(57)【要約】本開示は、膀胱がん患者をモニタリングし、メチル化ＤＮＡおよび必要に応じて特定の遺伝子突然変異の存在について、患者試料を分析する方法に関する。一部の実施形態では、分析結果は、膀胱がん再発リスクなどの臨床評価項目と相関する。上記方法は、例えば、患者から尿沈渣試料を得ることと；試料由来のＤＮＡを重亜硫酸塩変換することと；重亜硫酸塩変換ＤＮＡに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲを実施して、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子を含む遺伝子のセットから、試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を決定することとを含み得る。
2020519296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱がんを有する患者をモニタリングする方法であって、
前記患者から尿沈渣試料を得ることと、
前記試料由来のＤＮＡを重亜硫酸塩変換することと、
重亜硫酸塩変換ＤＮＡに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲを実施して、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットから、前記試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を決定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記患者が、筋層非浸潤性膀胱がんを有すると診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者の腫瘍が、Ｔａ、Ｔｉｓ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａもしくは異型度が低いと以前に診断されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
患者の腫瘍が、Ｔ１もしくは異型度が高い；またはＴ１、Ｔｉｓ、もしくは異型度が高い；またはＴ１〜Ｔ２もしくは異型度が高い；またはＴｉｓ、Ｔ１〜Ｔ２、もしくは異型度が高いと以前に診断されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、筋層浸潤性膀胱がんを有すると診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
膀胱鏡検査の前に行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
陰性の膀胱鏡検査後に行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１年に少なくとも１回、例えば、６カ月に１回、または３カ月に１回行われる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも４つの遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子の前記セットが、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ
のうちの１つを含む、請求項１から８または１０から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ；
のうちの１つ、ならびに
少なくとも１つの基準遺伝子
からなる、請求項１から８または１０から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者における再発リスクを決定すること、前記患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と比較することをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴのうちの１つまたは両方の突然変異について、重硫酸塩変換ＤＮＡを分析することをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴにおける突然変異の有無を膀胱がん患者の基準セットの突然変異の有無と比較することをさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
再発低リスクを有する膀胱がん患者を処置する方法であって、
前記患者から尿沈渣試料を得ることと、
前記試料由来のＤＮＡを重亜硫酸塩変換することと、
重亜硫酸塩変換ＤＮＡに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲを実施して、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットから、前記試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を決定することと、
前記患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と比較することによって、患者が再発低リスクを有することを決定することと、
積極的監視により、前記患者を処置すること
とを含む、方法。
【請求項１９】
積極的監視による前記処置によって、前記患者に対する膀胱鏡検査の頻度を低減することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が、筋層非浸潤性膀胱がんを有すると診断されている、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
患者の腫瘍が、Ｔａ、Ｔｉｓ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａもしくは異型度が低いと以前に診断されている、請求項１２０に記載の方法。
【請求項２２】
患者の腫瘍が、Ｔ１もしくは異型度が高い；またはＴ１、Ｔｉｓ、もしくは異型度が高い；またはＴ１〜Ｔ２もしくは異型度が高い；またはＴｉｓ、Ｔ１〜Ｔ２、もしくは異型度が高いと以前に診断されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
膀胱鏡検査の前に行われる、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
陰性の膀胱鏡検査後に行われる、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも４つの遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２を含む、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３を含む、請求項１８から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子の前記セットが、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに含む、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ
のうちの１つを含む、請求項１８から２４または２６から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ；
のうちの１つ、ならびに
少なくとも１つの基準遺伝子
からなる、請求項１８から２４または２６から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴのうちの１つまたは両方の突然変異について、重硫酸塩変換ＤＮＡを分析することをさらに含む、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴにおける突然変異の有無を膀胱がん患者の基準セットの突然変異の有無と比較することをさらに含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
膀胱がん患者由来の尿沈渣試料におけるＤＮＡメチル化を定量するためのシステムであって、（ａ）少なくとも１つのウェルを備えた少なくとも１つのカートリッジであって、前記少なくとも１つのウェルが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡの増幅のためのプライマーを含み、前記カートリッジが、前記遺伝子に対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成され、前記プライマーが前記少なくとも１つのウェルに必要に応じて結合されている、カートリッジ、（ｂ）各遺伝子由来の増幅ＤＮＡを検出するための検出装置、ならびに（ｃ）前記遺伝子由来のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を定量するためのコンピューターソフトウェアであって、前記患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と必要に応じて比較するソフトウェアを含むシステム。
【請求項３４】
前記カートリッジが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記カートリッジが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
前記カートリッジが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項３３、３４、または３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記カートリッジが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つを含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３８】
前記カートリッジが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つからなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、請求項３３から３８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４０】
前記プライマーが、少なくとも１つのウェルに結合されている、請求項３３から３９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４１】
前記カートリッジが、ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む、請求項３３から４０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法を実施することができる、請求項３３から４２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡの増幅のためのプライマーを含む少なくとも１つのウェルを含むカートリッジであって、前記カートリッジが、前記遺伝子に対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成され、前記プライマーが、前記少なくとも１つのウェルに必要に応じて結合されている、カートリッジ。
【請求項４５】
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項４４に記載のカートリッジ。
【請求項４６】
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項４４に記載のカートリッジ。
【請求項４７】
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項４４、４５、または４６に記載のカートリッジ。
【請求項４８】
以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つを含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項４４に記載のカートリッジ。
【請求項４９】
以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つからなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項４４に記載のカートリッジ。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、請求項４４から４９のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項５１】
前記プライマーが、前記少なくとも１つのウェルに結合されている、請求項４４から５０のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項５２】
ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を決定するための試薬をさらに含む、請求項４４から５１のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項５３】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項５２に記載のカートリッジ。
【請求項５４】
請求項４４から５３のいずれか一項に記載のカートリッジ、ならびに以下の：（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；ならびに（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のうちの少なくとも１つをさらに含むキット。
【請求項５５】
（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；および（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のそれぞれを含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
少なくとも１つの検出試薬をさらに含む、請求項５４または５５に記載のキット。
【請求項５７】
ＤＮＡの重亜硫酸塩変換のための少なくとも１つの試薬をさらに含む、請求項５４から５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む、請求項５４から５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
使用のための説明書をさらに含む、請求項５４から５９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６１】
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのプライマーのセットを含む組成物。
【請求項６２】
前記遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
前記遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む、請求項６１から６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
（ａ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；または
（ｉ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲのためのプライマーのセットを含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６６】
（ａ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；または
（ｉ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
からなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲのためのプライマーのセットを含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６７】
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、請求項６１から６６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む、請求項６１から６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
以下の：（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項６１から６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；ならびに（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のそれぞれを含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
少なくとも１つの検出試薬をさらに含む、請求項７０または７１に記載の組成物。
【請求項７３】
ＤＮＡの重亜硫酸塩変換のための少なくとも１つの試薬をさらに含む、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示は、膀胱がん患者をモニタリングし、メチル化ＤＮＡおよび必要に応じて特定の遺伝子突然変異の存在について、患者試料を分析する方法に関する。一部の実施形態では、分析結果は、膀胱がん再発リスクなどの臨床評価項目（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｍｅａｓｕｒｅｓ）と相関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
膀胱がんは、工業先進国において最も一般的ながんのうちの１つであり、診断およびモニタリングに最も費用のかかるがんのうちの１つである（R.  Siegelら、CA  Cancer  J  Clin  ６３巻：１１〜３０頁（２０１３年）を参照のこと；および、例えば、T.  Reinert  Adv.  Urol.、論文番号５０３２７１、doi:10.1155/2012/503271、１〜１１頁（２０１２年）を参照のこと；A.  Feberら、Clin.  Epigenetics  ９巻:８  doi：10.1186/s13148-016-0303-5（２０１７年）も参照のこと）。例えば、新たな症例の大多数は、転移の確率が低い筋層非浸潤性膀胱がんを呈するが、より侵襲性の疾患（例えば、異型度が高い、筋層浸潤性の疾患）へと進行する可能性も依然として存在し、疾患のより侵襲性の形態の進展について患者をモニタリングするには、かなり長期間にわたって高価かつ浸潤性の膀胱鏡検査手順に関する頻度の高い監視が必要とされる（例えば、５年またはそれより長期）。（例えば、M.  Babjukら  Eur.  Urol.  ５９巻：９９７〜１００８頁（２０１１年）；B.W.  van  Rhijnら、Eur.  Urol.  ５６巻：４３０〜４２頁（２００９年）；M.F.  Bottemanら、Pharmacoeconomics  ２１巻：１３１５〜３０頁（２００３年）を参照のこと）。例えば、膀胱鏡検査は、一部の患者では、初診で実施され、次いで、次は、外科的処置の３カ月後、陰性であれば、次いで、９カ月から１年の間隔後に次の５年間実施され得る。ある特定の高リスクの患者では、手術後２年まで３カ月毎に、次の３年間は６カ月毎に、次いで、その後は毎年、膀胱鏡検査が実施され得る。（Reinert、１頁を参照のこと）。よって、非浸潤性の診断検査は、患者の再発リスクの状態に関する情報をさらに提供し得るため、例えば、この積極的監視処置期間の膀胱鏡検査に加えて、役立つ場合がある。膀胱がんの診断検査についての１つの目的はまた、積極的監視中の膀胱鏡検査をなくすかまたは頻度を減らすことができるようにすることである。
以前の研究では、メチル基がＣｐＧジヌクレオチドストレッチのシトシンの５番目の炭素に付加されるＤＮＡメチル化が、いわゆるヒトゲノムのＣｐＧアイランドと同様に、遺伝子コード配列の内部でも起こり得ることが示されている。一般的に、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧジヌクレオチドは、正常細胞ではメチル化されておらず、一方、遺伝子コード領域における単離された配列ストレッチに見られるＣｐＧジヌクレオチドは、正常細胞でメチル化され得る。ＣｐＧアイランド領域の外側のＣｐＧジヌクレオチドは、正常細胞と比較して、がん細胞ではほとんどメチル化されることがない。（Reinertの４頁を参照のこと）。いくつかの研究によって、膀胱がん細胞が尿中にＤＮＡを「リークする」こと、およびこのＤＮＡを、尿試料中の遺伝子のメチル化を検査することによって検出できることが示されてきた。（同上  ４〜５頁の表３）。本開示は、ＤＮＡメチル化および尿沈渣試料由来の遺伝子突然変異の存在の検査から、膀胱がん患者の再発リスクを評価するための遺伝子セットおよびアルゴリズムについて記載する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】R.  Siegelら、CA  Cancer  J  Clin  ６３巻：１１〜３０頁（２０１３年）
【非特許文献２】T.  Reinert  Adv.  Urol.、論文番号５０３２７１、doi:10.1155/2012/503271、１〜１１頁（２０１２年）
【非特許文献３】A.  Feberら、Clin.  Epigenetics  ９巻:８  doi：10.1186/s13148-016-0303-5（２０１７年）
【非特許文献４】M.  Babjukら  Eur.  Urol.  ５９巻：９９７〜１００８頁（２０１１年）
【非特許文献５】B.W.  van  Rhijnら、Eur.  Urol.  ５６巻：４３０〜４２頁（２００９年）
【非特許文献６】M.F.  Bottemanら、Pharmacoeconomics  ２１巻：１３１５〜３０頁（２００３年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
この出願は、膀胱がんを有する患者をモニタリングする方法であって、例えば、患者から尿沈渣試料を得ることと；試料由来のＤＮＡを重亜硫酸塩変換することと；重亜硫酸塩変換ＤＮＡに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲを実施して、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットから、試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を決定することとを含む、方法を開示する。一部の実施形態では、患者は、筋層非浸潤性膀胱がんを有すると診断されている。一部の実施形態では、患者の腫瘍は、Ｔａ、Ｔｉｓ、Ｔ０、または異型度が低いと以前に診断されている。一部の実施形態では、患者の腫瘍は、Ｔ１または異型度が高いと以前に診断されている。一部の実施形態では、患者は、筋層浸潤性膀胱がんを有すると診断されている。一部の実施形態では、方法は、膀胱鏡検査の前に行われる。一部の実施形態では、方法は、陰性の膀胱鏡検査の後に行われる。一部の実施形態では、方法は、１年に少なくとも１回、例えば、６カ月に１回、または３カ月に１回、例えば、積極的な監視訪問の一部として行われる。
【０００５】
一部の実施形態では、少なくとも４つの遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２を含む。一部の実施形態では、基準遺伝子は、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、遺伝子のセットは、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子のセットは、少なくとも１つの基準遺伝子と一緒に、以下の遺伝子のセット：（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢのうちの１つを含む。一部の実施形態では、遺伝子のセットは、以下の遺伝子のセット：（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；および（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子のうちの１つからなる。
【０００６】
一部の実施形態では、方法は、患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と比較することを含む、患者における再発リスクを決定することまたは実際の再発の存在を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、患者は、再発低リスクを有すると以前に診断されており、例えば、この診断を確認するためおよび／または実際の再発が全く存在しないことを確認するために、方法が行われる。一部の実施形態では、患者は、ＴＵＲＢＴ、膀胱鏡検査由来の、または上部ＧＵ精密検査由来の組織を含む、Ｔａまたは異型度が低い腫瘍試料に基づいて、再発低リスクを有すると以前に決定されている。一部の実施形態では、低リスクの患者は、正常な膀胱鏡検査または異常な膀胱鏡検査のいずれかを有する。一部の実施形態では、低リスクの患者は、正常な細胞診または異常な細胞診のいずれかを有する。一部の実施形態では、患者は、再発高リスクを有すると以前に診断されており、例えば、この診断を確認するためおよび実際の再発が全く存在しないことを確認するために、方法が行われる。例えば、一部の実施形態では、患者は、ＴＵＲＢＴ、膀胱鏡検査由来の、または上部ＧＵ精密検査由来の組織を含む、異型度が高い、Ｔ１〜Ｔ２、またはＴｉｓ腫瘍試料に基づいて、再発高リスクを有すると以前に決定されている。一部の実施形態では、高リスクの患者は、正常な膀胱鏡検査または異常な膀胱鏡検査のいずれかを有する。一部の実施形態では、高リスクの患者は、正常な細胞診または異常な細胞診のいずれかを有する。
【０００７】
一部の実施形態では、方法は、ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴのうちの１つまたは両方における突然変異について、重硫酸塩（bisulfate）変換ＤＮＡを分析することをさらに含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３突然変異は、染色体の位置ｃｈ４：１８０３５６８にあり、ＴＥＲＴ突然変異は、染色体の位置ｃｈｒ５：１２９５２２８にある。一部の実施形態では、方法は、ＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴにおける突然変異の有無を膀胱がん患者の基準セットにおけるＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴ突然変異の出現率と比較することをさらに含む。
【０００８】
本開示は、再発低リスクを有する膀胱がん患者を処置する方法であって、例えば、患者から尿沈渣試料を得ることと；試料由来のＤＮＡを重亜硫酸塩変換することと；重亜硫酸塩変換ＤＮＡに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲを実施して、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットから、試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を決定することと；患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と比較することによって、患者が再発低リスクを有すると決定することと；積極的監視により、患者を処置することとを含む方法にも関する。一部の実施形態では、積極的監視に関する処置は、例えば、患者の低リスクの状態がこの方法によって確認される場合に、患者に対する膀胱鏡検査の頻度を低減することを含む。一部の実施形態では、患者は、筋層非浸潤性膀胱がんを有すると診断されている。一部の実施形態では、患者の腫瘍は、Ｔａ、Ｔｉｓ、Ｔ０、または異型度が低いと以前に診断されている。一部の実施形態では、患者の腫瘍は、Ｔ１または異型度が高いと以前に診断されている。一部の実施形態では、方法は、膀胱鏡検査の前に行われる。一部の実施形態では、方法は、陰性の膀胱鏡検査の後に行われる。
【０００９】
上記処置方法の一部の実施形態では、少なくとも４つの遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２を含む。一部の実施形態では、基準遺伝子は、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、遺伝子のセットは、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子のセットは、少なくとも１つの基準遺伝子と一緒に、以下の遺伝子のセット：（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢのうちの１つを含む。一部の実施形態では、遺伝子のセットは、以下の遺伝子のセット：（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；および（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子のうちの１つからなる。一部の実施形態では、方法は、ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴのいずれか１つまたは両方における突然変異について、重硫酸塩変換ＤＮＡを分析することをさらに含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３突然変異は、染色体の位置ｃｈ４：１８０３５６８にあり、ＴＥＲＴ突然変異は、染色体の位置ｃｈｒ５：１２９５２２８にある。一部の実施形態では、方法は、ＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴにおける突然変異の有無を膀胱がん患者の基準セットの突然変異の有無と比較することをさらに含む。
【００１０】
本開示は、膀胱がん患者由来の尿沈渣試料におけるＤＮＡメチル化を定量するためのシステムにも関する。一部の実施形態では、システムは、（ａ）少なくとも１つのウェルを備えた少なくとも１つのカートリッジであって、少なくとも１つのウェルが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡの増幅のためのプライマーを含み、カートリッジが、遺伝子に対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成され、プライマーが少なくとも１つのウェルに必要に応じて結合されている、カートリッジ、（ｂ）各遺伝子由来の増幅ＤＮＡを検出するための検出装置、ならびに（ｃ）遺伝子由来のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を定量するためのコンピューターソフトウェアであって、患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と必要に応じて比較するソフトウェアを含み得る。一部の実施形態では、カートリッジは、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている。一部の実施形態では、カートリッジは、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている。一部の実施形態では、カートリッジは、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている。一部の実施形態では、カートリッジは、以下の遺伝子のセット：（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子のうちの１つを含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている。一部の実施形態では、カートリッジは、以下の遺伝子のセット：（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；および（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子のうちの１つからなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている。一部の実施形態では、少なくとも１つの基準遺伝子は、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、プライマーは、カートリッジの少なくとも１つのウェルに結合している。一部の実施形態では、カートリッジは、ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３突然変異は、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、ＴＥＲＴ突然変異は、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である。一部の実施形態では、このシステムは、膀胱がん患者の尿沈渣試料におけるメチル化定量の上記方法の実施を可能とする。
【００１１】
本開示は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡの増幅のためのプライマーを含む少なくとも１つのウェルを含むカートリッジであって、カートリッジが、遺伝子に対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成され、プライマーが、少なくとも１つのウェルに必要に応じて結合されている、カートリッジにも関する。カートリッジは、上記システムの構成成分であってもよく、またはこれらは、上記システムと無関係であってもよい。例えば、カートリッジは、様々な検出装置およびシステムと共に作用するよう構成されていてもよい。一部の実施形態では、カートリッジは、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている。一部の実施形態では、遺伝子のセットは、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子のセットは、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む。一部の実施形態では、カートリッジは、以下の遺伝子のセット：（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子のうちの１つを含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている。一部の実施形態では、カートリッジは、以下の遺伝子のセット：（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；および（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子のうちの１つからなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている。一部の実施形態では、少なくとも１つの基準遺伝子は、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、プライマーは、カートリッジの少なくとも１つのウェルに結合している。一部の実施形態では、カートリッジは、ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３突然変異は、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、ＴＥＲＴ突然変異は、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である。上記カートリッジは、さらに上記の方法およびシステムにおいて使用されてもよい。
【００１２】
本開示は、上述のカートリッジを含むキットも企図する。キットは、以下の：（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；ならびに（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のうちの少なくとも１つをさらに含んでもよい。キットは、例えば、上述のシステムの構成成分であってもよく、この項の最初に記載した方法を実施するのに有用であり得る。一部の実施形態では、キットは、（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；ならびに（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のそれぞれを含む。一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つの検出試薬をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡの亜硫酸塩変換のための少なくとも１つの試薬をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む。一部のこのような実施形態では、ＦＧＦＲ３突然変異は、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、ＴＥＲＴ突然変異は、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である。キットは、本明細書では、使用のための説明書をさらに含んでもよい。
【００１３】
本明細書では、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのプライマーのセットを含む組成物も企図される。一部の組成物では、プライマーのセットは、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子からなる遺伝子の群のためのものである。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子からなる。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子からなる。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子からなる。本明細書の一部の組成物は：（ａ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｂ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｃ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｄ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｅ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｆ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｇ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｈ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；または（ｉ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットのメチル化特異的定量的ＰＣＲのためのプライマーのセットを含む。本明細書の一部の組成物は：（ａ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｂ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｃ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｄ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｅ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｆ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｇ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｈ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；または（ｉ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子からなる遺伝子のセットのメチル化特異的定量的ＰＣＲのためのプライマーのセットを含む。本明細書の一部の組成物では、少なくとも１つの基準遺伝子は、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む。本明細書の一部の組成物は、ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３突然変異は、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、ＴＥＲＴ突然変異は、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である。本明細書の一部の組成物は、以下の：（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のうちの少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；および（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のそれぞれを含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの検出試薬をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＤＮＡの重亜硫酸塩変換のための少なくとも１つの試薬をさらに含む。本明細書の組成物はさらに、上述のシステム、カートリッジ、およびキットの構成成分であってもよく、この項の最初に記載した方法において有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、以下の実施例３に記載したように、Ｍ１プラス突然変異アルゴリズムに従って、再発低リスクを有すると初期に診断された患者（「初期低リスク」患者）におけるメチル化ＤＮＡの量の分析についての性能概要を提供する。具体的には、図１は、陰性予測値（ＮＰＶ）、陽性予測値（ＰＰＶ）、感度、およびその初期低リスクプールにおいて、実際には再発高リスクを有する患者を予測するための具体的結果を提供する。
【図２】図２は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの量のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要のさらなるデータを提供する。具体的には、図２は、陰性予測値（ＮＰＶ）、陽性予測値（ＰＰＶ）、感度、および実際には再発の徴候を有するそれらの低リスクの患者を予測するための具体的データを提供する。
【図３−１】図３は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの量のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要の追加データを提供する。具体的には、図３は、図１および２のデータに基づく予測曲線およびＲＯＣ曲線を提供する。
【図３−２】図３は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの量のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要の追加データを提供する。具体的には、図３は、図１および２のデータに基づく予測曲線およびＲＯＣ曲線を提供する。
【図４】図４は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの量のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要を提供する。具体的には、図４は、陰性予測値（ＮＰＶ）、陽性予測値（ＰＰＶ）、感度、および実際には再発高リスクを有する、それらの高リスクの患者を予測するための具体的データを提供する。
【図５】図５は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの量のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要のさらなるデータを提供する。具体的には、図５は、陰性予測値（ＮＰＶ）、陽性予測値（ＰＰＶ）、感度、および実際には再発の徴候を有する、それらの高リスクの患者を予測するための具体的データを提供する。
【図６−１】図６は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの量のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要の追加データを提供する。具体的には、図６は、図４および５のデータに基づく予測曲線およびＲＯＣ曲線を提供する。
【図６−２】図６は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの量のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要の追加データを提供する。具体的には、図６は、図４および５のデータに基づく予測曲線およびＲＯＣ曲線を提供する。
【図７】図７は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの濃度のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要を提供する。具体的には、図１は、陰性予測値（ＮＰＶ）、陽性予測値（ＰＰＶ）、感度、および実際には再発高リスクを有する、それらの低リスクの患者を予測するための具体的データを提供する。
【図８】図８は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの濃度のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要のさらなるデータを提供する。具体的には、図８は、陰性予測値（ＮＰＶ）、陽性予測値（ＰＰＶ）、感度、および実際には再発の徴候を有する、それらの低リスクの患者を予測するための具体的データを提供する。
【図９−１】図９は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの濃度のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要の追加データを提供する。具体的には、図９は、図７および８のデータに基づく予測曲線およびＲＯＣ曲線を提供する。
【図９−２】図９は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発低リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの濃度のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要の追加データを提供する。具体的には、図９は、図７および８のデータに基づく予測曲線およびＲＯＣ曲線を提供する。
【図１０】図１０は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発高リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの濃度のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要を提供する。具体的には、図１０は、陰性予測値（ＮＰＶ）、陽性予測値（ＰＰＶ）、感度、および実際には再発高リスクを有する、それらの高リスクの患者を予測するための具体的データを提供する。
【図１１】図１１は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発高リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの濃度のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要のさらなるデータを提供する。具体的には、図１１は、陰性予測値（ＮＰＶ）、陽性予測値（ＰＰＶ）、感度、および実際には再発の徴候を有する、それらの高リスクの患者を予測するための具体的データを提供する。
【図１２−１】図１２は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発高リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの濃度のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要の追加データを提供する。具体的には、図１２は、図１０および１１のデータに基づく予測曲線およびＲＯＣ曲線を提供する。
【図１２−２】図１２は、以下の実施例３に記載したように、初期の再発高リスクの患者におけるメチル化ＤＮＡの濃度のＭ１プラス突然変異分析についての性能概要の追加データを提供する。具体的には、図１２は、図１０および１１のデータに基づく予測曲線およびＲＯＣ曲線を提供する。
【図１３】図１３は、本明細書に開示されているメチル化アッセイプロセスのステップのフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
定義
別段定義されていなければ、本明細書で使用される技術および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。Singletonら、Dictionary  of  Microbiology  and  Molecular  Biology  第２版、J.  Wiley  &  Sons（New  York、NY  １９９４年）、およびMarch、Advanced  Organic  Chemistry  Reactions,  Mechanisms  and  Structure  第４版、John  Wiley  &  Sons（New  York、NY  １９９２年）は、本出願で使用される多くの用語に対する一般的な指針を当業者に与える。
【００１６】
当業者は、本発明の実践において使用することができる、本明細書に記載のものと同様または等価な多くの方法および材料を認識するであろう。実際に、本発明は、本明細書に記載の方法および材料に決して限定されない。本発明の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
【００１７】
用語「腫瘍」および「病変」は、本明細書で使用する場合、悪性であるか良性であるかにかかわらず、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がんおよびがん細胞および組織を指す。当業者は、腫瘍組織試料が、複数の生体要素、例えば、１つもしくは複数のがん細胞、部分的もしくは断片化細胞、種々の病期の腫瘍、周囲の組織学的に正常と思われる組織、および／またはマクロもしくはミクロ解剖組織を含んでもよいことを認識するであろう。
【００１８】
用語「がん」、「がんの」および「癌」は、典型的には、未制御細胞成長によって特徴付けられる、哺乳動物の生理学的状態を指すかまたは記載する。本明細書で使用する場合、用語「膀胱がん」は、膀胱から生じたがんを指す。膀胱がんの例として、例えば、「筋層非浸潤性膀胱がん」または「ＮＭＩＢＣ」および「筋層浸潤性膀胱がん」または「ＭＩＢＣ」が挙げられる。
【００１９】
米国がん合同委員会（ＡＪＣＣ）ＴＮＭ病期分類システム（第７版、２０１０年）を使用して膀胱がんを病期分類することができる。ＴＮＭ病期分類システムにより、（Ｔ）主要なまたは原発の腫瘍が膀胱壁を通ってどの程度成長したか、および近くの組織へと成長したかどうか、（Ｎ）がんが膀胱の近くのリンパ節まで広がったかどうか、ならびに（Ｍ）がんが、遠隔部位、例えば、他の器官または膀胱に近くないリンパ節へと転移したか否か、と考えられる。膀胱がんのＴＮＭ病期分類システムは以下の通りである：
【表１】
2020519296.tif 000003
【００２０】
腫瘍の「病期」への言及は、本明細書で使用する場合、どの程度腫瘍が広がったかを指し、上記で与えられたＴ、Ｎ、およびＭ基準に基づく、膀胱がんについての上記病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのいずれかを指す。
【００２１】
腫瘍の「異型度」への言及は、本明細書で使用する場合、がん細胞が顕微鏡下でどのように見えるかに基づいた、膀胱がんの異型度分類を指す。「異型度が低い」（「高分化型」とも呼ばれる）がんは、顕微鏡下でより正常細胞のように見える。「異型度が高い」（「低分化型」または「未分化型」とも呼ばれる）がんは、顕微鏡下であまり正常細胞のように見えない。異型度が低いがんは、異型度が高いがんより予後が良好である傾向がある。
【００２２】
用語「予後」は、がん患者が、膀胱がんなどの新生物疾患の再発、転移性の広がり、および薬物耐性を含む、がんを原因とする死または進行を有する尤度の予測を指すために、本明細書で使用される。
【００２３】
用語「予測」または「予測する」は、がん患者が、原発腫瘍の外科的除去後に、陽性（「有益な応答」として知られる）であるか陰性であるかにかかわらず、処置に対して特定の応答を有する尤度を指すために本明細書で使用される。例えば、処置は、標的薬物、免疫療法、または化学療法を含み得る。
【００２４】
別段示されていなければ、本明細書で使用される各遺伝子名は、遺伝子に割り当てられたＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｙｍｂｏｌに対応し、この出願の出願日のものとして、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅによって提供される（ＵＲＬ：www  (dot)  ncbi  (dot)  nlm  (dot)  nih  (dot)  gov  (slash)  sites  (slash)  entrez）。
【００２５】
用語「相関した」および「関連した」は、２つの異なる測定値の間または１つの測定値もしくは一連の測定値、例えば、試料中のメチル化もしくは突然変異の存在の量もしくは濃度と、再発などの事象の間の関連を指すために本明細書で互換的に使用される。
【００２６】
用語「再発」および「再燃」は、膀胱がんの可能性のある臨床転帰の文脈で、本明細書で使用され、局所転移または遠隔転移のいずれかの再発を指す。再発は、例えば、膀胱鏡検査、細胞診、ＣＴイメージング、超音波、動脈造影図、またはＸ線、生検、尿もしくは血液の検査、身体検査、または研究センター腫瘍登録の１つまたは複数によって特定することができる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「膀胱鏡検査」は、膀胱鏡器具が尿道へと挿入され、尿道および膀胱の可視化を可能とし、必要に応じて、さらなる分析のために組織試料を取り除く手順を指す。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「経尿道切除術」または「膀胱腫瘍の経尿道切除術」（ＴＵＲまたはＴＵＲＢＴ）は、医師が、腫瘍が疑われる組織および必要に応じて腫瘍の周囲の筋組織を除去し、例えば、腫瘍が実際にがん性であるかどうかおよび腫瘍が周囲の筋組織に浸潤しているかどうかを決定する手順を指す。ＴＵＲＢＴおよび次の分析は、例えば、腫瘍の病期および異型度を決定するために使用され得る。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「細胞診」は、膀胱組織または細胞診もしくはＴＵＲＢＴ由来の洗液を検査するか、または顕微鏡下で尿試料を検査して、潜在的な膀胱がん細胞の存在を探索するおよび／または細胞の形態を評価して細胞の異型度を決定するプロセスを指す。
【００３０】
用語「手術」または「外科的切除」は、腫瘍の一部またはすべて、および通常周囲の組織の一部の外科的除去を指すために本明細書で使用される。外科的技法の例として、ＴＵＲＢＴ、腹腔鏡下手術、生検、または腫瘍アブレーション、例えば、寒冷両方、ラジオ波アブレーション、および高強度超音波が挙げられる。がん患者では、手術中に除去された組織の程度は、外科医によって観察された腫瘍の状態に依存する。
【００３１】
用語「積極的監視」は、膀胱がん患者に対して適用される場合、膀胱がんに対する一次処置後に、このような患者をモニタリングし、例えば、再発事象をチェックするか、または患者の将来の再発リスクを決定するプロセスを指す。例えば、腫瘍学者または他の医師への患者の「監視訪問」は、患者の監視手順の一部として意図された訪問、例えば、尿検査、膀胱鏡検査手順などが実施される訪問を指す。積極的な監視を受ける患者は、例えば、患者の再発リスクおよびがんの病期または異型度に応じて、１年に１、２、３、または４回の監視訪問を有する場合がある。膀胱鏡検査は、このような年間の訪問のうちの１回または複数回において実施されてもよい。
【００３２】
用語「Ｃｐ」は、本明細書で使用する場合、「クロッシングポイント（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）」を指す。Ｃｐ値は、ｑＰＣＲ増幅曲線全体の二次導関数およびそれらの最大値を決定することによって計算される。Ｃｐ値は、蛍光の増加が最も高く、ＰＣＲ増幅プロセスの対数期が開始するサイクルを表す。
【００３３】
用語「メチル化分率」または「ＭＦ」は、メチル化された特定の遺伝子または遺伝子のセットのパーセンテージまたは分率の評価を指す。メチル化は、本明細書に記載の数式に従うメチル化特異的Ｃｐから推定され得る。
【００３４】
用語、試料中の「メチル化ＤＮＡの量」は、試料ＤＮＡの収量を乗じたＭＦを指し、ナノグラムなどのグラムベースの単位で測定され得る。メチル化ＤＮＡの量は、各遺伝子毎に決定され、次いで、平均して、試料毎の「メチル化ＤＮＡの平均量」を得ることができる。用語、試料中の「メチル化ＤＮＡの濃度」は、試料体積に対する試料ＤＮＡの収量を乗じたＭＦを指す。メチル化ＤＮＡの濃度は、例えば、ｍＬ単位当たりのナノグラムで決定することができ、各遺伝子毎に決定され、次いで、平均して、試料毎の「平均メチル化ＤＮＡの濃度」を得ることができる。
【００３５】
「膀胱がん患者の基準セット」は、例えば、特定の患者のメチル化および必要に応じて突然変異データを、全体として、膀胱がん患者由来のデータとどのように比較するかを推定するために使用され得る。よって、基準セットは、再発低リスクと再発高リスクの両方を有することが知られているか、または再発してしまったかもしくは再発しなかったことが知られている患者を含み得る。したがって、基準セット由来のデータによって、メチル化ＤＮＡの量または濃度と相関する、可能性がある再発リスクの範囲を提供することができ、例えば、これに対して、個々の患者の新たなデータを比較することができる。
【００３６】
用語「ハザード比（ＨＲ）」は、本明細書で使用する場合、事象（すなわち、再発または死）のハザードまたはリスクに対する説明変数の効果を指す。比例ハザード回帰モデルでは、ＨＲは、２つの群（例えば、２つの異なる病期のがんを有する患者）または連続変数の単位変化（例えば、１標準偏差の変化）に対する予測ハザードの比である。
【００３７】
用語「陰性予測値」または「ＮＰＶ」は、診断アッセイで陰性の結果を有する対象が、実際に、対象が検査される状態もリスクも有さない確率である。これは、パーセンテージとして表される、真の陰性および偽陰性の合計で除した真の陰性対象の数として表現することができる。
【００３８】
用語「陽性予測値」または「ＰＰＶ」は、診断アッセイで陽性の結果を有する対象が、実際に、対象が検査される状態またはリスクを有する確率である。これは、パーセンテージとして表される、真の陽性と偽陽性の合計で除した真の陽性対象の数として表すことができる。
【００３９】
用語「感度」は、診断検査が診断することを意図する状態を有するものを正しく特定するための検査の能力を指す（すなわち、真の陽性率）。よって、検査の感度が非常に高い場合、例えば、陰性の結果を有する患者は、陰性の結果が正確であることをより確信することができる。
【００４０】
用語「特異度」は、検査される状態を有さない対象を、正しく除外するための診断検査の能力を指す（すなわち、真の陰性率）。よって、非常に特異度の高い検査は、偽陽性の結果の割合が低い可能性がある。
【００４１】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形または複数形で使用されるとき、一般的に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡであっても、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。よって、例えば、ポリヌクレオチドは、限定されないが、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖か、もしくはより典型的には二本鎖であり得る、または一本鎖および二本鎖領域を含み得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含むものと本明細書で定義される。加えて、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。このような領域の鎖は、同じ分子に由来しても、または異なる分子に由来してもよい。この領域は、分子の１つまたは複数のすべてを含んでもよいが、より典型的には、分子の一部の領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、多くの場合、オリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、特に、ｃＤＮＡを含む。この用語は、１つまたは複数の修飾された塩基を含有するＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。よって、安定性のため、または他の理由で、修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が本明細書で意図される「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの普通ではない塩基、または修飾された塩基、例えばトリチウム化された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で定義される用語「ポリヌクレオチド」の範囲内に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、未修飾ポリヌクレオチドのすべての化学的、酵素的および／または代謝的修飾形態、ならびに単純型および複雑型細胞を含むウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００４２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、限定されないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡを含む、比較的短いポリヌクレオチドを指す。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、化学的方法により合成されることが多い。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ媒介技法ならびに細胞および生物体内でのＤＮＡ発現を含む様々な他の方法によって作製することができる。
【００４３】
膀胱がん患者をモニタリングする方法
本開示は、膀胱がん患者をモニタリングする方法であって、患者のＤＮＡメチル化状態を決定すること、および必要に応じて、膀胱がんに広く存在する特定の遺伝子突然変異の存在をさらに決定することを伴う方法を含む。方法は、例えば、全体として、膀胱がん患者の再発リスクと比較した、患者の相対的再発リスクを決定するために行われ得る。例えば、患者は、がんに対する外科的処置後に、積極的監視を受けてもよい。
【００４４】
一部の実施形態では、方法は、患者から尿沈渣試料を得ること、試料からＤＮＡを抽出することおよび抽出したＤＮＡを亜硫酸塩に曝露して、特定の遺伝子におけるメチル化の存在を検出することを含む。例えば、一部の実施形態では、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子のメチル化状態が決定される。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴ遺伝子のうちの１つまたは両方における特異的突然変異の有無も決定される。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３突然変異は、染色体の位置ｃｈ４：１８０３５６８（受託番号ＮＭ＿００１１６３２１３．１）におけるＣからＧへの置換であり、タンパク質の２４９位におけるＳからＣへのアミノ酸変化を生じる。一部の実施形態では、ＴＥＲＴ突然変異は、染色体の位置ｃｈｒ５：１２９５２２８（受託番号ＮＭ＿００１１９３３７６．１）におけるＧからＡへの置換（または、反対鎖のＣからＴへの置換）であり、ＴＥＲＴ遺伝子に対するプロモーター領域における突然変異を生じる。
【００４５】
一部の実施形態では、メチル化分析に関する遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれぞれを含む。一部の実施形態では、以下の遺伝子のうちの１つまたは複数もメチル化分析に使用される：ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢ。一部の実施形態では、１、２、３、もしくは４つまたはそれより多い基準遺伝子が、例えば、検査遺伝子由来のシグナルを正規化し、よって、補正して試料中のＤＮＡ量を補償するために、メチル化分析において評価される。一部の実施形態では、基準遺伝子は、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、メチル化分析のための遺伝子は、本明細書の実施例３に記載のＭ１モデルの遺伝子を含む。一部の実施形態では、メチル化分析のための遺伝子は、本明細書の実施例３に記載のＭ２モデルの遺伝子を含む。一部の実施形態では、メチル化分析のための遺伝子は、本明細書の実施例３に記載のＭ３モデルの遺伝子を含む。一部の実施形態では、メチル化分析のための遺伝子は、本明細書の実施例３に記載のＭ４モデルの遺伝子を含む。一部の実施形態では、メチル化分析のための遺伝子は、本明細書の実施例３に記載のＭ５モデルの遺伝子を含む。一部の実施形態では、メチル化分析のための遺伝子は、本明細書の実施例３に記載のＭ６モデルの遺伝子を含む。一部の実施形態では、メチル化分析のための遺伝子は、本明細書の実施例３に記載のＭ７モデルの遺伝子を含む。一部の実施形態では、メチル化分析のための遺伝子は、本明細書の実施例３に記載のＭ８モデルの遺伝子を含む。一部の実施形態では、メチル化分析のための遺伝子は、本明細書の実施例３に記載のＭ９モデルの遺伝子を含む。
【００４７】
一部の実施形態では、本明細書における方法を、単独でまたは他の診断検査もしくはアッセイと組み合わせて使用して、種々の再発リスクまたは実際の再発レベルの膀胱がん患者の群からのデータと比較した患者の相対的再発リスクを決定する。例えば、再発リスクの分布は、他の診断検査から以前に決定された再発リスクを有する患者または再発するかもしくは再発しないことが知られている患者由来の保存試料に由来する試料に関するメチル化および必要に応じた突然変異アッセイの結果を注目することによって得ることができる。例えば、このようなデータを使用して、膀胱がん患者に関する再発リスクに対する検査結果の分布を作出することができる。次いで、新たな患者由来のデータをこの分布からのデータと比較して、患者の再発リスクが、例えば、この分布からの全体的平均と比較して低いかもしくは高いか、または新たな患者が、この分布曲線に沿うものであるかどうかを決定することができる。このような分析により、新たな患者に関する相対的再発リスクを与えることができる。
【００４８】
一部の実施形態では、患者は、筋層非浸潤性膀胱がんを有すると既に診断されている。一部の実施形態では、患者の腫瘍は、Ｔａ、Ｔｉｓ、Ｔ０、または異型度が低いと以前に診断されている。一部の他の実施形態では、患者の腫瘍は、Ｔ１または異型度が高いと以前に診断されている。一部の実施形態では、患者は、筋層浸潤性膀胱がんと診断されている。一部の実施形態では、患者は、他の診断および／または臨床検査の結果に基づいて、再発低リスクを有すると決定されている。一部の実施形態では、方法は、積極的監視訪問、例えば、膀胱鏡検査前の訪問または膀胱鏡検査を実施するべきか否かを決定するための訪問、またはどの程度の頻度で膀胱鏡検査を実施するべきかを決定するための訪問の間に行われる。例えば、本明細書におけるアッセイによって、患者が、膀胱がん再発低リスクを有することが明らかとなるかまたは確認される場合に、膀胱鏡検査は、アッセイが実行された後に直接実施されなくてもよく、または膀胱鏡検査の頻度を低減してもよい。本明細書におけるアッセイによって、患者が、以前に考えられたよりも再発リスクが高い可能性があることが明らかとなる場合に、膀胱鏡検査は、積極的監視訪問の一部として実施されてもよく、または引き続きの訪問で実施されてもよい。一部の実施形態では、本明細書における方法は、例えは、再発低リスクの確認を助けるために、陰性の膀胱鏡検査の後に行われてもよい。一部の実施形態では、本明細書における方法は、少なくとも１年に１回、例えば、６カ月に１回、または３カ月に１回行われる。
【００４９】
一部の実施形態では、患者は、ＴＵＲＢＴ、膀胱鏡検査から、または上部ＧＵ精密検査由来の組織を含むＴａまたは異型度が低い腫瘍試料に基づいて、再発低リスクを有することが以前に決定されている。一部の実施形態では、低リスクの患者は、正常な膀胱鏡検査または異常な膀胱鏡検査のいずれかを有する。一部の実施形態では、低リスクの患者は、正常な細胞診または異常な細胞診のいずれかを有する。一部の実施形態では、患者は、ＮＭＩＢＣを有し、ＴＵＲＢＴ、膀胱鏡検査、または上部ＧＵ精密検査のうちの１つまたは複数からの陰性組織分析結果を有し、本明細書における方法を使用して、膀胱がんの再発がないことを確認する。一部の実施形態では、患者は、ＮＭＩＢＣを有し、ＴＵＲＢＴ、膀胱鏡検査、または上部ＧＵ精密検査のうちの１つまたは複数からＴａまたは異型度が低いがんを与える組織分析結果を以前に有しており、本明細書における方法を使用して、患者が、膀胱がん再発低リスクを有することを確認する。このような方法では、本明細書における方法が、患者が、実際に、再発高リスクを有し、または再発の任意の実際の存在を示す場合、患者に対する膀胱鏡検査の頻度は、将来の監視訪問において増加する場合があり、またはさらなる組織分析が実施される場合がある。例えば、一部の実施形態では、患者は、ＴＵＲＢＴ、膀胱鏡検査由来、または上部ＧＵ精密検査由来の組織を含む異型度が高い、Ｔ１〜Ｔ２、またはＴｉｓ腫瘍試料に基づいて、再発高リスクを有することが以前に決定されている。一部の実施形態では、高リスクの患者は、正常な膀胱鏡検査または異常な膀胱鏡検査のいずれかを有する。一部の実施形態では、高リスクの患者は、正常な細胞診または異常な細胞診のいずれかを有する。一部の実施形態では、患者は、ＮＭＩＢＣを有し、異型度が高い、Ｔ１、Ｔ２、またはＴｉｓを示すＴＵＲＢＴ、膀胱鏡検査、または上部ＧＵ精密検査のうちの１つまたは複数からの組織分析結果を以前に有しており、本明細書における方法を使用して、患者が再発高リスクを有することを確認し、再発の存在をチェックする。この方法によって、患者が、実際には、再発低リスクを有することが示される場合、膀胱鏡検査の頻度は低減されてもよい。この方法によって、患者が、実際の再発を経験していることが示される場合、次いで、さらなる組織分析が実施されてもよい。
【００５０】
一部の実施形態では、異常な膀胱鏡検査結果は、追跡ＴＵＲＢＴ、上部ＧＵ管精密検査または追跡膀胱鏡検査を必要とする任意の異常性を含む。一部の実施形態では、異常な細胞診結果は、ＴＵＲＢＴまたは上部ＧＵ管精密検査または追跡膀胱鏡検査を導く任意の異常性を含む。
【００５１】
一部の実施形態では、本明細書における診断方法は、例えば、再発低リスクを有すると他の方法で決定された患者に対する処置方法の一部として含まれ得る。例えば、患者が、本明細書における方法に従って、再発低リスクを有すると確認される場合、患者は、積極的監視によって処置され続けてもよい。一部の実施形態では、膀胱鏡検査の頻度が低減されてもよい。他の実施形態では、患者が、本明細書における方法に従って、再発高リスクを有すると決定される場合、膀胱鏡検査の頻度は増加されてもよい。
【００５２】
遺伝子のメチル化および突然変異をアッセイする方法
膀胱がん患者の遺伝子のメチル化は、患者由来の試料、例えば、尿試料からアッセイされ得る。尿試料の採取後、試料を、例えば、遠心分離によって処理して、尿試料由来の細胞沈降物を単離することができる。次いで、例えば、ＤＮＡ単離キット、例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＭｉｎｉＫｉｔ（登録商標）または他の種類の市販のＤＮＡ抽出キットを使用して、ＤＮＡを沈降物から抽出することができる。
【００５３】
ＤＮＡの抽出後、試料中のＤＮＡ総量を、例えば、ナノグラムで定量し、次いで、メチル化分析のために重亜硫酸塩変換に供してもよい。例えば、ＣｐＧジヌクレオチドリピートにおけるシトシンヌクレオチドは、シトシンが、５−メチル−シトシンである、メチル化のための重要な標的部位である。亜硫酸ナトリウムのＤＮＡへの添加によって、メチル化されていないシトシンがウラシルに変換され、一方、メチル化シトシンは未修飾のままである。よって、メチル化シトシンの存在は、例えば、予期したウラシル変換を適応させるように修飾した配列を有する適切なプライマーを用いて、重硫酸塩処理したＤＮＡ鎖を増幅させる際に検出することができる。シークエンシングした際に、メチル化シトシンは、依然としてシトシンとして読みだされるが、一方、メチル化されていないシトシンは、ウラシルとして読みだされる。例えば、メチル化ＤＮＡの亜硫酸塩変換について記載する、K.  Pattersonら、J.  Vis.  Exp.５６巻：ｅ３１７０頁  doi:10.3791/3170（２０１１年）；R.  Shapiroら、J.  Am.  Chem.  Soc.９２巻（３号）：４２２〜４２４頁（１９７０年）；H.  Hayatsuら、J.  Am.  Chem.  Soc.９２巻（３号）：７２４〜６頁（１９７０年）；およびM.  Frommer、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.、USA  ８９巻（５号）；１８２７〜３１頁（１９９２年）を参照のこと。市販のキット、例えば、ＥｐｉＴｅｃｔ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅキット（Ｑｉａｇｅｎ；ＥｐｉＢｅａｔ）を使用して、亜硫酸塩変換を実施してもよい。
【００５４】
亜硫酸塩変換の後であって、メチル化ＤＮＡの検出前に、ＤＮＡの標的遺伝子を、ＧＣの豊富なＤＮＡ領域を増幅することができるポリメラーゼを使用してプレ増幅してもよい。例は、ＫＡＰＡ  Ｔａｑ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商標）（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。プレ増幅は、例えば、ＫＡＰＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｆａｓｔ（商標）ｑＰＣＲキット（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施してもよい。プレ増幅の後に、次いで、例えば、ＫＡＰＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｆａｓｔ（商標）キットで、ＧＣの豊富な領域を増幅することができるポリメラーゼを再度使用して、例えば、メチル化特異的定量的ＰＣＲ（ＭＳ−ｑＰＣＲ）による、さらなるＰＣＲ増幅を実施してもよい。
【００５５】
ＰＣＲ分析では、５’−ヌクレアーゼアッセイのデータを通常、最初に、閾値サイクル（「ＣＴ」）として表現する。蛍光値をすべてのサイクル中に記録し、増幅反応におけるその点までに増幅された産物の量を表す。閾値サイクル（ＣＴ）は、一般的に、蛍光シグナルが統計的に有意であると最初に記録された点として記載される。データはまた、クロッシングポイント（「Ｃｐ」）として表現されてもよい。Ｃｐ値は、ｑＰＣＲ増幅曲線全体の二次導関数とそれらの最大値を決定することによって計算される。Ｃｐ値は、蛍光の増加が最も高く、ＰＣＲ増幅の対数期が開始するサイクルを表す。
【００５６】
一部の実施形態では、ｑＰＣＲを使用して、特定の遺伝子または遺伝子調節領域の突然変異を検出してもよい。突然変異のＰＣＲ検出は、一部の実施形態では、例えば、亜硫酸塩処置の原因となるよう修飾した目的の遺伝子に対するプライマーを含むことによって、遺伝子のメチル化の検出と同じＰＣＲ反応で実施されてもよい。例えば、一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴなどの遺伝子における突然変異も検出されてもよい。例えば、一部の実施形態では、ゲノムの位置（ＨＧ１９）ｃｈｒ４：１８０３５６８に見られるＦＧＦＲ３突然変異が検出される。この突然変異は、ＤＮＡ配列におけるＣからＧへの変化に関与し、タンパク質におけるＳ２４９Ｃアミノ酸変化を生じる。一部の実施形態では、ゲノムの位置（ＨＧ１９）ｃｈｒ５：１２９５２２８に見られるＴＥＲＴ突然変異が検出される。この突然変異は、遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡ配列におけるＧからＡへの変化に関与する。
【００５７】
誤差および試料間の変動の作用を最小限にするために、内部標準を使用してＰＣＲを実施することができる。理想的な内部標準遺伝子（基準遺伝子とも称される）は、いずれのＣｐＧジヌクレオチドも含有せず、よって、膀胱がんを有さない患者よりも膀胱がん患者において、少しでもより高い程度にメチル化されることも低い程度にメチル化されることもないか、または他の理由で、がん患者におけるメチル化に変化を与えないかのいずれかである。よって、基準遺伝子に関するｑＰＣＲデータは、ＤＮＡのメチル化の程度よりも試料中のＤＮＡの量を反映すべきである。
【００５８】
ＰＣＲプライマーおよびプローブの設計
より一般的には、目的の遺伝子に対するＰＣＲプライマーおよびプローブは、例えば、目的の遺伝子のｍＲＮＡ転写物に存在するエクソンもしくはイントロン配列に基づくかまたは目的の遺伝子のいずれかの側のプロモーター領域に基づいて、および亜硫酸塩変換により期待される配列の修飾に基づいて、設計され得る。プライマー／プローブの設計は、公的に利用可能なソフトウェア、例えば、Kent,  W.J.、Genome  Res.１２巻（４号）：６５６〜６４頁（２００２年）によって開発されたＤＮＡ  ＢＬＡＴソフトウェア、またはそのバリエーションを含むＢＬＡＳＴソフトウェアによって実施することができる。
【００５９】
必要な場合または所望の場合、標的配列の反復配列は、非特異的シグナルを軽減するためにマスクすることができる。これを達成するための例示的ツールとして、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによりオンラインで利用可能なＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラムが挙げられ、これは、反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントがマスクされたクエリー配列を戻す。次いで、マスクされたイントロン配列を使用して、いずれかの市販されているか、またはそうでなければ公的に入手可能なプライマー／プローブ設計パッケージ、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢ  ａｓｓａｙ-ｂｙ-ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｐｒｉｍｅｒ３（Steve  RozenおよびHelen  J.  Skaletsky（２０００年）  Primer3  on  the  WWW  for  general  users  and  for  biologist  programmers）を使用して、プライマーおよびプローブ配列を設計することができる（S.  Rrawetz、S.  Misener、Bioinformatics  Methods  and  Protocols:Methods  in  Molecular  Biology、３６５〜３８６頁（Humana  Press）を参照のこと）。
【００６０】
ＰＣＲプライマーの設計に影響を及ぼすことができる他の因子として、プライマー長、融点（Ｔｍ）、およびＧ／Ｃ含量、特異度、相補的プライマー配列、および３’末端配列が挙げられる。一般的に、最適なＰＣＲプライマーは、一般的に、１７〜３０塩基長であり、約２０〜８０％、例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基などを含有し、５０から８０℃の間、例えば、約５０から７０℃のＴｍを呈する。一部の実施形態では、ＰＣＲプライマーもしくはブロッキング核酸は、ＤＮＡを含んでもよく、またはロックド核酸（ＬＮＡ）もしくはタンパク質核酸（ＰＮＡ）などのＤＮＡアナログを含んでもよい。
【００６１】
ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計のためのさらなる指針として、例えば、その開示全体が、参照により明示的に本明細書に組み込まれる、Dieffenbach,  CW.ら、PCR  Primerの「General  Concepts  for  PCR  Primer  Design」、A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、New  York、１９９５年、１３３〜１５５頁、InnisおよびGelfand、PCR  Protocolsの「Optimization  of  PCRs」、A  Guide  to  Methods  and  Applications、CRC  Press、London、１９９４年、５〜１１頁およびPlasterer,  T.N.  Primerselect：Primer  and  probe  design.  Methods  MoI.  Biol.７０巻：５２０〜５２７頁（１９９７年）を参照のこと。
【００６２】
アルゴリズムおよび統計的分析方法
分析される遺伝子のメチル化分率は、一部の実施形態では、リアルタイムまたは定量的ＰＣＲ技術を使用して決定される。例えば、クロッシングポイントまたはＣｐ値は、その時点で、例えば、特定遺伝子のメチル化が患者の試料中で最初に検出されるＰＣＲサイクルを表し得る。この情報を、メチル化遺伝子に対して以前に得たＣｐ値対ｌｏｇ１０濃度の標準曲線と比較し、次いで、この遺伝子のメチル化分率を得るために、基準遺伝子に対して同様の値へと正規化することができる。これは、以下の等式で例証され、ここで、ｍは検査遺伝子からのデータを表し、αはメチル化に依存しない（ＭＩＰ）基準遺伝子からのデータを表す：
【数１】
2020519296.tif 000004
【００６３】
第１に、標準曲線プロット、例えば、ｌｏｇ１０遺伝子濃度に対するＣｐは、遺伝子のメチル化されている、またはメチル化されていないバージョンに対して公知の濃度を表すＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ試料を採取し、１セットの連続希釈を実施し、各濃度における蛍光シグナルを測定し、その蛍光シグナルをそのシグナルに対応するＰＣＲサイクル値に関連付けることによって、各遺伝子に対して決定することができる。このようなＣｐ対ｌｏｇ１０濃度曲線は、いくつかの桁に対して直線であってもよく、傾きおよび切片の決定を可能とする（上記等式を参照のこと）。（例えば、このような標準曲線を得て、利用する方法について記載する、D.  Rodriguez-LazaroおよびM.  Hernandez、Real-Time  PCR  in  Food  Science：Current  Technology  and  ApplicationsのIntroduction  to  the  Real-Time  PCR、D.  Rodriguez-Lazaro編、Caister  Academic  Press、Norfolk、UK（２０１３年）を参照のこと）。
【００６４】
例えば、このような傾きおよび切片を得るための１５点線形分析は、公知の濃度の核酸を採取し、１４回の２倍連続希釈を実施し、また核酸を含まない第１５試料を得ることによって実施することができる。次いで、１５個の試料のそれぞれにおいて関連する遺伝子の発現が、各試料に対するＰＣＲを実施し、Ｃｐ値を決定することによって決定し、このＣｐ値は、核酸試料がＰＣＲサイクル数（例えば、４０回）に等しいことが期待されない。ＰＣＲ反応が完全である場合、次いで、それぞれ２倍希釈に対して１のＣｐ値の増加があるはずである。実測したＣｐ値は、核酸の公知の出発濃度に対してプロットされ、得られた直線の傾きおよびその切片が計算される。
【００６５】
この標準曲線（および１つまたは複数の基準遺伝子に対する同様の標準曲線）に対する傾きおよび切片が得られたら、これらを使用して、検査遺伝子に対するｍおよびα値、次に、メチル化分率（ＭＦ）を計算することができる（上記等式を参照のこと）。ＭＦ値がゼロと１の間にあることを保証するために、ＭＦは、一部の実施形態では、（ａ）ゼロまたは（ｂ）１または２ｍ−αの最小値に対応する値の最大値に等しい可能性がある。これは、ＭＦ＝ｍａｘ（０，ｍｉｎ（１，２ｍ−α））として表されてもよい。
【００６６】
次いで、目的の各遺伝子に対するＭＦを使用して、他の値を計算してもよい。一部の実施形態では、試料のＤＮＡ収量（例えば、ナノグラムで）を乗じたＭＦに等しいメチル化ＤＮＡの量はまた、各遺伝子に対して決定される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡの量は、どの程度の量の腫瘍関連ＤＮＡが患者の尿中に実際に「漏出している」かを反映し得る。他の実施形態では、メチル化ＤＮＡの濃度が決定され、これは、試料体積（例えば、ミリリットルで）で除したメチル化ＤＮＡの量に等しい。メチル化ＤＮＡの濃度は、例えば、検査実験室が受容する試料中の腫瘍関連ＤＮＡの濃度についての補正をもたらし、したがって、尿試料の一部のみが実験室に受容される場合に影響を受けないこともある。しかしながら、この値は、尿採取の前に患者が摂取する液量によって影響を受ける場合もある。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡの量および濃度の両方が、遺伝子毎に決定されてもよい。
【００６７】
一部の実施形態では、次いで、メチル化ＤＮＡの平均の量または濃度が、アッセイされる１セットの遺伝子に対して決定される。例えば、一部の実施形態では、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの検査遺伝子がアッセイされる。このような場合には、メチル化ＤＮＡの平均量または平均濃度は、本明細書におけるアルゴリズムにおいて報告され得る。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡの量および／または濃度は、１セットの遺伝子の各遺伝子に対して計算することができ、次いでその値を平均することができる。
【００６８】
一部の実施形態では、遺伝子突然変異も評価される。一部の実施形態では、このような突然変異も、リアルタイムまたは定量的ＰＣＲ方法を使用して評価することができる。よって、例えば、突然変異は、この突然変異に対する増幅産物と関連する蛍光シグナルがＰＣＲ増幅における特定のクロッシングポイントによって検出される場合に存在するとみなされ得る。一部の実施形態では、例えば、ＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴにおける突然変異はまた、本明細書におけるアッセイに含まれる。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３突然変異は、染色体の位置ｃｈｒ４：１８０３５６８にあり、これは、ＣをＧに変化させて、タンパク質におけるＳ２４９Ｃ突然変異を生じる。一部の実施形態では、ＴＥＲＴ突然変異は、染色体の位置ｃｈｒ５：１２９５２２８にあり、これは、ＧをＡに変化させて、プロモーター領域における突然変異を生じる。
【００６９】
一部の実施形態では、アルゴリズムを、検査遺伝子由来のメチル化ＤＮＡの平均の量または濃度から、必要に応じてＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴ突然変異の有無からも、開発することができる。一部の実施形態では、アルゴリズムは、以下のステップのセットを含んでもよい：
１）各メチル化マーカー遺伝子および基準遺伝子に関し、上記で議論した関連する標準曲線から推定した切片および傾きを使用して、異なるＰＣＲ増幅効率について補正する。
２）マーカーおよび基準遺伝子のｍおよびα値を計算する（２つ以上の基準遺伝子が分析において含まれる場合、平均α値がメチル化分率の等式で使用される）
３）ＭＦ＝ｍａｘ（０，（ｍｉｎ１，２ｍ−α）として各遺伝子に対してメチル化分率を推定する
４）選択した方法（ａ）または（ｂ）を適用して、個々の遺伝子のメチル化を定量する：
ａ．メチル化ＤＮＡの量  ａｍｏｕｎｔ＝ＭＦ＊試料の収量（ｎｇ）、または
ｂ．メチル化ＤＮＡの濃度  ｃｏｎｃ=＝ＭＦ＊試料の収量（ｎｇ）／試料の体積（ｍＬ）
５）Ｌｏｇ１０（遺伝子全体にわたる平均のａｍｏｕｎｔまたはｃｏｎｃ）を計算する
６）必要に応じて、ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴにおける突然変異の存在も定義する
一部の実施形態では、各突然変異の存在に対する閾値Ｃｐ値は、それによって、突然変異と関連する蛍光シグナルが、存在すると称される突然変異を表さなければならないサイクル数として定義される。最終アルゴリズムの性能を評価するために、一部の実施形態では、再発ＨＲ、再発ＬＲおよび再発なしのカテゴリーを有する多項ロジスティック回帰モデルを、以下の指標変数にフィットさせた：
−  選択した方法に対する自由度２の自然３次スプライン：
・  Ｌｏｇ１０（平均のａｍｏｕｎｔ）、または
・  Ｌｏｇ１０（平均のｃｏｎｃ）
−  ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴ突然変異に対する指標、アッセイに含まれる場合
−  患者の亜群に対する指標（すなわち、初期の再発低リスク（「初期ＬＲ」）または初期の再発高リスク（「初期ＨＲ」））
【００７０】
これらのステップから、一部の実施形態では、回帰分析を使用して、膀胱がん患者に対する「スコア」の範囲を与え、よって、新たな患者に対するデータが比較され得るアルゴリズム由来の「スコア」に対して再発リスクまたは実際の再発についての基準曲線を作成することができる。次いで、このような曲線を使用して、例えば、その新たな患者に対して、相対的な再発リスクを決定することができる。
【００７１】
一部の実施形態では、上記アルゴリズムでアッセイされる遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、および必要に応じて、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択されるさらなる遺伝子、および１つまたは複数の基準遺伝子を含む。一部の実施形態では、アッセイされる遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２のそれぞれを含む。一部の実施形態では、上記アルゴリズムでアッセイされる遺伝子は、１つまたは複数の基準遺伝子と一緒に、以下の実施例３で列挙されるＭ１遺伝子セットの遺伝子を含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、上記アルゴリズムでアッセイされる遺伝子は、１つまたは複数の基準遺伝子と一緒に、以下の実施例３で列挙されるＭ２遺伝子セットの遺伝子を含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、上記アルゴリズムでアッセイされる遺伝子は、１つまたは複数の基準遺伝子と一緒に、以下の実施例３で列挙されるＭ３遺伝子セットの遺伝子を含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、上記アルゴリズムでアッセイされる遺伝子は、１つまたは複数の基準遺伝子と一緒に、以下の実施例３で列挙されるＭ４遺伝子セットの遺伝子を含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、上記アルゴリズムでアッセイされる遺伝子は、１つまたは複数の基準遺伝子と一緒に、以下の実施例３で列挙されるＭ５遺伝子セットの遺伝子を含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、上記アルゴリズムでアッセイされる遺伝子は、１つまたは複数の基準遺伝子と一緒に、以下の実施例３で列挙されるＭ６遺伝子セットの遺伝子を含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、上記アルゴリズムでアッセイされる遺伝子は、１つまたは複数の基準遺伝子と一緒に、以下の実施例３で列挙されるＭ７遺伝子セットの遺伝子を含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、上記アルゴリズムでアッセイされる遺伝子は、１つまたは複数の基準遺伝子と一緒に、以下の実施例３で列挙されるＭ８遺伝子セットの遺伝子を含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、上記アルゴリズムでアッセイされる遺伝子は、１つまたは複数の基準遺伝子と一緒に、以下の実施例３で列挙されるＭ９遺伝子セットの遺伝子を含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、基準遺伝子は、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２Ａ、およびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む。
【００７２】
一部の実施形態では、アルゴリズムの性能は、例えば、公知の臨床転帰を有する検査集団において、陰性予測値（ＮＰＶ）、感度、陽性予測値（ＰＰＶ）、および特異度を評価することによって、モニタリングされ得る。例えば、再発低リスク（ＬＲ）を有すると初期に診断された患者に対して、本明細書における方法を使用して、ＬＲ診断を確認することができる。このような場合には、ＮＰＶは、本明細書における方法によってどの程度正確に陰性の結果、すなわち、患者が、再発高リスクを有さないことを正しく予測するかを測定し得る。感度は、例えば、この検査によって正しく予測される真に陽性の結果、すなわち、真に陽性であって偽陽性ではない結果のパーセンテージを反映し得る。これらの測定値は、例えば、再発診断を確認する際の検査の精度を示し得る。同様に、再発高リスク（ＨＲ）を有すると初期に診断された患者に関して使用される検査では、この方法を使用して、再発が生じる傾向にないことを確認することができる。ＰＰＶおよび特異度は、一部の実施形態では、この検査によって陽性の結果を予測する正確さの程度を評価するため、およびこの検査によって正しく予測される真に陰性の結果のパーセンテージを丁重に評価するために、決定することもできる。一部の実施形態では、この方法の目的は、監視を受けている患者に対する膀胱鏡検査の頻度の低減を可能とする高感度および高ＮＰＶ（例えば、８５％を超える、例えば、８８％を超える、例えば、９０％を超える感度、および９０％を超える、例えば、９５％を超える、例えば、９７％を超える、例えば、９８％を超えるＮＰＶ）を示すことである。
【００７３】
一部の実施形態では、さらなる性能評価を行い、例えば、予測曲線、すなわち、確率の集団分位数に対して再発高リスクまたは実際の再発ありの確率の推定値のプロットを決定するか、または、ＲＯＣ曲線、すなわち、１から検査の特異度を引いたものに対する感度のプロット（再発の各確率におけるカットポイントを含み得る）を決定するか、またはＲＯＣ曲線下面積を決定することができる。
【００７４】
当業者は、目的の結果（例えば、生存の尤度、再発の尤度）と特定のマーカーまたはパラメーター（例えば、遺伝子のメチル化状態または遺伝子突然変異の有無）の間に有意な関係が存在するかどうかを決定するために使用され得る、そのほかの多くの統計的方法が存在することを認識するであろう。この関係は、連続的なＲｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  Ｓｃｏｒｅ（登録商標）（ＲＳ）として表すことができるか、または患者をリスク群へと階層化することができる（例えば、低および高、または低、中、および高）。
【００７５】
本発明のキットおよびシステム
本発明の方法において使用するための材料をキットの調製に適合させる。よって、本開示は、例えば、本開示の遺伝子のメチル化および必要に応じて突然変異を定量するために、遺伝子特異的または遺伝子選択的プローブおよび／またはプライマーを含み得る薬剤を含むキットを提供する。キットはまた、例えば、ＰＣＲ増幅の間にＤＮＡ反復領域をブロックするためのブロッキング核酸を含み得る。このようなキットは、必要に応じて、試料からのＤＮＡの抽出のための、およびＤＮＡの亜硫酸塩変換のための試薬を含有し得る。さらに、キットは、必要に応じて、識別用の記載（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）もしくはラベルを有する試薬または本発明の方法におけるそれらの使用に関する説明書を含んでもよい。キットは、それぞれ、この方法において利用される種々の試薬（典型的には、濃縮形態の）のうちの１つまたは複数、例えば、予め作製したマイクロアレイ、緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および本発明の１つまたは複数のプローブおよびプライマー（例えば、メチル化分析ならびにＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴ突然変異分析のための各検査遺伝子および基準遺伝子に対する適切なプライマー）を含む容器（自動化したこの方法の実施において使用するのに適したマトリックス、マイクロタイタープレートなどを含む）を含む。予後または予測情報を推定または定量するために使用される数学アルゴリズムはまた、キットの潜在的な構成成分である。キットはまた、例えば、患者のメチル化および突然変異状態を決定するため、および患者の結果を基準の膀胱がん患者集団の結果に対して比較するための検出装置および／またはコンピューターソフトウェアを含むシステムの一部も形成し得る。
【００７６】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されているメチル化アッセイを実施するための亜硫酸塩修飾遺伝子（例えば、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子ならびに必要に応じて、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択されるさらなる遺伝子）のＰＣＲ増幅のための、および１つまたは複数の基準遺伝子のための、および必要に応じて、また、ＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴ突然変異状態を評価するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含んでもよい。キットはまた、ＧＣの豊富な配列を増幅することができるポリメラーゼなどのＰＣＲ試薬、およびアッセイの性能に対する説明書を含んでもよい。キットはまた、メチル化および必要に応じて突然変異の分析を実施するための、および患者における再発リスクを決定するためのコンピューターソフトウェアを含むシステムの一部を形成してもよい。
【００７７】
一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つのウェル（チャネル、チャンバー、領域、または表面を構成してもよい）を含むカートリッジを含んでもよい。本明細書で使用する場合、「カートリッジ」は、試薬を保持することができ、少なくとも１つの「ウェル」を含有する物理構造を意味する一般用語である。同様に、「ウェル」は、１つまたは複数の反応ステップ、例えば、ＰＣＲプロセスのステップ、試料からのＤＮＡ抽出、洗浄ステップ、または検出ステップなどを含有するために使用され得るチャネル、チャンバー、領域、または表面を意味する一般用語である。一部の実施形態では、少なくとも１つのウェルは、遺伝子のメチル化を検出するための１つまたは複数のプライマーを含んでもよい。遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに必要に応じて、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択されるさらなる遺伝子、ならびに必要に応じて、また、ＴＥＲＴまたはＦＧＦＲ３におけるような遺伝子突然変異を含んでもよい。一部の実施形態では、メチル化は、遺伝子ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２のそれぞれに対して検出される。一部の実施形態では、メチル化は、以下の実施例３に列挙されるＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、またはＭ９遺伝子のセットのうちの遺伝子に対して検出される。一部の実施形態では、プライマーは、カートリッジの１つまたは複数のウェルに結合される。一部の実施形態では、各ウェルは、２つ以上の遺伝子、例えば、２、３、４、５または６個の異なる遺伝子に対するプライマーを、例えば、異なる色素ラベルで標識したプライマーを使用することによって、含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのウェルは、少なくとも１つの基準遺伝子のメチル化を検出するための少なくとも１つのプライマーを含む。一部の実施形態では、カートリッジは、各ウェルが、上記遺伝子ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数におけるメチル化を検出するためのプライマー、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子のメチル化を検出するためのさらなるプライマーを含むように構成されている。一部の実施形態では、基準遺伝子は、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む。よって、一部の実施形態では、カートリッジは、遺伝子に関してメチル化特異的定量的ＰＣＲを実施するよう構成されており、これは、その構造および配置が、遺伝子のメチル化特異的定量的ＰＣＲ分析を実行するために使用され得ることを意味する。
【００７８】
一部の実施形態では、カートリッジは、ＰＣＲ酵素、緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰまたはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、およびｒＵＴＰ）、および重亜硫酸変換に対する試薬などの増幅試薬をさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、これらの試薬をカートリッジのウェルへと導入する１つまたは複数の構成成分を含むキットまたはシステムの一部である。一部の実施形態では、患者の試料由来のＤＮＡが抽出され、直接または亜硫酸塩変換の後にカートリッジに適用される。一部の実施形態では、抽出したＤＮＡは、カートリッジに適用され、カートリッジの１つまたは複数のウェル内で亜硫酸塩変換が行われる。一部の実施形態では、試料は、カートリッジに直接適用され、ＤＮＡ抽出が亜硫酸塩変換および増幅の前に必要とされる場合、抽出は、カートリッジの１つまたは複数のウェル内でも行われる。一部の実施形態では、試料は尿試料、例えば、尿沈渣試料（例えば、尿細胞ペレットを含む）である。他の実施形態では、試料は、組織試料である。よって、一部の実施形態では、カートリッジは、尿または組織試料のいずれかを受け入れることが意図される。一部の実施形態では、カートリッジは、尿（例えば、尿沈渣）試料または組織試料のいずれかのために設計される。一部の実施形態では、カートリッジおよび関連するシステムは、国際公開第ＷＯ２００６／１３６９９０号およびそれに関連する米国特許第９，５６８，４２４号に記載のものに基づいてもよい。
【００７９】
一部の実施形態では、カートリッジは、サーモサイクリングが行われる、プライマーを含む少なくとも１つのウェル、ならびに試料を導入し、溶解させおよび／または洗浄するための１つまたは複数のウェルを含む。一部の実施形態では、全体的なカートリッジ構造は、ポンプ、バルブ、プロセスウェル、ならびに流体および廃棄物リザーバーも含み、これによって、試料の処理およびＰＣＲ反応ならびにメチル化および必要に応じて、また、カートリッジ内での特定の遺伝子の突然変異の関連する検出を行うことが可能となる。
【００８０】
一部の実施形態では、カートリッジは、カートリッジ内に含まれるプライマーおよび試薬を使用して、試料由来のある特定の遺伝子のメチル化を定量することができるシステムの一部であり、このシステムは、遺伝子のメチル化を定量することができ、メチル化に基づいた値、例えば、試料の収量、試料の体積、メチル化分率（ＭＦ）、メチル化したＤＮＡの量、メチル化したＤＮＡの濃度、Ｃｐ値、および全体的なＲｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  Ｓｃｏｒｅ（ＲＳ）の結果を計算することもできるソフトウェアも含む。一部の実施形態では、このシステムは、対象のＭＦ、メチル化したＤＮＡの量、および／またはメチル化したＤＮＡの濃度、ならびに必要に応じて、ＴＥＲＴおよび／またはＦＧＦＲ３の突然変異の状態などの情報をまとめるレポートを作成することもできる。一部の実施形態では、このシステムによって、メチル化したＤＮＡの量および／またはメチル化したＤＮＡの濃度などの定量的値が膀胱がん患者の基準セットから得たこれらの値と比較され、患者における再発リスクを予測するかまたは患者が実際の再発を有しているか否かを検出することもできる。
【００８１】
レポート
この発明の方法は、商標的な診断目的のために実践される場合、一般的に、本明細書に記載の方法から得た情報のレポートまたはまとめを生じる。例えば、レポートには、メチル化したＤＮＡの量または濃度、遺伝子の突然変異の状態、膀胱がん患者の基準セットからのデータと比較した再発リスクをレポートするための全体的なＲｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  Ｓｃｏｒｅの結果、特定の患者における臨床帰結の予測、または患者がある特定の再発リスクの閾値を超えるかもしくは下回るか否かに関する情報を含み得る。この発明の方法およびレポートは、データベースにこのレポートを保存することをさらに含むことができる。この方法は、対象に対してデータベースに記録を作成し、その記録をデータと共に格納することができる。レポートは、紙のレポート、聴覚のレポート、または電子記録であってもよい。レポートは、コンピューターデバイス（例えば、ハンドヘルドデバイス、デスクトップコンピューター、スマートデバイス、ウェブサイトなど）に表示および／または保存されてもよい。レポートは、医師および／または患者に提供されることを企図する。レポートを受容することは、データおよびレポートを含むサーバーコンピューターへのネットワーク接続を確立すること、ならびにデータおよびレポートをサーバーコンピューターからリクエストすることをさらに含み得る。
【００８２】
コンピュータープログラム
上述のアッセイからの値、例えば、発現データ、再発スコア、処置スコアおよび／またはベネフィットスコアは、手動で計算および保存することもできる。あるいは、上述のステップは、コンピュータープログラム製品によって、完全にまたは部分的に実施することもできる。よって、本発明は、コンピューターにより読み取り可能な保存媒体上に保存されたコンピュータープログラムを有するその媒体を含むコンピュータープログラム製品を提供する。プログラムは、コンピューターによって読み取られる場合、個体由来の１つまたは複数の生体試料の分析から得た値に基づいて、関連する計算を実行することができる。コンピュータープログラム製品は、計算を実施するためのコンピュータープログラムをその中に保存している。
【００８３】
本開示は、上述のプログラムを実行するためのシステムを提供し、このシステムは、一般的に、以下を含む：ａ）中央計算環境；ｂ）計算環境に作動可能に接続され、患者データを受容するインプットデバイスであって、患者データが、例えば、上記で詳細に記載したように、患者由来の生体試料を使用するアッセイから得た発現レベルもしくは他の値、またはマイクロアレイデータを含み得る、インプットデバイス；ｃ）計算環境に接続され、使用者（例えば、医療関係者）に情報を提供するアウトプットデバイス；およびｄ）中央計算環境（例えば、プロセッサ）によって実行されるアルゴリズムであって、インプットデバイスよって受容されたデータに基づいて実行される、アルゴリズム。本発明によって提供される方法はまた、全体としてまたは部分的に自動化されてもよい。
【００８４】
本発明について記載してきたが、例証として提供され、本発明を限定することを決して意図するものではない以下の実施例を参照することによって、本発明がより容易に理解されることとなる。
【実施例】
【００８５】
（実施例１）
メチル化および概念証明研究を評価するための方法
概念証明（ＰＯＣ）研究を、６６名の膀胱がん患者（再発なしの２５名の患者、低リスク（ＬＲ）（Ｔａで異型度が低い）の１４名の患者および高リスク（ＨＲ）（Ｔ１または異型度が高い）の２７名の患者）由来の尿細胞ペレットを使用して実施した。再発は、文献に基づいて選択した１１個のメチル化遺伝子マーカーおよび１つのメチル化に依存しない（ＭＩＰ）基準遺伝子を使用して評価した。重硫酸塩変換に先立ってメチル化特異的定量的ＰＣＲ（ＭＳ−ｑＰＣＲ）分析を使用して、これら１２個の遺伝子におけるメチル化レベルを決定した。この研究を使用して、個々のメチル化マーカーの性能および再発の存在を予測することに関する合成スコアを評価した。メチル化シグナルを評価するいくつかの方法を、この研究に基づいて開発し、候補マーカーのより大きなセットに関する改善研究に利用した。
【００８６】
各遺伝子におけるメチル化分率（ＭＦ）をメチル化特異的Ｃｐから以下のように推定した：
【００８７】
第１に、遺伝子増幅からの公知の濃度のＰＣＲ産物の連続希釈を実施することによって、各遺伝子について、直線性研究を行った。産物を連続して２倍に１５回希釈し、各濃度におけるＣｐ値の曲線を作成し、その傾きとｙ切片を得た。第２に、直線性研究から導出した傾きおよび切片を使用して、以下のように、異なるＰＣＲ増幅効率について補正を適用した：
【数２】
2020519296.tif 000005
【００８８】
第３に、Ｃｐを、メチル化に依存しない基準遺伝子のデータを使用して正規化し、ＭＦを、以下の等式に従って推定した：
【数３】
2020519296.tif 000006
【００８９】
次いで、さらなるパラメーターを、以下の表に示すように、ＭＦ、およびＤＮＡ収量および試料の体積に基づいて得た：
【表２】
2020519296.tif 000007
【００９０】
ＰＯＣ研究からの１１個の遺伝子に基づいた合成スコアを、以下の表に示すように、再発の存在と関連付けた。
【表３】
2020519296.tif 000008
【００９１】
（実施例２）
メチローム発見研究
膀胱がんを有する患者由来の試料およびがんを有さない患者由来の試料において、差示的にメチル化される追加の遺伝子候補を特定する遺伝子発見研究を行った。がんを有する患者由来の合計２６個の腫瘍組織試料と７個の尿細胞ペレット（１４名の患者が再発低リスク（ＬＲ）を有すると以前に診断され、１９名の患者が再発高リスク（ＨＲ）を有すると以前に診断された）およびがんを有さない患者由来の７個の尿細胞ペレットと５個の組織試料（７名の健康な個体と、膀胱がんの診断を以前に受けていないかまたは以前に診断を受けたが、手術の時点で悪性ではなかった５名の患者）を分析において使用した。メチローム評価は、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の分析に基づいて、１１個のがんにわたって差示的にメチル化された領域のおよそ６００万個のヌクレオチドを標的とし、各試料毎におよそ７２４，０００部位をシークエンシングした。以下の評価をこの発見研究において行った。
【００９２】
第１に、がんを有さない試料に対するがん試料における差示的にメチル化された部位を、１％の偽発見率において特定した。第２に、改善研究に対するＰＣＲアッセイに対する最も強力な候補を以下に基づいて選択した：（ａ）強力なメチル化シグナルを有する領域、（ｂ）高被覆率、すなわち、ＣｐＧ部位の数が多い、（ｃ）がんを有さない試料からの低シグナル、（ｄ）プライマー／プローブにわたるＣｐＧ部位の分布および配置、および（ｅ）一貫したメチル化シグナルの領域。第３に、メチローム発見研究の知見に基づいて、８６個の候補メチル化マーカーを改善研究において採用した。この８６個の候補セットは、実施例１の概念証明研究で使用した１１個の遺伝子を含んだ。
【００９３】
（実施例３）
改善研究
改善研究では、遺伝子発見研究からの８６個のメチル化マーカー遺伝子、４個のメチル化に依存しない基準遺伝子および以前に膀胱がんの診断を受け、現在監視中である２０３名の患者に関する６個のＦＧＦＲ３突然変異を含む９６個のマーカーを評価した。６つのＦＧＦＲ３突然変異アッセイのうちの２つは、いずれのシグナルも生じることができず、さらなる評価から除外された。さらに、この研究における１７０名の患者については、２つのＴＥＲＴ突然変異をアッセイすることを含む追加の評価のために十分なＲＮＡが残った。ここで表される結果は、８６個のメチル化マーカー、４つの基準遺伝子、４つのＦＧＦＲ３突然変異および２つのＴＥＲＴ突然変異が評価されたこれらの１７０名の患者に基づく。患者は、再発を有さなかった８５名、再発ＬＲを有すると以前に診断された３２名および再発ＨＲを有すると以前に診断された５３名を含んだ。
【００９４】
重硫酸塩変換によって進行したＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、メチル化レベルを決定した。個々のメチル化マーカーの性能を、感度、特異度、陰性予測値（ＮＰＶ）および陽性予測値（ＰＰＶ）のノンパラメトリック推定を使用して評価した。この分析では、再発ＬＲ対象に対する感度、特異度、ＮＰＶ、およびＰＰＶを目的とした陽性事象は、再発ＨＲの予測であると考えられた。再発ＨＲ対象に対する陽性事象は、実際の再発ありのエビデンスであると考えられた。
【００９５】
最終モデルに対する遺伝子の選択は、以下を含む多数の検討に基づいた：（１）生物学的経路の表示、（２）再発ＨＲを予測するためのＮＰＶに関する強力な個々の遺伝子性能、（３）突然変異を強制的に含める場合および含めない場合の、再発ＨＲと再発ありエンドポイントの両方に対するエラスティックネット正則化回帰モデル（Zhou  H、Hastie  T.  Regularization  and  variable  selection  via  the  elastic  net.  Journal  of  the  Royal  Statistical  Society、Ｂシリーズ  ６７巻：３０１〜３２０頁）、（４）ＬＡＳＳＯ正則化回帰モデル（Tibshirani  R.  Regression  shrinkage  and  selection  via  the  LASSO.  Journal  of  the  Royal  Statistical  Society、Ｂシリーズ  ５８巻：２６７〜２８８頁）、および（５）ＰＯＣ研究への包含。２つの主要な生物学的経路を特定し：ホメオボックス官能基（例えば、ＩＲＸ５、ＭＥＩＳ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＴＰ、ＰＯＵ４Ｆ２、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１）、および免疫基（ＫＬＦ２、ＩＲＡＫ３、ＩＴＰＫＢ）が大量に表された。
【００９６】
エラスティックネット分析は、ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴ突然変異アッセイを含むかまたは含まないモデルに含まれるように一貫して選択されたいくつかの遺伝子を特定した：ＫＬＦ２、ＭＥＩＳ１、ＤＤＸ２５、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２およびＴＭＥＭ１０６Ａ。以下の表には、エラスティックネット分析を使用して選択された遺伝子が表される。
【表４】
2020519296.tif 000009
【００９７】
上記に概説した基準に基づいて選択した１３個のメチル化マーカーを、最終モデルに含めるために検討した。これらのメチル化マーカーの９つの組合せを以下の表に記載し、最終モデルＭ１〜Ｍ９に含めた。
【表５】
2020519296.tif 000010
【００９８】
ＰＯＣ研究に含まれた遺伝子は、上記の表で「ＰＯＣ」と記載した。記号＊は、突然変異あり、およびなしで、ＨＲおよび再発ありの両方に対するエラスティックネット選択モデルに一貫して入ることを示す。記号†は、個々の遺伝子としてのＮＰＶに対する強力な性能を示す。記号‡は、ＬＡＳＳＯモデルにおける強力な性能を示す。記号￥は、再発ありのエラスティックネットモデルへ入ることを示す。記号ｂは、免疫経路遺伝子を表す。
【００９９】
メチル化マーカーに加えて、２つの突然変異マーカーを、含めるために選択した。第１のものがＦＧＦＲ３内にあり、ゲノム位ｃｈ４：１８０３５６８において、ＣからＧへの突然変異を含み、これによりタンパク質においてＳ２４９Ｃ突然変異が生じる。この突然変異は、リスクの低い、異型度が低い膀胱がんを有する患者の６５％より多くで見られる。この突然変異に対する検出限界は、Ｃｐ＝３３の場合である。第２は、ゲノム位ｃｈｒ５：１２９５２２８のＴＥＲＴ内にあり、これは、最も一般的なＴＥＲＴ突然変異であり、遺伝子に対するプロモーター領域に見られる。突然変異は、一方のＤＮＡ鎖におけるＧからＡへの変化または反対鎖におけるＣからＴへの変化のいずれかである。これは、すべての膀胱がん患者の約６５％において見られる。この突然変異に対する検出限界は、Ｃｐ＝３０である場合である。低リスクおよび高リスクの患者における再発リスクに関するこれらの突然変異それぞれの存在に対する関連シグナルを以下の表に示す。
【表６】
2020519296.tif 000011
【０１００】
ＦＧＦＲ３突然変異の追加によって、再発ＬＲの予測が実質的に改善したが、一方、ＴＥＲＴ突然変異を含んでも、再発ＨＲの性能はわずかにしか改善しなかった。
【０１０１】
最大４つのメチル化に依存しない（ＭＩＰ）基準遺伝子を、直線性研究において使用し、十分に実施した。最終的な２つのＭＩＰ基準遺伝子である、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３を、４つの異なる正規化スキームの下で、Ｍ１メチル化マーカー、ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴ突然変異アッセイを含むモデルの性能に基づいて選択した。ＭＩＰ基準遺伝子の数が４から２へと低減した場合、性能において障害は観察されなかった。したがって、メチル化シグナルは、２つの遺伝子：ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３の平均に対して正規化した。
【０１０２】
各アルゴリズムの性能を、再発ＨＲ、再発ＬＲおよび再発なしの結果のカテゴリー、ならびにメチル化マーカー、変異の存在の指標および予測因子としての初期の腫瘍状態（低リスク対高リスク）に対する指標変数を用いる多項ロジスティック回帰モデルを使用して評価した。このモデルに基づいて、｛再発ＨＲ｝の確率および｛再発ＬＲ｝の確率を、研究集団の各患者に対して推定した。ＮＰＶ、ＰＰＶ、感度および特異度を、再発の確率のモデルに基づく推定、亜群における指標の重み付き経験分布（初期の高リスクまたは低リスクの腫瘍）、および標的集団の亜群における仮定した真の再発有病率、具体的には：初期のＬＲ腫瘍患者：８５％が再発なし、１０％が再発ＬＲ、５％が再発ＨＲおよび初期のＨＲ腫瘍患者：８５％が再発なし、２％が再発ＬＲ、１３％が再発ＨＲ、を使用して評価した。
【０１０３】
再発ＨＲの存在を定義するためのカットポイントを、初期のＬＲ患者のＰｒ｛再発ＨＲ｝の分布の特異的パーセンタイル、例えば、第５０パーセンタイルで決定した。再発の存在を定義するためのカットポイントを、初期のＨＲ患者、例えば、第８５パーセンタイルのＰｒ｛再発あり｝の分布の事前に指定したパーセンタイルで決定した。
【０１０４】
最終アルゴリズムＭ１〜Ｍ９は、以下のステップを含む：
７）メチル化マーカーおよび基準遺伝子のそれぞれに関し、直線性研究から推定した切片および傾きを使用して、異なるＰＣＲ増幅効率について補正する：
【数４】
2020519296.tif 000012
８）基準遺伝子の平均を計算する  ｍｉｐ＝基準遺伝子の平均α値
９）ＭＦ＝０または（１もしくは２ｍ−ｍｉｐの最小）の最大、すなわち、ｍａｘ０（ｍｉｎ１，２ｍ−ｍｉｐ）として、各遺伝子におけるメチル化分率を推定する
１０）選択した方法（ａ）または（ｂ）を適用して、個々の遺伝子のメチル化を定量する：
ａ．メチル化ＤＮＡの量  ａｍｏｕｎｔ＝ＭＦ＊試料収量（ｎｇ）、または
ｂ．メチル化ＤＮＡの濃度  ｃｏｎｃ=ＭＦ＊試料収量（ｎｇ）/試料体積（ｍＬ）
１１）Ｌｏｇ１０（遺伝子全体にわたる平均のａｍｏｕｎｔまたはｃｏｎｃ）を計算する
１２）３３Ｃｐ未満におけるＦＧＦＲ３または３０Ｃｐ未満におけるＴＥＲＴの突然変異の存在を定義する
最終アルゴリズムの性能を評価するために、再発ＨＲ、再発ＬＲおよび再発なしのカテゴリーを有する多項ロジスティック回帰モデルを以下の予測変数にフィットさせた：
−  選択した方法に対する自由度２の自然３次スプライン：
・  Ｌｏｇ１０（平均のａｍｏｕｎｔ）、または
・  Ｌｏｇ１０（平均のｃｏｎｃ）
−  ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴ突然変異に対する指標
−  患者の亜群に対する指標（初期のＬＲ対初期の再発ＨＲ）。
【０１０５】
性能パラメーターである、感度、特異度、陰性予測値（ＮＰＶ）、および陽性予測値（ＰＰＶ）を、フィットさせたロジスティック回帰モデル、ならびに最も低い推定再発確率から最も高い推定再発確率までの範囲のカットオフでの再発高リスクおよび再発ありの、仮定した真の母比率を使用して推定した。（図１〜２、４〜５、７〜８、および１０〜１１および以下の表を参照のこと）。文献および内部の研究に基づき、この分析では、再発の真の母比率についての以下の推定を使用した：
１）初期の低リスクの患者について：８５％の患者が再発なし、１０％の患者が再発低リスクおよび５％の患者が再発高リスク
２）初期の高リスクの患者について：８５％の患者が再発なし、２％の患者が再発低リスクおよび１３％の患者が再発高リスク
性能パラメーターを、これらの確率の推定集団分位数に対してプロットした。追加の性能評価は以下を含んだ（図３，６、９、および１２を参照のこと）：
１．予測曲線、すなわち、確率についての集団分位数に対する再発ＨＲまたは再発ありの推定確率のプロット
２．ＲＯＣ曲線、すなわち、再発の各確率におけるカットポイントに関する検査について、１から特異度を引いたものに対する感度のプロット、および
３．ＲＯＣ曲線下面積。
【０１０６】
最終モデルの性能を、以下の表および図１〜１２に記載する。Ｍ２〜Ｍ９遺伝子の組合せについてのモデル性能は、以下の表の改善研究におけるパーセンタイルカットポイントにおいてまとめる。具体的には、対象を、再発ＬＲまたは再発ＨＲの初期の診断を有するものへと分割した。初期の再発ＬＲ対象に対しては、陽性事象を、対象が実際に再発ＨＲカテゴリー（エンドポイント：再発ＨＲ）に属するとみなした。初期の再発ＨＲ対象に対しては、陽性事象を実際の再発あり（エンドポイント：再発あり）であるとみなした。以下の表には、検査集団の第５０および第８５パーセンタイルにおいて与えられる初期のＬＲ対象における再発ＨＲまたは初期のＨＲ対象における再発ありのいずれかに関連する感度、特異度、ＮＰＶ、およびＰＰＶが与えられる。
【０１０７】
メチル化ＤＮＡの量およびメチル化ＤＮＡの濃度に対するＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴ突然変異アッセイに関するＭ１モデルに対する性能の詳細なまとめも図１〜１２に示す。例えば、図１は、初期のＬＲ対象に対するＮＰＶ、ＰＰＶ、感度および特異度曲線、対象の第５０および第７５パーセンタイルにおけるＮＰＶ、ＰＰＶ、感度、および特異度値を示し、ここで、陽性の事象は、実際の再発ＨＲであると考えられる。図２は、初期のＬＲ対象に対するＮＰＶ、ＰＰＶ、感度および特異度線、および対象の第５０および第７５パーセンタイルにおけるＮＰＶ、ＰＰＶ、感度、および特異度値を示し、ここで、陽性の事象は実際の再発ありと考えられる。関連する予測性曲線およびＲＯＣ曲線を図３に示す。初期のＨＲ患者に対する同様のデータを図４〜６に示す。メチル化ＤＮＡの濃度の分析に基づくデータを図７〜１２に示す。
【表７】
2020519296.tif 000013
【表８】
2020519296.tif 000014
【０１０８】
（実施例４）
メチル化および突然変異検出のための方法
図１３に示したフロー図に従って、メチル化および突然変異検出のために以下の方法を使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＭｉｎｉＫｉｔ（登録商標）を、遠心分離した尿試料からのＤＮＡ抽出のために使用した。ＤＮＡの亜硫酸塩変換を、Ｑｉａｇｅｎ  ＥｐｉＴｅｃｔ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅキットを使用して実施した。標的遺伝子のプレ増幅およびメチル化特異的定量的ＰＣＲ（ＭＳ−ｑＰＣＲ）を、ＫＡＰＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｆａｓｔ（登録商標）キット（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。
【０１０９】
アッセイでは、メチル化およびＦＧＦＲ３／ＴＥＲＴ突然変異の状況を、単一のワークフローアッセイで検出した。これは、細胞ペレットのＤＮＡを亜硫酸塩変換して、メチル化シトシンがシトシンのままである一方、メチル化されていないシトシンがウラシルとなり、野生型ブロッキング核酸と共に、メチル化特異的プライマーおよび突然変異特異的プライマーを使用する限定数のＰＣＲサイクルを実施することによって可能となる。プライマーはすべて、亜硫酸塩変換ＤＮＡを増幅するよう設計され、亜硫酸塩変換鋳型をアニーリングした。この後に、増幅産物に関して、メチル化および突然変異のシングルプレックス定量的ＰＣＲ分析を行い、所望の部位のメチル化および突然変異の状況を決定した。この方法論のある特定の態様が、J.  Morlanら、PLoS  One  第４巻、第２号、ｅ４５８４、１〜１１頁（２００９年）に記載されている。
【０１１０】
（実施例５）
検証研究
再発を予測するための遺伝子マーカーおよびエピゲノムマーカーを用いる尿に基づくアッセイの臨床検証研究を、筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）の対象において行う。この研究には、約３０箇所の臨床現場が関与し、これらの現場で、異常な膀胱鏡検査および細胞診を有するすべての患者（最大で合計約３８０名の患者）の参加が募られることになる。３８０名の患者の参加が、約３００の分析に有用な患者の試料を得るために期待される。具体的には、選択基準は、以前の診断が、筋層非浸潤性、Ｔ１またはそれより低い、監視膀胱鏡検査を受ける予定のある膀胱の尿路上皮細胞癌を有する患者（ＮＭＩＢＣの初期の診断または最近の再発が、過去５年以内である）である。患者は、筋肉浸潤性疾患を有するかまたはＴ２もしくはそれより高いか、あるいは初期診断または最近の再発から利用可能な腫瘍ブロックを有さない、あるいはＴＵＲＢＴを含むある特定の臨床手順に対して禁忌を示す場合には除外される場合がある。
【０１１１】
この研究の主要な目的は、再発の尤度とメチル化アッセイからのスコアの結果の間の関連を検証することである。この研究によって、この群の患者におけるアッセイの感度、特異度、ＮＰＶおよびＰＰＶも特徴付けられることになる。尿試料を、最初の朝の排尿後であって、膀胱のいずれかの操作（例えば、膀胱鏡検査、手術、カテーテル法）の前の操作の少なくとも１日後に採取する。保管した、固定包埋（ＦＰＥ）組織試料も、ＴＵＲＢＴ、上部ＧＵ管精密検査、または膀胱鏡検査から得た腫瘍組織試料から採取した。患者の初期の膀胱鏡検査、細胞診（可能な場合）、ＴＵＲＢＴまたは膀胱鏡検査組織分析、および上部ＧＵ精密検査が提供される。膀胱鏡検査および細胞診は、正常または異常のいずれかと記録され、ＴＵＲＢＴおよび上部ＧＵ管精密検査からの組織は、陰性、またはＴａで異型度が低い、または異型度が高い、Ｔ１〜Ｔ２、Ｔｉｓとして記録される。この研究の目的として、異常な膀胱鏡検査の結果は、追跡ＴＵＲＢＴ、上部ＧＵ管精密検査または追跡膀胱鏡検査を必要とする、観察された任意の異常性である。異常な細胞診の結果はまた、ＴＵＲＢＴまたは上部ＧＵ管精密検査または追跡膀胱鏡検査を導く任意の異常性である。陽性の上部ＧＵ管精密検査を、組織学的に確認された上部ＧＵ管尿路上皮癌として定義し、一方、陰性の上部ＧＵ管精密検査を、上部ＧＵ管尿路上皮癌の臨床エビデンスなしとして定義する。
【０１１２】
検証するためにこの検査が使用される一次臨床エンドポイントは、患者の初期の膀胱鏡検査、細胞診（可能な場合）、ＴＵＲＢＴまたは膀胱鏡検査組織分析、および上部ＧＵ精密検査に基づく再発の存在である。一般的に、ＴＵＲＢＴもしくは膀胱鏡検査からの陰性組織分析結果および／または上部ＧＵ管精密検査からの陰性組織分析を有する患者を検査し、がんの再発がないことをチェックする。ＴＵＲＢＴ／膀胱鏡検査のいずれかおよび／または上部ＧＵ管精密検査の組織分析からのＴａで異型度が低い組織の結果を有する患者を検査して、再発リスクが低いことをチェックする。ＴＵＲＢＴ／膀胱鏡検査または上部ＧＵ管精密検査のいずれかの組織分析からの異型度が高い、Ｔ１〜Ｔ２、Ｔｉｓ組織の結果を有する患者を試験して、再発リスクが依然として高いままであることをチェックする。
【０１１３】
遺伝子マーカーのメチル化レベルを、ＦＰＥ試料と尿試料の両方における定量的ＰＣＲによって測定する。各メチル化マーカーに対して、Ｃｐ測定値が得られ、この測定値を、基準マーカーからのメチル化に依存しないアッセイに対して正規化する。各遺伝子毎の各試料由来のメチル化分率（ＭＦ）は、本明細書の他の箇所に記載したように計算される。
【０１１４】
統計分析は、尿およびＦＰＥ組織試料から得た膀胱がんメチル化分析の結果を有する約３００名のＮＭＩＢＣ患者に関することになる。この試料数を得るために、研究には、約３８０名の患者が参加することになる。再発の尤度とメチル化分析の結果の間に有意な関係があるかどうかを決定するために、分析を、上記実施例３に記載した多項ロジスティック回帰モデルにフィットさせることになる。膀胱がんスコアの結果を除くヌルモデルと膀胱がんスコアの結果を含むフルモデルの間の尤度比検査に対する０．０５未満のｐ値を有意とみなすことになる。
【０１１５】
特定したカットポイントにおけるメチル化分析の性能は、再発ありを予測するために、および別途再発高リスクを予測するために、感度、特異度、陰性予測値（ＮＰＶ）、および陽性予測値（ＰＰＶ）の点から特徴付けられる。これらのパラメーターは、研究にエントリーするためにスクリーニングした集団に由来する再発高リスクおよび再発低リスクの集団有病率の推定に関する、上記のロジスティック回帰モデルに基づいて計算されることになる。
【０１１６】
メチル化分析の結果と、ＥＯＲＴＣ、ＣＵＥＴＯ、およびＥＡＵ再発リスクまたはリスクスコア群とを有するモデルを含む、膀胱がんメチル化分析および既存リスクスコアリングシステムを含む多変数モデルも考慮されることになる。（それぞれ、R.J.  Sylvesterら、Eur.  Urol.４９巻：４６６〜７５頁（２００６年）；J.  Fernandez-Gomezら、J.  Urol.１８２巻：２１９５〜２０３頁（２００９年）；およびwww  "dot"  nccn  "dot"  org  "/"  professionals  "/"  physician_gls  "/"  pdf  "/"  bladder  "dot"  pdf.で利用可能なNCCN  Clinical  Practice  Guidelines  in  Oncology  Bladder  Cancer  バージョン２．２０１５年を参照のこと）。
【０１１７】
追加の分析には、以下のそれぞれが含まれることになる。第１に、監視訪問からの情報を使用する感度分析を行うことになる。具体的には、最初の研究中の監視では、がんの再発を有しないが、引き続きの監視訪問では再発を有した患者は、早期にがんの再発を検出するメチル化アッセイの能力を評価する分析において再発とみなされることになる。特定のカットポイント値におけるメチル化の結果の性能は、感度、特異度、ＮＰＶ、およびＰＰＶの点から特徴付けられることになる。第２に、上記した多項ロジスティック回帰分析モデルを使用するメチル化分析の結果の関数としての、再発低リスク、再発高リスクおよび再発ありの確率は、研究にエントリーするためにスクリーニングした集団に由来する再発高リスクおよび再発低リスクの集団有病率の推定を使用することによって推定されることになる。ロジスティックスモデルの根底にある仮定が保持されない場合、代替技法を使用して、メチル化アッセイの結果と再発の尤度の間の関係を推定し、方法の選択に対する確率推定の感度を評価してもよい。再発低リスク、再発高リスクおよび再発ありの確率は、種々のレベルの高度な予測可能共変数におけるメチル化分析の結果の関数として推定されることになる。ロジスティックスモデルへの非線形項または平滑化スプラインの包含などの方法を使用する、メチル化スコアの結果と再発の尤度の間の関連についての代替の関数形態が実施されてもよい。第３に、予測可能共変数によって定義される亜群におけるメチル化検査結果と再発の確率の間の関係は、メチル化検査結果、所与の共変数、およびこの２つの相互作用を含む多項ロジスティック回帰モデルにフィットさせることによって評価されることになる。このモデルは、他の高度な予測可能共変数に対して調整されてもよい。次いで、再発に対する亜群特異的オッズ比が報告されてもよい。
【図１】
2020519296.tif 000015
【図２】
2020519296.tif 000016
【図３−１】
2020519296.tif 000017
【図３−２】
2020519296.tif 000018
【図４】
2020519296.tif 000019
【図５】
2020519296.tif 000020
【図６−１】
2020519296.tif 000021
【図６−２】
2020519296.tif 000022
【図７】
2020519296.tif 000023
【図８】
2020519296.tif 000024
【図９−１】
2020519296.tif 000025
【図９−２】
2020519296.tif 000026
【図１０】
2020519296.tif 000027
【図１１】
2020519296.tif 000028
【図１２−１】
2020519296.tif 000029
【図１２−２】
2020519296.tif 000030
【図１３】
2020519296.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月19日(2019.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿沈渣試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を、膀胱がんを有する患者における臨床評価の指標とする方法であって、
前記患者から得られた前記試料由来のＤＮＡを重亜硫酸塩変換することと、
重亜硫酸塩変換ＤＮＡに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲを実施して、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットから、前記試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を決定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記患者が、筋層非浸潤性膀胱がんを有すると診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者の腫瘍が、Ｔａ、Ｔｉｓ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａもしくは異型度が低いと以前に診断されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
患者の腫瘍が、Ｔ１もしくは異型度が高い；またはＴ１、Ｔｉｓ、もしくは異型度が高い；またはＴ１〜Ｔ２もしくは異型度が高い；またはＴｉｓ、Ｔ１〜Ｔ２、もしくは異型度が高いと以前に診断されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、筋層浸潤性膀胱がんを有すると診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
膀胱鏡検査の前に行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
陰性の膀胱鏡検査後に行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１年に少なくとも１回、例えば、６カ月に１回、または３カ月に１回行われる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも４つの遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子の前記セットが、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ
のうちの１つを含む、請求項１から８または１０から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ；
のうちの１つ、ならびに
少なくとも１つの基準遺伝子
からなる、請求項１から８または１０から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記メチル化ＤＮＡの量および／または濃度が、前記患者における再発リスクの指標として使用され、前記方法が、前記患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と比較することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴのうちの１つまたは両方の突然変異について、重硫酸塩変換ＤＮＡを分析することをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴにおける突然変異の有無を膀胱がん患者の基準セットの突然変異の有無と比較することをさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
尿沈渣試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を、再発低リスクを有する膀胱がん患者の処置の指標とする方法であって、
前記患者から得られた前記試料由来のＤＮＡを重亜硫酸塩変換することと、
重亜硫酸塩変換ＤＮＡに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲを実施して、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットから、前記試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を決定することと、
前記患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と比較することと
を含み、前記患者におけるメチル化の量および／または濃度と膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度との比較に基づいて前記患者が再発低リスクを有することが決定されると、前記方法は、前記患者が積極的監視により処置され得ることを示す、方法。
【請求項１９】
積極的監視による前記処置によって、前記患者に対する膀胱鏡検査の頻度を低減することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が、筋層非浸潤性膀胱がんを有すると診断されている、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
患者の腫瘍が、Ｔａ、Ｔｉｓ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａもしくは異型度が低いと以前に診断されている、請求項１２０に記載の方法。
【請求項２２】
患者の腫瘍が、Ｔ１もしくは異型度が高い；またはＴ１、Ｔｉｓ、もしくは異型度が高い；またはＴ１〜Ｔ２もしくは異型度が高い；またはＴｉｓ、Ｔ１〜Ｔ２、もしくは異型度が高いと以前に診断されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
膀胱鏡検査の前に行われる、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
陰性の膀胱鏡検査後に行われる、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも４つの遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２を含む、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３を含む、請求項１８から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子の前記セットが、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに含む、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ
のうちの１つを含む、請求項１８から２４または２６から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ；
のうちの１つ、ならびに
少なくとも１つの基準遺伝子
からなる、請求項１８から２４または２６から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴのうちの１つまたは両方の突然変異について、重硫酸塩変換ＤＮＡを分析することをさらに含む、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴにおける突然変異の有無を膀胱がん患者の基準セットの突然変異の有無と比較することをさらに含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
膀胱がん患者由来の尿沈渣試料におけるＤＮＡメチル化を定量するためのシステムであって、（ａ）少なくとも１つのウェルを備えた少なくとも１つのカートリッジであって、前記少なくとも１つのウェルが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡの増幅のためのプライマーを含み、前記カートリッジが、前記遺伝子に対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成され、前記プライマーが前記少なくとも１つのウェルに必要に応じて結合されている、カートリッジ、（ｂ）各遺伝子由来の増幅ＤＮＡを検出するための検出装置、ならびに（ｃ）前記遺伝子由来のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を定量するためのコンピューターソフトウェアであって、前記患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と必要に応じて比較するソフトウェアを含むシステム。
【請求項３４】
前記カートリッジが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記カートリッジが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
前記カートリッジが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項３３、３４、または３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記カートリッジが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つを含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３８】
前記カートリッジが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つからなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、請求項３３から３８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４０】
前記プライマーが、少なくとも１つのウェルに結合されている、請求項３３から３９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４１】
前記カートリッジが、ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む、請求項３３から４０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法を実施することができる、請求項３３から４２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡの増幅のためのプライマーを含む少なくとも１つのウェルを含むカートリッジであって、前記カートリッジが、前記遺伝子に対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成され、前記プライマーが、前記少なくとも１つのウェルに必要に応じて結合されている、カートリッジ。
【請求項４５】
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項４４に記載のカートリッジ。
【請求項４６】
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項４４に記載のカートリッジ。
【請求項４７】
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項４４、４５、または４６に記載のカートリッジ。
【請求項４８】
以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つを含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項４４に記載のカートリッジ。
【請求項４９】
以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つからなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、請求項４４に記載のカートリッジ。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、請求項４４から４９のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項５１】
前記プライマーが、前記少なくとも１つのウェルに結合されている、請求項４４から５０のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項５２】
ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を決定するための試薬をさらに含む、請求項４４から５１のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項５３】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項５２に記載のカートリッジ。
【請求項５４】
請求項４４から５３のいずれか一項に記載のカートリッジ、ならびに以下の：（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；ならびに（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のうちの少なくとも１つをさらに含むキット。
【請求項５５】
（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；および（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のそれぞれを含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
少なくとも１つの検出試薬をさらに含む、請求項５４または５５に記載のキット。
【請求項５７】
ＤＮＡの重亜硫酸塩変換のための少なくとも１つの試薬をさらに含む、請求項５４から５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む、請求項５４から５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
使用のための説明書をさらに含む、請求項５４から５９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６１】
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのプライマーのセットを含む組成物。
【請求項６２】
前記遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
前記遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む、請求項６１から６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
（ａ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；または
（ｉ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲのためのプライマーのセットを含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６６】
（ａ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；または
（ｉ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
からなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲのためのプライマーのセットを含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６７】
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、請求項６１から６６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む、請求項６１から６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
以下の：（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項６１から６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；ならびに（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のそれぞれを含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
少なくとも１つの検出試薬をさらに含む、請求項７０または７１に記載の組成物。
【請求項７３】
ＤＮＡの重亜硫酸塩変換のための少なくとも１つの試薬をさらに含む、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本明細書では、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのプライマーのセットを含む組成物も企図される。一部の組成物では、プライマーのセットは、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子からなる遺伝子の群のためのものである。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子からなる。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子からなる。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む。本明細書の一部の組成物では、遺伝子は、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子からなる。本明細書の一部の組成物は：（ａ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｂ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｃ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｄ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｅ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｆ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｇ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｈ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；または（ｉ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットのメチル化特異的定量的ＰＣＲのためのプライマーのセットを含む。本明細書の一部の組成物は：（ａ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｂ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｃ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｄ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｅ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｆ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｇ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；（ｈ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；または（ｉ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子からなる遺伝子のセットのメチル化特異的定量的ＰＣＲのためのプライマーのセットを含む。本明細書の一部の組成物では、少なくとも１つの基準遺伝子は、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む。本明細書の一部の組成物は、ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３突然変異は、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、ＴＥＲＴ突然変異は、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である。本明細書の一部の組成物は、以下の：（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のうちの少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；および（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のそれぞれを含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの検出試薬をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＤＮＡの重亜硫酸塩変換のための少なくとも１つの試薬をさらに含む。本明細書の組成物はさらに、上述のシステム、カートリッジ、およびキットの構成成分であってもよく、この項の最初に記載した方法において有用であり得る。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
膀胱がんを有する患者をモニタリングする方法であって、
前記患者から尿沈渣試料を得ることと、
前記試料由来のＤＮＡを重亜硫酸塩変換することと、
重亜硫酸塩変換ＤＮＡに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲを実施して、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットから、前記試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を決定することと
を含む、方法。
（項目２）
前記患者が、筋層非浸潤性膀胱がんを有すると診断されている、項目１に記載の方法。
（項目３）
患者の腫瘍が、Ｔａ、Ｔｉｓ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａもしくは異型度が低いと以前に診断されている、項目２に記載の方法。
（項目４）
患者の腫瘍が、Ｔ１もしくは異型度が高い；またはＴ１、Ｔｉｓ、もしくは異型度が高い；またはＴ１〜Ｔ２もしくは異型度が高い；またはＴｉｓ、Ｔ１〜Ｔ２、もしくは異型度が高いと以前に診断されている、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記患者が、筋層浸潤性膀胱がんを有すると診断されている、項目１に記載の方法。
（項目６）
膀胱鏡検査の前に行われる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
陰性の膀胱鏡検査後に行われる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
１年に少なくとも１回、例えば、６カ月に１回、または３カ月に１回行われる、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記少なくとも４つの遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
遺伝子の前記セットが、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ
のうちの１つを含む、項目１から８または１０から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ；
のうちの１つ、ならびに
少なくとも１つの基準遺伝子
からなる、項目１から８または１０から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記患者における再発リスクを決定すること、前記患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と比較することをさらに含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴのうちの１つまたは両方の突然変異について、重硫酸塩変換ＤＮＡを分析することをさらに含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴにおける突然変異の有無を膀胱がん患者の基準セットの突然変異の有無と比較することをさらに含む、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
再発低リスクを有する膀胱がん患者を処置する方法であって、
前記患者から尿沈渣試料を得ることと、
前記試料由来のＤＮＡを重亜硫酸塩変換することと、
重亜硫酸塩変換ＤＮＡに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲを実施して、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットから、前記試料中のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を決定することと、
前記患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と比較することによって、患者が再発低リスクを有することを決定することと、
積極的監視により、前記患者を処置すること
とを含む、方法。
（項目１９）
積極的監視による前記処置によって、前記患者に対する膀胱鏡検査の頻度を低減することを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記患者が、筋層非浸潤性膀胱がんを有すると診断されている、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
患者の腫瘍が、Ｔａ、Ｔｉｓ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａ、Ｔ０、もしくは異型度が低い；またはＴａもしくは異型度が低いと以前に診断されている、項目１２０に記載の方法。
（項目２２）
患者の腫瘍が、Ｔ１もしくは異型度が高い；またはＴ１、Ｔｉｓ、もしくは異型度が高い；またはＴ１〜Ｔ２もしくは異型度が高い；またはＴｉｓ、Ｔ１〜Ｔ２、もしくは異型度が高いと以前に診断されている、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
膀胱鏡検査の前に行われる、項目１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
陰性の膀胱鏡検査後に行われる、項目１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記少なくとも４つの遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２を含む、項目１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３を含む、項目１８から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
遺伝子の前記セットが、ＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢから選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに含む、項目１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ
のうちの１つを含む、項目１８から２４または２６から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
遺伝子の前記セットが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ；および
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ；
のうちの１つ、ならびに
少なくとも１つの基準遺伝子
からなる、項目１８から２４または２６から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴのうちの１つまたは両方の突然変異について、重硫酸塩変換ＤＮＡを分析することをさらに含む、項目１８から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
ＦＧＦＲ３および／またはＴＥＲＴにおける突然変異の有無を膀胱がん患者の基準セットの突然変異の有無と比較することをさらに含む、項目３０または３１に記載の方法。
（項目３３）
膀胱がん患者由来の尿沈渣試料におけるＤＮＡメチル化を定量するためのシステムであって、（ａ）少なくとも１つのウェルを備えた少なくとも１つのカートリッジであって、前記少なくとも１つのウェルが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡの増幅のためのプライマーを含み、前記カートリッジが、前記遺伝子に対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成され、前記プライマーが前記少なくとも１つのウェルに必要に応じて結合されている、カートリッジ、（ｂ）各遺伝子由来の増幅ＤＮＡを検出するための検出装置、ならびに（ｃ）前記遺伝子由来のメチル化ＤＮＡの量および／または濃度を定量するためのコンピューターソフトウェアであって、前記患者におけるメチル化の量および／または濃度を膀胱がん患者の基準セットにおけるメチル化の量および／または濃度と必要に応じて比較するソフトウェアを含むシステム。
（項目３４）
前記カートリッジが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、項目３３に記載のシステム。
（項目３５）
前記カートリッジが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、項目３４に記載のシステム。
（項目３６）
前記カートリッジが、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、項目３３、３４、または３５に記載のシステム。
（項目３７）
前記カートリッジが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つを含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、項目３３に記載のシステム。
（項目３８）
前記カートリッジが、以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つからなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、項目３３に記載のシステム。
（項目３９）
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、項目３３から３８のいずれか一項に記載のシステム。
（項目４０）
前記プライマーが、少なくとも１つのウェルに結合されている、項目３３から３９のいずれか一項に記載のシステム。
（項目４１）
前記カートリッジが、ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む、項目３３から４０のいずれか一項に記載のシステム。
（項目４２）
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、項目４１に記載のシステム。
（項目４３）
項目１から１７のいずれか一項に記載の方法を実施することができる、項目３３から４２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目４４）
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡの増幅のためのプライマーを含む少なくとも１つのウェルを含むカートリッジであって、前記カートリッジが、前記遺伝子に対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成され、前記プライマーが、前記少なくとも１つのウェルに必要に応じて結合されている、カートリッジ。
（項目４５）
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、項目４４に記載のカートリッジ。
（項目４６）
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、項目４４に記載のカートリッジ。
（項目４７）
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、項目４４、４５、または４６に記載のカートリッジ。
（項目４８）
以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つを含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、項目４４に記載のカートリッジ。
（項目４９）
以下の遺伝子のセット：
（ａ）Ｍ１：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）Ｍ２：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）Ｍ３：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）Ｍ４：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）Ｍ５：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）Ｍ６：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）Ｍ７：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）Ｍ８：ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；ならびに
（ｉ）Ｍ９：ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
のうちの１つからなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲの性能のために構成されている、項目４４に記載のカートリッジ。
（項目５０）
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、項目４４から４９のいずれか一項に記載のカートリッジ。
（項目５１）
前記プライマーが、前記少なくとも１つのウェルに結合されている、項目４４から５０のいずれか一項に記載のカートリッジ。
（項目５２）
ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を決定するための試薬をさらに含む、項目４４から５１のいずれか一項に記載のカートリッジ。
（項目５３）
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、項目５２に記載のカートリッジ。
（項目５４）
項目４４から５３のいずれか一項に記載のカートリッジ、ならびに以下の：（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；ならびに（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のうちの少なくとも１つをさらに含むキット。
（項目５５）
（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；および（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のそれぞれを含む、項目５４に記載のキット。
（項目５６）
少なくとも１つの検出試薬をさらに含む、項目５４または５５に記載のキット。
（項目５７）
ＤＮＡの重亜硫酸塩変換のための少なくとも１つの試薬をさらに含む、項目５４から５６のいずれか一項に記載のキット。
（項目５８）
ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む、項目５４から５７のいずれか一項に記載のキット。
（項目５９）
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、項目５８に記載のキット。
（項目６０）
使用のための説明書をさらに含む、項目５４から５９のいずれか一項に記載のキット。
（項目６１）
ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａから選択される少なくとも４つの遺伝子、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子の重亜硫酸塩修飾ＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのプライマーのセットを含む組成物。
（項目６２）
前記遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子を含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６３）
前記遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＤＤＸ２５、およびＴＭＥＭ１０６Ａのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６４）
前記遺伝子が、ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、およびＫＬＦ２、ならびにＥＰＨＸ３、ＩＲＸ５、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、およびＩＴＰＫＢのうちの１つまたは複数、ならびに少なくとも１つの基準遺伝子を含む、項目６１から６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６５）
（ａ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；または
（ｉ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
を含む遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲのためのプライマーのセットを含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６６）
（ａ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｂ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｃ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｄ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｅ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＥＰＨＸ３、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｆ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＲＸ５、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｇ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＳＯＸ１、ＴＭＥＭ１０６Ａ、および少なくとも１つの基準遺伝子；
（ｈ）ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＳＲ１、ＳＯＸ１、ＥＯＭＥＳ、ＮＩＤ２、ＶＩＭ、および少なくとも１つの基準遺伝子；または
（ｉ）ＭＥＩＳ１、ＮＫＰＤ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＫＬＦ２、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＩＴＰＫＢ、および少なくとも１つの基準遺伝子
からなる遺伝子のセットに対するメチル化特異的定量的ＰＣＲのためのプライマーのセットを含む、項目６１に記載の組成物。
（項目６７）
前記少なくとも１つの基準遺伝子が、ＣＴＮＳ、ＴＯＰ３Ａ、ＣＯＬ２ＡおよびＳＬＣ２４Ａ３のうちの１つまたは複数を含む、項目６１から６６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６８）
ＴＥＲＴおよびＦＧＦＲ３のうちの１つまたは両方における突然変異を検出するための試薬をさらに含む、項目６１から６７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６９）
前記ＦＧＦＲ３突然変異が、ｃｈｒ４：１８０３５６８のＣからＧへの置換であり、前記ＴＥＲＴ突然変異が、ｃｈｒ５：１２９５２２８のＧからＡへの置換である、項目６８に記載の組成物。
（項目７０）
以下の：（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のうちの少なくとも１つをさらに含む、項目６１から６９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７１）
（ａ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；（ｂ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ酵素；ならびに（ｃ）少なくとも１つの反応および／または洗浄緩衝液のそれぞれを含む、項目７０に記載の組成物。
（項目７２）
少なくとも１つの検出試薬をさらに含む、項目７０または７１に記載の組成物。
（項目７３）
ＤＮＡの重亜硫酸塩変換のための少なくとも１つの試薬をさらに含む、項目７０から７２のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
2020519296.tif 000032
2020519296.tif 000033
2020519296.tif 000034