(57)【要約】  本発明は、とりわけ筋ジストロフィー、特に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療のための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、ＤＭＤの少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度、もしくは頻度が低減するように、あるいはその開始が遅延するように、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量を、ＤＭＤに罹患している、またはＤＭＤに感受性がある個人に投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列を含む組み換えフォリスタチンポリペプチドであって、前記組み換えフォリスタチンタンパク質が、ヘパリン結合配列（ＨＢＳ）を有し、かつ前記ＨＢＳ内の１つ以上のアミノ酸が、置換されたアミノ酸と比較してより少ない正電荷を有するアミノ酸で置換されている、組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項２】
前記ＨＢＳ内の前記１つ以上のアミノ酸が、中性電荷を有するアミノ酸で置換されている、請求項１に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項３】
前記ＨＢＳ内の前記１つ以上のアミノ酸が、負電荷を有するアミノ酸で置換されている、請求項１に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項４】
前記１つ以上が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項５】
前記１つ以上が３個のアミノ酸を含む、請求項４に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項６】
前記組み換えポリペプチドが、自然発生のフォリスタチンと比較して減少したヘパリン結合親和性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項７】
前記ＨＢＳ中の前記アミノ酸置換の数を増加させることが、ヘパリン結合親和性を漸進的に減少させる、請求項６に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項８】
前記ＨＢＳ内の前記アミノ酸置換の数が２個のアミノ酸である、請求項７に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項９】
前記ＨＢＳ内の前記アミノ酸置換の数が３個のアミノ酸である、請求項８に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１０】
前記アミノ酸置換が、前記ＨＢＳドメインのアミノ酸残基８１〜８４によって特定されるＢＢＸＢモチーフ内で行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１１】
前記アミノ酸置換が、前記ＨＢＳドメインのアミノ酸残基７５〜７８によって特定されるＢＢＸＢモチーフ内で行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１２】
前記最初の２つの塩基性アミノ酸残基が、負電荷を有するかまたは中性のアミノ酸残基で置換されている、請求項１０または１１に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１３】
前記最初の２つの塩基性アミノ酸残基が、負電荷を有するアミノ酸残基で置換されている、請求項１２に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１４】
前記組み換えフォリスタチンタンパク質がＢＭＰ−９またはＢＭＰ−１０と結合しない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１５】
前記組み換えフォリスタチンタンパク質が、配列番号１２〜４０または配列番号１０１〜１０６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一である配列を有する、請求項１に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列を含み、
配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６〜８８位に対応する前記アミノ酸が、配列番号４２〜６７または配列番号１１１〜１１６のうちのいずれか１つと同一である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６〜８８位に対応するアミノ酸の配列が、配列番号５８〜６７または配列番号  １１１〜１１３のうちのいずれか１つと同一である、請求項１６に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１８】
前記組み換えフォリスタチンポリペプチドが高グリコシル化変異体である、請求項１７に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列を含み、
Ｃ６６Ｓ、Ｃ６６Ａ、Ｇ７４Ｎ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７６Ａ、Ｋ７６Ｄ、Ｋ７６Ｓ、Ｋ７６Ｅ、Ｃ７７Ｓ、Ｃ７７Ｔ、Ｒ７８Ｅ、Ｒ７８Ｎ、Ｎ８０Ｔ、Ｋ８１Ａ、Ｋ８１Ｄ、Ｋ８２Ａ、Ｋ８２Ｄ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８２Ｔ、Ｋ８２Ｅ、Ｋ８４Ｅ、Ｐ８５Ｔ、Ｒ８６Ｎ、Ｖ８８Ｅ、およびＶ８８Ｔまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸変異のうちのいずれか１つを含む、組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項２０】
前記アミノ酸の配列が、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９０％同一である、請求項１６または１９に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項２１】
前記アミノ酸の配列が、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９５％同一である、請求項１６または１９に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項２２】
前記アミノ酸の配列が、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９８％同一である、請求項１６または１９に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項２３】
前記アミノ酸の配列が、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と１００％同一である、請求項１６または１９に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号１２、配列番号１７〜３０、および配列番号３２〜４０からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含む、組み換えフォリスタチンポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のフォリスタチンポリペプチドおよびＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２６】
フォリスタチンポリペプチドおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む組み換えフォリスタチン融合タンパク質であって、
前記組み換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列を含み、
配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６〜８８位に対応する前記アミノ酸が、配列番号４１、４２、４３、または５８と同一である、組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２７】
前記組み換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸の配列を含む、請求項２６に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２８】
前記組み換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸の配列を含む、請求項２６に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項２９】
前記組み換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９８％同一であるアミノ酸の配列を含む、請求項２６に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３０】
前記組み換えフォリスタチンポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と１００％同一であるアミノ酸の配列を含む、請求項２６に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３１】
フォリスタチンポリペプチドおよびＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む組み換えフォリスタチン融合タンパク質であって、
前記フォリスタチンポリペプチドが、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１５〜配列番号４０からなる群のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸の配列を含む、組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３２】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインがアミノ酸置換を含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質であって、
前記アミノ酸置換が、ＥＵナンバリングに従い、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３３】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインが配列番号６のアミノ酸の配列を含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質であって、
前記アミノ酸の配列が、ＥＵナンバリングに従い、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３４】
前記ＩｇＧ  Ｆｃドメインが、配列番号７〜配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３５】
前記ＩｇＧ  ＦｃドメインがヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインである、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３６】
前記ＩｇＧ  ＦｃドメインがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３７】
配列番号７３〜配列番号１００、配列番号１１７、または配列番号１１８のうちのいずれか１つのアミノ酸の配列を含む組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３８】
前記タンパク質が、１〜１００ｐＭの親和性解離定数（ＫＤ）でミオスタチンに結合する、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項３９】
前記タンパク質が、１〜１００ｐＭの親和性解離定数（ＫＤ）でアクチビンＡに結合する、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４０】
前記タンパク質が、０．２ｎＭ〜２５ｎＭの範囲の骨形態形成タンパク質−９（ＢＭＰ−９）および／または骨形態形成タンパク質−１０（ＢＭＰ−１０）に結合しない、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４１】
前記タンパク質が、０．１〜２５ｎＭ超の親和性解離定数（ＫＤ）でヘパリンに結合する、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４２】
前記タンパク質が、２５〜４００ｎＭの親和性解離定数（ＫＤ）でＦｃＲｎ受容体に結合する、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４３】
タンパク質が０．１〜１０ｎＭのＩＣ５０でミオスタチンを阻害する、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４４】
タンパク質が０．１〜１０ｎＭのＩＣ５０でアクチビンＡを阻害する、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質。
【請求項４５】
前記組み換えフォリスタチンタンパク質融合タンパク質が、野生型フォリスタチンと比較して増加した半減期を有する、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチンタンパク質融合タンパク質。
【請求項４６】
請求項２５〜４５のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項４７】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項４７または４８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５０】
請求項４７もしくは４８に記載のポリヌクレオチド、または請求項３０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５１】
請求項５０に記載の宿主細胞を培養することを含む、ミオスタチンに特異的に結合する組み換えフォリスタチン融合タンパク質を作製する方法。
【請求項５２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチンポリペプチドまたは請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項５３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法であって、
ＤＭＤの少なくとも１つの症状もしくは特徴の強度、重症度、または頻度が低減するか、またはそれらの開始を遅延させるように、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質または請求項３８に記載の医薬組成物の有効量を、ＤＭＤに罹患しているか、またはＤＭＤに感受性がある対象者に投与することを含む、方法。
【請求項５４】
前記方法が、１つ以上の追加的治療薬を対象者に投与することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記１つ以上の追加的治療薬が、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその断片、エダサロネキセント、パムレブルマブ、プレドニゾン、デフラザコート、ＲＮＡ調節治療薬、エクソンスキッピング治療薬、および遺伝子治療からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量が非経口的に投与される、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記非経口的投与が、静脈内、皮内、髄腔内、吸入、経皮（局所的）、眼内、筋肉内、皮下、経粘膜投与、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記非経口的投与が静脈内投与である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、静脈内投与で約１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、静脈内投与で約８ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約８ｍｇ／ｋｇである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記静脈内投与が月に１回行われる、請求項５８〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記非経口的投与が皮下投与である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、皮下投与で約２ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項５３〜５８、または請求項６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、皮下投与で約３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、皮下投与で約２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約２ｍｇ／ｋｇである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約３ｍｇ／ｋｇである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記皮下投与が週に１回行われる、請求項６６〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の投与が、用量に比例している、請求項５７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の投与が、用量直線的である、請求項５７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質が、表１から選択される１つ以上の骨格筋に送達される、請求項５３〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記投与が、対照に対して筋肉量の増加をもたらす、請求項５３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記筋肉が、表１から選択される１つ以上の骨格筋である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記筋肉が、横隔膜、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、腓腹筋、長指伸筋、腹直筋、四頭筋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記筋肉が腓腹筋である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記筋肉量の増加が、対照に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％または５００％の増加である、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記投与により、筋肉再生、筋力の増加、柔軟性の増加、可動域の増加、スタミナの増加、易疲労性の低減、血流の増加、認知の改善、肺機能の改善、炎症の抑制、筋線維症の低減、筋壊死の低減、および／または体重の増加がもたらされる、請求項５３〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
ＤＭＤの前記少なくとも１つの症状または特徴が、筋消耗、筋力低下、筋脆弱性、筋壊死、筋線維症、関節拘縮、骨格変形、心筋症、嚥下障害、腸・膀胱機能障害、筋虚血、認知機能障害、行動機能障害、社会化障害、脊柱側弯、および呼吸機能障害からなる群から選択される、請求項５３〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
対象者内のミオスタチンおよび／またはアクチビンを阻害する方法であって、
請求項２５〜３７のいずれか１項に記載の組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量を含む組成物を対象者に投与することを含む、方法。
【請求項８４】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、静脈内投与で約１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、静脈内投与で約８ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約８ｍｇ／ｋｇである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記静脈内投与が月に１回行われる、請求項８４〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、皮下投与で約２ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９１】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、皮下投与で約３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、皮下投与で約２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約２ｍｇ／ｋｇである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が少なくとも約３ｍｇ／ｋｇである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記組み換えフォリスタチン融合タンパク質の前記有効量が、皮下投与で少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
前記皮下投与が週に１回行われる、請求項９０〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月１７日出願の米国特許仮出願第６２／６１８，３７６号および２０１７年５月１２日出願の米国仮出願第６２／５０５，６４２号の優先権および利益を主張するものであり、そのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）はＸ染色体連鎖劣性障害であり、これは、３６００人に１人の男性が出生時に罹患していると推定され、世界中で５０，０００人が罹患していると推定される。本障害は進行性の筋消耗を特徴とし、罹患している小児は１３歳に達するまでに車椅子が必要となる。罹患者は通常３歳で症状を呈し、そのような患者の生存期間中央値は２５〜３０歳である。横隔膜の衰弱および心筋症に起因する呼吸不全が一般的な死亡原因である。
【０００３】
ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ジストロフィン遺伝子はＸ染色体上に位置し、タンパク質ジストロフィンをコード化する。ジストロフィンタンパク質は、筋繊維の収縮機構（アクチン−ミオシン複合体）を、ジストログリカン複合体を通して周囲の細胞外基質に連結する責任を有する。ジストロフィン遺伝子の変異は、ジストロフィンタンパク質の改変または欠如のいずれかおよび異常な筋線維膜機能をもたらす。男性と女性との両方がジストロフィン遺伝子に変異を持つ可能性があるが、女性はＤＭＤに罹患することは稀である。
【０００４】
ＤＭＤの１つの特徴は、罹患組織の虚血である。虚血は、組織または器官への血液供給の制限または減少であり、細胞代謝に必要な酸素および栄養素の不足を引き起こす。虚血は、一般的に血管の狭窄または閉塞によって引き起こされ、その結果、組織または器官の損傷または機能不全がもたらされる。虚血の治療は、罹患組織または器官への血流の増加へと方向付けられる。
【０００５】
現在、ＤＭＤの治療法はない。遺伝子治療およびコルチコステロイド投与を含むいくつかの治療手段が調査されたが、ＤＭＤ患者に対する代替治療法の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、とりわけ、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の投与に基づくＤＭＤの治療のための改善された方法および組成物を提供する。本発明は、とりわけ、フォリスタチンポリペプチドにおけるある特定のアミノ酸修飾が、高い親和性を有するミオスタチンおよびアクチビンＡを特異的に標的とし、かつ非標的ＢＭＰまたはヘパリンに意義のある親和性で結合しない改善されたフォリスタチンタンパク質をもたらすという予想外の観察を包含する。ミオスタチンおよびアクチビンＡによるＳｍａｄ２／３経路の活性化が、筋原性タンパク質発現の阻害につながり、結果として筋芽細胞は筋肉へと分化しないと考えられる。したがって、ミオスタチンおよびアクチビンは、筋肉再生の刺激のために実行可能な標的である。しかしながら、フォリスタチン（「ＦＳ」）を含むミオスタチンおよびアクチビン拮抗薬は、ある特定の構造的類似性に起因して骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に結合することができる。ＢＭＰ、特にＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０は、身体全体を通した組織構造を編成する中心的な形態形成シグナルである。こうしたＢＭＰの阻害は、望ましくない病的状態につながる場合がある。フォリスタチンはまた、３つのＦＳドメインのうち最初において、塩基性ヘパリン結合配列（ＨＢＳ）を通して細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンにも結合する。ヘパリン結合の不活性化、低減、または調節が、フォリスタチンのｉｎ  ｖｉｖｏ曝露および／または半減期を増加し得ると考えられる。それゆえに、本発明は、半減期がより長く、かつＤＭＤの効果的な治療に対してより強力な改善されたフォリスタチンを提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列を含み、組み換えフォリスタチンタンパク質が、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＳ）を有し、かつＨＢＳ内の１つ以上のアミノ酸が、置換されたアミノ酸と比較して正電荷がより少ないアミノ酸で置換された、組み換えフォリスタチンポリペプチドを提供する。一実施形態では、ＨＢＳ内の１つ以上のアミノ酸は、中性電荷を有するアミノ酸で置換される。一実施形態では、ＨＢＳ内の１つ以上のアミノ酸は、陰電荷を有するアミノ酸で置換される。一実施形態では、１つ以上は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、１つ以上は、少なくとも３個のアミノ酸を含む。一実施形態では、組み換えポリペプチドは、自然発生のフォリスタチンと比較して減少したヘパリン結合親和性を有する。一実施形態では、ＨＢＳ内のアミノ酸置換の数を増加させることは、ヘパリン結合親和性を漸進的に減少させる。一実施形態では、ＨＢＳ内のアミノ酸置換の数は２アミノ酸である。一実施形態では、ＨＢＳ内のアミノ酸置換の数は３アミノ酸である。一実施形態では、アミノ酸置換は、ＨＢＳドメインのアミノ酸残基８１〜８４によって特定されるＢＢＸＢモチーフ内で作製される。一実施形態では、アミノ酸置換は、ＨＢＳドメインのアミノ酸残基７５〜７８によって特定されるＢＢＸＢモチーフ内で作製される。一実施形態では、最初の２つの塩基性アミノ酸残基は、陰性に荷電した、または中性のアミノ酸残基で置換される。一実施形態では、最初の２つの塩基性アミノ酸残基は、陰性に荷電したアミノ酸残基で置換される。
【０００８】
一実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質はＢＭＰ−９またはＢＭＰ−１０に結合しない。一実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号１２〜４０または配列番号１０１〜１０６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一である配列を有する。
【０００９】
一態様では、本発明は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列を含む、組み換えフォリスタチンポリペプチドを提供し、配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６〜８８の位置に対応するアミノ酸は、配列番号４２〜６７または配列番号１１１〜１１６のいずれか１つと同一である。いくつかの実施形態では、配列番号２、配列番号４、または配列番号５の位置６６〜８８に対応するアミノ酸は、配列番号５８〜６７または配列番号１１１〜１１３のうちのいずれか１つと同一である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドは、高グリコシル化変異体である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸の配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸の配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸の配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９８％同一である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸の配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と１００％同一である。
【００１０】
一態様では、本発明は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列を含み、かつＣ６６Ｓ、Ｃ６６Ａ、Ｇ７４Ｎ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７５Ｎ、Ｋ７６Ａ、Ｋ７６Ｄ、Ｋ７６Ｓ、Ｋ７６Ｅ、Ｃ７７Ｓ、Ｃ７７Ｔ、Ｒ７８Ｅ、Ｒ７８Ｎ、Ｎ８０Ｔ、Ｋ８１Ａ、Ｋ８１Ｄ、Ｋ８２Ａ、Ｋ８２Ｄ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８２Ｔ、Ｋ８２Ｅ、Ｋ８４Ｅ、Ｐ８５Ｔ、Ｒ８６Ｎ、Ｖ８８Ｅ、およびＶ８８Ｔまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸変異のうちのいずれか一つを含む、組み換えフォリスタチンポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸の配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸の配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸の配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９８％同一である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸の配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と１００％同一である。
【００１１】
一態様では、本発明は、配列番号１２、配列番号１７〜３０、および配列番号３２〜４０からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含む組み換えフォリスタチンポリペプチドを提供する。
【００１２】
一態様では、本発明は、組み換えフォリスタチンポリペプチドおよびＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む組み換えフォリスタチン融合タンパク質を提供する。
【００１３】
一態様では、本発明は、フォリスタチンポリペプチドおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む組み換えフォリスタチン融合タンパク質を提供し、組み換えフォリスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列を含み、かつ配列番号２、配列番号４、または配列番号５の６６〜８８の位置に対応するアミノ酸は、配列番号４１、４２、４３または５８と同一である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と少なくとも９８％同一であるアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号５と１００％同一であるアミノ酸の配列を含む。
【００１４】
一態様では、本発明は、フォリスタチンポリペプチドおよびＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む組み換えフォリスタチン融合タンパク質を提供し、前記フォリスタチンポリペプチドは、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１５〜配列番号４０からなる群のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸の配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃドメインは１つのアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、ＥＵナンバリングに従い、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃドメインは配列番号６のアミノ酸の配列を含み、アミノ酸の配列は、ＥＵナンバリングに従い、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃドメインは、配列番号７〜配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。
【００１８】
一態様では、本発明は、配列番号７３〜配列番号１００のうちのいずれか１つのアミノ酸の配列を含む組み換えフォリスタチン融合タンパク質を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、１〜１００ｐＭの親和性解離定数（ＫＤ）でミオスタチンに結合する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、１〜１００ｐＭの親和性解離定数（ＫＤ）でアクチビンＡに結合する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、０．２ｎＭ〜２５ｎＭの範囲の骨形態形成タンパク質−９（ＢＭＰ−９）および／または骨形態形成タンパク質−１０（ＢＭＰ−１０）に結合しない。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、０．１〜２００ｎＭの親和性解離定数（ＫＤ）でヘパリンに結合する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、２５〜４００ｎＭの親和性解離定数（ＫＤ）でＦｃ受容体に結合する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、０．１〜１０ｎＭのＩＣ５０でミオスタチンを阻害する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、０．１〜１０ｎＭのＩＣ５０でアクチビンを阻害する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質融合タンパク質は、野生型フォリスタチンと比較して半減期の増加を有する。
【００２１】
一態様では、本発明は、組み換えフォリスタチン融合タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
一態様では、本発明は、組み換えフォリスタチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
一態様では、本発明は、組み換えフォリスタチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む。
【００２４】
一態様では、本発明は、宿主細胞を培養することによってミオスタチンおよびアクチビンＡに特異的に結合する組み換えフォリスタチン融合タンパク質を作製する方法を提供する。
【００２５】
一態様では、本発明は、組み換えフォリスタチンポリペプチドまたは組み換えフォリスタチン融合タンパク質を産生するハイブリドーマ細胞を提供する。
【００２６】
一態様では、本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法を提供し、方法は、ＤＭＤの少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度、もしくは頻度が低減するように、またはその開始が遅延するように、組み換えフォリスタチン融合タンパク質または組み換えフォリスタチン融合タンパク質を含む医薬組成物の有効量を、ＤＭＤに罹患している、またはＤＭＤに感受性がある対象者に投与することを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、方法は、対象者に１つ以上の追加的な治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加的な治療薬は、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその断片、エダサロネキセント、パムレブルマブプレドニゾン、デフラザコート、ＲＮＡ調節治療薬、エクソンスキッピング治療薬、および遺伝子治療からなる群から選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量を非経口的に投与する。いくつかの実施形態では、非経口的投与は、静脈内、皮内、髄腔内、吸入、経皮（局所的）、眼内、筋肉内、皮下、経粘膜投与、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非経口的投与は静脈内投与である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、静脈内投与で約１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、静脈内投与で約８ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、静脈内投与は月に１回行われる。いくつかの実施形態では、非経口投与は皮下投与である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、皮下投与で約２ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、皮下投与で約３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、皮下投与で約２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、皮下投与は、週に１回、週に２回、または週に３回行われる。いくつかの実施形態では、皮下投与は、週に１回行われる。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の投与は、用量に比例している。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の投与は、用量直線的である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、表１から選択される１つ以上の骨格筋に送達される。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の投与は、対照に対して筋肉量の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、筋肉は、表１から選択される１つ以上の骨格筋である。いくつかの実施形態では、筋肉は、横隔膜、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、腓腹筋、長指伸筋、腹直筋、四頭筋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、筋肉は腓腹筋である。いくつかの実施形態では、筋肉量の増加は、対照に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、または５００％の増加である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の投与は、筋肉再生、筋力の増加、柔軟性の増加、可動域の増加、スタミナの増加、易疲労性の低減、血流の増加、認知の改善、肺機能の改善、炎症の抑制、筋線維症の低減、筋壊死の低減、および／または体重の増加をもたらす。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＤＭＤの少なくとも１つの症状または特徴は、筋消耗、筋力低下、筋脆弱性、筋壊死、筋線維症、関節拘縮、骨格変形、心筋症、嚥下障害、腸・膀胱機能障害、筋虚血、認知機能障害、行動機能障害、社会化障害、脊柱側弯、および呼吸機能障害からなる群から選択される。
【００３２】
一態様では、本発明は、対象者内のミオスタチンおよび／またはアクチビンを阻害する方法を提供し、方法は対象者の筋肉に、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、静脈内投与で約１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、静脈内投与で約８ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、月に１回行われる。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、皮下投与で約２ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、皮下投与で約３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、皮下投与で約２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン融合タンパク質の有効量は、皮下投与で少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、皮下投与は、週に１回、週に２回、または週に３回行われる。いくつかの実施形態では、皮下投与は、週に１回行われる。
【００３３】
図面は、例示の目的のためのみのものであり、限定を目的としない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１はＦＳ３１５のタンパク質ドメイン構造を示す概略図である。ＦＳ３１５はＮ末端ドメイン（ＮＤ）、高い相同性を有する３つの連続的ＦＳドメイン（ＦＳＤ１、ＦＳＤ２、およびＦＳＤ３）、および強酸性Ｃ末端尾部（ＡＤ）から成る。ヘパリン結合部位（ＨＢＳ）はＦＳＤ１内に位置し、かつ２つの保存された塩基性ヘパリン結合コアモチーフが太字で示されている。３つの内因性Ｎ−結合型グリコシル化部位の定置は実線の三角形で示されている。
【図２】図２は、組み換えフォリスタチン構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースの機能的アッセイの結果を示す一連のグラフを示す。Ａ２０４横紋筋肉腫細胞におけるＳＭＡＤ２／３ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、ミオスタチンおよびアクチビンＡに対する阻害が調査された。図２のパネルＡは、代表的なＦＳ３１５−ｈＦｃバリアントに対するミオスタチンおよびアクチビンＡのＩＣ５０曲線を示す。単一、二重、および三重突然変異は機能的活性には影響を与えなかったが、ＨＢＳ  ｄｅｌ７５−８６バリアントは効力が大幅に低減していた。図２のパネルＢは、代表的なＦＳ３１５−ｈＦｃ高グリコシル化（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）バリアントに対するミオスタチンおよびアクチビンＡのＩＣ５０曲線を示す。３つの高グリコシル化バリアント、Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２Ｔ、Ｃ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ、およびＣ６６Ｓ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔは、効力の中等度の低減を有した。
【図３Ａ】図３Ａは、例示的な組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質または比較基準タンパク質であるＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃを投与されたＣＤ−１マウスにおける血清ＰＫプロファイルを図示する例示的な結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、例示的な組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質または比較基準タンパク質であるＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃを投与されたＣＤ−１マウスにおける血清ＰＫプロファイルを図示する例示的な結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、組み換えフォリスタチン構築物のヘパリン結合親和性がＰＫ特性と相関することを実証するグラフである。図４Ａに示すデータは、マウス（ｎ＝３）に対する各ヘパリン結合バリアントの１ｍｇ／ｋｇの単一の静脈内投与から得られた。図４Ａは、ＦＳ３１５−Ｆｃバリアントの１ｍｇ／ｋｇの単一の静脈内投与後の血漿中濃度対時間を示す。ＰＫプロファイルは、ヘパリン結合親和性の減少がＰＫ挙動の漸進的な改善と相関することを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、組み換えフォリスタチン構築物のヘパリン結合親和性がＰＫ特性と相関することを実証するグラフである。図４Ｂに示すデータは、マウス（ｎ＝３）に対する各ヘパリン結合バリアントの１ｍｇ／ｋｇの単一の静脈内投与から得られた。図４Ｂは、ＦＳ３１５−ｈＦｃバリアントのヘパリン結合親和性、およびそれらの血清クリアランスとの相関関係を示す。ヘパリン結合親和性の減少は、ｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスの減少をもたらす。
【図５Ａ】図５Ａは、高グリコシル化ＦＳバリアントならびに結果としてもたらされる分子量およびＰＩのシフトに関するゲルおよびグラフをそれぞれ示す。図５Ａは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された、低減したＦＳ３１５−ｈＦｃ高グリコシル化バリアントのクマシーブルー染色ゲルを示す。矢印は、高グリコシル化に起因するＭＷの明確なシフトを示すバリアントを示す。
【図５Ｂ】５Ｂは、高グリコシル化ＦＳバリアントならびに結果としてもたらされる分子量およびＰＩのシフトに関するゲルおよびグラフをそれぞれ示す。図５Ｂは、２つの代表的なバリアントに対するｃＩＥＦプロファイルを示すグラフを示す。高グリコシル化変異体Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２Ｔは、非高グリコシル化バリアントＫ８２Ｔと比較して明確な酸性シフトを示す。
【図６】図６は、ＦＳ３１５−ｈＦｃ高グリコシル化バリアントに対するプロファイルを示すグラフである。マウスに、静脈内投与（ｎ＝３／群）によって１ｍｇ／ｋｇのタンパク質の単回投与を行った。高グリコシル化バリアントＫ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２ＴおよびＣ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔは、非高グリコシル化バリアントＫ８２Ｔ、ならびに野生型よりもｐＰＫプロファイルの著しい改善を有した。
【図７】図７は、野生型マウスの握力と比較した、ＰＢＳ溶媒、１０ｍｇ／ｋｇのＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃ、または３ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃで治療されたｍｄｘマウスの前肢の握力を示すグラフである。前肢の握力は投与から１１週間後に測定した。データは、溶媒単独で治療されたマウスの握力と比較して、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃで治療されたｍｄｘマウスの前肢の握力が有意に増加したことを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ＦＳ３１５−ｈＦｃヘパリン結合バリアントに対するヘパリン結合領域内の配列を示す。野生型、コアＨＢＳ置換バリアントΔＨＢＳ、コアＨＢＳ欠失バリアントｄｅｌ７５−８６、および２つの塩基性ＢＢＸＢモチーフにおいて点突然変異を有する一連のバリアントに対するヘパリン結合領域における残基７３〜８８の配列を表にリストする。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＦＳ３１５−ｈＦｃ高グリコシル化バリアントに対するヘパリン結合領域内の配列を示す。１つまたは２つのコンセンサスＮ−グリコシル化部位（ＮＸＴ／Ｓ）を作り出す高グリコシル化バリアントの残基６６〜８８の配列を表にリストする。コアヘパリン結合配列は斜体で示されている。突然変異した残基は太字で示され、また作り出された新しいＮ−グリコシル化部位は下線付きで示されている。
【図９−１】図９−１のパネルＡ〜Ｄは、４週間のＣ５７ＢＬ／６マウス研究からの体重、筋肉重量、血清薬物濃度、および形態計測分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図９−１のパネルＡは、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの投与からの体重を示すグラフである。図９−１のパネルＢは、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの投与からの筋肉重量を示すグラフである。図９−１のパネルＣは、投与直前に採取した血清試料からのＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ濃度を示すグラフである。図９−１のパネルＤは、ＦＳ−ＥＥＥ−ｈＦｃの投与から２８日目における体重変化を示すグラフである。
【図９−２】図９−２のパネルＥは、４週間のＣ５７ＢＬ／６マウス研究からの体重、筋肉重量、血清薬物濃度、および形態計測分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図９−２のパネルＥは、ＦＳ−ＥＥＥ−ｈＦｃの投与からの筋肉重量を示すグラフである。
【図９−３】図９−３のパネルＦ〜Ｇは、４週間のＣ５７ＢＬ／６マウス研究からの体重、筋肉重量、血清薬物濃度、および形態計測分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図９−３のパネルＦは、四頭筋のＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅ（登録商標）４８８  ＷＧＡ染色による四頭筋形態計測分析を示す一連の顕微鏡写真である。図９−３のパネルＧは、筋線維直径のヒストグラムを示すグラフである。＊溶媒投与群と比較してｐ＜０．０５。
【図１０−１】図１０−１のパネルＡ〜Ｄは、ｍｄｘ四頭筋の免疫組織化学染色およびｑＰＣＲ分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図１０−１のパネルＡは、溶媒対照からの不均質壊死区域を示すマウスＩｇＧ陽性染色の代表的な画像を示し、図１０−１のパネルＢは、すべての用量群のスライド画像解析全体を示すグラフである。図１０−１のパネルＣは、溶媒対照からのマクロファージ浸潤に対するＣＤ６８陽性染色の代表的な画像を示し、図１０−１のパネルＤは、全体スライド画像解析を示すグラフである。
【図１０−２】図１０のパネルＥ〜Ｇは、ｍｄｘ四頭筋の免疫組織化学染色およびｑＰＣＲ分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図１０−２のパネルＥは、線維症のコラーゲンＩ陽性染色を示す一連の顕微鏡写真である：（左）溶媒対照、および（右）３０ｍｇ／ｋｇ  ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ。図１０−２のパネルＦは、コラーゲンＩの全体画像解析を示すグラフである。図１０−２のパネルＧは、線維症および炎症マーカーのｑＰＣＲを示すグラフである。
【図１１−１】図１１−１のパネルＡ〜Ｅは、１２週間の運動をしなかったｍｄｘ研究からの体重、筋肉重量、筋繊維サイズ、握力、および血清バイオマーカーを示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図１１−１のパネルＡは、体重を示すグラフである。図１１−１のパネルＢは、筋肉重量を示すグラフである。図１１−１のパネルＣは、四頭筋の大腿直筋区域を示すグラフである。図１１−１のパネルＤは、四頭筋のＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８  ＷＧＡ染色を示す、溶媒群からの例の顕微鏡写真である。図１１−１のパネルＥは、筋線維直径サイズ分布の四頭筋形態計測分析ヒストグラムを示すグラフである。
【図１１−２】図１１−２のパネルＦ〜Ｇは、１２週間の運動をしなかったｍｄｘ研究からの体重、筋肉重量、筋繊維サイズ、握力、および血清バイオマーカーを示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図１１−２のパネルＦは、前肢の握力を示すグラフである：（左）絶対値および（右）体重に対して正規化。図１１−２のパネル（Ｇ）は、血清バイオマーカー（左）クレアチンキナーゼ、（中央）骨格トロポニン１、（右）心筋トロポニン１を示すグラフである。＊＝ｐ＜０．０５  ｍｄｘ溶媒投与群と比較。
【図１２−１】図１２−１のパネルＡ〜Ｃは、ｍｄｘ横隔膜の免疫組織化学染色およびｑＰＣＲ分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図１２−１のパネルＡは、ＣＤ６８陽性染色の画像解析を示すグラフである。図１２−１のパネルＢは、コラーゲンＩ陽性染色の画像解析を示すグラフである。図１２−１のパネルＣは、コラーゲンＩ染色された横隔膜の代表的な拡大画像を示顕微鏡写真である：（左）溶媒対照および（右）３０ｍｇ／ｋｇのＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ。
【図１２−２】図１２−２のパネルＤは、ｍｄｘ横隔膜の免疫組織化学染色およびｑＰＣＲ分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図１２−２のパネルＤは、ｑＰＣＲ炎症および線維症マーカーを示すグラフである。＊＝ｐ＜０．０５  ｍｄｘ溶媒投与群と比較。
【図１３−１】図１３−１のパネルＡ〜Ｃは、１２週間の運動をしたｍｄｘ試験からの、体重、組織重量、機能的測定値、行動測定値、および１血清分析を示す一連のグラフである。図１３−１のパネル（Ａ）は体重を表し、（Ｂ）は筋肉重量を示し、（Ｃ）は臓器重量を示す。
【図１３−２】図１３−２のパネルＤ〜Ｆは、１２週間の運動をしたｍｄｘ試験からの、体重、組織重量、機能的測定値、行動測定値、および１血清分析を示す一連のグラフである。図１３−２のパネルＤは、前肢の握力（上）および体重に対して正規化された値（下）を示す。図１３−２のパネルＥは、ＥＤＬ筋肉（上）および断面積に対して正規化された（下）ｅｘ  ｖｉｖｏ力を示す。図１３−２のパネルＦは、強制トレッドミル距離（上）および体重に対して正規化された値（下）を示す。
【図１３−３】図１３−３のパネルＧ〜Ｈは、１２週間の運動をしたｍｄｘ試験からの、体重、組織重量、機能的測定値、行動測定値、および１血清分析を示す一連のグラフである。図１３−３のパネル（Ｇ）は、５６日目にサンプリングされた血清クレアチンキナーゼ測定値を示し、（Ｈ）は血清薬物濃度を示す。＊＝ｐ＜０．０５  記載のようにｍｄｘ溶媒投与群と比較。
【図１４−１】図１４−１のパネルＡ〜Ｃは、１２週間の運動をしたｍｄｘ研究からの四頭筋組織分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図１４−１のパネルＡ〜Ｃは、（上）溶媒対照および（中央）３０ｍｇ／ｋｇ  ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃからの代表的な画像、ならびに（下）パネル（Ａ）壊死に対するマウスＩｇＧ陽性染色、パネル（Ｂ）マクロファージ浸潤に対するＣＤ６８陽性染色、およびパネル（Ｃ）線維症に対するコラーゲンＩ陽性染色に関する全体スライド画像解析である。
【図１４−２】図１４−２のパネルＤは、１２週間の運動をしたｍｄｘ研究からの四頭筋組織分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図１４−２のパネルＤは、炎症および線維症マーカーのｑＰＣＲを示す。＊＝ｐ＜０．０５  ｍｄｘ溶媒投与群と比較。
【図１５−１】図１５−１のパネルＡ〜Ｃは、１２週間の運動をしたｍｄｘ試験からの横隔膜組織分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。パネルＡ〜Ｃは、（上）溶媒対照および（中央）３０ｍｇ／ｋｇ  ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃからの代表的な画像、ならびに（下）パネル（Ａ）壊死に対するマウスＩｇＧ陽性染色、パネル（Ｂ）マクロファージ浸潤に対するＣＤ６８陽性染色、およびパネル（Ｃ）線維症に対するコラーゲンＩ陽性染色に関する全体スライド画像解析を示す。
【図１５−２】図１５−２のパネルＤは、１２週間の運動をしたｍｄｘ試験からの横隔膜組織分析を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。パネル（Ｄ）は、炎症および線維症マーカーのｑＰＣＲを示す。＊＝ｐ＜０．０５  ｍｄｘ溶媒投与群と比較。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
本発明がより容易に理解されるように、最初にいくつかの用語を以下に定義する。以下の用語およびその他の用語に対するさらなる定義は、本明細書全体を通して説明される。
【００３６】
親和性：当技術分野で公知のように、「親和性」は、特定のリガンドがそのパートナーと結合する堅固さの尺度である。いくつかの実施形態では、リガンドまたはパートナーは、組み換えフォリスタチンポリペプチドである。いくつかの実施形態では、リガンドまたはパートナーは、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質である。親和性は、異なる方法で測定することができる。いくつかの実施形態では、親和性は、定量的アッセイによって測定される。いくつかのこうした実施形態では、結合パートナー濃度は、生理学的条件を模倣するために、リガンド濃度を超えるように固定されてもよい。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、結合パートナー濃度および／またはリガンド濃度は変化し得る。いくつかのこうした実施形態では、親和性は、同等の条件（例えば、濃度）下で参照と比較されてもよい。
【００３７】
改善：本明細書で使用される場合、「改善」という用語は、状態の予防、低減もしくは緩和、または対象者の状態の改善を意味する。改善には、病状の完全な回復または完全な防止が含まれるが、これを必要とはしない。
【００３８】
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達段階のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達段階のヒト以外の動物を指す。ある特定の実施形態では、ヒト以外の動物は哺乳類（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物としては哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚、昆虫および／または虫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、遺伝子導入動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであってもよい。
【００３９】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、１つ以上の目的の値に適用される場合、「およそ」または「約」という用語は、定められた参照値と類似の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の定めのない限りまたは文脈からそうでないことが明らかでない限り（こうした数字が可能な値の１００％を超えることになる場合を除く）を除いて、定められた参照値のいずれかの方向（それより大きい、または小さい）に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に収まる値の範囲を指す。
【００４０】
関連付けられる：この用語が本明細書で使用される場合、２つの事象または実体は、一方の存在、レベル、および／または形態がもう一方のものに相関する場合、互いに「関連付けられる」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド）は、その存在、レベル、および／または形態が（例えば、関連性のある集団にわたって）疾患、障害、または病状の発生率および／または感受性と相関する場合、特定の疾患、障害、または病状と関連付けられたと見なされる。いくつかの実施形態では、２つ以上の実体は、それらが相互に物理的近接の状態にあり、かつその状態を保持するように、それらが直接的または間接的に相互作用する場合、相互に物理的に「関連付けられる」。いくつかの実施形態では、相互に物理的に関連付けられている２つ以上の実体は、相互に共有結合しており、いくつかの実施形態では、相互に物理的に関連付けられている２つ以上の実体は、相互に共有結合されていないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気、およびそれらの組み合わせによって非共有的に関連付けられる。
【００４１】
バイオアベイラビリティ：本明細書で使用される場合、「バイオアベイラビリティ」という用語は、対象者の血流に達する投与用量の割合を一般的に指す。
【００４２】
生物学的活性：本明細書で使用される場合、「生物学的活性」という語句は、生体系、特に生命体において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、ある生命体に投与された時、その生命体に生物学的効果を有する薬剤は生物学的活性であると見なされる。特定の実施形態では、ペプチドが生物学的活性である場合、ペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのペプチドの一部分は、典型的には「生物学的活性」部分と呼ばれる。
【００４３】
心筋：本明細書で使用される場合、「心筋（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ）」という用語は、心臓の壁に見られる不随意な横紋筋の１つのタイプ、特に心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）を指す。
【００４４】
担体または希釈剤：本明細書で使用される場合、「担体」および「希釈剤」という用語は、医薬製剤の調製に有用な薬学的に許容可能な（例えば、ヒトへの投与のための安全かつ非毒性）担体または希釈物質を指す。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液が挙げられる。
【００４５】
剤形：本明細書で使用される場合、「剤形」および「単位剤形」という用語は、治療される患者のための治療用タンパク質（例えば、組み換えフォリスタチンポリペプチドまたは組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質）の物理的に個別の単位を指す。各単位は、望ましい治療効果を産生するよう計算された所定の量の活性物質を含有する。しかしながら、組成物の総投与量は、担当医によって健全な医学的判断の範囲内で決定することが理解されるであろう。
【００４６】
フォリスタチンまたは組み換えフォリスタチン：本明細書で使用される場合、「フォリスタチン（ＦＳ）」または「組み換えフォリスタチン」という用語は、別段の指定がない限り、実質的なフォリスタチン生物学的活性を保持する任意の野生型または修飾フォリスタチンタンパク質またはポリペプチド（例えば、アミノ酸突然変異、欠失、挿入、および／または融合タンパク質を有するフォリスタチンタンパク質）を指す。
【００４７】
Ｆｃ領域：本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、２つの「Ｆｃポリペプチド」の二量体を指し、各「Ｆｃポリペプチド」は、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除外した抗体の定常領域を含む。いくつかの実施形態では、「Ｆｃ領域」は、１つ以上のジスルフィド結合、化学リンカー、またはペプチドリンカーによって連結された２つのＦｃポリペプチドを含む。「Ｆｃポリペプチド」とは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、これらのドメインに対する柔軟なヒンジＮ末端の一部またはすべても含み得る。ＩｇＧについては、「Ｆｃポリペプチド」は免疫グロブリンドメインＣｇａｍｍａ２（Ｃγ２）およびＣｇａｍｍａ３（Ｃγ３）ならびにＣｇａｍｍａ１（Ｃγ１）とＣγ２との間のヒンジの下部を含む。Ｆｃポリペプチドの境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃポリペプチドは通常、Ｔ２２３またはＣ２２６またはＰ２３０で始まる残基をカルボキシル末端に含むように定義されているが、ナンバリングはＫａｂａｔら（１９９１，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ）のＥＵインデックスに従っている。ＩｇＡについては、Ｆｃポリペプチドは免疫グロブリンドメインＣａｌｐｈａ２（Ｃα２）およびＣａｌｐｈａ３（Ｃα３）ならびにＣａｌｐｈａ１（Ｃα１）とＣα２との間のヒンジの下部を含む。Ｆｃ領域は、合成とする、組み換えとする、またはＩＶＩＧなどの天然源から生成することができる。
【００４８】
機能的均等物または誘導体：本明細書で使用される場合、「機能的均等物」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸の配列の機能的誘導体の文脈で、元の配列と実質的に類似した生物学的活性（機能または構造のいずれか）を保持する分子を示す。機能的誘導体または均等物は、天然誘導体であってもよく、または合成的に調製されてもよい。例示的な機能的誘導体としては、タンパク質の生物学的活性が保存される限り、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または追加を有するアミノ酸の配列が挙げられる。置換するアミノ酸は、置換されたアミノ酸と類似した物理化学的特性を持つことが望ましい。望ましい類似の物理化学的特性には、電荷、嵩高性、疎水性、親水性などの類似点が含まれる。
【００４９】
融合タンパク質：本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」という用語は、元は別個の２つ以上のタンパク質またはその部分の結合を通して生成されるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、各タンパク質の間に存在することになる。融合タンパク質の非限定的な例は、Ｆｃ融合タンパク質である。融合タンパク質の非限定的な例は、フォリスタチンＦｃ融合タンパク質である。
【００５０】
半減期：本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、タンパク質濃度または活性などの量が、期間の開始時に測定されたその値の半分に低減するために必要とされる時間である。
【００５１】
肥大：本明細書で使用される場合、「肥大」という用語は、その構成要素細胞の拡大に起因する器官または組織の体積の増加を指す。
【００５２】
改善、増加、または低減：本明細書で使用される場合、「改善」、「増加」、もしくは「低減」または文法的均等物は、本明細書に記載の治療の開始前の同一人物の測定値、または本明細書に記載の治療が欠如した対照対象者（または複数の対照対象者）の測定値など、ベースライン測定値に対する値を示す。「対照対象者」は、治療される対象者と同じ形態の疾患を罹患しており、治療される対象者とほぼ同じ年齢の対象者である。
【００５３】
阻害：本明細書で使用される場合、「阻害」、「阻害する」、および「阻害性」という用語は、目的のタンパク質または遺伝子の活性および／または発現を減少または低減するプロセスまたは方法を指す。典型的には、タンパク質または遺伝子を阻害することは、本明細書に記載の、または当技術分野で認識された１つ以上の方法で測定したタンパク質または遺伝子の発現または関連する活性を、例えば、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上など、１０％以上低減させること、または発現または関連する活性の１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍を超えるまたはそれ以上の低減を指す。
【００５４】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、例えば、多細胞生命体の中ではなく、試験管または反応容器内、細胞培養内など、人工環境で生じる事象を指す。
【００５５】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、ヒトおよびヒト以外の動物などの多細胞生命体の中で生じる事象を指す。細胞ベースの系の文脈では、この用語は、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系とは対照的に）生きた細胞の中で生じる事象を指すために使用される場合がある。
【００５６】
ＫＤ：本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は解離定数を指すことが意図され、これはＫＤのＫａに対する比率（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、そしてモル濃度（Ｍ）として発現される。リガンドに対するＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。リガンドのＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによって、好ましくはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することである。
【００５７】
リンカー：本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、融合タンパク質では、天然タンパク質の特定の位置に現れるもの以外のアミノ酸の配列を指し、一般的には柔軟になるように、または２つのタンパク質部分の間にαヘリックスなどの構造を挟むように設計されている。リンカーはスペーサーとも呼ばれる。リンカーまたはスペーサーは典型的には、それ自体では生物学的機能を有しない。
【００５８】
薬学的に許容可能な：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触する使用に好適であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症を起こさず、妥当な利益／リスク比と釣り合った物質を指す。
【００５９】
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して一緒に連結されたアミノ酸の連続鎖を指す。本用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者であれば、この用語が長い鎖に限定されず、かつペプチド結合を介して連結された２つのアミノ酸を含む最小鎖を指すことができることを理解するであろう。当業者に知られているように、ポリペプチドは処理および／または修飾されてもよい。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は交換的に使用される。
【００６０】
防止：本明細書で使用される場合、疾患、障害、および／または病状の発生に関連して使用される場合、「防止」または「予防」という用語は、疾患、障害、および／または病状を発症するリスクの低減を指す。「リスク」の定義を参照のこと。
【００６１】
タンパク質：本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、個別ユニットとして機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが個別機能ユニットであり、かつ個別機能ユニットを形成するために他のポリペプチドと永久的または一時的な物理的関連を必要としない場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に使用され得る。個別の機能的ユニットが、相互に物理的に関連付けられた２つ以上のポリペプチドから成る場合、「タンパク質」という用語は、物理的に連結されており、かつ個別ユニットとして一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。
【００６２】
リスク：文脈から理解されるように、疾患、障害、および／または病状の「リスク」は、特定の個人が疾患、障害、および／または病状（例えば、筋ジストロフィー）を発症する可能性を含む。いくつかの実施形態では、リスクは割合で表現される。いくつかの実施形態では、リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および最大１００％である。いくつかの実施形態ではリスクは、参照試料または参照試料群に関連するリスクに対するリスクとして表現される。いくつかの実施形態では、参照試料または参照試料群は、疾患、障害、病状および／または事象（例えば、筋ジストロフィー）の公知のリスクを有する。いくつかの実施形態では、参照試料または参照試料群は、特定の個人と同等の複数の個人からのものである。いくつかの実施形態では、相対的リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である。
【００６３】
横紋筋：本明細書で使用される場合、「横紋筋」という用語は、細胞内収縮単位サルコメアの規則的配置を有し、顕微鏡を使用した横紋の外観をもたらし、かつ随意的制御下にある多核筋組織を意味する。典型的には、横紋筋は、心筋、骨格筋、および鰓節筋であり得る。
【００６４】
平滑筋：本明細書で使用される場合、「平滑筋」という用語は、単一筋および多元筋を含む不随意制御される非横紋筋を意味する。
【００６５】
対象者：本明細書で使用される場合、「対象者」という用語は、ヒトまたは任意のヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトは、出生前および出生後の形態を含む。多くの実施形態では、対象者はヒトである。対象者は患者である可能性があり、これは疾患の診断または治療のために医療提供者の元を訪れたヒトを指す。「対象者」という用語は、本明細書では「個人」または「患者」と互換的に使用される。対象者は、疾患もしくは障害に罹患しているか、または感受性がある可能性があるが、その疾患または障害の症状を呈する場合もあり、または呈さない場合もある。
【００６６】
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または性状を完全またはほぼ完全な範囲または程度示している定性的状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的現象は、あったとしても完了する、および／または完全に進むまたは絶対的結果を達成または避けることは稀であることを理解するであろう。したがって「実質的に」という用語は本明細書では、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如をとらえるために使用される。
【００６７】
実質的相同性：本明細書では「実質的な相同性」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者であれば理解するように、２つの配列はそれらが対応する位置に相同な残基を含む場合、「実質的に相同」であると一般的に見なされる。相同な残基は同一の残基であってもよい。代替的に、相同な残基は、適切に類似の構造および／または機能的特徴を有する非同一残基であってもよい。例えば、当業者には周知のように、ある特定のアミノ酸は典型的には「疎水性」もしくは「親水性」アミノ酸であるとして、かつ／または「極性」もしくは「非極性」側鎖を持つとして一般的に分類される。同じタイプの別のアミノ酸に対する一つのアミノ酸の置換は、「相同」置換としばしば見なされる場合がある。
【００６８】
当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ならびにアミノ酸の配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで入手可能なものを含む、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較され得る。例示的なこうしたプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に説明されている。相同配列を特定することに加えて、上述のプログラムは相同性の程度の指標を典型的に提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、残基の関連するひと続きに渡って、その対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が相同の場合、実質的に相同であると見なされる。いくつかの実施形態では、関連するひと続きは完全配列である。いくつかの実施形態では、関連するひと続きは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、４５０、４７５、５００またはそれ以上の残基である。
【００６９】
実質的に同一：本明細書では「実質的に同一」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者であれば理解するように、２つの配列はそれらが対応する位置に同一な残基を含む場合、「実質的に同一」であると一般的に見なされる。当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ならびにアミノ酸の配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで入手可能なものを含む、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較され得る。例示的なこうしたプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；、およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に説明される。同一の配列を特定することに加えて、上述のプログラムは同一性の程度の指標を典型的に提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、残基の関連するひと続きに渡って、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が同一である場合、実質的に同一であると見なされる。いくつかの実施形態では、関連するひと続きは完全配列である。いくつかの実施形態では、関連するひと続きは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、４５０、４７５、５００またはそれ以上の残基である。
【００７０】
表面プラズモン共鳴：本明細書で使用される場合、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、スウェーデン、ウパサラ、およびニュージャージー州、ピスカタウェイ）を使用することによるなどの、例えば、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化の検出を通して、特定の結合相互作用の分析をリアルタイムで可能にする光学現象を指す。詳しくは、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１、およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８：２６８−２７７を参照。
【００７１】
罹患している：疾患、障害、および／または病状に「罹患している（患う）」個人は、その疾患、障害、および／または病状を有すると診断されたか、またはそれらの１つ以上の症状を示す。
【００７２】
感受性がある：疾患、障害、および／または病状の「感受性がある」個人は、その疾患、障害、および／または病状を有すると診断されてはいない。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病状の感受性がある個人は、その疾患、障害、および／または病状の症状を示さない場合がある。いくつかの実施形態では、疾患、障害、病状、または事象（例えば、ＤＭＤ）に感受性がある個人は、以下の１つ以上により特徴付けられる場合がある：（１）疾患、障害、および／または病状の発症と関連する遺伝的突然変異、（２）疾患、障害、および／または病状の発症と関連する遺伝子多型、（３）疾患、障害、および／または病状と関連するタンパク質の発現および／または活性の増加および／または減少、（４）疾患、障害、病状および／または事象の発症と関連する習慣および／またはライフスタイル、（５）移植を受けた、移植を受けることを計画している、または移植を必要としていること。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病状の感受性がある個人は、その疾患、障害、および／または症状を発症するであろう。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病状の感受性がある個人は、その疾患、障害、および／または病状を発症しないであろう。
【００７３】
標的組織：本明細書で使用される場合、「標的組織」という用語は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）などの治療される疾患によって影響を受ける任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織としては、疾患関連病理、症状、または特徴を示す組織（筋消耗、骨格変形、心筋症、および呼吸機能障害を含むがこれに限定されない）が挙げられる。
【００７４】
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療薬の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、および／または病状の症状の開始を治療、診断、防止、および／または遅延するために、疾患、障害、および／もしくは病状に罹患している対象者、また感受性がある対象者に投与されたとき十分な量を意味する。当業者であれば、治療有効量は典型的には、少なくとも１単位用量を含む投与レジメンにより投与されることを理解するであろう。
【００７５】
治療：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害、および／または病状の１つ以上の症状または特徴を部分的もしくは完全に緩和する、改善する、解放する、抑制する、防止する、開始を遅延する、重症度を低減する、かつ／または発生率を低減させるために使用する任意の方法を指す。治療は、疾患に関連する病理の発症のリスクを減らす目的で、疾患の兆候を呈しない、および／または疾患の早期の兆候のみを呈する対象者に投与する場合もある。
【００７６】
ある特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、数ある中でも、タンパク質治療薬としてのフォリスタチンに基づく、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）および／またはベッカー型筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィーを治療するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＭＤの少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度、もしくは頻度が低減するように、または開始が遅延するように、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換え組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の有効量を、ＤＭＤに罹患している、またはＤＭＤに感受性がある個人に投与することを含む、ＤＭＤの治療方法を提供する。
【００７７】
本発明の様々な態様が以下のセクションに詳細に説明される。セクションの使用は本発明を限定することを意図しない。各セクションは本発明の任意の態様に適用することができる。本明細書では、別段の定めのない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。
【００７８】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）
ＤＭＤは、身体全体を通した筋肉の進行性の劣化および筋肉関連機能の喪失によって特徴付けされる疾患である。本発明は、筋肉再生のためならびに、様々な筋組織におけるＤＭＤおよびその他の筋ジストロフィーに関連する線維症、炎症およびその他の症状もしくは特徴を治療するための方法および組成物を提供すると考えられる。いくつかの実施形態では、提供される方法および組成物の対象者における使用は、その対象者内の線維症および／または壊死の減少をもたらす。
【００７９】
筋組織
動物には、横紋筋および平滑筋という２つの主なタイプの筋組織がある。本明細書で使用される場合、「横紋筋」という用語は、反復サルコメアを含有する筋組織を指す。横紋筋は随意的制御下にあり、骨格に結合している傾向があるが、例えば、横紋筋のいくつかの特性を有するが随意的制御下にはない心筋など、いくつかの例外がある。一般的に、横紋筋は身体の随意的な動きを可能にし、また四頭筋、腓腹筋、二頭筋、三頭筋、僧帽筋、三角筋、および多くの他のものなどが挙げられる主要な筋肉群を含む。横紋筋は非常に長い傾向があり、多くの横紋筋は独立して機能することができる。しかしながら、いくつかの横紋筋は、口腔、肛門、心臓、および食道の上部部分のものを含め、骨格に結合していない。
【００８０】
一方、平滑筋は非常に異なる構造を有する。別個の骨格結合を有する一連の長い筋肉ではなく、平滑筋は、平滑筋細胞間に機械的連結を有する連続的なシートへと構成される傾向がある。平滑筋はしばしば中空器官の壁に位置し、また通常は随意的制御下にはない。特定の器官をライニングする平滑筋は、同時に同じ負荷および収縮に耐えなければならない。平滑筋機能は、動きおよび／または姿勢もしくは圧力の変化によって引き起こされる中空器官上の負荷の変化を少なくとも部分的に取り扱うために機能する。この二重の役割は、平滑筋が横紋筋のように収縮できるだけでなく、持続的な負荷に対して器官の寸法を維持するように緊張的に収縮できなければならないことを意味する。平滑筋の例としては、血管、膀胱、直腸などの胃腸管をライニングするものが挙げられる。
【００８１】
筋肉の強度は、筋肉細胞の数およびサイズならびにその解剖学的配置に依存する。既存の筋原線維のサイズの増加（肥大）および／またはより多くの筋細胞の形成（過形成）によって筋繊維の直径が増加すると、筋肉の力発生能力が増加する。
【００８２】
筋肉もまた場所または機能によってグループ化され得る。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質は、顔の１つ以上の筋肉、咀嚼のための１つ以上の筋肉、舌および首の１つ以上の筋肉、胸部の１つ以上の筋肉、上肢帯および腕の１つ以上の筋肉、腕および肩の１つ以上の筋肉、１つ以上の腹側および背側の前腕筋、手の１つ以上の筋肉、脊柱起立筋の１つ以上の筋肉、下肢帯および脚の１つ以上の筋肉、および／または前脚および足の１つ以上の筋肉を標的とする。
【００８３】
いくつかの実施形態では、顔の筋肉としては、毛様体筋、瞳孔散大筋、虹彩括約筋などの内眼筋、耳介筋、側頭頭頂筋、アブミ骨筋、鼓膜張筋などの耳の筋肉、鼻根筋、鼻筋、鼻孔開大筋、鼻中隔下制筋、上唇鼻翼挙筋などの鼻の筋肉、口角挙筋、口角下制筋、口輪筋、頬筋、大頬骨筋および小頬骨筋、広頚筋、上唇挙筋、下唇下制筋、笑筋、オトガイ筋などの口の筋肉、および／または皺眉筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
いくつかの実施形態では、咀嚼筋肉としては、咬筋、側頭筋、内側翼突筋、外側翼突筋が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、舌および首の筋肉としては、オトガイ舌筋、茎突舌筋、口蓋舌筋、舌骨舌筋、顎二腹筋、茎突舌骨筋、顎舌骨筋、オトガイ舌骨筋、肩甲舌骨筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、甲状舌骨筋、胸鎖乳突筋、前斜角筋、中斜角筋、および／または後斜角筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
いくつかの実施形態では、胸部、上肢帯、および腕の筋肉としては、鎖骨下筋、大胸筋、小胸筋、腹直筋、外腹斜筋、内腹斜筋、腹横筋、横隔膜、外肋間筋、内肋間筋、前鋸筋、僧帽筋、肩甲挙筋、大菱形筋、小菱形筋、広背筋、三角筋、肩甲下筋、棘上筋、棘下筋、大円筋、小円筋、および／または烏口腕筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、腕および肩の筋肉としては、上腕二頭筋長頭、上腕二頭筋短頭、上腕三頭筋長頭、上腕三頭筋外側頭、上腕三頭筋内側頭、肘筋、円回内筋、回外筋、および／または上腕筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、腹側および背側前腕の筋肉としては、腕橈骨筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、長掌筋、尺側手根伸筋、長橈側手根伸筋、短橈側手根伸筋、指伸筋、小指伸筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
いくつかの実施形態では、手の筋肉としては、母指球筋、短母指外転筋、短母指屈筋、母指対立筋、小指球筋、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、掌側骨間筋、背側骨間筋および／または中様筋などの手の内在筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
いくつかの実施形態では、脊柱起立筋の筋肉としては、頸部筋、棘筋、最長筋、および／または腸肋筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、下肢帯および脚の筋肉としては、大腰筋、腸骨筋、足底方形筋、長内転筋、短内転筋、大内転筋、薄筋、縫工筋、大腿直筋などの大腿四頭筋、外側広筋、内側広筋、中間広筋、腓腹筋、長腓骨筋、ヒラメ筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、ハムストリング：大腿二頭筋：長頭、ハムストリング：大腿二頭筋：短頭、ハムストリング：半腱様筋、ハムストリング：半膜様筋、大腿筋膜張筋、恥骨筋、および／または前脛骨筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
いくつかの実施形態では、前肢および足の筋肉としては、長指伸筋、長母趾伸筋、短腓骨筋、足底筋、後脛骨筋、長母指屈筋、短指伸筋、短母指伸筋、母趾外転筋、短母指屈筋、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、短指伸筋、足の虫様筋、足底方形筋または副趾屈筋、短指屈筋、背側骨間筋、および／または底側骨間筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
例示的な筋肉標的を表１に要約する。
【表１−１】
2020519291.tif 000002
【表１−２】
2020519291.tif 000003
【００９３】
筋ジストロフィー
筋ジストロフィーは、筋肉の変性を引き起こし、動きの減弱および障害をもたらす一群の遺伝性障害である。すべての筋ジストロフィーの中心的な特徴は、進行性の性質であることである。筋ジストロフィーには、以下が含まれるがこれらに限定されない：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、および先天型の筋強直性ジストロフィー１型を含む筋強直性ジストロフィー１型および２型。症状は筋ジストロフィーの種類によって異なる場合があり、一部または全ての筋肉が影響を受ける。筋ジストロフィーの例示的な症状としては、筋運動能力の発達遅延、１つ以上の筋肉群の使用の困難、嚥下、会話、および摂食困難、流涎、眼瞼下垂、頻繁な転倒、成人としての筋肉または筋肉群の強度低下、筋肉サイズの喪失、身体のバイオメカニクスの弱化または変化による歩行障害、筋肥大、筋肉の偽性肥大、筋肉の脂肪浸潤、筋肉の非収縮性組織での置換（例えば、筋線維症）、筋壊死、および／または認知もしくは行動障害／精神遅滞が挙げられる。
【００９４】
筋ジストロフィーには公知の治療法はないが、対症療法および疾患修飾療法の両方を含むいくつかの補助的治療が使用されている。コルチコステロイド、理学療法、矯正具、車椅子、またはＡＤＬおよび肺機能のためのその他の支援医療用具が、筋ジストロフィーでは一般的に使用される。筋強直性ジストロフィーにおける心不整脈からの突然死を防止するために、心臓ペースメーカーが使用される。筋強直症（弛緩不能）の症状を改善する抗筋強直剤には、メキシリチン、および一部の事例ではフェニトイン、プロカインアミドおよびキニンが含まれる。
【００９５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、筋ジストロフィーの劣性Ｘ連鎖形態であり、筋変性および最終的な死をもたらす。ＤＭＤは、近位筋の弱化、異常な歩行、腓腹筋（ふくらはぎ）の筋肉の偽性肥大、およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の上昇を特徴とする。多くのＤＭＤ患者は、典型的に症状／兆候がより明らかになる、５歳頃に診断される。罹患者は典型的には、年齢１０〜１３歳頃に歩けなくなり、心肺機能不全のために２０代半ばから後半までに死亡する。
【００９６】
ＤＭＤ障害は、ヒトＸ染色体上に位置するジストロフィン遺伝子の突然変異によって引き起こされ、これは細胞膜のジストログリカン複合体（ＤＧＣ）に構造的安定性を提供する筋組織内の重要な構造構成要素であるタンパク質ジストロフィンをコード化する。ジストロフィンは、内部細胞質アクチンフィラメントネットワークおよび細胞外基質を連結し、筋繊維に物理的強度を提供する。したがって、ジストロフィンの改変または欠如は、異常な筋線維膜断裂および筋繊維の壊死をもたらす。男女の両方が突然変異を持つことができるが、女性が本疾患の重度の兆候を呈することは稀である。
【００９７】
ＤＭＤの主な症状は、筋消耗と関連する筋力低下であり、典型的には随意筋が最初に罹患し、特に臀部、骨盤領域、大腿、肩、およびふくらはぎの筋肉に影響を及ぼす。筋力低下は、腕、首、およびその他の領域でも生じる。ふくらはぎはしばしば場合、拡大する。兆候および症状は通常６歳前に現れ、乳児期に現れる場合もある。その他の身体症状としては、独立歩行能力の遅延化、歩行、足ふみ、または走ることが進行的に困難となり、最終的には、（通常は１５歳までに）歩くことができなくなる；頻繁な転倒；疲労；運動スキル（走る、跳び歩く、ジャンプ）の困難；股関節屈筋の短縮につながる腰椎前彎の増加；筋繊維が短縮し、線維症が結合組織で起こることによりアキレス腱およびハムストリングの拘縮が機能を障害；筋繊維変形；脂肪および結合組織による筋組織の置換によって起こる舌およびふくらはぎの筋肉の偽性肥大（拡大）；神経行動学的障害（例えば、ＡＤＨＤ）、学習障害（ディスレクシア）、および特定の認知スキル（特に短期言語記憶）の非進行的低下のリスクがより高くなる；骨格変形（一部の事例では、脊柱側弯を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
組み換えフォリスタチンタンパク質
単量体糖タンパク質であるフォリスタチン（ＦＳ）は、当初、ブタ卵巣卵胞液から特定され、下垂体卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌を特異的に抑制するその機能に基づいて命名された。その後、ヒトフォリスタチンの生理学的機能は、ＴＧＦ−βのある特定のメンバー、主にアクチビンおよびミオスタチンの結合および阻害によってさらに理解されてきた。アクチビンは、胚発生および成長、生殖、エネルギー代謝、骨のホメオスタシス、炎症および線維症など、様々な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。ミオスタチンは成長因子および分化因子８（ＧＤＦ−８）としても公知であるが、周知の筋形成および骨格筋量の重要な負の調節因子である。ミオスタチンの阻害は、肥大による骨格筋量の著しい増加を引き起こす。フォリスタチンは、アクチビンおよびミオスタチンの天然拮抗薬として、炎症、線維症、ならびにデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、および封入体筋炎（ＩＢＭ）などの筋肉障害に関連するヒト疾患を治療するための有望な治療標的として示されている。
【００９９】
フォリスタチン遺伝子は、染色体５ｑ１１．２上に局在化する。ＲＮＡ処理の代替的なスプライシング事象は、２つのコードされたフォリスタチン前駆体、３４４アミノ酸前駆体タンパク質、および２７アミノ酸カルボキシル末端切断３１７アミノ酸前駆体をもたらす。前駆体の最初の２９個のアミノ酸残基は、推定シグナル配列に対応し、これにより２つのＮ末端同一コア成熟ＦＳアイソフォーム、ＦＳ３１５およびＦＳ２８８がもたらされる。ＦＳの追加的バリアント、ＦＳ３０３は、ＦＳ３１５のタンパク質分解切断から生じることが報告されている。３つのアイソフォームは、リガンド結合および局在化に対するそれらの異なる親和性に基づいて、異なる生物学的役割を果たす。ＦＳ３１５は、ヒト血清中の主な循環アイソフォームとして提唱されており、一方でＦＳ３０３は卵巣卵胞液中の主なアイソフォームである。ＦＳのドメイン構造は、エクソンシャッフリング由来の典型的なモザイクタンパク質であり、これは、６３残基Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）、次いで３つの連続的ＦＳドメイン（ＦＳＤ１、ＦＳＤ２、およびＦＳＤ３）、ならびにＦＳ３１５およびＦＳ３０３アイソフォームの強酸性Ｃ末端尾部（ＡＤ）から成る（図１）。約５０％の主配列相同性を共有する３つのＦＳドメインは、その１０個のシステイン残基のアライメントによって明確に関連している。ＦＳＤ１の結晶構造は、ＦＳドメインを、Ｎ末端ＥＧＦ様モジュールおよびＣ末端カザールプロテアーゼ阻害剤ドメインの２つの別個のサブドメインへと分けることができることを示し、各ＦＳドメインは、１０個の保存されたシステインによって形成されたドメイン内のジスルフィド結合を通して自律的な折り畳みユニットを形成することが予測される。
【０１００】
細胞表面上のプロテオグリカンのヘパリンセファロース親和性カラムおよびヘパラン硫酸鎖とＦＳとの関連性は、元の単離および特徴解析研究に記述されている。後の研究では、ＦＳ中のコアヘパリン結合配列（ＨＢＳ）が特定され、これはＦＳＤ１ドメイン内に位置する、強塩基性１２残基セグメント（残基７５〜８６）である。ＨＢＳ領域は、２つのコンセンサスヘパリン結合モチーフＢＢＸＢを含み、ここでＢはリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であり、ヘパリン結合に関する重要な決定因子としての機能を果たす。ＢＢＸＢモチーフにおけるＨＢＳまたは点突然変異の置換は、ヘパリンへの結合を低減または消失させることができる。最近の動物研究では、除去したＨＢＳをマウスＩｇ１  Ｆｃドメイン（ＦＳ３１５ΔＨＢＳ−Ｆｃ）に融合した操作ＦＳ３１５は、マウスにおける曝露および半減期を著しく改善し、また筋委縮のマウスモデルにおける用量に依存した薬理学的効果も示し、これは治療上関連する組み換えＦＳバリアントを作るためにヘパリン結合親和性を操作する重要性を強調している。
【０１０１】
治療用途の組み換えＦＳの系統的タンパク質エンジニアリングは、ほとんど未開拓である。いくつかの実施形態では、本明細書には、操作された組み換えＦＳバリアントが示されている。いくつかの実施形態では、操作された組み換えＦＳバリアントはＩｇＧ  Ｆｃに融合されている。いくつかの実施形態では、操作された組み換えＦＳバリアントはヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合されている。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＦＳ  ＨＢＳ内の塩基性ＢＢＸＢモチーフのある特定の残基の電荷は、ヘパリン結合親和性に影響を与える。ＦＳ３１５はＮ末端ドメイン（ＮＤ）、３つのＦＳドメイン（ＦＳＤ１、ＦＳＤ２、およびＦＳＤ３）、および強酸性Ｃ末端尾部（ＡＤ）から成る（図１）。塩基性残基が豊富な２つのコアヘパリン結合モチーフＫＫＣＲおよびＫＫＮＫは、ＦＳＤ１内に位置し、ＦＳＤ２（ｐＩ  ６．７）およびＦＳＤ３（ｐＩ  ４．８）と比較して最も基本的なドメイン（Ｐｉ８．９）となっている。ヘパリンと複合した２０個の非冗長三次元タンパク質構造の構造解析により、静電気と水素結合の相互作用が、カチオン性残基（ＫまたはＲ）とヘパリン中のアニオン性基との間の結合に最も寄与することが示された。ヘパリン類似体と複合体化したＦＳ  ＦＳＤ１ドメインの結晶構造は、静電相互作用による負電荷を持つ硫酸基を通して、ヘパリン類似体が強塩基性ＨＢＳと関連付けられていることも示された。いくつかの実施形態では、ＨＢＳ領域のＢＢＸＢモチーフにおいてカチオン性残基をアニオン性残基で置換すると、静電相互作用を断ち、ヘパリン結合を消失させる。いくつかの実施形態では、負電荷残基置換バリアントＫ（７６，８１，８２）ＥおよびＫ（７６，８１，８２）Ｄは、ＳＰＲ結合アッセイにおいて、ヘパリン結合親和性が検出不能であったが、中性残基置換バリアントＫ（７６，８１，８２）Ａは９．４ＮｍのＫＤの結合を有しており、負電荷の置換を使用してヘパリン結合を除去することへの、効果がより大きいことが確認された。ヘパリン結合親和性に対する負電荷置換の顕著な影響により、わずか数個の点変異の導入で、ＨＢＳ置換バリアントΔＨＢＳおよびＨＢＳ欠失バリアントｄｅｌ７５−８６で見られるものと同じ結合の変化が達成される。発明者らの手により最小限の置換を利用することで、ＣＨＯのＦＳバリアントに対する発現レベルの改善およびタンパク質Ａ溶出液中のタンパク質凝集の低減が可能となっただけでなく、野生型と同様のアクチビンＡおよびミオスタチン結合親和性も保持された。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンバリアントにおけるグルタミン酸置換の程度が増加すると、ヘパリン結合が漸進的に低減する。いくつかの実施形態では、第二のＢＢＸＢモチーフＫＫＮＫ（８１〜８４）は、第一のＢＢＸＢモチーフＫＫＣＲ（７５〜７８）よりもヘパリン結合に支配的な役割を果たす。いくつかの実施形態では、ＦＳ  ＢＢＸＢモチーフの各々の第三の塩基性残基は、ヘパリン結合に対してより弱い効果を有する。いくつかの実施形態では、ＦＳ  ＢＢＸＢモチーフの最初の２つの塩基性残基は、ＦＳ  ＢＢＸＢモチーフの第三の塩基性残基よりもヘパリン結合および／またはクリアランスに影響を与える。
【０１０４】
負電荷残基グルタミン酸Ｅを使用して、ＢＢＸＢモチーフの主要残基に対する１つ、２つ、または３つの一連のアミノ酸置換を生成することにより、ヘパリン結合の主な位置および組み合わせが特定された。二重バリアントＫ（８１，８２）Ｅは、Ｋ（７５，７６）Ｅ、Ｋ（７６，８２）Ｅ、Ｋ（７６，８４）Ｅ、Ｒ７８Ｅ／Ｋ８２Ｅ、Ｒ７８Ｅ／Ｋ８４ＥおよびＫ（８２，８４）Ｅを含む、その他６個の二重バリアントと比べて、ヘパリン結合に対して最も大きな影響が観察されたので、第二のＢＢＸＢモチーフのＫ８１およびＫ８２が静電気相互作用に関して支配的な役割を果たすことが２つのＢＢＸＢモチーフの６つの塩基性残基のスクリーニングで示された（表８ｂ）。いくつかの実施形態では、Ｋ８２Ｅ突然変異を持つバリアントは、タンパク質発現レベルにおいて約２倍の増加を一貫して示し、タンパク質の折り畳みに対するＫ８２Ｅの正の影響を示唆した。いくつかの実施形態では、試験範囲で、野生型と比較して４〜１００倍の低減またはそれ以上の範囲の異なるヘパリン結合度でバリアントが生成される。ＦＳと細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの関連性が、急速な細胞取り込みおよびクリアランスを生じることが示されている。異なるヘパリン結合親和性を有する複数のバリアントを選択し、これらをメスのＣＤ１マウスに単回静脈内投与（１ｍｇ／ｋｇ）として投与した。すべてのバリアントは、野生型と比較してＰＫプロファイルの改善を示し、ヘパリン結合の低減は、ＡＵＣの増加およびクリアランスの減少と明らかに相関した（表１１）。実施例に示されたデータは、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの関連性が、フォリスタチンタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態プロファイルに対する決定因子プロセスのうちの１つであることを示す。治療用途のために、フォリスタチンタンパク質の曝露および薬物動態プロファイルは、ヘパリン結合を操作することによって調節することができる。
【０１０５】
ヘパリン結合とＡＵＣまたはクリアランスのいずれかとの関係とは対照的に、終末相半減期に対する直接関係はないが、多くのバリアントは野生型と比較して延長した半減期を有した。薬物の半減期はクリアランスおよび分布容積の両方に依存するため、分布容積（表１１）（タンパク質電荷および構造からもたらされ得る）は終末相半減期とヘパリン結合との非直接的な関係に寄与する因子であり得る。
【０１０６】
リガンド結合に対するＨＢＳ領域内の突然変異の影響は、異なるＦＳアイソフォーム／バリアントおよび異なるアッセイシステムで研究されており、異なるデータセットをもたらしている。ｄｅｌ７５−８６バリアントに対するミオスタチン阻害のおよそ２０倍の低減およびアクチビンＡ阻害の約５倍の低減が、分子の構造の変化によって生じる可能性がある。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンバリアントは、野生型フォリスタチンと比較して、ミオスタチン阻害を約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２．５、２、１．５、または１倍、低減させる。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンは、野生型フォリスタチンと比較して、アクチビンＡ阻害を約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１倍、低減させる。
【０１０７】
グリコエンジニアリング技術は、治療薬の医薬品特性を改善するための魅力的な戦略となりつつある。関連酵素の過剰発現または破壊による宿主生合成経路のグリコエンジニアリング遺伝子改変には多くのアプローチがある；２）可溶性酵素阻害剤の使用による宿主生合成経路の代謝干渉、３）精製タンパク質の翻訳後の酵素的または化学酵素的改変、および４）炭水化物含有量を増加させるためまたは特異的結合をブロックするための新たなグリコシル化部位の導入。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、高グリコシル化部位は、フォリスタチンのＮ７５上に見出される。ＦＳＤ１の結晶構造は、残基６４〜７４がループを形成し、その後にストランドβ１（７５〜７９）およびストランドβ２（８５〜８９）が続くことを示す。残基７５は、ループとストランドβ１を連結するＩＩ型βターン（７２〜７５）に位置し、これはある程度の柔軟性を有する露出ループ領域でグリコシル化がしばしば生じるという所見と一致する。
【０１０９】
２つの高グリコシル化バリアントＫ７５Ｎ／Ｃ７７Ｎ／Ｋ８２ＴおよびＣ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔは、マウスの研究で、野生型と比較してｉｎ  ｖｉｖｏ曝露の著しい改善を示した。Ｃ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔに対する、Ｎ７５にグリカンを添加することによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヘパリン結合低減はなかった。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、第一のＢＢＸＢモチーフ（残基７５〜７８）は、第二のＢＢＸＢモチーフ（残基８１〜８４）よりもヘパリン結合に与える影響が少ない。理論に束縛されるものではないが、Ｃ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔに対するｉｎ  ｖｉｖｏの曝露の約１０倍の改善はグリカン占有率の増加によって生じる可能性があり、これは組み換えＦＳ３１５−Ｆｃ分子に対するｉｎ  ｖｉｖｏの糖依存性クリアランスを低減させ、嵩高のグリカンのｉｎ  ｖｉｖｏでの追加によって一部のヘパリン結合をブロックする可能性も一定程度ある。バリアントＫ７５Ｎ／Ｃ７７Ｎ／Ｋ８２ＴはＣ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔよりも高いグリカン占有率および弱いｉｎ  ｖｉｔｒｏヘパリン結合親和性を有し、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露に対するより大きな改善に貢献した。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、本発明に好適な組み換えフォリスタチンには、実質的なフォリスタチン生物学的活性を保持する任意の野生型または改変フォリスタチンタンパク質（例えば、アミノ酸突然変異、欠失、挿入、および／または融合タンパク質を有するフォリスタチンタンパク質）が含まれる。典型的には、組み換えフォリスタチンタンパク質は、組み換え技術を使用して産生される。しかしながら、天然資源から精製された、化学的に合成されたフォリスタチンタンパク質（野生型または改変型）を本発明に従って使用することができる。典型的には、好適な組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、約１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、２日、２．５日、３日、３．５日、４日、４．５日、５日、５．５日、６日、６．５日、７日、７．５日、８日、８．５日、９日、９．５日、または１０日以上のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質は、０．５〜１０日、１日〜１０日、１日〜９日、１日〜８日、１日〜７日、１日〜６日、１日〜５日、１日〜４日、１日〜３日、２日〜１０日、２日〜９日、２日〜８日、２日〜７日、２日〜６日、２日〜５日、２日〜４日、２日〜３日、２．５日〜１０日、２．５日〜９日、２．５日〜８日、２．５日〜７日、２．５日〜６日、２．５日〜５日、２．５日〜４日、３日〜１０日、３日〜９日、３日〜８日、３日〜７日、３日〜６日、３日〜５日、３日〜４日、３．５日〜１０日、３．５日〜９日、３．５日〜８日、３．５日〜７日、３．５日〜６日、３．５日〜５日、３．５日〜４日、４日〜１０日、４日〜９日、４日〜８日、４日〜７日、４日〜６日、４日〜５日、４．５日〜１０日、４．５日〜９日、４．５日〜８日、４．５日〜７日、４．５日〜６日、４．５日〜５日、５日〜１０日、５日〜９日、５日〜８日、５日〜７日、５日〜６日、５．５日〜１０日、５．５日〜９日、５．５日〜８日、５．５日〜７日、５．５日〜６日、６日〜１０日、７日〜１０日、８日〜１０日、９日〜１０日のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。
【０１１２】
フォリスタチン（ＦＳ）は、下垂体細胞の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌を抑制する能力を有するタンパク質因子として、最初に卵胞液から単離された。ＦＳは、アクチビンの結合および中和を通して少なくとも部分的にＦＳＨに影響を及ぼす。
【０１１３】
ＦＳには少なくとも３つのアイソフォームがある：ＦＳ２８８、ＦＳ３０３、およびＦＳ３１５（表３）。全長ＦＳ３１５タンパク質は、エクソン６によってコードされる酸性２６残基Ｃ末端尾部を含む（配列番号２、Ｃ末端尾部は単一下線付き）。いくつかの事例では、ＦＳ３１５アイソフォームは、シグナル配列を含み得る（配列番号１、シグナル配列は太字およびイタリックで指定される）。ＦＳ２８８アイソフォームは、Ｃ末端における代替的スプライシングを通して生成され、それゆえにエクソン５（配列番号５）で終了する。フォリスタチンタンパク質は、アクチビン結合に重要な疎水性残基を含む６３個のアミノ酸Ｎ末端領域から成る独特の構造を有し、タンパク質の主要部分（残基６４〜２８８、例えば、配列番号２に示されるようなもの）は各々がおよそ７３〜７５個のアミノ酸である３つの１０−システインＦＳドメインを含む。これらのＮ末端からＣ末端までの１０−システインドメインは、それぞれドメイン１、ドメイン２、およびドメイン３（すなわち、ＦＳＤ１、ＦＳＤ２、およびＦＳＤ３）と呼ばれる。ＦＳ２８８はヘパリン結合ドメインの存在に起因する組織結合である傾向があり、一方ＦＳ３１５は、ヘパリン結合ドメインが拡張Ｃ末端によってマスクされるため、潜在的に循環形態である傾向がある。ＦＳ３０３（配列番号４）は、ＦＳ３１５からのＣ末端ドメインのタンパク質分解切断によって生成されると考えられる。いくつかの事例では、ＦＳ３０３アイソフォームは、シグナル配列を含み得る（配列番号３、シグナル配列は太字およびイタリックで指定される）。ＦＳ３０３は、ＦＳ２８８とＦＳ３１５の間に中等度レベルの細胞表面結合を有する。
【０１１４】
ヘパリン結合ドメインまたは配列（例えば、ＨＢＳ）は、ＦＳ３１５の残基７５〜８６に対応するアミノ酸を含み、例えば配列番号２に示されるように、ＦＳＤ１内にある。ＨＢＳは二重下線で指定される。ＦＳ３０３タンパク質およびＦＳ２８８タンパク質はまた、対応するアミノ酸（これも二重下線によって指定される）においてＨＢＳを含む。この領域内のアミノ酸の突然変異、欠失、または置換は、ヘパリン結合を低減または消失させ、これによって治療用フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のクリアランスを低減し、かつ半減期を改善することができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ＨＢＳ内の少なくとも１つ以上のアミノ酸を、より少ない正電荷を有するアミノ酸と置換して、ヘパリン結合親和性が低減した組み換えフォリスタチンタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、ＨＢＳ内の少なくとも１つ以上のアミノ酸を、より多くの中性または負の電荷を有するアミノ酸と置換して、低減したヘパリン結合親和性を有する組み換えフォリスタチンタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、元のアミノ酸残基と比べて電荷が低減したアミノ酸で置換すると、低減したヘパリン結合親和性を有する組み換えフォリスタチンタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、ＨＢＳ内に存在する１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を、より少ない正電荷を有する、中性電荷を有する、より多くの負電荷を有する、または低減した電荷を有するアミノ酸で置換すると、へパリン結合親和性が低減した組み換えフォリスタチンタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、ＨＢＳ内に存在する１、２、または３個のアミノ酸を、より少ない正電荷を有する、中性電荷を有する、より多くの負電荷を有する、または低減した電荷を有するアミノ酸で置換すると、へパリン結合親和性が低減した組み換えフォリスタチンタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、ＨＢＳの２つ以上のアミノ酸を、より少ない正電荷を有する荷電アミノ酸、中性アミノ酸、負に荷電したアミノ酸、または荷電を低減したアミノ酸で置換すると、なされたアミノ酸置換の量に対応してヘパリン結合が漸進的に低減する。例えば、ＨＢＳ内の３個のアミノ酸をより少ない正電荷、中性電荷、より多くの負電荷、または低減した電荷を有するアミノ酸で置換すると、ＨＢＳ内の２個のアミノ酸のみをより少ない正電荷、中性電荷、より多くの負電荷、または低減した電荷を有するアミノ酸で置換した場合と比べて、組み換えフォリスタチンタンパク質によるヘパリン結合が低くなる。別の例として、ＨＢＳ内の２個のアミノ酸をより少ない正電荷、中性電荷、より多くの負電荷、または低減した電荷を有するアミノ酸で置換すると、ＨＢＳ内の１個のアミノ酸のみをより少ない正電荷、中性電荷、より多くの負電荷、または低減した電荷を有するアミノ酸で置換した場合と比べて、組み換えフォリスタチンタンパク質によるヘパリン結合が低くなる。
【０１１６】
当業者であれば、他のアミノ酸と比較して、ある特定のアミノ酸は、より少なく正に荷電している、中性である、負に荷電している、または低減された電荷を有していることを認識するであろう。アミノ酸は、アミノ酸の等電点によって示されるように、正味荷電に基づいて分離することができる。等電点は、アミノ酸分子の平均正味荷電がゼロとなるｐＨである。ｐＨ＞ｐＩの場合、アミノ酸は正味負電荷を有し、ｐＨ＞ｐＩの場合、アミノ酸は正味正電荷を有する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質の測定ｐＩ値は、約３〜９（例えば、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、および９）およびその間の任意の値である。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質の測定ｐＩ値は、約４〜７（例えば、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０）およびその間の任意の値である。例示的なアミノ酸の等電点を下記の表２に示す。一般的に、正の電荷を帯びた側鎖を有するアミノ酸としては、例えば、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリシン（Ｋ）が挙げられる。負の電荷を帯びた側鎖を有するアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）が挙げられる。極性特性を有するアミノ酸としては、例えば、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、及びシステイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）が挙げられる。非極性アミノ酸としては、例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、およびプロリン（Ｐ）が挙げられる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＨＢＳ内の点変異は、ＨＢＳ内の１つ以上のリシン（Ｋ）残基の１つ以上の置換を含む。例えば、フォリスタチンポリペプチドのＨＢＳ内の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５個）のリシン残基は、別のアミノ酸に置換される。ＨＢＳは、ＦＳ３１５の残基７５〜８６、すなわち残基ＫＫＣＲＭＮＫＫＮＫＰＲに対応するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の負に荷電したアミノ酸、例えばグルタミン酸（Ｅ）および／またはアスパラギン酸（Ｄ）をリシン（Ｋ）アミノ酸に置換すると、ｐＩシフトとして知られる組み換えフォリスタチンポリペプチドの全体的な電荷の変化をもたらす。いくつかの実施形態では、フォリスタチン分子の全体的な電荷の変化はｉｎ  ｖｉｖｏのクリアランスおよび半減期を改善する。一実施形態では、組み換えフォリスタチンポリペプチドの全体的な電荷の変化はｉｎ  ｖｉｖｏのクリアランスを減速する。いくつかの実施形態では、１つ以上の負に荷電したアミノ酸、例えばグルタミン酸（Ｅ）および／またはアスパラギン酸（Ｄ）を１つ以上のリシン（Ｋ）アミノ酸に置換すると、組み換えフォリスタチン分子の全体的な電荷の変化をもたらす。いくつかの実施形態では、１つ以上の負に荷電したアミノ酸、例えばグルタミン酸（Ｅ）および／またはアスパラギン酸（Ｄ）を１つ以上のリシン（Ｋ）アミノ酸に置換すると、組み換えフォリスタチンポリペプチドの発現中の高分子量種の量の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、１つ以上の負に荷電したアミノ酸、例えばグルタミン酸（Ｅ）および／またはアスパラギン酸（Ｄ）を１つ以上のリシン（Ｋ）アミノ酸に置換すると、組み換えフォリスタチンポリペプチドの発現の増加をもたらす。
【表２】
2020519291.tif 000004
【０１１８】
ＦＳはｉｎ  ｖｉｔｒｏでミオスタチンおよびアクチビンの両方を阻害し、この阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏでマウスにおいて筋肥大につながる可能性があることが示されている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｍａｓｓ  ｂｙ  Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｎｓ，（２０１０），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２４（１０）：１９９８−２００８、Ｇｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｎ，（２００９），Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２９７（１）：Ｅ１５７−Ｅ１６４）。特定の理論に束縛されるものではないが、この観察された効果は、ＦＳがミオスタチンおよびアクチビンによるＳｍａｄ２／３経路の活性化を防止することに少なくとも部分的に起因し得る。Ｓｍａｄ２／３経路の活性化は、筋肉成長の負の調節をもたらすことが示されている（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｆｔｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，（２０１１），Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１７９（２）：９１５−９３０）。
【０１１９】
典型的な野生型または自然発生のヒトＦＳ３１５、ＦＳ３０３、およびＦＳ２８８タンパク質のアミノ酸の配列を表３に示す。
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１２０】
それゆえに、いくつかの実施形態では、本発明好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５（配列番号１または配列番号２）である。本明細書に開示されるように、配列番号２は、ヒトフォリスタチンタンパク質の基準のアミノ酸の配列を表す。いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質は、スプライスアイソフォームまたはタンパク質分解バリアント（ＦＳ３０３（配列番号３または配列番号４）など）であってもよい。いくつかの実施形態では、フォリスタチンタンパク質は、ＦＳ２８８（配列番号５）などのスプライスアイソフォームであってもよい。いくつかの実施形態では、好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、野生型または自然発生のタンパク質の相同体または類似体であってもよい。例えば、ヒト野生型または自然発生のフォリスタチンタンパク質の相同体または類似体は、相当なフォリスタチンタンパク質活性（例えば、ミオスタチン阻害またはアクチビン阻害）を保持しながら、野生型または自然発生のフォリスタチンタンパク質と比較して、１つ以上のアミノ酸またはドメインの置換、欠失、および／または挿入を含んでもよい（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５）。それゆえに、いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５フォリスタチンタンパク質（配列番号１）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号１に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上、相同なアミノ酸の配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５フォリスタチンタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号１に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸の配列を有する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５フォリスタチンタンパク質（配列番号２）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号２に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上、相同なアミノ酸の配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３１５フォリスタチンタンパク質（配列番号２）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号２に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸の配列を有する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３０３フォリスタチンタンパク質（配列番号３）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号３に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上、相同なアミノ酸の配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３０３フォリスタチンタンパク質（配列番号３）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号３に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸の配列を有する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３０３フォリスタチンタンパク質（配列番号４）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号４に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上、相同なアミノ酸の配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ３０３フォリスタチンタンパク質（配列番号４）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号４に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸の配列を有する。
【０１２４】
それゆえに、いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ２８８フォリスタチンタンパク質（配列番号５）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号５に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上、相同なアミノ酸の配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ヒトＦＳ２８８フォリスタチンタンパク質（配列番号５）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、配列番号５に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸の配列を有する。
【０１２５】
ヒトフォリスタチンタンパク質の相同体または類似体は、当業者に公知のポリペプチド配列を改変する方法（このような方法を集めた参考文献に見られるものなど）に従って調製することができる。当業者であれば理解するように、２つの配列はそれらが対応する位置に相同な残基を含む場合、「実質的に相同」であると一般的に見なされる。相同な残基は同一の残基であってもよい。代替的に、相同な残基は、適切に類似の構造および／または機能的特徴を有する、非同一残基であってもよい。例えば、当業者には周知のように、ある特定のアミノ酸は「疎水性」または「親水性」アミノ酸として典型的に分類され、かつ／または「極性」または「非極性」側鎖を有し、同じタイプ別の１つのアミノ酸の置換は、しばしば「相同」な置換とみなされ得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸の中でなされる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。いくつかの実施形態では、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を改変しないアミノ酸置換を指す。
【０１２６】
当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ならびにアミノ酸の配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで入手可能なものを含む、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較され得る。例示的なこうしたプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；、およびＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に説明される。相同配列を特定することに加えて、上述のプログラムは相同性の程度の指標を典型的に提供する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、野生型ヒトフォリスタチンタンパク質と比較して、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換を含む。例えば、好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、表４に示すように、アミノ酸の欠失、挿入、および／または置換を含んでもよい。例示的なアミノ酸の欠失、挿入、および／または置換は、配列番号２に対応するＦＳ３１５に例示される。いくつかの実施形態では、同じ欠失、挿入、または置換が、シグナル配列を含むＦＳ３１５（例えば、配列番号１）、ＦＳ３０３（例えば、配列番号３、配列番号４）、またはＦＳ２８８（例えば、配列番号５）の対応する場所に存在する場合がある。
【表４−１】
2020519291.tif 000007
【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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高グリコシル化バリアント
【０１２８】
グリコシル化は、糖タンパク質の複雑な翻訳後修飾であり、タンパク質溶解性、折り畳み、安定性、細胞輸送、免疫原性、生物活性、および分布に影響を与える。現在、１５個を超えるグリコエンジニアリング抗体が臨床試験で評価されている。天然ＦＳアイソフォームは、アスパラギンＮ９５、Ｎ１１２、およびＮ２５９において３つのＮ−グリコシル化部位を有する（図１）。潜在的炭水化物含有量を調節し、ヘパリン結合を阻害し、免疫原性のリスクを低減させるために、新規グリコシル化部位をＦＳヘパリン結合ループへと導入することはまた調査されていない。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質には、Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓコンセンサス配列を有するＨＢＳ領域の高グリコシル化変異体が含まれる。Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓコンセンサスは、グリコシル化コンセンサス配列モチーフであり、ここでＸはＡｓｎ（Ｎ）とＴｈｒ（Ｔ）またはＡｓｎ（Ｎ）とＳｅｒ（Ｓ）の間のプロリンを除いて任意のアミノ酸とすることができる。いくつかの実施形態では、グリコシル化コンセンサス配列の追加は、ヘパリン結合をマスクする、害する、または防止する。いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は表５に提供されるアミノ酸の配列を含み、これらは野生型ヒトフォリスタチンタンパク質ＦＳ３１５、ＦＳ３０３、およびＦＳ２８８（例えば、配列番号２、配列番号４、または配列番号５）の位置６６〜８８に対応する。いくつかの実施形態では、高グリコシル化バリアントは、改善されたＰＫパラメータを有する。いくつかの実施形態では、高グリコシル化バリアントは、ｐＩ（等電点）によって示される、電荷の正味変化を有しない。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチド内のアミノ酸の欠失、挿入、または置換は、ＨＢＳ内である。いくつかの実施形態では、アミノ酸の欠失、挿入、または置換は、ＨＢＳのＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸以内などのＨＢＳに近いか、またはそれに隣接している。理論に束縛されるものではないが、ＨＢＳ内、ＨＢＳの近く、またはＨＢＳに隣接した変化は、ＨＢＳのヘパリン結合を低減させると考えられる。ヘパリン結合の低減は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期などの組み換えタンパク質の薬物動態パラメータを改善すると考えられる。理論に束縛されるものではないが、ＨＢＳ内、ＨＢＳの近く、またはＨＢＳに隣接する変化は、免疫原性を低減させ、かつ／または組み換えタンパク質の発現を増加させ得るとも考えられる。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンの発現増加は、Ｋ７５Ｄ、Ｋ７５Ｅ、Ｋ７６Ｄ、Ｋ７６Ｅ、Ｋ８１Ｄ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８１Ｄ、またはＫ８２Ｅ  ＨＢＳ突然変異のうちの１つ以上に存在する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンの発現増加は、Ｋ８２Ｅ  ＨＢＳ突然変異に存在する。いくつかの実施形態では、ＨＢＳ内の少なくとも１つのアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）を、より少ない正電荷を有する少なくとも１つのアミノ酸残基で置換すると、組み換えフォリスタチンタンパク質によるヘパリン結合を低減させることができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチド内のアミノ酸置換は、ヘパリン結合領域内にコンセンサスグリコシル化部位を導入する（例えば、Ｋ８２Ｔ、Ｐ８５Ｔ、Ｒ７８Ｎ／Ｎ８０Ｔ、Ｒ８６Ｎ／Ｖ８８Ｔ、Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２Ｔ、Ｇ７４Ｎ／Ｋ７６Ｓ、Ｇ７４Ｎ／Ｋ７６Ｔ、Ｇ７４Ｎ／Ｋ７６Ｔ／Ｐ８５Ｔ、Ｃ６６Ｓ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ、Ｃ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ  Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｓ／Ｋ８２Ｔ、Ｃ６６Ｓ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｓ，  Ｃ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｓ）。その後のアミノ酸のグリコシル化は、ヘパリン結合ドメインをマスクし、そしてそれゆえに組み換えタンパク質のヘパリンへの結合を低減させると予想される。グリカンの存在はまた、置換アミノ酸をマスクし、これによって、組み換えタンパク質によって付与される免疫原性の任意の潜在的な増加を調節すると予想される。高グリコシル化は、組み換えタンパク質の溶解性および／または半減期を改善することも予想される。例示的な高グリコシル化バリアントを、表４、５、および９に示す。
【表５−１】
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【表５−２】
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【０１３２】
フォリスタチン融合タンパク質
好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は融合タンパク質構成とすることができると考えられる。例えば、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、例えば、フォリスタチンタンパク質の安定性、効力、および／または送達を強化または増加させる、または免疫原性もしくはクリアランスを低減または除去することにより、典型的にはフォリスタチンの治療効果を促進することができる、フォリスタチンドメインと別のドメインまたは部分との間の融合タンパク質とすることができる。フォリスタチン融合タンパク質に対するこうした好適なドメインまたは部分としては、Ｆｃドメイン、ＸＴＥＮドメイン、またはヒトアルブミン融合が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３３】
Ｆｃドメイン
いくつかの実施形態では、好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、ＦｃＲｎ受容体に結合するＦｃドメインまたはその一部分を含む。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、ＩｇＧなどの免疫グロブリンサブクラスに由来してもよい。いくつかの実施形態では、ドメインＦｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来する。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥに由来する。特に好適なＦｃドメインとしては、ヒトまたはヒト化抗体由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、修飾ヒトＦｃ部分などの修飾Ｆｃ部分である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、表６に提供されるアミノ酸の配列を含む。
【表６】
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【０１３５】
いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上、相同または同一であるアミノ酸の配列を含む。
【０１３６】
ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の結合の改善は、組み換えタンパク質の血清半減期の延長をもたらすと考えられる。それゆえに、いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＦｃＲｎへの結合の改善につながる１つ以上のアミノ酸突然変異を含む。ＦｃＲｎへの結合を改善する効果があるＦｃドメイン内の様々な突然変異が当技術分野で公知であり、本発明を実施するように適合することができる。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従い、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｕ３８０、Ｍｅｔ４２８、Ｈｉｓ４３３、および／またはＡｓｎ４３４に対応する１つ以上の位置に１つ以上の突然変異を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、ＥＵナンバリングに従い、ヒトＩｇＧ１のＬ２３４、Ｌ２３５、Ｈ４３３、およびＮ４３４に対応する１つ以上の位置に１つ以上の突然変異を含む。
【０１３８】
組み換え融合タンパク質のＦｃ部分は、Ｆｃ受容体を発現する細胞の標的化につながり、炎症促進性の影響をもたらし得る。Ｆｃドメインにおけるいくつかの突然変異は、組み換えタンパク質のＦｃガンマ受容体への結合を低減させ、これによってエフェクター機能を阻害する。一実施形態では、エフェクター機能は抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）である。例えば、好適なＦｃドメインは、Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）および／またはＬ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）（ＥＵナンバリング）の突然変異を含んでもよい。いくつかの実施形態ではＬ２３４Ａ突然変異およびＬ２３５Ａ突然変異は、ＬＡＬＡ突然変異とも呼ばれる。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＥＵナンバリング）を含有し得る。Ｌ２３４Ａ突然変異およびＬ２３５Ａ突然変異を含む例示的なＦｃドメイン配列が、表６に配列番号７として示されている。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）および／またはＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）（ＥＵナンバリング）の変異を含有してもよい。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、突然変異Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ（ＥＵナンバリング）を含有し得る。いくつかの実施形態では、Ｈ４３３Ｋ突然変異およびＮ４３４Ｆ突然変異は、ＮＨａｎｃｅ突然変異とも呼ばれる。突然変異Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆを組み込む例示的なＦｃドメイン配列が、表６の配列番号８として示される。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインは、Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）、Ｌ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）、Ｈ４３３Ｋ（Ｈｉｓ４３３Ｌｙｓ）、および／またはＮ４３４Ｆ（Ａｓｎ４３４Ｐｈｅ）（ＥＵナンバリング）の突然変異を含有してもよい。非限定的な例として、好適なＦｃドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ（ＥＵナンバリング）を含有し得る。突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ４３３Ｋ、およびＮ４３４Ｆを組み込む例示的なＦｃドメイン配列が、表６の配列番号９として示される。
【０１４１】
Ｆｃドメインに含むことができる追加のアミノ酸置換としては、例えば、米国特許第６，２７７，３７５号、同第８，０１２，４７６号、および同第８，１６３，８８１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが含まれる。
【０１４２】
リンカーまたはスペーサー
フォリスタチンドメインは、Ｆｃドメインに直接的または間接的に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、好適な組み換えフォリスタチンタンパク質は、フォリスタチンドメインとＦｃドメインを結合するリンカーまたはスペーサーを含有する。アミノ酸リンカーまたはスペーサーは、一般的に柔軟性、または２つのタンパク質部分の間にアルファヘリックスなどの構造を挟むように設計されている。リンカーまたはスペーサーは比較的短くすることができ、またはより長くすることができる。典型的には、リンカーまたはスペーサーは、例えば、３〜１００（例えば、５〜１００、１０〜１００、２０〜１００  ３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００、５〜５５、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０）のアミノ酸長を含有する。いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸長以上である。典型的には、より長いリンカーは立体障害を減少させ得る。いくつかの実施形態では、リンカーはグリシン残基およびセリン残基の混合物を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、トレオニン、プロリン、および／またはアラニン残基をさらに含み得る。それゆえに、いくつかの実施形態では、リンカーは、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＡＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号６８）からなるリンカーではない。
【０１４３】
非限定的な例として、本発明のために好適なリンカーまたはスペーサーは、以下を含むがこれらに限定されない：
ＧＧＧ（配列番号６９）；
ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（ＧＡＧリンカー、配列番号７０）；
ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（ＧＡＧ２リンカー、配列番号７１）；および
ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（ＧＡＧ３リンカー、配列番号７２）。
【０１４４】
好適なリンカーまたはスペーサーは、上記の例示的なリンカーと、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同または同一であるアミノ酸の配列を有するもの、例えば、ＧＡＧリンカー（配列番号７０）、ＧＡＧ２リンカー（配列番号７１）、またはＧＡＧ３リンカー（配列番号７２）も含む。いくつかの実施形態での使用のために好適な追加のリンカーは、２０１２年３月２日に出願された米国特許出願公開第２０１２０２３２０２１号の中に見出され、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチドがその同族リガンド（例えば、アクチビンＡ、ミオスタチン、ヘパリンなど）のいずれかと結合する能力に実質的に影響を与えることなく、フォリスタチンペプチドをＦｃドメインと関連付けるリンカーが提供される。いくつかの実施形態では、フォリスタチンポリペプチド単独と比較して、フォリスタチンペプチドのヘパリンへの結合が改変されないようなリンカーが提供される。
例示的なフォリスタチン融合タンパク質
【０１４５】
特定の実施形態では、好適な組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、フォリスタチンポリペプチドおよびＦｃドメインを含み、フォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトＦＳ３１５タンパク質（配列番号１または配列番号２）、ＦＳ３０３タンパク質（配列番号３、または配列番号４）またはＦＳ２８８（配列番号５）と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸の配列を含む。特定の実施形態では、好適な組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、フォリスタチンポリペプチド、Ｆｃドメイン、およびフォリスタチンポリペプチドをＦｃドメインと関連付けるリンカーを含み、フォリスタチンポリペプチドは、野生型ヒトＦＳ３１５タンパク質（配列番号１）またはＦＳ３１５タンパク質（配列番号２）と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸の配列を含む。典型的には、適切な組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、アクチビンＡおよびミオスタチンに結合することができる。いくつかの実施形態では、好適な組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、約０．５〜６日（例えば、約０．５〜５．５日、約０．５〜５日、約１〜５日、約１．５〜５日、約１．５〜４．５日、約１．５〜４．０日、約１．５〜３．５日、約１．５〜３日、約１．５〜２．５日、約２〜６日、約２〜５．５日、約２〜５日、約２〜４．５日、約２〜４日、約２〜３．５日、約２〜３日）のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。いくつかの実施形態では、好適な組み換えフォリスタチン融合タンパク質は、約２〜１０日の範囲（例えば、約２．５〜１０日、約３〜１０日、約３．５〜１０日、約４〜１０日、約４．５〜１０日、約５〜１０日、約３〜８日、約３．５〜８日、約４〜８日、約４．５〜８日、約５〜８日、約３〜６日、約３．５〜６日、約４〜６日、約４．５〜６日、約５〜６日の範囲）のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。
【０１４６】
非限定的な例として、好適なフォリスタチンＦｃ融合タンパク質は、表７に示すアミノ酸の配列を有してもよい。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【０１４７】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＦＳ３１５Ｋ（８１，８２）Ａ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（８１，８２）Ａ−ＧＧＧ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ａ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３０３Ｋ（７６，８１，８２）Ａ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ａ−ＧＧＧ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３０３Ｋ（７６，８１，８２）Ａ−ＧＧＧ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ８２Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３０３Ｋ８２Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ８２Ｔ−ＧＧＧ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３０３Ｋ８２Ｔ−ＧＧＧ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ／Ｖ８８Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７５，７６）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８２）Ｄ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｒ８６Ｎ／Ｖ８８Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｓ／Ｋ８２Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５  ｄｅｌ７５−８６−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（８１，８２）Ｄ−ｈＦｃＬＡＬＡ  ＦＳ３１５Ｋ８２Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｄ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｒ７８Ｎ／Ｎ８０Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｐ８５Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡまたはＦＳ３１５Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｎ／Ｋ８２Ｔ−ｈＦｃＬＡＬＡとして指定し得る。
【０１４８】
フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ二量体または単量体構成を含む様々な構成で提供され得ると考えられる。例えば、好適なホモ二量体構成は、両方のＦｃポリペプチド鎖のＮ末端に結合した融合パートナー（例えば、フォリスタチンポリペプチド＋リンカー）のＣ末端を有するように設計されてもよい。好適な単量体構成は、一つのＦｃ二量体、または一つのＦｃモノマーに融合された融合パートナー（例えば、フォリスタチンポリペプチド＋リンカー）のＣ末端を有するように設計されてもよい。単量体構成は、立体障害を低減させ得る。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、本明細書で特定された参照タンパク質配列（例えば、参照フォリスタチンタンパク質配列）に対する「アミノ酸の配列の同一性パーセント（％）」は、最大配列同一性パーセントを達成するために、いかなる保存的置換も配列同一性の一部としてみなさずに、必要な場合は配列を整列し、ギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸の配列の同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野のスキルのうちの様々な方法で達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェアを使用して、アミノ酸の配列の同一性を決定することが好ましい（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６，４６０−４８０（１９９６）；  ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを使用し、そのほとんどはデフォルト値に設定される。調節可能なパラメータは、以下の値に設定される：ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ＝１、ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、ｗｏｒｌｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝１１。ＨＳＰスコア（Ｓ）およびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的な値であり、特定の配列の組成に応じてプログラム自体によって確立されるが、最小値は調整されてもよく、上述のように設定されている。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ミオスタチンの結合および／または活性を阻害する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ミオスタチンに結合する時、約０．１ｐＭ超、約０．５ｐＭ超、約１ｐＭ超、約５ｐＭ超、約１０ｐＭ超、約５０ｐＭ超、約１００ｐＭ超、約５００ｐＭ超、または約１０００ｐＭ超のＫＤを有する。組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイなどの表面プラズモン共鳴アッセイで、測定され得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンＡの結合および／または活性を阻害する。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンＡに結合する時、約０．１ｐＭ超、約０．５超、約１超、約５ｐＭ超、約１０ｐＭ超、約５０ｐＭ超、約１００ｐＭ超、約５００ｐＭ超、または約１０００超のＫＤを有する。組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイなどの表面プラズモン共鳴アッセイで測定され得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、野生型フォリスタチン−Ｆｃタンパク質のヘパリンに対する結合親和性と比較して、ヘパリンに対する結合親和性が低下している。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ヘパリンと結合する時、約０．０１ｎＭ超、約０．０５ｎＭ超、約０．１ｎＭ超、約０．５ｎＭ超、約１ｎＭ超、約５ｎＭ超、約１０ｎＭ超、約５０ｎＭ超、約１００ｎＭ超、約１５０ｎＭ超、約２００ｎＭ超、約２５０ｎＭ超、または約５００ｎＭ超のＫＤを有する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ受容体に結合する時、約１ｎＭ超、約５ｎＭ超、約１０ｎＭ超、約５０ｎＭ超、約１００ｎＭ超、約５００ｎＭ超、または約１０００ｎＭ超のＫＤを有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、またはＦｃγＲＩＩＩＢである。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＢＭＰ−９に対する結合が最小限であるか、または明らかな結合を有していない。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＢＭＰ−１０に対する結合が最小限であるか、または明らかな結合を有していない。いくつかの実施形態では、最小限または明らかでない結合は、１９０ｐＭ〜２５０００ｐＭの範囲で決定される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ミオスタチン刺激アッセイにおける、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．２５ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満、約０．０５ｎＭ未満、または約０．０１ｎＭ未満のＩＣ５０によって特徴付けられる。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンＡアッセイにおける、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．２５ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満、約０．０５ｎＭ未満、または約０．０１ｎＭ未満のＩＣ５０によって特徴付けられる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏの投与は、対照と比べて筋肉量の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、筋肉量は、例えば、筋肉の重量である。いくつかの実施形態では、筋肉は、例えば、表１に示される１つ以上の骨格筋である。いくつかの実施形態では、筋肉は、横隔膜、三頭筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、腓腹筋、長指伸筋、腹直筋、四頭筋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、フォリスタチン−Ｆｃ投与は筋肥大をもたらす。いくつかの実施形態では、フォリスタチン−Ｆｃ投与は筋肉機能の改善をもたらす。
組み換えフォリスタチンまたは組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の生成
【０１５９】
本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、任意の利用可能な手段によって生成され得る。例えば、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質コード核酸を発現するように操作された宿主細胞系を利用することによって組み換えにより生成され得る。代替的または追加的に、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、内因性遺伝子を活性化することによって生成され得る。代替的または追加的に、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、化学合成によって部分的または完全に調製され得る。
【０１６０】
いくつかの例を挙げると、公知の発現システムとしては、例えば、大腸菌、卵、バキュロウイルス、植物、酵母、または哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞および／または以下に記載されるその他の哺乳類細胞が挙げられる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明のために好適な組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、哺乳類細胞で生成される。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ，ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６，ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣＣＲＬ  １６５１）、ヒト胎児由来腎臓株（懸濁培養液中増殖のためにサブクローンされたＨＥＫ２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９，１９７７）、ヒト繊維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ２１，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６，１９８０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１，１９８０）、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８，１９８２）、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒト以外の細胞またはヒト細胞から生成された組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＨＯ細胞またはＨＴ１０８０細胞から生成された組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【０１６３】
典型的には、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を発現するように操作された細胞は、本明細書に記載の組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含み得る。当然のことながら、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸は、制御配列、遺伝子制御配列、プロモーター、非コード化配列および／または組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を発現するためのその他の適切な配列を含み得る。典型的には、コード化領域は、これらの核酸構成要素のうちの１つ以上と動作可能に連結される。
【０１６４】
導入遺伝子のコード化領域は、特定の細胞型のコドン使用を最適化するための１つ以上のサイレント突然変異を含み得る。例えば、フォリスタチン導入遺伝子のコドンは、脊椎動物細胞の発現のために最適化されてもよい。いくつかの実施形態では、フォリスタチン導入遺伝子のコドンは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞での発現のために最適化され得る。いくつかの実施形態では、フォリスタチン導入遺伝子のコドンは、ヒト細胞の発現のために最適化され得る。
医薬組成物および投与
【０１６５】
本発明は、本発明による治療有効成分（例えば、組み換えフォリスタチンタンパク質、または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質）を、１つ以上の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と一緒に含む医薬組成物をさらに提供する。このような医薬組成物は、随意に１つまたは複数上の追加的治療活性物質を含んでもよい。
【０１６６】
本明細書に提供される医薬組成物の記述は、ヒトへの倫理的投与のために好適な医薬組成物を主に対象としているが、こうした組成物は一般的に全ての種類の動物への投与のために好適であることを当業者は理解するであろう。様々な動物への投与のために好適な組成物を与えるための、ヒトへの投与のために好適な医薬組成物の修正はよく理解されており、獣医学薬理学者の当業者であれば、もしある場合は単に通常の実験を用いて設計および／または実施することができる。
【０１６７】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で公知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、こうした調製方法は、有効成分を希釈剤または別の賦形剤もしくは担体および／または１つ以上のその他の副成分と関連付ける工程、そして次に必要な場合、および／または望ましい場合、製品を望ましい単一用量または複数用量単位へと成形および／または包装する工程を含む。
【０１６８】
本発明による医薬組成物は、バルクで、単一単位用量および／または複数の単一単位用量として、調製、包装、および／または販売されてもよい。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬組成物の個別量である。有効成分の量は、対象者に投与されることになる有効成分の投与量と一般的に等しい、かつ／またはこうした投与量の好都合な分数（例えば、このような投与量の半分または３分の１）である。
【０１６９】
本発明による医薬組成物中の有効成分、薬学的に許容可能な賦形剤または担体、および／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象者の身元、サイズ、および／または病状に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変化する。一例として、組成物は、０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。
【０１７０】
医薬製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤または担体をさらに含んでもよく、これは本明細書で使用される場合、望ましい特定の剤形のために適する、あらゆるすべての溶媒、分散媒体、希釈剤、またはその他の液体溶媒、分散または懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤およびこれに類するものを含む。ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＴｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６；  参照により本明細書に組み込まれる）は、医薬組成物の処方およびその調製のための公知技法に使用される様々な賦形剤を開示している。任意の従来の賦形剤または担体が、何らかの望ましくない生物学的効果を生じるか、そうでなければ医薬組成物のその他任意の構成要素と有害な様式で有害な方法で相互作用することにより、物質またはその誘導体と不適合な場合を除き、その使用は本発明の範囲内であると考えられる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤または担体は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの実施形態では、賦形剤または担体は、ヒトおよび獣医での使用のために承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤または担体は、米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤または担体は医薬品グレードである。いくつかの実施形態では、賦形剤または担体は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たしている。
【０１７２】
医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容可能な賦形剤または担体には、不活性な希釈剤、分散剤、および／または造粒剤、表面活性薬剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、および／または油が挙げられるがこれらに限定されない。こうした賦形剤または担体は随意に、医薬製剤に含まれ得る。処方者の判断により、組成物中には、ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤または担体、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、および／または着香剤が存在することができる。
【０１７３】
好適な薬学的に許容可能な賦形剤または担体としては、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアガム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロース、またはデンプンなど）、糖類（マンニトール、スクロース、またはその他など）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、およびそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。所望であれば、医薬品調製物は、活性化合物と有害に反応しない、またはその活性を妨害しない補助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、緩衝液、着色剤、香味および／または芳香物質など）と混合することができる。好ましい実施形態では、静脈内投与のために好適な水溶性担体が使用される。
【０１７４】
望ましい場合、好適な医薬組成物または薬剤は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはＰｈ緩衝剤も含むことができる。組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、または粉末とすることができる。組成物はまた、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体とともに、坐剤として製剤化することができる。口腔製剤としては、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を挙げることができる。
【０１７５】
医薬組成物または薬剤は、ヒトへの投与のために適合された医薬組成物として日常的な手順に従って製剤化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、静脈内投与のための組成物は典型的には、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は可溶化剤および注射部位の痛みを緩和する局所麻酔も含み得る。一般的に、成分は、例えば、有効成分の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封された容器中、乾燥凍結粉末または無水濃縮物として、単位剤形で別個にまたは一緒に混合されて供給される。組成物が注入によって投与される場合、組成物は、滅菌医薬品グレード水、生理食塩水、またはデキストロース／水を含む注入瓶とともに分与することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合してもよいように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１７６】
本明細書に記載される組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、中性形態または塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離アミノ基で形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する遊離カルボキシル基で形成されるものが挙げられる。
【０１７７】
医薬品の製剤および／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
【０１７８】
投与経路
本明細書に記載の組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質（または本明細書に記載の組み換えフォリスタチンタンパク質を含有する組成物もしくは薬剤）は、任意の適切な経路によって投与される。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質、またはそれを含有する医薬組成物は、全身投与される。全身投与は、静脈内、皮内、吸入、経皮（局所的）、眼内、筋肉内、皮下、筋肉内、経口、および／または経粘膜投与であり得る。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質またはそれらを含有する医薬組成物は、皮下投与される。本明細書で使用される場合、「皮下組織」という用語は、皮膚のすぐ下の緩い、不規則な結合組織の層として定義される。例えば、皮下投与は、大腿部領域、腹部領域、臀部領域、または肩甲骨領域を含むがこれらに限定されない区域に組成物を注入することによって実施され得る。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質またはそれらを含有する医薬組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質またはそれらを含有する医薬組成物は、経口投与される。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質またはそれらを含有する医薬組成物は、筋肉内投与される。例えば、筋肉内投与は、大腿部領域、腹部領域、臀部領域、肩甲骨領域の筋肉、または表１に開示される任意の筋肉を含むがこれらに限定されない区域に組成物を注入することによって実施され得る。望ましい場合、２つ以上の経路を同時に使用することができる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、投与は、個人に局所的効果のみを生じさせる一方、他の実施形態では、投与は、個人の複数の部分全体を通して効果をもたらし、例えば、全身効果をもたらす。典型的には、投与は、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の１つ以上の標的組織への送達をもたらす。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、心臓、脳、脊髄、横紋筋（例えば、骨格筋）、平滑筋、腎臓、肝臓、肺、および／または脾臓を含むがこれらに限定されない、１つ以上の標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、心臓に送達される。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、横紋筋、特に骨格筋に送達される。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、三頭筋、前脛骨筋、ヒラメ筋、腓腹筋、二頭筋、僧帽筋、三角筋、四頭筋、および／または横隔膜に送達される。
【０１８０】
剤形および投与レジメン
いくつかの実施形態では組成物は、治療有効量で、かつ／または特定の望ましい転帰（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーの治療またはリスク低減）と相関する投与レジメンに従って投与される。
【０１８１】
本発明に従って投与される特定の用量または量は、例えば、望ましい転帰の性質および／または程度、投与の経路および／またはタイミングの詳細、ならびに／または１つ以上の特徴（例えば、体重、年齢、個人歴、遺伝的特性、ライフスタイルパラメータ、心臓障害の重症度および／もしくは心臓障害リスクの程度など、またはその組み合わせ）に応じて、変動し得る。こうした用量または量は、当業者によって決定することができる。いくつかの実施形態では、適切な用量または量は、標準的な臨床技法に従って決定される。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、適切な用量または量は、投与される望ましい量または最適な投与範囲または量を特定するのに役立つ１つ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの使用を通して決定される。
【０１８２】
様々な実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質は治療有効量で投与される。一般に、治療有効量は、対象者に対して有意義な利益を達成するのに十分である（例えば、基礎疾患または病状の治療、調節、治癒、予防および／または改善）。いくつかの特定の実施形態では、投与される適切な用量または量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から外挿によって推定される場合がある。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーの治療用の治療有効量のフォリスタチン−Ｆｃは、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、静脈内投与される治療有効量は、動物またはヒトの体重の約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇであるが、この例示的範囲より上またはそれより下の投与量も本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、動物またはヒトの体重の約０．５ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇである（すなわち、治療有効量は約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、６０、６５、７０、または約７５ｍｇ／ｋｇである）。いくつかの実施形態では、静脈内投与される治療有効量は、約５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇである。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、治療有効量は、約５．０〜１８．０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５および１８．０  ｍｇ／ｋｇ、ならびにその間の任意の値）で静脈内投与される。いくつかの実施形態では、有効量は少なくとも約８ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、月に１回行われる。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、月に２回行われる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーの治療のためのフォリスタチン−Ｆｃ治療有効量が皮下投与される。いくつかの実施形態では、皮下投与される治療有効量は、動物またはヒトの体重の約２０ｍｇ／ｋｇ〜１１０ｍｇ／ｋｇである（すなわち、治療有効用量は約２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、または約１１０ｍｇ／ｋｇである）。いくつかの実施形態では、皮下投与される治療有効用量は、動物またはヒトの体重の約１．０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである（すなわち、治療有効量は約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および約５０ｍｇ／ｋｇである）。いくつかの実施形態では、皮下投与される治療有効量は、約３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇである。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーの治療のためのフォリスタチン−Ｆｃ治療有効量が皮下投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量が約１．５〜７．０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５および７．０  ｍｇ／ｋｇ、ならびにその間の任意の値）で皮下投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量は少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量は少なくとも約３．０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、皮下投与は、週に１回行われる。いくつかの実施形態では、皮下投与は、週に２回行われる。いくつかの実施形態では、皮下投与は、２週間に１回行われる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、フォリスタチン−Ｆｃタンパク質は、用量比例性を有する。いくつかの実施形態ではであるフォリスタチン−Ｆｃタンパク質は、用量直線性を有する。いくつかの実施形態では、投与用量の増加が曝露および転帰の比例的増加を伴う場合、用量比例性および／または用量直線性が生じる。いくつかの実施形態では、投与用量が高いほど、有益な転帰に対する効果が大きくなる。いくつかの実施形態では、治療された対象者の体重は、用量に依存する様式で増加する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、フォリスタチン−Ｆｃ投与は筋肥大をもたらす。いくつかの実施形態では、フォリスタチン−Ｆｃ投与は筋肉機能の改善をもたらす。いくつかの実施形態では、四頭筋および横隔膜の病理は、操作されたフォリスタチン治療に伴い改善される。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーを有する対象者のフォリスタチン−Ｆｃ治療は、ミオスタチン拮抗薬を用いた治療より大きい筋肉機能の改善をもたらす。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーを有する対象者のフォリスタチン−Ｆｃ治療は、ミオスタチン拮抗薬を用いた治療より大きい筋肉病理の改善をもたらす。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、提供される組成物は医薬製剤として提供される。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーの発生率またはリスクの低減の達成と相関する投与レジメンに従って投与するための単位用量量であるか、またはそれを含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤は、単回投与として投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤は、一定の間隔で投与される。本明細書で使用される場合、ある「間隔」での投与は、治療有効量が定期的に投与されること（単回投与と区別される）を示す。間隔は、標準的な臨床技法によって決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤は、隔月、毎月、月に２回、３週間ごと、隔週、毎週、週に２回、週に３回、毎日、１日に２回、または６時間ごとに投与される。単一の個人に対する投与間隔は、固定間隔である必要はなく、個人のニーズに応じて経時的に変更することができる。
【０１９１】
本明細書で使用される場合、「隔月」という用語は２ヶ月に１回（すなわち、２ヶ月ごとに１回）の投与を意味し、「毎月」という用語は月に１回の投与を意味し、「３週間ごと」という用語は３週間に１回（すなわち、３週間ごとに１回）の投与を意味し、「隔週」という用語は、２週間に１回（すなわち、２週間ごとに１回）の投与を意味し、「毎週」という用語は週に１回の投与を意味し、「毎日」という用語は１日に１回の投与を意味する。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤は、一定の間隔で無期限に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤は、一定の間隔で定められた期間の間投与される。
【０１９３】
本明細書に記載されるように、「治療有効量」という用語は、本発明の医薬組成物に含まれる治療薬の総量に基づいて主に決定される。治療有効量は、複数の単位用量を含んでもよい投与レジメンで一般的に投与される。任意の特定の組成物については、治療有効量（および／または有効投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路または他の医薬品との組み合わせに依存して異なり得る。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の投与は、少なくとも１つのＤＭＤの兆候もしくは症状の強度、重症度、もしくは頻度を低減させるか、または開始を遅延させる。いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の投与は、筋消耗、骨格変形、心筋症、筋虚血、認知機能障害、および呼吸機能障害からなる群から選択される少なくとも１つのＤＭＤの兆候もしくは症状の強度、重症度、もしくは頻度を低減させるか、または開始を遅延させる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の投与は、６分間歩行試験、定量的筋力試験、時間運動能力試験によって測定された臨床的転帰を改善する。ＢｒｏｏｋｅおよびＶｉｇｎｏｓ四肢機能スケール、肺機能試験（努力性肺活量、１秒量、最大呼気流量、最大吸気圧および呼気圧）、健康関連の生活の質、膝および肘屈筋、肘伸筋、肩外転、握力、背臥位からの立ち上がり所要時間、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、１０メートル歩行／走行時間、Ｅｇｅｎ−Ｋｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎスケール、Ｇｏｗｅｒｓスコア、Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ運動能力、徒手筋力計、可動域、ゴニオメトリー、高炭酸ガス血症、Ｎａｙｌｅｙ乳幼児発達尺度、および／または介護者負担感尺度。
【０１９６】
併用療法
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質は、筋ジストロフィーの治療に現在使用されている１つ以上の公知の治療薬（例えば、コルチコステロイド）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、公知の治療薬は、その標準的もしくは承認された投与レジメンおよび／またはスケジュールに従って投与される。いくつかの実施形態では、公知の治療薬は、その標準的もしくは承認された投与レジメンおよび／またはスケジュールと比較して改変されたレジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、こうした改変されたレジメンは、１つ以上の単位用量の量が改変されている（例えば、低減または増加）という点で、および／または投与の頻度が改変されている（例えば、単位用量間の１つ以上の間隔が拡大され、結果的に頻度がより低くなる、または間隔が低減され、結果的に頻度がより高くなる）という点で、標準的または承認された投与レジメンとは異なる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、組み換えフォリスタチンタンパク質または組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上の追加的治療薬と組み合わせて投与される。一実施形態では、追加的治療薬はコルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）である。別の実施形態では、追加的治療薬はグルココルチコイド（例えば、デフラザコート）である。別の実施形態では、追加的治療薬は抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合性断片である。別の実施形態では、追加的治療薬はＲＮＡ調節治療薬である。ＲＮＡ調節治療は、エクソンスキッピング治療または遺伝子治療であってもよい。ＲＮＡ調節治療薬は、例えば、Ｄｒｉｓｐｅｒｓｅｎ、ＣＡＴ−１００４、ＦＧ３０１９、ＰＲＯ０４４、ＰＲＯ０４５、Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ（ＡＶＩ−４６５８）、ＳＲＰ−４０５３、ＳＲＰ−４０４５、ＳＲＰ−４０５０、ＳＲＰ−４０４４、ＳＲＰ−４０５２、ＳＲＰ−４０５５、またはＳＲＰ−４００８であってもよい。いくつかの実施形態では、追加的治療薬は、筋ジストロフィーの治療に現在使用されている。他の実施形態では、追加的な治療薬は、他の疾患または障害を治療するためにも使用される場合がある。いくつかの実施形態では、公知の治療薬は、その標準的もしくは承認された投与レジメンおよび／またはスケジュールに従って投与される。いくつかの実施形態では、公知の治療薬は、その標準的もしくは承認された投与レジメンおよび／またはスケジュールと比較して改変されたレジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、こうした改変されたレジメンは、１つ以上の単位用量が量的に改変されている（例えば、低減または増加）という点で、および／または投与の頻度が改変されている（例えば、単位用量間の１つ以上の間隔が拡大され、結果的に頻度がより低くなる、または間隔が低減され、結果的に頻度がより高くなる）という点で、標準的または承認された投与レジメンとは異なる。
【実施例】
【０１９８】
実施例
実施例１．フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質はミオスタチンを標的とする
この実施例は、標的リガンドおよび非標的リガンドに結合しているフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を例示する。理論に束縛されるものではないが、ミオスタチンおよびアクチビンＡによるＳｍａｄ２／３経路の活性化は、筋原性タンパク質発現の阻害につながり、結果として筋芽細胞は筋肉へと分化しないと考えられる。したがって、ミオスタチンおよびアクチビンＡは、筋肉再生の刺激のために実行可能な標的と見なされる。しかしながら、可溶性アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＳａｃＴｒｉＩＢ）などの多くのミオスタチンおよびアクチビンＡ拮抗薬も、ある特定の構造的類似性に起因して骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に結合する。ＢＭＰ、特にＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０は、身体全体を通して組織構造を編成する中心的な形態形成シグナルであると見なされる。こうしたＢＭＰの阻害は、望ましくない病的状態につながる場合がある。フォリスタチンはまた、３つのＦＳドメインのうちの最初において、塩基性ヘパリン結合配列（ＨＢＳ）を通して細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンにも結合する。理論に束縛されるものではないが、例えば、ＨＢＳの突然変異または欠失による、ヘパリン結合の不活性化、低減または調節は、フォリスタチンおよび／またはフォリスタチン融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ曝露および／または半減期を増加し得る。下記に詳細に説明するように、本実施例で説明される実験的データは、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質が、高い親和性を有するミオスタチンを特異的に標的とし、かつ非標的ＢＭＰまたはヘパリンには意義のある親和性で結合しないことを確認する。
【０１９９】
具体的には、ミオスタチン、アクチビンＡ、ヘパリンＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０に対するフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性（ＫＤ）および動態を、以下に説明されるように、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイおよび標準方法を使用して評価した。
【０２００】
ミオスタチンに対する結合親和性および動態を決定するために、抗ヒトＦｃ（ＧＥカタログ番号ＢＲ−１００８−３９）を、１０μｌ／分の流量で４２０秒間、２つのフローセルＣＭ５チップの上へと固定化した。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋であった。すべての試料および対照を、ランニング緩衝液を使用して１０μｇ／ＭＬに希釈した。ミオスタチン（４ｍＭのＨＣｌ中０．１ｍｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号７８８−Ｇ８−０１０／ＣＦ）を、２５ｋＤａの分子量に基づいて０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、および５ｎＭに希釈した。アッセイは、５０μＬ／分の流量で８秒の捕捉設定、５０μＬ／分の流量で３００秒間の会合および５０μＬ／分の流量で１２００秒間の解離に続いて、３ＭのＭｇＣｌ２を使用した６０μＬ／分の流量で３０秒間の再生を行うことにより実施した。
【０２０１】
アクチビンＡの結合親和性および動態を決定するために、抗ヒトＦｃ（ＧＥカタログ番号ＢＲ−１００８−３９）を、１０μＬ／分の流量で４２０秒間、２つのフローセルＣＭ５チップの上へと固定化した。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋であった。すべての試料および対照を、ランニング緩衝液を使用して１０μｇ／ＭＬに希釈した。アクチビンＡ（４ｍＭのＨＣｌ中０．１ｍｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３３８−ＡＣ−０５０  ＣＦ）を、２６ｋＤａの分子量を使用して０．１５６、０．３１２５、０．６２５、１．２５、および２．５ｎＭに希釈した。
【０２０２】
ヘパリンの結合親和性および動態を決定するために、ビオチニル化ヘパリンを１ｍｇ／ｍＬでアッセイ当日に調製し、次にＨＢＳ＋Ｎ中で１００μｇ／ｍＬへと希釈した。ストレプトアビジンチップフローセルを、ＨＢＳ＋Ｎ緩衝液を使用して５μＬ／ｍｉｎで１００μｇ／ｍＬにて５分間、固定化することにより調製した。試料を、ＨＢＳ＋ＥＰ中で０．３１ｎＭ〜２５ｎＭの濃度まで希釈した。アッセイは、３０μＬ／分の流量で３００秒の会合時間、および３００秒の解離時間を使用し、続いて３０秒間４ＭのＮａｃｌで再生し、直ちに４ＭのＮａｃｌで３０秒間第２の再生成を行うことによって実施された。
【０２０３】
ＢＭＰ−９および／またはＢＭＰ−１０に対する結合親和性および動態を決定するために、抗ヒトＦｃを、ＣＭ５チップ上で、およそ６０００〜９０００ＲＵでＦＣ３およびＦＣ４に結合した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質が、ＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０への結合に対する陽性対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３３９−ＲＢＢ−１００）として使用された。ＢＭＰ−９結合の分析については、すべての試料を２．５μｇ／ｍＬに希釈し、またランニング緩衝液はＨＢＳ＋ＥＰであった。ＢＭＰ−１０結合の分析については、すべての試料を５μｇ／ｍＬに希釈し、またランニング緩衝液はＨＢＳ＋ＥＰ＋０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡであった。分析条件としては、１８０秒の接触時間、３００秒の解離時間、および３０μＬ／分の流量が挙げられる。ＢＭＰ−９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３２０９−ＢＰ−０１０ＣＦ）およびＢＭＰ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９２６−ＢＰ−０２５ＣＦ）を２５ｎＭから０．１９ｎＭへと３倍系列希釈法で希釈した。例示的な結果を表８Ａおよび表８Ｂに示す。
【表８Ａ−１】
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【表８Ａ−２】
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【表８Ａ−３】
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【表８Ｂ】
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【０２０４】
表８に示されるように、フォリスタチン融合タンパク質は高い親和性でミオスタチンと結合するが、ＢＭＰ−９および／またはＢＭＰ−１０とは結合しない。ＢＭＰ−１０に結合するフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を試験する研究では、試験範囲（２５０００〜１９０ｐＭ）内では運動定数は決定されなかった。これは、最も弱いミオスタチン結合ＫＤよりもおよそ４３０倍高い結合親和性を表す。ＢＭＰ−９に結合するフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質を試験する研究では、試験範囲（２５０００〜１９０ｐＭ）内では運動定数は決定されなかった。これは、最も弱いミオスタチン結合ＫＤよりもおよそ１４００倍高い結合親和性を表す。
【０２０５】
実施例２  ＦＳ  ＨＢＳ内の塩基性モチーフ（ＢＢＸＢ）の電荷はヘパリン結合親和性に影響する
抗体Ｆｃ断片に融合した場合でさえも、天然ＦＳの急速なヘパリン媒介性肝クリアランスは、その治療能力を制限する。この制限を克服するために、部位特異的突然変異誘発によるヘパリン結合活性の調節のためにＦＳのヘパリン結合ループを標的とした。ＦＳ２８８アイソフォームヘパリン結合モチーフ（（Ｋ（７５，７６）Ａ、Ｋ（８１，８２）ＡおよびＫ（７６，８１，８２）Ａ）内のリシン残基の突然変異は、競合アッセイでのヘパリン結合の減少をもたらした。２つのＢＢＸＢモチーフ内の正に荷電した残基を、負電荷を有するアミノ酸で置換すると、アラニン置換で見られるものよりもさらに大きなヘパリン結合の減少をもたらすと仮定した。この仮説を試験するために、Ｋ（８１，８２）Ｅ、Ｋ（８１，８２）Ｄ、Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ、およびＫ（７６，８１，８２）Ｄバリアントを生成し、Ｋ（８１，８１）ＡおよびＫ（７６，８１，８２）Ｄと比較した。いくつかの実施形態では、本明細書に示されるバリアントおよび野生型は、ヒトｇＧ１  Ｆｃ部分に直接融合したＦＳ３１５アイソフォームの組み換えタンパク質である。ＦＳバリアントとヘパリンとの間の結合相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を使用して測定された。結合親和性を測定し、平衡解離定数（ＫＤ）により報告した（表８Ａおよび８Ｂ）。より負電荷の残基に置換した後、Ｋ（８１，８２）ＥおよびＫ（８１，８２）Ｄは両方とも、Ｋ（８１，８２）Ａと比較してヘパリン結合が７〜１３分の１に低減し、さらなるヘパリン結合活性の低下を示した。一貫して、三重バリアントＫ（７６，８１，８２）ＥおよびＫ（７６，８１，８２）Ｄも、Ｋ（７６，８１，８２）Ａと比較して親和性が大きく低減していた。ＥおよびＤ三重バリアントの両方を含有する分子は、試験範囲内では検出可能なヘパリン結合を有しなかった。しかしながら、ヘパリンＳＰＲ結合ＫＤはＫ（７６，８１，８２）Ａに対して９．４ｎＭであり、二重Ｋ（８１，８２）ＥおよびＫ（８１，８２）Ｄバリアントと同等またはより強い親和性を有した。これらのデータは、負の荷電がより少ないしたアミノ酸との置換で、中性アミノ酸で置換された複数部位と同じようにヘパリン結合を低減させることができることを示す。まとめると、ＦＳ  ＨＢＳ内の塩基性ＢＢＸＢモチーフの電荷の変化が、ヘパリンへの結合親和性に有意に影響を及ぼすことをこれらのデータは示した。
【０２０６】
このデータはまた、２つのＢＢＸＢモチーフが改変された三重Ｋ（７６，８１，８２）ＥおよびＫ（７６，８１，８２）Ｄバリアントは、２つのＢＢＸＢモチーフのうちの１つだけが改変された二重Ｋ（８１，８２）ＥおよびＫ（８１，８２）Ｄバリアントと比較して親和性のより大きな低減を示すことも実証し、両方のモチーフがヘパリン結合に貢献することを示した（表８Ｂ）。ヘパリン結合親和性に対する２つのＢＢＸＢモチーフ内の主要な塩基性残基の役割をさらに理解するために、１つ、２つまたは３つの塩基性残基を負に荷電したグルタミン酸Ｅで置換した一連のバリアントを生成した。より大きな変化を有する２つのＨＢＳバリアントも生成された：１）ＨＢＳ（残基７５〜８６）が、ヘパリン結合能力を持たないＦＳＤ２（残基１４８〜１５９）からの対応セグメントで置換されたＨＢＳ置換バリアントΔＨＢＳ、および２）コア１２ａａ  ＨＢＳが欠失しているＨＢＳ欠失バリアントｄｅｌ７５−８６（配列は図８Ａおよび８Ｂにリストされる）。細胞ベースのアッセイにおいて、ｈＦｃと融合した組み換え野生型ＦＳ３１５アイソフォームは、ミオスタチンおよびアクチビンに対して、天然ＦＳ３１５（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号４８８９−ＦＮ／ＣＦ）と同様の効力を有していた。この均等物は「野生型」と名付けられ、全体を通して対照として使用された。ＳＰＲ結合データは、１つ、２つ、または３つのグルタミン酸置換を有するバリアントのすべてが、野生型と比較して異なる程度の親和性の低下を有することを示した（試験範囲内で４〜１００倍の低下または検出不能な結合）（表８Ｂ）。データは、グルタミン酸置換の程度が増すと、ヘパリン結合が漸進的に低減することを示した。例えば、ヘパリン結合ＫＤ値は、Ｋ８２Ｅ、Ｋ（８１，８２）Ｅ、およびＫ（７６，８１，８２）Ｅに対してそれぞれ１．５ｎＭ、１０．７ｎＭおよび検出不能な結合であった。Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ、ΔＨＢＳ、およびｄｅｌ７５−８６バリアントはすべて、類似したヘパリン結合消失を示し（表８Ｂ）、ＦＳヘパリン結合親和性が３つの負に荷電した点突然変異で効果的に消滅したことを示した。
【０２０７】
異なるバリアントを評価することにより、２つのＦＳ  ＢＢＸＢモチーフにおける塩基性残基の役割に関して次の結論が引き出された。第一に、Ｋ（８１，８２）Ｅ（ＫＤ  １０．７ｎＭ）はＫ（７５，７６）Ｅ（ＫＤ  １．１ｎＭ）と比べて、結合がおよそ１０倍弱いことで示されるように、第二のＢＢＸＢモチーフＫＫＮＫ（８１〜８４）は第一のＢＢＸＢモチーフＫＫＣＲ（７５〜７８）よりもヘパリン結合において主要な役割を果たした（表８Ｂ）。第二に、ＦＳ  ＢＢＸＢモチーフのそれぞれにおける第三の塩基性残基は、ヘパリン結合に対してはるかに弱い効果を有していた。データ（表８Ｂ）は次のことを示した；１）両方のモチーフ内に第二の塩基性残基突然変異を有する二重バリアントＫ（７６，８２）Ｅは、両方のモチーフに第三の塩基性残基Ｒ７８／Ｋ８４を有する二重バリアントＲ７８／Ｋ８４よりも結合が５倍弱い；２）Ｋ８２Ｅ、Ｋ７８Ｅ／８２Ｅ、およびＫ（８２，８４）ＥのＫＤは、それぞれ１．５ｎＭ、１．３ｎＭ、および１．１ｎＭであり、第３の塩基性残基の突然変異を各モチーフ（Ｒ７８ＥおよびＫ８４Ｅ）からＫ８２Ｅバリアントへと加えることは結合親和性に影響を及ぼさなかった；３）Ｋ（８１，８２）ＥバリアントはＫ（８２，８４）Ｅバリアントよりもヘパリンへの結合が約１０倍弱く（１０．７ｎＭ対１．１ｎＭ）、Ｋ（７６，８１，８２）ＥはＫ（７６，８２，８４）Ｅよりも結合親和性もはるかに弱く、Ｋ８４の軽微な役割を示した。いくつかの実施形態では、ヘパリン結合について、ＦＳ  ＢＢＸＢモチーフでは第一の２つの塩基性残基が、第三の塩基性残基よりも重要であることをデータは示した。まとめると、これらのデータは、アミノ酸置換の量、アミノ酸置換の位置、および残基の電荷がヘパリン結合親和性に影響を及ぼすことを実証した。
【０２０８】
実施例２  ＦｃＲｎ受容体に結合するフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質
Ｆｃドメイン内のいくつかの突然変異は、ＦｃＲｎ受容体との結合の低減につながり、これによってｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期が低減された。フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃＲｎ受容体への結合親和性を、標準的な方法を使用して評価した。例示的結果が表９に示されている。
【表９】
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【０２０９】
Ｆｃドメイン内のいくつかの突然変異は、ＦｃガンマＩＡ受容体との結合の低減につながり、これによってエフェクター機能が低下した。フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のガンマＩＡ受容体への結合親和性を、標準的な方法を使用して評価した。フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のガンマＩＡ受容体への結合親和性を、標準的な方法を使用して評価した。
【０２１０】
Ｆｃガンマ受容体ＩＡに対する結合親和性を決定するために、フォリスタチン−Ｆｃタンパク質を、酢酸ナトリウムｐＨ５．０中で、２．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＣＭ５チップ上で約１５０ＲＵにて固定化した。Ｆｃガンマ受容体ＲＩＡは、凍結乾燥ストックとしてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号１２５７−ＦＣ−０５０）から購入した。Ｆｃガンマ受容体ＩＡの分析については、ランニング緩衝液はＨＢＳ−Ｐ＋であった。分析条件としては、１８０秒の接触時間、６００秒の解離時間、および３０μＬ／分の流量が挙げられる。再生条件は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）、５００ｍＭのＮａＣｌを３０μＬ／分で１０秒間、３０秒の安定性であった。Ｆｃガンマ受容体ＩＡを６２．５ｎＭ〜０．４９ｎＭに希釈した。例示的な結果が表１０に示されている。
【表１０】
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【０２１１】
実施例３  フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は血清半減期を延長した
いくつかの実施形態では、ヘパリンへの結合親和性はｉｎ  ｖｉｖｏのＰＫプロファイルに影響する。フォリスタチンは、短い血清半減期を有することが報告されている。例えば、典型的な市販のＦＳ３１５タンパク質は、約１時間の血清半減期を有する。この例では、図３Ａ、図３Ｂ、および表１１に示す様々な突然変異を含むフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、比較タンパク質と比較して有意に延長された血清半減期を有することが決定された。
【０２１２】
表１１．投与後、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の血清レベルを様々な時点で収集した（図３Ａおよび図３Ｂ）。組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期は、４５．７〜１９４時間の範囲であった。
【０２１３】
塩基性ＢＢＸＢモチーフの突然変異誘発によって、異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏヘパリン結合親和性を有する一連のバリアントが生成された。ヘパリン結合は、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの会合に対する代用であり、これはｉｎ  ｖｉｖｏでの多くのタンパク質の内部移行およびクリアランスのための重要なプロセスである。マウスでの薬物動態について調節されたヘパリン結合を研究した。異なるヘパリン結合親和性を有する選択されたＨＢＳバリアントを、単一静脈内用量で（１ｍｇ／ｋｇ）メスのＣＤ１マウスに投与した。これらの分子の血清曝露を、投与後１６８時間までモニターした。１．０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後、野生型は３０ｍＬ／時間／ｋｇのクリアランス速度および６８時間の半減期を有し、ΔＨＢＳバリアントははるかに低いクリアランス（１．３ｍＬ／時間／ｋｇ）および長い半減期（９２時間）を有し（表１２）、ＦＳ３１５−ｍＦｃおよびＦＦＳ３１５ΔＨＢＳ−ｍＦｃの報告値と一致した。新たに設計されたヘパリン結合バリアントのすべてが、野生型と比較して改善されたＰＫプロファイルを示した（図３Ａ、表１１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヘパリン結合親和性の低減は、野生型と比較した場合、曲線下面積（ＡＵＣ）として測定される曝露の増加、およびクリアランスの低減（２〜２５分の１の範囲）と相関していた（図３Ａおよび３Ｂ、図４Ａおよび４Ｂ）。操作されたバリアントの大部分は、半減期の延長も示した（表１１）。データは、ｉｎ  ｖｉｖｏのＰＫ特性に対するヘパリン結合の重大な影響を明確に実証する。
【０２１４】
以前のレポートでは、組み換えＦＳ３１５ΔＨＢＳタンパク質は、マウスにおいて組み換え野生型と比較して、ＡＵＣおよび半減期を約８倍〜約３倍改善することが示されている。測定可能なヘパリン結合を示さなかったＫ（７６，８１，８２）Ｅバリアントは、野生型と比較して、ＡＵＣの約２５倍の改善および半減期の約２倍の改善を示した（表１１）。さらに、Ｋ（７６，８１，８２）Ｅは、発明者らの研究のΔＨＢＳバリアントと比較して、タンパク質発現の増加および凝集の低減を含む、より良好な発展性特性も示した（表１１）。本明細書に記載のＰＫプロファイルの改善および発展性特性に基づき、ヒトＦｃまたはマウスＦｃのいずれかに融合されたＫ（７６，８１，８２）Ｅバリアントが薬力学試験に使用され、用量に依存した様式で筋肉量の著しい増加および機能的改善をもたらした。
【表１１】
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【０２１５】
実施例４  フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質はミオスタチンおよびアクチビンＡを阻害する
ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイを使用して、フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質がミオスタチンおよびアクチビンＡ活性を阻害する能力を試験した。横紋筋肉腫Ａ２０４細胞が、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２−Ｌｕｃプラスミドを用いて安定的に形質移入され、これはホタルルシフェラーゼ遺伝子の前にＳｍａｄ３選択的応答要素を含有する。１．２ｎＭのミオスタチンまたはアクチビンＡをＳｍａｄ３シグナル伝達の刺激に使用した。融合タンパク質を細胞に添加する前に、ミオスタチンまたはアクチビンＡのいずれかとともに室温で３０分間インキュベートし、次に３７℃で２４時間インキュベーションした後、ルシフェラーゼ活性を測定した。シグナル伝達アッセイに使用されたミオスタチンまたはアクチビンＡの濃度は１．２ｎＭであった。表１４に示されるように、  刺激アッセイ内でフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質はミオスタチンを阻害し、ＩＣ５０は、０．５ｎＭ未満〜１．５ｎＭ超の範囲であった。表１２に示されるように、刺激アッセイ内でフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質はアクチビンＡを阻害し、ＩＣ５０は、０．５ｎＭ未満〜１．５ｎＭ超の範囲であった。
【０２１６】
負に荷電したアミノ酸で置換されたＦＳ３１５−ｈＦｃバリアントの中のヘパリン結合親和性について観察された大きな差異（野生型と比較して４〜１００分の１未満に低減）とは対照的に、本バリアントはミオスタチンに対する結合親和性の変化をほとんど示さなかった。ＳＰＲ方法によって決定されたＫＤ値を、表８Ａおよび８Ｂに要約する。いくつかのヘパリン結合バリアントは、ＳＰＲアッセイによりミオスタチン結合親和性が中程度に改善した（野生型と比較して１．５〜５倍の誘導）。ＨＢＳ欠失バリアントｄｅｌ７５−８６は、野生型と比較して、ミオスタチン結合親和性が３分の１に低減を示した。バリアントがＦＳ生物学的機能を変化させるかどうかを決定するために、バリアントのサブセットを選択し、Ａ２０４横紋筋肉腫細胞においてＳＭＡＤ２／３ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、ミオスタチンおよびアクチビンＡ誘発性Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達のバリアントのサブセットによる阻害を評価した。１つ、２つ、または３つの点突然変異を有するすべてのヘパリン結合バリアントについて、ミオスタチンおよびアクチビンシグナル伝達阻害の効力は類似しており、野生型と同等であった（表１２および図２Ａ）。ＨＢＳ欠失（ｄｅｌ７５−８６）バリアントは、細胞ベースのアッセイで野生型と比較して、ミオスタチン阻害が約２０分の１に、またアクチビン阻害が約５分の１に低減していた（表１２および図２Ａ）。しかしながら、ＨＢＳ置換バリアントΔＨＢＳに対する機能的低減はなく（表１２）、アミノ酸７５〜８６の欠失が分子の構造を変化させ得ることを示唆している。
【０２１７】
ＢＢＸＢモチーフでの突然変異をＳＰＲによって試験し、これらの突然変異が組み換えバリアントのＦｃ部分とＦｃＲｎとの相互作用に影響を及ぼすかどうかを評価した。この突然変異はＣ末端融合Ｆｃ領域から遠いＦＳＤ１のＨＢＳ領域に位置するため、データは、野生型と比較して我々のヘパリン結合バリアントのＦｃＲｎに明白な親和性変化がなかったことを示している（表８Ａおよび８Ｂ）。負に荷電したアミノ酸置換を有するバリアントの大部分、ならびにΔＨＢＳおよびｄｅｌ７５−８６バリアントについては、等電点（ｐＩ）は酸性範囲にシフトした（表８Ｂ）。
【表１２】
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【０２１８】
実施例５  フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質−全身投与のＩｎ  ｖｉｖｏ有効性
この実施例は、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内または皮下投与されたフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ＨｆＣｌＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃ）の、野生型マウスおよびデュシェンヌ型筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルへの全身投与が、ｉｎ  ｖｉｖｏの筋肉量の増加傾向をもたらすことを示す。
【０２１９】
具体的には１つの研究では、雄のＣ５７ＢＬ／６（野生型マウス）に溶媒（すなわち、ＰＢＳ）またはＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡを、１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射するかまたは２０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射することにより週に２回、４週間投与した。第二の試験では、雄のｍｄｘマウスに溶媒（すなわち、ＰＢＳ）またはＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃを、１０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射するか、またはマウス溶解性アクチビン受容体タイプＩＩＢキメラＦｃ融合（ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ）を、３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射することにより、週に２回、１２週間投与した。最後の治療の２４時間後に、マウスを屠殺し、腓腹筋および四頭筋を採取し、重量を計測した。表１３の例示的なデータは、溶媒のみで治療された腓腹筋および四頭筋と比較して、ｍｄｘおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方の腓腹筋または四頭筋の重量には著しい増加があったことを示す。それゆえに、野生型マウスおよびＤＭＤの動物モデルに全身投与した時、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質が筋肉量を増加させることが明確な指標があった。ｍｄｘ研究では、前肢の握力を投与から１１週間後に測定した。図７の例示的データは、溶媒のみで治療された動物の握力と比較して、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃで治療されたｍｄｘマウスの前肢の握力が有意に増加したことを示す。ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃで治療した動物に対する握力の度合いは、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ陽性対照で治療したマウスよりも大きく、野生型Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎＪマウスよりも大きかった。
【表１３】
2020519291.tif 000037
【０２２０】
実施例６：フォリスタチン構築物の特徴付け
この実施例は、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内または皮下投与されたフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｍＦｃ）の、野生型マウスおよびデュシェンヌ型筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルへの全身投与が、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋肉量の増加傾向をもたらすことを実証する。
【０２２１】
フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質に対するｐＩの変化も評価した。以下の表１４は、ＨＢＳでのＥおよびＤ突然変異ならびに高グリコシル化バリアントにおける、より酸性のｐＩへのシフトを示す。ｐＩのシフトは、ヘパリン結合の減少およびｉｎ  ｖｉｖｏ曝露の増加と相関する。
【０２２２】
ｃＩＥＦプロファイル（ｐＩ範囲）は、ＮａｎｏＰｒｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して決定された。試験した最終的なタンパク質濃度は０．００２５ｍｇ／ｍＬであり、１２μＬをウェルに装填した。使用された希釈緩衝液は、ＤＰＢＳおよび尿素／Ｃｈａｐｓ（１０Ｍ／０．６％）であった。使用された追加の試薬にはＧ２プレミックス：４−９（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ０４０−９６９）、Ｐｉ標準ラダー１（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ０４０−６４４）、一次抗体：ウサギ抗ＦＳ  ｐＡＢ（Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ４７９４１）１：１００希釈、二次抗体：ウサギ抗ＩｇＧ  ＨＲＰ抱合体（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃４０１１）１：１００希釈、および基質：ルミノール／過酸化物ＸＤＲが含まれた。
【表１４】
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【０２２３】
実施例７：卵巣切除した雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）およびミオスタチンレベルに対する組み換えフォリスタチン−Ｆｃの治療の効果
この研究の目的は、卵巣切除した雌のＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットへのＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＡＣＥ−０３１またはＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃの単回静脈内（ボーラス）注射が、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）およびミオスタチンレベルに及ぼす効果を評価することであった。
【０２２４】
これらの研究では、卵巣切除した雌のラットに、溶媒１（ＰＢＳ）、溶媒２（１０ｍＭクエン酸塩、８％スクロース、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ６．５）、溶媒３（２０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭアルギニン、６％スクロース、０．００５％ポリソルベート２０、ｐＨ６．８）、溶媒２中のＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、または溶媒３中のＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃの単一用量を静脈内（ＩＶ）（ボーラス）注射により投与した。以下の表１５は研究設計の概要である。
【表１５】
2020519291.tif 000039
【０２２５】
血液試料は、試験−２日目、−１日目、投与前、投与後５分、投与後１、２、６、１０、１６、２４、４８、７２、１６８、２４０、および３３６時間に、時点および群あたり６匹の雌から抗凝固薬入りの試験管の中へと採取された。これらの試験のＦＳＨ濃度データを以下の表１６に示す。
【表１６】
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【０２２６】
平均被試験物（ＴＡ）濃度（すなわち、溶媒１、溶媒２、溶媒３、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＡＣＥ−０３１、またはＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃ）を示す生物分析データを以下のＰＫ（薬物曝露）表１７にまとめる。
【表１７】
2020519291.tif 000041
【０２２７】
薬物動態解析
すべての雌のラットを、それぞれすべての用量レベルのＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＡＣＥ−０３１、またはＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃの単回ＩＶボーラス注入後に、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡ、ＡＣＥ−０３１、またはＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃに曝露させた。全体として、ＡＵＣｌａｓｔおよびＣｍａｘの観点から、１〜３０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で比較すると、ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡの曝露は一般的に用量に比例した様式で増加した。ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡのＣ１値は低く、すべての用量レベルにわたり０．０２４６〜０．０３１８ｍＬ／分／ｋｇの範囲であった。ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡのＶｓｓ値は、すべての用量レベルで０．１７７〜０．２１２  Ｌ／ｋｇの範囲であり、ラットの全血量（０．０５４Ｌ／ｋｇ）と比較した時、組織への中程度の分布を示唆している。ＦＳ３１５Ｋ（７６，８１，８２）Ｅ−ｈＦｃＬＡＬＡに対するＴ１／２値は、すべての用量レベルで７４．８〜１３５時間の範囲であった。ＡＣＥ−０３１のＣ１およびＶｓｓは、それぞれ０．００８１２ｍＬ／分／ｋｇおよび０．０８９１Ｌ／ｋｇであった。Ｃ１値はラットの全血量と比較した場合、低く、組織への分布（Ｖｓｓ）が小さかった。これらの値から、ＡＣＥ−０３１のＴ１／２は１３４時間となった。ＳＨＰ６１９のＣ１およびＶｓｓは、それぞれ  ２．８２ｍＬ／分／ｋｇおよび１０．１Ｌ／ｋｇ（両方とも近似値）であった。ラットの全血量と比較した場合、組織への分布（Ｖｓｓ）が高いとき、Ｃ１値は低かった。これらの値から、ＦＳ３１５ＷＴ−ｈＦｃに対してＴ１／２は６０．８時間（近似値）となった。
【０２２８】
実施例８：フォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質の用量予想
上記の実施例で示されたデータに基づき、筋ジストロフィーの治療に使用するための組み換えフォリスタチンＦｃ融合タンパク質（ＦＳ−Ｆｃ）に対するヒトにおける有効用量を予測するために、機構的ＰＫ／ＰＤモデルを作製した。以下は、機構的ＰＫ／ＰＤモデルの構造についての解析である。第一に、ミオスタチン／アクチビンシグナル伝達経路に関連する文献を分析して、ＰＫ／ＰＤモデルのパラメータ化、較正、およびバリデーションに使用できるデータを特定した。第二に、ミオスタチン／アクチビンＡ結合、および筋肉量増加およびＦＳＨ調節を含むＰＤ評価項目についての関連療法の効果の機構的モデルを開発した。このモデルは、前臨床および臨床曝露、バイオマーカー、ならびにツール分子および文献に報告されたミオスタチン抗体からの有効性データを使用して検証された。Ｊａｃｏｂｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＰＭＤ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｊｕｎｅ  ２６−２９，２０１６を参照のこと。この内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。最後に、機構的ＰＫ／ＰＤモデルを使用して、受容体占有率（ＲＯ）、筋肉量増加、および作用時間を含む、様々なＰＤ評価項目についての用量反応関係をシミュレーションした。
【０２２９】
構築された機構的ＰＫ／ＰＤモデルには、３つの区画、すなわち血漿、下垂体、および筋肉が含まれる。このモデルは、ＦＳ−Ｆｃの生物学的プロセス、およびミオスタチンおよびアクチビンＡとのその相互作用を説明するために設計された。血清から筋肉へおよび下垂体へのＦＳ−Ｆｃの生体分布を、ＰＢＰＫ方法論を使用して推定した。ＰＢＰＫ方法論は、Ｓｈａｈ  ａｎｄ  Ｂｅｔｔｓ  ＡＭ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ（２０１２）３９：６７−８６に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、卵巣切除したラットのＦＳＨ調節を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアクチビンＡ阻害を検証した。結果は、ミオスタチンおよびアクチビンＡ結合の両方による筋肉内のＡｃｔＲＩＩＢ  ＲＯが、筋肉量増加にリンクすることを示した。筋ジストロフィーの治療に対するＢＭＳ−９８６０８９の使用からの臨床データ（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＰＭＤ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｊｕｎｅ  ２６−２９，２０１６を参照）を使用して、ヒトにおける筋肉量増加のためのＡｃｔＩＩＢ  ＲＯの閾値を確立した。
【０２３０】
筋肉中のミオタチンおよびアクチビンＡ阻害のためにＡｃｔＲＩＩＢ  ＲＯを組み込んだ機構的ＰＫ／ＰＤモデルを適用することにより、ＦＳ−Ｆｃが、約３ｍｇ／ｋｇの用量の週に１回皮下投与で、健康なヒトボランティアの筋体積を著しく増加させることが予測された。このモデルはまた、ＦＳ−ＦＣが、約１０ｍｇ／ｋｇの用量の月に１回の静脈内投与で、健康なヒトボランティアの筋体積を著しく増加させることになることも予測した。
【０２３１】
まとめると、上記の実施例は、ＤＭＤ疾患モデルにおける筋肥大の誘導において組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質が、例えば、全身投与によって非常に効果的であることを実証する。ｍｄｘマウスモデルにおける筋肥大は、前肢の握力の機能的改善に変換された。それゆえに、組み換えフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＤＭＤの治療のための有効なタンパク質治療薬とすることができる。
【０２３２】
実施例９  高グリコシル化に対して導入された新規Ｎ−結合型グリコシル化コンセンサス配列（ＮＸＴ／Ｓ）
本実施例は、新しいＮ−結合型グリコシル化コンセンサス配列をヘパリン結合ループへと導入することによる、高グリコシル化組み換えＦＳ３１５−ｈＦｃバリアントの生成を示す。高グリコシル化突然変異体の作製に対する設定根拠には、免疫原性のリスクを低減させ、クリアランスを低減させるために炭水化物含有量を調節し、負に荷電した嵩高いグリカン構造を加えることによってヘパリン結合を阻害することが含まれた。ＨＢＳ領域内の７４、７５、７８、８０、８３、および８６位にある６個のコンセンサスＮ−結合型グリコシル化部位、ＮＸＴ／Ｓ（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸とすることができる）を示す、１０個の新しいバリアントが設計された。追加的炭水化物部分の組み込みの初期検出は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量（ＭＷ）シフトによって観察された（図５Ａ）。野生型および他のバリアントと比較して、バリアントＫ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２Ｔは、より高いＭＷへの明確なシフトを示し、グリカンの組み込みを示唆している。２つの追加的なバリアント（Ｃ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７ＴおよびＣ６６Ｓ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ）は、より高いＭＷへのシフトがそれほど顕著ではないことを示している（図５Ａ）。これらのバリアントの３つすべてが共通の突然変異部位Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔを有した。ｃＩＥＦデータは、Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２ＴバリアントがＫ８２Ｔバリアントと比較して、ｐＩの明確な酸性シフトを有することを示しており（図５Ｂ）、これはＭＷおよびｐＩシフトの両方を生じさせるＫ７５Ｎ部位における負に荷電したグリカン部分の潜在的占有を示した。すべての導入されたＮ−結合型グリコシル化部位上のグリカン占有の状態をさらに確認するために、ＬＣ／ＭＳベースの特徴解析を実施した。ヘパリン結合ループで研究された６つの部位の中で、グリコシル化コンセンサス部位を７５位に導入することにより高グリコシル化ＦＳが生成されたことが、ＬＣ／ＭＳデータで確認された（表１８）。同じＫ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ突然変異を含有する３つのバリアントＫ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２Ｔ、Ｃ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ、およびＣ６６Ｓ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔは、様々なグリカン占有率（６９．７％、３９．６％、および２１．５％）を有しており、Ｎ７５上のオリゴ糖モル当たりのシアル酸モル比は同様であった（１．９９、１．８８、および１．９６）（表１８）。ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上の可動性シフトの程度は、３つの高グリコシル化バリアントに対するＮ７５上のグリカン占有率と一致した（図５Ａおよび表１８）。野生型、ΔＨＢＳバリアント、および１０個のすべての設計グリカンバリアントは、天然ＦＳグリカン部位Ｎ１１２およびＮ２５９上で類似のグリカン占有率およびシアル酸含有量を有したが、Ｎ９５上の占有率はかなり変動していた（表１８）。
【表１８】
2020519291.tif 000042
【０２３３】
実施例１０：高グリコシル化バリアントのＩｎ  Ｖｉｔｒｏでの結合の特徴およびＩｎ  Ｖｉｖｏでの薬物動態特性
ＨＢＳ領域内で新しい高グリコシル化部位を設計する一つの設定根拠は、負に荷電した嵩高なグリカン構造を導入することによってヘパリン結合を阻害する試みであった。Ｎ７５上のグリカン占有を有する３つの高グリコシル化バリアントについては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヘパリン結合親和性の低減（野生型と比較して約１５分の１）は、Ｎ７５上で最も高いグリカン占有率を有するだけでなく第二のＢＢＸＢモチーフにＫ８２Ｔ突然変異も有するバリアントＫ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２Ｔでのみ観察され（表１９）、Ｎ７５上の炭水化物のヘパリン結合活性に対する効果は中等度であり得ることを示す。３つの高グリコシル化バリアントは、ＳＰＲによって測定した場合、野生型と比較してわずかまたは中等度のミオスタチン結合低減を示した（表１９）。Ａ２０４細胞ベースのレポーターアッセイでは、３つの高グリコシル化バリアントは、野生型および他の非高グリコシル化バリアントと比較してミオスタチン阻害が２〜３分の１に低減し、かつアクチビンＡ阻害が２〜４分の１に低減しており（表１９および図２のパネルＢ）、さらなる炭水化物による効力のわずかな阻害を示す。表１９は、Ｎ−グリコシル化のために新たに設計された１つまたは２つのコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）を有する組み換えＦＳ３１５−ｈＦｃバリアントを示す。ヘパリン、ミオスタチンまたはＦｃＲｎへのバリアントの結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された。結合親和性を測定し、平衡解離定数（ＫＤ）によって報告した。バリアントの電荷不均一性は、毛管等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）によって決定され、等電点（ｐＩ）の範囲として示されている。
【表１９】
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【０２３４】
薬物動態プロファイルへの高グリコシル化の効果を決定するために、野生型、ΔＨＢＳ、非高グリコシル化バリアントＫ８２Ｔ、および２つの高グリコシル化バリアントＫ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２ＴおよびＣ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔを使用して、マウスＰＫ研究を実施した。非高グリコシル化変異体Ｋ８２Ｔは、野生型と比較してわずかに改善されたＰＫの特徴を有したが、２つの高グリコシル化バリアントは、野生型と比較して著しく改善されたＰＫプロファイルを有した（図６および表１１）。バリアントＣ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔは、野生型と比較して約１０倍高い曝露を示し、バリアントＫ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２Ｔは、約１７倍高い曝露を示し、これはΔＨＢＳバリアントと類似していた（表１１）。Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔ／Ｋ８２ＴバリアントはＣ６６Ａ／Ｋ７５Ｎ／Ｃ７７Ｔより高いグリカン含有量および低いｉｎ  ｖｉｔｒｏヘパリン結合を有し、ヘパリン結合活性およびグリコシル化含有量の両方を調節することが、望ましいＦＳ治療分子を設計するための魅力的なアプローチとなり得ることを示した。
実施例１１：ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの投与は、用量に依存した様式で体重増加をもたらす
操作されたフォリスタチンおよび全身送達は、野生型マウスの筋肥大をもたらす
【０２３５】
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび４週間の投与を使用した研究において、２つの操作されたフォリスタチン分子を用いた。一つの研究では、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ（Ｋ７６、Ｋ８１、Ｋ８２〜グルタミン酸）を１〜５０ｍｇ／ｋｇで静脈内で投与した。ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの投与に伴い、体重は用量に依存する様式で増加し（図９−１、パネルＡ）、これは骨格筋量の増加と関連した（図９−１、パネルＢ）。ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの血清中濃度を電気化学発光免疫測定法を使用して測定し、図９−１のパネルＣに示すように、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃのトラフレベルは１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇまで用量に比例した。ＦＳ−ＥＥＥ−ｈＦｃ分子を、皮下および静脈内投与後に評価した。ＦＳ−ＥＥＥ−ｈＦｃを１０ｍｇ／ｋｇをＩＶで、または２０ｍｇ／ｋｇをＳＣで投与し、２０％の増加で体重に類似した影響をもたらし、個々の筋肉量の増加は２８％〜４４％の範囲であった。５０ｍｇ／ｋｇをＩＶで、または１００ｍｇ／ｋｇをＳＣで投与されたＦＳ−ＥＥＥ−ｈＦｃは、２６％増加して体重に類似した影響をもたらし、個々の筋肉量の増加は４６％〜６９％の範囲であった（図９−１、パネルＤおよび図９−２、パネルＥ）。心重量を脛骨の長さに対して正規化すると、心臓／脛骨の比の増加がＦＳ−ＥＥＥ−ｈＦｃの高用量で見られた。溶媒治療からの形態学的差異について、四頭筋組織試料を調べた。免疫蛍光顕微鏡を使用して、ＦＳ−ＥＥＥ−ｈＦｃ投与（図９−３、パネルＦ）では、溶媒投与された動物と比較して、より大きい筋線維サイズが観察された。平均筋線維直径は、両方の用量レベルにて、溶媒と比較して、ＦＳ−ＥＥＥ−ｈＦｃで増加した（図９−３、パネルＧ）。
ｍｄｘマウスのフォリスタチン治療は、筋肉肥大および筋機能の改善をもたらす
【０２３６】
ジストロフィー病理に対する効果を評価するために、組織壊死、炎症、および線維症のマーカーに対する免疫組織化学全スライド解析により、四頭筋組織および横隔膜組織の両方を分析した。壊死のマーカーとして、抗マウスＩｇＧを用いて内因性マウスＩｇＧを検出するＩＨＣ方法が開発され、これはヒスチジンに富んだ糖タンパク質（ＨＧＰ）に結合して壊死細胞クリアランスを促進するＨＧＰ−ＩｇＧ複合体を形成する、壊死エリアＩｇＧ蓄積を利用している。ｍｄｘ筋肉では、総ＩｇＧ検出によって評価した時、マウスＩｇＧ  ＩＨＣは壊死細胞を正確に標識したが、壊死面積は組織切片（図１０−１Ａ）および動物にわたって変動した（図１０−１Ｂ）。変動性を最大限に考慮するために、スライド画像全体を定量のために分析し、コホート動物数を各群（ｎ＝１５）について多くした。四頭筋の全スライド解析において、壊死組織面積の統計学的に有意な低減は、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの１０および３０ｍｇ／ｋｇの用量で達成されたが、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃの３ｍｇ／ｋｇ用量では達成されなかった。壊死の面積に対する所見と同様に、炎症促進性Ｍ１タイプのマクロファージのマーカーであるＣＤ６８の染色で、むらのある陽性染色面積が明らかになった（図１０−１Ｃ）。検出可能なマクロファージ浸潤の全体的なレベルが低いため、スライド画像全体をＣＤ６８陽性面積について定量化したとき、薬物治療効果は有意性に達しなかった（図１０−１Ｄ）。コラーゲンＩ検出では、溶媒対照において４％の陽性染色面積を特定することができたが、これは１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ両方のＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃならびに３ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢで著しく低減した（図１０−２Ｅおよび図１０−２Ｆ）。ｍｄｘの四頭筋におけるＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ治療の全体的パターンは、既存の中心核化された、再生筋線維の肥大と一致する。再生細胞の拡大により、変性の低減が生じ、細胞外基質内でコラーゲンの堆積を促進する損傷した壊死組織が低減し、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃは線維症を低減させた。
【０２３７】
ジストロフィー筋への影響を評価するために、フォリスタチンＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ分子を３週齢のｍｄｘマウスに１２週間皮下投与した。ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの３用量を３〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲から選択し、３ｍｇ／ｋｇで投与された組み換えアクチビンＩＩＢ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ）のＦｃ融合と比較した。マウスは定期的な運動を行わず、研究の１０週目に前肢の握力について評価した。図１１−１Ａに示されるように、ＦＳ−ＥＥＥｍＦｃについては用量にわたって体重が増加し、その範囲は９％〜２５％であったのに対し、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃでは１４％であった。骨格四肢筋の増加は、３ｍｇ／ｋｇ  ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃでは１２％〜２７％、３０ｍｇ／ｋｇ  ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃでは４６％〜５９％の範囲であった（図１１−１Ｂ）。心臓および横隔膜の重量の増加は四肢筋よりも小さく、ＰＢＳ溶媒治療と有意に異ならなかった。四頭筋から、大腿直筋の面積が定量化され、すべての薬物治療群で有意な増加が観察された（図１１−１Ｃ）。さらに、筋線維サイズを定量し、平均筋線維直径は溶媒対照と比較してＦＳ−ＥＥＥｍＦｃ治療により増加した（図１１−１Ｄおよび図１１−１Ｅ）。
【０２３８】
ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃのすべての用量は、Ｃ５７ＢＬ／１０野生型マウスのレベルよりも高いレベルまで絶対的前肢握力を回復させ、１０ｍｇ／ｋｇ  ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃで最大効果を有した（図１１−２Ｆ）。体重に対して正規化した場合、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ  ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの両方が、ｍｄｘ溶媒対照よりも高いレベル、および野生型と同様のレベルまで握力を増加させた。筋肉損傷の循環マーカーに対する効果を測定した。血清クレアチンキナーゼ活性は変動性が高く、ＦＳＥＥＥ−ｍＦｃの最高用量が、溶媒治療と比較して最大の低減をもたらした（図１１−２Ｇ）。骨格トロポニンＩレベルは最高のＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ用量では低減されたが、心筋トロポニンＩレベルは変化せず、心臓と比較してより大きな四肢筋の肥大が観察されたことと一致した。
【０２３９】
病理組織学的結果を確証するために、線維症に対する遺伝子マーカーを四頭筋組織のホモジネートから測定した。図１０−２Ｇに示されるように、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの３つのすべての用量は、コラーゲン、ｃｏｌ１Ａ１、ｌｏｘ、ｃｔｈｒｃ１、およびａｃｔａ２の堆積および架橋に関連する遺伝子の発現を低減させた。転写レベルはＣＤ６８またはｓｐｐ１に対して低減しなかった。これは、ｍｄｘモデルにおける線維症の発症およびＤＭＤ疾患の重症度と遺伝的関連性を持つ、ジストロフィー筋内の高度に発現された細胞外タンパク質、オステオポンチンをコードする。ｍＲＮＡ解析では、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ群は低減を示さず、一部の事例では、線維症および炎症に対する遺伝子マーカーのレベルが増加した。
【０２４０】
横隔膜組織において、ＣＤ６８陽性マクロファージ浸潤のベースラインレベルは四頭筋よりも高く、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃならびに３  ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃでも低減が観察された（図１２−１Ａおよび図１２−１Ｃ）。コラーゲンＩ免疫組織化学法では、横隔膜では四頭筋と比較して線維症のレベルが高く、両方の筋肉における溶媒対照については１２％対４％であった（図１２−１Ｂと図１０−２Ｆ）。四頭筋とは異なり、横隔膜コラーゲンＩ含有量は、薬物治療に伴い著しく変化しなかった。線維症および炎症に関与する遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの１０および３０ｍｇ／ｋｇ用量で、ＲＮＡ発現の低減を示した（図１２−２Ｄ）。四頭筋と同様に、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍｆＣグループの遺伝子転写物応答は線維症のマーカーに対して増加した。
【０２４１】
実施例１２：ｍｄｘマウスのフォリスタチン治療は、ミオスタチン拮抗薬を用いた治療より大きい筋機能および病理学の改善をもたらす
操作されたフォリスタチンのミオスタチン拮抗作用に特異的な薬剤に対する効果を比較するために、ミオスタチンに特異的に結合するように設計されたモノクローナル抗体を調製した。結果として得られるマウスＩｇＧ  Ｆｃ含有抗体を、表面プラズモン共鳴法を使用して、リガンドのミオスタチンおよびアクチビンＡに結合する能力についてＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃと比較した。ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃおよび抗ＭＳＴ抗体の両方がミオスタチンにしっかりと結合し、ＫＤ値はそれぞれ７．５および１５ｐＭであったのに対し、アクチビンＡ  ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃは６．１ｐＭのＫＤを示し、抗ＭＳＴ抗体は検出可能な結合を示さなかった。
【０２４２】
次に、両分子を、マウスのジストロフィー筋に対する効果について比較した。この研究では、５週齢であり、定期的な運動レジメンを受けたｍｄｘマウスに、１２週間皮下投与を行った。各分子の２用量は３ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇを選択したが、抗体の予測半減期が長いことに基づき、抗ミオスタチン抗体の週１回に対して、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ投与の頻度は週２回に設定した。
【０２４３】
両方の薬剤の両方の用量で体重および筋肉質量の増加が見られた（図１３−１Ａおよび１３−１Ｂ）。体重および筋肉質量の増加の度合いは、３０ｍｇ／ｋｇのＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの方が、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＭＳＴ抗体よりも大きかった。３ｍｇ／ｋｇ投与量で、体重および筋肉量の増加は３０ｍｇ／ｋｇに比べて大幅に低減し、両方の薬剤について効果の度合いは同等であった。抗ＭＳＴ抗体のより高い用量での脾臓重量の増加を除いて、心臓、肝臓、および脾臓重量は、絶対的な重量および体重に対して正規化された重量の両方とも変化しなかった（図１３−１Ｃ）。
【０２４４】
機能的および行動測定値を、ｍｄｘ研究に対して推奨される計測に対する動物順化に従って記録した。前肢の握力では、両方の薬剤の両方の用量が上記の溶媒治療の増加をもたらした（図１３−２Ｄ）。ＦＳ−ＥＥ−ｍＦｃの３０ｍｇ／ｋｇ用量は、抗ＭＳＴ抗体の３０ｍｇ／ｋｇよりも大きな増加を生じた。体重に対して正規化した後、握力の増加は溶媒治療と区別されなかった。ＥＤＬ筋の単独強縮力を研究終了時に測定した（図１３−２Ｅ）。両方の薬剤の３０ｍｇ／ｋｇ用量のみが強縮力の増加をもたらし、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの増加は抗ＭＳＴ抗体の増加よりも大きかった。ＥＤＬ断面積に対して正規化した場合、比力はｍｄｘ溶媒投与群と区別できなかった。強制トレッドミリングを調べたところ、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの３０ｍｇ／ｋｇ群だけでなく、抗ＭＳＴ抗体の両方の用量でも走行距離の低減が見られた（図１３−２Ｆ）。体重に対して正規化した場合、溶媒と比較したこれらの低減が維持された。
【０２４５】
血清ＣＫ分析は、高いレベルの群内変動性を示し、群間の有意差を見出すことは不可能であった（図１３−３Ｇ）。研究の第８週の間に薬物濃度についても、血清を分析した。図１３−３Ｈに示されるように、用量比例性は両方の薬剤について明らかであり、３０ｍｇ／ｋｇ用量では３ｍｇ／ｋｇ用量よりもおよそ１０倍高い濃度をもたらした。投与頻繁はより低かったが、抗ＭＳＴ抗体濃度はＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃよりも約４倍高かった。肥大性効果に対する血清濃度を比較すると、３ｍｇ／ｋｇ用量では、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃは抗ＭＳＴ抗体の４分の１の血清濃度で類似の筋肉質量効果を生じた。この傾向は３０ｍｇ／ｋｇの用量でより顕著であり、循環血中のＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ薬は４分の１であるにもかかわらず、抗ＭＳＴ抗体と比較するとＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃに対してより大きな筋肉質量、前肢の握力、およびＥＤＬ強縮力の増加が見られた。
【０２４６】
四頭筋組織および横隔膜組織を、ジストロフィー病理の変化について免疫組織化学およびｑＰＣＲで解析した。運動をしなかった研究と比較して、運動をした研究では、溶媒対照群において四頭筋および横隔膜筋の損傷の類似のバックグラウンドレベルが観察された。運動をしたｍｄｘと運動をしなかったｍｄｘとの比較で、四肢筋壊死の悪化および横隔膜線維症を記録した報告書を考慮すると、これは驚きであった。我々の研究について考えられる説明の一つは、動物の開始年齢の差である可能性がある（運動をしなかったものは３週齢、運動をしたものは５週齢）。
【０２４７】
図１４−１Ａ〜Ｃに示されるように、四頭筋の溶媒治療と比較して、両方の薬剤の３ｍｇ／ｋｇ用量は、筋壊死および線維症の小さな低減をもたらした。３０ｍｇ／ｋｇでは、ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃについては壊死および線維症の大幅な低減が見られたのに対し、抗ＭＳＴ抗体では低減が小さかった。ＣＤ６８陽性マクロファージ染色は、溶媒対照からの治療群を区別できなかったが、これはこのマーカーのベースライン染色のレベルが低いことにより制限された可能性がある。線維症および炎症のマーカーについての対側四頭筋のｍＲＮＡ解析が図１４−２Ｄに示されている。ここでは、転写レベルの低減はいずれの薬剤または用量に対しても観察されず、実際にいくつかのマーカーは、低用量抗ＭＳＴ抗体（ｃｏｌ１Ａ１、ｃｔｈｒｃ１、ＣＤ６８）および高用量のＦＳＥＥＥ−ｍＦｃ（ＣＤ６８）についてレベルのわずかな増加を示していた。線維症遺伝子マーカーについては、コラーゲンＩ  ＩＨＣとｃｏｌ１Ａ１遺伝子発現の違いについて考えられる一つの説明は、動物の年齢である。ｍｄｘでは、およそ３週齢で始まる四肢筋の重度の筋壊死の期間は、第８週までに回復して活性の低い損傷の状態になる。動物は、研究の終了時に月齢４カ月を超えており、結合組織の堆積を促進するために必要な炎症促進性、線維症促進性のシグナル伝達を生成することになる活動的な四肢の筋肉変性の時間枠を超える年齢であった。結果として、研究の初期段階で最も活動的であった線維症の遺伝子経路が試験終了時に静止したため、タンパク質レベルでＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃの抗線維症作用が発現した。
【０２４８】
横隔膜では、四頭筋と比較して全体的により高いレベルのベースライン組織損傷がＩＨＣによって観察された（図１５−１Ａ〜図１５−１Ｃ、図１５−２Ｄも参照）。抗ＭＳＴ抗体の両方の用量は、ＣＤ６８またはコラーゲンＩ染色に効果を示さなかった。ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃについては、３０ｍｇ／ｋｇでＣＤ６８マクロファージ浸潤の定性的低減が観察されたが、コラーゲンＩ染色では有意な変化は見られなかった。ｍＲＮＡ解析は、３０ｍｇ／ｋｇのＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ用量を溶媒治療と比較した場合、いくつかの炎症および線維症マーカーの転写レベルの低下を示した。オステオポンチンをコードするｓｐｐ１について最大の低減が見られた。オステオポンチンレベルを低減させると、再生促進性マクロファージに有利となるように、炎症促進性マクロファージ集団が低減することが示されている。このパターンに一致して、ＣＤ６８に対するｍＲＮＡも、ｓｐｐ１とともに、３０ｍｇ／ｋｇ  ＦＳ−ＥＥＥ−ｍＦｃ用量で低下した。
【０２４９】
同等物および範囲
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を日常的なものを超えない実験を使用して認識し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることは意図されず、むしろ以下の請求項に記載される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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