目的のタンパク質またはポリペプチド、およびレポータータンパク質を発現するように、あるいは２つの目的のタンパク質またはポリペプチドを単一のプロモーターから発現するように設計されてもよい。発現は、構成的に活性な双方向性ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＰｍｉｎＣＭＶ）によって駆動されてもよい。一実施形態では、第１の目的のポリペプチドはＤＭＡｂであり、第２の目的のポリペプチドは抗原である。一実施形態では、第１の目的のポリペプチドは第１のＤＭＡｂであり、第２の目的のポリペプチドは第２のＤＭＡｂである。一実施形態では、第１および第２のＤＭＡｂのうちの１つ以上は、構造修飾されたＤＭＡｂであってもよい。第２のＤＭＡｂは、第１のＤＭＡｂと同じ抗原、第１のＤＭＡｂと同じウイルス由来の異なる抗原、または異なるウイルスの抗原を標的にしてもよい。例えば、一実施形態では、本発明は、抗ＺＩＫＶ構造修飾ＤＭＡｂと抗ＤＥＮＶ構造修飾ＤＭＡｂとの組み合わせをコードする多価双方向性発現ベクターを提供する。一実施形態では、双方向性発現ベクターは、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、または配列番号１０６から選択されるアミノ酸配列を含む構造修飾されたＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列と、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む構造修飾されたＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列と、を含む。
【０２３０】
（６）ウイルスベクター
本発明の核酸を細胞に送達することが可能なウイルスベクターが本明細書で提供される。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７）、ならびに他のウイルス学および分子生物学の教書において、記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生命体において機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択可能なマーカーを含む。（例えば、国際公開第０１／９６５８４号、同第０１／２９０５８号、および米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を、哺乳動物、例えばヒトの細胞に挿入するために最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス等から導出され得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【０２３１】
（７）ベクターの調製方法
組換え核酸配列構築物が置かれる１つ以上のベクターを調製するための方法が本明細書で提供される。最後のサブクローニングステップの後、ベクターを使用し、当該技術分野で既知の方法を使用して、大規模発酵タンク中に細胞培養物を植菌することができる。
【０２３２】
他の実施形態では、最終サブクローニングステップの後、ベクターは、１つ以上の電気穿孔（ＥＰ）デバイスと共に使用することができる。ＥＰデバイスについては、後により詳細に記載する。
【０２３３】
１つ以上のベクターは、既知のデバイスおよび技法の組み合わせを使用して配合または製造することができるが、２００８年１２月４日公開の国際公開第２００８／１４８０１０号に記載されているプラスミド製造方法を使用して製造されることが好ましい。いくつかの例では、本明細書に記載のＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で配合され得る。製造技術はまた、認可された特許である２００７年７月３日発行の米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含め、米国出願第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般的に既知である様々なデバイスおよびプロトコルを含むか、またはそれらを組み込む。上で参照した出願および特許、それぞれ米国出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３４】
４．抗体
上記のように、組換え核酸配列は、構造修飾されたＤＭＡｂ、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードし得る。構造修飾されたＤＭＡｂは、後により詳細に記載する抗原と結合または反応することができる。
【０２３５】
構造修飾されたＤＭＡｂは、重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）のセットを含んでもよく、これは、ＣＤＲに支持を提供し、かつＣＤＲの互いに対する空間的関係を画定する重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）のセットの間にそれぞれ介在する。ＣＤＲセットは、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含有してもよい。重鎖または軽鎖のＮ末端から始めて、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含んでもよい。
【０２３６】
タンパク質分解酵素のパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片を生み、これらのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は、各々、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロ二量体を含む。酵素のペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を含むいくつかの断片を提供することが可能であり、これらの断片は、両方の抗原結合部位を含む。したがって、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
【０２３７】
構造修飾されたＤＭＡｂは、免疫グロブリン（Ｉｇ）を含み得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
【０２３８】
構造修飾されたＤＭＡｂは、重鎖および軽鎖のそれぞれＣＨ１およびＣＬ領域が欠如していてもよい。そのような実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、一本鎖ＤＭＡｂであってもよく、かつＶＬ領域をＶＨ領域に係止する働きをする柔軟なアミノ酸リンカー配列を含んでもよい。構造修飾されたＤＭＡｂは、ＶＬ領域、リンカー、ＶＨ領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む一本鎖を含んでもよい。ＶＨ領域は、ＶＬ領域にリンカーを介してＮ末端またはＣ末端連結し得る。
【０２３９】
構造修飾されたＤＭＡｂは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有する所望の抗原に結合する、非ヒト種由来の抗体であり得る。
【０２４０】
構造修飾されたＤＭＡｂは、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、またはＩｇＭ抗体であり得る。構造修飾されたＤＭＡｂは、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、またはＩｇＭ抗体のうちのいずれかのキメラであり得る。いくつかの実施形態では、抗体ヒンジドメインは修飾される。例えば、一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、ヒンジドメイン中でセリンからプロリンへのアミノ酸置換を含む。
【０２４１】
構造修飾されたＤＭＡｂは、後により詳細に記載するように、二重特異性抗体であり得る。抗体は、これも後により詳細に記載するように、二機能性抗体であり得る。
【０２４２】
上記のように、組成物を対象に投与すると、抗体が対象において生成され得る。抗体は、対象内での半減期を有してもよい。いくつかの実施形態では、抗体を修飾して、対象内でのその半減期を延長または短縮してもよい。そのような修飾については、後により詳細に記載する。
【０２４３】
抗体は、後により詳細に記載するように、脱フコシル化され得る。
【０２４４】
抗体を修飾して、後により詳細に記載するように、抗原に関連付けられる疾患の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を低減または防止してもよい。
【０２４５】
ａ．二重特異性抗体
組換え核酸配列は、二重特異性構造修飾されたＤＭＡｂ、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードし得る。二重特異性抗体は、２つの抗原、例えば、後により詳細に記載する抗原のうちの２つと結合または反応し得る。二重特異性抗体は、本明細書に記載の抗体のうちの２つの断片で構成されてもよく、それにより、二重特異性抗体が、後により詳細に記載する抗原、受容体のためのリガンドを含むリガンド、受容体上のリガンド結合部位を含む受容体、リガンド−受容体複合体、および癌マーカーを含むマーカーを含んでもよい、２つの所望の標的分子と結合または反応することが可能となる。
【０２４６】
本発明は、産生能、安定性、結合親和性、生物学的活性、ある特定のＴ細胞の特異的標的化、標的化効率、および低減した毒性等の特に有利な特性を有する、第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位と第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む新規の二重特異性抗体を提供する。いくつかの場合には、二重特異性抗体が高い親和性で第１の標的に結合し、低い親和性で第２の標的に結合する、二重特異性抗体が存在する。他の場合には、二重特異性抗体が低い親和性で第１の標的に結合し、高い親和性で第２の標的に結合する、二重特異性抗体が存在する。他の場合には、二重特異性抗体が、所望の親和性で第１の標的に結合し、所望の親和性で第２の標的に結合する、二重特異性抗体が存在する。
【０２４７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原に特異的に結合している抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と、ｂ）第２の抗原に特異的に結合している抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖とを含む、二価抗体である。
【０２４８】
本発明による二重特異性抗体分子は、任意の所望の特異性の２つの結合部位を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明による抗体分子の結合部位のうちの１つは、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子に結合することが可能である。Ｔ細胞特異的受容体は、いわゆる「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）であり、これにより、Ｔ細胞が、抗原提示細胞またはＡＰＣと呼ばれる別の細胞によって提示されるエピトープ／抗原に結合し、追加のシグナルが存在する場合には、このエピトープ／抗原によって活性化され、それに応答することができるようになる。Ｔ細胞受容体は、天然に存在する免疫グロブリンのＦａｂ断片に似ていることが知られている。これは、一般的に、アルファおよびベータ鎖を含む一価であり、いくつかの実施形態では、ガンマ鎖およびデルタ鎖を含む（上記参照）。したがって、いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲ（アルファ／ベータ）であり、いくつかの実施形態では、これはＴＣＲ（ガンマ／デルタ）である。Ｔ細胞受容体は、ＣＤ３  Ｔ細胞共受容体と複合体を形成する。ＣＤ３は、タンパク質複合体であり、４つの別々の鎖で構成される。哺乳動物では、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３６鎖、および２つのＣＤ３Ｅ鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子およびζ鎖と会合して、Ｔリンパ球中で活性化シグナルを生成する。故に、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的受容体は、ＣＤ３  Ｔ細胞共受容体である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞特異的受容体は、Ｔ細胞上でも発現されるタンパク質であるＣＤ２８である。ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化に必要とされる共刺激性シグナルを提供し得る。ＣＤ２８は、Ｔ細胞増殖および生存、サイトカイン産生、ならびにＴヘルパー２型の発達に重要な役割を果たす。Ｔ細胞特異的受容体のなおさらなる例は、Ｏｘ４０とも称されるＣＤ１３４である。ＣＤ１３４／ＯＸ４０は、活性化から２４〜７２時間後に発現され、二次共刺激性分子の定義に用いられる。Ｔ細胞受容体の別の例は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で４−１  ＢＢ−リガンドに結合することができ、それによりＴ細胞のための共刺激性シグナルを生成する、４−１  ＢＢである。主にＴ細胞上で見られる受容体の別の例は、ＣＤ５であり、これはＢ細胞上でも低いレベルで見られる。Ｔ細胞機能を修飾する受容体のさらなる例は、Ｆａｓ受容体としても知られるＣＤ９５であり、これは、他の細胞の表面で発現されるＦａｓ−リガンドによるアポトーシスシグナル伝達を媒介する。ＣＤ９５は、休止Ｔリンパ球におけるＴＣＲ／ＣＤ３駆動型シグナル伝達経路を調節すると報告されている。
【０２４９】
ＮＫ細胞特異的受容体分子の例は、低親和性Ｆｃ受容体およびＮＫＧ２ＤであるＣＤ１６である。Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞との両方の表面で提示される受容体分子の例は、ＣＤ２、およびＣＤ２スーパーファミリーのさらなるメンバーである。ＣＤ２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上で共刺激性分子として作用することが可能である。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、抗体分子の第１の結合部位は、標的抗原に結合し、第２の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合する。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、抗体分子の第１の結合部位は、ウイルス抗原（例えば、エボラウイルスＧＰグリカンキャップ、エボラウイルスＧＰ融合ループ、またはエボラウイルスＧＰカリスベース（ｃｈａｌｉｃｅ  ｂａｓｅ））または自己抗原（例えば、腫瘍抗原）を含むがこれらに限定されない、標的抗原に結合し、第２の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合する。いくつかの実施形態では、抗体分子の第１の結合部位は、標的抗原に結合し、第２の結合部位は、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ９５のうちの１つに結合する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、抗体分子の第１の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合し、第２の結合部位は、ウイルス抗原（例えば、エボラウイルスＧＰグリカンキャップ、エボラウイルスＧＰ融合ループ、またはエボラウイルスＧＰカリスベース）および自己抗原（例えば、腫瘍抗原）を含むがこれらに限定されない、標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗体の第１の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子に結合し、第２の結合部位は、標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、抗体の第１の結合部位は、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ９５のうちの１つに結合し、第２の結合部位は、標的抗原に結合する。
【０２５３】
ｂ．二機能性抗体
組換え核酸配列は、二機能性構造修飾されたＤＭＡｂ、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードし得る。二機能性抗体は、下記の抗原と結合または反応することができる。二機能性抗体はまた、抗原の認識および抗原への結合の他に、抗体に追加の機能を与えるように修飾することができる。そのような修飾には、Ｈ因子またはその断片へのカップリングが含まれ得るが、これらに限定されない。Ｈ因子は、補体活性化の可溶性調節因子であるので、補体媒介性溶解（ＣＭＬ）を介した免疫応答に寄与し得る。
【０２５４】
ｃ．抗体半減期の延長
上記のように、構造修飾されたＤＭＡｂを修飾して、対象における抗体の半減期を延長または短縮してもよい。修飾により、対象の血清における抗体の半減期が延長または短縮され得る。
【０２５５】
修飾は、抗体の定常領域に存在してもよい。修飾は、１つ以上のアミノ酸置換を含有しない抗体の半減期と比較して、抗体の半減期を延長する、抗体の定常領域における１つ以上のアミノ酸置換であってもよい。修飾は、１つ以上のアミノ酸置換を含有しない抗体の半減期と比較して、抗体の半減期を延長する、抗体のＣＨ２ドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換であってもよい。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、定常領域における１つ以上のアミノ酸置換は、定常領域におけるメチオニン残基のチロシン残基での代置、定常領域におけるセリン残基のトレオニン残基での代置、定常領域におけるトレオニン残基のグルタミン酸残基での代置、またはそれらの任意の組み合わせを含むことで、抗体の半減期を延長してもよい。
【０２５７】
他の実施形態では、定常領域における１つ以上のアミノ酸置換は、ＣＨ２ドメインにおけるメチオニン残基のチロシン残基での代置、ＣＨ２ドメインにおけるセリン残基のトレオニン残基での代置、ＣＨ２ドメインにおけるトレオニン残基のグルタミン酸残基での代置、またはそれらの任意の組み合わせを含むことで、抗体の半減期を延長してもよい。
【０２５８】
ｄ．脱フコシル化
組換え核酸配列は、フコシル化されていない構造修飾されたＤＭＡｂ（即ち、脱フコシル化抗体または非フコシル化抗体）、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードすることができる。フコシル化は、糖フコースの分子への付加、例えば、フコースのＮ−グリカン、Ｏ−グリカン、および糖脂質への付加を含む。したがって、脱フコシル化抗体において、フコースは、定常領域の炭水化物鎖に付着していない。こうして、このフコシル化の欠如により、フコシル化抗体と比較して、抗体によるＦｃγＲＩＩＩａ結合および抗体指向細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性が改善され得る。したがって、いくつかの実施形態では、非フコシル化抗体は、フコシル化抗体と比較して増加したＡＤＣＣ活性を呈し得る。
【０２５９】
構造修飾されたＤＭＡｂは、抗体のフコシル化を防止または阻害するように修飾してもよい。いくつかの実施形態では、そのような修飾された抗体は、修飾されていない抗体と比較して増加したＡＤＣＣ活性を呈し得る。修飾は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせにあってもよい。修飾は、重鎖における１つ以上のアミノ酸置換、軽鎖における１つ以上のアミノ酸置換、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０２６０】
ｅ．低減したＡＤＥ応答
構造修飾されたＤＭＡｂは、抗原に関連付けられる疾患の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を低減または防止するが、依然として抗原を中和するように修飾してもよい。例えば、抗体は、後により詳細に記載するＤＥＮＶと関連付けられる疾患のＡＤＥを低減または防止するが、依然としてＤＥＮＶを中和するように修飾してもよい。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、抗体を修飾して、抗体のＦｃｙＲ１ａへの結合を低減または防止する１つ以上のアミノ酸置換を含めてもよい。１つ以上のアミノ酸置換は、抗体の定常領域にあってもよい。１つ以上のアミノ酸置換は、抗体の定常領域におけるロイシン残基のアラニン残基への代置、即ち、ＬＡ、ＬＡ突然変異、またはＬＡ置換としても本明細書で知られるものを含んでよい。１つ以上のアミノ酸置換は、抗体の定常領域における２つのロイシン残基の各々のアラニン残基での代置を含んでよく、またＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ突然変異、またはＬＡＬＡ置換としても本明細書で知られている。ＬＡＬＡ置換が存在することにより、抗体のＦｃｙＲ１ａへの結合が防止または遮断され得るため、修飾された抗体が抗原に関連付けられる疾患のＡＤＥを強化または誘発しないが、依然として抗原を中和するようになる。
【０２６２】
５．抗原
本発明の構造修飾されたＤＭＡｂは、抗原もしくは断片またはその変異体を指向する。抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、多糖、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。多糖は、核酸でコードされた多糖であり得る。
【０２６３】
一実施形態では、本発明の合成抗体は、２つ以上の抗原を標的とする。一実施形態では、二重特異性抗体の少なくとも１つの抗原は、本明細書に記載の抗原から選択される。一実施形態では、２つ以上の抗原は、本明細書に記載の抗原から選択される。
【０２６４】
抗原は、任意の数の生命体、例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、または哺乳動物に由来し得る。抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息に関連し得る。他の実施形態では、抗原は、癌、ヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連し得る。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、抗原は外来である。いくつかの実施形態では、抗原は自己抗原である。
【０２６６】
ａ．外来抗原
いくつかの実施形態では、抗原は外来である。外来抗原は、体内に導入されたときに、免疫応答を刺激することができる任意の非自己物質（即ち、対象の外部で生じる）である。
【０２６７】
（１）ウイルス抗原
外来抗原は、ウイルス抗原、またはその断片、またはその変異体であってもよい。ウイルス抗原は、以下の科：アデノウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、ポリオーマ科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、またはトガウイルス科のうちの１つのウイルスに由来し得る。ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、天然痘ウイルス（大痘瘡および小痘瘡）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヘアリーセル白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（口腔ヘルペス）、単純ヘルペスウイルス２型（性器ヘルペス）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹、別名は水疱瘡）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えば、ヒトＣＭＶ、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、ラッサウイルス、アレナウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、または発癌性ウイルスに由来し得る。
【０２６８】
（ａ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原
ウイルス抗原は、ヒト免疫不全（ＨＩＶ）ウイルスであってもよい。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ抗原は、Ａ亜型エンベロープタンパク質、Ｂ亜型エンベロープタンパク質、Ｃ亜型エンベロープタンパク質、Ｄ亜型エンベロープタンパク質、Ｂ亜型Ｎｅｆ−Ｒｅｖタンパク質、ＧａｇのＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤ亜型タンパク質、ＭＰｏｌタンパク質、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、またはそれらの任意の組み合わせの核酸またはアミノ酸配列であり得る。
【０２６９】
（ｂ）チクングニアウイルス
ウイルス抗原は、チクングニアウイルスに由来してもよい。チクングニアウイルスは、トガウイルス科のアルファウイルス属に属する。チクングニアウイルスは、感染したヤブカ属等の蚊に刺されることによってヒトに伝播される。
【０２７０】
（ｃ）デングウイルス
ウイルス抗原は、デングウイルスに由来してもよい。デングウイルス抗原は、ウイルス粒子を形成する３つのタンパク質またはポリペプチド（Ｃ、ｐｒＭ、およびＥ）のうちの１つであってもよい。デングウイルス抗原は、ウイルスの複製に関与する７つの他のタンパク質またはポリペプチド（ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５）のうちの１つであってもよい。デングウイルスは、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、およびＤＥＮＶ−４を含むウイルスの５つの株または血清型のうちの１つであってもよい。抗原は、複数のデングウイルス抗原の任意の組み合わせであってもよい。
【０２７１】
デングウイルスに特異的な例示の構造修飾されたＤＭＡｂには、配列番号１０８をコードする配列番号１０７に列挙された構造修飾されたＤＭＡｂが挙げられるが、これに限定されない。
【０２７２】
（ｄ）肝炎抗原
ウイルス抗原は、肝炎ウイルス抗原（即ち、肝炎抗原）、またはその断片、またはその変異体を含んでもよい。肝炎抗原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、および／またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）のうちの１つ以上に由来する抗原または免疫原であり得る。
【０２７３】
肝炎抗原は、ＨＡＶ由来の抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＡＶカプシドタンパク質、ＨＡＶ非構造タンパク質、それらの断片、それらの変異体、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０２７４】
肝炎抗原は、ＨＣＶ由来の抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（即ち、コアタンパク質）、ＨＣＶエンベロープタンパク質（例えば、Ｅ１およびＥ２）、ＨＣＶ非構造タンパク質（例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂ）、それらの断片、それらの変異体、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０２７５】
肝炎抗原は、ＨＤＶ由来の抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＤＶデルタ抗原、その断片、またはその変異体であり得る。
【０２７６】
肝炎抗原は、ＨＥＶ由来の抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＥＶカプシドタンパク質、その断片、またはその変異体であり得る。
【０２７７】
肝炎抗原は、ＨＢＶ由来の抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ、遺伝子ＸによってコードされたＨＢＶタンパク質、それらの断片、それらの変異体、またはそれらの組み合わせであり得る。肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質、それらの断片、それらの変異体、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ、またはＨＢＶ遺伝子型Ｈに由来する抗原であり得る。
【０２７９】
（ｅ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原
ウイルス抗原は、ＨＰＶ由来の抗原を含んでもよい。ＨＰＶ抗原は、子宮頸癌、直腸癌、および／または他の癌を引き起こす、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、４５、５２、および５８型に由来し得る。ＨＰＶ抗原は、性器疣贅を引き起こし、また頭頸部癌の原因として知られる、ＨＰＶ６および１１型に由来し得る。
【０２８０】
ＨＰＶ抗原は、各ＨＰＶ型のＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７ドメインであり得る。例えば、ＨＰＶ  １６型（ＨＰＶ１６）の場合、ＨＰＶ１６抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、それらの断片、変異体、または組み合わせを含むことができる。同様に、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ  ６  Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ  １１  Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ  １８  Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ  ３１  Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ  ３３  Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ  ５２  Ｅ６および／もしくはＥ７、またはＨＰＶ  ５８  Ｅ６および／もしくはＥ７、それらの断片、変異体、または組み合わせであってもよい。
【０２８１】
（ｆ）ＲＳＶ抗原
ウイルス抗原は、ＲＳＶ抗原を含んでもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ融合タンパク質（本明細書において「ＲＳＶ  Ｆ」、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質」、および「Ｆタンパク質」とも称される）、またはその断片もしくは変異体であり得る。ヒトＲＳＶ融合タンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間に保存することができる。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９４．１）由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ａ２株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＢ５９８５８．１）由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体の単量体、二量体、または三量体であり得る。
【０２８２】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、融合前形態または融合後形態であり得る。ＲＳＶ  Ｆの融合後形態は、免疫動物において高力価の中和抗体を誘発し、動物をＲＳＶへの曝露から保護する。
【０２８３】
ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶ付着糖タンパク質（本明細書において「ＲＳＶ  Ｇ」、「ＲＳＶ  Ｇタンパク質」、および「Ｇタンパク質」とも称される）、またはその断片もしくは変異体であり得る。ヒトＲＳＶ  Ｇタンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間で異なる。抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９３）由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５６０１、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１０６８、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５５９８、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１１２３、またはそれらの断片もしくは変異体からのＲＳＶ  Ｇタンパク質であり得る。
【０２８４】
他の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質１（「ＮＳ１タンパク質」）、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８７．１）由来のＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ヒトＲＳＶ抗原はまた、ＲＳＶ非構造タンパク質２（「ＮＳ２タンパク質」）、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８８．１）由来のＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原はさらに、ヒトＲＳＶヌクレオカプシド（「Ｎ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８９．１）由来のＲＳＶ  Ｎタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶリン酸化タンパク質（「Ｐ」）  タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９０．１）由来のＲＳＶ  Ｐタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶ基質タンパク質（「Ｍ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９１．１）由来のＲＳＶ  Ｍタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。
【０２８５】
さらに他の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ小疎水性（「ＳＨ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９２．１）由来のＲＳＶ  ＳＨタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶ基質タンパク質２−１（「Ｍ２−１」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９５．１）由来のＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ＲＳＶ抗原はさらに、ヒトＲＳＶ基質タンパク質２−２（「Ｍ２−２」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９７．１）由来のＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。ヒトＲＳＶ抗原は、ＲＳＶポリメラーゼＬ（「Ｌ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９６．１）由来のＲＳＶ  Ｌタンパク質、またはその断片もしくは変異体であり得る。
【０２８６】
さらなる実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＬタンパク質の最適化されたアミノ酸配列を有し得る。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶゲノムによってコードされたタンパク質のうちのいずれか１つ等の、ヒトＲＳＶタンパク質または組換え抗原であり得る。
【０２８７】
他の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株のヒトＲＳＶゲノム、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｎタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｐタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  ＳＨタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ  Ｌタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５６０１由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１０６８由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５５９８由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１１２３由来のＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはそれらの断片、またはそれらの変異体であり得るが、これらに限定されない。
【０２８８】
ＲＳＶに特異的な例示的な構造修飾されたＤＭＡｂには、配列番号１１０〜配列番号１１９に列挙される構造修飾されたＤＭＡｂが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８９】
（ｇ）インフルエンザ抗原
ウイルス抗原は、インフルエンザウイルス由来の抗原を含んでもよい。インフルエンザ抗原は、哺乳動物において１つ以上のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を誘発することができる抗原である。抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含むことができる。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡ血清型Ｈ１、血清型Ｈ２、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の異なるセットの多数の株に由来するハイブリッド配列の多の株に由来してもよく、あるいはインフルエンザＢの多数の株に由来してもよい。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＢに由来してもよい。
【０２９０】
インフルエンザ抗原は、免疫応答が誘導され得る特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的であり得る少なくとも１つの抗原エピトープを含有することもできる。抗原は、免疫原性部位の全レパートリーと、インタクトなインフルエンザウイルス中に存在するエピトープとを提供することができる。抗原は、血清型Ｈ１または血清型Ｈ２の複数のインフルエンザＡウイルス株等の、１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列に由来してもよい。抗原は、２つの異なるヘマグルチニン抗原配列またはその一部を組み合わせることによって得られるハイブリッドヘマグルチニン抗原配列であってもよい。２つの異なるヘマグルチニン抗原配列の各々は、血清型Ｈ１の複数のインフルエンザＡウイルス株等の、１つの血清型の異なるセットの複数のインフルエンザＡウイルス株に由来し得る。抗原は、複数のインフルエンザＢウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列に由来するヘマグルチニン抗原配列であってもよい。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、またはＢＨＡ抗原であってもよい。
【０２９２】
（ｈ）エボラウイルス
ウイルス抗原は、エボラウイルスに由来してもよい。エボラウイルス疾患（ＥＶＤ）またはエボラ出血熱（ＥＨＦ）には、ブンディブギョウイルス（ＢＤＢＶ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、スーダンウイルス（ＳＵＤＶ）、およびタイフォレストウイルス（ＴＡＦＶ、コートジボワールエボラウイルス（アイボリーコーストウイルス、ＣＩＥＢＯＶ）とも称される）を含む５つの既知のエボラウイルスのうちの４つのいずれかが含まれる。
【０２９３】
構造修飾されたＤＭＡｂは、エボラウイルス抗原に特異的であってもよい。エボラウイルスに特異的な例示的な構造修飾されたＤＭＡｂには、配列番号１〜配列番号４６に列挙される構造修飾されたＤＭＡｂが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９４】
（ｉ）マールブルグマールブルグウイルス
ウイルス抗原は、マールブルグマールブルグウイルスに由来してもよい。マールブルグウイルス病（ＭＶＤ）またはマールブルグ出血熱（ＥＨＦ）には、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）およびラブン（Ｒａｖｎ）ウイルス（ＲＡＶＶ）を含む５つの既知のマールブルグウイルスのうちの４つのいずれかを含む。
【０２９５】
マールブルグウイルスの多数のサブタイプまたは血清型に対する幅広い免疫を誘導するために使用され得るマールブルグウイルス免疫原。抗原は、マールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質から誘導されてもよい。
【０２９６】
（ｊ）ジカウイルス
ウイルス抗原は、ジカウイルスに由来してもよい。ジカ病は、ジカウイルスによる感染によって引き起こされ、感染した蚊に刺されることによってヒトに伝播し得るか、またはヒトの間で性感染し得る。ジカ抗原は、ジカウイルスエンベロープタンパク質、ジカウイルスＮＳ１タンパク質、またはジカウイルスカプシドタンパク質を含み得る。
【０２９７】
構造修飾されたＤＭＡｂは、ジカウイルス抗原に特異的であってもよい。ジカウイルスに特異的な例示的な構造修飾されたＤＭＡｂには、配列番号６３〜配列番号１０６に列挙される構造修飾されたＤＭＡｂが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９８】
（２）細菌抗原
外来抗原は、細菌抗原またはその断片もしくは変異体であってもよい。細菌は、以下の門：Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、およびＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａのうちのいずれか１つに由来し得る。
【０２９９】
細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であってもよい。細菌は、好気性細菌または嫌気性細菌であってもよい。細菌は、独立栄養細菌または従属栄養細菌であってもよい。細菌は、中温菌、好中球菌、好極限性細菌、好酸球菌、好アルカリ菌、好熱菌、低温菌、好塩菌、または好濃菌であってもよい。
【０３００】
細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性菌、病原菌、食中毒菌、感染性細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌、または破傷風菌であってもよい。細菌は、マイコバクテリア、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅであってもよい。細菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであってもよい。
【０３０１】
（ａ）緑膿菌抗原
細菌抗原は、緑膿菌抗原であってもよい。例えば、一実施形態では、抗原は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、またはその断片、またはその変異体であってもよい。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原は、毒性因子に由来してもよい。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａと関連付けられる毒性因子には、構造成分、酵素、および毒素が挙げられるが、これらに限定されない。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ毒性因子は、エキソ多糖類、付着因子、リポ多糖類、ピオシアニン、外毒素Ａ、外毒素Ｓ、細胞毒素、エラスターゼ、アルカリプロテアーゼ、ホスホリパーゼＣ、ラムノリピド、および細菌分泌系の成分のうちの１つであり得る。
【０３０２】
一実施形態では、緑膿菌抗原は、細胞外多糖類（例えば、アルギン酸塩、Ｐｅｌ、およびＰｓｌ）である。一実施形態では、抗原は、多糖類合成座位（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｌｏｃｕｓ（ｐｓｌ））、その中に含有される遺伝子（例えば、ｐｓｌＡ、ｐｓｌＢ、ｐｓｌＣ、ｐｓｌＤ、ｐｓｌＥ、ｐｓｌＦ、ｐｓｌＧ、ｐｓｌＨ、ｐｓｌＩ、ｐｓｌＪ、ｐｓｌＫ、ｐｓｌＬ、ｐｓｌＭ、ｐｓｌＮ、およびｐｓｌＯ）、その中にコードされたタンパク質もしくは酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホマンノースイソメラーゼ／ＧＤＰ−Ｄ−マンノースピロホスホリラーゼ、輸送体、加水分解酵素、ポリメラーゼ、アセチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、およびトポイソメラーゼ）、またはそれらから産生される産物（例えば、「Ｐｓｌ」と称されるＰｓｌ菌体外多糖類）のうちの１つである。
【０３０３】
一実施形態では、緑膿菌抗原は、細菌分泌系の構成要素である。６つの異なるクラスの分泌系（Ｉ〜ＶＩ型）が細菌において説明されており、それらのうちの５つ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩ、Ｖ、およびＶＩ型）が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含めて、グラム陰性菌中に見られる。一実施形態では、抗原は、Ｉ型分泌系の遺伝子（例えば、ａｐｒまたはｈａｓ遺伝子）またはタンパク質（例えば、ＡｐｒＤ、ＡｐｒＥ、ＡｐｒＦ、ＨａｓＤ、ＨａｓＥ、ＨａｓＦ、およびＨａｓＲ）または分泌されたタンパク質（例えば、ＡｐｒＡ、ＡｐｒＸ、およびＨａｓＡｐ）のうちの１つである。一実施形態では、抗原は、ＩＩ型分泌系の遺伝子（例えば、ｘｃｐＡ／ｐｉｌＤ、ｘｐｈＡ、ｘｑｈＡ、ｘｃｐＰ〜Ｑ、およびｘｃｐＲ〜Ｚ）またはタンパク質（例えば、ＧｓｐＣ〜Ｍ、ＧｓｐＡＢ、ＧｓｐＮ、ＧｓｐＯ、ＧｓｐＳ、ＸｃｐＴ〜ＸｃｐＸ、ＦｐｐＡ）または分泌されたタンパク質（例えば、ＬａｓＢ、ＬａｓＡ、ＰｌｃＨ、ＰｌｃＮ、ＰｌｃＢ、ＣｂｐＤ、ＴｏｘＡ、ＰｍｐＡ、ＰｒｐＬ、ＬｉｐＡ、ＬｉｐＣ、ＰｈｏＡ、ＰｓＡＰ、ＬａｐＡ）のうちの１つである。一実施形態では、抗原は、ＩＩＩ型分泌系の遺伝子（例えば、ｐｓｃ、ｐｃｒ、ｐｏｐ、またはｅｘｓ遺伝子）またはタンパク質（例えば、ＰｓｃＣ、ＰｓｃＥ〜ＰｓｃＦ、ＰｓｃＪ、ＰｓｃＮ、ＰｓｃＰ、ＰｓｃＷ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＤ、ＰｃｒＨ、およびＰｃｒＶ）または分泌されたタンパク質（例えば、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＵ、およびＥｘｏＹ）のうちの１つである。一実施形態では、抗原は、ＩＩＩ型分泌系の調節因子（例えば、ＥｘｓＡおよびＥｘｓＣ）である。一実施形態では、抗原は、Ｖ型分泌系の遺伝子（例えば、ｅｓｔＡ）またはタンパク質（例えば、ＥｓｔＡ、ＣｕｐＢ３、ＣｕｐＢ５、およびＬｅｐＢ）または分泌されたタンパク質（例えば、ＥｓｔＡ、ＬｅｐＡ、およびＣｕｐＢ５）のうちの１つである。一実施形態では、抗原は、ＶＩ型分泌系の遺伝子（例えば、ＨＳＩ−Ｉ、ＨＳＩ−ＩＩ、およびＨＳＩ−ＩＩＩ遺伝子）またはタンパク質（例えば、Ｆｈａ１、ＣｌｐＶ１、ＶｇｒＧタンパク質、またはＨｃｐタンパク質）または分泌されたタンパク質（例えば、Ｈｃｐ１）のうちの１つである。
【０３０４】
（ｂ）ボレリア抗原
細菌抗原は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ抗原、またはその断片、またはその変異体であってもよい。Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ抗原は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉｅｌｌａ  ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｃｈｉｌｅｎｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｖａｌａｉｓｉａｎａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｅｎｓｉｓのうちのいずれか１つに由来し得る。
【０３０５】
細菌抗原は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ抗原、またはその断片、またはその変異体であってもよい。Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ抗原は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐの複製または生存を可能にする細菌産物に由来し得る。Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐの複製または生存を可能にする細菌産物には、構造成分、酵素、および毒素が含まれるが、これらに限定されない。そのような産物は、リポタンパク質、外表面タンパク質、脊椎動物宿主内での感染性または持続性に必要とされる産物、ならびに運動性および走化性に関与する産物のうちの１つであり得る。
【０３０６】
一実施形態では、抗原は、リポタンパク質（例えば、ＢｐｔＡ）である。一実施形態では、抗原は、外表面タンパク質（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、およびＯｓｐＣ）である。一実施形態では、抗原は、脊椎動物宿主内での感染性または持続性に必要とされる産物（例えば、ＰｎｃＡ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ、Ｂｇｐ、Ｐ６６、およびＶｌｓＥ）である。
【０３０７】
（ｃ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原
細菌抗原は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原（即ち、ＴＢ抗原またはＴＢ免疫原）、またはその断片、またはその変異体であってもよい。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＡｇ８５ファミリー、例えば、Ａｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂに由来してもよい。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＥｓｘファミリー、例えば、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ、およびＥｓｘＷに由来してもよい。
【０３０８】
（３）寄生虫抗原
外来抗原は、寄生虫抗原またはその断片もしくは変異体であってもよい。寄生虫は、原虫、原生動物、または外寄生生物であってもよい。蠕虫（即ち、虫）は、扁形動物（例えば、吸虫および条虫）、鉤頭虫、または回虫（例えば、蟯虫）であってもよい。外部寄生生物は、シラミ、ノミ、マダニ、およびコダニであってもよい。
【０３０９】
寄生虫は、以下の疾患のうちのいずれか１つの原因となる任意の寄生虫であり得る：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症、シャーガス病、肝吸虫症、らせん虫感染症、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮症、腸蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、および鞭虫症。
【０３１０】
寄生虫は、アカントアメーバ、アニサキス、回虫、ウマバエ、大腸バランチジウム、トコジラミ、サナダムシ（条虫）、ツツガムシ、ラセンウジバエ、赤痢アメーバ、肝蛭、ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、パラゴニムス−肺吸虫、蟯虫、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、住血吸虫、糞線虫、コダニ、条虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、またはバンクロフト糸状虫であってもよい。
【０３１１】
（ａ）ライム抗原
細菌抗原は、ライム病抗原であってもよい。抗原は、外表面タンパク質Ａ抗原（ＯｓｐＡ抗原）、またはその断片、またはその変異体であってもよい。抗原は、マラリアの原因となる寄生虫に由来し得る。ライム病は、細菌のＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉによって引き起こされ、感染したＩｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ（クロアシダニまたはシカダニ）に刺されることによってヒトに伝播する。
【０３１２】
（ｂ）マラリア抗原
外来抗原は、マラリア抗原（即ち、ＰＦ抗原またはＰＦ免疫原）、またはその断片、またはその変異体であってもよい。抗原は、マラリアの原因となる寄生虫に由来し得る。マラリアの原因となる寄生虫は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍであってもよい。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原は、サーカムスポロゾイト（ＣＳ）抗原を含み得る。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、マラリア抗原は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ免疫原ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１のうちの１つであり得る。免疫原は、全長タンパク質、または全長タンパク質の免疫原性断片であってもよい。
【０３１４】
他の実施形態では、マラリア抗原は、ＳＳＰ２とも称されるＴＲＡＰであり得る。さらに他の実施形態では、マラリア抗原は、ＣｅｌＴＯＳであってもよく、これはまたＡｇ２とも称され、高度に保存されたマラリア原虫抗原である。さらなる実施形態では、マラリア抗原は、高度に保存されたマラリア原虫抗原であるＡｍａ１であってもよい。いくつかの実施形態では、マラリア抗原はＣＳ抗原であり得る。
【０３１５】
他の実施形態では、マラリア抗原は、本明細書に記載されるＰＦタンパク質のうちの２つ以上の組み合わせを含む融合タンパク質であってもよい。例えば、融合タンパク質は、ＣＳ免疫原、ＣｏｎＬＳＡ１免疫原、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原、および互いに直接隣接して連結するか、または間にスペーサーもしくは１つ以上のアミノ酸を伴って連結するＣｏｎＡｍａ１免疫原のうちの２つ以上を含んでもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、２つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、３つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、４つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、５つのＰＦ免疫原を含む。２つのＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳおよびＬＳＡ１；ＣＳおよびＴＲＡＰ；ＣＳおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳおよびＡｍａ１；ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；またはＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含んでもよい。３つのＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、およびＴＲＡＰ；ＣＳ、ＬＳＡ１、およびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、およびＡｍａ１；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＡｍａ１；またはＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１を含んでもよい。４つのＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＡｍａ１；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１；ＣＳ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１；またはＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１を含んでもよい。５つのＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１を含んでもよい。
【０３１６】
（４）真菌抗原
外来抗原は、真菌抗原またはその断片もしくは変異体であってもよい。真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ、皮膚糸状菌、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、またはＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍであってもよい。
【０３１７】
ｂ．自己抗原
いくつかの実施形態では、抗原は自己抗原である。自己抗原は、免疫応答を刺激することができる対象自身の身体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態では、自己抗原は、対象が疾患状態、例えば自己免疫疾患にない限り、免疫応答を促さない。
【０３１８】
自己抗原には、サイトカイン、ＨＩＶおよびデングを含む上に列挙したウイルス等のウイルスに対する抗体、癌の進行または発生に影響する抗原、ならびに細胞表面受容体または膜貫通タンパク質を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０３１９】
（１）ＷＴ−１
自己抗原抗原は、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子１（ＷＴ１）、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせであり得る。ＷＴ１は、Ｎ末端でプロリン／グルタミンに富むＤＮＡ結合ドメインを、Ｃ末端で４つの亜鉛フィンガーモチーフを含有する転写因子である。ＷＴ１は、泌尿生殖器系の正常な発達において役割を果たし、多数の因子、例えば、既知の腫瘍抑制因子であるｐ５３、および細胞毒性薬による治療後にＷＴ１を多数の部位で切断するセリンプロテアーゼＨｔｒＡ２と相互作用する。ＷＴ１の突然変異は、腫瘍または癌形成、例えば、ウィルムス腫瘍またはＷＴ１を発現する腫瘍を引き起こし得る。
【０３２０】
（２）ＥＧＦＲ
自己抗原には、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）またはその断片もしくは変異体が含まれてもよい。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１およびＨＥＲ１とも称される）は、細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーの細胞表面受容体である。ＥＧＦＲは、受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーであり、これには、４つの密接に関係した受容体チロシンキナーゼであるＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ  ３（ＥｒｂＢ−３）、およびＨｅｒ  ４（ＥｒｂＢ−４）が含まれる。ＥＧＦＲ発現または活性に影響する突然変異により、癌が生じ得る。
【０３２１】
抗原には、ＥｒｂＢ−２抗原が含まれてもよい。Ｅｒｂ−２（ヒト上皮成長因子受容体２）は、Ｎｅｕ、ＨＥＲ２、ＣＤ３４０（表面抗原分類３４０）、またはｐ１８５としても知られ、ＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされる。この遺伝子の増幅または過剰発現は、ある特定の侵攻型の乳癌の発生および進行に役割を果たすことが示されている。乳癌を患う女性の約２５〜３０％において、ＥＲＢＢ２遺伝子中の遺伝子改変が生じ、その結果、増加した量のＨＥＲ２が腫瘍細胞の表面上で産生される。このＨＥＲ２の過剰発現により急速な細胞分裂が促進されるため、ＨＥＲ２が腫瘍細胞をマークする。
【０３２２】
（３）コカイン
自己抗原には、コカイン受容体抗原が含まれてもよい。コカイン受容体には、ドーパミン輸送体が含まれる。
【０３２３】
（４）ＰＤ−１
自己抗原には、プログラム死１（ＰＤ−１）が含まれてもよい。プログラム死１（ＰＤ−１）ならびにそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、Ｔ細胞活性化、寛容、および免疫病理学の間の均衡を調節する阻害シグナルを送達する。ＰＤ−１は、細胞外ＩｇＶドメイン、その後に膜貫通領域および細胞内尾部を含む、２８８アミノ酸細胞表面タンパク質分子である。
【０３２４】
（５）ＬＡＧ−３
自己抗原には、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ−３、またＣＤ２２３としても知られる）が含まれてもよい。ＬＡＧ−３は、ＭＨＣ−ＩＩ分子に結合し、かつ阻害シグナルを形質導入することが知られている活性化され寛容化されたＴ細胞上でのみ発現される、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである。ＬＡＧ−３は、エフェクターまたは記憶Ｔ細胞と比較して枯渇したＴ細胞上で顕著に上方調節される。ＬＡＧ−３は、Ｔ細胞受容体によって誘導されるカルシウム流出を阻害し、その結果、癌の状況下でＴ細胞記憶プールのサイズを制御することによって、Ｔ細胞増殖を負に調節し、ＬＡＧ３は、ＴＩＬ上で上方調節され、ＬＡＧ−３の遮断により、抗腫瘍Ｔ細胞免疫応答を増強することができる。ＣＤ８  Ｔ細胞の枯渇を引き起こすウイルス慢性モデルにおけるＬＡＧ−３の遮断により、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を活性化することができる。
【０３２５】
（６）ＧＩＴＲ
自己抗原には、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー１８（ＴＮＦＲＳＦ  １８）とも称されるグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）が含まれてもよい。ＧＩＴＲ活性化により、同時活性化シグナルがＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に送られ、調節性Ｔ細胞による免疫応答の抑制が防止される。加えて、ＧＩＴＲ発現エフェクターＴ細胞および調節性Ｔ細胞は多数の腫瘍型に浸潤するものの、非造血細胞上のＧＩＴＲの発現はほとんどまたは全くない。この分布プロファイルは、ＧＩＴＲ発現細胞が腫瘍に集中するようになり得ることを意味する。活性と分布とのこの組み合わせは、共同で、ＧＩＴＲ活性化を様々な癌の治療に魅力的なアプローチとする。抗原結合タンパク質を使用して、固形腫瘍と白血病を含む血液癌との両方を治療することができる。癌治療における使用に加えて、別の実施形態では、提供される抗原結合タンパク質を使用して、様々な病原体に存在するもの等の外来抗原に対する免疫応答を誘導または増強することができる。免疫応答が生成され得る病原体に存在する抗原の例には、ウイルス、寄生虫、細菌、および他の微生物に存在する、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、および糖脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２６】
（７）ＣＤ４０
自己抗原には、ＣＤ４０が含まれてもよい。ＣＤ４０は、正常なヒトＢ細胞および腫瘍性ヒトＢ細胞、樹状細胞、他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、内皮細胞、単球細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、上皮細胞、一部の上皮性腫瘍、ならびに肺癌、乳癌、卵巣癌、および結腸癌を含む多くの固形腫瘍の表面に存在する、５５ｋＤａの細胞表面抗原である。Ｂ細胞系列のいくつかの腫瘍に由来する悪性Ｂ細胞は、高レベルのＣＤ４０を発現し、生存および増殖のためにＣＤ４０シグナル伝達に依存するようである。このため、低悪性度および高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、およびホジキン病を患う患者に由来する形質転換細胞は、ＣＤ４０を発現する。ＣＤ４０発現はまた、急性骨髄芽球性白血病症例の３分の２、およびＡＩＤＳ関連リンパ腫の５０％で検出される。
【０３２７】
（８）ＯＸ４０
自己抗原には、ＯＸ４０が含まれてもよい。ＯＸ４０（ＣＤ１３４とも称される）は、５０キロダルトン（ＫＤａ）の糖タンパク質であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである。ＯＸ４０のリガンドであるＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ２５２とも称される）は、内皮細胞、マクロファージを含む活性化された抗原提示細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞上で発現されることが報告されている。理論に束縛されることを望むものではないが、抗原提示細胞上のＣＤ４０間の結合により、リポ多糖類（ＬＰＳ）同様、ＯＸ４０Ｌ発現が増加する。Ｔ細胞上のＯＸ４０の発現は、Ｔ細胞抗原受容体を介したシグナル伝達の後に誘導され得る。例えば、ＯＸ４０は、炎症の部位において活性化されたばかりのＴ細胞上で発現される。ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞は、炎症状態下でＯＸ４０を上方調節することができる。
【０３２８】
（９）ＴＩＭ−３
自己抗原には、ＴＩＭ−３が含まれてもよい。ＴＩＭ−３は、ＩＦＮ−ガンマを分泌するＴｈ１（Ｔヘルパー１）ＣＤ４−Ｔ細胞および細胞毒性ＣＤ８−Ｔ細胞上で発現される膜貫通受容体である。ＴＩＭ−３は、概して、未感作Ｔ細胞上では発現されず、むしろ活性化されたエフェクターＴ細胞上では上方調節される。ＴＩＭ−３は、インビボの免疫性および寛容を調節する役割を果たす。
【０３２９】
（１０）４−１ＢＢ
自己抗原には、４−１ＢＢリガンドが含まれてもよい。４−１ＢＢリガンドは、ＴＮＦスーパーファミリーに属する２型膜貫通糖タンパク質である。４−１ＢＢリガンドは、活性化されたＴリンパ球上で発現されてもよい。４−１ＢＢは、活性化誘導性Ｔ細胞共刺激分子である。４−１ＢＢを介したシグナル伝達により、生存遺伝子が上方調節され、細胞分裂が増強され、サイトカイン産生が誘導され、Ｔ細胞中の活性化誘導性細胞死が防止される。
【０３３０】
（１１）ＣＴＬＡ４
自己抗原には、ＣＤ１５２（表面抗原分類１５２）としても知られるＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原４）が含まれてもよい。ＣＴＬＡ−４は、抗原に対する細胞免疫攻撃を先導する、Ｔ細胞の表面に見られるタンパク質受容体である。抗原は、ＣＴＬＡ−４の断片、例えば、細胞外Ｖドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０３３１】
（１２）ＩＬ−６
自己抗原には、インターロイキン６（ＩＬ−６）が含まれてもよい。ＩＬ−６は、糖尿病、アテローム性動脈硬化、鬱病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、多発性骨髄腫、癌、ベーチェット病、リウマチ性関節炎、敗血症、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染等を非限定的に含む、多くの疾患において炎症および自己免疫過程を刺激する。
【０３３２】
（１３）ＣＤ１２６
自己抗原には、ＣＤ１２６が含まれてもよい。ＣＤ１２６は、ＩＬ−６の受容体であり、糖尿病、アテローム性動脈硬化、鬱病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、多発性骨髄腫、癌、ベーチェット病、リウマチ性関節炎敗血症、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染等を非限定的に含む、多くの疾患において炎症および自己免疫過程を刺激する。
【０３３３】
（１４）ＭＣＰ−１
自己抗原には、単球走化タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を含んでもよい。ＭＣＰ−１は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）または小型の誘導性サイトカインＡ２とも称される。ＭＣＰ−１は、ＣＣケモカインファミリーに属するサイトカインである。ＭＣＰ−１は、単球、記憶Ｔ細胞、および樹状細胞を、組織の損傷または感染のいずれかによって生じる炎症の部位に補充する。
【０３３４】
（１５）アミロイドベータ
自己抗原には、アミロイドベータ（Ａβ）またはその断片もしくは変異体が含まれてもよい。Ａβ抗原は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドを含むことができ、ここで、ＸとＹとの両方を含むヒト配列Ａβタンパク質のアミノ酸Ｘ位〜アミノ酸Ｙ位のアミノ酸配列、具体的には、アミノ酸１〜４７位に対応するアミノ酸配列のアミノ酸Ｘ位〜アミノ酸Ｙ位のアミノ酸配列；ヒトクエリ配列（配列番号６２）またはその変異体。Ａβ抗原は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ポリペプチドのＡβポリペプチドを含むことができ、ここで、Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２であることができ、Ｙは、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、または１５であることができる。Ａβポリペプチドは、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、または少なくとも４６個のアミノ酸である断片を含み得る。
【０３３５】
（１６）ＩＰ−１０
自己抗原には、インターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマによって誘導されるタンパク質１０（ＩＰ−１０）が含まれてもよい。ＩＰ−１０は、小型誘導性サイトカインＢ１０またはＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）としても知られる。ＣＸＣＬ１０は、ＩＦＮ−γに応答して、単球、内皮細胞、および線維芽細胞等のいくつかの細胞型によって分泌される。
【０３３６】
（１７）ＴＥＲＴ
自己抗原には、ＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素が含まれてもよい。ＴＥＲＴは、テロメアの末端でＴＴＡＧＧＧタグを合成して、染色体短縮に起因する細胞死を防止するテロメラーゼ逆転写酵素である。ＴＥＲＴ発現が異常に高い過剰増殖性細胞は、免疫療法の標的となり得る。最近の研究は、ＴＥＲＴ遺伝子でトランスフェクトした樹状細胞中のＴＥＲＴ発現により、抗原特異的な様式で、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞が誘導され、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が励起され得ることを示している。
【０３３７】
（１８）チロシナーゼ
自己抗原には、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）が含まれてもよい。Ｔｙｒは、（１）単球化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１）産生を遮断することで、骨髄性抑制性細胞（ＭＤＳＣ）を妨害し、腫瘍成長を抑制する抗体を生成するためのＢ細胞応答を介した液性免疫、（２）腫瘍細胞を攻撃および殺滅するためのＣＤ８＋（ＣＴＬ）等の細胞毒性Ｔリンパ球の増加、（３）Ｔヘルパー細胞応答の増加、ならびに（４）ＩＦＮ−γおよびＴＦＮ−αを介した炎症応答の増加、または前述の全てを誘導することによる免疫媒介性クリアランスのための重要な標的である。
【０３３８】
チロシナーゼは、植物および動物の組織に見ることができる銅含有酵素である。チロシナーゼは、チロシン等のフェノールの酸化により、メラニンおよび他の色素の産生を触媒する。黒色腫において、チロシナーゼは調節されない状態となり、その結果、メラニン合成の増加が生じ得る。チロシナーゼは、黒色腫に罹患している対象における細胞毒性Ｔ細胞認識の標的でもある。したがって、チロシナーゼは、黒色腫と関連付けられる抗原であり得る。
【０３３９】
抗原は、タンパク質エピトープを含むことができ、これは、それらを抗Ｔｙｒ免疫応答が誘導され得る免疫原として特に有効にするものである。抗原は、全長翻訳産物、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０３４０】
Ｔｙｒ抗原は、コンセンサスタンパク質を含み得る。Ｔｙｒ抗原は、抗原特異的Ｔ細胞およびより高い力価の抗体応答を、全ての癌および腫瘍関連細胞両方に対して全身的に誘導する。このように、防御免疫応答がＴｙｒコンセンサス抗原を含むワクチンによる腫瘍形成に対して提供される。したがって、いずれの使用者も、腫瘍形成、腫瘍転移、および腫瘍成長に対する幅広い免疫を提供するためにＴｙｒ抗原を含むように、本発明の免疫原性組成物を設計することができる。タンパク質は、Ｔｙｒ抗原、Ｔｙｒ抗原の断片、およびＴｙｒ抗原の断片と相同の配列を有するタンパク質と相同の配列を含んでもよい。
【０３４１】
（１９）ＮＹ−ＥＳＯ−１
自己抗原には、ＮＹ−ＥＳＯ−１が含まれてもよい。ＮＹ−ＥＳＯ−１は癌精巣抗原であり、これは、癌精巣抗原が細胞性免疫および液性免疫の両方を誘導することができる様々な癌において発現される。遺伝子発現研究により、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＴＡＧ１Ｂについて、粘液性脂肪肉腫および円形細胞脂肪肉腫において遺伝子の上方調節が示されている。
【０３４２】
（２０）ＭＡＧＥ
自己抗原には、ＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原）が含まれてもよい。ＭＡＧＥ抗原には、ＭＡＧＥ−Ａ４（黒色腫関連抗原４）が含まれてもよい。ＮＹ−ＥＳＯ−１は癌精巣抗原であり、これは、癌精巣抗原が細胞性免疫および液性免疫の両方を誘導することができる様々な癌において発現される。遺伝子発現研究により、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＴＡＧ１Ｂについて、粘液性脂肪肉腫および円形細胞脂肪肉腫において遺伝子の上方調節が示されている。
【０３４３】
ＭＡＧＥ−Ａ４は、雄生殖細胞、ならびに消化管癌、食道癌、および肺癌等の様々な組織型の腫瘍細胞中で発現される。ＭＡＧＥ−Ａ４は、癌タンパク質であるＧａｎｋｙｒｉｎに結合する。このＭＡＧＥ−Ａ４特異的結合は、そのＣ末端によって媒介される。研究により、外因性ＭＡＧＥ−Ａ４は、インビトロでＧａｎｋｙｒｉｎを過剰発現する細胞の接着非依存性成長を部分的に阻害し、ヌードマウスにおけるこれらの細胞から移行した腫瘍の形成を抑制し得ることが示されている。この阻害はＭＡＧＥ−Ａ４とＧａｎｋｙｒｉｎとの間の結合に依存し、このことは、ＧａｎｋｙｒｉｎとＭＡＧＥ−Ａ４との間の相互作用により、Ｇａｎｋｙｒｉｎ媒介性発癌が阻害されることを示唆する。主要組織中のＭＡＧＥ発現は、腫瘍形成の原因ではなく結果であり、ＭＡＧＥ遺伝子は、初期腫瘍細胞を破壊のために標的化することによって免疫過程に関与する可能性が高い。
【０３４４】
黒色腫関連抗原４タンパク質（ＭＡＧＥＡ４）は、胚発生ならびに腫瘍化および／または進行に関与し得る。ＭＡＧＥＡ４は、通常、組織および胎盤中で発現される。しかしながら、ＭＡＧＥＡ４は、多くの異なる種類の腫瘍、例えば、黒色腫、頭頚部扁平上皮癌、肺癌、および乳癌において発現され得る。したがって、ＭＡＧＥＡ４は、様々な腫瘍と関連付けられる抗原であり得る。
【０３４５】
ＭＡＧＥＡ４抗原は、抗原特異的Ｔ細胞および／または高い力価の抗体応答を誘導することで、抗原を発現している癌または腫瘍を指向するかまたはそれらに対して反応性である免疫応答を、誘導または励起し得る。いくつかの実施形態では、誘導または励起された免疫応答は、細胞性免疫応答、液性免疫応答、または細胞性免疫応答と液性免疫応答との両方であり得る。いくつかの実施形態では、誘導または励起された細胞性免疫応答は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の誘導または分泌を含み得る。他の実施形態では、誘導または励起された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍または癌の成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、非限定的に、ＭＨＣ提示を下方調節する因子、特異的調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を上方調節する因子、ＰＤ−Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−１０およびＴＦＧ−β等のサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞を低減または阻害し得る。
【０３４６】
ＭＡＧＥＡ４抗原は、タンパク質エピトープを含むことができ、これは、それらを抗ＭＡＧＥＡ４免疫応答が誘導され得る免疫原として特に有効にするものである。ＭＡＧＥＡ４抗原は、全長翻訳産物、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０３４７】
（２１）ＦＳＨＲ
自己抗原には、ＦＳＨＲ（卵胞刺激ホルモン受容体）が含まれてもよい。ＦＳＨＲは、卵巣顆粒膜細胞（Ｓｉｍｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．１９９７，１８：７３９−７７３）および低レベルで卵巣内皮（Ｖａｎｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５：１３５８−１３６６）中で女性において選択的に発現される抗原である。最も重要なのは、この表面抗原が卵巣癌の５０〜７０％において発現されることである。
【０３４８】
（２２）腫瘍微小環境抗原
自己抗原には、腫瘍微小環境抗原が含まれてもよい。線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−β）、およびＧｌｙｐｉｃａｎ−１（ＧＰＣ１）を含むがこれらに限定されない、いくつかのタンパク質が、腫瘍微小環境において過剰発現される。ＦＡＰは、ヒト癌の９０％超において癌関連線維芽細胞中で上方調節されるゼラチナーゼおよびペプチダーゼ活性を有する膜結合酵素である。ＰＤＧＦＲ−βは、胚発生、血管新生、細胞増殖および分化を含む、多くの生物学的過程の調節において役割を有する細胞表面チロシンキナーゼ受容体である。ＧＰＣ１は、癌細胞中で富化される細胞表面プロテオグリカンである。
【０３４９】
（２３）ＰＲＡＭＥ
自己抗原は、ＰＲＡＭＥ（腫瘍中で選択的に発現される黒色腫抗原）を含んでもよい。ＰＲＡＭＥは、ヒトにおいてＰＲＡＭＥ遺伝子によってコードされたタンパク質である。この遺伝子は、ヒト黒色腫において主に発現され、細胞溶解性Ｔリンパ球によって認識される抗原をコードする。これは、精巣を除いて正常な組織では発現されない。この遺伝子は、急性白血病においても発現される。同じタンパク質をコードする５つの選択的スプライスによる転写産物変異体が、この遺伝子について観察されている。タンパク質は、ＰＲＡＭＥ抗原、ＰＲＡＭＥ抗原の断片、およびＰＲＡＭＥ抗原の断片と相同の配列を有するタンパク質と相同の配列を含んでもよい。
【０３５０】
（２４）前立腺抗原
自己抗原は、前立腺抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＳＡ抗原、ＳＴＥＡＰ抗原、ＰＳＣＡ抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原、および他の既知の前立腺腫瘍抗原を含んでもよい。ＰＳＭＡは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミン酸ペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ  Ｉ）、ＮＡＡＧペプチダーゼ、または葉酸加水分解酵素（ＦＯＬＨ）としても知られる。ＰＭＳＡは、前立腺癌細胞によって高度に発現される内在性膜タンパク質である。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに向けられる抗体（抗ＰＳＭＡ抗体）をコードする組換え核酸配列は、配置２の組換え核酸配列構築物を含む組換え核酸配列であってもよい。
【０３５２】
さらに他の実施形態では、組換え核酸配列によってコードされた抗ＰＳＭＡ抗体は、本明細書に記載されるように修飾されてもよい。そのような修飾の１つは、実施例で示されるように市販の抗体と比較して増加したＡＤＣＣ活性を呈した、脱フコシル化抗体である。修飾は、重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせにあってもよい。修飾は、重鎖における１つ以上のアミノ酸置換、軽鎖における１つ以上のアミノ酸置換、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０３５３】
（２５）腫瘍抗原
自己抗原には、腫瘍抗原が含まれてもよい。本発明の背景では、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害と関連付けられる抗原」は、癌等の特定の過剰増殖性障害に一般的な抗原を指す。本明細書で考察される抗原は、例として挙げられるに過ぎない。このリストは排他的であるようには意図されず、さらなる例が当業者には容易に明らかとなる。
【０３５４】
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を励起する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の抗原結合部分の選択は、治療される癌の特定の種類に依存することになる。腫瘍抗原は、当該技術分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、臓器カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、スルビビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ならびにメソテリンが含まれる。
【０３５５】
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連付けられる１つ以上の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃に対する標的抗原として働くことができるいくつものタンパク質を発現する。これらの分子には、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、およびＧＰ  １００等の組織特異的抗原、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の標的分子は、形質転換関係分子、例えば、癌遺伝子のＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２の群に属する。さらに別の標的抗原の群は、腫瘍胎児性抗原、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有である真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ３７等のＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）のうちのいくつかは、限定された成果のある、モノクローナル抗体による受動免疫療法のための標的として使用されてきた。
【０３５６】
本発明で言及される腫瘍抗原の種類はまた、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であってもよい。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有であり、身体の他の細胞では生じない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に特有ではなく、その代わり、抗原に対する免疫寛容の状態を誘発するのに失敗する条件下で正常な細胞上でも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系の抗原への応答を可能にする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり、応答することができない胎児発達中に、正常な細胞上で発現される抗原であってもよく、あるいは通常は正常な細胞では極めて低いレベルで存在するが、腫瘍細胞でははるかに高いレベルで発現される抗原であってもよい。
【０３５７】
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例には、以下のものが挙げられる：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、および腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５；過剰発現された胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現された癌遺伝子および突然変異した腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転座から生じる特有の腫瘍抗原、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン−バーウイルス抗原であるＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原であるＥ６およびＥ７。他の大型のタンパク質系抗原には、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ  １５、ｐ  １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトタンパク質、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳが挙げられる。
【０３５８】
ｃ．他の抗原
いくつかの実施形態では、抗原は、外来抗原および／または自己抗原以外の抗原である。例示的な他の抗原には、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５９】
（ａ）ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１
他の抗原は、ＨＩＶ−１  ＶＲＣ０１であり得る。ＨＩＶ−１  ＶＣＲ０１は、ＨＩＶに対する中和ＣＤ４結合部位抗体である。ＨＩＶ−１  ＶＣＲ０１は、ＨＩＶ−１の、ｇｐ１２０ループＤ、ＣＤ４結合ループ、およびＶ５領域内に含まれる、ＨＩＶ−１の部分に接触する。
【０３６０】
（ｂ）ＨＩＶ−１  ＰＧ９
他の抗原は、ＨＩＶ−１  ＰＧ９であり得る。ＨＩＶ−１  ＰＧ９は、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１）エンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質（ｇｐ）三量体に優先的に結合し、ウイルスを広範に中和する、グリカン依存性ヒト抗体の増え続けているファミリーの元のメンバーである。
【０３６１】
（ｃ）ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０
他の抗原は、ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０であり得る。ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０は、中和抗ＨＩＶ抗体である。ＨＩＶ−１  ４Ｅ１０は、ｇｐ４１細胞外ドメインのＣ末端に位置するＨＩＶ−１の膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）にマッピングされた線状エピトープに向けられる。
【０３６２】
（ｄ）ＤＶ−ＳＦ１
他の抗原は、ＤＶ−ＳＦ１であり得る。ＤＶ−ＳＦ１は、４つのデングウイルス血清型のエンベロープタンパク質に結合する中和抗体である。
【０３６３】
（ｅ）ＤＶ−ＳＦ２
他の抗原は、ＤＶ−ＳＦ２であり得る。ＤＶ−ＳＦ２は、デングウイルスのエピトープに結合する中和抗体である。ＤＶ−ＳＦ２は、ＤＥＮＶ４血清型に特異的であり得る。
【０３６４】
（ｆ）ＤＶ−ＳＦ３
他の抗原は、ＤＶ−ＳＦ３であり得る。ＤＶ−ＳＦ３は、デングウイルスエンベロープタンパク質のＥＤＩＩＩ  Ａ鎖に結合する中和抗体である。
【０３６５】
６．核酸ワクチン
構造修飾されたＤＭＡｂ、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物は、単独でまたは組み合わせて、それを必要とする対象に投与して、操作されたＤＮＡコード化合成抗体のインビボ発現および形成を促進することができる。
【０３６６】
一実施形態では、本発明の組成物は、抗原に対する哺乳動物における免疫応答を励起する組成物と組み合わせて投与することができる。一実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上の抗原をコードする核酸と組み合わせて投与することができる。一実施形態では、第１の組成物は、ＤＮＡワクチンを含む。
【０３６７】
一実施形態では、本発明の組み合わせは、少なくとも２つの構造修飾されたｄＭＡｂをコードする少なくとも２つの核酸分子を含み、ここでは、各ｄＭＡｂが異なる抗原を標的とする。例えば、一実施形態では、各ｄＭＡｂは、単一のウイルスの異なるウイルス抗原を標的とする。別の実施形態では、各ｄＭＡｂは、異なるウイルスのウイルス抗原を標的とする。さらに別の実施形態では、各ｄＭＡｂは、異なる自己抗原を標的とする。
【０３６８】
一実施形態では、本発明の混合ワクチンは、少なくとも２つの構造修飾されたｄＭＡｂをコードする、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または６つ超の核酸分子を含み、各ｄＭＡｂは異なる抗原を標的にする。抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、多糖、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。多糖は、核酸でコードされた多糖であり得る。
【０３６９】
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも２つの構造修飾されたｄＭＡｂをコードする少なくとも２つの核酸分子を含み、各ｄＭＡｂは、異なる抗原を標的とし、各抗原は、異なるウイルスの抗原である。一実施形態では、本発明の混合ワクチンは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または６つ超のｄＭＡｂをコードする、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または６つ超の核酸分子を含み、コードされたｄＭＡＢは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または６つ超の異なるウイルスに由来する抗原を標的とする。
【０３７０】
本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂ、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物に関する。組成物は、それを必要とする対象に投与されたとき、対象において構造修飾されたＤＭＡｂの生成をもたらすことができる。合成抗体は、対象中に存在する標的分子（即ち、抗原）に結合することができる。そのような結合により、抗原が中和され、別の分子、例えばタンパク質または核酸による抗原の認識が遮断され、抗原に対する免疫応答が励起または誘導され得る。
【０３７１】
構造修飾されたＤＭＡｂは、組成物を投与した対象において、疾患の治療、予防、および／または疾患からの保護を行うことができる。構造修飾されたＤＭＡｂは、抗原に結合することにより、組成物を投与した対象において、疾患の治療、予防、および／または疾患からの保護を行うことができる。構造修飾されたＤＭＡｂは、組成物を投与した対象において疾患生存を改善することができる。一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、対象における疾患生存を、構造修飾されたＤＭＡｂを投与されていない疾患を有する対象の予測生存と比べて増大させることができる。様々な実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、組成物を投与した対象における疾患生存を、組成物の非存在下での予測生存と比べて、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、または１００％超増大させることができる。一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、対象における疾患に対する保護を、構造修飾されたＤＭＡｂを投与されていない対象の予測保護と比べて増大させることができる。様々な実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、組成物の非存在下での予測保護と比べて、組成物を投与した対象の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％において、疾患から保護することができる。
【０３７２】
組成物は、対象への組成物の投与の少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、または６０時間以内に、対象における構造修飾されたＤＭＡｂの生成を生じさせることができる。組成物により、対象への組成物の投与の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日以内に、対象における合成抗体を生じさせることができる。組成物により、対象への組成物の投与の１時間〜約６日、約１時間〜５日、約１時間〜約４日、約１時間〜約３日、約１時間〜約２日、約１時間〜約１日、約１時間〜約７２時間、約１時間〜約６０時間、約１時間〜約４８時間、約１時間〜約３６時間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜約１２時間、または約１時間〜約６時間以内に、対象における構造修飾されたＤＭＡｂの生成を生じさせることができる。
【０３７３】
組成物は、それを必要とする対象に投与されたとき、液性免疫応答を誘導するために抗原を投与した対象における内因性抗体の生成よりも迅速に、対象における構造修飾されたＤＭＡｂの生成を生じさせることができる。組成物は、液性免疫応答を誘導するために抗原を投与した対象における内因性抗体の生成の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日前に、構造修飾されたＤＭＡｂの生成を生じさせることができる。
【０３７４】
一実施形態では、本方法は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子を含む第１の組成物を、第２の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子を含む第２の組成物と組み合わせて投与することに関する。第１の組成物および第２の組成物は、同時に投与されてもよく、あるいは任意の順序で投与されてもよい。一実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、異なる注射部位に同時投与される。
【０３７５】
一実施形態では、本方法は、２つ以上の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする１つ以上の核酸分子を含む単一の組成物を投与することに関する。そのような実施形態では、２つ以上のＤＭＡｂは、単一の核酸分子上、または投与のために単一の組成物に組み合わされる別々の核酸分子上でコードされてもよい。
【０３７６】
一実施形態では、本方法は、１つ以上の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする１つ以上の核酸分子を、抗原に対する免疫応答を哺乳動物中で生成することが可能な核酸ワクチンと組み合わせて投与することに関する。一実施形態では、核酸ワクチンは、哺乳動物中でコンセンサス抗原を発現することが可能な少なくとも１つの核酸分子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。一実施形態では、核酸分子は、コンセンサス抗原をコードするコード配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗原をコードするコード配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、コード配列のＮ末端でＩｇＥリーダー配列に作動可能に連結した抗原をコードするコード配列を含む。
【０３７８】
核酸分子は、コード配列のＣ末端に付着したポリアデニル化配列をさらに含むことができる。一実施形態では、核酸分子は、コドン最適化される。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントである。一実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤である。一実施形態では、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質、およびより好ましくはポリ−Ｌ−グルタミン酸である。一実施形態では、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は、６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度である。一実施形態では、核酸ワクチンは、総核酸濃度が１ｍｇ／ｍｌ以上である。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、複数の特有のＤＮＡプラスミドを含み、これらの複数の特有のＤＮＡプラスミドの各々は、コンセンサス抗原を含むポリペプチドをコードする。
【０３８１】
本発明のいくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、アジュバントをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ΤΝＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、シグナル配列が欠失したＩＬ−１５を含み、かつ任意にＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＣＤ８６からなる群から選択される。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、以下をコードする遺伝子が挙げられる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌ−α、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、Ｃａｓｐａｓｅ  ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびこれらの機能性断片。いくつかの好ましい実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、またはＭＥＣから選択される。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、コンセンサス抗原に対して哺乳動物における免疫応答を誘発する方法は、粘膜免疫応答を誘導する方法を含む。そのような方法は、上記のコンセンサス抗原を含むＤＮＡプラスミドと組み合わせて、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびその機能性断片またはその発現可能なコード配列のうちの１つ以上を、哺乳動物に投与することを含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびその機能性断片のうちの１つ以上は、本明細書に提供される核酸ワクチンの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、およびその機能性断片からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする単離された核酸分子が、哺乳動物に投与される。
【０３８３】
本発明の組成物は、効果的な組成物に必須である特徴、例えば、組成物が疾病または死亡を引き起こさないように安全であること、疾病から保護すること、ならびに投与の簡便性、少ない副作用、生物学的安定性、および低い用量単価を有し得る。
【０３８４】
上記のように、組成物は、１つ以上の抗原を含む、ワクチン等の免疫原性組成物を含み得る。ワクチンを使用して、いくつもの抗原から保護することにより、抗原に基づく病変を治療、予防、および／またはそれから保護することができる。ワクチンは、ワクチンを投与した対象の免疫応答を大幅に誘導することで、抗原による感染から保護およびそれを治療することができる。
【０３８５】
ワクチンは、ＤＮＡワクチン、ペプチドワクチン、または組み合わせたＤＮＡおよびペプチドワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、抗原をコードする核酸配列を含み得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列はまた、ペプチド結合によって抗原に連結されたリンカー、リーダー、またはタグ配列をコードするさらなる配列も含むことができる。ペプチドワクチンは、抗原ペプチド、抗原タンパク質、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせを含み得る。組み合わせたＤＮＡおよびペプチドワクチンは、上記の抗原をコードする核酸配列および抗原ペプチドまたはタンパク質を含むことができ、抗原ペプチドまたはタンパク質およびコードされた抗原は、同じアミノ酸配列を有する。
【０３８６】
ワクチンは、ワクチンを投与された対象において液性免疫応答を誘導し得る。誘導された液性免疫応答は、抗原に特異的であり得る。誘導された液性免疫応答は、抗原と反応性であり得る。液性免疫応答は、ワクチンを投与された対象において、１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍誘導され得る。液性免疫応答は、ワクチンを投与された対象において、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍誘導され得る。
【０３８７】
ワクチンによって誘導された液性免疫応答は、ワクチンを投与されていない対象と比較して増加したレベルの、ワクチンを投与された対象と関連付けられる中和抗体を含み得る。中和抗体は、抗原に特異的であり得る。中和抗体は、抗原と反応性であり得る。中和抗体は、ワクチンを投与された対象における感染およびその関連する病変に対する保護および／またはその治療を提供し得る。
【０３８８】
ワクチンによって誘導された液性免疫応答は、ワクチンを投与されていない対象と比較して増加したレベルの、ワクチンを投与された対象と関連付けられるＩｇＧ抗体を含み得る。これらのＩｇＧ抗体は、抗原に特異的であり得る。これらのＩｇＧ抗体は、抗原と反応性であり得る。好ましくは、液性応答は、抗原の２つ以上の株に対して交差反応性である。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＩｇＧ抗体のレベルは、ワクチンを投与されていない対象と比較して、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍増加し得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＩｇＧ抗体のレベルは、ワクチンを投与されていない対象と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍増加し得る。
【０３８９】
ワクチンは、ワクチンを投与された対象において細胞性免疫応答を誘導し得る。誘導された細胞性免疫応答は、抗原に特異的であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、抗原に反応性であり得る。好ましくは、細胞性応答は、抗原の２つ以上の株に対して交差反応性である。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の励起を含み得る。励起されたＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、抗原と反応性であり得る。励起されたＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、多機能性であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の励起を含むことができ、これにおいて、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはＩＦＮ−γとＴＮＦ−αとの組み合わせを産生する。
【０３９０】
誘導された細胞性免疫応答は、ワクチンを投与されていない対象と比較して増加した、ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を含み得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、ワクチンを投与されていない対象と比較して、約２倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、または約４倍〜約２０倍増加し得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、ワクチンを投与されていない対象と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１６．０倍、少なくとも約１７．０倍、少なくとも約１８．０倍、少なくとも約１９．０倍、少なくとも約２０．０倍、少なくとも約２１．０倍、少なくとも約２２．０倍、少なくとも約２３．０倍、少なくとも約２４．０倍、少なくとも約２５．０倍、少なくとも約２６．０倍、少なくとも約２７．０倍、少なくとも約２８．０倍、少なくとも約２９．０倍、または少なくとも約３０．０倍増加し得る。
【０３９１】
誘導された細胞性免疫応答は、増加した頻度の、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含み得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋  Ｔ細胞の頻度は、ワクチンを投与されていない対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍増加し得る。
【０３９２】
誘導された細胞性免疫応答は、増加した頻度の、ＴＮＦ−αを産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含み得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＮＦ−α＋  Ｔ細胞の頻度は、ワクチンを投与されていない対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、または１４倍増加し得る。
【０３９３】
誘導された細胞性免疫応答は、増加した頻度の、ＩＬ−２を産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含み得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＩＬ−２＋  Ｔ細胞の頻度は、ワクチンを投与されていない対象と比較して、少なくとも約０．５倍、１．０倍、１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、または５．０倍増加し得る。
【０３９４】
誘導された細胞性免疫応答は、増加した頻度の、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αとの両方を産生するＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含み得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ３＋ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋  Ｔ細胞の頻度は、ワクチンを投与されていない対象と比較して、少なくとも約２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、または１８０倍増加し得る。
【０３９５】
ワクチンによって誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の励起を含み得る。励起されたＣＤ４＋  Ｔ細胞応答は、所望の抗原と反応性であり得る。励起されたＣＤ４＋  Ｔ細胞応答は、多機能性であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の励起を含むことができ、これにおいて、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、またはＩＦＮ−γとＴＮＦ−αとの組み合わせを産生する。
【０３９６】
誘導された細胞性免疫応答は、増加した頻度の、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含み得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋  Ｔ細胞の頻度は、ワクチンを投与されていない対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍増加し得る。
【０３９７】
誘導された細胞性免疫応答は、増加した頻度の、ＴＮＦ−αを産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含み得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＮＦ−α＋  Ｔ細胞の頻度は、ワクチンを投与されていない対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、または２２倍増加し得る。
【０３９８】
誘導された細胞性免疫応答は、増加した頻度の、ＩＬ−２を産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含み得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＬ−２＋  Ｔ細胞の頻度は、ワクチンを投与されていない対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、または６０倍増加し得る。
【０３９９】
誘導された細胞性免疫応答は、増加した頻度の、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αとの両方を産生するＣＤ３＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含み得る。ワクチンを投与された対象と関連付けられるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋の頻度は、ワクチンを投与されていない対象と比較して、少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１３．５倍、１４．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０．０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、または３５倍増加し得る。
【０４００】
本発明のワクチンは、ワクチン自体が疾病または死亡の原因とならないように安全であること、ウイルスまたは細菌等の生病原体への曝露から生じる疾病に対する保護作用があること、細胞の発明を予防するために中和抗体を誘導すること、細胞内病原体に対する保護Ｔ細胞を誘導すること、ならびに投与し易さ、少ない副作用、生物学的安定性、および低い用量単価を提供すること等の、有効なワクチンに要求される特徴を有し得る。
【０４０１】
本ワクチンは、筋肉または皮膚等の異なる組織に投与された場合に免疫応答をさらに誘導することができる。本ワクチンは、電気穿孔、または注射、または皮下、または筋肉内で投与された場合に免疫応答をさらに誘導することができる。
【０４０２】
ワクチン構築物およびプラスミド
本ワクチンは、１つ以上の抗原をコードする核酸構築物またはプラスミドを含み得る。核酸構築物またはプラスミドは、１つ以上の異種核酸配列を含み得るか、または含有し得る。抗原をコードする核酸配列を含み得る遺伝子構築物が本明細書で提供される。遺伝子構築物は、機能的な染色体外分子として細胞内に存在し得る。遺伝子構築物は、セントロメア、テロメア、プラスミド、またはコスミドを含む、線状ミニ染色体であり得る。遺伝子構築物は、１つ以上の異種核酸配列を含み得るか、または含有し得る。
【０４０３】
遺伝子構築物は、任意の順序で抗原を発現するプラスミドの形態であり得る。
【０４０４】
遺伝子構築物はまた、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス関連ウイルス、および組換えワクシニアを含む、組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子構築物は、細胞内に生きる弱毒化生微生物または組換え微生物ベクター中の遺伝物質の一部であり得る。
【０４０５】
遺伝子構築物は、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含み得る。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、停止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
【０４０６】
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子構築物を構成し得る。ベクターは、哺乳動物において免疫応答を励起するのに有効な量で哺乳動物の細胞中で抗原を発現することが可能であり得る。ベクターは組換えであり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであり得る。ベクターは、形質転換された宿主細胞が、抗原の発現が生じる条件下で培養され、維持される、抗原をコードする核酸による細胞のトランスフェクトに有用であり得る。
【０４０７】
コード配列は、安定性および高レベルの発現に対して最適化され得る。いくつかの場合には、コドンは、分子内結合に起因して形成されるもの等、ＲＮＡの二次構造形成を低減するように選択される。
【０４０８】
ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含むことができ、１つ以上の癌抗原コード配列（複数可）の上流にあり得る開始コドンと、抗原のコード配列（複数可）の下流にあり得る停止コドンとをさらに含むことができる。開始コドンおよび終止コドンは、抗原のコード配列（複数可）とインフレームであり得る。ベクターはまた、抗原のコード配列（複数可）に作動可能に連結するプロモーターを含み得る。プロモーターは、抗原のコード配列（複数可）に作動可能に連結したプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター等のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネイン等の、ヒト遺伝子に由来するプロモーターであり得る。プロモーターはまた、天然または合成の、筋または皮膚特異的プロモーター等の組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターの例は、内容全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載されている。
【０４０９】
ベクターは、抗原のコード配列（複数可）の下流にあり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロブリンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
【０４１０】
ベクターは、抗原の上流のエンハンサーも含み得る。エンハンサーは、ＤＮＡ発現に必須であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えば、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、ＥＢＶからのものであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、各々の内容が参照により完全に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、および第ＷＯ９４／０１６７３７号に記載されている。
【０４１１】
ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持し、細胞内でプラスミドの多数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点を含み得る。ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であることができ、これらは、エプスタイン−バーウイルスの複製起点、ならびに組み込みなしで高コピーエピソーム複製を生じ得る核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含むことができる。ベクターは、本明細書に記載の変異プラスミド等、変化を有するｐＶＡＸ１またはｐＶａｘ１変異体であり得る。変異ｐＶａｘ１プラスミドは、主鎖ベクタープラスミドｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）の２９９８塩基対変異体である。ＣＭＶプロモーターが塩基１３７〜７２４に位置する。Ｔ７プロモーター／プライミング部位が塩基６６４〜６８３にある。多重クローニング部位が塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルが塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子が塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣ起点が塩基２３２０〜２９９３にある。
【０４１２】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＶＡＸ１の配列に基づき、本明細書に示されるプラスミド１〜６の主鎖として使用したｐＶＡＸ１の配列中に以下の突然変異が見られた。
ＣＭＶプロモーター中のＣ＞Ｇ２４１
ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐｏｌｙＡ）の下流のＣ＞Ｔ  １９４２主鎖
カナマイシン遺伝子の下流のＡ＞−２８７６主鎖
ｐＵＣ複製起点（Ｏｒｉ）高コピー数突然変異中のＣ＞Ｔ  ３２７７（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８５参照）
ＲＮＡＳｅＨ部位の上流のｐＵＣ  Ｏｒｉの最末端中のＧ＞Ｃ  ３７５３
【０４１３】
塩基対２、３、および４は、ＣＭＶプロモーターの上流で、主鎖においてＡＣＴからＣＴＧに変化する。
【０４１４】
ベクターの主鎖はｐＡＶ０２４２であり得る。ベクターは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであり得る。
【０４１５】
ベクターはまた、ベクターが投与される哺乳動物またはヒト細胞における遺伝子発現に十分適していてもよい調節配列を含み得る。本明細書に開示される１つ以上の癌抗原配列は、コドンを含むことができ、これにより、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写が可能となり得る。
【０４１６】
ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のタンパク質産生に使用され得るｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。ベクターはまた、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株中のタンパク質産生に使用され得るｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。ベクターはまた、昆虫細胞中のタンパク質産生に使用され得るＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。ベクターはまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞中のタンパク質産生に使用され得るｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。ベクターは、参照により完全に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）を含む慣習的な技法および容易に入手可能な出発材料によってタンパク質を産生するための発現ベクターまたは発現系であり得る。
【０４１７】
７．組成物の賦形剤および他の成分
組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤等の機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよく、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレン等の小胞体、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤が挙げられる。
【０４１８】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は、６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で組成物中に存在してもよい。トランスフェクション促進剤はまた、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレン等の小胞体を含んでもよく、ヒアルロン酸も、組成物と共に使用投与されてもよい。組成物は、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ０９３２４６４０を参照）として当該技術分野で既知の他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）をはじめとする、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０４１９】
組成物は、遺伝子促進剤をさらに含んでもよい。
【０４２０】
組成物は、ＤＮＡを、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量で含んでもよい。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による組成物は、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。
【０４２１】
組成物は、使用される投与様式に従って配合され得る。注射可能な医薬組成物は、滅菌されており、パイロジェンフリーおよび微粒子フリーであり得る。等張性製剤または溶液を使用することができる。等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。組成物は、血管収縮剤を含み得る。等張溶液には、リン酸緩衝食塩水を挙げることができる。組成物は、ゼラチンおよびアルブミンをはじめとする安定化剤をさらに含み得る。ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオン等、安定化剤により、製剤を室温または周囲温度で長時間安定させることができる。
【０４２２】
８．構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子の生成方法
本発明の操作されたＤＭＡｂを得るために使用することができる操作戦略は多数ある。
【０４２３】
ＤＭＡｂの完全グラフト
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、完全グラフトによって生成される。一実施形態では、完全グラフト方法は、親ＤＭＡｂの可変軽鎖および可変重鎖のＣＤＲ領域を、ＤＭＡｂをより高く発現するフレームワークに転置することを含む。一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列は、完全グラフトＤＭＡｂのアミノ酸配列から生成される。
【０４２４】
一実施形態では、核酸配列は最適化される。最適化には、以下のうちの１つ以上が含まれ得る：転写を増加させるためのＧＣ含有量が低いリーダー配列の付加；ｍＲＮＡ安定性およびコドン最適化；翻訳増加のためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）の付加；翻訳増加のためのＩＲＥＳ配列の付加；転写増加のためのＷＰＲＥ配列の付加；シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列の付加；ならびにｃｉｓ作用性配列モチーフ（即ち、内部ＴＡＴＡボックス）の可能な限りの除去。
【０４２５】
一実施形態では、核酸分子は、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする最適化された核酸配列を含むように生成される。核酸分子を生成するためのいずれの方法も、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列の生成に使用することができる。特定のヌクレオチド配列を含む核酸分子の生成方法は、概して当該技術分野で既知である。
【０４２６】
ＤＭＡｂの部分グラフト
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、部分グラフトによって生成される。一実施形態では、部分グラフト方法は、構造アラインメントおよび可能性のある修飾の比較モデリングのうちの１つ以上を含む。一実施形態では、親ＤＭＡｂ  ＶＬドメイン配列は、１つ以上の有効な高度に発現された骨格ＶＬ配列のＶＬドメインに対してアラインメントされる。一実施形態では、比較モデリングは、ＶＬドメインの構造的な重ね合わせによって予測される突然変異を含む、多数の可能性のある部分グラフト配列に行われる。一実施形態では、比較モデリング方法は、エネルギー最小化分析、界面分析、配列特性予測、およびラマチャンドラン分析のうちの少なくとも１つを含む。候補の部分グラフトＤＭＡｂは、好ましい予測された特徴（例えば、改善された安定性）を有するものである。
【０４２７】
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列は、予測された部分グラフトＤＭＡｂアミノ酸配列から生成される。一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列は、さらに最適化され、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする最適化された核酸配列を含む核酸分子が生成される。
【０４２８】
骨格修飾
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂは、骨格修飾によって生成される。一実施形態では、骨格修飾方法は、親ＤＭＡｂのアミノ酸配列に１つ以上の特定のアミノ酸の変化を作製して、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂを生成することを含む。一実施形態では、特定のアミノ酸の変化により、親ＤＭＡｂと比較して、安定性、重鎖および軽鎖界面、ならびに構造修飾されたＤＭＡｂの分泌のうちの１つ以上が改善する。一実施形態では、特定のアミノ酸の変化により、親ＤＭＡｂと比較して、構造修飾されたＤＭＡｂの、可変鎖界面に基づくＤＭＡｂの凝集、パイ相互作用、等電点、およびラマチャンドラン分析が減少する。一実施形態では、１つ以上の特定のアミノ酸の変化は、等電点修飾、ＶＨ−ＶＬ界面相互作用の改変、またはそれらの組み合わせが生じるように作製される。
【０４２９】
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列は、修飾されたアミノ酸配列から生成される。一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列は、さらに最適化され、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする最適化された核酸配列を含む核酸分子が生成される。
【０４３０】
ＳｃＦｖ−Ｆｃ構造修飾ＤＭＡｂ
一実施形態では、低い発現を示す親ＤＭＡｂは、１周回以上のｓｃＦｖモデリングを受ける。様々な実施形態では、ＳｃＦｖモデリングは、リンカーモデリング、ヒンジ修飾モデリング、フレームワークモデリング、およびＣＤＲループ精密化のうちの少なくとも１つを含む。様々な実施形態では、モデリングは、ＶＨ−リンカー−ＶＬ形式およびＶＬ−リンカー−ＶＨ形式のうちの少なくとも１つでＤＭＡｂ配列に行われる。一実施形態では、リンカーがＣＤＲを遮らないまたはリンカーのＣＤＲへの影響が最小限である変異体が予測されるまで、様々な入力配列を用いて多数回のモデリングが行われる。例えば、一実施形態では、予測された変異体のリンカーがＣＤＲのうちの１つ以上を遮ることが予測されると、新たなリンカー配列を使用して別周回のＳｃＦｖモデリングが実施される。一実施形態では、新たなリンカーは、既にモデリングされたリンカーよりも、長くてもよく、短くてもよく、あるいは異なるアミノ酸配列を有してもよい。一実施形態では、１周回以上のＳｃＦｖモデリングに続いて、予測された構造に分析を実施して、予測されたＤＭＡｂがさらなる開発のための候補であるか否かを決定する。例えば、一実施形態では、リンカー融合部位付近の領域のＲＭＳＤ分析を行う。一実施形態では、リンカーによりＣＤＲの遮りが最小である予測されたＤＭＡｂを、候補のＤＭＡｂとして選択する。一実施形態では、リンカー融合部位付近の予測されたＲＭＳＤが低い予測されたＤＭＡｂを、候補のＤＭＡｂとして選択する。
【０４３１】
一実施形態では、候補の変異体をコードする核酸分子は、最適化される。一実施形態では、最適化は、ＶＨ、リンカー、およびＶＬ配列の各々を個々にコードするヌクレオチド配列に行われる（即ち、ヌクレオチド配列のモジュラー最適化）。一実施形態では、最適化は、単一のヌクレオチド配列として、ＶＨ−リンカー−ＶＬをコードするヌクレオチド配列に行われる。一実施形態では、最適化は、単一のヌクレオチド配列として、ＶＬ−リンカー−ＶＨをコードするヌクレオチド配列に行われる。
【０４３２】
一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子が生成される。一実施形態では、核酸分子は、最適化された構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸配列を含む。
【０４３３】
一実施形態では、その後、構造修飾されたＤＭＡｂの発現レベルおよび抗原結合が親ＤＭＡｂのものと比較される。一実施形態では、次に、発現が親ＤＭＡｂより優れていながら依然として抗原結合を示す構造修飾されたＤＭＡｂが、対象におけるインビボ発現および免疫応答を生成する能力についてさらに試験される。
【０４３４】
９．合成抗体の生成方法
本発明は、合成抗体の生成方法にも関する。本方法は、後により詳細に記載する送達方法を使用することによって、組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。したがって、合成抗体は、組成物を対象に投与した際に対象においてまたはインビボで生成される。
【０４３５】
本方法はまた、組成物を１つ以上の細胞内に導入することを含むことができ、それにより、合成抗体が１つ以上の細胞中で生成または産生され得る。本方法は、組成物を１つ以上の組織、例えば非限定的に皮膚および筋肉内に導入することをさらに含むことができ、それにより、合成抗体が１つ以上の組織中で生成または産生され得る。
【０４３６】
１０．抗体の同定またはスクリーニング方法
本発明は、上記の抗原に反応性であるかまたはそれに結合する上記の抗原を同定するかまたはそれについてスクリーニングする方法にさらに関する。抗体の同定またはスクリーニング方法は、抗体を同定またはスクリーニングするための当業者に既知の方法において抗原を使用し得る。そのような方法には、ライブラリ（例えば、ファージディスプレイ）からの抗体の選択、および動物の免疫化、その後の抗体の単離および／または精製が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０４３７】
１１．組成物の送達方法
本発明はまた、組成物を、それを必要とする対象に送達する方法に関する。送達方法は、組成物を対象に投与することを含み得る。投与には、インビボ電気穿孔を伴うまたは伴わないＤＮＡ注射、リポソーム媒介型送達、およびナノ粒子促進型送達が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０４３８】
組成物の送達を受ける哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、乳牛、畜牛、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、スイギュウ、バイソン、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであってもよい。
【０４３９】
組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせを含む、様々な経路によって投与され得る。獣医学的使用には、組成物は、通常の獣医学診療に従った好適な許容される製剤として投与され得る。獣医師であれば、特定の動物に最も適した投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。組成物は、伝統的なシリンジ、無針注入デバイス、「微粒子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などのその他の物理的方法によって投与されてもよい。
【０４４０】
ａ．電気穿孔
電気穿孔を介した組成物の投与は、可逆的な孔を細胞膜に形成するのに有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得る電気穿孔デバイスを使用して達成されてもよく、好ましくは、このエネルギーのパルスは、ユーザによる予め設定された電流入力に類似した定電流である。電気穿孔デバイスは、電気穿孔構成要素と、電極アセンブリまたはハンドルアセンブリとを備えてもよい。電気穿孔構成要素は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形ロガー、入力素子、状況報告要素、通信ポート、メモリ構成要素、電源、および電源スイッチを含む、電気穿孔デバイスの様々な要素のうちの１つ以上を含み、かつ組み込んでもよい。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進するために、インビボの電気穿孔デバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ  ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎ電気穿孔器（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を使用して達成してもよい。
【０４４１】
電気穿孔構成要素は、電気穿孔デバイスの１つの要素として機能してもよく、他の要素は、電気穿孔構成要素と通信している別個の要素（または構成要素）である。電気穿孔構成要素は、電気穿孔デバイスの２つ以上の要素として機能してもよく、これは、電気穿孔構成要素から離れた電気穿孔デバイスのさらに他の要素と通信していてもよい。電気機械的または機械的デバイスの一部として存在する電気穿孔デバイスの要素は限定されない場合があり、これは、要素が、１つの装置として、または互いに通信している別個の要素として機能することができるためである。電気穿孔構成要素は、所望の組織内に定電流を生じるエネルギーのパルスを送達することが可能であってもよく、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置で複数の電極を有する電極アレイを含んでもよく、電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からのエネルギーのパルスを受信し、これを、電極を通じて所望の組織に送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中に中性であり、所望の組織内のインピーダンスを測定し、インピーダンスを電気穿孔構成要素に通信する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受信してもよく、電気穿孔構成要素によって送達されたエネルギーのパルスを調節して、定電流を維持することができる。
【０４４２】
複数の電極が、分散パターンでエネルギーのパルスを送達してもよい。複数の電極は、プログラムされたシーケンス下での電極の制御を通して分散パターンでエネルギーのパルスを送達してもよく、プログラムされたシーケンスは、ユーザによって電気穿孔構成要素に入力される。プログラムされたシーケンスは、シーケンスで送達される複数のパルスを含んでもよく、複数のパルスの各々のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極によって送達され、後続の複数のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つによって送達される。
【０４４３】
フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実施されてもよい。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実施されてもよい。このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓごとに生じるが、好ましくはリアルタイムフィードバックまたは瞬時（即ち、応答時間を決定するために利用可能な技術によって決定されるように実質的に瞬時）である。中性電極は、所望の組織においてインピーダンスを測定してもよく、インピーダンスをフィードバック機構に通信し、フィードバック機構は、インピーダンスに応答し、エネルギーのパルスを調節して、予め設定された電流と同様の値に定電流を維持する。フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達中に定電流を連続的または瞬時に維持してもよい。
【０４４４】
本発明の組成物の送達を促進し得る電気穿孔デバイスおよび電気穿孔法の例には、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらによる米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されるものが含まれる。本組成物の送達を促進するために使用され得る他の電気穿孔デバイスおよび電気穿孔法には、全て全体が本明細書に組み込まれる、３５  ＵＳＣ１１９（ｅ）下で、２００６年１０月１７日出願の米国仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号に対する利益を主張する、２００７年１０月１７日出願の同時係属かつ共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されるものが含まれる。
【０４４５】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール電極システムおよびそれらの使用について記載している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極に導電性接続を提供する電気コネクタ、および電源を備えてもよい。操作者は、支持構造体に載置された複数の針電極を把持し、それらを体内または植物内の選択された組織へしっかりと挿入することができる。生体分子は、次いで、皮下注射針を介して選択された組織内に送達される。プログラム可能な定電流パルス制御器が作動し、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞内への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４４６】
Ｓｍｉｔｈらによる米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために使用され得る電気穿孔デバイスについて記載している。電気穿孔デバイスは、動作がソフトウェアまたはファームウェアによって特定される動電学的デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を含む。ＥＫＤデバイスは、ユーザ制御およびパルスパラメータの入力に基づき、アレイの電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生じ、電流波形データの記憶および取得を可能にする。電気穿孔デバイスはまた、一連の針電極、注入針用の中央注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクを有する、交換可能な電極ディスクを備える。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４４７】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイおよび方法は、筋肉等の組織だけではなく他の組織または器官へ深く浸透するように適合されてもよい。電極アレイの構成のため、注入針（選択した生体分子を送達するための）はまた、標的器官に完全に挿入され、注入は、電極によって事前に線引きされた領域内で標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは２０ｍｍの長さおよび２１ゲージである。
【０４４８】
加えて、電気穿孔デバイスおよびその使用を組み込むいくつかの実施形態において企図されるものには、以下の特許に記載されているものである電気穿孔デバイスがある：１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号。さらに、様々なデバイスのうちのいずれかを使用したＤＮＡの送達に関する２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡの注射方法に関心を寄せる２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号において提供される主題を網羅する特許が、本明細書で企図される。上記の特許は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４４９】
１２．治療方法
対象において構造修飾されたＤＭＡｂを生成することによって、疾患の治療、疾患からの保護、および／または疾患の予防を、それを必要とする対象において行う方法も、本明細書で提供される。本方法は、組成物を対象に投与することを含み得る。対象への組成物の投与は、上記の送達方法を使用して行うことができる。
【０４５０】
構造修飾されたＤＭＡｂが対象において生成されると、合成抗体は抗原に結合するかまたは抗原と反応することができる。そのような結合により、抗原が中和され、別の分子、例えばタンパク質または核酸による抗原の認識が遮断され、抗原に対する免疫応答が励起または誘導され、それにより、対象において抗原と関連付けられる疾患の治療、疾患からの保護、および／または疾患の予防を行うことができる。
【０４５１】
治療的および予防的免疫応答を誘導するために、ワクチンまたはワクチン接種の送達方法が提供されてもよい。ワクチン接種プロセスにより、抗原に対する免疫応答が哺乳動物中で生成されてもよい。ワクチンは、個人に送達されて、哺乳動物の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強してもよい。ワクチンの送達は、細胞中で発現され、細胞表面に送達され、その際に、免疫系が認識して、細胞性応答、液性応答、または細胞性応答および液性応答を誘導する、核酸分子としてのコンセンサス抗原のトランスフェクションであってもよい。ワクチンの送達を使用して、上で考察したようにワクチンを哺乳動物に投与することによって、抗原に対する哺乳動物における免疫応答を誘導または励起してもよい。
【０４５２】
組成物の用量は、１μｇ〜１０ｍｇ活性成分／体重１ｋｇ／時間であってもよく、２０μｇ〜１０ｍｇ成分／体重１ｋｇ／時間であってもよい。組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与することができる。効果的な治療のための組成物服用回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回であり得る。
【０４５３】
組成物は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上の、抗原をコードするＤＮＡワクチンを含み得る。組成物は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上の構造修飾されたＤＭＡｂまたはその断片を含んでもよい。
【０４５４】
ＤＮＡワクチンおよび構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子は、同じときに投与されても、異なるときに投与されてもよい。一実施形態では、ＤＮＡワクチンおよび構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子は、同時に投与される。一実施形態では、ＤＮＡワクチンは、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子の前に投与される。一実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子は、ＤＮＡワクチンの前に投与される。
【０４５５】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡワクチンは、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子が投与されてから、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、または１４日以上後に投与される。ある特定の実施形態では、ＤＮＡワクチンは、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子が投与されてから、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上、９週間以上、または１０週間以上後に投与される。ある特定の実施形態では、ＤＮＡワクチンは、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子が投与されてから、１か月以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、６か月以上、７か月以上、８か月以上、９か月以上、１０か月以上、１１か月以上、または１２か月以上後に投与される。
【０４５６】
ある特定の実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子は、ＤＮＡワクチンが投与されてから、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、または１４日以上後に投与される。ある特定の実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子は、ＤＮＡワクチンが投与されてから、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上、９週間以上、または１０週間以上後に投与される。ある特定の実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子は、ＤＮＡワクチンが投与されてから、１か月以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、６か月以上、７か月以上、８か月以上、９か月以上、１０か月以上、１１か月以上、または１２か月以上後に投与される。
【０４５７】
ある特定の実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子およびＤＮＡワクチンは、１回投与される。ある特定の実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子および／またはＤＮＡワクチンは、２回以上投与される。ある特定の実施形態では、構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子およびＤＮＡワクチンの投与により、持続的かつ全身的な免疫応答が得られる。
【０４５８】
１３．抗生物質との併用
本発明は、構造修飾されたＤＭＡｂと治療用抗生物質剤との組み合わせを投与することによって、疾患の治療、疾患からの保護、および／または疾患の予防を、それを必要とする対象において行う方法も提供する。
【０４５９】
構造修飾されたＤＭＡｂおよび抗生物質剤は、構造修飾されたＤＭＡｂおよび抗生物質剤の組み合わせが両方とも対象の中に存在するように、任意の好適な方法を使用して投与され得る。一実施形態では、本方法は、上で詳述した方法のいずれかによって本発明の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子を含む第１の組成物を投与することと、合成抗体の投与後、１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、７日未満、８日未満、９日未満、または１０日未満で、抗生物質剤を含む第２の組成物を投与することとを含んでもよい。一実施形態では、本方法は、上で詳述した方法のいずれかによって本発明の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子を含む第１の組成物を投与することと、合成抗体の投与後、１日超、２日超、３日超、４日超、５日超、６日超、７日超、８日超、９日超、または１０日超で、抗生物質剤を含む第２の組成物を投与することとを含んでもよい。一実施形態では、本方法は、抗生物質剤を含む第１の組成物を投与することと、抗生物質剤の投与後、１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、７日未満、８日未満、９日未満、または１０日未満で、上で詳述した方法のいずれかによって、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子を含む第２の組成物を投与することとを含んでもよい。一実施形態では、本方法は、抗生物質剤を含む第１の組成物を投与することと、抗生物質剤の投与後、１日超、２日超、３日超、４日超、５日超、６日超、７日超、８日超、９日超、または１０日超で、上で詳述した方法のいずれかによって、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子を含む第２の組成物を投与することとを含んでもよい。一実施形態では、本方法は、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子を含む第１の組成物と、抗生物質剤を含む第２の組成物とを、上で詳述した方法のいずれかによって同時に投与することを含んでもよい。一実施形態では、本方法は、本発明の構造修飾されたＤＭＡｂをコードする核酸分子および抗生物質剤を含む単一の組成物の投与を含んでもよい。
【０４６０】
本発明の合成抗体と併用することができる抗生物質の非限定的な例には、アミノグリコシド系（例えば、ゲンタマイシン、アミカシン、トブラマイシン）、キノロン系（例えば、シプロフロキサシン、レボフロキサシン）、セファロスポリン系（例えば、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン、セフピロム、セフトビプロール）、抗緑膿菌ペニシリン系：カルボキシペニシリン系（例えば、カルベニシリンおよびチカルシリン）およびウレイドペニシリン（例えば、メズロシリン、アズロシリン、およびピペラシリン）、カルバペネム系（例えば、メロペネム、イミペネム、ドリペネム）、ポリミキシン（例えば、ポリミキシンＢおよびコリスチン）、およびモノバクタム系（例えば、アズトレオナム）が挙げられる。
【０４６１】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される多数の態様を有する。
【実施例】
【０４６２】
本発明を、以下の実施例でさらに説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示目的のみで提供されることを理解されたい。上述の説明およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および修正を行って様々な用途および状況に適合させることができる。したがって、本明細書に示され、かつ説明されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかとなるであろう。そのような修正もまた、添付の特許請求の範囲内に入るように意図されている。
【０４６３】
実施例１：グラフトおよび骨格修飾
ＤＮＡベクターコード化モノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）により、電気穿孔（ＥＰ）を使用して骨格筋をトランスフェクトすることによってインビボｍＡｂを生成する手段を提供する。これまでの研究で、ＤＭＡｂは、高い血清レベルを達成することができ、インフルエンザおよび緑膿菌マウスチャレンジモデルにおいて精製されたｍＡｂに匹敵する保護を示したことが実証されている。臨床的応用に向けて、製剤化、投与、ヌクレオチドおよびアミノ酸の最適化を通したＤＭＡｂのインビボ発現レベルのさらなる増加にその努力が集中している。多数のＤＭＡｂ抗体修飾戦略が、元のｍＡｂクローンの生物学を犠牲にすることなくＤＭＡｂのインビボ発現レベルを増加させるためにフレームワークグラフトを用いて開発されている。
【０４６４】
図１は、最適化されたＤＭＡＢを生成するために使用される多数の戦略の概観を提供する。戦略には、完全骨格グラフト、部分骨格グラフト、および骨格修飾（多数の点突然変異）が含まれる。
【０４６５】
完全骨格グラフトには、ＣＤＲを、望ましくない特性を有する１つのＦｖ領域（ＶＨまたはＶＬ）から望ましい特性を有する第２のＦｖのフレームワークに移動させることが含まれる。この方法は、抗体ヒト化に用いられるものに多少類似している。Ｆｖ’の限定された選択が利用可能であり、理想的なＣＤＲ配置が困難となっている。骨格が完全に互換性でない場合、発現は良い影響を受け得るが、結合は悪い影響を受け得る。
【０４６６】
部分骨格グラフトには、折畳み安定性を増加させることを目的として、骨格の選択された領域を改変することが含まれる。ＣＤＲに近すぎる領域は、ＣＤＲの摂動を最低限に抑えるために回避される。一般に、可変軽鎖のＮ末端における最初の２０個の残基内で変化を作製して、高発現を有するＤＭＡｂの配列を模倣する。
【０４６７】
骨格修飾には、予測された一連の多数の突然変異を作製して、ＶＨ−ＶＬ界面での安定化相互作用を増加させるか、または等電点を好ましく改変することが含まれる。一般に、約３〜４個の個々のアミノ酸変化を作製して、安定性を増加させる。
【０４６８】
これから方法について記載する。
【０４６９】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）に、１００μｇのＤＭＡｂをコードするＤＮＡ−プラスミドを、筋肉内送達、続いて電気穿孔（ＩＭ−ＥＰ）によって、１つの治療部位に投与した。ＤＭＡｂの血清レベルを、ＥＬＩＳＡによって７日目に定量化した。血清ＤＭＡｂの結合を、ＥＬＩＳＡによって７日目に評定した。
【０４７０】
部分グラフト、完全グラフト、および骨格修飾を、表１に詳述するようにＢＤＢＶ２２３およびＺ５Ｄ２抗体に行った。
【表１】
2020519285.tif 000003
【０４７１】
以降、結果を記載する。
【０４７２】
多数の構築物を生成し、ＥＬＩＳＡによってインビボ発現についてスクリーニングした。部分グラフト方法は、発現不良に由来する可変軽鎖フレームワーク領域の一部分を、発現がより高いＤＭＡｂで代置することからなる。新たな部分グラフト構築物は、結合を維持しながら、元のＤＭＡｂよりもおよそ１対数高い増加を示した。
【０４７３】
ＢＤＢＶ２２３の部分グラフトにより、発現が増強され、かつ結合が維持された、最適化された抗体が得られた（図２）。対照的に、ＢＤＢＶ２２３のＶ２Ｌ２への完全グラフトでは、発現は増強されたが、抗原結合は失われた（図２）。同様の結果がＺ５Ｄ２抗体でも見られた。Ｚ５Ｄ２の部分グラフトにより、発現が増強され、かつ結合が維持された、最適化された抗体が得られた一方、Ｚ５Ｄ２の完全グラフトでは、抗原結合が失われた（図３）。図４は、完全グラフト、部分グラフト、および骨格修飾が、３つの異なる親ＤＭＡｂ配列から修飾された構造修飾されたＤＭＡｂの発現および抗原結合に与える影響の概要を提供する。
【０４７４】
実施例２：部分グラフト設計
２つの高発現ＤＭＡＢ（ｐＧＸ９２３２およびｐＧＸ９２１４）を、ｐＧＸ９２５６（１Ａ２）およびｐＧＸ９２９０（ＥＢＶ１１４）のＤＭＡＢ軽鎖に対してアラインメントした（図４）。
【０４７５】
ＣＤＲを用いるおよび用いない同一性マトリックスを計算した。結果を図５に提供する。アラインメントマトリックスも、ＦＲ１（最初のＣｙｓ残基まで）およびＦＲ４のみを使用して生成した。ＦＲ１マトリックスパターンからのパターンは、ＶＬおよび無ＣＤＲマトリックスと同一であった。１０個の残基のみ（末端Ｒを除く）に基づいたＦＲ４マトリックスは、異なるパターンをもたらしたが、全体的には極めて類似していた。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、類似したスコアが高いほどよいことが仮定される。操作された部分グラフトの配列は以下である。
＞ｐＧＸ９２５６＿（２３２）＿Ｌ（配列番号５８）
＞ｐＧＸ９２９０＿（２３２）＿Ｌ（配列番号５９）
＞ｐＧＸ９２５６＿（２１４）＿Ｌ（配列番号６０）
＞ｐＧＸ９２９０＿（２１４）＿Ｌ（配列番号６１）
【０４７６】
実施例３：ｓｃＦｖ−Ｆｃ変換
一本鎖ＳｃＦｖ−Ｆｃ変換は、ＣＨ１およびＣＬ領域の除去、ならびにＶＨとＶＬとの間のリンカーの付加である。変換により、重鎖−軽鎖対合および組織透過が向上する。ＤＭＡｂは、リンカーの付加により全長抗体からｓｃＦｖ−Ｆｃに変換される（図６および７に図示される通り）。
【０４７７】
これから方法について記載する。
【０４７８】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に、１００μｇのｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂをコードするＤＮＡ−プラスミドを、筋肉内送達、続いて電気穿孔（ＩＭ−ＥＰ）によって、１つの治療部位に投与した。血清を、投与後３５日にわたって収集した。
【０４７９】
２９３Ｔ細胞を、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂをコードするＤＮＡ−プラスミドでトランスフェクトした。ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂを、タンパク質Ａを使用して細胞上清から精製し、それらの正規化した結合親和性を、２つの異なるエボラウイルス発生株に由来する同一の抗原である、１９７６メインガ株または２０１４ギニア株に由来するザイールエボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）を使用して、ＥＬＩＳＡによって分析した。
【表２】
2020519285.tif 000004
【０４８０】
以降、結果を記載する。
【０４８１】
ＢＤＢＶ２２３のｓｃＦｖ−Ｆｃ変換により、抗原結合が減少した（図８）。Ｚ５Ｄ２のｓｃＦｖ−Ｆｃ変換により、発現が増加し、抗原結合が減少した（図９）。Ｚ１Ｈ３のｓｃＦｖ−Ｆｃ変換により、発現は増加したが、抗原結合に影響はなかった（図１０）。
【０４８２】
実施例４：ｓｃＦｖ−Ｆｃ設計
いくつかの見込みある操作アプローチが存在するが、この分野の多くの出版物は、逆を主張してはいるものの、極めて系特異的である。設計に使用され、現在ｄＭＡｂ空間において試験されているいくつかの新たなアプローチは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ空間に着想を与え得る可能性がある。
【０４８３】
結合および／または発現の増加と関連付けられるｓｃＦｖ  ＤＭＡｂの構造的特徴を同定するために、モデリングおよび分析を行った。モデリングは、ＦｖおよびｓｃＦｖに対して、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを使用して両方の形態（ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨ）で行った。１５セットのモデルを生成し、各セットには多数のモデルがあった。スコアリング方法および構造検査を使用して、各ステップのモデル構築を評定した。図１１は、フレームワークモデリングおよびＣＤＲループ精密化を含むモデリング過程中の異なるステップからの例となる出力を図示する。上位２０個のリンカー配座を評価した。リンカー付近の領域に注意して、主鎖の二乗平均平方根（ＲＭＳＤ）を生成した。
【０４８４】
リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）の配列を有する（Ｇ４Ｓ）３リンカーを、試験に組み入れるために選択した。
【０４８５】
以降、結果を記載する。
【０４８６】
予測ＳｃＦｖ−Ｆｃモデリングを５つの異なる親ＤＭＡｂに行った。各ＤＭＡｂを、ＶＨ−リンカー−ＶＬおよびＶＬ−リンカー−ＶＨの２つの配向でモデリングした。図１２および図１３は、リンカーがＣＤＲを遮るかまたはＣＤＲに干渉する可能性が高いかどうかを予測するために使用されるＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂの空間充填モデルを示す。
【０４８７】
表３は、さらなる開発のための候補のＤＭＡｂを同定するための決定木の要約を提供する。
【表３】
2020519285.tif 000005
【０４８８】
これらの結果に基づく推奨が表３である。いくつかの場合においては、ＲＭＳＤは、独立して最小化されたモデルについて通常の誤差以内である。一部の場合、特に、配座間で強力なシグナルが存在しない場合には、一方よりも他方を選択することに利益がない場合がある（ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨ）。他の場合には、モデリングにより、一方の配座が他方よりも優れた候補であり得ることが示される。ＲＭＳＤは、推奨を形成するための単純で一貫性のある測定であるが、ＲＭＳＤ以外の他の基準も有益であり得る。
【０４８９】
本明細書で使用するもの等のリンカー評価は、ひずみの問題を検出することができるが、会合において柔軟性または中間物に依存し、会合のためにより大きな移動度を必要とするＶドメイン会合に関する問題（例えば、「エントロピー検討（ｅｎｔｒｏｐｉｃ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）」）を容易に検出することはできない。
【０４９０】
実施例５：エボラウイルス疾患（ＥＶＤ）に対する合成ＤＮＡ−プラスミドコード抗体の治療用遺伝子導入のための構造的再フォーマットおよびタンパク質操作戦略の機能評定
エボラウイルス疾患（ＥＶＤ）は、ヒトにおいて重篤な出血熱を引き起こし、高い死亡率と関連付けられる。西アフリカにおける２０１３〜２０１５年のエボラの流行は、目下最も致死的であり、最近の新興疾患歴において最も長続きするものであった。そのような大発生の困難により、効果的なＥＶＤ抗ウイルス療法およびワクチンの必要性が浮き彫りとなった。ＥＶＤのためのワクチンがヒトにおいて有効であることが分かったものの、ワクチン防御は、即時的でなく、ＥＶＤの急性症例に対する治療背景において有益でない場合が多い。即時の防御免疫を与えるためにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の導入を必要とする受動免疫戦略が、ＥＶＤを含む感染疾患の背景において首尾よく使用されている。しかしながら、抗体投与に関連付けられる概念的および方法論的ハードルがある。これには、インビトロでのそれらの産生および最適化、それらのインビボでの投薬、そして最後に製造プロセス中に発生するコストが含まれる。この観点から、ＤＮＡ−プラスミドコード抗体のインビボ送達により、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）投与に対する革新的かつ安全なコスト効果的アプローチが得られる。
【０４９１】
様々な病原体に向けられたＤＮＡコードモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）のマウスにおけるインビボ電気穿孔（ＥＰ）媒介型遺伝子送達は、既に実証されている。最近の研究は、エボラウイルス糖タンパク質（ＥＢＯＶ−ＧＰ）であるＥＢＯＭＡｂ−１０およびＥＢＯＭＡｂ−１４を標的とする２つのＤＭＡｂを説明し、これはまた、免疫グロブリン（Ｉｇ）の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）への再フォーマット、および前述のＤＭＡｂ構造フレーム内の骨格グラフトからなる操作された修飾の機能的影響も説明している。ＥＢＯＭＡｂ−１０およびＥＢＯＭＡｂ−１４のそれらの未修飾形式および修飾形式におけるＥＰ媒介型遺伝子導入により、ＥＬＩＳＡによるＥＢＯＶ−ＧＰ抗原結合およびＥＢＯＶ−ＧＰ偽型ウイルスアッセイにおけるウイルス中和によって評定して、マウス血清における機能的抗体の分泌が生じる。これらの構造変化は、インビトロおよび表面糖タンパク質を発現する生細胞中でのＥＢＯＶ−ＧＰ結合ならびにウイルス中和に対して異質の効果を有する。まとめると、本明細書に記載のデータは、ＥＶＤ等の新興疾患に対する治療効力が増強した合成ＤＮＡプラスミドコードモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）の開発のための概念的枠組みを提供する。この試験はまた、ＤＭＡｂの構造操作を評定するための機能的パラダイムを提供し、全体として、ＤＮＡ系受動免疫アプローチを安全かつコスト効率的様式で臨床に転換するためのさらなるインビボの動物実験を支持する。
【０４９２】
これから方法について記載する。
【０４９３】
図１４は、これらの研究に使用される方法の流れ図を提供する。ＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂの生成に使用されるＤＭＡｂ設計戦略には、１）リンカー設計、２）ＶＨ−ＶＬ配向、および３）ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３選択が含まれる。親ＤＭＡｂは、部分グラフト、ＳｃＦｖ−Ｆｃ変換、または部分グラフトとＳｃＦｖ−Ｆｃ変換との組み合わせを受けた。
【０４９４】
ＤＭＡｂの２つのグループをこれらの試験で分析した。グループ１は、ＥＢＯＭＡｂ−１０  ＤＭＡｂ：ＥＢＯＭＡｂ−１０−ＩｇＧ（対照）、ＥＢＯＭＡｂ−１０−２（ＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂ）、ＥＢＯＭＡｂ−１０−３−ＩｇＧ部分グラフト、およびＥＢＯＭＡｂ−１０−４  ＳｃＦｖ−Ｆｃ部分グラフトからなる。グループ２は、ＥＢＯＭＡｂ−１４  ＤＭＡｂ：ＥＢＯＭＡｂ−１４−ＩｇＧ（対照）、ＥＢＯＭＡｂ−１４−２（ＳｃＦｖ−Ｆｃ修飾ＤＭＡｂ）、ＥＢＯＭＡｂ−１４−３−ＩｇＧ部分グラフト、およびＥＢＯＭＡｂ−１４−４  ＳｃＦｖ−Ｆｃ部分グラフトからなる。これらの試験に使用した配列を表４に示す。
【表４】
2020519285.tif 000006
【０４９５】
以降、結果を記載する。
【０４９６】
構造修飾されたＤＭＡｂの中和活性を評価した。全ての構造再フォーマットしたＤＭＡｂは、それらの親対照ＤＭＡｂに匹敵した（図１５）。ＩＣ５０およびＩＣ９０の評価により、ＳｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂは、ＩＣ９０が対照ＤＭＡｂのものより大きかったが、部分グラフト修飾したＤＭＡｂは、ＩＣ９０が対照のものより低かったことが示された（図１６）。グループ２のＤＭＡｂは、対照ＤＭＡｂと比較して増加した発現を示し、抗原結合は対照に対してわずかに増加したかまたは同等であった（図１７）。
【０４９７】
大部分が構造修飾されたＤＭＡｂは、機能（即ち、抗原結合および阻害能力）を大幅に失うことなくマウスにおいて高レベルで発現され得る。ＥＢＯＭＡｂ１０−３およびＥＢＯＭＡｂ−１４−３については、構造修飾により、ＩＣ５０およびＩＣ９０によって計算して、マウスにおける発現が増加し、阻害能力が増加する。
【０４９８】
このデータにより、ＤＭＡｂが、より高い可能性のある発現およびより高い治療効能のために操作することができる順応性のあるツールであるという概念の証拠がもたらされる。
【０４９９】
表５は、フレームワーク突然変異、完全グラフト、部分グラフト、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ変換を利用する、例となるエボラＤＭＡｂプラスミド構築物の一覧を提供する。
【０５００】
【表５−１】
2020519285.tif 000007
【表５−２】
2020519285.tif 000008
【０５０１】
実施例６：ジカウイルスに対するＤＮＡコード化モノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）のインビボ発現レベルを増加させるための戦略としての遺伝子最適化およびｓｃＦｖ−Ｆｃ再フォーマットの調査
遺伝子最適化およびｓｃＦｖ−Ｆｃ再フォーマットという２つの抗体修飾戦略を使用して、ジカウイルスを標的とする修飾されたＤＭＡｂを生成した（図１）。
【０５０２】
遺伝子最適化方法は、２つの全長ジカＤＭＡｂ配列の選択および６つの異なるアルゴリズムによる最適化からなった。コドン使用、ＧＣ含有量、潜在的スプライス部位、およびｍＲＮＡ二次構造等の、転写および翻訳に影響する多数のパラメータを、独自の多変数回帰アルゴリズムにおいて加重した。しかしながら、参照したデータのほとんどは、インビトロ発現系を使用して生成した。ジカＤＭＡｂのインビボ発現に最適なアルゴリズムを見いだすために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に、１００μｇのプラスミドＤＮＡを、１治療部位での筋肉内送達、続いて電気穿孔によって投与した。ＤＭＡｂの血清レベルおよび正規化結合を、ＥＬＩＳＡによって７日目に定量化した。ＺＫＤＭＡＢ−１については、アルゴリズム１により、１８ｕｇ／ｍｌで最高の発現が得られた（図１９および図２０）。ＺＫＤＭＡＢ−２については、アルゴリズム２により、３．５ｕｇ／ｍｌの最高の発現が得られた（図２１）。一貫して、アルゴリズム６によって最適化した両方のＤＭＡｂは、インビボ発現が最も低かったかまたは全くなかった。ほとんどの場合、ＥＬＩＳＡによる結合は保持されたが、いくつかのアルゴリズムはＺＫＤＭＡＢ−１についての減少を経験し、発現されたＤＭＡｂのタンパク質の折畳みまたは配座がヌクレオチド配列の影響を受けた可能性があることが示唆された（図１９、図２０、および図２２）。
【０５０３】
加えて、一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）変換を試験した。ＳｃＦｖ−Ｆｃ変換は、ＣＨ１およびＣＬ領域の除去、ならびにＶＨとＶＬとの間のリンカーの付加である。変換により、重鎖−軽鎖対合および組織透過が向上する。ＤＭＡｂは、リンカーの付加により全長抗体からｓｃＦｖ−Ｆｃに変換される（図１に図示される通り）。
【０５０４】
２つのジカＤＭＡｂを選択し、それらから多数の構築物を生成した。これらは、そのリンカー分子の選択およびＶＨ−ＶＬの配向が異なった。ＤＭＡｂを全長抗体からｓｃＦｖ−Ｆｃに変換することで、元のＤＭＡｂと比較してマウス発現が最大で６倍増加した。ＺＫＤＭＡＢ−１については、試験した４つの形式の発現は、１６ｕｇ／ｍｌから、下は８ｕｇ／ｍｌまでの範囲であり、ＶＨ−ＶＬ配向の（Ｇ４Ｓ）３リンカーが支持された。ＺＫＤＭＡＢ−２は、ＶＬ−ＶＨ配向の（Ｇ４Ｓ）３リンカーを使用して、最高の発現が１２ｕｇ／ｍｌに達した。重要なことに、ＤＭＡｂの大部分に行った修飾は抗原結合を保持した。これらの変化により、インビボ発現レベルは、元のｍＡｂクローンの生物学を犠牲にすることなく増加した（図２３および図２４）。これらのデータにより、ＤＭＡｂを遺伝子療法用途に設計するときに遺伝子およびタンパク質を調節することの明白な利益が示される。
【表６−１】
2020519285.tif 000009
【表６−２】
2020519285.tif 000010
【０５０５】
実施例７：ジカウイルス（ＺＩＫＶ）およびデングウイルス（ＤＥＮＶ）感染に対する多価ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＮＡコード化モノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）プラットフォームの評価
この研究では、それぞれＺＩＫＶおよびＤＥＮＶを標的とする２つの一本鎖断片可変Ｆｃ（ｓｃＦｖ−Ｆｃｓ）ＤＭＡｂ、Ｚ−ＤＭＡｂ１−ｓｃ、およびＤ−ＤＭＡｂ１−ｓｃの操作について説明する。これは、Ｚ−ＤＭＡｂ１−ｓｃとＤ−ＤＭＡｂ１−ｓｃとを多価双方向性プロモーター形式（Ｚ／Ｄ−ＤＭＡｂ１−ｓｃ）でコードする追加のＤＭＡｂの操作についても説明する。マウスモデルを使用し、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）−ＥＰ技術を使用して、様々なカクテルとして組み合わせたＺ−ＤＭＡｂ１−ｓｃおよびＤ−ＤＭＡｂ１−ｓｃならびに個々に製剤化した多価Ｚ／Ｄ−ＤＭＡｂ１−ｓｃを筋肉内送達した。これらのｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂの各々のＥＰ媒介性遺伝子導入により、ＥＬＩＳＡおよびウイルス抗原結合アッセイによって評定して、機能的ｓｃＦｖ−Ｆｃがマウス血清中で分泌された。この観察から、Ｚ−ＤＭＡｂ１−ｓｃおよびＤ−ＤＭＡｂ１についてのｓｃＦｖ−Ｆｃ発現は、単一の多価双方向性プロモーター構築物（Ｚ／Ｄ−ＤＭＡｂ１−ｓｃ）中で発現させた場合に、２つのＤＮＡプラスミド構築物を単一の調製物中で同時製剤化するか、または２つの個別の筋肉部位で別々に送達した場合よりも高いことが観察された。さらに、中和表現型のこれらの様々な同時製剤化および多価組み合わせの効果を分析した。全てをまとめると、これらのデータにより、重複する風土地で流行しているＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ等の多数の病原体による感染に対抗するために、より多用途であり得ることが分かっている多価ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＭＡｂプラットフォームを適合させることへの証拠が得られる。
【表７】
2020519285.tif 000011
【０５０６】
実施例８：呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するインビボ発現されたＤＮＡ系モノクローナル抗体（ｄＭＡｂ）の機能的特性評価
ｍＡｂは多くの感染疾患に対する保護の提供に効果的であることが示されているが、それらの普及は限定的である。限定されたインビボ半減期は、免疫を維持するために多数回の投薬が必要であることを意味し、また開発に伴う高いコストおよび複雑性、製造および低温流通体系、ならびに現場で用いることができる好適な投薬方法の欠如も、それらの世界的な使用の妨げとなっている。これに対し、抗体遺伝子のインビボ送達に基づく新たな戦略が開発されている。１つのそのようなプラットフォームは、ｄＭＡｂ、合成プラスミドＤＮＡコード化ｍＡｂである。ヒトｍＡｂをコードするＤＮＡ配列はプラスミドに挿入される。図１Ｂに図示するように、ｄＭＡｂプラスミドは筋肉組織に直接送達され、インビボの電気穿孔により、筋細胞による取り込みが増強される。トランスフェクトされた筋細胞は、ｍＡｂを産生し分泌する。ｍＡｂは、血液循環に進入し、全身的に機能することができる。概念実証研究では、ｄＭＡｂは、前臨床動物モデルにおいて、インフルエンザ、緑膿菌、ジカ、およびエボラを含む様々な感染疾患に対する保護を提供した。ここでは、ＲＳＶを標的とするｄＭＡｂの前臨床開発を示す。ＲＳＶ−ｄＭＡｂは、シーズンにわたってＲＳＶ感染からの重篤な合併症に対する予防的な保護を提供するために、ハイリスク集団に送達され得る。維持された発現により、初回１回のｄＭＡｂ送達がＲＳＶシーズン全体をカバーし、再送達は必要でない場合がある。
【０５０７】
抗ＲＳＶ  ｓｃ−ＦｖをコードするＤＮＡプラスミドを操作して、全長ヒトＩｇＧと比較して改善したインビボ発現プロファイルを持たせた（図２５Ａ）。全身性発現をさらに増強するため、最適化された送達プロトコルを用いた。最適化された製剤は、標的組織の細胞外マトリックスの修飾によりプラスミドＤＮＡの分散を増強する。電気穿孔は、標的細胞によるＤＮＡ分子の細胞取り込みを増加させる。インビボ発現されたヒトｓｃ−Ｆｖの機能性を、ＲＳＶ−融合タンパク質（ＲＳＶ−Ｆ）抗原への結合およびインビトロの生ＲＳＶ−Ａウイルスの中和について、処理マウスの血清から確認した。血清レベルの発現に加えて、インビボ発現されたヒトｓｃ−Ｆｖも、自然ＲＳＶ感染部位である肺において検出された。次に、投薬および送達方法を、ＲＳＶ予防薬開発のための標準前臨床モデルであるコットンラットに適用した。
【０５０８】
このｄＭＡｂのインビボ送達により、マウスの血清における抗体の堅牢な全身レベルが得られた（図２６および図２９Ａ）。一致したレベルの組換えパビリズマブにより、ＲＳＶ感染後の下気道疾患からの保護がもたらされた。ＲＳＶ感染後のヒト疾患のモデルとするための代表的基準であるコットンラットにおいて、ｄＭＡｂの持続した血清発現が、送達後６０日まで観察された（図３０）。抗体は、肺洗浄試料中でも検出され、効果的な生体内分布が示された（図２６Ｃおよび図２９Ｄ）。さらに、ＲＳＶ−Ｆ  ｄＭＡｂを保有する動物由来の血清は、抗原結合および生ウイルスの中和において機能的に活性であった（図２７、図２９Ｂ、図２９Ｃ、および図３１Ｂ）。コットンラットのインビボ生ウイルスチャレンジを実施するために、実験を設計する。コットンラットは、適合されていないヒトＲＳＶに対する感受性が高く、かつヒトにおける感染の病理の多くの特徴を呈するので、ＲＳＶワクチンの前臨床開発のための最適なモデルであると考えられる。
【０５０９】
これらの結果により、抗ＲＳＶヒトｓｃ−Ｆｖ  ｄＭＡｂが、ＲＳＶシーズン全体にわたるタンパク質−ｍＡｂの反復注射に対する効果的な代替となり得ることが示唆される。ＲＳＶ−ｄＭＡｂは、受動免疫と関連付けられるハードルのうちのいくつかを克服する可能性を有する。
【表８】
2020519285.tif 000012
【表９】
2020519285.tif 000013
【０５１０】
実施例９：ジカウイルス（ＺＩＫＶ）およびデングウイルス（ＤＥＮＶ）感染に対する多価ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＤＮＡコード化モノクローナル抗体（ｄＭＡｂ（商標））プラットフォームの評価
ジカ（ＺＩＫＶ）およびデング（ＤＥＮＶ）ウイルスは、深刻でない湿疹からさらに死に繋がり得る重篤な臓器不全まで様々な軽度から重度の病態を引き起こす蚊媒介性フラビウイルスであり、特に妊娠中のＺＩＫＶによる感染は、自然流産、または個人的にも社会的にも重圧となり得る小頭症および認識機能障害を含む新生児における重篤な発育不全と関連付けられる。これまでに公開されている前臨床モデルは、ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ感染に対する治療的介入のための基礎として中和モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を使用することについて論拠を立てた。ｍＡｂ投与は感染疾患のための予防的および治療的両方のアプローチとして極めて有望であるものの、ＺＩＫＶまたは／およびＤＥＮＶ感染に罹患する危険にさられている可能性がある数百万の人を特別に対象としたタンパク質ｍＡｂの大規模な投与と関連付けられる概念および方法論的障害が存在する。これらの疾患の治療のための代替的アプローチは、血清中のｍＡｂのインビボ産生および分泌をもたらす、骨格筋におけるプラスミドをコードする抗体（ｄＭＡｂ）の発現に基づく。病原の対象範囲が拡大したより多用途のｄＭＡｂプラットフォームを設計するために、それぞれＺＩＫＶおよびＤＥＮＶを標的とするＺ−ｄＭＡｂ１−ｓｃおよびＤ−ｄＭＡｂ１−ｓｃという２つの一本鎖断片可変Ｆｃ（ｓｃＦｖ−Ｆｃｓ）ｄＭＡｂを作製した（図３２）。Ｚ−ｄＭＡｂ１−ｓｃとＤ−ｄＭＡｂ１−ｓｃとの両方を多価双方向性プロモーター形式（Ｚ／Ｄ−ｄＭＡｂ１−ｓｃ）でコードする追加のｄＭＡｂも作製した（図３２および表１０）。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）−ＥＰ技術を使用して、プラスミドＤＮＡをコードするＺ−ｄＭＡｂ１−ｓｃおよびＤ−ｄＭＡｂ１−ｓｃの様々なカクテルとしての組み合わせ、ならびに個々に製剤化した多価プラスミドＤＮＡをコードするＺ／Ｄ−ｄＭＡｂ１−ｓｃをマウスモデルにおいて筋肉内送達した。これらのｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｄＭＡｂの各々のＥＰ媒介性遺伝子導入により、ＥＬＩＳＡおよびウイルス抗原結合アッセイによって評定して、機能的ｓｃＦｖ−Ｆｃがマウス血清中で分泌された（図３３）。この観察から、単一の多価双方向性プロモーター構築物（Ｚ／Ｄ−ｄＭＡｂ１−ｓｃ）中で発現させた場合、２つのＤＮＡプラスミド構築物を単一の調製物中で同時製剤化するか、または２つの個別の筋肉部位で別々に送達した場合と比較して、Ｚ−ｄＭＡｂ１−ｓｃおよびＤ−ｄＭＡｂ１について異質のｓｃＦｖ−Ｆｃ発現が認められた（図３４）。さらに、これらの様々な同時製剤化および多価組み合わせがどのように中和表現型に影響するのかを分析した（図３５）。多価ｓｃＦｖ−Ｆｃプラットフォームにより、２つの機能的ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｄＭＡｂ（Ｚ−ｄＭＡｂ１−ｓｃおよびＤ−ｄＭＡｂ１−ｓｃ）の産生が可能となる。ｓｃＦｖ−Ｆｃジカ／デングｄＭＡｂのカクテル化／混合は、デングｄＭＡｂ１−ｓｃ発現に有益であるように見受けられる。さらに、双方向性プロモータープラットフォームにおけるジカ／デングｄＭＡｂの分子操作は、デングｄＭＡｂの発現に極めて有益であり、ジカ発現においても顕著な差異はないように見受けられる。
【０５１１】
全てをまとめると、これらのデータにより、重複する風土地で流行しているＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ等の多数の病原体による感染に対抗するために、より適合性であり得ることが分かっている多価ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ｄＭＡｂプラットフォームが支持される。
【表１０】
2020519285.tif 000014
【０５１２】
上記の詳細な説明および付随する実施例は、単に例示であり、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義される本発明の範囲に対する制限であると解釈されるべきではないことを理解されたい。
【０５１３】
開示される実施形態に対する様々な変更および修正は、当業者には明白であろう。限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関連するものを含むかかる変更および修正は、その主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１Ａ−１Ｃ】
2020519285.tif 000015
【図１Ｄ】
2020519285.tif 000016
【図２Ａ−２Ｂ】
2020519285.tif 000017
【図３Ａ−３Ｂ】
2020519285.tif 000018
【図４】
2020519285.tif 000019
【図５】
2020519285.tif 000020
【図６】
2020519285.tif 000021
【図７Ａ】
2020519285.tif 000022
【図７Ｂ】
2020519285.tif 000023
【図７Ｃ】
2020519285.tif 000024
【図８Ａ】
2020519285.tif 000025
【図８Ｂ】
2020519285.tif 000026
【図８Ｃ】
2020519285.tif 000027
【図８Ｄ】
2020519285.tif 000028
【図９Ａ】
2020519285.tif 000029
【図９Ｂ】
2020519285.tif 000030
【図９Ｃ】
2020519285.tif 000031
【図９Ｄ】
2020519285.tif 000032
【図９Ｅ】
2020519285.tif 000033
【図９Ｆ】
2020519285.tif 000034
【図１０Ａ】
2020519285.tif 000035
【図１０Ｂ】
2020519285.tif 000036
【図１０Ｃ】
2020519285.tif 000037
【図１０Ｄ】
2020519285.tif 000038
【図１０Ｅ】
2020519285.tif 000039
【図１１】
2020519285.tif 000040
【図１２】
2020519285.tif 000041
【図１３】
2020519285.tif 000042
【図１４】
2020519285.tif 000043
【図１５Ａ】
2020519285.tif 000044
【図１５Ｂ】
2020519285.tif 000045
【図１６】
2020519285.tif 000046
【図１７Ａ】
2020519285.tif 000047
【図１７Ｂ】
2020519285.tif 000048
【図１７Ｃ】
2020519285.tif 000049
【図１７Ｄ】
2020519285.tif 000050
【図１７Ｅ】
2020519285.tif 000051
【図１７Ｆ】
2020519285.tif 000052
【図１８Ａ】
2020519285.tif 000053
【図１８Ｂ】
2020519285.tif 000054
【図１９Ａ】
2020519285.tif 000055
【図１９Ｂ】
2020519285.tif 000056
【図２０Ａ】
2020519285.tif 000057
【図２０Ｂ】
2020519285.tif 000058
【図２１Ａ】
2020519285.tif 000059
【図２１Ｂ】
2020519285.tif 000060
【図２２Ａ】
2020519285.tif 000061
【図２２Ｂ】
2020519285.tif 000062
【図２３】
2020519285.tif 000063
【図２４】
2020519285.tif 000064
【図２５Ａ】
2020519285.tif 000065
【図２５Ｂ】
2020519285.tif 000066
【図２６Ａ】
2020519285.tif 000067
【図２６Ｂ】
2020519285.tif 000068
【図２６Ｃ】
2020519285.tif 000069
【図２６Ｄ】
2020519285.tif 000070
【図２７】
2020519285.tif 000071
【図２８】
2020519285.tif 000072
【図２９Ａ】
2020519285.tif 000073
【図２９Ｂ】
2020519285.tif 000074
【図２９Ｃ】
2020519285.tif 000075
【図２９Ｄ】
2020519285.tif 000076
【図３０】
2020519285.tif 000077
【図３１Ａ】
2020519285.tif 000078
【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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