(57)【要約】  本明細書に記載されるのは、インターロイキン-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラニューカッスル病ウイルスである。該キメラニューカッスル病ウイルス及びその組成物は、プログラム細胞死タンパク質1(「PD-1」)又はそのリガンドのアンタゴニストと組み合わせて、癌の治療において有用である。特に、本明細書に記載されるのは、癌を治療する方法であって、該キメラニューカッスル病ウイルスをPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストと組み合わせて投与することを含み、ここで、該キメラニューカッスル病ウイルスがインターロイキン-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。【選択図】図１
2020519641.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象の癌を治療する方法における使用のための第一の組成物であって、該第一の組成物がキメラニューカッスル病ウイルス(NDV)を含み、ここで、該キメラNDVがヒトインターロイキン-12(「IL-12」)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子がヒトIL-12 p40サブユニット及びヒトIL-12 p35サブユニットをコードし、かつ該方法が第二の組成物を投与することをさらに含み、ここで、該第二の組成物が、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記キメラNDVがLa Sota株のNDV骨格を含む、請求項1記載の使用のための第一の組成物。
【請求項３】
前記キメラNDVがLa Sota株のNDV骨格を含み、前記パッケージングされたゲノムがアミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該突然変異型Fタンパク質が前記キメラNDVのビリオンに組み入れられている、請求項1記載の使用のための第一の組成物。
【請求項４】
前記IL-12が配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項５】
前記導入遺伝子が配列番号61に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項4記載の使用のための第一の組成物。
【請求項６】
前記IL-12が配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項７】
前記導入遺伝子が配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項6記載の使用のための第一の組成物。
【請求項８】
前記IL-12が配列番号43又は42に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項９】
前記導入遺伝子が、配列番号63、68、53、又は66に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項8記載の使用のための第一の組成物。
【請求項１０】
前記IL-12 p40サブユニットが配列番号38又は23に示されるアミノ酸配列を含み、前記IL-12 p35サブユニットが配列番号41又は25に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項１１】
前記パッケージングされたゲノムが、NDV NP遺伝子の転写ユニット、NDV P遺伝子の転写ユニット、NDV M遺伝子の転写ユニット、NDV F遺伝子の転写ユニット、NDV HN遺伝子の転写ユニット、及びNDV L遺伝子の転写ユニットを含み、前記導入遺伝子が該パッケージングされたゲノムの該NDV P遺伝子と該NDV M遺伝子の間に挿入されている、請求項1〜10のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項１２】
前記パッケージングされたゲノムが配列番号51に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の使用のための第一の組成物。
【請求項１３】
前記パッケージングされたゲノムが配列番号52又は60に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の使用のための第一の組成物。
【請求項１４】
前記抗体がペンブロリズマブである、請求項1〜13のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項１５】
前記抗体がニボルマブである、請求項1〜13のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項１６】
前記抗体がMEDI0680である、請求項1〜13のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項１７】
前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化１】
2020519641.tif 000297
を含むVLCR;及び
(b)アミノ酸配列
【化２】
2020519641.tif 000298
を含むVHCRを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項１８】
前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化３】
2020519641.tif 000299
を含む軽鎖;及び
(b)アミノ酸配列
【化４】
2020519641.tif 000300
を含む重鎖を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項１９】
前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化５】
2020519641.tif 000301
を含むVLCR;及び
(b)アミノ酸配列
【化６】
2020519641.tif 000302
を含むVHCRを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項２０】
前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化７】
2020519641.tif 000303
を含む軽鎖;及び
(b)アミノ酸配列
【化８】
2020519641.tif 000304
を含む重鎖を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項２１】
前記第一の組成物が前記対象に腫瘍内又はリンパ節内投与され、前記第二の組成物が該対象に、静脈内投与される、請求項1〜20のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項２２】
前記対象が皮膚もしくは皮下腫瘍又はリンパ節内腫瘍を示す、請求項21記載の使用のための第一の組成物。
【請求項２３】
前記癌が、メラノーマ、腎臓癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、肝細胞癌、膵癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳癌、頭頸部癌、非ホジキンリンパ腫もしくはホジキンリンパ腫、又はメラノーマ、肉腫、子宮癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される固形腫瘍である、請求項1〜22のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項２４】
前記肺癌が非小細胞肺癌であり、前記頭頸部癌が頭頸部の扁平上皮細胞癌であり、前記腎臓癌が腎細胞癌であり、前記結腸直腸癌が結腸直腸上皮癌であり、又は前記乳癌が乳房上皮癌である、請求項23記載の使用のための第一の組成物。
【請求項２５】
前記癌が、メラノーマ、非小細胞肺癌、頭頸部癌(HNSCC頭頸部扁平上皮細胞癌)、尿路上皮癌、トリプルネガティブ乳癌、胃癌、胃食道接合部腺癌、古典的ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、中皮腫、卵巣癌、小細胞肺癌、食道癌、鼻咽頭癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、ER+/HER2-乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、前立腺癌、膠芽腫、マイクロサテライト高不安定性(MSI-H)もしくはミスマッチ修復欠損癌(組織非依存性)、又は高い腫瘍突然変異負荷を有する腫瘍(組織非依存性)である、請求項1〜22のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項２６】
前記癌が切除不能である、請求項1〜25のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項２７】
前記癌が、皮膚、皮下、又はリンパ節転移を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項２８】
前記癌の生検がPD-L1陽性である、請求項1〜27のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項２９】
前記生検が少なくとも1％の腫瘍比率スコアを有する、請求項28記載の使用のための第一の組成物。
【請求項３０】
前記生検が少なくとも1の複合陽性スコアを有する、請求項28記載の使用のための第一の組成物。
【請求項３１】
前記対象が、PD-1に結合し、かつPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体による単剤療法治療に不応性又は再発性である、請求項1〜30のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項３２】
前記対象が、PD-1に結合し、かつPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体による単剤療法治療に不応性である、請求項1〜30のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項３３】
前記PD-1に結合する抗体がペンブロリズマブである、請求項31又は32記載の使用のための第一の組成物。
【請求項３４】
前記対象がPDL-1に対する抗体による単剤療法治療に不応性又は再発性である、請求項1〜30のいずれか一項記載の使用のための第一の組成物。
【請求項３５】
パッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであって、該パッケージングされたゲノムがヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該IL-12が配列番号39又は22に示されるアミノ酸配列を含む、前記キメラNDV。
【請求項３６】
前記導入遺伝子が配列番号61に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項35記載のキメラNDV。
【請求項３７】
パッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであって、該パッケージングされたゲノムがヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該IL-12が配列番号43又は42に示されるアミノ酸配列を含む、前記キメラNDV。
【請求項３８】
前記導入遺伝子が、配列番号63、68、53、又は66に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項37記載のキメラNDV。
【請求項３９】
前記キメラNDVがLa Sota株のNDV骨格を含み、前記パッケージングされたゲノムがアミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該突然変異型Fタンパク質が該キメラNDVのビリオンに取り込まれている、請求項35〜38のいずれか一項記載のキメラNDV。
【請求項４０】
前記パッケージングされたゲノムが、NDV NP遺伝子の転写ユニット、NDV P遺伝子の転写ユニット、NDV M遺伝子の転写ユニット、NDV F遺伝子の転写ユニット、NDV HN遺伝子の転写ユニット、及びNDV L遺伝子の転写ユニットを含み、前記導入遺伝子が該パッケージングされたゲノムの該NDV P遺伝子と該NDV M遺伝子の間に挿入されている、請求項35〜39のいずれか一項記載のキメラNDV。
【請求項４１】
前記パッケージングされたゲノムが配列番号51に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項35記載のキメラNDV。
【請求項４２】
前記パッケージングされたゲノムが配列番号52又は60に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項37記載のキメラNDV。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その各々が引用により完全に本明細書中に組み入れられる、2017年5月12日に出願された米国仮特許出願第62/505,759号及び2017年5月17日に出願された米国仮特許出願第62/507,690号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
本発明は、米国立衛生研究所により授与されたT32 CA009207及びHHSN26620070010Cの下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、かつ引用により完全に本明細書中に組み入れられる配列表を含む。2018年5月4日に作成された該ASCIIコピーは、6923-272-228_SL.txtという名称であり、サイズが263,022バイトである。
【０００４】
(1.序論)
本明細書に記載されるのは、癌を治療する方法であって、対象に、キメラニューカッスル病ウイルス(「NDV」)(又はそのようなキメラNDVを含む組成物)及びプログラム細胞死タンパク質1(「PD-1」)もしくはそのリガンドのアンタゴニスト(又はそのようなアンタゴニストを含む組成物)を投与することを含み、ここで、該キメラNDVがインターロイキン-12(「IL-12」)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。具体的な態様において、本明細書に記載されるのは、癌を治療する方法であって、キメラニューカッスル病ウイルス(又はそのようなキメラNDVを含む組成物)及びPD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)抗体との相互作用を遮断する抗PD-1抗体(又はそのようなアンタゴニストを含む組成物)を投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。別の態様において、本明細書に記載されるのは、対象の癌を治療する方法における使用のためのキメラニューカッスル病ウイルスであり、ここで、該キメラNDVは、IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、該方法は、PD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方)抗体との相互作用を遮断する抗PD-1抗体を投与することをさらに含む。
【背景技術】
【０００５】
(2.背景)
(2.1  ニューカッスル病ウイルス)
ニューカッスル病ウイルス(NDV)は、いくつかの鳥類に感染することが示されている、パラミクソウイルス科のアブラウイルス属のメンバーである(Alexander, DJの文献(1988))。ニューカッスル病、ニューカッスル病ウイルス--鳥パラミクソウイルス(Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus.)、Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. 1〜22ページ)。NDVは、マイナスセンスに一本鎖RNAゲノムを保有し、宿主ゲノムとの組換えも、他のウイルスとの組換えも起こさない(Alexander, DJの文献(1988))。ニューカッスル病、ニューカッスル病ウイルス--鳥パラミクソウイルス(Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus.)、Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. 1〜22ページ)。このゲノムRNAは、以下でさらに詳細に記載される、3'-NP-P-M-F-HN-L-5'という順序で遺伝子を含有する。2つのさらなるタンパク質であるV及びWは、RNA編集によって生成するオルタナティブmRNAにより、P遺伝子からNDVによって産生される。このゲノムRNAはまた、3'末端にリーダー配列を含有する。
【０００６】
ビリオンの構造エレメントは、細胞形質膜に由来する脂質二重層であるウイルスエンベロープを含む。糖タンパク質である血球凝集素-ノイラミニダーゼ(HN)が該エンベロープから突き出ることで、該ウイルスが血球凝集素(例えば、受容体結合/融合)活性とノイラミニダーゼ活性の両方を含有することが可能になっている。同じくウイルス膜と相互作用する融合糖タンパク質(F)が不活性な前駆体としてまず産生され、その後、翻訳後切断されて、2つのジスルフィド結合ポリペプチドを産生する。活性型Fタンパク質は、ウイルスエンベロープと宿主細胞形質膜との融合を容易にすることにより、宿主細胞へのNDVの侵入に関与する。マトリックスタンパク質(M)は、ウイルス集合に関与し、ウイルス膜とヌクレオカプシドタンパク質の両方と相互作用する。
【０００７】
ヌクレオカプシドの主なタンパク質サブユニットは、該カプシドにらせん形の対称性を付与するヌクレオカプシドタンパク質(NP)である。該ヌクレオカプシドと関連しているのは、Pタンパク質とLタンパク質である。リン酸化を受けるホスホタンパク質(P)は、転写において調節的な役割を果たすと考えられており、メチル化、リン酸化、及びポリアデニル化にも関与し得る。RNA依存性RNAポリメラーゼをコードするL遺伝子は、Pタンパク質とともにウイルスRNA合成に必要とされる。ウイルスゲノムのコード容量のほぼ半分を占めるLタンパク質は、ウイルスタンパク質のうちの最大のものであり、転写と複製の両方において重要な役割を果たす。Vタンパク質は、インターフェロン-αを阻害し、NDVの病原性に寄与することが示されている(Huangらの文献(2003))。ニューカッスル病ウイルスVタンパク質はウイルスの発病と関連し、αインターフェロンアンタゴニストとして機能する(Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an Alpha Interferon Antagonist.)、Journal of Virology 77: 8676-8685)。
【０００８】
天然のNDVは、種々の動物腫瘍モデルにおいて有効な腫瘍溶解性因子であることが報告されている(Sinkovics, JG及びHorvath, JCの文献(2000))。ニューカッスル病ウイルス(NDV):その腫瘍溶解性株の概歴(Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.)、J Clin Virol 16: 1-15; Zamarinらの文献、2009; Mol Ther 17: 697; Elankumaranらの文献、2010; J Virol 84: 3835; Schirrmacherらの文献、2009; Methods Mol Biol 542: 565; Bartらの文献、1973; Nat New Biol 245: 229)。天然のNDV株は、進行性ヒト癌に対する多数の臨床試験で使用されている(Sinkovics, JG及びHorvath, JCの文献(2000)。ニューカッスル病ウイルス(NDV):その腫瘍溶解性株の概歴(Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.)、J Clin Virol 16: 1-15; Lorenceらの文献(2007)。腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルスPV701の静脈内投与を用いた第1相臨床実験(Phase 1 clinical experience using intravenous administration of PV701, an oncolytic Newcastle disease virus.)、Curr Cancer Drug Targets 7: 157-167; Hotteらの文献(2007)。腫瘍溶解性ウイルスPV701の最適化された臨床レジメン(An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701.)、Clin Cancer Res 13: 977-985; Freemanらの文献(2006)。再発性多形性膠芽腫における静脈内NDV-HUJ腫瘍溶解性ウイルスの第I/II相試験(Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme.)、Mol Ther 13: 221-228; Pecoraらの文献(2002)。進行性固形癌を有する患者における腫瘍溶解性ウイルスPV701の静脈内投与の第I相試験(Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers.)、J Clin Oncol 20: 2251-2266; Csataryらの文献(2004)。ヒト高悪性度神経膠腫におけるMTH-68/H腫瘍溶解性ウイルス治療(MTH-68/H oncolytic viral treatment in human high-grade gliomas.)、J Neurooncol 67: 83-93)。しかしながら、進行性ヒト癌に対するこれらの臨床試験における天然のNDV株の成功は大したものではなかった(Hotteらの文献(2007))。腫瘍溶解性ウイルスPV701の最適化された臨床レジメン(An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701.)、Clin Cancer Res 13: 977-985; Freemanらの文献(2006)。再発性多形性膠芽腫における静脈内NDV-HUJ腫瘍溶解性ウイルスの第I/II相試験(Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme.)、Mol Ther 13: 221-228; Pecoraらの文献(2002)。進行性固形腫瘍を有する患者における腫瘍溶解性ウイルスPV701の静脈内投与の第I相試験(Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers.)、J Clin Oncol 20: 2251-2266)。したがって、癌、特に、進行癌の治療において有用なNDVベースの治療法が依然として必要とされている。
【０００９】
(2.2  PD-1アンタゴニスト)
抗PD-1遮断抗体及び抗PD-L1遮断抗体は、特定のタイプの癌の治療に承認されている。例えば、ペンブロリズマブは、(1)不応性の古典的ホジキンリンパ腫、(2)再発性もしくは転移性頭頸部扁平上皮細胞癌、(3)切除不能もしくは転移性メラノーマ、(4)局所性もしくは進行性もしくは転移性尿路上皮癌、(5)プログラム死-リガンド1(「PD-L1」)を発現する腫瘍を有する再発性局所進行性もしくは転移性の胃もしくは胃食道腺癌、(6)前治療の後に進行し、かつ満足できる代替治療選択肢がない切除不能もしくは転移性のマイクロサテライト高不安定性癌もしくはミスマッチ修復欠損固形腫瘍、又はフルオロピリミジン、オキサリプラチン、及びイリノテカンによる治療の後に進行した結腸直腸癌、並びに(7)PD-L1を発現する腫瘍を有する転移性非小細胞肺癌を含む、いくつかのタイプの癌の治療に承認されており;ニボルマブは、切除不能又は転移性メラノーマを含む、異なるタイプの癌の治療に承認されている。これらの療法はある程度の成功を示しているが、癌を治療するための治療法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
(3.概要)
一態様において、本開示は、インターロイキン-12(「IL-12」)(例えば、IL-12のp35及びp40サブユニット)又はその誘導体をコードするパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVを提供する。具体的な実施態様において、IL-12導入遺伝子は、本明細書に開示されるIL-12導入遺伝子である(例えば、第5.2節、第5.2.1節、第5.7節、第5.10節、及び第6節を参照)。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号26、53、61、63、66、又は68に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子はポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは、配列番号22、39、42、又は43に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12は、ヒトIL-12である。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、例えば、癌の治療に使用することができる。本明細書に開示されるキメラNDVは、腫瘍試料についての表15の18-遺伝子シグナチャーの遺伝子発現プロファイリングスコア(下の第6.3.1.14節を参照)を予想外に顕著に増大させる。
【００１１】
別の態様において、本明細書に提示されるのは、キメラNDV又はそのようなキメラNDVを含む組成物を、PD-1(例えば、ヒトPD-1)もしくはそのリガンドのアンタゴニスト又はそのようなアンタゴニストを含む組成物と組み合わせて利用して癌を治療する方法であって、該キメラNDVがIL-12(例えば、IL-12のp35及びp40サブユニット)又はその誘導体をコードするパッケージングされたゲノムを含む、方法である。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。
【００１２】
本明細書に記載される癌を治療する方法は、IL-12導入遺伝子(「NDV-IL-12」)をコードするように改変されたパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVがPD-1とPD-L1との相互作用を遮断する抗PD-1抗体の投与と組み合わせて腫瘍内投与された対象で見られる強い抗腫瘍活性に一部基づいている。治療を受けた対象におけるこの強い抗腫瘍活性は、NDV-IL-12が注射された腫瘍とNDV-IL-12が注射されなかった腫瘍の両方で観察され、それゆえ、遠達効果が観察された。本明細書に記載される癌を治療する方法は、NDV-IL-12が単独で又はPD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、もしくはPD-L1とPD-L2の両方)との相互作用を遮断する抗PD-1抗体と組み合わせて投与された対象で観察される遺伝子発現にも一部基づいている。
【００１３】
一実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、対象に、キメラNDV及びPD-1(例えば、ヒトPD-1)もしくはそのリガンドのアンタゴニストを投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、対象に、有効量のキメラNDV及び有効量のPD-1(例えば、ヒトPD-1)又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。該キメラNDV及びアンタゴニストは、同時に又は連続的に、該対象に投与することができる。ある実施態様において、該キメラNDV及びアンタゴニストは、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該キメラNDV及びアンタゴニストは、異なる組成物中で投与される。該NDV及びアンタゴニストは、同じ又は異なる投与経路で該対象に投与することができる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは対象に、腫瘍内投与され、該アンタゴニストは対象に、静脈内投与される。
【００１４】
別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、キメラNDVを含む第一の組成物及びPD-1(例えば、ヒトPD-1)又はそのリガンドのアンタゴニストを含む第二の組成物を投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子がIL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードする、方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、キメラNDV及びPD-1(例えば、ヒトPD-1)又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12をコードするパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該PD-1のアンタゴニストがPD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)との相互作用を遮断する抗PD-1抗体である、方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、キメラNDVを含む第一の組成物及びPD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)との相互作用を遮断する抗PD-1抗体を含む第二の組成物を投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子がIL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードする、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としているヒト対象に、キメラNDVを含む第一の組成物及びPD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)との相互作用を遮断する抗PD-1抗体を含む第二の組成物を投与することを含み、ここで、該キメラNDVがヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子がヒトIL-12 p40サブユニット及びヒトIL-12 p35サブユニットをコードする、方法である。該第一及び第二の組成物は、同じ又は異なる投与経路で投与することができる。具体的な実施態様において、該第一の組成物は、腫瘍内に投与され、該第二の組成物は、静脈内に投与される。例えば、NDVに関する情報については、下の第5.1節、第5.2節、及び第6節を、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(PD-1遮断抗体を含む)に関する情報については、下の第5.5節及び第6節を、組成物及び投与経路に関する情報については、下の第5.5.1節を、癌を治療する方法に関する情報については、下の第5.7節及び第6節を参照されたい。
【００１５】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードし、かつここで、該方法は、PD-1(例えば、ヒトPD-1)又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することをさらに含む。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードし、該方法は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することをさらに含み、かつここで、該PD-1(例えば、ヒトPD-1)のアンタゴニストは、PD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)との相互作用を遮断する抗PD-1抗体である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードし、かつここで、該方法は、PD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)との相互作用を遮断する抗PD-1抗体を投与することをさらに含む。該キメラNDV及び該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト又は該抗PD-1抗体は、同じ又は異なる投与経路で投与することができる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは腫瘍内投与され、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト又は該抗PD-1抗体は、静脈内に投与される。例えば、NDVに関する情報については、下の第5.1節、第5.2節、及び第6節を、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(PD-1遮断抗体を含む)に関する情報については、下の第5.5節及び第6節を、組成物及び投与経路に関する情報については、下の第5.5.1節を、癌を治療する方法に関する情報については、下の第5.7節及び第6節を参照されたい。
【００１６】
別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療するためのPD-1(例えば、ヒトPD-1)又はそのリガンドのアンタゴニストと組み合わせて使用するための医薬の調製におけるキメラNDVの使用であり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードする。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療するためのPD-1(例えば、ヒトPD-1)又はそのリガンドのアンタゴニストと組み合わせて使用するための医薬の調製におけるキメラNDVの使用であり、ここで、該キメラNDVは、IL-12をコードするパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該PD-1のアンタゴニストは、PD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)との相互作用を遮断する抗PD-1抗体である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療するためのPD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)との相互作用を遮断する抗PD-1抗体と組み合わせて使用するための医薬の調製におけるキメラNDVの使用であり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードする。該キメラNDV及び該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト又は該抗PD-1抗体は、同じ又は異なる投与経路で投与することができる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは腫瘍内投与され、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト又は該抗PD-1抗体は、静脈内に投与される。例えば、NDVに関する情報については、下の第5.1節、第5.2節、及び第6節を、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(PD-1遮断抗体を含む)に関する情報については、下の第5.5節及び第6節を、組成物及び投与経路に関する情報については、下の第5.5.1節を、癌を治療する方法に関する情報については、下の第5.7節及び第6節を参照されたい。
【００１７】
該キメラNDVは、限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異を誘発させたウイルス、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む、任意のNDV型又は株の骨格を有し得る。具体的な実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、長潜伏期性株である。具体的な実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、亜病原性株である。具体的な実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、短潜伏期性株である。一実施態様において、該キメラNDVは、突然変異した切断部位を有する突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該Fタンパク質の切断部位は、多塩基性アミノ酸配列を生成させるように突然変異させられ、それにより、該タンパク質は、細胞内プロテアーゼによって切断されることが可能になり、それにより、該ウイルスは、細胞に侵入し、合胞体を形成するのにより効果的になる。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該Fタンパク質の切断部位は、1つ又は2つの追加のアルギニン残基を含む切断部位と置き換えられ、それにより、該突然変異切断部位は、広範に発現されるフューリンファミリーのプロテアーゼによって活性化されることが可能になる。そのような突然変異型Fタンパク質を発現するNDVの具体的な例としては、rNDV/F2aa及びrNDV/F3aaが挙げられるが、これらに限定されない。突然変異した切断部位を有する突然変異型Fタンパク質を生成させるためにNDV Fタンパク質に導入される突然変異の説明については、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Parkらの文献(2006)、二重特異性を有する改変されたウイルスワクチン構築物:鳥インフルエンザ及びニューカッスル病(Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease.)、PNAS USA 103: 8203-2808を参照されたい。ある実施態様において、該キメラNDVは、NDV La Sota株又はサイトメガロウイルス(CMV)の糖タンパク質BのFタンパク質切断部位を有する突然変異型Fタンパク質を含む。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、サイトメガロウイルスの糖タンパク質Bに由来するFタンパク質切断部位を有する突然変異型Fタンパク質を含み、該Fタンパク質切断部位は、例えば、国際特許出願公開WO 2015/032755号に記載されている、アミノ酸配列
【化１】
2020519641.tif 000003
を含む。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、例えば、国際特許出願WO 2015/032755号に記載されている、以下の配列:
【化２】
2020519641.tif 000004
のうちの1つを有するFタンパク質切断部位を有する突然変異型Fタンパク質を含む。例えば、NDV Fタンパク質へと改変することができる突然変異型Fタンパク質切断部位のタイプの説明については、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際特許出願公開WO 2015/032755号を参照されたい。いくつかの実施態様において、該キメラNDVは、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該突然変異型Fタンパク質は、アミノ酸突然変異L289A(すなわち、La Sota Fタンパク質のL289に対応するアミノ酸位置におけるLからAへの突然変異)を含む。具体的な実施態様において、該L289A突然変異型Fタンパク質は、1つ、2つ、又は3つのアルギニン残基を該切断部位に保有する。ある実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDVとは異なる型又は株のNDVに由来するものである。他の実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDVと同じ型又は株のNDVに由来するものである。いくつかの実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである。具体的な実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換わるものである。
【００１８】
本明細書に記載されるNDVと組み合わせて使用するためのPD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.1節、第5.2節、第5.5節、第5.7節、及び/又は第6節を参照)は、当業者に公知の任意のPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストであり得る。PD-1のリガンドの具体的な例としては、PD-L1及びPD-L2が挙げられる。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1の天然リガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)とPD-1との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断する。好ましい実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1の天然リガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)とPD-1との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断し、かつPD-1とPD-1の天然リガンド(例えば、PD-L1及び/又はPD-L2)との相互作用によって誘導される抑制シグナルの伝達を妨害し又は低下させる。
【００１９】
特定の態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1のアンタゴニストである。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1に結合する抗体である。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1に結合し、かつPD-1とPD-L1との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断する抗体である。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1に結合し、PD-1とPD-L1との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断し、かつ抑制シグナルの伝達を妨害し又は低下させる抗体である。好ましい実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1に結合し、かつPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断する抗体である。別の好ましい実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1に結合し、PD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断し、かつ抑制シグナルの伝達を妨害し又は低下させる抗体である。ある実施態様において、該抗体は、ラクダ化抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である。具体的な実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。別の具体的な実施態様において、該抗体は、scFvである。
【００２０】
別の態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1のリガンド(例えば、PD-L1又はPD-L2)のアンタゴニストである。具体的な実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-L1のアンタゴニストである。ある実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-L1に結合し、かつPD-1とPD-L1との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断する、PD-L1のアンタゴニストである。いくつかの実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-L1に結合し、PD-1とPD-L1との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断し、かつ抑制シグナルの伝達を妨害し又は低下させる、PD-L1のアンタゴニストである。いくつかの実施態様において、PD-L1のアンタゴニストは、PD-L1とCD80(B7.1)の相互作用も(完全に又は部分的に)遮断する。
【００２１】
具体的な実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-L2のアンタゴニストである。ある実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-L2に結合し、かつPD-1とPD-L2との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断する、PD-L2のアンタゴニストである。ある実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-L2に結合し、PD-1とPD-L2との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断し、かつ抑制シグナルの伝達を妨害し又は低下させる、PD-L2のアンタゴニストである。
【００２２】
具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1の天然リガンドに特異的に結合する抗体又は可溶性受容体である。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1の天然リガンドに特異的に結合し、かつ該天然リガンドがPD-1に結合し、抑制シグナルを伝達するのを(完全に又は部分的に)遮断する抗体又は可溶性受容体である。ある具体的な実施態様において、該可溶性受容体は、PD-1(例えば、PD-1又はPD-1の誘導体の細胞外ドメイン)のリガンドに結合するPD-1の断片又はPD-1の誘導体の断片である。いくつかの実施態様において、該可溶性受容体は、PD-1又はPD-1の誘導体の少なくとも一部(例えば、PD-1又はPD-1の誘導体の細胞外ドメイン)と異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質である。具体的な実施態様において、該融合タンパク質は、PD-1又はPD-1の誘導体の少なくとも一部と免疫グロブリンのFc部分又はその断片を含む。具体的な実施態様において、該PD-1の部分又はその誘導体は、例えば、PD-1又はその誘導体の細胞外ドメインである。
【００２３】
具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1の天然リガンドに結合する抗体である。該抗体は、PD-L1又はPD-L2に結合することができる。ある実施態様において、該抗体は、ラクダ化抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である。具体的な実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。別の具体的な実施態様において、該抗体は、単鎖可変断片(scFv)であってもよい。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1に結合するが、抑制シグナルを伝達しない抗体又はリガンドである。別の実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1に結合するが、抑制シグナルを伝達しないリガンドである。ある具体的な実施態様において、該リガンドは、PD-1のリガンド又はPD-1のリガンドの誘導体の少なくとも一部と異種アミノ酸配列を融合タンパク質である。具体的な実施態様において、該融合タンパク質は、PD-1のリガンド又はPD-1のリガンドの誘導体の少なくとも一部と免疫グロブリンのFc部分又はその断片を含む。
【００２４】
具体的な実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1遮断抗体である。別の具体的な実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、ニボルマブである。好ましい実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、ペンブロリズマブである。別の具体的な実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-L1遮断抗体(例えば、デュラルマブ(duralumab)又はアベルマブ)である。
【００２５】
一態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としているヒト対象に、キメラニューカッスル病ウイルス(NDV)を含む第一の組成物及びヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを含む第二の組成物を投与することを含み、ここで、該キメラNDVがヒトインターロイキン-12(「IL-12」)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子がヒトIL-12 p40サブユニット及びヒトIL-12 p35サブユニットをコードする、方法である。具体的な実施態様において、該キメラNDVのパッケージングされたゲノムは、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該突然変異型Fタンパク質は、該キメラNDVのビリオンに取り込まれており、ここで、該突然変異型Fタンパク質は、突然変異した切断部位を含む。具体的な実施態様において、該突然変異した切断部位は、
【化３】
2020519641.tif 000005
である。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVのパッケージングされたゲノムは、アミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該突然変異型Fタンパク質は、該キメラNDVのビリオンに取り込まれている。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号40に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号23に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号42に示されるアミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号22に示されるアミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号43に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号39に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号40に示されるアミノ酸配列を含み、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入される。特定の実施態様において、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットは、該NDV P遺伝子及び該NDV M遺伝子の転写ユニットである。具体的な実施態様において、該第一の組成物は、該対象に腫瘍内又はリンパ節内投与される。別の具体的な実施態様において、該第二の組成物は、該対象に、静脈内投与される。
【００２６】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、ヒト対象の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVは、ヒトインターロイキン-12(「IL-12」)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、ヒトIL-12 p40サブユニット及びヒトIL-12 p35サブユニットをコードし、かつここで、該方法は、ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することをさらに含む。具体的な実施態様において、該キメラNDVのパッケージングされたゲノムは、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を投与することをさらに含み、該突然変異型Fタンパク質は、該キメラNDVのビリオンに取り込まれており、ここで、該突然変異型Fタンパク質は、突然変異した切断部位を含む。具体的な実施態様において、該突然変異した切断部位は、
【化４】
2020519641.tif 000006
である。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVのパッケージングされたゲノムは、アミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該突然変異型Fタンパク質は、該キメラNDVのビリオンに取り込まれている。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号23に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号22に示されるアミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号39に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号42に示されるアミノ酸配列をコードする。別の具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号40に示されるアミノ酸配列を含み、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入される。特定の実施態様において、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットは、該NDV P遺伝子及び該NDV M遺伝子の転写ユニットである。具体的な実施態様において、該パッケージングされたゲノムの配列は、配列番号51に示されている通りである。具体的な実施態様において、該パッケージングされたゲノムの配列は、配列番号52に示されている通りである。具体的な実施態様において、該第一の組成物は、該対象に腫瘍内又はリンパ節内投与される。別の具体的な実施態様において、該第二の組成物は、該対象に、静脈内投与される。
【００２７】
具体的な実施態様において、該キメラNDVは、長潜伏期性であるNDV骨格を含む。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、La Sota株のNDV骨格を含む。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、Hitchner B1株のNDV骨格を含む。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、r73T-R116ウイルスのNDV骨格を含む。
【００２８】
具体的な実施態様において、該ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、ヒトPD-1に結合する抗体である。別の具体的な実施態様において、該ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、ペンブロリズマブである。別の実施態様において、該抗体は、ニボルマブ又はMEDI0680である。具体的な実施態様において、該抗体は、アミノ酸配列
【化５】
2020519641.tif 000007
を含む可変軽鎖領域(VLCR)相補性決定領域(CDR)1、アミノ酸配列
【化６】
2020519641.tif 000008
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化７】
2020519641.tif 000009
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化８】
2020519641.tif 000010
を含む可変重鎖領域(VHCR)CDR 1、アミノ酸配列
【化９】
2020519641.tif 000011
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化１０】
2020519641.tif 000012
を含むVHCR CDR3を含む。別の実施態様において、該抗体は:(a)アミノ酸配列
【化１１】
2020519641.tif 000013
を含むVLCR;及び(b)アミノ酸配列
【化１２】
2020519641.tif 000014
を含むVHCRを含む。別の実施態様において、該抗体は:(a)アミノ酸配列
【化１３】
2020519641.tif 000015
を含む軽鎖;及び(b)アミノ酸配列
【化１４】
2020519641.tif 000016
を含む重鎖を含む。別の実施態様において、該抗体は、アミノ酸配列
【化１５】
2020519641.tif 000017
を含むVLCR CDR1、アミノ酸配列
【化１６】
2020519641.tif 000018
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化１７】
2020519641.tif 000019
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化１８】
2020519641.tif 000020
を含むVHCR CDR1、アミノ酸配列
【化１９】
2020519641.tif 000021
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化２０】
2020519641.tif 000022
を含むVHCR CDR3を含む。別の実施態様において、該抗体は:(a)アミノ酸配列
【化２１】
2020519641.tif 000023
を含むVLCR;及び(b)アミノ酸配列
【化２２】
2020519641.tif 000024
を含むVHCRを含む。別の実施態様において、該抗体は:(a)アミノ酸配列
【化２３】
2020519641.tif 000025
を含む軽鎖;及び(b)アミノ酸配列
【化２４】
2020519641.tif 000026
を含む重鎖を含む。
【００２９】
具体的な実施態様において、該ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、ヒトPD-L1に結合する抗体である。特定の実施態様において、該抗体は、デュルバルマブ、アベルマブ、bms-936559、又はアテゾリズマブである。
【００３０】
具体的な実施態様において、本明細書に提供される癌を治療する方法における本明細書に記載されるキメラNDVの投与は、IL-12p70、IFN-γ発現、IL-12p70とIFN-γの両方の発現を誘導する。具体的な実施態様において、本明細書に提供される癌を治療する方法における本明細書に記載されるキメラNDVの投与は、遺伝子発現プロファイル(GEP)スコアを増大させる。例えば、GEPスコアに関しては、下の実施例6.3を参照されたい。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、抗PD-1療法に対する応答を増大させる方法である。
【００３１】
具体的な実施態様において、本明細書に開示される方法に従って治療される患者は、皮膚もしくは皮下腫瘍又はリンパ節内の腫瘍を示す。
【００３２】
別の具体的な実施態様において、該癌は、メラノーマ、腎臓癌、肺癌(例えば、非小細胞肺癌)、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、膵癌、腎臓癌(例えば、腎細胞癌)、結腸直腸癌(例えば、結腸直腸癌)、乳癌(例えば、乳癌)、又は頭頸部癌(例えば、頭頸部の扁平上皮細胞癌)である。特定の実施態様において、該癌は、メラノーマ、頭頸部扁平上皮細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される固形腫瘍である。別の具体的な実施態様において、該癌は、非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫である。別の具体的な実施態様において、該癌は、転移性である。別の具体的な実施態様において、該癌は、切除不能である。特定の実施態様において、該癌は、皮膚、皮下、又はリンパ節転移を含む。具体的な実施態様において、該癌は、不応性もしくは再発性、又はその両方である。具体的な実施態様において、該癌の生検は、PD-L1陽性である。特定の実施態様において、該生検は、少なくとも1％の腫瘍比率スコアを有する。他の具体的な実施態様において、該癌の生検は、PD-L1陰性である。特定の実施態様において、該生検は、1％未満の腫瘍比率スコアを有する。
【００３３】
具体的な実施態様において、該対象は、PD-1に結合し、かつPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体による単剤療法治療に不応性である。別の具体的な実施態様において、該対象は、ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に不応性又は不応答性である。特定の実施態様において、該対象は、ニボルマブ、AMP-224、MEDI0680、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、bms-936559、又はアテゾリズマブによる単剤療法に不応性又は不応答性である。
【００３４】
(3.1  用語)
本明細書で使用される場合、数字と一緒に使用される場合の「約(about)」又は「約(approximately)」という用語は、言及された数字の1、5、又は10％以内の任意の数字を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、別の分子に結合し、生物学的反応を誘導する分子を指す。具体的な実施態様において、アゴニストは、細胞上の受容体に結合し、1以上のシグナル伝達経路を誘発する分子である。例えば、アゴニストには、細胞上の受容体に結合し、1以上のシグナル伝達経路を誘導する抗体又はリガンドが含まれる。ある実施態様において、該抗体又はリガンドは、細胞上の受容体に結合し、1以上のシグナル伝達経路を誘導する。他の実施態様において、該アゴニストは、天然リガンドと天然受容体との相互作用を促進する。
【００３６】
「アミノ酸配列同一性」という用語は、通常はパーセンテージとして表される、整列させた1対のアミノ酸配列間の同一性又は類似性の程度を指す。パーセント同一性は、配列を整列させ、必要であれば、最大のパーセント配列相同性を達成するようにギャップを導入した後のペプチド(又はポリペプチドもしくはタンパク質)中の対応するアミノ酸残基に対する、同一である(すなわち、アラインメント中の所与の位置のアミノ酸残基が同じ残基である)か又は類似している(すなわち、アラインメト中の所与の位置のアミノ酸残基が、以下で論じられているような、保存的置換である)候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージである。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、生物学的応答自体を引き起こすことなく、別の分子の作用を阻害する分子を指す。具体的な実施態様において、アンタゴニストは、細胞上の受容体に結合し、アゴニストの生物学的活性を遮断し又は減衰させる分子である。例えば、アンタゴニストには、細胞上の受容体に結合し、1以上のシグナル伝達経路を誘導することなく、天然リガンドと該受容体との結合を遮断し又は減衰させる抗体又はリガンドが含まれる。アンタゴニストの別の例には、天然リガンドとの結合を細胞上の天然受容体と競合し、それにより、該天然受容体が該天然リガンドに結合するときに誘導される1以上のシグナル伝達経路を遮断し又は減衰させる抗体又は可溶性受容体が含まれる。アンタゴニストの別の例には、天然受容体と天然リガンドとの結合を妨げないが、他の手段によって(例えば、受容体多量体化の阻害によって)シグナル伝達を妨げる抗体又は可溶性受容体が含まれる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「抗体(antibody)」及び「抗体(antibodies)」という用語は、抗原結合部位を含有する分子、例えば、免疫グロブリンを指す。抗体には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド結合二重特異性Fv(sdFv)、イントラボディ、及び抗イデオタイプ(抗Id)抗体(例えば、抗体に対する抗Id抗体及び抗-抗Id抗体を含む)、並びに上記のもののいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されない。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)又はサブクラスのものであることができる。具体的な実施態様において、抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。別の具体的な実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体又はscFvである。ある実施態様において、抗体は、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体又はscFvである。他の具体的な実施態様において、抗体は、二重特異性抗体である。ある実施態様において、該二重特異性抗体は、免疫細胞の共刺激受容体又は免疫細胞の抑制受容体及び癌細胞上の受容体に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、該二重特異性抗体は、免疫細胞上の2つの受容体、例えば、免疫細胞上の2つの共刺激受容体、免疫細胞上の2つの抑制受容体、又は免疫細胞上の1つの共刺激受容体と免疫細胞上の1つの抑制受容体に特異的に結合する。
【００３９】
「保存的置換」は、当業者によって理解される用語であり、通常、あるクラスのアミノ酸の同じクラスの別のアミノ酸との置換を指す。特定の実施態様において、保存的置換は、ポリペプチドの構造もしくは機能、又はその両方を変化させない。保存的置換のためのアミノ酸のクラスとしては、疎水性のもの、中性親水性のもの、酸性のもの、塩基性のもの、立体構造を破壊するもの、及び芳香族のものを挙げることができる。疎水性アミノ酸としては、Met、Ala、Val、Leu、及びIleを挙げることができる。中性親水性アミノ酸としては、Cys、Ser、及びThrを挙げることができる。酸性アミノ酸としては、Asp及びGluを挙げることができる。塩基性アミノ酸としては、Asn、Gln、His、Lys、及びArgを挙げることができる。立体構造を破壊するアミノ酸としては、Gly及びProを挙げることができる。芳香族アミノ酸としては、Trp、Tyr、及びPheを挙げることができる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、タンパク質又はポリペプチドとの関連における「誘導体」という用語は:(a)天然ポリペプチドと少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は80％〜85％、80％〜90％、80％〜95％、90％〜95％、85％〜99％、もしくは95％〜99％同一であるポリペプチド;(b)天然ポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は80％〜85％、80％〜90％、80％〜95％、90％〜95％、85％〜99％、もしくは95％〜99％同一である核酸配列によってコードされるポリペプチド;(c)天然ポリペプチドと比べて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、もしくはそれより多く、又は2〜5、2〜10、5〜10、5〜15、5〜20、10〜15、もしくは15〜20個のアミノ酸突然変異(すなわち、付加、欠失、及び/又は置換)を含有するポリペプチド;(d)高い、中程度の、又は典型的なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、天然ポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされるポリペプチド;(e)高い、中程度の、又は典型的なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも10個の連続するアミノ酸、少なくとも12個の連続するアミノ酸、少なくとも15個の連続するアミノ酸、少なくとも20個の連続するアミノ酸、少なくとも30個の連続するアミノ酸、少なくとも40個の連続するアミノ酸、少なくとも50個の連続するアミノ酸、少なくとも75個の連続するアミノ酸、少なくとも100個の連続するアミノ酸、少なくとも125個の連続するアミノ酸、少なくとも150個の連続するアミノ酸、又は10〜20個、20〜50個、25〜75個、25〜100個、25〜150個、50〜75個、50〜100個、75〜100個、50〜150個、75〜150個、100〜150個、もしくは100〜200個の連続するアミノ酸の天然ポリペプチドの断片をコードする核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされるポリペプチド;或いは(f)天然ポリペプチドの断片を指す。誘導体には、天然の成熟形態の哺乳動物ポリペプチドのアミノ酸配列及び異種のシグナルペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。さらに、誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質部分への結合などによって化学的に修飾されているポリペプチドが含まれる。さらに、誘導体には、1以上の非古典的アミノ酸を含むポリペプチドが含まれる。一実施態様において、誘導体は、単離されている。具体的な実施態様において、誘導体は、それが由来した天然ポリペプチドの1以上の機能を保持する。
【００４１】
パーセント同一性は、当業者に公知の任意の方法を用いて決定することができる。具体的な実施態様において、パーセント同一性は、Sequence Analysis Software Package(バージョン10; Genetics Computer Group社、University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin)の「Best Fit」又は「Gap」プログラムを用いて決定される。ハイブリダイゼーション条件に関する情報(例えば、高い、中程度の、及び典型的なストリンジェンシー条件)が記載されており、例えば、米国特許出願公開US 2005/0048549号(例えば、段落72〜73)を参照されたい。
【００４２】
本明細書で使用される場合、タンパク質性物質(例えば、タンパク質)の断片との関連における「断片」という用語は、8個以上の連続するアミノ酸、10個以上の連続するアミノ酸、15個以上の連続するアミノ酸、20個以上の連続するアミノ酸、25個以上の連続するアミノ酸、50個以上の連続するアミノ酸、75個以上の連続するアミノ酸、100個以上の連続するアミノ酸、150個以上の連続するアミノ酸、200個以上の連続するアミノ酸、又は10〜300個の連続するアミノ酸、10〜200個の連続するアミノ酸、10〜250個の連続するアミノ酸、10〜150個の連続するアミノ酸、10〜100個の連続するアミノ酸、10〜50個の連続するアミノ酸、50〜100個の連続するアミノ酸、50〜150個の連続するアミノ酸、50〜200個の連続するアミノ酸、50〜250個の連続するアミノ酸、50〜300個の連続するアミノ酸、25〜50個の連続するアミノ酸、25〜75個の連続するアミノ酸、25〜100個の連続するアミノ酸、もしくは75〜100個の連続するアミノ酸の範囲内のタンパク質性物質の断片を指す。具体的な実施態様において、タンパク質性物質の断片は、該タンパク質性物質の1以上の機能を保持する−すなわち、それは、機能性断片である。例えば、タンパク質性物質の断片は、別のタンパク質と相互作用し、及び/又は1以上のシグナル伝達経路を誘導、増強、もしくは活性化する能力を保持する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、タンパク質性物質との関連における「機能性断片」という用語は、タンパク質性物質の1以上の活性又は機能を保持するタンパク質性物質の部分を指す。例えば、抑制受容体の機能性断片は、1以上のそのリガンドに結合する能力を保持し得る。共刺激受容体のリガンドの機能性断片は、受容体に結合し、及び/又はその共刺激受容体へのリガンド結合によって媒介される1以上のシグナル伝達経路を誘導、増強、もしくは活性化する能力を保持し得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「GEPスコア」という用語は、表15の18-遺伝子シグナチャーに基づくヒト腫瘍組織培養物試料のRNA遺伝子発現プロファイリングを指す。各々の個々の試料の単離されたRNAの遺伝子発現データは、HK(ハウスキーピング)標準化によって標準化される。各々の腫瘍試料について、生カウントをlog10変換し、その後、各々の遺伝子を、全ハウスキーピング遺伝子(表15)の算術平均を減算することにより標準化する。遺伝子発現プロファイリング(GEP)シグナチャースコアは、18遺伝子アップダウンシグナチャー(表15)のハウスキーピング標準化値の加重和として計算される。各々の遺伝子のハウスキーピング標準化値に、スコアリングの重みのセットからのその遺伝子についての係数を掛けて、18遺伝子シグナチャーの遺伝子の各々についての加重RNA値を出し、該加重RNA値を加えて、腫瘍試料のシグナチャースコアを作成する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、天然のNDVと関連する(例えば、天然のNDVによってコードされる及び/又は天然のNDVのゲノムによって発現される)ことが天然では見出されない実体を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ヒト高齢者」という用語は、65歳以上のヒトを指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ヒト成人」という用語は、18歳以上のヒトを指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ヒト小児」という用語は、1歳から18歳までのヒトを指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「ヒト幼児」という用語は、1歳から3歳までのヒトを指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ヒト乳児」という用語は、新生児から1歳までのヒトを指す。
【００５１】
ある実施態様において、本明細書で使用される「高融合原性」及び同様の用語は、NDVが多数の細胞を含む合胞体を形成する能力の増大を指す。具体的な実施態様において、突然変異型Fタンパク質を発現するように改変されている本明細書に記載されるNDVに感染した細胞は、該ウイルスが由来し、非突然変異型Fタンパク質を有する親ウイルスに感染した細胞と比べて、合胞体を形成する能力が増大している。別の具体的な実施態様において、キメラウイルスが由来し、非突然変異型Fタンパク質を有する親ウイルスに感染した合胞体を形成する細胞の数と比べて、突然変異型Fタンパク質を発現するように改変されている本明細書に記載されるNDVに感染した約10％〜約25％、約25％〜約50％、約25％〜約75％、約50％〜約75％、約50％〜約95％、もしくは約75％〜約99％、又は約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは99％より多くの細胞が合胞体を形成する。ある実施態様において、合胞体は、一定期間(例えば、約8時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、約24時間〜約36時間、又は約36時間〜約48時間)後の合胞体当たりの核の数を計数することにより顕微鏡で定量される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「インターフェロンアンタゴニスト」という用語は、細胞性インターフェロン免疫応答を低下させ又は阻害する作用物質を指す。一実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、細胞性インターフェロン免疫応答を低下させ又は阻害するタンパク質性物質である。具体的な実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、細胞性インターフェロン免疫応答を低下させ又は阻害するウイルスタンパク質又はポリペプチドである。
【００５３】
具体的な実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、インターフェロン発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する作用物質である。一実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、I型IFNの発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する。別の実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、II型IFNの発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する。別の実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、III型IFNの発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する。具体的な実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、IFN-α、IFN-β、又はその両方のいずれかの発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する。別の具体的な実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、IFN-γの発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する。別の実施態様において、インターフェロンアンタゴニストは、IFN-α、IFN-β、及びIFN-γのうちの1つ、2つ、又は全ての発現及び/又は活性を低下させ又は阻害する。
【００５４】
ある実施態様において、孵化卵又は細胞におけるIFN-α、IFN-β、及び/又はIFN-γの発現及び/又は活性は、本明細書に記載される又は当業者に公知の技法によって測定したとき、そのようなインターフェロンアンタゴニストを発現していない、又はそのようなインターフェロンアンタゴニストと接触させていない対照孵化卵又は細胞におけるIFN-α、IFN-β、及び/又はIFN-γの発現及び/又は活性と比べて、インターフェロンアンタゴニストにより、約1〜約100倍、約5〜約80倍、約20〜約80倍、約1〜約10倍、約1〜約5倍、約40〜約80倍、又は1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100倍低下させられる。他の実施態様において、孵化卵又は細胞におけるIFN-α、IFN-β、及び/又はIFN-γの発現及び/又は活性は、本明細書に記載される又は当業者に公知の技法によって測定したとき、そのようなインターフェロンアンタゴニストを発現していない、又はそのようなインターフェロンアンタゴニストと接触させていない対照孵化卵又は細胞におけるIFN-α、IFN-β、及び/又はIFN-γの発現及び/又は活性と比べて、インターフェロンアンタゴニストにより、少なくとも20％〜25％、少なくとも25％〜30％、少なくとも30％〜35％、少なくとも35％〜40％、少なくとも40％〜45％、少なくとも45％〜50％、少なくとも50％〜55％、少なくとも55％〜60％、少なくとも60％〜65％、少なくとも65％〜70％、少なくとも70％〜75％、少なくとも75％〜80％、少なくとも80％〜85％、少なくとも85％〜90％、少なくとも90％〜95％、少なくとも95％〜99％、又は20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは99％低下させられる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「IFN欠損システム」又は「IFN欠損基体」という語句は、1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNを産生せず、又は任意のタイプのIFNを産生せず、又は低レベルの1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNを産生し、又は低レベルの任意のIFNを産生し(すなわち、同じ条件下のIFNコンピテントなシステムと比較したとき、5〜10％、10〜20％、20〜30％、30〜40％、40〜50％、50〜60％、60〜70％、70〜80％、80〜90％、もしくはそれを上回る任意のIFN発現の低下)、又は1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNに応答せずもしくはあまり効率的には応答せず、又は任意のタイプのIFNに応答せず、1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNに対する応答が遅延し、及び/又は1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNによって誘導されるもしくは任意のタイプのIFNによって誘導される抗ウイルス遺伝子の活性が欠損している、システム、例えば、細胞、細胞株、及び動物、例えば、マウス、ニワトリ、シチメンチョウ、ウサギ、ラット、ウマなどを指す。
【００５６】
「インターロイキン-12」及び「IL-12」は、当業者に公知の任意のIL-12を指す。ある実施態様において、IL-12は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、又はウシIL-12であってもよい。具体的な実施態様において、IL-12は、ヒトIL-12である。典型的なIL-12は、当業者に公知の2つの別々の遺伝子であるIL-12A(p35サブユニット)及びIL-12B(p40サブユニット)によってコードされるヘテロ二量体からなる。GenBank(商標)アクセッション番号NM_000882.3(GI番号325974478)は、例示的なヒトIL-12A核酸配列を提供している。GenBank(商標)アクセッション番号NM_002187.2(GI番号24497437)は、例示的なヒトIL-12B核酸配列を提供している。GenBank(商標)アクセッション番号NP_000873.2(GI番号24430219)は、例示的なヒトIL-12A(p35サブユニット)アミノ酸配列を提供している。GenBank(商標)アクセッション番号NP_002178.2(GI番号24497438)は、例示的なヒトIL-12B(p40サブユニット)アミノ酸配列を提供している。ある実施態様において、IL-12は、リンカー配列(例えば、配列番号:24及び46〜49のいずれか1つなど)によって任意に分離された、p35サブユニット及びp40サブユニットを含む、単一のポリペプチド鎖からなる。好ましい実施態様において、IL-12は、第6節に提供されているp35及びp40サブユニット配列、例えば、それぞれ、配列番号25及び23、又はそれぞれ、配列番号41及び40を含む。ある実施態様において、IL-12は、4つ1組で会合している複数のポリペプチド鎖、例えば、p35及びp40からなる。本明細書で使用される場合、「インターロイキン-12」及び「IL-12」という用語は、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化(例えば、N-結合型グリコシル化)、プロテアーゼ切断、及び脂質修飾(例えば、S-パルミトイル化)などの翻訳後プロセシングによって修飾されているインターロイキン-12ポリペプチドを包含する。いくつかの実施態様において、IL-12サブユニットの一方もしくは両方、又は単一のポリペプチド鎖からなるIL-12は、シグナル配列を含む。他の実施態様において、IL-12のサブユニットの一方もしくは両方、又は単一のポリペプチド鎖からなるIL-12は、シグナル配列を含まない。シグナル配列は、天然のシグナルペプチド配列又はその変異体であることができる。いくつかの実施態様において、シグナルペプチドは、IL-12シグナルペプチドである。いくつかの実施態様において、シグナルペプチドは、IL-12シグナルペプチドと非相同である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、及び「特異的に認識する」という用語は、抗体に関する類似用語であり、当業者に理解されるような抗原(例えば、エピトープ又は免疫複合体)に特異的に結合する分子を指す。抗原に特異的に結合する分子は、例えば、免疫アッセイ(例えば、ELISA)、表面プラズモン共鳴(例えば、BIAcore(登録商標))、KinExアッセイ(例えば、KinExA 3000機器(Sapidyne Instruments, Boise, ID)を使用するもの)、又は当技術分野で公知の他のアッセイにより決定したとき、より低い親和性で他のペプチド又はポリペプチドに結合することができる。具体的な実施態様において、抗原に特異的に結合する分子は、該分子が別の抗原に結合するときのKaよりも少なくとも2log、2.5log、3log、3.5log、4log、又はそれよりも大きい解離定数(すなわち、Ka)で該抗原に結合する。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、技術用語であり、一般に、均質な又は実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、各々のモノクローナル抗体は、通常、抗原上の単一のエピトープ(例えば、単一の立体構造エピトープ)を認識する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「感染多重度」又は「MOI」という語句は、感染細胞当たりのウイルスの平均数である。MOIは、添加したウイルスの数(添加したml×Pfu)を添加した細胞の数(添加したml×細胞/ml)で割ることにより決定される。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「天然リガンド」という用語は、天然受容体に結合する任意の天然リガンドを指す。具体的な実施態様において、該リガンドは、哺乳動物リガンドである。別の具体的な実施態様において、該リガンドは、ヒトリガンドである。
【００６１】
本明細書で使用される場合、タンパク質又はポリペプチドとの関連における「天然ポリペプチド」という用語は、未成熟又は前駆体及び成熟形態のタンパク質を含む、任意の天然アミノ酸配列を指す。具体的な実施態様において、天然ポリペプチドは、ヒトタンパク質又はポリペプチドである。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「天然受容体」という用語は、天然リガンドに結合する任意の天然受容体を指す。具体的な実施態様において、該受容体は、哺乳動物受容体である。別の具体的な実施態様において、該受容体は、ヒト受容体である。
【００６３】
「プログラム細胞死タンパク質1」、「PD1」、及び「PD-1」は、当業者に公知の任意のPD-1を指す。ある実施態様において、PD-1は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、又はウシPD-1であってもよい。具体的な実施態様において、PD-1は、ヒトPD-1である。GenBank(商標)アクセッション番号NM_005018.2(GI番号167857791)は、例示的なヒトPD-1核酸配列を提供している。GenBank(商標)アクセッション番号NP_005009.2(GI番号167857792)は、例示的なヒトPD-1アミノ酸配列を提供している。PD-1のリガンドには、プログラム死-リガンド1(「PD-L1」、「PDL1」、「分化群274」、「CD274」、「B7ホモログ1」、及び「B7-H1」とも呼ばれる)、並びにプログラム細胞死1リガンド2(「PDL2」、「PD-L2」、及び「B7-DC」とも呼ばれる)が含まれる。PD-L1は、当業者に公知の任意のPD-L1を指す。ある実施態様において、PD-L1は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、又はウシPD-L1であってもよい。具体的な実施態様において、PD-L1は、ヒトPD-L1である。GenBank(商標)アクセッション番号NM_001314029.1、NM_001267706.1、及びNM_014143.3(それぞれ、GI番号930425328、390979638、及び292658763)は、例示的なヒトPD-L1核酸配列を提供している。GenBank(商標)アクセッション番号NP_001300958.1、NP_001254635.1、及びNP_054862.1(それぞれ、GI番号930425329、390979639、及び7661534)は、例示的なヒトPD-L1アミノ酸配列を提供している。PD-L2は、当業者に公知の任意のPD-L2を指す。ある実施態様において、PD-L2は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、又はウシPD-L2であってもよい。具体的な実施態様において、PD-L2は、ヒトPD-L2である。GenBank(商標)アクセッション番号NM_025239.3(GI番号190014604)は、例示的なヒトPD-L2核酸配列を提供している。GenBank(商標)アクセッション番号NP_079515.2(GI番号190014605)は、例示的なヒトPD-L2アミノ酸配列を提供している。本明細書で使用される場合、PD-1、PD-L1、及びPD-L2は、それぞれ、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化(例えば、N-結合型グリコシル化)、プロテアーゼ切断、及び脂質修飾(例えば、S-パルミトイル化)などの翻訳後プロセシングによって修飾されているPD-1、PD-L1、及びPD-L2ポリペプチドを包含する。いくつかの実施態様において、PD-1、PD-L1、及びPD-L2は、それぞれ、シグナル配列を有するPD-1、PD-L1、及びPD-L2ポリペプチドを含む。他の実施態様において、PD-1、PD-L1、及びPD-L2は、それぞれ、シグナル配列を含まない、PD-1、PD-L1、及びPD-L2ポリペプチドを含む。PD-1のシグナル配列に関する情報を含む、PD-1の構造に関する情報については、例えば、Ishidaらの文献、1992, EMBO J. 11: 3887-3895及びShinoharaらの文献、1994, Genomics 23: 704-706(各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる)を参照されたい。PD-1又はそのリガンドの抗体との関連において使用される場合、該抗体は、PD-1、PD-L1、又はPD-L2の成熟形態に対するものである。
【００６４】
「不応性」は、当技術分野で認識されている用語であり、これは、通常、治療に応答しない、すなわち、「治療」下で記載されているような有益な効果を受容しない癌を意味する。該癌は、治療の開始時に抵抗性であってもよく、又はそれは、治療中に抵抗性になってもよい。
【００６５】
「再発性」は、当技術分野で認識されている用語であり、これは、通常、下記のような治療による一定期間の改善の後の疾患又は疾患の徴候及び症状の再発を意味する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「対象(subject)」又は「対象(subjects)」という用語は、動物を指す。いくつかの実施態様において、対象は、非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ウマ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)並びに霊長類(例えば、サル、チンパンジー、及びヒト)を含む哺乳動物である。いくつかの実施態様において、対象は、非ヒト哺乳動物である。ある実施態様において、対象は、ペット(例えば、イヌもしくはネコ)又は家畜(例えば、ウマ、ブタ、もしくはウシ)である。他の実施態様において、対象は、ヒトである。ある実施態様において、哺乳動物(例えば、ヒト)は、0〜6カ月、6〜12カ月、1〜5歳、5〜10歳、10〜15歳、15〜20歳、20〜25歳、25〜30歳、30〜35歳、35〜40歳、40〜45歳、45〜50歳、50〜55歳、55〜60歳、60〜65歳、65〜70歳、70〜75歳、75〜80歳、80〜85歳、85〜90歳、90〜95歳、又は95〜100歳である。具体的な実施態様において、対象は、鳥ではない動物である。
【００６７】
本明細書で使用される場合、療法の投与との関連における「治療する」、「治療」、及び「治療すること」という用語は、対象が、癌又はその症状の発生又は進行の低下、減少、減衰、縮小、安定化、緩和、抑制、阻害、又は停止などの有益な効果を受け得る治療/療法を指す。ある実施態様において、対象が受ける治療/療法は、以下の効果のうちの少なくとも1つ以上をもたらす:(i)癌及び/又はそれと関連する症状の重症度の軽減又は改善;(ii)癌と関連する症状の持続時間の短縮;(iii)癌と関連する症状の再発の予防;(iv)癌及び/又はそれと関連する症状の退行;(v)対象の入院の減少;(vi)入院期間の短縮;(vii)対象の生存の増加;(viii)癌及び/又はそれと関連する症状の進行の阻害;(ix)別の療法の治療効果の増強又は改善;(x)癌細胞集団の低下又は排除;(xi)腫瘍又は新生物の成長の低下;(xii)腫瘍サイズの減少;(xiii)腫瘍の形成の低下;(xiv)原発性、局所性、及び/又は転移性癌の根絶、除去、又は制御;(xv)転移の数又は大きさの減少;(xvi)死亡率の低下;(xvii)患者の無癌生存率の増加;(xviii)無再発生存の増加;(xix)寛解期にある患者の数の増加;(xx)入院率の減少;(xxi)療法の投与後、当業者に利用可能な従来の方法、例えば、MRI、X線、CTスキャン、及びPETスキャンにより測定したとき、腫瘍のサイズが維持され、かつサイズが増加しないか、又は腫瘍のサイズを5％もしくは10％未満だけ増加させること;(xxii)癌及び/又はそれと関連する症状の発症又は開始の予防;(xxiii)患者の寛解期間の延長;(xxiv)癌と関連する症状の数の低下;(xxv)癌患者の無症状生存の増加;(xxvi)転移の制限又は軽減;(xxvii)全生存;(xxviii)無増悪生存(例えば、RECIST v1.1.によって評価されるもの);(xxix)全応答率;並びに/或いは(xxx)応答持続時間の増加。いくつかの実施態様において、対象が受ける治療/療法は、癌を治癒させるのではなく、疾患の進行又は悪化を予防する。ある実施態様において、対象が受ける治療/療法は、癌の開始/発症を予防するのではなく、癌の症状の開始を予防することができる。当業者に公知の任意の方法を利用して、対象が受ける治療/療法を評価することができる。具体的な実施態様において、該治療/療法は、固形腫瘍における応答評価基準(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors)(「RECIST」)の公表規定に従って評価される。具体的な実施態様において、該治療/療法は、2000年2月に公表されたRECIST基準(「RECIST 1」とも呼ばれる)に従って評価される(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Therasseらの文献、2000, Journal of National Cancer Institute, 92(3):205-216を参照)。具体的な実施態様において、該治療/療法は、2009年1月に公表されたRECIST基準(「RECIST 1.1」とも呼ばれる)に従って評価される(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Eisenhauerらの文献、2009, European Journal of Cancer, 45:228-247を参照)。具体的な実施態様において、該治療/療法は、評価の時点で当業者によって利用されるRECIST基準に従って評価される。具体的な実施態様において、該治療/療法は、免疫関連RECIST(「irRECIST」)の公表規定に従って評価される(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Bohnsackらの文献、2014, ESMO Abstract 4958を参照)。具体的な実施態様において、該治療/療法は、評価の時点で当業者によって利用されるirRECIST基準に従って評価される。具体的な実施態様において、該治療/療��は、ルガノ(Lugano)基準に従って評価される。具体的な実施態様において、該治療/療法は、腫瘍関連血清マーカー、例えば、CA-125、CEA、CA-19-9、PSA、AFP、インヒビンA、インヒビンB、HCG、CA 15-3、チログロブリン、HE4などの低下によって評価される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、対象への療法(単数又は複数)の投与との関連における「組み合わせて」という用語は、複数の療法の使用を指す。「組み合わせて」という用語の使用は、療法が対象に投与される順序を制限しない。第一の療法は、対象への第二の療法の投与の前に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間前に)、それと同時に、又はその後に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間後に)投与することができる。例えば、本明細書に記載されるキメラNDVは、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの投与の前に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間前に)、それと同時に、又はその後に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間後に)投与することができる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「療法(therapies)」及び「療法(therapy)」という用語は、癌の治療で使用することができる任意のプロトコル、方法、及び/又は薬剤を指すことができる。ある実施態様において、「療法(therapies)」及び「療法(therapy)」という用語は、癌の治療において有用な生物療法、支持療法、ホルモン療法、化学療法、免疫療法、及び/又は他の療法を指す。具体的な実施態様において、療法には、補助療法が含まれる。例えば、ある療法を、薬物療法、生物療法、外科手術、及び/又は支持療法とともに使用する。ある実施態様において、「療法(therapy)」という用語は、本明細書に記載されるキメラNDVを指す。他の実施態様において、「療法(therapy)」という用語は、キメラNDVではない作用因子を指す。ある実施態様において、「療法(therapy)」という用語は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを指す。他の実施態様において、「療法(therapy)」という用語は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストではない作用因子を指す。ある実施態様において、「療法(therapy)」という用語は、本明細書に記載されるキメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを指す。ある実施態様において、「療法(therapy)」という用語は、本明細書に記載されるキメラNDVでも、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストでもない作用因子を指す。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
(4.図面の簡単な説明)
【図１】図1。NDV感染は(感染から24時間後に)インビトロ感染したB16F10細胞の表面でのMHC I、MHC II、及びICAM-1の発現を上方調節する。
【００７１】
【図２】図2A〜2E。腫瘍内NDV処置は、マクロファージ、NK細胞、CD8及びCD4エフェクター細胞の浸潤をもたらし、Tregの頻度を減少させる。図2A)全体的な研究スキーム。図2B)全CD45+浸潤。図2C)全免疫細胞浸潤。図2D)関連のあるCD4 FoxP3+及びFoxP3-サブセットの代表的なフローサイトメトリードットプロット。図2E)Teff/Treg及びCD8/Treg比。
【００７２】
【図３】図3A〜3C。NDVによる治療は、遠位腫瘍の腫瘍微小環境に対する望ましい効果を示す。図3A)関連のあるCD4 FoxP3+及びFoxP3-サブセットの代表的なフローサイトメトリードットプロット。図3B)腫瘍1グラム当たりのCD4エフェクター、Treg、及びCD8細胞の絶対数。図3C)Teff/Treg比及びCD8/Treg比。
【００７３】
【図４】図4A〜4C。遠位腫瘍に浸潤するリンパ球は、活性化、溶解、及び増殖マーカーを上方調節する。図4A)CD44、図4B)グランザイムB、及び図4C)Ki-67について、CD4エフェクター細胞の代表的な発現プロット(上)及びCD4エフェクター、CD8、Tregにおける対応するパーセンテージ(下)が示されている。
【００７４】
【図５】図5A〜D。NDV単剤療法は遠位腫瘍の成長を遅延させ、腫瘍再投与に対する若干の防御を提供する。両側腹腫瘍を図2Aに記載されている通りに樹立し、動物を処置し、生存について追跡調査した。図5A)右側腹(処置を受けた)腫瘍の成長。図5B)左側腹(処置を受けていない)腫瘍の成長。図5C)全生存。囲みの中の数字は、無腫瘍動物のパーセントを示している。図5D)NDVによってB16F10メラノーマが治癒し、75日目にB16F10メラノーマ細胞が再投与された動物の生存。1群当たり10匹のマウスを用いた2回の異なる実験の代表的な結果。
【００７５】
図5E〜5F。処置を受けた腫瘍と処置を受けていない腫瘍の両方に由来する腫瘍浸潤リンパ球は、NDV療法に応答してCTLA-4を上方調節する。図5E)右の(処置を受けた)腫瘍内のCD8、CD4エフェクター、及びTregにおけるCTLA-4発現の代表的なドットプロット。図5F)左の(処置を受けていない)腫瘍内のCD8、CD4エフェクター、及びTregにおけるCTLA-4発現の代表的なドットプロット。
【００７６】
【図６】図6A〜6C。NDV感染は、B16F10腫瘍におけるPD-L1の発現を上方調節する。図6A)NDVに24時間感染させたB16F10細胞上での表面PD-L1発現。図6B)感染B16F10細胞由来のUV不活化上清で処理したB16F10細胞上での表面PD-L1発現。図6C)図2Aと同様に処置された動物由来の注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍から単離された腫瘍細胞の表面でのPD-L1の上方調節(左の2枚のパネル−代表的なフローサイトメトリープロット、右のパネル−1群当たり5匹のマウスの計算された平均値)。
【００７７】
【図７】図7A〜7F。NDVと抗PD-1による併用療法は、B16メラノーマに対して全身効果があり、活性化マーカーの上方調節を伴うT細胞浸潤の増大をもたらす。図7A)全生存。動物を、図2Aに記載されている通りに、抗PD-1抗体あり又はなしで処置した。図7B)腫瘍内のCD45、CD3、CD8、及びCD4エフェクター細胞の絶対数。図7C)腫瘍浸潤リンパ球における調節性T細胞の相対的パーセンテージ。図7D及び図7E)遠位腫瘍由来の腫瘍浸潤リンパ球を単離し、ICOS(図7D)及びグランザイムB(図7E)の発現について染色した。図7F)腫瘍浸潤リンパ球を、腫瘍溶解物をロードした樹状細胞で再刺激し、IFNγの発現について細胞内サイトカイン染色により評価した。
【００７８】
【図８】図8A〜8D。NDV感染は注射を受けた腫瘍に限定される。図8A)組換えNDV-Flucを、CT26腫瘍を担持するBalb/C動物の腫瘍内(IT)又は静脈内(IV)に投与し、次の72時間にわたって画像を取得した。図8B)NDV-Flucを、両側性B16F10メラノーマ腫瘍を担持するC57BL/6マウスに投与し、動物を120時間モニタリングした。代表的な発光画像が示されている。図8C)バックグラウンド発光に対して標準化した腫瘍部位からの発光の定量。図8D)パネル(図8C)のデータから計算された曲線下面積(AUC)。データは、1群当たり3〜5匹のマウスを用いた3回の独立した実験のうちの1つの代表的な結果を示している。***p＜0.001(p＜0.05は、統計的有意性を示す)。
【００７９】
【図９】図9A〜9F。NDV感染は、ウイルス注射を受けた腫瘍における腫瘍白血球浸潤を増大させる。動物を図10Aに記載されているスキームに従って処置した。腫瘍を15日目に摘出し、TILを標識し、フローサイトメトリーにより解析した。図9A)腫瘍浸潤CD45+及びCD3+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。図9B)腫瘍1g当たりのCD45+細胞の絶対数。図9C)腫瘍1g当たりの自然免疫細胞の絶対数。図9D)CD4+FoxP3+(Treg)細胞及びCD4+FoxP3-(T conv)細胞のパーセンテージの代表的なプロット。図9E)腫瘍1g当たりの従来型及び調節性CD4+細胞及びCD8+細胞の絶対数。図9F)腫瘍からの計算されたTconv/Treg比及びCD8+/Treg比。データは、1群当たり3〜5匹のマウスを用いた3回の独立した実験の累積結果を表している。平均+/-SEMが示されている。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
【００８０】
【図１０】図10A〜10M。NDVは、遠位腫瘍リンパ球浸潤を増大させ、腫瘍成長を遅延させる。図10A)処置スキーム。図10B)腫瘍浸潤CD45+及びCD3+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。図10C)腫瘍1g当たりのCD45+細胞の絶対数。図10D)腫瘍1g当たりの自然免疫細胞の絶対数。図10E)遠位腫瘍由来の腫瘍切片をH&Eで染色するか(上のパネル)又はCD3及びFoxP3について標識し(下のパネル)、顕微鏡法により解析した。矢印で示された領域は、壊死及び炎症性浸潤物の領域を示している。スケールバーは200μmを表している。図10F)CD4+FoxP3+(Treg)細胞及びCD4+FoxP3-(Tconv)細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。図10G)フローサイトメトリーから計算された腫瘍1g当たりの従来型及び調節性CD4+細胞及びCD8+細胞の絶対数。図10H)CD45+細胞のうちのTregの相対的パーセンテージ。図10I)計算されたTconv/Treg比及びCD8+/Treg比。(図10J及び図10K)腫瘍浸潤Tconv(図10J)及びCD8+細胞(図10K)におけるICOS、グランザイムB、及びKi-67の上方調節。図10L)NDV注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍の成長。図10M)全体の動物生存。データは、1群当たりn＝3〜5匹を用いた3回(図10B〜10K)又は2回(図10L〜10M)の独立した実験の累積結果を表している。平均+/-SEMが示されている。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
【００８１】
【図１１】図11A〜11E。NDV療法は、両側性足蹠メラノーマモデルで遠位腫瘍リンパ球浸潤を増大させる。両側性足蹠メラノーマ腫瘍を担持する動物を図10Aに記載されているスケジュールに従って処置した。遠位腫瘍を15日目に摘出し、TILを標識し、フローサイトメトリーにより解析した。図11A)腫瘍浸潤CD45+細胞及びCD3+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。図11B)CD4+FoxP3+細胞及びCD4+FoxP3-細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。図11C)腫瘍1g当たりの従来型及び調節性CD4+細胞及びCD8+細胞の絶対数。図11D及び図11E)腫瘍浸潤CD8+リンパ球(図11D)及びTconvリンパ球(図11E)におけるICOS、グランザイムB、及びKi-67の上方調節。データは、1群当たり5匹のマウスを用いた2回の独立した実験のうちの1つの代表的な結果を示している。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
【００８２】
【図１２】図12A〜12I。NDVは、養子移植した腫瘍特異的リンパ球の浸潤を誘導し、腫瘍炎症を促進する。図12A)処置スキーム。図12B)NDVで処置し、Trp1-Flucリンパ球を養子移植した動物の代表的な発光画像。図12C)腫瘍部位からの平均発光の定量。図12D)パネル図12Cのデータから計算された曲線下面積(AUC)。図12E)フローサイトメトリーから計算された遠位腫瘍由来のPmelリンパ球の絶対数。図12F)図12Aの処置スキームで処置された動物の遠位腫瘍浸潤CD45+及びCD3+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。図12G)NDV又はPBSの単回注射で腫瘍内処置された動物からの血清移植の実験スキーム。図12H)血清注射を受けた腫瘍浸潤CD45+及びCD3+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。図12I)フローサイトメトリーから計算された血清注射を受けた腫瘍における表示された細胞サブセットの絶対数。図12B〜12Eのデータは、1群当たりn＝4〜5匹を用いた3回の実験のうちの1つを表している。図12G〜12Iのデータは、1群当たりn＝5匹を用いた2回の独立した実験のプールされたデータを表している。平均+/-SEMが示されている。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001。
【００８３】
【図１３】図13。腫瘍内NDVは腫瘍再投与からの防御をもたらす。NDVによりB16F10メラノーマが治癒した動物に、75日目に、1×105個のB16F10メラノーマ細胞を注射し、腫瘍成長についてモニタリングし、腫瘍が1000mm3に達したときに安楽死させた。全体の動物生存が示されている。データは、1群当たり10匹のマウスを用いた2回の独立した実験のうちの1つの累積結果を示している。****p＜0.0001。
【００８４】
【図１４】図14A〜14B。腫瘍浸潤CD8+リンパ球は、NDV療法に応答してCTLA-4を上方調節する。NDVで処置した腫瘍(図14A)及び遠位腫瘍(図14B)のCD8+細胞におけるCTLA-4発現の代表的なドットプロット(左)及び累積結果(右)。1群当たり3匹のマウスを用いた3回の実験のうちの1つの代表的な結果。*p＜0.05。
【００８５】
【図１５】図15A〜15B。NDV療法は、腫瘍及び腫瘍浸潤白血球上でのPD-L1の上方調節をもたらす。図15A)インビトロで感染させたB16F10細胞上での(左のパネル)、並びにウイルス注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍におけるインビボでのPD-L1発現。上、代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。下、腫瘍由来のB16F10細胞上でのPD-L1発現の平均蛍光強度中央値(MFI)。図15B)遠位腫瘍から単離された腫瘍浸潤白血球の表面でのPD-L1発現。上:代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。下:各々の細胞サブセットについての計算された平均MFI。
【００８６】
【図１６】図16A〜16D。NDVとPD-1を遮断する抗体との併用療法は、両側腹B16メラノーマモデルで抗腫瘍効果の増強をもたらす。図16A)処置スキーム。図16B)右側腹(NDV注射を受けた)腫瘍成長。図16C)左側腹(遠位)腫瘍成長。図16D)全生存。
【００８７】
【図１７】図17A〜17D。NDVとPD-L1を遮断する抗体との併用療法は、両側腹B16メラノーマモデルで抗腫瘍効力の増強をもたらす。図17A)処置スキーム。図17B)右側腹(NDV注射を受けた)腫瘍成長。図17C)左側腹(遠位)腫瘍成長。図17D)全生存。
【００８８】
【図１８】図18A〜18E。NDV及び抗PD-1療法による併用療法は、エフェクターによる遠位腫瘍浸潤の増大をもたらすが、調節性T細胞による遠位腫瘍浸潤の増大をもたらさない。図18A)腫瘍内のCD4+細胞及びCD8+細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。図18B)Tconv(CD4+FoxP3-)細胞及びTreg(CD4+FoxP3+)細胞のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。図18C)フローサイトメトリーから計算された、腫瘍1g当たりのT細胞サブセットの絶対数。図18D)CD4+ T細胞由来のTregの相対的パーセンテージ。図18E)計算されたTconv/Treg比及びCD8/Treg比。
【００８９】
【図１９】図19A〜19B。NDV及び抗PD-1併用療法で処置された動物の遠位腫瘍由来のTILは、溶解マーカー及び増殖マーカーを上方調節する。図19A)グランザイムB及びKi67陽性Tconv及びCD8リンパ球のパーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。図19B)グランザイムB及びKi67陽性Tconv及びCD8+ T細胞のパーセンテージ。
【００９０】
【図２０】図20A〜20C。NDVは、腫瘍免疫浸潤並びにウイルス注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍におけるCD4細胞及びCD8細胞上でのICOSの上方調節を誘導する。図20A)処置スキーム。図20B)NDV注射を受けた(右側腹)腫瘍から単離された腫瘍浸潤CD4+FoxP3-細胞及びCD8+細胞上でのICOSの発現。代表的なフローサイトメトリープロット(上)及び蛍光強度中央値(MFI)(下)が示されている。図20C)遠位(左側腹)腫瘍から単離された腫瘍浸潤CD4+FoxP3-細胞及びCD8+細胞上でのICOSの発現。代表的なフローサイトメトリープロット(上)及び蛍光強度中央値(MFI)(下)が示されている。
【００９１】
【図２１】図21: pT7NDV-LS-L289Aプラスミドの略図。
【００９２】
【図２２】図22A〜22D: B16F10両側性腫瘍モデルにおける抗muPD-1 mAb muDX400と組み合わせた腫瘍内NDV-muIL-12による抗腫瘍効力の増強。マウスB16F10細胞を免疫適格C57BL/6Jマウスの右側腹(2×105細胞)及び左側腹(1×105細胞)に皮下移植した。移植から9日後(0日目)、中央値TV＝65mm3を有する右側腹(注射を受けた腫瘍)の腫瘍体積(TV)に基づいて、動物を群に割り当てた。6つの群の左側腹(注射を受けていない腫瘍)の中央値TVは、31〜38mm3の範囲であった。投与を0日目に開始した。10mg/kgのマウスIgG1アイソタイプ対照及びmuDX400を4日毎に合計3回の投与で腹腔内投与した。PBS、1×107pfuのNDV WT及びNDV-muIL-12を右側腹の腫瘍内に2日毎に合計4回の投与で投与した。各々の群には10匹の動物がいた。図22A〜22B:それぞれ、注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍の成長曲線が提示されている。腫瘍体積(「TV」)は、68％信頼区間を有する中央値として提示されている。図22C及び22D:それぞれ、注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍についての13日目の個々の動物のTVが提示されている。点線は、0日目の中央値TVを示している。基幹比較のためのP-値が示されている(p＜0.05は、統計的有意性を示す)。第1群: mIgG1対照＋PBS;第2群: muDX400＋PBS;第3群: mIgG1対照＋NDV-WT;第4群: muDX400＋NDV-WT;第5群: mIgG1対照＋NDV-muIL-12;第6群: muDX400＋NDV-muIL-12。注射を受けた腫瘍について、完全な退縮の数は、次の通りであった:第1群: 0;第2群: 0;第3群: 1;第4群: 1;第5群: 2;及び第6群: 6。注射を受けていない腫瘍について、完全な退縮の数は、次の通りであった:第1群: 0;第2群: 1;第3群: 1;第4群: 3;第5群: 0;及び第6群: 5。
【００９３】
【図２３】図23A〜23D:図22A〜22Dの凡例に記載されているB16F10両側性腫瘍モデルにおける抗muPD-1 mAb muDX400と組み合わせた腫瘍内NDV-muIL 12による注射を受けた腫瘍における免疫遺伝子の誘導。実験デザインは、第6.3.1.9節及び第6.3.1.13節に記載されている。腫瘍を14日目に採取し、腫瘍組織における遺伝子発現をRTqPCRにより評価し、ユビキチンに対して標準化した。注射を受けた腫瘍におけるT細胞マーカー(図23A)、サイトカイン(図23B)、IFN誘導性遺伝子(図23C)、並びにPd-1及びPd-l1(図23D)の遺伝子の個々の動物の発現レベルが提示されている。線は平均値を表している。第3群と第5群、第4群と第6群、及び第5群と第6群の比較のために、＜0.05のp-値が示されている。
【００９４】
【図２４】図24A〜24D:図22A〜22Dの凡例に記載されているB16F10両側性腫瘍モデルにおける抗muPD-1 mAb muDX400と組み合わせた腫瘍内NDV-muIL-12による注射を受けていない腫瘍における免疫遺伝子の誘導。実験デザインは、第6.3.1.9節及び第6.3.1.13節に記載されている。腫瘍を14日目に採取し、腫瘍組織における遺伝子発現をRTqPCRにより評価し、ユビキチンに対して標準化した。注射を受けていない腫瘍におけるT細胞マーカー(図24A)、サイトカイン(図24B)、及びIFN誘導性遺伝子(図24C)、並びにPd-1及びPd-l1(図24D)の遺伝子の個々の動物の発現レベルが提示されている。線は、平均を表している。＜0.05のP-値が示されている。
【００９５】
【図２５】図25A及び25B:抗muPD-1 mAb muDX400と組み合わせたNDV-muIL 12による処置は、B16F10担持動物の生存を増大させた。マウスB16-F10細胞を免疫適格C57BL/6Jマウスの右側腹(2×105細胞)及び左側腹(1×105細胞)に皮下移植した。移植から7日後(0日目)、中央値TV＝56mm3を有する右側腹(注射を受けた腫瘍)の腫瘍体積(TV)に基づいて、動物を群に割り当てた。左側腹(注射を受けていない腫瘍)の中央値TVは、38mm3であった。投与を0日目に開始した。10mg/kgのマウスIgG1アイソタイプ対照及びmuDX400を4日毎に合計3回の投与で腹腔内投与した。PBS、1×107pfuのNDV-WT及びNDV-muIL-12を2日毎に合計4回の投与で右側腹の腫瘍に投与した。動物を54日目まで追跡調査した。注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍の体積の合計が≧2000mm3となるか又は体重減少が≧20％となったとき、動物を安楽死させた。各々の群には10匹の動物がいた。図25Aは、第1群(mIgG1対照＋PBS)、第3群(mIgG1対照＋NDV-WT)、及び第5群(mIgG1対照＋NDV-muIL-12)の生存曲線を示している。図25Bは、第2群(muDX400＋PBS)、第4群(muDX400＋NDV-WT)、及び第6群(muDX400＋NDV-muIL-12)の生存曲線を示している。
【００９６】
【図２６】図26A及び26B: B16F10両側性腫瘍モデルにおける抗muPD-1 mAb muDX400と組み合わせた腫瘍内NDV-muIL-12による注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍におけるCD3+ T細胞の浸潤の増大。マウスB16F10細胞を免疫適格C57BL/6Jマウスの右側腹(2×105細胞)及び左側腹(1×105細胞)に皮下移植した。移植から8日後(0日目)、平均TV＝108mm3を有する右側腹(注射を受けた腫瘍)の腫瘍体積(TV)に基づいて、動物を群に割り当てた。左側腹の平均TV＝63mm3。投与を0日目に開始した。10mg/kgのマウスIgG1アイソタイプ対照及びmuDX400を6日毎に合計2回の投与で腹腔内投与した。PBS、1×107pfuのNDV WT及びNDV-muIL-12を右側腹の腫瘍に2日毎に合計4回の投与で投与した。実験デザインは、第6.3.1.9節及び第6.3.1.10節に記載されている。注射を受けた腫瘍(図26A)及び注射を受けていない腫瘍(図26B)の8日目の代表的な画像が示されている。
【００９７】
【図２７】図27A: 26種のヒト癌細胞株:メラノーマ(n＝3)、頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC、n＝4)、肺癌(n＝4)、乳癌(n＝3)、卵巣癌(n＝3)、結腸癌(n＝4)、及び膵癌(n＝5)のパネルにおけるNDV-huIL-12の溶解活性。細胞をMOI 2及び6でNDV-huIL-12に感染させ、感染から48時間後に、細胞生存率を決定した。生存率は、非感染細胞と比べた感染細胞における生細胞のパーセンテージとして表されている。DMSO中の10μMピューロマイシンによる処理が細胞死滅の陽性対照として含まれており;生存率は、DMSOによる処理と比べた生細胞のパーセンテージとして表されている。値は、8つの複製物の平均±平均の標準誤差として提示されている。点線は、細胞生存率の20％低下のカットオフを示している。DMSO＝ジメチルスルホキシド。MOI＝感染多重度。
【００９８】
図27B: 26種のヒト癌細胞株のパネルにおけるIL-12p70、IFN-γ、及びIP-10の誘導。様々なヒト腫瘍細胞株:メラノーマ(n＝3)、頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC、n＝4)、肺癌(n＝4)、乳癌(n＝3)、卵巣癌(n＝3)、結腸癌(n＝4)、及び膵癌(n＝5)における模擬感染(白い棒)又はNDV-huIL-12(MOI＝2)による感染(黒の棒)から48時間後に、上清を採取した。様々なサイトカイン及びケモカインのタンパク質濃度について、免疫アッセイを用いて、上清を試験した。示されているのは、IL-12p70(上)、IFN-β(中央)、及びIP-10(下)についての4つの複製物の平均±平均の標準誤差である。点線は、LLOQ及びULOQ: IL 12p70(LLOQ＝5pg/mL及びULOQ＝5580pg/mL)、IFN-β(LLOQ＝98pg/mL)、並びにIP-10(LLOQ＝2pg/mL及びULOQ＝9040pg/mL)を示している。LLOQ＝定量下限; MOI＝感染多重度;及びULOQ＝定量上限。
【００９９】
【図２８】図28: NDV-huIL-12による処理を用いたヒト腫瘍組織培養物におけるIFN-α-2a、IL-12、IFN-γ、及びIP-10の誘導。腎細胞癌(RCC、n＝4)、結腸直腸癌(CRC、n＝3)、乳癌(n＝2)、及び頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC; n＝1)の試料を処理しなかったか(培地)、又は3×107pfuのNDV-WTもしくはNDV-huIL-12で最大48時間処理した。免疫アッセイを用いる様々なサイトカイン及びケモカインタンパク質濃度の評価のために、上清を該組織培養物から回収した。示されているのは、IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70、IFN-γ、及びIP-10についての平均±平均の標準誤差(ウィルコクソンの符号付き順位検定、＜0.05のp-値が示されている)である。点線は、LLOQ値: IFN-α-2a＝2.4pg/mL、IFN-β＝24pg/mL、IL-12p70＝2.4pg/mLを示している。上清を24時間で回収し、1:15希釈でアッセイしたIP-10を除いて、データは、48時間の時点で回収された未希釈の上清について示されている。LLOQ＝定量下限。
【０１００】
【図２９】図29A〜29D: NDV-huIL-12による処理によるヒト腫瘍組織培養物におけるIFN誘導性遺伝子、ケモカイン、Il-12p40、Ifn-γ、及びPd-l1(PD-L1をコードする遺伝子)の遺伝子発現の誘導。腎細胞癌(RCC、n＝4)、結腸直腸癌(CRC、n＝3)、乳癌(n＝2)、及び頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC、n＝1)の試料を処理しなかったか(培地)、又は3×107pfuのNDV-WTもしくはNDV-huIL-12で最大48時間処理した。該試料を急速凍結させ、RNA単離後、Fluidigm RTqPCRプラットフォームを用いて、免疫遺伝子のパネルの遺伝子発現を解析した。示されているのは、48時間の時点でのIFN誘導性遺伝子(図29A)、ケモカイン(図29B)、Il-12p40及びIfn-γ(図29C)、並びにPd-l1(図29D)についてのユビキチンに対して標準化された値の平均±平均の標準誤差(ウィルコクソンの符号付き順位検定、＜0.05のp値が示されている)である。
【０１０１】
【図３０】図30: NDV-huIL 12処理によるヒト全血におけるIFN-α-2a、IL-12p70、IFN-γ、及びIP-10の誘導。固形癌を有する患者(n＝5)及び正常な健常ドナー(n＝5)由来の全血(1mL)を処理しなかったか(培地)、又は3×107pfuのNDV-WTもしくはNDV-huIL-12で最大48時間処理した。免疫アッセイを用いる様々なサイトカイン及びケモカインのタンパク質濃度の評価のために、血漿を回収した。示されているのは、IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70、IFN-γ、及びIP-10についての平均±平均の標準誤差(ウィルコクソンの符号付き順位検定、＜0.05のp値が示されている)である。点線は、LLOQ値又はULOQ値のいずれか: IFN-α-2a(LLOQ)＝2.4pg/mL、IFN-β(LLOQ)＝24pg/mL、IP-10(ULOQ)＝2610pg/mLを示している。値は、48時間の時点で回収された未希釈の上清について示されている。LLOQ＝定量下限; ULOQ＝定量上限。
【０１０２】
【図３１】図31A〜31D: NDV-huIL 12処理によるヒト全血におけるIFN誘導性遺伝子、ケモカイン、Il-12p40、Ifn-γ、及びPd-l1の遺伝子発現の誘導。固形癌を有する患者(n＝5)及び正常な健常ドナー(n＝5)由来の全血(4mL)を処理しなかったか(培地)、又は12×107pfuのNDV-WTもしくはNDV-huIL-12で最大24時間処理した。全血をPAXgene血液RNAチューブに回収し、RNA単離後、Fluidigm RTqPCRプラットフォームを用いて、免疫遺伝子のパネルの遺伝子発現を解析した。示されているのは、24時間の時点でのIFN誘導性遺伝子(図31A)、ケモカイン(図31B)、Il-12p40及びIfn-γ(図31C)、並びにPd-l1(図31D)についてのユビキチンに対して標準化された値の平均±平均の標準誤差(ウィルコクソンの符号付き順位検定、＜0.05のp-値が示されている)である。
【０１０３】
【図３２】図32:フローウイルス測定によるNDV-huIL-12の解析。
【０１０４】
【図３３】図33:還元SDS-PAGEによるNDV-huIL-12の解析。MW:分子量マーカー; CB:清澄化バルク液;及びSFP:滅菌濾過生成物。
【０１０５】
【図３４】図34: NDV-huIL-12による24時間のVero細胞感染の後のMOI依存的huIL-12発現曲線。
【０１０６】
【図３５】図35: PathHunter(登録商標)バイオアッセイ検出キットを用いるhuIL-12誘導性の受容体二量体化。各々の曲線は、表示されたMOIでのNDV-huIL-12の24時間の感染の後のVero細胞によって産生されたhuIL-12の力価を表している。
【０１０７】
【図３６】図36: BSRT7細胞及び尿膜腔液におけるrNDV-mIL12発現。Y軸は、市販のELISAキット(マウスIL-12p70 Quantikine ELISAキット、R&D Systems、カタログ番号M1270)を用いて決定したときのmuIL-12の濃度(単位はpg/mL)である。左から右に: NDV-WT(陰性対照)、NDV-muIL-12(MOI＝3、24hpi)、NDV-muIL-12(MOI＝10、24hpi)、NDV-muIL-12(MOI＝3、48hpi)、もしくはNDV-muIL-12(MOI＝10、48hpi)に感染したBSRT7細胞、又はNDV-muIL-12に感染した卵由来の尿膜腔液。MOI＝感染多重度。Hpi＝感染後の時間。
【０１０８】
【図３７】図37A〜37N: B16F10両側性腫瘍モデルにおける抗muPD-1 mAb muDX400と組み合わせたNDV-muIL-23又はNDV-muIL-27と対比したNDV-muIL-12の抗腫瘍効力の増強。マウスB16F10細胞を免疫適格C57BL/6Jマウスの右側腹(2×105細胞)及び左側腹(1×105細胞)に皮下移植した。移植から9日後(0日目)、中央値TV＝65mm3を有する右側腹(注射を受けた腫瘍)の腫瘍体積(TV)に基づいて、動物を群に割り当てた。6つの群の左側腹(注射を受けていない腫瘍)の中央値TVは、31〜43mm3の範囲であった。投与を0日目に開始した。10mg/kgのマウスIgG1アイソタイプ対照及びmuDX400を4日毎に合計3回の投与で腹腔内投与した。PBS、1×107pfuのNDV-WT、NDV-muIL-12、NDV-muIL-23、及びNDV-muIL-27を2日毎に合計5回の投与で右側腹の腫瘍に投与した。各々の群には10匹の動物がいた。注射を受けたものについての個々の動物の成長曲線が提示されている:第1群: mIgG1対照＋PBS(図37A);第2群: muDX400＋PBS(図37B);第3群: muDX400＋NDV-WT(図37C);第4群: muDX400＋NDV-muIL-12(図37D);第5群: muDX400＋NDV-muIL-23(図37E);第6群: muDX400＋NDV-muIL-27(図37F)。注射を受けた腫瘍についての14日目の腫瘍体積(68％信頼区間を有する中央値)並びに完全及び部分退縮の数が図37Gに提示されている。注射を受けていないものについての個々の動物の成長曲線が提示されている:第1群: mIgG1対照＋PBS(図37H);第2群: muDX400＋PBS(図37I);第3群: muDX400＋NDV-WT(図37J);第4群: muDX400＋NDV-muIL-12(図37K);第5群: muDX400＋NDV-muIL-23(図37L);第6群: muDX400＋NDV-muIL-27(図37M)。注射を受けていない腫瘍についての14日目の腫瘍体積(68％信頼区間を有する中央値)並びに完全及び部分退縮の数が図37Nに提示されている。
【０１０９】
【図３８】図38A〜38J: B16F10両側性腫瘍モデルにおける抗muPD-1 mAb muDX400と組み合わせたNDV-muIL-2と対比したNDV-muIL-12による抗腫瘍効力の増強。マウスB16F10細胞を免疫適格C57BL/6Jマウスの右側腹(2×105細胞)及び左側腹(1×105細胞)に皮下移植した。移植から10日後(0日目)、中央値TV＝55mm3である右側腹(注射を受けた腫瘍)における腫瘍体積(TV)に基づいて、動物を群に割り当てた。左側腹(注射を受けていない腫瘍)の中央値TVは、34mm3であった。投与を0日目に開始した。10mg/kgのマウスIgG1アイソタイプ対照及びmuDX400を4日毎に合計5回の投与で腹腔内投与した。PBS、1×107pfuのNDV-WT、NDV-muIL-12、及びNDV-muIL-2を右側腹の腫瘍に2日毎に合計4回の投与で投与した。各々の群には12匹の動物がいた。注射を受けたものについての個々の動物の成長曲線をが提示されている:第1群: mIgG1対照＋PBS(図38A);第2群: muDX400＋NDV-WT(図38B);第3群: muDX400＋NDV-muIL-12(図38C);第4群: muDX400＋NDV-muIL-2(図38D)。注射を受けていないものについての個々の動物の成長曲線が示されている:第1群: mIgG1対照＋PBS(図38E);第2群: muDX400＋NDV-WT(図38F);第3群: muDX400＋NDV-muIL-12(図38G);第4群: muDX400＋NDV-muIL-2(図38H)。注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍について、最後の測定の腫瘍体積(68％信頼区間を有する中央値)並びに完全及び部分退縮の数が、それぞれ、図38I及び図38Jに提示されている。
【図３９】図39: NDV-huIL-12による処理によるヒト腫瘍組織培養物におけるNDV-huIL-12応答シグナチャーの誘導。腎細胞癌(RCC、n＝7)及び結腸直腸癌(CRC、n＝7)の試料を処理しなかったか(培地)、又は3×107pfuのNDV-huIL-12で最大48時間処理した。該試料を急速凍結させ、RNA単離後、Fluidigm Biomark RTqPCRプラットフォームを用いて、免疫遺伝子のパネルの遺伝子発現を解析した。示されているのは、6、24、及び48時間でのNDV-huIL-12と未処理(培地)の間での発現の平均変化倍率であり;ユビキチンに対して標準化された値を変化倍率の計算に用いた。
【０１１０】
【図４０】図40A〜B: GEP陰性腫瘍とGEP陽性腫瘍の両方におけるNDV及びNDV-huIL-12による炎症性T細胞のIFN-γ関連遺伝子シグナチャー(18-GEP)スコアの誘導。腎細胞癌(RCC、n＝10)、結腸直腸癌(CRC、n＝4)、乳癌(n＝2)、非小細胞肺癌(n＝2)、及び頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC、n＝1)の試料を処理しなかったか(培地)、又は3×107pfuのNDV-WTもしくは3×107pfuのNDV-huIL-12で最大24時間処理した。該試料を急速凍結させ、RNA単離後、NanoStringプラットフォームを用いて、18-遺伝子GEPシグナチャーを解析した。示されているのは、標準偏差及びp-値を伴う平均GEPスコア(ANOVAフリードマン検定と、その後のダンの多重比較検定)(図40A)並びに個々のGEPスコア(図40B)である。
【０１１１】
【図４１】図41A〜D:組換えIL-12及びNDV-huIL 12によるI型インターフェロン及びIP-10の誘導。腎細胞癌(RCC、n＝6)、結腸直腸癌(CRC、n＝1)、及び非小細胞肺癌(NSCLC、n＝2)由来の組織培養物試料を処理しなかったか(培地)、又は3×107pfuのNDV-WT、3×107のNDV-huIL-12、もしくは組換えヒトIL-12(10、25、及び50ng/mL)で最大48時間処理した。上清を回収し、IL-12p70(図41A)、IFN-α-2a(図41B)、IFN-β(図41C)、及びIP-10(図41D)の分泌について解析した。示されているのは、SEM及びp-値を伴う平均値(ANOVAフリードマン検定と、その後のダンの多重比較検定)である。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
(5.詳細な説明)
一態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載されるNDV(例えば、下の第5.1節もしくは第5.2節に記載されているNDVもしくはキメラNDV)又はそのようなキメラNDVを含む組成物を利用して、癌を治療する方法である。具体的な実施態様において、癌を治療する方法は、対象の癌細胞に、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載されるキメラNDV)又はその組成物を感染させることを含む。別の実施態様において、癌を治療する方法は、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載されるキメラNDV)又はその組成物を投与することを含む。具体的な実施態様において、有効量の本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載されるキメラNDV)又は有効量の本明細書に記載されるキメラNDVを含む組成物は、癌を治療するために対象に投与される。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、IL-12(例えば、IL-12 p35及びIL-12 p40サブユニット)をコードするパッケージングされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、IL-12(例えば、ヒトIL-12)は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。ある実施態様において、該NDVのゲノムは、突然変異型Fタンパク質もコードする。ある実施態様において、2以上のキメラNDVは、癌を治療するために対象に投与される。
【０１１３】
別の実施態様において、癌を治療する方法は、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるNDV(例えば、下の第5.1節及び/もしくは第5.2節に記載されているNDVもしくはキメラNDV)又はその組成物に感染させた癌細胞を投与することを含む。具体的な実施態様において、該癌細胞は、該対象に投与する前に又は該医薬組成物に組み込む前にγ線で処理されたものである。別の実施態様において、癌を治療する方法は、それを必要としている対象に、キメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載されるキメラNDV)又はその組成物に感染させた癌細胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜断片を投与することを含む。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードするパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該IL-12は、該NDVによって発現される。ある実施態様において、該NDVのゲノムは、該NDVによって発現される突然変異型Fタンパク質もコードする。
【０１１４】
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載されるNDV(例えば、下の第5.2節に記載されているようなキメラNDV)又は該NDVを含む組成物を1以上の他の療法と組み合わせて用いて癌を治療する方法である。一実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に、本明細書に記載されるNDV(例えば、下の第5.2節に記載されているようなキメラNDV)及び1以上の他の療法を投与することを含む、方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に、有効量の本明細書に記載されるNDV又は有効量の本明細書に記載されるNDVを含む組成物、及び1以上の他の療法を投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療するための1以上の他の療法と組み合わせて使用するための医薬の調製における本明細書に記載されるNDV(例えば、下の第5.2節に記載されているようなキメラNDV)の使用である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法であって、1以上の他の療法を投与することをさらに含む、方法で使用するための本明細書に記載されるNDV(例えば、下の第5.2節に記載されているようなキメラNDV)である
【０１１５】
好ましい実施態様において、該1以上の療法には、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、PD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、もしくはPD-L1とPD-L2の両方)との相互作用を遮断する抗PD-1抗体又はPD-L1とPD-1との相互作用を遮断する抗PD-l L1抗体)が含まれる。該NDV及び1以上の他の療法は、同時に又は連続的に、該対象に投与することができる。ある実施態様において、該NDV及び1以上の他の療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該NDV及び1以上の他の療法は、異なる組成物中で投与される。該NDV及び1以上の他の療法は、同じ又は異なる投与経路で、該対象に投与することができる。
【０１１６】
別の態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載されているようなキメラNDV)、又はそのようなキメラNDVを含む組成物を、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストと組み合わせて用いて癌を治療する方法であって、該キメラNDVがIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。一実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、下の第5.2節に記載されているようなキメラNDV)及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に、有効量の本明細書に記載されるキメラNDV又は有効量の本明細書に記載されるキメラNDVを含む組成物、及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。該キメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、同時に又は連続的に、該対象に投与することができる。ある実施態様において、該キメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該キメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、異なる組成物中で投与される。該キメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、同じ又は異なる投与経路で、該対象に投与することができる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは腫瘍内に投与され、該アンタゴニストは静脈内に投与される。
【０１１７】
一実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌の治療で使用するためのPD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト、本明細書に記載されるキメラNDVと組み合わせた使用のための医薬の調製におけるキメラNDVの使用であり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該方法は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することをさらに含む。該キメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、同時に又は連続的に、該対象に投与することができる。ある実施態様において、該キメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該キメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、異なる組成物中で投与される。該キメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、同じ又は異なる投与経路で、該対象に投与することができる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは腫瘍内に投与され、該アンタゴニストは静脈内に投与される。
【０１１８】
国際特許出願公開WO 2014/158811号並びに米国特許出願公開第2016/0015760 A1号及び第2014/0271677 A1号は、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。例えば、国際特許出願公開WO 2014/158811号並びに米国特許出願公開第2016/0015760 A1号及び第2014/0271677 A1号の第3節、第5.1節、第5.2節、第5.5節、及び第5.6節に記載されている、例えば、概要、NDVの説明、キメラNDVの説明、組成物の説明、投与経路の説明、並びに抗癌用途及び他の用途の説明は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
【０１１９】
(5.1  ニューカッスル病ウイルス)
限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異を誘発させたウイルス、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む任意のNDV型又は株を本明細書に開示される併用療法で使用することができる。当業者には、ウイルスが培養され、継代され、又は増殖する際に突然変異を受け得ることを理解されよう。NDVは、クローニング目的で導入された突然変異に加え、これらの天然の突然変異を含み得る。NDVは、これらの突然変異のいずれも含まない、又は1以上を含む、均一又は不均一な集団となり得る。具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、天然株である。ある実施態様において、該NDVは、溶解性株である。他の実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、非溶解性株である。ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、長潜伏期性株である。いくつかの実施態様において、該NDVは、亜病原性株である。他の実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、短潜伏期性株である。例えば、長潜伏期性、亜病原性、及び短潜伏期性NDV株に関する考察については、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、ニューカッスル病、トリパラミクソウイルス-1感染、ガチョウパラミクソウイルス感染、ラニケット病(Newcastle Disease, Avian Paramyoxvirus-1 Infection, Goose Paramyoxvirus Infection, Ranikhet disease)、アイオワ州立大学、食品安全・公衆衛生センター(Center for Food Security & Public Health, Iowa State University)、アイオワ州立大学、獣医学カレッジ、動物用生物学的製剤に関する国際協力機構(Institute for International Cooperation in Animal Biologics, College of Veterinary Medicine, Iowa State University)、1〜9ページ(2016年1月)を参照されたい。NDV株の具体的な例としては、73-T株、NDV HUJ株、Ulster株(例えば、GenBank番号U25837を参照)、MTH-68株、Italien株(例えば、GenBank番号EU293914を参照)、Hickman株(例えば、GenBank番号AF309418を参照)、PV701株、Hitchner B1株(例えば、GenBank番号AF309418又はNC_002617を参照)、La Sota株(例えば、GenBank番号AY845400及びJF950510.1並びにGI番号56799463を参照)、YG97株(例えば、GenBank番号AY351959又はAY390310を参照)、MET95株(例えば、GenBank番号AY143159を参照)、Roakin株(例えば、GenBank番号AF124443を参照)、並びにF48E9株(例えば、GenBank番号AF163440及びU25837を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、Hitchner B1株である。別の具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、GenBank番号AF309418又はNC_002617によって特定されるB1株である。別の具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、ATCC番号VR2239によって特定されるNDVである。別の具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、La Sota株である。具体的な実施態様において、La Sotaゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号50に示されている通りである。当業者は、NDVゲノムRNA配列が該NDVゲノムをコードするcDNA配列の逆相補体であることを理解しているであろう。したがって、その逆相補体配列に対するヌクレオチド配列を作成する任意のプログラムを利用して、NDVゲノムをコードするcDNA配列をゲノムRNA配列に変換することができる(例えば、www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html、www.fr33.net/seqedit.php、及びDNAStarを参照)。
【０１２０】
具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、当業者に公知の技法によって評価したとき、鳥で病原性がない。ある具体的な実施態様において、併用療法で使用されるNDVは、1日齢のニワトリへの該ウイルスの頭蓋内注射、並びに8日間スコアリングしたときの疾患発症及び死によって評価したとき、病原性ではない。いくつかの実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、0.7未満、0.6未満、0.5未満、0.4未満、0.3未満、0.2未満、又は0.1未満の頭蓋内病原性指数を有する。ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、0という頭蓋内病原性指数を有する。
【０１２１】
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、当業者に公知の技法によって評価したとき、鳥で病原性があるとは考えられないように遺伝子改変された亜病原性株である。ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、当業者に公知の技法によって評価したとき、鳥で病原性があるとは考えられないように遺伝子改変された短潜伏期性株である。
【０１２２】
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、突然変異型Fタンパク質を発現する。具体的な実施態様において、併用療法で使用されるNDVは、高融合原性で、かつ合胞体を形成することができる突然変異型Fタンパク質を発現する。別の具体的な実施態様において、該突然変異型Fタンパク質はビリオンに取り込まれる。
【０１２３】
一実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVのゲノムは、突然変異した切断部位を有する突然変異型Fタンパク質を発現するように改変される。具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、突然変異型Fタンパク質を発現するように改変され、ここで、該Fタンパク質の切断部位は、多塩基性アミノ酸配列を生成させるように突然変異させられ、それにより、該タンパク質は、細胞内プロテアーゼによって切断されることが可能になり、それにより、該ウイルスは、細胞に侵入し、合胞体を形成するのにより効果的になる。別の具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、突然変異型Fタンパク質を発現するように改変され、ここで、該Fタンパク質の切断部位は、1つ又は2つの追加のアルギニン残基を含有する突然変異した切断部位と置き換えられ、それにより、該突然変異切断部位は、広範に発現されるフューリンファミリーのプロテアーゼによって活性化されることが可能になる。そのような突然変異型Fタンパク質を発現するNDVの具体的な例としては、rNDV/F2aa及びrNDV/F3aaが挙げられるが、これらに限定されない。突然変異した切断部位を有する突然変異型Fタンパク質を産生するためにNDV Fタンパク質に導入される突然変異の説明については、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Parkらの文献(2006)、二重特異性を有する改変されたウイルスワクチン構築物:鳥インフルエンザ及びニューカッスル病(Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and Newcastle disease.)、PNAS USA 103: 8203-2808を参照されたい。
いくつかの実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、アミノ酸突然変異L289A(すなわち、La Sota Fタンパク質のL289に対応するアミノ酸位置におけるLからAへの突然変異)を有する突然変異型Fタンパク質を発現するように改変される。L289A突然変異の説明については、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Sergelらの文献(2000)、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質の単一アミノ酸変化は融合体におけるHNタンパク質の必要条件を変化させる(A Single Amino Acid Change in the Newcastle Disease Virus Fusion Protein Alters the Requirement for HN Protein in Fusion.)、Journal of Virology 74(11): 5101-5107を参照されたい。具体的な実施態様において、該L289A突然変異型Fタンパク質は、1つ、2つ、又は3つのアルギニン残基を該切断部位に保有する。いくつかの実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、アミノ酸突然変異L289A(すなわち、La Sota Fタンパク質のL289に対応するアミノ酸位置におけるLからAへの突然変異)を有する突然変異型Fタンパク質を発現するように改変されているLa Sota株である。ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、アミノ酸突然変異L289A(すなわち、La Sota Fタンパク質のL289に対応するアミノ酸位置におけるLからAへの突然変異)を有し、かつLa Sota株Fタンパク質切断部位
【化２５】
2020519641.tif 000027
を有する突然変異型Fタンパク質を発現するように改変されているLa Sota株である。いくつかの実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Kimらの文献、2017, PLOS ONE 12(3): e0173965及びKimらの文献、2016, J. of General Virology 97: 1297-1303に開示されているNDVである。ある実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDVとは異なる型又は株のNDVに由来するものである。ある実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDVと同じ株のNDVに由来するものである。いくつかの実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである。具体的な実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換わるものである。具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、アミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異型Fタンパク質を発現するように改変されているLa Sota株骨格を含む。具体的な実施態様において、該La Sota株ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号50に示されている通りである。
【０１２４】
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、NDV La Sota株又はサイトメガロウイルス(CMV)の糖タンパク質BのFタンパク質切断部位を有する突然変異型Fタンパク質を含む。具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、例えば、国際特許出願WO 2015/032755号に記載されている、以下の配列修飾:
【化２６】
2020519641.tif 000028
のうちの1つを有するFタンパク質切断を有する突然変異型Fタンパク質を含む。NDV Fタンパク質へと改変され得る突然変異型Fタンパク質切断部位のタイプの説明については、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際特許出願公開WO 2015/032755号を参照されたい。いくつかの実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである。具体的な実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換わるものである。
【０１２５】
別の具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、引用により完全に本明細書中に組み込まれる国際特許出願WO 2015/032755号に記載されている、改変された73T株である。別の具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、引用により完全に本明細書中に組み込まれる国際特許出願WO 2015/032755号に記載されている、r73T-R116ウイルス(Fタンパク質切断部位
【化２７】
2020519641.tif 000029
を有するr73T株)である。さらなる実施態様において、該NDVは、長さ60、102、144、198、又は318ntのHN及びL遺伝子間非コード配列を含む。
【０１２６】
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、該NDVが、少なくとも一部感染性を残し、インビボで複製することができるが、低い力価しか生じさせず、結果として、非病原性の不顕性レベルの感染をもたらすように、弱毒化される(例えば、Khattarらの文献、2009, J. Virol. 83:7779-7782を参照されたい)。そのような弱毒化NDVは、該ウイルスが、免疫原、例えば、生ワクチンとして作用するために対象に投与される実施態様に特に適する場合がある。該ウイルスは、当技術分野で公知の任意の方法によって弱毒化することができる。具体的な実施態様において、該NDVゲノムは、子孫が産生され、かつ感染レベルが不顕性となるような弱毒化ウイルスの感染及び複製に必要な配列を含む。具体的な実施態様において、該NDVは、ヒト細胞で複製可能である。
【０１２７】
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、NDV Vタンパク質コード配列を含まない。他の実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、突然変異Vタンパク質を発現する。例えば、突然変異Vタンパク質に関して、例えば、引用により本明細書中に組み込まれる、Elankumaranらの文献、2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844を参照されたい。ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用される亜病原性又は短潜伏期性NDV株は、例えば、Elankumaranらの文献、2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844によって開示されている、突然変異Vタンパク質を発現する。
【０１２８】
ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第7,442,379号、米国特許第6,451,323号、米国特許第6,146,642号、米国特許出願公開第2014/0271677 A1号、国際特許出願公開WO 2014/0158811号、又は米国特許出願公開第2016/0015760 A1号に開示されるNDVである。具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許出願公開第2014/0271677 A1号、国際特許出願公開WO 2014/0158811号、又は米国特許出願公開第2016/0015760 A1号の第5.1節に開示されるNDVである。具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、異種ペプチド又はタンパク質をコードし、それを発現するように遺伝子改変される。ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、当業者に公知のキメラNDV又は本明細書に開示されるキメラNDVである(例えば、下の第5.2節及び/もしくは第6節を参照)。ある実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許出願公開第2012/0058141号、第2012/0122185号、第2016/0015760 A1号、もしくは第2014/0271677 A1号、又は国際特許出願公開WO 2014/158811号に開示されているキメラNDVである。具体的な実施態様において、本明細書に開示される併用療法で使用されるNDVは、例えば、IL-12などのサイトカインを発現するように改変されたゲノムを含むキメラNDVである。
【０１２９】
(5.2  キメラニューカッスル病ウイルス)
一態様において、本明細書に記載されるのは、IL-12又はIL-12誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVである(例えば、第5.2.1節を参照)。言い換えると、該NDVは、該ウイルスに感染した細胞で発現されるIL-12又はIL-12誘導体を発現するように改変される「骨格」としての役割を果たす。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、IL-12又はその誘導体を含む。限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異を誘発させたウイルス、再集合体、及び/又は遺伝子改変されたウイルスを含む、任意のNDV型又は株が、本明細書に記載されるキメラNDVの骨格としての役割を果たし得る。具体的な実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変のための骨格としての役割を果たすNDVは、上の第5.1節に記載されているNDVである。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、非癌細胞と比較して癌細胞で優先的に複製する。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、弱毒化されているが、少なくとも一部感染性を残し、インビボで複製することができるが、非病原性であり、かつ低い力価のNDV子孫しか生じさせず、結果として、不顕性レベルの感染をもたらす。具体的な実施態様において、該キメラNDVゲノムは、子孫が産生され、かつ感染レベルが不顕性となるようなウイルスの感染及び複製に必要な配列を含む。NDVを弱毒化するための技法は、例えば、ゲノム内の突然変異又は置換及びNDV Vタンパク質の修飾又は欠失など、当技術分野で公知であり、これを用いて、本明細書に記載されるキメラNDVを弱毒化することができる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、ヒト細胞で複製可能である。
【０１３０】
具体的な態様において、本明細書に記載されるのは、該ウイルスに感染した細胞で発現され得る、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、キメラNDVである。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子及び突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含む、キメラNDVである。特定の実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、高融合原性である。具体的な実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、突然変異切断部位(例えば、本明細書に記載されているもの)を有する。いくつかの実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、アミノ酸突然変異L289A(すなわち、La Sota Fタンパク質のL289に対応するアミノ酸位置におけるLからAへの突然変異)を含む。いくつかの実施態様において、該キメラNDVは、アミノ酸突然変異L289A(すなわち、La Sota Fタンパク質のL289に対応するアミノ酸位置におけるLからAへの突然変異)を有する突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含む。ある実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDVとは異なる型又は株のNDVに由来するものである。他の実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDVと同じ型又は株のNDVに由来するものである。具体的な実施態様において、該L289A突然変異型Fタンパク質は、1つ、2つ、又は3つのアルギニン残基を該切断部位に保有する。いくつかの実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである。具体的な実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換わるものである。具体的な実施態様において、該突然変異型Fタンパク質はビリオンに取り込まれる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVは長潜伏期性である。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVのゲノムのFタンパク質に置き換わるものである。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVは、La Sota株である。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、突然変異NDV Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVは、La Sota株であり、ここで、該突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配���は、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVのゲノムのFタンパク質に置き換わるものであり、かつここで、該突然変異NDV Fタンパク質は、アミノ酸突然変異L289A(すなわち、La Sota Fタンパク質のL289に対応するアミノ酸位置におけるLからAへの突然変異)を有する。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、突然変異NDV Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVは、La Sota株であり、ここで、該突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVのゲノムのFタンパク質に置き換わるものであり、かつここで、該突然変異NDV Fタンパク質は、アミノ酸突然変異L289A(すなわち、La Sota Fタンパク質のL289に対応するアミノ酸位置におけるLからAへの突然変異)及びLa Sota株Fタンパク質切断部位
【化２８】
2020519641.tif 000030
を有する。
【０１３１】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるのは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVは、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Kimらの文献、2017, PLOS ONE 12(3): e0173965及びKimらの文献、2016, J. of General Virology 97: 1297-1303に開示されているNDVである。
【０１３２】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるのは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVは、配列番号50に示される配列を有するゲノムを含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、ここで、該パッケージングされたゲノムは、配列番号50のヌクレオチド配列及びIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むか又はこれらからなる。特定の実施態様において、該導入遺伝子は、2つのNDV遺伝子の転写ユニット(例えば、P及びM転写ユニット)の間に挿入されている。
【０１３３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるのは、例えば、Elankumaranらの文献、2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844によって開示されている、(i)IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子及び(ii)突然変異NDV Vタンパク質コード配列をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVである。他の実施態様において、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVは、NDV Vタンパク質コード配列を含まない。ある実施態様において、該キメラNDVのもとの骨格は、例えば、Elankumaranらの文献、2010, J. Virol. 84(8): 3835-3844によって開示されている、突然変異Vタンパク質をコードするように改変されている亜病原性又は短潜伏期性NDV株である。
【０１３４】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子及び突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、ここで、該突然変異型Fタンパク質は、NDV La Sota株又はサイトメガロウイルス(CMV)の糖タンパク質BのFタンパク質切断部位を有する。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子及び突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、ここで、該突然変異型Fタンパク質は、例えば、国際特許出願WO 2015/032755号に記載されている、以下の配列:
【化２９】
2020519641.tif 000031
のうちの1つを有するFタンパク質切断を有する。NDV Fタンパク質へと改変され得る突然変異型Fタンパク質切断部位のタイプの説明については、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる国際特許出願公開WO 2015/032755号を参照されたい。いくつかの実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に付加されたものである。具体的な実施態様において、該突然変異型Fタンパク質は、骨格NDV Fタンパク質に置き換わるものである。
【０１３５】
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVは、引用により完全に本明細書中に組み込まれる国際特許出願WO 2015/032755号に記載されている修飾された73T株である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVの骨格としての役割を果たすNDVは、引用により完全に本明細書中に組み込まれる国際特許出願WO 2015/032755号に記載されている、r73T-R116ウイルス(Fタンパク質切断部位
【化３０】
2020519641.tif 000032
を有するr73T株)である。さらなる実施態様において、該キメラNDVは、長さ60、102、144、198、又は318ヌクレオチドのHN及びL遺伝子間非コード配列を含む。
【０１３６】
具体的な実施態様において、該キメラNDVは、下の第6節に記載されるキメラNDVである。好ましい実施態様において、該キメラNDVは、下の第6節に記載されているNDV-huIL-12である。別の好ましい実施態様において、該キメラNDVは、配列番号51に示される配列を有するゲノムを含む。別の実施態様において、該キメラNDVは、配列番号52に示される配列を有するゲノムを含む。別の好ましい実施態様において、該キメラNDVは、配列番号60に示される配列を有するゲノムを含む。
【０１３７】
具体的な実施態様において、該キメラNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、該パッケージングされたゲノムは、ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該IL-12は、配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号61に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１３８】
具体的な実施態様において、該キメラNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、該パッケージングされたゲノムは、ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該IL-12は、配列番号22に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該IL-12は、シグナルペプチドを含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１３９】
具体的な実施態様において、該キメラNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、該パッケージングされたゲノムは、ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該IL-12は、配列番号43に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号63に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号68に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１４０】
具体的な実施態様において、該キメラNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、該パッケージングされたゲノムは、ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該IL-12は、配列番号42に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該IL-12は、シグナルペプチドを含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号53に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号66に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１４１】
具体的な実施態様において、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVは、本明細書に記載されるアッセイ(例えば、下の第6節に記載されているアッセイ)において、IL-12p70、IFN-γ、又はIL-12p70とIFN-γの両方の発現を誘導する。別の具体的な実施態様において、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVによる腫瘍試料の処理は、該キメラNDVによる処置の前の腫瘍試料のGEPスコアと比べて、遺伝子発現プロファイル(GEP)の増大をもたらす。GEPスコアに関しては、例えば、下の実施例6.3を参照されたい。別の具体的な実施態様において、IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVによる、例えば、下の第6節に記載されている、腫瘍試料の処理は、該キメラNDVによる処理の前の腫瘍試料のGEPスコアと比べて、該腫瘍試料のGEPスコアを増大させる。一実施態様において、対象の腫瘍試料は、-0.318よりも小さい表15の18遺伝子シグナチャーの遺伝子発現プロファイル(GEP)スコアを有する。別の実施態様において、対象の腫瘍試料は、-0.318よりも大きい表15の18遺伝子シグナチャーの遺伝子発現プロファイル(GEP)スコアを有する。任意の理論に束縛されるものではないが、GEPスコアの増大によって、結果的に、腫瘍が抗PD-1抗体(例えば、抗PD-1遮断抗体)、例えば、ペンブロリズマブによる処理に応答する可能性がより高くなると考えられる。したがって、具体的な実施態様において、抗PD-1抗体(例えば、抗PD-1遮断抗体、例えば、ペンブロリズマブ又は第5.5節に記載されている別の抗体)による処理に不応性、再発性、又は不応答性の癌を有する患者へのIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVの投与によって、結果的に、該患者が抗PD-1抗体(例えば、抗PD-1遮断抗体、例えば、ペンブロリズマブ又は第5.5節に記載されている別の抗体)による処理に応答性になり得る。特に、ペンブロリズマブ(KEYTRUDA(登録商標)、Merck & Co社、Kenilworth, NJ)による処理に不応性、再発性、又は不応答性の癌を有する患者へのIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVの投与によって、結果的に、該患者がペンブロリズマブによる処理に応答性になり得る。それゆえ、一実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を有する対象における抗PD-1療法に対する応答を増大させる方法である。
【０１４２】
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、(i)IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子及び(ii)異種インターフェロンアンタゴニストをコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVである。異種インターフェロンアンタゴニストを発現するように改変されたキメラNDVの例については、例えば、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第2012-0058141号を参照されたい。
【０１４３】
インターフェロンアンタゴニストは、例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる:米国特許第6,635,416号;第7,060,430号;及び第7,442,527号に記載されている技法を含む、当業者に公知の任意の技法を用いて同定することができる。具体的な実施態様において、該異種インターフェロンアンタゴニストは、ウイルスタンパク質である。そのようなウイルスタンパク質を任意のウイルスから入手し又は任意のウイルスから得ることができ、該ウイルスは、任意の種に感染することができる(例えば、該ウイルスは、ヒト又は非ヒト哺乳動物に感染することができる)。例示的な異種インターフェロンアンタゴニストとしては、限定するものではないが、ニパウイルスWタンパク質、ニパVタンパク質、エボラウイルスVP35タンパク質、ワクシニアウイルスE3Lタンパク質、インフルエンザウイルスNS1タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス(RSV) NS2タンパク質、1型単純ヘルペスウイルス(HSV) ICP34.5タンパク質、C型肝炎ウイルスNS3-4プロテアーゼ、自然免疫の誘導又は自然免疫に対する応答を遮断するドミナントネガティブ型細胞タンパク質(例えば、STAT1、MyD88、IKK、及びTBK)、並びに自然免疫応答の細胞性調節因子(例えば、SOCSタンパク質、PIASタンパク質、CYLDタンパク質、IkBタンパク質、Atg5タンパク質、Pin1タンパク質、IRAK-Mタンパク質、及びUBP43)が挙げられる。異種インターフェロンアンタゴニストに関するさらなる情報については、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第2012-0058141号を参照されたい。
【０１４４】
限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異を誘発させたウイルス、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む、任意のNDV型又は株は、IL-12(例えば、ヒトIL-12)、及びある実施態様においては、異種インターフェロンアンタゴニスト及び/又は突然変異型Fタンパク質をコードするように改変されているパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVの骨格としての役割を果たすことができる。具体的な実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、第5.1節に記載されているNDVである。具体的な実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、天然株である。ある実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、溶解性株である。他の実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、非溶解性株である。ある実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、長潜伏期性株である。いくつかの実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、亜病原性株である。他の実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、短潜伏期性株である。NDV株の具体的な例としては、NDV株の具体的な例としては、73-T株、NDV HUJ株、Ulster株(see、例えば、GenBank番号U25837)、MTH-68株、Italien株(例えば、GenBank番号EU293914を参照)、Hickman株(例えば、GenBank番号AF309418を参照)、PV701株、Hitchner B1株(例えば、GenBank番号AF309418又はNC_002617を参照)、La Sota株(例えば、GenBank番号AY845400及びJF950510.1並びにGI番号56799463を参照)、YG97株(例えば、GenBank番号AY351959又はAY390310を参照)、MET95株(例えば、GenBank番号AY143159を参照)、Roakin株(例えば、GenBank番号AF124443を参照)、並びにF48E9株(例えば、GenBank番号AF163440及びU25837を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、Hitchner B1株である。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、Genbank番号AF309418又はNC_002617によって特定されるB1株である。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVの遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、ATCC番号VR2239によって特定されるNDVである。別の具体的な実施態様において、遺伝子改変の骨格としての役割を果たすNDVは、La Sota株である。
【０１４５】
ある実施態様において、キメラNDVが、少なくとも一部感染性を残し、インビボで複製することができるが、低い力価しか生じさせず、結果として、非病原性の無症候性レベルの感染をもたらすような、キメラNDVの弱毒化、又はさらなる弱毒化が望ましい(例えば、Khattarらの文献、2009, J. Virol. 83:7779-7782を参照されたい)。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、Vタンパク質の欠失によって弱毒化される。そのような弱毒化NDVは、該ウイルスが、免疫原、例えば、生ワクチンとして作用するために対象に投与される実施態様に特に適する場合がある。該ウイルスは、当技術分野で公知の任意の方法によって弱毒化することができる。
【０１４６】
IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVの具体的な実施態様において、該パッケージングされたゲノムは、例えば、免疫細胞の抑制性受容体のアンタゴニスト、免疫細胞の共刺激性受容体のアゴニスト、さらなるサイトカイン、腫瘍抗原、アポトーシス促進分子、抗アポトーシス分子、自殺遺伝子、又は異種インターフェロンアンタゴニストなどの1以上の他の導入遺伝子も含む。免疫細胞の抑制性受容体の非限定的な例は、第5.7.6.1節に提供されている。免疫細胞の共刺激受容体の非限定的な例は、第5.7.6.1節に提供されている。サイトカインの非限定的な例としては、IL-2(例えば、Genbankアクセッション番号NM_000586.3及びGI番号125661059)、IL-7(例えば、Genbankアクセッション番号NM_000880.3、NM_001199886.1、NM_001199887.1、及びNM_001199888.1並びにGI番号315467865、315467866、315467868、及び315467870)、IL-9(例えば、Genbankアクセッション番号NM_000590.1及びGI番号10834979)、IL-15(例えば、Genbankアクセッション番号NM_172175.2及びNM_000585.4並びにGI番号323098328及び323098327)、IL-17(例えば、Genbankアクセッション番号NM_002190.2及びGI番号27477085)、IL-21(例えば、Genbankアクセッション番号NM_021803.3及びNM_001207006.2並びにGI番号365733583及び365733582)、IL-22(例えば、Genbankアクセッション番号NM_020525.4及びGI番号41393566)、IFN-γ(例えば、Genbankアクセッション番号NM_000619.2及びGI番号56786137)、GM-CSF(例えば、Genbankアクセッション番号M11220_1及びGI番号183363)、並びにTNF-α(例えば、Genbankアクセッション番号NM_000594.3)が挙げられる。腫瘍抗原の具体的な例としては、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、p-15、gp100、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、チロシナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ4、β-カテニン、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、ヒトパピローマウイルス-E6、ヒトパピローマウイルスE7、CD20、癌胎児性抗原(CEA)、上皮成長因子受容体、MUC-1、カスパーゼ-8、CD5、ムチン-1、ルイスx、CA-125、p185HER2、IL-2R、Fap-α、テネイシン、メタロプロテイナーゼと関連する抗原、及びCAMPATH-1が挙げられる。腫瘍抗原の他の例としては、KS 1/4汎癌抗原、卵巣癌抗原(CA125)、前立腺酸性ホスフェート、前立腺特異的抗原、メラノーマ関連抗原p97、メラノーマ抗原gp75、高分子量メラノーマ抗原(HMW-MAA)、前立腺特異的膜抗原、CEA、多型性上皮ムチン抗原、乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原(例えば: CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1、及びLEA)、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19、Bリンパ腫抗原−CD20、CD33、メラノーマ特異的抗原(例えば、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドGM3)、腫瘍特異的移植型の細胞表面抗原(TSTA)(例えば、DNA腫瘍ウイルスのT抗原及びRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘導性腫瘍抗原)、癌胎児抗原-α-フェトタンパク質、例えば、結腸のCEA、膀胱腫瘍癌胎児抗原、分化抗原(例えば、ヒト肺癌抗原L6及びL20)、線維肉腫の抗原、白血病T細胞抗原-Gp37、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳癌抗原(例えば、EGFR(上皮成長因子受容体)、HER2抗原(p185HER2)及びHER2 neuエピトープ)、多型性上皮ムチン(PEM)、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1、分化抗原(例えば、胎児赤血球、初期内胚葉に見られるI抗原、成体赤血球、着床前胚に見られるI抗原、胃腺癌に見られるI(Ma)、M18、乳房上皮に見られるM39��骨髄細胞に見られるSSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸癌に見られるD156-22、TRA-1-85(血液型H)、結腸腺癌に見られるC14、肺腺癌に見られるF3、胃癌に見られるAH6、Yハプテン、胎生期癌細胞に見られるLey、TL5(血液型A)、A431細胞に見られるEGF受容体、膵癌に見られるE1系列(血液型B)、胎生期癌細胞に見られるFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌に見られるCO-514(血液型Lea)、腺癌に見られるNS-10、CO-43(血液型Leb)、A431細胞のEGF受容体に見られるG49、結腸腺癌に見られるMH2(血液型ALeb/Ley)、結腸癌に見られる19.9、胃癌ムチン、骨髄細胞に見られるT5A7、メラノーマに見られるR24、胎生期癌細胞に見られる4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、及びM1:22:25:8、並びに4〜8細胞期胚に見られるSSEA-3及びSSEA-4)、皮膚T細胞リンパ腫のT細胞受容体由来ペプチド、C反応性タンパク質(CRP)、癌抗原-50(CA-50)、乳癌と関連する癌抗原15-3(CA15-3)、消化器癌と関連する癌抗原-19(CA-19)及び癌抗原-242、癌関連抗原(CAA)、クロモグラニンA、上皮ムチン抗原(MC5)、ヒト上皮特異的抗原(E1A)、ルイス(a)抗原、メラノーマ抗原、メラノーマ関連抗原100、25、及び150、ムチン様癌関連抗原、多剤耐性関連タンパク質(MRPm6)、多剤耐性関連タンパク質(MRP41)、Neu癌遺伝子タンパク質(C-erbB-2)、神経特異的エノラーゼ(NSE)、P-糖タンパク質(mdr1遺伝子産物)、多剤耐性関連抗原、p170、多剤耐性関連抗原、前立腺特異的抗原(PSA)、CD56、並びにNCAMが挙げられるが、これらに限定されない。アポトーシス促進分子の非限定的な例としては、Bax、Bak、Bad、BID、Bcl-xS、Bim、Noxa、Puma、AIF、FasL、及びTRAILが挙げられる。抗アポトーシス分子の非限定的な例としては、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、及びXIAPが挙げられる。自殺遺伝子の非限定的な例としては、チミジンキナーゼが挙げられる。
【０１４７】
ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子、並びに以下の導入遺伝子:(1)免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト;(2)免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニスト;(3)サイトカイン;(4)腫瘍抗原;(5)異種インターフェロンアンタゴニスト;(6)アポトーシス促進分子;(7)抗アポトーシス分子;及び/又は(8)自殺遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、もしくはそれより多く、又は全てを含むパッケージングされたゲノムを含む。さらに、該パッケージングされたゲノムは、突然変異型Fタンパク質(例えば、本明細書に記載されている突然変異型Fタンパク質など)をコードするヌクレオチド配列を含み得る。具体的な実施態様において、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノム、並びにある実施態様において、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び/又は異種インターフェロンアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムに加えて、キメラNDVのパッケージングされたゲノムは、自殺遺伝子(例えば、チミジンキナーゼ)又はNDVの複製もしくは機能を阻害する別の分子(NDVを抗生物質もしくは抗ウイルス剤に対して感受性にする遺伝子)をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノム、並びにある実施態様において、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び/又は異種インターフェロンアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムに加えて、キメラNDVのパッケージングされたゲノムは、組織特異的マイクロRNA(miRNA)標的部位(例えば、miR-21、miR-184、miR-133a/133b、miR-137、及び/又はmiR-193aマイクロRNAによって標的とされる部位)をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、該パッケージングされたゲノムは、miRNA標的部位をコードするヌクレオチド配列を含まない。
【０１４８】
ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該パッケージングされたゲノムは、異種インターフェロンアンタゴニストをコードしない。
【０１４９】
ある実施態様において、キメラNDVの指向性が改変される。具体的な実施態様において、該ウイルスの指向性は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)及びウロキナーゼなどの組織特異的又は腫瘍特異的プロテアーゼによって認識されるようにFタンパク質切断部位の修飾によって改変される。他の実施態様において、該ウイルスの指向性は、組織特異的miRNA標的部位の導入によって改変される。ある実施態様において、NDV HNタンパク質は、腫瘍特異的受容体を認識するように突然変異させられる。
【０１５０】
ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVは、IL-12又はその中の誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノムは、さらなる導入遺伝子を含まない。ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノムは、異種インターフェロンアンタゴニストをコードする導入遺伝子を含まない。ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノムは、以下のもの:(1)IL-12以外の1以上のサイトカインをコードする導入遺伝子;(2)1以上の腫瘍抗原をコードする導入遺伝子;(3)1以上の抗アポトーシス分子をコードする導入遺伝子;(4)自殺遺伝子をコードする導入遺伝子;(5)免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストをコードする導入遺伝子;(6)免疫細胞の抑制シグナルの1以上のアンタゴニストをコードする導入遺伝子;又は(7)1以上の抗アポトーシス分子をコードする導入遺伝子のうちの1つ、2つ、3つ、もしくはそれより多く、又は全てをコードする導入遺伝子を含まない。
【０１５１】
ある実施態様において、該キメラNDVのゲノムは、IL-12又はその誘導体(例えば、ヒトIL-12)以外の異種タンパク質をコードする異種配列を含まない。ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、ここで、該ゲノムは、NDVに見られる遺伝子及びIL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、ここで、該ゲノムは、NDVに見られる遺伝子及びIL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むが、任意の他の導入遺伝子を含まない。
【０１５２】
特定の実施態様において、該キメラNDVのゲノムは、IL-12又はその誘導体及び突然変異NDV Fタンパク質以外の異種タンパク質をコードする異種配列を含まず、ここで、該突然変異NDV Fタンパク質は、天然のNDV Fタンパク質に置き換わるものである。ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、ここで、該ゲノムは:(1)NDV Fタンパク質以外のNDVに見られる遺伝子;(2)IL-12又はその誘導体(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子、及び(3)NDV Fタンパク質に置き換わる、例えば、本明細書に記載される、突然変異NDV Fタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、ここで、該ゲノムは、(1)NDV Fタンパク質以外のNDVに見られる遺伝子;(2)IL-12又はその誘導体(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子、及び(3)NDV Fタンパク質に置き換わるが、他の任意の導入遺伝子を含まない、例えば、本明細書に記載される、突然変異NDV Fタンパク質を含む。
【０１５３】
ある実施態様において、以下のもの:(1)IL-12又はその誘導体;(2)異種インターフェロンアンタゴニスト;及び/又は(3)突然変異型Fタンパク質のうちの1つ又は複数は、キメラタンパク又は融合タンパク質として細胞内でキメラNDVによって発現される。具体的な実施態様において、IL-12又はその誘導体は、キメラタンパク又は融合タンパク質として、細胞内でキメラNDVによって発現される。具体的な実施態様において、突然変異型Fタンパク質は、キメラタンパク又は融合タンパク質としてキメラNDVによって発現される。具体的な実施態様において、該キメラタンパク質又は融合タンパク質は、NDV F又はNDV HNタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメイン又はその断片、並びに前の文に言及された分子のうちの1つを含む細胞外ドメインを含む。そのようなキメラタンパク質又は融合タンパク質の説明に関する米国特許出願第2012-0122185号と、国際出願公開WO 2007/064802号とを参照されたく、これらは各々、引用により本明細書中に組み込まれる。
【０１５４】
本明細書中の実施態様において、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子は、骨格NDVのゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入することができる。具体的な実施態様において、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子は、骨格NDVのゲノムのM転写ユニットとP転写ユニットの間又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間に挿入される。本明細書中の他の実施態様によれば、本明細書に記載される1以上の他の導入遺伝子又はヌクレオチド配列、例えば、異種インターフェロンアンタゴニスト及び/又は突然変異型Fタンパク質をコードするものは、骨格NDVのゲノムの2以上の転写ユニットの間(例えば、M転写ユニットとP転写ユニットの間又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に挿入することができる。
【０１５５】
いくつかの実施態様において、該キメラNDVは、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許出願公開第2014/0271677 A1号もしくは第2016/0015760 A1号、又は国際特許出願公開WO 2014/158811号の第5.2節に記載されているNDVである。
【０１５６】
(5.2.1  IL-12)
一態様において、本明細書に提供されるのは、パッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであり、ここで、該パッケージングされたゲノムは、IL-12又はその誘導体(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含む。該キメラNDVを単独で又は1以上の他の療法、例えば、PD-1もしくはそのリガンドのアンタゴニストと組み合わせて用いて、癌を治療することができる。
【０１５７】
別の態様において、本明細書に提示されるのは、キメラNDV又は該キメラNDVを含む組成物をPD-1もしくはそのリガンドのアンタゴニスト又はそのようなアンタゴニストを含む組成物と組み合わせて利用して癌を治療する方法であって、該キメラNDVがインターロイキン-12(「IL-12」)(例えば、IL-12のp35及びp40サブユニット)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、IL-12 p35サブユニット又はその誘導体をコードする第一の導入遺伝子及びIL-12 p40サブユニット又はその誘導体をコードする第二の導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。具体的な実施態様において、該アンタゴニストは、PD-1遮断抗体(例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ)である。いくつかの実施態様において、該アンタゴニストは、PD-L1遮断抗体(例えば、アベルマブ)である。
【０１５８】
別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDV又は該キメラNDVを含む組成物であり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、IL-12のp35及びp40サブユニット)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該方法は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト又はそのようなアンタゴニストを含む組成物を投与することをさらに含む。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。具体的な実施態様において、該アンタゴニストは、PD-1遮断抗体(例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ)である。いくつかの実施態様において、該アンタゴニストは、PD-L1遮断抗体(例えば、アベルマブ)である。
【０１５９】
本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノム中の導入遺伝子によってコードされるIL-12又はその誘導体は、当業者に公知の任意のIL-12であり得る。ある実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、又はウシIL-12又はその誘導体である。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、ヒトIL-12又はその誘導体である。典型的なIL-12は、当業者に公知の、IL-12A(p35サブユニット)及びIL-12B(p40サブユニット)という2つの別々の遺伝子によってコードされるヘテロ二量体からなる。GenBank(商標)アクセッション番号NM_000882.3(GI番号325974478)は、例示的なヒトIL-12A核酸配列を提供している。GenBank(商標)アクセッション番号NM_002187.2(GI番号24497437)は、例示的なヒトIL-12B核酸配列を提供している。GenBank(商標)アクセッション番号NP_000873.2(GI番号24430219)は、例示的なヒトIL-12A(p35サブユニット)アミノ酸配列を提供している。GenBank(商標)アクセッション番号NP_002178.2(GI番号24497438)は、例示的なヒトIL-12B(p40サブユニット)アミノ酸配列を提供している。ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノムによってコードされるIL-12又はその誘導体は、任意にリンカー配列によって隔てられた、IL-12 p35サブユニット(「IL-12A」とも呼ばれる)又はその誘導体及びIL-12 p40サブユニット(「IL-12B」とも呼ばれる)又はその誘導体を含む、単一のポリペプチド鎖からなる。ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノムによってコードされるIL-12又はその誘導体は、2つのポリペプチド鎖:(i)IL-12 p35サブユニット又はその誘導体を含む第一のポリペプチド、及び(ii)IL-12 p40サブユニット又はその誘導体を含む第二のポリペプチドからなる。ある実施態様において、該IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子は、IL-12 p35サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びIL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該IL-12 p35サブユニットをコードするヌクレオチド配列及び該IL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、内部リボソーム侵入部位によって隔てられている。配列番号29、55、及び65は、IL-12 p35サブユニットをコードする例示的なヌクレオチド配列を提供する。配列番号27、54、57、59、及び64は、例示的なIL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列を提供する。具体的な実施態様において、IL-12は、それぞれ、配列番号41及び38に示されるp35及びp40サブユニット配列を含む。別の具体的な実施態様において、IL-12は、配列番号25及び38に示されるp35及びp40サブユニット配列を含む。好ましい実施態様において、IL-12は、第6節に提供されるp35及びp40サブユニット配列、例えば、それぞれ、配列番号25及び23又はそれぞれ、配列番号41及び40を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノムによってコードされるIL-12は、配列番号43に示されるアミノ酸配列を含む単一のポリペプチド鎖からなる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノムによってコードされるIL-12は、配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む単一のポリペプチド鎖からなる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージ���グされたゲノムによってコードされるIL-12は、配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む単一のポリペプチド鎖からなる。好ましい実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノムによってコードされるIL-12は、第6節に提供されるアミノ酸配列、例えば、配列番号22を含む単一のポリペプチド鎖からなる。具体的な実施態様において、該導入遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号26、53、61、63、66、又は68に示されている通りである。具体的な実施態様において、該導入遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号26、53、61、63、66、又は68に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニット及びIL-12 p40サブユニット又はこれらの誘導体は、互いに直接的に融合している。具体的な実施態様において、互いに直接的に融合しているIL-12 p35サブユニット及びIL-12 p40サブユニット又はこれらの誘導体を含むポリペプチドは、機能的である(例えば、IL-12受容体に特異的に結合し、かつIL-12媒介性シグナル伝達及び/又はIL-12媒介性免疫機能を誘導することができる)。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニット及びIL-12 p40サブユニット又はこれらの誘導体は、1以上のリンカーを用いて互いに間接的に融合している。IL-12 p35サブユニット/p40サブユニット融合タンパク質を調製するのに好適なリンカーは、1以上のアミノ酸(例えば、ペプチド)を含み得る。具体的な実施態様において、アミノ酸リンカー(例えば、ペプチドリンカー)を用いて互いに間接的に融合しているIL-12 p35サブユニット及びIL-12 p40サブユニット又はこれらの誘導体を含むポリペプチドは、機能的である(例えば、IL-12受容体に特異的に結合し、かつIL-12媒介性シグナル伝達及び/又はIL-12媒介性免疫機能を誘導することができる)。具体的な実施態様において、該リンカーは、該IL-12 p35サブユニット及びIL-12 p40サブユニット又はこれらの誘導体が、IL-12受容体に結合し、かつIL-12媒介性シグナル伝達を誘導することができる機能的なIL-12ヘテロ二量体複合体を形成する能力を保持するのに十分長い。いくつかの実施態様において、該リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長である長さのアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、該リンカーは、長さが5〜20又は5〜15アミノ酸であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノム中の導入遺伝子によってコードされるIL-12又はその誘導体は、4つ1組で会合している複数のポリペプチド鎖、例えば、IL-12 p40サブユニット又はその誘導体を含むポリペプチド鎖と4つ1組で会合しているIL-12 p35サブユニット又はその誘導体を含むポリペプチド鎖からなる。ある実施態様において、該リンカーは、配列番号24に示されるアミノ酸配列である。ある実施態様において、該リンカーは、配列番号46に示されるアミノ酸配列である。ある実施態様において、該リンカーは、配列番号47に示されるアミノ酸配列である。ある実施態様において、該リンカーは、配列番号48に示されるアミノ酸配列である。ある実施態様において、該リンカーは、配列番号49に示されるアミノ酸配列である。ある実施態様において、該リンカーは、エラスチン様ポリペプチド配列である。ある実施態様において、該エラスチン様ポリペプチド配列は、アミノ酸配列
【化３１】
2020519641.tif 000033
を含み、ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸である。ある実施態様において、該エラスチン様ポリペプチド配列は、アミノ酸配列
【化３２】
2020519641.tif 000034
を含み、ここで、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸である。ある実施態様において、該リンカーは、引用により完全に本明細書中に組み込まれる米国特許第5,891,680号に記載されているリンカーであってもよい。
【０１６０】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノム中の導入遺伝子によってコードされるIL-12は、表7に示される配列のアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノム中の導入遺伝子によってコードされるIL-12は、表7に示されるアミノ酸配列からなる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノム中のIL-12をコードする導入遺伝子は、表8に示される配列のヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノム中のIL-12をコードする導入遺伝子は、表8に示される配列のヌクレオチド配列からなる。
【０１６１】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノム中のIL-12の誘導体をコードする導入遺伝子は、当業者に公知の任意のIL-12の誘導体である。具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、当業者に公知のIL-12と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％、又は99％のアミノ酸配列同一性を有する。具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、欠失形態の既知のIL-12を含み、ここで、最大約20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基が既知のIL-12から欠失している。また本明細書に提供されるのは、欠失形態の既知のIL-12を含むIL-12誘導体であり、ここで、約1〜3、3〜5、5〜7、7〜10、10〜15、又は15〜20個のアミノ酸残基が既知のIL-12から欠失している。さらに本明細書に提供されるのは、改変形態の既知のIL-12を含むIL-12誘導体であり、ここで、該既知のIL-12の最大約20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個のアミノ酸残基は、他のアミノ酸と置換されている(例えば、保存的に置換されている)。いくつかの実施態様において、該IL-12誘導体は、最大約20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個の保存的に置換されたアミノ酸を含む(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Huangらの文献、2016、前臨床バリデーション: AMLの免疫療法のための患者白血病細胞のLV/IL-12形質導入(Preclinical validation:LV/IL-12 transduction of patient leukemia cells for immunotherapy of AML)、Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, 3, 16074; doi:10.1038/mtm.2016.74を参照)。いくつかの実施態様において、保存的に置換されたアミノ酸は、サイトカイン/受容体界面にあるものと予測されない(see、例えば、Huangらの文献、2016、前臨床バリデーション: AMLの免疫療法のための患者白血病細胞のLV/IL-12形質導入(Preclinical validation:LV/IL-12 transduction of patient leukemia cells for immunotherapy of AML)、Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, 3, 16074; doi:10.1038/mtm.2016.74; Jones及びVignaliの文献、2011、IL-6/IL-12サイトカイン/受容体スーパーファミリーにおける分子相互作用(Molecular Interactions within the IL-6/IL-12 cytokine/receptor superfamily)、Immunol Res., 51(1):5-14, doi:10.1007/s12026-011-8209-yを参照されたく;これらは各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる)。いくつかの実施態様において、該IL-12誘導体は、アミノ酸置換L165Sを有するIL-12 p35サブユニットを含む(すなわち、該IL-12誘導体中のIL-12 p35サブユニットの位置165のロイシンは、セリンと置換されている)。いくつかの実施態様において、該IL-12誘導体は、C2Gというアミノ酸置換を有するIL-12 p40サブユニットを含む(すなわち、該IL-12誘導体中の未成熟なIL-12 p40サブユニット(すなわち、シグナルペプチドを含有するIL-12 p40サブユニット)の位置2のシステインは、グリシンと置換されている)。
【０１６２】
具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、天然IL-12と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％同一であるか、又は80％〜85％、80％〜90％、80％〜95％、90％〜95％、85％〜99％、もしくは95％〜99％同一(例えば、配列同一性)である。別の具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、天然IL-12をコードする核酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％同一であるか、又は80％〜85％、80％〜90％、80％〜95％、90％〜95％、85％〜99％、もしくは95％〜99％同一(例えば、配列同一性)である核酸配列によってコードされるポリペプチドである。具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、天然IL-12 p35サブユニットと少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％同一であるか、又は80％〜85％、80％〜90％、80％〜95％、90％〜95％、85％〜99％、もしくは95％〜99％同一である(例えば、配列同一性)であるIL-12 p35サブユニットを含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、核酸配列によってコードされるポリペプチドであり、ここで、核酸配列の部分は、IL-12 p35サブユニットをコードし、ここで、該部分の該核酸配列は、天然IL-12 p35サブユニットをコードする核酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％同一であるか、又は80％〜85％、80％〜90％、80％〜95％、90％〜95％、85％〜99％、もしくは95％〜99％同一(例えば、配列同一性)である。具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、天然IL-12 p40サブユニットと少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％同一であるか、又は80％〜85％、80％〜90％、80％〜95％、90％〜95％、85％〜99％、もしくは95％〜99％同一(例えば、配列同一性)であるIL-12 p40サブユニットを含む。別の具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、核酸配列によってコードされるポリペプチドであり、ここで、核酸配列の部分は、IL-12 p40サブユニットをコードし、ここで、該部分の該核酸配列は、天然IL-12 p40サブユニットをコードする核酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％同一であるか、又は80％〜85％、80％〜90％、80％〜95％、90％〜95％、85％〜99％、もしくは95％〜99％同一(例えば、配列同一性)である。別の具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、天然IL-12と比べて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、もしくはそれより多く、又は2〜5、2〜10、5〜10、5〜15、5〜20、10〜15、もしくは15〜20個のアミノ酸突然変異(すなわち、付加、欠失、及び/又は置換)を含有する。別の具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、高い、中程度の、又は典型的なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、天然IL-12をコードする核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされるポリペプチドである。別の具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、高い、中程度の、又は典型的なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも10個の連続するアミノ酸、少なくとも12個の連続するアミノ酸、少なくとも15個の連続するアミノ酸、少なくとも20個の連続するアミノ酸、少なくとも30個の連続するアミノ酸、少なくとも40個の連続するアミノ酸、少なくとも50個の連続するアミノ酸、少なくとも75個の連続するアミノ酸、少なくとも100個の連続するアミノ酸、���なくとも125個の連続するアミノ酸、少なくとも150個の連続するアミノ酸、又は10〜20個、20〜50個、25〜75個、25〜100個、25〜150個、50〜75個、50〜100個、75〜100個、50〜150個、75〜150個、100〜150個、もしくは100〜200個の連続するアミノ酸の天然IL-12をコードする核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされるポリペプチドである。別の具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、天然IL-12の断片である。別の具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、天然サブユニット(例えば、天然p40サブユニット又は天然p35サブユニット)をコードするヌクレオチドにその全長にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるサブユニット(例えば、p35又はp40)を含む。具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、天然IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットの誘導体を含む。具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、天然IL-12 p35サブユニット及びIL-12 p40サブユニットの誘導体を含む。IL-12誘導体には、天然の成熟形態のIL-12のアミノ酸配列及び異種のシグナルペプチドアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。さらに、IL-12誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質部分への結合などによって化学的に修飾されているポリペプチドが含まれる。さらに、IL-12誘導体には、1以上の非古典的アミノ酸を含むポリペプチドが含まれる。具体的な実施態様において、該IL-12誘導体は、それが由来した天然IL-12の機能のうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを保持する。IL-12誘導体がそれが由来した天然IL-12の1以上の機能を保持するかどうかを決定するための試験は当業者に公知であり、例が本明細書に提供されている。
【０１６３】
具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体をコードする本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノム中の導入遺伝子は、コドン最適化されている。具体的な実施態様において、天然IL-12の一方又は両方のサブユニットをコードするヌクレオチド配列がコドン最適化されていてもよい。IL-12 p35又はその誘導体をコードするコドン最適化された配列の非限定的な例としては、配列番号55が挙げられる。IL-12 p40又はその誘導体をコードするコドン最適化された配列の非限定的な例としては、配列番号54及び59が挙げられる。コドン最適化の方法は、当技術分野で公知であり、例えば、OptimumGene(商標)(GenScript(登録商標))プロトコル及び引用により完全に本明細書中に組み込まれる米国特許第8,326,547号がある。
【０１６４】
(5.3  NDVの構築)
本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び第6節を参照)は、リバースジェネティックス技法を用いて作製することができる。リバースジェネティックス技法は、ウイルスポリメラーゼによる認識及び成熟ビリオンを生成させるのに必要なシグナルのパッケージングに不可欠なマイナス鎖のウイルスRNAの非コード領域を含む合成組換えウイルスRNAの調製を伴う。該組換えRNAは、組換えDNA鋳型から合成され、精製ウイルスポリメラーゼ複合体とともにインビトロで再構築されて、細胞にトランスフェクトするのに使用することができる組換えリボヌクレオタンパク質(RNP)を形成する。より効率的なトランスフェクションは、ウイルスポリメラーゼタンパク質がインビトロ又はインビボのどちらかにおける合成RNAの転写中に存在する場合に達成される。合成組換えRNPは、感染性ウイルス粒子中にレスキューすることができる。前述の技法は、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、1992年11月24日に発行された米国特許第5,166,057号; 1998年12月29日に発行された米国特許第5,854,037号; 2000年11月14日に発行された米国特許第6,146,642号; 1996年2月20日に公開された欧州特許公開EP 0702085A1号;米国特許出願第09/152,845号; 1997年4月3日に公開された国際特許公開PCT WO97/12032号; 1996年11月7日に公開されたWO96/34625号;欧州特許公開EP A780475号; 1999年1月21日に公開されたWO 99/02657号; 1998年11月26日に公開されたWO 98/53078号; 1998年1月22日に公開されたWO 98/02530号; 1999年4月1日に公開されたWO 99/15672号; 1998年4月2日に公開されたWO 98/13501号; 1997年2月20日に公開されたWO 97/06270号;及び1997年6月25日に公開されたEPO 780 475A1号に記載されている。
【０１６５】
ヘルパーフリープラスミド技術を用いて、本明細書に記載されるNDVを改変することもできる。簡潔に述べると、NDV(例えば、Hitchner B1株)の完全なcDNAを構築し、プラスミドベクターに挿入し、2つの転写ユニット(例えば、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子;又はNDV HN遺伝子とNDV L遺伝子)の間にユニークな制限部位を含むように改変することができる。異種アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列(例えば、IL-12導入遺伝子又は例えば、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/もしくは抑制シグナルのアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列などの他の配列)を該ユニークな制限部位でウイルスゲノムに挿入することができる。或いは、挿入がウイルスの感染及び複製能力に影響を及ぼさない限り、異種アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列(例えば、IL-12導入遺伝子又は例えば、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/もしくは抑制シグナルのアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列などの他の配列)を改変して、NDV転写ユニット中に挿入することができる。単一のセグメントをT7プロモーターとδ型肝炎ウイルスリボザイムの間に位置付けて、T7ポリメラーゼから正確なマイナス又はプラスの転写物を生成させる。必要なウイルスタンパク質を含むプラスミドベクター及び発現ベクターを細胞にトランスフェクトして、組換えウイルス粒子の産生をもたらす(例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 01/04333号;米国特許第7,442,379号、第6,146,642号、第6,649,372号、第6,544,785号、及び第7,384,774号; Swayneらの文献(2003). Avian Dis. 47:1047-1050;並びにSwayneらの文献(2001). J. Virol. 11868-11873を参照)。
【０１６６】
抗体を発現するキメラNDVの産生技法は、当技術分野で公知である。2つの導入遺伝子から完全IgGを発現する組換えNDVの作製については、例えば、Puhlerらの文献、Gene Ther. 15(5): 371-283(2008)を参照されたい。
【０１６７】
単一のmRNAから多数のタンパク質を産生する二シストロン性技法は当業者に公知である。二シストロン性技法は、IRES配列の使用により、多数のタンパク質のコード配列を単一のmRNAに改変することを可能にする。IRES配列は、RNA分子へのリボソームの内部動員を誘導し、キャップ非依存的な様式での下流の翻訳を可能にする。簡潔に述べると、あるタンパク質のコード領域を第二のタンパク質のORFの下流に挿入する。挿入の両隣に、IRESと適切な発現及び/又は機能に必要な任意の非翻訳シグナル配列とを配置する。挿入は、第二のタンパク質のオープンリーディングフレームも、ポリアデニル化も、転写プロモーターも破壊してはいけない(例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Garcia-Sastreらの文献、1994, J. Virol. 68:6254-6261及びGarcia-Sastreらの文献、1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246を参照されたい)。
【０１６８】
導入遺伝子をコードし、該導入遺伝子によってコードされる異種タンパク質(例えば、IL-12)を発現するキメラNDVをクローニングする方法は、当業者に公知であり、例えば、NDVゲノムへと改変されている制限部位への導入遺伝子の挿入、NDV RNA依存性RNAポリメラーゼによる認識のための導入遺伝子への適切なシグナル(例えば、NDVポリメラーゼが前の遺伝子の末端及び導入遺伝子の先頭を認識するのを可能にする導入遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある配列、これは、例えば、単一ヌクレオチド遺伝子間配列によって間隔が空けられていてもよい)の包含、有効なKozak配列の包含(例えば、真核生物リボソーム翻訳を向上させるためのもの); NDVクローニングについての「6のルール」を満たす導入遺伝子の組み入れ;並びに導入遺伝子内の外来遺伝子末端及び/又は遺伝子開始配列を除去するためのサイレント突然変異の包含などがある。6のルールに関して、当業者は、NDV(及びより一般的には、パラミクソウイルス科ファミリーのほとんどのメンバー)の効率的な複製が、「6のルール」として知られる、6の倍数であるゲノム長に依存的であることを理解するであろう(例えば、Calain, P.及びRoux, L.の文献、6のルール、センダイウイルス欠損干渉RNAの効率的な複製の基本的特徴(The rule of six, a basic feature of efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.)、J. Virol. 67, 4822-4830(1993))。したがって、本明細書に記載されるキメラNDVを構築する場合、NDVクローニングについての「6のルール」を満たすように注意を払うべきである。NDVクローニングについての6のルールを満たす当業者に公知の方法を使用することができ、これには、例えば、導入遺伝子の下流のヌクレオチドの付加などがある。NDV(例えば、キメラNDV)のクローニング及びレスキューの方法の考察については、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、例えば、Ayllonらの文献、cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー(Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA.)、J. Vis. Exp.(80), e50830, doi:10.3791/50830(2013)を参照されたい。
【０１６９】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び第6節を参照)は、第6節に記載されている方法に従って作製することができる。
【０１７０】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるIL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVは、La Sota株骨格を含む。具体的な実施態様において、La Sota株骨格の(すなわち、導入遺伝子を含まない)ゲノム配列は、配列番号50に示されている通りである。具体的な実施態様において、キメラNDVは、配列番号51、52、又は60に示されるヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含む。具体的な実施態様において、キメラNDVは、配列番号51、52、又は60に示されるヌクレオチド配列を有するパッケージングされたゲノムを含む。いくつかの実施態様において、表10の配列に示されるヌクレオチド配列を含むプラスミドを用いて、キメラNDVを産生する。具体的な実施態様において、表10の配列に示されるヌクレオチド配列を有するプラスミドを用いて、キメラNDVを産生する。例えば、そのようなプラスミドを用いてキメラNDVを作製するために使用することができる技法については、下の第6節を参照されたい。
【０１７１】
(5.4  NDVの増殖)
本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV;例えば、第5.1節、第5.2節、及び第6節も参照)は、該ウイルスが本明細書に記載されるウイルスの使用を可能にする力価まで成長するのを可能にする任意の基体で増殖させることができる。一実施態様において、該基体は、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)が対応する野生型ウイルスについて決定された力価と同等の力価まで成長するのを可能にする。
【０１７２】
本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV;例えば、第5.1節、第5.2節、及び第6節も参照)を、該ウイルスによる感染を起こしやすい細胞(例えば、鳥細胞、ニワトリ細胞など)、孵化卵(例えば、鶏卵もしくはウズラ卵)、又は動物(例えば、鳥類)で成長させることができる。そのような方法は、当業者に周知である。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)を、癌細胞、例えば、上皮癌(carcinoma)細胞(例えば、乳癌細胞及び前立腺癌細胞)、肉腫細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、並びに胚細胞腫瘍細胞(例えば、精巣癌細胞及び卵巣癌細胞)で増殖させることができる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)を、細胞株、例えば、癌細胞株、例えば、HeLa細胞、MCF7細胞、THP-1細胞、U87細胞、DU145細胞、Lncap細胞、及びT47D細胞で増殖させることができる。ある実施態様において、該細胞又は細胞株(例えば、癌細胞又は癌細胞株)は、ヒトから得られる及び/又はヒトに由来する。別の実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)をニワトリ細胞又は孵化卵で増殖させる。代表的なニワトリ細胞としては、ニワトリ胚線維芽細胞及びニワトリ胚腎臓細胞が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)をVero細胞で増殖させる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)を、下の第6節に記載されている方法に従って、癌細胞で増殖させる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)を鶏卵又はウズラ卵で増殖させる。ある実施態様において、本明細書に記載されるNDVウイルス(例えば、キメラNDV)をまず孵化卵で増殖させ、その後、細胞(例えば、細胞株)で増殖させる。
【０１７３】
本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)を、例えば、6〜14日齢、6〜12日齢、6〜10日齢、6〜9日齢、6〜8日齢、8〜10日齢、又は10〜12日齢の孵化卵で増殖させることができる。幼若な又は未成熟な孵化卵を用いて、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)を増殖させることができる。未成熟な孵化卵は、IFNを欠損している、10日齢未満である卵、例えば、6〜9日齢又は6〜8日齢の卵を包含する。未成熟な孵化卵は、IFNシステムが10〜12日齢の卵と比較して完全には発達しないような、成長条件の変化、例えば、インキュベーション温度の変化;薬物による処理;又は発育が遅延した卵を生じさせる任意の他の変化の結果として、10日齢までの未成熟卵を人工的に模倣する卵も包含する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)を10日齢の孵化鶏卵で増殖させることができる。本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)を、孵化卵の様々な場所、例えば、尿膜腔で増殖させることができる。ウイルスの成長及び増殖に関する詳細な考察については、例えば、どちらも引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,852,522号及び米国特許第7,494,808号を参照されたい。
【０１７４】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるNDV(例えば、本明細書に記載されるキメラNDV)を増殖させる方法であって、該NDVに感染した基体(例えば、細胞株又は孵化卵)を培養することを含む、方法である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるNDV(例えば、本明細書に記載されるキメラNDV)を増殖させる方法であって:(a)該NDVに感染した基体(例えば、細胞株又は孵化卵)を培養すること;及び(b)該基体から該NDVを単離又は精製することを含む、方法である。ある実施態様において、これらの方法は、該基体を培養する前に、該基体を該NDVに感染させることを含む。本明細書に記載されるNDV(例えば、本明細書に記載されるキメラNDV)を増殖させるために使用することができる方法については、例えば、下の第6節を参照されたい。
【０１７５】
ウイルス単離のために、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)を孵化卵又は細胞培養物から取り出し、通常、例えば、遠心分離、深層濾過、及び精密濾過などの周知の清澄化手順によって、細胞成分から分離することができ、望ましい場合、当業者に周知の手順、例えば、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、密度勾配遠心分離、差次的抽出、又はクロマトグラフィーを用いて、さらに精製することができる。
【０１７６】
具体的な実施態様において、感染した卵(例えば、鶏卵)の尿膜腔液からのウイルス単離は、尿膜腔液を採取することから始まり、これを、特に、宿主細胞DNAをかなり低下させるような正味の正電荷を有する膜を含む、細胞及び他の大きい破片を除去するための濾過システム(例えば、1.2μmのガラスファイバーデッドエンド濾過を含む)を用いて清澄化する。その後、清澄化バルク液を、例えば、750kD中空糸膜を使用することによるタンジェンシャルフロー濾過により処理して、該清澄化バルク液を約5倍濃縮する。その後、濃縮した清澄化バルク液を、4透析容量の高塩バッファーに対して、次いで、4透析容量の低塩製剤バッファーに対して透析濾過し、その後、約10倍濃縮する。したがって、残留卵タンパク質、例えば、主にオボアルブミン、及び残留DNAは、許容し得るレベルにまで低下し、バッファーは、対象に投与されることになる組成物用のキメラNDVの製剤と適合するバッファーに交換される。その後、得られた産物を、フィルター、例えば、0.2μmフィルターに通して滅菌濾過し、適切な滅菌保存容器に分注し、凍結させ、摂氏-70度で保存する。
【０１７７】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び第6節を参照)を第6節に記載されている方法に従って増殖させ、単離し、及び/又は精製する。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び第6節を参照)を、第6節に記載されている方法を用いて増殖させ、単離し、もしくは精製するか、又は前述のいずれか2つ又は全てを行う。
【０１７８】
(5.5  PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト)
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるNDVと組み合わせて使用するためのPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストである(例えば、第5.1節、第5.2節、第5.5節、第5.7節、及び/又は第6節を参照)。当業者に公知のPD-1又はそのリガンドの任意のアンタゴニストを本明細書に記載される方法で利用することができる(例えば、第5.5節、第5.7節、及び/又は第6節を参照)。PD-1のリガンドの具体的な例としては、PD-L1及びPD-L2が挙げられる。
【０１７９】
別の実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1のリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、もしくはPD-L1とPD-L2の両方)に特異的に結合する抗体(もしくは抗原結合断片)又は可溶性受容体である。具体的な実施態様において、該アンタゴニストは、PD-1(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)のリガンドがPD-1に結合し、抑制シグナルを伝達するのを遮断する。ある実施態様において、該可溶性受容体は、PD-1(例えば、PD-1又はPD-1の誘導体の細胞外ドメイン)のリガンドに結合するPD-1の断片又はPD-1の誘導体の断片である。いくつかの実施態様において、該可溶性受容体は、PD-1又はPD-1の誘導体の少なくとも一部(例えば、PD-1又はPD-1の誘導体の細胞外ドメイン)と異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質である。具体的な実施態様において、該融合タンパク質は、PD-1又はPD-1の誘導体の少なくとも一部と免疫グロブリンのFc部分又はその断片を含む。
【０１８０】
具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1のリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)に結合する抗体(又はその抗原結合断片)である。具体的な実施態様において、該アンタゴニストは、PD-1のリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)がPD-1と相互作用し、抑制シグナルを伝達するのを(完全に又は部分的に)遮断する。ある具体的な実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は、scFvである。ある具体的な実施態様において、該抗体は、ラクダ化抗体である。特定の実施態様において、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。PD-1のリガンドに結合する抗体の非限定的な例としては、デュルバルマブ(「medi-4736」とも呼ばれる;例えば、Lutzkyらの文献、J Clin Oncol. 2014;32(suppl 5S):abstr 3001参照)、アベルマブ(例えば、メルケル細胞癌に対するもの)(「MSB0010718C」とも呼ばれる;例えば、Heeryらの文献J Clin Oncol. 2014;32(suppl 5S):abstr 3064参照)、bms-936559(例えば、Brahmerらの文献N. Engl. J. Med. 2012;366, 2455-2465参照)、並びにアテゾリズマブ(「mpdl3280A」又は「TECENTRIQ(登録商標)」とも呼ばれる;例えば、McDermottらの文献、J Clin Oncol. 2016; 34(8):833-842、Herbstらの文献、J Clin Oncol. 2013;31(suppl):abstr 3000及びTECENTRIQに関する完全処方情報(Full Prescribing Information for TECENTRIQ)、Reference ID: 3933242参照)が挙げられる。
【０１８１】
該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがPD-1のリガンド(例えば、PD-L1又はPD-L2)に結合する抗体である具体的な実施態様において、該抗体は、PD-1リガンド遮断抗体である。具体的な実施態様において、該抗PD-1リガンド抗体(例えば、抗PD-L1又は抗PD-L2抗体)は、PD-1リガンド(例えば、PD-L1又はPD-L2)に特異的に結合する。具体的な実施態様において、該PD-1リガンドは、ヒトPD-L1である。別の具体的な実施態様において、該PD-1リガンドは、ヒトPD-L2である。具体的な実施態様において、抗PD-L1又は抗PD-L2抗体は、それぞれ、PD-L1又はPD-L2とPD-1との相互作用を阻害し又は低下させる。具体的な実施態様において、抗PD-L1又は抗PD-L2抗体は、それぞれ、PD-L1又はPD-L2に結合し、それぞれ、PD-L1又はPD-L2とPD-1との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断し、それにより、抗腫瘍応答を含む、PD-1経路によって媒介される免疫応答の阻害を解除する抗体である。具体的な実施態様において、PD-L1又はPD-L2とPD-1との相互作用の遮断は完全なものである。具体的な実施態様において、PD-L1又はPD-L2とPD-1との相互作用の遮断とは、例えば、共免疫沈降又は共局在アッセイなどの当業者に公知の任意の方法によって評価したとき、陰性対照療法(例えば、抗IgG抗体)の存在下におけるそれぞれ、PD-L1又はPD-L2とPD-1との相互作用と比較して、PD-L1又はPD-L2とPD-1との相互作用の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％の遮断を指す。具体的な実施態様において、抗PD-L1又は抗PD-L2抗体は、それぞれ、PD-L1又はPD-L2依存的なPD-1の活性化を阻害し又は低下させる。具体的な実施態様において、リガンド依存的な活性化の阻害は、完全なものである。具体的な実施態様において、リガンド依存的な活性化の阻害とは、例えば、リン酸化アッセイなどの当業者に公知の任意の方法によって評価したとき、陰性対照療法(例えば、抗IgG抗体)の存在下におけるリガンド依存的なPD-1活性化と比較して、リガンド依存的な活性化の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％の阻害を指す。
【０１８２】
いくつかの実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-L1に結合し、PD-L1とPD-1との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断し、かつPD-L1とCD80(B7.1)の相互作用を(完全に又は部分的に)遮断する抗体である。ある実施態様において、該抗体は、IgG1モノクローナル抗体である。具体的な実施態様において、該抗体は、デュルバルマブである。
【０１８３】
別の実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、本明細書に記載される又は当業者に公知の技法によって測定したとき、PD-1(例えば、ヒトPD-1)に結合するが、抑制シグナルを伝達しない抗体又はリガンドである。具体的な実施態様において、該抗体又はリガンドは、ヒトPD-1に結合する。特定の実施態様において、該抗体又はリガンドは、PD-1(例えば、ヒトPD-1)に特異的に結合する。ある具体的な実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は、scFvである。ある具体的な実施態様において、該抗体は、ラクダ化抗体である。特定の実施態様において、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。PD-1に結合する抗体の非限定的な例としては、ペンブロリズマブ(「KEYTRUDA(登録商標)」;例えば、Hamidらの文献、N Engl J Med. 2013;369:134-44及びKEYTRUDAに関する完全処方情報(Full Prescribing Information for KEYTRUDA)、Reference ID: 3862712を参照)、ニボルマブ(「OPDIVO(登録商標)」;例えば、Topalianらの文献、N Engl J Med. 2012;366:2443-54及びOPDIVO(ニボルマブ)に関する完全処方情報(Full Prescribing Information for OPDIVO(nivolumab)))、Reference ID: 3677021を参照)、並びにMEDI0680(「AMP-514」とも呼ばれる;例えば、Hamidらの文献、Ann Oncol. 2016;27(suppl_6):1050PDを参照)が挙げられる。好ましい実施態様において、該抗PD-1抗体は、ペンブロリズマブである。
【０１８４】
該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがPD-1(例えば、ヒトPD-1)に結合する抗体である具体的な実施態様において、該抗体は、PD-1(例えば、ヒトPD-1)とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)との相互作用を遮断し又は低下させる抗PD-1抗体である。具体的な実施態様において、PD-1遮断抗体はPD-1に結合し、PD-1(例えば、ヒトPD-1)とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方)との相互作用を阻害し又は低下させる。具体的な実施態様において、該PD-1遮断抗体は、PD-1に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、抗PD-1は、PD-1(例えば、ヒトPD-1)に結合し、かつPD-1(例えば、ヒトPD-1)とPD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断し、それにより、抗腫瘍応答を含む、PD-1経路によって媒介される免疫応答の阻害を解除する抗体である。具体的な実施態様において、抗PD-1は、PD-1(例えば、ヒトPD-1)に結合し、PD-1(例えば、ヒトPD-1)とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断し、それにより、抗腫瘍応答を含む、PD-1経路によって媒介される免疫応答の阻害を解除する抗体である。具体的な実施態様において、PD-1(例えば、ヒトPD-1)とPD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方との相互作用の遮断は完全なものである。具体的な実施態様において、PD-1(例えば、ヒトPD-1)とPD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方との相互作用の遮断とは、例えば、共免疫沈降又は共局在アッセイなどの当業者に公知の任意の方法によって評価したとき、陰性対照療法(例えば、抗IgG抗体)の存在下におけるPD-1(例えば、ヒトPD-1)とPD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方との相互作用と比較して、PD-1(例えば、ヒトPD-1)とPD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方との相互作用の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％の遮断を指す。具体的な実施態様において、抗PD-1抗体は、PD-1(例えば、ヒトPD-1)のリガンド依存的(例えば、PD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方)活性化を阻害する。具体的な実施態様において、リガンド依存的な活性化の阻害は、完全なものである。具体的な実施態様において、リガンド依存的な活性化の阻害とは、例えば、リン酸化アッセイなどの当業者に公知の任意の方法によって評価したとき、陰性対照療法(例えば、抗IgG抗体)の存在下におけるリガンド依存的なPD-1(例えば、ヒトPD-1)活性化と比較して、リガンド依存的な活性化の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％の阻害を指す。
【０１８５】
別の実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1(例えば、ヒトPD-1)に結合するが、抑制シグナルを伝達しないリガンドである。別の実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1(例えば、ヒトPD-1)に結合するが、抑制シグナルを名目上しか伝達しないリガンドである。ある具体的な実施態様において、該リガンドは、PD-1のリガンド(例えば、ヒトPD-1)又はPD-1のリガンドの誘導体の少なくとも一部と異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質である。具体的な実施態様において、該融合タンパク質は、PD-1のリガンド又はPD-1のリガンドの誘導体の少なくとも一部と免疫グロブリンのFc部分又はその断片を含む。そのような融合タンパク質の例は、AMP-224である(例えば、Infanteらの文献、J Clin Oncol. 2013;31(suppl):abstr 3044を参照)。
【０１８６】
いくつかの実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1(例えば、ヒトPD-1)とそのリガンドとの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を(例えば、選択的に)阻害し又は低下させる。具体的な実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1(例えば、ヒトPD-1)と1以上のそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方)との結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、該アンタゴニストの非存在下におけるPD-1(例えば、ヒトPD-1)と1以上のそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方)との結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で阻害し又は低下させる。具体的な実施態様において、PD-1のアンタゴニスト又はそのリガンドは:(i)PD-1(例えば、ヒトPD-1)と1つの特定のリガンド(例えば、PD-L1)との結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、該アンタゴニストの非存在下におけるPD-1(例えば、ヒトPD-1)と1つの特定のリガンド(例えば、PDLI)との結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で阻害し又は低下させ;かつ(ii)PD-1(例えば、ヒトPD-1)と1以上の他のリガンド(例えば、PD-L2)との結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を阻害することも低下させることもないか、又は該アンタゴニストの非存在下におけるPD-1とそのような1以上の他のリガンドとの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、20％、15％、10％、5％、もしくは2％未満、2％〜5％、2％〜10％、5％〜10％、5％〜15％、5％〜20％、10％〜15％、もしくは15％〜20％の範囲で阻害しもしくは低下させる。
【０１８７】
具体的な実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1(例えば、ヒトPD-1)とPD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方との結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、該アンタゴニストの非存在下におけるPD-1(例えば、ヒトPD-1)とPD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方との結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で阻害し又は低下させる。具体的な実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、1以上の免疫活性、機能、又は応答を誘導し、活性化し、及び/又は増強する。該1以上の免疫活性、機能、又は応答は、例えば、抗体応答(液性応答)又は細胞性免疫応答、例えば、サイトカイン分泌(例えば、インターフェロン-γ)、ヘルパー活性、もしくは細胞性細胞傷害性の形態のものであることができる。一実施態様において、免疫細胞上の活性化マーカー(例えば、CD44、グランザイム、もしくはKi-67)の発現、免疫細胞上の共刺激受容体(例えば、ICOS、CD28、OX40、もしくはCD27)の発現、共刺激受容体のリガンド(例えば、B7HRP1、CD80、CD86、OX40L、もしくはCD70)の発現、サイトカイン分泌、免疫細胞(例えば、Tリンパ球、Bリンパ球、及び/もしくはNK細胞)の腫瘍への浸潤、抗体産生、エフェクター機能、T細胞活性化、T細胞分化、T細胞増殖、B細胞分化、B細胞増殖、及び/又はNK細胞増殖は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストとの接触後に誘導され、活性化され、及び/又は増強される。別の実施態様において、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の腫瘍浸潤及び増殖、Tregの腫瘍浸潤、活性化、及び増殖、末梢血MDSC及びTregの数は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストとの接触後に阻害される。別の実施態様において、PD-1のリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2、又はPD-L1とPD-L2の両方)の発現は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストとの接触後に誘導され、活性化され、及び/又は増強される。特定の実施態様において、PD-L1の発現は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストとの接触後に誘導され及び/又は増大する。別の実施態様において、下の第6節に記載されている効果のうちの1つ、2つ、又はそれより多くは、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストとの接触後に生じる。
【０１８８】
PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの非限定的な例としては、ペンブロリズマブ(「KEYTRUDA(登録商標)」;例えば、Hamidらの文献、N Engl J Med. 2013;369:134-44及びKEYTRUDA(ペンブロリズマブ)に関する完全処方情報(Full Prescribing Information for KEYTRUDA(Pembrolizumab))、Reference ID: 3862712を参照)、ニボルマブ(「OPDIVO(登録商標)」;例えば、Topalianらの文献、N Engl J Med. 2012;366:2443-54及びOPDIVO(ニボルマブ)に関する完全処方情報(Full Prescribing Information for OPDIVO(nivolumab))、Reference ID: 3677021を参照)、AMP-224(例えば、Infanteらの文献、J Clin Oncol. 2013;31(suppl):abstr 3044を参照)、MEDI0680(「AMP-514」とも呼ばれる;例えば、Hamidらの文献、Ann Oncol. 2016;27(suppl_6):1050PDを参照)、デュルバルマブ(「medi-4736」とも呼ばれる;例えば、Lutzkyらの文献、J Clin Oncol. 2014;32(suppl 5S):abstr 3001を参照)、アベルマブ(例えば、メルケル細胞癌に対するもの)(「MSB0010718C」とも呼ばれる;例えば、Heeryらの文献J Clin Oncol. 2014;32(suppl 5S):abstr 3064を参照)、bms-936559(例えば、Brahmerらの文献N. Engl. J. Med. 2012;366, 2455-2465を参照)、並びにアテゾリズマブ(「mpdl3280A」及び「TECENTRIQ(登録商標)」とも呼ばれる;例えば、McDermottらの文献、J Clin Oncol. 2016; 34(8):833-842、Herbstらの文献、J Clin Oncol. 2013;31(suppl):abstr 3000、及びTECENTRIQに関する完全処方情報(Full Prescribing Information for TECENTRIQ)、Reference ID: 3933242を参照)が挙げられる。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、米国FDAにより1以上の癌の治療に承認された療法である。米国FDAにより癌の治療に承認されたPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの非限定的な例としては、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、及びアベルマブが挙げられる。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、EMAにより1以上の癌の治療に承認された療法である。EMAにより癌の治療に承認されたPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの非限定的な例としては、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、及びアテゾリズマブが挙げられる。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、ニボルマブである。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、その各々が引用により完全に組み込まれる、国際特許出願公開第WO 2008/156712号、又は米国特許第8,354,509号、米国特許第8,952,136号、もしくは米国特許第8,900,587号に記載されている抗PD-1抗体である。好ましい実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、ペンブロリズマブである。
【０１８９】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合する抗体であり、この抗体は、アミノ酸配列
【化３３】
2020519641.tif 000035
を含む可変軽鎖領域(VLCR)相補性決定領域(CDR)1、アミノ酸配列
【化３４】
2020519641.tif 000036
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化３５】
2020519641.tif 000037
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化３６】
2020519641.tif 000038
を含む可変重鎖領域(VHCR) CDR1、アミノ酸配列
【化３７】
2020519641.tif 000039
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化３８】
2020519641.tif 000040
を含むVHCR CDR3を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合する抗体であり、この抗体は、(a)(i)アミノ酸配列
【化３９】
2020519641.tif 000041
を含むVLCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化４０】
2020519641.tif 000042
を含むVLCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化４１】
2020519641.tif 000043
を含むVLCR CDR3を含むVLCR;並びに(b)(i)アミノ酸配列
【化４２】
2020519641.tif 000044
を含むVHCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化４３】
2020519641.tif 000045
を含むVHCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化４４】
2020519641.tif 000046
を含むVHCR CDR3を含むVHCRを含む。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。ある実施態様において、該抗体は、ヒト化又はキメラ抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０１９０】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化４５】
2020519641.tif 000047
を含むVLCR;並びに(b)(i)アミノ酸配列
【化４６】
2020519641.tif 000048
を含むVHCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化４７】
2020519641.tif 000049
を含むVHCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化４８】
2020519641.tif 000050
を含むVHCR CDR3を含むVHCRを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合する抗体であり、この抗体は:(a)(i)アミノ酸配列
【化４９】
2020519641.tif 000051
を含むVLCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化５０】
2020519641.tif 000052
を含むVLCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化５１】
2020519641.tif 000053
を含むVLCR CDR3を含むVLCR;並びに(b)アミノ酸配列
【化５２】
2020519641.tif 000054
を含むVHCRを含む。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。ある実施態様において、該抗体は、ヒト化又はキメラ抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０１９１】
好ましい実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化５３】
2020519641.tif 000055
を含むVLCR;及び(b)アミノ酸配列
【化５４】
2020519641.tif 000056
を含むVHCRを含む。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０１９２】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は、アミノ酸配列
【化５５】
2020519641.tif 000057
を含む可変軽鎖領域(VLCR)相補性決定領域(CDR)1、アミノ酸配列
【化５６】
2020519641.tif 000058
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化５７】
2020519641.tif 000059
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化５８】
2020519641.tif 000060
を含む可変重鎖領域(VHCR) CDR1、アミノ酸配列
【化５９】
2020519641.tif 000061
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化６０】
2020519641.tif 000062
を含むVHCR CDR3を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は、(a)(i)アミノ酸配列
【化６１】
2020519641.tif 000063
を含む、VLCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化６２】
2020519641.tif 000064
を含む、VLCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化６３】
2020519641.tif 000065
を含む、VLCR CDR3を含むVLCR;並びに(b)(i)アミノ酸配列
【化６４】
2020519641.tif 000066
を含むVHCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化６５】
2020519641.tif 000067
を含むVHCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化６６】
2020519641.tif 000068
を含むVHCR CDR3を含むVHCRを含む。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。ある実施態様において、該抗体は、ヒト化又はキメラ抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０１９３】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化６７】
2020519641.tif 000069
を含むVLCR;並びに(b)(i)アミノ酸配列
【化６８】
2020519641.tif 000070
を含むVHCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化６９】
2020519641.tif 000071
を含むVHCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化７０】
2020519641.tif 000072
を含むVHCR CDR3を含むVHCRを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)(i)アミノ酸配列
【化７１】
2020519641.tif 000073
を含むVLCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化７２】
2020519641.tif 000074
を含むVLCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化７３】
2020519641.tif 000075
を含むVLCR CDR3を含むVLCR;並びに(b)アミノ酸配列
【化７４】
2020519641.tif 000076
を含むVHCRを含む。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。ある実施態様において、該抗体は、ヒト化又はキメラ抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０１９４】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化７５】
2020519641.tif 000077
を含むVLCRの、それぞれ、VLCR CDR1、VLCR CDR2、及びVLCR CDR3のアミノ酸配列を含むVLCR CDR1、VLCR CDR2、及びVLCR CDR3;並びに(b)アミノ酸配列
【化７６】
2020519641.tif 000078
を含むVHCRの、それぞれ、VHCR CDR1、VHCR CDR2、及びVHCR CDR3のアミノ酸配列を含むVHCR CDR1、VHCR CDR2、及びVHCR CDR3を含む。ある態様において、抗体のCDRは、Kabat付番体系に従って決定することができる。具体的な実施態様において、Kabat付番体系に従って決定される、アミノ酸配列
【化７７】
2020519641.tif 000079
を含むVLCR CDR1、アミノ酸配列
【化７８】
2020519641.tif 000080
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化７９】
2020519641.tif 000081
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化８０】
2020519641.tif 000082
を含むVHCR CDR1、アミノ酸配列
【化８１】
2020519641.tif 000083
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化８２】
2020519641.tif 000084
を含むVHCR CDR3。いくつかの態様において、抗体のCDRは、免疫グロブリン構造ループの位置を指すChothia付番方式に従って決定することができる(例えば、Chothia及びLeskの文献、1987, J. Mol. Biol., 196:901-917; Al-Lazikaniらの文献、1997, J. Mol. Biol., 273:927-948; Chothiaらの文献、1992, J. Mol. Biol., 227:799-817; Tramontano Aらの文献、1990, J. Mol. Biol. 215(1):175-82;並びに米国特許第7,709,226号を参照)。ある態様において、抗体のCDRは、Lefranc, M.-P.の文献、1999, The Immunologist, 7:132-136及びLefranc, M.-P.らの文献、1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212に記載されているIMGT付番体系に従って決定することができる。ある態様において、抗体のCDRは、MacCallumらの文献、1996, J. Mol. Biol., 262:732-745に従って決定することができる。例えば、Martin, A.の文献、「抗体可変ドメインのタンパク質配列及び構造解析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)」、抗体エンジニアリング(Antibody Engineering)所収、Kontermann及びDubel編、第31章、422〜439ページ、Springer-Verlag, Berlin(2001)も参照されたい。ある態様において、抗体のCDRは、AbM超可変領域を指すAbM付番方式に従って決定することができ、該AbM超可変領域は、Kabat CDRとChothia構造ループの折衷物に相当し、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。ある実施態様において、該抗体は、ヒト化又はキメラ抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０１９５】
「Kabat付番」という用語及び同様の用語は、当技術分野で認識されており、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域、又はこれらの抗原結合部分のアミノ酸残基を付番する体系を指す。ある態様において、抗体のCDRは、Kabat付番体系に従って決定することができる(例えば、Kabatらの文献(1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391及びKabatらの文献(1991)、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第5版、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照)。Kabat付番体系に関して、(i)VH CDR1は、通常、重鎖のアミノ酸位置31〜35に存在し、これは、アミノ酸位置35の後ろに1つ又は2つの追加のアミノ酸(Kabat付番方式では、35A及び35Bと呼ばれる)を任意に含むことができ;(ii)VH CDR2は、通常、重鎖のアミノ酸位置50〜65に存在し;かつ(iii)VH CDR2は、通常、重鎖のアミノ酸位置95〜102に存在する(Kabat, Elvin A.らの文献、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、ベセスダ:米国立衛生研究所(Bethesda: National Institutes of Health)、1983)。Kabat付番体系に関して、(i)VL CDR1は、通常、軽鎖のアミノ酸位置24〜34に存在し;(ii)VL CDR2は、通常、軽鎖のアミノ酸位置50〜56に存在し;かつ(iii)VL CDR3は、通常、軽鎖のアミノ酸位置89〜97に存在する(Kabat, Elvin A.らの文献、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、ベセスダ:米国立衛生研究所(Bethesda: National Institutes of Health)、1983)。当業者には周知であるように、Kabat付番体系を使用すると、抗体可変ドメインの実際の線状アミノ酸配列は、FR及び/又はCDRの短縮又は延長のために、より少ない又は追加のアミノ酸を含有することがあり、したがって、アミノ酸のKabat番号は、その線状アミノ酸番号と必ずしも同じではない。
【０１９６】
Chothia定義は、構造ループ領域の位置に基づく(Chothiaらの文献(1987) J Mol Biol 196: 901-917;及び米国特許第7,709,226号)。「Chothia CDR」という用語及び同様の用語は、当技術分野で認識されており、Chothia及びLeskの文献、1987, J. Mol. Biol., 196:901-917の方法に従って決定される抗体CDR配列を指し、これは、本明細書では、「Chothia CDR」と呼ばれる(例えば、米国特許第7,709,226号及びMartin, A.の文献、「抗体可変ドメインのタンパク質配列及び構造解析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)」、抗体エンジニアリング(Antibody Engineering)所収、Kontermann及びDubel編、第31章、422〜439ページ、Springer-Verlag, Berlin(2001)も参照)。Chothia付番体系に関して、VH領域のアミノ酸残基を付番するKabat付番体系を使用すると、(i)VH CDR1は、通常、重鎖のアミノ酸位置26〜32に存在し;(ii)VH CDR2は、通常、重鎖のアミノ酸位置53〜55に存在し;かつ(iii)VH CDR3は、通常、重鎖のアミノ酸位置96〜101に存在する。具体的な実施態様において、Chothia付番体系に関して、VH領域のアミノ酸残基を付番するKabat付番体系を使用すると、(i)VH CDR1は、通常、重鎖のアミノ酸位置26〜32又は34に存在し;(ii)VH CDR2は、通常、重鎖のアミノ酸位置52〜56に存在し(一実施態様において、CDR2は、位置52A〜56にあり、ここで、52Aは、位置52の後ろにある);及び(iii)VH CDR3は、通常、重鎖のアミノ酸位置95〜102に存在する(一実施態様において、96〜100の番号の位置にアミノ酸は存在しない)。Chothia付番体系に関して、VL領域のアミノ酸残基を付番するKabat付番体系を使用すると、(i)VL CDR1は、通常、軽鎖のアミノ酸位置26〜33に存在し;(ii)VL CDR2は、通常、軽鎖のアミノ酸位置50〜52に存在し;かつ(iii)VL CDR3は、通常、軽鎖のアミノ酸位置91〜96に存在する。具体的な実施態様において、Chothia付番体系に関して、VL領域のアミノ酸残基を付番するKabat付番体系を使用すると、(i)VL CDR1は、通常、軽鎖のアミノ酸位置24〜34に存在し;(ii)VL CDR2は、通常、軽鎖のアミノ酸位置50〜56に存在し;かつ(iii)VL CDR3は、通常、軽鎖のアミノ酸位置89〜97に存在する(一実施態様において、96〜100の番号の位置にアミノ酸は存在しない)。これらのChothia CDR位置は、抗体によって様々であることができ、かつ当技術分野で公知の方法に従って決定することができる。
【０１９７】
IMGT定義は、IMGTによるものである(「IMGT(登録商標)、international ImMunoGeneTics information system(登録商標)ウェブサイトimgt.org、設立者及びディレクター: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France;例えば、その両方が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Lefranc, M.-P.の文献、1999, The Immunologist, 7:132-136及びLefranc, M.-P.らの文献、1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212を参照)。IMGT付番体系に関して、(i)VH CDR1は、通常、重鎖のアミノ酸位置25〜35に存在し;(ii)VH CDR2は、通常、重鎖のアミノ酸位置51〜57に存在し;かつ(iii)VH CDR2は、通常、重鎖のアミノ酸位置93〜102に存在する。IMGT付番体系に関して、(i)VL CDR1は、通常、軽鎖のアミノ酸位置27〜32に存在し;(ii)VL CDR2は、通常、軽鎖のアミノ酸位置50〜52に存在し;かつ(iii)VL CDR3は、通常、軽鎖のアミノ酸位置89〜97に存在する。
【０１９８】
好ましい実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化８３】
2020519641.tif 000085
を含むVLCR;及び(b)アミノ酸配列
【化８４】
2020519641.tif 000086
を含むVHCRを含む。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０１９９】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化８５】
2020519641.tif 000087
を含む軽鎖;及び(b)アミノ酸配列
【化８６】
2020519641.tif 000088
を含むVHCRを含む重鎖を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化８７】
2020519641.tif 000089
を含むVLCRを含む軽鎖;及び(b)アミノ酸配列
【化８８】
2020519641.tif 000090
を含む重鎖を含む。
【０２００】
好ましい実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化８９】
2020519641.tif 000091
を含む軽鎖;及び(b)アミノ酸配列
【化９０】
2020519641.tif 000092
を含む重鎖を含む。
【０２０１】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合する抗体であり、この抗体は、アミノ酸配列
【化９１】
2020519641.tif 000093
を含むVLCR CDR1、アミノ酸配列
【化９２】
2020519641.tif 000094
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化９３】
2020519641.tif 000095
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化９４】
2020519641.tif 000096
を含むVHCR CDR1、アミノ酸配列
【化９５】
2020519641.tif 000097
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化９６】
2020519641.tif 000098
を含むVHCR CDR3を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合する抗体であり、この抗体は:(a)(i)アミノ酸配列
【化９７】
2020519641.tif 000099
を含むVLCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化９８】
2020519641.tif 000100
を含むVLCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化９９】
2020519641.tif 000101
を含むVLCR CDR3を含むVLCR;並びに(b)(i)アミノ酸配列
【化１００】
2020519641.tif 000102
を含むVHCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化１０１】
2020519641.tif 000103
を含むVHCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化１０２】
2020519641.tif 000104
を含むVHCR CDR3を含むVHCRを含む。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。ある実施態様において、該抗体は、ヒト化又はキメラ抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０２０２】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化１０３】
2020519641.tif 000105
を含むVLCR;並びに(b)(i)アミノ酸配列
【化１０４】
2020519641.tif 000106
を含むVHCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化１０５】
2020519641.tif 000107
を含むVHCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化１０６】
2020519641.tif 000108
を含むVHCR CDR3を含むVHCRを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合する抗体であり、この抗体は:(a)(i)アミノ酸配列
【化１０７】
2020519641.tif 000109
を含むVLCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化１０８】
2020519641.tif 000110
を含むVLCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化１０９】
2020519641.tif 000111
を含むVLCR CDR3を含むVLCR;並びに(b)
【化１１０】
2020519641.tif 000112
を含むVHCRを含む。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。ある実施態様において、該抗体は、ヒト化又はキメラ抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０２０３】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との結合を遮断する抗体であり、この抗体は、アミノ酸配列
【化１１１】
2020519641.tif 000113
を含むVLCR CDR1、アミノ酸配列
【化１１２】
2020519641.tif 000114
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化１１３】
2020519641.tif 000115
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化１１４】
2020519641.tif 000116
を含むVHCR CDR1、アミノ酸配列
【化１１５】
2020519641.tif 000117
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化１１６】
2020519641.tif 000118
を含むVHCR CDR3を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との結合を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)(i)アミノ酸配列
【化１１７】
2020519641.tif 000119
を含むVLCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化１１８】
2020519641.tif 000120
を含むVLCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化１１９】
2020519641.tif 000121
を含むVLCR CDR3を含むVLCR;並びに(b)(i)アミノ酸配列
【化１２０】
2020519641.tif 000122
を含むVHCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化１２１】
2020519641.tif 000123
を含むVHCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化１２２】
2020519641.tif 000124
を含むVHCR CDR3を含むVHCRを含む。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。ある実施態様において、該抗体は、ヒト化又はキメラ抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０２０４】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との結合を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化１２３】
2020519641.tif 000125
を含むVLCR;並びに(b)(i)アミノ酸配列
【化１２４】
2020519641.tif 000126
を含むVHCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化１２５】
2020519641.tif 000127
を含むVHCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化１２６】
2020519641.tif 000128
を含むVHCR CDR3を含むVHCRを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との結合を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)(i)アミノ酸配列
【化１２７】
2020519641.tif 000129
を含むVLCR CDR1、(ii)アミノ酸配列
【化１２８】
2020519641.tif 000130
を含むVLCR CDR2、及び(iii)アミノ酸配列
【化１２９】
2020519641.tif 000131
を含むVLCR CDR3を含むVLCR;並びに(b)
【化１３０】
2020519641.tif 000132
VHCRを含む。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。ある実施態様において、該抗体は、ヒト化又はキメラ抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０２０５】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との結合を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化１３１】
2020519641.tif 000133
を含むVLCRの、それぞれ、VLCR CDR1、VLCR CDR2、及びVLCR CDR3のアミノ酸配列を含むVLCR CDR1、VLCR CDR2、及びVLCR CDR3;並びに(b)アミノ酸配列
【化１３２】
2020519641.tif 000134
を含むVHCRの、それぞれ、VHCR CDR1、VHCR CDR2、及びVHCR CDR3のアミノ酸配列を含むVHCR CDR1、VHCR CDR2、及びVHCR CDR3CDR3を含む。ある態様において、抗体のCDRは、Kabat付番体系に従って決定することができる。いくつかの態様において、抗体のCDRは、Chothia付番方式に従って決定することができる。ある態様において、抗体のCDRは、MacCallumらの文献、1996, J. Mol. Biol., 262:732-745に従って決定することができる。いくつかの態様において、抗体のCDRは、Lefranc, M.-P.の文献、1999, The Immunologist, 7:132-136及びLefranc, M.-P.らの文献、1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212に記載されているIMGT付番体系に従って決定することができる。ある態様において、抗体のCDRは、AbM付番方式に従って決定することができる。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０２０６】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との結合を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化１３３】
2020519641.tif 000135
を含むVLCR;及び(b)アミノ酸配列
【化１３４】
2020519641.tif 000136
を含むVHCRを含む。具体的な実施態様において、該抗体は、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)抗体である。好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4抗体である。別の好ましい実施態様において、該抗体は、IgG4κ免疫グロブリンである。
【０２０７】
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化１３５】
2020519641.tif 000137
を含む軽鎖;及び(b)アミノ酸配列
【化１３６】
2020519641.tif 000138
を含むVHCRを含む重鎖を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化１３７】
2020519641.tif 000139
を含むVLCRを含む軽鎖、及び(b)アミノ酸配列
【化１３８】
2020519641.tif 000140
を含む重鎖を含む。
【０２０８】
好ましい実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトPD-1に結合し、かつヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体であり、この抗体は:(a)アミノ酸配列
【化１３９】
2020519641.tif 000141
を含む軽鎖及び(b)アミノ酸配列
【化１４０】
2020519641.tif 000142
を含む重鎖を含む。
【０２０９】
PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、当業者に公知の技法によって産生することができる。PD-1;又はそのリガンドのアンタゴニストを産生するために使用することができる技法の例については、例えば、米国特許第9,642,298号、米国特許第8,952,136号、米国特許第8,900,587号、米国特許第8,168,757号、米国特許第7,488,802号、米国特許出願公開第2016/0137721号、及び国際特許出願公開WO 2014/159960号を参照されたい。具体的な実施態様において、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、単離される。
【０２１０】
(5.5.1  抗体産生)
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される抗体又はPD-1もしくはそのリガンドの他のタンパク質性アンタゴニストを作製する方法である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される抗体又はPD-1もしくはそのリガンドの他のタンパク質性アンタゴニストは、例えば、配列の合成又は遺伝子改変による作出を伴う任意の手段によって調製し、発現させ、作出し、又は単離することができる。具体的な実施態様において、そのような抗体又はPD-1もしくはそのリガンドの他のタンパク質性アンタゴニストは、動物又は哺乳動物(例えば、ヒト)の抗体生殖系列レパートリーに天然には存在しないDNA配列によってコードされる配列を含む。
【０２１１】
ある態様において、本明細書に記載される抗体又はPD-1もしくはそのリガンドの他のタンパク質性アンタゴニストを作製する方法は、該抗体又はPD-1又はそのリガンドの他のタンパク質性アンタゴニストを発現する細胞(例えば、宿主細胞又はハイブリドーマ細胞)を培養する工程を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体又はPD-1もしくはそのリガンドの他のタンパク質性アンタゴニストを作製する方法は、該細胞によって発現される抗体又はPD-1又はそのリガンドの他のタンパク質性アンタゴニストを精製する工程をさらに含む。ある態様において、本明細書に記載される抗体又はPD-1もしくはそのリガンドの他のタンパク質性アンタゴニストを作製する方法は、該抗体又はPD-1又はそのリガンドの他のタンパク質性アンタゴニストをコードするポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞(例えば、宿主細胞又はハイブリドーマ細胞)を培養する工程を含む。特定の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される抗体を産生する方法であって、そのような抗体を宿主細胞から発現させることを含む、方法である。該細胞は、初代細胞又は細胞株であることができる。特定の実施態様において、該宿主細胞は、他の細胞から単離される。別の実施態様において、該宿主細胞は、対象の体内では見られない。
【０２１２】
分子生物学の標準的な方法は、Sambrook、Fritsch、及びManiatisの文献(1982年及び1989年の第2版、2001年の第3版)、分子クローニング、実験室マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook及びRussellの文献(2001)、分子クローニング(Molecular Cloning)、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wuの文献(1993)、組換えDNA(Recombinant DNA)、第217巻、Academic Press, San Diego, CA)に記載されている。標準的な方法は、細菌細胞におけるクローニング及びDNA突然変異誘発(第1巻)、哺乳動物細胞及び酵母におけるクローニング(第2巻)、複合糖質及びタンパク質発現(第3巻)、及びバイオインフォマティクス(第4巻)を記載している、Ausbelらの文献(2001)、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、第1巻〜第4巻、John Wiley and Sons社、New York, NYにも見られる。
【０２１３】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化を含む、タンパク質精製の方法が記載されている(Coliganらの文献(2000)、タンパク質科学の最新プロトコル(Current Protocols in Protein Science)、第1巻、John Wiley and Sons社、New York)。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、タンパク質のグリコシル化が記載されている(例えば、Coliganらの文献(2000)、タンパク質科学の最新プロトコル(Current Protocols in Protein Science)、第2巻、John Wiley and Sons社、New York; Ausubelらの文献(2001)、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、第3巻、John Wiley and Sons社、NY, NY, 16.0.5〜16.22.17ページ; Sigma-Aldrich社(2001)、生命科学研究用製品(Products for Life Science Research)、St. Louis, MO; 45〜89ページ; Amersham Pharmacia Biotech(2001)、BioDirectory, Piscataway, N.J., 384〜391ページを参照)。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の産生、精製、及び断片化が記載されている(Coliganらの文献(2001)、免疫学の最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)、第1巻、John Wiley and Sons社、New York; Harlow及びLaneの文献(1999)、抗体の使用(Using Antibodies)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow及びLaneの文献、上記)。リガンド/受容体相互作用を特徴解析するための標準的な技法が利用可能である(例えば、Coliganらの文献(2001)、免疫学の最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)、第4巻、John Wiley社、New Yorkを参照)。
【０２１４】
ある態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される抗体及び関連する発現ベクターを発現する(例えば、組換え発現する)細胞(例えば、宿主細胞)である。別の態様において、本明細書に提供されるのは、宿主細胞、好ましくは、哺乳動物細胞における組換え発現のための抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター(例えば、発現ベクター)である。また本明細書に提供されるのは、抗体をコードするポリヌクレオチド、又は本明細書に記載される抗体を組換え発現させるための抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、第一のベクターが本明細書に記載される抗体の可変重鎖領域をコードするポリヌクレオチドを含み、第二のベクターが本明細書に記載される抗体を組換え発現させるための可変軽鎖領域をコードするポリヌクレオチドを含む、2つのベクターを含む宿主細胞である。該細胞は、初代細胞又は細胞株であることができる。特定の実施態様において、該宿主細胞は、他の細胞から単離される。別の実施態様において、該宿主細胞は、対象の体内には見られない。
【０２１５】
本明細書に記載される抗体(例えば、モノクローナル抗体、例えば、キメラもしくはヒト化抗体、又はこれらの抗原結合断片)は、抗体の合成のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、化学合成によるか、もしくは組換え発現技法によって産生することができる。本明細書に記載される方法は、別途示されない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えDNA、有機化学、生化学、PCR、オリゴヌクレオチド合成及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、並びに当業者の能力の範囲内の関連分野における従来の技法を利用する。これらの技法は、本明細書で引用される参考文献に記載されており、かつ文献中で十分に説明されている。例えば、Maniatisらの文献(1982)、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrookらの文献(1989)、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrookらの文献(2001)、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley & Sons(1987年及び年次更新版);免疫学の最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)、John Wiley & Sons(1987年及び年次更新版)、Gait(編)(1984)、オリゴヌクレオチド合成:実用的アプローチ(Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach)、IRL Press; Eckstein(編)(1991)、オリゴヌクレオチド及び類似体:実用的アプローチ(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach)、IRL Press; Birrenら(編)(1999)、ゲノム解析:実験室マニュアル(Genome Analysis: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
【０２１６】
モノクローナル、ポリクローナル、及びヒト化抗体は、当技術分野で公知の技法によって調製することができる(例えば、Sheperd及びDean(編)(2000)、モノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies)、Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann及びDubel(編)(2001)、抗体エンジニアリング(Antibody Engineering)、Springer-Verlag, New York; Harlow及びLaneの文献(1988)、抗体  実験室マニュアル(Antibodies A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 139〜243ページ; Carpenterらの文献(2000) J. Immunol. 165:6205; Heらの文献(1998) J. Immunol. 160:1029; Tangらの文献(1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Bacaらの文献(1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothiaらの文献(1989) Nature 342:877-883; Foote及びWinterの文献(1992) J. Mol. Biol. 224:487-499;米国特許第6,329,511号)を参照されたい。
【０２１７】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、及びファージディスプレイ技術、又はこれらの組合せの使用を含む、多種多様な当技術分野で公知の技法を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法を用いて産生することができ、これには、当技術分野で公知であり、かつ例えば、Harlowらの文献、抗体:実験室マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988); Hammerlingらの文献:モノクローナル抗体及びT細胞ハイブリドーマ(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)、563 681所収(Elsevier, N.Y., 1981)に教示されているものが含まれる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。
【０２１８】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生及びスクリーニングする方法は、ルーチンであり、かつ当技術分野で周知である。例えば、ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えば、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスター、もしくはマカクザルを免疫して、免疫に使用されたタンパク質(例えば、PD-1)に結合する抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。その後、リンパ球を、好適な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Godingの文献、モノクローナル抗体:原理及び実践(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice)、59〜103ページ(Academic Press, 1986))。さらに、RIMMS(反復免疫多重部位)技法を用いて、動物を免疫することができる(引用により完全に組み込まれる、Kilptrackらの文献、1997 Hybridoma 16:381-9)。
【０２１９】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する1以上の物質を含有することが好ましい好適な培養培地中に播種し、その中で成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)という酵素を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み(HAT培地)、これらの物質は、HGPRT欠損細胞の成長を妨げる。
【０２２０】
具体的な実施態様は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支持し、かつHAT培地などの培地に感受性がある骨髄腫細胞を利用する。これらの骨髄腫細胞株の中に、ソーク研究所細胞配布センター(Salk Institute Cell Distribution Center)、San Diego, CA, USAから入手可能なMOPC-21及びMPC-11マウス腫瘍に由来するマウス骨髄腫株、並びにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、Rockville, MD, USAから入手可能なSP-2又はX63-Ag8.653細胞がある。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株も記載されている(Kozbor, J.の文献、Immunol., 133:3001(1984); Brodeurらの文献、モノクローナル抗体産生技法及び応用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)、51〜63ページ(Marcel Dekker社、New York, 1987))。
【０２２１】
ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地は、目的の抗原(例えば、PD-1)に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、当技術分野で公知の方法、例えば、免疫沈降によるか、又はインビトロ結合アッセイ、例えば、放射免疫アッセイ(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定される。
【０２２２】
所望の特異性、親和性、及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させることができる(Godingの文献、モノクローナル抗体:原理及び実践(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice)、59〜103ページ(Academic Press, 1986))。この目的のための好適な培養培地としては、例えば、D-MEM又はRPMI-1640培地が挙げられる。或いは、クローン細胞を、HATが補充された半固形寒天(Stemcell Technologies)を用いて単離することができる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物内の腹水腫瘍としてインビボで成長させることができる。
【０２２３】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインA-セファロース、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水液、又は血清から好適に分離される。
【０２２４】
いくつかの実施態様において、マウス(又は他の動物、例えば、ラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、もしくはイヌ)を抗原(例えば、ヒトPD-1)で免疫することができ、ひとたび免疫応答が検出されれば、例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されれば、マウス脾臓を採取し、脾臓細胞を単離する。その後、脾臓細胞を周知の技法によって任意の好適な骨髄腫細胞、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC(登録商標))(Manassas, VA)から入手可能な細胞株SP20由来の細胞に融合させて、ハイブリドーマを形成させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローン化する。ある実施態様において、免疫したマウスのリンパ節を採取し、NS0骨髄腫細胞と融合させる。
【０２２５】
その後、ハイブリドーマクローンを、抗原(例えば、ヒトPD-1)のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によりアッセイする。通常、高レベルの抗体を含む腹水液は、マウスを陽性ハイブリドーマクローンで免疫することにより作製することができる。
【０２２６】
したがって、本明細書に記載されるのは、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することにより、本明細書に記載される抗体を作製する方法である。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体を作製する方法は、抗体を精製する工程をさらに含む。
【０２２７】
具体的な実施態様において、ハイブリドーマを、目的の抗原(例えば、ヒトPD-1)で免疫されたマウス(又は他の動物、例えば、ラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、もしくはイヌ)から単離された脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合することにより作製し、その後、この融合から生じるハイブリドーマを、該抗原に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングする。ある実施態様において、ハイブリドーマを作製し、目的の抗原(例えば、ヒトPD-1)で免疫されたマウス(又は他の動物、例えば、ラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、もしくはイヌ)から単離されたリンパ節を骨髄腫細胞と融合することにより作製し、その後、この融合から生じるハイブリドーマを、該抗原に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングする。
【０２２８】
本明細書に記載される抗体には、目的の抗原(例えば、ヒトPD-1)を認識し、かつ当業者に公知の任意の技法によって作製することができる抗体断片が含まれる。例えば、本明細書に記載されるFab及びF(ab')2断片は、パパイン(Fab断片を生成させるため)又はペプシン(F(ab')2を生成させるため)などの酵素を用いる、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって産生することができる。Fab断片は、抗体分子の2つの同一のアームのうちの1つに相当し、かつ重鎖のVH及びCH1ドメインと対になった完全な軽鎖を含有する。F(ab')2断片は、ヒンジ領域のジスルフィド結合により連結された抗体分子の2つの抗原結合アームを含有する。
【０２２９】
さらに、本明細書に記載される抗体は、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインを、それをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示させる。特に、VHCR及びVLCRをコードするDNA配列を動物cDNAライブラリー(例えば、罹患組織のヒト又はマウスcDNAライブラリー)から増幅する。VHCR及びVLCRをコードするDNAをPCRによりscFvリンカーとともに組み換え、ファージミドベクターにクローニングする。該ベクターを大腸菌でエレクトロポレートし、該大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法で使用されるファージは、通常、fd及びM13を含む繊維状ファージであり、VHCR及びVLCRは、通常、ファージ遺伝子III又は遺伝子VIIIのいずれかに組換え融合される。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原で、例えば、標識された抗原又は固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を用いて選択又は同定することができる。本明細書に記載される抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmanらの文献、1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Amesらの文献、1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleboroughらの文献、1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persicらの文献、1997, Gene 187:9-18; Burtonらの文献、1994, Advances in Immunology 57:191-280; PCT出願第PCT/GB91/O1 134号;国際公開WO 90/02809号、WO 91/10737号、WO 92/01047号、WO 92/18619号、WO 93/11236号、WO 95/15982号、WO 95/20401号、及びWO97/13844号;並びに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号、及び第5,969,108号に開示されているものが挙げられる。
【０２３０】
上記の参考文献に記載されているように、ファージ選択後、該ファージ由来の抗体コード領域を単離し、これを用いて、ヒト抗体を含む全抗体、又は任意の他の所望の抗原結合断片を作製し、例えば、下記のような哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む、任意の所望の宿主で発現させることができる。Fab、Fab'、及びF(ab')2断片などの抗体断片を組換え産生させる技法を、当技術分野で公知の方法、例えば、PCT公開WO 92/22324号; Mullinaxらの文献、1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawaiらの文献、1995, AJRI 34:26-34;及びBetterらの文献、1988, Science 240:1041-1043に開示されているものを用いて利用することもできる。
【０２３１】
一態様において、全抗体を作製するために、VHCR又はVLCRヌクレオチド配列、制限部位、及び該制限部位を保護するための隣接配列を含むPCRプライマーを用いて、鋳型、例えば、scFvクローンからVHCR又はVLCR配列を増幅することができる。当業者に公知のクローニング技法を用いて、PCRで増幅されたVHCRを、可変重鎖定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、PCRで増幅されたVLCRを、可変軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ又はλ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。VHCR及びVLCRを、必要な定常領域を発現する1つのベクターにクローニングすることもできる。その後、当業者に公知の技法を用いて、重鎖変換ベクター及び軽鎖変換ベクターを細胞株にコトランスフェクトして、全長抗体、例えば、IgGを発現する安定又は一過性細胞株を作製する。
【０２３２】
ヒトにおける抗体のインビボ使用及びインビトロ検出アッセイを含む、いくつかの用途のために、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体を使用することが好ましいことがあり得る。完全ヒト抗体は、ヒト対象の治療的治療に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて、上記のファージディスプレイ法を含む当技術分野で公知の種々の方法によって作製することができる。米国特許第4,444,887号及び第4,716,111号;並びに国際公開WO 98/46645号、WO 98/50433号、WO 98/24893号、WO 98/16654号、WO 96/34096号、WO 96/33735号、及びWO 91/10741号も参照されたい。
【０２３３】
キメラ抗体は、抗体の様々な部分が様々な免疫グロブリン分子に由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に融合したマウスモノクローナル抗体の可変領域を含有することができる。キメラ抗体を産生する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Morrisonの文献、1985, Science 229:1202; Oiらの文献、1986, BioTechniques 4:214; Gilliesらの文献、1989, J. Immunol. Methods 125:191-202;並びに米国特許第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397号、及び第6,331,415号を参照されたい。
【０２３４】
いくつかの実施態様において、ヒト化抗体を産生する。ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することができ、かつヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域及び非ヒト免疫グロブリン(例えば、マウス免疫グロブリン)のアミノ酸配列を実質的に有するCDRを含む。ヒト化抗体は、限定されないが、CDRグラフティング(欧州特許EP 239,400号;国際公開WO 91/09967号;及び米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、及び第5,585,089号)、ベニアリング又はリサーフェシング(欧州特許EP 592,106号及びEP 519,596号; Padlanの文献、1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnickaらの文献、1994, Protein Engineering 7(6):805-814;並びにRoguskaらの文献、1994, PNAS 91:969-973)、鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)、並びに例えば、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、WO 9317105号、Tanらの文献、J. Immunol. 169:1119 25(2002)、Caldasらの文献、Protein Eng. 13(5):353-60(2000)、Moreaらの文献、Methods 20(3):267 79(2000)、Bacaらの文献、J. Biol. Chem. 272(16):10678-84(1997)、Roguskaらの文献、Protein Eng. 9(10):895 904(1996)、Coutoらの文献、Cancer Res. 55(23 Supp):5973s- 5977s(1995)、Coutoらの文献、Cancer Res. 55(8):1717-22(1995)、Sandhu JS, Gene 150(2):409-10(1994)、及びPedersenらの文献、J. Mol. Biol. 235(3):959-73(1994)に開示されている技法を含む、当技術分野で公知の種々の技法を用いて産生することができる。引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許公開US 2005/0042664 A1号(2005年2月24日)も参照されたい。
【０２３５】
ヒト抗体は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて産生することができる。例えば、機能的な内在性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用することができる。特に、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムに又は相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入することができる。或いは、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入することができる。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によって個別に又は同時に機能しないようにすることができる。特に、JH領域のホモ接合性欠失は、内在性抗体産生を妨げる。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞に顕微注入して、キメラマウスを生じさせる。その後、キメラマウスを交配させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を生じさせる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、抗原(例えば、ヒトPD-1)の全て又は一部を用いて、通常の方法で免疫する。該抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫されたトランスジェニックマウスから得ることができる。このトランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の間に再編成し、その後、クラススイッチング及び体細胞突然変異を経る。したがって、そのような技法を用いて、治療的に有用なIgG、IgA、IgM、及びIgE抗体を産生することができる。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説については、Lonberg及びHuszarの文献、1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するこの技術並びにそのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、PCT公開WO 98/24893号、WO 96/34096号、及びWO 96/33735号;並びに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、及び第5,939,598号を参照されたい。
【０２３６】
いくつかの実施態様において、ヒト抗体は、マウス-ヒトハイブリドーマを用いて産生することができる。例えば、エプスタイン・バーウイルス(EBV)で形質転換されたヒト末梢血リンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス-ヒトハイブリドーマを産生することができ、これらのマウス-ヒトハイブリドーマをスクリーニングして、標的抗原(例えば、B型インフルエンザウイルスNA)に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するものを決定することができる。そのような方法は公知であり、当技術分野で記載されている。例えば、Shinmotoらの文献、Cytotechnology, 2004, 46:19-23; Naganawaらの文献、Human Antibodies, 2005, 14:27-31を参照されたい。
【０２３７】
いくつかの実施態様において、ヒト抗体は、抗体のヒトCDR(例えば、VLCR CDR及び/又はVHCR CDR)をコードするポリヌクレオチドを、ヒトフレームワーク領域配列をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターに挿入することにより作製することができる。ある実施態様において、そのような発現ベクターは、ヒト軽鎖及び/又は重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施態様において、ヒト抗体は、ファージライブラリーから得られる抗体のヒトCDR(例えば、VLCR CDR及び/又はVHCR CDR)を、そのようなヒト発現ベクターに挿入することにより作製することができる。
【０２３８】
ある実施態様において、ヒト抗体は、非ヒト抗体の非ヒトCDR配列に相同(又は実質的に相同)であるヒトCDR配列を選択し、非ヒト抗体の非ヒトフレームワーク配列に相同(又は実質的に相同)であるヒトフレームワーク配列を選択することにより作製することができる。
【０２３９】
単鎖抗体、例えば、軽鎖を欠く抗体は、当技術分野で周知の方法によって産生することができる。Riechmannらの文献、1999, J. Immunol. 231:25-38; Nuttallらの文献、2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3):253-263; Muyldermanの文献、2001, J. Biotechnol. 74(4):277302; 米国特許第6,005,079号;並びに国際公開WO 94/04678号、第WO 94/25591号、及び第WO 01/44301号を参照されたい。
【０２４０】
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、1つの抗原の2つの異なるエピトープ又は2つの抗原の2つの異なるエピトープに結合することができる。具体的な実施態様において、二重特異性抗体は、2つの異なる抗原結合ドメインを有し、ここで、各々のドメインは、異なる抗原に特異的に結合する。他のそのような抗体は、第一の抗原(例えば、ヒトPD-1)に結合し、第二の抗原にさらに結合することができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab'):二重特異性抗体)として調製することができる。
【０２４１】
二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。(例えば、Millsteinらの文献、Nature, 305:537-539(1983); Trauneckerらの文献、EMBO J., 10:3655-3659(1991); Sureshらの文献、Methods in Enzymology, 121:210(1986); Kostelnyらの文献、J. Immunol., 148(5):1547-1553(1992); Hollingerらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993); Gruberらの文献、J. Immunol., 152:5368(1994);米国特許第4,474,893号;第4,714,681号;第4,925,648号;第5,573,920号;第5,601,81号;第95,731,168号;第4,676,980号;及び第4,676,980号、WO 94/04690号; WO 91/00360号; WO 92/200373号; WO 93/17715号; WO 92/08802号;及びEP 03089号を参照されたい)。
【０２４２】
目的の抗原(例えば、ヒトPD-1)に結合する本明細書に記載される抗体(例えば、本明細書に記載される全長抗体、抗体の重鎖及び/もしくは軽鎖、又は単鎖抗体)の組換え発現は、例えば、抗体又はその断片(例えば、VLCR及び/もしくはVHCR)をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター(例えば、発現ベクター)の構築を伴うことができる。ひとたび本明細書に記載される抗体分子、抗体の重鎖及び/もしくは軽鎖、又はこれらの抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドが得られれば、該抗体分子の産生用のベクターを当技術分野で周知の技法を用いる組換えDNA技術によって産生することができる。抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が本明細書に記載されている。当業者に周知である方法を用いて、抗体コード配列と適切な転写及び翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えDNA技法、合成技法、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。また提供されるのは、プロモーターに機能的に連結された、本明細書に記載される抗体分子、抗体の重鎖又は軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン又はこれらの断片、或いは重鎖又は軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能ベクターである。そのようなベクターは、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ(例えば、国際公開WO 86/05807号及びWO 89/01036号;並びに米国特許第5,122,464号を参照)、該抗体の可変ドメインを、完全な重鎖、完全な軽鎖、又は完全な重鎖と完全な軽鎖の両方の発現用のそのようなベクターにクローニングすることができる。
【０２４３】
例えば、抗原性断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能ドメイン、グリコシル化部位、及び配列アラインメントを決定するためのソフトウェアパッケージ及びデータベースが利用可能である(例えば、GenBank、Vector NTI(登録商標) Suite(Informax社、Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package(Accelrys社、San Diego, CA); DeCypher(登録商標)(TimeLogic社、Crystal Bay, Nevada); Menneらの文献(2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menneらの文献(2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wrenらの文献(2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijneの文献(1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijneの文献(1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690を参照)。
【０２４４】
発現ベクターを従来の技法によって細胞(例えば、宿主細胞)に移入することができ、その後、得られた細胞を従来の技法によって培養して、本明細書に記載される抗体又はその断片を産生することができる。したがって、本明細書に提供されるのは、宿主細胞におけるそのような配列の発現用のプロモーターに機能的に連結された、本明細書に記載される抗体もしくはその断片、又はその重鎖もしくは軽鎖、又はその抗原結合断片、又は本明細書に記載される単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞である。ある実施態様において、例えば、二本鎖抗体の発現のために、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを個別に、以下で詳述される、完全な免疫グロブリン分子の発現用の宿主細胞で共発現させることができる。ある実施態様において、宿主細胞は、本明細書に記載される抗体の重鎖と軽鎖の両方、又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する。具体的な実施態様において、宿主細胞は、第一のベクターが本明細書に記載される抗体の重鎖又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含み、第二のベクターが本明細書に記載される抗体の軽鎖又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む、2つの異なるベクターを含有する。他の実施態様において、第一の宿主細胞は、本明細書に記載される抗体の重鎖又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクターを含み、第二の宿主細胞は、本明細書に記載される抗体の軽鎖又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含む。
【０２４５】
種々の宿主発現ベクター系を利用して、本明細書に記載される抗体分子を発現させることができる(例えば、米国特許第5,807,715号を参照)。そのような宿主発現系は、目的のコード配列を産生し、その後、精製することができるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又はトランスフェクトしたとき、本明細書に記載される抗体分子をインサイチュで発現することができる細胞も表す。これらには、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌及びB.スブティリス(B.subtilis))などの微生物;抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロミセス・ピキア(Saccharomyces Pichia));抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染したもしくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系(例えば、緑藻、例えば、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii));又は哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現コンストラクトを保有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa、及びNIH 3T3細胞)が含まれるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、哺乳動物発現ベクターは、pOptiVEC(商標)又はpcDNA3.3である。好ましくは、細菌細胞、例えば、大腸菌、及びより好ましくは、組換え抗体分子全体の発現のための真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併せたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳動物細胞は、抗体の効果的な発現系である(Foeckingらの文献、1986, Gene 45:101;及びCockettらの文献、1990, Bio/Technology 8:2)。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は、CHO細胞又はNS0細胞によって産生される。具体的な実施態様において、目的の抗原(例えば、ヒトPD-1)に結合する本明細書に記載される抗体(又はその断片)をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターによって調節される。
【０２４６】
細菌系では、いくつかの発現ベクターを、発現される抗体分子に意図される用途に応じて、有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物の作製のために、大量のそのような抗体が産生されることになっている場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましいものとなり得る。そのようなベクターとしては、大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherらの文献、1983, EMBO 12:1791)(このベクターでは、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列をlac Zコード領域とインフレームで個々に連結させてベクターに入れることができる); pINベクター(Inouye及びInouyeの文献、1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke及びSchusterの文献、1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509);などが挙げられるが、これらに限定されない。pGEXベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオン 5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスのグルタチオンアガロースビーズへの吸着及び結合と、それに続く、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をGST部分から遊離させることができるように、トロンビン又は第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０２４７】
昆虫系では、キンウワバ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして用いて、外来遺伝子を発現させる。該ウイルスは、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞内で成長する。抗体コード配列を該ウイルスの非必須領域(例えば、ポリへドリン遺伝子)に個々にクローニングし、AcNPVプロモーター(例えば、ポリへドリンプロモーター)の制御下に配置することができる。
【０２４８】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コード配列をアデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三部分リーダー配列に連結させることができる。その後、このキメラ遺伝子をインビトロ又はインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域El又はE3)への挿入は、生存可能であり、かつ感染した宿主で抗体分子を発現することができる組換えウイルスを生じさせる(例えば、Logan及びShenkの文献、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359を参照)。特定の開始シグナルも、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳に必要となり得る。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するために、所望のコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の種々の起源のものであることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強することができる(例えば、Bittnerらの文献、1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照)。
【０２４９】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、任意のタイプの細胞、例えば、初代細胞又は細胞株由来の細胞を指す。具体的な実施態様において、「宿主細胞」という用語は、ポリヌクレオチドがトランスフェクトされた細胞及びそのような細胞の子孫又は潜在的子孫を指す。そのような細胞の子孫は、後の世代で起こり得る突然変異もしくは環境の影響又は宿主細胞ゲノムへのポリヌクレオチドの組込みのために、該ポリヌクレオチドがトランスフェクトされた親細胞と同一でなくてもよい。
【０２５０】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、又は遺伝子産物を所望の特定の方法で修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)及びプロセシング(例えば、切断)は、該タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾の特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株又は宿主系を選択して、発現される外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを保証することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を保有する真核生物宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、及びT47D、NS0(免疫グロブリン鎖を内在性に産生しないマウス骨髄腫細胞株)、CRL7O3O、並びにHsS78Bstが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態様において、本明細書に記載されるヒト化モノクローナル抗体は、哺乳動物細胞、例えば、CHO細胞で産生される。
【０２５１】
組換えタンパク質の長期間にわたる高収率産生のために、安定発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定発現する細胞株を人為作製することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって制御されるDNAと選択マーカーとで形質転換することができる。外来DNAの導入後、人為作製された細胞を濃縮培地中で1〜2日間成長させておくことができ、その後、選択培地に移し替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体にプラスミドを安定に組み込み、成長して、フォーカスを形成するのを可能にし、次に、このフォーカスをクローニングし、増殖させて、細胞株にすることができる。この方法を有利に用いて、抗体分子を発現する細胞株を人為作製することができる。そのような人為作製された細胞株は、抗体分子と直接的に又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価に特に有用であり得る。
【０２５２】
いくつかの選択系を使用することができ、これには、それぞれ、tk-細胞、hgprt-細胞、又はaprt-細胞で利用することができる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(Wiglerらの文献、1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Szybalska及びSzybalskiの文献、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202)、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Lowyらの文献、1980, Cell 22:8-17)が含まれるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗薬耐性を、以下の遺伝子: dhfr(これは、メトトレキサートに対する耐性を付与する)(Wiglerらの文献、1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hareらの文献、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt(これは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する)(Mulligan及びBergの文献、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo(これは、アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与する)(Wu及びWuの文献、1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshevの文献、1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulliganの文献、1993, Science 260:926-932;並びにMorgan及びAndersonの文献、1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):l55-2 15);並びにhygro(これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する)(Santerreらの文献、1984, Gene 30:147)の選択の基礎として使用することができる。組換えDNA技術の分野で一般に公知の方法をルーチンに適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、そのような方法は、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Ausubelら(編)、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley & Sons, NY(1993); Krieglerの文献、遺伝子導入及び発現、実験室マニュアル(Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual)、Stockton Press, NY(1990);並びにDracopoliら(編)、ヒト遺伝学の最新プロトコル(Current Protocols in Human Genetics)、John Wiley & Sons, NY(1994)の第12章及び第13章; Colberre-Garapinらの文献、1981, J. Mol. Biol. 150:1に記載されている。
【０２５３】
抗体分子の発現レベルをベクター増幅によって増大させることができる(概説については、Bebbington及びHentschelの文献、DNAクローニングでの哺乳動物細胞におけるクローニングされた遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの使用(The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning)、第3巻(Academic Press, New York, 1987)を参照)。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在するインヒビターのレベルの増加は、該マーカー遺伝子のコピー数を増加させることになる。増幅される領域が抗体遺伝子と関連しているので、該抗体の産生も増加することになる(Crouseらの文献、1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
【０２５４】
宿主細胞を、第一のベクターが重鎖由来ポリペプチドをコードし、第二のベクターが軽鎖由来ポリペプチドをコードする、本明細書に記載される2以上の発現ベクターでコトランスフェクトすることができる。この2つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有することができる。
【０２５５】
或いは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、かつ発現することができる、単一のベクターを使用することができる。そのような状況では、毒性のある過剰な遊離の重鎖を避けるために、軽鎖を重鎖の前に配置するべきである(Proudfootの文献、1986, Nature 322:52;及びKohlerの文献、1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-2199)。重鎖及び軽鎖のコード配列は、cDNA又はゲノムDNAを含むことができる。発現ベクターは、単シストロン性又は多シストロン性であることができる。多シストロン性核酸コンストラクトは、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、もしくはそれより多く、又は2〜5、5〜10、もしくは10〜20個の範囲の遺伝子/ヌクレオチド配列をコードすることができる。例えば、2シストロン性核酸コンストラクトは、以下の順序で、プロモーター、第一の遺伝子(例えば、本明細書に記載される抗体の重鎖)、及び第二の遺伝子(例えば、本明細書に記載される抗体の軽鎖)を含むことができる。そのような発現ベクターでは、両方の遺伝子の転写をプロモーターによって駆動することができるのに対し、第一の遺伝子からのmRNAの翻訳は、キャップ依存的なスキャニング機構によるものであることができ、第二の遺伝子からのmRNAの翻訳は、キャップ非依存的な機構による、例えば、IRESによるものであることができる。
【０２５６】
ひとたび本明細書に記載される抗体分子が組換え発現によって産生されれば、これを、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインAの後ろの特異的抗原に対する親和性によるもの、及びサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解によるか、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技法によって精製することができる。さらに、本明細書に記載される抗体を本明細書に記載されるか又は別の形で当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合させて、精製を容易にすることができる。
【０２５７】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される抗体(例えば、モノクローナル抗体、例えば、ヒト化もしくはキメラ抗体又はこれらの抗原結合断片)は、単離又は精製されている。通常、単離された抗体は、該単離された抗体と異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体である。例えば、特定の実施態様において、本明細書に記載される抗体の調製物は、細胞物質及び/又は化学前駆物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、抗体が、それが単離されるか又は組換え産生される細胞の細胞成分から分離されている抗体の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まない抗体は、(乾燥重量で)約30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％、又は0.1％未満の異種タンパク質(本明細書では、「夾雑タンパク質」とも呼ばれる)及び/又は抗体の変異体、例えば、異なる翻訳後修飾形態の抗体もしくは他の異なるバージョンの抗体(例えば、抗体断片)を有する抗体の調製物を含む。抗体が組換え産生される場合、それも、通常、培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約20％、10％、2％、1％、0.5％、又は0.1％未満に相当する。抗体が化学合成によって産生される場合、それは、通常、化学前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、それは、タンパク質の合成に関与する化学前駆物質又は他の化学物質から分離されている。したがって、そのような抗体調製物は、(乾燥重量で)約30％、20％、10％、5％未満の目的の抗体以外の化学前駆物質又は化合物を有する。具体的な実施態様において、本明細書に記載される抗体は、単離又は精製されている。
【０２５８】
(5.6  組成物及び投与経路)
本明細書に包含されるのは、組成物中の本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV;例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)の使用である。また本明細書に包含されるのは、組成物中のNDV感染細胞又はNDVに感染させた全癌細胞由来の形質膜断片の使用である。具体的な実施態様において、該組成物は、免疫原性製剤(例えば、ワクチン製剤)などの医薬組成物である。該組成物を癌の治療方法で使用することができる。
【０２５９】
一実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV;例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)を含む。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、ここで、該パッケージングされたゲノムのゲノムRNA配列は、配列番号51、52、又は60に示されている通りである。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV;例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)、及び任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。いくつかの実施態様において、該NDV(例えば、キメラNDV;例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)は、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。
【０２６０】
別の実施態様において、医薬組成物(例えば、腫瘍溶解性ワクチン)は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、NDVに感染させた癌細胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜断片調製物を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。別の実施態様において、医薬組成物(例えば、全細胞ワクチン)は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、NDVに感染させた癌細胞を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。
【０２６１】
別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、本明細書に記載されるPD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.5節を参照)を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の本明細書に記載されるPD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.5節を参照)、及び任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。いくつかの実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.5節を参照)は、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。
【０２６２】
別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、PD-1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の本明細書に記載されるPD-1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)、及び任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。ある実施態様において、医薬組成物は、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV)をさらに含む。ある実施態様において、医薬組成物は、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV)をさらに含む。いくつかの実施態様において、該PD-1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)は、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。具体的な実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ニボルマブである。好ましい実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ペンブロリズマブである。具体的な実施態様において、該PD-1遮断は: Kabat付番体系に従って決定される、(a)アミノ酸配列
【化１４１】
2020519641.tif 000143
を含むVLCR CDR1、(b)アミノ酸配列
【化１４２】
2020519641.tif 000144
を含むVLCR CDR2、(c)アミノ酸配列
【化１４３】
2020519641.tif 000145
を含むVLCR CDR3、(d)アミノ酸配列
【化１４４】
2020519641.tif 000146
を含むVHCR CDR1、(e)アミノ酸配列
【化１４５】
2020519641.tif 000147
を含むVHCR CDR2、及び(f)アミノ酸配列
【化１４６】
2020519641.tif 000148
を含むVHCR CDR3を含む。別の具体的な実施態様において、該PD-1遮断は:(a)アミノ酸配列
【化１４７】
2020519641.tif 000149
を含むVLCR CDR1、(b)アミノ酸配列
【化１４８】
2020519641.tif 000150
を含むVLCR CDR2、(c)アミノ酸配列
【化１４９】
2020519641.tif 000151
を含むVLCR CDR3、(d)アミノ酸配列
【化１５０】
2020519641.tif 000152
を含むVHCR CDR1、(e)アミノ酸配列
【化１５１】
2020519641.tif 000153
を含むVHCR CDR2、及び(f)アミノ酸配列
【化１５２】
2020519641.tif 000154
を含むVHCR CDR3を含む。
【０２６３】
別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、PD-L1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の本明細書に記載されるPD-L1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)、及び任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。ある実施態様において、医薬組成物は、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV)をさらに含む。ある実施態様において、医薬組成物は、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV)をさらに含む。いくつかの実施態様において、該PD-L1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)は、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。具体的な実施態様において、該PD-L1遮断抗体は、デュラルマブ(duralumab)又はアゼルマブ(azelumab)である。
【０２６４】
PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを含む医薬組成物の具体的な実施態様において、該医薬組成物は、凍結乾燥粉末又はケーキとして製剤化される。具体的な実施態様において、凍結乾燥粉末又はケーキは、再構成用の使い捨てバイアルに包装される。具体的な実施態様において、凍結乾燥粉末又はケーキは、L-ヒスチジン、ポリソルベート80、及びスクロース、並びに任意に、pHを5.5に調整するための塩酸及び/又は水酸化ナトリウム中に製剤化される。具体的な実施態様において、凍結乾燥粉末又はケーキは、所望の濃度のPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを得るための一定量の滅菌注射用水で、例えば、該滅菌注射用水を該凍結乾燥粉末又はケーキを含むバイアルに注入し、該バイアルをゆっくりと回転させて、該凍結乾燥粉末又はケーキの再構成を可能にし、しばらくの間、該凍結乾燥粉末又はケーキが完全に再構成されるのを待つことにより再構成される。具体的な実施態様において、2mLの再構成されたアンタゴニストは、50mgの該アンタゴニストを含有しており、かつL-ヒスチジン(3.1mg)、ポリソルベート80(0.4mg)、及びスクロース(140mg)、並びに任意に、pHを5.5を調整するための塩酸及び/又は水酸化ナトリウム中に製剤化される。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、KETRUDA(ペンブロリズマブ)に関する完全処方情報(Full Prescribing Information for KETRUDA(Pembrolizuma))、Reference ID: 3862712を参照されたい。ひとたび再構成されれば、該医薬組成物を、再構成時から6時間未満の間、室温で、又は再構成時から24時間未満の間、摂氏2℃〜摂氏8℃で冷蔵して保存するべきである。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、KETRUDA(ペンブロリズマブ)に関する完全処方情報(Full Prescribing Information for KETRUDA(Pembrolizuma))、Reference ID: 3862712を参照されたい。具体的な実施態様において、再構成された医薬組成物は、静脈内注入用にさらに製剤化される。例えば、所望の量の再構成されたPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、例えば、所望の濃度のPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを得るのに好適な容量の0.9％塩化ナトリウム又は5％ブドウ糖を含有する滅菌静脈内バッグに移される。
【０２６５】
PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを含む医薬組成物の別の具体的な実施態様において、該医薬組成物は、液体溶液として製剤化される。具体的な実施態様において、該医薬組成物は、静脈内注入用にさらに製剤化される。例えば、所望の量の該医薬組成物は、例えば、所望の濃度のPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを得るのに好適な容量の0.9％塩化ナトリウム又は5％ブドウ糖を含有する滅菌静脈内バッグに移される。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、OPDIVO(ニボルマブ)に関する完全処方情報(Full Prescribing Information for OPDIVO(nivolumab))、Reference ID: 3677021を参照されたい。
【０２６６】
別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、(i)本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)、並びに(ii)本明細書に記載されるPD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.5節を参照)を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の(i)本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)、並びに(ii)本明細書に記載されるPD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.5節を参照)、並びに任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。いくつかの実施態様において、該NDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)及び該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。
【０２６７】
別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、(i)IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV、及び(ii)本明細書に記載されるPD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.5節を参照)を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の(i)本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)、並びに(ii)本明細書に記載されるPD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.5節を参照)、並びに任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の(i)IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV、及び(ii)本明細書に記載されるPD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.5節を参照)、並びに任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。いくつかの実施態様において、該NDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)並びに該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。具体的な実施態様において、該IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV及び該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。
【０２６８】
別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、(i)IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV、及び(ii)PD-1遮断抗体(例えば、第5.5節に記載されているものなど)を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の(i)本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)、並びに(ii)本明細書に記載されるPD-1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)、並びに任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の(i)IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV、及び(ii)本明細書に記載されるPD-1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)、並びに任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。いくつかの実施態様において、該NDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)並びに該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。具体的な実施態様において、該IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV及び該PD-1遮断抗体は、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。具体的な実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ニボルマブである。好ましい実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ペンブロリズマブである。具体的な実施態様において、該医薬組成物は:(i)Kabat付番体系に従って決定される:(a)アミノ酸配列
【化１５３】
2020519641.tif 000155
を含むVLCR CDR1、(b)アミノ酸配列
【化１５４】
2020519641.tif 000156
を含むVLCR CDR2、(c)アミノ酸配列
【化１５５】
2020519641.tif 000157
を含むVLCR CDR3、(d)アミノ酸配列
【化１５６】
2020519641.tif 000158
を含むVHCR CDR1、(e)アミノ酸配列
【化１５７】
2020519641.tif 000159
を含むVHCR CDR2、及び(f)アミノ酸配列
【化１５８】
2020519641.tif 000160
を含むVHCR CDR3を含む抗体;並びに(ii)配列番号51に示されるヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVを含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は:(i)Kabat付番体系に従って決定される:(a)アミノ酸配列
【化１５９】
2020519641.tif 000161
を含むVLCR CDR1、(b)アミノ酸配列
【化１６０】
2020519641.tif 000162
を含むVLCR CDR2、(c)アミノ酸配列
【化１６１】
2020519641.tif 000163
を含むVLCR CDR3、(d)アミノ酸配列
【化１６２】
2020519641.tif 000164
を含むVHCR CDR1、(e)アミノ酸配列
【化１６３】
2020519641.tif 000165
を含むVHCR CDR2、及び(f)アミノ酸配列
【化１６４】
2020519641.tif 000166
を含むVHCR CDR3を含む抗体;並びに(ii)配列番号52に示されるヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVを含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は:(i)Kabat付番体系に従って決定される:(a)アミノ酸配列
【化１６５】
2020519641.tif 000167
を含むVLCR CDR1、(b)アミノ酸配列
【化１６６】
2020519641.tif 000168
を含むVLCR CDR2、(c)アミノ酸配列
【化１６７】
2020519641.tif 000169
を含むVLCR CDR3、(d)アミノ酸配列
【化１６８】
2020519641.tif 000170
を含むVHCR CDR1、(e)アミノ酸配列
【化１６９】
2020519641.tif 000171
を含むVHCR CDR2、及び(f)アミノ酸配列
【化１７０】
2020519641.tif 000172
を含むVHCR CDR3を含む抗体;並びに(ii)配列番号60に示されるヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVを含む。
【０２６９】
別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、(i)IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV、及び(ii)PD-L1遮断抗体(例えば、第5.5節に記載されているものなど)を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の(i)本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)、並びに(ii)本明細書に記載されるPD-L1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)、並びに任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の(i)IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV、及び(ii)本明細書に記載されるPD-L1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)、並びに任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。いくつかの実施態様において、該NDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)並びに該PD-L1又はそのリガンドのアンタゴニストは、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。具体的な実施態様において、該IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV及び該PD-L1遮断抗体は、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。具体的な実施態様において、該PD-L1遮断抗体は、デュラルマブ(duralumab)又はアベルマブである。
【０２７０】
本明細書に提供される医薬組成物は、該組成物を対象に投与することを可能にする任意の形態であることができる。具体的な実施態様において、該医薬組成物は、動物及び/又はヒトへの投与に好適である。本明細書で使用される場合、「医薬として許容し得る」という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局に承認されているか、又は米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、それとともに医薬組成物が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクル体を指す。生理食塩水溶液及び水性デキストロース溶液及びグリセロール溶液は、特に注射用溶液のための液体担体として利用することもできる。好適な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。好適な医薬担体の例は、E. W. Martin著、「レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。製剤は、投与様式に適するべきである。
【０２７１】
具体的な実施態様において、医薬組成物は、対象への意図された投与経路に適するように製剤化される。例えば、医薬組成物は、非経口、静脈内、動脈内、胸腔内、吸入、腹腔内、経口、皮内、結腸直腸、腹腔内、頭蓋内、及び腫瘍内投与に適するように製剤化することができる。具体的な実施態様において、医薬組成物は、静脈内、動脈内、経口、腹腔内、鼻腔内、気管内、胸腔内、頭蓋内、皮下、筋肉内、局所、肺、又は腫瘍内投与用に製剤化することができる。
【０２７２】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)を含む医薬組成物は、該対象(例えば、ヒト対象)への腫瘍内投与に好適であるように製剤化される。具体的な実施態様において、IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVを含む医薬組成物は、該対象(例えば、ヒト対象)への腫瘍内投与に好適であるように製剤化される。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号51に示される配列を含むか、又は該配列からなる。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号52に示される配列を含むか、又は該配列からなる。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号60に示される配列を含むか、又は該配列からなる。
【０２７３】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節、第5.2節、及び/又は第6節を参照)を含む医薬組成物は、該対象(例えば、ヒト対象)への静脈内投与に好適であるように製剤化される。具体的な実施態様において、IL-12(例えば、ヒトIL-12)又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVを含む医薬組成物は、該対象(例えば、ヒト対象)への静脈内投与に好適であるように製剤化される。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号51に示されている通りである。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号52に示されている通りである。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号60に示されている通りである。
【０２７４】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるPD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.5節を参照)を含む医薬組成物は、該対象(例えば、ヒト対象)への静脈内投与に好適であるように製剤化される。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるPD-1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)を含む医薬組成物は、該対象(例えば、ヒト対象)への静脈内投与に好適であるように製剤化される。具体的な実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ニボルマブである。好ましい実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ペンブロリズマブである。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるPD-L1遮断抗体(例えば、第5.5節を参照)を含む医薬組成物は、該対象(例えば、ヒト対象)への静脈内投与に好適であるように製剤化される。具体的な実施態様において、該PD-L1遮断抗体は、デュラルマブ(duralumab)又はアベルマブである。
【０２７５】
(5.7  抗癌用途及び他の用途)
(5.7.1  NDV-IL12及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを用いて癌を治療する方法)
一態様において、本明細書に提示されるのは、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、第5.2節及び/もしくは第6節に記載されるキメラNDV)又はそのようなキメラNDVを含む組成物を、PD-1もしくはそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、第5.5節及び/もしくは第6節に記載されているアンタゴニスト)又はそのようなアンタゴニストを含む組成物と組み合わせて利用して、癌を治療する方法であって、該キメラNDVがIL-12又はその誘導体をコードするパッケージングされたゲノムを含む、方法である。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。該キメラNDV、又はその組成物、及び該PD-1もしくはそのリガンドのアンタゴニスト、又はその組成物は、任意の次数の治療(例えば、第一次、第二次、第三次、第四次、又は第五次治療)として使用することができる。具体的な実施態様において、該治療方法は、該対象に、第5.7.6節、例えば、第5.7.6.1節に記載されている1以上のさらなる療法を投与することをさらに含む。
【０２７６】
一実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、対象に、キメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12又はその誘導体(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、対象に、有効量のキメラNDV及び有効量のPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12又はその誘導体(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。該キメラNDV及びアンタゴニストは、同時に又は連続的に、該対象に投与することができる。ある実施態様において、該キメラNDV及びアンタゴニストは、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該キメラNDV及びアンタゴニストは、異なる組成物中で投与される。該キメラNDV及びアンタゴニストは、同じ又は異なる投与経路で該対象に投与することができる。当業者に公知の又は本明細書に記載される任意の経路を用いて、該キメラNDV及びアンタゴニストを投与することができる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは腫瘍内に投与され、該アンタゴニストは、静脈内に投与される。いくつかの実施態様において、該キメラNDV及び該アンタゴニストは、静脈内に投与される。
【０２７７】
別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療するためのPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストと組み合わせて使用するための医薬の調製におけるキメラNDVの使用であり、ここで、該キメラNDVは、IL-12又はその誘導体(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む。別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該方法は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、ヒトIL-12)を投与することをさらに含む。具体的な実施態様において、該IL-12又はその誘導体は、該キメラNDVに感染した細胞によって発現される。該キメラNDV及びアンタゴニストは、同時に又は連続的に、該対象に投与することができる。ある実施態様において、該キメラNDV及びアンタゴニストは、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該キメラNDV及びアンタゴニストは、異なる組成物中で投与される。該キメラNDV及びアンタゴニストは、同じ又は異なる投与経路で該対象に投与することができる。当業者に公知の又は本明細書に記載される任意の経路を用いて、該キメラNDV及びアンタゴニストを投与することができる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは腫瘍内に投与され、該アンタゴニストは、静脈内に投与される。いくつかの実施態様において、該キメラNDV及び該アンタゴニストは、静脈内に投与される。別の実施態様において、該キメラNDVは、リンパ節内に投与され、該アンタゴニストは静脈内に投与される。
【０２７８】
別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象(例えば、ヒト対象)に、キメラNDVを含む第一の組成物及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを含む第二の組成物を投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子がIL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードする、方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象(例えば、ヒト対象)に、キメラNDV及びPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12をコードするパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該PD-1のアンタゴニストが、PD-1に結合し、かつPD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方)との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断する抗体(本明細書では、「PD-1遮断抗体」と呼ばれることもある)である、方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象(例えば、ヒト対象)に、キメラNDVを含む第一の組成物及びPD-1遮断抗体を含む第二の組成物を投与することを含み、ここで、該キメラNDVがIL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子がIL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードする、方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としているヒト対象に、キメラニューカッスル病ウイルス(NDV)を含む第一の組成物及びPD-1遮断抗体を含む第二の組成物を投与することを含み、ここで、該キメラNDVがヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子がヒトIL-12 p40サブユニット及びヒトIL-12 p35サブユニットをコードする、方法である。具体的な実施態様において、該ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号51に示されている通りである。具体的な実施態様において、該ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号52に示されている通りである。具体的な実施態様において、該ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号60に示されている通りである。好ましい実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ペンブロリズマブである。他の実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ニボルマブ、MEDI0680、PDR001、又はアテゾリズマブである。該第一及び第二の組成物は、同じ又は異なる投与経路で投与することができる。当業者に公知の又は本明細書に記載される任意の経路を用いて、該第一及び第二の組成物を投与することができる。具体的な実施態様において、該第一の組成物は、腫瘍内に投与され、該第二の組成物は、静脈内に投与される。いくつかの実施態様において、該第一及び第二の組成物は、静脈内に投与される。例えば、NDVに関する情報については、上の第5.1節及び第5.2節、並びに下の第6節を、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストに関する情報については、上の第5.5節及び下の第6節を、組成物及び投与経路に関する情報については、上の第5.5.1節を参照されたい。
【０２７９】
別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療するためのPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストと組み合わせて使用するための医薬の調製におけるキメラNDVの使用であり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードする。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療するためのPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストと組み合わせて使用するための医薬の調製におけるキメラNDVの使用であり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードするパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該PD-1のアンタゴニストは、PD-1(例えば、ヒトPD-1)に結合し、かつPD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方)との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断する抗体(本明細書では、「PD-1遮断抗体」と呼ばれることもある)である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療するためのPD-1遮断抗体と組み合わせて使用するための医薬の調製におけるキメラNDVの使用であり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードする。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療するためのPD-1遮断抗体と組み合わせて使用するための医薬の調製におけるキメラNDVの使用であり、ここで、該キメラNDVは、ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、ヒトIL-12 p40サブユニット及びヒトIL-12 p35サブユニットをコードする。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号51に示されている通りである。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号52に示されている通りである。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号60に示されている通りである。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、表7に示される配列を有するIL-12アミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、表7に示されるアミノ酸配列を含むIL-12アミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、表8に示される配列のヌクレオチド配列を含むIL-12をコードする導入遺伝子。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子は、表8に示される配列からなる。好ましい実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ペンブロリズマブである。他の実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ニボルマブ、MEDI0680、PDR001、又はアテゾリズマブである。該第一及び第二の組成物(すなわち、該キメラNDV及び該アンタゴニスト)は、同じ又は異なる投与経路で投与することができる。当業者に公知の又は本明細書に記載される任意の経路を用いて、該第一及び第二の組成物(すなわち、該キメラNDV及び該アンタゴ���スト)を投与することができる。具体的な実施態様において、該第一の組成物(すなわち、該キメラNDV)は腫瘍内に投与され、該第二の組成物(すなわち、該アンタゴニスト)は静脈内に投与される。別の具体的な実施態様において、該第一の組成物(すなわち、該キメラNDV)は、リンパ節内に投与され、該第二の組成物(すなわち、該アンタゴニスト)は静脈内に投与される。いくつかの実施態様において、該第一及び第二の組成物(すなわち、該キメラNDV及び該アンタゴニスト)は静脈内に投与される。例えば、NDVに関する情報については、上の第5.1節及び第5.2節、並びに下の第6節を、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストに関する情報については、上の第5.5節及び下の第6節を、組成物及び投与経路に関する情報については、上の第5.5.1節を参照されたい。
【０２８０】
別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードし、かつここで、該方法は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することをさらに含む。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードし、該方法は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することをさらに含み、かつここで、該PD-1のアンタゴニストは、PD-1(例えば、ヒトPD-1)に結合し、かつPD-1とそのリガンド(例えば、PD-L1、PD-L2のどちらか、又は両方)との相互作用を(完全に又は部分的に)遮断する抗体(本明細書では、「PD-1遮断抗体」と呼ばれることもある)である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVは、IL-12(例えば、ヒトIL-12)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードし、かつここで、該方法は、PD-1遮断抗体を投与することをさらに含む。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであり、ここで、該キメラNDVは、ヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、ヒトIL-12 p40サブユニット及びヒトIL-12 p35サブユニットをコードし、かつここで、該方法は、PD-1遮断抗体を投与することをさらに含む。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号51に示されている通りである。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号52に示されている通りである。具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号60に示されている通りである。好ましい実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ペンブロリズマブである。他の実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ニボルマブ、PDR001、MEDI0680、又はアテゾリズマブである。該第一及び第二の組成物(すなわち、該キメラNDV及び該アンタゴニスト)は、同じ又は異なる投与経路で投与することができる。当業者に公知の又は本明細書に記載される任意の経路を用いて、該第一及び第二の組成物(すなわち、該キメラNDV及び該アンタゴニスト)を投与することができる。具体的な実施態様において、該第一の組成物(すなわち、該キメラNDV)は腫瘍内に投与され、かつ該第二の組成物(すなわち、該アンタゴニスト)は静脈内に投与される。別の具体的な実施態様において、該第一の組成物(すなわち、該キメラNDV)は、リンパ節内に投与され、第二の組成物(すなわち、該アンタゴニスト)は、静脈内に投与される。いくつかの実施態様において、該第一及び第二の組成物(すなわち、該キメラNDV及び該アンタゴニスト)は、静脈内に投与される。例えば、NDVに関する情報については、上の第5.1節及び第5.2節、並びに下の第6節を、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストに関する情報については、上の第5.5節及び下の第6節を、組成物及び投与経路に関する情報については、上の第5.5.1節を参照されたい。
【０２８１】
具体的な実施態様において、該キメラNDVは、ヒトIL-12導入遺伝子をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子は、IL-12 p40サブユニット及びIL-12 p35サブユニットをコードする。IL-12導入遺伝子の例については、例えば、第5.2.1節、第5.7節、及び第6節を参照されたい。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、La Sota株のNDV骨格を含む。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、長潜伏期性であるNDV骨格を含む。具体的な実施態様において、該パッケージングされたゲノムは、突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該突然変異型Fタンパク質は、該キメラNDVによって発現され、ここで、該突然変異型Fタンパク質は、突然変異した切断部位を含む。具体的な実施態様において、該パッケージングされたゲノムは、アミノ酸突然変異L289A(すなわち、NDV La Sota株 Fタンパク質のL289に対応するアミノ酸位置におけるLからAへの突然変異)を有する突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該突然変異型Fタンパク質は、該キメラNDVによって発現される。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、La Sota株であるNDV骨格を含み、かつここで、該パッケージングされたゲノムは、アミノ酸突然変異L289A(すなわち、NDV La Sota株 Fタンパク質のL289に対応するアミノ酸位置におけるLからAへの突然変異)を有する突然変異型Fタンパク質をコードし、ここで、該突然変異型Fタンパク質は、該キメラNDVによって発現される。IL-12又はその誘導体をコードするキメラNDVの例については、例えば、第5.2節及び第6節を参照されたい。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、配列番号51、52、又は60に示されるヌクレオチド配列を有するパッケージングされたゲノムを含む。
【０２８２】
具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、第5.5節及び/又は第6節に記載されているアンタゴニストである。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1のリガンドに特異的に結合する抗体(もしくはその抗原結合断片)又は可溶性受容体である。ある実施態様において、該可溶性受容体は、PD-1のリガンドに特異的に結合するPD-1の断片又はPD-1の誘導体の断片(例えば、PD-1又はPD-1の誘導体の細胞外ドメイン)である。いくつかの実施態様において、該可溶性受容体は、PD-1又はPD-1の誘導体の少なくとも一部(例えば、PD-1又はPD-1の誘導体の細胞外ドメイン)と異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質である。具体的な実施態様において、該融合タンパク質は、PD-1又はPD-1の誘導体の少なくとも一部と免疫グロブリンのFc部分又はその断片を含む。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1のリガンドに特異的に結合する抗体(又はその抗原結合断片)である。別の実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1に結合するが、抑制シグナルを伝達しない抗体(もしくはその抗原結合断片)又はリガンドである。別の実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、PD-1に結合するが、抑制シグナルを伝達しないリガンドである。ある具体的な実施態様において、該リガンドは、PD-1のリガンド又はPD-1のリガンドの誘導体の少なくとも一部と異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質である。具体的な実施態様において、該融合タンパク質は、PD-1のリガンド又はPD-1のリガンドの誘導体の少なくとも一部と免疫グロブリンのFc部分又はその断片を含む。PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの非限定的な例としては、ペンブロリズマブ(「KEYTRUDA(登録商標)」;例えば、Hamidらの文献、N Engl J Med. 2013;369:134-44及びKEYTRUDA(ペンブロリズマブ)に関する完全処方情報(Full Prescribing Information for KEYTRUDA(Pembrolizumab))、Reference ID: 3862712を参照)、ニボルマブ(「OPDIVO(登録商標)」;例えば、Topalianらの文献、N Engl J Med. 2012;366:2443-54及びOPDIVO(ニボルマブ)に関する完全処方情報(Full Prescribing Information for OPDIVO(nivolumab))、Reference ID: 3677021を参照)、AMP-224(例えば、Infanteらの文献、J Clin Oncol. 2013;31(suppl):abstr 3044を参照)、MEDI0680(「AMP-514」とも呼ばれる;例えば、Hamidらの文献、Ann Oncol. 2016;27(suppl_6):1050PDを参照)、デュルバルマブ(「medi-4736」とも呼ばれる;例えば、Lutzkyらの文献、J Clin Oncol. 2014;32(suppl 5S):abstr 3001を参照)、アベルマブ(例えば、メルケル細胞癌に対するもの)(「MSB0010718C」とも呼ばれる;例えば、Heeryらの文献J Clin Oncol. 2014;32(suppl 5S):abstr 3064を参照)、bms-936559(例えば、Brahmerらの文献N. Engl. J. Med. 2012;366, 2455-2465を参照)、並びにアテゾリズマブ(「mpdl3280A」及び「TECENTRIQ(登録商標)」とも呼ばれる;例えば、McDermottらの文献、J Clin Oncol. 2016; 34(8):833-842、Herbstらの文献、J Clin Oncol. 2013;31(suppl):abstr 3000、及びTECENTRIQに関する完全処方情報(Full Prescribing Information for TECENTRIQ)、Reference ID: 3933242を参照)が挙げられる。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、米国FDAにより1以上の癌の治療に承認された療法である。米国FDAにより癌の治療に承認されたPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの非限定的な例としては、ペンブロリズマブ、ニボ��マブ、アテゾリズマブ、及びアベルマブが挙げられる。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、EMAにより1以上の癌の治療に承認された療法である。EMAにより癌の治療に承認されたPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの非限定的な例としては、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、及びアテゾリズマブが挙げられる。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、ニボルマブ、MEDI0680、又はペンブロリズマブである。好ましい実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、ペンブロリズマブである。別の実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストは、ニボルマブ、AMP-224、MEDI0680、PDR001、デュルバルマブ、アベルマブ、bms-936559、又はアテゾリズマブである。
【０２８３】
具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子は、配列番号42に示されるアミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号53に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入される。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニット間に挿入され、ここで、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットは、該NDV P遺伝子及び該NDV M遺伝子の転写ユニットである。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号40に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号54に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号55に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０２８４】
具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子は、配列番号43に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号63に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入される。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニット間に挿入され、ここで、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットは、該NDV P遺伝子及び該NDV M遺伝子の転写ユニットである。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号59に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号55に示されている通りである。
【０２８５】
具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子は、配列番号22に示されるアミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号26に示される通りである。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入される。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニット間に挿入され、ここで、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットは、該NDV P遺伝子及び該NDV M遺伝子の転写ユニットである。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号23に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号27に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号29に示されている通りである。
【０２８６】
具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子は、配列番号39に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号61に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入される。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニット間に挿入され、ここで、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットは、該NDV P遺伝子及び該NDV M遺伝子の転写ユニットである。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号57に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号29に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０２８７】
具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子は、配列番号42に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号66に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入される。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニット間に挿入され、ここで、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットは、該NDV P遺伝子及び該NDV M遺伝子の転写ユニットである。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号40に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号64に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号65に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０２８８】
具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子は、配列番号43に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。具体的な実施態様において、該IL-12導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号68に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入される。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニット間に挿入され、ここで、該パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットは、該NDV P遺伝子及び該NDV M遺伝子の転写ユニットである。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号57に示されるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む。具体的な実施態様において、該IL-12 p35サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、配列番号65に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０２８９】
具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号51に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０２９０】
具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号52に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０２９１】
具体的な実施態様において、該IL-12をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムの配列は、配列番号60に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０２９２】
具体的な実施態様において、該キメラNDV(又は該キメラNDVを含む組成物)は、第5.5.1節及び/又は第6節に記載されている経路を介して該対象に投与される。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、該対象に、腫瘍内投与される。具体的な実施態様において、該腫瘍内投与は、皮下へのものである。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、該対象に、リンパ節内投与される。別の実施態様において、該キメラNDVは、該対象に、静脈内投与される。
【０２９３】
具体的な実施態様において、該PD-1もしくはそのリガンドのアンタゴニスト(又は該アンタゴニストを含む組成物)は、第5.5.1節及び/又は第6節に記載されている経路を介して該対象に投与される。具体的な実施態様において、該PD-1もしくはそのリガンドのアンタゴニスト(又は該アンタゴニストを含む組成物)は、該対象に、静脈内投与される。
【０２９４】
具体的な実施態様において、治療される癌は、第5.7.5節及び/又は第6節に記載されている癌である。具体的な実施態様において、該癌は、メラノーマ、腎臓癌、肺癌、膀胱癌、又は頭頸部癌である。具体的な実施態様において、該肺癌は、非小細胞肺癌である。具体的な実施態様において、該頭頸部癌は、頭頸部の扁平上皮細胞癌である。具体的な実施態様において、該癌は、子宮癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、脳腫瘍、又は肉腫である。具体的な実施態様において、該癌は、再発性(recurrent)又は再発性(relapsed)である。具体的な実施態様において、該癌は、転移性である。具体的な実施態様において、該癌は、切除不能である。具体的な実施態様において、該癌は、皮膚、皮下、又はリンパ節転移を含む。具体的な実施態様において、該癌の生検は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1陽性である。具体的な実施態様において、生検は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1の細胞染色のパーセンテージである腫瘍比率スコア(TPS)が、少なくとも1％、2％、3％、5％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は100％である場合、PD-L1陽性である。別の具体的な実施態様において、生検は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1の細胞染色のパーセンテージである腫瘍比率スコア(TPS)が、1％〜100％、25％〜50％、25％〜100％、50％〜75％、50％〜100％、又は75％〜100％場合、PD-L1陽性である。他の実施態様において、該癌の生検は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1陰性である。具体的な実施態様において、生検は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、腫瘍比率スコア(TPS)が1％未満である場合、PD-L1陰性である。
【０２９５】
具体的な実施態様において、該対象は、第5.7.3節及び/又は第6節に記載されている対象である。具体的な実施態様において、該対象は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる治療に不応性である。具体的な実施態様において、該対象は、ニボルマブ、AMP-224、MEDI0680、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、bms-936559、又はアテゾリズマブによる治療に不応性である。具体的な実施態様において、該対象は、ペンブロリズマブのみによる治療に不応性である。具体的な実施態様において、該対象は、ペンブロリズマブのみによる治療に不応答性である。
【０２９６】
具体的な実施態様において、該対象は、再発癌を有し、かつPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストよる治療に不応性である。具体的な実施態様において、該対象は、再発癌を有し、かつニボルマブ、AMP-224、MEDI0680、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、bms-936559、又はアテゾリズマブよる治療に不応性である。具体的な実施態様において、該対象は、再発癌を有し、かつペンブロリズマブよる治療に不応性である。
【０２９７】
(5.7.2  さらなる方法)
一態様において、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)を癌の治療で使用することができる。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)又はその組成物を投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)又はその組成物を投与することを含む、方法である。
【０２９８】
具体的な実施態様において、癌の治療で使用されるキメラNDVは、IL-12をコードするパッケージングされたゲノムを含む(例えば、第5.2節及び/又は第6節を参照)。
【０２９９】
癌を治療する方法で使用される本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)もしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞癌ワクチンは、任意の次数の治療(例えば、第一次、第二次、第三次、第四次、又は第五次治療)として使用することができる。
【０３００】
ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)は、癌を治療するために投与される唯一の活性成分である。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)は、癌を治療するために投与される組成物中の唯一の活性成分である。
【０３０１】
該キメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)又はその組成物は、対象に、局所又は全身投与することができる。例えば、キメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)又はその組成物は、対象に、非経口的に(例えば、静脈内に、動脈内に、もしくは皮下に)、腫瘍内に、リンパ節内に、胸腔内に、鼻腔内に、腹腔内に、腔内に、頭蓋内に、経口的に、経直腸的に、吸入により、筋肉内に、局所に、又は皮内に投与することができる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、例えば、肝動脈注射により、肝動脈経由で投与され、これは、画像下治療(interventional radiology)によるか又は動脈注入ポンプの留置によって行うことができる。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、外科手術中、腹腔鏡手術下、内視鏡手術下で、又は画像ガイダンスによって投与される。具体的な実施態様において、該キメラNDVの腹腔内投与は、直接的な注射、カテーテルによる注入、又は腹腔鏡手術中の注射によって行われる。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、腫瘍内に投与される。ある実施態様において、画像ガイダンスは、該キメラNDVを投与するために使用される。具体的な実施態様において、該キメラNDVは、静脈内に投与される。別の具体的な実施態様において、該キメラNDVは、リンパ節内に投与される。
【０３０２】
ある実施態様において、本明細書に記載される方法は、治療法がない癌の治療を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)又はその組成物は、他の従来治療の代替法として癌を治療するために対象に投与される。
【０３０３】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)又はその組成物及び例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる療法を投与することを含む、方法である。特定の実施態様において、1以上の療法は、癌を治療するために、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)又はその組成物と組み合わせて対象に投与される。具体的な実施態様において、該追加の療法は、癌の治療で使用現在使用されているものであるか、癌の治療で使用されてきたものであるか、又は癌の治療において有用であることが知られているものである。別の実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)又はその組成物は、支持療法、疼痛緩和療法、又は癌に対する治療効果を有しない他の療法と組み合わせて対象に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)と組み合わせて投与される1以上のさらなる療法は、下の第5.7.6.1節に記載されている療法のうちの1つ又は複数である。ある実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)及び1以上のさらなる療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、キメラNDV及び1以上のさらなる療法は、異なる組成物中で投与される。
【０３０４】
ある実施態様において、2つ、3つ、又は多数のNDV(1つ、2つ、又はそれより多くの本明細書に記載されるキメラNDV、例えば、1つ、2つ、又はそれより多くの上の第5.2節に記載されているキメラNDVを含む)は、癌を治療するために対象に投与される。癌を治療するために対象に2つ、3つ、又は多数のNDVを投与することを含む本明細書に記載される方法に従って使用される2以上のキメラNDVは、天然のキメラNDV又は異種アミノ酸配列(例えば、サイトカイン)を発現するように改変されている改変キメラNDVであることができる。第一及び第二のキメラNDVは、同じ医薬組成物又は異なる医薬組成物の部分であることができる。ある実施態様において、第一のキメラNDV及び第二のキメラNDVは、同じ投与経路で投与される(例えば、どちらも腫瘍内又は静脈内に投与される)。他の実施態様において、第一のキメラNDV及び第二のキメラNDVは、異なる投与経路で投与される(例えば、一方は腫瘍内に投与され、もう一方は静脈内に投与される)。
【０３０５】
別別の態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)を、癌の治療において、例えば、本明細書中、下の第5.7.6節(例えば、下の第5.7.6.1節)に記載される、1以上のさらなる療法と組み合わせて使用することができる。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるNDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)又はその組成物及び例えば、本明細書中、下の第5.7.6節(例えば、第5.7.6.1節)に記載される、1以上のさらなる療法を投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の本明細書に記載されるNDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)又はその組成物及び例えば、下の第5.7.6節(例えば、第5.7.6.1節)に記載される、有効量の1以上のさらなる療法を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)及び例えば、下の第5.7.6節(例えば、第5.7.6.1節)に記載される、1以上のさらなる療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、NDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)及び1以上のさらなる療法は、異なる組成物中で投与される。
【０３０６】
1以上のさらなる療法と組み合わせて使用されるNDVは、全身又は局所投与することができる。例えば、該NDV又はその組成物は、対象に、非経口的に(例えば、静脈内に、動脈内に、もしくは皮下に)、腫瘍内に、リンパ節内に、胸腔内に、鼻腔内に、腹腔内に、頭蓋内に、経口的に、経直腸的に、吸入により、筋肉内に、局所に、又は皮内に投与することができる。具体的な実施態様において、該NDVは、例えば、肝動脈注射により、肝動脈経由で投与され、これは、画像下治療(interventional radiology)によるか又は動脈注入ポンプの留置によって行うことができる。別の具体的な実施態様において、該NDVは、外科手術中、腹腔鏡手術下、又は内視鏡手術下で投与される。具体的な実施態様において、該NDVの腹腔内投与は、直接的な注射、カテーテルによる注入、又は腹腔鏡手術中の注射によって行われる。
【０３０７】
例えば、本明細書中、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる療法と組み合わせた、本明細書に記載されるNDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)もしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞癌ワクチンは、本明細書に記載される方法に従って癌を治療するための任意の次数の治療(例えば、第一次、第二次、第三次、第四次、又は第五次治療)として使用することができる。
【０３０８】
別の態様において、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)に感染させた全癌細胞を用いて、癌を治療することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)を癌細胞又は癌細胞の集団と接触させることができ、感染させた癌細胞又は癌細胞の集団を対象に投与して、癌を治療することができる。一実施態様において、癌細胞は、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)に感染させる前に、γ線照射を受ける。別の実施態様において、癌細胞は、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)に感染させた後に、γ線照射を受ける。特定の実施態様において、癌細胞が対象中で増殖することができないように、癌細胞は対象に投与される前に処理される。具体的な実施態様において、癌細胞は対象中で増殖することができず、ウイルスは対象に感染することができない。一実施態様において、癌細胞は、対象に投与される前にγ線照射を受ける。別の実施態様において、癌細胞は、対象に投与される前に超音波処理される。別の実施態様において、癌細胞は、対象に投与される前に、マイトマイシンCで処理される。別の実施態様において、癌細胞は、対象に投与される前に、凍結及び解凍によって処理される。別の実施態様において、癌細胞は、対象に投与される前に、熱処理で処理される。癌細胞は、対象に、局所又は全身投与することができる。例えば、癌細胞は、対象に、非経口的に(例えば、静脈内にもしくは皮下に)、腫瘍内に、リンパ節内に、鼻腔内に、経口的に、吸入により、胸腔内に、局所に、又は皮内に投与することができる。具体的な実施態様において、癌細胞は、腫瘍内に又は対象の皮膚(例えば、皮内)に投与される。使用される癌細胞は、自己のもの又は同種異系のものであることができる。具体的な実施態様において、キメラNDVの骨格は、非溶解性株である。癌細胞は、単独で又は追加の療法と組み合わせて、対象に投与することができる。癌細胞は、医薬組成物中にあることが好ましい。ある実施態様において、癌細胞は、例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる療法と組み合わせて投与される。ある実施態様において、癌細胞及び1以上のさらなる療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、癌細胞及び1以上のさらなる療法は、異なる組成物中で投与される。
【０３０９】
別の態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)に感染させた全癌細胞は、癌の治療において、本明細書中、下の第5.7.6節に記載される1以上のさらなる療法と組み合わせて使用することができる。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるNDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)に感染させた全癌細胞を、本明細書中、下の第5.7.6節に記載される1以上のさらなる療法と組み合わせて投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の本明細書に記載されるNDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)に感染させた全癌細胞を、下の第5.7.6節に記載される有効量の1以上のさらなる療法と組み合わせて投与することを含む、方法である。ある実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)に感染させた全癌細胞及び下の第5.7.6節に記載される1以上のさらなる療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)に感染させた全癌細胞及び1以上のさらなる療法は、異なる組成物中で投与される。
【０３１０】
別の態様において、キメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)に感染させた溶解した癌細胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜調製物を用いて、癌を治療することができる。一実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVに感染させた癌細胞由来の断片を含む形質膜調製物を用いて、癌を治療することができる。別の実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVに感染させた癌細胞由来のタンパク質濃縮物を用いて、癌を治療することができる。当業者に公知の技法を用いて、該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物を産生することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDV(例えば、上の第5.2節に記載されているキメラNDV)を癌細胞又は癌細胞の集団と接触させることができ、感染させた癌細胞又は癌細胞の集団を、当業者に公知の技法を用いて溶解させて、NDVに感染させた癌細胞のタンパク質濃縮物又は形質膜断片を得ることができ、該NDVに感染させた癌細胞のタンパク質濃縮物又は形質膜断片を対象に投与して、癌を治療することができる。該タンパク質濃縮物又は形質膜断片は、対象に、局所又は全身投与することができる。例えば、該タンパク質濃縮物又は形質膜断片は、対象に、非経口的に、腫瘍内に、リンパ節内に、鼻腔内に、胸腔内に、経口的に、吸入により、局所に、又は皮内に投与することができる。具体的な実施態様において、そのようなタンパク質濃縮物又は形質膜調製物は、腫瘍内に又は対象の皮膚(例えば、皮内)に投与される。該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物を産生するために使用される癌細胞は、自己のもの又は同種異系のものであることができる。具体的な実施態様において、キメラNDVの骨格は、溶解性株である。該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物は、単独で又は追加の療法と組み合わせて対象に投与することができる。該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物は、医薬組成物中にあることが好ましい。ある実施態様において、該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物は、例えば、下の第5.7.6節(例えば、第5.7.6.1節)に記載される、1以上のさらなる療法と組み合わせて投与される。ある実施態様において、該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物及び1以上のさらなる療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物及び1以上のさらなる療法は、異なる組成物中で投与される。
【０３１１】
別の態様において、NDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)に感染させた溶解した癌細胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜調製物は、癌の治療において、例えば、本明細書中、下の第5.7.6節(例えば、第5.7.6.1節)に記載される、1以上のさらなる療法と組み合わせて使用することができる。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、NDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)に感染させた溶解した癌細胞由来のタンパク質濃縮物又は形質膜調製物を、例えば、本明細書中、下の第5.7.6節(例えば、第5.7.6.1節)に記載される、1以上のさらなる療法と組み合わせて投与することを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を治療する方法であって、それを必要としている対象に、NDV(例えば、上の第5.1節に記載されているNDV)に感染させた溶解した癌細胞由来の有効量のタンパク質濃縮物又は形質膜調製物を、例えば、下の第5.7.6節(例えば、第5.7.6.1節)に記載される、有効量の1以上のさらなる療法と組み合わせて投与することを含む、方法である。ある実施態様において、該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物及び例えば、下の第5.7.6節に記載される、1以上のさらなる療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、該タンパク質濃縮物又は形質膜調製物及び1以上のさらなる療法は、異なる組成物中で投与される。
【０３１２】
ある実施態様において、癌を治療する方法は、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際特許出願公開WO 2014/158811号並びに米国特許出願公開第2016/0015760 A1号及び第2014/0271677 A1号の第5.6節に記載されているものである。
【０３１３】
(5.7.3  患者集団)
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、癌に罹患している対象に投与される。他の実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、癌の素因を有するか又は癌になりやすい対象に投与される。いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、癌と診断された対象に投与される。癌の種類の具体的な例は、本明細書に記載されている(例えば、第5.7.5節及び第6節を参照)。一実施態様において、該対象は、転移性癌を有する。別の実施態様において、該対象は、ステージ1、ステージ2、ステージ3、又はステージ4の癌を有する。別の実施態様において、該対象は、寛解期にある。また別の実施態様において、該対象は、癌の再発を有する。
【０３１４】
ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、0〜6カ月、6〜12カ月、6〜18カ月、18〜36カ月、1〜5歳、5〜10歳、10〜15歳、15〜20歳、20〜25歳、25〜30歳、30〜35歳、35〜40歳、40〜45歳、45〜50歳、50〜55歳、55〜60歳、60〜65歳、65〜70歳、70〜75歳、75〜80歳、80〜85歳、85〜90歳、90〜95歳、又は95〜100歳であるヒトに投与される。具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、例えば、1歳、2歳、3歳、4歳、5歳、6歳、7歳、8歳、9歳、10歳、11歳、12歳、13歳、14歳、15歳、16歳、又は17歳である小児患者に投与される。ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、1〜5歳、2〜5歳、1〜10歳、2〜10歳、5〜10歳、1〜18歳、2〜18歳、5〜18歳、又は10〜18歳であるヒト小児患者に投与される。いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒト乳児に投与される。他の実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒト幼児に投与される。他の実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒト小児に投与される。いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、18歳以上である成人患者に投与される。他の実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒト成人に投与される。また他の実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒト高齢者に投与される。具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、皮膚もしくは皮下腫瘍又はリンパ節内腫瘍を示す患者に投与される。
【０３１５】
ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、免疫不全状態もしくは免疫抑制状態にあるか、又は免疫不全状態もしくは免疫抑制状態になるリスクのある対象に投与される。ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、免疫抑制療法を受けているか又は免疫抑制療法から回復しつつある対象に投与される。ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、癌を有しているか又は癌になるリスクのある対象に投与される。ある実施態様において、該対象は、外科手術、化学療法、及び/又は放射線療法を受けているか、これらを受ける予定であるか、又はこれらを受けたことがある。ある実施態様において、患者は、外科手術を受けて、腫瘍又は新生物を除去したことがある。具体的な実施態様において、外科手術を施して、腫瘍又は新生物を除去した後に、患者に、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法を投与する。他の実施態様において、外科手術を施して、腫瘍又は新生物を除去する前に、患者に、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法を投与する。ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、組織移植、臓器移植、又は輸血を受けているか、これらを受ける予定であるか、又はこれらを受けた対象に投与される。
【０３１６】
いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、該キメラNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物、全細胞ワクチン、又は併用療法以外の療法に不応性であることが分かっているが、これらの療法をもはや受けていない患者に投与される。具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、化学療法に不応性であることが分かっている患者に投与される。具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる治療に不応性又は不応答性であることが分かっている患者に投与される。具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に不応性又は不応答性であることが分かっている患者に投与される。具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、PD-1遮断抗体(例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ)による治療に不応性又は不応答性であることが分かっている患者に投与される。具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、PD-1遮断抗体(例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性であることが分かっている患者に投与される。具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、PD-L1遮断抗体(例えば、アテゾリズマブ)による治療に不応性又は不応答性であることが分かっている患者に投与される。別の具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、PD-L1遮断抗体(例えば、アテゾリズマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性であることが分かっている患者に投与される。具体的な実施態様において、患者が不応性であることが分かっている療法は、併用療法の一部である。例えば、具体的な実施態様において、患者は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる治療に不応性又は不応答性あることが分かっている;しかしながら、任意の特定の理論に束縛されるものではないが、該患者は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストとNDV(例えば、キメラNDV)もしくは��の組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法との組合せによる治療に応答性である。癌が不応性であるかどうかの決定は、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。ある実施態様において、不応性の患者は、標準療法に不応性の患者である。いくつかの実施態様において、癌を有する患者は、最初は療法に応答性であるが、その後、不応性になる。
【０３１７】
ある実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、該キメラNDVもしくはその組成物、癌溶解物、全細胞ワクチン、又は併用療法以外の療法による治療の後に再発した患者である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる治療の後に再発した患者である。ある実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療の後に再発した患者である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、PD-1遮断抗体(例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ)による治療の後に再発した患者である。ある実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、PD-1遮断抗体(例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ)による単剤療法治療の後に再発した患者である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、PD-L1遮断抗体(例えば、アテゾリズマブ)による治療の後に再発した患者である。ある実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、PD-L1遮断抗体(例えば、アテゾリズマブ)による単剤療法治療の後に再発した患者である。
【０３１８】
ある実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、該キメラNDVもしくはその組成物、癌溶解物、全細胞ワクチン、又は併用療法以外の療法による治療の後に再発し、かつPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる治療に不応性又は不応答性である患者である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる治療の後に再発し、かつPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に不応性又は不応答性である患者である。ある実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、PD-1遮断抗体(例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ)による治療の後に再発し、かつPD-1遮断抗体による単剤療法治療に不応性又は不応答性である患者である。ある実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、PD-L1遮断抗体(例えば、アテゾリズマブ)による治療の後に再発し、かつPD-L1遮断抗体による単剤療法治療に不応性又は不応答性である患者である。
【０３１９】
ある実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療されることになる患者は、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、又は他の生物療法/免疫療法もしくは抗癌療法で既に治療されている患者である。これらの患者の中に、不応性患者、及び従来の療法を施すには若すぎる患者がいる。いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法を投与されている対象は、該キメラNDVもしくはその組成物、該腫瘍溶解物ワクチン、又は該全細胞ワクチン、又は該併用療法の投与前に、療法を受けたことがない。
【０３２０】
いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、癌を発症するリスクのある患者で癌の発生を予防するために、患者に投与される。いくつかの実施態様において、化合物は、従来の療法に対する有害反応を起こしやすい患者に投与される。
【０３２１】
いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法を投与されている対象は、先行治療を受けたことがない。他の実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、該NDV(例えば、キメラNDV)もしくは組成物、該腫瘍溶解物ワクチン、該全細胞ワクチン、又は該併用療法の投与前に治療を受けたことがある対象に投与される。いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法を投与される対象は、先行治療に対する有害な副作用を経験したか、又は先行治療は、該対象に対する許容されないレベルの毒性が原因で中止された。
【０３２２】
具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法を投与されている対象は、1以上のPD-L1陽性腫瘍又は悪性腫瘍を有する。具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、PD-L1陽性である。具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1の細胞染色のパーセンテージである該腫瘍又は悪性腫瘍の生検の腫瘍比率スコア(TPS)が、少なくとも1％、2％、3％、5％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は100％である場合、PD-L1陽性である。別の具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1の細胞染色のパーセンテージである該腫瘍又は悪性腫瘍の生検の腫瘍比率スコア(TPS)が、1％〜100％、25％〜50％、25％〜100％、50％〜75％、50％〜100％、又は75％〜100％である場合、PD-L1陽性である。
【０３２３】
具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1の細胞染色のパーセンテージである該腫瘍又は悪性腫瘍の生検の複合陽性スコア(CPS)が、少なくとも1％、2％、3％、5％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は100％である場合、PD-L1陽性である。別の具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1の細胞染色のパーセンテージである該腫瘍又は悪性腫瘍の生検の複合陽性スコア(CPS)が、1％〜100％、25％〜50％、25％〜100％、50％〜75％、50％〜100％、又は75％〜100％である場合、PD-L1陽性である。CPSを決定するために、対象由来の腫瘍組織試料中の生存しているPD-L1陽性腫瘍細胞の数、生存しているPD-L1陰性腫瘍細胞の数、及び生存しているPD-L1陽性単核炎症細胞(MIC)の数を決定し、その後、次式を用いて、複合陽性スコア(CPS)を計算する: CPS＝(PD-L1陽性腫瘍細胞の数＋PD-L1陽性単核炎症細胞(MIC)の数/PD-L-1陽性腫瘍細胞＋PD-L1陰性腫瘍細胞の数)×100％。複合陽性スコア(CPS)の説明については、例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許出願公開第2017/0285037号及びKulangaraらの文献、Journal of Clinical Oncology 2017 35:15_suppl, e14589-e14589を参照されたい。
【０３２４】
いくつかの実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法を投与されている対象は、1以上のPD-L1陰性腫瘍又は悪性腫瘍を有する。具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、PD-L1陰性である。具体的な実施態様において、該癌の生検は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1陰性である。具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1の細胞染色のパーセンテージである該腫瘍又は悪性腫瘍の生検の腫瘍比率スコア(TPS)が1％未満である場合、PD-L1陰性である。
【０３２５】
具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、PD-L1の細胞染色のパーセンテージである該腫瘍又は悪性腫瘍の生検の複合陽性スコア(CPS)が1％未満である場合、PD-L1陰性である。
【０３２６】
具体的な実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、又は本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法を投与されている対象は、低レベルのPD-L1を有する1以上の腫瘍又は悪性腫瘍を有する。具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、該腫瘍又は悪性腫瘍の生検が、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、1％〜50％、又は1％〜40％、1％〜30％、1％〜25％、1％〜15％、もしくは1％〜10％の腫瘍比率スコア(TPS)を有する場合、低レベルのPD-L1発現を有する。具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、該腫瘍又は悪性腫瘍の生検が、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、50％未満であるが、1％以上の腫瘍比率スコア(TPS)を有する場合、低レベルのPD-L1発現を有する。
【０３２７】
具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、該腫瘍又は悪性腫瘍の生検が、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、1％〜50％、又は1％〜40％、1％〜30％、1％〜25％、1％〜15％、もしくは1％〜10％の複合陽性スコア(CPS)を有する場合、低レベルのPD-L1発現を有する。具体的な実施態様において、腫瘍又は悪性腫瘍は、該腫瘍又は悪性腫瘍の生検が、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、50％未満であるが、1％以上の複合陽性スコア(CPS)を有する場合、低レベルのPD-L1発現を有する。
【０３２８】
具体的な実施態様において、ELISAは、腫瘍細胞がPD-L1陽性であるかどうかを決定するために及び/又は腫瘍又は悪性腫瘍が低レベルのPD-L1を有するかどうかを決定するために使用される。具体的な実施態様において、免疫組織化学検査は、腫瘍細胞が、PD-L1陰性、PD-L1陽性であるかどうか、及び/又は腫瘍もしくは悪性腫瘍が低レベルのPD-L1を有するかどうかを決定するために使用される。具体的な実施態様において、腫瘍もしくは悪性腫瘍(又はこれらの生検)は、PD-L1のレベルを決定するための米国食品医薬品局(U.S. Food and Drug Administration)によって承認されている1以上のアッセイに従って、PD-L1陰性、PD-L1陽性である、及び/又は低レベルのPD-L1を有すると決定される。PD-L1のレベルを決定するための米国食品医薬品局(U.S. Food and Drug Administration)によって承認されているアッセイの非限定的な例としては、PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Dako North America社製)及びVentana PD-L1(SP142)アッセイ(Ventana Medical Systems社製)が挙げられる。別の具体的な実施態様において、腫瘍もしくは悪性腫瘍(又はこれらの生検)におけるPD-L1のレベルは、臨床検査室改善修正法(Clinical Laboratory Improvement Amendments)による認証を受けた実験室で実施される実験室で開発された検査に従って決定される。
【０３２９】
(5.7.4  投薬量及び頻度)
癌の治療において有効であるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞ワクチンの量は、癌の性質、投与経路、対象の全体的な健康などによって決まり、医師の判断に従って決定されるべきである。最適な投薬量範囲の特定を助けるために、インビトロアッセイなどの標準的な臨床的技法を任意に利用することができる。しかしながら、投与用のNDVの好適な投薬量範囲は、通常、約102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、又は1012pfu、最も好ましくは、約104〜約1012、106〜1012、108〜1012、109〜1012、又は109〜1011pfuであり、必要に応じた間隔で、1回、2回、3回、4回、又はそれより多くの回数、対象に投与することができる。投与用の腫瘍溶解物ワクチンの投薬量範囲は、0.001mg、0.005mg、0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、1.0mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、10.0mg、0.001mg〜10.0mg、0.01mg〜1.0mg、0.1mg〜1mg、及び0.1mg〜5.0mgを含むことができ、必要に応じた間隔で、1回、2回、3回、又はそれより多くの回数、対象に投与することができる。投与用の全細胞ワクチンの投薬量範囲は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、又は1012細胞を含むことができ、必要に応じた間隔で、1回、2回、3回、又はそれより多くの回数、対象に投与することができる。ある実施態様において、NDV、腫瘍溶解物ワクチン、又は全細胞ワクチンの臨床試験で現在使用されているのと同様の投薬量が対象に投与される。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から推定することができる。
【０３３０】
ある実施態様において、NDV(例えば、キメラNDV)又はその組成物は、単一用量として、次いで、1〜6週間後、1〜5週間後、1〜4週間後、1〜3週間後、1〜2週間後に第二の用量として、対象に投与される。これらの実施態様に従って、追加免疫接種物を、2回目の接種後6〜12カ月の間隔で、対象に投与することができる。ある実施態様において、腫瘍溶解性ワクチン又は全細胞ワクチンは、単一用量として、次いで、1〜6週間後、1〜5週間後、1〜4週間後、1〜3週間後、1〜2週間後に第二の用量として、対象に投与される。
【０３３１】
ある実施態様において、同じNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、又は全細胞ワクチンの投与を繰り返すことができ、該投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日、6日、7日、10日、14日、15日、21日、28日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月の間隔を空けることができる。他の実施態様において、同じNDV(例えば、NDV)もしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、又は全細胞ワクチンの投与を繰り返すことができ、該投与は、1〜14日、1〜7日、7〜14日、1〜30日、15〜30日、15〜45日、15〜75日、15〜90日、1〜3カ月、3〜6カ月、3〜12カ月、又は6〜12カ月の間隔を空けることができる。いくつかの実施態様において、第一のNDV(例えば、第一のキメラNDV)又はその組成物を対象に投与し、次いで、第二のNDV(例えば、第二のキメラNDV)又はその組成物を投与する。ある実施態様において、第一及び第二のNDV(例えば、第一及び第二のキメラNDV)又はそれらの組成物は、少なくとも1日、2日、3日、5日、6日、7日、10日、14日、15日、21日、28日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月の間隔を空けることができる。他の実施態様において、第一及び第二のNDV(例えば、第一及び第二のキメラNDV)又はそれらの組成物は、1〜14日、1〜7日、7〜14日、1〜30日、15〜30日、15〜45日、15〜75日、15〜90日、1〜3カ月、3〜6カ月、3〜12カ月、又は6〜12カ月の間隔を空けることができる。
【０３３２】
ある実施態様において、NDVもしくはその組成物又は腫瘍溶解物ワクチン又は全細胞ワクチンは、1以上のさらなる療法、例えば、下の第5.7.6節に記載される療法と組み合わせて、対象に投与される。他の1以上のさらなる療法の投薬量は、例えば、療法、癌の性質、投与経路、対象の全体的な健康などを含む、様々な因子によって決まり、医師の判断に従って決定されるべきである。具体的な実施態様において、他の療法の用量は、本明細書に開示される方法に従って使用される単剤として使用するための療法に推奨される療法の用量及び/又は投与頻度である。他の実施態様において、他の療法の用量は、本明細書に開示される方法に従って使用される単剤として使用するための療法に推奨されるよりも低用量及び/又は低頻度の療法の投与である。認可された療法の推奨用量は、医師用卓上参考書(Physician's Desk Reference)に見出すことができる。
【０３３３】
ある実施態様において、NDVもしくはその組成物又は腫瘍溶解物ワクチン又は全細胞ワクチンは、1以上のさらなる療法の投与と同時に対象に投与される。他の実施態様において、NDVもしくはその組成物又は腫瘍溶解物ワクチン又は全細胞ワクチンは、3〜7日毎、1〜6週間毎、1〜5週間毎、1〜4週間毎、2〜4週間毎、1〜3週間毎、又は1〜2週間毎に対象に投与され、1以上のさらなる療法(例えば、下の第5.7.6節に記載されているもの)は、3〜7日毎、1〜6週間毎、1〜5週間毎、1〜4週間毎、1〜3週間毎、又は1〜2週間毎に投与される。ある実施態様において毎、NDVもしくはその組成物又は腫瘍溶解物ワクチン又は全細胞ワクチンは、1〜2週間毎に対象に投与され、1以上のさらなる療法(例えば、下の第5.7.6節に記載されているもの)は、2〜4週間毎に投与される。いくつかの実施態様において、NDVもしくはその組成物又は腫瘍溶解物ワクチン又は全細胞ワクチンは、毎週対象に投与され、1以上のさらなる療法(例えば、下の第5.7.6節に記載されているもの)は、2週間毎に投与される。
【０３３４】
対象を治療するために使用されるPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの投薬量は、例えば、療法、癌の性質、投与経路、対象の全般的な健康などを含む、様々な要因によって決まり、医師の判断により決定されるべきである。具体的な実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの用量は、単一の薬剤が本明細書に開示される方法に従って使用される場合の使用のためのPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストに推奨される該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの投与の用量及び/又は頻度である。いくつかの実施態様において、該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストの用量は、単一の薬剤が本明細書に開示される方法に従って使用される場合の使用のためのPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストに推奨されるものよりも少ない用量及び/又は少ない投与頻度の療法である。承認された療法の推奨用量は、医師の卓上参考書(Physician's Desk Reference)に見出すことができる。
【０３３５】
該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがニボルマブである具体的な実施態様において、ニボルマブの投薬量は、一定期間、例えば、30分間にわたる、2週間毎の静脈内注入として、240mgであってもよい。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2018年4月に改訂された、OPDIVOに関する完全処方情報(Full Prescribing Information for OPDIVO)を参照されたい。該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがニボルマブである別の具体的な実施態様において、ニボルマブの投薬量は、一定期間、例えば、30分間にわたる、4週間毎の静脈内注入として、480mgであってもよい。同掲書。該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがニボルマブである別の具体的な実施態様において、ニボルマブの投薬量は、一定期間、例えば、60分間にわたる、2週間毎の静脈内注入として、3mgであってもよい。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、OPDIVOに関する完全処方情報(Full Prescribing Information for OPDIVO)、Reference ID: 3677021を参照されたい。該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがペンブロリズマブである具体的な実施態様において、ペンブロリズマブの投薬量は、一定期間、例えば、30分間にわたる、3週間毎の静脈内注入として、200mgであってもよい。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2017年11月に改訂された、KEYTRUDAに関する完全処方情報(Full Prescribing Information for KEYTRUDA)を参照されたい。該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがペンブロリズマブである別の具体的な実施態様において、ペンブロリズマブの投薬量は、一定期間、例えば、30分間にわたる、3週間毎の静脈内注入として、2mg/kgであってもよい。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、KEYTRUDAに関する完全処方情報(Full Prescribing Information for KEYTRUDA)、Reference ID: 3862712を参照されたい。該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがペンブロリズマブである別の具体的な実施態様において、ペンブロリズマブの投薬量は、一定期間、例えば、30分間にわたる、3週間毎の静脈内注入として、2mg/kg〜最大200mg/kgであってもよい。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、KEYTRUDAに関する完全処方情報(Full Prescribing Information for KEYTRUDA)、Reference ID: 3862712を参照されたい。該PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがアテゾリズマブである具体的な実施態様において、アテゾリズマブの投薬量は、一定期間、例えば、60分間にわたる、3週間毎の静脈内注入として、1,200mgであってもよい。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、TECENTRIQに関する完全処方情報(Full Prescribing Information for TECENTRIQ)、Reference ID: 4000525を参照されたい。
【０３３６】
(5.7.5  癌の種類)
本明細書に記載される方法に従って治療することができる癌の具体的な例としては:白血病、例えば、限定されないが、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤血球性白血病、並びに骨髄異形成症候群;骨髄線維症、慢性白血病、例えば、限定されないが、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病;真性赤血球増加症;リンパ腫、例えば、限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病;多発性骨髄腫、例えば、限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞(placancer cell)白血病、孤立性形質細胞腫(placancercytoma)、及び髄外性形質細胞腫(placancercytoma);ワルデンストレームマクログロブリン血症;意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症;良性単クローン性ガンマグロブリン血症;重鎖病;骨肉腫及び結合組織肉腫、例えば、限定されないが、骨肉腫(bone sarcoma)、骨肉腫(osteosarcoma)、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫(angiosarcoma)(血管肉腫(hemangiosarcoma))、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫;脳腫瘍、例えば、限定されないが、神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、希突起膠腫、非神経膠腫、多形性膠芽腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫;限定されないが、トリプルネガティブ乳癌、ER+/HER2-乳癌、腺管癌、腺癌、小葉(癌細胞)癌、腺管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状腺乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病、及び炎症性乳癌を含む、乳癌;副腎癌、例えば、限定されないが、褐色細胞腫(pheochromocytom)及び副腎皮質癌;甲状腺癌、例えば、限定されないが、乳頭状又は濾胞状甲状腺癌、髄様甲状腺癌、及び未分化甲状腺癌;膵癌、例えば、限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、及びカルチノイド又は島細胞腫瘍;下垂体癌、例えば、限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、及び尿崩症;眼癌、例えば、限定されないが、眼メラノーマ、例えば、虹彩メラノーマ、脈絡膜メラノーマ、及び毛様体メラノーマ(cilliary body melanoma)、並びに網膜芽腫;膣癌、例えば、扁平上皮細胞癌、腺癌、及びメラノーマ;外陰癌、例えば、扁平上皮細胞癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞癌、肉腫、及びパジェット病;子宮頸癌、例えば、限定されないが、扁平上皮細胞癌及び腺癌;子宮癌、例えば、限定されないが、子宮内膜癌及び子宮肉腫;卵巣癌、例えば、限定されないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍、及び間質性腫瘍;食道癌、例えば、限定されないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、メラノーマ、形質細胞腫(placancercytoma)、疣状癌、及び燕麦細胞(癌細胞)癌;胃癌、例えば、限定されないが、腺癌、歯状(ポリープ状)、潰瘍性、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性のリンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び癌肉腫;結腸癌;直腸癌;肝臓癌、例えば、限定されないが、肝細胞癌及び肝芽腫;胆嚢癌、例えば、腺癌;胆管癌、例えば、限定されないが、乳頭状、結節性、及びびまん性;肺癌、例えば、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌(類表皮癌)、腺癌、大細胞癌、及び癌細胞肺癌;精巣癌、例えば、限定されないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的(典型的)、精母細胞性、非精上皮腫、胎生期癌、奇形腫癌、絨毛腫(卵黄嚢腫瘍)、前立腺癌、例えば、限定されないが、前立腺上皮内腫瘍、腺癌、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫;陰茎癌(penal cancer);口腔癌、例えば、限定されないが、扁平上皮細胞癌;基底癌;唾液腺癌、例えば、限定されないが、腺癌、粘液性類表皮癌、及び腺様嚢胞癌;咽頭癌、例えば、限定されないが、扁平上皮細胞癌、及び疣状;皮膚癌、例えば、限定されないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、及びメラノーマ、表在拡大型メラノーマ、結節性メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端性黒子性メラノーマ;腎臓癌、例えば、限定されないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行細胞癌(腎盂及び/又は尿管(uterer));ウィルムス腫瘍;膀胱癌、例えば、限定されないが、移行細胞癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨肉腫(osteogenic sarcoma)、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、及び乳頭腺癌が挙げられる(そのような障害の総説については、Fishmanらの文献、1985、Medicine、第2版、J.B. Lippincott社、Philadelphia、及びMurphyらの文献、1997、インフォームド・ディシジョン:癌の診断、治療、及び回復の完全本(Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery)、Viking Penguin, Penguin Books U.S.A.社、United States of Americaを参照されたい)。
【０３３７】
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVもしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、本明細書中の全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、(限定されないが)以下のもの:膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、頸部、甲状腺、及び皮膚の癌を含む癌;扁平上皮細胞癌を含む;白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含むリンパ球系統の造血系腫瘍;急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄球系統の造血系腫瘍;線維肉腫及び横紋筋肉腫(rhabdomyoscarcoma)を含む間葉起源の腫瘍;メラノーマ、精上皮腫、奇形腫、神経芽腫、及び神経膠腫を含む他の腫瘍;星細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む、中枢及び末梢神経系の腫瘍;線維肉腫、横紋筋肉腫(rhabdomyoscarama)、及び骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍;並びにメラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫(keratoactanthoma)、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形腫を含む他の腫瘍を含む、種々の癌及び異常増殖性疾患の治療において有用である。
【０３３８】
いくつかの実施態様において、アポトーシスの異常と関連する癌を、本明細書に記載される方法に従って治療する。そのような癌としては、濾胞性リンパ腫、p53突然変異を有する癌、乳房、前立腺、及び卵巣のホルモン依存性腫瘍、並びに前癌病変、例えば、家族性腺腫性ポリポーシス、並びに骨髄異形成症候群を挙げることができるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、悪性腫瘍もしくは異常増殖性変化(例えば、化生及び異形成)、又は皮膚、肺、肝臓、骨、脳、胃、結腸、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、膵臓、卵巣、及び/もしくは子宮の過剰増殖性障害を、本明細書に記載される方法に従って治療する。他の具体的な実施態様において、肉腫又はメラノーマを、本明細書に記載される方法に従って治療する。
【０３３９】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫(例えば、多発性骨髄腫)である。本明細書に記載される方法に従って治療することができる白血病及び他の血行性癌の具体的な例としては、急性リンパ芽球性白血病「ALL」、急性リンパ芽球性B細胞白血病、急性リンパ芽球性T細胞白血病、急性骨髄芽球性白血病「AML」、急性前骨髄球性白血病「APL」、急性単芽球性白血病、急性赤白血病性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リンパ球性(nonlymphocyctic)白血病、急性未分化白血病、慢性骨髄球性白血病「CML」、慢性リンパ球性白血病「CLL」、及び有毛細胞白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４０】
本明細書に記載される方法に従って治療することができるリンパ腫の具体的な例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、及び真性赤血球増加症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４１】
別の実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、固形腫瘍である。本明細書に記載される方法に従って治療することができる固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵癌、骨癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻腔癌、咽喉癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、癌細胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、皮膚癌、メラノーマ、神経芽腫、及び網膜芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、転移性である。別の実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、悪性である。
【０３４２】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、メラノーマ(例えば、進行性メラノーマ)、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC)、古典的ホジキンリンパ腫、進行性尿路上皮癌、マイクロサテライト高不安定性癌、又は胃もしくは胃食道接合部腺癌である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、子宮癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、脳腫瘍、又は肉腫である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、(1)不応性の古典的ホジキンリンパ腫、(2)再発性又は転移性頭頸部扁平上皮細胞癌、(3)切除不能又は転移性メラノーマ、(4)局所性又は進行性又は転移性尿路上皮癌、(5)プログラム死-リガンド1(「PD-L1」)を発現する腫瘍(例えば、CPS≧1を有する腫瘍)を有する再発性局所進行性又は転移性の胃又は胃食道腺癌、(6)前治療の後に進行し、かつ満足できる代替治療選択肢がない切除不能もしくは転移性のマイクロサテライト高不安定性癌もしくはミスマッチ修復欠損固形腫瘍、又はフルオロピリミジン、オキサリプラチン、及びイリノテカンによる治療の後に進行した結腸直腸癌、或いは(7)PD-L1を発現する腫瘍(例えば、≧1％又は50％のTPSを有する腫瘍)を有する転移性非小細胞肺癌である。
【０３４３】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、メラノーマ、非小細胞肺癌、頭頸部癌(HNSCC頭頸部扁平上皮細胞癌)、尿路上皮癌、トリプルネガティブ乳癌、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、中皮腫、卵巣癌、小細胞肺癌、食道癌、鼻咽頭癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、ER+/HER2-乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、前立腺癌、膠芽腫、マイクロサテライト高不安定性(MSI-H)もしくはミスマッチ修復欠損癌(組織非依存性)、又は高い腫瘍突然変異負荷を有する腫瘍(組織非依存性)である。
【０３４４】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、予後が悪い、並びに/又は化学療法及び放射線などの従来の療法に対する応答が悪い癌である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、悪性メラノーマ、悪性神経膠腫、腎細胞癌、膵腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺腺癌、肺小細胞癌、肺扁平上皮細胞癌、未分化甲状腺癌、及び頭頸部扁平上皮細胞癌である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、下の第6節に記載されている種類の癌である。
【０３４５】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、不応性ホジキンリンパ腫、再発性もしくは転移性頭頸部扁平上皮細胞癌、切除不能もしくは転移性メラノーマ、又は転移性非小細胞肺癌である。
【０３４６】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-L1陽性である。具体的な実施態様において、癌は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、該癌の生検におけるPD-L1の細胞染色のパーセンテージである腫瘍比率スコア(TPS)が、少なくとも1％、2％、3％、5％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は100％である場合、PD-L1陽性である。別の具体的な実施態様において、癌は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、該癌の生検におけるPD-L1の細胞染色のパーセンテージであるTPSが、少なくとも1％又は1％〜100％である場合、PD-L1陽性である。別の具体的な実施態様において、癌は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、該癌の生検におけるPD-L1の細胞染色のパーセンテージであるTPSが、1％〜100％、25％〜50％、25％〜100％、50％〜75％、50％〜100％、又は75％〜100％である場合、PD-L1陽性である。具体的な実施態様において、TPSスコアを用いてPD-L1陽性であると決定される癌は、非小細胞肺癌である。
【０３４７】
具体的な実施態様において、癌は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、該癌の生検におけるPD-L1の細胞染色のパーセンテージである複合陽性スコア(CPS)が、少なくとも1％、2％、3％、5％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は100％である場合、PD-L1陽性である。別の具体的な実施態様において、癌は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、該癌の生検におけるPD-L1の細胞染色のパーセンテージであるCPSが、少なくとも1％又は1％〜100％である場合、PD-L1陽性である。別の具体的な実施態様において、癌は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、該癌の生検におけるPD-L1の細胞染色のパーセンテージであるCPSが、1％〜100％、25％〜50％、25％〜100％、50％〜75％、50％〜100％、又は75％〜100％である場合、PD-L1陽性である。具体的な実施態様において、CPSスコアを用いてPD-L1陽性であると決定される癌は、胃癌(例えば、再発性局所進行性の転移性胃癌又は胃食道接合部腺癌)である。
【０３４８】
いくつかの具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-L1陰性である。具体的な実施態様において、癌は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、該癌の生検におけるPD-L1の細胞染色のパーセンテージであるTPSが1％未満である場合、PD-L1陰性である。具体的な実施態様において、TPSスコアを用いてPD-L1陰性であると決定される癌は、非小細胞肺癌である。
【０３４９】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、低レベルのPD-L1発現を有する。具体的な実施態様において、癌は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、該癌の生検におけるPD-L1の細胞染色のパーセンテージであるTPSが、1％〜50％、又は1％〜40％、1％〜30％、1％〜25％、1％〜15％、もしくは1％〜10％である場合、低レベルのPD-L1発現を有する。具体的な実施態様において、癌は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される技法、例えば、免疫組織化学検査又はPD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies社)によって評価したとき、該癌の生検におけるPD-L1の細胞染色のパーセンテージであるTPSが、50％未満であるが、1％以上である場合、低レベルのPD-L1発現を有する。
【０３５０】
具体的な実施態様において、ELISAは、癌の生検が、PD-L1陽性、PD-L1陰性であるかどうか、及び/又は低レベルのPD-L1発現を有するかどうかを決定するために使用される。具体的な実施態様において、免疫組織化学検査は、癌の生検が、PD-L1陽性、PD-L1陰性であるかどうか、及び/又は低レベルのPD-L1を有するかどうかを決定するために使用される。具体的な実施態様において、腫瘍もしくは悪性腫瘍(又はこれらの生検)は、PD-L1のレベルを決定するための米国食品医薬品局(U.S. Food and Drug Administration)によって承認されている1以上のアッセイに従って、PD-L1陽性、PD-L1陰性である、及び/又は低レベルのPD-L1を有すると決定される。PD-L1のレベルを決定するための米国食品医薬品局(U.S. Food and Drug Administration)によって承認されているアッセイの非限定的な例としては、PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Dako North America社製)及びVentana PD-L1(SP142)アッセイ(Ventana Medical Systems社製)が挙げられる。別の具体的な実施態様において、腫瘍もしくは悪性腫瘍(又はこれらの生検)におけるPD-L1のレベルは、臨床検査室改善修正法(Clinical Laboratory Improvement Amendments)による認証を受けた実験室で実施される実験室で開発された検査に従って決定される。別の具体的な実施態様において、腫瘍もしくは悪性腫瘍(又はこれらの生検)におけるPD-L1のレベルは、PCRを用いて決定される。別の具体的な実施態様において、腫瘍もしくは悪性腫瘍(又はこれらの生検)におけるPD-L1のレベルは、NanoString Technologies製のキットを用いて特定の腫瘍関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルを評価することにより決定される。
【０３５１】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に不応性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-1遮断抗体(例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-L1遮断抗体(例えば、アベルマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性である。
【０３５２】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-L1陰性であり、かつPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に応答性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-L1陰性であり、かつPD-1遮断抗体(例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ)による単剤療法治療に応答性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-L1陰性であり、かつPD-L1遮断抗体(例えば、アベルマブ)による単剤療法治療に応答性又は不応答性である。
【０３５３】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、低レベルのPD-L1発現を有し、かつPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に不応性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、低レベルのPD-L1発現を有し、かつPD-1遮断抗体(例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、低レベルのPD-L1発現を有し、かつPD-L1遮断抗体(例えば、アベルマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性である。
【０３５４】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、再発性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、再発性であり、かつPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に応答性又は不応答性である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、再発性であり、かつPD-1遮断抗体(例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ)による単剤療法治療に応答性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、再発性であり、かつPD-L1遮断抗体(例えば、アベルマブ)による単剤療法治療に応答性又は不応答性である。
【０３５５】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-L1陰性であり、かつ再発性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、低レベルのPD-L1発現を有し、かつ再発性である。
【０３５６】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、再発性であり、PD-L1陰性であり、かつPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に不応性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、再発性であり、PD-L1陰性であり、かつPD-1遮断抗体(例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、再発性であり、PD-L1陰性であり、かつPD-L1遮断抗体(例えば、アベルマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性である。
【０３５７】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、低レベルのPD-L1発現を有し、かつ再発性であり、かつPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に不応性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、低レベルのPD-L1発現を有し、かつ再発性であり、かつPD-1遮断抗体(例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、低レベルのPD-L1発現を有し、かつ再発性であり、かつPD-L1遮断抗体(例えば、アベルマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性である。
【０３５８】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に不応性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-1遮断抗体(例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、PD-L1遮断抗体(例えば、アベルマブ)による単剤療法治療に不応性又は不応答性である。
【０３５９】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、転移性である癌である。具体的な実施態様において、該癌は、皮膚、皮下、又はリンパ節転移を含む。具体的な実施態様において、該癌は、腹膜又は胸膜転移を含む。具体的な実施態様において、該癌は、内臓転移例えば、肝臓、腎臓、脾臓、又は肺転移を含む。
【０３６０】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、再発性/不応性固形腫瘍型、例えば、メラノーマ、肉腫、頭頸部の扁平上皮細胞癌(SSCHN)、皮膚転移を伴う乳癌、及び到達しやすい皮膚/SC/リンパ節転移を伴う他の悪性腫瘍である。
【０３６１】
具体的な実施態様において、本明細書に記載される方法に従って治療される癌は、切除不能である癌である。当業者に公知の任意の方法を利用して、癌が切除不能であるかどうかを決定することができる。
【０３６２】
(5.7.6  さらなる療法)
癌の治療のために本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞ワクチンと組み合わせて使用することができるさらなる療法としては、小分子、合成薬物、ペプチド(環状ペプチドを含む)、ポリペプチド、タンパク質、核酸(例えば、限定されないが、アンチセンスヌクレオチド配列、三重らせん、RNAi、及び生体活性のあるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、DNA及びRNAヌクレオチド)、抗体、合成又は天然無機分子、模倣剤、並びに合成又は天然有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、該さらなる療法は、化学療法剤である。
【０３６３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞ワクチンは、x線、γ線、及び癌細胞を破壊する他の放射線源の使用を含む放射線療法と組み合わせて使用される。具体的な実施態様において、該放射線療法は、外照射放射線又は遠隔療法として投与され、ここで、放射線は、遠隔源から向けられる。他の実施態様において、該放射線療法は、内科療法又は近接照射療法として投与され、ここで、放射能源は、体内で癌細胞及び/又は腫瘍塊の近くに置かれる。
【０３６４】
ある実施態様において、本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞癌ワクチンは、養子T細胞療法と組み合わせて使用される。具体的な実施態様において、養子T細胞療法で利用されるT細胞は、対象から単離され、特定のT細胞又はクローンがその用途のために拡大された腫瘍浸潤リンパ球である。いくつかの実施態様において、養子T細胞療法で利用されるT細胞は、患者が癌ワクチンを受けた後に患者の血液から採取され、使用前にインビトロで拡大されたT細胞である。別の具体的な実施態様において、養子T細胞療法で利用されるT細胞は、腫瘍を強く認識し、攻撃するように影響を受けたT細胞である。別の具体的な実施態様において、養子T細胞療法で利用されるT細胞は、腫瘍抗原特異的T細胞受容体又はキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子修飾されている。具体的な実施態様において、利用される養子T細胞療法は、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 2014/158811号及び米国特許出願公開第2016/0015760号の第6.2節に記載されているものと類似している。
【０３６５】
ある実施態様において、本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞癌ワクチンは、サイトカインと組み合わせて使用される。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞癌ワクチンは、インターフェロン(例えば、IFN-γ)と組み合わせて使用される。
【０３６６】
現在利用可能な癌療法、並びにその投薬量、投与経路、及び推奨使用量は当技術分野で公知であり、医師用卓上参考書(Physician's Desk Reference)(第67版、2013年)のような文献に記載されている。
【０３６７】
本明細書に記載されるNDV又はその組成物と組み合わせて使用し得る抗癌剤の具体的な例としては:ホルモン剤(例えば、アロマターゼ阻害剤、選択的エストロゲン受容体調節因子(SERM)、及びエストロゲン受容体アンタゴニスト)、化学療法剤(例えば、微小管分解遮断薬、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、及びDNA架橋剤又は損傷剤)、抗血管新生剤(例えば、VEGFアンタゴニスト、受容体アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、血管標的化剤(VTA)/血管破壊剤(VDA))、放射線療法、並びに従来の外科手術が挙げられる。
【０３６８】
本明細書に記載されるNDV又はその組成物と組み合わせて使用し得るホルモン剤の非限定的な例としてはアロマターゼ阻害剤、SERM、及びエストロゲン受容体アンタゴニストが挙げられる。アロマターゼ阻害剤であるホルモン剤は、ステロイド性であっても、非ステロイド性であってもよい。非ステロイド性ホルモン剤の非限定的な例としては、レトロゾール、アナストロゾール、アミノグルテチミド、ファドロゾール、及びボロゾールが挙げられる。ステロイド性ホルモン剤の非限定的な例としては、アロマシン(エキセメスタン)、ホルメスタン、及びテストラクトンが挙げられる。SERMであるホルモン剤の非限定的な例としては、タモキシフェン(Nolvadex(登録商標)として商標化/市販されている)、アフィモキシフェン、アルゾキシフェン、バゼドキシフェン、クロミフェン、フェマレル(femarelle)、ラソフォキシフェン、オルメロキシフェン、ラロキシフェン、及びトレミフェンが挙げられる。エストロゲン受容体アンタゴニストであるホルモン剤の非限定的な例としては、フルベストラントが挙げられる。他のホルモン剤としては、アビラテロン及びロナプリサンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６９】
本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞ワクチンと組み合わせて使用し得る化学療法剤の非限定的な例としては、微小管分解遮断薬、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、及びDNA架橋剤又は損傷剤が挙げられる。微小管分解遮断薬である化学療法剤としては、タキセン(taxene)(例えば、パクリタキセル(タキソール(登録商標)として商標化/市販されている)、ドセタキセル、アブサキサン、ラロタキセル、オルタタキセル、及びテセタキセル);エポチロン(例えば、イキサベピロン);並びにビンカアルカロイド(例えば、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びビンクリスチン(オンコビン(登録商標))として商標化/市販されている)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７０】
代謝拮抗薬である化学療法剤としては、葉酸代謝拮抗薬(例えば、メトトレキセート、アミノプテリン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド);プリン代謝拮抗薬(例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン);ピリミジン代謝拮抗薬(例えば、5-フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))、シタラビン、デシタビン、フロクスウリジン、テガフール);及びデオキシリボヌクレオチド代謝拮抗薬(例えば、ヒドロキシウレア)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７１】
トポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤としては、クラスI(カンプトテカ)トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、トポテカン(HYCAMTIN(登録商標)として商標化/市販されている)イリノテカン、ルビテカン、及びベロテカン);クラスII(ポドフィルム)トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、エトポシド又はVP-16、及びテニポシド);アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ドキシル、アクラルビシン、アムルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、及びゾルビシン);並びにアントラセンジオン(例えば、ミトキサントロン及びピクサントロン)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７２】
DNA架橋剤(又はDNA損傷剤)である化学療法剤としては、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、イホスファミド(IFEX(登録商標)として商標化/市販されている)、トロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、プレドニムスチン、ベンダムスチン、ウラムスチン、エストラムスチン、カルムスチン(BiCNU(登録商標)として商標化/市販されている)、ロムスチン、セムスチン、ホテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファン、カルボコン、N,N'N'-トリエチレンチオホスホラミド、トリアジコン、トリエチレンメラミン);アルキル化様剤(例えば、カルボプラチン(PARAPLATIN(登録商標)として商標化/市販されている)、シスプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン);非古典的DNA架橋剤(例えば、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド(テモダール(登録商標)として商標化/市販されている)、アルトレタミン、ミトブロニトール);並びにインターカレート剤(例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、及びプリカマイシン)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７３】
(5.7.6.1  免疫調節因子)
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、キメラNDV)もしくはその組成物、腫瘍溶解性ワクチン、又は全細胞ワクチンは、以下のもの:当業者に公知の、免疫細胞(例えば、T-リンパ球、NK細胞、又は抗原提示細胞(例えば、樹状細胞もしくはマクロファージ)など)の共刺激シグナルの任意のアゴニスト及び/又は免疫細胞(例えば、T-リンパ球、NK細胞、又は抗原提示細胞(例えば、樹状細胞もしくはマクロファージ)など)の抑制シグナルの任意のアンタゴニストのうちの1つ又は複数と組み合わせて対象に投与される。
【０３７４】
具体的な実施態様において、該アゴニスト及び/又はアンタゴニストは、免疫細胞のヒト共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫細胞のヒト抑制シグナルのアンタゴニストである。
【０３７５】
ある実施態様において、共刺激シグナルのアゴニストは、例えば、Tリンパ球(例えば、CD4+もしくはCD8+ Tリンパ球)、NK細胞、及び/又は抗原提示細胞(例えば、樹状細胞もしくはマクロファージ)などの免疫細胞に見られる共刺激分子(例えば、共刺激受容体)のアゴニストである。共刺激分子の具体的な例としては、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体(GITR)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS又はCD278)、OX40(CD134)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、リンホトキシンα(LTα)、LIGHT(リンホトキシン様、誘導性発現を示し、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質DとHVEMを競合する、Tリンパ球によって発現される受容体)、CD226、細胞傷害性及び調節性T細胞分子(CRTAM)、死受容体3(DR3)、リンホトキシン-β受容体(LTBR)、膜貫通活性化因子及びCAML相互作用因子(TACI)、B細胞活性化因子受容体(BAFFR)、並びにB細胞成熟タンパク質(BCMA)が挙げられる。具体的な実施態様において、該アゴニストは、免疫細胞のヒト共刺激受容体のアゴニストである。ある実施態様において、該共刺激受容体のアゴニストは、ICOSのアゴニストではない。
【０３７６】
具体的な実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは、該共刺激受容体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。共刺激受容体の具体的な例としては、GITR、ICOS、OX40、CD27、CD28、4-1BB、CD40、LTα、LIGHT、CD226、CRTAM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR、及びBCMAが挙げられる。ある具体的な実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。他の具体的な実施態様において、該抗体は、sc-Fvである。他の具体的な実施態様において、該抗体は、ラクダ化抗体である。具体的な実施態様において、該抗体は、免疫細胞上の2つの受容体に結合する二重特異性抗体である。他の実施態様において、該二重特異性抗体は、免疫細胞上の受容体及び癌細胞上の別の受容体に結合する。具体的な実施態様において、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は、NDV Fタンパク質もしくはその断片、又はNDV HNタンパク質もしくはその断片を有するを有するキメラタンパク質として発現される。キメラF又はキメラHNタンパク質の作製に関する説明については、例えば、引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許出願公開第2012/0122185号を参照されたい。
【０３７７】
別の実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは、該共刺激受容体のリガンドである。ある実施態様において、該リガンドは、天然リガンドの断片である。天然リガンドの具体的な例としては、ICOSL、B7RP1、CD137L、OX40L、CD70、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)、CD80、及びCD86が挙げられる。天然リガンドをコードするヌクレオチド配列及び天然リガンドのアミノ酸配列は当技術分野で公知である。例えば、B7RP1(別名、ICOSLとして知られている; GenBankヒト: NM_015259.4、NP_056074.1、マウス: NM_015790.3、NP_056605.1)、CD137L(GenBankヒト: NM_003811.3、NP_003802.1、マウス: NM_009404.3、NP_033430.1)、OX40L(GenBankヒト: NM_003326.3、NP_003317.1、マウス: NM_009452.2、NP_033478.1)、CD70(GenBankヒト: NM_001252.3、NP_001243.1、マウス: NM_011617.2、AAD00274.1)、CD80(GenBankヒト: NM_005191.3、NP_005182.1、マウス: NM_009855.2、NP_033985.3)、及びCD86(GenBankヒト: NM_005191.3、CAG46642.1、マウス: NM_019388.3、NP_062261.3)のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をGenBankで見出すことができる。他の実施態様において、該リガンドは、天然リガンドの誘導体である。いくつかの実施態様において、該リガンドは、共刺激受容体に特異的に結合する天然リガンド又は天然リガンドの誘導体の少なくとも一部と異種アミノ酸配列とを含む融合タンパク質である。具体的な実施態様において、該融合タンパク質は、共刺激受容体に特異的に結合する天然リガンド又は天然リガンドの誘導体少なくとも一部と免疫グロブリンのFc部分又はその断片とを含む。リガンド融合タンパク質の一例は、免疫グロブリンのFc部分に融合した4-1BBリガンド(Meseck Mらの文献、J Immunother. 2011 34:175-82に記載されている)である。
【０３７８】
いくつかの実施態様において、該アンタゴニストは、例えば、Tリンパ球(例えば、CD4+もしくはCD8+ Tリンパ球)、NK細胞、及び/又は抗原提示細胞(例えば、樹状細胞もしくはマクロファージ)などの免疫細胞に見られる抑制性分子(例えば、抑制受容体)のアンタゴニストである。抑制性分子の具体的な例としては、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA-4又はCD52)、プログラム細胞死タンパク質1(PD1又はCD279)、B及びT-リンパ球アテニュエーター(BTLA)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、T細胞膜タンパク質3(TIM3)、CD160、アデノシンA2a受容体(A2aR)、免疫グロブリンドメインとITIMドメインを有するT細胞免疫受容体(TIGIT)、白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1)、並びにCD160が挙げられる。具体的な実施態様において、該アンタゴニストは、免疫細胞のヒト抑制受容体のアンタゴニストである。具体的な実施態様において、該抑制性分子のアンタゴニストは、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニスト(例えば、上の第5.5節に記載されているものなど)である。
【０３７９】
別の実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、該抑制受容体の天然リガンドに特異的に結合し、かつ該天然リガンドが該抑制受容体に結合して、抑制シグナル(複数可)を伝達するのを遮断する、抗体(もしくは抗原結合断片)又は可溶性受容体である。抑制受容体の天然リガンドの具体的な例としては、PDL-1、PDL-2、B7-H3、B7-H4、HVEM、Gal9、及びアデノシンが挙げられる。天然リガンドに結合する抑制受容体の具体的な例としては、CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3、及びA2aRが挙げられる。
【０３８０】
具体的な実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、該抑制受容体の天然リガンドに特異的に結合し、かつ該天然リガンドが該抑制受容体に結合して、抑制シグナル(複数可)を伝達するのを遮断する、可溶性受容体である。ある実施態様において、該可溶性受容体は、天然リガンドに特異的に結合する天然の抑制受容体の断片又は天然の抑制受容体の誘導体の断片(例えば、天然の抑制受容体又は抑制受容体の誘導体の細胞外ドメイン)である。いくつかの実施態様において、該可溶性受容体は、天然の抑制受容体又は天然の抑制受容体の誘導体(例えば、天然の抑制受容体又は天然の抑制受容体の誘導体の細胞外ドメイン)の少なくとも一部と異種アミノ酸配列とを含む融合タンパク質である。具体的な実施態様において、該融合タンパク質は、天然の抑制受容体又は天然の抑制受容体の誘導体の少なくとも一部と免疫グロブリンのFc部分又はその断片とを含む。可溶性受容体融合タンパク質の一例は、LAG3-Ig融合タンパク質(Huard Bらの文献、Eur J Immunol. 1995 25:2718-21に記載されている)である。
【０３８１】
具体的な実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、該抑制受容体の天然リガンドに特異的に結合し、かつ該天然リガンドが該抑制受容体に結合して、抑制シグナルを伝達するのを遮断する、抗体(又は抗原結合断片)である。ある具体的な実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。他の具体的な実施態様において、該抗体は、scFvである。特定の実施態様において、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。抑制性リガンドに対する抗体の具体的な例は、抗PD-L1抗体(Iwai Yの文献、PNAS 2002; 99:12293-12297)である。
【０３８２】
別の実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、該抑制受容体に結合するが、抑制シグナルを伝達しない、抗体(もしくは抗原結合断片)又はリガンドである。抑制受容体の具体的な例としては、CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3、及びA2aRが挙げられる。ある具体的な実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。他の具体的な実施態様において、該抗体は、scFvである。特定の実施態様において、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。抑制受容体に対する抗体の具体的な例は、抗CTLA-4抗体(Leach DRらの文献、Science 1996; 271: 1734-1736)である。抑制受容体に対する抗体の別の例は、抗PD-1抗体(Topalian SLの文献、NEJM 2012; 28:3167-75)である。
【０３８３】
ある実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、例えば、イピリムマブ又はトレメリムマブなどのCTLA-4のアンタゴニストである。ある実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、例えば、MDX-1106(BMS-936558)、MK3475、CT-011、AMP-224、又はMDX-1105などのPD-1のアンタゴニストである。ある実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、例えば、IMP321などのLAG3のアンタゴニストである。ある実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、例えば、MGA271などの、B7-H3に結合する抗体(例えば、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、又はscFv)である。具体的な実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは、抗CD28 scvFv、ICOSL、CD40L、OX40L、CD137L、GITRL、及び/又はCD70である。
【０３８４】
ある実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストは、共刺激受容体のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を誘導する(例えば、選択的に誘導する)。具体的な実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは、該共刺激受容体の1以上のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、該アゴニストの非存在下での該共刺激受容体の1以上のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で誘導する。具体的な実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは:(i)該共刺激受容体の1つの特定のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、該アゴニストの非存在下での該共刺激受容体の該特定のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で誘導し;及び(ii)該共刺激受容体の1以上の他のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を誘導しないか、或いは該シグナル伝達経路を、該アゴニストの非存在下での該共刺激受容体のそのような1以上の他のリガンドによって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、20％、15％、10％、5％、もしくは2％未満、又は2％〜5％、2％〜10％、5％〜10％、5％〜15％、5％〜20％、10％〜15％、もしくは15％〜20％の範囲で誘導する。
【０３８５】
ある実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニストは、共刺激受容体のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を活性化又は増強する(例えば、選択的に活性化又は増強する)。具体的な実施態様において、共刺激受容体のアゴニストは、該共刺激受容体の1以上のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、該アゴニストの非存在下での共刺激受容体の1以上のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で活性化又は増強する。具体的な実施態様において、共刺激受容体のアゴニスト:(i)共刺激シグナルのアゴニストは、該共刺激受容体の1つの特定のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、該アゴニストの非存在下での該共刺激受容体の該特定のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で活性化又は増強し;及び(ii)該共刺激受容体の1以上の他のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を活性化又は増強しないか、或いは該シグナル伝達経路を、該アゴニストの非存在下での該共刺激受容体のそのような1以上の他の結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、20％、15％、10％、5％、もしくは2％未満、又は2％〜5％、2％〜10％、5％〜10％、5％〜15％、5％〜20％、10％〜15％、もしくは15％〜20％の範囲で活性化又は増強する。
【０３８６】
いくつかの実施態様において、免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストは、抑制受容体のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を(例えば、選択的に)阻害し又は低下させる。具体的な実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは、該抑制受容体の1以上のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、該アンタゴニストの非存在下での該抑制受容体の1以上のそのリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で阻害し又は低下させる。具体的な実施態様において、抑制受容体のアンタゴニストは:(i)該抑制受容体の1つの特定のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を、該アンタゴニストの非存在下での該抑制受容体の該1つの特定のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、少なくとも25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、又は25％〜50％、25％〜75％、50％〜75％、50％〜95％、75％〜95％、もしくは75％〜100％の範囲で阻害し又は低下させ;及び(ii)該抑制受容体の1以上の他のリガンドの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路を阻害し又は低下させないか、或いは該シグナル伝達経路を、該アンタゴニストの非存在下での抑制受容体のそのような1以上の他のリガンドへの結合によって誘導される1以上のシグナル伝達経路と比べて、20％、15％、10％、5％、もしくは2％未満、又は2％〜5％、2％〜10％、5％〜10％、5％〜15％、5％〜20％、10％〜15％、もしくは15％〜20％の範囲で阻害し又は低下させる。
【０３８７】
具体的な実施態様において、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストは、1以上の免疫活性、機能、又は応答を誘導し、活性化し、及び/又は増強する。該1以上の免疫活性、機能、又は応答は、例えば、抗体応答(液性応答)又は細胞性免疫応答、例えば、サイトカイン分泌(例えば、インターフェロン-γ)、ヘルパー活性、又は細胞傷害性の形態であることができる。一実施態様において、免疫細胞上の活性化マーカー(例えば、CD44、グランザイム、もしくはKi-67)の発現、免疫細胞上の共刺激受容体(例えば、ICOS、CD28、OX40、もしくはCD27)の発現、共刺激受容体のリガンド(例えば、B7HRP1、CD80、CD86、OX40L、もしくはCD70)の発現、サイトカイン分泌、免疫細胞(例えば、Tリンパ球、Bリンパ球、及び/もしくはNK細胞)の腫瘍への浸潤、抗体産生、エフェクター機能、T細胞活性化、T細胞分化、T細胞増殖、B細胞分化、B細胞増殖、並びに/又はNK細胞増殖は、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストとの接触後に誘導され、活性化され、及び/又は増強される。別の実施態様において、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の腫瘍浸潤及び増殖、Tregの腫瘍浸潤、活性化、及び増殖、末梢血MDSC及びTregの数は、免疫細胞の共刺激シグナルのアゴニスト及び/又は免疫細胞の抑制シグナルのアンタゴニストとの接触後に阻害される。
【０３８８】
(5.8  生物学的アッセイ)
ある実施態様において、下の第6節に記載されているアッセイを用いて、例えば、キメラNDVの産生、キメラNDVによって発現されるIL-12の発現、機能、もしくはその両方、又は本明細書に記載される方法の有効性を特徴付ける/評価する。
【０３８９】
(5.8.1  インビトロウイルスアッセイ)
ウイルスアッセイには、ウイルス複製(例えば、プラーク形成により決定される)又はウイルスタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット解析により決定される)又はウイルスRNAの産生(例えば、RT-PCRもしくはノーザンブロット解析により決定される)を、当技術分野で周知の方法を用いて、インビトロで、培養細胞で直接測定するアッセイが含まれる。
【０３９０】
本明細書に記載されるNDVの成長は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される任意の方法により(例えば、細胞培養(例えば、ニワトリ胚腎臓細胞の培養又はニワトリ胚線維芽細胞(CEF)の培養)で)評価することができる(例えば、第6節を参照)。ウイルス力価は、本明細書に記載されるNDVの段階希釈液を、細胞培養物(例えば、CEF、MDCK、EFK-2細胞、Vero細胞、初代ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)、H292ヒト上皮細胞株、もしくはHeLa細胞)、ニワトリ胚、又は生きた動物(例えば、鳥)に接種することにより決定することができる。ウイルスを規定の時間インキュベートした後、標準的な方法を用いて、該ウイルスを単離する。ウイルス力価の物理的定量は、ウイルス上清に適用されるPCR(Quinn及びTrevorの文献、1997; Morganらの文献、1990)、血球凝集アッセイ、組織培養感染用量(TCID50)、又は卵感染用量(EID50)を用いて実施することができる。ウイルス力価を評価する例示的な方法は、下の第6節に記載されている。
【０３９１】
本明細書に記載されるキメラNDVのゲノムへの異種ペプチド又はタンパク質(例えば、サイトカイン、突然変異型Fタンパク質、突然変異Vタンパク質、又はmiRNA標的部位)をコードするヌクレオチド配列の組込みは、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される任意の方法により(例えば、細胞培養、動物モデル、又は孵化卵中のウイルス培養で)評価することができる。例えば、孵化卵の尿膜腔液の細胞培養物由来のウイルス粒子を、スクロースクッションに通す遠心分離により精製し、その後、当技術分野で周知の方法を用いて、ウェスタンブロッティングにより、融合タンパク質発現について解析することができる。
【０３９２】
免疫蛍光に基づく手法を用いて、ウイルスを検出し、ウイルス成長を評価することもできる。そのような手法は、当業者に周知であり、例えば、蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーがある(下の第6節を参照)。蛍光活性化細胞選別(FACS)を含む、フローサイトメトリーの方法が利用可能である(例えば、Owensらの文献(1994)、臨床実験室実践のためのフローサイトメトリー原理(Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice)、John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givanの文献(2001)、フローサイトメトリー(Flow Cytometry)、第2版; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiroの文献(2003)、実践的フローサイトメトリー(Practical Flow Cytometry)、John Wiley and Sons, Hoboken, NJを参照)。例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマー及びプローブを含む核酸、ポリペプチド、並びに抗体を修飾するのに好適な蛍光試薬が利用可能である(Molecular Probesy(2003)、カタログ、Molecular Probes社、Eugene, OR; Sigma-Aldrich(2003)、カタログ、St. Louis, MOを参照)。
【０３９３】
免疫系の組織学的検査の標準的な方法が記載されている(例えば、Muller-Harmelink(編)(1986)、ヒト胸腺:組織病理学及び病理学(Human Thymus: Histopathology and Pathology)、Springer Verlag, New York, NY; Hiattらの文献(2000)、組織学のカラーアトラス(Color Atlas of Histology)、Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louisらの文献(2002)、基礎組織学:テキスト及びアトラス(Basic Histology: Text and Atlas)、McGraw-Hill, New York, NYを参照)。
【０３９４】
(5.8.2  IFNアッセイ)
本明細書に記載されるNDVによるIFN誘導及び放出は、当業者に公知の又は本明細書に記載される技術を用いて決定することができる(例えば、第6節を参照)。例えば、本明細書に記載されるNDVへの感染後に細胞で誘導されるIFNの量を、免疫アッセイ(例えば、ELISA又はウェスタンブロットアッセイ)を用いて決定して、IFN発現を測定し、又はその発現がIFNにより誘導されるタンパク質の発現を測定することができる。或いは、誘導されるIFNの量は、当業者に公知のアッセイ、例えば、ノーザンブロット及び定量的RT-PCRにより、RNAレベルで測定することができる。具体的な実施態様において、放出されるIFNの量は、ELISPOTアッセイを用いて測定することができる。(例えば、下の第6節に記載されている方法を参照されたい)。さらに、サイトカイン及び/又はインターフェロン刺激遺伝子の誘導及び放出は、例えば、免疫アッセイ又はELISPOTアッセイにより、タンパク質レベルで、及び/又は定量的RT-PCRもしくはノーザンブロットにより、RNAレベルで決定することができる。サイトカイン及び/又はインターフェロン刺激遺伝子の誘導及び放出を測定するためのアッセイに関しては、下の第6節を参照されたい。
【０３９５】
(5.8.3  活性化マーカーアッセイ)
免疫細胞による活性化マーカー、共刺激分子、リガンド、又は抑制性分子の発現を評価するための技法は、当業者に公知である。例えば、免疫細胞(例えば、Tリンパ球又はNK細胞)による活性化マーカー、共刺激分子、リガンド、又は抑制性分子の発現は、フローサイトメトリーにより評価することができる。具体的な実施態様において、下の第6節に記載されている技法を用いて、免疫細胞による活性化マーカー、共刺激分子、リガンド、又は抑制性分子の発現を評価する。
【０３９６】
(5.8.4  免疫細胞浸潤アッセイ)
免疫細胞浸潤を評価するための技法は、当業者に公知である。具体的な実施態様において、下の第6節に記載されている技法を用いて、免疫細胞浸潤を評価する。
【０３９７】
(5.8.5  毒性研究)
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法を、細胞傷害性について、哺乳動物、好ましくは、ヒト細胞株で試験する(例えば、下の第6節に記載されている細胞傷害性アッセイを参照されたい)。ある実施態様において、細胞傷害性を、1以上の以下の非限定的な細胞株例で評価する: U937、ヒト単球細胞株;初代末梢血単核細胞(PBMC); Huh7、ヒト肝芽腫細胞株; HL60細胞、HT1080、HEK 293T、及び293H、MLPC細胞、ヒト胚性腎臓細胞株;ヒトメラノーマ細胞株、例えば、SkMel2、SkMel-119、及びSkMel-197; THP-1、単球細胞; HeLa細胞株;並びに神経芽腫細胞株、例えば、MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y、及びBE(2)-C。ある実施態様において、細胞傷害性を様々な癌細胞で評価する。いくつかの実施態様において、ToxLiteアッセイを用いて、細胞傷害性を評価する。
【０３９８】
当技術分野で周知の多くのアッセイを用いて、本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物への感染、又は本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、本明細書に記載される全細胞ワクチン、もしくは本明細書に記載される併用療法による処理の後の細胞又は細胞株の生存を評価し、それにより、該NDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療法の細胞傷害性を決定することができる。例えば、細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン(BrdU)の取込み、(3H)チミジンの取込みを測定することによるか、直接的な細胞カウントによるか、又は既知の遺伝子、例えば、癌原遺伝子(例えば、fos、myc)もしくは細胞周期マーカー(Rb、cdc2、サイクリンA、D1、D2、D3、Eなど)の転写、翻訳、もしくは活性の変化を検出することによりアッセイすることができる。そのようなタンパク質及びmRNA及び活性のレベルは、当技術分野で周知の任意の方法により決定することができる。例えば、市販の抗体を含む抗体を用いる公知の免疫診断方法、例えば、ELISA、ウェスタンブロッティング、又は免疫沈降により、タンパク質を定量することができる。当技術分野で周知かつルーチンの方法を用いて、例えば、ノーザン解析、RNアーゼ保護、又は逆転写と関連するポリメラーゼ連鎖反応を用いて、mRNAを定量することができる。細胞の生存は、トリパンブルー染色又は当技術分野で公知の他の細胞生死マーカーを用いて評価することができる。具体的な実施態様において、細胞のATPレベルを測定して、細胞の生存を決定する。好ましい実施態様において、本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療法は、癌細胞を死滅させるが、健常(すなわち、非癌)細胞を死滅させない。一実施態様において、本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療法は、癌細胞を優先的に死滅させるが、健常(すなわち、非癌)細胞を死滅させない。
【０３９９】
具体的な実施態様において、細胞の生存は、細胞内ATPレベルを測定する、当技術分野で標準的なアッセイ、例えば、CellTiter-Gloアッセイキット(Promega)を用いて、3日及び7日の期間で測定される。細胞ATPの低下は、細胞毒性効果を示すものである。別の具体的な実施態様において、細胞の生存は、ニュートラルレッド取込みアッセイで測定することができる。他の実施態様において、形態変化の目視観察には、肥大、粒状度、ギザギザの縁を有する細胞、薄膜状の外観、円形化、ウェル表面からの剥離、又は他の変化が含まれ得る。
【０４００】
本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療法を、インビボ毒性について、動物モデルで試験することができる(例えば、下の第6節に記載されている動物モデルを参照されたい)。例えば、癌に対する化合物の効果を試験するために使用される、本明細書に記載される動物モデル及び/又は当技術分野で公知の他のものを用いて、本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療法のインビボ毒性を決定することもできる。例えば、動物に、様々なpfuの本明細書に記載されるNDV(例えば、下の第5.2節に記載されるキメラNDV)を投与する。その後、該動物を、致死率、体重減少もしくは体重増加失敗、及び/又は組織損傷を示し得る血清マーカーのレベル(例えば、全般的な組織損傷の指標としてのクレアチンホスホキナーゼレベル、肝損傷の可能性の指標としてのグルタミン酸シュウ酸トランスアミナーゼ又はピルビン酸トランスアミナーゼのレベル)について経時的にモニタリングする。これらのインビボアッセイは、投薬量の他に、様々な投与様式及び/又はレジメンの毒性を試験するために適合させることができる。
【０４０１】
本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法の毒性及び/又は効力は、例えば、LD50(集団の50％に致死的な用量)及びED50(集団の50％で治療的に有効な用量)を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、これは、比LD50/ED50と表すことができる。大きい治療指数を示す療法が好ましい。毒性のある副作用を示す療法を使用してもよいが、非癌細胞に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより、副作用を軽減するために、そのような療法を罹患組織の部位にターゲッティングする送達系を設計するよう、注意を払うべきである。
【０４０２】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、対象で使用される療法の投薬量の範囲を定める際に使用することができる。そのような薬剤の投薬量は、循環濃度の範囲内にあることが好ましく、この範囲には、ほとんど又は全く毒性のないED50が含まれる。投薬量は、利用される剤形及び利用される投与経路によって、この範囲内で異なり得る。本明細書に記載される任意の療法について、治療有効用量を、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量を動物モデルで定めて、循環血漿濃度範囲を得ることができ、この循環血漿濃度範囲には、細胞培養で決定されるIC50(すなわち、症状の半最大阻害を達成するキメラNDVの濃度)が含まれる。そのような情報を用いて、対象での有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０４０３】
(5.8.6  抗癌研究)
本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法は、癌の動物モデルを用いて、生物学的活性について試験することができる(例えば、第6節を参照)。そのような動物モデル系としては、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV又は併用療法の抗癌活性は、マウスモデル系で試験される。そのようなモデル系は広く使用され、当業者に周知であり、例えば、SCIDマウスモデル又はトランスジェニックマウスがある。
【０４０４】
本明細書に記載されるNDVもしくはその組成物、本明細書に記載される腫瘍溶解物ワクチン、本明細書に記載される全細胞ワクチン、又は本明細書に記載される併用療法の抗癌活性は、該NDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療法を動物モデルに投与し、該NDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物ワクチン、全細胞ワクチン、又は併用療法が、癌の重症度の軽減、癌の症状の軽減、癌転移の減少、及び/又は該動物モデルの腫瘍サイズの減少に効果的であることを立証することにより決定することができる(例えば、下の第6節を参照)。一般的な癌の動物モデルの例としては、PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる治療に不応性又は不応答性の動物モデル、例えば、B16F10マウスモデルなど(例えば、第6節に記載されているもの)、及びコンパニオン動物の自然発生腫瘍(例えば、Vail及びMacEwenの文献、2000, Cancer Invest 18(8):781-92参照)が挙げられるが、これらに限定されない。肺癌の動物モデルの例としては、Zhang及びRothらの文献(1994, In-vivo 8(5):755-69)に記載される肺癌動物モデル及びp53機能が破壊されたトランスジェニックマウスモデル(例えば、Morrisらの文献、1998, J La State Med Soc 150(4):179-85参照)が挙げられるが、これらに限定されない。乳癌の動物モデルの例としては、サイクリンD1を過剰発現するトランスジェニックマウスが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Hosokawaらの文献、2001, Transgenic Res 10(5):471-8を参照されたい)。結腸癌の動物モデルの例としては、TCR b及びp53の二重ノックアウトマウスが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Kadoらの文献、2001, Cancer Res. 61(6):2395-8を参照されたい)。膵癌の動物モデルの例としては、PancO2マウス膵腺癌の転移モデル(例えば、Wangらの文献、2001, Int. J. Pancreatol. 29(1):37-46参照)及び皮下膵臓腫瘍で作製されたnu-nuマウス(例えば、Ghanehらの文献、2001, Gene Ther. 8(3):199-208参照)が挙げられるが、これらに限定されない。非ホジキンリンパ腫の動物モデルの例としては、重症複合免疫不全(「SCID」)マウス(例えば、Bryantらの文献、2000, Lab Invest 80(4):553-73参照)及びIgHmu-HOX11トランスジェニックマウス(例えば、Houghらの文献、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(23):13853-8参照)が挙げられるが、これらに限定されない。食道癌の動物モデルの例としては、ヒトパピローマウイルス16型E7癌遺伝子が遺伝子導入されたマウスが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Herberらの文献、1996, J. Virol. 70(3):1873-81を参照されたい)。結腸直腸癌の動物モデルの例としては、Apcマウスモデル(例えば、Fodde及びSmitsの文献、2001, Trends Mol Med 7(8):369 73及びKuraguchiらの文献、2000参照)並びにID8卵巣癌モデルが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、下の第6節に記載されている癌の動物モデルを用いて、NDVもしくはその組成物、腫瘍溶解物、全細胞ワクチン、又は併用療法の有効性を評価する。
【０４０５】
(5.8.7  IL-12の発現)
IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVに感染した細胞におけるIL-12又はその誘導体の発現を試験するためのアッセイは、例えば、ウェスタンブロット、免疫蛍光、及びELISAなどの当技術分野で公知の任意のアッセイ、又は本明細書に記載される任意のアッセイ(例えば、第6節を参照)を用いて実施することができる。
【０４０６】
具体的な態様において、ELISAは、IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVに感染した細胞におけるIL-12又はその誘導体の発現を検出するために利用される。例えば、細胞(例えば、Vero細胞)を、組織培養プレート(例えば、96ウェルプレート)中、適切な濃度(例えば、1×104個のvero細胞/96ウェルプレートのウェル)で、2％グルタミン(例えば、Corning、カタログ番号25-005-CI)が補充された無血清培地(例えば、OptiPRO無血清培地(Gibco、カタログ番号12309-019)に播種し、標準的な条件(例えば、37±2℃、5±2％CO2)下で、一定期間(例えば、約24時間)、インキュベートする。該キメラNDVの試験試料を、低血清培地(例えば、Opti-MEM(1×)低血清培地(Gibco、カタログ番号31985-070))に、所望の力価(例えば、2×104pfu/mL)まで予め希釈する。一定容量の予め希釈した試験試料(例えば、300μL)を、例えば、0.5mL Assay Block(Costar、カタログ番号3956)の1列に添加し、一定容量の試料を一定容量の低血清培地に(例えば、150μLの試料を150μLのOpti-MEM(1×)低血清培地に)移すことにより、連続希釈(例えば、2倍連続希釈)を横一列にわたって実施する。試料当たり2回の複製物を用意してもよい。播種から一定期間後(例えば、播種から約24時間後)、細胞(例えば、Vero細胞)を含有する組織培養プレート(例えば、96ウェルプレート)をインキュベーターから取り出し、使用済みの培地を該プレートから除去する。該細胞に、一定容量(例えば、100μL)の連続希釈した試験試料を接種し、標準的な条件(例えば、37℃、5％CO2)下でインキュベートする。一定期間のインキュベーション(例えば、約24時間)の後、一定容量の上清液(例えば、90μL)を感染プレートから取り除き、抗ヒトIL-12 p70捕捉抗体(例えば、Affymetrix eBioscience、カタログ番号14-7128-68)でプレコーティングされたELISAプレートに移し、一定期間(例えば、室温で2時間)、インキュベートする。捕捉されたhuIL-12を抗ヒトIL-12 p70検出抗体(例えば、Affymetrix eBioscience、カタログ番号33-8261-68A)及び例えば、アビジン-HRPで検出し、例えば、供給業者の手順(Affymetrix eBioscience、ヒトIL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go! ELISAキット、カタログ番号88-7126-88)に従ってHRP基質TMBで可視化する。具体的な実施態様において、ヒトIL-12を、例えば、下の6.3.1.19節に記載されているELISAを用いて定量する。
【０４０７】
一実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノムによってコードされるIL-12又はその誘導体は、当技術分野で公知の抗体-抗原相互作用についての任意のアッセイを用いて抗IL-12抗体に特異的に結合するその能力を試験することにより、適切なフォールディング及び機能性についてアッセイされる。別の実施態様において、本明細書に記載されるキメラNDVのパッケージングされたゲノムによってコードされるIL-12又はその誘導体は、例えば、NMR、X線結晶学的方法、又は二次構造予測法、例えば、円偏光二色性などの当技術分野で公知の方法を用いるIL-12又はその誘導体の構造又は立体構造の決定により、適切なフォールディングについてアッセイされる。
【０４０８】
IL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVに感染した細胞におけるIL-12又はその誘導体の機能性を試験するためのアッセイは、例えば、PathHunter(登録商標)バイオアッセイ検出キット(DiscoverX、カタログ番号93-0933)などの、当技術分野で公知の任意のアッセイを用いて実施することができる。例えば、huIL-12又はその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDVに感染した細胞における該キメラNDVから産生されるhuIL-12の機能性を評価するために、細胞(例えば、vero細胞)をプレート(例えば、5×105個のvero細胞/6ウェル組織培養プレートのウェル)に播種し、一定期間、例えば、24時間、該細胞型についての当業者に公知の標準的な条件(例えば、37℃、5％CO2)下でインキュベートする。該キメラNDVの試験試料を(例えば、1×106pfu/mLまで)低血清培地(例えば、Opti-MEM(1×)低血清培地)に希釈し、様々な量の希釈試料を0.03〜1の目標MOIになるまで細胞プレートに移す。その後、培地を組織培養プレートのサイズに適した最終容量(例えば、6ウェル組織培養プレートのウェル当たり2mL)まで各々のウェルに添加する。感染細胞プレートを37℃、5％CO2で24時間インキュベートし、産生された上清中のhuIL-12又はその誘導体の機能を、製造業者の指示に従ってPathHunter(登録商標)バイオアッセイ検出キット(DiscoverX、カタログ番号93-0933)を用いてアッセイする。簡潔に述べると、U2OS IL12RB1/IL12RB2細胞を96ウェル細胞プレートに(例えば、5×103細胞/ウェルで)播種し、標準的な条件(例えば、37℃、5％CO2)下で、一定期間(例えば、4〜6時間)、インキュベートする。キメラNDV感染プレートの各々のプレート由来の一定容量の上清液(例えば、60μL)を96ウェル試料希釈プレートの2列目に移し、AssayComplete細胞プレーティング試薬(DiscoverX、93-0563R5A)中での3倍連続希釈を実行する。各々の希釈上清の一部(例えば、10μL)をU2OS細胞プレートに移し、該プレートを、標準的な条件(例えば、37℃、5％CO2)下で、一定期間(例えば、16〜20時間)、インキュベートする。検出試薬1(例えば、10μL)を各々のウェルに添加し、該プレートを、一定期間(例えば、15分間)、室温でインキュベートする。検出試薬2(例えば、40μL)を各々のウェルに添加し、該プレートを、室温で一定期間(例えば、60分間)、さらにインキュベートする。プレートリーダー(例えば、SpectraMax M5プレートリーダー)を用いて、化学発光シグナルを検出する。具体的な実施態様において、ヒトIL-12の機能性を、下の第6.3.1.18節に記載されているアッセイを用いてアッセイする。
【０４０９】
(5.9  キット)
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組成物(例えば、医薬組成物)の成分のうちの1つ又は複数が充填された1以上の容器を含む医薬パック又はキットである。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、第一の容器及び第二の容器を含む医薬パック又はキットであり、ここで、該第一の容器は、本明細書に記載されるPD-1もしくはそのリガンドのアンタゴニスト、又は該アンタゴニストを含む医薬組成物を含み、該第二の容器は、IL-12(例えば、ヒトIL-12)もしくはその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV、又は該キメラNDVを含む医薬組成物を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、第一の容器及び第二の容器を含む医薬パック又はキットであり、ここで、該第一の容器は、本明細書に記載されるPD-1遮断抗体、又は該PD-1遮断抗体を含む医薬組成物を含み、該第二の容器は、IL-12(例えば、ヒトIL-12)もしくはその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV、又は該キメラNDVを含む医薬組成物を含む。一実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ニボルマブである。好ましい実施態様において、該PD-1遮断抗体は、ペンブロリズマブである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、第一の容器及び第二の容器を含む医薬パック又はキットであり、ここで、該第一の容器は、本明細書に記載されるPD-L1遮断抗体、又は該PD-L1遮断抗体を含む医薬組成物を含み、該第二の容器は、IL-12(例えば、ヒトIL-12)もしくはその誘導体をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むキメラNDV、又は該キメラNDVを含む医薬組成物を含む。ある実施態様において、該PD-L1遮断抗体は、デュラルマブ(duralumab)又はアベルマブである。医薬品又は生物学的製剤の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって定められた形での注意書きを、そのような容器に任意に関連付けることができ、この注意書きは、該機関による、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の認可を示すものである。
【０４１０】
(5.10  配列)
表1.例示的なp40配列(アミノ酸)
【表１】
2020519641.tif 000173
【０４１１】
表2.例示的なp40配列(核酸)
【表２】
2020519641.tif 000174
2020519641.tif 000175
2020519641.tif 000176
【０４１２】
表3.例示的なp35配列(アミノ酸)
【表３】
2020519641.tif 000177
【０４１３】
表4.例示的なp35配列(核酸)
【表４】
2020519641.tif 000178
【０４１４】
表5.例示的なリンカー配列(アミノ酸)
【表５】
2020519641.tif 000179
【０４１５】
表6.例示的なリンカー配列(核酸)
【表６】
2020519641.tif 000180
【０４１６】
表7.例示的なIL-12導入遺伝子配列(アミノ酸)
【表７】
2020519641.tif 000181
2020519641.tif 000182
【０４１７】
表8.例示的なIL-12導入遺伝子配列(核酸)
【表８】
2020519641.tif 000183
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【０４１８】
表9.例示的なキメラNDVゲノムRNA配列
【表９】
2020519641.tif 000188
2020519641.tif 000189
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2020519641.tif 000214
【０４１９】
表10.キメラNDVをコードする例示的なプラスミド配列(核酸)
【表１０】
2020519641.tif 000215
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【０４２０】
表11.NDVプラスミド配列
【表１１】
2020519641.tif 000236
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【０４２１】
表12.例示的な抗体関連配列
【表１２】
2020519641.tif 000244
2020519641.tif 000245
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【０４２２】
表13.プライマー配列
【表１３】
2020519641.tif 000247
【０４２３】
表15.切断配列
【表１４】
2020519641.tif 000248
【実施例】
【０４２４】
(6.実施例)
国際特許出願公開WO 2014/158811号の作業実施例(すなわち、国際特許出願公開WO 2014/158811号の第6節及び第7節)並びに米国特許出願公開第2016/0015760 A1号の作業実施例(すなわち、米国特許出願公開第2016/0015760 A1号の第6節)並びに2014/0271677 A1号の作業実施例(すなわち、米国特許出願公開第2014/0271677 A1号の第6節及び第7節)は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
【０４２５】
(6.1  実施例1)
本実施例は、癌の治療において免疫賦活作用がある免疫チェックポイント調節因子と組み合わせたNDV療法の治療効果を示している。
【０４２６】
(6.1.1  材料及び方法)
(6.1.1.1  マウス)
BALB/cマウス(6〜8週齢)及びWT C57BL/6マウスは、Jackson Laboratoryから購入した。全てのマウスをマイクロアイソレーターケージで維持し、NIH及び米国実験動物管理協会(American Association of Laboratory Animal Care)の規制に従って処置した。本研究のための全てのマウス処置及び実験は、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター施設動物管理及び使用委員会(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee)による承認を受けた。
【０４２７】
(6.1.1.2  細胞株)
メラノーマのマウス癌細胞株(B16F10)並びに結腸癌のマウス癌細胞株(CT26及びMC38)を、10％胎仔ウシ血清及びペニシリンがストレプトマイシンとともに補充されたRPMI培地中で維持した。マウス前立腺癌細胞株TRAMP-C2を、5％胎仔ウシ血清(FCS; Mediatech社)、5％Nu血清IV(BD Biosciences)、HEPES、2-ME、pen/strep、L-glut、5μg/mLインスリン(Sigma)、及び10nmol/L DHT(Sigma)が補充されたDMEM培地中で維持した。
【０４２８】
(6.1.1.3  抗体)
治療用の抗PD-1(クローンRMP1-14)、及び抗PD-L1モノクローナル抗体は、BioXcellにより産生された。フローサイトメトリーに使用される抗体は、eBioscience、Biolegend、Invitrogen、及びBD Pharmingenから購入した。
【０４２９】
(6.1.1.4  ウイルス及びクローニング)
組換え長潜伏期性NDV LaSota株を全ての実験に使用した。ウイルスを、先に記載されている方法を用いてcDNAからレスキューし、インサートの忠実度について逆転写PCRによりシークエンシングした。ウイルス力価を段階希釈及びVero細胞における免疫蛍光により決定した。
【０４３０】
(6.1.1.5  インビトロ感染実験)
NDVによる表面MHC-I、MHC-II、及びICAM-1の上方調節の評価のために、並びにNDV-ICOSLウイルスからのICOSL導入遺伝子の表面発現の評価のために、B16F10細胞を、6ウェルディッシュ中、MOI 2で、3連で感染させた。24時間後、細胞を機械的剥離により回収し、表面標識及びフローサイトメトリーによる定量用に処理した。ウイルス成長曲線実験のために、B16F10細胞を、室温で、ウイルスとともに、6ウェル培養デュッシュ中、表示されたMOIで、100μlの全容量でインキュベートした。インキュベーションから1時間後、感染培地を吸引し、細胞を、10％ニワトリ尿膜腔液を含む1mlのDMEM中、37℃でインキュベートした。24、48、及び72時間後、上清を回収し、ウイルス力価を上記のように決定した。インビトロ細胞傷害実験のために、感染を同様の様式で実施した。感染から24、48、72、及び96時間後、細胞を洗浄し、1％Triton X-100とともに、37℃で30分間インキュベートした。溶解物中のLDH活性を、製造元の指示に従って、Promega CytoTox 96アッセイキットを用いて決定した。
【０４３１】
(6.1.1.6  腫瘍投与生存実験)
注射を受けた腫瘍と全身腫瘍の両方における治療効果についてモニタリングするために、両側腹腫瘍モデルを樹立した。単剤としてのNDV又は抗PD-1による10〜20％の腫瘍クリアランスを達成するために、処置スケジュール及び細胞用量を各々の腫瘍モデルについて確立した。野生型NDV(NDV-WT)と免疫チェックポイント遮断との併用療法を評価する実験については、0日目に2×105個のB16F10細胞を右側腹に皮内注射し、4日目に5×104個の細胞を左側腹に注射することにより、B16F10腫瘍を移植した。7、10、13、及び16日目に、PBS中の2×107pfuのNDVを100μlの全容量で4回腫瘍内注射することにより、マウスを処置した。同時に、7、10、13、及び16日目に、マウスに、抗PD-1抗体(250μg)の腹腔内注射を4回受けさせた。対照群には、対応する用量のアイソタイプ抗体の腹腔内注射及びPBSの腫瘍内注射を受けさせた。腫瘍サイズ及び発生率を、キャリパーを用いた測定により、経時的にモニタリングした。
【０４３２】
TRAMP-C2モデルについては、0日目に5×105個の細胞を右側腹に移植し、8日目に5×105個の細胞を左側腹に移植した。処置を、上記と同様の様式で、11、14、17、及び20日目に実施した。
【０４３３】
CT26モデルについては、0日目に1×106個のCT26細胞を右側腹に皮内注射し、2日目に1×106個の細胞を左側腹に注射することにより、腫瘍を移植した。処置を、上記の通りに、6、9、及び12日目に実施した。
【０４３４】
(6.1.1.7  腫瘍浸潤リンパ球の単離)
0日目に2×105個のB16F10細胞を右側腹に皮内注射し、4日目に2×105個の細胞を左側腹に注射することにより、B16F10腫瘍を移植した。7、10、及び13日目に、マウスを、2×107pfuのNDVの3回の腫瘍内注射、及び指定されている場合、250μgの抗PD-1抗体の腹腔内注射で処置した。15日目に、マウスをCO2吸入により屠殺した。腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節を、鉗子及び手術鋏を用いて摘出し、計量した。各々の群由来の腫瘍を鋏で細かく刻んだ後、1.67ワンチU/mLのリベラーゼ及び0.2mg/mLのDNアーゼとともに、37℃で30分間インキュベートした。腫瘍をピペッティングの繰り返しによりホモジナイズし、70-μmナイロンフィルターに通して濾過した。細胞懸濁液をコンプリートRPMIで1回洗浄し、Ficoll勾配で純化して、死細胞を除去した。腫瘍流入領域リンパ節由来の細胞は、該リンパ節を70-μmナイロンフィルターに通してすり潰すことにより単離した。
【０４３５】
(6.1.1.8  フローサイトメトリー)
腫瘍又は腫瘍流入領域リンパ節から単離された細胞を、CD45、CD3、CD4、CD8、CD44、PD-1、ICOS、CD11c、CD19、NK1.1、CD11b、F4/80、Ly6C、及びLy6Gを染色するいくつかの抗体パネルによる表面標識用に処理した。固定可能な生死判定色素eFluor780(eBioscience)を用いて、生細胞を識別した。細胞を、FoxP3固定及び透過処理キット(eBioscience)を用いてさらに透過処理し、Ki-67、FoxP3、グランザイムB、CTLA-4、及びIFNγについて染色した。データを、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて取得し、FlowJoソフトウェア(Treestar)を用いて解析した。
【０４３６】
(6.1.1.9  DC純化及びローディング)
未感作マウス由来の脾臓を単離し、37℃で30分間、1.67ワンチU/mLのリベラーゼ及び0.2mg/mLのDNアーゼで消化した。得られた細胞懸濁液を70umナイロンフィルターに通して濾過し、コンプリートRPMIで1回洗浄した。CD11c+樹状細胞を、Miltenyi磁気ビーズを用いる陽性選択により純化した。単離された樹状細胞を組換えGM-CSF及びB16F10腫瘍溶解物とともに一晩培養し、フィコール勾配で純化した。
【０４３７】
(6.1.1.10  サイトカイン産生の解析)
腫瘍又は腫瘍流入領域リンパ節由来の細胞懸濁液をプールし、Miltenyi T細胞純化キットを用いて、T細胞について濃縮した。単離されたT細胞を計数し、B16F10腫瘍細胞溶解物をロードした樹状細胞と、20U/ml IL-2(R 及び D)＋ブレフェルジンA(BD Bioscience)の存在下で、8時間共培養した。再刺激後、リンパ球を、上記のように、フローサイトメトリー用に処理した。
【０４３８】
(6.1.1.11  統計)
データを両側スチューデントt検定により解析し、P＜0.05を統計的有意とみなした。
【０４３９】
(6.1.2  結果)
ニューカッスル病ウイルス(NDV)感染により誘導される抗腫瘍免疫応答を特徴付けるために、インビトロ感染細胞の表面でのMHC I及びMHC II分子並びにICAM-1の発現を評価した。図1に示されているように、B16メラノーマ細胞へのNDV感染は、MHCクラスI及びII分子並びに接着分子ICAM-1の上方調節を誘導する。これらの分子は全て、腫瘍特異的リンパ球の動員及び抗腫瘍免疫応答の活性化に重要であると考えられている。次に、インビボでのNDV感染により誘導される抗腫瘍免疫応答をマウスメラノーマモデルで評価し、ウイルス注射を受けた腫瘍とウイルスを受容していない遠位腫瘍の両方における応答のモニタリングを可能にする2側腹モデルを樹立した。図2A〜2Eに示されているように、ウイルス感染腫瘍は、NK細胞、マクロファージ、並びにCD8及びCD4細胞などの免疫細胞の劇的な浸潤を示すが、調節性T細胞の浸潤は示さない。この免疫応答の一部は、腫瘍ではなく、ウイルスに対する応答であり得るので、対側腫瘍に対する免疫応答を評価した(図3A〜3C)。興味深いことに、これらの腫瘍は、同等のCD8及びCD4エフェクターの増加を示したが、T reg浸潤物の増加は示さなかった。これらの細胞の解析により、それらが、活性化、増殖、及び溶解マーカーを上方調節することが明らかになった(図4A〜4C)。NDV単剤療法は、処置を受けた腫瘍の制御に効果的であったが(図5A)、対側腫瘍の成長をごくわずかしか減速させなかった(図5B)。しかしながら、腫瘍を排除したマウスは、さらなる腫瘍投与に対するある程度の防御を示し(図5C〜D)、NDV療法が持続的免疫を誘導し得ることを示唆した。
【０４４０】
次に、さらなるメカニズムを標的にして、NDVが生じさせる抗腫瘍効果を増強することができるかどうかを評価した。NDVを注射された腫瘍と注射されていない腫瘍の両方に由来する腫瘍浸潤リンパ球の特徴付けにより、リンパ球上の抑制受容体CTLA-4の上方調節が明らかになった(図5E〜F)。
【０４４１】
NDV療法と組み合わせた免疫チェックポイントの標的化が有益であり得るかどうかを明らかにするために、NDV感染後のPD-1−PD-L1経路に対する効果を評価した。図6A〜6Cに示されているように、インビトロとインビボの両方におけるNDV感染腫瘍細胞は、該細胞の表面での抑制性PD-L1リガンドの発現を上方調節していた。この効果は、直接的なウイルス感染の結果であっただけでなく、非感染細胞をウイルス感染細胞由来のUV不活化上清で処理した場合にも(図6B)、対側非感染腫瘍でも(図6C)見られた。これにより、NDVと抗PD-1抗体による併用療法を検討することになった。侵襲性B16メラノーマモデルにおける抗PD-1と組み合わせたNDV療法は、大多数の動物に治癒をもたらし、これは、エフェクターリンパ球の活性化とともに腫瘍浸潤の増大を伴う効果であった(図7A〜7F)。
【０４４２】
実施された研究の全体を通して、併用療法の治療効果は、より大きな腫瘍投与を使用した場合に減少した。次に、より良好な応答を予測し得る及び治療効果のさらなる改善のために標的とし得る活性化マーカーを評価した。ICOS上方調節は、悪性メラノーマに対する抗CTLA-4療法で処置された患者のより持続的な治療応答及び生存の増加と関連することが以前に示されている。
【０４４３】
全体的に見て、これらの研究は、NDVと免疫チェックポイント調節抗体との組合せを、腫瘍溶解性ウイルス療法と抗体療法の両方の限界を回避する戦略として使用することができることを示している。これらの研究結果には臨床応用性がある。
【０４４４】
(6.2  実施例2)
本実施例は、PD-1遮断と組み合わせた腫瘍溶解性NDVにより誘導される抗腫瘍免疫応答及びNDVにより誘導される抗腫瘍応答を示している。
【０４４５】
(6.2.1  材料及び方法)
(6.2.1.1  マウス)
C57BL/6Jマウス及びBalb/Cマウスは、Jackson Laboratoryから購入した。C57BL/6JバックグラウンドのIFNAR-/-マウスは、Eric Pamer博士の好意による寄贈品であった。Pmel-1及びTrp-1 TCRトランスジェニックマウスは報告されており(Overwijkらの文献、2003, J. Exp. Med, 198:568, Muranskyらの文献、2008, Blood 112:362)、N. Restifo(National Cancer Institute, Bethesda, MD)により提供された。Trp1マウスを、MD Anderson Cancer Center(Houston, TX)のPatrick Hwuにより提供されたCD2:ルシフェラーゼマウスと交配させ、Trp1ルシフェラーゼ+(Trp1-Fluc)マウスを作出した。全てのマウスをマイクロアイソレーターケージで維持し、NIH及び米国実験動物管理協会(American Association of Laboratory Animal Care)の規制に従って処置した。本研究のための全てのマウス処置及び実験は、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター施設動物管理及び使用委員会(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee)による承認を受けた。
【０４４６】
(6.2.1.2  細胞株)
メラノーマのマウス癌細胞株(B16F10)、並びに結腸癌のマウス癌細胞株(CT26及びMC38)を、10％胎仔ウシ血清及びペニシリンがストレプトマイシンとともに補充されたRPMI培地中で維持した。マウス前立腺癌細胞株TRAMP-C2を、5％胎仔ウシ血清(FCS; Mediatech社)、5％Nu血清IV(BD Biosciences)、HEPES、2-ME、pen/strep、L-glut、5μg/mLインスリン(Sigma)、及び10nmol/L DHT(Sigma)が補充されたDMEM培地中で維持した。
【０４４７】
(6.2.1.3  抗体)
治療用の抗PD-1(クローンRMP1-14)、抗PD-L1(クローン9G2)、抗CD8(クローン2.43)、抗CD4(クローンGK1.5)、抗IFN-γ(クローンXMG1.2)、及び抗NK1.1(クローンPK136)モノクローナル抗体は、BioXcellにより産生された。フローサイトメトリーに使用される抗体は、eBioscience、Biolegend、Invitrogen、及びBD Pharmingenから購入した。
【０４４８】
(6.2.1.4  ウイルス及びクローニング)
組換え長潜伏期性NDV LaSota株を全ての実験に使用した。ウイルスを、先に記載されている方法を用いてcDNAからレスキューし、インサートの忠実度について逆転写PCRによりシークエンシングした。ウイルス力価を段階希釈及びVero細胞における免疫蛍光により決定した。
【０４４９】
(6.2.1.5  インビトロ感染実験)
細胞表面標識のために、細胞を、6ウェルディッシュ中、MOI 2(B16F10)又はMOI 5(TRAMP C2)で、3連で感染させた。24時間後、細胞を剥離により回収し、表面標識及びフローサイトメトリーによる定量用に処理した。インビトロ細胞傷害実験のために、細胞を表示されたMOIで感染させ、250ng/ml TPCKトリプシンの存在下、無血清培地中、37℃でインキュベートした。感染から24、48、72、及び96時間後、細胞を洗浄し、1％Triton X-100とともに、37℃で30分間インキュベートした。溶解物中のLDH活性を、製造元の指示に従って、Promega CytoTox 96アッセイキットを用いて決定した。
【０４５０】
(6.2.1.6  腫瘍投与生存実験)
注射を受けた腫瘍と全身腫瘍の両方における治療効果についてモニタリングするために、両側腹腫瘍モデルを樹立した。NDVによる10〜20％の腫瘍クリアランスを達成するために、処置スケジュール及び細胞用量を各々の腫瘍モデルについて確立した。NDVと抗PD-1抗体との併用療法を評価する実験については、0日目に2×105個のB16F10F10細胞を右側腹に皮内(i.d.)注射し、4日目に5×104個の細胞を左側腹に注射することにより、B16F10腫瘍を移植した。7、9、11、及び13日目に、PBS中の2×107pfuのNDVを100μlの全容量で腫瘍内注射することにより、マウスを処置した。同時に、7、9、11、及び13日目に、マウスに、抗PD-1抗体(250μg)、又は抗PD-L1抗体(250μg)の腹腔内(i.p.)注射を受けさせた。対照群には、対応する用量のアイソタイプ抗体の腹腔内注射及びPBSの腫瘍内注射を受けさせた。苦痛の兆候があるか又は全腫瘍容積が1000mm3に達した場合、動物を安楽死させた。免疫細胞の除去のために、マウスに、腫瘍投与の1日前及び2日後に、500μgのCD8+、CD4+、NK1.1、又はIFNγに対するモノクローナル抗体を腹腔内注射し、その後、実験の全体を通して5日おきに、250μgを注射した。TRAMP-C2モデルについては、0日目に1×106個の細胞を右側腹に移植し、4日目に5×105個の細胞を左側腹に移植した。処置を、上記と同様の様式で、7、10、13、及び16日目に実施した。CT26モデルについては、0日目に1×106個のCT26細胞を右側腹に皮内注射し、2日目に1×106個の細胞を左側腹に注射することにより、腫瘍を移植した。処置を、上記の通りに、6、9、及び12日目に実施した。
【０４５１】
(Trp1リンパ球及びPmelリンパ球の単離及び養子移植)
トランスジェニックマウス由来の脾臓及びリンパ節を単離し、70-umナイロンフィルターに通してすり潰した。CD4+及びCD8+細胞を、Miltenyi磁気ビーズを用いる陽性選択により純化した。
【０４５２】
単離されたTrp1細胞又はPmel細胞を、それぞれ、マウス1匹当たり2.5×104細胞及びマウス1匹当たり1×106細胞で、表示されたスケジュールで、尾静脈経由でレシピエント動物に注射した。
【０４５３】
(6.2.1.7  血清移植実験)
腫瘍担持マウスの群をNDV又はPBSの単回注射で腫瘍内処置した。4日目に、血液を終末採血により回収し、血清を遠心分離により単離した。血清を各々の群からプールし、Stratalinker 1800にて300mJ/cm2のUV光の6回のパルスでUV処理して、存在する可能性がある全てのウイルスを不活化した。100μlの未希釈の血清を、未感作B16F10腫瘍担持マウスに、1日おきに投与される合計3回の注射で腫瘍内注射した。最後の注射から3日後に腫瘍を摘出し、下記の通りに、腫瘍浸潤リンパ球の単離用に処理した。
【０４５４】
(6.2.1.8  生体発光イメージング)
6日目から2〜3日おきに、マウスをイメージングした。マウスに、PBS中の50μlの40mg/ml D-ルシフェリン(Caliper Life Sciences)を後眼窩から注射し、IVISイメージングシステム(Caliper Life Sciences)を用いてすぐにイメージングした。グレースケール画像と生体発光カラー画像を、The Living Image、バージョン4.0(Caliper Life Sciences)ソフトウェアオーバーレイを用いて重ね合せた。対象領域(ROI)を腫瘍にわたって手動で選択し、ROIの面積を一定にした。
【０４５５】
(6.2.1.9  腫瘍浸潤リンパ球の単離)
0日目に2×105個のB16F10細胞を右側腹に皮内注射し、4日目に2×105個の細胞を左側腹に注射することにより、B16F10腫瘍を移植した。7、9、及び11日目に、マウスを、2×107pfuのNDVの腫瘍内注射、及び指定されている場合、抗PD-1抗体の腹腔内注射で処置した。腫瘍負荷が原因で死んだ数少ない動物(常に未処置対照群に含まれる)又は腫瘍を完全に除去した動物(常に処置群に含まれる)は、解析に使用しなかった。15日目に、マウスを屠殺し、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節を、鉗子及び手術鋏を用いて摘出し、計量した。各々の群由来の腫瘍を鋏で細かく刻んだ後、1.67ワンチU/mLのリベラーゼ及び0.2mg/mLのDNアーゼとともに、37℃で30分間インキュベートした。腫瘍をピペッティングの繰り返しによりホモジナイズし、70-μmナイロンフィルターに通して濾過した。細胞懸濁液をコンプリートRPMIで1回洗浄し、Ficoll勾配で純化して、死細胞を除去した。腫瘍流入領域リンパ節由来の細胞は、該リンパ節を70-μmナイロンフィルターに通してすり潰すことにより単離した。
【０４５６】
(6.2.1.10  フローサイトメトリー)
腫瘍又は腫瘍流入領域リンパ節から単離された細胞を、CD45、CD3、CD4、CD8、CD44、ICOS、CD11c、CD19、NK1.1、CD11b、F4/80、Ly6C、及びLy6Gを染色するいくつかの抗体パネルによる表面標識用に処理した。固定可能な生死判定色素eFluor506(eBioscience)を用いて、生細胞を識別した。細胞を、FoxP3固定及び透過処理キット(eBioscience)を用いてさらに透過処理し、Ki-67、FoxP3、グランザイムB、CTLA-4、及びIFNγについて染色した。データは、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して取得し、FlowJoソフトウェア(Treestar)を使用して分析した。
【０４５７】
(6.2.1.11  DC純化及びローディング)
未感作マウス由来の脾臓を単離し、37℃で30分間、1.67ワンチU/mLのリベラーゼ及び0.2mg/mLのDNアーゼで消化した。得られた細胞懸濁液を70umナイロンフィルターに通して濾過し、コンプリートRPMIで1回洗浄した。CD11c+ DCを、Miltenyi磁気ビーズを用いる陽性選択により純化した。単離されたDCを組換えGM-CSF及びB16F10腫瘍溶解物とともに一晩培養し、フィコール勾配で純化した。
【０４５８】
(6.2.1.12  サイトカイン産生の解析)
腫瘍又は腫瘍流入領域リンパ節由来の細胞懸濁液をプールし、Miltenyi T細胞純化キットを用いて、T細胞について濃縮した。単離されたT細胞を計数し、B16F10腫瘍細胞溶解物をロードしたDCと、20U/ml IL-2(R 及び D)＋ブレフェルジンA(BD Bioscience)の存在下で、8時間共培養した。再刺激後、リンパ球を、上記の通りに、フローサイトメトリー用に処理した。
【０４５９】
(6.2.1.13  免疫蛍光及び顕微鏡観察)
腫瘍をマウスから切断し、PBS中で洗浄し、4％パラホルムアルデヒド中で固定し、以前に記載されているプロトコルに従って、パラフィン包埋用に処理した。切片をミクロトームを用いて切り出し、スライドに載せ、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)による又は抗CD3抗体及び抗FoxP3抗体による染色用に処理した。スライドを、Zeiss Axio 2広視野顕微鏡で、10倍及び20倍の対物レンズを用いて解析した。
【０４６０】
(6.2.1.14  統計)
データを両側スチューデントt検定(2群比較用)及び必要に応じてANOVAにより解析した。生存に関するデータをログ-ランク(マンテル-コックス)検定により解析した。両側p＜0.05を統計的有意とみなした(P≦0.05(*)、P≦0.01(**)、P＜0.001(***)、P＜0.0001(****))。
【０４６１】
(6.2.2  結果)
(6.2.2.1  NDV複製は注射を受けた腫瘍部位に限定される)
NDVの腫瘍内及び全身投与によるウイルス分布動態を特徴付けた。ホタルルシフェラーゼレポーターを発現する組換えNDV(NDV-Fluc)の腫瘍内注射は、注射を受けた側腹腫瘍内でのルシフェラーゼシグナルの持続をもたらしたが、該ウイルスの全身投与は、腫瘍内での検出可能なルシフェラーゼシグナルを生じさせなかった(図8A)。限定された全身ウイルス送達は十分な腫瘍溶解及び免疫応答を誘導する可能性が低かったので、腫瘍内NDV注射を、全身OV療法の限界を克服する可能性がある抗腫瘍免疫応答を誘発する手段として検討した。したがって、さらなる研究のために、モデル化された転移性疾患を、両側腹B16F10腫瘍モデルを用いることによりモデル化した(図10A)。右側腹腫瘍へのNDV-Fluc投与は、注射を受けた腫瘍内でのウイルス複製をもたらし、ルシフェラーゼシグナルは、最大96時間検出可能であった(図8B〜8D)。対側(左側腹)腫瘍では、発光イメージング(図8B〜8D)、孵化卵での継代、又はRT-PCRにより、ウイルスが検出されなかった。したがって、このシステムにより、ウイルス注射を受けた腫瘍とNDVによる直接的な影響を受けない遠位腫瘍の両方における免疫応答の特徴付けが可能になった。
【０４６２】
(6.2.2.2  NDV療法は局所及び遠位腫瘍リンパ球浸潤を増大させ、腫瘍成長を遅延させる)
ウイルス注射を受けた腫瘍の解析により、白血球共通抗原CD45を発現する細胞の浸潤の増大によって明白に示される炎症応答が示された(図9A〜9B)。免疫浸潤物は、骨髄細胞、NK細胞、及びNKT細胞を含む自然免疫コンパートメント(図9C)、並びにCD8+及び従来型CD4+FoxP3-(Tconv) T細胞を含む適応コンパートメントの増加を特徴としており、CD8及びTconv対調節性(Treg) T細胞比の有意な増加を生じさせた(それぞれ、p＝0.0131及びp＝0.0006)(図9D〜9F)。注目すべきことに、対側腫瘍の解析により、自然免疫細胞(図10D)とエフェクターT細胞(図10E及び10G)の両方の数の増加を特徴とする、炎症性浸潤物の同様の増加が明らかになった(図10B及び10C)。注目すべきことに、Tregの絶対数には大きな変化がなかったが(図10G)、その相対的パーセンテージは実質的に減少し(図10E、10F、及び10H)、CD8及びTconv対Treg比の有意な増大が見られた(それぞれ、p＝0.002及びp＝0.0021)(図10I)。遠位腫瘍から単離されたエフェクターT細胞は、それぞれ、活性化、増殖、溶解のマーカーであるICOS、Ki-67、及びグランザイムBの発現の増大を示した(図10J及び10K)。先述のように、ウイルス又はウイルスRNAは遠位腫瘍から単離することができなかったが、これは、遠位腫瘍微小環境の観察された変化が直接的なウイルス感染によるものではなかったことを示唆している。検出できない局所ウイルス拡散の可能性をさらに排除するために、腫瘍を両側後足蹠などの他の遠位部位に移植し、これにより、同様の研究結果が得られた(図11A〜11E)。
【０４６３】
観察された炎症効果と一致して、NDVの腫瘍内投与は、注射を受けた腫瘍の成長遅延だけでなく、対側腫瘍の成長遅延ももたらし、長期の動物生存をもたらした(図10L及び10M)。この効果が一過性であるかどうか、及び持続的な抗腫瘍防御が可能であるかどうかを明らかにするために、単側腹B16F10腫瘍担持マウスをNDVで腫瘍内処置し、長期生存マウスの反対の側腹にB16F10細胞を注射した。大多数の動物は腫瘍成長遅延を示し、該動物の30％は、再投与された細胞を完全に拒絶し、NDVによる腫瘍内療法が防御的抗腫瘍記憶応答を実際に誘導することができることを示唆した(図13)。
【０４６４】
(6.2.2.3  NDVは腫瘍浸潤及び腫瘍特異的リンパ球の増殖を誘導する)
抗腫瘍免疫応答が、NDVを注射された腫瘍型に依存するのか、それともNDV感染により生じた非特異的炎症の結果であるのかを明らかにするために、異種腫瘍(MC38結腸癌及びB16F10メラノーマ)を反対の側腹に移植して、実験を行った(図12A)。腫瘍特異的リンパ球を追跡するために、メラノーマ分化抗原gp100(Pmel)及びTrp1(Trp1)を認識する、T細胞受容体が遺伝子導入されたコンジェニック標識CD8+(Pmel)細胞又はルシフェラーゼ標識CD4+(Trp1)細胞を養子移植した(Muranskiらの文献、2008, Blood, 112: 362; Overwijkらの文献、2003, J Exp Med, 198: 569)。生体発光イメージングを用いて、養子移植されたTrp1細胞の分布及び増殖動態を測定した。PBS処置した腫瘍担持動物へのTrp1細胞の移植は、腫瘍内でのTrp1蓄積を生じさせることができず、このモデルにおける腫瘍微小環境の免疫抑制性の高い性質を強調した(図12B〜D)。B16F10腫瘍へのNDV注射は、Trp1 T細胞増殖を示す、注射を受けた腫瘍内でのルシフェラーゼシグナルの有意な増加(曲線下面積(AUC) p＝0.0084)をもたらした(図12B〜D)。注目すべきことに、同様の増殖は、遅れてではあったが、対側腫瘍でも見られた(p＝0.0009)(図12B〜D)。対照的に、MC38腫瘍へのNDV注射は、注射を受けたMC38腫瘍又は遠位B16F10腫瘍への実質的なTrp1浸潤を誘導することができず(図12B〜D)、遠位腫瘍特異的リンパ球浸潤が、注入された腫瘍の抗原の素性に依存する可能性が高いことを示唆した。同様に、NDVの腫瘍内注射は、遠位腫瘍へのPmel細胞の浸潤の増大をもたらしたが、これは、注入された腫瘍が、MC38ではなくB16F10であるときに、より顕著であった(図12E)。
【０４６５】
興味深いことに、養子移植されたリンパ球による遠位B16F10腫瘍の浸潤は、注入された腫瘍の素性に依存するが、遠位腫瘍は、注入された主要な腫瘍がMC38である場合でも、免疫浸潤の増大を確かに示し(図12F)、これは、非特異的炎症応答成分も役割を果たし得ることを示唆している。実際、潜在的ウイルスを不活化するためにUV照射で処置したNDV処置動物由来の血清は、未感作B16F10腫瘍担持マウスに腫瘍内注射したとき、腫瘍白血球浸潤を誘導し(図12G及び12H)、この増加の大部分は、NK及びCD8+コンパートメントで見られた(それぞれ、p＝0.0089及びp＝0.0443)(図12I)。
【０４６６】
(6.2.2.4  NDVは腫瘍浸潤T細胞上のCTLA-4を上方調節する)
顕著な炎症応答及び成長遅延が遠位腫瘍で見られたにもかかわらず、長期生存を伴う完全な対側腫瘍拒絶は、動物の約10％でしか見られず(図10M)、これは、腫瘍微小環境における活発な免疫抑制機構を示唆するものであった。NDV注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍の特徴付けにより、腫瘍浸潤T細胞上のCTLA-4の上方調節が明らかになった(図14)。
【０４６７】
(6.2.2.5  NDV療法は腫瘍細胞上及び腫瘍浸潤白血球上のPD-L1の上方調節をもたらす)
NDV療法と組み合わせて他の免疫チェックポイントを標的とすることが有益であり得るかどうかを明らかにするために、NDV感染後のPD-1−PD-L1経路に対する効果を評価した。図15に示されているように、インビボとインビトロの両方におけるNDV感染腫瘍細胞は、該細胞の表面での抑制性PD-L1リガンドの発現を上方調節させており(図15A)、これは、遠位の非感染腫瘍でも見られた。PD-L1の上方調節は、腫瘍細胞に限られたものではなく、自然免疫系統と適応免疫系統の両方の腫瘍浸潤白血球でも見られた(図15B)。
【０４６８】
(6.2.2.6  NDVとPD-1及びPD-L1遮断抗体との併用療法は抗腫瘍免疫の向上及び長期の動物生存をもたらす)
NDVとPD-1を遮断する抗体との組合せ及びNDVとPD-L1を遮断する抗体との組合せを上記の両側腹メラノーマモデルで評価した。抗PD-1又は抗PD-L1抗体のどちらかと組み合わせたNDV療法は、動物生存の向上をもたらした(図16A〜16D及び図17A〜17D)。NDVと抗PD-1抗体の組合せで処置した動物由来の遠位腫瘍を特徴付けた。図18A〜18Eを見て分かるように、腫瘍内NDVと全身PD-1遮断との組合せは、免疫細胞による顕著な遠位腫瘍浸潤をもたらし、腫瘍浸潤CD8細胞の増加が最も顕著な所見であった。浸潤細胞は、それぞれ、増殖及び溶解のマーカーであるKi67及びグランザイムBを上方調節した(図19A〜19B)。
【０４６９】
(6.2.2.7  NDVはウイルス注射を受けた腫瘍及び遠位腫瘍並びに腫瘍流入領域リンパ節(TDLN)におけるCD4細胞及びCD8細胞上でのICOSの腫瘍免疫浸潤上方調節を誘導する)
上記の研究結果は、腫瘍内NDVと全身免疫チェックポイント遮断との組合せが2つの治療的手法の間で著しい相乗効果を生むことを示した。これらの研究結果をさらに深めるために、関連のある共刺激経路を介した腫瘍微小環境内でのT細胞エフェクター機能の増強がより良好な抗腫瘍免疫応答を誘導し得ることを調べた。過去の研究により、T細胞上での誘導性共刺激因子(ICOS)の持続的な上方調節が患者のCTLA-4遮断に対する応答の強力な指標であることが確認された(Carthonらの文献、2010, Clin. Canc. Res., 16:2861)。ICOSは、T細胞依存性Bリンパ球応答及び全Tヘルパーサブセットの発生に極めて重要であることが示されている、活性化T細胞の表面で上方調節されるCD28ホモログである(Simpsonらの文献、2010 Curr Opin Immunol. 22:326)。CTLA-4遮断の抗腫瘍性腫瘍効果におけるICOSの役割がマウス研究により最近確認された。この研究において、ICOS欠損マウスは、CTLA-4遮断により、抗腫瘍応答の発生が重度に障害された(Fuらの文献、2011, Cancer Res., 71:5445)。
【０４７０】
NDVで処置した両側腹腫瘍モデルにおけるICOSの発現を特徴付け、該受容体がこの治療的手法における標的としての役割を果たし得るかどうかを明らかにした。腫瘍内NDV療法の局所及び遠達効果を特徴付けるために、両側腹B16F10メラノーマモデルを利用し、該ウイルスを片側の腫瘍に投与した(図20A)。より良好な応答を予測することができ、かつ治療効果のさらなる改善を求めて標的とすることができる活性化マーカーを評価した。持続的なICOS上方調節は、悪性メラノーマに対する抗CTLA-4療法で処置された患者におけるより持続的な治療応答及び生存の増加と関連することが以前に示されているので、実施例の重点をICOSに置いた。腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節から単離されたリンパ球の解析により、共刺激分子ICOSの上方調節が、処置を受けた動物における活性化マーカーのうちの1つであることが確認された(図20B及び20C)。
【０４７１】
(6.2.3  結論)
免疫原性腫瘍細胞死及び炎症応答を誘発するために、非病原性NDVを利用した。非病原性NDVは、その比較的弱い溶解活性にもかかわらず、I型IFN及びDC成熟の強力な誘導因子であることが示されている(Wildenらの文献、2009, Int J Oncol 34: 971; Katoらの文献、2005, Immunity 23: 19)。同時免疫による影響を受けないことが以前に示されたスケジュールで腫瘍を交互に移植する両側腹メラノーマモデルを利用した(Turkらの文献、2004, J Exp Med 200: 771)。本実施例は、NDVの腫瘍内注射が、遠位ウイルス拡散の非存在下で遠位腫瘍免疫浸潤をもたらすことを示している。特に、この効果は、Tregの数の相対的減少とCD4及びCD8エフェクター対Treg比の顕著な増大とを伴っていたが、これらは、免疫療法に対する望ましい免疫応答のマーカーであることが以前に示されている(Quezadaらの文献、2006, J Clin Invest 116: 1935; Curranらの文献、2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107: 4275)。
【０４７２】
本実施例のデータは、NDVが腫瘍特異的リンパ球による腫瘍浸潤を増強することを示しており、これは、ウイルス注射を受けた腫瘍の素性に依存した効果であった。腫瘍浸潤の増強及び養子移植リンパ球の増殖は、腫瘍溶解性ウイルス療法と養子T細胞移植を利用する治療的手法との間の相乗作用をさらに示唆している。腫瘍特異的リンパ球が、初期ウイルス感染の部位で活性化及び増殖を経た後、他の腫瘍部位に移動するというのがもっともらしいが、これは、ケモカイン及びリンパ球ホーミング受容体に依存的である可能性が高い(Franciszkiewiczらの文献、2012, Cancer Res 72: 6325)。本実施例のデータは、遠位腫瘍免疫浸潤が一部非特異的であり、異種腫瘍のNDV感染によって、又は処置を受けた動物から未感作腫瘍担持マウスへの血清の移植によって誘導され得ることも示している。IL-6などの炎症性サイトカインによって誘導される血管透過性の増大は、腫瘍血管系の活性化及び腫瘍内へのリンパ球動員に強く寄与し得る(Fisherらの文献、2011, The Journal of clinical investigation 121: 3846)。
【０４７３】
TILの顕著な増加にもかかわらず、遠位腫瘍における治療効果は、NDV単剤療法の場合、かなり低く、これらの腫瘍の微小環境の免疫抑制的な性質を強調している(Sprangerらの文献、2013, Sci Transl Med 5)。
【０４７４】
まとめると、本実施例は、NDVによるB16メラノーマの限局性腫瘍内療法が、炎症応答を誘導し、遠位ウイルス拡散を伴わずに、遠位(ウイルス注射を受けていない)腫瘍におけるリンパ球性浸潤物及び抗腫瘍効果をもたらすことを示している。炎症効果は、腫瘍特異的CD4+及びCD8+ T細胞による遠位腫瘍浸潤と同時に発生し、これは、ウイルス注射を受けた腫瘍の素性に依存する。本実施例は、腫瘍溶解性NDVによる限局性療法が遠位腫瘍において炎症性免疫浸潤物を誘導し、該遠位腫瘍を免疫調節抗体による全身療法に対して感受性にすることを示している。
【０４７５】
(6.3  実施例3)
本実施例は、抗PD-1抗体の投与と組み合わせたIL-12をコードするNDVの腫瘍内投与がNDV-IL-12注射を受けた腫瘍とNDV-IL-12注射を受けていない腫瘍の両方で強い抗腫瘍活性を生じることを示している。下に示されているように、この抗腫瘍活性は、免疫遺伝子の誘導及びCD3+ T細胞の浸潤と相関している。
【０４７６】
(6.3.1  材料及び方法)
(6.3.1.1  クローニング及びウイルスのレスキュー)
NDVゲノムは、核タンパク質(NP)、ホスホタンパク質(P)、マトリックスタンパク質(M)、融合タンパク質(F)、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ(HN)、及び巨大ウイルスポリメラーゼタンパク質(L)をコードする6つのオープンリーディングフレームを含有する。IL-12 p40サブユニットをコードする核酸配列、
【化１７１】
2020519641.tif 000249
リンカー、及びIL-12 p35サブユニットからなるヒトIL-12導入遺伝子(配列番号26)を、pT7NDV-LS-L289Aプラスミド(図21;配列番号21)中のP遺伝子とM遺伝子の間のSacIIクローニング部位に挿入した。結果として得られたヒトIL-12導入遺伝子を含有するpT7NDV-LS-L289Aプラスミド(配列番号31)を、本実施例では「NDV-huIL-12」又は「pT7NDV-LS-L289A-huIL-12」と呼ぶ。図21に示されているように、pT7NDV-LS-L289Aプラスミドは、T7プロモーターの転写制御下にある長潜伏期性NDV La Sota配列を含有する。該プラスミドは、NDV Fタンパク質をコードする配列中にL289A突然変異を含有する。NDV Fタンパク質中のL289A突然変異は、Fタンパク質を野生型Fタンパク質と比較してより融合原性にし、かつ腫瘍溶解活性を促進することが報告されている。例えば、Sergelらの文献、2000, J. Virol. 74:5101; Altomonteらの文献、2010, Mol. Ther. 18:275を参照されたい。
【０４７７】
pT7NDV-LS-L289Aプラスミドに挿入するためのヒトIL-12導入遺伝子を作製するために、フォワードプライマー及びリバースプライマー(配列番号32及び33)を「6のルール」を念頭に置いて設計し、これらのプライマーを用いて、pT7NDV-LS-L289Aプラスミド中のSacIIクローニング部位と相同な15塩基対を有する末端を含むPCR断片を作製した。NDVのレスキューの成功は、該導入遺伝子を有するゲノムが「6のルール」に従うことを要求するので、この「6のルール」をプライマー設計時に考慮し、必要な場合、確認し、修正した。pT7NDV-LS-L289AプラスミドをSacII(NEB、カタログ番号R0157S)により摂氏37度で一晩消化し、その後、アルカリホスファターゼ(NEB、カタログ番号M0289S)により摂氏37度で30分間処理して、プラスミドの再環状化を防いだ。消化及びアルカリホスファターゼ処理の後、NucleoSpinクリーンアップキット(Macherey-Nagel、カタログ番号740609.250)を用いて、線状化したプラスミドを精製した。その後、Takara Clontech製のInfusion HDクローニングキットを用いて、PCR断片と切断したプラスミドを1つに融合させた。得られたプラスミドをMax Efficiency Stbl2コンピテント細胞(Life Technologies、カタログ番号10268-019)に形質転換した。陽性クローンをコロニーPCR及び配列確認により同定した。配列確認のために、クローニングされた領域の外側にアニールするプライマー
【化１７２】
2020519641.tif 000250
を利用した。その後、PureLink HiPureミディプレップキット(Invitrogen、カタログ番号K210004)を用いて、エンドトキシンを含まないミディプレップを作製した。
【０４７８】
NDV-huIL-12コンストラクトに関する上記と同様の戦略をクローニング及びマウスIL-12導入遺伝子をコードするNDV(配列番号30)のレスキューに利用した。すなわち、フォワードプライマー及びリバースプライマー(配列番号34及び35)を「6のルール」を念頭に置いて設計し、これらのプライマーを用いて、pT7NDV-LS-L289Aプラスミド中のSacIIクローニング部位と相同な15塩基対を有する末端を含むPCR断片を作製した。このPCR断片を、上記の技法を用いてpT7NDV-LS-L289Aプラスミドにクローニングし、陽性クローンを上記のように選択した。マウスIL-12導入遺伝子を含有するpT7NDV-LS-L289Aプラスミド(配列番号31)を、本実施例では「NDV-muIL-12」又はpT7NDV-LS-L289A-muIL-12と呼ぶ。
【０４７９】
T7 RNAポリメラーゼを発現するベビーハムスター腎臓(BHK)由来細胞(BSR-T7)に、TransIT(登録商標)-LT1トランスフェクション試薬(Mirrus、カタログ番号MIR2300)を用いて、L、NP、P、及びT7 RNAポリメラーゼタンパク質をコードするプラスミド並びにpT7NDV-LS-L289A-huIL-12プラスミド又はpT7NDV-LS-L289A-muIL-12をトランスフェクトした。特に、レスキュートランスフェクションのために、1ウェル当たり30μLのTrans-IT LT1試薬及び150μLのOptiMEMを、以下のプラスミド濃度(μg/6ウェルプレートのウェル): 4.0μgのpT7NDV-LS-L289A-huIL-12又はpT7NDV-LS-L289A-muIL-12プラスミド; 2.0μgのNプラスミド、1.0μgのPプラスミド; 1.0μgのLプラスミド; 2.0μgのT7optプラスミド(Benhur Lee labからの寄贈品として得られた、Addgeneプラスミド#65974)とともに使用した。NDV-WTを作製するために、同様の方法でpT7NDV-LS-L289A(すなわち、huIL-12導入遺伝子を欠くpT7NDV-LS-L289A-huIL-12プラスミド)を用いて、レスキュートランスフェクションを実施した。組換えNDVをcDNAからレスキューするためのプロセスの説明については、例えば、Ayllonらの文献、2013, J. of Visualized Experiments, 80:e50830を参照されたい。トランスフェクションから48時間後、上清を細胞とともに(セルスクレイパーを用いて)回収し、9〜10日齢の孵化鶏卵の尿膜腔に注射するまで氷上で保持した。注射を受けた卵を摂氏37度で2日間インキュベートし、その後、摂氏4度で一晩インキュベートした。その後、尿膜腔液を採取した。尿膜腔液を採取するために、卵の殻を滅菌条件下で割って開け、ピペットを用いて尿膜腔液を回収し、氷上で保持された滅菌ファルコンチューブに移し、細胞破片を遠心分離(15×g)により除去した。ウイルスの成長を確認するために、次に、この尿膜腔液の試料をヘマグルチニンアッセイで使用した。その後、ウイルスを分注し、使用まで、そのまま凍結させた(摂氏-80度)。
【０４８０】
NDVへのマウス又はヒトIL-12導入遺伝子の導入によって、ウイルス力価の違いは観察されなかった。卵中で培養した後、代表的なウイルス力価は、次に掲げる通りである: NDV-huIL12の場合、1.40×108; NDV-wtの場合、3×108;及びNDV-mIL12の場合、1.7×108。
【０４８１】
(6.3.1.2  ヘマグルチニン(HA)アッセイ)
V底マイクロタイタープレートを用いて、HAアッセイを行った。50μLの1×PBSをプレート中の最初の行を除く、全てのウェルに添加した。最初の行には、ウイルスを保有する100μLのニート(すなわち、未希釈)の尿膜腔液を入れた。その後、ウイルス上清の2倍連続希釈を行全体にわたって行った。最後の行の後に、余分な50μLを廃棄した。ウェルは全て、50μLの最終容量を有していた。その後、50μLの0.5％シチメンチョウ赤血球懸濁液を全てのウェルに添加し、プレートを軽く叩いた。このプレートを赤血球が沈殿するまで摂氏4度で20〜30分間インキュベートした。完全な血球凝集を示す試料をウイルスについて陽性と見なした。陰性の結果は、プレートの底の透明な赤いペレットとして観察された。
【０４８２】
(6.3.1.3  IL-12発現)
huIL-12及びmuIL-12発現を、R&D systems製の市販のキット−ヒトIL-12 Quantikine ELISAキット(D2050)及びマウスIL-12 Quantikine ELISAキット(M1270)により確認した。
【０４８３】
(6.3.1.4  NDV-huIL-12の解析)
NDV-huIL-12を、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Vlasakらの文献、Vaccine 34(2016) 2321-2328に記載されている技法を用いるフローウイルス測定により定量し、特徴解析した。
【０４８４】
さらに、6つのNDVタンパク質(F、HN、NP、L、P、及びM)の発現を還元条件下のSDS-PAGEにより解析した。特に、このSDS-PAGE解析は、MOPS(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸))バッファーマトリックス中でInvitrogen NuPAGE 4-12％ビス-トリスゲル(ThermoFisher Scientific、カタログ番号NP0321BOX)を用いて実施した。試料をドデシル硫酸リチウム(LDS)及びジチオスレイトール(DTT)を用いて還元し、70℃で10分間加熱処理した。ゲルをGelCode Blue染色液(ThermoFisher Scientific、カタログ番号24590)を用いて一晩染色し、水で脱染した後、Molecular Dynamics Personal Densitometer SI及びImageQuantソフトウェアを用いてイメージングした。
【０４８５】
さらに、NDV力価を、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、ニューカッスル病ウイルス:増殖、定量、及び保存(Newcastle disease virus: propagation, quantification, and storage.)、Curr. Protoc Microbiol. 2006, Jun、第15章:ユニット15F.2に記載されているような、トリプシンの存在下でVero細胞を用いるプラークアッセイにより決定した。
【０４８６】
(6.3.1.5  マウス)
WT C57BL/6マウスをJackson Laboratoryから購入した。全てのマウスをマイクロアイソレーターケージで維持し、NIH及び米国実験動物管理協会(American Association of Laboratory Animal Care)の規制に従って処置した。本研究のための全てのマウス処置及び実験は、メルク研究所(ボストン及びパロアルト)の施設動物管理及び使用委員会(Merck Research Laboratories (Boston and Palo Alto) Institutional Animal Care and Use Committee)による承認を受けた。
【０４８７】
(6.3.1.6  細胞株)
メラノーマのマウス癌細胞株(B16F10)を、10％胎仔ウシ血清が補充されたDMEM培地中で維持した。
【０４８８】
(6.3.1.7  抗体)
抗マウスPD-1モノクローナル抗体(muDX400)及びマウスIgG1アイソタイプ対照抗体(マウス×[HEXON_アデノウイルス](TC31.27F11.C2) IgG1)は、メルク研究所(Merck Research Laboratories)によって産生された。
【０４８９】
(6.3.1.8  ウイルス及びクローニング)
組換え長潜伏期性NDV La Sota株を全ての実験に使用した。先に記載された方法を用いて、ウイルスをcDNAからレスキューし、挿入物の忠実度について、逆転写PCRによりシークエンシングした。ウイルス力価を連続希釈及びVero細胞における免疫蛍光により決定した。
【０４９０】
(6.3.1.9  腫瘍投与実験)
両側性側腹腫瘍モデルを樹立して、注射を受けた腫瘍と全身性腫瘍の両方における治療効力についてモニタリングした。処置スケジュール及び細胞用量を各々の腫瘍モデルについて確立して、10〜20％腫瘍クリアランスを単剤としてのNDV又は抗PD-1により達成した。野生型NDV(NDV-WT)又はマウスIL-12を発現するNDV(NDV-muIL-12)のいずれかとPD-1遮断との併用療法を評価する実験のために、B16F10腫瘍を、それぞれ、右側腹及び左側腹への2×105個及び1×105個のB16F10細胞の皮下(SC)注射により移植した。腫瘍移植から7〜9日後に、投与を開始した。0日目は、投与初日を示す。0、2、4、及び6日目に、マウスを、右側腹の腫瘍(注射を受けた腫瘍と呼ばれる)への100μlの全容量のPBS中の1×107pfuのNDV-WT又はNDV-muIL-12の4回の腫瘍内注射により処置した。左側腹の腫瘍は、注射を受けていない腫瘍と呼ばれる。同時に、(研究デザインによって)0、4、及び8日目又は0及び6日目に、マウスは、3回又は2回のいずれかの抗PD-1抗体(10mg/kg)のi.p.注射を受容した。対照群は、対応する用量のアイソタイプ抗体のi.p.注射及びPBSの腫瘍内注射を受容した。腫瘍サイズ及び発生率をキャリパーによる測定により経時的にモニタリングした。動物を安楽死させた後、腫瘍を採取し、RNA単離及び遺伝子発現解析用に液体窒素を用いて急速凍結させるか、又は免疫組織化学検査用に10％中性緩衝ホルマリンで48時間固定し、70％エタノールに移し、パラフィンブロックに包埋するかのいずれかにした。
【０４９１】
(6.3.1.10  免疫組織化学検査)
4μm厚のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に対して、マウスCD3染色を行った。この切片を脱パラフィン化し、エタノール系列中で再水和させた。スライドを熱誘導性エピトープ賦活化と内在性ペルオキシダーゼのブロッキングとに供した後、1:1000の作業希釈の一次抗体の抗マウスCD3ラットmAbクローンCD3-12(AbD Serotec、カタログ番号MCA1477)とともに室温で60分間インキュベートした。その後、切片を、二次抗体の吸着済みウサギ抗ラットIgG H&L(Abcam、ab102248)とともに15分間、その後、ImmPRESS(商標) HRP抗ウサギIgG(ペルオキシダーゼ)ポリマー検出キット(Vector Laboratories、カタログ番号MP-7401)とともに15分間インキュベートした。3,3-ジアミノベンジジン(Dako、カタログ番号K3468)を用いて、抗原-抗体結合を可視化した。切片をMayerのヘマトキシリン(Poly Scientific、カタログ番号S216-1GL)を用いて対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。
【０４９２】
(6.3.1.11  ヒト腫瘍組織培養物)
腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌、非小細胞肺癌、及び頭頸部扁平上皮細胞癌を有する患者由来のヒト腫瘍標本を、州及び連邦の規制に準拠して、市販の供給源(BioOptions、Boston BioSource(Tufts)、Folio Biosciences、及びTissue Solutions)並びに大学の協力者(University of Rochester)から入手した。新鮮な腫瘍組織を外科手術から1時間以内に回収して、患者から腫瘍を摘出し、AQIX輸送培地に入れ、4℃で一晩、メルク研究所(Merck Research Laboratories)、Palo Alto, CAに輸送した。腫瘍を1％低融点ゲルに包埋し、Mcllwain Tissue Chopperを用いて切削して、400μmスライスにした。腫瘍スライスを、1mLのダルベッコ改変イーグル培地、10％FBS、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシンを含有する6ウェルディッシュ中のMillicell-CMインサート上にセットした。
【０４９３】
次の実験において、5つの腎細胞癌(RCC; n＝4)試料、3つの結腸直腸癌(CRC)試料、2つの乳癌試料、及び1つの頭頸部扁平上皮細胞癌試料を評価した。或いは、6つのRCC試料、1つのCRC試料、及び2つの非小細胞肺癌(NSCLC)試料を評価した。腫瘍スライスを3×107pfuのNDV-WTもしくはNDV-huIL-12又は10、25、及び50ng/mLの組換えIL-12とともにインキュベートし、5％CO2を含む雰囲気下、37℃で24又は48時間、大気培地界面で培養した。ある実験については、試料を急速凍結させ(すなわち、試料をチューブに入れ、凍結させるまで液体窒素に沈め、その後、ドライアイス上に移し、-80℃で保存し)、該試料由来のRNAを、下の第6.3.1.13節に記載されている通りに単離した。
【０４９４】
他の実験については、組織試料由来の培地を、サイトカイン及びケモカインについて、様々なキットを用いて解析した。ヒト炎症促進性9-プレックス組織培養キット(Meso Scale Discovery、カタログ番号K15007B-2)を用いて、GM-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-1-β、IL-2、IL-6、IL-8、及びTNF-αを解析した。ヒトIFN-α組織培養キット(Meso Scale Discovery、カタログ番号K151ACB-4)を用いて、IFN-α-2aを解析し;ヒトIFN-β組織培養キット(Meso Scale Discovery、カタログ番号K151ADB-4)を用いて、IFN-βを解析した。V-PLEXケモカインパネル1(ヒト)キット(Meso Scale Discovery、カタログ番号K15047D-2)を用いて、エオタキシン、エオタキシン-3、IL-8、IP-10、MCP-1、MCP-4、MIP-1a、MIP-1b、MDC、及びTARCを解析し、IP-10組織培養キット(Meso Scale Discovery、カタログ番号K151AVB)を用いて、IP-10を解析した。
【０４９５】
(6.3.1.12  ヒト全血アッセイ)
固形腫瘍を有する患者(n＝5)由来の全血をConversant Bio(Huntsville, AL)から入手し、健常ドナー(n＝5)由来の全血をメルク研究所(Merck Research Laboratories)の内部血液ドナープログラムを通じて入手した。以下の2つの実験条件を使用した。(1)1mLの全血を処理しないで放置するか、又は3×107pfuのNDV-WTもしくはNDV-huIL-12で48時間処理した。ヒト腫瘍組織培養物研究について上で記載されているキットを用いる様々なサイトカイン及びケモカインタンパク質濃度の評価のために、血漿を回収した。(2)4mLの全血を処理しないで放置するか、又は3×107pfuのNDV-WTもしくはNDV-huIL-12で24時間処理した。全血をPAXgene血液RNAチューブ(BD Biosciencesカタログ番号762165)中に回収し、RNA単離後、Fluidigm RTqPCRプラットフォームを用いて、免疫遺伝子のパネルの遺伝子発現を解析した(第6.3.1.13節を参照)。
【０４９６】
(6.3.1.13  RNAの抽出及びリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RTqPCR))
RNAを、マウスB16F10腫瘍(第6.3.1.9節)、ヒト腫瘍標本(第6.3.1.11節)、及びヒト全血(第6.3.1.12節)から単離した。全RNAを、ポリトロンホモジナイザーを用いるRNA STAT-60(Tel-Test社、Friendswood, TX))中へのホモジナイゼーションにより単離した。全RNAを製造業者のプロトコルに従って抽出した。イソプロパノールによる沈殿の後、全RNAを、フェーズロック軽量チューブを用いて、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で再抽出した。
【０４９７】
DNアーゼ処理した全RNAを、製造業者のプロトコルに従ってQuantiTect逆転写(Qiagen、カタログ番号2015310)を用いて逆転写した。プライマーは、Life Technologiesから入手した:
【表１５】
2020519641.tif 000251
【表１６】
2020519641.tif 000252
【０４９８】
各々の試料由来の10ngのcDNAに対するリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RTqPCR)を、各々900nMの非標識プライマーを250nMのFAM標識プローブとともに、TAQMAN(商標) RTqPCR反応液(Thermo Fisher Scientific、Foster City, CA)中で用いて、Fluidigm Biomark配列検出システムで、製造業者のプロトコル(Fluidigm、Foster City, CA)に従って実施した。ユビキチンのレベルを別の反応で測定し、Δ-ΔCt法によるデータの標準化に使用した。各々の試料のユビキチン及び目的遺伝子の平均サイクル閾値(Ct)値を用いて、以下の式: 1.8(Ctユビキチン−Ct目的遺伝子)×104を用いて、標準化値を得た。
【０４９９】
(6.3.1.14  Nanostring遺伝子発現解析)
下の第6.3.2.6節で実施される解析のために、RNAを、NanoDrop ND1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific)を用いて定量した。遺伝子発現解析をNanoString nCounter遺伝子発現プラットフォーム(NanoString Technologies)で実施した。T細胞生物学、免疫調節、並びに腫瘍浸潤リンパ球及び腫瘍関連マクロファージの細胞マーカーに関連する800-遺伝子パネルからなるカスタムコードセットを使用した。試料毎に、5μLの最終容量中の50ngの全RNAを、3'ビオチン化捕捉プローブ及びカスタム遺伝子発現コードセットの蛍光バーコードでタグ化された5'レポータープローブと混合した。プローブ及び標的転写物を、製造業者の推奨に従って、65℃で一晩12〜16時間、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズした試料を、高感度プロトコルを用いて、NanoString nCounter調製ステーション上で泳動させた。このプロトコルでは、余分な捕捉プローブ及びレポータープローブが除去され、転写物特異的な三成分複合体がストレプトアビジンコーティングされたカートリッジ上に固定化される。試料を、nCounterデジタルアナライザーで、最大スキャン解像度でスキャンした。各々の個々の試料の遺伝子発現データをHK(ハウスキーピング)標準化により標準化した。各々の腫瘍試料について、生カウントをlog10変換し、その後、各々の遺伝子を、全ハウスキーピング遺伝子(表15)の算術平均を減算することにより標準化した。遺伝子発現プロファイリング(GEP)シグナチャースコアは、18遺伝子アップダウンシグナチャー(表15)のハウスキーピング標準化値の加重和として計算した。各々の遺伝子のハウスキーピング標準化値に、スコアリングの重みのセットからのその遺伝子についての係数を掛けて、18遺伝子シグナチャーの遺伝子の各々についての加重RNA値を出し、該加重RNA値を加えて、腫瘍試料のシグナチャースコアを作成した。Ayersらの文献、2017, J of Clinical Investigation 127: 2930-2940及びWO2016094377号を参照されたい。
【０５００】
表15:
【表１７】
2020519641.tif 000253
【０５０１】
(6.3.1.15  細胞生存アッセイ)
細胞(10,000個/ウェル/10％FBSが補充された200μLのDMEM又はRPMI)を8〜96ウェルプレートの複製物中にプレーティングし、5％CO2の雰囲気下、37℃で18時間インキュベートして、細胞を接着させた。細胞培養培地をウェルから除去した後、NDV-huIL-12に感染させた。8つの複製物において、細胞を、20μL無血清培地(DMEM＋0.3％BSA＋ペニシリン/ストレプトマイシン)中で、MOI 2(20,000pfu)又は6(60,000pfu)のNDV-huIL-12に感染させた。ウイルスを含まない(模擬感染)培地又は10μMピューロマイシン(もしくはそのビヒクルDMSO)を含む培地を並列のウェルに添加した。プレートを平面上で室温で1時間インキュベートし、その後、培地を吸引した。10％血清を含む細胞培養培地(100μL)を各々のウェルに添加し、プレートを、5％CO2を含む雰囲気下、37℃で48時間インキュベートした。上清を回収し、サイトカイン及びケモカインの解析用に-80℃で保存した。その後、このプレートを、製造業者の指示に従ってCell Titer Gloアッセイキット(Promega、カタログ番号G7573)を用いて解析した。
【０５０２】
(6.3.1.16  ヒト腫瘍細胞株由来のサイトカイン及びケモカインの解析)
NDV-huIL-12(MOI 2、4つの複製物)に感染した26種の細胞株由来の上清を様々なサイトカイン及びケモカインについてアッセイした。IL-10、IL-1β、IL-2、MCP-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、MIP-1b、及びTNF-αを、ヒトカスタムバイオマーカーキット(Meso Scale Discovery、カタログ番号K15067L-2)を用いて解析した。IFN-α2a、IFN-β、IFN-γ、及びIL-29/IFN-λ1を、ヒトインターフェロンコンボキット(Meso Scale Discovery、カタログ番号K15094K-2)を用いて解析した。
【０５０３】
(6.3.1.17  統計)
腫瘍体積:個々の動物の追跡調査は、過剰な腫瘍負荷又は他の理由のために、早期に終了することができた。この理由及び最後の測定時の腫瘍サイズによって、最後に観察された腫瘍体積を、その動物についての後続の全ての日における体積の下限(右側打ち切りデータ)として処理した。
【０５０４】
所与の日における2つの処置群を比較するために、右側打ち切りデータを許容するノンパラメトリックマン・ホイットニー(又はウィルコクソン順位和)検定の一般化を使用した: ピトー及びピトーバージョンのゲーハン・ブレスロウ検定。比較されている2つの処置間の動物の20,000回のランダムな再割当から、両側p-値を推定した。所与の処置ペアについての全ての時点にわたるファミリーワイズエラー率を制御するために、p-値をホルム法により多重度調整した。0.05未満のp-値を用いて、統計的有意性を定義した。
【０５０５】
腫瘍投与研究からの遺伝子発現データ:所与の日における2つの処置群を比較するために、ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定を使用した。0.05未満のp-値を用いて、統計的有意性を定義した。
【０５０６】
ヒト腫瘍組織培養物及び全血研究からのサイトカイン/ケモカイン及び/又は遺伝子発現データ:所与の日における2つの処置群を比較するために、ノンパラメトリックウィルコクソンの符号付き順位検定を使用した。0.05未満のp-値を用いて、統計的有意性を定義した。
【０５０７】
(6.3.1.18  IL-12バイオアッセイ)
NDV-huIL-12感染細胞でNDV-huIL-12から産生されたhuIL-12の機能性を評価するために、Vero細胞を6ウェル組織培養プレートに5×105細胞/ウェルで播種し、37℃、5％CO2で24時間インキュベートした。NDV-huIL-12ウイルスの試験試料をOpti-MEM(1×)低血清培地に1×106pfu/mLまで希釈し、様々な量の希釈試料を0.03〜1の目標MOIになるまで細胞プレートに移した。その後、Opti-MEM(1×)低血清培地を各々のウェルに2mLの最終容量まで添加した。感染細胞プレートを37℃、5％CO2で24時間インキュベートした。上清中の産生されたhuIL-12の機能を、PathHunter(登録商標)バイオアッセイ検出キット(DiscoverX、カタログ番号93-0933)を用いてアッセイした。
【０５０８】
PathHunter(登録商標) U2OS IL12RB1/IL12RB2細胞を、ヒトIL-12受容体β1及びβ2を共発現するように改変した。一方の受容体を酵素ドナー(ED)に融合させ、他方の受容体を酵素アクセプター(EA)に融合させた。機能的なhuIL-12が結合すると、これらの2つの受容体は二量体化し、EDとEAの相補を強制して、基質を加水分解して、化学発光シグナルを発生させる機能的β-ガラクトシダーゼを形成する。U2OS IL12RB1/IL12RB2細胞を96ウェル細胞プレートに5×103細胞/ウェルで播種し、37℃、5％CO2で4〜6時間インキュベートした。感染したVeroプレートの各々のウェル由来の合計60μLの上清液を96ウェル試料希釈プレートの2番目の行に移し、AssayComplete細胞プレーティング試薬(DiscoverX、93-0563R5A)中での3倍連続希釈を横一列にわたって実施した。合計10μLの各々の希釈上清をU2OS細胞プレートに移し、このプレートを37℃、5％CO2で16〜20時間インキュベートした。その後、10μLの検出試薬1を各々のウェルに添加し、このプレートを室温で15分間インキュベートした。その後、40μLの検出試薬2を各々のウェルに添加し、このプレートを室温で60分間さらにインキュベートした。SpectraMax M5プレートリーダーを用いて、化学発光シグナルを検出した。
【０５０９】
(6.3.1.19  ELISAによるhuIL-12の定量)
Vero細胞を、2％グルタミン(Corning、カタログ番号25-005-CI)が補充されたOpti-PRO無血清培地(Gibco、カタログ番号12309-019)中、96ウェル組織培養プレートに1×104細胞/ウェルで播種し、37±2℃、5±2％CO2で約24時間インキュベートした。NDV-huIL-12ウイルスの試験試料(バッチA及びB)を目標の2×104pfu/mLになるまでOpti-MEM(1×)低血清培地(Gibco、カタログ番号31985-070)に予め希釈した。合計300μLの各々の予め希釈した試験試料を0.5mLアッセイブロック(Costar、カタログ番号3956)の最初の列に添加し、150μLの試料を150μLのOpti-MEM(1×)低血清培地に移すことにより、2倍連続希釈を横一列にわたって実施した。試料当たり2つの複製物を調製した。Vero細胞を含有する96ウェルプレートを播種から約24時間後にインキュベーターから取り出し、使用済み培地をこのプレートから除去する。この細胞に100μLの連続希釈試験試料を接種し、37℃、5％CO2でインキュベートした。約24時間のインキュベーションの後、90μLの上清液を感染プレートから取り除き、抗ヒトIL-12 p70捕捉抗体(Affymetrix eBioscience、カタログ番号14-7128-68)でプレコーティングされたELISAプレートに移し、室温で2時間インキュベートした。捕捉されたhuIL-12を抗ヒトIL-12 p70検出抗体(Affymetrix eBioscience、カタログ番号33-8261-68A)及びアビジン-HRPで検出し、供給業者の手順(Affymetrix eBioscience、ヒトIL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go! ELISAキット、カタログ番号88-7126-88)により、HRP基質TMBで可視化した。MOI依存的なhuIL-12発現曲線をNDV-huIL-12参照標準と比較した(図34)。
【０５１０】
(6.3.1.20  精製)
採取した尿膜腔液からのNDV-huIL-12の精製には、以下の単位操作:(1)清澄化、(2)タンジェンシャルフロー濾過、及び(3)滅菌濾過からなるプロセスが使用される。採取した尿膜腔液を、1.2μmガラスファイバーデッドエンド濾過を用いて清澄化して、細胞及び他の大きい破片を除去した。この工程に使用された膜は、宿主細胞DNAのかなりの低下をもたらす正味の正電荷を含有する。その後、清澄化バルク液(CB)を、750kD中空糸膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過(TFF)により処理した。この工程において、バッチを〜5倍濃縮し、4透析容量(DV)の高塩バッファーに対して、次いで、4DVの低塩製剤バッファーに対して透析濾過し、その後、〜10倍濃縮した。この単位操作は、残留卵タンパク質、主にオボアルブミン、及び残留DNAを許容し得るレベルにまで低下させる主要な精製工程を構成する。この工程は、バッファーを製剤と適合するバッファーに交換する役割も果たす。その後、TFF産物(TFFP)を0.2μmフィルターに通して滅菌濾過し、適切な滅菌保存容器に分注した。その後、精製したウイルスバルク液(PVB)を凍結させ、摂氏-70度で保存した。
【０５１１】
(6.3.2  結果)
(6.3.2.1  同系マウスB16F10両側性腫瘍モデルにおける抗muPD-1 mAbと組み合わせたNDV-muIL-12の抗腫瘍効力及び作用機序)
B16F10腫瘍は、T細胞が浸潤しにくく、抗PD-1療法に抵抗性である。B16F10腫瘍は、非常に積極的な成長を示し、ハードルの高いモデルを表す。それゆえ、B16F10モデルを選択して、マウスIL-12導入遺伝子をコードするNDVベクターを非武装(unarmed)NDV(「NDV野生型」(「NDV-WT」))と比較して評価した。該NDVベクターを2腫瘍担持C57BL/6マウスで評価して、遠達効果(すなわち、NDVが投与されていない腫瘍における抗腫瘍効力)を評価した。
【０５１２】
マウスIgG1アイソタイプ対照(第1群)と比較して、muDX400のみ(第2群)の投与は、注射を受けた腫瘍(p＝1.0)又は注射を受けていない腫瘍(p＝0.475)のいずれの腫瘍体積の有意な低下もたらさなかった(図22)。NDV-WT(第3群)と比較して、NDV-muIL-12のみ(第5群)の投与は、注射を受けた腫瘍の腫瘍体積の有意な低下をもたらした(p＝0.027)が、注射を受けていない腫瘍の腫瘍体積の有意な低下をもたらさなかった(p＝1.0)(図22)。しかしながら、NDV-muIL-12(第5群)と比較して、muDX400(第6群)と組み合わせたNDV-muIL-12は、注射を受けた腫瘍(p＝0.047)と注射を受けていない腫瘍(p＝0.020)の両方の腫瘍体積の有意な低下をもたらした(図22A〜22D)。さらに、muDX400と組み合わせたNDV-muIL-12は、注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍で、それぞれ、10匹中6匹での完全な退縮(CR)及び10匹中5匹でのCRをもたらした(図22A〜22D)。これらの結果は、独立した実験で再現性があり、これは、マウス前臨床モデルにおいて、NDVが免疫チェックポイント遮断に対する抵抗を破ることを証明した以前の知見と一致している(Zamarinらの文献、2014, Sci. Transl. Med. 6:226ra32(2014))。注射を受けた腫瘍について、完全な退縮の数は、次の通りであった:第1群: 0;第2群: 0;第3群: 1;第4群: 1;第5群: 2;及び第6群: 6。注射を受けていない腫瘍について、完全な退縮の数は、次の通りであった:第1群: 0;第2群: 1;第3群: 1;第4群: 3;第5群: 0;及び第6群: 5。
【０５１３】
同じ研究において、腫瘍を14日目に採取して、様々な免疫遺伝子の発現を評価した。図23及び図24は、それぞれ、注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍におけるT細胞マーカー(図23A及び図24A)、サイトカイン(図23B及び図24B)、IFN誘導性遺伝子(図23C及び図24C)、並びにPD-1経路(図23D及び図24D)の代表的な遺伝子のmRNA発現を示している。Il-12p35のmRNA発現は、NDV-muIL-12が投与された動物(第5群及び第6群)の注射を受けた腫瘍でのみ検出される。この結果は、NDVそれ自体がIL-12を誘導するものでなかったことを示唆している。また、第5群及び第6群の注射を受けていない腫瘍におけるIl-12p35のmRNA発現の検出の欠如は、NDVがNDV注射を受けた腫瘍に限定されるという以前の知見を裏付けている(Zamarinらの文献、2014, Sci. Transl. Med. 6:226ra32(2014)。図23A〜23Dに示されているように、注射を受けた腫瘍におけるCD3-ε、CD8-β、Gzmb、IL-12p35、IL-15、IFN-γ、Irf7、Mx1、Oas1a、PD-1、及びPD-L1のmRNA発現は、以下の処置順:対照(第1群)、muDX400単剤療法(第2群)、NDV-WT単剤療法(第3群)、muDX400とNDV-WTの組合せ(第4群)、NDV-muIL-12単剤療法(第5群)、及びmuDX400とNDV-muIL-12の組合せ(第6群)で増加し、この増加は、第3群と第5群及び第4群と第6群の間で統計的に有意である(p＜0.05)。注射を受けていない腫瘍におけるこれらの遺伝子の増加は、対照(第1群)とmuDX400とNDV-WTの組合せ(第4群)又はmuDX400とNDV-muIL-12の組合せ(第6群)の間で統計的に有意である(図24A〜24D)。同様の結果が、独立した実験から得られた。
【０５１４】
別の独立した両側性B16F10研究において、マウスB16F10細胞を免疫適格C57BL/6Jマウスの右側腹(2×105細胞)及び左側腹(1×105細胞)に皮下移植した。移植から7日後(0日目)、中央値TV＝56mm3を有する右側腹(注射を受けた腫瘍)の腫瘍体積(TV)に基づいて、動物を6つの群に割り当てた。左側腹(注射を受けていない腫瘍)の中央値TVは、38mm3であった。投与を0日目に開始した。10mg/kgのマウスIgG1アイソタイプ対照及びmuDX400を4日毎に合計3回の投与で腹腔内投与した。PBS、1×107pfuのNDV-WT及びNDV-muIL-12を右側腹の腫瘍に2日毎に合計4回の投与で投与した。動物を54日目まで追跡調査した。注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍の体積の合計が≧2000mm3となるか又は体重減少が≧20％となったとき、動物を安楽死させた。各々の群には10匹の動物がいた。図25A〜25Bに示されているように、muDX400と組み合わせた腫瘍内NDV-muIL-12による処置は、動物の最長の全生存をもたらした。
【０５１５】
別の両側性B16F10研究において、マウスB16F10細胞を免疫適格C57BL/6Jマウスの右側腹(2×105細胞)及び左側腹(1×105細胞)に皮下移植した。移植から9日後(0日目)、平均TV＝108mm3を有する右側腹(注射を受けた腫瘍)の腫瘍体積(TV)に基づいて、動物を6つの群に割り当てた。左側腹(注射を受けていない腫瘍)の中央値TVは83mm3であった。投与を0日目に開始した。10mg/kgのマウスIgG1アイソタイプ対照及びmuDX400を4日毎に合計2回の投与で腹腔内投与した。PBS、1×107pfuのNDV WT及びNDV-muIL-12を右側腹の腫瘍に2日毎に合計4回の投与で投与した。注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍(n＝3/群)を8日目に採取し、CD3発現を免疫組織化学検査により解析した。図26A〜26Bに示されているように、muDX400と組み合わせた腫瘍内NDV-muIL-12による処置は、注射を受けた腫瘍と注射を受けていない腫瘍の両方で著しく高いCD3+ T細胞の浸潤をもたらした。フローサイトメトリー解析により、浸潤しているCD3+細胞の大部分が活性化されたCD8又はCD4エフェクター細胞であることが示唆された(図示せず)。
【０５１６】
さらに、両側性B16F10において、NDVを、抗muPD-1モノクローナル抗体(muDX400)と組み合わせて、他のサイトカイン(IL-23、IL-27、及びIL-2)と対比したIL-12で武装することの抗腫瘍効力を評価した。muDX400との組合せで、NDV-muIL-12とNDV-muIL-23及びmuIL-27とを比較する研究において、NDV-muIL-12＋muDX400による処置は、注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍で最大数の退縮(完全及び部分)をもたらしたが(図37A〜37N)、注射を受けた腫瘍も注射を受けていない腫瘍も腫瘍体積が有意には低下しなかった(p＞0.05)。この研究において、NDV-muIL-12とmuDX400の組合せは、注射を受けた腫瘍及び注射を受けていない腫瘍で、抗muDX400とNDV-muIL-23又はNDV-muIL-27の組合せよりも多い数の完全な退縮をもたらした(図37G及び37N)。さらに、muDX400との組合せで、NDV-muIL-12とNDV-mIL-2とを比較する研究において、これら2つの処置による注射を受けた腫瘍に対する効果は同等であり、結果として、同等数の完全及び部分退縮並びに同等の中央値TV及び68％信頼区間が18日目に得られた(図38C、38D、及び38Iを参照)。注射を受けていない腫瘍については(図38G、38H、及び38J)、18日目の腫瘍体積の低下はこれら2つの処置の間で有意でなかったが(p＞0.05)、NDV-muIL-12＋muDX400により、NDV-muIL-2＋muDX400: 68％信頼区間(207,1036mm3)を有する中央値TV＝255と比較して中央値TV＝130mm3及びより厳格な68％信頼区間(102,244mm3)が得られた。この研究において、NDV-muIL-12とmuDX400の組合せは、注射を受けていない腫瘍で、muDX400とNDV-muIL-IL-2の組合せよりも多い数の完全な退縮をもたらした(図38J)。
【０５１７】
(6.3.2.2  ヒト腫瘍細胞株におけるNDV-huIL-12の溶解活性)
NDV-huIL-12の溶解活性を、感染から48時間後に、感染多重度(MOI) 2及び6で、26種のヒト癌細胞株のパネルで評価した(図27A)。このパネルには、7つの癌タイプ:メラノーマ、HNSCC(頭頸部扁平上皮細胞癌)、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、及び膵癌が含まれていた。細胞生存率を、ウイルス感染から48時間後に、ATPベースの定量法によって評価した(図27A)。各々の細胞株について、NDV-huIL-12(MOI 2及び6)の溶解活性を模擬感染細胞と比べた生存のパーセンテージとして表し; 10μMピューロマイシン(陽性対照)の溶解活性をビヒクル(DMSO)処理細胞と比べた生存のパーセンテージとして表した。
【０５１８】
単塩基のFタンパク質切断部位の場合、NDV-huIL-12は、腫瘍細胞における1サイクルの複製に限定される。これを考慮して、NDV-huIL-12に対する感受性の基準をMOI 2で＞20％の細胞生存率の低下に設定した。この基準によると、26種の細胞株のうちの22種がNDV-huIL-12による溶解に感受性であった。MOI 6では、全ての細胞株がNDV-huIL-12による溶解に対して感受性であった(＞20％の細胞生存率の低下)。結論として、NDV-huIL-12の溶解活性は、様々なヒト腫瘍細胞株で示された。
【０５１９】
(6.3.2.3  NDV-huIL-12処理によるヒト腫瘍細胞株におけるサイトカイン及びケモカインの誘導)
NDV-huIL-12(MOI 2)感染又は模擬感染の溶解活性についてアッセイされた26種のヒト腫瘍細胞株由来の細胞培養上清を48時間で採取し、様々なサイトカイン及びケモカインについて免疫アッセイにより解析した。IL-12p70、IFN-β、及びIP-10の平均濃度が図27Bに提示されている。NDV-huIL-12は、肺癌細胞株H322を除く全ての細胞株における免疫アッセイで検出上限を上回るレベルのIL-12p70の分泌を誘導した。NDV-huIL-12は、これらの細胞株のいずれにおいてもIFN-γを誘導しなかった(データは示さない); IL-12受容体は活性化T細胞及びNK細胞によって主に発現されるので、これは想定内である。NDV-huIL 12は、2つの細胞株(乳腺SK BR-3及びHNSCC SCC15;データは示さない)でのみIFN-α-2aを誘導したが、これらの細胞株の3分の1でIFN-βを誘導した。さらに、NDV-huIL-12は、20種の細胞株において中等度/高レベルのIP-10を誘導した。
【０５２０】
(6.3.2.4  NDV-huIL-12処理によるヒト腫瘍組織培養物及び全血における免疫遺伝子の誘導)
ヒト腫瘍組織培養アプローチは、無傷の新鮮な癌組織を薬物の存在下で最大48時間培養することを可能にする。腫瘍標本中の癌細胞及び既に存在する免疫細胞に対する薬物の効果を評価することができる。NDV-WT及びNDV-huIL-12によるサイトカイン及びケモカイン(タンパク質発現)並びに免疫遺伝子(遺伝子発現)の誘導をこのプラットフォームで評価した。これらの研究において、4つの腎細胞癌(RCC)試料、3つの結腸直腸癌(CRC)試料、2つの乳癌試料、1つのHNSCC試料を3×107pfuのNDV-WT又はNDV-huIL-12で最大48時間処理した。24時間及び48時間の時点で、該組織培養物由来の上清を回収し、様々なサイトカイン及びケモカインについて免疫アッセイにより解析し、腫瘍を急速凍結させ、RNAを免疫遺伝子の解析用に単離した。IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70、及びIFN-γ、並びにIP-10の平均濃度が図28に提示され、IFN誘導性遺伝子IRF7、IFIT2、及びMX2、ケモカインCXCL9、CXCL10(IP-10)、及びCXCL11、IL-12P40、IFN-γ、並びにPD-L1の遺伝子発現が図29A〜29Dに提示されている。NDV-WTとNDV-huIL-12はどちらも、IFN-α-2a及びIP-10の分泌を誘導し;どちらもIFN-βの分泌を誘導しなかった。NDV-huIL 12のみが、IL-12p70及びIFN-γを誘導した。様々な免疫遺伝子の遺伝子発現の解析により、NDV-huIL-12が複数の癌型でケモカイン及びPD-L1の誘導とともに強い1型IFN及びIL-12応答を誘導することが示された。
【０５２１】
同様に、NDV-WT及びNDV-huIL-12によるサイトカイン及びケモカイン(タンパク質発現)(図30)並びに免疫遺伝子(遺伝子発現)(図31A〜31D)の誘導を固形腫瘍悪性腫瘍を有する患者(n＝5)と健常ドナー(n＝5)の両方に由来する全血で評価した。癌細胞は癌患者由来の全血中に存在し得るが、NDV-WT及びNDV-huIL-12による免疫活性化のパターンは、両方の組のドナー由来の血液間で同等である。IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70、及びIFN-γ、並びにIP-10並びにIFN誘導性遺伝子、ケモカイン、Il-12p40、IFN-γ、及びPd l1の遺伝子発現の誘導のパターンは、ヒト腫瘍組織培養物で観察されたものと同様であり、NDV-huIL-12が無傷の腫瘍組織における免疫細胞に一部作用していることが示唆された。
【０５２２】
I型IFN経路は、抗腫瘍免疫応答の重要な調節因子として浮上しており、いくつかの研究によって、抗原提示及び樹状細胞成熟におけるその役割が示されている(例えば、Zitvogelらの文献、Nature reviews. Immunology 15, 405-414(2015)、Fuertesらの文献、J Exp Med 208, 2005-2016(2011)、Diamondらの文献、J Exp Med 208, 1989-2003(2011)、Katoらの文献、Immunity 23, 19-28(2005)を参照)。ヒト腫瘍組織培養プラットフォームにおいて、3×107pfuのNDV-huIL-12による腫瘍の処理は、25ng/mL(9636±1405pg/mL)及び50ng/mL(15308±1726pg/mL)の組換えIL-12による処理に沿うレベルのIL-12(11189±2877pg/mL)の分泌をもたらした(図41A〜41D)。しかしながら、組換えIL-12(10〜50ng/mL)ではなく、NDV-huIL-12による処理のみが、被験ドナーのほとんどでIFN-α-2a及びIFN-βを誘導した(図41A〜41D)。さらに、NDV-huIL-12による処理は、腫瘍部位へのT細胞動員において重要な役割を果たす有意に高いレベルのIP-10の分泌を誘導した(図41A〜41D)。
【０５２３】
(6.3.2.5  NDV-huIL-12応答シグナチャーの同定)
ヒト腫瘍組織培養プラットフォームを用いて、3×107pfuのNDV-huIL-12で最大48時間処理した後に、p＜0.01で少なくとも2倍調節される遺伝子を同定した。遺伝子発現は、RNAシークエンシングにより解析した。インターフェロン誘導性遺伝子(例えば、GBP4、IFIT1、IFIT2、IFIT3、OAS3、及びOASL)、ケモカイン(例えば、CXCL10及びCXCL11)、並びにPD-L1を含む応答シグナチャーをさらなる腫瘍試料(n＝14)でRTqPCR解析により確認した(図39)。
【０５２４】
(6.3.2.6  GEP陰性腫瘍とGEP陽性腫瘍の両方におけるNDV-huIL-12応答シグナチャーの誘導)
抗PD-1ペンブロリズマブ処置患者のベースライン腫瘍試料由来のRNAを用いて、ペンブロリズマブによる臨床的利益と相関する免疫関連遺伝子発現プロファイル(GEP)を同定した(Ayersらの文献、2017, J of Clinical Investigation 127: 2930-2940)。炎症性T細胞のGEPは、抗原提示、ケモカイン発現、細胞傷害活性、及び適応免疫耐性に関連するIFN-γ応答遺伝子を含有していた。GEP陰性である患者は、ペンブロリズマブに滅多に応答しない。GEPスコアの増大が腫瘍の処置についてNDV-WTと比較してNDV-huIL-12でより高いことがヒト腫瘍組織培養プラットフォームで示されている(n＝19)。さらに、3×107pfu NDV-huIL-12による処置は、培地対照と比較したとき、GEP陰性スコア(GEPスコア＜-0.318)からGEP陽性スコア(GEPスコア＞-0.318)への変換を含む、GEPスコアの統計的に有意な増大(P＜0.0001)を有する(図40A〜B)。
【０５２５】
(6.3.2.7  NDV-huIL12の解析的展開及び特徴解析)
NDV-huIL12を第6.3.1.1節に提供されている方法に従って作製した。NDV-huIL-12をフローウイルス測定(FV、個々の粒子を解析し、定量するためのフローサイトメーターの使用)により定量し、特徴解析することができる。フローウイルス測定の説明については、例えば、Vlasakらの文献、2016, Vaccine 34:2321-2328を参照されたい。FV解析により、粒子の大部分をマウス抗NDV HN抗体7B1(ISMMS)で標識することができることが示され、該粒子の大部分がNDV-huIL-12ウイルスであることが示唆された(図32)。NDV-huIL-12は、報告されているパラミクソウイルスと一致する、多形態粒径分布を示す(Goffらの文献、2012, J Virol. 86(19):10852-6)。
【０５２６】
NDVは、6つのタンパク質: F、HN、NP、L、P、及びMを含有する。還元条件下でのSDS-PAGE解析は、6つのタンパク質(F1(〜47kDa)、HN(〜63kDa)、NP(〜53kDa)、L(〜250kDa)、P(〜42kDa)、及びM(〜40kDa))を分離し、定量的純度アッセイとしての役割を果たすことができる。精製されたNDV-huIL-12をSDS-PAGEにより解析した(図33)。これにより、報告されている他のNDVと同様のタンパク質バンドパターンが示され、ワクチン中の大部分のタンパク質がウイルスタンパク質であることが示唆された。
【０５２７】
NDV-huIL-12によるヒトIL-12の産生は、Vero細胞を感染させ、感染から24時間後に採取される培養培地中のIL-12を定量することにより確認した。IL-12をELISAによりアッセイした(図34)。図34は、NDV-huIL-12の参照バッチと比較したMOI依存的huIL-12発現を示している。
【０５２８】
発現したhuIL-12の活性を、DiscoverX製のPathHunter二量体化アッセイを用いる細胞ベースの機能アッセイで測定した(図35)。このアッセイでは、改変された細胞におけるhuIL-12誘導性の受容体二量体化が検出される。機能的huIL-12を、MOI 0.1〜1のNDV-huIL-12感染vero細胞の上清中に検出した(図35)。細胞ベースのアッセイを最適化して、精製されたウイルスを特徴解析する。
【０５２９】
細胞ベースのアッセイを最適化して、精製されたウイルスを特徴解析する。
【０５３０】
(6.4  実施例4:臨床研究)
本明細書に記載される前臨床データは、NDV-huIL-12の腫瘍内投与と免疫チェックポイントインヒビターPD-1の遮断薬の全身性静脈内共投与との組合せを支持する(例えば、第6.3節を参照)。NDV-huIL-12の腫瘍内投与を可能にするアクセス可能な皮膚及び皮下悪性病変を有する進行性固形腫瘍を有する患者におけるペンブロリズマブとNDV-huIL-12の組合せが臨床試験で評価される。これらの固形腫瘍には、再発性/不応性固形腫瘍タイプ、例えば、メラノーマ、頭頸部の扁平上皮細胞癌(SSCHN)、乳癌、子宮癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、脳腫瘍、皮膚転移を有する肉腫、及びアクセス可能な皮膚/SC/リンパ節転移を有する他の悪性腫瘍が含まれる。抗PD-1/PD L1療法が承認される適応については、これらの療法に不応性又は再発性の患者及びこれらの薬剤に対する応答が全く期待されない患者の処置が本研究に含まれる。再発性、不応性、及び/又は再発性かつ不応性の腫瘍型並びに抗PD-1/PD-L1に通常は応答しないが、腫瘍内注射に適している腫瘍を有する患者も評価される。画像ガイダンスによってアクセス可能であるさらなる腫瘍型、例えば、肝転移を有するものが検討される。
【０５３１】
(6.4.1  NDV-huIL-12の産生及びウイルスの精製)
NDV-huIL-12を孵化卵又は細胞培養物中で産生することができる。孵化卵中では、NDV-huIL-12を特定病原体除去孵化卵の尿膜腔で増殖させることができる。NDV-huIL-12を、例えば、上の第6.3.1.20節に記載されている方法を用いて精製することができる。NDV-huIL-12臨床医薬品(DP)を滅菌注射溶液中に提供することができる。
【０５３２】
NDV-huIL-12は、IL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号40に示されるアミノ酸配列を含み、任意に、ここで、該ヌクレオチド配列は、配列番号54又は64に示されるヌクレオチド配列を含む。NDV-huIL-12は、IL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、任意に、ここで、該ヌクレオチド配列は、配列番号57又は59に示されるヌクレオチド配列を含む。NDV-huIL-12は、IL-12 p40サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、該IL-12 p40サブユニットは、配列番号23に示されるアミノ酸配列を含み、任意に、ここで、該ヌクレオチド配列は、配列番号27に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０５３３】
NDV-huIL-12は、IL-12 p35サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含み、任意に、ここで、該ヌクレオチド配列は、配列番号55又は65に示されるヌクレオチド配列を含む。NDV-huIL-12は、IL-12 p35サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、該IL-12 p35サブユニットは、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含み、任意に、ここで、該ヌクレオチド配列は、配列番号29に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０５３４】
NDV huIL-12は、配列番号51に示されるヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むことができる。或いは、NDV huIL-12は、配列番号52に示されるヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むことができる。或いは、NDV huIL-12は、配列番号60に示されるヌクレオチド配列を含むパッケージングされたゲノムを含むことができる。
【０５３５】
NDV-huIL-12は、アミノ酸配列をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、ここで、該アミノ酸配列は、配列番号42に示されるアミノ酸配列を含み、任意に、ここで、該導入遺伝子は、配列番号53又は66に示されるヌクレオチド配列を含む。NDV-huIL-12は、アミノ酸配列をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、ここで、該アミノ酸配列は、配列番号43に示されるアミノ酸配列を含み、任意に、ここで、該導入遺伝子は、配列番号63又は68に示されるヌクレオチド配列を含む。NDV-huIL-12は、アミノ酸配列をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、ここで、該アミノ酸配列は、配列番号22に示されるアミノ酸配列を含み、任意に、ここで、該導入遺伝子は、配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む。NDV-huIL-12は、アミノ酸配列をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、ここで、該アミノ酸配列は、配列番号39に示されるアミノ酸配列を含み、任意に、ここで、該導入遺伝子は、配列番号61に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０５３６】
(6.5  実施例5: BSRT7細胞及び尿膜腔液におけるrNDV-muIL12発現)
rNDV-muIL-12に感染したBSRT7細胞におけるmuIL-12の発現を評価した。rNDV-muIL-12は、第6.3.1.1節に記載されている通りに作製した。BSRT7細胞をrNDV-muIL-12(「NDV-muIL 12」とも呼ばれる)に感染多重度(「MOI」) 3又は10で感染させ、感染から24又は48時間後に上清を回収した。回収された上清中のmuIL-12濃度を、マウスIL-12p70 Quantikine ELISAキット(R&D Systems、カタログ番号M1270)を用いて測定した。被験条件下でrNDV-muIL-12に感染したBSRT7細胞は、検出可能なレベルのmuIL-12を産出した(図36)。任意の特定の理論によって束縛されるものではないが、より低いMOIで感染させた細胞と比較して、より高いMOIで感染させた細胞におけるmuIL-12の濃度がより低いのは、より低いMOIで感染させた、muIL-12を産生する生細胞の数と比較して、より高いMOIで感染させた、muIL-12を産生する生細胞の数がより少ないことが原因であったと仮定される(データは示さない)。
【０５３７】
muIL-12を、前の継代に由来する100μlのrNDV-muIL-12に1:100000希釈で感染させた10日齢の孵化卵の尿膜腔液中でも決定した。この卵を摂氏37度で2日間インキュベートし、その後、尿膜腔液を先に記載されている方法に従って、該卵から回収した(図36)。該尿膜腔液中のmuIL-12濃度を、マウスIL-12p70 Quantikine ELISAキット(R&D Systems、カタログ番号M1270)を用いて測定した。
【０５３８】
(7.実施態様)
本明細書に提供されるのは、以下の例示的な実施態様である:
1.癌を治療する方法であって、それを必要としているヒト対象に、キメラニューカッスル病ウイルス(NDV)を含む第一の組成物及びヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを含む第二の組成物を投与することを含み、ここで、該キメラNDVがヒトインターロイキン-12(「IL-12」)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子がヒトIL-12 p40サブユニット及びヒトIL-12 p35サブユニットをコードする、前記方法。
2.前記キメラNDVが長潜伏期性であるNDV骨格を含む、実施態様1の方法。
3.前記キメラNDVがLa Sota株のNDV骨格を含む、実施態様1又は2の方法。
4.前記キメラNDVがHitchner B1株のNDV骨格を含む、実施態様1又は2の方法。
5.前記パッケージングされたゲノムが突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ該突然変異型Fタンパク質が該キメラNDVのビリオンに取り込まれ、ここで、該突然変異型Fタンパク質が突然変異した切断部位を含む、実施態様1又は2の方法。
6.前記突然変異した切断部位が、
【化１７３】
2020519641.tif 000254
である、実施態様5の方法。
7.前記キメラNDVがr73T-R116ウイルスのNDV骨格を含む、実施態様1の方法。
8.前記パッケージングされたゲノムがアミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該突然変異型Fタンパク質が前記キメラNDVのビリオンに取り込まれる、実施態様1〜4のいずれか1つの方法。
9.前記IL-12が配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様1〜8のいずれか1つの方法。
10.前記導入遺伝子が配列番号61に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様9の方法。
11.前記IL-12が配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様1〜8のいずれか1つの方法。
12.前記導入遺伝子が配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様11の方法。
13.前記IL-12が配列番号43に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様1〜8のいずれか1つの方法。
14.前記導入遺伝子が配列番号63に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様13の方法。
15.前記導入遺伝子が配列番号68に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様13の方法。
16.前記IL-12が配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様1〜8のいずれか1つの方法。
17.前記導入遺伝子が配列番号53に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様16の方法。
18.前記導入遺伝子が配列番号66に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様16の方法。
19.前記IL-12 p40サブユニットが配列番号38に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様1〜8のいずれか1つの方法。
20.前記IL-12 p40サブユニットが配列番号23に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様1〜8のいずれか1つの方法。
21.前記IL-12 p35サブユニットが配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様19又は20の方法。
22.前記IL-12 p35サブユニットが配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様19又は20の方法。
23.前記導入遺伝子が前記パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットの間に挿入される、実施態様1〜22のいずれか1つの方法。
24.前記パッケージングされたゲノムが、NDV NP遺伝子の転写ユニット、NDV P遺伝子の転写ユニット、NDV M遺伝子の転写ユニット、NDV F遺伝子の転写ユニット、NDV HN遺伝子の転写ユニット、及びNDV L遺伝子の転写ユニットを含む、実施態様23の方法。
25.前記パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットが該NDV P遺伝子及び該NDV M遺伝子の転写ユニットである、実施態様24の方法。
26.前記パッケージングされたゲノムが配列番号51に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様1の方法。
27.前記パッケージングされたゲノムが配列番号52に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様1の方法。
28.前記パッケージングされたゲノムが配列番号60に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様1の方法。
29.前記ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがヒトPD-1に結合する抗体である、実施態様1〜28のいずれか1つの方法。
30.前記抗体がヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する、実施態様29の方法。
31.前記抗体がペンブロリズマブである、実施態様29又は30の方法。
32.前記抗体がニボルマブ又はMEDI0680である、実施態様29又は30の方法。
33.前記抗体が、アミノ酸配列
【化１７４】
2020519641.tif 000255
を含む可変軽鎖領域(VLCR)相補性決定領域(CDR)1、アミノ酸配列
【化１７５】
2020519641.tif 000256
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化１７６】
2020519641.tif 000257
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化１７７】
2020519641.tif 000258
を含む可変重鎖領域(VHCR)CDR 1、アミノ酸配列
【化１７８】
2020519641.tif 000259
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化１７９】
2020519641.tif 000260
を含むVHCR CDR3を含む、実施態様29又は30の方法。
34.前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化１８０】
2020519641.tif 000261
を含むVLCR;及び
(b)アミノ酸配列
【化１８１】
2020519641.tif 000262
を含むVHCRを含む、実施態様29又は30の方法。
35.前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化１８２】
2020519641.tif 000263
を含む軽鎖;及び
(b)アミノ酸配列
【化１８３】
2020519641.tif 000264
を含む重鎖を含む、実施態様29又は30の方法。
36.前記抗体が、アミノ酸配列
【化１８４】
2020519641.tif 000265
を含むVLCR CDR1、アミノ酸配列
【化１８５】
2020519641.tif 000266
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化１８６】
2020519641.tif 000267
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化１８７】
2020519641.tif 000268
を含むVHCR CDR1、アミノ酸配列
【化１８８】
2020519641.tif 000269
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化１８９】
2020519641.tif 000270
を含むVHCR CDR3を含む、実施態様29又は30の方法。
37.前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化１９０】
2020519641.tif 000271
を含むVLCR;及び
(b)アミノ酸配列
【化１９１】
2020519641.tif 000272
を含むVHCRを含む、実施態様29又は30の方法。
38.前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化１９２】
2020519641.tif 000273
を含む軽鎖;及び
(b)アミノ酸配列
【化１９３】
2020519641.tif 000274
を含む重鎖を含む、実施態様29又は30の方法。
39.前記ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがヒトPD-L1に結合する抗体である、実施態様1〜28のいずれか1つの方法。
40.前記抗体がデュルバルマブ、アベルマブ、bms-936559、又はアテゾリズマブである、実施態様39の方法。
41.前記第一の組成物が前記対象に腫瘍内又はリンパ節内投与される、実施態様1〜40のいずれか1つの方法。
42.前記対象が皮膚もしくは皮下腫瘍又はリンパ節内の腫瘍を示す、実施態様41の方法。
43.前記第二の組成物が前記対象に、静脈内投与される、実施態様1〜42のいずれか1つの方法。
44.前記第二の組成物が前記対象に皮下投与される、実施態様1〜42のいずれか1つの方法。
45.前記癌が、メラノーマ、腎臓癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、肝細胞癌、膵癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳癌、又は頭頸部癌である、実施態様1〜44のいずれか1つの方法。
46.前記癌が、非小細胞肺癌、古典的ホジキンリンパ腫、マイクロサテライト高不安定性癌、メラノーマ、胃癌、尿路上皮癌、又は頭頸部扁平上皮細胞癌である、実施態様1〜44のいずれか1つの方法。
47.前記癌がびまん性大細胞型B細胞リンパ腫又は子宮頸癌である、実施態様1〜44のいずれか1つの方法。
48.前記癌が、メラノーマ、非小細胞肺癌、頭頸部癌(HNSCC頭頸部扁平上皮細胞癌)、尿路上皮癌、トリプルネガティブ乳癌、胃癌、胃食道接合部腺癌、古典的ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、中皮腫、卵巣癌、小細胞肺癌、食道癌、鼻咽頭癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、ER+/HER2-乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、前立腺癌、膠芽腫、マイクロサテライト高不安定性(MSI-H)もしくはミスマッチ修復欠損癌(組織非依存性)、又は高い腫瘍突然変異負荷を有する腫瘍(組織非依存性)である、実施態様1〜44のいずれか1つの方法。
49.前記肺癌が非小細胞肺癌である、実施態様45の方法。
50.前記頭頸部癌が頭頸部の扁平上皮細胞癌であり、該腎臓癌が腎細胞癌であり、該結腸直腸癌が結腸直腸癌であり、又は該乳癌が、乳房上皮癌、トリプルネガティブ乳癌、もしくはER+/HER2-乳癌である、実施態様45の方法。
51.前記癌が、メラノーマ、肉腫、子宮癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される固形腫瘍である、実施態様1〜44のいずれか1つの方法。
52.前記癌が非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫である、実施態様1〜44のいずれか1つの方法。
53.前記癌が転移性である、実施態様1〜52のいずれか1つの方法。
54.前記癌が切除不能である、実施態様1〜51のいずれか1つの方法。
55.前記癌が、皮膚、皮下、又はリンパ節転移を含む、実施態様1〜52のいずれか1つの方法。
56.前記癌が、不応性もしくは再発性、又はその両方である、実施態様1〜55のいずれか1つの方法。
57.前記癌の生検がPD-L1陽性である、実施態様1〜56のいずれか1つの方法。
58.前記生検が少なくとも1％の腫瘍比率スコアを有する、実施態様57の方法。
59.前記生検が少なくとも1の複合陽性スコアを有する、実施態様57の方法。
60.前記癌の生検がPD-L1陰性である、実施態様1〜56のいずれか1つの方法。
61.前記生検が1％未満の腫瘍比率スコアを有する、実施態様60の方法。
62.前記生検が1未満の複合陽性スコアを有する、実施態様60の方法。
63.前記対象が、PD-1に結合し、かつPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体による単剤療法治療に不応性である、実施態様1〜62のいずれか1つの方法。
64.前記キメラNDVの投与が、IL-12p70発現、IFN-γ発現、又はIL-12p70発現とIFN-γ発現の両方を誘導する、実施態様63の方法。
65.前記キメラNDVの投与が表15の18-遺伝子シグナチャーの遺伝子発現プロファイリング(GEP)スコアを増大させる、実施態様63の方法。
66.前記対象がヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に不応性又は不応答性である、実施態様1〜62のいずれか1つの方法。
67.前記PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストが、ニボルマブ、AMP-224、MEDI0680、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、bms-936559、又はアテゾリズマブである、実施態様66の方法。
68.パッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであって、該パッケージングされたゲノムがヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該IL-12が配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む、前記キメラNDV。
69.前記導入遺伝子が配列番号61に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様68のキメラNDV。
70.パッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであって、該パッケージングされたゲノムがヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該IL-12が配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む、前記キメラNDV。
71.前記導入遺伝子が配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様70のキメラNDV。
72.パッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであって、該パッケージングされたゲノムがヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該IL-12が配列番号43に示されるアミノ酸配列を含む、前記キメラNDV。
73.前記導入遺伝子が配列番号63に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様72のキメラNDV。
74.前記導入遺伝子が配列番号68に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様72のキメラNDV。
75.パッケージングされたゲノムを含むキメラNDVであって、該パッケージングされたゲノムがヒトIL-12をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該IL-12が配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む、前記キメラNDV。
76.前記導入遺伝子が配列番号53に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様75のキメラNDV。
77.前記導入遺伝子が配列番号66に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様75のキメラNDV。
78.前記キメラNDVが長潜伏期性であるNDV骨格を含む、実施態様68〜77のいずれか1つのキメラNDV。
79.前記キメラNDVがLa Sota株のNDV骨格を含む、実施態様68〜78のいずれか1つのキメラNDV。
80.前記キメラNDVがHitchner B1株のNDV骨格を含む、実施態様68〜78のいずれか1つのキメラNDV。
81.前記パッケージングされたゲノムが突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該突然変異型Fタンパク質が前記キメラNDVのビリオンに取り込まれており、ここで、該突然変異型Fタンパク質が突然変異した切断部位を含む、実施態様68〜78のいずれか1つのキメラNDV。
82.前記突然変異した切断部位が、
【化１９４】
2020519641.tif 000275
である、実施態様81のキメラNDV。
83.前記キメラNDVがr73T-R116ウイルスのNDV骨格を含む、実施態様68〜77のいずれか1つのキメラNDV。
84.前記パッケージングされたゲノムがアミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該突然変異型Fタンパク質が前記キメラNDVのビリオンに取り込まれている、実施態様68〜80のいずれか1つのキメラNDV。
85.前記パッケージングされたゲノムが配列番号51に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様68〜71のいずれか1つのキメラNDV。
86.前記パッケージングされたゲノムが配列番号52に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様72、73、75、又は76のキメラNDV。
87.前記パッケージングされたゲノムが配列番号60に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様72、74、75、又は77のキメラNDV。
88.前記導入遺伝子が前記パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニット間に挿入されている、実施態様68〜84のいずれか1つのキメラNDV。
89.前記パッケージングされたゲノムが、NDV NP遺伝子の転写ユニット、NDV P遺伝子の転写ユニット、NDV M遺伝子の転写ユニット、NDV F遺伝子の転写ユニット、NDV HN遺伝子の転写ユニット、及びNDV L遺伝子の転写ユニットを含む、実施態様88のキメラNDV。
90.前記パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットが該NDV P遺伝子及びNDV M遺伝子の転写ユニットである、実施態様89のキメラNDV。
91.ヒト対象の癌を治療する方法で使用するためのキメラNDVであって、該キメラNDVがヒトインターロイキン-12(「IL-12」)をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該導入遺伝子がヒトIL-12 p40サブユニット及びヒトIL-12 p35サブユニットをコードし、かつここで、該方法がヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストを投与することをさらに含む、前記キメラNDV。
92.前記キメラNDVが長潜伏期性であるNDV骨格を含む、実施態様91のキメラNDV。
93.前記キメラNDVがHitchner B1のNDV骨格を含む、実施態様91又は92のキメラNDV。
94.前記キメラNDVがLa Sota株のNDV骨格を含む、実施態様91又は92のキメラNDV。
95.前記パッケージングされたゲノムが突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該突然変異型Fタンパク質が前記キメラNDVのビリオンに取り込まれており、ここで、該突然変異型Fタンパク質が突然変異した切断部位を含む、実施態様91又は92のキメラNDV。
96.前記突然変異した切断部位が、
【化１９５】
2020519641.tif 000276
である、実施態様95のキメラNDV。
97.前記キメラNDVがr73T-R116ウイルスのNDV骨格を含む、実施態様91のキメラNDV。
98.前記パッケージングされたゲノムがアミノ酸突然変異L289Aを有する突然変異型Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該突然変異型Fタンパク質が前記キメラNDVのビリオンに取り込まれている、実施態様91〜94のいずれか1つのキメラNDV。
99.前記IL-12が配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様91〜98のいずれか1つのキメラNDV。
100.前記導入遺伝子が配列番号61に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様99のキメラNDV。
101.前記IL-12が配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様91〜98のいずれか1つのキメラNDV。
102.前記導入遺伝子が配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様101のキメラNDV。
103.前記IL-12が配列番号43に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様91〜98のいずれか1つのキメラNDV。
104.前記導入遺伝子が配列番号63に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様103のキメラNDV。
105.前記導入遺伝子が配列番号68に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様103のキメラNDV。
106.前記IL-12が配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様91〜98のいずれか1つのキメラNDV。
107.前記導入遺伝子が配列番号53に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様106のキメラNDV。
108.前記導入遺伝子が配列番号66に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様106のキメラNDV。
109.前記IL-12 p40サブユニットが配列番号38に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様91〜98のいずれか1つのキメラNDV。
110.前記IL-12 p40サブユニットが配列番号40に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様91〜98のいずれか1つのキメラNDV。
111.前記IL-12 p35サブユニットが配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様109又は110のキメラNDV。
112.前記IL-12 p35サブユニットが配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む、実施態様109又は110のキメラNDV。
113.前記導入遺伝子が前記パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニット間に挿入されている、実施態様91〜112のいずれか1つのキメラNDV。
114.前記パッケージングされたゲノムが、NDV NP遺伝子の転写ユニット、NDV P遺伝子の転写ユニット、NDV M遺伝子の転写ユニット、NDV F遺伝子の転写ユニット、NDV HN遺伝子の転写ユニット、及びNDV L遺伝子の転写ユニットを含む、実施態様113のキメラNDV。
115.前記パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットが該NDV P遺伝子及びNDV M遺伝子の転写ユニットである、実施態様114のキメラNDV。
116.前記パッケージングされたゲノムが配列番号51に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様91のキメラNDV。
117.前記パッケージングされたゲノムが配列番号52に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様91のキメラNDV。
118.前記パッケージングされたゲノムが配列番号60に示されるヌクレオチド配列を含む、実施態様91のキメラNDV。
119.前記ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがPD-1に結合する抗体である、実施態様91〜118のいずれか1つのキメラNDV。
120.前記抗体がヒトPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する、実施態様119のキメラNDV。
121.前記抗体がペンブロリズマブである、実施態様119又は120のキメラNDV。
122.前記抗体がニボルマブ又はMEDI0680である、実施態様119又は120のキメラNDV。
123.前記抗体が、アミノ酸配列
【化１９６】
2020519641.tif 000277
を含む可変軽鎖領域(VLCR)相補性決定領域(CDR)1、アミノ酸配列
【化１９７】
2020519641.tif 000278
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化１９８】
2020519641.tif 000279
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化１９９】
2020519641.tif 000280
を含む可変重鎖領域(VHCR)CDR1、アミノ酸配列
【化２００】
2020519641.tif 000281
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化２０１】
2020519641.tif 000282
を含むVHCR CDR3を含む、実施態様119又は120のキメラNDV。
124.前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化２０２】
2020519641.tif 000283
を含むVLCR;及び
(b)アミノ酸配列
【化２０３】
2020519641.tif 000284
を含むVHCRを含む、実施態様119又は120のキメラNDV。
125.前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化２０４】
2020519641.tif 000285
を含む軽鎖;及び
(b)アミノ酸配列
【化２０５】
2020519641.tif 000286
を含む重鎖を含む、実施態様119又は120のキメラNDV。
126.前記抗体が、アミノ酸配列
【化２０６】
2020519641.tif 000287
を含むVLCR CDR1、アミノ酸配列
【化２０７】
2020519641.tif 000288
を含むVLCR CDR2、アミノ酸配列
【化２０８】
2020519641.tif 000289
を含むVLCR CDR3、アミノ酸配列
【化２０９】
2020519641.tif 000290
を含むVHCR CDR1、アミノ酸配列
【化２１０】
2020519641.tif 000291
を含むVHCR CDR2、及びアミノ酸配列
【化２１１】
2020519641.tif 000292
を含むVHCR CDR3を含む、実施態様119又は120のキメラNDV。
127.前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化２１２】
2020519641.tif 000293
を含むVLCR;及び
(b)アミノ酸配列
【化２１３】
2020519641.tif 000294
を含むVHCRを含む、実施態様119又は120のキメラNDV。
128.前記抗体が:
(a)アミノ酸配列
【化２１４】
2020519641.tif 000295
を含む軽鎖;及び
(b)アミノ酸配列
【化２１５】
2020519641.tif 000296
を含む重鎖を含む、実施態様119又は120のキメラNDV。
129.前記ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストがヒトPD-L1に結合する抗体である、実施態様91〜118のいずれか1つのキメラNDV。
130.前記抗体が、デュルバルマブ、アベルマブ、bms-936559、又はアテゾリズマブである、実施態様129のキメラNDV。
131.前記キメラNDVが前記対象に腫瘍内又はリンパ節内投与される、実施態様91〜130のいずれか1つのキメラNDV。
132.前記対象が皮膚もしくは皮下腫瘍又はリンパ節内の腫瘍を示す、実施態様131のキメラNDV。
133.前記ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストが前記対象に、静脈内投与される、実施態様91〜131のいずれか1つのキメラNDV。
134.前記ヒトPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストが前記対象に皮下投与される、実施態様91〜131のいずれか1つのキメラNDV。
135.前記癌が、メラノーマ、腎臓癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、肝細胞癌、膵癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳癌、又は頭頸部癌である、実施態様91〜134のいずれか1つのキメラNDV。
136.前記癌が、非小細胞肺癌、古典的ホジキンリンパ腫、マイクロサテライト高不安定性癌、メラノーマ、胃癌、尿路上皮癌、又は頭頸部扁平上皮細胞癌である、実施態様91〜134のいずれか1つのキメラNDV。
137.前記癌がびまん性大細胞型B細胞リンパ腫又は子宮頸癌である、実施態様91〜134のいずれか1つのキメラNDV。
138.前記癌が、メラノーマ、非小細胞肺癌、頭頸部癌(HNSCC頭頸部扁平上皮細胞癌)、尿路上皮癌、トリプルネガティブ乳癌、胃癌、胃食道接合部腺癌、古典的ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、中皮腫、卵巣癌、小細胞肺癌、食道癌、鼻咽頭癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、ER+/HER2-乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、前立腺癌、膠芽腫、マイクロサテライト高不安定性(MSI-H)もしくはミスマッチ修復欠損癌(組織非依存性)、又は高い腫瘍突然変異負荷を有する腫瘍(組織非依存性)である、実施態様91〜134のいずれか1つのキメラNDV。
139.前記肺癌が非小細胞肺癌である、実施態様135のキメラNDV。
140.前記頭頸部癌が頭頸部の扁平上皮細胞癌であり、該腎臓癌が腎細胞癌であり、該結腸直腸癌が結腸直腸癌であり、又は該乳癌が、乳房上皮癌、トリプルネガティブ乳癌、もしくはER+/HER2-乳癌である、実施態様135のキメラNDV。
141.前記癌が、メラノーマ、肉腫、子宮癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮細胞癌、及び乳癌からなる群から選択される固形腫瘍である、実施態様91〜134のいずれか1つのキメラNDV。
142.前記癌が非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫である、実施態様91〜134のいずれか1つのキメラNDV。
143.前記癌が転移性である、実施態様91〜142のいずれか1つのキメラNDV。
144.前記癌が切除不能である、実施態様91〜141のいずれか1つのキメラNDV。
145.前記癌が、皮膚、皮下、又はリンパ節転移を含む、実施態様91〜142のいずれか1つのキメラNDV。
146.前記癌が、不応性、再発性、又はその両方である、実施態様91〜145のいずれか1つのキメラNDV。
147.前記癌の生検がPD-L1陽性である、実施態様91〜145のいずれか1つのキメラNDV。
148.前記生検が少なくとも1％の腫瘍比率スコアを有する、実施態様147のキメラNDV。
149.前記生検が少なくとも1の複合陽性スコアを有する、実施態様147のキメラNDV。
150.前記癌の生検がPD-L1陰性である、実施態様91〜146のいずれか1つのキメラNDV。
151.前記生検が1％未満の腫瘍比率スコアを有する、実施態様150のキメラNDV。
152.前記生検が1未満の複合陽性スコアを有する、実施態様150のキメラNDV。
153.前記対象が、PD-1に結合し、かつPD-1とそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2との相互作用を遮断する抗体による単剤療法治療に不応性である、実施態様91〜152のいずれか1つのキメラNDV。
154.前記キメラNDVの投与が、IL-12p70発現、IFN-γ発現、又はIL-12p70発現とIFN-γ発現の両方を誘導する、実施態様153のキメラNDV。
155.前記キメラNDVの投与が表15の18-遺伝子シグナチャーのGEPスコアを増大させる、実施態様153のキメラNDV。
156.前記対象がPD-1又はそのリガンドのアンタゴニストによる単剤療法治療に不応性又は不応答性である、実施態様91〜152のいずれか1つのキメラNDV。
157.前記PD-1又はそのリガンドのアンタゴニストが、ニボルマブ、AMP-224、MEDI0680、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、bms-936559、又はアテゾリズマブである、実施態様156のキメラNDV。
【０５３９】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様によって範囲が限定されるものではない。実際、記載されているものの他に、本発明の様々な変更が、前述の説明及び付随する図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０５４０】
本明細書に引用される全ての参考文献は、各々の個々の刊行物又は特許又は特許出願が、あらゆる目的のために引用により完全に本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個別的に示される場合と同じ程度まで、引用により完全に及びあらゆる目的のために本明細書中に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ−Ｅ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図７Ｄ−Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｆ】
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【図１０Ｇ−Ｍ】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｃ】
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【図１２Ｄ−Ｉ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ−Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ−Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ−Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ−Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ−２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ−Ｇ】
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【図３７Ｈ−Ｎ】
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【図３８Ａ−Ｈ】
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【図３８Ｉ−Ｊ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月17日(2020.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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