【手続補正書】
【提出日】平成29年8月10日(2017.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性細胞又はその集団と、以下の作用剤
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤
を含むフィーダーフリー培地とを含む組成物であって、
前記多能性細胞がマウス胚性幹細胞ではなく、
前記フィーダーフリーが、フィーダー細胞を含まず、且つ、フィーダー細胞で予備馴化されていないことであり、前記フィーダー細胞が動物細胞又はヒト以外の動物細胞を含む、組成物。
【請求項２】
前記多能性細胞の集団が基底状態の多能性を有するナイーブ多能性細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記基底状態の多能性が、フィーダーフリー条件下でのクローン性の改善；並びに、以下の特徴の１又は複数：Ｘｉｓｔの発現の抑制の増大；Ｘ染色体の再活性化の増大；胚体外の幹細胞マーカーの発現増大；フィーダーフリー条件下での自己再生能の改善；フィーダーフリー条件下での単一細胞の生存率の改善；及び長期培養の間に通常の核型及び通常の染色体コピー数を有すること、を特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＲＯＣＫ阻害剤がチアゾビビンまたはＹ２７６３２であり、
前記ＴＧＦβ受容体阻害剤がＡ−８３−０１、ＳＢ４３１５４２、または別のＡＬＫ５阻害剤であり、
前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯであり、そして／または
前記ＭＥＫ阻害剤がＰＤ９８０５９またはＰＤ０３２５９０１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記培地が成長因子およびサイトカインを含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
増大した多能性を有する細胞又はその集団であって、
前記細胞が、
再プログラミング細胞をフィーダーフリー環境において、以下の作用剤：
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
を含むフィーダーフリー培地と接触させて、該培地と接触させる前の該細胞と比較して、前記細胞の多能性を増大させるステップを含む方法により得られ、
前記フィーダーフリーが、フィーダー細胞を含まず、且つ、フィーダー細胞で予備馴化されていないことであり、前記フィーダー細胞が動物細胞又はヒト以外の動物細胞を含む、
増大した多能性を有する細胞又はその集団。
【請求項７】
（ｉ）再プログラミング細胞がヒト細胞、体細胞、多分化能細胞、人工多能性幹細胞、またはプライムされた多能性細胞であり；そして／または
（ｉｉ）多能性が増大している再プログラミング細胞が、ＴＧＦβ受容体、アクチビン、およびＭＥＫシグナル伝達経路の外因性の刺激の不在下、および必要に応じてｂＦＧＦ経路の外因性の刺激の不在下で複製し、かつ多能性を維持し；そして／または
（ｉｉｉ）多能性が増大している再プログラミング細胞にフィーダーフリー環境において少なくとも１回の細胞分裂を可能にさせるステップをさらに含む、請求項６に記載の増大した多能性を有する細胞又はその集団。
【請求項８】
増大した多能性が基底状態の多能性を含む、請求項６に記載の増大した多能性を有する細胞又はその集団。
【請求項９】
前記細胞の基底状態の多能性が、前記作用剤との接触なしに得られた人工多能性細胞と比較して、以下の特徴の１又は複数：
ａ）クローン性の改善；
ｂ）Ｘ染色体の再活性化の増大；
ｃ）胚体外の幹細胞マーカーの発現増大；
ｄ）フィーダーフリー条件下での自己再生能の改善；
ｅ）フィーダーフリー条件下での単一細胞の生存率の改善；
ｆ）通常の核型及び通常の染色体コピー数を有すること、
ｇ）少なくとも５０％低いＸｉｓｔ活性を有すること、
によって特徴付けられる、
請求項７に記載の増大した多能性を有する細胞又はその集団。
【請求項１０】
基底状態の多能性を有さない細胞と、ＲＯＣＫ阻害剤並びに、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＭＥＫ阻害剤のうちの１又は複数を含む作用剤とを含む、組成物。
【請求項１１】
前記基底状態の多能性を有さない細胞が再プログラミング細胞を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
再プログラミング細胞がヒト細胞、体細胞、多分化能細胞、人工多能性細胞、又はプライム型多能性細胞を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物がフィーダーフリーであり、前記フィーダーフリーが、フィーダー細胞を含まず、且つ、フィーダー細胞で予備馴化されていないことであり、前記フィーダー細胞が動物細胞又はヒト以外の動物細胞を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
再プログラミングされた細胞又はその集団であって、
前記細胞が、
ａ）フィーダーフリー環境においてＯｃｔ４と、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の一方又は両方とを含む再プログラミング因子を細胞集団に導入するステップと、
ｂ）ステップａ）の細胞を、以下の作用剤：
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
と、接触させるステップとを含む方法によって得られ、
前記方法が、前記作用剤との接触なしに再プログラミングするものと比較して改善した効率を有し、
ステップａ）の前の細胞の集団が、体細胞又は非多能性細胞を含み、
前記フィーダーフリーが、フィーダー細胞を含まず、且つ、フィーダー細胞で予備馴化されていないことであり、前記フィーダー細胞が動物細胞又はヒト以外の動物細胞を含む、再プログラミングされた細胞又はその集団。
【請求項１５】
前記方法が
ｃ）ステップｂ）由来の細胞を解離するステップと、
ｄ）単一細胞選別をしてＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ５０、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＯＣＴ４、ＮａｎｏｇまたはＳｏｘ２を含む多能性のマーカーのうちの１又は複数を発現する個々の細胞を得るステップと
を更に含む、請求項１４に記載の再プログラミングされた細胞又はその集団。
【請求項１６】
前記方法が
ｅ）ステップｄ）の個々の細胞をフィーダーフリー環境において、以下の：
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
のうちの１又は複数を含むフィーダーフリー培地において培養し、それにより、再プログラミングされた細胞の多能性を維持するステップを更に含む、請求項１５に記載の再プログラミングされた細胞又はその集団。
【請求項１７】
再プログラミングされた細胞が基底状態の多能性細胞を含む、請求項１５に記載の再プログラミングされた細胞又はその集団。
【請求項１８】
再プログラミングされた細胞の集団がクローン細胞を含む、請求項１５に記載の再プログラミングされた細胞又はその集団。
【請求項１９】
改善したゲノム安定性を有する人工多能性細胞又はその集団であって、
前記細胞がフィーダーフリー環境の方法により得られ、当該方法が、
ａ）フィーダーフリー環境においてＯｃｔ４と、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の一方又は両方とを含む再プログラミング因子を細胞集団に導入して再プログラミングを誘導するステップと、
ｂ）ステップａ）の細胞を、
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
を含む作用剤と接触させ、それにより、通常の核型及び／又は通常の染色体コピー数を含む、改善したゲノム安定性を有する多能性細胞を得るステップを含み、
前記フィーダーフリーが、フィーダー細胞を含まず、且つ、フィーダー細胞で予備馴化されていないことであり、前記フィーダー細胞が動物細胞又はヒト以外の動物細胞を含む、
改善したゲノム安定性を有する人工多能性細胞又はその集団。
【請求項２０】
前記方法が
ｃ）ステップｂ）の個々の細胞をフィーダーフリー環境において、以下の：
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
のうちの１又は複数を含むフィーダーフリー培地において培養し、それにより前記人工多能性細胞の多能性を維持するステップを更に含む、
請求項１９に記載の改善したゲノム安定性を有する人工多能性細胞又はその集団。
【請求項２１】
前記人工多能性細胞が、基底状態の多能性、改善したクローナリティ、及び／又は増強された解離後の生存率、を有する、請求項１９又は２０に記載の改善したゲノム安定性を有する人工多能性細胞又はその集団。
【請求項２２】
増強された生存率を有する、解離した人工多能性細胞又はその集団であって、
前記細胞がフィーダーフリー環境の方法により得られ、当該方法が、
ａ）以下の作用剤：ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤；ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤；ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤の存在下又は不在下で、人工多能性細胞を解離して解離した細胞を得るステップと、
ｂ）ステップａ）の解離した人工多能性細胞と、以下の作用剤：
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
のうちの１又は複数を含むフィーダーフリー培地とを接触させるステップとを含み、
前記の解離した細胞がフィーダーフリー条件下で、単一細胞として増強された生存率を有し、
前記の解離した細胞の多能性がフィーダーフリー条件下で維持され、
前記フィーダーフリーが、フィーダー細胞を含まず、且つ、フィーダー細胞で予備馴化されていないことであり、前記フィーダー細胞が動物細胞又はヒト以外の動物細胞を含む、増強された生存率を有する、解離した人工多能性細胞又はその集団。
【請求項２３】
前記方法が
ｃ）単一細胞選別をしてＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ５０、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＯＣＴ４、ＮａｎｏｇまたはＳｏｘ２を含む多能性のマーカーのうちの１又は複数を発現する個々の解離された細胞を得るステップと
を更に含む、請求項２２に記載の解離した人工多能性細胞又はその集団。
【請求項２４】
前記方法が
ｄ）ステップｃ）の個々の解離された細胞をフィーダーフリー環境において、以下の：
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
のうちの１又は複数を含むフィーダーフリー培地において培養し、それにより解離した人工多能性細胞の多能性を維持するステップを更に含む、請求項２３に記載の解離した人工多能性細胞又はその集団。
【請求項２５】
人工多能性細胞を単一細胞選別する方法であって、
ａ）解離した人工多能性細胞を得るステップと、
ｂ）解離した人工多能性細胞と、以下の作用剤：
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
のうちの１又は複数を含むフィーダーフリー培地とを接触させるステップと、
ｃ）解離した人工多能性細胞を選別してＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ５０、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＯＣＴ４、ＮａｎｏｇまたはＳｏｘ２を含む多能性のマーカーのうちの１又は複数を発現する単一の細胞を得て、それにより、単一の解離した人工多能性細胞を得るステップとを含み、
前記の解離した細胞がフィーダーフリー条件下で、単一細胞として増強された生存率を有し、
前記の解離した細胞の多能性がフィーダーフリー条件下で維持され、
前記フィーダーフリーが、フィーダー細胞を含まず、且つ、フィーダー細胞で予備馴化されていないことであり、前記フィーダー細胞が動物細胞又はヒト以外の動物細胞を含む、方法。
【請求項２６】
ｄ）ステップｃ）の単一の解離した人工多能性細胞をフィーダーフリー環境において、以下の：
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
のうちの１又は複数を含むフィーダーフリー培地において培養し、それにより単一の解離した人工多能性細胞の多能性を維持するステップを更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
解離した人工多能性細胞を得ることが、以下の作用剤：ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤；ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤；ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤の存在下又は不在下で人工多能性細胞を解離することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の、単一の解離した人工多能性細胞又はその集団。
【請求項２９】
請求項６−９、１４−１８、１９−２１、２２−２４、及び２８のいずれか１項に記載の細胞を含む組成物。
【請求項３０】
以下の：
ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
のうちの１又は複数を含むフィーダーフリー培地を更に含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項６−９、１４−１８、１９−２１、２２−２４、及び２８のいずれか１項に記載の細胞、又はそれらから誘導した所望の細胞型の分化細胞を含む、治療用組成物。
【請求項３２】
薬剤の製造における、請求項３１に記載の治療用組成物の使用。
【請求項３３】
前記治療用組成物に含まれる細胞が同種又は自家である、請求項３２に記載の治療用組成物の使用。