(57)【要約】本発明の一実施形態は、バイシストロン性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトを提供する。ＣＡＲコンストラクトに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、及び医薬組成物が開示される。哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法も開示される。ＣＡＲコンストラクトを作成する方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）切断可能なドメイン；
（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、
第一の膜貫通ドメイン、及び
第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第一のＣＡＲ；並びに
（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、
第二の膜貫通ドメイン、及び
第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第二のＣＡＲ；
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、
第一及び第二のＣＡＲが、切断可能なドメインを介して連結され、
第一の抗原結合ドメインが、ｍ９７１抗体の抗原結合ドメインを含み、
第一のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第一の抗原結合ドメインはＣＤ２２に対する抗原特異性を有する、コンストラクト。
【請求項２】
切断可能なドメインを切断することにより、ＣＡＲコンストラクトから第一及び第二のＣＡＲが切り離される、請求項１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項３】
第一の抗原結合ドメインが、配列番号３〜９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１〜１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１又は２に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項４】
第一の抗原結合ドメインが配列番号３〜９及び１１〜１７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項５】
第二のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第二の抗原結合ドメインがＣＤ１９に対する抗原特異性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項６】
第二の抗原結合ドメインがＦＭＣ６３抗体の抗原結合ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項７】
第二の抗原結合ドメインが、配列番号３１〜３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３〜２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項８】
第二の抗原結合ドメインが配列番号２３〜２９及び３１〜３７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項９】
（ａ）切断可能なドメイン；
（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、
第一の膜貫通ドメイン、及び
第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第一のＣＡＲ；並びに
（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、
第二の膜貫通ドメイン、及び
第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第二のＣＡＲ；
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、
第一及び第二のＣＡＲが、切断可能なドメインを介して連結され、
第一の抗原結合ドメインが、ＦＭＣ６３抗体の抗原結合ドメインを含み、
第一のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第一の抗原結合ドメインはＣＤ１９に対する抗原特異性を有する、コンストラクト。
【請求項１０】
切断可能なドメインを切断することにより、ＣＡＲコンストラクトから第一及び第二のＣＡＲが切り離される、請求項９に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項１１】
第一の抗原結合ドメインが、配列番号３１〜３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３〜２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項９又は１０に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項１２】
第一の抗原結合ドメインが配列番号２３〜２９及び３１〜３７のアミノ酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項１３】
第二のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第二の抗原結合ドメインがＣＤ２２に対する抗原特異性を有する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項１４】
第一又は第二の膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ８ヒンジドメインを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項１５】
ＣＤ８膜貫通ドメインが配列番号１９のアミノ酸配列を含み、ＣＤ８ヒンジドメインが配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項１６】
第一又は第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項１７】
４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項１８】
第一又は第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ζ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項１９】
ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項２０】
切断可能なドメインが２Ａ又はフューリンである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項２１】
ＣＡＲコンストラクトが、それぞれ第一及び第二のＣＡＲである、ちょうど２つのＣＡＲを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＣＡＲコンストラクト。
【請求項２２】
配列番号４８、４９、５０、５１、又は５２のアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクト。
【請求項２３】
配列番号６３〜７０のいずれか１と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクト。
【請求項２４】
（ａ）２以上の切断可能なドメイン；
（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、
第一の膜貫通ドメイン、及び
第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第一のＣＡＲ；並びに
（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、
第二の膜貫通ドメイン、及び
第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第二のＣＡＲ；
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、
第一及び第二のＣＡＲが、２以上の切断可能なドメインを介して連結される、コンストラクト。
【請求項２５】
２以上の切断可能なドメインが、直接隣接するか、少なくとも２つの切断可能なドメインの間に少なくとも１つのリンカーを有する、請求項２４のＣＡＲコンストラクト。
【請求項２６】
ちょうど２つの切断可能なドメインが存在する、請求項２５又は２４のＣＡＲコンストラクト。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項のＣＡＲアミノ酸コンストラクトをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項２８】
配列番号５３〜５７又は７１〜７８のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
請求項２７又は２８の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２９の組換え発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項３１】
少なくとも１つの、請求項３０の宿主細胞を含む、細胞集団。
【請求項３２】
請求項１〜２６のいずれか１項のＣＡＲコンストラクト、請求項２７若しくは２８の核酸、請求項２９の組換え発現ベクター、請求項３０の宿主細胞、又は請求項３１の細胞集団と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３３】
哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって：
（ａ）  哺乳動物由来の１以上の細胞を含むサンプルと、請求項１〜２６のいずれか１項のＣＡＲコンストラクト、請求項２７若しくは２８の核酸、請求項２９の組換え発現ベクター、請求項３０の宿主細胞、請求項３１の細胞集団、又は請求項３２の医薬組成物とを接触させ、それにより複合体を形成させること、及び
（ｂ）  該複合体の検出が、哺乳動物におけるがんの存在の指標である、複合体を検出すること
を含む、方法。
【請求項３４】
哺乳動物における、がんの治療又は予防において用いるための、請求項１〜２６のいずれか１項のＣＡＲコンストラクト、請求項２７若しくは２８の核酸、請求項２９の組換え発現ベクター、請求項３０の宿主細胞、請求項３１の細胞集団、又は請求項３２の医薬組成物。
【請求項３５】
前記がんが、血液悪性腫瘍である、請求項３４の使用のための、ＣＡＲコンストラクト。
【請求項３６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトの作製方法であって、
（ａ）第一の抗原結合ドメイン、
第一の膜貫通ドメイン、及び
第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第一のＣＡＲ；並びに
（ｂ）第二の抗原結合ドメイン、
第二の膜貫通ドメイン、及び
第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第二のＣＡＲ
の間に２以上の切断可能なドメインを設計し、第一及び第二のＣＡＲが該２以上の切断可能なドメインを介して連結されること；そして
第一のＣＡＲ、２以上の切断可能なドメイン、及び第二のＣＡＲを、Ｎ末端からＣ末端までに含む配列を、プラスミドにクローニングすること
を含む、方法。
【請求項３７】
２以上の切断可能なドメインが、直接隣接するか、又は少なくとも２つの切断可能なドメイン間に少なくとも１つのリンカーを有する、請求項３６の方法。
【請求項３８】
ちょうど２つの切断可能なドメインが存在する、請求項３６又は３７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１７年５月１５日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５０６，２６８号（参照によりその全体が本明細書に組込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
連邦によって支援された研究開発に関する陳述
本発明は、連邦政府の支援を受け、プロジェクト番号Ｚ０１  ＢＣ０１１５６５の下、米国国立衛生研究所、米国国立がん研究所によりなされた。本発明において、連邦政府は一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された物件の参照による取り込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に組込まれる：２０１８年５月１５日付の「７３９２６７＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」という名前の１８０，９３９バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
がんは公衆衛生上の懸念である。化学療法等の治療における進歩にもかかわらず、血液悪性腫瘍を含む多くのがんの予後は不良であり得る。従って、がん、特に血液悪性腫瘍の更なる治療に対する、満たされていないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要旨
本発明の一実施形態は、（ａ）切断可能なドメイン；（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、及び第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第一のＣＡＲ；並びに（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、第二の膜貫通ドメイン、及び第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第二のＣＡＲ；を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、第一及び第二のＣＡＲが、切断可能なドメインを介して連結され、第一の抗原結合ドメインが、ｍ９７１抗体の抗原結合ドメインを含み、第一のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第一の抗原結合ドメインはＣＤ２２に対する抗原特異性を有する、コンストラクトを提供する。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、（ａ）切断可能なドメイン；（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、及び第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第一のＣＡＲ；並びに（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、第二の膜貫通ドメイン、及び第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第二のＣＡＲ；を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、第一及び第二のＣＡＲが、切断可能なドメインを介して連結され、第一の抗原結合ドメインが、ＦＭＣ６３抗体の抗原結合ドメインを含み、第一のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第一の抗原結合ドメインはＣＤ１９に対する抗原特異性を有する、コンストラクトを提供する。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、（ａ）２以上の切断可能なドメイン；（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、及び第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第一のＣＡＲ；並びに（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、第二の膜貫通ドメイン、及び第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第二のＣＡＲ；を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、第一及び第二のＣＡＲが、２以上の切断可能なドメインを介して連結される、コンストラクトを提供する。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトの作製方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、及び第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第一のＣＡＲ；並びに（ｂ）第二の抗原結合ドメイン、第二の膜貫通ドメイン、及び第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第二のＣＡＲの間に２以上の切断可能なドメインを設計し、第一及び第二のＣＡＲが該２以上の切断可能なドメインを介して連結されること；そして第一のＣＡＲ、２以上の切断可能なドメイン、及び第二のＣＡＲを、Ｎ末端からＣ末端までに含む配列を、プラスミドにクローニングすることを含む、方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含むＣＡＲアミノ酸コンストラクトを提供する。
【００１０】
本発明の更なる実施形態は、関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、並びに本発明のＣＡＲアミノ酸コンストラクトに関連する医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明の更なる実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の実施形態による、例示的なＣＡＲコンストラクトの模式図を提示する。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｃは、本発明の実施形態による、（２Ａ）Ｔ細胞を単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（「ＣＤ１９  ＣＡＲ」と表示される抗ＣＤ１９  ＣＡＲ）又はＶ１  ＣＡＲコンストラクト（バイシストロン性−Ｖ１又はｂｉｃｉｓ−Ｖ１とも表示される）をコードするベクターで形質導入する場合、抗ＣＤ１９  ＣＡＲとＣＤ３の、ヒトＴ細胞上の表面発現を比較する、蛍光活性化細胞選別ドットプロットを提示する。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｃは、本発明の実施形態による、（２Ｂ）Ｔ細胞を単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ（「ＣＤ２２  ＣＡＲ」と表示される抗ＣＤ２２  ＣＡＲ）又はＶ１  ＣＡＲコンストラクトをコードするベクターで形質導入する場合、抗ＣＤ２２  ＣＡＲ及びＣＤ３の、ヒトＴ細胞上の表面発現を比較する、蛍光活性化細胞選別ドットプロットを提示する。
【図２−３】図２Ａ〜２Ｃは、本発明の実施形態による、（２Ｃ）細胞をＶ１  ＣＡＲコンストラクトをコードするベクターで形質導入する場合、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの、ヒトＴ細胞上の表面発現を比較する、蛍光活性化細胞選別ドットプロットを提示する。
【図３】図３は、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＬｏｏｐＣＡＲ６をコードするベクターで形質導入したか、又は、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ及び単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲをコードする別々のベクターで共形質導入した場合の、ヒトＴ細胞上の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの表面発現を比較する蛍光活性化細胞選別ドットプロットを提示する。
【図４】図４は、本発明の実施形態による、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、Ｖ５  ＣＡＲコンストラクト（バイシストロン性−Ｖ５又はｂｉｃｉｓ−Ｖ５とも表示される）、又はＬｏｏｐＣＡＲ６をコードするベクターで形質導入した場合の、ヒトＴ細胞上の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの表面発現を比較する蛍光活性化細胞選別ドットプロットを提示する。
【図５−１】図５Ａは、本発明の実施形態による、サイトカイン産生に基づくインビトロ活性を示す棒グラフである。図５ＡはＩＬ２レベルを示し、図５ＢはＩＦＮγレベルを示す（ＣＤ１９、ＣＤ２２、両方、を発現するか、又はいずれもしないＫ５６２細胞を、本発明の実施形態による、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＣＡＲ１９）、又は単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ（ＣＡＲ２２）をコードするベクターで形質導入したＴ細胞と接触させる場合に測定）。
【図５−２】図５Ｂは、本発明の実施形態による、サイトカイン産生に基づくインビトロ活性を示す棒グラフである。図５ＡはＩＬ２レベルを示し、図５ＢはＩＦＮγレベルを示す（ＣＤ１９、ＣＤ２２、両方、を発現するか、又はいずれもしないＫ５６２細胞を、本発明の実施形態による、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＣＡＲ１９）、又は単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ（ＣＡＲ２２）をコードするベクターで形質導入したＴ細胞と接触させる場合に測定）。
【図６−１】図６Ａは、本発明の実施形態による、サイトカイン産生に基づくインビトロ活性を示す棒グラフである。図６ＡはＩＬ２レベルを示し、図６ＢはＩＦＮγレベルを示す（ＣＤ１９、ＣＤ２２、両方、を発現するか、又はいずれもしないＫ５６２細胞を、本発明の実施形態による、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、Ｖ５  ＣＡＲコンストラクト、ＬｏｏｐＣＡＲ６、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、又は単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞と接触させる場合に測定）。
【図６−２】図６Ｂは、本発明の実施形態による、サイトカイン産生に基づくインビトロ活性を示す棒グラフである。図６ＡはＩＬ２レベルを示し、図６ＢはＩＦＮγレベルを示す（ＣＤ１９、ＣＤ２２、両方、を発現するか、又はいずれもしないＫ５６２細胞を、本発明の実施形態による、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、Ｖ５  ＣＡＲコンストラクト、ＬｏｏｐＣＡＲ６、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、又は単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞と接触させる場合に測定）。
【図７−１】図７Ａは、本発明の実施形態による、サイトカイン産生に基づくインビトロ活性を示す棒グラフである。図７ＡはＩＬ２レベルを示し、図７ＢはＩＦＮγレベルを示す（ＣＤ１９  ＫＯ及び／又はＣＤ２２  ＫＯ  ＮＡＬＭ６細胞を、本発明の実施形態による、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、Ｖ５  ＣＡＲコンストラクト、ＬｏｏｐＣＡＲ６、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、又は単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞と接触させる場合に測定）。
【図７−２】図７Ｂは、本発明の実施形態による、サイトカイン産生に基づくインビトロ活性を示す棒グラフである。図７ＡはＩＬ２レベルを示し、図７ＢはＩＦＮγレベルを示す（ＣＤ１９  ＫＯ及び／又はＣＤ２２  ＫＯ  ＮＡＬＭ６細胞を、本発明の実施形態による、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、Ｖ５  ＣＡＲコンストラクト、ＬｏｏｐＣＡＲ６、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、又は単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞と接触させる場合に測定）。
【図８】図８は、本発明の実施形態による、サイトカイン産生に基づくインビトロ活性を示す棒グラフである。図８は、ＣＡＲ  Ｔ細胞をＮＡＬＭ６腫瘍細胞と１８時間共インキュベーションし、培養上清中のＩＬ２産生レベルをＥＬＩＳＡで測定したことを示す（「−Ｎ」：ＮＡＬＭ６；「−Ｎ−１９」：ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ；「−Ｎ−１９−２２」：ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ−ＣＤ２２ｎｅｇ）。
【図９】図９〜１４は、モックＴ細胞（非形質導入Ｔ細胞）と比較した、本発明の実施形態による、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＬｏｏｐＣＡＲ６、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、又はＶ５  ＣＡＲコンストラクトをコードするベクターで形質導入されたＴ細胞を用いる治療後のインビボでの白血病進行の生物発光イメージングを提示する。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。「Ｌｅｎｔｉ」は、ＣＡＲがレンチウイルス骨格内で設計及び作製されていることを示す。
【図１０】図９〜１４は、モックＴ細胞（非形質導入Ｔ細胞）と比較した、本発明の実施形態による、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＬｏｏｐＣＡＲ６、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、又はＶ５  ＣＡＲコンストラクトをコードするベクターで形質導入されたＴ細胞を用いる治療後のインビボでの白血病進行の生物発光イメージングを提示する。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。「Ｌｅｎｔｉ」は、ＣＡＲがレンチウイルス骨格内で設計及び作製されていることを示す。
【図１１】図９〜１４は、モックＴ細胞（非形質導入Ｔ細胞）と比較した、本発明の実施形態による、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＬｏｏｐＣＡＲ６、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、又はＶ５  ＣＡＲコンストラクトをコードするベクターで形質導入されたＴ細胞を用いる治療後のインビボでの白血病進行の生物発光イメージングを提示する。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。「Ｌｅｎｔｉ」は、ＣＡＲがレンチウイルス骨格内で設計及び作製されていることを示す。
【図１２】図９〜１４は、モックＴ細胞（非形質導入Ｔ細胞）と比較した、本発明の実施形態による、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＬｏｏｐＣＡＲ６、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、又はＶ５  ＣＡＲコンストラクトをコードするベクターで形質導入されたＴ細胞を用いる治療後のインビボでの白血病進行の生物発光イメージングを提示する。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。「Ｌｅｎｔｉ」は、ＣＡＲがレンチウイルス骨格内で設計及び作製されていることを示す。
【図１３】図９〜１４は、モックＴ細胞（非形質導入Ｔ細胞）と比較した、本発明の実施形態による、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＬｏｏｐＣＡＲ６、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、又はＶ５  ＣＡＲコンストラクトをコードするベクターで形質導入されたＴ細胞を用いる治療後のインビボでの白血病進行の生物発光イメージングを提示する。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。「Ｌｅｎｔｉ」は、ＣＡＲがレンチウイルス骨格内で設計及び作製されていることを示す。
【図１４】図９〜１４は、モックＴ細胞（非形質導入Ｔ細胞）と比較した、本発明の実施形態による、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＬｏｏｐＣＡＲ６、Ｖ１  ＣＡＲコンストラクト、又はＶ５  ＣＡＲコンストラクトをコードするベクターで形質導入されたＴ細胞を用いる治療後のインビボでの白血病進行の生物発光イメージングを提示する。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。「Ｌｅｎｔｉ」は、ＣＡＲがレンチウイルス骨格内で設計及び作製されていることを示す。
【図１５】図１５は、ＣＤ１９の喪失前後の、患者におけるＣＤ２２発現を示す線グラフである。
【図１６】図１６は、ＣＤ１９及びＣＤ２２の発現（ＣＲＩＳＰＲ  ＣＤ１９ｎｅｇ及びＣＤ２２ｎｅｇ白血病株と親ＮＡＬＭ６株との比較）を示すドットプロットである。
【図１７】図１７は、インビボでの進行の（ＣＲＩＳＰＲ  ＣＤ１９ｎｅｇ及びＣＤ２２ｎｅｇ白血病細胞と親ＮＡＬＭ６細胞との）比較を示す画像を提示する。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図１８】図１８は、本明細書に記載のＣＡＲを用いる治療方法の比較を示す画像を提示する。ＮＳＧマウスに、０日目に２．５Ｅ５のＮＡＬＭ６とＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ及びＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇの白血病株の混合物を投与した。連続治療群中のマウスには、３日目に３Ｅ６のＣＡＲ＋の、９日目に３Ｅ６のＣＡＲ＋のＴ細胞を投与した。共注射群中のマウスには、３日目に３Ｅ６の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋及び３Ｅ６の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ＋のＴ細胞の、合計６Ｅ６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を投与した。共形質導入群中のマウスには、３Ｅ６の抗ＣＤ１９＋及び３Ｅ６の抗ＣＤ２２＋のＣＡＲ  Ｔ細胞を含有する合計８Ｅ６のＴ細胞を投与した。ＣＤ１９又はＣＤ２２群中のマウスには、３Ｅ６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を投与した。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの共注射又は共形質導入により、ＣＤ１９とＣＤ２２の両方を同時に標的とすることによって、白血病の再発が低減され得ることが示唆される。
【図１９】図１９は、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲコンストラクトによる単独ベクター形質導入と共形質導入との比較を示すドットプロットである。
【図２０】図２０は、実施例７に記載のＣＡＲ治療後の白血病表現型のグラフプロットの提示である。
【図２１】図２１は、本発明の実施形態による、実施例７のＴａｎＣＡＲを図式的に提示する。
【図２２−１】図２２Ａは、本発明の実施形態による、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＣＤ２２、及びＫ５６２−ＣＤ１９ＣＤ２２標的細胞株での、本明細書に記載の様々なＣＡＲのサイトカイン産生を示す棒グラフである。
【図２２−２】図２２Ｂは、本発明の実施形態による、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＣＤ２２、及びＫ５６２−ＣＤ１９ＣＤ２２標的細胞株での、本明細書に記載の様々なＣＡＲのサイトカイン産生を示す棒グラフである。
【図２３−１】図２３Ａは、インビボでの白血病の治療に関するＴａｎＣＡＲ１及びＴａｎＣＡＲ４の比較を示す画像を提示する。ＮＳＧマウスに、０日目に１Ｅ６のルシフェラーゼ発現ＮＡＬＭ６白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）を投与した。３日目に、マウスに３Ｅ６のＣＡＲ発現Ｔ細胞をＩＶ注射した。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図２３−２】図２３Ｂ〜２３Ｄは、本発明の実施形態による各ＣＡＲ又はモックのＴ細胞産物の共インキュベーションを伴うＩｎｃｕｃｙｔｅキリングアッセイを示すドットプロットを提示する。
【図２３−３】図２３Ｂ〜２３Ｄは、本発明の実施形態による各ＣＡＲ又はモックのＴ細胞産物の共インキュベーションを伴うＩｎｃｕｃｙｔｅキリングアッセイを示すドットプロットを提示する。
【図２３−４】図２３Ｂ〜２３Ｄは、本発明の実施形態による各ＣＡＲ又はモックのＴ細胞産物の共インキュベーションを伴うＩｎｃｕｃｙｔｅキリングアッセイを示すドットプロットを提示する。
【図２４】図２４は、本発明の実施形態による、実施例７のＬｏｏｐＣＡＲを図式的に提示する。
【図２５−１】図２５Ａ〜２５Ｃは、本発明の実施形態による、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＣＤ２２、及びＫ５６２−ＣＤ１９ＣＤ２２標的細胞株での、様々なＣＡＲのサイトカイン産生を示す棒グラフを提示する。
【図２５−２】図２５Ａ〜２５Ｃは、本発明の実施形態による、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＣＤ２２、及びＫ５６２−ＣＤ１９ＣＤ２２標的細胞株での、様々なＣＡＲのサイトカイン産生を示す棒グラフを提示する。
【図２５−３】図２５Ａ〜２５Ｃは、本発明の実施形態による、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＣＤ２２、及びＫ５６２−ＣＤ１９ＣＤ２２標的細胞株での、様々なＣＡＲのサイトカイン産生を示す棒グラフを提示する。
【図２６】図２６は、本発明の実施形態による、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＣＤ２２、及びＫ５６２−ＣＤ１９ＣＤ２２標的細胞株での、様々なＣＡＲのサイトカイン産生を示す棒グラフである。
【図２７】図２７は、本発明の実施形態による各ＣＡＲ又はモックのＴ細胞産物と１０：１のＮＡＬＭ６：ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ細胞との共インキュベーションでのＩｎｃｕｃｙｔｅキリングアッセイを示すドットプロットである。
【図２８】図２８は、本発明の実施形態による各ＣＡＲ又はモックのＴ細胞産物と１０：１のＮＡＬＭ６：ＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇ細胞との共インキュベーションでのＩｎｃｕｃｙｔｅキリングアッセイを示すドットプロットである。
【図２９−１】図２９Ａ〜２９Ｆは、ＬｏｏｐＣＡＲ６が、標的抗原と共インキュベーションした場合に、様々なサイトカインを産生することを示す棒グラフである。図２９Ａ：インターフェロンガンマ。
【図２９−２】図２９Ａ〜２９Ｆは、ＬｏｏｐＣＡＲ６が、標的抗原と共インキュベーションした場合に、様々なサイトカインを産生することを示す棒グラフである。図２９Ｂ：ＩＬ６。
【図２９−３】図２９Ａ〜２９Ｆは、ＬｏｏｐＣＡＲ６が、標的抗原と共インキュベーションした場合に、様々なサイトカインを産生することを示す棒グラフである。図２９Ｃ：ＴＮＦアルファ。
【図２９−４】図２９Ａ〜２９Ｆは、ＬｏｏｐＣＡＲ６が、標的抗原と共インキュベーションした場合に、様々なサイトカインを産生することを示す棒グラフである。図２９Ｄ：ＩＬ８。
【図２９−５】図２９Ａ〜２９Ｆは、ＬｏｏｐＣＡＲ６が、標的抗原と共インキュベーションした場合に、様々なサイトカインを産生することを示す棒グラフである。図２９Ｅ：ＩＬ１３。
【図２９−６】図２９Ａ〜２９Ｆは、ＬｏｏｐＣＡＲ６が、標的抗原と共インキュベーションした場合に、様々なサイトカインを産生することを示す棒グラフである。図２９Ｆ：ＩＬ２。
【図３０】図３０は画像を示す。ＮＳＧマウスに、０日目に１Ｅ６のルシフェラーゼ発現ＮＡＬＭ６白血病を投与した。３日目に、マウスに３Ｅ６のＣＡＲ発現Ｔ細胞をＩＶ注射した。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図３１】図３１は画像を示す。ＮＳＧマウスに、０日目に１Ｅ６のルシフェラーゼ発現ＮＡＬＭ６白血病を投与した。３日目に、マウスに９Ｅ６、３Ｅ６及び１Ｅ６の、Ｌｏｏｐ  Ｆ  ＣＡＲ（本明細書中ＬｏｏｐＣＡＲ６とも列記される）を発現するＴ細胞をＩＶ注射した。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図３２】図３２は画像を提示する。ＮＳＧマウスに、０日目に１Ｅ６のＮＡＬＭ６を投与した。連続治療群中のマウスには、３日目に３Ｅ６のＣＡＲ＋の、７日目に３Ｅ６のＣＡＲ＋のＴ細胞を投与した。共注射群中のマウスには、３日目に３Ｅ６の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ＋及び３Ｅ６の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ＋のＴ細胞の、合計６Ｅ６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を投与した。共形質導入群中のマウスには、３Ｅ６の抗ＣＤ１９＋及び３Ｅ６の抗ＣＤ２２＋のＣＡＲ  Ｔ細胞を含有する合計１０Ｅ６のＴ細胞を投与した。ＣＤ１９又はＣＤ２２群中のマウスには、３Ｅ６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を投与した。抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの共注射又は共形質導入により、ＣＤ１９とＣＤ２２の両方を同時に標的とすることによって、白血病の再発が低減され得ることが示唆される。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図３３−１】図３３Ａは画像を示す。ＮＳＧマウスに、０日目に５Ｅ５のＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇと５Ｅ５のＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇのルシフェラーゼ発現白血病の混合物を投与した。３日目に、マウスを３Ｅ６のＣＡＲ発現Ｔ細胞で治療した。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図３３−２】図３３Ｂは画像を示す。ＮＳＧマウスに、図に示す通り０日目に１Ｅ６のルシフェラーゼ発現白血病細胞を投与した。これらの群の幾つかにおける白血病に、１％のＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ又はＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇ細胞を混合した。３日目に、マウスを６Ｅ６のＣＡＲ発現Ｔ細胞で治療した。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図３４−１】図３４Ａは画像を示す。ＮＳＧマウスに、０日目に１Ｅ６のＮＡＬＭ６白血病を投与した。７日目に、マウスに８Ｅ６のモックのＴ細胞、ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＬｏｏｐ  Ｆ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞による治療を施した。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図３４−２】図３４Ｂは画像を示す。ＮＳＧマウスに、０日目に１Ｅ６のＮＡＬＭ６白血病を投与した。７日目に、マウスに８Ｅ６のモックＴ細胞、ＣＤ１９、ＣＤ２２、又はＬｏｏｐ  Ｆ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞による治療を施した。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図３５−１】図３５Ａは、本発明の実施形態による、正常組織を代表する様々な細胞株と共インキュベーション後の、ＬｏｏｐＣＡＲ６のＩＦＮγ産生を示す棒グラフである。
【図３５−２】図３５Ｂは、本発明の実施形態による、正常組織を代表する様々な細胞株と共インキュベーション後の、ＬｏｏｐＣＡＲ６のＩＦＮγ産生を示す棒グラフである。
【図３６】図３６は、８日目に解析されたＣＤ１９  ＣＡＲ及びＣＤ２２  ＣＡＲのヒトＰＢＭＣ表面発現を示すドットプロットである。
【図３７−１】図３７Ａ−３７Ｇ：サイトカイン産生のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞（１Ｅ５）を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、３７℃インキュベーター内の９６ウェルプレート中の２００ｍｌ  ＲＰＭＩ培地中で、同数の標的細胞と１５〜２０時間共インキュベーションした。多量抗原標的細胞（ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）については、ＣＤ１９若しくはＣＤ２２、又はＣＤ１９とＣＤ２２の両方を発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｋ５６２を用い、Ｋ５６２細胞はネガティブコントロールとして機能した。少量標的抗原株（ｌｏｗ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｎｅ）については、ＮＡＬＭ６及びＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ及びＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇを用い、ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇＣＤ２２ｎｅｇをネガティブコントロールとして用いた。試験はすべてトリプリケートであった。培養上清中のＩＬ２のサイトカインレベルを、Ｒ＆ＤのＥＬＩＳＡキットにより検出した。図３７Ａ：異なる共刺激（ｃｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）ドメイン及び異なる抗原密度レベルでのＣＤ１９及びＣＤ２２  ＣＡＲのサイトカイン産生。
【図３７−２】図３７Ａ−３７Ｇ：サイトカイン産生のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞（１Ｅ５）を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、３７℃インキュベーター内の９６ウェルプレート中の２００ｍｌ  ＲＰＭＩ培地中で、同数の標的細胞と１５〜２０時間共インキュベーションした。多量抗原標的細胞（ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）については、ＣＤ１９若しくはＣＤ２２、又はＣＤ１９とＣＤ２２の両方を発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｋ５６２を用い、Ｋ５６２細胞はネガティブコントロールとして機能した。少量標的抗原株（ｌｏｗ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｎｅ）については、ＮＡＬＭ６及びＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ及びＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇを用い、ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇＣＤ２２ｎｅｇをネガティブコントロールとして用いた。試験はすべてトリプリケートであった。培養上清中のＩＬ２のサイトカインレベルを、Ｒ＆ＤのＥＬＩＳＡキットにより検出した。図３７Ｂ：異なる共刺激（ｃｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）ドメイン及び異なる抗原密度レベルでのバイシストロン性ＣＡＲのサイトカイン産生。
【図３７−３】図３７Ａ−３７Ｇ：サイトカイン産生のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞（１Ｅ５）を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、３７℃インキュベーター内の９６ウェルプレート中の２００ｍｌ  ＲＰＭＩ培地中で、同数の標的細胞と１５〜２０時間共インキュベーションした。多量抗原標的細胞（ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）については、ＣＤ１９若しくはＣＤ２２、又はＣＤ１９とＣＤ２２の両方を発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｋ５６２を用い、Ｋ５６２細胞はネガティブコントロールとして機能した。少量標的抗原株（ｌｏｗ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｎｅ）については、ＮＡＬＭ６及びＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ及びＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇを用い、ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇＣＤ２２ｎｅｇをネガティブコントロールとして用いた。試験はすべてトリプリケートであった。培養上清中のＩＬ２のサイトカインレベルを、Ｒ＆ＤのＥＬＩＳＡキットにより検出した。図３７Ｃ：バイシストロン性ＣＡＲのサイトカイン産生と二価ＣＡＲのそれとの比較。
【図３７−４】図３７Ａ−３７Ｇ：サイトカイン産生のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞（１Ｅ５）を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、３７℃インキュベーター内の９６ウェルプレート中の２００ｍｌ  ＲＰＭＩ培地中で、同数の標的細胞と１５〜２０時間共インキュベーションした。多量抗原標的細胞（ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）については、ＣＤ１９若しくはＣＤ２２、又はＣＤ１９とＣＤ２２の両方を発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｋ５６２を用い、Ｋ５６２細胞はネガティブコントロールとして機能した。少量標的抗原株（ｌｏｗ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｎｅ）については、ＮＡＬＭ６及びＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ及びＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇを用い、ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇＣＤ２２ｎｅｇをネガティブコントロールとして用いた。試験はすべてトリプリケートであった。培養上清中のＩＬ２のサイトカインレベルを、Ｒ＆ＤのＥＬＩＳＡキットにより検出した。図３７Ｄ〜３７Ｆ：ｉｎｃｕｃｙｔｅキリングアッセイに関しては、５Ｅ４の標的腫瘍細胞と、同量のＣＡＲ  Ｔ細胞を共インキュベーションした。ＧＦＰ蛍光発現についてプレートをスキャンして、３０分ごとに、４０時間細胞をモニタリングした。各時点での細胞死滅の割合をベースライン補正した。
【図３７−５】図３７Ａ−３７Ｇ：サイトカイン産生のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞（１Ｅ５）を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、３７℃インキュベーター内の９６ウェルプレート中の２００ｍｌ  ＲＰＭＩ培地中で、同数の標的細胞と１５〜２０時間共インキュベーションした。多量抗原標的細胞（ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）については、ＣＤ１９若しくはＣＤ２２、又はＣＤ１９とＣＤ２２の両方を発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｋ５６２を用い、Ｋ５６２細胞はネガティブコントロールとして機能した。少量標的抗原株（ｌｏｗ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｎｅ）については、ＮＡＬＭ６及びＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ及びＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇを用い、ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇＣＤ２２ｎｅｇをネガティブコントロールとして用いた。試験はすべてトリプリケートであった。培養上清中のＩＬ２のサイトカインレベルを、Ｒ＆ＤのＥＬＩＳＡキットにより検出した。図３７Ｄ〜３７Ｆ：ｉｎｃｕｃｙｔｅキリングアッセイに関しては、５Ｅ４の標的腫瘍細胞と、同量のＣＡＲ  Ｔ細胞を共インキュベーションした。ＧＦＰ蛍光発現についてプレートをスキャンして、３０分ごとに、４０時間細胞をモニタリングした。各時点での細胞死滅の割合をベースライン補正した。
【図３７−６】図３７Ａ−３７Ｇ：サイトカイン産生のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞（１Ｅ５）を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、３７℃インキュベーター内の９６ウェルプレート中の２００ｍｌ  ＲＰＭＩ培地中で、同数の標的細胞と１５〜２０時間共インキュベーションした。多量抗原標的細胞（ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）については、ＣＤ１９若しくはＣＤ２２、又はＣＤ１９とＣＤ２２の両方を発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｋ５６２を用い、Ｋ５６２細胞はネガティブコントロールとして機能した。少量標的抗原株（ｌｏｗ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｎｅ）については、ＮＡＬＭ６及びＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ及びＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇを用い、ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇＣＤ２２ｎｅｇをネガティブコントロールとして用いた。試験はすべてトリプリケートであった。培養上清中のＩＬ２のサイトカインレベルを、Ｒ＆ＤのＥＬＩＳＡキットにより検出した。図３７Ｄ〜３７Ｆ：ｉｎｃｕｃｙｔｅキリングアッセイに関しては、５Ｅ４の標的腫瘍細胞と、同量のＣＡＲ  Ｔ細胞を共インキュベーションした。ＧＦＰ蛍光発現についてプレートをスキャンして、３０分ごとに、４０時間細胞をモニタリングした。各時点での細胞死滅の割合をベースライン補正した。
【図３７−７】図３７Ａ−３７Ｇ：サイトカイン産生のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞（１Ｅ５）を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、３７℃インキュベーター内の９６ウェルプレート中の２００ｍｌ  ＲＰＭＩ培地中で、同数の標的細胞と１５〜２０時間共インキュベーションした。多量抗原標的細胞（ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）については、ＣＤ１９若しくはＣＤ２２、又はＣＤ１９とＣＤ２２の両方を発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｋ５６２を用い、Ｋ５６２細胞はネガティブコントロールとして機能した。少量標的抗原株（ｌｏｗ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｎｅ）については、ＮＡＬＭ６及びＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ及びＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇを用い、ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇＣＤ２２ｎｅｇをネガティブコントロールとして用いた。試験はすべてトリプリケートであった。培養上清中のＩＬ２のサイトカインレベルを、Ｒ＆ＤのＥＬＩＳＡキットにより検出した。図３７Ｇ：ＮＡＬＭ６ＣＤ１９ｎｅｇＣＤ２２ｎｅｇ細胞によるＩｎｃｕｃｙｔｅキリングアッセイ。
【図３８】図３８：ＲＮＡ配列決定解析により、共刺激ドメインの異なる組合せに関連する特有の遺伝子発現が実証される。バイシストロン性ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＡＭＶ培地中で２４時間、同数のＮＡＬＭ６と共インキュベーションした。ＮＡＬＭ６細胞を磁気ビーズで除去し、直ちにＴＲＮＡを抽出してＲＮＡ配列決定解析に用いた。ＰＣＡプロットは、共刺激ドメインの異なる組合せに関連する、異なる遺伝子発現プロファイルを示す。
【図３９−１】図３９Ａは画像を提示する。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。図３９Ａ：ＮＳＧマウスに、０日目に１Ｅ６のルシフェラーゼ発現ＮＡＬＭ６白血病を投与した。３日目に、マウスに５Ｅ６のＣＡＲ発現Ｔ細胞をＩＶ注射した。生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図３９−２】図３９Ｂは画像を提示する。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。図３９Ｂ：ＮＳＧマウスに、０日目に１Ｅ５のルシフェラーゼ発現ＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ、及びＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇ白血病細胞を投与した。３日目に、マウスに３Ｅ６のＣＡＲ発現Ｔ細胞をＩＶ注射した。
【図４０】図４０：ＮＳＧマウスに、０日目に２．５Ｅ５のルシフェラーゼ発現ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ及びＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇ白血病細胞を投与した。３日目に、マウスに３Ｅ６のＣＡＲ発現Ｔ細胞をＩＶ注射した。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図４１】図４１：ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼ発現ＨＭＢ２８患者由来ＡＬＬ異種移植細胞（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）（ＣＤ１９ｎｅｇＣＤ２２＋、１ｘ１０６）をＩＶ注射した。図に示す通り、８日目にマウスに３Ｅ６のＣＡＲ発現Ｔ細胞を注射した。陰影レベルの増加によって示す生物発光強度は腫瘍負荷を表す。
【図４２】図４２は、実施例７に記載の部位密度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一実施形態は、（ａ）切断可能なドメイン；（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、及び第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第一のＣＡＲ；並びに（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、第二の膜貫通ドメイン、及び第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第二のＣＡＲ；を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、第一及び第二のＣＡＲが、切断可能なドメインを介して連結され、第一の抗原結合ドメインが、ｍ９７１抗体の抗原結合ドメインを含み、第一のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第一の抗原結合ドメインはＣＤ２２に対する抗原特異性を有する、コンストラクトを提供する。
【００１４】
ＣＡＲは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結された１以上の抗体の抗原結合ドメイン（例、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））を含有する、人為的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲの特徴としては、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、ＭＨＣ非拘束性の様式で選択された標的に対する、Ｔ細胞の特異性及び反応性を向けなおす、その能力が挙げられる。ＭＨＣ非拘束性の抗原認識によって、ＣＡＲを発現しているＴ細胞に、抗原プロセッシングに依存せずに抗原を認識する能力が付与され、従って、腫瘍の主要なエスケープ機構をバイパスする。更に、Ｔ細胞において発現する場合、ＣＡＲは好都合にも、内在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。本明細書中で用いられる場合、表現「抗原特異性」及び「抗原特異的な応答を誘発する」は、抗原に対するＣＡＲの結合が免疫応答を誘発するように、ＣＡＲが抗原に特異的に結合できること及び抗原を免疫学的に認識できることを意味する。
【００１５】
ＣＤ２２は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する、系譜に限定されたＢ細胞抗原である。ＣＤ２２はＢ細胞リンパ腫及び白血病の６０〜７０％（例、慢性Ｂリンパ球性白血病、毛状細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及びバーキットリンパ腫）で発現し、Ｂ細胞の発生の初期段階における細胞表面や幹細胞上には存在しない（Ｖａｉｃｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１：２６７−２９７（１９９１）；Ｂａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１１：１５４５−５０（２００５））。ＣＤ１９（Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９、Ｂ４、及びＣＶＩＤ３としても知られる）は、Ｂリンパ球と造血系の濾胞樹状細胞にのみ発現する細胞表面分子である。それは、Ｂ系譜に限定された、発現する抗原のうち最も早いものであり、大抵の小児Ｂ細胞並びに大抵の非Ｔ細胞急性リンパ球性白血病細胞及びＢ細胞型慢性リンパ球性白血病細胞上に存在する（Ｔｅｄｄｅｒ  ａｎｄ  Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１４３：７１２−７１７（１９８９））。
【００１６】
本発明の実施形態においては、本発明は、それぞれが単一の抗原に結合する複数のＣＡＲ（例えば、２、３、４、５以上）であって、各ＣＡＲが切断可能なドメインによって分離されているＣＡＲを提供する。本発明の一実施形態においては、切断可能なドメインを切断することにより、各ＣＡＲ、例、第一及び第二のＣＡＲがＣＡＲコンストラクトから切り離され、各切断されたＣＡＲがＴ細胞表面上に別々に存在し、それぞれがそのそれぞれの標的に対して抗原特異性を有し、そして、それぞれが抗原特異的応答を誘発し得る。一実施形態においては、かかるＣＡＲコンストラクトは、２つのＣＡＲを切断し／切り離し得る、例、バイシストロン性ＣＡＲである。理論又はメカニズムに縛られることは望まないが、これらのＣＡＲの切断可能なドメインは、完全な配列の完全な翻訳後、又は各ＣＡＲ及び切断可能なドメインの翻訳後に、ＣＡＲが、配列中における次のＣＡＲの翻訳の前に切断／切り離されるように、切断され得る。本明細書におけるかかるＣＡＲの例としては、Ｖ１、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、及びＶ８が挙げられる。
【００１７】
本発明の実施形態においては、本発明は、各ＣＡＲが２つの抗原（例、ＣＤ１９及びＣＤ２２）に同時に結合し得るＣＡＲを提供する。これらのＣＡＲは、ＣＤ２２及びＣＤ１９に対する二重の特異性を有する。ＣＡＲに関して本明細書中で用いられる場合、語句「二重特異性」、「二重特異的（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、及び「二価」は、同じＣＡＲが２つの異なる抗原に特異的に結合し、免疫学的に認識できることを意味する。２つの抗原のうちの少なくとも１つに対するＣＡＲの結合により、免疫応答が誘発される。本明細書におけるかかるＣＡＲの例としては、ＴａｎＣＡＲ２〜４及びＬｏｏｐＣＡＲ１〜５が挙げられる。別の実施形態においては、二重特異性ＣＡＲは、切断可能なドメインにより連結され得る。
【００１８】
本発明の実施形態は、ｍ９７１抗体（「ｍ９７１」）の抗ＣＤ２２抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。ｍ９７１の抗原結合ドメインはＣＤ２２に特異的に結合する。これに関して、本発明の好ましい実施形態は、ｍ９７１の抗原結合ドメインの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る抗ＣＤ２２抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。ＨＡ２２免疫毒素及びｍ９７１抗体は、異なるＣＤ２２エピトープに結合する。
【００１９】
抗ＣＤ２２抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含み得る。本発明の一実施形態においては、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む。これに関して、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１領域；配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２領域；配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域のうちの１以上を含み得る。好ましくは、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインの重鎖は、配列番号４、６、及び８のすべてのアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本発明の一実施形態においては、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインの軽鎖可変領域は、軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域、及び軽鎖ＣＤＲ３領域を含み得る。これに関して、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１領域；配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２領域；及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域のうちの１以上を含み得る。好ましくは、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインの軽鎖は、配列番号１２、１４、及び１６のすべてのアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態においては、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインは、配列番号４、６、８、１２、１４、及び１６のすべてのアミノ酸配列を含む。
【００２１】
抗ＣＤ２２抗原結合ドメインの重鎖可変領域は、配列番号３〜９のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、又は実質的にそれからなり得る。抗ＣＤ２２抗原結合ドメインの軽鎖可変領域は、配列番号１１〜１７のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、又は実質的にそれからなり得る。従って、本発明の一実施形態においては、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインは、配列番号３〜９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号１１〜１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。好ましくは、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインは、配列番号３〜９及び１１〜１７のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
本発明の実施形態においては、第二のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第二の抗原結合ドメインはＣＤ１９に対する抗原特異性を有する。
【００２３】
本発明の実施形態においては、第二の抗原結合ドメインは、ＦＭＣ６３抗体の抗原結合ドメインを含む。本発明の実施形態においては、第二の抗原結合ドメインは、以下に記載のＦＭＣ６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、以下に記載のＦＭＣ６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。本発明の実施形態においては、第二の抗原結合ドメインは、以下に記載のＦＭＣ６３のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、（ａ）切断可能なドメイン；（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、及び第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第一のＣＡＲ；並びに（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、第二の膜貫通ドメイン、及び第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第二のＣＡＲ；を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、第一及び第二のＣＡＲが、切断可能なドメインを介して連結され、第一の抗原結合ドメインが、ＦＭＣ６３抗体の抗原結合ドメインを含み、第一のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第一の抗原結合ドメインはＣＤ１９に対する抗原特異性を有する、コンストラクトを提供する。実施形態においては、第二のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第二の抗原結合ドメインはＣＤ２２に対する抗原特異性を有する。
【００２５】
本発明の一実施形態は、ＦＭＣ６３抗体（「ＦＭＣ６３」）の抗ＣＤ１９抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。ＦＭＣ６３の抗原結合ドメインはＣＤ１９に特異的に結合する。これに関して、本発明の好ましい実施形態は、ＦＭＣ６３の抗原結合ドメインの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る抗ＣＤ１９抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。
【００２６】
抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含み得る。
【００２７】
本発明の一実施形態においては、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインの軽鎖可変領域は、軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域、及び軽鎖ＣＤＲ３領域を含み得る。これに関して、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１領域；配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２領域；及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域のうちの１以上を含み得る。好ましくは、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインの軽鎖は、配列番号２４、２６、及び２８のすべてのアミノ酸配列を含む。
【００２８】
本発明の一実施形態においては、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインの重鎖可変領域は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む。これに関して、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１領域；配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２領域；及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域のうちの１以上を含み得る。好ましくは、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインの重鎖は、配列番号３２、３４、及び３６のすべてのアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態においては、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、配列番号２４、２６、２８、３２、３４、及び３６のすべてのアミノ酸配列を含む。
【００２９】
抗ＣＤ１９抗原結合ドメインの重鎖可変領域は、配列番号３１〜３７のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、又は実質的にそれからなり得る。抗ＣＤ１９抗原結合ドメインの軽鎖可変領域は、配列番号２３〜２９のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、又は実質的にそれからなり得る。従って、本発明の一実施形態においては、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、配列番号３１〜３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号２３〜２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。好ましくは、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、配列番号２３〜２９及び３１〜３７の両方のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
抗ＣＤ２２抗原結合ドメイン及び抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、それぞれ抗ＣＤ２２又は抗ＣＤ１９抗体の任意の抗原結合部分を含み得る。抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、及びトリアボディ等、少なくとも１つの抗原結合部位を有する任意の部分であり得る。好ましくは、抗原結合部分は、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体フラグメントである。ｓｃＦｖは、合成ペプチドリンカーを介して軽抗体鎖のＶドメインに連結された抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含む短縮型Ｆａｂフラグメントであり、通常の組換えＤＮＡテクノロジーの技術を用いて生成され得る。同様に、ジスルフィド安定化可変領域フラグメント（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡテクノロジーによって調製され得る。
【００３１】
本発明の一実施形態においては、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、リンカーによって互いに連結され得る。リンカーは、任意の好適なアミノ酸配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、リンカーは、約１〜約１００、約３〜約２０、約５〜約３０、約５〜約１８、又は約３〜約８のアミノ酸長のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、連続するグリシン及び／又はセリン残基から成る。従って、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーはグリシン及び／又はセリン残基からなり得る。好ましくは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーは、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号１０）を含み、複数の配列番号１０がリンカー内に存在し得る。本発明の別の実施形態においては、リンカーは配列番号３０のアミノ酸配列を含む。任意のリンカー配列が、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサーとして用いられ得る。
【００３２】
本発明の実施形態においては、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、リンカーによって互いに連結され得る。リンカーは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるリンカーのいずれかであり得る。本発明の一実施形態においては、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、配列番号１０又は３０のアミノ酸配列を含むリンカーによって互いに連結される。
【００３３】
一実施形態においては、抗ＣＤ２２抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、及びリンカーを含む。これに関して、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、及びリンカーを含む抗ＣＤ２２抗原結合ドメインの実施形態は、配列番号３〜１７のすべてを含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る。
【００３４】
一実施形態においては、抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、及びリンカーを含む。これに関して、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、及びリンカーを含む抗ＣＤ１９抗原結合ドメインの実施形態は、配列番号２３〜３７のすべてを含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る。
【００３５】
本発明のＣＡＲコンストラクトの第一のＣＡＲ及び第二のＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ以上の切断可能なドメインを介して互いに連結される。切断可能なドメイン（複数可）は、切断酵素によって認識されるドメイン又は自己切断するドメインを含む、任意の好適な切断可能なドメインのうちの１以上を含み得る。好適なドメインとしては、例えば、Ｔ２Ａ及び／又はＰ２Ａ等の２Ａドメイン、及びフューリン（ｆｕｒｉｎ）切断配列が挙げられる。表１は、例示的、好適で切断可能なドメインを提示する。
【００３６】
【表１】
2020519298.tif 000002
【００３７】
本発明の一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクトは１超の切断可能なドメインを含有し、切断可能なドメインはすべて同じである。本発明の一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクトは、ＣＡＲコンストラクト内で隣接する１超の切断可能なドメインを含有し、少なくとも１つの切断可能なドメインは異なっている。
【００３８】
一実施形態においては、抗原結合ドメインはリーダー配列を含む。本発明の一実施形態においては、リーダー配列は、ＣＡＲコンストラクト内の抗ＣＤ１９  ＣＡＲのアミノ末端に位置し得る。本発明の別の実施形態においては、リーダー配列は、ＣＡＲコンストラクト内の抗ＣＤ２２  ＣＡＲのアミノ末端に位置し得る。リーダー配列は、任意の適切なリーダー配列を含み得る。一実施形態においては、リーダー配列は、配列番号２又は配列番号６２のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る。本発明の一実施形態においては、リーダー配列は、細胞の表面上の切り離された／切断されたタンパク質の発現を促進し得るが、発現したＣＡＲ中におけるリーダー配列の存在は、ＣＡＲが機能するために必要ではない。本発明の一実施形態においては、細胞表面上でのＣＡＲの発現に際して、切り離されたＣＡＲからリーダー配列が切断されて除かれ得る。従って、本発明の一実施形態においては、切り離されたＣＡＲはリーダー配列を欠く。本発明の一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト内のＣＡＲはリーダー配列を欠く。
【００３９】
本発明の一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクトはヒンジドメインを含む。本発明の一実施形態においては、ヒンジドメインはＣＤ８ヒンジドメインである。好ましい実施形態においては、ＣＤ８ヒンジドメインはヒトのである。好ましくは、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１８を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る。本発明の一実施形態においては、ヒンジドメインはＣＤ２８ヒンジドメインである。好ましい実施形態においては、ＣＤ２８ヒンジドメインはヒトのである。好ましくは、ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号４０を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る。
【００４０】
本発明の一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクトは膜貫通（ＴＭ）ドメインを含む。本発明の一実施形態においては、ＴＭドメインはＣＤ８  ＴＭドメインである。好ましい実施形態においては、ＣＤ８  ＴＭドメインはヒトのである。好ましくは、ＣＤ８  ＴＭドメインは、配列番号１９を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る。本発明の一実施形態においては、ＴＭドメインはＣＤ２８  ＴＭドメインである。好ましい実施形態においては、ＣＤ２８  ＴＭドメインはヒトのである。好ましくは、ＣＤ２８  ＴＭドメインは、配列番号４１を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る。
【００４１】
本発明の一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクトは細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。本発明の一実施形態においては、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列を含む。４−１ＢＢはＣＤ１３７としても知られ、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを伝達し、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存を亢進する。好ましくは、４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列はヒトのである。好ましい実施形態においては、４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る。
【００４２】
本発明の一実施形態においては、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列を含む。ＣＤ３ζはＴＣＲと結合してシグナルを生成し、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。好ましくは、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列はヒトのである。好ましい実施形態においては、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る。
【００４３】
本発明の一実施形態においては、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列を含む。好ましくは、ＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列はヒトのである。好ましい実施形態においては、ＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る。
【００４４】
第一及び第二のＣＡＲは、ＣＡＲコンストラクト中に、任意の好適な向きで配置され得る。本発明の一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクトは、Ｎ末端からＣ末端までに：抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、１以上の切断可能なドメイン、次いで抗ＣＤ２２  ＣＡＲを含む。本発明の別の実施形態においては、ＣＡＲコンストラクトは、Ｎ末端からＣ末端までに：抗ＣＤ２２  ＣＡＲ、１以上の切断可能なドメイン、次いで抗ＣＤ１９  ＣＡＲを含む。
【００４５】
図１は、本発明の実施形態による、例示的なＣＡＲコンストラクトの模式図を提示する。
【００４６】
本発明の更なる実施形態は、表２〜６に記載のアミノ酸配列のいずれか１を含むか、それから成るか、又は実質的にそれから成る完全長ＣＡＲコンストラクトを提供する。
【００４７】
【表２−１】
2020519298.tif 000003
【００４８】
【表２−２】
2020519298.tif 000004
【００４９】
【表３−１】
2020519298.tif 000005
【００５０】
【表３−２】
2020519298.tif 000006
【００５１】
【表４−１】
2020519298.tif 000007
【００５２】
【表４−２】
2020519298.tif 000008
【００５３】
【表４−３】
2020519298.tif 000009
【００５４】
【表５−１】
2020519298.tif 000010
【００５５】
【表５−２】
2020519298.tif 000011
【００５６】
【表５−３】
2020519298.tif 000012
【００５７】
【表６−１】
2020519298.tif 000013
【００５８】
【表６−２】
2020519298.tif 000014
【００５９】
【表６−３】
2020519298.tif 000015
【００６０】
【表７−１】
2020519298.tif 000016
【００６１】
【表７−２】
2020519298.tif 000017
【００６２】
【表８−１】
2020519298.tif 000018
【００６３】
【表８−２】
2020519298.tif 000019
【００６４】
【表９−１】
2020519298.tif 000020
【００６５】
【表９−２】
2020519298.tif 000021
【００６６】
【表１０−１】
2020519298.tif 000022
【００６７】
【表１０−２】
2020519298.tif 000023
【００６８】
【表１０−３】
2020519298.tif 000024
【００６９】
【表１１−１】
2020519298.tif 000025
【００７０】
【表１１−２】
2020519298.tif 000026
【００７１】
【表１２−１】
2020519298.tif 000027
【００７２】
【表１２−２】
2020519298.tif 000028
【００７３】
【表１２−３】
2020519298.tif 000029
【００７４】
【表１３−１】
2020519298.tif 000030
【００７５】
【表１３−２】
2020519298.tif 000031
【００７６】
【表１４−１】
2020519298.tif 000032
【００７７】
【表１４−２】
2020519298.tif 000033
【００７８】
【表１４−３】
2020519298.tif 000034
【００７９】
【表１５−１】
2020519298.tif 000035
【００８０】
【表１５−２】
2020519298.tif 000036
【００８１】
【表１６−１】
2020519298.tif 000037
【００８２】
【表１６−２】
2020519298.tif 000038
【００８３】
【表１６−３】
2020519298.tif 000039
【００８４】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＶ１と表示）は配列：
【００８５】
【化１】
2020519298.tif 000040
【００８６】
を有する。
【００８７】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＶ５と表示）は配列：
【００８８】
【化２】
2020519298.tif 000041
【００８９】
を有する。
【００９０】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＶ６と表示）は配列：
【００９１】
【化３】
2020519298.tif 000042
【００９２】
を有する。
【００９３】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＶ７と表示）は配列： 
【００９４】
【化４】
2020519298.tif 000043
【００９５】
を有する。
【００９６】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＶ８と表示）は配列：
【００９７】
【化５】
2020519298.tif 000044
【００９８】
を有する。
【００９９】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＴａｎＣＡＲ２と表示）は配列：
【０１００】
【化６】
2020519298.tif 000045
【０１０１】
を有する。
【０１０２】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＴａｎＣＡＲ３と表示）は配列：
【０１０３】
【化７】
2020519298.tif 000046
【０１０４】
を有する。
【０１０５】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＴａｎＣＡＲ４と表示）は配列：
【０１０６】
【化８】
2020519298.tif 000047
【０１０７】
を有する。
【０１０８】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＬｏｏｐＣＡＲ１と表示）は配列：
【０１０９】
【化９】
2020519298.tif 000048
【０１１０】
を有する。
【０１１１】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＬｏｏｐＣＡＲ２と表示）は配列：
【０１１２】
【化１０】
2020519298.tif 000049
【０１１３】
を有する。
【０１１４】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＬｏｏｐＣＡＲ３と表示）は配列：
【０１１５】
【化１１】
2020519298.tif 000050
【０１１６】
を有する。
【０１１７】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＬｏｏｐＣＡＲ４と表示）は配列：
【０１１８】
【化１２】
2020519298.tif 000051
【０１１９】
を有する。
【０１２０】
一実施形態においては、ＣＡＲコンストラクト（本明細書においてはＬｏｏｐＣＡＲ５と表示）は配列：
【０１２１】
【化１３】
2020519298.tif 000052
【０１２２】
を有する。
【０１２３】
本発明のＣＡＲコンストラクトは多くの利点を提供し得る。本発明の一実施形態においては、例えば、本発明のＣＡＲコンストラクトは、好都合なことに、がん細胞による１の抗原、例、ＣＤ１９又はＣＤ２２の発現の喪失によるがん細胞のエスケープを低減又は防止し得る。例えば、本発明のＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ１９又はＣＤ２２のみに対する抗原特異性を有するＣＡＲによる治療後に、がんがその抗原の発現を喪失したがん患者において観察されている再発を減少又は予防し得ると考えられる。また、本発明のＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ１９又はＣＤ２２の発現レベルが不均一な患者を治療するためにも好都合であり得る。本発明のＣＡＲコンストラクトは、首尾よく治療され得る患者集団も増加させ得る。たとえば、ＣＤ１９のみを標的とするＣＡＲ療法に応答しない可能性がある患者は、ＣＤ２２を標的とするＣＡＲ療法に応答し得、ＣＤ２２のみを標的とするＣＡＲ療法に応答しない可能性がある患者は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ療法に応答し得る。更に、本発明の切断可能なＣＡＲに関して、それぞれが単独のＣＡＲを有する２つのベクターを使用したＴ細胞の共形質導入は、ＣＡＲの両方を発現する細胞の割合がほんの僅かで、相当数が一方又は他方のＣＡＲのみを発現するＴ細胞を提供する；本発明の切断可能なＣＡＲコンストラクトを用いる利点は、コンストラクトを首尾よく組込む各Ｔ細胞における各ＣＡＲの発現が等しく又は実質的に等しくなり得ることである。更に、ＣＤ１９とＣＤ２２の両方を標的とすることにより、本発明の切断可能及び切断不可能なＣＡＲコンストラクトは、好都合なことに、単一の抗原のみを標的とする治療と比較して相乗的な応答を提供し、がん細胞上でＣＤ１９及びＣＤ２２の一方又は両方の不均一な発現を伴う患者により広く積極的な治療も提供し得る。
【０１２４】
従って、特定の理論又はメカニズムには縛られないが、２つの抗原、例、ＣＤ２２及びＣＤ１９に対する抗原特異的応答を誘発することにより、本発明のＣＡＲコンストラクトは以下：ＣＤ２２発現がん細胞標的化及び破壊、ＣＤ１９発現がん細胞の標的化及び破壊、がん細胞の減少又は排除、腫瘍部位（複数可）への免疫細胞の浸潤の促進、及び抗がん応答の亢進／延長のいずれか１以上を提供すると考えられる。
【０１２５】
本発明の範囲には、本明細書に記載された本発明のＣＡＲコンストラクトの機能的部分が含まれる。ＣＡＲに言及する際に用いられる場合、用語「機能的部分」は、部分又はフラグメントが、それが部分であるＣＡＲコンストラクト（親のＣＡＲコンストラクト）の生物学的活性を保持する、本発明のＣＡＲコンストラクトの任意の部分又はフラグメントを指す。機能的部分は、例えば、親のＣＡＲコンストラクトと類似する程度、同じ程度、又はより高い程度に、標的細胞を認識する能力、又は疾患を検出、治療若しくは予防する能力、を保持するＣＡＲコンストラクトの部分を包含する。親のＣＡＲコンストラクトに関して、機能的部分は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％以上を含み得る。
【０１２６】
機能的部分は、部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端、又はその両方の末端に、更なるアミノ酸を含み得、その更なるアミノ酸は親のＣＡＲコンストラクトのアミノ酸配列には見られない。望ましくは、更なるアミノ酸は、機能的部分の生物学的機能、例、標的細胞を認識し、がんを検出し、がんを治療又は予防する等、と干渉しない。より望ましくは、更なるアミノ酸は、親のＣＡＲコンストラクトの生物学的活性と比較して、その生物学的活性を増強する。
【０１２７】
本発明の範囲には、本明細書に記載された本発明のＣＡＲコンストラクトの機能的変異体が含まれる。本明細書中で用いられる場合、用語「機能的変異体」は、機能的変異体が、それが変異体であるＣＡＲの生物学的活性を保持する、親のＣＡＲコンストラクトと実質的又は有意な配列同一性若しくは類似性を有する、ＣＡＲコンストラクト、ポリペプチド、又はタンパク質を指す。機能的変異体は、例えば、親のＣＡＲコンストラクトと類似する程度、同じ程度、又はより高い程度に標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されたＣＡＲコンストラクト（親のＣＡＲコンストラクト）の変異体を包含する。親のＣＡＲコンストラクトに関して、機能的変異体は、例えば、親ＣＡＲコンストラクトに対し、アミノ酸配列で、少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上であり得る。
【０１２８】
機能的変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的なアミノ酸置換を有する、親のＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。代替的に又は追加的に、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的なアミノ酸置換を有する、親のＣＡＲコンストラクトのアミノ酸配列を含み得る。この場合においては、非保存的なアミノ酸置換が、機能的変異体の生物学的活性と干渉しないか、又はそれを阻害しないことが好ましい。非保存的なアミノ酸置換は、該機能的変異体の生物学的活性が、親のＣＡＲコンストラクトと比べて増大するよう、機能的変異体の生物学的活性を増強し得る。
【０１２９】
本発明のＣＡＲコンストラクトのアミノ酸置換は、好ましくは保存的なアミノ酸置換である。保存的なアミノ酸置換は、当該技術分野において公知であり、特定の物理的及び／又は化学的性質を有する１つのアミノ酸が、同じ又は類似の化学的又は物理的性質を有する別のアミノ酸と交換されるアミノ酸置換が挙げられる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負電荷の極性アミノ酸を別の酸性／負電荷の極性アミノ酸（例、Ａｓｐ又はＧｌｕ）に置換、非極性側鎖を有するアミノ酸を別の非極性側鎖を有するアミノ酸（例、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ等）に置換、塩基性／正電荷の極性アミノ酸を別の塩基性／正電荷の極性アミノ酸（例、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ等）に置換、極性側鎖を有する電荷を持たないアミノ酸を別の極性側鎖を有する電荷を持たないアミノ酸（例、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ等）に置換、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸を別のベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ及びＶａｌ）に置換、芳香族側鎖を有するアミノ酸を別の芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）に置換等であり得る。
【０１３０】
ＣＡＲコンストラクトは、他の構成要素、例、他のアミノ酸が、機能的変異体の生物学的活性を実質的に変更しないように、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列又は配列から実質的になり得る。
【０１３１】
本発明の実施形態のＣＡＲコンストラクト（機能的部分及び機能的変異体を含む）は任意の長さであり得、即ち、ＣＡＲコンストラクト（又はそれらの機能的部分若しくは機能的変異体）が、例、抗原に特異的に結合する能力、哺乳動物において疾患細胞を検出する能力、又は哺乳動物において疾患を治療若しくは予防する能力等、それらの生物学的活性を保持するという条件で、任意の数のアミノ酸を含み得る。例えば、ＣＡＲは、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００以上のアミノ酸長等の、約５０〜約５０００アミノ酸長であり得る。
【０１３２】
本発明の実施形態のＣＡＲコンストラクト（本発明の機能的部分及び機能的変異体を含む）は、１以上の天然に生じるアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は当該技術分野において公知であり、例えばアミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノ−ｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−及びトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン  β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リジン、６−ヒドロキシリジン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、並びにα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが挙げられる。
【０１３３】
本発明の実施形態のＣＡＲコンストラクト（機能的部分及び機能的変異体を含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、環化（例えばジスルフィド架橋を介した）、又は酸付加塩へ変換及び／又は必要に応じて二量体化若しくは多量体化、又はコンジュゲート化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）され得る。
【０１３４】
本発明の実施形態のＣＡＲコンストラクト（機能的部分及び機能的変異体を含む）は、当該技術分野で公知の方法によって得られ得る。ＣＡＲコンストラクトは、デノボ合成を含む、ポリペプチド又はタンパク質の任意の好適な作製方法により作製され得る。また、ＣＡＲコンストラクトは、標準的な組換え法を用い、本明細書に記載の核酸を用いて、組換えで作製され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第４版）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照。更に、本発明のＣＡＲコンストラクトの幾つかの部分（その機能的部分及び機能的変異体を含む）は、植物、細菌、昆虫、哺乳動物、（例、ラット、ヒト等）等のソースから単離及び／又は精製され得る。単離及び精製の方法は、当該技術分野において周知である。代替的には、本明細書に記載のＣＡＲコンストラクト（その機能的部分及び機能的変異体を含む）は、Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及びＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の企業によって商業的に合成され得る。これに関して、本発明のＣＡＲコンストラクトは、合成のものであり得、組換えのものであり得、単離され得、及び／又は精製され得る。
【０１３５】
本発明の別の実施形態は、（ａ）２以上の切断可能なドメイン；（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、及び第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第一のＣＡＲ；並びに（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、第二の膜貫通ドメイン、及び第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第二のＣＡＲ；を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、第一及び第二のＣＡＲが、２以上の切断可能なドメインを介して連結される、コンストラクトを提供する。一実施形態においては、２以上の切断可能なドメインは、直接隣接しているか、又は少なくとも２つの切断可能なドメインの間に少なくとも１つのリンカーを有する。一実施形態においては、ちょうど２つの切断可能なドメインが存在する。
【０１３６】
本発明の別の実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトの作製方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、及び第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第一のＣＡＲ；並びに（ｂ）第二の抗原結合ドメイン、第二の膜貫通ドメイン、及び第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む第二のＣＡＲの間に２以上の切断可能なドメインを設計し、第一及び第二のＣＡＲが該２以上の切断可能なドメインを介して連結されること；そして第一のＣＡＲ、２以上の切断可能なドメイン、及び第二のＣＡＲを、Ｎ末端からＣ末端までに含む配列を、プラスミドにクローニングすることを含む、方法を提供する。一実施形態においては、２以上の切断可能なドメインは、直接隣接しているか、又は少なくとも２つの切断可能なドメインの間に少なくとも１つのリンカーを有する。一実施形態においては、ちょうど２つの切断可能なドメインが存在する。
【０１３７】
本発明の一実施形態によって、本明細書に記載されたＣＡＲコンストラクト（それらの機能的部分及び機能的変異体を含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が更に提供される。本発明の核酸は、本明細書に記載されたリーダー配列、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、リンカー及び／又は細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１３８】
一実施形態においては、核酸は、本明細書に記載の任意のＣＡＲコンストラクトをコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の一実施形態においては、核酸は、配列番号５３（抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２  Ｖ１  ＣＡＲ）、配列番号５４（抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２  Ｖ５  ＣＡＲ）、配列番号５５（抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２  Ｖ６  ＣＡＲ）、配列番号５６（抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２  Ｖ７  ＣＡＲ）、配列番号５７（抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２  Ｖ８  ＣＡＲ）、配列番号７１（ＴａｎＣＡＲ２）、配列番号７２（ＴａｎＣＡＲ３）、配列番号７３（ＴａｎＣＡＲ４）、配列番号７４（ＬｏｏｐＣＡＲ１）、配列番号７５（ＬｏｏｐＣＡＲ２）、配列番号７６（ＬｏｏｐＣＡＲ３）、配列番号７７（ＬｏｏｐＣＡＲ４）、又は配列番号７８（ＬｏｏｐＣＡＲ５）のヌクレオチド配列を含むか、それから成るか、又はそれから実質的に成り得る。
【０１３９】
本明細書中で用いられる場合、「核酸」としては「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」が挙げられ、一般的にＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味し、一本鎖又は二本鎖であり得、合成され又は天然のソースから取得され（例、単離及び／又は精製され）得、天然、非天然又は改変ヌクレオチドを含有し得、並びに天然の結合、非天然の結合又は未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間で見出されるホスホジエステルの代わりに、例えば、ホスホロアミダイト結合若しくはホスホロチオエート結合等の改変されたヌクレオチド間結合を含有し得る。幾つかの実施形態においては、核酸は挿入、欠失、逆位及び／又は置換を何ら含まない。しかしながら、本明細書において検討されるように、幾つかの例においては、核酸が１以上の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含むことが好適であり得る。幾つかの実施形態においては、核酸は、ＣＡＲコンストラクトの機能に影響を与えず、宿主細胞による核酸の発現に際して翻訳される場合もあり、されない場合もある更なるアミノ酸配列をコードし得る。
【０１４０】
本発明の一実施形態の核酸は、組換え体であり得る。本明細書中で用いられる場合、用語「組換え体」は、（ｉ）生細胞内で複製され得る核酸分子に、天然又は合成の核酸セグメントを生細胞外で連結することによって構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されるものの複製によって生じる分子、を指す。本明細書の目的のためには、複製はインビトロ複製又はインビボ複製であり得る。
【０１４１】
組換え核酸は、天然で生じない配列を有するか、又は組換えでなければ２つの配列が分離したセグメントの、人工的な組合せによって作製される配列を有するものであり得る。この人工的な組合せは、化学的な合成によってか、又はより一般的には、例、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ（上記）に記載されたもの等の遺伝子工学技術による、核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、頻繁に達成される。核酸は、当技術分野で公知の手順を用いて、化学合成及び／又は酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ（上記）を参照。例えば、核酸は、天然で生じるヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増加するよう、若しくはハイブリダイゼーション時に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された様々な修飾ヌクレオチド（例、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて化学的に合成され得る。核酸を生成するために用いられ得る修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、５−ブロモウラシル（５−ｂｒｏｍｏｕｒａｃｉｌ）、５−クロロウラシル（５−ｃｈｌｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、５−ヨードウラシル（５−ｉｏｄｏｕｒａｃｉｌ）、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、キサンチン（ｘａｎｔｈｉｎｅ）、４−アセチルシトシン（４−ａｃｅｔｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル（５−（ｃａｒｂｏｘｙｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｕｒａｃｉｌ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン（５−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ）、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル（５−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、ジヒドロウラシル（ｄｉｈｙｄｒｏｕｒａｃｉｌ）、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、Ｎ６−イソペンテニルアデニン（Ｎ６−ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、１−メチルグアニン（１−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、１−メチルイノシン（１−ｍｅｔｈｙｌｉｎｏｓｉｎｅ）、２，２−ジメチルグアニン（２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、２−メチルアデニン（２−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、２−メチルグアニン（２−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、３−メチルシトシン（３−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、Ｎ６−置換アデニン（Ｎ６−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ａｄｅｎｉｎｅ）、７−メチルグアニン（７−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、５−メチルアミノメチルウラシル（５−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル（５−ｍｅｔｈｏｘｙａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ）、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル（５’−ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、５−メトキシウラシル（５−ｍｅｔｈ���ｘｙｕｒａｃｉｌ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン（２−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ−Ｎ６−ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｅ）、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）（ｕｒａｃｉｌ−５−ｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｖ））、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン（２−ｔｈｉｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−メチル−２−チオウラシル（５−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ）、２−チオウラシル（２−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ）、４−チオウラシル（４−ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ）、５−メチルウラシル（５−ｍｅｔｈｙｌｕｒａｃｉｌ）、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル（ｕｒａｃｉｌ−５−ｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル（３−（３−ａｍｉｎｏ−３−Ｎ−２−ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｕｒａｃｉｌ）及び２，６−ジアミノプリン（２，６−ｄｉａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、１以上の本発明の核酸は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）等の企業から購入され得る。
【０１４２】
核酸は、ＣＡＲコンストラクト又はそれらの機能的部分若しくは機能的変異体のいずれかをコードする、任意の単離又は精製されたヌクレオチド配列を含み得る。代替的に、ヌクレオチド配列は、該配列のいずれかに縮退した（ｉｓ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｔｏ）ヌクレオチド配列、又は縮退配列の組合せを含み得る。
【０１４３】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又はストリンジェントな条件下で本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離又は精製された核酸も提供する。
【０１４４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシーな条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的なハイブリダイゼーションよりも強く検出できる量で、標的配列（本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシーな条件には、ヌクレオチド配列と一致するほんの僅かな小さな領域（例、３〜１０塩基）を偶然有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド又は散在する僅かなミスマッチを含有するに過ぎないポリヌクレオチドを区別する条件が含まれる。かかる相補性の小領域は、１４〜１７塩基又はそれ以上の完全長の相補体よりも容易に融解し、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションによりそれらが容易に区別される。比較的に高ストリンジェンシーな条件には、約５０〜７０℃の温度での、約０．０２〜０．１ＭのＮａＣｌ又はそれと同等なものによって提供される等の、低塩条件及び／又は高温条件が含まれる。かかる高ストリンジェンシーな条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間のミスマッチがあるとしても、ごくわずかしか許容せず、本発明のＣＡＲコンストラクトのいずれかの発現を検出するのに特に適している。ホルムアミド添加量を増加することにより、条件をよりストリンジェントにし得ることは一般的に理解されている。
【０１４５】
本発明は、本明細書に記載された核酸のいずれかに対して、少なくとも約７０％以上、例、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
【０１４６】
一実施形態においては、本発明の核酸は、組換え発現ベクターに組込まれ得る。これに関して、本発明の一実施形態は、本発明の核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のためには、用語「組換え発現ベクター」は、コンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを発現させるために十分な条件下でベクターを細胞と接触させる場合、宿主細胞による、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現を可能にする、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのコンストラクトを意味する。本発明のベクターは全体として天然で生じるものではない。しかしながら、ベクターの部分は天然に生じ得る。本発明の組換え発現ベクターは、一本鎖又は二本鎖であり得、合成され又は天然のソースから部分的に取得され得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有し得る、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むが、これらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然で生じるヌクレオチド間結合、天然で生じないヌクレオチド間結合、又はその両方の型の結合を含み得る。好ましくは、天然で生じないか又は改変された、ヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写又は複製を妨害しない。例示的なベクター骨格は、配列番号５８のレンチ−ベクターの骨格である。
【０１４７】
一実施形態においては、本発明の組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションするために用いられ得る。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルス等の増殖及び増幅（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のため若しくは発現のため、又はその両方のために設計されたものが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｉｎｅ，ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から成る群から選択され得る。バクテリオファージベクター、λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４及びλＮＭ１１４９等も用いられ得る。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）が挙げられる。組換え発現ベクターはウイルスベクター、例、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターであり得る。
【０１４８】
一実施形態においては、本発明の組換え発現ベクターは、例えばＧｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。環状又は線状である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核宿主細胞において機能的である複製システムを含有するように調製され得る。複製システムは、例、ＣｏｌＥ１、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス等に由来し得る。
【０１４９】
組換え発現ベクターは、適宜、ベクターがＤＮＡベースであるか、又はＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞（例、細菌、真菌、植物又は動物）の種類に特異的な、転写の、並びに翻訳の開始及び終止コドン等の、制御配列を含み得る。組換え発現ベクターは、クローニングを促進するために制限酵素認識部位も含み得る。
【０１５０】
組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクションした宿主細胞のセレクションを可能にする１以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子としては、殺生物剤耐性、例、抗生物質、重金属等に対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における相補性等が挙げられる。本発明の発現ベクターにとって好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１５１】
組換え発現ベクターは、ＣＡＲコンストラクト（それらの機能的部分及び機能的変異体を含む）をコードするヌクレオチド配列、又はＣＡＲコンストラクトをコードするヌクレオチド配列に相補的であるか若しくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、ネイティブ又は非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例、強、弱、誘導性、組織特異性及び発生段階特異性は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組合せも当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、又はマウス幹細胞ウイルスの長鎖末端反復配列（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）に見出されるプロモーターであり得る。
【０１５２】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定した発現のためのいずれか、又はその両方のために、設計され得る。また、組換え発現ベクターは構成的発現のため又は誘導性発現のために作製され得る。
【０１５３】
更に、組換え発現ベクターは自殺遺伝子を含むよう作製され得る。本明細書中で用いられる場合、用語「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に、試薬、例、薬剤、に対する感受性を付与し、細胞がその試薬と接触若しくはそれに対して曝露される場合に細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野で公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びニトロレダクターゼが挙げられる。
【０１５４】
本発明の範囲には、本発明のＣＡＲコンストラクト（それらの機能的部分又は変異体のいずれかを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、又は宿主細胞集団のいずれかを含む、コンジュゲート、例、バイオコンジュゲートが含まれる。コンジュゲート及びコンジュゲートを合成する方法は、一般的に、当該技術分野において公知である。
【０１５５】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載された組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を更に提供する。本明細書中で用いられる場合、用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の種の細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例、植物、動物、菌類若しくは藻類であり得、又は原核細胞、例、バクテリア又は原生動物であり得る。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞、即ち生物、例、ヒトから直接単離され得る。宿主細胞は、付着細胞又は懸濁細胞、即ち懸濁液中で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は当該技術分野で公知であり、例えば、ＤＨ５α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のために、宿主細胞は原核細胞、例、ＤＨ５α細胞であり得る。組換えＣＡＲコンストラクトを産生する目的のために、宿主細胞は哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞はヒト細胞であり得る。宿主細胞は任意の細胞種のものであり得、任意の種の組織に由来し得、任意の発生段階であり得るが、宿主細胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。宿主細胞はＴ細胞又はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）であり得る。
【０１５６】
本明細書の目的のために、Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞、例、初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等、又は哺乳動物から得られたＴ細胞等の任意のＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他の組織若しくは体液を含むが、これらに限定されない多数のソースから得られ得る。Ｔ細胞は、濃縮又は精製もされ得る。Ｔ細胞はヒトＴ細胞であり得る。Ｔ細胞はヒトから単離されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞等を含むが、これらに限定されない、任意の種のＴ細胞であり得、任意の発生段階のものであり得る。Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
【０１５７】
本発明の一実施形態によって、本明細書に記載された少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団も提供される。細胞集団は、少なくとも１つの他の細胞、例、組換え発現ベクターのいずれも含まない宿主細胞（例、Ｔ細胞）、又はＴ細胞以外の細胞、例、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加え、記載された組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む、不均一な集団であり得る。代替的に、細胞集団は、集団が組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例、実質的にそれから成る）、実質的に均質な集団であり得る。集団は、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含むように、集団の全ての細胞が、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンである、細胞のクローン集団でもあり得る。本発明の一実施形態においては、細胞集団は、本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【０１５８】
ＣＡＲコンストラクト（それらの機能的部分及び変異体を含む）、核酸、組換え発現ベクター、並びに宿主細胞（それらの集団を含む）（これらの全ては、以後、集合的に「本発明の抗ＣＡＲコンストラクト材料」と称される）は、単離及び／又は精製され得る。本明細書中で用いられる場合、用語「単離された」はその天然環境から取り出されていることを意味する。用語「精製された」又は「単離された」は完全な精製又は単離を必要としない；むしろ相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製された（又は単離された）宿主細胞の調製物は、宿主細胞が、体内におけるその自然な環境での細胞よりも高純度なものである。かかる宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって生成され得る。幾つかの実施形態においては、宿主細胞が、調製物の総細胞含有量の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％に相当するように、宿主細胞の調製物が精製される。例えば、純度は少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％若しくは約８０％超であり得、又は約１００％であり得る。
【０１５９】
本発明のＣＡＲコンストラクト材料は、医薬組成物等の組成物に製剤化され得る。これに関して、本発明の一実施形態は、本明細書に記載された本発明のＣＡＲコンストラクト材料のいずれか及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のＣＡＲコンストラクト材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、１超の本発明のＣＡＲコンストラクト材料、例、ＣＡＲコンストラクト及び核酸、又は２以上の異なるＣＡＲコンストラクトを含み得る。代替的に、医薬組成物は、例、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）等の化学療法剤等の、他の医薬的な活性剤又は薬剤との組合せで、本発明のＣＡＲコンストラクト材料を含み得る。好ましい実施形態においては、医薬組成物は、本発明の宿主細胞又はその集団を含む。
【０１６０】
医薬組成物に関して、医薬的に許容される担体は従来から使用されるもののいずれかであり得、溶解性及び活性剤（複数可）との反応性の欠如等の化学物理的考察、並びに投与の経路によってのみ制限される。本明細書に記載された医薬的に許容される担体、例えば、ビヒクル、補助剤、賦形剤及び希釈剤は、当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。医薬的に許容される担体は、使用の条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【０１６１】
担体の選択は、特定の本発明のＣＡＲコンストラクト材料によって、及び本発明のＣＡＲコンストラクト材料を投与するために用いられる特定の方法によって、ある程度決定される。従って、本発明の医薬組成物の種々の好適な製剤がある。投与可能な（例、非経口投与可能な）組成物を調製するための方法は、当業者に公知であるか、又は明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ；２２版（２０１２）により詳細に記載されている。
【０１６２】
本発明のＣＡＲコンストラクト材料は、任意の好適な様式で投与され得る。好ましくは、本発明のＣＡＲコンストラクト材料は、注射（例、皮下、静脈内、腫瘍内、動脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、又は髄腔内）によって投与される。好ましくは、本発明のＣＡＲコンストラクト物材料は静脈内投与される。注射用の本発明のＣＡＲコンストラクト材料について好適な医薬的に許容される担体は、例えば、通常の生理食塩水（水中約０．９０％  ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水１リットル当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ  Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％のデキストロース、又は乳酸リンゲル液等の任意の等張性の担体が挙げられ得る。一実施形態においては、医薬的に許容される担体には、ヒト血清アルブミンが補充される。
【０１６３】
「有効量」又は「治療有効量」は、個体におけるがんを予防又は治療するために十分な用量を指す。治療又は予防用途に有効である量は、例えば、治療されている疾患又は病気の段階及び重篤度、患者の年齢、体重及び一般的健康状態、並びに処方医師の判断に左右される。用量のサイズは、選択された活性、投与方法、投与のタイミング及び頻度、特定の活性の投与に伴い得る有害な任意の副作用の存在、性質及び程度、並びに所望の生理学的効果によっても決定される。様々な疾患又は障害に、投与の各々のラウンド又は様々なラウンドにおいて、複数回の投与を含む延長した治療が、恐らく本発明のＣＡＲコンストラクト材料を用いて必要となる場合があることが、当業者によって理解される。発明を限定することは意図しないが、例として、本発明のＣＡＲコンストラクト材料が宿主細胞である場合、宿主細胞の例示的な用量は、最低１００万細胞（１ｘ１０６細胞／用量）であり得る。
【０１６４】
本発明の目的のために、投与される本発明のＣＡＲコンストラクト材料の量又は用量は、合理的な時間枠に亘り、対象又は動物における治療的又は予防的応答をもたらすために十分であるべきである。例えば、本発明のＣＡＲコンストラクト材料の用量は、抗原に結合するか、又は投与時から、約２時間以上、例、約１２〜約２４時間以上の期間で、がんを検出、治療若しくは予防するために十分であるべきである。特定の実施形態においては、期間は更に長くなる場合がある。用量は、特定の本発明のＣＡＲコンストラクト材料の効能及び動物（例、ヒト）の状態、並びに治療される動物（例、ヒト）の体重によって決定される。
【０１６５】
本発明の目的のために、例えば、Ｔ細胞の種々の用量がそれぞれ与えられる１組の哺乳動物間で、哺乳動物にかかるＴ細胞のある特定の用量が投与される際に、本発明のＣＡＲコンストラクトの、切り離されたＣＡＲを発現するＴ細胞により標的細胞が溶解され及び／又はＩＦＮ−γが分泌される程度を比較することを含むアッセイが、哺乳動物に投与する開始用量を決定するために用いられ得る。特定の用量の投与の際に標的細胞が溶解され及び／又はＩＦＮ−γが分泌される程度は、当該技術分野において公知の方法によってアッセイされ得る。
【０１６６】
本発明のＣＡＲコンストラクト材料が、１以上の更なる治療剤と共に投与される場合、１以上の更なる治療剤が哺乳動物に共投与され得る。「共投与」は、本発明のＣＡＲコンストラクト材料が１以上の更なる治療剤の効果を増強し得るように、又はその逆であるように、十分に近い時間で、１以上の更なる治療剤と本発明のＣＡＲコンストラクト材料とを投与すること意味する。これに関して、本発明のＣＡＲコンストラクト材料が最初に投与され得、１以上の更なる治療剤が二番目に投与され得るか、又はその逆である。代替的に、本発明のＣＡＲコンストラクト材料と１以上の更なる治療剤とが、共投与され得る。ＣＡＲコンストラクト材料と共に共投与され得る例示的な治療剤は、ＩＬ−２である。ＩＬ−２は本発明のＣＡＲコンストラクト材料の治療効果を増強すると考えられる。
【０１６７】
本発明のＣＡＲコンストラクト材料は、哺乳動物における疾患を治療又は予防する方法において用いられ得ることが企図される。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、本発明のＣＡＲコンストラクトは、細胞によって発現された場合、切り離されたＣＡＲが、抗原、例、ＣＤ１９及びＣＤ２２の一方又は両方を発現している細胞に対する免疫応答を媒介できるように、生物学的活性（例、抗原（例、ＣＤ１９及びＣＤ２２の一方又は両方）を認識するＣＡＲを切り離す／切断する能力）を有する。これに関して、本発明の一実施形態は、哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法であって、哺乳動物におけるがんを治療又は予防するために有効な量で、本発明のＣＡＲコンストラクト、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、及び／又は医薬組成物のいずれかを哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。
【０１６８】
本発明の一実施形態は、本発明のＣＡＲコンストラクト材料を投与することに先立って、哺乳動物においてリンパ枯渇させることを更に含む。リンパ枯渇の例としては、非骨髄抑制性リンパ枯渇化学療法、骨髄抑制性リンパ枯渇化学療法、全身放射線照射等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
本発明の方法の目的のために、宿主細胞又は細胞集団が投与され、該細胞は、哺乳動物に対して同種異系又は自己である細胞であり得る。好ましくは、該細胞は哺乳動物に対して自己である。
【０１７０】
本明細書で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書中で用いられる場合、用語「哺乳動物」は、マウス及びハムスター等のネズミ目の哺乳動物、並びにウサギ等のウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物はネコ科動物（ネコ）及びイヌ科動物（イヌ）を含むネコ目由来であり得る。哺乳動物はウシ亜科動物（ウシ）及びイノシシ科動物（ブタ）を含むウシ目、又はウマ科動物（ウマ）を含むウマ目由来であり得る。哺乳動物は霊長目、セボイド目若しくはシモイド目（サル）又は類人目（ヒト及び類人猿）であり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１７１】
本発明の治療方法に関して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん（例、膀胱がん）、骨のがん、脳のがん（例、髄芽細胞種）、乳がん、肛門、肛門管又は肛門直腸のがん、目のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、首、胆嚢又は胸膜のがん、鼻、鼻腔又は中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、胃腸カルチノイド腫瘍、頭部及び頸部のがん（例、頭部と頸部の扁平上皮がん）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん（例、非小細胞性肺がん）、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、慢性Ｂリンパ球性白血病、Ｂ前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、小児Ｂ前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病（ＢＣＰ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及びバーキットリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、大網及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、及び子宮がんのいずれかを含む、任意のがんであり得る。好ましくは、がんは血液悪性腫瘍（例、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、慢性Ｂリンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）（「急性リンパ芽球性白血病」とも称される）、Ｂ−ＡＬＬ、ＢＣＰ−ＡＬＬ、Ｂ細胞リンパ腫、及びバーキットリンパ腫を含むがこれらに限定されない白血病又はリンパ腫）である。好ましくは、がんはＣＤ２２及びＣＤ１９の一方又は両方の発現が特徴的であり、より好ましくはＣＤ１９及びＣＤ２２の一方又は両方の発現が特徴的な血液悪性腫瘍である。
【０１７２】
本明細書中で用いられる場合、用語「治療」及び「予防」、並びにそれに由来する語は、必ずしも１００％又は完全な治療若しくは予防を意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、治療又は予防の様々な程度がある。これに関して、本発明の方法は、哺乳動物における、任意の量の任意のレベルのがんの治療又は予防を提供し得る。更には、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防される、疾患、例、がんの１以上の状態又は症状の治療又は予防を含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患、又はその症状若しくは状態の発症を遅延させることを包含し得る。
【０１７３】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物におけるがんの治療又は予防のための、本発明のＣＡＲコンストラクト、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物の使用を提供する。
【０１７４】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって：（ａ）哺乳動物に由来する１以上の細胞を含むサンプルと、本発明のＣＡＲコンストラクト、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、又は医薬組成物とを接触させ、それにより複合体を形成すること、（ｂ）該複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す、複合体を検出すること、を含む方法を提供する。
【０１７５】
サンプルは、任意の好適な方法、例、生検又は剖検によって取得され得る。生検は、個体から組織及び／又は細胞を取り出すことである。かかる取り出しは、取り出された組織及び／又は細胞に対して実験を行うために、個体から組織及び／又は細胞を回収することであり得る。この実験は、個体が特定の状態又は疾患状態を有するか、及び／又はそれらを患っているかどうかを決定するための実験を含み得る。状態又は疾患は、例、がんであり得る。
【０１７６】
哺乳動物におけるがんの存在を検出する本発明の方法の一実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含むサンプルは、全細胞、その溶解物、又は全細胞の溶解物の画分、例、核若しくは細胞質の画分、全タンパク質の画分、又は核酸の画分を含むサンプルであり得る。サンプルが全細胞を含む場合、該細胞は、哺乳動物の任意の細胞、例、血液細胞又は内皮細胞を含む、任意の器官又は組織の細胞であり得る。
【０１７７】
本発明の検出方法の目的のためには、接触は、哺乳動物に関して、インビトロ又はインビボで行われ得る。好ましくは、接触はインビトロである。
【０１７８】
また、複合体の検出は、当該技術分野において公知である任意の数の方法によって行われ得る。例えば、本明細書に記載された本発明のＣＡＲコンストラクト、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、又は細胞集団は、例えば、放射性同位元素、蛍光色素分子（例、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例、アルカリフォスファターゼ、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ）及び元素粒子（例、金粒子）等の検出可能な標識を用いて標識され得る。
【０１７９】
標的細胞を認識する能力について、及び抗原特異性について、ＣＡＲを試験する方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：５０７−５１３（１９９９）は、サイトカイン（例、インターフェロン−γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−α）又はインターロイキン２（ＩＬ−２））の放出を測定する方法を教示している。更に、ＣＡＲの機能は、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７４：４４１５−４４２３（２００５）に記載されている通り、細胞の細胞傷害性を測定することによって評価され得る。
【０１８０】
以下に、本発明の特定の態様を挙げる。
【０１８１】
１．（ａ）切断可能なドメイン；
（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、
第一の膜貫通ドメイン、及び
第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第一のＣＡＲ；並びに
（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、
第二の膜貫通ドメイン、及び
第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第二のＣＡＲ；
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、
第一及び第二のＣＡＲが、切断可能なドメインを介して連結され、
第一の抗原結合ドメインが、ｍ９７１抗体の抗原結合ドメインを含み、
第一のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第一の抗原結合ドメインはＣＤ２２に対する抗原特異性を有する、コンストラクト。
【０１８２】
２．切断可能なドメインを切断することにより、ＣＡＲコンストラクトから第一及び第二のＣＡＲが切り離される、態様１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１８３】
３．第一の抗原結合ドメインが、配列番号３〜９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１〜１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、態様１又は２に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１８４】
４．第一の抗原結合ドメインが配列番号３〜９及び１１〜１７のアミノ酸配列を含む、態様１〜３のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１８５】
５．第二のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第二の抗原結合ドメインがＣＤ１９に対する抗原特異性を有する、態様１〜４のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１８６】
６．第二の抗原結合ドメインがＦＭＣ６３抗体の抗原結合ドメインを含む、態様１〜５のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１８７】
７．第二の抗原結合ドメインが、配列番号３１〜３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３〜２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、態様１〜６のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１８８】
８．第二の抗原結合ドメインが配列番号２３〜２９及び３１〜３７のアミノ酸配列を含む、態様１〜７のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１８９】
９．（ａ）切断可能なドメイン；
（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、
第一の膜貫通ドメイン、及び
第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第一のＣＡＲ；並びに
（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、
第二の膜貫通ドメイン、及び
第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第二のＣＡＲ；
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、
第一及び第二のＣＡＲが、切断可能なドメインを介して連結され、
第一の抗原結合ドメインが、ＦＭＣ６３抗体の抗原結合ドメインを含み、
第一のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第一の抗原結合ドメインはＣＤ１９に対する抗原特異性を有する、コンストラクト。
【０１９０】
１０．切断可能なドメインを切断することにより、ＣＡＲコンストラクトから第一及び第二のＣＡＲが切り離される、態様９に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１９１】
１１．第一の抗原結合ドメインが、配列番号３１〜３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２３〜２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、態様９又は１０に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１９２】
１２．第一の抗原結合ドメインが配列番号２３〜２９及び３１〜３７のアミノ酸配列を含む、態様９〜１１のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１９３】
１３．第二のＣＡＲがコンストラクトから切断される場合、第二の抗原結合ドメインがＣＤ２２に対する抗原特異性を有する、態様９〜１２のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１９４】
１４．第一又は第二の膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ８ヒンジドメインを含む、態様１〜１３のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１９５】
１５．ＣＤ８膜貫通ドメインが配列番号１９のアミノ酸配列を含み、ＣＤ８ヒンジドメインが配列番号１８のアミノ酸配列を含む、態様１４に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１９６】
１６．第一又は第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列を含む、態様１〜１５のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１９７】
１７．４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、態様１６に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１９８】
１８．第一又は第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ζ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列を含む、態様１〜１７のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０１９９】
１９．ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達配列が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、態様１８に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０２００】
２０．切断可能なドメインが２Ａ又はフューリンである、態様１〜１９のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０２０１】
２１．ＣＡＲコンストラクトが、それぞれ第一及び第二のＣＡＲである、ちょうど２つのＣＡＲを含む、態様１〜２０のいずれか１に記載のＣＡＲコンストラクト。
【０２０２】
２２．配列番号４８、４９、５０、５１、又は５２のアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクト。
【０２０３】
２３．配列番号６３〜７０のいずれか１と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性（例、１００％）を有するアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクト。
【０２０４】
２４．（ａ）２以上の切断可能なドメイン；
（ｂ）第一の抗原結合ドメイン、
第一の膜貫通ドメイン、及び
第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第一のＣＡＲ；並びに
（ｃ）第二の抗原結合ドメイン、
第二の膜貫通ドメイン、及び
第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第二のＣＡＲ；
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトであって、
第一及び第二のＣＡＲが、２以上の切断可能なドメインを介して連結される、コンストラクト。
【０２０５】
２５．２以上の切断可能なドメインが、直接隣接するか、少なくとも２つの切断可能なドメインの間に少なくとも１つのリンカーを有する、態様２４のＣＡＲコンストラクト。
【０２０６】
２６．ちょうど２つの切断可能なドメインが存在する、態様２５又は２４のＣＡＲコンストラクト。
【０２０７】
２７．態様１〜２６のいずれか１のＣＡＲアミノ酸コンストラクトをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【０２０８】
２８．配列番号５３〜５７又は７１〜７８のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、態様２７に記載の核酸。
【０２０９】
２９．態様２７又は２８の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【０２１０】
３０．態様２９の組換え発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【０２１１】
３１．少なくとも１の、態様３０の宿主細胞を含む、細胞集団。
【０２１２】
３２．態様１〜２６のいずれか１のＣＡＲコンストラクト、態様２７若しくは２８の核酸、態様２９の組換え発現ベクター、態様３０の宿主細胞、又は態様３１の細胞集団と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【０２１３】
３３．哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって：
（ａ）  哺乳動物由来の１以上の細胞を含むサンプルと、態様１〜２６のいずれか１のＣＡＲコンストラクト、態様２７若しくは２８の核酸、態様２９の組換え発現ベクター、態様３０の宿主細胞、態様３１の細胞集団、又は態様３２の医薬組成物とを接触させ、それにより複合体を形成させること、及び
（ｂ）  該複合体の検出が、哺乳動物におけるがんの存在の指標である、複合体を検出すること
を含む、方法。
【０２１４】
３４．哺乳動物における、がんの治療又は予防において用いるための、態様１〜２６のいずれか１のＣＡＲコンストラクト、態様２７若しくは２８の核酸、態様２９の組換え発現ベクター、態様３０の宿主細胞、態様３１の細胞集団、又は態様３２の医薬組成物。
【０２１５】
３５．前記がんが、血液悪性腫瘍である、態様３４の使用のための、ＣＡＲコンストラクト。
【０２１６】
３６．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）アミノ酸コンストラクトの作製方法であって、
（ａ）第一の抗原結合ドメイン、
第一の膜貫通ドメイン、及び
第一の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第一のＣＡＲ；並びに
（ｂ）第二の抗原結合ドメイン、
第二の膜貫通ドメイン、及び
第二の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン
を含む第二のＣＡＲ
の間に２以上の切断可能なドメインを設計し、第一及び第二のＣＡＲが該２以上の切断可能なドメインを介して連結されること；そして
第一のＣＡＲ、２以上の切断可能なドメイン、及び第二のＣＡＲを、Ｎ末端からＣ末端までに含む配列を、プラスミドにクローニングすること
を含む、方法。
【０２１７】
３７．２以上の切断可能なドメインが、直接隣接するか、又は少なくとも２つの切断可能なドメイン間に少なくとも１のリンカーを有する、態様３６の方法。
【０２１８】
３８．ちょうど２つの切断可能なドメインが存在する、態様３６又は３７の方法。
【０２１９】
以下の実施例は本発明を更に説明するが、決してその範囲を限定すると解釈すべきではない。
【０２２０】
実施例１
本実施例は、本発明の実施形態による、ＣＡＲコンストラクト、ＣＡＲコンストラクトをコードするレンチウイルスベクター、及びＣＡＲ発現Ｔ細胞の生成、並びに比較のための他のＣＡＲの生成を実例で示す。
【０２２１】
ＣＡＲコンストラクトを、ＧＥＮＥＷＩＺ（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）によって合成し、次いでレンチウイルスプラスミド骨格に、ＮｈＥ１とＨｉｎｃＩＩ部位の間にサブクローニングした。
【０２２２】
ＣＡＲコンストラクトをコードするレンチウイルスベクターは、２９３Ｔ細胞株の一過性トランスフェクションにより産生した。簡単に言うと、２９３Ｔ細胞をポリ−Ｄリジンでコーティングした１５ｃｍプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に播種した。翌日、リポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｌｒｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、２９３Ｔ細胞を、パッケージング及びエンベロープベクター（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＭＤ−２Ｇ、及びｐＲＳＶ−Ｒｅｖ）と共にＣＡＲコンストラクトをコードするプラスミドでトランスフェクションした。レンチウイルス上清を、トランスフェクションの４８〜７２時間後に回収し、細胞残渣を除去するために３０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、次いで−８０℃で保存した。正常なドナーからのヒトＰＢＭＣを、４０ＩＵ／ｍＬの組換えＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２；Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地中の１：１の比のＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２４時間活性化した。活性化Ｔ細胞を、レンチウイルス上清３ｍＬと１０μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む新鮮なＡＩＭ−Ｖ培地１ｍＬあたり２００万細胞で再懸濁し、６ウェルプレートで培養した。プレートを、３２℃で２時間、１０００×ｇで遠心分離し、次いで、３７℃で一晩インキュベーションした。翌日、２回目の形質導入を行った。３日目に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、細胞を、１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を含有するＡＩＭ−Ｖ中に３００，０００細胞／ｍＬで培養し、８日目又は９日目の回収まで、新鮮なＩＬ２含有培地を２〜３日ごとに添加した。
【０２２３】
単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲ、及び二重特異性ＬｏｏｐＣＡＲ６用のベクターは、２９３Ｔレンチパッケージング細胞株の一過性トランスフェクションにより作製した。
【０２２４】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲの配列は以下：
【０２２５】
【化１４】
2020519298.tif 000053
【０２２６】
である。
【０２２７】
抗ＣＤ２２  ＣＡＲの配列は以下：
【０２２８】
【化１５】
2020519298.tif 000054
である。
【０２２９】
ＬｏｏｐＣＡＲ６は、国際特許公開第ＷＯ２０１６／１４９５７８号に記載されており、以下の配列：
【０２３０】
【化１６】
2020519298.tif 000055
【０２３１】
を有する。
【０２３２】
実施例２
本実施例は、他のＣＡＲと比較した、本発明の実施形態による、ＣＡＲコンストラクトから切断されたＣＡＲのヒトＴ細胞上の表面発現を実例で示す。
【０２３３】
Ｖ１形質導入Ｔ細胞上の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの表面発現は約１５％であり、一方、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲのみをコードするベクターからの抗ＣＤ１９  ＣＡＲの発現は６１％であり、単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲのみをコードするベクターからの抗ＣＤ２２  ＣＡＲの発現は５６％である（図２Ａ〜２Ｃ）。
【０２３４】
健康なドナー由来のヒトＰＢＭＣを、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズで２４時間活性化した。活性化したＴ細胞は、次いで、ベクターで個別に形質導入したか、又は単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲベクターと単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲベクターの両方を一緒に共形質導入した。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの表面発現を８日目に解析した。共形質導入したＴ細胞は、二重特異性ＬｏｏｐＣＡＲ６と比較して、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２の両方のＣＡＲの発現がはるかに低かった。共形質導入したＴ細胞上の抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの発現は、等しいモル比ではない。対照的に、ＬｏｏｐＣＡＲ６は、対角プロットとして表示される抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの発現においてほぼ１：１の比を示した。図３を参照。
【０２３５】
二重特異性ＬｏｏｐＣＡＲ６並びにＶ１及びＶ５  ＣＡＲ用のベクターは、２９３Ｔレンチパッケージング細胞株の一過性トランスフェクションにより産生した。健康なドナー由来のヒトＰＢＭＣを、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズで２４時間活性化した。次いで、活性化したＴ細胞をベクターで形質導入した。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの表面発現を、フローサイトメトリーを用いて７日目に解析した。Ｖ５  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞は、ＣＡＲの切断により提供される分離された抗ＣＤ１９  ＣＡＲ及び分離された抗ＣＤ２２  ＣＡＲ両方の細胞表面発現が、Ｖ１  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞よりも高い（図４）。
【０２３６】
実施例３
本実施例は、他のＣＡＲと比較した、本発明の実施形態による、ＣＡＲコンストラクトのサイトカイン産生ベースのインビトロ活性を実例で示す。
【０２３７】
ＣＡＲで形質導入したＴ細胞（１Ｅ５）を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、次いで、３７℃インキュベーター内の９６ウェルプレート中の２００ｍｌのＲＰＭＩ培地中の同数の標的細胞と１５〜２０時間共インキュベーションした。標的細胞は、ＣＤ１９若しくはＣＤ２２、又はＣＤ１９とＣＤ２２の両方を発現するＫ５６２であった。Ｋ５６２細胞はネガティブコントロールとして機能した。培養上清中のＩＬ２及びＩＦＮγのサイトカインレベルをＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）で測定した。すべての試験をトリプリケートで設定した。Ｖ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ２２発現標的細胞と共培養した場合はＩＬ２とＩＦＮｇを大量に産生したが、ＣＤ１９発現標的細胞と共培養した場合は低レベルのＩＬ２とＩＦＮｇしか産生しなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。
【０２３８】
標的抗原を発現するために、ＣＭＬ細胞株Ｋ５６２を人為的にＣＤ１９若しくはＣＤ２２又はその両方で形質導入した。Ｋ５６２細胞はネガティブコントロールとして機能した。１Ｅ５のＣＡＲ  Ｔ細胞を３回洗浄し、次いで３７℃でＲＰＭＩ培地中で１Ｅ５の標的細胞と共インキュベーションした。１４時間後、培養上清を回収し、サイトカインの産生をＥＬＩＳＡキットで測定した。Ｖ５は、二重特異性ＬｏｏｐＣＡＲ６並びに抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２単独ＣＡＲと比較した場合に、Ｋ５６２上に発現した標的抗原と共インキュベーションすると、ＩＬ２及びＩＦＮｇの両方が最高レベルになる。二重特異性ＬｏｏｐＣＡＲ６並びに抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２単独ＣＡＲと比較した場合、Ｖ１は、Ｋ５６２で発現した標的抗原と共インキュベーションするとＩＬ２及びＩＦＮｇの両方を十分に産生する。図６Ａ及び６Ｂを参照。
【０２３９】
Ｂ細胞白血病細胞株ＮＡＬＭ６は、ＣＤ１９及びＣＤ２２の表面抗原の両方を発現する。ＣＤ１９又はＣＤ２２を、これらの標的抗原の発現を排除するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術でノックアウトした。ＮＡＬＭ６細胞はポジティブコントロールとして機能した。１Ｅ５のＣＡＲ  Ｔ細胞を３回洗浄し、次いで、３７℃でＲＰＭＩ培地中で１Ｅ５の標的細胞と共インキュベーションした。１４時間後、培養上清を回収し、サイトカインの産生をＥＬＩＳＡキットで測定した。Ｖ５は、二重特異性ＬｏｏｐＣＡＲ６並びに抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２単独ＣＡＲと比較した場合、ＮＡＬＭ６上に発現したＣＤ１９と共インキュベーションすると、最高レベルのＩＬ２及びＩＦＮｇを共に産生する。Ｖ５は、抗ＣＤ２２単独ＣＡＲと比較した場合、ＮＡＬＭ６上に発現したＣＤ２２と共インキュベーションすると、より少ない量のＩＬ２及びＩＦＮｇを産生する。Ｖ１は、Ｖ５  ＣＡＲと比較した場合、ＮＡＬＭ６上で発現した標的抗原と共インキュベーションすると、少量のＩＬ２及びＩＦＮｇを産生する。Ｖ１は、二重特異性ＬｏｏｐＣＡＲ６並びに抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２単独ＣＡＲに匹敵する量のＩＬ２及びＩＦＮｇを産生する。図７Ａ及び７Ｂを参照。
【０２４０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞をＮＡＬＭ６腫瘍細胞と１８時間共インキュベーションし、培養上清中のＩＬ２産生レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。図８に見られるように、Ｂｉｃｉｓ−Ｖ５及びＢｉｃｉｓ−Ｖ６は相乗効果を有し得る。
【０２４１】
実施例４
本実施例は、他のＣＡＲと比較した、本発明の実施形態によるＣＡＲコンストラクトを用いる、再発白血病モデルの治療を実例で示す。
【０２４２】
生物発光イメージングを用いて、インビボで白血病の進行を追跡した０日目に、５０万のＣＤ１９ＫＯ  ＮＡＬＭ６細胞を同数のＣＤ２２ＫＯ  ＮＡＬＭ６細胞と混合し、ＮＳＧマウスに注射した。３日後、これらのマウスを３００万のＣＡＲ  Ｔ細胞又はモックのＴ細胞で治療した。
【０２４３】
白血病は、Ｖ１  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞の使用により完全に根絶されるようであったが、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ又は単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲのいずれかをコードするベクターで形質導入したＴ細胞の使用ではそうはならなかった（図９）。
【０２４４】
マウスを１４日目に安楽死させた。骨髄（ＢＭ）細胞を、白血病の検出のために抗ＣＤ１９又は抗ＣＤ２２抗体で染色し、抗ＣＤ２２  ＣＡＲ又は抗ＣＤ１９  ＣＡＲの検出のために、それぞれＣＤ２２  Ｆｃ又はＣＤ１９の抗イディオタイプでも染色した。
【０２４５】
Ｖ１  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞で治療したマウスにおいては、検出可能なレベルの白血病はなかったが、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ又は単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲのいずれかをコードするベクターで形質導入したＴ細胞で治療したマウスにおいては、高い腫瘍負荷があった。モックＴ細胞で治療したマウスにおいては高い腫瘍負荷があった。Ｖ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞はＢＭコンパートメントで１４日目まで持続した。
【０２４６】
０日目に、ＮＳＧマウスに混合白血病細胞（０．１Ｅ６のＮＡＬＭ６及び０．１Ｅ６のＮＡＬＭ６−ＣＤ１９−及び０．１Ｅ６のＮＡＬＭ６−ＣＤ２２−）を注射した。３日目に、６Ｅ６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を有する群２（Ｇ２）を除くすべての群で、マウスに３Ｅ６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を投与した。群５（Ｇ５）中のマウスには、ＣＤ１９  ＣＡＲ及びＣＤ２２  ＣＡＲ共形質導入Ｔ細胞を投与した。群６中のマウス（Ｇ６）には、３Ｅ６のＣＤ１９  ＣＡＲ及び３Ｅ６のＣＤ２２  ＣＡＲを共投与した。群９（Ｇ９）中のマウスには、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ＋Ｔ細胞を投与し、ネガティブコントロールとして機能した。生物発光強度は、腫瘍負荷を表す。データは、同じ用量レベルのＣＡＲ  Ｔ細胞（３Ｅ６）では、バイシストロン性−Ｖ１  ＣＡＲが、この再発モデルにおいて白血病を減少させるのに最も強力であり得ることを示唆する（図１０）。
【０２４７】
実施例５
本実施例は、他のＣＡＲと比較した、本発明の実施形態によるＣＡＲコンストラクトを使用したＣＤ１９−及びＣＤ２２−白血病の治療を実例で示す。
【０２４８】
生物発光イメージングを用いて、インビボで白血病の進行を追跡した。０日目に、５０万のＣＤ１９ＫＯ  ＮＡＬＭ６細胞を同数のＣＤ２２ＫＯ  ＮＡＬＭ６細胞と混合し、ＮＳＧマウスに注射した。３日後、これらのマウスを３００万のＣＡＲ  Ｔ細胞で治療した。
【０２４９】
Ｖ１  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞の使用により、白血病のほぼすべてが除去されたが、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ又は単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲのいずれかをコードするベクターで形質導入したＴ細胞の使用ではそうはならなかった。（図１１）。
【０２５０】
ＮＳＧマウスに、０日目に１Ｅ５のＮＡＬＭ６細胞、１Ｅ５のＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ＫＯ細胞、及び１Ｅ５のＣＤ２２ＫＯ白血病細胞を投与し、次いで３日目に３Ｅ６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を投与した。生物発光強度は、腫瘍負荷を表す。画像は、Ｖ１、Ｖ５、Ｖ６、及びＶ７  ＣＡＲがＣＤ１９＋ＣＤ２２＋白血病及びＣＤ１９陰性且つＣＤ２２陰性白血病細胞の両方を減少させるのに有効であるが、抗ＣＤ１９又は抗ＣＤ２２の単独のＣＡＲはそうできなかったことを示す。図１２。
【０２５１】
実施例６
本実施例は、他のＣＡＲと比較した、本発明の実施形態によるＣＡＲコンストラクトによる白血病の治療を実例で示す。
【０２５２】
０日目に、１Ｅ６のＮＡＬＭ６白血病細胞をＮＳＧマウスに投与した。群１及び群２中のマウス（マウスの群については図１３を参照）には、３日目に単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ又は単独の抗ＣＤ２２をコードするベクターで形質導入した１Ｅ６のＴ細胞、そして７日目に他の単独のＣＡＲをエンコードするベクターで形質導入した３Ｅ６のＴ細胞での連続治療を施した。群３中のマウスには、３日目に、単独の抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入した３Ｅ６のＴ細胞及び単独の抗ＣＤ２２  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入した３Ｅ６のＴ細胞の合計６Ｅ６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を共投与した。群４〜７中のマウスには、３日目に、図１３に表示されるＣＡＲをコードするベクターで形質導入した３Ｅ６のＴ細胞を投与した。群４中のマウスには、共形質導入したＴ細胞上での低い発現のために、ほぼ１０Ｅ６の総ＣＡＲ＋Ｔ細胞を投与した。図１３は、ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方を同時に標的とすることは、単一標的ＣＡＲによる連続治療よりも優れていることを実証する。
【０２５３】
０日目に、ＮＳＧマウスに０．２５Ｅ６のＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ＫＯ及び０．２５Ｅ６のＣＤ２２ＫＯ白血病細胞を投与した。３日目に、ＮＳＧマウスに３Ｅ６のＣＡＲ＋Ｔ細胞を注射した。Ｖ１  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞の使用及びＶ５  ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したＴ細胞の使用により、ＣＤ１９−及びＣＤ２２−白血病細胞の両方が完全に根絶されるようである（図１４）。
【０２５４】
実施例７
本実施例は、本発明の実施形態による、二重特異性ＣＡＲを実例で示す。
【０２５５】
ヒト白血病サンプル
患者サンプルを、米国国立がん研究所（ＮＣＩ）治験審査委員会（ＩＲＢ）承認のスクリーニングプロトコルよって、抗原発現についてスクリーニングした。異種移植細胞生成のためのヒトＡＬＬサンプルを収集し、国立がん研究所（ＮＣＩ）−ＩＲＢ承認組織取得プロトコルへのインフォームドコンセント後に保存した。ヒト被験体からのすべての研究検体は、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを得て得られた。
【０２５６】
細胞株及び培養条件
以下の白血病細胞株：赤白血病Ｋ５６２−ＣＤ２２（ヒトＣＤ２２で形質導入、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ、カタログ：ＥＸ−Ｚ９３６４−Ｌｖ１５１）、Ｋ５６２−ＣＤ１９（ヒトＣＤ１９で形質導入）、Ｋ５６２−ＣＤ１９ＣＤ２２（ヒトＣＤ１９及びＣＤ２２の両方で形質導入）、ネガティブコントロールとしての非形質導入Ｋ５６２；Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病株ＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ６−ＧＬ（ＧＦＰ及びルシフェラーゼで形質導入）及びＲＥＨ−ＴＳＬＰＲ−ＧＬ（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２６：６２９−３９（２０１５）、参照により組込まれる）を用いた。細胞株を、１０％熱非働化ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した培地中で培養した。Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔレンチパッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ．Ｃａｔ＃６３２１８０）をＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中で培養した。
【０２５７】
ＣＤ１９ｎｅｇ及びＣＤ２２ｎｅｇ白血病再発モデルの作製
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９技術を用いてＮａｌｍ６を編集し、ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９ｎｅｇ−ＧＬ（ＣＲＩＳＰＲ  ＣＤ１９（エクソン３における））、ＮＡＬＭ６−ＣＤ２２ｎｅｇ−ＧＬ（ＣＲＩＳＰＲ  ＣＤ２２（エクソン６における））を生成した。ＮＡＬＭ６上のＣＤ１９又はＣＤ２２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集用のレンチウイルスベクターは以前に記述された（Ｆｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２４：２０−２８（２０１８）、参照により組込まれる）。簡単に言うと、ガイドＲＮＡは、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／により最適化し、ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ  ｖ２プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ５２，９６１）にクローニングした。次いで、プラスミドをパッケージングプラスミドと共に共トランスフェクションし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換した。２日後、上清を回収し、濾過し、濃縮した。ウイルス形質導入のために、１０５のＮＡＬＭ６細胞を１０ｍｌの濃縮ウイルス上清と２日間インキュベーションした後、ＲＰＭＩ培地中で増幅させた。細胞表現型をフローサイトメトリーにより評価した後、表現型の変化を伴う細胞の分取及び単一細胞クローニングを行った。遺伝子型の変化を確認するために、単一細胞クローンに関して配列決定を行った。
【０２５８】
ＣＡＲレンチウイルスベクターの産生とＴ細胞の形質導入
二価ＣＡＲコンストラクトを設計及び合成した後、レンチウイルス導入プラスミドにクローニングした。二価のＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔレンチパッケージング細胞株の一過性トランスフェクションにより産生した。簡単に言えば、ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｄリジンでコーティングした１５ｃｍプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種した。翌日、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＣＡＲコンストラクトをコードするプラスミドで、パッケージング及びエンベロープベクター（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＭＤ−２Ｇ、及びｐＲＳＶ−Ｒｅｖ）と共にトランスフェクションした。レンチウイルス上清を、トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後に回収し、細胞残渣を除去するために３０００  ＲＰＭで１０分間遠心分離し、ドライアイス上で凍結し、−８０℃で保存した。正常ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、ＮＩＨ承認プロトコルにより得て、４０ＩＵ／ｍＬ組換えＩＬ−２及び５％ＦＢＳを含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で、１：３の比のＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃１１１４１Ｄ）で２４時間活性化した。活性化Ｔ細胞を、レンチウイルス上清２ｍＬと最終濃度１０ｕｇ／ｍＬの硫酸プロタミン及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む新鮮なＡＩＭ−Ｖ培地１ｍＬあたり２００万細胞で、６ウェルプレート中で再懸濁した。プレートを、３２℃で２時間、１０００×ｇで遠心分離し、３７℃で一晩インキュベーションした。上記と同じ形質導入手順を繰り返すことにより、翌日に２回目の形質導入を行った。形質導入後３日目にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、細胞を１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ２を含有するＡＩＭ−Ｖ中で３００，０００細胞／ｍＬで培養し、新鮮なＩＬ２含有培地を、８又は９日目の回収まで２〜３日ごとに追加した。
【０２５９】
フローサイトメトリー解析
ＣＤ２２  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の表面発現を、ＣＤ２２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるフローサイトメトリーの後、ヒトＩｇＧ−Ｆｃに特異的なＰＥ−Ｆ（ａｂ）２又はＡＰＣ−Ｆ（ａｂ）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのインキュベーションにより決定した。ＣＤ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の表面発現は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ  ＡＰＣ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いることにより、ＡＰＣと結合した抗ＣＤ１９イディオタイプ又は組換えヒトＣＤ１９  Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出した。個々の図について示されるように、両方の検出試薬の組合せを用いて、二価ＣＡＲの発現を評価した。Ｂ−ＡＬＬ株上でのＣＤ１９及びＣＤ２２の発現を、以下の抗ヒト抗体：ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１９−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＣＤ１９−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ１０−ＰＥ−Ｃｙ７、及びＣＤ２２−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて検出した。Ｔ細胞を、以下の抗体：ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、及びＣＤ８ａ−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で特性解析した。
【０２６０】
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞毒性アッセイ
１００ｕｌのＲＰＭＩ培地中の５Ｅ４の標的腫瘍細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＢｉｏＣｏａｔTM  Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ＴＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ）に充填した。翌日、指定のウェルに等量のＣＡＲ  Ｔ細胞を加えた。アポトーシスマーカー（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を１００ｕｌのＰＢＳに希釈し、１ｕｌの希釈液を各ウェルに加えた。プレートをＧＦＰ蛍光発現についてスキャンして、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ（登録商標）システムを用いて、４０時間の持続時間で３０分ごとにアポトーシス（ＧＦＰ陽性細胞消失）をモニタリングした。各時点での細胞死滅のパーセンテージは、ベースラインに対して決定した。
【０２６１】
サイトカイン産生の解析
標的腫瘍細胞及び形質導入したＣＡＲ陽性Ｔ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＲＰＭＩに１Ｅ６／ｍｌで再懸濁した。Ｔ細胞のみ及び腫瘍細胞のみのコントロールを伴って、１００ｕｌの腫瘍細胞懸濁液及び１００ｕｌのＣＡＲ  Ｔ細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに、デュプリケート又はトリプリケートで充填した（ｌｏａｄｅｄｉｎｔｏ）。３７℃インキュベーターで１８時間後、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は多重アッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）のいずれかを用いて、サイトカインの検出のために培養上清を回収した。
【０２６２】
インビボ研究
動物実験は、ＮＣＩ  ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）動物実験委員会により承認されたプロトコルの下で実施した。Ｂ−ＡＬＬ細胞株及び異種移植したヒトＢ−ＡＬＬ検体をＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｓｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｊａｋｃｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にＩＶ注射した。ルシフェラーゼ発現株については、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて白血病を検出した。マウスに３ｍｇのＤ−ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内注射し、４分後にＮＡＬＭ６については３０秒、ＰＤＸについては２分の露光時間で画像化した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、各マウスについて生物発光シグナルフラックスを光子／秒／ｃｍ２／ｓｒとして解析した。ルシフェラーゼを発現しない異種移植細胞における白血病負荷を、末梢血、骨髄、及び脾臓のフローサイトメトリーにより測定した。
【０２６３】
患者由来の異種移植細胞
以下の主要サンプル：ＣＤ１９−ＡＬＬ及びＣＤ１９＋ＣＤ２２ｄｉｍ（デノボ再発検体ＡＬＬ＿Ｈ０１１３＿ｐｏｓｔ２２＿ｒ（ＣＡＲ３）、ＡＬＬ＿Ｈ００９０＿ｐｏｓｔ１９＿ｐｄ（ＨＭＢ１５）をＰＤＸモデルの生成に用いた。ＰＤＸを、１Ｅ６〜１０Ｅ６の患者ＡＬＬ細胞の、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ｇａｍｍａ，ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）への静脈内注射により作製した。２回の継代に成功した後、ＰＤＸ株をレンチ−ＧＦＰ−Ｌｕｃウイルスで形質導入し、１回目及び２回目の継代後に、ＧＦＰ及びルシフェラーゼの高発現について選別した。ＧＦＰで形質導入したＰＤＸ白血病のインビボ負荷を、毎週、蛍光イメージングにより評価し、ヒトＡＬＬが蛍光イメージングで検出可能になった時点で、動物を、尾静脈注射により、ＣＡＲ  Ｔ細胞で治療した。健常者ドナー由来のエルトリエート（Ｅｌｕｔｒｉａｔｅ）したヒトリンパ球は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）臨床センターの輸血医学部からＩＲＢ承認プロトコルの下で取得した。ヒトリンパ球をＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。
【０２６４】
ＰＤＸモデルのゲノム解析
Ｑｉａｇｅｎ  ＡｌｌＰｒｅｐ  ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔを用いて、製造業者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って生体凍結保存した（ｖｉａｂｌｙ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）サンプルで核酸抽出を実施した。ＤＮＡ及びＲＮＡを定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを用いて、品質について評価した。Ｈｉｓｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プラットフォームでＴｒｕＳｅｑ  ４．０ケミストリーを用いて、ポリアデニル化ＲＮＡライブラリーを作製し、配列決定した。全エクソームデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＸＴ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎ  Ｖ５及びＴｒｕＳｅｑ  Ｖ４ケミストリーを用いて生成し、ＨｉＳｅｑ  ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、中央値がカバレッジの１００倍になるように配列決定した。
【０２６５】
全エクソーム及びＲＮＡ配列決定のデータは、ＣＣＲ共同バイオインフォマティクス（ＣＣＢＲ）パイプライン（ＣＣＲ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  （ＣＣＢＲ）  ｐｉｐｅｌｉｎｅ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）を用いてマッピング及び解析した。リードを参照ゲノムＨｇ１９にアラインメントした。ＭｕＴｅｃｔ２０を用いて体細胞バリアントのコールを行い、Ｎｅｘｕｓ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ＃９（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いてコピー数の変化を解析した。ＣＤ１９及びＣＤ２２遺伝子の完全性を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）を用いる手動検査によって更に調査した。各サンプルについてのＲＮＡ配列決定のリードを、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃソフトウェアを用いてそのアダプターと低クオリティーの塩基をトリミングし、ＳＴＡＲソフトウェアを用いて参照ヒトＨｇ  ３８及びＧｅｎｅｃｏｄｅ  Ｖ２４転写産物とアライメントした。
【０２６６】
統計解析
Ｐｒｉｓｍ  ７．０ソフトウェアを用いて統計解析を行った。患者のＣＤ１９及びＣＤ２２の解析について、統計的有意性をマン・ホイットニー検定を用いて算出した。
【０２６７】
小児Ｂ  ＡＬＬ上のＣＤ１９及びＣＤ２２の不均一且つ動的な発現。
多発再発性疾患（ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）を有する患者に主に由来する患者サンプルを、ＣＤ１９及びＣＤ２２発現について評価した。免疫療法を施す前のＣＤ１９及びＣＤ２２の発現においては幅広い範囲があった（図４２）。ＣＤ１９エピトープの損失は、ＣＤ１９を標的とした免疫療法を受けてよく記述されている。マッチドペア解析においては、患者において、ＣＤ１９の喪失の前後にＣＤ２２発現が評価され、ＣＤ１９喪失に関連するＣＤ２２発現の一貫した減少が実証された。このことにより、単一抗原の喪失によって、抗原の発現も広範に調節され得ることが示唆される（図１５）。これらの結果は、単一抗原標的免疫療法に関連する課題を示す。
【０２６８】
ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方の同時標的化は、抗原喪失−再発モデルの再発又は疾患の進行を予防する点で、連続治療よりも優れている。
臨床試験で見られるＣＤ１９及びＣＤ２２の再発現象をモデル化するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いて、表１７中に提供した特定のデータを示すプレＢ  ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６細胞からＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を欠失させた（図１６）。
【０２６９】
【表１７】
2020519298.tif 000056
【０２７０】
ＣＲＩＳＰＲ編集ＮＡＬＭ６株及び親ＮＡＬＭ６は両方、安定性を確保するための単一細胞クローニング後、すべて、Ｂ細胞受容体関連遺伝子の欠失及び対応する表面タンパク質発現の損失にもかかわらず、ＮＳＧマウスに生着すると疾患の進行を示した（図１７）。
【０２７１】
２つの抗原に対して免疫療法的圧力をかけるための１つのアプローチは、抗ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞、それに続く抗ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞、又はその逆の連続注入を介するものである。この戦略を試験するために、ＣＤ１９ｎｅｇ、ＣＤ２２ｎｅｇ、及び親ＮＡＬＭ６（ＣＤ１９ｐｏｓ／ＣＤ２２ｐｏｓ）ＡＬＬの混合物をマウスに注射して、抗原陰性の再発をシミュレートした。単一抗原特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与により、標的抗原を発現しない白血病の再発がもたらされ、これにより再発モデルが実証された（図１８）。驚くべきことに、治療用量の抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲＴの、６日隔てた連続注入はＡＬＬ進行を予防しなかった。重要なことに、再発の表現型により、２回目のＣＡＲ注入の有効性の減少が実証された。抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２標的ＣＡＲＴの両方の共投与（共注入）は、連続注入よりも優れていたが、依然としてＣＤ２２を発現しているＣＤ１９ｎｅｇ  ＡＬＬの進行をもたらし、このことにより抗ＣＤ１９  ＣＡＲが支配的になり得ることが示唆された。
【０２７２】
次の工程は、ＣＤ２２  ＣＡＲと共注入した場合の抗ＣＤ１９  ＣＡＲの明白な優位性を考慮した上で、共形質導入を通じて抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの両方を同じＴ細胞に導入することであり、これにより、二重特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を含有するＴ細胞のプールが生成された。しかし、共形質導入効率は一貫して低く、総Ｔ細胞産物のわずか４分の１しか得られず、それらは抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２  ＣＡＲの両方を発現した（図１９）。更に、再発表現型（ＣＤ２２＋ＣＤ１９ｎｅｇ及びＣＤ２２ｎｅｇＣＤ１９ｎｅｇ、図２０）は、両方の抗ＣＡＲ又は抗ＣＤ２２  ＣＡＲを単独で発現するＴ細胞を投与した場合、やはり抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞が支配的となり得ることを示唆する。従って、２つのベクターによる遺伝子導入の非効率性、２つのベクターの管理に関連する技術的な課題とコスト、及び２つの単独のＣＡＲを発現するＴ細胞を含めることが、二重特異性Ｔ細胞集団の増幅を損なう可能性に基づいて、同一ベクターから二重特異性を導入するためのアプローチを追求した。
【０２７３】
ｓｃＦｖのタンデム配列決定を伴う二価ＣＡＲの開発
２つの異なるｓｃＦｖドメインを単一のＣＡＲコンストラクトに結合することにより、２価のＣＡＲを生成した。抗ＣＤ１９ｘ抗ＣＤ２２  ＣＡＲの構築において取り組んだアプローチは、図２１に示す通り、各ｓｃＦｖ（ＣＤ１９についてはＦＭＣ６３、及びＣＤ２２についてはｍ９７１）について重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）を順番に配置して、タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）を作製することであった。ＴａｎＣＡＲ１に関しては、各単独ＣＡＲ由来のＶＨとＶＬの間の元のリンカーは維持し、２つのｓｃＦｖをＧ（Ｓ）４ｘ５リンカーを用いて接続した（この形式は、形質導入後に細胞表面上において、単一抗原標的ＣＡＲに匹敵するレベルで検出され得た）。ＴａｎＣＡＲ１は、国際特許公開番号第ＷＯ２０１６／１４９５７８号に記載されている。重要なことに、ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、すべて抗ＣＤ２２  Ｆｃ融合及び抗ＦＭＣ６３イディオタイプを用いて検出され得た。ＴａｎＣＡＲ２（配列番号６３）に関しては、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖの順序が反転し、表面での検出がはるかに低くなった。ＣＤ１９ｐｏｓ／ＣＤ２２ｎｅｇ  ＡＬＬに対する一価のＣＤ１９  ＣＡＲＴと比較して、ＴａｎＣＡＲ１の良好な表面検出及び匹敵するＩＬ２産生レベルもかかわらず、ＣＤ９ｎｅｇ／ＣＤ２２ｐｏｓ  ＡＬＬと共インキュベーションした場合、ＩＬ−２産生は非常に低かった（図２２Ａ及び２２Ｂ）。抗ＣＤ２２  ＶＨとＶＬの間の非常に短いリンカー（Ｇ４Ｓ）を踏まえ、ＣＤ２２  ｓｃＦｖ内のリンカーの長さを増大させてＴａｎＣＡＲ３（配列番号６４）を構築した（この形式は、ＣＤ２２  Ｆｃと抗イディオタイプの結合を無効化した）（図２１）。ＴａｎＣＡＲ４（配列番号６５）に関しては、抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖについての親の短いリンカーは維持したが、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖと抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖの間のリンカーの長さは減少させた。これにより、ＣＤ１９−／ＣＤ２２＋ＡＬＬに対するＩＬ２産生によって測定されたように、ＴａｎＣＡＲ１と比較して、ＣＡＲ表面発現（抗ＣＤ２２  Ｆｃ及び抗ＦＭＣ６３イディオタイプの結合）及びＣＤ２２に対する機能の増強がもたらされた（図２２Ａ及び２２Ｂ）。
【０２７４】
ＴａｎＣＡＲ１及びＴａｎＣＡＲ４の細胞毒性を更に評価し、ＣＤ１９及びＣＤ２２の一価のＣＡＲに匹敵する活性を実証した。インビトロでの活性にもかかわらず、インビボでは、ＴａｎＣＡＲ１もＴａｎＣＡＲ４もＣＤ１９ｐｏｓＣＤ２２ｐｏｓ  ＡＬＬを完全に根絶しなかった（図２３Ａ〜２３Ｄ）。
【０２７５】
ループ構造をもたらすｓｃＦｖの代替配列を伴う二価ＣＡＲの開発
一連の二価ＣＡＲコンストラクトを構築した（図２４）。ＬｏｏｐＣＡＲ１（配列番号６６）は、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間の抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ（短いリンカーを維持する）により構築した（この形式は細胞表面で低いパーセンテージでしか検出できない）。ＬｏｏｐＣＡＲ２（配列番号６７）に関しては、ループ構造の折り畳みを促進するために、抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ間でリンカーの長さを増大させ、ジスルフィド結合形成を促進するために、リンカーのアミノ酸構造を抗ＣＤ１９可変鎖と抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖの間でわずかに改変した。これにより、ＣＡＲの表面検出が改善された。ＬｏｏｐＣＡＲ１は、ＣＤ１９又はＣＤ２２のいずれに対してもＩＬ−２産生を引き起こせなかった。表面検出の改善及びＣＤ１９に対する幾らかのＩＬ−２の生成にもかかわらず、ＬｏｏｐＣＡＲ２はＣＤ２２抗原に対して検出可能なＩＬ−２を生成しなかった。図２５Ａ及び２５Ｂを参照。
【０２７６】
ＬｏｏｐＣＤＡＲ３（配列番号６８）は、更に改変し、抗ＣＤ１９重鎖と抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖとの間のリンカーの長さを減少させ、Ｌｏｏｐ２に導入したＶＨとＶＬの間のわずかに長いリンカーを維持した。このことにより、ＣＤ１９ｎｅｇ／ＣＤ２２ｐｏｓ  ＡＬＬに対するＩＬ−２産生の改善がもたらされた。次の一連のコンストラクトについては、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖを膜の遠位の位置、且つ抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖの可変鎖の間に配置した。ＬｏｏｐＣＡＲ４（配列番号６９）においては、ＬｏｏｐＣＡＲ３に導入した抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖと抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ可変鎖の間のリンカーを維持し、このことにより以前の形式のいずれと比較しても高レベルのＣＡＲ検出及びより優れたＩＬ２産生がもたらされた。このことにより、抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖの、膜の近位の所在が最適であり得ることが示唆される。ＣＤ１９ｎｅｇ／ＣＤ２２ｐｏｓ  ＡＬＬに対するＩＬ−２産生が一価の抗ＣＤ２２  ＣＡＲよりも依然として劣っていることを踏まえ、ＬｏｏｐＣＡＲ５（配列番号７０）は、改変してジスルフィド結合形成を促進した（この構造はサイトカイン産生を改善しなかった）。図２５Ｃを参照。
【０２７７】
最後に、ＬｏｏｐＣＡＲ６（配列番号６１）においては、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖと抗ＣＤ２２可変鎖の間に短いリンカーを組込み、これによりＣＡＲ検出及びＣＤ１９ｐｏｓ／ＣＤ２２ｎｅｇとＣＤ１９ｎｅｇ／ＣＤ２２ｐｏｓ  ＡＬＬの両方に対するＩＬ−２産生の両方（図２６）、並びに単一抗原を発現するＡＬＬのインビトロでの死滅（図２７及び２８）が劇的に改善された。注目すべきことに、抗ＣＤ２２  ＣＡＲを発現するＴ細胞と比較してＬｏｏｐＣＡＲ６を発現するＴ細胞によるＣＤ１９ｎｅｇ  ＡＬＬの殺傷の動態は、ＣＤ２２に対する効力がわずかに低いことを示唆した。ＬｏｏｐＣＡＲ６は、ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方に応答して複数のサイトカインを産生し（図２９Ａ〜２９Ｆ）、ＬｏｏｐＣＡＲ６を発現するＴ細胞の効力及び多機能性が更に確認された。従って、ＣＤ１９ｘＣＤ２２の特異性を組込んだ二価ＣＡＲにとっては、おそらくＣＤ２２結合の維持が困難なため、ループの設計が最適であり得る。設計及び試験した複数のコンストラクトの中で、Ｌｏｏｐ６は最も強力な形式として特定され、インビボモデルで更に試験した。
【０２７８】
ＬｏｏｐＣＡＲ６は、ＣＤ１９ｐｏｓＣＤ２２ｎｅｇ及びＣＤ１９ｎｅｇ  ＰＤＸを効率的に根絶する
次に、ＬｏｏｐＣＡＲ６をＮａｌｍ６異種移植細胞に対して試験した。８ｘ１０６の用量のＬｏｏｐＣＡＲ６は、ＣＤ１９ｐｏｓ／ＣＤ２２ｐｏｓ  Ｎａｌｍ６を根絶するようであり（図３０）、３ｘ１０６の用量まで活性を保持した（図３１）。ＣＤ１９ｐｏｓ／ＣＤ２２ｐｏｓ  ＡＬＬに対しては、ＬｏｏｐＣＡＲ６は連続注入よりも優れていた（図３２）。しかし、ＬｏｏｐＣＡＲ６は、低用量では、親ＮＡＬＭ６と比較してＣＤ２２の発現が低い細胞株であるＣＤ１９ｎｅｇ／ＣＤ２２ｐｏｓ白血病に対して、同様には機能しなかった（図３３Ａ）。
【０２７９】
ＬｏｏｐＣＡＲ６を、生着したＡＬＬ接種物が９９％ＣＤ１９ｐｏｓ／ＣＤ２２ｐｏｓＡＬＬと共に１％ＣＤ１９ｎｅｇ又はＣＤ２２ｎｅｇ  ＡＬＬを含んだ「急上昇（ｓｐｉｋｅ  ｉｎ）」再発モデルにおいて更に試験した（小さな既存のクローンからの再発を模倣するアッセイ）。このモデルにおいては、ＬｏｏｐＣＡＲ６は、ＣＤ２２ｎｅｇ  ＡＬＬの除去においては抗ＣＤ１９  ＣＡＲに匹敵しており、このことにより、ＬｏｏｐＣＡＲ６の、ＣＤ１９に対する一価の抗ＣＤ１９  ＣＡＲに匹敵する効力が確認された。しかし、一価の抗ＣＤ２２  ＣＡＲとは対照的に、ＬｏｏｐＣＡＲ６は、低ＣＤ２２部位密度でＣＤ１９ｎｅｇ／ＣＤ２２ｐｏｓ  ＡＬＬを完全に除去することはできなかった（図３３Ｂ）。総合すると、またＣＤ２２単独発現ＡＬＬのインビボでの殺傷の動態によって示唆されるように（図２７）、インビボ実験により、ＬｏｏｐＣＡＲ６は、ＣＤ１９に対しては一価の抗ＣＤ１９  ＣＡＲに匹敵する効力を有しているが、ＣＤ２２に対しては一価の抗ＣＤ２２  ＣＡＲよりも効力がわずかに低いことが示唆される。
【０２８０】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ耐性の臨床的に関連するモデルにおけるＬｏｏｐＣＡＲ６のインビボ活性を更に調査するために、デノボ再発検体から生成した２つの異なる患者由来異種移植細胞（ＨＭＢ１５；ＣＤ１９ｐｏｓ／ＣＤ２２ｐｏｓ及びＨＭＢ２８；ＣＤ１９ｎｅｇ／ＣＤ２２ｐｏｓ）を利用した。２つのＰＤＸモデル系を特性解析するために、全エクソーム及び全トランスクリプトーム配列決定を行った。ＨＭＢ１５には、ＭＬＬ（エキソン１〜６）のＮ末端とＭＬＬＴ１０のＣ末端間にインフレームの融合がん遺伝子が生じる転座がある。このモデルにおいては、ＣＤ１９及びＣＤ２２ゲノム遺伝子座は無傷である。ＨＭＢ２８  ＰＤＸの主要ながん遺伝子ドライバーは、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄの点突然変異である。更に、このモデルにはＣＤ１９中に未成熟終止コドンがある（表１８）。
【０２８１】
【表１８】
2020519298.tif 000057
【０２８２】
ＨＭＢ１５は、一価のＣＡＲ及びＬｏｏｐＣＡＲ６の両方によって除去されるようであった（図３４Ａ及び３４Ｂ）。ＨＭＢ２８は一価の抗ＣＤ１９  ＣＡＲに耐性であり、従って、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ耐性の優れたモデルであった。心強いことに、ＬｏｏｐＣＡＲ６はＨＭＢ２８における進行を妨げ、このことによりＬｏｏｐＣＡＲ６が抗ＣＤ１９  ＣＡＲ耐性の予防に効果的であり得ることが示される。
【０２８３】
ＬｏｏｐＣＡＲ６のオフターゲット活性の証拠はない
潜在的な腫瘍外毒性（ｏｆｆ  ｔｕｍｏｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）をもたらす、２つの異なるＶＨ及びＶＬの誤対合の可能性を考慮し、ＬｏｏｐＣＡＲ６を発現するＴ細胞の機能的スクリーニングを行った。ＬｏｏｐＣＡＲ６  Ｔ細胞を複数の正常組織を表すヒトｉＰＳＣ細胞株と共インキュベーションし、培養上清中でＩＦＮγ産生を測定した。開発した活性のあるＣＡＲコンストラクトはすべてＩＦＮγを誘導するので、ＩＦＮγ産生を用いて反応性を測定した。ＮＡＬＭ６及びＲＥＨ−ＴＳＬＰＲ、ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方を発現する２つの別個のＡＬＬ細胞株を陽性コントロールとして用いた。
【０２８４】
このアッセイにおいては、ＬｏｏｐＣＡＲ６は、Ｔ細胞においてＮＡＬＭ６及びＲＥＨ−ＴＳＬＰＲの両方に対してＩＦＮγを誘導した。ＩＦＮγ産生は、いずれのｉＰＳ細胞株の存在下でのＬｏｏｐＣＡＲ６発現Ｔ細胞の上清中に（ｏｆ  ｂｙ）も検出されなかった（図３５Ａ及び３５Ｂ）。
【０２８５】
表１９は、結果の要約を提示する。
【０２８６】
【表１９】
2020519298.tif 000058
【０２８７】
実施例８
本実施例は、本発明の実施形態による、切断可能なＣＡＲを実例で示す。
【０２８８】
細胞株及び培養条件
以下の白血病細胞株：赤白血病Ｋ５６２−ＣＤ２２（ヒトＣＤ２２で形質導入、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ、カタログ：ＥＸ−Ｚ９３６４−Ｌｖ１５１）、Ｋ５６２−ＣＤ１９（ヒトＣＤ１９で形質導入）、Ｋ５６２−ＣＤ１９ＣＤ２２（ヒトＣＤ１９及びＣＤ２２の両方で形質導入）、ネガティブコントロールとしての非形質導入Ｋ５６２；Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病株ＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ６−ＧＬ（ＧＦＰ及びルシフェラーゼで形質導入）、ＮＡＬＭ６−ＣＤ１９−−ＧＬ（エキソン３におけるＣＤ１９のＣｒｉｓｐｅｒ  ＫＯ）、ＮＡＬＭ６−ＣＤ２２−−ＧＬ（エキソン６におけるＣＤ２２のＣｒｉｓｐｅｒ  ＫＯ）を用いた。細胞株を、１０％熱非働化ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した培地中で培養した。Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔレンチパッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ．Ｃａｔ＃６３２１８０）をＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中で培養した。
【０２８９】
原発性ヒト白血病サンプル及び患者由来の異種移植細胞
ヒトＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）サンプルを収集し、ＩＲＢ承認組織取得プロトコル（プロトコル番号：１５−Ｃ−００２９）へのインフォームドコンセント後に保存した。ヒト被験体からのすべての研究検体は、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを得て得られた。次の主要サンプル：ＣＤ１９−ＡＬＬ及びＣＤ１９＋ＣＤ２２ｄｉｍ（デノボ再発検体ＡＬＬ＿Ｈ０１１３＿ｐｏｓｔ２２＿ｒ（ＣＡＲ３）、ＡＬＬ＿Ｈ００９０＿ｐｏｓｔ１９＿ｐｄ（ＨＭＢ１５））を、二重特異性ＣＡＲコンストラクトのインビボ試験に用いた（ｗｅｒｅ  ｕｓｅｄ）。ＰＤＸモデルを、１Ｅ６〜１０Ｅ６の患者ＡＬＬ細胞の、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ｇａｍｍａ，  ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）への静脈内注射により作製した。ＰＤＸ株をレンチ−ＧＦＰ−Ｌｕｃウイルスで形質導入し、１回目及び２回目の継代後に、ＧＦＰ及びルシフェラーゼを発現する白血病細胞について選別した。これらの研究のために、ＰＤＸの二回目及び後の継代をそれぞれ再発ＡＬＬ検体及びデノボＡＬＬ検体用に用いた。ＧＦＰで形質導入したＰＤＸ白血病のインビボ負荷を、毎週、蛍光イメージングにより評価し、ヒトＡＬＬが蛍光イメージングで検出可能になった時点で、動物を、尾静脈注射により、ＣＡＲ  Ｔ細胞で治療した。健常者ドナー由来のエルトリエート（Ｅｌｕｔｒｉａｔｅ）したヒトリンパ球は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）臨床センターの輸血医学部からＩＲＢ承認プロトコルの下で取得した。ヒトリンパ球をＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。
【０２９０】
ＣＲＩＳＰＲによるＣＤ１９陰性又はＣＤ２２陰性白血病の生成
ＮＡＬＭ６におけるＣＤ１９又はＣＤ２２のＣＲＩＳＰＲノックアウト用のレンチウイルスベクターを作成した。簡単に言うと、ガイドＲＮＡは、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／により最適化し、ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ  ｖ２プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ５２，９６１）にクローニングした。次いで、プラスミドをパッケージングプラスミドと共に共トランスフェクションし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ形質転換した。２日後、ＣＲＩＳＰＲ上清を回収し、濾過し、濃縮した。ウイルス形質導入のために、１０５のＮＡＬＭ６細胞を１０ｍｌの濃縮ウイルス上清と２日間インキュベーションした後、ＲＰＭＩ培地中で増幅させた。細胞表現型をフローサイトメトリーにより評価した後、表現型の変化を伴う細胞の分取及び単一細胞クローニングを行った。遺伝子型の変化を確認するために、単一細胞クローンに関して配列決定を行った。
【０２９１】
レンチ−ウイルスＣＡＲコンストラクトの作成
各ＣＤ１９及びＣＤ２２  ＣＡＲにおけるＣＤ２８又は４−１ＢＢ共刺激ドメインの種々の組合せにより、ＣＤ１９／ＣＤ２２バイシストロン性ＣＡＲを作製し、間を切断可能なリンカーで連結した。各ＣＤ１９及びＣＤ２２  ＣＡＲには、先頭にリーダー配列があり、その後にＣＤ１９又はＣＤ２２の単鎖可変フラグメント、次いで４−１ＢＢ及びＣＤ３ゼータドメインに連結したＣＤ８膜貫通ドメイン、又は、ＣＤ２８及びＣＤ３ゼータドメインに連結したＣＤ２８膜貫通ドメインのいずれかが続く。これらのＣＡＲを、ｐＥＬＮＳレンチベクターの骨格にサブクローニングした。制限酵素はすべてＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。すべてのＣＡＲコンストラクトの配列を、Ｍａｃｒｏｇｅｎで配列決定することにより確認した。
【０２９２】
本実施例に記載するＣＡＲは、以下：２２−ＢＢ／１９−２８（本明細書ではＶ５としても列記される）、２２−２８／１９−ＢＢ（本明細書ではＶ６としても列記される）、２２−ＢＢ／１９−ＢＢ（本明細書ではＶ７としても列記される）、及び２２−２８／１９−２８（本明細書ではＶ８としても列記される）である。
【０２９３】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の生成
バイシストロン性ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔレンチパッケージング細胞株の一過性トランスフェクションにより産生した。簡単に言えば、ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｄリジンでコーティングした１５ｃｍプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種した。翌日、リポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞を、ＣＡＲコンストラクトをコードするプラスミドで、パッケージング及びエンベロープベクター（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＭＤ−２Ｇ、及びｐＲＳＶ−Ｒｅｖ）と共にトランスフェクションした。レンチウイルス上清を、トランスフェクションの２４時間後及び４８時間後に回収し、細胞残渣を除去するために３０００  ＲＰＭで１０分間遠心分離し、ドライアイス上で凍結し、−８０℃で保存した。正常ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、ＮＩＨ承認プロトコルにより得て、４０ＩＵ／ｍＬ組換えＩＬ−２及び５％ＦＢＳを含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で、１：３の比のＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃１１１４１Ｄ）で２４時間活性化した。活性化Ｔ細胞を、レンチウイルス上清２ｍＬと１０ｍｇ／ｍＬの硫酸プロタミン及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む新鮮なＡＩＭ−Ｖ培地１ｍＬあたり２００万細胞で、６ウェルプレート中で再懸濁した。プレートを、３２℃で２時間、１０００×ｇで遠心分離し、３７℃で一晩インキュベーションした。上記と同じ形質導入手順を繰り返すことにより、翌日に２回目の形質導入を行った。形質導入後３日目にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、細胞を１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ２を含有するＡＩＭ−Ｖ中で３００，０００細胞／ｍＬで培養し、新鮮なＩＬ２含有培地を、８又は９日目の回収まで２〜３日ごとに追加した。
【０２９４】
フローサイトメトリー
ＣＤ２２  ＣＡＲで形質導入したＴ細胞の表面発現を、ＣＤ２２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるフローサイトメトリーに続く、ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に特異的なＰＥ−Ｆ（ａｂ）２又はＡＰＣ−Ｆ（ａｂ）２とのインキュベーションにより測定した。ＣＤ１９  ＣＡＲで形質導入したＴ細胞の表面発現は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ  ＡＰＣ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いることにより、ＡＰＣに結合した抗ＣＤ１９イディオタイプ又は組換えヒトＣＤ１９  Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により検出した。Ｂ−ＡＬＬ株上のＣＤ１９、ＣＤ２２の発現は、以下：ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１９−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＣＤ１９−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ１０−ＰＥ−Ｃｙ７、及びＣＤ２２−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の抗ヒト抗体を用いて検出した。Ｔ細胞は、以下の抗体：ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、及びＣＤ８ａ−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で特性解析した。
【０２９５】
細胞毒性アッセイ
１００ｕｌのＲＰＭＩ培地中の５Ｅ４の標的腫瘍細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＢｉｏＣｏａｔTM  Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ＴＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ）に充填した。翌日、指定のウェルに同量のＣＡＲ  Ｔ細胞を加えた。最初のｉｎｃｕｃｙｔｅアポトーシスマーカー（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を１００ｕｌのＰＢＳに希釈し、１ｕｌの希釈液を各ウェルに加えた。ＩｎｃｕＣｙｔｅＺＯＯＭ（登録商標）システムを用いて、ＧＦＰ及び／又はＲＦＰ蛍光発現についてプレートをスキャンし、４０時間の持続時間で３０分ごとに細胞アポトーシスをモニタリングした。各時点での細胞死滅の割合をベースライン補正した。
【０２９６】
サイトカイン産生の解析
標的腫瘍細胞及び形質導入したＣＡＲ陽性Ｔ細胞を１ＸＰＢＳで３回洗浄し、ＲＰＭＩ中に１Ｅ６／ｍｌで再懸濁した。１００ｕｌの腫瘍細胞を、１００ｕｌのＣＡＲ陽性Ｔ細胞と共に、９６ウェルプレートの各ウェルに充填した。Ｔ細胞のみ及び腫瘍細胞のみのコントロールを設定した。試験はすべてデュプリケート又はトリプリケートで行った。細胞を３７℃で１８時間インキュベーションし、サイトカイン産生の検出のために１２０ｕｌの培養上清を回収した。上清中のサイトカインレベルを、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）又は多重アッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）のいずれかを用いて測定した。
【０２９７】
ＲＮＡ配列決定解析
ＮＡＬＭ６及びＣＡＲ  Ｔ細胞を１Ｅ６／ｍｌで再懸濁した。５Ｅ５のＮＡＬＭ６を、２５ｍｌ培養フラスコ中の４０ＵのＩＬ２を含む１０ｍｌのＡＩＭＶ培養培地中で、５Ｅ５  ＣＡＲ＋Ｔ細胞と２４時間、デュプリケート又はトリプリケートで共インキュベーションした。ＣＤ１９マイクロビーズを伴うＮＡＬＭ６を、ＬＤカラムにより除去した。全溶出液を回収し、細胞を１２００ｒｐｍ、６分間の遠心分離でペレット化した。ｔＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔで直ちに抽出した。ＲＮＡサンプルを、解析のためにＮＩＨコア施設に送付した。ＲＮＡの品質はＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により評価した。ＲＮＡ配列決定を、ＴｒｕＳｅｑ  ＬＴアッセイによりＮｅｘｔＳｅｑ  ＦＡＳＴＱで行った。
【０２９８】
生体エネルギー解析
解糖ストレス試験のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）及びＮａＣｌ（１４３ｍＭ）を添加した無血清非緩衝化ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に懸濁した。０．６ｍＬの０．５％フェノールレッド溶液（ＳｉｇｍａＰ０２９０）を３ｍｇ／Ｌの最終濃度で添加し、ｐＨを７．３５＋／−０．０５に調整した。ＣＡＲ  Ｔ細胞をＳｅａｈｏｒｓｅ細胞プレートに播種（ウェルあたり３Ｅ５細胞）し、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングしてＴ細胞の接着を促進した。簡単に言うと、アッセイの前日にカートリッジを水和させた。アッセイの当日、プレートをＣｅｌｌ−Ｔａｋでコーティングし、細胞をＣｅｌｌ−Ｔａｋでコーティングしたプレートに播種し、アッセイのためにＸＦ２４アナライザーに配置した。詳細な手順は次の通りである。アッセイカートリッジを、最初に２００ｕｌ／ウェルのＸＦ較正（ｃａｌｉｂｒａｎｔ）溶液で水和し、ハイドロブースター（ｈｙｄｒｏ  ｂｏｏｓｔｅｒ）を加え、パラフィルム上でたわませ、センサーカートリッジをユーティリティプレートの上に置き、ＣＯ２なしで３７℃で一晩インキュベーションした。次いで、細胞培養プレートを次のようにＣｅｌｌ−Ｔａｋでコーティングした。１プレートについては、４６μｌのＣｅｌｌ−Ｔａｋを２０４μｌのＴＣ水と１ｍｌのＮａＨＣＯ３に希釈した。ミキサー（ｍｉｘｅｒ）を各ウェル中に５０μｌ分注し、プレートを室温で少なくとも２０分間インキュベーションした。Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ溶液の除去後、２５０ｍｌのＴＣ水を用いて各ウェルを洗浄した。ＣＡＲ  Ｔ細胞（３Ｅ５／ウェル）を１５８μｌのアッセイ培地に播種した。次いで、細胞培養プレートを、低加速且つ減速なしで１秒間、４５０ｒｐｍで回転させ、次いで、プレートの向きを逆にし、低加速且つ減速なしで、１秒間、６５０ｒｐｍで回転させた。次いで、プレートを３７℃、０％ＣＯ２で２５〜３０分間インキュベーションした。２５〜３０分間のインキュベーション後、手動のＰ２００ピペッターを用いて、１５８ｕｌの加温アッセイ培地を壁の側面に沿って各ウェルの上部にゆっくりと穏やかに加えた。細胞プレートを１５〜２５分間インキュベーションした。１５〜２５分後、プレートをＸＦ２４  Ａｎａｌｙｚｅｒに配置した（キャリブレーション終了後）。ＸＦアッセイを実行した。溶液を３つのポートを通して連続して注入した。ポートＡ：グルコース８０ｍＭ（３ｍｌアッセイ培地中９６μｌのストック溶液）。ポートＢ：オリゴマイシン１８μＭ（３ｍｌアッセイ培地中１０．８μｌのストック溶液）。ポートＣ：２−デオキシグルコース（２ＤＧ）はストック溶液を使用。解糖ストレス試験は、カートリッジポートに７５μｌの薬液を充填した後、定常状態でＥＣＡＲ（ｍｐＨ／分）を測定することにより行った。ミトコンドリアストレス試験のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｄ−グルコース（２５ｍＭ）及びピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を含む無血清の非緩衝化ＤＭＥＭ培地に懸濁した。ミトコンドリアストレス試験を、上記と同様に、オリゴマイシン（０．５μＭ）、ＦＣＣＰ（０．５μＭ）、ロテノン（１μＭ）及びアンチマイシンＡ（１μＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の連続注入後に、定常状態で、ＯＣＲ（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ）を測定することにより行った。Ｓｅａｈｏｒｓｅシステムによる実験では、次のアッセイ条件：２分混合物；２分待機；３分測定を利用した。
【０２９９】
蛍光顕微鏡イメージング及び解析
Ｔ細胞を、ＣＡＲ−Ｃｅｒｕｌｅａｎ又はＣＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を発現するように共形質導入した。ＣＡＲ陽性Ｔ細胞を分取し、親油性トレーサー−ＤｉＤ膜色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＰＢＳ中のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｂｌｕｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。次いで、細胞を洗浄してマウントした。画像を、ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｍカメラを装着したＺｅｉｓｓ  Ａｐｏｔｏｍｅにより、Ｚｅｉｓｓ  ｐｌａｎ  ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ２０ｘ対物レンズを用いて取得した。露光設定は、実験全体に関して同一であった。ＩｍａｇｅＪソフトウェアをデータ解析用に用いた。死細胞は除外した。ＤｉＤ膜染色を用いて、各細胞について同定した。Ｃｅｒｕｌｅａｎ（ＣＦＰ）陽性又はｍＣｈｅｒｒｙ陽性領域の面積と最大強度を計測した。１超の最大強度のみを計測した。ＤｉＤ染色についての閾値を、最大ピクセル強度の１０％に設定した。Ｃｅｒｕｌｅａｎチャネル及びｍＣｈｅｒｒｙチャネルについての閾値を、最大ピクセル強度の２０％に設定した。
【０３００】
インビボ実験
動物実験は、ＮＣＩ  ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）動物実験委員会により承認されたプロトコルの下で実施した。Ｂ−ＡＬＬ細胞株及び異種移植されたヒトＢ−ＡＬＬ検体をＮＳＧマウスにＩＶ注射した。ルシフェラーゼ発現株については、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて白血病を検出した。ＮＳＧに３ｍｇのＤ−ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内注射し、４分後にＮＡＬＭ６細胞については３０秒、ＰＤＸについては２分の露光時間で画像化した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、各マウスについて生物発光シグナルフラックスを光子／秒／ｃｍ２／ｓｒとして解析した。ルシフェラーゼを発現しない異種移植細胞における白血病負荷を、末梢血、骨髄、及び脾臓のフローサイトメトリーにより測定した。
【０３０１】
統計解析
Ｐｒｉｓｍ  ７．０ソフトウェアを用いて統計解析を行った。プロットを、平均＋／−ＳＤとして提示する。患者のＣＤ１９及びＣＤ２２の解析について、すべてのデータの統計的有意性をマン・ホイットニー検定を用いて算出した。
【０３０２】
バイシストロン性ＣＡＲの開発
低用量のＣＡＲを用いた非常に悪性の再発モデルにおいて試験した場合、二価ＬｏｏｐＣＡＲ６はＣＤ１９ｎｅｇ及びＣＤ２２ｎｅｇ白血病を完全には根絶しない。１１種の形態の二価ＣＡＲを試験後、二価形態のＣＤ２２活性を確保することは困難であることがわかった。
【０３０３】
バイシストロン性ＣＡＲ発現を、フローサイトメトリーにより測定し、ビスシトロン性コンストラクトの発現を確認した。図３６に示すように、タンパク質の翻訳に際して、バイシストロン性のＣＤ１９  ＣＡＲ及びＣＤ２２  ＣＡＲは２つの別々のフラグメントになり、最終的に細胞表面上に２つのＣＡＲとして発現した。第４象限における細胞のクラスター化により、ＣＤ１９及びＣＤ２２  ＣＡＲの、細胞表面上での等モル発現が示された。２２−ＢＢ／１９−２８発現システムを伴うＣＡＲは、二重陽性細胞の割合が最も高く、７０．３％の陽性細胞であることがわかった。二重発現の最低レベルは、二重のＢＢか、又は二重の２８のいずれかのものに関連付けられ、それぞれ４０．８％と５８．１％であった。共刺激ドメインを切り替えた場合、二重陽性集団において約１０％の発現が失われた。
【０３０４】
４−１ＢＢとＣＤ２８の組合せを伴うバイシストロン性ＣＡＲは、二価及び他のバイシストロン性ＣＡＲと比較して、インビトロで優れた機能を有する
以前に、共刺激エンドドメインＣＤ２８及び４−１ＢＢが、ＣＡＲ機能の免疫調節に対して異なる効果を有することが報告されている。単一標的ＣＡＲコンストラクトの感受性を明らかにするために、各ＣＡＲ−Ｔ細胞を、同種抗原をさまざまな密度で発現する白血病と共培養し、１８時間共培養の上清中でＩＬ−２レベルを測定した。標的抗原密度はサイトカイン産生において１０倍もの差を生じさせ、ＣＤ２２  ＣＡＲは標的密度に特に高感受性である（図３７Ａ）。共刺激ドメインもサイトカイン産生における差に寄与するが、共刺激ドメインに起因する差は、標的抗原密度の影響と比較して軽度であった。
【０３０５】
次に、共刺激ドメインの種々の組合せを有するバイシストロン性ＣＡＲをＫ５６２及びＮＡＬＭ６由来細胞とインキュベーションして、抗原密度がサイトカイン産生に影響するかどうかを決定した。ＣＤ２８及び４−１ＢＢの共刺激ドメインの両方を組合せたバイシストロン性ＣＡＲは、ＣＤ２８若しくは４−１ＢＢの共刺激ドメインのみを持つもの又は単一標的ＣＡＲよりも多くのサイトカインを産生する（図３７Ｂ）。抗原密度は、やはりＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生に最も大きく影響した。２２−ＢＢ／１９−２８は、２２−２８／１９−ＢＢ  ＣＡＲよりもわずかに多くのサイトカインを産生する。２２−ＢＢ／１９−２８  ＣＡＲはまた、ＣＤ１９／ＣＤ２２二価ＣＡＲよりも多くのサイトカインを産生した（図３７Ｃ）。すべてのバイシストロン性ＣＡＲは、標的細胞株の効果的な死滅を実証した（図３７Ｄ−３７Ｇ）。
【０３０６】
ＲＮＡ配列決定解析により、共刺激ドメインの種々の組合せに関連する特有の遺伝子発現が示される
種々の共刺激ドメインの組合せに関連する生物学的経路を調べるために、ＲＮＡ配列決定解析を行った。バイシストロン性ＣＡＲをＣＤ１９＋ＣＤ２２＋ＮＡＬＭ６細胞と共インキュベーションし、ＲＮＡ配列決定解析のために全ＲＮＡを抽出した。主成分分析（ＰＣＡ）は、種々の組合せが異なる遺伝子発現プロファイルに関連することを示す（図３８）。
【０３０７】
バイシストロン性ＣＡＲは、ＣＤ１９＋ＣＤ２２＋白血病、及びＣＤ１９ｎｅｇ又はＣＤ２２ｎｅｇ白血病芽球の両方を効率的に減少させる
ＣＤ１９＋ＣＤ２２＋ＮＡＬＭ６株を用いて、バイシストロン性ＣＡＲのインビボ活性を試験した。ＣＤ２８又は４−１ＢＢを含むＣＤ１９及びＣＤ２２の単一ＣＡＲをコントロールとして用いた。図３９に示すように、一般に、バイシストロン性ＣＡＲは単一標的ＣＡＲよりも優れている。ＣＤ２８及び４−１ＢＢの共刺激の種々の組合せは、率の異なる腫瘍除去を誘導する。２２−ＢＢ／１９−２８が、白血病芽球を除去において最適なものである。
【０３０８】
再発患者においては、ＣＤ１９ｎｅｇ及び低ＣＤ２２の芽球が観察されている。この臨床状況をシミュレートするために、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９テクノロジーを用い、ＮＡＬＭ６細胞を用いてＣＤ１９ｎｅｇ及びＣＤ２２ｎｅｇ白血病株を生成した。ＣＤ１９ｎｅｇ、ＣＤ２２ｎｅｇ、及び親ＮＡＬＭ６細胞の混合物を免疫不全ＮＳＧに注射して、臨床的再発状況をシミュレートするための悪性の異種移植モデルを作製した。３つのバイシストロン性ＣＡＲを、ＣＤ１９及びＣＤ２２の単一標的ＣＡＲと比較した（図３９Ｂ）。単一標的ＣＡＲは、白血病の進行を防ぐことができなかった。ＣＤ２８及び４−１ＢＢの両方を含むバイシストロン性ＣＡＲには、白血病の除去に関して非常に強力な活性があった。
【０３０９】
ＣＤ１９ｎｅｇ及びＣＤ２２ｎｅｇ混合白血病を用いたインビボでのバイシストロン性ＣＡＲ及び二価ＣＡＲと更に比較した（図４０）。バイシストロン性ＣＡＲは、ＣＤ１９ｎｅｇ及びＣＤ２２ｎｅｇ白血病の低減において、二価ＣＡＲよりも優れている。
【０３１０】
バイシストロン性ＣＡＲの強力な活性
臨床的に関連するＣＤ１９ｎｅｇ  ＰＤＸモデル（ＨＭＢ２８）を用いて、バイシストロン性ＣＡＲを試験した（ｔｅｓｔｅｄｕｓｉｎｇ）。ＰＤＸモデル用の白血病は、以前にＣＤ１９  ＣＡＲで治療され、ＣＤ１９陰性白血病再発により再発し、続いて抗ＣＤ２２  ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ２２を弱く発現する芽球の出現により白血病を除去できなかった）で治療された患者に由来した。バイシストロン性ＣＡＲは、ＣＤ１９陰性白血病芽球を完全に根絶し得る（図４１）。
【０３１１】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組込まれる。
【０３１２】
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つの」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１以上の事項の列挙の後での用語「少なくとも１つの」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１つの」）は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項から選択された１の事項（Ａ若しくはＢ）又は列挙した事項のうちの２以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがこれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記載されているかのように本明細書中に組込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と特に明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【０３１３】
発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載される。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書中に添付した特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書中に特記しない限り又は特に文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図２９−４】
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【図２９−５】
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【図２９−６】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３７−４】
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【図３７−５】
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【図３７−６】
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【図３７−７】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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