(57)【要約】本開示は、治療用核酸を使用して、急速に進化する生物学的実体（例えば、がん細胞、細菌、ウイルスなど）を処置するための方法及び組成物を記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
急速に進化する生物学的実体に関連する疾患について対象を処置する方法であって、
（ａ）前記急速に進化する生物学的実体を標的とする治療用核酸を前記対象に投与すること；
（ｂ）前記対象が治療反応を示すか否かを判断すること；及び
（ｃ）前記対象が治療反応を示すことができない場合：
（ｉ）前記急速に進化する生物学的実体を含む対象から試料を取得すること；
（ｉｉ）前記急速に進化する生物学的実体を標的とする新しい治療用核酸を特定するためのスクリーニングアッセイを実施すること；
（ｉｉｉ）新しい治療用核酸を対象に投与すること、
を包含する方法。
【請求項２】
前記対象が治療反応を示す場合、ステップ（ｃ）が治療用核酸を投与し続けることをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）〜（ｃ）が繰り返される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記急速に進化する生物学的実体が前記対象から排除されるまで、ステップ（ｂ）〜（ｃ）が繰り返される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記急速に進化する生物学的実体に関連する疾患が処置されるまで、ステップ（ｂ）〜（ｃ）が繰り返される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）の前に、以下のステップ：
（１）急速に進化する生物学的実体を含む対象から試料を取得すること；及び
（２）治療用核酸を特定するためのスクリーニングアッセイを行うこと、
をさらに包含する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）の前に、前記急速に進化する生物学的実体の分析を行うことをさらに包含する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記急速に進化する生物学的実体の分析が、核酸配列決定分析、プロテオーム分析、表面マーカー発現分析、細胞周期分析、メタボロミクス分析、または核酸の直接選択による分析を、前記実体の遺伝子型及び／または表現型の先験的知識なしで含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
急速に進化する生物学的実体に関連する疾患について対象を処置する方法であって、
（ａ）前記急速に進化する生物学的実体を標的とする治療用核酸を対象に投与すること；
（ｂ）一定期間後、急速に進化する生物学的実体を含む対象から試料を取得すること；
（ｃ）前記急速に進化する生物学的実体を標的とする新しい治療用核酸を特定するためのスクリーニングアッセイを実施すること；
（ｄ）新しい治療用核酸を対象に投与すること、
を包含する方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）の期間が、前記急速に進化する生物学的実体が治療用核酸に対する耐性を獲得するのに必要な期間以下である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）の期間が、急速に進化する生物学的実体が複製サイクルを完了するのに必要な期間以下である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
急速に進化する生物学的実体に関連する疾患が処置されるまで、ステップ（ｂ）〜（ｄ）が繰り返される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）の前に、以下のステップ：
（１）急速に進化する生物学的実体を含む対象から試料を取得すること；
（２）治療用核酸を特定するためのスクリーニングアッセイを行うこと、
を行うことをさらに包含する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）の前に、急速に進化する生物学的実体の分析を行うことをさらに包含する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記急速に進化する生物学的実体の分析が、核酸配列決定分析、プロテオーム分析、表面マーカー発現分析、細胞周期分析、メタボロミクス分析、または核酸の直接選択による分析を、前記実体の遺伝子型及び／または表現型の先験的知識なしで含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記急速に進化する生物学的実体が細菌である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記細菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＴｏｘｏｐｌａｓｍａまたはＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅの属のものである、前記方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記細菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｄｌｅｒｉ、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｌｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｍｐｈｏｒｉｆｏｒｍｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｉｎｇｕｉｎａｌｅ、Ｌｙｍｐｈｏｐａｔｈｉａ  ｖｅｎｅｒｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ．  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｏｖｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｆｏｅｔｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｑｕｕｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｏｒａｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｒａｍｏｓａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｅｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｒａｍｏｓａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍの種のものである、前記方法。
【請求項１９】
前記急速に進化する生物学的実体がウイルスである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、水痘ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、おたふく風邪ウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、またはインフルエンザウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
急速に進化する生物学的実体ががん細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記癌が、巨細胞及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛細血管癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の組み合わせ；小柱腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープの腺癌；腺癌；家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；分枝肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；乳頭及び濾胞性腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺癌；ムチン性嚢細胞癌；ムチン性腺癌；印環細胞癌；浸潤管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；ページェット病、乳腺；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；及び芽球腫、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳腺外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロマン肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒色腫巨大色素性母斑；類上皮細胞黒色腫；青母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；肺胞性横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；発芽細胞腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛腫；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨大細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル芽細胞性線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣細胞腫；星状細胞腫；原形質星細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；グリア芽細胞腫；乏突起細胞腫；乏突起膠腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；傍肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核球性白血病；骨髄肉腫；及びヘアリー細胞白血病である、前記方法。
【請求項２３】
前記治療用核酸が、干渉ＲＮＡまたは核酸アプタマーである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療用核酸が核酸アプタマーである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アプタマーがモノクローナルアプタマーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アプタマーがポリクローナルアプタマーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２４から２６のいずれか１項に記載の方法であって、前記スクリーニングアッセイが以下：
（１）表面に固定された複数のアプタマークラスターを、試料由来の急速に進化する生物学的実体と接触させること；及び（２）前記急速に進化する生物学的実体に特異的に結合する固定されたアプタマークラスターを特定すること
を包含する、前記方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、さらに以下のステップ：
（ａ）表面上のアプタマーライブラリーから複数のアプタマーを固定すること；及び
（ｂ）表面上の複数の固定されたアプタマーを局所的に増幅して、複数の固定されたアプタマークラスターを形成すること、
を包含する、前記方法。
【請求項２９】
前記増幅が、ブリッジＰＣＲ増幅またはローリングサークル増幅を介して行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
一本鎖の固定されたアプタマークラスターを提供するために、固定されたアプタマークラスターから相補鎖を除去することをさらに包含する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記固定されたアプタマークラスターが、ステップ（１）の前に配列決定される、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記配列決定が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定を介して行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
アプタマーライブラリーからのアプタマーを表面にプリントすることにより、複数の固定されたアプタマークラスターを生成することをさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１０８個の異なるアプタマーが表面に固定されている、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
各アプタマークラスターが少なくとも５０個の同一のアプタマーを含む、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記表面がフローセル表面である、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、ステップ（１）の後に洗浄ステップを実行して、表面から未結合の急速に進化する生物学的実体を除去することをさらに包含する、請求項２７から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記固定されたアプタマーのそれぞれが、式ＩＩまたは式ＩＩＩによる配列：
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｐ２（ＩＩ）、または
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｐ２（ＩＩＩ）、
を有し、ここで：
Ｐ１は５’プライマー部位配列であり；
Ｐ２は３’プライマー部位配列であり；
Ｓ１及びＳ２は、それぞれ独立して、少なくとも１つの塩基のステム領域配列であり；
Ｓ１＊はＳ１に対する相補配列であり；
Ｓ２＊はＳ２に対する相補配列であり；そして
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、少なくとも１つの塩基のループ領域配列である、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記急速に進化する生物学的実体が検出可能に標識されている、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記スクリーニングアッセイが以下：
（１）表面上に固定された複数のアプタマークラスターを、急速に進化する生物学的実体と接触させること；及び（２）急速に進化する生物学的実体の特性を調節する固定されたアプタマークラスターを特定すること、
を包含する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、以下のステップ：
（ａ）表面上にアプタマーライブラリーからの複数のアプタマーを固定すること；及び
（ｂ）複数の固定されたアプタマーをフローセル表面で局所的に増幅して、複数の固定されたアプタマークラスターを形成すること、
をさらに包含する、前記方法。
【請求項４２】
前記増幅が、ブリッジＰＣＲ増幅またはローリングサークル増幅を介して行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
一本鎖の固定されたアプタマークラスターを提供するために、前記固定されたアプタマークラスターから相補鎖を除去することをさらに包含する、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記固定されたアプタマークラスターが、ステップ（１）の前に配列決定される、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記配列決定がＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定を介して行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
アプタマーライブラリー由来のアプタマーを表面にプリントすることにより、複数の固定されたアプタマークラスターを生成することをさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１０８個の別個のアプタマーが表面に固定されている、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
各アプタマークラスターが少なくとも５０個の同一のアプタマーを含む、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記表面がフローセル表面である、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記固定されたアプタマーのそれぞれが、式ＩＩまたは式ＩＩＩによる配列：
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｐ２（ＩＩ）、または
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｐ２（ＩＩＩ）、
を有し、ここで：
Ｐ１が５’プライマー部位配列であり；
Ｐ２が３’プライマー部位配列であり；
Ｓ１及びＳ２が、それぞれ独立して、少なくとも１つの塩基のステム領域配列であり；
Ｓ１＊がＳ１の相補配列であり；
Ｓ２＊がＳ２の相補配列であり；そして
Ｌ１及びＬ２がそれぞれ独立して、少なくとも１つの塩基のループ領域配列である、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記急速に進化する生物学的実体が、前記アプタマーを前記標的と接触させる前に検出可能な標識で標識されている、請求項４０〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記検出可能な標識が蛍光色素である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記蛍光色素が、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記検出可能な標識が、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度マーカーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞が、蛍光標識抗体またはその抗原結合フラグメント、アネキシンＶ、蛍光標識融合タンパク質、蛍光標識糖、または蛍光標識レクチンで標識される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記急速に進化する生物学的実体が、細胞へのアプタマーの曝露後に検出可能に標識される、請求項４０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記調節される前記急速に進化する生物学的実体の特性が、細胞生存率、細胞増殖、遺伝子発現、細胞形態、細胞活性化、リン酸化、カルシウム動員、脱顆粒または細胞移動、細胞分化である、請求項４０〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記アプタマーライブラリーを合成することをさらに包含する、請求項２７〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年５月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５０３，０７４号の優先権の恩典を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
がん、細菌、及びウイルスは、全てヒトの健康に対する大きな脅威であり、世界経済に深刻な負担をかけている。がん、細菌、及びウイルスは非常に異なるが、１つの重要な要素（進化し、薬剤耐性を獲得するという能力）を共有している。これらのような急速に進化する標的は、単一の「魔法の弾丸」では効果的に対抗できないことは明らかである。しかし、従来の方法論を使用してこれらの疾患を処置する新薬の発見には何年もかかる場合がある。したがって、これらの標的に対する新しい治療薬を生成するには、新しい治療法を開発するための、より迅速で費用対効果の高い新しい方法が必要である。
【０００３】
アプタマーは、特定の標的分子に結合するか、及び／またはそれに影響を発揮し得る短い一本鎖核酸オリゴマーである。アプタマーは通常、反復プロセスでオリゴヌクレオチドの大きなランダムプールから選択される。つい最近では、細胞内、インビボ、及びインビトロでアプタマーが首尾よく選択されている。
【０００４】
アプタマーの選択、それらの構造と機能の関係、及びそれらの作用機序は、全て十分に理解されていない。１００を超えるアプタマー構造が解明及び報告されているが、繰り返し起こる構造モチーフはほとんど特定されていない。
【０００５】
特定の標的に結合できるアプタマーを特定するためのさまざまな異なるアプタマー選択プロセスが記載されている。しかし、目的の標的に対する望ましい機能的効果を媒介し得るアプタマーを迅速かつ便利に特定する能力は、アプタマー治療に、及び急速に進化する疾患の処置に顕著な影響を有するであろう。
【発明の概要】
【０００６】
要約
本開示は、急速に進化する生物学的実体（例えば、がん、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染など）によって引き起こされる疾患及び障害を処置するための組成物及び方法に関する。本明細書に開示される方法は、急速に進化する標的（例えば、がん、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染など）に関連する疾患または状態を処置するための新規治療薬（例えば、標的特異的アプタマー）の迅速な開発を可能にする。
【０００７】
特定の態様において、本明細書に提供されるのは、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患（例えば、がん、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染など）について対象（例えば、ヒト対象）を処置する方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）急速に進化する生物学的実体（例えば、がん細胞、細菌、ウイルス）を標的とする治療用核酸（例えば、アプタマーまたは干渉ＲＮＡ）を対象に投与すること；（ｂ）対象が治療反応を示すか否かを判断すること；及び（ｃ）対象が治療反応を示せないならば、急速に進化する生物学的実体を含む対象から試料を取得し、スクリーニングアッセイを行って急速に進化する生物学的実体を標的とする新しい治療用核酸を特定し、対象に新しい治療用核酸を投与すること、を包含する。いくつかの実施形態では、この方法のステップ（ｃ）はまた、対象が治療反応を示す場合、治療用核酸の投与を継続することも包含する。いくつかの実施形態では、この治療用核酸は核酸アプタマーである。
【０００８】
いくつかの実施形態では、この方法のステップ（ｂ）〜（ｃ）が繰り返される（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返される）。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）〜（ｃ）は、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患が処置されるまで、及び／または急速に進化する生物学的実体が対象において除去されるまで繰り返される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、この方法はさらに、（１）急速に進化する生物学的実体を含む対象から試料を取得すること；（２）スクリーニングアッセイを実行して、ステップ（ａ）の前に急速に進化する生物学的実体を標的とする治療用核酸を特定すること、を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、ステップ（ａ）の前に、急速に進化する生物学的実体の分析を実行することをさらに包含する。
【００１０】
特定の態様において、本明細書に開示される方法は、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患（例えば、がん、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染など）について対象（例えば、ヒト対象）を処置する方法であり、この方法は、（ａ）急速に進化する生物学的実体を標的とする治療用核酸（例えば、アプタマーまたは干渉ＲＮＡ）を対象に投与すること；（ｂ）一定期間後、急速に進化する生物学的実体を含む対象から試料を取得すること；（ｃ）急速に進化する生物学的実体を標的とする新しい治療用核酸を特定するためのスクリーニングアッセイを実施すること；ならびに（ｄ）新しい治療用核酸を対象に投与すること、を包含する。いくつかの実施形態では、この治療用核酸は、核酸アプタマーである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の期間は、急速に進化する生物学的実体が第１の治療用核酸に対する耐性を獲得するのに必要な期間以下である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の期間は、急速に進化する生物学的実体が複製サイクルを完了するのに必要な期間以下である。いくつかの実施形態では、この期間は少なくとも２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、または６か月である。特定の実施形態では、この期間は６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、または６か月以下である。特定の実施形態では、この期間は約６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、または６か月である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、この方法のステップ（ｂ）〜（ｄ）が繰り返される（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返される）。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）〜（ｄ）は、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患が処置されるまで、及び／または急速に進化する生物学的実体が対象から除去されるまで繰り返される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、この方法はさらに、（１）急速に進化する生物学的実体を含む対象から試料を取得すること；（２）スクリーニングアッセイを実行して、ステップ（ａ）の前に急速に進化する生物学的実体を標的とする治療用核酸を特定すること、を包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、ステップ（ａ）の前に急速に進化する生物学的実体の分析を実行することをさらに包含する。
【００１４】
特定の実施形態では、この方法はさらに、急速に進化する生物学的実体に特異的に結合する１つ以上のアプタマーを特定することを包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｉ）表面（例えば、フローセル表面）に固定された複数のアプタマークラスターと急速に進化する生物学的実体とを接触させること；及び（ｉｉ）急速に進化する生物学的実体に結合する固定されたアプタマークラスターを特定することを包含する。特定の実施形態において、この方法は、ステップ（ｉ）の後に洗浄ステップを行って、表面（例えば、フローセル表面）から、結合していない急速に進化する生物学的実体を除去することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、この急速に進化する生物学的実体は検出可能に標識される（例えば、蛍光標識される）。
【００１５】
いくつかの実施形態では、この方法は、急速に進化する生物学的実体の特性を調節する１つ以上のアプタマーを特定することを包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉ）表面に固定された複数のアプタマークラスターと急速に進化する生物学的実体とを接触させること；及び（ｉｉ）この急速に進化する生物学的実体の特性（例えば、細胞生存率、細胞増殖、遺伝子発現、細胞形態など）を調節する固定されたアプタマークラスターを特定することを包含する。いくつかの実施形態において、この方法は、表面（例えば、フローセル表面）から、結合していない急速に進化する生物学的実体を除去するために、ステップ（ｉ）の後に洗浄ステップを実行することをさらに包含する。いくつかの実施形態では、この急速に進化する生物学的実体は、検出可能な標識（例えば、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素などの蛍光色素）を含む。いくつかの実施形態において、この急速に進化する生物学的実体の特性の変化は、この急速に進化する生物学的実体の特性を調節する固定されたアプタマークラスターを特定するために、検出される検出可能な標識の特性の変化を引き起こす。
【００１６】
特定の実施形態では、この方法は、固定されたアプタマークラスターの生成をさらに包含する。いくつかの実施形態において、この固定されたアプタマークラスターは、以下：（ａ）複数のアプタマー（例えば、アプタマーライブラリーから）を表面に固定すること；及び（ｂ）フローセル表面上の複数の固定されたアプタマーを局所的に増幅し（例えば、ブリッジＰＣＲ増幅またはローリングサークル増幅を介して）、複数の固定されたアプタマークラスターを形成することによって、生成される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、固定されたアプタマークラスターから相補鎖を除去して、一本鎖の固定されたアプタマークラスターを提供することをさらに包含する。特定の実施形態において、この固定されたアプタマークラスターは、ステップ（ｂ）に続いて配列決定される（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定を使用する）。いくつかの実施形態において、この固定されたアプタマークラスターは、表面上にアプタマークラスター（例えば、アプタマーライブラリーから）を直接プリントすることにより生成される。いくつかの実施形態において、この方法は、アプタマーライブラリーの生成を包含する（例えば、化学的核酸合成による）。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】２つのパネルがある。パネルＡは、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患を処置するプロセスの概略図であり、本明細書に記載の特定の実施形態による連続サンプリング、標的分析、薬剤選択、処置及び効果のワークフローを含む。パネルＢは、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患を処置するプロセスの概略図であり、本明細書に記載の特定の実施形態によるサンプリング、分析、及び薬剤選択のワークフローを含む。
【図２】急速に進化する生物学的実体に関連する疾患を処置するプロセスの概略図であり、疾患または状態の標的の増殖／発症、薬剤の選択、標的耐性の獲得、処置のための第２薬剤の選択、第２耐性の獲得、及び第３の薬剤の選択（本明細書に記載の特定の実施形態による）を包含する
【図３】本明細書に記載される特定の実施形態による、アプタマーライブラリー合成、配列決定、及び標的特定ワークフローの概略図である。
【図４】アプタマーのライブラリー（Ｌｉｂ）、ランダム配列の短いまたは長いアプタマー、特定の標的細胞サイクル６及び７（それぞれＣｙｃ６及びＣｙｃ７）のＳＥＬＥＸ選択プロセスのアプタマー出力、ＳＥＬＥＸ選択プロセスからの特定のアプタマー配列（Ａｐｔ１及びＡｐｔ２）、及びＩｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩｘフローセル上の空のレーン（空）への標的細胞（Ｈａｎａ細胞）の結合を示す棒グラフである。細胞をフローセルレーンに流し、結合細胞をカウントした（結合対非結合、分数として表す、１＝１００％の細胞）。
【図５】フローセル上のアプタマーに結合した細胞の画像である。この画像は、経時的な、表面に対する細胞の動きを示す。その画像によって、細胞が表面自体に付着するのではなく、固定されたアプタマークラスターによって保持されており、したがって、自由に移動できるが、その場所に限定されていることが示される。画像化は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩｘで実行した。
【図６】本明細書で提供される特定の例示的な実施形態による特定のアプタマー構造の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
全般
本開示は、急速に進化する標的（例えば、がん、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染など）の核酸ベースの治療に関するものであり、急速に進化する標的の新しく変異したバージョンに対して新しい治療剤（複数可）を開発するための反復プロセスに依存する。いくつかの実施形態では、選択プロセスは、ｆＴｈｅｒ≧ｆＴＥによって定義され、ここでｆＴｈｅｒは、治療選択の頻度であり、ｆＴＥは、標的進化の頻度、またはより正確には標的による耐性獲得の頻度である。本開示の薬剤（例えば、本明細書に開示される治療用核酸）は、標的に対する任意の機能（例えば、結合、細胞毒性、増殖阻害、特定の膜またはカプセル分子への結合、抗クオラムセンシングなど）について、それが被る全ての表現型の変化の後に、または一定の時間間隔で、選択され得る。
【００１９】
本明細書で提供されるのは、標的（例えば、標的細胞または標的分子）に結合するか、及び／または標的に対する機能的効果を媒介するアプタマーを使用した、急速に進化する生物学的実体（例えば、がん、細菌感染、ウイルス感染など）の処置に関連する方法及び組成物である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本開示は、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患（例えば、がん、細菌感染、ウイルス感染など）について対象を処置する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、急速に進化する生物学的実体を標的とする第１の治療用核酸を対象に投与すること、及び対象が第１の治療用核酸に対して治療反応を示すか否かを決定することを包含する。いくつかの実施形態では、対象が、第１の治療用核酸に対する治療反応を対象が示せない場合、試料を、急速に進化する生物学的実体を含む対象から得て、スクリーニングアッセイを行って、急速に進化する生物学的実体を標的とする第２の治療用核酸を特定して、この対象に第２の治療薬核酸を投与する。いくつかの実施形態において、この方法はさらに、この対象が第１の治療用核酸に対する治療反応を示す場合、第１の治療用核酸を投与し続けることをさらに包含する。
【００２１】
いくつかの態様では、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患が処置されるまで、この方法を繰り返す。いくつかの実施形態では、この方法は、急速に進化する生物学的実体を標的とする第１の治療用核酸を対象に投与する前に、この急速に進化する生物学的実体の分析を実行することをさらに包含する。いくつかの実施形態では、治療用核酸は、干渉ＲＮＡまたは核酸アプタマーである。一実施形態では、治療用核酸は、核酸アプタマーである。
【００２２】
他の態様では、この方法は、急速に進化する生物学的実体を標的とする第１の治療用核酸を対象に投与すること、急速に進化する生物学的実体を含む試料を一定期間後に対象から取得することを包含する。いくつかの実施形態では、スクリーニングアッセイを実施して、急速に進化する生物学的実体を標的とする第２の治療用核酸を特定し、第２の治療用核酸を対象に投与する。いくつかの実施形態では、この治療用核酸はアプタマーである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本開示は、アプタマー（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの任意の天然もしくは合成の類似体）、及び急速に進化する標的の処置のための標的特異的アプタマーを迅速に選択する方法に関する。
【００２４】
特定の実施形態では、各々の固定されたアプタマークラスターの配列は、例えば、アプタマークラスターを配列決定することにより、または既知配列のアプタマーを表面の所定の位置にプリントすることにより、既知となるか及び／または決定される。したがって、急速に進化する生物学的実体がアプタマークラスターに結合するか、それと相互作用するか、及び／またはそれによって調節される表面上の位置を決定することにより、関連する効果を、その位置のアプタマー配列に関連付けることができる。
【００２５】
例えば、いくつかの実施形態において、急速に進化する生物学的実体に結合するアプタマーは、既知の配列のアプタマークラスターが既知の位置に固定されている表面を横切って、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含む急速に進化する生物学的実体を含む組成物を流すことにより特定される。この急速に進化する生物学的実体が保持される表面上の位置が決定され（例えば、蛍光顕微鏡を使用して）、それらの位置に固定されたアプタマーが標的に結合することが示される。
【００２６】
特定の実施形態では、急速に進化する生物学的実体を機能的に調節するアプタマーは、既知の配列のアプタマークラスターが既知の位置に固定されている表面にまたがって、調節されている機能を示す検出可能な標識（例えば、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素などの蛍光色素）を含む急速に進化する生物学的実体を含む組成物を流すことにより特定される。急速に進化する生物学的実体が調節されることを検出可能な標識が示す表面上の位置が決定され（例えば、蛍光顕微鏡を使用して）、それらの位置に固定されたアプタマーが、急速に進化する生物学的実体を調節可能であることが示される。
【００２７】
特定の態様において、表面上に固定されたアプタマークラスターの生成に関連する方法及び組成物も本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、アプタマー（例えば、本明細書に開示されるアプタマーライブラリー由来）は、フローセル表面などの表面上に固定される。いくつかの実施形態では、次いで、ブリッジ増幅またはローリングサークル増幅などの局所的増幅プロセスを実行して、アプタマークラスターが生成される。次いで、各々のアプタマークラスターの配列を、表面上の位置と関連付けるために、そのアプタマークラスターを配列決定してもよい（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定により）。相補鎖を除去して、一本鎖アプタマークラスターを生成してもよい。次いで、表面（例えば、フローセル）を、本明細書で提供されるアプタマー特定方法で使用する準備を行う。
【００２８】
定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。
【００２９】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の２つ以上（例えば、少なくとも１つ）を指すために使用される。一例として、「要素」とは、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「投与すること」という用語は、対象に対して薬剤または組成物を提供することを意味し、これには、限定するものではないが、医療専門家による投与及び自己投与を包含する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、タンパク質もしくはペプチド標的に特異的に結合し得る短い（例えば、２００塩基未満）一本鎖核酸分子（ｓｓＤＮＡ及び／またはｓｓＲＮＡ）を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合「アプタマークラスター」という用語は、同一配列の局所的に固定されたアプタマーの集合（例えば、少なくとも１０個）を指す。
【００３３】
「結合」または「相互作用する」という用語は、会合であって、例えば、生理学的条件下での、静電、疎水性、イオン及び／または水素結合の相互作用に起因して、例えばアプタマーと標的との間の２つの分子間の安定した結合であり得る会合を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、２つの核酸配列は、それらが各位置で互いに塩基対を形成する場合、互いに「相補性」であるか、またはお互いに対して「相補的」である。
【００３５】
本明細書で使用する場合、２つの核酸配列は、両方が同じ核酸配列に相補的である場合、互いに「対応する」。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「干渉ＲＮＡ分子」、「阻害ＲＮＡ分子」及び「ＲＮＡｉ分子」という用語は、互換的に使用される。干渉ＲＮＡ分子としては、限定するものではないが、ｓｉＲＮＡ分子、一本鎖ｓｉＲＮＡ分子及びｓｈＲＮＡ分子が挙げられる。干渉ＲＮＡ分子は一般に、選択的に分解または「ノックダウン」されている標的分子とヘテロ二本鎖を形成することにより作用し、したがって標的ＲＮＡを不活性化する。いくつかの条件下では、干渉ＲＮＡ分子は、転写産物の翻訳を抑制するか、及び／または転写産物の転写を阻害することにより、標的転写産物を不活性化する場合もある。
【００３７】
「調節」という用語は、機能的特性または生物学的な活性もしくはプロセス（例えば、酵素活性または受容体結合）に関して使用される場合、上方制御する（例えば、活性化または刺激する）か、下方制御する（例えば、阻害または抑制する）か、そうでなければこのような特性、活性、もしくはプロセスの質を変更する能力を指す。特定の例では、そのような調節は、シグナル伝達経路の活性化などの特定の事象の発生を条件とする場合もあるし、及び／または特定の細胞タイプでのみ顕在化する場合もある。
【００３８】
「患者」または「対象」とは、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」とは、所定の標的に結合するアプタマーの能力を指す。典型的には、アプタマーは、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、または約１０−９Ｍ以下というＫＤに対応する親和性で、その標的に特異的に結合し、その非特異的で無関係な標的（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、またはＨＥＫ２９３細胞もしくはＥ．ｃｏｌｉ細胞などの無関係な細胞）への結合に対するその親和性よりも有意に少ない（例えば、少なくとも２倍小さい、少なくとも５倍小さい、少なくとも１０倍小さい、少なくとも５０倍小さい、少なくとも１００倍小さい、少なくとも５００倍小さい、または少なくとも１０００倍小さい）ＫＤで標的に結合する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、２つのオリゴヌクレオチドのＴｍまたは融解温度とは、オリゴヌクレオチド／標的の５０％が結合し、オリゴヌクレオチド標的分子の５０％が結合しない温度である。２つのオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、オリゴヌクレオチド濃度に依存し、反応混合物中の一価、二価カチオンの濃度によって影響される。Ｔｍは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ，Ｊ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：１４６０−１４６５（１９９８）に記載されているように、経験的に決定されてもよいし、または最近傍式を使用して計算されてもよい。
【００４１】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有する場合があり、既知または未知の任意の機能を行う場合がある。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコーディングまたは非コーディング領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数可）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、合成ポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリの前に付与されても、または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される場合がある。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などによりさらに修飾されてもよい。
【００４２】
対象の疾患を「処置する」または疾患を有する対象を「処置する」とは、疾患の少なくとも１つの症状が軽減されるか、または悪化が防がれるように、対象を薬学的処置、例えば本明細書に開示されるか、または意図される組成物の投与に供することを指す。
【００４３】
処置の方法
特定の態様において、治療用核酸を使用して、がん細胞、細菌、ウイルス、及び／または真菌などの急速に進化する生物学的実体に関連するか、及び／またはそれにより引き起こされる疾患および障害を処置する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、この方法は、標的特異的アプタマーの迅速な特定のために、本明細書で提供される方法を活用して、対象に投与される治療用核酸を調整して生物学的実体の進化を補償する。
【００４４】
図１Ａは、本明細書に記載の特定の実施形態による連続サンプリング、標的分析、薬剤選択、処置および効果のワークフローを含む、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患を治療するための例示的なプロセスの概略図を提供する。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患について対象をアプタマーで処置することに関する。この方法は、（ａ）急速に進化する生物学的実体を標的とする第１の治療用核酸を対象に投与すること；（ｂ）対象が第１の治療用核酸に対する治療反応を示すか否かを決定すること；及び（ｃ）対象が最初の治療用核酸に対する治療反応を示さなかった場合を包含する。いくつかの実施形態では、対象が第１の治療用核酸に対する治療反応を示せない場合、この方法はさらに、（ｉ）急速に進化する生物学的実体を含む対象から試料を得ること；（ｉｉ）急速に進化する生物学的実体を標的とする第２の治療用核酸を特定するためのスクリーニングアッセイの実施；及び（ｉｉｉ）対象に第２の治療用核酸を投与すること、を包含する。いくつかの実施形態では、対象が第１の治療用核酸に対する治療反応を示す場合、第１の治療用核酸の投与が継続される。いくつかの実施形態では、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患が治療されるまで、ステップ（ｂ）〜（ｃ）が繰り返される。いくつかの実施形態では、方法のステップ（ｂ）〜（ｃ）が繰り返される（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返される）。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）〜（ｃ）は、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患が治療されるまで、及び／または急速に進化する生物学的実体がその対象において除去されるまで繰り返される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ａ）の前に、対象から得られた試料に対してスクリーニングアッセイを実施して、第１の治療用核酸を特定するステップをさらに包含する。いくつかの実施形態では、この方法は、対象から試料を取得することをさらに包含する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、この方法は、急速に進化する生物学的実体の分析をステップ（ａ）の前に実行することをさらに包含する。一実施形態において、急速に進化する生物学的実体の分析は、核酸配列決定分析、プロテオーム分析、表面マーカー発現分析、細胞周期分析、またはメタボロミクス分析、または核酸の直接選択による分析を、その実体の遺伝子型及び／または表現型の先験的な知識なしで含む。
【００４７】
図１Ｂは、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患を処置する例示的なプロセスの概略図を示しており、これには、本明細書に記載の特定の実施形態によるサンプリング、分析、および薬剤選択のワークフローを含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患について対象を処置することに関し、この方法は、以下を含む：（ａ）急速に進化する生物学的実体を標的とする第１の治療用核酸を対象に投与すること；（ｂ）一定期間後、急速に進化する生物学的実体を含む対象から試料を取得すること；（ｃ）急速に進化する生物学的実体を標的とする第２の治療用核酸を特定するためにスクリーニングアッセイを実施すること；及び（ｄ）第２の治療用核酸を対象に投与すること。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の期間は、急速に進化する生物学的実体が第１の治療用核酸に対する耐性を獲得するのに必要な期間以下である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の期間は、この急速に進化する生物学的実体が複製サイクルを完了するのに必要な期間以下である。いくつかの実施形態では、この期間は少なくとも６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、または６か月である。特定の実施形態では、この期間は６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、または６か月以下である。特定の実施形態では、この期間は約６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、または６か月である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、この方法のステップ（ｂ）〜（ｄ）が繰り返される（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返される）。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）〜（ｄ）は、急速に進化する生物学的実体に関連する疾患が治療されるまで、及び／または急速に進化する生物学的実体が対象から除去されるまで繰り返される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、急速に進化する生物学的実体は細菌である。いくつかの実施形態では、この細菌は、任意の病原性細菌であり得る。いくつかの実施形態では、この細菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＴｏｘｏｐｌａｓｍａまたはＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅという属である。特定の実施形態では、この細菌は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｄｌｅｒｉ、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｌｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｍｐｈｏｒｉｆｏｒｍｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｉｎｇｕｉｎａｌｅ、Ｌｙｍｐｈｏｐａｔｈｉａ  ｖｅｎｅｒｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ．  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｏｖｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｆｏｅｔｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｑｕｕｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｏｒａｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｒａｍｏｓａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｅｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｒａｍｏｓａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍという種である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、この急速に進化する生物学的実体は、ウイルスである。いくつかの実施形態では、この急速に進化する生物学的実体は、任意のウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、このウイルスは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、水痘ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、おたふく風邪ウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、またはインフルエンザウイルスである。
【００５２】
上記急速に進化する生物学的実体が癌細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。いくつかの実施形態では、この細胞は、任意の種類のがん由来であってもよく、このがんとしては限定するものではないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮由来のがん細胞が挙げられる。さらに、このがんは具体的には以下の組織型のものであってもよいが、これらに限定されない：新生物、悪性、癌腫、癌腫、未分化、巨細胞及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行細胞癌；乳頭移行細胞癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の組み合わせ；小柱腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープの腺癌；腺癌；家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；分枝肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；乳頭及び濾胞性腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺癌；ムチン性嚢細胞癌；ムチン性腺癌；印環細胞癌；浸潤管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；ページェット病；乳腺；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性及び芽球腫、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳腺外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロマン肉腫、悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒色腫巨大色素性母斑；類上皮細胞黒色腫；青母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；肺胞性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；発芽細胞腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛腫；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨大細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル芽細胞性線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣細胞腫；星状細胞腫；原形質星細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；グリア芽細胞腫；乏突起細胞腫；乏突起膠腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；傍肉芽腫、悪性リンパ腫；小リンパ球、悪性リンパ腫；大細胞；びまん性、悪性リンパ腫；濾胞；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核球性白血病；骨髄肉腫；及びヘアリー細胞白血病。
【００５３】
いくつかの実施形態では、治療用核酸は干渉核酸である。いくつかの実施形態において、干渉核酸はアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、一本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。特定の実施形態では、干渉核酸は一本鎖である。他の実施形態では、干渉核酸は二本鎖である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、治療用核酸は核酸アプタマーである。一実施形態では、核酸アプタマーは、本明細書に開示されるアプタマースクリーニング方法の１つに従って特定されたアプタマーである。いくつかの実施形態では、アプタマーは、本明細書で提供されるアプタマーライブラリー由来のアプタマーである。別の実施形態では、核酸アプタマーは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＩＶのアプタマーである。
【００５５】
特定の実施形態では、治療用核酸は医薬組成物として投与され、本明細書に記載の医薬組成物には、本明細書に記載の治療用核酸および薬学的に許容される担体またはビヒクルが含まれる。本明細書に記載の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように処方される。特定の実施形態において、この医薬組成物は、注射（例えば、静脈内注射、腫瘍内注射）を介して投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、経口送達に適合するように処方される。
【００５６】
アプタマーライブラリー
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、アプタマーライブラリーに存在するアプタマーのうちで所望の特性を有するアプタマーの特定に関する。本明細書で使用される場合、アプタマーライブラリーは、別個の配列（例えば、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６または１０７の別個の配列）を有する核酸分子（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）の集合であり、少なくとも核酸分子のサブセットは、標的タンパク質、またはペプチドに特異的に結合し得るように構造化されている。いくつかの実施形態では、潜在的なアプタマーの任意のライブラリーが、本明細書で提供される方法及び組成物で使用され得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｒ−Ｐ２（Ｉ）
による配列を有する核酸分子（例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含む、からなるか、及び／または本質的にからなり
ここで、Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列であり；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；及びＲは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下のランダムに配置された塩基を含む配列である。
【００５８】
一実施形態では、Ｒは、約２５％のＡを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＴを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＧを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＣを含む配列である。さらに別の実施形態では、Ｒは、約２５％のＡ、約２５％のＴ、約２５％のＧ、及び約２５％のＣを含む配列である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｒ”−Ｐ２（Ｉ）
による配列を有する核酸分子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含むかか、からなるか、及び／または本質的にからなり、
ここで、Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列であり；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；及びＲ”は、バイアスのかかった混合物からのランダムに配置された塩基、またはランダムな文字列と反復またはバイアスされた文字列の任意の組み合わせを含む、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、または５０塩基長以下の配列である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式ＩＩ：
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｐ２（ＩＩ）
による配列を有する核酸分子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含むか、からなるか、及び／または本質的にからなり（例示的な模式図は、図６Ａに示される）、
ここで、
Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列であり；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；Ｓ１及びＳ２は、各々独立して、少なくとも１つの塩基（例えば、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０塩基長）のステム領域配列であり；Ｓ１＊は、Ｓ１の相補配列であり；Ｓ２＊はＳ２の相補配列であり；Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、少なくとも１塩基（例えば、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基長）のループ領域配列であり；及びＳ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊は、合計で少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０塩基長、及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式ＩＩＩ：
Ｐ１−Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｐ２（ＩＩＩ）、
による配列を有する核酸分子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含むか、からなるか、及び／または本質的にからなり（例示的な模式図を、図６Ｂに示す）、
ここで、
Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列であり；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；
Ｓ１及びＳ２は、各々独立して、少なくとも１つの塩基（例えば、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０塩基長）のステム領域配列であり；Ｓ１＊はＳ１の相補配列であり；Ｓ２＊はＳ２の相補配列であり；
Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、少なくとも１塩基（例えば、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０塩基長のループ領域配列である）であり；そして
Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊は、合計で少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長、及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式ＩＶ：
Ｐ１−Ｌｉｂ−Ｍ１／Ｍ２−Ｄ−Ｍ１／Ｍ２＊−Ｌｉｂ−Ｐ２（ＩＶ）
による配列を有する核酸分子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含むか、からなるか、及び／または本質的にからなり（例示的な概略図を図６Ｃに提供する）、
ここで、
Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列である；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；
Ｌｉｂは：（ｉ）Ｒ；（ｉｉ）Ｒ”；（ｉｉｉ）Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊；及び（ｉｖ）Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊から選択される式を有する配列であり；
Ｒは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下のランダムに配置された塩基を含む配列であり；
Ｒ”は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長、及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下の配列であり、バイアスされた混合物からのランダムに配置された塩基、またはランダムな文字列と繰り返しもしくはバイアスされた文字列との任意の組み合わせを含む；
Ｓ１及びＳ２は、各々独立して、少なくとも１つの塩基（例えば、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長）のステム領域配列であり；Ｓ１＊はＳ１の相補配列であり；Ｓ２＊はＳ２の相補配列であり；
Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、少なくとも１塩基（例えば、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基長）のループ領域配列であり；
ここで、Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊は、合計で少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下であり；
Ｄは、少なくとも１つの塩基（例えば、約１〜２０塩基長、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０塩基長）を含むスペーサー配列であり；
Ｍ１は、約１０〜１８塩基長または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８塩基長の多量体形成ドメイン配列であり、配列の鎖が相補的なドメインを含む別の鎖と相互作用し得；そして
Ｍ２は、Ｍ１配列の鎖と相互作用する鎖を含むＭ１の相補的ドメインである。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物で使用されるアプタマーライブラリーは、式Ｖ：
Ｐ１−Ｌｉｂ−Ｔ＊−Ｌｉｂ−Ｐ２（Ｖ）による配列を有する核酸分子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を含むか、からなるか、及び／または本質的にからなり（例示的な概略図を図６Ｄに示す）、
ここで：
Ｐ１は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の５’プライマー部位配列であり；Ｐ２は、約１０〜１００塩基長、約１０〜５０塩基長、約１０〜３０塩基長、約１５〜５０塩基長、または約１５〜３０塩基長の３’プライマー部位配列であり；
Ｌｉｂは、以下から選択される式を有する配列である：（ｉ）Ｒ；（ｉｉ）Ｒ”；（ｉｉｉ）Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊；及び（ｉｖ）Ｓ１−Ｌ１−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊−Ｌ１−Ｓ１＊；
Ｒは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下のランダムに配置された塩基を含む配列であり；
Ｒ”は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下の配列であり、バイアスされた混合物からのランダムに配置された塩基、またはランダムな文字列と繰り返しもしくはバイアスされた文字列との任意の組み合わせを含み；
Ｓ１及びＳ２は、各々独立して、少なくとも１つの塩基（例えば、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長）のステム領域配列であり；
Ｓ１＊はＳ１の相補配列であり；Ｓ２＊はＳ２の相補配列であり；
Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、少なくとも１塩基（例えば、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基長）のループ領域配列であり；
ここで、Ｓ１−Ｌ１−Ｓ１＊−Ｓ２−Ｌ２−Ｓ２＊は、合計で少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下であり；
Ｔは、Ｌｉｂ配列またはＴ＊の任意の部分にワトソン／クリックまたはフーグスティーンの塩基対によって結合される２番目の鎖であり、ここでこの鎖は、必要に応じてその５’及び３’末端に不対ドメインを含む（例えば、アプタマーへの機能的部分の付着を促進するため）；そして
Ｔ＊は専用ドメイン配列である（例えば、約４〜４０塩基長、または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長）。
【００６４】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｒは少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長、及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下という任意のランダム混合物（例えば、基準塩基の場合、２５％Ａ、２５％Ｔ、２５％Ｇ、２５％Ｃ）からランダムに配置された塩基である。
【００６５】
上記式の一実施形態では、Ｒは約２５％のＡを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＴを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＧを含む配列である。別の実施形態では、Ｒは約２５％のＣを含む配列である。さらに別の実施形態では、Ｒは約２５％のＡ、約２５％のＴ、約２５％のＧ、及び約２５％のＣを含む配列である。
【００６６】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｒ”は、バイアスされた混合物からランダムに配置された塩基を含む配列である（例えば、基準塩基については、１塩基あたり２５％から逸脱する任意の混合物）。いくつかの実施形態では、Ｒ”は約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％のＡを含む配列である。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％のＴを含む配列である。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％のＣを含む配列である。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％のＧを含む配列である。いくつかの実施形態では、Ｒ”はランダムな文字列（文字列は、単一の塩基を含む任意の配列）と繰り返し文字列またはバイアス文字列との任意の組み合わせを含む配列である。
【００６７】
上記の式のいくつかの実施形態において、Ｒ”は、バイアスされた混合物からランダムに配置された塩基（例えば、基準塩基の場合、１塩基あたり２５％から逸脱する任意の混合物）；またはランダムな文字列（文字列は単一の塩基を含む任意の配列）と、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５もしくは８０塩基長、及び／または約１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５もしくは５０塩基長以下の繰り返しまたはバイアスされた文字列との任意の組み合わせである。
【００６８】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｓ１は少なくとも１塩基以上のステム領域配列である。他の実施形態では、Ｓ１は、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長のステム領域配列である。
【００６９】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｓ２は少なくとも１塩基以上のステム領域配列である。他の実施形態では、Ｓ２は、約４〜４０塩基長または４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基長の間のステム領域配列である。
【００７０】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｌ１は少なくとも１つの塩基のループ領域配列である。他の実施形態では、Ｌ１は、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基長のループ領域配列である。
【００７１】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｌ２は少なくとも１つの塩基のループ領域配列である。他の実施形態では、Ｌ２は、約１〜５０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基長のループ領域配列である。
【００７２】
上記の式のいくつかの実施形態では、Ｔはその５’及び３’末端に不対ドメインを含んでもよく、またはパドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）テール（例えば、ライブラリーと対になった２つのドメイン間のループ）であってもよい。
【００７３】
本開示のアプタマーは、任意の数のステム及びループ、ならびにステム及びループからなる他の構造（例えば、ヘアピン、バルジなど）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アプタマーのループは、主ライブラリー軸に直交するステムを形成する安定したループ−ループＷＣペアリングを形成するために埋め込まれた塩基を含む。他の実施形態では、アプタマー内の２つのループが一緒になって直交ステムを形成する。さらに他の実施形態では、アプタマーのループは、主ライブラリー軸に沿って既存のステムと安定したフーグスティーンペアリングを形成するために埋め込まれた塩基を含む。他の実施形態では、アプタマーのループは、アプタマーの任意のステムとフーグスティーンペアリングを形成し得る。
【００７４】
上記の式のいくつかの実施形態では、アプタマー配列は、１つ以上の多量体形成ドメインをさらに含む。
【００７５】
上記の式のいくつかの実施形態では、アプタマー配列は、１つ以上（例えば、約１〜２０塩基長または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０塩基長）のスペーサーをさらに含む。
【００７６】
本開示のアプタマーは、様々な方法で調製され得る。一実施形態では、アプタマーは化学合成により調製される。別の実施形態では、アプタマーは酵素合成により調製される。一実施形態では、酵素合成は、鋳型を使用してまたは使用せずに、ヌクレオチドを付加してプライマーを伸長し得る任意の酵素を使用して実行され得る。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ｋマー（例えば、ｋ≧２塩基）を一緒にアセンブルすることにより調製される。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本開示のアプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにそれらの天然及び／または合成類似体の任意の組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、アプタマーはＤＮＡを含む。一実施形態では、アプタマーはＲＮＡを含む。
【００７８】
他の実施形態において、本開示のアプタマーは、５’末端、３’末端、または内部に任意の改変を含んでもよい。アプタマーの修飾としては、限定するものではないが、スペーサー、リン酸化、リンカー、結合化学、フルオロフォア、クエンチャー、光反応性、及び修飾塩基（例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＵＮＡ、ＰＳ、メチル化、２−Ｏ−メチル、ハロゲン化、超強塩基、ｉｓｏ−ｄＮ、逆塩基、Ｌ−リボース、骨格としての他の糖など）が挙げられる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本開示のアプタマーは、５’末端、３’末端、または内部的に、外部の非核酸分子に結合され得る。非核酸分子の非限定的な例としては、限定するものではないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、低分子薬、単糖類及び多糖類、脂質、抗体及び抗体断片、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８０】
本開示のアプタマーは、生物学的機能を有する任意のドメインを含んでもよい。本明細書に記載のアプタマーの生物学的機能の非限定的な例としては、限定するものではないが、ＲＮＡ転写の鋳型としての機能、タンパク質への結合、認識、及び／または活性の調節、転写因子への結合、特殊化された核酸構造（例えば、Ｚ−ＤＮＡ、Ｈ−ＤＮＡ、Ｇ−ｑｕａｄなど）、制限酵素の酵素基質としての作用、特定のエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、組換え部位、編集部位、またはｓｉＲＮＡが挙げられる。一実施形態では、アプタマーは、少なくとも１つのタンパク質の活性を調節する。別の実施形態では、アプタマーは少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害する。さらに別の実施形態では、アプタマーは少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害する。
【００８１】
他の実施形態では、本開示のアプタマーは、いくつかの公知の方法のいずれか１つによって構築された核酸ナノ構造に組み込むための任意のドメインを含んでもよい（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２７：６１８−６２１（２００４）；Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ４４０：２９７−３０２（２００６）；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：７４−７７（２００９）；Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：７２５−７３０（２００９）；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８５：６２３−６２６（２０１２）；Ｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８：１１７７−１１８３（２０１２）；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：８３１−８３４（２０１２）、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。さらに他の実施形態では、本開示のアプタマーは、分子論理及び計算の機能を果たす任意のドメインを含んでもよい（Ｓｅｅｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１５８５−１５８８（２００６）；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ６：２５９８−２６０３（２００６）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：３６８−３７２（２０１１）；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：８３１−８３４（２０１２）；Ａｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：３５３−３５７（２０１４）、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本開示のアプタマーは、標的（例えば、真核生物または原核生物の細胞、ウイルスまたはウイルス粒子、分子、組織、または生物全体、インビボまたはエキソビボ）に対して１回以上の負の選択サイクルを受ける。他の実施形態では、本開示のアプタマーは、標的（例えば、真核細胞または原核細胞、ウイルスまたはウイルス粒子、分子、組織、または生物全体、インビボまたはエキソビボ）に対して１回以上の正の選択サイクルを受ける。
【００８３】
本開示のアプタマーは、溶液中にあってもよいし、固相（例えば、表面、粒子、樹脂、基質など）に付着してもよい。いくつかの実施形態では、アプタマーは表面に付着している。一実施形態では、表面はフローセル表面である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本開示のアプタマーは、アプタマーライブラリーで合成される。本開示のアプタマーライブラリーは、様々な方法で調製され得る。一実施形態では、アプタマーライブラリーは化学合成により調製される。別の実施形態では、アプタマーライブラリーは、酵素合成により調製される。一実施形態では、この酵素合成は、鋳型を使用してまたは使用せずに、ヌクレオチドを付加してプライマーを伸長し得る任意の酵素を使用して行われ得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの天然及び／または合成類似体の任意の組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、ＤＮＡを含む。一実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーはＲＮＡを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、アプタマーライブラリーで合成されるアプタマーは、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然または合成塩基、塩基類似体、またはそれらの組み合わせ）１０Ｋ種（Ｋ≧２）のコレクションであり、１種あたりＺコピー（１≦Ｚ≦Ｋ−１）がある。
【００８７】
他の実施形態において、本開示のアプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、５’末端、３’末端、または内部に、任意の改変を含んでもよい。アプタマーの修飾としては、限定するものではないが、スペーサー、リン酸化、リンカー、結合化学、フルオロフォア、クエンチャー、光反応性修飾、及び修飾塩基（例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＵＮＡ、ＰＳ、メチル化、２−Ｏ−メチル、ハロゲン化、超強塩基、ｉｓｏ−ｄＮ、逆塩基、Ｌ−リボース、骨格としての他の糖）が挙げられる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、５’末端、３’末端、または内部で外部の非核酸分子に結合されてもよい。非核酸分子の非限定的な例としては、限定するものではないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、低分子薬、単糖類及び多糖類、脂質、抗体及び抗体断片、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８９】
アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、生物学的機能を有する任意のドメインを含んでもよい。本明細書に記載のアプタマーの生物学的機能の非限定的な例としては、限定するものではないが、ＲＮＡ転写の鋳型としての機能、タンパク質への結合、認識、及び／またはタンパク質の活性調節、転写因子への結合、特殊化された核酸構造（例えば、Ｚ−ＤＮＡ、Ｈ−ＤＮＡ、Ｇ−ｑｕａｄなど）、制限酵素の酵素基質としての作用、特定のエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、組換え部位、編集部位、またはｓｉＲＮＡが挙げられる。一実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、少なくとも１つのタンパク質の活性を調節する。別の実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害する。さらに別の実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、少なくとも１つのタンパク質の活性を阻害する。
【００９０】
他の実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、いくつかの公知の方法の１つによって構築された核酸ナノ構造への組み込みのための任意のドメインを含んでもよい（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２７：６１８−６２１（２００４）；Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ４４０：２９７−３０２（２００６）；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：７４−７７（２００９）；Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：７２５−７３０（２００９）；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８５：６２３−６２６（２０１２）；Ｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８：１１７７−１１８３（２０１２）；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：８３１−８３４（２０１２）、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。さらに他の実施形態では、本開示のアプタマーは、分子論理及び計算の機能を果たす任意のドメインを含んでもよい（Ｓｅｅｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１５８５−１５８８（２００６）；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ６：２５９８−２６０３（２００６）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：３６８−３７２（２０１１）；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：８３１−８３４（２０１２）；Ａｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：３５３−３５７（２０１４）、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９１】
いくつかの実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、標的（例えば、真核細胞または原核細胞、ウイルスまたはウイルス粒子、分子、組織、または生物全体、インビボまたはエキソビボ）に対して１回以上の負の選択サイクルを受ける。他の実施形態では、本開示のアプタマーは、標的（例えば、真核細胞または原核細胞、ウイルスまたはウイルス粒子、分子、組織、または生物全体、インビボまたはエキソビボ）に対して１回以上の正の選択サイクルを受ける。
アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは、溶液中にあっても、固相（例えば、表面、粒子、樹脂、基質など）に付着していてもよい。いくつかの実施形態では、アプタマーライブラリーで合成されたアプタマーは表面に付着している。一実施形態では、表面はフローセル表面である。
【００９２】
固定されたアプタマークラスター
特定の態様では、表面に固定された複数のアプタマークラスター（例えば、本明細書で提供されるアプタマーライブラリー由来のアプタマーのクラスター）にまたがって標的を含む試料を流すことにより、急速に進化する生物学的標的に結合するか及び／または調節するアプタマーを特定する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、この表面は任意の固体支持体であってもよい。いくつかの実施形態では、この表面はフローセルの表面である。いくつかの実施形態では、この表面はスライドまたはチップである（例えば、遺伝子チップの表面）。いくつかの実施形態では、表面はビーズ（例えば、常磁性ビーズ）である。
【００９３】
特定の実施形態では、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、表面上に固定されたアプタマークラスターを生成し得る。いくつかの実施形態では、アプタマークラスターは表面に直接プリントされる。例えば、いくつかの実施形態において、アプタマークラスターは、ガラススライド上に細いピンでプリントされるか、フォトリソグラフィーを使用してプリントされるか、インクジェットプリントを使用してプリントされるか、または微小電極アレイ上の電気化学によってプリントされる。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６または１０７個の別個のアプタマークラスターが表面にプリントされる。いくつかの実施形態では、各々のアプタマークラスターは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または１００，０００個の同一のアプタマー分子を含む。有利なことに、マイクロアレイの直接プリントにより、既知の配列のアプタマーを表面の所定の位置に特異的に固定可能になり、その後の配列決定が不要になる場合がある。
【００９４】
特定の実施形態では、表面に固定されたアプタマークラスターは、最初にアプタマー（例えば、本明細書に開示されたアプタマーライブラリーから）を表面に固定すること（例えば、各々のアプタマーが固定される位置はランダムである）により生成される。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０個の別個のアプタマーが表面上に固定される。アプタマーの固定化に続いて、局所増幅プロセス（例えば、ブリッジ増幅またはローリングサークル増幅）を実行して、それによって、元の固定されたアプタマーの固定化部位の近くに配置された各々の固定されたアプタマーのコピーのクラスターを生成する。特定の実施形態（例えば、ローリングサークル増幅が実施される実施形態）では、アプタマークラスターは、表面に直接固定されるのではなく、表面のナノピットまたは細孔に収容される。いくつかの態様において、増幅は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または１００，０００個の同一のアプタマー分子を含む各々のアプタマークラスターをもたらす。特定の実施形態では、次いで、各々のアプタマークラスターの配列を表面上のその位置に関連付けるために、アプタマークラスターを配列決定する（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ配列決定により）。存在する場合、一本鎖アプタマーのクラスターを生成するために、鎖のハイブリダイゼーションの影響を受けにくい（例えば、塩濃度及び／または温度による）条件下で、表面を洗浄することにより、相補鎖をアプタマークラスターから除去してもよい。次いで、表面（例えば、フローセル）は、本明細書で提供されるアプタマー特定方法で使用する準備が行われる。いくつかの実施形態において、固定されたアプタマークラスターは、１つの機器上で調製及び／または配列決定され、次いで、アプタマー特定のために別個の機器に移される。他の実施形態において、アプタマークラスターは、アプタマー特定に使用されるのと同じ機器で調製及び／または配列決定される。
【００９５】
上記の方法のいくつかの実施形態において、アプタマーまたはアプタマークラスター（例えば、アプタマーライブラリー由来）は、アプタマーを表面の高さにするアダプターを含む（例えば、細孔を備えるフローセルのように表面が平坦でない場合）。一実施形態において、アプタマーまたはアプタマークラスターは、フローセル表面上の細孔の内側に固定され、アダプターを使用して、アプタマーを表面に結合させて、アプタマーを表面の高さにする。いくつかの実施形態において、アダプターは核酸アダプター（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００塩基長の配列）である。いくつかの実施形態において、アダプター配列に相補的な配列は、アプタマースクリーニングの前にアダプターにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、アダプターは化学アダプター（例えば、アプタマーを表面に接続するポリマー）である。
【００９６】
アプタマーライブラリースクリーニング
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、標的（例えば、急速に進化する標的）に特異的に結合するか、及び／または調節する１つ以上のアプタマーを特定するスクリーニングアッセイであり、この方法は、一般的に以下を含む：（ｉ）表面に固定された複数のアプタマークラスターと標的とを接触させること；及び（ｉｉ）標的に特異的に結合するか、及び／または調節する固定されたアプタマークラスターを特定すること。各々のアプタマークラスターの配列は表面上の特定の位置（例えば、本明細書で提供される方法に従って決定される）に関連付けられているため、その結合／変調に関与するアプタマーの配列が特定され、標的が結合するか、及び／または調整される位置が決定され得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、標的は検出可能な標識で標識されるか、及び／または検出可能な標識を含む。この標的は、検出可能に直接（例えば、直接化学リンカーを介して）または間接的に（例えば、検出可能に標識された標的特異的抗体を使用して）標識され得る。標的が細胞である実施形態では、検出可能な標識が細胞によって内在化されるような条件下で、標的細胞を検出可能な標識とインキュベートすることにより、この標的細胞が標識され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマースクリーニング方法を実施する前に、標的を検出可能に標識する。いくつかの実施形態において、標的は、本明細書で提供されるアプタマースクリーニング方法の実施中に標識される。いくつかの実施形態において、この標的は、アプタマークラスターに結合した後に標識される（例えば、結合した標的を検出可能に標識された抗体と接触させることにより）。いくつかの実施形態では、任意の検出可能な標識が使用され得る。検出可能な標識の例としては、限定するものではないが、蛍光部分、放射性部分、常磁性部分、発光部分及び／または比色部分が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される標的は、蛍光部分に連結されるか、それを含むか、及び／またはそれによって結合される。蛍光部分の例としては、限定するものではないが、アロフィコシアニン、フルオレセイン、フィコエリトリン、ペリジニン−クロロフィルタンパク質複合体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０、ＥＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ＥＹＦＰ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｃｅｒｕｅａｎ、及びＣｙＰｅｔが挙げられる。
【００９８】
標的は、非分子標的であっても、または超分子標的であってもよい。本開示のアプタマーが結合及び／または調節し得る標的の非限定的な例としては、限定するものではないが、細胞、細菌、真菌、古細菌、原生動物、ウイルス、ビリオン粒子、合成及び自然発生の顕微鏡的粒子、及びリポソームが挙げられる。いくつかの実施形態では、フローセルに導入される標的は、生／天然である。他の実施形態において、フローセルに導入される標的は、任意の溶液に固定されている。
【００９９】
いくつかの実施形態では、標的は細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は細菌細胞である。他の実施形態では、この細菌は、グラム陽性細菌である。さらに他の実施形態では、この細菌は、グラム陰性細菌である。細菌の非限定的な例としては、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（属）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｉｓ、Ｄｉｐｌｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、ＭａｆＢ  ｔｏｘｉｎｓ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ、Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ及びＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅが挙げられる。例示的な種としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｉｎｇｕｉｎａｌｅ、Ｌｙｍｐｈｏｐａｔｈｉａ  ｖｅｎｅｒｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ．  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｏｖｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｆｏｅｔｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｑｕｕｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓ���、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｑｕｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｅｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｄｌｅｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｍｐｈｏｒｉｆｏｒｍｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ  ｒａｍｏｓａ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｏｎｔｉａｃ  ｆｅｖｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｒａｍｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｏｒａｌｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレットまたは霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）などの非ヒト動物に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、寄生虫細胞（例えば、マラリア細胞、リーシュマニア細胞、クリプトスポリジウム細胞またはアメーバ細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなどの真菌細胞である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、細胞はがん細胞（例えば、ヒトがん細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、任意のがん性または前がん性腫瘍由来である。がん細胞の非限定的な例としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮由来のがん細胞が挙げられる。さらに、がんは具体的には以下の組織型のものであってもよいが、これらに限定されない：新生物、悪性、癌腫、がん、未分化、巨細胞及び紡錘細胞癌、小細胞癌、乳頭癌、扁平上皮癌、リンパ上皮癌、基底細胞癌、毛母癌、移行細胞癌、乳頭移行細胞癌、腺癌、ガストリノーマ、悪性、胆管癌、肝細胞癌、肝細胞癌と胆管癌の組み合わせ、小柱腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫性ポリープの腺癌、腺癌、家族性大腸ポリポーシス、固形癌、カルチノイド腫瘍、悪性、分枝肺胞腺癌、乳頭腺癌、嫌色素性癌、好酸性癌、好酸性腺癌、好塩基性癌、明細胞腺癌、顆粒細胞癌、濾胞性腺癌、乳頭及び濾胞性腺癌、非被包性硬化癌、副腎皮質癌、子宮内膜癌、皮膚付属器癌、アポクリン腺癌、皮脂腺癌、耳垢腺癌、粘表皮癌、嚢胞腺癌、乳頭嚢胞腺癌、乳頭漿液性嚢胞腺癌、ムチン性嚢細胞癌、ムチン性腺癌、印環細胞癌、浸潤管癌、髄様癌、小葉癌、炎症性癌、ページェット病、乳腺、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮化生随伴腺癌、胸腺腫、悪性、卵巣間質腫瘍、悪性、莢膜腫、悪性、顆粒膜細胞腫瘍、悪性および芽球腫、悪性、セルトリ細胞癌、ライディッヒ細胞腫瘍、悪性、脂質細胞腫瘍、悪性、傍神経節腫、悪性、乳腺外傍神経節腫、悪性、褐色細胞腫、グロマン肉腫、悪性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒色腫巨大色素性母斑、類上皮細胞黒色腫、青母斑、悪性、肉腫、線維肉腫、線維性組織球腫、悪性、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胚性横紋筋肉腫、肺胞性横紋筋肉腫、肺胞横紋筋肉腫、間質肉腫、混合腫瘍、悪性、ミュラー混合腫瘍、腎芽腫、肝芽腫、癌肉腫、間葉腫、悪性、ブレンナー腫瘍、悪性、葉状腫瘍、悪性、滑膜肉腫、中皮腫、悪性、発芽細胞腫、胎児性癌、奇形腫、悪性、卵巣甲状腺腫、悪性、絨毛腫、中腎腫、悪性、血管肉腫、血管内皮腫、悪性、カポジ肉腫、血管周囲細胞腫、悪性、リンパ管肉腫、骨肉腫、傍皮質骨肉腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫、悪性、間葉性軟骨肉腫、骨の巨大細胞腫瘍、ユーイング肉腫、歯原性腫瘍、悪性、エナメル上皮歯牙肉腫、エナメル上皮腫、悪性、エナメル芽細胞性線維肉腫、松果体腫、悪性、脊索腫、神経膠腫、悪性、上衣細胞腫、星状細胞腫、原形質星細胞腫、線維性星状細胞腫、星状芽細胞腫、グリア芽細胞腫、乏突起細胞腫、乏突起膠腫、原始神経外胚葉、小脳肉腫、神経節芽細胞腫、神経芽腫、網膜芽腫、嗅神経原性腫瘍、髄膜腫、悪性、神経線維肉腫、神経鞘腫、悪性、顆粒細胞腫瘍、悪性、悪性リンパ腫、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、傍肉芽腫、悪性リンパ腫、小リンパ球、悪性リンパ腫、大細胞、びまん性、悪性リンパ腫、濾胞、菌状息肉腫、その他の特定の非ホジキンリンパ腫、悪性組織球症、多発性骨髄腫、肥満細胞肉腫、免疫増殖性小腸疾患、白血病、リンパ性白血病、形質細胞白血病、赤白血病、リンパ肉腫細胞白血病、骨髄性白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、単球性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、骨髄肉腫、及びヘアリー細胞白血病。
【０１０１】
本開示の治療用核酸（例えば、アプタマー）は、直接細胞傷害性（例えば、細胞機構を通じてアポトーシスを誘導し、標的構造の完全性を触媒的／機械的に混乱させるなど）であるか、間接的に細胞傷害性（標的に対する宿主防御応答を誘導するなど）であるか、増殖阻害性であるか、または認識／結合中和剤（ウイルスまたは他の病原体が細胞に結合して細胞に侵入する場合など）であり得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、標的はウイルスである。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＨＡＶ−６、ＶＺＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、感染性単核球症、ウイルス性胃腸炎（胃インフルエンザ）、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、狂犬病ウイルス、またはエボラウイルスである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、調節される細胞の特性は、細胞生存率、細胞増殖、遺伝子発現、細胞形態、細胞活性化、リン酸化、カルシウム動員、脱顆粒、細胞移動、及び／または細胞分化である。特定の実施形態では、標的は、標的に対する生物学的または化学的効果の検出を可能にする検出可能な標識に連結されるか、結合されるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識とは蛍光色素である。蛍光色素の非限定的な例としては、限定するものではないが、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、及び酸化還元電位色素が挙げられる。一実施形態では、標的は、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素で標識される。
【０１０４】
特定の実施形態では、標的は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで標識されている。さらに別の実施形態では、標的は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで、標的へのアプタマーの曝露前に標識されている。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、標的は、標的へのアプタマーの曝露後に標識される。一実施形態では、標的は、蛍光標識抗体、アネキシンＶ、抗体断片、及び人工抗体ベースの構築物、融合タンパク質、糖、またはレクチンで標識されている。別の実施形態では、標的は、蛍光標識抗体、アネキシンＶ、抗体断片及び人工抗体ベースの構築物、融合タンパク質、糖、またはレクチンで、標的へのアプタマーの曝露の後に、標識される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、標的細胞は蛍光色素で標識されている。蛍光色素の非限定的な例としては、限定するものではないが、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、及び酸化還元電位色素が挙げられる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、カルシウム感受性色素、細胞トレーサー色素、親油性色素、細胞増殖色素、細胞周期色素、代謝産物感受性色素、ｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、または酸化還元電位色素で標識されている。特定の実施形態では、標的細胞は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで標識されている。さらに別の実施形態では、標的細胞は、活性化関連マーカー、酸化ストレスレポーター、血管新生マーカー、アポトーシスマーカー、オートファジーマーカー、細胞生存マーカー、またはイオン濃度のマーカーで、細胞へのアプタマーの曝露前に標識されている。いくつかの実施形態において、標的細胞は、標的へのアプタマーの曝露後に標識される。一実施形態では、標的細胞は、蛍光標識抗体またはその抗原結合断片、アネキシンＶ、蛍光標識融合タンパク質、蛍光標識糖、または蛍光標識レクチンで標識される。一実施形態において、標的細胞は、蛍光標識抗体またはその抗原結合断片、アネキシンＶ、蛍光標識融合タンパク質、蛍光標識糖、または蛍光標識レクチンで、細胞へのアプタマーの曝露後に標識される。
【０１０８】
表面上の検出可能なマーカーの位置は、例えば蛍光顕微鏡法を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定され得る。
【０１０９】
図３は、本明細書で提供される方法の特定の実施形態を示す例示的なワークフローを提供する。このワークフローは、あたかもＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定のように選択及び準備された最初のアプタマーライブラリー（例えば、本明細書で提供されるアプタマーライブラリー）から始まる。このライブラリーは、例えば、新しく合成されてもよく、または以前の選択プロセスの出力であってもよい。このプロセスには、１つ以上の正の選択サイクル、１つ以上の負の選択サイクル、または両方を、組み合わせ及び配列のいずれかで含み得る。
【０１１０】
準備されたライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルのアダプターにマウントされる。ブリッジＰＣＲ増幅は、初期ライブラリーの各単一配列を、同じ配列の約１００，０００コピーのクラスターに変換する。次いで、このライブラリーはＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定される。このプロセスにより、ライブラリーの各配列をフローセル表面の特定の座標セットにリンクするマップが作成される。
【０１１１】
合成による配列決定のプロセスで追加された、ライブラリー由来の鎖に相補的な鎖は、多数の方法のうちいずれか１つ（例えば、界面活性剤、変性剤など）によって除去される。次に、Ｉｌｌｕｍｉｎａのアダプター、及びＰＣＲプライマーに相補的なオリゴヌクレオチド鎖をフローセルにポンピングし、アプタマー領域のみを一本鎖にする。ＲＮＡアプタマーがライブラリーの一部として合成される場合、転写は多くの方法（例えば、Ｔｅｒ結合Ｔｕｓタンパク質、ビオチン結合ストレプトアビジンタンパク質）のいずれか１つによって開始及び停止される。
【０１１２】
表面上の全てのオリゴヌクレオチドが折り畳みプロトコールに従って折り畳まれて適切な３Ｄ構造をとることができるように、フローセルの温度を上げた後、冷却する。この状態では、オリゴライブラリーは折りたたまれており、標的と係合する準備ができている。
【０１１３】
標的を含む溶液を、機器のハードウェアを使用してフローセルに流す。標的に対する生物学的または化学的効果を報告する目的で、フローセル／機器に導入する前に蛍光色素で標的を標識してもよい。標的を一定時間インキュベートして、効果を発生させる。次に、生物学的または化学的効果（例えば、細胞の活性化、アポトーシスなど）を報告するための蛍光色素またはマーカーをフローセルにポンピングしてもよい（図３を参照のこと）。
【０１１４】
影響を受ける標的（ヒット）を画像分析によって認識して、対応する配列を分析する。抽出された配列を、結合及び機能について個別に合成及び試験する。
【実施例】
【０１１５】
実施例１−アプタマーライブラリーの準備
アプタマーライブラリーは、フローセルの表面に既に付着している鎖を補完するために試料配列の側面にアダプターＤＮＡ配列の添付を含んだ、Ｉｌｌｕｍｉｎａのハイスループット配列決定プラットフォーム試料調製キットを使用して調製した。調製したライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルの表面のアダプターにマウントした。
【０１１６】
アプタマーライブラリーの調製には、アダプターを取り付けるために２ステップの「テール」ＰＣＲプロセスを使用した。ＰＣＲ反応ミックスには、表１に示す以下の成分を含んでいた。
【表１】
2020519615.tif 000002
【０１１７】
プライマーは、アダプターが試料配列に対して特定の方向を持つように設定した。これは、クラスター内のフォワードアプタマー配列を、１回の読み取りで保持するように行った。
【０１１８】
１回目のＰＣＲ反応で使用されるプライマーの配列：
ＴｒｕＳｅｑ  ｐ７側スタブフォワードプライマー
ＧＴＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＡ  ［配列番号１］；及び
ＴｒｕＳｅｑ  ｐ５側スタブリバースプライマー
ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＴＡＡＧＣＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡ  ［配列番号２］
最初の反応に使用されたＰＣＲプログラムは、以下の表２に示されている。
【表２】
2020519615.tif 000003
【０１１９】
最初のＰＣＲ反応の生成物（ＰＣＲ  １）は、２回目のＰＣＲ反応の入力である。
【０１２０】
２回目のＰＣＲ反応で使用されるプライマーの配列：
ＴｒｕＳｅｑ  ｐ７側開始
ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧ  ［配列番号３］；及び
ＴｒｕＳｅｑ  ｐ５側開始
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧ  ［配列番号４］。
【０１２１】
２番目の反応に使用されるＰＣＲプログラムは、以下の表３に示されている：
【表３】
2020519615.tif 000004
【０１２２】
完成したライブラリーには、濃度のｑｂｉｔチェックならびにライブラリーのサイズ及び副産物をチェックするためのタップステーション／フラグメントアナライザー（断片分析器）を含む品質管理を行った。クラスターの生成及び配列決定は、シーケンシングプラットフォーム及びＩｌｌｕｍｉｎａのプロトコールに従って実行した。配列決定プロセスの後、変性によりクラスターが一本鎖型で提供される。その後、アダプター及びプライマーがブロックされ、アプタマーは、それらの折り畳み緩衝液中で、その３Ｄの高次構造に折り畳まれる。
【０１２３】
クラスターの生成及び配列決定
ブリッジＰＣＲ増幅を使用して、初期ライブラリーの由来の各単一配列を、同じ配列の約１００，０００コピーのクラスターに変換した。その後、クラスタライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定した。このプロセスにより、ライブラリー由来の各配列をフローセル表面の特定の座標セットにリンクするマップが作成された。
【０１２４】
合成による配列決定のプロセスで追加されたライブラリーからの相補鎖を除去し、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター及びＰＣＲプライマーに相補的なオリゴヌクレオチド鎖を、フローセルにポンピングし、アプタマー領域のみを一本鎖にした。ＲＮＡアプタマーの場合、転写は多数の方法（Ｔｅｒ結合Ｔｕｓタンパク質、またはビオチン結合ストレプトアビジンタンパク質など）のうちのいずれか１つによって開始及び停止された。
【０１２５】
フローセルの温度を上げてから冷却し、フローセルの表面上の全てのオリゴヌクレオチドが適切な折りたたみ緩衝液中で適切な３Ｄ高次構造をとるようにさせた。例えば、使用された１つの折りたたみ緩衝液レシピ（セルセレックス紙）には、１リットルのＰＢＳ、５ｍｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、及び４．５ｇのグルコースを含んでいた。
【０１２６】
標的
導入
標的（例えば、細胞、細菌、粒子、ウイルス、タンパク質など）は、機械のハードウェアを使用して、使用される環境（例えば、ヒト血清、ＰＢＳ、ｌｂ）に応じて、所望の結合緩衝液でシステムに導入した。一般的な結合緩衝液レシピのオプションの１つは（セルセレックス紙）：１リットルのＰＢＳ、５ｍｌの１ＭのＭｇＣｌ２、４．５ｇのグルコース、１００ｍｇのｔＲＮＡ、及び１ｇのＢＳＡである。標的は、フローセル／機械への導入の前または後に標識され、特定の時間インキュベートされて効果が生じた。
【０１２７】
プラットフォームの励起源と発光フィルターに適合する種々のフルオロフォアを使用して、標的を標識してもよい。標識化は、標的で利用可能な任意の可能なドッキング部位を通じて行ってもよい。標識剤の例としては、限定するものではないが、ＤｉＩ、抗ＨＬＡ＋二次Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６５０、抗ＨＬＡ  ＰＥ−Ｃｙ５、及びＤｙｌｉｇｈｔ  ６５０が挙げられる。
【０１２８】
機能的アプタマーのスクリーニングでは、蛍光レポーターを使用して効果が視覚化され得る。例えば、フローセルへの７ＡＡＤの導入を使用して、標的を標識して細胞死をスクリーニングしてもよく、また、アネキシンＶフルオロフォアコンジュゲートを使用して、アポトーシスをスクリーニングするために標的を標識してもよい。レポーター剤、その濃度、インキュベーション時間、及び特定のレシピプロトコールは、特定のスクリーニング効果に従って調整する必要がある。
【０１２９】
初期ライブラリーを配列決定した後、標的細胞を導入し、機能性オリゴヌクレオチドクラスターを取得する代表的な方法
８０μｌの「取り込みミックス緩衝液（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  Ｂｕｆｆｅｒ）」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。次に、温度を５５℃に設定する。６０μｌの「取り込みミックス（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）」を、２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、８０秒後に１０μｌの「取り込みミックス」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。２１１秒後、温度を２２℃に設定し、６０μｌの「取り込みミックス緩衝液」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。次に、７５μｌの「スキャンミックス（Ｓｃａｎ  Ｍｉｘ）」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。
【０１３０】
次に、この方法は、クラスターの平面に焦点を合わせ、顕微鏡とフローセルの平面を位置合わせするように調整する。１００μｌの「取り込みミックス緩衝液」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。上記の組み込みステップを９９回反復する。
【０１３１】
温度制御をオフにして、１２５μｌの「Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ」を、２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。次に、温度を５５℃に設定し、７５μｌの「Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｉｘ」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。８０秒後、２５μｌの「Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｉｘ」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。
さらに８０秒後、２５μｌの「Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｉｘ」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。８０秒後、温度を２２℃に設定する。次いで、温度制御をオフにして、６０μｌの「取り込みミックス緩衝液」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングする。次いで、各々の水チューブに残っている容積をチェックして、適切な送達を確認する。
【０１３２】
その後、変性が起こり、キャッピングが続く。変性ステップの場合、温度は１２０秒間２０℃に設定する。７５μｌの「洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）」をフローセルに６０μｌ／分の速度でポンピングし、続いて７５μｌの「Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を６０μｌ／分の速度で、７５μｌの「洗浄緩衝液」を６０μｌ／分の速度でポンピングする。
【０１３３】
キャッピングステップでは、７５μｌの「洗浄緩衝液」を６０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１２０秒間８５℃に設定する。次に、８０μｌの「５’キャップ」を８０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を３０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を、１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を６０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を９０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を、１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１２０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１５０秒間８５℃に設定する。
【０１３４】
１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１８０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２１０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２４０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「５’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２７０秒間８５℃に設定する。７５μｌの「洗浄緩衝液」を６０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１２０秒間８５℃に設定する。
【０１３５】
３’キャップの場合、８０μｌの「３’キャップ」を８０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を３０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を６０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を９０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１２０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１５０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を、１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を１８０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２１０秒間８５℃に設定する。１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２４０秒間８５℃に設定する。
【０１３６】
１０μｌの「３’キャップ」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２７０秒間８５℃に設定する。７５μｌの「洗浄緩衝液」を６０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を０℃に設定する。２００μｌの「折り畳み緩衝液（Ｆｏｌｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（冷却）」を２５０μｌ／分の速度で、続いて１６０μｌの折り畳み緩衝液（冷却）」を４０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を６００秒間０℃に設定する。
【０１３７】
その温度を１２０秒間３７℃に上げる。これに結合ステップが続く。
【０１３８】
結合ステップでは、８０μｌの「結合緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）」を２５０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を３７℃に設定する。８０μｌの「標的＃１」を１００μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を３００秒間３７℃に設定する。１０μｌの「標的実体＃１」を、再び１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を３００秒間３７℃に設定する。最後に、１０μｌの「標的＃１」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングし、その温度を２７００秒間３７℃に設定する。
【０１３９】
その後、３つの連続した取り込みステップ及び洗浄ステップを続けて、未結合の標的を除去し、これは、取り込み、８０μｌの「結合緩衝液」を１３μｌ／分の速度でフローセルにポンピングすること、取り込み、８０μｌの「結合緩衝液」を８０μｌ／分の速度でフローセルにポンピングすること、取り込み、８０μｌの「結合緩衝液」を２００μｌ／分の速度でフローセルにポンピングすること、及び取り込みからなる。
【０１４０】
上記の変性、キャッピング、結合、取り込み、洗浄の各ステップは、配列決定と標的の導入が完了するまで繰り返される。次いで、種々の標的を追加して、アプタマーへの結合及び／または活性を評価する。
【０１４１】
図５は、フローセルに結合されたハナ（Ｈａｎａ）セルの動きの低速度撮影の画像を示している。その結果、セルは実際には表面自体ではなく表面自体に結合された配列によって結合されているため、自由に移動するが、その場所に限定されていることが示されている。
【０１４２】
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての出版物、特許、及び特許出願は、各々の個々の出版物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書の任意の定義を含む本出願が支配する。
【０１４３】
等価物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または慣用的な実験以下を使用して確認することができるであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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