【手続補正書】
【提出日】平成29年2月6日(2017.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、配列番号：１３のアミノ酸配列から成るｄｅ２−７接合点ペプチドに結合しないものである；ヒト野生型ＥＧＦＲの残基２７３−５０１の配列内のエピトープに結合するものである；軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、アミノ酸配列ＨＳＳＱＤＩＮＳＮＩＧ（配列番号：１８）を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域と、アミノ酸配列ＨＧＴＮＬＤＤ（配列番号：１９）を有する第二のポリペプチド結合ドメイン領域と、アミノ酸配列ＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（配列番号：２０）を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域とを含み、
該重鎖の可変領域が、アミノ酸配列ＳＤＦＡＷＮ（配列番号：１５）を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域と、式ＩＸに示すアミノ酸配列：
ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＸａａ９ＰＳＬＫＳ      （ＩＸ）
（式中、Ｘａａ９は、非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸残基である。）（配列番号：１５９）、
に対応するアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド結合ドメイン領域と、アミノ酸配列ＶＴＡＧＲＧＦＰＹ（配列番号：１７）を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域とを含むものである抗体を提供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
【図１】図１は、神経膠腫細胞系のフローサイトメトリー分析の結果を提示するものである。Ｕ８７ＭＧ（薄灰色ヒストグラム）およびＵ８７ＭＧ．Δ２−７（濃灰色ヒストグラム）細胞を、示されているとおり、無関係なＩｇＧ２ｂ抗体（白（ｏｐｅｎ）ヒストグラム）、ＤＨ８．３（ｄｅ２−７  ＥＧＦＲに特異的）、ｍＡｂ８０６または５２８（野生型とｄｅ２−７  ＥＧＦＲの両方を結合する。）いずれかで染色した。
【図２−１】図２Ａ−Ｄは、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂＤＨ８．３およびｍＡｂ５２８のＥＬＩＳＡの結果を提示するものである。（Ａ）ｓＥＧＦＲコートＥＬＩＳＡプレートへの漸増濃度のｍＡｂ８０６（▲）ＤＨ８．３（●）または５２８（■）の結合。（Ｂ）溶液中の漸増濃度の可溶性ＥＧＦＲ（ｓＥＧＦＲ）によるｓＥＧＦＲコートＥＬＩＳＡプレートへのｍＡｂ８０６およびｍＡｂ５２８の結合の阻害。（Ｃ）ｄｅ２−７接合点ペプチドへの漸増濃度のＤＨ８．３の結合により、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ５２８についての固定化野生型ｓＥＧＦＲへの結合曲線（Ｄ）が説明される。
【図２−２】図２Ｅおよび２Ｆは、Ｃ末端ビオチン化ペプチドを使用する、および本発明のモノクローナル抗体を他の公知抗体（これらの中で、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲ突然変異体の接合点ペプチドを認識するＬ８Ａ４抗体）および対照と一緒に含む、ＢＩＡｃｏｒｅ結合研究の結果をグラフで提示するものである。
【図３】図３は、ｍＡｂ８０６およびＤＨ８．３抗体の内在化を描写するものである。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞をｍＡｂ８０６（▲）またはＤＨ８．３（●）と共に４℃で前保温し、３７℃に移し、ＦＡＣＳによって内在化を判定した。データは、３回（ＤＨ８．３）または４回（ｍＡｂ８０６）の独立した実験の各時点での平均内在化±ＳＥを表す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片を有するヌードマウスにおける放射標識（ａ）１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６および（ｂ）１３１Ｉ−ＤＨ８．３の生体内分布（％ＩＤ／ｇ腫瘍組織）を図示するものである。各点は、１時間（ｎ＝４）を除く５匹のマウスの平均±ＳＥを表す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片を有するヌードマウスにおける（ａ）腫瘍：血液または（ｂ）腫瘍：肝臓比として表示した放射標識１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６（白棒）および１３１Ｉ−ＤＨ８．３（黒棒）抗体の生体内分布を図示するものである。各棒は、１時間（ｎ＝４）を除く５匹のマウスの平均±ＳＥを表す。
【図６】図６Ａ−Ｃは、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する細胞系のフローサイトメトリー分析を図示するものである。Ａ４３１細胞をｍＡｂ８０６、ＤＨ８．３または５２８のいずれかで染色し（黒ヒストグラム）、無関係なＩｇＧ２ｂ抗体（白ヒストグラム）と比較した。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＡ４３１異種移植片を有するヌードマウスにおける放射標識（ａ）１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６および（ｂ）１３１Ｉ−５２８の生体内分布（％ＩＤ／ｇ腫瘍組織）を図示するものである。
【図８】図８Ａ−Ｄは、（Ａ、Ｃ）Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７および（Ｂ、Ｄ）Ａ４３１異種移植片を有するヌードマウスにおける（Ａ、Ｂ）腫瘍：血液または（Ｃ、Ｄ）腫瘍：肝臓比として表示した放射標識１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６（白棒）および１３１Ｉ−５２８（黒棒）ならびに抗体の生体内分布を図示するものである。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、予防的モデルにおける（Ａ）Ｕ８７ＭＧおよび（Ｂ）Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片成長率に対するｍＡｂ８０６の抗腫瘍効果を図示するものである。週齢４−６週ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、（ｎ＝５）、の両側腹部に、第０日に、３×１０６  Ｕ８７ＭＧまたはＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞をｓ．ｃ．注射した。腫瘍細胞接種の１日前に開始して１ｍｇのｍＡｂ８０６（●）；０．１ｍｇのｍＡｂ８０６（▲）；またはビヒクル（○）のいずれかをマウスにｉ．ｐ．注射した。矢印により示すように２週間、週３回、注射を施した。平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表示する。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、確率モデルにおける（Ａ）Ｕ８７ＭＧ，（Ｂ）Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７および（Ｃ）Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片に対するｍＡｂ８０６の抗腫瘍効果を図示するものである。週齢４−６週ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、（ｎ＝５）、の両側腹部に、３×１０６  Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７またはＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞をｓ．ｃ．注射した。腫瘍が６５−８０ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したときに開始して１ｍｇ用量のｍＡｂ８０６（●）；０．１ｍｇ用量のｍＡｂ８０６（▲）；またはビヒクル（○）のいずれかをマウスにｉ．ｐ．注射した。矢印により示すように２週間、週３回、注射を施した。平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表示する。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、（Ａ）予防的モデルおよび（Ｂ）確率モデルにおけるＡ４３１異種移植片に対するｍＡｂ８０６の抗腫瘍効果を図示するものである。週齢４−６週ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、（ｎ＝５）、の両側腹部に、３×１０６  Ａ４３１細胞をｓ．ｃ．注射した。予防的モデルの場合は腫瘍細胞接種の１日前に開始して、または腫瘍が２００ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したときに開始して、１ｍｇ用量のｍＡｂ８０６（●）；またはビヒクル（○）のいずれかをマウスにｉ．ｐ．注射した。矢印により示すように２週間、週３回、注射を施した。平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表示する。
【図１２】図１２は、予防的モデルにおけるＡ４３１異種移植片に対するＡＧ１４７８での治療と組み合わせたｍＡｂ８０６での治療の抗腫瘍効果を図示するものである。平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表示する。
【図１３】図１３は、漸増濃度（０．５μＭおよび５μＭ）のＡＧ１４７８の存在下でのＡ４３１細胞へのｍＡｂ８０６の結合を描写するものである。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、８０６ＶＨ鎖遺伝子の（Ａ）核酸配列および（Ｂ）このアミノ酸翻訳（それぞれ、配列番号：１および配列番号：２）を図示するものである。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、８０６ＶＬ鎖遺伝子の（Ａ）核酸配列および（Ｂ）このアミノ酸翻訳（それぞれ、配列番号：３および配列番号：４）を図示するものである。
【図１６】図１６は、Ｋａｂａｔに従って番号付けしたＶＨ鎖配列（配列番号：２）を示すものであり、ＣＤＲ（配列番号：１５、１６および１７）に下線を引く。ＶＨ鎖配列（配列番号：２）の鍵残基は、２４、３７、４８、６７および７８である。
【図１７】図１７は、Ｋａｂａｔに従って番号付けしたＶＬ鎖配列（配列番号：４）を示すものであり、ＣＤＲ（配列番号：１８、１９および２０）に下線を引く。ＶＬ鎖配列（配列番号：４）の鍵残基は、３６、４６、５７および７１である。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｄは、併用抗体療法、特にｍＡｂ８０６および５２８抗体、の治療効果を判定するために計画したインビボ研究の結果を示すものである。マウスにＵ８７ＭＧ．Ｄ２−７（ＡおよびＢ）、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ（Ｃ）、またはＡ４３１（Ｄ）細胞の接種を施した。
【図１９】図１９Ａ−Ｄは、電子顕微鏡検査による内在化の分析を示すものである。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞を４℃で、ｍＡｂ８０６またはＤＨ８．３と共に、続いて金コンジュゲート型抗マウスＩｇＧと共に前保温し、３７℃に移し、電子顕微鏡検査によって様々な時点で内在化を検査した。（Ａ）５分後の被覆小窩（矢印）へのＤＨ８．３抗体の局在化；（Ｂ）２分後のマクロピノサイトーシス（矢印）によるｍＡｂ８０６の内在化；（Ｃ）２０分後のリソソーム（矢印）へのＤＨ８．３の局在化；（Ｄ）３０分後のリソソーム（矢印）へのｍＡｂ８０６の局在化。すべての画像についての原倍率は、３０，０００倍である。
【図２０】図２０は、１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６の注射の８時間後に採集したＵ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植切片のオートラジオグラフィーを示すものである。
【図２１】図２１は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する細胞系のフローサイトメトリー分析を示すものである。ＨＭ５およびＭＤＡ−４６８細胞を、無関係なＩｇＧ２ｂ抗体（破線での白ヒストグラム）、ｍＡｂ８０６（黒ヒストグラム）または５２８（閉線での白ヒストグラム）で染色した。ＤＨ８．３抗体は、両方の細胞系に対して完全に陰性であった（データを示さない。）。
【図２２】図２２は、細胞系からのＥＧＦＲの免疫沈降を示すものである。ｍＡｂ８０６、ｓｃ−０３抗体またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照で３５Ｓ標識Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７またはＡ４３１細胞からＥＧＦＲを免疫沈降させた。側面の矢印は、ｄｅ２−７およびｗｔＥＧＦＲの位置を示す。３回の独立した実験において同一のバンディングパタンが得られた。
【図２３】図２３は、１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６の注射の２４時間後に採集したＡ４３１異種移植切片のオートラジオグラフィーを示すものであり、生組織への局在領域を指摘する（矢印）。
【図２４−１】図２４Ａおよび２４Ｂは、全身ｍＡｂ８０６治療を施した頭蓋内Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ（Ａ）およびＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲ（Ｂ）異種移植片を有するヌードマウスの生存延長を示すものである。Ｕ８７ＭＧ．ＥＧＦＲ細胞（１×１０５）またはＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲ細胞（５×１０５）をヌードマウスの脳に内植し、内植後第０日から第１４日まで、これらの動物を、ｍＡｂ８０６、ＰＢＳ、またはアイソタイプＩｇＧのいずれかで治療した。  図２４Ｅは、腫瘍内ｍＡｂ８０６治療を施した頭蓋内Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ異種移植片を有するヌードマウスの生存延長を示すものである。説明したようにＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲを内植した。第１日に開始して１日おきに５回、５μＬの体積で１０ｍｇのｍＡｂ８０６またはアイソタイプＩｇＧ対照を腫瘍注射部位に注射した。
【図２４−２】図２４Ｃおよび２４Ｄは、ｍＡｂ８０６治療による頭蓋内腫瘍の成長阻害を示すものである。ｍＡｂ８０６またはアイソタイプＩｇＧ対照のいずれかで治療したヌードマウス（１群あたり５匹）を、Ｕ８７ＭＧ．ＥＧＦＲ（Ｃ）については第９日に、およびＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲ（Ｄ）については第１５日に安楽死させ、これらの脳を回収し、固定し、切開した。対照の腫瘍容積を１００％と考えることによってデータを計算した。値は、平均±ＳＤである。＊＊＊、Ｐ＜０．００１；対照対ｍＡｂ８０６。矢じり、腫瘍組織。
【図２５】図２５Ａ、２５Ｂおよび２５Ｃは、ｍＡｂ８０６が、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ脳腫瘍を有するマウスの生存を延長するが、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫまたはＵ８７ＭＧ脳腫瘍を有するマウスの生存を延長しないことを示すものである。Ｕ８７ＭＧ（Ａ）、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ（Ｂ）、またはＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ（Ｃ）細胞（５×１０５）をヌードマウスの脳に内植し、内植後第０日から第１４日までｍＡｂ８０６で治療し、その後、治療中止後、観察した。
【図２６】図２６Ａは、Ｕ８７ＭＧ細胞系でのｍＡｂ８０６の反応性のＦＡＣＳ分析を示すものである。Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ、およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞を、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ５２８、ＥＧＦＲ．１および抗ΔＥＧＦＲ抗体、ｍＡｂ８０６で染色した。モノクローナルＥＧＦＲ．１抗体は、ｗｔＥＧＦＲを排他的に認識し、ならびにモノクローナル５２８抗体は、ｗｔＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲ両方と反応した。ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ＤＫと強く反応し、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲとは弱く反応した。横座標上のバー、一次抗体不在下での細胞の最大染色。結果は、３回の異なる実験で再現された。  図２６Ｂは、ＥＧＦＲ形態のｍＡｂ８０６免疫沈降を示すものである。突然変異体およびｗｔＥＧＦＲを、（レーン１）Ｕ８７ＭＧ、（レーン２）Ｕ８７Δ．ＥＧＦＲ、（レーン３）Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ、および（レーン４）Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞から、抗ＥＧＦＲ抗体、５２８、ＥＧＦＲ．１、または抗ΔＥＧＦＲ抗体、ｍＡｂ８０６で免疫単離し（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｅｄ）、その後、抗ｐａｎ  ＥＧＦＲ抗体、Ｃ１３でのウエスタンブロッティングによって検出した。
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂは、ｍＡｂ８０６での全身治療が、ΔＥＤＦＲのリン酸化、およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ脳腫瘍におけるＢｃｌ−ＸＬ発現を減少させることを示すものである。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ腫瘍をｍＡｂ８０６治療の第９日に切除し、直ちに液体窒素で凍結させ、腫瘍溶解産物調製まで−８０℃で保管した。  （Ａ）ΔＥＧＦＲの発現および自己リン酸化度のウエスタンブロット分析。３０μｇの腫瘍溶解産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにさらし、ニトロセルロース膜に転写し、抗ホスホチロシンｍＡｂでプローブし、その後、ストリッピングし、抗ＥＧＦＲ抗体、Ｃ１３で再プローブした。  （Ｂ）（Ａ）の場合と同じ腫瘍溶解産物を使用することによるＢｃｌ−ＸＬのウエスタンブロッティング。抗ヒトＢｃｌ−Ｘポリクローナル抗体で膜をプローブした。レーン１および２、アイソタイプ対照で治療したＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ脳腫瘍；レーン３および４、ｍＡｂ８０６で治療したＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ脳腫瘍。
【図２８】図２８は、ｍＡｂ８０６治療が、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ腫瘍において、成長および脈管形成の減少、ならびにアポトーシスおよびマクロファージ蓄積の増加をもたらすことを示すものである。腫瘍切片をＫｉ−６７について染色した。各群４匹のマウスからの頭蓋内腫瘍における４つのランダムに選択した高倍率視野（４００倍）からＫｉ−６７陽性であった全細胞の百分率によって、細胞増殖指数を評定した。データは、平均±ＳＥである。アポトーシス細胞をＴＵＮＥＬアッセイによって検出した。各群４匹のマウスからの頭蓋内腫瘍における４つのランダムに選択した高倍率視野（４００倍）からのＴＵＮＥＬ陽性細胞：全細胞数の比によって、アポトーシス指数を評定した。データは、平均±ＳＥである。腫瘍切片を抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した。各群４匹のマウスからの頭蓋内腫瘍における４つのランダムに選択した視野（２００倍）からのコンピュータ画像解析によって、ＭＶＡを分析した。ｍＡｂ８０６治療Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ腫瘍におけるマクロファージの腫瘍周辺浸潤。腫瘍切片を抗Ｆ４／８０抗体で染色した。
【図２９】図２９は、親Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞系およびトランスフェクトされたＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞系のフローサイトメトリー分析を示すものである。示されているとおり、無関係なＩｇＧ２ｂ抗体（白ヒストグラム）または５２８抗体またはｍＡｂ８０６（黒ヒストグラム）のいずれかで細胞を染色した。
【図３０】図３０は、細胞系からのＥＧＦＲの免疫沈降を示すものである。ＥＧＦＲを、３５Ｓ標識Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、およびＡ４３１細胞から、ｍＡｂ８０６（８０６）、ｓｃ−０３抗体（ｃ−ｔｅｒｍ）、またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（ｃｏｎ）で免疫沈降させた。矢印、ｄｅ２−７およびｗｔＥＧＦＲの位置。
【図３１】図３１は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片の代表Ｈ＆Ｅ染色パラフィン切片を示すものである。上の図１０において説明したように治療したマウスからＵ８７ＭＧ．Δ２−７（腫瘍接種の２４日後に採集）およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ（腫瘍接種の４２日後に採集）異種移植片を切除し、Ｈ＆Ｅで染色した。ビヒクル治療Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７（腫瘍接種の１８日後に採集）およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ（腫瘍接種の３７日後に採集）異種移植片は、壊死を殆ど示さなかった（左パネル）が、ｍＡｂ８０６で治療したＵ８７ＭＧ．Δ２−７とＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲの両方において広範な壊死（矢印）が観察された（右パネル）。
【図３２】図３２は、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片から採取した凍結切片におけるＥＧＦＲ発現の免疫組織化学的分析を示すものである。上の図３１において説明した時点で切片を採集した。異種移植切片を５２８抗体（左パネル）およびｍＡｂ８０６（右パネル）で免疫染色した。ｗｔＥＧＦＲ、増幅されたＥＧＦＲ、またはｄｅ２−７  ＥＧＦＲのいずれに対する免疫反応性減少も、ｍＡｂ８０６で治療した異種移植片では観察されなかった。インビトロデータと一致して、親Ｕ８７ＭＧ異種移植片は、５２８抗体について陽性であったが、ｍＡｂ８０６染色については陰性であった。
【図３３】図３３は、産生されるバイシストロン性発現構築物の略図を示すものである。キメラ抗体鎖の転写を伸長因子−１プロモーターによって開始させ、強力な人工終結配列によって終結させる。軽鎖のコーディング領域とＮｅｏＲのコーディング領域の間、および重鎖のコーディング領域とｄｈｆｒ遺伝子のコーディング領域の間に、ＩＲＥＳ配列を導入した。
【図３４】図３４Ａおよび３４Ｂは、Ｕ８７ＭＧ−ｄｅ２−７異種移植腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて（Ａ）１２５Ｉまたは（Ｂ）１１１Ｉｎのいずれかで放射標識したｃｈ８０６の生体内分布分析を行ったことを示すものである。５μｇの放射標識抗体をマウスに注射し、８、２８、４８または７４時間、いずれかの時点で、１時点につき４匹のマウスの群で犠牲にした。器官を採集し、計量し、ガンマカウンターで放射能を測定した。
【図３５】図３５Ａおよび３５Ｂは、（Ａ）％ＩＤグラム腫瘍組織および（Ｂ）腫瘍対血液比を描写するものである。インジウム−１１１抗体は、おおよそ３０％のＩＤ／グラム組織および４．０の腫瘍対血液比を示す。
【図３６】図３６は、確率腫瘍モデルにおけるキメラ抗体ｃｈ８０６の治療効力を描写するものである。週齢４−６週の雌ヌードマウスの両側腹部に、１００μＬのＰＢＳ中の３×１０６  Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞をｓ．ｃ．接種した。ｍＡｂ８０６を陽性対照として含めた。腫瘍が５０ｍｍ３の平均容積に達したとき治療を開始し、この治療は、示されている日での合計５回の注射についてのｉ．ｐ．で施した１ｍｇのｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６から成った。データを各治療群について平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．として提示する。
【図３７】図３７は、抗ＥＧＦＲキメラＩｇＧＩ抗体ｃｈ８０６および対照ｃＧ２５０についてのターゲット（Ａ）Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７および（Ｂ）Ａ４３１細胞に対するＣＤＣ活性を示すものである。三重反復判定の細胞傷害性平均（バー；±ＳＤ）パーセントを提示する。
【図３８】図３８は、ｃｈ８０６およびアイソタイプ対照ｃＧ２５０（０−１０μｇ／ｍＬ）によって媒介される５０：１のエフェクター：ターゲット細胞比でのターゲット（Ａ）Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７および（Ｂ）Ａ４３１細胞に対するＡＤＣＣを示すものである。三重反復判定の細胞傷害性平均（バー；±ＳＤ）パーセントとして結果を提示する。
【図３９】図３９は、ターゲットＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞に対する１μｇ／ｍＬの親ｍＡｂ８０６およびｃｈ８０６によって媒介されるＡＤＣＣをある範囲のエフェクター：ターゲット比に関して示すものである。三重反復判定の平均（バー；±ＳＤ）を提示する。
【図４０】図４０は、ｃｈ８０６を結合するがｈｕＩｇＧを結合しない抗体を生産する２５のハイブリドーマを最初に選択したことを示すものである。その後、高親和性結合を有するこれらの抗ｃｈ８０６ハイブリドーマのうちの４つ（クローン３Ｅ３、５Ｂ８、９Ｄ６および４Ｄ８）を制限希釈により単個細胞からのクローン増殖について追跡し、それぞれ、Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（ＬＭＨ）−１１、−１２、−１３および−１４と呼んだ。加えて、ｈｕＩｇＧに特異的なｍＡｂを生産する２つのハイブリドーマもクローニングし、さらに特性づけした：クローン２Ｃ１０（ＬＭＨ−１５）および２Ｂ８（ＬＭＨ−１６）。
【図４１】図４１Ａ、４１Ｂおよび４１Ｃは、クローン増殖後、ハイブリドーマ培養上清を、ｓＥＧＦＲ６２１でｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６抗原結合活性を中和する能力についてＥＬＩＳＡにより三重反復で検査した。平均（±ＳＤ）結果は、ｓＥＧＦＲでコーティングしたプレートへのｃｈ８０６およびマウスｍＡｂ８０６両方の結合の溶解状態での遮断で抗イディオタイプｍＡｂ  ＬＭＨ−１１、−１２、−１３および−１４のアンタゴニスト活性を明示した（ＬＭＨ−１４を示さない。）。
【図４２−１】図４２Ａ、４２Ｂは、１０μｇ／ｍＬの精製（Ａ）ＬＭＨ−１１、（Ｂ）ＬＭＨ−１２および（Ｃ）ＬＭＨ−１３でコーティングしたマクロタイタープレートを示すものである。これら３種の精製クローンを、血清または１％ＦＣＳ／培地中のｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６を捕捉するこれらの能力について比較した。その後、結合したｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６を検出する。二次コンジュゲートアビジン−ＨＲＰおよびＡＢＴＳ基質のための対照に加えて、血清および１％ＦＣＳ／培地中のアイソタイプ対照抗体ｈｕ３Ｓ１９３およびｍ３Ｓ１９３を含めた。検出のためにビオチン化ＬＭＨ−１２（１０μｇ／ｍＬ）を使用して三重反復試験サンプルの平均（±ＳＤ）として結果を提示する。これらの結果は、捕捉および検出のために使用したＬＭＨ−１２が、血清中のｃｈ８０６（３ｎｇ／ｍＬ）に対する最高の感受性と無視できる程度のバックグラウンド結合を有したことを示している。
【図４２−２】４２Ｃは、１０μｇ／ｍＬの精製（Ａ）ＬＭＨ−１１、（Ｂ）ＬＭＨ−１２および（Ｃ）ＬＭＨ−１３でコーティングしたマクロタイタープレートを示すものである。これら３種の精製クローンを、血清または１％ＦＣＳ／培地中のｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６を捕捉するこれらの能力について比較した。その後、結合したｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６を検出する。二次コンジュゲートアビジン−ＨＲＰおよびＡＢＴＳ基質のための対照に加えて、血清および１％ＦＣＳ／培地中のアイソタイプ対照抗体ｈｕ３Ｓ１９３およびｍ３Ｓ１９３を含めた。検出のためにビオチン化ＬＭＨ−１２（１０μｇ／ｍＬ）を使用して三重反復試験サンプルの平均（±ＳＤ）として結果を提示する。これらの結果は、捕捉および検出のために使用したＬＭＨ−１２が、血清中のｃｈ８０６（３ｎｇ／ｍＬ）に対する最高の感受性と無視できる程度のバックグラウンド結合を有したことを示している。
【図４３】図４３は、１μｇ／ｍＬの抗イディオタイプＬＭＨ−１２および１μｇ／ｍＬのビオチン化ＬＭＨ−１２をそれぞれ捕捉および検出のために使用する、最適な薬物動力学的ＥＬＩＳＡ条件の妥当性検証を示すものである。３回の独立したＥＬＩＳＡを四重反復で行って、３人の健常ドナーからのドナー血清中のｃｈ８０６（●）または１％ＢＳＡ／培地中のｃｈ８０６（■）を、血清中のアイソタイプ対照ｈｕ３Ｓ１９３（▲）または１％ＢＳＡ／培地中のアイソタイプ対照ｈｕ３Ｓ１９３（▼）と共に測定した。二次コンジュゲートアビジン−ＨＲＰについての対照（◆）およびＡＢＴＳ基質についての対照（六角形）単独も各ＥＬＩＳＡに含めた。平均（±ＳＤ）結果は、３ｎｇ／ｍＬの検出限界で血清中のｃｈ８０６（２μｇ／ｍＬ−１．６ｎｇ／ｍＬ）の測定について非常に再現性のある結合曲線を明示する（ｎ＝１２；１−１００ｎｇ／ｍＬ、変動係数＜２５％；１００ｎｇ／ｍＬ−５μｇ／ｍＬ、変動係数＜１５％）。試験した３つの血清のいずれに関してもはっきりわかるバックグラウンド結合はなく、および無視できる程度の結合がアイソタイプ対照ｈｕ３Ｓ１９３に関して観察された。
【図４４】図４４は、ｍＡｂ８０６でブロットした、ＣＨＯ細胞において発現された組換えｓＥＧＦＲの免疫ブロットを描写するものである。組換えｓＥＧＦＲをＰＮＧａｓｅＦで処理して、Ｎ結合型グリコシル化（脱グリコシル化したもの）または未処理のもの（未処理のもの）を除去し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、膜に転写し、ｍＡｂ８０６で免疫ブロットした。
【図４５】図４５は、異なる抗体（ＳＣ−０３、８０６および５２８抗体）での３５Ｓ標識細胞系（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、Ｕ８７ＭＧ−ｗｔＥＧＦＲ、およびＡ４３１）からのＥＧＦＲの免疫沈降を描写するものである。
【図４６】図４６は、３５Ｓメチオニン／システインでのパルス標識後、異なる時点（時間０から２４０分）での異なる細胞（Ａ４３１およびＵ８７ＭＧ．Δ２−７）からのＥＧＦＲの免疫沈降を描写するものである。抗体５２８および８０６を免疫沈降に使用する。
【図４７】図４７は、高マンノース型炭水化物を除去するためのＥｎｄｏ  Ｈ消化の不在下（−）でのおよびＥｎｄｏ  Ｈ消化後（＋）の様々な抗体（ＳＣ−０３、８０６および５２８）での様々な細胞系（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、Ｕ８７ＭＧ−ｗｔＥＧＦＲ、およびＡ４３１）からのＥＧＦＲの免疫沈降を描写するものである。
【図４８】図４８は、Ａ４３１およびＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞系の細胞表面ヨウ素化後の８０６抗体での、およびＥｎｄｏ  Ｈ消化を伴うまたは伴わない、免疫沈降を描写するものであり、この図により、Ａ４３１細胞の細胞表面にｍＡｂ８０６によって結合されたＥＧＦＲがＥｎｄｏＨ感受性形態であることが確証される。
【図４９−１】図４９−１は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＬＣ  Ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。
【図４９−２】図４９−２は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＬＣ  Ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。
【図４９−３】図４９−３は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＬＣ  Ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。
【図４９−４】図４９−４は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＬＣ  Ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。
【図４９−５】図４９−５は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＬＣ  Ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。
【図４９−６】図４９−６は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＬＣ  Ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。
【図５０−１】図５０−１は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＨＣ  ＤＨＦＲ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。
【図５０−２】図５０−２は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＨＣ  ＤＨＦＲ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。
【図５０−３】図５０−３は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＨＣ  ＤＨＦＲ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。
【図５０−４】図５０−４は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＨＣ  ＤＨＦＲ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。
【図５０−５】図５０−５は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＨＣ  ＤＨＦＲ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。
【図５０−６】図５０−６は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＨＣ  ＤＨＦＲ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。
【図５０−７】図５０−７は、ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＨＣ  ＤＨＦＲ  Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。
【図５１−１】図５１Ａ−Ｂは、ｍＡｂ１２４  ＶＨおよびＶＬ鎖核酸配列（それぞれ、配列番号：２１および２６）およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：２２および２７）を示すものである。
【図５１−２】図５１Ｃ−Ｄは、ｍＡｂ１２４  ＶＨおよびＶＬ鎖核酸配列（それぞれ、配列番号：２１および２６）およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：２２および２７）を示すものである。
【図５２−１】図５２Ａ−Ｂは、ｍＡｂ１１３３  ＶＨおよびＶＬ鎖核酸配列（それぞれ、配列番号：３１および３６）およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：３２および３７）を示すものである。
【図５２−２】図５２Ｃ−Ｄは、ｍＡｂ１１３３  ＶＨおよびＶＬ鎖核酸配列（それぞれ、配列番号：３１および３６）およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：３２および３７）を示すものである。
【図５３】図５３は、ｈｕ８０６Ｈ（ＶＨ＋ＣＨ）発現カートリッジを含有するｐＥＥ１２．４とｈｕ８０６Ｌ（ＶＬ＋ＣＬ）発現カートリッジを含有するｐＥＥ６．４とを含む複合２遺伝子ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡプラスミド図を示すものである。
【図５４−１】図５４−１は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体  配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである：  （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列；  （ラベンダー）：ｈｕ８０６  ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域；  （ピンク）：ｈｕ８０６  ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域；  （緑色）：ｈｕ８０６  ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および  （黄色）：ｈｕ８０６  ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。
【図５４−２】図５４−２は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体  配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである：  （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列；  （ラベンダー）：ｈｕ８０６  ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域；  （ピンク）：ｈｕ８０６  ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域；  （緑色）：ｈｕ８０６  ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および  （黄色）：ｈｕ８０６  ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。
【図５４−３】図５４−３は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体  配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである：  （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列；  （ラベンダー）：ｈｕ８０６  ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域；  （ピンク）：ｈｕ８０６  ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域；  （緑色）：ｈｕ８０６  ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および  （黄色）：ｈｕ８０６  ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。
【図５４−４】図５４−４は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体  配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである：  （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列；  （ラベンダー）：ｈｕ８０６  ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域；  （ピンク）：ｈｕ８０６  ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域；  （緑色）：ｈｕ８０６  ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および  （黄色）：ｈｕ８０６  ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。
【図５４−５】図５４−５は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体  配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである：  （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列；  （ラベンダー）：ｈｕ８０６  ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域；  （ピンク）：ｈｕ８０６  ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域；  （緑色）：ｈｕ８０６  ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および  （黄色）：ｈｕ８０６  ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。
【図５４−６】図５４−６は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体  配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである：  （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列；  （ラベンダー）：ｈｕ８０６  ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域；  （ピンク）：ｈｕ８０６  ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域；  （緑色）：ｈｕ８０６  ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および  （黄色）：ｈｕ８０６  ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。
【図５４−７】図５４−７は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体  配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである：  （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列；  （ラベンダー）：ｈｕ８０６  ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域；  （ピンク）：ｈｕ８０６  ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域；  （緑色）：ｈｕ８０６  ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および  （黄色）：ｈｕ８０６  ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。
【図５４−８】図５４−７は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体  配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである：  （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列；  （ラベンダー）：ｈｕ８０６  ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域；  （ピンク）：ｈｕ８０６  ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域；  （緑色）：ｈｕ８０６  ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および  （黄色）：ｈｕ８０６  ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。
【図５４−９】図５４は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体  配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである：  （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列；  （ラベンダー）：ｈｕ８０６  ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域；  （ピンク）：ｈｕ８０６  ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域；  （緑色）：ｈｕ８０６  ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および  （黄色）：ｈｕ８０６  ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。
【図５５】図５５Ａおよび５５Ｂは、ｈｕ８０６翻訳アミノ酸配列（配列番号：１６４および１６６のＶＨおよびＶＬ鎖ならびに配列番号：１６３および１６５のこれらそれぞれのシグナルペプチド；配列番号：４３および４８のＣＨおよびＣＬ鎖）を示す、ならびにＶＨおよびＶＬ鎖（それぞれ、配列番号：１６４および１６５）についてのＫａｂａｔ番号を与えるものであり、ＣＤＲ（配列番号：４４−４６および４９−５１）に下線を引く。
【図５６−１】図５６Ａおよび５６Ｂは、ベニアリング設計における最初の段階、表面露出についてのｍＡｂ８０６配列（配列番号：１６７のＶＨ鎖および配列番号：１２のＶＬ鎖）内のアミノ酸残基の等級づけを示すものである。等級を各残基の上にアスタリスク（＊）の数で与え、最大露出残基は３つのアスタリスクを有する。これらの図は、最初のオリゴヌクレオチド（ＶＨ鎖：図５６Ｃならびに配列番号：５２および１６９−１７７；ＶＬ鎖：図５７Ｃならびに配列番号：６２、６６、６８および１８１−１８７）がどのようにオーバーラップして、第一のベニアリングされた産物（配列番号：１６８のＶＨ鎖および配列番号：１８０のＶＬ鎖）を形成するかを示す設計図を含む。
【図５６−２】図５６Ｃは、ベニアリング設計における最初の段階、表面露出についてのｍＡｂ８０６配列（配列番号：１６７のＶＨ鎖および配列番号：１２のＶＬ鎖）内のアミノ酸残基の等級づけを示すものである。等級を各残基の上にアスタリスク（＊）の数で与え、最大露出残基は３つのアスタリスクを有する。これらの図は、最初のオリゴヌクレオチド（ＶＨ鎖：図５６Ｃならびに配列番号：５２および１６９−１７７；ＶＬ鎖：図５７Ｃならびに配列番号：６２、６６、６８および１８１−１８７）がどのようにオーバーラップして、第一のベニアリングされた産物（配列番号：１６８のＶＨ鎖および配列番号：１８０のＶＬ鎖）を形成するかを示す設計図を含む。
【図５７−１】図５７Ａおよび５７Ｂは、ベニアリング設計における最初の段階、表面露出についてのｍＡｂ８０６配列（配列番号：１６７のＶＨ鎖および配列番号：１２のＶＬ鎖）内のアミノ酸残基の等級づけを示すものである。等級を各残基の上にアスタリスク（＊）の数で与え、最大露出残基は３つのアスタリスクを有する。これらの図は、最初のオリゴヌクレオチド（ＶＨ鎖：図５６Ｃならびに配列番号：５２および１６９−１７７；ＶＬ鎖：図５７Ｃならびに配列番号：６２、６６、６８および１８１−１８７）がどのようにオーバーラップして、第一のベニアリングされた産物（配列番号：１６８のＶＨ鎖および配列番号：１８０のＶＬ鎖）を形成するかを示す設計図を含む。
【図５７−２】図５７Ｃは、ベニアリング設計における最初の段階、表面露出についてのｍＡｂ８０６配列（配列番号：１６７のＶＨ鎖および配列番号：１２のＶＬ鎖）内のアミノ酸残基の等級づけを示すものである。等級を各残基の上にアスタリスク（＊）の数で与え、最大露出残基は３つのアスタリスクを有する。これらの図は、最初のオリゴヌクレオチド（ＶＨ鎖：図５６Ｃならびに配列番号：５２および１６９−１７７；ＶＬ鎖：図５７Ｃならびに配列番号：６２、６６、６８および１８１−１８７）がどのようにオーバーラップして、第一のベニアリングされた産物（配列番号：１６８のＶＨ鎖および配列番号：１８０のＶＬ鎖）を形成するかを示す設計図を含む。
【図５８−１】図５８−１は、コドン最適化ｈｕＩｇＧ１重鎖ＤＮＡ配列（配列番号：８０；補体  配列番号：１７８）およびアミノ酸翻訳（配列番号：４３）のマップを示すものである。
【図５８−２】図５８−２は、コドン最適化ｈｕＩｇＧ１重鎖ＤＮＡ配列（配列番号：８０；補体  配列番号：１７８）およびアミノ酸翻訳（配列番号：４３）のマップを示すものである。
【図５９】図５９は、ｈｕ８０６  ＶＨ＋ＣＨアミノ酸配列（８Ｃ６５ＡＡＧ  ｈｕ８０６  ＶＨ＋ＣＨ；配列番号：８１）とｍＡｂ８０６  ＶＨ鎖（配列番号：１６７）についての原参照ファイルを比較するタンパク質アラインメントを示すものである。強調表示領域は、ＶＨ鎖内の保存アミノ酸配列を示す。ＣＤＲに下線を引く。アスタリスクは、初期べニアリング方法において計画し、実行した変更を表す。番号がついている部位は、後の修飾への参照である。
【図６０】図６０は、ｍＡｂ８０６  ＶＬ鎖（配列番号：１７９）についての原参照ファイルへのｈｕ８０６  ＶＬ＋ＣＬアミノ酸配列（８Ｃ６５ＡＡＧ  ｈｕ８０６シグナル＋ＶＬ＋ＣＬ；配列番号：８３）についての対応するアラインメントを示すものである。これは、修飾番号７でなされる変更を図示するために含めた追加のファイル（ｒ２ｖｋ１  ｈｕ８０６シグナル＋ＶＬ＋ＣＬ；配列番号：８２）、前駆体構築物を含有する。
【図６１】図６１は、ｈｕ８０６  シグナル＋ＶＬおよびＣＬ配列（８Ｃ６５ＡＡＧ  ｈｕ８０６  Ｖｌ＋Ｃｌ；配列番号：１９０および１８８）と対応するｃｈ８０６配列（ｐＲＥＮ  ｃｈ８０６  ＬＣ  Ｎｃｏ；ＬＩＣＲ；配列番号：１８９）のヌクレオチドおよびアミノ酸アラインメントを示すものである。図６２において説明するように、これを修飾し、アノテートする。
【図６２】図６２は、ｈｕ８０６シグナル＋ＶＨ配列（８Ｃ６５ＡＡＧ  ｈｕ８０６  ＶＨ鎖；配列番号：１９２）と対応するｍＡｂ８０６配列［コドン変更（ｃｃ）およびベニアリング（ｖｅｎ）前のｍＡｂ８０６  ＶＨ鎖；配列番号：１９１］のヌクレオチドアラインメントを示すものである。図５９および６０のアミノ酸変更の後のヌクレオチド変更を図示し、ならびにアミノ酸の無変更につながった保存的核酸変更も示す。より容易に検分できるように、ｈｕ８０６におけるシグナルおよびＶＨ鎖間のイントロンを除去した。シグナル配列およびＣＤＲに下線を引く。対応するアミノ酸配列（配列番号：４２）を前記アラインメントに重ね合わせた。
【図６３】図６３は、Ｂｉａｃｏｒｅによって判定したときの、一過性トランスフェクタント２９３細胞から得た精製ｈｕ８０６抗体の組換えＥＧＦＲ−ＥＣＤへの結合を示すものである。精製対照ヒトＩｇＧ１抗体でではＥＧＦＲ−ＥＣＤへの結合は観察されなかった。
【図６４−１】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−３】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−４】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−５】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−６】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−７】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−８】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−９】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−１０】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−１１】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−１２】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−１３】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−１４】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−１５】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−１６】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−１７】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−１８】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−１９】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２０】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２１】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２２】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２３】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２４】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２５】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２６】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２７】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２８】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−２９】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−３０】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６４−３１】ＩｇＧ１  ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。
【図６５】図６５は、ｍＡｂ８０６（配列番号：１５−１８、２０および１９３）およびｍＡｂ１７５（配列番号：１３０−１３２、１３５および１９４−１９５）からのＣＤＲについてのアミノ酸配列のアラインメントを示すものである。２抗体間の配列の相違を太字にする。
【図６６】図６６Ａおよび６６Ｂは、ｍＡｂ１７５での細胞系および正常ヒト肝臓の免疫組織化学的染色を示すものである。（Ａ）Ａ４３１細胞（ｗｔＥＧＦＲを過発現する。）、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞（Δ２−７ＥＧＦＲを発現する。）およびＵ８７ＭＧ細胞（ｗｔＥＧＦＲを中程度レベルで発現する。）を含有するブロックから調製した切片を、ビオチン化ｍＡｂ１７５を使用して染色した。（Ｂ）ｍＡｂ１７５（左パネル）、アイソタイプ対照（中央パネル）および二次抗体対照（右パネル）での正常ヒト肝臓の染色（４００倍）。特異的洞様毛細血管または肝細胞染色は観察されなかった。
【図６７】図６７Ａ、６７Ｂおよび６７Ｃは、酵母に提示されたＥＧＦＲの断片とｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５の反応性を示すものである。（Ａ）酵母提示ＥＧＦＲ断片のｍＡｂ１７５およびｍＡｂ８０６標識の平均蛍光シグナルを描写する代表フローサイトメトリーヒストグラム。酵母ディスプレイでは、細胞のある割合は、これらの表面でタンパク質を発現せず、その結果、２つのヒストグラムピークが得られる。すべての断片が線状Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグを含有するので、９Ｅ１０抗体を陽性対照として使用する。（Ｂ）様々なＥＧＦＲ断片に結合する抗体の概要。（Ｃ）酵母ペレットを３０分間、８００℃に加熱することによって、ＥＧＦＲ断片を変性させた。すべての事例で、ｃ−ｍｙｃタグは、９Ｅ１０抗ｍｙｃ抗体により依然として認識された。このことは、熱処理が酵母表面提示タンパク質を損なわせないことを明示している。高次構造感受性ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ２２５を使用して変性を確認した。
【図６８】図６８Ａ、６８Ｂ、６８Ｃおよび６８Ｄは、脳および前立腺癌異種移植片に対するｍＡｂ１７５の抗腫瘍効果を示すものである。（Ａ）Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片を有するマウス（ｎ＝５）に、ＰＢＳ、１ｍｇのｍＡｂ１７５またはｍＡｂ８０６（陽性対照）と共に、２週間、週３回、出発腫瘍容積が１００ｍｍ３であったときには第６、８、１０、１３、１５および１７日に、ｉ．ｐ．注射した。データを平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。（Ｂ）２つの無関係な抗体（青色、塗りつぶし、および緑色、中空）、全ＥＧＦＲのためのｍＡｂ  ５２８（ピンク色、塗りつぶし）、ｍＡｂ８０６（薄青色、中空）およびｍＡｂ１７５（オレンジ色、中空）で細胞を染色し、その後、ＦＡＣＳによって分析した。（Ｃ）ＤＵ１４５細胞を溶解し、ｍＡｂ  ５２８、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５または２つの独立した無関係な抗体でのＩＰに付し、その後、ＥＧＦＲについて免疫ブロットした。（Ｄ）ＤＵ１４５異種移植片を有するマウス（ｎ＝５）に、ＰＢＳ、１ｍｇのｍＡｂ１７５またはｍＡｂ８０６を１日１回、出発腫瘍容積が８５ｍｍ３であったときには第１８−２２、２５−２９および３９−４３日に、ｉ．ｐ．注射した。データを平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。
【図６９】図６９Ａ、６９Ｂ、６９Ｃ、６９Ｄ、６９Ｅおよび６９Ｆは、Ｆａｂ断片に結合したＥＧＦＲペプチド２８７−３０２の結晶構造を示すものである。（Ａ）軽鎖、赤色；重鎖、青色；結合ペプチド、黄色；およびＥＧＦＲからの重ねたＥＧＦＲ２８７−３０２、紫色での、Ｆａｂ  ８０６のコンピュータプリントアウト画像。（Ｂ）軽鎖、黄色；重鎖、緑色；結合ペプチド、ライラック色；およびＥＧＦＲ（ＤＩ−３）からのＥＧＦＲ２８７−３０２、紫色での、Ｆａｂ  １７５のコンピュータプリントアウト画像。（Ｃ）ＦＡＢ  １７５に結合したペプチドへの該受容体内のＥＧＦＲ２８７−３０２の類似性を示す、（Ｂ）の詳細。ペプチド骨格をＣαトレースとして、および相互作用している側鎖をスティックとして示す。主鎖に関して、Ｏ原子を赤色に彩色する；Ｎ、青色；Ｓ、オレンジ色；およびＣ。（Ｄ）空間的オーバーラップを示す、Ｆａｂ１７５：ペプチド複合体とＥＧＦＲの重ね合わせ。ＥＧＦＲ１８７−２８６の表面を青緑色に彩色して、（Ｃ）の場合のように彩色。（Ｅ）不透明青色で示すＥＧＦＲ１８７−２８６および透明な軽鎖表面（オレンジ色）および重鎖表面（緑色）での、（Ｄ）に対する直交図。（Ｆ）抗原結合部位を調べる１７５Ｆａｂ複合体の詳細な立体図。（Ｃ）の場合のように彩色し、水素結合を黒色の点々で示す。複合体を形成して隠れている水分子を赤色の球として示す。
【図７０】図７０Ａ、７０Ｂ、７０Ｃおよび７０Ｄは、ＥＧＦＲに結合するｍＡｂ８０６に対する２７１−２８３システイン結合の影響を示すものである。（Ａ）ｗｔＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ−Ｃ２７１Ａ、ＥＧＦＲ−Ｃ２８３ＡまたはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体でトランスフェクトした細胞をｍＡｂ５２８で（塗りつぶしピンク色ヒストグラム）、ｍＡｂ８０６で（青色線）、または二次抗体のみで（紫色）染色し、その後、ＦＡＣＳによって分析した。クラスを合わせた無関係な抗体を使用して、ゲインを設定した。（Ｂ）ＥＧＦＲ−Ｃ２７１ＡまたはＣ２７１／２８３Ａ  ＥＧＦＲを発現するＢａＦ３細胞を、説明したようなＭＴＴアッセイにおいてＥＧＦへのこれらの応答について検査した。データ点のＢｏｌｚｍａｎフィットを用いて、ＥＣ５０Ｓを導出した。三重反復測定の平均およびｓｄとしてデータを表す。（Ｃ）野生型またはＥＧＦＲ−Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａを発現するＢａＦ３細胞をＩＬ−３および血清飢餓させ、その後、ＥＧＦまたはビヒクル対照に暴露した。全細胞溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ホスホチロシン抗体（上方パネル）または抗ＥＧＦＲ抗体（下方パネル）で免疫ブロットした。（Ｄ）野生型（左パネル）またはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ（右パネル）ＥＧＦＲを発現するＢａＦ３細胞を、抗体不在下（中白記号）、ｍＡｂ  ５２８（灰色丸）またはｍＡｂ８０６（黒色三角）の存在下（両方とも１０μｇ／ｍＬ）、漸増濃度のＥＧＦで刺激した。三重反復測定の平均およびｓｄとしてデータを表す。
【図７１】図７１Ａ、７１Ｂおよび７１Ｃは、（Ａ）声帯の転移性扁平上皮細胞癌腫を有する患者における１１１Ｉｎ  ｃｈ８０６の生体内分布の全身ガンマカメラ画像［右頚部（矢印）における腫瘍への定量的な高い取り込み量を示している。血液プール活性、および肝臓における遊離１１１Ｉｎの小さな異化も見られる］。（Ｂ）この患者の頚部の単一光子コンピュータ断層撮影（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＳＰＥＣＴ）画像［生存腫瘍（矢印）での１１１Ｉｎの取り込みと、壊死を示す中心部取り込み減少を示している］。（Ｃ）対応する頚部ＣＴスキャン［大きな右頚部腫瘍量（矢印）と中心性壊死を明示している］を示すものである。
【図７２】図７２Ａおよび７２Ｂは、テザリングされていないＥＧＦＲ１−６２１の構造の立体モデルを示すものである。受容体骨格を青色で、およびリガンドＴＧＦ−αを赤色で描く。ｍＡｂ８０６／１７５エピトープを青緑色で、およびジスルフィド結合を黄色で描写する。エピトープを受容体に結び付けるジスルフィド結合の原子を空間充填形式で示す。テザリングされた高次構造からのＥＧＦＲ−ＥＣＤ  ＣＲ２ドメインをテザリングされていないＥＧＦＲ単量体の構造にこのリガンドの存在下でドッキングさせることによって、このモデルを構築した。
【図７３】図７３は、ＥＧＦＲの断片とｍＡｂ８０６の反応性を示すものである。可溶性１−５０１  ＥＧＦＲ断片またはＣＨ／ＥＧＦＲ断片融合タンパク質（ＧＨ−２７４−５０１、ＧＨ−２８２−５０１、ＧＨ−２９０−５０１およびＧＨ−２９８−５０１）を発現するベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割し、膜に転写し、ｍＡｂ８０６（左パネル）または抗ｍｙｃ抗体９Ｂ１１（右パネル）で免疫ブロットした。
【図７４】図７４Ａおよび７４Ｂは、ｍＡｂ１７５  ＶＨ鎖核酸配列（配列番号：１２８）およびアミノ酸配列（単数または複数）（配列番号：１２９）をそれぞれ示すものである。
【図７５】図７５Ａおよび７５Ｂは、ｍＡｂ１７５  ＶＬ鎖核酸配列（配列番号：１３３）およびアミノ酸配列（単数または複数）（配列番号：１３４）をそれぞれ示すものである。
【図７６−１】図７６Ａおよび７６Ｂは、小規模（１００ｍＬ）振盪フラスコ培養でのＧＳ−ＣＨＯ（１４Ｄ８、１５Ｂ２および４０Ａ１０）およびＧＳ−ＮＳ０（３６）ｈｕ８０６トランスフェクタントの（Ａ）体積産物濃度および（Ｂ）生細胞濃度［８０６抗イディオタイプをコーティング抗体としておよびｃｈ８０６  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌｏｔ：Ｊ０６０２４を標準物質として使用してＥＬＩＳＡにより産物の濃度を推定した。］；（Ｃ）１５Ｌ攪拌タンク型バイオリアクターにおけるＧＳ−ＣＨＯ  ４０Ａ１０トランスフェクタント細胞成長および体積生産量［生細胞密度（◆ｘ１０５細胞／ｍＬ）、細胞生存度（■）および生産量（▲ｍｇ／Ｌ）］を示すものである。
【図７６−２】７６Ｃは、小規模（１００ｍＬ）振盪フラスコ培養でのＧＳ−ＣＨＯ（１４Ｄ８、１５Ｂ２および４０Ａ１０）およびＧＳ−ＮＳ０（３６）ｈｕ８０６トランスフェクタントの（Ａ）体積産物濃度および（Ｂ）生細胞濃度［８０６抗イディオタイプをコーティング抗体としておよびｃｈ８０６  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌｏｔ：Ｊ０６０２４を標準物質として使用してＥＬＩＳＡにより産物の濃度を推定した。］；（Ｃ）１５Ｌ攪拌タンク型バイオリアクターにおけるＧＳ−ＣＨＯ  ４０Ａ１０トランスフェクタント細胞成長および体積生産量［生細胞密度（◆ｘ１０５細胞／ｍＬ）、細胞生存度（■）および生産量（▲ｍｇ／Ｌ）］を示すものである。
【図７７−１】図７７Ａ、７７Ｂおよび７７Ｃは、小規模培養により生産したプロテインＡ精製ｈｕ８０６抗体構築物ならびに対照ｃｈ８０６およびｍＡｂ８０６のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｂｉｏｓｅｐ  ＳＥＣ−Ｓ３０００）分析を示すものである。各図の上方パネルにＡ２１４ｎｍでのクロマトグラムをおよび下方パネルにＡ２８０ｎｍでのクロマトグラムを提示する。
【図７７−２】７７Ｄおよび７７Ｅは、小規模培養により生産したプロテインＡ精製ｈｕ８０６抗体構築物ならびに対照ｃｈ８０６およびｍＡｂ８０６のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｂｉｏｓｅｐ  ＳＥＣ−Ｓ３０００）分析を示すものである。各図の上方パネルにＡ２１４ｎｍでのクロマトグラムをおよび下方パネルにＡ２８０ｎｍでのクロマトグラムを提示する。
【図７８】図７８は、大規模生産およびプロテインＡ精製後のプロテインＡ精製ｈｕ８０６抗体構築物４０Ａ１０のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｂｉｏｓｅｐ  ＳＥＣ−Ｓ３０００）分析を示すものである。１．２％の凝集物が存在する９８．８％の純度を示す、２１４ｎｍでのクロマトグラムを提示する。
【図７９】図７９は、Ｎｏｖｅｘ，ＵＳＡからのプレキャスト４−２０％Ｔｒｉｓ／グリシンゲルを標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で使用して、精製トランスフェクタントｈｕ８０６標品（５μｇ）ＧＳ  ＣＨＯ（１４Ｄ８、１５Ｂ２および４０Ａ１０）およびＧＳ−ＮＳ０（３６）ｈｕ８０６を還元条件下で分析したことを示すものである。クマシーブルー染色剤によって検出したタンパク質。
【図８０】図８０は、プレキャスト４−２０％Ｔｒｉｓ／グリシンゲルを標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で使用して、精製トランスフェクタントｈｕ８０６標品（５μｇ）ＧＳ  ＣＨＯ（１４Ｄ８、１５Ｂ２および４０Ａ１０）およびＧＳ−ＮＳ０（３６）を非還元条件下で分析したことを示すものである。クマシーブルー染色剤によって検出したタンパク質。
【図８１】図８１は、プレキャスト４−２０％Ｔｒｉｓ／グリシンゲルを標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で使用して、精製トランスフェクタントｈｕ８０６  ＧＳ  ＣＨＯ  ４０Ａ１０（５μｇ）を大規模生産後に分析したことを示すものである。クマシーブルー染色剤によって検出したタンパク質。
【図８２】図８２は、１５Ｌ生産後の精製トランスフェクタントｈｕ８０６  ＧＳ  ＣＨＯ  ４０Ａ１０（５μｇ）の等電点電気泳動ゲル分析を示すものである。クマシーブルー染色によって検出したタンパク質。レーン１、ｐＩマーカー；レーン２、ｈｕ８０６（３つのアイソフォーム、ｐＩ８．６６から８．８２）；レーン３、ｐＩマーカー。
【図８３】図８３は、Ａ４３１細胞への結合を示すものである：プロテインＡ精製ｈｕ８０６抗体標品（２０μｇ／ｍＬ）およびアイソタイプ対照ｈｕＡ３３（２０μｇ／ｍＬ）のフローサイトメトリー分析。対照は、二次抗体単独（緑色）およびｃｈ８０６（赤色）を含む。Ｈｕ８０６構築物を小規模培養によって生産した。
【図８４】図８４は、Ａ４３１細胞への結合を示すものである：示すとおりの、細胞表面の野生型ＥＧＦＲの〜１０％を結合する精製ｍＡｂ８０６、ｃｈ８０６およびｈｕ８０６  ４０Ａ１０抗体標品（２０μｇ／ｍＬ）、５２８（野生型ＥＧＦＲとｄｅ２−７  ＥＧＦＲの両方を結合する。）および無関係な対照抗体（２０μｇ／ｍＬ）のフローサイトメトリー分析。
【図８５】図８５は、Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７神経膠腫細胞への結合を示すものである。精製ｍＡｂ８０６、ｃｈ８０６およびｈｕ８０６  ４０Ａ１０抗体標品（２０μｇ／ｍＬ）ならびに５２８抗ＥＧＦＲおよび無関係な対照抗体（２０μｇ／ｍＬ）のフローサイトメトリー分析。
【図８６】図８６は、（Ａ）Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７神経膠腫細胞および（Ｂ）Ａ４３１癌腫細胞への１２５Ｉ放射標識８０６抗体構築物の特異的結合を示すものである。
【図８７】図８７は、スキャッチャード解析を示すものである：Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞への１２５Ｉ放射標識（Ａ）ｃｈ８０６および（Ｂ）ｈｕ８０６抗体構築物の結合。
【図８８】図８８は、スキャッチャード解析を示すものである：Ａ４３１細胞への１２５Ｉ放射標識（Ａ）ｃｈ８０６および（Ｂ）ｈｕ８０６抗体構築物の結合。
【図８９】図８９Ａおよび図８９Ｂは、２８７−３０２  ＥＧＦＲ  ８０６ペプチドエピトープへの該固定化ペプチド上を通過する５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭおよび３００ｎＭの漸増濃度の（Ａ）ｈｕ８０６および（Ｂ）ｃｈ８０６による結合についてのＢＩＡｃｏｒｅ分析を示すものである。
【図９０】図９０Ａおよび図９０Ｂは、（Ａ）エフェクター対ターゲット細胞比範囲（Ｅ：Ｔ＝０．７８：１から１００：１）にわたって１μｇ／ｍＬの各抗体で；（Ｂ）ターゲットＡ４３１に対して各抗体の濃度範囲（３．１５ｎｇ／ｍＬ−１０μｇ／ｍＬ）にわたってＥ：Ｔ＝５０：１で判定した、ターゲットＡ４３１細胞に対するｃｈ８０６媒介およびｈｕ８０６媒介抗体依存性細胞傷害性を示すものである。
【図９１】図９１は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける確率したＡ４３１異種移植片の治療を示すものである。５匹のマウスの群に６×１ｍｇの用量での２週間にわたる抗体療法を示すとおり（矢印）に施した。研究終了までの平均±ＳＥＭ腫瘍容積を提示する。
【図９２】図９２は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける確率したＵ８７Ｍｇ．ｄｅ２−７異種移植片の治療を示すものである。５匹のマウスの群に６×１ｍｇの用量での２週間にわたる抗体療法を示すとおり（矢印）に施した。研究終了までの平均±ＳＥＭ腫瘍容積を提示する。
【図９３】図９３は、ｍＡｂ８０６ペプチド（Ａ）Ｎ、（Ｂ）ＨＮおよび（Ｃ）ＨＡについてのランダムコイル化学シフト値からの偏差を示すものである。ｐＨ６．８の５％  ２Ｈ２Ｏ、７０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  ＮａＰＯ４を含有するＨ２Ｏ溶液中でペプチドを調製した。逐次的割当てに用いたすべてのスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ５００おいて２９８Ｋで獲得した。
【図９４】図９４Ａ、９４Ｂ、９４Ｃ、９４Ｄ、９４Ｅおよび９４Ｆは、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の注入後第５日におけるＡ）腹側、およびＢ）背側の患者７の前進ガンマカメラ像を示すものである。肺（矢印）における転移病変での１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の高い取り込み量がはっきりわかる。Ｃ）およびＤ）は、ＣＴスキャンで転移病変を示すものである。Ｅ）胸部の３Ｄ  ＳＰＥＣＴ画像、およびＦ）転移病変（矢印）での１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の特異的取り込みを示すＳＰＥＣＴとＣＴの位置合わせした（ｃｏ−ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ）断層画像。
【図９５】図９５Ａ、９５Ｂ、９５Ｃ、９５Ｄ、９５Ｅおよび９５Ｆは、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の注入後、Ａ）第０日、Ｂ）第３日およびＣ）第７日に得た患者８の頭頸部の平面画像を示すものである。最初の血液プール活性が第０日に見られ、右前頭葉における退形成性星状細胞腫での１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の取り込みが第３日（矢印）にははっきりわかり、第７日まで増加する。１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の特異的取り込みは、Ｄ）脳（矢印）のＳＰＥＣＴ画像において確認され、Ｅ）１８Ｆ−ＦＤＧ  ＰＥＴ、およびＦ）ＭＲＩでは腫瘍部位（矢印）ではっきりわかる。
【図９６】図９６Ａ、９６Ｂ、９６Ｃおよび９６Ｄは、患者４と比較して患者３において、選別腫瘍サンプルにおける８０６抗原発現の差にもかかわらず、腫瘍での１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の同様の取り込みがはっきりわかることを示すものである。Ａ）はっきりわかる心血液プール活性（Ｂ）を伴う、患者４に関するＳＰＥＣＴ断層画像における肺転移（矢印）の１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６局在。Ｂ）対応するＣＴスキャン。保存腫瘍は、８０６発現について陽性率＜１０％を有することが明らかになった。Ｃ）はっきりわかる心血液プール活性（Ｂ）を伴う、患者３に関する肺転移（矢印）の１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６局在。Ｄ）対応するＣＴスキャン。保存腫瘍は、８０６発現について５０−７５％の陽性率を有することが明らかになった。
【図９７】図９７は、ＥＬＩＳＡによって測定したｃｈ８０６タンパク質についてのプールされた集団の薬物動態を示すものである。注入後の時間（時）に対する実測および予測ｃｈ８０６（％ＩＤ／Ｌ）。
【図９８】図９８Ａおよび９８Ｂは、５ｍｇ／ｍ２（■）、１０ｍｇ／ｍ２（△）、２０ｍｇ／ｍ２（▽）、および４０ｍｇ／ｍ２（◆）用量レベルでの１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６のＡ）正規化された全身クリアランスおよびＢ）肝クリアランスについての個々の患者の結果を示すものである。各パネルに示したデータセットについての線形回帰［Ａ）ｒ２＝０．９５９５；Ｂ）ｒ２＝０．９４１５］。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６１】
【表４】
2016188209.tif 000001
＊様々な組織において多少の間質染色
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５９５】
【表１２】
2016188209.tif 000002
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６２７】
２．結果
患者
８人の患者［女性１人および男性７人；平均年齢６１歳（範囲４４−７５歳）］が治験を完了した（表１３）。原発腫瘍部位、以前の治療歴、および試験登録時の疾患部位も表１３に示す。８人すべての患者が、保存腫瘍において８０６抗原陽性を有した（表１３）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６２８】
すべての患者が組み入れ基準を満たしており、患者８（原発性脳腫瘍を有した者）を除くすべてが試験登録時に転移性疾患を有した。ターゲット病変として分類した腫瘍部位は、以下を含んだ：肺（５人の患者）、脳（１人の患者）、リンパ節（１人の患者）、声門上（１人の患者）。転移性疾患の他の部位（非ターゲット領域）は、副腎腫瘤、骨およびリンパ節を含んだ（表１３）。カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス中央値は９０であった（範囲８０−１００）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６２９】
【表１６】
2016188209.tif 000003
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６３０】
有害事象およびＨＡＣＡ
ｃｈ８０６に関連した有害事象を表１４および１５に列挙する。注入関連有害事象は、観察されなかった。ＤＬＴはなく、従って、ＭＴＤに達しなかった。治験担当医の意見ではことによるとｃｈ８０６に起因し得る原則毒性（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ）は、一過性そう痒症、軽度悪心、疲労／嗜眠、ならびに血清ＡＬＰおよびＧＧＴレベルに対して起こり得る影響であった。患者５においてＣＴＣグレード２のＧＧＴの上昇が観察されたが、この上昇は、ベースライングレード１上昇のバックグラウンドに基づくものであり、事実上、一過性であった。３つの重篤有害事象（ＳＡＥ）が報告されたが、ｃｈ８０６に起因しなかった。総合的に言えば、ｃｈ８０６は、すべての用量レベルで安全および十分認容性であり、一般に予測可能で管理できる軽症の毒性が観察された。さらなる用量漸増は、この治験に利用できるｃＧＭＰ  ｃｈ８０６の限られた量のため、行わなかった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６３２】
【表１７】
2016188209.tif 000004
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６３３】
【表１８】
2016188209.tif 000005
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６３６】
薬物動態
１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の単回注入についての個々の患者の薬物動態パラメータＴ１／２αおよびＲ１／２β、Ｖ１、Ｃｍａｘ、ＡＵＣおよびＣＬを表１６に示す。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ順位和検定をアルファおよびβ半減期、Ｖ１およびクリアランスに適用した。用量レベル間の有意差は観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６３７】
プールされた集団ＥＬＩＳＡデータにフィッティングした薬物動態曲線を図９７に示す。平均±ＳＤ薬物動態パラメータは、Ｔ１／２α  ２９．１６±２１．１２時間、Ｔ１／２β  １７２．４０±９０．８５時間、Ｖ１  ２９８４．５９±９１．９１ｍＬ、およびＣＬ  １９．４４±４．０５ｍＬ／時間であった。測定ピークおよびトラフｃｈ８０６血清濃度（ＣｍａｘおよびＣｍｉｎ）データを各患者について表１７に提示する。予想どおり、各用量レベルに関してにＣｍａｘおよびＣｍｉｎついて比例関係が観察された。ｃｈ８０６  ＥＬＩＳＡ薬物動態データについて決定した平均±ＳＤ値は、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６薬物動態データについて得た値とよく一致していた（表１６）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６３８】
【表１９】
2016188209.tif 000006
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６３９】
【表２０】
2016188209.tif 000007
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６４３】
臨床活動の評定
この１ヶ月試験の完了時、５人の患者は、安定病態を、３人の患者は進行性疾患を有することが判明した（表１３）。興味深いことに、１人の患者（患者７、４０ｍｇ／ｍ２用量レベル）は、置換期間中に（細針穿刺吸引で転移性ＳＣＣであると証明された）触知可能な耳リンパ節の一過性修飾の臨床徴候を有した。このことは、ｃｈ８０６の潜在的生物活性を示唆している。しかし、この患者は、試験完了時にＲＥＣＩＳＴにより進行性疾患が確認された。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６５１】
【表２１】
2016188209.tif 000008
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６５３】
【表２２】
2016188209.tif 000009
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2016188209000001.app
【手続補正１９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた組換え抗ヒト上皮成長因子受容体（ｈＥＧＦＲ）モノクローナルＩｇＧ１抗体を含む免疫複合体であって、該抗ｈＥＧＦＲ抗体は、配列番号１６４に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号１６６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、抗原に対する単一の結合親和性により特徴付けられる、免疫複合体。
【請求項２】
抗体が、配列番号４８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
【請求項３】
抗体がＣＨＯ細胞において産生される請求項１または２に記載の免疫複合体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫複合体を含む、ヒト患者における癌の治療用医薬組成物。
【請求項５】
癌が腫瘍である請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
腫瘍が充実性腫瘍である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
充実性腫瘍が、上皮性腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、頭部腫瘍および頸部腫瘍からなる群より選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
腫瘍がＥＧＦＲを過発現している、請求項４〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫複合体を含む、ヒト患者における膠芽腫の治療用医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体と逐次的または同時に使用するための治療薬をさらに含む、請求項４〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療薬が、チロシンキナーゼ阻害剤、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチンまたはロムスチンである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記治療薬がテモゾロミドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７８】
2016188209.tif 000010
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７９】
2016188209.tif 000011
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８０】
2016188209.tif 000012
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８１】
2016188209.tif 000013
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８２】
2016188209.tif 000014
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８３】
2016188209.tif 000015
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８４】
2016188209.tif 000016
【手続補正２７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８５】
2016188209.tif 000017
【手続補正２８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８９】
2016188209.tif 000018
【手続補正２９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９０】
2016188209.tif 000019
【手続補正３０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９１】
2016188209.tif 000020