(57)【要約】  進行型の多発性硬化症を治療する方法であって、脂肪組織由来幹細胞を中枢神経系（ＣＮＳ）に投与するステップを含む方法が提供される。更に、現在用いられている方法と比較して費用対効果がより高くより高い収量をもたらす、ＡＤＳＣを得るための改善された方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非遺伝子組み換えのヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を、それを必要とする対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することを含む、一次進行型多発性硬化症を治療する方法。
【請求項２】
前記ｈＡＤＳＣは、
（ａ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、
（ｂ）前記吸引脂肪組織を解凍し、組織分散酵素を用いて、又は機械的破砕により分散させるステップと、
（ｃ）前記ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングし、任意に細胞生存率を支持可能な懸濁培地で前記ペレットを洗浄し、前記懸濁液を少なくとも１回の追加の遠心分離にかけるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記ペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で再懸濁し、再懸濁された前記ペレット内の細胞集団からｈＡＤＳＣを選択するステップと、
（ｅ）任意に、前記ｈＡＤＳＣの選択の前に少なくとも１回濾過をおこなうステップと、
（ｆ）任意に、前記ｈＡＤＳＣを少なくとも３継代にわたって培養するステップと、
によってヒト皮下脂肪から得られたｈＡＤＳＣである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｈＡＤＳＣは、（ｉ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、（ｉｉ）前記吸引脂肪組織を解凍し、組織分散酵素を用いて、又は機械的破砕により分散させるステップと、（ｉｉｉ）前記ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングするステップと、（ｉｖ）前記ペレットを等張緩衝液又は培養液で洗浄し、追加の遠心分離にかけるステップと、（ｖ）ステップ（ｉｖ）で得られた前記ペレットを等張緩衝液又は培養液で再懸濁し、少なくとも１回濾過をおこなうステップと、（ｖｉ）再懸濁された前記ペレット内の細胞集団からｈＡＤＳＣを選択するステップと、（ｖｉｉ）前記ｈＡＤＳＣを少なくとも３継代にわたって培養するステップと、によってヒト皮下脂肪から得られたｈＡＤＳＣである、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
遠心分離後に得られた前記ｈＡＤＳＣを含む前記細胞分画は、赤血球溶解バッファーにさらされない、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｈＡＤＳＣは、前記細胞培養容器への付着性によって選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を、それを必要とする対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に注入する方法であって、
（ａ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、
（ｂ）前記吸引脂肪組織を解凍し、組織分散酵素を用いて、又は機械的破砕により分散させるステップと、
（ｃ）前記ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングし、任意に細胞生存率を支持可能な懸濁培地で前記ペレットを洗浄し、前記懸濁液を少なくとも１回の追加の遠心分離にかけるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記ペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で再懸濁し、少なくとも１回濾過をおこなうステップと、
（ｅ）再懸濁された前記ペレット内の細胞集団からｈＡＤＳＣを選択するステップと、
（ｆ）任意に、前記ｈＡＤＳＣを少なくとも３継代にわたって培養するステップと、
（ｇ）前記対象の前記ＣＮＳに前記ｈＡＤＳＣを注入するステップと、
によってヒト皮下脂肪からｈＡＤＳＣを取得することを含む、方法。
【請求項７】
ヒト皮下脂肪からヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を、それを必要とする対象への投与のために取得する方法であって、
（ａ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、
（ｂ）前記吸引脂肪組織を解凍し、組織分散酵素を用いて、又は機械的破砕により分散させるステップと、
（ｃ）前記ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングし、任意に前記ペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で洗浄し、前記懸濁液を少なくとも１回の追加の遠心分離にかけるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記ペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で再懸濁し、少なくとも１回濾過をおこなうステップと、
（ｅ）再懸濁された前記ペレット内の細胞集団からｈＡＤＳＣを選択するステップと、
（ｆ）任意に、前記ｈＡＤＳＣを前記対象への投与の前に少なくとも３継代にわたって培養するステップと、
を含む、方法。
【請求項８】
前記ｈＡＤＳＣは、組織培養容器への付着性によって選択される、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記対象は多発性硬化症（ＭＳ）を患っている、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記多発性硬化症は進行性ＭＳである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記進行性ＭＳは二次進行型ＭＳである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記進行性ＭＳは一次進行型ＭＳである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記凍結は−８０℃で実施され、その後に気相液体窒素が続く、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組織分散酵素は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ又はそれらの組合わせから選択される、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組織分散酵素はコラゲナーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｈＡＤＳＣは、前記細胞の少なくとも９５％によるＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０の陽性発現と、前記細胞の少なくとも９０％によるＣＤ１０５の陽性発現と、前記細胞の少なくとも９５％によるＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの陰性発現とによって特徴付けられる、
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｈＡＤＳＣは、前記細胞の少なくとも９８％によるＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０の陽性発現と、前記細胞の少なくとも９０％によるＣＤ１０５の陽性発現と、前記細胞の少なくとも９８％によるＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの陰性発現とによって特徴付けられる、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｈＡＤＳＣは更に、前記細胞の１〜１０％によるＣＤ３４の陽性発現によって特徴付けられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＣＤ９０に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｈＡＤＳＣは、投与の前に継代数３〜１０まで培養されたｈＡＤＳＣである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｈＡＤＳＣは、投与の前に継代数３〜５まで培養されたｈＡＤＳＣである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｈＡＤＳＣは１回投与される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｈＡＤＳＣは複数回投与される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｈＡＤＳＣは２〜８ヶ月毎に１回投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｈＡＤＳＣは３〜１２ヶ月毎に１回投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｈＡＤＳＣを投与することは髄腔内投与による、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｈＡＤＳＣを投与することは室内又は脳室内（ＩＣＶ）投与による、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｈＡＤＳＣは自己由来である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｈＡＤＳＣは同種由来である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｈＡＤＳＣを投与することは、１回の投与につき約１０５〜３×１０８個の細胞を投与することを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
中枢神経系（ＣＮＳ）への投与による一次進行型多発性硬化症の治療における使用のための、非遺伝子組み換えのヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪組織由来幹細胞の投与を含む多発性硬化症の治療計画に関する。特に、本発明は、脂肪組織由来幹細胞の脳室内又は髄腔内投与を用いた進行型の多発性硬化症の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の慢性炎症性疾患であり、一般に若い成人に起こり、男性よりも女性に多く見られる。ＭＳは、脳と脊髄の神経細胞の互いに情報伝達し身体機能を制御する能力に影響を与える。臨床上の障害は、ＣＮＳの軸索を取り囲む保護鞘であるミエリンの炎症に関連し、ミエリンは、自己免疫性の攻撃と神経変性プロセスによって損傷を受ける。結果として、脳及び脊髄の白質は限局性病変（プラーク）により瘢痕化し、神経学的機能障害が生じる。ＭＳの症状にはいくつかのパターンがある。ほとんどの患者は、初期段階で再発寛解（ＲＲＭＳ）の経過をたどる。これは、予測できない再発と、それに続く部分的又は完全な回復（寛解）を特徴とし、ある時点で進行性（ＰＭＳ）になる。このような進行性ＭＳは、二次進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）に分類される。症状の発症から進行性の経過をたどる患者もおり、そのような疾患パターンは一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）として分類される。
【０００３】
再発寛解型ＭＳの患者は通常、急性発作（再発）時にはコルチコステロイドで治療され、新たな再発と障害の進行を防ぐために免疫調節薬又は免疫抑制薬で治療される。これらは、インターフェロンベータ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標））、酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））、フマル酸ジメチル（Ｔｅｃｆｉｄｅｒａ（登録商標））、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ（登録商標））、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））、より重症のケースでは化学療法薬ミトキサントロンを含む。
【０００４】
進行型のＭＳは同様の薬物を用いて治療されることがあるが、治療は主に症状とリハビリテーションの管理に焦点を当てている。ＭＳに関する治療の選択肢は全て、部分的にのみ有効である。
【０００５】
最近のレビューでは、進行性ＭＳが現在、利用可能な疾患修飾治療が不足している領域であることが強調されている（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１６、第１６（６）巻、ｓ５３−ｓ５９頁）。オクレリズマブ（ＯＣＲＥＶＵＳ（商標））は、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であり、２０１６年に食品医薬品局（ＦＤＡ）からＰＰＭＳに対する画期的治療薬指定（Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）が付与された（バーゼルのロシュによる投資家アップデート、２０１６年２月１７日）。
【０００６】
自己免疫疾患及び／又は神経変性疾患の治療のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）：
【０００７】
ＭＳＣは、元々は成人の骨髄で特定された、多能性自己再生細胞の供給源である。生来、それらは分化して骨芽細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞を産生する。ＭＳＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞に代わって多能性幹細胞の利用しやすい供給源を提供する。ＭＳＣは、自己供給源由来とすることができ、同種異系の使用に有利な免疫特権の性質を特徴とするので、細胞療法における免疫抑制の必要性が潜在的に回避される。
【０００８】
ＭＳＣベースの治療法は、移植片対宿主病、脳卒中、心筋梗塞、肺線維症及び自己免疫障害を含む多くの適応症の前臨床試験において、有効であることが示されている。ＭＳＣは、神経変性疾患に対する治療ツールとしても広く研究されている。ＭＳＣは、神経変性疾患との関連において２つの側面、すなわち特定の条件下で神経細胞に分化転換する能力と、その神経保護及び免疫調節の効果に関して議論されている。ＭＳＣは、脳に移植されると、損傷組織を保護し再生を誘導する神経栄養因子及び成長因子を産生する。更に、ＭＳＣは遺伝子導入溶媒としても検討されており、例えば、脳でグリア由来又は脳由来の神経栄養因子を過剰発現するように遺伝子操作されている。ＭＳ、ＡＬＳ、外傷性脳損傷、脊髄損傷及び脳卒中について、ＭＳＣを伴う臨床試験が現在進行中である。
【０００９】
脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）：
【００１０】
過去数十年にわたって、脂肪組織はそのエネルギー貯蔵庫としての主な機能に加えて、多能性間質細胞の豊富な資源でもあることが示されている（Ｚｕｋ他、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００２；１３：４２７９−４２９５）。
【００１１】
国際公開第２０１０／０４５６４５号は、脂肪組織から脂肪幹細胞を回収する方法を開示している。
【００１２】
米国特許第８，０２１，８８２号は、脂肪幹細胞の培養物を提供し、その上清を収集することにより、神経障害の治療のための幹細胞馴化培地を作製する方法を開示している。
【００１３】
Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ他（２００９）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．、２７（１０）：２６２４−３５は、慢性の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスへの脂肪組織由来間葉系幹細胞の静脈内投与を研究した。
【００１４】
Ｓｔｅｐｉｅｎ他（２０１６）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、ｖｏｌ．２０１６は、髄腔内に注入された自己脂肪幹細胞で治療されたＲＲＭＳ又はＳＰＭＳのＭＳ患者の１年間の追跡調査を報告している。
【００１５】
国際公開第２００６／０５７００３号は、とりわけ、グラチラマーと組み合わせて骨髄由来の幹細胞を用いる幹細胞療法の方法を開示している。
【００１６】
Ａｈａｒｏｎｉ他（２００９）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、２１５（１−２）：７３−８３は、脳室内又は腹腔内のいずれかに移植された筋肉前駆細胞（ＭＰＣ）、及び酢酸グラチラマーによる、ＥＡＥ誘導マウスの共治療について報告している。
【００１７】
当技術分野では、多発性硬化症を治療するための、特に進行型の該疾患を有する患者のための、改善された方法が必要である。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、一部の態様によれば、中枢神経系（ＣＮＳ）に投与される脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を用いた、進行性ＭＳ、特に一次進行型ＭＳを含む多発性硬化症（ＭＳ）の治療法を提供する。本発明は更に、ＡＤＳＣを得るための改善された方法を提供し、本方法は現在使用されている方法と比較してより費用効率が高く、より高い収量を提供する。
【００１９】
本発明は、部分的に、慢性多発性硬化症の動物モデルにおける臨床スコアに対する、ＣＮＳに投与されたヒトＡＤＳＣの驚くべき効果に基づく。該細胞は、最大疾患スコアを低減すること、そして重要なことに、疾患の進行を遅らせることに特に効果的であることが分かった。有利なことに、細胞は、本明細書で以下に例示される改善された方法を用いて単離された。本明細書で初めて開示される改良された方法は、脂肪吸引によって得られた脂肪組織すなわち吸引脂肪組織のサンプルを、更なる処理の前に凍結及び解凍することを含む。また、改良された方法は、現在用いられている方法で必要とされるような、吸引脂肪組織に見られる赤血球を破壊するために緩衝液を適用する必要性を回避する。よって改善された方法は、その後、細胞残屑からＡＤＳＣを分離することも排除する。驚くべきことに、赤血球溶解バッファーが適用されなくても、結果として得られるＡＤＳＣサンプルは、標準的な方法に従って単離されたサンプルと同じくらい効果的に増殖することが分かった。
【００２０】
一態様によれば、本発明は、非遺伝子組み換えのヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を、それを必要とする対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することを含む、一次進行型多発性硬化症を治療する方法を提供する。
【００２１】
一部の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、
（ａ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、
（ｂ）吸引脂肪組織を解凍し、組織分散酵素を用いて、又は機械的破砕により分散させるステップと、
（ｃ）ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングし、任意にペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で洗浄し、懸濁液を少なくとも１回の追加の遠心分離にかけるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で再懸濁し、再懸濁されたペレット内の細胞集団からｈＡＤＳＣを選択するステップと、
（ｅ）任意に、ｈＡＤＳＣの選択の前に少なくとも１回濾過をおこなうステップと、
（ｆ）任意に、ｈＡＤＳＣを少なくとも３継代にわたって培養するステップと、
によってヒト皮下脂肪から得られたｈＡＤＳＣである。
【００２２】
一部の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、（ｉ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、（ｉｉ）吸引脂肪組織を解凍し、組織分散酵素を用いて、又は機械的破砕により分散させるステップと、（ｉｉｉ）ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングするステップと、（ｉｖ）ペレットを等張緩衝液又は培養液で洗浄し、更なる遠心分離にかけるステップと、（ｖ）ステップ（ｉｖ）で得られたペレットを等張緩衝液又は培養液で再懸濁し、少なくとも１回濾過をおこなうステップと、（ｖｉ）再懸濁されたペレット内の細胞集団からｈＡＤＳＣを選択するステップと、（ｖｉｉ）ｈＡＤＳＣを少なくとも３継代にわたって培養するステップと、によってヒト皮下脂肪から得られたｈＡＤＳＣである。
【００２３】
本明細書に開示されるように、ＡＤＳＣを得る方法により、吸引脂肪組織に元々見られる赤血球の溶解を引き起こすために緩衝液を適用する必要性が回避される。よって、一部の実施形態では、吸引脂肪組織は、赤血球溶解バッファーを適用することなく、脂肪組織由来幹細胞を単離するために処理される。これらの実施形態によれば、遠心分離後に得られたｈＡＤＳＣを含む細胞分画は、赤血球溶解バッファーにさらされない。
【００２４】
別の態様によれば、本発明は、ヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を、それを必要とする対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に注入する方法を提供する。本方法は、
（ａ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、
（ｂ）吸引脂肪組織を解凍し、組織分散酵素を用いて、又は機械的破砕により分散させるステップと、
（ｃ）ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングし、任意にペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で洗浄し、少なくとも１回の追加の遠心分離にかけるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたペレットを緩衝液又は培養液で再懸濁し、少なくとも１回濾過をおこなうステップと、
（ｅ）再懸濁されたペレット内の細胞集団からｈＡＤＳＣを選択するステップと、
（ｆ）任意に、ｈＡＤＳＣを少なくとも３継代にわたって培養するステップと、
（ｇ）対象のＣＮＳにｈＡＤＳＣを注入するステップと、
によってヒト皮下脂肪からｈＡＤＳＣを取得することを含む。
【００２５】
更なる態様によれば、本発明は、ヒト皮下脂肪からヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を、それを必要とする対象への投与のために取得する方法を提供する。本方法は、
（ａ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、
（ｂ）吸引脂肪組織を解凍し、組織分散酵素を用いて、又は機械的破砕により分散させるステップと、
（ｃ）ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングし、任意にペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で洗浄し、懸濁液を少なくとも１回の追加の遠心分離にかけるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で再懸濁し、少なくとも１回濾過をおこなうステップと、
（ｅ）再懸濁されたペレット内の細胞集団からｈＡＤＳＣを選択するステップと、
（ｆ）任意に、ｈＡＤＳＣを対象への投与の前に少なくとも３継代にわたって培養するステップと、
から成る。
【００２６】
本明細書に開示されるように、遠心分離後に得られたｈＡＤＳＣを含む細胞分画は、赤血球溶解バッファーにさらされない。
【００２７】
一部の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、細胞培養容器への付着性によって選択される。一部の実施形態では、細胞はプラスチック組織培養容器に付着する。
【００２８】
一部の実施形態では、凍結は−８０℃で実施され、その後に気相液体窒素が続く。
【００２９】
一部の実施形態では、組織分散酵素は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ又はそれらの組合わせから選択される。一部の具体的な実施形態では、組織分散酵素はコラゲナーゼである。
【００３０】
一部の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、細胞の少なくとも９５％によるＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０の陽性発現と、細胞の少なくとも９０％によるＣＤ１０５の陽性発現と、細胞の少なくとも９５％によるＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの陰性発現とによって特徴付けられる。一部の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは更に、細胞の１〜１０％によるＣＤ３４の陽性発現によって特徴付けられる。
【００３１】
一部の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、細胞の少なくとも９８％によるＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０の陽性発現と、細胞の少なくとも９０％によるＣＤ１０５の陽性発現と、細胞の少なくとも９８％によるＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの陰性発現とによって特徴付けられる。
【００３２】
一部の実施形態では、細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＣＤ９０に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である。
【００３３】
一部の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、投与の前に継代数３〜１０まで培養されたｈＡＤＳＣである。追加の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、投与の前に継代数３〜５まで培養されたｈＡＤＳＣである。
【００３４】
一部の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、投与の前にゼノフリー培地で培養されたｈＡＤＳＣである。
【００３５】
一部の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは１回投与される。
【００３６】
他の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは、例えば２回、３回、４回など複数回投与される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは２〜８ヶ月毎に１回投与される。追加の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは３〜１２ヶ月毎に１回投与される。
【００３７】
一部の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣを投与することは髄腔内投与による。
【００３８】
他の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣを投与することは、室内又は脳室内（ＩＣＶ）投与、すなわち脳室への投与による。
【００３９】
一部の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは、脂肪吸引法によって得られたヒト皮下脂肪由来である。
【００４０】
一部の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは自己由来である。
【００４１】
他の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは同種由来である。
【００４２】
一部の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣを投与することは、１回の投与につき約１０５〜３×１０８個の細胞を投与することを含む。
【００４３】
本明細書に記載の治療される対象は、一般にヒトである。一部の実施形態によれば、本発明の方法及び組成物は、多発性硬化症、特に進行型の多発性硬化症（ＭＳ）の治療に有用である。よって、一部の実施形態によれば、対象はＭＳに罹患している。一部の実施形態では、対象は、進行型のＭＳに罹患している対象である。一部の具体的な実施形態では、進行性ＭＳは二次進行型ＭＳである。追加の具体的な実施形態では、進行性ＭＳは一次進行型ＭＳである。
【００４４】
本発明のこれら並びに更なる態様及び特徴は、以下の詳細な説明、実施例及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＥＡＥに対するＡＤＳＣ用量反応：２８日までの平均臨床スコア分析。全ての群（ｎ＝１０／群、＋／−標準誤差）。
【図２】ＥＡＥに対するＡＤＳＣ用量反応：２８日までの平均臨床スコア分析。２×１０５細胞／動物と比較した溶媒。（ｎ＝１０／群、＋／−標準誤差）。
【図３】ＥＡＥに対するＡＤＳＣ用量反応：２８日までの平均臨床スコア分析。１×１０５個の細胞、２×１０５個の細胞及び４×１０５個の細胞／動物の比較。（ｎ＝１０／群、＋／−標準誤差）。
【図４】ＥＡＥに対するＡＤＳＣ用量反応：２９日までの体重分析。（ｎ＝１０／群、＋／−標準誤差）。
【図５】ＥＡＥに対するＡＤＳＣ細胞用量の効果：２８日までの平均臨床スコア（疾病負荷）の平均ＡＵＣ。＊Ｐ＜０．０５（ｎ＝１０／群、＋／−標準誤差）
【図６】ＥＡＥに対するＡＤＳＣ用量の効果：２８日目までの平均最大スコア分析。＊Ｐ＜０．０５（ｎ＝１０／群、＋／−標準誤差）。
【図７】継代数に応じたＡＤＳＣの細胞表面マーカー発現。細胞を脂肪組織から単離し、実施例のセクションに記載されているように培養し、示されたマーカーの発現について分析した。結果は、９つのサンプルの平均＋／−標準偏差である。
【図８】図８Ａ−図８Ｂ。赤血球溶解を伴う又は伴わない単離後のＳＶＦ細胞計数データ。（Ａ）細胞／ｍｌ；（Ｂ）％生存率。
【図９】図９Ａ−図９Ｂ。赤血球溶解を伴う又は伴わない単離後の継代０での細胞計数データ。（Ａ）細胞／ｍｌ；（Ｂ）％生存率。
【図１０】図１０Ａ−図１０Ｃ。吸引脂肪組織サンプルの初期量に応じたＳＶＦ及びＡＤＳＣ収量：第１のバッチ。ＳＶＦ単離直後（Ａ）、Ｐ＃０（Ｂ）及びＰ＃１（Ｃ）での生細胞の総数。
【図１１】図１１Ａ−図１１Ｃ。吸引脂肪組織サンプルの初期量に応じたＳＶＦ及びＡＤＳＣ収量：第２のバッチ。ＳＶＦ単離直後（Ａ）、Ｐ＃０（Ｂ）及びＰ＃１（Ｃ）での生細胞の総数。
【図１２】図１２Ａ−図１２Ｃ。吸引脂肪組織サンプルの初期量に応じたＳＶＦ及びＡＤＳＣ収量：第３のバッチ。ＳＶＦ単離直後（Ａ）、Ｐ＃０（Ｂ）及びＰ＃１（Ｃ）での生細胞の総数。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、一部の態様によれば、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を用いた進行性ＭＳを含む多発性硬化症（ＭＳ）の治療法を提供する。
【００４７】
一部の実施形態では、ヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を、それを必要とする対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することを含む、一次進行型多発性硬化症を治療する方法が提供される。
【００４８】
本発明の発明者らは、疾患の転帰に対する脂肪組織由来間葉系幹細胞の効果の評価のために、ＭＯＧ誘導ＥＡＥモデルを利用した。ＭＯＧは、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経のミエリン化プロセスで重要と考えられる糖タンパク質である。ＭＯＧ３５−５５ペプチドによる免疫化は、一般にＣ５７ＢＬ／６マウスの慢性ＥＡＥの誘導に用いられる。ＭＯＧを用いてＥＡＥが誘導されたマウスの脳室（ＩＣＶ）にＡＤＳＣを注入した。マウスを様々な用量の幹細胞を用いて治療した。
【００４９】
本明細書で初めて開示される驚くべき所見により、臨床スコア、最大平均疾患スコア及び疾患進行を含む、慢性ＥＡＥに対するヒトＡＤＳＣの明らかな効果が示されている。
【００５０】
よって本発明は、進行型の多発性硬化症に罹患している対象へのヒト間葉系脂肪組織由来幹細胞の投与を含む治療方法及びレジメンを提供する。これらの治療は、幹細胞を用いた静脈内治療と比較して、多発性硬化症に対して優れた治療効果をもたらす。現在の治療は、様々な臨床スコアによって決定されるように、改善された長期の効果をもたらした。
【００５１】
現在、脂肪組織由来幹細胞の投与を含む多発性硬化症の治療のための方法及びレジメンは、効果的且つ安全であるとはまだ証明されておらず、市販の治療薬もない。このような治療法は、多くの患者、特に神経学的症状又は身体障害を伴う進行性疾患をもつ患者にとって有益であろう。具体的には、この治療は進行型の多発性硬化症の患者に有益であろう。
【００５２】
本明細書で用いられる「治療する」という用語は、一次進行型若しくは二次進行型の多発性硬化症の発症後の症状又は複数の症状の予防、抑制又は緩和を指す。特定の実施形態において、症状は、協調障害、歩行能力障害、平衡障害、脚の衰弱、脚の硬直、記憶障害、認知機能障害、嚥下困難、視覚障害、全身疲労、疼痛、膀胱機能障害、腸機能障害及びそれらの組合わせから成る群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００５３】
一部の特定の実施形態では、本発明に従って多発性硬化症を治療することは、疾患の進行を遅らせること、すなわち障害の進行を遅らせることを含む。
【００５４】
細胞が投与される「対象」は哺乳類であり、一般にヒトである。一部の実施形態に係る対象は、進行型の多発性硬化症に罹患しており、すなわち、進行型の多発性硬化症と診断されている。
【００５５】
本明細書で用いられる「多発性硬化症」という用語は、上記の症状の１つ以上を伴う中枢神経系の自己免疫疾患を指す。一部の実施形態では、進行性ＭＳは二次進行型ＭＳである。他の実施形態では、進行性ＭＳは一次進行型ＭＳである。追加の実施形態では、進行性ＭＳは進行性の再発性ＭＳである。
【００５６】
一部の実施形態によれば、ＡＤＳＣは１回投与される。一部の実施形態によれば、ＡＤＳＣは複数回、例えば２〜８ヶ月毎、３〜１２ヶ月毎、又はより低い頻度で投与される。
【００５７】
一部の実施形態によれば、ＡＤＳＣは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月毎に１回投与される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００５８】
脂肪組織由来幹細胞
【００５９】
本発明は、脂肪組織由来の間葉系幹細胞を利用する。本明細書で用いられる場合、「脂肪組織由来間葉系幹細胞」又は「脂肪組織由来幹細胞」という用語、「ＡＤＳＣ」又は「ｈＡＤＳＣ」（すなわちヒト脂肪組織由来幹細胞）という略語は、脂肪組織から回収された、プラスチック付着性の多能性細胞集団を指す。細胞集団は、細胞の少なくとも９５％によるＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０の陽性発現と、細胞の少なくとも９０％によるＣＤ１０５の陽性発現と、細胞の少なくとも９５％によるＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの陰性発現とによって特徴付けられる。
【００６０】
一部の実施形態では、細胞集団は、細胞の少なくとも９８％によるＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０の陽性発現と、細胞の少なくとも９０％によるＣＤ１０５の陽性発現と、細胞の少なくとも９８％によるＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの陰性発現とによって特徴付けられる。
【００６１】
細胞集団は更に、細胞の最大１０％〜２０％によるＣＤ３４の陽性発現によって特徴付けられる。一部の実施形態では、細胞集団は、細胞の最大５％によるＣＤ３４の陽性発現によって特徴付けられる。
【００６２】
一部の実施形態では、細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＣＤ９０に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である。
【００６３】
一部の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの９０〜１００％が、マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０に対して陽性である。追加の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの少なくとも９５％が、マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０に対して陽性である。更なる追加の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの少なくとも９８％が、マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０に対して陽性である。
【００６４】
一部の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの６５〜１００％がＣＤ１０５に対して陽性である。追加の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの８０〜１００％がＣＤ１０５に対して陽性である。更なる追加の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの９０〜１００％がＣＤ１０５に対して陽性である。更なる追加の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの８０〜９５％がＣＤ１０５に対して陽性である。
【００６５】
一部の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの０．１〜２０％がマーカーＣＤ３４を発現する。追加の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの０．１〜１０％がマーカーＣＤ３４を発現する。
【００６６】
他の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの１〜１０％がマーカーＣＤ３４に対して陽性である。他の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの１〜５％がマーカーＣＤ３４に対して陽性である。一部の実施形態によれば、細胞の少なくとも９０％、例えば細胞の少なくとも９５％が、マーカーＣＤ３４に対して陰性である。
【００６７】
一部の実施形態によれば、投与されるヒトＡＤＳＣの少なくとも９０％が、マーカーＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である。追加の実施形態によれば、投与されるヒトＡＤＳＣの少なくとも９５％が、マーカーＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である。更なる追加の実施形態によれば、投与されるヒトＡＤＳＣの少なくとも９８％が、マーカーＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である。
【００６８】
一部の実施形態によれば、注入されるヒトＡＤＳＣの少なくとも５０％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＣＤ９０に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である。追加の実施形態によれば、注入されるヒトＡＤＳＣの少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＣＤ９０に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性である。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００６９】
細胞表面マーカー発現の特徴付けは、当技術分野で既知の方法により、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、実行することができる。ＦＡＣＳのＦＡＣＳプロトコルは、例えば、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ６９９  ２０１１，Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｔｅｒｅｓａ  Ｓ．Ｈａｗｌｅｙ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｇ．Ｈａｗｌｅｙ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．でレビューされている。例示的な手順を以下に記載する。
【００７０】
多能性間質／幹細胞の供給源としての脂肪組織には、他の供給源に対していくつかの利点がある（Ｂａｅｒ  ＰＣ、Ｇｅｉｇｅｒ  Ｈ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔ  ２０１２；２０１２：８１２６９３）。例えば、皮下脂肪はヒトに遍在し、脂肪吸引法の吸引により大量に簡単に利用可能である。脂肪吸引法は、大量の組織吸引物をもたらす忍容性の高い手順である。吸引脂肪組織は通常、医療廃棄物として廃棄されるので、脂肪組織由来の間質／幹細胞（ＡＳＣ）単離の優れた出発材料として適格である。組織は、培養液中で単離及び増殖することができる多数の多能性細胞を含む。
【００７１】
一部の実施形態によれば、ＡＤＳＣはヒト皮下脂肪に由来する。特定の実施形態によれば、細胞は、脂肪吸引法の吸引によって得られたヒト皮下脂肪由来である。ＡＤＳＣは、腹部、腰、大腿部、腕、首、臀部など、体の様々な部位において脂肪吸引法の手順によって取得されてよい。本発明によれば、ＡＤＳＣを得るために、脂肪吸引法の任意の手順が用いられてよく、これには、当技術分野で既知であるように腹部形成術によるレーザー、超音波及び脂肪除去が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
脂肪組織は、脂肪組織由来幹細胞を単離するために処理される。調製方法は通常、組織をＰＢＳや生理食塩水などの緩衝液及び／又は増殖培地（通常、外部サイトカインや増殖因子などの添加物を伴わない）（例えばＤＭＥＭ、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）又はＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ）で洗浄するステップと、組織をコラゲナーゼなどの組織分散酵素で処理するステップ及び／又は例えばＴｕｌｉｐ  Ｎａｎｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（商標）などの装置を用いて組織を非酵素的機械的破砕にかけるステップと、を含む。サンプルの酵素消化は、ディスパーゼとコラゲナーゼの組合わせを用いて実行することもできる。リポソームは、一般に凝集しており、遠心分離により、幹細胞や、赤血球、内皮細胞及び線維芽細胞などの他の細胞を含む遊離間質細胞から分離することができる。適切な溶解バッファーを用いて、懸濁したペレットから赤血球を溶解することができ、残りの細胞を濾過又は遠心分離することができる。
【００７３】
本明細書に開示されるように、脂肪組織由来幹細胞を単離するための改善された方法は、更なる処理の前に脂肪組織を凍結及び解凍することを含む。有利なことに、解凍後、溶解バッファーを適用して赤血球を破壊する必要なく、組織を処理して幹細胞を単離することができる。標準的な溶解バッファーは、通常、ｐＨ７．３の塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３）及びＥＤＴＡの溶液である。このような緩衝液組成物は、赤血球の細胞の特定の特性と浸透圧ストレスに抵抗する能力が限られていることを活用して、これらの細胞を選択的に溶解する。
【００７４】
一部の実施形態に係る凍結は、以下のように実行される。吸引脂肪組織を凍結バッグに入れ、ＤＭＳＯを最終濃度１０％で添加する。凍結バッグを凍結キャニスターに入れ、サンプルを−８０℃で一晩（〜２４時間）保持する。次に、凍結したサンプルを気相液体窒素タンクに移す。保存期間中に安定性テストを実行することができる。
【００７５】
解凍では、一部の実施形態によれば、サンプルを取り出し、室温で数分間、通常５〜１０分間放置する。次に、サンプルを３７℃の水浴で数分間（通常は５〜１０分間）、又はサンプルの大部分が解凍されるまで、解凍する。次に、サンプルを３７℃で、細胞生存率を支持可能な懸濁培地（本明細書では、間葉系幹細胞に適した等張緩衝液又は培養液として定義される）、例えばＰＢＳなどの緩衝液で洗浄する。サンプルは通常２回洗浄する。
【００７６】
一部の実施形態では、プロセスは、少なくとも１回の濾過をおこなうことを含む。組織を更に分離しＳＶＦ分画の収集を容易にするために、濾過は、一部の実施形態では、１００ミクロンメッシュを通し、その後４０ミクロンメッシュを通して実行される。
【００７７】
ＳＶＦ分画の細胞集団内からＡＤＳＣを単離するために、通常、細胞培養容器への付着による（例えばプラスチック付着による）選択及び／又はビーズ／抗体による選択などのプロセスが適用される。任意に、細胞は細胞選別によって分離されるか、免疫組織化学的に分離されてよい。Ｂｕｎｎｅｌｌ他（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ．，４５（２）：１１５〜１２０は、ＡＤＳＣの単離のための方法を検討している。
【００７８】
培養容器への付着による選択は、通常、ＳＶＦ細胞を適切な培養液を用いて培養フラスコ（例えばプラスチック製フラスコ）に播種し、播種した細胞を一晩インキュベートし（一部の実施形態では、少なくとも１２時間、又は２４〜４８時間）、フラスコを洗浄して、非付着細胞と組織残屑を除去し、フラスコに新鮮な培養液を加えることによって、実施される。付着性細胞（ＡＤＳＣ）は、所望のレベルのコンフルエンシーまで培養されてよく、その後、それらを収集して保存するか、又は更なる継代まで継代培養してよい。
【００７９】
一部の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、（ａ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、（ｂ）吸引脂肪組織を解凍し、組織分散酵素を用いて、又は機械的破砕により分散させるステップと、（ｃ）ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングし、任意にペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で洗浄し、懸濁液を少なくとも１回の追加の遠心分離にかけるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で再懸濁し、プラスチック製フラスコでの一晩のインキュベーションにより、プラスチック付着性ｈＡＤＳＣを選択するステップと、（ｅ）任意に、プラスチック付着性選択の前に、少なくとも１回の濾過をおこなってｈＡＤＳＣを単離するステップと、（ｆ）任意に、ｈＡＤＳＣを少なくとも３継代にわたって培養するステップと、によってヒト皮下脂肪から得られたｈＡＤＳＣである。
【００８０】
一部の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、（ａ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、（ｂ）吸引脂肪組織を解凍し、コラゲナーゼで消化するステップと、（ｃ）ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングし、任意にペレットを緩衝液又は培養液で洗浄し、更なる遠心分離にかけるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたペレットを適切な培養液で再懸濁し、細胞培養容器への付着性によってｈＡＤＳＣを選択するステップと、によってヒト皮下脂肪から得られたｈＡＤＳＣである。
【００８１】
一部の実施形態では、ヒト皮下脂肪からｈＡＤＳＣを、それを必要とする対象への投与のために取得するための方法は、本質的に、
（ａ）吸引脂肪組織を凍結するステップと、
（ｂ）吸引脂肪組織を解凍し、組織分散酵素を用いて、又は機械的破砕により分散させるステップと、
（ｃ）ｈＡＤＳＣを含む細胞分画を遠心分離によってペレッティングし、任意にペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で洗浄し、懸濁液を少なくとも１回の追加の遠心分離にかけるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたペレットを、細胞生存率を支持可能な懸濁培地で再懸濁し、少なくとも１回濾過をおこなうステップと、
（ｅ）細胞培養容器への付着性によってｈＡＤＳＣを選択するステップと、
（ｆ）任意に、対象への投与の前にｈＡＤＳＣを少なくとも３継代にわたって培養するステップと、
から成る。
【００８２】
ＡＤＳＣを単離するための例示的な手順は、以下の実施例１に記載される。
【００８３】
一部の好適な実施形態では、ＡＤＳＣは、それを必要とする対象に提供される前に（及び／又は後で使用するために保存される前に）培養される。好ましくは、細胞はゼノフリー培地で培養される。一部の実施形態では、ＡＤＳＣは、対象への投与の前に約８０％〜１００％のコンフルエンシー、例えば約８０％のコンフルエンシーまで培養され、継代数３〜１０、好ましくは３〜５又は３〜４まで継代培養される。よって、一部の実施形態では、投与される細胞は３〜１０の継代にある。追加の実施形態では、投与される細胞の継代数は３〜５である。一部の実施形態では、ＡＤＳＣは継代数３まで継代培養される。一部の実施形態では、ＡＤＳＣは継代数４まで継代培養される。一部の実施形態では、ＡＤＳＣは継代数５まで継代培養される。
【００８４】
投与前に細胞はカウントされ、薬学的に許容される希釈剤／キャリアで注入のために調製される。通常、細胞は対象に投与される前に濃縮される。濃度は通常、１．５×１０４／ｍｌ〜１００×１０６／ｍｌの範囲である。
【００８５】
本発明の方法に係る単回投与のための幹細胞組成物は、一部の実施形態では、１０５〜３×１０８個のヒトＡＤＳＣを含む。一部の実施形態によれば、組成物は１０５〜１０８個のヒトＡＤＳＣを含む。追加の実施形態によれば、１０６〜１０７個のヒトＡＤＳＣが１回の投与で注入される。更なる追加の実施形態によれば、２００×１０６〜３００×１０６個のヒトＡＤＳＣが１回の投与で注入される。更なる追加の実施形態によれば、１０７〜２×１０８個のヒトＡＤＳＣが１回の投与で注入される。
【００８６】
一部の実施形態によれば、本発明のＡＤＳＣ組成物は全身投与による使用を目的とする。通常、投与は対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に対しておこなわれる。このような投与は、血液脳関門の迂回を目的とすることがある。更に他の実施形態によれば、ＡＤＳＣは脳の特定の領域に直接投与される。
【００８７】
一部の実施形態によれば、組成物はＣＮＳに投与され、例えば脊髄内投与によって投与される。一部の実施形態によれば、組成物は髄腔内に投与される。他の実施形態によれば、組成物は室内又は脳室内（ＩＣＶ）経路によって投与され、つまり脳室に投与される。
【００８８】
脳室内薬物送達は、槽（Ｃ１〜２椎骨）及び頭蓋内脳室の脳脊髄液内での薬物の送達である。薬物を直接投与することにより、必要な薬物が少なくなり、経口投与される薬物よりも副作用が少なくなる。薬剤は通常、当技術分野で知られているように、ポンプに接続された埋め込みカテーテルを通して送達される。ポンプはプログラム可能であり、埋込み型又は外部型のいずれかであることがある。
【００８９】
髄腔内投与は、薬物が脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、脊柱管、より具体的にはくも膜下腔への注入による薬物の投与経路であり、脊椎麻酔、化学療法又は疼痛管理用途に有用である。また、この経路は、特定の感染症、特に神経外科手術後の感染症と闘う薬物を導入するためにも用いられる。薬物は、血液脳関門を避けるために、この方法で投与される必要がある。髄腔内及び硬膜外の薬物送達は、薬物投与の脊髄内経路を含む。各経路は、薬物を脳脊髄液（ＣＳＦ）に送達する。髄腔内送達は、脊柱の髄腔内空間内のＣＳＦへの薬物の直接注入を伴うが、硬膜外腔に注入された薬物は、ＣＳＦに到達するために硬膜を通過する必要がある。そのようなものとして、硬膜外投与された薬物は全身循環に達する可能性があるが、髄腔内投与された薬物は、脊柱及び脳室を循環するＣＳＦ内に限局される。
【００９０】
本発明には、脂肪組織由来幹細胞と任意に少なくとも１つの他の活性薬剤との併用療法も包含される。
【００９１】
本発明の範囲内の活性薬剤は、インターフェロン（例えばｐｅｇ化又は非ペグ化α‐インターフェロン）又はβ‐インターフェロン（例えばインターフェロンβ‐１ａやインターフェロンβ‐１ｂ）又はτ‐インターフェロン；任意に抗増殖／抗腫瘍活性を伴う免疫抑制剤（例えばミトキサントロン、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロホスファミド）又はステロイド（例えばメチルプレドニゾロン、プレドニゾンやデキサメタゾン）又はステロイド分泌剤（例えばＡＣＴＨ）；アデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えばクラドリビン）；様々なＴ細胞表面マーカーに対するＩＶ免疫グロブリンＧ（例えばＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｍａｙ  ５０（５）：１２７３−８１に開示のもの）モノクローナル抗体（例えばナタリズマブ（ＡＮＴＥＧＲＥＮ（登録商標））やアレムツズマブ）；ＴＨ２促進サイトカイン（例えばＩＬ−４，ＩＬ−１０）、又はＴＨ１促進サイトカインの発現を抑制する化合物（例えばホスホジエステラーゼ阻害剤（例えばペントキシフィリン））；バクロフェン、ジアゼパム、ピラセタム、ダントロレン、ラモトリジン、リフルゾール、チザニジン、クロニジン、ベータ遮断薬、シプロヘプタジン、オルフェナドリン又はカンナビノイドを含む鎮痙剤；ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体拮抗薬（例えば２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン、［１，２，３，４、−テトラヒドロ−７−モルホリン−イル−２，３−ジオキソ−６−（トリフルオロメチル）キノキサリン−ｉ−イル］メチルホスホネート、１−（４−アミノフェニル）−４−メチル−７，８−メチレン‐ジオキシ−５Ｈ−２，３−ベンゾジアゼピン、又は（−）１−（４−アミノフェニル）−４−メチル−７，８−メチレン−ジオキシ−４，５−ジヒドロ−３−メチルカルバモイル−２，３−ベンゾジアゼピン；ＶＣＡＭ−１発現の阻害剤又はそのリガンドの拮抗薬（例えばα４β１インテグリンＶＬＡ−４及び／又はα−４−β−７インテグリの拮抗薬、例えばナタリズマブ（ＡＮＴＥＧＲＥＮ（登録商標））；抗マクロファージ遊走阻止因子（Ａｎｔｉ−ＭＩＦ）；ｘｉｉ）カテプシンＳ阻害剤；ｘｉｉｉ）ｍＴｏｒ阻害剤を含むが、これらに限定されない。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。現在好ましい他の活性薬剤のひとつは、免疫抑制剤のクラスに属するＦＴＹ７２０（２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１、３−ジオール；フィンゴリモド）である。
【００９２】
本発明は、ＡＤＳＣと、少なくとも１つの追加の薬物、好ましくは免疫抑制剤、特にフィンゴリモドとの組合わせを包含する。
【００９３】
本発明はまた、ヒトＡＤＳＣの多発性硬化症の治療における使用を、任意に多発性硬化症の治療に適した追加の薬物と共に提供する。
【００９４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより完全に説明するために提示される。しかしながら、それらは決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される原理の多くの変形及び変更を容易に考案することができる。
【００９５】
実施例
【００９６】
実施例１：ヒト脂肪組織由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）がＣ５７ＢＬ／６マウスのＭＯＧ誘導慢性ＥＡＥに及ぼす影響
【００９７】
材料及び方法
【００９８】
ＡＤＳＣの単離：
【００９９】
ヒトの健康なドナーから得られた吸引脂肪組織を−８０℃で凍結し、その後気相液体窒素で（１週間以上）凍結した。次に、吸引脂肪組織を解凍し、３７℃において等量のＰＢＳで２回洗浄した。次に吸引脂肪組織を、３７℃で３５分間振盪しながら、コラゲナーゼ（ＮＢ４、Ｓｅｒｖａ）で消化した。等量のＤＭＥＭを追加し、サンプルをＲＴで１０分間、３００〜５００ｇで１回遠沈した。沈殿した分画をＤＭＥＭで洗浄し、再度遠沈し、赤血球溶解バッファーを適用せずに、ペレットを培養液（ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｔｙｉ）で再懸濁した。培養液の量は、初期吸引脂肪組織の１５０ｍｌごとに５０ｍｌとして計算した。次に、サンプルを１００μｍフィルターで濾過し、続いて５ｍｌの培地を追加し、ＲＴで１０分間、５００ｇで遠心分離した。この手順を、４０μｍフィルターを用いて繰り返し、細胞を計数した。結果として得られた細胞を、間質血管分画（ＳＶＦ）と呼ぶ。
【０１００】
細胞培養：
【０１０１】
ＳＶＦ分画を、コーティングなしで７５ｃｍ２あたり約２×１０６細胞の密度で播き、一晩インキュベートしてプラスチック付着細胞（ＡＤＳＣ）を選択した。翌日、フラスコを洗浄して非付着細胞及び組織残屑を除去し、新鮮な培地を加え、細胞を８０〜１００％コンフルエントまで増殖させ、トリプシン処理して継代３〜５まで継代培養した。
【０１０２】
次に細胞を収集し、マーカーＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ３４について分析した。細胞は使用するまで液体窒素で凍結保存した。使用の際は、凍結細胞を解凍し、５０００細胞／ｃｍ２の濃度で播き、一晩インキュベートした。
【０１０３】
細胞のＩＣＶ注入の前に、細胞をトリプシン処理し、カウントし、以下の表２に詳述される選択された濃度で注入の準備をおこない、３０分を超えない期間、使用まで氷上で保管した。ＩＣＶ注入は定位システムを用いて実施し、マウスの脳を傷付けないように注意を払った。
【０１０４】
動物：全ての動物実験は、地元の倫理委員会によって承認された。７〜９週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、同様の平均体重の対照群又は治療群に無作為に分けた。動物は実験を通して自由に食物と水を与えられた。
【０１０５】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘導：ＥＡＥを誘導するために、修正完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、米国）でのミエリン・オリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）３５−５５（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｃｏ．Ｌｔｄ、上海、中国）のエマルジョンを、次のように調製した。熱殺菌された結核菌株Ｈ３７ＲＡ（Ｓｉｇｍａ）を、最終濃度４ｍｇ／ｍＬに達するようにＣＦＡに添加した。その後、２ｍｇ／ｍＬのＭＯＧ３５−５５を等量の修飾ＣＦＡで乳化した。このエマルジョンをマウスの剃毛された背中の１ヶ所に皮下（ＳＣ）注射し、続いて、０日目とＭＯＧ免疫化の４８時間後にＰＢＳに溶かした百日咳菌毒素（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内注射することで、ＥＡＥを誘発した。
【０１０６】
測定：
【０１０７】
体重は、０日目から２９日目まで毎日測定した。ＥＡＥは、免疫後０日目から２９日目までの１日１回のマウスの臨床スコアリングによって評価した（表１）。死亡した動物（発生した場合）には臨床スコア５を与え、動物の死亡前の最後の体重測定値を最終体重として記録した。
【０１０８】
【表１】
2020519645.tif 000002
【０１０９】
以下の計算は、臨床スコアの生データから導出された。
【０１１０】
平均最大スコア：
【０１１１】
指示された分析日までの特定群の各マウスについて記録された最高スコアの平均である。
【０１１２】
平均疾患期間：
【０１１３】
（分析の日−各マウスの疾患発症日）の合計／（群ごとのマウスの数）
【０１１４】
平均発症日：
【０１１５】
各マウスの疾患発症日の合計／群ごとのマウスの数
【０１１６】
臨床スコアの曲線下面積（ＡＵＣ）：
【０１１７】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて計算され、疾病負荷を表す。
【０１１８】
実験計画：
【０１１９】
ＥＡＥモデルの実験計画の詳細を表２に示す（各群ｎ＝１０）。
【０１２０】
【表２】
2020519645.tif 000003
【０１２１】
統計分析：各データセットを、単一因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析し、その後、不等分散を想定した２標本両側スチューデントｔ検定をおこなった（ｎ＝１０／群、＋／−標準誤差）。
【０１２２】
結果
【０１２３】
被験物質の初回注入から２８日まで計算された試験の結果を、表３と図１〜６に記載する。
【０１２４】
【表３】
2020519645.tif 000004
【０１２５】
【表４】
2020519645.tif 000005
【０１２６】
ＥＡＥ  ＭＯＧモデルにおけるＡＤＳＣのＩＣＶ移植では、研究した３つの用量全てで疾患の症状の出現率の低下が示された（図１）。最も効果的な用量は２×１０５細胞／動物であり、これは疾患の重症度の有意な低下を示し、平均臨床スコアは、溶媒群の２．７５±０．２５と比較して、２±０．１１でプラトーに達した（図２）。マウスあたり１０万（１×１０５）個の細胞では、疾患の進行の変化を誘発するのに十分ではないと思われ、動物の挙動は溶媒対照群と同様であった。図３に見られるように、最高用量（４×１０５細胞／動物）は、症状の軽減には効果的であるが、中用量の２×１０５細胞／動物よりも効果が低い。これはおそらく、マウスの小さなＩＣＶ空間において細胞の密度が高いためである。
【０１２７】
動物の体重の分析により、動物の臨床スコアの分析で認められた所見が確認された。細胞の２つの高用量（２×１０５細胞／動物及び４×１０５細胞／動物）では、結果として得られる平均体重が高く、これは実験全体で保存された（図４）。
【０１２８】
免疫化後２８日目の細胞用量に応じて計算された平均臨床スコアの曲線下面積（ＡＵＣ）は、溶媒及び１×１０５ＡＤＳＣと比較して、２×１０５ＡＤＳＣ及び４×１０５ＡＤＳＣ動物グループで有意に低かった（図５）。更に、免疫化後２８日目の２×１０５ＡＤＳＣ群の平均最大疾患スコアは、１×１０５ＡＤＳＣ及び対照群のそれよりも有意に低かった（図６）。
【０１２９】
実験データにより、マウスあたり２×１０５個の細胞で最大効果を発揮する、ＡＤＳＣのＩＣＶ移植の明確な利点が示される。このＡＤＳＣ投与は、ＥＡＥ症状の減弱に長期的な影響を与え、これにより疾病負荷が大幅に減少した。
【０１３０】
実施例２：ＡＤＳＣの細胞表面マーカーの分析
【０１３１】
表４〜１２は、上記の実施例１で説明したように調製されたＡＤＳＣの９つのサンプルの、１〜５継代後のＦＡＣＳ分析をまとめたものである。表１３〜１４及び図７は、平均及び標準偏差（“ＳｔＤｅｖ”）の値を示す。表及び図から分かるように、マーカーはＰ３の後に安定化している。継代数Ｐ３〜Ｐ４は、せいぜい約１４回の集団倍加に相当する。
【０１３２】
【表５】
2020519645.tif 000006
【０１３３】
【表６】
2020519645.tif 000007
【０１３４】
【表７】
2020519645.tif 000008
【０１３５】
【表８】
2020519645.tif 000009
【０１３６】
【表９】
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【０１３７】
【表１０】
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【０１３８】
【表１１】
2020519645.tif 000012
【０１３９】
【表１２】
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【０１４０】
【表１３】
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【０１４１】
【表１４】
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【０１４２】
【表１５】
2020519645.tif 000016
【０１４３】
実施例３：赤血球溶解ありと赤血球溶解なしのＳＶＦ単離
【０１４４】
研究計画
【０１４５】
２つの１５０ｍｌ凍結保存吸引脂肪組織サンプルを、気相窒素に保存された２つの異なるバッチから採取した（合計４つの吸引脂肪組織サンプル）。以下に詳述するように、組織サンプルを解凍し、各サンプルからＳＶＦを単離した。赤血球溶解バッファーのステップの前に、各組織サンプルを同じ方法で処理した。その時点で、２つのサンプル（各バッチから１つ）にはＡＣＫ溶解バッファー（Ｌｏｎｚａ）を用いて赤血球溶解ステップを実施し（“Ａ”と表記されたサンプル）、一方その他の２つのサンプル（各バッチから１つ）にはこのステップを実施しなかった（“Ｂ”と表記されたサンプル）。溶解ステップの後、全てのサンプルについて同じ方法でＳＶＦ単離プロセスを進めた。
【０１４６】
ＳＶＦ単離に続いて細胞をカウントし、以下のパラメータを測定した。
・生細胞数／ｍｌ
・死細胞数／ｍｌ
・サンプルごとの生細胞の総数
・生存率
・平均細胞サイズ（μｍ）
【０１４７】
次に、各サンプルの細胞を播種し増殖させ、継代０（Ｐ０）とした。各バッチについて、サンプルのうち１つが７０〜８０％のコンフルエンシーに達したときに、全てのフラスコを回収した。Ｐ０において以下のパラメータを測定した。
・生細胞数／ｍｌ
・死細胞数／ｍｌ
・サンプルごとの生細胞の総数
・生存率
・平均細胞サイズ（μｍ）
・ＭＳＣ形態
・免疫表現型（ＦＡＣＳ分析：ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４５及びＣＤ３１）
・回収までの時間（日）
【０１４８】
手順
【０１４９】
吸引脂肪組織の解凍とＳＶＦ単離
【０１５０】
２つの異なるバッチ（バッチＥＦ１３７及びバッチＥＦ１４４として識別される）からの２つの１５０ｍｌ吸引脂肪組織サンプルを解凍した（合計４つの吸引脂肪組織サンプル）。解凍した各組織サンプルを５００ｍｌの遠心管に移した。各バッチについて、１つのチューブに“Ａ”とラベリングし、もう１つのチューブに“Ｂ”とラベリングした。各チューブに１５０ｍｌコラゲナーゼ溶液（１４２ｍｌ  ＰＢＳ、７．５ｍｌの５％コラゲナーゼストック溶液、０．６ｍｌ  ＣａＣｌ２  １Ｍ）を加え、チューブを振盪しながら（１３０ｒｐｍ）水浴において３７℃で約３０分間インキュベートした。次に、各チューブに２００ｍｌのＤＭＥＭ低グルコース（ＤＭＥＭ  ＬＧ、Ｇｉｂｃｏ）を室温で加え、チューブを５００×ｇ、２１±２℃で１０分間遠心分離にかけた。遠心分離の終わりに上清の大部分を除去し、約５ｍｌを残した。各チューブのペレットを残りの上清に再懸濁し、５０ｍｌコニカルチューブに移した。次に、各５０ｍｌチューブに４５ｍｌのＤＭＥＭ  ＬＧを加え、チューブを５００×ｇ、２１±２℃で１０分間遠心分離にかけた。この２回目の遠心分離の後、上清を除去し、“Ｂ”と指定されたチューブのペレットを５ｍｌのＤＭＥＭ  ＬＧに再懸濁した。
【０１５１】
“Ａ”と指定されたチューブでは、ペレットを１０ｍｌのＡＣＫ赤血球溶解バッファーに再懸濁し、１５〜２５℃で約１０分間インキュベートした。次に、２０ｍｌのＰＢＳ（１５〜２５℃）をチューブに加え、チューブを５００×ｇ、２１±２℃で１０分間遠心分離にかけた。遠心分離後、上清を除去し、ペレットを５ｍｌのＤＭＥＭ  ＬＧに再懸濁した。
【０１５２】
次に、Ａと指定されたチューブとＢと指定されたチューブの両方に対し、同様の方法で２つの濾過ステップをおこなった。１００μｍのメッシュフィルターを新しいラベル付き５０ｍｌチューブ（“Ａ”又は“Ｂ”とラベリングした）の上部に設置し、懸濁液を濾過した。各フィルターを追加の５ｍｌのＤＭＥＭ  ＬＧで洗浄した後、濾液を５００×ｇ、２１±２℃で１０分間遠心分離した。ペレットを５ｍｌのＤＭＥＭ  ＬＧに再懸濁した。次に、４０μｍのフィルターを新しいラベル付き５０ｍｌチューブ（“Ａ”又は“Ｂ”とラベリングした）のもう一組の上部に設置し、懸濁液を濾過した。各フィルターを追加の５ｍｌのＤＭＥＭ  ＬＧで洗浄した後、濾液を５００×ｇ、２１±２℃で１０分間遠心分離した。各ペレットを５ｍｌのＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培養培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に再懸濁した。
【０１５３】
ＳＶＦ細胞計数及びＳＶＦ播種
【０１５４】
ＮＣ−２００  Ｎｕｃｌｅｏ−Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて、各チューブの細胞数をカウントした。以下のパラメータ、すなわち生細胞／ｍｌ、死細胞／ｍｌ、生存率（％）、平均細胞サイズ（μｍ）及び生細胞の総数を記録した。各チューブを２回計数し、２つの計数の平均を計算した。
【０１５５】
次に、各チューブから２．６×１０６細胞を７５ｃｍ２のフラスコに二重に播種し、１５ｍｌのＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ増殖培地を各フラスコに加えた。フラスコを一晩インキュベートして、プラスチック付着細胞（ＡＤＳＣ）を選別した。翌日、フラスコを洗浄して非付着細胞と組織残屑を除去し、新鮮な培地を加えて細胞を増殖させた。群のうち１つが約８０％のコンフルエンスに達したときに、細胞を回収した。
【０１５６】
Ｐ０の回収
【０１５７】
細胞を回収し計数した。以下のパラメータ、すなわち生細胞／ｍｌ、死細胞／ｍｌ、生存率（％）、平均細胞サイズ（μｍ）、生細胞の総数及び播種から回収までの時間（日）を記録した。各チューブを２回計数し、２つの計数の平均を計算した。
【０１５８】
免疫表現型−Ｐ０
【０１５９】
各チューブからの細胞を、以下のマーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ３１及び対照としてのＩｇＧ１についてＦＡＣＳによって分析した。
【０１６０】
結果
【０１６１】
以下の表１５及び表１７と図８Ａ〜８Ｂ、９Ａ〜９Ｂは、ＳＶＦ単離直後及び継代０（Ｐ０）での細胞計数データ（各サンプルの２つの計数の平均）を示す。標準偏差（ＳＤ）データを表１６、１８にまとめた。
【０１６２】
【表１６】
2020519645.tif 000017
【０１６３】
【表１７】
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【０１６４】
【表１８】
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【０１６５】
【表１９】
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【０１６６】
表及び図から分かるように、更に良好な一部のパラメータについて、細胞計数データは、赤血球溶解を実施しなかったサンプル（“Ｂ”と指定されたサンプル）と溶解ステップを実施したサンプル（“Ａ”と指定されたサンプル）で本質的に同じであり、溶解テップの省略は得られた細胞の増殖に悪影響を及ぼさないことが示された。
【０１６７】
有利なことに、Ｐ０では、赤血球溶解をおこなわなかったサンプルは、溶解ステップをおこなったサンプルよりも速く７０〜８０％のコンフルエンシーに達した。
【０１６８】
表１９は、継代０での免疫表現型データ（マーカー発現）をまとめたものである。
【０１６９】
表から分かるように、マーカー発現は、赤血球溶解を実施しなかったサンプルと溶解ステップを実施したサンプルで本質的に同じであり、このステップの省略は得られた細胞の表現型に悪影響を及ぼさないことが示された。
【０１７０】
【表２０】
2020519645.tif 000021
【０１７１】
結論として、赤血球溶解バッファーが適用されなくても、得られるＡＤＳＣサンプルは、赤血球溶解を採用する標準的な方法に従って単離されたサンプルと同じくらい効果的に増殖することが見出された。
【０１７２】
実施例４：間質血管分画（ＳＶＦ）及び脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の収量に対する初期組織量の影響
【０１７３】
吸引脂肪組織サンプルから得ることのできるＡＤＳＣの量は、とりわけ、吸引脂肪組織サンプルの初期量に依存する。本明細書に記載の多発性硬化症の治療などの治療用途では、少なくとも１０５個のＡＤＳＣ、又は更には少なくとも１０６個のＡＤＳＣを得ることが提案される。
【０１７４】
以下の研究は、本発明に係る多発性硬化症の治療などの治療目的に十分な量のＡＤＳＣを得るために用いることのできる脂肪組織（吸引脂肪組織）の最小量を定め、処理に利用できる量が１００ｍｌ未満である場合に収量を向上させ得る、生産プロセスへの可能な変更を評価することを目的とした。
【０１７５】
研究計画
【０１７６】
ヒト吸引脂肪組織の３つの異なるバッチを得た。各バッチから、５、１０、２０、５０、１５０ｍｌのサンプルをＰＢＳで洗浄し、凍結バッグに入れた。ＤＭＳＯを最終濃度１０％で添加し、サンプルを使用するまで液体窒素で保存した。
【０１７７】
ＳＶＦ作製
【０１７８】
上記の実施例１及び３に記載されているように、全てのサンプルを解凍し、赤血球溶解を適用することなく処理してＳＶＦを得た。５、１０、２０及び５０ｍｌのサンプルは濾過を適用せずに処理した（すなわち、赤血球溶解の省略に加えて、１００μｍフィルターとその後の４０μｍフィルターによる濾過のステップを省略した）。
【０１７９】
細胞培養
【０１８０】
２０、５０及び１５０ｍｌのサンプルから得られたＳＶＦ分画を３５×１０３／ｃｍ２の濃度で播種した。５ｍｌ及び１０ｍｌのサンプルから得られたＳＶＦ分画を約４×１０３細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。プラスチック付着細胞（ＡＤＳＣ）を選別するために一晩インキュベートした後、フラスコを洗浄し、新鮮な培地を加え、細胞をＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ培地で約８０％コンフルエンシーまで増殖させた。この段階で、細胞継代をＰ＃０と定めた。次に細胞をトリプシン処理し、回収し、５×１０３細胞／ｃｍ２の濃度で新しいフラスコに播種し、再び約８０％コンフルエンシーまで増殖させてＰ＃１と定められる次の継代とした。次に細胞をトリプシン処理し、回収し、使用するまで１ｍｌの凍結チューブで約５×１０６／ｍｌの濃度で凍結保存した。
【０１８１】
更に、５０ｍｌサンプルの処理中に、組織消化と遠心分離の後に多数の組織凝集体が観察されたので、個別に処理した場合に凝集体も間葉系幹細胞を生成できるか否かを検証することを決めた。凝集体を収集し、別のフラスコに播種し、一晩インキュベートしてプラスチック付着細胞を選別した。非付着細胞を洗浄し、残りのサンプルを他のサンプルと同じ方法で更に処理した。
【０１８２】
分析：
【０１８３】
細胞を解凍し、解凍直後に細胞数、細胞生存率及び細胞直径を決定した。ＦＡＣＳ分析では、分析前に細胞を一晩回復させた（１７５ｃｍ２のフラスコに１つの凍結バイアルを播種）。
【０１８４】
結果
【０１８５】
以下の表２０〜２２及び図１０Ａ〜Ｃ、１１Ａ〜Ｃ、１２Ａ〜Ｃは、ＳＶＦ単離直後と継代０及び１（Ｐ＃０、Ｐ＃１）での各サンプルの細胞計数データを示す。
【０１８６】
【表２１】
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【０１８７】
【表２２】
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【０１８８】
【表２３】
2020519645.tif 000024
【０１８９】
３つの異なるバッチ間でＳＶＦ収量に大きなばらつきが見られた。更に、ＳＶＦ分画の細胞数は、Ｐ＃０で得られた細胞数と必ずしも相関しなかった。ただし、選択したＭＳＣ集団が回収されると（Ｐ＃０）、Ｐ＃１への更なる増大はＰ＃０でのＭＳＣ細胞の数と相関し、Ｐ＃１では所与のバッチの細胞数はＰ＃０での該バッチの細胞数と相関した。
【０１９０】
上記のように、５０ｍｌサンプルは濾過されず、大きな凝集体が観察された。凝集体を収集し、（通常行われるように廃棄するのではなく）個別に播種した。凝集体は多数のＭＳＣを産生したので、収量を上げるために凝集体を保持し培養することが有利であると結論付けられた。
【０１９１】
ＦＡＣＳ分析：
【０１９２】
３つのバッチのＰ＃１サンプルを回収し、約５×１０６細胞／ｍｌの濃度で凍結保存した。次に細胞を解凍し、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅで一晩播種し、回収してＦＡＣＳで分析した。分析されたマーカーを表２３に挙げる。分析の結果を表２４〜２７に示す。
【０１９３】
【表２４】
2020519645.tif 000025
【０１９４】
【表２５】
2020519645.tif 000026
【０１９５】
【表２６】
2020519645.tif 000027
【０１９６】
【表２７】
2020519645.tif 000028
【０１９７】
【表２８】
2020519645.tif 000029
【０１９８】
陽性マーカーは、３つの被験バッチ（陽性ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ４４）の全てから得られた処理量の全てにおいて、（ＩＳＣＴガイドラインで定義されている）間葉系幹細胞の割合が高いことを示した。
【０１９９】
陰性マーカーは、脂肪組織由来間葉系幹細胞で通常見られるものよりも高い割合を示し、造血前駆細胞の不純物としての存在を示した。別個の実験において、細胞を５継代にわたって培養し、陰性マーカーは継代に応じて減少することが実証された。
【０２００】
フィルター処理されていないサンプルでは、組織凝集体はより多くの造血前駆細胞を捕捉する可能性があり、ＣＤ３４のより高い発現と、より高いＣＤ４５及びＣＤ１９の発現細胞をもたらす。この仮定は、最高のＣＤ３４発現を示した５０ｍｌの凝集体培養によって支持される。
【０２０１】
結論として、大きなばらつきにも関わらず、結果は、非常に低い初期組織量からも、本明細書に開示されるＭＳの治療などの治療用途に十分な量のＡＤＳＣが得られることを示している。低い初期容量を利用するために、細胞の損失を減らし、十分な純度のＡＤＳＣ集団を得るために、濾過の省略や少なくとも４継代にわたる培養など、生産プロセスへの特定の適応を適用することができる。
【０２０２】
可能であれば、少なくとも５０ｍｌの初期組織量を用いることが提案される。更に、とりわけ、早い継代でのＡＤＳＣの純度を向上させるために、一連のフィルターを介した濾過を含む（しかし本明細書に開示されるように、赤血球溶解を欠く）生産プロセスを適用することが提案される。
【０２０３】
ただし、患者から収集された吸引脂肪組織の量が５０ｍｌ未満であり、それ以上収集できない場合は、適合プロセスを適用することができる。
【０２０４】
本発明を特に説明してきたが、当業者であれば、多くの変形及び修正が可能であることを理解するであろう。したがって、本発明は、特に記載された実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、本発明の範囲及び概念は、以下の特許請求の範囲を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【図１】
2020519645.tif 000030
【図２】
2020519645.tif 000031
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020519645.tif 000040
【図１２】
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【国際調査報告】
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