【手続補正書】
【提出日】平成28年12月27日(2016.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
図１においては、下位分類決定プログラム３５に係るように、スペクトル取得部３７、m/z読み取り部３８、及び下位分類判定部３９が示されている。これはいずれも基本的にはＣＰＵ２１が下位分類決定プログラム３５を実行することによりソフトウェア的に実現される機能手段である。なお、下位分類決定プログラム３５は必ずしも単体のプログラムである必要はなく、例えば種決定プログラム３３や、質量分析部１０を制御するためのプログラムの一部に組み込まれた機能であってもよく、その形態は特に問わない。なお、種決定プログラム３３としては、例えば、従来のフィンガープリント法による微生物識別を行うプログラム等を利用することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
（２）タンパク質質量データベースの構築
リボソームサブユニットタンパク質及びバイオマーカー候補のタンパク質のアミノ酸配列を、米国の国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information、ＮＣＢＩ）のデータベースより入手した。各タンパク質の計算質量の算出には、スイス生物情報科学機構により提供されるExPASyプロテオミクスサーバーのCompute pI/Mw tool を使用した。このとき、最後から２番目のアミノ酸残基がGly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, 又はCysである場合には、Ｎ−末端メチオニンが切断されるものとして前記計算質量を算出した。なお、ゲノム未解読の株については、S10-spc-alphaオペロンにコードされるリボソームタンパク質、及びバイオマーカー候補のタンパク質のＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンシングにより決定した。具体的には、リボソームタンパク質遺伝子の領域（〜5kbp）及びバイオマーカータンパク質の領域を、それぞれＮＣＢＩのデータベースより入手した大腸菌ゲノム解読株の対象領域の上流及び下流のコンセンサス配列に基づいて設計したプライマーを使用し、高正確性（high fidelity）ＤＮＡポリメラーゼであるKOD plus（東洋紡，大阪, 日本）を用いたＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）によって増幅した。ＤＮＡシークエンシングは、Big Dye ver. 3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライド・バイオシステムズ, Foster City, カリフォルニア州）を用いて行った。ＰＣＲ及びＤＮＡシークエンシングに使用したプライマーを図５及び図６に示す。
以上で得られた上記５０菌株の塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号１〜２８に示す。各配列番号に対応する配列の概要は以下の通りである。
配列番号１：Ｏ１５７におけるＳ１５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号２：その他の大腸菌１（NBRC13893以外の非Ｏ１５７菌株）におけるＳ１５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号３：その他の大腸菌２（NBRC13893）におけるＳ１５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号４：Ｏ１５７におけるＳ１５のアミノ酸配列。
配列番号５：前記その他の大腸菌１におけるＳ１５のアミノ酸配列。
配列番号６：前記その他の大腸菌２におけるＳ１５のアミノ酸配列。
配列番号７：Ｏ１５７におけるＬ２５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号８：その他の大腸菌３（NBRC 15034, NBRC 14237,ATCC BAA-1743, JCM16575以外の非Ｏ１５７菌株）におけるＬ２５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号９：その他の大腸菌４（NBRC 15034, NBRC 14237,ATCC BAA-1743, JCM16575）におけるＬ２５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号１０：Ｏ１５７におけるＬ２５のアミノ酸配列。
配列番号１１：前記その他の大腸菌３におけるＬ２５のアミノ酸配列。
配列番号１２：前記その他の大腸菌４におけるＬ２５のアミノ酸配列。
配列番号１３：Ｏ１５７におけるＨｄｅＢのＤＮＡ塩基配列。
配列番号１４：その他の大腸菌５（上記５０菌株の内の非Ｏ１５７菌株全て）におけるＨｄｅＢのＤＮＡ塩基配列。
配列番号１５：Ｏ１５７におけるＨｄｅＢのアミノ酸配列。
配列番号１６：前記その他の大腸菌５におけるＨｄｅＢのアミノ酸配列。
配列番号１７：Ｏ２６及びＯ１１１におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号１８：その他の大腸菌６（NBRC 3301, NBRC 3972, NBRC 13891, GTC 14518, GTC 14529, GTC 14603）におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号１９：その他の大腸菌７（NBRC 3548, NBRC 12734, GTC 14602, NBRC 13168, GTC 14530, GTC 14601）におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号２０：その他の大腸菌８（NBRC 14237, NBRC 15034）におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号２１：その他の大腸菌９（NBRC 13893）におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号２２：その他の大腸菌１０（上記その他の大腸菌６〜９以外の非Ｏ２６・Ｏ１１１菌株）におけるＨ−ＮＳのＤＮＡ塩基配列。
配列番号２３：Ｏ２６及びＯ１１１におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
配列番号２４：前記その他の大腸菌６におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
配列番号２５：前記その他の大腸菌７におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
配列番号２６：前記その他の大腸菌８におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
配列番号２７：前記その他の大腸菌９におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
配列番号２８：前記その他の大腸菌１０におけるＨ−ＮＳのアミノ酸配列。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
以上の結果、S10-spc-alphaオペロンにコードされるリボソームタンパク質のうち、図７及び図８に示されていないもの、すなわちＳ１０、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ２３、Ｓ１９、Ｌ２２、Ｓ３、Ｌ１６、Ｌ２９、Ｓ１７、Ｌ１４、Ｌ５、Ｓ８、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ３０、Ｌ３６、Ｓ１１、Ｓ４、及びＬ１７については計算質量がいずれの菌株でも同一であった。また、Ｌ２４、Ｓ５、及びＳ１３は、その計算質量からバイオマーカーの候補と考えられたが、質量差が小さかったり、分子量が大きすぎたりしたためにピーク形状が不明瞭であり、安定的なバイオマーカーとしては不適当であった。一方、リボソームタンパク質Ｓ１５とＬ２５については、GTC 14550とGTC14553を除く全てのＯ１５７の菌株において、他の大腸菌（例えばＫ−１２グループ）と比べて特有且つ明確な質量シフトが観測された（図９参照）。また、同図に示すように、これらのタンパク質のピークの強度及び鮮鋭度はＯ１５７と他の大腸菌とを区別するのに十分なものであった。このことは、マトリックス溶液にシナピン酸を用いた場合でもＣＨＣＡを用いた場合でも同様であり、更にコロニーから直接採取した菌体を用いた場合でも液体培地から抽出してギ酸に懸濁した菌体を用いた場合でも同様であった。これらタンパク質のＤＮＡ塩基配列によると、Ｏ１５７に特異的な、リボソームタンパク質Ｓ１５におけるＡ２３９Ｇの点変異がＱ８０Ｒのアミノ酸残基の変化を生じており、その結果、該タンパク質のm/zが10138.6から10166.6に変化していた。同様に、Ｏ１５７に特異的な、リボソームタンパク質Ｌ２５におけるＧ１５０Ａの点変異がＭ５０Ｉのアミノ酸残基の変化を生じており、その結果、該タンパク質のm/zが10694.4から10676.4に変化していた。なお、これら２つのリボソームタンパク質は、NBRC 13893, NBRC 15034, NBRC 14237, ATCC BAA-1743,及びJCM16575の計算質量においても質量シフトが見られた（図７及び図８参照）が、シフト量が非常に小さいため実際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析ではこれらは他の大腸菌と区別できなかった。