(57)【要約】神経サイレンシング複合体ＲＥＳＴｉのノックダウンと組み合わせた、再プログラミング因子の二重プロモーターベクターに基づく、誘導されたニューロン（ｉＮ）に成体線維芽細胞を変換するための最適化された方法が提供される。本発明者らはまた、ベクター構築物を設計およびクローニングし、前記ベクター構築物のいくつかは、高齢個体から得られたものを含む真皮線維芽細胞を効率的に再プログラムするための単一工程方法を可能にする、前記ベクター構築物の構成要素をすべて含む。単一ベクターシステムを使用して、パーキンソン病、ハンチントン病、ならびにアルツハイマー病を含むある範囲の家族性および散発性神経変性障害を有する老齢個体由来の生検材料から高収率および高純度のｉＮを取得することができる。2020519286.tif 000011
2020519286.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．Ａｓｃｌ１をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ．Ｂｒｎ２をコードするヌクレオチド配列と、
ｃ．ＲＥＳＴ発現を抑制することができるＲＥＳＴサイレンシング配列をコードする、少なくとも１つのヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子発現システム。
【請求項２】
（ａ）および（ｂ）のヌクレオチド配列が単一のベクターに含まれ、任意に（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のヌクレオチド配列が単一のベクターに含まれる、請求項１に記載の遺伝子発現システム。
【請求項３】
前記発現システムがレンチウイルスベクターであり、かつ／または（ａ）および（ｂ）のヌクレオチド配列が、単一の転写物に転写される（例えば、２シストロン性）ように構成されている、請求項１または２に記載の遺伝子発現システム。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列が、ＰＧＫプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下にあるか、またはドキシサイクリン調節可能プロモーターなどの調節可能なプロモーターの制御下にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子発現システム。
【請求項５】
（ａ）および（ｂ）のヌクレオチド配列の順序がｐＢｒｎ２．ｐＡｓｃｌ１であり、任意に、前記プロモーターがＰＧＫでありかつ前記順序がｐｇｋ．Ｂｒｎ２．ｐｇｋ．Ａｓｃｌ１（ｐＢ．ｐＡ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子発現システム。
【請求項６】
前記遺伝子発現システムがウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含み、かつ／または前記ＲＥＳＴサイレンシング配列がｓｈＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子発現システム。
【請求項７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子発現システムで形質転換された、それを形質導入された、またはそれをトランスフェクトされた、任意にヒト細胞である、哺乳動物細胞。
【請求項８】
前記細胞が、ヒトなどの動物から得られた生検サンプルに由来し、任意に、（ｉ）前記生検サンプルが、皮膚パンチ生検材料または肺生検材料などの線維芽細胞を含み、かつ／または（ｉｉ）前記生検サンプルが、神経変性障害を有する個体から得られ、任意に、前記神経変性障害が、家族性もしくは散発性アルツハイマー病または家族性もしくは散発性パーキンソン病、またはハンチントン病であり、かつ／または（ｉｉｉ）前記生検サンプルが健常個体から得られ、かつ／または（ｉｖ）前記遺伝子発現システムの導入後、誘導されたニューロンに直接変換されるまで前記細胞が培養されており、任意に、前記細胞が少なくとも３回継代された、もしくは前記細胞が前記遺伝子発現システムの導入前に最大１０回継代された、請求項８に記載の細胞。
【請求項９】
線維芽細胞からニューロンを直接誘導する方法であって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子発現システムを線維芽細胞に導入する工程を含み、任意に、９．
前記遺伝子発現システムが形質導入により前記線維芽細胞に導入される、前記方法。
【請求項１０】
前記遺伝子発現システムの線維芽細胞への導入後、前記細胞が、ＮＤｉｆｆ２２７などの神経分化培地中で培養され、任意に、
ａ．前記神経分化培地には１つ以上の成長因子が補充され、任意に、前記１つ以上の成長因子が、ＬＭ−２２Ａ４、ＧＤＮＦ、ＮＴ３、およびｄｂ−ｃＡＭＰから選択され、かつ／または
ｂ．前記神経分化培地には１つ以上の小分子が補充され、任意に、前記１つ以上の小分子が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ−４３１５４２、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、およびバルプロ酸ナトリウム塩から選択され、かつ／または
ｃ．前記方法が、前記細胞を、任意に、免疫細胞化学、蛍光活性化細胞選別、および電気生理学から選択される少なくとも１つの方法によって、１つ以上のニューロン特性について評価することをさらに含む、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の方法を実行することにより得ることができ、任意に、少なくとも３回継代されたまたは前記遺伝子発現システムの導入前に最大５０回継代された、誘導されたニューロン細胞。
【請求項１２】
疾患モデリングにおけるまたは診断におけるまたは薬物スクリーニングにおける、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子発現システムまたは請求項７もしくは８で定義される細胞の使用。
【請求項１３】
診断におけるまたは細胞療法におけるまたは遺伝子療法における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子発現システムまたは請求項７もしくは８で定義される細胞。
【請求項１４】
少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーを変更する化合物についてスクリーニングする方法であって、
ａ．請求項７、８、および１１のいずれか１項で定義される誘導されたニューロンを、試験される少なくとも１つの化学化合物に曝露すること、
ｂ．少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーのレベルを記録すること、
ｃ．ｂ．における少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーの記録されたレベルを、１つ以上の参照レベルと比較すること、ならびに
ｄ．前記１つ以上の参照レベルを用いて、少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーの前記レベルを変更する少なくとも１つの化合物を選択すること
を含み、
任意に、前記疾患関連バイオマーカーが、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病のいずれかなどの神経障害のバイオマーカーである、前記方法。
【請求項１５】
個体における年齢に関連する神経学的臨床状態の存在、進行、または早期発症／発生を検出するための方法であって、
ａ．請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子発現システムを、前記個体から得られた生検サンプル中の線維芽細胞に導入すること、
ｂ．誘導されたニューロンの段階で、これらの細胞における少なくとも１つの潜在的な疾患に関連する表現型またはバイオマーカーのレベルを記録すること、
ｃ．ｂ．における少なくとも１つの潜在的な疾患に関連する表現型またはバイオマーカーの記録したレベルを、１つ以上の参照レベルと比較すること、ならびに
ｄ．年齢に関連する神経学的臨床状態の非存在、存在、進行、または早期発症／発生の指標としての、ｃ．における参照レベルとの相関に基づいて、前記サンプルを層別化すること
を含み、
任意に、（ｉ）前記潜在的な疾患に関連する表現型もしくはバイオマーカーが、アルツハイマー病、パーキンソン病、もしくはハンチントン病のいずれかなどの潜在的な神経疾患に関連する表現型もしくはバイオマーカーであり、かつ／または（ｉｉ）個体における年齢に関連する神経学的臨床状態が、家族性および散発性アルツハイマー病、家族性および散発性パーキンソン病、ハンチントン病を含む群から選択される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現システムに関し、特に、誘導されたニューロンを成体線維芽細胞から得る際に使用するための遺伝子発現システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
体細胞の再プログラミングの新たな進歩は、インビトロで神経障害をモデル化するために、規定された患者グループからのヒトニューロンへの独特なアクセスを提供している。このことは、病理がどのように生じるかおよび発生するかをより良好に理解するため、ならびにまた、早期のかつ差次的な診断試験および薬物スクリーニングの新たな機会を作るための、多くの機構的研究を可能にしてきた。
【０００３】
疾患特異的なおよび患者特異的なニューロンを生成するための代替手段として、化学的再プログラミング用の化学物質、転写因子の規定されたセット、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を使用して、成体線維芽細胞が機能的ニューロンに直接変換されることができる。このタイプの直接再プログラミングは、増殖性幹細胞中間体を介して移行することなく、誘導されたニューロン（ｉＮ）に線維芽細胞が変換されることを可能にし、プロセスをより速くかつ容易にする。さらに、最近の研究は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）とは異なり、得られたｉＮがドナーの加齢サインを維持し、このことがｉＮを遅発性疾患の神経病理のモデリングのための理想的な候補にすることもまた実証してきた。
【０００４】
しかし、ドナーの種および年齢、継代数、変換前の細胞の長期培養などの多くの要因が、このアプローチの再プログラミング効率を制限する。特に、ヒト細胞はげっ歯類細胞よりも再プログラミングが難しく、成体ドナーからの細胞は胎児細胞よりも再プログラミングがはるかに難しく、そしてインビトロでの増大ならびに／または細胞の変換前の広範な培養および継代は、しばしば変換の成功を妨げる。これらの相違の理由は完全には理解されていないが、老齢個体由来のヒト線維芽細胞は、胎児線維芽細胞よりも再プログラミングに対して抵抗性／不応性であるという事実によって、これらの細胞を大規模な生物医学的適用および将来の臨床適用のために使用するための障壁が生じる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、ＲＥ１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）複合体を成体ヒト線維芽細胞の再プログラミングに対する潜在的な障壁として同定した。本発明者らは、ＲＥＳＴ阻害（ＲＥＳＴｉ）が、神経変換遺伝子Ａｓｃｌ１およびＢｒｎ２と組み合わされたときに、成体の皮膚および肺線維芽細胞の再プログラミング障壁を除去し、非常に多数の機能的に成熟したニューロンを生成できることを示すことによって、このことを確認している。この高レベルの変換は、線維芽細胞の広範な継代にわたって維持される。
【０００６】
さらに、本発明者らは、成体の皮膚線維芽細胞の頑強で高収率の神経変換に必要なすべての構成要素を含むオールインワンの神経変換ベクターを構築した。次いで、本発明者らは、このようなベクターが、特発性および遺伝性型のパーキンソン病およびアルツハイマー病の個体からならびにハンチントン病の患者から、３つの異なる臨床現場で収集した線維芽細胞を効率的に変換するために使用できることを実証した。ｉＮ変換へのこの新しいアプローチは、後年に発症するある範囲の神経障害にわたって、つまり、モデリングすることが今日までほとんど不可能であった一連の状態にわたって、このアプローチを使用する疾患モデリング、診断、ならびに薬物のスクリーニングおよび発見のための大きな可能性を有している。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様は、
ａ．ニューロン変換因子をコードする、少なくとも１つのヌクレオチド配列と、
ｂ．ＲＥＳＴ発現を抑制することが可能であるＲＥＳＴサイレンシング配列をコードする、少なくとも１つのヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子発現システムを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
「遺伝子発現システム」は、１つ以上の遺伝子の発現に必要とされる他の任意の１つ以上の核酸分子とともに発現される１つ以上の遺伝子の意味を含む。発現システムは、通常、コード配列の上流および／または下流に１つ以上の調節配列を含む。好ましくは、１つ以上の調節配列は、発現される１つ以上の遺伝子に作動可能に連結される。
【０００９】
例えば、転写因子は、転写調節配列を認識して結合し、遺伝子から転写されるメッセージの生成を制御する。遺伝子発現の調節に関与する転写調節核酸配列には、プロモーター、エンハンサー、および調節配列が含まれ、これらに、転写因子または転写調節タンパク質が結合し、これらは転写の開始に必要である。他の調節配列には、翻訳の開始および終結のシグナルまたは他の翻訳調節配列が含まれてもよい。したがって、１つ以上のコード配列に加えて、遺伝子発現システムは、１つ以上の調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写因子および／または転写調節タンパク質が結合する調節配列、翻訳の開始のシグナルおよび終結のシグナル）を含んでもよい。このような調節エレメントは当該技術分野において周知であり、所定の宿主細胞における１つ以上の遺伝子の発現を最適化するために選択することができる。
【００１０】
「遺伝子」は、関心対象のタンパク質またはペプチドに転写されることが可能である任意の核酸配列の意味を含む。遺伝子は、コーディング領域と非コーディング領域の両方を含んでもよいか、またはコーディング領域のみを含んでもよい。言い換えれば、遺伝子は、エキソン（例えば、コード配列）のみを含んでいてもよいか、またはエキソンとイントロンを含んでいてもよい。
【００１１】
「ニューロン変換因子」は、非ニューロン細胞からニューロン様特性を有する細胞への、すなわち誘導されたニューロン細胞への変換を誘導する任意の遺伝子産物または分子の意味を含む。したがって、ニューロン変換因子は、ニューロンとして特徴決定されていない細胞を（例えば、形態と機能の組み合わせに基づいて）１つ以上のニューロン様特性を有する細胞に変換または再プログラムする場合がある。これはまた、誘導されたニューロン細胞への非ニューロン細胞の分化と見なすこともできる。ニューロン変換因子が、増殖性幹細胞中間体を介して移行することなく、非ニューロン細胞をニューロン様細胞にまたは誘導されたニューロンに変換する場合が好ましい。
【００１２】
疑念を避けるために、本発明者らは、非ニューロン細胞を部分的または完全に分化させるニューロン変換因子を、ニューロン様特性を有する細胞に含める。したがって、ニューロン変換因子は、以前には存在しなかったニューロン様特性を１つのみ有するように非ニューロン細胞を誘導するものであってもよいか、または、ニューロン変換因子は、以前には存在しなかった複数のニューロン様特性、例えば、少なくとも２、３、４、もしくは５つのニューロン様特性、または、それと同数の、形態学的および機能的試験の組み合わせに基づいて細胞がニューロン様細胞であると判定されることを意味するニューロン様特性を有するように、非ニューロン細胞を誘導するものであってもよい。
【００１３】
「ニューロン様特性」は、ニューロン／神経細胞に通常起因する特性の意味、例えば、形態学的特性（例えば、神経突起伸長、神経細胞体／細胞体の存在、樹状突起、軸索および／またはシナプス）；ＭＡＰ２、ｂＩＩＩ−チューブリン、ＮｅｕＮ、シナプシン、およびタウなどのニューロン特異的マーカーの発現；例えばｖＧｌｕｔおよび／またはＧａｄ６７の発現による証拠としての、興奮性または抑制性膜特性；ならびに、例えばパッチクランプアッセイにおいて測定される膜脱分極能力などの意味を含む。このような特性は、当該技術分野において十分に確立された方法を使用して、および実施例においてさらに説明されるように、決定することができる。たとえば、顕微鏡を使用してニューロン様形態を評価することができ、免疫蛍光または遺伝子発現分析を使用してニューロン特異的マーカーを評価することができ、そしてパッチクランプ電気生理学または機能イメージングによって機能的特性を評価することができる。細胞を「ニューロン様細胞」であると特徴決定するために使用できる適切な技術には、Ｄｒｏｕｉｎ−Ｏｕｅｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１：５３０に記載されている技術も含まれ、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００１４】
通常、ニューロン変換因子、ならびに、１つ以上のニューロン様特性を誘導または上方制御することは、非ニューロン細胞に起因する１つ以上の特性を下方制御する。さらにまた、そのような特性は、形態学的特性、非ニューロン細胞の特定のマーカーの発現、および／または非ニューロン細胞の機能的特性であり得る。そのような特性、およびそれらを評価するための技術は、当該技術分野において周知である。例えば、線維芽細胞の特性には、形態学的特性およびマーカー遺伝子発現、例えば、コラーゲン、および／または抗線維芽細胞抗体クローンＴＥ−７（例えば、Ｍｅｒｃｋカタログ番号ＣＢＬ２７１）との免疫反応性が含まれる。
【００１５】
ニューロン変換因子は、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、核酸、マイクロＲＮＡ、天然産物、合成産物、炭水化物、アプタマー、または小分子のいずれかなどの任意の分子であり得る。例えば、ニューロン変換因子は、細胞運命調節の進展中のニューロン系統決定に関与することが知られている転写因子、シグナル伝達分子、またはマイクロＲＮＡであり得る。好ましくは、ニューロン変換因子は核酸または小分子である。ニューロン変換因子の例には、転写因子、小分子、マイクロＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれる。ニューロン変換係数の特定の例には以下が含まれる：Ｄｒｏｕｉｎ−Ｏｕｅｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７  Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉの表１の「Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ」列にリストされているもの、Ｙ−２７６３２；ＳＰ６００１２５；レプソックス（Ｒｅｐｓｏｘ）；Ｇ０６９８３；ＦｏｘＡ２；Ｌｍｘ１ａ；Ｌｍｘ１ｂ；Ｏｔｘ２。
【００１６】
本発明の文脈において、ニューロン変換因子は、少なくとも１つのヌクレオチド配列によってコードされることが可能でなければならないことが理解される。
【００１７】
好ましい実施形態では、ニューロン変換因子は、ＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２からなる群より選択される。したがって、本発明は、
ａ．（ｉ）ＡＳＣＬ１をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）ＢＲＮ２をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ．ＲＥＳＴ発現を抑制することが可能であるＲＥＳＴサイレンシング配列をコードする、少なくとも１つのヌクレオチド配列と
を含む遺伝子発現システムを提供することが理解される。
【００１８】
ＡＳＣＬ１またはＡＳＣＬ１ペプチドは、２５ｋＤａの基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）タンパク質であるＡｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅホモログ１（ＡＳＣＬ１、これは、Ａｓｈｌ、ｈＡＳＨ−１、ｂＨＬＨａ４６、または基本的なヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質４６とも呼ばれる）の意味を含む。ヒトＡＳＣＬ１のアミノ酸配列は、
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であり、したがって、一実施形態では、ＡＳＣＬ１はヒトＡＳＣＬ１である。他の種、例えば、マウス（ＮＰ＿０３２５７９）、チンパンジー（ＸＰ＿００９４２４４５８）、カニクイザル（ＸＰ＿００５５７２１０１）、およびラット（ＮＰ＿０３２５７９）などの哺乳動物種に由来するＡＳＣＬ１のオルソログの意味もまた含まれる。
【００１９】
ＢＲＮ２またはＢＲＮ２ペプチドは、Ｂｒａｉｎ−２（ＢＲＮ２、脳特異的ホメオボックス／ＰＯＵドメインタンパク質２、ＰＯＵ３Ｆ２、神経系特異的オクタマー結合転写因子Ｎ−Ｏｃｔ−３、オクタマー結合タンパク質７、Ｏｃｔ−７、またはオクタマー結合転写因子７（ＯＴＦ−７）とも呼ばれる）の意味を含む。ヒトＢＲＮ２のアミノ酸配列は、
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であり、したがって、一実施形態において、ＢＲＮ２はヒトＢＲＮ２である。また、他の種、例えば、マウス（ＮＰ＿０３２９２５）などの哺乳動物種に由来するＢＲＮ２のオルソログの意味も含まれる。
【００２０】
特定のポリペプチドが多型であることは周知であるので、上記に概説したＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２の配列のいくつかの自然変異が起こり得ることが理解される。したがって、１つ以上のアミノ酸残基が別のアミノ酸で置き換えられている、ヒトＡＳＣＬ１またはそのオルソログの天然バリアント、およびヒトＢＲＮ２またはそのオルソログの天然バリアントもまた含まれる。
【００２１】
ＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２の機能的バリアントも含まれている。機能的バリアントには、タンパク質（例えば、ＡＳＣＬ１またはＢＲＮ２）の少なくとも１つの活性、例えば、ニューロン変換因子として作用する能力を保持するタンパク質（例えば、ＡＳＣＬ１またはＢＲＮ２）のバリアントの意味が含まれる。変異には、保存的または非保存的のいずれかである挿入、削除、および置換が含まれる。「保存的置換」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを意図する。機能的バリアントには、ヒトＡＳＣＬ１またはその任意のオルソログのバリアントが含まれる。バリアントがニューロン変換因子の活性を保持しているかどうかを評価するための試験は、当該技術分野で公知であり、上記のものが含まれる。好ましくは、ＡＳＣＬ１および／またはＢＲＮ２の機能的バリアントは、線維芽細胞をニューロンに変換することが可能である。
【００２２】
ＡＳＣＬ１の機能的バリアントが、ヒトＡＳＣＬ１のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に対して少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する場合が好ましい。
【００２３】
同様に、ＢＲＮ２の機能的バリアントが、ヒトＢＲＮ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に対して少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する場合が好ましい。
【００２４】
ＡＳＣＬ１、ＡＳＣＬ１ペプチド、ＢＲＮ２、またはＢＲＮ２ペプチドは、完全長のＡＳＣＬ１またはＢＲＮ２タンパク質の一部、またはそのバリアントであるが、それにも関わらずニューロン変換因子として作用する能力を保持しているものの意味もまた含む。バリアントがニューロン変換因子の活性を保持しているかどうかを評価するための試験は、当該技術分野で公知であり、上記のものが含まれる。ＡＳＣＬ１の一部は、ヒトＡＳＣＬ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）などの上述の完全長ＡＳＣＬ１タンパク質またはバリアントの少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、１５０、または２００個の連続したアミノ酸を含み得る。ＢＲＮ２の一部は、ヒトＡＳＣＬ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）などの上述の完全長ＡＳＣＬ１タンパク質またはバリアントの少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００個の連続したアミノ酸を含み得る。また、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個までのアミノ酸残基など１個以上のアミノ酸残基が置換されているＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２（例えば、ヒトＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２）の一部も含まれる。したがって、ＡＳＣＬ１またはＢＲＮ２の一部のバリアントもまた含まれることが理解される。
【００２５】
ＲＥＳＴには、転写抑制因子として機能するＲＥ１サイレンシング転写因子（ニューロン制限サイレンサー因子（ＮＲＳＦ）ＸＢＲ、ＲＥＳＴ４、ＷＴ６、ＧＩＮＧＦ５、およびＨＧＦ５とも呼ばれる）の意味が含まれる。ヒトＲＥＳＴのアミノ酸配列は、
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であり、したがって、一実施形態において、ＲＥＳＴはヒトＲＥＳＴである。
【００２６】
また、他の種、例えば、マウス（ＮＰ＿０３５３９３．２）およびラット（ＮＰ＿１１３９７６．１）などの哺乳動物種などに由来するＲＥＳＴのオルソログの意味も含まれる。また、ＲＥＳＴ活性、例えば、転写抑制活性を共有するＲＥＳＴの天然バリアントおよび機能的バリアントも含まれる。
【００２７】
ＲＥＳＴ発現を抑制することが可能なＲＥＳＴサイレンシング配列は、ＲＥＳＴの転写および／または翻訳のレベルを低下させる任意のヌクレオチド配列、通常はＲＮＡの意味を含む。ＲＥＳＴの転写および／または翻訳のレベルを低下させるとは、ＲＥＳＴの転写および／または翻訳のレベルを、ＲＥＳＴサイレンシング配列の非存在下で明らかなＲＥＳＴの転写および／または翻訳のレベルの９０％未満まで、例えば、８０％未満、７０％未満、６０％未満、好ましくは、ＲＥＳＴサイレンシング配列の非存在下で明らかなＲＥＳＴの転写および／または翻訳のレベルの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満まで、最も好ましくは、ＲＥＳＴの転写および／または翻訳の検出不可能なレベルまで、低下させるという意味を含む。実施例においてさらに記載されるＰＣＲ（例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲ）など、当該技術分野において公知であるような、ＲＥＳＴの転写および／または翻訳のレベルを決定する任意の適切な方法を使用することができる。
【００２８】
誤解を避けるために、「ＲＥＳＴ発現を抑制することが可能なＲＥＳＴサイレンシング配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列」は、ヌクレオチド配列がＲＥＳＴサイレンシング配列自体であり、ヌクレオチド配列が、例えば、転写および／または逆転写によってＲＥＳＴサイレンシング配列に変換できるという意味を含むことが理解される。
【００２９】
一実施形態において、ＲＥＳＴサイレンシング配列は、当該技術分野において周知であるようなＲＮＡ干渉分子である。この配列はアンチセンス配列であってもよい。適切な配列の例には、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子またはその類似体、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子またはその類似体、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。マイクロＲＮＡ分子もまた使用できる。
【００３０】
好ましい実施形態において、ＲＥＳＴサイレンシング配列はｓｈＲＮＡ分子である。ＲＥＳＴ発現をサイレンシングするために使用できるｓｈＲＮＡ分子の例には、以下の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）がＤＮＡ型で示される。
2020519286.tif 000006
【００３１】
ＲＮＡ干渉のために適したｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を同定するための一般的な方法は、当該技術分野において周知である。
【００３２】
ＲＥＳＴの核酸配列は公知であるので（例えば、ヒトＲＥＳＴはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＧ＿０２９４４７の下の配列を有する）、当業者はＲＥＳＴを標的とする他の候補ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｈＲＮＡ分子）を設計および試験する方法を容易に理解できる。
【００３３】
例として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、長さが約５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、長さが約１０〜約２５ヌクレオチド、または長さが約２０〜約２５ヌクレオチドである。アンチセンス技術の一般的な議論については、例えば、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｄ．Ｍｅｌｔｏｎ，ｅｄ．，１９８８）を参照のこと。
【００３４】
さらなる例として、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、通常長さが約２０〜２４ヌクレオチドであり、ｓｈＲＮＡの相補的センス領域およびアンチセンス領域もまた通常約２０〜２４ヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡ技術に関する一般情報については、例えば、ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ  ９４２，Ｄ．Ｊ．Ｔａｘｍａｎ，ｅｄ．，２０１３）を参照のこと。ｓｈＲＮＡ技術に関するさらなる一般情報については、例えば、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６２９：１４１−１５８を参照のこと。
【００３５】
本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害物質の適切な化学修飾は、当該技術分野において一般的であるようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性を確保するために行うことができる。ヌクレオチド配列の変更、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さの変更を行って、阻害物質の最大効率および熱力学的安定性を確保することができる。さらにまた、このような配列および／または長さの改変は、当業者によって容易に決定される。
【００３６】
ＲＮＡｉ分子は、標的核酸の一部に完全に相補的なヌクレオチド配列を含むことができるが、ＲＮＡｉプローブと標的核酸との間の１００％の配列相補性は必要ではないことが理解される。
【００３７】
ＲＮＡｉ分子は、当該技術分野で知られている標準的な方法、例えば、自動合成機の使用により合成することができる。そのような方法によって生成されたＲＮＡは、高純度であり、効率的にアニールしてｓｉＲＮＡ二重鎖またはｓｈＲＮＡヘアピンステムループ構造を形成する傾向がある。化学合成の後、一本鎖ＲＮＡ分子は脱保護され、アニールされてｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成し、そして精製される（例えば、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣにより）。あるいは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（例えば、Ｔ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）を有するＤＮＡテンプレートからのＲＮＡのインビトロ転写のために、標準的な手順を使用してもよい。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用したｓｉＲＮＡの調製のための効率的なインビトロプロトコールが記載されてきた（Ｄｏｎｚｅ  ａｎｄ  Ｐｉｃａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００２；３０：ｅ４６；ａｎｄ  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２；９９：６０４７−６０５２）。同様に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用したｓｈＲＮＡの調製のための効率的なインビトロプロトコールが記載されてきた（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ、同上）。センスおよびアンチセンス転写物は、２つの独立した反応で合成されて後でアニールされてもよく、単一の反応で同時に合成されてもよい。
【００３８】
遺伝子発現システムは、ニューロン変換因子をコードする１つより多いヌクレオチド配列を含み得ることが理解される。このようにして、複数のニューロン変換因子を細胞に導入できる。遺伝子発現システムは、ニューロン変換因子をコードする２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のヌクレオチド配列を含み得る。特に好ましい実施形態において、遺伝子発現システムは、それぞれのニューロン変換因子ＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２をコードする少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
遺伝子発現システムは、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＲＥＳＴサイレンシング配列など、１つより多いＲＥＳＴサイレンシング配列を含み得ることが理解される。特に好ましい実施形態では、遺伝子発現システムは、２つのＲＥＳＴサイレンシング配列（例えば、ｓｈＲＮＡ分子）を含む。
【００４０】
本発明の第１の態様の遺伝子発現システムの（例えば、成分（ａ）および（ｂ）の）１つ以上またはすべてのヌクレオチド配列がベクターに組み込まれ得ることが理解される。
【００４１】
一実施形態において、（ａ）のヌクレオチド配列（例えば、（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列）は、単一のベクターに含まれる。
【００４２】
さらなる実施形態において、（ａ）および（ｂ）のヌクレオチド配列（例えば、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）、および（ｂ）のヌクレオチド配列）は単一のベクターに含まれる。
【００４３】
ベクターは、複製されることおよび／または発現することができる細胞（例えば、原核生物（例えば、細菌）または真核生物（例えば、哺乳動物）細胞）に外来性（すなわち外因性）遺伝物質を人工的に運ぶことができるビヒクルの意味を含むことが理解される。ベクターの例には、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、コスミド、またはフォスミドなどの非哺乳動物核酸ベクターが含まれる。ベクターの他の例には、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターが含まれる。
【００４４】
ベクターの正確なポリヌクレオチド配列は、意図する宿主細胞の性質、本発明の第１の態様のポリヌクレオチドの宿主細胞への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが望ましいかどうかに依存する。ベクターは、抗生物質耐性（例えば、カナマイシンまたはネオマイシン）などの少なくとも１つの選択可能なマーカーを含んでもよい。しかし、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子にパッケージングされた核酸分子中に選択可能なマーカーを含まないことが理解される。
【００４５】
特に好ましい実施形態では、ベクターは、当該技術分野で周知であるレンチウイルスベクターである。
【００４６】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ）に基づくベクターなどのレンチウイルスベクターは、非増殖細胞に組み込むことが可能なため広く使用されている。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを別々の部分に分割することにより、例えば、別々のプラスミドに配置することにより、複製を欠損させることができる。たとえば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓによって開発されたいわゆる第１世代のレンチウイルスベクターは、パッケージング発現カセット、エンベロープ発現カセット、およびベクター発現カセットからなる３プラスミド発現システムとして構築された。「パッケージングプラスミド」には、ｇａｇ−ｐｏｌ配列全体、調節配列（ｔａｔおよびｒｅｖ）、および付属配列（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｔ）が含まれる。「エンベローププラスミド」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で、天然のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の代わりに水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶｇ）を保持する。第３のプラスミド（「導入プラスミド」）は、長い末端反復配列（ＬＴＲ）、カプセル化配列（ψ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列、および宿主細胞内で導入遺伝子を発現するＣＭＶプロモーターを保有する。
【００４７】
第２のレンチウイルスベクターの生成は、病原性配列ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、およびｎｅｆの欠失を特徴とした。パッケージングベクターは、より単純なｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖ遺伝子にされたため、システムの安全性が向上した。
【００４８】
レンチウイルスシステムを改善するために、パッケージング構築物からｔａｔ遺伝子を削除し、ベクターカセットからのＬＴＲを不活性化し、それによって挿入変異誘発効果に関連する問題を減少させることによって、第３世代のベクターが設計された。
【００４９】
したがって、特に好ましい実施形態において、遺伝子発現システムは、第３世代レンチウイルスベクターの中に含まれる。
【００５０】
さまざまなレンチウイルスの世代については、以下の参考資料：第１世代：Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２（５２５９）：２６３−７；第２世代：Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（９）：８７１−５；第３世代：Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−７で説明されており、これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。レンチウイルスベクターの開発に関する概説は、以下において見い出すことができる：Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４４３（３）：６０３−１８およびＰｉｃａｎｃｏ−Ｃａｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｐａｔｅｎｔｓ  １８（５）：５２５−５３９。
【００５１】
遺伝子発現システムは、１つより多いタンパク質をコードする場合、タンパク質のコード配列が、例えば、別々のプロモーターの制御下で別々の転写物として転写されるように（すなわち、各コーディング配列が、１つのタンパク質に翻訳される別個のｍＲＮＡ分子に転写されるように）、または、例えば１つのプロモーターの制御下で、単一の転写物として転写されるように（すなわち、ｍＲＮＡ分子がマルチシストロン性であり、異なるタンパク質に翻訳される１つより多いコード領域を含み；複数のコード領域が、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）によって分離され得るように）、構成されることができることが理解される。例えば、遺伝子発現システムがＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２をコードする場合、ＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２は、それぞれ独立して転写される別個のｍＲＮＡ分子から翻訳されてもよく、ＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２は、１つのｍＲＮＡから翻訳されてもよい（例えば、２つのコード領域を有する２シストロン性のもの）ことが理解される。複数または単一の転写物としての発現を含む、遺伝子およびｃＤＮＡのクローニングおよび操作のための分子生物学的方法は、参照により本明細書に組み込まれる、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹにおいて例示されるように、当該技術分野において周知である。好ましくは、遺伝子発現システムによりコードされるタンパク質は独立して転写される。
【００５２】
本発明のベクターは、通常、構成的プロモーター、組織または細胞型特異的プロモーター、調節可能または誘導性プロモーター、エンハンサーなどを含むがこれらに限定されない異種制御配列を含む。
【００５３】
例示的なプロモーターには以下が含まれるがこれらに限定されない：ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ならびにｈＡＡＴプロモーター。これらおよび多数の追加のプロモーターのヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知である。関連する配列は、公共のデータベースから容易に入手でき、本発明の実施における使用のためにベクターに組み込むことができる。
【００５４】
一実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＰＧＫプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下にあるか、またはドキシサイクリン調節可能プロモーターなどの調節可能なプロモーターの制御下にある。
【００５５】
特に好ましい実施形態において、遺伝子発現システムは、ＡＳＣＬ１をコードするヌクレオチド配列、およびＢＲＮ１をコードするヌクレオチド配列を含み、それぞれのヌクレオチド配列はそれぞれのプロモーターの制御下にある。ＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２の発現は、同じかまたは異なるプロモーターの制御下にあり得ることが理解される。好ましくは、これらの発現は同じプロモーターの制御下にあり、最も好ましくはＰＧＫプロモーターの制御下にある。
【００５６】
ＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子発現システム（例えば、レンチウイルスベクターなどのベクター）に任意の順序で組み込むことができることが理解される。例えば、ＡＳＣＬ１をコードするヌクレオチド配列はＢＲＮ２をコードするヌクレオチド配列の５’末端にあってもよいか、またはＢＲＮ２をコードするヌクレオチド配列はＡＳＣＬ１をコードするヌクレオチド配列の５’末端にあってもよい。本発明者らは、ＢＲＮ２をコードするヌクレオチド配列を、ＡＳＣＬ１をコードするヌクレオチド配列の５’末端に配置することによって、誘導されたニューロンの最高収量がもたらされることを見い出した。したがって、ヌクレオチド配列がｐＢ．ｐＡの順序で構成される場合、すなわち、プロモーター（ｐ）の制御下でＢＲＮ２（「Ｂ」）をコードするヌクレオチド配列が、プロモーター（ｐ）の制御下でＡＳＣＬ１（「Ａ」）をコードするヌクレオチド配列の５’末端に位置する場合が好ましい。好ましくは、プロモーターは構成的プロモーターｐＧＫであり、したがって、遺伝子発現システムはｐＧＫ．Ｂ．ｐＧＫ．Ａの順序で構成されたヌクレオチド配列を含み得ることが理解される。
【００５７】
さらなる実施形態では、遺伝子発現システムは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）などの１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上）のエンハンサー配列をさらに含む。これは、転写されると発現を増強する三次構造を生じさせるＤＮＡ配列であり、一般的に分子生物学においてウイルスベクターの遺伝子の発現を増大させるために使用される（Ｄｏｎｅｌｌｏ，ＪＥ；Ｌｏｅｂ，ＪＥ；Ｈｏｐｅ，ＴＪ（Ｊｕｎ  １９９８）．“Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ”．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（６）：５０８５−９２．ＰＭＣ  １１００７２．ＰＭＩＤ  ９５７３２７９を参照のこと）。このエレメントの配列は、当該技術分野において周知であり、日常的なこととして当業者によって本発明の遺伝子発現システムに容易に組み込まれる。
【００５８】
さらにまた、１つ以上のエンハンサー配列は、ニューロン変換因子をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２をコードするヌクレオチド配列）に対して異なる位置および／または距離に配置できることが理解される。
【００５９】
本発明はまた、
ａ．（ｉ）ＡＳＣＬ１をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）ＢＲＮ２をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ．ＲＥＳＴを阻害可能な分子と
を含む、遺伝子発現システムを提供する。
【００６０】
ＲＥＳＴを阻害可能な分子は、ＲＥＳＴの少なくとも１つの機能を減少させる任意の分子（例えば、小分子）の意味を含む。ＲＥＳＴの少なくとも１つの機能を減少させるは、ＲＥＳＴの少なくとも１つの機能を、分子の非存在下で明らかなＲＥＳＴの少なくとも１つの機能の９０％未満まで、例えば、分子の非存在下で明らかなＲＥＳＴの少なくとも１つの機能の８０％未満、７０％未満、または６０％未満、および好ましくは５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満まで、最も好ましくは、ＲＥＳＴの少なくとも１つの機能の検出できないレベルまで、減少させることを意味する。ルシフェラーゼアッセイなどによって、当該技術分野において公知であるように、ＲＥＳＴの少なくとも１つの機能を決定する任意の適切な方法を使用することができる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｒｂｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，３１（９）：１８１６−１８２８において記載されているように）。
【００６１】
ＲＥＳＴを阻害可能な適切な分子には、ＲＥＳＴ阻害物質、Ｘ５０５０が含まれる（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋカタログ番号５０６０２６）。本発明者らは、当業者にとって、例えば、Ｃｈａｒｂｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，同上に記載されている方法を使用して、そのような分子をさらに同定することは日常的なことであると見なす。
【００６２】
上記のように、ＲＥＳＴを阻害することは、ＲＥＳＴの量を減少させること、ＲＥＳＴ発現を抑制すること、ならびに／またはＲＥＳＴの転写および／もしくは翻訳のレベルを低下させるという意味も含むことが理解される。したがって、ＲＥＳＴを阻害可能な分子には、ＲＮＡ干渉分子など、上記のＲＥＳＴ発現を抑制可能なＲＥＳＴサイレンシング配列が含まれる。
【００６３】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の遺伝子発現システムを含む細胞を提供する。このような細胞は、本発明の第１の態様の遺伝子発現システムが導入されて、その結果、以下でさらに説明するような誘導されたニューロン細胞になるように再プログラムできるものであってもよい。
【００６４】
好ましい遺伝子発現システムには、本発明の第１の態様に関連して上述したものが含まれる。
【００６５】
前記細胞は原核生物または真核生物であり得る。
【００６６】
本発明の第１の態様の遺伝子発現システムの構築および増幅は、細菌細胞（例えば、遺伝子発現システムが、細菌プラスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、フォスミドなどの形態である場合）、酵母細胞（例えば、遺伝子発現システムがＹＡＣの形態の場合）、および哺乳動物細胞（例えば、遺伝子発現システムがウイルスベクター中に含まれる場合、通常ウイルス粒子中の核酸のカプセル化）において都合よく実施されることが理解されるが、一方、ニューロン変換のための遺伝子発現システムの使用は、通常、哺乳動物細胞に限定されている。
【００６７】
遺伝子発現システムは、公知の技術、すなわち形質転換、形質導入、またはトランスフェクションのいずれかによって細胞に導入することができ、これらはすべて当該技術分野において標準的な技術であることが理解される。好ましくは、遺伝子発現システムはウイルスベクター中に含まれ、したがって遺伝子発現システムは形質導入により細胞に導入される。
【００６８】
前記細胞が、ヒト、マウス、ラット、またはサル由来の細胞を含む任意の脊椎動物細胞などの哺乳動物細胞である場合が好ましい。
【００６９】
前記細胞は、一次細胞、二次細胞、または細胞系統であり得る。
【００７０】
一実施形態において、細胞は、成熟細胞型から培養された初代細胞であり、例えば、細胞は初代線維芽細胞であり得る。
【００７１】
したがって、細胞は、ヒトなどの動物から得られた生検サンプルに由来し得ることが理解される。好ましくは、生検サンプルは、皮膚パンチ生検材料または肺生検材料などの線維芽細胞を含むものである。生検サンプルからの一次細胞の調製は、当該技術分野で日常的であり、実施例に記載されているものを含む任意の適切な技術を使用することができる。
【００７２】
上述のように、本発明の遺伝子発現システムは、神経変性疾患のモデル化に価値があり、したがって、生検サンプルが神経変性障害を有する個体から得られる場合に特に望ましい。例えば、生検サンプルは、家族性もしくは散発性アルツハイマー病または家族性もしくは散発性パーキンソン病の個体から得られてもよい。同様に、生検サンプルはハンチントン病患者から得られてもよい。しかし、生検サンプルは健常個体から得ることができることも理解されており、これは疾患モデリングまたは薬物スクリーニング実験において有用な対照として役立ち得る。
【００７３】
あるいは、本発明の第２の態様の細胞は、細胞系統に由来するものであってもよい。例えば、細胞は、ヒト胎児肺線維芽細胞（ＨＦＬ１）細胞系統（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−１５３）に由来する線維芽細胞であり得る。細胞系統は、本発明の遺伝子発現システムの構築、開発および試験において使用するための便利な細胞源である。
【００７４】
本発明の遺伝子発現システムを細胞に導入した後、細胞を培養することによって、誘導されたニューロンへの細胞の変換がもたらされる。したがって、本発明の第２の態様の細胞には、本発明の遺伝子発現システムが導入され、誘導されたニューロンに直接変換されるまで培養された細胞も含まれる（例えば、増殖性幹細胞中間体を介した移行なし）。ニューロンのように、誘導されたニューロンは有糸分裂を行うことができないため、これは、有糸分裂後の状態、つまり有糸分裂後とみなすこともできる。
【００７５】
実施例において実証されているように、本発明者らは、遺伝子発現システムの再プログラミング効率が出発初代培養（例えば、初代線維芽細胞培養）の継代数によって影響されないことを示し、このことは、この技術を大規模な疾患モデリングに特に適切なものにする。したがって、細胞は遺伝子発現システムが導入される前に何回も継代されていてもよく、その場合、細胞は二次細胞であることが理解される。例えば、細胞は、本発明の遺伝子発現システムの導入前に少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、または５０回継代されていてもよい。一実施形態において、細胞は、遺伝子発現システムが導入される前に少なくとも３回継代されたものである。さらなる態様において、細胞は、遺伝子発現システムが導入される前に５０回を超えて継代されなかった細胞である。
【００７６】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様の遺伝子発現システムを線維芽細胞に導入する工程を含む、線維芽細胞からニューロンを直接誘導する方法を提供する。この方法は、通常、インビトロまたはエキソビボである。
【００７７】
好ましい遺伝子発現システムおよび線維芽細胞には、本発明の第１および第２の態様に関連して上述したものが含まれる。
【００７８】
この方法は、線維芽細胞を誘導されたニューロンに再プログラミングする文脈で説明されているが、他の体細胞も同様に再プログラミングされ得ることが理解される。したがって、本発明の第３の態様が線維芽細胞に関して説明される場合はいつでも、任意の他の体細胞、例えば、血液由来細胞を使用できることが理解される。
【００７９】
遺伝子発現システムは、形質転換、形質導入、およびトランスフェクションなどの当該技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して細胞に導入することができる。
【００８０】
好ましい実施形態において、遺伝子発現システムはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）に含まれ、ウイルスベクターは、実施例に記載されるような形質導入により線維芽細胞に導入される。
【００８１】
一般に、線維芽細胞は、遺伝子発現システムを細胞に導入するプロセスの前およびその間に、線維芽細胞の成長に適した成長培地（すなわち、線維芽細胞培地）中で培養される。そのような培地は当該技術分野において周知であり、複数の供給業者から市販されている。１つの例は、実施例において使用されるような、１００ｍｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、および１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）である。
【００８２】
ニューロン細胞への分化を支援するために、一実施形態において、遺伝子発現システムの線維芽細胞への導入後、細胞は神経分化培地、例えば、神経分化に適した細胞培養培地中で培養される。神経分化培地は、好ましくは無血清培地である。誘導されたニューロンの培養をサポートする任意の培地が使用できる。神経分化培地は、当該技術分野で周知であるように、好ましくは基礎培地およびホルモン補充物を含む。
【００８３】
神経分化培地の好ましい例は、Ｎ２、Ｂ２７、Ｎ２Ｂ２７、および／またはＧ５補充物からなる群から選択される補充物を含む細胞培養培地である。さまざまなそのような培地が市販されており、１つの適切な例はＮＤｉｆｆ２２７であり、これは、Ｔａｋａｒａ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている（オリジナルの組成については、Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１（２）：１８３−１８６を参照のこと）。
【００８４】
通常、神経分化培地には、ＬＭ−２２Ａ４、ＧＤＮＦ、ＮＴ３、ｄｂ−ｃＡＭＰのいずれかなどの１つ以上の成長因子が補充され、かつ／または神経分化培地には、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ−４３１５４２、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、およびバルプロ酸ナトリウム塩のいずれかなどの１つ以上の小分子が補充される。
【００８５】
特に好ましい実施形態では、線維芽細胞は、以下の任意の濃度：ＬＭ−２２Ａ４（２μＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＧＤＮＦ（２ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＮＴ３（１０ｎｇ／μｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびｄｂ−ｃＡＭＰ（０．５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）の成長因子を補充し；かつ以下の任意濃度ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ、Ａｘｏｎ）、ＳＢ−４３１５４２（１０μＭ、Ａｘｏｎ）、ノギン（０．５μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＤＮ−１９３１８９（０．５μＭ、Ａｘｏｎ）、およびバルプロ酸ナトリウム塩（ＶＰＡ；１ｍＭ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の小分子を補充した、ＮＤｉｆｆ２２７培地で培養される。
【００８６】
細胞培養技術は当該技術分野で標準であり、任意の適切なプロトコールを使用することができる。一般的に、細胞は、誘導されたニューロン細胞を形成するまで、１０〜１２５日間、例えば、２５日間培養される。
【００８７】
好都合なことに、細胞は、マルチウェルプレート形式などの固定化された支持体上で培養される。培養プロセス中、例えば１０〜１２日後、細胞を新鮮な支持体に再プレートすることが望ましいことがあり得る。新鮮な支持体は、ポリオルニチン、フィブロネクチン、およびラミニンまたは同様のもののいずれか１つ以上でコーティングされたものなど、ニューロン細胞培養に特に適したものであってもよい。
【００８８】
神経分化培地の少なくとも一部は、定期的な間隔で交換することができる（例えば、２〜４日；典型的な最小値は４日ごとである）。
【００８９】
一実施形態において、この方法は、形態学的特性（例えば、神経突起伸長、神経細胞体／細胞体の存在、樹状突起、軸索および／またはシナプス）を含む１つ以上のニューロン特性；ＭＡＰ２、ＮＦ−Ｈ、ｂＩＩＩ−チューブリン、ＮｅｕＮ、シナプシン、タウなどのニューロン特異的マーカーの発現；例えば、ｖＧｌｕｔおよび／またはＧａｄ６７の発現による証拠としての興奮性または抑制性の膜特性；および膜の脱分極能力について細胞を評価することをさらに含む。ニューロンの特徴を評価するための方法は、当該技術分野で周知であり、本発明の第１の態様に関連して説明された方法のすべてが含まれる。例えば、免疫細胞化学、蛍光活性化細胞選別、および電気生理学技術のいずれかが使用され得る。これらの手法およびその他の適切な手法については、実施例において説明される。
【００９０】
本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様の方法を実行することにより得ることができる、誘導されたニューロン細胞を提供する。
【００９１】
好ましい細胞には、本発明の第２の態様に関連して説明したものが含まれる。細胞は、遺伝子発現システムの導入前に少なくとも３回継代されたものまたは最大５０回継代されたものでもよい。
【００９２】
本発明の第５の態様は、疾患モデリングにおけるまたは診断におけるまたは薬物スクリーニングにおける、本発明の第１の態様による遺伝子発現システムまたは本発明の第２もしくは第４の態様による細胞の使用を提供する。
【００９３】
本発明の第６の態様は、医薬における使用のための、本発明の第１の態様による遺伝子発現システム、または本発明の第２または第４の態様による細胞を提供する。
【００９４】
例えば、本発明は、診断におけるまたは細胞療法におけるまたは遺伝子療法における使用のための、本発明の第１の態様による遺伝子発現システムまたは本発明の第２もしくは第４の態様による細胞を含む。例えば、本発明の第１の態様による遺伝子発現システム、または本発明の第２もしくは第４の態様による細胞は、遺伝子または細胞療法のための細胞または組織の調製において使用され得る。
【００９５】
本発明は、本発明の第１の態様による遺伝子発現システム、または本発明の第２の態様による細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物もまた含む。
【００９６】
本発明の作用物質（すなわち、遺伝子発現システムまたは細胞）が単独で投与されることは可能であるが、それを１つ以上の許容可能な担体とともに医薬製剤として与えることが好ましい。担体は、治療剤と適合性があり、その受容者に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。通常、担体は、滅菌されており発熱物質を含まない、水または生理食塩水である。
【００９７】
適切な場合、製剤は、好都合なことに単位剤形で提供されてもよく、薬学の技術分野において周知の方法のいずれかによって調製されてもよい。そのような方法は、活性成分を１つ以上の補助成分を構成する担体と結合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または微粉化した固体担体またはその両方と均一かつ密接に結合させ、次いで必要に応じて生成物を成形することにより調製される。
【００９８】
経口投与のために適した本発明による製剤は、それぞれが所定量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤、または錠剤などの別個の単位として；粉末または顆粒として；水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液として；あるいは水中油型液体エマルジョンまたは油中水型液体エマルジョンとして与えられてもよい。有効成分はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして与えられてもよい。
【００９９】
錠剤は、任意に１つ以上の補助成分とともに、圧縮または成形することにより作製できる。圧縮錠剤は、任意に結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤、または分散剤と混合した、粉末または顆粒などの自由流動形態の活性成分を、適切な機械で、圧縮することにより調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適切な機械で成形することにより作製することができる。錠剤は、任意にコーティングまたは刻み目を入れてもよく、例えば、所望の放出プロファイルを提供するために様々な割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用して、その中の活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化してもよい。
【０１００】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注射液；ならびに、懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供されてもよく、滅菌液体担体、例えば、使用直前の注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥（フリーズドライ）状態で保存されてもよい。即時注射溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【０１０１】
上記で特に言及した成分に加えて、本発明の製剤は、当該の製剤の種類を考慮して、当該技術分野における従来の他の薬剤を含み得ることが理解されるべきである。
【０１０２】
個体に投与される薬剤の量は、特定の個体の状態と戦うために有効な量である。量は医師によって決定されてもよい。
【０１０３】
好ましくは、本明細書に記載される本発明の任意の態様の文脈において、対象または個体はヒトである。あるいは、対象は、動物、例えば、飼いならされた動物（例えば、犬または猫）、実験動物（例えば、実験用げっ歯類、例えば、マウス、ラット、もしくはウサギ）または農業で重要な動物（すなわち家畜）、例えば、馬、牛、羊、もしくはヤギであってもよい。
【０１０４】
本発明の第７の態様は、少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーを変化させる化合物についてスクリーニングする方法を提供し、この方法は、
ａ．本発明の第２または第４の態様による誘導されたニューロンを、試験される少なくとも１つの化学化合物に曝露すること、
ｂ．少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーのレベルを記録すること、
ｃ．ｂ．における少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーの記録したレベルを、１つ以上の参照レベルと比較すること、および
ｄ．１つ以上の参照レベルを用いて、少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーのレベルを変化させる少なくとも１つの化合物を選択すること
を含む。
【０１０５】
化学化合物は、抗体、ペプチド、ペプチド模倣物、天然物、炭水化物、アプタマー、または有機低分子もしくは合成低分子のいずれかを含む任意の化合物であり得る。
【０１０６】
一実施形態において、誘導されたニューロンは、工程（ａ）において１つより多い化学化合物に曝露される。これは、１つより多い化学化合物が単独ではなく組み合わせでのみ有効であることが知られているかまたは信じられている場合に望ましいことがある。
【０１０７】
当該技術分野において周知であるように、バイオマーカーは、正常な生物学的過程の指標、病理学的過程の指標、および／または治療的介入に対する薬理学的応答の指標を提供するために客観的に測定および評価できる任意の特性であり得る。「疾患関連バイオマーカー」には、任意のバイオマーカーの意味が含まれており、その評価を使用して疾患の状態の表示を提供することができる。例えば、疾患関連バイオマーカーは、対象に対する治療の推定効果の指標（リスク指標または予測バイオマーカー）を提供し得るか、疾患がすでに存在しているかどうかの指標（診断バイオマーカー）を提供し得るか、または治療の種類に関係なく、個々の症例においてこのような疾患がどのように発症し得るかについての指標（予後バイオマーカー）を提供し得る。
【０１０８】
一実施形態において、バイオマーカーは、核酸、タンパク質、または代謝産物などの分子であり、その濃度は、ある疾患状態の重症度または存在を反映している。例えば、疾患関連バイオマーカーは、健常な細胞または組織には通常存在しないか、または検出可能ではないが、疾患細胞または組織には存在しかつ検出可能な分子であり得るか、あるいは、健常な細胞または組織の分子の濃度に対して、疾患細胞もしくは組織において異なる濃度で存在する分子であり得る。核酸、タンパク質、および代謝産物などの分子の検出および定量化は、当該技術分野の標準的な方法を使用して日常的に実施することができる。例えば、核酸は、ＰＣＲまたはｒＲＴ−ＰＣＲを使用して検出でき、タンパク質は、ＥＬＩＳＡおよび抗体結合アッセイを使用して検出でき、代謝産物は、ＨＰＬＣ、ＬＣ、および／または質量分析を含む既知の分析化学技術によって測定できる。
【０１０９】
疾患関連バイオマーカーは、細胞内分子であってもなくてもよく、したがってこの用語には、細胞外分子および／または細胞内分子の両方が含まれることが理解される。
【０１１０】
別の実施形態において、バイオマーカーは、分子ではないが、検出可能な活性もしくは機能、または細胞形態もしくは任意の他の表現型の検出可能な変化などの、他の方法で検出可能な別の特性である。さらにまた、当業者は、例えば、パッチクランプ技術、画像化、および顕微鏡検査を含む当該技術分野における標準的な慣行を用いて、例えば、神経細胞の活動または機能または形態を容易に評価できる。
【０１１１】
本発明の技術によって生成される、誘導されたニューロン細胞は、神経変性疾患およびその治療の研究において特に有用であると考えられ、したがって、好ましい実施形態において、疾患関連バイオマーカーは、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病のいずれかのなどの神経障害のバイオマーカーである。
【０１１２】
そのような疾患関連バイオマーカーは、当業者に周知であり、科学文献を調査することにより容易に特定することができる。実際、研究成果がますます多くの疾患の疾患関連バイオマーカーを文書化し続けているため、それらを効率的に抽出するためのシステムが導入されている（例えば、Ｂｒａｖｏ  ｅｔ  ａｌ  “Ａ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−Ｄｒｉｖｅｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ”  ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１４（２０１４）、論文ＩＤ  ２５３１２８、１１ページを参照のこと）。
【０１１３】
一実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の疾患関連バイオマーカーが工程（ｂ）で評価される。疾患が複数の疾患関連バイオマーカーを有する疾患である場合、１つより多い疾患関連バイオマーカーを評価することがしばしば望ましく、それらのいくつかまたはすべてのレベルを変更する化合物を見つけることは、治療法を見つける機会を改善し得る。しかし、この方法は、１つの疾患関連バイオマーカーの評価のみを必要とする場合があることが理解される。
【０１１４】
工程（ｂ）における疾患関連バイオマーカーの「レベルを記録すること」または「測定レベルを記録すること」は、化学化合物への誘導されたニューロンの曝露後に明らかな疾患関連バイオマーカーのレベルを示すという意味を含む。これには、疾患関連バイオマーカーのレベルを測定すること、または疾患関連バイオマーカーのすでに測定されたレベルを書き記すことが含まれ得る。次いで、書き記したまたは記録されたレベルは、疾患関連バイオマーカーの参照レベルと比較できる。
【０１１５】
工程（ｃ）の「疾患関連バイオマーカーの参照レベル」は、化学化合物によって引き起こされる疾患関連バイオマーカーのレベルに変化があったかどうかを判定するために、工程（ｄ）で記録されたレベルと比較できる疾患関連バイオマーカーのレベルの意味が含まれる。参照レベルは、化学化合物に直ちに曝露した同じまたは異なる細胞において記録されたもの、または実験の前に記録されて比較使用のために保存されたものであり得る。
【０１１６】
工程（ｂ）で記録された１つ以上の疾患関連バイオマーカーのレベルが工程（ｃ）の１つ以上の参照レベルと異なる場合、化学化合物は１つ以上の疾患関連バイオマーカーを変更するものである。
【０１１７】
疾患関連バイオマーカーを変更する化学化合物の同定は、薬物スクリーニング経路の最初の段階であり得、同定された作用物質は、例えば、当該の疾患のモデルにおける有効性のためにさらに選択できることが理解される。したがって、本方法は、当該の疾患（例えば、神経変性疾患）のモデル（例えば、動物モデル）において化学化合物を試験する工程をさらに含むことができる。
【０１１８】
これらの方法は、当業者に周知の用語である薬物スクリーニング法であり得、化学化合物は、薬物様化合物の開発のための薬物様化合物またはリード化合物であり得ることが理解される。
【０１１９】
「薬物様化合物」という用語は、当業者に周知であり、例えば、医薬の有効成分として、医薬における使用に適するようにすることができる特性を有する化合物の意味を含み得る。従って、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技術により、あまり好ましくないが分子生物学または生化学の技術により合成され得る分子であり得、そして好ましくは５０００ダルトン未満であり得、水溶性であり得る小分子である。薬物様化合物は、特定の１つまたは複数のタンパク質との選択的相互作用の特徴をさらに示し得、かつ、生体利用可能でありかつ／または標的細胞膜もしくは血液脳関門を透過することができ得るが、これらの特徴は必須ではないことが理解される。
【０１２０】
「リード化合物」という用語は、同様に当業者によく知られており、それ自体が薬物としての使用には適していないが（例えば、それが、単に、その意図した標的に対して効力が弱いか、作用が非選択的であるか、不安定であるか、難溶性であるか、合成が困難であるか、または生物学的利用能が低いため）、より望ましい特性を有する可能性がある他の化合物の設計のための出発点を提供する可能性がある、化合物という意味を含み得る。
【０１２１】
一実施形態において、同定された化合物は修飾され、修飾化合物は、１つ以上の疾患関連バイオマーカーを変更する能力について試験される。
【０１２２】
化合物はまた、当業者に周知のように、他の試験、例えば毒物学試験または代謝試験に供されてもよい。
【０１２３】
本発明の第８の態様は、個体における加齢に関連する神経学的臨床状態の存在、進行、または初期発症／発生を検出するための方法を提供し、この方法は、
ａ．本発明の第１の態様の遺伝子発現システムを、個体から得られた生検サンプル中の線維芽細胞に導入すること、
ｂ．誘導されたニューロンの段階で、これらの細胞における少なくとも１つの潜在的な疾患に関連する表現型またはバイオマーカーのレベルを記録すること、
ｃ．ｂ．における少なくとも１つの潜在的な疾患に関連する表現型またはバイオマーカーの記録したレベルを、１つまたは複数の参照レベルと比較すること、および
ｄ．年齢に関連する神経学的臨床状態の不在、存在、進行、または早期発症／発生の指標としての、ｃ．における参照レベルとの相関に基づいて、サンプルを層別化すること
含む。
【０１２４】
好ましい遺伝子発現システム、生検サンプル、および遺伝子発現システムの線維芽細胞への導入（例えば形質導入）には、本発明の第１および第２の態様に関連して上述したものが含まれる。
【０１２５】
好都合なことに、遺伝子発現システムを導入する前に、例えば、上記および実施例に記載のように線維芽細胞成長培地で細胞を培養することにより、線維芽細胞集団を増大させるために生検サンプルを培養する。
【０１２６】
一実施形態では、年齢に関連する神経学的臨床状態は、家族性および散発性アルツハイマー病、家族性および散発性パーキンソン病、ならびにハンチントン病を含む群から選択される。
【０１２７】
疑念を避けるために、「疾患に関連する」および「疾患関連」という用語は本書では同等であり、「疾患に関連する表現型」という用語は、「疾患関連バイオマーカー」と同じとみなすことができる。
【０１２８】
潜在的な疾患に関連する表現型またはバイオマーカーには、疾患関連バイオマーカー、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病のいずれかなどの神経学的状態の疾患関連バイオマーカーになる可能性のある任意の測定可能なバイオマーカーの意味が含まれる。
【０１２９】
例えば、工程（ｂ）は、疾患関連バイオマーカーとして現在知られていない誘導されたニューロンの細胞内タンパク質のレベルを測定することを含み得るが、一旦、その記録したレベルが工程（ｃ）において１つ以上の参照レベルと比較されると、例えば、年齢に関連する神経学的状態の不在、存在、進行、または早期発症／発生の既知の状態を有する個体から得られた誘導されたニューロンにおいて測定されるように、細胞内タンパク質のレベルを、年齢に関連する神経学的状態の不在、存在、進行、または早期発症／発生の状態と相関させることが可能であり得る。そのような相関は、細胞内タンパク質のレベルが、年齢に関連する神経学的状態の不在、存在、進行、または早期発症／発生の状態に応じて実際に変化すると仮定すると可能になる。細胞内タンパク質のレベルがそれほど変化しない場合、それは疾患関連バイオマーカーとは見なされない。
【０１３０】
（ｃ）の参照レベルとの相関に基づいてサンプルを層別化することは、年齢に関連する神経学的状態の不在、存在、進行、または早期発症／発生の特定の状態を有する個体にサンプルを帰属させる意味を含む。例えば、所定の細胞内タンパク質のレベルが、加齢に伴う神経障害の不在、存在、進行、または早期発症／発生に応じて変化する場合、その細胞内タンパク質のレベルが決定されている任意の所与のサンプルをその年齢に関連する神経障害の正確な状態に帰属させることが可能となる。
【０１３１】
本発明の第９の態様は、誘導されたニューロンに線維芽細胞を直接変換する際の、ＲＥＳＴ阻害物質、例えば、ＲＥＳＴ発現を抑制することができるＲＥＳＴサイレンシング配列の使用を含む。
【０１３２】
本発明はまた、線維芽細胞を、ＲＥＳＴ阻害物質と、例えば、ＲＥＳＴ発現を抑制することができるＲＥＳＴサイレンシング配列と接触させることを含む、誘導されたニューロンに線維芽細胞を直接変換する方法を提供する。この方法は、インビトロまたはエキソビボで実施され得る。
【０１３３】
好ましいＲＥＳＴ阻害物質、例えば、ＲＥＳＴ発現を抑制することができるＲＥＳＴサイレンシング配列、および線維芽細胞は、本発明の第１および第２の態様に関連して上述されている。
【０１３４】
ＲＥＳＴサイレンシング配列が、ＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２など、本発明の第１の態様に関連して上述した１つまたは複数の既知のニューロン変換因子と組み合わせて使用される場合が好ましい。
【０１３５】
本発明はまた、本発明の第１の態様に関して、特に、Ａｓｃｌ１のペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列、Ｂｒｎ２のペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列、およびＲＥＳＴ発現を抑制する短いヘアピンＲＥＳＴ配列などのＲＥＳＴサイレンシング配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の第３ヌクレオチド配列を含む遺伝子発現システムに関して上述した遺伝子発現システムを含む、ヒト線維芽細胞などの動物線維芽細胞においてニューロンを誘導するための要素のキットを提供する。
【０１３６】
本明細書における明らかに以前に公開された文書のリストまたは議論は、その文書が当該分野の状態の一部であるか、または一般的な一般知識であると認めるとして必ずしも受け取られるべきではない。
【０１３７】
ここで、以下の図および実施例を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】２シストロン性アプローチは、胎児線維芽細胞を再プログラムすることに成功するが、成体線維芽細胞を再プログラムすることはできない。（Ａ）ＭＡＳＨ１およびＢＲＮ２Ａ、ならびに、ウッドチャック肝炎転写後エレメント（ＷＰＲＥ）を異なる位置でコードする神経変換因子ＡＳＣＬ１を含有する構築物のベクターマップ。（Ｂ）異なる構築物による形質導入後のＡＳＣＬ１（赤い棒グラフ）とＢＲＮ２ａ（黄色の棒グラフ）の蛍光強度の差異を示す定量分析。（Ｃ）Ｐｇｋ．Ａｓｃｌ１＋Ｐｇｋ．Ｂｒｎ２ａ＋Ｐｇｋ．Ｍｙｔ１ＬまたはｐＢ．ｐＡのいずれかによる形質導入の１２日後に変換されたｉＮの数の定量化。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。（Ｄ）遺伝子オントロジー濃縮解析により、ｐＢ．ｐＡを形質導入された胎児線維芽細胞の上方制御された遺伝子の中でニューロン遺伝子（太字）の大幅な濃縮が明らかにされている。（Ｅ）ｐＢ．ｐＡを形質導入された胎児線維芽細胞では上方制御されているが、ｐＢ．ｐＡを形質導入された成体線維芽細胞では上方制御されていないニューロン（太字）に関連する遺伝子を示す遺伝子オントロジー濃縮分析。データ情報：データは平均値±ＳＥＭとして表され、生物学的レプリケート（ｎ＝３）からのものである。＊ｐ＜０．０５。
【図２】ＲＥＳＴノックダウンは、成体ヒト線維芽細胞のｐＢ．ｐＡ駆動の再プログラミングを促進する。（Ａ）ＲＥＳＴ遺伝子発現のｑＰＣＲ分析。（Ｂ）５人の健常ドナー（６１〜７１歳）からの神経効率とｐＢ．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉの再プログラムされた成体ヒト皮膚線維芽細胞の純度。（Ｃ）異なる継代においてｐＢ．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉで再プログラムされた成体ヒト皮膚線維芽細胞系統のニューロン効率と純度の定量化。（Ｄ）形質導入後１２〜１５週間での成熟神経生理学を示す反復電流誘導活動電位を示す成体ｉＮのインビトロパッチクランプ記録。（Ｅ）移植後８週間のインビボでの反復電流誘発活動電位および自発的なシナプス後電流の存在。データ情報：略語：ａｈＤＦ：成体ヒト皮膚線維芽細胞、ｓｈＲＥＳＴ：ＲＥＳＴに対する短いヘアピンＲＮＡ。データは平均±ＳＥＭとして表され、生物学的レプリケート（ｎ＝３〜４）からのものである。＊ｐ＜０．０５。
【図３】ニューロンのマイクロＲＮＡ発現は、成体線維芽細胞のニューロンの再プログラミングを部分的に促進する。（Ａ）ｐＢ．ｐＡのみまたはｐＢ．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉで再プログラムされ、非形質導入線維芽細胞値で正規化された成体線維芽細胞におけるｍｉＲ−１２４およびｍｉＲ−９のｑＰＣＲ測定（黄色の破線）。（Ｂ）ｐＢ．ｐＡのみまたはｐＢ．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉで再プログラミングされ、非形質導入線維芽細胞値で正規化された成体線維芽細胞の領域特異的マイクロＲＮＡ  ｑＰＣＲ測定（黄色の破線）。（Ｃ）ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−１２４を有するおよびこれらを有さない転写因子Ａｓｃｌ１およびＢｒｎ２ａを含む構築物のベクターマップ、およびＲＥＳＴに対するｓｈＲＮＡ配列。（Ｄ）異なる再プログラミングベクターを形質導入された成体線維芽細胞におけるＭＡＰ２発現により評価されるニューロン収量の定量化。（Ｅ）ｍｉＲ−１２４を有するおよびこれを有さない成体ｉＮの細胞総数、ＴＡＵ＋細胞の割合および平均蛍光強度の定量化。（Ｆ）ｍｉＲ−９ノックダウンを有するおよびこれを有さない成体ｉＮの細胞総数、ＴＡＵ＋細胞の割合、および平均蛍光強度の定量化。データ情報：略語：ＣＴＲ：対照、ＫＤ：ノックダウン。データは平均±ＳＥＭとして表され、生物学的レプリケート（ｎ＝３〜４）からのものである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図４】さまざまな神経変性疾患の患者の皮膚線維芽細胞を再プログラムするためのオールインワンベクター。（Ａ）ＲＥＳＴ  ｓｈＲＮＡ配列ならびにＢｒｎ２ａおよびＡｓｃｌ１を含む単一の再プログラミングベクターのマップ。（Ｂ）４つの異なる成体皮膚線維芽細胞系統でのｐＢ．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉ再プログラミング用の個別または単一のベクターを使用する、細胞の総数、ならびに１ウェルあたりのＭＡＰ２＋およびＴＡＵ＋細胞の数の定量的比較。（Ｃ）ニューロン数と純度の定量化。（Ｄ）各系統のさまざまな数の神経突起を表示している細胞の割合（1系統あたりｎ＝３のレプリケート）。（Ｅ）健常個体およびさまざまな神経変性障害患者の６つのニューロン遺伝子のｑＰＣＲ分析。データ情報：略語：ＦＡＤ：家族性アルツハイマー病、ＦＰＤ：家族性パーキンソン病、ＨＤ：ハンチントン病、ＳＰＤ：散発性パーキンソン病。データは平均±ＳＥＭとして表され、生物学的レプリケート（ｎ＝４）からのものである。
【図５】ｐＢ．ｍｉｒ９／１２４．ｐＡによる形質導入後の高いｍｉＲＮＡ−９およびｍｉＲＮＡ−１２４の発現。（ａ、ｂ）線維芽細胞レベルと比較した、ｐＢ．ｐＡまたはｐＢ．ｍｉｒ９／１２４．ｐＡのいずれかによる形質導入の３日後のｍｉＲ−９（ａ）およびｍｉＲ−１２４（ｂ）の定量的ＰＣＲ分析。略語：ａｈＤＦ：成体ヒト皮膚線維芽細胞。
【実施例】
【０１３９】
実施例１  ＲＥＳＴ抑制はマイクロＲＮＡ依存性および非依存性経路を介して成体ヒト線維芽細胞の神経変換を媒介する
緒言
誘導されたニューロン（ｉＮ）と呼ばれる成熟しかつ機能的なニューロンへのヒト線維芽細胞の直接変換は、６年前に初めて達成された。この技術は、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および他の生物医学適用のために、患者および疾患固有のニューロンを取得するための有望な近道を提供する。しかし、成体ドナーの線維芽細胞は胎児ドナーほど簡単に再プログラミングできず、再プログラミング手法は、大規模な適用に患者由来の材料を使用してこの技術を使用できるほど十分に効率的ではない。ここでは、胎児ヒト線維芽細胞と成体ヒト線維芽細胞の間の再プログラミング必要条件における相違を調査し、成体線維芽細胞の主要な再プログラミング障壁としてＲＥＳＴを特定する。ＲＥＳＴで制御されたニューロン固有のマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−１２４を過剰発現およびノックダウンする機能的実験を通して、本発明者らは、ＲＥＳＴ阻害の効果がマイクロＲＮＡの上方制御を介して部分的にのみ媒介されることを示す。転写解析は、ＲＥＳＴノックダウンが、マイクロＲＮＡの過剰発現としてのニューロン遺伝子の重複サブセットと、マイクロＲＮＡの過剰発現を介して活性化されないニューロン遺伝子の異なるセットを活性化することを確認した。これに基づいて、本発明者らは、単一ベクターシステムを使用して高齢個体由来の皮膚線維芽細胞を効率的に再プログラムするために最適化された単一工程方法を開発し、パーキンソン病、ハンチントン病、ならびにアルツハイマー病を含むある範囲の家族性および散発性神経変性障害を有する老齢個体から高収率および高純度のｉＮを取得できることを実証した。
【０１４０】
結果
神経変換遺伝子の同時送達のための２シストロン性ベクターの開発
各細胞の転写因子発現の変動が少ない高度に効果的かつ再現性のある変換システムを達成するために、本発明者らは、３つの異なる二重プロモーターベクターを生成して試験した。各導入遺伝子の発現のレベルは各細胞間で異なる場合があるが、この二重ベクターアプローチは、すべての細胞で２つの神経変換遺伝子Ａｓｃｌ１（ＮＭ＿００８５５３．４）およびＢｒｎ２（ＮＭ＿００８８９９．２）のコーディング配列の送達を保証する。ベクターはヒトＰＧＫプロモーターに基づいており、変換遺伝子はウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）とは異なる順序と距離で配置された（図１ａ）。調節可能なシステムのために、ＰＧＫプロモーターをドキシサイクリン調節可能プロモーターに置き換えることができる。ヒト胎児線維芽細胞で発現した場合、３つの構築物は、異なるレベルの変換遺伝子の発現をもたらし（図１ｂ）、本発明者らは、ＡＳＣＬ１とＢＲＮ２のタンパク質発現比が最も高いｐＢ．ｐＡ構築物が、最高レベルの神経変換をもたらすことを見い出した。ｐＢ．ｐＡ二重プロモーターベクターを使用して２つの変換因子を同時送達した場合、本発明者らは、別個のベクターを使用して神経変換因子を送達した場合と比較して、ｉＮの収量が３０倍より多く増加したことを見い出した（図１ｃ）。
【０１４１】
胎児線維芽細胞と成体線維芽細胞の変換メカニズム／必要条件における相違
全体的な遺伝子発現解析により、ｐＢ．ｐＡ二重プロモーター構築物が胎児線維芽細胞の遺伝子発現に大きな変化を誘導することが確認された。本発明者らは、５６１の有意に（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）修正ｐ値＜０．００１）上方制御された遺伝子、３２８の有意に下方制御された遺伝子を、変換ベクターの送達後５日目に見い出した。遺伝子オントロジー分析は、この再プログラミングベクターを使用して観察された高い変換収率と一致して、上方制御された遺伝子の多くがニューロンの同一性と関連していることを示した。次に、本発明者らは、同じシステムを使用して、６７歳の環状個体の成体皮膚線維芽細胞を変換した。しかし、３０日後に検出されたｉＮは、あったとしてもごくわずかであった。この再プログラムの失敗が実際に成体の線維芽細胞対胎児の線維芽細胞に関連しており、線維芽細胞の起源の相違によるものではない可能性を排除するため、４５〜６５人の個体からの成体肺線維芽細胞を使用した再プログラムの失敗を確認した。
【０１４２】
胎児線維芽細胞と成体線維芽細胞の再プログラミング必要条件における相違をより良好に理解するために、本発明者らは、ＲＮＡ−ｓｅｑを使用して二重変換ベクターの送達後の細胞の転写応答を評価した。ｐＢ．ｐＡ二重プロモーターベクターによる形質導入後、本発明者らは、成体と胎児の両方の線維芽細胞で２０４の遺伝子が上方制御された（ｐ＜０．００１）一方で、別の３５７および４２１の遺伝子がそれぞれ、形質導入された胎児または成体の線維芽細胞において独特に上方制御されたことを見い出した（ピアソン相関：０．３０７、図１ｄ）。胎児の線維芽細胞で上方制御された遺伝子のＧＯ解析は、ニューロン機能に関連する遺伝子カテゴリーをもたらしたが、成体線維芽細胞ではそうではなかった（図１ｅ）。これは、神経変換因子が、２つの出発集団でオーバーラップが制限されている、大きく異なる遺伝子のセットを活性化することを実証し、胎児線維芽細胞ではなく成体線維芽細胞に存在する再プログラミングに対する特定の障壁があることを示唆する。胎児の線維芽細胞において独特に上方制御されたニューロンの分化と発達に関連する上位１０の遺伝子を見ると、４つがＲＥＳＴターゲット：ＪＡＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＤＹＮＬＬ２、ＤＣＬＫ１として同定され、ＲＥＳＴが、成体線維芽細胞のニューロン遺伝子の活性化とそれに続く神経細胞変換をブロックすることを示唆する。
【０１４３】
ＲＥＳＴ阻害は成体の肺および皮膚の線維芽細胞における神経再プログラミング妨害を解消する
ＲＥＳＴがＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２を形質導入された成体線維芽細胞の神経変換を妨げるという仮説を検証するために、本発明者らは、胎児および成体の線維芽細胞でｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、これは、成体細胞でＲＥＳＴ転写産物のレベルがわずかに増加することを明らかにした（図２ａ、ｐ＜０．０５）。次に、本発明者らは、ＲＮＡｉを使用してＲＥＳＴをノックダウンし、これは、成体線維芽細胞のＲＥＳＴ転写レベルを胎児ヒト線維芽細胞で観察されたレベルまで低下させた（図２ａ）。本発明者らが、２人の異なるドナー（６１および６７歳）からの成体皮膚線維芽細胞でＲＥＳＴに対するｓｈＲＮＡとともに二重プロモーター変換ベクターを発現させたとき、本発明者らは、例外的に高い神経変換レベルを一貫して観察した。また、本発明者は、ＲＥＳＴｉが成体肺線維芽細胞の再プログラミング障壁を除去することも確認した。高い変換効率は、６１歳から７１歳までの年齢であり、３つの異なる臨床現場から供給された個体の皮膚生検材料からの５つの一次系統を使用して確認された（図２ｂ）。本発明者らはまた、より継代数の多い継代で再プログラミング効率が低下することを実証する以前のレポートとは対照的に、６７歳のドナーからの線維芽細胞が二重プロモーター構築物と、３から１０世代の範囲の継代のＲＥＳＴｉを用いて再プログラミングした場合、変換効率またはニューロン純度の低下はなかったことを観察し（図２ｃ）、このことは、ＲＥＳＴｉが、以前に観察された線維芽細胞の広範な継代に関連する再プログラミングに対する障壁も除去することを暗示する。
【０１４４】
次に、本発明者らは、得られたｉＮの成熟ニューロンの特性を分析した。本発明者らは、これらが、ＭＡＰ２、ＮＥＵＮ、シナプシン、およびＴＡＵなどの成熟ニューロンマーカーを実際に発現することを見い出した。培養における最終分化および成熟後のｉＮのパッチクランプ電気生理学的記録は、それらがニューロンの機能特性を獲得したことを示した（図２ｄおよび表Ｓ２）。これは、ヒトシナプシンプロモーターの制御下で発現したＧＦＰを含むベクターで前標識された細胞が、新生児の脳に移植され、インビボで７〜９週間の成熟後に分析された場合にも当てはまる。ＧＦＰ発現に基づいて検出された移植ｉＮを分析するとき、本発明者らは、再度、ｉＮにおいて電流誘発された複数の活動電位（４つの異なるマウスからのｎ＝８）が再び検出され（図２ｅ）を見い出し、細胞は、グルタミン酸拮抗薬ＣＮＱＸでブロックできるシナプス後電流を示し（図２ｅ）、これらの成体ｉＮ細胞は、ＲＥＳＴｉが機能的に成熟し、統合され、宿主の脳からのグルタミン酸作動性シナプス入力を受けると、存在下で変換されることを実証した。
【０１４５】
ＲＥＳＴｉは神経特異的ｍｉＲＮＡの上方制御をもたらす
ｍｉＲＮＡは、神経変換を含む、細胞の再プログラミングの重要なメディエーターとして関与してきた。ＲＥＳＴの阻害は、ニューロン特異的なｍｉＲＮＡの発現を増大させることが知られており、本発明者らは、ｍｉＲＮＡの潜在的な上方制御は、成体ヒト線維芽細胞の神経変換中にＲＥＳＴｉの効果を媒介するものであり得ると推測した。したがって、本発明者らは、ＲＥＳＴ阻害の非存在下および存在下でニューロン特異的なｍｉＲＮＡ発現レベルを評価し、成体線維芽細胞がＲＥＳＴｉの存在下で変換される場合、ｍｉＲ−９が上方制御されることを見い出した（図３ａ）。また、多数の領域特異的ｍｉＲＮＡの発現をチェックしたが、明らかな差異は見られず、これは、サブタイプの同一性に影響を与えることなく、ＲＥＳＴｉが汎ニューロンの発現に影響を与えることを示す（図３ｂ）。これをさらに調査するために、本発明者らは、ニューロン特異的なｍｉＲＮＡの発現がＲＥＳＴｉの効果を模倣できるかどうかを試験した。したがって、本発明者らは、ｍｉＲ−９／９＊およびｍｉＲ−１２４を変換因子（図３ｃ）とともに発現させたが、ＲＥＳＴｉはなかった。本発明者らは、この構築物を形質導入された成体線維芽細胞が、高レベルのｍｉＲ−９およびｍｉＲ−１２４を発現し（図Ｓ１ａ、ｂ）、成体線維芽細胞を、ＲＥＳＴｉで処理された細胞と同様の効率でニューロンに変換することを見い出し（図３ｄ）、このことは、ＲＥＳＴｉ効果はｍｉＲ−９／９＊およびｍｉＲ−１２４の上方制御を介して媒介される可能性があり、ＲＥＳＴｉのようなｍｉＲＮＡは成体線維芽細胞における再プログラミング障壁を除去し、老齢ドナー由来の線維芽細胞も効率的かつ再現可能にニューロンに変換できるという仮説を支持する。
【０１４６】
ＲＥＳＴｉ効果がｍｉＲＮＡの上方制御を介して媒介されるかどうか実験的に取り組むために、本発明者らは、次にｐＢ．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉを使用して変換を行い、同時に細胞内のｍｉＲ−１２４またはｍｉＲ−９をノックダウンし、神経変換への影響を確認した（図３ｅ〜ｆ）。変換中のｍｉＲ−１２４の阻害はｉＮ形成に有意な影響を及ぼさなかったが（図３ｅ）、変換中のｍｉＲ−９の阻害は、対照と比較して生成されたｉＮの数の減少をもたらした（図３ｆ）。
【０１４７】
まとめると、私たちのデータは、ＲＥＳＴｉの効果がｍｉＲＮＡの過剰発現を介して模倣できるが、変換プロセス中のｍｉＲＮＡ阻害のブロックは神経変換に部分的にしか影響しないことを示す。これは、ｍｉＲＮＡの活性化、およびＲＥＳＴｉとｍｉＲＮＡ間の以前に提案された相互作用を介して、ＲＥＳＴｉが作用することを支持する。
【０１４８】
ＲＥＳＴ阻害のマイクロＲＮＡ非依存性効果
ＲＥＳＴｉまたはｍｉＲ−９／ｍｉＲ−１２４によって駆動される成体線維芽細胞の変換を媒介するメカニズムをより良好に理解するために、本発明者らは、変換の開始から５日後に、ＲＮＡ配列決定を使用して全体的な遺伝子発現の比較分析を行った。この分析では、本発明者らは、未変換の成体ヒト線維芽細胞と、ＲＥＳＴが阻害されている対照としての成体線維芽細胞とを含めた。含まれた変換グループは以下であった：ｐＢ．ｐＡ（存在する場合、非常に低レベルのｉＮ変換のみを与える）；ｐＢ．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉ；ｐＢ．ｍｉＲ９／１２４．ｐＡおよびｐＢ．ｍｉＲ９／１２４．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉ。本発明者らは、ｐＢ．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉグループとｐＢ．ｍｉＲ９／１２４．ｐＡグループで、上方制御された遺伝子（ＢＨ補正ｐ値＜０．００１）を比較した。この分析は、ＲＥＳＴｉとｍｉＲ−９／ｍｉＲ−１２４の両方の送達が、細胞に大きなトランスクリプトームの変化が生じ、その効果は累積的ではないことが示された。さらなる分析は、最大のＦＣを有する遺伝子のほとんどが、ｍｉＲ−９／ｍｉＲ−１２４形質導入細胞およびＲＥＳＴｉ形質導入細胞の両方で有意であることが示した（ピアソン相関＝０．８１）。ほとんどの遺伝子（１７００個より多い）は両方のグループで上方制御されており、これらの要因が主に同じ神経経路に作用しかつ類似の遺伝子カスケードを活性化することを示唆している。
【０１４９】
次に、本発明者らは、ＲＥＳＴｉ変換細胞とｍｉＲＮＡ変換細胞の間の遺伝子発現プロファイルの差異をより詳細に調べた。ユークリッドのサンプル距離に基づく教師なしクラスタリングは、２つの対照（線維芽細胞と線維芽細胞＋ＲＥＳＴｉ）およびｐＢ．ｐＡ（非常に低い変換のグループ）が一緒にクラスター化され、その一方で、神経変換が成功した３つのグループすべてが一緒にクラスター化されたことを明らかにした。主成分分析は、３つの変換グループはＰＣ１軸上で非常に類似しており、対照グループとは明らかに異なることを明らかにした。さらに、ＰＣ２軸は、ＲＥＳＴｉのあるグループとそうでないグループの分離を示した。ＧＯ用語と、差次的に発現する遺伝子の京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）経路分析は、ＲＥＳＴｉ変換グループで差次的に発現する遺伝子が、シナプス伝達、シナプス可塑性、ならびに細胞形態形成および分化の調節、神経発生およびシナプス形成の調節について濃縮されていることを明らかにした。対照的に、ｐＢ．ｍｉＲ９／１２４．ｐＡにおいて独特に上方制御された遺伝子は、ニューロンの特性と関連していなかった。
【０１５０】
まとめると、本発明者らの結果は、ＲＥＳＴｉが神経変換遺伝子Ａｓｃｌ１およびＢｒｎ２ａと組み合わされると、再プログラミングと神経成熟の両方のヒト特有の障壁を克服することを示す。ｍｉＲＮＡノックダウン実験ならびにグローバルトランスクリプトーム解析は、この効果がｍｉＲ−９／ｍｉＲ−１２４発現を介して部分的にのみ媒介されることを示唆する。
【０１５１】
これに基づいて、本発明者らは、同じコンストラクト上でＲＥＳＴｉヘアピンと変換遺伝子の両方を発現する単一の「オールインワン」構築物を設計およびクローニングした（図４ａ）。このベクターは、二重プロモーターベクターｐＢ．ｐＡと３つの別々のベクター上の２つのＲＥＳＴ  ｓｈＲＮＡとを使用して変換遺伝子が送達されるベクターシステムと比較して、ウイルスの必要性があまりないながらも、同様の変換効率をもたらした（図４ｂ）。高齢ドナー由来のｉＮは加齢の特徴を維持し、年齢がこれらの障害を発症する最大の危険因子であることを考えると、これは重要であることが示されているため、神経変性障害のモデル化はこの技術から大きな恩恵を受ける。疾患モデリング用の細胞を生成するためのその有用性を確立するために、本発明者らは、新しい単一ベクターシステムを使用して、健常成体からならびに散発性ＰＤ、家族性ＰＤ（ＬＲＲＫ２  ｃ．６０５５Ｇ＞Ａ突然変異）、ＨＤ（４１ＣＡＧリピート）、および家族性ＡＤ（ＡＰＰ  ＫＭ６７０／６７１ＮＬ突然変異）の個体からの皮膚線維芽細胞を変換した（表Ｓ１）。すべての系統が、収量と純度の点で系統間に多少の違いはあるものの、ＭＡＰ２を発現するｉＮに変換されることに成功した（図４ｃ）。本発明者らは、より成熟したニューロンへの変換を評価するために、ＭＡＰ２に加えてＴＡＵをニューロンマーカーとして使用した。すべての系統の変換は、各系統のさまざまな数の神経突起を発達させている細胞の割合によって評価されるように、同様の形態学的複雑さを有するニューロンをもたらした（図４ｄ）。さらに、ｑＰＣＲ分析は、ドナーの疾患状態に関係なく、変換されたすべての系統において、本発明者らが評価したすべてのニューロン遺伝子（ＮＣＡＭ、ＭＡＰ２、ＭＡＰＴ、シナプシン、ＳＮＣＡ、およびシナプトフィジン）の大幅な増大を明らかにした（図４ｅ）。
【０１５２】
（表１）生検材料ドナーに関する人口統計情報
2020519286.tif 000007
2020519286.tif 000008
【０１５３】
（表２）電気生理学的特性の概要
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【０１５４】
考察
幹細胞中間体を経由せずに、ある細胞型を別の細胞型に直接変換することが、ニューロンの生成を含む多くの細胞型で達成されることに成功した。このタイプの変換により、別の方法では患者および疾患に特異的なニューロンへのアクセスが困難である研究ができるようになり、神経障害の年齢に関連するモデルの作製に大きな期待が持てる。直接変換によって取得されるｉＮは、誘導分化多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用し、その後に方向付けられた分化が続く、従来のリプログラミングアプローチと比較して、ニューロンを生成するためのより速いルートを提示する。しかし、ｉＮ技術は、１つの成熟細胞型を有糸分裂後ニューロンに直接変換するので、下流の適用のために十分な数のニューロンを得るためには、高収率の変換が絶対的に不可欠である。
【０１５５】
これまでに、１２超の研究で、幅広い変換遺伝子、化学カクテル、およびｍｉＲＮＡを使用した成体初代皮膚線維芽細胞の神経再プログラミングの成功が報告されているが、すべてが比較的少ない数の誘導されたニューロンという結果になっている。精製工程または抗生物質の選択によりｉＮの純度が向上することができるが、これは大きな細胞損失に関連しており、総収量が低くなるため、多数のインプット細胞が必要になり、成体ヒト皮膚線維芽細胞はいつまでも増大しないため、この場合は制限される。この研究では、本発明者らは、胎児線維芽細胞対成体線維芽細胞の初期転写応答を研究することにより、成体ヒト線維芽細胞に特異的に存在する再プログラミングへの道筋の機構的理解を深めることに着手した。本発明者らは、最も一般的に使用される神経変換遺伝子（ＡＳＣＬ１およびＢＲＮ２）が、これら２つの集団で大きく異なる転写応答を誘発することを発見した。本発明者らの実験からのバイオインフォマティクスのデータは、胎児線維芽細胞でのみ上方制御された遺伝子の多くがＲＥＳＴ標的であることを示し、したがって、ＲＥＳＴを潜在的な成体特有の再プログラミング障壁として示唆した。
【０１５６】
したがって、本発明者らは、その後の研究の焦点をＲＥＳＴのノックダウンに合わせた。ＲＥＳＴｉは、ｍｉＲ−１２４ならびにｍｉＲ−９の発現も多数の細胞タイプで誘導することが示されており、これらのｍｉＲＮＡが、単独で、または神経転写因子と一緒に発現したときに、神経変換を媒介できることを考えると、これは興味深い。本発明者はまた、ニューロン固有のｍｉＲＮＡの過剰発現を介してＲＥＳＴｉの効果を部分的に模倣できる一方で、神経変換プロセス中のｍｉＲＮＡの活性化を阻害すると、ｉＮの形成が部分的にのみ阻害されることも示す。これは、ＲＥＳＴｉがニューロンのｍｉＲＮＡの上方制御だけでなく、ｍｉＲＮＡに依存しないメカニズムの両方を介して、神経変換への影響を媒介することを示唆する。この仮説は、同じニューロン遺伝子の多くがＲＥＳＴｉ、ｍｉＲＮＡ過剰発現、またはＲＥＳＴｉとｍｉＲＮＡの両方の組み合わせた発現で変換された線維芽細胞で上方制御されていることを明らかにした比較ＲＮＡ−ｓｅｑ分析によってサポートされ、ニューロンのアイデンティティに関連する追加の遺伝子転写の変化は、ＲＥＳＴｉの存在下で線維芽細胞が再プログラムされると、独特に上方制御される。
【０１５７】
まとめると、本発明者らの結果は、変換因子Ａｓｃｌ１とＢｒｎ２のＲＥＳＴｉと併用する同時送達に基づく変換戦略が、追加のｍｉＲＮＡ発現がなくても、以前に成体ドナーに関連付けられていた再プログラミング障壁を克服するのに十分であることを示す。それは、精製工程を必要とせずに、老化した皮膚線維芽細胞の高効率かつ高純度変換をもたらす。さらに、本発明者は、出発線維芽細胞培養の継代数が、少なくとも１０継代までは再プログラミング効率に影響を与えず、１回の皮膚生検で大規模な疾患モデリング、薬物スクリーニング、および移植研究を完了するために十分なｉＮ材料を提供することを保証することも示す。例えば、本発明者らのシステムの効率性により、１つの皮膚生検材料から約１００億個のニューロンを取得することが可能になり、これは、これまでのところ、高齢ドナー由来の皮膚生検材料を使用して、本発明者らの方法を、これまで報告された最も効率的なアプローチにする。これにより、本発明者らのアプローチがこれらの細胞の任意の潜在的な疾患に関連する表現型を探索するのに適したアプローチになり、薬物スクリーニングおよび診断に関連する細胞の容易に入手可能なソースが提供される。
【０１５８】
材料および方法
生検サンプリング
成体皮膚線維芽細胞は、ジョンヴァンゲースト脳修復センター（英国、ケンブリッジ）のパーキンソン病研究所およびハンチントン病クリニックから得られ現地の倫理的承認の下で使用されており（ＲＥＣ０９／Ｈ０３１１／８８）、臨床記憶研究ユニット（スウェーデン、マルモ）から得られスウェーデン、ルンドの地域倫理審査委員会の下で使用され（Ｄｎｒ  ２０１３−４０２）、カロリンスカ研究所（ストックホルム、スウェーデン）から得られ（Ｄｎｒ  ２００５／４９８−３１／３，４８５／０２；２０１０／１６４４−３２）、そして肺疾患の臨床病歴のない健常個体からの肺線維芽細胞は、現地の倫理委員会の承認の下でルンズ大学から得られた（Ｄｎｒ  ４１３／２００８および４１２／０３）（表Ｓ１を参照）。各参加者から書面によるインフォームドコンセントを取得し、局所麻酔（１％リドカイン）の下、上腕または下腕から４ｍｍのパンチ生検で皮膚生検を行い、その後、部位をステリストリップまたはステッチで閉じた。生検材料からの初代線維芽細胞培養物は、次の２つの方法に従って培養された。（１）標準的な線維芽細胞培地（１００ｍｇ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、および１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ））を使用して線維芽細胞を分離した。皮膚生検材料を４〜６片に切断し、１．５ｍｌの培地を含む０．１％ゼラチンでコーティングした６ｃｍ皿に入れ、１週間２〜３日ごとに０．５ｍｌを補充した。細胞の最初のプレーティングダウンの１週間後、すべての培地を除去し、２ｍｌの新鮮な培地を加えた。線維芽細胞の十分な集密度が観察されるまで、培地を３〜４日ごとに交換した。次に、皮膚生検サンプルを新しい皿に移し、生検材料から細胞がもはや成長しなくなるまでプロセスを繰り返した。（２）スウェーデンのバイオファインダー研究からの対象は、標準的な臨床手順を使用して、真皮全体から皮下脂肪層まで３ｍｍの皮膚パンチ生検を受けた。生検材料は直ちに、グルコース（１．８ｇ／ｌ）および抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）を含むカルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝生理食塩水中の氷上に置かれた。１．５〜４時間以内に、皮下脂肪と表皮を避けて生検材料を１０〜１５個に切断した。真皮片を６ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ）の１つのウェルに入れ、通常１５分未満の間、乾燥するまで層流キャビネット内に放置した。その後、２ｍｌの線維芽細胞培養液（ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質−抗真菌薬、すべてＧｉｂｃｏ）を加えた。インキュベーションは、５％ＣＯ２の標準細胞培養インキュベーターおよび３７℃の加湿空気で行った。培地の半分は週に２回交換された。培養ウェル表面の約３０％が線維芽細胞で覆われたとき、細胞を３７℃で約５分間のトリプシン処理により回収した（０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ）。細胞を洗浄し、室温で、１００×ｇで３分間遠心分離し、Ｔ２５培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移し、ＤＭＥＭ（上記と同様に１０％ＦＢＳを含む）または規定の無血清培地（Ｆｉｂｒｏｌｉｆｅ，Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）で培養した）。外植片には、２０％ＦＢＳを含む新しいＤＭＥＭを与え、インキュベーターに戻し、線維芽細胞をさらに移動させた。Ｔ２５フラスコで増大した線維芽細胞を１つのＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移すか、長期保存のために凍結した。肺生検のために、肺葉の実質標本を下葉の胸膜から２〜３ｃｍ採取した。血管および小さな気道を末梢肺組織から除去し、残りの組織を小さな断片に切り刻み、細胞培養フラスコのプラスチックに４時間付着させた。次に、線維芽細胞の増殖がコンフルエントになるまで、３７℃の細胞インキュベーター内の細胞培養培地に保存した。
【０１５９】
細胞培養および細胞株
ＨＦＬ１（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−１５３）細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、標準線維芽細胞培地で増殖させた。この研究で使用したすべての線維芽細胞は、線維芽細胞培地中の５％ＣＯ２で、３７℃で増大させた。次いで、細胞を０．０５％トリプシンで解離し、遠心分離し、１０％ＤＭＳＯを含む５０／５０  ＤＭＥＭ／ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）または１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳのいずれかの中で凍結した。
【０１６０】
ウイルスベクターおよびウイルス形質導入
調節されていない遍在性ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む第３世代のレンチウイルスベクター中のｍｉＲ−９／９＊およびｍｉＲ−１２４のＲＥＳＴまたはｍｉＲＮＡループを標的とする短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の有無にかかわらず、Ａｓｃｌ１またはＢｒｎ２またはＡｓｃｌ１とＢｒｎ２の組み合わせのマウスオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現するＤＮＡプラスミドが、生成された。インビボでの電気生理学的記録のために、ニューロン特異的シナプシンプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するベクターが生成され、０日目に感染多重度（ＭＯＩ）５で細胞が形質導入された。すべての構築物は配列により検証されている。レンチウイルスベクターは、標準的な技術を使用して作製され、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析により力価測定された（ｔｉｔｒａｔｅｄ）。特に断りのない限り、形質導入は、別々のベクターの場合はＭＯＩ  １０、単一ベクターの場合はＭＯＩ  ２０で行われた（この研究で使用されたウイルスはすべて３×１０８から６×１０９の間の力価測定されたものである）。
【０１６１】
神経再プログラミング
直接神経再プログラミングのために、線維芽細胞を、０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に１ｃｍ２あたり細胞２７８００個の密度で播種した。ウイルス形質導入の３日後、線維芽細胞培地を、次の濃度の成長因子を添加した神経分化培地（ＮＤｉｆｆ２２７；Ｔａｋａｒａ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に置き換えた：ＬＭ−２２Ａ４（２μＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＧＤＮＦ（２ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＮＴ３（１０ｎｇ／μＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびｄｂ−ｃＡＭＰ（０．５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）および小分子ＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ、Ａｘｏｎ）、ＳＢ−４３１５４２（１０μＭ、Ａｘｏｎ）、ｎｏｇｇｉｎ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＤＮ−１９３１８９（０．５μＭ、Ａｘｏｎ）、ならびにバルプロ酸ナトリウム塩（ＶＰＡ；１ｍＭ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。ニューロン変換培地の半分は、２〜３日ごとに交換された。形質導入後１２日目に、細胞をポリオルニチン（１５μｇ／ｍＬ）、フィブロネクチン（０．５ｎｇ／μＬ）およびラミニン（５μｇ／ｍＬ）コーティング２４ウェルプレートの組み合わせに再播種した。形質導入の１８日後、小分子を停止し、実験終了まで神経培地に成長因子（ＬＭ−２２Ａ４、ＧＤＮＦ、ＮＴ３、ｄｂ−ｃＡＭＰ）のみを補充した。
【０１６２】
マイクロＲＮＡノックダウン実験
ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−１２４（ノックダウンスポンジシーケンス）に結合するときに中央のバルジを形成する、相補的が不完全な配列の８つのタンデム反復配列が合成され、ＰＧＫプロモーターの下で第３世代のレンチウイルスベクターにクローニングされた。スポンジ配列は次の通りであった：
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。成体皮膚線維芽細胞に、ｐｇｋ．Ｂｒｎ２ａ．ｐｇｋ．Ａｓｃｌ１（ｐＢ．ｐＡ）、ＲＥＳＴ  ｓｈＲＮＡ（すべてのＭＯＩ＝１０）、ならびに、ｍＣｈｅｒｒｙ．ｍｉｒ−９．ｓｐおよびＧＦＰ．ｍｉｒ−１２４．ｓｐ、または、レポーター遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙまたはＧＦＰ）のみを含む対照ベクターのいずれかを含むレンチウイルスベクターを導入した（すべてのＭＯＩ＝５）。細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙ．ｍｉｒ−９．ｓｐ、ＧＦＰ．ｍｉｒ−１２４．ｓｐ、ｍＣｈｅｒｒｙ、またはＧＦＰを再度毎週形質導入され、各条件の３つ組は、再プログラミング因子による形質導入後２５日で分析された。ＧＦＰ＋またはｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞において平均蛍光強度分析を実施した。
【０１６３】
免疫細胞化学、イメージング、および高含量スクリーニング定量化
細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１Ｍ  ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で１０分間透過処理した。その後、細胞を０．１Ｍ  ＰＢＳ中の５％正常血清を含む溶液で３０分間ブロッキングした。次の一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、４℃で一晩適用した：マウス抗ＡＳＣＬ１（１：１００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヤギ抗ＢＲＮ２（１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗ＭＡＰ２（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＭＡＰ２（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、マウス抗ＮＥＵＮ（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗シナプシンＩ（１：２００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、マウス抗ＴＡＵクローンＨＴ７（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびウサギ抗ＴＵＪ１（１：５００、Ｃｏｖａｎｃｅ）。フルオロフォア結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をブロッキング溶液で希釈し、２時間適用した。細胞をＤＡＰＩで１５分間対比染色し、ＰＢＳで３回洗浄した。１ウェルあたりのＤＡＰＩ＋、ＭＡＰ２＋、およびＴＡＵ＋細胞の総数、ならびにＡＳＣＬ１、ＢＲＮ２、およびＴＡＵの平均蛍光強度を、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎ（Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎ  ＶＴＩ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して定量化した。「標的活性化（Ｔａｒｇｅｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」プログラムを適用すると、２８９個の領域（１０倍の倍率）が中心から螺旋状に取得された。プログラム「神経プロファイリング」を使用して、同じアレイをＴＡＵ＋細胞あたりの神経突起の数の分析に使用した。ニューロンの純度は、実験終了時にウェル内の細胞の総数に対するＭＡＰ２＋またはＴＡＵ＋の数として計算されたのに対し、変換効率は、再プログラミングのために播種された線維芽細胞の総数に対するＴＡＵ＋の数として計算された。
【０１６４】
蛍光活性化セルソーティング
ニューロンの遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析では、再プログラムされた細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して培養物から分離し、１％ウシ血清アルブミンとＤＮアーゼとを有するハンクの平衡塩溶液（ＧＩＢＣＯ）を含む洗浄緩衝液で穏やかに粉砕および洗浄した。線維芽細胞は、ＧＦＰ発現による選別に直接使用するか、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＮＣＡＭ抗体（胎児線維芽細胞の場合１：５０、成体線維芽細胞の場合１：１０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む洗浄緩衝液で、４℃、１５分間インキュベートした。細胞は、染色されていない変換されたｉＮに対してゲーティングされたヒトＮＣＡＭ（神経細胞接着分子１）発現に従ってＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩセルソーターを使用して選別された。
【０１６５】
ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２４、およびＲＥ１サイレンシング転写因子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析
ｍｉＲＮＡを含む総ＲＮＡは、マイクロｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）、続いてユニバーサルｃＤＮＡ合成キット（ＲＮＡ分析用のＦｅｒｍｅｎｔａｓ、ｍｉＲＮＡ発現用のＥｘｉｑｏｎ）を使用して、同じ系統のＮＣＡＭ＋選別済み変換線維芽細胞と同様に、ヒト線維芽細胞から抽出された。各ｑＰＣＲ分析のために３つの参照遺伝子を使用した（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、およびＨＰＲＴ１）。ｈｓａ−ｍｉＲ−９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１０３（後者は正規化ｍｉＲＮＡとして使用）に特異的なＬＮＡ−ＰＣＲプライマーセットはＥｘｉｑｏｎから購入し、ｍｉＲＮＡ  ｑＰＣＲ分析に使用した。すべてのプライマーは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）とともに使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲの標準手順を使用し、ΔΔＣｔメソッドを使用してデータを定量化した。統計分析は、各グループから３つ組で実施した。
【０１６６】
ＲＮＡ−ｓｅｑ分析
線維芽細胞に異なるレンチウイルスベクター（ｐＢ．ｐＡまたはｐＢ．ｍｉｒ９／１２４．ｐＡ＋／−ＲＥＳＴｉ）を形質導入し、非形質導入線維芽細胞とＲＥＳＴ  ｓｈＲＮＡのみを形質導入した線維芽細胞の両方を対照（ＣＴＲ）として使用した。形質導入の５日後に細胞を収集した。ＲＮＡは、ＤＮアーゼ処理を備えたＲＮＡｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出され、ＲＮＡ−ｓｅｑのためにＵＣＬＡ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅに送られた。ＫＡＰＡｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＫＡＰＡ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔを使用してｃＤＮＡライブラリーを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００からの５０ｂｐ単鎖末端の読み取りは、デフォルトパラメーターを使用してＳＴＡＲ（２．４．０ｊ）を使用して、ヒトゲノムアセンブリ（ＧＲＣｈ３８）にマッピングされた。ｍＲＮＡ発現は、ＮＣＢＩアノテーション（ＧＲＣｈ３８）に定量化するサブリードパッケージＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓを使用して定量化した。リードカウントは、ゲノムにマッピングされたリードの総数に正規化された。クラスタリングと微分発現解析は、ＤＥＳｅｑ２を用いて行われた。下流分析は、社内のＲスクリプトおよびＵＮＩＸスクリプトを使用して実行された。遺伝子オントロジー分析は、ＤＡＶＩＤ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ６．７のＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌを使用して行われた。遺伝子オントロジー解析で独特に上方制御された遺伝子のリストを取得するには、ＢＨ修正ｐ値＜０．００１を使用して、１つのグループ（胎児線維芽細胞＋ｐＢ．ｐＡおよびｐＢ．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉ）で強く上方制御される遺伝子を取得し、一方、他のグループ（成体線維芽細胞＋ｐＢ．ｐＡおよびｐＢ．ｍｉｒ９／１２４．ｐＡ）のｐ値＜０．０５の遺伝子は、遺伝子リストから削除された。これにより、上方制御の強い傾向を示す遺伝子が「上方制御されていない」と分類されないことを保証した。主成分分析（ＰＣＡ）のために、ｐＢ．ｐＡ＋ＲＥＳＴｉの３つ組の１つは、ｐＢ．ｐＡグループとクラスター化され、これは、ｐＢ．ｐＡとＲＥＳＴ  ｓｈＲＮＡは別々のベクターで送達されるため、ｐＢ．ｐＡとＲＥＳＴ  ｓｈＲＮＡの共発現がないことが原因である可能性が最も高いた。このグループは、さらなる分析から除外された。
【０１６７】
移植
成体線維芽細胞は、最初にＳｙｎ−ＧＦＰを形質導入され、次にｐＢ．ｐＡ、ＲＥＳＴ  ｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスベクターを形質導入された。神経変換の開始から３日後に移植用に細胞を準備し、ガラス毛細管（外径６０〜８０μｍ）を取り付けた５μＬハミルトンシリンジを使用して、フェンタニルドーミター麻酔下で新生児ラットの線条体（ｐ１）に移植した。ラットは、１回の針貫通で２０００００個の細胞の１μＬ注射を受けた。注入後、シリンジを２分間そのままにしてからゆっくりと引き込んだ。
【０１６８】
電気生理学
インビトロパッチクランプ電気生理学は、カバースリップ上の成体皮膚線維芽細胞から再プログラムされ、形質導入後８５〜１００日の間にグリアと共培養されたｉＮで実施された。（ｍＭ単位の）１１９  ＮａＣｌ、２．５  ＫＣｌ、１．３  ＭｇＳＯ４、２．５  ＣａＣｌ２、２５グルコース、２６  ＮａＨＣＯ３で構成されるクレブス液中の細胞を記録した。丸い細胞体に処理することによって証拠付けられる神経形態学を持つ細胞（ｎ＝２０）、プロセス、およびシナプシンプロモーターの制御下で発現するＧＦＰ（リプログラミング因子を共形質導入された）を全細胞記録用にパッチした。
【０１６９】
切片上での記録のために、移植されたラットからの冠状脳切片は、変換後８週間で準備された。ラットはペントバルビタールの過剰摂取により殺され、脳は迅速に除去され、２７５μｍのビブラトームで冠状に切断された。切片を記録チャンバーに移し、２８℃で９５％Ｏ２および５％ＣＯ２でガス処理した連続的に流れるクレブス液に浸した。切片記録用のクレブス液の組成は、（ｍＭ単位の）１２６  ＮａＣｌ、２．５  ＫＣｌ、１．２  ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ、１．３  ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、２．４  ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏであった。変換された細胞は、ＧＦＰ蛍光によって識別され、パッチが適用された（合計ｎ＝８）。
【０１７０】
記録はマルチクランプ７００Ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して行われ、信号はｐＣｌａｍｐ１０ソフトウェアとデータ取得ユニット（Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して１０ｋＨｚで取得された。パッチング用のホウケイ酸ガラスピペット（３〜７ＭΩ）に次の細胞内溶液を充填した：（ｍＭ単位の）１２２．５  グルコン酸カリウム、１２．５  ＫＣｌ、０．２  ＥＧＴＡ、１０  Ｈｅｐｅｓ、２  ＭｇＡＴＰ、０．３  Ｎａ３ＧＴＰおよび８  ＮａＣｌ、（２９）と同様にＫＯＨでｐＨ７．３に調整。静止膜電位は、電流クランプモードで、セルに侵入した直後にモニターされた。培養において、細胞は−６０ｍＶ〜−８０ｍＶの膜電位に保たれ、活動電位を誘導するために１０ｐＡの増分を使用して５００ｍｓの電流が−２０ｐＡから＋９０ｐＡに注入された。切片のために、−１００ｐＡから＋４００ｐＡまで５０ｐＡの増分で５００ｍｓの電流を注入すると、活動電位が誘導された。自発的なシナプス後活動は、０．１ｋＨｚローパスフィルターを使用して静止膜電位において電流クランプモードで記録された。
【０１７１】
統計分析
すべてのデータは、平均±平均の標準誤差として表される。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０を使用して統計分析を実施した。有意性に関して、ｐ＜０．０５のアルファレベルが設定された。２つのグループのみの場合、一元配置分散分析とボンフェローニポストホックまたはスチューデントｔ検定を使用してグループを比較した。
【０１７２】
本発明の実施形態
１．ａ．Ａｓｃｌ１のペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、
ｂ．Ｂｒｎ２のペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、
ｃ．ＲＥＳＴ発現を抑制する短いヘアピンＲＥＳＴ配列などのＲＥＳＴサイレンシング配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の第３のヌクレオチド配列
を含む、遺伝子発現システム。
２．実施形態１に従い、前記発現システムはレンチウイルスベクターシステムまたは任意の適切なベクターシステムである。
３．上記の実施形態のいずれかに従い、発現される前記ヌクレオチド配列は、ＰＧＫプロモーターまたは調節可能なプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下にある。
４．上記の実施形態のいずれかに従い、Ａｓｃｌ１およびＢｒｎ２のヌクレオチド配列は同じベクターにクローニングされる。
５．上記のいずれかの実施形態に従い、Ａｓｃｌ１とＢｒｎ２はクローニングされて単一の転写物に転写される（例えば、２シストロン性）。
６．上記のいずれかの実施形態に従い、変換遺伝子は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）とは異なる順序および距離で配置された（図１ａ）。
７．上記のいずれかの実施形態に従い、第１および第２のヌクレオチド配列の順序はｐｇｋ．Ｂｒｎ２．ｐｇｋ．Ａｓｃｌ１（ｐＢ．ｐＡ）である。
８．上記のいずれかの実施形態に従い、前記遺伝子発現システムは単一のベクターに含まれる。
９．実施形態１〜８の遺伝子発現システムで形質転換された／それを形質導入された／それをトランスフェクトされた、哺乳動物細胞。
１０．実施形態９の哺乳動物細胞はヒト細胞である。
１１．実施形態９または１０の哺乳動物細胞は、初代線維芽細胞にまで培養された成熟細胞型である。
１２．実施形態９〜１１の細胞は、有糸分裂後ニューロンに直接変換されるまで培養される。
１３．ヒトなどの個々の動物から得られた生検サンプルに由来する、実施形態９〜１２の細胞。
１４．前記生検サンプルが、皮膚パンチ生検材料または肺生検材料などの線維芽細胞を含む、実施形態１３の細胞。
１５．実施形態９〜１４に従い、生検サンプルは、様々な神経変性障害を有する個体、特に、家族性もしくは散発性アルツハイマー病；家族性もしくは散発性パーキンソン病；ハンチントン病の病歴を有する個体から、または健常個体から得られる。
１６．実施形態１〜８の遺伝子発現システムを線維芽細胞に形質導入する工程を含む、前記線維芽細胞からニューロンを直接誘導する方法。
１７．疾患関連バイオマーカーを変化させる化合物についてスクリーニングする方法であって、
実施形態９〜１５のいずれかの細胞を培養する工程を含み、
ａ．前記細胞、例えば誘導されたニューロン（ｉＮ）を、少なくとも１つの試験される化合物に曝露する工程、
ｂ．少なくとも１つの疾患関連のバイオマーカーまたは細胞内マーカーの選択に関する測定レベルを記録する工程、
ｃ．ｂ．で記録された測定レベルを１つ以上の参照レベルと比較する工程、
ｄ．疾患関連のバイオマーカーまたは細胞内マーカーを変更する化合物について選択する工程
を含む、前記方法。
１８．個体における年齢に関連する神経学的臨床状態の存在、進行、または初期発症／発生を検出するための方法であって、
ａ．実施形態１〜７の遺伝子発現システムを、調査される個体から得られた生検サンプル中の線維芽細胞に形質導入すること、
ｂ．誘導されたニューロンの段階で、これらの細胞中の任意の潜在的な疾患に関連する表現型またはバイオマーカーの測定レベルを記録すること、
ｃ．ｂ．で記録された測定レベルを１つ以上の参照レベルと比較すること、
ｄ．年齢に関連する神経学的臨床状態の非存在、存在、進行、または早期発症／発生の指標としての、ｃ．の参照レベルとのサンプルの相関に基づいて、前記サンプルを層別化すること
を含む、前記方法。
１９．実施形態１８に従い、個体における前記年齢に関連する神経学的臨床状態は、家族性および散発性アルツハイマー病；家族性および散発性パーキンソン病；ハンチントン病を含む群から選択される。
２０．ヒト線維芽細胞などの動物線維芽細胞においてニューロンを誘導するための要素のキットであって、
ａ．実施形態１〜７に係る発現ベクターシステム
を含む、前記キット。
２１．診断における、または細胞治療における生体細胞、組織の調製のための、または遺伝子治療のための細胞もしくは組織の調製のための、上記実施形態のいずれかの使用。
【０１７３】
発明の項目−Ｉ
１．ａ．Ａｓｃｌ１のペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、
ｂ．Ｂｒｎ２のペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、
ｃ．ＲＥＳＴ発現を抑制する短いヘアピンＲＥＳＴ配列などのＲＥＳＴサイレンシング配列をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の第３のヌクレオチド配列
を含む、遺伝子発現システム。
２．項目１に従い、前記発現システムはレンチウイルスベクターシステムまたは任意の適切なベクターシステムである。
３．上記の項目のいずれかに従い、前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列の順序はｐｇｋ．Ｂｒｎ２．ｐｇｋ．Ａｓｃｌ１（ｐＢ．ｐＡ）である。
４．上記の項目のいずれかに従い、遺伝子発現システムは単一のベクターに含まれる。
５．項目１〜４の遺伝子発現システムを形質導入された哺乳類細胞。
６．項目５の哺乳類細胞はヒト細胞である。
７．線維芽細胞に項目１〜４の遺伝子発現システムを形質導入する工程を含む、前記線維芽細胞から直接ニューロンを誘導する方法。
８．疾患関連バイオマーカーを変更する化合物についてスクリーニングする方法であって、
項目５〜７のいずれかの細胞を培養する工程を含み、
ａ．前記細胞、例えば誘導されたニューロン（ｉＮ）を、少なくとも１つの試験される対象化合物に曝露する工程、
ｂ．少なくとも１つの疾患関連のバイオマーカーまたは細胞内マーカーの選択に関する測定レベルを記録する工程、
ｃ．ｂ．で記録された測定レベルを１つ以上の参照レベルと比較する工程、
ｄ．疾患関連のバイオマーカーまたは細胞内マーカーを変更する化合物について選択する工程
を含む、前記方法。
９．個体における年齢に関連する神経学的臨床状態の存在、進行、または初期発症／発生を検出するための方法であって、
ａ．項目１〜４の遺伝子発現システムを、調査される個体から得られた生検サンプル中の線維芽細胞に形質導入すること、
ｂ．誘導されたニューロンの段階で、これらの細胞中の任意の潜在的な疾患に関連する表現型またはバイオマーカーの測定レベルを記録すること、
ｃ．ｂ．で記録された測定レベルを１つ以上の参照レベルと比較すること、
ｄ．年齢に関連する神経学的臨床状態の非存在、存在、進行、または早期発症／発生の指標としての、ｃ．の参照レベルとのサンプルの相関に基づいて、前記サンプルを層別化すること
を含む、前記方法。
１０．診断における、または細胞治療における生物学的材料、細胞、もしくは組織の調製のための、または遺伝子治療のための細胞もしくは組織の調製のための、上記のいずれかの項目の使用。
【０１７４】
発明の項目−ＩＩ
１．ａ．ニューロン変換因子をコードする、少なくとも１つのヌクレオチド配列と、
ｂ．ＲＥＳＴ発現を抑制することができるＲＥＳＴサイレンシング配列をコードする、少なくとも１つのヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子発現システム。
２．ａ．（ｉ）Ａｓｃｌ１をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）Ｂｒｎ２をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ．ＲＥＳＴ発現を抑制することができるＲＥＳＴサイレンシング配列をコードする、少なくとも１つのヌクレオチド配列と
を含む、項目１に記載の遺伝子発現システム。
３．（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、単一のベクターに含まれる、項目２に記載の遺伝子発現システム。
４．（ａ）および（ｂ）のヌクレオチド配列が、単一のベクターに含まれる、項目１〜３のいずれかに記載の遺伝子発現システム。
５．レンチウイルスベクターである、項目１〜４のいずれかに記載の遺伝子発現システム。
６．（ａ）のヌクレオチド配列、例えば、（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、単一の転写物に転写される（例えば、２シストロン性）ように構成されている、項目１〜５のいずれかに記載の遺伝子発現システム。
７．前記ヌクレオチド配列が、ＰＧＫプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下にあるか、またはドキシサイクリン調節可能プロモーターなどの調節可能なプロモーターの制御下にある、項目１〜６のいずれかに記載の遺伝子発現システム。
８．（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列の順序がｐＢｒｎ２．ｐＡｓｃｌ１であり、任意に、前記プロモーターがＰＧＫでありかつ前記順序がｐｇｋ．Ｂｒｎ２．ｐｇｋ．Ａｓｃｌ１（ｐＢ．ｐＡ）である、項目２〜７のいずれかに記載の遺伝子発現システム。
９．ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）などの転写調節エレメントをさらに含む、項目１〜８のいずれかに記載の遺伝子発現システム。
１０．前記ＲＥＳＴサイレンシング配列が、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択される、項目１〜９のいずれかに記載の遺伝子発現システム。
１１．任意に、宿主細胞が哺乳動物細胞である、項目１〜１０の遺伝子発現システムを含む細胞。
１２．ヒト細胞である、項目１１の細胞。
１３．成熟細胞型から培養された初代線維芽細胞である、項目１１または１２の細胞。
１４．ヒトなどの動物から得られた生検サンプルに由来する、項目１１〜１３のいずれかの細胞。
１５．前記生検サンプルが、皮膚パンチ生検材料または肺生検材料などの線維芽細胞を含む、項目１４の細胞。
１６．前記生検サンプルが、神経変性障害を有する個体から得られ、任意に、神経変性障害が家族性もしくは散発性アルツハイマー病、または家族性もしくは散発性パーキンソン病、またはハンチントン病であるか、あるいは前記生検サンプルが健常個体から得られる、項目１４または１５の細胞。
１７．前記遺伝子発現システムの導入後、誘導されたニューロンに直接変換されるまで培養された、項目１１〜１６のいずれかの細胞。
１８．前記遺伝子発現システムの導入前に少なくとも３回継代された、請求項１７に記載の細胞。
１９．項目１〜１０の遺伝子発現システムを体細胞（たとえば線維芽細胞）に導入する工程を含む、体細胞（たとえば線維芽細胞）からニューロンを直接誘導する方法。
２０．前記遺伝子発現システムが形質導入により体細胞（例えば、線維芽細胞）に導入される、項目１９に記載の方法。
２１．体細胞（例えば、線維芽細胞）への前記遺伝子発現システムの導入後、ＮＤｉｆｆ２２７などの神経分化培地で細胞を培養する、項目１９または２０の方法。
２２．前記神経分化培地に１つまたは複数の成長因子が補充され、任意に１つまたは複数の成長因子がＬＭ−２２Ａ４、ＧＤＮＦ、ＮＴ３、およびｄｂ−ｃＡＭＰから選択される、項目２１に記載の方法。
２３．前記神経分化培地に１つまたは複数の小分子が補充され、任意に１つまたは複数の小分子がＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ−４３１５４２、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、およびバルプロ酸ナトリウム塩から選択される、項目２１または２２に記載の方法。
２４．前記細胞を、任意に、免疫細胞化学、蛍光活性化細胞選別、および電気生理学から選択される少なくとも１つの方法によって、１つまたは複数の神経特性について評価することをさらに含む、項目１９〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．項目１９〜２４のいずれかの方法を実行することにより取得可能な誘導されたニューロン細胞。
２６．少なくとも３回継代されたまたは遺伝子発現システムの導入前に最大５０回継代された、項目２５に記載の神経細胞。
２７．疾患モデリングにおけるまたは診断におけるまたは薬物スクリーニングにおける、項目１〜１０のいずれかに記載の遺伝子発現システムまたは項目１１〜１８、２５、および２６のいずれかで定義された細胞の使用。
２８．医薬における使用のための、項目１〜１０のいずれかに記載の遺伝子発現システムまたは項目１１〜１８、２５、および２６のいずれかで定義された細胞。
２９．診断におけるまたは細胞療法におけるまたは遺伝子療法における使用のための、項目１〜１０のいずれかに記載の遺伝子発現システムまたは項目１１〜１８、２５、および２６のいずれかで定義された細胞。
３０．項目１〜１０のいずれかに記載の遺伝子発現システムまたは項目１１〜１８、２５、および２６のいずれかで定義された細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
３１．少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーを変更する化合物についてスクリーニングするための方法であって、
ａ．項目１７、１８、２５、および２６のいずれかで定義された誘導されたニューロンを、試験される少なくとも１つの化合物に曝露すること、
ｂ．少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーのレベルを記録すること、
ｃ．ｂ．における少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーの記録したレベルを、１つまたは複数の参照レベルと比較すること、ならびに
ｄ．前記１つまたは複数の参照レベルを用いて、前記少なくとも１つの疾患関連バイオマーカーのレベルを変更する少なくとも１つの化合物を選択すること
を含む、前記方法。
３２．前記疾患関連バイオマーカーが、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病のいずれかなどの神経障害のバイオマーカーである、項目３１に記載の方法。
３３．個体における年齢に関連する神経学的臨床状態の存在、進行、または初期発症／発生を検出するための方法であって、
ａ．前記個体から得られた生検サンプル中の線維芽細胞に項目１〜１０のいずれかの遺伝子発現システムを導入すること、
ｂ．誘導されたニューロンの段階で、これらの細胞における少なくとも１つの潜在的な疾患に関連する表現型またはバイオマーカーのレベルを記録すること、
ｃ．ｂ．少なくとも１つの潜在的な疾患に関連する表現型またはバイオマーカーの記録したレベルを、１つまたは複数の参照レベルと比較すること、および
ｄ．年齢に関連する神経学的臨床状態の不在、存在、進行、または早期発症／発生の指標としての、ｃ．の参照レベルとの相関に基づいて、前記サンプルを層別化すること
を含む、前記方法。
３４．前記潜在的な疾患に関連する表現型またはバイオマーカーが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病のいずれかなどの潜在的な神経学的疾患に関連する表現型またはバイオマーカーである、項目３３に記載の方法。
３５．個体における前記年齢に関連する神経学的臨床状態が、家族性および散発性アルツハイマー病；家族性および散発性パーキンソン病；ハンチントン病を含む群から選択される、項目３３または３４に記載の方法。
３６．誘導されたニューロンに線維芽細胞を直接変換する際のＲＥＳＴｉの使用。
３７．線維芽細胞をＲＥＳＴ阻害物質と接触させることを含む、誘導されたニューロンに線維芽細胞を直接変換する方法。
【図１−１】
2020519286.tif 000012
【図１−２】
2020519286.tif 000013
【図２】
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【図３−１】
2020519286.tif 000015
【図３−２】
2020519286.tif 000016
【図４−１】
2020519286.tif 000017
【図４−２】
2020519286.tif 000018
【図５】
2020519286.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月16日(2020.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020519286000001.app
【国際調査報告】
2020519286.tif 000020
2020519286.tif 000021
2020519286.tif 000022
2020519286.tif 000023