【手続補正書】
【提出日】平成29年3月31日(2017.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の遺伝物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで修飾する方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡ配列を含有する細胞を提供するステップと、
（ｂ）転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼをコードするベクターを前記細胞へ導入するステップであって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼは、
（ｉ）二本鎖ＤＮＡを切断することができるエンドヌクレアーゼドメイン、ここで、前記エンドヌクレアーゼドメインはＩＩ型制限ヌクレアーゼに由来する、および
（ｉｉ）組み合わせで標的ＤＮＡ配列中の特定のヌクレオチド配列と結合する複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含むＴＡＬエフェクタードメイン
を含むものであり、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼが、前記細胞中の前記特定のヌクレオチド配列内にあるまたはそれに隣接する前記標的ＤＮＡ配列を切断するように、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを前記細胞へ導入する、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡ配列と前記核酸との間で相同組換えが起こるように、前記標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部分に相同的な配列を含む核酸を、前記細胞に提供するステップをさらに含む、方法。
【請求項３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が植物細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、
前記導入ステップが、前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしているベクターを用いて細胞を形質移入することを含む、方法。
【請求項６】
前記ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼがＦｏｋＩである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列と結合する前記ＴＡＬエフェクタードメインが、１５以上のＴＡＬエフェクター反復配列を含む、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する反復可変性二残基（ＲＶＤ）を含み、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記ＲＶＤが、
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
Ｇを認識するためのＮＮ、
Ａを認識するためのＮＳ、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＩＧ、
Ｇを認識するためのＮＫ、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、および
Ｇを認識するためのＮＡ、
のうちの１つまたは複数を含む、方法。
【請求項９】
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸を作製する方法であって、前記方法は、
（ａ）細胞のゲノム中の第１のユニークなヌクレオチド配列を同定するステップと、
（ｂ）（ｉ）組み合わせで前記第１のユニークなヌクレオチド配列と結合する複数のＴＡＬエフェクター反復配列、および（ｉｉ）第１のヌクレオチド配列内にあるまたはそれに隣接する二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼを含む、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸を合成するステップであって、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼが、以下のＲＶＤ：
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
Ｇを認識するためのＮＮ、
Ａを認識するためのＮＳ、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＩＧ、
Ｇを認識するためのＮＫ、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、および
Ｇを認識するためのＮＡ、
のうちの１つまたは複数を含む
ステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記第１のヌクレオチド配列が、最小で１５個の塩基の長さであり、５’から３’に配向されており、Ｔが５’末端の部位の直前にある、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、
前記細胞のゲノム中の第２のヌクレオチド配列を同定するステップをさらに含み、
前記第１および第２のヌクレオチド配列が、１８ｂｐで分離されている、方法。
【請求項１２】
前記エンドヌクレアーゼが、前記第１および第２のヌクレオチド配列の間に二本鎖切断を生じる、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項１３】
エンドヌクレアーゼドメインと標的ＤＮＡに特異的なＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含む単量体ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼであって、
前記エンドヌクレアーゼドメインはＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに由来し、
前記ＤＮＡ結合ドメインが複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含み、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が前記標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っている、単量体ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ。
【請求項１４】
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼがＦｏｋＩである、請求項１３に記載の単量体ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ。
【請求項１５】
前記単量体が、スペーサーを含む二連認識部位にわたって、別の単量体とのダイマーとして機能し、ＦｏｋＩを二量体化させて、前記スペーサー内の前記標的ＤＮＡ内に二本鎖切断を生じる、請求項１４に記載の単量体ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ。
【請求項１６】
請求項１３に記載の単量体ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼであって、
前記単量体ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼが、以下のＲＶＤ：
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
Ｇを認識するためのＮＮ、
Ａを認識するためのＮＳ、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＩＧ、
Ｇを認識するためのＮＫ、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、および
Ｇを認識するためのＮＡ、
のうちの１つまたは複数を含む
単量体ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ。
【請求項１７】
非ヒト動物を作製する方法であって、
ｉ）遺伝子修飾を導入することが所望される標的ＤＮＡ配列を含む真核細胞を提供するステップであって、前記細胞は請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む、ステップと、
ｉｉ）ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを用いて、前記標的ＤＮＡ配列内で二本鎖切断を生じるステップと、
二本鎖切断が起こった細胞から非ヒト動物を作製するステップとを含む、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同的な配列を含む外因性核酸を、前記細胞内に導入するステップであって、
前記導入するステップが、前記外因性核酸と前記細胞またはその子孫中の前記標的ＤＮＡ配列との間に相同組換えが起こることを可能にする条件下で行われる、ステップと、
相同組換えが起こった細胞またはその子孫から非ヒト動物を作製するステップと
をさらに含む、方法。
【請求項１９】
植物を作製する方法であって、
ｉ）事前に選択された遺伝子修飾の導入が所望される標的ＤＮＡ配列を含む植物細胞を提供するステップであって、前記植物細胞は請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む、ステップと、
ｉｉ）ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを用いて、前記標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生じるステップ
と、
ｉｉｉ）二本鎖切断が起こった細胞またはその子孫から植物を作製するステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部分に相同的な配列を含む外因性核酸を、前記植物細胞内に導入するステップであって、前記導入するステップが、前記外因性核酸と前記細胞またはその子孫中の前記標的ＤＮＡ配列との間で相同組換えが起こることを可能にする条件下で行われる、ステップと、
相同組換えが起こった細胞またはその子孫から植物を作製するステップと
をさらに含む、方法。
【請求項２１】
細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的化遺伝子組換えの方法であって、
ｉ）請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸を前記細胞内に導入するステップであって、前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼは選択されたＤＮＡ標的配列を標的とする、ステップと、
ｉｉ）前記細胞内での前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの発現を誘導するステップと、
ｉｉｉ）前記選択されたＤＮＡ標的配列が突然変異を示している細胞を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項２２】
前記突然変異が、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、ならびに遺伝物質の欠失および挿入の両方からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞内にドナーＤＮＡを導入するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が昆虫細胞、植物細胞、魚細胞、または哺乳動物細胞である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
核酸であって、
（ｉ）二本鎖ＤＮＡを切断することができるエンドヌクレアーゼドメイン、ここで、前記エンドヌクレアーゼドメインはＩＩ型制限ヌクレアーゼに由来する、および
（ｉｉ）組み合わせで選択された標的ＤＮＡ配列と結合する、複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含むＴＡＬエフェクタードメイン、
を含むＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードする、
核酸。
【請求項２６】
前記エンドヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩに由来する、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発現カセットを含む宿主細胞。