(57)【要約】本開示は、受容体ポリペプチドを含む長時間作用性の副甲状腺または副甲状腺ホルモン様融合ポリペプチドと、副甲状腺機能低下症及び骨粗しょう症の処置におけるその使用とに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ポリペプチドであって、
副甲状腺ホルモンまたはその生物学的活性断片もしくはアナログのアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
受容体ポリペプチドまたはその断片もしくはアナログのアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含み、前記副甲状腺ホルモンまたはその生物学的活性断片もしくはアナログが、翻訳融合体として、直接的または間接的に、前記受容体ポリペプチドに連結している、前記融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記融合ポリペプチドが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモンを含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記融合ポリペプチドが、アミノ酸１−２８、１−２９、１−３０、１−３１、１−３２、１−３３、１−３４、または１−３５を含む配列番号１０の断片を含む、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記融合ポリペプチドが、配列番号９に記載の配列を含む副甲状腺ホルモンを含む、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記融合ポリペプチドが、アミノ酸１−２８、１−２９、１−３０、１−３１、１−３２、１−３３、１−３４、または１−３５を含む配列番号９の断片を含む、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記融合ポリペプチドが、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモンを含む、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記融合ポリペプチドが、式（Ｉ）のアミノ酸配列：
Ｘａａ０１−Ｖａｌ−Ｘａａ０３−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ０８−Ｈｉｓ−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｌｅｕ−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘａａ２２−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ（配列番号８）
（（ＩＩ）において、Ｘａａ０１は、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘａａ０３は、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘａａ０８は、ＭｅｔまたはＬｅｕであり、Ｘａａ１０は、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎであり、Ｘａａ１１は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ１２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇであり、Ｘａａ１３は、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ１４は、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒであり、Ｘａａ１６は、ＧｌｎまたはＡｓｎであり、Ｘａａ１７は、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘａａ１８は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり、Ｘａａ２２は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ２５は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、またはＡｒｇである）
を含むもしくはそれからなる副甲状腺ホルモンアナログ、またはＸａａ１８のうちの少なくとも１つがＬｅｕでもＭｅｔでもなく、Ｘａａ２２がＰｈｅではなく、Ｘａａ２６がＨｉｓではないことを条件に、式（Ｉ）のアミノ酸１−２８、１−２９、１−３０、１−３１、１−３２、１−３３、１−３４、もしくは１−３５を含むその断片を含む、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記融合ポリペプチドが、副甲状腺ホルモンと、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモンアナログアミノ酸配列とを含む、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドが、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む副甲状腺ホルモン関連タンパク質またはその生物学的活性断片もしくはアナログを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記融合ポリペプチドが、副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインを含む受容体ポリペプチドを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインを含む、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記融合ポリペプチドが、配列番号３に記載の全長アミノ酸配列に対し１０−９９％同一であるアミノ酸配列を含む副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインまたはその断片を含み、前記ドメインまたは断片が、副甲状腺ホルモン、その断片またはアナログに結合する、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対し１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインまたはその断片を含み、前記ドメインが、副甲状腺ホルモン、その断片またはアナログに結合する、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記融合ポリペプチドが、前記副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインをコードする修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾が、配列番号３に記載のＩ１０７Ｋ、Ｄ１０９Ａ、Ｐ１０４Ｌ、またはＬ１５９Ａからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸置換である、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記融合ポリペプチドが、配列番号３に記載のＩ０７Ｋ置換を含む副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインを含む、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記融合ポリペプチドが、修飾された副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインを含み、前記修飾が、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によるものであり、前記修飾されたポリペプチドが、副甲状腺ホルモン結合活性を実質的に欠いているか、副甲状腺ホルモン結合活性が低減している、請求項１０から１５のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
受容体ポリペプチドを含む前記融合ポリペプチドが、成長ホルモン受容体の成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを代替的または追加的に含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記融合ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン受容体の細胞外成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含む、請求項１７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記融合ポリペプチドが、配列番号５に記載のアミノ酸配列から構成される細胞外成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含む、請求項１８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記融合ポリペプチドが、修飾された細胞外成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含み、前記修飾が、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によるものであり、前記修飾されたポリペプチドが、成長ホルモン結合活性を実質的に欠いているか、成長ホルモン結合活性が低減している、請求項１９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記融合ポリペプチドが、配列番号５に記載のＷ１６９、Ｒ４３、Ｅ４４、Ｉ１０３、Ｗ１０４、Ｉ１０５、Ｐ１０６、Ｉ１６４、及びＤ１６５からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの１つ以上の修飾を含む、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記融合ポリペプチドが、配列番号５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基トリプトファン１０４の欠失を含む、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記融合ポリペプチドが、配列番号５に記載のアミノ酸配列のトリプトファン１０４の置換を含む、請求項２２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記融合ポリペプチドが、配列番号７に記載のアラニンに対するトリプトファン１０４の置換を含む、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記融合ポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸残基１−２８、１−２９、１−３０、１−３１、１−３２、１−３３、１−３４、または１−３５を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモン断片を含むまたはそれからなる、請求項１から２４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記融合ポリペプチドが、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、前記副甲状腺ホルモンアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって修飾され、前記修飾された融合ポリペプチドが、副甲状腺ホルモン活性を保持する、請求項２５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
前記融合ポリペプチドが、副甲状腺受容体ドメインポリペプチドを含み、前記副甲状腺受容体ドメインポリペプチドが、前記融合ポリペプチドのカルボキシル末端端部に位置する、請求項１から２６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
前記融合ポリペプチドが、副甲状腺受容体ドメインポリペプチドを含み、前記副甲状腺受容体ドメインポリペプチドが、前記融合ポリペプチドのアミノ末端端部に位置する、請求項１から２６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
前記融合ポリペプチドが、成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含み、前記成長ホルモン結合ドメインポリペプチドが、前記融合ポリペプチドのカルボキシル末端端部に位置する、請求項１から２６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
前記融合ポリペプチドが、成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含み、前記成長ホルモン結合ドメインポリペプチドが、前記融合ポリペプチドのアミノ末端端部に位置する、請求項１から２６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３１】
前記融合ポリペプチドが、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３２】
前記融合ポリペプチドが、配列番号１５または２０に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３３】
前記融合ポリペプチドが、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、または５３に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３４】
前記融合ポリペプチドが、プロペプチドを含む、請求項１から３３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
前記融合ポリペプチドが、ペプチド分泌シグナルをさらに含む、請求項１から３３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
前記融合ポリペプチドが、副甲状腺ホルモン、その断片またはアナログを含み、ペプチドリンカーによって前記受容体ポリペプチドに直接的または間接的に連結している、請求項１から３３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３７】
前記副甲状腺ホルモン、断片、またはアナログが、インフレーム翻訳融合体として前記受容体ポリペプチドに直接的に連結している、請求項１から３３のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３８】
請求項１から３７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３９】
請求項３８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４０】
請求項３８または３９に記載の核酸分子またはベクターを用いてトランスフェクションまたは形質転換された、単離細胞。
【請求項４１】
融合ポリペプチドの産生のための方法であって、
ｉ）請求項４０に記載の細胞及び細胞培地を提供することと、
ｉｉ）前記細胞を培養することと、
ｉｉｉ）前記細胞または培地から本発明における融合ポリペプチドを単離することと
からなるステップを含む、前記方法。
【請求項４２】
賦形剤または担体を含む請求項１から３７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項４３】
対象における副甲状腺機能低下症の処置における使用のための、請求項１から３７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４４】
ヒト対象における骨粗しょう症の処置における使用のための、請求項１から３７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４５】
前記融合ポリペプチドが、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の使用における融合ポリペプチド。
【請求項４６】
前記融合ポリペプチドが、炭酸カルシウム及び／またはビタミンＤサプリメント、例えば、カルシトロールまたはアルファカルシトロールと組み合わせて投与される、請求項４４または４５に記載の使用における融合ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、長時間作用性の副甲状腺ホルモン融合ポリペプチドであって、受容体ポリペプチドを含み、当該受容体ポリペプチドが、副甲状腺ホルモン受容体及び／または成長ホルモン受容体である、副甲状腺ホルモン融合ポリペプチドと、当該融合ポリペプチドをコードする核酸分子と、当該融合ポリペプチドを発現するように適合されたベクターと、当該核酸またはベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた細胞と、副甲状腺機能低下症の処置における当該ポリペプチドの使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベルが低いことによって特徴づけられる副甲状腺機能低下症は、まれな状態であり、先天性であるか、またはより高頻度には頸部手術後の後天性のものである。ＰＴＨは、頸部内の甲状腺の隣に位置する４つの副甲状腺によって分泌され、カルシウム恒常性、ビタミンＤ依存的カルシウム吸収、腎臓のカルシウム再吸収、及び腎臓のリン酸クリアランスを調節する。ＰＴＨは、骨からのカルシウム放出を刺激し、腸内のカルシウム吸収を強化する。ＰＴＨレベルの低減は、低カルシウム血症を招き、神経筋の過敏性などの症状（錯感覚、筋れん縮、咽頭けいれん、テタニー、及び発作を含む）を含み、処置されない場合には死を招く恐れがある。
【０００３】
現時点での標準治療は、高用量のカルシウム及び活性ビタミンＤであるが、処置がカルシウムレベルを変動させるにもかかわらず、多くの患者が抑うつの発生率増加を示し、さらに、感染症のリスクならびに腎臓合併症（例えば、石灰化及び腎機能不全）の増加も示す。ＰＴＨは、８４アミノ酸長のポリペプチドであり、３４の長さのアミノ酸のＮ末端生物学的活性ドメインを含み、これが有効なＰＴＨ受容体アゴニストであることが見いだされた。
【０００４】
現時点では、組換えＰＴＨが毎日の皮下注射として投与されている。ＰＴＨは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで不安定であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が短いことが知られており、その結果、吐き気及び嘔吐に関連するＰＴＨレベルの変動がもたらされる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＴＨを安定化する組成物は、ＵＳ７５５０４３４、ＵＳ７１４４８６１、ＵＳ６７７０６２３、ＷＯ２００６／１２９９９５、またはＷＯ２０１３／１０８２３５で開示されており、最大３６アミノ酸の修飾ＰＴＨ断片を含む薬物動態及び薬物力学が強化された組換えＰＴＨアナログは、ＷＯ２０１１１４３４０６で開示されている。しかし、毎日皮下注射を行う必要性を最小限にするために、血清カルシウムレベルへの調節増大と副作用の低減とを備えた長時間作用性のＰＴＨ生物製剤が緊急に必要とされている。
【０００５】
医薬品で使用される組換えタンパク質及びペプチドは、多くの場合、血清クリアランスが増加するという難点がある。投与されたタンパク質が循環から除去されるという結果をもたらす要因には、２つの構成要素：腎臓の濾過及びタンパク質分解が存在する。典型的には、７０ｋＤａを上回る分子量のタンパク質は、単に濾過するには大き過ぎるため、糸球体濾過により除去されることはないが、低分子量のタンパク質は、糸球体によって濾過され、尿中に見いだされる。有効な分子量のタンパク質を増加させ、免疫原性が低減された製品を生産する方法は、タンパク質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングすることである。ＰＥＧは、ペグ化タンパク質の流体力学的体積を増加させることにより、腎クリアランスを緩徐化すると考えられている（Ｍａｘｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ，１６：５０５−５０９（１９７５））。しかし、タンパク質のペグ化は、タンパク質の受容体に対する親和性の低下をもたらし、生物学的活性を低減する恐れがある。タンパク質生物製剤のＰＫ及びＰＤを向上させる代替的手段がＷＯ２００９／０１３４６１に開示されている。ヒト成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の細胞外ドメインに融合したヒト成長ホルモンは、ＰＫ及びＰＤが強化され、成長ホルモンと比較しておよそ２００倍ＰＫが向上している。ＰＣＴ／ＧＢ２０１６／０５３２１８（現時点では未発表）では、レプチン及び顆粒球コロニー刺激因子（ＧＳＣＦ）はＧＨＲと融合された場合にＰＫ及びＰＤが向上するという、ＧＨＲが非成長ホルモンポリペプチドに及ぼす効果が開示されている。
【０００６】
本開示は、ＰＴＨ融合ポリペプチドに関し、受容体（例えば、同族受容体及び／またはＧＨＲ）に融合したＰＴＨのＰＫ及びＰＤが向上するというものである。ＰＴＨ融合ポリペプチドは、副甲状腺機能低下症を含めた異常なＰＴＨ活性からもたらされる状態の処置と、骨粗しょう症を含めたＰＴＨ療法の恩恵を受ける状態の処置とにおいて有用性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様によれば、融合ポリペプチドであって、
副甲状腺ホルモンまたはその生物学的活性断片もしくはアナログのアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
受容体ポリペプチドまたはその断片もしくはアナログのアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含み、当該副甲状腺ホルモンまたはその生物学的活性断片もしくはアナログが、翻訳融合体として、直接的または間接的に、当該受容体ポリペプチドに連結している、融合ポリペプチドが提供される。
【０００８】
「アナログ」とは、副甲状腺ホルモン受容体または受容体ポリペプチドアミノ酸配列バリアントに結合する副甲状腺ホルモンを意味する。副甲状腺ホルモンアナログとしては、以下に限定されないが、副甲状腺ホルモン関連タンパク質及びそのバリアントをコードするアミノ酸配列が挙げられる。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモンを含む。
【００１０】
本発明の参照される実施形態において、当該融合ポリペプチドは、アミノ酸１−２８、１−２９、１−３０、１−３１、１−３２、１−３３、１−３４、または１−３５を含む配列番号１０の断片を含む。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号９に記載の配列を含む副甲状腺ホルモンを含む。
【００１２】
本発明の参照される実施形態において、当該融合ポリペプチドは、アミノ酸１−２８、１−２９、１−３０、１−３１、１−３２、１−３３、１−３４、または１−３５を含む配列番号９の断片を含む。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモンを含む。
【００１４】
本発明の参照される実施形態において、当該融合ポリペプチドは、アミノ酸１−２８、１−２９、１−３０、１−３１、１−３２、または１−３３を含む配列番号５４の断片を含む。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、式（Ｉ）のアミノ酸配列：
Ｘａａ０１−Ｖａｌ−Ｘａａ０３−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｘａａ０８−Ｈｉｓ−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｌｅｕ−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘａａ２２−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ（配列番号８）
（（Ｉ）において、Ｘａａ０１は、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘａａ０３は、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘａａ０８は、ＭｅｔまたはＬｅｕであり、Ｘａａ１０は、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎであり、Ｘａａ１１は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ１２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇであり、Ｘａａ１３は、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ１４は、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＳｅｒであり、Ｘａａ１６は、ＧｌｎまたはＡｓｎであり、Ｘａａ１７は、ＡｓｐまたはＳｅｒであり、Ｘａａ１８は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり、Ｘａａ２２は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ２５は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、またはＡｒｇである）
を含むもしくはそれからなる副甲状腺ホルモンアナログ、またはＸａａ１８のうちの少なくとも１つがＬｅｕでもＭｅｔでもなく、Ｘａａ２２がＰｈｅではなく、Ｘａａ２６がＨｉｓではないことを条件に、式（Ｉ）のアミノ酸１−２８、１−２９、１−３０、１−３１、１−３２、１−３３、１−３４、もしくは１−３５を含むその断片を含む。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、副甲状腺ホルモンと、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモンアナログアミノ酸配列とを含む。
【００１７】
本発明の代替的な実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む副甲状腺ホルモン関連タンパク質またはその生物学的活性断片もしくはアナログを含む。
【００１８】
本発明の参照される実施形態において、当該融合ポリペプチドは、アミノ酸１−２８、１−２９、１−３０、１−３１、１−３２、１−３３、１−３４、または１−３５を含む配列番号４０の断片を含む。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、副甲状腺ホルモン細胞外ドメインを含む受容体ポリペプチドを含む。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインを含む。
【００２１】
本発明のさらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号３に記載の全長アミノ酸配列に対し１０−９９％同一であるアミノ酸配列を含む副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインまたはその断片を含み、当該ドメインまたは断片は、副甲状腺ホルモン、その断片またはアナログに結合する。
【００２２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対し１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインまたはその断片を含み、当該ドメインは、副甲状腺ホルモン、その断片またはアナログに結合する。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインをコードする修飾されたアミノ酸配列を含み、当該修飾は、配列番号３に記載のＩ１０７Ｋ、Ｄ１０９Ａ、Ｐ１０４Ｌ、またはＬ１５９Ａからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸置換である。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号３に記載のＩ０７Ｋ置換を含む副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインを含む。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号１０に記載の配列のアミノ酸残基１−１４を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモンを含む。
【００２６】
本発明の代替的な実施形態において、当該融合ポリペプチドは、修飾された副甲状腺ホルモン受容体細胞外ドメインを含み、当該修飾は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によるものであり、当該修飾されたポリペプチドは、副甲状腺ホルモン結合活性を実質的に欠いているか、副甲状腺ホルモン結合活性が低減している。
【００２７】
本発明の一実施形態において、受容体ポリペプチドを含む当該融合ポリペプチドは、代替的または追加的に、成長ホルモン受容体の成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含む。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン受容体の細胞外成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含む。
【００２９】
本発明のさらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列から構成される細胞外成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含む。
【００３０】
本発明の代替的な実施形態において、当該融合ポリペプチドは、修飾された細胞外成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含み、当該修飾は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によるものであり、当該修飾されたポリペプチドは、成長ホルモン結合活性を実質的に欠いているか、成長ホルモン結合活性が低減している。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号５に記載のＷ１６９、Ｒ４３、Ｅ４４、Ｉ１０３、Ｗ１０４、Ｉ１０５、Ｐ１０６、Ｉ１６４、及びＤ１６５からなる群より選択されるアミノ酸残基のうちの１つ以上の修飾を含む。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基トリプトファン１０４の欠失を含む。
【００３３】
本発明の代替的な実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列のトリプトファン１０４の置換を含む。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号７に記載のアラニンに対するトリプトファン１０４の置換を含む。
【００３５】
本発明のさらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸残基１−２８、１−２９、１−３０、１−３１、１−３２、１−３３、１−３４、または１−３５を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモン断片を含むまたはそれからなる。
【００３６】
さらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号８、９、または１０に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモンまたはそのアナログを含み、当該副甲状腺ホルモンアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって修飾され、当該修飾された融合ポリペプチドは、副甲状腺ホルモン活性を保持する。
【００３７】
さらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモンまたはそのアナログを含み、当該副甲状腺ホルモンアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって修飾され、当該修飾された融合ポリペプチドは、副甲状腺ホルモン活性を保持する。
【００３８】
さらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号３７または４０に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる副甲状腺ホルモンアナログを含み、当該副甲状腺ホルモンアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、または置換によって修飾され、当該修飾された融合ポリペプチドは、副甲状腺ホルモン活性を保持する。
【００３９】
さらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号８、９、または１０に記載のアミノ酸配列の全長に対し４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一である修飾されたアミノ酸配列を含む。
【００４０】
さらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号４０または３７に記載のアミノ酸配列の全長に対し４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一である修飾されたアミノ酸配列を含む。
【００４１】
さらに好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列の全長に対し４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一である修飾されたアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、副甲状腺受容体ドメインポリペプチドを含み、当該副甲状腺受容体ドメインポリペプチドは、当該融合ポリペプチドのカルボキシル末端端部に位置する。
【００４３】
本発明の代替的な実施形態において、当該融合ポリペプチドは、副甲状腺受容体ドメインポリペプチドを含み、当該副甲状腺受容体ドメインポリペプチドは、当該融合ポリペプチドのアミノ末端端部に位置する。
【００４４】
本発明の代替的な実施形態において、当該融合ポリペプチドは、成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含み、当該成長ホルモン結合ドメインポリペプチドは、当該融合ポリペプチドのカルボキシル末端端部に位置する。
【００４５】
本発明の一実施形態において、当該融合ポリペプチドは、成長ホルモン結合ドメインポリペプチドを含み、当該成長ホルモン結合ドメインポリペプチドは、当該融合ポリペプチドのアミノ末端端部に位置する。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号１５または２０に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、または５３に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、プロペプチドを含む。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、当該プロペプチドは、配列番号１１を含むまたはそれからなる。
【００５１】
本発明の代替的な好ましい実施形態において、当該プロペプチドは、配列番号４を含むまたはそれからなる。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドはさらに、ペプチド分泌シグナルを含む。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、副甲状腺ホルモンペプチド分泌シグナルを含む。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態において、当該副甲状腺ホルモンペプチド分泌シグナルは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、副甲状腺ホルモン関連タンパク質ペプチド分泌シグナルを含む。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態において、当該副甲状腺ホルモン関連タンパク質ペプチド分泌シグナルは、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
本発明の代替的な実施形態において、当該融合ポリペプチドは、成長ホルモンペプチド分泌シグナルを含む。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる成長ホルモン分泌シグナルを含む。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態において、当該融合ポリペプチドは、副甲状腺ホルモン、その断片またはアナログを含み、ペプチドリンカーによって当該受容体ポリペプチドに直接的または間接的に連結している。
【００６０】
本発明の代替的な実施形態において、当該副甲状腺ホルモン、断片、またはアナログは、インフレーム翻訳融合として当該受容体ポリペプチドに直接的に連結している。
【００６１】
好ましくは、当該ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒを含む。
【００６２】
さらに好ましい実施形態において、当該ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒを含むペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の繰返し単位を含む。
【００６３】
さらに好ましい実施形態において、当該ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの４個の繰返し単位を含む。
【００６４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明における融合ポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
【００６５】
本発明のさらなる態様によれば、本発明における核酸分子を含むベクターが提供される。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態において、当該ベクターは、本発明における核酸分子を発現するように適合された発現ベクターである。
【００６７】
本発明における核酸（複数可）を含むベクターは、特に、安定したトランスフェクションのためにゲノムへの組換えで核酸を細胞に導入するのに使用される場合、プロモーターまたはその他の制御配列を含む必要がない。好ましくは、ベクター内の核酸は、宿主細胞における転写のための適切なプロモーターまたは他の制御エレメントに対し作用可能に連結している。ベクターは、複数の宿主内で機能する二機能性発現ベクターであり得る。「プロモーター」とは、転写開始部位の上流にあり、転写に必要とされる全ての制御領域を含有するヌクレオチド配列を意味する。好適なプロモーターとしては、真核及び原核細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導的、発生的、またはその他のプロモーターが挙げられる。「作用可能に連結」とは、同じ核酸分子の一部として結びついており、プロモーターから開始される転写に対し好適に配置され方向づけられていることを意味する。プロモーターに対し作用可能に連結しているＤＮＡは、プロモーターの「転写開始制御下」にある。
【００６８】
好ましい実施形態において、プロモーターは、構成的、誘導的、または制御可能なプロモーターである。
【００６９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明における核酸分子またはベクターを用いてトランスフェクションまたは形質転換された細胞が提供される。
【００７０】
好ましくは、当該細胞は真核細胞である。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、当該細胞は、真菌細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ）、哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、植物細胞からなる群より選択される。
【００７２】
本発明の代替的な実施形態において、当該細胞は原核細胞である。
【００７３】
本発明の一態様によれば、本発明における融合ポリペプチドの産生のための方法であって、
ｉ）本発明における細胞及び細胞培地を提供することと、
ｉｉ）当該細胞を培養することと、
ｉｉｉ）当該細胞または培地から本発明における融合ポリペプチドを単離することと
からなるステップを含む、方法が開示される。
【００７４】
本発明のさらなる態様によれば、賦形剤または担体を含む本発明における融合ポリペプチドを含む薬学的組成物が提供される。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態において、当該薬学的組成物は、さらなる治療剤と組み合わされる。
【００７６】
投与される場合、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される調製物で投与される。このような調製物は、通例的には、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合性の担体、及び任意選択によりその他の治療剤（例えば、化学療法剤）を含有し得る。
【００７７】
本発明の薬学的組成物は、注射を含めた任意の従来的経路によって投与され得る。投与及び適用は、例えば、皮下であり得る。
【００７８】
本発明の薬学的組成物は、有効量で投与される。「有効量」とは、単体で、またはさらなる用量の相乗的薬物と共に、所望される応答をもたらす医薬品／組成物の量である。有効量は、疾患進行の一時的な緩徐化を伴うに過ぎない場合もあるが、より好ましくは、永続的な疾患進行の停止を伴う。有効量は、通例的な方法によってモニターすることも、診断方法に従ってモニターすることもできる。
【００７９】
対象に投与される薬学的組成物の用量は、種々のパラメーターに従って、特に使用する投与様式及び対象の状態（すなわち、年齢、性別）に従って、選択することができる。投与される場合、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される量で、及び薬学的に許容される組成物で適用される。医薬に使用される場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩も、その薬学的に許容される塩を調製するのに好都合に使用される場合があり、本発明の範囲から除外されない。このような薬理学的及び薬学的に許容される塩としては、以下に限定されないが、以下の酸から調製される塩が挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マロン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に許容される塩は、ナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類金属として調製されてもよい。
【００８０】
薬学的組成物は、所望される場合、薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒトへの投与に好適な１つ以上の適合性の固体または液体の増量剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。「担体」という用語は、適用を容易にするために活性成分と組み合わされる、天然または合成の有機成分または無機成分を示す。また、薬学的組成物の構成要素は、所望の薬学的効力を実質的に損なう相互作用が存在しないような方法で、本発明の分子と混合すること及び互いに混合することも可能である。
【００８１】
薬学的組成物は、塩における酢酸、塩におけるクエン酸、塩におけるホウ酸、及び塩におけるリン酸を含めた好適な緩衝剤を含有し得る。また薬学的組成物は、任意選択で、ベンザルコニウム塩化物、クロロブタノール、パラベン、及びチメロサールなどの好適な保存料を含有してもよい。
【００８２】
薬学的組成物は、単位剤形で好都合に提示することができ、薬学分野で周知されている任意の方法によって調製することができる。全ての方法は、活性薬剤を、１つ以上の補助的成分を構成する担体と連合させるステップを含む。概して、組成物は、活性化合物を液体担体、微粉固体担体、またはこの両方と一様かつ密接に連合させ、次に、必要な場合は生成物を整形することによって調製される。
【００８３】
好都合には、皮下投与に好適な組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張である、無菌の水性または非水性の調製物を含む。この調製物は、公知の方法に従って好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて製剤化することができる。また、無菌の注射用調製物は、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射用溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であってもよい。用いられてもよい許容される溶媒に含まれるものとして、水、リンガー液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の固定油も、溶媒または懸濁媒体として好都合に用いられる。この目的において、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激の固定油を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も注射液の調製で使用することができる。皮下投与に好適な担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見いだすことができる。
【００８４】
本発明の一態様によれば、対象における副甲状腺機能低下症の処置における使用のための、本発明における融合ポリペプチドが提供される。
【００８５】
本発明のさらなる態様によれば、副甲状腺機能低下症を患うヒト対象を処置する方法であって、有効量の本発明における融合ポリペプチドを投与することを含み、当該投与によって副甲状腺機能低下症を処置する、方法が提供される。
【００８６】
本発明の一態様によれば、ヒト対象における骨粗しょう症の処置における使用のための、本発明における融合ポリペプチドが提供される。
【００８７】
本発明のさらなる態様によれば、骨粗しょう症を患うヒト対象を処置する方法であって、有効量の本発明における融合ポリペプチドを投与することを含み、当該投与によって骨粗しょう症を処置する、方法が提供される。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態または方法において、当該融合ポリペプチドは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。
【００８９】
好ましい実施形態または本発明の方法において、当該融合ポリペプチドは、炭酸カルシウム及び／またはビタミンＤサプリメント、例えば、カルシトロール（ｃａｌｃｉｔｒｏｌ）またはアルファカルシトロール（ａｌｆａｃａｌｃｉｔｒｏｌ）と組み合わせて投与される。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態または方法において、当該副甲状腺機能低下症は、甲状腺もしくは頸部の手術、自己免疫疾患、放射線療法、がん、アジソン病、またはディジョージ症候群によって引き起こされる。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態または方法において、当該融合ポリペプチドは、少なくとも１日に１回投与される。
【００９２】
本発明の一実施形態または方法において、当該融合ポリペプチドは、少なくとも１週間に１回または２回投与される。
【００９３】
本明細書の説明及び請求項全体において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」ならびにこれらの語の変化形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「以下を含むがこれに限定されない」ことを意味し、その他の部分、添加物、構成要素、整数、またはステップを除外するようには意図されていない（かつ除外しない）。
【００９４】
本明細書の説明及び請求項全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈上他の意味が要求されない限り、本明細書は単数だけではなく複数を企図しているものと理解されるべきである。
【００９５】
本発明における特定の態様、実施形態、または例と共に説明される特徴、整数、特性、化合物、化学的部分、または化学基は、矛盾しない限り、本明細書で説明される他の任意の態様、実施形態、または例にも適用可能であると理解されるべきである。
【００９６】
ここで、本発明の一実施形態が、単に例として、以下の図面を参照しながら説明される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＰＴＨ（残基１−３４）をＮ末端ＰＴＨ受容体ドメイン（ＰＴＨｒＥｘｔ）及び成長ホルモン結合タンパク質（ＧＨＢＰ）に連結した。ＧＨＢＰは、分子量を増加させクリアランスを遅延させるように設計された不活性部分である。ＰＴＨとＰＴＨｒＥｘｔとの結合はＰＴＨを分解から保護し、より生理的ＰＴＨ曝露を生成する活性ＰＴＨと平衡下にある「不活性」ＰＴＨのプールをもたらす。分子は、ＰＴＨ分泌シグナル（プロペプチドの包含を伴ってまたは伴わずに）または成長ホルモン分泌シグナルいずれかの調節下で発現し、ＣＨＯ細胞株内での効率的なプロセシングを可能にする。
【図２】精製されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。Ａ）精製された１４Ａ１、Ｂ）精製された１４Ａ２ｂ。タンパク質をＣＨＯ細胞株内で発現させ、Ｑ−セファロースと抗成長ホルモン受容体親和性クロマトグラフィーとの組合せを用いて、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ  Ｕｔｉｌｉｔｙ培地からの分泌産物として精製した。タンパク質は、約７５〜１００ｋＤａにて分離し、分解の徴候を伴うことなくインタクトである。
【図３】１４Ａ１及び１４Ａ２タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生体活性。精製されたタンパク質について、ＰＴＨ応答性細胞株ＵＭＲ−１０６（ラット骨芽細胞様細胞株）からのｃＡＭＰ産生を刺激する能力を試験した。試験分子の存在下で細胞を１５分間刺激し、ｃＡＭＰ特異的Ｅｌｉｓａを用いて細胞ライセートからｃＡＭＰレベルを測定した。ＰＴＨ  １−３４（１００ｎＭ）、フォルスコリン（１００μＭ）双方の陽性対照及び陰性対照（細胞のみ、緩衝液のみ、及び対照タンパク質、エリスロポエチン）を解析に含めた。データは、ｐｍｏｌ  ｃＡＭＰ／ｍｌ  ＋／−標準偏差として提示されている。
【図４】副甲状腺ホルモン、ＬＯＣＵＳ  ＮＭ＿０００３１５  ８３４ｂｐ  ｍＲＮＡ  ｌｉｎｅａｒ  ＰＲＩ  １３−ＪＵＮ−２０１６，ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ．，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿０００３１５，ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＭ＿０００３１５．３，ＫＥＹＷＯＲＤＳ  ＲｅｆＳｅｑ．，ＳＯＵＲＣＥ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ｈｕｍａｎ）。ａ）シグナルペプチドは下線部、プロペプチドはイタリック体／小文字、成熟タンパク質（１−３４）は大文字／太字。ｂ）原配列。シグナルペプチドは下線部（１１６−１９０ｂｐ）、プロペプチドは小文字／イタリック体、成熟タンパク質は大文字／太字（２０９−４６０ｂｐ）。
【図５】融合タンパク質で使用されるＰＴＨ  １−３４。ａ）ＰＴＨ  １−３４のアミノ酸配列。ｂ）ヌクレオチド配列（１０２ｂｐ）、ｃ）融合タンパク質で使用されるＰＴＨシグナルペプチドのアミノ酸配列及びプロペプチド配列（プロペプチドは小文字／イタリック体）。ｄ）融合タンパク質で使用されるＰＴＨシグナルペプチドのヌクレオチド配列及びプロペプチド配列（プロペプチドは小文字／イタリック体）。
【図６】ヒト副甲状腺ホルモン受容体１。ａ）ＬＯＣＵＳ  ＮＭ＿００１１８４７４４  ２００７ｂｐ  ｍＲＮＡ  ｌｉｎｅａｒ  ＰＲＩ  ０６−ＯＣＴ−２０１６，ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＴＨ１Ｒ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２，ｍＲＮＡ．，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１１８４７４４  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＭ＿００１１８４７４４．１，ＫＥＹＷＯＲＤＳ  ＲｅｆＳｅｑ．，ＳＯＵＲＣＥ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ｈｕｍａｎ）。シグナルペプチドは下線部、成熟細胞外ドメインは太字（Ｄ２９−ｌ１８７）。ｂ）シグナルペプチドは下線部、成熟細胞外ドメインは太字。
【図７】融合タンパク質で使用されるＰＴＨ受容体細胞外ドメイン。ａ）アミノ酸配列（アミノ酸Ｄ２９−Ｌ１８７）。ｂ）ヌクレオチド配列（４７７ｂｐ）。
【図８】ヒト成長ホルモン結合タンパク質（ＧＨＢＰ）。ａ）融合体のＧＨＢＰ部分は、アミノ酸残基１−２３８（細胞外ドメイン）から構成され、Ｗ１０４Ａ変異を含む。ＧＨＢＰのヌクレオチド配列（７１４ｂｐ）。ｂ）アミノ酸配列（アミノ酸１−２３８）。
【図９】ＧＨ分泌シグナルのａ）アミノ酸配列、ｂ）ヌクレオチド配列。
【図１０】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘ−（ｇ４ｓ）４−ＧＨＢＰ（コード＃１４Ａ１）。ＰＴＨシグナルペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（アミノ酸１−１５９）：太字／小文字、ＧＨＢＰ（アミノ酸１−２３８）：大文字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図１１】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ−（ｇ４ｓ）４−ＧＨＢＰ（コード＃１４Ａ２）。ＰＴＨシグナルペプチド及びプロペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（アミノ酸１−１５９）：小文字／太字、ＧＨＢＰ（アミノ酸１−２３８）：大文字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図１２】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ−（ｇ４ｓ）４−ＧＨＢＰ（コード＃１４Ａ３）。ＧＨシグナルペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（アミノ酸１−１５９）：小文字／太字、ＧＨＢＰ（アミノ酸１−２３８）：大文字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図１３】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＧＨＢＰ（コード＃１４Ａ４）。ＧＨシグナルペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＧＨＢＰ（アミノ酸１−２３８）：大文字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図１４】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ＿Ｈｉｓｔ（コード＃１４Ａ５＿Ｈｉｓｔ）。ＧＨシグナルペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（アミノ酸１−１５９）：小文字／太字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字、Ｃ末端６ｘ  Ｈｉｓｔタグ：大文字／下線部。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図１５】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ（コード＃１４Ａ５）。ＧＨシグナルペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（アミノ酸１−１５９）：小文字／太字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図１６】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ＿Ｈｉｓｔ（コード＃１４Ａ６＿Ｈｉｓｔ）。ＰＴＨシグナルペプチド及びプロペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（アミノ酸１−１５９）：小文字／太字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字、Ｃ末端６ｘ  Ｈｉｓｔタグ：大文字／下線部。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図１７】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ＿Ｈｉｓｔ（コード＃１４Ａ６）。ＰＴＨシグナルペプチド及びプロペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（アミノ酸１−１５９）：小文字／太字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図１８】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＧＨＢＰ（コード＃１４Ａ７）。ＰＴＨシグナルペプチド及びプロペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＧＨＢＰ（アミノ酸１−２３８）：大文字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図１９】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ（Ｉ１３５Ｋ）−（ｇ４ｓ）４−ＧＨＢＰ（コード＃１４Ａ８）。ＰＴＨシグナルペプチド及びプロペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（アミノ酸１−１５９）：小文字／太字（Ｉ１３５Ｋ変化は下線付き）。ＧＨＢＰ（アミノ酸１−２３８）：大文字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図２０】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＧＨＢＰ（コード＃１４Ａ９）。ＧＨシグナルペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（Ｉ１３５Ｋ）（アミノ酸１−１５９）：小文字／太字（Ｉ１３５Ｋ変化は下線付き）、ＧＨＢＰ（アミノ酸１−２３８）：大文字、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図２１】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ（Ｉ１３５Ｋ）−Ｈｉｓｔ（コード＃１４Ａ１０）。ＰＴＨシグナルペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（Ｉ１３５Ｋ）（アミノ酸１−１５９）：小文字／太字（Ｉ１３５Ｋ変化は下線付き）、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字、Ｃ末端６ｘ  Ｈｉｓｔタグ：大文字／下線部。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図２２】ＰＴＨ−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ（Ｉ１３５Ｋ）−Ｈｉｓｔ（コード＃１４Ａ１１−Ｈｉｓｔ）。ＧＨシグナルペプチド：小文字、ＰＴＨ（アミノ酸１−３４）：大文字／下線部、ＰＴＨｒＥｘｔ（Ｉ１３５Ｋ）（アミノ酸１−１５９）：小文字／太字（Ｉ１３５Ｋ変化は下線付き）、リンカー領域（ｇ４ｓ）４：大文字／太字、Ｃ末端６ｘ  Ｈｉｓｔタグ：大文字／下線部。ａ）ヌクレオチド配列、ｂ）タンパク質配列。
【図２３】ＰＴＨ配列（アミノ酸１−８４）。
【図２４】配列番号４０：ＰＴＨｒＰ（１−３６）。
【図２５】配列番号４１：ＰＴＨｒＰシグナル配列。
【図２６】配列番号４：ＰＴＨｒＰプロペプチド。
【図２７】ＰＴＨ融合分子の構造を示す図解モデル。１Ａ：ＰＴＨｒＥｘｔ（緑色）に連結しているＰＴＨ（紫色）が、今度はＧＨＢＰ（橙色）に連結する。リンカーは灰色の線で示されている。Ｗ１０４Ａ変化は、ＧＨＢＰ上に青色で示されている。ＰＴＨｒＥｘｔに結合したＰＴＨ（不活性状態：Ａ）と放出されＰＴＨＲ１に結合可能なＰＴＨ（活性状態：Ｂ）との間に平衡状態が存在すると仮定されている。１Ｂ：ＧＨＢＰ（橙色）に連結しているＰＴＨ（紫色）。リンカーは灰色の線で示されている。Ｗ１０４Ａ変化は、ＧＨＢＰ上に青色で示されている。
【図２８】非還元条件下での１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製されたＰＴＨ融合分子の解析（クーマシー染色）。図２Ａ：レーン１：５μｇの１４Ａ２ｃ。レーン２：５μｇの１４Ａ３ｂ。１４Ａ２ｃ（ＰＴＨプレプロペプチドを含有）は、６０−１００ｋＤａから２本の拡散したバンドとして分離する。１４Ａ３ｂ（ＧＨｓｓ）は、約７５−１００ｋＤａの１本の拡散したバンドとして分解する。図２Ｂ：レーン３：６μｇの１４Ａ７。レーン４：３μｇの１４Ａ４。タンパク質は９０％超の純度と判定。１リットルのローラーボトル培養装置から精製タンパク質、約１０ｍｇの１４Ａ２ｃ、約４ｍｇの１４Ａ３ｂ、１．４２ｍｇの１４Ａ７、及び０．２９ｍｇの１４Ａ４が得られた。Ｃ：抗ＰＴＨ  １４Ａ２及び１４Ａ３ｂのウェスタンブロット。非還元条件下での１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製されたＰＴＨ融合分子の解析。試料をＰＶＤＦメンブレンに移し、抗ヒトＰＴＨ（１−３４）特異的抗体でプローブした。レーン１−３：１２５ｎｇ、２５０ｎｇ、及び５００ｎｇのローディングにおける１４Ａ２ｃ。レーン４−６：１２５ｎｇ、２５０ｎｇ、及び５００ｎｇのローディングにおける１４Ａ３ｂ。１４Ａ２ｃは、抗ＰＴＨ抗体による検出に対する感受性がより高い。３つの独立したウェスタンブロット実験を代表するもの。
【図２９−１】Ａ：ｃＡＭＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導。ＵＭＲ−１０６細胞を、３７℃／５％  ＣＯ２にて１５分間、５００ｎＭのＰＴＨ融合体または１００ｎＭのヒトＰＴＨ  １−３４のいずれかに曝露した。細胞を溶解し、Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｃＡＭＰ  Ｅｌｉｓａを用いてｃＡＭＰレベルを測定した。データは、ｌｏｇ  ｐｍｏｌ  ｃＡＭＰ／ｍｌ±ＳＤとして提示されている。１４Ａ２において、１４Ａ３ｂの１１倍のｃＡＭＰレベル増加が見られ、平均±ＳＤは２６４±１２に対し２５±０．９５ｐｍｏｌ  ｃＡＭＰ／ｍｌであった。いずれの融合体も、ＰＴＨ  １−３４（平均±ＳＤは２５５１±１８６ｐｍｏｌ  ｃＡＭＰ／ｍｌ）と比較すると生物学的活性の低減を示した。二重反復で行ったｎ＝１実験の平均。Ｂ：ｃＡＭＰ活性についてのデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ。ＵＭＲ−１０６細胞に対し、レポータープラスミドｐＧＬ４．２９／ＣＲＥ／Ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ及びトランスフェクション対照プラスミドｐｈＲＬ（Ｒｅｎｉｌｌａ）を用いてトランスフェクションし、３７℃／５％  ＣＯ２にて５時間、ＰＴＨ融合体またはヒトＰＴＨ  １−３４のいずれかに曝露した。細胞を溶解し、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキットを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。データは、対照±ＳＤの誘導倍数として提示されている。１４Ａ２ｃは、１４Ａ３ｂよりも生物活性が高く、１００ｎＭ及び５００ｎＭにおいてそれぞれ約１．３から１．６倍の増加に等しい。平均誘導倍数±ＳＤは、１６．５±１．７、６３±５．９に対し１２．４±１．０、４０．３±３．１である。三重反復の値の平均。いずれの融合体も、１００ｎＭの当量濃度におけるＰＴＨ  １−３４（平均±ＳＤは６７．３±１．６）と比較すると生物学的活性の低減を示した。３つの別々の実験を代表するもの。
【図２９−２】Ｃ：４つ全てのＰＴＨ融合分子のｃＡＭＰ活性比較のためのデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ。ＵＭＲ−１０６細胞に対し、レポータープラスミドｐＧＬ４．２９／ＣＲＥ／Ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ及びトランスフェクション対照プラスミドｐｈＲＬ（Ｒｅｎｉｌｌａ）を用いてトランスフェクションし、３７℃／５％  ＣＯ２にて５時間、ＰＴＨ融合体またはヒトＰＴＨ  １−３４のいずれかに曝露した。細胞を溶解し、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキットを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。データは、対照±ＳＤの誘導倍数として提示されている。活性のパターンは、ＰＴＨに対する１４Ａ２ｃ及び１４Ａ３ｂについての先のアッセイと同様である。いずれのＰＴＨ−ＧＨＢＰ融合分子も（１４Ａ４は４９±４．１７、１４Ａ７は４４±０．４２）、１００ｎＭにおけるＰＴＨ−ＰＴＨｒＥｘｔ−ＧＨＢＰ融合分子（１４Ａ２ｃは１５±０．０９、１４Ａ３ｂは７．７±３．１３）よりも活性が高い。１００ｎＭにおいて、１４Ａ４及び１４Ａ７の両方がＰＴＨ（５４±２．７）に匹敵する活性を有する。Ｄ：デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたＰＴＨ及びＰＴＨ融合体におけるＥＣ５０値の定量。ＰＴＨは、３２±１０．６７ｎＭのＥＣ５０を有し（ｎ＝４実験）、１４Ａ２ｃ（ＥＣ５０＝５７９±１３８ｎＭ、ｎ＝３実験）よりも約１８倍強力であり、１４Ａ３ｂ（ＥＣ５０＝８９６ｎＭ、ｎ＝１）よりも２８倍強力であり、１４Ａ７（ＥＣ５０＝１５３ｎＭ、ｎ＝１実験）よりも４．７倍強力である。
【００９８】
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表１
ＰＴＨｓｓ＝副甲状腺ホルモン分泌シグナル；ｐｐ＝プロペプチド；ＧＨｓｓ＝成長ホルモン分泌シグナル；ＰＴＨ＝（記載通りのアミノ酸１−３４もしくは１−８４またはその断片）；ＰＴＨｒＥｘｔ＝ＰＴＨ受容体細胞外ドメイン；ＧＨＢＰ＝成長ホルモン結合タンパク質（アミノ酸１−２３８）；（ｇ４ｓ）４＝アミノ酸ＧＧＧＧＳの４つのリピート；Ｈｉｓｔタグ＝ＨＨＨＨＨＨ；Ｉ１３５Ｋ＝ＰＴＨｒＥｘｔにおけるイソロイシン−１３５からリジンへの変異；ＬＡ：ＰＴＨ＝長時間作用性ＰＴＨ［テキストで記載されているようなＰＴＨ  １−１４とＰＴＨｒＰとの融合体］。
【００９９】
上記の融合体におけるリンカー領域は、ＧＧＧＧＳの繰返しから構成されている。表１に示される例では、リンカー領域は４×ＧＧＧＧＳから構成されているが、様々な繰返しが使用されてもよい。
【０１００】
選択されたコンストラクトにおけるＰＴＨｒＥｘｔに存在するＩ１３５Ｋ変化は、受容体に対するＰＴＨの結合を低減することが示された。Ｄ１３７Ａ、Ｐ１３２Ｌ、及びＬ１８７Ａなどの他のアミノ酸変化も、組み合わせてまたは単一の点変異として使用され得る（配列番号５６）。
【０１０１】
下記の配列におけるＰＴＨｒＥｘｔのナンバリングは、アラニン２８にてプロセシングされた成熟タンパク質を意味し、そのため、Ｄ２９−Ｉ１８７は、以下の配列においてアミノ酸１−１５９（配列番号３）と呼ばれる。
【０１０２】
上記のＰＴＨ配列の全ては、所望される場合はＰＴＨ  １−８４及びその可変物で置き換えられてもよい。
表２：提唱される全てのＰＴＨｒＰ融合コンストラクトの一覧（配列番号４２−５３）
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ＰＴＨｒＰｓｓ＝副甲状腺ホルモン関連タンパク質分泌シグナル；ｐｐ＝プロペプチド；ＧＨｓｓ＝成長ホルモン分泌シグナル；ＰＴＨｒＰ＝（アミノ酸１−３６またはその断片）；ＰＴＨｒＥｘｔ＝ＰＴＨ受容体細胞外ドメイン；ＧＨＢＰ＝成長ホルモン結合タンパク質（アミノ酸１−２３８）；（ｇ４ｓ）４＝アミノ酸ＧＧＧＧＳの４つのリピート；Ｈｉｓｔタグ＝ＨＨＨＨＨＨ；Ｉ１３５Ｋ＝ＰＴＨｒＥｘｔにおけるイソロイシン−１３５からリジンへの変異
表３  配列番号の概要
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【０１０３】
材料及び方法
ＰＴＨ融合体の構築：遺伝子合成（Ｅｕｒｏｆｉｎ  ＭＷＧ）と標準的なＤＮＡ操作技法との組合せによって分子を構築した。全長ＰＴＨ融合体をコードする組換え遺伝子を、修飾された哺乳類発現プラスミド、ｐＳｅｃＴａｇ／ＦＲＴＮ５／Ｈｉｓｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、製造業者の指示に従って安定した細胞株を産生し、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ  Ｕｔｉｌｉｔｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）における無血清培地に適合させた。ＰＴＨ融合体を、ＰＴＨまたはＧＨシグナルペプチドのいずれかの分泌発現下においた。
【０１０４】
発現及び精製：ローラーボトル培養装置内のＨｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ  Ｕｔｉｌｉｔｙ培地中で細胞を維持し、２〜３日ごとに継代させ、細胞密度を０．２５×１０６生細胞／ｍｌ（ＶＣＰＭ）から１．５×１０６ＶＣＰＭの間に保った。発現試験のために、ローラーボトルを０．５×１０６ＶＣＰＭにて播種し、３７℃、５％  ＣＯ２にて成長させ、１×１０６ＶＣＰＭに到達させた。バルプロ酸を添加して２ｍＭの最終濃度とし、温度を３１℃に低減した。細胞を最大８〜１０日間成長させ、２２，０００ｘｇでの遠心分離をＢｅｃｋｍａｎ  ＪＬＡ  １６−２５ローターを用いて４℃にて２０分行って採取物を清澄化したところ、生存率は依然約７０％であった。ＥＤＴＡ及びベンズアミジン−ＨＣｌを添加して、最終濃度をそれぞれ５ｍＭ及び１０ｍＭとし、Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ２００タンジェンシャルフロー濃縮装置を用いて培地を濃縮し、−２０℃にて冷凍保管した。アニオン交換（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びアフィニティークロマトグラフィー（抗ＧＨＢＰ抗体カラム）により、この濃縮物から標的タンパク質を精製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによってタンパク質濃度を測定し、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試料を解析し、クーマシーブルーで染色するか、または市販の抗ＰＴＨ  １−３４抗体（Ａｂｅａｍ  １４４９３）もしくは内製の抗ＧＨＢＰ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。精製した試料を分割し、−８０℃にて保管した。
【０１０５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性：精製されたタンパク質について、ＰＴＨ応答性細胞株ＵＭＲ−１０６（ラット骨芽細胞様細胞株）からのｃＡＭＰ産生を刺激する能力を試験した。試験分子の存在下で細胞を１５分間刺激し、ｃＡＭＰ特異的Ｅｌｉｓａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて細胞ライセートからｃＡＭＰレベルを測定した。
【０１０６】
副甲状腺機能低下症の動物モデル
Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．は、ＬＡ−ＰＴにおける研究で副甲状腺機能低下症の動物モデルを使用した。このモデルでは、ラットに対し、処置の前に甲状腺副甲状腺摘出（ＴＰＴＸ）を行った。簡潔に述べると、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．から取得した６週齢のラットに外科的ＴＰＴＸを実施した。手術後、１．１０％のカルシウム及び１．０９％のリン酸塩を含有するペレット飼料（ＣＥ−２；ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を水道水で湿らせたものを、偽手術ラット及びＴＰＴＸラットにおいてアクセス及び消化がしやすいように各ケージ内で供給した。ＴＰＴＸ手術から５日後に８．０ｍｇ／ｄＬ未満のｓＣａレベルを示した手術後ラットを、翌日からの後続のペプチド注射試験用に選定した。
【０１０７】
実施例１
ＰＴＨ及びＮドメインＰＴＨ受容体の結晶構造解析［１］から、ＰＴＨが、Ｎ末端受容体部分によって形成された溝の中に位置することが示されている。この相互作用様式が、ＰＴＨを分解から保護し、ＰＴＨの「不活性プール」を創出することでＰＴＨの生物学的活性を持続させて長時間作用性のＰＴＨを創出すると仮定されている。新規分子（図１を参照）は、ＰＴＨ（残基１−３４）、Ｎ末端ＰＨＴ受容体ドメイン（ＰＴＨｒＥｘｔ、最も一般的には残基Ｄ２９−Ｌ１８７、ただしその他の組合せに制限されない）、及び成長ホルモン結合タンパク質（ＧＨＢＰ、残基１−２３８）の間の融合体となることが提唱される。ＧＨＢＰは、Ｍｗを増加させ、そのためクリアランスを遅延させるように設計された不活性部分である。ＧＨＢＰは、循環におけるＧＨとの相互作用を予防するためのＷ１０４Ａ変異を含有する。
【０１０８】
実施例２
初期発現研究から、さらなる進行の根拠となるのに十分なレベル（約１０ｍｇ／Ｌ）でＣＨＯ細胞株からＰＴＨ融合分子を発現及び精製できることが示された。全ての分子は、インタクトでありＳＤＳ−ＰＡＧＥによる判定で９５％超の純度と思われる。
【０１０９】
これまでに試験したＰＴＨ融合分子はいずれも、生物学的活性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのｃＡＭＰアッセイにおいて用量応答をもたらす。
【０１１０】
実施例３
ＰＴＨ  １−３４を、ＰＴＨ受容体の細胞外ドメイン（ＰＴＨｅｘｔＲ）を伴ってまたは伴わずに、成長ホルモン結合タンパク質（ＧＨｂｐ）と融合させた。次に、分子をＧＨ（ＧＨｓｓ）またはＰＴＨ（ＰＴＨｓｓ）シグナル配列のいずれか及びプロペプチド（ｐｐ）と共に発現させた。このようにして、以下の４つの分子が生成された。
・１４Ａ２ｃ＝ＰＴＨｓｓ−ｐｐ−ＰＴＨ（１−３４）−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ−（ｇ４ｓ）４−ＧＨｂｐ（配列番号１３）
・１４Ａ３ｂ＝ＧＨｓｓ−ＰＴＨ（１−３４）−（ｇ４ｓ）４−ＰＴＨｒＥｘｔ−（ｇ４ｓ）４−ＧＨｂｐ（配列番号１４）
・１４Ａ４＝ＧＨｓｓ−ＰＴＨ（１−３４）−（ｇ４ｓ）４−ＧＨｂｐ（配列番号１５）
・１４Ａ７＝ＰＴＨｓｓ−ｐｐ−ＰＴＨ（１−３４）−（ｇ４ｓ）４−ＧＨｂｐ（配列番号２０）
【０１１１】
４つ全ての分子に対する安定したクローンを生成し、全ての安定したクローンはタンパク質を発現し、４つ全てのタンパク質をＧＰｂｐについてアフィニティーカラムで精製した。ＧＨｓｓを用いた分子はより低いレベルで発現しており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及びバイオアッセイからは、Ｎ末端における追加のアミノ酸による翻訳産物の不十分なプロセシングと、場合によっては、ＰＴＨｓｓを用いた分子と比べてのＧＨｓｓを用いた分子における差次的なグリコシル化とが存在し得ることが示唆される。（図２８）このことは、ＰＴＨが、プレプロＰＴＨ配列を完全にプロセシングするのにそれ自身のシグナル配列を必要とすることと適合し、これはＰＴＨｓｓを伴う分子の設計には含まれている。全ての分子は、使用した２つのバイオアッセイにおいて生物活性を示しており、エビデンスからは、ＰＴＨｅｘｔＲを含む分子はより生物活性が低いことが示唆される（図２９及び３０）。
【０１１２】
ＰＴＨ融合分子：設計及び仮説
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、８４アミノ酸のペプチドであり、生物学的活性は残基１−３４に存在する。ＰＴＨは、低い血清カルシウムレベルに応答して副甲状腺により産生される。ＰＴＨは、骨及び腎臓上の副甲状腺受容体（ＰＴＨＲ１）上で作用し、骨からのカルシウム放出を促進し、腎臓からのカルシウム排泄を緩徐化し、腸からの吸収を増加させ、リン酸の腎排泄を促進する。副甲状腺機能低下症（ＨｙｐｏＰＴ）では、副甲状腺は存在しないかまたは損傷しており、そのため、副甲状腺ホルモンを全く産生することができないか、または十分な量を産生することができない。初期的な処置は、経口のカルシウム及び活性ＶＤ３のサプリメントを用いる。最近、ＨｙｐｏＰＴにおいてＮａｔｐａｒａ（ＰＴＨ  １−８４）によるＰＴＨの置換えが認可されたが、毎日の皮下注射が必要とされ、またカルシウムレベルの変動を併発する。持続ポンプ療法が有効であるが、ほとんどの患者にとっては実際的なものではない。そのため、一定の生理的レベルのＰＴＨ活性をもたらす長時間作用性のＰＴＨ分子に対するアンメットニーズが存在する。以前、発明者らは、成長ホルモンとその結合タンパク質（ＧＨＢＰ）との融合体が長時間作用性の成長ホルモンを生成し得ることを示した（１）。この技術を用いて、発明者らは複数のＰＴＨ融合分子を生成した（図１Ａ及びＢを参照）。ＰＴＨ融合体は、タンパク質サイズが増加したことによって持続性の循環半減期を有し、その一方で生物学的活性を保持すると予測される。図１Ａに示されているＰＴＨ融合体のさらなる変更形態として、ＰＴＨが、ＰＴＨｒＥｘｔとの分子内相互作用を形成し、分解から保護され、活性ＰＴＨの血管内プールをもたらすことが仮定される。ＧＨ結合を予防するために、ＧＨＢＰ部分におけるトリプトファン１０４からアラニンへの単一のアミノ酸変化（Ｗ１０４Ａ）が全てのＰＴＨ融合分子に導入されることになる。全てのＰＴＨ融合体は、天然存在のＰＴＨプレプロペプチド配列またはＧＨ分泌シグナルを用いて発現することになる。
【０１１３】
参考文献
Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  Ｌｏｎｇ−Ａｃｔｉｎｇ  ＰＴＨ  Ａｎａｌｏｇ（ＬＡ−ＰＴＨ）  ｉｎ  Ｔｈｙｒｏｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｅｃｔｏｍｉｚｅｄ（ＴＰＴＸ）  Ｒａｔｓ  ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，２０１６．３１（７）：ｐ．１４０５−１２
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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