(57)【要約】  本願発明は概して、Ｅ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織への標的化ナノ粒子送達に関する。具体的には、この発明は、Ｅ−セレクチン媒介性またはＰ−セレクチン媒介性のトランスサイトーシスを介したがん性の細胞または組織に対する標的化薬剤送達に用いるキナ酸修飾ナノ粒子を調製するための方法を開示する。本明細書に記載される本発明はまた、がんを治療するための医薬組成物および方法に関する。
2020519617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ナノ粒子（ＮＰ）；
ｂ．ポリフェノール化合物；および
ｃ．キナ酸誘導体を含み、前記ＮＰが、前記ポリフェノール化合物で被覆されており、前記ポリフェノール化合物が、前記キナ酸誘導体によってさらに修飾されている、
Ｅ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）。
【請求項２】
前記ＮＰが、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール−ＰＬＧＡコンジュゲート、Ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステル（ＴＰＧＳ）−ＰＬＧＡコンジュゲート、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、メソ孔シリカ、リポソーム、およびポリフェノール凝集体からなる群から選択される、請求項１に記載のＱＡＮＰ。
【請求項３】
前記ＮＰが、１つまたは複数の被包された治療薬剤を含む、請求項１に記載のＱＡＮＰ。
【請求項４】
前記治療薬剤が、パクリタキセル、ソラフェニブ、イトラコナゾール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、カンプトテシン、シスプラチン、オキサリプラチン、シタラビン、ビンクリスチン、イリノテカン、アンホテリシンＢ、ゲムシタビン、ポリミキシンＢ、デキサメタゾン、およびビタミンＤからなる群から選択される、請求項３に記載のＱＡＮＰ。
【請求項５】
前記ポリフェノール化合物が、重合ドーパミン（ｐＤ）である、請求項１に記載のＱＡＮＰ。
【請求項６】
前記キナ酸誘導体が、
【化１】
2020519617.tif 000010
である、請求項１に記載のＱＡＮＰ。
【請求項７】
前記Ｐ−セレクチン陽性またはＥ−セレクチン陽性の細胞または組織が、がん性の細胞もしくは組織、またはがん性の細胞もしくは組織の周囲の内皮細胞である、請求項１に記載のＱＡＮＰ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＱＡＮＰを１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて含む医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物が、がんに罹った患者を治療するためのものである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｅ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスであって、
ａ．ナノ粒子（ＮＰ）を調製するステップ；
ｂ．前記ＮＰをポリフェノール化合物で被覆するステップ；および
ｃ．ポリフェノール被覆ＮＰをキナ酸誘導体で修飾して、前記ＱＡＮＰを与えるステップ
を含む、プロセス。
【請求項１１】
前記ＮＰが、１つまたは複数の治療薬剤を含む、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記ポリフェノール化合物が、重合ドーパミン（ｐＤ）である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記キナ酸誘導体が、
【化２】
2020519617.tif 000011
である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記ＮＰが、ＰＬＧＡ、ポリエチレングリコール−ＰＬＧＡコンジュゲート、Ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステル（ＴＰＧＳ）−ＰＬＧＡコンジュゲート、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、メソ孔シリカ、リポソーム、およびポリフェノール凝集体から作製される、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１５】
１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のプロセスにしたがって製造された医薬製品。
【請求項１６】
１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のプロセスにしたがって製造された医薬組成物。
【請求項１７】
前記Ｐ−セレクチン陽性またはＥ−セレクチン陽性の細胞または組織が、がん性の細胞もしくは組織、またはがん性の細胞もしくは組織の周囲の内皮細胞である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１８】
がんの患者を治療するための方法であって、前記がんの緩和を必要とする患者に、請求項８、９、１５、および１６のいずれか１項に記載の治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１９】
対象でがんを治療するための医薬の製造における、請求項８、９、１５、および１６のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本米国特許出願は、２０１７年５月８日出願の米国仮特許出願第６２／５０２，８４７号に関連しかつその優先権の利益を主張するものであり、その出願の内容は参照によりその全体をここに組み込まれる。
【０００２】
政府による支援に関する条項
この発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金第ＥＢ０１７７９１号の下、政府による支援によりなされたものである。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本願発明は概して、Ｅ−セレクチン陽性の細胞または組織への標的化ナノ粒子送達に関する。具体的には、この発明は、Ｅ−セレクチン媒介性トランスサイトーシスを介したがん性の細胞または組織に対する標的化薬剤送達に用いるキナ酸修飾ナノ粒子を調製するための方法を開示する。本明細書に記載される本発明はまた、がんを治療するための医薬組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
この節では、開示をより良く理解し易くする助けとなる態様を紹介する。したがって、これらの記述は、この観点から読まれるものとなり、何が先行技術でありまたは何がそうではないかを自認するものであるとは理解されないものとする。
【０００５】
がんは、異常な細胞の成長に伴う最も多様な疾患の一群である。現在、ヒトならびに動物に影響を及ぼす１００種を超える特定されたがんがある。２０１６年には、米国のみで、推定で１，６８５，２１０人の新たに診断されたヒトのがん症例と、５９５，６９０人のがんによる死亡者があった（非特許文献１）。がんと戦うための新しい療法および新規の療法の未だ満たされないニーズおよび増加の一途にあるニーズがある。
【０００６】
ナノ粒子（ＮＰ：nanoparticle）は、化学療法薬の有望な担体であると考えられている。ＮＰベースの化学療法の根拠が前提とするのは、腫瘍が脈管構造の過多とリンパ系の不良とを進展させる傾向があり、それゆえに正常組織に比べて選択的にＮＰが接近することが可能になるという概念である（非特許文献２）。浸透性と滞留性の増強（ＥＰＲ：enhanced permeability and retention）効果とよばれるこの現象は、腫瘍の標的化の機構に関わらず、ＮＰベースの薬剤送達の支配的な原理となりつつある。しかしながら、腫瘍でのＮＰの蓄積のパーセンテージが低く（非特許文献３）、ＮＰの恩恵を支持する臨床的なエビデンスに乏しいために、ＮＰベースの化学療法を有望なものとすることがここ最近は難題となっている。腫瘍へのＮＰの送達を制限する潜在的な理由の１つは、疾患が多岐にわたっており対象間および対象内の差異が大きく、その結果、ＥＰＲ効果の効率が様々となることにあると思われる（非特許文献４）。がん治療のためのＮＰベースの化学療法の臨床的な成功のために、現状での可能なレベルを超えてＥＰＲ効果を強化しＮＰの送達効率を亢進するべく、追加の手段が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cancer Statistics 2016 - American Cancer Society, Inc.
【非特許文献２】Y Matsumura, Cancer Res. 1986, 46, 6387-6392.
【非特許文献３】S Wilhelm, et al., Nature Review Materials, 2016, 1, 1-12.
【非特許文献４】E Karathanasis, et al., PLoS one, 2009, 4, e5843.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
実施形態によっては、本願発明は、
ａ．ナノ粒子（ＮＰ）；
ｂ．ポリフェノール化合物；および
ｃ．キナ酸誘導体を含み、前記ＮＰが、前記ポリフェノール化合物で被覆されており、前記ポリフェノール化合物が、前記キナ酸誘導体によってさらに修飾されている、
Ｅ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関する。
【００１０】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記ＮＰは、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール−ＰＬＧＡコンジュゲート、Ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステル（ＴＰＧＳ）−ＰＬＧＡコンジュゲート、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、メソ孔シリカ、リポソーム、およびポリフェノール凝集体からなる群から選択される。
【００１１】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記ＮＰは、１つまたは複数の被包された治療薬剤を含む。
【００１２】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記治療薬剤は、パクリタキセル、ソラフェニブ、イトラコナゾール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、カンプトテシン、シスプラチン、オキサリプラチン、シタラビン、ビンクリスチン、イリノテカン、アンホテリシンＢ、ゲムシタビン、ポリミキシンＢ、デキサメタゾン、およびビタミンＤからなる群から選択される。
【００１３】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記ポリフェノール化合物は、重合ドーパミン（ｐＤ）である。
【００１４】
いくつかの他の実施形態では、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記キナ酸誘導体は以下の通りである。
【００１５】
【化１】
2020519617.tif 000003
【００１６】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記Ｐ−セレクチン陽性またはＥ−セレクチン陽性の細胞または組織は、がん性の細胞もしくは組織、またはがん性の細胞もしくは組織の周囲の内皮細胞である。
【００１７】
いくつかの他の実施形態では、本願発明は、本明細書に開示されるＱＡＮＰを１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて含む医薬組成物に関する。
【００１８】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＱＡＮＰを１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて含む医薬組成物に関し、前記医薬組成物は、がんに罹った患者を治療するためのものである。
【００１９】
実施形態によっては、本願発明は、
ａ．ナノ粒子（ＮＰ）を調製するステップ；
ｂ．前記ＮＰをポリフェノール化合物で被覆するステップ；および
ｃ．ポリフェノール被覆ＮＰをキナ酸誘導体で修飾して、前記ＱＡＮＰを与えるステップ
を含む、Ｅ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスに関する。
【００２０】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスに関し、前記ＮＰは、１つまたは複数の治療薬剤を含む。
【００２１】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスに関し、前記ポリフェノール化合物は、重合ドーパミン（ｐＤ）である。
【００２２】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスに関し、前記キナ酸誘導体は以下の通りである。
【００２３】
【化２】
2020519617.tif 000004
【００２４】
実施形態によっては、 本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスに関し、前記ＮＰは、ＰＬＧＡ、ポリエチレングリコール−ＰＬＧＡコンジュゲート、Ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステル（ＴＰＧＳ）−ＰＬＧＡコンジュゲート、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、メソ孔シリカ、リポソーム、およびポリフェノール凝集体から作製される。
【００２５】
実施形態によっては、 本願発明は、１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて、本明細書に開示されるプロセスにしたがって製造された医薬製品に関する。
【００２６】
実施形態によっては、本願発明は、１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて、本明細書に開示されるプロセスにしたがって製造された医薬組成物に関する。
【００２７】
実施形態によっては、本願発明は、前記がんの緩和を必要とする患者に、本明細書に開示される治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、がんの患者を治療するための方法に関する。
【００２８】
実施形態によっては、本願発明は、対象でがんを治療するための医薬の製造における、本明細書に開示される医薬組成物の使用に関する。
【００２９】
いくつかの他の実施形態では、本願発明は、本明細書に開示される１つまたは複数の化合物のナノ粒子を１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＰＬＧＡ  ＮＰ（左）；ＰＬＧＡ−ｐＤＮＰ（中央）；ＱＡＮＰ（右）の透過型電子顕微鏡像を示す。酢酸ウラニルを用いて陰性染色を行った。スケールバー：１００ｎｍ。
【図２Ａ】図２は、休止期のＨＵＶＥＣおよびＴＮＦ−αにより活性化されたＨＵＶＥＣと共にインキュベーションされた裸のＮＰおよびＱＡＮＰの共焦点画像を図示する。緑：ＮＰ；青：細胞核；赤：原形質膜。
【図２Ｂ】図２Ｂは、休止期のＨＵＶＥＣおよびＴＮＦ−αにより活性化されたＨＵＶＥＣのフローサイトメトリ−のヒストグラムを表す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、裸のＮＰまたはＱＡＮＰと相互作用しているＨＵＶＥＣ細胞の定量測定を示す。
【図３】図３Ａは、ＨＵＶＥＣとのＱＡＮＰの結合への遊離ＱＡ−ＮＨ２による競合阻害を示す。  図３Ｂは、ＨＵＶＥＣとのＱＡＮＰの結合への抗Ｅ−セレクチン抗体による競合阻害を示す。ＱＡＮＰ−ＨＵＶＥＣの結合を、フローサイトメトリ−によって定量した。
【図４】図４Ａは、経内皮遊走アッセイの模式図である。  図４Ｂは、ＨＵＶＥＣ単層の代表的なＴＥＥＲプロットである。  図４Ｃは、ＴＮＦ−α活性化がある場合とない場合のコンフルエントなＨＵＶＥＣ単層を横断するＮＰ輸送のパーセンテージを示す。  図４Ｄは、ＱＡＮＰのリガンド密度と経内皮輸送との間の関係を示す。
【図５】図５Ａは、様々なヒトがん細胞株を用いて条件調整された培地中で成長した、ＨＵＶＥＣのＥ−セレクチンの発現を示す。＃：一元ＡＮＯＶＡ後のダネットの多重比較検定によりＥＧＭ−２群に対してｐ＜０．００１。  図５Ｂは、様々なマウスがん細胞株を用いて条件調整された培地中で成長した、ＥＯＭＡ細胞のＥ−セレクチンの発現を示す。＃：ｐ＜０．００１；＊：ｐ＜０．０１；一元ＡＮＯＶＡ後のダネットの多重比較検定によりＤＭＥＭ群に対して。
【図６】図６は、注射後２４時間での動物の代表的な全身イメージングを示す。皮下にＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植片を担持した動物に、尾静脈を介してＱＡＮＰ（上）、ＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧ（中央）、および遊離ＩＣＧ（下）を注射した。
【図７】図７Ａは、全身イメージングの最後に取り出した主要臓器のｅｘ  ｖｉｖｏ画像の蛍光強度を図示する。１群当たりｎ＝５頭のマウス。＃：二元ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニの多重比較検定によるｐ＜０．０００１。  図７Ｂは、主要臓器から抽出されたＩＣＧの蛍光強度を示す。１群当たりｎ＝５頭のマウス。＃：二元ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニの多重比較検定によるｐ＜０．０００１。
【図８】図８Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を有する雌ヌードマウスに、ＰＴＸ  ２０ｍｇ／ｋｇ相当の単回用量として与えられた処理を示す。腫瘍体積（Ｖ）が２０００ｍｍ３に達したかまたは動物プロトコールに定められたいずれかの病的状態のサインを示した際に、マウスを屠殺した。群当たりｎ＝５。腫瘍特異的成長率をΔｌｏｇＶ／Δｔ（ｔ：日数での時間）と定義する。＊：対応のないｔ検定によるｐ＜０．０５  図８Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を有する雌ヌードマウスに、２週間にわたって５回用量の２０ｍｇ  ＰＴＸ相当／ｋｇ／用量として与えられた処理を示す。群当たりｎ＝５。＊：ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定によるｐ＜０．０５。
【図９】図９Ａは、生理食塩水、ブランクＰＥＧ−ＮＰ、ブランクＱＡ−ＮＰ、およびＰＴＸ＠ＰＥＧ−ＮＰと比較した際のＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰの抗がん効能を示す。２週間にわたって１０回用量の３０ｍｇ  ＰＴＸ相当／ｋｇ／用量として処理を行った。群当たりｎ＝５。  図９Ｂは、ＰＥＧ−ＮＰ、ＱＡ−ＮＰ、または生理食塩水（陰性対照として）の単回注射後５日目の各リガンド（ＰＥＧ、ＱＡ）に対する抗体の検出を示す。群当たりｎ＝３。＊：ログランク（マンテル・コックス）検定によるｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本願の開示の概念が、本明細書に図および記載にて詳細に説明および記載されている一方で、図およびその記載にある結果は、例示であるものと考えられ特徴を制限するものとはならはないが、なぜなら、実例となる実施形態が示され記載されているに過ぎず、本開示の趣旨の内に入る全ての変更および修飾が保護されることが望まれていると理解されるためである。
【００３２】
実施形態によっては、本願発明は、
ａ．ナノ粒子（ＮＰ）；
ｂ．ポリフェノール化合物；および
ｃ．キナ酸誘導体を含み、前記ＮＰが、前記ポリフェノール化合物で被覆されており、前記ポリフェノール化合物が、前記キナ酸誘導体によってさらに修飾されている、
Ｅ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関する。
【００３３】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記ＮＰは、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール−ＰＬＧＡコンジュゲート、Ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステル（ＴＰＧＳ）−ＰＬＧＡコンジュゲート、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、メソ孔シリカ、リポソーム、およびポリフェノール凝集体からなる群から選択される。
【００３４】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記ＮＰは、１つまたは複数の被包された治療薬剤を含む。
【００３５】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記治療薬剤は、パクリタキセル、ソラフェニブ、イトラコナゾール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、カンプトテシン、シスプラチン、オキサリプラチン、シタラビン、ビンクリスチン、イリノテカン、アンホテリシンＢ、ゲムシタビン、ポリミキシンＢ、デキサメタゾン、およびビタミンＤからなる群から選択される。
【００３６】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記ポリフェノール化合物は、重合ドーパミン（ｐＤ）である。
【００３７】
いくつかの他の実施形態では、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記キナ酸誘導体は以下の通りである。
【００３８】
【化３】
2020519617.tif 000005
【００３９】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）に関し、前記Ｐ−セレクチン陽性またはＥ−セレクチン陽性の細胞または組織は、がん性の細胞もしくは組織、またはがん性の細胞もしくは組織の周囲の内皮細胞である。
【００４０】
いくつかの他の実施形態では、本願発明は、本明細書に開示されるＱＡＮＰを１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて含む医薬組成物に関する。
【００４１】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＱＡＮＰを１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて含む医薬組成物に関し、前記医薬組成物は、がんに罹った患者を治療するためのものである。
【００４２】
実施形態によっては、本願発明は、
ａ．ナノ粒子（ＮＰ）を調製するステップ；
ｂ．前記ＮＰをポリフェノール化合物で被覆するステップ；および
ｃ．ポリフェノール被覆ＮＰをキナ酸誘導体で修飾して、前記ＱＡＮＰを与えるステップ
を含む、Ｅ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスに関する。
【００４３】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスに関し、前記ＮＰは、１つまたは複数の治療薬剤を含む。
【００４４】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスに関し、前記ポリフェノール化合物は、重合ドーパミン（ｐＤ）である。
【００４５】
実施形態によっては、本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスに関し、前記キナ酸誘導体は以下の通りである。
【００４６】
【化４】
2020519617.tif 000006
【００４７】
実施形態によっては、 本願発明は、本明細書に開示されるＥ−セレクチン陽性またはＰ−セレクチン陽性の細胞または組織を選択的に標的とするキナ酸修飾ナノ粒子（ＱＡＮＰ）を製造するためのプロセスに関し、前記ＮＰは、ＰＬＧＡ、ポリエチレングリコール−ＰＬＧＡコンジュゲート、Ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸エステル（ＴＰＧＳ）−ＰＬＧＡコンジュゲート、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、メソ孔シリカ、リポソーム、およびポリフェノール凝集体から作製される。
【００４８】
実施形態によっては、 本願発明は、１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて、本明細書に開示されるプロセスにしたがって製造された医薬製品に関する。
【００４９】
実施形態によっては、本願発明は、１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて、本明細書に開示されるプロセスにしたがって製造された医薬組成物に関する。
【００５０】
実施形態によっては、本願発明は、前記がんの緩和を必要とする患者に、本明細書に開示される治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、がんの患者を治療するための方法に関する。
【００５１】
実施形態によっては、本願発明は、対象でがんを治療するための医薬の製造における、本明細書に開示される医薬組成物の使用に関する。
【００５２】
いくつかの他の実施形態では、本願発明は、１つまたは複数の希釈剤、賦形剤、または担体と合わせて、本明細書に開示される１つまたは複数の化合物のナノ粒子を含む医薬組成物に関する。
【００５３】
本願発明のこれらおよび他の特長、態様、および利点は、以下の図、記載、および特許請求の範囲を参照してさらによく理解されてゆくものとなる。
【００５４】
本明細書に用いられる際に、以下の用語および節は、下記に明記された意味を有するものとする。別段に定義のない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００５５】
本願の開示では、用語「約」は、値または範囲におけるある程度の可変性を、例えば、記述された値または記述された限度の範囲の１０％以内、５％以内、または１％以内に許容することができる。本願の開示では、用語「実質的には」は、値または範囲におけるある程度の可変性を、例えば、記述された値または記述された限度の範囲の９０％以内、９５％以内、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、または少なくとも約９９．９９９％以上に許容することができる。
【００５６】
この文書では、用語「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、別段に文脈が明確に記述しない限り、１つまたは１つを超えるものを含むために使用される。用語「または」は、別段に示されない限り、非排他的な「または」を指すために使用される。さらに、本明細書に採用されかつ別段に定義のない言い回しまたは専門用語は、記載のみの目的のためであって、限定の目的のためではないことが理解されよう。節の見出しのいかなる使用も、本文書の読み取りの助けとすることが意図されており、限定として解釈されないものとなる。さらに、節の見出しに関連のある情報が、その特定の節の内部または外側で発生することがある。さらに、この文書で言及される全ての刊行物、特許、および特許文書は、個別に参照により組み込まれるがごとく、参照により本明細書にその全体を組み込まれる。この文書とそのように参照により組み込まれた文書との間に用法の不一致がある場合、組み込まれた参考文献中の用法は、この文書の用法を補足するものと考えられるべきである。そして、相容れない不一致については、この文書での用法が支配的である。
【００５７】
用語「医薬的に許容可能な担体」は、当技術分野で認識されており、任意の対象組成物またはその構成成分の運搬または輸送に関与する医薬的に許容可能な材料、組成物、または媒体、例えば液体もしくは固体のフィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくは被包材料などを指す。各担体は、対象組成物およびその構成成分に適合し患者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。医薬的に許容可能な担体として機能を果たし得る材料のいくつかの例としては、（１）糖類、例えばラクトース、グルコース、およびスクロースなど；（２）デンプン類、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど；（４）粉末トラガカント；（５）モルト；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばココアバターおよび坐剤ワックス類など；（９）油類、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、およびダイズ油など；（１０）グリコール類、例えばプロピレングリコールなど；（１１）ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなど；（１２）エステル類、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェン不含水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；ならびに（２１）医薬製剤に採用される他の非毒性の適合する物質が挙げられる。
【００５８】
本明細書に用いられる際に、用語「投与すること」は、本明細書に記載される化合物および組成物を患者に導入するあらゆる手段を含み、そのようなものとしては、以下に限定されないが、経口（ｐｏ）、静脈内（ｉｖ）、筋肉内（ｉｍ）、皮下（ｓｃ）、経皮、吸入、バッカル、眼内、舌下、膣、直腸などが挙げられる。本明細書に記載される化合物および組成物は、従来の非毒性の医薬的に許容可能な担体、アジュバント、および媒体を含有する単位剤形および／または製剤で投与されてもよい。
【００５９】
経口投与の実例となる形式としては、錠剤、カプセル、エリキシル、シロップなどが挙げられる。非経口投与の実例となる経路としては、静脈内、動脈内、腹腔内、硬膜外、尿道内、胸骨内、筋肉内、および皮下、ならびに非経口投与の経路として認識される任意の他の技法が挙げられる。
【００６０】
非経口投与の実例となる手段としては、針（顕微針を含む）注射器、針のない注射器、および輸注手法、ならびに当技術分野で認識されている任意の他の非経口投与の手段が挙げられる。非経口製剤は、典型的には、塩、炭水化物、および緩衝剤（好ましくは約３から約９までの範囲のｐＨで）などの賦形剤を含有し得る水溶液であるが、用途によっては、それらは、滅菌された非水溶液として、または滅菌されたパイロジェン不含水などの適した媒体と併せて使用される乾燥形態として、さらに適切に製剤化されることがある。滅菌条件下、例えば凍結乾燥による、非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技法を使用して容易に達成されることがある。化合物の非経口投与は、実例として、生理食塩水溶液の形態で、またはリポソーム内に組み込まれた化合物を用いて実施される。化合物がそれ自体では溶解するのに充分な可溶性を持たない場合に、エタノールなどの可溶化剤を適用することができる。
【００６１】
特許請求の範囲に記載された組合せの各化合物の投与量は、複数の要因に依存し、そのような要因としては、投与方法、治療される状態、状態の重症度、その状態が治療または予防されるものとなるか否か、ならびに治療される人物の年齢、体重、および健康状態が挙げられる。さらに、特定の患者に関する薬理ゲノミクス（遺伝子型が治療薬の薬物動態、薬力学、または効能のプロファイルに及ぼす影響）の情報が、使用される投与量に影響を及ぼすことがある。
【００６２】
本明細書に記載される方法では、共投与の個々の構成成分または組合せを、任意の適した手段によって、同時期に、同時に、連続的に、別々に、または単回の医薬製剤で、投与できることが理解されよう。共投与される化合物または組成物が別々の剤形で投与される場合、各化合物の１日当たりに投与される投与数は、同じであっても異なっていてもよい。本化合物または組成物は、同じ投与経路を介しても異なる投与経路を介しても投与され得る。本化合物または組成物は、同時のレジメンに従っても交互のレジメンに従っても、治療過程の間に同時でも異なる時でも、併行して分割形態でも単一形態でも、投与され得る。
【００６３】
用語「治療有効量」は、本明細書に用いられる際には、治療されている疾患または障害の症状の軽減を含めて、研究者、獣医、医師、または他の臨床医学者の探求する組織系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的な応答を惹起する、活性化合物または医薬剤の量を指す。一態様では、治療有効量とは、任意の医学的処置に適用可能な理に適ったベネフィット／リスク比で、疾患または疾患の症状を治療または軽減し得るものである。しかし、本明細書に記載される化合物および組成物の毎日の総使用量は、主治医によって健全な医学的判断の範囲内で決定され得ることが理解されよう。いかなる特定の患者に対する具体的な治療上有効な用量レベルも、種々の要因に依存するものとなり、そのような要因としては、治療されている障害および障害の重症度；採用される具体的な化合物の活性；採用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食事：採用される具体的な化合物の投与時間、投与経路、および排泄率；治療期間；採用される具体的な化合物との組合せでまたは同時に使用される薬剤；ならびに研究者、獣医、医師、または通常の技能を有する他の臨床医学者に周知されている類似の要因が挙げられる。
【００６４】
投与経路に応じて、多岐にわたる許容投与量が本明細書に想定され、そのようなものとしては、約１μｇ／ｋｇから約１ｇ／ｋｇまでの範囲にある用量が挙げられる。投与量は単一であっても分割であってもよく、多様なプロトコールに従って投与され得るが、そのようなものとしては、ｑ．ｄ．（１日１回）、ｂ．ｉ．ｄ．（１日２回）、ｔ．ｉ．ｄ．（１日３回）、または他のさらに多くの日毎に、週に１回、月に１回、四半期に１回などが挙げられる。これらの場合のそれぞれでは、本明細書に記載される治療有効量は、投与の実例に、あるいはまた、用量投与プロトコールによって決定されるような毎日、毎週、毎月、もしくは四半期の総用量に、対応することが理解される。
【００６５】
本明細書に記載される実例となる投与量および用量投与プロトコールに加えて、本明細書に記載される化合物のいずれか１つまたは混合物の有効量は、公知の手法を使用することによって、および／または類似の状況下で得られる結果を観察することによって、所属の診断医または主治医が決定できることが理解されよう。有効量または用量を決定する際に、所属の診断医または主治医によって数多くの要因が考慮されるが、そのようなものとしては、以下に限定されないが、ヒトを含めた哺乳動物の種、そのサイズ、年齢、および全身の健康状態、関与する具体的な疾患または障害、疾患または障害の程度または関与または重症度、個別の患者の応答、投与される特定の化合物、投与様式、投与される調製物のバイオアベイラビリティの特徴、選択される用量レジメン、併用薬物の使用、および他の関連のある状況が挙げられる。
【００６６】
用語「患者」は、ヒトならびに非ヒト動物、例えば伴侶動物（イヌおよびネコなど）および家畜動物などを含む。家畜動物とは、食料生産のために飼育される動物である。治療される患者は、好ましくは哺乳動物、具体的にはヒトである。
【００６７】
ナノ粒子（ＮＰ）は、化学療法薬の有望な担体であると考えられている。ＮＰベースの化学療法の根拠が前提とするのは、腫瘍が脈管構造の過多とリンパ系の不良とを進展させる傾向があり、それゆえに正常組織に比べて選択的にＮＰが接近することが可能になるという概念である。浸透性と滞留性の増強（ＥＰＲ）効果とよばれるこの現象は、腫瘍の標的化の機構に関わらず、ＮＰベースの薬剤送達の支配的な原理となりつつある。しかしながら、腫瘍でのＮＰの蓄積のパーセンテージが低く、ＮＰの恩恵を支持する臨床的なエビデンスに乏しいために、ＮＰベースの化学療法を有望なものとすることがここ最近は難題となっている。腫瘍へのＮＰの送達を制限する潜在的な理由の１つは、疾患が多岐にわたっており対象間および対象内の差異が大きく、その結果、ＥＰＲ効果の効率が様々となることにあると思われる。ＮＰベースの化学療法を臨床的に成功させるために、現状での可能なレベルを超えてＥＰＲ効果を強化しＮＰの送達効率を亢進する、追加の手段があるべきである。
【００６８】
確かなＥＰＲ効果がない場合、血管内皮−循環しているＮＰが出会う最初の細胞層−は、その下にある腫瘍へのアクセス障壁としての機能を果たす。そのため、内皮障壁と活発に相互作用することが可能なＮＰは、腫瘍内へ滲出する機会がより高いものとなる。これに関連して、我々は、腫瘍周囲の内皮の表面で上方制御される特徴的な一連の接着分子に注目した（N Makrilia, et al., Cancer Invest 2009, 27, 1023-1037）。例えば、Ｅ−セレクチンは、炎症誘発性の刺激があると内皮細胞上に発現する膜貫通糖タンパク質であるが（GS Kansas, Blood 1996, 88, 3259-3287）、腫瘍周囲の内皮上にも過剰発現しており、血管新生（AE Koch, et al, Nature 1995, 376, 517）および腫瘍増殖を促進する。さらに、Ｅ−セレクチンは、循環する腫瘍細胞の接着点としての機能を果たし、それらが滲出して転移を形成する一助となる（H Kobayashi, et al, Current Medicinal Chemistry 2007, 14, 377-386; GE Rice, et al, Science 1989, 246, 1303）。
【００６９】
Ｅ−セレクチンに対する天然のリガンドは、炭水化物部分であるシアリルルイスｘ（ｓＬｅｘ）、すなわちシアル酸、ガラクトース、フコース、およびＮ−アセチルーガラクトサミンからなる四糖である（M Phillips, et al, Science 1990, 250, 1130-1132）。腫瘍の進行および転移におけるＥ−セレクチンの密接な関わりを前提として、ｓＬｅｘおよびその類似体が、Ｅ−セレクチンアンタゴニストとして探究されている（S Pedatella, et al, Carohydrate Research 2008, 343, 31-38)。ｓＬｅｘの数多くの化学類似体が、Ｅ−セレクチンに対するその特異性および親和性を亢進するために提案されている（EE Simanek, et al, Chemical Review 1998, 98, 833-862）。それらのうち、キナ酸（ＱＡ）は、その誘導体と併せて、化学修飾の安定性、単純さ、および容易性のために、有望な候補として注目されている（N Kaila, et al, J. Med. Chem. 2005, 48, 4346-4357）。これらのＥ−セレクチンリガンドはまた、化学療法薬を腫瘍周囲の内皮に送達するための高分子およびＮＰ薬剤担体の標的リガンドとして使用されている（Y Shamay, et al, J. Controlled Release 2015, 217, 102-112）。ごく最近、炎症性好中球の膜で被覆されたポリマー性ＮＰが、接着分子とのその相互作用に基づいて転移前の内皮に対処するように創製された（T Kang, et al, ACS Nano 2017, 11, 1397-1411)。
【００７０】
これらの研究が、腫瘍への薬剤送達を亢進するために内皮標的化リガンドを使用することの実現可能性を実証する一方で、新しいポリマー合成の複雑さと非効率性ゆえに、この有望な原理の臨床への橋渡しが妨げられる可能性がある。この難題に対処するため、我々は、化学的な反応性に関わらず種々のＮＰプラットフォームに適用可能な、ドーパミン重合（J Park, et al., ACS Nano 2014, 8, 3347-3356）に基づく単純な表面官能化法を採用した。このドーパミン重合法は、単純にＮＰを酸化条件下ドーパミン溶液中でインキュベーションすることを含み、それによってドーパミンが重合して、ＮＰ表面に化学反応性層を形成しリガンド分子を収めることが可能になる（H Lee, et al, Science 2007, 318, 426-430）。この方法により、ＱＡ誘導体を含めて様々なタイプのリガンドをコンジュゲーションすること、およびＮＰ表面のＱＡ密度を柔軟に制御することが可能になる。そのような多用性および柔軟性により、我々は、ＱＡを介してＮＰの経内皮輸送を増大させるための最適な条件を検討し、ＱＡ修飾ＮＰとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの典型的なステルス被覆を含有するものとを比較することが可能となっている。この研究で、我々が実証するのは、ポリマー性ＮＰが、重合ドーパミン（ポリドーパミン、ｐＤ）を介してＱＡによって容易に修飾することが可能であり、活性化された内皮細胞に効率良く相互作用して内皮細胞層を移動させ、典型的なステルスＮＰがＥＰＲ効果に基づいて行うよりもはるかに高度に腫瘍に到達することである。
【実施例】
【００７１】
ｓＬｅｘの合成模倣体ＱＡ−ＮＨ２の合成
ｓＬｅｘの合成模倣体であるＱＡ−ＮＨ２を、以前に報告されたスキームに僅かな改変を加えたものに従って合成した。全体の収率は６２％であった。１ＨプロトンＮＭＲにより、化合物の構造を確定した。電子スプレーイオン化質量分析により、化合物の質量対電荷比が予想通りに３２４．９（−ＭＳモード）であることを見出した。
【００７２】
ＱＡＮＰの製作および特性解析
ＮＰ−ｐＤ−ＱＡ（ＱＡＮＰ）を、ドーパミン媒介性の表面修飾法(J Park, et al., ACS Nano 2014, 8, 3347-3356）を用いて調製した。ＰＬＧＡ  ＮＰを、まず単一エマルジョン溶媒蒸発法によって調製し、ｐＤ層で覆い、次いでマイケル付加反応および／またはシッフ塩基反応を介してＮＰ表面にＱＡ−ＮＨ２を収容する（H Lee, et al, Science 2007, 318, 426-430)。ＱＡＮＰは、動的光散乱法によれば、平均径１４５ｎｍおよびゼータ電位−６．５ｍＶを有していた。ＱＡＮＰの電子スプレーイオン化質量（ＭＳ−ＥＳＩ）分析により、ＱＡＮＰ上でＱＡ−ＮＨ２のコンジュゲーションに成功したことの定性的な証拠を得た。ｐＤ官能化を行わずに単純にＱＡ−ＮＨ２と共にインキュベーションされたＰＬＧＡ  ＮＰ（ＰＬＧＡ／ＱＡ  ＮＰ）は、ＭＳ−ＥＳＩではＱＡ−ＮＨ２の特徴となるピークを持たず、それゆえに、ｐＤ被覆がＱＡ−ＮＨ２コンジュゲーションのメディエーターとして必須の役割を有することが確認された。透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）（図１）では、ｐＤ被覆に起因して、ＰＬＧＡコアＮＰの表面に追加の層が特定された（表１）。しかし、ＰＬＧＡ−ｐＤ  ＮＰとＱＡＮＰとの間には目に見える違いがなく、このことは他のリガンドを用いた過去の例に一致する（J Park, et al, ACS Nano 2014, 8, 3347-3356）。
【００７３】
ＱＡＮＰの表面にコンジュゲーションされたＱＡ−ＮＨ２の数は、本来のＱＡ−ＮＨ２供給から反応培地中に残っていたＱＡ−ＮＨ２量を差し引くことによって、間接的に決定した。ＱＡＮＰの単位表面積にコンジュゲーションされるＱＡ−ＮＨ２は、ＱＡ−ＮＨ２供給に伴って直線的に増加し、試験供給の範囲ではプラトーに到達しなかった。
【００７４】
表１．ＮＰの粒子径、ゼータ電位、および多分散性指標（ＰＤＩ）
【表１】
2020519617.tif 000007
【００７５】
血清中のＱＡＮＰの安定性
ＱＡＮＰの生物学的評価の前に、５０％ＦＢＳ中でのそれらのサイズの分布を、０．０５ｍｇ／ｍＬから０．２ｍｇ／ｍＬに及ぶ様々な濃度で試験した。濃度に関わらず、ＱＡＮＰは、１２０ｎｍに一貫したピークを示した。１０ｎｍおよび８０ｎｍにある２つの特徴的なピークは、血清タンパク質およびそれらの凝集体であるものと特定された。５０％ＦＢＳ中で２時間にわたって、ＱＡＮＰの凝集または集塊は発生しなかった。
【００７６】
ＱＡＮＰと活性化ＨＵＶＥＣとの相互作用
ＱＡＮＰ−ＨＵＶＥＣ相互作用を、共焦点顕微鏡観察およびフローサイトメトリ−を用いて調べた（図２Ａ〜２Ｃ）。具体的には、ＨＵＶＥＣを、ＴＮＦ−αによる活性化がある場合とない場合で、蛍光標識化ＱＡＮＰまたは裸のＮＰと共に６時間インキュベーションした。ＴＮＦ−α処理は、ＨＵＶＥＣ上のＥ−セレクチンの発現を誘導する。比較のために、裸のＰＬＧＡ  ＮＰも同じように供試した。図２Ａは、ＱＡＮＰがＨＵＶＥＣ細胞膜と会合していたことを示しており、一方で、裸のＮＰは、最小限の非特異的な結合を示した。細胞と共に保持されているＮＰを定量するために、フローサイトメトリ−を用いて、細胞溶解物の蛍光強度を測定した。ＱＡＮＰと共にインキュベーションした活性化ＨＵＶＥＣは、対照群［ＱＡＮＰ（または裸のＮＰ）と共存させた非活性化ＨＵＶＥＣ、または非修飾ＮＰと共存させた活性化ＨＵＶＥＣ］に比べて最大の蛍光強度を示し、これは共焦点イメージングに一致した（図２Ｂ、図２Ｃ）。これらの結果は、ＱＡＮＰが、活性化ＨＵＶＥＣに対する親和性を有し、それゆえに腫瘍周囲の内皮上に濃縮する能力を有することを示す。
【００７７】
ＱＡ−Ｅ−セレクチン相互作用のメディエーターを確かめるために、遊離ＱＡ−ＮＨ２または抗Ｅ−セレクチン抗体の存在下でインキュベーションを行った。活性化ＨＵＶＥＣとのＱＡＮＰの結合は、遊離ＱＡ−ＮＨ２（図３Ａ）および抗Ｅ−セレクチン抗体（図３Ｂ）によって用量依存的に低減したが、それは、遊離ＱＡ−ＮＨ２がＱＡＮＰと競合すること、およびＥ−セレクチンの遮断が活性化ＨＵＶＥＣとのＱＡＮＰの結合に干渉することをそれぞれ示す。これらの結果は、活性化ＨＵＶＥＣとのＱＡＮＰの結合が、Ｅ−セレクチンとのＱＡの相互作用によって媒介されたことを確定するものである。
【００７８】
ＱＡＮＰの滲出能を試験するための経内皮遊走アッセイ
ＱＡＮＰと腫瘍周囲の内皮との間の相互作用は、ＮＰを腫瘍の近辺に濃縮し、ＮＰが滲出して腫瘍に到達する機会を増加させる一助となる。我々は、ボイデンチャンバーアッセイ（S Boyden, J. Experimental Med. 1962, March, 453-466）と同様に、ＱＡＮＰがＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート上に成長した内皮細胞層を横断して輸送する能力（図４Ａ）を評価した。ＴＮＦ−α前処理のある場合とない場合で、コンフルエントなＨＵＶＥＣ層を含有するＴｒａｎｓｗｅｌｌの頂上側上に、ＱＡＮＰおよび対照ＮＰを配し（図４Ｂ）、頂上側に残っていたＮＰと底面外側で回収されたＮＰとを定量した。予想通り、内皮層を横断する輸送は、ＱＡＮＰおよびＴＮＦ−α活性化（＝Ｅ−セレクチン発現）ＨＵＶＥＣでのみ観察された（図４Ｃ）。
【００７９】
リガンド密度と経内皮輸送との関係を調べるために、様々なリガンド密度のＱＡＮＰを、活性化ＨＵＶＥＣと共にインキュベーションした（図４Ｄ）。ＱＡＮＰのリガンド密度が２５ＱＡ−ＮＨ２／ｎｍ２から１００ＱＡ−ＮＨ２／ｎｍ２に増加するにつれて、ＱＡＮＰ輸送が増加した。しかし、リガンド密度をさらに２００ＱＡ−ＮＨ２／ｎｍ２に増加させたところ、内皮層を横切る細胞のパーセンテージは減少した。可能性のある説明として、リガンド密度の増加に伴って、ＱＡ−ＮＨ２は、Ｅ−セレクチンと相互作用する代わりに、水素結合に起因する分子間クラスターを形成していた可能性がある。総じて、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ実験が示唆しているのは、最適な表面密度を持つＱＡリガンドが、活性化ＨＵＶＥＣを横断してＮＰを輸送する一助となることである。
【００８０】
様々ながん細胞は、内皮細胞でＥ−セレクチンの上方制御を誘導する
【００８１】
Ｅ−セレクチンの血管での発現は、腫瘍のタイプに応じて変わる。文献では、内皮細胞におけるＥ−セレクチンの上方制御と腫瘍の分泌するインターロイキン−１αの量との間に強い相関があることが示唆されている（M Nguyen, Am J Pathol 1997, 150, 1307-1314）。我々は、複数のヒトがん細胞株の条件培地をスクリーニングし、それらがＨＵＶＥＣでＥ−セレクチンの発現を誘導するか否かを調べた。条件培地に曝露されたＨＵＶＥＣは、様々なレベルのＥ−セレクチンを発現した（図５Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１条件培地は、最大レベルのＥ−セレクチンの発現を誘導した。同様の観察を、一連のマウス細胞株を用いて取得した（図５Ｂ）。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞または４Ｔ１乳がん細胞を用いて条件検討された培養培地は、Ｅ−セレクチン発現を誘導したが、このことは、Ｅ−セレクチンの標的化を広範に適用可能であることを示している。
【００８２】
ＱＡ−ＮＰとＥ／Ｐ−セレクチンとの相互作用が、ＱＡ−ＮＰが滲出して腫瘍に進入する一助となるか否かを検討するために、我々は、生体顕微鏡を使用し、ＧＦＰ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有したマウスでＱＡ−ＮＰを可視化した。ＱＡ−ＮＰを、血管近くでの注射の２時間後から観察した。ＱＡ−ＮＰシグナルは、時間と共に増加し、腫瘍内にさらに遊走した。この観察は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴｒａｎｓｗｅｌｌの結果と合致しており、Ｅ／Ｐ−セレクチンとのＱＡ−ＮＰの相互作用が滲出を高めて腫瘍への蓄積を亢進したというｉｎ  ｖｉｖｏのコンセプト実証（proof-of-concept）を与えるものである。
【００８３】
ＱＡＮＰのＩｎ  ｖｉｖｏ全身イメージング
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１がＨＵＶＥＣ上のＥ−セレクチンの発現に正の効果を及ぼすことから、我々は、ＱＡＮＰの分布を評価するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植のマウスモデルを選択した。我々は、ＱＡＮＰが、Ｅ−セレクチンを介して腫瘍周囲の内皮と活発な相互作用を展開し、内皮を横断してトランスサイト―シスを行い、ＥＰＲ効果に依存する長期循環性ＮＰよりも高度にＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍中にＮＰを蓄積するものとなるという仮説を立てている。全身蛍光イメージングシステムを用いてＮＰの分布を経時的に追跡するために、近赤外線蛍光染料であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を用いてＱＡＮＰを標識した。カルボジイミド化学を介して、ＩＣＧをＰＬＧＡに共有結合によりコンジュゲーションした。ＩＣＧ−ＰＬＧＡコンジュゲート（ＩＣＧ−ＮＰ）を用いて作製された裸のＮＰは、ＩＣＧを物理的に被包する裸のＮＰ（ＩＣＧ／ＮＰ）とは対照的に、５０％ＦＢＳ中でインキュベーションされたＮＰ中で安定のままであったが、このことは、ＩＣＧ−ＮＰのＩＣＧの蛍光がｉｎ−ｖｉｖｏイメージングにおいてＮＰを表すものとなることを示す。
【００８４】
ＱＡＮＰ、ＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧ  ＮＰ（ＰＥＧ化長期循環性ＮＰを表す）、および遊離ＩＣＧを、尾静脈を介して注射し、２４時間にわたってイメージングした（図６）。遊離ＩＣＧは、投与の直後に全身にわたって広がり、胆汁排出によって徐々に除かれたのに対して、ＱＡＮＰおよびＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧ  ＮＰは、肝臓に現れた。ＱＡＮＰの腫瘍への顕著な蓄積が、注射の２時間後に始まって観察されたのに対して、遊離ＩＣＧおよびＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧを処理された動物では、ほぼ蛍光が検出されなかった（表２）。腫瘍に蓄積されたＱＡＮＰは、経時的に徐々に減少したが、２４時間の実験期間を通じて持続した。ＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧおよび遊離ＩＣＧを受けた動物は、全ての時点で腫瘍に蛍光を示さなかった。興味深いことに、ＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧは腫瘍に全く観察されなかった。ＬＳ１７４Ｔ異種移植片のような過度な血管形成ではなかったものの、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片は、エバンスブルーの蓄積の程度によれば、やはり筋肉組織よりも多くの血管形成を生じた（ＬＳ１７４Ｔ／筋肉＝１．３４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／筋肉＝１．０４）。文献もまた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍での血管形成と長期循環性ＮＰの蓄積とを支持している。我々は、ＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧのＰＥＧ修飾が不充分であったとは疑っていない。蛍光検出の閾値が非常に高く設定されたために、弱い蛍光を捉えていなかった可能性が大きい。この実験を、別のセットの動物を用いて繰り返して、結果の再現性を確かめた。ＱＡＮＰおよびＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧを受けた動物は、腫瘍中で様々な蛍光シグナルを示したが、これは過去の実験と一致する。
【００８５】
表２．タキソール、ＰＴＸ＠ＰＥＧ−ＮＰ、およびＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰの血漿中の薬物動態学的パラメータ
【表２】
2020519617.tif 000008
【００８６】
ＱＡＮＰの臓器分布のｅｘ  ｖｉｖｏ分析
全身イメージングの完了後すぐにｅｘ  ｖｉｖｏ分析を実施した。最後のイメージング時点の後（注射の２４時間後）、動物を屠殺して、イメージングのために全ての主要臓器を取り出した。所見は、全身イメージングの結果に一致した（図７Ａ）。ＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧを受けた動物の場合、肝臓が最大の蛍光シグナルを示し、肺および脾臓がそれに続いた。ＱＡＮＰは、ＲＥＳ臓器に蓄積を示した一方で、ＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧよりも顕著に高いシグナルを腫瘍に、低いシグナルを肺に示した。注射の６時間後のｅｘ  ｖｉｖｏ画像（第２の実験セットから取得）は、腫瘍中のＱＡＮＰシグナルが、肝臓または脾臓のそれよりも強く、それらの肝臓および脾臓のシグナルが、ＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧよりも少ない強度を有していたことを示している。
【００８７】
ＩＣＧ標識ポリマーを組織ホモジネートから抽出することによって、各臓器中のＩＣＧ含有量を定量した。傾向はｅｘ−ｖｉｖｏイメージングに一致したものの、肝臓のＩＣＧレベルは、実質的には他の臓器よりも高く、各臓器における２つのＮＰの差は、統計学的に有意ではなかった（図７Ｂ）。この相違は、ＩＣＧ抽出法を使用した際に我々の考慮した追加の次元が存在すること（ＩＣＧ抽出については３次元分析であるのに対し、ｅｘ  ｖｉｖｏイメージングについては２次元表面分析である）および／または高密度な腫瘍からのＩＣＧの抽出が不充分であったことに起因すると我々は考えている。
【００８８】
抗がん効能：タキソールとの比較
ＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰの抗がん効能を、まず、皮下のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の雌ヌードマウスモデルで単回用量（２０ｍｇ／ｋｇ  ＰＴＸ相当）を用いて試験した。界面活性剤により可溶化された市販のＰＴＸ製剤であるタキソールを、参考文献と同じ用量で使用した。図８Ａに示されるように、ＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の成長をタキソールよりも効率良く減弱させた。ＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰの生存時間の中央値は、６２日間であり、タキソールよりも顕著に長かった（４４日間、ｐ＜０．０１、ログランク検定）。同じレジメンを、同系のＢ１６Ｆ１０腫瘍を有した雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した。公知の侵襲性の性質を反映して、この腫瘍は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１よりもはるかに速く成長したが、ＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰはやはり、同じ用量で、タキソールよりも優れた腫瘍の減弱を誘導した。次に、ＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰを、２週間にわたって３日おきに（全５回：ｑ３ｄ×５）、２０ｍｇ／ｋｇ／用量で与えた（図８Ｂ）。ＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰは、５匹の動物のうち３匹に顕著な生存ベネフィットをもたらし、（この報告の投稿物にあるように）＞２００日間まで完全な寛解を示したのに対し、タキソール群では、同じ期間で１匹が生存したのみであった。タキソールを処理された２匹の動物は、腫瘍サイズに基づくエンドポイントに達したが、１匹は、潰瘍性腫瘍を伴う健康状態の悪化があり、もう１匹は、明らかな理由がなく死亡が見られた。これらの結果は併せて、ＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰが同等の用量でタキソールよりも大きな抗がん効能をもたらすことを実証している。
【００８９】
抗がん効能：ＰＥＧ−ＮＰとの比較
我々は、決定された最大耐用量で、ＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰをＰＴＸ＠ＰＥＧ−ＮＰと比較した。健康な雌ヌードマウスは、２週間にわたる３０ｍｇ／ｋｇ／用量でのＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰの１０回の注射で、顕著な体重低下なく生存した。そこで、皮下のＭＤＡ−ＭＢ−２３１動物を有した雌ヌードマウスに、以下の処理のうち１つを、２週間の期間にわたって１０回処理した：（ｉ）生理食塩水；（ｉｉ）ブランクＱＡ−ＮＰ；（ｉｉｉ）ブランクＰＥＧ−ＮＰ；（ｉｖ）ＰＴＸ＠ＰＥＧ−ＮＰを３０ｍｇ／ｋｇ／用量；および（ｖ）ＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰを３０ｍｇ／ｋｇ／用量。ＰＴＸ＠ＱＡ−ＮＰ群のみが、生理食塩水群に比べて、＞２００日間現在で４０％の完全寛解という生存ベネフィットを示した（図９Ａ）。他の全ての群が死に至り、生存時間の中央値は、６８日間（生理食塩水）、８６日間（ブランクＱＡ−ＮＰ）、８０日間（ブランクＰＥＧ−ＮＰ）、および７０日間（ＰＴＸ＠ＰＥＧ−ＮＰ）であった。驚くべきことに、ＰＴＸ＠ＰＥＧ−ＮＰ群は、生存した動物のなかった陰性対照群よりも良好ではなかった。我々は、その理由を、ＰＥＧ化リポソームを用いた文書に記載されているように（Y Mima, et al., Molecular Pharmaceutics 2015, 12, 2429-2435; T Ishida, et al., Journal of controlled release 2003, 88, 35-42）、ＰＴＸ＠ＰＥＧ−ＮＰが抗ＰＥＧ抗体の産生を誘導した可能性があり、それはその後に用量投与されたＰＴＸ＠ＰＥＧ−ＮＰのクリアランスを加速するものになったためと考えている。
【００９０】
この可能性を検討するために、我々は、健康なヌードマウスを、生理食塩水、ブランクＰＥＧ−ＮＰ、またはブランクＱＡ−ＮＰで処理し、５日後に血液を採集し、ｍＰＥＧまたはＱＡで被覆したプレートにその血清を添加して、抗体の存在を検出した。ＰＥＧ−ＮＰを受けた動物は、ＰＥＧ修飾された表面に結合する抗体を産生したのに対して、他の処理（生理食塩水、ＱＡ−ＮＰ）は産生しなかった（図９Ｂ）。ＱＡ−ＮＰの注射は、抗ＱＡ抗体の産生を誘導しなかった。これらの結果は、ＱＡ−ＮＰが反復投与によってＰＥＧ−ＮＰよりも効率良くＰＴＸを腫瘍に送達したことを実証している。
【００９１】
スキーム１．ｓＬｅｘの合成模倣体であるキナ酸（ＱＡ）誘導体４の合成
【００９２】
【化５】
2020519617.tif 000009
【００９３】
材料および方法
材料。ＰＬＧＡ（ＬＡ：ＧＡ＝８５：１５、遊離酸、ＭＷ：１５０ｋＤａ）、フルオレセインコンジュゲートＰＬＧＡ（ＬＡ：ＧＡ＝４８：５２、ＭＷ：５ｋＤａ）、およびＰＬＧＡ−エチレンジアミン（ＰＬＧＡ−ＮＨ２、ＬＡ：ＧＡ＝５７：４３、ＭＷ：５ｋＤａ）は、アキナ社（Akina, Inc.）（ウェストラファイエット、インディアナ州、米国）から購入した。インドシアニングリーン−Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＩＣＧ−ＮＨＳ）は、イントレース・メディカル（Intrace medical）（ローザンヌ、スイス）から購入した。ヘキスト３３３４２および組換えヒト腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）は、インビトロジェン（ユージーン、オレゴン州、米国）から購入した。メトキシ−ポリエチレングリコール−アミン（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、ＭＷ：５ｋＤａ）は、ジェンケムテクノロジーＵＳＡ（JenKem Technology USA）（アレン、テキサス州、米国）から購入した。コラーゲンＩラット尾は、ＢＤバイオサイエンス（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から購入した。ドーパミン塩酸塩は、アルファエイサー（Alfa Aesar）（ワード・ヒル、マサチューセッツ州、米国）から購入した。ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）ディープレッド膜染色染料は、サーモフィッシャーサイエンティフィック（ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）から購入した。Ｅ−セレクチン抗体（Ｐ２Ｈ３）ＦＩＴＣおよびＥ−セレクチン抗体（ＵＺ５）ＦＩＴＺは、サンタクルズ（ダラス、テキサス州、米国）から購入した。３．０μｍ孔径のＴｒａｎｓｗｅｌｌポリカーボネート膜細胞培養インサート（６．５ｍｍ）は、コーニング（コーニング、ニューヨーク州、米国）から購入した。他の全ての材料は、シグマ−アルドリッチ（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。
【００９４】
ＱＡ−ＮＨ２の合成
（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−１，３，４，５−テトラアセトキシシクロヘキサン−１−カルボン酸（化合物２）：キナ酸（化合物１，９６１ｍｇ、５ｍｍｏｌ）を１２ｍＬの無水酢酸−ピリジン１：２混合物に溶解した。溶液を４−ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）と混合し、５℃で１２時間攪拌した。次いで、反応混合物を氷水に添加し、ｐＨ３に酸性化し、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して白色固体を得た（１．７５ｇ、収率９７％）。ＥＳＩ：（Ｍ＋Ｈ）＋：３６１．
【００９５】
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ）−５−（（３−アミノ−５−（メトキシカルボニル）フェニル）カルバモイル）シクロヘキサン−１，２，３，５−テトライルテトラアセテート（化合物３）：化合物２（９５８ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解した。溶液をＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４３２ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）と混合して、０℃で５分間攪拌した。次いで、（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（６１２ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．５ｍＬ、４．３ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、０℃で１時間攪拌した。最後に、３，５−ジアミノ安息香酸メチル（１．７ｇ、７．７ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド中溶液（５ｍＬ）を混合物に添加し、室温に昇温させて７２時間攪拌した。次いで、反応混合物を氷水に添加し、ＤＣＭを用いて抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過してさらに蒸発させた。残渣をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル３：７）によって精製して、茶色の固体化合物を生じた（１．３ｇ、収率９２％）。ＥＳＩ：（Ｍ＋Ｈ）＋：５０９。
【００９６】
３−アミノ−５−（（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−１，３，４，５−テトラヒドロキシシクロヘキサン−１−カルボキシアミド）安息香酸（化合物４）：化合物３（１０２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン中溶液（５ｍＬ）を、水酸化リチウム一水和物（６３ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）と共に室温で４８時間攪拌した。次いで、反応混合物を、アンバーライト酸性樹脂を用いてｐＨ５に酸性化し、濾過し、Ｃ１８−逆相シリカゲル上で逆相カラムクロマトグラフィー（水−アセトニトリル１：２）によって精製して、白色固体化合物を生じた（４５ｍｇ、収率６９％）。ＥＳＩ：（Ｍ＋Ｈ）＋：３２７。
【００９７】
ＩＣＧ−コンジュゲートＰＬＧＡの合成
２００ミリグラムのＰＬＧＡ−エチレンジアミンを、２ｍＬのＤＭＳＯに室温で溶解した。１．５ｍｇのＩＣＧ−ＮＨＳを、室温で１ｍＬのＤＭＳＯに激しいボルテックス混合で溶解した。１ミリリットルのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）をＰＬＧＡ溶液に添加した後、ＩＣＧ−ＮＨＳ溶液を滴下添加した。混合物を２時間常時攪拌し、再生した分子量カットオフ３，５００Ｄａのセルロース透析バッグ［スペクトラムラボ（SpectrumLabs）、ランチョ・ドミンゲス、カリフォルニア州、米国］に入れ、過剰量のＤＭＳＯに対して３回、ＤＣＭに対して３回、透析した。精製した試料を、回転蒸発を介して採集し、−２０℃で保管した。
【００９８】
コアＰＬＧＡ  ＮＰの調製
コアＰＬＧＡ  ＮＰを単一エマルジョン溶媒蒸発法によって生産した。簡単に述べると、１００ｍｇのＰＬＧＡを４ｍＬのＤＣＭに溶解した。このポリマー溶液を１２ｍＬの４％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液に添加し、Ｓｏｎｉｃｓ  Ｖｉｂｒａｃｅｌｌプローブソニケータ（ソニックス、ニュータウン、コネチカット州、米国）を２分間用いて乳化した。エマルジョンを４０ｍＬの脱イオン化水に添加し、４時間攪拌してＤＣＭを蒸発させた。次いで、ＮＰをＯｐｔｉｍａ  ＭＡＸ−ＸＰ超遠心分離機（ベックマンコールター、ブレア、カリフォルニア州、米国）を用いた遠心分離によって収集し、脱イオン化（ＤＩ）水で３回洗浄した。共焦点顕微鏡観察およびフローサイトメトリ−に用いるために、フルオレセインコンジュゲートＰＬＧＡを用いてＮＰを調製した。光学ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに用いるために、ＩＣＧ−コンジュゲートＰＬＧＡを用いてＮＰを調製した。
【００９９】
粒子表面の修飾
室温で回転しながら２ｍＬのドーパミン塩酸塩のトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）中溶液中、３時間インキュベーションすることによって、コアＮＰをｐＤで被覆した。ｐＤ被覆ＰＬＧＡ  ＮＰ（ＮＰ−ｐＤ）を超遠心分離によって収集し、ＤＩ水で２回洗浄した。さらに別の表面官能化を行うため、ＱＡ−ＮＨ２またはｍＰＥＧを含有するトリス緩衝液にＮＰ−ｐＤを再懸濁し、ＮＰ−ｐＤとリガンドとの重量比を１：２で維持するものとした。３０分間のインキュベーション後、超遠心分離を介してＮＰを収集し、ＤＩ水で２回洗浄した。表面を官能化されたＮＰを、それぞれＮＰ−ｐＤ−ＱＡ（またはＱＡＮＰ）およびＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧと命名した。
【０１００】
ＱＡ−ＮＨ２リガンド密度の定量
既知量のＮＰ−ｐＤを、既知量のＱＡ−ＮＨ２（ＱＡ−ＮＨ２供給）を含有するトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）に再懸濁した。３０分間のインキュベーション後、超遠心分離を介してＮＰを収集し、ＨＰＬＣにより上清を分析して、コンジュゲートしなかった遊離ＱＡ−ＮＨ２の量を決定した。表面にコンジュゲートされたＱＡ−ＮＨ２は、遊離ＱＡ−ＮＨ２をＱＡ−ＮＨ２供給から差し引くことによって算出した。ＱＡ−ＮＨ２リガンド密度は、表面にコンジュゲートされたＱＡ−ＮＨ２の数をＮＰ−ｐＤの総表面積で除することによって算出した。
【０１０１】
粒子の特性解析
ＮＰをリン酸緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ７．４）中に分散し、それらのサイズおよびゼータ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０（ウスターシャー、イギリス）によって測定した。ＮＰの形態を、酢酸ウラニルによる陰性染色の後、Ｔｅｃｎａｉ（商標）透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、ヒルズボロ、オレゴン州、米国）によって観察した。ＱＡ−ＮＨ２の表面修飾を、ＱＡＮＰのエレクトロスプレーイオン化質量（ＥＳＩ−ＭＳ）分析によって確認した。ＰＥＧ−ＮＨ２の表面修飾をによって確認した。
【０１０２】
ＱＡＮＰの血清中安定性
サイズの安定性を評価するために、５ｍｇのＱＡＮＰを５ｍＬの５０％ＦＢＳに懸濁し、室温で２時間インキュベーションした。粒子径の分布を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０によって測定した。蛍光の安定性を評価するために、ＩＣＧ標識ＱＡＮＰを５０％ＦＢＳに懸濁した。予め指定された時点でＮＰペレットおよび上清を超遠心分離によって分離し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａを用いてイメージングして、蛍光強度を検出した。
【０１０３】
細胞培養
４継代目のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州、米国）を、ＥＧＭ−２完全培地中で成長させた。培養プレートは、５μｇ／ｃｍ２のラット尾Ｉ型コラーゲンで予め被覆した。ヒト乳腺癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＡＴＣＣ；ＭＣＦ−７、ＡＴＣＣ）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ヒト結腸腺癌細胞（ＬＳ１７４Ｔ、ＡＴＣＣ）は、１０％ＦＢＳを補充したイーグル最小必須完全培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。ヒト卵巣がん細胞（Ａ２７８０、ＡＴＣＣ）は、１０％ＦＢＳを補充したＧｉｂｃｏ（商標）ＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ）中で培養した。ヒト卵巣がん細胞（ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ）は、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。全ての培地には、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充した。全ての細胞は、７０〜８０％コンフルエントになってゆく際に、比１：７．５で継代培養した。
【０１０４】
共焦点顕微鏡観察およびフローサイトメトリ−
ラット尾Ｉ型コラーゲンを被覆したガラス窓［マットテック社（MatTek Corporation）、アッシュランド、マサチューセッツ州、米国］を有する３５ｍｍディッシュに、ＨＵＶＥＣを播種し、ＥＧＭ−２  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ完全培地中で成長させた。ＨＵＶＥＣがおよそ８０％コンフルエントになった際に、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを含有するＥＧＭ−２を用いて細胞を４時間インキュベーションした。０．２ｍｇ／ｍＬの蛍光標識ＮＰ懸濁液を含有するＥＧＭ−２で培地を置換し、３７℃で２時間インキュベーションした。０．５μＭのＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）ディープレッド膜染色染料を含有する新鮮なＥＧＭ−２培地で、懸濁液を置換した。１０分後、細胞をＰＢＳで２回、穏やかに洗浄した。ヘキスト核染色剤（濃度０．２ｍｇ／ｍＬで１０μＬ）を、イメージングの１０分前に添加した。Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １６３ＣアルゴンイオンレーザーおよびＣｏｈｅｒｅｎｔ  ＣＵＢＥダイオードレーザーを備え付けたニコンＡ１Ｒ共焦点顕微鏡を用いて、共焦点顕微鏡イメージングを実施した。３４６ｎｍ、６３３、および６４９ｎｍのレーザーをそれぞれ用いて、ＮＰ、細胞核、および細胞膜を励起させた。
【０１０５】
フローサイトメトリ−に用いるために、上記と同じ方法でＮＰを用いてＨＵＶＥＣを処理し、ＰＢＳで２回穏やかに洗浄して、遊離または緩く結合したＮＰを除去した。次いで、細胞をトリプシン処理し、９３０×ｇで５分間の遠心分離によって収集し、０．２ｍＬのＰＢＳに０℃で再懸濁して、ＦＬ−１検出器（λｅｘ／λｅｍ＝４８８／５２５ｎｍ）を備え付けたＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメータ（ＢＤバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を用いて分析した。競合アッセイのために、ＮＰ処理およびフローサイトメトリ−の前に、既知濃度の遊離ＱＡ−ＮＨ２またはＥ−セレクチン抗体を、ＨＵＶＥＣと共に３０分間プレインキュベーションした。
【０１０６】
経内皮遊走アッセイ
ラット尾Ｉ型コラーゲンを被覆したコーニングＴｒａｎｓｗｅｌｌインサートに、ＨＵＶＥＣを播種し、ＥＧＭ−２  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ完全培地中で成長させた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートを横断する経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を、ＥＶＯＭ２（商標）上皮ボルトオームメータ［ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ（World Precision Instruments）、サラソータ、フロリダ州、米国］によって毎日モニタリングした。インサートを横断するＴＥＥＲ値がプラトーに達した際に、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで４時間処理した後、０．１ｍｇ／ｍＬの蛍光標識ＱＡＮＰと共に８時間インキュベーションした。インキュベーション前の総ＮＰの蛍光強度とインキュベーション期間後のＴｒａｎｓｗｅｌｌ区画の下方と上方におけるＮＰのそれとを、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ３スペクトルフルオロメータ（堀場製作所、エジソン、ニュージャージー、米国）によって測定した。
【０１０７】
腫瘍条件培地による内皮でのＥ−セレクチンの上方制御
ラット尾Ｉ型コラーゲンを被覆した６ウェルプレートに、ＨＵＶＥＣを密度１０，０００細胞個／ｃｍ２で播種した。ＨＵＶＥＣがおよそ７０〜８０％コンフルエントになってゆく際に、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、Ａ２７８０細胞、およびＮＣＩ−ＡＤＲ細胞を用いて調整した培養培地に細胞を４時間曝露した。ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、遠心分離を介して収集した。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、２０μＬ（１×製造推奨用量に相当）のＦＩＴＣ標識抗Ｅ−セレクチン抗体で染色した。Ｅ−セレクチンの上方制御の程度を、もしあれば、フローサイトメトリ−によって定量した。
【０１０８】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ全身イメージング
全ての動物の処置は、実験動物の飼養および使用のためのＮＩＨのガイドラインを遵守して、パデュー動物飼養および使用委員会によって認可された。６〜７週齢の雌の無胸腺ヌードマウス（Ｆｏｘｎ１ｎｕ）をエンヴィーゴ（Envigo）（インディアナポリス、インディアナ州、米国）から購入し、処置前に１週間馴化させた。各マウスは、皮下注射により後肢の隣接部に５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を受けた。平均腫瘍体積が２００ｍｍ３に届いた際に、各マウスは、ＰＢＳ中６ｍｇのＩＣＧ標識されたＱＡＮＰまたはＮＰ−ｐＤ−ＰＥＧを、尾静脈注射を介して受けた。ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａシステム［キャリパーライフサイエンス（Caliper Life Sciences）、ホプキントン、マサチューセッツ州、米国］を用いて動物をイメージングし、近赤外線蛍光シグナルを４８時間にわたって検出した。４８時間後、マウスを屠殺して、腫瘍および主要臓器を取り出し、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａシステムを用いてイメージングした。各臓器のＩＣＧ含有量を定量するために、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍａｓｔｅｒホモジナイザー［オムニ・インターナショナル（Omni International）、ケネソー、ジョージア州、米国］を用いて、腫瘍および主要臓器をＤＭＳＯ中でホモジナイズした。臓器ホモジネートを遠心分離し、０．１ｍＬの上清を各ホモジネートからサンプリングして、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａシステムにより分析した。
【０１０９】
がん治療のための薬剤のＮＰへの被包化
疎水性と親水性の両方のがん治療薬を、この分野の当業者に公知の以下の技法によって、容易にＮＰ中に被包することができる。具体的には、ポリエステルおよびポリフェノールで作製されたＮＰを使用してがん治療剤を被包することが、下記に例として提供される。ポリフェノール化合物の例としては、タンニン酸、ピロガロール、没食子酸エピカテキン、没食子酸エピガロカテキンなどが挙げられる。
（ｉ）疎水性の薬剤をエマルジョン法によってポリエステルＮＰ中に被包する。
疎水性の薬剤およびポリエステルを、ジクロロメタンまたは酢酸エチルに溶解し、乳化剤を含有する水溶液中に乳化する。常時攪拌しながら回転蒸発によって溶媒を蒸発させる。凝固したＮＰを水で洗浄し、使用するまで凍結乾燥する。
（ｉｉ）親水性の薬剤をエマルジョン法によってポリエステルＮＰ中に被包する。
親水性の薬剤を水に溶解し、ポリエステルを含有する有機溶液中に乳化する。そうして形成された一次エマルジョンを、乳化剤を含有する水溶液中に乳化する。常時攪拌しながら回転蒸発によって溶媒を蒸発させる。凝固したＮＰを水で洗浄し、使用するまで凍結乾燥する。
（ｉｉｉ）疎水性薬剤をポリフェノールナノカプセル中に被包する。
疎水性薬剤をエタノールまたは他の適切な溶媒に溶解し、タンニン酸のエタノール性濃縮溶液と混合する。この混合物に、塩化鉄を含有するある体積の水を添加して、重合タンニン酸の集合体で被覆された薬剤に富むナノコアを界面で形成する。粒子を、複数回の遠心分離および水への再懸濁により洗浄して、過剰分のタンニン酸、塩化鉄、および取り込まれなかった薬剤を除去する。
（ｉｖ）親水性薬剤をポリフェノールナノカプセル中に被包する。
親水性薬剤を高濃度で水に溶解し、界面活性剤と共にグリセロール中に分散させる。分散後直ちにタンニン酸および塩化鉄を添加して、界面を安定化させる。結果として得られたＮＰを水で洗浄して、グリセロールを除去する。
（ｖ）ナノ結晶性の疎水性薬剤。
疎水性薬剤および界面活性剤を、丸底フラスコ中でクロロホルムに溶解する。ロータリーエバポレータを用いて有機溶媒を蒸発させて、水中に水和したフィルムを形成する。水和した薬剤−界面活性剤混合物を超音波処理して、ナノ結晶を形成し、アルブミンと共にインキュベーションして、水で洗浄する。
【０１１０】
統計分析
全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７（Ｌｏｃａｔｉｏｎ）を用いて実施した。全てのデータを一元または二元ＡＮＯＶＡ検定を用いて解析し、様々な群間の平均値の統計学的有意性を決定した後、ダネットまたはボンフェローニの多重比較検定を行った。０．０５未満のｐ値を統計学的有意性のあるものとみなした。
【０１１１】
当業者は、数多くの改変を上記に記載された特定の実施に成すことができることを認識するものとなる。実施は、記載された具体的な限定に限定されるべきではない。他の実施が可能となり得る。
【０１１２】
本発明が、図面および前掲の記載にて詳細に説明および記載されている一方で、同じことは、実例として考えられるものとなり特徴を制限するものとはならないが、それはなぜなら、ある特定の実施形態が示され記載されているに過ぎず、本発明の趣旨の内に入る全ての変更および修飾は保護されることが望まれるものと理解されるためである。
【０１１３】
本願の方法および組成物の範囲は、以下の特許請求の範囲により定義されることが意図されている。しかし、この開示は、その趣旨または範囲から逸脱することなく、具体的に説明および例証される以外に実践され得ることを理解しなければならない。本明細書に記載される実施形態の様々な代替が、特許請求の範囲の実践に際して、以下の特許請求の範囲に定義されるような趣旨および範囲を逸脱することなく採用され得ることを、当業者は理解するべきである。
【図１】
2020519617.tif 000012
【図２Ａ】
2020519617.tif 000013
【図２Ｂ】
2020519617.tif 000014
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
2020519617.tif 000017
【図５】
2020519617.tif 000018
【図６】
2020519617.tif 000019
【図７】
2020519617.tif 000020
【図８】
2020519617.tif 000021
【図９】
2020519617.tif 000022
【国際調査報告】
2020519617.tif 000023
2020519617.tif 000024