【手続補正書】
【提出日】平成29年9月7日(2017.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞をＣＤ４３＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞を含まないか、またはフィーダー細胞を本質的に含まず、マトリックス成分、ならびにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む培養培地で培養する工程；および
ｂ）前記多能性幹細胞を、５．５％未満酸素の低酸素雰囲気下で前記ＣＤ４３＋前駆細胞を得るための期間分化させる工程
を含む、方法。
【請求項２】
ｂ）において、前記多能性幹細胞を、胚様体を経ずに、分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養培地がＲＯＣＫインヒビターまたはミオシンＩＩインヒビターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記低酸素雰囲気は０．５％酸素ガスから５．５％酸素ガスを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記低酸素雰囲気は、１．５％酸素ガスから５．３％酸素ガスを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤ４３＋前駆細胞またはその子孫を培養から８日から１２日で収集する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地はＢＭＰ−４を５ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地はＶＥＧＦを５ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地はｂＦＧＦを５ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養培地は血清またはフィーダー細胞を含まないか、あるいは血清またはフィーダー細胞を本質的に含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法の少なくとも一部を自動化するためロボットを使用することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
複数の前記多能性幹細胞はバイオリアクターを使用して培養される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ３４、ＣＤ４３およびＣＤ３１からなる群の１つまたは複数の発現に基づき前記ＣＤ４３＋前駆細胞を分取する工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を用いて作製されたＣＤ４３＋前駆細胞。
【請求項１５】
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３４＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞を含まないか、またはフィーダー細胞を本質的に含まず、マトリックス成分、ならびにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む培養培地で培養する工程；および
ｂ）前記多能性幹細胞を、胚様体を経ずに、５．５％未満酸素の低酸素雰囲気下で前記ＣＤ３４＋前駆細胞を得るための期間分化させる工程
を含む、方法。
【請求項１６】
前記培養培地がＲＯＣＫインヒビターまたはミオシンＩＩインヒビターを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記低酸素雰囲気は０．５％酸素ガスから５．５％酸素ガスを含む、請求項１５または１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記低酸素雰囲気は、１．５％酸素ガスから５．３％酸素ガスを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞またはその子孫を培養から８日から１２日で収集する工程をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養培地はＢＭＰ−４を５ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養培地はＶＥＧＦを５ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養培地はｂＦＧＦを５ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記培養培地は血清またはフィーダー細胞を含まないか、あるいは血清またはフィーダー細胞を本質的に含まない、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法の少なくとも一部を自動化するためロボットを使用することを含む、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
複数の前記多能性幹細胞はバイオリアクターを使用して培養される、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＤ３４、ＣＤ４３およびＣＤ３１からなる群の１つまたは複数の発現に基づき前記ＣＤ３４＋前駆細胞を分取する工程をさらに含む、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法を用いて作製されたＣＤ３４＋前駆細胞。
【請求項２８】
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３１＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞を含まないか、またはフィーダー細胞を本質的に含まず、マトリックス成分、ならびにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む培養培地で培養する工程；および
ｂ）前記多能性幹細胞を、胚様体を経ずに、５．５％未満酸素の低酸素雰囲気下で前記ＣＤ３１＋前駆細胞を得るための期間分化させる工程
を含む、方法。
【請求項２９】
前記培養培地がＲＯＣＫインヒビターまたはミオシンＩＩインヒビターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記低酸素雰囲気は０．５％酸素ガスから５．５％酸素ガスを含む、請求項２８または２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記低酸素雰囲気は、１．５％酸素ガスから５．３％酸素ガスを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＤ３１＋前駆細胞またはその子孫を培養から８日から１２日で収集する工程をさらに含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養培地はＢＭＰ−４を５ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記培養培地はＶＥＧＦを５ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記培養培地はｂＦＧＦを５ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記培養培地は血清またはフィーダー細胞を含まないか、あるいは血清またはフィーダー細胞を本質的に含まない、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法の少なくとも一部を自動化するためロボットを使用することを含む、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
複数の前記多能性幹細胞はバイオリアクターを使用して培養される、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＣＤ３４、ＣＤ４３およびＣＤ３１からなる群の１つまたは複数の発現に基づき前記ＣＤ３１＋前駆細胞を分取する工程をさらに含む、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法を用いて作製されたＣＤ３１＋前駆細胞。