【手続補正書】
【提出日】平成29年11月7日(2017.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法において、下層チャンバー（１）と上層チャンバー（４）から構成されているスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（８）を用いて、最初に前記デバイス（８）に培養液（１１Ａ）を導入し、スフェロイド（１２）を前記上層チャンバー（４）の中に入れ、少量の前記培養液（１１Ａ）を前記上層チャンバー（４）側に足し、その後、前記上下層チャンバー（１，４）間の前記培養液（１１Ａ）の流れによって前記スフェロイド（１２）が移動し、前記スフェロイド（１２）が前記上層チャンバー（４）の底に形成された孔（７）に固定され、前記スフェロイド（１２）が固定された後に、異なる培養液（１１Ｂ）を前記下層チャンバー（１）の片側から流し込み器具であるピペット（１３）で流し込み、前記下層チャンバー（１）の反対側から吸い込み器具であるアスピレーター（１４）で吸い続けることで、前記下層チャンバー（１）内の前記培養液を置き換えることを特徴とする。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
〔６〕スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置において、下層チャンバー（１）とドーナツ型の上層チャンバー（４）から構成されるスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（８）であって、前記上層チャンバーのウェルの底に貼られたＰＤＭＳの薄膜（６）と、この薄膜に形成された孔とを備え、前記デバイス（８）に培養液（１１Ａ）を導入し、スフェロイド（１２）を前記上層チャンバー（４）中に入れ、少量の前記培養液（１１Ａ）を前記上層チャンバー（４）側に足し、その後、前記上下層チャンバー（１，４）間の前記培養液（１１Ａ）の流れによって前記スフェロイド（１２）が移動し、前記スフェロイド（１２）が前記上層チャンバー（４）の底に形成された孔（７）に固定され、前記スフェロイド（１２）が固定された後に、異なる培養液（１１Ｂ）を前記下層チャンバー（１）の片側から流し込み器具であるピペット（１３）で流し込み、前記下層チャンバー（１）の反対側から吸い込み器具であるアスピレーター（１４）で吸い続けることで、前記下層チャンバー（１）内の前記培養液を置き換えることを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法は、下層チャンバー１と上層チャンバー４から構成されているスフェロイド１２の特定部位に対する培養条件制御デバイス８を用いて、最初に前記デバイス８に培養液１１Ａを導入し、スフェロイド１２を前記上層チャンバー４の中に入れ、少量の前記培養液１１Ａを前記上層チャンバー４側に足し、その後、前記上下層チャンバー間の前記培養液１１Ａの流れによって前記スフェロイド１２が移動し、前記スフェロイド１２が前記上層チャンバー４の底に形成された孔７に固定され、前記スフェロイド１２が固定された後に、異なる培養液１１Ｂを前記下層チャンバー１に片側から流し込み器具であるピペット１３で流し込み、前記下層チャンバー１の反対側から吸い込み器具であるアスピレーター１４で吸い続けることで、下層チャンバー１内の前記培養液を置き換える。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
まず、培養液を入れていない状態〔図６（ａ）参照〕のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）８に対して、上層チャンバー４から培養液１１Ａを入れると、孔７を通して培養液１１Ａは下層チャンバー１へも流れ込み、下層チャンバー１が満たされる。このとき、上層チャンバー４も全て満たすのではなく、上層チャンバー４には少し培養液１１Ａが残るようにする〔図６（ｂ）参照〕。次いで、スフェロイド（ここでは多能性幹細胞の集合体である胚様体）１２を入れ、少量の培養液１１Ａを上層チャンバー４に足すと、スフェロイド１２は直ぐに孔７上に固定される〔図６（ｃ）参照〕。次いで、下層チャンバー１の培養液１１Ａを吸い込み器具であるアスピレーター１４で吸いながら異なる培養液１１Ｂを流し込み器具であるピペット１３で入れていく〔図６（ｄ）参照〕。下層チャンバー１の片側から流し込み器具であるピペット１３で培養液（１１Ｂ）を入れると、図６（ｅ）のように反対側では培養液１１Ａの表面張力によって培養液１１Ａの表面が球面状に高くなってくるので、この球面部分を吸い込み器具であるアスピレーター１４で吸い取るようにしてもよい〔図６（ｆ）参照〕。この作業を繰り返すことで、下層チャンバー１内を異なる培地に交換することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
このように、使用方法として、図６に示すように、最初にデバイス８に培養液１１Ａを導入する。次に、細胞のスフェロイド１２を上層チャンバー４の中に入れ、少しの培養液１１Ａを上層側に足す。すると、上下チャンバー１，４間の培養液１１Ａの流れによってスフェロイド１２が移動し、スフェロイド１２が孔７に固定される。スフェロイド１２が固定された後に、異なる培養液１１Ｂを下層チャンバー１に流し込み器具であるピペット１３で流し込み、反対側から吸い込み器具であるアスピレーター１４で吸い続けることで、下層チャンバー１内の培養液を換えることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
１    下層チャンバー
２，５    ウェル
６    薄膜
４    上層チャンバー
７    孔
８    スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス
１１、１１Ａ、１１Ｂ    培養液
１２    スフェロイド
１３    流し込み器具であるピペット
１４    吸い込み器具であるアスピレーター
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
下層チャンバーと上層チャンバーから構成されているスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイスを用いて、最初に前記デバイスに培養液を導入し、スフェロイドを前記上層チャンバーの中に入れ、少量の前記培養液を前記上層チャンバー側に足し、その後、前記上下層チャンバー間の前記培養液の流れによって前記スフェロイドが移動し、前記スフェロイドが前記上層チャンバーの底に形成された孔に固定され、前記スフェロイドが固定された後に、異なる培養液を前記下層チャンバーの片側から流し込み器具で流し込み、前記下層チャンバーの反対側から吸い込み器具で吸い続けることで、前記下層チャンバー内の前記培養液を置き換えることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
下層チャンバーとドーナツ型の上層チャンバーから構成されるスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイスであって、
前記上層チャンバーのウェルの底に貼られたＰＤＭＳの薄膜と、該薄膜に形成された孔とを備え、
前記デバイスに培養液を導入し、スフェロイドを前記上層チャンバーの中に入れ、少量の前記培養液を前記上層チャンバー側に足し、その後、前記上下層チャンバー間の前記培養液の流れによって前記スフェロイドが移動し、前記スフェロイドが前記上層チャンバー底に形成された孔に固定され、前記スフェロイドが固定された後に、異なる培養液を前記下層チャンバーの片側から流し込み器具で流し込み、前記下層チャンバーの反対側から吸い込み器具で吸い続けることで、前記下層チャンバー内の前記培養液を置き換えることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置。