(57)【要約】  組換え酸性αグルコシダーゼおよび組換え酸性αグルコシダーゼを含む薬学的組成物であって、組換え酸性αグルコシダーゼが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現され、アルグルコシダーゼアルファの、１個または２個のマンノース−６−リン酸残基を保有するＮ−グリカン単位の含有量と比較して、１個または２個のマンノース−６−リン酸残基を保有するＮ−グリカン単位の含有量が増加している、組換え酸性αグルコシダーゼおよび組換え酸性αグルコシダーゼを含む薬学的組成物が提供される。対象に投与するための組換え酸性αグルコシダーゼまたは薬学的組成物を産生、精製および製剤化する方法、および組換え酸性αグルコシダーゼまたは薬学的組成物を使用するポンペ病などの疾患または障害を処置する方法が同様に提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるポンペ病を処置する方法であって、
ｒｈＧＡＡ分子が、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、平均で３〜４個のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して決定されたｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で少なくとも約０．５ｍｏｌのビス−マンノース−６−リン酸（ビス−Ｍ６Ｐ）を第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に含み；
ｒｈＧＡＡの集団が、対象において疾患進行を逆転させることができる投薬量で投与される、方法。
【請求項２】
疾患進行を逆転させることが、対象の筋肉中のリソソームのサイズを低減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
疾患進行を逆転させることが、対象の筋肉中のオートファジーのビルドアップを消滅させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対象において分析された筋線維の６５％未満が、処置後にオートファジーのビルドアップを有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
対象がＥＲＴ−切り替え患者である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＥＲＴ−切り替え患者が、少なくとも２年間、アルグルコシダーゼアルファを用いて以前処置されたことがある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象において分析された筋線維の少なくとも３６％が、処置後に正常または正常に近い所見を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるポンペ病を処置する方法であって、
ｒｈＧＡＡ分子が、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、平均で３〜４個のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定されたｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で少なくとも約０．５ｍｏｌのビス−マンノース−６−リン酸（ビス−Ｍ６Ｐ）を第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に含み；
処置後の対象の筋肉中のグリコーゲン含有量が、アルグルコシダーゼアルファが同じ投薬量で投与された場合よりも速く低減される、方法。
【請求項９】
処置後の対象の筋肉中のグリコーゲン含有量が、アルグルコシダーゼアルファが同じ投薬量で投与された場合の速度より少なくとも約１．２５、１．５、１．７５、２．０または３．０倍速い速度で低減される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１、２、３、４、５または６回投与後に評価した場合に、処置後の対象の筋肉中のグリコーゲン含有量が、アルグルコシダーゼアルファが同じ投薬量で投与された場合よりもさらに有効に低減される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
処置後の対象の筋肉中のグリコーゲン含有量が、アルグルコシダーゼアルファが同じ投薬量で投与された場合よりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、５０％、７５％または９０％さらに有効に低減される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
グリコーゲン含有量が６回投与後に評価される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象が処置後に尿中ヘキソース四糖のレベルの低減を示す、請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
処置後６カ月の尿中ヘキソース四糖のレベルが、ベースラインと比較して少なくとも３０％低減される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象が歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者または歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者であり、処置後６カ月の対象の尿中ヘキソース四糖のレベルが、ベースラインと比較して少なくとも３５％低減される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
対象が、歩行可能ＥＲＴ−未処置患者であり、処置後６カ月の対象の尿中ヘキソース四糖のレベルが、ベースラインと比較して少なくとも４５％低減される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるポンペ病を処置する方法であって、
ｒｈＧＡＡ分子が、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、平均で３〜４個のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定されたｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で少なくとも約０．５ｍｏｌのビス−マンノース−６−リン酸（ビス−Ｍ６Ｐ）を第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に含み；
ｒｈＧＡＡの集団が、対象において運動機能を改善できる投薬量で投与される、方法。
【請求項１８】
対象における運動機能の改善が、６分間歩行検査（６ＭＷＴ）、タイムドアップアンドゴー検査、４段上り検査、１０メートル歩行検査、ガワーズ検査、歩行−段−ガワー−椅子（ＧＳＧＣ）検査およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの運動機能検査によって測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ベースラインと比較して、処置後６カ月の対象の６ＭＷＴ距離が、少なくとも２０メートル増加する、処置後６カ月の対象のタイムドアップアンドゴー検査時間が少なくとも１秒間減少する、処置後６カ月の対象の４段上り検査時間が少なくとも０．６秒間減少する、処置後６カ月の対象の１０メートル歩行検査時間が少なくとも０．７秒間減少する、処置後６カ月の対象のガワーズ検査時間が少なくとも１秒間減少する、または処置後６カ月の対象のＧＳＧＣスコアが少なくとも１減少する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象が、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者であり、ベースラインと比較して、処置後６カ月の対象の６ＭＷＴ距離が、少なくとも２０メートル増加する、処置後６カ月の対象のタイムドアップアンドゴー検査時間が少なくとも１．５秒間減少する、処置後６カ月の対象の４段上り検査時間が少なくとも０．６秒間減少する、または処置後６カ月の対象のガワーズ検査時間が少なくとも１秒間減少する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
対象が、歩行可能ＥＲＴ未処置患者であり、ベースラインと比較して、処置後６カ月の対象の６ＭＷＴ距離が、少なくとも４０メートル増加する、処置後６カ月の対象のタイムドアップアンドゴー検査時間が少なくとも１秒間減少する、処置後６カ月の対象の４段上り検査時間が少なくとも０．６秒間減少する、処置後６カ月の対象の１０メートル歩行検査時間が少なくとも０．７秒間減少する、または処置後６カ月の対象のＧＳＧＣスコアが少なくとも１減少する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
対象が、以前アルグルコシダーゼアルファ酵素補充療法を受けており、以前のアルグルコシダーゼアルファ酵素補充療法後の対象の運動機能検査結果と比較して、ｒｈＧＡＡの集団を用いた処置後に、対象が、少なくとも１つの運動機能検査において改善を示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるポンペ病を処置する方法であって、
ｒｈＧＡＡ分子が、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、平均で３〜４個のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定されたｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で少なくとも約０．５ｍｏｌのビス−マンノース−６−リン酸（ビス−Ｍ６Ｐ）を第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に含み；
ｒｈＧＡＡの集団が、対象において上半身強度を改善できる投薬量で投与される、方法。
【請求項２４】
対象における上半身強度の改善が、徒手筋力スコアによって測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象が、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者であり、処置後６カ月にベースラインと比較して上半身徒手筋力スコアにおいて少なくとも１の改善を示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
対象が、歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者であり、処置後６カ月にベースラインと比較して上半身徒手筋力スコアにおいて少なくとも５．５の改善を示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
対象における上半身強度の改善が、上肢強度の改善であり、上肢強度が、肩内転、肩外転、肘屈曲および肘伸展からなる群から選択される少なくとも１つの上肢筋群の定量的筋力検査または徒手筋力検査によって測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
対象が、歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者であり、ベースラインと比較して処置後６カ月の対象の肩内転が少なくとも８ポンド力改善される、処置後６カ月の対象の肩外転が少なくとも１ポンド力改善される、処置後６カ月の対象の肘屈曲が少なくとも２ポンド力改善される、または処置後６カ月の対象の肘伸展が少なくとも５ポンド力改善される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象が、歩行可能であり、処置後に下半身強度および／または全身強度の改善をさらに示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
対象が、以前アルグルコシダーゼアルファ酵素補充療法を受けており、以前のアルグルコシダーゼアルファ酵素補充療法後の対象の上半身強度と比較して、ｒｈＧＡＡの集団を用いた処置後に、対象が、上半身強度において改善を示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるポンペ病を処置する方法であって、
ｒｈＧＡＡ分子が、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、平均で３〜４個のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定されたｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で少なくとも約０．５ｍｏｌのビス−マンノース−６−リン酸（ビス−Ｍ６Ｐ）を第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に含み；
ｒｈＧＡＡの集団が、対象において肺機能を改善できる投薬量で投与される、方法。
【請求項３２】
対象における肺機能の改善が、直立位努力肺活量（ＦＶＣ）検査、最大呼気圧（ＭＥＰ）検査、最大吸気圧（ＭＩＰ）検査およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの肺機能検査によって測定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ベースラインと比較して、処置後６カ月の対象のＦＶＣが少なくとも４％改善する、処置後６カ月の対象のＭＥＰが少なくとも１６ｃｍＨ２Ｏ改善する、または処置後６カ月の対象のＭＩＰが少なくとも０．３ｃｍＨ２Ｏ改善する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対象が、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者であり、ベースラインと比較して、処置後６カ月の対象のＭＥＰが少なくとも１６ｃｍＨ２Ｏ改善する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
対象が、歩行可能ＥＲＴ−未処置患者であり、ベースラインと比較して、処置後６カ月の対象のＦＶＣが少なくとも４％改善する、または処置後６カ月の対象のＭＩＰが少なくとも１１ｃｍＨ２Ｏ改善する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
対象が、以前アルグルコシダーゼアルファ酵素補充療法を受けており、以前のアルグルコシダーゼアルファ酵素補充療法後の対象の肺機能検査結果と比較して、ｒｈＧＡＡの集団を用いた処置後に、対象が、少なくとも１つの肺機能検査において改善を示す、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるポンペ病を処置する方法であって、
ｒｈＧＡＡ分子が、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、平均で３〜４個のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定されたｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で少なくとも約０．５ｍｏｌのビス−マンノース−６−リン酸（ビス−Ｍ６Ｐ）を第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に含み；
ｒｈＧＡＡの集団が、疲労重症度スケール（ＦＳＳ）スコアによって測定される対象における疲労を低減できる投薬量で投与される、方法。
【請求項３８】
処置後６カ月の対象のＦＳＳスコアが、ベースラインと比較して少なくとも３．５減少する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
対象が歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象が、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者であり、処置後６カ月の対象のＦＳＳスコアが、ベースラインと比較して少なくとも８減少する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４１】
対象が、歩行可能ＥＲＴ−未処置患者であり、処置後６カ月の対象のＦＳＳスコアが、ベースラインと比較して少なくとも５減少する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４２】
対象が、以前アルグルコシダーゼアルファ酵素補充療法を受けており、以前のアルグルコシダーゼアルファ酵素補充療法後の対象のＦＳＳスコアと比較して、ｒｈＧＡＡの集団を用いた処置後に、対象のＦＳＳスコアが低下する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるポンペ病を処置する方法であって、
ｒｈＧＡＡ分子が、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、平均で３〜４個のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定されたｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で少なくとも約０．５ｍｏｌのビス−マンノース−６−リン酸（ビス−Ｍ６Ｐ）を第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に含み；
ｒｈＧＡＡの集団が、クレアチンキナーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの筋損傷バイオマーカーのレベルを低減できる投薬量で投与される、方法。
【請求項４４】
少なくとも１つの筋損傷バイオマーカーがクレアチンキナーゼである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ベースラインと比較して、処置後６カ月の対象のクレアチンキナーゼレベルが少なくとも１５％低減する、処置後６カ月の対象のＡＬＴレベルが少なくとも５％低減するまたは処置後６カ月の対象のＡＳＴレベルが少なくとも５％低減する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
対象が、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者であり、ベースラインと比較して、処置後６カ月の対象のクレアチンキナーゼレベルが少なくとも１５％低減する、処置後６カ月の対象のＡＬＴレベルが少なくとも１５％低減する、または処置後６カ月の対象のＡＳＴレベルが少なくとも１０％低減する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
対象が、歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者であり、ベースラインと比較して、処置後６カ月の対象のクレアチンキナーゼレベルが少なくとも２０％低減する、処置後６カ月の対象のＡＬＴレベルが少なくとも５％低減する、または処置後６カ月の対象のＡＳＴレベルが少なくとも５％低減する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
対象が、歩行可能ＥＲＴ−未処置患者であり、ベースラインと比較して、処置後６カ月の対象のクレアチンキナーゼレベルが少なくとも３５％低減する、処置後６カ月の対象のＡＬＴレベルが少なくとも３５％低減する、または処置後６カ月の対象のＡＳＴレベルが少なくとも３０％低減する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
ｒｈＧＡＡ分子の集団が、約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ｒｈＧＡＡ分子の集団が、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ｒｈＧＡＡ分子の集団が、２カ月に１回、１カ月に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回または毎日投与される、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ｒｈＧＡＡ分子の集団が、２週間に１回投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ｒｈＧＡＡ分子の集団が、静脈内投与される、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ｒｈＧＡＡ分子の集団が、薬理的シャペロンと同時にまたは連続的に投与される、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
薬理的シャペロンが、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩が、経口投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩が、約２００ｍｇから約６００ｍｇの用量で投与される、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩が、約２６０ｍｇの用量で投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ｒｈＧＡＡ分子の集団が、約５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩が、約２３３ｍｇから約５００ｍｇの用量で経口投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩が、約５０ｍｇから約２００ｍｇの用量で経口投与される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
ｒｈＧＡＡ分子の集団が、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩が、約２６０ｍｇの用量で経口投与される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩が、ｒｈＧＡＡの投与に先行して投与される、請求項５５から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩が、ｒｈＧＡＡの投与に約１時間先行して投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
対象が、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩の投与前少なくとも２時間および投与後少なくとも２時間絶食する、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
ｒｈＧＡＡ分子が、配列番号１または配列番号５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
ｒｈＧＡＡ分子が、配列番号１または配列番号５に同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
少なくとも３０％のｒｈＧＡＡ分子が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定される、１つのマンノース−６−リン酸残基（モノ−Ｍ６Ｐ）またはビス−Ｍ６Ｐを保有する１つまたは複数のＮ−グリカン単位を含む、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
ｒｈＧＡＡ分子が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定される、１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり平均で約０．５ｍｏｌから約７．０ｍｏｌのモノ−Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐを含む、請求項１から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
ｒｈＧＡＡ分子が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定される、１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり平均で少なくとも２．５ｍｏｌのＭ６Ｐおよび１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり少なくとも４ｍｏｌのシアル酸を含む、請求項１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ｒｈＧＡＡ分子が、１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり平均で：
（ａ）第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に約０．４から約０．６ｍｏｌのモノ−Ｍ６Ｐ；
（ｂ）第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に約０．４から約０．６ｍｏｌのビス−Ｍ６Ｐ；および
（ｃ）第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に約０．３から約０．４ｍｏｌのモノ−Ｍ６Ｐ；
を含み、
（ａ）〜（ｃ）がＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定される、請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
ｒｈＧＡＡ分子が、１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり約４ｍｏｌから約７．３ｍｏｌのシアル酸をさらに含み；
ｒｈＧＡＡ分子が、１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり平均で：
（ａ）第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に約０．９から約１．２ｍｏｌのシアル酸；
（ｂ）第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に約０．８から約０．９ｍｏｌのシアル酸；および
（ｃ）第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に約１．５から約４．２ｍｏｌのシアル酸
を含み、
（ａ）〜（ｃ）がＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ｒｈＧＡＡ分子の集団が、薬学的組成物に製剤化される、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
薬学的組成物が、クエン酸塩、リン酸塩およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのバッファー、ならびにマンニトール、ポリソルベート８０およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤をさらに含み、薬学的組成物が約５．０から約７．０のｐＨを有する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
薬学的組成物が約５．０から約６．０のｐＨを有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
薬学的組成物が、水、酸性化剤、アルカリ化剤またはこれらの組合せをさらに含む、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
薬学的組成物中の、ｒｈＧＡＡ分子の集団が、約５〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、少なくとも１つのバッファーが、約１０〜１００ｍＭの濃度で存在するクエン酸ナトリウムバッファーであり、少なくとも１つの賦形剤が、約１０〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するマンニトールおよび約０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するポリソルベート８０であり、薬学的組成物が、水をさらに含み、任意選択で酸性化剤および／またはアルカリ化剤を含み；薬学的組成物が、約６．０のｐＨを有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
薬学的組成物中の、ｒｈＧＡＡ分子の集団が、約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、クエン酸ナトリウムバッファーが、約２５ｍＭの濃度で存在し、マンニトールが、約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、ポリソルベート８０が、約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許の相互参照
本出願は、それぞれの優先権が主張され、それぞれが参照によりその全体が組み込まれる、米国仮特許出願第６２／５０６，５６１号、２０１７年５月１５日出願、米国仮特許出願第６２／５０６，５６９号、２０１７年５月１５日出願、米国仮特許出願第６２／５０６，５７４号、２０１７年５月１５日出願、米国仮特許出願第６２／５６４，０８３号、２０１７年９月２７日出願、米国仮特許出願第６２／５６７，３３４号、２０１７年１０月３日出願、米国仮特許出願第６２／６１８，０２１号、２０１８年１月１６日、米国仮特許出願第６２／６２４，６３８号、２０１８年１月３１日出願および米国仮特許出願第６２／６６０，７５８号、２０１８年４月２０日出願の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、医薬、遺伝学および組換え糖タンパク質生化学の分野に関与し、具体的には、細胞上のＣＩＭＰＲを効率的に標的化し、次いでｒｈＧＡＡを、異常に高いレベルに蓄積したグリコーゲンをそれが分解できるリソソームに送達するマンノース−６−リン酸保有Ｎ−グリカンの高い総含有量を有する、組換えヒトα−グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）組成物に関する。本発明のｒｈＧＡＡは、従来のｒｈＧＡＡ産生物と比較して優れた筋細胞への取り込み、次いでリソソームへの送達を示し、ポンペ病を有する対象の酵素補充療法のためにそれを特に有効にする他の薬物動態学的特性を示す。
【０００３】
本発明は、ｒｈＧＡＡと薬理的シャペロンとの組合せを個体に投与することを含む、ポンペ病を処置するための方法も提供する。例えば一部の実施形態では、本発明は、ｒｈＧＡＡとミグルスタットとの組合せを個体に投与することを含む、ポンペ病を処置するための方法を提供する。本発明のｒｈＧＡＡは、ポンペ病を罹患している対象において疾患進行を処置することおよび逆転させることに驚くべき有効性を示す。
【背景技術】
【０００４】
背景
ポンペ病は、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性の欠乏から生じる遺伝性リソソーム貯蔵疾患である。ポンペ病を有する者は、グリコーゲンをグルコース、筋肉のための主なエネルギー源に分解する酵素、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）を欠いているまたはレベルが低減している。この酵素の欠乏は、通常グリコーゲンおよび他の細胞性デブリまたは老廃物を分解する酵素を含有する細胞内オルガネラであるリソソームにおける過剰なグリコーゲン蓄積を生じる。ポンペ病を有する対象のある特定の組織、特に筋肉におけるグリコーゲン蓄積は、正常に機能する細胞の能力を損なう。ポンペ病では、グリコーゲンは、適切に代謝されず、リソソーム、特に骨格筋細胞中および疾患の乳児発症形態では心筋細胞に進行性で蓄積される。グリコーゲンの蓄積は、筋肉および神経の細胞ならびに罹患した他の組織のものを損傷する。
【０００５】
伝統的には、発症年齢に応じてポンペ病は、臨床的に早期小児型または遅発型のいずれかとして認識される。発症年齢は、ポンペ病を生じる遺伝子変異の重度と平行する傾向がある。最も重度の遺伝子変異は、ＧＡＡ活性の完全な喪失を生じ、乳児期の間に早期発症疾患として顕在化する。ＧＡＡ活性を減らすが、完全には除かない遺伝子変異は、発症および進行が遅いポンペ病の形態と関連している。乳児発症ポンペ病は、出生直後に顕在化し、筋力低下、呼吸不全および心不全によって特徴を明らかにされる。未処置であると通常２年以内に致死的である。小児および成人発症ポンペ病は、後年顕在化し、通常乳児発症疾患よりも遅く進行する。この形態の疾患は、一般的に心臓に影響を与えないが、骨格筋および呼吸に関与するものの衰弱のために死に至る場合もある。
【０００６】
ポンペ病の現在の非対症処置は、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）またはアルグルコシダーゼアルファとして周知の組換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）を使用する酵素補充療法（ＥＲＴ）を含む。この従来の酵素補充療法は、ｒｈＧＡＡを投与することによってリソソームにおいて失われているＧＡＡを補充し、それによりリソソームグリコーゲンを分解する細胞の能力を回復させることによってポンペ病を処置しようと努めている。「Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）」および「Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）」は、Ｇｅｎｚｙｍｅによって生物製剤として産生され、市販され、米国食品医薬品局によって承認されているｒｈＧＡＡの従来の形態であり、（本明細書に参照により組み込まれている）Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２０１４）に参照により記載されている。アルグルコシダーゼアルファは、化学名［１９９−アルギニン、２２３−ヒスチジン］プレプロ−α−グルコシダーゼ（ヒト）；分子式、Ｃ４７５８Ｈ７２６２Ｎ１２７４Ｏ１３６９Ｓ３５；ＣＡＳ番号４２０７９４−０５−０として同定されている。これらの産生物は、グリコーゲン貯蔵疾患ＩＩ型（ＧＳＤ−ＩＩ）または酸性マルターゼ欠乏疾患としても周知の、ポンペ病を有する対象に投与される。
【０００７】
ｒｈＧＡＡ分子の細胞取り込みは、筋細胞などの標的細胞上に存在するカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合する、特定の糖、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）によって促進される。結合により、ｒｈＧＡＡ分子は、標的細胞によって取り込まれ、続いて細胞内のリソソームに輸送される。しかし従来のｒｈＧＡＡ産生物のほとんどは、モノ−Ｍ６Ｐ−およびビス−Ｍ６Ｐ保有Ｎ−グリカン（すなわち、それぞれ１つのＭ６Ｐ残基を保有するＮ−グリカンまたは２つのＭ６Ｐ残基を保有するＮ−グリカン）の高い総含有量を有さず、このことはそれらのＣＩＭＰＲを介する細胞取り込みおよびリソソーム送達を制限し、それにより従来の酵素補充療法の有効性を不十分にする。例えば、２０ｍｇ／ｋｇ以上の用量での従来のｒｈＧＡＡ産生物はポンペ病の一部の状況を改善する一方でそれらは、疾患進行を逆行させるように、とりわけ（ｉ）根底にある細胞機能障害を処置する、（ｉｉ）筋肉構造を回復させる、または（ｉｉｉ）骨格筋などの多くの標的組織において蓄積したグリコーゲンを低減することは、十分にはできない。さらに、高用量は、ｒｈＧＡＡを静脈内に投与するために必要な点滴時間を延長するなど、対象および対象を処置する医療従事者に追加の負担を強いる場合がある。組織取り込みが改善され、酵素活性が改善され、安定性が改善され、免疫原性が低減されたｒｈＧＡＡなどの、ポンペ病の処置のための酵素補充療法にさらなる改善の必要がある。
【０００８】
ＧＡＡまたはｒｈＧＡＡのグリコシル化は、Ｃａｎｆｉｅｌｄら、米国特許第６，５３４，３００号に記載されるとおり、Ｍ６Ｐ基を生成するようにホスホトランスフェラーゼおよびアンカバーリング酵素によってインビトロで酵素的に修飾され得る。酵素的グリコシル化は、十分にコントロールされ得ず、望ましくない免疫学的および薬理的特性を有するｒｈＧＡＡを産生する場合がある。酵素的に修飾されたｒｈＧＡＡは、ホスホトランスフェラーゼまたはアンカバーリング酵素でインビトロで潜在的にすべて酵素的にリン酸化される可能性がある高マンノースオリゴ糖だけを含有する場合があり、ＧＡＡの１個あたり平均５〜６個のＭ６Ｐ基を含有する可能性がある。ＧＡＡのインビトロでの酵素処置によって産生されるグリコシル化パターンは、追加の末端マンノース残基、特に非リン酸化末端マンノース残基が、修飾ｒｈＧＡＡの薬物動態に悪影響を与えることから問題がある。そのような酵素的に修飾された産生物がインビボに投与されると、これらのマンノース基は、ＧＡＡの非生産的クリアランスを増加させ、酵素的に修飾されたＧＡＡの免疫細胞による取り込みを増加させ、骨格筋ミオサイトなどの標的組織に到達するＧＡＡの減少によりｒｈＧＡＡ治療有効性を低減する。例えば、末端非リン酸化マンノース残基は、肝臓および脾臓におけるマンノース受容体に対する周知のリガンドであり、酵素的に修飾されたｒｈＧＡＡの急速なクリアランスをもたらし、標的組織へのｒｈＧＡＡの標的化を低減する。さらに、末端非リン酸化マンノース残基を有する高マンノースＮ−グリカンを有する酵素的に修飾されたＧＡＡのグリコシル化パターンは、酵母およびカビにおいて産生される糖タンパク質上のものと類似しており、酵素的に修飾されたｒｈＧＡＡに対して生命を脅かす重度のアレルギー反応（アナフィラキシー）または過敏症反応などの免疫およびアレルギー応答を引き起こすリスクを増加させる。
【０００９】
従来のｒｈＧＡＡ産生物およびｒｈＧＡＡをリン酸化するためのインビトロ法のこれらの欠陥の観点から、本発明者らは、体内分布およびリソソーム取り込みの増強ならびにそれにより投与されたｒｈＧＡＡの非生産的クリアランスを最少化するために最適化されたＮ−グリカンプロファイルを有するｒｈＧＡＡを産生する方法を懸命に探索し、同定した。本発明は、細胞レベルで疾患進行を逆転させる有効な治療を安定または減退ポンペ患者に提供する。本発明者らは、本発明のｒｈＧＡＡが疾患進行を逆転させる−現在の標準治療よりも効率的にリソソームグリコーゲンをクリアすることを含む−および本発明のｒｈＧＡＡを用いて処置される患者が、臨床研究から種々の有効性結果（例えば、実施例１０および１１）において実証されたとおり、筋力、運動機能および／もしくは肺機能における改善を含む、ならびに／または疾患進行における逆転を含む驚くべき顕著な健康改善を示すことも報告する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団を投与することを含む、対象におけるポンペ病などの疾患または障害を処置する方法に関する。
【００１１】
本明細書に記載のｒｈＧＡＡ分子は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現されてよく、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡ分子の集団のＮ−グリコシル化プロファイルは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して決定される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子は、平均で３〜４個のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子は、ｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で少なくとも約０．５ｍｏｌのビス−リン酸化Ｎ−グリカン基（ビス−Ｍ６Ｐ）を第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、配列番号１または配列番号５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、配列番号１または配列番号５と同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の少なくとも３０％の分子は、１つまたは２つのＭ６Ｐ残基を保有する１つまたは複数のＮ−グリカン単位を含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子は、ｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり１つまたは２つのＭ６Ｐ残基を保有するＮ−グリカン単位を平均で約０．５ｍｏｌから約７．０ｍｏｌ含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子は、１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり少なくとも２．５モルのＭ６Ｐ残基および１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり少なくとも４ｍｏｌのシアル酸残基を平均で含む。一部の実施形態では、１ｍｏｌあたり平均で３〜４個のＭ６Ｐ残基および１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり平均で約少なくとも０．５ｍｏｌのビス−Ｍ６Ｐを第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に含むｒｈＧＡＡ分子は、第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり平均で約０．４から約０．６ｍｏｌのモノ−リン酸化Ｎ−グリカン（モノ−Ｍ６Ｐ）、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり約０．４から約０．６ｍｏｌのビス−Ｍ６Ｐ、および第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり約０．３から約０．４ｍｏｌのモノ−Ｍ６Ｐをさらに含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子は、第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり約０．９から約１．２ｍｏｌのシアル酸、第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり約０．８から約０．９ｍｏｌのシアル酸、および第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に１ｍｏｌのｒｈＧＡＡあたり約１．５から約４．２ｍｏｌのシアル酸を含む、ｒｈＧＡＡの１ｍｏｌあたり平均で約４ｍｏｌから約７．３ｍｏｌのシアル酸をさらに含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、薬学的組成物に製剤化される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団を含む薬学的組成物は、クエン酸塩、リン酸塩、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのバッファー、ならびにマンニトール、ポリソルベート８０およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤をさらに含む。一部の実施形態では、薬学的組成物のｐＨは、約５．０から約７．０、約５．０から約６．０または約６．０である。一部の実施形態では、薬学的組成物は、水、��性化剤、アルカリ化剤またはこれらの組合せをさらに含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、６．０のｐＨを有し、約５〜５０ｍｇ／ｍＬ  ｒｈＧＡＡ分子の集団、約１０〜１００ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー、約１０〜５０ｍｇ／ｍＬマンニトール、約０．１〜１ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０および水を含み、任意選択で酸性化剤および／またはアルカリ化剤を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、６．０のｐＨを有し、約１５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＡＡ分子の集団、約２５ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファー、約２０ｍｇ／ｍＬマンニトール、約０．５ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０および水を含み、任意選択で酸性化剤および／またはアルカリ化剤を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、２カ月に１回、１カ月に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回または毎日、例えば２週間に１回与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、静脈内投与される。
【００１３】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、ミグルスタット（ＡＴ２２２１とも称される）などの薬理的シャペロンまたは薬学的に許容されるその塩と同時にまたは連続的に投与される。一部の実施形態では、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩は、例えば約２００ｍｇから約６００ｍｇ、および任意選択で約２６０ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、約５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩は、約２３３ｍｇから約５００ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、約５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩は、約５０ｍｇから約２００ｍｇの用量で経口投与される。一実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩は、約２６０ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態では、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩は、ｒｈＧＡＡ分子の集団の投与に先行して（例えば、約一時間先行して投与される。少なくとも１つの実施形態では、対象は、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩の投与前少なくとも２時間および投与後少なくとも２時間絶食する。
【００１４】
本発明の実施形態は、ポンペ病を有する対象において疾患進行を処置するおよび逆転するための本明細書に記載のｒｈＧＡＡの有効性を実証する。
【００１５】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、対象の疾患進行を逆転できる投薬量で投与される。例えば処置後、対象における筋肉または筋線維は、リソソームのサイズの低減および／またオートファジーのビルドアップの消滅を示す。一部の実施形態では、処置後に、対象において分析された筋線維の６５％未満が、オートファジーのビルドアップを有する。一部の実施形態では、処置後に、対象において分析された筋線維の少なくとも３６％が、正常または正常に近い所見を有する。一部の実施形態では、処置後に疾患進行における逆転を経験する対象は、ＥＲＴ−切り替え患者、例えば、少なくとも２年間、アルグルコシダーゼアルファを用いて以前処置されたＥＲＴ−切り替え患者である。
【００１６】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、アルグルコシダーゼアルファの同じ投薬量よりも速く対象の筋肉中のグリコーゲン含有量を低減できる投薬量で投与される。ｒｈＧＡＡは、アルグルコシダーゼアルファの同じ投薬量よりも少なくとも約１．２５、１．５、１．７５、２．０または３．０倍速くグリコーゲン含有量を低減できる。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、１、２、３、４、５または６回投与後に評価された場合に、同じ投薬量で投与されたアルグルコシダーゼアルファのよりも有効に対象の筋肉中のグリコーゲン含有量をさらに低減できる投薬量で投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、同じ投薬量で投与されたアルグルコシダーゼアルファよりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、５０％、７５％または９０％さらに有効にグリコーゲン含有量を低減する。一部の実施形態では、処置後に、対象は、低レベルのグリコーゲン蓄積バイオマーカー、尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）を示す。少なくとも１つの実施形態では、対象におけるＨｅｘ４レベルは、ベースラインと比較して処置後６カ月に少なくとも３０％低減される。例えば、酵素補充療法を用いて以前処置された（ＥＲＴ−切り替え患者）歩行可能または歩行不能対象は、ベースラインと比較して処置後６カ月にＨｅｘ４レベルの少なくとも３５％の低減を示し得る。別の場合では、酵素補充療法（ＥＲＴ−未処置患者）を以前受けたことがない歩行可能対象は、ベースラインと比較して処置後６カ月にＨｅｘ４レベルの少なくとも４５％の低減を示し得る。
【００１７】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、対象において運動機能を改善できる投薬量で投与される。運動機能における改善は、６分間歩行検査（６ＭＷＴ）、タイムドアップアンドゴー検査（timed up and go test）、４段上り検査（four-stair climb test）、１０メートル歩行検査、ガワーズ検査（gowers test）、歩行−段−ガワー−椅子（gait-stair-gower-chair：ＧＳＧＣ）検査またはこれらの組合せなどの運動機能検査によって測定され得る。一部の実施形態では、処置後６カ月の対象は（ベースラインと比較した場合に）、少なくとも２０メートルの６ＭＷＴ距離の増加、少なくとも１秒間のタイムドアップアンドゴー検査時間の減少、少なくとも０．６秒間の４段上り検査時間の減少、少なくとも０．７秒間の１０メートル歩行検査時間の減少、少なくとも１秒間のガワーズ検査時間の減少および／または少なくとも１のＧＣＳＣスコアの減少を示す。例えば、処置後６カ月に歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者は（ベースラインと比較して）、少なくとも２０メートルの６ＭＷＴ増加、少なくとも１．５秒間のタイムドアップアンドゴー検査時間の減少、少なくとも０．６秒間の４段上り検査時間の減少および／または少なくとも１秒間のガワーズ検査時間の減少を示し得る。別の場合では、処置後６カ月に歩行可能ＥＲＴ−未処置患者は（ベースラインと比較して）、少なくとも４０メートルの６ＭＷＴ距離の増加、少なくとも１秒間のタイムドアップアンドゴー検査時間の減少、少なくとも０．６秒間の４段上り検査時間の減少、少なくとも０．７秒間の１０メートル歩行検査時間の減少および／または少なくとも１のＧＳＧＣスコアの減少を示す場合がある。一部の実施形態では、ＥＲＴ−切り替え患者は、アルグルコシダーゼアルファを用いる以前のＥＲＴ後の患者の運動機能検査結果と比較して、処置後に少なくとも１つの運動機能検査において改善を示す。
【００１８】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、対象において上半身強度を改善できる投薬量で投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、歩行可能対象に投与され、対象において下半身強度および／または全身強度をさらに改善することができる。
【００１９】
一部の実施形態では、上半身強度における改善は、徒手筋力スコアを使用して測定される。対象の徒手筋力スコアは、ベースラインと比較して処置後６カ月に少なくとも１（歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者について）または少なくとも５．５（歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者について）改善し得る。一部の実施形態では、ＥＲＴ−切り替え患者は、アルグルコシダーゼアルファを用いる以前のＥＲＴ後の患者の上半身強度と比較して、処置後に上半身強度において改善を示す。
【００２０】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、肩内転、肩外転（should abduction）、肘屈曲および／または肘伸展の定量的筋力検査または徒手筋力検査によって測定される上肢強度を改善できる投薬量で投与される。例えば、ベースラインと比較して処置後６カ月に、歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者は、少なくとも８ポンド力の肩内転における改善、少なくとも１ポンド力の肩外転における改善、少なくとも２ポンド力の肘屈曲における改善および／または少なくとも５ポンド力の肘伸展における改善を示し得る。
【００２１】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、対象において肺機能を改善できる投薬量で投与される。運動機能における改善は、直立位（座位）努力肺活量検査、最大呼気圧（ＭＥＰ）検査、最大吸気圧（ＭＩＰ）検査またはこれらの組合せなどの肺機能検査によって測定され得る。一部の実施形態では、対象は、処置後６カ月に（ベースラインと比較した場合に）、少なくとも４％のＦＶＣにおける改善、少なくとも１６ｃｍＨ２ＯのＭＥＰにおける改善および／または少なくとも０．３ｃｍＨ２ＯのＭＩＰにおける改善を示す。例えば、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者は、処置後６カ月に（ベースラインと比較して）、少なくとも１６ｃｍＨ２ＯのＭＥＰにおける改善を示す場合がある。別の場合では、歩行可能ＥＲＴ−未処置患者は、処置後６カ月に（ベースラインと比較して）、少なくとも４％のＦＶＣにおける改善および／または少なくとも１１ｃｍＨ２ＯのＭＩＰにおける改善を示す場合がある。一部の実施形態では、ＥＲＴ−切り替え患者は、アルグルコシダーゼアルファを用いる以前のＥＲＴ後の患者の肺機能検査結果と比較して、処置後に少なくとも１つの肺機能検査における改善を示す。
【００２２】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、疲労重症度スケール（fatigue severity scale：ＦＳＳ）スコアにより測定される、対象における疲労を低減できる投薬量で投与される。例えば、対象は、歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者であり、ベースラインと比較して処置後６カ月に少なくとも３．５のＦＳＳスコアの低下を示す。別の例では、対象は、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者であり、ベースラインと比較して処置後６カ月に少なくとも８のＦＳＳスコアの低下を示す。さらに別の例では、対象は、歩行可能ＥＲＴ−未処置患者であり、ベースラインと比較して処置後６カ月に少なくとも５のＦＳＳスコアの低下を示す。一部の実施形態では、ＥＲＴ−切り替え患者は、アルグルコシダーゼアルファを用いる以前のＥＲＴ後の患者のＦＳＳスコアと比較して、処置後に低いＦＳＳスコアを示す。
【００２３】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、少なくとも１つの筋損傷バイオマーカー、例えばクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）またはこれらの組合せのレベルを低減できる投薬量で投与される。一部の実施形態では、処置後６カ月の対象のＣＫレベルは、ベースラインと比較して少なくとも１５％低減され、処置後６カ月の対象のＡＬＴレベルは、ベースラインと比較して少なくとも５％低減される、および／または処置後６カ月の対象のＡＳＴレベルは、ベースラインと比較して少なくとも５％低減される。例えば、対象は、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者であり、ベースラインと比較して処置後６カ月に、少なくとも１５％のＣＫレベルにおける低減、少なくとも１５％のＡＬＴレベルにおける低減および／または少なくとも１０％のＡＳＴレベルにおける低減を示す。別の例では、対象は、歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者であり、ベースラインと比較して処置後６カ月に、少なくとも２０％のＣＫにおける低減、少なくとも５％のＡＬＴレベルにおける低減、および／または少なくとも５％のＡＳＴレベルにおける低減を示す。さらに別の例では、対象は、歩行可能ＥＲＴ−未処置患者であり、ベースラインと比較して処置後６カ月に、少なくとも３５％のＣＫレベルにおける低減、少なくとも３５％のＡＬＴレベルにおける低減、および／または少なくとも３０％のＡＳＴレベルにおける低減を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ａは、非リン酸化高マンノースＮ−グリカン、モノ−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンおよびビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンを示す図である。Ｂは、Ｍ６Ｐ基の化学構造を示している。各四角は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、各円は、マンノースを表し、各Ｐは、リン酸を表す。
【図２】Ａは、Ｍ６Ｐを保有するＮ−グリカンを介したｒｈＧＡＡの標的組織（例えば、ポンペ病を有する対象の筋肉組織）への生産的標的化を示す図である。Ｂは、非標的組織（例えば、肝臓および脾臓）への、または非標的組織への非Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンの結合による、非生産的薬物クリアランスを記載している。
【図３】組換えリソソームタンパク質の製造、捕捉および精製のための例示的プロセスの模式図である。
【図４】ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡを用いてＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡコンストラクトを示す図である。
【図５】図５は、陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムでの捕捉を用いる（実施形態２）または用いない（実施形態１）ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図６Ａ】２つの異なるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術を使用するＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す図である。図６Ａは、ＡＴＢ２００に関する７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位の部位占有率を示している。
【図６Ｂ】２つの異なるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術を使用するＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す図である。図６Ｂは、ＡＴＢ２００に関する第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルの２つの分析を示している。
【図６Ｃ】２つの異なるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術を使用するＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す図である。図６Ｃは、ＡＴＢ２００に関する第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルの２つの分析を示している。
【図６Ｄ】２つの異なるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術を使用するＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す図である。図６Ｄは、ＡＴＢ２００に関する第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルの２つの分析を示している。
【図６Ｅ】２つの異なるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術を使用するＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す図である。図６Ｅは、ＡＴＢ２００に関する第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルの２つの分析を示している。
【図６Ｆ】２つの異なるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術を使用するＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す図である。図６Ｆは、ＡＴＢ２００に関する第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルの２つの分析を示している。
【図６Ｇ】２つの異なるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術を使用するＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す図である。図６Ｇは、ＡＴＢ２００に関する第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルの２つの分析を示している。
【図６Ｈ】２つの異なるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術を使用するＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す図である。図６Ｈは、第１の、第２の、第３の、第４の、第５のおよび第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に関するモノリン酸化およびビス−リン酸化分子種の相対パーセントの概要を述べる図である。
【図７】Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ、薄い線、左側に溶出されている）およびＡＴＢ２００（濃い線、右側に溶出されている）のＰｏｌｙｗａｘ溶出プロファイルを示すグラフである。
【図８】ＢＰ−ｒｈＧＡＡ、ＡＴＢ２００−１およびＡＴＢ２００−２として同定されるＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの３種の異なる調製物と比較したＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）のＮ−グリカン構造の概要を示す表である。
【図９】ＡおよびＢは、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図１０】Ａは、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ（左トレース）のＣＩＭＰＲ結合親和性をＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）（右トレース）のものと比較するグラフである。Ｂは、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのビス−Ｍ６Ｐ含有量を比較する表である。
【図１１】Ａは、種々のＧＡＡ濃度で、正常線維芽細胞内のＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ活性（左トレース）をＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右トレース）と比較するグラフである。Ｂは、種々のＧＡＡ濃度でポンペ病を有する対象由来の線維芽細胞内のＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡ活性（左トレース）をＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右トレース）と比較する表である。Ｃは、正常対象およびポンペ病を有する対象由来の線維芽細胞のＫｕｐｔａｋｅを比較する表である。
【図１２】タンパク質が変性すると増大する蛍光色素としてＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅを使用する熱安定性アッセイにおいて評価された酸性または中性ｐＨバッファー中のＡＴＢ２００の安定性を示すグラフである。
【図１３】アミログルコシダーゼ消化を使用して決定した、ＷＴマウスまたはビヒクル、アルグルコシダーゼアルファもしくはＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１を用いて処置されたＧａａ  ＫＯマウスの組織グリコーゲン含有量を示す図である。バーは、マウス７匹／群の平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ分析の下でダネット法を使用する多重比較でのアルグルコシダーゼアルファと比較。
【図１４】ビヒクル、アルグルコシダーゼアルファもしくはＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１を用いて処置されたＧａａ  ＫＯマウスまたはＷＴマウスの筋線維中のＬＡＭＰ１−陽性ベシクルを示す図である。画像は外側広筋から撮影され、群あたりマウス７匹の代表例である。拡大率＝２００×（挿入内１，０００×）。
【図１５Ａ】ビヒクル、アルグルコシダーゼアルファもしくはＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１を用いて処置されたＧａａ  ＫＯマウスまたはＷＴマウスの筋線維におけるＬＣ３−陽性凝集物を示す図である。画像は外側広筋から撮影され、群あたりマウス７匹の代表例である。拡大率＝４００×。
【図１５Ｂ】ＬＣ３ＩＩタンパク質のウェスタンブロット分析を示す図である。合計３０ｍｇのタンパク質を各レーンにローディングした。
【図１６】ビヒクル、アルグルコシダーゼアルファもしくはＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１を用いて処置されたＧａａ  ＫＯマウスまたはＷＴマウスの筋線維におけるジスフェリン発現を示す図である。画像は外側広筋から撮影され、群あたりマウス７匹の代表例である。拡大率＝２００×。
【図１７】ビヒクル、アルグルコシダーゼアルファまたはＡＴＢ２００を用いて処置されたＧａａ  ＫＯマウスの白色腓腹筋から単離された単一の線維でのＬＡＭＰ１（緑）（例えば「Ｂ」を参照されたい）およびＬＣ３（赤）（例えば「Ａ」を参照されたい）の同時免疫蛍光性染色を示す図である。「Ｃ」は、オートファジーのデブリのクリアランスおよび肥大リソソームの欠如を示す。各動物について最少３０本の線維が検討された。
【図１８】それぞれ１７μＭおよび１７０μＭ  ＡＴ２２２１でのＡＴ２２２１によるＡＴＢ２００の安定化をＡＴＢ２００単独と比較して示す図である。
【図１９Ａ】ＡＴＢ２００−０２研究設計を示す図である。低用量＝１３０ｍｇ  高用量＝２６０ｍｇ  図２６Ａでは、「６ＭＷＴ」＝６分間歩行検査；「ＦＶＣ」＝努力肺活量；「ＱＯＷ」＝隔週；「ａ」＝コホート１からの２名のセンチネル患者由来の安全性データはコホート２および３における投薬前に各用量レベルで審査された；「ｂ」＝ステージ２および３の間に、ＡＴ２２２１はＡＴＢ２００静脈内注入の開始に先行して経口投与された。すべての用量について、ＡＴＢ２００は、４時間の継続時間で静脈内注入された。「ｃ」＝コホート２および３での最初の２名の患者は、それらそれぞれのコホートについてのセンチネル患者とされた。
【図１９Ｂ】ＡＴＢ２００−０２研究設計を示す図である。低用量＝１３０ｍｇ  高用量＝２６０ｍｇ  図２６Ａでは、「６ＭＷＴ」＝６分間歩行検査；「ＦＶＣ」＝努力肺活量；「ＱＯＷ」＝隔週；「ａ」＝コホート１からの２名のセンチネル患者由来の安全性データはコホート２および３における投薬前に各用量レベルで審査された；「ｂ」＝ステージ２および３の間に、ＡＴ２２２１はＡＴＢ２００静脈内注入の開始に先行して経口投与された。すべての用量について、ＡＴＢ２００は、４時間の継続時間で静脈内注入された。「ｃ」＝コホート２および３での最初の２名の患者は、それらそれぞれのコホートについてのセンチネル患者とされた。
【図１９Ｃ】コホート１、２および３にわたって登録された患者のベースライン特徴の概要を述べる図である。「ＮＡ」＝適用不可。「ＳＤ」＝標準偏差。「ａ」＝コホート１患者は、ベースラインで２〜６年間アルグルコシダーゼアルファを受けるよう要求された。ＬＯＰＤ＝遅発型ポンペ病。
【図２０】ＡＴ２２２１についての薬物動態データを示す表である。「ＡＵＣ」＝曲線下面積；「ＣＬ／Ｆ」＝ＡＴ２２２１経口生物学的利用率について調整された血漿クリアランス；「Ｃｍａｘ」＝最大薬物濃度；「ＣＶ」＝変動係数；「ｔ１／２」＝半減期；「ｔｍａｘ」＝最大薬物濃度までの時間；「ＶＺ／Ｆ」＝ＡＴ２２２１経口生物学的利用率について調整された見かけの最終相分布容積。「ａ」＝幾何平均（ＣＶ％）；「ｂ」＝中央値（最小−最大）；「ｃ」＝加算平均（ＣＶ％）。
【図２１】コホート１および３についてのシグネチャーペプチドＴ０９による総ＧＡＡタンパク質を示す表である。「ＡＵＣ」＝曲線下面積；「ＣＬＴ」＝全身クリアランス；「Ｃｍａｘ」＝最大薬物濃度；「ＣＶ」＝変動係数；「ＭＤ」＝複数用量；「ｔ１／２」＝半減期；「ｔｍａｘ」＝最大薬物濃度までの時間；「Ｆｒｅｌ」＝２０ｍｇ／ｋｇ  ＡＴＢ  ２００単独および１０ｍｇ／ｋｇ  ＡＴＢ２００単独対５ｍｇ／ｋｇ  ＡＴＢ２００単独、ならびに２０ｍｇ／ｋｇ  ＡＴＢ２００＋低用量または高用量ＡＴ２２２１対２０ｍｇ／ｋｇ  ＡＴＢ２００単独のＡＵＣ比。「ａ」＝幾何平均（ＣＶ％）；「ｂ」＝中央値（最小−最大）；「ｃ」＝加算平均（ＣＶ％）；「ｄ」＝ｎ＝１１；「ｅ」＝ｎ＝５  低用量＝１３０ｍｇ  高用量＝２６０ｍｇ。
【図２２Ａ−Ｂ】コホートごとの総ＧＡＡタンパク質を示すグラフである。低用量＝１３０ｍｇ  高用量＝２６０ｍｇ。Ａは、コホート１（単一用量）に関する平均総ＧＡＡタンパク質濃度−時間プロファイルを示している。Ｂは、コホート１（複数用量）に関する平均総ＧＡＡタンパク質濃度−時間プロファイルを示している。
【図２２Ｃ−Ｄ】コホートごとの総ＧＡＡタンパク質を示すグラフである。低用量＝１３０ｍｇ  高用量＝２６０ｍｇ。Ｃは、コホート１対コホート３（単一用量）に関する平均総ＧＡＡタンパク質濃度−時間プロファイルを示している。Ｄは、コホート１対コホート３（複数用量）に関する平均総ＧＡＡタンパク質濃度−時間プロファイルを示している。
【図２２Ｅ−Ｆ】コホートごとの総ＧＡＡタンパク質を示すグラフである。低用量＝１３０ｍｇ  高用量＝２６０ｍｇ。Ｅは、投薬後１２時間で２０ｍｇ／ｋｇ  ＡＴＢ２００と比較した総ＧＡＡタンパク質を示している；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｆは、投薬後２４時間で２０ｍｇ／ｋｇ  ＡＴＢ２００と比較した総ＧＡＡタンパク質を示している；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；「ｎｓ」＝有意でない。
【図２３】シグネチャーペプチドＴ０９による総ＧＡＡタンパク質についての変動の分析（ＡＮＯＶＡ）を示す表である。曲線下面積（ＡＵＣ）は、μｇ・ｈ／ｍＬで示されている；「ＣＩ」＝信頼区間。
【図２４Ａ】６分間歩行検査（「６ＭＷＴ」）の分析の概要および入手できる中間データを示す図であり、コホート１およびコホート３の患者についての６カ月、９カ月および１２カ月でのベースラインからの変化（「ＣＦＢＬ」）を示している。
【図２４Ｂ】コホート１およびコホート３の個々の患者についての６ＭＷＴデータを示す表である。
【図２４Ｃ】他の運動機能検査：タイムドアップアンドゴー運動機能検査、４段上り検査、１０メートル（１０Ｍ）歩行検査、ガワーズおよび歩行−段−ガワー−椅子（「ＧＳＧＣ」）運動機能検査からの分析の概要および入手できる中間データを示す図であり、コホート１およびコホート３の患者についての６カ月、９カ月および１２カ月でのベースラインからの変化（「ＣＦＢＬ」）を示している。ＧＳＧＣは、４つの運動機能評価：歩行（１０メートル歩行）、４段上り、ガワーズ（床から立ち上がる）および椅子から立ち上がる、の観察者評価複合スコアである。各検査は、１（正常）から７（実施不能；椅子から立ち上がる検査については最大スコア６）でスコア化される。合計スコアは、４から２７の範囲である。「ａ」＝ｎ＝９、は、患者が検査実施を拒否したために得られなかった欠測値；「ｂ」＝ベースラインからの中央値変化は−１．５であった、患者７／９名は減少を有した；「ｃ」＝ベースラインからの中央値変化は−０．８であった、患者４／５名は減少を有した。
【図２５】筋力検査（ＱＭＴ）の分析の概要および入手できる中間データを示す図であり、コホート２の患者についての６カ月および９カ月でのベースラインからの変化（「ＣＦＢＬ」）を示している。ＱＭＴ＝定量化筋力検査。値は、右側および左側を合わせたポンド力で表して示されている。「ａ」＝肩内転は、対象１名について入手できなかった；「ｂ」＝スコア化：（１）目に見える筋肉の動きだが関節での動きではない；（２）関節での動きだが、重力に反していない；（３）重力に反する動きだが、付加抵抗に対してではない；（４）付加抵抗に反する動きだが、正常未満；（５）正常な強度。
【図２６Ａ】コホート１患者における徒手筋力検査（ＭＭＴ）スコアの分析の概要および入手できる中間データを示す図である。ＭＭＴスコアは、上半身（最大スコア：４０）、下半身（最大スコア：４０）および全身（最大スコア：８０）について算出された。徒手筋力強度における増加がコホート１患者において６、９および１２カ月で観察された。「ＳＤ」＝標準偏差。
【図２６Ｂ】コホート２患者における徒手筋力検査（ＭＭＴ）スコアの分析の概要および入手できる中間データを示す図である。ＭＭＴスコアは、上半身（最大スコア：４０）について算出された。徒手筋力強度における増加がコホート２患者において６および９カ月で観察された。「ＳＤ」＝標準偏差。ＭＭＴ結果は、ＱＭＴ結果（図２８に示す）と全般に一致した。
【図２６Ｃ】コホート３患者における徒手筋力検査（ＭＭＴ）スコアの分析の概要および入手できる中間データを示す図である。ＭＭＴスコアは、上半身（最大スコア：４０）、下半身（（最大スコア：４０）および全身（（最大スコア：８０）について算出された。徒手筋力強度における増加がコホート３患者について６、９および１２カ月でそれぞれ観察された。「ＳＤ」＝標準偏差。
【図２７】座位努力肺活量（ＦＶＣ）、最大吸気圧（ＭＩＰ）および最大呼気圧（ＭＥＰ）からの分析の概要および入手できる中間データを示す図であり、コホート１およびコホート３の患者についての６カ月、９カ月および１２カ月でのベースラインからの変化（「ＣＦＢＬ」）を示している。「ａ」＝ＦＶＣは対象１名について入手できなかった。ＭＥＰおよびＭＩＰは、ｃｍＨ２Ｏで測定された。
【図２８】疲労重症度スケール（「ＦＳＳ」）、それぞれ１から７のスケールでスコア化される９個の質問からなる自己評価質問票の分析の概要および入手できる中間データを示す図である。合計スコアは、９から６３の範囲であり、高い値は、疾患状態によるより高いレベルの疲労を表す。健康な集団での標準値は、約２１である。図２８は、コホート１、コホート２およびコホート３の患者についての６カ月、９カ月および１２カ月でのベースラインからの変化（「ＣＦＢＬ」）を示している。
【図２９Ａ】すべての患者コホートにおける傷害マーカー（アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびクレアチンキナーゼ）のマーカーにおけるベースラインからの平均百分率変化を示す図である。図２９Ａは、５８週間にわたるコホート１患者からのデータを示している。「ＢＬ」＝ベースライン。「ＳＥ」＝標準誤差。「ＷＫ」＝週。「Ｍ」＝月。
【図２９Ｂ】すべての患者コホートにおける傷害マーカー（アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびクレアチンキナーゼ）のマーカーにおけるベースラインからの平均百分率変化を示す図である。図２９Ｂは、２４週間にわたるコホート２患者からのデータを示している。「ＢＬ」＝ベースライン。「ＳＥ」＝標準誤差。「ＷＫ」＝週。「Ｍ」＝月。
【図２９Ｃ】すべての患者コホートにおける傷害マーカー（アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびクレアチンキナーゼ）のマーカーにおけるベースラインからの平均百分率変化を示す図である。図２９Ｃは、３６週間にわたるコホート３患者からのデータを示している。「ＢＬ」＝ベースライン。「ＳＥ」＝標準誤差。「ＷＫ」＝週。「Ｍ」＝月。
【図２９Ｄ】コホート１、コホート２およびコホート３の患者について１２カ月までの筋損傷（ＣＫ＝クレアチンキナーゼ）および疾患基質（Ｈｅｘ４＝尿中ヘキソース四糖）のマーカーにおけるベースラインからの平均百分率変化を示している。「ＢＬ」＝ベースライン。「ＳＥ」＝標準誤差。「ＷＫ」＝週。「Ｍ」＝月。
【図３０】ＡＴＢ２００−０２研究からの安全性データの概要を述べる図である。「ＡＥ」＝有害事象「ＩＡＲ」＝点滴関連反応；「ａ」＝中間データ分析を通じて報告された（最大２０＋カ月）；「ｂ」＝上腹部および下腹部痛を含む。
【図３１】ＡＴＢ２００−０２研究から入手できる有効性および安全性データを要約する図である。
【図３２Ａ−Ｈ】プロテアーゼ消化ＡＴＢ２００のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を使用する、第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位についてのＮ−グリコシル化プロファイルを含む、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ−グリコシル化分析の結果を示す図である。図３２Ａ〜３２Ｈは、異なる規模で産生されたＡＴＢ２００の１０個のロットについての平均データを提供する。
【図３２Ａ】ＡＴＢ２００に関する７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位平均部位の占有率を示している。Ｎ−グリコシル化部位は、配列番号１により提供される。ＣＶ＝変動係数。
【図３２Ｂ】ＡＴＢ２００に対する７個すべての潜在的Ｎ−グリコシル化部位の部位特異的Ｎ−グリコシル化分析を、配列番号５に従って提示される部位番号と共に示す図である。バーは、分析したＡＴＢ２００の１０個のロットについて特定のＮ−グリカン基として同定したＮ−グリカン分子種の最大および最小百分率を示す図である。図３２Ｂは、ＡＴＢ２００に対する第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。
【図３２Ｃ】ＡＴＢ２００に対する７個すべての潜在的Ｎ−グリコシル化部位の部位特異的Ｎ−グリコシル化分析を、配列番号５に従って提示される部位番号と共に示す図である。バーは、分析したＡＴＢ２００の１０個のロットについて特定のＮ−グリカン基として同定されたＮ−グリカン分子種の最大および最小百分率を示す図である。図３２Ｃは、ＡＴＢ２００に対する第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。
【図３２Ｄ】ＡＴＢ２００に対する７個すべての潜在的Ｎ−グリコシル化部位の部位特異的Ｎ−グリコシル化分析を、配列番号５に従って提示される部位番号と共に示す図である。バーは、分析したＡＴＢ２００の１０個のロットについて特定のＮ−グリカン基として同定されたＮ−グリカン分子種の最大および最小百分率を示す図である。図３２Ｄは、ＡＴＢ２００に対する第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。
【図３２Ｅ】ＡＴＢ２００に対する７個すべての潜在的Ｎ−グリコシル化部位の部位特異的Ｎ−グリコシル化分析を、配列番号５に従って提示される部位番号と共に示す図である。バーは、分析したＡＴＢ２００の１０個のロットについて特定のＮ−グリカン基として同定されたＮ−グリカン分子種の最大および最小百分率を示す図である。図３２Ｅは、ＡＴＢ２００に対する第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。
【図３２Ｆ】ＡＴＢ２００に対する７個すべての潜在的Ｎ−グリコシル化部位の部位特異的Ｎ−グリコシル化分析を、配列番号５に従って提示される部位番号と共に示す図である。バーは、分析したＡＴＢ２００の１０個のロットについて特定のＮ−グリカン基として同定されたＮ−グリカン分子種の最大および最小百分率を示す図である。図３２Ｆは、ＡＴＢ２００に対する第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。
【図３２Ｇ】ＡＴＢ２００に対する７個すべての潜在的Ｎ−グリコシル化部位の部位特異的Ｎ−グリコシル化分析を、配列番号５に従って提示される部位番号と共に示す図である。バーは、分析したＡＴＢ２００の１０個のロットについて特定のＮ−グリカン基として同定されたＮ−グリカン分子種の最大および最小百分率を示す図である。図３２Ｇは、ＡＴＢ２００に対する第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。
【図３２Ｈ】ＡＴＢ２００に対する７個すべての潜在的Ｎ−グリコシル化部位の部位特異的Ｎ−グリコシル化分析を、配列番号５に従って提示される部位番号と共に示す図である。バーは、分析したＡＴＢ２００の１０個のロットについて特定のＮ−グリカン基として同定されたＮ−グリカン分子種の最大および最小百分率を示す図である。図３２Ｈは、ＡＴＢ２００に対する第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。
【図３３Ａ】図３２Ａ〜３２Ｈにも示されるＡＴＢ２００のＮ−グリコシル化プロファイルの特徴をさらに明らかにし、概要を述べる図である。図３３Ａは、ＡＴＢ２００の２−アントラニル酸（２−ＡＡ）グリカンマッピングおよびＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析を示し、総蛍光の百分率としてＡＴＢ２００において同定されたＮ−グリカン分子種の概要を述べている。２−ＡＡグリカンマッピングおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析からのデータは、表５にも示されている。
【図３３Ｂ】図３２Ａ〜３２Ｈにも示されるＡＴＢ２００のＮ−グリコシル化プロファイルをさらに特徴を明らかにし、概要を述べる図である。図３３Ｂは、ＡＴＢ２００に対する７個すべての潜在的Ｎ−グリコシル化部位について、平均部位占有率ならびに、総リン酸化、モノリン酸化、ビス−リン酸化およびシアル化を含む平均Ｎ−グリカンプロファイルの概要を述べている。ＮＤ＝不検出。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明のいくつかの例示的実施形態を記載する前に、本発明が、続く記載に記される構築またはプロセスステップの詳細に限定されないことが理解される。本発明は、他の実施形態を可能にし、種々の方法で行ったり実行したりすることができる。
【００２６】
Ｉ．定義
本明細書において使用される用語は、本発明の内容におけるおよび各用語が使用される具体的な内容における当該技術分野でのそれらの通常の意味を一般に有する。ある特定の用語は、本発明の組成物および方法ならびにそれらをどのように作製および使用するかを記載して、施術者に追加的な指針を提供するために、下に、または本明細書他所で考察される。冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、冠詞の文法的目的物の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指す。用語「または」は、内容が他を明確に示さない限り、用語「および／または」を意味し、互換的に使用される。本出願において単数形の使用は、別に具体的に明記しない限り複数形を含む。さらに用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定ではない。本明細書に記載される任意の範囲は、エンドポイントおよびエンドポイント間のすべての値を含むと理解される。語または必要な関連事項を表現するために内容が他を必要とする場合を除いて、本明細書において、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、包括的意味で使用される、すなわち、本発明の種々の実施形態において述べられる特性の存在を特定するが、さらなる特性の存在または付加を除外しない。
【００２７】
用語「ＧＡＡ」は、リソソームグリコーゲンのα−１，４−およびα−１，６−グリコシド連結の加水分解を触媒するヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）酵素ならびにＧＡＡアミノ酸配列および酵素活性を発揮する長いＧＡＡ配列の断片の挿入、関連または置換変異体を指す。ヒト酸性αグルコシダーゼは、ＧＡＡ遺伝子（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）遺伝子番号２５４８）によってコードされ、第１７番染色体の長腕（位置１７ｑ２５．２−ｑ２５．３）にマッピングされている。ＧＡＡをコードする例示的ＤＮＡ配列は、ＮＰ  ０００１４３．２であり、参照により組み込まれる。５００を超える変異がヒトＧＡＡ遺伝に中に現在同定されており、その多くはポンペ病に関連している。酸性αグルコシダーゼ酵素のミスフォールディングまたはミスプロセシングを生じる変異として、Ｔ１０６４Ｃ（Ｌｅｕ３５５Ｐｒｏ）およびＣ２１０４Ｔ（Ａｒｇ７０２Ｃｙｓ）が挙げられる。追加的に、酵素の成熟およびプロセシングに影響を与えるＧＡＡ変異として、Ｌｅｕ４０５ＰｒｏおよびＭｅｔ５１９Ｔｈｒが挙げられる。アミノ酸残基５１６〜５２１の保存されたヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥは、酸性αグルコシダーゼタンパク質の活性のために必要とされている。本明細書において使用される場合、略号「ＧＡＡ」は、ヒト酸性αグルコシダーゼ酵素を指すことが意図され、一方で、斜体の略号「ＧＡＡ」は、ヒト酸性αグルコシダーゼ酵素をコードするヒト遺伝子を指すことが意図される。斜体の略号「Ｇａａ」は、これだけに限らないがラットまたはマウス遺伝子を含む、非ヒト酸性αグルコシダーゼ酵素をコードする非ヒト遺伝子を指すことが意図され、略号「Ｇａａ」は、非ヒト酸性αグルコシダーゼ酵素を指すことが意図される。
【００２８】
用語「ｒｈＧＡＡ」は、組換えヒト酸性αグルコシダーゼ酵素を指すことが意図され、内因性のＧＡＡを合成または組換え産生ＧＡＡ（例えば、ＧＡＡをコードするＤＮＡを用いて形質転換したＣＨＯ細胞から産生されるＧＡＡ）から識別するために使用される。用語「ｒｈＧＡＡ」は、個々のｒｈＧＡＡ分子の集団を包含する。ｒｈＧＡＡ分子の集団の特性は、本明細書において提供される。用語「従来のｒｈＧＡＡ産生物」は、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）またはＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）などのアルグルコシダーゼアルファを含有する産生物を指すことが意図される。
【００２９】
用語「遺伝的に修飾された」または「組換え」は、コード配列の発現をコントロールする制御因子要素と共に遺伝子産物をコードするコード配列を含む核酸の導入後に、ｒｈＧＡＡなどの特定の遺伝子産物を発現するＣＨＯ細胞などの細胞を指す。核酸の導入は、遺伝子標的化および相同組換えを含む、当該技術分野で周知の任意の方法によって達成され得る。本明細書において使用される場合、用語は、例えば、遺伝子活性化技術によって、そのような細胞によって通常発現されない内因性遺伝子または遺伝子産物を発現または過発現するように操作された細胞も含む。
【００３０】
本明細書において使用される場合、用語「精製された」は、物質が得られた天然物質を含む無関係な物質、すなわち夾雑物の存在を低減または除く条件下で単離された物質を指す。例えば、精製タンパク質は、細胞中で関連している他のタンパク質または核酸を好ましくは実質的に含まず；精製核酸分子は、細胞内において見出され得るタンパク質または他の無関係の核酸分子を実質的に含まない。本明細書において使用される場合、用語「実質的に含まない」は、物質の分析的検査の内容において操作上で使用される。好ましくは、夾雑物を実質的に含まない精製された物質は、少なくとも９５％純粋であり；より好ましくは少なくとも９７％純粋であり、さらにより好ましくは少なくとも９９％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、酵素的アッセイおよび当該技術分野で周知の他の方法によって評価され得る。具体的な実施形態では、精製は、夾雑物のレベルがヒトまたは非ヒト動物への安全な投与のために規制当局によって許容されるレベルを下回っていることを意味する。ｒｈＧＡＡなどの組換えタンパク質は、クロマトグラフィーでのサイズ分離、アフィニティークロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる当該技術分野で周知の方法を使用してＣＨＯ細胞から単離または精製され得る。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、陰イオン交換クロマトグラフィーに続いて固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、任意選択で続いて第３のクロマトグラフィーカラムを使用する精製を含む方法によって精製される。
【００３１】
本明細書において使用される場合、用語「アルグルコシダーゼアルファ」は、［１９９−アルギニン，２２３−ヒスチジン］プレプロ−α−グルコシダーゼ（ヒト）；化学情報検索登録番号４２０７９４−０５−０として同定される組換えヒト酸性αグルコシダーゼを指すことが意図される。アルグルコシダーゼアルファは、製品Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）として、Ｇｅｎｚｙｍｅによる米国における販売について承認されている。
【００３２】
本明細書において使用される場合、用語「ＡＴＢ２００」は、その開示が本明細書に参照により組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５３２５２号に記載される、組換えヒト酸性αグルコシダーゼを指すことが意図される。
【００３３】
本明細書において使用される場合、用語「グリカン」は、タンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸残基に共有結合的に結合する多糖鎖を指すことが意図される。本明細書において使用される場合、用語「Ｎ−グリカン」または「Ｎ−結合グリカン」は、アミノ酸残基の窒素原子への共有結合を通じてタンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸残基に結合している多糖鎖を指すことが意図される。例えば、Ｎ−グリカンは、アスパラギン残基の側鎖窒素原子に共有結合的に結合できる。グリカンは、１個または数個の単糖単位を含有する場合があり、単糖単位は、直鎖または分岐鎖を形成するように共有結合的に連結されてよい。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡに結合するＮ−グリカン単位は、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトース、フコース、マンノース−６−リン酸またはシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つまたは複数の単糖単位を含んでよい。タンパク質上のＮ−グリカン単位は、質量分析などの、任意の適切な分析技術によって決定され得る。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡに結合したＮ−グリカン単位は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ（商標）Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ  Ｔｒｉｂｉｄ（商標）Ｍａｓｓ  ＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒまたはＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ（登録商標）Ｇ２−ＸＳ  ＱＴｏｆＭａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒなどの装置を利用して、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって決定される。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語「高マンノースＮ−グリカン」は、１個から６個以上のマンノース単位を有するＮ−グリカンを指すことが意図される。一部の実施形態では、高マンノースＮ−グリカン単位は、アスパラギン残基に結合し、分枝ポリマンノース鎖にさらに結合したビス（Ｎ−アセチルグルコサミン）鎖を含有する場合がある。本明細書において互換的に使用される場合、用語「Ｍ６Ｐ」または「マンノース−６−リン酸」は、６位でリン酸化されたマンノース単位を指すことが意図される、すなわち、６位でヒドロキシル基に結合したリン酸基を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＮ−グリカン単位の１つまたは複数のマンノース単位は、マンノース−６−リン酸単位を形成するように６位でリン酸化される。一部の実施形態では、用語「Ｍ６Ｐ」または「マンノース−６−リン酸」は、リン酸基での「キャップ」としてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するマンノースホスホジエステルならびに、ＧｌｃＮＡｃキャップを欠いている露出したリン酸基を有するマンノース単位の両方を指す。少なくとも１つの実施形態では、タンパク質のＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃキャップを有する少なくとも１つのＭ６Ｐ基およびＧｌｃＮＡｃキャップを欠いている少なくとも１つの他のＭ６Ｐ基含む複数のＭ６Ｐ基を有する場合がある。
【００３５】
本明細書において使用される場合、用語「複合Ｎ−グリカン」は、ＧｌｃＮａｃおよびマンノース以外の種類の糖類、例えば１つまたは複数のガラクトースおよび／またはシアル酸単位を含むＮ−グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態では、複合Ｎ−グリカンは、１つまたはマンノース単位が、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つまたは複数の単糖単位にさらに結合する、高マンノースＮ−グリカンである場合がある。本明細書において使用される場合、「ハイブリッドＮ−グリカン」は少なくとも１つの高マンノース分枝および少なくとも１つの複合分枝を含むＮ−グリカンを指すことが意図される。非リン酸化、モノ−Ｍ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンについての代表的構造は、図１Ａに示されている。マンノース−６−リン酸基は、図１Ｂに示されている。
【００３６】
本明細書において使用される場合、筋肉中のリソソームの「正常化」は、その蓄積したグリコーゲンのサイズおよび数を低減させ、それにより罹患した筋肉が正常なリソソーム形態に実質的に類似し、最終的に疾患進行の逆転をもたらす、罹患した筋肉を野生型筋肉のリソソーム形態に回復させるプロセスを指す。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「疾患進行の逆転」は、とりわけ、的確には（ｉ）グリコーゲン蓄積を低減または除くこと、（ｉｉ）リソソーム腫脹および／または機能不全を低減または除くこと、ならびに（ｉｉｉ）オートファジーのデブリのビルドアップを低減または除くことを意味する。疾患進行の逆転は、次の「臨床的改善」：（ａ）少なくとも２０メートルの６分間歩行検査距離における平均増加、（ｂ）少なくとも１６ｃｍＨ２Ｏの最大呼気圧における平均改善、および（ｃ）少なくとも７の疲労重症度スケールスコアにおける平均減少、の２つ以上として歩行可能ＥＲＴ経験ポンペ病患者において顕在化し得る。疾患進行の逆転は、次の「臨床的改善」：（ａ）少なくとも８ポンド力の肩内転における平均改善、（ｂ）少なくとも５ポンド力の肘伸展における平均改善、および（ｃ）少なくとも３．５の疲労重症度スケールスコアにおける平均減少、の２つ以上として歩行不能ＥＲＴ経験ポンペ病患者において顕在化し得る。疾患進行の逆転は、次の「臨床的改善」：（ａ）少なくとも４０メートルの６分間歩行検査距離における平均増加、（ｂ）少なくとも４％の直立位（座位）努力肺活量における平均改善、（ｃ）少なくとも１１ｃｍＨ２Ｏの最大吸気圧における平均改善、および（ｄ）少なくとも５の疲労重症度スケールスコアにおける平均減少、の２つ以上としてＥＲＴ未処置ポンペ病患者において顕在化し得る。
【００３８】
アルグルコシダーゼアルファの投与と比較した本明細書において開示される処置方法の、有利点は、前者を用いて処置されたポンペ患者が臨床的改善の延長を示すことである。例えば改善は、例えば最初の処置の投与から４、５または６年間を含んで、最初の処置の投与から２から３年またはそれを超えて観察される場合がある。対照的に、標準治療（例えば、アルグルコシダーゼアルファ）を用いた酵素補充療法の２年後に、ポンペ病患者は、（ｉ）処置に先行するベースラインからの利益を維持しているが、２もしくは３年基準を超える識別可能な改善を示さない、または（ｉｉ）ゆっくりとした減退を経験し、標準治療を用いた処置後２もしくは３年間を通じて達成したすべての利益を喪失する、のいずれかである。Ｋｕｐｅｒｕｓら、２０１７．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ  ５−ｙｅａｒ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．８９：２３６５〜２３７３．対照的に、本明細書に記載のｒｈＧＡＡは、標準治療によってよりもさらに効率的にリソソームグリコーゲンをクリアし、酵素補充療法を行った後に少なくとも２年間改善が期待されない患者において改善を誘発することが示されている（例えば、研究ＡＴＢ２００−０２の「ＥＲＴ切り替え歩行可能」コホート１）。本明細書に記載されるｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物を使用する今日までの臨床データは、処置２年後でさえも患者の転帰に継続的な改善をもたらすことが期待される。したがって一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物を用いて処置された患者は、処置後２年を超えて１つまたは複数の臨床的改善における進行を示し続けている（例えば、２年基準までにまたは２年基準で達成された利益を超えるさらなる利益を経験する）。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「リソソーム病理学の逆転」は、最適なＧＡＡ活性の欠如により細胞中に蓄積したグリコーゲンの部分的なまたは完全なクリアランスを意味する。
【００４０】
本明細書において使用される場合、努力肺活量または「ＦＶＣ」は、対象が可能な限り深く吸気した後に対象の肺から強制的に吐き出され得る空気の量である。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「６分間歩行検査」（６ＭＷＴ）は、硬く、平らな表面上を合計６分間にわたって個体が歩くことができる距離を測定するための検査である。検査は、個体を６分間にできるだけ遠くまで歩かせることによって実施される。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「１０メートル歩行検査」（１０ＭＷＴ）は、個体がウオーキングシューズで平らな表面上を１０メートル歩くためにかかる時間を測定するための検査である。
【００４３】
本明細書において使用される場合、Ｎ−ブチル−１−デオキシノジリマイシンまたはＮＢ−ＤＮＪまたは（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−１−ブチル−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−３，４，５−トリオールとしても周知の化合物ミグルスタットは、次の化学式：
2020519638.tif 000003
を有する化合物である。
【００４４】
ミグルスタットの１つの製剤は、１型ゴーシェ疾患のための単剤療法として商品名Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）の下で市販されている。一部の実施形態では、ミグルスタットは、ＡＴ２２２１と称される。
【００４５】
下に考察のとおり、ミグルスタットの薬学的に許容される塩は、本発明においても使用され得る。ミグルスタットの塩が使用される場合、塩の投薬量は、患者が受けるミグルスタットの用量が、ミグルスタット遊離塩基が使用された場合に受ける量と等量であるように調整される。
【００４６】
本明細書において使用される場合、１−デオキシノジリマイシンまたはＤＮＪまたは（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−３，４，５−トリオールとしても周知の化合物ドゥボグルスタットは、次の化学式：
2020519638.tif 000004
を有する化合物である。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「薬理的シャペロン」または時に簡潔に用語「シャペロン」は、酸性αグルコシダーゼに特異的に結合し、次の効果：
・タンパク質の安定な分子立体構造の形成を増強すること；
・小胞体から別の細胞位置、好ましくは天然での細胞位置へのタンパク質の適切な輸送を増強し、それによりタンパク質の小胞体関連分解を妨げること；
・立体構造的に不安定なまたはミスフォールドしたタンパク質の凝集を妨げること；
・タンパク質の少なくとも部分的な野生型機能、安定性および／もしくは活性を回復および／もしくは増強すること；ならびに／または
・酸性αグルコシダーゼを担持する細胞の表現型もしくは機能を改善すること
の１つまたは複数を有する分子を指すことが意図される。
【００４８】
したがって、酸性αグルコシダーゼについての薬理的シャペロンは、酸性αグルコシダーゼに結合する分子であり、酸性αグルコシダーゼの適切なフォールディング、輸送、非凝集および活性をもたらす。本明細書において使用される場合、この用語は、これだけに限らないが酵素、阻害剤またはアンタゴニストおよびアゴニストの活性部位に結合する活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）を含む。少なくとも１つの実施形態では、薬理的シャペロンは、酸性αグルコシダーゼの阻害剤またはアンタゴニストであり得る。本明細書において使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、酸性αグルコシダーゼに結合し、酸性αグルコシダーゼの活性を部分的にまたは完全にブロックする、阻害する、低減するまたは中和する任意の分子を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態では、薬理的シャペロンはミグルスタットである。酸性αグルコシダーゼについての薬理的シャペロンの別の非限定的例は、ドゥボグルスタットである。
【００４９】
本明細書において使用される場合、用語「活性部位」は、タンパク質の特定の生物活性に関連し、そのために必要であるタンパク質の領域を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態では、活性部位は、基質または他の結合パートナーに結合し、化学結合の形成および切断に直接関与するアミノ酸残基に寄与する部位であり得る。本発明における活性部位は、酵素の触媒部位、抗体の抗原結合部位、受容体のリガンド結合ドメイン、制御因子の結合ドメインまたは分泌タンパク質の受容体結合ドメインを包含し得る。活性部位は、トランス活性化、タンパク質タンパク質相互作用または転写因子および制御因子のＤＮＡ結合ドメインも包含し得る。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「ＡＵＣ」または「曲線下面積」は、所与の薬物への経時的な身体の総曝露を評価するための数学的算定を指すことが意図される。対象に投与された薬物の血中濃度が投薬後に経時的にどのように変化したかをプロットするグラフでは、薬物濃度変数をｙ軸に、時間をｘ軸にする。薬物濃度曲線と指定の時間範囲のｘ軸との間の面積がＡＵＣである。ＡＵＣは、投薬スケジュールのための指針としておよびさまざまな薬物の身体における有効性の生物学的利用率を比較するために使用される。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「Ｃｍａｘ」は、対象への投与後に達成される薬物の最大血漿濃度を指すことが意図される。
【００５２】
本明細書において使用される場合、用語「分布容積」または「Ｖ」は、血漿において観察されるのと同じ濃度で、投与された薬物の総量を含有するために必要である理論的容積を指すことが意図され、薬物が血漿よりも身体組織に分布される程度を表している。より高い値のＶは、より高い程度の組織分布を示している。「中心性分布容積」または「Ｖｃ」は、血液および血液によって高度に灌流される組織内の分布容積を指すことが意図される。「末梢性分布容積」または「Ｖ２」は、末梢組織内の分布容積を指すことが意図される。
【００５３】
本明細書において互換的に使用される用語、「クリアランス」、「全身性クリアランス」または「ＣＬ」は、投与された薬物が完全にクリアされる単位時間あたりの血漿の体積を指すことが意図される。「末梢クリアランス」は、投与された薬物がクリアされる単位時間あたりの末梢組織の体積を指すことが意図される。
【００５４】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、ヒトに投与された場合に生理的に許容可能であり、典型的には有害反応を生じない分子実体および組成物を指すことが意図される。好ましくは、本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、動物およびさらに具体的にはヒトにおける使用のために、連邦または州政府の規制当局によって承認されているまたは米国薬局方もしくは他の一般に認識されている局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される場合、用語「担体」は、それと共に化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指すことが意図される。好適な薬学的担体は、当該技術分野で周知であり、少なくとも１つの実施形態では、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１８版または他の版に記載されている。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される塩」は、正当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などを伴わずにヒトおよび下等動物の組織と接触する使用のために好適であり、合理的な利益／リスク比にみあっており、一般に水または油に可溶型または分散性であり、それらの目的の使用のために有効である塩を意味すると意図される。用語は、薬学的に許容される酸付加塩および薬学的に許容される塩基付加塩を含む。好適な塩のリストは、例えば、参照により組み込まれるＳ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９７７、６６、１〜１９頁に見出される。本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持しており、生物学的にまたは他に望ましくなくはなく、無機酸と共に形成される塩を意味すると意図される。本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される塩基付加塩”」は、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持しており、生物学的にまたは他に望ましくなくはなく、無機酸と共に形成される塩を意味すると意図される。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「バッファー」は、弱酸および、ｐＨの変化を妨げることに役立つそのコンジュゲート塩基を含有する溶液を指す。
【００５７】
本明細書において使用される場合、用語「治療有効用量」および「有効量」は、対象において治療応答を生じるために十分な酸性αグルコシダーゼおよび／もしくはミグルスタットならびに／またはこれらの組合せの量を指すと意図される。治療応答は、本明細書に記載されるおよび当該技術分野で周知の任意の代替臨床マーカーまたは症候を含んで、使用者（例えば、臨床医）が治療への有効な応答として認識する任意の応答であってよい。したがって少なくとも１つの実施形態では、治療応答は、当該技術分野で周知のものなどのポンペ病の１つまたは複数の症候またはマーカーの改善または抑制であり得る。ポンペ病の症候またはマーカーとしては、これだけに限らないが、酸性αグルコシダーゼ組織活性の減少；心臓ミオパシー；心拡大；進行性筋力低下、特に体幹または下肢において；重度の筋緊張低下；巨舌症（および一部の場合では、舌の突出症）；嚥下、吸引および／または摂食困難；呼吸不全；肝腫大（中程度）；顔面筋の弛緩症；反射消失；運動不耐性；労作時呼吸困難；起座呼吸；睡眠時無呼吸；起床時の頭痛；傾眠；脊柱前弯および／または脊柱側弯症；深部腱反射の低下；腰痛；ならびに運動の発達診査事項に合致しないこと、が挙げられる。酸性αグルコシダーゼに阻害効果を有するミグルスタットの濃度が、インビボ投与でのミグルスタットの希釈（および結果としての、平衡およびｐＨにおける変化による結合におけるシフト）、生物学的利用率および代謝により本発明の目的のための「有効量」を構成することは注目されるべきである。
【００５８】
治療応答は、グリコーゲン蓄積、リソソーム増殖およびオートファジーゾーンの形成などの分子応答も含む。治療応答は、本明細書に記載のｒｈＧＡＡを用いた処置前後で筋生検の生理的および分子応答を比較することによって評価され得る。例えば、生検試料中に存在するグリコーゲンの量は、治療応答を決定するためのマーカーとして使用され得る。別の例としては、リソソーム貯蔵機能不全の指標として使用され得るＬＡＭＰ−１、ＬＣ３およびジスフェリンなどのバイオマーカーが挙げられる。例えば、本明細書に記載のｒｈＧＡＡを用いた処置前後で回収された筋生検は、バイオマーカーの１つを認識する抗体を用いて染色され得る。
【００５９】
本明細書において使用される場合、用語「酵素補充療法」または「ＥＲＴ」は、そのような酵素が欠乏している個体への非天然、精製酵素の導入を指すことが意図される。投与されるタンパク質は、天然材料からまたは組換え発現によって得ることができる。用語は、精製酵素の投与を必要とする他のまたはそれから利益を得る個体における精製酵素の導入も指す。少なくとも１つの実施形態では、そのような個体は、酵素不全を罹患している。導入される酵素は、インビトロで産生された精製、組換え酵素または胎盤もしくは畜乳などの単離された組織もしくは体液から、または植物から精製されたタンパク質であり得る。
【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「併用療法」は、２つ以上の個々の療法が同時にまたは連続的に投与される任意の療法を指すと意図される。一部の実施形態では、併用療法の結果は、各治療が個々に実施される場合の効果と比較して増強される。増強は、単独で実施される場合に治療によって達成される結果と比較して有利な結果を生じ得る種々の治療の効果の任意の改善を含み得る。増強される効果または結果としては、相乗的増強、増強された効果はそれだけで実施される場合の各治療の相加効果より大きい；相加増強、増強される効果はそれだけで実施される場合の各治療の相加効果と実質的に等しい；または相加効果未満、増強される効果はそれだけで実施される場合の各治療の相加効果より低いが、それだけで実施される場合の各治療の効果よりはまだ良い、が挙げられる。増強される効果は、それにより処置有効性または転帰が測定され得る当該技術分野で周知の任意の手段によって測定されてよい。
【００６１】
本明細書において使用される場合、用語「同時」は、当業者によって理解されるとおり、同じ時または、前後の合理的に短い期間以内を意味することが意図される。例えば、２つの処置が互いに同時に投与される場合、２つの処置の後者を調製するために必要な時間考慮して、一方の処置は他方の処置の前または後に投与され得る。したがって２つの処置の「同時投与」は、これだけに限らないが、一方の処置に続く約３０分間以下、約３０分間、２０分間以下、約２０分間、約１５分間、約１０分間、約９分間、約８分間、約７分間  約６分間  約５分間、約４分間、約３分間、約２分間、約１分間または１分間未満までの他方の処置を含む。
【００６２】
「ポンペ病」は、リソソームグリコーゲン代謝を損なう欠損酸アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）活性によって特徴を明らかにされる常染色体潜性ＬＳＤを指す。酵素欠乏は、リソソームグリコーゲン蓄積をもたらし、疾患の後期に進行性骨格筋力低下、心機能の低減、呼吸不全および／またはＣＮＳ機能障害を生じる。ＧＡＡ遺伝子中の遺伝子変異は、発現低下を生じるまたは安定性および／もしくは生物活性が変化した酵素の変異形態を産生し、最終的に疾患を生じる（一般に、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  Ｒ、１９９５、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ：Ａｃｉｄ  ａ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ａｃｉｄ  Ｍａｌｔａｓｅ）Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｓｃｒｉｖｅｒら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第７版、２４４３〜２４６４頁を参照されたい）。３種の認知されているポンペ病の臨床形態（乳児、小児および成人）は、残存α−グルコシダーゼ活性のレベルと相関関係がある（Ｒｅｕｓｅｒ  Ａ  Ｊら、１９９５、Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ（Ａｃｉｄ  Ｍａｌｔａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、Ｍｕｓｃｌｅ  ＆  Ｎｅｒｖｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３、Ｓ６１〜Ｓ６９）。乳児性ポンペ病（ＩまたはＡ型）は、最も一般的で最も重度であり、成長障害、全身性の低緊張、心肥大および生後２年以内の心肺不全、によって特徴を明らかにされる。小児ポンペ病（ＩＩまたはＢ型）は、重症度において中間であり、心拡大を伴わない筋肉症候の優勢によって特徴を明らかにされる。小児ポンペ個体は、通常呼吸不全により２０歳に至る前に死亡する。成人ポンペ病（ＩＩＩまたはＣ型）は、１０代または遅く６０代になってからゆっくり進行するミオパシーとしてしばしば現れる（Ｆｅｌｉｃｉａ  Ｋ  Ｊら、１９９５、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ−Ｏｎｓｅｔ  Ａｃｉｄ  Ｍａｌｔａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  Ａｆｆｅｃｔｅｄ  Ｓｉｂｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７４、１３１〜１３５）。ポンペでは、α−グルコシダーゼがグリコシル化、リン酸化およびタンパク質分解処理によって翻訳後に広範に修飾されていることが示されている。リソソームでのタンパク質分解による１１０キロダルトン（ｋＤａ）前駆体から７６および７０ＫＤａ成熟形態への変換は、最適なグリコーゲン触媒作用のために必要とされる。本明細書において使用される場合、用語「ポンペ病」は、すべての種類のポンペ病を指す。本出願において開示される製剤および投薬レジメンは、例えばＩ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型ポンペ病を処置するために使用され得る。
【００６３】
「対象」または「患者」は、好ましくはヒトであるが、グリコーゲンの蓄積に関する障害を有する他の哺乳動物および非ヒト動物も処置され得る。対象は、ポンペ病または他のグリコーゲン貯蔵もしくは蓄積障害を有する胎児、新生児、小児（child）、小児または成人であり得る。処置される個体の一例は、ＧＳＤ−ＩＩ（例えば、乳児性ＧＳＤ−ＩＩ、小児ＧＳＤ−ＩＩまたは成人発症ＧＳＤ−ＩＩ）を有する個体（胎児、新生児、小児（child）、小児、青年または成人ヒト）である。個体は、残存ＧＡＡ活性を有するまたは測定可能な活性を有さない場合がある。例えばＧＳＤ−ＩＩを有する個体は、正常ＧＡＡ活性の約１％未満であるＧＡＡ活性（乳児性ＧＳＤ−ＩＩ）、正常ＧＡＡ活性の約１〜１０％であるＧＡＡ活性（小児ＧＳＤ−ＩＩ）または正常ＧＡＡ活性の約１０〜４０％であるＧＡＡ活性（成人ＧＳＤ−ＩＩ）を有する場合がある。一部の実施形態では、対象または患者は、酵素補充療法を以前受けたことがあるポンペ病患者を指す「ＥＲＴ経験」または「ＥＲＴ切り替え」患者である。一部の実施形態では、対象または患者は、酵素補充療法を以前受けていないポンペ病患者を指す「ＥＲＴ未処置」患者である。ある特定の実施形態では、対象または患者は歩行可能である（例えば、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者または歩行可能ＥＲＴ−未処置患者）。ある特定の実施形態では、対象または患者は、歩行不能である（例えば、歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者）。歩行可能または歩行不能状態は、６分間歩行検査（６ＭＷＴ）によって決定され得る。一部の実施形態では、歩行可能患者は、６ＭＷＴにおいて少なくとも２００メートル歩行できるポンペ病患者である。一部の実施形態では、歩行不能患者は、補助を受けずに歩くことができないまたは車椅子から離れられないポンペ病患者である。
【００６４】
本明細書において使用される場合、用語「処置する」および「処置」は、疾患に関連する１つまたは複数の症候の改善、疾患の１つまたは複数の症候の発症の予防もしくは遅延、および／または疾患の１つまたは複数の症候の重症度もしくは頻度の軽減を指す。例えば処置は、心臓の状態の改善（例えば、拡張終期および／または収縮末期体積の増加、またはＧＳＤ−ＩＩにおいて典型的に見出される進行性心臓ミオパシーの低減、改善もしくは予防）または肺機能の改善（例えば、ベースライン能力を超える啼泣時肺活量の増加、および／または啼泣時の酸素不飽和の正常化）；神経発達および／または運動技能における改善（例えば、ＡＩＭＳスコアの増加）；疾患を罹患した個体の組織におけるグリコーゲンレベルの低減；またはこれらの効果の任意の組合せ、指すことができる。好ましい一実施形態では、処置は、心臓の状態の改善、特にＧＳＤ−ＩＩ関連心臓ミオパシーの低減または予防を含む。
【００６５】
本明細書において使用される場合、用語「改善する」、「増加する」および「低減する」は、本明細書に記載の処置の開始に先行する同じ個体での測定値、または本明細書に記載の処置を欠いているコントロール個体（もしくは複数のコントロール個体）での測定値などの、ベースライン測定値と比較した値を示す。コントロール個体は、処置される個体と同じ形態のＧＳＤ−ＩＩ（乳児、小児または成人発症のいずれか）を患っており、処置される個体とおよそ同じ年齢である（処置個体およびコントロール個体（複数可）での疾患のステージが比較可能であることを確実にするため）個体である。
【００６６】
本明細書において使用される場合、用語「約」および「およそ」は、測定値の性質および精度を考慮して、測定された量についての許容される誤差の程度を指すことが意図される。例えば、誤差の程度は、当該技術分野で理解されるとおり、測定値について提供される有意な数値の数によって示され、これだけに限らないが、測定値について報告される最も正確で有意な数値における±１の変動が挙げられる。誤差の典型的例示的な程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、およびさらに好ましくは５％以内である。本明細書で示される数量は、特に明記しない限りおよそであり、用語「約」または「およそ」は、明確に述べられない場合推測であってよいことを意味する。
【００６７】
ＩＩ．組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）
一部の実施形態では、組換えヒト酸性αグルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）は、配列番号１、配列番号３、配列番号４または配列番号５に記載されるアミノ酸配列を有する酵素である。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、配列番号２に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。
2020519638.tif 000005
2020519638.tif 000006
【００６８】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、米国特許第８，５９２，３６２号に記載される配列番号１に記載の野生型ＧＡＡアミノ酸配列を有し、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＨＥ２４１０４．１（ＧＩ：５６８７６０９７４）を有する。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｙ００８３９．１を有するｍＲＮＡ配列、配列番号２にコードされる野生型ＧＡＡアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、配列番号３に記載の野生型ＧＡＡアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、配列番号４に記載されるＧＡＡアミノ酸配列を有し、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）寄託番号ＮＰ＿０００１４３．２を有する。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、アルグルコシダーゼアルファ、ＧＡＡ遺伝子の９個の観察されたハプロタイプの最も主たるものによってコードされるヒト酸性αグルコシダーゼ酵素である。
【００６９】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、配列番号１に記載の野生型ＧＡＡの全長９５２アミノ酸配列を有して最初に発現され、ｒｈＧＡＡは、アミノ酸の一部、例えば最初の５６アミノ酸を除去する細胞内プロセシングを受ける。したがって、宿主細胞によって分泌されるｒｈＧＡＡは、細胞内で最初に発現されたｒｈＧＡＡより短いアミノ酸配列を有する場合がある。一実施形態では、短いタンパク質は、シグナルペプチドおよび前駆体ペプチドを含む最初の５６アミノ酸が除去され、それにより８９６アミノ酸を有するタンパク質が生じることにおいてだけ配列番号１と異なる配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する。アミノ酸の数における他の変動も、配列番号１または配列番号５に記載のアミノ酸配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上の欠失、置換および／または挿入を有するなど可能である。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ産生物としては、さまざまなアミノ酸長を有する組換えヒト酸性αグルコシダーゼ分子の混合物が挙げられる。
【００７０】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、配列番号１または配列番号５に少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であり、例えば初期設定で使用され得る、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む種々の配列比較アルゴリズムおよび／またはプログラムが、２つの配列の間の同一性を算出するために使用され得る。例えば、本明細書に記載の特定のポリペプチドに少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有し、好ましくは実質的に同じ機能を提示するポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、検討される。別途指示がない限り同様のスコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づいている。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性パーセントはＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、高スコア配列対中で同一である合計残基の数および割合を示しており；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、配列比較スコアが陽性値を有し、互いに類似している残基の数および割合を示している。本明細書に開示のアミノ酸配列にこれらの程度の同一性もしくは類似性、または任意の中間程度の類似性の同一性を有するアミノ酸配列は、本開示によって検討され、包含される。類似するポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードを使用して推定され、従来の手段によって、具体的には遺伝子コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得ることができる。
【００７１】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸残基に翻訳後および／または化学修飾を受ける。例えば、メチオニンおよびトリプトファン残基は酸化を受ける場合がある。別の例として、Ｎ末端グルタミンはピログルタメートを形成する場合がある。別の例として、アスパラギン残基は、アスパラギン酸への脱アミドを受ける場合がある。さらに別の例として、アスパラギン酸残基は、イソアスパラギン酸への異性化を受ける場合がある。さらに別の例として、タンパク質中の不対システイン残基は、遊離グルタチオンおよび／またはシステインとジスルフィド結合を形成する場合がある。したがって一部の実施形態では、酵素は、配列番号１、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２によってコードされるアミノ酸配列を有して最初に発現され、酵素は、これらの翻訳後および／または化学修飾の１つまたは複数を受ける。そのような修飾も本開示の範囲内である。
【００７２】
ＩＩＩ．ｒｈＧＡＡのＮ−結合型グリコシル化
単一のｒｈＧＡＡ分子上に７個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位がある。これらの潜在的グリコシル化部位は、配列番号５の次の位置：Ｎ８４、Ｎ１７７、Ｎ３３４、Ｎ４１４、Ｎ５９６、Ｎ８２６およびＮ８６９にある。同様に、配列番号１の全長アミノ酸配列について、これらの潜在的グリコシル化部位は、次の位置：Ｎ１４０、Ｎ２３３、Ｎ３９０、Ｎ４７０、Ｎ６５２、Ｎ８８２およびＮ９２５にある。ｒｈＧＡＡの他の変異体は、アスパラギン残基の位置に応じて同様のグリコシル化部位を有し得る。一般に、タンパク質中のアミノ酸配列のＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒの配列は、ＸがＨｉｓまたはＰｒｏになりえない例外を有して、潜在的グリコシル化部位を示す。
【００７３】
本明細書に記載のｒｈＧＡＡ分子は、平均１、２、３または４個のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）基をそれらのＮ−グリカン上に有する場合がある。例えば、ｒｈＧＡＡ分子上の１つだけのＮ−グリカンがＭ６Ｐを保有する場合があり（モノリン酸化もしくはモノ−Ｍ６Ｐ）、単一のＮ−グリカンが２つのＭ６Ｐ基を保有する場合があり（ビス−リン酸化もしくはビス−Ｍ６Ｐ）、または同じｒｈＧＡＡ分子上の２つの異なるＮ−グリカンが、それぞれ単一のＭ６Ｐ基を保有する場合がある。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡ分子は、それらのＮ−グリカン上に平均３〜４個のＭ６Ｐ基を有する。組換えヒト酸性αグルコシダーゼ分子は、Ｍ６Ｐ基を保有しないＮ−グリカンも有する。別の実施形態では、平均でｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり２．５ｍｏｌを超えるＭ６ＰおよびｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり４ｍｏｌを超えるシアル酸を含む。一部の実施形態では、平均でｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり約３〜３．５ｍｏｌ  Ｍ６Ｐを含む。一部の実施形態では、平均でｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり約４〜５．４ｍｏｌシアル酸を含む。平均で、ｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０％または２０％は、モノ−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンの形態であってよい、例えば総Ｎ−グリカンの約６．２５％は、単一のＭ６Ｐ基を保有する場合があり、平均でｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの少なくとも約０．５、１、１．５、２．０、２．５、３．０％は、ビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンの形態であり、平均で総ｒｈＧＡＡの２５％未満は、ＣＩＭＰＲに結合するリン酸化Ｎ−グリカンを含有しない。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの平均で約１０％から約１４％は、モノリン酸化されている。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの平均で約７％から約２５％は、ビスリン酸化されている。一部の実施形態では、平均でｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり、約１．３ｍｏｌ  ビス−Ｍ６Ｐを含む。
【００７４】
本明細書に記載のｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり０．５から７．０ｍｏｌの範囲のＭ６Ｐまたは、ｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５もしくは７．０ｍｏｌ  Ｍ６Ｐを含む任意の中間値もしくはその部分的な範囲でＭ６Ｐを保有するＮ−グリカンの平均含有量を有する場合がある。ｒｈＧＡＡは、異なる平均数のモノ−Ｍ６Ｐ−保有またはビス−Ｍ６Ｐ−保有Ｎ−グリカンを含むｒｈＧＡＡ調製物を提供するように分画され得、それにより具体的な画分を選択することによって、または異なる画分を選択的に組み合わせることによって、標的組織中のリソソームに標的化するｒｈＧＡＡのさらなるカスタマイズを可能にする。
【００７５】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ上のＮ−グリカンの６０％までは、完全にシアル化されている場合があり、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％までのＮ−グリカンは、完全にシアル化されている場合がある。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ上のＮ−グリカンの５０％以下は完全にシアル化されている。一部の実施形態では、総Ｎ−グリカンの４％から２０％までは完全にシアル化されている。他の実施形態では、ｒｈＧＡＡ上のＮ−グリカンの５％、１０％、２０％または３０％以下は、シアル酸および末端ガラクトース残基（Ｇａｌ）を保有している。この範囲は、すべての中間値および部分的な範囲を含む、例えばｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの７％から３０％は、シアル酸および末端ガラクトースを保有している場合がある。さらに他の実施形態では、ｒｈＧＡＡ上のＮ−グリカンの５％、１０％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％以下は、末端ガラクトースだけを有し、シアル酸を含有しない。この範囲は、すべての中間値および部分的な範囲を含み、例えば組成物中のｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの８％から１９％は、末端ガラクトースだけを有し、シアル酸を含有しない。
【００７６】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの４０％、４５％、５０％もしくは５５％から６０％は、複合型Ｎ−グリカンである；またはｒｈＧＡＡ上の総Ｎ−グリカンの１％、２％、３％、４％、５％、６％もしくは７％以下は、ハイブリッド型Ｎ−グリカンであり；ｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ−グリカンの５％、１０％、１５％、２０％もしくは２５％以下は非リン酸化されている；ｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ−グリカンの少なくとも５％もしくは１０％はモノリン酸化されている；および／またはｒｈＧＡＡ上の高マンノース型Ｎ−グリカンの少なくとも１％もしくは２％はビス−リン酸化されている。これらの値は、すべての中間値および部分的な範囲を含む。ｒｈＧＡＡは、上に記載の１つまたは複数の含有量範囲に合致し得る。
【００７７】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均２．０から８．０ｍｏｌｅのシアル酸残基を保有する場合がある。この範囲は、ｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０ｍｏｌシアル酸残基を含むすべての中間値およびその部分的な範囲を含む。理論に束縛されることなく、シアル酸残基を保有するＮ−グリカン単位の存在は、アシアロ糖タンパク質受容体によるｒｈＧＡＡの非生産的クリアランスを妨げることができると考えられている。
【００７８】
１つまたは複数の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、ある特定のＮ−グリコシル化プロファイルをある特定の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に有する。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有する。一部の実施形態では、少なくとも２０％のｒｈＧＡＡは第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位（例えば、配列番号５についてのＮ８４および配列番号１についてのＮ１４０）でリン酸化されている。例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ−Ｍ６Ｐ  および／またはビス−Ｍ６Ｐ単位の結果であってよい。一部の実施形態では、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にモノ−Ｍ６Ｐ単位を保有している。一部の実施形態では、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にビス−Ｍ６Ｐ単位を保有している。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約１．４ｍｏｌのＭ６Ｐ（モノ−Ｍ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐ）を含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で少なくとも約０．５ｍｏｌのビス−Ｍ６Ｐを含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．２５ｍｏｌのモノ−Ｍ６Ｐを含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．２ｍｏｌから約０．３ｍｏｌのシアル酸を含む。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに示される第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図６Ｂに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを有する。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図３２Ａに示される第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図３２Ｂまたは図３３Ｂに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを有する。
【００７９】
一部の実施形態では、少なくとも２０％のｒｈＧＡＡは第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位（例えば、配列番号５についてのＮ１７７および配列番号１についてのＮ２２３）でリン酸化されている。例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第２のＮ−グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ−Ｍ６Ｐおよび／またはビス−Ｍ６Ｐ単位の結果であってよい。一部の実施形態では、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第２のＮ−グリコシル化部位にモノ−Ｍ６Ｐ単位を保有している。一部の実施形態では、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第２のＮ−グリコシル化部位にビス−Ｍ６Ｐ単位を保有している。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．５ｍｏｌのＭ６Ｐ（モノ−Ｍ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐ）を含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．４から約０．６ｍｏｌのモノ−Ｍ６Ｐを含む。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに示される第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図６Ｃに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを含む。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図３２Ａに示される第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図３２Ｃまたは図３３Ｂに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを含む。
【００８０】
１つまたは複数の実施形態では、少なくとも５％のｒｈＧＡＡは、第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位（例えば、配列番号５についてＮ３３４および配列番号１についてＮ３９０）でリン酸化されている。他の実施形態では、５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満のｒｈＧＡＡは、第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でリン酸化されている。例えば、第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、非リン酸化高マンノースＮ−グリカン、二、三および四分岐複合Ｎ−グリカンの混合物ならびに主な分子種としてハイブリッドＮ−グリカンを有する。一部の実施形態では、少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％のｒｈＧＡＡは、第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でシアル化されている。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．９から約１．２ｍｏｌのシアル酸を含む。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに示される第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図６Ｄに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを有する。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図３２Ａに示される第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図３２Ｄまたは図３３Ｂに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを含む。
【００８１】
一部の実施形態では、少なくとも２０％のｒｈＧＡＡは、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位（例えば、配列番号５についてＮ４１４および配列番号１についてＮ４７０）でリン酸化されている。例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ−Ｍ６Ｐおよび／またはビス−Ｍ６Ｐ単位の結果であってよい。一部の実施形態では、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にモノ−Ｍ６Ｐ単位を保有している。一部の実施形態では、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にビス−Ｍ６Ｐ単位を保有している。一部の実施形態では、少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％または２５％のｒｈＧＡＡは、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でシアル化されている。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約１．４ｍｏｌのＭ６Ｐ（モノ−Ｍ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐ）を含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．４から約０．６ｍｏｌのビス−Ｍ６Ｐを含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．３から約０．４ｍｏｌのモノ−Ｍ６Ｐを含む。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに示される第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図６Ｅに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを有する。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図３２Ａに示される第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図３２Ｅまたは図３３Ｂに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを含む。
【００８２】
一部の実施形態では、少なくとも５％のｒｈＧＡＡは、第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位（例えば、配列番号５についてＮ５９６および配列番号１についてＮ６９２）でリン酸化されている。他の実施形態では、５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満のｒｈＧＡＡは、第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でリン酸化されている。例えば、第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、フコシル化二分岐複合Ｎ−グリカンを主な分子種として有し得る。一部の実施形態では、少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でシアル化されている。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．８から約０．９ｍｏｌのシアル酸を含む。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに示される第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図６Ｆに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを有する。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図３２Ａに示される第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図３２Ｆまたは図３３Ｂに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを有する。
【００８３】
一部の実施形態では、少なくとも５％のｒｈＧＡＡは、第６のＮ−グリコシル化部位（例えば、配列番号５についてＮ８２６および配列番号１についてＮ８８２）でリン酸化されている。他の実施形態では、５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満のｒｈＧＡＡは、第６のＮ−グリコシル化部位でリン酸化されている。例えば、第６のＮ−グリコシル化部位は、二、三および四分岐複合Ｎ−グリカンの混合物を主な分子種として有し得る。一部の実施形態では、少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｒｈＧＡＡは、第６のＮ−グリコシル化部位でシアル化されている。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約１．５から約４．２ｍｏｌのシアル酸を含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．９ｍｏｌのアセチル化シアル酸を含む。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに示される第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図６Ｇに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを有する。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図３２Ａに示される第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図３２Ｇまたは図３３Ｂに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを有する。
【００８４】
一部の実施形態では、少なくとも５％のｒｈＧＡＡは、第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位（例えば、配列番号５についてＮ８６９および配列番号１についてＮ９２５）でリン酸化されている。他の実施形態では、５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満のｒｈＧＡＡは、第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でリン酸化されている。一部の実施形態では、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％未満のｒｈＧＡＡは、第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に任意のＮ−グリカンを有する。一部の実施形態では、少なくとも３０％、３５％または４０％のｒｈＧＡＡは、第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にＮ−グリカンを有する。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．８６ｍｏｌのシアル酸を含む。少なくとも実施形態では、第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に同定されるすべてのＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンである。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、図６Ａに示されるまたは図３２Ａに示される第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位占有率、および図３２Ｈまたは図３３Ｂに示されるＮ−グリコシル化プロファイルを有する。
【００８５】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ分子１つあたり平均３〜４個のＭ６Ｐ残基を含み、ｒｈＧＡＡ分子  １ｍｏｌあたり約４から約７．３ｍｏｌのシアル酸を含む。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり少なくとも平均で約０．５ｍｏｌのビス−Ｍ６Ｐ、第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり約０．４から約０．６ｍｏｌのモノ−Ｍ６Ｐ、第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり約０．９から約１．２ｍｏｌのシアル酸、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり約０．４から約０．６ｍｏｌのビス−Ｍ６Ｐ、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり約０．３から約０．４ｍｏｌのモノ−Ｍ６Ｐ、第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり約０．８から約０．９ｍｏｌのシアル酸、および第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり約１．５から約４．２ｍｏｌのシアル酸をさらに含む。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位にｒｈＧＡＡ  １ｍｏｌあたり平均で約０．８６ｍｏｌのシアル酸をさらに含む。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を図６Ａ〜６Ｈに示される占有率およびＮ−グリコシル化プロファイルで含む。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡは、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を図３２Ａ〜３２Ｈおよび図３３Ａ〜３３Ｂに示される占有率およびＮ−グリコシル化プロファイルで含む。
【００８６】
ｒｈＧＡＡを作製する方法は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／０５７，８４２号、２０１４年９月３０日出願に開示されている。
【００８７】
リソソームの内側になると、ｒｈＧＡＡは、蓄積グリコーゲンを酵素的に分解できる。しかし、従来のｒｈＧＡＡ産生物は、モノ−Ｍ６Ｐ−およびビス−Ｍ６Ｐ保有Ｎ−グリカンの合計レベルが低く、それにより筋細胞を標的化しにくく、リソソームへのｒｈＧＡＡの送達が劣る。これらの従来の産生物中のｒｈＧＡＡ分子の多くは、リン酸化Ｎ−グリカンを有さず、それによりＣＩＭＰＲへの親和性を欠いている。非リン酸化高マンノースＮ−グリカンは、ＥＲＴの非生産的クリアランスを生じるマンノース受容体によってもクリアされ得る（図２Ｂ）。対照的に、図２Ａに示すとおり本明細書に記載のｒｈＧＡＡは、モノ−Ｍ６Ｐ−およびビス−Ｍ６Ｐ保有Ｎ−グリカンを多量に含有でき、筋肉などの特定の組織へのｒｈＧＡＡの産生的取り込みをもたらす。
【００８８】
ＩＶ．Ｎ−結合型グリコシル化ｒｈＧＡＡの産生および精製
その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５３２５２号に記載のとおり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの細胞は、本明細書に記載のｒｈＧＡＡを産生するために使用され得る。ＣＨＯ細胞において高Ｍ６Ｐ  ｒｈＧＡＡを発現することは、前者だけがグリカンデグレーション（degration）によって最適なグリコーゲン加水分解を有するｒｈＧＡＡの形態に転換され得、それにより治療有効性が増強されることから少なくとも部分的に、ｒｈＧＡＡのグリカンプロファイルを翻訳後に修飾することに有利である。
【００８９】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、本明細書に記載のｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡコンストラクトを用いて形質転換される１つまたは複数のＣＨＯ細胞株から好ましくは産生される。そのようなＣＨＯ細胞株は、ＧＡＡをコードするポリヌクレオチドの５、１０、１５または２０個以上のコピーなどの遺伝子の複数のコピーを含有してよい。酸性αグルコシダーゼの対立遺伝子変異体または、配列番号１もしくは配列番号５に少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一であるものなどの、他の変異体酸性αグルコシダーゼアミノ酸配列を発現するＤＮＡコンストラクトは、コンストラクトされ、ＣＨＯ細胞において発現され得る。当業者は、そのようなＤＮＡコンストラクトの産生のためにＣＨＯ細胞を形質転換するために好適な代替的ベクターを選択できる。
【００９０】
そのようなＣＨＯ細胞株を作製するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５３２５２号に記載されている。簡潔には、これらの方法は、ＧＡＡまたはＧＡＡ変異体をコードするＤＮＡを用いてＣＨＯ細胞を形質転換すること、ＧＡＡをコードするＤＮＡをその染色体（複数可）に安定に組み込んでおり、ＧＡＡを安定に発現するＣＨＯ細胞を選択すること、およびモノ−Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐを保有している高含有量のＮ−グリカンを有するＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択すること、ならびに任意選択で、高シアル酸含有量のＮ−グリカンを有するおよび／または非リン酸化高マンノースを低含有量で含むＮ−グリカンを有するＣＨＯ細胞を選択することを含む。選択されたＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ細胞株を培養し、ＣＨＯ細胞の培養物から前記組成物を回収することによってｒｈＧＡＡおよびｒｈＧＡＡ組成物を産生するために使用され得る。一部の実施形態では、選択されたＣＨＯ細胞株から産生されるｒｈＧＡＡは、ＣＩＭＰＲを標的化するモノ−Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐを保有するＮ−グリカンを高含有量で含有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のとおり産生されるｒｈＧＡＡは、末端ガラクトースを有する複合Ｎ−グリカンを低レベルで有する。一部の実施形態では、選択されたＣＨＯ細胞株は、ＧＡ−ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００−Ｘ５−１４と称される。一部の実施形態では、選択されたＣＨＯ細胞株は、そのようなＣＨＯ細胞培養物の継代培養物または派生物を包含する。一部の実施形態では、選択されたＣＨＯ細胞株から産生されるｒｈＧＡＡは、ＡＴＢ２００と称される。
【００９１】
本明細書に記載のとおり産生されるｒｈＧＡＡは、次の、両方がその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２４９８１号および米国仮特許出願第６２／５０６，５６９号に記載の方法に従って精製され得る。ＣＨＯ細胞株から産生されるｒｈＧＡＡを産生、捕捉および精製するための例示的プロセスは、図３に示されている。
【００９２】
簡潔には、バイオリアクター６０１は、ｒｈＧＡＡを周囲の液体培養培地に発現および分泌するＣＨＯ細胞などの細胞の培養物を含有する。バイオリアクター６０１は、灌流、バッチまたは流加培養バイオリアクターなどの、細胞を培養するための任意の適切なバイオリアクターであってよい。培養培地は、ｒｈＧＡＡを産生する細胞のための十分な期間後にバイオリアクターから除去される。そのような培地除去は灌流バイオリアクターについては継続的であってよく、バッチまたは流加培養バイオリアクターについてはバッチごとあってよい。培地は、細胞を除去するために濾過系６０３によって濾過され得る。濾過系６０３は、交互タンジェント流濾過（ＡＴＦ）系、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）系、および／または遠心濾過系を含む、任意の適切な濾過系であってよい。種々の実施形態では、濾過系は、約１０ナノメートルから約２マイクロメートルの間のポアサイズを有するフィルターを利用する。
【００９３】
濾過後、濾液を、タンパク質捕捉系６０５にローディングする。タンパク質捕捉系６０５は、１つまたは複数のクロマトグラフィーカラムを含み得る。１つより多いクロマトグラフィーカラムが使用される場合、次にカラムは連続的に配置してもよく、それにより第１のカラムがローディングされると次のカラムがローディングされ始める。代替的に、媒体除去プロセスは、カラムが切り替えられる時間の間は停止されてよい。
【００９４】
種々の実施形態では、タンパク質捕捉系６０５は、ｒｈＧＡＡ、特に高Ｍ６Ｐ含有量を有するｒｈＧＡＡの直接産生物捕捉のための１つまたは複数の陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムを含む。タンパク質捕捉系６０５によって捕捉されるｒｈＧＡＡは、カラム中のｐＨおよび／または塩含有量を変化させることによってカラム（複数可）から溶出される。ＡＥＸカラムのための例示的条件は、表２に提供されている。
2020519638.tif 000007
【００９５】
溶出されたｒｈＧＡＡは、さらなる精製ステップおよび／または品質保証ステップに供されてよい。例えば、溶出されたｒｈＧＡＡは、ウイルス殺滅ステップ６０７に供されてよい。そのようなウイルス殺滅６０７は低ｐＨ殺滅、界面活性剤殺滅または当該技術分野で周知の他の技術の１つまたは複数を含んでよい。ウイルス殺滅ステップ６０７由来のｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡ産生物をさらに精製するために第２のクロマトグラフィー系６０９に導入されてよい。代替的にタンパク質捕捉系６０５から溶出されたｒｈＧＡＡは、第２のクロマトグラフィー系６０９に直接供給されてよい。種々の実施形態では、第２のクロマトグラフィー系６０９としては、不純物のさらなる除去のための１つまたは複数の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムが挙げられる。ＩＭＡＣカラムのための例示的条件は、下の表３に提供されている。
2020519638.tif 000008
【００９６】
ｒｈＧＡＡが、第２のクロマトグラフィー系６０９にローディングされた後、組換えタンパク質は、カラム（複数可）から溶出される。溶出されたｒｈＧＡＡは、ウイルス殺滅ステップ６１１に供され得る。ウイルス殺滅６０７と同様に、ウイルス殺滅６１１は、低ｐＨ殺滅、界面活性剤殺滅または当該技術分野で周知の他の技術の１つまたは複数を含んでよい。一部の実施形態では、ウイルス殺滅６０７または６１１の１つだけが使用される、またはウイルス殺滅は精製プロセスの同じ段階で実施される。
【００９７】
ウイルス殺滅ステップ６１１由来のｒｈＧＡＡは、組換えタンパク質産生物をさらに精製するために第３のクロマトグラフィー系６１３に導入され得る。代替的に、第２のクロマトグラフィー系６０９から溶出された組換えタンパク質は、第３のクロマトグラフィー系６１３に直接供給されてよい。種々の実施形態では、第３のクロマトグラフィー系６１３は、不純物のさらなる除去のために１つまたは複数の陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラムおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムを含む。次いでｒｈＧＡＡ産生物は、第３のクロマトグラフィー系６１３から溶出される。ＣＥＸカラムのための例示的条件は、下の表４に提供されている。
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【００９８】
ｒｈＧＡＡ産生物は、さらなる処理に供されてもよい。例えば、別の濾過系６１５は、ウイルスを除去するために使用され得る。一部の実施形態では、そのような濾過は、５から５０μｍの間のポアサイズを有するフィルターを利用し得る。他の産生物処理は、組換えタンパク質産生物が滅菌、濾過、濃縮、保管され得、および／または最終産生物製剤に加えるための追加的成分を有する、産生物調整ステップ６１７を含み得る。
【００９９】
本明細書において使用される場合、用語「ＡＴＢ２００」は、ＧＡ−ＡＴＢ２００細胞株から産生され、本明細書に記載の方法を使用して精製される、モノ−Ｍ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐを保有する高含有量のＮ−グリカンを有するｒｈＧＡＡを指す。
【０１００】
Ｖ．薬学的組成物
種々の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡを単独でまたは他の治療剤および／もしくは薬学的に許容される担体との組合せで含む薬学的組成物は提供される。
【０１０１】
１つまたは複数の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、薬学的に許容される塩を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、本明細書で使用される薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される酸付加塩である。薬学的に許容される酸付加塩としては、これだけに限らないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、硝酸、リン酸など、およびこれだけに限らないが酢酸、トリフルオロ酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、酪酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、ジグルコン酸、エタンスルホン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリセロリン酸、ヘミスルフィック酸（hemisulfic acid）、ヘキサン酸、ギ酸、フマル酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸（イセチオン酸）、乳酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メシチレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、２−ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、パモン酸、ペクチン酸、フェニル酢酸、３−フェニルプロピオン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデカン酸が挙げられる有機酸が挙げられる。
【０１０３】
一部の実施形態では、本明細書で使用される薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される塩基付加塩である。薬学的に許容される塩基付加塩としては、これだけに限らないが、アンモニアあるいは、アンモニウムまたはナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムなどの金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは炭酸水素塩が挙げられる。薬学的に許容される有機無毒性塩基由来の塩としては、これだけに限らないが、一級、二級および三級アミン、四級アミン化合物、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンならびに、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、ヒドラバミンアミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、ピリジン、Ν，Ν−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ν，Ν−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン（ephenamine）、Ν，Ν’−ジベンジルエチレンジアミンなどの塩基性イオン交換レジン、ポリアミンレジンなどの塩が挙げられる。
【０１０４】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡまたは薬学的に許容されるその塩は、静脈内投与用に適合された薬学的組成物として製剤化されてよい。一部の実施形態では、薬学的組成物は、滅菌等張水性バッファー中の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤および注射部位の疼痛を緩和するために局所麻酔も含んでよい。薬学的組成物の成分は、単位投与形態とは別にまたは共に混合してのいずれかで、例えば、活性剤の量を表示したアンプルまたはサシェ剤などの密封封印した容器中に凍結乾燥粉末または水不含有濃縮物として供給されてよい。組成物が点滴によって投与される場合、滅菌医薬品グレード純水、生理食塩水またはデキストロース／水を含有する点滴ボトルに分注されてよい。一部の実施形態では、点滴は、病院または診療所で行われてよい。一部の実施形態では、点滴は、病院または診療所設定の外で、例えば対象の住居で行われてよい。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、成分が投与に先行して混合され得るように提供され得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡまたは薬学的に許容されるその塩は、経口投与のために製剤化されてよい。経口投与可能な組成物は、即時、遅延、修飾、持続性、パルスもしくはコントロール放出適用のために、錠剤、カプセル、オーブレ（ovule）、エリキシル剤、溶液もしくは懸濁物、ゲル、シロップ剤、口腔洗浄薬または使用前に水もしくは他の好適なビヒクルを用いて再構成するための乾燥粉剤の形態に、任意選択で香味および着色剤を含んで製剤化されてよい。錠剤、カプセル、ロゼンジ、香錠、丸剤、ボーラス、粉剤、ペースト剤、顆粒剤、ビュレット、糖衣錠またはプレミックス調製物などの固体組成物も使用され得る。経口使用のための固体および液体組成物は、当該技術分野で周知の方法により調製され得る。そのような組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体および固体または液体形態であり得る賦形剤も含有する場合がある。錠剤またはカプセルは、これだけに限らないが結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤または湿潤剤が挙げられる薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製され得る。好適な薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野で周知であり、これだけに限らないか、アルファ化でんぷん、ポリビニルピロリドン、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ショ糖、ゼラチン、アカシア、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘネート、タルク、シリカ、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、グリシンクロスカルメロースナトリウムおよび複合ケイ酸塩が挙げられる。錠剤は、当該技術分野で十分周知の方法によってコーティングされてよい。
【０１０６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２４９８２号および米国仮特許出願第６２／５０６，５７４号に従って製剤化され得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物のｐＨは、約５．０から約７．０または約５．０から約６．０である。一部の実施形態では、ｐＨは約５．５から約６．０の範囲である。一部の実施形態では、薬学的組成物のｐＨは６．０である。一部の実施形態では、ｐＨは、水酸化ナトリウムおよび／または塩酸などのｐＨ調整剤（例えば、アルカリ化剤および酸性化剤）を使用することによって標的ｐＨに調整され得る。
【０１０７】
本明細書に記載の薬学的組成物は、クエン酸塩系、リン酸塩系およびこれらの組合せなどのバッファー系を含んでよい。クエン酸塩および／またはリン酸塩は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムであってよい。他の塩として、カリウムおよびアンモニウム塩が挙げられる。１つまたは複数の実施形態では、バッファーは、クエン酸塩を含む。さらなる実施形態では、バッファーは、クエン酸ナトリウム（例えば、無水クエン酸ナトリウムとクエン酸一水和物との混合物）を含む。１つまたは複数の実施形態では、クエン酸塩を含むバッファー溶液は、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸を含んでよい。一部の実施形態では、両方のクエン酸塩およびリン酸バッファーの両方が存在する。
【０１０８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、少なくとも１つの賦形剤を含む。賦形剤は、等張化剤、増量剤および／または安定剤として機能できる。等張化剤は、製剤がヒト血液と同様のまたは同じ浸透圧を有することを確実にすることを補助する成分である。増量剤は、製剤（例えば凍結乾燥される）に量を加える成分であり、ケーキに適切な構造を与える。安定剤は、疎水性空気−水界面での凝集物の形成を予防または最少化できる化合物である。ある賦形剤は、同時に等張化剤および増量剤として機能できる。例えば、マンニトールは、等張化剤としても機能でき、増量剤としての利益も提供できる。
【０１０９】
等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、マンニトール、ショ糖およびトレハロースが挙げられる。一部の実施形態では、等張化剤はマンニトールを含む。一部の実施形態では、等張化剤（複数可）の総量は、約１０ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬの量の範囲にある。さらなる実施形態では、等張化剤（複数可）の総量は、約１０、１１、１２、１３、１４または１５ｍｇ／ｍＬから約１６、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｇ／ｍＬの量の範囲にある。
【０１１０】
一部の実施形態では、賦形剤は、安定剤を含む。一部の実施形態では、安定剤は界面活性剤である。一部の実施形態では、安定剤は、ポリソルベート８０である。１つまたは複数の実施形態では、安定剤の総量は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。さらなる実施形態では、安定剤の総量は、約０．１、０．２、０．３、０．４または０．５ｍｇ／ｍＬから約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。さらにさらなる実施形態では、安定剤の総量は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇ／ｍＬである。
【０１１１】
一部の実施形態では、薬学的組成物は、（ａ）ｒｈＧＡＡ（ＡＴＢ２００など）、（ｂ）クエン酸塩、リン酸塩およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのバッファー、ならびに（ｃ）マンニトール、ポリソルベート８０およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤を含み、（ｉ）約５．０から約６．０または（ｉｉ）約５．０から約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、組成物は、水をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、酸性化剤および／またはアルカリ化剤をさらに含み得る。
【０１１２】
一部の実施形態では、薬学的組成物は、（ａ）約５〜５０ｍｇ／ｍＬ、約５〜３０ｍｇ／ｍＬまたは約１５ｍｇ／ｍＬの濃度でのｒｈＧＡＡ（ＡＴＢ２００など）、（ｂ）約１０〜１００ｍＭまた約２５ｍＭの濃度でのクエン酸ナトリウムバッファー、（ｃ）約１０〜５０ｍｇ／ｍＬまたは約２０ｍｇ／ｍＬの濃度でのマンニトール、（ｄ）約０．１〜１ｍｇ／ｍＬ、約０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬまたは約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するポリソルベート８０、および（ｅ）水を含み、約６．０のｐＨを有する。少なくとも１つの実施形態では、薬学的組成物は、（ａ）１５ｍｇ／ｍＬ  ｒｈＧＡＡ（ＡＴＢ２００など）（ｂ）２５ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー、（ｃ）２０ｍｇ／ｍＬマンニトール（ｄ）０．５ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、および（ｅ）水を含み、約６．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、組成物は、酸性化剤および／またはアルカリ化剤をさらに含み得る。
【０１１３】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡを含む薬学的組成物は、それを必要とする対象への投与に先行して希釈される。
【０１１４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、シャペロンを含む。一部の実施形態では、シャペロンは、ミグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩である。別の実施形態では、シャペロンは、ドゥボグルスタットまたは薬学的に許容されるその塩である。
【０１１５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡは、１つの薬学的組成物に製剤化され、一方ミグルスタットなどのシャペロンは、別の薬学的組成物に製剤化される。一部の実施形態では、ミグルスタットを含む薬学的組成物は、Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）（Ａｃｔｅｌｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として市販で入手できる製剤に基づいている。
【０１１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、ケーキまたは粉剤を提供するために凍結乾燥（フリーズドライ）プロセスを受ける場合がある。したがって、本発明の別の態様は、凍結乾燥後の薬学的組成物に関する。凍結乾燥混合物は、本明細書に記載のｒｈＧＡＡ（例えば、ＡＴＢ２００）、クエン酸塩、リン酸塩およびこれらの組合せからなる群から選択されるバッファー、およびトレハロース、マンニトール、ポリソルベート８０およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤を含み得る。一部の実施形態では、他の成分（例えば、他の賦形剤）は、凍結乾燥混合物に加えられてよい。凍結乾燥製剤を含む薬学的組成物は、保存、輸送、再構成および／または患者に投与され得るバイアルで提供され得る。
【０１１７】
ＶＩ．処置方法
Ａ．疾患の処置
本発明の別の態様は、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物を投与することによるグリコーゲン貯蔵調節不全に関する疾患または障害の処置の方法に関する。一部の実施形態では、疾患はポンペ病（酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）およびグリコーゲン貯蔵疾患ＩＩ型（ＧＳＤ  ＩＩ）としても周知）である。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡはＡＴＢ２００である。一部の実施形態では、薬学的組成物はＡＴＢ２００を含む。
【０１１８】
本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、適切な経路によって投与される。一実施形態では、ｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、静脈内投与される。他の実施形態では、ｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、心臓もしくは骨格筋（例えば、筋肉内）または神経系（例えば、脳；脳室内；髄腔内への直接注射）などの標的組織に直接投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、経口投与される。必要に応じて、１つより多い経路が同時に使用され得る。
【０１１９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の治療効果は、次の評価基準：（１）心臓の状態（例えば、拡張終期および／または収縮末期体積の増加またはＧＳＤ−ＩＩにおいて典型的に見出される進行性心臓ミオパシーの低減、改善もしくは予防）、（２）肺機能（例えば、ベースライン能力を超える啼泣時肺活量における増加、および／または啼泣時の酸素飽和度の正常化）、（３）神経発達および／または運動技能（例えば、ＡＩＭＳスコアの増加）、ならびに（４）疾患を罹患している個体の組織におけるグリコーゲンレベルの低減、の１つまたは複数に基づいて評価され得る。
【０１２０】
一部の実施形態では、対象の心臓の状態は、ビヒクルを用いて処置された対象のものまたは処置に先行する対象のものと比較して、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の１つまたは複数の投薬量の投与後に、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（またはこの間の任意の百分率）改善される。対象の心臓の状態は、拡張終期および／もしくは収縮末期体積を測定することによって、ならびに／または心臓ミオパシーを臨床的に評価することによって評価され得る。一部の実施形態では、対象の肺機能は、ビヒクルを用いて処置された対象のものまたは処置に先行する対象のものと比較して、ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００を含む薬学的組成物の１つまたは複数の投薬量の投与後に、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（またはこの間の任意の百分率）改善される。ある特定の実施形態では、改善は、投与から１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月またはそれを超えた（またはその間の任意の期間）後に達成される。ある特定の実施形態では、ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００を含む薬学的組成物は、投与から１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月またはそれを超えた（またはその間の任意の期間）後に対象の肺機能を改善する。
【０１２１】
一部の実施形態では、対象の肺機能は、ビヒクルを用いて処置された対象のものまたは処置に先行する対象のものと比較して、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の１つまたは複数の投薬量の投与後に、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（またはこの間の任意の百分率）改善される。対象の肺機能は、ベースライン能力を超える啼泣時肺活量、および／または啼泣時の酸素飽和度の正常化によって評価され得る。一部の実施形態では、対象の肺機能は、ビヒクルを用いて処置された対象のものまたは処置に先行する対象のものと比較して、ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００を含む薬学的組成物の１つまたは複数の投薬量の投与後に、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（またはこの間の任意の百分率）改善される。ある特定の実施形態では、改善は、投与から１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月またはそれを超えた（またはその間の任意の期間）後に達成される。ある特定の実施形態では、ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００を含む薬学的組成物は、投与から１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月またはそれを超えた（またはその間の任意の期間）後に対象の肺機能を改善する。
【０１２２】
一部の実施形態では、対象の神経発達および／または運動技能は、ビヒクルを用いて処置された対象のものまたは処置に先行する対象のものと比較して、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の１つまたは複数の投薬量の投与後に、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（またはこの間の任意の百分率）改善される。対象の神経発達および／または運動技能はＡＩＭＳスコアを決定することによって評価され得る。ＡＩＭＳは、臨床医が管理し、スコア化する１２項目の固定スケールである（Ｒｕｓｈ  ＪＡ  Ｊｒ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｍｅａｓｕｒｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、２０００、１６６〜１６８を参照されたい）。項目１〜１０は、５点の固定スケールで等級付けられる。項目１〜４は、口腔顔面運動を評価する。項目５〜７は、体肢および躯幹ジスキネジアを扱う。項目８〜１０は、試験者によって判断される全体的な重症度、ならびに患者の動作の認識およびそれに伴う困難を扱う。項目１１〜１２は、歯および／または義歯に伴う問題（そのような問題は、ジスキネジアの誤診を生じる場合がある）に関するはい／いいえ質問である。一部の実施形態では、対象の神経発達および／または運動技能は、ビヒクルを用いて処置された対象のものまたは処置に先行する対象のものと比較して、ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００を含む薬学的組成物の１つまたは複数の投薬量の投与後に、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（またはこの間の任意の百分率）改善される。ある特定の実施形態では、改善は、投与から１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月またはそれを超えた（またはその間の任意の期間）後に達成される。ある特定の実施形態では、ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００を含む薬学的組成物は、投与から１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月またはそれを超えた（またはその間の任意の期間）後に対象の神経発達および／または運動技能を改善する。
【０１２３】
一部の実施形態では、対象のある特定の組織のグリコーゲンレベルは、ビヒクルを用いて処置された対象のものまたは処置に先行する対象のものと比較して、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の１つまたは複数の投薬量の投与後に、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（またはこの間の任意の百分率）低減される。一部の実施形態では、組織は四頭筋、三頭筋および腓腹筋などの筋肉である。組織のグリコーゲンレベルは、当該技術分野で周知の方法を使用して分析され得る。グリコーゲンレベルの決定は、アミログルコシダーゼ消化に基づいて十分周知であり：Ａｍａｌｆｉｔａｎｏら（１９９９）、「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｙｐｅ  ｉｉ  ａｆｔｅｒ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｃｉｄ−ａｌｐｈａｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６：８８６１〜８８６６などの刊行物に記載されている。一部の実施形態では、対象の筋肉中のグリコーゲンレベルは、ビヒクルを用いて処置された対象のものまたは処置に先行する対象のものと比較して、ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００を含む薬学的組成物の１つまたは複数の投薬量の投与後に、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（またはこの間の任意の百分率）低減される。ある特定の実施形態では、低減は、投与から１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月またはそれを超えた（またはその間の任意の期間）後に達成される。ある特定の実施形態では、ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００を含む薬学的組成物は、投与から１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月またはそれを超えた（またはその間の任意の期間）後に対象の筋肉中のグリコーゲンレベルを低減する。
【０１２４】
Ｂ．バイオマーカー
尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）などの対象の筋線維におけるグリコーゲン蓄積のバイオマーカーは、ポンペ病を有する対象における酵素補充療法の治療効果を評価および比較するために使用され得る。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡまたはｒｈＧＡＡを含む薬学的組成物のグリコーゲン蓄積への治療効果は、対象におけるＨｅｘ４のレベルを測定することによって評価される。
【０１２５】
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などの筋損傷または損傷のバイオマーカーは、ポンペ病を有する対象における酵素補充療法の治療効果を評価および比較するために使用され得る。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡまたはｒｈＧＡＡを含む薬学的組成物の筋損傷への治療効果は、対象におけるＣＫ、ＡＬＴおよび／またはＡＳＴのレベルを測定することによって評価される。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡまたはｒｈＧＡＡを含む薬学的組成物の筋損傷への治療効果は、対象におけるＣＫのレベルを測定することによって評価される。
【０１２６】
ＬＡＭＰ−１、ＬＣ３およびジスフェリンなどのバイオマーカーも、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の治療効果を評価および比較するために使用され得る。ポンペ病では、リソソームグリコーゲンを加水分解するＧＡＡの欠如は一部の組織においてグリコーゲンで満たされた大きなリソソームの異常な蓄積を生じる（Ｒａｂｅｎら、ＪＢＣ  ２７３：１９０８６〜１９０９２、１９９８）。ポンペ病のマウスモデルでの研究は、骨格筋における肥大リソソームは、器質的能力の低減を十分に説明できず、分解された筋原線維を含有する大きな封入体の存在（すなわち、オートファジーのビルドアップ）が筋肉機能の障害に寄与していることを示している（Ｒａｂｅｎら、Ｈｕｍａｎｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １７：３８９７〜３９０８、２００８）。報告は、オートファジー流動の障害がポンペ患者における不十分な治療転帰に関連することも示唆している（Ｎａｓｃｉｍｂｅｎｉら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｎａｎ．１２２１４、２０１５；Ｆｕｋｕｄａら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４：８３１〜８３９、２００６）。加えて、遅発性ポンペ病は、重症度の異なる３０を超える遺伝的に定義された亜型を含む遺伝子的に不均一な神経筋疾患の群である、未分類肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤｓ）においてよく見られる（Ｐｒｅｉｓｌｅｒら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  １１０：２８７〜２８９、２０１３）。ＩＨＣ検査は、Ｇａａ  ＫＯマウスの骨格筋線維中のジスフェリンの筋形質での実質的に上昇した存在を明らかにした。
【０１２７】
種々の周知の方法が、そのようなバイオマーカーの遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質レベルを測定するために使用され得る。例えば、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物を用いて処置された対象由来の試料は、組織、具体的には筋肉の生検などで得ることができる。一部の実施形態では、試料は対象の筋肉の生検である。一部の実施形態では、筋肉は、四頭筋、三頭筋および腓腹筋から選択される。対象から得られた試料は、そのようなバイオマーカーを検出する１つもしくは複数の抗体または他の検出剤を用いて染色されてよい、あるいは質量分析によって同定および定量されてよい。試料は、例えばＲＴ−ｑＰＣＲ法を介して、バイオマーカーをコードするｍＲＮＡなどの核酸の存在を検出するためにも、または代替的に処理されてよい。
【０１２８】
一部の実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーの遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質レベルは、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物を用いる処置に先行しておよび後に個体から得られる筋生検において測定される。一部の実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーの遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質レベルは、ビヒクルを用いて処置された個体から得られる筋生検において測定される。一部の実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーの遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質レベルは、ビヒクルを用いて処置された対象のものまたは処置に先行する対象のものと比較して、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の１つまたは複数の投薬量の投与後に、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（またはこの間の任意の百分率）低減される。一部の実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーの遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質レベルは、ビヒクルを用いて処置された対象のものまたは処置に先行する対象のものと比較して、ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００を含む薬学的組成物の１つまたは複数の投薬量の投与後に、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（またはこの間の任意の百分率）低減される。ある特定の実施形態では、低減は、投与から１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月またはそれを超えた（またはその間の任意の期間）後に達成される。ある特定の実施形態では、ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００を含む薬学的組成物は、投与から１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月またはそれを超えた（またはその間の任意の期間）後に１つまたは複数のバイオマーカーの遺伝子発現レベルおよび／またはタンパク質レベルを低減する。
【０１２９】
Ｃ．ｒｈＧＡＡの投薬量
薬学的製剤または再構成組成物は、治療的有効量（例えば、一定間隔で投与される場合、疾患に関連する症候を改善する、疾患の発症を予防するもしくは遅らせる、および／または疾患の症候の重症度もしくは頻度を軽減する、などの疾患を処置するために十分である投薬量）で投与される。疾患の処置において治療有効である量は、疾患の影響の性質および程度に応じる場合があり、標準的臨床技術によって決定され得る。加えて、インビトロまたはインビボアッセイは、最適投薬範囲を同定することを補助するために任意選択で使用され得る。少なくとも１つの実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたはｒｈＧＡＡを含む薬学的組成物は、約５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇなどの約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。少なくとも１つの実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。少なくとも１つの実施形態では、ｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、薬理的シャペロンと同時にまたは連続的に投与される。一部の実施形態では、薬理的シャペロンはミグルスタットである。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、約２６０ｍｇの経口用量として投与される。具体的な個体のための有効用量は、経時的に、個体の必要性に応じて変動（例えば、増加または減少）する場合がある。例えば、身体的疾患もしくはストレスの時期、または抗酸性αグルコシダーゼ抗体が存在するようになるもしくは増加する場合、または病徴が悪化した場合、量は増加されてよい。
【０１３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の治療有効用量は、従来のｒｈＧＡＡ産生物のものより低い。例えば従来のｒｈＧＡＡ産生物の治療有効用量が２０ｍｇ／ｋｇである場合、従来のｒｈＧＡＡ産生物と同じまたはより良好な治療効果を生じるために必要な本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の用量は、２０ｍｇ／ｋｇより低い。治療効果は、上で考察した１つまたは複数の評価基準（例えば、心臓の状態、グリコーゲンレベルまたはバイオマーカー発現）に基づいて評価され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の治療有効用量は、従来のｒｈＧＡＡ産生物のものより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはこれを超えて低い。
【０１３１】
一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の治療効果は、運動機能における改善、筋力（上半身、下半身または全身）における改善、肺機能における改善、疲労低下、筋損傷の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの低減、グリコーゲン蓄積の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの低減またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の治療効果は、筋線維におけるリソソーム病理学の逆転、筋線維でのグリコーゲン含有量のより速いおよび／またはより効果的な低減、６分間歩行検査距離の増加、タイムドアップアンドゴー検査時間の減少、４段上り検査時間の減少、１０メートル歩行検査時間の減少、歩行−段−ガワー−椅子スコアの減少、上肢強度の増加、肩内転の改善、肩外転の改善、肘屈曲の改善、肘伸展の改善、上半身強度の改善、下半身強度の改善、全身強度の改善、直立位（座位）努力肺活量の改善、最大呼気圧の改善、最大吸気圧における改善、疲労重症度スケールスコアの減少、尿中ヘキソース四糖レベルの低減、クレアチンキナーゼレベルの低減、アラニンアミノトランスフェラーゼレベルの低減、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベルの低減、またはこれらの組合せを含む。
【０１３２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、同じ用量で投与された場合に、従来のｒｈＧＡＡ産生物よりも速く所望の治療効果を達成する。治療効果は、上で考察した１つまたは複数の評価基準（例えば、心臓の状態、グリコーゲンレベルまたはバイオマーカー発現）に基づいて評価され得る。例えば、従来のｒｈＧＡＡ産生物の単一用量が処置された個体の組織におけるグリコーゲンレベルを１週間で１０％減少させる場合、同じ用量の本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物が投与されると、同じ程度の低減は１週間未満で達成され得る。一部の実施形態では、同じ用量で投与する場合、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、従来のｒｈＧＡＡ産生物より少なくとも約１．２５、１．５、１．７５、２．０、３．０またはこれを超えて速く所望の治療効果を達成できる。
【０１３３】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡ（またはｒｈＧＡＡを含む組成物もしくは医薬）の治療的有効量は、１回より多く投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、疾患の影響の性質および程度に応じて一定の間隔で、および継続的に投与される。本明細書において使用される場合「一定間隔での」投与は、治療的有効量が定期的に投与される（１回だけの用量とは区別される）ことを示す。間隔は、標準的臨床技術によって決定され得る。ある特定の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、２カ月に１回、１カ月に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回または毎日投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは、１週間に２回、毎週または１週間おきに静脈内投与される。単一の個体ための投与間隔は、固定された間隔でなくてもよく、個体の必要に応じて経時的に変動する場合がある。例えば、身体的疾患もしくはストレスの時期、または抗ｒｈＧＡＡ抗体が存在するようになるもしくは増加する場合、または病徴が悪化した場合、投与間の間隔は減少されてよい。
【０１３４】
一部の実施形態では、同じ用量で使用される場合、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、従来のｒｈＧＡＡ産生物よりも低い頻度で投与されてよく、従来のｒｈＧＡＡ産生物と同じまたはより良好な治療効果をさらに産生できる。例えば、従来のｒｈＧＡＡ産生物が２０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される場合、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、ｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物がより低い頻度、例えば２週間に１回または毎月で投与されても、２０ｍｇ／ｋｇで投与される場合の従来のｒｈＧＡＡ産生物と同じまたはより良好な治療効果を産生できる。治療効果は、上で考察した１つまたは複数の評価基準（例えば、心臓の状態、グリコーゲンレベルまたはバイオマーカー発現）に基づいて評価され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の２用量の間の間隔は、従来のｒｈＧＡＡ産生物のものより長い。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物の２つの用量間の間隔は、従来のｒｈＧＡＡ産生物のものより少なくとも約１．２５、１．５、１．７５、２．０、３．０倍またはこれを超えて長い。
【０１３５】
一部の実施形態では、同じ処置条件下（例えば、同じ間隔で投与される同じ用量）で、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、従来のｒｈＧＡＡ産生物によって提供されるよりも優れた程度で治療効果を提供する。治療効果は、上で考察した１つまたは複数の評価基準（例えば、心臓の状態、グリコーゲンレベルまたはバイオマーカー発現）に基づいて評価され得る。例えば、毎週２０ｍｇ／ｋｇで投与される従来のｒｈＧＡＡ産生物と比較して、毎週２０ｍｇ／ｋｇで投与されるｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、処置される個体の組織におけるグリコーゲンレベルをさらに高い程度に低減できる。一部の実施形態では、同じ処置条件下で投与される場合、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、従来のｒｈＧＡＡ産生物のものより少なくとも約１．２５、１．５、１．７５、２．０、３．０倍またはこれを超えて大きい治療効果を提供する。
【０１３６】
Ｄ．併用療法
１つまたは複数の実施形態では、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたはｒｈＧＡＡを含む薬学的組成物は、薬理的シャペロンと同時にまたは連続的に投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、薬理的シャペロンとは異なる経路を介して投与される。例えば薬理的シャペロンは、経口投与される一方でｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物は、静脈内投与される。
【０１３７】
種々の実施形態では、薬理的シャペロンはミグルスタットである。一部の実施形態では、ミグルスタットは、約５０ｍｇから約６００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、約２００ｍｇから約６００ｍｇの経口用量で、または約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇもしくは約６００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、約２３３ｍｇから約５００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、約２５０から約２７０ｍｇの経口用量で、または約２５０ｍｇ、約２５５ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２６５ｍｇもしくは約２７０ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、約２６０ｍｇの経口用量で投与される。
【０１３８】
約２００ｍｇから６００ｍｇの範囲またはその任意のより少ない範囲内のミグルスタットの経口用量が、彼／彼女の体重に応じて成人患者に好適であり得ることは当業者によって理解される。例えば、これだけに限らないが乳児、小児（children）または低体重成人を含む約７０ｋｇより顕著に低い体重を有する患者のために、医師によって少ない用量が適切であるとして検討され得る。したがって、少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、約５０ｍｇから約２００ｍｇの経口用量で、または約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇもしくは約２００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは約６５ｍｇから約１９５ｍｇの経口用量で、または約６５ｍｇ、約１３０ｍｇもしくは約１９５ｍｇの経口用量で投与される。
【０１３９】
一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは約５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、ミグルスタットは約５０ｍｇから約６００ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは約５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、ミグルスタットは約５０ｍｇから約２００ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは約５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、ミグルスタットは約２００ｍｇから約６００ｍｇの用量で経口投与される。一部の実施形態では、一部の実施形態では、ｒｈＧＡＡは約５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、ミグルスタットは約２３３ｍｇから約５００ｍｇの用量で経口投与される。一実施形態では、ｒｈＧＡＡは約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与され、ミグルスタットは約２６０ｍｇの用量で経口投与される。
【０１４０】
一部の実施形態では、ミグルスタットおよびｒｈＧＡＡは、同時に投与される。例えば、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与の前または後の１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１分間以内に投与され得る。一部の実施形態では、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与の前または後の５、４、３、２または１分間以内に投与される。
【０１４１】
一部の実施形態では、ミグルスタットおよびｒｈＧＡＡは、連続的に投与される。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与に先行して投与される。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与に３時間未満先行して投与される。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与に約２時間先行して投与される。例えば、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与に約１．５時間、約１時間、約５０分間、約３０分間または約２０分間先行して投与され得る。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与に約１時間先行して投与される。
【０１４２】
一部の実施形態では、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与後に投与される。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与後３時間以内に投与される。少なくとも１つの実施形態では、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与後２時間以内に投与される。例えば、ミグルスタットは、ｒｈＧＡＡの投与後約１．５時間、約１時間、約５０分間、約３０分間または約２０分間以内に投与される。
【０１４３】
一部の実施形態では、対象は、ミグルスタットの投与前少なくとも２時間および後少なくとも２時間絶食する。
【０１４４】
Ｅ．キット
本発明の別の態様は、本明細書に記載のｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物を含むキットに関する。１つまたは複数の実施形態では、キットは、ｒｈＧＡＡまたは薬学的組成物（凍結乾燥前または後のいずれか）および再構成、希釈および投与のための説明書を含む容器（例えば、バイアル、チューブ、袋など）を含む。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：モノまたはビス−Ｍ６Ｐ保有Ｎ−グリカンを高含有量で有するｒｈＧＡＡを産生するＣＨＯ細胞の調製
ＤＧ４４  ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞をｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡコンストラクトを用いてトランスフェクトした。ＤＮＡコンストラクトを図４に示す。トランスフェクション後、安定に組み込まれたＧＡＡ遺伝子を含有するＣＨＯ細胞をヒポキサンチン／チミジン欠乏性（−ＨＴ）培地）を用いて選択した。これらの細胞でのＧＡＡ発現をメトトレキサート処置（ＭＴＸ、５００ｎＭ）によって誘導した。
【０１４６】
多量のＧＡＡを発現する細胞プールをＧＡＡ酵素活性アッセイによって同定し、ｒｈＧＡＡを産生する個々のクローンを確立するために使用した。個々のクローンを半流動性培地プレート上で生成し、ＣｌｏｎｅＰｉｘ系によって採取し、２４ディープウエルプレートに移した。個々のクローンを高レベルのＧＡＡを発現しているクローンを同定するためにＧＡＡ酵素活性についてアッセイした。ＧＡＡ活性を決定するための条件培地は、４−ＭＵ−α−グルコシダーゼ基質を使用した。ＧＡＡ酵素アッセイによって測定した高レベルのＧＡＡを産生するクローンを、生存率、増殖力、ＧＡＡ産生力、Ｎ−グリカン構造および安定タンパク質発現についてさらに評価した。モノ−Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンが増強されたｒｈＧＡＡを発現しているＣＨＯ細胞株ＧＡ−ＡＴＢ２００を含むＣＨＯ細胞株を、この手順を使用して単離した。
【０１４７】
実施例２：ｒｈＧＡＡの精製
本発明によるｒｈＧＡＡの複数のバッチをＣＨＯ細胞株ＧＡ−ＡＴＢ２００を使用して振盪フラスコにおいておよび灌流バイオリアクターにおいて産生し、その産生物を「ＡＴＢ２００」と称する。弱陰イオン交換（「ＷＡＸ」）液体クロマトグラフィーを末端リン酸塩およびシアル酸によりＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡを分画するために使用した。溶出プロファイルを塩の量を増加させてＥＲＴを溶出することによって生成した。プロファイルをＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）によってモニターした。同様のＣＩＭＰＲ受容体結合（少なくとも約７０％）プロファイルをさまざまな産生バッチ由来の精製ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡについて観察し（図５）、ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡが持続的に産生され得ることを示している。
【０１４８】
実施例３：ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡのオリゴ糖特徴づけ
ＡＴＢ２００  ｒｈＧＡＡをさまざまなＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術を使用して部位特異的Ｎ−グリカンプロファイルについて分析した。最初の２種のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の結果を図６Ａ〜６Ｈに示す。第３のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の結果を２−ＡＡグリカンマッピングと共に図３２Ａ〜３２Ｈ、図３３Ａ〜３３Ｂおよび表５に示す。
【０１４９】
第１のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では、タンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に先行して変性、還元、アルキル化および消化した。タンパク質変性および還元の間に、２００μｇのタンパク質試料、５μＬの１ｍｏｌ／Ｌトリス−ＨＣｌ（最終濃度５０ｍＭ）、７５μＬの８ｍｏｌ／ＬグアニジンＨＣｌ（最終濃度６Ｍ）、１μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（最終濃度５ｍＭ）、２μＬの１ｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ（最終濃度２０ｍＭ）およびＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を１．５ｍＬチューブに合計体積１００μＬになるように加えた。試料を混合し、５６℃、３０分間ドライバスでインキュベートした。アルキル化の間に、変性および還元したタンパク質試料を５μＬの１ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド（ＩＡＭ、最終濃度５０ｍＭ）と混合し、次いで１０〜３０℃、暗所で、３０分間インキュベートした。アルキル化後、４００μＬの予め冷却したアセトンを試料に加え、混合物を−８０℃冷却で４時間凍結した。次いで試料を５分間、１３０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離し、上清を除去した。４００μＬの予め冷却したアセトンをペレットに加え、次いで５分間、１３０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離し、上清を除去した。次いで試料を氷上、暗所で空気乾燥し、アセトン残留物を除去した。４０マイクロリットルの８Ｍ尿素および１６０μＬの１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３を試料に加えてタンパク質を溶解させた。トリプシン消化の間に、次いで５０μｇのタンパク質に最終体積１００μＬまでトリプシン消化バッファーを加え、５μＬの０．５ｍｇ／ｍＬトリプシン（タンパク質対酵素の比２０／１  ｗ／ｗ）を加えた。溶液を十分混合し、一晩（１６±２時間）、３７℃でインキュベートした。２．５マイクロリットルの２０％ＴＦＡ（最終濃度０．５％）を加えて反応をクエンチした。次いで試料をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ（商標）Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して分析した。
【０１５０】
第２のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では、ＡＴＢ２００試料は、ヨード酢酸（ＩＡＡ）をＩＡＭの代わりにアルキル化剤として使用したことを除いて、同様の変性、還元、アルキル化および消化手順により調製し、次いでＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ  Ｔｒｉｂｉｄ（商標）Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して分析した。
【０１５１】
第１のおよび第２の分析の結果を図６Ａ〜６Ｈに示す。図６Ａ〜６Ｈでは、第１の分析の結果が左のバー（暗灰色）によって表され、第２の分析からの結果が右のバー（明灰色）によって表されている。グリカン提示についての記号の命名は、Ｖａｒｋｉ，Ａ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．、Ｅｓｋｏ  Ｊ．Ｄ．ら、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（２００９）に従う。
【０１５２】
図６Ａ〜６Ｈから見られるとおり、２つの分析は、結果の間にいくらかの変動はあるが同様の結果を提供した。この変動は、使用した装置およびＮ−グリカン分析の完全性を含む多数の要因による可能性がある。例えば、リン酸化Ｎ−グリカンの一部の分子種が同定されなかった、および／または定量されなかった場合、それによりリン酸化Ｎ−グリカンの総数は過小評価され、その部位にリン酸化Ｎ−グリカンを保有するｒｈＧＡＡの百分率は、過少評価される可能性がある。別の例として、非リン酸化Ｎ−グリカンの一部の分子種が同定されなかった、および／または定量されなかった場合、それにより非リン酸化Ｎ−グリカンの総数は過小評価され、その部位にリン酸化Ｎ−グリカンを保有するｒｈＧＡＡの百分率は、過大評価される可能性がある。
【０１５３】
図６Ａは、ＡＴＢ２００のＮ−グリコシル化部位占有率を示している。図６Ａに見られるとおり、両方の分析が、９０％付近または超えるおよび約１００％までのＡＴＢ２００酵素が各潜在的Ｎ−グリコシル化部位に検出されるＮ−グリカンを有することを検出して、第１の、第２の、第３の、第４の、第５のおよび第６のＮ−グリコシル化部位は、大部分が占有されている。しかし、第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、約半分の時間でＮ−グリコシル化されている。
【０１５４】
図６Ｂは、第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位Ｎ８４のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。図６Ｂに見られるとおり、主なＮ−グリカン分子種は、ビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンである。第１のおよび第２の両方の分析は、７５％を超えるＡＴＢ２００がビス−Ｍ６Ｐを第１の部位に有することを検出し、第１の部位でのＡＴＢ２００  １ｍｏｌあたり約０．８ｍｏｌビス−Ｍ６Ｐの平均に対応する。
【０１５５】
図６Ｃは、第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位Ｎ１７７のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。図６Ｃに見られるとおり、主なＮ−グリカン分子種は、モノ−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンおよび非リン酸化高マンノースＮ−グリカンである。第１のおよび第２の両方の分析は、４０％を超えるＡＴＢ２００がモノ−Ｍ６Ｐを第２の部位に有することを検出し、第２の部位でのＡＴＢ２００  １ｍｏｌあたり約０．４から約０．６ｍｏｌモノ−Ｍ６Ｐの平均に対応する。
【０１５６】
図６Ｄは、第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位Ｎ３３４のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。図６Ｄに見られるとおり、主なＮ−グリカン分子種は、非リン酸化高マンノースＮ−グリカン、二、三および四分岐複合Ｎ−グリカンならびにハイブリッドＮ−グリカンである。第１のおよび第２の両方の分析は、２０％を超えるＡＴＢ２００がシアル酸残基を第３の部位に有することを検出し、第３の部位でのＡＴＢ２００  １ｍｏｌあたり約０．９から約１．２ｍｏｌシアル酸の平均に対応する。
【０１５７】
図６Ｅは、第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位Ｎ４１４のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。図６Ｅに見られるとおり、主なＮ−グリカン分子種は、ビス−Ｍ６Ｐおよびモノ−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンである。第１のおよび第２の両方の分析は、４０％を超えるＡＴＢ２００がビス−Ｍ６Ｐを第４の部位に有することを検出し、第４の部位でのＡＴＢ２００  １ｍｏｌあたり約０．４から約０．６ｍｏｌビス−Ｍ６Ｐの平均に対応する。第１のおよび第２の両方の分析は、２５％を超えるＡＴＢ２００がモノ−Ｍ６Ｐを第４の部位に有することも検出し、第４の部位でのＡＴＢ２００  １ｍｏｌあたり約０．３から約０．４ｍｏｌモノ−Ｍ６Ｐの平均に対応する。
【０１５８】
図６Ｆは、第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位Ｎ５９６のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。図６Ｆに見られるとおり、主なＮ−グリカン分子種は、フコシル化二分岐複合Ｎ−グリカンである。第１のおよび第２の両方の分析は、７０％を超えるＡＴＢ２００がシアル酸残基を第５の部位に有することを検出し、第５の部位でのＡＴＢ２００  １ｍｏｌあたり約０．８から約０．９ｍｏｌシアル酸の平均に対応する。
【０１５９】
図６Ｇは、第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位Ｎ８２６のＮ−グリコシル化プロファイルを示している。図６Ｇに見られるとおり、主なＮ−グリカン分子種は、二、三および四分岐複合Ｎ−グリカンである。第１のおよび第２の両方の分析は、８０％を超えるＡＴＢ２００がシアル酸残基を第６の部位に有することを検出し、第６の部位でのＡＴＢ２００  １ｍｏｌあたり約１．５から約１．８ｍｏｌシアル酸の平均に対応する。
【０１６０】
第７の部位Ｎ８６９でのＮ−グリコシル化の分析は、最も一般的なＮ−グリカンがＡ４Ｓ３Ｓ３ＧＦ（１２％）、Ａ５Ｓ３Ｇ２Ｆ（１０％）、Ａ４Ｓ２Ｇ２Ｆ（８％）およびＡ６Ｓ３Ｇ３Ｆ（８％）である、およそ４０％  Ｎ−グリコシル化を示した。
【０１６１】
図６Ｈは、７個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位それぞれでのリン酸化の概要を示している。図６Ｈにおいて見られるとおり、第１のおよび第２の両方の分析は、第１の、第２のおよび第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位で高いリン酸化レベルを検出した。両分析は、８０％を超えるＡＴＢ２００が第１の部位でモノまたはビス−リン酸化されており、４０％を超えるＡＴＢ２００が第２の部位でモノ−リン酸化されており、８０％を超えるＡＴＢ２００が第４の部位でモノ−またはビス−リン酸化されていることを検出した。
【０１６２】
ＡＴＢ２００の別のＮ−グリコシル化分析を下に記載のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により実施した。この分析は、１０ロットのＡＴＢ２００にわたる平均Ｎ−グリコシル化プロファイルをもたらした（図３２Ａ〜３２Ｈ、図３３Ａ〜３３Ｂ）。
【０１６３】
ＡＴＢ２００由来のＮ−結合グリカンをＰＮＧａｓｅ−Ｆを用いて酵素的に遊離し、２−アントラニル酸（２−ＡＡ）を用いて標識した。２−ＡＡ標識Ｎ−グリカンを固体相抽出（ＳＰＥ）によってさらに処理して、過剰な塩および他の夾雑物を除去した。精製した２−ＡＡ  Ｎ−グリカンをアセトニトリル／水（２０／８０；ｖ／ｖ）に溶解し、１０マイクログラムを、蛍光検出（ＨＰＬＣ−ＦＬＤ）および高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）分析を備えた高速液体クロマトグラフィー用のアミノポリマー分析用カラム（ａｐＨｅｒａ（商標）、Ｓｕｐｅｌｃｏ）にローディングした。
【０１６４】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離を移動相Ａ（アセトニトリル中２％酢酸）および移動相Ｂ（水中、５％酢酸；２０ミリモル酢酸アンモニウム、水酸化アンモニウムを用いてｐＨ４．３に調整）を用いる勾配溶出様式の順相条件下で実施した。開始移動相組成は、７０％Ａ／３０％Ｂであった。蛍光検出のために、検出機（ＲＦ−２０Ａｘｓ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）に関するパラメーターは、励起（Ｅｘ）：３２０ｎｍ；発光（Ｅｍ）：４２０ｎｍであった。ＨＲＭＳ分析をＱｕａｄｒｕｐｏｌｅ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｓｃｉｅｘ  Ｘ５００Ｂ  ＱＴＯＦ）を使用してＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＩＤＡ）モードで運用して実行した。取得したデータファイルを、ＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄからのＭＳＣｏｎｖｅｒｔを使用してｍｚＭＬファイルに変換し、次にＧＲＩＴＳ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．２  Ｍｏｒｎｉｎｇ  Ｂｌｅｎｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＵＧＡ）をグリカンデータベース検索および次の同定したＮ−グリカンのアノテーションのために利用した。Ｎ−グリカンを前駆体モノアイソトピック質量（ｍ／ｚ）および産生物イオンｍ／ｚの両方を使用して同定した。実験的産生物イオンおよび断片化パターンをＧｌｙｃｏＷｏｒｋｂｅｎｃｈ  ２アプリケーションを使用してコンピューター内で確認した。
【０１６５】
ＡＴＢ２００由来のＮ−結合グリカンの相対量を決定するために、ＨＰＬＣ−ＦＬＤ−ＱＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ実験から取得されたデータを次のとおり処理した。ＦＬＤクロマトグラム中のすべてのＮ−グリカンピークを積分し、各ピークにＦＬＤクロマトグラム中のすべてのピークの合計面積の百分率を割り当てた。ピーク面積として表される蛍光性シグナルは試料中の各Ｎ−グリカンの量の定量測定値である（図３３Ａ）。しかし、ほとんどの場合では複数のＮ−グリカン分子種は、同じＦＬＤピークに含有された。したがって、質量分析計データも各Ｎ−グリカン分子種の相対定量を得るために必要であった（表５）。各Ｎ−グリカンについてのイオン強度シグナルを抽出物イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）と呼ばれるクロマトグラフィーピークを作成するためにデータから「抽出した」。ＸＩＣを、ＦＬＤクロマトグラフィーピークと位置を合わせ、１つだけのＮ−グリカン分子種に特異的であった。イオン強度シグナルから作成したＸＩＣピークを次いで積分し、このピーク面積が、存在するグリカンの量の相対的定量測定である。ＦＬＤピーク面積および質量分析計ＸＩＣピーク面積の両方を本明細書に報告するＡＴＢ２００のすべてのＮ−結合グリカン分子種の相対的定量を可能にするために使用した。
【０１６６】
このＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を、下の表５に提供する。グリカン提示のための記号の命名は、次に従う。Ｗｏｐｅｒｅｉｓ  Ｗら、２００６．Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｅｒｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｉａｌｕｒｉａ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ．１７６２：５９８〜６０７；Ｇｏｒｎｉｋ  Ｏら、２００７．Ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｇｌｙｃａｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１７：１３２１〜１３３２  ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｇｌｙｃｏｂ／ｃｗｍ１０６；Ｋａｔｔｌａ  ＪＪら、２０１１．Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：  Ｍｕｒｒａｙ  Ｍｏｏ−Ｙｏｕｎｇ（編）、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、３：４６７〜４８６；Ｔｈａｒｍａｌｉｎｇａｍ−Ｊａｉｋａｒａｎ  Ｔら、Ｎ−ｇｌｙｃａｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ  ａｔ  ｋｅｙ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｔａｇｅｓ．２０１４．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．１４８：５６９〜５８０；Ｃｌｅｒｃ  Ｆら、Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．２０１５．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１０７１９−０１５−９６２６−２；およびＢｌａｃｋｌｅｒ  ＲＪら、２０１６．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｍ６Ｐ−１  ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ  ａ  ｍａｎｎｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｂｒａｎｃｈ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｎｎｅｒ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２６〜２：１８１〜１９２．
2020519638.tif 000010
【０１６７】
この２−ＡＡおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に基づいて、および図３３Ｃにさらに要約するとおり、検査したＡＴＢ２００は、１ｍｏｌのＡＴＢ２００あたり３〜５ｍｏｌの平均Ｍ６Ｐ含有量（モノ−Ｍ６Ｐおよびビス−Ｍ６Ｐの両方に対して）および１ｍｏｌのＡＴＢ２００あたり４〜７ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。
【０１６８】
図３２Ａ〜３２Ｈに示し、図３３Ｂに要約するとおり、ＡＴＢ２００の第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は約１．４ｍｏｌ  Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ  ＡＴＢ２００の平均Ｍ６Ｐ含有量を有し、約０．２５ｍｏｌモノ−Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ  ＡＴＢ２００の平均モノ−Ｍ６Ｐ含有量および約０．５６ｍｏｌビス−Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ  ＡＴＢ２００の平均ビス−Ｍ６Ｐ含有量の主要因である；ＡＴＢ２００の第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、主なリン酸化Ｎ−グリカン分子種がモノ−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンであって約０．５ｍｏｌ  Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ  ＡＴＢ２００の平均Ｍ６Ｐ含有量を有する；ＡＴＢ２００の第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、約１ｍｏｌシアル酸／ｍｏｌ  ＡＴＢ２００の平均シアル酸含有量を有する；ＡＴＢ２００の第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、約１．４ｍｏｌ  Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ  ＡＴＢ２００の平均Ｍ６Ｐ含有量を有し、約０．３５ｍｏｌモノ−Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ  ＡＴＢ２００の平均モノ−Ｍ６Ｐ含有量および約０．５２ｍｏｌビス−Ｍ６Ｐ／ｍｏｌ  ＡＴＢ２００の平均ビス−Ｍ６Ｐ含有量の主要因である；ＡＴＢ２００の第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、約０．８６ｍｏｌシアル酸／ｍｏｌ  ＡＴＢ２００の平均シアル酸含有量を有する；ＡＴＢ２００の第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、約４．２ｍｏｌシアル酸／ｍｏｌ  ＡＴＢ２００の平均シアル酸含有量を有する；ならびにＡＴＢ２００の第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、約０．８６ｍｏｌシアル酸／ｐｏｌ  ＡＴＢ２００の平均シアル酸含有量を有する。
【０１６９】
同様にこの２−ＡＡおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析技術により、ＡＴＢ２００の第１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でのＮ−グリカンの平均で約６５％は高マンノースＮ−グリカンであり、ＡＴＢ２００の第２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でのＮ−グリカンの約８９％は高マンノースＮ−グリカンであり、ＡＴＢ２００の第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でのＮ−グリカンの過半数はシアル化（およそ２０％が完全シアル化）されており、ＡＴＢ２００の第３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でのＮ−グリカンの約８５％は複合Ｎ−グリカンであり、ＡＴＢ２００の第４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位での約８４％のＮ−グリカンは、高マンノースＮ−グリカンであり、ＡＴＢ２００の第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位での約７０％のＮ−グリカンはシアル化（約２６％は完全シアル化）されており、ＡＴＢ２００の第５の潜在的Ｎ−グリコシル化部位での約１００％のＮ−グリカンは複合Ｎ−グリカンであり、ＡＴＢ２００の第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でのＮ−グリカンの約８５％はシアル化（２７％近くは完全シアル化）されており、ＡＴＢ２００の第６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でのＮ−グリカンの約９８％は複合Ｎ−グリカンであり、ＡＴＢ２００の第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でのＮ−グリカンの約８７％はシアル化（８％近くは完全シアル化）されており、ＡＴＢ２００の第７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位でのＮ−グリカンの約１００％は複合Ｎ−グリカンである。
【０１７０】
実施例４：ＡＴＢ２００とＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）／Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）との分析的比較
精製したＡＴＢ２００およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）Ｎ−グリカンを各ＥＲＴで見出される個々のＮ−グリカン構造を決定するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって評価した。Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）は市販の供給源から得た。図７に示すとおり、ＡＴＢ２００は、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）の右に溶出される４つの突出したピークを示した。これは、この評価がＣＩＭＰＲ親和性よりも末端電荷によることから、ＡＴＢ２００がＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）よりも高い程度でリン酸化されたことを確認している。図８に要約する、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）よりもＡＴＢ２００試料は、少ない量の非リン酸化高マンノース型Ｎ−グリカンを含有することが見出された。
【０１７１】
Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）中の従来のｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲと相互作用する能力を評価するために、２つの従来のｒｈＧＡＡ調製物をＣＩＭＰＲ親和性カラム（Ｍ６Ｐ基を有するｒｈＧＡＡに結合する）に注入し、素通り画分を回収した。結合した物質を遊離Ｍ６勾配を用いて溶出させた。画分を９６ウエルプレートに回収し、４ＭＵ−α−グルコシダーゼ基質によってＧＡＡ活性をアッセイした。未結合（素通り画分）および結合（Ｍ６Ｐ溶出）ｒｈＧＡＡの相対量をＧＡＡ活性に基づいて決定し、総酵素の割合として報告した。図９Ａおよび９Ｂは、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）中のｒｈＧＡＡの結合プロファイルを示している：Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）中の７３％のｒｈＧＡＡ（図９Ｂ）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）中の７８％のｒｈＧＡＡ（図９Ａ）は、ＣＩＭＰＲに結合しなかった。実際に、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）中の２７％だけのｒｈＧＡＡおよびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）中の２２％のｒｈＧＡＡが、筋細胞上のＣＩＭＰＲにそれを標的化するために生産的である可能性があるＭ６Ｐを含有した。対照的に図５に示すとおり、同じ条件下でＡＴＢ２００中の７０％を超えるｒｈＧＡＡがＣＩＭＰＲに結合することが見出された。
【０１７２】
ＣＩＭＰＲに結合できるｒｈＧＡＡのより高い百分率を有することに加えて、その相互作用の質を理解することは重要である。Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）およびＡＴＢ２００受容体結合をＣＩＭＰＲプレート結合アッセイを使用して決定した。簡潔にはＣＩＭＰＲコートプレートをＧＡＡを捕捉するために使用した。種々の濃度のｒｈＧＡＡを固定した受容体に適用し、未結合ｒｈＧＡＡを洗い落とした。残ったｒｈＧＡＡの量をＧＡＡ活性によって決定した。図１０Ａに示すとおり、ＡＴＢ２００は、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）よりも顕著に良好にＣＩＭＰＲに結合した。図１０Ｂは、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）（従来のｒｈＧＡＡ産生物）および本発明によるＡＴＢ２００中のビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカンの相対含有量を示している。Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）について、平均で１０％の分子だけがビス−リン酸化Ｎ−グリカンを有する。対照的に、平均でＡＴＢ２００中のすべてのｒｈＧＡＡ分子が少なくとも１つのビス−リン酸化Ｎ−グリカンを有する。
【０１７３】
全体的に、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）においてよりもＡＴＢ２００におけるＭ６Ｐ  Ｎ−グリカンの高い含有量は、ＡＴＢ２００中のｒｈＧＡＡ分子のより多い部分が筋細胞を標的化できることを示している、上に示すとおり、ＭＡＬＤＩによって決定されたモノ−リン酸化およびビス−リン酸化構造の高い百分率は、ＡＴＢ２００のＣＩＭＰＲ受容体への顕著に高い結合を例示しているＣＩＭＰＲプロファイルと一致する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を介するＮ−グリカン分析は、平均で各ＡＴＢ２００分子が少なくとも１つの天然ビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカン構造を含有することを確認した。ＡＴＢ２００でのこの高いビス−Ｍ６Ｐ  Ｎ−グリカン含有量は、Ｍ６Ｐ受容体プレート結合アッセイでのＣＩＭＰＲへの高い親和性結合と直接関連する（ＫＤ約２〜４ｎＭ）。
【０１７４】
ＡＴＢ２００およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）ｒｈＧＡＡの相対的細胞取り込みを正常およびポンペ線維芽細胞細胞株を使用して比較した。比較は、本発明による５〜１００ｎＭのＡＴＢ２００と１０〜５００ｎＭの従来のｒｈＧＡＡ産生物Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）とに関した。１６時間インキュベーション後、外部のｒｈＧＡＡをＴＲＩＳ塩基を用いて不活性化し、細胞を回収の前にＰＢＳを用いて３回洗浄した。内部移行したＧＡＡを４ＭＵ−α−グルコシド加水分解によって測定し総細胞内タンパク質と比較してグラフ化し、結果を図１１Ａ〜１１Ｃに示す。
【０１７５】
ＡＴＢ２００は、細胞に効率的に内部移行されることも示されている。図１１Ａ〜１１Ｂに示すとおり、ＡＴＢ２００は、正常およびポンペ線維芽細胞の両方に内部移行され、従来のｒｈＧＡＡ産生物Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）よりも高い程度で内部移行される。ＡＴＢ２００は、約２０ｎＭで細胞受容体を飽和状態にする一方で、約２５０ｎＭのＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）が細胞受容体を飽和状態にするために必要である。これらの結果から推定される取り込み効率定数（Ｋｕｐｔａｋｅ）は、図１１Ｃによって示されるとおりＡＴＢ２００について２〜３ｎｍ、およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）について５６ｎＭである。これらの結果は、ＡＴＢ２００がポンペ病のための十分に標的化された処置であることを示唆している。
【０１７６】
実施例５：ＡＴＢ２００および薬理的シャペロン
酸性または中性ｐＨバッファー中でのＡＴＢ２００の安定性を、タンパク質が変性すると色素の蛍光が増加するＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅを使用する熱安定性アッセイにおいて評価した。図１２に示すとおり、リソソームの酸性環境を模倣する条件ｐＨ５．２でのＡＴＢ２００の安定性と比較して、ＡＴ２２２１の添加は、ＡＴＢ２００をｐＨ７．４で濃度依存的様式で安定化した。表６に要約するとおり、ＡＴ２２２１の添加は、ＡＴＢ２００の融解温度（Ｔｍ）を１０ｏＣ近く上昇させた。
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【０１７７】
実施例６：Ｇａａ  ＫＯマウスでのＡＴＢ２００およびＡＴ２２２１の同時投与
ＡＴＢ２００およびＡＴ２２２１の治療効果をＧａａ  ＫＯマウスにおいて評価および、アルグルコシダーゼアルファに対して比較した。研究のためにオスＧａａ  ＫＯ（３から４月齢）および同齢野生型（ＷＴ）マウスを使用した。アルグルコシダーゼアルファをボーラス尾静脈静脈内（ＩＶ）注射を介して投与した。同時投与レジメンでＡＴ２２２１を経口経管栄養（ＰＯ）を介して、ＡＴＢ２００のＩＶ注射に３０分間先行して投与した。処置は、２週間に１回で与えた。処置マウスを最終投与１４日後に屠殺し、種々の組織をさらなる分析のために回収した。表７は研究設計を要約している：
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【０１７８】
組織試料中の組織グリコーゲン含有量を上に考察のとおりアミログルコシダーゼ消化を使用して決定した。図１３に示すとおり、２０ｍｇ／ｋｇ  ＡＴＢ２００と１０ｍｇ／ｋｇ  ＡＴ２２２１との併用は、４つの異なる組織（四頭筋、三頭筋、腓腹筋および心臓）において同投薬量のアルグルコシダーゼアルファと比較してグリコーゲン含有量を顕著に低減させた。
【０１７９】
次の：Ｋｈａｎｎａ  Ｒら（２０１２）、「Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ＡＴ２２２０  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｃｉｄ  α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ７（７）：ｅ４０７７６；およびＫｈａｎｎａ，Ｒら（２０１４）、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ＡＴ２２２０  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐｏｍｐｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（７）：ｅ１０２０９２において考察されている方法に従って組織試料をバイオマーカー変化についても分析した。図１４に示すとおり、リソソーム増殖の指標であるＬＡＭＰ１−陽性ベシクルの顕著な増加および拡張がＷＴと比較してＧａａ  ＫＯ動物の筋線維において見られた。ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１の同時投与は、標準化ＬＡＭＰ１レベルを有してさらなる線維をもたらし、一方残りのＬＡＭＰ１−陽性ベシクルもサイズが低減していた（挿入図）。
【０１８０】
同様に、未処置Ｇａａ  ＫＯマウスの筋線維における著しいＬＣ３−陽性凝集物は、オートファジーゾーンおよびオートファジービルドアップの存在を示している。ＬＣ３−陽性凝集物（赤）は、アルグルコシダーゼアルファを用いて処置したマウスと比較して、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１同時投与を用いて処置したマウスにおいて選択的に低減していた（図１５Ａ）。同様の観察がＬＣ３の発現をウェスタンブロットを使用して評価した場合にも見られた。図１５Ｂに示すとおり、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１を用いて処置した動物の大部分は、オートファジー流動の改善を示唆するオートファゴソームと関連する脂質付加形態、ＬＣ３  ＩＩのレベルにおける顕著な減少を示した。対照的に、オートファジーへのアルグルコシダーゼアルファの効果は中程度であった。
【０１８１】
膜修復に関与し、その欠乏／誤輸送が多数の筋ジストロフィーと関連するタンパク質、ジスフェリンも評価した。図１６に示すとおり、ジスフェリン（茶）は、Ｇａａ  ＫＯマウスの筋形質に重度に蓄積していた。アルグルコシダーゼアルファと比較して、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１は、より多くの筋線維の筋細胞膜にジスフェリンを戻すことができた。
【０１８２】
これらのデータは、ＡＴＢ２００およびミグルスタットを用いて処置したヒトポンペ病患者において実証された細胞レベルでの改善と一致し（例えば、患者はグリコーゲン蓄積および筋損傷のバイオマーカーのレベルの低減を示す）、ポンペ病の有効な処置だけでなく、疾患進行の逆転ももたらす。ヒトポンペ病患者での臨床データは、下の実施例８〜１３に要約されている。
【０１８３】
実施例７：単一線維分析
図１７に示すとおり、ビヒクル処置マウスの大部分が大幅に肥大したリソソーム（緑）（、例えば「Ｂ」を参照されたい）、広範なオートファジーのビルドアップ（赤）（例えば「Ａ」を参照されたい）の存在を示した。Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）処置マウスは、ビヒクル処置マウスと比較していかなる顕著な差異も示さなかった。対照的に、ＡＴＢ２００を用いて処置したマウスから単離したほとんどの線維は、劇的に減少したリソソームのサイズを示した（例えば「Ｃ」を参照されたい）。さらに、オートファジーのビルドアップを有する面積も種々の程度で低減した（例えば「Ｃ」を参照されたい）。結果として、ＡＴＢ２００処置マウス由来の分析した筋線維のかなりの部分（３６〜６０％）が、正常または正常に近いと考えられた。下の表８は、図１７に示す単一線維分析を要約している。
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【０１８４】
全体としてデータは、高いＭ６Ｐ含有量を有するＡＴＢ２００は、単独および血液の中性ｐＨでの薬理的シャペロンＡＴ２２２１によるさらなる安定化の両方で、Ｇａａ  ＫＯマウスに投与した場合にアルグルコシダーゼアルファと比較して、組織標的化およびリソソーム輸送においてさらに効率的であり、図１８に示すＡＴ２２２１によるＡＴＢ２００の安定化と一致することを示している。結果として、ＡＴＢ２００の投与およびＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１の同時投与は、グリコーゲン蓄積、リソソーム増殖およびオートファジーゾーンの形成などの疾患関連病態の一部の矯正においてアルグルコシダーゼアルファよりも有効であった。これらの陽性治療効果により、ＡＴＢ２００およびＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１同時投与の投与は、損傷からの筋線維の回復する機会を改善し、および最適なＧＡＡ活性の欠如により細胞中に蓄積したグリコーゲンをクリアすることにより損傷をさらに逆転させることが示されている。実施例６のとおり、これらのデータは、ＡＴＢ２００およびミグルスタットの投与後のポンペ病の有効な治療および疾患進行の逆転の両方ももたらす、ヒトポンペ病患者において実証された細胞レベルでの改善とも一致している。ヒトポンペ病患者における臨床データを下の実施例８〜１３に要約する。
【０１８５】
実施例８：ＡＴＢ２００−０２治験：ポンペ病を有する患者におけるＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１の非ヒト研究
前臨床研究を、薬物動態（ＰＫ）およびグリコーゲン低減の効率を評価するためにＡＴＢ２００酵素補充療法（ＥＲＴ）およびＡＴ２２２１シャペロン用量を変動させてＧａａノックアウトマウスにおいて実施した。これらのデータをヒトでの相当するＡＴ２２２１シャペロン用量を推定するために使用した。次に研究ＡＴＢ２００−０２（ＮＣＴ０２６７５４６５）を非盲検固定連続、漸増投与、ファースト・イン・ヒューマン、第１／２相研究として、ポンペ病を有する患者にＡＴ２２２１と共投与するＡＴＢ２００の安全性、忍容性、ＰＫ、薬力学的（ＰＤ）および有効性を評価するために設計した。図１９Ａ〜１９Ｂは、ＡＴＢ２００−０２研究設計を示している。アルグルコシダーゼアルファを用いる酵素補充療法を以前受けた歩行可能患者は、歩行可能ＥＲＴ−切り替え（もしくはＥＲＴ−切り替え歩行可能）患者またはコホート１患者と称される。アルグルコシダーゼアルファを用いる酵素補充療法を以前受けた歩行不能患者は、歩行不能ＥＲＴ−切り替え（もしくはＥＲＴ−切り替え歩行不能）患者またはコホート２患者と称される。アルグルコシダーゼアルファを用いる酵素補充療法を以前受けていない歩行可能患者は、ＥＲＴ−未処置（もしくはＥＲＴ−未処置歩行可能）患者またはコホート３患者と称される。
【０１８６】
５カ国、１６箇所の臨床現場がＡＴＢ２００−０２研究に参加した。研究は、次の重要な組み入れ基準を使用した：ＧＡＡ酵素活性の実証された欠乏に基づいてまたはＧＡＡ表現型によってポンペ病を有すると診断され、治験開始前にアルグルコシダーゼアルファを用いる酵素補充療法を２〜６年間（コホート１）（またはコホート２について≧２年間）受けた、年齢１８〜６５歳の男性および女性。適格対象は、２週間ごとの頻度でアルグルコシダーゼアルファを現在受けており、最近２回の点滴を投与中断を生じる薬物関連有害事象（ＡＥ）を伴わずに完了した（コホート１および２）者であった。対象は、６分間歩行検査（６ＭＷＴ）で２００から５００メートルを歩行することができた（コホート１および３）、予測正常値の３０〜８０％の直立位努力肺活量（ＦＶＣ）を有する（コホート１および３）または車椅子から離れられないもしくは支援を受けずに歩行できない（コホート２）。６ＭＷＴおよびＦＶＣ検査のためのプロトコールは、例えば、ＬａｃｈｍａｎおよびＳｃｈｏｓｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２０１３、８：１６０およびＢｉｔｔｎｅｒおよびＳｉｎｇｈ、Ｔｈｅ  ６  Ｍｉｎｕｔｅ  Ｗａｌｋ  Ｔｅｓｔ、Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ａｄｖｉｓｏｒ、２０１３に見出すことができる。図１９Ｃは、対象２０名についてのベースライン特性を提供する。安全性、忍容性およびバイオマーカーをコホート１、２および３について評価した。次の機能性評価をコホート１および３について評価した：６ＭＷＴ、他の運動機能検査（時間検査および歩行−段−ガワー−椅子（ＧＳＧＣ））、徒手筋力検査および肺機能（ＦＶＣ、最大吸気圧（ＭＩＰ）／最大呼気圧（ＭＥＰ））。時間検査およびＧＳＧＣ検査のためのプロトコールは、例えば、ＬａｃｈｍａｎおよびＳｃｈｏｓｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２０１３、８：１６０に見出すことができる。コホート２について、機能評価は筋力検査を含んだ。
【０１８７】
実施例９：ＡＴＢ２００−０２治験からの中間ＰＫ結果
ＡＴ２２２１についての薬物動態データの概要を図２０に示す。ＡＴＢ２００について５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇでの血漿中の総ＧＡＡタンパク質濃度をｒｈＧＡＡ−特異的「シグネチャー」ペプチド（複数可）Ｔ０９（一次）およびＴ５０（確認）の検証されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量によってステージ１および２を完了した１１名のコホート１患者について、ならびにステージ３でＰＫ研究を完了した５名のコホート２患者について決定した。ステージ１について、血漿総ＧＡＡタンパク質濃度のための血液試料をＡＴＢ２００点滴の開始に先行してならびに点滴の開始１、２、３、３．５、４、４．５、５、６、８、１０、１２および２４時間後に回収した。ステージ２およびステージ３について、血漿総ＧＡＡタンパク質濃度のための血液試料を点滴の開始に先行してならびに点滴開始の１、２、３、３．５、４、４．５、５、６、８、１０、１２および２４時間後に回収した。
【０１８８】
ＡＴ２２２１  ＰＫ分析をステージ１および２を完了した１１名のコホート１患者およびＰＫ研究をステージ３で完了した５名のコホート２患者について実施した。血漿ＡＴ２２２１濃度のための血液試料をＡＴ２２２１経口投与の直前（時間０）ならびに、ＡＴ２２２１経口投与１．５、２、２．５、３、４、５、６、９、１１および２５時間後に採取した。血漿ＡＴ２２２１を検証されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイによって決定した。
【０１８９】
図２１に示すとおり、ＡＴＢ２００のレベルは、単独で投与される場合に用量比例的様式よりもわずかに大きく増加した。２０ｍｇ／ｋｇでのＡＴＢ２００のＡＴ２２２１の単回高用量（２６０ｍｇ）との同時投与は、単独で投与される２０ｍｇ／ｋｇでのＡＴＢ２００と比較して、総ＧＡＡタンパク質曝露曲線下面積（ＡＵＣ）をおよそ１７％増加させた（図２１、図２２Ｃ）。２０ｍｇ／ｋｇでのＡＴＢ２００と複数の高用量（２６０ｍｇ）のＡＴ２２２１との同時投与は、総ＧＡＡタンパク質曝露曲線下面積（ＡＵＣ）を、２０ｍｇ／ｋｇで単独で投与されたＡＴＢ２００と比較しておよそ２９％増加させた（図２１、図２２Ｄ）。分布半減期および部分ＡＵＣ−２４時間における増加が、終末除去相の間は対数スケールで観察された（図２１、図２２Ａ、図２２Ｂ）。図２１に示すとおり、分布半減期（α相）は、４０％増加し、血漿中のＡＴＢ２００について高用量ＡＴ２２２１の安定化効果と一致した。分布半減期における増加は、最大血漿濃度時から投薬２４時間後までの部分ＡＵＣの４２．２％の増加を伴った（図２１、図２２Ｂ）。ＡＴ２２２１によるＡＴＢ２００の安定化のさらなる証拠が低および高用量ＡＴ２２２１対ＡＴＢ２００単独の比較で投薬１２および２４時間後に観察された（図２２Ｅおよび２２Ｆ）。ＥＲＴ−未処置（コホート３）とＥＲＴ−切り替え患者（コホート１）との間で血漿総ＧＡＡタンパク質曝露において統計的有意差はなかった（図２３）。シグネチャーペプチドＴ５０のＰＫ動態は、シグネチャーペプチドＴ０９（ＡＵＣ比：１．００）のものと異ならなかった。
【０１９０】
実施例１０：ＡＴＢ２００−０２治験からの中間有効性結果
図２４Ａおよび２４Ｂに示すとおり、６ＭＷＴは、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者およびＥＲＴ−未処置患者を６カ月時点で改善し、観察された利益は１２カ月まで継続した。６ＭＷＴは、６、９および１２カ月でそれぞれ７／１０名、８／１０名および８／８名のＥＲＴ−切り替え患者において増加した。６ＭＷＴは、６、９および１２カ月でそれぞれ５／５名、５／５名および２／２名のＥＲＴ−未処置患者において増加した。
【０１９１】
図２４Ｃ、図２６Ａおよび図２６Ｃに示すとおり、６ＭＷＴと共に運動機能検査および徒手筋力における改善は、ＥＲＴ−切り替えおよびＥＲＴ−未処置患者の両方についての筋肉機能における全般的改善と１２カ月にわたって一致する。
【０１９２】
図２５および図２６Ｂに示すとおり、一貫した実質的な増加が、６カ月および９カ月ですべての歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者において上肢強度において観察された。
【０１９３】
図２７に示すとおり、ＦＶＣは、６、９および１２カ月でそれぞれ５／９名、６／９名および３／７名のＥＲＴ−切り替え患者において安定または増加し、ＦＶＣは、６、９および１２カ月でそれぞれ５／５名、５／５名および２／２名のＥＲＴ−未処置患者において安定または増加した。同様に図２７に示すとおり、ＥＲＴ−切り替え歩行可能患者において最大吸気圧（ＭＩＰ）は安定であり、最大呼気圧（ＭＥＰ）は増加した一方で、ＥＲＴ−未処置患者ではＭＩＰは増加し、ＭＥＰは安定であった。
【０１９４】
疲労重症度スケール（「ＦＳＳ」）は、それぞれ１から７のスケールでスコア化される９個の質問からなる自己評価質問票である。合計スコアは９から６３の範囲であり、高い値は疾患状態による高レベルの疲労を表している。健康な集団での標準値はおよそ２１である（Ｇｒａｃｅ  Ｊら、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  Ｒｅｌａｔ  Ｄｉｓｏｒｄ．２００７；１３：４４３〜４４５）。図２８に示すとおり、すべてのコホートは、ベースラインでの疲労によって顕著に影響を与えられ、すべてのコホートは、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１を受けた後にそれらのＦＳＳでの改善を実証した。
【０１９５】
実施例１１：ＡＴＢ２００−０２治験からの中間結果：筋損傷のマーカー
次の筋肉損傷マーカーを評価した：クレアチンキナーゼ（ＣＫ）酵素、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）。９カ月間の臨床治験後に入手できる結果を図２９Ａ〜２９Ｃに報告する（コホート１、２および３についてそれぞれ最大５８週間、２４週間および３６週間から得たデータ；低いｎ値は、一部のデータが分析できなかったか、またはまだ分析されていないかのいずれかを示している）。これらそれぞれの時点で観察されたベースラインからの平均低減は、およそ、歩行可能ＥＲＴ−切り替え患者（ｎ＝９）について３０〜３５％、歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者（ｎ＝４）について５〜２０％、およびＥＲＴ−未処置患者（ｎ＝５）について４０〜５５％であった。１２カ月の臨床治験後に得られたＣＫ酵素についての結果は、図２９Ｄに報告されている（コホート１、２および３について最大１２カ月から得たデータ；低いｎ値は、一部のデータが分析できなかったか、またはまだ分析されていないかのいずれかを示す）。
【０１９６】
尿中ヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）をグリコーゲン蓄積のマーカーとして評価した。１２カ月の臨床治験後に得られたＨｅｘ４についての結果を図２９Ｄに報告した（コホート１、２および３について最大１２カ月から得たデータ；低いｎ値は、一部のデータが分析できなかったか、またはまだ分析されていないかのいずれかを示す）。
【０１９７】
実施例１２：ＡＴＢ２００−０２治験からの中間安全性結果
処置の最も長い継続期間は、２０カ月を超えた。有害事象（ＡＥ）は、３つすべてのコホートにわたる合計４００を超える点滴後に非常に低い率の点滴関連反応（１％未満）を伴って、一般に軽度で一過性であった。これらの発生は、標準的な前投薬によってコントロールされた。
【０１９８】
７２週間までに処置関連として報告された最も一般的なＡＥは、悪心（３／２０名）、振戦（３／２０名）、頭痛（３／２０名）、疲労（３／２０名）、下痢（２／２０名）、筋けいれん（２／２０名）および関節腫脹（２／２０名）であった。
【０１９９】
２０＋カ月までに処置関連として報告された最も一般的なＡＥは、腹痛（上部および下部腹痛を含む）（８／２０名）、下痢（８／２０名）、上咽頭炎（６／２０名）、悪心（５／２０名）、頭痛（５／２０名）および上気道感染（５／２０名）（図３０）であった。研究薬物とは無関係であった１例の重度のＡＥが報告された（下気道感染のための入院）。ＡＥのために研究が中断された患者はいなかった。
【０２００】
標準的な前投薬によってコントロールされた、点滴関連反応（ＩＡＲ）の３例のインシデントが５５０＋回の点滴においてあった。１例のＩＡＲ事象（皮膚変色）は、歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者（コホート２）において生じた。２例のＩＡＲ事象（局所そう痒、紅斑および灼熱感）は、ＥＲＴ−未処置患者（コホート３）において生じた（図３０）。
【０２０１】
実施例１３：ＡＴＢ２００−０２治験からの中間結果の概要および結論
図３１に要約のとおり、さまざまなコホートにわたって筋損傷および基質蓄積のマーカー、筋肉機能検査（時限検査および持続時間）、徒手筋力強度の顕著で予想外の平行する改善、ならびに呼吸機能検査での安定化および／または改善を示すＡＴＢ２００−０２治験からの中間データに一致がある。筋肉機能は６および９カ月でそれぞれ１６／１８名および１０／１０名の患者において改善した。６ＭＷＴ距離における増加は、ＥＲＴ−切り替え歩行可能およびＥＲＴ−未処置患者において１２カ月まで一貫し、恒久的であり、ＥＲＴ−切り替え歩行可能およびＥＲＴ−未処置患者における他の運動機能検査における改善と同様であった。定性的および定量的測定は、歩行不能ＥＲＴ−切り替え患者における上肢強度に６および９カ月で増加を示した。ＦＶＣ、ＭＩＰおよびＭＥＰは、ＥＲＴ−切り替え患者において一般に安定であり、ＥＲＴ−未処置患者において増加した。疲労スコアにおける改善は、すべてのコホートにおいた観察された。バイオマーカーレベル（例えば、ＣＫおよびＨｅｘ４のレベル）は、すべてのコホートにおいて減少し、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１は全般に良好な耐容性を示した。
【０２０２】
したがって、治療の多次元的影響は、ＡＴＢ２００／ＡＴ２２２１の併用レジメンがポンペ病を有する患者のための重要な処置選択肢である可能性があることを示唆している。これらの臨床結果は、実施例７に記載される単一線維分析研究からの結果を支持しており、処置が筋線維から病態をクリアすることに有効であることを実証している。臨床治験のさらなる研究は進行中である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ−Ｂ】
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【図２２Ｃ−Ｄ】
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【図２２Ｅ−Ｆ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３２Ｈ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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