(57)【要約】  抗体を単離する方法が開示されている。この方法は、疎水性キレート剤、非イオン性界面活性剤および金属イオンを含む凝集体を生成するために、疎水性キレート剤、非イオン性界面活性剤および金属イオンを接触させるステップ、および凝集体への抗体の分配を可能にする条件下で、凝集体を、抗体を含む培地と接触させるステップを含む。抗体を単離するためのキットも開示されている。【選択図】図１
2020519602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を単離する方法であって、
（ａ）疎水性キレート剤、非イオン性界面活性剤および金属イオンを含む凝集体を生成するために、前記疎水性キレート剤、前記非イオン性界面活性剤および前記金属イオンを接触させるステップ、および
（ｂ）前記凝集体への前記抗体の分配を可能にする条件下で、前記凝集体を、前記抗体を含む培地と接触させ、それにより前記抗体を単離するステップ
を含む方法。
【請求項２】
疎水性キレート剤、非イオン性界面活性剤、３〜６のｐＨの緩衝液、および金属イオンを含むキット。
【請求項３】
疎水性キレート剤、ポリソルベートサーファクタント、および金属イオンを含むキット。
【請求項４】
前記培地が細胞溶解物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞溶解物が全細胞溶解物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記培地がハイブリドーマ培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培地が血清アルブミンを含む、請求項１または６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞溶解物が約２ミクロンより大きいオルガネラを欠いている、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）の前記条件が、１００ｍＭ未満の塩のレベルを有することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）の後に前記抗体を可溶化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記可溶化が、３〜６の間のｐＨを有する緩衝液で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記可溶化が、３．８〜４の間のｐＨを有する緩衝液で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝液がさらに塩を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
３〜６の間のｐＨを有する緩衝液をさらに含む、請求項３に記載のキット。
【請求項１５】
前記緩衝液がカルボン酸緩衝液である、請求項２、１１または１４のいずれか一項に記載のキットまたは方法。
【請求項１６】
前記緩衝液がアミノ酸を含む、請求項２、１１または１４のいずれか一項に記載のキットまたは方法。
【請求項１７】
前記カルボン酸緩衝液が、イソロイシン、バリン、グリシンおよび酢酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１１、１４または１５に記載のキットまたは方法。
【請求項１８】
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベートサーファクタントである、請求項１または２に記載の方法またはキット。
【請求項１９】
前記ポリソルベートサーファクタントが、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０からなる群から選択される、請求項３または１８に記載の方法またはキット。
【請求項２０】
前記疎水性キレート剤が８−ヒドロキシキノリンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項２１】
前記疎水性キレート剤がフェナントロリンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項２２】
前記フェナントロリンが、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）メタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ１）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）エタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ２）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）プロパンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ３）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ブタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ４）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ペンタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ５）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ヘキサンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ６）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ヘプタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ７）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）オクタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ８）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ノナンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ９）および、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）デカンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ１０）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法またはキット。
【請求項２３】
前記フェナントロリンが、バソフェナントロリン、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ヘキサンアミド）（Ｐｈｅｎ−６）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）デカンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ１０）、およびＮ−（１，１０−フェナントロリン−５−ｙｌ）オクタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ８）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法またはキット。
【請求項２４】
前記フェナントロリンがバソフェナントロリンである、請求項２３に記載の方法またはキット。
【請求項２５】
前記金属イオンが二価金属イオンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項２６】
前記二価金属イオンが、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｏ２＋からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法またはキット。
【請求項２７】
前記二価金属イオンが、Ｚｎ２＋およびＦｅ２＋からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法またはキット。
【請求項２８】
前記疎水性キレート剤が、約０．１％から約１０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で水溶液中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記金属イオンが、約０．１％から約１０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で前記水性物中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞溶解物が細菌細胞に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞溶解物が哺乳動物細胞に由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が組換え抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＧからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、抗体を精製するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、モノクローナル抗体（ｍＡｂ’）は、治療薬として最も一般的に使用されている組換えタンパク質である。２０１２年には、米国で最大の販売クラスの生物製剤であった。１リットルあたりわずかなミリグラムからかなり多いグラムの濃度へそれらの発現レベルが劇的に増加することは、一部が必要とされる何百キログラムからトン単位の量と共に、複合的な混合物からｍＡｂを効率的に捕捉できる業界での精製方法の継続的な課題を提起する。これは通常、最初の捕捉ステップとしてＰｒｏＡクロマトグラフィーにより達成され、通常、ホストＤＮＡ、ウイルス混入物、浸出ＰｒｏＡの大部分を除去しながら、高い回収率（約９５％）、純度（＞９５％）をもたらす。
【０００３】
これらの顕著な特徴により、ＰｒｏＡクロマトグラフィーは抗体製造のゴールドスタンダードになった。しかし、ＰｒｏＡ樹脂は非親和性高分子支持体（イオン交換体など）に比べてコストが高いため、より経済的な代替品を開発する動機がある。この動機は、現在および将来のグローバルなバイオテクノロジーの需要（つまり、年間数百トンの精製ｍＡｂ）が開発中の様々な治療用ｍＡｂを表し、すべてが様々な癌、自己免疫および炎症性疾患を対象とすることを考慮するときにさらに正当化される。
【０００４】
ＰｒｏＡの使用、および一般的なクロマトグラフィー戦略は、ｍＡｂ’の工業的精製に固有の「生産性のボトルネック」であり、総製造コストの最大８０％を占める可能性があり、したがって（ａ）リガンドとしてのＰｒｏＡおよび／または（ｂ）主要な捕捉ステップとしてのクロマトグラフィーを必要としない抗体捕捉方法を将来の医薬品のニーズに対する魅力的な代替手段にすると主張されている。
【０００５】
背景技術には、Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１３，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２４，  ｐａｇｅｓ  １２７０−１２７５；  Ｇｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．（１９９４）  ６６１，  １３−２３；  Ｍａｎｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９７）  ２００８，  ６５−７３；  Ｆｏｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｆａｈｒｎｅｒ  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．（２００４）  １０２４，  ７９−８５およびＧｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．（２００６）  １１０７，  １０４−１０９が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１３，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２４，  ｐａｇｅｓ  １２７０−１２７５
【非特許文献２】Ｇｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．（１９９４）  ６６１，  １３−２３
【非特許文献３】Ｍａｎｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９７）  ２００８，  ６５−７３
【非特許文献４】Ｆｏｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｆａｈｒｎｅｒ  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．（２００４）  １０２４，  ７９−８５
【非特許文献５】Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．（２００６）  １１０７，  １０４−１０９
【発明の概要】
【０００７】
抗体精製の新しい概念が明らかになった。ヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）およびマウスＩｇＧは、非イオン性界面活性剤、金属イオンおよび疎水性キレート剤の凝集体にほぼ定量的に（デンシトメトリーにより約９５％）分配されるが、非ＩｇＧタンパク質の大部分（デンシトメトリーにより＞８５％）が（すなわち、不純物が）拒否される。このプロセスは、キレート剤と金属の存在に依存しているため、非常に特異的であった。凝集体に吸着されるまたは埋め込まれる抗体は、凝集体の溶解を伴わずに抽出することができ、より純度の高いＩｇＧの調製（デンシトメトリーにより約９５％）に至る。含まれるプロセスの全体的な収率：ＩｇＧの分配と抽出範囲は、約４０〜４６％（デンシトメトリーによる）。円偏光二色性分光法（ＣＤ）は、抽出されたｈＩｇＧの二次構造の保存を示した。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、抗体を単離する方法が提供され、この方法は以下を含む：
（ａ）疎水性キレート剤、非イオン性界面活性剤および金属イオンを含む凝集体を生成するために、疎水性キレート剤、該非イオン性界面活性剤および金属イオンを接触させるステップ、および
（ｂ）凝集体への抗体の分配を可能にする条件下で、凝集体を、抗体を含む培地と接触させ、それにより抗体を単離するステップ。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、疎水性キレート剤、非イオン性界面活性剤、ｐＨが３〜６の緩衝液および金属イオンを含むキットが提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、疎水性キレート剤、ポリソルベートサーファクタントおよび金属イオンを含むキットが提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培地は細胞溶解物を含む。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞溶解物は全細胞溶解物である。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞溶解物は、約２ミクロンより大きいオルガネラを欠いている。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップ（ｂ）の条件は、１００ｍＭ未満の塩レベルを有することを含む。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、ステップ（ｂ）の後に抗体を可溶化することをさらに含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、可溶化は、３〜６の間のｐＨを有する緩衝液で達成される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、可溶化は、３．８〜４の間のｐＨを有する緩衝液で達成される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、緩衝液はさらに塩を含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、キットはさらに、３〜６の間のｐＨを有する緩衝液を含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、緩衝液はカルボン酸緩衝液である。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、カルボン酸緩衝液は、イソロイシン、バリン、グリシンおよび酢酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、緩衝液はアミノ酸を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、非イオン性界面活性剤はポリソルベートサーファクタントである。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリソルベートサーファクタントは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０からなる群から選択される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疎水性キレート剤は、８−ヒドロキシキノリンを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疎水性キレート剤はフェナントロリンを含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フェナントロリンは、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）メタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ１）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）エタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ２）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）プロパンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ３）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ブタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ４）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ペンタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ５）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ヘキサンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ６）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ヘプタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ７）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）オクタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ８）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ノナンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ９）および、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）デカンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ１０）からなる群から選択される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フェナントロリンは、バソフェナントロリン、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ヘキサンアミド）（Ｐｈｅｎ−６）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）デカンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ１０）、およびＮ−（１，１０−フェナントロリン−５−ｙｌ）オクタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ８）からなる群から選択される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、フェナントロリンはバソフェナントロリンである。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、金属イオンは二価金属イオンである。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、二価金属イオンは、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｏ２＋からなる群から選択される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、二価金属イオンは、Ｚｎ２＋およびＦｅ２＋からなる群から選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疎水性キレート剤は、約０．１％から約１０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で水溶液中に存在する。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培地はハイブリドーマ培地を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培地は血清アルブミンを含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、金属イオンは、約０．１％〜約１０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で水性物中に存在する。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞溶解物は細菌細胞に由来する。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞溶解物は哺乳動物細胞に由来する。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体はヒト化抗体である。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は組換え抗体である。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＧからなる群から選択される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。
【００４４】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が支配する。さらに、材料、方法、および例は単なる例示であり、必ずしも限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
本明細書では、本発明のいくつかの実施形態を、単なる例として、添付の図面を参照して説明する。ここで図面を詳細に具体的に参照すると、示されている詳細は例としてであり、本発明の実施形態の例示的な説明の目的のためであることが強調される。これに関して、図面と共に得られる説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。
【図１】図１は、本発明の実施形態による、本明細書で開示される方法の概略図である。非イオン性界面活性剤で構成されるミセルは、Ｆｅ２＋イオンの存在下で疎水性キレート剤および特異的クラスターとのインキュベーションにより人工ミセルに変換され、それにより［金属：キレート剤］複合体によって相互接続されたミセル凝集体を形成する。抗体はミセル凝集体に分配されるが、他のより親水性の高いタンパク質は分配されない。界面活性剤凝集体を無傷に保つ定められた条件下で、標的ＩｇＧのさらなる抽出が達成される。
【図２Ａ−２Ｄ】図２Ａ−図２Ｄは、光学顕微鏡検査とクライオＴＥＭ分析の効果を示す写真である。図２Ａは、光学顕微鏡法：［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］赤色複合体を介して結合したＴｗｅｅｎ−２０ミセルである。図２Ｂは、図２Ａと同様だがＦｅ２＋非存在下の対照実験である。図２Ｃは、クライオＴＥＭで、［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］複合体を介して結合するＴｗｅｅｎ−２０ミセルである。図２Ｄは、Ｔｗｅｅｎ−２０ミセルのみを含む対照実験（黒い点）である。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す写真である。図３Ａは、プロセスの実行可能性と金属およびキレート剤への依存である。レーン１：大腸菌溶解物；レーン２：標的ｈＩｇＧ；レーン３：［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］複合体の存在下でのペレット組成；レーン４〜５：レーン３と同様だが、それぞれキレート剤と金属が存在しない；レーン６：タンパク質を添加しないＴｗｅｅｎ−２０凝集体。レーン３のアスタリスクは、タンパク質を含まない染色されたＴｗｅｅｎ−２０凝集体を示している。ゲルはクーマシー染色されている。図３Ｂは、ｈＩｇＧの精製に対するイオン強度の効果である。レーン３〜８において、ｈＩｇＧの精製は、指定されたＮａＣｌの濃度で実施された。図３Ｃは、マウスＩｇＧの精製に対するイオン強度の効果である。レーン３〜８において、図３Ｂと同様である。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ−図４Ｃは、異なる二価金属陽イオンの存在下でのプロセス効率を示している。図４Ａは、異なる二価金属陽イオンの存在下でのプロセス効率を示している：レーン１：大腸菌溶解物；レーン２：標的ｈＩｇＧ；レーン３：［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］複合体の存在下でのペレット組成；レーン４〜５：レーン３と同様だが、それぞれＺｎ２＋およびＮｉ２＋が存在する。図４Ｂは、合成された１，１０−フェナントロリン誘導体の存在下でのプロセス効率である。レーン１：大腸菌溶解物；レーン２：標的ｈＩｇＧ；レーン３〜６：各々バソフェナントロリン、Ｐｈｅｎ−Ｃ１０、Ｐｈｅｎ−Ｃ８およびＰｈｅｎ−Ｃ６の存在下でのペレット組成。図４Ｃは、使用したキレート剤の化学構造である。ゲルはクーマシー染色されている。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ−図５Ｂは、一般的に使用される大規模ｍＡｂ精製プロセスの概略図（図５Ａ）およびＴｗｅｅｎ−２０凝集体を利用する代替ルートの概略図（図５Ｂ）である。ＵＦとＤＦは、それぞれ限外ろ過と透析ろ過を表す。
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ−図６Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＤ分析を示している。図６Ａは、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体からのｈＩｇＧの抽出である。レーン１：大腸菌溶解物；レーン２：標的ｈＩｇＧ；レーン３〜８：示された緩衝液および塩濃度とのインキュベーション後の上清組成。図６Ｂは、図６Ａと同様だが、マウスＩｇＧの存在下である。ゲルはクーマシー染色されている。図６Ｃは、２０ｍＭのＮａＣｌ中の５０ｍＭのＡｃＯＨ（ｐＨ４．６）の存在下でＴｗｅｅｎ−２０凝集体から抽出されたｈＩｇＧのＣＤ分析である。
【図７Ａ−７Ｄ】図７Ａ−図７Ｄは、無血清培地でのヒトおよびマウスＩｇＧの精製に対するＢＳＡの効果を示している。図７Ａは、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）の捕捉である：レーン１：ｈＩｇＧおよびＢＳＡ；レーン２〜１０：Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体をｈＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートした後に得られたペレット組成物で、実験の部において記載されている無血清培地のＢＳＡ濃度を示している。図７Ｂは、実験の部において説明されているように、ｐＨ３．８で５０ｍＭのイソロイシンとゲルＡ−Ｉ（レーン２〜１０）で生成された対応するペレットをインキュベートした後の上清組成である。図７Ｃは、図７Ａに記載されているのと同様であるが、マウスＩｇＧの存在下である。  図７Ｄは、図７Ａに記載されているのと同様であるが、マウスＩｇＧの存在下である。文字：ＨとＬは、それぞれ標的抗体の還元された重鎖と軽鎖を表す。文字Ａは、界面活性剤凝集バンドを指している。ゲルはクーマシー染色されている。
【図８Ａ−８Ｅ】図８Ａ−図８Ｅは、抽出緩衝液の効率、円偏光二色性分析、およびＤＬＳ分析を示している。図８Ａは、ｈＩｇＧ抽出に対する緩衝液組成の効果である。レーン１：ｈＩｇＧおよびＢＳＡ；レーン２：実験の部で説明したように、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体をｈＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）およびＢＳＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）と無血清培地でインキュベートした後得られたペレット組成物。レーン３〜９：実験の部で説明されているように、ｐＨ３．８の指定されたアミノ酸を含む緩衝液で、レーン２に示された条件下で生成されたペレットからｈＩｇＧを抽出した後の上清組成。文字：ＨとＬは、それぞれ標的抗体の還元された重鎖と軽鎖を表す。文字Ａは、界面活性剤凝集バンドを指している。ゲルはクーマシー染色されている。図８Ｂは、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体で精製し、ｐＨ３．８の指定緩衝液で抽出したヒトおよびマウスＩｇＧ（点線）と、対して、対照として機能させて精製は行っていない同一のＩｇＧ（黒い線）の動的光散乱（ＤＬＳ）分析である。  図８Ｃは、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体で精製し、ｐＨ３．８の指定緩衝液で抽出したヒトおよびマウスＩｇＧ（点線）と、対して、対照として機能させて精製は行っていない同一のＩｇＧ（黒い線）の動的光散乱（ＤＬＳ）分析である。図８Ｄは、円偏光二色性（ＣＤ）の吸収である。対照（未処理）のｈＩｇＧが直線精製したｈＩｇＧが点線である。図８Ｅは、図８Ｄと同様であるが、マウスＩｇＧを使用する。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ−図９Ｂは、抽出されたＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析である。ウサギ（ｎａｋｅｄ）またはヒツジ（ビオチン化）に由来するポリクローナル抗ＢＳＡ  ＩｇＧを、提示された精製方法にかけ、ｐＨ３．８で指定されたアミノ酸緩衝液（５０ｍＭ）でＴｗｅｅｎ−２０凝集体から３２℃（５分）で抽出した。これらの精製された抗体がＢＳＡ上の標的エピトープに結合する能力は、材料と方法に記載されているＥＬＩＳＡアッセイによって判定された。提示されたデータは、少なくとも１２の独立した実験に依存している。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ−図１０Ｂは、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体によるＩｇＭの精製である。図１０Ａは、ＩｇＭ捕捉の特異度である。レーン１：ｈＩｇＧ；レーン２：ＢＳＡ；レーン３：ウシポリクローナルＩｇＭ；レーン４：ＩｇＭ＋ＢＳＡ混合物（総使用量）；レーン５：ＩｇＭ＋ＢＳＡ混合物を［Ｔｗｅｅｎ−２０：ｂａｔｈｏ：Ｆｅ２＋］凝集体とインキュベートし、上清を除去した後のペレット組成。アスタリスクは、染色されたＴｗｅｅｎ−２０凝集体を指す；レーン６〜７：レーン５と同様であるが、それぞれキレート剤（バソ）のみまたは金属（Ｆｅ２＋）のみ存在しない；レーン８：追加タンパク質を含まない［Ｔｗｅｅｎ−２０：ｂａｔｈｏ：Ｆｅ２＋］凝集体で構成されるペレット。図１０Ｂは、ＩｇＭ抽出である。レーン１：ｈＩｇＧ；レーン２：ウシポリクローナルＩｇＭ；レーン３：ＩｇＭを［Ｔｗｅｅｎ−２０：ｂａｔｈｏ：Ｆｅ２＋］凝集体とインキュベートし、上清を除去した後のペレット組成。アスタリスクは、染色されたＴｗｅｅｎ−２０凝集体を指す。レーン４〜７：指定された尿素濃度のｐＨ３でＩｇＭを含むＴｗｅｅｎ−２０ペレットをインキュベートした後の上清組成。両方のゲルはクーマシー染色されている。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、抗体を精製するための方法およびキットに関する。特に、この方法は、一般的なリガンドであるプロテインＡ（ＰｒｏＡ）を使用せずに抗体を捕捉する代替経路に関するものである。
【００４７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるか実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行することができる。
【００４８】
抗体の精製では、通常、最初の捕捉ステップとしてプロテインＡ（ｐｒｏＡ）クロマトグラフィーを使用する。ただし、ｐｒｏＡクロマトグラフィーは非常に高価であり、「生産性のボトルネック」を生み出す。
【００４９】
したがって、本発明者らは、ＩｇＧを精製するための代替物を探した。抗体は非常に親水性であるが、本発明者らは驚くべきことに、通常疎水性タンパク質の単離に使用される共役Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート２０）ミセルも、抗体の単離に一般的に使用されるＰｒｏＡカラムの代替として使用できることを発見した。本発明者らの実験結果は、非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０で構成されるミセルが、疎水性の［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］赤色複合体の存在下で特異的に結合し、顆粒状赤色沈殿物をもたらせることを示している（図２Ａ）。ミセル共役は、金属（図２Ｂ）もキレート剤（図示せず）も存在しない場合には発生しないため、非常に特異的であることがわかった。クライオＴＥＭによる赤色の凝集体の分析は、［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］複合体が様々な凝集形態をもたらすことを示しているが、その一部はサイズが１００ｎｍ（図２Ｃ）に達し、複合体の非存在下ではミセルの分散は単分散のように見える（図２Ｄ）。これらの結果は、［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］複合体のミセルクラスタリングを誘発する能力の直接的な証拠を提供する。
【００５０】
ＩｇＧの精製を実証するために、大腸菌溶解物中の標的ヒトＩｇＧの混合物（人工汚染バックグラウンドとして機能した）を、事前に形成されたＴｗｅｅｎ−２０凝集体に加えた。５分間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上清に存在する不純物を廃棄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペレットの分析により、還元された重鎖と軽鎖の存在が明らかになった（図３Ａ、レーン３）。さらに、システム（図３Ａ、レーン１）に存在する不純物の大部分はペレット（図３Ａ、レーン３）に存在せず、ＩｇＧ以外の水溶性タンパク質（平均してＩｇＧよりも極性が高い）は、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体とは結合しないが、抗体分子は結合するという仮説と一致した。
【００５１】
プロセスの一般性を実証するために、本発明者らは、ポリクローナルマウスＩｇＧによるＩｇＧ分配挙動の依存性も研究し（図３Ｃ）、非常に類似したパターンを発見した。異なる生物学的起源（ヒトおよびマウス）からのＩｇＧがＴｗｅｅｎ−２０凝集体に効率的に分配されるという事実は、本精製戦略が標的ＩｇＧの特定のアミノ酸配列に依存しない可能性があることを意味する。これはひいては、各治療用モノクローナル抗体のための特定の精製プロトコルを開発する必要性を回避し、したがって、標準化された精製プラットフォームが達成され得る。
【００５２】
２つの代表的な緩衝系（ＮａＯＡｃはｐＨ４．６で、ＧｌｙはｐＨ４）は、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体からｈＩｇＧおよびマウスＩｇＧを抽出する能力を実証し、一方凝集体の溶解と疎水性不純物の同時抽出を大幅に抑制した（図６Ａ〜図６Ｂ）。ｈＩｇＧの二次構造の保存を円偏光二色性（ＣＤ）で調べた（図６Ｃ）。ＣＤ分析は、精製ｈＩｇＧの二次構造に顕著な変化が生じなかったことを示している（図６Ｃ）。
【００５３】
他の緩衝系も、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体からｈＩｇＧおよびマウスＩｇＧを抽出できることが示された−図８Ａを参照。
【００５４】
本発明をさらに実施する一方で、本発明者らは、精製戦略を使用して、ハイブリドーマ無血清培地から抗体を精製することもできることを示した（図７Ａ〜７Ｄ）。
【００５５】
本発明者らの抗体は、精製後も活性を維持した（図９Ａ〜９Ｂを参照）。
【００５６】
さらに、本発明者らは、精製プロトコルが単量体抗体（ＩｇＧ）だけでなく、五量体抗体（ＩｇＭ）にも有効であることを示した−図１０Ａ〜１０Ｂを参照。
【００５７】
ここで紹介する精製戦略には、いくつかの固有の利点がある。（Ａ）原材料コストの削減。（Ｂ）特定のリガンドが関与していないため、リガンド変性による精製収率の低下は無関係である。（Ｃ）アフィニティカラムの限られた容量（現在３０ｇ／Ｌ）は、カラムとアフィニティ樹脂の使用に依存していないため、現在の技術には適用できない。（Ｄ）スピード−現在使用されている大規模な抗体精製プロセスは１〜２日を要す。１つ（または２つ）のクロマトグラフィーステップを削除すると、全体の精製時間が大幅に短縮され、それによって生産効率が大幅に短縮される可能性がある。
【００５８】
したがって、本発明の第１の態様によれば、抗体を単離する方法が提供され、この方法は以下を含む：
（ａ）疎水性キレート剤、非イオン性界面活性剤および金属イオンを含む凝集体を生成するために、疎水性キレート剤、非イオン性界面活性剤および金属イオンを接触させるステップ、および
（ｂ）凝集体への抗体の分配を可能にする条件下で、凝集体を、抗体を含む培地と接触させ、それにより抗体を単離するステップ。
【００５９】
本発明で使用される「抗体」という用語は、抗原のエピトープへの結合ができる、無傷の分子およびその機能的断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖなど、またはＶＨおよびＶＬなどの単一ドメイン分子）を含む。
【００６０】
本発明によって企図される適切な抗体断片には、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）（本明細書では「軽鎖」と呼ばれる）、免疫グロブリン重鎖の相補性決定領域（本明細書では「重鎖」と呼ばれる）、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Ｆｄ断片、およびＦｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２などの軽鎖と重鎖の両方の本質的に完全な可変領域を含む抗体断片を含む。
【００６１】
本明細書で使用される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域内に見られる抗原結合領域を指すために互換的に使用される。一般に、抗体は、ＶＨのそれぞれに３つのＣＤＲ（ＣＤＲ  ＨＩまたはＨＩ；ＣＤＲ  Ｈ２またはＨ２；およびＣＤＲ  Ｈ３またはＨ３）とＶＬのそれぞれに３つ（ＣＤＲ  ＬＩまたはＬＩ；ＣＤＲ  Ｌ２またはＬ２；およびＣＤＲ  Ｌ３またはＬ３）を含む。
【００６２】
可変領域またはＣＤＲを構成する特定の抗体のアミノ酸残基の同一性は、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができ、Ｋａｂａｔらによって定義された配列可変性（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  ＮＩＨ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．を参照）、Ｃｈｏｔｈｉａらによって定義された構造ループ領域の位置（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３，  １９８９を参照）、オックスフォード・モレキュラーのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在のＡｃｃｅｌｒｙｓ（商標）、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８６：９２６８；およびｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅ  ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｂｉｏｉｎｆ−ｏｒｇ（ｄｏｔ）ｕｋ／ａｂｓ参照）、コンタクト定義で定義された利用可能な複雑な結晶構造（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２６２：７３２−７４５  １９９６参照）、および「立体配座の定義」（例えば、Ｍａｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２８３：１１５６−１１６６，  ２００８を参照）などの方法を含むことができる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「可変領域」および「ＣＤＲ」は、アプローチの組み合わせを含む、当技術分野で公知の任意のアプローチによって定義される可変領域およびＣＤＲを指し得る。
【００６４】
軽鎖と重鎖の両方の完全可変領域または本質的に完全可変領域を含む機能的抗体断片は、以下のように定義される；
（ｉ）Ｆｖ、２本の鎖として表される軽鎖の可変領域（ＶＬ）と重鎖の可変領域（ＶＨ）からなる遺伝子操作された断片として定義される；
（ｉｉ）単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された単鎖分子であり、遺伝子融合単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結されている。
【００６５】
（ｉｉｉ）ジスルフィド安定化Ｆｖ（「ｄｓＦｖ」）、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された抗体、遺伝子操作されたジスルフィド結合によって連結された。
【００６６】
（ｉｖ）Ｆａｂ、抗体全体を酵素パパインで処理して、無傷の軽鎖と、可変およびそのＣＨ１ドメインからなる重鎖のＦｄ断片を生成することにより得られる抗体分子の一価抗原結合部分を含む抗体分子の断片；
（ｖ）Ｆａｂ’抗体全体を酵素ペプシンで処理し、その後還元することにより取得できる抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片（抗体分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる）；
（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２、抗体全体を酵素ペプシンで処理することにより得られる抗体分子の一価抗原結合部分を含む抗体分子の断片（すなわち、２つのジスルフィド結合により一緒に保持されたＦａｂ’断片の二量体）；および
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体またはナノボディは、抗原に対して十分な親和性を示す単一のＶＨまたはＶＬドメインで構成されている。
【００６７】
一実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。
【００６８】
別の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００６９】
なおさらなる実施形態では、抗体は組換え抗体である。
【００７０】
さらなる実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【００７１】
なおさらなる実施形態において、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）である。
【００７２】
さらなる態様において、抗体はＩｇＭである。
【００７３】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにその断片を産生する方法は当技術分野で周知である（例えば，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７４】
本発明のいくつかの実施形態による抗体断片は、抗体のタンパク質分解加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡの大腸菌または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）における発現によって、調製することができる。抗体断片は、従来の方法による抗体全体のペプシンまたはパパインの消化によって取得できる。例えば、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓ断片を提供するペプシンを伴う抗体の酵素的な切断によって生成することができる。この断片は、チオール還元剤、および任意でジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のブロック基を使用してさらに切断し、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を生成することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素による切断から、２つの一価Ｆａｂ’断片とＦｃ断片が直接生成される。
【００７５】
これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号明細書および第４，３３１，６４７号明細書、およびそれに含まれる参考文献に記載されている。これらの特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｐｏｒｔｅｒ、Ｒ．Ｒ．［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９−１２６（１９５９）］も参照されたい。断片が無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、重鎖を分離して一価の軽・重鎖断片を形成するなどの、抗体を切断する他の方法、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、または遺伝的手法を使用してもよい。
【００７６】
Ｆｖ断片は、ＶＨおよびＶＬ鎖の結合を含む。Ｉｎｂａｒらの［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−６２（１９７２０］）に記載されているように、この結合は非共有結合であってよい。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって結合されるか、グルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋され得る。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーにより接続されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、続いて大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを伴う単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成する方法は、例えば、［Ｗｈｉｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｆｉｌｐｕｌａ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９７−１０５  （１９９１）；  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６  （１９８８）；  Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７  （１９９３）；および米国特許第４，９４６，７７８号明細書に記載されている。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７７】
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより取得できる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ  ［Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２：１０６−１０  （１９９１）］を参照されたい。
【００７８】
非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列など）のキメラ分子である。
【００７９】
ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）形成の残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲから得る残基に置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。
【００８０】
ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを最適に含む［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２９  （１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，  ２：５９３−５９６  （１９９２）］。
【００８１】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体には、非ヒト由来のソースから１つ以上のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、インポート残基と呼ばれ、通常、インポート可変ドメインから取得される。Ｗｉｎｔｅｒと同僚の方法に従って、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列に置き換えることにより、ヒト化を本質的に実行することができる［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）］。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類の抗体の類似部位から得る残基で置換されているヒト抗体である。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２２７：３８１  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１  （１９９１）］を含む当技術分野で知られている様々な技術を使用して製造することもできる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用できる（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。
【００８２】
同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されたマウスに導入することにより作成できる。挑んでみると、ヒト抗体の産生が観察される。これは、遺伝子再構成、アセンブリ、抗体レパートリーなど、ヒトに見られるものとあらゆる点でよく似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；第５，５４５，８０６号明細書；第５，５６９，８２５号明細書；第５，６２５，１２６号明細書；第５，６３３，４２５号明細書；第５，６６１，０１６号明細書、および以下の科学出版物：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，：７７９−７８３  （１９９２）；  Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９  （１９９４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３  （１９９４）；  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８４５−５１  （１９９６）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６  （１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，  ６５−９３  （１９９５）に記載されている。
【００８３】
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、ペリプラズム空間で産生されるか、培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、最初のステップとして、宿主細胞または溶解細胞のいずれかの粒子状の破片を、例えば遠心分離または限外ろ過により除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現システムからの上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（商標）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）限外ろ過ユニットを使用して最初に濃縮できる。
【００８４】
細胞の溶解は、機械的せん断、浸透圧ショック、または酵素処理など、様々な方法で実行できる。そのような破壊は、細胞の内容物全体をホモジネートに放出し、さらに、サイズが小さいために除去が困難な細胞内断片を生成する。これらは通常、分画遠心法またはろ過によって除去される。抗体が分泌される場合、そのような発現システムからの上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（商標）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）限外ろ過ユニットを使用して最初に濃縮される。抗体が培地に分泌される場合、組換え宿主細胞は、例えば接線流ろ過によって、細胞培養培地から単離することもできる。
【００８５】
本明細書で使用される「細胞溶解物」という用語は、抗体を含む細胞生物学的材料の水溶液を指し、細胞のかなりの部分の細胞性物質が破壊され、その内部成分が放出される。
【００８６】
一実施形態では、細胞溶解物は全細胞から調製される。
【００８７】
全細胞溶解物の場合、細胞膜の破壊に続いて、細胞溶解物を処理して、約２ミクロンを超える細胞小器官（例えば細胞核）を除去できることが理解されよう。したがって、例えば、細胞溶解物から細胞核を沈殿させるために、細胞溶解物全体を遠心分離してもよい。例示的な遠心分離条件には、５００〜１０００ｘｇで１〜５分（例えば９８５ｘｇで２分）が含まれる。
【００８８】
細胞溶解物は、抗体を発現する任意の細胞から調製され得る。細胞は、真核生物（例えば、哺乳類、植物、真菌）または原核生物（細菌）であり得る。
【００８９】
一実施形態では、細胞は抗体をその細胞質に分泌する。
【００９０】
細胞は、抗体を発現するように遺伝的に改変されていてもよい。別の実施形態では、細胞は遺伝子改変されていない。
【００９１】
意図される例示的な細胞には、グラム陰性菌細胞、例えば大腸菌；グラム陽性菌細胞、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｚｅａｅ／ｃａｓｅｉまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）；酵母細胞、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ；糸状菌、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；昆虫細胞；哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および植物細胞を含むがこれらに限定されない。
【００９２】
一実施形態では、細胞は不死化されており、細胞株の一部、例えばハイブリドーマである。上述のように、本発明のこの態様の単離方法は、抗体を含む培地を非イオン性界面活性剤、疎水性キレート剤および金属イオンの凝集体と接触させることにより実施される。
【００９３】
抗体産生細胞を培養するための細胞培地の例には、ハイブリドーマ培地、例えば無血清ハイブリドーマ培地が含まれる。このような培地は、Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの企業から簡単に入手できる。
【００９４】
一実施形態では、培地は、ウマ血清アルブミン（ＨＡＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミンを含む。
【００９５】
好ましくは、血清アルブミンは、０．５ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で、例えば０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌの間で存在する。
【００９６】
このステップの前に、任意選択で培地を清澄化することができる。
【００９７】
本明細書で使用する用語「清澄化された」は、宿主細胞および／または細胞の残骸を除去するための遠心分離、精密ろ過および深層ろ過の１つまたは複数を含む固液分離工程を経たサンプル（すなわち細胞懸濁液）を指す。清澄化された発酵ブロスは、細胞培養上清であり得る。清澄化は、一次または初期回復ステップと呼ばれることもあり、通常はクロマトグラフィーまたは同様のステップの前に行われる。
【００９８】
「非イオン性界面活性剤」という用語は、非荷電の親水性頭部を含む界面活性剤を指す。一部の非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンまたはグリコシドに基づいている。前者の一般的な例には、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、およびＢｒｉｊシリーズが含まれる。これらの材料は、エトキシレートまたはＰＥＧｌｙａｔｅｓおよびその代謝物、ノニルフェノールとしても知られている。グリコシドは、非荷電親水性頭部として糖を持っている。例には、オクチルチオグルコシドおよびマルトシドが含まれる。ＨＥＧＡおよびＭＥＧＡシリーズの界面活性剤は似ており、頭部として糖アルコールを有している。
【００９９】
特定の実施形態によれば、非イオン性界面活性剤はポリソルベート界面活性剤である。そのような例には、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
一実施形態では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０である。
【０１０１】
本発明によって企図される他の例示的な非イオン性界面活性剤には、プルロニックファミリーに属するもの、例えばＦ−６８およびＦ−１２７が含まれる。
【０１０２】
本明細書で使用する「キレート剤」という用語は、多座配位子と単一の中心原子との間の２つ以上の別個の配位結合の形成または存在により、溶液から金属イオンを結合する化合物を指す。本発明のこの態様のキレート剤は、単離に使用される金属イオンをキレート化することができる。好ましくは、キレート剤は、金属イオンに静電的に結合（非共有結合）する。特定の実施形態によれば、キレート剤は、キレート剤と金属の比２：１以上で金属イオンをキレート化することができる。
【０１０３】
キレート剤の疎水性は、非イオン性界面活性剤の凝集体に分配できるほどのものである。一実施形態では、キレート剤は、非イオン性界面活性剤の凝集体に埋め込むことができる。
【０１０４】
一実施形態では、疎水性キレート剤は、少なくとも８個の炭素を（例えば、鎖または環の中に）含み、荷電基を含まない。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、疎水性キレート剤は８−ヒドロキシキノリンまたはその誘導体である。８−ヒドロキシキノリンの例示的な誘導体には、２−メチル−８−ヒドロキシキノリン（ＣＨ３−ＨＱ）、５，７−ジクロロ−２−メチル−８−ヒドロキシキノリン（Ｃｌ２−ＣＨ３−ＨＱ）、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン（Ｂｒ２−ＨＱ）、５−スルホ−７−ヨード−８−ヒドロキシキノリン（フェロン）および５−スルホ−８−ヒドロキシキノリン（ＳＯ３Ｈ−ＨＱ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、疎水性キレート剤はフェナントロリン、例えば１，１０−フェナントロリンを含む。親水性置換基で置換されていない他のフェナノトロリンも考えられる。
【０１０７】
例示的な疎水性フェナントロリンには、バソフェナントロリンおよびＮ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）アルキルアミドが含まれるが、これらに限定されず、アルキルの長さは長さ１〜１０個の炭素原子である。例示的なＮ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）アルキルアミド）化合物には、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）メタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ１）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）エタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ２）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）プロパンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ３）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ブタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ４）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ペンタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ５）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ヘキサンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ６）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ヘプタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ７）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）オクタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ８）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ノナンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ９）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）デカンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ１０）が含まれる。
【０１０８】
いくつかのそのような実施形態において、フェナントロリンは、バソフェナントロリン、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ヘキサンアミド）（Ｐｈｅｎ−６）、Ｎ−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）デカンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ１０）、およびＮ−（１，１０−フェナントロリン−５−ｙｌ）オクタンアミド）（Ｐｈｅｎ−Ｃ８）からなる群から選択される。
【０１０９】
本明細書全体を通して、「アルキルアミド」は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒを描写し、Ｒはアルキルである。
【０１１０】
「アルキル」という用語は、直鎖および分岐鎖の基を含む飽和脂肪族炭化水素を表す。好ましくは、アルキル基は１〜２０個の炭素原子の長さである。「１〜２０」などの数値範囲が本明細書で述べられているときはいつも、アルキル基の場合、基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子、２０個までの炭素原子などを含み得ることを意味する。より好ましくは、アルキルは、１〜１０個の炭素原子を有する中程度の大きさのアルキルである。アルキル基は置換または非置換であってもよい。置換されているアルキルは１つ以上の置換基を有してもよく、それにより、各置換基は独立して、例えば、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびヘテロアリールであり得る。追加の置換基には、キレート剤の機能性が維持されている限り、例えば、ヒドロキシアルキル、トリハロアルキル、ヘテロ脂環式、アミン、ハライド、スルホネート、スルホキシド、ホスホネート、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ニトロ、アゾ、スルホンアミド、Ｃ−カルボキシレート、Ｏ−カルボキシレート、Ｎ−チオカルバメート、Ｏ−チオカルバメート、尿素、チオ尿素、Ｎ−カルバメート、Ｏ−カルバメート、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、グアニル、グアニジンおよびヒドラジンを有し得る。
【０１１１】
一部の実施形態では、フェナントロリンは、Ｐｈｅｎ−Ｃ１０またはＰｈｅｎ−Ｃ８である。
【０１１２】
疎水性キレート剤の追加の例には、酸性有機リンキレート剤、例えばＤＥＨＰＡ、ＥＨＥＨＰＡおよびＤＴＭＰＰＡ；中性有機リンキレート剤、例えばＴＢＰおよびトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）、二官能性有機リンキレート剤、例えばＣＭＰＯおよびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラオクチル−３−オキサメンタンジアミド（ＴＯＧＤＡ）；塩基性キレート剤、例えばトリ−ｎ−オクチルアミン（ＴＯＡ）および塩化トリカプリルメチルアンモニウムが含まれる。ヒドロキシオキシム、例えば５，８−ジエチル−７−ヒドロキシ−６−ドデカンオキシムおよび２−ヒドロキシ−５−ノニルアセトフェノンオキシム、クラウンエーテル、例えばジ−ｔ−ブチル−ジシクロヘキサノ−１８−クラウン−６、およびジチオセミカルバゾンを含む、当業者に知られている他のキレート剤も使用することができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態によれば、疎水性キレート剤は、キレート剤２０ｍＭ溶液の約０．１％から約１０％（ｖ／ｖ）、例えば約０．５％から約１０％（ｖ／ｖ）、約１％〜約１０％（ｖ／ｖ）、例えば約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％などの範囲の濃度で水溶液中に存在する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、金属イオンは二価金属イオンである。
【０１１５】
一部の実施形態では、二価金属イオンは、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｏ２＋からなる群から選択される。好ましくは、二価金属イオンはＺｎ２＋またはＦｅ２＋である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、金属イオンは、金属イオン５０ｍＭ溶液の約０．１％から約１０％（ｖ／ｖ）、例えば約０．５％から約１０％（ｖ／ｖ）、約１％〜約１０％（ｖ／ｖ）、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％などの範囲の濃度で水溶液中に存在する。
【０１１７】
インキュベーションの条件は、金属イオン、疎水性キレート剤および非イオン性界面活性剤を含む凝集体が形成されるようなものである。
【０１１８】
したがって、例えば、凝集体の生成は、典型的には、約０℃〜約２５℃、より好ましくは約４℃  〜約２５℃の温度で実施される。本発明のこの態様の凝集体は、典型的には１０〜５００ｎＭ、１０〜２００ｎＭ、１〜１００ｍＭまたは１０〜１００ｍＭである。
【０１１９】
凝集体中の塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は、典型的には１００ｍＭ未満であり、より好ましくは５０ｍＭ未満である。一実施形態では、塩の濃度は、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、さらには５ｍＭ未満である。例示的な範囲には、２０〜１００ｍＭ、２０〜５０ｍＭ、０〜５０ｍＭ、０〜４０ｍＭ、０〜３０ｍＭ、０〜２５ｍＭ、０〜２０ｍＭが含まれる。特定の一実施形態では、塩の濃度は約２５ｍＭである。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤と疎水性キレート剤との接触は、金属イオンとの接触の前に実施される。
【０１２１】
他の実施形態では、非イオン性界面活性剤と疎水性キレート剤との接触は、金属イオンとの接触と同時に行われる。
【０１２２】
なおさらなる実施形態において、疎水性キレート剤は、最初に金属イオンと接触し、その後非イオン性界面活性剤と接触する。凝集体が形成されたら、凝集体への抗体（細胞溶解物に存在する）の分配を可能にする条件下で、それらは細胞溶解物と接触する。
【０１２３】
これが発生すると（数秒から数時間−例えば５分から１時間）、遠心分離（例えば、超遠心分離）によって複合体の沈殿が促進できるが、場合によっては（例えば、大きな複合体の場合）遠心分離が不要であるか、非常に穏やかな遠心分離を使用できる（溶液をより高密度にするために−例えば、１３Ｋの速度で１〜５分間）。
【０１２４】
沈殿後、ペレット化された複合体から抗体が放出される、すなわち可溶化される場合がある。
【０１２５】
最初に、ペレットを洗浄することができる−例えば、低塩溶液（例えば、５０ｍＭ以下、例えば、２０ｍＭのＮａＣｌ溶液）。
【０１２６】
抽出は、３〜６、より好ましくは３．８〜５のｐＨを有する緩衝液で行うことができる。一実施形態では、緩衝液はカルボン酸緩衝液であり、その例には、酢酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。酢酸ナトリウムの例示的なｐＨは約ｐＨ４．６である。
【０１２７】
別の実施形態では、緩衝液はアミノ酸を含む。一実施形態では、緩衝液は単一のアミノ酸を含む。別の実施形態では、緩衝液は少なくとも２つのアミノ酸を含む。
【０１２８】
一実施形態において、アミノ酸は、（ｉ）抗体側鎖と界面活性剤凝集体（例えばバリンまたはイソロイシン）との間の疎水性相互作用；（ｉｉ）抗体側鎖と界面活性剤凝集体（アスパラギン酸、グルタミン酸、またはアルギニンなど）との間のイオン結合および／またはＨ結合相互作用；または（ｉｉｉ）抗体側鎖と界面活性剤凝集体（例えば、ヒスチジン）との間の金属キレート化相互作用について競合できるものである。
【０１２９】
特定の実施形態では、アミノ酸緩衝液はグリシン、バリンまたはイソロイシンである。別の実施形態では、アミノ酸緩衝液はイソロイシンである。
【０１３０】
アミノ酸緩衝液の例示的なｐＨは約ｐＨ３．８またはｐＨ４である。
【０１３１】
サンプルは、抽出を促進する時間、例えば（１〜６０分）、１分、５分、１０分間加熱できる。温度は、抽出された抗体の活性に影響を与えず、界面活性剤の凝集体が溶解しないように選択される。例示的な温度は２５〜３５℃である。特定の実施形態によれば、サンプルは３２℃で５分間加熱される。
【０１３２】
放出された抗体の純度を高めるために、緩衝液に塩を加えてもよい（例えば、５〜５０ｍＭのＮａＣｌまたは１０〜２０ｍＭのＮａＣｌ間）。複合ペレットから放出される抗体の量を増やすために、本発明者らは、塩を含まない緩衝液の使用を想定している。しかし、その場合放出された抗体の純度が損なわれる可能性があることは理解されるであろう。
【０１３３】
単離され、必要に応じて可溶化される抗体の意図される用途に応じて、タンパク質（膜または細胞質ゾル）またはそれに結合する薬剤は、さらなる精製工程に供され得る。これは、当技術分野で周知の多くの生化学的方法を使用することにより達成され得る。例には、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース）での分画、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ウイルス不活化（ウイルスろ過など）および限外ろ過が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
追加の精製ステップ（およびそれらが実行され得る順序）の例を図５Ｂにまとめる。
【０１３５】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）などの正に帯電した基を含むイオン交換樹脂を使用して、電荷に基づいて物質を分離するプロセスである。溶液では、樹脂は正に帯電した対イオン（陽イオン）でコーティングされている。陰イオン交換樹脂は負に帯電した分子に結合し、対イオンを置き換える。
【０１３６】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）およびスルホン酸（Ｓ）などの負に帯電した基を含むイオン交換樹脂を使用して、電荷に基づいて物質を分離するプロセスである）。溶液では、樹脂は負に帯電した対イオン（陰イオン）でコーティングされている。陽イオン交換樹脂は、正に帯電した分子に結合し、対イオンを置き換える。
【０１３７】
本明細書で使用される「ウイルス不活化」という語句は、特定のサンプル中の外来性エンベロープウイルスの活性の低下（「不活化」）を指す。エンベロープウイルスの活性のそのような減少は、約３対数減少因子（ＬＲＦ）、好ましくは約４ＬＲＦ、より好ましくは約５ＬＲＦ、さらにより好ましくは約６ＬＲＦ程度であり得る。
【０１３８】
熱不活性化（低温殺菌）、ｐＨ不活性化、溶媒／界面活性剤処理、ＵＶおよびγ線照射、ならびにβ−プロピオラクトン、または例えば、その全教示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５３４，９７２号明細書におけるものなどの銅フェナントロリンなどの特定の化学不活化剤の添加など、ウイルス不活化の様々な方法のいずれか１つまたは複数を使用できる。
【０１３９】
ｐＨウイルス不活化の方法には、低ｐＨで一定期間混合物をインキュベートし、その後ｐＨを中和することが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、混合物は約２〜５のｐＨで、好ましくは約３〜４のｐＨで、より好ましくは約３．６のｐＨでインキュベートされる。
【０１４０】
試料混合物のｐＨは、クエン酸、酢酸、カプリル酸、または他の適切な酸を含むがこれらに限定されない任意の適切な酸によって低下し得る。ｐＨレベルの選択は、抗体製品と緩衝液成分の安定性プロファイルに大きく依存する。低ｐＨウイルス不活化中の標的抗体の質は、ｐＨおよび低ｐＨインキュベーションの期間に影響されることが知られている。特定の実施形態では、低ｐＨインキュベーションの持続時間は０．５時間から２時間、好ましくは０．５時間から１．５時間であり、より好ましくは持続時間は約１時間である。ウイルスの不活性化は、高濃度での不活性化を制限する可能性のあるタンパク質濃度に加えて、これらの同じパラメーターに依存している。
【０１４１】
したがって、タンパク質濃度、ｐＨ、および不活性化の持続時間の適切なパラメーターを選択して、ウイルス不活性化の望ましいレベルを達成できる。
【０１４２】
特定の実施形態では、ウイルスろ過が実施される。これは、適切なフィルターを使用することで実現できる。適切なフィルターの非限定的な例は、Ｐａｌｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルターである。特定の実施形態では、限定されないが、ザルトリウスフィルター、ビレソルブ（商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビレリカ）；Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＶＲ（商標）フィルター（ＣＵＮＯ；メリデン、コネチカット州）；およびＰｌａｎｏｖａ（商標）フィルター（旭化成ファーマ、Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、１１１）などの代替フィルターがウイルス不活化に使用される。
【０１４３】
限外ろ過については、Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｌ．Ｚｅｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｚｙｄｎｅｙ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９９６）；およびＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｍｕｎｉｒ  Ｃｈｅｒｙａｎ  （Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  １９８６；  ＩＳＢＮ  Ｎｏ．  ８７７６２−４５６−９））で詳細に説明されている。好ましいろ過プロセスは、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」  ｐｐ．１７７−２０２（マサチューセッツ州ベッドフォード、１９９５／９６）と題されたＭｉｌｌｉｐｏｒｅのカタログに記載されている接線流ろ過である。限外ろ過は、一般に、平均の大きさが（例えば）５０ｋＤａ以下のタンパク質の移動を可能にする孔径のフィルターを使用したろ過を意味すると考えられている。そのような小さな孔径を有するフィルターを使用することにより、フィルターの後ろに抗体が保持されている間、サンプル緩衝液がフィルターを透過することにより、サンプルの体積を減らすことができる。
【０１４４】
ダイアフィルトレーションは、限外ろ過を使用して、塩、糖、および非水性溶媒を除去および交換し、結合種から分離し、低分子量物質を除去し、および／またはイオンおよび／またはｐＨの環境を急速に変化させる方法である。限外ろ過の速度にほぼ等しい速度で、限外ろ過される溶液に溶媒を加えることにより、微量の溶質が最も効率的に除去される。これにより、一定量の溶液から微量種が洗浄され、保持された抗体が効果的に精製される。本発明の特定の実施形態では、ダイアフィルトレーションステップを使用して、場合によりさらなるクロマトグラフィーまたは他の精製ステップの前に、本発明に関連して使用される様々な緩衝液を交換し、また抗体から不純物を除去する。
【０１４５】
一実施形態では、単離される抗体は結晶化される。
【０１４６】
本明細書で使用される「結晶化」という用語は、その原子および頻繁に外部である平面の規則的な繰り返し内部配列を形成するための対象分子の固化を指す。
【０１４７】
目的の分子の結晶化を促進するために、当技術分野で知られているいくつかの結晶化アプローチをサンプルに適用することができる。結晶化アプローチの例には、自由界面拡散法［Ｓａｌｅｍｍｅ，  Ｆ．  Ｒ．（１９７２）  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１５１：５３３−５３９］、ハンギングドロップまたはシッティングドロップ法での蒸気拡散（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ａ．（１９８２）  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ  ８２−１２７）、および液体透析（Ｂａｉｌｅｙ，  Ｋ．（１９４０）  Ｎａｔｕｒｅ  １４５：９３４−９３５）を含むがそれらに限定されない。
【０１４８】
現在、ハンギングドロップ法は、溶液から高分子結晶を成長させるために最も一般的に使用されている方法である。このアプローチは、タンパク質結晶の生成に特に適している。通常、タンパク質溶液を含む液滴はカバースリップにスポットされ、沈殿剤の濃度がより高いリザーバーを含む密閉されたチャンバーに懸濁される。時間が経つにつれて、液滴内の溶液は、液滴から水蒸気を拡散することによりリザーバーと平衡し、それにより、液滴内のタンパク質と沈殿剤の濃度が徐々に増加し、ひいてはタンパク質の沈殿または結晶化が生じる。
【０１４９】
別の実施形態では、タンパク質は２Ｄゲル電気泳動にかけられる。
【０１５０】
抗体の精製に使用される薬剤はキットとして提供されてもよい。
【０１５１】
したがって、本発明のさらに別の態様によれば、疎水性キレート剤、金属イオン、非イオン性界面活性剤、および３〜６の間のｐＨを有する緩衝液を含むタンパク質を精製するためのキットが提供される。
【０１５２】
これらの構成要素は、本明細書で上記に説明されている。
【０１５３】
別の構成において、キットは、疎水性キレート剤、ポリソルベートサーファクタントおよび金属イオンを含んでもよい。
【０１５４】
疎水性キレート剤は、金属イオンとは別の容器に包装することが好ましい。
【０１５５】
キットはまた、プロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。
【０１５６】
プロテアーゼ阻害剤には、セリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤、およびメタロプロテアーゼ阻害剤が含まれる。
【０１５７】
一実施形態では、キットは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つのプロテアーゼ阻害剤を含む。
【０１５８】
プロテアーゼ阻害剤の例には、ＡＥＢＳＦ、ベスタチン、Ｅ−６４、ペプスタチンＡ、ホスホラミドン、ロイペプチンおよびアプロチニンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５９】
プロテアーゼ阻害剤は、個別にまたは単一の容器に（すなわち、カクテルとして）パッケージ化されてもよい。
【０１６０】
プロテアーゼ阻害剤カクテルは、例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。
【０１６１】
好ましくは、本発明のこの態様のキットの容器はラベルを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。
【０１６２】
加えて、安定剤、緩衝液、遮断剤などの他の添加剤も加えてもよい。
【０１６３】
この出願から満了する特許の存続期間中に、多くの関連する疎水性キレート剤が開発されることが予想される。疎水性キレート剤という用語の範囲は、すべてのそのような新技術を先験的に含むことが意図される。
【０１６４】
本明細書で使用される「約」という用語は、±１０％を指す。
【０１６５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの結合は、「含むが限定されない」ことを意味する。
【０１６６】
「からなる」という用語は、「含んで限定される」ことを意味する。
【０１６７】
「から本質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、ステップおよび／または部品を含むことができるが、追加の成分、ステップおよび／または部品がクレームされる組成物、方法、または構造の基本的および新規の特性を実質的に変更しない場合のみを含み得ることを意味する。
【０１６８】
本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【０１６９】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの副次的な範囲およびその範囲内の個々の番号、例えば１、２、３、４、５、６を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０１７０】
本明細書で使用される「方法」という用語は、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の実務家により公知であるか、公知の様式、方法、手段、技術および処置から容易に開発される様式、手段、技術、および手順を含むがこれらに限定されない、所与のタスクを達成するための様式、手段、技術、および手順を指す。
【０１７１】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴は、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションで、または本発明の他の説明された実施形態で適切に提供されてもよい。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしで動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
【０１７２】
本明細書の上記で詳述され、以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例で実験的裏付けを見出す。
【実施例】
【０１７３】
ここで、以下の実施例を参照するが、これらの実施例は、上記の説明とともに、本発明のいくつかの実施形態を非限定的な方法で説明するものである。
【０１７４】
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験室手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献で徹底的に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）；  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．，  ｅｄ．（１９９４）；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；  Ｐｅｒｂａｌ，  “Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；  Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）  “Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，  Ｖｏｌｓ．１−４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；第４，６８３，２０２号明細書；第４，８０１，５３１号明細書；第５，１９２，６５９号明細書および第５，２７２，０５７号明細書；  “Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．，  ｅｄ．（１９９４）；  “Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”  ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎ．Ｙ．（１９９４），  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，  ｅｄ．（１９９４）；  Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），  “Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４）；  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  “Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）にて記載されている方法論を参照されたい；米国特許第３，７９１，９３２号明細書；第３，８３９，１５３号明細書；第３，８５０，７５２号明細書；第３，８５０，５７８号明細書；第３，８５３，９８７号明細書；第３，８６７，５１７号明細書；第３，８７９，２６２号明細書；第３，９０１，６５４号明細書；第３，９３５，０７４号明細書；第３，９８４，５３３号明細書；第３，９９６，３４５号明細書；第４，０３４，０７４号明細書；第４，０９８，８７６号明細書；第４，８７９，２１９号��細書；第５，０１１，７７１号明細書、および第５，２８１，５２１号明細書；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｇａｉｔ，  Ｍ．Ｊ．，  ｅｄ．（１９８４）；  “Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，  ｅｄｓ．（１９８５）；  “Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，  ｅｄｓ．（１９８４）；  “Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．，  ｅｄ．（１９８６）；  “Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）；  “Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，  （１９８４）  ａｎｄ  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌ．１−３１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  “ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）；  Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）などの特許および科学文献に利用可能なイムノアッセイが広範囲に記載されており、参照されたい；これらはすべて、ここに完全に記載されているかのように参照により組み込まれている。他の一般的な参考文献は、この文書全体で提示されている。その中の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。ここに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０１７５】
材料および方法
材料：Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート２０）、マウスＩｇＧ、バソフェナトロリン、ＮａＣｌ、ＦｅＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＮｉＢｒ２はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手した。ヒトＩｇＧは、米国ミズーリ州セントルイスのＬｅｅＢｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ製であった。
【０１７６】
Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体の調製：Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体は、等量の培地ＡとＢを混合することで得られた：培地Ａは、１０μＬの疎水性キレート剤バソフェナントロリン（メタノール中２０ｍＭ）を、９０μＬの０．２５ｍＭのＴｗｅｅｎ−２０に加え、激しくボルテックスしながら、最終的な体積を１００μＬにすることにより調製した。次に、激しくボルテックスしながら、２０ｍＭのＮａＣｌ中の１ｍＭのＦｅＳＯ４から構成される等体積の培地Ｂを、培地Ａに加えた。
【０１７７】
Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体によるｈＩｇＧおよびマウスＩｇＧの精製：大腸菌溶解物（５μＬ）および標的ＩｇＧ（５μＬ）を含む混合物を、事前に形成されたＴｗｅｅｎ−２０凝集体に加え、室温（または４℃）で５分間インキュベートした。遠心分離（１３Ｋ、２分間）を適用し、上清を廃棄し、ペレットを１００μＬの冷２０ｍＭのＮａＣｌで簡単に洗浄した。ペレットをサンプル緩衝液の存在下で溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１７８】
Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体からのＩｇＧの抽出：標的ＩｇＧを含むＴｗｅｅｎ−２０ペレットを記載のように生成し、さらに５０μＬの、５０ｍＭのＮａＯＡ（ｐＨ４．６）／２０ｍＭのＮａＣｌまたは５０ｍＭのＧｌｙ（ｐＨ４）／２０ｍＭのＮａＣｌのいずれかとインキュベートした。５〜１０分後、室温（または４℃）でサンプルを中和し、ゲルに充填するか、ＣＤで分析した。
【０１７９】
光学顕微鏡検査：画像は、オリンパスＵ−ＴＶ１Ｘ−２デジタルカメラを備えたオリンパスＣＸ−４０光学顕微鏡を使用して得られた。
【０１８０】
クライオＴＥＭ分析：クライオＴＥＭのサンプル（１０μｌ）は、制御された環境のガラス化システム（ＣＥＶＳ）で調製し、２５℃および飽和状態で平衡化した。ガラス化した試料は、１２０ｋＶで動作するＦＥＩ  Ｔ１２  Ｇ２  ＴＥＭで検査された。前述のように、低線量条件下で画像を記録した。［２７、２８］クライオＴＥＭ画像の測定は、ＩｍａｇｅＪ（ｉｍａｇｅｊ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ）ソフトウェアを使用してなされた。
【０１８１】
円偏光二色性（ＣＤ）分光法：上記のようにＴｗｅｅｎ−２０凝集体から抽出された抗体を、Ｃｈｉｒａｓｃａｎ  ＣＤ分光計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）を使用してＣＤ分析にかけた。ＣＤスペクトルは、波長の関数として左右の円偏光［θ＝３３００°（ＡＬ−ＡＲ）２０］の吸光度の差に比例する楕円率θを報告する。クォーツ１×１ｃｍというパスの長さのキュベットを使用した。ＣＤスペクトルは、２０℃で、１ｎｍのステップで、１ｎｍの帯域幅分解能で記録された。ＣＤスペクトルは、対応する緩衝液の参照スペクトルを差し引くことでベースラインの歪みを補正した。
【０１８２】
デンシトメトリー：クーマシー染色ゲルに存在するバンドは、ＥＺＱｕａｎｔプログラムを使用して定量化した。
結果
【０１８３】
Ｔｗｅｅｎ−２０ミセルの結合：Ｔｗｅｅｎ−２０ミセルを含む水溶液への疎水性キレート剤：バソフェナントロリンの添加に続いて、水相のメディエーターとして機能するＦｅ２＋イオンを加えた。室温で数分間インキュベートした後、赤い粒状沈殿物の形で相分離が観察された（図２Ａ）。Ｆｅ２＋の非存在下での対照実験は、細長い微結晶をもたらした−おそらく疎水性キレート剤：バソフェナントロリンで構成されていた（図２Ｂ）。キレート剤のみ、またはキレート剤と金属の両方の非存在下での追加の対照は、いずれの相分離をも誘発しなかった（つまり、示されていないが、下降は明確である）。結果の赤い凝集体をクライオＴＥＭで分析すると、界面活性剤と金属（図２Ｃの暗いスポット）が不規則な形状とサイズの濃縮された凝集体を生成することが示された（図２Ｃ）が、対照実験では、［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］疎水性複合体がなく、ミセルは均一に分布し、相分離は観察されなかった（図２Ｄ）。
【０１８４】
プロセスの特異度と低イオン強度への依存：結合したＴｗｅｅｎ−２０ミセル（すなわち、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体）とのｈＩｇＧの短いインキュベーション（５分）、その後の短い遠心分離ステップ（１３Ｋ、２分）により、凝縮した赤いペレットに至り、効率的な上清除去を可能にする。ペレットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ペレットには重鎖と軽鎖が減少していることが示された（図３Ａ、レーン３）。さらに、システム内に存在していた不純物の大部分（デンシトメトリーで＞８５％）は、ペレットにない（図３Ａのレーン１と３を比較されたい）。キレート剤のみまたは金属のみの非存在下での対照実験では、還元された重鎖および軽鎖の量が大幅に減少した（それぞれ図３Ａ、レーン４〜５）。タンパク質を含まないＴｗｅｅｎ−２０凝集体（不純物またはＩｇＧ）もクーマシーで染色され（図３Ａ、レーン６）、レーン３のゲルの前面で観察されたバンドに移動した（アスタリスクを参照）。
【０１８５】
イオン強度の効果を図３Ｂに示す。比較的低い塩濃度（例えば、２０ｍＭのＮａＣｌ）では、ｈＩｇＧの捕捉が効率的である（図３Ｂ、レーン３〜４）が、高い塩濃度（５０〜５００ｍＭ）では、プロセス効率は次第に抑制される（図３Ｂ、レーン５〜８）ことがわかった。イオン強度の増加に伴う重鎖と軽鎖の両方の減少は、界面活性剤凝集体を表すバンドにも適用されることがわかった（図３Ｂ、レーン４〜８）。標的ＩｇＧがマウス由来の場合も、同様の結果と一般的な強度の傾向が観察された（図３Ｃ）。
【０１８６】
他の金属および疎水性キレート剤への適用性：３つのバソフェナントロリン部分を並行して結合することが知られている２つの追加イオン（つまりＺｎ２＋およびＮｉ２＋）も同様に研究された。Ｚｎ２＋で得られた結果はＦｅ２＋で得られた結果と非常に似ていたが、Ｎｉ２＋イオンはＦｅ２＋またはＺｎ２＋に比べて収率が低くなった（図４Ａ、レーン３〜５）。キレート剤の疎水性部分の変化は、深遠な効果を持つことがわかった。市販のバソフェナントロリン（図４Ｃ）で、２つのフェニル基の代わりに６、８または１０の炭素鎖を含む３つの合成１，１０−フェナントロリン類似体を使用することは、プロセスの収率が劇的に低下することを示している（図４Ｂ、レーン３〜６）。
【０１８７】
Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体からのｈＩｇＧおよびマウスＩｇＧの抽出；ＣＤ分析：２つの異なる緩衝系：５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．６）または５０ｍＭのＧｌｙ（ｐＨ４）を使用して、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体から標的ｈＩｇＧ（またはマウスＩｇＧ）を抽出した。ＮａＣｌの存在は、抽出効率に大きく影響することがわかった。ＮａＣｌが存在しない場合、上清には抗体と界面活性剤の凝集体が含まれ、両方の緩衝液が検証された（図６Ａ、レーン３および６）。しかし、１０〜２０ｍＭのＮａＣｌの添加は、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体の水溶性を大幅に抑制し、同時に、抗体の濃度を低下させた（図６Ａ、レーン４〜５および７〜８）。デンシトメトリー測定により、ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．６）またはＧｌｙ（ｐＨ４）を使用した場合のプロセスの全体的な収率（すなわち分配および抽出）は、それぞれ約４２〜４６％と約４０〜４６％の範囲で、凝集体の溶解は最小であった（示さず）。
【０１８８】
マウスＩｇＧの一般的な傾向は類似していた（図６Ｂ）。ここでも、ＮａＣｌの存在はＴｗｅｅｎ−２０凝集体の水溶性を抑制したが、抽出収率はｈＩｇＧで得られたものよりも低く、ＮａＯＡｃ緩衝液で２８〜１５％、Ｇｌｙ緩衝液で２２〜１３％の範囲であった（図６Ｂ）。
【０１８９】
Ｔｗｅｅｎ−２０凝集プロセスにかけられたｈＩｇＧから得られたＣＤスペクトルは、精製された抗体の二次構造に有意な変化を示していない（図６Ｃ）。
考察
【０１９０】
この研究では、一般的に使用されるＰｒｏＡカラムの代替として、共役Ｔｗｅｅｎ−２０ミセルでＩｇＧを精製する可能性を探る。実験結果は、非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート２０）で構成されるミセルが、疎水性の［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］赤色複合体の存在下で特異的に結合し、顆粒状赤色沈殿物をもたらせることを示している（図２Ａ）。ミセル共役は、金属（図２Ｂ）もキレート剤（図示せず）も存在しない場合には発生しないため、非常に特異的であることがわかった。Ｆｅ２＋の非存在下では、疎水性キレート剤の結晶が観察される（図２Ｂ）。クライオＴＥＭによる赤色の凝集体の分析は［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］複合体が様々な凝集形態をもたらすことを示しているが、その一部はサイズが１００ｎｍ（図２Ｃ）に達し、複合体の非存在下ではミセルの分散は単分散のように見える（図２Ｄ）。これらの結果は、［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］複合体のミセルクラスタリングを誘発する能力の直接的な証拠を提供する。
【０１９１】
ＩｇＧの精製を実証するために、大腸菌溶解物中の標的ＩｇＧの混合物（人工汚染バックグラウンドとして機能した）を、事前に形成されたＴｗｅｅｎ−２０凝集体に加えた。５分のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上清に存在する不純物を廃棄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペレットの分析により、還元された重鎖と軽鎖の存在が明らかになった（図３Ａ、レーン３）。これは、複合的な混合物からｈＩｇＧを捕捉するＴｗｅｅｎ−２０凝集体の能力の最初の指標であった。さらに、システム（図３Ａ、レーン１）に存在する不純物の大部分はペレット（図３Ａ、レーン３）に存在せず、ＩｇＧ以外の水溶性タンパク質（平均してＩｇＧよりも極性が高い）は、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体とは結合しないが、抗体分子は結合するという仮説と一致した。
【０１９２】
キレート剤と金属へのプロセスの依存性は、図３Ａのレーン４と５に示されている。キレート剤のみがない場合、重鎖と軽鎖に対応するバンドの強度は劇的に減少する（図３Ａ、レーン４）。同様の結果は、金属のみが存在しない場合にも観察された（図３Ａ、レーン５）。両方の発見は、金属またはキレート剤が存在しない場合、ｈＩｇＧが自然に分配される界面活性剤凝集体が生成されないことを示唆しており、プロセス効率の劇的な低下を説明している（図３Ａ、レーン４〜５）。予想外のバンドがレーン３のゲルの前面に現れた（図３Ａ、レーン３のアスタリスクを参照）。このバンドはペレットに由来するように見えたが、大腸菌溶解物（図３Ａ、レーン１）または標的ｈＩｇＧ（図３Ａ、レーン２）には現れない。したがって、タンパク質を含まないＴｗｅｅｎ−２０凝集体がゲルに充填されるまで、その同一性は不明であった（図３Ａ、レーン６）。これらの凝集体は、クーマシー色素で染色され、レーン３で観察されたバンドのように移動することがわかった。これらすべての結果は、非ＩｇＧタンパク質の大部分が上清に残っているあいだの、［（バソフェナントロリン）３：Ｆｅ２＋］複合体の必須要件と、ＩｇＧを捕捉するＴｗｅｅｎ−２０凝集体の能力を示している。
【０１９３】
プロセスの最適化中に、イオン強度が収率に劇的な影響を与えることが明らかになった。低イオン強度（０〜２０ｍＭ）ではプロセスは非常に効率的であった（図３Ｂ、レーン４）が、塩濃度が高くなるとプロセスは次第に非効率になった（図３Ｂ、レーン５〜８）。
【０１９４】
この傾向は、塩濃度の関数としての重鎖（または軽鎖）に対応するバンドの強度を比較すると明確に見られる（図３Ｂ、レーン４〜８）。この現象は、様々な塩濃度での界面活性剤凝集体の挙動を分析することで説明できる。Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体は、２０ｍＭのＮａＣｌを添加すると最小の水溶性になり（図３Ｂ、レーン４）、５００ｍＭのＮａＣｌが存在していると最大の水溶性になる（図３Ｂ、レーン８）。この挙動は、低および高イオン強度でそれぞれ高および低ｈＩｇＧ回収率が得られる理由を説明できる。したがって、プロセスの有効性（すなわち、ｈＩｇＧ捕捉の収率）とＴｗｅｅｎ−２０凝集体の水溶性との間の単純な相関関係が見つかった。
【０１９５】
プロセスの潜在的な一般性を実証するために、本発明者らは、ポリクローナルマウスＩｇＧによるＩｇＧ分配挙動の依存性も研究し（図３Ｃ）、非常に類似したパターンを発見した。異なる生物学的起源（ヒトおよびマウス）からのＩｇＧがＴｗｅｅｎ−２０凝集体に効率的に分配されるという事実は、当精製戦略が標的ＩｇＧの特定のアミノ酸配列に依存しない可能性があることを意味する。これはひいては、各治療用モノクローナル抗体のための特定の精製プロトコルを開発する必要性を回避し、したがって、標準化された精製プラットフォームが達成され得る。Ｆｅ２＋イオンをＺｎ２＋に置換すると、純度と収率に関して同様の結果が得られた（図４Ａ、レーン４）。一方、Ｎｉ２＋イオンの使用は効率が低いようであった（図４Ａ、レーン５）。Ｚｎ２＋イオンがＦｅ２＋によって得られる結果と同様の結果を生成するという事実は、可能性のある成分の範囲を広げるので有望である。ただし、市販のキレート剤：バソフェナントロリンを、６、８、および１０の炭素テールを含む３つの合成１，１０−フェナントロリンアナログのＰｈｅｎ−Ｃ１０、Ｐｈｅｎ−Ｃ８、およびＰｈｅｎ−Ｃ６（図４Ｃ）のいずれかと交換すると、長いアルキルのテールに対するバソフェナントロリンの２つのフェニル基の利点が強調された。
【０１９６】
デンシトメトリー測定により、ｈＩｇＧまたはマウスＩｇＧのＴｗｅｅｎ−２０凝集体への分配収率（理想的な塩条件下）が本質的に定量的（約９５％）であることが示されているため、このような凝集体は治療グレードのｍＡｂの大規模なダウンストリーム処理で概して使用されるＰｒｏＡカラムの可変代替物を提供し得る（図５Ａ）と論じることができる。実際にＰｒｏＡカラムを式から削除してＴｗｅｅｎ−２０凝集体に置き換えることができる場合（図５Ｂ）、ＩｇＧが凝集体に分配された後、不純物の大部分を含む上清が除去され、ペレットが溶解でき、次いで標的ｍＡｂが最終仕上げステップとして、一般的に使用される２つのイオン交換体にさらされる（図５Ｂ）。
【０１９７】
明らかに、３つの従来のクロマトグラフィーステップの１つ（つまり、ＰｒｏＡカラム）を除去すると、ｍＡｂの生成が促進され、したがって精製プロセス全体の費用対効果が向上すると予想される。この理論的根拠に続いて、本発明者らは、生産効率をさらに高めるので、３つのうちの２つのクロマトグラフィーステップ、すなわちイオン交換の１つを同様に除去することが可能かどうかを検討した。そのような目的は、図３Ａ〜図３Ｃおよび４Ａ〜図４Ｃに提示されているものよりも大幅に高い純度のＩｇＧ製剤を生成できる場合にのみ考慮することができる。したがって、本発明者らは、界面活性剤凝集体の溶解および／または凝集体中に存在する可能性のある疎水性実体の抽出を並行して抑制する一方で、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体に埋め込まれたＩｇＧを新鮮な緩衝液に抽出する可能性を評価した。
【０１９８】
２つの緩衝系（ＮａＯＡｃはｐＨ４．６で、ＧｌｙはｐＨ４）は、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体からｈＩｇＧおよびマウスＩｇＧを抽出する能力を実証し、一方凝集体の溶解と疎水性不純物の同時抽出を大幅に抑制した（図６Ａ〜図６Ｂ）。Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体の水溶性に対するＮａＣｌ濃度の劇的な効果が再び観察された。ｈＩｇＧを含むペレットを、ＮａＣｌを加えずに５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．６）とインキュベートした場合、上清には比較的純粋なＩｇＧが含まれていたが、溶解したＴｗｅｅｎ−２０凝集体もかなり含まれていた（図６Ａ、レーン３）。１０ｍＭのＮａＣｌの添加により、界面活性剤凝集体の溶解性が大幅に抑制されたが、同時に上清中のｈＩｇＧの濃度が減少した（図６Ａ、レーン４）。塩をさらに添加すると、界面活性剤の溶解が完全になくなるように見えたが、ｈＩｇＧの回収率は低くなった（図６Ａ、レーン５）。緩衝系がＧｌｙ（ｐＨ４）で構成されている場合、回収率の向上が観察された（図６Ａ、レーン８）。
【０１９９】
デンシトメトリー測定により、ＮａＯＡｃまたはＧｌｙ緩衝液のいずれかを使用した２つのステップ（つまり、分配と抽出）の全体的な収率が４０〜４６％の範囲にあることが示される。これらの値は、上清にミセル凝集体が存在する証拠がない状態を表している。（例えば）レーン８で抽出されたｈＩｇＧの純度は、レーン２の純度と同等である。後者は９９％を超える純度（製造元による）を表すため、抽出効率をさらに向上させることができれば、クロマトグラフィーなしでＰｒｏＡを使用せずに、大幅に高い純度を達成できることを意味する。これにより、現在使用されている３つのステップのうち２つのクロマトグラフィーステップを削除する道が開かれる可能性がある。低い抽出効率がマウスＩｇＧで観察された（図６Ｂ）。ただし、マウスＩｇＧを含むＴｗｅｅｎ−２０凝集体の水溶性に対する塩濃度の全般的な影響は、ｈＩｇＧで得られたものと同様であった。
【０２００】
ｈＩｇＧの二次構造の保存を円偏光二色性（ＣＤ）で調べた（図６Ｃ）。ＣＤ分析は、精製ｈＩｇＧの二次構造に顕著な変化が生じなかったことを示している（図６Ｃ）。
結論
【０２０１】
ＰｒｏＡをリガンドとして使用せずにＩｇＧを精製できる２つの潜在的な非クロマトグラフィープロセスが提示された。Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体への抗体の自発的な分配とそれに続く凝集体の溶解により、高収率と低純度が得られるが、短い抽出ステップの後、低回収率と高純度が達成される。この戦略は、標的抗体の特定の配列に依存しないようであり、したがって標準化された精製プラットフォームを提供する可能性がある。Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体の粒状のテクスチャーにより、（例えば）ろ過が可能になり、したがって連続精製プロセスでのプロセスの実装が可能になると予想される。
【実施例２】
【０２０２】
無血清培地でのヒトおよびマウスＩｇＧの精製
大腸菌溶解物の存在下での最適化試験の完了により、ハイブリドーマ無血清培地でのこの方法の実施に向けた道が開かれた。ｈＩｇＧとマウスＩｇＧの両方がＴｗｅｅｎ−２０ペレットで観察された。（図７Ａおよび７Ｃ）（標的ＩｇＧに加えて）０．５ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度のＢＳＡまたはＨＳＡを含めると、凝集体内のアルブミン濃度の増加に伴い、ＩｇＧの結合が徐々に抑制されることがわかった。（図７Ａおよび７Ｃ）。
【０２０３】
特に重要なのは、ＢＳＡの著しい共抽出や凝集体の溶解なしに、ヒトおよびマウスＩｇＧが５０ｍＭのイソロイシン（ｐＨ３．８）を含むＴｗｅｅｎ−２０凝集体から抽出できるという発見であった（図７Ｂおよび７Ｄ：レーン３〜４）。より高いＢＳＡ濃度（≧０．５ｍｇ／ｍｌ）では、抽出されたＩｇＧにアルブミンが観察された（図７Ｂおよび７Ｄ：レーン５〜１０）。ＢＳＡをＨＳＡに置き換えた場合にも、同様の結果が観察された（示さず）。
【０２０４】
最適な条件下で、ＩｇＧ捕捉の収率は、ｈＩｇＧ／ＢＳＡで８０〜９０％、マウスＩｇＧ／ＢＳＡで７６〜７９％、ｈＩｇＧ／ＢＳＡで６７〜５５％、マウスＩｇＧ／ＨＳＡで７５〜７８％の範囲であった。以下の表１に要約されている。
【０２０５】
【表１】
2020519602.tif 000003
【実施例３】
【０２０６】
抽出緩衝液、円偏光二色性（ＣＤ）および動的光散乱（ＤＬＳ）
様々なアミノ酸（すべてｐＨ３．８）で構成される抽出緩衝液を研究した。最高の回収率が得られたのは、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＩｌｅ緩衝液（図８Ａ：レーン３〜５）で、一方ＡｒｇまたはＨｉｓ緩衝液は効率が低いことがわかった（図８Ａ：レーン６〜７）。ＡｓｐまたはＧｌｕ緩衝液の使用により、部分的な凝集体の溶解が促進された。（図８Ａ：レーン８〜９、ゲル前面のバンドを参照）。
【０２０７】
３２℃でのインキュベーションは、低温（４〜１９℃、図示せず）と比較して最高の抽出収率をもたらし、治療用ｍＡｂは高温（例えば３７℃、ｐＨ４．５）およびより長いインキュベーション時間（１〜４日）での科学的な改変を経ることが報告されているため、懸念を表明しないように思われた。
【０２０８】
動的光散乱（ＤＬＳ）測定では、精製ＩｇＧと対照ＩｇＧのサイズのいずれかの変化や、ＩｇＧより大きい粒子の存在は示されなかった（図８Ｂおよび８Ｃ）。これらの結果が３つの抽出緩衝液と２つのＩｇＧ集団（ヒトおよびマウス）で繰り返されたという事実は、凝集体の溶解を伴わずにＩｇＧの抽出が達成できることを示唆している。
【０２０９】
Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体で精製し、Ｇｌｙ緩衝液で抽出したｈＩｇＧのＣＤスペクトルとそうでないもの（すなわち、対照ｈＩｇＧ）のＣＤスペクトルの比較は、両方のスペクトルが非常に類似しており、ＩｇＧの顕著な二次構造を表していることを示している（すなわち、−２１８ｎｍで負の吸収を持つアンチ平行ベータシート［１８］）［１９］で、以前の報告［２０］と一致している（図８Ｄ）。同様のスペクトルがマウスＩｇＧでも得られたため（図８Ｅ）、提示された精製アプローチは穏やかであり、検証したＩｇＧの二次構造が保存されていることが示唆される。
【実施例４】
【０２１０】
ＩｇＧ特異性の保存（ＥＬＩＳＡアッセイ）
精製プロセスの終了時のＩｇＧ特異性の保存は、ＢＳＡを認識する２種類のポリクローナル抗体（Ｓｈｅｅｐ＆Ｒａｂｂｉｔ）で研究された。これらのＡｂのそれぞれは、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体（ＨＳＡを含みＢＳＡを含まず、ＢＳＡをシステムから除去する）で精製され、７つの研究された緩衝液のそれぞれで（一度に１つ）抽出され、最終的に、ＥＬＩＳＡアッセイで標的：ＢＳＡに結合する能力について検証された。観察されたＥＬＩＳＡシグナルの違い（図９Ａ〜図９Ｂ）は、ｈＩｇＧとマウスＩｇＧで観察された抽出効率の違いを反映している。抽出緩衝液がＡｓｐまたはＧｌｕで構成されている場合に、最高のシグナルが得られた。これらの所見は、ＡｓｐおよびＧｌｕ緩衝液が部分的な凝集体の溶解を誘導することが示された以前の説明と一致しており（図８Ａ：レーン８〜９）、強いＥＬＩＳＡシグナルを即時に説明する高いＩｇＧの濃度に至る（図９Ａ〜図９Ｂ）。
【実施例５】
【０２１１】
Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体によるＩｇＭの精製
材料および方法
Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体によるＩｇＭの捕捉：Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体は、０．１１２５ｍＭのＴｗｅｅｎ−２０、１ｍＭバソフェナントロリン、０．５ｍＭのＦｅＳＯ４および１０ｍＭのＮａＣｌを室温で１０分間インキュベートすることにより生成された。次に、ＩｇＭとＢＳＡの混合物（ＩｇＭ／ＢＳＡ）を新たに調製したＴｗｅｅｎ−２０凝集体に加え、システムを室温でさらに１０分間インキュベートした。ＩｇＭ／ＢＳＡ混合物は、ＩｇＭとＢＳＡの両方が０．５ｍｇ／ｍｌであるＥｘ−ＣＥＬＬ培地（Ｓｉｇｍａ−Ｈ４２８１）にポリクローナルＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ−Ｉ８１３５）をＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａ２１５３）に溶解することにより調製した。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５分）により上清を除去し、得られたペレットを５０μｌの冷えた２０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、ペレットの組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体からのＩｇＭ抽出
【０２１２】
捕捉したＩｇＭを含むペレットを酸性条件（５０ｍＭイソロイシンｐＨ３）に供し、３２℃で３０分間インキュベートした。サンプルを遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５分）し、上清の組成（抽出物）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
結果
【０２１３】
ウシポリクローナルＩｇＭ抗体は、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体：Ｔｗｅｅｎ−２０、疎水性キレート剤：バソフェナントロリン（バソ）およびＦｅ２＋イオンで構成、に効率的に結合した。
【０２１４】
この結論は、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体と［ＩｇＭ＋ＢＳＡ］の混合物との短時間のインキュベーション（５分）の後に上清を除去すると、標的ＩｇＭの重鎖と軽鎖が減少したペレットが得られるという発見に裏付けられている（図１０Ａレーン５）。Ｔｗｅｅｎ−２０ペレットではＩｇＭが検出されないため、プロセス効率はキレート剤（バソ）と金属（Ｆｅ２＋）の存在に完全に依存する（図１０Ａレーン６〜７）。
【０２１５】
これらの結果は、ＩｇＭ抗体が吸着／結合する疎水性または半疎水性環境の必要性によって説明できる。したがって、キレート剤（バソ）の不在または金属（Ｆｅ２＋）の不在は、Ｔｗｅｅｎ−２０ミセルを独立に維持する。つまり、非共役であるため、ＩｇＭの結合／分配のための疎水性環境は存在しない（図１０Ａ、レーン６〜７）。
【０２１６】
ＩｇＭ抗体は、ＩｇＭを含むペレットから、ペレットの同時溶解なしに抽出できる（つまり、Ｔｗｅｅｎ−２０凝集体）。これは、酸性条件下（５０ｍＭのイソロイシン、ｐＨ３）でペレットを３２℃で３０分間インキュベートすることで達成され、その後、上清から不混和性粒子を除去する遠心分離が続く。上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、検出可能な量のＴｗｅｅｎ−２０凝集体なしで、ＩｇＭの還元された重鎖および軽鎖が上清に存在することを示している（図１０Ｂ、レーン４〜７）。
【０２１７】
本発明をその特定の実施形態に関連して説明したが、多くの代替、修正、および変形が当業者には明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内にあるそのようなすべての代替、修正、および変形を包含することが意図されている。
【０２１８】
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照により全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または識別は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。セクションの見出しが使用される限り、それらは必ずしも限定するものと解釈されるべきではない。
参考文献
【０２１９】
１．Ａｇｇａｒｗａｌ，  Ｒ．Ｓ．，  Ｗｈａｔ’ｓ  ｆｕｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ｅｎｇｉｎｅ−２０１２  ｔｏ  ２０１３．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２０１４．３２（１）：ｐ．３２−９．
２．Ｗｕｒｍ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２００４．２２（１１）：ｐ．１３９３−８．
３．Ｌｏｗ，  Ｄ．，  Ｒ．Ｏ’Ｌｅａｒｙ，  ａｎｄ  Ｎ．Ｓ．Ｐｕｊａｒ，  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，  ２００７．８４８（１）：ｐ．４８−６３．
４．Ｇａｇｎｏｎ，  Ｐ．，  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  ２０１２．１２２１：ｐ．５７−７０．
５．＜Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｃａｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｐｄｆ＞．
６．Ｓｈｕｋｌａ，  Ａ．Ａ．ａｎｄ  Ｊ．Ｔｈoeｍｍｅｓ，  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２０１０．２８（５）：ｐ．２５３−２６１．
７．Ａｚｅｖｅｄｏ，  Ａ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｆｒｅｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２００９．２７（４）：ｐ．２４０−７．
８．Ｒｏｑｕｅ，  Ａ．Ｃ．，  Ｃ．Ｒ．Ｌｏｗｅ，  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｔａｉｐａ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，  ２００４．２０（３）：ｐ．６３９−５４．
９．Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｋ．Ｚ．Ｍａｈ，  ａｎｄ  Ｒ．Ｇｈｏｓｈ，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｕｓｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｈｙｂｒｉｄ  ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ：Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２００９．６６（２）：ｐ．２４２−２４７．
１０．Ｖｅｎｋｉｔｅｓｈｗａｒａｎ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｆｏｕｌｉｎｇ  ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  ２００８．１０１（５）：ｐ．９５７−６６．
１１．Ｋｕｃｚｅｗｓｋｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｕｓｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ａ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ，  ２０１１．６（１）：ｐ．５６−６５．
１２．ＭｃＤｏｎａｌｄ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  ２００９．１０２（４）：ｐ．１１４１−５１．
１３．Ｋｕｍａｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｍａｒｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００７．３２（１０）：ｐ．１２０５−１２３７．
１４．Ｓｈｕｋｌａ，  Ａ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，  ２００７．８４８（１）：ｐ．２８−３９．
１５．ｖａｎ  Ｒｅｉｓ，  Ｒ．ａｎｄ  Ａ．Ｚｙｄｎｅｙ，  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００７．２９７（１−２）：ｐ．１６−５０．
１６．Ｋｅｌｌｅｙ，  Ｂ．，  Ｖｅｒｙ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｃａｓｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｔ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，  ２００７．２３（５）：ｐ．９９５−１００８．
１７．Ｋｅｌｌｅｙ，  Ｂ．，  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＡｂ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ａｔ  ａ  ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ．ＭＡｂｓ，  ２００９．１（５）：ｐ．４４３−５２．
１８．Ｇｕｓｅ，  Ａ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ４  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，  １９９４．６６１（１−２）：ｐ．１３−２３．
１９．Ｍａｎｚｋｅ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９９７．２０８（１）：ｐ．６５−７３．
２０．Ｆｏｌｌｍａｎ，  Ｄ．Ｋ．ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｆａｈｒｎｅｒ，  Ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｅｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｔｅｐｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，  ２００４．１０２４（１−２）：ｐ．７９−８５．
２１．Ｇｈｏｓｈ，  Ｒ．ａｎｄ  Ｌ．Ｗａｎｇ，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，  ２００６．１１０７（１−２）：ｐ．１０４−９．
２２．Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ：ａ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，  ２０１２．８（３２）：ｐ．８４５６−８４６３．
２３．Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，  ２０１３．２４（７）：ｐ．１２７０−５．
２４．Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｎｉｏｎｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ−ｍｉｃｅｌｌｅｓ．Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，  ２０１４．１０（２７）：ｐ．４９２２−８．
２５．Ｄｕｔｔａ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ−ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ−ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ａｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｌｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ．Ａｎａｌｙｓｔ，  ２０１５．１４０（１）：ｐ．２０４−１２．
２６．Ｍａｒｔｅｌｌ，  Ａ．Ｅ．ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ．１９７４，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ．
２７．Ｄａｎｉｎｏ，  Ｄ．，  Ａ．Ｂｅｒｎｈｅｉｍ−Ｇｒｏｓｗａｓｓｅｒ，  ａｎｄ  Ｙ．Ｔａｌｍｏｎ，  Ｄｉｇｉｔａｌ  ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ａｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｓｐｅｃｔｓ，  ２００１．１８３−１８５：ｐ．１１３−１２２．
２８．Ｄａｎｉｎｏ，  Ｄ．，  Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ  ｏｆ  ｓｏｆｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ＆  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１２．１７（６）：ｐ．３１６−３２９．
２９．Ｌｉ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＭＡｂｓ，  ２０１０．２（５）：ｐ．４６６−７９．
３０．Ｏｒｅｌｌａｎａ，  Ｃ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｉｇｈ−ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ，  ２０１５．１４（２）：ｐ．６０９−１８．
【図１】
2020519602.tif 000004
【図２Ａ】
2020519602.tif 000005
【図２Ｂ】
2020519602.tif 000006
【図２Ｃ】
2020519602.tif 000007
【図２Ｄ】
2020519602.tif 000008
【図３Ａ】
2020519602.tif 000009
【図３Ｂ】
2020519602.tif 000010
【図３Ｃ】
2020519602.tif 000011
【図４Ａ】
2020519602.tif 000012
【図４Ｂ】
2020519602.tif 000013
【図４Ｃ】
2020519602.tif 000014
【図５】
2020519602.tif 000015
【図６Ａ】
2020519602.tif 000016
【図６Ｂ】
2020519602.tif 000017
【図６Ｃ】
2020519602.tif 000018
【図７Ａ】
2020519602.tif 000019
【図７Ｂ】
2020519602.tif 000020
【図７Ｃ】
2020519602.tif 000021
【図７Ｄ】
2020519602.tif 000022
【図８Ａ】
2020519602.tif 000023
【図８Ｂ】
2020519602.tif 000024
【図８Ｃ】
2020519602.tif 000025
【図８Ｄ】
2020519602.tif 000026
【図８Ｅ】
2020519602.tif 000027
【図９Ａ】
2020519602.tif 000028
【図９Ｂ】
2020519602.tif 000029
【図１０Ａ】
2020519602.tif 000030
【図１０Ｂ】
2020519602.tif 000031
【国際調査報告】
2020519602.tif 000032
2020519602.tif 000033
2020519602.tif 000034