(57)【要約】  本発明は、ピルビン酸カルボキシラーゼおよびピルビン酸カルボキシラーゼコーディングＤＮＡ、そのＤＮＡを含有するプラスミド、ならびに産生用微生物、およびそれらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の製造方法、および染色体に関する。本発明によると、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする、配列番号１に対する少なくとも７０％の同一性を有するＤＮＡが提供され、そのＤＮＡでは、１０２７〜１０２９位において、トレオニン３４３をコードするトリプレットが、アラニンをコードするトリプレットで置換されている。好ましい一実施形態では、このＤＮＡ中で、３０３４〜３０３６位において、イソロイシンをコードするトリプレットが、セリンをコードするトリプレットで追加的に置換されている。これらの遺伝子の発現により、それらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の収量を、天然Ｐｙｃを有する株と比べて９〜１９％高めることができるピルビン酸カルボキシラーゼが得られる。
2020519240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０２７〜１０２９位のトリプレットがアラニンをコードする、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するＤＮＡ配列。
【請求項２】
ＤＮＡが配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
配列番号１によるＤＮＡであることを特徴とする、請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
３０３４〜３０３６位において、セリンをコードするトリプレットが追加的に存在することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
ＤＮＡが配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有することを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
配列番号２によるＤＮＡであることを特徴とする、請求項４または５に記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
３４３位にアラニンが存在する、配列番号３によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して少なくとも９０％の同一性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ。
【請求項８】
配列番号３によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して少なくとも９５％の同一性を有することを特徴とする、請求項７に記載のピルビン酸カルボキシラーゼ。
【請求項９】
配列番号３によるピルビン酸カルボキシラーゼであることを特徴とする、請求項７または８に記載のピルビン酸カルボキシラーゼ。
【請求項１０】
１０１２位においてセリンを追加的に有することを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一つに記載のピルビン酸カルボキシラーゼ。
【請求項１１】
配列番号４によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して少なくとも９５％の同一性を有することを特徴とする、請求項１０に記載のピルビン酸カルボキシラーゼ。
【請求項１２】
配列番号４によるピルビン酸カルボキシラーゼであることを特徴とする、請求項１０または１１に記載のピルビン酸カルボキシラーゼ。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一つに記載のＤＮＡ配列を含有することを特徴とする、ベクター。
【請求項１４】
プラスミドであることを特徴とする、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一つに記載のＤＮＡを含有することを特徴とする、微生物。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載のベクターを含有することを特徴とする、請求項９に記載の微生物。
【請求項１７】
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属からなる群からの微生物であることを特徴とする、請求項１５または１６に記載の微生物。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一つに記載のＤＮＡを含有する、請求項７〜１２のいずれか一つに記載の配列を有するピルビン酸カルボキシラーゼを生成する微生物を発酵させ、培地中または細胞内で生成物の富化を行うことを特徴とする、生成物であってそれらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の製造方法。
【請求項１９】
生成物が単離されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
微生物として、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、カンジダ属、ピキア属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属、エシェリキア属、ザイモモナス属、ヤロウィア属、メチロバクテリウム属、ラルストニア属、ビブリオ属およびクロストリジウム属からなる群からの種を使用することを特徴とする、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
アスパルテートファミリーのアミノ酸を製造することを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
Ｌ−リジン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−メチオニンを製造することを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アミノ酸のグルタメートファミリー、例えば、Ｌ−グルタメート、グルタミン  Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−シトルリンまたはＬ−オルニチンからの物質、クエン酸回路の中間体、例えば、マレート、フマレート、スクシネート、マレート、フマレート  シトレート、イソシトレートまたは２−オキソグルタメート、ジアミン、例えば、ジアミノペンタンまたはジアミノブタン、およびオキサロアセテートから産生されるさらなる代謝産物、例えば、イタコネート、エクトイン、ガンマ−アミノブチレート、ブタノール、１−プロパノール、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−アルギニンまたは４−ヒドロキシプロリンを製造することを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜６のいずれか一つに記載の遺伝子をより強力に発現させることを特徴とする、請求項１８〜２３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜６のいずれか一つに記載のＤＮＡ配列を含有する染色体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピルビン酸カルボキシラーゼおよびピルビン酸カルボキシラーゼコーディングＤＮＡ、そのＤＮＡを含有するプラスミド、ならびに産生用微生物、および生成物であってそれらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の製造方法、および染色体に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は、アミノ酸、とりわけＬ−グルタミン酸およびＬ−リジンを製造するために工業的に利用される。Ｌ−リジンを製造するためには、クエン酸回路から、中間体であるオキサロアセテートを取り去るが、なぜなら、オキサロアセテートは、アスパルテートファミリーのアミノ酸または当該アミノ酸の塩の前駆体として利用されるからである。これらは、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トレオニンおよびＬ−イソロイシンである。これらの中間体の取去りにもかかわらずクエン酸回路が、引き続き進行できるように、クエン酸回路は、いわゆるアナプレロティック反応によって再び補充される必要がある。糖を用いた増殖においては、オキサロアセテートプールの補充は、ピルベートまたはホスホエノールピルベートからオキサロアセテートへのカルボキシル化によって行われる。ピルベートおよび二酸化炭素またはＨＣＯ３−からの、ＡＴＰ依存性のオキサロアセテートの生成は、酵素ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）によって触媒される。したがって、アスパルテートファミリーのアミノ酸、例えばＬ−リジン、およびグルタメートファミリーのアミノ酸、例えばＬ−グルタメートの微生物による工業的産生には、高いＰｙｃ活性が重要である。クエン酸回路の中間体から誘導される別の代謝産物を製造するためにも高いＰｙｃ活性が有益である。
【０００３】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの天然Ｐｙｃの酵素活性は、とりわけアスパルテートによってアロステリック阻害されるため、細胞内のアスパルテート濃度が高い場合には、限定的な活性のみ有する。そのため、Ｌ−リジン、およびオキサロアセテートから誘導される他の生成物の産生も制限されているが、なぜなら限定的な量の前駆体代謝産物のみが提供されるからである。これまで記載されたＰｙｃバリアントは、Ｌ−リジン産生の緩やかな上昇のみをもたらす。
【０００４】
Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ等の刊行物「Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ  ｆｏｒ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１）３２：２９５−３００（非特許文献１）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＤＧ５２−５株中でのｐｙｃ遺伝子の欠失がリジン力価の６０％の低下をもたらす一方で、ＤＧ５２−５株中でのｐｙｃ遺伝子のプラスミド仲介過剰発現は５０％上昇したリジン力価をもたらすことを開示する。野生株ＡＴＣＣ１３０３２中でのｐｙｃ遺伝子の欠失が、Ｔｗｅｅｎ  ６０によって誘導されるＬ−グルタミン酸産生をおよそ５０％低下させる一方で、プラスミドベースのｐｙｃ遺伝子過剰発現はグルタメート生成を７００％上昇させることがさらに示される。リジンおよびグルタメートの産生に対する高Ｐｙｃ活性の重要性は、後に他の刊行物中でもさらに示された（Ｂｌｏｍｂａｃｈ等、２００７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７６：６１５−６２３（非特許文献２）、Ｓｈｉｒａｉ等、２００７、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ６：１９（非特許文献３）、ＮｅｕｎｅｒおよびＨｅｉｎｚｌｅ、２０１１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：３１８−３２９（非特許文献４）、Ｎｅｕｎｅｒ等、２０１３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６３：２１７−２２４（非特許文献５）、Ｇｕｏ等、２０１３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５：９４３−９５０（非特許文献６））。
【０００５】
クエン酸回路の中間体であるか、またはクエン酸回路の中間体から誘導される、アミノ酸以外の他の代謝産物の製造にとっても、高いＰｙｃ活性が非常に重要である。Ｓｈｏｈｅｉ  Ｏｋｉｎｏ等、「Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎ  ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｓｔｒａｉｎ」、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８）８１：４５９−４６４（非特許文献７）およびＴｏｒｂｅｎ  Ｈｏｅｆｅｌ等、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ−ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｓｔｉｒｒｅｄ  ｔａｎｋ  ｂｉｏｒｅａｃｔｉｏｒｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．、２０１２、７：１２７７−１２８７（非特許文献８）の刊行物は、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現または過剰発現が、スクシネートの産生または産生の上昇をもたらすことを開示する。これは、さらなる刊行物においても示される（Ｌｉ等、２０１６、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１８：２１７−２２３（非特許文献９）、Ｔａｊｉｍａ等、２０１５、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８１：９２９−９３７（非特許文献１０）、Ｌｉｔｓａｎｏｖ等、２０１２、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７８：３３２５−３３３７（非特許文献１１）、Ｍｅｎｇ等、２０１６、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １５：１４１（非特許文献１２））。テルモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）によるマレートの産生に関しても、上昇したＰｙｃ活性が有益であると同じく判明した（Ｄｅｎｇ等、２０１６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ３１：１４−２０（非特許文献１３））。クエン酸回路の中間体から誘導されるジアミン、例えば、プトレシン（１，４−ジアミノブタン）またはカダべリン（１，５−ジアミノペンタン）の産生に関して、Ｐｙｃ活性の増強が同じく使用された（Ｎｇｕｙｅｎ等、２０１５、Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ５：２１１−２３１（非特許文献１４）、Ｋｉｎｄ等、２０１０、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２：３４１−３５１（非特許文献１５））。
【０００６】
Ｏｈｎｉｓｈｉ等（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００２）５８：２１７−２２３（非特許文献１６））は、野生株ＡＴＣＣ  １３０３２をベースとし、ならびに２つの点突然変異、ホモセリンデヒドロゲナーゼの遺伝子（ｈｏｍ）中のＶａｌ５９Ａｌａおよびアスパラギン酸キナーゼの遺伝子（ｌｙｓＣ）中のＴｈｒ３１１Ｉｌｅを担持するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＨＤ２への、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＰｙｃの４５８位におけるプロリンからセリンへのアミノ酸置換の染色体への挿入を記載した。ｐｙｃ−Ｐ４５８Ｓ突然変異を有するＡＨＰ−３株は、親株ＡＨＤ−２よりも６％多くＬ−リジンを生成した。著者等は、ｐｙｃ突然変異を同定するためには公知の選択可能な表現型が存在せず、ｐｙｃ突然変異は、おそらく比較ゲノム分析によってのみ見出せると記載している。その上、ＰｙｃバリアントであるＰｙｃ−Ｐ４５８Ｓは、まだそれ以上は特性化されていない。
【０００７】
刊行物ＵＳ７，３００，７７７Ｂ２（特許文献１）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ  ２１５２３由来のＰｙｃと比べて複数の突然変異（Ｍ１Ｖ、Ｅ１５３Ｄ、Ａ１８２Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｈ２２７Ｒ、Ａ４５２Ｇ、Ｄ１１２０Ｅ）を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４由来のピルビン酸カルボキシラーゼが単離された生物を記載する。前記の突然変異の少なくとも１つは、低濃度（１〜１０ｍＭ）のアスパルテートによりその活性の点で２．５倍まで促進され、およびより高いアスパルテート濃度では、アスパルテートの不在下での活性の最大限３０％まで再び阻害されるＰｙｃバリアントをもたらす。３０ｍＭのアスパルテートにおいて、ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株由来のＰｙｃは、アスパルテートの不在下と同じ活性をなおも示した一方で、ＡＴＣＣ  ２１５２３株のＰｙｃは、３０ｍＭのアスパルテートにおいて、アスパルテートの不在下で示した活性の３０％のみをなおも有した。しかしながら、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４由来のフィードバック耐性Ｐｙｃバリアントが、アミノ酸、とりわけＬ−リジンおよびＬ−グルタメートの発酵産生に対して及ぼす影響は、刊行物ＵＳ７，３００，７７７Ｂ２（特許文献１）では開示されなかった。
【０００８】
独国特許出願１０２０１２０１６７１６．４（特許文献２）は、改善された酵素を見出すことができるスクリーニング法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＵＳ７，３００，７７７Ｂ２
【特許文献２】独国特許出願１０２０１２０１６７１６．４
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ等、「Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ  ｆｏｒ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１）３２：２９５−３００
【非特許文献２】Ｂｌｏｍｂａｃｈ等、２００７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７６：６１５−６２３
【非特許文献３】Ｓｈｉｒａｉ等、２００７、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ６：１９
【非特許文献４】ＮｅｕｎｅｒおよびＨｅｉｎｚｌｅ、２０１１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：３１８−３２９
【非特許文献５】Ｎｅｕｎｅｒ等、２０１３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６３：２１７−２２４
【非特許文献６】Ｇｕｏ等、２０１３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５：９４３−９５０
【非特許文献７】Ｓｈｏｈｅｉ  Ｏｋｉｎｏ等、「Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎ  ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｓｔｒａｉｎ」、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８）８１：４５９−４６４
【非特許文献８】Ｔｏｒｂｅｎ  Ｈｏｅｆｅｌ等、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ−ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｓｔｉｒｒｅｄ  ｔａｎｋ  ｂｉｏｒｅａｃｔｉｏｒｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．  、２０１２、７：１２７７−１２８７
【非特許文献９】Ｌｉ等、２０１６、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１８：２１７−２２３
【非特許文献１０】Ｔａｊｉｍａ等、２０１５、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８１：９２９−９３７
【非特許文献１１】Ｌｉｔｓａｎｏｖ等、２０１２、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７８：３３２５−３３３７
【非特許文献１２】Ｍｅｎｇ等、２０１６、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １５：１４１
【非特許文献１３】Ｄｅｎｇ等、２０１６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ３１：１４−２０
【非特許文献１４】Ｎｇｕｙｅｎ等、２０１５、Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ５：２１１−２３１
【非特許文献１５】Ｋｉｎｄ等、２０１０、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２：３４１−３５１
【非特許文献１６】Ｏｈｎｉｓｈｉ等（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００２）５８：２１７−２２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
それゆえ、本発明の課題は、それらを使用すると、オキサロアセテートから誘導される生成物を製造する際に、収量、力価、体積測定による生産性（ｇ生成物／リットル／時）または特異的生産性（ｇ生成物／時／ｇ細胞乾質量）を高めることができる微生物、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子、この遺伝子を含有するプラスミドまたは染色体、および生成物であってそれらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の製造方法を提供することである。とりわけ、アスパルテートファミリーのアミノ酸、つまりＬ−リジン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−メチオニンの産生が高まることになる。グルタメートファミリーのアミノ酸、例えば、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニンもしくはＬ−プロリンの産生、クエン酸回路の塩および酸といった中間体、例えば、スクシネート、マレート、フマレート、２−オキソグルタメート、シトレートもしくはイソシトレートの産生、ジアミン、例えば、１，５−ジアミノペンタンもしくは１，４−ジアミノブタンの産生、またはその上、さらなる生成物、例えば、イタコネート、エクトイン、ガンマ−アミノブチレート、ブタノール、１−プロパノール、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−アルギニンもしくは４−ヒドロキシプロリンの産生もさらに高まることになる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この課題は、請求項１の前提部および同等の請求項を起点に、本発明により、請求項１および同等の請求項の特徴部分で記載される特徴によって解決される。
【００１３】
前記の微生物、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子、この遺伝子を含有するプラスミドまたは染色体、および製造方法を用いて、生成物であってそれらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の収量を高めることができる。とりわけ、オキサロアセテート／アスパルテートファミリーのアミノ酸、つまりＬ−リジン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンの産生を高めることができる。グルタメートファミリーのアミノ酸、例えば、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニンもしくはＬ−プロリンの産生、クエン酸回路の塩および酸といった中間体、例えば、スクシネート、マレート、フマレートもしくは２−オキソグルタレート、シトレートもしくはイソシトレートの産生、ジアミン、例えば、１，５−ジアミノペンタンもしくは１，４−ジアミノブタンの産生、またはその上、さらなる生成物、例えば、イタコネート、エクトイン、ガンマ−アミノブチレート、ブタノール、１−プロパノール、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−アルギニンもしくは４−ヒドロキシプロリンの産生もさらに高めることができる。本発明の有利なさらなる形態は、従属請求項に記載されている。
【００１４】
以下では、本発明をその一般的な形において記載するが、これは限定的に解釈されるものではない。
【００１５】
驚くべきことに、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ株と比べて改変した３４３位のトレオニンのアラニンでの置換を有するピルビン酸カルボキシラーゼ、およびこのピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝的に改変した遺伝子、この遺伝子を含有するプラスミド、ならびにこの遺伝子またはプラスミドを含有する微生物、ならびに製造方法が、提起された課題を解決することが見出された。例えば、Ｌ−リジンの産生に関して、ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ株と比べて１５％上昇したＬ−リジンの最終濃度が認められる。
【００１６】
好ましい一変形形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ株と比べて改変したピルビン酸カルボキシラーゼが、３４３位のトレオニンのアラニンでの置換に加えて、１０１２位のイソロイシンのセリンでの置換を追加的に含有する。それに応じて、本発明は、この、Ｔ３４３ＡおよびＩ１０１２Ｓという改変を有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝的に改変した遺伝子、この遺伝子を含有するプラスミド、ならびにこの遺伝子またはプラスミドを含有する微生物、ならびに製造方法にも関する。この実施形態では、Ｌ−リジンの産生に関して、ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ株と比べて９から１９％上昇したＬ−リジンの最終濃度が認められる。
【００１７】
本発明によると、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする、配列番号１による遺伝子の少なくとも７０％の同一性の遺伝子が提供され、その遺伝子は、配列番号１の少なくとも７０％の同一性の遺伝子を起点に、１０２７〜１０２９位において、トレオニン３４３をコードするトリプレットの、アラニンをコードするトリプレットでの置換を有する。したがって、１０２７〜１０２９位は、アラニンをコードする。本発明によるＤＮＡには、７０％〜１００％の同一性の配列が含まれる。好ましくは、同一性は、８０％、８５％〜９０％である。特に好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。とりわけ好ましくは、遺伝子が、配列番号１による。
【００１８】
好ましい一形態では、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする、配列番号１による遺伝子の少なくとも７０％の同一性の遺伝子が提供され、その遺伝子は、配列番号１の少なくとも７０％の同一性の遺伝子を起点に、３０３４〜３０３６位において、セリンをコードするトリプレットを追加的に有する。この実施形態においても、７０％〜１００％の同一性の配列が含まれる。好ましくは、同一性が、８０％、８５％〜９０％である。特に好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。とりわけ好ましくは、遺伝子が、配列番号２による。
【００１９】
本明細書で使用する同一性とは、式Ｉ（％）＝［１−Ｖ／Ｘ］ｘ１００によって定義可能であり、式中、Ｉは同一性を意味し、Ｘは比較配列の核酸塩基の総数であり、Ｖは考察される配列の、比較配列に対して異なる核酸塩基の数である。いずれの場合でも、ポリペプチドをコードする核酸配列という用語により、遺伝コードの縮重（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）に応じて可能であると思われるすべての配列が含まれる。
【００２０】
本発明によると、Ｔ３４３ＡあるいはＴ３４３ＡおよびＩ１０１２Ｓという改変を有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードするこの遺伝子を含有するベクター、好ましくはプラスミドがさらに提供される。その際、あらゆる空ベクターまたはあらゆる空プラスミドが、出発ベクターまたは出発プラスミドとして基本的に考慮に値する。例えば、空ベクターとして、Ｆｒｕｎｚｋｅ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８、６７：３０５−３２２の刊行物中で記載されるようなプラスミドｐＡＮ６を使用でき、そのプラスミドに、本発明による遺伝子が挿入されている。
【００２１】
本発明によると、Ｔ３４３ＡあるいはＴ３４３ＡおよびＩ１０１２Ｓという改変を有する本発明によるＤＮＡを含有する染色体も提供される。その際、本発明によるＤＮＡは、微生物の生存能力にとって重要な遺伝子の機能が損なわれないか、または破壊されないように染色体へと挿入されている。
【００２２】
配列番号１による遺伝子の発現により、ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ株のピルビン酸カルボキシラーゼを起点に３４３位のトレオニンがアラニンで置換されている（ｐｙｃＴ３４３Ａ）、配列番号３によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する本発明によるピルビン酸カルボキシラーゼが得られる。したがって、ピルビン酸カルボキシラーゼの３４３位には、本発明によると、例えば配列番号３中と同様にアラニンが存在する。本発明によるピルビン酸カルボキシラーゼによって、配列番号３に対して９０％〜１００％の同一性のピルビン酸カルボキシラーゼが含まれる。好ましくは、同一性は、本発明により改変した、配列番号３のピルビン酸カルボキシラーゼの９５％、９６％、または９７％、特に好ましくは９８％または９９％である。とりわけ好ましくは、ピルビン酸カルボキシラーゼが、配列番号３による。
【００２３】
配列番号２による遺伝子の発現により、ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ株のピルビン酸カルボキシラーゼを起点に３４３位のトレオニンがアラニンで置換されている上に１０１２位のイソロイシンがセリンで置換されている（ｐｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓ）、配列番号４によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する本発明によるピルビン酸カルボキシラーゼが得られる。したがって、本発明によると、ピルビン酸カルボキシラーゼの３４３位にはアラニンが存在し、１０１２位にはセリンが存在する。本発明によるピルビン酸カルボキシラーゼによって、配列番号４に対して９０％〜１００％の同一性のピルビン酸カルボキシラーゼが含まれる。好ましくは、同一性は、本発明により改変した、配列番号４のピルビン酸カルボキシラーゼの９５％、９６％、または９７％、特に好ましくは９８％または９９％である。とりわけ好ましくは、ピルビン酸カルボキシラーゼが、配列番号４による。
【００２４】
本明細書で使用される同一性という表現は、式Ｉ（％）＝［１−Ｖ／Ｘ］ｘ１００によって定義可能であり、式中、Ｉは同一性を意味し、Ｘは比較配列のアミノ酸の総数であり、Ｖは考察される配列の、比較配列に対して異なるアミノ酸の数である。以下の配列が、配列表に列挙されている：
配列番号１：本発明により改変したピルビン酸カルボキシラーゼｐｙｃＴ３４３Ａをコードする、本発明により改変した、プラスミドベースバリアントのＤＮＡ配列
配列番号２：本発明により改変したピルビン酸カルボキシラーゼｐｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓをコードする、本発明により改変した、プラスミドベースバリアントのＤＮＡ配列
配列番号３：本発明により改変したピルビン酸カルボキシラーゼＰｙｃ−Ｔ３４３Ａのアミノ酸配列
配列番号４：本発明により改変したピルビン酸カルボキシラーゼＰｙｃ−Ｔ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓのアミノ酸配列
配列番号５：ピルビン酸カルボキシラーゼの野生型に関する参考株ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＴ３１１ＩのＤＮＡ配列
配列番号６：ピルビン酸カルボキシラーゼの野生型に関する参考株ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＴ３１１Ｉのピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列
配列番号７：Ｐｙｃ−Ｔ３４３Ａをコードする、本発明による染色体的バリアントＤＮＡ−ｐｙｃ−Ａ１０２７Ｇ−Ｔ１０３５ＧのＤＮＡ配列
配列番号８：Ｐｙｃ−Ｔ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓをコードする、本発明による染色体的バリアントＤＮＡ−ｐｙｃ−Ａ１０２７Ｇ−Ｔ１０３５Ｇ−Ｔ３０３５Ｇ−Ｃ３０３９ＧのＤＮＡ配列
【００２５】
本発明の有利な一変形形態では、本発明による遺伝子の発現を増強できる。そのためには、限定的ではないものの模範的にはより強力なプロモータを使用してもよいか、遺伝子コピー数を増やしてもよいか、またはｍＲＮＡの翻訳を高めるために、リボソーム結合部位を変えてもよい。これらの方法を行うために使用される方法は、当業者には公知である。
【００２６】
本発明による遺伝子または本発明によるベクターを含有する微生物が、さらに本発明の主題である。この微生物は、好ましくは、コリネ型細菌である。コリネ型細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）またはブレビバクテリウム・ラクトフェルメントゥム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）が挙げられ得る。
【００２７】
本発明によると特に好ましい細胞は、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞であり、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・エフィシエンス、ブレビバクテリウム・フラブム、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメントゥム、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・ブランキイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｌａｎｋｉｉ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、メチロバクテリウム・エクストルケンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が特に好ましい。本発明により最も好ましい細胞は、コリネバクテリウム属およびエシェリキア属の細胞であり、コリネバクテリウム・グルタミクムおよびエシェリキア・コリがとりわけ好ましい細菌株である。
【００２８】
とりわけ、生成物がＬ−リジンである場合、遺伝子工学的に改変した細胞は、とりわけ、コリネバクテリウム・グルタミクム  ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム  ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム  ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・メラッセコラ  ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラブム  ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメントゥム  ＡＴＣＣ１３８６９およびブレビバクテリウム・ディバリカトゥム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）  ＡＴＣＣ１４０２０、ならびにそれらの細胞から製造されたＬ−アミノ酸産生突然変異体または株、例えば、Ｌ−リジン産生株であるコリネバクテリウム・グルタミクム  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０９、ブレビバクテリウム・フラブム  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０８、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメントゥム  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７１２、コリネバクテリウム・グルタミクム  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６３、コリネバクテリウム・グルタミクム  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６４、およびコリネバクテリウム・グルタミクム  ＤＳＭ  ５７１５、または例えばＬ−メチオニン産生株コリネバクテリウム・グルタミクム  ＡＴＣＣ２１６０８からなる群から選択される細胞から誘導できる。適切なエシェリキア・コリ株の例としては、エシェリキア・コリ  ＡＪ１１４４２（ＪＰ５６−１８５９６およびＵＳ４，３４６，１７０を参照）、エシェリキア・コリ株  ＶＬ６１１およびエシェリキア・コリ株  ＷＣ１９６（ＷＯ−Ａ−９６／１７９３０を参照）を挙げる。
【００２９】
本発明によると、生成物であってそれらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の製造方法が提供される。
【００３０】
そのためには、タンパク質中の置換Ｔ３４３Ａまたは２つの置換Ｔ３４３ＡおよびＩ１０１２Ｓをコードする遺伝子改変を有する、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子を含有する微生物を、オキサロアセテートから誘導される代謝産物の産生に使用する。
【００３１】
このためには、１０２７〜１０２９位においてトレオニンをコードするトリプレットがアラニンをコードするトリプレットで置換されている配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する遺伝子、または１０２７〜１０２９位においてトレオニンをコードするトリプレットがアラニンをコードするトリプレットで置換されている上に３０３４〜３０３６位においてイソロイシンをコードするトリプレットがセリンをコードするトリプレットで置換されている配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有する遺伝子を微生物内に導入する。
【００３２】
本発明による方法には、配列番号１または配列番号２による遺伝子に対して少なくとも７０％〜１００％の同一性を有する遺伝子の使用が含まれる。
【００３３】
好ましくは、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも８０％〜９０％の同一性の遺伝子を有する微生物を使用する。特に好ましくは、配列番号１または配列番号２に対して９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する遺伝子を、製造方法のために使用する。とりわけ好ましくは、遺伝子が、配列番号１または配列番号２による。
【００３４】
その際、本発明により使用される、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子は、染色体上で、またはベクター、好ましくはプラスミドにおいて使用できる。
【００３５】
当該遺伝子が発現し、３４３位においてトレオニンがアラニンで置換されている配列番号３によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して少なくとも９０％の同一性を有する本発明によるピルビン酸カルボキシラーゼが、オキサロアセテートから誘導される代謝産物の産生の上昇をもたらす。
【００３６】
３４３位においてトレオニンがアラニンで置換されており、１０１２位においてイソロイシンがセリンで置換されている配列番号４によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して少なくとも９０％の同一性を有する本発明によるピルビン酸カルボキシラーゼの発現も、オキサロアセテートから誘導される代謝産物の産生の上昇をもたらす。
【００３７】
本発明による方法には、配列番号３および配列番号４によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して９０％から１００％の同一性を有するピルビン酸カルボキシラーゼの使用が含まれる。
【００３８】
好ましくは、本発明により使用されるピルビン酸カルボキシラーゼの同一性が、配列番号３または配列番号４に対して９５％、９６％、または９７％、特に好ましくは９８％または９９％である。配列番号３によるピルビン酸カルボキシラーゼの使用が特に好ましい。配列番号４によるピルビン酸カルボキシラーゼの使用がとりわけ好ましい。
【００３９】
好ましい一実施形態では、本発明による遺伝子が強力に発現される。
【００４０】
そのように得られた微生物を発酵させる。
【００４１】
産生生物としては、好ましくは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェリキア属、バチルス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ザイモモナス属、メチロバクテリウム属、ラルストニア属、クロストリジウム属、カンジダ属、ピキア属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属およびヤロウィア属からなる群からの生物が使用可能であり、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・エフィシエンス、ブレビバクテリウム・フラブム、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメントゥム、エシェリキア・コリ、サッカロミセス・セレビシアエ、クルイベロミセス・ラクティス、カンジダ・ブランキイ、カンジダ・ルゴサ、ザイモモナス・モビリス、ヤロウィア・リポリティカ、メチロバクテリウム・エクストルケンス、ラルストニア・ユートロファおよびピキア・パストリスが特に好ましい。本発明により最も好ましい細胞は、コリネバクテリウム属およびエシェリキア属の細胞であり、コリネバクテリウム・グルタミクムおよびエシェリキア・コリがとりわけ好ましい細菌株である。
【００４２】
とりわけ、代謝産物がＬ−リジンである場合、遺伝子工学的に改変した細胞または微生物を、とりわけ、コリネバクテリウム・グルタミクム  ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム  ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム  ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・メラッセコラ  ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラブム  ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメントゥム  ＡＴＣＣ１３８６９、およびブレビバクテリウム・ディバリカトゥム  ＡＴＣＣ１４０２０、ならびにそれらの細胞から製造されたＬ−アミノ酸産生突然変異体または株、例えば、Ｌ−リジン産生株であるコリネバクテリウム・グルタミクム  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０９、ブレビバクテリウム・フラブム  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０８、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメントゥム  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７１２、コリネバクテリウム・グルタミクム  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６３、コリネバクテリウム・グルタミクム  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６４、およびコリネバクテリウム・グルタミクム  ＤＳＭ  ５７１５、または例えばＬ−メチオニン産生株コリネバクテリウム・グルタミクム  ＡＴＣＣ２１６０８からなる群から選択される細胞から誘導できる。適切なエシェリキア・コリ株の例としては、エシェリキア・コリ  ＡＪ１１４４２（ＪＰ５６−１８５９６およびＵＳ４，３４６，１７０を参照）、エシェリキア・コリ株  ＶＬ６１１、およびエシェリキア・コリ株  ＷＣ１９６（ＷＯ−Ａ−９６／１７９３０を参照）を使用する。
【００４３】
本発明による方法を用いると、とりわけアスパルテートファミリーのアミノ酸を高めることができ、つまりＬ−リジン、Ｌ−アスパルテート、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−メチオニンを産生できる。さらに、グルタメートファミリーのアミノ酸、例えば、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニンもしくはＬ−プロリンの産生、クエン酸回路の中間体、例えば、スクシネート、フマレート、マレート、シトレート、イソシトレートもしくは２−オキソグルタレートの産生、ジアミン、例えば、ジアミノペンタンもしくはジアミノブタンの産生、またはさらには、他の生成物、例えば、イタコネート、エクトイン、ガンマ−アミノブチレート、ブタノール、１−プロパノール、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−アルギニンもしくは４−ヒドロキシプロリンの産生も高めることができる。
【００４４】
発酵によって産生され、培養上清中へと分泌される生成物を、次いで富化して単離する。
【００４５】
以下では、本発明を模範的に描写する図を手がかりに実験結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】天然Ｐｙｃ、染色体上にコードされたＰｙｃＴ３４３Ａ、および染色体上にコードされたＰｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉの増殖。
【図２】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ、染色体上にコードされたＰｙｃＴ３４３Ａを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ、および染色体上にコードされたＰｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ各株のＬ−リジン産生。
【図３】プラスミドｐＡＮ６−ｐｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃの増殖。
【図４】プラスミドｐＡＮ６−ｐｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃ株のＬ−リジン産生。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
図１には、染色体上にコードされたＰｙｃバリアントＰｙｃＴ３４３ＡおよびＰｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ各株の増殖を示す。図１では、横座標が、時間を時間（ｈ）で示し、縦座標が、６２０ｎｍでの後方散乱の値（Ａ．Ｕ．）を細胞密度の尺度として示す。対照としては、天然Ｐｙｃを有する、つまり３４３位にトレオニンおよび１０１２位にイソロイシンを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ株を利用した。すべての株は、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）システム内の４％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースを含むＣＧＸＩＩ最小培地中で、３０℃および１２００ｒｐｍにおいて２４ｈ培養した。
【００４８】
図２は、染色体上にコードされたＰｙｃバリアントＰｙｃＴ３４３Ａを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ、および染色体上にコードされたＰｙｃバリアントＰｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ各株のＬ−リジン産生を示す。図中、横座標が、３つの独立した再実験およびそれら３つの実験の平均値を表し、縦座標が、百分率でのリジン濃度を表し、対照菌株ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ（黒色バー）のリジン濃度を、３つの独立した再実験において、それぞれ１００％と設定した。ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩｐｙｃＴ３４３Ａ株のＬ−リジン濃度は、斜線網掛けバーとして表示する。ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩｐｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓ株のＬ−リジン濃度は、横線網掛けバーとして表示する。細胞をＢｉｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）システム内で２４ｈ培養してから（図１を参照）、細胞を回収し、各培養の上清中のＬ−リジン濃度を、オルトフタルジアルデヒド誘導体化を伴う逆相ＨＰＬＣを介して特定した。３つの再実験のすべてにおいて、突然変異させたＰｙｃバリアントＰｙｃＴ３４３Ａを有する株同様に、突然変異させたＰｙｃバリアントＰｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓを有する株も、天然Ｐｙｃを有する比較株よりも高いリジン力価を示した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉと比べて、平均して１５〜１９％の最終Ｌ−リジン濃度の上昇が認められる。測定した、個々の突然変異体のリジン濃度は、ｔ検定を用いて比較した。その際、図に示す星印は、ｐ≦０．０１を表す。
【００４９】
図３には、プラスミドｐＡＮ６−ｐｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃ株の増殖を示す。図中では、この場合も同様に横座標が、時間を時間（ｈ）で示し、縦座標が、６２０ｎｍでの後方散乱の値（Ａ．Ｕ．）を示す。対照としては、空プラスミドｐＡＮ６、または天然ｐｙｃを有するプラスミドｐＡＮ６−ｐｙｃのいずれか一方を担持するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃ株を伴った。すべての株は、ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）システム内の４％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースおよび２５ｍｇＬ−１のカナマイシンを含むＣＧＸＩＩ最小培地中で、３０℃および１２００ｒｐｍにおいて２４ｈ培養した。培養の開始時に、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を用いてｐｙｃの発現を誘導した。
【００５０】
図４は、プラスミドｐＡＮ６−ｐｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃ株のＬ−リジン産生を示す。図中、横座標が、空ベクターｐＡＮ６（網掛けバー）、天然ピルビン酸カルボキシラーゼを有するベクターｐＡＮ６−ｐｙｃ（白色バー）、またはベクターｐＡＮ６−ｐｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓ（黒色バー）を含有する各Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃ株を比較で示す。細胞をＢｉｏＬｅｃｔｏｒ（登録商標）システム内で２４ｈ培養してから（図３を参照）、細胞を回収し、各培養の上清中のＬ−リジン濃度を、オルトフタルジアルデヒド誘導体化を伴う逆相ＨＰＬＣを介して特定した。比較として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株のＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃ／ｐＡＮ６（Ｐｙｃを含まない）およびＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ／ｐＡＮ６−ｐｙｃ（天然Ｐｙｃを含む）中のリジン産生を測定した。提示するデータは、少なくとも６つの生物学的な再実験からの平均値および標準偏差を表す。測定した、個々の突然変異体のリジン濃度は、ｔ検定を用いて比較した。その際、図に示す星印は、ｐ≦０．０５を表す。ＰｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓバリアントを有する株中では、天然Ｐｙｃを有する株と比べて、９％の最終Ｌ−リジン濃度の明らかな上昇が認められる。
【００５１】
本発明の枠内において、Ｌ−リジン産生の上昇をもたらす、ｐｙｃ遺伝子中の突然変異を同定できた。まずエラープローンＰＣＲを用いて、プラスミドベースのＰｙｃ突然変異体ライブラリーを作製し、続いて、そのライブラリーを、ＡＴＣＣ１３０３ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃ株中で、遺伝的にコードされたリジンセンサー（ｐＳｅｎＬｙｓ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、まず高まった蛍光に関してスクリーニングした。単離した細胞を、続いて増殖させ、リジン生成の上昇を試験した。これらの方法は、当業者には公知である（Ｂｉｎｄｅｒ等、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．、２０１２、１３：Ｒ４０を参照）。その際に単離された遺伝子バリアントおよび酵素バリアントを遺伝的に特性化すると、最終的には、Ｌ−リジンの産生、およびオキサロアセテートから誘導される他の代謝産物の産生を高める本発明によるＰｙｃバリアントが同定された。見出された突然変異は、Ｔ３４３ＡおよびＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓである。
【００５２】
１．染色体上にコードされたＰｙｃバリアントＰｙｃ−Ｔ３４３Ａ：
染色体上にコードされたＰｙｃバリアントＰｙｃ−Ｔ３４３Ａを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩのＬ−リジン産生の測定：
染色体上のｐｙｃ遺伝子中のトレオニンコドン３４３の、アラニンコドンでの置換は、当業者には公知の方法（Ｓｃｈａｅｆｅｒ等、１９９４、Ｇｅｎｅ  １４５：６９−７３、Ｈｏｃｈｈｅｉｍ等、２０１７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３９：２８３−２８８）により、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターを使用して、二重相同組換えを用いて行った。その産生を、染色体上の天然ｐｙｃ遺伝子を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ株と比較した。各株を、Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒシステム内の４％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースを含むＣＧＸＩＩ最小培地８００μｌ中で、２４ｈにわたり、３０℃および１２００ｒｐｍにおいて培養した（図１）。６００ｎｍでの開始ＯＤは０．５であった。２４ｈ後に、個々の培養の細胞を沈殿させ、上清中のＬ−リジン濃度を測定した。測定は、オルトフタルジアルデヒドによるアミノ酸のプレカラム誘導体化を伴う逆相ＨＰＬＣを介して行った。移動相としては、８０％溶液Ａ（１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．２））および２０％溶液Ｂ（１００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）メタノール）から２０％溶液Ａおよび８０％溶液Ｂへの勾配を使用した。この例は、調べたＰｙｃバリアントは、そのＰｙｃバリアントＰｙｃ−Ｔ３４３Ａが野生型Ｐｙｃタンパク質の代わりに染色体上にコードされている場合、リジン産生に対して有利な効果を有し、リジン産生が１５％まで高まり得ることを示す。
【００５３】
２．染色体上にコードされたＰｙｃバリアントＰｙｃ−Ｔ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓ：
染色体上にコードされたＰｙｃバリアントＰｙｃ−Ｔ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩのＬ−リジン産生の測定：
染色体上のｐｙｃ遺伝子中のトレオニンコドン３４３の、アラニンコドンでの置換およびイソロイシンコドン１０１２の、セリンコドンでの置換は、当業者には公知の方法（Ｓｃｈａｅｆｅｒ等、１９９４、Ｇｅｎｅ  １４５：６９−７３、Ｈｏｃｈｈｅｉｍ等、２０１７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３９：２８３−２８８）により、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターを使用して、二重相同組換えを用いて行った。その産生を、染色体上の天然ｐｙｃ遺伝子を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１Ｉ株と比較した。各株を、Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒシステム内の４％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースを含むＣＧＸＩＩ最小培地８００μｌ中で、２４ｈにわたり、３０℃および１２００ｒｐｍにおいて培養した（図１）。６００ｎｍでの開始ＯＤは０．５であった。２４ｈ後に、個々の培養の細胞を沈殿させ、上清中のＬ−リジン濃度を測定した。測定は、オルトフタルジアルデヒドによるアミノ酸のプレカラム誘導体化を伴う逆相ＨＰＬＣを介して行った。移動相としては、８０％溶液Ａ（１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．２））および２０％溶液Ｂ（１００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）メタノール）から２０％溶液Ａおよび８０％溶液Ｂへの勾配を使用した。この例は、調べたＰｙｃバリアントは、そのＰｙｃバリアントＰｙｃ−Ｔ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓが野生型Ｐｙｃタンパク質の代わりに染色体上にコードされている場合、リジン産生に対して有利な効果を有し、リジン産生が１９％まで高まり得ることを示す。
【００５４】
３．プラスミドにコードされたＰｙｃバリアントＰｙｃ−Ｔ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓ：
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃ／ｐＡＮ６−ｐｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２ＳのＬ−リジン産生の測定：
その産生を、天然ｐｙｃをコードするＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃ／ｐＡＮ６−ｐｙｃ株および空プラスミド対照Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ｌｙｓＣＴ３１１ＩΔｐｙｃ／ｐＡＮ６と比較した。各株を、Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒシステム内の４％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースおよび２５ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＣＧＸＩＩ最小培地８００μｌ中で、２４ｈにわたり、３０℃および１２００ｒｐｍにおいて培養した（図３）。６００ｎｍでの開始ＯＤは０．５であった。２４ｈ後に、個々の培養の細胞を沈殿させ、上清中のＬ−リジン濃度を測定した。測定は、オルトフタルジアルデヒドによるアミノ酸のプレカラム誘導体化を伴う逆相ＨＰＬＣを介して行った。移動相としては、８０％溶液Ａ（１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．２））および２０％溶液Ｂ（１００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）メタノール）から２０％溶液Ａおよび８０％溶液Ｂへの勾配を使用した。この例は、プラスミドｐＡＮ６上に野生型Ｐｙｃの代わりにＰｙｃバリアントＰｙｃＴ３４３Ａ；Ｉ１０１２Ｓがコードされている場合、リジン産生が９％まで高まり得ることを示す（図４）。
【００５５】
除外条項：
Ｏｈｎｉｓｈｉ等（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００２）５８：２１７−２２３）のような以下の従来技術、すなわち、野生株ＡＴＣＣ  １３０３２をベースとし、２つの点突然変異、ホモセリンデヒドロゲナーゼの遺伝子（ｈｏｍ）中のＶａｌ５９Ａｌａおよびアスパラギン酸キナーゼの遺伝子（ｌｙｓＣ）中のＴｈｒ３１１Ｉｌｅを担持するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＨＤ２中への、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＰｙｃの４５８位におけるプロリンからセリンへのアミノ酸置換の染色体への導入から、ならびにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ  ２１５２３由来のＰｙｃと比べて複数の突然変異（Ｍ１Ｖ、Ｅ１５３Ｄ、Ａ１８２Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｈ２２７Ｒ、Ａ４５２Ｇ、Ｄ１１２０Ｅ）を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４に由来するピルビン酸カルボキシラーゼが単離された生物に関する刊行物ＵＳ７，３００，７７７Ｂ２（特許文献１）から公知である突然変異は、本発明の主題ではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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