(57)【要約】  本発明は、メトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物、及び、これを含む坑癌又は抗炎症用の薬学的組成物に関する。本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、坑癌又は抗炎症の作用のような生理活性に優れるだけでなく、細胞に対する毒性が顕著に減少されるため、医薬品のような多様な分野に有用に用いられ得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物。
【請求項２】
前記ペプチドは、２から３０個のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ペプチドは、８から１５個のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ペプチドは、水溶性ペプチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖（ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有するアミノ酸の比率が５０％以上である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の比率が７０％以上である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の比率が９０％以上である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記親水性側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、グリシン（Ｇｌｙ）及びプロリン（Ｐｒｏ）でなる群から選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
前記水溶性ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸が５個以下である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１０】
前記水溶性ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸が３個以下である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記疎水性側鎖を有するアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）でなる群から選択される、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ペプチドは、配列番号１で構成されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか一項に記載の化合物を含有する、坑癌又は抗炎症用の薬学的組成物。
【請求項１４】
散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液でなる群から選択される剤形を有する、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ＭＴＸ）は、急性リンパ芽球性白血病、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫を含めた多様な小児癌の治療に最も普遍的に用いる薬剤であって、急性リンパ芽球性白血病では強化療法と維持療法において重要な薬剤として用いられる。メトトレキサートは、代謝拮抗剤（ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）であり、ジヒドロ葉酸（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ、ＦＨ２）がテトラヒドロ葉酸（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ、ＦＨ４）になるための必須酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼと結合してＦＨ４の生成を抑制し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質合成を阻害することで抗増殖性細胞毒性の効果を示す薬剤である。高容量投与時に投与量の９０％が尿中に排泄されるため、メトトレキサートの排泄は腎臓機能と密接な関連がある。メトトレキサート投与後に排泄が遅延されると薬物の蓄積による副作用が発生する可能性が高くなるため、投与後に薬物濃度のモニタリングが非常に重要である。メトトレキサート投与後に発生し得る副作用としては、肝毒性、腎毒性、血液学的毒性、口内炎、神経学的症状等があり、毒性による死亡率が約５−６％と報告されている。メトトレキサートは、細胞内では葉酸のようなポリグルタミン酸と結合した形態で存在する。
【０００３】
また、メトトレキサートは、炎症疾患の治療において有用なものと知られているが、これと係わって特許文献１（韓国公開特許第２００９−００７９８７６号公報）では炎症性自家免疫疾患の治療をメトトレキサート溶液の使用を開示しており、特許文献２（韓国公開特許第２００７−０１００２６１号公報）では有効量のメトトレキサート及びＡ３アデノシン受容体アゴニスト（Ａ３ＡＲアゴニスト）の配合物を投与し、炎症を治療する方法に対する内容を開示しており、特許文献３（韓国公開特許第２００７−００８３８６２号公報）ではメトトレキサートとＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）の結合体及び賦形剤を含有する自家免疫疾患を治療するための経皮伝達薬剤組成物を開示しており、特許文献４（韓国公開特許第２００２−００３２０７９号公報）ではメトトレキサートを有効成分として含有する関節炎治療のための経皮投与用組成物を開示している。
【０００４】
しかし、このようなメトトレキサートを用いると骨髄の破壊、過多出血によるプラーク破壊、消化器官における出血、胃腸穿孔、脱毛、肝臓と腎臓機能の障害等のような副作用が生じ得ることが知られている。
【０００５】
したがって、前記のような特性を有するメトトレキサートの副作用を減少させながら生理学的効能もさらに強化させることができる新規の化合物の開発が要求されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第２００９−００７９８７６号公報
【特許文献２】韓国公開特許第２００７−０１００２６１号公報
【特許文献３】韓国公開特許第２００７−００８３８６２号公報
【特許文献４】韓国公開特許第２００２−００３２０７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記のような従来のメトトレキサートが有している問題点を改善するためのものであり、自然型のメトトレキサートと比較して同一又より優れた生理学的活性を示しつつも副作用が減少された新規のメトトレキサート由来の化合物を提供することを技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を達成するために、本発明は、メトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物を提供する。
【０００９】
本発明の一具現例によれば、前記ペプチドは２から３０個、好ましくは５から２０個、より好ましくは８から１５個、さらに好ましくは１０から１２個のアミノ酸配列でなってよいが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
本発明の他の具現例によれば、前記ペプチドは、水溶性ペプチドであるのが好ましいが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい具現例によれば、前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖（ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有するアミノ酸の比率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％と高いのが好ましい。本発明の他の好ましい具現例によれば、前記水溶性ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸が５個以下、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、より好ましくは１個以下で存在し、存在しないのが最も好ましい。
【００１１】
本発明の他の具現例によれば、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列で構成されるペプチドであってよいが、これらに限定されるものではない。また、本発明は、前記に開示した或る一つの化合物を含有する抗癌又は抗炎症用の薬学的組成物を提供する。
【００１２】
本発明の一具現例によれば、前記薬学的組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ等の経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して用いられてよいが、これらに限定されるものではない。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、坑癌又は抗炎症の作用のような生理活性に優れるだけでなく、細胞に対する毒性が顕著に減少されるため、医薬品のような多様な分野に有用に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ａ】本発明の化合物及びメトトレキサートが繊維芽細胞及び角質細胞において細胞の増殖に与える影響を示すグラフである。
【図１ｂ】本発明の化合物及びメトトレキサートが繊維芽細胞及び角質細胞において細胞の増殖に与える影響を示すグラフである。
【図２】本発明の化合物及びメトトレキサートが脾臓細胞及び角質細胞において炎症に係わる遺伝子の発現に与える影響を示すＲＴ−ＰＣＲ電気泳動写真である。
【図３】本発明の化合物及びメトトレキサートが脾臓細胞及び角質細胞において炎症に係わる遺伝子の発現に与える影響を示すＲＴ−ＰＣＲ電気泳動写真である。
【図４ａ】本発明の化合物及びメトトレキサートが脾臓細胞においてＩＬ−１７陽性細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に与える影響を示すフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＦＡＣＳ）グラフである。
【図４ｂ】本発明の化合物及びメトトレキサートが脾臓細胞においてＩＬ−１７陽性細胞の集団に与える影響を示すＦＡＣＳグラフである。
【図５ａ】本発明の化合物及びメトトレキサートが大食細胞株においてＴＮＦ−α陽性細胞の集団に与える影響を示すフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）グラフである。
【図５ｂ】本発明の化合物及びメトトレキサートが大食細胞株においてＴＮＦ−α陽性細胞の集団に与える影響を示すフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）グラフである。
【図６】本発明の化合物及びメトトレキサートが脾臓細胞において活性化された免疫及びＡＰＣ陽性細胞の集団に与える影響を示すフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）グラフである。
【図７】本発明の化合物及びメトトレキサートが脾臓細胞において炎症性サイトカインの発現に与える影響を示すグラフである。
【図８】本発明の化合物及びメトトレキサートが角質細胞株においてＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の活性に与える影響を示す電気泳動写真及びグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
前記課題を達成するために、本発明は、メトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物を提供する。
【００１６】
前記メトトレキサートは、化学式Ｃ２０Ｈ２２Ｎ８Ｏ５の化合物を示すものであって、下記化学式で表される化学的構造を有する。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
本明細書において、『ペプチド』とは、用語はペプチド結合によってアミノ酸等が互いに結合され形成された直鎖状の分子を意味する。前記ペプチドは、本技術分野に公知された通常の生物学的又は化学的な合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって製造されてよい（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））。
【００１９】
前記ペプチドは、水溶性ペプチドであるのが好ましいが、これらに限定されるものではない。本発明の一具現例によれば、前記ペプチドは２から３０個、好ましくは５から２０個、より好ましくは８から１５個、さらに好ましくは１０から１２個のアミノ酸でなる。本発明の好ましい具現例によれば、前記ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の比率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％と高いのが好ましい。一方、前記ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸の比率が５０％未満、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％で低いのが好ましい。本発明において、『親水性側鎖を有するアミノ酸』は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、グリシン（Ｇｌｙ）及びプロリン（Ｐｒｏ）を示し、『疎水性側鎖を有するアミノ酸』は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）を示すが、これに限定されるのではなく、前記のような自然界に存在するアミノ酸の以外にも、これらの変形体等も制限なく用いられてよい。本発明の好ましい具現例によれば、前記疎水性側鎖を有するアミノ酸は、前記ペプチド内に５個以下、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、より好ましくは１個以下で存在し、存在しないのが最も好ましい。本発明の一具現例によれば、前記ペプチドは、配列番号１から配列番号４のアミノ酸配列で構成されるペプチドであるのが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明の一具現例によれば、本発明の化合物は、陽性対照群として用いられたメトトレキサートと比較して顕著に低い細胞毒性を示し(図１参照）、また、細胞内の炎症反応に係わる遺伝子の発現を顕著に減少させることができる（図２及び図３参照）。本発明の他の具現例によれば、本発明の化合物は、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、活性化された免疫及びＡＰＣ陽性細胞集団の数を顕著に減少させることができる（図４から図６参照）。本発明の他の具現例によれば、本発明の化合物は、炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ａの分泌を顕著に減少させることができるだけでなく（図７参照）、ＭＭＰ遺伝子の発現を顕著に減少させることができる（図８参照）。
【００２１】
本発明の化合物は、それ自体において安定性に優れるが、化合物に結合されたペプチドを構成する任意のアミノ酸を変形させることで、安定性がさらに向上され得る。本発明の一具現例によれば、前記ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でなる群から選択される保護基が結合され、安定性をさらに向上させることができる。本発明の他の具現例によれば、前記ペプチドは、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でなる群から選択される保護基が結合され、安定性をさらに向上させることができる。
【００２２】
前述したようなアミノ酸の変形は、本発明の化合物の安定性を大きく改善する作用を行う。本明細書において、『安定性』という用語は、『生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）』の安定性だけでなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）のような『試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）』の安定性も包括する意味で用いられる。また、前述した保護基は、生体内及び試験管内においてタンパク質分解酵素の攻撃から本発明の化合物を保護する作用を行う。
【００２３】
また、本発明は、前記化合物を有効成分として含む坑癌又は抗炎症用の組成物を提供する。本発明において、前記組成物は、薬学的組成物の形態であってよいが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の組成物は、前述した本発明の化合物を有効成分として含むため、この二つの間に共通された内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００２５】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明の化合物の薬学的有効量と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物である。
【００２６】
本明細書において、『薬学的有効量』という用語は、前述した本発明の化合物の効能又は活性を達成に十分な量を意味する。
【００２７】
本発明の一具現例において、前記癌は、急性リンパ芽球性白血病、骨肉種、ビホジキンリンパ種のような血液癌だけでなく、胃癌、肝臓癌、肺癌、大膓癌、前立腺癌、悪性黒色腫、乳癌、子宮癌のような固形癌を非制限的に含む意味で用いられる。また、本発明の他の具現例において、本発明の薬学的組成物は、炎症反応に係わる自家免疫疾患の予防又は治療に用いられてよい。前記炎症反応に係わる自家免疫疾患としては、関節リウマチ、ベーチェット病、クローン病、鼻炎、喘息等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイル等を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤等をさらに含んでよい。適切な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００２９】
本発明の薬学的組成物は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に実施できる方法に従って、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより単位容量形態で製造されるか、又は多用量容器内に内入させて製造されてよい。ここで、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ヒドロゲル）形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでよい。
【００３０】
本発明による薬学的組成物は、臨床投与時に経口的又は非経口的に投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で用いられてよい。すなわち、本発明の薬学的組成物は、実際の臨床投与時に経口及び非経口の多様な剤形で投与されてよいが、製剤化する場合には普段用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤又は賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、生薬抽出物又は生薬発酵物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチン等を混合して調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムスチレートタルクのような潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれてよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステル等が用いられてよい。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール、マクロゴ−ル、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチン等が用いられてよい。
【００３１】
投薬単位は、例えば、個別投薬量の１、２、３又は４倍で、又は１／２、１／３又は１／４倍で含有し得る。個別投薬量は、有効薬物が１回に投与される量を含有し、これは、通常１日の投与量の全量、１／２、１／３又は１／４倍に該当する。
【００３２】
本発明の薬学的組成物は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量形態で製造されるか又は多用量容器内に内入させて製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ヒドロゲル）形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでよい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を介して本発明を詳しく説明する。
但し、以下の実施例は、本発明を例示するためだけのものであり、本発明の内容が以下の実施例によって限定されるのではない。
【００３４】
実施例１．本発明の化合物の合成
＜１−１＞配列番号１のペプチドの合成
７００ｍｇのクロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ，Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ［００６４］Ｃａｔ  Ｎｏ．０１−６４−００２１）を反応容器に入れ、メチレンクロリド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かし、１時間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄してメタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かし、１０分間反応させて過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れ、１０分間常温で撹拌してから溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れ、再び１０分間反応を維持してから溶液を除去し、それぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄してＴｒｐ−ＣＴＬ樹脂を製造した。
【００３５】
新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅ  ＤＩＥＡを分画して２回にわたって入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を、脱保護された樹脂がある反応容器に入れ、１時間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌してから除去した。反応樹脂を少量採取し、ニンヒドリンテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ  Ｔｅｓｔ）を用いて反応の程度を点検した。脱保護溶液で前記と同様に２回脱保護反応させ、Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−ＣＴＬ樹脂を製造した。ＤＭＦとＭＣで十分に洗浄し、再度ニンヒドリンテストを行った後、前記と同様に以下のアミノ酸付着実験を行った。
【００３６】
選定されたアミノ酸配列に基づき、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）順で連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。製造されたペプチジル樹脂をＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールにそれぞれ３回洗浄し、窒素空気をゆっくり流して乾燥してからＰ２Ｏ５下で真空に減圧して完全に乾燥し、脱漏溶液［トリフルオロ酢酸９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングを行って樹脂を濾過し、樹脂を少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体の体積が半分程度残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分に乾燥し、精製前のＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷペプチド（配列番号１）を１．４０ｇ合成した（収率：９２．４％）。分子量測定器を用いて測定時の分子量１５１６．７（理論値：１５１６．８）を得ることができた。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
＜１−２＞本発明の化合物の合成
ペプチド反応器にペプチジル樹脂（１ｍｍｏｌ）と１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）１０ｍｌを入れ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）２７０ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート７５９ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）とメトトレキサート２７７ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）添加し、３０分間反応させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３８８ｍｇ（３ｅｑｕｉｖ．）を添加して常温で１２〜４８時間反応し、濾過して反応されたペプチジル樹脂を収得した。収得された樹脂を、切断溶液（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて常温で２時間反応しレジン及び保護基を除去し、ジエチルエーテル１０ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）を用いて再結晶を行い、ハイブリッドペプチドを収得した。
【００３９】
実験例１．本発明の化合物の細胞毒性テスト
実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物が細胞毒性に与える影響を確認するために、細胞増殖実験を行った。具体的に、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞株とＨａＣａＴ角質細胞株を１×１０６細胞／ウェルで９６−ウェルプレートに接種して培養し、翌日に前記実施例＜１−２＞で製造されたメトトレキサート−ペプチド化合物とメトトレキサートをそれぞれ３．９から５００μＭの濃度で処理した。４８時間培養した後、Ｅｚ−ｃｙｔｏｘキット（Ｄａｅｉｌｌａｂ／韓国）を用いたＭＴＴ分析を介して前記化合物が細胞の増殖に与える影響を確認した。
【００４０】
その結果、陽性対照群として用いられたメトトレキサートは、両細胞株の全てにおいて細胞増殖を抑制し相当な程度の細胞毒性を示したが、本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、未処理陰性対象群と類似するか、むしろこれより優れた細胞増殖活性を示すことにより、細胞毒性を示さないことを確認した（図１ａ及び図１ｂ）。
【００４１】
実験例２．本発明の化合物の炎症抑制効果（１）
実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物が炎症反応に与える影響を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。具体的に、生後６−７週のマウスを犠牲にし脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を得て、細胞濾過器を用いて脾臓をつぶして無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地とともに遠心分離した。上清は廃棄し、赤血球（ＲＢＣ）を除去するためにＲＢＣ溶解バッファーを２回用いた。以後、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した後、適量の無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した。細胞数を測定し、２４−ウェルプレート（１×１０７細胞／ディッシュ）に接種しており、翌日実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物又はメトトレキサート（５μＭ及び５０μＭ）及び刺激剤として用いられたＬＰＳ（１０ｎＭ）とＩＬ−１７（２００ｎｇ／ｍｌ）を処理した。
【００４２】
培養２４時間後、ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ）を用いて全体のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡを合成するために、３μｇのＲＮＡ、ランダムヘキサマー２μｇとＤＥＰＣを処理した水を加え、６５℃で５分間反応させた。５Ｘファースストレンドバッファー(第1本のバッファー？)、０．１Ｍ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、逆転写酵素を入れて合計２０ｍｌになるようにし、４２℃で１時間反応させた。再び９５℃で５分間加熱した後、蒸留水２０ｍｌを加えて最終４０ｍｌのｃＤＮＡを作った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、３μｌのｃＤＮＡ、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３及びＧＡＰＤＨの各遺伝子に、特異的な下記表２に示した１０ｐｍｏｌｅのプライマー、１０Ｘ  Ｔａｇバッファー、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ及びｉ−Ｔａｇ  ＤＮＡ重合酵素を混合して行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、５５〜５６℃で３０秒、７２℃で３０秒反応させた。サイクル数遺伝子は、ＰＣＲ結果が指数的に増幅できる条件で分析した。５ｍｌのＰＣＲ産物を得て１％のアガロースゲルに電気泳動し、エチジウムブロミド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色して炎症及び自家免疫疾患に係わる遺伝子であるＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、Ｔ−ｂｅｔ及びＧＡＴＡ３のｍＲＮＡレベルを確認した。
【００４３】
【表２】
2020519623.tif 000005
【００４４】
その結果、本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、メトトレキサートと比較して、よほど低い濃度においても炎症の形成に係わる遺伝子の発現をより顕著に減少させる可能性があることを確認した（図２）。
【００４５】
実験例３．本発明の化合物の炎症抑制効果（２）
実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物が炎症反応に与える影響を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。このために、用いた細胞株としてＨａＣａＴ角質細胞株を用い、炎症関連遺伝子として乾癬の進行に関連があるＫｅｒａｔｉｎ６Ａ、Ｋｅｒａｔｉｎ１６、Ｋｅｒａｔｉｎ５、Ｋｅｒａｔｉｎ１４、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９及びＳ１００Ａ１２を用いたことを除いては、前記実験例２と同一の方式でＲＴ−ＰＣＲを行っており、このとき、前記遺伝子に特異的なプライマーとしては、下記表３に示したプライマーを用いた。
【００４６】
【表３】
2020519623.tif 000006
【００４７】
その結果、本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、メトトレキサートと比較して、毒性が大きく緩和されただけでなく、よほど低い濃度においても乾癬の進行に係わる遺伝子の発現をより顕著に減少させることができ、メトトレキサートよりも効果がむしろ増加されていることを確認した（図３）。
【００４８】
実験例４．本発明の化合物がＩＬ−１７Ａ＋／ＣＤ４＋細胞の集団に与える影響
実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物がＩＬ−１７Ａ＋／ＣＤ４＋細胞の集団に与える影響を確認するために、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を行った。具体的に、前記実験例２に記載された通り、生後６−７週のマウスから脾臓細胞を分離した後、実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物又はメトトレキサート、刺激剤として用いられたＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）及びＴｈ１７分化促進サイトカインであるＴＧＦ−α及びＩＬ−２３（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）を処理した。２４時間後、Ｔｈ１７分化マーカーであるＩＬ−１７Ａ及びＣＤ４に特異的な抗体を３０分間処理した後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析を行った。
【００４９】
その結果、本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、メトトレキサートと比較して、ＩＬ−１７＋／ＣＤ４＋細胞集団の数を顕著に減少させる可能性があることを確認した（図４ａ及び図４ｂ）。
【００５０】
実験例５．本発明の化合物がＴＮＦ−α＋／ＣＤ４＋細胞の集団に与える影響
実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物がＴＮＦ−α＋／ＣＤ４＋細胞の集団に与える影響を確認するために、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を行った。具体的に、肥満細胞（Ｒａｗ２６４．７）を培養した後、実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物又はメトトレキサート及び刺激剤として用いられたＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）を処理した。２４時間後、肥満細胞活性化マーカーであるＴＮＦ−α及びＣＤ４に特異的な抗体を３０分間処理した後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析を行った。
【００５１】
その結果、本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、メトトレキサートと比較して、ＴＮＦ−α＋／ＣＤ４＋細胞集団の数を顕著に減少させる可能性があることを確認した（図５ａ及び図５ｂ）。
【００５２】
実験例６．本発明の化合物が活性化になった免疫及びＡＰＣ陽性細胞の集団に与える影響
実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物が活性化された免疫及びＡＰＣ陽性細胞の集団に与える影響を確認するために、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を行った。具体的に、肥満細胞（Ｒａｗ２６４．７）を培養した後、実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物又はメトトレキサート、刺激剤として用いられたＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）及びＴｈ１７分化促進サイトカインであるＴＧＦ−β  及びＩＬ−２３（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）を処理した。２４時間後、肥満細胞分化マーカーであるＣＤ１１ｂ及びＣＤ８６に特異的な抗体を３０分間処理した後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析を行った。
【００５３】
その結果、本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、メトトレキサートと比較して、ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ８６＋細胞集団の数を顕著に減少させる可能性があることを確認した（図６）。
【００５４】
実験例７．本発明の化合物が炎症性サイトカインの発現に与える影響
実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物が脾臓細胞においてのＩＬ−１７Ａ及びＩＦＮ−γ分泌に与える影響を確認するために、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的に、前記実験例２に記載された通り、生後６−７週のマウスから脾臓細胞を分離した後、実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物又はメトトレキサート、刺激剤として用いられたＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）及びＴｈ１７分化促進サイトカインであるＴＧＦ−β及びＩＬ−２３（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）を処理した。４８時間後、Ｔｈ１７分化時の分泌マーカーであるＩＬ−１７Ａ及びＩＦＮ−γに特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて吸光度測定（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を行った。
【００５５】
その結果、本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、メトトレキサートと比較して、炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ａの分泌を顕著に減少させる可能性があることを確認した（図７）。
【００５６】
実験例８．本発明の化合物のＭＭＰ活性抑制効果
実施例＜１−２＞で合成された本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物が、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７によって誘導されるＭＭＰの活性に与える影響を確認した。具体的に、ＨａＣａＴ角質細胞を培養後、５、１０又は１００μＭの本発明のメトトレキサート−ペプチド化合物又はメトトレキサートを細胞に前処理し、３０分後に刺激剤であるＴＮＦ−α及びＩＬ−１７を処理した。４８時間培養した後、培養液を収去し、前記培養液とザイモグラフィー（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）バッファー（４％のＳＤＳ、０．０１％のｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ、２０％のｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１２５ＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．８））（Ｓｉｇｍａ）を１：１で反応させた後、２０μｌの反応液を８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（１０％のｇｅｌａｔｉｎ）に電気泳動した。その後、ゲルを０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｄａｅｊｕｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ＆Ｍｅｔａｌｓ  Ｃｏ．ＬＴＤ）バッファーに１０分間３回洗浄し、ＴＮＣＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２／Ｄ．Ｗ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）バッファーに活性化させ、クマシーブルー染色した後、バンドの強度を測定した。
【００５７】
その結果、本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、メトトレキサートと比較して、よほど低い濃度においてもＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２の遺伝子の発現をより顕著に減少させる可能性があることを確認した（図８）。
【００５８】
製造例１．薬学的組成物の製造
＜１−１＞散剤の製造
本発明のメトトレキサートペプチド・・・・・・・・・・２ｇ
乳糖・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填し、散剤を製造した。
【００５９】
＜１−２＞錠剤の製造
本発明のメトトレキサートペプチド・・・・・・・・・１００ｍｇ
とうもろこし澱粉  ・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍｇ
乳糖・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠し、錠剤を製造した。
【００６０】
＜１−３＞カプセル剤の製造
本発明のメトトレキサートペプチド・・・・・・・・・１００ｍｇ
とうもろこし澱粉・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍｇ
乳糖・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法によってゼラチンカプセルに充填し、カプセル剤を製造した。
【００６１】
＜１−４＞丸薬の製造
本発明のメトトレキサートペプチド・・・・・・・・・・１ｇ
乳糖・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１．５ｇ
グリセリン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１ｇ
キシリトール・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法によって１錠当たり４ｇになるように製造した。
【００６２】
＜１−５＞顆粒の製造
本発明のメトトレキサートペプチド・・・・・・・・・１５０ｍｇ
大豆抽出物・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５０ｍｇ
ブドウ糖・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２００ｍｇ
澱粉・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％のエチルアルコール１００ｍｇを添加して６０℃で乾燥し、顆粒を形成してから包に充填した。
【００６３】
＜１−６＞注射液剤の製造
本発明のメトトレキサートペプチド・・・・・・・・１０μｇ／ｍｌ
薄い塩酸ＢＰ・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｐＨ３．５になるまで
注射用の塩化ナトリウムＢＰ・・・・・・・・・・・最大１ｍｌ
適切な容積の注射用の塩化ナトリウムＢＰ中に本発明のＴＲＰＶ１抑制ペプチドを溶解させ、生成された溶液のｐＨを、薄い塩酸ＢＰを用いてｐＨ３．５に調節した後、注射用の塩化ナトリウムＢＰを用いて容積を調節し、十分に混合した。溶液を透明ガラスでできた５ｍｌタイプＩアンプル中に充填させ、ガラスを溶解させることで空気の上部の格子下に封入し、１２０℃で１５分以上オートクレーブして殺菌し、注射液剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のメトトレキサートとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、坑癌又は抗炎症の作用のような生理活性に優れるだけでなく、細胞に対する毒性が顕著に減少されるため、医薬品のような多様な産業分野に適用され得る。
【図１ａ】
2020519623.tif 000007
【図１ｂ】
2020519623.tif 000008
【図２】
2020519623.tif 000009
【図３】
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【図４ａ】
2020519623.tif 000011
【図４ｂ】
2020519623.tif 000012
【図５ａ】
2020519623.tif 000013
【図５ｂ】
2020519623.tif 000014
【図６】
2020519623.tif 000015
【図７】
2020519623.tif 000016
【図８】
2020519623.tif 000017
【配列表】
2020519623000001.app
【国際調査報告】
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2020519623.tif 000020
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