(57)【要約】  本発明は、以下のいずれかにより、製造および収集の間の抗体の還元を防止する、または製造および収集の間のシアノコバラミン（ＣＮ−Ｃｂｌ）からヒドロキソコバラミン（ＨＯ−Ｃｂｌ）への変換を阻害することにより、抗体製造の間のピンク色の生成を防止する方法である。細胞培養培地調製および保存エリアにおける白色光を赤色光に置き換えることは、ＨＯ−ＣｂｌへのＣＮ−Ｃｂｌの変換を阻害する。収集時に清澄化バルクへの過酸化物の添加は抗体ジスルフィド結合の還元を阻害する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）抗体ジスルフィド結合の還元を防止すること、および
ｂ）培地におけるシアノコバラミン（ＣＮ−Ｃｂｌ）からヒドロキソコバラミン（ＨＯ−Ｃｂｌ）への変換を阻害すること
を含む、抗体製造の間のピンク色の形成を阻害する方法。
【請求項２】
ＨＯ−ＣｂｌへのＣＮ−Ｃｂｌ変換が、培地調製、培地保存、抗体生産および抗体収集から選択される１回以上の間に可視光線への細胞培養培地露光を防止することにより阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＮ−Ｃｂｌが、培地調製、培地保存、抗体生産および抗体収集から選択される１回以上の間にＵＶＡライトのみに曝される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＮ−Ｃｂｌが、培地調製、培地保存の間に、および所望により抗体生産および抗体収集の間に赤色光（＞６０００ｎｍ）のみに曝される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抗体ジスルフィド結合の還元が、収集時に清澄化バルク（ｂｕｌｋ）に過酸化水素を加えることにより防止される、請求項１−４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
過酸化水素濃度が≦１０ｍＭで維持される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質が、抗体（Ａｂ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト抗体（ＨｕＭＡｂ）、ヒト化抗体およびキメラ抗体から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ａ）抗体ジスルフィド結合の還元を防止すること、または
ｂ）培地におけるシアノコバラミン（ＣＮ−Ｃｂｌ）からヒドロキソコバラミン（ＨＯ−Ｃｂｌ）への変換を阻害すること
を含む、細胞培養物製造の間にビタミンＢ１２が抗体に結合することを阻害する方法。
【請求項９】
ＨＯ−ＣｂｌへのＣＮ−Ｃｂｌ変換が、培地調製、培地保存、抗体生産および抗体収集から選択される１回以上の間に可視光線への細胞培養培地露光を防止することにより阻害される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＮ−Ｃｂｌが、培地調製、培地保存の間に、および所望により抗体生産および抗体収集の間に赤色光（＞６０００ｎｍ）のみに曝される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質ジスルフィド結合の還元が、収集時に清澄化バルク（ｂｕｌｋ）に過酸化水素を加えることにより防止される、請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
過酸化水素濃度が≦１０ｍＭで維持される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質が、抗体（Ａｂ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト抗体（ＨｕＭＡｂ）、ヒト化抗体およびキメラ抗体から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
以下：
ａ）赤色光（＞６００ｎｍ）条件下で細胞培養培地を調製すること、および保存すること、
ｂ）赤色光条件下で目的の抗体を産生する細胞を培養すること、
ｃ）赤色光条件下で細胞培養物から抗体を収集すること、および
ｄ）収集時に清澄化バルクの過酸化水素濃度を≦１０ｍＭで維持すること
を含む、抗体の産生のための細胞培工程。
【請求項１５】
以下：
ａ）  赤色光（＞６００ｎｍ）条件下で培養培地を調製および保存すること、
ｂ）  赤色光条件下で目的の抗体を産生する細胞を培養すること、および
ｃ）  赤色光条件下で細胞培養物から目的の抗体を収集すること
、を含む抗体の産生のための細胞培工程。
【請求項１６】
以下：
ａ）  目的の抗体を産生する細胞を培養すること、
ｂ）  細胞培養物から目的の抗体を収集すること、および
ｂ）  収集時に清澄化バルクの過酸化水素濃度を≦１０ｍＭで維持すること
、を含む、抗体の産生のための細胞培工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月９日に提出された米国仮出願第６２／５０３６１５号の利益を主張し、その全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療薬は、複数のヒト疾患の治療においてより一般的になる。高分子として、翻訳後修飾の広い範囲のために、ｍＡｂはある程度不均一性を有する。製品の品質と安全性、および治療用タンパク質のロット間の一貫性を確保するには、製造プロセスの制御を成功させることが重要である。実際、ＩＣＨ  Ｑ６Ｂガイドラインには製品の外観書が必要である。
【０００３】
通常の抗体製造では、一般的に許容できる色のばらつきがある（Ｄｅｒｆｕｓ  ＧＥ，  ｅｔ．ａｌ．，  ＭＡｂｓ  ２０１４、６（３）：６７９−６８８，  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  ＫＭ，  ｅｔ．  ａｌ．，  ＭＡｂｓ  ２０１３、５（６）：９７４−９８１，  Ｖｉｊａｙａｓａｎｋａｒａｎ  Ｎ，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２０１３、２９（５）：１２７０−１２７７，  Ｘｕ  Ｊ，  ｅｔ．  ａｌ．，  ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１４、４９：１３０−１３９４）。しかしながら、工程内の不純物による色のばらつきは、工程制御の欠如の懸念である。最終原薬のピンク／赤色の主な原因の１つは、ビタミンＢ１２−ｍＡｂ複合体であると特定されている（Ｄｅｒｆｕｓ，  ２０１４，  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ，  ２０１３）。相互作用の性質は解明されていないが、ビタミンＢ１２のタンパク質への付着は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフ、低ｐＨウイルス不活性化、様々なポリッシングクロマトグラフならびに限外ろ過および透析ろ過を含む複数のダウンストリーム精製工程を通して共溶出するほど強いようである。
【０００４】
抗体はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞において一般的に産生され、細胞培養培地へと細胞外に分泌される。培養工程の終了時に、細胞は、収集液体を清澄化するために遠心分離、深層ろ過、または凝集などの方法を使用して、一次回収工程の間に培養培地から分離される。このプロセスの間に、細胞はしばしば機械的せん断、低溶存酸素（ＤＯ）環境への曝露、または温度およびｐＨシフトを含む様々なストレスを受ける。これらのストレスは細胞損傷を引き起こし、清澄化された液体へ望ましくない細胞内成分の放出を引き起こす。脂質や酵素などのこれらの細胞質ゾル成分は、製品の品質に影響を及ぼす可能性があり、慎重に監視または除去されなければならない。例えば、細胞内還元剤の放出は、抗体のジスルフィド結合還元につながる可能性がある。（Ｍｕｎ  Ｍ．，  ｅｔ．ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２０１５；１１２：７３４−７４２；Ｒｕａｕｄｅｌ  Ｊ，  ｅｔ．ａｌ．  ＢＭＣ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ２０１５；９（Ｓｕｐｐｌ  ９）：Ｐ２４；Ｍｕｌｌａｎ  Ｂ，  ｅｔ．ａｌ．  ＢＭＣ  Ｐｒｏｃ．  ２０１１；５（Ｓｕｐｐｌ  ８）：Ｐ１１０；Ｔｒｅｘｌｅｒ−Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ，  ｅｔ．ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２０１０；１０６：４５２−４６１；Ｋｏｔｅｒｂａ，  ＫＬ，  ｅｔ．ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１２；１５７：２６１−２６７；Ｈａｎｄｌｏｇｔｅｎ  ＭＷ，  ｅｔ．ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２０１７；１１４：１４６９−１４７７；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｎ，  ｅｔ．ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００６；９５：４８３−４９１）。
【０００５】
製造プロセスの間、収集操作および／またはプロテインＡクロマトグラフィーの後に大幅な抗体の還元が観察された。複数のプロセスパラメータが抗体還元の程度に影響を与えてもよい。例えば、収集の間に高レベルの溶存酸素（ＤＯ）を維持することは、抗体分子をインタクトに保つために不可欠である（Ｍｕｎ  Ｍ．  ２０１５；Ｔｒｅｘｌｅｒ−Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ，  ２０１０）。細胞溶解および細胞成分を収集液に漏れ出すことを引き起こす機械的せん断力も還元に大きくかかわる（Ｋａｏ  ＹＨ，  ｅｔ．ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２０１０；１０７：６２２−６３２；Ｈｕｔｔｅｒｅｒ  ＫＭ，  ｅｔ．ａｌ．  ＭＡｂｓ．  ２０１３；５：６０８−６１３）。収集保持時間（Ｃｈｕｎｇ  ＷＫ，  ｅｔ．ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２０１７；１１４：１２６４−１２７４１）、培地成分（銅イオン、システイン／システインなど）ならびにｐＨおよび温度（Ｔｒｅｘｌｅｒ−Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ，  ２０１０；Ｃｈｕｎｇ，  ２０１７）などの他のプロセスパラメーターもまた、ジスルフィド還元の程度に影響を与える。
【０００６】
抗体製品の品質を確保するために、製造の間の製造管理は、抗体ジスルフィド結合の還元から形成される低分子量（ＬＭＷ）種を制御するために必要である。その結果、近年、ジスルフィド還元を制御するためのいくつかの戦略が提案されている。化学阻害剤は、抗体の還元を防ぐために試験されており、硫酸銅（Ｃｈａｄｅｒｊｉａｎ  ＷＢ，ｅｔ．ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ２００５；２１：５５０−５５３）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオレドキシン阻害剤（米国特許第８，５７４，８６９）システイン、メチルブルー（ＷＯ２０１５／０８５００３）およびコエンザイムＱアナログ（Ｌｉ  ＷＷ，  ｅｔ．ａｌ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ２００５；１２７：６１４０−６１４）などの抗還元剤による収集前および収集後処理を含む。緩和戦略を取り巻く知識と方法は長年にわたって増加しているが、生産におけるこれらの方法の実装には、クロマトグラフィー工程により除去する必要がある化学副産物の導入、処理時間の増加、およびオフターゲット修飾または抗体製品の損傷のリスクなど、困難が伴わないわけではない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、以下のいずれか；
１）製造および収集の間の抗体の還元を防止する、または２）製造および収集の間のシアノコバラミン（ＣＮ−Ｃｂｌ）からヒドロキソコバラミン（ＨＯ−Ｃｂｌ）への変換を阻害する、または３）製造および収集の間の抗体の還元を防止し、かつシアノコバラミンからヒドロキソコバラミンへの変換を阻害する、の両方
により、抗体製造の間のピンク色の生成を防止する方法である。
【０００８】
本発明の一実施形態では、ＨＯ−ＣｂｌへのＣＮ−Ｃｂｌ変換は、培地調製、培地保存、抗体生産および抗体収集から選択される１回以上の間に可視光線への培地露光を防止することにより阻害される。
【０００９】
本発明の一実施形態では、ＣＮ−Ｃｂｌは、培地調製、培地保存、抗体生産および抗体収集から選択される１回以上の間にＵＶＡライトのみに曝される。
【００１０】
本発明の一実施形態では、ＣＮ−Ｃｂｌは、培地調製、培地保存の間に、および所望により抗体生産および抗体収集の間に赤色光（＞６０００ｎｍ）のみに曝される。
【００１１】
本発明の一実施形態では、抗体ジスルフィド結合の還元は、収集時に清澄化バルク（ｂｕｌｋ）に過酸化水素を加えることにより防止される。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、以下
１）製造および収集の間の抗体ジスルフィド結合の還元を防止すること、または２）細胞培養培地調製、培地保存、細胞培工程または抗体収集の間のＨＯ−ＣｂｌへのＣＮ−Ｃｂｌの変換を阻害すること
を含む、製造の間にビタミンＢ１２が抗体に結合することを阻害する方法である。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、以下
１）赤色光（＞６００ｎｍ）条件下で細胞培養培地を調製すること、および保存すること、２）赤色光条件下で目的の抗体を産生する細胞を培養すること、３）赤色光条件下で細胞培養物から抗体を収集すること、および４）収集溶液に過酸化水素を加えること
を含む抗体の産生のための方法である。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、以下
１）赤色光（＞６００ｎｍ）条件下で細胞培養培地を調製すること、および保存すること、２）赤色光条件下で目的の抗体を産生する細胞を培養すること、および３）赤色光条件下で細胞培養物から目的の抗体を収集することを含む、抗体の産生のための方法である。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、以下
１）目的の抗体を産生する細胞を培養すること、２）細胞培養物から目的の抗体を収集すること、および３）収集溶液に過酸化水素を加えること
を含む、抗体の産生ための方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、ビタミンＢ１２およびｍＡｂ  Ｂの２ロットのスペクトル吸収を示す。１ＡはビタミンＢ１２およびｍＡｂ  Ｂの２ロットの吸収スペクトルである。２５０から８００ｎｍの、ＰＢＳで５ｍｇ／ＬでのビタミンＢ１２（シアノコバラミン）（青線）、ピンク色のロット（赤線）および無色ロット（紫線）。１Ｂは、詳細を示すために（１Ａ）から再スケーリングされたプロットである。１Ｄは目に見えるピンク色を有するｍＡｂ  ＢについてのプロテインＡ溶出液のボトルである。
【図２】図２Ａ−２Ｄは、抗体へのビタミンＢ１２の付着が二次反応であることを示す。（２Ａ）２つの無色のｍＡｂ  Ａのロット、還元抗体分子が検出されていないロット（「良」ロット）およびもう一つは大多数の還元抗体を有する（「不良」ロット）をＣＮ−ＣｂｌまたはＨＯ−Ｃｂｌのいずれかと混合させた。インキュベーション後、過剰の遊離ビタミンＢ１２を除去した。試料は左から右に、良ロットとＣＮ−Ｃｂｌ；不良ロットとＣＮ−Ｃｂｌ；良ロットとＨＯ−Ｃｂｌ；不良ロットとＨＯ−Ｃｂｌであり；および不良ロットは最初に過酸化水素で処理し、ＨＯ−Ｃｂｌと混合した。（２Ｂ）ＣＥ  ＳＤＳにより示されるように、過酸化水素は還元抗体を酸化でき、抗体モノマーを再形成する。（２Ｃ）２Ｂにおいて示される、過酸化水素処理および未処理のｍＡｂにおけるｍＡｂモノマーおよび様々な低分子量種の定量。（２Ｄ）ビタミンＢ１２付着前（青線）および後（黒線）のｍＡｂ  Ａバッチ２材料の非還元ＣＥ−ＳＤＳ解析。おそらく空気中での遊離スルフヒドリル基の酸化およびジスルフィド結合の再形成が原因でビタミンＢ１２とのインキュベーションの前後で個々のピークパターンが変化した。
【図３】図３Ａ−３Ｃは、ビタミンＢ１２コンジュゲーション識別のための質量スペクトルデータを示す。（３Ａ）ＨＯ−Ｃｂｌからｍ／ｚ＝６６４．７９およびＣＮ−Ｃｂｌからｍ／ｚ＝６７８．２９のＭＳ／ＭＳスペクトル。（３Ｂ）ペプチド−コバラミン複合体Ｌ１９−コバラミンおよびＬ１８−１９−コバラミンのＭＳ／ＭＳスペクトル。（３Ｃ）ＩｇＧ４抗体ジスルフィド結合の図。ビタミンＢ１２に結合するシステイン残基は青で示され、かつジスルフィド結合を形成するシステイン残基のペアは赤で囲まれる。
【図４】図４Ａ−４Ｅは、実施例１において使用されるカラーフィルターの光透過スペクトルを示す。（４Ａ）ＲＰ−ＵＰＬＣでの分離についてのクロマトグラムおよび３６０ｎｍでの検出（４Ｂ）標準におけるＣＮ−ＣｂｌおよびＨＯ−Ｃｂｌ；（４Ｃ）ｍＡｂ  Ａについての新たな培養培地；（４Ｄ）赤色光に曝された培地；および（４Ｅ）緑色光に曝された培地。（４Ｄおよび４Ｅ）において、黒、青および赤線はそれぞれ、０．３、０．６、および１．２百万ｌｕｘ時の露光エネルギーを示した。
【図５】図５Ａ−５Ｃは、ＣＢにおける遊離スルフヒドリルレベルおよび低分子量（ＬＭＷ）を示す。（５Ａ）ｍＡｂ  １  ＣＢ試料の遊離チオールレベルおよび対応するプロテインＡ精製試料（ＰＡＶＩＢ）におけるＬＭＷの存在の相関。ＰＡＶＩＢをＬＭＷ種についてＮＲ＿Ｃａｌｉｐｅｒにより解析した。ＬＭＷ≧５％のそれらの試料は「Ｙｅｓ」として標識し、そうでなけでば「Ｎｏ」である。解析はＪＭＰ  ｓｏｆｔｗａｒｅで行った。（５Ｂ）異なる収集処理下でのＣＢにおける遊離チオールレベルの測定。ｍＡｂ  １を含有する実験室規模のバイオリアクター（５−Ｌ）からの清澄化収集バルク（ＣＢ）を硫酸デキストランの非存在下または存在下でｐＨを４．８に低下させることにより処理した。ＣＢ試料を、試料が深層ろ過される前に室温で１時間インキュベートした。深層ろ過後、各試料のアリコートを、遊離スルフヒドリル含量が測定される前に１ｍＭ  ＮＡＰＤＨの添加のありまたはなしで３７℃で７５分間インキュベートした。ＬＭＷの高い割合の製造ロットおよび代表的なロット（通常のロット）もまた、比較のために含まれる。（５Ｃ）（５Ｂ）における試料についてインタクトな抗体の割合。インタクトな抗体をプロテインＡ精製後にＮＲ＿Ｃａｌｉｐｅｒにより測定した。
【図６】図６Ａ−６Ｆは、ＬＭＷ生成についての予測マーカとしての酸化還元指示薬ＤＣＰＩＰ処理および色変化の観察を示す。（６Ａ）ＤＣＰＩＰの構造および反応。（６Ｂ）左の＞９５％ＬＭＷ（抗体タンパク質あたり３．１スルフヒドリル基）を有するｍＡｂ２精製ＤＳ試料は、ＤＣＰＩＰで処理すると無色を示した。右の９８％以上のインタクトな抗体（抗体タンパク質あたり０．４スルフヒドリル）のｍＡＢ２試料はＤＣＰＩＰの存在下で紫色（ｐＨ５．５で）を示した。（６Ｃ）異なる培養条件からのｍＡｂ  ２のＣＢにおけるＤＣＰＩＰの色変化。左の２つのチューブのＤＣＰＩＰは完全に無色となり、ＣＢに高い還元電位が存在したことを示す；真ん中の２つのチューブのＤＣＰＩＰは青色を有しており、還元作用がないことを示す；および右のチューブのＤＣＰＩＰは部分的に還元された。（６Ｄ）細胞溶解のｍＡｂ  ２割合の関数としての遊離チオール濃度。ｍＡｂ  ２の１００％細胞溶解物を通常のＣＢと混合し、細胞溶解物の希釈曲線を作成し、遊離チオール濃度を測定し、重複試料の平均として報告した。線形回帰式およびＲ二乗はＥｘｃｅｌで算出した。（６Ｅ）ＤＣＰＩＰの色変化の順序および遊離チオール量を試験する研究設計。（６Ｆ）表７の研究のＤＣＰＩＰ試験結果の画像。一次回収の前および一次回収の間に上部パネルの試料は空気を入れた。一次回収の前および一時回収の間に底部の試料は窒素ガスフラッシングを受けた。左から右の試験管の順序は上から下への表７における順序と同じであった。
【図７】図７Ａ−７Ｋは、ジスルフィド結合還元を防止する過酸化水素の使用を示す。ｍＡｂ  ２実験室規模生成ＣＢを様々な濃度の過酸化水素の容器に分注した。容器内のエアレス状態を窒素フラッシングにより生成し、１日間室温で保持した。得られた試料をプロテインＡ精製なしで非還元（７Ａ、７Ｃ、７Ｅ、７Ｇ、７Ｉ）および還元（７Ｂ、７Ｄ、７Ｆ、７Ｈ、７Ｊ）Ｃａｌｉｐｅｒにより直接解析した。（７Ａおよび７Ｂ）過酸化水素の添加なしのＣＢをコントロールとして空気に曝した。過酸化水素０ｍＭのＣＢ（７Ｃおよび７Ｄ）、過酸化水素０．３３ｍＭのＣＢ（７Ｅおよび７Ｆ）、過酸化水素１ｍＭのＣＢ（７Ｇおよび７Ｈ）、および過酸化水素３ｍＭのＣＢ（７Ｉおよび７Ｊ）をエアレス状態で保持した。（７Ｋ）ｍＡｂ断片化の非還元Ｃａｌｉｐｅｒ結果の概要。宿主細胞から分泌されるこのｍＡｂの過剰な軽鎖があるため。軽鎖の量は断片として含まれない。ＬＭＷ種に使用される略語：ＬＣ、軽鎖；ＨＣ、重鎖；ＨＬ、１軽鎖および１重鎖のハーフ抗体；ＨＨＬ、１軽鎖および２重鎖の部分的な抗体。
【図８】図８Ａ−８Ｆは、最悪の場合におけるジスルフィド結合還元を防止するために過酸化水素を使用することの評価を示す。試験したｍＡｂ  ２ＣＢは、実施例２に記載されるように１００％細胞溶解を有した。空気ありまたはなしの保持条件は図７と同じであった。（８Ａ）過酸化水素処理なし、および空気ありで保持したＣＢ試料は、コントロールとして役立つ。（８Ｂ）過酸化水素処理なし、およびエアレス状態で保持したＣＢ試料。（８Ｃ）５ｍＭ過酸化水素をエアレス状態における保持の前にＣＢ試料に加えた。（８Ｃ）１０ｍＭ過酸化水素をエアレス状態における保持の前にＣＢ試料に加えた。得られたＣＢ試料（８Ａから８Ｄ）をプロテインＡ精製なしで直接非還元Ｃａｌｉｐｅｒにより解析した。（８Ｅ）未精製のＣＢからのｍＡｂ断片化の非還元Ｃａｌｉｐｅｒ結果の概要。（８Ｆ）プロテインＡクロマトグラフィーにより精製され、かつ非還元Ｃａｌｉｐｅｒにより解析された試料８Ａから８Ｄのインタクトな抗体純度の概要。
【図９】図９Ａ−９Ｄは、抗体ジスルフィド結合還元を防止するための代替過酸化物の使用を示す。過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウムを１００％細胞溶解とのｍＡｂ  ２  ＣＢの最悪の場合で使用した。（９Ａ）空気ありで保持し、過酸化物なしのＣＢ試料。（９Ｂ）エアレス状態で保持し、過酸化物なしのＣＢ試料。（９Ｃ）５ｍＭ過炭酸ナトリウム処理ＣＢ試料の代表的な結果。過炭酸ナトリウムをエアレス状態での保持の前に加えた。未精製のＣＢの非還元Ｃａｌｉｐｅｒからの結果（９Ａから９Ｃ）。（９Ｄ）過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウム処理の概要。未精製のＣＢの非還元Ｃａｌｉｐｅｒからの結果。
【００１７】
発明の詳細な説明
生物製剤製造の工程管理は製品品質および安全性ならびに治療用タンパク質のロット間の一貫性を確保するために重要である。製造の間の色生成のメカニズムを理解することは制御戦略を開発するために重要である。本発明者らは抗体製造の間のピンク色の生成が、還元抗体の遊離スルフヒドリル基およびビタミンＢ１２の活性型であるヒドロキソコバラミンの両方の濃度に依存する二次反応であることを発見した。両方の反応物が必要であり、いずれか単独ではピンク色を生成するのに十分でない。本発明は、以下；１）製造および収集の間の抗体の還元を防止すること、または２）製造および収集の間のシアノコバラミン（ＣＮ−Ｃｂｌ）からヒドロキソコバラミン（ＨＯ−Ｃｂｌ）への変換を阻害することのいずれかにより、抗体製造の間のピンク色の生成を防止する方法である。あるいは、本発明は、１）製造および収集の間の抗体の還元を防止する、および２）製造および収集の間のシアノコバラミンからヒドロキソコバラミンへの変換を阻害することによる、抗体製造の間のピンク色の生成を防止する方法である。
【００１８】
本発明者らは、ビタミンＢ１２の活性型が重鎖１３４（ＨＣ１３４）、軽鎖２１４（ＬＣ２１４）、重鎖３２１（ＨＣ３２１）、重鎖３６７（ＨＣ３６７）、および重鎖４２５（ＨＣ４２５）に位置するシステインの遊離スルフヒドリル基に付着することを発見した。５つのシステイン残基はＦａｂおよびＦｃ領域の両方に分布している。これらの５つのシステイン残基の間には、ＬＣ２１４とＨＣ１３４およびＨＣ３６７とＨＣ４２５、の２対のジスルフィド結合がある（図３ｃ）。これらの特定のジスルフィド結合が製造および収集の間に還元されると、ジスルフィド対におけるシステイン残基の両方がヒドロキソコバラミン付着につき同等のアクセシビリティを有する。
【００１９】
本明細書中で使用されるように、「シアノコバラミン」および「ＣＮ−Ｃｂｌ」は互換的に使用され、および細胞培養培地のビタミンＢ１２（ＶＢ１２）成分を指す。同様に、「ヒドロキソコバラミン」および「ＨＯ−Ｃｂｌ」は互換的に使用され、製造および収集の間に還元抗体に結合するために利用可能な細胞培養培地におけるビタミンＢ１２の活性型（ＶＢ１２）を指す。
【００２０】
抗体は通常、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞において産生され、細胞培養培地に細胞外へ分泌される。細胞培工程の最後に、細胞は、遠心分離、深層ろ過、または凝集などの方法を使用する一次回収工程の間に培養培地から分離され、収集液体を清澄化する。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、「清澄化バルク」および「ＣＢ」は互換的に使用され、細胞培養液を清澄化するために使用される遠心分離、深層ろ過、または凝集などの一次回収工程の後に回収された溶液を指す。
【００２２】
本明細書中で使用されるように、「細胞培養培地調製」、「細胞培養培地保存」、「細胞培工程」、「抗体製造」、「抗体生産」、および「抗体収集」、「収集」は、抗体を生産するために必要な多くの工程を指す。各工程は、製造施設内の異なる場所で発生してもよい。
【００２３】
ピンク色の制御戦略としての製造環境での赤色光の使用
【００２４】
ヒドロキソコバラミンおよび還元抗体の両方がピンク色産物の生成に必要とされるため、いずれか一つまたは両方の因子の制御は、ピンク色生成を防止するだろう。
【００２５】
光誘発ビタミンＢ１２変換は、培地調製、培地保存および細胞培工程の間に起こり得る。培地調製、保存期間、およびガラスリアクタ−での細胞培養期間に透明の使い捨てのバイオプロセシングバッグの使用はビタミンＢ１２光曝露および変換のリスクを高める。適切な容器（たとえば、ステンレス鋼容器）を使用する、追加の層材料で覆う、不要な光曝露を避ける、などの一般的な制御戦略は、光からの保護を提供できる。ただし、これらの戦略の実装には課題がないわけではなく、多くの場合追加費用が含まれる。
【００２６】
実施例１は、赤色光がＨＯ−ＣｂｌへのＣＮ−Ｃｂｌ変換を誘導しないことを示す。還元ｍＡｂ  Ａを白色光、または赤色光または緑色光に曝された、または暗所を保った培養培地にスパイクした。一晩インキュベートした後、ｍＡｂをプロテインＡカラムで精製し、結合したビタミンＢ１２をＥＬＩＳＡアッセイで測定した。表７に示すように、ビタミンＢ１２コンジュゲーション率の順番は、白色光＞緑色光＞赤色光、および暗所コントロールであった。
【００２７】
本発明の一実施形態では、ヒドロキソコバラミンへのシアノコバラミン変換は、細胞培養培地が調製され、保存されるエリアにおいて、および所望により細胞培養物製造および収集エリアにおいて白色光を赤色光（波長＞６００ｎｍ）と置き換えることにより阻害され、低減され、または防止される。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、ヒドロキソコバラミンへのシアノコバラミン変換は、細胞培養培地が調製され、保存されるエリアにおいて、および所望により細胞培養物製造および収集エリアにおいて白色電球を赤色ＬＥＤ電球（波長＞６００ｎｍ）と置き換えることにより阻害され、低減され、または防止される。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、ヒドロキソコバラミンへのシアノコバラミン変換は、細胞培養培地が調製され、保存されるエリアにおいて、および所望により細胞培養物製造および収集エリアにおいて白色電球の上に赤色プラスチックシートあるいは赤色チューブを置くことにより阻害され、低減され、または防止される。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、細胞培養培地が調製され、保存されるエリアにおける白色光、および、また細胞培養物製造および収集エリアにおける白色光は、白色電球を赤色ＬＥＤ電球（波長＞６００ｎｍ）と置き換えることにより、または白色電球の上に赤色プラスチックシートあるいは赤色チューブを置くことにより赤色光と置換される。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、細胞培養培地が調製され、保存されるエリアにおける白色光、および、また、細胞培養物収集エリアにおける白色光は、白色電球を赤色ＬＥＤ電球（波長＞６００ｎｍ）と置き換えることにより、または白色電球の上に赤色プラスチックシートあるいは赤色チューブを置くことにより赤色光と置換される。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、細胞培養培地が調製され、保存されるエリアにおける白色光、および、また、細胞培養物製造エリアにおける白色光は、白色電球を赤色ＬＥＤ電球（波長＞６００ｎｍ）と置き換えることにより、または白色電球の上に赤色プラスチックシートあるいは赤色チューブを置くことにより赤色光と置換される。
【００３３】
ピンク色制御戦略としてのタンパク質収集および一次回収の間の抗体還元の防止。
【００３４】
還元抗体およびヒドロキソコバラミンの両方がピンク色産物の生成に必要とされるため、いずれか一つまたは両方の因子の制御は、ピンク色生成を防止するだろう。
【００３５】
ｍＡｂ製造の間のジスルフィド結合の還元は、酵素酸化還元反応であり、抗体製造プロセスの間の低分子量種（ＬＭＷ）形成の根本原因である。ＬＭＷ生成の原因はよく理解されいないが、ＬＭＷの出現は抗体の還元環境を作り出す温度、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、生存率、細胞密度、溶解率などの細胞培養条件の組み合わせ効果に起因すると考えられている。これは、還元環境で抗体を保持する清澄化バルク（ＣＢ）保持条件（例えば温度、時間、曝気）によってさらに悪化する。ＬＭＷの検出は、通常、清澄化バルクまたはプロテインＡ溶出液プールのステップで視覚化される。
【００３６】
実施例２は、遊離チオールレベルが１００ｍＭ未満の場合、ＬＭＷ生成のリスクが低いこと；１００〜２００ｍＭの遊離チオールレベルは警告サインであること；および２００ｍＭ超えの遊離チオールレベルは、ＬＭＷ生成のリスクが高いこと、を示す。抗体の還元を防ぐための多くの緩和戦略として、酸化還元反応に関与する酵素を阻害するか、またはＮＡＤＰＨなどの重要な酵素補因子を酸化および枯渇させることが提案されている（Ｍｕｎ  Ｍ  ２０１５，  Ｔｒｅｘｌｅｒ−Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ  ２０１０）。エアスパージングは、抗体の還元を防ぐ強力な方法として示されている。しかしながら、総遊離チオールレベルは、製造の間のマイクロモルレベルから、空気なしでＣＢを保持した後のミリモルレベルまで変動する（表７）。図８は、最悪の清澄化バルク条件の場合、空気への曝露が抗体還元を完全には抑制できなかったことを示している。
【００３７】
本発明者らは、収集の間に清澄化バルクに過酸化物を添加すると、抗体ジスルフィド結合の還元およびＬＭＷ種の生成が防止されることを発見した。過酸化物を使用する利点には、１）過酸化物を任意の比率で水と混合できること、および２）過剰な過酸化物の除去は下流の精製に負担がかからないことが含まれる。しかしながら、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の１０ｍＭ溶液が水と酸素に完全に分解すると、理論的に５ｍＭの酸素が生成され得るが、このプロセスは触媒がないと遅くなる。
【００３８】
実施例２は、過酸化水素、または過炭酸ナトリウムや過ホウ酸ナトリウムなどの代替無機または有機過酸化物を清澄化バルクに添加すると、抗体のジスルフィド結合の還元を効果的に防ぐことができることを示す。
【００３９】
本発明の一実施形態では、抗体ジスルフィド結合還元は、収集時に清澄化バルク（ｂｕｌｋ）に過酸化水素を加えることにより防止される。
【００４０】
本発明の一実施形態では、抗体ジスルフィド結合還元は、収集時に清澄化バルクに過炭酸ナトリウムまたは過ホウ酸ナトリウムなどの無機または有機過酸化物を加えることにより防止される。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、抗体ジスルフィド結合還元は収集時に清澄化バルクの過酸化水素濃度を≦１０ｍＭで維持することにより防止される。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、抗体ジスルフィド結合還元は収集時に清澄化バルクの過酸化水素濃度を３ｍＭから１０ｍＭの間に維持することにより防止される。
【実施例】
【００４３】
実施例１
ｍＡｂとのビタミンＢ１２結合
タンパク質ストック
２つの異なる治療用ＩｇＧ４分子（ｍＡｂ  ＡおよびＢ）をこの研究で使用した。それらの両方が元のＩｇＧ４のヒンジ領域モチーフＣＰＳＣにおいてセリンからプロリンへの１つの点突然変異を有し、ＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合構造に類似していた。（Ｌｉｕ  Ｈ  ｅｔ．ａｌ．：  ＭＡｂｓ  ２０１２、４（１）：１７−２３；Ａａｌｂｅｒｓｅ  ＲＣ  ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２、１０５（１）：９−１９）。ＩｇＧ４抗体はＣＨＯ細胞において産生され、およびプロテインＡクロマトグラフィー、追加のポリッシングクロマトグラフィーおよびヒスチジン−ベースバッファへの最終ＵＦ／ＤＦろ過を使用してアフィニティ精製した。原薬（ＤＳ）のタンパク質濃度は２８０ｎｍでの吸光度により決定した。
【００４４】
ビタミンＢ１２ＥＬＩＳＡ。
精製タンパク質に結合したビタミンＢ１２（ＶＢ１２）の量の決定には、製造元の推奨手順とともに市販のＶＢ１２測定キット（Ｍｏｎｏｂｉｎｄ  Ｉｎｃ．，  Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，  ＣＡ）を使用した。
【００４５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、原薬へのビタミンＢ１２結合。
ヒスチジンベースバッファ中のｍＡｂ  ＡまたはｍＡｂ  Ｂ溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）をモル比４：１から２：１（タンパク質：ＶＢ１２）でＣＮ−Ｃｂｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｖ２８７６、ストック溶液１ｍｇ／ｍｌ水）またはＨＯ−Ｃｂｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｖ５３２３、ストック溶液１ｍｇ／ｍｌ水）のいずれかと混合した。反応は室温で、暗所で１日間行った。リン酸生理食塩水バッファ（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ５６５２）でのバッファ交換はフロースルーにおいて色が見えなくなるまで５０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターを介して行われた。バッファ交換反応溶液をペプチドマッピング分析に供した。
【００４６】
還元抗体の過酸化水素酸化。
ｍＡｂ  Ａの１ロットは、製造の間に部分的に還元されたジスルフィド結合であった。原薬を０．１％過酸化水素（３０ｍＭ）と室温で４時間混合し、過剰な過酸化水素を上述のバッファ交換により除去した。
【００４７】
光曝露研究。
ｍＡｂ  Ａ用に新たに調製した培地を光曝露試験で使用した。ＣＮ−Ｃｂｌを最終濃度１０ｍｇ／Ｌまで添加した（１ｍｇ／ｍｌストック溶液から）。
【００４８】
１３Ｗ白色光コンパクト蛍光灯（ＣＦＬ）を可視光源として使用した。３６０ｎｍを中心とする１３Ｗの市販のブラックライト電球をＵＶ光源として使用した。ランプは、溶液の加熱を防ぐために、毎分２００立方フィートの空気流量でドラフトチャンバーを設置した。ベンチの表面は、光の反射を避けるために暗かった。試料は、ランプから約１２〜１３インチ離れて配置され（平均強度はチューブの表面で６７２ｌｕｘあった）、通常の室内照明条件（５００〜１，０００ｌｕｘ）をシミュレートした。光の強度は、光度計（それぞれＵＶＡおよび可視光につきＳｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＶＡ／Ｂ光度計Ｍｏｄｅｌ  ８５０００９およびＥｘｔｅｃｈ  ＨＤ４００）で測定した。カラーフィルターはＡｒｂｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｋｉｔ  ３３−０１９０）から購入した。フィルターの透過スペクトルを図４に示す。ポリカーボネートプラスチックシート（厚さ２．４ｍｍ）をハードウェアストアから購入し、ＵＶＡ光をフィルターで除去するために使用した。
【００４９】
すべての培地試料を光源にさらし、可視光の場合は０．３、０．６、および１．２百万ｌｕｘ時間（強度×露光時間）、ＵＶＡ光の場合は１平方メートルあたり７１および２１２ワットでサンプリングした。
【００５０】
遊離スルフヒドリル基アッセイ。
当該方法は文献（Ａｒｎｅｒ  ＥＳ  ｅｔ．ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９９、３００：２２６−２３９）からわずかに変更を加えてエルマン試薬、３，３’−ジチオ−ビス（６−ニトロ安息香酸）、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル（ｎｉｔｏｐｈｅｎｙｌ）ジスルフィド；２，２’−ジニトロ−５，５’−ジチオ安息香酸（ＤＴＮＢ）を使用する。簡潔には、９６ウェルプレートで１０μＬの原薬の試料を１５μＬのＴＥバッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）と混合した。ＤＴＮＢ溶液（エタノール中５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ８１３０）を、使用前に体積比１：９で０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中の８Ｍグアニジン−ＨＣｌと新たに混合した。次に、１００μＬのＤＴＮＢ／グアニジン溶液を各ウェルに加えて混合した。４１２ｎｍでのスペクトル吸収を測定し、１３，６００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数値を計算に使用した。
【００５１】
抗体変性試験。
熱変性のために、１ｍＬのｍＡｂ  Ａ（プロテインＡアフィニティカラム精製後、Ｔｒｉｓで中和）をエッペンドルフテストチューブで８０℃で２０分間加熱した。加熱と冷却の後、目に見える沈殿物が形成された。チューブを１８，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。上清をタンパク質アッセイ（ＯＤ２８０）およびビタミンＢ１２ＥＬＩＳＡアッセイに使用した。ＳＤＳ変性について、０．２５ｍＬの原薬を、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）中０．７５ｍＬの０．３％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と混合し、室温で１日間放置した。余分なＳＤＳは、５０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターを介したＰＢＳとのバッファ交換により除去した。
【００５２】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用した原薬−ビタミンＢ１２反応混合物のペプチドマッピング解析。
ｍＡｂ  ＡおよびビタミンＢ１２を含有する試料は、事前の還元またはアルキル化を行わずにトリプシンで消化した。トリプシンを酵素対タンパク質比１：２５（重量／重量）で添加する前に、消化バッファ（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ塩化カルシウム、２Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を使用して、バッファ交換反応混合物を１ｍｇ／ｍＬに希釈した）。３７℃でのインキュベーション後、消化された混合物は直接ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析に供した。ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｑ−ＥＸＡＣＴＩＶＥ  ＰＬＵＳ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で分析する前に、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ（ＴＭ）ＵＰＬＣを使用して、約１０μｇのトリプシン消化物をクロマトグラフィーで分離した。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  ＣＳＨ（ＴＭ）Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ）を分離に使用した（４５℃で）。６０分以上１％から８０％の移動相Ｂの直線勾配を使用して、ペプチドを水中で溶出した（移動相Ａ：０．１％ギ酸および５ｍＭギ酸アンモニウム；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸および５ｍＭギ酸アンモニウム）、流速０．２ｍＬ／分。Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計は、３．０ｋＶのスプレー電圧で陽イオンモードで動作した。ヒーター温度とキャピラリー温度は、それぞれ３００℃と２７５℃に設定した。ＭＳの取得は７０，０００の分解能で実行され、ＭＳ／ＭＳ解析用に１７，５００の分解能で各デューティサイクルで１０個の最も強いイオンを選択した。ダイナミックエクスクルージョン機能は有効であった。２５の正規化された衝突エネルギーを使用して、フラグメンテーションスペクトルを取得した。
【００５３】
ピンク色を生成するには、ジスルフィド還元ｍＡｂとＨＯ−Ｃｂｌの両方が必要である。
ｍＡｂの製造の間に、ピンク色は通常プロテインＡ溶出ステップで現れることが観察され、ｍＡｂが濃縮され、培地組成からバックグラウンド色が除去される。ビタミンＢ１２の含有量をＥＬＩＳＡ法で分析した結果、ピンク色のロットは無色のバッチよりも約２０倍高いビタミンＢ１２を有することがわかった（表１、バッチ１対２）。
表１．ビタミンＢ１２（ＶＢ１２）付着およびｍＡｂ  Ｂの遊離チオール
【表１】
2020519265.tif 000002
【００５４】
分子量とビタミンＢ１２およびｍＡｂの濃度に基づいて、着色された材料は４７ｍＡｂ分子中に約１つのビタミンＢ１２分子を有していた。ビタミンＢ１２には、３６０、４２０、５５０ｎｍ付近に３つの主要な吸収ピークがある。スペクトルスキャンにより、ピンク色のバッチは３２０ｎｍより大きいところで無色のバッチよりも高い吸収率を示した（図１Ａおよび図１Ｂ、赤色対紫色の線）。
【００５５】
ジスルフィド結合の還元と遊離スルフヒドリル基の生成は、ピンク色の出現に関連していることが提案されている（Ｄｅｒｆｕｓ  ＧＥ  ｅｔ．ａｌ．．  ＭＡｂｓ  ２０１４、６（３）：６７９−６８８）。ピンク色のロットのｍＡｂ  Ｂの遊離スルフヒドリル含量は、無色バッチよりも高い遊離スルフヒドリルレベルを有した（表１）。一方、遊離スルフヒドリル含量が高いいくつかのバッチ（ｍＡｂ  ＡについてＮ＝４、ｍＡｂ  ＢについてＮ＝２）は、原薬ではピンク色を有していなかった。例えば、ｍＡｂ  Ａのバッチ２には、バッチ１よりも高いレベルの遊離スルフヒドリル基が有していたが、両方のバッチは無色で、同様のレベルのビタミンＢ１２を有していた（表２）。これらの結果は、遊離スルフヒドリル基が必要であるが、単独ではピンク色の産物を生成するには不十分であることを示している。
表２．  ビタミンＢ１２付着およびｍＡｂ  Ａの遊離チオール
【表２】
2020519265.tif 000003
【００５６】
ビタミンＢ１２は、哺乳類の細胞培養に不可欠な補因子である。ビタミンＢ１２の最も安定した形態であるＣＮ−Ｃｂｌは、細胞培養プロセスで使用される唯一のソースである。光はＣＮ−ＣｂｌをＨＯ−Ｃｂｌに変換できることが報告されており、これはｍＡｂに対する反応性が高い（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  ＫＭ  ｅｔ．ａｌ．：  ＭＡｂｓ  ２０１３，  ５（６）：９７４−９８１）。原薬でピンク色を生成するには、タンパク質からの遊離チオールおよび反応性ＨＯ−Ｃｂｌの両方の必要性を実証するために、低（バッチ１）または高（バッチ２）レベルの遊離スルフヒドリル含量のｍａｂ  ＡとＣＮ−ＣｂｌまたはＨＯ−Ｃｂｌをインキュベートすることによって一連の試験を設定した。ビタミンＢ１２アイソフォームとｍＡｂを混合し、室温で１日間暗所でインキュベートした。インキュベーション後、遊離ビタミンＢ１２をろ過により除去した。保持されたビタミンＢ１２量は（表２）；
（１）ＨＯ−Ｃｂｌは、同じバッチｍＡｂと複合体を形成するにはＣＮ−Ｃｂｌよりもはるかに活性が高く、
（２）遊離スルフヒドリル基のレベルが高い原薬は遊離スルフヒドリル基のレベルが低い原薬よりも反応性が高いこと、および
（３）最も高いビタミンＢ１２取り込みはＨＯ─Ｃｂｌ存在下でかつ高いレベルの遊離スルフヒドリル基を有する原薬において起こり、１００倍以上の増加したビタミンＢ１２を引き起こしたことを示した。各試料のビタミンＢ１２量に起因する色における差異は肉眼で明らかであった（図２ａ）。
【００５７】
遊離スルフヒドリル基は、タンパク質中の還元されたジスルフィド結合に由来する。ｍＡｂ  Ａバッチ２の原薬は、タンパク質分子あたり平均３．１の遊離スルフヒドリル基を有し（表２）、抗体分子の９５％以上が還元された（図２ｂおよび図２ｃ）。過酸化水素（０．１％ｖ／ｖ）をバッチ２材料に加え、低分子量種（ＬＭＷ）の大部分（８６．６％）を抗体モノマーに変換した（図２ｂおよび図２ｃ）。再酸化された材料は、より低い遊離スルフヒドリルレベル（Ｈ２Ｏ２処理後およびＨＯ−Ｃｂｌのインキュベーション前に測定）およびＨＯ−Ｃｂｌに対するより低い反応性を有していた。これらの結果は、ピンク色の生成が二次反応であり、その速度が両方の反応物、すなわち遊離スルフヒドリル基とＨＯ−Ｃｂｌの濃度に依存することを示す。
【００５８】
ビタミンＢ１２は抗体に共有結合する。
以前の文献では、非共有結合性の性質が示唆されたが、ビタミンＢ１２の付着の性質に関する実験的証拠は提供されていない（Ｄｅｒｆｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。推定される非共有結合は、ビタミンＢ１２に対する抗体の構造および電荷の相補性が必要であり、したがって、天然のタンパク質構造の破壊により、結合したビタミンＢ１２が放出されるであろう。２つの変性方法、加熱およびＳＤＳ処理を使用した。８５℃で２０分間加熱すると、ｍＡｂ  Ｂピンク色の材料が変性して沈殿した。タンパク質をほとんど含まない上清は、開始タンパク質溶液の総ビタミンＢ１２の約３．５％しか含まれていなかった（表１）。ＳＤＳは、ペプチド骨格に結合し、変性タンパク質を溶液に溶解した状態に維持することにより、タンパク質を変性させる。ビタミンＢ１２アッセイでは、ビタミンＢ１２のすべてではないにしても、ほとんどが依然として変性タンパク質に結合していることが示された（表１）。非還元キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ（ＣＥ−ＳＤＳ）で、着色物質の移動度シフトが検出された。初期のｍＡｂ  Ａ原薬とｍＡｂ  Ａ−ビタミンＢ１２の両方の着色された複合体は、ジスルフィド還元に起因して、非還元ＣＥＳＤＳで複数のバンドを有していた。初期材料で対応するピークに重なったピークに加えて、着色物質は高分子量側にシフトする追加のピークがあり、単一の軽鎖や重鎖などの低分子量ピークでシフトがより顕著であって（図２ｄ）。この観察結果は、ｍＡｂへのビタミンＢ１２分子の追加として簡単に説明できた。まとめると、これらの結果は、ビタミンＢ１２が変性タンパク質と結合しており、変性条件下でタンパク質と共移動することを実証する。したがって、ビタミンＢ１２とｍＡｂの相互作用が非共有結合的性質であることはないであろう。
【００５９】
ＣＮ−ＣｂｌとＨＯ−Ｃｂｌの両方が、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析によるトリプシン消化物で観察された。ＣＮ−ＣｂｌおよびＨＯ−Ｃｂｌの理論分子量は、それぞれ１２５４．５６７および１３４５．５６７Ｄａである。ＣＮ−Ｃｂｌで観察される主なイオンは、ｍ／ｚ６７８．２９３の二重荷電イオンであり、２つのプロトンが追加されたＣＮ−Ｃｂｌに対応する。しかしながら、ＨＯ−Ｃｂｌで観察される最も主なイオンは、配位化合物を放出し、かつプロトンを加える、ＯＨリガンドを有するＢ１２−ＯＨに対応するｍ／ｚ６６４．７８９の二重荷電イオンである。ＨＯ−Ｃｂｌからのｍ／ｚ６６４．７８９種およびＣＮ−Ｃｂｌからのｍ／ｚ６７８．２９３のＭＳ／ＭＳスペクトルがそれぞれ、図４Ａおよび４Ｂに示される。２つのＭＳ／ＭＳスペクトルには、１４７．０９、３５９．１０、４５６．７２、９１２．４４、および１１２４．４５のｍ／ｚ値を含む多くの共通するフラグメンテーションがある。ＣＮ−ＣｂｌのＭＳ／ＭＳスペクトルのｍ／ｚ９９７．４８および１２０９．４９は、ＣｏＣＮ基を失うことなく、ｍ／ｚ９１２．４４および１１２４．４５の種に由来する。
【００６０】
トリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析により、いくつかのシステイン残基との配位により、コバラミンとＩｇＧ間の配位共有結合が発見された。各軽鎖には５つのシステイン残基があり、各重鎖には１１のシステイン残基がある。しかしながら、表３に記載されているように、ＭＳによってコバラミンと配位錯体を形成することが観察されたのはそのうちの５つ（Ｌ−Ｃ２１４、Ｈ−Ｃ１３４、Ｈ−Ｃ３２１、Ｈ−３６７、Ｈ−Ｃ４２５）だけである。Ｌ−Ｃ２１４は軽鎖のＣ末端にあり、それは、配位共有結合の形成に関与する唯一の軽鎖システイン残基である。
表３．  ＩｇＧ−ビタミンＢ１２反応混合物のトリプシン消化物で観察されるペプチド−コバラミン複合体を含有するシステイン
【表３】
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【００６１】
これは、２ｐｐｍの質量精度で、Ｃ末端ペプチドＬ１９−Ｃｂｌ複合体（１６３５．６４６Ｄａ）および不完全消化ペプチドＬ１８−１９−Ｃｂｌ複合体（２１３９．８９４Ｄａ）で観測される質量によって証明される。これらの配位錯体は、ＭＳ／ＭＳ解析でも確認された。これら２つのペプチド−Ｃｂｌ複合体のＭＳ／ＭＳスペクトルは非常に類似しており、主にコバラミンからのフラグメントからなる。ＭＳ／ＭＳフラグメントの大部分は、ＨＯ−Ｃｂｌのｍ／ｚ６６４．７８９種のＭＳ／ＭＳスペクトルと比較することで特定できる。図４Ａおよび４Ｂに示すように、ｍ／ｚ１４７．０９、３５９．１０、４８６．２４は、ＨＯ−ＣｂｌのＭＳ／ＭＳスペクトルとまったく同じである。さらに、ｍ／ｚ９７１．４７および１１８３．４８の種は、ｍ／ｚ９１２．４４および１１２４．４５の同じ構造と、コバルト（原子質量５８．９３Ｄａ）からなる。
【００６２】
同様に、重鎖上の４つのシステインがコバラミンと配位結合を形成することが確認されている。Ｈ−Ｃ１３４は、ＦＡＢ領域のＬ−Ｃ２１４とのジスルフィド結合のカウンターパートである。他の３つのシステイン残基Ｈ−Ｃ３２１、ＨＣ−Ｃ３６７およびＨ−Ｃ４２５は、重鎖Ｆｃ領域上の３つのＣ末端システインである。さらに、ＨＣ−Ｃ３６７とＨ−Ｃ４２５は、ネイティブＩｇＧ４のペアのジスルフィド架橋である。
【００６３】
ＨＯ−ＣｂｌへのＣＮ−Ｃｂｌの光変換およびピンク色産物の工程管理。上記のように、ピンク色の反応は、還元抗体分子とＨＯ−Ｃｂｌの濃度に依存する２次反応である。したがって、抗体分子の還元および／またはＨＯ−Ｃｂｌの生成を防ぐために、工程管理戦略が必要である。抗体産物の還元の制御は非常に複雑なプロセスであり、抗体再設計（Ｐｅｔｅｒｓ  ＳＪ  ｅｔ．ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１２、２８７（２９）：２４５２５−２４５３３；Ａａｌｂｅｒｓｅ  ＲＣ  ｅｔ．ａｌ，  ２００２）、培養培地組成（Ｔｒｅｘｌｅｒ−Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ  ｅｔ．ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２０１０、１０６（３）：４５２−４６１）、プロセスパラメーター（Ｍｕｎ  Ｍ  ｅｔ．ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２０１５、１１２（４）：７３４−７４２）および収集処理（Ｔｒｅｘｌｅｒ−Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ  ｅｔ．ａｌ，  ２０１０）を伴い得る。可視光への曝露を避けることでＨＯ−Ｃｂｌの量を制御することも代替戦略である。しかしながら、これらのオプションは、操作に不便をもたらす可能性があり、細胞系統特異的であることがある。
【００６４】
ＣＮ−Ｃｂｌ変換を引き起こす波長を特定することでこの問題に取り組み、光源から有害な波長を除去することにより制御戦略を設定した。ビタミンＢ１２は、ＵＶＡと可視光の両方の吸収を有する（図１）。新しく調製したｍＡｂ  Ａ培地を、（１）５００−１，０００ｌｕｘの強度の白色蛍光灯チューブから提供される通常の実験室の光、または（２）ＣＦＬ蛍光灯によって提供される強化可視光、または（３）３６０ｎｍを中心とする強化ＵＶＡ光の下で曝露した。ＣＮ−ＣｂｌとＨＯ−Ｃｂｌは、ＲＰ−ＵＰＬＣによって分離および定量した（図４Ｂ）。結果は、ＣＮ−ＣｂｌをＨＯ−Ｃｂｌに主に変換させたのは、ＵＶＡ光ではなく可視光であったことを示す（表４）。変換率は通常の実験室の光と高強度の可視光の両方からの全体的な照明（強度×時間）の関数であった。
表４  ．ＵＶＡライトでなく可視光線がＣＮ−Ｃｂｌ変換の原因である。
【表４】
2020519265.tif 000005
＊エネルギー単位は、可視光につきＫｌｕｘ時間およびＵＶＡライト用のメーターにつきワット／ｓｑである。
【００６５】
次に、エネルギーの関数としてＣＮ−Ｃｂｌの変換を引き起こすことができる可視波長（または色）の範囲を調査した。選択したカラーフィルターを使用して、特定した波長カットオフを持つ光を生成し、光スペクトルの特定の領域を分離した（図４Ａ）。表５に示すように、異なる色の光への露光時間の関数としてのＣＮ−Ｃｂｌ変換の程度。ポリカーボネートガラスはほとんどのＵＶＡ光を遮断できるが、可視光を透過させるため、ＣＮ−Ｃｂｌ変換を防ぐことができなかった。波長が６００ｎｍを超える赤色光への曝露は、最も遅いＣＮ−Ｃｂｌ変換の速度を有した（図４ｄ）。対照的に、緑色光（図４ｅ）と青色光の両方は、はるかに高いＣＮ−Ｃｂｌ変換率を有する。ＣＮ−Ｃｂｌは、４２０ｎｍおよび５００−５５０ｎｍの領域に吸収ピークを有し、この研究で使用される青色および緑色の光スペクトルと重なる。これらの結果は、異なる色の光がＣＮ−Ｃｂｌ変換に異なる影響を及ぼし、＜６００ｎｍを超える波長のみがＣＮ−Ｃｂｌ変換を引き起こすという見解を裏付ける確かな証拠を提供する。
表５．  色光はＣＮ−Ｃｂｌ変換に影響を与える。
【表５】
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【００６６】
ピンク色の管理戦略として、製造環境で赤色光を使用する。通常の白色蛍光灯の代わりに赤色光を使用して、実験室の設定で試験した。還元したｍＡｂ  Ａ（表２のバッチ２製品）は、収集時に実際の細胞培養と同様のｍＡｂ  Ａ濃度で培養培地にスパイクした。培養培地は、以前に白色光、赤色光または緑色光にさらした（１．２百万時間）。暗所で一晩（２０時間）インキュベートした後、ｍＡｂをプロテインＡカラムで精製し、結合したビタミンＢ１２をＥＬＩＳＡアッセイで測定した。表６に示すように、白と緑の両方の光にさらされた培地におけるビタミンＢ１２付着は、赤光にさらされたものと暗所コントロールよりも多かった。これらの結果は、赤色光が実際にＣＮ−Ｃｂｌを変換から保護できることを示す。
表６．  様々な色光に曝されたＣＢにスパイクされたｍＡｂ  Ａ原薬
【表６】
2020519265.tif 000007
【００６７】
実施例２
製造プロセスの間の抗体ジスルフィド結合還元を防止するために過酸化水素を使用すること
【００６８】
タンパク質ストック
２つのＩｇＧ４分子（１および２）および２つのＩｇＧ１分子（３および４）を本研究において使用した。ＩｇＧ４分子は、ＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合構造ＣＰＰＣに似た元のＩｇＧ４のヒンジ領域モチーフＣＰＳＣのセリンからプロリンへの単一点突然変異を有していた（Ｌｉｕ  Ｈ  ｅｔ．ａｌ．  ＭＡｂｓ．  ２０１２；４：１７−２３，  Ａａｌｂｅｒｓｅ  ＲＣ  ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２；１０５：９−１９）。すべてのｍＡｂはＣＨＯ細胞培養で産生され、細胞生存率は５０から９０％の範囲であった。清澄化バルク（ＣＢ）は、特に指定がない限り、通常、深層ろ過で生成され、この場合、遠心分離によって生成した。いくつかの場合のｍＡｂ  １細胞培養物は、深層ろ過の前に低ｐＨと硫酸デキストランで処理した。ダウンストリーム精製はプロテインＡクロマトグラフィー、追加のポリッシングクロマトグラフ工程およびヒスチジン−シュガー−ベースバッファへの最終限外ろ過／透析ろ過工程により達成される。タンパク質濃度はＤｒｏｐｓｅｎｓｅ−９６分光計（Ｔｒｉｎｅａｎ  ＮＶ，  ９０５０  Ｇｅｎｔ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）による２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）により決定した。
【００６９】
遊離スルフヒドリルコンテント（チオール）アッセイ
該方法では文献（Ａｒｎｅｒ  ＥＳ  ｅｔ．ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９９；３００：２２６−２３９）を若干改変し、２，２’−ジニトロ−５，５’−ジチオ安息香酸（ＤＴＮＢ）を使用した。簡潔には、１０ｍＬの清澄化バルクまたは原薬（ＤＳ）の試料を９６ウェルプレートで１５ｍＬのＴＥバッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）と混合した。ＤＴＮＢ溶液（エタノール中５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ８１３０）を使用前に１：９の体積比で０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中８Ｍグアニジン−ＨＣｌと新たに混合した。１００ｍＬのＤＴＮＢ／グアニジン溶液を各ウェルに加え、混合した。重複試料を試験した。４１２ｎｍでのスペクトル吸収を測定し、モル吸光係数値１３，６００Ｍ−１ｃｍ−１を遊離チオール含量の計算に使用した。
【００７０】
酸化還元指示薬アッセイ
２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（Ｄ２９３２、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＭＦＧ  Ｃｏｒｐ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）を水に溶解して、新鮮な１％ストック溶液を作製した。２，６−ジクロロフェノールインドフェノールの酸化型は中性ｐＨで青色であり、還元されると無色になった。酸性ｐＨでは、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールの酸化型は紫色で、還元されると無色に変化した。還元および非還元の試料につきＤＣＰＩＰ色範囲を決定するために、１００％ｍＡｂ  ２細胞溶解物を遠心分離により産生された通常の清澄化バルクと混合して一連の細胞溶解物の０、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０および７０％希釈を精製した。各希釈の遊離チオール含量をすぐに測定し、希釈の関数としてプロットした（図６Ｄ）。ＤＣＰＩＰ（１０ｍＬ）を一連の細胞溶解希釈物（室温で１ｍＬ）に加え、数秒から数分以内に目視検査でどの希釈液が色の変化を示したかを判定した。
【００７１】
非還元および還元Ｃａｌｉｐｅｒ
ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を製造元の推奨に従って、還元（Ｒ＿Ｃａｌｉｐｅｒ）および非還元（ＮＲ＿Ｃａｌｉｐｅｒ）条件下の両方で、ｍＡｂ純度解析のために使用した。ＮＲ＿Ｃａｌｉｐｅｒは２重鎖１軽鎖（ＨＨＬ）、１重鎖１軽鎖（ＨＬ）、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む抗体断片を分離しかつ定量するための最も便利なハイスループットツールであった。サイズ排除クロマトグラフィーをインタクトなｍＡｂおよび高分子量（ＨＭＷ）種をモニターするために使用した。
【００７２】
ｍＡｂの抗体酸化の質量分析測定
ｍＡｂ２および３の試料をジチオトレイトールにより還元し、ヨードアセトアミドによってアルキル化し、トリプシンで消化した。トリプシン消化物を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｑ−ＥＸＡＣＴＩＶＥＴＭ  ＰＬＵＳ質量分析計（Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により解析する前に、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ  Ｕ．Ｓ．Ａ．）クロマトグラフィーで分離した。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ、２．１£１５０ｍｍ）を分離に使用した（４０℃で）。１１０分間にわたる２％から８０％移動相Ｂの直線勾配を使用して０．２ｍＬ／分の流速でペプチド（移動相Ａ：水中０．１％ギ酸；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸）を溶出した。
【００７３】
Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ質量分析計はＭＳとＭＳ／ＭＳの取得を切り替えるためにデータ依存モードで動作していた。４０のシースガス流量、１０の補助ガス流量、３ｋＶのスプレー電圧、２７５℃のキャピラリー温度、および６０のＳ−Ｌｅｎｓ  ＲＦレベルを使用して、イオンを生成した。解像度はそれぞれ、サーベイスキャンおよびＭＳ／ＭＳイベントについて７０，０００（ＡＧＣターゲット３ｅ６）および１７，５００（ＡＧＣターゲット１ｅ５）に設定した。１０ｓのダイナミックエクスクルージョン時間は単一の繰り返し回数で使用した。相対的な定量は、サーベイスキャンの選択されたイオンクロマトグラムで、酸化ペプチドのピーク面積を天然ペプチドと酸化ペプチドの合計で割ることにより達成した。
【００７４】
過酸化水素および他の過酸化物処理
３０％ストック過酸化水素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃａｔ．  ２１６７６３、密度１．１１ｇ／ｍＬ）を使用前に水で３％ストック（ｖ／ｖ、９８０ｍＭに等しい）に新たに希釈した。３％ストックを細胞培養物またはＣＢに加え、必要に応じて０．１から２０ｍＭの最終濃度にした。抗体ジスルフィド還元への過酸化水素の影響を試験するために、過酸化水素ストックを最終濃度０、０．１、０．３３、１、３、５、１０または２０ｍＭでＣＢに加えた。
【００７５】
過酸化水素、過炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃａｔ．  ３７１４３２、２Ｎａ２ＣＯ３  ３Ｈ２Ｏ２）および過ホウ酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃａｔ．  ３７２８６２、ＮａＢＯ３  Ｈ２Ｏ）を含有する２つの無機化学物質も試験した。過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウムの両方は、水と接触すると加水分解を受け、それぞれ、過酸化水素ならびに炭酸塩もしくはホウ酸塩を産生する。
【００７６】
ジスルフィド結合還元の小規模モデル
吸引キャップ付きの５００ｍＬボトル（ＦｌｅｘＢｉｏＳｙｓ，  Ｃａｔ  ＦＸＢ−５００Ｍ−０００５）を３００ｍＬ清澄化バルクで充填した。あるいは、５０ｍＬのバイオプロセスバッグ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，  Ｃａｔ  ＳＨ３０６５８．１１）を３０ｍＬ清澄化バルクで充填した。容器を純窒素ガス供給ラインに接続し、室温で１−２時間窒素ガス（≦５ｐｓｉ）でフラッシュし、その後、１日間エアレス（ａｉｒｌｅｓｓ）状態で密閉した。保持後、試料を遊離チオールアッセイで直ちに解析するか、ＮＲ＿Ｃａｌｉｐｅｒで解析する前にヨードアセトアミド（最終濃度２０ｍＭ）と混合した。
【００７７】
抗体ジスルフィド結合還元の最悪の場合を生成するために、１００％細胞破壊を機械的破壊により人工的に誘発した。細胞培養物を遠心し（５００ｇ、２０分間）、細胞ペレットを元の容量の１／１０でＲＩＰＡバッファ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，  Ｃａｔ  ８９９０．２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、ｐＨ７．６）に懸濁し、室温で３０分間振とうして溶解し、次いで氷上で冷却し、３分間高速組織ホモジナイザーにかけた。これらの工程で完全な細胞溶解が達成されたと想定された。次に、溶解した材料を遠心分離した上清に戻した。この細胞溶解物を、過酸化水素を含むまたは含まない５０ｍＬバッグに充填し、次いで窒素ガスでフラッシュし、上記のように室温で１日間エアレス状態で保持した。インキュベーション後、細胞溶解物を４℃で６０分間、３，０００ｇで２回遠心分離し、０．２ミクロンフィルターを通過させ、上記のように解析した。
【００７８】
過酸化水素処理および製品品質特性へのその影響
ｍＡｂ  ４について、実験室規模のバイオリアクターの細胞培養液を次の２つの実験に使用した。最初の実験では、遠心分離と０．２ミクロンフィルターを使用したろ過により、清澄化バルクが生成された。得られた清澄化バルクは、（ａ）コントロールとして４℃で４日間保存したか、（ｂ）過酸化水素と組み合わせて最終濃度１０ｍＭの過酸化物とし、４℃で４日間保存した。第二の実験では、過酸化水素を細胞培養液（細胞を含む）に添加し、遠心分離の前に室温で１時間インキュベートした。得られた清澄化バルクは、（ａ）コントロールとして４℃で４日間保存するか、（ｂ）３日目に室温に置き、窒素ガスでフラッシュし、もう１日間室温で保持した。
【００７９】
得られたすべての試料は、プロテインＡクロマトグラフィーで処理され、続いてプロセス中心点条件を使用する低ｐＨウイルス不活化および中和工程が行われた。製品の品質特性は、インタクトな抗体および凝集体レベルを解析するためのサイズ排除超高速液体クロマトグラフィーにより、電荷変異分布の画像化キャピラリー等電点電気泳動により、および純度に関して還元および非還元条件下でＣａｌｉｐｅｒにより、評価した。工程不純物は、宿主細胞タンパク質についてのＥＬＩＳＡおよび残留ＤＮＡについてのｑＰＣＲによって推定された。
【００８０】
ｍＡｂ  ２について、過酸化水素を最終濃度０、３、５および１０ｍＭで清澄化バルクに加え、次いで、窒素ガスを流しながら１日間室温で保持した。得られた試料を解析の前にハイスループットプロテインＡクロマトグラフィーを介して処理した。
【００８１】
製造の間のジスルフィド結合還元
ｍＡｂの還元は、清澄化バルク（ＣＢ）またはプロテインＡ溶出（ＰＡＥ）のいずれかにおいて、いくつかのＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体分子について工程開発で観察された。
【００８２】
他のグループと同様に、我々は収集と一次回収の間に清澄化バルクにおける総遊離チオールの蓄積を観察した（ＷＯ２０１５／０８５００３，  Ｒｕａｕｄｅｌ  Ｊ，  ｅｔ．ａｌ．  ＢＭＣ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ２０１５；９（９）：２４）。ジスルフィド還元を示したｍＡｂ  １清澄化バルクの試料と、示さなかった試料との間の遊離チオール濃度における違いは、顕著であった（図５Ａ）。ｍＡｂ  １の場合、清澄化バルクにおける遊離チオールレベルが１００ｍＭ未満であると、低分子量生成のリスクは低かった；１００−２００ｍＭの遊離チオールレベルは潜在的なリスクをもたらした；および２００ｍＭを超える遊離チオールレベルは低分子量生成のリスクが高かった。注意すべき点は、エルマン試薬（２，２’−ジニトロ−５，５’−ジチオ安息香酸；ＤＴＮＢ）がタンパク質における遊離スルフヒドリル基に加えて、還元グルタチオン、システインおよびリポ酸などの小スルフヒドリル含有分子の両方のスルフヒドリル基と反応することである。したがって、遊離チオールレベルのベースラインレベルは、細胞株、培地組成（小スルフヒドリル含有分子）および細胞生存率に依存する。それにもかかわらず、ジスルフィド結合の還元が起こったとき、遊離チオールレベルはベースラインよりもはるかに高くなる傾向があった。
【００８３】
清澄化バルクにおける遊離チオールのレベルは非常に動的であり、組成と処理プロセスに関係する。空気曝露に加えて、保存温度およびｐＨなどの他の要因も、そのダイナミクスに影響する。ｍＡｂ  １清澄化バルクのｐＨを７から４．８に調整し、その後深層ろ過により細胞を除去すると、遊離チオールレベルおよび観察される低分子量の割合がわずかに減少した（図５Ｂおよび５Ｃ）。細胞収集物をｐＨ４．８および硫酸デキストラン（０．０５ｇ／Ｌおよび６０分間混合後、遠心分離およびろ過）の組み合わせで処理した場合、遊離チオールレベルは大幅に低下し、凝集（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）がＴｒｘ／ＴｒｘＲおよびＧｌｕ／ＧＲを含む宿主細胞タンパク質を除去し、かつ、いくつかの小スルフヒドリル含有分子を除去することがあるという観察と一致した。遊離チオールのレベも温度により異なった。コントロールの清澄化バルクの３７℃で７５分間のインキュベーションは遊離チオール含量の６０％低下を引き起こした。しかしながら、ＴｒｘＲおよびＧＲ反応に必要な成分である１ｍＭのＮＡＤＰＨを３７℃インキュベーションの前にその溶液に加えた場合、遊離チオールレベルの増加がコントロールおよびｐＨ調整ＣＢで見られた（図５Ａ）。これらの動的な変化は、低分子量生成のリスクをよりよく予測するために、収集前から収集後の工程で遊離チオールレベルがモニターされるべきであるということを示す。
【００８４】
ジスルフィド結合還元を予測するために酸化還元指示薬を使用する
ジスルフィド結合還元は酸化還元反応であるため、ＤＴＮＢ試験に代わるシンプルで迅速かつ堅牢な方法として酸化還元指示薬を使用し、かつ収集および回収の間の低分子量形成の潜在的なリスクを予想することができる。酸化還元指示薬は、ｐＨ指示薬が特定のｐＨで色変化を受けるのと同様の方法で、特定の電極電位で明確な色変化を受ける。適切な酸化還元指示薬を見つけるために、一連の市販の酸化還元指示薬が試験され、いくつかを生物製剤製造プロセスで使用できる最良の潜在的候補として特定した。
【００８５】
酸化還元指示薬の例は、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ、図６Ａ）である。その色は低分子量の割合が高いｍＡｂ  ２精製原薬において変化し（図６Ｂ）、そしてその色はそれぞれ、高、中、および低レベルの遊離チオールの清澄化バルクにおいて完全に変化し、部分的に変化し、または変化しなかった（図６Ｃ）。ＤＣＰＩＰ色変化範囲を決定するために、ＤＣＰＩＰストック溶液を既知の遊離チオール濃度のｍＡｂ  ２細胞溶解物の連続希釈液に加えた（図６Ｄ）。ＤＣＰＩＰは３−５％細胞溶解物および８０−１００ｍＭ範囲の遊離チオール濃度でｍＡｂ  ２  ＣＢにおいて色変化を受けた。したがって、清澄化バルク試料が１００ｍＭより高い遊離チオール濃度を有した場合、ＤＣＰＩＰの色が変わり、この機能はＤＣＰＩＰを製造の間のジスルフィド結合還元のリスクを予測するための迅速かつ使いやすい方法とする。
【００８６】
ＤＣＰＩＰにおける色変化が遊離チオールレベルと相関しているかどうか、および低分子量の生成を正しく予測することができかどうかを調べるために研究を設計した（図６Ｅ）。ｍＡｂ  ３清澄化バルクを処理前にフィルタートレイン（ｆｉｌｔｅｒ  ｔｒａｉｎ）の空気または窒素ガスフラッシングで深層ろ過により生成した。窒素ガスフラッシングを使用して収集プロセスの間に液体に酸素が曝されない「エアレス」状態を生成した。得られた清澄化バルクを液体体積に対して０、２０、５０および１００％空気オーバーレイヘッドスペース体積で小さな容器に分注し、４℃、２４℃および３７℃で１日インキュベートした。表７に示されるように、収集および回収の間の空気の存在は低分子量生成の防止に重要であった。この場合、開始時の清澄化バルクはエアレス状態（２０７ｍＭ）と比較してより低い遊離チオール濃度（５１ｍＭ）を有し、かつ溶存酸素（ＤＯ）レベルは空気オーバーレイ％および異なる温度での保持条件でも低分子量生成を抑制するのに十分（≧３７％）であった。
表７．  生成され、および様々な空気およびエアレス状態で保持されたｍＡｂ  ３清澄化バルクにおける遊離チオール濃度およびＤＣＰＩＰ色変化。
【表７】
2020519265.tif 000008
ＮＡ：アプライせず
【００８７】
対照的に、保持の間の％空気オーバーレイはエアレス状態で生成される清澄化バルクにとって重要になった。最悪の場合はエアレス収集およびエアレス保持であり、インタクトなｍＡｂモノマーは９６．５％から８１．６％に減少した。さらに、空気オーバーレイが２０％以上である場合に、ジスルフィド還元は起こらなかった。インキュベーション温度は、遊離チオール濃度に対して異なる効果を有した。最も高い遊離チオール濃度および最大の還元は２４℃保持で起こった。４℃保持後の遊離チオール量は、保持前の量と近かった。３７℃での保持はＴｒｘＲおよびＧＲ酵素活性に最適な温度であると推定された。しかしながら、すべての条件で遊離チオール量が普遍的に減少し、データは図５に示すようにｍＡｂ１の結果と一致した。
【００８８】
１日間の保持試験の最後に、各試料をＤＣＰＩＰストック溶液と混合した。色の変化は、目視で評価した（図６Ｆ）。表７は、色変化のシーケンスが遊離チオール濃度と強い相関関係を有することを示し；遊離チオール濃度が高いほど、ＤＣＰＩＰの色の変化は速くなった。曝気条件で収集されたすべての試料は色の変化を何も示さなかった。
【００８９】
異なる標準還元電位の追加の酸化還元指示薬も同様の方法で試験し、チオニンとメチレンブルーは、それぞれ６００−８００および＞１，０００ｍＭの遊離チオールレベルで色が変化することがわかった（データは示していない）。これらの色素は、製造の間のリスクのレベルを迅速に予測するための指標のラダーを含むようまとめることができる。
【００９０】
収集および一次回収の間のジスルフィド結合還元を再現するためのスケールダウンモデル
数多くの証拠は、ジスルフィド結合の減少が、収集操作中の細胞溶解および経時的に室温で十分な量の空気が入っていない密閉容器（例：使い捨てバッグ）に保持されている清澄化バルクと相関していることを示唆していますＭｕｎ  Ｍ  ｅｔ．ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２０１５；１１２：７３４−７４２）。したがって、密閉可能な容器に少量の清澄化バルク（１０から３００ｍＬ）を充填し、かつ窒素ガスを流し、室温を保持してその後低分子量についてのＮＲ＿Ｃａｌｉｐｅｒ解析によりエアレス状態を作り出すことによりこの現象を模倣する小規模モデルを開発した（図７）。
【００９１】
製造操作からの清澄化バルクは細胞損傷の観点および収集前から収集後に様々な工程の保持時間において、ロット間で変化することがあるため、低分子量含量は数パーセントからほぼ１００％までの広範囲にわたって変化し得る。小規模な研究をシミュレートするため、１００％細胞溶解をシミュレートするためＣＨＯ細胞からの細胞溶解物を元の容量の細胞培養物の上清と混合し、空気の存在下でさえ低分子量の生成させる最悪のシナリオを作製し（上記材料および方法に記載される）（図８Ａ）、密閉可能な容器に充填し、窒素ガスでフラッシュしかつ１日間室温でインキュベートした。これらの条件下で、清澄化バルクにおけるインタクトなｍＡｂ  ２抗体分子はすべて完全に断片化された（図８Ｂおよび９Ｂ）。１００％細胞溶解清澄化バルクにおける遊離チオール含量は１から３ｍＭで測定され、それは通常の操作のものよりも少なくとも１０倍以上高かった。
【００９２】
過酸化水素はジスルフィド結合の還元を阻害できる。
ｍＡｂにおけるジスルフィド結合の還元を制御する１つの方法は、ｍＡｂが還元される前に清澄化バルクに含有される還元電位を除去することである。この目的でＨ２Ｏ２の使用を試験した。図７に示されるように、コントロールｍＡｂ  ２清澄化バルクは１日間室温でエアレス状態で保持された後に約２０％の低分子量を生成した（図７Ｃ）。過酸化水素をエアレス保持の前に０．３３、１および３ｍＭの濃度で同じ清澄化バルクに加えた。結果は３ｍＭ（約０．０１％）過酸化水素が低分子量の生成を完全に防止できることを示した（図７Ｅ、７Ｇおよび７Ｉ）。これらの結果は過酸化水素がジスルフィド結合還元を効果的に防止することを示す。
【００９３】
最悪の場合で低分子量生成を阻害するのに必要なＨ２Ｏ２の最小濃度を決定するために、上記の１００％溶解細胞培養物モデルを使用した。本研究では、１００％溶解細胞培養物を０、５または１０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２存在下でエアレス状態で保持した。１日保持後、インタクトなｍＡｂ２抗体分子は残らず、低分子量種が、ハーフマー（ｈａｌｆｍｅｒ）のわずかの分画の軽鎖および重鎖により多数を占めており、これは、空気にさらされたコントロール試料と比較して還元がほぼ完全に完了したことを示す（図９Ａおよび９Ｂ）。Ｈ２Ｏ２の５ｍＭおよび１０ｍＭの追加はそれぞれ、部分的に（図８Ｃ）および完全に（図８Ｄ）低分子量生成を阻害できる。未精製のＣＢからのこれらのＮＲ＿Ｃａｌｉｐｅｒの結果を図８Ｅにまとめた。プロテインＡ精製後、０、５および１０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２の試料はＮＲ＿ｃａｌｉｐｅｒ結果から、それぞれ０、１０．１および９８．３％の純度の抗体モノマーを有していた（図８Ｆ）。空気にさらされた試料が８３％の純度の抗体モノマーを有していた。これらの結果は、１０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２が清澄化バルク処理の最悪の場合でのｍＡｂ還元を効果的に防止できることを確認する。
【００９４】
過酸化水素と置き換えられ得る無機または有機の過酸化物含有化合物は多くある。２つの無機形態の過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウムを過酸化水素の代替として試験した。結果は、両方の過酸化物が濃度依存的にジスルフィド結合の還元を効果的に抑制できることを示す（図９）。
【００９５】
過酸化水素処理および抗体分子の酸化
過酸化水素を使用する主な懸念の１つは、ｍＡｂを酸化する可能性である。メチオニン残基は過酸化水素酸化の影響を最も受けやすい（Ｌｕｏ  Ｑ，  ｅｔ．ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０１１；２８６：２５１３４−２５１４４，  Ｓｔｒａｃｋｅ  Ｊ，  ｅｔ．ａｌ．  ＭＡｂｓ．  ２０１４；６：１２２９−１２４２）。ｍＡｂ  ２および３（それぞれ、ＩｇＧ４およびＩｇＧ１サブクラスに属する）を様々な過酸化水素処理後にメチオニン酸化について質量分析により解析した。両方の分子について、Ｈ２Ｏ２の添加（１ｍＭから１０ｍＭ）および１日間の室温でのインキュベーション後、Ｈ２Ｏ２濃度に依存する酸化におけるわずかの増加が、上記の過酸化水素処理下の同一ロットの試料で観察された（表８および９）。しかしながら、トリプシンペプチドマッピングおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法に１％のばらつきがあるため、両方のｍＡｂ  ２および３についてのＨ２Ｏ２誘導酸化変化はわずかであった。
表８．過酸化水素処理後のｍＡｂ  ２メチオニン残基の酸化
【表８】
2020519265.tif 000009
表９．過酸化水素処理後のｍＡｂ  ３メチオニン残基の酸化
【表９】
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【００９６】
これらの結果は最適な過酸化物濃度下では、過酸化水素または他の過酸化物により媒介されるｍＡｂ酸化は有意な増加を示さず、酸化レベルを制御できることを示す。
【００９７】
製品品質特性への過酸化水素処理の影響
酸化に加えて、他の原薬の品質特性およびダウンストリーム精製プロセスに対する過酸化水素の潜在的な影響も、実験室規模の研究で評価した。実験デザインには、ｍＡｂ  ２（ＩｇＧ４）およびｍＡｂ  ４（ＩｇＧ１）の両方を含んだ。ｍＡｂ  ４について、過酸化水素を収集前細胞培養液および収集後清澄化バルク（細胞なし）に加えた。様々な過酸化水素処理後、得られた清澄化バルクをプロテインＡクロマトグラフィーで処理し、その後、解析前に中央プロセスポイント（ｃｅｎｔｅｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｐｏｉｎｔ）条件を使用して低ｐＨウイルス不活性化および中和工程をした。表１０に示されるｍＡｂ  ４についての解析結果は、過酸化水素処理および未処理試料間で試験したすべての特性に目立った変化がないことを示した。工程不純物（宿主細胞タンパク質および残留ＤＮＡ）はまた、コントロールに匹敵し、プロセス範囲で許容された（データ未掲載）。同様の結果もまた、１日間室温で０、３、５および１０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２により処理したｍＡｂ  ２について観察された（表１０）。
表１０．  ｍＡｂ  ２および４の製品品質特性への過酸化水素処理。
【表１０】
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＊ｍＡｂ  ４の場合、処理は収集前細胞培養液または清澄化バルク工程のいずれかで行われ、得られた清澄化バルクは、プロセス中心点条件を使用してプロテインＡクロマトグラフィーおよび低ｐＨウイルス不活化および中和（ＰＡＶＩＢ）ステップをした。解析結果はＰＡＶＩＢ試料から得られた。ｍＡｂ  ２の場合、過酸化水素処理およびコントロール清澄化バルク試料は解析前にハイスループットプロテインＡカラムにより精製した。ＮＤは「未決定」である。
【００９８】
したがって、これらの結果は過酸化水素処理（最大１０ｍＭ）は細胞除去の前および後に過酸化水素で処理された試料において試験されたすべての特性における目立った変化を有しないことを示す。
【図１】
2020519265.tif 000012
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【国際調査報告】
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