(57)【要約】植物のタンパク質、特に穀物胚乳における組換え抗体全体の安定生産のための発現ベクターであって、遺伝子発現において同じ方向と同じ制御および調節要素を有する抗体のポリペプチド軽鎖（Ｌ）の発現カセットとポリペプチド重鎖（Ｈ）の発現カセットを含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
穀物の胚乳における組換え抗体全長の安定生産のための発現ベクターであって、前記発現ベクターは単一ベクターで、
−抗体のポリペプチド軽鎖（Ｌ）の発現カセット、
−抗体のポリペプチド重鎖（Ｈ）の発現カセット、
を含み、同じ向きおよび同じ遺伝子発現の調節要素を有し、ポリペプチド軽鎖（Ｌ）およびポリペプチド重鎖（Ｈ）の前記発現カセットは、
ａ）植物のゲノムに一体的に挿入されたＤＮＡセグメント内で機能的にリンクされ、
ｂ）以下の遺伝子発現の調節要素をそれぞれ含み、
ｉ）天然または人工由来の胚乳特異的プロモーター、
ｉｉ）天然または人工由来のリーダー配列（５’−ＵＴＲ）、
ｉｉｉ）胚乳を構成する細胞の小胞体の内腔内に組換えポリペプチド鎖を通過させる天然または人工由来のシグナルペプチド、
ｉｖ）抗体の軽（Ｌ）または重（Ｈ）それぞれの成熟型ポリペプチド鎖をコードする天然または人工由来のヌクレオチド配列、
ｖ）天然または人工由来のトレーラー配列（３’− ＵＴＲ）、
遺伝子発現の調節要素ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）およびｖ）は、ポリペプチド軽鎖（Ｌ）およびポリペプチド重鎖（Ｈ）の前記発現カセット間で同一である。
【請求項２】
前記穀物はイネである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
天然または人工由来の前記胚乳特異的プロモーターｉ）は、配列番号２に示すイネグルテリン４遺伝子（ＧｌｕＢ−４）のプロモーターである、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記リーダー配列５’−ＵＴＲ  ｉｉ）は合成的性質のものであり、配列番号３に示す反復ＣＡＡトリヌクレオチド要素および翻訳開始部位の認識のためのコンセンサス配列ＡＧＣＣＡＴＧＧＣを特徴とする、請求項２または３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
シグナルペプチドｉｉｉ）のヌクレオチド配列は、小胞体内にグルテリン４前駆体（ＰＳＧｌｕＢ−４）をターゲットするためにイネで使用されるシグナルペプチドをコードする配列番号４に対応する、請求項２、３、または４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記トレーラー配列３’−ＵＴＲ  ｖ）は、配列番号７に示すＮＯＳターミネーター、またはイネＧｌｕＢ−４遺伝子のターミネーターである、請求項２乃至５の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
抗体の軽（Ｌ）または重（Ｈ）の成熟型ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列ｉｖ）は、配列番号５および配列番号６にそれぞれ示す抗体Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの軽（Ｌ）および重（Ｈ）ポリペプチド鎖をコードする配列により表される、請求項２乃至６の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記ベクターは、形質転換植物の選択を可能にするさらなる発現カセットを含む、請求項１乃至７の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項９】
抗体の軽（Ｌ）または重（Ｈ）ポリペプチド鎖をコードする配列が、優先的な種特異的同義コドンの使用により穀物での発現に最適化されている、請求項１乃至８の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記ベクターは、
−天然または人工由来の構成的プロモーター、
−天然または人工のバージョンで同義の選択マーカーをコードする配列、
−植物発現システムに適した天然または人工由来のターミネーター、
を含む形質転換植物細胞の選択のための発現カセットを含む、請求項１乃至９の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記単一発現ベクターが配列番号１に示す配列を有する、請求項１乃至１０の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１乃至１１の何れか一項に記載の発現ベクターを含む細菌株。
【請求項１３】
請求項１乃至１１の何れか一項に記載の発現ベクターおよびＶｉｒ領域を有する相補的ベクターからなるアグロバクテリウム種によって媒介される形質転換のためのバイナリーシステム。
【請求項１４】
請求項１乃至１１の何れか一項に記載の発現ベクターにより形質転換された植物細胞、植物および植物種子。
【請求項１５】
治療的処置における直接的または間接的な使用のための、請求項１４に記載の形質転換された植物細胞、植物および植物種子。
【請求項１６】
穀類胚乳における組換え抗体全長の安定生産のための方法であって、前記方法は、
−請求項１乃至１１の何れか一項に記載の植物の遺伝的形質転換のための分子ベクターの構築
−形質転換された種子の工業的処理、
−目的とする抗体の抽出および精製、を含む。
【請求項１７】
安定的に産生される組換え抗体全長の収量が、胚乳１キログラム当たり抗体０．６グラムを超える、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載される実施形態は、植物における医薬品タンパク質の工業生産、特に穀物種の胚乳内部での抗体全長の合成および蓄積を目的とする遺伝子工学操作に関する。特に、本明細書に記載される実施形態は、植物におけるヒトまたは動物のタンパク質、特に穀物胚乳における組換え抗体全長の安定した産生のための発現ベクターおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモン、サイトカイン、ワクチンとともに、抗体は治療および診断用途に登録されているバイオ医薬品の主要なクラスの１つであることが知られている。まだ開発段階にあるバイオ医薬品が検討される場合、抗体全体がさらに重要な意味を持つ。抗体または免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、２本は重（Ｈ）、２本は軽（Ｌ）で、互いに同一である４本のポリペプチド鎖で構成される４次構造を持つタンパク質である。免疫系の枠組みでは、抗原決定基またはエピトープとして知られている高分子の一部を認識することにより、ウイルスや細菌などの異物を中和する機能がある。抗体全長と並んで、Ｆａｂフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇの頭字語）、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅの頭字語）、ｓｃＦｖ二量体、ミニ抗体、単一可変鎖のドメインなど、いくつかの抗体様分子が開発されている。
【０００３】
それらの特性により、抗体は、多くのヒトの病状（関節炎、腫瘍、自己免疫疾患、炎症状態など）の予防、検出、治療に広く使用されている。組換え抗体の開発は、リスクのある患者の受動免疫法への道を開いた。受動免疫法は、抗生物質耐性細菌株の出現頻度の増加と新しい病原体の出現を考慮すると、興味深い治療代替法である。
【０００４】
組換え抗体の工業的規模での生産は、適切なバイオリアクターでの遺伝的に形質転換された哺乳類細胞の無菌培養に本質的に基づいている。特に、ＣＨＯシステム（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓの頭字語）は、ヒト適合性のグリコシル化プロファイルを備えた正しく組み立てられた抗体全長を生成する能力があるため、最も広く普及している。しかしながら、このシステムには、高い投資と運用コスト、最終生産規模への到達の遅れ、病原菌（細菌、ウイルス、マイコプラズマ）、毒素、プリオンによる培養物と製品の汚染の潜在的なリスクなど、多くの問題がある。この分野で事業を展開している業界によって何度か提示された楽観的な予測にもかかわらず、抗体のミリグラム（ｍｇ）当たりの価格は過去１０年間ほぼ一定であり、イタリア医薬品庁は欧州医薬品庁と合致して、大規模生産のための代替システムの開発を求めている（ＡＩＦＡ、２０１３年）。
【０００５】
組換えタンパク質の生産において植物が提供する可能性は長い間知られており、広く文書化されている(Giddings, 2001; Obembe et al., 2011; Stoeger et al., 2014)。植物から生産された組換え抗体は臨床使用のためにこれまで登録されていないが、植物種によるＩｇＧの効果的な生産能力を示す多くの実験的証拠がある(Hiatt et al., 1989; During et al., 1990; Conrad and Fiedler, 1994; Ma et al., 1998; Ma et al., 2003; Nicholson et al., 2005; Stoeger et al., 2005; Ramessar et al., 2008; Villani et al., 2009; De Muynck et al., 2010; Vamvaka et al., 2016). E. Torres et al. (2001)はまた、植物における組換えおよび非組換えタンパク質の蓄積についても説明している。
【０００６】
現在の先行技術では、宿主細胞内での発現に関して、ポリペプチド軽鎖Ｌとポリペプチド重鎖Ｈは別々に考慮されるため、それらの合成に関連する遺伝情報を運ぶ分子ベクターは区別され、および/またはコード配列の転写と翻訳を制御する要素は互いに一致しない。したがって、軽鎖Ｌおよび重鎖Ｈは４次構造を持つ分子の一部として認識されるが、先行技術では、対応する分子発現カセットは独立して構築され、植物の遺伝的形質転換の手順は構造的および機能的に相関しない２つのタンパク質を発現するために通常使用されるものである。図１３に示す表は、ポリペプチド鎖Ｌ（ＣＤＳ−Ｌ）およびＨ（ＣＤＳ−Ｈ）をコードする配列の構成の一般的なスキームを示す。
【０００７】
先行技術によれば、各ＣＤＳ（コーディング配列）の上流にはプロモーターおよびリーダー配列が配置され、下流にはターミネーターが存在する。ＣＤＳの発現の調節要素の性質および特定の特徴は、使用されるベクターにおいても異なり、宿主植物および抗体の最終的な発現が意図される組織にも依存する。発現カセットは、物理的または生物学的方法を使用した植物の遺伝的形質転換に使用されるプラスミドまたはウイルスベクター内に含まれている。ほとんどの場合、宿主植物種はニコチアナ種に代表され、最終的な抗体は、葉、特に葉の葉肉の細胞で発現される。組換え抗体の細胞内局在は、小胞体、アポプラストまたは液胞の内腔に対応し得る。
【０００８】
先行技術によれば、同じ細胞内での軽鎖Ｌと重鎖Ｈの共存は、共形質転換（つまり、異なる分子ベクターの併用）によって、あるいは、一方または他方の鎖を別々に発現させることによる植物の形質転換（分子ベクターのばらばらの使用）に続く、異なるタイプの植物間のハイブリダイゼーションによる。図１４は、宿主細胞においてＨ鎖とＬ鎖の結合した存在を得るために最も広く使用されているスキームを示す。これらは、分子カセットを必然的または潜在的にトランス配置する手順である。
【０００９】
ただし、使用する手順に関係なく、科学および技術文献は一般に肯定的な結果を示している。組換え抗体は、実際には形質転換植物によって産生され、標的抗原を認識して結合することができる。また、抗体収量に関しても、植物で得られたデータは満足できるものである。
【００１０】
しかし、生産ラインの選択手順の簡素化と、診断または治療目的に使用できる抗体のより迅速な開発経路を得るために、植物で得られる抗体の収量を大幅に増やす必要がある。
【００１１】
先行技術では、植物で抗体全長を得るために異なる戦略が使用されており、各戦略には一般的および特定のタイプの重要な因子が含まれている。それらを示すために、異なる一次形質転換体内において各ポリペプチド鎖（Ｈ、Ｌ）をばらばらに合成するための遺伝情報を運ぶベクターによる植物の形質転換を想定する方法論を最初に調べることが有用である。抗体全長を取得するには、一次形質転換体からの自己受精または半数体型の産生によって生成された純粋なホモ接合系統を交配することにより、ハイブリッドを取得する。この手順は、特定の単子葉植物および双子葉植物種で広く使用されている場合でも、それが伴う範囲で異なるカウンターインディケーション（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）を有する。１．一次形質転換体を選択するのがより困難な作業（鎖毎にそれぞれ異なる検出方法を採用する必要があるため複雑になる）、２．個々の導入遺伝子のホモ接合状態を決定する負担。またこれは、正しく組み立てられ、生物学的に活性な抗体全長の産生の証拠がない場合も含む、３．ハイブリッドを作成するための制御された手動交配の実行、４．両方の導入遺伝子の最終的なホモ接合生産ラインをリリースすることを目的としたさらなる選択介入。
【００１２】
上記の方法のバリアントは、一次形質転換体を交配させることによるハイブリッドの産生と、その後の抗体全長の検出による産物の選択を伴う。純粋に技術的な意味で作業が非常に単純化されている場合、一次形質転換体は常に導入遺伝子のヘミ接合性であり、方法論的な観点からはそれほどではなく、いくつかのゲノム挿入部位が存在する場合、この状態は複数になる可能性がある。交差する親の予備知識がない場合、選択プログラムを大きく広げる必要がある。なぜなら、交差する親はそれぞれ異なる配偶子を生成し、配偶子のランダムな接合は不均一な子孫の形成につながり、この子孫は導入遺伝子の独立した形態または関連する形態での分離のために、さまざまな子孫を生成するようになる。
【００１３】
植物で抗体を生産するために使用される２番目の戦略は、異なるベクターからの導入遺伝子を同時挿入するために同時形質転換法を適用することを提供する。上記のバリアントと比較して、この手順では１世代の時間を節約することができるが、導入遺伝子が同じ染色体部位で頻繁に共統合し、遺伝子サイレンシングプロセスを引き起こす逆または直接タンデム構造を生成するという悪化した状況により、方法論的な制限が維持される(Meyer and Saedler, 1996; Ye and Signer, 1996; Muskens et al., 2000; Stam et al., 2000; Wang and Waterhouse, 2000; De Buck et al., 2001; Ma and Mitra, 2002; Lechtenberg et al., 2003; Fojtova et al., 2006; Skarn et al., 2006; Mlotshwa et al., 2010; Otagaki et al., 2011; Martinez De Alba et al., 2013; Ramkumar et al., 2015)。さらに、セクションの損失または獲得を伴う分子発現カセットの再構築の可能性があり、これらのイベントは、完全なゲノムシーケンシングを通じてのみ識別され、必要な規制要件の欠如により、生産ラインの放棄を引き起こす。特に、工業レベルの抗体の合成に使用できる生産ラインを開発するためには、物理的因子（バイオリスティック、エレクトロポレーション）に基づく共形質転換法は、しばしば複数コピーの導入遺伝子の複数の挿入部位への挿入を決定するため非常に不適切である。バイオリスティック方法の例は、Rademacher et al., 2008に記載されている。
【００１４】
要約すると、Ｈ鎖とＬ鎖の組み合わせ発現のための分子ベクターの同時使用による同時形質転換は、トランスまたはシス配置の形成をもたらす可能性があるが、どちらの場合も鎖の生産の不均衡と遺伝子サイレンシング現象の確立のため、抗体全体の発現と生産ラインの選択は問題となる。
【００１５】
他の技術的解決策は、ウイルス発現ベクターによるＩｇＧの産生、またはアグロバクテリウムの操作された株による葉組織の浸潤後の抗体の一時的な合成を提供する。これらの方法は、生産されたポリペプチド鎖のバイオセーフティと信頼性の問題を抱えているだけでなく、高等胞子体植物（被子植物および裸子植物）の安定した形質転換に固有の方法とバイオテクノロジー製品の品質のみを評価する現在のヨーロッパの法律ではカバーされていない（ＥＭＡ、２００８年）。これにより、産業上の利用可能性に関して上記の方法の実質的な無関係性が決定される。
【００１６】
Zhong Huang et al. (2010)では、ニコチアナ  ベンサミアナの葉での一過性発現に使用されるウイルス発現ベクターについて説明している。
【００１７】
これらの前提に基づいて、最終生産ラインが同じ細胞コンパートメント内で高くおよび基本的に等モル量の２つのポリペプチド鎖ＨおよびＬを発現することが望ましいことに留意すべきである。実際、２鎖間の強い定量的不一致は、２つの成分の１つが不足し、異常な分子の産生とのそのアセンブリにおける干渉の可能性があるため、必然的に抗体の最終収量の低下につながる。ＨおよびＬ鎖の異なる発現レベルを決定できる要因には、導入遺伝子の挿入部位（位置効果）、導入遺伝子のコピー数、分子発現カセットの特定の組成がある。
【００１８】
図１５は、位置効果の例を模式的に示している：エンハンサー要素（Ｅ）、サイレンサー（Ｓ）、およびメチル化ＤＮＡ（ＭＥ）を含む領域によって生成される干渉により、Ｌ鎖とＨ鎖の合成に関する情報を持つ導入遺伝子が別々に発現される。
【００１９】
前述したように、繰り返される外因性ＤＮＡ配列の使用、または、一方または両方の導入遺伝子の複数のコピーの挿入に続くそれらの形成は、挿入されたセグメントのサイレンシング、またはあまり好ましくないが、導入遺伝子の発現の減少および不安定性という依然として否定的な状況を引き起こす。これらの現象は、ゲノム内の挿入位置に関係なく発生し、逆方向だけでなく直接的なタンデムリピートの生成に関連している。したがって、現在の先行技術では、植物で抗体全長を生産することを目的とする場合、遺伝子発現の制御要素（プロモーター、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ）の異なる組成を特徴とする発現カセットを保持するベクターが使用されることが予想される。この解決策は、先行技術において導入遺伝子の効果的な発現の観点から必要であると認識されているにもかかわらず、高い生産能力を備えた純粋で安定した系統を得るのにかなりの困難を伴う。実際、ポリペプチド鎖ＨおよびＬの同期的かつ協調的な発現をプログラムすること、さらにはそれを取得することは難しいという点において、分子カセットのすべての構成要素は、導入遺伝子の発現レベルに異なる特定の方法で影響を与えることが可能であることが知られている。抗体発現が得られる植物または組織の生理学的条件が変化するにつれて、発現カセットがそれぞれいくつかの相互依存する成分で構成され、異なる活性を持つと考えると、問題はさらに明らかになる。特に、誘導性プロモーターは共通の誘導因子または異なる誘導因子によって異なるように活性化され、組織特異的なプロモーターは同じフェーズ依存性（ｐｈａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）または同じ転写活性を示さず、一方、構成的プロモーターは器官、組織、発達段階および植物の成長条件によって異なる転写強度を示す。
【００２０】
したがって、先行技術の欠点の少なくとも１つを克服できる、植物タンパク質、特に穀物胚乳における組換え抗体全長の安定生産のための発現ベクターおよび方法を完成させる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
特に、本発明の１つの目的は、植物、特に単子葉植物、特に穀物種の胚乳内部での抗体全長の工業的生産のための発現ベクターおよび方法を完成させることであり、これにより、使用されるベクターの数とタイプ、選択されたベクターシステム、逆方向あるいは直接的なタンデム構造での反復ＤＮＡ配列の存在から生じる遺伝子サイレンシング、遺伝子形質転換手順、および軽Ｌおよび重Ｈポリペプチド鎖の合成に使用される遺伝子発現の制御要素に関して先行技術に言及される特徴が改善される。これは、高発現と、関連する抗体分子の特定の組織およびサブ組織の局在化を得るためである。
【００２２】
出願人は、欠点を克服し、先行技術の特徴を改善し、治療分子の生産のために工業レベルで使用可能な組換え抗体の生産のためのより効率的なシステムを得るために、本発明を考案、試験、および実施した。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、独立請求項に記載され、特徴付けられているが、従属請求項は、本発明の他の特徴または主要な発明思想の変形を記載している。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、植物におけるヒトまたは動物のタンパク質、特に穀物胚乳中の組換え抗体全長の安定生産のための発現ベクターが提供される。一実施形態によれば、発現ベクターは、以下を含む単一のベクターである：
−抗体のポリペプチド軽鎖（Ｌ）の発現カセット、
−抗体のポリペプチド重鎖（Ｈ）の発現カセット、
を含み、同じ向きおよび同じ遺伝子発現の調節要素を有する。
【００２５】
可能な実施形態によれば、ポリペプチド軽鎖（Ｌ）およびポリペプチド重鎖（Ｈ）の発現カセットは、
ａ）植物のゲノムに一体的に挿入されたＤＮＡセグメント内に、特に同じ頭尾方向に従って挿入され、機能的にリンクされ、
ｂ）以下の遺伝子発現の調節要素をそれぞれ含み、
ｉ）天然または人工由来の胚乳特異的プロモーター、
ｉｉ）天然または人工由来のリーダー配列（５’−ＵＴＲ）、
ｉｉｉ）胚乳を構成する細胞の小胞体の内腔内に組換えポリペプチド鎖を通過させる天然または人工由来のシグナルペプチド、
ｉｖ）抗体の軽（Ｌ）または重（Ｈ）それぞれの成熟型ポリペプチド鎖をコードする天然または人工由来のヌクレオチド配列、
ｖ）天然または人工由来のトレーラー配列（３’−ＵＴＲ）、
遺伝子発現の調節要素ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）およびｖ）は、ポリペプチド軽鎖（Ｌ）およびポリペプチド重鎖（Ｈ）の発現カセット間で同一である。
【００２６】
他の可能な実施形態によれば、穀物はイネである。
【００２７】
さらに、可能な実施形態によれば、天然または人工由来の胚乳特異的プロモーターｉ）は、配列番号２に示すイネグルテリン４遺伝子（ＧｌｕＢ−４）のプロモーターである。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、５’−ＵＴＲ領域  ｉｉ）は合成的性質のものであり、配列番号３に示す反復ＣＡＡトリヌクレオチド要素および翻訳開始部位の認識のためのコンセンサス配列ＡＧＣＣＡＴＧＧＣによって特徴付けられる。
【００２９】
他の実施形態によれば、シグナルペプチドｉｉｉ）のヌクレオチド配列は、小胞体内にグルテリン４前駆体（ＰＳＧｌｕＢ−４）を運ぶためにイネで使用されるシグナルペプチドをコードする配列番号４に対応する。
【００３０】
可能な実施形態では、トレーラー配列３’−ＵＴＲ  ｖ）は、配列番号７に示すＮＯＳターミネーター、またはイネＧｌｕＢ−４遺伝子のターミネーターである。
【００３１】
他の実施形態によれば、抗体の軽（Ｌ）または重（Ｈ）の成熟型ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列ｉｖ）は、配列番号５および配列番号６にそれぞれ示す抗体Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの軽（Ｌ）および重（Ｈ）ポリペプチド鎖をコードする配列により表される。
【００３２】
他の可能な実施形態において、軽（Ｌ）および重（Ｈ）ポリペプチド鎖をコードする配列は、優先的な種特異的同義コドンの使用により植物での発現に最適化されている。
【００３３】
他の可能な実施形態では、発現ベクターは、形質転換植物の選択を可能にすることができる遺伝子、特にＰＭＩ（ホスホ−マンノースイソメラーゼ）選択カセットを含む。
【００３４】
他の可能な実施形態では、ベクターは、以下を含む形質転換植物細胞の選択のための発現カセットを含む：
−天然または人工由来の構成的プロモーター、
−天然または人工のバージョンで同義の選択マーカーをコードする配列、
−植物発現システムに適した天然または人工由来のターミネーター。
【００３５】
他の可能な実施形態では、単一発現ベクターは、配列番号１に示す配列を有する。
【００３６】
他の実施形態によれば、本明細書に係る発現ベクターを含む細菌株が提供される。可能な実施形態において、細菌株はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはＡ．リゾゲネス（Ａ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の株である。
【００３７】
他の実施形態によれば、本明細書に係る発現ベクターおよびバイナリー形質転換システムの構築のためのＶｉｒ領域を有する相補的ベクターからなる、アグロバクテリウム種によって媒介されるバイナリー形質転換システムが提供される。
【００３８】
他の実施形態によれば、本明細書に係る発現ベクターを用いて得られた、安定的に形質転換された植物細胞、植物および植物種子が提供される。可能な実施形態において、植物細胞、植物および植物種子は、治療的処置における直接的または間接的な使用のためのものである。
【００３９】
他の実施形態は、植物におけるヒトまたは動物のタンパク質、特に穀物胚乳中の組換え抗体全長の安定生産のための方法に関し、前記方法は以下を含む：
−本明細書に係る植植物の遺伝的形質転換のための分子ベクターの構築
−形質転換された種子の工業的処理、
−目的とする抗体の抽出および精製。
【００４０】
有利なことに、安定的に産生される組換え抗体全長の収量は、胚乳1キログラムあたり抗体０．６グラム以上、特に約０．７グラム以上、特に約０．８グラム以上、さらに特に約０．９グラム以上であってもよい。
【００４１】
「約」という表現は、示されている値よりも２０％多いまたは少ない可能性のある変動を意味する。
【００４２】
可能な抗体の収量値の例は、例えば、胚乳1キログラムあたり抗体０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、１．０５、１．１５、１．２、１．２５、１．３グラム以上である。
【００４３】
有利なことに、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの場合、収量は、胚乳１キログラムあたりＲｉｔｕｘｉｍａｂ約０．９グラムより大きくなり得る。例えば、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの収量は、胚乳１キログラムあたりＲｉｔｕｘｉｍａｂ約０．９〜約１．５グラム、特に約０．９５〜約１．２グラムで変動し得る。
【００４４】
本開示のこれらおよび他の態様、特徴、および利点は、以下の説明、図面、および添付の特許請求の範囲を参照してよりよく理解されるであろう。本明細書に統合され、一部を形成する図面は、本発明の実施形態のいくつかの形態を示し、説明とともに、本開示の原理を説明することを意図している。
【００４５】
本明細書で説明される様々な態様および特徴は、可能な場合、個別に適用することができる。これらの個々の側面、たとえば、添付の従属請求項に記載されている側面および特性は、分割出願の対象となり得る。
【００４６】
特許取得プロセス中に発見された既知の側面または特性は、クレームされず、免責事項の対象となることを理解されたい。
【００４７】
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照して非限定的な例として与えられる以下のいくつかの実施形態の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１ａ】図１ａおよび１ｂは、ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０ソフトウェアによるＧｌｕＢ−４のＰＳとポリペプチド鎖Ｌ（セクションＡ）およびＨ（セクションＢ）との間の切断部位の予測を示す。
【図１ｂ】図１ａおよび１ｂは、ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０ソフトウェアによるＧｌｕＢ−４のＰＳとポリペプチド鎖Ｌ（セクションＡ）およびＨ（セクションＢ）との間の切断部位の予測を示す。
【図２】図２は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ抗体の胚乳特異的産生に使用される最終的なｐＴＲＳ＿Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ発現ベクターのマップである。
【図３】図３は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの軽鎖（Ａ）および重鎖（Ｂ）のアミノ酸配列を示す。ＧｌｕＢ−４シグナルペプチドが強調表示されている。
【図４】図４ａおよび４ｂは、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの軽鎖および重鎖の発現カセットを含むベクターｐＵＣ１８／／ＧｌｕＢ−４：：ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：：ＮＯＳ（セクションＡ）およびｐＵＣ１８／／（ＰｍｅＩ）ＧｌｕＢ−４：：ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ：：ＮＯＳ（ＰｍｅＩ）（セクションＢ）のマップを示している。
【図５】図５は、１０個のイネ一次形質転換体の粉から調製された２つの独立したタンパク質抽出物中のＲｉｔｕｘｉｍａｂの検出のためにＤＡＳ−ＥＬＩＳＡで得られたデータを示す。
【図６】図６は、形質転換イネのタンパク質抽出物からのＲｉｔｕｘｉｍａｂのバッチ精製のためのプロテインＡでのアフィニティークロマトグラフィーの実行に関するＵＶ吸収およびｐＨのグラフを示す。ｘ軸に描かれたセグメントは、収集されたフラクション（１から１１）、特に抗体分子を含むピーク（フラクション８および９）に対応するものを強調している。
【図７】図７は、電気泳動分析の結果を示す。特に、−図７ａは、３系統の形質転換イネ（５４Ｄ、２０７Ｓ、及び１０Ｂ）について、プロテインＡによる抗体の捕捉後に得られたクロマトグラフィー溶出液に対して変性および非還元条件下で行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ポジティブコントロール（ＣＰ）としてＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ−Ｒｏｃｈｅ）を使用して、異なる量のタンパク質（０．５−１−２μｇ）をロードした。−図７ｂは、ゲルろ過に由来する画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。サンプルを中和し、２％ＳＤＳ、５％ベータメルカプトエタノールの最終濃度に希釈し、９５℃で５分間変性させた。レーン１：分子マーカー（Ｓｈａｒｐｍａｓｓ  ＶＩＩ、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）、２：軽鎖を含む画分、３−５：重抗体鎖を含む画分。
【図８】図８は、米粉からプロテインＡで事前に精製された４．２ｍｇのＲｉｔｕｘｉｍａｂのＰＢＳでの定組成溶離により実施されたゲルろ過に関するＵＶ吸収およびコンダクタンスのクロマトグラフのグラフを示す。抗体分子のダイマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）に対応する２つの溶出ピークが示されている。
【図９】図９は、２系統の形質転換イネ（２０７Ｓ及び５４Ｄ）から精製したＲｉｔｕｘｉｍａｂの２つのサンプルと、ポジティブコントロール（ｃｐ）として使用したＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）サンプルで実行した３つの異なるゲルろ過のＵＶクロマトグラフのグラフを比較する。
【図１０】図１０は、ＰＮＧａｓｅ  Ａ処理後の重鎖により放出されるグリコフォームに関連するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに記録されたシグナル、単糖中の対応する組成、および可能性のある構造の説明を示す。
【図１１】図１１ａおよび１１ｂはそれぞれ以下を示す。−図１１ａは細胞蛍光測定分析（ＦＡＣＳ）の結果：Ａ．５００，０００ＭＥＣ−１細胞、Ｂ．市販のＲｉｔｕｘｉｍａｂ存在下でのＭＥＣ−１細胞、Ｃ．ＲＴＸ  ＰＢＳ（イネから精製された抗体）存在下でのＭＥＣ−１細胞。−図１１ｂは市販の抗体Ｒｉｔｕｘｉｍａｂとイネから精製された抗体によって得られた平均蛍光強度。ＦＬ１−Ｈ：蛍光強度。
【図１２】図１２は、ＲＴＸ  ＰＢＳ、市販のＲｉｔｕｘｉｍａｂ、およびネガティブコントロールとして使用した非対照抗体（抗ＣＤ５２、Ｃａｍｐａｔｈ）の競合アッセイのＦＡＣＳ分析を示す。ＦＬ１−Ｈ：蛍光強度;
【図１３】図１３は、ＨおよびＬ鎖の植物における発現のための分子カセットの組成の一般的なスキームを示す。凡例−Ｐｒｏ１／２：１／２プロモーター；ＳＰ１／２：１／２シグナルペプチドの配列；Ｔｅｒ１／２：１／２ターミネーター；ＣＤＳ−Ｌ／Ｈ：Ｌ／Ｈ鎖のシーケンスコーディング；ＶL/H：Ｌ／Ｈ鎖の可変領域；ＣＤＲ1/2/3：重鎖および軽鎖の超可変領域；ＣＬ：軽鎖の定常領域；ＣＨ１1/2/3：重鎖の定常領域；
【図１４】図１４は、植物における抗体全長の発現のために最も一般的に使用される戦略の概略図である。Ａ：Ｈ鎖とＬ鎖の別々の発現のための分子ベクターのばらばらな使用と、それに続く導入遺伝子のホモ接合系統のハイブリダイゼーション；Ｂ：ハイブリダイゼーションが一次形質転換体のレベルで行われるＡのバリアント；Ｃ：一次形質転換体でのＨ鎖とＬ鎖の組み合わせ発現のための分子ベクターの共同使用（共形質転換）；
【図１５】図１５は、位置効果の例を模式的に示す。Ｌ鎖とＨ鎖の合成に関する情報を持つ導入遺伝子は、エンハンサー要素（Ｅ）、サイレンサー（Ｓ）、およびメチル化ＤＮＡ（ＭＥ）を含む領域によって生成される干渉により別々に発現される。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
ここで、本発明の様々な実施形態を詳細に参照し、そのうちの１つまたは複数の例を添付の図面に示す。各例は、本発明の例示として提供されており、本発明を限定するものとして理解されるべきではない。例えば、それらが１つの実施形態の一部である限り図示または説明された特徴は、他の実施形態で、または関連して、他の実施形態を生成するために採用され得る。本発明は、すべてのそのような修正および変形を含むものと理解される。
【００５０】
これらの実施形態を説明する前に、添付の図面を使用した以下の説明で説明するように、本説明がその適用において構成要素の構造および配置の詳細に限定されないことを明確にする必要がある。本説明は、他の実施形態を提供することができ、様々な他の方法で取得または実行することができる。また、ここで使用されている語法や用語は説明のみを目的としており、限定的なものとみなすことはできないことを明確にする必要がある。
【００５１】
特に定義されない限り、ここおよび今後使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の経験を有する人が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施および試行において使用することができるとしても、方法および材料を例として以下に記載する。矛盾が生じた場合、その定義を含め、本出願が優先するものとする。材料、方法、および例は純粋に例示目的であり、限定的に理解されるものではない。
【００５２】
すべての測定は特に指定がない限り、２５℃、大気圧で実行される。すべての温度は、特に指定がない限り、摂氏で表される。
【００５３】
示されているすべてのパーセンテージと比率は、特に指定がない限り、組成物全体の重量（ｗ/ｗ）を参照すること意図する。
【００５４】
本明細書に記載の実施形態は、分子農業の分野に言及し、特に、植物、穀物胚乳、例えばイネにおける抗体全長の産生のための方法の開発、特に安定な発現ベクターの構築を扱う。
【００５５】
本明細書に記載の他の実施形態は、抗体分子の両方の構造成分、すなわち軽（Ｌ）および重（Ｈ）ポリペプチド鎖の植物における発現を行うことができるプラスミドベクターに関する。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、発現ベクターは、穀類種子におけるグリコシル化された抗体全長の胚乳特異的発現のために作成された。特に、ベクターを作成するために、植物の遺伝的形質転換、遺伝子発現の制御要素（プロモーター、リーダー領域、ターミネーター）、ポリペプチド鎖ＨおよびＬをコードする配列、シグナルペプチドをコードする配列に関する側面を考慮した。
【００５７】
したがって、本発明は、植物における抗体全長の収量の大幅な増加、生産ラインの選択手順の大幅な簡素化、および診断または治療目的に使用可能な抗体のより迅速な開発経路を可能にする方法を提案する。
【００５８】
本発明は、分子農業の分野で働いた経験のある人が以前に特定したことも、偶然にも直接的または間接的に解決したことのない特定の技術的問題に対応する範囲の発明活動の結果である。
【００５９】
本発明は、出願人によって実施され、ポリペプチド鎖ＬおよびＨの共局在および協調発現の観点で計画された実験試験の結果を表す。本発明によれば、これらはもはや別個の前駆体要素としてではなく、それらの細胞合成から始まる密接に関連する因子として意図されている。
【００６０】
合成における相互依存の必要性に対する新規で独創的な技術的解決策を提供するために、出願人は、分子カセットがＬおよびＨ鎖に関連する分子ベクターを考案および実施した。分子カセットは、
ａ）植物のゲノムに一体的に挿入されたＤＮＡセグメント内で機能的にリンクされている。
ｂ）同じ遺伝子発現の制御および調節要素であるプロモーター、５’−ＵＴＲ、ターミネーターが提供される。
ｃ）同じ向きである。
【００６１】
さらに有利なことに、植物のゲノム内でタンデムに繰り返されるＤＮＡ配列の存在に関連する発現の不安定性および遺伝子サイレンシングの問題を解決するために、出願人はこれらの現象が起こらない植物組織を同定するための実験的試験をさらに行った。このようにして、穀物種の胚乳内部での合成で示される技術的解決策を特定する。
【００６２】
ベクターシステムは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはＡ．リゾゲネスによって達成できる植物の遺伝的形質転換の観点から選択される。したがって、バイナリー形質転換システムの形成のためにＶｉｒ領域を有する第２のプラスミドを相補するように構成されたＴ−ＤＮＡベクター（Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＤＮＡの略）が構築される。
【００６３】
可能な実施形態では、本開示に係るＴ−ＤＮＡを有するベクターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内で多数のコピーを有する複製起点によって特徴付けることができる。
【００６４】
可能な実施形態では、本明細書に係るＴ−ＤＮＡを有するベクターは、アグロバクテリウム種に高い安定性を付与するのに適した複製起点の存在によって特徴付けることができる。（例：ｐＶＳ１）。
【００６５】
可能な実施形態では、本明細書に係るＴ−ＤＮＡを有するベクターは、小さな寸法（＜１０ｋｂ）によって特徴付けることができる。
【００６６】
可能な実施形態では、本明細書に係るＴ−ＤＮＡを有するベクターは、プラスミドのモジュール修飾（ｍｏｄｕｌａｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に適した制限部位の存在によって特徴付けることができる。
【００６７】
可能な実施形態では、本明細書に係るＴ−ＤＮＡを有するベクターは、マルチクローニングサイトの存在によって特徴付けることができる。
【００６８】
可能な実施形態では、本明細書に係るＴ−ＤＮＡを有するベクターは、形質転換された細菌の選択を可能にする遺伝子の存在によって特徴付けることができる（例えば、ｎｐｔ  ＩＩ、カナマイシンによる陽性コロニーの同定のため、ＩＩ型ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの酵素をコードする）。
【００６９】
可能な実施形態では、本明細書に係るＴ−ＤＮＡを有するベクターは、形質転換植物の選択を可能にする遺伝子の存在によって特徴付けることができる（例えば、ＰＭＩ、マンノースで形質転換されたエンブリオジェニックカルスの同定のため、ホスホマンノースイソメラーゼの酵素をコードする、）。
【００７０】
可能な実施形態では、本明細書に係るＴ−ＤＮＡを有するベクターは、Ｔ−ＤＮＡ、すなわち、宿主植物のゲノムへの完全な移入のために導入遺伝子の発現カセットが配置されているプラスミドのセグメントによって特徴付けることができる。
【００７１】
可能な実施形態では、本明細書に係るＴ−ＤＮＡを有するベクターは、Ｔ−ＤＮＡの左マージンおよび右マージンそれぞれの、反復配列ＬＢＲ（左境界領域）およびＲＢＲ（右境界領域）によって特徴付けることができる。
【００７２】
有利なことに、可能な実施形態によれば、発現ベクターのヌクレオチド配列は、配列番号１に示す通りである。
【００７３】
遺伝子発現の制御要素に関して、本明細書に係るベクターのＴ−ＤＮＡは、その中に３つの発現カセットを含み、そのうちの１つは形質転換植物または植物細胞の選択に関連し、２つは抗体を構成するポリペプチド鎖ＨおよびＬに関連する。
【００７４】
本明細書に係る１つ以上の実施形態によれば、形質転換植物または植物細胞の選択のための発現カセットは、天然または人工由来の構成的プロモーター、その天然バージョンまたは人工異名の選択マーカーのコード配列、そして、植物発現システムに適している天然または人工由来のターミネーター、を含む。
【００７５】
有利な実施形態によれば、構成的プロモーターはＣａＭＶの３５Ｓであり、マーカーをコードする配列は大腸菌のホスホ−マンノースイソメラーゼ酵素（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋアクセス番号Ｍ１５３８０）に関連するものであり、ターミネーターはＣａＭＶの３５Ｓｔｅｒである。
【００７６】
一実施形態によれば、抗体鎖に関連する発現カセットは類似の構造を有し、以下の遺伝子発現の制御要素を備えている：ｉ天然または人工由来の胚乳特異的プロモーター、ｉｉ天然または人工由来のリーダー配列５’−ＵＴＲ、ｉｉｉ胚乳を構成する細胞の小胞体の内腔内に組換えポリペプチド鎖を通過させ、組織に蓄積させるための天然または人工由来のシグナルペプチド、ｉｖ抗体の軽（Ｌ）または重（Ｈ）それぞれの成熟型ポリペプチド鎖をコードする天然または人工由来のヌクレオチド配列、ｖ天然または人工由来のトレーラー配列３’−ＵＴＲ。
【００７７】
本明細書に係るいくつかの実施形態によれば、遺伝子発現の調節要素ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）およびｖ）は、ポリペプチド軽鎖（Ｌ）およびポリペプチド重鎖（Ｈ）の発現カセット間で同一である。
【００７８】
一実施形態によれば、プロモーターｉ）は、イネのグルテリン４プロモーター（ＧｌｕＢ−４）であり、その配列を配列番号２に示す。
【００７９】
有利な実施形態によれば、５’−ＵＴＲ領域  ｉｉ）は合成的性質のものであり、配列番号３に示す反復ＣＡＡトリヌクレオチド要素および例えばイネに特異的な翻訳開始部位の認識のためのコンセンサス配列（ＡＧＣＣＡＴＧＧＣ）によって特徴付けられる。
【００８０】
例えば、リーダー配列５’−ＵＴＲは、多数の反復ＣＡＡトリヌクレオチド要素、特に２つ以上のＣＡＡトリヌクレオチド要素、より具体的には３つ以上、さらにより具体的には３つ以上を含むことができる。
【００８１】
別の実施形態によれば、要素ｉｉｉ）のヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるＰＳＧｌｕＢ−４の配列に対応し、小胞体内にグルテリン４前駆体を運ぶためにイネで使用されるシグナルペプチドをコードする。
【００８２】
他の実施形態によれば、要素ｉｖ）のヌクレオチド配列は、配列番号５および配列番号６に示す、抗体、例えばＲｉｔｕｘｉｍａｂ抗体、の軽鎖および重鎖をコードする配列によって表される。
【００８３】
本発明の有利な実施形態によれば、要素ｖ）のトレーラー配列３’−ＵＴＲはターミネーターＮＯＳであり、その配列を配列番号７に示す。あるいは、イネのＧｌｕＢ−４遺伝子のターミネーターを用いることができる。
【００８４】
３つの発現カセットは、Ｔ−ＤＮＡの左右のマージン（ＬＢＲ及びＲＢＲ）によって区切られ、同じ頭尾方向を有する。
【００８５】
関連する遺伝子をコードする配列に関して、ＤＮＡおよびＲＮＡレベルで穀物胚乳における抗体の高発現に有利な構造的状況を達成するために、軽（Ｌ）および重（Ｈ）ポリペプチド鎖をコードする配列はコドンコンテキスト法、つまり同義種固有のコドンの使用、を用いてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで再定義される。配列内で、不可解なイントロン、不安定性または不正確な転写に関連するモチーフ、および/または望ましくない制限部位を除去するために、仕上げの介入も行われる。
【００８６】
一実施形態によれば、発現ベクターは、植物の遺伝的形質転換のために直接的または間接的に使用される細菌株に導入される。有利なことに、細菌株は、大腸菌、アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびＡ．リゾゲネスを含む群から選択される。好ましくは、形質転換植物は穀物である。好ましい実施形態によれば、細菌株は、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｓｐ．  ｊａｐｏｎｉｃａ，  ｖａｒ．  ＣＲ  Ｗ３）のエンブリオジェニックカルスの形質転換に使用される。これは、種子の胚乳で発現させるために導入遺伝子を植物のゲノムに確実に挿入する安定した形質転換の一種である。
【００８７】
本発明は、分子ベクターの作成および植物の遺伝的形質転換の工程に加えて、形質転換された種子の工業的処理工程および関連する抗体の抽出および精製の工程も含む。
【００８８】
可能な実施形態によれば、工業的処理は、適切な乾燥の後、形質転換された穀類植物から収穫された成熟種子を、皮質除去および白色化の操作に供して、繊維性成分、胚芽および不要タンパク質を含む糊粉層を除去することを提供する。
【００８９】
別の可能な実施形態によれば、抽出工程は、適切な緩衝食塩水中で種子粉を均質化し、続いてろ過による清澄化および限外ろ過による濃縮を提供する。精製ステップは、例えば、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くゲルろ過によって実行することができる。
【００９０】
本明細書に係る実施形態は、先行技術で知られている技術とは異なり、特にイネの安定した遺伝的形質転換を通じてトランスジェニック穀物植物を得て、単一のベクターと２鎖の遺伝子発現のための同一の制御配列を使用した種子胚乳中での抗体全長の大量生産および蓄積ができ、抗体分子は正しく組み立てられており、局在化、安定性、生物活性、補体活性化、および治療分野での使用に関して有害ではないとしても役に立たない追加のアミノ酸残基なしに、プログラムされたアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖で構成されるという点で明らかに革新的で有利である。本発明では、抗体収量は、胚乳１ｋｇあたり約１ｇ以上の範囲であり得る。得られた収率は、ここで説明した技術の有利な産業用途に絶対的な関連性があり、先行技術で報告されているものよりも大幅に大きいと考えている。
【００９１】
抗体の産生に必要な分子発現カセットは、通常のメンデルのパターンに従って子孫から継承されることが有利であり、ホモ接合性で容易に取得することができる。
【００９２】
有利なバリアントによれば、産生される抗体は、ＣＤ２０エピトープを標的とするモノクローナル抗体であるＲｉｔｕｘｉｍａｂである。
【００９３】
発現カセットの構築に使用される発現ベクターおよびヌクレオチド配列と同様に、本発明はそれらの相補配列に関する。
【００９４】
さらに、本発明は、突然変異の性質、原因となるものおよび位置に関係なく、突然変異プロセスに由来する前述のものと同等の配列に関する。したがって、本発明はまた、ベクター、発現カセットまたはそれに相補的な配列の任意の領域の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、遷移、転換によって得られる配列に関する。
【００９５】
本発明は、種子胚乳で機能する、または前記配列に相補的なヌクレオチド配列で機能する抗体分子全長の合成および蓄積を得るのに適した、プロモーター要素、小胞体に送る配列、および５’および３’に翻訳されない領域を有する成熟型の軽Ｌおよび重Ｈポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列の組み合わせを含む。
【００９６】
本発明はまた、上記の要素ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖ）の、他の抗体の軽Ｌ鎖および重Ｈ鎖をコードする配列との組み合わせ、またはその配列に相補的なヌクレオチド配列で作られた組み合わせに関する。
【００９７】
本発明はまた、組換えタンパク質、特に組換え抗体全長の安定生産のための植物の形質転換のための上記発現ベクターの使用に関する。
【００９８】
上記発現ベクターを含む細菌株も本発明に含まれる。
【００９９】
上記発現ベクターで形質転換された植物細胞も本発明に含まれる。本発明の可能な解決策によれば、細胞は穀物細胞であり、好ましくは栽培イネ種（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）に属する。
【０１００】
スターチおよびその誘導体の抽出および製造のために工業的に活用されているワキシータイプ（ｗａｘｙ  ｔｙｐｅｓ）の使用も、本発明に含まれる。
【０１０１】
また、本発明の一部は、上記の発現ベクターを使用して形質転換された植物種子である。本発明の１つの解決策によれば、種子は、穀類のクラスに属する安定に形質転換された植物のものであり、好ましくは、安定に形質転換された植物は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．の種に属する。
【０１０２】
また、本発明の保護の範囲内には、組換え抗体の発現のための安定に形質転換された植物があり、これは上記の発現ベクターによって安定に形質転換される。
【０１０３】
また、本発明には、自家受精または交雑育種によって得られた子孫、または上記の植物から選択された形質転換株も含まれる。本発明はまた、治療的処置における直接的または間接的な使用のための上記の種子に関する。
【０１０４】
本明細書に係る特定の実施形態は、穀物胚乳、特にイネ胚乳(Oryza sativa L.)における抗体全長の生産方法に関する。この方法は、組成とアセンブリにおいてユニークな特性を持つ遺伝子発現カセットをホストできる特定のベクターシステムの構築に基づく。
【０１０５】
この方法の実施形態は、同じ頭尾方向を有する少なくとも以下の２つの遺伝子カセットを含む単一の発現ベクターを使用して、植物の安定した形質転換を提供する。特に、単一の発現ベクターは以下を含む：
−抗体のポリペプチド軽鎖（Ｌ）の発現カセット。
−抗体のポリペプチド重鎖（Ｈ）の発現カセット。
【０１０６】
さらに、可能な実施形態において、発現ベクターは、第３のカセット、すなわち形質転換植物細胞の選択のための発現カセットも含む。
【０１０７】
可能な実施形態において、上記の３つのカセットはＴ−ＤＮＡ領域に含まれる。これは、発現ベクターは、第二のプラスミドと関連して、アグロバクテリウムにより媒介されるバイナリー形質転換システムを含むためであり、発現ベクターに含まれるヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１に示されるとおりである。
【０１０８】
可能な実施形態によれば、形質転換植物または植物細胞の選択に関する発現カセットは、天然または人工由来の構成的プロモーター、天然または人工のバージョンで同義のマーカーをコードする配列、および植物発現システムに適した天然または人工由来のターミネーターを含む。
【０１０９】
有利な実施形態によれば、構成的プロモーターはＣａＭＶの３５Ｓであり、マーカーをコードする配列は大腸菌のホスホ−マンノースイソメラーゼ酵素（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋアクセス番号Ｍ１５３８０）に関連するものであり、ターミネーターはＣａＭＶの３５Ｓｔｅｒである。
【０１１０】
一実施形態によれば、抗体の軽（Ｌ）および重（Ｈ）ポリペプチド鎖に関連する発現カセットは、それぞれに次の制御要素が提供された同様の構造を有する。ｉ天然または人工由来の胚乳特異的プロモーター、ｉｉ天然または人工由来のリーダー配列５’−ＵＴＲ、ｉｉｉ胚乳を構成する細胞の小胞体の内腔内に組換えポリペプチド鎖を通過させ、組織に蓄積させるための天然または人工由来のシグナルペプチド、ｉｖ抗体の成熟型の鎖（軽または重）をコードする天然または人工由来のヌクレオチド配列、ｖ天然または人工由来のトレーラー配列３’−ＵＴＲ。
【０１１１】
可能な実施によれば、穀類および特にイネ種の可能な胚乳特異的プロモーターの中で、配列が配列番号２に示されるイネグルテリン４（ＧｌｕＢ−４）の遺伝子プロモーターを有利に使用することができる。有利なことに、このプロモーターは、ＧｌｕＢ−４以外のグロブリン、プロラミンおよびグルテリンなどのイネ胚乳に存在する他の貯蔵タンパク質のプロモーターと比較して、より高い転写活性によって区別される。
【０１１２】
プロモーターＧｌｕＢ−４は、ワキシー種ＣＲ  Ｗ３(Ente Nazionale Risi, Milan, Italy)からリーダー領域と共にＰＣＲにより単離された。しかしながら、後者はかなり短く、遺伝子発現を強化できる要素を十分に備えていないことが分かった。このため、リーダー領域は、多数のトリヌクレオチド要素ＣＡＡ（すなわち、ＴＭＶリーダーΩの翻訳効率を高めることができる要素、Gallie and Walbot, 1992）およびイネの典型的なＡＴＧのコンセンサス認識シーケンス(ＡＧＣＣＡＴＧＧＣ; Rangan et al., 2008)を特徴とする合成リーダー配列５’−ＵＴＲ（配列番号３に示す）に置き換えた。ＧｌｕＢ−４シグナルペプチド（ＰＳＧｌｕＢ−４と略記）は、配列番号４に報告するヌクレオチド配列によりコードされる。後者は、軽（Ｌ）および重（Ｈ）ポリペプチド鎖をコードする配列の前に有利に配置されている。ＰＳＧｌｕＢ−４は、小胞体の内腔に両方の鎖を運ぶために使用される。
【０１１３】
ＰＳＧｌｕＢ−４／ＬおよびＰＳＧｌｕＢ−４／Ｈ複合体の最も可能性の高いタンパク質分解切断部位を決定するために、ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０ソフトウェアを使用した(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。このサイトは、ちょうどＰＳとＬ／Ｈの間に位置していた（ＰＳ−Ｌ：ＭＡＴＩＡＦＳＲＬＳＩＹＦＣＶＬＬＬＣＨＧＳＭＡ／／ＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩ．．．；ＰＳ−Ｈ：ＭＡＴＩＡＦＳＲＬＳＩＹＦＣＶＬＬＬＣＨＧＳＭＡ／／ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥ．．．)（図１）。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ抗体の軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）のアミノ酸配列は、米国特許Ａ−５，７３６，１３７から推測された。上記の鎖をコードするヌクレオチド配列およびＰＳＧｌｕＢ−４は、個々のコドンを選択することにより人工的に合成され（コドンコンテキスト法）、これはイネでの高発現を考慮して行った。したがってこれらの配列は、上記の特許で報告されているものとは異なるが、完全に同義である（図３）。
【０１１４】
ＬおよびＨのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号５および配列番号６に報告する。
【０１１５】
両方の発現カセットで使用したポリアデニル化シグナルはＮＯＳ  ｔｅｒ、すなわち、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリン合成酵素をコードする遺伝子のターミネーターである。ＮＯＳ  ｔｅｒの配列は、配列番号７に示す。
【０１１６】
抗体の各軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）の発現カセットは、特定の制限部位を活用して、上記の要素を連続して結合することにより構成した。
【０１１７】
カセットは最終発現ベクター、すなわち、申請者が開発し、Ｔ−ＤＮＡ内にＰＭＩ（ホスホ−マンノースイソメラーゼ）選択カセットを備えたｐＴＲＳと呼ぶ単一のベクターに導入した。配列全体を配列番号１に示すｐＴＲＳ＿Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（図２）と呼ばれる最終発現ベクターの構築に使用されるすべての配列を検証した後、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・ツメファシエンス、ＥＨＡ  １０５株に導入した。適切なコントロールの後、操作された株はイネエンブリオジェニックカルス（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｓｐ．  ｊａｐｏｎｉｃａ，  ｖａｒｉｅｔｙ  ＣＲ  Ｗ３）の形質転換に使用した。
【０１１８】
選択した基質上での形質転換と実生の再生の全手順は定期的に行われた。１８０の一次形質転換体が得られた。それらが成熟したら、それらのそれぞれの種子は、抗体の存在とその発現レベルの検証、および、子孫の作成と生産ラインの確立に使用される最適な発現体の識別のための選択に関する後続の分析に使用するために収集した。
【０１１９】
一次形質転換体と同様に、子孫も正常に発達し、目的の組換え抗体を含む種子を生産した。
【０１２０】
形質転換された米粉中の抗体の存在は、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡによって実証した（図５）。同様の免疫学的アッセイは、単一のＴ−ＤＮＡ挿入イベントを特徴とする一次形質転換体の選択に使用され、その上で非常に生産性の高いホモ接合株の発生が見つかった。
【０１２１】
形質転換植物によって生産された種子を使用して、出願人は、種子自体を処理し、生タンパク質抽出物を取得し、組換え抗体を抽出/精製するためのプロトコルを開発した。後者の手順は、本質的にプロテインＡのアフィニティークロマトグラフィーによるキャプチャーステップと、ゲルろ過による最終精製ステップに基づく。種子の処理（皮質除去および白色化）は、不要タンパク質のほとんどを除去するのに非常に有用であることが証明された。プロテインＡを使用して処理および精製された米粉から抽出されたＲｉｔｕｘｉｍａｂは、９５％以上の高い純度を示した（図７）。
【０１２２】
変性および非還元条件下で行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、精製タンパク質は、市販の標準Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ−Ｒｏｃｈｅ）とほぼ同等の移動度を示し、見かけの分子量は約１５０  ｋＤａであった。この重量は、２本の軽鎖（各約２５  ｋＤａ）と２本の重鎖（各約５０  ｋＤａ）からなる抗体全長に予測される重量に相当する。
【０１２３】
ゲルろ過にかけた同精製サンプルは、抗体分子のダイマーを含む１つ目のマイノリティーピークと、モノマーに対応し、正しく組み立てられ、市販のＲｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））の保持容量に重ねることができる（図９）明らかに支配的な２つ目のピークの２つの溶出ピークを示した（図８）。
【０１２４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのペプチドマッピングに基づくさらなる生化学的分析は、イネ胚乳で産生された抗体の完全性、および後者とその市販品の間のアミノ酸配列の完全な同一性をテストすることを目的とした。米粉から精製された抗体のトリプシン消化物の繰り返しＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析により、両方の鎖にシグナルペプチドが存在せず、予想どおり重鎖のＡｓｎ  ３２５部位に単一のＮ−グリコシル化部位が存在することも確認された。この部位は占有されており、グリコシル化プロファイルは、キシロース残基を含むフコシル化コアとキシロース残基を含まないフコシル化コアとのポーシマンノース型（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ  ｔｙｐｅ）に起因する（図１０）。
【０１２５】
本明細書に従って得られた精製組換え抗体は、その市販の対応物に対して機能的な生物学的同等性を有することが証明された。実際、試験されたサンプルはＣＤ２０エピトープを認識し、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）と効率的に競合することが実証された。さらに、エピトープ／抗体結合の同じ共局在化が観察された。実際、生および非凝集ＭＥＣ−１細胞（図１１ａ、セクションＡ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏテスト（実施例９）では、ＦＡＣＳ分析により、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）はＭＥＣ−１細胞の９８．９１％を認識することが示され（図１１ａ、セクションＢ）、イネの種子で生産されたもの（ＲＴＸ  ＰＢＳ）は９８．３３％であった（図１１ａ、セクションＣ）。このデータは、平均蛍光強度（図１１ｂ）とともに、２つの抗体がＣＤ２０抗原に結合する同等の能力を有していることを示している。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）またはＣＤ２０（Ｃａｍｐａｔｈ）に近いＣＤ５２エピトープを認識できる無関係な抗体の存在下で、ＭＥＣ−１細胞で行われた競合アッセイでは、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）抗体とＲＴＸ  ＰＢＳが特異的に同じサイトで競合することを示すこともできた（図１２）。
【０１２６】
ＦＡＣＳ分析を行うために使用されるのと同じ飽和条件でインキュベートされたＭＥＣ−１細胞で行われた免疫蛍光分析から、イネ由来ＲＴＸ  ＰＢＳ抗体がＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の抗原／抗体結合と同じ局在性を有することを確認することもできた。ＣＤ２０抗原の濃度は、実際には、フルオレセイン化抗ＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＲＴＸ  ＰＢＳ）によって提供されるシグナルが、膜のマーキングに使用されるＦａｓｔＤｉｌと比較して共局在しているため、単一の膜領域で強調された（実施例９）。ＦＩＴＣと結合したＲＴＸ  ＰＢＳを使用して直接免疫蛍光を観察した場合、結果はさらに明白に見えた。
【実施例】
【０１２７】
実施例１：最終的な発現ベクターｐＴＲＳ＿ＲＩＴＵＸＩＭＡＢの生成
一例として、本明細書に記載の可能な実施形態によるＲｉｔｕｘｉｍａｂ抗体の胚乳特異的発現のためのイネの遺伝的形質転換に使用できる発現ベクターを生成できる手順を以下に提供する。同様の手順を使用して、他の抗体を取得したり、他の胚乳特異的プロモーターおよび/または小胞体を標的とする配列および/またはターミネーター配列の存在を特徴とするコンストラクトのバリアントを作成することができる。
【０１２８】
コード配列の人工合成
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ抗体を構成する各鎖（それぞれ軽および重、略称Ｌ及びＨ）は、コドンレベルで最適化されたヌクレオチド配列を介してイネで発現された（コドンコンテキスト法）。軽（Ｌ）および重（Ｈ）ポリペプチド鎖をコードする配列は両方とも人工的に合成され、発現カセットに挿入された。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで計画された分子生物学の手順に基づいて人工的に合成されたセグメントには、ＧｌｕＢ−４プロモーターの一部（ヌクレオチド位置９０６から開始し、合計５２５  ｂｐ）、リーダー配列（５’−ＵＴＲ）７０ｂｐ、および考慮されるポリペプチド鎖をコードする全配列（軽鎖Ｌについては７１４ｂｐ、重鎖Ｈについては１４２８ｂｐ）が含まれる。プラスミドでのクローニング操作を容易にするために、制限部位Ｓｐｅ  ＩおよびＳａｃ  Ｉをそれぞれ５’及び３’末端に配置した。それぞれ１３１５及び２０２９ｂｐの軽鎖および重鎖と呼ばれる両方のプログラムされた断片は、合成された後、特定のベクターにクローン化された。
【０１２９】
分子発現カセットの生産
中間ベクターｐＵＣ１８（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、各Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ鎖の発現カセットを作成した。より具体的には、ベクターｐＵＣ１８／／ＧｌｕＢ−４：：ＮＯＳを使用した。このベクターは、ＧｌｕＢ−４イネプロモーター（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．  ＡＹ４２７５７１）とアグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼターミネーター（ＮＯＳ，  ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ  ＡＦ４８５７８３）両方を供給するように出願人によって作成された。
【０１３０】
２番目のｐＵＣ１８／／ＧｌｕＢ−４：：ＮＯＳへの重鎖フラグメントの挿入は、制限部位Ｓｐｅ  ＩおよびＳａｃ  Ｉを利用して、指向性クローニングによって同様に実行された。ただし、この場合、この最後の手順の前に、ベクターｐＵＣ１８／／ＧｌｕＢ−４：：ＮＯＳを改変する作業を実行する必要があった。特に、最終ベクターへの発現カセットの挿入を促進するために（次の段落を参照）、ＧｌｕＢ−４プロモーターの５’末端に存在する制限部位Ｅｃｏ  ＲＩと、ＮＯＳターミネーターの３’とで、サイトＰｍｅ  Ｉを使用する必要があった。この置換は、いくつかの中間分子生物学のステップとシーケンスによる制御を介してベクターｐＵＣ１８／／（Ｐｍｅ  Ｉ）ＧｌｕＢ−４：：ＮＯＳ（Ｐｍｅ  Ｉ）を取得することができる、特定のリンカー設計を用いてＰＣＲによって実行された。次に、この最後のベクターを使用して、重鎖フラグメントを挿入した。このようにして、それぞれの軽および重鎖Ｒｉｔｕｘｉｍａｂに関連する発現カセットを有する、ｐＵＣ１８／／ＧｌｕＢ−４：：ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：：ＮＯＳおよびｐＵＣ１８／／（Ｐｍｅ  Ｉ）  ＧｌｕＢ−４：：ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ：：ＮＯＳ（Ｐｍｅ  Ｉ）と呼ばれる２つのベクターを構築した（図４）。
【０１３１】
最終発現ベクターの構築
この目的のために、本出願人により開発された発現カセットの分子操作に基本的な以下の機能的要素により特徴付けられたプラスミドベクターであるｐＴＲＳが使用された。１．形質転換された細菌株の選択においてカナマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ  ＩＩ遺伝子（ベクターバックボーンレベルで存在）、２．ホスホ−マンノースイソメラーゼ酵素をコードするＰＭＩ遺伝子（Ｔ−ＤＮＡ内に位置する）は、形質転換植物の早期同定におけるポジティブ選択剤として使用される。ｐＴＲＳベクターは、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの軽鎖および重鎖に関連する両方の発現カセットのアクセプターとして使用された。２つのカセットのクローニングは、それぞれ制限部位Ｅｃｏ  ＲＩおよびＰｍｅ  Ｉを介して連続して行われた。次に、最終発現ベクター（図２）を配列検証にかけた後、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＥＨＡ１０５株にエレクトロポレーションにより挿入した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの操作された株は、最終的にＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｓｐ．  ｊａｐｏｎｉｃａ，  ｖａｒ．  ＣＲ  Ｗ３の形質転換に使用した。
【０１３２】
実施例２：アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるＯＲＹＺＡ  ＳＡＴＩＶＡの遺伝的形質転換
イネの遺伝的形質転換のために、Hiei et al. protocol (1994)を使用し、形質転換されたカルスが得られるまで、Hoge (Rice Research Group, Institute of Plant Science, Leiden University)およびGuiderdoni (Biotrop program, Cirad, Montpellier, France)によって修正された。形質転換された植物組織のその後の選択ステップのために、Datta and Datta protocol (2006)を適用した。これは、培地中のマンノース濃度の増加に関連して、ホスホマンノースイソメラーゼ酵素をマーカーシステムとして活用する。実行される主な手順を以下に簡単に説明する。
【０１３３】
イネ胚盤からのエンブリオジェニックカルスの調製と開発
イネの形質転換は、胚盤に由来するエンブリオジェニックカルスで行った。胚盤組織からのカルスの増殖を誘導するために、以下の操作プロトコルが使用された：
・５００個のイネ種子の皮質除去（包頴の機械的除去）を行った。
・潜在的な病原体と汚染した腐生菌を除去するために、皮質除去した種子を消毒した。
・最初の消毒処理において、皮質除去した種子は７０％エタノール溶液に２分間つけた。
・その後、皮質除去した種子を２滴のＴｗｅｅｎ−２０洗剤を含む５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に移し、３０分間ゆっくりと攪拌した。
・次亜塩素酸ナトリウムの痕跡をすべて除去するために、滅菌Ｈ2Ｏでそれぞれ１５分間３回洗浄した。
・最後の洗浄後、皮質除去した種子は滅菌ティッシュペーパーで乾燥した。
・ペトリディッシュ（Φ９０ｍｍ）内に２５ｍＬの量で分注したカルス誘導培地（ＣＩＭ）の表面に、プレートあたり１２個の皮質除去した種子を配置した。
・この方法で得られたプレートを、暗所、温度２８℃で２１日間インキュベートした。誘導の１週間後、胚乳と幼根は除去され、胚盤に由来するカルスの発育を促進した（胚盤は、黄色い胚乳に一部含まれるコンパクトな塊で認識される）。
・誘導の３週間後、カルスを新しいＣＩＭに移し、カルスに自然に存在するフラクションライン（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｎｅｓ）に従って、メスを使用せずにカルス塊を断片化した。
・エンブリオジェニックカルスを発育し、形質転換に適したものにするために、継代培養を１０日間継続した。
【０１３４】
Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとカルスの共培養
・形質転換に十分な量のＡ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを得るために、バイナリー発現システムを有するコロニーαをＬＢ培地で成長させた。次に、細菌懸濁液を寒天カナマイシンＬＢを含むペトリディッシュに播種した。
・３０℃で３日間培養した後、細菌のパティーナ（ｐａｔｉｎａ）を取り、３〜５  １０9ｃｅｌｌｓ／ｍｌに対応するＯＤ６００が約１．０が得られるまで共培養培地液（ＣＣＭＬ）に懸濁した。
・直径約２ｍｍのコンパクトで白っぽい色の良い状態のカルスを、３５ｍＬの細菌懸濁液を含むペトリディッシュに移し、１５分間浸漬した。
・次に、滅菌ティッシュペーパーを使用してカルスを乾燥させた。
・共培養培地固体（ＣＣＭＳ）を含むハイエッジペトリディッシュ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）あたり最大２０カルスを配置した。
・次に、カルスを暗所、温度２５℃で３日間インキュベートした。
【０１３５】
ＰＭＩシステムを使用した形質転換されたカルスの選択
イネのエンブリオジェニックカルスとアグロバクテリウムの共培養を行った後、大腸菌のホスホマンノースイソメラーゼをコードする遺伝子の挿入で得られたマンノース−６−リン酸のフルクトース−６−リン酸への変換能力を活用し、形質転換された組織を選択した。この目的で使用される手順は次のとおりである。
・共培養から得たカルスを、３％スクロースを含むマンノースを含まない培地（ＳＭＩ）に移し、暗所、温度２８℃で１週間インキュベートした。
・２％スクロースおよび１．５％マンノースを含むＳＭＩＩ選択培地にカルスを移し、暗所、温度２８℃で２週間インキュベートした。
・１％スクロースおよび２％マンノースを含むＳＭＩＩ選択培地にカルスを移し、暗所、温度２８℃で２週間インキュベートした。
・０．５％スクロースおよび２．５％マンノースを含むＰＲＭ（再生前培地）にカルスを移し、暗所、温度２８℃で２週間インキュベートした。
【０１３６】
形質転換されたカルスからのイネ苗の再生
・茶色ではないカルスは、マンノースを含まない再生培地（ＲＭ）を含むハイエッジペトリディッシュに移した。
・４８時間後、選択したカルスを含むディッシュに光を当てた。
・実生がカルスから分離するのに十分な大きさ（高さ３ｃｍ以上）であることが判明した場合、発芽培地（ｒｍ）を含む培養チューブに移した。
・チューブ内のサブカルチャーは、常に光の下２８℃で約３週間続けた。
・再生プロセスの最後に、植物は泥炭に移し、温室で栽培した。
【０１３７】
次の表は、イネの遺伝的形質転換のプロトコルで使用されるさまざまな培地の組成を示す。
【０１３８】
【表１】
2020519239.tif 000003
凡例  ＣＩＭ：カルス誘導培地、ＣＣＭＬ：共培養培地液、ＣＣＭＳ：共培養培地固体、ＰＳＭ：選択前培地、ＳＭＩ：選択培地Ｉ、ＳＭＩＩ：選択培地ＩＩ、ＰＲＭ：再生前培地、ＲＭ：再生培地、ｒｍ：発芽培地。
【０１３９】
【表２】
2020519239.tif 000004
【０１４０】
実施例３：米粉からの総タンパク質の抽出
形質転換されたイネの種子は、最初に外皮を取り除き、Ｓａｔａｋｅ  ＴＯ−９２ホワイトニング装置（Ｓａｔａｋｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）で白色化した。精白した種子は、０．５ｍｍスクリーンを使用して、ベンチローターミル（ＲＥＴＳＣＨ、ドイツ）で粉砕した。次に、得られた粉を、緩衝液の体積（ｍｌ）と粉の重量（ｇ）の比が５：１になるように、抽出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に均質化した。攪拌しながら４℃で１時間インキュベートした後、３０００×ｇで１０分間遠心分離を行った。上清を回収した後、残留ペレットは次の変更を加えてさらに２回抽出した。抽出緩衝液と粉の比率は、２回目の抽出では５：１、３回目の抽出では４：１で行った。氷冷でのインキュベーションは１０分間だけで、これらのステップの後、続けて３０００×ｇで１０分間遠心分離をそれぞれ行った。次に、３つの上清を混ぜ合わせて、精製実験で使用する単一のサンプルを形成した。
【０１４１】
実施例４：植物由来のＲｉｔｕｘｉｍａｂ抗体の検出のためのＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ
このアッセイは、イネ種子中の抗体の存在を定量的に確認するために開発および適用された。形質転換されたバイオマスのバッチにおける組換え分子の存在を検証するために、また、一次形質転換体の選択においても使用した。
・９６ウェルの平底ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、２ｍＭリン酸ナトリウムおよび３０ｍＭ塩化ナトリウムの緩衝液、ｐＨ７．２で０．５μｇ／ｍｌの濃度に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体の溶液１００μＬずつを各ウェルに分注することでコーティングした。コーティングプロセスは、攪拌しながら室温で２０分間行った。
・コーティング溶液を除去した後、０．０１％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）溶液２５０μＬ／ｗｅｌｌでプレートを２０分間ブロックした。
・ブロッキング溶液を除去した後、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）になるようＰＢＳに適切に希釈し、新たに調製した５０μＬのサンプルを各ウェルにまいた。試料は、攪拌しながら３７℃で２０分間インキュベートした。
・サンプルを取り除いた後、新しく調製した３００μＬの０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳでウェルを３回洗浄した。
・１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳで０．２５μｇ/ｍＬの濃度に希釈したＨＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と結合した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）５０μＬを各ウェルに加えた。撹拌しながら３７℃で２０分間インキュベートした。
・結合された抗体溶液を除去した後、新たに調製した３００μＬの０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳでウェルを４回洗浄した。
・１００μＬ  ＴＭＢ（ＫＰＬ）を各ウェルに追加した。攪拌しながら３７℃で約５分、現像を行った。
・１００μＬ/ｗｅｌｌの１Ｍ塩酸で現像を停止した。サンプルの吸光度は、４５０ｎｍの波長で読み取った。
【０１４２】
アッセイで使用される基準曲線を作成するために、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ−Ｒｏｃｈｅ）を使用した。使用した濃度範囲は０．３１２５−５ｐｇ／μＬであった。このアッセイによって、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの濃度が２から４０ｎｇ／ｍｌの範囲で線形応答が得られた。一次形質転換体の抗体含有量を良好に評価するために、加工種子粉から得られた総タンパク質抽出物の１：６００希釈液を使用した。
【０１４３】
実施例５：Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ抗体の同定のための１８０の一次形質転換体の分析
形質転換したイネのサンプル中のＲｉｔｕｘｉｍａｂ抗体の存在を検出するために、以下のプロトコルに従って、各一次形質転換体によって生成された４０個の種子の総タンパク質抽出を行った。
・Ｒｅｔｓｃｈ  ＭＭ  ２００デジタルミルを使用して、速度１５Ｈｚで１分間、各サンプルをひく。
・特定の識別コードでマークされたエッペンドルフ型テストチューブで粉を回収する。
・得られた粉７０ｍｇをサンプリングする。
・特定の識別コードでマークされたエッペンドルフ型テストチューブで、１ｍＬの抽出緩衝液で粉を均質化する。
・懸濁液を、７ｍｌの抽出緩衝液を含むマークされたファルコンチューブに移す。
・攪拌しながら氷中で１時間チューブをインキュベートする。
・抽出物１ｍＬをマークされたエッペンドルフ型テストチューブに移し、１６，０００×ｇ、４℃で４０分間遠心分離する。
・上清を回収し、新しいマーク付きエッペンドルフ型テストチューブに移す。
・残りの抽出物を−２０℃で保存する。
【０１４４】
この方法は、単一の抽出介入が存在するという点で、実施例３で報告する方法と異なる。そのシンプルさのおかげで、多数のサンプルの分析、特に一次形質転換体からの自家受精によって派生した子孫の分離に非常に役立つ。手順は抗体の部分抽出を伴うが、反復配列の存在に起因する遺伝子サイレンシング現象の実体を非常に正確に評価することができる。免疫学的分析（実施例４のようなＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ）では、１８０のうち１つのケース（０．５６％）でのみ組換え抗体の存在を検出できないことが示されている。これは、本発明が先行技術の問題および制限を非常に効果的に解決することを示している。データの堅実性を高めるため、各サンプルの２回目の抽出物で免疫学的分析を繰り返し、同じ結果を得た。例として、図５は１０個の一次形質転換体に関連するタンパク質抽出物について重複して得られた値を示す。
【０１４５】
自己受精とホモ接合株の選択を繰り返した後、実施例３に記載の全手順で得られた抽出物中のＲｉｔｕｘｉｍａｂ含量は、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（実施例４と同様）により決定した。Ｔ−ＤＮＡの単一挿入イベントを特徴とする３つの独立した株では、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂの含有量は：０．９５０ｇ／ｋｇ、１．０７２ｇ／ｋｇ、０．９２３ｇ／ｋｇであった。これらの値は、本発明により、サイレンシング現象がない場合の形質転換株の形質転換および選択手順を単純化するだけでなく、産業用途に絶対的に適した抗体収量を得ることができることを示す。
【０１４６】
実施例６：植物由来のＲｉｔｕｘｉｍａｂ抗体の精製
Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ抗体の精製には、プロテインＡに基づくプロトコルが適用された。すべてのクロマトグラフィーステップは、ＡｋｔａＰｕｒｉｆｉｅｒ  ＵＰＣ−１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフで実行した。
【０１４７】
精製の前に、抽出から得られた上清を、１μｍの多孔度を有するＰｏｌｙｃａｐ  ３６  ＨＤカートリッジ（Ｗｈａｔｍａｎ）を通してろ過した。ろ液は、元の容量の１/１０に達するまで、ＵＦＰ−５０−Ｃ−４ＭＡカートリッジを備えたＱＸ−Ｓｔａｎｄ接線システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で限外ろ過した。次に、０．４５μｍの多孔性を備えた２５ｍｍ  ＧＤ／ＸＰポリエーテルスルホンカートリッジ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、保持液を再ろ過した。次に、プロテインＡセファロースＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードした。ロード後、ＰＢＳ、ｐＨ ７．４で洗浄を行った。次に、ピークの分別収集とともに、クエン酸バッファー（５０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ３．０）で溶出を行った（図６）。集めた画分を３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．８で中和し、０．４Ｍアルギニン、ｐＨ８．０で保存のために安定化した。このようにして得られた精製サンプルは、抗体分子の生化学的特性評価（ＨおよびＬ鎖の構造の研究）と、抗原を認識するｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬理試験の両方に使用した。
【０１４８】
実施例７：抗原を認識するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬理試験のための予備的ろ過ゲル
トランスジェニックイネの胚乳で生産されたＲｉｔｕｘｉｍａｂのバッチをプロテインＡのクロマトグラフィーにより精製し（実施例６参照）、総タンパク質の９５％より高い純度の調製物を得た（図７）。タンパク質濃度１７ｍｇ／ｍｌの２５０μＬの製剤を、ゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０/３００ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、流量０．５ｍｌ／ｍｉｎのＰＢＳバッファーで溶出した。ゲルろ過溶出液をフラクションに集めた。植物由来の抗体分子は、常に２つのピークで溶出することが示された（図８）。小さい方の１つ目のピークは保持容量９．５ｍｌに位置し、２つ目のより大きいピークは保持容量１２．１ｍｌに近い位置にある。１つ目のピークには抗体ダイマーが含まれている。代わりに、２つ目のピークは正しく組み立てられたモノマーで構成されている。これを証明するように、植物由来の抗体と市販のＲｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ−Ｒｏｃｈｅ）について記録された保持容量のピークは完全に重なる（図９）。
【０１４９】
モノマーを含む溶出画分（ＲＴＸ  ＰＢＳと呼ばれる）500μLを細胞蛍光測定実験に使用し、ＣＤ２０エピトープの認識において市販のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）と比較したイネで生産されたＲｉｔｕｘｉｍａｂの同等性を確認することを目的とした（実施例９）。
【０１５０】
実施例８：ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるイネの胚乳で生産されたＲｉｔｕｘｉｍａｂのポリペプチドＬおよびＨ鎖の生化学的分析
最後のゲルろ過（実施例７）に供されたイネ由来の精製Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ試サンプルを、ＤＴＴによる還元、ヨードアセトアミドによるアルキル化、およびＲＰ−ＨＰＬＣによる脱塩に供した。
【０１５１】
ＨＰＬＣで手動で収集した画分を濃縮し、トリプシンによる加水分解にかけた。こうして生成されたペプチド混合物の一定分量をＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析にかけた。
【０１５２】
続いて、Ｎ−グリコシル化部位の存在も確認するために、サンプルのトリプシン混合物をＰＮＧａｓｅ  Ａとインキュベートし、生成された混合物の一定分量を再びＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析にかけた。
【０１５３】
２鎖のペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析で得られたスペクトルの研究により、それらの「ペプチドマップ」を構築した。軽鎖の配列の９７％と重鎖の７８．９％をカバーする２鎖（軽と重）のアミノ酸配列が結果として確認された。重鎖の配列の部分的なカバーは、領域Δ［１７６−２３８］がトリプシンまたは他の特定の酵素または化学物質のいずれに対しても加水分解部位を持たないという事実によるものである。両方の鎖について、シグナルペプチドの正しい除去およびＮ末端位置のＧｌｎ残基の部分環化が発見された。Ａｓｎ３２５をＮ−グリコシル化部位として特定することもできた。
【０１５４】
グリコフォームの研究に関しては、ＰＮＧａｓｅ  Ａとのインキュベーション後、オリゴ糖をＳｅｐ−Ｐａｋクロマトグラフィーによってペプチド成分から分離し、濃縮してからＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した。この分析により、グリコフォームの存在に起因する一連のシグナルの存在を検出することができた（図１０）。グリコシル化プロファイルは、植物で発現されるタンパク質、すなわち、キシロース残基を伴うまたは伴わないフコシル化コアを有するポーシマンノース型のタンパク質について予想されるプロファイルであった。
【０１５５】
実施例９：抗原結合、競合、および抗原/抗体結合の共局在化に関するＩＮ  ＶＩＴＲＯでの薬理試験
ＲＴＸ  ＰＢＳ画分（実施例７）を細胞蛍光測定実験で使用して、市販のＲｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））と比較したＣＤ２０抗原に対するその結合活性を評価した。
【０１５６】
細胞蛍光分析（ＦＡＣＳ）には、ＭＥＣ−１細胞を使用した。ＭＥＣ−１は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂによって認識されるエピトープであるＣＤ２０を発現できるＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）のヒト細胞株に対応する。実験の第一段階は、アポトーシスによる細胞凝集体や破片のない生Ｂリンパ球のみで行うために、抗体結合を決定するＭＥＣ−１細胞をスクリーニングすることである。こうして分離および収集された細胞集団（図１１ａ、セクションＡの多角形で強調表示）で、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびイネ種子から精製された類似の組換え体（ＲＴＸ  ＰＢＳ）の存在下での蛍光強度（ＦＬＨ−１）を分析した。特に、５００，０００  ＭＥＣ−１細胞を５ｎｇ／μＬのＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）または同量のＲＴＸ  ＰＢＳと３７℃で１時間インキュベートした。二次抗体ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧとのインキュベーション後に、ＦＡＣＳ分析を行った。この分析により、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）はＭＥＣ−１細胞の９８．９１％（図１１ａ、セクションＢ）を認識し、ＲＴＸ  ＰＢＳは９８．３３％（図１１ａ、セクションＣ）を認識することを示すことができた。図１１ａの点線において、セクションＢおよびＣは、無関係の二次抗体によって提供される蛍光寄与を示す。このデータは、平均蛍光強度（図１１ｂ）とともに、２つの抗体のＣＤ２０抗原に結合する能力が同じであることを示す。ＲＴＸ  ＰＢＳ抗体は、フルオレセインで直接マーキングした後でもＣＤ２０を認識することを確認しており、ＭＥＣ−１細胞の９９．１５％が陽性であった。
【０１５７】
抗原抗体結合の位置を特定するために、ＦＡＣＳによって分析された同じ細胞に対して顕微鏡下で免疫蛍光分析を実施した。ＭＥＣ−１細胞をスライド上に接着し、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、１μｇ/μＬ）でマークして核を表示し、ＦａｓｔＤｉｌ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ、１μｇ/μＬ）で細胞膜を表示した。代わりに、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびＲＴＸ  ＰＢＳ抗体は、ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ二次抗体によって、またはＲＴＸ  ＰＢＳ抗体のみの場合、ＦＩＴＣ分子（フルオロセイン-5-イソチオシアネート）との直接結合によって示した。文献で知られているように、ＣＤ２０は細胞表面全体に存在する４膜貫通ドメイン分子である。しかし、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと結合した後、脂質ラフトとして知られるコレステロールの豊富な脂質構造内に集中する傾向がある。この特性により、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ分子は、細胞表面の制限されたゾーンに自身を配置し、Ｃ１ｑ因子に結合して相補的なカスケードを活性化またはアポトーシスを誘導できるようにＦｃ部分を互いに近づける。免疫蛍光分析から、フルオレセイン抗体によって与えられるシグナルとＦａｓｔＤｉｌのシグナルの共局在化のおかげで、単一膜領域におけるＣＤ２０抗原の集中を確認することができた。この証拠は、ＦＩＴＣと直接結合したＲＴＸ  ＰＢＳを使用するとさらにはっきりと見えた。
【０１５８】
競合アッセイ（図１２）では、ＭＥＣ−１細胞を２５μＬのＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（１００μ／ｍｌ）またはコントロール抗体（抗ＣＤ５２、Ｃａｍｐａｔｈ−１  １００μｇ／ｍｌ）で１０分間インキュベートした。次に、２５μＬのＦＩＴＣ標識ＲＴＸ抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。３７℃で１時間インキュベートし、結合していない抗体画分を洗浄により除去した後、細胞を細胞蛍光分析にかけた。競合アッセイでは、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）またはＣａｍｐａｔｈ−１によって認識されるエピトープがＲＴＸ  ＰＢＳと同じ場合、関与する部位がすでに占有されているため、ＲＴＸ  ＰＢＳの抗原への結合の減少が期待される。したがって、競合の指標として、低蛍光（100〜102）の細胞を考慮する必要がある。マークされたＲＴＸ  ＰＢＳの存在下（および他の抗体の非存在下）で低蛍光を示した細胞は、わずか７．１８％であった（図１２Ａ）。それどころか、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）を使用した競合アッセイでは、９７％以上の細胞が低い蛍光強度を示し（図１２Ｃ）、これはＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）とＲＴＸ  ＰＢＳが同じ部位で競合していることを示している。Ｃａｍｐａｔｈの存在下では、細胞のわずか１０．３６％が低蛍光領域内に存在し（図１２Ｂ）、ＲＴＸ  ＰＢＳとＣａｍｐａｔｈが異なるエピトープを認識することを証明している。
【０１５９】
本発明の分野および範囲から逸脱することなく、植物タンパク質、特にこれまでに記載されている穀物胚乳における組換え抗体全長の安定生産のための方法に、部分の修正および/または追加を行うことができることは明らかである。
【０１６０】
また、いくつかの特定の例を参照して本発明を説明したが、当業者は、植物タンパク質、特に穀物胚乳における組換え抗体全長の安定生産のため、請求項に記載された特徴を有し、したがってすべてによって定義される保護分野に含まれる他の多くの同等の形態の方法を確実に達成できることも明らかである。
【０１６１】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020519239.tif 000022
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