(57)【要約】ヒト多能性幹細胞を、分析、スクリーニングプログラム等で使用するためのオリゴデンドロサイトを含むオリゴデンドロ−スフェロイドに、インビトロで分化させる。
2020519237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでヒトオリゴデンドロサイトを作製する方法であって、
多能性幹細胞の浮遊培養に神経系の運命を誘導し、神経系前駆細胞のスフェロイドを提供すること、
スフェロイドの前記神経系前駆細胞を、オリゴデンドロサイトを含むヒトオリゴデンドロ−スフェロイド（ｈＯＳ）に分化するよう分化させること、及び
前記ヒトオリゴデンドロ−スフェロイドを神経系用培地に長期間維持し、髄鞘を形成するオリゴデンドロサイト、ニューロン及びアストロサイトが含まれる培養を導くこと
を含む、方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞は、髄鞘障害に関連した少なくとも１つのアレルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞は人工多能性幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞の浮遊培養は、前記多能性幹細胞の無傷のコロニーを有効用量のＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養することによって神経系の運命に誘導される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記神経系用培地は、多能性幹細胞を神経系の運命に誘導するために有効な用量のドルソモルフィン及びＳＢ−４３１５４２を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記浮遊培養は支持細胞層を用いない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記神経系用培地はさらに有効用量のｗｎｔ阻害剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
神経系前駆細胞を維持するために有効な用量のＦＧＦ２及びＥＧＦを含む神経系用培地で培養することによって、細胞を神経系前駆細胞に分化させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ソニック・ヘッジホッグ経路アゴニスト及びレチノイン酸、またはソニック・ヘッジホッグ経路アゴニスト及びＷｎｔ阻害剤を用いて、スフェロイドのパターン形成を行うことをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＧＦ２及びＥＧＦを欠き、かつ、有効用量のＰＤＧＦ−ＡＡ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、インスリン、ｃＡＭＰ、Ｔ３、及びビオチンを含む神経系用培地で培養することによって、神経系前駆細胞をオリゴデンドロサイトに分化させることをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
作製したオリゴデンドロ−スフェロイドを、増殖因子を欠くがアスコルビン酸、インスリン、ｃＡＭＰ、Ｔ３、及びビオチンが含まれる神経系用培地で長期間維持することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
フローサイトメトリー、磁性免疫選択、またはイムノパニングによって皮質性の球体からオリゴデンドロサイトを単離することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
単離されたオリゴデンドロサイトを候補薬剤または関心対象処置に曝露する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴデンドロサイトを、ニューロンまたは神経細胞前駆細胞と組み合わせる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項９または１０に記載の方法によって得られるオリゴデンドロサイトの集団。
【請求項１６】
ヒトオリゴデンドロサイトに対する候補薬剤の効果を判定する方法であって、
前記オリゴデンドロサイトが任意選択で神経疾患に関連した変異をコードする少なくとも１つのアレルを含み、請求項９または１０に記載の方法に従ってヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から分化させたアストロサイトの１つまたは１パネルと前記候補薬剤とを接触させること、及び
形態、遺伝子または機能のパラメータに対して前記候補薬剤が及ぼす効果を判定すること
を含む、方法。
【請求項１７】
前記候補薬剤は、免疫エフェクター細胞または免疫調節剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴデンドロサイトのパネルは、遺伝子型が異なる少なくとも２つのアストロサイトを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
オリゴデンドロサイトのパネルは、異なる環境条件下のオリゴデンドロサイトを含む、請求項１８に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトの中枢神経系の複雑な発達を理解し、患者の神経障害及び精神障害の機序を解明することにおいて、機能するヒトの脳組織へのアクセスが制限されていることにより、大きな進展は見られていない。げっ歯類及び他の哺乳類での研究では、神経発達の基本原理に関する重要な洞察が与えられたが、霊長類で前脳が大きく発達していることの原因となる細胞及び分子のプロセスも、またヒトに特異的な、前脳の多数の特徴の原因となる細胞及び分子のプロセスも、ほとんど分かっていない。
【０００２】
近年、この分野では、細胞の初期化という、最終分化した体細胞が多能性幹細胞に変換され得る過程を導入してパラダイムシフトが達成され、その多能性幹細胞はヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）と命名された。これらのｈｉＰＳＣはいかなる個体からも作製することができ、重要なことには、神経系細胞を含め、胚葉性のすべての誘導体への分化をインビトロで誘導することができる。
【０００３】
ｈｉＰＳＣを作製する方法及び効率は大幅に改善され、あちこちの研究機関で標準化されてきているが、特定の神経系細胞種及びグリア細胞種に誘導する方法は引き続き課題となっている。この１０年で、単層における多能性幹細胞の神経系への特異化及び分化に関するプロトコルが改善されたことにより、多種多様な細胞が作製されるに至った。それでもなお、２次元（２Ｄ）の方法では、発達中の３次元（３Ｄ）神経系の細胞構築、または生体内神経系のネットワーク及び回路の複雑性と機能性とを再現しにくい。さらに、これらの方法は骨が折れるうえに費用がかかり、効率が悪く、比較的未成熟なニューロンを生じさせる。
【０００４】
オリゴデンドロサイトは、脳機能で重要な役割を果たす中枢神経系にあるグリア細胞である。オリゴデンドロサイトは、ニューロンの軸索に絶縁層を巻き付ける突起を伸長させ、ニューロン間でシグナルがより急速に伝達されるようにしている。オリゴデンドロサイトはまた、ニューロンへの栄養因子の供給と細胞外環境の緩衝とによって支持的役割も果たす。髄鞘形成の消失は、ニューロンの死及び神経系機能障害をもたらし得る。結果として、多発性硬化症または白質消失病など多くのヒト疾患が髄鞘形成の消失または低下に関連している。
【０００５】
健康及び疾患における髄鞘形成の研究では、利用可能な適切なモデルが少ないことから限界がある。げっ歯類は、ヒト生物学の側面を研究するための代替として一般的に使用されるが、ヒトの脳では髄鞘形成はげっ歯類の脳よりはるかに広範囲にわたる。さらに、ヒト患者から得た利用可能な健常脳試料の数には限界があるため、ヒトの脳で髄鞘形成を広く研究することはできない。近年、インビトロでの髄鞘形成研究用に、ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞（ｈＥＳＣ、ｈｉＰＳＣ）からオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）及びオリゴデンドロサイトを作製する試みがなされてきた。
【０００６】
ｈＥＳＣ由来及びｈｉＰＳＣ由来の髄鞘形成モデルは、正常状態及び疾患状態下のオリゴデンドロサイトの発達及び髄鞘形成という過程を研究するために不可欠であるばかりではなく、調合薬のスクリーニングに応用することもできる。これらのモデルを使用して、特定の疾患状態に関連した特異的異常を修正する化合物をスクリーニングすることも、また新治療用化合物及び化学物質の毒性をヒトへの曝露に先立ち試験することもできる。特に、神経毒性の分野では、神経細胞またはグリア細胞の機能障害を評価することができる試験法は、ヒト細胞ではまだない。
【０００７】
したがって、ニューロンの髄鞘形成など、高度に機能するヒト組織を再現するインビトロのスクリーニングプラットフォームの開発が最も重要である。
【０００８】
刊行物
霊長類の分化した体細胞を多能性状態に初期化させる方法には、分化した体細胞の核移植、分化した体細胞と多能性幹細胞との融合、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を産生させる直接的初期化が含まれる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２、Ｐａｒｋ  ＩＨ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：１４１−１４６、Ｙｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−１９２０、Ｋｉｍ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：４７２−４７６、Ｓｏｌｄｎｅｒ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ．１３６：９６４−９７７、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：１２６９−１２７５、Ｌｉ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：１６−１９）。
【発明の概要】
【０００９】
中枢神経系ニューロンを用いて３次元系で培養され得る、ヒトのＯＰＣ及び髄鞘を形成するオリゴデンドロサイトをインビトロで作製するための組成物及び方法を提供する。本発明の特徴は、治療薬物及び治療レジメン用に細胞を疾患に関連させて作製しスクリーニングすることを可能にする、ＯＰＣ及びオリゴデンドロサイトを患者試料から作製する能力である。かかる方法はヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を利用するが、これは患者または保因者の細胞試料、例えば、脂肪細胞、角化細胞、線維芽細胞等から得てよい。ｈｉＰＳＣを、インビトロで外胚葉運命が発生するよう誘導し、その後、オリゴデンドロサイトを含有するスフェロイド、すなわちヒトオリゴデンドロ−スフェロイド（ｈＯＳ）、ならびに神経系前駆細胞、アストロサイト及びニューロンに分化させる。ｈＯＳから細胞集団を単離することも、また無傷のｈＯＳを相互作用細胞集団のモデルとして使用することもできる。ｈＯＳ及びそれに由来する細胞は、移植用、実験評価用、系列及び細胞に特異的な産物の供給源等として使用できる。いくつかの実施形態では、細胞培養は支持細胞を用いず、異種由来成分不含である。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態では、疾患関連オリゴデンドロサイトなど、これに限定されない精製されたヒトのＯＰＣまたはオリゴデンドロサイトの集団を提供し、その場合、かかる細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から分化させる。いくつかの実施形態では、そのようなインビトロで作製される細胞のパネルを提供し、その場合、かかるパネルには、遺伝子の異なる２つ以上の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、そのような細胞のパネルを提供し、その場合、かかる細胞は、複数の候補薬剤、またはある候補薬剤の複数用量に供され得る。候補薬剤には、低分子、すなわち、目的ＲＮＡの発現、電気的変化を増加または減少させる遺伝子構成体、及び薬物などが含まれる。いくつかの実施形態では、パネルとは、２つ以上の異なる状態から得た患者個別の細胞を用いる系または方法を指し、状態は、遺伝学的に別個の３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上の状態であってよい。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態では、ｈＯＳから得たオリゴデンドロサイトに対する候補薬剤の活性を決定する方法を提供し、かかる方法は、候補薬剤を、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から分化させた、精製されたニューロン、アストロサイト、ＯＰＳまたはオリゴデンドロサイトの集団の１種またはパネル１組と接触させることを含む。細胞集団は、任意選択で、髄鞘形成性もしくは脱髄性疾患もしくはオリゴデンドロサイトの発達障害が関連するかまたは生じる変異をコードする少なくとも１つのアレルを含み、その後、遺伝子発現プロファイリングなど、これに限定されない、形態、遺伝子または機能のパラメータに対して薬剤が及ぼす効果を判定する。スクリーニング方法と免疫エフェクター細胞とを併用し、オリゴデンドロサイトのそのような免疫細胞の活性及び髄鞘形成、またはｈＯＳのオリゴデンドロサイト、アストロサイトと、患者から得た自己由来免疫細胞との相互作用を決定してよい。単個細胞レベルでの分析方法は特に関心対象であり、例えば、髄鞘形成試験法、単個細胞遺伝子発現、オリゴデンドロサイトがニューロンまたはアストロサイトに及ぼす作用、及び神経細胞シグナル伝達等である。候補薬剤には、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ミクログリア細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞など、及び免疫エフェクタータンパク質、例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、サイトカイン、インターフェロンなどが含まれ、特に、炎症性脱髄性疾患での関与が疑われるような細胞及びタンパク質が含まれる。
【００１２】
本発明の方法は、オリゴデンドロサイトの分化及び髄鞘形成における神経系細胞と前駆細胞との自然の相互作用を利用する。いくつかの実施形態では、ｈｉＰＳＣからオリゴデンドロサイトへの分化は実質的に無血清培地で実施される。
【００１３】
ｈＯＳでの分化後、オリゴデンドロサイトなど、これに限定されない、関心対象の個々の細胞種を各種目的用に単離することができる。細胞は、発達の適切な段階で採取されるが、その段階は、所望の細胞種のマーカー発現及び表現型の特性に基づいて決定してよい。培養は、関心対象マーカーの存在についての免疫染色もしくは遺伝子発現、または形態学的決定等、いずれによっても経験的に試験してよい。薬物による選択、パニング、密度勾配遠心等による陽性選択ステップの前または後に任意選択で細胞を濃縮する。別の実施形態では、陰性選択を実施し、その場合、かかる選択は、ヒトのＥＳ細胞、線維芽細胞、神経系細胞、上皮細胞等で見られるマーカーの１つ以上の発現に基づいて行われる。選択には、パニング法、磁性粒子による選択、粒子選別装置による選択等を用いてよい。
【００１４】
さまざまな体細胞がｈｉＰＳＣの供給源として利用されるが、特に関心対象となるのは、脂肪組織由来幹細胞、線維芽細胞、角化細胞、末梢血細胞等である。遺伝子型、特に、神経障害及び精神障害に関連している可能性がある遺伝子型が異なる複数の個人から得たｈｉＰＳＣを使用することが特に関心対象となる。ｈｉＰＳＣを単個細胞に解離させ、特定細胞数のスフェロイドに集合させてから浮遊状態で増殖させ、その後、ＢＭＰ経路及びＴＧＦβ経路を阻害することによって神経系の運命に誘導する。その後、スフェロイドをＦＧＦ２及びＥＧＦの存在下で培地に移し、Ｗｎｔ経路阻害剤またはレチノイン酸、ならびにソニック・ヘッジホッグ経路のアクチベーターでパターン形成させる。分化を促進するため、スフェロイドを、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、インスリン、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ｃＡＭＰ、Ｔ３、及びビオチンを含む培地に交換する。そのような培養後、スフェロイドは、インスリン、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、Ｔ３、及びビオチンを含有している神経系用培地で、増殖因子非存在下、長期間、例えば、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月またはそれ以上の期間、維持が可能である。
【００１５】
本発明のこれら及び他の課題、利点、ならびに特徴は、下記で十分に詳述される、対象とする方法及び組成物の詳細を読むと、当業者には明らかとなる。
【００１６】
本発明は、添付の図面と併せて読むと、以下の詳細な説明から最も良く理解される。通例に従い、図面のさまざまな特徴は、縮尺通りではないことが強調される。むしろ、さまざまな特徴の大きさは、分かりやすくするために任意に拡大または縮小されている。図面には、以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、３ＤヒトｉＰＳＣ由来オリゴ−スフェロイド（ｈＯＳ）で産生されたオリゴデンドロサイト前駆細胞及び成熟オリゴデンドロサイトである。ｈＯＳの５１日目の固定切片ではＮＫＸ２．２／ＯＬＩＧ２+ オリゴデンドロサイト前駆細胞が存在している。図１Ｂは、ｈＯＳの１００日目の固定切片におけるＯ４+ 及びＯ１+ オリゴデンドロサイトの例である。図１Ｃは、ｈＯＳの１１５日目の固定切片において、ＭＢＰ+ 成熟オリゴデンドロサイトの分布を示す免疫蛍光標識である。図１Ｄは、ｈＯＳの１１５日目の固定切片において、物理的に相互作用するＭＢＰ+ のオリゴデンドロサイトの突起とＧＦＡＰ＋のアストロサイトの突起の例である。図１Ｅは、ｈＯＳの１１５日目の固定切片において、ニューロフィラメント＋の軸索に巻き付くＭＢＰ+ のオリゴデンドロサイトの突起の例である。図１Ｆは、ヒトｉＰＳＣ由来ｈＯＳの髄鞘形成の例である。髄鞘が形成された軸索の透過型電子顕微鏡画像はインビトロで１００日目に撮像された。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本願組成物及び方法を記載する前に、本発明は、記載されている特定の組成物及び方法に限定されるものではなく、そのような組成物及び方法は当然ながら異なり得ることを理解されるべきである。本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、あくまで個々の実施形態の記載を目的とするものであり、限定することを意図しないということも理解されるべきである。
【００１９】
値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限と下限との間に介在する値のそれぞれ（文脈で特に明確な指示がない限り、下限の１０分の１の単位まで）も明確に開示される。記述された範囲内の任意の記述された値または介在している値と、その記述された範囲内で他に記述されているか介在している任意の値とに挟まれる、より小さな範囲の各々は、本発明に包含される。これらの小範囲の上限及び下限は、その記述された範囲内に独立して含まれても除外されてもよく、また、その小範囲内にある、限界値の一方もしくは両方を含むかまたはいずれも含まない範囲の各々も、その記述された範囲で明確に除外された限界値に従って、本発明に包含される。記述されている範囲に限界値のうち一方または両方が含まれる場合、その含まれた限界値のいずれかまたは両方を除外した範囲もまた本発明に含まれる。
【００２０】
特に明記しないかぎり、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、本発明が属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。本発明の実施または試験に際し、本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の任意の方法及び材料も使用することができるが、有力かつ好ましい方法及び材料のいくつかをここに記載する。本明細書で言及される刊行物はすべて、引用されている刊行物と関連させて方法及び／または材料を開示及び記載するために参照することにより本明細書に組み込まれる。矛盾がある限り、本開示は、組み込まれた刊行物のいかなる開示にも優先すると理解される。
【００２１】
本明細書及び添付の請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「初期化因子ポリペプチド」への言及には、そのようなポリペプチドの複数が含まれ、「人工多能性幹細胞」への言及には、当業者に公知の１つ以上の人工多能性幹細胞及びその同等物への言及が含まれるということになる。
【００２２】
本明細書で論じる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のみを目的として提供されている。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明を理由としてかかる刊行物に先行する権利がないことを承認するものと解釈すべきではない。さらに、記載の刊行日は実際の刊行日と異なる可能性があり、実際の刊行日を個別に確認する必要がある可能性がある。
【００２３】
「多能性」及び多能性幹細胞により、そのような細胞が、生物内であらゆる種類の細胞に分化する能力を有することを意味する。用語「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）のように、生物内であらゆる種類の細胞に分化する能力を維持したまま長期の培養が可能であるが、ＥＳＣとは異なり、分化した体細胞、すなわち、潜在能力がより狭く、より定義されてしまった、実験操作なしでは生物内であらゆる種類の細胞を生じさせるということはできなかった細胞に由来する、多能性細胞を包含する。ｈｉＰＳＣは、ヒトＥＳＣ様の形態をしており、平坦なコロニーで増殖し、核−細胞質比が大きく、境界は画定され、核が際立っている。さらに、ｈｉＰＳＣは当業者に公知のいくつかの多能性マーカーを発現し、それらには、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１６０、ＴＲＡ−１８１、ＴＤＧＦ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＴＥＲＴ、及びＺＦＰ４２が含まれるが、これに限定されるものではない。さらに、ｈｉＰＳＣは奇形腫を形成することができる。ｈｉＰＳＣは、生きている生物内で外胚葉、中胚葉、または内胚葉の組織を形成するかまたはかかる組織に寄与することができる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「初期化因子」とは、細胞に作用して転写を変化させ、それにより細胞を初期化して複能性または多能性にする生物学的に活性な因子の１つ以上、すなわちカクテルを指す。初期化因子は、細胞、例えば、線維芽細胞、脂肪細胞等などの心疾患についての関心対象の家族歴または遺伝子構造を有する個体から得た細胞に対し、個々別々かまたは初期化因子の単一組成物として、すなわち、予混合組成物として提供されてよい。因子は、同一モル比または異なるモル比で提供されてよい。因子は、対象発明の細胞の培養期間中、１回または複数回提供されてよい。いくつかの実施形態では、初期化因子は、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ３、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ−２８など、これに限定されない転写因子である。
【００２５】
体細胞を、上記で定義したような初期化因子と、ある組み合わせで、細胞を多能性に初期化するために十分な量で接触させる。初期化因子は、体細胞に対し、個々別々かまたは初期化因子の単一組成物として、すなわち、予混合組成物として提供されてよい。いくつかの実施形態では、初期化因子は、ベクター上の複数のコード配列として提供される。体細胞は、当該技術分野で公知のように線維芽細胞、脂肪細胞、間質細胞等であってよい。体細胞またはｈｉＰＳＣは、セルバンク、正常ドナー、関心対象の神経性疾患または精神疾患を有する個人等から得ることができる。
【００２６】
多能性の誘導に続き、ｈｉＰＳＣを任意の好都合な方法に従って、例えば、照射支持細胞及び市販培地などで培養する。ｈｉＰＳＣは、プロテアーゼ、例えば、アクターゼなどを用いて支持細胞から解離させることができ、プレートから単個細胞に剥離するために十分な濃度及び期間で消化させることが好ましい。
【００２７】
遺伝子は、多種多様な目的で体細胞またはそれに由来するｈｉＰＳＣに導入してよく、例えば、機能喪失変異がある遺伝子の交換、マーカー遺伝子の提供等のために導入してよい。別法として、アンチセンスｍＲＮＡまたはリボザイムを発現するベクターを導入し、それにより、望ましくない遺伝子の発現を遮断する。遺伝子治療の他の方法は、正常前駆細胞を優位にして選択圧を受けやすくさせる薬物耐性遺伝子の導入であり、例えば、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、またはＢＣＬ−２のような抗アポトーシス遺伝子である。上述のように、当該技術分野で公知のさまざまな技術を使用して標的細胞に核酸を導入してよく、例えば、電気穿孔法、カルシウム沈降ＤＮＡ、融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染等がある。ＤＮＡを導入する特定の方法が本発明の実施に重要というわけではない。
【００２８】
用語「オリゴデンドロサイト」、「オリゴデンドロサイト前駆細胞」等は、オリゴデンドロサイト系列の細胞、すなわち、最終的にオリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）、及び成熟したミエリン形成性オリゴデンドロサイトを生じさせる神経系前駆細胞を包含し得、それらは、本発明の目的のため、実験操作によってオリゴデンドロサイト以外の細胞から生じる。オリゴデンドロサイトは、以下に考察するようにオリゴデンドロサイト系列細胞に特異的なマーカーによって同定することができる。オリゴデンドロサイトは機能的特性を有してよい、すなわち、ニューロンに髄鞘を形成する能力などを有してよい。「オリゴデンドロサイト前駆細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）」または「オリゴデンドロサイト前駆細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）」は、オリゴデンドロサイトを含め、子孫を生じさせる能力がある細胞であると定義される。
【００２９】
オリゴデンドロサイトは、中枢神経系の髄鞘形成細胞である。オリゴデンドロサイトは多くの突起を伸長させ、軸索に接触し、長く伸びていく軸索に被膜を形成していく。こうして巻き付いたオリゴデンドロサイトの膜の層がその後凝縮して髄鞘を形成する。１本の軸索には、多くの異なるオリゴデンドロサイトによる髄鞘節が含有され得る。
【００３０】
髄鞘形成には、オリゴデンドログリア細胞系列の成熟における多数の連続的ステップを要する。これらのステップには、細胞表面抗原の発現の協調的変化を伴う。オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーには、例えば、血小板由来増殖因子α受容体（ＰＤＧＦＲ−α）が含まれる。オリゴデンドロサイトの他のマーカーには、ネスチン、プロテオリピドタンパク質、ポリシアリル化形態の神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ガングリオシドＧＤ３、及び炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡ−ＩＩ）が含まれる。ＣＡ−ＩＩなどのいくつかのマーカーは、系列のすべての段階をカバーし、成体オリゴデンドロサイトのマーカーでもある。同様に、ガラクトシルセラミド及び硫酸化ガラクトシルセラミドは、成熟オリゴデンドロサイトの表面に存在したまま残る初期マーカーである。特定のミエリンタンパク質をコードする他の遺伝子は、オリゴデンドロサイトの分化及び成熟が異なる段階で発現される。例えば、２’，３’−環状ヌクレオチド−３’−ホスホヒドラーゼ（ＣＮＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＰＬＰ／ＤＭ−２０、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、及びミエリン／オリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）の各遺伝子、ならびに他の少数のミエリンタンパク質はすべて、成熟オリゴデンドロサイトのマーカーである。
【００３１】
オリゴデンドロサイトの成熟及び生存には数多くの因子を要すると推測されてきた。これらの因子を、本発明のヒトオリゴデンドロサイト培養を用いて試験することができる。関心対象の因子には、ＰＤＧＦ、塩基性ＦＧＦ、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、グリア増殖因子（ＧＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＩＬ−６、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β及びＩＬ−２が含まれ得る。
【００３２】
髄鞘は、脊椎動物の神経系に最も大量にある膜構造を構成している。髄鞘に脂質が大量に存在し水含有量が少ないことにより、軸索の電気的絶縁が可能になり、また髄鞘形成された領域の独特な分節構造は神経インパルスの跳躍伝導に関与している。これにより、髄鞘は、脊椎動物中枢神経系の比較的細い軸索で素速い神経伝導を支持することができる。高速伝導、長距離シグナル伝達の忠実性、及び空間経済は、脊椎動物神経系に髄鞘が付与する主要利点である。
【００３３】
髄鞘形成及びこの複雑な過程を調節するシグナルの機序を、本発明の細胞及び培養を用いて試験してよい。連続的ステップがあり、３Ｄスフェロイド内で髄鞘形成されるべき軸索へとオリゴデンドロサイトが遊走する、かかる軸索にオリゴデンドロサイトの突起が接着する、軸索周囲への突起の巻き付けを、所定数の髄鞘で、髄鞘形成対象外の空間を認識して行う、というステップである。これらのステップの各々を、提案する発明の生きた細胞で試験し、操作することができる。さらに、発達時のオリゴデンドロサイトとアストロサイトとの相互作用を、ここに提示の３Ｄスフェロイドで試験することができる。また、スフェロイドは培養で長期生存するため、これらの相互作用における経時的な髄鞘の可塑性及び変化を試験することもできる。
【００３４】
脳の領域間のオリゴデンドロサイトの遊走を、提案する発明で試験することもできる。脳の発達の際、外套下部で波のように初期オリゴデンドロサイトが産生され、皮質または外套へ遊走する。オリゴデンドロサイトを含有するスフェロイドを皮質スフェロイドと融合させ、遊走動態、方向性の鍵、及び皮質へのオリゴデンドロサイトの遊走を支配する対立シグナルのモデルを作製することができる。この系は、異常なオリゴデンドロサイトの遊走または分布が役割を果たしている可能性がある疾患の研究に使用することもできる。オリゴデンドロサイトは生体内では組織を通って遊走するので、提案する３Ｄモデルでは、２Ｄオリゴデンドロサイトモデルの場合のように平坦な表面に沿う場合とは対照的に、オリゴデンドロサイトの遊走がより良く保持される可能性が高い。
【００３５】
オリゴデンドロサイトは、インビトロでの培養細胞としてのさまざまな使用に加え、適切な動物モデルでの試験も可能である。あるレベルにおいて、細胞を、生体内で生き残り、その表現型を維持する能力について評価する。細胞組成物を免疫不全動物（ヌードマウス、または化学的に、もしくは照射によって免疫不全になっている動物など）に投与する。再増殖期間の後、組織を採取し、投与した細胞またはその子孫がまだ存在しているか否かについて評価するが、その後、関心対象処置に対する応答について表現型を解析してよい。動物モデルで適性を決定することもでき、その際、損傷後に続いて生じる回復の程度、または疾患の場合は、本発明の分化細胞を用いた処置の結果としての回復の程度を評価することを手段とする。
【００３６】
疾患との関連性
多数の病理がオリゴデンドロサイトの機能不全に関連している。ヒトの遺伝性髄鞘疾患である白質ジストロフィーは、髄鞘形成不全、髄鞘低形成、または脱髄により生じる可能性がある。髄鞘形成不全及び髄鞘低形成は、胎生期または乳児期初期に髄鞘形成に障害が生じるもので、ペリツェウス−メルツバッハー病のさまざまな型で観察される。髄鞘の崩壊である脱髄は、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ＡＬＤ、カナバン病、アレキサンダー病、正染性白質ジストロフィー、またはミトコンドリア病などの代謝性白質ジストロフィーの特徴である。髄鞘形成不全及び脱髄は、白質ジストロフィーの一部の型に統合され得る。
【００３７】
いくつかの遺伝性疾患は白質脳症を生じさせ得、その場合、脱髄は、血管、ミトコンドリア、もしくは神経細胞の変化に続発しているか、または徴候が広範に分布する代謝性疾患に関連し得る。皮質下梗塞と白質脳症とを伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）は、常染色体優性脳動脈症である。ＭＲＩで多発性の皮質下梗塞が証明され、おおよそ広範になり得る白質の脱髄を伴う。ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群）は、血清及びＣＳＦ中の乳酸対ピルビン酸比の上昇を伴う乳酸アシドーシスを呈する。ＭＲＩでは、白質の変容が皮質萎縮症と共に存在することが示される。
【００３８】
フェニルケトン尿症は脱髄に関連し得る。中間代謝異常も脱髄を生じさせる場合がある。いくつかの遺伝性神経細胞疾患は髄鞘に影響を及ぼし得る（ＧＭ２ガングリオシドーシス、ウィルソン病、及びＣＮＳ変性疾患）。
【００３９】
血液脳関門の崩壊は、ＣＮＳの脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、ＥＡＥの脱髄型、及びウイルス誘導性脱髄などの病理学的徴候における主要事象である。Ｔ細胞はこの過程において極めて重要な役割を果たす。活性化Ｔ細胞のＣＮＳへの接近は、炎症細胞、マクロファージ、及びミクログリアによる、炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α及びインターフェロン−γなどの放出の原因であり得る。
【００４０】
用語「治療」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「「治療する（ｔｒｅａｔ）」等は本明細書では一般に、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指すために使用される。かかる効果は、疾患またはその症状を完全もしくは部分的に予防するという点で予防的であり得、及び／または、疾患及び／またはかかる疾患に起因する有害作用に対する部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒という点で治療的であり得る。本明細書で使用する場合、「治療」は、哺乳類、特にヒトの疾患の任意の治療を包含し、それには、（ａ）疾患または症状にかかりやすい可能性はあるが、まだそのように診断されていない対象において、かかる疾患または症状の発現を予防すること、（ｂ）疾患の症状を阻害すること、すなわち疾患症状の発症を停止させること、または（ｃ）疾患の症状を軽減すること、すなわち疾患もしくは症状を退縮させることが含まれる。
【００４１】
用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は本明細書では同じ意味で使用され、診断、治療、または療法が所望される任意の哺乳類対象、特にヒトを指す。
【００４２】
本発明の方法
ヒトオリゴデンドロ−スフェロイド（ｈＯＳ）のインビトロ細胞培養及びそこに含まれる細胞、具体的にはオリゴデンドロサイト及びニューロンを獲得及び使用するための方法を提供し、その場合、かかる細胞をヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から分化させる。いくつかの実施形態では、ｈｉＰＳＣは、神経学的に正常な個体から得られた体細胞に由来する。他の実施形態ではｈｉＰＳＣは、上記の髄鞘形成関連疾患など、これに限定されない神経疾患に関連した変異をコードする少なくとも１つのアレルを含む個体から得られた体細胞に由来する。いくつかの実施形態では、そのようなオリゴデンドロサイトのパネルを提供し、その場合、かかるパネルには、遺伝子が異なるオリゴデンドロサイトが２つ以上含まれる。いくつかの実施形態では、そのようなオリゴデンドロサイトのパネルを提供し、その場合、かかるオリゴデンドロサイトを、複数の候補薬剤もしくは他の治療介入、または複数の候補薬剤用量または他の治療介入に供する。候補薬剤には、低分子、すなわち、目的ＲＮＡの発現、電気的変化を増加または減少させる遺伝子構成体、及び薬物など、これに限定されない。
【００４３】
疾患関連細胞での候補薬剤の活性を決定する方法も提供し、かかる方法は、候補薬剤を、神経疾患に関連した変異をコードする少なくとも１つのアレルを任意選択で含むヒト多能性幹細胞から分化させた細胞、例えば、ｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣから分化させた細胞などの１つまたは１パネルと接触させること、及び遺伝子発現プロファイリングが非限定的に含まれる、形態、遺伝子または機能のパラメータに対し薬剤が及ぼす効果を判定することを含む。これらの方法は、遺伝性疾患モデルの他、オリゴデンドロサイトの成熟及び髄鞘形成に影響を与える環境操作に応用することができ、これには、酸素張カ、温度、及び加える力の変更が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４４】
ヒトオリゴデンドロ−スフェロイド（ｈＯＳ）及びそこに含まれる細胞、例えば神経系前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、アストロサイト、髄鞘形成オリゴデンドロサイト及びニューロンなどを体細胞から作製するには多段階過程を用いる。初めに、ｈｉＰＳＣは、任意の好都合な供給源から得ることも、また当該技術分野で認められている方法を使用して体細胞から作製することも可能である。ｈｉＰＳＣを支持細胞から解離させ、ＦＧＦ２非存在下で、好ましくは単個細胞として解離した際に、浮遊培養で増殖させる。ある実施形態では培養には、例えば、ビトロネクチンでコートした容器で増殖させた場合などに、支持細胞層を用いず、ｈｉＰＳＣを単個細胞浮遊液として解離させ、特定サイズのスフェロイドに集合させる。培養さらに、非ヒト成分不含、すなわち、異種由来成分不含であってよい。浮遊液増殖には、任意選択で、有効用量の選択的Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤が培養初期、最高約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間までの期間、培地中に含まれる（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：６８１  ６８６を参照のこと）。そのような目的に有用な阻害剤には、限定することなく、Ｙ−２７６３２；チアゾビビン（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２０１３，２３（１０）：１１８７−２００；ファスジル（ＨＡ−１０７７）ＨＣｌ（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２０１４，１２４（９）：３７５７−６６）；ＧＳＫ４２９２８６Ａ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２０１４，１１１（１２）：Ｅ１１４０−８）；ＲＫＩ−１４４７；ＡＴ１３１４８等が含まれる。
【００４５】
その後、ｈｉＰＳＣの浮遊培養を神経系の運命に誘導する。この培養は、支持細胞なしであってよい。神経系の誘導には、有効用量のＢＭＰ阻害剤、及び有効用量のＴＧＦβ経路阻害剤を少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、及び最高約１０日、最高約９日、最高約８日、最高約７日、最高約６日、最高約５日の期間培地に加える。例えば、ドルソモルフィン（ＤＭ）を、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約５０μＭ、最高約１００μＭの濃度という有効用量で加えることができ、これは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型受容体（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３及びＡＬＫ６）を阻害する。他の有用なＢＭＰ阻害剤には、限定することなく、Ａ８３−０１、ＤＭＨ−１、Ｋ０２２８８、ＭＬ３４７、ＳＢ５０５１２４等が含まれる。ＳＢ−４３１５４２は、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約５０μＭ、最高約１００μＭの濃度という有効用量で加えることができ、これは、ＴＧＦβシグナル伝達を阻害するがＢＭＰシグナル伝達には全く影響を与えない。他の有用なＴＧＦβ阻害剤には、限定することなく、ＬＤＮ−１９３１８９（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２０１５，１２５（２）：７９６−８０８）、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１４，７４（２１）：５９６３−７７）、ＬＹ２１０９７６１（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１４，３２６Ｃ：９−１７）、ＳＢ５２５３３４（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ，２０１４，２６（１２）：３０２７−３５）、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、カルトゲニン、ＤＭＨ１、ＬＤＮ−２１２８５４、ＭＬ３４７、ＬＤＮ−１９３１８９ＨＣｌ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２０１３，１１０（５２）：Ｅ５０３９−４８）、ＳＢ５０５１２４、ピルフェニドン（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２０１４，１０．１００７／ｓ００４１８−０１４−１２２３−０）、ＲｅｐＳｏｘ、Ｋ０２２８８、ヘスペレチン、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７等が含まれる。
【００４６】
有効用量のＷｎｔ阻害剤を培地中に２日目、３日目、４日目、５日目、６日目または７日目から開始して、例えば、約０．１μＭ〜約１００μＭなどの濃度で含めてよく、また、選択される阻害剤の活性に応じて約１μＭ〜約２５μＭの濃度で含めてよい。例示的な阻害剤として、限定することなく挙げると、ＸＡＶ−９３９は、タンキラーゼ１／２の阻害によりＷｎｔ／β−カテニン介在性の転写を選択的に阻害し、無細胞アッセイでのＩＣ５０は１１ｎＭ／４ｎＭであり、ＩＣＧ−００１は、Ｗｎｔ／β−カテニン／ＴＣＦ介在性の転写に拮抗して配列結合タンパク質（ＣＢＰ）に特異的に結合し、ＩＣ５０は３μＭであり、ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏは、Ｗｎｔ３Ａ発現Ｌ−細胞でＩＣ５０が１８０ｎＭであるＷｎｔ経路阻害剤であり、アキシン２タンパク質レベルを誘導し、アキシン−骨格分解複合体の安定化によりβ−カテニンのリン酸化を促進し、Ｗｎｔ−Ｃ５９（Ｃ５９）は、ルシフェラーゼを誘導する多量体化したＴＣＦ結合部位のＷｎｔ３Ａ介在性活性化に対するＰＯＲＣＮ阻害剤であり、ＨＥＫ２９３細胞でのＩＣ５０は７４ｐＭであり、ＬＧＫ−９７４は、強力かつ特異的ＰＯＲＣＮ阻害剤であり、ＴＭ３細胞でＷｎｔシグナル伝達を０．４ｎＭのＩＣ５０で阻害し、ＫＹ０２１１１は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害によりｈＰＳＣの心筋細胞への分化を促進し、ＡＰＣ及びＧＳＫ３βの下流で作用し得て、ＩＷＰ−２は、無細胞アッセイでのＩＣ５０が２７ｎＭである、Ｗｎｔのプロセッシング及び分泌の阻害剤であり、Ｐｏｒｃｎ介在性のＷｎｔパルミトイル化を選択的に遮断し、一般にＷｎｔ／β−カテニンには影響を与えず、Ｗｎｔの刺激を受けての細胞応答に対する影響を全く示さず、ＩＷＰ−Ｌ６は、ＥＣ５０が０．５ｎＭの極めて強力なＰｏｒｃｎ阻害剤であり、ＷＩＫＩ４は、ＴＮＫＳ２に対するＩＣ５０が１５ｎＭの新規タンキラーゼ阻害剤であり、Ｗｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達の阻害をもたらし、ＦＨ５３５はＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達阻害剤であり、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲδの二重アンタゴニストでもある。Ｗｎｔ阻害剤の代わりに、培地にレチノイン酸を１０ｎＭ〜１μＭの範囲の濃度で含めてよい。
【００４７】
ソニック・ヘッジホッグ経路のアゴニストを１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、または１５日目に加え始めてもよい。強力なアゴニストにはＳＡＧ及びパルモルファミンが含まれ、１００ｎｍ〜１０μＭの範囲の濃度で使用する。
【００４８】
浮遊培養をして約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、約１０日後、浮遊スフェロイドを神経系用培地に移し、神経系前駆細胞に分化させる。培地に有効用量のＦＧＦ２及びＥＧＦを添加する。増殖因子はそれぞれについて少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、最高約５００ｎｇ／ｍｌ、最高約２５０ｎｇ／ｍｌ、最高約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で提供され得る。
【００４９】
初期前駆細胞のオリゴデンドロサイトへの分化を促進するため、ＦＧＦ２／ＥＧＦへの曝露から約１週間、約２週間、約３週間、約４週間の後、神経系用培地を交換して、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＩＷＰ−２、及びＳＡＧを有効用量のＰＤＧＦ−ＡＡ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ３に置き換える。増殖因子はそれぞれについて少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、最高約５００ｎｇ／ｍｌ、最高約２５０ｎｇ／ｍｌ、最高約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で提供され得る。培地はさらに、例えば、インスリン、Ｔ３、ｃＡＭＰアナログ、ビオチン等を含んでよく、インスリンについては最高約５０μｇ／ｍｌ、最高約２５μｇ／ｍｌの濃度で含んでよい。
【００５０】
分化因子への曝露から約４週間、約５週間、約６週間、約７週間の後、球体は、増殖因子非存在下、神経系用培地中で長期間、例えば、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月またはそれ以上の期間、維持が可能である。神経系用培地は、アスコルビン酸、２５μｇ／ｍＬのインスリン、１μＭのｃＡＭＰアナログ、６０ｎｇ／ｍＬのＴ３、及び１００ｎｇ／ｍＬのビオチンを含んでよく、４〜５日おきに培地交換を行う。
【００５１】
フローサイトメトリー、磁性免疫選択、イムノパニング等など任意の好都合な方法によって球体から細胞集団を単離することができる。好都合なことに、ＰＤＧＦＲ及び／またはＭＢＰはそれぞれ、オリゴデンドロサイト前駆細胞及びオリゴデンドロサイトに対する陽性選択マーカーとして使用する。こうして単離された細胞は、許容される培地での再浮遊及び培養での維持、凍結、関心対象パラメータについての解析、ヒトまたは動物モデルへの移植等をすることができる。オリゴデンドロサイト前駆細胞またはオリゴデンドロサイトの集団が関心対象であり、例えば、ＣＮＳニューロンの髄鞘再形成の方法において、例えば、外傷性損傷後のニューロンの再増殖、また多発性硬化症のような脱髄性疾患の治療的処置などにおいての関心対象であり、その場合、有効用量の細胞がそれを必要とする患者に提供される。
【００５２】
スクリーニングアッセイ
低分子のスクリーニングアッセイでは、培養中の細胞に候補薬剤を加えることによる効果を、細胞と細胞環境とからなるパネルを用いて試験するが、その場合、かかる細胞環境には、イオン性変化などの電気刺激、関心対象の候補薬剤での刺激、ニューロン及び神経系前駆細胞、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞、ミクログリア細胞、マクロファージ等などが非限定的に含まれる他の細胞との接触という刺激のうち１つ以上が含まれ、また、オリゴデンドロサイトの各パネルは、遺伝子型、関心対象環境への曝露歴、提供される薬剤の用量等が異なってよい。通常、少なくとも１つの対照、例えば、陰性対照及び陽性対照が含まれる。細胞の培養は典型的に、滅菌環境で実施され、例えば、加湿した９２〜９５％空気／５〜８％ＣＯ2 雰囲気が含有されるインキュベーターで３７℃にて実施する。細胞培養は、ウシ胎児血清などの組成が不明確な生体液、または組成が完全に既知かつ無血清の培地を含有している栄養混合物中で行ってよい。形態学的変化、機能的変化及び遺伝子変化など、複数の出力パラメータをモニタリングして環境変化が与える影響を評価する。
【００５３】
遺伝因子のスクリーニングアッセイでは、細胞の遺伝子構成を変化させるためにパネル内の細胞のうち１つ以上にポリヌクレオチドを加えることができる。出力パラメータをモニタリングし、表現型に変化があるか否かを決定する。このような方法で、関心対象経路のタンパク質の発現をコードするかまたは影響を与える遺伝子配列を同定する。結果をデータ処理装置に入力し、スクリーニング結果のデータセットを得る。異なる条件下で得られたスクリーニング結果の比較及び分析にはアルゴリズムを使用する。
【００５４】
単個細胞レベルでの分析方法は特に関心対象であり、例えば、上記のように、原子間力顕微鏡、シングルセル遺伝子発現、シングルセルＲＮＡシークエンシング、カルシウムイメージング、フローサイトメトリー、髄鞘形成、電子顕微鏡、ライブイメージング等は関心対象である。さまざまなパラメータを測定して、薬物または処置がオリゴデンドロサイトに及ぼす効果を判定することができる。
【００５５】
パラメータは、定量化が可能な細胞成分であり、特に、正確に、望ましくはハイスループットシステムで測定することができる成分である。パラメータは任意の細胞成分または細胞産物でもあり得、これには、細胞表面決定因子、受容体、タンパク質またはその立体配座的修飾もしくは翻訳後修飾、脂質、炭水化物、有機分子もしくは無機分子、核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡなど、またはそのような細胞成分に由来する部分またはその組み合わせが含まれる。ほとんどのパラメータでは定量的な読み出しが得られるが、いくつかの場合には、半定量的または定性的な結果が許容される。読み出しには、単一の決定値が含まれても、または平均、中央値もしくは分散等が含まれてもよい。変動性が予測され、被験パラメータのセットの各々の値の範囲は標準的な統計方法を使用して取得し、共通の統計方法を用いて単一の値を取得する。
【００５６】
関心対象のパラメータには、細胞質の生体分子、細胞表面生体分子または分泌される生体分子の検出、多くの場合は生体高分子、例えば、本明細書に開示するさまざまな髄鞘成分を含め、ポリペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド、脂質等の検出が含まれる。細胞表面分子、髄鞘分子、及び分泌される分子は、細胞のコミュニケーション及び細胞エフェクター応答を仲介し、アッセイがより容易にできることから、パラメータの種類として好ましい。一実施形態では、パラメータには特定のエピトープが含まれる。エピトープは、しばしば、特異的モノクローナル抗体または受容体プローブを使用して同定される。場合によっては、エピトープを含む分子種は、２つ以上の物質であり、定義された構造を含む。パラメータは、特異的に修飾されたタンパク質またはオリゴ糖の検出であってよい。パラメータは、特異的モノクローナル抗体または決定基と結合するリガンドもしくは受容体で定義されてよい。
【００５７】
関心対象の候補薬剤は、多数の化学薬品の種類が包含される生物学的に活性な薬剤、有機金属分子が含まれ得る主要有機分子、無機分子、遺伝子配列等である。本発明の重要な態様は、候補薬物を評価し、好ましい生物学的応答機能を有する、治療用抗体及びタンパク質系治療薬を選択することである。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、しばしば、官能性化学基の少なくとも２つが含まれる。候補薬剤は、上記官能基の１つ以上で置換された、炭素環式（ｃｙｃｌｉｃａｌ  ｃａｒｂｏｎ）もしくは複素環式の構造及び／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含むことが多い。候補薬剤はまた、生体分子にも見られ、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、またはその誘導体、構造類似体もしくは組み合わせが含まれる。
【００５８】
薬理学的活性薬物、遺伝学的に活性な分子等が含まれる。関心対象化合物には、化学療法薬、抗炎症剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト、イオンチャネル修飾物質、及び神経活性剤が含まれる。本発明に好適な例示的な医薬品は、”Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９６），Ｎｉｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、以下の章（ｓｅｃｔｉｏｎ）：Ｄｒｕｇｓ  Ａｃｔｉｎｇ  ａｔ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｉｔｅｓ；Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇｓ；Ｖｉｔａｍｉｎｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ；ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙに記載の医薬品であり、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
検体化合物には、上記のすべてのクラスの分子が含まれ、内容物が不明の試料をさらに含んでよい。関心対象となるものは、植物などの天然材料に由来する天然に生じる化合物の複合混合物である。多くの試料は溶液中に化合物を含むが、適切な溶媒に溶解可能な固体試料をアッセイしてもよい。関心対象試料には、環境試料、例えば、地下水、海水、鉱業廃水など、生体試料、例えば、農作物、組織試料等から調製した溶解物など、製造時試料、例えば、医薬品調製の際の経時変化など、ならびに分析用に調製した化合物のライブラリー等が含まれる。関心対象試料には、潜在的治療価について評価する化合物、すなわち、薬物候補が含まれる。
【００６０】
試料という用語には、上記液体にさらなる成分、例えば、イオン強度、ｐＨ、総タンパク質濃度等に影響を与える成分などを加えたものも含まれる。さらに、試料を処理して、少なくとも一部の分取または濃縮を達成してよい。生体試料は、例えば、窒素下、凍結、またはその組み合わせなど、化合物の分解を抑制するように注意を払う場合は保存され得る。使用する試料容量は、測定可能な検出ができる量で十分であり、通常、約０．１ｍｌ〜１ｍｌの生体試料で十分である。
【００６１】
候補薬剤など化合物は、合成化合物または天然化合物のライブラリーなど、多種多様な材料から得られる。例えば、生体分子など多種多様な有機化合物のランダム及び指向性合成では多数の手段が利用可能であり、無作為化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現が含まれる。別法として、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態の天然化合物ライブラリーは利用可能であるかまたは容易に作製される。さらに、天然または合成によって作製されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を介して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーの作製に使用され得る。薬理作用がある既知の物質を指向性またはランダムな化学修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等などに供して構造類似体を生成してよい。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝因子」とは、ポリヌクレオチド及びその類似体を指し、細胞に遺伝因子を付加することにより、かかる因子を本発明のスクリーニングアッセイで試験する。遺伝因子の導入により、細胞の全体的な遺伝子構成が変更される。ＤＮＡなどの遺伝因子は、実験的に導入した変化を細胞のゲノムにもたらし得、一般に、染色体内への配列の組み込みを介して行う。遺伝子の変更は一過性でもあり得、その場合、その外来配列は組み込まれないがエピソーム因子として維持される。アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの遺伝因子は、ｍＲＮＡの転写または翻訳に干渉することによって、細胞の遺伝子型を変えずにタンパク質の発現に影響を与えることもできる。遺伝因子の効果は、細胞内の１つ以上の遺伝子産物の発現を増加または減少させることである。
【００６３】
ポリペプチドをコードする発現ベクターの導入を使用して、かかる配列を欠く細胞でコードされた産物を発現させるかまたは産物を過剰発現させることができる。構成的プロモーターまたは外部制御を受けやすいプロモーターのさまざまなものを使用することができ、その場合、後者の状況では、遺伝子の転写のオン・オフを行うことができる。これらのコード配列には、完全長ｃＤＮＡまたはゲノムのクローン、それに由来する断片、または天然に生じる配列と、他のコード配列の機能ドメインもしくは構造ドメインとを組み合わせるキメラが含まれ得る。別法として、導入配列は、アンチセンス配列をコードしてよく、アンチセンスオリゴヌクレオチド、天然配列のドミナントネガティブ変異または優勢変異もしくは構成的に活性な変異をコードするＲＮＡｉ、改変制御配列等であってよい。
【００６４】
アンチセンス及びＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の方法によって化学合成することができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、その細胞内の安定性及び結合親和性を高めるために、天然のホスホジエステル構造から化学的に修飾されている。そのような修飾の多数が文献に記載されており、それらは骨格、糖または複素環式塩基の化学を改変する。骨格化学における有用な変更は、ホスホロチオエート、非架橋の両酸素がイオウで置換されているホスホロジチオアート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートである。アキラルなリン酸誘導体には、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオアート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオアート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホナート及び３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミダートが含まれる。ペプチド核酸はリボースのホスホジエステル骨格全体をペプチド結合で置き換える。糖修飾、例えば、モルホリノオリゴヌクレオチド類似体なども、安定性及び親和性を高めるために使用される。デオキシリボースのα−アノマーを使用してよく、その場合、かかる塩基を、天然のβ−アノマーに対して反転させる。リボース糖の２’−ＯＨを変更して２’−Ｏ−メチル糖または２’−Ｏ−アリル糖を形成してよく、これにより、親和性を含まずに耐分解性が得られる。
【００６５】
薬剤を生物学的活性についてスクリーニングし、その際、薬剤を少なくとも１つの細胞、通常は複数の細胞に、１つまたは複数の環境条件で、例えば、β−アドレナリン作動薬での刺激後、電気的刺激後または機械的刺激後などに加えることによって行う。薬剤に応答した、パラメータ読み出しの変化を測定し、望ましくは正規化を行い、その後、得られるスクリーニング結果を、参照スクリーニングから得た結果、例えば、関心対象の他の変異を有する細胞、正常オリゴデンドロサイト、他のファミリーメンバー由来オリゴデンドロサイト等を用いた結果と比較することにより評価する。参照スクリーニングから得た結果には、異なる環境変化がある場合とない場合との読み出し、既知薬物が含まれているかいないかを問わず他の薬剤を用いて得られたスクリーニング結果などが含まれ得る。
【００６６】
薬剤は、溶液または易溶性形態で、培養中の細胞の培地に好都合に加えられる。薬剤は、間欠流または連続流としてフロースルーシステムで加えても、または別法として、大量化合物を単回もしくは徐々に増量して、他の点では変更がない溶液に加えてもよい。フロースルーシステムでは２種の液体を使用し、その場合、一方は生理学的中性溶液、もう一方は、同一溶液で被験化合物を加えたものである。第１の液体を細胞にかけ、その後、第２の液体をかける。単一溶液法では、大量の被験化合物を細胞を取り囲む培地容積に加える。培地の成分の全体濃度は、大量添加後、またはフロースルー法の２液間のいずれの場合でも、有意に変化させるべきではない。
【００６７】
好ましい薬剤処方物には、全体処方物に有意な影響を及ぼし得る防腐剤などのさらなる成分は含まれない。したがって、好ましい処方物は本質的に、生物学的に活性な化合物及び生理学的に許容される担体、例えば、水、エタノール、ＤＭＳＯ等からなる。ただし、化合物が溶媒不含の液体である場合は、処方物は本質的に化合物それ自体からなってよい。
【００６８】
異なる薬剤濃度で複数の試験法を並行して実施し、さまざまな濃度に対する差次的応答を得てよい。当該技術分野で公知のように、ある薬剤の有効濃度の決定には典型的に、１：１０、または他の対数スケール、希釈で得られる濃度範囲を使用する。濃度は、必要に応じて、第２の希釈系列でさらに精製してよい。典型的に、これらの濃度の１つを陰性対照として使用する、すなわち、ゼロ濃度もしくは薬剤の検出レベル以下、または検出可能な変化を表現型に与えない薬剤濃度以下の対照として使用する。
【００６９】
上記の機能性パラメータに加え、選択したパラメータの存在を定量化するためにさまざまな方法を利用することができる。存在する分子の量を測定する場合、好都合な方法は、蛍光性、発光性、放射性、酵素により活性などであり得る検出可能部分を用いて分子、特に、パラメータと高い親和性で特異的に結合する分子を標識することであり、蛍光部分は事実上いかなる生体分子、構造、または細胞種の標識にも容易に利用することができる。免疫蛍光部分は、特定タンパク質だけではなく、特定のコンフォメーション、切断産物、またはリン酸化のような部位修飾にも結合するよう指向させることができる。個々のペプチド及びタンパク質を人工操作して自己蛍光させることができ、例えば、細胞内に緑色蛍光タンパク質キメラを発現させることにより可能である（概説についてはＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１２）：４７７−８１を参照のこと）。したがって、抗体を遺伝子組換えし、その構造の一部として蛍光色素を得ることができる。
【００７０】
選択する標識に応じて、蛍光標識以外を使用してパラメータを測定してよく、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）のような免疫測定法、均一系酵素免疫測定法、及び関連する非酵素的技術を使用して測定してよい。これらの技術では特異的抗体をレポーター分子として利用するが、こうした抗体は、単一分子標的への結合が高度に特異的であるため特に有用である。米国特許第４，５６８，６４９号には、シンチレーション計測を利用するリガンド検出系が記載されている。これらの技術は、タンパク質もしくは修飾タンパク質のパラメータもしくはエピトープ、または炭水化物決定基に特に有用である。タンパク質及び他の細胞決定基についての細胞読み出しは蛍光タグまたは他のタグが付されたレポーター分子を使用して得ることができる。細胞を用いるＥＬＩＳＡまたは関連する非酵素的方法もしくは蛍光による方法により、細胞表面パラメータ及び分泌パラメータの測定が可能になる。捕捉ＥＬＩＳＡ及び関連する非酵素的方法では通常２つの特異的抗体またはレポーター分子が用いられ、溶液のパラメータの測定に有用である。フローサイトメトリー法は、細胞表面及び細胞内のパラメータならびに形状変化及び粒度を測定するため、ならびに抗体またはプローブが結合した試薬として使用されたビーズを解析するために有用である。そのような試験法から得られる読み出しは、個々の蛍光抗体検出細胞表面の分子もしくはサイトカインに関連した平均蛍光、または平均蛍光強度、蛍光強度中央値、蛍光強度分散値、またはこれら同士の一部の関係であってよい。
【００７１】
単個細胞マルチパラメータ及び複数細胞マルチパラメータマルチプレックス試験法では、投入細胞種を同定し、定量的イメージング及び蛍光によってパラメータが読み取られ、当該技術分野では共焦点顕微鏡が使用される（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１２２．）Ｐａｄｄｏｃｋ，Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８を参照のこと）。これらの方法は、１９９９年１１月２３日発行の米国特許第５，９８９，８３３号に記載されている。
【００７２】
核酸、特に、メッセンジャーＲＮＡの定量もパラメータとして関心対象である。これらは、核酸のヌクレオチドの配列に依存するハイブリダイゼーションにより測定することができる。技術には、ポリメラーゼ連鎖反応法ならびに遺伝子アレイ手法が含まれる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０００、Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６（１）：１１２−２２５、Ｋａｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ９（１２）：１３０５−１２、及びＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５１（３）：３１３−２４を参照のこと。
【００７３】
被験化合物から得られたスクリーニング結果と、参照スクリーニングから得た結果（複数可）との比較は、適切な演繹による手順、ＡＩシステム、統計比較等の使用により達成される。好ましくは、スクリーニング結果と、参照スクリーニング結果のデータベースとを比較する。参照スクリーニング結果のデータベースは収集可能である。これらのデータベースには、既知の薬剤もしくは薬剤の組み合わせが含まれるパネルから得た参照結果、ならびに単一または複数の環境的な条件もしくはパラメータが除去または特異的に変更されている環境条件下で処理された細胞の分析から得た参照結果が含まれ得る。参照結果は、特定の細胞経路を選択的に標的とするかまたは調節する遺伝子構成体を有する細胞が含有されるパネルから作製してもよい。
【００７４】
読み出しは、中位、平均、中央値または分散、または測定値に関連した他の統計的もしくは数学的に導かれた値であってよい。パラメータ読み出し情報は、対応する参照読み出しと直接比較することによりさらに精緻化されてよい。同一条件下で各パラメータについて得られた絶対値は変動性を示すが、これは生きた生物系では本質的なものであり、個々の細胞の変動性及び個体間に本質的な変動性も反映する。
【００７５】
便宜上、対象発明の系はキットで提供され得る。キットには、使用対象の細胞（凍結、冷蔵または生存率を維持する他の何らかの方法で処理されてよい）、パラメータ測定用試薬、及びスクリーニング結果を準備するソフトウェアが含まれ得る。ソフトウェアは結果を受け取って分析を実施し、参照データを含むことができる。ソフトウェアは結果を、対照培養から得られた結果を用いて正規化することもできる。組成物は、任意選択で、スクリーニング方法等など所望の目的に関する使用説明書と共に適切な容器にパッケージングされてよい。
【００７６】
本発明の実施の際に有用な一般技術のさらなる詳細について、医師は、細胞生物学、組織培養、発生学、及び神経生物学の標準的教科書及び総説を参照することができる。組織培養及び胚性幹細胞に関し、読者は奇形癌腫及び胚性幹細胞の参照を望む場合がある。Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．１９８７）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．１０：３１，１９９８）などである。
【００７７】
分子・細胞生化学における一般的方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）、及びＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）のような標準的教科書に見出すことができる。本開示で言及された遺伝子操作用の試薬、クローニングベクター、及びキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、及びＣｌｏｎＴｅｃｈなどの商用販売会社より入手可能である。
【００７８】
本明細書で引用された各刊行物は、あらゆる目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７９】
本発明は、記載されている特定の方法、プロトコル、細胞株、動物の種もしくは属、及び試薬に制限されるものではなく、それらは異なり得ることを理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、あくまで個々の実施形態の記載を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することは意図しておらず、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるということも理解されるべきである。
【００８０】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」には、複数のそのような細胞が含まれ、「培養（ｔｈｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）」には、当業者に公知の１つ以上の培養及びその同等物が含まれるということになる。本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、特に明確な指示がない限り、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。
【００８１】
以下の例は、本発明の作製及び使用方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示するものであり、発明者らが自身の発明であると見なす範囲を限定することも、また、下記実験が実施した全てまたは唯一の実験であると表すことも意図しない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関し、正確さを保証するべく試みがなされたが、実験上の一部の誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に指定しない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度はセ氏温度、及び圧力は大気圧または大気圧近傍圧である。
【実施例】
【００８２】
実施例１
ヒトオリゴデンドロサイトを作製しインビトロで髄鞘形成の過程をモデル化する先の方法は２次元（２Ｄ）培養で実施されてきた。これらのプロトコルでは、髄鞘形成は、合成ナノピラーの周囲へのオリゴデンドロサイト突起の巻き付きとして研究される。これらの方法では、髄鞘形成を、ヒトの脳で生じるような３次元の過程として研究することはできない。別法として、ヒト幹細胞由来オリゴデンドロサイトがげっ歯類に移植されたが、マウスでの環境がヒトのオリゴデンドロサイトの生態学及び髄鞘形成にどの程度まで影響するのかは不明であり、これらの方法は骨が折れる上、ハイスループットのスクリーニングを可能にするものではない。以下に記載する方法は、ヒトのｈｉＰＳＣまたはｈＥＳＣのみから誘導されたインビトロでのミエリン形成オリゴデンドロサイトを３次元（３Ｄ）培養で作製する初の方法であり、インビトロで健常条件及び疾患条件のヒトの髄鞘形成の研究を可能にするものである。
【００８３】
ｈｉＰＳＣの維持及び集合
ビトロネクチン（０．５μｇ／ｃｍ2 ）含有ｉＰＳＣ培地（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン含有完全Ｅ８培地）でコートした組織培養用処理済プレートでヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株を培養した。浮遊集合体を形成させるため、最初に、５００μＬのｈｉＰＳＣ培地にＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（１０ｎＭ）を加えて２，０００ｇで５分間遠心にかけＡｇｇｒｅｗｅｌｌプレートを準備した。ｈｉＰＳＣをＹ−２７６３２で１時間、前処理した後、予熱したアクターゼで５〜７分間処理して解離させた。解離した時点で、ｈｉＰＳＣを採取し、ｈｉＰＳＣ培地に希釈してから計数した。３００万ｈｉＰＳＣの分注を１５ｍＬファルコンチューブに移して２，０００ｇで５分間遠心にかけ、その後、Ｙ−２７６３２を含んだ１．５ｍＬのｈｉＰＳＣ培地に再浮遊させた。その後、３百万細胞の浮遊液を調製済みＡｇｇｒｅｗｅｌｌプレートの個々のウェルに加え、プレートを１００ｇで３分間遠心にかけた。その後、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌプレートを５％ＣＯ2 、３７℃のインキュベーター内で一晩保存した。
【００８４】
翌日、ｈｉＰＳＣ集合体を、Ｐ−１０００ピペットでカットチップを使用してピペティングすることによってＡｇｇｒｅｗｅｌｌから洗い流した。除去された集合体を、４０μｍの細胞用フィルターを使用してろ過し、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有Ｅ６培地が入った超低接着組織培養用１００ｍｍディッシュに移した。
【００８５】
神経系の誘導及びオリゴデンドロサイト発生の促進
神経系の誘導では、最初の６日間、連日ドルソモルフィン（５μＭ）及びＳＢ−４３１５４２（１０μＭ）を加えた。スフェロイドを２種類作製し、一部は、３日目からオールトランスレチノイン酸（ＲＡ、１００ｎＭ）に連日曝露し、残りは４日目からＷｎｔ経路阻害剤ＩＷＰ−２（５μＭ）に曝露した。浮遊６日目、浮遊スフェロイドを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ−２サプリメント、ビタミンＡ不含Ｂ−２７血清代替物、ＧｌｕｔａＭａｘ（１：１００）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１：１００）、０．１ｎＭ  β−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する神経系用培地（ＮＭ）に移した。ＮＭには２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及び２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦも１９日間添加し、最初の１０日は培地を毎日交換し、その後の９日間は隔日で交換した。１１日目、スムーズンドアゴニストＳＡＧ（１μＭ）も培地に連日加えた。神経系前駆細胞のオリゴデンドロサイトへの分化を促進するため、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＩＷＰ−２、ＲＡ、及びＳＡＧを除去し、１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＡＡ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１、５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、２５μｇ／ｍＬのインスリン、１μＭのｃＡＭＰアナログ、６０ｎｇ／ｍＬのＴ３、１００ｎｇ／ｍＬのビオチン、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ及び２０ｎｇ／ｍＬのＮＴ３を、２５日目からＮＭ培地に加え始めた。２５日目から４３日目まで培地交換を隔日行った。４３日目以降、２０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、２５μｇ／ｍＬのインスリン、１μＭのｃＡＭＰアナログ、６０ｎｇ／ｍＬのＴ３、及び１００ｎｇ／ｍＬのビオチンを含有するＮＭでスフェロイドを培養し、４〜５日おきに培地交換をおこなった。
【００８６】
結果：
図１Ａ、図１Ｂ．
三次元培養でのオリゴデンドロサイトの誘導
培養５１日後、スフェロイドを４％ＰＦＡで一晩固定した。スフェロイドをＯＣＴに包埋して薄片にし、ともにオリゴデンドロサイト前駆細胞を同定するマーカーであるＮＫＸ２．２及びＯＬＩＧ２に対する抗体を使用して免疫蛍光法により標識した。その後、同じ手法を用いて１００日目のｈＯＳを固定して切片を調製し、それを、幼若オリゴデンドロサイト及び成熟オリゴデンドロサイトの表面マーカーであるＯ４、及び成熟オリゴデンドロサイトの表面マーカーであるＯ１を用いて免疫蛍光法により標識した。ＮＫＸ２．２／ＯＬＩＧ２+ 細胞ならびに多極性Ｏ４+ 細胞及びＯ１+ 細胞の存在は、記載の方法で誘導されたヒトスフェロイド中にオリゴデンドロサイト前駆細胞及び成熟オリゴデンドロサイトのどちらも存在していることを示唆する。
【００８７】
図１Ｃ〜図１Ｅ．
三次元培養の細胞種間の相互作用
１１５日目のｈＯＳから切片を調製し、髄鞘の形成に関与するタンパク質であり、成熟オリゴデンドロサイトのマーカーであるＭＢＰ、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ、及び軸索のマーカーであるニューロフィラメントに対する抗体で標識した。ＭＢＰ+ 及びＧＦＡＰ+ の突起の重なりはオリゴデンドロサイト−アストロサイト相互作用を示す。ＭＢＰ+ 突起のニューロフィラメント+ 突起周囲への巻き付きは、１１５日目のｈＯＳにおいてオリゴデンドロサイトが軸索に巻き付いていることを示唆する。
【００８８】
図１Ｆ．
ヒトｈｉＰＳＣ由来三次元培養（ｈＯＳ）での髄鞘形成
培養１００日後、記載の方法により誘導されたスフェロイドを固定し、透過型電子顕微鏡用に処理した。軸索を取り囲む環状層の存在は髄鞘形成と一致する。
【００８９】
有意性及び用途
髄鞘形成は正常な脳機能にとって不可欠であり、髄鞘形成の異常は数多くの神経性障害の基礎となる。本方法に記載のヒト神経系３Ｄスフェロイドは、髄鞘を形成するオリゴデンドロサイトを含有する初めてのものであり、これを使用して、健康及び疾患における髄鞘形成過程を体系的に研究することができる。この方法は特に、このプロトコルに用いられるｈｉＰＳＣが脱髄性疾患患者の皮膚細胞から直接初期化され得ることから、疾患モデリングに適用できる。さらに、方法の拡張性のため、これらの培養を薬物スクリーニングに使用して、健常状態及び疾患特異的状態の両方において髄鞘形成に影響を与える化合物を同定することもできる。さらに、これは、ヒトの発達における主要な細胞−細胞相互作用、ニューロンとオリゴデンドロサイトとの間、オリゴデンドロサイトとアストロサイトとの間等の相互作用の研究を可能にする初の系でもある。最終的に、これらの培養で誘導されたオリゴデンドロサイトは、今後の脱髄性疾患治療における移植用の細胞供給源として使用することができる。
【００９０】
ここまでの記載はあくまで本発明の原則の説明に過ぎない。当業者は、本明細書に明示的に記載または示されてはいなくても、本発明の原則を具体的に実施し、本発明の趣旨及び範囲内に含まれるさまざまな構成を考案することができることは認識される。さらに、本明細書で引用した例及び条件的表現はすべて、本発明の原則、及び技術をさらに前進させる、発明者らにより提供される概念を理解する上で読者の一助となることを主に意図しており、そのように具体的に記述された例及び条件に限定されるわけではないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原則、態様、及び実施形態、ならびにその具体例を記述する本明細書の記述はすべて、それらの構造的及び機能的同等物のいずれも包含することが意図される。さらに、そのような同等物には、現在知られている同等物も、また将来開発される同等物、すなわち、構造を問わず、同じ機能を行ういかなる開発要素も含まれることが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示し、記載する例示的な実施形態に限定されることを意図しない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の請求の範囲によって具体化される。
【００９１】
連邦政府の助成による研究開発
本発明は、政府の支援により、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈより助成を受けた委託契約ＭＨ１０７８００のもと実施された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【図１】
2020519237.tif 000003
【国際調査報告】
2020519237.tif 000004
2020519237.tif 000005