(57)【要約】本明細書では、疎水性治療薬の濃度を高め、安定性を改善したリポソームの調製方法、およびその使用を提供する。ある実施態様において、リポソームは、熱、有機溶媒、タンパク質、および／または無機塩を使用せずに調製される。    【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性治療薬を予備形成されたリポソームに組み込む方法であって、以下のステップを含む：
（ａ）（ｉ）水性媒体に懸濁された複数の予備形成された、脂質二重層相を形成する脂質を含むリポソームを含むリポソーム懸濁液と、（ｉｉ）疎水性治療薬の固体形態を提供すること； 
（ｂ）前記疎水性治療薬の固体形態をリポソーム懸濁液に添加し、それによりリポソーム-薬物懸濁液を形成すること；そして
（ｃ）リポソーム薬物懸濁液を均質化すること；
これにより、前記疎水性治療薬が脂質二重層相に組み込まれ、そして、ステップ（ｃ）は、周囲温度以下の温度で行われる、
前記方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）および／または（ｃ）が溶媒の非存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）および／または（ｃ）が界面活性剤の非存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疎水性治療薬が小分子薬または抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性治療薬の少なくとも約８０％が、ステップ（ｃ）の後に脂質二重層相に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
リポソーム脂質に対する治療薬のモル比が少なくとも約１：１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）におけるリポソーム薬物懸濁液の均質化が、微小流動化、超音波処理、押出、凍結融解、またはそれらの組み合わせによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記治療薬がステップ（ｂ）および（ｃ）中に溶媒と接触せず、前記リポソームの形成前に前記リポソーム脂質と接触しない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リポソームが、ステップ（ｃ）の後に本質的に単層である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記リポソームが、ステップ（ｃ）の後に約１００ｎｍ以下の直径を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記リポソームが、ステップ（ｃ）後に約５０ｎｍ以下の直径を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）で提供される前記リポソーム懸濁液が、前記水性媒体および／または前記リポソームに存在する追加の治療薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リポソームの内側および外側の前記水性媒体の組成が、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）において同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記リポソーム脂質が２０％以下の飽和脂肪酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記リポソーム脂質がＬ−α−ホスファチジルコリンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、ステップ（ｃ）の後に、滅菌濾過、凍結乾燥、または凍結乾燥および水性媒体による再構成を行うことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療薬が、約４℃の水性媒体中に貯蔵されてステップ（ｃ）の後少なくとも２ヶ月間、リポソームの脂質二重層相に結合したままである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療薬が、ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥および周囲温度での少なくとも１年間の貯蔵および水性媒体中での再構成の後、脂質二重層相と会合したままである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）後の平均リポソームサイズが、約４℃で水性媒体中に保存されて少なくとも２ヶ月間約１００ｎｍ未満を維持している、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥、周囲温度で少なくとも１年間の貯蔵、および水性媒体での再構成後、前記平均リポソームサイズが約１００ｎｍ未満を維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記温度が約１５℃から約３５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記脂質二重層相が前記温度で液晶である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｂ）および（ｃ）における前記リポソーム薬物懸濁液の脂質濃度が約１〜約７重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｂ）で加えられた前記固体疎水性治療薬が、前記リポソーム薬物懸濁液中に約１〜約２０ｍｇ／ｍＬの薬剤の総濃度を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
疎水性治療薬を予備形成されたリポソームに組み込む方法であって、以下のステップを含む：
（ａ）（ｉ）水性媒体に懸濁した複数の予備形成された、脂質二重層相を形成する脂質を含むリポソームを含むリポソーム懸濁液と、（ｉｉ）溶媒を含むかまたは溶媒からなる液体媒体に溶解した疎水性治療薬を含む治療薬濃縮物を提供すること； 
（ｂ）前記治療薬濃縮物を前記リポソーム懸濁液に加えてリポソーム薬物懸濁液を形成すること、ここで、前記リポソーム薬物懸濁液中の溶媒の総濃度は１０重量パーセント以下であり；そして 
（ｃ）前記リポソーム薬物懸濁液を均質化すること； 
これにより、前記疎水性治療薬が前記脂質二重層相に組み込まれ、そして、ステップ（ｃ）は、周囲温度以下の温度で行われる、
前記方法。
【請求項２６】
ステップ（ｂ）における前記リポソーム薬物懸濁液中の溶媒の総濃度が約５重量パーセント以下である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記溶媒が水混和性有機溶媒である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記液体媒体が水または水性媒体をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記溶媒が、アルコール、ケトン、エーテル、有機酸、有機塩基、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶媒が、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、およびＤＭＳＯからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記液体媒体が１００％エタノールである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｃ）が界面活性剤を使用せずに行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記疎水性治療薬が小分子薬または抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記疎水性治療薬の少なくとも約８０％が、ステップ（ｃ）の後に脂質二重層相と会合している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
脂質に対する治療薬のモル比が少なくとも約１：１０である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｃ）における前記リポソーム薬物懸濁液の均質化が、微小流動化、超音波処理、押出、凍結融解、またはそれらの組み合わせによって行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療薬が、前記リポソームの形成前に前記リポソーム脂質と接触しない、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記リポソームがステップ（ｃ）の後に本質的に単層である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
前記リポソームが、ステップ（ｃ）の後に約１００ｎｍ以下の直径を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
前記リポソームが、ステップ（ｃ）の後に約５０ｎｍ以下の直径を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ａ）で提供される前記リポソーム懸濁液が、前記水性媒体および／または前記リポソームに存在する追加の治療薬を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４２】
前記リポソームの内側および外側の前記水性媒体の組成が、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）において同一である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４３】
前記リポソーム脂質が２０％以下の飽和脂肪酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４４】
前記リポソーム脂質がＬ−α−ホスファチジルコリンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、ステップ（ｃ）の後に、滅菌濾過、凍結乾燥、または凍結乾燥および水性媒体による再構成を行うことをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４６】
前記治療薬が、約４℃で水性媒体中に保存されてステップ（ｃ）の後少なくとも２ヶ月間、前記リポソームの前記脂質二重層相への結合を維持したままである、請求項２５に記載の方法。
【請求項４７】
前記治療薬が、ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥および周囲温度での少なくとも１年間の貯蔵および水性媒体での再構成の後、前記脂質二重層相との会合を維持する、請求項２５に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｃ）後の平均リポソームサイズが、約４℃で水性媒体中に保存すると、少なくとも２ヶ月間約１００ｎｍ未満を維持する、請求項２５に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥、周囲温度での少なくとも１年間の貯蔵、および水性媒体での再構成の後、前記平均リポソームサイズが約１００ｎｍ未満を維持する、請求項２５に記載の方法。
【請求項５０】
前記温度が約１５℃から約３５℃である、請求項２５に記載の方法。
【請求項５１】
前記脂質二重層相が前記温度で液晶である、請求項２５に記載の方法。
【請求項５２】
ステップ（ｂ）および（ｃ）における前記リポソーム−薬物懸濁液の前記脂質濃度が約１〜約７重量％である、請求項２５に記載の方法。
【請求項５３】
ステップ（ｂ）で加えられた前記固体疎水性治療薬が、前記リポソーム薬物懸濁液中に約１〜約２０ｍｇ／ｍＬの薬物の総濃度を提供する、請求項２５に記載の方法。
【請求項５４】
以下をさらに含む、請求項２５に記載の方法：
（ｄ）前記均質化されたリポソーム懸濁液を凍結乾燥し、それにより前記溶媒を除去すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書では、疎水性治療薬の濃度を高め、安定性を改善したリポソームの調製方法、およびその使用を提供する。ある実施態様において、リポソームは、熱、有機溶媒、タンパク質、および／または無機塩を使用せずに調製される。
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年５月１２日に出願された出願番号１５／５９３，５８６の一部継続出願であり、それは米国の一部継続出願である。２０１３年１１月２５日に出願された出願番号１４／０８８，６５７は、米国の継続出願である。２０１０年９月２３日に出願された出願番号１２／８８９，３０５、現在は特許番号８，５９１，９４２号は、米国の３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１９の下、２００９年９月２３日に出願された仮特許出願第６１／２４５，１８５号の利益を請求する。前述の出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の生物学的利用能は、薬物の溶解度と安定性に一部分大きく依存している。薬物の生物学的利用能を改善するために、ｐＨ調整、洗剤のミセルへの薬物の会合、有機溶媒への可溶化、シクロデキストリンまたは他のポリマーとの複合体形成、リポソーム二重層への薬物のカプセル化を含むが、限定はされない多くの方法が採用されている（Strickley, R. G., Pharmaceutical Research, No. 21, 2004:201~230）。薬物自体または薬物の可溶化に使用される賦形剤のいずれかが、アレルギー反応や溶血などの副作用を引き起こす可能性がある。
【０００３】
溶媒（エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）など）、錯化剤（ニコチンアミドなど）、界面活性剤（オレイン酸ナトリウムなど）は溶血性であることが知られており、したがって注射液での使用には望ましくない。注射可能な製品に有機溶媒を使用する他の制限には、沈殿、注射時の痛み、炎症が含まれる。
【０００４】
リポソームは、同心円状の二重層（ラメラ）によって形成された脂質膜に囲まれた中央の水腔で構成される顕微鏡的な脂質小胞である。リポソームは、親水性物質（水性内部に）または疎水性物質を（脂質膜に）組み込むことができる。リポソームは、単一の脂質二重層を有する単層小胞（「ＵＭＶ」）、または一連の脂質二重層（「オリゴラメラ小胞」とも呼ばれる）を有する多重層小胞（「ＭＬＶ」）であり得る。多重層小胞は、通常、直径が０．２μｍから１０μｍのサイズの範囲である。例えば、ＷＯ９８／００６８８２を参照。製剤では一般に抗溶血対策が取られているが、リポソームの賦形剤との非相溶性、または製剤中のリポソームの不安定性により、製剤中に十分な量のリポソームを維持することは現実的ではないかも知れない。さらに、疎水性薬物を含有する凍結乾燥製剤の再構成はしばしば困難である。これは、例えば、ドセタキセル、オレイン酸ナトリウム、およびリポソームの再構成の場合である。さらに、リポソームは、濃有機溶媒を含む製剤では安定ではない。
【０００５】
直径が０．２μｍ未満（例えば、０．０２から０．２μｍの間）の単層小胞は、小さな単層小胞（「ＳＵＶ」）として一般に知られている。直径が０．４５μｍを超える（場合によっては１μｍを超える）単層小胞は、大きな単層小胞（「ＬＵＶ」）として一般に知られている。
【０００６】
リポソームの二重層は、ほとんどの場合リン脂質を含むが、脂肪酸、脂肪酸塩、および／または脂肪族アルコールを含むがこれらに限定されない脂質も含み得る。リポソームの特性は、他の要因の中でも、成分の性質に依存する。その結果、ある特性を備えたリポソームが得られる場合、その極性基の電荷および／またはその脂肪酸鎖の長さおよび飽和度を考慮しなければならない。
【０００７】
さらに、たとえばコレステロールや他の脂質を膜に取り込み、脂質二重層の数を変更したり、天然分子（たとえば、タンパク質、多糖類、糖脂質、抗体、酵素）、または合成分子（例、ポリエチルグリコール）を表面に共有結合したりして、リポソームの特性を修飾し得る。リポソームを得るために水性媒体には、リン脂質の場合により他の脂質またはコレステロールとの多数の組み合わせがある。調製方法と使用する脂質に応じて、異なるサイズ、構造、特性の小胞を得ることができる。
【０００８】
リポソームの形成に関して考慮すべき別の重要なパラメーターは、脂質二重層の剛性である。二重層の部分を形成する水和脂質は、液晶（流体）状態またはゲル状態のいずれかであり得る。温度が上昇すると、ゲル状態は液晶状態に変換される。これは、各脂質に固有の転移温度（Ｔｃ）として知られる温度で起こる。Ｔｃは鎖長に直接比例し、脂肪酸の不飽和度に反比例し、極性基の性質に依存する。
【０００９】
それにも関わらず、リポソームなどの脂質小胞の調製における一般的な方法は、脂質が溶解され、その後、任意に緩衝された水溶液に分散される有機溶媒を蒸発させることを含む。バンガム法として知られる例示的な一方法は、元々Bangham et al., J Mol. Biol., 11：238252(1965) に記載されている。バンガム法の変法は当業者に知られており、そのいくつかを以下に説明する。
【００１０】
薄い脂質層の水和
構成する二重層の脂質の有機溶液から始めて、有機溶媒の除去を介して脂質膜を調製し、これは、蒸発（例えば、ロータリーエバポレーターにおける減圧下）または凍結乾燥により達成し得る。得られた乾燥脂質フィルムは、水溶液を添加し、Ｔｃを超える温度で混合物を攪拌することにより水和される。
【００１１】
逆相蒸発
構成する二重層の脂質の有機溶液から始めて、有機溶媒の除去を介して脂質膜が調製される。系は窒素でパージされ、脂質は通常ジエチルエーテルおよび／またはイソプロピルエーテルで構成される第２の有機溶液に再溶解される。水相は再溶解した脂質に添加される。系は連続窒素下で維持される。ゲルは、第２の有機溶媒を除去することにより形成される。
【００１２】
溶剤注入
有機溶媒に溶解された脂質は、ゆっくりと水溶液に注入される。使用される有機溶媒は、多くの場合、水混和性溶媒であり、水溶液は温められ得る。
【００１３】
多重層小胞の調製のための追加の方法は、例えば、
Szoka and Papandjopoulos, Ann. Rev. Biophys. Bioeng。、2：467-508（1980）、およびDousset and Douste-Blazy、Les Liposomes、PuisieDousset and Douste-Blazy, Les Liposomes, Puisieux and Delattre, Editors, Tecniques et Documentation Lavoisier, Paris, pp. 1-73 (1985)に見出し得る。
【００１４】
さらに、複数の脂質の取り込みが望まれる場合、脂質はリポソーム小胞内に均一に分布したままでなければならない。伝統的に、これは脂質を有機溶媒に予め溶解し、得られた有機溶媒をリポソームの調製に使用することにより達成される。
【００１５】
米国特許第４，５０８，７０３号には、少なくとも１つの両親媒性脂質と、任意に疎水性または部分的疎水性の少なくとも１つの成分との粉末混合物を得る方法、混合物の成分を少なくとも１つの有機溶媒に溶解し、得られた溶液を不活性ガスに噴霧することを含む方法が記載されている。この方法は、水性媒体に容易に分散できる脂質混合物の調製を可能にするが、有機溶媒の使用を避けられない。
【００１６】
ＷＯ９２／１０１６６は、カプセル化能力が高められたリポソームを調製する方法を記載している。この方法では、脂質の混合物を使用できるが、混合物は、有機溶媒への脂質の事前の溶解とその後の蒸発によって得られる。さらに、脂質と活性物質の水溶液との接触は、Ｔｃを超える温度で行われる。
【００１７】
その上、有機溶媒を使用せずにリポソームを作成する場合、好ましくないある特性を持つ製剤をもたらし得る他の操作が一般に必要であることが報告されている。たとえば、米国特許出願公開第２００８／０２７４１７２号には、有機溶媒を使用せずに少なくとも２つのリン脂質を含有するリポソームを調製する方法が記載されている。しかし乍ら、無機塩を含有する水溶液から安定したリポソームを得るために、Ｔｃを超える温度が使用された。
【００１８】
結果として、リポソームを調製するための既存の方法は、有機溶媒、タンパク質、無機塩、および／または熱を利用している。その毒性と可燃性のために、有機溶媒は、医薬品、化粧品、およびその他の用途のためのリポソームの調製において望ましくない。その上、有機溶媒とタンパク質の使用は、生産コスト、安全性、労働衛生、環境の面でマイナスの影響を及ぼす。同様に、リポソームの調製における熱の使用は、生産コスト、安全性、および環境の観点から望ましくない。無機塩の導入はリポソームのサイズを増加させ、および／またはより濁った製剤をもたらすため、リポソームの調製における無機塩の使用は望ましくない。例えば、Castile et al., International Journal of Pharmaceutics, 1999, vol. 188, issue 1, pp. 87-95を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、望ましくない薬剤および手順を使用せずにリポソームを調製する方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本明細書では、疎水性治療薬をリポソームに組み込む方法が提供される。ある実施態様において、リポソームは、プロセスにおいて熱、有機溶媒、タンパク質、および／または無機塩を使用せずに調製される。
一実施態様において、疎水性治療薬を予備形成されたリポソームに組み込む方法が提供され、この方法は以下を含む。
（ａ）（ｉ）水性媒体に懸濁された複数の予備形成された、脂質二重層相を形成する脂質を含むリポソームを含むリポソーム懸濁液と、（ｉｉ）疎水性治療薬の固体形態を提供すること； 
（ｂ）疎水性治療薬の固体形態をリポソーム懸濁液に添加し、それによりリポソーム-薬物懸濁液を形成すること；そして 
（ｃ）リポソーム薬物懸濁液を均質化すること； 
これにより、疎水性治療薬が脂質二重層相に組み込まれ；そして 
ここで、ステップ（ｃ）は、周囲温度以下の温度で行われる。
【００２１】
ある実施態様において、ステップ（ｂ）および／または（ｃ）は、溶媒の非存在下で行われる。ある実施態様において、ステップ（ｂ）および／または（ｃ）は、界面活性剤の非存在下で行われる。
【００２２】
ある実施態様において、疎水性治療薬は小分子薬または抗体である。ある実施態様において、ステップ（ｃ）の後に、疎水性治療薬の少なくとも約８０％が脂質二重層相に結合される。
【００２３】
ある実施態様において、リポソーム脂質に対する治療薬のモル比は少なくとも約１：１０である。
ある実施態様において、ステップ（ｃ）におけるリポソーム薬物懸濁液の均質化は、微小流動化、超音波処理、押出、凍結融解、またはそれらの組み合わせにより行われる。
ある実施態様において、治療薬は、ステップ（ｂ）および（ｃ）中に溶媒と接触せず、リポソームの形成前にリポソーム脂質と接触しない。
【００２４】
ある実施態様において、リポソームは、ステップ（ｃ）の後、本質的に単層である。
ある実施態様において、リポソームは、ステップ（ｃ）後に約１００ｎｍ以下の直径を有する。ある実施態様において、リポソームは、ステップ（ｃ）後に約５０ｎｍ以下の直径を有する。
ある実施態様において、ステップ（ａ）で提供されるリポソーム懸濁液は、水性媒体および／またはリポソームに存在する追加の治療薬を含む。ある実施態様において、リポソームの内側および外側の水性媒体の組成は、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）において同一である。
【００２５】
ある実施態様において、リポソーム脂質は、２０％以下の飽和脂肪酸を含む。ある実施態様において、リポソーム脂質は、Ｌ−α−ホスファチジルコリンを含む。
ある実施態様において、この方法は、ステップ（ｃ）の後、滅菌濾過、凍結乾燥、または凍結乾燥および水性媒体での再構成を行うことをさらに含む。
ある実施態様において、治療薬は、約４℃で水性媒体中に保存すると、ステップ（ｃ）の後少なくとも２ヶ月間、リポソームの脂質二重層相への結合を維持する。ある実施態様において、治療薬は、ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥および周囲温度での少なくとも１年間の貯蔵および水性媒体での再構成後、脂質二重層相との会合を維持する。
【００２６】
ある実施態様において、ステップ（ｃ）後の平均リポソームサイズは、約４℃で水性媒体に保存すると、少なくとも２ヶ月間約１００ｎｍ未満を維持する。ある実施態様において、ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥、周囲温度で少なくとも１年間の貯蔵、および水性媒体での再構成の後、平均リポソームサイズは約１００ｎｍ未満を維持する。
【００２７】
ある実施態様において、周囲温度は約１５℃から約３５℃である。
ある実施態様において、脂質二重層相は前記温度で液晶である。
ある実施態様において、ステップ（ｂ）および（ｃ）におけるリポソーム薬物懸濁液の脂質濃度は、約１から約７重量％である。
【００２８】
ある実施態様において、ステップ（ｂ）で添加される固体疎水性治療薬は、約１から約２０ｍｇ／ｍＬのリポソーム薬物懸濁液中の薬剤の総濃度を提供する。
別の実施態様において、疎水性治療薬を予備形成されたリポソームに組み込む方法が提供され、この方法は以下のステップを含む：
（ａ）（ｉ）水性媒体に懸濁した複数の予備形成された、脂質二重層相を形成する脂質を含むリポソームを含むリポソーム懸濁液と、（ｉｉ）溶媒を含むかまたは溶媒からなる液体媒体に溶解した疎水性治療薬を含む治療薬濃縮物を提供すること； 
（ｂ）治療薬濃縮物を前記リポソーム懸濁液に加えてリポソーム薬物懸濁液を形成すること、ここで、リポソーム薬物懸濁液中の溶媒の総濃度は１０重量パーセント以下であり；そして 
（ｃ）リポソーム薬物懸濁液を均質化すること； 
これにより、疎水性治療薬が脂質二重層相に組み込まれ；そして 
ここで、ステップ（ｃ）は、周囲温度以下の温度で行われる。
【００２９】
ある実施態様において、ステップ（ｂ）におけるリポソーム薬物懸濁液中の溶媒の総濃度は、約５重量パーセント以下である。ある実施態様において、溶媒は水混和性有機溶媒である。
【００３０】
ある実施態様において、液体媒体は、さらに水または水性媒体を含む。
ある実施態様において、溶媒は、アルコール、ケトン、エーテル、有機酸、有機塩基、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある実施態様において、溶媒は、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、およびＤＭＳＯからなる群から選択される。
ある実施態様において、液体媒体は１００％エタノールである。
【００３１】
ある実施態様において、ステップ（ｃ）は、界面活性剤を使用せずに行われる。
ある実施態様において、疎水性治療薬は小分子薬または抗体である。ある実施態様において、ステップ（ｃ）の後に、疎水性治療薬の少なくとも約８０％が脂質二重層相に結合される。
ある実施態様において、治療薬とリポソーム脂質のモル比は少なくとも約１：１０である。
【００３２】
ある実施態様において、ステップ（ｃ）におけるリポソーム薬物懸濁液の均質化は、微小流動化、超音波処理、押出、凍結融解、またはそれらの組み合わせにより行われる。
ある実施態様において、治療薬は、ステップ（ｂ）および（ｃ）中に溶媒と接触せず、リポソームの形成前にリポソーム脂質と接触しない。
【００３３】
ある実施態様において、リポソームは、ステップ（ｃ）の後、本質的に単層である。
ある実施態様において、リポソームは、ステップ（ｃ）後に約１００ｎｍ以下の直径を有する。ある実施態様において、リポソームは、ステップ（ｃ）後に約５０ｎｍ以下の直径を有する。
ある実施態様において、ステップ（ａ）で提供されるリポソーム懸濁液は、水性媒体および／またはリポソームに存在する追加の治療薬を含む。ある実施態様において、リポソームの内側および外側の水性媒体の組成は、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）において同一である。
【００３４】
ある実施態様において、リポソーム脂質は、２０％以下の飽和脂肪酸を含む。
ある実施態様において、リポソーム脂質は、Ｌ−α−ホスファチジルコリンを含む。
ある実施態様において、この方法は、ステップ（ｃ）の後、滅菌濾過、凍結乾燥、または凍結乾燥および水性媒体での再構成を行うことをさらに含む。
ある実施態様において、治療薬は、約４℃で水性媒体中に保存すると、少なくとも２ヶ月間、ステップ（ｃ）の後リポソームの脂質二重層相への結合を維持する。ある実施態様において、治療薬は、ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥および周囲温度での少なくとも１年間の貯蔵および水性媒体での再構成後、脂質二重層相との結合を維持する。
【００３５】
ある実施態様において、（ｃ）からの均質化されたリポソーム懸濁液は凍結乾燥され、それにより溶媒が除去される。好ましくは、溶媒の少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または本質的に１００％が除去される。
ある実施態様において、ステップ（ｃ）後の平均リポソームサイズは、約４℃で水性媒体に保存すると、少なくとも２ヶ月間約１００ｎｍ未満を維持する。ある実施態様において、ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥、周囲温度で少なくとも１年間の貯蔵、および水性媒体での再構成の後、平均リポソームサイズは約１００ｎｍ未満を維持する。
ある実施態様において、周囲温度は約１５℃から約３５℃である。
【００３６】
ある実施態様において、脂質二重層相は前記温度で液晶である。ある実施態様において、ステップ（ｂ）および（ｃ）におけるリポソーム薬物懸濁液の脂質濃度は、約１から約７重量％である。
ある実施態様において、ステップ（ｂ）で添加される固体疎水性治療薬は、約１から約２０ｍｇ／ｍＬのリポソーム薬物懸濁液中の薬剤の総濃度を提供する。
【００３７】
本発明は、以下の実施態様の列挙で要約することもできる。
１．疎水性治療薬を予備形成されたリポソームに組み込む方法であって、該方法は以下のステップを含む：。
（ａ）（ｉ）水性媒体に懸濁された複数の予備形成された、脂質二重層相を形成する脂質を含むリポソームを含むリポソーム懸濁液と、（ｉｉ）疎水性治療薬の固体形態を提供すること； 
（ｂ）疎水性治療薬の固体形態をリポソーム懸濁液に添加し、それによりリポソーム-薬物懸濁液を形成すること；そして 
（ｃ）リポソーム薬物懸濁液を均質化すること； 
これにより、前記疎水性治療薬が脂質二重層相に組み込まれ、そして、ステップ（ｃ）は、周囲温度以下の温度で行われる。
【００３８】
２．ステップ（ｂ）および／または（ｃ）が溶媒の非存在下で行われる、実施態様１の方法。
３．ステップ（ｂ）および／または（ｃ）が界面活性剤の非存在下で行われる、実施態様１の方法。
４．疎水性治療薬が小分子薬または抗体である、実施態様１の方法。
５．疎水性治療薬の少なくとも約８０％が、ステップ（ｃ）の後に脂質二重層相に結合している、実施態様１の方法。
【００３９】
６．治療薬とリポソーム脂質のモル比が少なくとも約１：１０である、実施態様１の方法。
７．ステップ（ｃ）におけるリポソーム薬物懸濁液の均質化が、微小流動化、超音波処理、押出、凍結融解、またはそれらの組み合わせによって行われる、実施態様１の方法。
８．治療剤がステップ（ｂ）および（ｃ）中に溶媒と接触せず、リポソームの形成前にリポソーム脂質と接触しない、実施態様１の方法。
９．リポソームがステップ（ｃ）後に本質的に単層である、実施態様１の方法。
【００４０】
１０．リポソームが、ステップ（ｃ）後に約１００ｎｍ以下の直径を有する、実施態様１の方法。
１１．リポソームが、ステップ（ｃ）後に約５０ｎｍ以下の直径を有する、実施態様１の方法。１２．ステップ（ａ）で提供されるリポソーム懸濁液が、水性媒体および／またはリポソーム中に存在する追加の治療薬を含む、実施態様１の方法。
１３．リポソームの内側および外側の水性媒体の組成が、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）において同一である、実施態様１の方法。
１４．リポソーム脂質が２０％以下の飽和脂肪酸を含む、実施態様１の方法。
１５．リポソーム脂質がＬ−α−ホスファチジルコリンを含む、実施態様１の方法。
【００４１】
１６．ステップ（ｃ）の後に、滅菌濾過、凍結乾燥、または凍結乾燥および水性媒体での再構成を行うことをさらに含む、実施態様１の方法。
１７．約４℃で水性媒体中に保存すると、ステップ（ｃ）の後、少なくとも２ヶ月間、治療薬がリポソームの脂質二重層相への結合を維持する、実施態様１の方法。
１８．治療薬が、ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥および周囲温度での少なくとも１年間の貯蔵および水性媒体中の再構成の後、脂質二重層相との会合を維持する、実施態様１の方法。
【００４２】
１９．ステップ（ｃ）後の平均リポソームサイズが、約４℃で水性媒体中に保存すると、少なくとも２ヶ月間約１００ｎｍ未満を維持する、実施態様１の方法。
２０．ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥、周囲温度で少なくとも１年間の貯蔵、および水性媒体での再構成の後、平均リポソームサイズが約１００ｎｍ未満を維持する、実施態様１の方法。
２１．前記温度が約１５℃から約３５℃である、実施態様１の方法。
【００４３】
２２．脂質二重層相が前記温度で液晶である、実施態様１の方法。
２３．ステップ（ｂ）および（ｃ）におけるリポソーム薬物懸濁液の脂質濃度が約１〜約７重量％である、実施態様１の方法。
２４．ステップ（ｂ）で添加される固体疎水性治療薬が、約１から約２０ｍｇ／ｍＬのリポソーム薬物懸濁液中の薬剤の総濃度を提供する、実施態様１の方法。
【００４４】
２５．疎水性治療薬を予備形成されたリポソームに組み込む方法であって、該方法は以下のステップを含む：。
（ａ）（ｉ）水性媒体に懸濁した複数の予備形成された、脂質二重層相を形成する脂質を含むリポソームを含むリポソーム懸濁液と、（ｉｉ）溶媒を含むかまたは溶媒からなる液体媒体に溶解した疎水性治療薬を含む治療薬濃縮物を提供すること； 
（ｂ）治療薬濃縮物をリポソーム懸濁液に加えてリポソーム薬物懸濁液を形成すること、ここで、前記リポソーム薬物懸濁液中の溶媒の総濃度は１０重量パーセント以下であり；そして 
（ｃ）リポソーム薬物懸濁液を均質化すること； 
これにより、前記疎水性治療薬が脂質二重層相に組み込まれ、そして、ステップ（ｃ）は、周囲温度以下の温度で行われる。
【００４５】
２６．ステップ（ｂ）におけるリポソーム薬物懸濁液中の溶媒の総濃度が約５重量パーセント以下である、実施態様２５の方法。
２７．溶媒が水混和性有機溶媒である、実施態様２５の方法。
２８．液体媒体が水または水性媒体をさらに含む、実施態様２５の方法。
２９．溶媒が、アルコール、ケトン、エーテル、有機酸、有機塩基、およびそれらの混合物からなる群から選択される、実施態様２５の方法。
【００４６】
３０．溶媒が、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、およびＤＭＳＯからなる群から選択される、実施態様２５の方法。
３１．液体媒体が１００％エタノールである、実施態様２５の方法。
３２．ステップ（ｃ）が界面活性剤を使用せずに行われる、実施態様２５の方法。
３３．疎水性治療薬が小分子薬または抗体である、実施態様２５の方法。
３４．疎水性治療薬の少なくとも約８０％がステップ（ｃ）の後の脂質二重層相と会合している、実施態様２５の方法。
３５．治療薬と脂質のモル比が少なくとも約１：１０ある、実施態様２５の方法。
【００４７】
３６．ステップ（ｃ）におけるリポソーム薬物懸濁液の均質化が、微小流動化、超音波処理、押出、凍結融解、またはそれらの組み合わせによって行われる、実施態様２５の方法。
３７．治療薬が、リポソームの形成前にリポソーム脂質と接触しない、実施態様２５の方法。
３８．リポソームがステップ（ｃ）の後に本質的に単層である、実施態様２５の方法。
３９．リポソームが、ステップ（ｃ）の後に約１００ｎｍ以下の直径を有する、実施態様２５の方法。
【００４８】
４０．リポソームが、ステップ（ｃ）の後に約５０ｎｍ以下の直径を有する、実施態様２５の方法。
４１．ステップ（ａ）で提供されるリポソーム懸濁液が、水性媒体および／またはリポソーム中に存在する追加の治療薬を含む、実施態様２５の方法。
４２．リポソームの内側および外側の水性媒体の組成が、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）において同一である、実施態様２５の方法。
４３．リポソーム脂質が２０％以下の飽和脂肪酸を含む、実施態様２５の方法。
４４．リポソーム脂質がＬ−α−ホスファチジルコリンを含む、実施態様２５の方法。
【００４９】
４５．方法が、ステップ（ｃ）の後に、滅菌濾過、凍結乾燥、または凍結乾燥および水性媒体での再構成を行うことをさらに含む、実施態様２５の方法。
４６．実施態様２５の方法であって、治療薬は、約４℃で水性媒体中に保存すると、ステップ（ｃ）の後、少なくとも２ヶ月間、リポソームの脂質二重層相に結合を維持する。
４７．治療薬が、ステップ（ｃ）の後、凍結乾燥および周囲温度での少なくとも１年間の貯蔵および水性媒体での再構成の後、脂質二重層相との会合を維持する、実施態様２５の方法。
４８．ステップ（ｃ）後の平均リポソームサイズが、約４℃で水性媒体中に保存すると、少なくとも２ヶ月間約１００ｎｍ未満を維持する、実施態様２５の方法。
【００５０】
４９．ステップ（ｃ）に続く凍結乾燥、周囲温度での少なくとも１年間の貯蔵、および水性媒体中での再構成の後、平均リポソームサイズが約１００ｎｍ未満を維持する、実施態様２５の方法。
５０．前記温度が約１５℃から約３５℃である、実施態様２５の方法。
５１．脂質二重層相が前記温度で液晶である、実施態様２５の方法。
５２．ステップ（ｂ）および（ｃ）におけるリポソーム薬物懸濁液の脂質濃度が約１〜約７重量％である、実施態様２５の方法。
【００５１】
５３．実施態様２５の方法であって、ステップ（ｂ）で添加される固体疎水性治療薬が、約１から約２０ｍｇ／ｍＬのリポソーム薬物懸濁液中の薬剤の総濃度を提供する。
５４．以下をさらに含む、実施態様２５の方法：
（ｄ）前記均質化されたリポソーム懸濁液を凍結乾燥し、それにより前記溶媒を除去すること。
【００５２】
定義 
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「脂質」は、脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪族アルコール、またはリン脂質であると理解される。脂質は、コレステロールを含むがこれに限定されないステロール、スフィンゴミエリンを含むがこれに限定されないスフィンゴ脂質、ガングリオシド、グロボシド、およびセレブロシドを含むがこれらに限定されないスフィンゴ糖脂質、および、限定されないが、ステアリル、オレイルおよびリノレイルアミンを含む界面活性剤アミンを含むと読むこともできる。
【００５３】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「リン脂質」は、そのヒドロキシル基の１つがリン酸でエステル化され、他の２つのヒドロキシル基が、互いに等しいか異なることができ、そして飽和または不飽和であり得る長鎖脂肪酸でエステル化されているグリセロールの両親媒性誘導体であると理解される。中性リン脂質は、一般に、他のリン酸ヒドロキシルが極性基（通常はヒドロキシルまたはアミノ）で置換されたアルコールによってエステル化され、正味電荷がゼロであるものである。電荷を持つリン脂質は一般に、他のリン酸ヒドロキシルが極性基で置換されたアルコールによってエステル化され、その正味電荷が正または負であるものである。
【００５４】
リン脂質の例には、ホスファチジン酸（「ＰＡ」）、ホスファチジルコリン（「ＰＣ」）、ホスファチジルグリセロール（「ＰＧ」）、ホスファチジルエタノールアミン（「ＰＥ」）、ホスファチジルイノシトール（「ＰＩ」）、およびホスファチジルセリン（「ＰＳ」）、スフィンゴミエリン（脳スフィンゴミエリンを含む）、レシチン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド、ジアラキドイルホスファチジルコリン（「ＤＡＰＣ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルコリン（「ＤＤＰＣ」）、ジエライドイルホスファチジルコリン（「ＤＥＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルコリン（「ＤＬＰＣ」）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジオレオイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（「ＰＯＰＣ」）、ジアラキドイルホスファチジルフリセロール（「ＤＡＰＧ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルグリセロール（「ＤＤＰＧ」）、ジエリドイルホスファチジルグリセロール（「ＤＥＰＧ」）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＬＰＧ」）、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジオールコイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルグリセｒ−ル（「ＰＯＰＧ」）、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミノ（「ＤＡＰＥ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン（「ＤＤＰＥ」）、ジエライドイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＥＰＥ」）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＬＰＥ」）、ジリノレオイルホスファチジルフタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン（「ＰＯＰＥ」）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（「ＤＡＰＩ」）、ジデカノイル−L−α−ホスファチジルイノシトール（「ＤＤＰＩ」）、ジエライドイルホスファチジルイノシトール（「ＤＥＰＩ」）、ジラウロイルホスチジルイノシトール（「ＤＬＰＩ」）、ジリノレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（「ＤＭＰＩ」）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（「ＤＯＰＩ」）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（「ＤＰＰＩ」）、ジステアロイルホスファチジルリノシトール（「ＤＳＰＩ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルイノシトール（「ＰＯＰＩ」）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（��ＤＡＰＳ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルセリン（「ＤＤＰＳ」）、ジエライドイルホスファチジルセリン（「ＤＥＰＳ」）、ジラウロイルホスファチジルセリン（「ＤＬＰＳ」）、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジオレオイルホスファチジルセリン（「ＤＯＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、ジステアロイルホスファチジルセリン（「ＤＳＰＳ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルセリン（「ＰＯＰＳ」）、ジアラキドイルスフィンゴミエリン、ジデカノイルスフィンゴミエリン、ジエライドイルスフィンゴミエリン、ジラウロイルスフィンゴミエリン、ジリノレオイルスフィンゴミエリン、ジミリストイルスフィンゴミエリン、スフィンゴミエリン、ジオレオイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、および１−パルミトイル−２−オレオイル−スフィンゴミエリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用される「抗体」は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得、天然または組換え免疫グロブリン分子であり得る。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなどの免疫グロブリンの任意のクラスであり得る。本発明で使用される抗体には、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｖなど）、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、ナノボディ、ｓｃＦｖなどの単一ドメイン抗体、および抗体融合タンパク質などの抗体類似体および誘導体が含まれる。それらは、単一特異性、二重特異性、または多重特異性である。抗体は、例えば、マウス、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体であり得る。
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「カプセル化する」または「カプセル化」は、リポソームまたはリポソーム小胞に活性剤を組み込むプロセスであると理解される。カプセル化された活性剤は、水性の内部に残るか、膜と会合することができる。
【００５６】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、化合物の溶解度に関連して使用する場合の「（〜を）高める」または「高まる」という用語は、本明細書で提供する方法により、水中の同じ化合物の溶解度と比較して化合物の溶解度が増加することを意味する。特異的には、用語「高める」または「高まる」は、本明細書で提供される方法が使用される場合、化合物の溶解度が参照溶媒中の同じ化合物の溶解度の約２０パーセント以上、約４０パーセント以上、約６０パーセント以上、約８０パーセント、約１００パーセント以上、または約２００パーセント以上増加することを意味する。いくつかの実施態様において、参照溶媒は水である。
【００５７】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「疎水性化合物」または「疎水性治療薬」という用語は、水溶性がほとんど、または全くない化合物を意味する。疎水性化合物または疎水性治療薬は、任意のサイズの有機分子または無機分子または生体分子であり得る。いくつかの実施態様において、疎水性化合物は、約２０重量パーセント未満、約１５重量パーセント、約１０重量パーセント、約５重量パーセント、約１重量パーセン、約０．１重量％または約０．０１重量％の固有の水溶性（すなわち、非イオン化形態の水溶性）を有する。
【００５８】
他の実施態様において、疎水性化合物は、約１０ｍｇ／ｍＬ未満、約７ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ約３ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬまたは約０．１ｍｇ／ｍＬの固有の水溶性を有する。いくつかの実施態様において、疎水性化合物または治療薬は、例えば、約０より大きい、約０．５より大きい、約１より大きい、約１．５より大きい、約２より大きい、約２．５より大きい、約３より大きい、約３．５より大きい、または約４より大きいオクタノール−水分配係数（ｌｏｇＰ値）を有することができる。いくつかの実施態様では、疎水性治療薬は両親媒性である。疎水性治療薬は、疎水性相互作用に加えて、静電相互作用、水素結合、および／またはファンデルワールス相互作用を含む、あらゆるタイプの非共有相互作用を介してリポソーム脂質と相互作用し得る。
【００５９】
本明細書で使用する場合、または特に明記しない限り、用語「水性媒体（単数）」または「水性媒体（複数）」には、水、生理食塩水、糖溶液、輸液、緩衝液、および他の容易に入手可能な水系媒体などの水系媒体が含まれる。さらに、水性媒体は、１つ以上の水溶性有機溶媒を含んでもよい。非経口溶液の場合、水性媒体は好ましくは無菌であり、活性剤の担体としての使用に適している。水性媒体の例には、注射用水、生理食塩水、リンゲル液、Ｄ５Ｗ、またはブドウ糖や他の電解質などの水混和性物質の他の溶液が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、用語「脂肪酸」は、その構造が１つ以上の炭素原子を有する炭化水素鎖に結合したカルボキシル基である化合物を意味する。炭化水素鎖は飽和または不飽和（すなわち、アルキル、アルケニルまたはアルキニル炭化水素鎖）であり得る。また、炭化水素鎖は直鎖でも分岐鎖でもよい。さらに、いくつかの実施態様において、炭化水素鎖の水素が置換されていてもよい。
【００６１】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、用語「脂肪族アルコール」は、その構造が１つ以上の炭素原子を有する炭化水素鎖に結合したアルコール基である化合物を意味する。炭化水素鎖は飽和または不飽和（すなわち、アルキル、アルケニルまたはアルキニル炭化水素鎖）であり得る。また、炭化水素鎖は直鎖でも分岐鎖でもよい。さらに、いくつかの実施態様において、炭化水素鎖の水素が置換されていてもよい。
【００６２】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「脂肪酸塩」という用語は、脂肪酸と無機／有機塩基との反応から形成される化合物を意味する。さらに、この用語には、脂肪族アルコールと無機／有機酸との反応から形成される化合物が含まれる。そのような酸の例には、硫酸およびリン酸が含まれるが、これらに限定されない。脂肪酸塩の炭化水素鎖は飽和または不飽和（すなわち、アルキル、アルケニルまたはアルキニル炭化水素鎖）であり得る。加えて、炭化水素鎖は直鎖でも分岐鎖でもよい。さらに、いくつかの実施態様において、炭化水素鎖の水素が置換されていてもよい。
【００６３】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「置換」という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アロイル、ハロ、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）または置換または非置換ヘテロシクロアルキル、ハロアルコキシ（例えば、トリフルオロメトキシ）、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、オキソ、アルカノイル、アリール、置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール（例えば、インドリル、イミダゾリル、フリル、チエニル、チアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジルなど）、アリールアルキル、アルキルアリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロシクロ、アリールオキシ、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ、モノおよびジ置換アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、置換アルカノイルアミノ、置換アリールアミノ、置換アラルカノイルアミノ、カルバミル（例、ＣＯＮＨ２）、置換カルバミル（例、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮＨ−アリール、ＣＯＮＨ−アリールアルキルまたは例えば、窒素に２つの置換基がある場合）、カルボニル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、シアノ、エステル、エーテル、グアニジノ、ニトロ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールアルキルスルホニル、スルホンアミド（例：ＳＯ２ＮＨ２）、置換スルホンアミド、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アリールアルキルチオ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロチオ、アルキルチオノ、アリールチオノおよびアリールアルキルチオノを含むがこれらに限定されない１つ以上の置換基で置換された基を意味する。
【００６４】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、用語「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１０個の炭素原子、最も好ましくは１〜４個の炭素原子を有する飽和直鎖または分岐鎖の非環状炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチル、−ｎ−ヘキシル、−ｎ−ヘプチル、−ｎ−オクチル、−ｎ−ノニルおよび−ｎ−デシルが含まれる；一方、飽和分岐アルキルには、  −イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、２，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルペンチル、２，４−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルヘキシル、２，４−ジメチルヘキシル、２，５−ジメチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，２−ジメチルヘキシル、３，３−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルヘキシル、４，４−ジメチルヘキシル、２−エチルペンチル、３−エチルペンチル、２−エチルヘキシル、３−エチルヘキシル、４−エチルヘキシル、２−メチル−２−エチルペンチル、２−メチル−３−エチルペンチル、２−メチル−４−エチルペンチル、２−メチル−２−エチルヘキシル、２−メチル−４−エチルヘキシル、２，２−ジエチルペンチル、３，３−ジエチルヘキシル、２，２−ジエチルヘキシル、３，３−ジエチルヘキシルなどを含む。アルキル基は非置換でも置換されていてもよい。不飽和アルキル基には、アルケニル基およびアルキニル基が含まれ、これらについては以下で説明する。
【００６５】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「アルケニル」という用語は、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１０個の炭素原子、最も好ましくは２〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の非環式炭化水素を意味し、少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を含む。代表的な直鎖および分岐（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルには、−ビニル、−アリル、−１−ブテニル、−２−ブテニル、−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、−２−メチル−２−ブテニル、−２，３−ジメチル−２−ブテニル、−１−ヘキセニル、−２−ヘキセニル、−３−ヘキセニル、−１−ヘプテニル、−２−ヘプテニル、−３−ヘプテニル、−１−オクテニル、−２−オクテニル、−３−オクテニル、−１−ノネニル、−２−ノネニル、−３−ノネニル、−１−デセニル、−２−デセニル、−３−デセニルなどを含む。アルケニル基の二重結合は、別の不飽和基と非共役でも、共役していてもよい。アルケニル基は非置換でも置換されていてもよい。
【００６６】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、用語「アルキニル」は、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１０個の炭素原子、最も好ましくは２〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の非環式炭化水素を意味し、少なくとも１つの炭素-炭素三重結合を含む。代表的な直鎖および分岐（Ｃ２‐Ｃ１０）アルキニルには、−アセチレニル、−プロピニル、−１−ブチニル、−２−ブチニル、−１−ペンチニル、−２−ペンチニル、−３−メチル−１−ブチニル、−４−ペンチニル、−１−ヘキシニル、−２−ヘキシニル、−５−ヘキシニル、−１−ヘプチニル、−２−ヘプチニル、−６−ヘプチニル、−１−オクチニル、−２−オクチニル、−７−オクチニル、−１−ノニニル、−２−ノニニル、−８−ノニニル、−１−デシニル、−２−デシニル、−９−デシニルなどが含まれる。アルキニル基の三重結合は、非共役または別の不飽和基に共役することができる。アルキニル基は、非置換でも置換され得る。
【００６７】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「薬学的に許容し得る塩」という用語は、無機酸および無機塩基および有機酸および有機塩基を含む薬学的に許容し得る非毒性酸または塩基から調製される塩をいう。本明細書で提供される組成物に適した薬学的に許容し得る塩基付加塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛から作られた金属塩、またはリジン、Ｎ，Ｎ’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインから作られた金属塩が含まれるが、これらに限定されない。適切な非毒性酸には、酢酸、アルギン酸、アントラニル酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、樟脳スルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、フロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グリコール酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、硫酸、酒石酸、およびｐ−トルエンスルホン酸などの無機および有機酸が含まれるが、これらに限定されない。特定の非毒性酸には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、およびメタンスルホン酸が含まれる。したがって、特定の塩の例には、塩酸塩およびメシレート塩が含まれる。他のものは、当技術分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton Pa. (1990) or Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Publishing, Easton Pa.(1995)などを参照されたい。
【００６８】
本明細書で使用される「水和物」という用語は、非共有分子間力により結合された化学量論的または非化学量論的量の水をさらに含む、本明細書で提供される化合物またはその塩を意味する。
【００６９】
本明細書で使用される「クラスレート」という用語は、ゲスト分子（例えば、溶媒または水）が閉じ込められた空間（例えば、チャネル）を含有する結晶格子の形態における本明細書で提供される化合物、またはその塩を意味する。
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、用語「プロドラッグ（前駆薬剤）」は、生物学的条件下（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）で加水分解、酸化、または反応して活性化合物を提供できる化合物の誘導体を意味する。プロドラッグの例には、生体加水分解性アミド、生体加水分解性エステル、生体加水分解性カルバメート、生体加水分解性炭酸塩、生体加水分解性ウレイド、および生体加水分解性リン酸類似体などの生体加水分解性部分を含む化合物の誘導体および代謝産物が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、カルボキシル官能基を有する化合物のプロドラッグは、カルボン酸の低級アルキルエステルである。分子上に存在するカルボン酸部分のいずれかをエステル化すると、カルボン酸エステルが便利に形成される。プロドラッグは、Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6th ed. (Donald J. Abraham ed., 2001, Wiley), およびDesign and Application of Prodrugs (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers Gmfh)によって記載されたものなど、よく知られた方法を使用して通常、調製され得る。
【００７０】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「安定」という用語は、製剤に関連して使用する場合、本明細書で提供する方法を使用して調製した場合、製剤の活性剤が特定の時間可溶化したままであり、大幅に劣化または凝集しない、または他の方法で修飾されない（たとえば、ＨＰＬＣによる判定）ことを意味する。リポソームの懸濁液を指す場合、「安定」という用語は、本明細書で提供される方法を使用して調製された場合、リポソームが特定の時間懸濁液中に分散したままであり、著しく分解、凝集、沈殿、またはラメラのサイズや数を変更するなど他の方法で修飾されないことを意味する。リポソームの安定性は、電子顕微鏡や動的光散乱などの既知の手法で監視し得る。
【００７１】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「Ｔｃ未満の温度」は、最も低いＴｃを有する脂質のＴｃより低い温度であると理解され、「Ｔｃより高い温度」は、最高のＴｃを有する脂質のＴｃよりも高い温度であると理解される。
【００７２】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「有害成分」という用語は、医薬組成物に関連して使用される場合、溶血、過敏症、末梢神経障害などの臨床的副作用、および／または組成物の有効成分の生物学的利用能の低下を引き起こし得る医薬組成物で一般的に使用される成分を意味する。有害成分の例には、エタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸メチル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（「ＭＴＢＥ」）、テトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」）、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、ジオキサン、エチレングリコール、ジエチルエングリコール、ジグライム、１，２−ジメトキシエタン、１−ブタノール、２−ブタノール、２−ブタノン、ベンゼン、トルエン、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）、ジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）、ヘキサメチルホスホラミド（「ＨＭＰＡ」）、Ｎ−メチルピロリドン、グリセリン、ニトロメタン、トリエチルアミン、キシレン、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ．ＲＴＭ．ＥＬ、およびポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などの有機溶媒を含む毒性溶媒、；ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎなど）またはビタミンＥなどの補助洗剤または界面活性剤；ヒマシ油またはコーン油などの油；ＨＳＡなどのタンパク質；または潜在的な汚染源であるその他の生物製剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書で使用される「水混和性溶媒」という用語は、使用される溶媒と水の比で水と混合される場合、単一の連続相を形成する溶媒をいう。混和性は、目視検査やその他の光学的方法など、さまざまな既知の方法で判断できる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、タキソテールおよびミラドセタキセル（Ｑ７ＤＸ３）をさまざまな濃度のヌードマウスに注射後の体重変化率を示している。
【図２】図２は、タキソテールとミラドセタキセル（Ｑ７ＤＸ３）を２０ ｍｇ／ｋｇの用量でヌードマウスに注射した後の体重変化率を示している。
【図３】図３は、ヒトメラノーマ腫瘍に対するタキソテールとミラドセタキセルの有効性を示している。
【図４】図４は、ヒト前立腺腫瘍に対するタキソテールとミラドセタキセルの有効性を示している。
【図５】図５は、タキソテールおよびミラドセタキセル製剤中の２５ ｍｇ／ｋｇのドセタキセル単回投与後のラットにおけるドセタキセル平均血漿濃度の比較を示している。
【図６】図６は、本発明の異なる実施態様によるリポソームによる１つ以上の疎水性治療薬のカプセル化の異なるモードの概略図である。
【図７】図７Ａは、リポソームを添加しないアダリムマブ抗体のサイズ排除ＨＰＬＣのコントロール溶出プロファイルを示す。図７Ｂは、リポソームカプセル化トラスツズマブ抗体のサイズ排除ＨＰＬＣの溶出プロファイルを示す。図７Ｃは、リポソームカプセル化アダリムマブ抗体のサイズ排除ＨＰＬＣの溶出プロファイルを示す。
【図８】図８は、ミラドセタキセル含有リポソームの凍結乾燥および−２０℃で２年間保存後の粒子サイズを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
詳細な説明 
本明細書では、疎水性治療薬を含有するリポソームの調製方法が提供される。該方法は、疎水性治療薬をリポソームに組み込むことにより、疎水性治療薬を高濃度で水性媒体中に効果的に可溶化することを可能にする。リポソームは安定であり、その生産は有機溶媒、界面活性剤、および他の有害な成分の使用を削減または回避する。
【００７６】
いくつかの実施態様において、本発明の任意の方法により、２つ以上の異なる疎水性治療薬がリポソームに組み込まれる。いくつかの実施態様において、疎水性治療薬は、薬剤の有機溶媒溶液をリポソームに提示することなく、固体としてリポソームにカプセル化される。他の実施態様において、疎水性治療薬は、溶媒を含むかまたは溶媒からなる液体媒体に溶解された予備形成されたリポソームと接触される。
【００７７】
疎水性治療薬は、疎水性相互作用、静電（イオン性）相互作用、水素結合、および／またはファンデルワールス相互作用を含む、あらゆるタイプの非共有相互作用を介してリポソーム脂質と相互作用し得る。好ましくは、疎水性相互作用は、疎水性薬剤分子とリポソーム脂質分子との間の結合相互作用の重要な構成要素である。好ましくは、結合相互作用は完全に非共有であり、好ましくは、疎水性化合物および脂質分子は、２つの間に共有または非共有会合を形成するように化学修飾されていない。疎水性治療薬は、さまざまな方法でリポソームに組み込まれるか、リポソームに付着させることができる。疎水性治療薬は、リポソーム脂質相によって部分的または完全にカプセル化することができる。いくつかの実施態様において、疎水性治療薬はリポソーム脂質二重層に可逆的にくっついている。いくつかの実施態様において、疎水性治療薬は、アシル鎖と会合し脂質二重層の疎水性内部またはコアの全部または一部に位置する。いくつかの実施態様において、疎水性治療薬は、脂質二重層の外面および／または内面に全部または一部配置され、リポソーム脂質の極性基と相互作用する。いくつかの実施態様において、疎水性治療薬は、リポソーム脂質の極性基と非極性基の両方との非共有相互作用によってリポソームに結合している。
【００７８】
図６は、カプセル化された疎水性治療薬を含有する水性媒体６１に懸濁されたリポソーム６０の概略図を示す。一実施態様において、疎水性治療薬６３は、脂質二重層６２の疎水性コアと優先的に会合し、結合する。別の実施態様において、疎水性治療薬６４は、脂質二重層６２の疎水性内部と、脂質二重層の疎水性コア内に部分的にのみ位置する脂質二重層の外側６７および／または内側６８表面の両方に会合し、結合する。さらに別の実施態様において、疎水性治療薬６５は、リポソームの水性内部６６内に位置することができる。いくつかの実施態様において、疎水性治療薬は、位置６２、６７、６８、および６６のうちの２つ以上に見られる。
【００７９】
一実施態様において、疎水性治療薬は固体形態からリポソーム膜に加えられたり、リポソーム膜内に組み込まれたりする。本発明者らは、疎水性化合物を、顆粒、結晶、または沈殿物などの固体形態で提供される疎水性化合物を、水性媒体に懸濁した予備形成されたリポソーム膜にさらすことにより、リポソームに組み込むことができることを発見した。本発明者らは、二重層の外面が荷電されたおよび親水性部分を含有しているにもかかわらず、リポソーム膜がミセルへのそのような化合物の取り込みに類似した方法で、医薬品などの疎水性または両親媒性化合物を可溶化できることを発見した。この方法は、（ａ）（ｉ）水性媒体に懸濁された複数の予備形成された、脂質二重層相を形成する脂質を含有するリポソームを含有するリポソーム懸濁液、および（ｉｉ）固体形態の疎水性治療薬を提供すること、（ｂ）固体形態の疎水性治療薬をリポソーム懸濁液に添加し、それによりリポソーム-薬物懸濁液を形成すること、ならびに  （ｃ）リポソーム薬物懸濁液を均質化することの各ステップを含む。疎水性治療薬は、脂質二重層相に組み込まれる。ステップ（ｃ）は、周囲温度以下の温度下など、熱を加えずに行われる。いくつかの実施態様において、ステップ（ｂ）および／または（ｃ）は、溶媒を使用せずに行われる。いくつかの実施態様において、ステップ（ｂ）および／または（ｃ）は、界面活性剤を使用せずに行われる。
【００８０】
本発明の別の側面は、疎水性治療薬を溶媒含有溶液から予備形成されたリポソームに組み込む方法である：この方法は、（ａ）（ｉ）水性媒体に懸濁された複数の予備形成された、脂質二重層相を形成する脂質を含有するリポソームを含有するリポソーム懸濁液、および（ｉｉ）溶媒を含むかまたは溶媒からなる液体媒体に溶解した疎水性治療薬を含む治療薬濃縮物を提供すること、（ｂ）治療薬濃縮物をリポソーム懸濁液に加えてリポソーム薬物懸濁液を形成すること（ここで、リポソーム薬物懸濁液中の溶媒の総濃度は１０重量パーセント以下である）、ならびに（ｃ）リポソーム薬物懸濁液を均質化することの各ステップを含む。疎水性治療薬は、脂質二重層相に組み込まれる。ステップ（ｃ）は、周囲温度以下の温度下など、熱を加えることなく行うことができる。治療薬濃縮物の液体媒体は、疎水性治療薬を完全に溶解することができる任意の組成を有することができる。いくつかの実施態様において、液体媒体は、溶媒または２つ以上の溶媒の混合物からなる。いくつかの実施態様において、液体媒体は、有機溶媒からなるか、またはそれを含む。いくつかの実施態様において、液体媒体は、水混和性溶媒からなる。いくつかの実施態様において、液体媒体は、１００％エタノールからなる。いくつかの実施態様において、液体媒体は、水混和性溶媒に加えて水を含有する。いくつかの実施態様において、液体媒体は、溶媒または２つ以上の溶媒の混合物を含む。
【００８１】
水混和性溶媒を含有する実施態様において、水混和性溶媒は、アルコール、ケトン、エーテル、有機酸、有機塩基、およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、水混和性溶媒は、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、水混和性溶媒はエタノールである。いくつかの実施態様において、水混和性溶媒はエタノールであり、液体媒体は少なくとも５０％エタノール、少なくとも６０％エタノール、少なくとも７０％エタノール、少なくとも８０％エタノール、少なくとも９０％エタノール、少なくとも９５％エタノール、または少なくとも９８％エタノールを含み、残りはが好ましくは水である。
いくつかの実施態様において、ステップ（ｂ）におけるリポソーム薬物懸濁液中の溶媒の総濃度は、最大７重量パーセント、最大５重量パーセント、最大４重量パーセント、最大３重量パーセント、最大２重量パーセント 、または最大１重量パーセントである。
【００８２】
いくつかの実施態様において、ステップ（ｂ）および／または（ｃ）は、最大で１重量パーセント、最大で０．５重量パーセント、最大で０．２５重量パーセント、最大で０．１重量パーセントなどの限られた濃度の界面活性剤を使用して行われる。いくつかの実施態様において、リポソーム脂質と界面活性剤のモル比は、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３００：１、少なくとも５００：１、または少なくとも１０００：１である。ある実施態様において、ステップ（ｃ）は、界面活性剤を使用せずに行われる。本発明を如何なる特定のメカニズムに限定するつもりはないが、界面活性剤は、化合物を含有するミセルを形成し、その後リポソーム膜に分配するか、疎水性化合物のリポソーム膜への取り込みを促進できるように、脂質二重層構造をわずかに破壊することにより、化合物のリポソーム膜への取り込みを強化することができる。
【００８３】
いくつかの実施態様において、疎水性化合物をリポソーム膜に組み込む方法は、周囲温度で方法を行うことなどにより、熱を加えることなく行われる。周囲温度は、約１５℃から約３５℃の温度であり得る。いくつかの実施態様において、この方法は、脂質二重層相が液晶である温度で実施される。
【００８４】
いくつかの実施態様において、疎水性治療薬は、１５００ダルトン以下の分子量を有する分子などの小分子である。小分子の例には、ラパコン（β−ラパコン）、タキサン（タキソール、７−エピタキソール、７−アセチルタキソール、１０−デスアセチルタキソール、１０−デスアセチル−７−エピタキソール、７−キシロシルタキソール、１０−デスアセチル−７−シロシルタキソール、７−グルタリルタキソール、７−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシクロタキソール、７−Ｌ−アラニルタキソール、タキソテール、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない）、パクリタキセル、コルヒチン、トランスフェリン、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、ケトプロフェン、プロポフォール、アセチルサリチル酸、アセトアミノフェン、アンフォテリシン、ジゴキシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、血管新生阻害剤（例えば、ビタキシン、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、フマギリン類似体（例えば、ＴＮＰ−４７０）、ＣＭ１０１、ＩＦＮ−アルファ、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、スロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲ拮抗薬、アンジオスタチン、エンドスタチン、２−メトキシエストラジオール、テコガラン、サリドマイド、プロラクチン、リノミド、アンジオポエチン−１、塩基性線維芽細胞成長因子、血管内皮増殖因子）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシド）、シタラビン、アクチノマイシン、エトポシド、ブレオマイシン、ゲンタマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ストレプトゾトシン、シトシン、β−Ｄ−アラビノフラノシド−５’−三リン酸、シトクロムＣ、シスプラチン、Ｎ−ホスホノ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸、５−フルオロオロチン酸、アシクロビル、ジドブジン、インターフェロン、アミノグリコシド、セファロスポリン、テトラサイクリン、プロプラノロール、チモロール、ラベトロール、クロニジン、ヒドララジン、イミプラミン、アミトリプチリン、ドキセピン、フェニトイン、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、プロメタジン、プロスタグランジン、メトトレキサート、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、エストロゲン、エピルビシン、ベクロメタゾンおよびエステル、ビタミンＥ、コルチゾン、デキサメタゾンおよびエステル、吉草酸ベータメタゾン、ビフェニルジメチルジカルボン酸、カルシトニン、カンプトテシン、カプトプリル、セファゾリン、クロロキニン、クロロチアゾール、凝集因子ＶＩＩＩおよびＩＸ、ｄ−α−トコフェロール、デキサメタゾン、ジクロフェナック、エトポシド、フェルデン、フルビプロフェン、５−フルオロウラシル、フルオキセチン、フシジン酸、ゲンタマイシン、グリブリド、グラニセトロン、成長ホルモン、インドメタシン、インスリン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、メトトレキサート、メトロニダゾール、ミノキシジル、マイトマイシン、ナフシリン、ナプロキセン、オンダンセトロン、オキシフェンブタゾン、パラゾシン、フィゾスチグミン、ピロキシカム、プレドニソロン、プキマキン、キニン、ラミプリル、タキソタン、テノキシカム、テラゾシン、トリアムシノロン、ウロキナーゼ、オピオイド鎮痛薬（例えば、アルフェンタニル、アニレリジン、コジエン、ジアモヒネ、フェンタニル、ヒドロコドン、ヒドロモルホン、メペリジン、モルヒネ、オキシコドン、オキシモルホン、プロポキシフェン、スフェンタニル、ペンタゾシンおよびナルブフィン）、非ステロイド系抗炎症薬（例、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、メフェナム酸、フェニルブタゾン）、アンジオテンシン変換酵素（「ＡＣＥ」）阻害剤（例、カプトプリルポリエン）、プロテインキナーゼＣ阻害剤、抗生物質（例えば、イミダゾールおよびトリアゾール抗生物質）、葉酸、アントラサイクリン系抗生物質、トリカテカム、微生物リボソーム不活性化毒素（例、ゲロニン、アブリン、リシンＡ鎖、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、ポケウィード抗ウイルスペプチド）、ピペコリン酸誘導体（例えば、タクロリムス）、植物アルカロイド、色素、放射性同位元素標識化合物、放射線不透過性化合物、放射線増感剤（例、５−クロロ−２‘−デオキシウリジン、５−ブロモ―２‘−デオキシウリジンおよび５−ヨード−２’−デオキシウリジン）、蛍光化合物、散瞳化合物、気管支拡張薬、局所麻酔薬（例えば、ジブカインおよびクロルプロマジン）、抗真菌薬（例えば、ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、ブタコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィンおよびアムホテリシンＢ）、抗寄生虫薬、ホルモン、ホルモン拮抗薬、免疫調節薬、神経伝達物質拮抗薬、抗糖尿病薬、抗緑内障薬、ビタミン、麻薬、造影剤が含まれるが、それらに限定されない。治療用小分子の追加の開示については、Gilman et al., Goodman and Gilman's:The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001; The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M. D. et al. (eds.), 17th Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories. Rahway, N.J., 1999; Cecil Textbook of Medicine, 20th Ed., Bennett and Plum (eds.), W.B. Saunders, Philadelphia, 1996を参照されたい。
【００８５】
いくつかの実施態様において、疎水性治療薬は抗体またはその抗原結合断片である。抗体の例としては、アダリムマブ、アブシキマブ、アレファセプト、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベズロトクスマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ・ペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、インフレクトラ、イピリムマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、セスキヌマブ、ウステキヌマブが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施態様において、疎水性治療薬は、組換えタンパク質などのタンパク質である。
【００８６】
疎水性化合物をリポソームに組み込んだ後、リポソームを均質化して、化合物を含有するリポソームの均一で安定した集団を産生することが望ましい。当該分野で公知の任意の適切な方法が、懸濁液の均質化に使用され得る。いくつかの実施態様において、均質化は、マイクロフルイダイザーまたは高圧ホモジナイザーを使用して、懸濁液の超音波処理(sonication)または超音波処理(ultrasonication)、フィルターまたは同様の構造を介した懸濁液の押出または微小押出、凍結／解凍サイクルの使用、またはそれらの任意の組み合わせによって行われる。均質化は通常、小さな単層リポソームの均質な集団をもたらす。いくつかの実施態様において、リポソームは、ステップ（ｃ）の後、本質的に単層である。いくつかの実施態様において、ステップ（ｃ）の後、リポソームは、約１００ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、または約１０ｎｍ以下の直径を有する。いくつかの実施態様において、均質化方法は、治療薬の高効率取り込みを提供するように選択され得る。いくつかの実施態様において、疎水性治療薬の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８ ％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％は、ステップ（ｃ）後、脂質二重層相と会合している。
【００８７】
ある実施態様において、得られるリポソームの直径は約１μｍ未満である。一実施態様において、得られるリポソームの直径は約５００ｎｍ未満である。
一実施態様において、得られるリポソームの直径は約１００ｎｍ未満である。
一実施態様において、脂質の少なくとも１つは、リン脂質またはリン脂質の混合物である。リン脂質の例には、ホスファチジン酸（「ＰＡ」）、ホスファチジルコリン（「ＰＣ」）、ホスファチジルグリセロール（「ＰＧ」）、ホスファチジルエタノールアミン（「ＰＥ」）、ホスファチジルイノシトール（「ＰＩ」）、およびホスファチジルセリン（「ＰＳ」）、スフィンゴミエリン（脳スフィンゴミエリンを含む）、レシチン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド、ジアラキドイルホスファチジルコリン（「ＤＡＰＣ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルコリン（「ＤＤＰＣ」）、ジエライドイルホスファチジルコリン（「ＤＥＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルコリン（「ＤＬＰＣ」）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジオレオイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（「ＰＯＰＣ」）、ジアラキドイルホスファチジルフリセロール（「ＤＡＰＧ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルグリセロール（「ＤＤＰＧ」）、ジエリドイルホスファチジルグリセロール（「ＤＥＰＧ」）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＬＰＧ」）、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルグリセｒ−ル（「ＰＯＰＧ」）、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミノ（「ＤＡＰＥ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン（「ＤＤＰＥ」）、ジエライドイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＥＰＥ」）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＬＰＥ」）、ジリノレオイルホスファチジルフタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル-ホスファチジルエタノール  アミン（「ＰＯＰＥ」）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（「ＤＡＰＩ」）、ジデカノイル−L−α−ホスファチジルイノシトール（「ＤＤＰＩ」）、ジエライドイルホスファチジルイノシトール（「ＤＥＰＴ」）、ジラウロイルホスチジルイノシトール（「ＤＬＰＩ」）、ジリノレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（「ＤＭＰＩ」）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（「ＤＯＰＩ」）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（「ＤＰＰＩ」）、ジステアロイルホスファチジルリノシトール（「ＤＳＰＩ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルイノシトール（「ＰＯＰＩ」）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（「ＤＡＰＳ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルセリン（「ＤＤＰＳ」）、ジエライドイルホスファチジルセリン（「ＤＥＰＳ」）、ジラウロイルホスファチジルセリン（「ＤＬＰＳ」）、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジオレオイルホスファチジルセリン（「ＤＯＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、ジステアロイルホスファチジルセリン（「ＤＳＰＳ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルセリン（「ＰＯＰＳ」）、ジアラキドイルスフィンゴミエリン、ジデカノイルスフィンゴミエリン、ジエライドイルスフィンゴミエリン、ジラウロイルスフィンゴミエリン、ジリノレオイルスフィンゴミエリン、ジミリストイルスフィンゴミエリン、スフィンゴミエリン、ジオレオイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、および１−パルミトイル−２−オレオイル−スフィンゴミエリンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、リン脂質は大豆ホスファチジルコリンである。
【００８８】
本明細書で提供されるリン脂質は、キラルまたはアキラルであり得る。本明細書で提供されるキラルリン脂質は、Ｄ−またはＬ−リン脂質、例えば、Ｌ−α−ホスファチジルコリンまたはＬ−３−ホスファチジルコリンであり得る。
いくつかの実施態様において、リポソームは不飽和脂質を含む。いくつかの実施態様において、飽和脂肪酸は、リポソームの総脂質の最大２０％、または総脂質の最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％を構成する。
いくつかの実施態様において、リポソーム薬物懸濁液の脂質濃度は、均質化の前および／または後において、約１重量％、３重量％、５重量％、または７重量％である。
一実施態様において、Ｌ−α−ホスファチジルコリンは、本明細書で提供される方法で使用される。
【００８９】
別の実施態様において、リポソームの調製方法が本明細書で提供され、この方法は以下を含む：
（ａ）周囲温度で水性媒体中でオレイン酸ナトリウムとＬ−α−ホスファチジルコリンを組み合わせること； 
（ｂ）オレイン酸ナトリウムとＬ−α−ホスファチジルコリンを水性媒体に分散させること；そして
（ｃ）得られた混合物に１つ以上の糖を添加し、それによりリポソームの溶液を形成すること。
別の実施態様において、得られる溶液は１０重量％のトレハロースを含有する。
【００９０】
一実施態様において、疎水性治療薬は、活性医薬品の薬学的に許容し得る塩、水和物、包接化合物またはプロドラッグである。本明細書で提供される方法で使用され得る糖の例には、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、マルトース、マンノース、ガラクトース、およびトレハロースが含まれるが、これらに限定されない。一実施態様において、糖はトレハロースである。
【００９１】
一実施態様において、リポソーム製剤は、１つ以上の疾患または障害に苦しむ患者への非経口投与に適している。一実施態様において、患者はヒトである。
一実施態様において、水性媒体は、１つ以上の追加の活性薬剤、またはその薬学的に許容し得る塩、水和物、包接化合物もしくはプロドラッグを含有する。活性剤の例には、これらに限定されないが、一実施態様において、追加の活性剤は、疎水性化合物、または水への溶解度が低い化合物を含む。
【００９２】
本明細書で提供されるように、疎水性活性剤の添加の順序により、活性剤の溶解度が向上する。疎水性薬物をリポソームに組み込む従来の方法は、リポソーム調製の前に薬物を脂質に加えることである。例えば、Immordino, M. L. et al., Journal of Controlled Release, 2003, 91：417-429を参照されたい。
それらは、従来のプロセスでは、疎水性抗腫瘍剤であるドセタキセルのリポソーム取り込みがわずか０．３〜０．７ｍｇ／ｍＬであることを示している。対照的に、本方法は、ドセタキセルの取り込みを５ｍｇ／ｍＬと、１０倍増加する。
【００９３】
本発明の方法は、リポソームの形成後に疎水性治療薬の添加を含み、それにより、疎水性治療薬をリポソームに充填する他の方法と比較して、疎水性治療薬の溶解度を高める。ある実施態様において、治療薬はリポソームの形成に先立ちリポソーム脂質と接触しない。一実施態様において、リポソーム中の疎水性治療薬の溶解度は、従来のプロセスと比較して少なくとも約２倍、３倍、５倍、または１０倍増加する。いくつかの実施態様において、ステップ（ｂ）で添加される固体疎水性治療薬の量は、約３ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約１７ｍｇ／ｍＬ、または約１９ｍｇ／ｍＬなど、約１から約２０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施態様において、治療薬と脂質のモル比は、少なくとも約１：９、少なくとも約１：８、少なくとも約１：７、少なくとも約１：６、または少なくとも約１：５などの少なくとも約１：１０である。
【００９４】
ある実施態様において、疎水性治療薬の添加の順序は、疎水性治療薬のリポソームへの取り込みのより高い効率をもたらす。ある実施態様において、取り込みの効率は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％である。ある実施態様において、取り込みの効率は、約９０％、９５％、９８％、９９％または１００％である。
【００９５】
特定の理論またはメカニズムに限定されることなく、疎水性治療薬の既製リポソームへの取り込みの増加（例えば、約５ｍｇ／ｍＬの濃度へ）は、リポソームの表面積の増加によるかもしれない。いくつかの実施態様において、ステップ（ａ）で提供されるリポソーム懸濁液は、水性媒体および／またはリポソームに存在する追加の活性剤を含む。一実施態様において、追加の活性剤は、トランスフェリン、またはその薬学的に許容し得る塩、水和物、包接化合物もしくはプロドラッグである。一実施態様において、追加の活性剤は、シクロスポリン、またはその薬学的に許容し得る塩、水和物、包接化合物もしくはプロドラッグである。一実施態様において、追加の活性剤は、ラパコン、またはその薬学的に許容し得る塩、水和物、包接化合物もしくはプロドラッグである。一実施態様において、追加の活性剤は、トランスフェリンおよびラパコン、またはその薬学的に許容し得る塩、水和物、包接化合物もしくはプロドラッグである。
【００９６】
ある実施態様において、本明細書で提供される方法は、リポソームおよび疎水性治療薬を含む安定な溶液、組成物または製剤をもたらす。如何なる理論にも束縛されるものではないが、リポソームの調製中の溶媒の濃度の低下または溶媒の完全な欠如により、残留溶媒がほとんどまたはまったくないリポソーム懸濁液が生成されると考えられている。溶媒の非存在下では、リポソームはより安定であり、治療薬がリポソームの脂質二重層相とより長く会合したままになり、リポソームの凝集を防ぐ。いくつかの実施態様において、安定な溶液は、１つ以上の追加の活性薬剤を含む。
【００９７】
いくつかの実施態様において、疎水性治療薬を含有するリポソームは、特定の時間、溶液中に分散されたままであり、有意に分解、凝集、沈殿、または他の方法で修飾されない（例えば、動的光散乱によって決定されるように）。
いくつかの実施形態において、疎水性治療薬は、特定の時間可溶化されたままであり、有意に分解、凝集または他の方法で修飾されない（例えば、ＨＰＬＣにより決定されるように）。
【００９８】
いくつかの実施態様において、１つ以上の疎水性治療薬の約７０パーセント以上、約８０パーセント以上、または約９０パーセント以上は、高温（例えば、約３５℃以上）で許容し得る希釈剤による希釈後、１週間後でも可溶化されたままである。
【００９９】
他の実施態様において、１つ以上の疎水性治療薬の約７０パーセント以上、約８０パーセント以上、または約９０パーセント以上は、室温（例えば、約１５℃〜３５℃）で許容し得る希釈剤による希釈後、１週間後でも可溶化されたままである。
【０１００】
他の実施態様において、１つ以上の疎水性治療薬の約７０パーセント以上、約８０パーセント以上、または約９０パーセント以上は、低温（例えば、約１０℃以下、または例えば４℃以下）で許容し得る希釈剤による希釈後、１週間後でも可溶化されたままである。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、疎水性治療薬の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％は、低温（例えば、約１０℃以下、または約４℃以下）で水性媒体に保存してから少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、または少なくとも６ヶ月、リポソームの脂質二重層相と会合したままである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）後の平均リポソームサイズは、低温（例えば、約１０℃以下、または約４℃以下）で水性媒体に保存すると、少なくとも２ヶ月間、約１００ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、または約１０ｎｍ以下を維持する。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、この方法は、ステップ（ｃ）の後、滅菌濾過、凍結乾燥、または凍結乾燥および水性媒体での再構成を行うことをさらに含む。一実施態様において、凍結乾燥製剤は、望ましい高濃度または低濃度の水溶液中で再構成される。ある実施態様において、治療薬は、凍結乾燥および周囲温度での少なくとも１年間、少なくとも２年間または少なくとも３年間の貯蔵し、その後水性媒体で再構成しても脂質二重層相と会合したままである。いくつかの実施態様において、再構成されたリポソームは、約１００ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、または約１０ｎｍ以下の平均サイズを有する。
【０１０４】
ある実施態様において、本明細書で提供される方法は、水性媒体中の同じ疎水性治療薬の溶解度と比較して、疎水性治療薬の溶解度を高める結果になる。具体的には、本明細書で提供される方法が使用される場合、疎水性治療薬の溶解度が，参照溶媒中の同じ疎水性治療薬の溶解度の約２０パーセント以上、約４０パーセント以上、約６０パーセント以上、約８０パーセント、約１００パーセント以上、または約２００パーセント以上増加する。いくつかの実施態様において、参照溶媒は水である。
【０１０５】
本明細書に開示される方法は、リポソームへの高レベルの薬物充填を達成するために、浸透圧勾配またはｐＨ勾配などの水性媒体内の勾配の確立を必要としない。したがって、リポソームの内部および外部の水性媒体の組成は、イオン、塩、糖、および他の賦形剤の存在と濃度；活性剤の存在と濃度；およびｐＨおよび浸透圧レベルを含むすべての側面で同一であり得る。ある実施態様において、リポソームの内側および外側の水性媒体の組成は、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）において同一である。
【０１０６】
一実施態様において、リポソーム調剤は、１つ以上の疾患または障害に苦しむ患者への非経口投与に適している。いくつかの実施態様において、疾患はがんである。一実施態様において、患者はヒトである。
また、本明細書で提供されるリポソーム組成物を使用して疾患または障害を処置する方法も本明細書で提供される。いくつかの実施態様において、疾患または障害には、腫瘍学的障害、増殖性障害、中枢神経系障害、自己免疫障害、および炎症性の疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本明細書で提供される方法により処置され得る増殖性障害（例えば、がん）には、新生物、腫瘍（悪性および良性）および転移、または制御されない細胞増殖を特徴とする任意の疾患または障害が含まれるが、これらに限定されない。がんは、原発性または転移性のがんであり得る。本発明の方法に従って予防、管理、処置または改善することができるがんの具体例には、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸部、骨、肺 、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、脳のがんが含まれるが、これらに限定されない。その他のがんには、以下が含まれるが、これらに限定されない：白血病（例、急性白血病、急性リンパ球性白血病）、急性骨髄性白血病（例、骨髄芽球、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病白血病および骨髄異形成症候群）、慢性白血病（例：慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病）、真性多血症、リンパ腫（例、ホジキン病、非ホジキン病）、多発性骨髄腫（例、くすぶり多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外形質細胞腫）、ワルデンストロームのマクログロブリン血症、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、良性単クローン性ガンマグロブリン血症、重鎖疾患、骨および結合組織肉腫（例、骨肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨大細胞腫瘍、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫）、脳腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、乏突起膠腫、非神経膠腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果細胞腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫）、乳がん（例、腺がん、小葉（小細胞）がん、管内がん、髄乳がん、粘液乳がん、尿細管乳がん、乳頭乳がん、パジェット病、炎症性乳がん）、副腎がん（例えば、褐色細胞腫および副腎皮質がん）、甲状腺がん（甲状腺乳頭がんまたは濾胞がん、甲状腺髄様がん、未分化甲状腺がんなど）、膵がん（インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ヴィポマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは膵島細胞腫瘍）、下垂体がん（例、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、および尿崩症）、眼がん（例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、毛様体黒色腫などの眼の黒色腫、および網膜芽細胞腫）、膣がん（例えば、扁平上皮がん、腺がん、黒色腫）、外陰がん（例、扁平上皮がん、黒色腫、腺がん、基底細胞がん、肉腫、パジェット病）、子宮頸がん（例えば、扁平上皮がん、腺がん）、子宮がん（子宮内膜癌や子宮肉腫など）、卵巣がん（例えば、卵巣上皮がん、境界線腫瘍、胚細胞腫瘍、間質腫瘍）、食道がん（例えば、扁平上皮がん、腺がん、腺様嚢胞がん、粘表皮がん、腺扁平上皮がん、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅性がん、およびエンバク細胞（小細胞）癌）、胃がん（例えば、腺癌、真菌性（ポリープ）、潰瘍性、表在性拡散、びまん性拡散、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫）、結腸癌、直腸癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌および肝芽腫、腺癌などの胆嚢癌）、胆管癌（例えば、乳頭状、結節��、びまん性）、肺がん（例、非小細胞肺がん、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺がん、精巣癌（例えば、胚性腫瘍、セミノーマ、未分化、古典的（典型的）、精母細胞、非セミノーマ、胎児性癌、奇形癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、前立腺癌、例えば腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫）、陰茎癌、口腔がん（例えば、扁平上皮癌）、基底がん、唾液腺がん（腺がん、粘表皮がん、腺様嚢胞癌など）、咽頭がん（扁平上皮がん、ゆうぜい性がんなど）、皮膚がん（例：基底細胞がん、扁平上皮がん、黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、黒子悪性黒色腫、末端部黒子黒色腫）、腎がん（例、腎細胞がん、腺がん、高腎腫、線維肉腫、移行上皮がん（腎盂および／または子宮））、ウィルムス腫瘍、膀胱癌（例えば、移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫）、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌 、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異を有する癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、家族性腺腫性ポリポーシスなどの前癌病変、および骨髄異形成症候群。
【０１０８】
本明細書で提供される方法によって処置され得る他の特定の疾患および障害には、以下が含まれるがこれらに限定されない：アレルギー障害、炎症、喘息、関節炎、脳炎、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、炎症性骨溶解、慢性または急性閉塞性肺疾患、慢性または急性肺炎症性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、痛風、ベチェット病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病（「ＨＳＰ」）、敗血症性ショック、敗血症、髄膜炎、大腸炎、再灌流による炎症、乾癬、肺線維症を含む線維症、パーキンソン病、運動緩慢、筋肉硬直、パーキンソン病性振戦、パーキンソン病性歩行、運動凍結、うつ病など。
長期記憶障害、ルービンシュタイン・タイビ症候群（ＲＴＳ）、認知症、睡眠障害、不眠症、姿勢不安定性、運動低下障害、運動亢進性障害、シヌクレイン障害、多系統萎縮症、線条体黒質変性、オリーブ橋小脳萎縮、Ｓｈｙ−Ｄｒａｇｅｒ症候群、パーキンソン病の特徴を伴う運動ニューロン疾患、レビー小体型認知症、タウ病理障害、進行性上肢麻痺、皮質基底変性、前頭側頭型認知症;アミロイド病状障害、軽度認知障害、アルツハイマー病、パーキンソニズムを伴うアルツハイマー病、ウィルソン病、ハラーフォルデン・スパッツ病、チェディアック・ハガシ病、ＳＣＡ−３脊髄小脳性運動失調、Ｘ連鎖ジストニア・パーキンソニズム、ハンチントン病、プリオン病、舞踏病、バリズム、ジストニア振戦、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、ＣＮＳ外傷、ミオクローヌス、および望ましくない免疫反応に関連する疾患または障害（臓器移植に関連する臓器拒絶反応など）。
【実施例】
【０１０９】
実施例１  ６％Ｌ−α−ホスファチジルコリン（大豆）リポソームの調製。
６ｇのＬ−α−ホスファチジルコリン（大豆）をマグネチックスターラーを使用して２００ｒｐｍで１０分間、周囲温度で１００ｍＬの水に分散させた。分散リポソーム（多層）を１５，０００ｐｓｉでマイクロ流体ホモジナイザーに通した。３回の通過により、直径１００ｎｍ未満のリポソームが得られた。次に、リポソームにトレハロースを１０％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加えた。得られた安定な等張性リポソームを液体として使用するか、凍結乾燥した。
【０１１０】
実施例２  ラパコンでカプセル化されたリポソームの調製
２００ｍｇのラパコンと６ｇのＬ−α−ホスファチジルコリン（大豆）をマグネチックスターラーを使用して２００ｒｐｍで１０分間、周囲温度で１００ｍＬの水に分散させた。分散リポソーム（多層）を１５，０００ｐｓｉでマイクロ流体ホモジナイザーに通した。３サイクルの通過により、直径１００ ｎｍ未満の２ ｍｇ／ｍＬのラパコンでカプセル化されたリポソームが得られた。次に、リポソームにトレハロースを１０％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加えた。得られた安定な等張性リポソームを液体として使用するか、凍結乾燥した。
【０１１１】
実施例３  シクロスポリンを用いてカプセル化およびマイクロ乳化したリポソームの調製
５ｍＬＭＩＧＬＹＯＬ中の５００ｍｇのシクロスポリンと６ｇのＬ−α−ホスファチジルコリン（大豆）をマグネチックスターラーを使用して２００ｒｐｍで１０分間、周囲温度で１００ｍＬの水に分散させた。分散リポソーム（多層）を１５，０００ｐｓｉでマイクロ流体ホモジナイザーに通した。３サイクルの通過により、直径１００ ｎｍ未満の５ ｍｇ／ｍＬのシクロスポリンを用いてカプセル化されたリポソームが得られた。  次に、リポソームにトレハロースを１０％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加えた。シクロスポリンを用いてカプセル化およびマイクロ乳化して得られた安定な等張性リポソーム製剤は、液体として使用されるか、凍結乾燥された。
【０１１２】
実施例４  トランスフェリンを用いてカプセル化されたリポソームの調製
２００ｍｇのトランスフェリンと６ｇのＬ−α−ホスファチジルコリン（大豆）をマグネチックスターラーを使用して２００ｒｐｍで１０分間、周囲温度で１００ｍＬの水に分散させた。分散リポソーム（多層）を１５，０００ｐｓｉでマイクロ流体ホモジナイザーに通した。３サイクルの通過により、直径１００ ｎｍ未満の５ ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを用いてカプセル化されたリポソームが得られた。  次に、リポソームにトレハロースを１０％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加えた。トランスフェリンを用いてカプセル化して得られた安定な等張性リポソーム製剤は、液体として使用されるか、凍結乾燥された。
【０１１３】
実施例５  コルヒチンを用いてカプセル化されたリポソームの調製
６ｍｇのオレイン酸ナトリウム、１０ ｇのトレハロースおよび６ ｇのＬ−α−ホスファチジルコリン（大豆）を、マグネチックスターラーを使用して２００ ｒｐｍで周囲温度で１０分間、１００ ｍＬの水に分散させた。分散リポソーム（多層）を１５，０００ｐｓｉでマイクロ流体ホモジナイザーに１０回通した。アセトンに溶解した１００μＬのコルヒチンは、予め作られたリポソーム１ｍＬ中に打ち付け、凍結乾燥した。薬物を用いてカプセル化して得られた安定した等張性凍結乾燥リポソームは、凍結乾燥後、本質的に有機溶媒を含まない。凍結乾燥後、製品は１ ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬまたは４ｍｇ／ｍＬの水溶液（注射用水など）として再構成できる。
【０１１４】
実施例６  リポソーム内の抗体カプセル化
抗体を含む多くの治療用タンパク質には、疎水性部分がある。一実施態様において、抗体は、他の疎水性タンパク質または疎水性薬物と同様に、抗体を予備形成されたリポソームに加えることにより、リポソームによってカプセル化することができる。驚くべきことに、リポソーム膜は、リポソームの二重層のアルキル鎖部分に抗体の疎水性部分をカプセル化できることがわかった。これは、抗体を含むタンパク質が、チオール−マレイミド反応やペプチド反応を介するなどの化学修飾によって脂質に結合する従来の方法とは対照的である。本発明において、治療用タンパク質の化学的修飾は必要とされず、タンパク質はその天然構造を維持する。
【０１１５】
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（ハーセプチンとも記載）は、ＨＥＲ２過剰発現およびリンパ節陽性またはリンパ節陰性（ＥＲ／ＰＲ陰性または１つの高リスク特性を伴う）の乳がんのアジュバント処置に適応される。ハーセプチンは、静脈内投与用の無菌で白色から淡黄色の防腐剤を含まない凍結乾燥粉末として提供される。ハーセプチンの複数回使用バイアルにはそれぞれ、４４０ｍｇのトラスツズマブ、４００ｍｇのα，α−１，１−トレハロース二水和物、９．９ｍｇのＬ−ヒスチジンＨＣ１、６．４ｍｇのＬ−ヒスチジン、および１．８ｍｇのポリソルベート２０、ＵＳＰを含有する。
【０１１６】
ハーセプチンのバイアルを注射用水２０ｍＬで再構成すると、ｐＨが約６．０でトラスツズマブ２１ｍｇ／ｍＬを含有する溶液が得られた。トラスツズマブ１．７５ｍｇを含有する溶液のアリコートを３ｍＬバイアル中で凍結乾燥し、抗体の最終濃度が８．７５ｍｇ／ｍＬ（抗体の添加後、マイクロ流体化は行われず、穏やかに混合されただけ）の凍結乾燥抗体に６％大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）リポソーム（マイクロ流動化を使用して調製）２００μＬを加えることで再構成した。試料を、移動相として１００ｍＭの硫酸ナトリウムと１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ６．０を使用して、東ソーＧ３０００ ＳＷＸＬゲル濾過カラム上に試料１０μＬを注入することによって、サイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。リポソームを含まないＨＵＭＩＲＡサンプルを対照として使用した（図７Ａを参照）。データは、空隙容量でのその溶出に基づいて、５．６ ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブがリポソームにカプセル化されたことを示した（図７Ｂ）
リポソーム製剤ハーセプチンの組成を以下の表１に示す。
【０１１７】
【表１】
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【０１１８】
アダリムマブは、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、および尋常性乾癬の処置に適応する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ブロッカーである。アダリムマブは、皮下投与用の無菌の防腐剤を含まない溶液として供給される。薬物製品は、使い捨てのプレフィルドのペン（ＨＵＭＩＲＡペン）または使い捨ての１ｍＬプレフィルドのガラス注射器として提供される。アダリムマブの溶液は透明で無色で、ｐＨは約５．２である。各シリンジは、アダリムマブ４０ｍｇ、塩化ナトリウム４．９３ｍｇ、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物０．６９ｍｇ、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物１．２２ｍｇ、クエン酸ナトリウム０．２４ｍｇ、クエン酸一水和物１．０４ｍｇ、マンニトール９．６ｍｇ、０．８ｍｇポリソルベート８０、および注射用水、ＵＳＰを含有する薬物製品０．８ｍＬを供給する。必要に応じて水酸化ナトリウムを加えてｐＨを調整する。
【０１１９】
１．７５ｍｇのアダリムマブを含有するアリコートを、３ｍＬのバイアル中で凍結乾燥し、次いで最終濃度８．７５ｍｇ／ｍＬの抗体を持つ２００μＬの ６％のＳＰＣリポソームで再構成した。試料を、移動相として１００ｍＭの硫酸ナトリウム、１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ６．０を使用して、東ソーＧ３０００ＳＷＸＬゲル濾過カラムを使用してサンプル１０μＬを注入することによって、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。アダリムマブのサンプルを、リポソームなしの対照として使用した。驚くべきことに、データは、空隙容量でのその溶出に基づいて、５．６ｍｇ／ｍＬのハーセプチンがリポソームにカプセル化されたことを示した（図７Ｃ）これらのデータは、ハーセプチンの疎水性ポケットが、化学修飾なしで二重層のホスファチジルコリンのアルキル基の間に位置していることを示唆している。
リポソームアダリムマブの組成を以下の表２に示す。
【０１２０】
【表２】
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抗体の液体（すなわち、凍結乾燥されていない水可溶化）調製物をリポソームの水性懸濁液に加えることにより、抗体の同様の取り込みが得られた。
【０１２１】
実施例７  ドセタキセルを用いてカプセル化されたリポソームの調製
５００ｍｇのドセタキセル、６ｍｇのオレイン酸ナトリウム、および６ｇのＬ−α−ホスファチジルコリン（大豆）を、マグネチックスターラーを使用して２００ｒｐｍで周囲温度で１０分間、１００ｍＬの水に分散させた。分散リポソーム（多層）を１５，０００ｐｓｉでマイクロ流体ホモジナイザーに通した。３サイクルの通過により、直径１００ｎｍ未満の５ｍｇ／ｍＬのドセタキセルを用いてカプセル化されたリポソームが得られた。次に、リポソームにトレハロースを１０％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加えた。ドセタキセルを用いてカプセル化し得た安定な等張性リポソームを液体として使用するか、凍結乾燥した。
【０１２２】
実施例８  ドセタキセルおよびトランスフェリンを用いてカプセル化されたリポソームの調製
５００ｍｇのドセタキセル、２００ｍｇのトランスフェリン、６ｍｇのオレイン酸ナトリウム、および６ ｇのＬ−α−ホスファチジルコリン（大豆）を、マグネチックスターラーを使用して２００ｒｐｍで周囲温度で１０分間、１００ｍＬの水に分散させた。分散リポソーム（多層）を１５，０００ｐｓｉでマイクロ流体ホモジナイザーに通した。３サイクルの通過により、直径１００ｎｍ未満の５ｍｇ／ｍＬのドセタキセルおよび２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを用いてカプセル化されたリポソームが得られた。次に、リポソームにトレハロースを１０％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加えた。ドセタキセルおよびトランスフェリンを用いてカプセル化して得た安定な等張性リポソームを液体として使用するか、凍結乾燥した。この製剤は、特に腫瘍を標的とし、その生存には血管新生が必要である。腫瘍にはトランスフェリン受容体があることが知られており、ドセタキセル製剤にトランスフェリンを組み込むと、薬物が正常細胞に影響を与えることなく腫瘍に特異的に集中するため、毒性が低くなり、効力が高くなる。
【０１２３】
実施例９  ドセタキセルおよびラパコンを用いてカプセル化されたリポソームの調製
５００ｍｇのドセタキセル、２００ｍｇのラパコン、６ｍｇのオレイン酸ナトリウム、および６ｇのＬ−α−ホスファチジルコリン（大豆）を、マグネチックスターラーを使用して２００ｒｐｍで周囲温度で１０分間、１００ｍＬの水に分散させた。分散リポソーム（多層）を１５，０００ｐｓｉでマイクロ流体ホモジナイザーに通した。３サイクルの通過により、直径１００ ｎｍ未満の５ ｍｇ／ｍＬのドセタキセルおよび２ｍｇ／ｍＬのラパコンでカプセル化されたリポソームが得られた。次に、リポソームにトレハロースを１０％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加えた。ドセタキセルおよびラパコンを用いてカプセル化して得た安定な等張性リポソームを液体として使用するか、凍結乾燥した。この製剤は、核酸（ラパコン）とチューブリン（ドセタキセル）の両方を標的とするため、処置の有効性が向上する。
【０１２４】
実施例１０  ドセタキセル、トランスフェリンおよびラパコンを用いてカプセル化されたリポソームの調製
５００ｍｇのドセタキセル、２００ｍｇのトランスフェリン、２００ｍｇのラパコン、６ｍｇのオレイン酸ナトリウム、および６ ｇのＬ−α−ホスファチジルコリン（大豆）を、マグネチックスターラーを使用して２００ｒｐｍで周囲温度で１０分間、１００ｍＬの水に分散させた。分散リポソーム（多層）を１５，０００ｐｓｉでマイクロ流体ホモジナイザーに通した。３サイクルの通過により、直径１００ｎｍ未満の５ｍｇ／ｍＬのドセタキセル、２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリン、および２ｍｇ／ｍＬのラパコンを用いてカプセル化されたリポソームが得られた。次に、リポソームにトレハロースを１０％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加えた。ドセタキセル、ラパコンおよびでトランスフェリンを用いてカプセル化して得た安定な等張性リポソームを液体として使用するか、凍結乾燥した。この製剤は、特異的に腫瘍を標的とし、その生存には血管新生が必要である。腫瘍にはトランスフェリン受容体があることが知られており、ドセタキセル製剤にトランスフェリンを組み込むと、薬物が正常細胞に影響を与えることなく腫瘍に特異的に集中するため、毒性が低くなり、効力が高くなる。この製剤は、核酸（ラパコン）とチューブリン（ドセタキセル）の両方を標的とするため、処置の有効性が向上する。
【０１２５】
実施例１１  オレイン酸中のドセタキセルの可溶化
ドセタキセル（５ ｍｇ）を３１μＬのオレイン酸に加え、ＶＯＲＴＥＸを使用して混合した。続いてエタノールアミン（６μＬ）を添加し、ＶＯＲＴＥＸを使用して混合した。混合後、サンプルを９６３μＬの注射用水に分散させた。ドセタキセルは可溶性であり、製剤は５ ｍｇ／ｍＬで透明であった。ドセタキセルは可溶性のままであり、逆相高速液体クロマトグラフィー法により分析されるように、希釈（２．５％グリセロール中で１：１０）すると２４時間まで製剤は安定であった。
【０１２６】
実施例１２  ドセタキセルのオレイン酸ナトリウム中の可溶化
ドセタキセル（５．０ ｍｇ）を１ ｍＬの０．０５Ｍオレイン酸ナトリウムに添加し、ＶＯＲＴＥＸを使用して混合した。ドセタキセルは可溶性であり、製剤は５ ｍｇ／ｍＬで透明であった。ドセタキセルは可溶性のままであり、製剤は、逆相高速液体クロマトグラフィー法によって分析されるように、希釈（２．５％グリセロールで１：１０）すると２４時間まで安定であった。
実施例１３  ドセタキセルのカプリル酸ナトリウム中の可溶化
ドセタキセル（２ ｍｇ）を１ ｍＬの１ Ｍカプリル酸ナトリウムに加え、ＶＯＲＴＥＸで混合した。ドセタキセルは可溶性であり、製剤は２ ｍｇ／ｍＬで透明であった。ドセタキセルは可溶性のままであり、製剤は、逆相高速液体クロマトグラフィー法によって分析されるように、希釈（ ２．５％グリセロールで１：２に）すると２４時間まで安定であった。
【０１２７】
実施例１４  ドセタキセルのリノール酸ナトリウム中の可溶化
ドセタキセル（７．０ ｍｇ）を１ ｍＬの１Ｍリノール酸ナトリウムに添加し、ＶＯＲＴＥＸを使用して混合した。ドセタキセルは可溶性であり、製剤は７．０ ｍｇ／ｍＬで透明であった。ドセタキセルは可溶性のままであり、製剤は、逆相高速液体クロマトグラフィー法によって分析されるように、希釈（ 
２．５％グリセロールで１：１０）すると２４時間まで安定であった。
実施例１５  ドセタキセルのオレイン酸塩リポソームにおける可溶化
ドセタキセル（５ ｍｇ）を、２ ｍＭのオレイン酸ナトリウムと６％の大豆ホスファチジルコリン、１０％のトレハロースを含有する既製のリポソーム１ ｍＬに加え、酢酸を使用してｐＨを５〜７に調整し、ＶＯＲＴＥＸを使用して混合し、 １５，０００ ｐｓｉで１０回通過のマイクロフルイダイザーを使用して微小流動化した。マイクロフルイダイザーを１５，０００ ｐｓｉでさらに５回通過させて、５ ｍｇの薬物すべてを１ ｍＬの既製リポソームに組み込んだ。ドセタキセルは可溶性であり、製剤は５ ｍｇ／ｍＬで透明であった。ドセタキセルは可溶性のままであり、製剤は、逆相高速液体クロマトグラフィー法によって分析されるように、希釈（ Ｄ５Ｗ中１：１０に）すると２４時間まで安定であった。製剤は凍結乾燥可能であり、凍結乾燥製剤は１年以上安定である。
【０１２８】
実施例１６  有機溶媒に溶解した脂肪酸の可溶化
疎水性または親油性化合物は、有機溶媒に溶解した脂肪酸のナトリウム（または任意のイオン）塩に直接可溶化し得る。有機溶媒は、その後、回転蒸発、噴霧乾燥、または他の薬学的に許容し得るプロセスを使用して除去される。その後、薬物−脂肪酸ナトリウム塩混合物を水、等張性グリセロール、または任意の薬学的に許容し得る等張液に分散させて、可溶化化合物の所望の濃度を達成する。例えば、ドセタキセル（５ ｍｇ／ｍＬ）は、１００％エタノール中の１００ ｍＭオレイン酸ナトリウムに溶解した。エタノールは、２０℃で回転蒸発を使用して完全に蒸発させた。ドセタキセル−オレイン酸ナトリウムを、注射用水（「ＷＦＩ」）または２．５％グリセロールで再構成して、５ ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、または２０ｍｇ／ｍＬの濃度のドセタキセルを提供した。再構成されたドセタキセルは、２時間、４時間、６時間、８時間または２４時間溶液中に残った。
【０１２９】
実施例１７ 有機溶媒への薬物の可溶化とナノソームオレイン酸塩への注入
エタノール中５０μＬのドセタキセル（１００ｍｇ／ｍＬ）を、２ ｍＭのオレイン酸ナトリウムと６％の大豆ホスファチジルコリン、１０％のトレハロースを含有する既製のリポソーム１ ｍＬに加え、酢酸を使用してｐＨを５〜７に調整し、ＶＯＲＴＥＸを使用して混合し、 １５，０００ ｐｓｉで１０回通過のマイクロフルイダイザーを使用してマイクロ流動化した。ドセタキセルは可溶性であり、製剤は５ ｍｇ／ｍＬで透明であった。ドセタキセルは可溶性のままであり、製剤は、逆相高速液体クロマトグラフィー法によって分析されるように、希釈（ Ｄ５Ｗ中１：１０に）すると２４時間まで安定であった。製剤は凍結乾燥可能であり、凍結乾燥製剤は１年以上安定である。凍結乾燥製品は、５ ｍｇ、１０、または２０ ｍｇ／ｍｌの濃度で、本質的に有機溶媒を含まない注射用水で再構成される。
【０１３０】
実施例１８  ナノソーム製剤におけるミラドセタキセルの安全性
タキソテールと比較したミラドセタキセルの最大耐用量を理解するために、ヌードマウスモデルを使用して、実施例１５のように処方されたドセタキセルの安全性を研究した。許容できない副作用を引き起こさない薬物または処置の最高用量として定義される最大耐用量（「ＭＴＤ」）は、許容可能な副作用を伴う最高用量が見つかるまでさまざまなグループの人々に用量を増やして試験することにより、臨床試験で決定される。
タキソテールとミラドセタキセルのＭＴＤは、ヌードマウスで処理された。マウスモデルでは、ＭＴＤはグループ内のマウスを殺さないか、２０％の体重減少を引き起こさない最高用量と見なされる。５匹のヌードマウスのグループに、異なる濃度で静脈内投与した。注射スケジュールはＱ７Ｄ３（３回注射、７日ごとに１回）であった。各動物について、体重減少の割合と内臓の肥大検査をモニターした。
【０１３１】
タキソテールおよびミラドセタキセルに対する無胸腺ヌードマウスの最大耐用量を表３に提示し、体重減少率を図１および２に提示する。
【表３】
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２０ｍｇ／ｍＬ濃度での体重減少は、タキソテール注射群では２０％以上であったが、ミラドセタキセル注射群では１０％未満の体重減少が認められた（図２）。臓器の肥大検査は、どのグループにも損傷がないことを示唆した。このＭＴＤの結果に基づいて、ミラドセタキセルはタキソテールよりも安全であると考えられる。
【０１３２】
実施例１９  ヒト黒色腫腫瘍および前立腺腫瘍の異種移植片を使用した脂肪酸塩ナノソームで処方されたドセタキセルの有効性
実施例１７のように処方されたドセタキセルの有効性は、ヒト黒色腫腫瘍および前立腺腫瘍の異種移植片を使用して研究された。マウスに異種移植された異なるがん細胞株をそれぞれ使用する２つの別々のｉｎ−ｖｉｖｏ研究が実施された。ヒト黒色腫腫瘍Ａ３７５または前立腺腫瘍ＰＣ ３細胞のいずれかを移植した無胸腺マウス（ｎｕ／ｎｕ）および細胞は腫瘍を樹立させた。その後、マウスをタキソテールまたはミラドセタキセルで処理された（Ｑ７ＤＸ３）（３回注射、７日ごとに１回）。タキソテールは、Ｔｗｅｅｎ ８０−エタノール−生理食塩水製剤（１５ ｍｇ／ｋｇ）として送達され、ミラドセタキセルは、１５ ｍｇ／ｋｇおよび３０ ｍｇ／ｋｇの濃度にてオレイン酸ナトリウム−リポソーム製剤として送達された。上記の実施例１８に示すように、ミラドセタキセル送達は、タキソテールと比較して毒性を低減することが示された。図１および２参照。これにより、ミラドセタキセルに対して３０ ｍｇ／ｋｇの高用量の使用が正当化された。ミラドセタキセルの１５ ｍｇ／ｋｇの投与は、タキソテール１５ ｍｇ／ｋｇの投与よりも効果的であり、これは両方の腫瘍モデルにおける腫瘍成長の遅延によって証明された。図３および４参照。腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ）は、対照群の平均腫瘍サイズが約１５００ｍｍ３に達した時点での、処置群の平均腫瘍サイズ（Ｔ）を対照群の平均腫瘍サイズ（Ｃ）で割ったものである。４２％以下のＴ／Ｃ値は、国立癌研究所（ＮＣＩ）の癌治療Ｄｉｖｉｓｉｏｎの薬物評価Ｂｒａｎｃｈによって重要な抗腫瘍活性とみなされている。腫瘍成長遅延（Ｔ−Ｃ）は、処置群腫瘍（Ｔ）が約２５０ｍｍ3に達するのに必要な平均時間（日数）と、対照群腫瘍（Ｃ）が同じサイズに達するのに要する平均時間（日数）の差である。Ｔ／Ｃ、Ｔ−Ｃで得られた結果を表２および３に示す。データは、Ｔ／Ｃ値が４２％を超えていたため、タキソテールには黒色腫に対する抗腫瘍活性がないことを示している。ただし、ミラドセタキセル処置には、Ｔ／Ｃ値が２０の有意な腫瘍抑制がある。その上、腫瘍成長遅延（Ｔ−Ｃ）の結果は、ミラドセタキセル処置がタキソテールよりも腫瘍の成長を大幅に遅延させることを示した。
【０１３３】
【表４】
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【０１３４】
【表５】
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【０１３５】
実施例２０  ラットモデルシステムを使用した脂肪酸塩ナノソームにおいて処方されたドセタキセルの薬物動態
タキソテールまたはミラドセタキセル製剤中の２５ｍｇ／ｋｇドセタキセルの単回静脈内投与後の雄ラットにおけるドセタキセルの薬物動態を評価した。タキソテールは、約４〜５時間の調和平均Ｔ１／２値を持つ多重指数関数的減衰を示した。ミラドセタキセルは、表６および図５に示すように、投与後のドセタキセル・タキソテールの対応する薬物動態よりも２．２倍高い血漿ドセタキセル曝露（ＡＵＣ（０-ｉｎｆ））および約２倍低い全身ＣＬをもたらした。
ドセタキセルの血漿中濃度は、４．０２＋０．２６６時間の調和平均Ｔ１／２を伴う多重指数曲線の特性を示した（表６および図５）。タキソテールにおけるドセタキセルは、ＡＵＣ（Ｏ-ｉｎｆ）、ＣＬおよびＶｓｓ平均値は、それぞれ２１，１００±１２９０ｎｇｈ／ｍＬ、１．１９±０．０７２９ Ｌ／ｈ／ｋｇおよび２．３５＋０．０５０３ Ｌ／ｋｇであった（表６）。ミラドセタキセルにおけるドセタキセルは、ＡＵＣ（Ｏ-ｉｎｆ）、ＣＬおよびＶｓｓ平均値はそれぞれ４６，５００±７６４０ ｎｇｈ／ｍＬ、０．５４８±０．０９５３ Ｌ／ｈ／ｋｇおよび０．４０８＋０．１７６ Ｌ／ｋｇであった（表６）。
【０１３６】
【表６】
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【０１３７】
実施例２１  ミラドセタキセルの単位剤形 
ミラドセタキセルは、適切なサイズのバイアルで凍結乾燥粉末として調製される。所望の投与量を適切な容器に充填し、凍結乾燥して、本質的に脂肪酸塩、リン脂質およびドセタキセルを所望の量で含有する粉末を得ることができる。次いで、そのような容器は、滅菌水性希釈剤で使用時に適切な容量に再構成され、希釈剤中のドセタキセルの均質で透明な溶液が得られる。この再構成された溶液は、標準の静脈内輸液セットを注射または注入することにより、患者に直接投与できる。
【０１３８】
実施例２２  凍結乾燥リポソームカプセル化ミラドセタキセルの安定性
ミラドセタキセルをカプセル化した凍結乾燥リポソームの安定性は、高温（４０℃）および低温（−２０℃）で評価された。表７に示すように、４０℃で６か月後、製剤の濃度、純度、外観は変化せず、粒径は７０ ｎｍ未満のままであった。結果は、製剤が室温で少なくとも２年間安定であることを示している。図８は、初期粒子サイズ、ならびに−２０℃で１年および２年貯蔵後の粒子サイズを示し、２年貯蔵後に平均粒子サイズが約６２．９〜６４．４ｎｍのままであることを示している。
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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