(57)【要約】  純粋な形での分離およびその後の長期的な系統追跡を必要としない、系統タイピングするためのシステムおよび方法。方法は、標的中に存在する１つまたは複数の遺伝領域の位置を特定する工程を含む。遺伝領域は、標的の２つ以上の変異体（すなわち、系統）の間で異なる遺伝子座を含む。デバイスは、遺伝子座のそれぞれの特有の配列を検出する。その遺伝子座を有する生物材料の試料が得られた後、デバイスは、標的中に存在する遺伝領域に対するアンプリコンを生成する。アンプリコンは、コンプリメンタリープローブにハイブリダイズし、ハイブリダイズしたプローブおよびハイブリダイズしないプローブが生じ、これらは検出される。検出されたハイブリダイズしたプローブは識別子が割り当てられる。デバイスは、識別子をパターンに変換する。パターンは記録され、１つまたは複数の記録された他のパターンと比較され、パターンが１つまたは複数の他のパターンと異なるかどうかが決定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、遺伝情報を解析するための方法：
ａ．標的中に存在する１つまたは複数の遺伝領域の位置を特定する工程であって、遺伝領域が、標的の２つ以上の変異体の間で異なる遺伝子座を含む工程、
ｂ．遺伝子座のそれぞれの特有の配列を検出するように構成されるデバイスを提供する工程、
ｃ．その遺伝子座を有する生物材料の試料を得る工程、
ｄ．標的中に存在する１つまたは複数の遺伝領域に対してアンプリコンを生成する工程、
ｅ．アンプリコンを遺伝子座に対する１種または複数のプローブにハイブリダイズさせる工程であって、１種または複数のプローブが遺伝子座のある変異体にハイブリダイズし、遺伝子座のある変異体にはハイブリダイズしない工程、
ｆ．アンプリコンにハイブリダイズした各プローブをデバイスを介して検出する工程、
ｇ．ハイブリダイズした各プローブに識別子を割り当てる工程であって、識別子が、ハイブリダイズしないプローブに割り当てられた識別子と異なる工程、
ｈ．各プローブに対して割り当てられた識別子をハイブリダイズしたプローブの識別子の記録されるパターンにデバイスを介して変換する工程、
ｉ．記録されたパターンを１つまたは複数の記録された他のパターンと比較する工程、
ｊ．記録されたパターンが１つまたは複数の記録された他のパターンと異なるかどうかを決定する工程。
【請求項２】
最低でも６遺伝子座が標的中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物材料が純粋培養物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生物材料が複合混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
パターンおよび１つまたは複数の他のパターンが、有線接続または無線接続の少なくとも１つを介してデバイスに接続したデータベースに保存される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
データベース中に保存されたパターンをデータベース中に保存された前のパターンと比較する工程であって、前のパターンが以前に解析した試料から得られた工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
パターンを報告する工程であって、パターンが生物材料の一連の決定的遺伝的特性を表す工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的がリステリアである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標的の２つ以上の変異体がリステリアの系統である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
パターンが一連の２つ以上の２進数字である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
試料が環境からの生物材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
アンプリコンを遺伝子座に対する１種または複数のプローブにハイブリダイズさせる工程がハイブリダイゼーションアレイ上で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
アンプリコンを遺伝子座に対する１種または複数のプローブにハイブリダイズさせる工程がビーズ上で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程を含む、複雑な生物材料において標的生物を系統タイピングするための方法：
ａ．可変性の遺伝子座を含む核酸配列を複雑な生物材料からデバイスを介して増幅して、アンプリコンを生成する工程、
ｂ．アンプリコンを遺伝子座に対する１種または複数のプローブにハイブリダイズさせる工程であって、第１のハイブリダイゼーションアレイおよび第１のビーズの少なくとも１つにおいて、１種または複数のプローブが遺伝子座のある変異体にハイブリダイズし、遺伝子座のある変異体にはハイブリダイズしない工程、
ｃ．第１のハイブリダイゼーションアレイおよび第１のビーズの少なくとも１つにおいて、１種または複数のハイブリダイズしたプローブおよび１種または複数のハイブリダイズしないプローブを検出する工程、
ｄ．第１のハイブリダイゼーションアレイおよび第１のビーズの少なくとも１つにおいて、各ハイブリダイズしたプローブおよびハイブリダイズしないプローブに識別子を割り当てる工程、
ｅ．第１のハイブリダイゼーションアレイおよび第１のビーズの少なくとも１つにおいて、１つまたは複数の識別子の第１のパターンを生成する工程、
ｆ．第１のハイブリダイゼーションアレイおよび第１のビーズの少なくとも１つの第１のパターンを第２のハイブリダイゼーションアレイおよび第２のビーズの少なくとも１つの第２のパターンと比較する工程、および
ｇ．第１のパターンが第２のパターンと異なるかどうかを決定する工程。
【請求項１５】
第１のパターンおよび第２のパターンがデバイスに作動可能に接続したデータベース中に保存される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
識別子が２進数字である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
第１のパターンおよび第２のパターンを報告する工程であって、第１のパターンおよび第２のパターンが複雑な生物材料の一連の決定的遺伝的特性を表す工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
最低でも６遺伝子座が標的中に存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
第１のハイブリダイゼーションアレイの画像をカメラで取得する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
標的がリステリアである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年５月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／５０６，０５４号に関連し、それに対して優先権を主張する。
【０００２】
１．技術分野
本発明は、一般に、核酸解析のためのシステムおよび方法、より詳細には、複雑な生物マトリックスからの核酸配列を解析し、そのような配列の存在の調査のために解析を使用するシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
混合生物集団は、集団に関する様々な属性を決定するために研究され得る。任意の集団内に、組織の様々なレベルでサブグループが存在し得る。生物システム中の最も一般的な組織構造は、属−種システムとも呼ばれ得るリンネ（Ｌｉｎｅａｎ）システムである。核酸解析を使用して、集団内で、個体間の違い、または非常に近縁の個体間の違いを示すように、リンネシステムを改良することができる。例えば、ある特定の生物では、集団において、単一種の２つのサブタイプを区別するのに使用することができる、単一核酸配列中の単一核酸塩基の違いのみが存在し得る。遺伝子配列中の１つまたは複数の核酸塩基が異なる集団内の個体は、サブタイプまたは系統（Ｓｔｒａｉｎ）と呼ばれる。
【０００４】
混合集団から生物の特定の属、種または系統を同定することは、重要な活動である。大抵の場合、そのような研究は、そのような同定または特性評価を行うために、生存生物を互いに分離および精製するための、大規模で、費用がかかり、時間がかかるプロトコールを必要とする。多くの場合、精製は時間がかかり過ぎ、ある特定の集団はこのプロセスを生き延びることができないか、生存生物の存続は解析を実施する技術者に有害であり得る。
【０００５】
系統タイピングの現行方法は、生物の分子特性評価を実施する前に、生物の純粋培養を必要とする。そのような分子特性評価は、配列ベース（多遺伝子座もしくは全ゲノムを含む）アプローチ、マクロ制限消化（ｍａｃｒｏ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｄｉｇｅｓｔ）（パルスフィールドゲル電気泳動）技法またはハイブリダイゼーションベース（自動化もしくは手動リボタイピング）方法を使用して行うことができる。系統を精製するプロセスおよび分子特性評価を実施するプロセスは、両方とも時間的に長く、費用がかかる。現行方法はまた、様々なマーケットセグメントにとって危険である。例えば、食品製造者または病院は、病人からの分離体と直接比較され得る分離体を同定する場合、重大な負担を負う可能性がある。
【０００６】
さらに、環境（食品製造、農業もしくはヘルスケアの状況のいずれか）における、または個々の環境部位における、特定の系統の経時的な存続は、衛生不全の指標となり得る。そのような存続は、製造された生成物の汚染または動物もしくはヒトの病気を導く可能性がある。あるいは、（無秩序なまたは周期的な）断続的な特定の配列の存在は、ある特定の生物による環境への度重なる侵入に関する情報を提供する。
【０００７】
現在、試験機器は、最初に試料から生物を分離することなしには、複合試料から一定量のデータ（すなわち、情報）を引き出し、処理して、そのような系統に関連した詳細を提供することはできない。さらに、従来の分子診断アッセイは、単一アッセイにおいて３〜５種の標的しか検出することができない。この少数の標的は、十分な系統判別力を非常に有用なものにするのに十分な情報ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、環境からの複雑な（すなわち、混合の）生物材料を処理する、および分離物を特に特定することなしに目的の特定の系統の存在を検出するシステムおよび方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、特に、複雑な生物マトリックスからの核酸配列を解析し、そのような配列の存在の調査のために解析を使用するシステムおよび方法を対象とする。一実施形態では、遺伝情報を解析するための方法は、以下の工程を含む：（ｉ）標的中に存在する１つまたは複数の遺伝領域の位置を特定する工程であって、遺伝領域が、標的の２つ以上の変異体の間で異なる遺伝子座を含む工程、（ｉｉ）遺伝子座のそれぞれの特有の配列を検出するように構成されるデバイスを提供する工程、（ｉｉｉ）その遺伝子座を有する生物材料の試料を得る工程、（ｉｖ）標的中に存在する１つまたは複数の遺伝領域に対してアンプリコンを生成する工程、（ｖ）アンプリコンを遺伝子座に対する１種または複数のプローブにハイブリダイズさせる工程であって、１種または複数のプローブが遺伝子座のある変異体にハイブリダイズし、遺伝子座のある変異体にはハイブリダイズしない工程、（ｖｉ）アンプリコンにハイブリダイズした各プローブをデバイスを介して検出する工程、（ｖｉｉ）ハイブリダイズした各プローブに識別子を割り当てる工程であって、識別子が、ハイブリダイズしないプローブに割り当てられた識別子と異なる工程、（ｖｉｉｉ）各プローブに対して割り当てられた識別子をハイブリダイズしたプローブの識別子の記録されるパターンにデバイスを介して変換する工程、（ｉｘ）記録されたパターンを１つまたは複数の記録された他のパターンと比較する工程、および（ｘ）記録されたパターンが１つまたは複数の記録された他のパターンと異なるかどうかを決定する工程。
【００１０】
別の実施形態では、複雑な生物材料において標的生物を系統タイピングするための方法は、以下の工程を含む：（ｉ）可変性の遺伝子座を含む核酸配列を複雑な生物材料からデバイスを介して増幅して、アンプリコンを生成する工程、（ｉｉ）アンプリコンを遺伝子座に対する１種または複数のプローブにハイブリダイズさせる工程であって、第１のハイブリダイゼーションアレイおよび第１のビーズの少なくとも１つにおいて、１種または複数のプローブが遺伝子座のある変異体にハイブリダイズし、遺伝子座のある変異体にはハイブリダイズしない工程、（ｉｉｉ）第１のハイブリダイゼーションアレイおよび第１のビーズの少なくとも１つにおいて、１種または複数のハイブリダイズしたプローブおよび１種または複数のハイブリダイズしないプローブを検出する工程、（ｉｖ）第１のハイブリダイゼーションアレイおよび第１のビーズの少なくとも１つにおいて、各ハイブリダイズしたプローブおよびハイブリダイズしないプローブに識別子を割り当てる工程、（ｖ）第１のハイブリダイゼーションアレイおよび第１のビーズの少なくとも１つにおいて、１つまたは複数の識別子の第１のパターンを生成する工程、（ｖｉ）第１のハイブリダイゼーションアレイおよび第１のビーズの少なくとも１つの第１のパターンを第２のハイブリダイゼーションアレイおよび第２のビーズの少なくとも１つの第２のパターンと比較する工程、ならびに（ｖｉｉ）第１のパターンが第２のパターンと異なるかどうかを決定する工程。
【００１１】
本発明の１つまたは複数の態様は、本明細書の終わりの特許請求の範囲における例として特に指摘され、明確に請求される。本発明の前述のおよび他の目的、特色および利点は、添付の図面と併せて、以下の説明から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、従来技術のシステムのワークステーションで使用される消耗デバイスの例示的実施形態の上面図である。
【００１３】
【図２】図２は、複雑な生物マトリックスからの核酸配列を解析し、そのような配列の存在の調査のために解析を使用するための方法の例示的実施形態のフローチャートである。
【００１４】
【図３】図３は、ハイブリダイゼーションアレイまたはビーズおよびアレイまたはビーズ上の特定の核酸配列に結合するためのアンプリコンを生成するのに必要とされるプライマーを調製するための標的を選択するのに使用され得る、核酸配列間のアライメントの例示的実施形態の図解である。
【００１５】
【図４】図４は、系統特性評価のためにビーズを使用する区別スキームの例示的実施形態の図解である。
【００１６】
【図５Ａ】図５Ａは、系統特性評価のためにハイブリダイゼーションアレイを使用する単純化した３遺伝子座区別スキームの例示的実施形態の図解である。
【００１７】
【図５Ｂ】図５Ｂは、系統特性評価のためにハイブリダイゼーションアレイを使用する単純化した３標的区別スキームの例示的実施形態のさらなる図解である。
【００１８】
【図６Ａ】図６Ａは、アンプリコンにハイブリダイズした、すべての利用可能な変異体遺伝子座プローブスポット、およびスポットのパターンを記録するためのカメラの配向に使用される３スポットを有する、９×３ハイブリダイゼーションアレイの例示的実施形態の上面図である。
【００１９】
【図６Ｂ】図６Ｂは、アンプリコンにハイブリダイズした７つのみの変異体遺伝子座プローブスポットおよびスポットのパターンを記録するためのカメラの配向に利用可能な３スポットを示す、生物材料からの９×３ハイブリダイゼーションアレイの例示的実施形態の上面図、ならびにアンプリコンが、アレイ上の既知の位置に位置するそれらのコンプリメンタリープローブにハイブリダイズしたハイブリダイゼーションイベントのパターンを表す２進コードへのスポット位置の変換を表す表である。
【００２０】
【図７】図７は、両方のアレイ上で同じパターンのアンプリコンハイブリダイゼーションを示す２つの別々の生物材料から生成された、図６Ａおよび図６Ｂと同じプローブおよびカメラ配向スポットの位置配置を有する１対のハイブリダイゼーションアレイの例示的実施形態の上面図である。
【００２１】
【図８】図８は、２つのアレイ上で異なるパターンのアンプリコンハイブリダイゼーションを示す２つのさらなる別々の生物材料から生成された、図６Ａおよび図６Ｂと同じプローブおよびカメラ配向スポットの位置配置を有する１対のハイブリダイゼーションアレイの例示的実施形態の上面図である。
【００２２】
【図９】図９は、純粋培養における分離の必要なくリステリアを系統タイピングする方法の例示的実施形態のタイムラインと比較した、食品安全規制者および疫学者によって使用されるリステリアを系統タイピングする代表的な現行方法のタイムラインであり、再発または特有性についてパターン結果を比較するのに使用される、生成されたパターンを比較する単純化した報告も含む。
【００２３】
【図１０】図１０は、例示的９×３アレイ上のプローブ位置およびプローブタイプを詳述するフィルターキーならびに代替のパターンコーディング手順を含む、リステリア６系統を系統タイピングするための方法の例示的実施形態のチャートである。
【００２４】
【図１１】図１１は、最初に純粋培養から解析され、次に複雑な環境増菌物に添加された異なるリステリア６系統から生成されるハイブリダイゼーションアレイの上面図である。
【００２５】
【図１２】図１２は、スパイクされた陰性環境増菌物（ｓｐｉｋｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）からそれぞれ解析された異なるリステリア１２系統から生成されたハイブリダイゼーションアレイの上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の態様およびそのある特定の特色、利点および詳細を、添付の図面に図示される非限定例に関連して、以下により十分に説明する。本発明を不必要に詳細に不明瞭にしないために、周知の構造に関する説明は省略する。詳細な説明および特定の非限定例は、本発明の態様を示しているが、例示のためのみに与えられ、限定のために与えられるものではないことを理解されたい。根底にある発明概念の趣旨および／または範囲内にある様々な置換、修正、追加および／または配置は、本開示から当業者には明白である。
【００２７】
本発明は、複雑な生物マトリックス由来の核酸配列のパターンの存在を解析し、そのような配列の解析から生成されるパターンの重複またはバリエーションの調査のために解析を使用するためのシステムおよび方法である。このシステムは、例えば、図１に示すＲｈｅｏｎｉｘ  Ｏｐｔｉｍｕｍ（商標）ワークステーションで使用されるカートリッジなどの消耗品を含む従来のワークステーション、およびしたがって試薬を含む試験キット（非表示）を含むことができる。本発明の実施形態の例示的な構造的および機能的態様は、米国特許第８，３８３，０３９号に記載および例示されるワークステーションの要素およびその消耗品と類似しているか、それらを含む。それらの類似性は、公開された特許とともに、本開示および添付の図面のレビューと併せて、当業者によって理解されるべきであり、さらに本明細書で詳細に論じない。図１に示す消耗デバイス（例えば、カートリッジ）の（従来技術）の上面図は、ワークステーションとインターフェイス接続しており、アッセイの例示バージョンが実施される場所である。このデバイスは、流体リザーバー層１７の底部に形成されるトランケートされたチャネル１６に接続したリザーバーを含む流体リザーバー層１７を含む。流体リザーバー層１７中のある特定のリザーバーは、アレイ化プローブへのアンプリコンのハイブリダイゼーションのための低密度核酸プローブアレイ４７を含む。図１に示すものなどのカートリッジと一体となったＲｈｅｏｎｉｘ  Ｏｐｔｉｍｕｍ（商標）ワークステーションは、自動化された様式で、本明細書に記載の方法の工程を実施する。このシステムおよび方法は、ハイブリダイゼーションアレイの代わりの他の手段を使用して、実施することもでき、例えば、それぞれ特有の識別子を含み、それぞれ、それらの自身のオリゴヌクレオチドプローブに結合しており、その結果、各ビーズを解析すること、および本明細書で生成されるパターンに見合ったパターンを生成することによって、ハイブリダイゼーションイベントの解析が達成され得るビーズである。
【００２８】
ここで図２を参照すると、複雑な生物マトリックスからの核酸配列を解析し、そのような配列の解析から生成されるパターンの重複またはバリエーションの調査のために解析を使用するための方法１００のフローチャートが示されている。第１工程１０２では、調査のための標的生物が特定される。そのような標的生物は、標的生物に特有である、および標的生物の系統間で異なる、少なくとも２つの遺伝領域を有するべきである。非標的菌叢の大きなバックグラウンドを含む試料から方法を直接実施するために、標的生物に特有の遺伝領域の選択は重要であり、これは、過度の非標的遺伝物質のバックグラウンド中でさえ、特有の領域によって、アッセイが、標的生物から、存在する遺伝領域のみを増幅することが可能になるからである。
【００２９】
次の工程１０４では、標的生物の特定された遺伝領域内の遺伝子座が特定される。図３に示す実施形態では、示される遺伝領域内に、標的生物の６系統に関して、変異体位置１および変異体位置２に示される２つの遺伝子座変異体が存在する（すなわち、核酸配列に沿って変異体位置１および変異体位置２の塩基対が６系統の間で異なる）。図３に示すように、ハイブリダイゼーションイベントの各潜在的結果は、識別子、例えば、２進数字などが割り当てられる。図３に示すように、６変異体のそれぞれの第１の位置の塩基対は、ＡＡ、ＧＣまたはＧＴでもよい。例では、塩基対合ＡＡは２進数字「１」が割り当てられるが、「ＡＡでない」と呼ばれる任意の他の塩基対合は２進数字「０」が割り当てられる。同様に、６変異体のそれぞれの第２の位置の塩基対はＧＴまたはＡＡでもよい。例では、塩基対合ＧＴは２進数字「１」が割り当てられるが、「ＧＴでない」と呼ばれる任意の他の塩基対合は２進数字「０」が割り当てられる。したがって、二進法を使用してバリエーションを示す２つの遺伝子座では、各核酸配列について合計で４つの可能な２進コードの組み合わせが存在する（「０，０」または「０，１」または「１，０」または「１，１」）。図３に示す実施形態では、標的の６系統が存在し、これらは、４つの可能な２進コードの組み合わせのうちの３つを生成する。例えば、第１の系統は、第１の位置のＡＡ塩基対および第２の位置のＧＴ塩基対の両方を有する。したがって、第１の系統は「１，１」の２進コードを有する。これに対して、第６の系統は第１の位置のＧＴ塩基対および第２の位置のＡＡ塩基対を有する。したがって、第６の系統は「０，０」の２進コードを有する。例は、６系統の間で、３パターンが生成されることをさらに示す。２個の「１，１」パターン、１個の「０，１」パターン、３個の「０，０」パターンおよびゼロ個の「１，０」パターンが存在する。重要なことに、生成されるパターンは、系統１および２を互いに区別しないが、系統１および２を他の４系統と区別する。系統４、５および６も互いに区別されないが、系統１、２および３と区別される。実際には、そのようなバリエーションを示すｎ遺伝子座の選択は、２ｎ（ｎ＝位置の数）までの潜在的なパターンを提供するであろう。例えば、例の２遺伝子座は４つのパターンを生成し、３遺伝子座は８パターンを生成し、４遺伝子座は１６パターンを生成し、５遺伝子座は３２パターンを生成し、６遺伝子座は６４の潜在的なハイブリダイゼーションパターンを提供するなどであり、プローブが調製される多くの遺伝子座に対して同様である。特定の変異体遺伝子座およびプローブの選択は、プローブが十分に小さなグループに変異体を分類する（各グループはパターンを表す）ようでなければならない。一実施形態では、十分に小さなグループでは、最大で３５％の標的生物が任意の１グループに分類される。しかし、グループはまた、各変異体（すなわち、系統）がそれ自身のグループに分類されないほど十分に大きくなければならない。換言すれば、遺伝子座およびプローブは、単一パターンが最大で３５％の標的生物を表すが、標的生物の任意の１つの特定の系統は表さないように選択されなければなない。
【００３０】
工程１０６に示すように、変異体位置が選択された後、増幅反応を実施して変異体位置を含む配列のアンプリコンを生成するために、核酸プライマーが生成される。核酸プローブは次の工程１０８で生成され、各位置について２進結果を生成するために、図３に記載されている方法で、ある特定のアンプリコンにハイブリダイズし、他のアンプリコンにハイブリダイズしないように設計される。標的核酸配列の検出は、標的配列、またはその代わりにそのアンプリコンと実質的に相補的であるヌクレオチド塩基配列を有する核酸プローブの使用を必要とする。選択的アッセイ条件下で、プローブは、試料中に存在する場合に従事者が標的配列の存在を検出することを可能にする方法で、標的配列またはそのアンプリコンにハイブリダイズする。有効なプローブは、標的配列の存在の検出を妨げるであろう任意の核酸配列との非特異的ハイブリダイゼーションを防ぐように設計される。プローブおよび／またはアンプリコンは、検出可能な標識を含むことができ、標識は、例えば、放射標識、蛍光色素、ビオチン、酵素、電気化学的化合物または化学発光化合物である。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、ビーズ上に固定化されたプローブに対するものでもよく、この場合、ビーズは、ビーズそれ自体が特定されるように特定の標識を有することもでき、またはビーズの特定とオリゴヌクレオチド上の標識の組み合わせが使用される。本明細書に記載の方法の一実施形態では、標的配列の有無は、逆ドットブロット（ＲＤＢ）ハイブリダイゼーションを使用して、ワークステーション上のカメラで検出される。ワークステーション上のカメラは、得られたハイブリダイゼーションアレイの画像を取得し、グレイスケール画像処理手順を実行するソフトウェアの制御下で、好結果のハイブリダイゼーションイベントを表すのに十分な暗さである、または好結果のハイブリダイゼーションイベントを表すのには十分な暗さでない、ハイブリダイゼーションスポットを選択する。グレイスケール値は、アッセイ開発の間に生成されたデータを使用して、前もって設定される。次いで、好結果のハイブリダイゼーションは、「１」であり得る識別子、またはアレイ上の位置に対する、ある他の特有の識別子が与えられる。好結果でないハイブリダイゼーションは、「０」であり得る識別子が与えられる。
【００３１】
次の工程１１０では、生物材料の供給源がアッセイにかけられる。そのような生物材料は、その中に含まれる生物が別のものから分離されていないような、天然状態であり得る。一実施形態では、生物材料は純粋培養由来である。別の実施形態では、生物材料は複雑な増菌物由来である。核酸ベースのアッセイを実施する場合、試料の調製は、試料に存在し得る核酸を遊離させ、安定化するための、第１の工程であり、最も重要な工程である。試料調製は、ヌクレアーゼ活性を排除する、および核酸増幅または核酸の検出の潜在的な阻害物質を除去するまたは失活させるのにも役立ち得る。本システムのワークステーションは、試料調製工程のすべてを自動化された様式で実施し、技術者が実施する（すなわち、使用者が実施する）１回のピペット操作工程のみが必要とされる。試験キットおよびワークステーションを利用して、使用者は、細胞溶解および核酸精製（すなわち、ＤＮＡ単離）を行うことにより、試料を調製することができる。純粋培養で標的生物を完全に分離および精製する必要がないパターンタイピングの別の実施形態では、試料の調製は、交差反応性種を除去するために、ワークステーションまたはオフラインのいずれかで実施される予備的な免疫磁気分離（ＩＭＳ）を含む。例えば、予備的なＩＭＳは、特定の標的生物、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に必要とされ得る。
【００３２】
次の工程１１２では、核酸（例えば、ＤＮＡ）を単離した後、使用者からのいかなる追加的な投入もなしで、ワークステーションは精製された核酸を反応リザーバーに移し、ここで、特定の核酸配列の増幅が生じる。生物材料からの特定の遺伝子配列を増幅して、生物材料の核酸配列を得る。特に、核酸増幅は、増幅される核酸配列に相同な配列を含む核酸アンプリコン（すなわち、コピー）の酵素的合成である。当技術分野で行われる核酸増幅手順の例としては、中でも、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ法）（ＳＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写関連増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＡＡ）、Ｃｏｌｄ  ＰＣＲおよび非酵素的増幅技術（ＮＥＡＴ）が挙げられる。
【００３３】
核酸増幅は、試料中に存在する標的配列の量が非常に少ない場合に特に有利である。標的配列を増幅し、合成されたアンプリコンを検出することによって、アッセイの感度が大いに向上され得、これは、目的の生物またはウイルスに属する試料中の核酸の検出をより確実にするために、アッセイの開始時により少ない標的配列しか必要とされないからである。本明細書に記載の方法の一実施形態では、系統間に多型を有する標的生物に特異的な配列が増幅される。換言すれば、標的生物に特異的であるが、検出と系統特性評価の両方が可能な十分な違いも含む配列の増幅である。すなわち、標的生物に特異的（他の属または種に存在しない）であるが、標的の属または種の系統の１００％には存在しない配列が選択される。標的生物の系統が区別され得るように、十分なこれらの配列が選択され、増幅される。
【００３４】
ここで図４を参照すると、ビーズベース型式が示されている。示される実施形態のビーズベース型式では、プローブの各バリエーションを別の蛍光標識されたビーズに加えることができる。ビーズは、どのアンプリコン変異体が存在するかを決定するために、ビーズを照らし、それを、ビーズの蛍光特性と核酸プローブに連結したフルオロフォアの特性の両方について検出器で解析することによって、結合イベントを検出するのに使用される。この場合、蛍光ビーズ１は、そのビーズとプローブのフルオロフォアの両方に対するシグナルを与えると思われ（陽性結果）、一方で、蛍光ビーズ２は、ビーズのみに対するシグナルを与え、そのプローブのフルオロフォアに対するシグナルを与えないと思われ（陰性結果）、これは、相補的なアンプリコンが存在しないからである。本明細書に記載のパターンベースタイピングスキームを形成するために、多くのタイプのビーズ／プローブの組み合わせを高度に多重化することができる。
【００３５】
最終的に、上記の生物材料から生成されたアンプリコンのハイブリダイゼーションの解析は、生物材料から生成されたアンプリコンの特異的なハイブリダイゼーションの有無を決定するために、少なくとも６種のハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、少なくとも６４パターン）を解析することができるように、十分な多重化能力を有するシステムを用いて行われる。上記の例に示すように、所定のプローブ配列とのアンプリコンのハイブリダイゼーションの存在は、プローブ配列のそれぞれについて非存在／存在ハイブリダイゼーション決定因子を提供することができる、比色分析、蛍光定量、Ｘ線検査、電気泳動、質量分析または任意の他のそのような特定分析方法を使用して、得ることができる。
【００３６】
例えば、本明細書に記載の方法の実施形態の次の工程１１４では、アンプリコンは、その相補的プローブによって捕獲される（すなわち、ハイブリダイズされる）。プローブによる捕獲の後、次の工程１１６では、ハイブリダイズしたプローブ（およびハイブリダイズしないプローブ）が検出される。一実施形態では、ワークステーション上のカメラが、アレイ上の増幅産物に結合した酵素の活性により沈着したレポーター分子の暗色化をイメージングすることにより、結合したＤＮＡを検出する。増幅産物が作られない場合（すなわち、ハイブリダイズしないプローブ）、所与のスポットの暗色化はない。別の実施形態では、ハイブリダイズしたプローブを有するビーズは、適切なシステムを用いて、検出され、解析され得る。次の工程１１８では、システムは、上記のイメージングソフトウェアのグレイスケールカットオフ値に基づいて、各プローブ位置に識別子を割り当てる。次の工程１２０では、識別子は識別子のパターンに変換され、パターンは記録され、保存される。
【００３７】
ここで図５Ａおよび５Ｂを参照すると、系統特性評価のための単純化した３遺伝子座区別スキームに関する例示的実施形態の図解が示されている。示される実施形態では、標的生物の系統を識別する３つの遺伝子座（または、プローブハイブリダイゼーションの８つまでの可能なパターンを提供する、図３に示すものより１つ多い塩基対の位置）が存在する。上記のように、アンプリコンとのプローブのハイブリダイゼーションがある場合、２進数字「１」が割り当てられる。同様に、ハイブリダイゼーションがない場合、２進数字「０」が割り当てられる。例えば、図５Ａに示すように、アッセイが、第１のプローブ位置および第３のプローブ位置で２つの暗スポットを示し、第２のプローブ位置にスポットなし（したがって、プローブへのハイブリダイゼーションなし）を示すので、２進コードパターンは「１，０，１」である。別の例では、図５Ｂに示すように、アッセイが、第３のプローブ位置で１つの暗スポットを示し、第１および第２のプローブ位置にスポットなし（したがって、プローブへのハイブリダイゼーションなし）を示すので、２進コードパターンは「０，０，１」である。
【００３８】
ここで図６Ａおよび６Ｂを参照すると、３つのハイブリダイゼーションアレイによる９つの例示的実施形態の上面図が示されている。図６Ａのハイブリダイゼーションアレイは、アンプリコンにハイブリダイズしたすべての利用可能なプローブを示し、暗スポットの間に参照スポットの配置を含む（環状のチェッカーボードパターンで示される）。参照スポットを使用して、正確な画像取得のために、およびアッセイが適切に実施されたことを検証するのを支援するために、ワークステーションのカメラを方向づける。利用されるカメラは、米国特許第８，３８３，０３９号に記載および例示されるものと類似している、ワークステーションに取り付けられた従来のカメラである。それらの類似性は、公開された特許とともに、本開示および添付の図面のレビューと併せて、当業者によって理解されるべきであり、さらに本明細書で詳細に論じない。ハイブリダイゼーションメンブレン上のアレイは、特定のスポットが常にカメラ参照スポットに対して同じ場所にあるように、３列および９行の型式で配置される。カメラによって取得された画像は、ワークステーションで実行され（または、ワークステーションに接続されたデバイスで実行され）、特定のスポットのそれぞれのグレイスケールを特性評価するように設計されている、ソフトウェアプログラムにかけられる。ソフトウェアはグレイスケールの特定の値が提供され、それより上で、ソフトウェアは好結果のハイブリダイゼーションを示す識別子（例えば、「１」）を割り当て、それより下で、好結果でないハイブリダイゼーションを示す異なる識別子（例えば、「０」）を割り当てる。図６Ａのスポットのすべてはハイブリダイズしており、識別子「１」が割り当てられると思われる。
【００３９】
ここで図６Ｂを参照すると、生物材料の試料に由来する代表的なハイブリダイゼーションメンブレンが示されている。方法の工程１２０では、好結果のまたは好結果でないハイブリダイゼーションのいずれかをともなうプローブ位置に割り当てられた識別子が、生物材料に対する識別子のパターン（すなわち、コード）に変換され、パターンは記録され、保存される。そのようなパターンを図示する図６Ｂは、図６Ａに示すものと同じカメラ配向スポットを示す。しかし、ハイブリダイゼーション（または、結合）イベントを示す暗い陽性スポットが少ない。プローブは、図６Ａで使用されるものと同じ行および列形式で配置されている。結合イベント（すなわち、暗スポット）は２進数字「１」が割り当てられ、非結合イベント（すなわち、スポットなし）は２進数字「０」が割り当てられる。割り当てられた「１」および「０」は、各行およびアレイの全体にわたって読み取られた場合、２進コードを生成する。得られた２進コードは、特定の試料からのすべてのハイブリダイズおよび非ハイブリダイズイベントを表す。図６Ｂに示される実施形態では、１行目は２進コード「１，０，１」を有し、「１」は対照スポットを表す。２行目に対する２進コードは２進コード「０，１，１」を有し、「１」は２および３列目の暗い陽性スポットを表す。したがって、生物材料に対するパターン（すなわち、コード）は、左から右および上から下に読まれ得る。図６Ａ〜６Ｂは、配向に使用される３プローブを差し引く２７プローブを提供する３列９行アレイであるので、利用可能な２４プローブを有するアレイを示す。したがって、図６Ａ〜６Ｂのアレイは最大で２２４または１６，７７７，２１６の潜在的なパターンを提供する。
【００４０】
ここで図７および８を参照すると、生物材料から生成されたハイブリダイゼーションアレイの例示的実施形態の上面図が示されている。方法の次の工程１２２では、１つまたは複数のハイブリダイゼーションアレイに対するパターン（すなわち、コード）が比較される。図７は、２つの別々の生物材料から生成された１対のハイブリダイゼーションアレイを示す。試料のそれぞれに対して生成された２進コード（すなわち、パターン）を、各試料について、対応するハイブリダイゼーションアレイの下に示す。図７の各生物材料に対するパターンは、ハイブリダイゼーションイベントを示す、アレイ中の陽性スポットである。２つの別々の生物材料間の同一の２進コードは、試料が変異体の同じセットを含んでいたことを示す。試料は、同じ系統のものでもよいし、または同じパターンを報告する２つの異なる系統由来でもよい（例えば、図３の系統１および２を参照されたい）。２つ以上の試料から生成される特定のパターンの存続は、変化していない１つまたは複数の系統が集団内にあることを示し得る。食品生産環境サンプリングプログラムでは、本発明を使用して開発されたパターン認識アッセイからの結果は、生物を混入する持続的な潜在的最終生成物の危険性を低減するために、衛生標準操作手順（ｓａｎｉｔａｔｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）（ＳＳＯＰ）に対する修正を通知するために使用することができる。これらの生物は、大発生を導く可能性がある病原体、または食品の品質低下と関連する経済的損失を導く可能性がある品質生物（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）のいずれかあり得る。
【００４１】
ここで図８を参照すると、別々の生物材料（同様に、図７に示すものとは異なる）のさらなる対がある。図８に示す別々の生物材料に対する２進コード（すなわち、パターン）は同一ではない。パターンの違いは、ハイブリダイゼーションイベントを示すアレイ上の暗い陽性スポットの位置の違いによって証明される。２つの別々の生物材料間で生成される異なるパターンは、変異体の異なるセットが別々の試料に存在すること、および１つまたは複数の系統または集団の一過的性質を示す。したがって、次の工程、方法の工程１２４は、パターンが一致するか異なるかどうかを決定し、それによって、持続的または一過的として生物材料を特性評価することである。換言すれば、パターンを比較することによって、標的生物［例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）］の１つまたは複数の系統または集団が、１つまたは複数の生物材料中に存在するかどうかを決定することができる。
【００４２】
図６Ａ〜８に示す、解析される各生物材料に対するこれらのパターンの決定（工程１２４）後、最終的な工程１２６は、生物材料のさらなる解析とのその後の比較のために、適切なコンピュータシステム、データベースまたは任意の他の適切な記憶媒体に保存され得る有用な報告を生成することを含む。過去の保存されたパターンのレポジトリと新しく得られたパターンとの比較は、生物材料の試料間の類似性および違いを特定する方法を提供する。そのような比較は、多数の分野の病原体を検出するのに重要である。例えば、長期的に採取される食品製造施設環境、一次生産物または食品の試料から繰り返し起こるパターン（例えば、図７に示すように、繰り返すことが示されるパターン）が見出される場合、標的生物は持続的集団である可能性がある。これに対して、図８に示すように、長期的に採取される試料から異なるまたは一過的なパターンが存在することが見出される場合、標的生物は、異なる集団であること、および別々のリザーバーに由来する可能性がある。
【００４３】
ここで図９を参照すると、純粋培養で分離する必要なく、複雑な増菌物からリステリアを系統タイピングするための方法の例示的実施形態のフローチャートと比較した、リステリアを系統タイピングする現行方法のタイムラインが示されている。要約すると、リステリアを系統タイピングするための現行方法は、試料を増菌する工程から始まり、これは、およそ１〜２日かかる。次に、数時間にわたって、分子診断スクリーニング試験が実施される。その後、培養による分離が実施され、これは、およそ３〜４日間かかる。最後に、１〜７日間にわたって、培養物に対して分子系統タイピングが実施される。したがって、リステリアを系統タイピングするための現行方法の全タイムラインは、およそ５〜１３日間かかる。
【００４４】
さらに図９を参照すると、リステリアを系統タイピングする現行方法が、本発明の例示的実施形態と比較される。純粋培養で分離する必要がない、複雑な増菌物からリステリアを系統タイピングするための方法は、系統タイピングを完了するのに必要とされる時間を劇的に低減させる。現行方法と類似して、例示的実施形態は、試料を増菌することが必要となり、これは、およそ１〜２日かかる。さらに、分子診断スクリーニング試験は、その後１〜４時間にわたって行われる。しかし、本発明が系統タイピングについて現行方法より性能が優れている点は、最終的な工程にある。図９に示す例示的実施形態によれば、系統タイピングは、最大で５時間内で、増菌から直接実施することができる。したがって、４〜１１日間かかる、培養による分離およびそれからの分子系統タイピングの現行方法は、本発明を使用すると５時間に短縮される。最終的に、５〜１３日かかる現行方法と比較して、培養による分離なしで複雑な増菌物から系統タイピングするための方法の例示的実施形態は、およそ２〜３日かかる。図９は、単純化した３試料の報告も示し、これは、試料１（Ｓ１）および試料２（Ｓ２）は新しい特有のパターンであるが、試料３（Ｓ３）は以前に生成されたパターンであることを示す。
【００４５】
ここで図１０を参照すると、リステリア６系統を系統タイピングするための方法の例示的実施形態のチャートが示されている。チャートは、合計で６つの異なるリステリアの系統について、２つの異なる種を示す。血清型の行は、従来の系統タイピング方法からの結果を示す。系統の行に示すように、本発明は、血清型方法を使用して同じであるとみなされる２つの異なる系統を識別することができる（パターン７）。本発明のシステムおよび方法を使用するハイブリダイゼーションアッセイは、血清型の結果の下の行に示される。
【００４６】
図１０に示すように、本発明のシステムおよび方法によるハイブリダイゼーションアッセイは、４つのパターン（６、７、１０および１９）を示す。２つのパターン（７および１９）は、別々の系統に対する同じパターンである。パターンは、示される「フィルターキー」を使用して変換される。フィルターキーは、カメラ配向スポット（または、参照スポット「ＲＳ」）、２つのアッセイ対照スポット（ＭＭ１およびＭＭ２）、２つの種特定スポット（Ｌｍ  ｃｔｒおよびＬ  ｓｐｐ  ｃｔｒ）を示し、ハイブリダイゼーションアレイ上の互いの潜在的なスポット位置に数値を割り当てる。ハイブリダイゼーションアレイをフィルターキーと比較する（一般に、カメラおよび画像処理ソフトウェアによって実施される）ことによって、アレイは数値コードに変換される。例えば、系統４については、アレイは、パターンコード６、１２、１８、２０に変換され、これは、パターン番号１０にさらに変換される。本例で示す２０スポットアレイから生成され得る２２０または１，０４８，５７６までの可能なパターンが存在する。
【００４７】
システムの使用者は、試験した各生物材料について生成される数値コード（すなわち、パターン）またはそれらの報告を受け取る。パターンに基づいて、使用者は、生物材料がリステリアの系統の同じ集団を有するか、またはリステリアの系統の非類似集団を有するかを決定することができる。同じまたは様々な場所からの複数の生物材料を試験する際に、使用者が同じパターンを見続ける場合、使用者は、繰り返しパターンがリステリアの系統の同じ集団を表すことが分かる。数値コードのみで、使用者は、安全な最終生成物を助長するために、衛生標準操作手順（ＳＯＰ）に急速な科学に基づく変化を引き起こすのに十分な知識を有する。
【００４８】
パターンのみを受け取ることは、使用者が他のサブタイピング方法で生じる負担にさらされることが減少するので、使用者のためになる。特に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、リステリアの特定の系統の報告を要求する。次いで、ＦＤＡは、報告されたリステリアの存在を公表し、報告された系統の場所における生産および他の活動を停止し、使用者の代わりに様々なコンプライアンス対策を要求する。したがって、数値コードは、特定の系統を知ることなしに、系統の常在集団または系統の一過的集団が存在するかどうかを知るのに十分な情報を使用者に提供し、強化されたＦＤＡ規制に使用者がさらされることを制限する。
【００４９】
ここで図１１を参照すると、純粋培養からのリステリア系統と複雑な環境増菌物からのリステリア系統の間のアッセイの性能を比較することから生成されたハイブリダイゼーションアレイの上面図が示されている。図１１に示される２セットのハイブリダイゼーションアレイは、純粋培養からまたは複雑な増菌物からのいずれかの、示される特定の系統のそれぞれについて、同一のパターンを有する。複雑な増菌物については、リステリア系統は、事前に増菌したリステリア陰性環境増菌物中に人為的に導入した。特に、純粋培養試料からの同じリステリア複製物を、事前に増菌し、標的生物の存在について陰性であることが見出された環境試料中に播種した。本発明のシステムおよび方法を使用して、添加された環境増菌物を解析した。その結果、ハイブリダイゼーションアレイは、環境由来の様々な生物の混合物中に存在するリステリアを検出し、系統タイピングする。図１１は、使用した分離菌が純粋培養で試験される場合に、および生物材料が環境から採取される場合に、本発明のシステムおよび方法が同じパターンを生成するという証拠である。したがって、図１１によって、現行方法によって現在および日常的に実施される培養による分離および分子系統タイピングは、もはや必要とされず、生物材料を系統タイピングするのにかかる時間を著しく減らすことが確認される。
【００５０】
ここで図１２を参照すると、事前に増菌したリステリア陰性環境増菌物中に添加された１２のリステリア系統から生成されたハイブリダイゼーションアレイの上面図が示されている。アレイによって、本明細書の方法が１２系統を別々の１０パターンに分類できることが確認される。さらなる６系統を加えて、図１１で使用された系統が図１２で再び繰り返されることに留意されたい。アレイは、可変性の遺伝子座の特定のセットが決定される遺伝領域を慎重に選択することによって、本明細書の方法を使用して遺伝子座をアッセイすることから生成されるパターンに基づいて、集団に常在するリステリアの集団を対策可能な情報（ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に分類する確固たる方法が提供されることを示す。増菌された試料中に存在するリステリアは、分子サブタイピングを実施する前に純粋培養で分離される必要がないので、結果は、衛生プロトコールに関する決定を現在利用可能な方法よりもはるかに速く通知するのに使用することができる。この方法はまた、環境モニタリングプログラムの構成要素として分子サブタイピングを実施する費用を著しく低減し、それにより、より幅広い食品生産者が進歩した分子系統特性評価を利用できるようになる。
【００５１】
本発明の説明において（特に、以下の特許請求の範囲において）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および同様の指示対象の使用は、本明細書で別段指示がない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンド用語（すなわち、「含むが、これらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。用語「接続した」は、たとえ何かが介在しているとしても、部分的にまたは完全に含まれた、付着した、または結合したと解釈されるべきである。
【００５２】
本明細書における値の範囲の記述は、本明細書で別段指示がない限り、範囲内に入る別々の各値に個々に言及することの簡略法として働くことが単に意図され、別々の各値は、本明細書に個々に記載されるかのように本明細書に組み込まれる。
【００５３】
本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で別段指示がない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば、「などの」）の使用は、本発明の実施形態をより明確にすることが単に意図され、特に要求がない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。
【００５４】
本明細書のいかなる言語も、特許請求していない任意の要素が本発明の実施に不可欠であると示すものとして解釈されるべきでない。
【００５５】
本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な修正および変更を本発明に行うことができることは当業者には明白である。本発明を開示される特定の形態に限定する意図はなく、それどころか、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の趣旨および範囲内に入るすべての修正、代替構成および等価物を包含することが意図される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内にあるという条件で、本発明の修正および変更を包含することが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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