(57)【要約】バッテン病の治療のための方法及び組成物が本明細書において提供される。そのような組成物は組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド及びその中にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ  ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＶカプシド及びその中にパッケージされたベクターゲノムを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムは、
（ａ）ＡＡＶ  ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；
（ｂ）プロモーター；
（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；
（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲ
を含む、前記ｒＡＡＶ。
【請求項２】
（ｃ）の前記コード配列は、配列番号：２の天然ヒトコード配列と少なくとも７０％同一であるコドン最適化されたヒトＣＬＮ２である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項３】
（ｃ）の前記コード配列は配列番号：３である、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項４】
前記ｒＡＡＶカプシドはＡＡＶ９またはそのバリアントである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項５】
前記プロモーターはニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項６】
前記プロモーターは、ＣＢＡプロモーター配列及びサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項７】
前記ＡＡＶ  ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ  ３’ＩＴＲはＡＡＶ２由来のものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項８】
前記ベクターゲノムはポリＡをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項９】
前記ポリＡは合成ポリＡである、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ−グロビン（ＲＧＢ）、もしくは改変されたＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来のものである、請求項８に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１０】
イントロンをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１１】
前記イントロンは、ＣＢＡ、ヒトベータグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、アルファ−グロブリン、ベータ−グロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３である、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１２】
エンハンサーをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１３】
前記エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１４】
前記ベクターゲノムは、サイズが約３キロベース〜約５．５キロベースである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１５】
前記ベクターゲノムは、サイズが約４キロベースである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、及び中枢神経系への送達に適した薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、及びＩＣＶ髄腔内送達に適した薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む、組成物。
【請求項１８】
バッテン病を有する対象への投与に適した水性懸濁液であって、前記懸濁液は、水性懸濁化液体と、バッテンに対する治療法として有用な組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の約１×１０９ＧＣ（７．５ｅ９ＧＣ／ｇｒ脳）〜約１×１０１５（１ｅ１２ＧＣ／ｇｒ脳）またはウイルス粒子とを含み、前記ｒＡＡＶはＡＡＶカプシドを有し、ならびにその中にパッケージされた、
（ａ）ＡＡＶ  ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；
（ｂ）プロモーター；
（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするコード配列；及び
（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲ
を含むベクターゲノムを有する、前記水性懸濁液。
【請求項１９】
前記懸濁液は髄腔内送達に適している、請求項１８に記載の懸濁液。
【請求項２０】
前記懸濁液は、ＩＣＶ及び髄腔内腰部（ＩＴ−Ｌ）注射から選択される髄腔内送達に適している、請求項１８に記載の懸濁液。
【請求項２１】
前記懸濁液は、前記水性懸濁化液体中に溶解した界面活性剤、防腐剤、及び／またはバッファーをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の懸濁液。
【請求項２２】
前記プロモーターは配列番号：５のｎｔ３３９６〜ｎｔ４０６１であり、かつヒトＴＰＰ１をコードする前記コード配列は配列番号：３である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の懸濁液。
【請求項２３】
前記ＡＡＶ  ５’ＩＴＲは配列番号：５のｎｔ３１９９〜３３２８であり、かつ前記ＡＡＶ  ３’ＩＴＲは配列番号：５の２４８〜３７７である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の懸濁液。
【請求項２４】
前記ベクターゲノムは、配列番号：５のｎｔ３３〜１５９のポリＡ配列をさらに含む、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の懸濁液。
【請求項２５】
前記ｒＡＡＶカプシドはＡＡＶ９カプシドである、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の懸濁液。
【請求項２６】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の懸濁液、または請求項１６もしくは１７に記載の組成物を用いて、バッテンを有する対象を治療する方法。
【請求項２７】
前記ｒＡＡＶ投薬量は、水性懸濁液中約１×１０９〜約１×１０１６ベクターゲノムである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物は髄腔内投与される、請求項２６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記髄腔内投与は、ＩＣＶ及び髄腔内腰部（ＩＴ−Ｌ）注射から選択される、請求項２６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｒＡＡＶは、約または少なくとも１〜２０ミリリットルを含む容量中１×１０９〜１×１０１３ｒＡＡＶの投薬量で投与される、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象はヒトである、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
バッテンの治療のための医薬の調製のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の懸濁液、または請求項１６もしくは１７に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
前記ｒＡＡＶ投薬量は、水性懸濁液中約１×１０９〜約１×１０１６ベクターゲノムである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記組成物は髄腔内投与される、請求項３２〜３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
前記髄腔内投与は、ＩＣＶ及び髄腔内腰部（ＩＴ−Ｌ）注射から選択される、請求項３２〜３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
前記ｒＡＡＶは、約または少なくとも１〜２０ミリリットルを含む容量中１×１０９〜１×１０１３ｒＡＡＶの投薬量で投与される、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
前記対象はヒトである、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子書式で提出された資料の参照による組み入れ
本出願者は、本明細書とともに電子書式で申請される配列表資料を参照により本明細書によって組み入れる。このファイルは、「ＵＰＮ−１７−８１５１ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名前を付されている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、希少でかつ遺伝性の神経変性障害の群である。それらは、最もよく見られる神経遺伝性貯蔵症であると見なされており、自家蛍光性脂肪色素に似たセロイド及びリポフスチンの蓄積が患者において見られる。ＮＣＬは、筋肉の緊張または痙攣の異常な増加、失明または視覚の問題、認知症、筋肉協調運動の欠如、知的障がい、運動障害、発作、及び不安定な歩行を含めた、変動的であるが進行性の症状を伴う。この疾患の頻度は、１２，５００個体あたりおよそ１人である。主な３つのタイプのＮＣＬがある：成人型（クーフス病またはパリー病）；若年型；及び遅発性乳児型（ジャンスキー−ビールショウスキー（Ｊａｎｓｋｙ−Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ）病）。神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、もともと、彼らの発症の年齢及び臨床症状（本明細書において記される）によって定義された。しかしながら、それらは、その後より新しい分子知見に基づいて再分類されており、それは、臨床表現型によって以前に示唆されていたよりも、種々の遺伝的バリアントに対するはるかに多くの重複の証拠を提供している。
【０００３】
少なくとも２０種の遺伝子がＮＣＬと関連して同定されている。ＣＬＮ２変異を有するＮＣＬ患者は、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＴＰ１）と呼ばれるペプスタチン非感受性リソソームペプチダーゼを欠損している。ＴＴＰ１は、ポリペプチドのＮ末端からトリペプチドを除去する。ＣＬＮ２遺伝子の１３個のエクソンのすべてにおいて変異が報告されている。一部の変異は、より長引く過程をもたらす。発症は通常では乳児期後期であるが、より遅い発症が記載されている。５８個を上回る数の変異がＣＬＮ２において記載されている。
【０００４】
バッテン病の一形態であるＣＬＮ２病は、１００，０００人の生児出生あたり０．０７〜０．５１という推定発生率を有する希少なリソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）である（Ａｕｇｅｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃｌａｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｍｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂａｔｔｅｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｒｅｇｉｓｔｒｙ；Ｐｏｕｐｅｔｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓａｎｔｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＣＬＮ２病は、染色体１１ｑ１５に位置し及び可溶性リソソーム酵素トリペプチジルペプチダーゼ−１（ＴＰＰ１）をコードするＣＬＮ２遺伝子における変異によって引き起こされる、致死性の常染色体劣性神経変性ＬＳＤである。ＣＬＮ２遺伝子における変異、及びそれに続くＴＰＰ１酵素活性の欠損は、貯蔵物質のリソソーム蓄積、ならびに脳及び網膜の神経変性をもたらす（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｗｌｏｄａｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＣＬＮ２病は、通常では反復性発作（てんかん）及び運動協調困難（運動失調）を含めた初期特質を有する、２〜４歳での早期発症を特徴とする。当該疾患は、以前に習得した技能の喪失（発達退行）ももたらす。てんかんは医学的療法にしばしば不応性であり、精神運動機能の全般的崩壊は、小児期中期までの早死前に３回目〜５回目の誕生日の間で急速かつ一様である（Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）（Ｎｉｃｋｅｌ
Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｗｏｒｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０００５】
ＣＬＮ２病の治療のための、組み換えＴＰＰ１（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）セルリポナーゼアルファ、ＢｉｏＭａｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いた酵素補充（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）療法（ＥＲＴ）が米国（ＵＳ）及び欧州連合（ＥＵ）において近年承認され、永久埋め込み型デバイスを介した側脳室への隔週注入として投与されている。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の臨床的有益性は、ＦＤＡによって、運動機能の安定化に限定されると指定されたが、一方で欧州医薬品庁（ＥＭＡ）は、言語技能にもプラスの影響があると判定した（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＦＤＡ承認審査概要（Ｓｕｍｍａｒｙ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ａｐｐｒｏｖａｌ）；Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ［ＥＰＡＲ］；Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）は、脳内にポートを直接埋め込むための専門知識を要し、脳室内（ＩＣＶ）投与に精通している訓練を受けた専門家によって医療背景において２週間ごとの４時間の注入の間に投与されなければならない。一部にはそれぞれ７時間及び１１．５日間であると推定されるＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の短いＣＳＦ半減期及びリソソーム半減期に起因して、反復注入が必要である（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＥＰＡＲ）。ゆえに、ＥＲＴの反復投与に伴う重い患者負担及び罹患率なく、ＣＬＮ２病を有する患者の中枢神経系（ＣＮＳ）において永続性がありかつ長期にわたるＴＰＰ１酵素活性を提供し得る新しい療法に対する重大な満たされていない必要性が残る。それゆえ、ＣＬＮ２病を治療することを必要としている対象においてＴＰＰ１を送達する及び発現させるのに有用な組成物が必要とされる。イヌＴＰＰ１を発現する組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）（ｒＡＡＶ２．ｃａＴＰＰ１）の１回限りの投与は、主として上衣細胞におけるＴＰＰ１の高発現及び脳脊髄液中への当該酵素の分泌をもたらし、臨床的有益性につながることが示された。Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｎｏｖ  １１；７（３１３）：３１３ｒａ１８０；及びＫＡＴＺ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１７  Ｆｅｂ  ２４（４）：２１５−２２３を参照されたく、それらは参照により本明細書に組み入れられる。しかしながら、ＡＡＶ２は、脳実質に浸透せずかつニューロンを標的にせず、ゆえに、新規の神経向性ＡＡＶを用いて達成され得るものと比較して、予想される有益性が限定される。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
１つの態様において、ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）をコードする、配列番号：３のコドン最適化された操作された核酸配列が本明細書において提供される。
【０００７】
別の態様において、ヒトＴＰＰ１をコードする、コドン最適化されたＣＬＮ２核酸配列である配列番号：３が本明細書において提供される。１つの実施形態において、コドン最適化されたヒトＣＬＮ２は、配列番号：２の天然ヒトコード配列と少なくとも７０％同一である。配列番号：２（天然）及び配列番号：３（コドン最適化）のアライメントは、図１５Ａ〜１５Ｂに提供されている。
【０００８】
別の態様において、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。１つの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド及びその中にパッケージされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ  ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲを含む。
【０００９】
１つの態様において、本明細書において記載されるｒＡＡＶのいずれか、及び薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む組成物が提供される。１つの実施形態において、組成物は、脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内（ＩＴ）送達に適している。
【００１０】
さらに別の態様において、バッテン病を有する対象への投与に適した水性懸濁液が提供される。１つの実施形態において、懸濁液は、水性懸濁化液体と、バッテンに対する治療法として有用な組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の約７．５×１０１２ＧＣ（７．５×１０９ＧＣ／グラム脳）〜約１×１０１５ＧＣ（１×１０１２ＧＣ／グラム脳）またはウイルス粒子とを含み、当該ｒＡＡＶはＡＡＶカプシドを有し、ならびにその中にパッケージされた、（ａ）ＡＡＶ  ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲを含むベクターゲノムを有する。
【００１１】
別の態様において、本明細書において記載されるｒＡＡＶを用いて、バッテンを有する対象を治療する方法が提供される。
【００１２】
他の態様及び実施形態は、本明細書において記載される情報に基づいて容易に明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＴＰＰ１ｃｏ．ＲＢＧベクターゲノムの概略的表示である。ＩＴＲは、ＡＡＶ２逆位末端反復を表す。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリベータアクチンプロモーターを表す。ＲＢＧポリＡは、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナルを表す。
【図１Ｂ】ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターの産生プラスミドのマップを提供している。
【図２】実施例２に記載される、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏをトランスフェクトされた細胞（三角形）及び対照細胞（四角形）の培養上清において測定されたＴＰＰ１酵素活性の折れ線グラフである。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、実施例３に記載される、処理を有しないまたは１１×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏのＩＣＶ投与を有する野生型マウスの脳（図３Ａ）、ＣＳＦ（図３Ｂ）、血清（図３Ｃ）、及び肝臓（図３Ｄ）において測定されたＴＰＰ１酵素活性を提供している。
【図４】図４Ａは、ＰＢＳのみ（雄、閉じた直立三角形；雌、閉じた逆位三角形）、３×１０９ＧＣ（雄、ひし形；雌、開いた丸）、または３×１０１１ＧＣ（雄、十字；雌、開いた三角形）のＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターで処理されたＴＰＰ１  ＫＯマウスの生存曲線である。野生型マウス（雄、閉じた丸；雌、開いた四角形）が対照として働いた。各群において、雄及び雌動物の両方をモニターし及び別個に記録して、潜在的な性別差を明らかにした。図４Ｂは、図４Ａに示されるデータに基づいて算出された生存期間中央値を提供している。
【図５】ＰＢＳのみ（雌、閉じた三角形）、３×１０９ＧＣ（雄、開いたひし形）、または３×１０１１ＧＣ（雄、開いた四角形；雌、開いた三角形）のＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＴＰＰ１  ＫＯマウスの体重をグラムで示した折れ線グラフである。野生型マウス（雄、閉じた丸；雌、閉じた四角形）が対照として働いた。
【図６】実施例５に記載される、ＰＢＳのみ、３×１０９ＧＣ、または３×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＴＰＰ１  ＫＯマウスにおいて試験された運動協調性アッセイの結果を提供している。野生型マウスが対照として働いた。各群において、雄及び雌動物の両方を試験し及び別個に記録して、潜在的な性別差を明らかにした。落下するまでの潜時を、ロッド上で過ごした時間として秒で測定した。
【図７Ａ】実施例５に記載される、ＰＢＳのみ、３×１０９ＧＣ、または３×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＴＰＰ１  ＫＯマウスの血清における抗ＴＰＰ１抗体の作出及び量を示したＥＬＩＳＡ結果である。野生型マウスが対照として働いた。各群において、雄及び雌動物の両方を試験し及び別個に記録して、潜在的な性別差を明らかにした。測定された光学密度（ＯＤ）をｙ軸にプロットした。より高いＯＤ値ほど、より大きな量の抗ＴＰＰ１抗体を示す。
【図７Ｂ】実施例５に記載される、ＰＢＳのみ、３×１０９ＧＣ、または３×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＴＰＰ１  ＫＯマウスの血清において試験されたＴＰＰ１酵素活性の結果を提供している。野生型マウスが対照として働いた。各群において、雄及び雌動物の両方を試験し及び別個に記録して、潜在的な性別差を明らかにした。
【図８】実施例５に記載される、ＴＰＰ１  ＫＯマウスならびに野生型マウスの側脳室（ＬＶ）、海馬、及び視床の一部を含む脳区画において試験されたＴＰＰ１酵素活性の結果を提供している。０．１〜１０μｇのＢＳＡを陰性対照として利用した。
【図９】実施例５に記載される、ＰＢＳのみまたは３×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏを注射されたＴＰＰ１  ＫＯマウス、及びＰＢＳのみを注射された野生型マウスの、脳区画（側脳室（ＬＶ）、海馬、及び視床の一部を含み、ＬＶ区画と名前を付されている）ならびに小脳及び肝臓において試験されたＴＰＰ１酵素活性の結果を提供している。
【図１０】実施例４に記載される、ＰＢＳのみまたは１×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＴＰＰ１  ＫＯ及び野生型マウスの血清において試験されたＴＰＰ１酵素活性の結果を提供している。
【図１１】実施例４に記載される、ＰＢＳ（ＫＯ＋ＰＢＳ、ｎ＝３）または１×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏ（ＫＯ＋１ｅ１１ＧＣ、ｎ＝５）を注射されたＫＯマウスの体重を提供している。
【図１２】図１２Ａは、実施例４に記載される、ＰＢＳのみ（ＫＯ＋ＰＢＳ、ｎ＝４）または１×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏ（ＫＯ＋１ｅ１１ＧＣ、ｎ＝４）で処理されたＴＰＰ１  ＫＯマウスにおいて試験されたロッキングロータロッドアッセイの結果を提供している。落下するまでの潜時を、ロッド上で過ごした時間として秒で測定した。図１２Ｂ及び１２Ｃは、実施例４に記載される、注射の日に開始する試験（Ｄ０）または注射の６０日後に開始する試験（Ｄ６０）における、ＰＢＳのみ（ＫＯ＋ＰＢＳ、ｎ＝４）または１×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏ（ＫＯ＋１ｅ１１ＧＣ、ｎ＝４）で処理されたＴＰＰ１  ＫＯマウスにおいて試験された加速式ロータロッドアッセイの結果を提供している。落下するまでの潜時を、ロッド上で過ごした時間として秒で測定した。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、ＴＰＰ１配列の配列番号：２（天然）及び配列番号：３（コドン最適化）のアライメントを提供している。
【図１４】ＣＬＮ２のＡＡＶｒｈ１０ベクターに基づく送達が、ＣＬＮ２−／−マウス（ＣＬＮ２病のＴｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウスモデル）において生存期間を引き延ばすことを立証している。Ｓｏｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８から再現された図。
【図１５】Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウス（「ＫＯ」と印される；ｎ＝６０）及び野生型同腹仔対照（ｎ＝４０）の生存曲線を示している。生存期間中央値は、雄及び雌に対してそれぞれ１６及び１９週間であることが観察された。雄における早期死亡は、ケージ闘争誘発性発作に起因した。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、１及び３ヶ月齢のＴｐｐ１ｍ１ｊ（ＫＯ）及び野生型同腹仔（ＷＴ）におけるＴＰＰ１酵素活性を示している（肝臓、図１６Ａ；及び大脳、図１６Ｂ）。雌動物に対するデータは青で印され；雄動物に対するデータは黒で印される。
【図１７】早くも１ヶ月齢（発症前）のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスの皮質及び海馬において観察された進行性のアストロサイトーシスを示している。結果（ＧＦＡＰスコア）は、２０×倍率視野あたりのアストロサイトの平均数である。＊＊＊対応のないマン・ホイットニー検定。
【図１８】図１８Ａ及び１８Ｂは、神経行動学的評価を提供している。図１８Ａ：注射後１１週の時点において、運動協調性アッセイは、高用量動物に対して表現型の補正を示唆するが、低用量または未処理のＴＰＰ１１ｍ１Ｊ対照動物に対してはそうではない。運動協調性は、ロッキングロータロッド上（１０ｒｐｍ、回転ごとに方向を変える）での１８０秒間の試行中に記録された、落下するまでの潜時と相関する。図１８Ｂ：注射後２０週の時点において、生存動物に対して実施された運動学習アッセイは、ＷＴ対照と高用量動物との間に差がないことを示した。運動学習は、連続３日間加速式ロータロッド上（３００秒での５〜４０ｒｐｍ）で記録された、落下するまでの潜時と相関する。図中に描かれた用量レベルは、動物あたりの総／ＧＣに基づき、７．５×１０９及び７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量と等価である。対応のないマン・ホイットニー検定によるＰ値。
【図１９】生存動物における注射後３０週（３４週齢）の時点での脳及び肝臓におけるＴＰＰ１酵素活性を立証している。図１９：ＷＴ及び高用量動物（分析のための生存した低用量動物はいなかった）。Ｍ＝雄；Ｆ＝雌。
【図２０】生存動物における注射後３０週（３４週齢）の時点での脳及び肝臓におけるＴＰＰ１酵素活性を立証している。図２０：ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＴＰＰ１の投与後のＴＰＰ１酵素活性の増加。高用量動物において、ＴＰＰ１酵素活性は、注射後３０週の時点で、大脳、小脳、及び肝臓において超生理学的レベルまで増加した。Ｍ＝雄；Ｆ＝雌；ＷＴ＝野生型同腹仔。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｃは、高用量及びＴｐｐ１ｍ１Ｊマウス（注射後３０週；７．５ｍｏと名前を付されている）及び対照動物（１５週齢；３ｍｏと名前を付されている）の脳におけるアストロサイトーシスの補正を立証している。実施例５に記載されるように、ＴＰＰ１  ＫＯマウスにＰＢＳのみまたは３×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏを注射し、ならびに野生型マウスにＰＢＳのみを注射した。ＧＦＡＰスコアを、高用量群における動物の脳の３つの異なる部分（海馬−図２１Ａ；皮質−図２１Ｂ；脳幹−図２１Ｃ）において確立し、調査の終わりの時点で生きているビヒクル対照動物はいなかったことから、自然病歴調査からの１５週齢Ｔｐｐ１ｍ１ｊ対照マウスにおけるＧＦＡＰスコアと比較した。２０×倍率視野あたりのアストロサイトの平均数として提示されたデータ。対応のないマン・ホイットニー検定によるＰ値。
【図２２】図２２Ａ及び２２Ｂは、３×１０１１ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＴＰＰ１ｃｏの脳室内注射で処理されたＫＯマウスの生存率の増加を立証している。ビヒクル処理されたすべてのＫＯ動物は、死んで発見されまたは１９週齢の前に人道的に安楽死し、一方でベクター処理された雌（ＫＯ  ３ｅ１１  Ｆ）の６７％及びベクター処理された雄（ＫＯ  ３ｅ１１  Ｍ）の５７％は、予定された２３週目の評価項目の時点で生きていた。＊＊＊＊ログ−ランク・マンテル−コックス検定、ｐ＜０．０００１。図２２Ａは、性別及び処理によってグループ分けされた生存率を示している。図２２Ｂは、性別を組み合わせた生存率を示している。
【図２３】図２３Ａ及び２３Ｂは、図２２Ａ及びＢにあるように処理されたマウスにおける週平均体重を示している。ビヒクル処理されたＫＯマウスは、注射の６週間後に重量を失い始めた。ベクター処理された動物は、屠殺までそれらの体重を維持した。
【図２４】図２２Ａ及び２２Ｂにあるように処理されたマウスにおける週平均夜間動作を示している。週平均夜間動作速度モニタリングは、臨床症状の発症前の治療効力を示している。Ｒプログラム内の線形混合効果モデリングを用いて比較を行った。分析は、性別によって階層化されなかった。統計的有意性を０．０５レベルで査定した。ＫＯ動物における処理効果は、Ｖｉｕｍ４０日目から有意であった（注射後７．７週；１４．７週齢）。
【図２５】図２５Ａ及び２５Ｂは、処理されたＫＯマウスにおいて神経炎症が低下することを立証している。（Ａ）１０×視野あたりの皮質アストロサイト平均カウント数。黒の記号は雌、開いた記号は雄。死んで発見された動物は、自己融解に起因して除外された。（Ｂ）抗ＧＦＡＰ抗体を用いた、アストロサイトの代表的な免疫染色。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書において記載される方法及び組成物は、ＮＣＬの治療のためにそれを必要としている対象に、ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするＣＬＮ２核酸配列を送達するための組成物及び方法を伴う。１つの実施形態において、そのような組成物は、配列番号：３に示されるものなどのＣＬＮ２コード配列のコドン最適化を伴う。より低い用量の試薬が用いられ得ることから、産物の効力を増加させ、ゆえに安全性を増加させることが望ましい。配列番号：２に示される天然ＣＬＮ２コード配列を含む組成物も本明細書に包含される。
【００１５】
ＣＬＮ２としても知られるＴＰＰ１遺伝子は、トリペプチジルペプチダーゼＩ活性を有するリソソームセリンプロテアーゼであるトリペプチジルペプチダーゼ１をコードする。それは、リソソームプロテイナーゼによって産生される分解産物からトリペプチドを生成しかつ非置換Ｎ末端を有する基質を要する、非特異的リソソームペプチダーゼとして作用するとも考えられている。本明細書において使用するとき、「ＴＰＰ１」、「ＣＬＮ２」、及び「トリペプチジルペプチダーゼ１」という用語は、コード配列に言及する場合、互換可能に用いられる。ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１をコードする天然核酸配列は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＭ＿０００３９１．３で報告されており、本明細書で配列番号：２に再現される。ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１の２つのアイソフォームが、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔアクセッションＯ１４７７３−１及びＯ１４７７３−２（本明細書で配列番号：１及び４として再現される）として報告されている。ＣＬＮ２遺伝子における変異は、遅発性乳児型ＮＣＬ（ＬＩＮＣＬ）病と関連性がある。
【００１６】
例示的なＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターが本明細書において記載され、それは本明細書においてＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２と呼ばれることもある。これらの用語の使用は互換可能である。加えて、１つの実施形態において、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２ベクターに言及する場合、本明細書において記載される構成要素を利用した代替的な実施形態が企図される。
【００１７】
本発明のある特定の実施形態において、対象は神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）を有し、それを治療するために本発明の構成要素、組成物、及び方法は設計される。本明細書において使用するとき、本明細書において用いられる「対象」という用語は、ヒト、獣医学的動物または家畜、飼いならされた動物またはペット、及び臨床研究に通常用いられる動物を含めた、哺乳類動物を意味する。１つの実施形態において、これらの方法及び組成物の対象はヒトである。さらに他の適切な対象には、限定されることなく、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類等が含まれる。本明細書において使用するとき、「対象」という用語は、「患者」と互換可能に用いられる。
【００１８】
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、進行性の知的後退及び運動機能後退、発作、ならびに早死を特徴とする、遺伝性の神経変性リソソーム貯蔵障害の群である。視力喪失は、ほとんどの形態の特質である。臨床表現型は、発症の年齢及び臨床的特質の出現の順序に従って、乳児、後期乳児、若年、成人、及び北部てんかん（精神遅滞を伴う進行性てんかん［ＥＰＭＲ］としても知られる）に伝統的に特徴付けされている。しかしながら、遺伝子及びアレル異質性が存在し；提唱される新しい命名及び分類システムは、責任遺伝子及び疾患発症時の年齢の両方を考慮するように開発されている；例えば、古典的な遅発性乳児型であるＣＬＮ２病。第一の症状は、典型的に２〜４歳に出現し、通常ではてんかんから始まり、その後に発達の診査事項の退行、ミオクローヌス運動失調、及び錐体路徴候が続く。視覚機能障害は、典型的に４〜６歳で出現し、明／暗認識のみまで急速に進行する。平均余命は６歳〜１０代前半に及ぶ。本明細書において使用するとき、「バッテン病」という用語は、ＣＬＮ２病を指すために用いられ、それは「ＮＣＬ」と互換可能に用いられる。
【００１９】
１つの態様において、ヒト（ｈ）ＴＰＰ１をコードするコドン最適化された操作された核酸配列が提供される。ある特定の実施形態において、天然ＴＰＰ１配列（配列番号：２）と比較して翻訳を最大限に高めるように設計された、操作されたヒト（ｈ）ＴＰＰ１  ｃＤＮＡが本明細書において提供される（配列番号：３として）。好ましくは、コドン最適化されたＴＰＰ１コード配列は、全長天然ＴＰＰ１コード配列（配列番号：２）と約８０％未満の同一性、好ましくは約７５％の同一性、またはそれを下回る割合を有する。１つの実施形態において、コドン最適化されたＴＰＰ１コード配列は、配列番号：２の天然ＴＰＰ１コード配列と約７４％の同一性を有する。１つの実施形態において、コドン最適化されたＴＰＰ１コード配列は、ＡＡＶ媒介性送達（例えば、ｒＡＡＶ）後の、天然ＴＰＰ１と比較して向上した翻訳率を特徴とする。１つの実施形態において、コドン最適化されたＴＰＰ１コード配列は、配列番号：２の全長天然ＴＰＰ１コード配列と約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％未満、またはそれを下回る割合の同一性を共有する。１つの実施形態において、コドン最適化された核酸配列は、配列番号：３のバリアントである。別の実施形態において、コドン最適化された核酸配列は、配列番号：３と約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、またはそれを上回る割合の同一性を共有する配列である。１つの実施形態において、コドン最適化された核酸配列は配列番号：３である。別の実施形態において、核酸配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。他の実施形態において、異なるＴＰＰ１コード配列が選択される。
【００２０】
核酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」という用語は、対応するようにアラインされた場合に同じである２つの配列における残基を指す。配列同一性比較の長さはゲノムの全長にわたり得、遺伝子コード配列の全長または少なくとも約５００〜５０００ヌクレオチドのフラグメントが所望される。しかしながら、より小さなフラグメント、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０〜２４ヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２ヌクレオチド、少なくとも約３６ヌクレオチド、またはそれを上回る数のヌクレオチドの間での同一性も所望され得る。
【００２１】
同一性パーセントは、タンパク質、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、もしくはそのペプチドフラグメントの全長にわたるアミノ酸配列、または対応する核酸配列コード配列に対して容易に決定され得る。適切なアミノ酸フラグメントは、長さが少なくとも約８アミノ酸であり得、最高で約７００アミノ酸であり得る。一般的に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「アラインされた」配列を参照して決定される。「アラインされた」配列または「アライメント」とは、参照配列と比較して、失われたまたは付加的な塩基またはアミノ酸に対する補正をしばしば含有する、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。
【００２２】
同一性は、配列のアライメントを調製することによって、ならびに当技術分野において公知のまたは市販の多様なアルゴリズム及び／またはコンピュータープログラム［例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ；ＣｌｕｓｔａｌＯ；ＦＡＳＴＡ；例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いた］
の使用を通じて決定され得る。アライメントは、多様な公的にまたは商業的に使用可能な多重配列アライメントプログラムのいずれかを用いて実施される。配列アライメントプログラム、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムは、アミノ酸配列に対して使用可能である。一般的に、これらのプログラムのいずれかは初期設定で用いられるが、とはいえ当業者であれば必要に応じてこれらの設定を変更し得る。あるいは、当業者であれば、少なくとも、参照されたアルゴリズム及びプログラムによって提供されるもののレベルの同一性またはアライメントを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用し得る。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，「Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。
【００２３】
多重配列アライメントプログラムは、核酸配列に対しても使用可能である。そのようなプログラムの例には、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」、「ＣＡＰ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が含まれ、それはインターネット上でウェブサーバーを通じてアクセス可能である。そのようなプログラムのための他の供給元は、当業者に公知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩユーティリティーも用いられる。上で記載されるプログラムに含有されるものを含めた、ヌクレオチド配列同一性を測定するために用いられ得る当技術分野において公知のいくつかのアルゴリズムも存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較され得る。Ｆａｓｔａ（商標）は、クエリー及び検索配列間での最良の重複の領域のアライメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、参照により本明細書に組み入れられるＧＣＧバージョン６．１において提供されるその初期設定パラメーター（スコア行列に対する６というワードサイズ及びＮＯＰＡＭファクター）を有するＦａｓｔａ（商標）を用いて決定され得る。
【００２４】
コドン最適化されたコード領域は、様々な異なる方法によって設計され得る。この最適化は、オンラインで使用可能である方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて実施され得る。１つのコドン最適化法は、例えば米国国際特許公報第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記載されており、それは参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。例えば、米国特許公報第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公報第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。適切には、産物に対するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長が改変される。しかしながら、一部の実施形態において、ＯＲＦのフラグメントのみが変更され得る。これらの方法の１つを用いることによって、任意の所定のポリペプチド配列に頻度を適用し得、当該ポリペプチドをコードするコドン最適化されたコード領域の核酸フラグメントを産生し得る。
【００２５】
コドンへの実際の変化を実施するために、または本明細書において記載されるように設計されたコドン最適化されたコード領域を合成するために、いくつかの選択肢が使用可能である。そのような改変または合成は、当業者に周知の標準的でかつルーチン的な分子生物学的操縦を用いて実施され得る。１つの手法において、長さがそれぞれ８０〜９０ヌクレオチドの及び所望の配列の長さに及ぶ一連の相補的オリゴヌクレオチド対は、標準的方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングがあると、それらが、付着末端を含有する８０〜９０塩基対の二本鎖フラグメントを形成するように合成され、例えば、対における各オリゴヌクレオチドは、対における他方のオリゴヌクレオチドに相補的である領域を３、４、５、６、７、８、９、１０塩基、またはそれを上回る数
の塩基越えて伸長するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドのもう一方の対の一本鎖末端とアニールするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次いでこれら二本鎖フラグメントのおよそ５〜６個を一本鎖付着末端を介して一緒にアニールさせ、次いでそれらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクター内にクローニングする。次いで、構築物を標準的方法によってシーケンスする。一緒にライゲーションされた８０〜９０塩基対フラグメントの５〜６個のフラグメント、すなわち約５００塩基対のフラグメントからなるこれら構築物のいくつかを、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物において表されるように調製する。次いで、これらプラスミドのインサートを適当な制限酵素で切り取り、一緒にライゲーションして最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクター内にクローニングし、シーケンスする。付加的な方法は、当業者に即座に明白であろう。加えて、遺伝子合成は、商業的に容易に利用可能である。
【００２６】
「操作された」によって、本明細書において記載されるＴＰＰ１タンパク質をコードする核酸配列が組み立てられ、例えば非ウイルス性送達システム（例えば、ＲＮＡに基づくシステム、ネイキッドＤＮＡ等）を作出するために、またはパッケージング宿主細胞においてウイルスベクターを作出するために、及び／または対象における宿主細胞への送達のために、その上に乗せたＴＰＰ１配列を宿主細胞に移動させる任意の適切な遺伝子エレメント、例えばネイキッドＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム等の中に置かれることを意味する。１つの実施形態において、遺伝子エレメントはプラスミドである。そのような操作された構築物を作製するために用いられる方法は、核酸操縦における当業者に公知であり、遺伝子操作、組み換え操作、及び合成技法を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
【００２７】
本明細書において使用するとき、「宿主細胞」という用語は、組み換えＡＡＶが産生プラスミドから産生されるパッケージング細胞株を指し得る。代替的に、「宿主細胞」という用語は、コード配列の発現が所望される任意の標的細胞を指し得る。ゆえに、「宿主細胞」とは、任意の手段、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技法、ＤＮＡでコーティングした高速弾、ウイルス感染、及び原形質融合によって細胞内に導入されている外因性または異種ＤＮＡを含有する原核または真核細胞を指す。本明細書におけるある特定の実施形態において、「宿主細胞」という用語は、ウイルスベクターまたは組み換えウイルスを作出し及びパッケージするために採用される細胞を指す。本明細書における他の実施形態において、「宿主細胞」という用語は、本明細書において記載される組成物のインビトロ査定のための、様々な哺乳類種のＣＮＳ細胞の培養物を指す。さらに他の実施形態において、「宿主細胞」という用語は、バッテン病に対してインビボで治療されている対象の脳細胞に言及することを意図される。そのような宿主細胞には、脳室系の上皮層である上衣を含めたＣＮＳの上皮細胞が含まれる。他の宿主細胞には、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアが含まれる。
【００２８】
本明細書において使用するとき、「治療」または「治療すること」という用語は、バッテン病の１つまたは複数の症状を改善する目的で、本明細書において記載される１種または複数種の化合物または組成物を対象に投与することを包含すると定義される。ゆえに、「治療」には、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）の発症もしくは進行を低下させること、疾患を予防すること、疾患症状の重症度を低下させること、または失明の進行を含
めたそれらの進行を遅滞させること、疾患症状を取り除くこと、疾患の発症を遅らせること、または所定の対象における疾患の進行もしくは療法の効力をモニターすることのうちの１つまたは複数が含まれ得る。
【００２９】
１つの実施形態において、ＴＰＰ１をコードする核酸配列は、それに共有結合で連結された、タグポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。タグポリペプチドは、限定されることなく、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニンタグポリペプチド、ｆｌａｇタグポリペプチド、及びマルトース結合タンパク質タグポリペプチドを含めた、公知の「エピトープタグ」から選択され得る。
【００３０】
別の態様において、ＴＰＰ１をコードする核酸配列を含む発現カセットが提供される。１つの実施形態において、配列は、コドン最適化された配列である。別の実施形態において、コドン最適化された核酸配列は、ヒトＴＰＰ１をコードする配列番号：３である。
【００３１】
本明細書において使用するとき、「発現カセット」とは、ＴＰＰ１タンパク質に対するコード配列、プロモーターを含み、かつそれに対する他の調節配列を含み得る核酸分子を指し、そのカセットはウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のカプシド内にパッケージされ得る。典型的に、ウイルスベクターを作出するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルによって隣接された本明細書において記載されるＣＬＮ２配列、及び本明細書において記載されるものなどの他の発現制御配列を含有する。例えば、ＡＡＶウイルスベクターに関して、パッケージングシグナルは、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲである。ＡＡＶカプシド内にパッケージされた場合、発現カセットと連動したＩＴＲは、本明細書において「組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノム」または「ベクターゲノム」と呼ばれ得る。１つの実施形態において、発現カセットは、ＴＰＰ１タンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列を含む。１つの実施形態において、カセットは、ＴＰＰ１をコードするコドン最適化された核酸配列の宿主細胞における発現を指揮する発現制御配列と作動可能なように結び付いたコドン最適化されたＣＬＮ２を提供する。
【００３２】
別の実施形態において、ＡＡＶベクターにおける使用のための発現カセットが提供される。その実施形態において、ＡＡＶ発現カセットは、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。別の実施形態において、発現カセットは、５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列を含む。１つの実施形態において、５’及び３’ＩＴＲは、任意で、ＴＰＰ１をコードするコドン最適化された核酸配列の宿主細胞における発現を指揮する付加的な配列とともに、ＴＰＰ１をコードするコドン最適化された核酸配列に隣接する。ゆえに、本明細書において記載されるように、ＡＡＶ発現カセットは、その５’末端で５’ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって及びその３’末端で３’ＡＡＶ  ＩＴＲによって隣接された、上で記載される発現カセットを記載することを企図される。ゆえに、このｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子内に発現カセットをパッケージするために要される最小配列、すなわちＡＡＶ  ５’及び３’ＩＴＲを含有する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、本明細書において記載されるものなど、任意のＡＡＶのＩＴＲ配列から獲得され得る。これらのＩＴＲは、結果として生じる組み換えＡＡＶにおいて採用されるカプシドと同じＡＡＶ起源のもの、または異なるＡＡＶ起源のもの（ＡＡＶ偽型を産生する）であり得る。１つの実施形態において、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列またはその欠失型（ΔＩＴＲ）が便宜上及び規制当局承認を早めるために用いられる。しかしながら、他のＡＡＶ供給源由来のＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、かつＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、結果として生じるベクターは偽型と称され得る。典型的に、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ  ５’ＩＴＲ、ＴＰＰ１コード配列及び任意の調節配列
、ならびにＡＡＶ  ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらエレメントの他の構成が適切であり得る。Ｄ配列及び末端分解部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）が欠失しているΔＩＴＲと称される、５’ＩＴＲの短縮型が記載されている。他の実施形態において、全長ＡＡＶ  ５’及び３’ＩＴＲが用いられる。次いで、各ｒＡＡＶゲノムは、産生プラスミド内に導入され得る。
【００３３】
本明細書において使用するとき、「調節配列」、「転写制御配列」、または「発現制御配列」という用語は、イニシエーター配列、エンハンサー配列、及びプロモーター配列などのＤＮＡ配列を指し、それは、それらが作動的に連結されているタンパク質コード核酸配列の転写を誘導する、抑制する、または別様に制御する。
【００３４】
本明細書において使用するとき、「作動的に連結された」または「作動可能なように結び付いた」という用語は、ＴＰＰ１をコードする核酸配列と近接している発現制御配列、及び／またはトランスでもしくは少し離れて作用してその転写と発現を制御する発現制御配列の両方を指す。
【００３５】
１つの態様において、本明細書において記載される発現カセットのいずれかを含むベクターが提供される。本明細書において記載されるように、そのようなベクターは、多様な起源のプラスミドであり得、本明細書においてさらに記載される組み換え複製欠陥ウイルスの作出のためのある特定の実施形態において有用である。
【００３６】
本明細書において用いられる「ベクター」とは、外因性のまたは異種のまたは操作された核酸導入遺伝子が挿入され得る核酸分子であり、それは次いで適当な宿主細胞内に導入され得る。ベクターは、好ましくは、１つまたは複数の複製の起点、及び組み換えＤＮＡが挿入され得る１つまたは複数の部位を有する。ベクターは、ベクターを有する細胞が有しないものから選択され得る手段をしばしば有し、例えばそれらは薬物耐性遺伝子をコードする。よく用いられるベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、及び（主に酵母及び細菌における）「人工染色体」が含まれる。ある特定のプラスミドが本明細書において記載される。
【００３７】
１つの実施形態において、ベクターは、その記載される発現カセット、例えば「ネイキッドＤＮＡ」、「ネイキッドプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含む非ウイルス性プラスミドであり；例えばミセル、リポソーム、カチオン性脂質−核酸組成物、ポリグリカン組成物及び他のポリマー、脂質及び／またはコレステロールに基づく核酸抱合体、ならびに本明細書において記載されるものなどの他の構築物を含めた、様々な組成物ならびにナノ粒子と共役される。例えば、Ｘ．Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４−７８７；ウェブ公開：２０１１年３月２１日；ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたく、そのすべては参照により本明細書に組み入れられる。そのような非ウイルス性ＴＰＰ１ベクターは、本明細書において記載される経路によって投与され得る。ウイルスベクターまたは非ウイルス性ベクターは、遺伝子導入及び遺伝子療法適用における使用のために、生理学的に許容されるキャリアとともに製剤化され得る。
【００３８】
別の実施形態において、ベクターは、その中で記載される発現カセットを含むウイルスベクターである。「ウイルスベクター」は、外因性または異種ＣＬＮ２核酸導入遺伝子を含有する複製欠陥ウイルスとして定義される。１つの実施形態において、本明細書において記載される発現カセットは、薬物送達にまたはウイルスベクターの産生に用いられるプラスミド上に操作され得る。適切なウイルスベクターは、好ましくは複製欠陥であり、脳細胞を標的にするものの中から選択される。ウイルスベクターには、アデノウイルス；ヘルペスウイルス；レンチウイルス；レトロウイルス；パルボウイルス等を含むがそれらに
限定されない、遺伝子療法に適した任意のウイルスが含まれ得る。しかしながら、理解をしやすくするために、アデノ随伴ウイルスが例示的なウイルスベクターとして本明細書において参照される。
【００３９】
「複製欠陥ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、関心対象の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージされており、任意のウイルスゲノム配列も当該ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージされている場合に複製欠損である、合成または組み換えウイルス粒子を指す；すなわち、それらは子孫ビリオンを作出し得ないが、標的細胞に感染し得る能力を保持する。１つの実施形態において、ウイルスベクターのゲノムは、複製するために要される酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは「実質がない（ｇｕｔｌｅｓｓ）」ように操作され得、増幅及び人工ゲノムのパッケージングに要されるシグナルによって隣接された関心対象の導入遺伝子のみを含有する）が、これらの遺伝子は産生の間に供給され得る。それゆえ、複製に要されるウイルス酵素の存在下を除いて、複製及び子孫ビリオンによる感染は生じ得ないことから、それは遺伝子療法における使用にとって安全であると考えられる。
【００４０】
別の実施形態において、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが提供される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及びその中にパッケージされたベクターゲノムを含む。ベクターゲノムは、１つの実施形態において、（ａ）ＡＡＶ  ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするコード配列；及び（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲを含む。別の実施形態において、ベクターゲノムは、本明細書において記載される発現カセットである。１つの実施形態において、ＣＬＮ２配列は、全長ＴＰＰ１タンパク質をコードする。１つの実施形態において、ＴＰＰ１配列は、配列番号：１のタンパク質配列である。別の実施形態において、コード配列は、配列番号：３またはそのバリアントである。
【００４１】
パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）〜６ｋｂの一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する小さなエンベロープを持たない正二十面体ウイルスである。公知のＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等がある。ＩＴＲまたは他のＡＡＶ構成要素は、ＡＡＶから、当業者に使用可能な技法を用いて容易に単離され得るまたは操作され得る。そのようなＡＡＶは、学術的、商業的、または公的な供給元（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離され得る、操作され得る、または獲得され得る。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献において、または例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのデータベースにおいて入手可能であるものなどの公開された配列を参照することにより、合成手段または他の適切な手段によって操作され得る。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学技法によって操作され得、核酸配列の細胞特異的送達のために、免疫原性を最小限に抑えるために、安定性及び粒子寿命を調整するために、効率的な分解のために、核への精確な送達のために等、これらの粒子を最適化するのを可能にする。
【００４２】
ＡＡＶのフラグメントは、多様なベクターシステム及び宿主細胞において容易に利用され得る。望ましいＡＡＶフラグメントには、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３、及び超可変領域を含めたｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含めたｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列がある。そのようなフラグメントは、単独で、他のＡＡＶ血清型配列もしくはフラグメントと組み合わせて、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて用いられ得る。本明細書において使用するとき、人工ＡＡＶ血清型には、限定されることなく、天然に存在しないカプシドタンパク質を有するＡＡＶが含まれる。そのような人工カプシ
ドは、別のＡＡＶ血清型（公知または新規）から、同じＡＡＶ血清型の非近接部分から、非ＡＡＶウイルス供給源から、または非ウイルス供給源から獲得され得る異種配列と組み合わせて、本発明の新規のＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質のフラグメント）を用いて、任意の適切な技法によって作出され得る。人工ＡＡＶ血清型は、限定されることなく、キメラＡＡＶカプシド、組み換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。１つの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ９  ｃａｐ及び／またはｒｅｐ配列を含有する。米国特許第７，９０６，１１１号を参照されたく、それは参照により本明細書に組み入れられる。
【００４３】
１つの実施形態において、配列番号：６のアミノ酸配列を特徴とするＡＡＶ９カプシドを有するＡＡＶベクターが本明細書において提供され、古典的遅発性乳児型神経セロイドリポフスチン症２（ＣＬＮ２）遺伝子をコードする核酸は、それを必要としている患者におけるその発現を指揮する調節配列の制御下にある。
【００４４】
本明細書において使用するとき、「ＡＡＶ９カプシド」は、選択的スプライシングバリアントとして典型的に発現され、配列番号：６の種々の長さのタンパク質をもたらす、約６０個の可変タンパク質（ｖｐ）の会合体であるＤＮＡｓｅ耐性粒子を特徴とする。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４．１も参照されたく、それは参照により本明細書に組み入れられる。ＵＳ７９０６１１１及びＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。本明細書において使用するとき、「ＡＡＶ９バリアント」には、例えばＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、及びＵＳ８，７３４，８０９に記載されるものが含まれる。アミノ酸配列は配列番号：６に再現され、コード配列は配列番号：７に再現される。１つの実施形態において、ＡＡＶ９カプシドには、配列番号：７、またはそれと少なくとも約９０％、９５％、９５％、９８％、もしくは９９％の同一性を共有する配列によってコードされるカプシドが含まれる。
【００４５】
最も大きなタンパク質であるｖｐ１は、大抵、配列番号：６のアミノ酸配列の全長（配列番号：６のａａ１〜７３６）である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ９  ｖｐ２タンパク質は、配列番号：６の１３８〜７３６のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ９  ｖｐ３タンパク質は、配列番号：６の２０３〜７３６のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、ｖｐ１、２、または３タンパク質は、切り取りを有し得る（例えば、Ｎ末端またはＣ末端において１つまたは複数のアミノ酸）。ＡＡＶ９カプシドは約６０個のｖｐタンパク質から構成され、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３は、会合したカプシド内に約１個のｖｐ対約１個のｖｐ２対約１０〜２０個のｖｐ３タンパク質の比率で存在する。この比率は、用いられる産生システムに応じて変動し得る。ある特定の実施形態において、ｖｐ２がない操作されたＡＡＶ９カプシドが作出され得る。
【００４６】
ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含めた、このＡＡＶ９カプシドをコードする核酸配列を設計することは当技術分野における技能の範囲内にある。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ９  ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号：７に提供される。他の実施形態において、配列番号：７と７０％〜９９．９％同一性の核酸配列を選択して、ＡＡＶ９カプシドを発現させ得る。ある特定の他の実施形態において、核酸配列は、配列番号：７と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％〜９９．９％同一である。
【００４７】
本明細書において使用するとき、「クレード」という用語は、それがＡＡＶの群に関するとき、ＡＡＶ  ｖｐ１アミノ酸配列のアライメントに基づき、少なくとも７５％のブートストラップ値（少なくとも１０００回の複製についての）による近隣結合アルゴリズム
及びわずか０．０５のポアソン補正距離測定を用いて判定される、互いに系統発生学的に関係しているＡＡＶの群を指す。近隣結合アルゴリズムは文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実行するために用いられ得るコンピュータープログラムが入手可能である。例えば、ＭＥＧＡ  ｖ２．１プログラムは、改変型Ｎｅｉ−Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実行する。これらの技法及びコンピュータープログラム、ならびにＡＡＶ  ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を用いれば、当業者であれば、選択されたＡＡＶが、本明細書において同定されるクレードの１つに含有されるか、別のクレードに含有されるか、またはこれらのクレードから外れるかどうかを容易に判定し得る。例えば、Ｇ  Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００４  Ｊｕｎ；７８（１０）：６３８１−６３８８を参照されたく、それはクレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦを同定し、新規のＡＡＶの核酸配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５５３〜ＡＹ５３０６２９を提供している。ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。ＡＡＶ９は、クレードＦ内にあることをさらに特徴とする。他のクレードＦ  ＡＡＶには、ＡＡＶｈｕ３１及びＡＡＶｈｕ３２が含まれる。
【００４８】
本明細書において使用するとき、ＡＡＶに関して、バリアントという用語は、アミノ酸または核酸配列にわたって少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、またはそれを上回る割合の配列同一性を共有するものを含めた、公知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味する。別の実施形態において、ＡＡＶカプシドには、任意の記載されるまたは公知のＡＡＶカプシド配列からの最高で約１０％の変動を含み得るバリアントが含まれる。つまり、ＡＡＶカプシドは、本明細書において提供される及び／または当技術分野において公知のＡＡＶカプシドと、約９０％の同一性〜約９９．９％の同一性、約９５％〜約９９％の同一性、または約９７％〜約９８％の同一性を共有する。１つの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶカプシドの同一性パーセントを決定する場合、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のいずれかにわたって比較がなされ得る。１つの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３にわたって、ＡＡＶ９と少なくとも９５％の同一性を共有する。
【００４９】
本明細書において使用するとき、「人工ＡＡＶ」とは、限定されることなく、天然に存在しないカプシドタンパク質を有するＡＡＶを意味する。そのような人工カプシドは、異なる選択されたＡＡＶから、同じＡＡＶの非近接部分から、非ＡＡＶウイルス供給源から、または非ウイルス供給源から獲得され得る異種配列と組み合わせて、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質のフラグメント）を用いて、任意の適切な技法によって作出され得る。人工ＡＡＶは、限定されることなく、偽型ＡＡＶ、キメラＡＡＶカプシド、組み換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。１種のＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質で置き換えられている偽型ベクターは、本発明において有用である。１つの実施形態において、ＡＡＶ２／９及びＡＡＶ２／ｒｈ．１０は、例示的な偽型ベクターである。
【００５０】
別の実施形態において、自己相補的ＡＡＶが用いられる。「自己相補的ＡＡＶ」とは、組み換えＡＡＶ核酸配列によって運ばれるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている発現カセットを有するプラスミドまたはベクターを指す。感染があると、第二の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的半分が会合して、即時の複製及び転写の準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ  Ｍ  ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，「Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２００１），Ｖｏｌ  ８，Ｎｕｍｂｅｒ  １６，Ｐａｇｅｓ  １２４８−１２５４を参照されたい。自己相補的ＡＡＶは、例えば米国特許第６，５９６，５３５号；第７，１２５，７１７号；及び第７，４５６，６８３号に記載されており、そのそれぞれは参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
【００５１】
核酸配列またはタンパク質を記載するために用いられる「外因性」という用語は、核酸またはタンパク質が、それが染色体または宿主細胞において存在する場所には天然には存在しないことを意味する。外因性核酸配列は、同じ宿主細胞または対象に由来しかつそれに挿入されるが、天然でない状態で、例えば異なるコピー数で、または異なる調節エレメントの制御下に存在する配列も指す。
【００５２】
核酸配列またはタンパク質を記載するために用いられる「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、それが発現される宿主細胞または対象とは異なる生物、または同じ生物の異なる種に由来したことを意味する。「異種」という用語は、タンパク質、またはプラスミド、発現カセット、もしくはベクターにおける核酸に関連して用いられる場合、タンパク質または核酸が別の配列または部分配列とともに存在し、問題になっているタンパク質または核酸は天然における互いに対する同じ関係性で見い出されないことを示す。
【００５３】
さらに別の実施形態において、本明細書において記載されるもののいずれかを含めた発現カセットを採用して、組み換えＡＡＶゲノムを作出する。
【００５４】
１つの実施形態において、本明細書において記載される発現カセットは、ウイルスベクターを作出するのに及び／または宿主細胞への送達に有用な適切な遺伝子エレメント（ベクター）、例えばネイキッドＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム等の中に操作され、それはその上に乗せたＣＬＮ２配列を移動させる。選択されたベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技法、ＤＮＡでコーティングした高速弾、ウイルス感染、及び原形質融合を含めた、任意の適切な方法によって送達され得る。そのような構築物を作製するために用いられる方法は、核酸操縦における当業者に公知であり、遺伝子操作、組み換え操作、及び合成技法を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。
【００５５】
発現カセットまたはｒＡＡＶゲノムまたは産生プラスミドをビリオン内にパッケージすることに関して、ＩＴＲは、発現カセットと同じ構築物においてシスで要される唯一のＡＡＶ構成要素である。１つの実施形態において、複製（ｒｅｐ）及び／またはカプシド（ｃａｐ）に対するコード配列をＡＡＶゲノムから取り出し、トランスでまたはパッケージング細胞株によって供給して、ＡＡＶベクターを作出する。
【００５６】
対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを作出する及び単離するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許７７９０４４９；米国特許７２８２１９９；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１；ＷＯ２００６／１１０６８９；及びＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。１つのシステムにおいて、産生細胞株に、ＩＴＲによって隣接された導入遺伝子をコードする構築物、ならびにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）を一過性にトランスフェクトする。第二のシステムにおいて、ｒｅｐ及びｃａｐを安定に供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲによって隣接された導入遺伝子をコードする構築物を一過性にトランスフェクトする。これらの
システムのそれぞれにおいて、ＡＡＶビリオンは、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスによる感染に応答して産生され、混入ウイルスからのｒＡＡＶの分離を要する。より最近では、ＡＡＶを回復させるためにヘルパーウイルスによる感染を要しないシステムが開発されており、要されるヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）は、システムによってトランスでも供給される。これらのより新しいシステムにおいて、ヘルパー機能は、要されるヘルパー機能をコードする構築物での細胞の一過性トランスフェクションによって供給され得る、または細胞は、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含有するように操作され得、その発現は転写もしくは転写後レベルで制御され得る。
【００５７】
「単離された」という用語は、物質が、その本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合には天然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きた動物に存在している天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムにおいて共存する物質の一部またはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、たとえその後に天然システムに再導入されるとしても、単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、及び／またはそのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部であり得、かつそのようなベクターもしくは組成物がその天然環境の一部でないという点において依然として単離された状態であり得る。
【００５８】
さらに別のシステムにおいて、ＩＴＲ及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子によって隣接された発現カセットは、バキュロウイルスに基づくベクターによる感染によって昆虫細胞内に導入される。これらの産生システムについての総説に関しては、一般的に、例えばＺｈａｎｇ
ｅｔ  ａｌ，２００９，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：９２２−９２９を参照されたく、その内容は参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。これらの及び他のＡＡＶ産生システムを作製する及び使用する方法も、以下の米国特許に記載されており、そのそれぞれの内容は参照によりその全体として本明細書に組み入れられる：５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；及び７，４３９，０６５。一般的に、例えばＧｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９−１４５；Ｂｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，「Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ
ｖｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１０：７１７−７３３；及び下記で引用される参考文献を参照されたく、そのそれぞれは参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
【００５９】
本発明の任意の実施形態を構築するために用いられる方法は、核酸操縦における当業者に公知であり、遺伝子操作、組み換え操作、及び合成技法を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作出する方法は周知であり、適切な方法の選択は本発明に対する限
定ではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。
【００６０】
「プラスミド」は、一般的に、当業者によく知られている標準的な命名規則に従い、先行する小文字のｐ及び／またはそれに続く大文字及び／または数字によって本明細書において指定される。本発明に従って用いられ得る多くのプラスミドならびに他のクローニング及び発現ベクターは、当業者に周知であり及び容易に使用可能である。さらに、当業者であれば、本発明における使用に適したいくつもの他のプラスミドを容易に構築し得る。本発明における、そのようなプラスミドならびに他のベクターの特性、構築、及び使用は、本開示から当業者に容易に明白であろう。
【００６１】
１つの実施形態において、産生プラスミドは、本明細書において記載されるもの、または参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１２／１５８７５７に記載されるものである。ｒＡＡＶベクターを産生することにおける使用のための、様々なプラスミドが当技術分野において公知であり、本明細書において有用である。産生プラスミドを、ＡＡＶ  ｃａｐ及び／またはｒｅｐタンパク質を発現する宿主細胞において培養する。宿主細胞において、各ｒＡＡＶゲノムはレスキューされかつカプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質内にパッケージされて、感染性ウイルス粒子を形成する。
【００６２】
１つの態様において、上で記載される発現カセットを含む産生プラスミドが提供される。１つの実施形態において、産生プラスミドは図１Ｂに示されるものである。このプラスミドは、ｒＡＡＶ−ヒトコドン最適化ＴＰＰ１ベクターの作出のために実施例において用いられる。そのようなプラスミドは、５’ＡＡＶ  ＩＴＲ配列；選択されたプロモーター；ポリＡ配列；及び３’ＩＴＲを含有するものであり；加えて、それは、ニワトリベータ−アクチンイントロンなどのイントロン配列も含有する。例示的な略図が図１Ａに示されている。さらなる実施形態において、イントロン配列は、約３キロベース（ｋｂ）〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約３ｋｂ〜約５．５ｋｂ、または約４．７ｋｂ〜５．５ｋｂのサイズを有するｒＡＡＶベクターゲノムを保つ。ＴＰＰ１コード配列を含む産生プラスミドの例は、配列番号：５に見い出され得る。別の実施形態において、産生プラスミドを改変して、ベクタープラスミド産生効率を最適化する。そのような改変には、他の中立な配列の付加、またはベクタープラスミドのスーパーコイルのレベルを変調するラムダスタッファー配列の内包が含まれる。そのような改変が本明細書において企図される。他の実施形態において、ターミネーター及び他の配列がプラスミドに含まれる。
【００６３】
ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ発現カセット、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、ウイルス（ｒＡＡＶなど）、及び／または産生プラスミドは、ＡＡＶ逆位末端反復配列、ＴＰＰ１をコードするコドン最適化された核酸配列、及び宿主細胞におけるコードタンパク質の発現を指揮する発現制御配列を含む。他の実施形態において、ｒＡＡＶ発現カセット、ウイルス、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、及び／または産生プラスミドは、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ、転写後調節エレメント等のうちの１つまたは複数をさらに含む。１つの実施形態において、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
【００６４】
発現カセット、ベクター、及びプラスミドは、例えば本明細書において記載されるコドン最適化を含めた当技術分野において公知の技法を用いて、特異的種に対して最適化され得る他の構成要素を含む。カセット、ベクター、プラスミド、及びウイルス、または本明細書において記載される他の組成物の構成要素は、発現制御配列の一部としてプロモーター配列を含む。別の実施形態において、プロモーターは細胞特異的である。「細胞特異的」という用語は、組み換えベクターに対して選択された特定のプロモーターが、特定の細胞または組織タイプにおける最適化されたＴＰＰ１コード配列の発現を指揮し得ることを
意味する。１つの実施形態において、プロモーターは、脳室系の上皮層である上衣における導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態において、プロモーターは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアから選択される脳細胞における発現に特異的である。１つの実施形態において、プロモーターを１つまたは複数の制限部位を付加するように改変して、クローニングを容易にする。
【００６５】
別の実施形態において、プロモーターは、ユビキタスまたは構成的プロモーターである。適切なプロモーターの例は、配列番号：５におけるｎｔ３３９６〜４０６１に示される配列など、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントを有するハイブリッドニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。別の実施形態において、プロモーターはＣＢ７プロモーターである。他の適切なプロモーターには、ヒトβ−アクチンプロモーター、ヒト伸長因子−１αプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。例えば、Ｄａｍｄｉｎｄｏｒｊ  ｅｔ  ａｌ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２０１４）Ａ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  Ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（８）：ｅ１０６４７２を参照されたい。さらに他の適切なプロモーターには、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーターが含まれる［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］。あるいは、生理学的合図に応答性のプロモーターが、本明細書において記載される発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、ベクター、プラスミド、及びウイルスにおいて利用され得る。１つの実施形態において、プロモーターは、ＡＡＶベクターのサイズ制限に起因して、１０００ｂｐを下回る小さなサイズのものである。別の実施形態において、プロモーターは４００ｂｐを下回る。他のプロモーターは、当業者によって選択され得る。
【００６６】
さらなる実施形態において、プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ファージラムダ（ＰＬ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、テトラサイクリン制御トランス活性化因子応答性プロモーター（ｔｅｔ）システム、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、ＢＩＶ  ＬＴＲ、もしくはＨＩＶ  ＬＴＲなどの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルスのＵ３領域プロモーター、グランザイムＡプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（複数可）、ＣＤ３４プロモーター、ＣＤ８プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、ＰＧＫプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、ＨＳＰ６５及びＨＳＰ７０プロモーターなどの熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｌａｃプロモーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモーター、ＭＮＤプロモーター、またはＭＮＣプロモーターから選択される。そのプロモーター配列は当業者に公知である、または文献においてもしくはデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄ等においてなど、公的に入手可能である。
【００６７】
別の実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、ラパマイシン／ラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）プロモーター、エクジソンプロモーター、エストロゲン応答性プロモーター、及びテトラサイクリン応答性プロモーター、またはヘテロ二量体リプレッサースイッチを含めた、公知のプロモーターから選択され得る。Ｓｏｃｈｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎ  Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓｌｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｏｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５  Ｎｏｖ  ２４；５：１７１０５、及びＤａｂｅｒ  Ｒ，Ｌｅｗｉｓ  Ｍ．，Ａ  ｎｏ
ｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９  Ａｕｇ
２８；３９１（４）：６６１−７０，Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｎ  ２１を参照されたく、それらは両方とも参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられる。
【００６８】
他の実施形態において、本明細書において記載される発現カセット、ベクター、プラスミド、及びウイルスは、他の適当な転写開始、終結、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；ＴＡＴＡ配列；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；イントロン；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに所望の場合には、コードされた産物の分泌を増強する配列を含有する。発現カセットまたはベクターは、本明細書において記載されるエレメントのどれも含有しなくても、いずれかのうちの１つまたは複数を含有してもよい。
【００６９】
適切なポリＡ配列の例には、例えば合成ポリＡ、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ−グロビン（ＲＧＢ）、もしくは改変されたＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来のものが含まれる。さらなる実施形態において、ポリＡは、配列番号：５のｎｔ３３〜１５９由来の核酸配列を有する。
【００７０】
適切なエンハンサーの例には、他の中でも、例えばＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、アルファフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／アルファ１−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥが含まれる。
【００７１】
１つの実施形態において、ＴＰＰ１コード配列の上流にＫｏｚａｋ配列を含んで、正しい開始コドンからの翻訳を増強する。別の実施形態において、ＣＢＡエクソン１及びイントロンが発現カセットに含まれる。１つの実施形態において、ＴＰＰ１コード配列は、ハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下に置かれる。このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー、近位ニワトリβアクチンプロモーター、及びイントロン１配列によって隣接されたＣＢＡエクソン１からなる。
【００７２】
別の実施形態において、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトベータグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、アルファ−グロブリン、ベータ−グロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、ｐ５３、またはそのフラグメントから選択される。
【００７３】
１つの実施形態において、発現カセット、ベクター、プラスミド、及びウイルスは、５’ＩＴＲ、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡエクソン１及びイントロン、ヒトコドン最適化ＣＬＮ２配列、ウサギグロビンポリＡ、ならびに３’ＩＴＲを含有する。さらなる実施形態において、発現カセットは、配列番号：９のｎｔ１〜４０２０を含む。なおさらなる実施形態において、５’ＩＴＲは配列番号：５のｎｔ３１９９〜ｎｔ３３２８の核酸配列を有し、かつ３’ＩＴＲは配列番号：５のｎｔ２４８〜ｎｔ３７７の核酸配列を有する。さらなる実施形態において、産生プラスミドは、図１Ｃ〜１Ｅにも示される配列番号：５の配列を有する。
【００７４】
別の態様において、ＣＬＮ２遺伝子における欠陥によって引き起こされるバッテン病を治療するための方法は、本明細書において記載される、ＴＰＰ１をコードするベクター（ｒＡＡＶなど）を、それを必要としている対象に送達することを含む。１つの実施形態において、本明細書において記載されるｒＡＡＶを用いてバッテン病を有する対象を治療する方法が提供される。
【００７５】
方法において用いられる「投与すること」によって、ＣＬＮ２遺伝子における欠陥を特徴とする標的選択細胞に組成物を送達することを意味する。１つの実施形態において、方法は、髄腔内注射によって組成物を送達することを伴う。別の実施形態において、対象へのＩＣＶ注射が採用される。別の実施形態において、対象への髄腔内−腰部（ＩＴ−Ｌ）注射が採用される。さらに別の方法において、血管内注射が採用され得る。別の実施形態において、筋肉内注射が採用される。投与のさらに他の方法は、本開示を考慮して、当業者によって選択され得る。
【００７６】
「投与すること」または「投与の経路」とは、対象への、薬学的キャリアまたは賦形剤の有りまたは無しでの、本明細書において記載される組成物の送達である。所望の場合、投与の経路は組み合わせられ得る。一部の実施形態において、投与は周期的に繰り返される。本明細書において記載される薬学的組成物は、任意の適切な経路または種々の経路の組み合わせによる、それを必要としている対象への送達のために設計される。一部の実施形態において、脳への直接送達（任意で、髄腔内、ＩＣＶ、またはＩＴ−Ｌ注射を介した）、または全身経路を介した送達、例えば血管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び投与の他の非経口経路が採用される。本明細書において記載される核酸分子、発現カセット、及び／またはベクターは、単一の組成物または複数の組成物で送達され得る。任意で、２種もしくはそれを上回る種類の異なるＡＡＶ、または多種ウイルスが送達され得る［例えば、ＷＯ２０２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい］。別の実施形態において、多種ウイルスは、単独でまたはタンパク質と組み合わせて、種々の複製欠陥ウイルス（例えば、ＡＡＶ及びアデノウイルス）を含有し得る。本明細書において使用するとき、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管内への、より具体的にはクモ膜下腔内への、注射を介した薬物の投与の経路を指し、それによりそれは脳脊髄液（ＣＳＦ）に達する。髄腔内送達には、腰椎穿刺、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）穿刺（脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ）穿刺、及び／またはＣ１−２穿刺が含まれ得る。例えば、物質は、腰椎穿刺によってクモ膜下腔全体にわたる拡散のために導入され得る。別の例において、注射は大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ  ｍａｇｎａ）内へのものであり得る。
【００７７】
本明細書において使用するとき、「大槽内送達」または「大槽内投与」という用語は、小脳延髄大槽の脳脊髄液中への直接の、より具体的には後頭下穿刺を介したまたは大槽内への直接注射によるまたは永久的に配置されたチューブを介した、薬物の投与の経路を指す。脳脊髄液中に本明細書において記載される組成物を送達するのに有用であるデバイスは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１６１３３に記載されており、それは参照により本明細書に組み入れられる。
【００７８】
薬学的組成物も本明細書において提供される。本明細書において記載される薬学的組成物は、任意の適切な経路または種々の経路の組み合わせによる、それを必要としている対象への送達のために設計される。
【００７９】
さらに他の態様において、これらの核酸配列、ベクター、発現カセット、及びｒＡＡＶウイルスベクターは薬学的組成物において有用であり、それは、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、バッファー、希釈剤、界面活性剤、防腐剤、及び／またはアジュバント等も含む。そのような薬学的組成物を用いて、そのような組み換え操作されたＡＡＶまたは人工ＡＡＶによる送達を通じて、宿主細胞において最適化ＴＰＰ１を発現させる。
【００８０】
核酸配列、ベクター、発現カセット、及びｒＡＡＶウイルスベクターを含有するこれらの薬学的組成物を調製するために、配列またはベクターまたはウイルスベクターを、好ましくは従来の方法によってコンタミネーションについて査定し、次いで患者への投与に適
した薬学的組成物に製剤化する。そのような製剤化は、ｐＨを適当な生理学的レベルに維持するための、緩衝生理食塩水または他のバッファー、例えばＨＥＰＥＳなど、薬学的に及び／または生理学的に許容されるビヒクルまたはキャリアの使用、ならびに任意で、他の薬効のある作用物質、薬学的作用物質、安定剤、バッファー、キャリア、アジュバント、希釈剤、界面活性剤、または賦形剤等の使用を伴う。注射に関して、キャリアは典型的に液体である。例示的な生理学的に許容されるキャリアには、無菌の発熱物質不含水及び無菌の発熱物質不含リン酸緩衝生理食塩水が含まれる。多様なそのような公知のキャリアは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許公報第７，６２９，３２２号に提供されている。１つの実施形態において、キャリアは等張塩化ナトリウム溶液である。別の実施形態において、キャリアは平衡塩類溶液である。１つの実施形態において、キャリアはｔｗｅｅｎを含む。ウイルスが長期間保管されることになる場合、それはグリセロールまたはＴｗｅｅｎ２０の存在下で凍結され得る。
【００８１】
１つの例示的な具体的な実施形態において、キャリアまたは賦形剤の組成は、０．０００１％〜０．０１％プルロニックＦ６８（ＰＦ６８）とともに１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．３を含有する。バッファーの生理食塩水構成要素の正確な組成は、１６０ｍＭ〜１８０ｍＭ  ＮａＣｌに及ぶ。任意で、具体的に記載されるバッファーの代わりに、異なるｐＨバッファー（潜在的には、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム、ＴＲＩＳ）が用いられる。さらにあるいは、０．９％ＮａＣｌを含有するバッファーが有用である。
【００８２】
本明細書において使用するとき、「投薬量」という用語は、治療の過程において対象に送達される総投薬量、または単一単位（または複数単位または分割投薬量）の投与で送達される量を指し得る。薬学的ウイルス組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり約１．０×１０９ＧＣ〜約１．０×１０１６ＧＣの値域内にある、本明細書において記載されるＴＰＰ１をコードするコドン最適化された核酸配列を運ぶ複製欠陥ウイルスの量を含有するように投薬量単位に製剤化され得る。１つの実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣを含有するように製剤化される。１つの実施形態において、ヒト適用に関して
、用量は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり１×１０１０〜約１×１０１２ＧＣに及び得る。すべての投薬量は、参照により本明細書に組み入れられる、例えばＭ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１に記載されるｏｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）による測定を含めた、任意の公知の方法によって測定され得る。
【００８３】
１つの実施形態において、バッテン患者への投与に適した水性懸濁液が提供される。懸濁液は、水性懸濁化液と、バッテン病に対する治療法として有用な本明細書において記載される組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の、グラム脳あたり約７．５×１０９ＧＣまたはウイルス粒子〜約１×１０１２ＧＣまたはウイルス粒子とを含む。
【００８４】
本発明の薬学的組成物の複数の「ブースター」投薬量を投与することも望ましくあり得る。例えば、ＣＮＳ内での導入遺伝子の持続期間に応じて、最初の投与後６ヶ月間隔でまたは年１回、ブースター投薬量を送達し得る。ｒＡＡＶベクターの投与によってＡＡＶ中和抗体が作り出されなかったという事実は、付加的なブースター投与を可能にするはずである。
【００８５】
そのようなブースター投薬量及びそれに対する必要性は、例えばＴＰＰ１活性及び下記の実施例において記載される神経認知試験を用いて、主治医によってモニターされ得る。他の同様の試験を用いて、治療された対象の状態を経時的に判定し得る。適当な試験の選択は、主治医によって行われ得る。さらにあるいは、本発明の方法は、正常な対象に見い出されるものに近いＴＰＰ１活性レベルを可能にする、単回または複数回の感染におけるより大きな容量のウイルス含有液の注射も伴い得る。
【００８６】
これら上記の用量は、患者のサイズ、用いられるウイルス力価、投与の経路、及び方法の所望される効果に応じて、値域内のすべての数を含めた約１００マイクロリットル〜約５０ｍＬに及ぶ多様な容量のキャリア、賦形剤、またはバッファー製剤で投与され得る。１つの実施形態において、キャリア、賦形剤、またはバッファーの容量は少なくとも約５００μＬである。１つの実施形態において、容量は約７５０μＬである。別の実施形態において、容量は約１ｍＬである。別の実施形態において、容量は約２ｍＬである。別の実施形態において、容量は約３ｍＬである。別の実施形態において、容量は約４ｍＬである。別の実施形態において、容量は約５ｍＬである。別の実施形態において、容量は約６ｍＬである。別の実施形態において、容量は約７ｍＬである。別の実施形態において、容量は約８ｍＬである。別の実施形態において、容量は約９ｍＬである。別の実施形態において、容量は約１０ｍＬである。別の実施形態において、容量は約１１ｍＬである。別の実施形態において、容量は約１２ｍＬである。別の実施形態において、容量は約１３ｍＬである。別の実施形態において、容量は約１４ｍＬである。別の実施形態において、容量は約１５ｍＬである。別の実施形態において、容量は約１６ｍＬである。別の実施形態において、容量は約１７ｍＬである。別の実施形態において、容量は約１８ｍＬである。別の実施形態において、容量は約１９ｍＬである。別の実施形態において、容量は約２０ｍＬである。別の実施形態において、容量は約２１ｍＬである。別の実施形態において、容量は約２２ｍＬである。別の実施形態において、容量は約２３ｍＬである。別の実施形態において、容量は約２４ｍＬである。別の実施形態において、容量は約２５ｍＬまたはそれを上回る量である。１つの実施形態において、最大注射容量は、総脳脊髄液容量の約１０％である。
【００８７】
１つの実施形態において、ウイルス構築物は、マウスなどの小動物対象に対して、約１００マイクロリットルｍＬ〜約１ｍＬの容量中少なくとも１×１０９〜少なくとも約１×１０１３ＧＣの用量で送達され得る。より大きな獣医学的対象に関しては、上で明記され
るより大きなヒト投薬量及び容量が有用である。様々な獣医学的動物への物質の投与のための優れた実践の考察に関しては、例えばＤｉｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２１：１５−２３（２００１）を参照されたい。この文書は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００８８】
最低有効濃度のウイルスまたは他の送達ビヒクルを利用して、毒性などの望ましくない効果の危険性を低下させることが望ましい。これらの値域内のさらに他の投薬量は、治療されている対象、好ましくはヒト、対象の年齢、及び障害が発生している程度を考慮して、主治医によって選択され得る。
【００８９】
本明細書において記載されるさらに別の態様は、哺乳類対象におけるバッテン病を治療する、その進行を遅滞させるまたは止めるための方法である。１つの実施形態において、好ましくは生理学的に適合するキャリア、希釈剤、賦形剤、及び／またはアジュバント中に懸濁された、ＣＬＮ２の天然の、改変された、またはコドン最適化された配列を運ぶｒＡＡＶは、治療上有効量で、ヒト対象を含めた所望の対象に投与され得る。この方法は、核酸配列、発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、プラスミド、ベクターもしくはｒＡＡＶベクター、またはそれらを含有する組成物のいずれかを、それを必要としている対象に投与することを含む。１つの実施形態において、組成物は髄腔内に送達される。別の実施形態において、組成物はＩＣＶを介して送達される。さらに別の実施形態において、組成物は、バッテン病の治療に適した投与経路の組み合わせを用いて送達され、静脈内投与または他の従来的な投与経路も伴い得る。
【００９０】
これらの方法における使用に関して、各投薬の容量及びウイルス力価は、本明細書においてさらに記載されるように、個々に決定される。投薬量、投与、及びレジメンは、本明細書の教示を考慮して、主治医によって決定され得る。別の実施形態において、方法は、２回またはそれを上回る回数の投薬（例えば、分割投薬）で組成物を投与することを伴う。別の実施形態において、選択された発現カセット（例えば、ＣＬＮ２含有カセット）を含むｒＡＡＶの第二の投与は、より後の時点で実施される。そのような時点は、第一の投与の数週間、数ヶ月、または数年後であり得る。そのような第二の投与は、１つの実施形態において、第一の投与からのｒＡＡＶとは異なるカプシドを有するｒＡＡＶを用いて実施される。別の実施形態において、第一及び第二の投与からのｒＡＡＶは、同じカプシドを有する。
【００９１】
さらに他の実施形態において、本明細書において記載される組成物は、単一の組成物または複数の組成物で送達され得る。任意で、２種もしくはそれを上回る種類の異なるＡＡＶ、または多種ウイルスが送達され得る（例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい）。別の実施形態において、多種ウイルスは、種々の複製欠陥ウイルス（例えば、ＡＡＶ及びアデノウイルス）を含有し得る。
【００９２】
本発明によると、「治療上有効量」のｈＴＰＰ１を本明細書において記載されるように送達して、所望の結果、すなわちバッテン病またはその１つもしくは複数の症状の治療を達成する。身体査定、発作査定、行動査定、及び能力査定を含む包括的システムである、統一バッテン病評定尺度（Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｂａｔｔｅｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）（ＵＢＤＲＳ）が提唱されている。ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｆｉｌｅｓ／ｍｉｎｋ．ｐｄｆでアクセス可能なＭｉｎｋ，Ｊ．，Ｔｈｅ  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｂａｔｔｅｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅを参照されたい。１つの実施形態において、治療の目標は、疾患の進行を抑えることである。これは、ＣＬＮ２病評定疾患尺度またはＵＢＤＲＳを用いた、症状の定量的及び定性的な評価によって査定され得る。
【００９３】
別の実施形態において、方法は、付加的な試験、例えばアッセイ及び神経認知試験を実施して、治療の効力を判定することを含む。そのような試験は、上で述べられるＵＢＤＲＳの一部として実施されるものを含み、限定されることなく、発話の明瞭性、挺舌、視力、調整（腕、脚、首）、強度（腕、脚）、ハンドタッピング、かかとで踏み鳴らすこと、自発運動（無動症）、常同症、ジストニア、ミオクローヌス、振戦、舞踏病、測定障害、歩行、姿勢の安定性、発作、行動及び気分、ならびに全体的な健康状態についての査定を含む。
【００９４】
本明細書において記載される方法の１つの実施形態において、本明細書において記載される組成物の１回限りの送達、例えば最適化されたＣＬＮ２カセットの１回のＡＡＶ送達は、対象におけるバッテン病を治療することにおいて有用である。本明細書において記載される方法の別の実施形態において、本明細書において記載される組成物の１回限りの送達、例えば最適化されたＣＬＮ２カセットの１回のＡＡＶ送達は、ＣＬＮ２欠陥を有する対象におけるバッテン病を予防することにおいて有用である。
【００９５】
ゆえに、１つの実施形態において、組成物は、疾患発症前に投与される。別の実施形態において、組成物は、神経学的機能障害の開始前に投与される。別の実施形態において、組成物は、神経学的機能障害の開始後に投与される。１つの実施形態において、新生児治療とは、分娩の８時間以内、最初の１２時間、最初の２４時間、または最初の４８時間以内に、本明細書において記載されるＴＰＰ１コード配列、発現カセット、またはベクターを投与されることとして定義される。別の実施形態において、特に霊長類（ヒトまたは非ヒト）に関して、新生児送達は、約１２時間〜約１週間、２週間、３週間、もしくは約１ヶ月の期間以内、または約２４時間〜約４８時間後である。別の実施形態において、組成物は、症状の発症後に送達される。１つの実施形態において、患者の治療（例えば、最初の注射）は、生後１年より前に開始される。別の実施形態において、治療は、最初の１年の後に、または最初の２〜３歳の後、５歳の後、１１歳の後に、またはより年長の歳に開始される。１つの実施形態において、治療は、約４歳〜約１２歳の年齢から開始される。１つの実施形態において、治療は、約４歳でまたはその後に開始される。１つの実施形態において、治療は、約５歳でまたはその後に開始される。１つの実施形態において、治療は、約６歳でまたはその後に開始される。１つの実施形態において、治療は、約７歳でまたはその後に開始される。１つの実施形態において、治療は、約８歳でまたはその後に開始される。１つの実施形態において、治療は、約９歳でまたはその後に開始される。１つの実施形態において、治療は、約１０歳でまたはその後に開始される。１つの実施形態において、治療は、約１１歳でまたはその後に開始される。１つの実施形態において、治療は、約１２歳でまたはその後に開始される。しかしながら、治療は、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、もしくは約４０歳でまたはその後に開始され得る。１つの実施形態において、子宮内治療とは、胎児に本明細書において記載される組成物を投与することとして定義される。例えば、Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎ  ｕｔｅｒｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｇｉｖｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｈｅｅｐ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１  Ａｐｒ；２２（４）：４１９−２６．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．００７．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｆｅｂ  ２を参照されたく、それは参照により本明細書に組み入れられる。
【００９６】
別の実施形態において、組成物は、後日に再投与される。任意で、１回を上回る回数の再投与が認められる。そのような再投与は、同じタイプのベクター、異なるウイルスベクターを用いた、または本明細書において記載される非ウイルス性送達を介したものであり得る。
【００９７】
本明細書において記載される治療の目標には、バッテン病の進行を抑えるまたは止めることが含まれる。治療の望ましい結果には、限定されることなく、ＵＢＤＲＳの査定スコアのいずれかの増加、ＴＰＰ１活性または発現レベルの増加、神経認知試験によって判定される運動機能の増加（またはその機能障害の進行の低下）、及びＭＲＩによる皮質体積の増加（またはその機能障害の進行の低下）が含まれる。所望の結果には、筋肉衰弱を低下させること、筋肉の強度及び調整を増加させること、または呼吸器の健康状態を維持することもしくは増加させること、または振戦もしくは痙攣を低下させることが含まれる。他の所望の評価項目は、医師によって決定され得る。
【００９８】
さらに別の実施形態において、上で記載される方法のいずれかは、別の療法、すなわち二次療法と組み合わせて実施される。二次療法は、これらの変異もしくは欠陥、またはそれに伴う影響のいずれかを阻止する、食い止める、または改善するのを助ける、任意の現在公知のまたは未知の療法であり得る。二次療法は、上で記載される組成物の投与の前に、それと同時に、または後に施され得る。１つの実施形態において、二次療法は、神経栄養因子、抗酸化物質、抗アポトーシス剤の投与など、網膜細胞の健康状態を維持するための非特異的な手法を伴う。非特異的な手法は、タンパク質、組み換えＤＮＡ、組み換えウイルスベクター、幹細胞、胎児組織、または遺伝子改変細胞の注射を通じて達成される。後者には、カプセル化されている遺伝子改変細胞が含まれ得る。１つの実施形態において、二次療法は脳室内セルリポナーゼアルファ（ＢＭＮ  １９０）である。Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃｅｒｌｉｐｏｎａｓｅ  ａｌｆａ（ＢＭＮ  １９０）  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ＣＬＮ２  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｓｅ  １／２  ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ，Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３９：Ｓ５１を参照されたく、それは参照により本明細書に組み入れられる。推奨投薬量は、隔週で投与される３０〜３００ｍｇ  ＩＣＶ注入である。
【００９９】
１つの実施形態において、組み換えｒＡＡＶを作出する方法は、上で記載されるＡＡＶ発現カセットを含有するプラスミドを獲得すること、及び感染性ＡＡＶエンベロープまたはカプシド内へのＡＡＶウイルスゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なウイルス配列の存在下で、当該プラスミドを運ぶパッケージング細胞を培養することを含む。ｒＡＡＶベクター作出の具体的な方法は上で記載されており、上で及び下記の実施例において記載される発現カセット及びゲノムにおけるコドン最適化ＣＬＮ２を送達し得るｒＡＡＶベクターを作出する際に採用され得る。
【０１００】
本発明のある特定の実施形態において、対象はバッテン病を有し、それを治療するために本発明の構成要素、組成物、及び方法は設計される。本明細書において使用するとき、本明細書において用いられる「対象」という用語は、ヒト、獣医学的動物または家畜、飼いならされた動物またはペット、及び臨床研究に通常用いられる動物を含めた、哺乳類動物を意味する。１つの実施形態において、これらの方法及び組成物の対象はヒトである。さらに他の適切な対象には、限定されることなく、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類等が含まれる。本明細書において使用するとき、「対象」という用語は、「患者」と互換可能に用いられる。
【０１０１】
本明細書において使用するとき、「治療」または「治療すること」という用語は、バッテン病の１つまたは複数の症状を改善する目的で、本明細書において記載される１種または複数種の化合物または組成物を対象に投与することを包含すると定義される。ゆえに、「治療」には、バッテン病の発症もしくは進行を低下させること、疾患を予防すること、疾患症状の重症度を低下させること、または神経学的機能障害の進行を含めたそれらの進行を遅滞させること、疾患症状を取り除くこと、疾患の発症を遅らせること、または所定の対象における疾患の進行もしくは療法の効力をモニターすることのうちの１つまたは複
数が含まれ得る。
【０１０２】
１つの態様において、機能的ＴＰＰ１タンパク質をコードするコード配列が提供される。「機能的ｈＴＰＰ１」によって、疾患と関連しない天然ＴＰＰ１タンパク質またはその天然バリアントもしくは多型の生物学的活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはほぼ同じ、または１００％を上回る割合を提供するＴＰＰ１タンパク質をコードする遺伝子を意味する。
【０１０３】
インビトロでＴＰＰ１発現及び活性レベルを測定するための多様なアッセイが存在する。例えば、下記の実施例２を参照されたい。本明細書において記載される方法は、バッテン病またはその症状の治療に対する他の任意の療法とも組み合わせられ得る。ＣＬＮ２病の管理は複雑である。患者は、高い症状負荷及び急速な機能衰退に起因して、広範な集学的医療を要し、家族は広範な心理社会的サポートを要するが、現在この状況に対する管理指針は存在しない。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ＣＬＮ２  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６９（２０１７）１０２ｅ１１２を参照されたく、それは参照により本明細書に組み入れられる。しかしながら、ある特定の実施形態において、標準治療には、脳室内セルリポナーゼアルファ（ＢＭＮ  １９０）が含まれ得る。Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃｅｒｌｉｐｏｎａｓｅ  ａｌｆａ（ＢＭＮ  １９０）  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ＣＬＮ２  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｓｅ  １／２  ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ，Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３９：Ｓ５１を参照されたく、それは参照により本明細書に組み入れられる。推奨投薬量は、隔週で投与される３０〜３００ｍｇ  ＩＣＶ注入である。
【０１０４】
ある特定の実施形態において、ＡＡＶ９．ＣＬＮ２ベクターを産生する。いくつかの適切な精製法が選択され得る。適切な精製法の例は、例えば、「Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＡＡＶ９」と題した、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号、ならびにその優先権文書である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号及び２０１５年１２月１１日に出願された第６２／２２６，３５７号に記載されており、それは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０５】
ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量が、製剤に含有される用量の測定基準として用いられ得る。当技術分野において公知の任意の方法を用いて、本発明の複製欠陥ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定し得る。ＡＡＶ  ＧＣ数の滴定を実施するための１つの方法は以下のとおりである：精製されたＡＡＶベクターサンプルをまずＤＮａｓｅで処理して、混入している宿主ＤＮＡを産生工程から排除する。次いで、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理に供して、カプシドからゲノムを放出する。次いで、放出されたゲノムを、ウイルスゲノムの特異的領域（例えば、ポリＡシグナル）を標的にするプライマー／プローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲによって定量化する。ゲノムコピーを決定するための別の適切な方法は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、特に最適化ｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲである［編集に先立って２０１３年１２月１３日にオンラインで公開された、Ｌｏｃｋ  Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｐｒｉｌ  ２０１４，２５（２）：１１５−１２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１］。あるいは、ＶｉｒｏＣｙｔ３１００、つまりフローサイトメトリーが粒子定量に用いられ得る。別の方法において、最適化されたＴＰＰ１コード配列をコードする核酸配列を運ぶ組み換えアデノ随伴ウイルスの有効用量は、Ｓ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３に記載されているように測定され、それは参照によりそ
の全体として組み入れられる。
【０１０６】
複製欠陥ウイルス組成物は、ヒト患者に対して、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた約１．０×１０９ＧＣ〜約９×１０１５ＧＣ（体重が７０ｋｇの平均的対象を治療するために）、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ〜１．０×１０１４ＧＣの値域内にある複製欠陥ウイルスの量を含有するように投薬量単位に製剤化され得る。１つの実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態において、組成物は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣを含有するように製剤化される。１つの実施形態において、ヒト適用に関して、用量は、値域内のすべての整数または部分的な量を含めた、投薬あたり１×１０１０〜約１×１０１５ＧＣに及び得る。
【０１０７】
ある特定の実施形態において、用量は、約１×１０９ＧＣ／ｇ脳質量〜約１×１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の値域内にあり得る。ある特定の実施形態において、用量は、約３×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量〜約３×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の値域内にあり得る。ある特定の実施形態において、用量は、約５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量〜約１．８５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の値域内にあり得る。
【０１０８】
１つの実施形態において、ウイルス構築物は、少なくとも約１×１０９ＧＣ〜約１×１０１５、または約１×１０１１〜５×１０１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量及び濃度の送達のための適切な容量は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ〜１５０ｍＬの容量が選択され得、成人にはより高い容量が選択される。典型的に、生まれたばかりの乳児に関して、適切な容量は約０．５ｍＬ〜約１０ｍＬであり、より年長の乳児に関しては、約０．５ｍＬ〜約１５ｍＬが選択され得る。幼児に関しては、約０．５ｍＬ〜約２０ｍＬの容量が選択され得る。小児に関しては、最高で約３０ｍＬの容量が選択され得る。１０代前半及び１０代に関しては、最高で約５０ｍＬの容量が選択され得る。さらに他の実施形態において、患者は、約５ｍＬ〜約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ〜約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受け得る。投薬量は、任意の副作用に対する治療的有益性のバランスを取るように調整され、そのような投薬量は、組み換えベクターが採用される治療的適用に応じて変動し得る。
【０１０９】
上記の組み換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。ある特定の実施形態において、ヒト患者への投与に関して、ｒＡＡＶは、適切には、生理食塩水、界面活性剤、及び生理学的に適合する塩または塩の混合物を含有する水溶液中に懸濁される。適切には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨに、例えばｐＨ６〜９、またはｐＨ６．５〜７．５、ｐＨ７．０〜７．７、またはｐＨ７．２〜７．８の値域内に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８〜約７．３２であることから、髄腔内送達に関しては、この値域内のｐＨが所望され得る；一方で、静脈内送達に関しては、６．８〜約７．２のｐＨが所望され得る。しかしながら、送達の他の経路には、最も広い値域及びこれらの部分値域内の他のｐＨが選択され得る。
【０１１０】
適切な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択され得る。１つの実施形態において、例えば、中性ｐＨを有し、８４００の平均分子量を有するポロキサマー１８８としても知られるプルロニック（登録商標）Ｆ６８（ＢＡＳＦ）など、第一級ヒドロキシル基で終結する二官能性ブロック共重合体界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわちポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖によって隣接されたポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心の疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロック共重合体、ＳＯＬＵＴＯＬ  ＨＳ  １５（マクロゴール−１ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。１つの実施形態において、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、「Ｐ」（ポロキサマーに関して）、それに続く３つの数字で一般に名前を付され：最初の２つの数字×１００はポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量を与え、最後の数字×１０はポリオキシエチレン含有量パーセンテージを与える。１つの実施形態において、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高で約０．０００５％〜約０．００１％の量で存在し得る。
【０１１１】
１つの例において、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、及びその混合物のうちの１種または複数種を含む緩衝生理食塩溶液を含有し得る。適切には、髄腔内送達に関して、オスモル濃度は、脳脊髄液と適合する値域内にある（例えば、約２７５〜約２９０）；例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６−ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意で、髄腔内送達に関して、市販の希釈剤が懸濁化剤として、または別の懸濁化剤及び他の任意の賦形剤と組み合わせて用いられ得る。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ（登録商標）ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｋａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を参照されたい。他の実施形態において、製剤は、１種または複数種の透過増強剤を含有し得る。適切な透過増強剤の例には、例えばマンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡが含まれ得る。
【０１１２】
別の実施形態において、組成物は、キャリア、希釈剤、賦形剤、及び／またはアジュバントを含む。適切なキャリアは、導入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの適切なキャリアには生理食塩水が含まれ、それは多様な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）とともに製剤化され得る。他の例示的なキャリアには、無菌の生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ごま油、及び水が含まれる。バッ
ファー／キャリアは、ｒＡＡＶが注入チューブにくっつくのを阻止するがインビボでのｒＡＡＶ結合活性を妨げない構成要素を含むべきである。
【０１１３】
任意で、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及びキャリア（複数可）に加えて、防腐剤などの他の従来的な薬学的成分、または化学安定剤を含有し得る。適切な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。適切な化学安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。
【０１１４】
本発明に従った組成物は、上で規定されるものなど、薬学的に許容されるキャリアを含み得る。適切には、本明細書において記載される組成物は、薬学的に適切なキャリア中に懸濁された、及び／または注射、浸透圧ポンプ、髄腔内カテーテルを介した対象への送達のために、または別のデバイスもしくは経路による送達のために設計された適切な賦形剤と混和された、有効量の１種または複数種のＡＡＶを含む。１つの例において、組成物は髄腔内送達のために製剤化される。１つの実施形態において、髄腔内送達は、脊柱管内、例えばクモ膜下腔内への注射を包含する。１つの実施形態において、送達の経路は脳室内注射（ＩＣＶ）である。別の実施形態において、送達の経路は髄腔内−腰部（ＩＴ−Ｌ）送達である。
【０１１５】
本明細書において記載されるウイルスベクターは、それを必要としている対象（例えば、ヒト患者）にｈＴＰＰ１を送達するための、対象に機能的ＴＰＰ１を供給するための、及び／またはバッテン病を治療するための医薬を調製することにおいて用いられ得る。治療の過程は、任意で、同じウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ９ベクター）または異なるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ１０）の反復投与を伴い得る。本明細書において記載されるウイルスベクター及び非ウイルス性送達システムを用いた、さらに他の組み合わせが選択され得る。
【０１１６】
本明細書において記載されるｈＴＰＰ１  ｃＤＮＡ配列は、当技術分野において周知の技法を用いて、インビトロ及び合成で作出され得る。例えば、Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ＤＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １，７９１−７９７（２００６）によって記載されるように、長いＤＮＡ配列のＰＣＲに基づく精確な合成（ＰＡＳ）法が利用され得る。二重非対称ＰＣＲと重複伸長ＰＣＲ法とを組み合わせた方法が、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｎｇ，Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｔｏｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４；３２（７）：ｅ５９によって記載されている。Ｇｏｒｄｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  ｐｈｙｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２０１０  Ｍａｙ；８１（２）：１４７−５２．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｍａｒ  １０も参照されたく；以下のｐａｔｅｎｔｓ  ｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｅｎｅ
Ｓｅｑ．２０１２  Ａｐｒ；６（１）：１０−２１；ＵＳ８００８００５；及びＵＳ７９８５５６５も参照されたい。これらの文書のそれぞれは、参照により本明細書に組み入れられる。加えて、ＰＣＲを介してＤＮＡを作出するためのキット及びプロトコールは市販されている。これらは、限定されることなく、Ｔａｑポリメラーゼ；ＯｎｅＴａｑ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；及びＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇ２ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含めた、ポリメラーゼの使用を含む。ＤＮＡは、本明細書において記載されるｈＯＴＣ配列を含有するプラスミ
ドをトランスフェクトされた細胞からも作出され得る。キット及びプロトコールは公知であり、市販されており、限定されることなく、ＱＩＡＧＥＮプラスミドキット；Ｃｈａｒｇｅｓｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｆｉｌｔｅｒプラスミドキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；及びＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）プラスミドキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む。本明細書において有用な他の技法には、熱サイクルの必要性を排除する配列特異的等温増幅法が含まれる。熱の代わりに、これらの方法は、典型的に、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のような鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを採用して、二重鎖ＤＮＡを分離する。ＤＮＡは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである逆転写酵素（ＲＴ）の使用を介した増幅によりＲＮＡ分子からも作出され得る。ＲＴは、元のＲＮＡ鋳型に相補的であり、ｃＤＮＡと呼ばれるＤＮＡの鎖を重合させる。次いで、このｃＤＮＡは、ＰＣＲまたは上で概説される等温法によりさらに増幅され得る。特注ＤＮＡは、限定されることなく、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；ＧＥＮＥＷＩＺ（登録商標）；ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを含めた会社から、商業的にも作出され得る。
【０１１７】
「発現」という用語は、本明細書においてその最も広い意味で用いられ、ＲＮＡの産生、またはＲＮＡ及びタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特にペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は一過性であり得るまたは安定であり得る。
【０１１８】
本発明の文脈における「翻訳」という用語は、リボソームにおける工程に関し、ｍＲＮＡ鎖はアミノ酸配列の組み立てを制御して、タンパク質またはペプチドを作出する。
【０１１９】
「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つまたは複数を指すことに留意されるべきである。
【０１２０】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、排他的ではなく内包的と解釈されるべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という単語、及びその異形は、内包的ではなく排他的と解釈されるべきである。本明細書における様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語を用いて提示されているものの、他の状況下で、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という言語を用いて解釈され及び記載されることも意図される。
【０１２１】
本明細書において使用するとき、「疾患」、「障害」、及び「病状」は、対象における異常な状態を示すために互換可能に用いられる。
【０１２２】
本明細書において使用するとき、「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（〜）」という用語は、別様に指定されていない限り、与えられた参照からの１０％の変動を意味する。
【０１２３】
本明細書において用いられる「調節」という用語またはその変形は、組成物が、生物学的経路の１種または複数種の構成要素を阻害し得る能力を指す。
【０１２４】
本明細書において別様に定義されていない限り、本明細書において用いられる技術的及び科学的な用語は、当業者によって、及び本出願において用いられる用語の多くへの一般的指針を当業者に提供する公開されたテキストへの参照によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【実施例】
【０１２５】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明を限定することを意図されるわけではない。
【０１２６】
実施例１：ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクター
ヒト（ｈ）ＴＰＰ１をコードするコドン最適化されたｃＤＮＡを、最適なコドン使用法に対して特注で設計し、合成した。次いで、図１Ｆに示され及び配列番号：３として再現されるｈＴＰＰ１ｃｏ  ｃＤＮＡを、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリベータアクチンプロモーターとの間のハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって推進される導入遺伝子発現カセット内に置き、一方でこのプロモーターからの転写は、ニワトリベータアクチンイントロン（ＣＩ）の存在によって増強される（図１Ａ及び１Ｂ）。発現カセットに対するポリＡシグナルは、ウサギベータ−グロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。
【０１２７】
ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクター（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＴＰＰ１ｃｏ．ＲＢＧ）の６８４１ｂｐ産生プラスミドを、ＡＡＶ２由来ＩＴＲによって隣接された本明細書において記載されるｈＴＰＰ１ｃｏ発現カセット、ならびに選択マーカーとしてのアンピシリンに対する耐性を用いて構築した（図１Ｂ）。カナマイシンに対する耐性を有する類似のＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏ産生プラスミドも構築した。両プラスミドに由来するベクターは、本明細書において記載されるｈＴＰＰ１ｃｏ発現カセットに隣接するＡＡＶ２由来ＩＴＲを有する一本鎖ＤＮＡゲノムであった。
【０１２８】
ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターを三重トランスフェクションによって作製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び０．００１％プルロニックＦ６８（ＰＦ６８）からなる賦形剤中に製剤化した。例えば、Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈｉｒｏａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｄｉｓｓ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８を参照されたい。産生されたベクターのゲノム力価を、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により決定した。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｆｅｂ  １４を参照されたい。
【０１２９】
実施例２：ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターのインビトロ発現
ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏを、インビトロでの機能的ＴＰＰ１の発現について試験した。ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに播種した。約９０％コンフルエンスに達した時点で、細胞に５μｇのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターまたはＤＮＡなしをトランスフェクトした。７２時間後、細胞培養物の上清を収穫し、ＴＰＰ１活性／酵素アッセイのために処理した。
【０１３０】
ＴＰＰ１アッセイに関して、蛍光発生基質ＡＡＦ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ＃Ｉ−１４１５、ＤＭＳＯ中に溶解された１０ｍＭ）を、ｐＨ５．０にて５０ｍＭ酢酸ナトリウム及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有するアッセイバッファー中に５００μＭに希釈した。まず、５０μＬの試験サンプル（上清）を、黒色ウェルプレートに二つ組で載せた。５００μＭ基質の５０μＬを各ウェルに添加して、機能的ＴＰＰ１によって触媒される、基質を産物に変換する反応を開始させ、蛍光産物ＡＭＣが放出された。サンプルからの蛍光シグナルの強度を、蛍光マイクロプレートリーダーによりカイネティックモードで１０分間モニターした（発光波長を４６０ｎｍに設定し、一方で励起波長を３８０ｎｍに設定した）。７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＃Ａ１９１）を蛍光参照標準物質として利用した。放出された蛍光産物の濃度を、アッセ
イバッファー中に希釈されたＡＭＣの検量線に基づいて算出し、次いで図２にプロットした。
【０１３１】
１０分間の観察期間中、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏをトランスフェクトされた細胞培養物からの上清は、蛍光シグナルの着実でかつ急激な増加を示し（ＣＢ７．ＣＬＮ２、図２における上の線）、一方でトランスフェクトされていない細胞からの上清は、わずかな増加を示しただけであった（モック、図２における下の線）。この結果は、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターが、機能的なヒトＴＰＰ１タンパク質をインビトロで発現させ得ることを示した。
【０１３２】
実施例３：ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターのインビボ発現
本明細書において記載されるＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターのインビボ発現を査定するために、１０匹のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ野生型雄マウスに、本明細書において記載されるＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏを脳室内投与により１×１０１１ＧＣで注射した。マウスを１２時間の明／１２時間の暗サイクルに保ち、食糧／水を自由に提供した。注射なしの１０匹の野生型雄マウスが対照として働いた。注射の１４日後に、すべてのマウスを屠殺し、剖検を実施した。ＴＰＰ１の発現及び顕在的毒性を評価した。
【０１３３】
マウス脳におけるＴＰＰ１の発現を査定するために、上で記載されるマウスの脳サンプルを収穫し、ＭＰＳ（登録商標）組織溶解バッファー中でホモジナイズした。脳溶解物中のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡアッセイ）によって決定した。脳溶解物のＴＰＰ１酵素活性を実施例２に記載されるように測定し、単位／ｈ／μｇ脳タンパク質に対して正規化した。基質ありかつ脳溶解物なしでインキュベートされたアッセイバッファーが、陰性対照として働いた。結果を図３Ａにプロットした。注射なしの野生型マウスの脳溶解物（ＷＴ、図３Ａ）は、陰性対照（ブランク、図３Ａ）と比較してＴＰＰ１酵素活性を示し、一方で最も高いレベルのＴＰＰ１酵素活性は、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたマウスにおいて観察された（ＷＴ＋１ｅ１１、図３Ａ）。
【０１３４】
上で記載される試験された動物の脳脊髄液（ＣＳＦ、図３Ｂ）、血清（図３Ｃ）、及び肝臓（図３Ｄ）を用いて、ＴＰＰ１酵素活性についての並行調査を実施した。回収中に血液で汚染したＣＳＦサンプルは、測定から除外された。肝臓サンプルに関する結果を、ＢＣＡアッセイによって決定される単位／ｈ／μｇ肝臓タンパク質に対して正規化し、一方でＣＳＦ及び血清サンプルに関するものを、アッセイに用いられた試験サンプルの単位／ｈ／μｌ液体容量に対して正規化した。処理なしのマウス（ＷＴ）と比較して、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏを注射されたマウスのＴＰＰ１酵素活性の増加が、ＣＳＦ（ＷＴ＋１ｅ１１、図３Ｂ）、血清（ＷＴ＋１ｅ１１、図３Ｃ）、及び肝臓（ＷＴ＋１ｅ１１、図３Ｄ）において観察された。
【０１３５】
上記を考慮して、本明細書において記載されるＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏの注射は、インビボにおける機能的ヒトＴＰＰ１の発現をもたらした。
【０１３６】
脳、眼、肝臓、肺、腎臓、及び筋肉など、試験されたマウスの組織及び臓器も回収し、形態学及び損傷応答マーカー（ＧＦＡＰ等）の免疫染色など、毒性評価のために処理した。
【０１３７】
実施例４：ＴＰＰ１ノックアウト（ＫＯ）マウス／マウスモデルにおけるＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクター
ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏ注射の効力を査定するために、ＴＰＰ１ノックアウト（ＫＯ）マウスを獲得し、食糧／水が自由に提供される１２時間の明／１２時間の暗サイクルで維持した。２〜３ヶ月齢の雌ＴＰＰ１  ＫＯマウス（ＫＯマウス）を利用した。５匹のマウ
スに、１×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターを脳室内投与により注射し、一方で４匹のマウスに、対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射した。試験されたマウスの体重をモニターし及び記録した。脳、ＣＳＦ、血清、及び肝臓からのサンプルのＴＰＰ１酵素活性を測定した。リポフスチン自家蛍光、及びＧＦＡＰ発現によって査定されるアストロサイトーシスなどの脳組織学を評価した。ロータロッド、振戦スコアリング、及び造巣などの機能試験及び行動試験を実施した。
【０１３８】
ＣＬＮ２病のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルは科学文献において広範に記載されていないものの、Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）及び自然病歴調査からの使用可能なデータにより、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルは、標的患者集団の特徴的な特質の多くを再現する、ＣＬＮ２病の生物学的に関連した動物モデルであることが確立されている。Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルは、可溶性リソソーム酵素ＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２遺伝子のエクソン８の下流にあるスプライスドナー部位における単一ヌクレオチド変異により生じる。この変異の結果として、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスは、脳組織において検出不能なレベルのＴＰＰ１酵素活性、ならびにＣＬＮ２病を有するヒトと同様の病態生理、表現型、及び死亡率を呈する。ＣＮＳ組織における炎症及びグリア細胞活性化は、このマウスモデルおいて早くも１ヶ月齢で始まるように見え、一方でリポフスチンの蓄積は、ニューロンにおいて２ヶ月齢までに検出可能である。その後、動物は、脳、脊髄、及び運動ニューロンにおける進行性の神経変性を呈する。Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスは、持続性振戦、神経行動学的機能の減退、及び体重減少に経時的に進行する前に、２ヶ月齢で開始する間欠性振戦及び猫背の姿勢を初めに示す。発作及び死亡は早くも３．５ヶ月齢で観察され、１００％の死亡率が６ヶ月齢までに観察される（Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；非公開データ）。要約すると、Ｔｐｐ１ｍ１Ｊマウスモデルは、ＣＬＮ２病の生物学的に関連した動物モデルであり、Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウス（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）及びＴＰＰ１ヌルのダックスフント（Ａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）モデルを含めた、他の確立されたマウス及びイヌモデルに非常に類似している。
【０１３９】
イヌ及びマウスモデルを含めた、ＣＬＮ２病のいくつかの報告された動物モデルが存在する。科学文献において最もよく特徴付けされているものは、ダックスフントの集団において最初に報告されたＴＰＰ１ヌルのイヌモデルである（Ａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。イヌＴＰＰ１（ヒトＣＬＮ２のイヌオルソログ）のエクソン４における単一ヌクレオチド欠失、及び未成熟終止コドンによる予想されるフレームシフト変異の結果として、罹患したイヌは、欠損したＴＰＰ１酵素活性（脳組織において、＜１％ＷＴレベル）、全般性ミオクローヌス発作（ジアゼパムに応答性）、網膜変性及び視力喪失、進行性の神経学的徴候（嘔吐、振戦、学習性指令（ｌｅａｒｎｅｄ  ｃｏｍｍａｎｄ）への非応答性、固有受容性運動失調（ｐｒｏｐｒｉｏｃｅｐｔｉｖｅ  ａｔａｘｉａ）、脅威応答の非対称性低下、小脳性運動失調、運動機能不全、多動性、頭部のミオクローヌス、認知機能の減少）、ならびに早期死亡（約１０〜１２ヶ月齢）を含めた、ＣＬＮ２病を有するヒトの臨床的及び生化学的兆候の多くを呈する。神経細胞喪失、白質の枯渇、進行性の脳萎縮、及び特徴的な曲線様物質からなる自家蛍光性貯蔵顆粒のリソソーム蓄積を含めた、ヒトにおけるＣＬＮ２病と合致した広範な神経病理も顕著である。しかしながら、飼育制約及びこの動物の極めて限定された使用可能性は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に対する前臨床試験プログラムにおけるＴＰＰ１ヌルのイヌモデルの使用に課題をもたらす。
【０１４０】
科学文献におけるＣＬＮ２病の最もよく報告されるマウスモデルは、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ
Ｌｏｂｅｌによって開発されたＴｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウスモデルである（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。このモデルにおいて、ＣＬＮ２遺伝子は、イントロン１１にネオマイシンカセットを持つ。結果として、これらの動物の脳において検出可能なＴＰＰ１酵素活性はない。このモデルにおける病態生理学的及び神経行動学的な変化は、進行性の神経学的徴候（損なわれた運動機能、振戦、発作）、広範な神経病理（進行性のリ
ソソーム蓄積及び脳における炎症、広範囲にわたる軸索変性）、及び寿命の短縮（約６ヶ月）を含めた、ヒトにおけるＣＬＮ２病を反映する。Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウスモデルは、数々の臨床病期プログラムの前臨床試験プログラムに組み入れられている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号：ＮＣＴ００１５１２１６、ＮＣＴ０１４１４９８５、ＮＣＴ０１１６１５７６；Ｐａｓｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｐａｓｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｏｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｓｏｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。しかしながら、Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウスモデルは市販されておらず、ゆえに、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に対する前臨床試験プログラムに組み入れられるのは実現可能ではなかった。
【０１４１】
Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウスモデルに非常に類似しているＣＬＮ２病のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを通じて市販されている。このマウスモデルは、ＣＬＮ２遺伝子のエクソン８の下流にあるスプライスドナー部位における単一ヌクレオチド変異により生じる。この変異の結果として、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスは、脳組織において検出不能なレベルのＴＰＰ１酵素活性、ならびにＣＬＮ２病を有するヒトと同様の病態生理、表現型、及び死亡率を呈する（Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０１４２】
自然病歴調査を行って、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルをさらに特徴付けした。簡潔には、１ヶ月齢（ｎ＝２０）、３ヶ月齢（ｎ＝２０）、及び５．５ヶ月齢（ｎ＝２０）の時点における（実現可能なものとして、生存動物の）予定された屠殺を有して、野生型（ｎ＝４０）及びＴｐｐ１ｍ１ｊマウス（ｎ＝６０）を、疾患表現型（体重、臨床観察、生存率）の進行についてモニターして、脳組織におけるＴＰＰ１酵素活性及び組織病理（リソソーム貯蔵物質の蓄積、アストロサイトーシス）を評価した。簡潔には、ケージ側での観察により、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスの大多数において２ヶ月齢の時点で中程度の歩行異常及び／または振戦の発症が明らかになり、一方で少数の動物は、他の臨床症状の発症前に、全般性致死性発作を経験するように見えた。臨床観察をすると、運動協調性のわずかな機能障害がＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて３ヶ月齢の時点で観察された。早くも３．５ヶ月齢で始まる、痙攣大発作または全般性間代性強直性発作が、動物の大多数において観察された。発作は、ケージ変化の間、大きな騒音、及び闘争などの環境ストレスによって引き起こされる及び／または増幅されるように見えた（留意すべきは、大きな騒音などの環境刺激によって誘発される明らかな致死性驚愕発作の報告例は、Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウスモデルにおいても報告されていることである（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４））。概して、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスは、運動性の減少、漸進的な体重減少、餌を食べることができないこと、部分的次いで全般性の振戦、発作、及び早期死亡（６ヶ月齢までに１００％の死亡率；図１５）を含めた、症状の発症後に急速な悪化を示した。生存曲線の明らかな性別特異的差異は、闘争に起因した雄動物における環境刺激誘発性致死性発作のより高い発生率の結果であると仮説される。
【０１４３】
ＴＰＰ１酵素活性を、Ｓｏｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｏｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）によるプロトコールの改変版を用いて、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスの脳及び肝臓において測定した。データは、すべての時点で、すべての試験された組織においていかなる残存ＴＰＰ１活性もないことを裏付けている（図１６）。
【０１４４】
皮質、海馬、脳幹、及び小脳を１、３、及び５．５ヶ月齢の時点で収穫し、処理して、神経病理、及び疾患の進行に対するマーカーとしてのリソソーム貯蔵物質の蓄積を分析した。ＣＮＳ組織は進行性のリソソーム蓄積及び神経病理を示し、それは５．５ヶ月の時点における終末期疾患で際立った（データ示さず）。簡潔には、Ｈ＆Ｅ染色した切片に関して、脳は１ヶ月齢の時点で目立ったことはなかった（一方で、ＧＦＡＰ免疫染色をすると、軽度のアストロサイトーシスがすでに存在した）。３ヶ月齢の時点で、大型の脳幹ニュ
ーロンにおける好酸性貯蔵物質、皮質におけるグリオーシス、及び脳の多数の領域における広範囲にわたるアストロサイトーシスを含めた、神経病理の数々の測定が観察された。５．５ヶ月齢の時点で、脳全域の広範囲にわたるかつ著しいアストロサイトーシスに加えて、錐体皮質ニューロン及び脳幹大型ニューロンにおいて貯蔵病理が著しかった。貯蔵物質は、特に脳幹において、蛍光灯（染色なし）の下で容易に明らかであった。
【０１４５】
内因性の神経欠陥の他に、多くのＬＳＤ（ＣＬＮ２病を含む）に共通する別の出現因子は、ニューロンの生存に負の影響を与え得及び進行性の神経変性に寄与し得る神経炎症である。ミクログリア及びアストロサイト活性化は、ＣＮＳに影響を及ぼす多くのＬＳＤの証であり、それは、最終的なニューロン喪失が生じる領域にしばしば先行し及びそれを予測する（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ゆえに、アストロサイトーシスの客観的定量を可能にするために、スコアリングシステムをＧＦＡＰ染色に基づいて開発した（すなわち、ＧＦＡＰスコア）。ＧＦＡＰスコアを、２０×倍率視野あたりの活性化アストロサイト（抗ＧＦＡＰ抗体で染色される）の平均数として定義した。この自然病歴調査では、ＧＦＡＰスコアを、１、３、及び５．５ヶ月齢の時点で海馬及び皮質において算出した。結果は、疾患の進行と一致するＧＦＡＰの進行性の蓄積を示している（図１７）。アストロサイトーシスは、それが、貯蔵蓄積（それは３ヶ月齢で検出された）の前に観察されたことから、ニューロン貯蔵蓄積よりも神経病理のより高感度のマーカーであるように見える。リポフスチン蓄積を検出するために用いられる方法（免疫組織化学によるシグナル増幅なしの非特異的色素）の感度は、ＧＦＡＰ染色と比べて減少するが、皮質及び海馬における早くも１ヶ月齢でのアストロサイトーシスの観察は、ＣＬＮ２病におけるニューロンの死の主な原因としての炎症の仮説上の役割と合致する。要約すると、Ｔｐｐ１ｍ１Ｊマウスモデルは、ＣＬＮ２病の生物学的に関連した動物モデルであり、Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウス（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）及びＴＰＰ１ヌルのダックスフント（Ａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）動物モデルを含めた、他の確立されたマウス及びイヌモデルに非常に類似している。Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスは、臨床症状の発症時の若年齢、異常な表現型の急速な進行、及び寿命の短縮、ならびに同様の病態生理学的、生化学的、及び機能的な変化を含めた、ヒトにおけるＣＬＮ２病の特徴的な特質を呈する。Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスにおける生後１週間（及びおそらく出生前）で開始して、ＴＰＰ１酵素活性の欠損は、ニューロンの細胞質における、リポフスチン顆粒としても知られる、リソソーム消化の脂質含有残留物の蓄積に至る。ニューロンの細胞質におけるリポフスチン蓄積はＨ＆Ｅ染色によって明らかとなり、アストロサイト活性化またはアストロサイトーシスの増加（神経炎症の指標）と相関する。その後、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスは、運動機能の進行性の悪化及び歩行異常、振戦、発作、体重減少及び食べることができないこと、ならびに早期死亡を経験する。
【０１４６】
Ａ．重量
１×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターを注射された５匹のＴＰＰ１  ＫＯマウスの体重を、注射後の約１４日ごとにモニターした（図１１に示される線によってつながれた閉じた四角形）。ＰＢＳのみを注射された３匹のＴＰＰ１  ＫＯマウスが対照として働いた（図１１における線によってつながれた閉じた丸）。ゆえに、調査の間に死んだ第四のＴＰＰ１  ＫＯマウスはここから除外された。注射後４日目の時点での体重は、処理されたマウスと対照との間で同等であったが、一方で１×１０１１ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＣＬＮ２ｃｏ．ＲＢＧでの処理は、ＫＯ雌における体重増大を助長するように見えた。
【０１４７】
Ｂ．ＴＰＰ１酵素活性
ＰＢＳ（図１０、ＫＯ＋ＰＢＳ、ｎ＝４）または１×１０１１ＧＣ  ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＣＬＮ２ｃｏ．ＲＢＧ（図１０、ＫＯ＋１ｅ１１、ｎ＝５）をＩＣＶ注射されたＴＰＰ１  ＫＯ雌の血清におけるＴＰＰ１酵素活性を測定した。実施例３に記載される
、注射なしの（図１０、ＷＴ、ｎ＝２）または１×１０１１ＧＣ  ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＣＬＮ２ｃｏ．ＲＢＧ（図１０、ＷＴ＋１ｅ１１、ｎ＝２）をＩＣＶ注射された野生型雄マウスを、精確な比較のために同時に試験した。
【０１４８】
ＴＰＰ１酵素活性を血清において測定し、実施例２に記載されるアッセイに用いられた血清の容量で割ることによって、単位／μＬ／ｈに対して正規化した。ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏでの注射後、雌ＫＯマウスは、雄野生型マウスとは対照的に、血清においてＴＰＰ１酵素活性の上昇を示さなかった（図１０）。
【０１４９】
Ｃ．脳組織学
ＰＢＳまたは１×１０１１ＧＣ  ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＣＬＮ２ｃｏ．ＲＢＧでのＩＣＶ注射の６０日後、動物を安楽死させ、脳、肺、肝臓、筋肉、及び腎臓などの組織を収穫した。脳サンプルを切片化し、さらなる組織学的分析のために採取した。
【０１５０】
皮質及び視床を、アストロサイト活性化のマーカーであるＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）に対して免疫組織化学によって染色した。アストロサイトーシスとしても知られるアストロサイト活性化は、ＮＣＬにおけるニューロンの死／喪失の主な原因の１つである。ＷＴ動物は、皮質及び視床において比較的わずかなＧＦＡＰ染色を示した（示されず）。ＰＢＳ処理されたノックアウトは、皮質及び視床において劇的に増加したＧＦＡＰ染色を示した（示されず）。１×１０１１ＧＣ  ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＣＬＮ２ｃｏ．ＲＢＧで処理されたノックアウトは、皮質及び視床の両方においてＧＦＡＰ染色の改善を示すように見えた（示されず）。
【０１５１】
Ｄ．機能試験及び行動試験
ａ．造巣
ＰＢＳ（ｎ＝４）または１×１０１１ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＣＬＮ２ｃｏ．ＲＢＧ（ｎ＝５）をＩＣＶ注射されたＴＰＰ１  ＫＯ雌を集団で飼育した。動物を新しいケージに住まわせ、ケージ変化の２４時間後に、ネストレットを造巣の徴候について観察した。
【０１５２】
ＰＢＳで処理されたＫＯ雌は、それらのネストレットをビリビリに引き裂く及び巣を造る最小限の徴候を示し、それは、Ｐｅｔｅｒ  ＬｏｂｅｌモデルにおけるＲｏｎ  Ｃｒｙｓｔａｌによって記載された観察結果と合致している。１×１０１１ＧＣ  ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＣＬＮ２ｃｏ．ＲＢＧで処理されたＫＯ雌は、それらのネストレットをビリビリに引き裂き及び正常な巣を造り、マウスの正常な行動の向上を立証した。造巣試験は、定量目的のために１匹を上回る数のマウスに対して実施されている。
【０１５３】
ｂ．ロッキングロータロッド試験
ＰＢＳ（ｎ＝４）または１×１０１１ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＣＬＮ２ｃｏ．ＲＢＧ（ｎ＝５）をＩＣＶ注射されたＴＰＰ１  ＫＯ雌は、下記のプロトコールに従ってロッキングロータロッド試験を受けた。
【０１５４】
ロータロッド試験に関して、マウスを、１回の馴化及びロッキングロータロッドセッション、次いでその後３回の訓練セッション（運動学習及びロッキングロータロッドを含む）という連続４日間ロータロッドに供した。「落下する」までの潜時の増加は、学習が生じたことを示す。訓練及び試験の日の時間周期を同じに保ち、それは午前８時〜午後１２時であった。１日目に、２回の試行を一定の低速（５ｒｐｍ）で実施して、マウスを装置に馴化させた。マウスを５ｒｐｍでのロータロッド走行に１２０秒間置いた。マウスが落ちた場合、動物をロッド上に戻した。２回の試行の間に、２分間の休憩を許した。ロータロッドを５ｒｐｍでの一定速度モードに設定した。同日、ロッキングロータロッドセッシ
ョンを、馴化後すぐに開始した（その間に２分間の休憩を許した）。ロータロッドを、合計１８０秒間、１回転おきに逆回転する１０ｒｐｍに設定した。マウスが落ちた場合または１８０秒後に、試行を終結した。３分間の試行間間隔（ＩＴＩ）の後、第二の試行を実施した。もう３分間のＩＴＩの後、第三の最後の試行を実施した。ロータロッド設定を、１回の完全な回転後に逆回転する１０ｒｐｍでのロッキングモードに設定した。
【０１５５】
３ヶ月齢の動物を試験し、注射日（Ｄ０）ならびに注射後６０日目（約５ヶ月齢、Ｄ６０）に開始した。各マウスを、Ｄ０に３回及びＤ６０に３回試験した。各群に関してロータロッド上で過ごした時間として秒で測定される、落下するまでの潜時の平均を図１２Ａにプロットした。Ｄ６０に、ＰＢＳ（ＫＯ＋ＰＢＳ、図１２Ａにおける線によってつながれた閉じた丸、ｎ＝４）と、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＫＯ（ＫＯ＋１ｅ１１ＧＣ、図１２Ａにおける線によってつながれた閉じた四角形、ｎ＝４）との間で有意な差は観察されなかった。
【０１５６】
ｃ．加速式ロータロッド試験
ＰＢＳ（ｎ＝４）または１×１０１１ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＣＬＮ２ｃｏ．ＲＢＧ（ｎ＝５）をＩＣＶ注射されたＴＰＰ１  ＫＯ雌は、下記のプロトコールに従って加速式ロータロッド試験を受けた。
【０１５７】
マウスを、１回の馴化及びロッキングロータロッドセッション、次いでその後３回の訓練セッション（運動学習及び加速式ロータロッドを含む）という連続４日間ロータロッドに供した。「落下する」までの潜時の増加は、学習が生じたことを示した。訓練及び試験の日の時間周期を同じに保ち、それは午前８時〜午後１２時であった。１日目に、２回の試行を一定の低速（５ｒｐｍ）で実施して、マウスを装置に馴化させた。次いで、マウスを５ｒｐｍでのロータロッド走行に１２０秒間置いた。マウスが落ちた場合、動物をロッド上に戻した。２回の試行の間に、２分間の休憩を許した。ロータロッドを５ｒｐｍでの一定速度モードに設定した。２〜４日目に、マウスを加速式ロータロッドに供した。ロータロッドを、３００秒間にわたって５ｒｐｍから４０ｒｐｍに加速するように設定した。マウスが落ちた場合、しがみつきながら１回の受け身の完全な回転をした場合、または３００秒後に、試行を終結した。５分間のＩＴＩの後、第二の試行を実施した。もう５分間のＩＴＩの後、第三の最後の試行を実施した。このセッションの間、ロータロッドを、３００秒間の５から４０ｒｐｍへの加速式傾斜モードに設定した。
【０１５８】
３ヶ月齢の動物を試験し、注射日（Ｄ０）ならびに注射後６０日目（約５ヶ月齢、Ｄ６０）に開始した。各マウスを、Ｄ０に３回及びＤ６０に３回試験した。各群に関してロータロッド上で過ごした時間として秒で測定される、落下するまでの潜時の平均を図１２Ｂ（Ｄ０）及び１２Ｃ（Ｄ６０）にプロットした。Ｄ６０の試験の間、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＫＯにおいて２日目の訓練日に学習の向上が観察された。
【０１５９】
実施例５：用量効力
実験を実施して、様々な用量でのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏ注射の効力及び毒性を査定した。ＴＰＰ１ノックアウト（ＫＯ）マウス及び野生型マウスを、食糧／水が自由に提供される１２時間の明／１２時間の暗サイクルで維持した。１ヶ月齢のＴＰＰ１  ＫＯマウスに、３×１０９（低用量）または３×１０１１（高用量）ＧＣの、上で記載されるＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏを脳室内投与により注射した。ＴＰＰ１  ＫＯ及び野生型マウスにＰＢＳも注射し、対照として働いた。各群は、１０匹の雄及び１０匹の雌動物を含有した。試験されたマウスの生存及び体重をモニターし及び記録した。脳、ＣＳＦ、血清、及び肝臓からのサンプルのＴＰＰ１酵素活性を測定した。リポフスチン自家蛍光、及びＧＦＡＰ発現によって査定されるアストロサイトーシスなどの脳組織学を評価した。運動協調性アッセイなどの機能試験及び行動試験を実施した。さらに、抗ＴＰＰ１免疫応答も評価した。
【０１６０】
Ａ．生存曲線及び体重
生存を毎日モニターし、動物を、それらが重量の２０％を喪失した場合に安楽死させた。生存曲線を図４Ａにプロットし、一方で各試験群に関する生存週中央値を算出し、図４Ｂに列挙した。高用量で処理された動物の死亡は、１匹の雌を例外として、観察期間中に検出されなかった。低用量で処理されたすべての動物及び未処理ＫＯは死んで発見された。雄ＫＯマウスの生存週中央値は１５であり、一方で雌ＫＯマウスは、２４週の生存時間中央値を示した。３×１０９ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＫＯマウスにおいて、雄の生存期間中央値は１６週であり、一方で雌の１匹は１９週であった（図４Ｂ）。
【０１６１】
高用量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与された動物は、野生型対照と比較して運動学習（小脳機能）の正常化、ならびに劇的に増加した生存率（注射後３０週の時点で８５％の生存率対対照動物における０％の生存率）を呈した（図４Ａ’）。低用量（７．５×１０９ＧＣ／ｇ脳質量）のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与されたＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて、生存率または生物活性の他の測定において有益性があるようには見えず、低用量及び対照動物の両方において、約１７週間の観察される生存期間中央値を有した。
【０１６２】
上で記載されるすべての試験された動物の体重を図５にプロットした。高用量で処理された動物は、ＫＯと比較して中程度の体重減少を示した。
【０１６３】
Ｂ．運動協調性アッセイ
ＮＣＬはＣＮＳ疾患であり、ニューロンの死は運動機能に影響を及ぼす。疾患表現型を評価するために、マウスを、実施例４に記載されるようにロータロッドで運動協調性について試験した。マウスを、１ヶ月齢から３週間ごとにこのプロトコールで訓練した。ロータロッド上で過ごした時間で秒で測定される落下するまでの潜時を記録した。療法の９０日後に開始する試験の３日目における試行３の結果を図６にプロットした。未処理と高用量で処理されたＫＯとの間に有意な差が観察され、一方で、ＷＴと高用量で処理されたＫＯとの間で同じ身体能力が観察された。これらの結果は、高用量療法が、ＴＰＰ１  ＫＯマウスにおける疾患表現型を補うことを立証した。
【０１６４】
Ｃ．抗ＴＰＰ１免疫応答
上で記載されるＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏの毒性及び酵素補正を評価するために、ＴＰＰ１に対する免疫応答を評価した。ＩＣＶ注射後７０日の時点で、本実施例において上で記載される３．３ヶ月齢のマウスから血を抜き取った。産生された血清を抗ＴＰＰ１抗体の存在について試験して、ＴＰＰ１タンパク質に対する免疫応答を評価した。
【０１６５】
免疫応答を、下で記載されるようにＥＬＩＳＡによって測定した。ｐＨ７．５のＴＰＰ１タンパク質を、常用ＰＢＳ中に２．５μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするために、５０μＬの希釈されたＴＰＰ１を各ウェルに載せ、蓋をしたプレートを低温室で一晩保った。翌日、バッファーＢによる５回の洗浄をプレート洗浄器で実施した。２００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ中に希釈された２％（１００ｍｌあたり２ｇ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を各ウェルに添加し、室温で最低でも１時間インキュベートして、プレートの非特異的結合部位をブロッキングした。プレートを反転させかつしっかりと振とうすることによって、ブロッキング溶液を除去した。回収した血清を常用ＰＢＳ中に千倍希釈し、各ウェルに５０μｌのそのような希釈された血清を載せた。ＰＢＳのみのウェルが陰性対照として働き、一方で陽性サンプルを１／１０、１／３０、１／９０、１／２７０、１／８１０、１／２４３０、及び１／７２９０で希釈して、検量線を作出した。試験された各血清に対して二つ組または三つ組を実施した。室
温で２時間のインキュベーション後、バッファーＢでの５回の洗浄をプレート洗浄器で実施した。
【０１６６】
抗ＴＰＰ１  ＩｇＧを試験するために、ＨＲＰ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体である一次抗体を、ブロッキングバッファー中に１：１０，０００で希釈した。１００μＬの調製された一次抗体を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。バッファーＢでの５回の洗浄をプレート洗浄器で実施した。１５０μｌ  ＨＲＰ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＴＭＢ）を各ウェルに載せた。検出可能な色を発色させるために、暗所で１〜３０分間インキュベートさせた。必要であれば優しくピペッティングしながら、５０μｌ停止バッファー（硫酸）を各ウェルに添加した。４５０ｎｍにおけるシグナルを、プレートリーダーを用いて測定した。
【０１６７】
抗ＴＰＰ１  ＩｇＭを検出するために、上で記載される同じプロトコールを、以下の改変を有して実施した。一次抗体はヤギ抗マウスＩｇＭであった。一次抗体とのインキュベーションの後、バッファーＢでの５回の洗浄を実施し、その後に、ブロッキングバッファー中に１：１０，０００で希釈された１００μｌ  ＨＲＰ抱合抗ヤギ二次抗体との３０分間のインキュベーションが続いた。
【０１６８】
低用量で処理された雄及び雌ＫＯマウス、ならびに高用量で処理された雌マウスの両方とも、ＴＰＰ１に対して強い免疫応答を示し（図７Ａ）、この免疫応答が治療用量とは無関係であることを立証した。高用量のＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターで処理された雄ＫＯは、中程度の免疫応答を示した。同じ血清における付随的ＴＰＰ１酵素活性を、実施例２及び４に記載されるように測定し、図７Ｂ及び図２０にプロットした。酵素活性は、抗ＴＰＰ１抗体の存在と逆相関した。それにもかかわらず、実施例５に示されるように、雄及び雌の高用量の間で治療効力の差は観察されず、抗ＴＰＰ１免疫応答の負の影響がないことを示唆した。
【０１６９】
Ｄ．ＴＰＰ１酵素活性
種々の臓器におけるＴＰＰ１酵素活性を評価するために、ならびに罹患組織（大部分は脳）における酵素補正を査定するために、ＴＰＰ１酵素活性を、実施例２及び４に記載されるように測定した。実施例４に記載されるように、皮質、ならびに側脳室（ＬＶ）、海馬、及び視床の一部を含む区画（図９においてＬＶ区画と名前を付されている）などの脳組織を収穫し、切開し、及び処理した。ＴＰＰ１活性は、３ヶ月齢の雄及び雌ＴＰＰ１  ＫＯマウスにおいて観察されず、ゆえに、ＫＯにおいて残存ＴＰＰ１が完全にないことを示すベースラインとして用いられ、一方で１ヶ月齢の野生型マウスは、正常でかつ検出可能なレベルのＴＰＰ１活性を示した（図８）。野生型マウスならびにＰＢＳのみを注射されたＫＯにおいて、小脳及び肝臓を含めた他の臓器において、同様の結果が観察された（図９）。比較のために、上で記載される３×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＴＰＰ１酵素活性も測定し、図９にプロットした。試験された３つの異なる臓器において（ＬＶ区画、小脳、及び肝臓）、高用量ベクターで処理されたＫＯは、野生型よりも多くのＴＰＰ１活性を提供し、一方でＰＢＳを注射されたＫＯのＴＰＰ１活性レベルは低いままであり、ゆえに図９に示されるすべてのサンプルから差し引かれ、ｈＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＫＯマウスにおける細胞内酵素補正の成功及び健常な表現型が立証された。
【０１７０】
高用量動物において、ＴＰＰ１酵素活性（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２によってコードされる酵素）は、注射後３０週の時点で、大脳、小脳、及び肝臓において超生理学的なレベルまで増加した（図２０）。
【０１７１】
Ｅ．組織学的分析
脳におけるＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏのＩＣＶ注射の生物活性及び効力を査定するために、試験されたマウスの脳サンプルを、活性化アストロサイト／アストロサイトーシスのマーカーであるＧＦＡＰに対して免疫組織化学により染色した。画像は示されず。１ヶ月齢の野生型マウスの皮質及び視床の両方ともＧＦＡＰを示さなかったが、ＫＯ動物の対応するサンプルは、１ヶ月齢の時点でアストロサイトーシスを有することが観察され、ＴＰＰ１変異に起因したニューロンにおける脂質の蓄積によってアストロサイトが活性化され、そのようなアストロサイトーシスの進行は１ヶ月齢またはそれよりも早くに開始することが示された。ＫＯマウスにおいて、成長すると、アストロサイトーシスは増加し続けた。３ヶ月齢の時点で、さらに上昇したレベルのＧＦＡＰが、ＫＯマウスにおける皮質及び視床の両方において検出された。図４に示される生存曲線において、ＫＯ動物の死亡は３．５ヶ月齢で開始することが観察され、それは、ＮＣＬ患者及び動物モデルの脳の種々の部分において観察される活性化アストロサイトとニューロンの死との間の報告されるつながりと合致している。ゆえに、このニューロン喪失が、ＫＯにおいて観察される振戦及び運動協調性異常という疾患表現型を付与した。この結論は、実施例４に記載されるようにＰＢＳを注射され及び死んで発見された３．５ヶ月齢のＫＯマウスの側脳室に近接した海馬区画におけるＧＦＡＰ免疫染色により観察された大規模なアストロサイトーシスによってさらに支持された。
【０１７２】
さらに、ＧＦＡＰ染色を、上で記載される１×１０１１ＧＣのＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたＫＯ動物、ならびにＰＢＳを注射された野生型及びＫＯマウスの脳サンプルを用いて、４．５ヶ月齢の時点でのみ実施した。ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏで処理されたマウスの脳は、野生型と同様の観察結果を有してアストロサイトーシスがなく、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏ療法が、活性化アストロサイトを制御するだけでなく積極的に抑制もすることを示した。アストロサイトーシスの定量を実施する。高用量の動物において、脳ニューロンは、注射後３０週の時点で、アストロサイトーシス（神経炎症のマーカー）及び基質のリソソーム蓄積における補正を呈した（図９）。
【０１７３】
上記を考慮すると、ＴＰＰ１  ＫＯマウスの酵素活性及び生理学的表現型は、ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＴＰＰ１ｃｏ．ＲＢＧの投与により回復することに成功した。
【０１７４】
実施例６：製造
簡潔には、マスターセルバンク（ＭＣＢ）からのＨＥＫ２９３細胞に３種のプラスミドをトランスフェクトして、パッケージされたベクターゲノムを産生する：ＣＬＮ２発現カセットを含有するプラスミド、ならびにＡＡＶ９カプシドタンパク質及び複製エレメントをコードする２種のヘルパープラスミド。ウイルスベクター産物を含有する細胞培養上清を収穫し、浄化し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮し、その後にアフィニティー及びアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーが続く。ＡＥＸ画分をプールし、ＴＦＦを繰り返して、精製された原薬（ｂｕｌｋ  ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）（ＢＤＳ）を産生し、最終製剤バッファーで濃度を調整し（希釈またはＴＦＦによる濃縮）、その後に滅菌濾過及びバイアル内への充填が続くことによって、そこから薬物製品が産生される。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２  ＢＤＳ及び最終薬物製品（ＦＤＰ）の製造工程は、安全性、同一性、品質、純度、ならびにＢＤＳ及びＦＤＰの効能を確保するための現行適正製造基準（ｃＧＭＰ）を用いて、受託製造機関（複数可）（ＣＭＯ）で実施される。
【０１７５】
細胞培養及び収穫
細胞培養及び収穫製造工程は、４つの主な製造ステップ：細胞の播種及び拡張、一過性のトランスフェクション、ベクター収穫、ならびにベクター浄化、を含む。これらの工程ステップは、概略工程フロー図に描かれている。
【０１７６】
細胞の播種及び拡張：要件を満たしたＨＥＫ２９３細胞株を産生工程に用いる。ＭＣＢはＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃで産生され、十分に特徴付けされた。ベクター産生に用いられる細胞培養を、１本の融解したＭＣＢバイアルから開始し、拡張する。Ｔフラスコ及び１０層の細胞培養チャンバー（ＣＳ−１０）を用いて、細胞を拡張しておよそ１．４×１０１０個細胞の総生細胞数を達成する。次第により大きな表面積（１×Ｔ−７５、４×Ｔ−２２５、２×ＣＳ−１０、及び１４×ＣＳ−１０）を用いて、培養を４段階で拡張する。第一段階において、細胞をコンフルエントになるまで３〜４日間成長させ、次いで次の段階に継代する。後続の段階において、細胞を４〜５日間成長させ、次いで継代する。この拡張は、ＢＤＳロットあたりのベクター産生に対して最高で５０個の３６層の細胞培養容器（ＨＳ−３６）に播種するのに十分な細胞質量が作出されるのを可能にする。拡張工程を通じて、１０％ガンマ照射したＵＳから調達されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補給したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）から構成される培地中で細胞を培養した。利用された細胞は足場依存性であり、細胞解離は、動物性産物不含の細胞解離試薬であるＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを用いて遂行される。細胞播種は、無菌の単回使用の使い捨てバイオプロセス用バッグ及びチューブセットを用いて遂行される。細胞を５％（±０．５％）ＣＯ２大気中３７℃（±２℃）で維持する。バイアル融解から５０個のＨＳ−３６の接種までの総処理時間は、１５〜２０日間である。
【０１７７】
一過性のトランスフェクション：成長（ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ）の４日後、ＨＳ−３６細胞培養培地を新鮮な血清不含ＤＭＥＭ培地で置き換え、最適化されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基づくトランスフェクション法を用いて３種の産生プラスミドをトランスフェクトする。十分なＤＮＡプラスミドトランスフェクション複合体を、生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内で調製して、最高で５０個のＨＳ−３６（ＢＤＳバッチあたり）にトランスフェクトする。まず、７．９ｍｇのｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＣＬＮ２．ＲＢＧ．ＫａｎＲベクターゲノムプラスミド、１５８ｍｇのｐＡｄＤｅｌｔａＦ６、７９ｍｇのｐＡＡＶ２９ＫａｎＲＧＸＲｅｐ２  ＡＡＶプラスミド、及びＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＳＡ）を含有する、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を調製する。混合した後、溶液を室温で２５分間休ませ、次いで血清不含培地に添加して反応をクエンチングし、次いでＨＳ−３６に添加する。トランスフェクション混合物をＨＳ−３６の全３６層間で均等化し、細胞を５％（±０．５％）ＣＯ２大気中３７℃（±２℃）で５日間インキュベートする。
【０１７８】
ベクター収穫：上清を使い捨てバイオプロセス用バッグに無菌的にポンプで送り込むことによって、細胞培養上清をＨＳ−３６から収穫する。回収後、収穫物質にＭｇＣｌ２を２ｍＭの最終濃度まで補給し（ベンゾナーゼの補因子）、ベンゾナーゼヌクレアーゼを≧２５単位／ｍＬの最終濃度まで添加する。収穫物質（使い捨てバイオプロセス用バッグ中）を混合し、３７℃で２時間インキュベートして、トランスフェクション手順の結果として収穫物中に存在する残存する細胞ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡの酵素消化に十分な時間を提供する。このステップを実施して、最終的なベクター薬物製品における残存ＤＮＡの量を最小限に抑える。インキュベーション期間の後、ＮａＣｌを５００ｍＭの最終濃度まで添加して消化を終わらせ、濾過及び下流のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）の間の産物の回収を助ける。
【０１７９】
ベクター浄化：ペリスタルティックポンプによって推進される無菌の密閉式チューブ及びバッグセットとして、直列に接続されたＳａｒｔｏｇｕａｒｄポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）カプセルフィルター（１．２／０．２μｍ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ
Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いて、ベンゾナーゼ処理された収穫物質から細胞及び細胞残屑を除去する。バイオバーデン低減濾過は、フィルタートレーンの終端で、上流の産生工程の間に潜在的に導入される任意のバイオバーデンが下流の精製前に低減されることを確保する。
【０１８０】
ベクター精製工程
精製工程は、下で詳細に記載される４つの主な製造ステップ：ＴＦＦによる濃縮及びバッファー交換、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、ならびにＴＦＦによる濃縮及びバッファー交換、を含む。
【０１８１】
タンジェンシャルフロー濾過による濃縮及びバッファー交換：浄化産物の容量低下（１０倍）は、特注の無菌の密閉式バイオプロセス用チューブ、バッグ、及び膜セットを用いたＴＦＦによって達成される。ＴＦＦの原理は、適切な多孔度（１００ｋＤａ）の膜に平行して、圧力下で溶液を流すことである。圧力差により、より小さなサイズの分子は膜を通り抜けかつ廃棄流に効果的に入り、一方で膜の細孔よりも大きな分子は保持される。溶液を再循環させることによって、平行した流れは膜表面を一掃し、膜の細孔が詰まるのを阻止する。適当な膜の細孔サイズ及び表面積を選定することによって、液体サンプルは容量を急速に低下させ得、一方で所望の分子は保持され及び濃縮される。ＴＦＦ適用における透析濾過は、液体が膜を通過し及び廃棄流に移るのと同じ速度で再循環サンプルに新鮮なバッファーを添加することを伴う。透析濾過の容量が増加するにつれて、増加量の小分子が、再循環サンプルから除去される。これは、浄化産物のわずかな精製をもたらし、後続のアフィニティーカラムクロマトグラフィーステップと適合するバッファー交換も達成する。したがって、１００ｋＤａのＰＥＳ膜を濃縮に用い、次いでそれを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５から構成されるバッファーの≧３．３容量で透析濾過する。透析濾過産物を、次いで２〜８℃で≧１６時間保管し、次いで１．２／０．２μｍ深度フィルターカプセルでさらに浄化して、任意の沈殿物質を除去する。収穫、浄化、及び濃縮ステップのための処理時間はおよそ２日間である。
【０１８２】
アフィニティークロマトグラフィー：透析濾過産物を、その後、ＡＡＶ９血清型を効率的に捕捉するＰＯＲＯＳ（登録商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＡＡＶ９アフィニティーマトリックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用する。これらのイオン条件下で、残存する細胞ＤＮＡ及びタンパク質の相当なパーセンテージがカラムを素通りし、一方でＡＡＶ９粒子は効率的に捕捉される。適用後、カラムを２種のバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて洗浄して、さらなる供給不純物（ｆｅｅｄ
ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）を除去し、その後に低ｐＨの段階溶出（４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５）が続く。溶出物を、溶出物の１０％容量での中和バッファー（２００ｍＭビストリスプロパン、０．０１％プルロニックＦ６８、ｐＨ１０．２）の添加によって直ちに中和する。アフィニティークロマトグラフィーステップのための処理時間は１日未満である。さらなる処理の前に、工程中間物は２〜８℃で一晩保たれ得る。
【０１８３】
アニオン交換クロマトグラフィー：空のＡＡＶ粒子を含めた工程間不純物のさらなる低下を達成するために、アニオン交換クロマトグラフィーステップが採用される。このステップに関しては、ＰＯＲＯＳ−ＡＡＶ９溶出プールを５０倍希釈して（２０ｍＭビストリスプロパン、０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８、ｐＨ１０．２）、イオン強度を低下させて、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＱＡモノリスマトリックス（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）への結合を可能にする。低塩での洗浄後（２０ｍＭビストリスプロパン、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ１０．２）、ベクター産物を、６０カラム容量（ＣＶ）のＮａＣｌ線形塩勾配（２０ｍＭビストリスプロパン、０．００１％プルロニックＦ６８、ｐＨ１０．２中、１０〜１９０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて溶出する。この浅い塩勾配は、ベクターゲノムを含有する粒子（完全粒子）からベクターゲノムを含まないカプシド粒子（空の粒子）を分離し、完全カプシドに富んだ調製物をもたらす。画分を、３．７％容量の１Ｍビストリス、０．２７％プルロニックＦ６８、ｐＨ６．３を含有するバッグ中に回収し
て、バッグへの非特異的結合及び高ｐＨへの曝露の長さをそれぞれ最小限に抑える。適当なピーク画分を回収し及びプールする。アニオン交換クロマトグラフィーステップのための処理時間は１日未満である。さらなる処理の前に、工程中間物は２〜８℃で一晩保たれ得る。
【０１８４】
中空糸タンジェンシャルフロー濾過による濃縮及びバッファー交換：プールされたアニオン交換中間物を、ＴＦＦを用いることによって濃縮し及びバッファー交換する。このステップでは、１００ｋＤａ膜の中空糸ＴＦＦ膜が用いられる。ステップの間、産物は、決定された標的濃度に至る。この濃縮ステップの後、４容量の製剤バッファーでの透析濾過によってバッファー交換を達成する。０．４５／０．２２μｍ濾過の後、サンプルをＢＤＳ試験のために取り出す。濃縮及びバッファー交換ステップのための処理時間は１日未満である。
【０１８５】
充填及び保管：濾過及びサンプリングの後、ＢＤＳをポリプロピレンボトルに充填し、ＦＤＰ処理のための放出まで、隔離場所で≦−６０℃で凍結して保管する。
【表１】
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【０１８６】
融解及びプール：ＢＤＳの凍結したアリコートを室温で融解する。複数のＢＤＳバッチをプールし得、旋回により混合し得る。融解したＢＤＳは、２〜８℃で一晩保たれ得る。
【０１８７】
ＴＦＦまたは希釈による任意の濃縮：ＢＤＳを、中空糸ＴＦＦを用いて濃縮してまたは製剤バッファーで希釈して、所望の濃度（ＧＣ／ｍＬで）を達成し得る。任意の濃縮ステップは、１００ｋＤａ中空糸ＴＦＦ膜によるＴＦＦを用いて実施され、ＢＤＳ工程における中空糸ＴＦＦ濃縮ステップと同一である。濃縮されたＤＰ中間物は、２〜８℃で一晩保たれ得る。
【０１８８】
滅菌濾過：ＤＰ中間物のバイオバーデンサンプルを、濾過の直前に採取する。あらかじめ滅菌された部品を用いて、ＤＰを０．２２μｍ濾過する。０．２２μｍフィルター（Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ  ＩＩを備えたＰａｌｌ  ｍｉｎｉＫｌｅｅｎｐａｋ  ２０）を製剤バッファーで洗い流し、次いで水気を切る。次いで、ＤＰ中間物を濾過し、フィルターメーカーによって使用前完全性試験されているフィルターを、ＤＰをバイアル内に充填する前に、使用後完全性試験する。フィルターが使用後完全性試験に落第した場合、濾過された中間物は、異なるフィルターを用いて再濾過され得る。
【０１８９】
充填、保管、及び輸送：濾過されたＤＰを、ペリスタルティックポンプを用いてＣＺバイアル内に充填する。初回バイアルは、試験のために最適された容量で充填される（例えば、１０ｍＬバイアル中１ｍＬ）。これらは、無菌性、内毒素、及び他の放出または安定性試験に用いられる。充填容量は、次のセットのバイアルに対して増加し（例えば、１０
ｍＬバイアル中５ｍＬ）、それが臨床において用いられる。最終セットのバイアルは、再度、より低い容量で充填され（例えば、１０ｍＬバイアル中１ｍＬ）、無菌性、内毒素、及び他の放出または安定性試験に用いられる。あらかじめ規定された間隔で、重量チェックを実施する。バイアルに蓋をし及び圧着し、次いで１００％目視点検し、ラベルし、箱の中にパッケージし、及び≦−６０℃で凍結する。
【０１９０】
臨床現場への配送に関しては、箱の中に事前にパッケージされたＦＤＰバイアルを、温度ロガーを備えたあらかじめ認可を受けた段ボール配送箱の中に入れる。箱にドライアイスを詰めて、≦−６０℃の配送温度を維持する。配送物が受領されると、温度ロガーを読み取って、配送中に温度逸脱がないことを確認する。
【０１９１】
実施例７：将来的調査
提案される調査では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、２×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量〜最大実現可能用量（ＭＦＤ）の７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量（解剖学的制約に起因して）の用量レベル域で、４週齢のマウスにＩＣＶ注射により投与する。動物の半分を、対照動物において予想される神経病理及び死亡と一致する注射後６０日の時点で屠殺し、ＴＰＰ１酵素活性、リソソーム貯蔵物質の蓄積及び貯蔵病理、ならびにアストロサイトーシスを含めた生物活性について評価する。動物の残りを、疾患表現型（臨床観察時の振戦及び／または歩行異常によって規定される）の発症までの時間について評価し、対照動物において１００％の死亡率が予想される時点を超える注射後最高で２１０日間の長期生存について追跡する。
【０１９２】
パイロット調査において行われたように、提案される調査では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２をＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにＩＣＶ注射により投与する、なぜなら、ｉ）解剖学的制約及び動物福祉への懸念に起因して、ＩＣ注射はＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて実現可能ではなく；ならびにｉｉ）マウスにおけるＩＣＶ注射、ならびにイヌ、ブタ、及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＩＣ注射の後の、ＡＡＶ９ベクターに基づく産物の生体内分布（ＢＤ）及び導入遺伝子発現プロファイルは同等であることが示されている（Ｈａｕｒｉｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；ＭｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；非公開データ）（第３．４．２．５節を参照されたい）ためである。重要なことには、これらの類似点には、ベクターＢＤの主要標的組織ならびにそれに続くＣＮＳ（脳、脊髄）及び末梢組織（肝臓、脾臓）における導入遺伝子発現が含まれ、それにより、標的及び非標的組織の両方における導入遺伝子の発現／過剰発現についての査定が可能となる。ゆえに、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２のＩＣＶ注射後のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて作出される薬理学データは、標的患者集団における臨床シナリオ及び計画されたＩＣ  ＲＯＡに関連している。
【０１９３】
実施例８：前臨床調査
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に対する提案される前臨床試験プログラムは、ＣＬＮ２病のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルにおいて行われるハイブリッド薬理学／毒物学調査を含む。複数の用量レベルでＩＣＶ注射によりＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与されたマウスを、以下のように複数の時点で安全性について評価する。
・臨床観察（ケージ側、毎日）
・体重（週１回）
・臨床病理（ｄ６０、ｄ９０、ｄ２１０）
・血清における液性免疫応答（血清中の抗ｈＴＰＰ１抗体、ＥＬＩＳＡ）（ベースライン、ｄ１４、ｄ６０、ｄ２１０）
・臓器重量（ｄ６０、ｄ９０、ｄ２１０）
・肉眼的病理及び組織の包括的リストの組織病理（ｄ６０、ｄ９０、ｄ２１０）
【０１９４】
一般的に、ハイブリッド調査設計は、臨床背景における製品の安全性及び生物活性に影響を与え得る、標的患者集団の局所微小環境及び病態生理学的状態を再現する疾患背景における試験品目の安全性についての評価を容易にする。ゆえに、提案されるハイブリッド薬理学／毒物学調査から作出される安全性／毒物学データは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の安全性プロファイルに関する重要な情報を提供すると期待される。機関指導勧告によると、「生物活性及び安全性についての査定に選択される動物種は、臨床試験設計を導くデータを作出するために、ヒトにおいて予想されるものと同様の、治験用［製品］に対する生物学的応答を示すべきである」。それゆえ、ＣＬＮ２病のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルの選択は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の安全性についての評価に適当である。
【０１９５】
罹患したＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおける基礎病理及び早期死亡は、潜在的な試験品目関連効果をマスクし得る、ならびに環境刺激誘発性致死性発作に対するＴｐｐ１ｍ１ｊマウスの感受性に起因して、一部の安全性査定（連続出血など）を実施し得る能力は限定され得るという懸念を含めて、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて安全性を査定する上でのいくつかの潜在的な課題が存在する。これらの懸念が経験によって証明され、かつＴｐｐ１ｍ１ｊマウス安全性データが規制要件を満たすのに十分であると見なされない場合、付加的なＧＬＰ準拠の毒物学調査がＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて行われる。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に伴う潜在的毒性を検出するのに適当であると見なされる、なぜなら、ｉ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、薬理学査定において用いられるＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルのバックグラウンド系統であり；ｉｉ）マウスにおけるＩＣＶ注射及び大型動物におけるＩＣ注射の後の、ＡＡＶ９ベクターに基づく産物の生体内分布及び導入遺伝子発現プロファイルの同等性が確立されており；ｉｉｉ）健常マウスにおいて安全性査定を実施する実現可能性は、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスなどにおける動物取扱懸念または環境刺激誘発性致死性発作に対する感受性によって限定されず；ならびにｉｖ）健常マウスにおけるＧＬＰ準拠の安全性／毒物学調査の実行は、実現可能であり、十分に確立されており、かつ統計学的に堅牢であるためである。
【０１９６】
この潜在的なＧＬＰ安全性／毒物学調査では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、７．５×１０１０、２×１０１１、及びＭＦＤの７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量レベルで、４週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスにＩＣＶ注射により投与し、マウスを複数の時点で安全性／毒性について評価する。Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスにおけるＡＡＶ９ベクター生体内分布の速度論及び疾患表現型の進行と一致するように、計画された予定された屠殺（注射後３０日及び９０日）及び調査継続期間（注射後９０日間）を選択した。安全性査定は、臨床観察、体重、臨床病理、免疫原性、肉眼的病理、及び組織の包括的リストの組織病理を含む。
【０１９７】
イヌ及びマウスモデルを含めた、ＣＬＮ２病のいくつかの報告された動物モデルが存在する。科学文献において最もよく特徴付けされているものは、ダックスフントの集団において最初に報告されたＴＰＰ１ヌルのイヌモデル（Ａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）であるが、とはいえ、この動物モデルの限定された使用可能性及び飼育制約は、前臨床試験におけるその使用の実現可能性を厳しく制限する。科学文献におけるＣＬＮ２病の最もよく報告されるマウスモデルは、Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウスモデル（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）であるが、とはいえ、このマウスモデルは現在市販されておらず、ゆえに前臨床試験における使用に関して実現可能ではない。Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウス及びＴＰＰ１ヌルのイヌモデルに非常に類似している、ＣＬＮ２病のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルは市販されており、ヒトにおけるＣＬＮ２病の特徴的な特質を反復する。このＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルは、ＣＬＮ２遺伝子のエクソン８の下流にあるスプライスドナー部位における単一ヌクレオチド変異により生じる。この変異の結果として、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスは、脳組織において検出不能なレベルのＴＰＰ１酵素活性、ならびにＣＬＮ２病を有するヒトと同様の病態生理、表現型、及び死亡率を呈する（Ｋａｒｓｔ  ｅ
ｔ  ａｌ．，２０１６；自然病歴調査からの非公開データ）。
【０１９８】
ＣＬＮ２病の生物学的に関連したマウスモデル（Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウス）において行われた完了したパイロット調査は、ＣＬＮ２病の治療のためのコドン最適化されたＣＬＮ２導入遺伝子のＡＡＶ９媒介性送達の科学的論拠への予備的支持を提供する。完了したパイロット調査では、４週齢のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスに、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を７．５×１０９ＧＣ／ｇ脳質量（低用量）または７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量（高用量）のいずれかの用量レベルでＩＣＶ注射により投与し、動物を、注射後３０週間、疾患の進行及び生物活性についてモニターした。高用量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与された動物は、野生型対照と比較して運動学習（小脳機能）の正常化、ならびに劇的に増加した生存率（注射後３０週の時点で８５％の生存率対対照動物における０％の生存率）を呈した。すべての生存動物を、ＴＰＰ１酵素活性及び組織病理についての評価のために、注射後３０日の時点で屠殺した。高用量動物において、ＴＰＰ１酵素活性（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２によってコードされる酵素）は、大脳、小脳、及び肝臓において超生理学的なレベルまで増加し、脳ニューロンは、アストロサイトーシス及び基質のリソソーム蓄積における補正を呈した。低用量（７．５×１０９ＧＣ／ｇ脳質量）のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与されたＴｐｐ１ｍ１ｊにおいて、生存率または生物活性の他の測定において有益性があるようには見えず、低用量及び対照動物の両方において、約１７週間の観察される生存期間中央値を有した。
【０１９９】
パイロット調査では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、計画された臨床的ＩＣ投与経路（ＲＯＡ）とは異なるＩＣＶ注射によりＴｐｐ１ｍ１ｊマウスに投与した（ならびに、最も信頼できる薬理学及び安全性／毒物学調査のために計画される）。しかしながら、解剖学的制約及び動物福祉への懸念に起因して、ＩＣ注射はＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて実現可能ではない。ＩＣ投与は、臨床においてＩＣＶに勝るいくつかの利点を付与するものの、複数の動物調査からのデータは、マウスにおけるＩＣＶ注射、ならびにイヌ、ブタ、及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＩＣ注射の後の、ＡＡＶ９ベクターに基づく産物の同様の生体内分布（ＢＤ）及び導入遺伝子発現プロファイルを示している（Ｈａｕｒｉｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；ＭｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；非公開データ）。ゆえに、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２のＩＣＶ注射後のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて作出される薬理学データは、標的患者集団における臨床シナリオ及び計画されたＩＣ  ＲＯＡに関連している。
【０２００】
パイロット調査から作出されたデータ、ならびに類似のＡＡＶ９ベクターに基づく産物の前臨床試験プログラムからのプラットフォームデータを用いて、ＣＬＮ２病の生物学的に関連したマウスモデルであるＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおける、計画されたＩＮＤにより可能となるハイブリッド薬理学／毒物学調査の設計に情報を与えた。提案される調査では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、２×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量〜ＭＦＤの７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量のベクター用量レベル域で、４週齢のマウスにＩＣＶ注射により投与する。動物を、複数の時点で生物活性及び／または安全性／毒性の数々の測定について評価する。この調査から作出されるデータを用いて、標的患者集団におけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の投与についての安全でかつ効力のある開始臨床用量レベルを選択し、及び望ましい有益性：危険性プロファイルを支持する。
【０２０１】
動物取扱及び福祉への懸念（すなわち、連続出血など、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスおいて一部の安全性査定を行う上での潜在的な課題）に起因して、計画されたハイブリッド薬理学／毒物学調査から十分な安全性データが獲得され得ない事象において、データは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＧＬＰ準拠の安全性／毒物学調査におけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２のＩＣＶ投与後に作出される付加的な安全性データによって補完され得る。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に伴う潜在的毒性を検出するのに適
当であると見なされる、なぜなら、ｉ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、薬理学査定において用いられるＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルのバックグラウンド系統であり；ｉｉ）マウスにおけるＩＣＶ注射及び大型動物におけるＩＣ注射の後の、ＡＡＶ９ベクターに基づく産物の生体内分布及び導入遺伝子発現プロファイルの同等性が確立されており；ｉｉｉ）健常マウスにおいて安全性査定（例えば、連続出血）を実施する実現可能性は、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスなどにおける動物取扱懸念または環境刺激誘発性致死性発作に対する感受性によって限定されず；ならびにｉｖ）健常マウスにおけるＧＬＰ準拠の安全性／毒物学調査の実行は、実現可能であり、十分に確立されており、かつ統計学的に堅牢であるためである。
【０２０２】
この潜在的なＧＬＰ安全性／毒物学調査では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、７．５×１０１０、２×１０１１、またはＭＦＤの７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量レベルで、４週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスにＩＣＶ注射により投与し、マウスを複数の時点で安全性／毒性について評価する。Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスにおけるＡＡＶ９ベクター生体内分布の速度論及び疾患表現型の進行と一致するように、計画された予定された屠殺（注射後３０日及び９０日の時点）及び調査継続期間（注射後９０日間）を選択した。安全性査定は、臨床観察、体重、臨床病理、免疫原性、肉眼的病理、及び組織の包括的リストの組織病理を含む。
【０２０３】
概念実証（ＰＯＣ）及び薬理学
ＣＬＮ２病を治療するための、ＣＮＳにおける増加するＴＰＰ１酵素活性に対する科学的論拠
ＣＬＮ２病に対する治療としてＴＰＰ１酵素活性の増加を標的にすることに対する科学的論拠は、ＣＬＮ２病の治療におけるＥＲＴ、及びＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の投与を用いた前臨床及び臨床経験によって支持される（Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＦＤＡ承認審査概要；Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）ＥＰＡＲ；Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。永久埋め込み型デバイスを介したＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の側脳室への隔週注入は、ＣＬＮ２病を有する患者における運動機能を安定させるとＦＤＡによって判定され、一方でＥＭＡは、言語技能にもプラスの影響があると判定した。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）のＣＳＦ及びリソソーム半減期は、それぞれ７時間及び１１．５日間であると推定され；結果として、上昇したＴＰＰ１酵素活性レベル（及びおそらく臨床的有益性）を維持するためにＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の反復注入が必要である。ゆえに、ＥＲＴの反復投与に伴う重い患者負担及び罹患率なく、ＣＮＳにおいて永続性がありかつ長期にわたるＴＰＰ１酵素活性を提供し得る新しい療法に対する満たされていない必要性が残る。
【０２０４】
ＣＬＮ２病を治療するための、ＣＬＮ２のＡＡＶ９媒介性遺伝子導入に対する科学的論拠
ＣＮＳを標的にし得るＡＡＶベクターに基づく産物の能力は、単一遺伝子ＣＮＳ疾患の数々のモデルにおいて立証されており、第一世代のＡＡＶベクターに基づく産物を評価するいくつかの早期ヒト試験は、脳へのベクター送達の安全性を示している（Ｂａｒｔｕｓ
ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｊａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｋａｐｌｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。しかしながら、これら第一世代のＡＡＶベクターの低い形質導入効率を含めた多くの因子が、動物モデルにおいて観察される生物活性の臨床への移転を妨げた。第二世代のＡＡＶベクターの到来とともに、脳への遺伝子導入の潜在性が大きく高まっている。特に、ＣＮＳを選択的に標的にし得及び高効率で広範囲にわたる遺伝子導入を達成し得るＡＡＶ９ベクターに基づく産物の能力は、齧歯類、ネコ、イヌ、ＮＨＰにおいて立証されている（Ｆｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ｂ；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ
ａｌ．，２０１６；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，２０１６ｂ；Ｈａｕｒｉｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．
，２０１３；Ｂｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｐａｓｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；図１５）。この能力は、バリアントＣＬＮ６病、脊髄性筋萎縮症Ｉ型、巨大軸索ニューロパチー、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩＩａ、及びＭＰＳ  ＩＩＩｂを含めた、多様な適応症に対してＡＡＶ９ベクターに基づく産物を評価する数々の臨床試験の開始につながっている。
【０２０５】
ＣＮＳへのＣＬＮ２導入遺伝子（可溶性ＴＰＰ１をコードする）のＡＡＶ媒介性送達の成功も、疾患のマウス及びイヌモデル、ならびに健常なラット及びＮＨＰにおいて行われた数々の動物調査において立証されている（Ｈａｃｋｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｏｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｏｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＣＮＳにおいて堅牢でかつ持続的なレベルのＴＰＰ１酵素活性を誘導し得る、疾患の発症を遅らせ得る、ならびにＩＣＶ注入及び直接線条体または小脳注射後の生存率を増加させ得る、ＣＬＮ２を発現するＡＡＶ２ベクターの能力は、ＣＬＮ２病のマウス及びイヌモデルにおいて立証された（Ｈａｓｋｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。同様に、ＣＬＮ２病のマウスモデル（Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウス）において行われた動物調査は、直接頭蓋内注射後にＣＮＳにＣＬＮ２導入遺伝子を送達し得るＡＡＶ５及びＡＡＶｒｈ１０ベクターの両方の能力を立証し、結果として生じるＴＰＰ１発現及び酵素活性の増加、神経行動学的機能の向上、ならびに全体的生存率の向上を有した（Ｐａｓｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｐａｓｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｏｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｓｏｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。これらの効果は、マウスにおいて年齢依存的であるように見え；２日齢でＡＡＶｒｈ１０ベクターに基づく産物を投与された新生仔ＣＬＮ２マウス（Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂマウスモデル；Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）は、３週齢及び７週齢で当該産物を与えられたマウスと比較して、持続的なＴＰＰ１発現ならびに神経行動学的機能及び生存率の付随的向上を示した（図１４；Ｓｏｎｄｈｉ
ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０２０６】
これらの有望な動物データは、ＣＬＮ２病を有する患者における複数の臨床試験の開始を支持した（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌ．ｇｏｖ識別番号：ＮＣＴ００１５１２１６、ＮＣＴ０１４１４９８５、ＮＣＴ０１１６１５７６）。第１相臨床試験において、ＣＮＬ２を組み入れたＡＡＶ２ベクターに基づく産物を、ＣＬＮ２病を有する１０人の対象に、６つの穿頭孔を通じた直接頭蓋内注射によりＣＮＳにおける１２箇所に投与した。改変版ハンブルクＬＩＮＣＬ臨床評定尺度による運動機能、発作活動、及び言語技能についての査定は、遺伝子療法が、１２ヶ月及び１８ヶ月の追跡調査の両方における、同時対照の対象と比較した神経学的状態の統計的に有意なより穏やかな衰退と関連付けられることを示した（Ｗｏｒｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００４）。同一の導入遺伝子を送達するＡＡＶｒｈ１０ベクターに基づく産物を評価する後続の臨床試験は、ＣＬＮ２導入遺伝子のＡＡＶｒｈ１０ベクター媒介性送達が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８ベクターに基づく産物と比較して、ＣＬＮ２（Ｔｐｐ１ｔｍ１Ｐｌｏｂ）マウスにおけるＣＮＳにおいてより大きなベクターＢＤをもたらすという動物調査における観察結果に基づいて開始された（Ｓｏｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）（この試験からの臨床データは入手不可である）。まとめると、これらの前臨床及び臨床経験は、ＣＬＮ２病を治療するための、ＣＮＳへのＣＬＮ２導入遺伝子のＡＡＶ媒介性送達の科学的論拠を支持するが；しかしながら、これらのＡＡＶ２及びＡＡＶｒｈ１０ベクターに基づく手法は、ＣＮＳを標的にする一連の侵襲的頭蓋内注射を組み入れ、臨床試験において疾患の進行を止めることに失敗した。
【０２０７】
これらの問題に対処するために、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を開発した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に組み入れられるＡＡＶ９血清型は、非侵襲的ＩＣ注射後の、ＣＬＮ２導入遺伝子の効率的な形質導入及びＣＮＳにおける広範囲にわたる生体内分布を可能
にする。ＣＬＮ２病を有する患者において、ＣＮＳ内の細胞へのＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２導入遺伝子の非侵襲的送達は、分泌型ＴＰＰ１の永久的供給源を潜在的に提供し得、ゆえにＴＰＰ１酵素活性を回復させ、ＣＮＳ全体にわたる細胞の長期補正を可能にする。種々の量のＴＰＰ１を発現するマウスＣＬＮ２変異体を評価した動物調査からの公開データに基づき、低レベルのＴＰＰ１酵素活性でさえ、疾患の発症を劇的に遅らせ及び生存率を増加させるのに十分であるように見える：脳における正常ＴＰＰ１活性のおよそ３％が、正常レベルの約０．２％を発現するマウスと比較して、疾患の発症を遅らせ及び約９ヶ月の中央値まで寿命を倍増させ；正常ＴＰＰ１活性の６％の発現は、罹患していないマウスのものに迫る約２０ヶ月の寿命中央値を有して、疾患を劇的に弱めた（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＣＬＮ２病を有する患者からの付加的な臨床データは、ＣＬＮ２におけるある特定の変異が、ＴＰＰ１酵素活性の不完全な喪失（少なくとも末梢組織における）及びその後長引く表現型につながり得ることを示唆する（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｂｅｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ゆえに、標的患者集団におけるわずかなレベルのＴＰＰ１酵素活性でさえ、臨床上意義があり得る。
【０２０８】
実施例９：ＮＨＰにおけるＡＡＶ９の生体内分布／安全性
ＩＣ注射後のＡＡＶ９ベクターに基づく産物の生体内分布（ＢＤ）は、類似の産物に対する前臨床試験プログラムの一部として、注射後最高で２年間、ネコ、イヌ、及びＮＨＰを含めた複数の種において特徴付けされている。要約すると、類似のＡＡＶ９ベクターに基づく産物は、多様な動物種における大槽内（ＩＣ）注射の後、脳及び脊髄において広く分布し及び持続した。複数の用量レベルを評価した場合、ベクター組織レベルはほぼ用量依存的であった。肝臓及び脾臓へのベクター分布は、概して、脳において観察されたものと同じぐらい高く、ときにはそれよりも高かった。ＣＮＳ及び肝臓以外の組織におけるベクター濃度は、調査内及び調査間の両方で非常に変動的であったが、評価された組織の大多数がベクターを含有した。全体として、複数の調査にわたって回収されたデータは、ＣＮＳ（脳、脊髄）及び末梢（肝臓、脾臓）における広い分布を有して、ＡＡＶ９ベクターに基づく産物に対して合致したＢＤプロファイル（速度論及び標的組織／臓器）を示した。
【０２０９】
類似のＡＡＶ９ベクターに基づく産物（及びそれらの動物類似体）のＢＤに関するこれら既存のデータは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に適用可能である、なぜなら、当該産物は類似しており、ウイルス媒介性ベクターのＢＤは、主に導入遺伝子とは無関係であると思われるためである（Ｂｒａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｔｉｅｓｊｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｇｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｃｅａｒｌｅｙ  ｅｔ
ａｌ．，２００６；Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０２１０】
計画された臨床的投与経路（ＲＯＡ）である大槽内（ＩＣ）注射（大槽内への画像誘導による後頭下穿刺を介したクモ膜下腔送達）の安全性は、類似のＡＡＶ９ベクターに基づく産物に対する前臨床試験プログラムの一部として行われたＧＬＰ準拠のＮＨＰ調査からの安全性データに基づく。簡潔には、投与処置はすべての動物において忍容性が良好であり；ＩＣ注射後１４、３０、または９０日の時点で、いかなる動物においても投与処置に関係した臨床的、肉眼的、または組織学的な所見はなかった。
【０２１１】
計画された臨床試験における免疫抑制の使用に対する科学的論拠は、一部には、少なくとも部分的に免疫介在性であるように見えるが、とはいえいかなる観察された臨床的異常とも関連付けられない所見である、類似のＡＡＶ９ベクターに基づく産物を投与されたＮＨＰのＣＮＳ及び後根神経節における最小限に軽度の軸索変性症及び神経変性の組織病理学的な所見に基づく。
【０２１２】
実施例１０：臨床試験
「ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２遺伝子療法：大槽内（ＩＣ）注射による単回投与処置の間の、ＣＬＮ２病を有する小児科患者に対する、遅発性乳児型神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ２）を有する小児科対象における非盲検の多施設での逐次的単回大槽内用量漸増調査（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｎ  Ｏｐｅｎ−Ｌａｂｅｌ，Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌ  Ｄｏｓｅ  Ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｌａｔｅ−Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｅｒｏｉｄ  Ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ２（ＣＬＮ２）
ｔｏ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＣＬＮ２  ｄｉｓｅａｓｅ
ｄｕｒｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｖｉａ  ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌ（ＩＣ）  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」と題されたＦＩＨ臨床試験において。当該試験は、２つのパートから構成される。
【０２１３】
試験のパートＩにおいて、主要な焦点は安全性及び忍容性にあり、最高で２つの用量レベルが保守的な用量漸増設計の一部として計画され、ＩＴ  ＥＲＴ（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標））での治療中に３〜５のベースラインＣＲＳ（組み合わせた運動及び言語ドメイン）スコアを有する≧２歳である対象が、最低８週間離れて逐次的に登録され、安全性委員会審査が進行中である。定期的なＩＴ  ＥＲＴ注入の直前に、ＣＳＦにおけるＴＰＰ１酵素活性のトラフレベルを測定する。トラフＴＰＰ１活性（すなわち、先行ＥＲＴ注入からの任意の残存活性）は、Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の短い半減期に基づき、進行中のＥＲＴ治療から検出不能である／低いと予想され、一方で遺伝子療法からの持続的ＴＰＰ１活性は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の注射後１〜４週間まで測定可能であると予想される。トラフＴＰＰ１活性（すなわち、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の投与後に形質導入された細胞からのＴＰＰ１の分泌）が測定可能であり次第、内部安全性委員会（ＩＳＣ）は、ある特定のあらかじめ指定された基準が満たされた場合（例えば、まだ特定されていないが、安定したＣＲＳの適切性、持続的なＴＰＰ１酵素活性などの基準が考慮されている）、後続のＩＴ  ＥＲＴ注入を中断すると決断し得る。対象は、最低でも、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の注射後２週及び４週の時点でＩＴ  ＥＲＴを受け、８週目の来院前に最高で４週間ＩＴ  ＥＲＴを絶たれる。２人の対象は、第一の用量レベルで投薬される。
【０２１４】
調査のパートＩＩにおいて、外部独立データモニタリング委員会（ＩＤＭＣ）は、第一の投薬コホートと同じ様式でより高い用量レベルで２人の対象に投薬することに進むことが安全であるかどうかを判定する。最高忍容用量コホートは、最高で合計１３人の付加的な対象まで拡張され得、ＩＴ  ＥＲＴ治療された対象及びＩＴ  ＥＲＴナイーブの対象の両方の患者集団を含む（図６）。組み入れ／除外基準は、ＣＬＮ２病ＣＲＳに関する３〜５のスコアを含めて、その他の点でこの拡張集団において同じままである。臨床上適当なＩＴ  ＥＲＴ「レスキュー」注入を決める基準は、以前にＩＴ  ＥＲＴで治療された患者に対して前向きに規定される。
【０２１５】
提案される臨床試験では、ＣＳＦにおけるＴＰＰ１酵素活性、ならびに、ｉ）ＣＬＮ２病ＣＲＳの６ポイントの組み合わせた言語及び運動ドメインにおいて、逆転しない（持続的な）２カテゴリー衰退（すなわち、言語及び運動ドメインのそれぞれにおいて１つ、または運動ドメインのみで２つ）を有しない対象（Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）；ならびにｉｉ）「レスキュー」ＩＴ  ＥＲＴ注入を有しない対象、として定義される応答者としてカテゴリー分けされる対象の割合を含めた、効力についての複数の測定が評価される。２組の患者集団（すなわち、ＩＴ  ＥＲＴナイーブ及びＩＴ  ＥＲＴ治療された）が、パートＩＩの拡張コホートにおいて計画され、ＩＴ  ＥＲＴナイーブの対象は７２週間追跡され、ＩＴ  ＥＲＴ治療された対象は８０週間追跡され、組み合わせた
２つの患者集団を自然病歴コホートと比較する。これら２つの集団を組み合わせる主な理由は、一般的なＣＬＮ２病の希少性、及びＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の近年の承認後のＩＴ  ＥＲＴナイーブの患者のさらなる低下に起因して、試験登録を促すためである。
【０２１６】
ＩＴ  ＥＲＴ治療された患者における任意の残存ＥＲＴの潜在的な影響、ならびにＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の安全性及び生物活性についての査定に対する潜在的交絡効果に起因して、「ウォッシュアウト」期間が調査設計に組み入れられる。ＣＳＦ及び血漿におけるＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）に関する薬物動態（ＰＫ）データは、ＣＳＦ及びリソソームにおけるそれぞれおよそ７時間及び１１．５日間の半減期を有して、明らかな蓄積またはＰＫ時間依存性がないことを示唆し（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）ＥＰＡＲ）、ゆえに、ＩＴ  ＥＲＴの中断後最高で４週間という提案される「ウォッシュアウト」期間は適当である。
【０２１７】
言語技能及び発達についての査定は、ＣＬＮ２病進行の主要な構成要素であり、ゆえにＣＲＳに組み入れられる（Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＣＲＳの６ポイントの組み合わせた言語及び運動ドメイン（それは、Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）販売申請の審査中にＦＤＡ／ＣＤＥＲによって特定された［Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＦＤＡ承認審査概要］）のうちの言語ドメインの利用性に関する任意の懸念に対処するために、包括的な緩和計画を実行して潜在的バイアスを除去する。
【０２１８】
ＦＤＡは、希少疾患に対する薬物開発を促す複数の機会を提供し、産業界に対するＦＤＡドラフトガイダンス：Ｅｘｐｅｄｉｔｅｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｒｉｏｕｓ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ−Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ−２０１４において欠損遺伝子の標的化に具体的に対処している。このガイダンスは、希少遺伝子疾患に対する製品の登録を支持するのに十分であり得る評価項目に関連したいくつかの洞察も提供し、「一部のよく理解された酵素欠損に関して、欠損した酵素の補充は臨床的有益性を確実に予測する」と述べている。これは、導入遺伝子発現活性を確実に示す遺伝子療法が、２１  ＣＦＲ  ３１４、ｓｕｂｐａｒｔ  Ｈの下での加速した承認のための基準を満たし得ることを示唆する。さらには、この主張に基づき、欠損した酵素レベルが公知の病因につながり、かつそれらの補正または正常化が、臨床上意義のある効果と関連付けられる疾患に対して、早期承認の評価項目に対する論証がなされ得る。
【０２１９】
以前に承認されたＥＲＴの背景において、酵素レベル（典型的に副次的評価項目）と臨床上意義のある転帰（先行する主要評価項目）との間の相関関係はすでに確立されている。これらの場合、ＣＬＮ２病を含めた多くのＬＳＤなどにおいて、機能する遺伝子コピーの送達の成功及びその後の導入遺伝子産物の発現は、臨床転帰の観察される向上に十分に先立って、早期の時点で顕著である（ＣＳＦリソソーム貯蔵物質の低下または酵素活性の測定結果などにより）。これは、遺伝子療法後の酵素活性が、臨床的有益性の代理として用いられ得ることを示唆する。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）に対する承認審査概要文書に伴うＦＤＡディレクターメモにおいて近年述べられているように、提案される承認の根拠としての酵素活性の使用はＦＤＡ前例とも合致しており、それは、「ＣＬＮ２はＴＰＰ１の欠損に特異的に寄与するため、ＴＰＰ１の補充が持続的であるまたは治療が疾患の過程において早期に始められる場合、その兆候の逆転または予防は理論的に可能である」と述べている。それゆえ、ＴＴＰ１活性を評価項目として用いる潜在性は、ＦＤＡガイダンスと合致する。
【０２２０】
提案される臨床試験では、ＣＳＦにおけるＴＰＰ１酵素活性の継続的測定、ならびにＣＬＮ２病ＣＲＳの６ポイントの組み合わせた言語及び運動ドメインにおける安定化を含めた、効力についての複数の測定が評価される。リソソーム貯蔵物質の病的蓄積及びＣＬＮ２病の公知の病因を予防することにおけるＴＰＰ１酵素活性の確立された役割に基づき、
ＴＰＰ１活性の大幅でかつ持続的な増加は、神経行動学的機能における長期安定化を予測する可能性が高い。種々の量のＴＰＰ１を発現するマウスＣＬＮ２変異体を評価した調査からのデータに基づき、正常の３〜６％のＴＰＰ１酵素活性レベルが、疾患の発症を劇的に遅らせ及び生存率を増加させるのに十分であるように見える（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＣＬＮ２病を有する患者からの付加的な臨床データは、ＣＬＮ２におけるある特定の変異が、ＴＰＰ１酵素活性の不完全な喪失（少なくとも末梢組織における）及びその後長引く表現型につながることを示唆する（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｂｅｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。さらに、永久埋め込み型デバイスを介したＣＳＦへの隔週注入として投与される、組み換えＴＰＰ１（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、セルリポナーゼアルファ、ＢｉｏＭａｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いたＥＲＴは、ｉ）ＦＤＡによる９６週間の調査期間にわたる運動機能の衰退；ならびにｉｉ）ＥＭＡによる４８週間の調査期間にわたる運動及び言語機能の両方の衰退、を安定化させると判定された。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、ＣＮＳにおけるＴＰＰ１の効率的でかつ持続的な発現のために設計され、ＣＦＳへのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の１回限りの送達は、ＴＰＰ１酵素の長期供給源を提供し、ならびに満たされていない高い必要性を有するこの希少遺伝子疾患における疾患の進行及び神経認知の衰退を止める（または大幅に遅らせる）潜在性を有する。ゆえに、臨床データが、臨床上意義のあるＣＲＳにおける安定化のより長期にわたる向上を示唆する、早期の時点でのＣＳＦにおけるＴＰＰ１酵素活性の大幅でかつ継続的な測定結果を示す場合、将来的な販売申請におけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の効力への主要な支持を提供するこれらのデータの妥当性がＦＤＡとともに議論される。
【０２２１】
実施例１１：完了したパイロット調査
Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスにおけるパイロット用量域調査（調査＃Ｗ２５５３）を含めた、いくつかのインビトロ及びインビボ前臨床研究及びパイロット調査を行って、臨床候補を選択し、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の生物活性に関する予備的データを回収した（研究及びパイロット調査はＩＮＤに要約される）。調査＃Ｗ２５５３では、１ヶ月齢のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスに、７．５×１０９ＧＣ／ｇ脳質量（低用量；ｎ＝１０／性別）または７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量（高用量；ｎ＝１０／性別）のいずれかの用量レベルで合計５μｌの容量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２をＩＣＶ注射により投与した。ノックアウト（ｎ＝１０／性別）及び野生型対照（ｎ＝１０／性別）動物には、ＰＢＳをＩＣＶ注射により投与した。動物を、注射後３０週間、疾患の進行及び生存率についてモニターし；臨床観察、体重、ロータロッドに基づく神経行動学アッセイ（運動協調性及び運動学習）、ヒトＴＰＰ１導入遺伝子産物に対する液性免疫応答、脳及び肝臓におけるＴＰＰ１酵素活性、アストロサイトーシス、基質のリソソーム蓄積、ならびに生存率を含めた、安全性及び生物活性の予備的測定結果を複数の時点で回収した。
【０２２２】
振戦及び歩行異常を、Ｔｐｐ１ｍ１ｊ対照群及び低用量群における動物において、毎日の臨床観察時に定性的に書き留め、注射後８週間頃に始まり及び調査の継続期間に進行的に増悪した。環境刺激誘発性発作は、未処理ＫＯ及び低用量で処理されたＫＯに対してそれぞれ１３〜１７週齢で目に見えるようになった。運動協調性及び運動学習についての査定を実施して、注射後７、１１、及び２０週の時点での生存動物における神経行動学的機能を評価した。注射後１１週の時点で実施された運動協調性アッセイ（落下するまでの潜時を査定するロッキングロータロッド上での１８０秒間の試行；１０ｒｐｍ）において、低用量群及びＴｐｐ１ｍ１ｊ対照群における動物は、高用量群及び野生型対照群における動物と比較して、機能の減少を呈するように見えた（図１８Ａ）。注射後２０週の時点で実施された運動学習アッセイ（連続３日間にわたる加速式ロータロッド上での３００秒間の試行；５〜４０ｒｐｍ）において、野生型群及び高用量群における生存動物の間に差があるようには見えず（図１８Ｂ）、それは、このパイロット調査におけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の投与後の小脳機能衰退の阻止を示唆する。他の時点における神経行動学
的機能についての評価は、非常に変動的であった（データ示さず）。
【０２２３】
このパイロット調査からのデータは、小脳機能衰退の阻止に対するＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の効果を示唆するものの、これら神経行動学的アッセイの利用性はＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて限定されている。早期死亡は、より遅い時点におけるＴｐｐ１ｍ１ｊ対照動物の評価を妨げ、臨床観察時の明らかに損なわれた機能（例えば、著名な歩行異常及び振戦）にもかかわらず、データはこれらのアッセイにおいて非常に変動的であるように見えた。疾患発症から早期死亡までの急速な進行、ならびに動物取扱の間の環境刺激誘発性致死性発作の潜在性はさらなる課題をもたらす。
【０２２４】
全体として、Ｔｐｐ１ｍ１ｊ対照及び低用量動物の間で生存率の差はなく、一方ですべての高用量動物は、自然病歴データに基づくＴｐｐ１ｍ１ｊマウスの予想生存期間中央値を超えて生存した。注射後３０週の時点で、低用量群及びＴｐｐ１ｍ１ｊ対照群における０％に対して、高用量群における生存率は８５％（１０／１０匹雄；７／１０匹雌）であった（図４Ａ）。すべての生存動物を、組織病理のために注射後３０週の時点で剖検した。
【０２２５】
注射後３０週の時点におけるすべての生存動物を安楽死させ（すなわち、高用量群及びＷＴ対照群のみ；Ｔｐｐ１ｍ１ｊ対照群または低用量群から生存した動物はいなかった）、ＴＰＰ１酵素活性、炎症（アストロサイトーシス）、及びリソソームにおける基質の蓄積についての評価のために組織を収穫した。まとめると、データは、ｉ）血清における野生型レベル（データ示さず）ならびに大脳、小脳、及び肝臓における超生理学的レベル（図１９及び２０）へのＴＰＰ１酵素活性の増加；ｉｉ）脳のいくつかの部分における、最も際立って海馬（図２１Ａ）及び皮質（図２１Ｂ）におけるアストロサイトーシスのほぼ完全な補正（図２１Ｃは脳幹を示している）；ならびにｉｉｉ）３つの異なる技法により示される、ニューロンにおける異常なリソソーム貯蔵表現型の定性的補正（データ示さず）を含めた、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の生物活性の付加的な証拠を提供する。脳幹ニューロンにおけるリソソーム貯蔵は、３つの異なる技法：自家蛍光、Ｈ＆Ｅ、及び過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色、を用いて可視化され得る。注射後３０週の時点における、野生型対照マウス及び高用量のＡＡＶ９−ｈＣＬＮ２を投与されたＴｐｐ１ｍ１ｊマウスからの代表的な画像を獲得した（示さず）。５．５ヶ月齢の時点における、Ｔｐｐ１ｍ１ｊ対照マウス（「ＫＯ」と印される）からの代表的な画像を獲得した（示さず）。これら３つの異なる技法は、リソソーム蓄積の同様のパターンを示している。異常な貯蔵は、Ｔｐｐ１ｍ１ｊ対照マウスのニューロンに蓄積し、高用量動物において補正されるように見える。これらの技法は単に定性的であるが、注射後３０週の時点で、高用量動物の脳幹の大型ニューロンにおけるリソソーム貯蔵の低下は容易に検出された。肝臓への生体内分布が観察され（データ示さず）、細胞形質導入のレベルは、肝臓及び血清の両方においてＴＰＰ１酵素活性と相関するように見えた。このパイロット調査において、他の組織は生体内分布について評価されなかった。
【０２２６】
ヒトＴＰＰ１導入遺伝子産物に対する液性免疫応答を、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の注射後３、１０、及び３０週の時点で、ＥＬＩＳＡを用いて血清において査定した。データは持続的な免疫応答を示したが、とはいえレベルは非常に変動的であるように見え；ヒトＴＰＰ１導入遺伝子産物に対する液性免疫応答は、注射後１０週の時点で低用量雄において最も高く見え、注射後１０及び３０週の両方の時点で高用量雄において最小限の応答のみが観察され；高用量群内では、抗ＴＰＰ１免疫応答も、注射後１０及び３０週の両方の時点で雄よりも雌において高かった。これらのパイロットデータは、マウスにおけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２生体内分布及び導入遺伝子発現またはその後の部分的忍容性における潜在的な性別特異的差異を示唆し得る。マウスにおけるＡＡＶベクターに基づく産物の肝臓形質導入効率はテストステロン依存的であり
得るといういくつかの証拠があるが（Ｄａｖｉｄｏｆｆ，２００３）、とはいえこのパイロット調査における変動的なデータは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の生体内分布プロファイルまたは免疫原性における任意の性別特異的差異よりも、動物におけるヒトタンパク質に対する免疫応答の評価への課題（ならびに、ヒト臨床シナリオへのそれらの解釈可能性及び適用可能性における課題）をより例示する可能性が高い。それにもかかわらず、任意の潜在的な性別特異的差異、具体的には生物活性または免疫原性に対する任意の効果を、計画されたＩＮＤにより可能となるハイブリッド薬理学／毒物学調査においてさらに評価する。
【０２２７】
実施例１２：脳室内（ＩＣＶ）及び大槽内（ＩＣ）投与の経路の比較可能性
Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルにおいて行われたパイロット調査では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２をＩＣＶ注射により投与した。この投与の経路は、計画された臨床的ＩＣ投与経路とは異なるが、しかしながら、ＩＣ注射はＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて実現可能ではない。ＩＣ注射処置の間、小容量のＣＳＦを引き抜いて、ＣＳＦコンパートメントにおける圧力を減少させ及び大槽における正しい針の配置を確認する必要がある。マウスにおける比較的少ないＣＳＦ容量に起因して、正しい針の配置は、ＣＳＦを引き抜くことによって確認され得ない。ゆえに、注射前に筋膜と筋肉とを解離して硬膜を曝露する必要がある。この外科的処置は時間がかかり、マウスにおける処置誘発性運動機能障害及び／または病変の危険性を提示する。
【０２２８】
ＩＣ注射がＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて実現可能でないことを考慮して、大型動物におけるＩＣ注射及びマウスにおけるＩＣＶ投与の後の、ＡＡＶ９ベクターに基づく産物の生体内分布及び導入遺伝子発現プロファイルの類似性に起因して、ＩＣＶ投与経路を薬理学／毒物学調査に選択した。
【０２２９】
類似のＡＡＶ９ベクターに基づく産物に対する前臨床試験プログラムにおいて、生体内分布プロファイル（標的組織／臓器）は、マウスにおけるＩＣＶ注射及びＮＨＰにおけるＩＣ注射のいずれかの後で同等であることが示された。同様に、Ｈａｕｒｉｇｏｔ  ｅｔ
ａｌ．，（２０１３）によって公開された調査では、ＩＣ（ｎ＝１）またはＩＣＶ（ｎ＝２）注射のいずれかによる２×１０１３ｖｇ／動物のＡＡＶ９．ＧＦＰベクターのＣＳＦ送達後のイヌにおいて、ＡＡＶ９ベクター生体内分布及びＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現が比較された。ＣＮＳ及び体細胞器官におけるＡＡＶ９ベクター生体内分布及び導入遺伝子発現プロファイルについての比較分析は、いずれかの送達の経路を用いたベクター形質導入プロファイルの大きな差を示唆しなかった。
【０２３０】
ゆえに、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２のＩＣＶ注射後のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて作出される薬理学／毒物学データは、標的患者集団における臨床シナリオ及び計画されたＩＣ投与経路に関連している。
【０２３１】
実施例１３：ＣＬＮ２病のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルにおける計画されたハイブリッド薬理学／毒物学調査
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に対する提案される前臨床試験プログラムは、ＣＬＮ２病のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルにおいて行われる、ＩＮＤにより可能となるハイブリッド薬理学／毒物学調査を含む。一般的に、ハイブリッド調査設計は、臨床背景における製品の安全性及び生物活性に影響を与え得る、標的患者集団の局所微小環境及び病態生理学的状態を再現する疾患背景における試験品目の安全性及び生物活性についての評価を容易にする。結果として、ハイブリッド調査において作出されるデータは、健常動物において行われる調査から獲得されるデータよりも関連している場合が多い。ゆえに、提案されるハイブリッド薬理学／毒物学調査から作出されるデータは、安全でかつ効力のある初回臨床用量レベルの選択に情報を与えるのに役立つ。
【０２３２】
提案される調査では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、２×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量〜ＭＦＤの７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量レベル域で、４週齢のマウスにＩＣＶ注射により投与する。動物の半分を、対照動物において予想される神経病理及び死亡と一致する注射後６０日の時点で屠殺し、ＴＰＰ１酵素活性、リソソーム貯蔵物質の蓄積及び貯蔵病理、ならびにアストロサイトーシスを含めた生物活性について評価する。動物の残りを、疾患表現型（臨床観察時の発作、振戦、及び／または歩行異常によって規定される）の発症までの時間について評価し、対照動物において１００％の死亡率が予想される時点を超える注射後最高で２１０日間の長期生存について追跡する。すべてのマウスを、実現可能なものとして、複数の時点で安全性の限定された査定について評価する。
【０２３３】
パイロット調査からのデータは、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスにおける小脳機能衰退の阻止に対するＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の効果を示唆したものの、これら神経行動学的アッセイの利用性は限定されており、長期生存に関するデータは、生物活性についてのより客観的測定であると見なされる。ゆえに、パイロット調査において用いられた神経行動学的アッセイは、この調査の設計に組み入れられなかった。具体的には、早期死亡は、より遅い時点におけるＴｐｐ１ｍ１ｊ対照マウスの評価を妨げ、臨床観察時の明らかに損なわれた機能（例えば、著名な歩行異常及び振戦）にもかかわらず、パイロット調査からのデータは非常に変動的であるように見えた。疾患発症から早期死亡までの急速な進行、ならびに動物取扱の間の環境刺激誘発性致死性発作の潜在性は、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいてこれらの査定を行うことにとってさらなる課題をもたらす。
【０２３４】
限定された組織入手可能性、及び環境刺激誘発性致死性驚愕発作に対するＴｐｐ１ｍ１ｊマウスの感受性（それは、連続出血など、動物取扱を要する生存中安全性査定を実施し得る能力を限定し得る）に起因して、すべての群における安全性及び生物活性についてのすべての提案される測定結果を回収することは実現可能ではない。ゆえに、生物活性についての査定を群１〜６において優先し、安全性／毒物学についての査定を群７〜９において優先する。
【０２３５】
提案される調査のための主要な設計要素、及びそれらの科学的論拠の考察が下記で提供される。
１）疾患の動物モデル：Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルは、ＣＬＮ２病の生物学的に関連したマウスモデルである。
２）試験品目：意図される臨床用製品及び製剤（バッファー／希釈剤）を評価する。
３）用量レベル域：２×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量〜７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の値域内にある複数の用量レベルを評価して、最小有効用量（ＭＥＤ）及び無毒性量（ｎｏ−ｏｂｓｅｒｖｅｄ−ａｄｖｅｒｓｅ−ｅｆｆｅｃｔ−ｌｅｖｅｌ）（ＮＯＡＥＬ）を特定する。パイロット調査において、７．５×１０９ＧＣ／ｇ脳質量の用量レベルでＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与されたＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて、生存率または生物活性の他の測定において有益性があるようには見えなかった。ＩＣＶ投与経路（ＲＯＡ）を利用するＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおけるＭＦＤは、７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量である。
４）脳室内（ＩＣＶ）投与経路（ＲＯＡ）：ＩＣ及びＩＣＶ経路間の類似性についての詳細な説明に関しては第３．４．２．５節をぜひ参照されたく、それは、計画された臨床シナリオへのマウスにおけるＩＣＶ経路の適用可能性を支持する。ＩＣ注射処置の重大な安全性は、ＩＮＤ＃１７５６５の下で行われたＮＨＰ調査において以前に確立された。
５）予定された屠殺及び調査継続期間：Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルにおける疾患表現型の発症（疾患発症は、歩行異常、振戦、発作、及び突然死によって特徴付けされる）、ならびに予想される神経病理及び早期死亡とそれぞれ一致するように、注射後６０日及び９０日の時点における予定された屠殺を選択した。自然病歴データに基づき、いかなるＴｐ
ｐ１ｍ１ｊ対照マウスも、注射後２１０日の時点における最終的な予定される屠殺までは生存しないと予想される。
６）薬理学／生物活性評価項目：生物活性を評価する定量的評価項目には、疾患表現型（臨床観察時の歩行異常及び／または振戦によって規定される）の発症までの時間、注射後６０日の時点でのアストロサイトーシス補正、体重変化（週１回測定される）、注射後６０日の時点での脳組織におけるＴＰＰ１酵素活性、及び注射後２１０日までの生存率、が含まれる。剖検（注射後６０日）の時点で、リソソーム貯蔵補正の定性的組織学、ならびに大脳、小脳、肝臓、及び血清におけるＴＰＰ１酵素活性は、生物活性についての付加的な測定結果を提供する。パイロット調査からのデータは、神経行動学的測定（ロータロッドに基づくアッセイ）が、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルにおける利用性が限定されていることを示し；ゆえに、これらの査定はこの調査の設計に組み入れられていない。
７）安全性／毒性評価項目：対照マウス、及び最高用量レベル（ＭＦＤ）でＩＣＶ注射によりＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与されたＴｐｐ１ｍ１ｊマウスを、以下のように複数の時点で安全性及び免疫原性について評価する。
・臨床観察（ケージ側での罹患率及び死亡率の検査、毎日）
・詳細な臨床観察（週１回）
・体重（週１回）
・完全な臨床病理（ｄ３０、ｄ９０）
・免疫原性（血清中の抗ＴＰＰ１抗体、ＥＬＩＳＡ）（ベースライン、ｄ１４、ｄ６０、ｄ２１０）
・臓器重量（ｄ６０、ｄ９０）
・肉眼的病理、ならびに組織の包括的リスト及び巨視的異常を示す任意の組織の組織病理（ｄ６０、ｄ９０）
８）免疫原性査定：液性免疫応答（ｈＴＰＰ１に対する血清抗体）を、ベースラインならびに注射後１４、６０、及び２１０日の時点で評価する。マウスにおける導入遺伝子産物に対する液性免疫応答は、ＮＨＰにおいて観察される応答と相関することが示されている（データ示さず）。しかしながら、細胞性免疫応答（すなわち、インターフェロンガンマＴ細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）は、アッセイをランするほど十分なＰＢＭＣを全血から単離することは技術的に実現可能でないため、マウスにおいてそれほど情報を与えない。この理由のために、マウスにおけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、脾細胞を用いて実施される必要があるが、しかしながら、ＮＨＰから単離された脾細胞におけるＴ細胞応答の評価を含む以前の調査からのデータは、同じＮＨＰ由来のＰＢＭＣにおいて獲得されたデータと相関しなかった。ゆえに、Ｔ細胞免疫応答の評価は調査設計に組み入れられない。
９）予定外の死亡：剖検及び他の査定を、必要に応じてすべての予定外の死亡に対して実施して、死亡の原因を判定する。
【０２３６】
実施例１４：安全性／毒物学及び生体内分布
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける潜在的ＧＬＰ安全性／毒物学調査
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に対する提案される前臨床試験プログラムは、ＣＬＮ２病のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルにおいて行われるハイブリッド薬理学／毒物学調査を含む。最高でＭＦＤまでの複数の用量レベルでＩＣＶ注射によりＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を投与されたマウスを、以下のように、生存中の複数の時点及び予定された屠殺の時点で安全性について評価する。
・臨床観察（ケージ側、毎日）
・体重（週１回）
・臨床病理（ｄ６０、ｄ９０、ｄ２１０）
・血清における液性免疫応答（血清中の抗ｈＴＰＰ１抗体、ＥＬＩＳＡ）（ベースライン、ｄ１４、ｄ６０、ｄ２１０）
・臓器重量（ｄ６０、ｄ９０、ｄ２１０）
・任意の生存動物に対する肉眼的病理及び組織の包括的リストの組織病理（ｄ６０、ｄ９
０、ｄ２１０）（対照動物において、６ヶ月齢までに１００％の死亡率が予想される）
【０２３７】
一般的に、ハイブリッド調査設計は、臨床背景における製品の安全性及び生物活性に影響を与え得る、標的患者集団の局所微小環境及び病態生理学的状態を再現する疾患背景における試験品目の安全性についての評価を容易にする。ゆえに、提案されるハイブリッド薬理学／毒物学調査から作出される安全性／毒物学データは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の安全性プロファイルに関する重要な情報を提供すると期待される。機関指導勧告によると、「生物活性及び安全性についての査定に選択される動物種は、臨床試験設計を導くデータを作出するために、ヒトにおいて予想されるものと同様の、治験用［製品］に対する生物学的応答を示すべきである」。それゆえ、ＣＬＮ２病のＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルの選択は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の安全性についての評価に適当である。
【０２３８】
罹患したＴｐｐ１ｍ１ｊマウスにおける基礎病理及び早期死亡は、潜在的な試験品目関連効果をマスクし得る、ならびに環境刺激誘発性致死性発作に対するＴｐｐ１ｍ１ｊマウスの感受性に起因して、一部の安全性査定（連続出血など）を実施し得る能力は限定され得るという懸念を含めて、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスにおいて安全性を査定する上でのいくつかの潜在的な課題が存在する。これらの懸念が経験によって証明され、かつＴｐｐ１ｍ１ｊマウス安全性データが規制要件を満たすのに十分であると見なされない場合、付加的なＧＬＰ準拠の毒物学調査がＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて行われる。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に伴う潜在的毒性を検出するのに適当であると見なされる、なぜなら、ｉ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、薬理学査定において用いられるＴｐｐ１ｍ１ｊマウスモデルのバックグラウンド系統であり；ｉｉ）マウスにおけるＩＣＶ注射及び大型動物におけるＩＣ注射の後の、ＡＡＶ９ベクターに基づく産物の生体内分布及び導入遺伝子発現プロファイルの同等性が確立されており；ｉｉｉ）健常マウスにおいて安全性査定を実施する実現可能性は、Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスなどにおける動物取扱懸念または環境刺激誘発性致死性発作に対する感受性によって限定されず；ならびにｉｖ）健常マウスにおけるＧＬＰ準拠の安全性／毒物学調査の実行は、実現可能であり、十分に確立されており、かつ統計学的に堅牢であるためである。代替種としてのラットの選択は潜在的に適当であり、計画された臨床的ＩＣ  ＲＯＡ（それはマウスにおいて実現可能でない）の組み入れを理論的に可能にするが、しかしながら、この種は、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に対する前臨床試験プログラムにおけるその使用を支持するのに十分なほど特徴付けされていない（例えば、ＣＳＦへの送達後のＡＡＶ９ベクターに基づく産物の生体内分布プロファイル）。
【０２３９】
この潜在的なＧＬＰ安全性／毒物学調査では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、７．５×１０１０、２×１０１１、及びＭＦＤの７．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量レベルで、４週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスにＩＣＶ注射により投与し、マウスを複数の時点で安全性／毒性について評価する。Ｔｐｐ１ｍ１ｊマウスにおけるＡＡＶ９ベクター生体内分布の速度論及び疾患表現型の進行と一致するように、計画された予定された屠殺（注射後３０日及び９０日）及び調査継続期間（注射後９０日間）を選択した。安全性査定は、臨床観察、体重、臨床病理、免疫原性、肉眼的病理、及び組織の包括的リストの組織病理を含む。提案されるＩＣ  ＲＯＡの安全性は、ＩＮＤ＃１７５６５の下でＮＨＰにおいて行われた調査において以前に確立されている。
【０２４０】
大槽内注射によるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の投与についての科学的論拠及び安全性
限られたＣＳＦコンパートメント内の標的ＣＮＳ組織へのベクターの直接的でかつ非侵襲的な送達を可能にする、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に対する投与の経路（ＲＯＡ）として大槽内（ＩＣ）注射を選択した（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ｂ；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；ＩＮＤ＃１７５６５）。ＡＡＶ９ベクター
に基づく産物の静脈内送達も、ＣＮＳ内の細胞を標的にすることが示されているものの、ＣＳＦへの送達は、より低いベクター用量レベルで及び末梢臓器のより低い形質導入で、脳におけるより効率的な形質導入を達成することが示されている（Ｎａｔｈｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ｂ）。
【０２４１】
大槽内への画像誘導による後頭下穿刺を介したＩＣ注射（すなわち、計画された臨床的ＲＯＡ）についての最も信頼できる安全性査定は、類似のＡＡＶ９ベクターに基づく産物に対する前臨床試験プログラムの一部として行われたＧＬＰ準拠のＮＨＰ調査において以前に評価された。簡潔には、投与処置は、複数の調査にわたってすべての動物において忍容性が良好であり；ＩＣ注射後１４、３０、または９０日の時点で、いかなる動物においても投与処置に関係した臨床的、肉眼的、または組織学的な所見はなかった。完全な前臨床調査報告（及び入手可能な臨床データ）は、ＩＮＤ提出の際に提供される。
【０２４２】
ＩＣ注射後のＡＡＶ９ベクターに基づく産物に対する既存の生体内分布データ
標的患者集団におけるＩＣ注射後のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の可能性のある生体内分布プロファイルは、類似のＡＡＶ９ベクターに基づく産物に対して作出された既存の生体内分布データから情報を得ている。例えば、類似のＡＡＶ９ベクターに基づく産物の生体内分布は、ＩＣ注射後最高で２年間、ネコ、イヌ、及びＮＨＰを含めた複数の種において包括的に特徴付けされており、生体内分布についての最も信頼できる査定は、ＦＤＡ／ＣＢＥＲ／ＯＴＡＴの投入で設計されたＧＬＰ準拠のＮＨＰ調査（ＰＴＳ＃ＰＳ００２６５３及びＰＴＳ＃ＰＳ００２９１９）において行われた。要約すると、これらの産物は、多様な動物種におけるＩＣ注射の後、脳及び脊髄において広く分布し及び持続することが示された。複数の用量レベルを評価した場合、ベクター組織レベルはほぼ用量依存的であった。肝臓及び脾臓へのベクター分布は、概して、脳において観察されたものと同じぐらい高く、ときにはそれよりも高く；限定されたデータは、ＣＮＳ発現に対する観察可能な効果はなかったものの、ＡＡＶ９に対する既存の力価が末梢組織ベクター発現を低下させ得ることを示唆する。ＣＮＳ及び肝臓以外の組織におけるベクター濃度は、調査内及び調査間の両方で非常に変動的であったが、評価されたすべての組織がベクターを含有した。さらに、ベクター発現は、ＮＨＰにおける生体内分布についての最も信頼できる査定において、投与後最高で６ヶ月間、意義があるほどに変化しなかった。
【０２４３】
全体として、ＡＡＶ９ベクターに基づく産物に関する生体内分布プロファイル（標的組織／臓器、及び生体内分布の速度論）は、複数の種及び調査にわたって合致していることが示されている。
【０２４４】
実施例１５：臨床試験
臨床開発プログラム及び計画された中核的臨床試験の概略
ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２に対する提案される臨床開発プログラムは、２つのパートで行われる単一試験を含む（図２６；図２７）。詳細な梗概は第４節に提供されている。
【０２４５】
試験のパートＩにおいて、主要な焦点は安全性及び忍容性にあり、最高で２つの用量レベルが保守的な用量漸増設計の一部として計画され、ＩＴ  ＥＲＴ（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標））での治療中に３〜５のベースラインＣＲＳ（組み合わせた運動及び言語ドメイン）スコアを有する≧２歳である対象が、最低８週間離れて逐次的に登録され、ＩＳＣ審査が進行中である。２人の対象は第一の用量レベルで投薬され、安全性についての評価の後、外部ＩＤＭＣは、より高い用量レベルで２人の対象に投薬することに進むことが安全であるかどうかを判定する。
【０２４６】
調査のパートＩＩにおいて、最高忍容用量コホートは、最高で合計１５人の対象まで拡張され得、ＩＴ  ＥＲＴ治療された対象及びＩＴ  ＥＲＴナイーブの対象の両方の患者集団を含む。組み入れ／除外基準は、ＣＬＮ２病ＣＲＳに関する３〜５のスコアを含めて、その他の点でこの拡張集団において同じままである。
【０２４７】
試験のパートＩにおいて、効力パラメーターが測定されるものの、焦点は安全性及び忍容性にある。第一の投薬コホートにおいて、ＩＴ  ＥＲＴ中の２人の適格な対象が、最低８週間離れて逐次的に登録されて、効力のある用量であると予想されるより低い用量を受ける。各対象はスクリーニングを経験し（−３５日目〜−１日目）、適格である場合、１日目にＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の単回ＩＣ投薬を受け、観察のために投薬後およそ３０〜３６時間病院に滞在する。対象は、スクリーニングの間２週間ごとにかつＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の投与後最高で８週間まで、ＩＴ  ＥＲＴを受け続ける。ＩＴ  ＥＲＴ注入の直前に、ＣＳＦ  ＴＰＰ１活性のトラフレベルを測定する。トラフＴＰＰ１活性は、注入から検出不能であると予想され、一方で遺伝子療法からのＴＰＰ１活性は、投与後１〜４週間測定可能であると予想される。トラフＴＰＰ１活性が測定可能であり次第及びあらかじめ指定された基準が満たされた場合には、ＩＳＣは、ある特定のあらかじめ指定された基準が満たされた場合に、ＩＴ  ＥＲＴ注入を停止すると決断し得る。対象は、最低でも、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２後２週及び４週の時点でＩＴ  ＥＲＴを受け、８週目の来院前に最高で４週間ＩＴ  ＥＲＴを絶たれる。ＩＳＣは、この対象に対する最初の８週間の間に獲得された安全性データ（８週目の来院中に獲得されたデータを含む）を審査し、安全性懸念がない場合、次の対象が登録され得る。第二の対象は、いつＩＴ
ＥＲＴを中断するかを決定することにおいて同じ工程を経験する。安全性審査要因（ＳＲＴ）が観察されない場合（表３５）、第二の対象に対する最高で８週目の来院までかつ８週目の来院を含んで獲得されたすべての安全性データはＩＤＭＣによって評価される。任意の事象が停止規則の基準を満たす場合、すべての安全性データについての完全な審査が実施されるまで、任意の新たな対象の投薬は保留される。投薬コホートの終わりの時点で計画されるまたはＳＲＴによって要求されるかどうかにかかわらない任意の所定のＩＤＭＣ会議で、ＩＤＭＣは、試験を停止する、現在の用量で付加的な対象に投薬する、次の投薬コホートに進む、またはより低い用量で進むことを勧告し得る。リアルタイムで、投薬された各対象の安全性及び忍容性を以下のように査定する。
【表２】
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【０２４８】
決断が第二の投薬コホートに進むことである場合、パートＩにおけるＩＴ  ＥＲＴ中の後続の２人の適格な対象は、初回投薬コホートと同じ投薬スキームに従い、後続の各患者の投薬は、先の対象に対する最初の８週間の間に獲得されたすべての安全性データ（８週目の来院中に獲得されたデータを含む）が審査された後に生じる。ＳＲＴが観察されない場合、第二の対象に対する最高で８週目の来院までかつ８週目の来院を含んで獲得されたすべての安全性データはＩＤＭＣによって評価される。
【０２４９】
ＩＤＭＣが、試験のパートＩＩに進むことが安全であると判定した場合には、ＩＴ  ＥＲＴを受けているところであるまたはＩＴ  ＥＲＴにナイーブであるおよそ１３人の付加的な対象が、競合的でかつ平行した様式で登録される。計画された年２回のＩＤＭＣ会議があるが、ＩＳＣはＩＤＭＣ会議をいつでも要求することを決断し得、それは登録を止めることも伴い得る。
【０２５０】
現在ＩＴ  ＥＲＴ中であるそうした対象は、適当なあらかじめ指定された基準が満たされた場合（例えば、安定したＣＲＳ、遺伝子療法からのＣＳＦ  ＴＰＰ１活性の証拠、及び他の基準が考慮されている）、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２療法のおよそ４〜６週間後にＥＲＴを中断することを求められる。変化が観察される場合、ＣＲＳ（運動及び言語ドメイン）を８週間ごとにまたはより高頻度に測定する。ＩＴ  ＥＲＴを再開するための具体的なガイドラインは、プロトコール開発時に前向きに規定され、ＣＲＳスコアの変化、ならびに治験責任医師自身の臨床評価及び判断に基づく可能性が高い。後者に関して、ＣＲＳ測定に近接した種々の臨床状況（例えば、病気、発作頻度）はスコアに影響を与え
得、疾患の進行を反映しない可能性があり；ゆえに、治療的介入（例えば、発作医薬の変更）及び付加的な試験を実施して、ＣＲＳスコアにおける可逆性を査定し得る。
【０２５１】
ＩＣ空間へのベクターの適用は、ヒトにおいてこれまで行われたことがないため、この処置の危険性はまだ判定されていない。当該処置は、もともと、いかなる画像化もせずに実施された１９１９年に記載された。２０人の対象における４３例の処置の症例シリーズは深刻な合併症を報告しておらず、技法が慎重な執刀医の管理下において安全であることを証明するであろうと結論付けた（Ａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９２０）。最小限を上回る危険性を表す後頭下穿刺による、潜在的に深刻な合併症がある。しかしながら、プロトコールは、これらの危険性を最小限に抑える徹底的な緩和ストラテジーを提案する。彼らの病歴及び手術歴またはＭＲＩに存在する解剖学的異常に基づき、合併症の危険性がより高くあり得る患者は調査から除外される。さらに、スクリーニング期間の間に獲得されたＭＲＩ画像は、参加施設の神経放射線科医／神経外科医のグループによって審査され、危険性をさらに最小限に抑えるＣＴ誘導の下で行われる処置を進めるには意見の一致が要される。計画された臨床試験においてこの処置を実施する医師には訓練プログラムも要される。全体として、予想は、本発明者らが見なし得る危険性が、頭痛及び注射部位反応を含めた、腰椎穿刺で見られるものによく似ているということである。
【０２５２】
治療用導入遺伝子を搭載したＡＡＶ血清型の臨床的安全性及び効力は、リポタンパク質リパーゼ欠損症に適応される、ＥＭＥＡにより承認された遺伝子療法ＧＬＹＢＥＲＡ（登録商標）（アリポジーンティパルボベク；ＧＬＹＢＥＲＡ  ＳｍＰＣ，２０１６）において立証されている。遺伝型の失明（ＭａｃＬａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｍａｑｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、Ｂ型血友病（Ｎａｔｈｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、及び他の多くの疾患適応症（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）に対するＡＡＶベクターを用いた臨床試験経験は、ＡＡＶ遺伝子療法の安全性及び潜在的効力に対する付加的な支持を提供する。ＡＡＶ９を含めたＡＡＶを利用したいくつかの進行中の遺伝子療法調査がある。しかしながら、ＡＡＶ媒介性遺伝子導入の長期にわたる危険性に対処する直接的臨床データは限定されており、長期にわたる危険性は未知のままである。
【０２５３】
ＩＳ療法が本調査において実行され、コルチコステロイド（１日目投薬前に１回メチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇ静脈内［ＩＶ］、及び２日目に０．５ｍｇ／ｋｇ／日で開始し、漸減しながら１２週目までに中断する経口プレドニゾン）、タクロリムス（２〜４ｎｇ／ｍＬの標的血中レベルで２日目〜２４週目、及び２４週目〜３２週目の間の８週間にわたって漸減する、経口で［ＰＯ］、０．５ｍｇ／ｋｇを１日２回［ＢＩＤ］）、及びシロリムス（−２日目に４時間ごと×３回の投薬の１ｍｇ／ｍ２の負荷用量、次いで−１日目から：４８週目まで１〜３ｎｇ／ｍｌの標的血中レベルでのＢＩＯ投薬に分割されるシロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日）を含む。
【０２５４】
免疫抑制は、安全性及び効力の両方に対するＡＡＶ及び／または導入遺伝子への免疫応答の影響を最小限に抑えるために、他のＣＮＳ指向性ＡＡＶ遺伝子療法調査に含まれており、安全でかつ忍容性が良好であるように見える。Ｌｙｓｏｇｅｎｅ（ＡＡＶｒｈ．１０ベクターに基づく産物を開発している）及びｕｎｉＱｕｒｅ（ＡＡＶ５ベクターに基づく産物を開発している）の２社は、プレドニゾロン、ＭＭＦ、及びカルシニューリン阻害剤であるタクロリムスのＩＳレジメンを利用した、サンフィリポ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩ）を有する患者における臨床試験を行った。Ｌｙｓｏｇｅｎｅは、遺伝子療法後３年間にわたる安全性データにより、良好な忍容性、注射産物に関係した有害事象（ＡＥ）がないこと、及び免疫抑制薬に関係した毒性の生物学的徴候がないことが示されたことを報告した（Ｔａｒｄｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。同様に、ｕｎｉＱｕｒｅは、遺伝子療法後１年間にわたって、治験療法または処置に関係した局所炎症または他の安全性懸念がないことを報告した（ＵｎｉＱｕｒｅ，２０１５）。
【０２５５】
進行中のＡＡＶ９媒介性ＩＴ遺伝子導入調査において、ＧＡＮ遺伝子に少なくとも１つのミスセンス変異を有するＧＡＮ患者は、コルチコステロイド単独でのＩＳを受け、一方でヌル変異を有する１人の患者は、コルチコステロイド、タクロリムス、及びシロリムスでのＩＳを受けて、適応性抗導入遺伝子応答のより高い潜在的危険性を最小限に抑えた（Ｂｈａｒｕｃｈａ−Ｇｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。今までのところ、当該療法は、臨床上忍容性が良好であることが報告されており、ＣＳＦ及び末梢ＡＡＶ９  ＮＡＢ力価の両方における観察される上昇、ならびにＣＳＦ髄液細胞増加は、臨床的安全性に影響を与えるようには見えない。
【０２５６】
提案される調査において、ＩＳレジメンは、使用にとって適切であると見なされ、以下の理由で計画されている。
・とりわけ遺伝子産物の完全な欠如をもたらし得る遺伝子変異を有する患者において、ＴＰＰ１に対する潜在的に過剰な免疫応答を阻止するまたは最小限に抑えるため。そのような免疫応答は、導入遺伝子を発現する組織に対する過敏性反応または免疫介在性反応の危険性を増加させ得る。
・ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２及び／またはＩＴ  ＥＲＴの生物活性を潜在的に低下させ得る、ＴＰＰ１に対するＮＡｂの形成またはＴＰＰ１に対するＮＡｂの増加（既存のＮＡｂを有する可能性が高いＥＲＴ中の患者における）を阻止するため。
【０２５７】
コルチコステロイドは、慎重に、ＡＡＶ治療後早期に見られ得る即時の炎症の程度を低下させ、ゆえに組織損傷を引き起こし得る炎症応答の能力を最小限に抑え、ならびにＴ細胞及びＢ細胞媒介性適応免疫応答をプライムする。タクロリムスはカルシニューリン阻害剤であり、それはＴ細胞活性化におけるかなり早期のステップを遮断し、損なわれたサイトカイン産生、ならびにＴ細胞の拡張及びエフェクター細胞への分化の遮断につながる。それは、主に肝臓及び腎臓移植において、ステロイド及びＭＭＦとともに移植後レジメンの一部としてルーチン的に用いられる（Ｓｃａｌｅａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。タクロリムスは、導入遺伝子などの外因性抗原に対するＴ細胞媒介性免疫応答を阻止するために使用可能な有効な薬物である。導入遺伝子に対するＢ細胞抗体産生にはＴ細胞ヘルプも要されるため、この作用物質は、細胞媒介性免疫及び液性免疫の両方を遮断するのに有効であると予想され得る。
【０２５８】
ラパマイシンとしても知られるシロリムス（ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）ＵＳＰＩ，２０１７）は、カルシニューリン阻害剤のものとは異なるメカニズムを介して作用し；それは、細胞内シグナル伝達及び代謝経路を遮断することによって、サイトカインがＴ細胞の拡張及び成熟を促進し得る能力を阻害する。しかしながら、その正味の効果は、同じ細胞過程の多くを標的にすることである。それは、移植後ＩＳにおいてもよく用いられる（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。加えて、非臨床及び臨床調査により、シロリムスは調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の相対的温存を提供し得、それにより、リバウンド免疫反応なく薬物の離脱を可能にし得ることが示唆される（Ｈｅｎｄｒｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。遺伝子療法文献、及びタクロリムスで最初に治療される対象となる患者に対する固形臓器移植臨床試験の両方に前例があり、次いで、免疫抑制効力の優れた持続を有して、ラパマイシンへの「変換」の成功を有する（Ｅｌ−Ａｇｒｏｕｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【０２５９】
様々な免疫抑制剤に対する療法の継続期間は、ヒト移植におけるそれらの使用の成功、及びＭＰＳ  ＩＩＩまたはＧＡＮ遺伝子療法調査に利用された設計に部分的に基づく。対象を、調査の間、とりわけＩＳを低下させるまたは中断する際に、任意のＡＥについて実験室検査及び臨床検査によって綿密にモニターする。
【０２６０】
以下の評価項目が提案される。
安全性査定：
・ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２投薬後の安全性：ＡＥ、ＳＡＥ、実験室評価、バイタルサイン、ＥＣＧ、ＥＥＧ、身体検査、視力、発達の診査事項、及び神経学的査定
・免疫原性測定
・ＡＡＶ９に対する中和抗体、ならびにＣＳＦ及び血漿におけるＴＰＰ１に対する結合抗体
・酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ：ＡＡＶ９及びＴＰＰ１に対するＴ細胞応答
・ウイルス排出：ＣＳＦ、血清、及び尿中のベクター濃度
効力査定：
・血漿及びＣＳＦにおけるＴＰＰ１活性
・自然病歴コホートと比較した、ＣＲＳの６ポイントの組み合わせた言語及び運動ドメインにおいて、逆転しない（持続的な）２カテゴリー衰退（すなわち、言語及び運動ドメインのそれぞれにおいて１つ、または運動ドメインのみで２つ）を有しない対象、ならびにＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２後に、ＩＴ  ＥＲＴナイーブの対象に対して７２週間及びＩＴ  ＥＲＴ治療された対象に対して８０週間を通じてレスキュー医薬なしの対象の割合・自然病歴コホートと比較した、ＣＲＳの６ポイントの組み合わせた言語及び運動ドメインにおいて、逆転しない（持続的な）２カテゴリー衰退（すなわち、言語及び運動ドメインのそれぞれにおいて１つ、または運動ドメインのみで２つ）を有しない対象、ならびにＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２後の９６週間（ＩＴ  ＥＲＴナイーブ）／１０４週間（ＩＴ  ＥＲＴ治療された）を通じてレスキュー医薬なしの対象の割合
・自然病歴コホートと比較した、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２後の７２週間（ＩＴ  ＥＲＴナイーブ）／８０週間（ＩＴ  ＥＲＴ治療された）、及び９６週間（ＩＴ  ＥＲＴナイーブ）／１０４週間（ＩＴ  ＥＲＴ治療された）を通じた、ＣＲＳの６ポイントの組み合わせた言語及び運動ドメインにおける衰退の平均速度、ならびにベースラインからの変化
・自然病歴コホートと比較した、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２投薬後の７２週間（ＩＴ
ＥＲＴナイーブ）／８０週間（ＩＴ  ＥＲＴ治療された）、及び９６週間（ＩＴ  ＥＲＴナイーブ）／１０４週間（ＩＴ  ＥＲＴ治療された）を通じた、ＣＲＳの組み合わせた及び個々の構成要素（運動、言語、視力、発作ドメイン）における衰退の平均速度、ならびにベースラインからの変化
・ＣＲＳの６ポイントの組み合わせた運動及び／または言語ドメインにおける、逆転しない２カテゴリー衰退までの時間
・知能指数（ＩＱ）のための検証された機器（ウェクスラー短縮版知能尺度［ＷＡＳＩ−ＩＩ］）
・ヴァインランド適応行動尺度、第２版（ＶＡＢＳ−ＩＩ）からの親報告
・ＭＲＩによる灰白質及び白質ならびにＣＳＦ脳室の容量分析
・ＳＤ−ＯＣＴによる網膜厚
・ＱＯＬ測定：小児生命の質目録（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）（ＰｅｄｓＱＬ）総合的コア尺度（Ｇｅｎｅｒｉｃ  Ｃｏｒｅ
Ｓｃａｌｅｓ）及びＣＬＮ−２特異的補足；乳幼児生命の質質問票（Ｉｎｆａｎｔ  Ｔｏｄｄｌｅｒ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（商標）（ＩＴＱＯＬ）
【０２６１】
提案される臨床試験では、ＣＳＦにおけるＴＰＰ１酵素活性、ならびに、ｉ）ＣＬＮ２病ＣＲＳの６ポイントの組み合わせた言語及び運動ドメインにおいて、逆転しない（持続的な）２カテゴリー衰退（すなわち、言語及び運動ドメインのそれぞれにおいて１つ、または運動ドメインのみで２つ）を有しない対象（Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２
００２）；ならびにｉｉ）「レスキュー」ＩＴ  ＥＲＴ注入を有しない対象、として定義される応答者としてカテゴリー分けされる対象の割合を含めた、効力についての複数の測定が評価される。２組の患者集団（すなわち、ＩＴ  ＥＲＴナイーブ及びＩＴ  ＥＲＴ治療された）が、パートＩＩの拡張コホートにおいて計画され、ＩＴ  ＥＲＴナイーブの対象は７２週間追跡され、ＩＴ  ＥＲＴ治療された対象は８０週間追跡され、組み合わせた２つの患者集団を自然病歴コホートと比較する。これら２つの集団を組み合わせる主な理由は、一般的なＣＬＮ２病の希少性、及びＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の近年の承認後のＩＴ  ＥＲＴナイーブの患者のさらなる低下に起因して、試験登録を促すためである。ＩＴ  ＥＲＴ治療された患者における任意の残存ＥＲＴの潜在的な影響、ならびにＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２についての査定に対する潜在的交絡効果に起因して、「ウォッシュアウト」期間が調査設計に組み入れられる。ＣＳＦ及び血漿におけるＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）に関するＰＫデータは、ＣＳＦ及びリソソームにおけるそれぞれおよそ７時間及び１１．５日間の半減期を有して、明らかな蓄積またはＰＫ時間依存性がないことを示唆し（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）ＥＰＡＲ）、ゆえに、ＩＴ  ＥＲＴの中断後最高で４週間という提案される「ウォッシュアウト」期間は適当である。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２高用量群における組み合わせたＩＴ  ＥＲＴナイーブの対象及びＩＴ  ＥＲＴ治療された対象と、外部の自然病歴対照群における最も近い１−１でマッチした対象とを比較することによって、応答者分析を用いて分析を行う。マクネマー正確検定を実施して、マッチした集団を分析する。自然病歴対照群からの１−１でマッチした対象を、ベースラインＣＬＮ２スコア、±６ヶ月齢、及び共通の遺伝子型に基づいて選択する。１つを上回る数のマッチが生じる場合、以下の順序（１）詳細な遺伝子型及び（２）性別で、付加的な基準に対してさらにマッチさせることによって選択を狭める。この分析を、ＩＴ  ＥＲＴナイーブの対象に対して７２週の時点で、及びＩＴ  ＥＲＴ治療された対象に対して８０週の時点で実施する。ベースラインＣＲＳ（組み合わせた運動及び言語ドメイン）スコアは、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２群に対するＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２注射前である。自然病歴対照群におけるマッチした対象に対する７２週を通じたデータを分析に用いる。
【０２６２】
米国におけるＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の承認は、９６週の期間にわたり、ＣＬＮ２病ＣＲＳの運動ドメインにおいて、逆転しない（持続的な）２カテゴリー（生の）衰退がないまたは０の逆転しないスコアを有する対象の割合についての主要効力評価項目に基づいた。ＢｉｏＭａｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによるもともと提案された主要効力評価項目は、４８週間にわたり、運動−言語総スコアにおいて、逆転しない（持続的な）２ポイントレート（傾き）の衰退がないまたは０のスコアを有する対象の割合であった。機関は、運動−言語総スコアを用いることに同意せず、運動ドメインのみの使用を勧告した。主要効力分析のための時点も、４８週から、効力の実質的な証拠が４８週及び７２週の時点で見い出されなくなった後の、９６週に修正された。対照的に、Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）は、歴史的な自然病歴データと比較して、４８週の調査期間中に、ＣＬＮ２病ＣＲＳの組み合わせた運動及び言語ドメインに関する２ポイント衰退を有しなかった対象の割合に基づいて、ＥＭＡによって承認された。いくつかの感度及び支持的分析もこれらの結果を裏付けた。
【０２６３】
機関は、Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）販売申請における種々の調査にわたって用いられるＣＬＮ２病ＣＲＳの比較可能性に対するいくつか懸念を提起した（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＦＤＡ承認審査概要）。臨床転帰査定審査において特定された最初の重要な問題は、用いられる記述子の潜在的差異により、それ自体が、とりわけ「２」というスコア前後の定性的記述子の引用される例において、特定のスコアが臨床上何を意味するかについての明確な理解に役立ち得ないという懸念であった。機関によって特定された第二の問題は、ｉ）自然病歴調査における対象が、実演査定及び二次的供給元（例えば、カルテ、親との面談等）を通じて遡及的及び前向きの両方で臨床医によって評定され、一方で
Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）中核的調査における対象は、実演査定のみを通じて前向きに臨床医によって評定された、という評定の異なる方法；ならびにｉｉ）ＣＬＮ２  ＣＲＳ尺度が、自然病歴調査及びＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）中核的調査において、それぞれおよそ１２週間及び８週間ごとに査定された、という査定の異なるスケジュール、の両方をめぐるものであった。本発明者らは、機関の審査から、自然病歴調査及びＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）中核的調査において用いられたＣＬＮ２尺度への評定の相違があったように、映像比較可能性調査からの知見も、ＣＬＮ２運動−言語総スコアにおける言語項目の使用を支持しなかったと理解する。言語項目とのより大きな不一致があることが観察された。
【０２６４】
言語技能及び発達についての査定は、ＣＬＮ２病患者集団において重大であり、ゆえに、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の計画された臨床試験におけるＣＲＳに組み入れられる。言語ドメイン（それは、Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）販売申請の審査中にＦＤＡ／ＣＤＥＲによって特定された［Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＦＤＡ承認審査概要］）を組み入れる利用性に関する潜在的懸念に対処するために、緩和計画を実行して、このツールを用いた潜在的バイアスを除去する。具体的には、
・一貫性のある言語ドメイン評定により、各調査内及び調査間の運動−言語総スコアの解釈及び直接比較が容易になり得るように、自然病歴調査において用いられる言語ドメイン評定についての元の記述テキストを用いる。
・評価は、複数の独立した盲検検査官による、映像査定の複数の無作為審査を組み入れ、各対象に対する複数の審査のうちの１つのみが、正しい／本当の時系列で完了する（他の審査は、映像査定の無作為に並べ替えた順序で実施される（及び破棄される））。このようにして、縦断的でかつ個体間のスコアリングが、いかなる潜在的バイアスも導入せずに、同じ検査官によって実施される。
【０２６５】
サンプルサイズ算出は、自然病歴コホートと比較した、ＣＲＳの６ポイントの組み合わせた言語及び運動ドメインにおいて、逆転しない（持続的な）２カテゴリー衰退（すなわち、言語及び運動ドメインのそれぞれにおいて１つ、または運動ドメインのみで２つ）を有しない対象、ならびにＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２後に、ＩＴ  ＥＲＴナイーブの対象に対して７２週間及びＩＴ  ＥＲＴ治療された対象に対して８０週間を通じてレスキュー医薬なしの対象の割合に対して、マクネマー正確検定を用いて実施されている。第一のコホートにおける２人の適格な対象に加えて、高用量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２群における合計１５人の対象が、ＩＴ  ＥＲＴナイーブの対象に対して７２週及びＩＴ  ＥＲＴ治療された対象に対して８０週の時点で、応答者の割合における６０％前後の差を検出することを要され、自然病歴対照群、ならびにＩＴ  ＥＲＴナイーブ及びＩＴ  ＥＲＴ治療されたＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２群においてそれぞれ３５％及び９５％前後の応答率、０．０５の両側有意水準、ならびに８０％検出力が推測された。自然病歴対照群における７２週の時点での３５％の応答率は、４８週の時点で４５％の応答率が報告されたＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）調査結果に基づいて推定された。
【０２６６】
データの全体に基づく臨床効力の確立
ＦＤＡは、希少疾患に対する薬物開発を促す複数の機会を提供し、産業界に対するＦＤＡドラフトガイダンス：Ｅｘｐｅｄｉｔｅｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｒｉｏｕｓ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ−Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ−２０１４において欠損遺伝子の標的化に具体的に対処している。このガイダンスは、希少遺伝子疾患に対する製品の登録を支持するのに十分であり得る評価項目に関連したいくつかの洞察も提供し、「一部のよく理解された酵素欠損に関して、欠損した酵素の補充は臨床的有益性を確実に予測する」と述べている。これは、導入遺伝子発現活性を確実に示す遺伝子療法が、２１  ＣＦＲ  ３１４、ｓｕｂｐａｒｔ  Ｈの下での加速した承認のための基準を満たし得ることを示唆する。さらには、この主張に基づき、欠損した酵素レベルが公知の病因に
つながり、かつそれらの補正または正常化が、臨床上意義のある効果と関連付けられる疾患に対して、早期承認の評価項目に対する論証がなされ得る。
【０２６７】
以前に承認されたＥＲＴの背景において、酵素レベル（典型的に副次的評価項目）と臨床上意義のある転帰（先行する主要評価項目）との間の相関関係はすでに確立されている。これらの場合、ＣＬＮ２病を含めた多くのＬＳＤなどにおいて、機能する遺伝子コピーの送達の成功及びその後の導入遺伝子産物の発現は、臨床転帰の観察される向上に十分に先立って、早期の時点で顕著である（ＣＳＦリソソーム貯蔵物質の低下または酵素活性の測定結果などにより）。これは、遺伝子療法後の酵素活性が、臨床的有益性の代理として用いられ得ることを示唆する。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の承認におけるＦＤＡディレクターメモにおいて近年述べられているように、提案される承認の根拠としての酵素活性の使用はＦＤＡ前例とも合致しており、それは、「ＣＬＮ２はＴＰＰ１の欠損に特異的に寄与するため、ＴＰＰ１の補充が持続的であるまたは治療が疾患の過程において早期に始められる場合、その兆候の逆転または予防は理論的に可能である」と応答の持続期間の承認可能性を取り上げている。それゆえ、ＴＴＰ１活性を評価項目として用いる潜在性は、ＦＤＡガイダンスと合致する。
【０２６８】
リソソーム貯蔵物質の病的蓄積及びＣＬＮ２病の公知の病因を予防することにおけるＴＰＰ１酵素活性の確立された役割に基づき、ＴＰＰ１活性の大幅でかつ持続的な増加は、神経行動学的機能における長期安定化を予測する可能性が高い。種々の量のＴＰＰ１を発現するマウスＣＬＮ２変異体を評価した調査からのデータに基づき、正常の３〜６％のＴＰＰ１酵素活性レベルが、疾患の発症を劇的に遅らせ及び生存率を増加させるのに十分であるように見える（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＣＬＮ２病を有する患者からの付加的な臨床データは、ＣＬＮ２におけるある特定の変異が、ＴＰＰ１酵素活性の不完全な喪失（少なくとも末梢組織における）及びその後長引く表現型につながることを示唆する（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｂｅｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。さらに、永久埋め込み型デバイスを介したＣＳＦへの隔週注入として投与される、組み換えＴＰＰ１（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、セルリポナーゼアルファ、ＢｉｏＭａｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いたＥＲＴは、ｉ）ＦＤＡによる９６週間の調査期間にわたる運動機能の衰退；ならびにｉｉ）ＥＭＡによる４８週間の調査期間にわたる運動及び言語機能の両方の衰退、を安定化させると判定された。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２は、ＣＮＳにおけるＴＰＰ１の効率的でかつ持続的な発現のために設計され、ＣＦＳへのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の１回限りの送達は、ＴＰＰ１酵素の長期供給源を提供し、ならびに満たされていない高い必要性を有するこの希少遺伝子疾患における疾患の進行及び神経認知の衰退を止める（または大幅に遅らせる）潜在性を有する。ゆえに、臨床データが、臨床上意義のあるＣＲＳにおける安定化のより長期にわたる向上を示唆する、早期の時点でのＣＳＦにおけるＴＰＰ１酵素活性の大幅でかつ継続的な増加を示す場合、将来的な販売申請におけるＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２の効力への主要な支持を提供するこれらのデータの妥当性がＦＤＡとともに議論される。
【０２６９】
実施例１６：デジタル生態動物園（ｄｉｇｉｔａｌ  ｖｉｖａｒｉｕｍ）を用いた、バッテンマウスにおける脳室内ＡＡＶ９．ｈＣＬＮ２ｃｏ効力についての査定
バッテン病の一形態であるＣＬＮ２病は、可溶性酵素トリペプチジルペプチダーゼ−１（ＴＰＰ１）をコードする遺伝子における変異によって引き起こされる神経変性リソソーム貯蔵障害である。当該疾患は、小児期中期までの死亡前に、発作及び運動失調を有する、２〜４歳での早期発症を特徴とする。組み換えＴＰＰ１（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＢｉｏＭａｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いた酵素補充療法（ＥＲＴ）が近年承認され、永久埋め込み型デバイスを介した側脳室への隔週注入として投与されている。組み換え酵素の短い半減期に起因して、反復注入が必要である。ゆえに、反復
投与に伴う重い負担なく、患者において持続的なＴＰＰ１酵素活性を提供し得る療法に対する重大な満たされていない必要性が残る。
【０２７０】
これに対処するために、本発明者らは、ＣＬＮ２病のマウスモデルであるＴＰＰ１ｍ１Ｊ変異体において、ヒトＴＰＰ１をコードする脳室内（ＩＣＶ）ＡＡＶ９の効力を査定する調査を行った。ＴＰＰ１ｍ１Ｊマウスは、寿命の短縮、発作、または異常歩行など、ヒト疾患のほとんどの特質を反復する。しかしながら、このモデルにおける神経行動学的機能の客観的モニタリングは、それらが３ヶ月齢以降にストレス誘発性致死性発作を起こしやすく、かつこの歳より前にいかなる測定可能な欠損も提示しないことから困難である。これを回避するために、本発明者らは、デジタル生態動物園（Ｖｉｕｍ，Ｉｎｃ．）におけるバイアスのない非侵襲的フルタイムモニタリングシステムを用いた。この技術は、いかなるオペレーター操縦もなく、単独で飼育されたマウスのホームケージにおける連続的記録を可能にし、ゆえにストレス及び外部バイアスを限定する。７週齢のＣ５７Ｂｌ／６
ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスは、右脳室に３×１０１１ＧＣのＡＡＶ９−ｈＣＬＮｃｏの単回投薬を受け；ビヒクルを注射されたＷＴ同腹仔及びＴＰＰ１ｍ１Ｊマウスを対照として用いた。記録は処理の２週間後に開始し、屠殺または予定外の死亡まで続いた。ＩＣＶ注射後１６週の調査終結時に、剖検を実施し、脳及び肝臓をサンプリングした。
【０２７１】
すべてのマウスは、以下のパラメーター：
−夜間動作
−日常動作
−呼吸速度
−概日リズム
の連続的記録を有して、Ｖｉｕｍスマートハウスで単独で飼育された。
【０２７２】
加えて、週１回の臨床観察及び体重を文書で記録した。記録は、ＡＡＶ９−ｈＣＬＮｃｏ  ＩＣＶ注射の２週間後（９週齢）に開始し、予定された屠殺（注射後１６週、２３週齢）までまたは予定外の死亡の場合にはその前まで続いた。調査を通じて、死亡及び瀕死動物の安楽死を記録した。ＩＣＶ注射後１６週の予定された調査終結時に、残った動物において剖検を実施し、脳及び肝臓重量を記録し、ならびに脳及び肝臓における組織病理についての査定を行った。
【０２７３】
すべての未処理ＫＯ動物は、振戦、猫背の姿勢、異常歩行、もしくは発作を有する、または瀕死で発見されもしくは死んで発見され、一方でベクター処理されたＫＯ動物の５４％は、調査を通じて目立ったことはなかった。ビヒクル処理されたすべてのＫＯは、早くも１４．９週に開始する報告された臨床徴候を有し、一方でベクター処理されたＫＯの５４％（１３匹のうちの７匹）は、調査を通じて臨床上目立ったことはなかった。最初の臨床事象時の平均齢は、ＫＯビヒクル処理された動物において１６．１週、及び臨床事象が記録された６ベクター処理されたＫＯにおいて１８．６週であり；７ベクター処理されたＫＯは、臨床事象を有しなかった。処理は、すべての動物において忍容性が良好であり、肝臓において超生理学的ＴＰＰ１活性をもたらし、及びＫＯマウスの寿命を増加させた。最終評価項目の時点（２３週齢）で、未処理ＫＯマウスの０％に対して、処理されたＫＯの６２％が生存した（図２２Ｂ）。ベクターは、臨床事象の発生を遅らせかつ減少させた（表２）。ベクター処理されたマウスの寿命は有意に増加した（図２５Ａ及び２５Ｂ）。ビヒクル処理された動物の生存期間中央値は、ＫＯ雄において１７．６週、及びＫＯ雌において１７．４週であった（単独で飼育された未処理ＴＰＰ１ｍ１Ｊマウスの生存期間に対する性別効果なし）（図２２Ａ）。死亡は、臨床上目に見える徴候の発症の平均１．５週間後に生じた。最終屠殺評価項目の時点（注射後１６週、２３週齢）で、処理された雄の５７％（７匹のうちの４匹）及び処理された雌の６７％（６匹のうちの４匹）が生存し、一方ですべての未処理ＫＯマウスは１９週齢までに死亡した（図２２Ａ及び２２Ｂ）。
処理されたＫＯマウス及びビヒクル処理されたＫＯマウスの生存曲線の比較は、処理された動物における生存率の統計的に有意な増加を示している（ログ−ランク・マンテル−コックス検定、ｐ＜０．０００１）。
【表３】
2020519292.tif 000004
【０２７４】
さらに、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターは、疾患に関連した体重減少を阻止した（図２３Ａ及び２３Ｂ）。処理は、二相性概日動作プロファイル（データ示さず）、及び週平均夜間動作（図２４）を保存した。ＷＴ及び処理されたＫＯ動物の両方とも、明確な二相性概日動作プロファイルを示し、一方でビヒクル処理されたマウスは、１６週齢前後で二相性プロファイルを失い始めた。スマートケージを用いた動作の連続的記録により、１４．７週齢から以降のビヒクル処理されたＴＰＰ１ｍ１Ｊマウスにおける、その他の点では無症状のマウスにおける、神経行動学的機能障害の検出が可能となった（図２４）。呼吸速度は、すべての群において同等であった（示さず）。
【０２７５】
デジタル生態動物園によって可能となった反復測定を活用すると、線形混合効果モデリングを用いた夜間動作速度についての統計分析は、１４．７週齢で開始する、ベクター処理されたＫＯマウスにおける有意な治療的有益性を示し、一方で最初の臨床事象時の平均齢は１６．１週であった。これは、ＫＯマウスが、肉眼で目に見える臨床徴候の発症に先行する神経行動学的機能障害を有すること、及び処理がこの機能障害をレスキューしたことを立証している。神経行動学的パラメーターのレスキューに対応して、神経炎症のマーカーであるアストロサイトーシス（図２５Ａ及び２５Ｂ）は、ベクター処理された動物において減少した。
【０２７６】
結局のところ、これらの結果は、神経行動学的兆候を阻止する、生存率を増加させる、生命の質を維持する、及びＣＬＮ２病に関係した神経炎症をレスキューする、ＡＡＶ９媒介性遺伝子療法の治療効力を立証している。最先端のデジタル生態動物園を用いて、本発明者らは、このモデルにおける客観的な早期の効力読み取りを提供する、発症前マウスにおける概日リズム異常の存在も立証した。このパイロット調査は、脳脊髄液中へのＡＡＶ９の単回投与が、ＣＬＮ２病の治療に対する反復ＥＲＴの代替策であり得ることを示唆する。
【０２７７】
２０１８年４月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５２，００６号、２０１７年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９，８１６号、及び２０１７年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／５０４，８１７号がそうであるように、本明細書において引用されるすべての公開された文書は、参照により本明細書に組み入れ
られる。同様に、本明細書において参照され及び添付の配列表に登場する配列番号は、参照により組み入れられる。本発明は特定の実施形態を参照して記載されているものの、本発明の精神から逸脱することなく改変が加えられ得ることが解されるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の内に入ることが意図される。
【０２７８】
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数字識別子＜２２３＞の下でのフリーテキストを含有する配列に対して提供される。
【表４】
2020519292.tif 000005
【図１Ａ】
2020519292.tif 000006
【図１Ｂ】
2020519292.tif 000007
【図２】
2020519292.tif 000008
【図３】
2020519292.tif 000009
【図４】
2020519292.tif 000010
【図５】
2020519292.tif 000011
【図６】
2020519292.tif 000012
【図７−１】
2020519292.tif 000013
【図７−２】
2020519292.tif 000014
【図８Ａ】
2020519292.tif 000015
【図９】
2020519292.tif 000016
【図１０】
2020519292.tif 000017
【図１１】
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【図１２−１】
2020519292.tif 000019
【図１２−２】
2020519292.tif 000020
【図１３−１】
2020519292.tif 000021
【図１３−２】
2020519292.tif 000022
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2020519292.tif 000026
【図１８】
2020519292.tif 000027
【図１９】
2020519292.tif 000028
【図２０】
2020519292.tif 000029
【図２１−１】
2020519292.tif 000030
【図２１−２】
2020519292.tif 000031
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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