【手続補正書】
【提出日】平成29年11月15日(2017.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を封入した脂質ナノ粒子を調製するための方法であって、次のステップ：
水混和性有機溶媒中に溶解されたカチオン性脂質、ヘルパー脂質、ステロール、およびＰＥＧ脂質を含む、脂質の溶液を調製すること；
前記核酸分子およびｐＨ３．５〜６．５の水性緩衝液を含む、第１の水性溶液を調製すること；
前記脂質の溶液を、混合容器内で攪拌されている前記水性溶液中に、２５〜４５％（ｖ：ｖ）の有機溶媒を含む最終溶液が得られるまで、２５〜５５℃の温度にて、一定速度で１〜１００分かけて注入し、０．０６〜０．１６（ｗ：ｗ）の核酸：脂質比、および１：２．５〜１：１の核酸：脂質の電荷比を有する、脂質ナノ粒子を生成すること；ならびに
前記有機溶媒を、中性ｐＨにて第２の水性緩衝溶液に対するダイアフィルトレーションにより、前記混合物から除去すること、
を含み、
ここで核酸は、１０〜１００ヌクレオチド長である、前記方法。
【請求項２】
第２の溶液が、多糖類をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多糖類が、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクトース、マルトースおよびイヌリンからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
核酸分子を封入した脂質ナノ粒子を凍結乾燥するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
有機溶媒が、エタノールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
カチオン性脂質が、脂質の４０〜６０モルパーセントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
カチオン性脂質が、ＨＥＤＣ、ＨＥＤＯＤＣおよびＨＥ−Ｅｔ−ＤＯＤＣからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
カチオン性脂質が、永久カチオン性脂質および／またはイオン化可能カチオン性脂質を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
脂質の溶液が、
式（Ａ）の化合物
Ｌ−Ｘ−Ｒ          Ａ
式中、
・脂質（Ｌ）は、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＣからなる群から選択され；
・リンカー（Ｘ）は、不在、ＰＥＧ５５０、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ−グルタミン酸（−Ｇｌｕ）、Ｇｌｕ、Ｃ６、グリシン、およびＧｌｕＮＨ、Ｎ１，Ｎ１９−ビス（３−（２−（２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドからなる群から選択され；および
・レチノイド（Ｒ）は、トレチノイン、アダパレン、レチノール、４−ヒドロキシ（フェニル）レチンアミド（４−ＨＰＲ）、レチノイン酸、９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキス−１−エン−１−イル）ノナン酸、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキス−１−エン−１−イル）ノナン酸、３，７−ジメチル−９−（２，２，６−トリメチルシクロヘキシル）ノナン酸、および任意の部分的または完全飽和レチノイドからなる群から選択される、
式（Ｂ）の化合物
Ｒ−Ｘ−Ｒ          Ｂ
式中、
・リンカー（Ｘ）は、Ｎ１，Ｎ１９−ビス（３−（２−（２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドまたはＮ１，Ｎ１９−ビス（１６，２０−ジアミノ−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザイコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドであり；および
・レチノイド（Ｒ）は、トレチノイン、アダパレン、レチノール、４−ヒドロキシ（フェニル）レチンアミド（４−ＨＰＲ）、およびレチノイン酸、９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキス−１−エン−１−イル）ノナン酸、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキス−１−エン−１−イル）ノナン酸、３，７−ジメチル−９−（２，２，６−トリメチルシクロヘキシル）ノナン酸、および任意の部分的または完全飽和レチノイドからなる群から選択される、
葉酸、ビタミンＥ、ペプチドリガンドおよび／またはモノクローナル抗体
からなる群から選択される化合物をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第１の溶液および第２の溶液が、２５〜５５℃である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の緩衝溶液がシトラートを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
脂質の溶液を、マルチノズルを通して空気−水界面に注入することにより、水性溶液に添加する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
脂質の溶液を、サブマージ注入により水性溶液に添加する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により生成された、核酸を封入した脂質ナノ粒子を含む、医薬製剤。
【請求項１５】
カチオン性脂質が、脂質の４０〜６０モルパーセントである、請求項１４に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
カチオン性脂質が、ＨＥＤＣ、ＨＥＤＯＤＣ、およびＨＥ−Ｅｔ−ＤＯＤＣからなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
カチオン性脂質が、イオン化可能または非イオン化可能な正電荷からなる、請求項１４または１５に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
脂質の溶液が、
式（Ａ）の化合物
Ｌ−Ｘ−Ｒ          Ａ
式中、
・脂質（Ｌ）は、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＣからなる群から選択され；
・リンカー（Ｘ）は、不在、ＰＥＧ５５０、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ−グルタミン酸（−Ｇｌｕ）、Ｇｌｕ、Ｃ６、グリシン、およびＧｌｕＮＨ、Ｎ１，Ｎ１９−ビス（３−（２−（２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドからなる群から選択され；および
・レチノイド（Ｒ）は、トレチノイン、アダパレン、レチノール、４−ヒドロキシ（フェニル）レチンアミド（４−ＨＰＲ）、レチノイン酸、９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキス−１−エン−１−イル）ノナン酸、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキス−１−エン−１−イル）ノナン酸、３，７−ジメチル−９−（２，２，６−トリメチルシクロヘキシル）ノナン酸、および任意の部分的または完全飽和レチノイドからなる群から選択される、
式（Ｂ）の化合物
Ｒ−Ｘ−Ｒ          Ｂ
式中、
・リンカー（Ｘ）は、Ｎ１，Ｎ１９−ビス（３−（２−（２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドまたはＮ１，Ｎ１９−ビス（１６，２０−ジアミノ−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザイコシル）−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサノナデカン−１，１９−ジアミドであり；および
・レチノイド（Ｒ）は、トレチノイン、アダパレン、レチノール、４−ヒドロキシ（フェニル）レチンアミド（４−ＨＰＲ）、およびレチノイン酸、９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキス−１−エン−１−イル）ノナン酸、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキス−１−エン−１−イル）ノナン酸、３，７−ジメチル−９−（２，２，６−トリメチルシクロヘキシル）ノナン酸、および任意の部分的または完全飽和レチノイドからなる群から選択される、
葉酸、ビタミンＥ、ペプチドリガンドおよび／またはモノクローナル抗体
からなる群から選択される化合物をさらに含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１９】
方法がさらに、核酸を封入した脂質ナノ粒子の凍結乾燥を含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
多糖類をさらに含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
多糖類が、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースおよびイヌリンからなる群から選択される、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
核酸を封入した脂質ナノ粒子の平均粒子径が、５０〜１００ｎｍである、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
核酸を封入した脂質ナノ粒子が、０．２未満の多分散性指数を有する、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本明細書の一側面は、ポリアニオンを封入した脂質ナノ粒子を調製するための方法であって、水混和性有機溶媒に溶解した脂質を含む第１の溶液を、水性緩衝液中のポリアニオンを含む第２の溶液中に、第２の溶液を撹拌しつつ一定の速度で添加して、有機溶媒を２５〜４５％（ｖ：ｖ）で含む混合物を生成すること；および有機溶媒を混合物から、中性ｐＨにて水性緩衝溶液に対するダイアフィルトレーションにより除去すること、のステップを含む、前記方法である。第１の溶液の第２の溶液への添加は、好ましくは１〜１００分で完了される。ポリアニオンは、核酸、例えばＲＮＡ分子であってよい。ポリアニオンは好ましくは、０．０８〜０．８ｍｇ／ｍｌの濃度である。脂質ナノ粒子の薬物：脂質比（ｗ：ｗ）は、好ましくは０．０６〜０．１６である。脂質ナノ粒子の薬物：脂質の電荷比は、好ましくは１：２．５〜１：１である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
一態様は、核酸、ＲＮＡ分子、または二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む医薬製剤を含む。好ましくは、脂質ナノ粒子の薬物：脂質比は０．０６〜０．１６（ｗ：ｗ）であり、脂質ナノ粒子の薬物：脂質の電荷比は、１：２．５〜１：１である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
説明の方法は従来方法に比べて、０．２未満、好ましくは０．１未満のＰＤＩの粒子の集団を、予備形成された小胞を生成するために必要な追加のステップなしで再現性よく生成できることにより、利点を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
脂質−核酸粒子について、最終的なＲＮＡ濃度は０．００１〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌである。最終的な薬物／脂質比は、０．０６〜０．１６ｗ：ｗ（１：２．５〜１：１の電荷：電荷比）である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
凝集体の形成は、例えば粒子表面の脱水のために、凍結乾燥の凍結および／または乾燥のステップ中に生じる可能性がある。凍結プロセスは、氷が形成されるにつれて粒子間の距離が短縮される、濃縮効果を有する（Alison et al., Biochim Biophys Acta. 2000 Sep 29;1468(1-2):127-38; Armstrong and Anchordoquy, J Pharm Sci. 2004 Nov;93(11):2698-709）。この脱水は、凍結乾燥前の懸濁液に、多糖類などの溶解保護剤（lyoprotectant）を使用することによって回避することができる。適切な多糖類は、スクロース、ラクチュロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、またはセロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、トレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース（gentiobiulose）、マンノビオース（mannobiose）、メリビオース、メリビウロース（melibiulose）、ルチノース、ルチヌロース（rutinulose）、およびキシロビオースを含む。一態様において、組成物は、スクロースである多糖類を含む。別の態様において、組成物は、トレハロースである多糖類を含む。出願人らによる結果は、出発懸濁液と比較した場合に、等価のＤＬＳサイズ分布が再構成時に得られることを示している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
表４は、水和温度の２５から４５℃への上昇が、粒子サイズを１３５．７から１０２．２ｎｍに減少させ、一方でｓｉＲＮＡ回収率を８０％から８７％に改善することを示す。最終エタノールパーセントの上昇は、ｓｉＲＮＡ回収率に影響を与ることなく粒子サイズを増加させたが、封入効率を８８％に低下させた。
【表４】
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