(57)【要約】ＲＮＡ標的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用する、一ヌクレオチド分解能で、プログラム可能なＲＮＡ編集を実施するための技術が、本明細書において開示される。出願者らが「Ｃａｓ９により狙いを定めたＲＮＡ編集」または「ＣＲＥＤＩＴ」と名付けたこのアプローチは、ＤＮＡ配列を永続的に変化させることに立脚する、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９駆動式のゲノム工学とは異なり、遺伝情報を一時的な方式で可逆的に変化させる手段を提供する。
2020519269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＲＮＡについて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによる狙いを定めたＲＮＡ編集を行うための組み換え発現系であって、
（Ａ）ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）の触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ編集融合タンパク質をコードする核酸配列と
（Ｂ）（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む前記標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、および（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列を含む延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列と
を含む、前記組み換え発現系。
【請求項２】
前記ｅｓｇＲＮＡが、（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡに対して相同性の領域を含むスペーサー配列をさらに含む、請求項１に記載の組み換え発現系。
【請求項３】
（Ａ）および（Ｂ）が、同一のベクター内に含まれる、または異なるベクター内に含まれる、請求項１に記載の組み換え発現系。
【請求項４】
前記ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、およびＡＤＡＲ３からなる群から選択される、前述の請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項５】
前記ＡＤＡＲの触媒的に活性なデアミナーゼドメインが、ＡＤＡＲ２の触媒的に活性なデアミナーゼドメインである、請求項４に記載の組み換え発現系。
【請求項６】
前記ＡＤＡＲ２の触媒的に活性なデアミナーゼドメインが、（１）ヒトＡＤＡＲ２の野生型の触媒的に活性なデアミナーゼドメイン、または（２）野生型ヒトＡＤＡＲ２と比較して触媒活性が高まっているヒトＡＤＡＲ２の触媒的に活性なデアミナーゼドメインの変異体である、請求項５に記載の組み換え発現系。
【請求項７】
前記ヒトＡＤＡＲ２の触媒的に活性なデアミナーゼドメインの変異体が、Ｅ４８８Ｑ変異を含む、請求項６に記載の組み換え発現系。
【請求項８】
前記ｄＣａｓが、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である、前述の請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項９】
前記ｄＣａｓ９のＮ末端ドメインが、前記ＡＤＡＲの触媒的に活性なデアミナーゼドメインのＣ末端に融合している、請求項８に記載の組み換え発現系。
【請求項１０】
前記ｄＣａｓが、リンカーを介して、前記ＡＤＡＲの触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合している、前述の請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項１１】
前記リンカーが、半可動性のＸＴＥＮペプチドリンカーである、請求項１０に記載の組み換え発現系。
【請求項１２】
前記ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列が、３’延長配列である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項１３】
前記ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列が、標的配列とほぼ完璧なＲＮＡ−ＲＮＡ塩基対形成する能力を有する相同性の領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項１４】
前記ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列が、前記標的ＲＮＡ内のアデノシンについて第２のミスマッチをさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項１５】
前記ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列が、前記標的ＲＮＡ内のアデノシンについて第３のミスマッチ、および任意選択的に前記標的ＲＮＡ内のアデノシンについて第４のミスマッチをさらに含む、請求項１４に記載の組み換え発現系。
【請求項１６】
前記ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列が、長さ約１５ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドである、先行する請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項１７】
前記ｅｓｇＲＮＡが、マーカー配列をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項１８】
前記ｅｓｇＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項１９】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター配列である、請求項１８に記載の組み換え発現系。
【請求項２０】
前記ｅｓｇＲＮＡが、スペーサー配列とスキャフォールド配列の間にリンカー配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項２１】
前記ｅｓｇＲＮＡ（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の配列が、前記ｅｓｇＲＮＡ内で３’から５’に向かって位置している、請求項２に記載の組み換え発現系。
【請求項２２】
ＰＡＭ配列をコードする核酸をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組み換え発現系。
【請求項２３】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３に記載の組み換え発現系。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターである、請求項２２に記載の組み換え発現系。
【請求項２５】
延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸を含むベクターであって、
（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列と、
（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列と、
（ｉｉｉ）標的配列に対して相補的な配列（スペーサー配列）と、
を含み、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が、前記ｅｓｇＲＮＡ内で３’から５’に向かって位置している、前記ベクター。
【請求項２６】
ウイルスベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターである、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
発現コントロール要素をさらに含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２９】
請求項２５から２８のいずれか一項に記載のベクターを含むウイルス粒子。
【請求項３０】
請求項１から２４に記載の組み換え発現系、請求項２５から２８に記載のベクター、または請求項２９に記載のウイルス粒子のうちのいずれか１つを含む細胞。
【請求項３１】
（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列と、
（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列と
を含む、ｅｓｇＲＮＡ。
【請求項３２】
ＡＤＡＲの触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ編集融合タンパク質。
【請求項３３】
選択的ＲＮＡ編集を行う方法であって、
請求項１から２４に記載の組み換え発現系、請求項２５から２８に記載のベクター、または請求項２９に記載のウイルス粒子のうちのいずれか１つを細胞に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
２’ＯＭｅ  ＲＮＡとＤＮＡ塩基の繰り返しを含むアンチセンス合成オリゴヌクレオチド化合物（ＰＡＭｍｅｒ）を投与することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
狙いを定めた細胞ＲＮＡ編集がプロセシングおよび動力学に及ぼす効果を特徴づける方法であって、
請求項１から２４に記載の組み換え発現系、請求項２５から２８に記載のベクター、請求項２９に記載のウイルス粒子、または請求項３０に記載の細胞のうちのいずれか１つをサンプルに対して投与すること、およびその効果を決定することを含む、方法。
【請求項３７】
前記サンプルが、対象に由来する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象における疾患または状態を治療する方法であって、
請求項１から２４に記載の組み換え発現系、請求項２５から２８に記載のベクター、請求項２９に記載のウイルス粒子、または請求項３０に記載の細胞のうちのいずれか１つを、対象または対象から単離されたサンプルに対して投与することを含む、方法。
【請求項３９】
標的ＲＮＡにおいて、ＧからＡへの変異の修正をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患が、ハーラー症候群、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷、聴覚消失（ノイズへの過剰暴露または聴器毒性による）、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルコール中毒症、アルコール離脱症候、過急速ベンゾジアゼピン離脱症候群、およびハンチントン病の群から選択される、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
（Ａ）
（ｉ）請求項１から２４のいずれか一項に記載の組み換え発現系、
（ｉｉ）請求項２５から２８のいずれか一項に記載のベクター、
（ｉｉｉ）請求項２９に記載のウイルス粒子、および／または
（ｉｖ）請求項３０に記載の細胞、
（ｖ）請求項３１に記載のｅｓｇＲＮＡ、
（ｖｉ）および、請求項３２に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ編集融合タンパク質
のうちの１つまたは複数と、
（Ｂ）使用説明書と
を含む、キット。
【請求項４２】
前記説明書が、請求項３３から４０に記載の方法のいずれか１つによる使用のためのものである、請求項４１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月１０日出願の米国仮特許出願第６２／５０４，４９７号明細書に対して、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき付与された優先権を主張し、その内容は、参考として本明細書にそのまま組み込まれている。
【０００２】
政府支援の記載
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成番号第ＨＧ００４６５９号および同第ＮＳ０７５４４９号に基づく政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
生細胞内のＲＮＡを標的とし、それを操作することを目的とする本戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または工学的に操作されたＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）の使用に主に立脚する。ＡＳＯ療法には、病原性転写物の除去またはＲＢＰ結合の調節において高い将来性が認められるものの、その構築は合成的であり、したがってＤＮＡ内にコードされることは不可能である。これは、患者の生存期間全体を通じてＡＳＯを定期的に投与することに立脚する有望な遺伝子療法戦略を複雑にしている。さらに、同療法はＲＮＡの遺伝子配列を調節することができない。ＲＢＰ、例えばタンパク質のＰｕｍｉｌｉｏやＦＢＦ相同性ファミリー（ＰＵＦ）等は、標的転写物を認識し、そしてＲＮＡ修飾エフェクターに融合して特異的認識および操作を可能にするように設計され得るものの、この種のコンストラクトに基づくプラットフォームは、標的毎に広範なタンパク質エンジニアリングを必要とし、また困難かつ高コストであることが証明され得る。
【０００４】
ＲＮＡを直接編集するのに使用される現在のシステムは、コーディングが不可能なコンポーネント、例えばガイドＲＮＡのエディターゼ部分（例えば、ＳＮＡＰタグ）への化学的融合等、またはコーディングが可能なアプタマー結合部分（例えば、ＢｏｘＢタンパク質）の融合による比較的低親和性の繋留に立脚する。
【０００５】
現在のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ標的システムは、シングルガイドＲＮＡ、任意選択的に２’ＯＭｅ  ＲＮＡおよびＤＮＡ塩基の繰り返しからなるオリゴヌクレオチド（ＰＡＭｍｅｒ）を一般的に使用して、生細胞内の特定のＲＮＡ分子を標的とするための簡便迅速にプログラム可能なシステムを提供する。しかし、このようなシステムを改善および／または変更すれば、効率、特異性、および／またはオフターゲット編集イベントに関係する諸問題に対処するのに役立つ可能性がある。本開示は、このような必要性に対処し、そして関連する長所を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の要旨
したがって、有効かつ可逆的な操作、ならびに簡便性、信頼性、および汎用性のある標的ＲＮＡの調節を実現するための、完全にコーディング可能できわめて特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、組成物、および方法が本明細書に提示される。
【０００７】
いくつかの態様では、標的ＲＮＡについて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによる狙いを定めたＲＮＡ編集（CRISPR/Cas-directed RNA editing）を行うための組み換え発現系であって、（Ａ）ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）の触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（nuclease-dead CRISPR associated endonuclease）（ｄＣａｓ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ編集融合タンパク質をコードする核酸配列と、（Ｂ）（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、および（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列を含む延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含む、それからなる、または実質的になる組み換え発現系が本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、前記発現系は、標的配列について、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ−ＲＮＡ塩基特異的アデノシンからイノシンへの（Ａ−Ｉ）編集を行う能力を有するｄＣａｓ−ＡＤＡＲ核タンパク質複合体を発現する。
【０００８】
組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡは、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡに対して相同性の領域を含むスペーサー配列をさらに含む。
【０００９】
組み換え発現系のいくつかの実施形態では、（Ａ）および（Ｂ）は、同一のベクター内に含まれる、または異なるベクター内に含まれる。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターである。
【００１０】
組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、およびＡＤＡＲ３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲの触媒的に活性なデアミナーゼドメインは、ＡＤＡＲ２の触媒的に活性なデアミナーゼドメインである。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ＡＤＡＲ２の触媒的に活性なデアミナーゼドメインは、（１）ヒトＡＤＡＲ２の野生型触媒的に活性なデアミナーゼドメイン、または（２）野生型ヒトＡＤＡＲ２と比較して触媒活性が高まっているヒトＡＤＡＲ２の触媒的に活性なデアミナーゼドメインの変異体（mutant human catalytically active deaminase domain of ADAR2）である。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ヒトＡＤＡＲ２の触媒的に活性なデアミナーゼドメインの変異体は、Ｅ４８８Ｑ変異を含む。
【００１１】
組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｄＣａｓは、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９のＮ末端ドメインは、ＡＤＡＲの触媒的に活性なデアミナーゼドメインのＣ末端に融合している。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｄＣａｓは、リンカーを介してＡＤＡＲの触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合している。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、リンカーは、半可動性の（semi-flexible）ＸＴＥＮペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳＧＳリンカーである。
【００１２】
組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列は、３’延長配列である。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列は、標的配列とほぼ完璧なＲＮＡ−ＲＮＡ塩基対形成する能力を有する相同性の領域を含む。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列は、標的ＲＮＡ内のアデノシンについて第２のミスマッチをさらに含む。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列は、標的ＲＮＡ内のアデノシンについて第３のミスマッチ、および任意選択的に標的ＲＮＡ内のアデノシンについて第４のミスマッチをさらに含む。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列は、長さ約１５ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドである。
【００１３】
組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡは、マーカー配列をさらに含む。
【００１４】
組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列をさらに含む。組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列は、Ｕ６プロモーター配列である。
【００１５】
組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡは、スペーサー配列とスキャフォールド配列の間にリンカー配列を含む。
【００１６】
組み換え発現系のいくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡ（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の配列は、ｅｓｇＲＮＡ内で３’から５’に向かって位置している。
【００１７】
組み換え発現系のいくつかの実施形態では、発現系は、ＰＡＭ配列をコードする核酸をさらに含む。
【００１８】
いくつかの態様では、延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸を含む、それからなる、または実質的になるベクターであって、（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列と、（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列と、（ｉｉｉ）標的配列に対して相補的な配列（スペーサー配列）とを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が、ｅｓｇＲＮＡ内で３’から５’に向かって位置しているベクターが、本明細書に提示される。
【００１９】
ベクターのいくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ベクターのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターである。ベクターのいくつかの実施形態では、ベクターは、発現コントロール要素（expression control element）をさらに含む。
【００２０】
いくつかの態様では、（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列と、（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列と、（ｉｉｉ）標的配列に対して相補的な配列（スペーサー配列）とを含む延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸を含む、それからなる、または実質的になるベクターを含むウイルス粒子であって、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が、ｅｓｇＲＮＡにおいて３’から５’に向かって位置しているウイルス粒子が本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、（Ａ）ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）の触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ編集融合タンパク質をコードする核酸配列と、（Ｂ）（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、および（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列を含む延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含む、１つまたは複数のベクターを含むウイルス粒子が本明細書に提示される。
【００２１】
いくつかの態様では、（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列と、（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列と、（ｉｉｉ）標的配列に対して相補的な配列（スペーサー配列）とを含む、延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸を含む、それからなる、または実質的になる組み換え発現系、ウイルス粒子、および／またはベクターを含む細胞であって、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が、ｅｓｇＲＮＡにおいて３’から５’に向かって位置している細胞が本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、（Ａ）ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）の触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ編集融合タンパク質をコードする核酸配列と、（Ｂ）（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、および（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列を含む延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含む、１つまたは複数のウイルス粒子、組み換え発現系、および／またはベクターを含む細胞が本明細書に提示される。
【００２２】
（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列、および（ｉｉｉ）標的配列に対して相補的な配列（スペーサー配列）を含む延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸を含む、それからなる、または実質的になる組み換え発現系、ウイルス粒子、および／またはベクターのうちの任意の１つを細胞に対して投与することを含む、それからなる、または実質的になる選択的ＲＮＡ編集を行う方法であって、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が、ｅｓｇＲＮＡにおいて３’から５’に向かって位置している方法についても本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、方法は、２’ＯＭｅ  ＲＮＡとＤＮＡ塩基の繰り返しを含むアンチセンス合成オリゴヌクレオチド化合物（ＰＡＭｍｅｒ）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎｖｉｖｏ法である。いくつかの実施形態では、（Ａ）ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）の触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ編集融合タンパク質をコードする核酸配列と、（Ｂ）（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、および（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列を含む、延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含む、それからなる、または実質的になる組み換え発現系、ウイルス粒子、および／またはベクターのうちの任意の１つを投与することを含む、それからなる、または実質的になる選択的ＲＮＡ編集を行う方法が、本明細書に提示される。
【００２３】
（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列、および（ｉｉｉ）標的配列に対して相補的な配列（スペーサー配列）を含む、延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸を含む、それからなる、または実質的になる組み換え発現系、ウイルス粒子、および／またはベクターのうちの任意の１つをサンプルに対して投与すること、およびその効果を決定することを含む、狙いを定めた細胞ＲＮＡ編集（directed cellular RNA editing）がプロセシングおよび動力学に及ぼす効果を特徴づける方法であって、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が、ｅｓｇＲＮＡにおいて３’から５’に向かって位置している前記方法についても、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、サンプルは対象に由来する。いくつかの実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法である。いくつかの実施形態では、（Ａ）ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）の触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ編集融合タンパク質をコードする核酸配列と、（Ｂ）（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、および（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列を含む延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含む、それからなる、または実質的になる組み換え発現系、ウイルス粒子、および／またはベクターのうちの任意の１つをサンプルに対して投与すること、およびその効果を決定することを含む、狙いを定めた細胞ＲＮＡ編集がプロセシングおよび動力学に及ぼす効果を特徴づける方法が、本明細書に提示される。
【００２４】
その他の態様では、（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列、および（ｉｉｉ）標的配列に対して相補的な配列（スペーサー配列）を含む延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸を含む、それからなる、または実質的になる組み換え発現系、ウイルス粒子、および／またはベクターのうちの任意の１つを、対象または対象から単離されたサンプルに対して投与することを含む、対象における疾患または状態を治療する方法であって、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が、ｅｓｇＲＮＡにおいて３’から５’に向かって位置している方法が本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、（Ａ）ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）の触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ編集融合タンパク質をコードする核酸配列と、（Ｂ）（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、および（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列を含む延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含む、それからなる、または実質的になる組み換え発現系、ウイルス粒子、および／またはベクターのうちの任意の１つを対象または対象から単離されたサンプルに対して投与することを含む、対象における疾患または状態を治療する方法が本明細書に提示される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、方法は、標的ＲＮＡにおけるＧからＡへの変異をさらに修正する。いくつかの実施形態では、疾患は、ハーラー症候群、嚢胞性線維症、デュシェンヌ筋ジストロフィー、脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷、聴覚消失（ノイズへの過剰暴露または聴器毒性による）、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルコール中毒症、アルコール離脱症候群、過急速ベンゾジアゼピン離脱症候群、およびハンチントン病の群から選択される。
【００２６】
その他の態様では、（Ａ）ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）の触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ編集融合タンパク質をコードする核酸配列と、（Ｂ）（ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、および（ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列を含む、延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含む、それからなる、または実質的になる組み換え発現系、ウイルス粒子、および／またはベクターのうちの１つまたは複数と、使用説明書とを含む、それからなる、またはそれからなるキットが本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、説明書は、本明細書に記載される方法のいずれか１つに基づき使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、組み換え発現系の実施形態およびそれに関係するデータについて非限定的に例証する図である。図１Ａは、（ｉ）様々な疾患、例えばがんや神経変性等を引き起こすおそれのある様々なＲＮＡの編集について、生細胞を対象としたＣＲＥＤＩＴのコンセプチュアルコンセプト、および（ｉｉ）ｄＣａｓ９−デアミナーゼ融合体がガイドＲＮＡに結合すると、標的アデノシン近傍のガイド延長部のハイブリダイゼーションを誘発して、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）Ａ−Ｉ塩基特異的編集標的を生成することを示す図である。特に、図１Ｂは、ＸＴＥＮリンカーによりヒトＡＤＡＲＢ１（ＡＤＡＲ２）のデアミナーゼドメイン（ＤＤ）に融合した、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９タンパク質から構成されるＣＲＥＤＩＴ組み換え発現系、および３’短鎖ＲＮＡ延長部（ｅｓｇＲＮＡ）を有するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を示す図である。図１Ｃの蛍光画像データは、図１Ｂの組み換え発現系は、脱アミノを誘発する３’延長部を有する標的デュアルガイドＲＮＡを必要とし、またｅＧＦＰレポーター転写物からの発現において、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）により媒介される発現停止を回復させることができることを示す図である。図１Ｄは、標的ガイドおよび非標的ガイドにより誘発された、ＲＣａｓ９との野生型デアミナーゼ融合体、ハイパー活性デアミナーゼ融合体を利用する組み換え発現系のＦＡＣＳ定量化を示す図である。
【図２】図２は、ＡＡＶに基づくベクター系として、代表的な組み換え発現系について非限定的に例証する図である。ＡＡＶ系は、ＡＡＶビリオンとしてパッケージングされるＡＤＡＲデアミナーゼドメイン／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸配列と延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）とを担持するベクターを含む。
【図３】図３は、ｐｃＤＮＡ３．１（１）＿ＡＤＡＲ２＿ＸＴＥＮ＿ｄＣａｓ９（配列番号２７）のマップについて例証する図である。ＣＭＶエンハンサーは、位置２３５〜６１４（長さ３８０ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞において組み換えタンパク質の構成的発現を駆動する。ＣＭＶプロモーターは、位置６１５〜８１８（長さ２０４ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞における組み換えタンパク質の構成的発現を駆動する。ＡＤＡＲＢ１触媒ドメインは、９６１〜２１００（長さ１１４０ｂｐ）に位置し、ヒトＡＤＡＲ２（ＡＤＡＲＢ１）の触媒的に活性な脱アミノ化ドメインをコードする。ＸＴＥＴは、位置２１０１〜２１４８（長さ４８ｂｐ）に位置し、組み換えタンパク質ドメインを結びつけるペプチドリンカーをコードする。ｄＣａｓ９は、位置２１４９〜６２５２（長さ４１０４ｂｐ）に位置し、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来の、触媒的に不活性化な（Ｄ１０ＡおよびＨ８４１Ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質をコードする。ＨＡは、位置６２５６〜６２８２（長さ２７ｂｐ）に位置し、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグをコードする。２Ｘ  ＳＶ４０  ＮＬＳは、位置６３０１〜６３４８（長さ４８ｂｐ）に位置し、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）大型Ｔ抗原に由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする。ｂＧＨポリ（Ａ）シグナルは、位置６４２６〜６６５０（長さ２２５ｂｐ）に位置し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードする。
【図４】図４は、ｐｃＤＮＡ３．１（１）＿ＡＤＡＲ２＿ＸＴＥＮ＿コントロール（配列番号２８）のマップについて例証する図である。ＣＭＶエンハンサーは、位置２３５〜６１４（長さ３８０ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞における組み換えタンパク質の構成的発現を駆動する。ＣＭＶプロモーターは、位置６１５〜８１８（長さ２０４ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞における組み換えタンパク質の構成的発現を駆動する。ＡＤＡＲＢ１触媒ドメインは、位置９６１〜２１００（長さ１１４０ｂｐ）に位置し、ヒトＡＤＡＲ２の触媒的に活性な脱アミノ化ドメイン（ＡＤＡＲＢ１）をコードする。ＸＴＥＮは、位置２１０１〜２１４８（４８ｂｐ）に位置し、組み換えタンパク質ドメインを結びつけるペプチドリンカーをコードする。ＨＡは、位置２１５２〜２１７８（２７ｂｐ）に位置し、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグをコードする。２Ｘ  ＳＶ４０  ＮＬＳは、位置２１９７〜２２４４（４８ｂｐ）に位置する、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）大型Ｔ抗原に由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）である。ｂＧＨポリ（Ａ）シグナルは、位置２３２２〜２５４６（２２５ｂｐ）に位置し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードする。
【図５】図５は、ｐｃＤＮＡ３．１＿ＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ）＿ＸＴＥＮ＿ｄＣａｓ９（配列番号２９）のマップについて例証する図である。ＣＭＶエンハンサーは、位置２３５〜６１４（３８０ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞において組み換えタンパク質の構成的発現を駆動する。ＣＭＶプロモーターは、位置６１５〜８１８（２０４ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞において組み換えタンパク質の構成的発現を駆動する。ＡＤＡＲＢ１（Ｅ４８８Ｑ）触媒ドメインは、位置９６１〜２１００（１１４０ｂｐ）に位置し、活性過多の点変異（Ｅ４８８Ｑ）を含む、ヒトＡＤＡＲ２の触媒的に活性な脱アミノ化ドメイン（ＡＤＡＲＢ１）をコードする。ＸＴＥＮは、位置２１０１〜２１４８（４８ｂｐ）に位置し、組み換えタンパク質ドメインを結びつけるペプチドリンカーをコードする。ｄＣａｓ９は、位置２１４９〜６２５２（４１０４ｂｐ）に位置し、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来の触媒的に不活性な（Ｄ１０ＡおよびＨ８４１Ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質をコードする。ＨＡは、位置６２５６〜６２８２（２７ｂｐ）に位置し、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグをコードする。２Ｘ  ＳＶ４０  ＮＬＳは、位置６３０１〜６３４８（４８ｂｐ）に位置し、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）大型Ｔ抗原ｂＧＨに由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする。ポリ（Ａ）シグナルは、位置６４２６〜６６５０（２２５ｂｐ）に位置し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードする。
【図６】図６は、ｐｃＤＮＡ３．１＿ＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ）＿ＸＴＥＮ＿コントロール（配列番号３０）のマップについて例証する図である。ＣＭＶエンハンサーは、位置２３５〜６１４（３８０ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞において組み換えタンパク質の構成的発現を駆動する。ＣＭＶプロモーターは、位置６１５〜８１８（２０４ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞において組み換えタンパク質の構成的発現を駆動する。ＡＤＡＲＢ１（Ｅ４８８Ｑ）触媒ドメインは、位置９６１〜２１００（１１４０ｂｐ）に位置し、活性過多の点変異（Ｅ４８８Ｑ）を含む、ヒトＡＤＡＲ２の触媒的に活性な脱アミノ化ドメイン（ＡＤＡＲＢ１）をコードする。ＸＴＥＮは、位置２１０１〜２１４８（４８ｂｐ）に位置し、組み換えタンパク質ドメインを結びつけるペプチドリンカーをコードする。ＨＡは、位置２１５２〜２１７８（２７ｂｐ）に位置し、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグをコードする。２Ｘ  ＳＶ４０  ＮＬＳは、位置２１９７〜２２４４（４８ｂｐ）に位置し、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）大型Ｔ抗原に由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする。ｂＧＨポリ（Ａ）シグナルは、位置２３２２〜２５４６（２２５ｂｐ）に位置し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードする。
【図７】図７は、５０ｂｐ＿ＧＦＰ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿延長部（配列番号３１）のマップについて例証する図である。Ｕ６プロモーターは、位置４５５５〜４８１７（２６３ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞においてｓｇＲＮＡの発現を駆動するＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。ＥＧＦＰ標的スペーサーは、位置４８１８〜４８３８（２１ｂｐ）に位置し、相補的なＥＧＦＰレポーターｍＲＮＡを標的とするｓｇＲＮＡのスペーサー配列をコードする。ｓｇＲＮＡスキャフォールドは、位置４８３９〜４９２４（８６ｂｐ）に位置し、（Ｆ＋Ｅ）修飾を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム用のｓｇＲＮＡスキャフォールドをコードする（Chen et al. 2014）。リンカーは、位置４９２５〜４９３０（６ｂｐ）に位置し、ｓｇＲＮＡスキャフォールドを延長配列に架橋するリンカー配列をコードする。またＥＧＦＰ延長部は、位置４９３１〜４９５１（２１ｂｐ）に位置し、標的部位と塩基対形成するＲＮＡ延長配列をコードし、そしてＡ−Ｃミスマッチを使用してＡからＩへの編集を促進する。ｓｇＲＮＡスキャフォールド終止部位は、位置１〜７（７ｂｐ）に位置し、Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＲＮＡ合成を終了させるポリ（Ｔ）配列を含む。Ｅｆ１ａプロモーターは、位置２１〜５６６（５４６ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞においてタンパク質の発現を駆動する構成型プロモーターである。ｍＣｈｅｒｒｙは、位置５７２〜１２８２（７１１ｂｐ）に位置し、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質の単量体誘導体をコードする。ｂＧＨポリ（Ａ）シグナルは、位置１３３０〜１５５４（２２５ｂｐ）に位置し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードする。
【図８】図８は、スペーサーレス＿ＧＦＰ  ｍＣｈｅｒｒｙ＿延長部（配列番号３２）のマップについて例証する図である。Ｕ６プロモーターは、位置７５７〜１０１９（２６３ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞においてｓｇＲＮＡの発現を駆動するＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。ｓｇＲＮＡスキャフォールドは、位置１０２０〜１１０５（８６ｂｐ）に位置し、（Ｆ＋Ｅ）修飾を含むストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム用のｓｇＲＮＡスキャフォールドをコードする（Chen et al. 2014）。リンカーは、位置１１０６〜１１１１（６ｂｐ）に位置し、ｓｇＲＮＡスキャフォールドを延長配列に架橋するリンカー配列を含む。ＥＧＦＰ延長部は、位置１１１２〜１１３２（２１ｂｐ）に位置し、標的部位と塩基対形成するＲＮＡ延長配列をコードし、そしてＡ−Ｃミスマッチを使用してＡからＩへの編集を促進する。ｓｇＲＮＡスキャフォールド終止部は、位置１１３３〜１１３９（７ｂｐ）に位置し、Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＲＮＡ合成を終了させるポリ（Ｔ）配列を含む。Ｅｆ１ａプロモーターは、位置１１５３〜１６９８（５４６ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞においてタンパク質の発現を駆動する構成型プロモーターである。ｍＣｈｅｒｒｙは、位置１７０４〜２４１４（７１１ｂｐ）に位置し、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質の単量体誘導体をコードする。ｂＧＨポリ（Ａ）シグナルは、位置２４６２〜２６８６（２２５ｂｐ）に位置し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードする。
【図９】図９は、ＧＦＰ＿ｎｏ＿ｓｐａｃｅｒ＿ｒｅｖｃｏｍｐ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ギブソン（配列番号３３）のマップについて例証する図である。Ｕ６プロモーターは、位置４５５５〜４８１７（２６３ｂｐ）に位置し、また哺乳動物細胞においてｓｇＲＮＡの発現を駆動するＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。ｓｇＲＮＡスキャフォールドは、位置４８１８〜４９０３（８６ｂｐ）に位置し、（Ｆ＋Ｅ）修飾を含むストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム用のｓｇＲＮＡスキャフォールドをコードする（Chen et al. 2014）。リンカーは、位置４９０４〜４９０９（６ｂｐ）に位置し、ｓｇＲＮＡスキャフォールドを延長配列に架橋するリンカー配列をコードする。ＥＧＦＰ  ｒｅｖｃｏｍｐ延長部は、位置４９１０〜４９３０（２１ｂｐ）に位置し、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ標的部位の配列とマッチングするＲＮＡ逆相補性延長配列をコードする。ｓｇＲＮＡスキャフォールド終止部位は、位置１〜７（７ｂｐ）に位置し、Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＲＮＡ合成を終了させるポリ（Ｔ）配列を含む。Ｅｆ１ａプロモーターは、位置２１〜５６６（５４６ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞においてタンパク質の発現を駆動する構成型プロモーターである。ｍＣｈｅｒｒｙは、位置５７２〜１２８２（７１１ｂｐ）に位置し、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質の単量体誘導体をコードする。ｂＧＨポリ（Ａ）シグナルは、位置１３３０〜１５５４（２２５ｂｐ）に位置し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードする。
【図１０】図１０は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋Ｕ６−ラムダ２−ｓｇＲＮＡ（Ｆ＋Ｅ）（配列番号３４）のマップについて例証する図である。Ｕ６プロモーターは、位置７５７〜１０１９（２６３ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞においてｓｇＲＮＡの発現を駆動するＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。ラムダ２ガイドＲＮＡは、位置１０２０〜１０３９（２０ｂｐ）に位置し、ラムダファージ２を標的とする非標的ｓｇＲＮＡ配列をコードする。ｓｇＲＮＡスキャフォールドは、位置１０４１〜１１３２（９２ｂｐ）に位置し、（Ｆ＋Ｅ）修飾を含むストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム用のｓｇＲＮＡスキャフォールドをコードする（Chen et al. 2014）。
【図１１】図１１は、ＥＧＦＰ＿スペーサーレス＿ＳａＣａｓ９＿ｓｇＲＮＡ（配列番号４７）のマップについて例証する図である。Ｕ６プロモーターは、位置４５５５〜４８１７（２６３ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞においてｓｇＲＮＡの発現を駆動するＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。Ｓａ  ｓｇＲＮＡスキャフォールドは、位置４８１９〜４８９４（７６ｂｐ）に位置し、Ａ−Ｕ塩基フリップを含む黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム用のｓｇＲＮＡスキャフォールドをコードする（Chen et al. 2016）。リンカーは、位置４８９５〜４９００（６ｂｐ）に位置し、ｓｇＲＮＡスキャフォールドを延長配列に架橋するリンカー配列をコードする。ＥＧＦＰ延長部は、位置４９０１〜４９２１（２１ｂｐ）に位置し、標的部位と塩基対形成するＲＮＡ延長配列をコードし、Ａ−Ｃミスマッチを使用してＡからＩへの編集を促進する。ｓｇＲＮＡスキャフォールド終止部位は、位置１〜７（７ｂｐ）に位置し、ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＲＮＡ合成を終了させるポリ（Ｔ）配列を含む。Ｅｆ１ａプロモーターは、位置２１〜５６６（５４６ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞においてタンパク質の発現を駆動する構成型プロモーターである。ｍＣｈｅｒｒｙは、位置５７２〜１２８２（７１１ｂｐ）に位置し、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質の単量体誘導体をコードする。ｂＧＨポリ（Ａ）シグナルは、位置１３３０〜１５５４（２２５ｂｐ）に位置し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードする。
【図１２】図１２は、ＡＤＡＲ２＿Ｅ４８８Ｑ＿ｄＳａＣａｓ９＿ｐＣＤＮＡ３＿１（配列番号４８）のマップについて例証する図である。ＣＭＶエンハンサーは、位置２３５〜６１４（３８０ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞において組み換えタンパク質の構成的発現を駆動する。ＣＭＶプロモーターは、位置６１５〜８１８（２０４ｂｐ）に位置し、哺乳動物細胞において組み換えタンパク質の構成的発現を駆動する。ＡＤＡＲＢ１触媒ドメインは、位置９６１〜２１００（１１４０ｂｐ）に位置し、ヒトＡＤＡＲ２の触媒的に活性な脱アミノ化ドメイン（ＡＤＡＲＢ１）をコードする。ＧＳリンカーは、位置２１０１〜２１１２（１２ｂｐ）に位置し、タンパク質ドメインを架橋するためのグリシン−セリンペプチドリンカーをコードする。ｄＳａＣａｓ９は、位置２１１３〜５２６８（３１５６ｂｐ）に位置し、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の触媒的に不活性化な（点変異Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａを含む）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質をコードする。ＨＡは、位置５２７２〜５２９８（２７ｂｐ）に位置し、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグをコードする。２Ｘ  ＳＶ４０  ＮＬＳは、位置５３１７〜５３６４（４８ｂｐ）に位置し、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）大型Ｔ抗原に由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）である。ｂＧＨポリ（Ａ）シグナルは、位置５４４２〜５６６６（２２５ｂｐ）に位置し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルをコードする。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｂは、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）に由来するヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９を含む組み換え発現系（ｄＳｐＣａｓ９）と黄色ブドウ球菌（S. aureus）に由来するヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）の間の比較について例証する図である。ｄＳａＣａｓ９は、ｄＳｐＣａｓ９より有意に小さく、ウイルスにパッケージングする際に効率性を提供する。図１３Ａは、ＸＴＥＮリンカーを含むＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ）−ｄＳｐＣａｓ９融合コンストラクト（Ｓｐ−ＣＲＥＤＩＴｖ１）の例証図、およびＧＳＧＳリンカーを含むＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ）−ｄＳａＣａｓ９融合コンストラクト（Ｓａ−ＣＲＥＤＩＴｖ１）の例証図を示す。図１Ｂは、Ｓｐ−ＣＲＥＤＩＴｖ１の有効性をＳａ−ＣＲＥＤＩＴｖ１の有効性と比較する実験の結果を示す。このデータは、両ＣＲＥＤＩＴシステムによるＧＦＰレポーターの編集の成功例を示し、Ｓａ−ＣＲＥＤＩＴｖ１の方が編集細胞について最高頻度を示す。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｂは、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）に由来するヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９を含む組み換え発現系（ｄＳｐＣａｓ９）と黄色ブドウ球菌（S. aureus）に由来するヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）の間の比較について例証する図である。ｄＳａＣａｓ９は、ｄＳｐＣａｓ９より有意に小さく、ウイルスにパッケージングする際に効率性を提供する。図１３Ａは、ＸＴＥＮリンカーを含むＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ）−ｄＳｐＣａｓ９融合コンストラクト（Ｓｐ−ＣＲＥＤＩＴｖ１）の例証図、およびＧＳＧＳリンカーを含むＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ）−ｄＳａＣａｓ９融合コンストラクト（Ｓａ−ＣＲＥＤＩＴｖ１）の例証図を示す。図１Ｂは、Ｓｐ−ＣＲＥＤＩＴｖ１の有効性をＳａ−ＣＲＥＤＩＴｖ１の有効性と比較する実験の結果を示す。このデータは、両ＣＲＥＤＩＴシステムによるＧＦＰレポーターの編集の成功例を示し、Ｓａ−ＣＲＥＤＩＴｖ１の方が編集細胞について最高頻度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本開示に基づく実施形態は、以下でより十分に記載される。ただし、本開示の態様は、異なる形態で具体化され得るものであり、本明細書に記載する実施形態に限定されるものと解釈すべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が網羅的かつ完全であるように、また当業者に本発明の範囲を十分に伝達するように提供される。本明細書における説明で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的に限定され、制限するように意図されない。
【００２９】
別途定義されなければ、本明細書で使用されるすべての用語（技術的用語および科学的用語を含む）は、本発明が属する当業者により理解される意味と同一の意味を一般的に有する。用語、例えば一般的に使用される辞書で定義される用語等は、本出願および関連する技術の文脈における意味と整合する意味を有するものと解釈すべきであり、また本明細書においてそのように明示的に定義されない限り、理想的または過度に形式的な意味合いで解釈すべきでないものとさらに理解される。下記で明示的に定義されないものの、そのような用語はその一般的な意味に基づき解釈されるべきである。
【００３０】
本明細書における説明で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的に限定され、本発明を制限するように意図されない。本明細書に記載されるすべての公開資料、特許出願、特許、およびその他の参考資料は、参考としてそのまま組み込まれている。
【００３１】
本技術の実践では、別途明示されない限り、当技術分野の技能に含まれる、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組み換えＤＮＡの従来技術が採用される。
【００３２】
文脈が別途示唆しない限り、本明細書に記載する本発明の様々な特性は、任意の組み合わせで使用可能であることが特に意図されている。さらに、本開示は、いくつかの実施形態において、本明細書に記載する任意の特性または特性の組み合わせは、除外または省略可能であることについても検討する。例証するならば、複合物がコンポーネントＡ、Ｂ、およびＣを含むことを本明細書が記載する場合、Ａ、Ｂ、もしくはＣのいずれかまたはその組み合わせは、ことさらにまたは任意の組み合わせで省略および否定され得ることが特に意図されている。
【００３３】
別途明示されない限り、すべての特定された実施形態、特性、および用語には、列挙された実施形態、特性、または用語と、その生物学的等価物の両方が含まれるように意図されている。
【００３４】
すべての数字表示、例えばｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、その範囲を含め、該当する場合には１．０または０．１の増加分だけ、あるいは±１５％、あるいは１０％、あるいは５％、あるいは２％の変動分だけ増減する近似値である。必ずしも明示されないが、すべての数字表示には、用語「約」が先行するものと理解される。必ずしも明示されないが、本明細書に記載される試薬は単なる例示であるものと、そしてそのような試薬の等価物が当技術分野において公知であるものとやはり理解される。
【００３５】
定義
本発明の説明、および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示しない限り、複数形もやはり含むように意図されている。
【００３６】
用語「約」は、本明細書で使用する場合、測定可能な数値、例えば量または濃度等を参照するとき、所定量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％の変動、または０．１％の変動さえも含むように意図されている。
【００３７】
用語「許容される」、または「有効な」、または「十分な」は、本明細書で開示される任意のコンポーネント、範囲、用量形態等の選択を記載するのに使用されるとき、前記コンポーネント、範囲、用量形態等が開示される目的に適することが意図されている。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、本明細書において交換可能に使用される場合、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列は二本鎖または一本鎖であり得る。ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列が一本鎖であるとき、２つの相補鎖のいずれかを指し得る。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはその類似物、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに組み込み可能である任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチドおよびその類似物等を含み得る。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチドコンポーネントにより中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えばラベリングコンポーネントとのコンジュゲーション等によりさらに改変され得る。その他の種類の改変として、例えば、「ｃａｐｓ」、天然に存在するヌクレオチドにおける、そのうちの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば無電荷結合（メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホアミデート、カバメート等）を含むもの、および有電荷結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を含むもの、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）のペンダント部分を含有するもの、インターカレーター（アクリジン、ソラレン等）を含むもの、キレート剤（金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、改変された結合（αアノメリック核酸等）を含むもの等、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の非修飾形態が挙げられる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えば、ホスホナート基、ホスフェート基により置換され、標準的な保護基により保護され、もしくは追加のヌクレオチドとの追加の結合に備えるために活性化され得る、または固体支持体にコンジュゲートし得る。５’末端および３’末端ＯＨは、リン酸化され得る、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子からなる有機キャッピング基部分と置換され得る。その他のヒドロキシルも、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボース糖について、例えば、２’−Ｏ−メチル−２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式の糖類似物、α−アノマー糖、エピマー糖（例えばアラビノース、キシロース、またはリキソース等）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式の類似物、および無塩基ヌクレオシド類似物（例えばメチルリボシド等）を含む、当技術分野において一般的に公知の類似の形態も含有し得る。１つまたは複数のホスホジエステル結合が、代替的結合基に置換し得る。この代替的結合基として、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、「（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’��ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタル」）により置換されている実施形態であって、ただし各ＲまたはＲ’が、独立にＨ、または任意選択的にエーテル（−Ｏ−）結合を含有する置換されたもしくは置換されていないアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルである実施形態が挙げられるが、ただしこれに限定されない。ポリヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。これまでの説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含め、本明細書で参照されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
【００３９】
「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用する場合、長さ約２００ヌクレオチド未満が一般的であるが、ただし必ずしもそうではない、一般的に一本鎖、一般的に合成の短鎖ポリヌクレオチドを一般的に指す。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記説明は、オリゴヌクレオチドに同じように全面的に適用される。
【００４０】
「核酸」、「核酸分子」、または「核酸配列」は、本明細書ではポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドを指すのに交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドと交換可能に使用される。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「実質的に相補的、または実質的に一致した」とは、２つの核酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、２つの核酸配列は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。あるいは、「実質的に相補的、または実質的に一致した」とは、２つの核酸配列が、高度に厳密な条件（複数可）の下でハイブリダイズすることができることを意味する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「〜を改善する」とは、少なくとも約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、３５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％もしくはそれ超の、または列挙されている数値の任意の間の任意の数値の変化を意味する。あるいは、「〜を改善する」とは、少なくとも約１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍もしくはそれ超の、または列挙されている数値の任意の間の任意の数値の変化を意味し得る。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「ヌクレアーゼヌル型」または「ヌクレアーゼ不活性型」とは、ヌクレアーゼ活性が低下している、エンドもしくはエキソ−ＤＮＡｓｅ活性もしくはＲＮＡｓｅ活性が低下している、ニッカーゼ活性が低下している、またはＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡを開裂させる能力が低下しているポリペプチドを意味し得る。ヌクレアーゼ不活性型であるＣａｓ関連エンドヌクレアーゼの非限定的な例はとして、ＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨヌクレアーゼドメインを不活性にする変異を有するエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを開裂させることができないヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９分子を引き起こす点変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａにより不活性となり得る。ｄＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡ標的配列に基づき標的ＲＮＡに結合する能力を保持する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「ヌクレアーゼ活性の低下」とは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ＤＮＡｓｅ、またはＲＮＡｓｅ活性における、少なくとも約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、３５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％もしくはそれ超の、または列挙されている数値の任意の間の任意の数値の減衰を意味する。あるいは、「ヌクレアーゼ活性の低下」とは、少なくとも約１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍もしくはそれ超の、または列挙されている数値の任意の間の任意の数値の逆数倍の減衰を意味し得る。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「触媒活性の上昇」とは、触媒活性、例えばデアミナーゼ活性において、対応する野生型触媒活性（例えば、野生型デアミナーゼ活性）と比較したときに、少なくとも約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、３５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％もしくはそれ超の、または列挙されている数値の任意の間の任意の数値の増加を意味する。あるいは、「触媒活性の上昇」とは、対応する野生型触媒活性（例えば、野生型デアミナーゼ活性）と比較して、少なくとも約１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍もしくはそれ超の、または列挙されている数値の任意の間の任意の数値の増加を意味し得る。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「ＡＤＡＲ」とは、ＡからＩへの編集と呼ばれる、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）においてアデノシンからイノシンへの加水分解式の脱アミノ化を触媒する、二本鎖ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼを指し、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼとしても知られている。このタンパク質の非限定的な代表的配列およびそのドメインの注解は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ５５２６５（ヒト）およびＱ９９ＭＵ３（マウス）に見出される。
【００４７】
用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」とは、本明細書で使用する場合、この名称と関連するウイルスのクラスのメンバーを指し、そしてパルボウイルス科（parvoviridae）ディペンドパルボウイルス属（dependoparvovirus）に属する。このウイルスの複数の血清型が遺伝子送達に適することが公知であり、すべての公知の血清型が、様々な組織型に由来する細胞に感染することができる。連続して番号付けされた少なくとも１１個が先行技術に開示されている。本明細書に開示される方法において有用で非限定的な代表的血清型として、１１個の血清型のうちのいずれか、例えばＡＡＶ２およびＡＡＶ８が挙げられる。
【００４８】
やはり本明細書で使用する場合、「および／または」とは、関連する列挙された項目のうちの１つまたは複数のあらゆるすべての可能な組み合わせ、ならびにもう一方の（「または」）で解釈されるときには、組み合わせの欠如を意味し、それを含む。
【００４９】
用語「アプタマー」とは、本明細書で使用する場合、１つまたは複数の選択された標的と高い親和性および特異性を有して結合することができる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。非限定的な代表的標的として、タンパク質またはペプチドが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００５０】
用語「Ｃａｓ関連」とは、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）関連エンドヌクレアーゼを指す。「Ｃａｓ９」は、この名称（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｇ３ＥＣＲ１（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＴＲ））により名付けられたＣａｓ関連エンドヌクレアーゼである。不活性型Ｃａｓ９または「ｄＣａｓ９」は、エンドヌクレアーゼおよび／または切断活性を欠くまたは実質的に欠くＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。ｄＣａｓ９の非限定的な例は、ＡｄｄＧｅｎｅデータベースを通じて市販されているＡｄｄＧｅｎｅプラスミド＃７４７１０内でコードされるｄＣａｓ９である。
【００５１】
用語「細胞」とは、本明細書で使用する場合、任意選択的に対象または市販供給元から得られる原核細胞または真核細胞を意味し得る。
【００５２】
用語「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」とは、本明細書で使用する場合、ＣＲＩＳＰＲ技術を利用する修正において、特定の遺伝子を標的とするのに使用されるガイドＲＮＡ配列を指す。標的特異性を目的としてｇＲＮＡおよびドナー治療用ポリヌクレオチドを設計する技術は当技術分野において周知されている。例えば、本明細書において参考として組み込まれているDoench, J., et al. Nature biotechnology 2014;32(12): 1262-7、およびGraham, D., et al. Genome Biol. 2015; 16: 260。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ」とは、ＲＮＡ干渉とは異なり、転写レベルにおいて遺伝子発現を制御する、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列経路に立脚する配列特異的遺伝子操作技術を指す。用語「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」とは、本明細書で使用する場合、ＣＲＩＳＰＲ技術を利用する修正において、特定の遺伝子を標的とするのに使用されるガイドＲＮＡ配列を指す。標的特異性を目的としてｇＲＮＡおよびドナー治療用ポリヌクレオチドを設計する技術は当技術分野において周知されている。例えば、Doench, J., et al. Nature biotechnology 2014;32(12): 1262-7、およびGraham, D., et al. Genome Biol. 2015; 16: 260。「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」は、Ｃａｓ９と結合して複合体を活性化させ、必要なストランド切断を生み出すｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＲＮＡ）と、ｔｒａｃｒＲＮＡに対して相補的なヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）とを単一のＲＮＡコンストラクトに複合体化させる特別な種類のｇＲＮＡである。本明細書に記載されるように、「延長されたシングルガイドＲＮＡ」または「ｅｓｇＲＮＡ」は、Ａ−Ｃミスマッチが標的転写物との間に形成され、膨らんだアデノシン残基において編集される「偽ｄｓＲＮＡ」基質を生成するように、編集対象となる標的ＲＮＡの標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の延長配列を含む特別な種類のｓｇＲＮＡである。
【００５４】
本明細書で使用する場合、用語「〜を含むこと（comprising）」は、組成物および方法には列挙した要素が含まれるが、しかしその他を除外しないことを意味するように意図されている。本明細書で使用する場合、移行句「〜から実質的になる」（および文法的変形形態）では、列挙した実施形態の列挙した物質またはステップ、および「基本的で新規の特徴（複数可）に顕著に影響を及ぼさない物質またはステップ」を包含するものと解釈される。In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976)（原本にて強調されている）を参照；MPEP § 2111.03も参照。したがって、用語「〜から実質的になる（essentially consisting of）」は、本明細書で使用する場合、「〜を含むこと（comprising）」と同等と解釈してはならない。「〜からなる（consisting of）」は、その他の配合物の微量要素および本明細書で開示される組成物を投与するための実質的な方法ステップを超える部分の排除を意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれにより定義される側面は、本開示の範囲内にある。
【００５５】
用語「〜をコードする」とは、核酸配列に適用されるとき、ポリヌクレオチドであって、その天然の状態において、または当業者にとって周知の方法により操作されたときに、転写および／または翻訳されて、ポリペプチドおよび／またはその断片に対応するｍＲＮＡを生成することができるならば、ポリペプチド「をコードする」と言えるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、コーディング配列がそれから推測され得る。
【００５６】
用語「同等」または「生物学的同等」は、特定の分子、生体物質または細胞物質を指す場合、交換可能に使用され、そして最低限の相同性を有する一方、望ましい構造または機能をなおも維持するものを意図する。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合には、発現は、真核細胞内におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織サンプル内でｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することにより決定され得る；さらに、特定のサンプルについて発現プロファイルを立証するために、複数の遺伝子の発現レベルが決定されることもあり得る。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「サンプル」とは、標的を含む組成物を指し得る。開示される方法、デバイス、およびシステムにより分析するための好適なサンプルとして、細胞、組織、臓器、もしくは生物、または細胞、組織、もしくは生物から得られる組成物が挙げられる。いくつかの実施形態では、サンプルは対象から単離される。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「機能的」は、特別な所定の効果を実現することを意図して、任意の分子、生体物質または細胞物質を修飾するのに使用され得る。
【００６０】
「遺伝子送達媒体」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞に運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達媒体の例は、リポソーム、ミセル、生体適合性ポリマー（天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む）；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工的なウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌またはウイルス（例えばバキュロウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルス等）、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ならびに様々な真核生物宿主および原核生物宿主内での発現についてすでに記載されており、また遺伝子療法の他、単純なタンパク質発現に使用され得る、当技術分野で一般的に使用されるその他の組み換え媒体である。
【００６１】
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達媒体を使用して細胞または組織に送達され得る。「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、「形質導入」等は、本明細書で使用する場合、導入で使用される方法の如何を問わず、外因性のポリヌクレオチド（「導入遺伝子」と時に呼ばれる）の宿主細胞への導入を指す用語である。そのような方法には、様々な周知技術、例えばベクター媒介式の遺伝子移入（例えば、ウイルスの感染／トランスフェクション、または様々なその他のタンパク質に基づくまたは脂質に基づく遺伝子送達複合体による）、ならびに「ネイキッド」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術等（例えばエレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入で使用される様々なその他の技術等）が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に安定的または一時的に維持され得る。安定に維持するには、導入されるポリヌクレオチドが宿主細胞に適合する複製開始点を含有すること、またはその複製開始点が宿主細胞のレプリコン、例えば染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）、または核染色体もしくはミトコンドリア染色体等に組み込まれていることが一般的に必要である。当技術分野において公知であり、また本明細書に記載されるように、いくつかの「ベクター」が、遺伝子の哺乳動物細胞への移送を媒介する能力を有することが公知である。
【００６２】
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立的に複製する能力を有する、染色体ＤＮＡから分離した染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、プラスミドは、環状および二本鎖である。プラスミドは、病原菌集団内で遺伝子水平伝播するための機構を提供し、また所与の環境状態において選択的長所を一般的に提供する。プラスミドは、競合的な環境的ニッチにおいて天然に存在する抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を担持し得る、あるいは生成したタンパク質が類似した状況下で毒素として作用し得る。
【００６３】
遺伝子工学で使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。多くのプラスミドが、そのような用途のために市販されている。複製される遺伝子はプラスミドのコピーに挿入されるが、同プラスミドは、特定の抗生物質に対して細胞を耐性にする遺伝子、およびいくつかの一般的に使用される制限部位を含有する短鎖領域であり、この場所においてＤＮＡ断片の容易な挿入を可能にする複数のクローニング部位（ＭＣＳまたはポリリンカー）を含有する。プラスミドの別の主要な用途は、大量のタンパク質を作成することである。この場合、研究者は、対象とする遺伝子を内包するプラスミドを含有する細菌を増殖させる。バクテリアがその抗生物質耐性を付与するタンパク質を産生するのと全く同様に、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように、やはり誘発可能である。
【００６４】
「酵母菌人工的染色体」または「ＹＡＣ」とは、大型のＤＮＡ断片（１００ｋｂよりも大きく、最大３０００ｋｂ）をクローニングするために使用されるベクターを指す。それは、人工的に構築された染色体であり、酵母菌細胞における複製および保存に必要とされるテロメア配列、セントロメア配列、および複製起点配列を含有する。最初に環状プラスミドを使用して構築されるが、制限酵素を使用することにより直鎖状となり、次にＤＮＡリガーゼが、付着末端を使用することにより直鎖状分子内に対象とする配列または遺伝子を付加することができる。酵母菌はそれ自体が真核細胞であり、翻訳後修飾を有する真核生物タンパク質生成物を得ることができるので、酵母菌発現ベクター、例えばＹＡＣ、ＹＩｐ（プラスミドを組み込んだ酵母菌）やＹＥｐ（酵母菌エピソーマルプラスミド）等は極めて有用であるが、ただしＹＡＣは、ＢＡＣよりも不安定であり、キメラ効果を生成することが判明している。
【００６５】
「ウイルスベクター」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで宿主細胞内に送達されるポリヌクレオチドを含む、組み換えにより生成されるウイルスまたはウイルス粒子として定義される。
【００６６】
ウイルスベクターの例として、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が挙げられる。感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に基づくベクターは、タンパク質を製造するのに使用可能であり、そしてタバコ葉内でグリフィスシンを発現することが報告されている（O'Keefe et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104）。アルファウイルスベクター、例えばセムリキ森林ウイルス（Semliki Forest virus）に基づくベクターおよびシンドビスウイルス（Sindbis virus）に基づくベクター等も、遺伝子療法および免疫療法で使用されるために開発された。Schlesinger & Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439、およびYing et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827を参照。遺伝子移入がレトロウイルスベクターにより媒介される態様では、ベクターコンストラクトとは、レトロウイルスゲノムまたはその一部、および治療遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子移入で使用される現代のベクター法に関するさらなる詳細は、例えば、Kotterman et al. (2015) Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook Annual Review of Biomedical Engineering 17.に見出され得る。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「レトロウイルス媒介式の遺伝子移入」または「レトロウイルス形質導入」は同一の意味を帯び、またウイルスが細胞に進入し、そして宿主細胞ゲノム内にそのゲノムを組み込むことによって、遺伝子または核酸配列が宿主細胞に安定的に移されるプロセスを指す。ウイルスは、その通常の感染機構により宿主細胞に進入することができ、またはウイルスが異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドと結合して細胞に進入するように、それを改変することができる。本明細書で使用する場合、レトロウイルスベクターとは、ウイルスまたはウイルス様の進入機構を通じて、外因性の核酸を細胞に導入することができるウイルス粒子を指す。
【００６８】
レトロウイルスは、ＲＮＡの形態でその遺伝情報を担持する；ただし、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡは、ＤＮＡの形態に逆転写され、感染した細胞のゲノムＤＮＡ内に組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ形態は、プロウイルスと呼ばれる。
【００６９】
遺伝子移入がＤＮＡウイルスベクター、例えばアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等により媒介される態様では、ベクターコンストラクトとは、ウイルスゲノムまたはその一部、および導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、比較的十分に特徴づけられているウイルスの均質な群であり、５０を超える血清型を含む。Ａｄは宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。組み換えＡｄ由来のベクター、特に野生型ウイルスの組み換えおよび生成の可能性を低下させるベクターも構築されている。そのようなベクターが、供給業者、例えばＴａｋａｒａ  ＢｉｏＵＳＡ社（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）、およびＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｇｅｎｅ社（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）等から市販されている。野生型ＡＡＶは、宿主細胞のゲノムへの組み込みにおいて高い感染性と特異性を有する。Wold and Toth (2013) Curr. Gene. Ther. 13(6):421-433, Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6466-6470,およびLebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996を参照。
【００７０】
プロモーター、およびポリヌクレオチドが作動的に連結することができるクローニング部位の両方を含有するベクターは、当技術分野において周知されている。そのようなベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡを転写する能力を有し、供給業者、例えばＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）やＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）等から市販されている。発現および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を最適化するためには、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加、または変更して、転写もしくは翻訳のレベルにおいて発現を妨害もしくは低減し得る余分の不適切な選択的翻訳開始コドンまたはその他の配列の可能性を取り除くことが必要となり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位が、発現を増強するために開始コドンの５’側直近に挿入され得る。
【００７１】
遺伝子送達媒体として、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセル、および標的ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体も挙げられる。標的抗体またはその断片も含むリポソームは、本明細書に開示する方法において使用可能である。ポリヌクレオチドの細胞または細胞集団への送達に付加して、本明細書に記載されるタンパク質を細胞または細胞集団に直接導入することが、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技術により実施可能であるが、あるいは発現を増強することができ、および／または本明細書で開示されるタンパク質の活性を向上させることができる培養条件が、その他の非限定的な技術に該当する。
【００７２】
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較目的でアライメントされ得る各配列内の位置を比較することにより決定可能である。比較される配列内の位置が同一の塩基またはアミノ酸により占められるとき、分子は、その位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列に共通するマッチングまたは相同的位置の数の関数である。「無関連」の配列または「非相同的」配列では、本開示の配列のうちの１つと共有される同一性は４０％未満、あるいは２５％未満である。
【００７３】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、厳密な条件下でハイブリダイズする２つの核酸分子を指す場合もある。
【００７４】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間水素結合により安定化している複合体を形成する反応を指す。水素結合はワトソン・クリック塩基対形成、フーグステイン（Hoogstein）結合により、または任意のその他の配列特異的な方式で生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２本のストランド、マルチストランド複合体を形成する３本もしくはそれ超のストランド、単一の自己ハイブリダイジングストランド、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より多岐にわたるプロセスにおいて、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断等のステップを構成し得る。
【００７５】
厳密なハイブリダイゼーション条件の例として、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中程度ハイブリダイゼーション条件の例として、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣのバッファー濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高度に厳密な条件の例として、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣのバッファー濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。一般的に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、５分〜２４時間であり、１、２、もしくはそれ超の洗浄ステップを伴い、および洗浄インキュベーション時間は、約１、２、または１５分である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸バッファーである。その他のバッファー系を使用するＳＳＣの等価物も採用可能であるものと理解される。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「特異的に結合する」とは、特異的に結合する対の結合特異性を指す。潜在する他の標的の存在下でも、特定の標的ポリヌクレオチド配列の標的特異的核酸配列によりハイブリダイズすることは、そのような結合の１つの特徴である。特異的結合は、２つの異なる核酸分子と関係し、化学的または物理的手段を通じて、核酸分子の１つが第２の核酸分子と特異的にハイブリダイズする。２つの核酸分子は、それらが相互に結合する場合、類似した特徴を有するその他のアッセイ構成成分からその結合パートナーを識別する能力を有する、という意味合いで関連している。結合コンポーネントの対の各メンバーは、リガンドおよび受容体（アンチリガンド）、特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーおよびＳＢＰパートナー等と呼ばれる。
【００７７】
用語「単離された」とは、本明細書で使用する場合、その他の物質を実質的に含まない分子または生物学的製剤または細胞物質を意味する。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語「リンカー」とは、２つのタンパク質ドメインの間に存在し得る短鎖ペプチド配列を指す。リンカーは、多くの場合、可動性のアミノ酸残基、例えばグリシンまたはセリンを含み得、隣接しているが融合しているタンパク質ドメインの自由な動きを可能にする。「ＸＴＥＮ」とは、Schellenberger et al. (2009) Nat Biotechnol. 27: 1186-1190. doi: 10.1038/nbt. l588に提示される代表的なリンカーまたはその等価なバリアントのうちの任意の１つを指す。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「臓器」は、個々の生物の特定部分に該当する構造であり、そこでは個々の生物のある１つの機能または複数の機能が局所的に実施され、また形態学的に分離している。臓器の非限定的な例として、皮膚、血管、角膜、胸腺、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、甲状腺、および脳が挙げられる。
【００８０】
用語「フォトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」とは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインを活性化させる配列を指す。「ＰＡＭｍｅｒ」とは、ＰＡＭ提示オリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合、用語ＰＡＭｍｅｒとは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを最適化し、そして非標的ＲＮＡとの間で、またはゲノムＤＮＡに対して交差反応することなく、ＲＮＡ標的の特異的切断を生成することができる２’ＯＭｅ  ＲＮＡとＤＮＡ塩基の繰り返し（alternating 2'OMe RNA and DNA bases）から構成されるアンチセンス合成オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＡＭ提示オリゴヌクレオチドのその他の変形体を一般的に指す。例えば、O'Connell et al. (2014) Nature. 516(7530):263-266を参照。
【００８１】
用語「プロモーター」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子等のコーディング配列の発現を制御する任意の配列を指す。プロモーターは、例えば、構成的、誘導可能、抑制可能、または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、転写の開始および速度がコントロールされるポリヌクレオチド配列の領域に該当するコントロール配列である。プロモーターは、制御タンパク質および分子が結合し得る遺伝的要素、例えばＲＮＡポリメラーゼおよびその他の転写因子等を含有し得る。非限定的な代表的プロモーターとして、ＣＭＶプロモーターおよびＵ６プロモーターが挙げられる。
【００８２】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は交換可能に使用され、そしてその広義の意味合いにおいては、アミノ酸、アミノ酸類似物、またはペプチド模倣物の２つもしくはそれ超のサブユニットからなる化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合により連結し得る。別の態様では、サブユニットは、その他の結合、例えばエステル結合、エーテル結合等により連結し得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、またタンパク質の配列またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数について制限は設けられない。タンパク質およびペプチドは、末端アミノ酸上に未結合のカルボキシ基を備えた末端部を意味するＣ末端、および末端アミノ酸上に未結合のアミン基を備えた末端部を意味するＮ末端を有することが公知である。本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」とは、グリシン、およびＤおよびＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似物、およびペプチド模倣物を含む、天然アミノ酸および／または非天然もしくは合成アミノ酸を指す。用語「融合した」とは、タンパク質またはポリペプチドの文脈において、２つもしくはそれ超のタンパク質またはポリペプチド（またはそのドメイン）の末端間において融合タンパク質を形成する結合を指す。
【００８３】
本明細書で使用する場合、用語「組み換え発現系」とは、組み換えにより形成された特定の遺伝物質またはタンパク質を発現させるための遺伝子コンストラクトを指す。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、「患者」と交換可能に使用され、また任意の動物を意味するように意図されている。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒト以外の哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ネコ、イヌ、類人猿、ラット、またはヒトである。
【００８５】
用語「組織」は、生きているもしくは死んだ生物の組織、または生きているもしくは死んだ生物に由来する、またはそれを模倣するように設計された任意の組織を指すのに、本明細書において使用される。組織は、健康である場合もあれば、疾患を有する場合もあり、および／または遺伝子変異を有する場合もある。生物学的組織は、任意の単一の組織（例えば、相互に連結し得る細胞の集合）、あるいは臓器または生物の身体の一部もしくは領域を構成する組織の群を含み得る。組織は均質な細胞物質を含み得る、あるいは複合構造、例えば胸部（例えば肺組織を含み得る）、骨組織、および／または筋肉組織を含む、身体のいくつかの領域に見出される構造等であり得る。代表的な組織として、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆樹、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓、および腸に由来する組織が、任意のこれらの組み合わせを含め挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００８６】
本明細書で使用する場合、対象における疾患「を治療すること」またはその「治療」とは、（１）疾患に罹りやすいまたは疾患の症状をいまだ示していない対象において、症状または疾患が生ずるのを予防すること；（２）疾患を阻害すること、またはその発症を阻止すること；あるいは（３）疾患もしくは疾患の症状を改善すること、またはその退化を引き起こすことを指す。当技術分野において理解されるように、「治療」とは、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を取得するためのアプローチである。現在の技術の目的に照らせば、有益なまたは所望の結果は、検出可能であるかまたは検出可能でないかを問わず、１つまたは複数の症状の軽減または改善、病状（疾患を含む）の範囲の縮減、病状（疾患を含む）の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、病状（疾患を含む）、進行の遅延または低速化、病状（疾患を含む）、状態の改善または緩和、および寛解（部分的であるかまたは全体的であるかを問わない）のうちの１つまたは複数を含み得るが、ただしこれらに限定されない。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」には、非分裂性および／または低速分裂性の細胞に感染し、ならびに形質導入する能力および標的細胞のゲノムに一体化する能力を保持する組み換えベクターが意図されている。ベクターは、野生型ウイルスに由来し得るまたは基づき得る。本開示の態様は、アデノ随伴ウイルスベクターと関連する。
【００８８】
いくつかのその他のベクター要素、例えばプラスミド、プロモーター、リンカー、シグナル等が本明細書に開示される。これらのベクター要素の性質および機能は、当技術分野において一般的に理解されており、またこれらのベクター要素のいくつかが市販されている。その非限定的な代表的配列、例えば配列番号１〜８が本明細書に開示されており、またそのさらなる説明が本明細書において下記に提供され、および／または図３〜図１０で例証される。
【００８９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによる狙いを定めたＲＮＡ編集（ＣＲＥＤＩＴ）
ＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（ＲＣａｓ）を使用して、一ヌクレオチド分解能でプログラム可能なＲＮＡ編集を実施するための、効率的で汎用性があり、かつ簡便なプラットフォーム技術が本明細書で開示される。出願者らが「Ｃａｓによる狙いを定めたＲＮＡ編集」または「ＣＲＥＤＩＴ」と呼ぶこのアプローチは、ＤＮＡ配列を永続的に変化させることに立脚する、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９駆動式ゲノムエンジニアリングとは異なり、遺伝情報を一次的に可逆変化させる手段を提供する。組み換え発現系は、ガイドＲＮＡデザインによる決定に従い、特定のＲＮＡ塩基に対して編集を誘発するように工学的に操作される。したがって、いくつかの実施形態では、出願者らは、ＡＤＡＲデアミナーゼドメインおよび対応する延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）に融合したストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のヌクレアーゼ不活性型バージョンを含む、完全にコーディング可能な組み換え発現系を提供する。いくつかの実施形態では、システムは、リボヌクレオチド塩基修飾を行い、ＲＮＡ分子の配列が細胞機構により認識される様式を変化させる能力を有するエフェクターデアミナーゼ酵素複合体と共に組み換えタンパク質を生成する。いくつかの実施形態では、ＣＲＥＤＩＴ発現系は、Ａ）ＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）の触媒的に活性なデアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）をコードする核酸配列と、Ｂ）ｉ）標的アデノシンについてミスマッチを含む標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列、ｉｉ）ｄＣａｓスキャフォールド結合配列、および任意選択的にｉｉｉ）標的ＲＮＡ配列に対して相補的な配列（ｓｇＲＮＡの文脈においてスペーサー配列としても知られている）を含む延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）配列とを含む。ＣＲＥＤＩＴ発現系コンポーネントを発現する代表的なコンストラクトとして、非限定的に、空間的に分離するために「ＸＴＥＮ」リンカーペプチドを使用してヒトＡＤＡＲ２の触媒的に活性なデアミナーゼドメイン（ｈＡＤＡＲ２ＤＤ、Ｅ４８８ＱｈＡＤＡＲ２ＤＤ）に融合したｄＣａｓ９が挙げられる（図１Ｂ）。ＲＢＤ（ＲＮＡ結合ドメイン）の代用としてｄＣａｓ９を用いて、出願者らは、標的特異的Ａ−Ｉ編集するために、ｈＡＤＡＲ２ＤＤをＲＮＡ部位に差し向ける独自の短鎖延長配列（ｅｓｇＲＮＡ）を有するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を工学的に作出し、そしてカスタマイズした。本開示の目的に照らせば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９オルソログ（例えば、Ｃａｓ１３（Ｃ２ｃ２としても知られている）、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ６ｆ／Ｃｓｙ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、およびＣａｓＲｘ）以外のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連エンドヌクレアーゼも、ＣＲＥＤＩＴ発現系で使用するために本明細書に提供される。Wright et al., Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering, Cell, Vol. 164 (1-2): 29-44, 2016も参照。
【００９０】
本明細書で開示されるいくつかの実施形態では、ｄＣａｓポリペプチドが、標的ＲＮＡを認識するように工学的に操作され、その場合、不活性なＣａｓポリペプチドはエフェクターと会合する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓポリペプチドは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ｄＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９ポリペプチドは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９ポリペプチド内に、変異、例えばＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ等、またはその両方を含む。この改作されたまたは工学的に操作されたｄＣａｓ９ポリペプチド含有核タンパク質複合体はＲＮＡと結合し、本明細書ではＲｄＣａｓ９と呼ばれる。ＣＲＩＳＰＲは、ヒト細胞においてＤＮＡの簡便にプログラム化された認識を可能にすることによりゲノムエンジニアリングを一新したが、また画像化および遺伝子発現調節における関連技術を支援した。国際公開第２０１７／０９１６３０号パンフレット（本明細書においてそのまま参照として組み込まれている）では、ＲＣａｓ９を使用してＲＮＡを標的とする類似の手段が開発された。このより早期の研究では、工学的に操作された核タンパク質複合体が、Ｃａｓ９タンパク質およびシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡコンポーネントはいずれも、任意の標的ＲＮＡ配列を仮想的に認識するように工学的に操作された。任意選択的に、そのようなシステムでは、標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを介してＣａｓ９により認識するためのＤＮＡ基質をシミュレートするために、（化学的に改変されたまたは合成の）アンチセンスＰＡＭｍｅｒオリゴヌクレオチドをＲＣａｓ９システムに含めることができた。しかし、驚くべきことに、ＰＡＭｍｅｒを用いなくても、きわめて有効にＲＮＡを標的とすることも明らかとなった。ここで、ＰＡＭｍｅｒを必要としないＲｄＣａｓ−ＡＤＡＲ  ＲＮＡ編集システムが本明細書において開示されるが、同システムは、したがって標的ＲＮＡを改変するための可逆的プラットフォームを提供する、完全にコーディング可能なＣａｓ９媒介式のＲＮＡ標的システムである。
【００９１】
本開示の目的に照らせば、本明細書で使用されるＣａｓ９エンドヌクレアーゼとして、非限定的に、古細菌または細菌Ｃａｓ９ポリペプチドに由来するオルソログが挙げられる。そのようなポリペプチドは、非限定的に、ハロフェラックス・メディテラネイ（Haloferax mediteranei）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、野兎病菌（Francisetta tularensis）亜種ノビシダ（subsp. novicida）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ３、カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）ＣＦ８９−１２、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）Ｆ系統、ニトラチフラクター・サルスギニス（Nitratifractor salsuginis）ＤＳＭ１６５１  １系統、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）、ネイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、アゾスピリルム属Ｂ５１０、スファエロカエタ・グロブス（Sphaerochaeta globus）バディ（Ｂｕｄｄｙ）系統、フラボバクテリウム・カラムナーレ（Flavobacterium columnare）、フルヴィコラ・タフェンシス（Fluviicola taffensis）、バクテロイデス・コプロフィルス（Bacteroides coprophilus）、マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ストレプトコッカス・パステウリアヌス（Streptococcus pasteurianus）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、スタフィロコッカス・シュディンテルメディウス（Staphylococcus pseudintermedius）、フィリファクター・アロキス（Filifactor alocis）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）パリス系統、ステレラ・ウォズワーセンシス（Sutterella wadsworthensis）、コリネバクター・ジフテリア（Corynebacter diphtheriae）、またはストレプトコッカス・アウレウス（Streptococcus aureus）；フランシセラ・ノビサイダ（Francisella novicida）（例えば、フランシセラ・ノビサイダ（Francisella novicida）ＣＰｆ１）、またはナトロノバクテリウム・グレゴリー（Natronobacterium gregoryi）アルゴノートに由来し得る。このような候補Ｃａｓポリペプチドのそれぞれは、ＲＮＡを標的とするように改変および／または改作され、そして本明細書で開示されるシステムで使用されるＡＤＡＲデアミナーゼドメインと融合するが、同システムは、ガイド「スキャフォールド配列」を含む、延長されたｓｇＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）をさらに含み、ガイド「スキャフォールド配列」は、このような細菌または古細菌微生物それぞれについて、その野生型（ＷＴ）で同一起源のガイド核酸の全部または一部を含む、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、本明細書で用いられるＣａｓエンドヌクレアーゼとして、非限定的に、Ｃａｓ１３（ｃ２Ｃ２）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、およびＣａｓＲｘが挙げられる。
【００９２】
Ｃａｓ９のオルソログおよび生物学的等価物のさらなる非限定的な例は、下記の表に提示される：
【００９３】
【表１】
2020519269.tif 000003
2020519269.tif 000004
2020519269.tif 000005
2020519269.tif 000006
2020519269.tif 000007
2020519269.tif 000008
2020519269.tif 000009
2020519269.tif 000010
2020519269.tif 000011
2020519269.tif 000012
2020519269.tif 000013
2020519269.tif 000014
【００９４】
いくつかの実施形態では、ｄＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列は、コドン最適化ｄＣａｓである。コドン最適化配列の例は、この事例において、非限定的に、真核生物、動物、および／または哺乳動物、例えばヒトにおける発現について最適化された（すなわち、ヒトでの発現について最適化された）配列である；例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（本明細書において参考としてそのまま組み込まれている）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に提示されるシステムで使用されるｄＣａｓエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼが、その対応する野生型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して、切断活性を欠く、または切断活性を実質的に欠くようにする変異を含むＣａｓエンドヌクレアーゼのバリアントである。例えば、国際公開第２０１７／０９１６３０号パンフレット（参照により本明細書にそのまま組み込まれている）を参照すると、本明細書で開示される１つの実施形態では、Ｃａｓ９活性部位（１０および８４０）において、アラニンへの変異（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）を生じさせることにより、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９の切断活性を除去し、ヌクレアーゼ欠損型または不活性型Ｃａｓ９（すなわち、ｄＣａｓ９）を生成することができる。ＲｕｖＣドメインは、ｄＣａｓ９一次構造（残基１〜６０、７１９〜７７５、および９１０〜１０９９）の３つの非連続部分に分布している。Ｒｅｃローブは、残基６１〜７１８から構成される。ＨＮＨドメインは、残基７７６〜９０９から構成される。ＰＡＭ−ＩＤドメインは、残基１１００〜１３６８から構成される。ＲＥＣローブは、ｓｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡ／ＲＮＡを認識するための構造的なスキャフォールドと考えられ得る。ＮＵＣローブは、２つのヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）に加え、任意選択的なＰＡＭ配列を認識するＰＡＭ−相互作用ドメイン（ＰＡＭ−ＩＤ）を含有する。この先行する研究では、例えば、非限定的に、約９８個のヌクレオチドからなるｓｇＲＮＡは、２つの主要な構造的コンポーネントに一般的に分割される：第１は、標的特異的ガイドまたは「スペーサー」セグメント（ヌクレオチド１〜２０）に加え、リピート−テトラループ−アンチリピートおよびステムループ１（ＳＬ１）領域を含有する；第２は、ステムループ２および３（ＳＬ２、ＳＬ３）を含有する。したがって、ガイド〜ＳＬ１  ＲＮＡセグメントには、Ｃａｓ９  ＲＥＣローブが主に結合し、そしてＳＬ２〜ＳＬ３セグメントには、ＮＵＣローブが主に結合する。
【００９６】
本明細書で開示されるシステムで使用されるｄＣａｓ９のいくつかの実施形態では、高い親和性を有して標的ＲＮＡ配列を認識する、最低限度の（すなわち、できる限り少ないヌクレオチド塩基対を用いて）Ｃａｓ９のコンストラクトが工学的に作出される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９をコードする最小のコンストラクトは、ＲＥＣのみのコンストラクトである。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、ＨＮＨ、ＰＡＭ−ＩＤ、各ドメインの一部を欠いている、各ドメインの両方を欠いている、それほどには最低限に抑えられていないコンストラクト、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＨＮＨドメインは、残基７７５と９０９の間に５残基可動性リンカーを挿入することにより切除される（ΔΗΝΗ）。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ−ＩＤの全部または一部が除去される。いくつかの実施形態では、残基１０９８においてＣａｓ９をトランケートすること（ΔＰＡΜ−ＩＤ＃１）、残基１１３８および１３４５を８残基リンカーと融合させること（ΔＰＡΜ−ＩＤ＃２）、または残基１１３８を１２００と残基１２１８を１３３９と融合させること（５残基リンカーおよび２残基リンカーをそれぞれ用いて：ΔＰＡΜ−ＩＤ＃３）が、ＰＡＭ−ＩＤの全部または一部を除去するのに使用される。ΔＰＡΜ−ＩＤ＃２および＃３コンストラクトは、ｓｇＲＮＡリピート−アンチリピート（残基１０９９〜１１３８）、およびＳＬ２〜ＳＬ３（残基１２００〜１２１８および残基１３３９〜１３６８）セグメントの結合に寄与するＰＡＭ−ＩＤの要素を保持する。いくつかの実施形態では、ＨＮＨ欠損は、３つのＰＡＭ−ＩＤ欠損と組み合わされる。いくつかの実施形態では、国際公開第２０１６／１９６５５号パンフレット（参照として本明細書にそのまま組み込まれている）に記載の、ヌクレアーゼ活性および／または切断活性を欠くまたは実質的に欠くＣａｓ９バリアントは、本明細書で開示される組み換え発現系で使用されるｄＣａｓ９の例である。
【００９７】
したがって、本明細書で開示される組み換え発現系で使用されるのは、ｄＣａｓ−ＡＤＡＲデアミナーゼドメイン融合タンパク質をコードする核酸配列である。１つの実施形態では、ｄＣａｓ９は、触媒的に活性なＡＤＡＲデアミナーゼドメインに融合している。そのようなシステムの文脈において、対応する延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）が、標的ＲＮＡのアデノシンを標的とし、編集するのに使用される。システムは、リボヌクレオチド塩基修飾を行って、ＲＮＡ分子の配列が細胞機構により認識される様式を変化させる能力を有するエフェクターデアミナーゼ酵素を含む組み換えタンパク質を生成する。１つの実施形態では、ｄＣａｓおよびＡＤＡＲデアミナーゼドメインは、リンカーにより分離している。別の実施形態では、リンカーは、非限定的に、隣接したタンパク質ドメインを隔離するのに使用される可動性リンカーであるＸＴＥＮリンカーである。ＸＴＥＮリンカーは当技術分野において公知であり、また例えば、国際公開第２０１３／１３０６８４号パンフレット（本明細書において参考として本明細書にそのまま組み込まれている）に見出され得る。
【００９８】
ＲＮＡ編集は、ＲＮＡ内に軽微な改変を引き起すことにより、所与の配列の遺伝子産物について、その多様性を増大させる天然プロセスである。一般的に、改変は、ゲノムによりコードされるＲＮＡ配列とは異なるＲＮＡ配列をもたらす、アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への変換と関係する。ＲＮＡの改変は、ＡＤＡＲ酵素により一般的に保証され、それによってプレＲＮＡ標的が、編集対象となるアデノシンを含有するエクソンと非コード領域のイントロン要素の間で塩基対形成することにより、不完全二本鎖ＲＮＡを形成する。古典的なＡ−Ｉ編集の例は、グルタミン酸レセプターＧｌｕＲ−Ｂ  ｍＲＮＡであり、それによって生じた変化が、チャンネルのコンダクタンス特性の改変を引き起こす（Higuchi M, et al. Cell. 1993;75: 1361-70）。
【００９９】
本開示の目的に照らせば、ＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）デアミナーゼドメインは、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、またはＡＤＡＲ３デアミナーゼドメインであり得る。Nishikura, K. A-to-I editing of coding and non-coding RNAs by ADARs. Nat Rev Mol Cell Biol 17, 83-96, doi: 10.1038/nrm.2015.4 (2016)を参照。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲデアミナーゼドメインは、ＡＤＡＲ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ５５２６５）の全部または一部に由来する。ＡＤＡＲ１の非限定的な代表的配列が下記（配列番号２４）に提示される：
【０１０１】
【表２】
2020519269.tif 000015
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲデアミナーゼドメインは、ＡＤＡＲ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ７８５６３）の全部または一部に由来する。ＡＤＡＲ２の非限定的な代表的配列が下記（配列番号２５）に提示される：
【０１０３】
【表３】
2020519269.tif 000016
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲデアミナーゼドメインは、ＡＤＡＲ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＮＳ３９）の全部または一部に由来する：ＡＤＡＲ２の非限定的な代表的配列が下記（配列番号２６）に提示される：
【０１０５】
【表４】
2020519269.tif 000017
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲドメインは、野生型ＡＤＡＲドメインと比較して、触媒活性の増加を引き起こす変異を含み得る。いくつかの実施形態では、触媒的に活性なデアミナーゼドメイン（ＤＤ）は、野生型ヒトＡＤＡＲ２  ＤＤ、または酵素活性およびＲＮＡ基質に対する親和性を増加させる変異（Ｅ４８８Ｑ）を担持するヒトＡＤＡＲ２  ＤＤに由来する（Phelps et al., Jan 2015, Nuc. Acid Res., 43(2): 1123-1132; Kuttan & Bass, Nov 2012, PNAS 109(48): E3295-E3304）。
【０１０７】
ＡＤＡＲ２の触媒ドメインは、そのＲＮＡ認識モチーフとは独立して、ｄｓＲＮＡ領域内の対応する塩基がないアデノシン残基を脱アミノ化するのが好ましいので、出願者らは、本明細書で開示されるシステムのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）コンポーネントの構造を改変して、基質特異性を一ヌクレオチド分解能まで向上させた。補足的な３’末端カセットを用いて工学的に操作されたｇＲＮＡは、生細胞内でその標的能力を維持することが報告された（Konermann et al. Jan 2015, Nature, 517: 583-588）。
【０１０８】
出願者らは、所望の編集部位において標的ＲＮＡと塩基対形成する能力を有する追加の相同性の領域を含むシステムのｓｇＲＮＡ構造において、その戦略的改変に基づき、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介式のＲＮＡ編集（ＣＲＥＤＩＴ）プラットフォームを開発した。ｓｇＲＮＡ構造に対するそのような改変から、開示されるシステムの延長されたｓｇＲＮＡ（すなわち、ｅｓｇＲＮＡ）が生成し、その結果、標的転写物との間でＡからＣへのミスマッチが生じ、膨らんだアデノシンにおいて編集される「偽ｄｓＲＮＡ」基質が生成する（図１Ａを参照）。したがって、本明細書で開示されるＣＲＥＤＩＴプラットフォームおよびシステムは、トランスクリプトーム内の実質的にすべてのアデノシンを標的としてイノシンへの変換（すなわち、Ａ−Ｉ  ＲＮＡ編集）を誘発する能力を提供し、それは最終的に、翻訳機構およびスプライシング機構によりグアノシンとして読み取られる。
【０１０９】
その全体的なデザインの単純性ならびにその完全にコーディング可能な性質に起因して、本明細書で開示される組み換え発現系は、その他の類似したＲＮＡ改変システムおよび方法と比較したときに、高度の有用性および工学汎用性を提供する。ｄＣａｓ９は、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列に対してピコモルの親和性を有して結合するので、またこの改善したシステムは、標的親和性および特異性の両方を高めるために、延長されたシングルガイドＲＮＡ、すなわちｅｓｇＲＮＡ構造に基づくデュアルガイドアーキテクチャを使用するので、オフターゲット編集イベントの可能性を最低限に抑えつつ、ＲＮＡの直接編集が効率的に実現される。いくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡは、ｉ）スキャフォールド配列、およびｉｉ）短鎖延長配列を用いて、ただしスペーサー配列を用いずに設計され得る。
【０１１０】
１つの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡは、ｉ）ほぼ完璧なＲＮＡ−ＲＮＡ塩基対形成能力を有する相同性の領域（すなわち、標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列）、およびｉｉ）ｄＣａｓ９結合領域（すなわち、スキャフォールド配列）の少なくとも２つの領域から構成される。１つの実施形態では、短鎖延長配列は、標的トランスクリプトームとの間でＡ−Ｃミスマッチを形成し、そして膨らんだアデノシン残基において編集される「偽ＲＮＡ」基質を生成するミスマッチを含む。したがって、短鎖延長配列の相同性領域は、本明細書で開示される組み換え発現系の特異性を決定し、特に細胞トランスクリプトーム内のどのＲＮＡ塩基が編集されるかを特異的に決定する。編集されるＲＮＡ塩基は、相同性領域内のミスマッチアデノシン残基および標的ＲＮＡ二本鎖により区別される。図１Ａを参照。短鎖延長配列の相同性領域およびスキャフォールドの配置には融通性がある。１つの実施形態では、スキャフォールド配列は、ｅｓｇＲＮＡの５’末端に位置する。別の実施形態では、ほぼ完璧なＲＮＡ−ＲＮＡ塩基対形成能力を有する相同性領域を担持する短鎖延長配列は、ｅｓｇＲＮＡの３’末端に位置する。別の実施形態では、短鎖延長配列は、ｅｓｇＲＮＡの５’末端に位置する。本開示の目的に照らせば、「３’末端」または「５’末端」とは、ｅｓｇＲＮＡのいずれのシナリオにおいても、ｅｓｇＲＮＡの末端部分を指す。別の実施形態では、ｅｓｇＲＮＡは、第３の領域、ｉｉｉ）標的ＲＮＡに対して第２の相同性領域を含むスペーサー配列をさらに含む。１つの実施形態では、スペーサー配列は、スキャフォールド配列の５’末端に位置する。スペーサー配列は、標的ＲＮＡに対して相補的であるが、しかし標的ＲＮＡのＡ−Ｉ編集を有効にするのにミスマッチを必要としない。１つの実施形態では、スペーサー配列は、スキャフォールド配列の５’末端に位置する。別の実施形態では、短鎖延長配列は、スキャフォールド配列の３’末端、またはスペーサー配列の５’末端に位置する。別の実施形態では、短鎖延長配列は、ｅｓｇＲＮＡの末端部分に位置する。別の実施形態では、短鎖延長配列は、スペーサー配列と連続している。別の実施形態では、短鎖延長配列は、スペーサー配列と連続していない。別の実施形態では、ｅｓｇＲＮＡは３’から５’方向でｉ）〜ｉｉｉ）を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、核タンパク質複合体が、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、または本明細書に開示するように、延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）と複合体形成する。いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡスキャフォールド配列内の二次的構造の延長部（標的アデノシンを編集する能力を有するｅｓｇＲＮＡ内の相同性の短鎖延長配列以外の部分であり、それに付加して）を担持する。いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡは、転写終結配列、またはトランス作用性のヌクレアーゼの作用により転写後のシングルガイドＲＮＡ（またはｅｓｇＲＮＡ）を不安定化させる配列について、それを部分的または全面的に除去することにより、シングルガイドＲＮＡ（またはｅｓｇＲＮＡｓ）の発現レベルを改善する、１つまたは複数の点変異を含む。いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡ（またはｅｓｇＲＮＡ）は、５’末端において、前記シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡを分解に対して安定化させる変更を含む。いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡは、５’末端においてＲＮＡ標的を改善する変更を含む。いくつかの実施形態では、前記シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡの５’末端における変更は、２’Ｏ−メチルホスホロチオエートおよびチオホスホノアセテート結合および塩基からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡは、標的認識を改善するため、またはシングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡに対するヌクレアーゼ活性を低下させるために、ｓｇＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡのスペーサーまたはスキャフォールド領域内に２’−フッ化、２’Ｏ−メチル、および／または２’−メトキシエチル塩基修飾を含む。いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡに対するヌクレアーゼ活性を低下させる１つまたは複数のメチルホスホネート、チオホスホノアセテート、またはホスホロチオエート結合を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡは、例えば標的ＲＮＡにハイブリダイズすることにより標的ＲＮＡを認識することができる。いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡは、１０ｎｔ、２０ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、６０ｎｔ、７０ｎｔ、８０ｎｔ、９０ｎｔ、１００ｎｔ、１１０ｎｔ、１２０ｎｔ、１３０ｎｔ、１４０ｎｔ、１５０ｎｔ、１６０ｎｔ、１７０ｎｔ、１８０ｎｔ、１９０ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、１，０００ｎｔ、２，０００ｎｔにほぼ等しい、それ未満、もしくはそれを超える長さ、または上記数値の任意の２つに挟まれる範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡは、１つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含み得る。
【０１１３】
さらなる実施形態では、様々なＲＮＡ標的が、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡにより認識可能である。例えば、標的ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、シグナル認識粒子ＲＮＡ（ＳＲＰ  ＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）、長鎖非コーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、レトロトランスポゾンＲＮＡ、ウイルスゲノムＲＮＡ、ウイルス非コーディングＲＮＡ等であり得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、病状、例えばがん、神経変性、皮膚の病状、内分泌の病状、腸の疾患、感染性の病状、神経障害、肝疾患、心臓障害、自己免疫疾患等に関する病因または治療目標に関与するＲＮＡであり得る。
【０１１４】
さらなる実施形態では、標的ＲＮＡの代表的なＧからＡへの変異、および治療の対象となる対応する疾患、病状、および／または症候群は、非限定的に下記の通りである。
傍神経節腫、胃間質肉腫、傍神経節腫４、クローム親和細胞腫、傍神経節腫１、および／または遺伝性のがん易罹患性症候群を治療するためのＳＤＨＢ（コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体−鉄硫黄サブユニットＢ）；
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損、ヒルシュスプルング病１、フルオロウラシル応答性、ピリミジン類似体応答性−毒性／ＡＤＲ、カペシタビン応答性−毒性／ＡＤＲ、フルオロウラシル応答性−毒性／ＡＤＲ、および／またはテガフール応答性−毒性／ＡＤＲを治療するためのＤＰＹＤ（ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ）；
リンチ症候群、腫瘍素因症候群、および／またはターコット症候群を治療するためのＭＳＨ２（ｍｕｔＳホモログ２）；
リンチ症候群を治療するためのＭＳＨ６（ｍｕｔＳホモログ６）；
三好型筋ジストロフィー１、および／または肢帯筋ジストロフィー２Ｂ型を治療するためのＤＹＳＦ（ジスフェリン）；
幼児期における重度ミオクローヌスてんかんを治療するためのＳＣＮ１Ａ（ナトリウム電位作動型チャンネルαサブユニット１）；
原発性拡張型心筋症を治療するためのＴＴＮ（チチン）／ＴＴＮ−ＡＳ１；
フォン・ヒッペル・リンドウ症候群；および／または遺伝性のがん易罹患性症候群を治療するためのＶＨＬ（フォン・ヒッペル・リンドウ腫瘍抑制因子）；
リンチ症候群、遺伝性のがん易罹患性症候群、および／または腫瘍素因症候群を治療するためのＭＬＨ１（ｍｕｔＬホモログ１）；
網膜色素変性および／または網膜色素変性４０を治療するためのＰＤＥ６Ｂ（ホスホジエステラーゼ６Ｂ）；
虫部の家族性形成不全および／またはジュベール症候群９を治療するためのＣＣ２Ｄ２Ａ（コイルドコイルおよびＣ２ドメインを含有する２Ａ）；
潜在眼球症候群を治療するためのＦＲＡＳ１（フレイザー細胞外マトリックス複合体サブユニット１）；
不整脈惹起性の右室心筋症８型および／または心筋症を治療するためのＤＳＰ（デスモプラキン）；
リンチ症候群および／または腫瘍素因症候群を治療するためのＰＭＳ２（ＰＭＳ１ホモログ２、ミスマッチ修復システムコンポーネント）；
アルギニノコハク酸尿症を治療するためのＡＳＬ（アルギニノコハク酸リアーゼ）；
大動脈弁上狭窄症を治療するためのＥＬＮ（エラスチン）；
前庭水管拡大症候群および／またはペンドレッド症候群を治療するためのＳＬＣ２６Ａ４（溶質輸送体ファミリー２６メンバー４）；
嚢胞性線維症を治療するためのＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）；
色覚障害３を治療するためのＣＮＧＢ３（環状ヌクレオチド感受性チャンネルβ３）；
ファンコーニ貧血および／または遺伝性のがん易罹患性症候群を治療するためのＦＡＮＣＣ（ファンコーニ貧血相補群Ｃ）−Ｃ９ｏｒｆ３；
遺伝性のがん易罹患性症候群、バナヤン・ライリー・ルバルカバ症候群、カウデン病、乳がん、自閉症スペクトラム障害、頭頸部扁平上皮癌、肺がん、および／または前立腺がんを治療するためのＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシンホモログ）；
肢帯筋ジストロフィー２Ｌ型、顎骨骨幹異形成症、三好型ミオパチー、および／または三好型筋ジストロフィー３を治療するためのＡＮＯ５（アノクタミン５）；
一次性家族性肥大性心筋症を治療するためのＭＹＢＰＣ３（ミオシン結合タンパク質Ｃ、心臓）；
家族性孤立性の副甲状腺機能亢進症、複数の内分泌新生物、原発性大結節性副腎過形、および／または腫瘍を治療するためのＭＥＮ１（メニン１）；
運動失調末梢血管拡張症候群、および／または遺伝性のがん易罹患性症候群を治療するためのＡＴＭ（ＡＴＭセリン／トレオニンキナーゼ）および／またはＡＴＭ−Ｃ１１ｏｒｆ６５；
不整脈惹起性の右室心筋症９型および／または不整脈惹起性の右室心筋症を治療するためのＰＫＰ２（プラコフィリン２）；
フェニルケトン尿症を治療するためのＰＡＨ（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）；
聴覚消失、常染色体劣性１Ａ、非症候群性遺伝性聴覚消失、および／または聴覚障害を治療するためのＧＪＢ２（ギャップ結合タンパク質β２）；
ピーターズプラス症候群を治療するためのＢ３ＧＬＣＴ（β３−グルコシルトランスフェラーゼ）；
家族性の乳房のがん、乳房−卵巣がん−家族性２、遺伝性のがん易罹患性症候群、ファンコーニ貧血、相補群Ｄ１、遺伝性の乳房および卵巣がん症候群、遺伝性のがん易罹患性症候群、乳房−卵巣がん−家族性１、および／または遺伝性の乳房および卵巣がん症候群を治療するためのＢＲＣＡ２（ＢＲＣＡ２、ＤＮＡ修復関連）；
原発性拡張型心筋症、心筋症、および／または心筋症−左室緻密化障害を治療するためのＭＹＨ７（ミオシン重鎖７）；
マルファン症候群を治療するためのＦＢＮ１（フィブリリン１）；
テイ・サックス病を治療するためのＨＥＸＡ（ヘキソサミニダーゼサブユニットＡ）；
結節性硬化症２、および／または結節性硬化症症候群を治療するためのＴＳＣ２（ＴＳＣ複合体サブユニット２）；
ルビンシュタイン・テイビ症候群を治療するためのＣＲＥＢＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）；
遺伝性びまん性胃がん、腫瘍素因症候群、および／または遺伝性のがん易罹患性症候群を治療するためのＣＤＨ１（カドヘリン１）；
痙性対麻痺７を治療するためのＳＰＧ７（ＳＰＧ７、パラプレギンマトリックスＡＡＡペプチダーゼサブユニット）；
乳房−卵巣がん−家族的性１、遺伝性の乳房および卵巣がん症候群、および／または遺伝性のがん易罹患性症候群を治療するためのＢＲＣＡ１（ＢＲＣＡ１、ＤＮＡ修復関連）；
家族性の乳房のがんおよび／または腫瘍素因症候群を治療するためのＢＲＩＰ１（ＢＲＣＡ１相互作用性タンパク質Ｃ末端ヘリカーゼ１）；
家族性高コレステロール血症および／または高コレステロール血症を治療するためのＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）および／またはＬＤＬＲ−ＭＩＲ６８８６；
メープルシロップ尿症を治療するためのＢＣＫＤＨＡ（分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼＥ１、αポリペプチド）；
家族性の乳房のがん、乳房および結腸直腸がん−感受性、および／または遺伝性のがん易罹患性症候群を治療するためのＣＨＥＫ２（チェックポイントキナーゼ２）；
ベッカー型筋ジストロフィー、デュシェンヌ筋ジストロフィー、および／または拡張型心筋症３Ｂを治療するためのＤＭＤ（ジストロフィン）；ならびに／あるいは
ハーラー症候群、多発性骨形性不全症、ムコ多糖症、ＭＰＳ−Ｉ−Ｈ／Ｓ、および／またはムコ多糖症Ｉ型を治療するためのＩＤＵＡ（イズロニダーゼ、α−Ｌ）。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡは、長さ約１０〜１００ヌクレオチドである、または長さ約１０、１５〜６０、２０〜５０、もしくは２５〜４０である、またはその間の任意の範囲のヌクレオチドである標的ＲＮＡに対して相同性の短鎖延長配列を含む。いくつかの実施形態では、ｅｓｇＲＮＡの短鎖延長配列は、非限定的に、約１個のミスマッチ、または２、３、４、もしくは５個のミスマッチを含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡまたはｅｓｇＲＮＡには、標的ＲＮＡと結合するまたはハイブリダイズする配列、例えばＲＮＡ認識が特異性によって支援され、そして独特の可動性を有するように、標的ＲＮＡに対して相同性の追加の領域を含むスペーサー配列等（本明細書で開示される相同性の短鎖延長配列に付加して）が非限定的に含まれ、アクセス可能なゲノム操作を提供する。本明細書において参照としてそのまま組み込まれる国際公開第２０１７／０９１６３０号パンフレットを参照。
【０１１７】
ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、Ｒｅｆ  Ｓｅｑ：ＮＭ＿０００４９２）およびＩＤＵＡ  ｍＲＮＡ（イズロニダーゼ、Ｒｅｆ  Ｓｅｑ：ＮＭ＿０００２０３）を標的とするｅｓｇＲＮＡ用として設計された非限定的な代表的スペーサー配列および延長配列は、下記の表に提示される：
【０１１８】
【表５】
2020519269.tif 000018
【０１１９】
１つの実施形態では、本明細書で開示されるシステムは、単一のベクターに適合するヌクレオチド長まで最小化された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターはＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、サイズが約４．５ｋｂである導入遺伝子をパッケージングする能力を有する。いくつかの事例では、例えば約４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、７．５ｋｂ、８．０ｋｂ、９．０ｋｂ、１０．０ｋｂ、１１．０ｋｂ、１２．０ｋｂ、１３．０ｋｂ、１４．０ｋｂ、１５．０ｋｂ、またはそれ超等のより大きな導入遺伝子をパッケージングする能力を有するＡＡＶベクターが使用される。
【０１２０】
別の実施形態では、本明細書で開示されるシステムは、非限定的に、システムコンポーネントの発現を駆動するための１つまたは複数のプロモーター配列を含む。小分子ＲＮＡを発現させるための代表的なプロモーターは、非限定的にポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＵ６やＨ１等である。システムコンポーネントの発現を駆動するためのその他のプロモーターは、非限定的に、ＥＦ１α（またはその短鎖、イントロンレス形態、ＥＦＳ）、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、およびウサギβ−グロビンスプライスアクセプター部位の融合物）、ミニＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＣＭＶ、ＭＣＫ（筋クレアチンキナーゼ）、ＭＣＫ／ＳＶ４０、デスミン、および／またはｃ５１２（グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ）である。
【０１２１】
１つの実施形態では、組み換え発現系は、ベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）により担持されるＤＮＡにコードされ、そして下記の方法のうちの１つにより該当する組織に送達され得る：特異的な組織親和性を示す特異的なＡＡＶ血清型の使用（例えばニューロンまたは筋肉を標的とするＡＡＶ−９等）；ＲｄＣａｓ９システムをコードするネイキッドＤＮＡの組織、例えば筋肉または肝臓等への注射；脂質、ポリマー、または治療用組み換え発現系をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを担持するその他の合成もしくは天然の物質から構成されるナノ粒子の使用；あるいは一方のウイルスがｄＣａｓ９タンパク質−ＡＤＡＲ融合物をコードし、そして他方のウイルスがｓｇＲＮＡをコードする；または一方のウイルスがｄＣａｓ９タンパク質および／もしくはｓｇＲＮＡをコードする一方、他方のウイルスが、ＡＤＡＲタンパク質および／もしくはｓｇＲＮＡをコードするように、２つの異なるウイルスまたはＤＮＡ分子の間でシステムが分離されている上記方法のいずれか。ＣＲＥＤＩＴのいくつかの部分が、異なるベクター上でコードされる複数の実施形態では、ｄＣａｓ９のコードされるいくつかの部分とＡＤＡＲは、機能的なｄＣａｓ９−ＡＤＡＲ核タンパク質複合体が形成されるように相互作用することができる。代表的な分離システムは、Wright et al., Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. PNAS 112:2984-2989 (2015)に認めることができる（その内容は、本明細書により参照としてそのまま組み込まれている）。
【０１２２】
ヒト対象または動物の治療において、本明細書に提示されるような代表的な組み換え発現系を使用するために、ベクター系、例えばＡＡＶの系が、例えば下記の方法により注射可能である：（１）骨格筋組織（筋肉内）、複数部位同時（関連する適応：筋緊張性ジストロフィー）−主要な筋肉群、例えば腹筋、二頭筋、三角筋、脊柱起立筋、腓腹筋、ヒラメ筋、殿筋、膝腱、広背筋、菱形筋、斜筋、胸筋、四頭筋、僧帽筋、および／または三頭筋等への注射１回当たり１０11〜１０14ＧＣ（ゲノムコピー）の注射；（２）筋肉を標的とする標的ＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ９またはＡＡＶ６等の静脈内送達−注射１回当たり１０11〜１０14ＧＣの注射で、合計１０12〜１０17ＧＣが送達される；３．ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、またはニューロン親和性を示す別の血清型の軟膜下脊髄注射−単回または多数回投与での１０11〜１０17ＧＣの注射；４．ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、またはニューロン親和性を示す別の血清型の頭蓋骨内注射−単回または多数回投与での１０11〜１０17ＧＣの注射。
【０１２３】
その他の実施形態では、本明細書で開示される組み換え発現系は、当技術分野において公知の方法により処方化され得る。さらに、任意の投与経路、例えば経口、肺、腹腔内（ｉｐ）、静脈内（ｉｖ）、筋肉内（ｉｍ）、皮下（ｓｃ）、経皮、バッカル、鼻腔、舌下、眼球、直腸、および膣腔を含む、ただしこれらに限定されない任意の従来式の投与経路等によることが想定され得る。さらに、神経系への直接投与は、ポンプデバイスを用いたまたは用いない、頭蓋骨内または脊椎内注射針またはカテーテルを経由する送達による脳内、脳室内、側脳室内、髄腔内、大槽内、脊髄内、または脊髄周辺の投与経路を含み得るが、ただしこれらに限定されない。本明細書に記載される治療効果を提供する任意の用量または投与頻度が、本治療で使用するのに適する。特定の実施形態では、対象には、本開示に基づく組み換え発現系をコードするウイルスベクターが筋肉内経路により投与される。１つの実施形態では、ベクターは、上記で定義したＡＡＶベクターであり、ＡＡＶ９ベクターである。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、ベクターの単回注射を受け得る。さらに、標準的な薬学的方法が、作用持続時間をコントロールするために採用され得る。これらは、当技術分野において周知されており、また放出コントロール型製剤を含み、そしてふさわしい高分子、例えばポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミンを含み得る。さらに、医薬組成物は、本開示の組み換え発現系を含有するナノ粒子を含み得る。
【０１２４】
本明細書に記載されるような組み換え発現系、ベクター、細胞、またはウイルス粒子のうちの１つまたは複数、および担体を含む、それからなる、または実質的になる組成物も、本発明により提供される。いくつかの実施形態では、担体は薬学的に許容される担体である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組み換え発現系は、任意選択的に、ＰＡＭｍｅｒオリゴヌクレオチドの追加投与、すなわち開示されるシステムと、対応するＰＡＭｍｅｒとの同時または連続した同時期の投与を含むことができる。ＰＡＭｍｅｒオリゴヌクレオチド配列に関する選択技術は当技術分野において周知されており、また例えば国際公開第２０１５／０８９２７７号パンフレット（参照として本明細書にそのまま組み込まれている）に見出され得る。ＰＡＭｍｅｒは、いくつかの事例では、ＲＮＡに対するｄＣａｓ９のｉｎ  ｖｉｖｏならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合親和力を増加させ得るが、出願者らのこれまでの研究、国際公開第２０１７／０９１６３０号パンフレット（参照として本明細書にそのまま組み込まれている）では、ＲＮＡ認識および編集の実現においてＰＡＭｍｅｒは不要であることが驚くべきことに見出された。本明細書に記載の出願者らの送達戦略を単純化するため、および本明細書における開示システムを完全にコーディング可能なシステムとして維持するために、下記の実験をＰＡＭｍｅｒの不存在下で実施した。この機構の概略を図１Ａに要約する。
【０１２６】
本明細書に開示されるような組み換え発現系を使用する方法が、例えば狙いを定めた細胞ＲＮＡ編集がプロセッシングおよび動力学に与える効果を特徴づけるための研究ツールとして本明細書で開示される。
【０１２７】
例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでＲＮＡ編集するための組み換え発現系を送達して、そのような編集を必要とする疾患を治療するために、ウイルス（ＡＡＶ）またはその他のベクターに基づく送達アプローチを使用することにより、本明細書に開示されるような組み換え発現系を疾患治療薬として使用する方法が、本明細書にさらに開示される。
【０１２８】
標的および関連疾患の非限定的な例として、未成熟終止コドンＲＮＡ疾患、例えばハーラー症候群、嚢胞性線維症、デュシェンヌ筋ジストロフィー等、ならびにＲＮＡ編集における欠陥と関連した疾患、例えばＡＭＰＡサブユニットＧｌｕＡ２のＱ／Ｒ残基の過少編集が合併した興奮毒性のニューロン障害等が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。興奮毒性は、脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷、聴覚消失（ノイズへの過剰暴露または聴器毒性による）、および中枢神経系（ＣＮＳ）の神経変性疾患、例えば多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルコール中毒症またはアルコール離脱症候群、特に過急速ベンゾジアゼピン離脱症候群、およびハンチントン病等に関与し得る。
【実施例】
【０１２９】
下記の実施例は、本開示を有効に実施する際の様々な事例において使用可能である手順の非限定的および例証的な例である。さらに、本明細書おいて開示される下記参考資料のすべてが参考としてそのまま組み込まれている。
【０１３０】
１）生細胞において、１塩基特異的レベルでレポーターｍＲＮＡコンストラクトを認識および編集し、および２）生細胞において、ｅＧＦＰレポーター転写物からの発現について、未成熟終止コドン（ＰＴＣ）が媒介する発現停止を回復させる、出願者により生み出された組み換え発現系のプロトタイプについて以下に記載する（図１Ｃおよび図１Ｄを参照）。
【０１３１】
実施例１  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の核送達による細胞ＲＮＡの狙いを定めた編集
プラスミドの構築
ｄＣａｓ９−２ｘＮＬＳをコードする配列を、ｐＣＤＮＡ３．１−ｄＣａｓ９−２ｘＮＬＳ−ＥＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃７４７１０）からクローン化した。ＡＤＡＲ２−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９融合生成物の場合、ＸＴＥＮペプチドリンカーと融合したｄＣａｓ９配列、およびＡＤＡＲ２触媒ドメイン（ヒトＡＤＡＲ２  ＯＲＦからＰＣＲ増幅した）を、ギブソン・アセンブリを使用してｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）バックボーンに組み込んだ。ｄＣａｓ９部分を、ｄＣａｓ９−ＮＬＳ配列に隣接するプライマーを使用して逆ＰＣＲにより除去し、ＡＤＡＲ２−ＸＴＥＮ融合物を生成した。ＡＤＡＲ２−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９およびＡＤＡＲ２−ＸＴＥＮをテンプレートとしてそれぞれ使用して、ＰＣＲ媒介式の部位特異的な変異誘発を実施し、ＡＤＡＲ２−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９Ｅ４８８ＱおよびＡＤＡＲ２−ＸＴＥＮ  Ｅ４８８Ｑ変異バリアントを生成した。ＰＣＲ増幅およびＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用した制限酵素消化を通じて、すべての融合配列をｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローン化した。
【０１３２】
ｅｓｇＲＮＡバックボーンを構築するために、哺乳動物Ｅｆ１ａプロモーター、ｍＣｈｅｒｒｙ  ＯＲＦ、およびＢＧＨポリ（Ａ）シグナルに関する配列を、Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより駆動される改変されたｓｇＲＮＡスキャフォールド（Chen et al. 2013）を担持するｐＢｌｕｅＳｃｎｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）バックボーンにギブソン・アセンブルした。３’延長配列を担持するｓｇＲＮＡそれぞれを、スペーサーおよび延長配列を担持するテールドプライマーを使用して、改変されたｓｇＲＮＡスキャフォールドを増幅するＰＣＲ、ならびにＵ６プロモーターの下流に位置するｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）−ｍＣｈｅｒｒｙベクターにギブソン・アセンブルすることにより生成した。
【０１３３】
細胞系およびトランスフェクション
Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥＸ２９３を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ社）が補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で培養した。ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ社）を使用して、細胞を３〜４日毎に継代し、そして５％のＣＯ2を含む組織培養インキュベーター中、３７℃で維持した。
【０１３４】
安定でドキシサイクリン誘導可能な系統を、１０ｃｍの組織培養皿上に細胞を播種し、そしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用しながら、６０〜７０％の集密度で、ＦｌｐリコンビナーゼをコードするｐＯＧ４４（９μｇ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と共に、ＡＤＡＲ２融合コンストラクトを担持するｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（１μｇ）を用いて同時トランスフェクトすることにより生成した。その後、細胞を２５％の集密度まで継代し、そして４８時間後に、５μｇ／ｍｌのブラストサイジンおよび１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｇｉｂｃｏ社）を用いて選択した。個々のハイグロマイシン耐性コロニーが識別されるまで、細胞を選択条件下に留め、そして８〜１０個のコロニーを増殖およびバリデーション用に取り出した。
【０１３５】
トランスフェクションに先立ち、トランスフェクション当日の２４時間前に、細胞０．１×１０6個を２４ウェルプレート上に播種し、そしてドキシサイクリンと共に、１μｇ／ｍｌの最終濃度で２４時間プレインキュベートした。細胞を、次にリポフェクトアミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用しながら、３５０μｇのＷ５８Ｘ変異体またはＷＴｅＧＦＰレポーターコンストラクト（Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ  Ｌａｂからの寄贈）と共に、１５０μｇの各ｓｇＲＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙコンストラクトを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、画像検査およびＦＡＣＳ分析の前に、細胞をドキシサイクリン誘発条件下で４８時間保持した。Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を使用して、２０×倍率で画像を撮影した。
【０１３６】
フローサイトメトリー分析
標準的なプロトコールを使用して、細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓにより解離した。細胞を次に５％のＦＢＳが補充された１×ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中で再懸濁し、３５μｍのナイロンセルストレーナーに通過させ、そしてＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａまたはＡｃｃｕｒｉ装置（ＢＤ社）を使用してフローサイトメトリー分析を行った。細胞を適切に篩い分けし、そしてＧＦＰ（ＦＩＴＣ）蛍光について分析した。トランスフェクション効率について標準化するために、Ｗ５８Ｘ  ｅＧＦＰトランスフェクション集団に由来するＧＦＰ陽性細胞の割合を求め、そしてＷＴ  ｅＧＦＰレポーターにより代わりにトランスフェクトしたときのＧＦＰ陽性細胞の割合で割り算することにより、融合物−ｅｓｇＲＮＡの対毎に補正後のパーセントｅＧＦＰの個々の数値を算出した。ＦＡＣＳ分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行い、そしてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を使用してコンパイル後の結果をプロットした。
【０１３７】
考察
これらの実験では、非限定的に、上記組み換え発現系は、Ａ）ヒトＡＤＡＲ２タンパク質の触媒性デアミナーゼドメインに融合したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質をコードする核酸配列、およびＢ）Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより駆動される延長されたシングルガイドＲＮＡ（ｅｓｇＲＮＡ）配列を含む。該当するトランスフェクション試薬を用いて、システムを哺乳動物細胞の核に送達したが、ＲＣａｓ９−ＲＮＡ認識複合体を形成した後、配列は標的ｍＲＮＡと結合し、それを編集する。これは、標的アデノシン残基が、細胞機構によりグアノシンとして認識されるイノシンに脱アミノ化されるという、選択的ＲＮＡ編集を可能にする。
【０１３８】
上記システムにおいて記載される触媒的に活性なデアミナーゼドメイン（ＤＤ）は、野生型ヒトＡＤＡＲ２、または野生型ヒトＡＤＡＲ２と比較して、ＲＮＡ基質に対する酵素活性および親和性を増加させる変異（Ｅ４８８Ｑ）を担持するヒトＡＤＡＲ２  ＤＤのいずれかである。ＤＤを、そのＣ末端において半可動性ＸＴＥＮペプチドリンカーに融合させ、次にそのＮ末端においてｄＣａｓ９に融合させた（図１Ｂ）。ＲＮＡ認識非依存性のバックグラウンド編集をコントロールするために、ｄＣａｓ９部分を欠いている融合コンストラクトも作成した（ＡＸ、ＡＸ−４８８Ｑ）。
【０１３９】
ｅｓｇＲＮＡコンストラクトを、所望の編集部位においてほぼ完璧なＲＮＡ−ＲＮＡ塩基対を形成する能力を有する相同性の領域を含め改変した。相同性領域は標的アデノシンのミスマッチを含み、Ａ−Ｃミスペアリングを生じさせ、そして標的転写物上に「偽ｄｓＲＮＡ」基質を生成する（図１Ａ）。これは、プログラム可能なＲＮＡ基質認識、ならびに同時塩基特異的脱アミノ化の手段を生み出す。さらに、これらの改変されたｅｓｇＲＮＡコンストラクトを、マーカー遺伝子、例えば実施例に示すような別のＥｆ１ａ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターにより駆動されるｍＣｈｅｒｒｙコンストラクトをさらに含むベクター中にクローン化した。これは、ｅｓｇＲＮＡでトランスフェクトされた細胞についてフローサイトメトリーを使用するソーティング、さらには標的ＲＮＡ編集による細胞の富化を可能にした。
【０１４０】
実施例２  ｄＳｐＣａｓ９とｄＳａＣａｓ９  ＣＲＥＤＩＴシステムの比較
ｄＳａＣａｓ９は、ｄＳｐＣａｓ９より有意に小さく、ウイルスパッケージングにおいて効率性をもたらす。ＣＲＥＤＩＴシステムを、（１）ＧＳＧＳリンカーを用いたＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ）−ｄＳａＣａｓ９融合物（配列番号１２）、および（２）ＥＧＦＰレポーターを標的とする、ＳａＣａｓ９に特異的なスキャフォールド配列を有するｅｓｇＲＮＡ（配列番号１１）を含め、調製した。図１３Ｂに示すように、このシステムによるｍＲＮＡ編集効率を、ＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ）−ｄＳｐＣａｓ９を含むシステムと比較した。ＡＤＡＲ２−ｄＳｐＣａｓ９による約２０％と比較して、ＡＤＡＲ２−ｄＳａＣａｓ９では、標的細胞の約３０％が編集されたＥＧＦＰ  ＲＮＡを発現することに成功した。総じて、このデータは、ＡＤＡＲ２−ｄＳａＣａｓ９およびＡＤＡＲ２−ｄＳｐＣａｓ９の両方において編集が成功したことを示している。
【０１４１】
実施例３  肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型の治療
肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型は、ジスフェリン遺伝子内の欠陥により引き起こされる。対象内のジスフェリンｍＲＮＡを正確に修正する方法を開発することにより、完全に機能的なジスフェリンタンパク質が、この障害を有する患者内で発現され得る。
【０１４２】
本開示の組み換え発現系は、変異体ジスフェリンｍＲＮＡの簡便な修正を可能にする。開示されるＡＡＶ送達システムと組み合わせたとき、これらのシステムは、単回静脈内投与することであらゆる主要な筋肉を効率的に標的とするのに使用可能であり、また筋ジストロフィーを治療するための強力な治療戦略を提供する。ＡＡＶは骨格筋を標的とするのに最終的に使用されるので、骨格筋親和性を有するＡＡＶ、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９等を使用すべきである。
【０１４３】
ウイルス粒子は、本明細書に記載されるように調製される。要するに、実施例１に記載するように、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥＸ２９３細胞に、ベクターをトランスフェクトした。ｅｓｇＲＮＡは、対象のジスフェリンｍＲＮＡ内の変異遺伝子座を標的とするように設計される。ｅｓｇＲＮＡは、下記のジスフェリンｍＲＮＡのうちの１つまたは複数における変異を標的とするように設計可能である：ＮＭ＿００１１３０４５５、ＮＭ＿００１１３０９７６、ＮＭ＿００１１３０９７７、ＮＭ＿００１１３０９７８、ＮＭ＿００１１３０９７９、ＮＭ＿００１１３０９８０、ＮＭ  ００１１３０９８１、ＮＭ＿００１１３０９８２、ＮＭ＿００１１３０９８３、ＮＭ＿００１１３０９８４、ＮＭ＿００１１３０９８５、ＮＭ＿００１１３０９８６、ＮＭ＿０１１３０９８７、またはＮＭ＿００３４９４。いくつかの実施形態では、修正可能なＡ点変異の存在を確認するために、ｅｓｇＲＮＡの設計前に、対象のジスフェリンｍＲＮＡが配列決定される。ｅｓｇＲＮＡをコードする核酸が、適するベクターにクローン化される。パッケージング細胞のトランスフェクションの後で、アセンブルされたウイルス粒子が採取され、そしてＣａｓ９タンパク質の発現、ならびにｅｓｇＲＮＡの発現について試験される。パッケージングされたウイルスは、ウイルス力価についてもアッセイされ、該ウイルス力価は、約１０8ＧＣ／ｍＬ〜１０17ＧＣ／ｍＬの範囲であるべきであり、約１０13ＧＣ／ｍＬの力価が最適である。ウイルス力価は、ウェスタンブロットにより、またはｑＰＣＲによるウイルスゲノムコピー数によりアッセイ可能であり、そして標準サンプルのコピー数と比較可能である。
【０１４４】
改変されたウイルス粒子は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型を有する対象から得られた筋幹細胞または前駆細胞に、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与され得る。ウイルスベクターが組み込まれたら、改変された細胞は、筋肉内注射により対象に再移植される。改変されたＡＡＶで処置された細胞を用いた細胞療法の有効性は、筋肉形態の改善、多量体化したジストロフィン−糖タンパク質複合体およびニューロン一酸化窒素シンターゼの筋細胞膜局在化の減少、ならびにジスフェリン発現の検出により測定される。
【０１４５】
あるいは、ウイルス粒子は、例えば、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射等の局所送達または全身送達を通じて、筋肉組織にｉｎ  ｖｉｖｏで投与され得る。ウイルス遺伝子療法の有効性は、筋肉形態の改善、ならびにジスフェリン発現の検出により測定される。
【０１４６】
ＣＲＩＳＰＲ媒介式のＲＮＡ編集の有効性は、修復されたジスフェリンｍＲＮＡ断片の逆転写されたコピーを検出するＰＣＲプライマーを設計することによりアッセイされる。修復された遺伝子産物の発現は、治療された筋肉組織のＰＣＲ、組織学的染色、またはウェスタンブロットによっても検出可能である。
【０１４７】
実施例４  ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡの編集
嚢胞性線維症は、肺、膵臓、肝臓、腎臓、および腸に影響を及ぼす遺伝的障害である。長期的な症状として、多発する肺感染症の結果として生ずる呼吸困難および粘液吐出が挙げられる。その他の兆候および症状として、副鼻腔感染症、成長不良、脂肪便、指およびつま先の太鼓撥指形成、および不妊症を挙げることができる。嚢胞性線維症は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子内の変異により引き起こされる。対象内のＣＦＴＲ  ｍＲＮＡを正確に修正する方法を開発することにより、十分に機能的なＣＦＴＲタンパク質が、これらの患者内で発現され得る。
【０１４８】
本開示の組み換え発現系は、ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡの簡便な修正を可能にする。ＡＡＶまたはレンチウイルス等のウイルス送達システムと組み合わせた場合、このシステムは、患部組織を有効に標的とし、また嚢胞性線維症を治療するための強力な治療戦略を提供するのに使用可能である。肺親和性を有するＡＡＶとして、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１４９】
ｅｓｇＲＮＡは、対象のＣＴＦＲ  ｍＲＮＡ内の変異遺伝子座を標的とするように設計される。いくつかの実施形態では、修正可能なＡ点変異の存在を確認するために、ｅｓｇＲＮＡの設計前に対象のＣＦＴＲ  ｍＲＮＡが配列決定される。ｅｓｇＲＮＡをコードする核酸が、適するベクターにクローン化される。適するＣＦＴＲ標的スペーサー配列の非限定的な例は、配列番号４３である。適するＣＦＴＲ延長配列の非限定的な例は、配列番号４４である。ＣＦＴＲを標的とするｅｓｇＲＮＡを含むレンチウイルスのプラスミドの非限定的な例は、ＬＣＶ２＿ｐｕｒｐｏ＿ＣＦＴＲ＿５１＿１２１７＿ギブソン（配列番号３５）である。
【０１５０】
パッケージング細胞のトランスフェクション後、アセンブルされたウイルス粒子が採取され、そしてＣａｓ９タンパク質の発現、ならびにｅｓｇＲＮＡの発現について試験される。パッケージングされたウイルスは、ウイルス力価についてもアッセイされ、該ウイルス力価は、約１０8ＧＣ／ｍＬ〜１０17ＧＣ／ｍＬの範囲にあるべきであり、約１０13ＧＣ／ｍＬの力価が最適である。ウイルス力価は、ウェスタンブロットにより、またはｑＰＣＲによるウイルスゲノムコピー数によりアッセイ可能であり、そして標準的なサンプルのコピー数と比較可能である。
【０１５１】
ウイルス粒子は、例えば、腹腔内注射、臓器標的注射、または静脈内注射等の局所送達または全身送達を通じて、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与され得る。ウイルス遺伝子療法の有効性は、肺機能の改善、嚢胞性線維症の１つもしくは複数の症状の軽減もしくは改善、および／または修正されたＣＦＴＲタンパク質発現の検出により測定される。
【０１５２】
ＣＲＩＳＰＲ媒介式のＲＮＡ編集の有効性は、修復されたＣＦＴＲ  ｍＲＮＡ断片の逆転写されたコピーを検出するＰＣＲプライマーを設計することによりアッセイされる。修復された遺伝子産物の発現は、治療された肺組織のＰＣＲ、組織学的染色、またはウェスタンブロットによりやはり検出可能である。
【０１５３】
実施例５  ＩＤＵＡ  ｍＲＮＡの編集
ハーラー症候群は、リソゾーム内でのムコ多糖の分解に関与する酵素であるα−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）の欠陥に起因して、グリコサミノグリカンの蓄積を引き起こす遺伝的障害である。この酵素がなければ、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の蓄積が体内で生ずる。症状として、肝脾腫、低身長症、特有の顔つき、進行性の精神遅滞、および臓器障害に起因する早期死亡が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１５４】
本開示の組み換え発現系は、ＩＤＵＡ  ｍＲＮＡの簡便な修正を可能にする。ＡＡＶまたはレンチウイルス等のウイルス送達システムと組み合わせたとき、このシステムは、ハーラー症候群を治療するための強力な治療戦略を提供するのに使用可能である。
【０１５５】
ｅｓｇＲＮＡは、対象のＩＤＵＡ  ｍＲＮＡ内の変異体遺伝子座を標的とするように設計される。いくつかの実施形態では、修正可能なＡ点変異の存在を確認するために、ｅｓｇＲＮＡの設計前に対象のＩＤＵＡ  ｍＲＮＡが配列決定される。ｅｓｇＲＮＡをコードする核酸が、適するベクターにクローン化される。適するＩＤＵＡ標的スペーサー配列の非限定的な例は、配列番号４５である。適するＩＤＵＡ延長配列の非限定的な例は、配列番号４６である。ＩＤＵＡを標的とするｅｓｇＲＮＡを含むレンチウイルスプラスミドの非限定的な例は、ＡＸＣＭ＿ＬＣＶ２＿ｐｕｒｏ＿ＩＤＵＡ＿Ｎｏ−ｓｐａｃｅｒ＿ｇｉｂｓｏｎ（配列番号３９）である。
【０１５６】
パッケージング細胞のトランスフェクション後、アセンブルされたウイルス粒子が採取され、そしてＣａｓ９タンパク質の発現、ならびにｅｓｇＲＮＡの発現について試験される。パッケージングされたウイルスは、ウイルス力価についてもアッセイされ、該ウイルス力価は、約１０8ＧＣ／ｍＬ〜１０17ＧＣ／ｍＬの範囲であるべきであり、約１０13ＧＣ／ｍＬの力価が最適である。ウイルス力価は、ウェスタンブロットにより、またはｑＰＣＲによるウイルスゲノムコピー数によりアッセイ可能であり、そして標準的なサンプルのコピー数と比較され得る。
【０１５７】
ウイルス粒子は、例えば、静脈内注射等の全身送達を通じてｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与され得る。ウイルス遺伝子療法の有効性は、対象内のヘパリン硫酸の量の減少、ハーラー症候群の１つもしくは複数の症状の軽減もしくは改善、および／または修正されたＩＤＵＡタンパク質の発現の検出により測定される。
【０１５８】
ＣＲＩＳＰＲ媒介式のＲＮＡ編集の有効性は、修復されたＩＤＵＡ  ｍＲＮＡ断片の逆転写されたコピーを検出するＰＣＲプライマーを設計することによりアッセイされる。修復された遺伝子産物の発現は、治療された組織のＰＣＲ、組織学的染色、またはウェスタンブロットにより、やはり検出可能である。
【０１５９】
等価物
本発明は好ましい実施形態および任意選択的な特性によって特別に開示されてきたが、本明細書において開示されるような、そこで具体化される本発明の改変、改善、および変更は、当業者によってなし得ること、およびそのような改変、改善、および変更は本発明の範囲内にあるとみなされるものと理解すべきである。ここで提示される物質、方法、および実施例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的であり、および本発明の範囲に対する制限とは意図されない。
【０１６０】
本発明は、本明細書において、広範囲にわたり、一般的に記載されている。一般的な開示の範囲内に含まれるより狭い種および亜属のグルーピングのそれぞれもまた本発明の一部をなす。これには、切り取られた物質が本明細書において特別に列挙されているまたはいないに関わらず、属から任意の主題を除去するただし書きまたは否定的限定を伴う本発明の一般的な説明が含まれる。
【０１６１】
さらに、本発明の特徴または側面が、マーカッシュ群において記載されている場合、当業者は、本発明は、マーカッシュ群のメンバーを構成する任意の個々のメンバーまたはサブグループにおいても記載されているものと認識する。
【０１６２】
本明細書に記載されるすべての公開資料、特許出願、特許、およびその他の参考資料は、あたかもそのそれぞれが参考として個別に組み込まれているかのように、それと同じ程度で参考としてそのまま明示的に組み込まれている。矛盾する場合、本明細書が、定義を含め、コントロールする。
【０１６３】
【表６】
2020519269.tif 000019
【０１６４】
配列
本明細書に記載される構築物の例示的配列を以下に提供する。
【０１６５】
【表７】
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【０１６６】
【表８】
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【０１６７】
【表９】
2020519269.tif 000036
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【０１６８】
【表１０】
2020519269.tif 000046
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【０１６９】
【表１１】
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【０１７０】
【表１２】
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【０１７１】
【表１３】
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【０１７２】
【表１４】
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【０１７３】
【表１５】
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【０１７４】
【表１６】
2020519269.tif 000078
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【０１７５】
【表１７】
2020519269.tif 000087
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【０１７６】
【表１８】
2020519269.tif 000097
2020519269.tif 000098
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2020519269.tif 000104
2020519269.tif 000105
【図１】
2020519269.tif 000106
【図２】
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【図３】
2020519269.tif 000108
【図４】
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【図５】
2020519269.tif 000110
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【国際調査報告】
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