【手続補正書】
【提出日】平成29年3月17日(2017.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
カテキン類の優れた生理機能が数多く報告される一方で、カテキン類の生体内動態に関する研究も広く行われている。カテキン類は生体内への吸収量が非常に低く、経口摂取した大部分のカテキン類は腸内において腸内微生物（腸内細菌）の作用により分解され、代謝物として生体内へ吸収されることが示されている。腸内微生物によるカテキン類の代謝に関する報告は多く（非特許文献３−６参照）、主な代謝物として５−フェニル−γ−バレロラクトン（5-phenyl-γ-valerolactone）や５−フェニル−４−ヒドロキシ−吉草酸（5-phenyl-4-hydroxy-valeric acid）などが挙げられる。また、５−フェニル吉草酸（5-phenyl-valeric acid）、３−フェニルプロピオン酸（3-phenyl-propionic acid）、フェニル酢酸(phenyl acetic acid）、安息香酸（benzoic acid）など様々な代謝物が尿中から見出されている（非特許文献７−９参照）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
カテキン代謝物の生体内での機能性に関する知見としては、上記に示した５−フェニル−γ−バレロラクトン及び５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸の血圧上昇抑制作用、５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの抗炎症作用、５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの食道扁平上皮癌細胞、ヒト結腸腺癌細胞に対する増殖抑制効果及び抗炎症作用などが報告されている（特許文献３、非特許文献１０、１１参照）。しかしながら、カテキン代謝物又はその誘導体の免疫細胞増殖作用や免疫賦活作用については知られていない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明者らは、主なカテキン類の代謝物として報告のある１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール、１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール、２−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３，５，７−トリオール、５−フェニル吉草酸、５−（３−ヒドロキシフェニル）−レブリン酸、５−フェニル−γ−バレロラクトン、３−フェニルプロピオン酸の生理活性作用を検討した。その結果、これらのカテキン代謝物には、免疫賦活と深く関与するマウス脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びマウスパイエル板内の細胞の増殖促進効果があることを見いだし、本発明を完成した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
本件化合物は、例えば次の文献に示す公知の有機化学合成法（Chem. Rev., 89, 4, 863-927, 1989.、有機合成化学会誌, 59, 2, 109-120, 2001、Adv. Synth. Catal. 346, 111-124, 2004、Angew. Chem. Int. Ed., 48, 6507-6510, 2009、J. Agric. Food Chem., 57, 1231-1238, 2009、SYNTHESIS, 9, 1512-1520, 2010、Bioorg. Med. Chem. Lett., 15, 873-876, 2005）を組み合わせることにより得ることができる。例えば、５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの場合は３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ）ブロモベンゼン[(3-(tert-Butyldimethylsiloxy)bromobenzene)を基質とし、スワーン酸化やウィッティヒ反応を含む７つの反応を用いることで調製することが可能である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
式（I）で表わされる化合物を、式（III）のＲ1が水酸基で表わされる５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸、式（III）のＲ1が水素で表される５−フェニル吉草酸、式（V-1）、式(V-2)、式(V-3)、式(VI-1)、式(VI-2)、式(VI-3)、式(VI-4)で表わされる５−フェニル−γ−バレロラクトンに変換する能力を有する微生物の好ましい例としては、ユウバクテリウム属細菌及びクロスリジウム属細菌（新学名としてフラボニフラクター属細菌に属する細菌）を挙げることができ、さらに好ましくは、ユウバクテリウム・プラウティ：Eubacterium plautii（新学名；フラボニフラクター・プラウティ：Flavonifractor plautii）ATCC29863株、ユウバクテリウム・プラウティ：Eubacterium plautii（新学名；フラボニフラクター・プラウティ：Flavonifractor plautii）MT42株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７６５）及びクロストリジウム・オルビシンデンス：Clostridium orbiscindens（新学名；フラボニフラクター・プラウティ：Flavonifractor plautii）ATCC49531株を挙げることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
カテキン類を式（I）で表わされる化合物に変換する能力を持つ微生物と、式（I）で表わされる化合物を式（III）のＲ1が水酸基で表わされる５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸、式(III)のＲ1が水素で表される５−フェニル吉草酸、式(V-1)、式(V-2)、式(V-3)、式(VI-1)、式(VI-2)、式(VI-3)、式(VI-4)記載の５−フェニル−γ−バレロラクトンに変換する能力を有する微生物を共存させた培養菌体懸濁液又は培養液に、カテキン類及び／又はカテキン含有物を基質として添加し、嫌気条件下でインキュベーション処理することで上記の５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸、５−フェニル吉草酸及び／又は５−フェニル−γ−バレロラクトン含有物を容易に得ることができる。インキュベーション処理方法については、上記微生物を培養後、集菌したものを緩衝液や生理食塩水、水などに懸濁させ基質を添加する方法、若しくは前記微生物の培養時あるいは培養開始後一定期間経過後に基質を添加する方法がある。さらに、前記微生物の生育する培養液中に基質を添加し、嫌気条件下でインキュベーション処理することで５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸、５−フェニル吉草酸及び／又は５−フェニル−γ−バレロラクトンを容易に得ることもできる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
本件化合物の抱合体は、有機合成法及び微生物変換法により得られた５−フェニル−γ−バレロラクトンを基質とし、次の文献に示す公知の有機化学合成法（J. Nat. Prod., 76, 157-169, 2013.、Org. Biomol. Chem., 3(5), 886-900, 2005）を組み合わせることにより調製することができる。例えば、５−フェニル−γ−バレロラクトンのグルクロン酸抱合体は、次の文献に示す光延反応（Angew. Chem. Int. Ed., 48, 6507-6510, 2009）を用いて基質をグルクロン酸化させることで調製することが可能である。その他の調製法としては、ラットやマウスなどにカテキン類を投与し、回収した尿からカテキン代謝物抱合体を精製する方法や、抱合化酵素が含まれる動物の臓器ホモジネートを粗酵素として利用する方法、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）遺伝子組み換え酵母をカテキン類に加えてインキュベーション処理する方法などが挙げられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
【表１】
2016003200.tif 000001
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
（製造例２）
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＡＴＣＣ２９８６３株及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸[(R)-5-(3,5-Dihydroxyphenyl)-4-Hydroxy-Valeric Acd]（化合物（IIIa））及び（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン[(R)-5-(3,5-dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone]（化合物(VI-1a)）の製造方法を以下に示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株及びユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＡＴＣＣ２９８６３株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（−）−エピガロカテキン２９０ｍｇを含む１００ｍｌのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清を製造例１のＬＣ／ＭＳ分析と同条件で分析することで（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。次に、上記ＡＴＣＣ２９８６３株の前培養液を加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行った。その後、培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）に供し、得られた上清を製造例１と同様のＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸及び（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの生成を確認した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）し、菌体を除去した。上清に塩酸を加えｐＨ３．５に調整した後、２００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル層に５０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液１００ｍｌを加えよく混合し、遠心分離（５０００×ｇ、５分間）により２層分配させた。この酢酸エチル層に再度５０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液１００ｍｌを加えて混合し、同様に遠心分離（５０００×ｇ、５分間）により２層分配を行った。この酢酸エチル層はエバポレーターにより濃縮乾固し、製造例１と同様に分取ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ分析処理を行い、（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを４５ｍｇ得た。回収した炭酸ナトリウム水溶液は約２０ｍｌになるまでエバポレーターで濃縮し、塩酸を加えてｐＨ２．０〜４．０に調整後、分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件を以下に記載する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（♂、日本チャールスリバー株式会社）５匹から糞便を５．６ｇ採取し、ＧＡＭブイヨン３００ｍｌに入れ、３７℃で２日間嫌気培養を行った。次に、この培養液を滅菌済みの遠心管に入れ、９０００×ｇで２０分間遠心分離を行った。上清を捨て、菌体に２００ｍｌの滅菌水を加えて菌体を洗浄した後、再度遠心分離（９０００×ｇ、２０分）を行った。得られた菌体を（−）−エピガロカテキン５０ｍｇを含む１００ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁した。３７℃で１０日間嫌気培養した。その後、培養液に２Ｍ塩酸水を加えてｐＨ４．０に調整し、遠心分離（９０００×ｇ、２０分）に供して菌体を除去した。上清を１００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出を行った後、酢酸エチル層を合わせてエバポレーターで減圧濃縮し、得られた濃縮液を１０％メタノール水溶液で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣは製造例１の方法に従って行った。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
（製造例６）
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＭＴ４２株及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸[(R)-5-(3-hydroxyphenyl)-4-hydroxy-valeric acid]（化合物(IIId)）及び（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン[(R)-5-(3-hydroxyphenyl)-γ-valerolactone]（化合物(V-1a)）の製造方法を以下に示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株及びユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＭＴ４２株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（−）−エピカテキン２００ｍｇを含む２００ｍｌのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。次に、培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清を製造例１と同様のＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｓ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。その後、さらに上記ＭＴ４２株の前培養液を加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行い、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸及び（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンへの変換を行った。培養後、製造例２に記載の方法に準じて培養液を調製し、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを５１ｍｇ得た。また、製造例２と同様の方法で培養液から（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸のナトリウム塩を５３ｍｇ得た。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
（製造例８）
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＡＴＣＣ４９５３１株及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸[(S)-5-(3-hydroxyphenyl)-4-hydroxy-valeric acid]（化合物(IIIe)）及び（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン[(S)-5-(3-hydroxyphenyl)-γ-valerolactone]（化合物(V-1b)）の製造方法を以下に示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株及びユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＡＴＣＣ４９５３１株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（＋）−カテキン２９０ｍｇを含む３００ｍｌのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養後、培養液１ｍｌをサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）して菌体を除去し、上清を製造例１と同様のＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。その後、さらに上記ＡＴＣＣ４９５３１株の前培養液を加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行い、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸及び（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンへの変換を行った。製造例２に記載の方法に準じて培養液を調製し、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを４１ｍｇ得た。また、製造例２に記載の方法と同様の方法で培養液から（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸のナトリウム塩を５２ｍｇ得た。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
１．０ｍＬのアセトンに、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン４８．７ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム１０５ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌させた。次に、クロロメチルメチルエーテル（chloromethylmethyl ether）を８０．４μＬ（０．５０ｍｍｏｌ）加え、室温で２日間攪拌させた。攪拌後、５％クエン酸溶液を加えて溶液をｐＨ４．０に調整し、水を３ｍＬ加えた後、クロロホルム５ｍＬで３回抽出した。クロロホルム層を水５ｍＬと飽和食塩水５ｍＬで洗浄後、エバポレーターで減圧濃縮し、（Ｒ）−５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）−γ−バレロラクトン[(R)-5-(3-methoxymethyloxyphenyl)-γ-valerolactone]を６３．３ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ、収率９６．０％）得た。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
得られた（Ｒ）−５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）−γ−バレロラクトンの全量（０．２４ｍｍｏｌ）をメタノール１ｍＬに溶解させ、３Ｍ水酸化カリウム溶液を１００μＬ加えて室温で１時間攪拌した。次に、１Ｍギ酸−ナトリウムバッファーを加えて溶液をｐＨ４．０に調整し、水を３ｍＬ加えた後、酢酸エチル４ｍＬで３回抽出した。さらに、酢酸エチル層にトリエチルアミンを１００μＬ加え、エバポレーターで減圧濃縮することにより、５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）吉草酸[5-(3-methyoxymethyloxyphenyl)-valeric acid]のトリエチルアミン塩を５８．４ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ、収率９５．０％）得た。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
（製造例１３）
有機合成方法による（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトン（化合物(V-2a)）の製造方法を以下に示す。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
３０．９ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）の（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンにピリジン１０ｍｌ、硫酸ナトリウム５ｍｇ及び三酸化硫黄ピリジン１５２．２ｍｇ（０．９６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３日間攪拌させた。次に、０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）と水を加えて反応停止させてエバポレーターで減圧濃縮し、得られた濃縮残渣を３ｍＬの水で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件を以下に記載する。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮し（（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトンの粗精製物を得た。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
次に、得られた粗精製物に水を加え、エバポレーターにより減圧濃縮してアセトニトリルを除去した。この濃縮液をＳＵＰＥＬＣＯ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＤＳＣ−１８カラムにのせ、水３０ｍｌで洗浄した後、アセトニトリル３０ｍｌにて（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトンを溶出した。溶出後、得られたアセトニトリル溶出画分をエバポレーターで減圧濃縮して凍結乾燥に供することにより、白色粉末状の（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトンの精製物を１５．８ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ、収率３６．３％）得た。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
（製造例１４）
有機合成方法による（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン］（化合物(VI-2a)）及び（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物(VI-4a)）の製造方法を以下に示す。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
１６３．１ｍｇ（０．７８ｍｍｏｌ）の（Ｒ）−５−（３，５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンにピリジン１０ｍｌと硫酸ナトリウム５ｍｇを加え、室温で１０分間攪拌した。次に、三酸化硫黄ピリジンを７９０．４ｍｇ（４．６８ｍｍｏｌ）加え、室温で１時間攪拌させた。攪拌後、０．２Ｍリン酸二水素ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）を加えて反応停止させ、エバポレーターで減圧濃縮して得られた濃縮残渣を３ｍｌの水で溶解し分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件を以下に記載する。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮することによりアセトニトリルを除去し、（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン及び（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトンの粗精製物をそれぞれ得た。得られた各粗精製物をＳＵＰＥＬＣＯ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＤＳＣ−１８カラムにＯＤＳ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  １５−３０μｍ、１０ｃｍ３）を追加充填したカラムにのせ、水１６０ｍｌで洗浄した後、アセトニトリル１７５ｍｌにて溶出した。得られた各アセトニトリル溶出画分をそれぞれエバポレーターで減圧濃縮して凍結乾燥に供することにより、白色粉末状の（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン及び（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトンの精製物をそれぞれ１２．５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ、収率５．２％）、１４．２ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ、収率４．４％）得た。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
得られた精製物を１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ以下のケミカルシフト値が得られ、目的の化合物であることを確認した。
（Ｒ）−５−（３−スルフォオキシ−５−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ６．２４（２Ｈ，ｓ），６．１９（１Ｈ，ｓ），４．７９（１Ｈ，ｍ），２．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．５５（１Ｈ，ｍ），２．４６（１Ｈ，ｍ），２．３３（１Ｈ，ｍ），２．００（１Ｈ，ｍ）
（Ｒ）−５−（３，５−ジスルフォオキシフェニル）−γ−バレロラクトン：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ７．１４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），３．７０（２Ｈ，ｓ），２．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．５２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
（製造例１５）
ラットを用いた（−）−エピカテキン経口投与による（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトン(化合物((V-3a))の製造方法を以下に示す。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
回収した尿２３０ｍＬを合一し、エバポレーターで約４５ｍＬになるまで減圧濃縮した。次に、得られた濃縮液にメタノール２２５ｍＬを加えてよく混合した後、高速遠心分離（３０００×ｇ、１０分間、４℃）によりタンパク質沈殿物を除去した。得られた上清をエバポレーターで約４５ｍＬになるまで減圧濃縮し、水を加えて４５０ｍＬとした後、酢酸を加えてｐＨ３．０に調整した。０．１Ｍリン酸−クエン酸バッファーでｐＨ３．０に調整した尿水溶液をＯａｓｉｓＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、３５ｃｃ）に通液した後、水１７５ｍＬ、２０％メタノール１７５ｍＬの順で洗浄した後、４０％メタノール１７５ｍＬにて（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンを含む画分を溶出した。得られた４０％メタノール溶出画分をエバポレーターで減圧濃縮し、濃縮残渣に水５ｍＬを加えて分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件は以下に記載する。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
分取後、得られた分取液をＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンが含まれることを確認した。ＬＣ／ＭＳ条件を以下に記載する。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
さらに、（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンが含まれる画分をリサイクルＨＰＬＣに供し、精製を行った。リサイクルＨＰＬＣ条件は以下に記載する。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
分取後、本製造例１５における上記のＬＣ／ＭＳ分析により、分画した画分に（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンが含まれていることを確認した。この（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンが含まれる画分をエバポレーターで濃縮乾固し、乾固物に５ｍｌの水を加えて溶解した後、再度減圧下で濃縮乾固した。この操作を３回繰り返すことで、有機溶媒に含まれていた酸を完全に除去した。最後に、乾固物に水２ｍＬを加えて溶解し、凍結乾燥に供することで（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンを５．０ｍｇ得た。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
（製造例１６）
ラットを用いた（−）−エピガロカテキン経口投与による（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトン（化合物(VI-3a)）の製造方法を以下に示す。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
８週齢のＷｉｓｔａｒ系ラット（♂、日本チャールスリバー株式会社）６匹を精製飼料で１週間予備飼育し、試験前日より絶食させて試験に用いた。投与サンプルは（−）−エピガロカテキンを生理食塩水に溶解させた溶液とし、各ラットに２０ｍｇ/１．７ｍＬずつ胃内強制投与した。投与は４日間反復して行い、それぞれ投与後６時間〜２４時間の尿を回収した。回収した尿２５０ｍＬを合一し、製造例１５記載の方法に準じて調製及び分取精製を行うことで、（Ｒ）−５−［３−（β―Ｄ−グルコピラヌロノシルオキシ−５−ヒドロキシ）フェニル］−γ−バレロラクトンを２８．０ｍｇ得た。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
（製造例：錠剤）
（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（０．５重量％）、キシリトール（３３．８重量％）、マンニトール（３０．６重量％）、微結晶性セルロース（６．１重量％）、着香料（１４．１重量％）、ステアリン酸（４．３重量％）、タルク（０．６重量％）及びソルビトール（１０．０重量％）を混合した粉体を錠剤プレスによって圧縮し、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを含有する免疫機能の維持向上を目的とした錠剤を得た。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
（製造例：皮膚外用液剤）
精製水に（Ｒ）−５−(３，５−ジスルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトン（５．０重量％）、グリセリン（５．０重量％）及びプロピレングリコール（４．０重量％）を加え溶解した。一方、エタノール（０．１重量％）にオレイルアルコール（０．１重量％）及び安息香酸（０．０５重量％）を室温で溶解した。これを精製水部に加えて可溶化してろ過後、充填することにより、（Ｒ）−５−(３，５−ジスルフォオキシフェニル)−γ−バレロラクトンを含有する免疫機能の維持向上を目的とした皮膚外溶液剤を得た。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
（製造例：スポーツ飲料）
（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシ− ５−ヒドロキシフェニル)−γ−バレロラクトン（０．１ｍｇ）、ビタミンＢ１塩酸塩（０．４５ｍｇ）、ビタミンＢ２（０．２ｍｇ）、ビタミンＣ（１０ｍｇ）、ナイアシン（０．８ｍｇ）、パントテン酸Ｃａ（０．２２ｍｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（１２．５７ｍｇ）、クエン酸（１００ｍｇ）及び果糖（２．５ｇ）の成分にイオン交換水を加え全量を２００ｍｌとし、（Ｒ）−５−(３−スルフォオキシ− ５−ヒドロキシフェニル)−γ−バレロラクトンを含有する免疫機能の維持向上を目的としたスポーツ飲料を調製した。