(57)【要約】本発明は、細胞免疫療法の分野、およびより詳細には新世代のキメラ抗原受容体 (CAR) に関する。これらの新たなCARは主に、発現されてプロテアーゼによって活性化され得かつプロテアーゼ阻害剤の添加によりスイッチオフされ得るキメラポリペプチド前駆体の形態で、細胞内で発現される。そのようなCARは、プロテアーゼによってひとたび活性化されると、免疫細胞の表面に到達して特異的抗原と結合する。より具体的には、細胞表面におけるこれらCARの提示は、プロテアーゼドメインおよび／または分解ドメイン（例えば、デグロン）をそれらのポリペプチド構造中に含めることによって制御可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドを含むキメラポリペプチドであって、第1ポリペプチドがキメラ抗原受容体 (CAR) をコードし、第2ポリペプチドが、第1ポリペプチドに対する切断活性を有するプロテアーゼを含む、キメラポリペプチド。
【請求項２】
プロテアーゼ活性が、前記キメラポリペプチドが産生される免疫細胞の表面におけるCARポリペプチドの提示を妨げる効果を有する（スイッチオフ）、請求項1記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
前記プロテアーゼ活性がプロテアーゼ阻害剤によって阻害される（スイッチオン）、請求項2記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
プロテアーゼ活性が、第2ポリペプチドの切除を可能にして第1ポリペプチドを放出させ、機能的なCARを形成する（スイッチオン）、請求項1記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
前記プロテアーゼ活性がプロテアーゼ阻害剤によって阻害される（スイッチオフ）、請求項4記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
前記プロテアーゼおよび前記プロテアーゼ阻害剤が表2のリストより選択される、請求項3または5記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
前記プロテアーゼ阻害剤が、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、およびシルプレビルなどの小分子である、請求項3または5記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
前記プロテアーゼが、非構造タンパク質3 (NS3)プロテアーゼと同一性を有する、請求項7記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
前記キメラポリペプチドの細胞内分解を強化するデグロンポリペプチド配列をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
デグロンがSEQ ID NO.32、38、41、または43を含む、請求項9記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
デグロンが第2ポリペプチドの配列中に含まれる、請求項9記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
第1ポリペプチドが、モノクローナル抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメインに連結された膜貫通ドメインを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
前記膜貫通ドメインがCD8α膜貫通ドメインに由来する、請求項1〜12のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
第1ポリペプチドが、CD3ζシグナリングドメインを含む細胞質ドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
第1ポリペプチドが、CD8αヒンジ、IgG1ヒンジ、またはFcγRIIIαヒンジなどのヒンジをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６】
第1ポリペプチドが、単鎖CARでまたは多鎖CARの膜貫通サブユニットで構成される、請求項1〜15のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
CARが、CD19、CD22、CD33、CD38、CD123、CS1、CLL1、ROR1、OGD2、BCMA、HSP70、およびEGFRvIIIより選択される抗原を標的化する、請求項1〜16のいずれか一項記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか一項記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項18記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２０】
それぞれが第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列のセットであって、第1ポリペプチドがキメラ抗原受容体 (CAR) をコードし、第2ポリペプチドがプロテアーゼをコードし、該プロテアーゼが第1ポリペプチドに対する切断活性を有する、ポリヌクレオチド配列のセット。
【請求項２１】
前記配列が同じポリヌクレオチド上に担持される、請求項20記載のポリヌクレオチド配列のセット。
【請求項２２】
前記配列が請求項1〜17記載のキメラポリペプチドをコードする、請求項21記載のポリヌクレオチド配列のセット。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチド配列が免疫細胞に同時トランスフェクトされる、請求項20〜22のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列のセット。
【請求項２４】
請求項20〜23のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列のセットで形質転換された、操作された免疫細胞。
【請求項２５】
エフェクターポリペプチド、プロテアーゼドメイン、およびデグロンを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された、操作された免疫細胞。
【請求項２６】
請求項18記載のポリヌクレオチドで形質転換された、操作された免疫細胞。
【請求項２７】
前記免疫細胞が初代細胞である、請求項24〜26のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項２８】
前記細胞がT細胞またはNK細胞である、請求項24〜27のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項２９】
エフェクター免疫細胞においてTCRの発現が低減または抑制される、請求項24〜28のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３０】
CARが、TCR遺伝子座において導入された外因性コード配列によってコードされる、請求項24〜29のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３１】
前記免疫細胞において、少なくとも1つのMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現が抑制される、請求項24〜30のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３２】
前記免疫細胞がドナーまたは患者から提供されたものである、請求項24〜31のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３３】
がんの処置において使用するための、請求項24〜32のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項３４】
少なくとも以下の段階を含む、エフェクター細胞内で、膜貫通受容体に関連付けられた機能を不活性化（スイッチオフ）するための方法：
‐エフェクター細胞を提供する段階、
‐受容体ポリペプチド、プロテアーゼ、およびデグロンを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列のセットを、エフェクター細胞内に導入する段階；
‐プロテアーゼ活性がデグロンを除去しかつ該受容体ポリペプチドが細胞の表面において提示されるように、該キメラポリペプチドを該細胞内で発現させる段階；
‐デグロンがもはや除去されないようにおよび発現された該キメラポリペプチドがプロテアソームによって分解されるように、該プロテアーゼ活性を阻害するプロテアーゼ阻害剤を細胞の環境内に導入する段階であって、それにより該エフェクター細胞内で膜貫通受容体に関連づけられた機能をスイッチオフする、段階。
【請求項３５】
前記キメラポリペプチドが請求項9記載のものである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも以下の段階を含む、エフェクター細胞内で膜貫通受容体に関連づけられた機能を活性化（スイッチオン）するための方法：
‐エフェクター細胞を提供する段階、
‐(i) 膜貫通受容体ポリペプチドと (ii) 該膜貫通受容体ポリペプチドに対して向けられたプロテアーゼドメインとをコードするポリヌクレオチド配列のセットまたは特有のポリヌクレオチドを、該エフェクター細胞内に導入する段階、
‐該受容体ポリペプチド機能を不活性化するプロテアーゼ活性を有する該ポリペプチドを、該エフェクター細胞内で発現させる段階、
‐該プロテアーゼ活性を阻害するためにおよび膜貫通受容体が細胞表面において提示されることを可能にするために、プロテアーゼ阻害剤を免疫細胞の環境内に導入する段階であって、それにより該エフェクター細胞内で該受容体の機能を活性化する、段階。
【請求項３７】
(i) 膜貫通受容体ポリペプチドと (ii) 該膜貫通受容体ポリペプチドに対して向けられたプロテアーゼドメインとをコードするポリヌクレオチド配列が、IRES（内部リボソーム侵入部位）または2Aペプチドによって好ましくは分離される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
膜貫通受容体がCARである、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
膜貫通受容体が組換えTCRである、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
エフェクター免疫細胞が初代細胞である、請求項34〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
免疫細胞がT細胞またはNK細胞である、請求項34〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
エフェクター免疫細胞においてTCRの発現が低減または抑制される、請求項34〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫細胞において、少なくとも1つのMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現が抑制される、請求項34〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫細胞がドナーまたは患者から提供されたものである、請求項34〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
膜貫通受容体ポリペプチドが付与されたエフェクター免疫細胞が、病的細胞を除去するのに寄与する、疾患の処置のための請求項34〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
膜貫通受容体ポリペプチドが病的細胞と結合する、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
病的細胞が悪性細胞である、請求項46記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞免疫療法の分野、およびより詳細には新世代のキメラ抗原受容体 (CAR) に関する。これらの新たなCARは、主に、プロテアーゼによって活性化され得るキメラポリペプチド前駆体の形態で細胞内で発現される。それらはひとたび活性化されると、免疫細胞の表面に到達し、特異的抗原と結合する。より具体的には、細胞表面におけるこれらCARの提示は、プロテアーゼドメインおよび／または分解ドメイン（例えば、デグロン）をそれらのポリペプチド構造中に含めることによって制御可能となる。そのようなドメインは、小分子（例えば、プロテアーゼ阻害剤）、好ましくは承認薬の存在または非存在などのある特定の条件下で、細胞表面におけるCARの提示を妨げることができ、および切除され得る。本発明はそれにより、細胞に容易に浸透し得る小分子に感受性がある様々なCAR構造を提供する。これらの新たなキメラポリペプチドは、より安全に治療に用いるための、NKまたはTリンパ球などの操作された免疫細胞をもたらすために用いられる。本発明の方法はまた、組換えT細胞受容体 (TCR) にも適用され得る。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エクスビボで作製された自己または同種の抗原特異的免疫細胞の移入を伴う養子免疫療法は、ウイルス感染症およびがんを処置するための有望な戦略である [Poirot, L. et al. (2015) Multiplex Genome-Edited T-cell Manufacturing Platform for “Off-the-Shelf” Adoptive T-cell Immunotherapies. Cancer Res. 75(18)（非特許文献1）]。養子免疫療法に一般的に用いられる免疫細胞は、抗原特異的T細胞またはNK細胞の増大によって作製され得る [Chu, J. et al. (2014) CS1-specific chimeric antigen receptor (CAR)-engineered natural killer cells enhance in vitro and in vivo antitumor activity against human multiple myeloma. Leukemia 28:917-927（非特許文献2）]。このアプローチの可能性は、キメラ抗原受容体 (CAR) または操作されたTCRの遺伝子操作および移入を通じてT細胞の特異性を方向づけ直す能力に依存する1。多くの臨床研究により、がん治療のためのCAR T細胞の養子移入の可能性が実証された。しかしながら、一部では、いわゆるサイトカイン放出症候群 (CRS) および「on-target off-tumor」作用に関連するリスクに対する懸念が生じた [Morgan, R. A. et al. (2010) Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2. Mol Ther 18:843-851（非特許文献3）]。
【０００３】
これまでに、CARで操作されたT細胞を薬理学的に制御するための戦略がいくつか開発されている。現在の戦略は主に自殺機序に依存する [Marin, V. et al. (2012) Comparison of different suicide-gene strategies for the safety improvement of genetically manipulated T cells. Hum Gene Ther Methods 23:376-386（非特許文献4）]。そのような自殺戦略は、操作されたT細胞の完全な根絶を目的としており、それは処置の中途終了をもたらすことになる。したがって、操作されたCAR T細胞の非致死的制御を実行することは、CAR T細胞技術およびその安全性を改善するための重要な前進となり得る。
【０００４】
パートナータンパク質の二量体化に依存する小分子ベースのアプローチが、とりわけT細胞受容体誘発の機序を研究するために既に用いられている [James, J. R. et al. (2012) Biophysical mechanism of T-cell receptor triggering in a reconstituted system. Nature.487: 64-69（非特許文献5）]。最近、Limらは、多鎖受容体の使用を通じて、操作されたT細胞を制御するために、このアプローチを適用した [Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science (2015) Vol. 350 (6258)（非特許文献6）]。
【０００５】
本明細書において、本発明者らは、単鎖および多鎖CARに対して実行され得る、制御可能な操作されたCAR T細胞を作出するための戦略を打ち立てた。本発明者らのアプローチは、プロテアソームを通じてCARの細胞内分解を促進する、デグロンなどの分解ドメインが導入された古典的なCAR構造に基づいている。この分解は承認薬化合物の依存下に置かれ、したがって細胞の表面におけるCAR提示を、該薬物の投与を通じてインビボで調節することができる。
【０００６】
本発明者らは、このような新たな構造のCAR（デグロンCAR）の発現に際して、細胞表面におけるscFv提示を制御することにより、様々な用量の薬物化合物を通じて、操作されたT細胞の細胞溶解特性をインビボで誘導または停止できることを示した。全体的に見て、この非致死的システムは、「一過性CAR T細胞」を提供し、それによってその安全性および治療活性を改善する（免疫細胞の消耗を軽減する）という利点をもたらす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Poirot, L. et al. (2015) Multiplex Genome-Edited T-cell Manufacturing Platform for “Off-the-Shelf” Adoptive T-cell Immunotherapies. Cancer Res. 75(18)
【非特許文献２】Chu, J. et al. (2014) CS1-specific chimeric antigen receptor (CAR)-engineered natural killer cells enhance in vitro and in vivo antitumor activity against human multiple myeloma. Leukemia 28:917-927
【非特許文献３】Morgan, R. A. et al. (2010) Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2. Mol Ther 18:843-851
【非特許文献４】Marin, V. et al. (2012) Comparison of different suicide-gene strategies for the safety improvement of genetically manipulated T cells. Hum Gene Ther Methods 23:376-386
【非特許文献５】James, J. R. et al. (2012) Biophysical mechanism of T-cell receptor triggering in a reconstituted system. Nature.487: 64-69
【非特許文献６】Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science (2015) Vol. 350 (6258)
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明は、免疫細胞において発現可能であり、かつ該免疫細胞の表面における提示を目的としたキメラ抗原受容体 (CAR) の前駆体と見なされ得る、新たなキメラポリペプチドおよび関連ポリヌクレオチドに注目する。そのようなキメラポリペプチドは典型的に、該キメラポリペプチドの切断を誘導する能力を有するプロテアーゼをコードする第2ポリペプチドに連結された、CARをコードする第1ポリペプチドを含む。プロテアーゼによって切断されると、機能的CARが放出され、これは免疫細胞の表面に位置することができ、特異的抗原と相互作用することで該免疫細胞の活性化を可能にする。
【０００９】
本発明のある特定の態様によると、キメラポリペプチド中に含まれるプロテアーゼは、プロテアーゼ阻害剤によって阻害され得る。そのような事象において、CARは必ずしもプロテアーゼによって切断されるわけではなく、不活性のままであるか、または弱い活性のままである。免疫細胞の表面におけるCARの提示はその結果、操作された細胞をある用量の該プロテアーゼ阻害剤と必要とされる間接触させて維持することにより、減少させるかまたは保留にすることができる（スイッチオフ配置）。反対に、CARが、細胞内で同時発現されるプロテアーゼによって認識される切断部位を伴って設計される場合には、プロテアーゼ阻害剤を投与することでCARポリペプチドの切断を減少させることができ、それによって免疫細胞の表面におけるその提示が可能になる（スイッチオン配置）。
【００１０】
本発明はまた、CARの細胞内分解を指示する、プロテアソームによって認識されるデグロン-ポリペプチド配列を含むキメラポリペプチドを提供する。本発明のキメラポリペプチド中に含まれるそのようなデグロンは、プロテアソームによるCARの分解を誘導することができ、細胞の表面におけるCARの提示を減少させるかまたは損なう効果がある。それ故に、キメラポリペプチドを発現する免疫細胞の活性化の低下が得られ得る。
【００１１】
さらに本発明によると、キメラポリペプチドは、CARポリペプチドに対する制御を強化するために、デグロンおよびプロテアーゼドメインの両方を含み得る。ある特定の態様によると、デグロンは好ましくは自己切除ドメイン中に含まれる。好ましい態様において、デグロンは、プロテアーゼをコードする自己切除ドメイン中に位置する。そのようなプロテアーゼの一例は非構造タンパク質3 (NS3)プロテアーゼであり、その活性は、アスナプレビル、シメプレビル、ダノプレビル、またはシルプレビルなどのプロテアーゼ阻害剤によって減少し得るかまたは阻害され得る。
【００１２】
プロテアーゼおよび／またはデグロンを含む本発明によるキメラポリペプチドは、本出願においてさらに詳述されるように異なる構造を示し得る。
【００１３】
本発明はまた、特に免疫細胞のゲノム中に挿入するための、より好ましくはT細胞またはNK細胞のTCR遺伝子座において挿入するための、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。この遺伝子座におけるそのような挿入は、TCRの不活性化または低発現をもたらし、そのような操作された細胞のアロ反応性を弱めることができる。
【００１４】
本発明はまた、そのようなキメラポリペプチドを免疫細胞内で発現させて、細胞療法において用いられるべき操作された免疫細胞を作出する方法、同種処置または自家処置の一環のいずれかとして、そのような操作された免疫細胞で患者を処置する方法、および免疫細胞の表面におけるCARの発現を制御するために、操作された免疫細胞をプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて患者に注入し、そして最終的にその治療活性のより良い制御を得る方法を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のデグロンCARおよび使用の原理の概略図。CARはその構造内に、デグロンを含む、小分子（例えば：プロテアーゼ阻害剤）によって制御可能な分解部分を含む。小分子の存在下では、分解部分は機能的ではなく、デグロンはプロテアソームによるCARの細胞内分解を誘導する。小分子の非存在下では、プロテアーゼ活性が発現され、デグロンはCARから切断される。機能的CARはプロテアソームによって分解されず、T細胞の表面においてその外部結合ドメイン（例えば、ScFv）を提示し得る。それ故に、CARは活性化し、T細胞を活性化し得る。
【図２】アスナプレビルなどのプロテアーゼ阻害剤を培養液中に添加するかまたは患者へ投与することでスイッチオフされ得るCARが付与された治療用免疫細胞を得るための本発明の原理を特集する概略図。CARはSWOFF-CAR（スイッチオフキメラ抗原受容体）と称される。A：プロテアーゼ阻害剤の非存在下では、CARは発現され、デグロンから切断され、免疫細胞の表面において正常に提示される。B：プロテアーゼ阻害剤の存在下では、CARはデグロンから分離されず、プロテアソームを通じた分解に関して完全にプロセシングされる。
【図３】本発明のCARシステムによる薬物依存的かつ抗原依存的なCAR免疫細胞の活性化（例えば：「ANDゲート」は、活性化シグナルを伝達するために、薬物の非存在および特異的抗原の存在を必要とする）の概略図。
【図４】本発明による小分子制御性分解を備えたCARの構造の例。4A：N末端の自己切除デグロンを備えたCAR。4B：C末端の自己切除デグロンを備えたCAR（配列の詳細は実施例1において示される）。
【図５】本発明による、小分子ベースの制御活性化を可能にするCARの構造のさらなる例。
【図６】本発明のCARが付与されたT細胞を用いて得られた実験結果。6A：プロテアーゼ阻害剤アスナプレビルの存在下または非存在下における、CAR陽性T細胞（形質導入細胞の表面における抗CD123 CARの提示）の割合。6B：プロテアーゼ阻害剤アスナプレビルの存在下または非存在下における、CAR陽性T細胞（形質導入細胞の表面における抗CD22 CARの提示）の割合。対照は、制御性分解部分を欠いているCARが付与されたT細胞である（形質導入細胞の表面におけるCARの高い提示）。CAR陽性細胞の割合は、フローサイトメトリーによって測定する。実験の詳細は実施例2において提供される。
【図７】アスナプレビルの存在下 (+ ASN) および非存在下 (- ASN) における、制御性分解部分を含むCARが付与された、本発明に従って操作されたT細胞によって死滅したCD22陽性標的細胞の割合。死滅した細胞の割合は、3つの実験において500 nMアスナプレビルの添加により減少する。データは、形質導入されていないヒト初代T細胞を用いて正規化してある。実験の詳細は実施例3において提供される。
【図８】CD22陽性Raji細胞に対して行われた細胞傷害アッセイ‐D5およびD6において、Raji細胞を本発明によるCAR 抗CD22 T細胞と共にインキュベートし、アスナプレビルの存在下（500 mM ASNを添加し、D3、D4、D5、およびD6において停止した）または非存在下（薬物なし）における、CAR 抗CD22 T細胞によって死滅したRaji細胞の%を0〜24hおよび24〜48hの期間において測定した。8A：第1期間0〜24hにわたって死滅したCD22陽性細胞の%。8B：第2期間24〜48hにわたって死滅したCD22陽性細胞の%。
【図９】漸増濃度のアスナプレビルの存在下でのT細胞の増殖（実施例5を参照されたい）。0 nM ASNに対する、100 nM、500nM、または1000 nM ASNの存在下で培養された細胞の、異なる日における総数を示す。データは、二つ組で行われた2名のドナー由来のPBMCの中央値として示される。
【図１０】アスナプレビル濃度に応じた、抗CD22 CAR T細胞と標的細胞の共培養後のサイトカイン定量化（実施例6を参照されたい）。データは、各点当たり二つ組の平均値±SDとして示される。
【図１１】実施例7においてさらに詳述される、500nMアスナプレビルの非存在下（白いバー）または存在下（濃い灰色、2名の異なる提供者）における、操作されたCARが形質導入された初代T細胞のMFI（CAR検出）。
【図１２】本明細書の実施例8において用いられた、本発明によるドナー鋳型およびTRAC遺伝子座の概略図。
【図１３】実施例8においてさらに詳述される、TCRα/βノックアウト（TCR遺伝子座における、CARをコードする外因性配列の挿入）に際した、操作されたCARの表面発現のフローサイトメトリー解析。
【図１４】実施例8において詳述される、アッセイの終了時に測定されたルシフェラーゼシグナル(標的細胞)（シグナルは、各反復物の最高値に対して正規化してある）。データは、各点当たり三つ組の中央値と95%信頼区間として示される。N=2、三つ組で実施した。
【図１５】ルシフェラーゼシグナルが治療的に許容可能なASN濃度において有意であることを示す、ASN濃度に関する正規化ルシフェラーゼシグナルのフィッティング。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書で特に定義されない限り、用いられる専門用語および科学用語はすべて、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００１７】
本発明の実施は、他に指示のない限り、当技術分野の技能の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技法を用いる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York) のシリーズ、具体的にはVol. 154および155 (Wu et al. eds.) ならびにVol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)；ならびにManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) を参照されたい。
【００１８】
本発明は主に、キメラ抗原受容体 (CAR) または人工的T細胞受容体（「組換えTCR」とも称される）の形態でエフェクター免疫細胞において異種的に発現されるべきキメラポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドに注目する。
【００１９】
本発明によるキメラポリペプチドは、好ましくは、薬物によって制御可能な「条件的」キメラ抗原受容体の形態で発現される。薬物の効果は、本出願においてさらに詳述されるようなキメラポリペプチドの設計に応じて、正（すなわち、CARの活性化をもたらす = 「スイッチオン」効果）または負（すなわち、CARの活性化の阻害をもたらす = 「スイッチオフ」効果）であってよい。
【００２０】
そのような本発明によるキメラポリペプチドは、プロテアーゼおよび／またはデグロンポリペプチドドメイン、好ましくはそれらの両方を含むこと、ならびにより好ましくは、プロテアーゼおよびデグロンドメインがキメラポリペプチドから切除されて機能的なエフェクター膜貫通ポリペプチドを放出し得るような方法で含むことを特徴とする。
【００２１】
「薬物」とは、上記のキメラポリペプチドとの相互作用を考慮して、免疫細胞に浸透し得る、好ましくはヒト投与について承認された、小分子を意味する。
【００２２】
「キメラポリヌクレオチドまたはポリペプチド」とは、異なるポリヌクレオチドコード配列またはポリペプチド配列を含む、単鎖のポリヌクレオチドまたはポリペプチド構造を意味する。本発明による該キメラポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、エフェクターポリペプチド、好ましくはキメラ抗原受容体または組換えT細胞受容体を含み得る。
【００２３】
「エフェクターポリペプチド」とは、任意の膜貫通ポリペプチド、一般的には感染、捕食、または競争の状況において宿主に利益をもたらすタンパク質またはペプチド分子、好ましくは外部シグナルを細胞内に伝達してその機能性のうちのいくつかを活性化する受容体またはその成分を意味する。
【００２４】
「キメラ抗原受容体」とは、単一の融合ポリペプチド中の、1つまたは複数のシグナリングドメインと会合している外部ターゲティング部分からなる合成受容体である。概して、CARの結合部分は、可動性リンカーによって連結されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片および重鎖可変断片を含む一本鎖抗体 (scFv) の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドのドメインに基づく結合部分もまた、使用に成功している。第一世代CARのためのシグナリングドメインは、CD3ζ鎖またはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第一世代CARは、T細胞の細胞傷害性を首尾良く方向づけ直すことが示されたが、インビボで長期増大および抗腫瘍活性をもたらす目的で、CAR改変T細胞の生存を向上させ、増殖を増加させるために、CD28、OX-40 (CD134)、ICOS、および4-1BB (CD137) を含む共刺激分子に由来するシグナリングドメインが、単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）付加された。
【００２５】
「組換えT細胞受容体」とは、その成分のうちの少なくとも1つが外因性ポリヌクレオチドの発現によって得られる、人工的に改変されたT細胞受容体を意味する。組換え体の細胞内シグナリングドメインは、細胞内活性化を誘導するための膜結合型受容体の細胞質部分、例えばFcεRI受容体γ鎖またはCD3ζ鎖に由来し得る。この種類の組換え受容体を使用することにより、MHC非依存的な抗体ベースの抗原結合と、受容体リガンドに特異的に結合した際の効率的なT細胞活性化との利点を組み合わせることができる。このアプローチは、免疫療法のための抗原特異的T細胞の操作に関してCARの代替手段と見なされ得る [Hombach, A. et al. (2002) The recombinant T cell receptor strategy: insights into structure and function of recombinant immunoreceptors on the way towards an optimal receptor design for cellular immunotherapy. Curr Gene Ther. 2(2):211-26]。そのようなT細胞受容体の成分をプロテアーゼまたはデグロンポリペプチドドメインに連結して、本発明によるキメラポリヌクレオチドまたはポリペプチドを形成することができる。
【００２６】
キメラ抗原受容体 (CAR) または組換えT細胞受容体の発現は、初代免疫細胞の、特に腫瘍または感染細胞を処置するためのT細胞の特異性を方向づけるかまたは改善するための最先端のものとなっている。そのような免疫細胞において発現されたCARは、抗原マーカーを特異的に標的とすることにより、該免疫細胞がインビボで悪性細胞または感染細胞を破壊するのに役立つ (Sadelain M. et al. 「The basic principles of chimeric antigen receptor design」 (2013) Cancer Discov. 3(4):388-98)。CARは通常、特異的抗原への結合に応答して免疫細胞を刺激する活性化ドメインを含むように設計されるが（いわゆる正のCAR）、逆の効果を有する阻害ドメインを含んでもよい（いわゆる負のCAR）(Fedorov, V. D. (2014) 「Novel Approaches to Enhance the Specificity and Safety of Engineered T Cells」 Cancer Journal 20 (2):160-165)。正のCARと負のCARを組み合わせるかまたは同時発現させて、標的細胞の表面に存在する様々な抗原に応じて細胞の免疫特異性を精密に調整することができる。
【００２７】
CARにおいて用いるためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調して作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変種および同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナリング配列の2つの異なるクラス、抗原依存的な一次活性化を開始するもの、および抗原非依存的な様式で作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するものを含む。一次細胞質シグナリング配列は、ITAMの免疫受容体活性化チロシンモチーフとして公知であるシグナリングモチーフを含み得る。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼの結合部位として働く、種々の受容体の細胞質内尾部中に見出される十分に明らかにされたシグナリングモチーフである。本発明において用いられるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれ得る。好ましい態様において、CARのシグナリング伝達ドメインは、(SEQ ID NO: 9) からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインを含み得る。
【００２８】
特定の態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、効率的な免疫応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子と特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドには、CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド (ICOS-L)、細胞内接着分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、Tollリガンド受容体と結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3と特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドはまた、とりわけ、これらに限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンドなどの、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を包含する。
【００２９】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが増殖などの、細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびTollリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。共刺激分子の例には、CD27、CD28、CD8、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンド等が含まれる。
【００３０】
好ましい態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、4-1BB (GenBank: AAA53133) およびCD28 (NP_006130.1) の断片からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。詳細には、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、または99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本発明によるCARは、細胞の表面膜上に発現される。したがって、そのようなCARは膜貫通ドメインをさらに含む。適切な膜貫通ドメインの特徴的な特色は、細胞、本発明において好ましくは免疫細胞、詳細にはリンパ球またはナチュラルキラー (NK) 細胞の表面において発現され、所定の標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指示するために共に相互作用する能力を含む。膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γ、もしくはζなどのT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体のp55（α鎖）、p75（β鎖）、もしくはγ鎖、Fc受容体、詳細にはFcγ受容体IIIのサブユニット鎖、またはCDタンパク質であってよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。好ましい態様において、該膜貫通ドメインはヒトCD8α鎖（例えば、NP_001139345.1）に由来する。膜貫通ドメインは、該細胞外リガンド結合ドメインと該膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含み得る。本明細書で用いられる「ヒンジ領域」という用語は一般的に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するよう機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインに、より多くの可動性および接近可能性を提供するために用いられる。ヒンジ領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは10〜100個のアミノ酸、および最も好ましくは25〜50個のアミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子のすべてもしくは一部、例えば、CD8、CD4、もしくはCD28の細胞外領域のすべてもしくは一部、または抗体定常領域のすべてもしくは一部などに由来し得る。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全に合成のヒンジ配列であってもよい。好ましい態様において、該ヒンジドメインは、本明細書においてそれぞれSEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、およびSEQ ID NO. 5と称されるFcγRIIIα受容体、ヒトCD8α鎖、もしくはIgG1の一部、またはこれらのポリペプチドと好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、もしくは99%の配列同一性を示すヒンジポリペプチドを含む。
【００３２】
本発明によるCARは一般的に、SEQ ID NO. 6または7のポリペプチドとの同一性を示す、より詳細にはCD8αおよび4-1BBより選択される膜貫通ドメイン (TM) をさらに含む。
【００３３】
（表１）異なるCAR成分の配列
2020519267.tif 000002
【００３４】
本発明によるキメラ抗原受容体は、CARのすべてのドメインが1本のポリペプチド鎖中に含まれる単鎖CAR、または多鎖CARであってよい。多鎖CARは、典型的に少なくとも1つのエクトドメインと少なくとも1つのエンドドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在するように、複数のポリペプチドから形成されたキメラ抗原受容体である。異なるポリペプチド鎖はごく近接して膜に固定されており、互いに相互作用することが可能である。そのような構造において、シグナリングドメインおよび共刺激ドメインは膜近傍の位置にあってよく（すなわち、その内側で細胞膜に隣接しており)、これは共刺激ドメインの機能の改善を可能にすると考えられる。多サブユニット構造は、より多くの柔軟性、およびT細胞活性化をよりよく制御するCARを設計する能力を提供すると考えられる。例えば、異なる特異性を有するいくつかの細胞外抗原認識ドメインを含めて、多重特異性CAR構造を得ることが可能である。多鎖CARの中に入る異なるサブユニット間の相対比を制御することも可能である。この種類の構造は、本出願人によってWO2014039523において、詳細には図4に記載されており、これは参照により組み入れられる。
【００３５】
したがって、本発明による多鎖CARは、
i) 細胞外抗原結合ドメイン；および
ii) 1つの膜貫通ドメイン
を含む少なくとも1つのエクトドメイン；ならびに
ならびにシグナル伝達ドメイン、および任意に共刺激ドメインを含む少なくとも1つのエンドドメインを含むもののうちの1つであってよい。
【００３６】
ある特定の態様によると、本発明の多鎖CARは、
i) 共刺激ドメインを含む少なくとも1つのエンドドメイン；および
ii) 少なくとも1つの膜貫通ドメイン
を含む第3ポリペプチドをさらに含み得る。
【００３７】
単一の多鎖CARの一部としての異なる鎖は、例えば、IgEの高親和性受容体 (FcεRI) の異なるα、β、およびγ鎖を用いることにより、例えば、FcεRIα鎖の高親和性IgE結合ドメインをエクトドメインで置き換える一方で、FcεRIβ鎖および／またはγ鎖のN末端および／またはC末端尾部を、それぞれシグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインを含むエンドドメインに融合することによって、組み立てることができる。細胞外リガンド結合ドメインは、T細胞特異性を細胞標的へ方向づけ直す役割を有し、一方シグナル伝達ドメインは免疫細胞応答を活性化する。FcεRIのα、β、およびγポリペプチドに由来する異なるポリペプチド鎖が、膜近傍位置に位置する膜貫通ポリペプチドであるという事実は、より柔軟性の高い構造をCARに提供して、抗原標的に対する特異性を改善し、かつ免疫細胞のバックグラウンド活性化を減少させる。
【００３８】
本発明によると、条件的多鎖CARの発現を考慮して、前述の多鎖CARの少なくとも1つの成分（例えば、ポリペプチド）をデグロンおよび／またはプロテアーゼドメインに結合させて、本明細書に記載されるキメラポリヌクレオチドまたはポリペプチドを形成することができる。
【００３９】
CARをコードする遺伝子配列は一般的に、Liechtenstein, T.ら [Lentiviral Vectors for Cancer Immunotherapy and Clinical Applications (2013) Cancers. 5(3):815-837] によって概説されているように、レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターを用いて細胞のゲノム中に導入される。レンチウイルスベクターは、形質導入効率を上昇させるが、ランダムな位置に組み込む。代替法として、本発明によるキメラ抗原受容体 (CAR) の成分をコードするキメラポリヌクレオチドは、US8921332に記載されるように、相同組換えによる部位特異的遺伝子挿入、または低頻度切断エンドヌクレアーゼを用いるNHEJにより、選択された遺伝子座において導入することができる。
【００４０】
本発明の好ましい態様によると、本発明のCAR成分をコードするキメラポリヌクレオチドは、Macleod D.ら [Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells (2017) Molecular Therapy 25(4):949-961] によって示唆されるように、TCR遺伝子座において、またはさらに好ましくは、転写活性が、免疫細胞活性化によって上方制御される内因性プロモーターの制御下にある他の遺伝子座において挿入される。
【００４１】
また、本発明はより詳細には、CARをコードする第1ポリペプチドおよびプロテアーゼまたはデグロンドメインを含む第2ポリペプチドを一般的に含む、本発明によるキメラポリペプチドに関する。概して、該第1ポリペプチドは、単鎖CAR、または多鎖CARの膜貫通サブユニットをコードし、この場合、該第1ポリペプチドは好ましくは、
‐モノクローナル抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメインに連結された膜貫通ドメイン、
‐CD8α膜貫通ドメイン由来の膜貫通、
‐CD3ζシグナリングドメインを含む細胞質ドメイン、
‐ならびに任意に、CD28または4-1BB由来の共刺激ドメイン
を含む。
【００４２】
いくつかの態様によると、前記第1ポリペプチドは、CD8αヒンジ、IgG1ヒンジ、またはFcγRIIIαヒンジなどのヒンジをさらに含み得る。
【００４３】
本発明によるCARは好ましくは、CD19、CD22、CD33、CD38、CD123、CS1、CLL1、ROR1、OGD2、BCMA、HSP70、およびEGFRvIIIより選択される抗原を標的とする。
【００４４】
本発明によるキメラポリヌクレオチドを発現するエフェクター免疫細胞は好ましくは、NK細胞またはT細胞などの初代免疫細胞である。
【００４５】
「免疫細胞」とは、典型的にはCD3またはCD4陽性細胞などの、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞を意味する。本発明による免疫細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であってよい。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍（例えば腫瘍浸潤リンパ球の場合）を含む、多数の非限定的な供給源から得られ得る。いくつかの態様において、該免疫細胞は、健常ドナー、がんと診断された患者、または感染症と診断された患者に由来し得る。別の態様において、該細胞は、CD4陽性細胞、CD8陽性細胞、およびCD56陽性細胞を含むような、異なる表現型的特徴を提示する免疫細胞の混合集団の一部である。
【００４６】
「初代細胞（「primary cell」または「primary cells」）とは、生存組織（例えば、生検材料）から直接採取され、限られた期間にわたるインビトロでの成長のために確立された細胞を意図し、このことは、それらが集団倍加を受け得る回数が限られていることを意味する。初代細胞は、持続的な腫瘍形成性の細胞株または人為的に不死化された細胞株とは対照的である。そのような細胞株の非限定的な例は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；ジャーカット細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞である。初代細胞は、より機能的でありかつ腫瘍形成性が低いと見なされるため、細胞療法において一般に用いられている。
【００４７】
概して、初代免疫細胞は、例えばSchwartz J.ら (Guidelines on the use of therapeutic apheresis in clinical practice-evidence-based approach from the Writing Committee of the American Society for Apheresis: the sixth special issue (2013) J Clin Apher. 28(3):145-284) によって概説されている白血球アフェレーシス技法によるなど、当技術分野で公知の種々の方法を介して、ドナーまたは患者から提供される。
【００４８】
本発明による初代免疫細胞はまた、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞 (HSC) 、および人工多能性幹細胞 (iPS) などの幹細胞から分化させることもできる。
【００４９】
本発明のキメラポリヌクレオチドで免疫細胞を形質転換すると、本発明の意味での「操作された免疫細胞」が得られる。そのような形質転換は、ウイルスベクター形質導入またはRNAトランスフェクションなどの、当技術分野で公知の様々な方法によって行うことができる。
【００５０】
1つの態様によると、本発明によるキメラポリペプチドは、キメラ抗原受容体をコードする第1ポリペプチド、および第1ポリペプチドに対する切断活性を有するプロテアーゼを含む第2ポリペプチドを含む。
【００５１】
概して、プロテアーゼは、本明細書において「切断ドメイン」と称される特定のポリペプチドモチーフまたは配列に対して活性のある特異的プロテアーゼである。そのような態様によると、この切断ドメインは、キメラ抗原受容体をコードする第1ポリペプチド中に含まれ得、したがってプロテアーゼが発現されると、CARは切断されて不活性となる。別の態様によると、切断ドメインはCARの外側、好ましくは第1ポリペプチドと第2ポリペプチドを連結するポリペプチド配列中に設定され得、したがって第2ポリペプチドが第1ポリペプチドから切除される。そのような配置において、プロテアーゼは機能的CARを成熟させることができ、このCARは最初のキメラポリペプチドから放出され、次いで、特異的抗原との結合によって活性化されるように細胞の表面において提示され得る。それにより、該プロテアーゼは、キメラポリペプチドの構造に応じて、それぞれ、形質転換免疫細胞の表面におけるCARポリペプチドの提示を妨げるか、または不活性のCAR前駆体を機能的CARに変換する効果を有し得る。
【００５２】
本発明の1つの態様によると、前記プロテアーゼ活性は、二者択一的にスイッチオン分子またはスイッチオフ分子として作用するプロテアーゼ阻害剤によって阻害され得る。これまでの態様を参照すると、プロテアーゼが細胞表面における機能的CARの提示を妨げる場合、プロテアーゼ阻害剤の添加は、表面におけるCARの適切な提示、および特異的抗原とのその相互作用の可能性をもたらし、それにより操作された免疫細胞に関してスイッチオンとして働く。対照的に、プロテアーゼが活性CARをプロセシングする場合、プロテアーゼ阻害剤の添加は、機能的CARの提示を妨げ、操作された免疫細胞の活性化に関してスイッチオフとして働く。
【００５３】
異なるプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤、詳細には抗ウイルス療法について承認された小分子、例えば抗レトロウイルスHIV-1プロテアーゼ阻害剤またはC型肝炎ウイルスNS3/4Aプロテアーゼ阻害剤などを本発明において用いることができる。抗レトロウイルスHIV-1プロテアーゼ阻害剤の例は、アンプレナビル、アタザナビル、ダルナビル、ホスアンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、またはチプラナビルである。好ましいC型肝炎ウイルスNS3/4Aプロテアーゼ阻害剤は、アスナプレビル、ボセプレビル、グラゾプレビル、パリタプレビル、シメプレビル、およびテラプレビルである。最も好ましいのは、非構造タンパク質3 (NS3)プロテアーゼと同一性を有するプロテアーゼのプロテアーゼ活性を阻害するためのアスナプレビルである。
【００５４】
（表２）プロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤の例
2020519267.tif 000003
【００５５】
1つの態様によると、本発明によるキメラポリペプチドは、少なくとも1つのデグロンポリペプチド配列をさらに含む。
【００５６】
「デグロン」とは、タンパク質を分解に関して標的とするためにE3ユビキチンリガーゼによって用いられる機能的エレメントとして、文献において同定された任意のポリペプチド配列を意味する。大部分のデグロンは、モジュラータンパク質の配列内に埋め込まれた短い線状モチーフである。デグロンは典型的に、5〜20アミノ酸、好ましくは6〜10アミノ酸から構成され、一般的にタンパク質の可動性領域内に位置し、そのためデグロンは他のタンパク質と容易に相互作用し得る。デグロンは、もはや必要ではないタンパク質の除去を可能にして、その起こり得る機能障害を妨げる。
【００５７】
E3リガーゼ-デグロン対の十分に特徴づけられた例は、p53中のデグロンと、RINGドメイン含有個別E3リガーゼであるE3リガーゼMDM2（マウスダブルマイニュート2）である (49)。DNA損傷または他のストレスシグナルがない場合には、MDM2は、一定して産生されるp53を分解に関して標的とする。MDM2とp53との間に形成される構造により、デグロンモチーフに相当するp53のN末端領域上の短いセグメントが、MDM2のSWIBドメインに結合するαヘリックス区間を形成することが示される [Kussie, S. et al. (1996) Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor transactivation domain. Science. 274, 948-953]。
【００５８】
デグロンは、ユビキチン依存性またはユビキチン非依存性、プロテアソーム性またはリソソーム性に分類される。本発明において用いられるものは好ましくは二機能性であり、このことはそれが、ポリペプチドSEQ ID NO. 32、38、41、または43を含む例において用いられるもののように、プロテアソーム性とリソソーム性の両方であることを意味する。
【００５９】
そのようなデグロンポリペプチドをキメラポリペプチド中に導入して、CARの細胞内分解を強化し、それによって細胞表面におけるCARの提示を妨げることができる。好ましい態様によると、デグロンは、本発明のキメラポリペプチド中に含まれる第2ポリペプチド中に含まれ、これは好ましくはプロテアーゼによって切除される。
【００６０】
本発明によるキメラポリペプチド構造の例は、以下の表3〜8において説明される。
【００６１】
（表３）構造V-1のキメラポリペプチド
2020519267.tif 000004
【００６２】
（表４）構造V-2のキメラポリペプチド
2020519267.tif 000005
【００６３】
（表５）構造V-3のキメラポリペプチド
2020519267.tif 000006
【００６４】
（表６）構造V-4のキメラポリペプチド
2020519267.tif 000007
【００６５】
（表７）構造V-5のキメラポリペプチド
2020519267.tif 000008
【００６６】
（表８）構造V-6のキメラポリペプチド
2020519267.tif 000009
【００６７】
本発明の1つの局面によると、CARまたは組換えT細胞受容体の細胞外結合ドメインは、特異的抗体、好ましくは表9に収載されるような治療上承認されている抗体によって認識され得る特定のエピトープを含み得る。
【００６８】
（表９）本発明のCARの細胞外ドメイン中に含まれ得る、ミモトープとも称されるmAb特異的エピトープ（およびそれらの対応するmAb）の例
2020519267.tif 000010
【００６９】
したがって、本発明によるキメラポリペプチドは、以下の配列のうちの1つを含む細胞外結合ドメインのポリペプチド配列を含み得る：
V1-L1-V2-(L)X-エピトープ1-(L)X-；
V1-L1-V2-(L)X-エピトープ1-(L)X-エピトープ2-(L)X-；
V1-L1-V2-(L)X-エピトープ1-(L)X-エピトープ2-(L)X-エピトープ3-(L)X-；
(L)X-エピトープ1-(L)X-V1-L1-V2；
(L)X-エピトープ1-(L)X-エピトープ2-(L)X-V1-L1-V2；
エピトープ1-(L)X-エピトープ2-(L)X-エピトープ3-(L)X-V1-L1-V2；
(L)X-エピトープ1-(L)X-V1-L1-V2-(L)X-エピトープ2-(L)X；
(L)X-エピトープ1-(L)X-V1-L1-V2-(L)X-エピトープ2-(L)X-エピトープ3-(L)X-；
(L)X-エピトープ1-(L)X-V1-L1-V2-(L)X-エピトープ2-(L)X-エピトープ3-(L)X-エピトープ4-(L)X-；
(L)X-エピトープ1-(L)X-エピトープ2-(L)X-V1-L1-V2-(L)X-エピトープ3-(L)X-；
(L)X-エピトープ1-(L)X-エピトープ2-(L)X-V1-L1-V2-(L)X-エピトープ3-(L)X-エピトープ4-(L)X-；
V1-(L)X-エピトープ1-(L)X-V2；
V1-(L)X-エピトープ1-(L)X-V2-(L)X-エピトープ2-(L)X；
V1-(L)X-エピトープ1-(L)X-V2-(L)X-エピトープ2-(L)X-エピトープ3-(L)X；
V1-(L)X-エピトープ1-(L)X-V2-(L)X-エピトープ2-(L)X-エピトープ3-(L)X-エピトープ4-(L)X；
(L)X-エピトープ1-(L)X-V1-(L)X-エピトープ2-(L)X-V2；または
(L)X-エピトープ1-(L)X-V1-(L)X-エピトープ2-(L)X-V2-(L)X-エピトープ3-(L)X
式中、
V1はVLでありかつV2はVHであるか、またはV1はVHでありかつV2はVLであり；
L1は、VH鎖をVL鎖に連結するのに適したリンカーであり；
Lはグリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであり、細胞外結合ドメイン内のLの各存在は、同じ細胞外結合ドメイン内のLの他の存在と同一であってもよいし、または異なってもよく、かつ
xは0または1であり、xの各存在は他のものから独立して選択され；かつ
エピトープ1、エピトープ2、およびエピトープ3は、表3におけるようなmAb特異的エピトープであり、同一であってもよいし、または異なってもよい。
【００７０】
さらに本発明によると、L1は、グリシンおよび／またはセリンを含むリンカーであってよく、アミノ酸配列 (Gly-Gly-Gly-Ser)n もしくは (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n、式中、nは1、2、3、4、もしくは5である、を含み得るか、またはアミノ酸配列 (Gly4Ser)4 もしくは (Gly4Ser)3 を含むリンカーであってよい。
【００７１】
Lは、
2020519267.tif 000011
より選択されるアミノ酸配列を有する、グリシンおよび／またはセリンを含むリンカーであってよい。
【００７２】
エピトープ1、エピトープ2、エピトープ3、およびエピトープ4は、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ-CD3、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、QBEND-10、およびウステキヌマブによって特異的に認識されるmAb特異的エピトープより独立して選択され得る。好ましい態様において、該エピトープ1、エピトープ2はリツキシマブによって特異的に認識され、かつエピトープ3はQBEND-10によって特異的に認識される。
【００７３】
本発明は、本明細書に記載されるキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および本発明によるそのようなポリヌクレオチドを含む任意のベクターを包含する。本発明の1つの局面によると、キメラ抗原受容体 (CAR) をコードする第1ポリペプチド、およびプロテアーゼをコードする第2ポリペプチドは、ポリヌクレオチドのセットと称される別々のポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされ、これらは細胞において同時トランスフェクトまたは同時発現され得る。
【００７４】
本発明による好ましいCARは、実施例において詳述されるものとの同一性を示すポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を有するもの、特にSEQ ID NO:68と同一性を有するCAR 抗CD22、またはSEQ ID NO:63と同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列である。実施例8において説明される好ましい態様として、本発明によるCARをTCR遺伝子座において挿入するための挿入マトリックスとして用いられるべき、SEQ ID NO:59と同一性を有するポリヌクレオチド、特にそれを含むAAVベクターまたはレンチウイルスベクターもまた提供される。
【００７５】
本発明はさらに、典型的にエフェクターポリペプチド、プロテアーゼドメイン、およびデグロンを含む、本発明によるキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された、操作された免疫細胞に関する。そのような免疫細胞は好ましくは、T細胞またはNK細胞などの初代免疫細胞である。さらに本発明によると、TCRの発現が低減または抑制されている免疫細胞が、細胞療法処置におけるその同種使用のために好ましい。いくつかの態様においては、インビボにおけるその持続性を増加させるために、少なくとも1つのMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現もまた低減または抑制され得る。
【００７６】
本発明は、以下の段階のうちの少なくとも1つを含む、エフェクター細胞内で、膜貫通受容体に関連づけられた機能を不活性化（スイッチオフ）するための方法を広く提供する：
‐エフェクター細胞を提供する段階、
‐より詳細には受容体ポリペプチド、プロテアーゼ、およびデグロンを含むキメラポリペプチドをコードする、本発明によるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを、エフェクター細胞内に導入する段階；
‐プロテアーゼ活性がデグロンを除去し、かつ該受容体ポリペプチドが細胞の表面において提示されるように、該キメラポリペプチドを該細胞内で発現させる段階；
‐デグロンがもはや除去されず、発現された該キメラポリペプチドがプロテアソームによって分解されるように、該プロテアーゼ活性を阻害するプロテアーゼ阻害剤を細胞の環境内に導入する段階であって、それにより該エフェクター細胞内で膜貫通受容体に関連づけられた機能をスイッチオフする、段階。
【００７７】
本発明はまた、少なくとも以下の段階を含む、エフェクター細胞内で、膜貫通受容体に関連づけられた機能を活性化（スイッチオン）するための方法を提供する：
‐エフェクター細胞を提供する段階、
‐(i) 膜貫通受容体ポリペプチドと (ii) 該膜貫通受容体ポリペプチドに対して向けられたプロテアーゼドメインとをコードするポリヌクレオチド配列のセットまたは特有のポリヌクレオチドを、該エフェクター細胞内に導入する段階、
‐該受容体ポリペプチド機能を不活性化するプロテアーゼ活性を有する該ポリペプチドを、該エフェクター細胞内で発現させる段階、
‐該プロテアーゼ活性を阻害するためおよび、膜貫通受容体が細胞表面において提示されることを可能にするために、プロテアーゼ阻害剤を免疫細胞の環境内に導入する段階であって、それにより該エフェクター細胞内で該受容体の機能を活性化する、段階。
【００７８】
前述したように、膜貫通受容体は、例えば、CARもしくは組換えTCR、または病的細胞の表面マーカーと結合する任意の膜貫通受容体ポリペプチドであってよい。
【００７９】
1つの態様によると、(i) 膜貫通受容体ポリペプチドと (ii) 該膜貫通受容体ポリペプチドに対して向けられたプロテアーゼドメインとをコードする前記ポリヌクレオチド配列は、IRES（内部リボソーム侵入部位）または2Aペプチドによって分離された単一のポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００８０】
上記の方法は好ましくは疾患の処置のために用いられ、この場合、膜貫通受容体ポリペプチドが付与された前記エフェクター免疫細胞は、患者において悪性細胞または感染細胞などの病的細胞を除去するのに寄与する。
【００８１】
操作された免疫細胞および免疫細胞の集団
本発明はまた、単離された形態でまたは細胞集団の一部として、前述の方法のうちの1つに従って得られ得る、種々の操作された免疫細胞に注目する。詳細には、本発明は、本発明において言及されるポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列のいずれかを含む細胞、特に本明細書に記載されるCARを発現する細胞を対象とする。
【００８２】
本発明の好ましい局面によると、操作された細胞は、一般的に異なる種類の細胞を含み得る細胞集団の一部である、NK細胞またはT細胞などの初代免疫細胞である。概して、PBMC（末梢血単核細胞）から白血球アフェレーシスにより単離された、患者またはドナーに由来する集団。
【００８３】
本発明の好ましい局面によると、前記集団中に含まれる免疫細胞の50%超が、TCR陰性T細胞である。本発明のより好ましい局面によると、該集団中に含まれる免疫細胞の50%超が、CAR陽性T細胞である。
【００８４】
本発明は、それぞれ独立して上記された、異なる外因性コード配列と遺伝子不活性化の任意の組み合わせを含む免疫細胞を包含する。これらの組み合わせのうち、免疫細胞の活性化中に定常的に活性があり、かつ好ましくは該活性化とは独立している内因性プロモーターの転写制御下のCARの発現と、免疫細胞の活性化中に上方制御されるプロモーターの転写制御下の、IL-2、IL-12、またはIL-15などのサイトカインをコードする外因性配列の発現を組み合わせたものが、特に好ましい。
【００８５】
別の好ましい組み合わせは、CARまたはその構成成分のうちの1つをコードする外因性配列の、低酸素誘導因子1遺伝子プロモーター (Uniprot: Q16665) の転写制御下への挿入である。
【００８６】
本発明はまた、以下の段階を含む、感染症またはがんを処置するための、前述の操作された初代免疫細胞または免疫細胞集団を含む薬学的組成物、および処置を必要とする患者を処置する方法に注目する：
‐前述の本発明の方法に従って、操作された初代免疫細胞の集団を調製する段階；
‐任意に、該操作された初代免疫細胞を精製または選別する段階；
‐該細胞を該患者に注入した時点で、またはその後に、操作された初代免疫細胞の該集団を活性化する段階。
【００８７】
T細胞の活性化および増大
遺伝子改変の前であるか後であるかにかかわらず、たとえ本発明による免疫細胞が抗原結合機構とは独立して活性化または増殖することができるとしても、それらを活性化または増大させることができる。T細胞は詳細には、例えば米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005号に記載される方法を用いて、活性化および増大させることができる。T細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。T細胞は一般的に、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激してT細胞に対する活性化シグナルを生じる薬剤と接触させることによって、増大させる。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート (PMA)、またはフィトヘムアグルチニン (PHA) のような分裂促進レクチンなどの化学物質を、T細胞に対する活性化シグナルの生成に用いることができる。
【００８８】
非限定的な例として、T細胞集団は、表面上に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片または抗CD2抗体との接触、またはプロテインキナーゼC活性化因子（例えば、ブリオスタチン）とカルシウムイオノフォアとの接触などによって、インビトロで刺激され得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子を同時刺激するために、アクセサリー分子と結合するリガンドが用いられる。例えば、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、T細胞の集団を抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。T細胞培養に適した条件には、血清（例えば、胎仔ウシ血清または胎児ヒト血清）、インターロイキン-2 (IL-2)、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知である細胞の成長のための任意の他の添加物を含む、増殖および生存能に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5 (Lonza)）が含まれる。細胞の成長のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート (plasmanate)、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、無血清の、あるいは適量の血清（もしくは血漿）、または規定されたホルモンセット、ならびに／またはT細胞の成長および増大に十分な量のサイトカインが補充された、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは実験用培養物にのみ含まれ、対象に注入される予定の細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下で、例えば適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気 + 5% CO2）の下で維持される。異なる刺激時間に曝露されたT細胞は、異なる特徴を示し得る。
【００８９】
別の特定の態様において、前記細胞は、組織または細胞と共培養することによって増大させることもできる。該細胞はまた、インビボで、例えば該細胞を対象に投与した後に対象の血液中で増大させることもできる。
【００９０】
治療組成物および適用
上記の本発明の方法により、操作された初代免疫細胞を、それらが特にその細胞傷害活性に関して完全な免疫治療可能性を維持するように、約15〜30日、好ましくは15〜20日、および最も好ましくは18〜20日という限定された時間枠内で生成することが可能になる。
【００９１】
これらの細胞は細胞集団を形成し、その集団は好ましくは単一のドナーまたは患者に由来する。これらの細胞集団は、最も高い製造規範要件に従うよう閉鎖培養レシピエント下で増大させることができ、患者に注入する前に凍結することができ、それによって「既製の」または「すぐに使える」治療組成物を提供する。
【００９２】
本発明によると、同一の白血球アフェレーシスに由来するかなりの数の細胞を得ることができ、このことは患者を処置するのに十分な用量を得るために重要である。様々なドナーに由来する細胞集団間の変動が認められ得るが、白血球アフェレーシスによって得られる免疫細胞の数は一般的に、PBMC約108〜1010個細胞である。PBMCはいくつかの細胞型：顆粒球、単球、およびリンパ球を含み、そのうちの30〜60%がT細胞であり、これは一般的にドナー1名からの初代T細胞108〜109個を意味する。本発明の方法は一般的には最終的に、一般的には約108個超のT細胞、より一般的には約109個超のT細胞、さらにより一般的には約1010個超のT細胞、および通常は1011個超のT細胞に到達する、操作された細胞の集団をもたらす。
【００９３】
したがって本発明はより詳細には、初代免疫細胞の治療上有効な集団に注目し、この場合、該集団中の細胞の少なくとも30%、好ましくは50%、より好ましくは80%が、本明細書に記載される方法のいずれか1つに従って改変されている。本発明による初代免疫細胞の治療上有効な該集団は、少なくとも1つの外因性遺伝子配列が、表5に収載される遺伝子のうちの少なくとも1つに由来する内因性プロモーターの転写制御下に組み込まれた免疫細胞を含む。
【００９４】
そのような組成物または細胞集団はしたがって、処置を必要とする患者における、特にがんを処置するための、詳細にはリンパ腫の処置のための、しかしまたメラノーマ、神経芽細胞腫、神経膠腫、または肺腫瘍、乳房腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍、もしくは卵巣腫瘍などのがん腫といった固形腫瘍のための医薬品として用いることができる。
【００９５】
別の局面において、本発明は、処置を必要とする患者を処置する方法であって、以下の段階のうちの少なくとも1つを含む方法に依存する：
(a) 患者の腫瘍生検試料の表面に存在する特異的抗原マーカーを決定する段階；
(b) 前述の本発明の方法の1つによって操作された、該特異的抗原マーカーに対するCARを発現する操作された初代免疫細胞の集団を提供する段階；
(c) 操作された初代免疫細胞の該操作された集団を該患者に投与する段階。
【００９６】
一般的に、前記細胞集団は主に、T細胞などのCD4およびCD8陽性免疫細胞を含み、これは頑強なインビボT細胞増大を起こすことができ、インビトロおよびインビボにおいて長期間にわたり存続し得る。
【００９７】
本発明による操作された初代免疫細胞を伴う処置は、寛解的、治癒的、または予防的であってよい。それは自家免疫療法の一環であってもよく、または同種免疫療法処置の一環であってもよい。自家とは、患者の処置に用いられる細胞、細胞株、または細胞集団が、該患者またはヒト白血球抗原 (HLA) 適合ドナーに由来することを意味する。同種とは、患者の処置に用いられる細胞または細胞集団が該患者に由来せず、ドナーに由来することを意味する。
【００９８】
別の態様において、本発明による前記の単離された細胞または該単離された細胞に由来する細胞株は、液性腫瘍、および好ましくはT細胞急性リンパ性白血病の処置に用いることができる。
【００９９】
成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんもまた含まれる。
【０１００】
本発明による操作された免疫細胞を用いた処置は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子治療、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法の群より選択される、がんに対する1種または複数種の治療と併用することができる。
【０１０１】
本発明の好ましい態様によると、前記処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施行することができる。実際に、本発明は好ましくは、そのような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化に起因して、少なくとも1種の免疫抑制剤に対して耐性にされた細胞または細胞集団に依存する。この局面において、免疫抑制処置は、患者における本発明によるT細胞の選択および増大を支援するはずである。
【０１０２】
本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、内服、輸液、植え込み、または移植を含む、任意の簡便な様式で実施され得る。本明細書に記載される組成物は、患者の皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内に、静脈内もしくはリンパ内注射によって患者に、または患者の腹腔内に投与され得る。1つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
【０１０３】
細胞または細胞集団の投与は、これらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む、体重1 kg当たり104〜109個の細胞、好ましくは105〜106個の細胞／kg体重の投与からなり得る。したがって本発明は、単一のドナーまたは患者の試料採取に由来する、106〜108個の遺伝子編集細胞を含む、10回超、一般的には50回超、より一般的には100回超、および通常は1000回超の用量を提供し得る。
【０１０４】
細胞または細胞集団は、1回または複数回の用量で投与され得る。別の態様では、前記有効量の細胞が単一用量として投与される。別の態様では、該有効量の細胞が、ある期間にわたり2回以上の用量として投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断内にあり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から入手することができる。個々のニーズは異なるが、特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内である。有効量とは、治療的または予防的な利益をもたらす量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、もしあれば併用処置の種類、処置の頻度、ならびに望ましい効果の性質に依存する。
【０１０５】
別の態様において、前記有効量の細胞またはそのような細胞を含む組成物は、非経口投与される。該投与は静脈内投与であってよい。該投与は、腫瘍内への注射により直接行うこともできる。
【０１０６】
本発明のある特定の態様において、細胞は、抗ウイルス療法、シドホビル、およびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）などの薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むがこれらに限定されない、多数の関連する処置様式と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）、患者に投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506など、抗体、またはその他の免疫除去 (immunoablative) 剤、例えばCAMPATH、抗CD3抗体、もしくはその他の抗体療法など、サイトキシン (cytoxin)、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と併用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子誘導性シグナリングに重要であるp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）(Henderson, Naya et al. 1991；Liu, Albers et al. 1992；Bierer, Hollander et al. 1993)。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射療法 (XRT)、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを用いるT細胞除去療法と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）、患者に投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのB細胞除去療法の後に投与される。例えば、1つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的処置を受けた後に、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある特定の態様において、移植の後、対象は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。
【０１０７】
本発明に従ってCARが免疫細胞または免疫細胞の集団において発現される場合、好ましいCARは、CD22、CD38、CD123、CS1、HSP70、ROR1、GD3、およびCLL1より選択される少なくとも1つの抗原を標的とするものである。
【０１０８】
CD22を標的とするCARまたは改変TCRが付与された本発明による操作された免疫細胞は好ましくは、急性リンパ性白血病 (ALL) などの白血病を処置するために用いられ、CD38を標的とするCARまたは改変TCRが付与されたものは好ましくは、T細胞急性リンパ性白血病 (T-ALL) などの白血病または多発性骨髄腫 (MM) を処置するために用いられ、CD123を標的とするCARまたは改変TCRが付与されたものは好ましくは、急性骨髄性白血病 (AML) などの白血病および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍 (BPDCN) を処置するために用いられ、CS1を標的とするCARまたは改変TCRが付与されたものは好ましくは、多発性骨髄腫 (MM) を処置するために用いられる。
【０１０９】
本発明はまた、低頻度切断エンドヌクレアーゼの使用による遺伝子不活性化などの、典型的にドナーから得られたT細胞などの免疫細胞におけるTCR発現を減少させることを目的とした、当技術分野で公知の任意の方法と適合する限り、同種免疫療法に適している。そのような方法により、アロ反応性が低下した免疫細胞の生成が可能になる。結果として得られた改変免疫細胞は、プールし、1名または数名の患者に投与することができ、Poirotら [Poirot, L. et al. (2015) Multiplex Genome-Edited T-cell Manufacturing Platform for “Off-the-Shelf” Adoptive T-cell Immunotherapies. Cancer Res. 75(18)] によって記載されるような「既製の」治療製品として利用可能になる。本発明によるキメラポリヌクレオチドのTCR遺伝子座における遺伝子標的挿入もまた、TCR遺伝子不活性化をもたらし、アロ反応性の低い操作された同種（初代）免疫細胞を提供し得る。
【０１１０】
ある特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、がんの処置において使用するためのものであり、およびより詳細には固形腫瘍または液性腫瘍の処置において使用するためのものである。特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、固形腫瘍の処置において使用するためのものである。他の特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、液性腫瘍の処置において使用するためのものである。
【０１１１】
特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、肺がん、小細胞肺がん、乳がん、子宮がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸がん、肝臓がん、膵臓がん、および皮膚がんからなる群より選択されるがんの処置において使用するためのものである。さらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、肺がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、小細胞肺がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、乳がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、子宮がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、前立腺がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、腎臓がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、結腸がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、肝臓がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、膵臓がんの処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、皮膚がんの処置において使用するためのものである。
【０１１２】
他の特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、肉腫の処置において使用するためのものである。
【０１１３】
他の特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、がん腫の処置において使用するためのものである。さらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、腎がん、肺がん、または結腸がんの処置において使用するためのものである。
【０１１４】
他の特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、急性リンパ性白血病 (ALL)、急性骨髄性白血病 (AML)、慢性リンパ性白血病 (CLL)、慢性骨髄性白血病 (CML)、および慢性骨髄単球性白血病 (CMML) などの白血病の処置において使用するためのものである。さらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、急性リンパ性白血病 (ALL) の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、急性骨髄性白血病 (AML) の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、慢性リンパ性白血病 (CLL) の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、慢性骨髄性白血病 (CML) の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、慢性骨髄単球性白血病 (CMML) の処置において使用するためのものである。
【０１１５】
他の特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、B細胞リンパ腫などのリンパ腫の処置において使用するためのものである。さらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、原発性CNSリンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、ホジキンリンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、非ホジキンリンパ腫の処置において使用するためのものである。さらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫 (DLBCL) の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、濾胞性リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、辺縁帯リンパ腫 (MZL) の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、粘膜関連リンパ組織リンパ腫 (MALT) の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、小細胞型リンパ球性リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、マントル細胞リンパ腫 (MCL) の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、バーキットリンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、原発性縦隔（胸腺）大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、ワルデンストレームマクログロブリン血症の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、節性辺縁帯B細胞リンパ腫 (NMZL) の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、脾性辺縁帯リンパ腫 (SMZL) の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、血管内大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、原発性滲出性リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、リンパ腫様肉芽腫症の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、T細胞／組織球豊富型大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、CNS（中枢神経系）の原発性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、原発性皮膚びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、高齢者のEBV陽性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、炎症に不随するびまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、ALK陽性大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、形質芽球性リンパ腫の処置において使用するためのものである。他のさらに特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、HHV8関連多中心性キャッスルマン病で生じる大細胞型B細胞リンパ腫の処置において使用するためのものである。
【０１１６】
ある特定の態様によると、免疫細胞または組成物は、HIV感染症またはHBV感染症などのウイルス感染症の処置において使用するためのものである。
【０１１７】
ある特定の態様によると、免疫細胞は、処置されるべき患者、例えばヒト患者に由来する。ある特定の他の態様によると、免疫細胞は、少なくとも1名のドナーに由来する。
【０１１８】
処置は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子治療、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法の群より選択される、1種または複数種の治療と併用することができる。
【０１１９】
ある特定の態様によると、本発明の免疫細胞は患者に投与されると頑強なインビボ免疫細胞増大を起こすことができ、長期間にわたって、好ましくは1週間、より好ましくは2週間、さらにより好ましくは少なくとも1ヶ月にわたって体液中に存続し得る。本発明による免疫細胞は、これらの期間にわたって存続すると予測されるが、患者の体内でのその寿命は、1年、好ましくは6ヶ月、より好ましくは2ヶ月、およびさらにより好ましくは1ヶ月を超えないことが意図される。
【０１２０】
本発明による免疫細胞または組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、内服、輸液、植え込み、または移植を含む、任意の簡便な様式で実施され得る。本明細書に記載される免疫細胞または組成物は、患者の皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内に、静脈内もしくはリンパ内注射によって患者に、または患者の腹腔内に投与され得る。
【０１２１】
ある特定の態様によると、免疫細胞または組成物は静脈内注射によって投与される。
【０１２２】
その他のある特定の態様によると、免疫細胞または組成物は非経口投与される。
【０１２３】
ある特定のその他の態様によると、免疫細胞または組成物は腫瘍内に投与される。該投与は、腫瘍内へ直接またはその近傍に注射することによって行うことができる。
【０１２４】
細胞または細胞集団の投与は、これらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む、体重1 kg当たり104〜109個の細胞、好ましくは105〜106個の細胞／kg体重の投与からなり得る。細胞または細胞集団は、1回または複数回の用量で投与され得る。別の態様では、該有効量の細胞が単一用量として投与される。別の態様では、該有効量の細胞が、ある期間にわたり2回以上の用量として投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断内にあり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から入手することができる。個々のニーズは異なるが、特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内である。有効量とは、治療的または予防的な利益をもたらす量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、もしあれば併用処置の種類、処置の頻度、ならびに望ましい効果の性質に依存する。
【０１２５】
本発明のある特定の態様によると、免疫細胞は、抗ウイルス療法、シドホビル、およびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）などの薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むがこれらに限定されない、多数の関連する処置様式と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）、患者に投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506など、抗体、またはその他の免疫除去剤、例えばCAMPATH、抗CD3抗体、もしくはその他の抗体療法など、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と併用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子誘導性シグナリングに重要であるp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射療法 (XRT)、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを用いるT細胞除去療法と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）、患者に投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのB細胞除去療法の後に投与される。例えば、1つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的処置を受けた後に、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある特定の態様において、移植の後、対象は、増大させた本発明の遺伝子操作された免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。
【０１２６】
処置を必要とする患者において処置するための方法であって、a) 本発明の少なくとも1つの免疫細胞、好ましくは該免疫細胞の集団を提供する段階程；およびb) 該免疫細胞または集団を該患者に投与する段階を含む方法もまた、本発明のこの局面に包含される。
【０１２７】
本発明によるキメラポリペプチドが付与された操作された免疫細胞と、ある用量のプロテアーゼ阻害剤、特に経口投与による1日当たり10〜600 mgの範囲の用量の、好ましくは成人患者に関して40〜400 mg／日、より好ましくは50〜200 mg／日のアスナプレビルとの同時投与を含む処置もまた、包含される。
【０１２８】
本発明の少なくとも1つの免疫細胞、および好ましくは該免疫細胞の集団を用いて医薬品を調製する方法もまた、本発明のこの局面に包含される。したがって、本発明は、医薬品の製造における、本発明の少なくとも1つの免疫細胞、および好ましくは該免疫細胞の集団の使用を提供する。好ましくは、そのような医薬品は、上記で指定された疾患の処置において使用するためのものである。
【０１２９】
その他の定義
‐ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書では1文字コードに従って指定され、例えば、QはGlnまたはグルタミン残基を意味し、RはArgまたはアルギニン残基を意味し、およびDはAspまたはアスパラギン酸残基を意味する。
【０１３０】
‐アミノ酸置換は、1つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを意味し、例えば、ペプチド配列中でアルギニン残基をグルタミン残基で置き換えることは、アミノ酸置換である。
【０１３１】
‐ヌクレオチドは以下のように指定される：ヌクレオシドの塩基を指定するために、1文字コードが用いられ：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、およびgはグアニンである。縮重ヌクレオチドに関しては、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、およびnはg、a、t、またはcを表す。
【０１３２】
‐本明細書で用いられる場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド、および／またはデオキシリボ核酸 (DNA) もしくはリボ核酸 (RNA) などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって生成された断片、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片を指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（DNAおよびRNAなど）もしくは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）である単量体、またはその両方の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、1つまたは複数のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置き換えが含まれ、または糖はエーテルもしくはエステルとして官能化され得る。さらに、糖部分の全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体などの、立体的かつ電子的に類似した構造で置き換えられ得る。塩基部分における修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはそのような結合に類似したものによって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい。
【０１３３】
‐「エンドヌクレアーゼ」という用語は、DNAまたはRNA分子、好ましくはDNA分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる、任意の野生型または変種酵素を指す。エンドヌクレアーゼは、その配列に関係なくDNAまたはRNA分子を切断するのではなく、特異的ポリヌクレオチド配列においてDNAまたはRNA分子を認識し切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、10塩基対 (bp) よりも長い、より好ましくは14〜55 bpのポリヌクレオチド認識部位を有する場合に、低頻度切断エンドヌクレアーゼとして分類され得る。低頻度切断ヌクレアーゼは、規定された遺伝子座におけるDNA二本鎖切断 (DSB) を誘導することによって、相同組換えを顕著に増加させ、それによって遺伝子修復または遺伝子挿入療法が可能になる (Pingoud, A. and G. H. Silva (2007). Precision genome surgery. Nat. Biotechnol. 25(7): 743-4.)。低頻度切断エンドヌクレアーゼの例は、例えばArnould S.ら (WO2004067736) によって記載されるホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばUrnov F.ら [Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases (2005) Nature 435:646-651] によって記載されるジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN)、例えばMussolinoら [A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity (2011) Nucl. Acids Res. 39(21):9283-9293] によって記載されるTALE-ヌクレアーゼ、例えばBoisselら [MegaTALs: a rare-cleaving nuclease architecture for therapeutic genome engineering (2013) Nucleic Acids Research 42 (4):2591-2601] によって記載されるMegaTALヌクレアーゼ、または、とりわけ、その教示が参照により本明細書に組み入れられるDoudna, J.ら [The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 (2014) Science 346 (6213):1077)] およびZetsche, B.ら [Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015) Cell 163(3): 759-771] による教示による、Cas9もしくはCpf1などのRNAガイドエンドヌクレアーゼである。
【０１３４】
-「切断」という用語は、ポリヌクレオチドの共有結合骨格の破壊を指す。切断は、典型的にエンドヌクレアーゼを用いる、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を含むがこれらに限定されない、種々の方法によって開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、2つの異なる一本鎖切断事象の結果とし起こり得る。二本鎖のDNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッドの切断は、平滑末端または付着末端 (staggered end) のいずれかの生成をもたらし得る。
【０１３５】
‐「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的DNA配列」、「核酸標的配列」、「標的配列」、または「プロセシング部位」とは、本発明による低頻度切断エンドヌクレアーゼによって標的とされプロセシングされ得るポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、細胞内の特定のDNAの位置、好ましくはゲノムの位置だけでなく、非限定的な例として、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、またはミトコンドリアのような細胞小器官内の遺伝物質などの、遺伝物質の本体とは独立して存在し得る遺伝物質の部分も指す。RNAガイド標的配列の非限定的な例は、RNAガイドエンドヌクレアーゼを所望の遺伝子座に方向づけるガイドRNAとハイブリダイズし得るゲノム配列である。
【０１３６】
‐「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチド配列における最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、またはそれ以上の、ヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図する。変異は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を及ぼし得る。変異はまた、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造／安定性に影響を及ぼす場合もある。
【０１３７】
‐「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、それらが連結されている核酸の自己複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適切なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス (AAV)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）など、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルスおよびアルファウイルスなど、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
【０１３８】
‐本明細書で用いられる場合、「遺伝子座」という用語は、ゲノム中のDNA配列（例えば、遺伝子）の特定の物理的位置である。「遺伝子座」という用語は、染色体上または感染体ゲノム配列上の低頻度切断エンドヌクレアーゼ標的配列の特定の物理的位置を指し得る。そのような遺伝子座は、本発明による配列特異的エンドヌクレアーゼによって認識および／または切断される標的配列を含み得る。本発明の関心対象の遺伝子座は、細胞の遺伝物質の本体（すなわち、染色体）に存在する核酸配列だけでなく、非限定的な例として、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、またはミトコンドリアのような細胞小器官内の遺伝物質などの、遺伝物質の該本体とは独立して存在し得る遺伝物質の部分にも当てはまることが理解される。
【０１３９】
「細胞溶解活性」とは、前記CARを発現する免疫細胞によってもたらされる標的細胞の細胞溶解の割合を意味する。
【０１４０】
細胞傷害性を決定する方法を以下に記載する。
【０１４１】
接着標的細胞に関して：2 x 104個の特異的標的抗原 (STA) 陽性細胞またはSTA陰性細胞を、96ウェルプレートにおいてウェル当たり0.1 ml中に播種する。プレーティングの翌日に、STA陽性細胞およびSTA陰性細胞をCellTrace CFSEで標識し、4 x 105個のT細胞と4時間共培養する。次いで細胞を回収し、固定可能な生死判別色素 (eBioscience) で染色し、MACSQuantフローサイトメーター (Miltenyi) を用いて解析する。
【０１４２】
特異的溶解の割合は、以下の式：
2020519267.tif 000012
を用いて算出される。
【０１４３】
懸濁標的細胞に関して：STA陽性細胞およびSTA陰性細胞をそれぞれ、CellTrace CFSEおよびCellTrace Violetで標識する。96ウェルプレートにおいてウェル当たり0.1ml中で、約2 x 104個のROR1陽性細胞を2 x 104個のSTA陰性細胞と4 x 105個のT細胞と共培養する。4時間のインキュベーション後、細胞を回収し、固定可能な生死判別色素 (eBioscience) で染色し、MACSQuantフローサイトメーター (Miltenyi) を用いて解析する。
【０１４４】
特異的溶解の割合は、上記の式を用いて算出される。
【０１４５】
「特異的標的抗原 (STA) 陽性細胞」は、キメラ抗原受容体が特異性を示す標的抗原を発現する細胞を意味するのに対して、「STA陰性細胞」は、その特異的標的抗原を発現しない細胞を意味する。非限定的な例として、CARがCD19に対して向けられたものである場合、特異的標的抗原はCD19である。したがって、細胞溶解活性を決定するには、CD19陽性細胞およびCD19陰性細胞が用いられるべきである。
【０１４６】
それ故に、上記の細胞傷害アッセイは、免疫細胞によって発現されるキメラ抗原受容体の抗原特異性に応じて、それぞれの標的細胞に適応させる必要があろう。
【０１４７】
細胞溶解活性をアッセイするための同様の方法は、例えばValton et al. (2015) またはPoirot et al. (2015) にも記載されている。
【０１４８】
ある特定の態様によると、本発明によるキメラ抗原受容体は、それを発現する免疫細胞の多量体化リガンドの非存在下での細胞溶解活性と比較して、対応する多量体化リガンドの存在下では、調節された細胞溶解活性を該免疫細胞に付与する。
【０１４９】
「増加した細胞溶解活性」とは、多量体化リガンドの非存在下で前記CARを発現する免疫細胞によりもたらされる標的細胞の細胞溶解%と比較して、多量体化リガンドの存在下では、該免疫細胞によりもたらされる標的細胞の細胞溶解%が少なくとも10%、例えば少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも100%など増加することを意味する。
【０１５０】
‐「同一性」は、2つの核酸分子またはポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列中のある位置が同一の塩基によって占有される場合、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、核酸配列に共通の位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。2つの配列間の同一性を算出するには、GCG配列解析パッケージ（University of Wisconsin、Madison, Wis.）の一部として利用可能であるFASTAまたはBLASTを含む、様々な整列アルゴリズムおよび／またはプログラムを用いることができ、それらは例えばデフォルト設定で用いることができる。例えば、本明細書に記載される特定のポリペプチドとの少なくとも70%、85%、90%、95%、98%、または99%の同一性を有し、かつ好ましくは実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。
【０１５１】
‐本明細書で用いられる「対象」または「患者」という用語は、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全メンバーを含む。
【０１５２】
‐本発明の上記の説明は、当技術分野のいかなる当業者も本発明を作製し使用することができるように、それを作製し使用する様式および過程を提供しており、この実施可能性は、詳細には、当初明細書の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために提供される。
【０１５３】
数値的な限界または範囲が本明細書において記載される場合には、終点が含まれる。また、数値的な限界または範囲内の値および部分範囲はすべて、あたかも明確に書き出されたかのように、具体的に含まれる。
【０１５４】
本発明を一般的に説明してきたが、さらなる理解は、ある特定の具体例を参照することにより得ることができ、これらの具体例は、単なる例示のために本明細書において提供され、特許請求される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１５５】
実施例1.
小分子ベースの分解特性を備えたCARを発現する初代T細胞の形質導入を考慮して、ポリヌクレオチド配列を集めてレンチウイルスベクターを構築した。
【０１５６】
C末端の小分子ベースの制御性分解部分を備えたCARをコードするレンチウイルスベクター
以下の構造（N末端からC末端へ）のように、自己切除デグロンを含むCARを設計した：
(1) T細胞表面糖タンパク質CD8α鎖に由来する、細胞表面を標的とするためのシグナルペプチド (SEQ ID NO: 21)、
(2) それぞれ抗CD123抗体および抗CD22抗体に由来する抗原結合ドメイン (ScFv)（SEQ ID NO: 22およびSEQ ID NO: 23）、
(3) T細胞表面糖タンパク質CD8α鎖に由来するストーク（またはヒンジ）ドメイン (SEQ ID NO: 24)、
(4) T細胞表面糖タンパク質CD8α鎖に由来する膜貫通ドメイン (SEQ ID NO: 25)、ならびに
(5) それ自体が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9に由来する共刺激部分 (SEQ ID NO: 27)、およびT細胞表面糖タンパク質CD3ζ鎖に由来するITAMベースの活性化部分 (SEQ ID NO: 28) を含む、細胞内ドメイン (SEQ ID NO: 26)。
【０１５７】
上記の(1) から (6) の配列は、免疫細胞の表面において発現されるべき活性CARを形成し、それらはその3'末端（C末端）において、自己切除デグロンを形成する以下のポリヌクレオチド配列に融合される：
(6) プロテアーゼ標的部位 (SEQ ID NO: 29)、
(7) リンカー／タグ (SEQ ID NO: 30)、
(8) NS3プロテアーゼドメインに由来するプロテアーゼ (SEQ ID NO: 31)、
(9) NS3プロテアーゼドメインまたはNS4Aタンパク質に由来するデグロン (SEQ ID NO: 32)、それぞれpCLS29306（C-terデグロンCAR 抗CD123‐SEQ ID NO: 33）およびpCLS30066（C-terデグロンCAR 抗CD22‐SEQ ID NO: 34）をもたらす。
【０１５８】
製造業者の説明書に従って、PCR（AgilentヘラクレスII融合酵素 cat#600677）、酵素制限消化（New England BiolabsまたはThermoFisher）、ライゲーション（T4 DNAリガーゼ cat#EL0011）、および細菌形質転換（XL1b、Agilent cat#200236またはOne shot Stbl3、ThermoFisher cat#C7373-03）などの標準的な分子生物学技法を用いて、結果として得られたポリヌクレオチド配列（図4Aに示される）をレンチウイルス産生プラスミド（ゲノムプラスミド）のSFFVプロモーター (SEQ ID NO: 15) の制御下にクローニングする。
【０１５９】
CAR融合配列の完全性を、Sanger DNA配列決定 (GenScript) により検証した。レンチウイルス粒子の調製に用いられるプラスミドは、One shot Stbl3形質転換から得て、Nucleobond Maxi Xtra EFキット (Macherey-Nagel cat#740424.50) を用いて精製した。レンチウイルス粒子は、標準的なトランスフェクション手順に従ってOpti-MEM培地 (Gibco cat#31985-062) およびLipofectamine 2000 (Thermo Fisher cat# 11668-019) を用いて、10% FBS (Gibco cat# 10091-148)、1% HEPES (Gibco cat#15630-80)、1% L-グルタミン (Gibco cat# 35050-61)、および1% ペニシリン／ストレプトマイシン (Gibco cat#15070-063) を補充したRPMI 1640培地 (ThermoFisher cat#SH30027FS) 中で培養した293FT細胞 (ThermoFisher) において作製する。トランスフェクションの48時間後および／または72時間後に、ウイルス粒子を含む上清を回収し、超遠心分離によって濃縮する。
【０１６０】
N末端の小分子ベースの制御性分解部分を備えたCARをコードするレンチウイルスベクター
以下の構造を有する、CAR領域およびそのN末端に自己切除デグロンを含む、さらなるCARを構築した：
(1) T細胞表面糖タンパク質CD8α鎖に由来する、細胞表面を標的とするためのシグナルペプチド (SEQ ID NO: 21)、
(2) それぞれ抗CD22抗体に由来する抗原結合ドメイン (ScFv)(SEQ ID NO: 23）、
(3) T細胞表面糖タンパク質CD8α鎖に由来するストーク（またはヒンジ）ドメイン (SEQ ID NO: 24)、
(4) T細胞表面糖タンパク質CD8α鎖に由来する膜貫通ドメイン (SEQ ID NO: 25)、ならびに
(5) それ自体が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9に由来する共刺激部分 (SEQ ID NO: 27)、およびT細胞表面糖タンパク質CD3ζ鎖に由来するITAMベースの活性化部分 (SEQ ID NO: 28) を含む、細胞内ドメイン (SEQ ID NO: 26)。
【０１６１】
上記の(1) から (6) のポリヌクレオチド配列は、その5'末端（N末端）において、自己切除デグロンを形成する以下のポリヌクレオチド配列に融合される：
‐プロテアーゼ標的部位 (SEQ ID NO: 29)、
‐リンカー／タグ (SEQ ID NO: 30)、
‐NS3プロテアーゼドメインに由来するプロテアーゼ (SEQ ID NO: 31)、
‐NS3プロテアーゼドメインまたはNS4Aタンパク質に由来するデグロン (SEQ ID NO: 27)、pCLS30018（N-terデグロン-CAR 抗CD22‐SEQ ID NO: 28）をもたらす。
【０１６２】
製造業者の説明書に従って、PCR（AgilentヘラクレスII融合酵素 cat#600677）、酵素制限消化（New England BiolabsまたはThermoFisher）、ライゲーション（T4 DNAリガーゼ cat#EL0011）、および細菌形質転換（XL1b、Agilent cat#200236またはOne shot Stbl3、ThermoFisher cat#C7373-03）などの標準的な分子生物学技法を用いて、結果として得られたポリヌクレオチド配列（図4Bに示される）をレンチウイルス産生プラスミド（ゲノムプラスミド）のSFFVプロモーター (SEQ ID NO: 35) の制御下にクローニングする。
【０１６３】
CAR融合配列の完全性を、Sanger DNA配列決定 (GenScript) により検証した。レンチウイルス粒子の調製に用いられるプラスミドは、One shot Stbl3形質転換から得て、Nucleobond Maxi Xtra EFキット (Macherey-Nagel cat#740424.50) を用いて精製した。レンチウイルス粒子は、標準的なトランスフェクション手順に従ってOpti-MEM培地 (Gibco cat#31985-062) およびLipofectamine 2000 (Thermo Fisher cat# 11668-019) を用いて、10% FBS (Gibco cat# 10091-148)、1% HEPES (Gibco cat#15630-80)、1% L-グルタミン (Gibco cat# 35050-61)、および1% ペニシリン／ストレプトマイシン (Gibco cat#15070-063) を補充したRPMI 1640培地 (ThermoFisher cat#SH30027FS) 中で培養した293FT細胞 (ThermoFisher) において作製する。トランスフェクションの48時間後および／または72時間後に、ウイルス粒子を含む上清を回収し、超遠心分離によって濃縮する。
【０１６４】
実施例において用いられたポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチド配列を、以下の表10に詳述する。
【０１６５】
（表１０）実施例1〜4において用いられたポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列
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【０１６６】
実施例2.
初代ヒトT細胞におけるC末端融合CARの表面発現の特徴づけ
末梢血単核細胞 (PBMC) を融解し、5% AB血清 (Seralab cat#GEM-100-318) および20 ng/ml IL-2 (Miltenyi Biotech cat#130-097-748) を補充したX-vivo-15培地 (Lonza cat#BE04-418Q) 中に1x106個細胞／mlでプレーティングして、37℃で一晩培養した。5% AB血清および20 ng/ml IL-2を補充したX-vivo-15培地中で、ヒトT活性化因子CD3/CD28 (Life Technology cat#11132D) を用いてPBMCを活性化した。
【０１６７】
活性化された時点で直ちに、1x106個の活性化PBMC（600μl中）を、30μg/mLレトロネクチン (Takara cat#T100B) で予めコーティングされた未処理の12ウェルプレート中で、ビーズを除去することなく、デグロンCARをコードする実施例1で調製されたレンチウイルス粒子の存在下で、37℃で2時間インキュベートした。次いで600μlの2x X-vivo-15培地（X-vivo-15、10% AB血清および40ng/ml IL-2）を添加し、細胞をさらに37℃で72時間インキュベートした。形質導入の3〜5日後に、T細胞を500 nMアスナプレビルと共に、またはそれなしで48時間インキュベートした。次いで、その表面においてCARを発現するT細胞の割合を、CARに標的とされる標識組換えタンパク質CD22またはCD123 (LakePharma) を用いて定量化した。
【０１６８】
結果から、形質導入されたT細胞集団の表面におけるCARの提示が、アスナプレビルによって制御されるのに対して（図6）、自己切除デグロンを欠いている対照CARはアスナプレビルに反応しないことが示された。
【０１６９】
実施例3.
アスナプレビルプロテアーゼ阻害剤の添加による、初代ヒトT細胞におけるC末端融合デグロンCARの細胞溶解特性の特徴づけ
PBMCを融解し、5% AB血清 (Seralab cat#GEM-100-318) および20 ng/ml IL-2 (Miltenyi Biotech cat#130-097-748) を補充したX-vivo-15培地 (Lonza cat#BE04-418Q) 中に1x106個細胞／mlでプレーティングして、37℃で一晩培養する。5% AB血清および20 ng/ml IL-2を補充したX-vivo-15培地中で、ヒトT活性化因子CD3/CD28 (Life Technology cat#11132D) を用いてPBMCを活性化した。活性化された時点で直ちに、1x106個の活性化PBMC（600μl中）を、30μg/mLレトロネクチン (Takara cat#T100B) で予めコーティングされた未処理の12ウェルプレート中で、ビーズを除去することなく、実施例1の操作されたCARをコードするレンチウイルス粒子の存在下で、37℃で2時間インキュベートした。次いで600μlの2x X-vivo-15培地（X-vivo-15、10% AB血清および40ng/ml IL-2）を添加し、細胞を37℃で72時間インキュベートする。形質導入されたT細胞（1.5E6個の細胞）を、12ウェルプレートにおいて、CAR標的抗原を提示し、かつルシフェラーゼを発現する標的細胞 (Raji)（0.5E6個の細胞）と3:1の比率で、500 nMのアスナプレビル（Apexbio TechnologyまたはMedChem Express）を補充したまたは補充していない完全X-vivo-15培地中でインキュベートした。24時間後、細胞をペレット化し、ルシフェラーゼ定量化のために上清を収集し、ペレット化された細胞を（500 nMアスナプレビルを補充したまたは補充していない）新鮮な完全X-vivo中に再懸濁し、0.5x106個の標的細胞（CD22陽性細胞）を添加した。この段階を連続3日間繰り返した。結果から、形質導入されたT細胞におけるCAR細胞溶解特性（CD22陽性細胞の死滅）が維持され、アスナプレビルを用いて負に制御され得ることが示された（図6）。
【０１７０】
実施例4.
アスナプレビルプロテアーゼ阻害剤の洗浄除去後の、初代ヒトT細胞におけるC末端融合デグロンCARの細胞溶解特性の特徴づけ
実施例3において記載されたように、実施例3において記載された操作された抗CD22デグロンCARをPBMCに形質導入し、500 nMのアスナプレビル（Apexbio TechnologyまたはMedChem Express）を補充したまたは補充していない完全X-vivo-15培地中でインキュベートした。72時間後、最初に500 nMのアスナプレビルと共にインキュベートした細胞の一部画分を洗浄し、完全X-vivo-15（X-vivo-15、5% AB血清および20ng/ml IL-2）培地中で37℃でインキュベートする（細胞傷害アッセイの48時間前の洗浄除去ポイントに相当する）。96時間後、最初に500 nMのアスナプレビルと共にインキュベートした細胞の別の画分を洗浄し、完全X-vivo-15培地中で37℃でインキュベートする（細胞傷害アッセイの24時間前の洗浄除去ポイントに相当する）。120時間後、最初に500 nMのアスナプレビルと共にインキュベートした細胞の別の画分を洗浄し、完全X-vivo-15培地中で37℃でインキュベートする（細胞傷害アッセイ時の洗浄除去ポイントに相当する）。細胞の一部画分は、500 nMのアスナプレビル下で維持する（洗浄除去なしポイントに相当する）。
【０１７１】
形質導入されたT細胞の異なる画分を、12ウェルプレートにおいて、CAR標的抗原を提示し、かつルシフェラーゼを発現する標的細胞 (Raji) と3:1の比率で、500 nMのアスナプレビル（Apexbio TechnologyまたはMedChem Express）を補充した（洗浄除去なしポイント）または補充していない（他のすべてのポイント）完全X-vivo-15培地中でインキュベートする。24時間後、細胞をペレット化し、ルシフェラーゼ定量化のために上清を収集する。結果から、アスナプレビルが徐々に減少するとCAR活性が増加することから、CAR細胞溶解特性が可逆的様式でアスナプレビルによって制御されることが示された（図8Aおよび8B）。
【０１７２】
実施例5.
アスナプレビル (ASN) プロテアーゼ阻害剤のT細胞増殖
T細胞を、様々な用量（0〜1000 nM）のアスナプレビルプロテアーゼ阻害剤の存在下で、5% ヒト血清hAB (Gemini) および20 ng/ml IL-2 (Miltenyi) を補充したX-Vivo 15 (Lonza) 中で1x106個細胞／mlの密度で培養した。
【０１７３】
結果から、100 nM〜1μM ASNによる処理後に、T細胞の増殖および生存率に対して小分子ASNの影響がないことが示された（図9）。
【０１７４】
実施例6.
アスナプレビルプロテアーゼ阻害剤の存在下でのサイトカインプロファイリング
12ウェル培養プレートにおいて、様々な濃度のASNの存在下で、T細胞をRaji標的細胞と24時間共培養した。細胞を遠心沈殿させ、上清を分注して凍結した。上清中のサイトカインレベルを、LEGEND plexヒトThサイトカインパネル (Biolegend) を用いて測定した。
【０１７５】
結果から、ASNによる処理がサイトカイン産生の著しい変動（増加または減少）を引き起こさないことが示された（図10）。
【０１７６】
実施例7.
初代ヒトT細胞におけるC末端融合CARの表面発現の特徴づけ
PBMCを融解し、5% AB血清 (Seralab cat#GEM-100-318) および20 ng/ml IL-2 (Miltenyi Biotech cat#130-097-748) を補充したX-vivo-15培地 (Lonza cat#BE04-418Q) 中に1x106個細胞／mlでプレーティングして、37℃で一晩培養する。
【０１７７】
5% AB血清および20 ng/ml IL-2を補充したX-vivo-15培地中で、ヒトT活性化因子CD3/CD28 (Life Technology cat#11132D) を用いてPBMCを活性化する。1x106個の活性化PBMC（600μl中）を直ちに、30μg/mLレトロネクチン (Takara cat#T100B) で予めコーティングされた未処理の12ウェルプレート中で、ビーズを除去することなく、操作されたSWOFF 抗CD22CAR (SEQ ID NO:68) をコードするレンチウイルス粒子の漸増量の存在下で、37℃で2時間インキュベートする。次いで600μlの2 x X-vivo-15培地（X-vivo-15、10% AB血清および40ng/ml IL-2）を添加し、細胞を37℃で72時間インキュベートする。形質導入の3〜5日後に、T細胞を500 nMアスナプレビルと共に、またはそれなしで48時間インキュベートした。標識組換えタンパク質 (LakePharma) を用いて、表面CARの発現（平均蛍光強度 (MFI) によって測定された）を記録した。
【０１７８】
結果から、培養液中にASNを添加すると、CAR陽性集団のMFIが顕著に低下することが示された（図11）。
【０１７９】
実施例8.
操作されたCARのTRAC遺伝子座における組込み
標準的な分子生物学手順に従って、TRAC left homology (SEQ ID NO:60)、続いてHAタグ (SEQ ID NO:61)、続いてTCRリーディングフレームを回復させる2A「自己切断」ペプチド (SEQ ID NO:62)、続いてSWOFF 抗CD22 CAR (SEQ ID NO:63)、続いてBGHポリアデニル化シグナル (SEQ ID NO:64)、続いてTRAC right homology  (SEQ ID NO:65) をコードする、相同組換えのための修復マトリックス (SEQ ID NO:59) を設計して組み立て、組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV6) の産生を可能にするベクター中にクローニングした（図12）。異なる配列を表11において報告する。
【０１８０】
ヒトPBMCを融解し、5% hAB血清 (Gemini) またはCTS免疫細胞SR (ThermoFisher) および20 ng/ml IL-2 (Miltenyi Biotech) を補充したX-vivo 15培地 (Lonza) 中に1x106個細胞／mlでプレーティングして、37℃で一晩培養した。翌日、PBMCをヒトT活性化因子CD3/CD28 (Life Technology) を用いて活性化し、5% hAB血清またはCTS免疫細胞SRおよび20 ng/ml IL-2を補充したX-vivo-15培地中で、1x106個細胞／mlの密度で3日間培養した。
【０１８１】
次いで、トランスフェクション／形質導入の前日に、T細胞を完全培地中で1x106個細胞／mlで継代した。トランスフェクション／形質導入の当日、細胞から磁気分離 (EasySep) によってビーズを除去し、Cytoporation緩衝液T（BTX Harvard Apparatus、Holliston, Massachusetts）で2回洗浄し、同じ溶液中に28x106個細胞／mlの最終濃度で再懸濁した。細胞懸濁液を、TALE-ヌクレアーゼアームのヘテロ二量体ポリペプチド（それぞれSEQ ID NO:69およびSEQ ID NO:70）をコードする2.5μg mRNAと、200μlの最終容量中で混合した。トランスフェクションはPulse Agile技術を用いて行い、0.4cmギャップキュベット中で最終容量200μlのCytoporation緩衝液T（BTX Harvard Apparatus、Holliston, Massachusetts）中、3,000 V/cmの0.1 mSパルスを2回適用し、続いて325 V/cmの0.2 mSパルスを4回適用した。
【０１８２】
次いで、エレクトロポレーションされた細胞を、予め加温したX-vivo-15無血清培地1 mlを含む12ウェルプレートに直ちに移し、37℃で15分間インキュベートした。次いでこの細胞を、96ウェル丸底プレートにおいて全容量20μlの無血清培地中、AAVと共に10,000個細胞／ウェルの濃度でプレーティングした（MOI：1 x105 vg／細胞）。30℃で2時間培養した後、10% hAB血清および40 ng/ml IL-2を補充した25μLのXvivo-15培地を細胞懸濁液に添加し、混合液を37℃の同じ培養条件において20時間インキュベートした。次いで、100μLの新鮮な完全培地を添加した。形質導入の6日後に、0.5x106個の細胞をG-Rex 24ウェルプレート (Wilson Wolf) において5 mlの完全X-vivo-15培地中に播種し、11日間培養した。
【０１８３】
形質導入されたT細胞（1.5x106個の細胞）を、12ウェルプレートにおいて、CAR標的抗原を提示し、かつルシフェラーゼを発現する標的細胞 (Raji)（0.5x106個の細胞）と3:1（T細胞：標的）の比率で、1〜500 nM アスナプレビル（Apexbio TechnologyまたはMedChem Express）を補充したまたは補充していない、5% hAB血清を含み、Il-2を欠くX-vivo-15培地中でインキュベートした。24時間後、細胞を収集して混合し、100 ulの細胞をルシフェラーゼ定量化（OneGlo、Promega）に用いた。残りの細胞をペレット化し、（1〜500 nMアスナプレビルを補充したまたは補充していない）5% hAB血清を含み、Il-2を含まない新鮮なX-vivo 15培地中に再懸濁し、付加的な0.5x106個の標的細胞を添加した。この段階を連続3日間繰り返した。
【０１８４】
結果から、効率的なTRACノックアウトおよびTRAC遺伝子座におけるCAR組込みが示された（図13）。結果から、CAR-T細胞の細胞溶解特性がアスナプレビルの添加によって制御され（図14）、IC50が約15 mMであり（図15）、ASNを投与された齧歯類、イヌ、およびヒトの血漿中で報告された濃度の範囲内であることもまた示された。
【０１８５】
（表１１）実施例8において用いられたポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列
2020519267.tif 000020
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2020519267.tif 000031
【図５】
2020519267.tif 000032
【図６】
2020519267.tif 000033
【図７】
2020519267.tif 000034
【図８】
2020519267.tif 000035
【図９】
2020519267.tif 000036
【図１０】
2020519267.tif 000037
【図１１】
2020519267.tif 000038
【図１２】
2020519267.tif 000039
【図１３】
2020519267.tif 000040
【図１４】
2020519267.tif 000041
【図１５】
2020519267.tif 000042
【配列表】
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【国際調査報告】
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