(57)【要約】  未改変ＭＳＣおよび改変ＭＳＣならびにそのエキソソームを含む医薬組成物を投与することによって、対象の老化関連疾患を治療する、および老化を阻害する方法が提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照の老化を阻害する、または老化関連疾患を治療する方法であって、実質的に羊膜胎盤間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含まず、薬学的に許容される担体と、
ａ．絨毛膜胎盤ＭＳＣ、
ｂ．絨毛膜胎盤ＭＳＣ由来エキソソーム、
ｃ．脱分化ＭＳＣ、
ｄ．脱分化ＭＳＣ由来エキソソーム、
ｅ．分化ＭＳＣ、
ｆ．分化ＭＳＣ由来エキソソームおよび
ｇ．上記のものの組合せ
のうち少なくとも１つのものとを含む医薬組成物を前記対象に投与し、それにより対象の老化を阻害することを含む、方法。
【請求項２】
ＭＳＣにＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４およびその組合せのうちいずれか１つのものを導入することによって前記脱分化ＭＳＣを作製する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
５−アザセチジン（ａｚａｃｅｔｉｄｉｎｅ）（５−ＡＺＡ）を含有する培地中でＭＳＣをインキュベートし、任意選択で、前記ＭＳＣを酸性培地または低酸素培地中でさらにインキュベートすることによって前記脱分化ＭＳＣを作製する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記老化が、筋肉老化、神経老化、膵臓老化および関節老化から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
神経老化が、認知機能障害、記憶障害またはその両方を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
筋肉老化が、筋量減少、線維症亢進またはその両方を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記老化関連疾患が、サルコペニア、線維症、２型糖尿病、関節炎、筋萎縮症、アルツハイマー病、認知症、脳卒中による脳損傷およびハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記線維症が心筋線維症または骨格筋線維症である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記関節炎が変形性関節症である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
老化を阻害することが、線維症の軽減、炎症の軽減、反応性酸化種（ＲＯＳ）産生の減少、筋量の増加、幹細胞自己再生の増大、グルコース恒常性の改善、認知機能の増進、記憶力の増進、軟骨細胞生存能の増大およびプロジェリン、ＳＲＳＦ１またはその両方のレベル低下のうち少なくとも１つのものを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）および衛星細胞のうちいずれか１つのものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療することが、
ａ．癌ではない老化関連疾患を治療すること、および
ｂ．癌の発症リスクを低下させること、癌を治療すること、またはその両方
を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記分化ＭＳＣを星状膠細胞、神経幹細胞、運動神経細胞、オリゴデンドロサイト、衛星細胞および筋芽細胞のうちいずれか１つのものに分化させる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）−１０ｂ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−１２２５、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−６７５、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）ＭＥＧ３およびｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯから選択される少なくとも１つの調節ＲＮＡを導入することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１５４およびｍｉＲ−２１のうち少なくとも１つのものに結合してこれを阻害する少なくとも１つのＲＮＡ阻害分子を前記ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣに導入することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象がヒトである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が獣医学的動物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
外来性マイクロＲＮＡ  ｌｅｔ−７と、ｍｉＲ−１３３ｂに結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子とを含む、遺伝子改変ＭＳＣ。
【請求項１９】
ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６７５から選択される少なくとも１つの外来性ｍｉＲを含む、遺伝子改変ＭＳＣ。
【請求項２０】
ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１３３ｂのうち少なくとも１つのものに結合してこれを阻害する少なくとも１つのＲＮＡ阻害分子を含む、遺伝子改変ＭＳＣ。
【請求項２１】
外来性ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５４に結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子およびその組合せのうち少なくとも１つのものを含む、遺伝子改変ＭＳＣ。
【請求項２２】
外来性ｍｉＲ−３７５、外来性ｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯ、ｍｉＲ−２１に結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子およびその組合せのうち少なくとも１つのものを含む、遺伝子改変ＭＳＣ。
【請求項２３】
外来性ｌｎｃＲＮＡ  ＭＥＧ３、外来性ｍｉＲ−１４３およびその組合せのうち少なくとも１つのものを含む、遺伝子改変ＭＳＣ。
【請求項２４】
外来性のｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５を含む、遺伝子改変ＭＳＣ。
【請求項２５】
ａ．請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の遺伝子改変ＭＳＣと、
ｂ．薬学的に許容される担体、補助剤または賦形剤と
を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
老化の阻害または老化関連疾患の治療への請求項２５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２７】
筋肉老化の治療への請求項２５に記載の医薬組成物の使用であって、前記組成物が、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子改変ＭＳＣを含む、使用。
【請求項２８】
ａ．２型糖尿病、
ｂ．癌または癌の発症リスクおよび
ｃ．上記のものの組合せ
のうちいずれか１つのものの治療への請求項２５に記載の医薬組成物の使用であって、  前記組成物が、請求項２２に記載の遺伝子改変ＭＳＣを含む、使用。
【請求項２９】
ａ．関節炎、
ｂ．神経老化、
ｃ．癌または癌の発症リスクおよび
ｄ．上記のものの組合せ
のうちいずれか１つのものの治療への請求項２５に記載の医薬組成物の使用であって、  前記組成物が、請求項２３に記載の遺伝子改変ＭＳＣを含む、使用。
【請求項３０】
ａ．筋肉老化、
ｂ．神経老化、
ｃ．ＨＧＰＳおよび
ｄ．上記のものの組合せ
のうちいずれか１つのものの治療への請求項２５に記載の医薬組成物の使用であって、  前記組成物が、請求項２４に記載の遺伝子改変ＭＳＣを含む、使用。
【請求項３１】
神経老化の治療への請求項２５に記載の医薬組成物の使用であって、前記組成物が、請求項２２に記載の遺伝子改変ＭＳＣを含み、前記ＭＳＣが、ｍｉＲ−２１に結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子を発現する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）ならびに老化および老化関連障害の治療へのその使用の分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、中胚葉由来間質細胞の不均一集団であり、自己の骨髄、歯髄もしくは脂肪組織または同種の羊水、胎盤および臍帯から得られる。ＭＳＣはＭＨＣＩＩ分子のレベルが低いため最小限の免疫原性を呈し、この特徴は羊水、絨毛膜胎盤および臍帯由来のＭＳＣでより顕著であり、これらは非免疫原性であると考えられている。このような非免疫原性細胞は誰にでも投与できるため、既製の細胞として使用することができる。これらの細胞由来のエキソソームも同じく非免疫原性であり、このようなものとして使用することもできる。最近の報告では、これらの細胞は生来的に軟骨細胞、骨細胞および脂肪細胞に分化することが可能であることに加えて、肝細胞、筋細胞、内皮細胞、神経細胞およびインスリン産生細胞を含めた他の細胞型に分化形質転換する可能性も秘めていることが明らかにされている。
【０００３】
ＭＳＣは、実験動物モデルで、またごく最近では予備臨床試験で様々な疾患および機能不全に治療効果を発揮することが示されている（Ｇａｏら，２０１５，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，１６８：３１９１−３１９９；Ｚｈａｎｇら，２０１３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，１０：１０６）。これらの細胞には、炎症および損傷部位に移動して生着し、常在組織内で局所効果を発揮する能力がある。これまでに、成体ＭＳＣが非免疫原性であることが報告されており、このことは、それを同種宿主に移植するのに免疫抑制は不要であることを示している。
【０００４】
いくつかの研究では、ＭＳＣが免疫抑制特性および免疫調節特性を有することが示されている。ＭＳＣの有益な効果は、主としてこの免疫調節活性および栄養因子の分泌に起因するものとされている。実際、ＭＳＣは成長因子、サイトカインおよびケモカインなどの多種多様な生物活性分子を分泌し、複数の組織に栄養を補給することができる。さらに、最近の研究では、ＭＳＣが細胞間コミュニケーションの一環として、様々なタンパク質に加えて、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子を送達する細胞外小胞を分泌することが明らかにされている。
【０００５】
創傷治癒の促進および組織成長の補助に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いることは以前から知られている。ごく最近では、骨髄ＭＳＣおよび臍帯ＭＳＣの培地を用いて皮膚の老化を抑えることが可能であることが示されている（米国特許第９２８４５２８号）。しかし、皮膚に限らず、あらゆる器官および系が老化による影響を受ける。先進諸国では、医学の飛躍的進歩ならびに栄養および生活習慣の改善によって平均寿命が延びるに伴って、老化を遅らせる、または老化関連障害を治療することができる治療法が大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＭＳＣおよびそのエキソソームを含む医薬組成物を投与することによって、対象の老化関連疾患を治療する、および老化を阻害する方法を提供する。
【０００７】
第一の態様では、対象の老化を阻害する、または老化関連疾患を治療する方法が提供され、この方法は、実質的に羊膜胎盤間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含まず、薬学的に許容される担体と、
ａ．絨毛膜胎盤ＭＳＣ；
ｂ．絨毛膜胎盤ＭＳＣ由来エキソソーム；
ｃ．脱分化ＭＳＣ；
ｄ．脱分化ＭＳＣ由来エキソソーム；
ｅ．分化ＭＳＣ；
ｆ．分化ＭＳＣ由来エキソソームおよび
ｇ．上記のものの組合せ
のうち少なくとも１つのものとを含む医薬組成物を対象に投与し、それにより対象の老化を阻害することを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣにＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４およびその組合せのうちいずれか１つのものを導入することによって脱分化ＭＳＣを作製する。いくつかの実施形態では、５−アザセチジン（ａｚａｃｅｔｉｄｉｎｅ）（５−ＡＺＡ）を含有する培地中でＭＳＣをインキュベートすることによって脱分化ＭＳＣを作製する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣを酸性培地中または低酸素下でさらにインキュベートすることによって脱分化ＭＳＣを作製する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、老化は、筋肉老化、神経老化、膵臓老化および関節老化から選択される。いくつかの実施形態では、神経老化は、認知機能障害、記憶障害またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、筋肉老化は、筋量減少、線維症亢進またはその両方を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、サルコペニア、線維症、２型糖尿病、関節炎、筋萎縮症、アルツハイマー病、認知症、脳卒中による脳損傷およびハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）から選択される。いくつかの実施形態では、線維症は心筋線維症または骨格筋線維症である。いくつかの実施形態では、関節炎は変形性関節症である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、老化を阻害することは、線維症の軽減、炎症の軽減、反応性酸化種（ＲＯＳ）産生の減少、筋量の増加、幹細胞自己再生の増大、グルコース恒常性の改善、認知機能の増進、記憶力の増進、軟骨細胞生存能の増大およびプロジェリン、ＳＲＳＦ１またはその両方のレベルの低下のうち少なくとも１つのものを含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）および衛星細胞のうちいずれか１つのものである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、治療することは、
ａ．癌ではない老化関連疾患を治療すること；および
ｂ．癌の発症リスクを低下させること、癌を治療すること、またはその両方
を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、分化ＭＳＣを星状膠細胞、神経幹細胞、運動神経細胞、オリゴデンドロサイト、衛星細胞および筋芽細胞のうちのいずれか１つに分化させる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）−１０ｂ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−１２２５、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−６７５、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）ＭＥＧ３およびｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯから選択される少なくとも１つの調節ＲＮＡを導入することをさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１５４およびｍｉＲ−２１のうち少なくとも１つのものに結合してこれを阻害する少なくとも１つのＲＮＡ阻害分子をＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣに導入することをさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は獣医学的動物である。
【００１７】
別の態様では、遺伝子改変ＭＳＣが提供され、ＭＳＣは、外来性マイクロＲＮＡ  ｌｅｔ−７と、ｍｉＲ−１３３ｂに結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子とを含む。
【００１８】
別の態様では、遺伝子改変ＭＳＣが提供され、ＭＳＣは、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６７５から選択される少なくとも１つの外来性ｍｉＲを含む。
【００１９】
別の態様では、遺伝子改変ＭＳＣが提供され、ＭＳＣは、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１３３ｂのうち少なくとも１つのものに結合してこれを阻害する少なくとも１つのＲＮＡ阻害分子を含む。
【００２０】
別の態様では、遺伝子改変ＭＳＣが提供され、ＭＳＣは、外来性ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５４に結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子およびその組合せのうち少なくとも１つのものを含む。
【００２１】
別の態様では、遺伝子改変ＭＳＣが提供され、ＭＳＣは、外来性ｍｉＲ−３７５、外来性ｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯ、ｍｉＲ−２１に結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子およびその組合せのうち少なくとも１つのものを含む。
【００２２】
別の態様では、遺伝子改変ＭＳＣが提供され、ＭＳＣは、外来性ｌｎｃＲＮＡ  ＭＥＧ３、外来性ｍｉＲ−１４３およびその組合せのうち少なくとも１つのものを含む。
【００２３】
別の態様では、遺伝子改変ＭＳＣが提供され、ＭＳＣは、外来性のｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５を含む。
【００２４】
別の態様では、
ａ．本発明の遺伝子改変；および
ｂ．薬学的に許容される担体、補助剤または賦形剤
を含む、医薬組成物が提供される。
【００２５】
老化の阻害および老化関連疾患の治療への本発明の医薬組成物の使用。
【００２６】
筋肉老化の治療への本発明の医薬組成物の使用であって、組成物が遺伝子改変ＭＳＣを含み、ＭＳＣが、
ａ．外来性マイクロＲＮＡ  ｌｅｔ−７およびｍｉＲ−１３３ｂに結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子；
ｂ．ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６７５から選択される少なくとも１つの外来性ｍｉＲ；
ｃ．ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１３３ｂのうち少なくとも１つのものに結合してこれを阻害する少なくとも１つのＲＮＡ阻害分子；ならびに
ｄ．外来性ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５４に結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子およびその組合せのうち少なくとも１つのもの
のうち少なくとも１つのものを含む、使用。
【００２７】
ａ．２型糖尿病；
ｂ．癌または癌の発症リスク；および
ｃ．上記のものの組合せ
のうちいずれか１つのものの治療への本発明の医薬組成物の使用であって、組成物が遺伝子改変ＭＳＣを含み、ＭＳＣが、外来性ｍｉＲ−３７５、外来性ｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯ、ｍｉＲ−２１に結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子およびその組合せのうち少なくとも１つのものを含む、使用。
【００２８】
ａ．関節炎；
ｂ．神経老化；
ｃ．癌または癌の発症リスク；および
ｄ．上記のものの組合せ
のうちいずれか１つのものの治療への本発明の医薬組成物の使用であって、組成物が遺伝子改変ＭＳＣを含み、ＭＳＣが、外来性ｌｎｃＲＮＡ  ＭＥＧ３、外来性ｍｉＲ−１４３およびその組合せのうち少なくとも１つのものを含む、使用。
【００２９】
ａ．筋肉老化；
ｂ．神経老化；
ｃ．ＨＧＰＳ；および
ｄ．上記のものの組合せ
のうちいずれか１つのものの治療への本発明の医薬組成物の使用であって、組成物が遺伝子改変ＭＳＣを含み、ＭＳＣが、外来性のｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５を含む、使用。
【００３０】
神経老化の治療への本発明の医薬組成物の使用であって、組成物が遺伝子改変ＭＳＣを含み、ＭＳＣが、ｍｉＲ−２１に結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子を発現する、使用。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態および全適用範囲については、のちに記載する詳細な説明から明らかになるであろう。ただし、当業者にはこの詳細な説明から本発明の趣旨および範囲に含まれる様々な変更および修正が明らかになることから、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すとともに単に例示として記載されるものであることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１Ａ−図１Ｃ。ＭＳＣが抗老化因子を発現することを示す図である。様々な組織に由来するＭＳＣでの抗老化遺伝子（１Ａ）ＴＩＭＰ２、（１Ｂ）ＧＤＦ１１および（１Ｃ）ＫＬＯＴＨＯの相対ｍＲＮＡ発現量を示す棒グラフ。
【図２】絨毛膜ＭＳＣおよび臍帯ＭＳＣがＲＯＳ産生を減少させることを示す図である。ミオスタチン処理から３日後の相対活性酸素種（ＲＯＳ）生成量を示す棒グラフ。
【図３】図３Ａ−図３Ｃ。ＭＳＣが筋肉再生を増大させ線維症を軽減することを示す図である。（３Ａ）５×１０５個のＭＳＣまたはそのエキソソームを注射してから４週間後のＭＤＸマウス四頭筋でのＴＮＦα、ユートロフィン、コラーゲンＩおよびＮＣＡＭの相対発現レベルを示す棒グラフ。（３Ｂ）様々な組織に由来するＭＳＣ５×１０５個を注射してから４週間後のＭＤＸマウス四頭筋でのコラーゲンＩの相対発現レベルを示す棒グラフ。（３Ｃ）ＭＳＣ５×１０５個に由来するエキソソームを注射してから４週間後のｍｄｘマウス四頭筋内のＮＣＡＭ陽性細胞をカウントすることによって測定したパーセント再生を示す棒グラフ。（３Ｄ）ＭＳＣ５×１０５個に由来するエキソソームを注射してから４週間後のｍｄｘマウス四頭筋内のＮＣＡＭ陽性細胞をカウントすることによって測定したパーセント再生を示す棒グラフ。（３Ｅ）様々な組織に由来するＭＳＣと共培養したヒト筋細胞の相対ユートロフィン発現レベルを示す棒グラフ。（３Ｆ）様々な組織のＭＳＣと共培養した後の健常筋芽細胞のうち少なくとも４個の細胞からなる筋管を形成した筋芽細胞の％を示す棒グラフならびに（３Ｇ）同健常筋芽細胞でのＭＹＨ２タンパク質発現を示すウエスタンブロット画像。（３Ｈ）様々な組織に由来するＭＳＣと共培養した後のＤＭＤ患者由来筋芽細胞のうち少なくとも４個の細胞からなる筋管を形成した筋芽細胞の％を示す棒グラフ。（３Ｉ）様々な組織のＭＳＣまたはそのエキソソームと共培養した後の衛星細胞でのＭｙｏＤタンパク質発現を示すウエスタンブロット画像。（３Ｊ）様々な組織のＭＳＣまたはそのエキソソームと共培養した後のマウスＣ２Ｃ１２細胞でのＭｙｏＤタンパク質発現のウエスタンブロット画像。ＢＭ−骨髄、ＡＤ−脂肪、ＡＭ−羊膜胎盤、ＣＨ−絨毛膜胎盤、ＵＣ−臍帯。（３Ｋ）移植から２週間後の移植ヒト筋芽細胞または衛星細胞の相対蛍光を示す棒グラフ。細胞は単独で移植するか、またはＭＳＣと共移植した。
【図４】ＭＳＣが老化筋肉モデルでの増殖を衛星細胞の非対称分裂とともに増大させることを示す図である。若年者（１５〜２０歳）血清および高年者（５５〜６０歳）血清の存在下で増殖させた衛星細胞培養物の相対ＭｙｏＤ発現量を示す棒グラフ。ＭｙｏＤ発現量は衛星細胞から筋芽細胞への非対称分裂の量の尺度となる。
【図５】図５Ａ−図５Ｃ。ＭＳＣがＮＳＣ自己再生を増大させることを示す図である。（５Ａ〜５Ｂ）トランスウェルでＭＳＣ、その小胞、臍帯血およびそれらの組合せと共培養した後のＮＳＣの自己再生を示す棒グラフであり、（５Ａ）はヒドロキシウレア処理を実施しなかった場合のもの、（５Ｂ）はヒドロキシウレア処理を実施した場合のものである。対照には培地のみでヒドロキシウレア処理を実施しない培養物を用い、これを１に設定した。
【図６】図６Ａ−図６Ｃ。脱分化ＭＳＣおよび未処理ＭＳＣを用いたサルコペニアの治療を示す図である。（６Ａ）１×１０６個の未刺激ＭＳＣおよび刺激ＭＳＣを注射してから４週間後の野生型マウス四頭筋の線維症マーカーであるコラーゲンＩおよび再生マーカーであるＮＣＡＭのパーセント発現変化を示す棒グラフ。偽注射を実施した対照四頭筋に対して測定した発現レベル。（６Ｂ）ＰＢＳまたはミオスタチンで処理してから３日後の筋管の直径（ｍＭ）を示す棒グラフ。（６Ｃ）心臓毒処理から７日後の野生型マウス腓腹筋に新たに生じた筋線維の数を示す棒グラフ。マウスには予めＰＢＳ、ＭＳＣまたは刺激ＭＳＣを注射した。
【図７】図７Ａ−図７Ｂ。ＭＳＣを用いた２型糖尿病の治療を示す図である。（７Ａ）未改変ＭＳＣおよびその細胞外小胞または（７Ｂ）ｍｉＲ−３７５とｍｉＲ−２１に対するアンタゴマーとを発現するＭＳＣを投与してから１０日後の糖尿病マウスの血糖レベルを示す棒グラフ。
【図８】図８Ａ−図８Ｂ。ＭＳＣを用いた変形性関節症の治療を示す図である。（８Ａ〜８Ｂ）ＩＬ−１ベータで処理し、トランスウェルでＭＳＣと共培養した後の（８Ａ）ヒト軟骨細胞および（８Ｂ）イヌ軟骨細胞のＳＡベータｇａｌ活性（老化）を示す棒グラフ。
【図９】図９Ａ−図９Ｅ。治療剤送達システムとしてのＭＳＣの使用を示す図である。（９Ａ）記載のアンタゴマーを充填したＭＳＣ由来エキソソームとインキュベートした後の筋芽細胞の相対ユートロフィンｍＲＮＡ発現量を示す棒グラフ。（９Ｂ）ｌｅｔ−７およびｍｉＲ−１３３ｂに対するアンタゴマーを発現するＣＨ−ＭＳＣを注射した後の筋細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでのユートロフィン発現を示すウエスタンブロット画像。（９Ｃ）ｌｅｔ−７に対するアンタゴマーを発現するＣＨ−ＭＳＣに由来する筋肉標的化エキソソームおよび未標的化エキソソームを注射した後の筋細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでのユートロフィン発現を示すウエスタンブロット画像。（９Ｄ）ｌｅｔ−７に対するアンタゴマーを発現するＣＨ−ＭＳＣと共培養した後のミオシン重鎖陽性細胞の相対数を示す棒グラフ。（９Ｅ）トランスフェクションにより細胞に改変ＭｙｏＤ  ｍＲＮＡを導入し、ＭＳＣ由来の予め充填したエキソソームとインキュベートするか、またはトランスウェルで改変ｍＲＮＡを発現するＭＳＣと共培養した後、ＭｙｏＤタンパク質に対する核染色がみられた筋芽細胞の数を示す棒グラフ。
【図１０】ＭＳＣが筋細胞の線維症を軽減することを示す図である。ＴＧＦベータで処理し、トランスウェルでＭＳＣと培養した骨格筋細胞および心筋細胞の相対コラーゲン１Ａ１発現量を示す棒グラフ。
【図１１】図１１Ａ−図１１Ｂ。ＭＳＣがＮＳＣの自己再生を増大させることを示す図である。（１１Ａ〜１１Ｂ）（１１Ａ）ヒドロキシウレアを添加せずに、および（１１Ｂ）ヒドロキシウレアを添加してＭＳＣとのトランスウェル培養で増殖させたＮＳＣの相対自己再生を示す棒グラフ。
【図１２】図１２Ａ−図１２Ｂ。ＭＳＣが多種多様な癌に対して抗腫瘍効果を発揮することを示す図である。（１２Ａ）ＭＳＣおよびその小胞の癌細胞増殖に対する効果を示す棒グラフ。バーは順に、神経膠腫、髄膜腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、白血病、肺転移および神経芽腫の癌細胞を表す。（１２Ｂ）ＭＥＧ−３、ｍｉＲ−１４３または両者の組合せを発現するＭＳＣとのトランスウェル培養の後、肺癌幹細胞の自己再生が減少したことを示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
いずれの図面もエラーバーは標準誤差を表す。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＭＳＣとそのエキソソームとを含む医薬組成物を投与することによって対象の老化関連疾患を治療する、および老化を阻害する方法を提供する。
【００３５】
一態様では、本発明は、必要とする対象の老化関連疾患を治療する方法に関するものであり、この方法は、薬学的に許容される担体と、
ａ．未改変ＭＳＣ；
ｂ．未改変ＭＳＣ由来エキソソーム；
ｃ．脱分化ＭＳＣ；
ｄ．脱分化ＭＳＣ由来エキソソーム；
ｅ．部分分化ＭＳＣ；
ｆ．部分分化ＭＳＣ由来エキソソームおよび
ｇ．その組合せ
のうち少なくとも１つのものとを含む医薬組成物を対象に投与し、それにより対象の老化関連病態を治療することを含む。
【００３６】
別の態様では、担体と、未改変ＭＳＣ；未改変ＭＳＣ由来エキソソーム；脱分化ＭＳＣ；脱分化ＭＳＣ由来エキソソーム；部分分化ＭＳＣ；部分分化ＭＳＣ由来エキソソームおよびその組合せのうち少なくとも１つのものとを含み、老化関連疾患の治療に使用する、医薬組成物が提供される。
【００３７】
別の態様では、本発明は、対象の老化を阻害する方法に関するものであり、この方法は、薬学的に許容される担体と、
ａ．未改変ＭＳＣ；
ｂ．未改変ＭＳＣ由来エキソソーム；
ｃ．脱分化ＭＳＣ；
ｄ．脱分化ＭＳＣ由来エキソソーム；
ｅ．部分分化ＭＳＣ；
ｆ．部分分化ＭＳＣ由来エキソソームおよび
ｇ．その組合せ
のうち少なくとも１つのものとを含む医薬組成物を対象に投与し、それにより対象の老化関連病態を治療することを含む。
【００３８】
別の態様では、担体と、未改変ＭＳＣ；未改変ＭＳＣ由来エキソソーム；脱分化ＭＳＣ；脱分化ＭＳＣ由来エキソソーム；部分分化ＭＳＣ；部分分化ＭＳＣ由来エキソソームおよびその組合せのうち少なくとも１つのものとを含み、老化の阻害に使用する、医薬組成物が提供される。
【００３９】
本明細書で使用される「老化」という用語は、生物体、具体的には生物体の細胞の自然な経時的劣化を指す。いくつかの実施形態では、老化は、幹細胞が分化細胞を生じさせる能力の低下を含む。いくつかの実施形態では、老化は、幹細胞が自己再生する能力の低下を含む。いくつかの実施形態では、老化は、老化に入っている細胞を含む。いくつかの実施形態では、老化は細胞死の亢進を含む。いくつかの実施形態では、老化は細胞呼吸の低下を含む。いくつかの実施形態では、老化は、細胞内の反応性酸化種（ＲＯＳ）の増加を含む。いくつかの実施形態では、老化は炎症亢進を含む。いくつかの実施形態では、老化は線維症亢進を含む。いくつかの実施形態では、老化は瘢痕組織の増加を含む。いくつかの実施形態では、老化は心臓従属栄養（ｃａｒｄｉａｃ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｙ）を含む。いくつかの実施形態では、老化はグルコース恒常性障害を含む。いくつかの実施形態では、老化は認知機能低下を含む。いくつかの実施形態では、老化は記憶力低下または記憶障害を含む。いくつかの実施形態では、老化は軟骨細胞生存能の低下を含む。いくつかの実施形態では、老化は、プロジェリン、セリン／アルギニンリッチスプライシング因子１（ＳＲＳＦ１）またはその両方のレベルの上昇を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、老化は皮膚老化ではない。いくつかの実施形態では、老化は、皮膚老化以外の任意のタイプの老化である。いくつかの実施形態では、老化は筋肉老化である。いくつかの実施形態では、老化は筋肉老化ではない。いくつかの実施形態では、老化は、皮膚老化および筋肉老化以外の任意の老化である。いくつかの実施形態では、老化は神経老化である。いくつかの実施形態では、老化は膵臓老化である。いくつかの実施形態では、老化は関節老化である。いくつかの実施形態では、老化は脳老化である。いくつかの実施形態では、老化は、筋肉老化、神経老化、膵臓老化および関節老化から選択される。いくつかの実施形態では、老化は、神経老化、膵臓老化および関節老化から選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、老化は認知機能低下を含む。いくつかの実施形態では、老化は筋量減少を含む。いくつかの実施形態では、老化はホルモン産生減少を含む。いくつかの実施形態では、老化は反射低下を含む。いくつかの実施形態では、老化は、特に限定されないが、循環系、筋骨格系、免疫系、呼吸器系、神経系、消化器系、辺縁系、グルコース恒常性系、神経筋系、関節系および腎臓系を含めた身体の系のうちの１つの機能障害を含む。
【００４２】
本明細書で使用される「老化関連疾患」は老年病を指す。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、年齢とともに有病率が増大する病態または疾患を指す。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、細胞老化が亢進している、または亢進したときに高い頻度で発症する疾患である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、老化関連疾患は皮膚疾患ではない。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、皮膚疾患ではない任意の老齢疾患である。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、筋疾患、神経疾患、関節疾患および膵疾患から選択される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、老化関連疾患は筋疾患である。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は筋疾患ではない。いくつかの実施形態では、筋疾患は、サルコペニアおよび線維症から選択される。いくつかの実施形態では、筋疾患は、サルコペニア、悪液質および線維症から選択される。いくつかの実施形態では、線維症は、心筋線維症、横隔膜線維症および骨格筋線維症から選択される。いくつかの実施形態では、線維症は心筋線維症である。いくつかの実施形態では、線維症は骨格筋線維症である。いくつかの実施形態では、筋疾患は、線維症、筋量減少および筋萎縮症のうち少なくとも１つのものを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、老化関連疾患は神経疾患である。いくつかの実施形態では、神経疾患は、記憶障害、認知機能障害、認知症、脳卒中による脳損傷およびアルツハイマー病から選択される。いくつかの実施形態では、神経疾患は、記憶障害、認知機能障害またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、神経疾患はアルツハイマー病である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、老化関連疾患は関節疾患である。いくつかの実施形態では、関節疾患は関節炎である。いくつかの実施形態では、関節疾患は変形性関節症である。いくつかの実施形態では、関節疾患は椎間板変性である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、老化関連疾患は膵疾患である。いくつかの実施形態では、老化関連疾患はグルコース恒常性の疾患である。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は２型糖尿病である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、老化関連疾患はハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）である。いくつかの実施形態では、本発明の方法はＨＧＰＳを治療する方法である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、サルコペニア、線維症、２型糖尿病、変形性関節症、筋萎縮症、アルツハイマー病およびＨＧＰＳから選択される。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、サルコペニア、線維症、２型糖尿病、関節炎、筋萎縮症、アルツハイマー病、認知症、脳卒中による脳損傷およびＨＧＰＳから選択される。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は癌である。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、サルコペニア、線維症、２型糖尿病、変形性関節症、筋萎縮症、アルツハイマー病、癌およびＨＧＰＳから選択される。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、サルコペニア、線維症、２型糖尿病、関節炎、筋萎縮症、アルツハイマー病、認知症、脳卒中による脳損傷、癌およびＨＧＰＳから選択される。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、サルコペニア、認知症、血管性認知症、アルツハイマー病、糖尿病、心血管疾患、骨粗鬆症、早老症候群、高血圧症、関節炎、白内障、腎疾患、肝疾患、線維症および癌から選択される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、癌ではない第一の老化関連疾患および癌である第二の老化関連疾患を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、癌ではない老化関連疾患を治療する、および癌の発症リスクを低下させるためのものである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、老化と同様の細胞損傷を示す疾患を含む。いくつかの実施形態では、老化と同様の損傷を示す疾患は、放射線誘発脳損傷、反復性頭部損傷症候群、自閉症、虚血性損傷、脳性麻痺およびＨＧＰＳから選択される。いくつかの実施形態では、虚血性損傷は虚血性脳損傷である。いくつかの実施形態では、虚血性損傷は虚血性心損傷である。いくつかの実施形態では、老化関連疾患はハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、老化対象のミクロビオームを変化させること、線維症を軽減すること、炎症を軽減すること、老化対象の炎症性応答を減少させること、および反応性酸化種（ＲＯＳ）の産生を減少させることのうち少なくとも１つのものを含む。いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、線維症を軽減することを含む。いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、筋量を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、幹細胞自己再生を増大させることを含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は神経幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は衛星細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は筋肉幹細胞である。いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、グルコース恒常性を改善することを含む。いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、認知機能を増進させることを含む。いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、記憶力を増進させることを含む。いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、プロジェリンレベル、ＳＲＳＦ１レベルまたはその両方を低下させることを含む。いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、軟骨細胞生存能を増大させることを含む。いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、癌を治療することを含む。いくつかの実施形態では、老化の治療または阻害は、癌の発症リスクを低下させることを含む。
【００５２】
本明細書で使用される「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」という用語は、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨芽細胞、骨格筋細胞および内皮細胞に分化する能力を有する多能性間質幹細胞を指す。ＭＳＣは、組織のなかでも特に骨髄、脂肪組織、末梢血、絨毛膜胎盤、羊膜胎盤、臍帯血および歯髄に存在する。「多能性」という用語は、多数の細胞型を生じることが可能な幹細胞を指す。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣは、臍帯または絨毛膜胎盤に由来するものである。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣは、歯髄、臍帯または絨毛膜胎盤に由来するものである。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣは絨毛膜胎盤に由来するものである。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣは臍帯に由来するものである。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣは歯髄に由来するものである。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣは、臍帯、歯髄および絨毛膜胎盤のうちいずれか１つのものに由来するものである。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣは羊膜胎盤に由来するものではない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は羊膜胎盤ＭＳＣを含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は羊膜胎盤ＭＳＣを実質的に含まない。
【００５３】
いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、獣医学的動物などの動物細胞である。いくつかの実施形態では、獣医学的動物は、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギから選択される。いくつかの実施形態では、細胞はイヌ科動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、筋関連疾患または筋損傷の治療が必要な対象に対して同種性である。いくつかの実施形態では、細胞は、筋疾患または筋損傷の治療が必要な対象に対して自己性である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣを投与に適した担体に懸濁させる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は獣医学的動物である。いくつかの実施形態では、対象はイヌ／イヌ科動物である。
【００５５】
絨毛膜ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣおよび臍帯ＭＳＣについては当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、以下のうちのいずれかの発現を検討することによって絨毛膜ＭＳＣまたはその分泌小胞を同定することができる：ａ）ＳＣＡ８、ＴＵ００１７６、ＬＩＮＣ−ＶＬＤＬＲおよび任意選択でＲＯＲからなる群より選択される１つまたは複数の長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）；ｂ）ｍｉｒ−３１６３、ｍｉｒ−１２８、ｍｉｒ−２７ａ、ｍｉｒ−２７ｂ、ｍｉｒ−１４８ａ、ｍｉｒ−１４８ｂ、ｍｉｒ−１５２、ｍｉｒ−６５１、ｍｉｒ−９、ｍｉｒ−４６６、ｍｉｒ−５７７、ｍｉｒ−３８０、ｍｉｒ−２９０９、ｍｉｒ−４８０３、ｍｉｒ−５５６−３ｐ、ｍｉｒ−１８２、ｍｉｒ−４６７７−５ｐ、ｍｉｒ−４６７２、ｍｉｒ−３９４２−５ｐ、ｍｉｒ−４７０３−５ｐ、ｍｉｒ−４７６５、ｍｉｒ−４２９１、ｍｉｒ−１４４、ｍｉｒ−１２０６、ｍｉｒ−４４３５、ｍｉｒ−４５２、ｍｉｒ−４６７６−３ｐ、ｍｉｒ−２５、ｍｉｒ−３２、ｍｉｒ−３６３、ｍｉｒ−３６７、ｍｉｒ−９２ａ、ｍｉｒ−９２ｂ、ｍｉｒ−３４０、ｍｉｒ−３６２０、ｍｉｒ−４３２４、ｍｉｒ−４７８９−５ｐ、ｍｉｒ−３４６、ｍｉｒ−９４４、ｍｉｒ−３１８０−５ｐ、ｍｉｒ−２０２、ｍｉｒ−５１１、ｍｉｒ−４３２６、ｍｉｒ−５７８、ｍｉｒ−４３１２、ｍｉｒ−４２８２、ｍｉｒ−５９７、ｍｉｒ−３６８９ｄ、ｍｉｒ−２１１６、ｍｉｒ−４５１７、ｍｉｒ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉｒ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉｒ−３１２９−５ｐ、ｍｉｒ−５２０ｄ−５ｐ、ｍｉｒ−５２４−５ｐ、ｍｉｒ−２０３、ｍｉｒ−３９４２−３ｐ、ｍｉｒ−５０１−５ｐ、ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−４７７０、ｍｉｒ−４４２２、ｍｉｒ−４４９５、ｍｉｒ−１２７１、ｍｉｒ−９６、ｍｉｒ−１２９７、ｍｉｒ−２６ａ、ｍｉｒ−２６ｂ、ｍｉｒ−４４６５、ｍｉｒ−４２７３、ｍｉｒ−１２９４、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉｒ−４４５８、ｍｉｒ−４５００、ｍｉｒ−９８、ｍｉｒ−４６５２−３ｐ、ｍｉｒ−４７１６−５ｐ、ｍｉｒ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉｒ−２２３、ｍｉｒ−４２８８、ｍｉｒ−４５５−５ｐ、ｍｉｒ−６３２、ｍｉｒ−４４７７ｂ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−５６１、ｍｉｒ−４６９８、ｍｉｒ−３１４０−３ｐ、ｍｉｒ−３６６２、ｍｉｒ−４１０、ｍｉｒ−３７６ａ、ｍｉｒ−３７６ｂ、ｍｉｒ−１２７０、ｍｉｒ−６２０、ｍｉｒ−５１５−５ｐ、ｍｉｒ−８７５−５ｐ、ｍｉｒ−１４０−５ｐ、ｍｉｒ−４２５６、ｍｉｒ−３０ａ、ｍｉｒ−３０ｂ、ｍｉｒ−３０ｃ、ｍｉｒ−３０ｄ、ｍｉｒ−３０ｅ、ｍｉｒ−４２５４、ｍｉｒ−５１５−３ｐ、ｍｉｒ−５１９ｅ、ｍｉｒ−２９６４ａ−５ｐ、ｍｉｒ−２１１５、ｍｉｒ−５２０ａ−５ｐ、ｍｉｒ−５２５−５ｐ、ｍｉｒ−１２４４、ｍｉｒ−３１９０、ｍｉｒ−５４８ａ−５ｐ、ｍｉｒ−５４８ａｂ、ｍｉｒ−５４８ａｋ、ｍｉｒ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉｒ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉｒ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉｒ−５４８ｈ、ｍｉｒ−５４８ｉ、ｍｉｒ−５４８ｊ、ｍｉｒ−５４８ｗ、ｍｉｒ−５４８ｙ、ｍｉｒ−５５９、ｍｉｒ−２６８１、ｍｉｒ−３６７１、ｍｉｒ−３７５、ｍｉｒ−４７８９−３ｐ、ｍｉｒ−３１４３、ｍｉｒ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉｒ−１２５ｂ、ｍｉｒ−４３１９、ｍｉｒ−５０９６、ｍｉｒ−３３８−５ｐ、ｍｉｒ−４９３、ｍｉｒ−３１５３、ｍｉｒ−８７５−３ｐ、ｍｉｒ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉｒ−３２３−３ｐ、ｍｉｒ−３０６５−５ｐ、ｍｉｒ−４７６２−３ｐ、ｍｉｒ−３６１７、ｍｉｒ−６４１、ｍｉｒ−１２４、ｍｉｒ−５０６、ｍｉｒ−４５３１、ｍｉｒ−４５１２、ｍｉｒ−５７０、ｍｉｒ−４６７９、ｍｉｒ−３１４４−３ｐ、ｍｉｒ−４７７７−３ｐ、ｍｉｒ−４７３２−３ｐ、ｍｉｒ−３１７７−５ｐ、ｍｉｒ−５４８ｎ、ｍｉｒ−４３２８、ｍｉｒ−２３５５−３ｐ、ｍｉｒ−４３３０、ｍｉｒ−４５２４、ｍｉｒ−４７１９、ｍｉｒ−３９７６、ｍｉｒ−５４４、ｍｉｒ−３６０７−３ｐ、ｍｉｒ−５８１、ｍｉｒ−２０５、ｍｉｒ−４７３１−３ｐ、ｍｉｒ−４８０１、ｍｉｒ−３６６７−５ｐ、ｍｉｒ−１２４５ｂ−３ｐ、ｍｉｒ−４７６０−３ｐ、ｍｉｒ−１３７、ｍｉｒ−３１９４−３ｐ、ｍｉｒ−３４２−３ｐ、ｍｉｒ−２６８２、ｍｉｒ−４４９ｃ、ｍｉｒ−５３２−３ｐ、ｍｉｒ−４３０５、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−２０６、ｍｉｒ−６１３、ｍｉｒ−６７６、ｍｉｒ−１２９６、ｍｉｒ−１９６ａ、ｍｉｒ−１９６ｂ、ｍｉｒ−３９４１、ｍｉｒ−４７９５−３ｐ、ｍｉｒ−４３１、ｍｉｒ−６０７、ｍｉｒ−５４８ｋ、ｍｉｒ−４４６４、ｍｉｒ−４７４８、ｍｉｒ−６５４−３ｐ、ｍｉｒ−５４４ｂ、ｍｉｒ−３０７４−５ｐ、ｍｉｒ−３１１５、ｍｉｒ−４６３５、ｍｉｒ−４３２３、ｍｉｒ−５４８ｔ、ｍｉｒ−４６８０−５ｐ、ｍｉｒ−１３３ａ、ｍｉｒ−１３３ｂ、ｍｉｒ−６００、ｍｉｒ−１２０８、ｍｉｒ−４７０８−５ｐ、ｍｉｒ−３１２３、ｍｉｒ−４２５１、ｍｉｒ−４３０７、ｍｉｒ−３１８５、ｍｉｒ−５８２−５ｐ、ｍｉｒ−４４３６ｂ−３ｐ、ｍｉｒ−３７８、ｈａｓ、ｍｉｒ−３７８ｂ、ｍｉｒ−３７８ｃ、ｍｉｒ−３７８ｄ、ｍｉｒ−３７８ｅ、ｍｉｒ−３７８ｆ、ｍｉｒ−３７８ｈ、ｍｉｒ−３７８ｉ、ｍｉｒ−４２２ａ、ｍｉｒ−４４６０、ｍｉｒ−２００ｂ、ｍｉｒ−２００ｃ、ｍｉｒ−４２９、ｍｉｒ−４４７０、ｍｉｒ、１２４５ｂ−５ｐ、ｍｉｒ−３１４２、ｍｉｒ−５７６−３ｐ、ｍｉｒ−５４８ｍ、ｍｉｒ−４６６６−３ｐ、ｍｉｒ−３２５、ｍｉｒ−３３０−３ｐ、ｍｉｒ−３６９０、ｍｉｒ−５４８ａ−３ｐ、ｍｉｒ−５４８ｅ、ｍｉｒ−５４８ｆ、ｍｉｒ−４７０９−５ｐ、ｍｉｒ−５３２−５ｐ、ｍｉｒ−５３９、ｍｉｒ−４３０３、ｍｉｒ−４３０２、ｍｉｒ−３００、ｍｉｒ−３８１、ｍｉｒ−４６４５−３ｐ、ｍｉｒ−３９１０、ｍｉｒ−１３０１、ｍｉｒ−５０４７、ｍｉｒ−１８８−５ｐ、ｍｉｒ−３９７４、ｍｉｒ−３９２３、ｍｉｒ−３６８６、ｍｉｒ−６７０、ｍｉｒ−２０５２、ｍｉｒ−５４８ａｌ、ｍｉｒ−３２００−３ｐ、ｍｉｒ−４６８６、ｈａｓ、ｍｉｒ−３５４５−５ｐ、ｍｉｒ−１９４、ｍｉｒ−４９８、ｍｉｒ−３９１３−３ｐ、ｍｉｒ−３１６８、ｍｉｒ−４９９−３ｐ、ｍｉｒ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉｒ−６５６、ｍｉｒ−４７６２−５ｐ、ｍｉｒ−４４９６、ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−２００ａ、ｍｉｒ−３５２９、ｍｉｒ−３７９、ｍｉｒ−３６９１−３ｐ、ｍｉｒ−５２０ｆ、ｍｉｒ−５０３、ｍｉｒ−４４７７ａ、ｍｉｒ−５１３ａ−３ｐ、ｍｉｒ−３１４９、ｍｉｒ−３９２７、ｍｉｒ−１２８３、ｍｉｒ−４７６７、ｍｉｒ−４８７ｂ、ｍｉｒ−４６３７、ｍｉｒ−１９ａ、ｍｉｒ−１９ｂ、ｍｉｒ−４６８３、ｍｉｒ−５４８ａｎ、ｍｉｒ−１２００、ｍｉｒ−４６３８−３ｐ、ｍｉｒ−１８２５、ｍｉｒ−５２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−９３からなる群より選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡ；ｃ）ＨＧＦ、ｗｎｔ２、ＧＤＮＦ、オステオプロテジェリン、ＭＩＰ３α、ＮＴ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＦＧＦ７、ＮＴ−４、ＥＧＦＬ６ならびに任意選択でＬＩＦおよびＢＤＮＦからなる群より選択される１つまたは複数の分泌因子；ｄ）ＴＣＲα−β、ＣＤ５５、ＬＩＦＲおよびＳＴ６ＧＡＬＮＡＣＳから選択される１つまたは複数の表面マーカー；ｅ）低ＹＫＬ４０およびＫＬＦ４から選択される１つまたは複数の幹細胞性および間葉性マーカー；ｆ）ＣＯＬ４Ａ２、ＬＧＡＬＳ３、ＳＣＵＢＥ１、ＬＧＡＳ３およびＳ１００Ａ１０からなる群より選択される１つまたは複数のタンパク質のＭＳＣ由来小胞発現；ｇ）ＢＣＭＳ、ＢＩＣおよび任意選択でＨＡＲ１Ｂからなる群より選択される１つまたは複数のｌｎｃＲＮＡのＭＳＣ由来小胞発現；ならびにｈ）その組合せ。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＳＫ、ＣＯＬ３Ａ１、Ｂ２Ｍ、ＣＤＨ２、ＣＴＮＮＡ１、ＤＬＧ１、ＥＧＦＲ、Ｆ３、ＦＡＲＰ１、ＧＰＣ１、ＣＤＨ２、ＣＴＮＮＡ１、ＨＡＰＬＮ１、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＰＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＬＯＸＬ２、ＭＣＡＭ、ＮＩＤ１、ＯＬＸＮＢ２、Ｓ１００Ａ６、ＴＮＣ、ＷＮＴ５ＡおよびＰＬＸＮＢ２からなる群より選択される１つまたは複数のタンパク質を含む細胞由来小胞によって絨毛膜ＭＳＣを同定してもよい。
【００５７】
他のＭＳＣについては、内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８０８３７００号に記載されているマーカーなどのマーカーによって同定し得る。
【００５８】
本明細書で使用される「脱分化ＭＳＣ」という用語は、幹細胞の特徴が少なくとも１つ増強されているが、依然としてＭＳＣ表現型を保持しているＭＳＣを指す。いくつかの実施形態では、脱分化ＭＳＣは、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４およびＫＬＦ４のうち少なくとも１つのものを発現する。いくつかの実施形態では、脱分化ＭＳＣは、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４およびＫＬＦ４のうち少なくとも１つのものを未処理ＭＳＣで発現する場合よりも高いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、脱分化ＭＳＣは、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４およびＫＬＦ４のうち複数のものを発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣにＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４およびその組合せのうちいずれか１つのものを導入することによって脱分化ＭＳＣを作製する。いくつかの実施形態では、導入は異所性導入または外来性導入である。いくつかの実施形態では、５−アザセチジン（ａｚａｃｅｔｉｄｉｎｅ）（５−ＡＺＡ）を含有する培地中でＭＳＣをインキュベートすることによって脱分化ＭＳＣを作製する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣを５−ＡＺＡと接触させることによって脱分化ＭＳＣを作製する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣを酸性培地または低酸素培地中でインキュベートすることによって脱分化ＭＳＣを作製する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣを５−ＡＺＡ、酸性培地、低酸素培地およびその組合せのうちいずれか１つのものとインキュベートすることによって脱分化ＭＳＣを作製する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ４４およびＣＤ１４６からなる群より選択される少なくとも１つの表面マーカーの発現を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ４４およびＣＤ１４６からなる群より選択される複数の表面マーカーの発現を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型はＩＬ−１０の発現を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、主要組織適合複合体タンパク質ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）の発現不在を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、ＣＤ７３発現、ＣＤ１０５発現、ＣＤ９０発現、ＣＤ１４６発現およびＣＤ４４発現からなる群より選択される少なくとも１つの発現マーカーならびにＭＨＣＩＩの発現不在を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、ＣＤ７３発現、ＣＤ１０５発現、ＣＤ９０発現、ＣＤ１４６発現およびＣＤ４４発現からなる群より選択される複数の発現マーカーならびにＭＨＣＩＩの発現不在を含む。
【００６０】
本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子産物の転写および／または翻訳を含めた前記遺伝子産物の生合成を指す。したがって、核酸分子の発現は、核酸フラグメントの転写（例えば、ｍＲＮＡもしくはその他の機能性ＲＮＡを生じる転写）および／またはＲＮＡから前駆体タンパク質もしくは成熟タンパク質（ポリペプチド）への翻訳を指し得る。いくつかの実施形態では、発現マーカーはＲＮＡ発現を指す。いくつかの実施形態では、発現マーカーはタンパク質発現を指す。いくつかの実施形態では、表面発現マーカーは、細胞の細胞表面上または細胞膜内でのタンパク質発現を指す。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は抗炎症能を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣは抗炎症性細胞である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、炎症を軽減する能力を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、抗炎症性サイトカインの分泌を含む。抗炎症性サイトカインは当業者に周知であり、特に限定されないが、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）がこれに含まれる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、炎症、損傷または疾患の部位にホーミングする能力を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は免疫調節能を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、対象の免疫系を調節する能力を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は免疫抑制能を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、対象の免疫系を抑制する能力を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、Ｔ細胞の活性化を低下させる能力を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ表現型は、炎症、損傷または疾患の部位にホーミングする能力を含む。
【００６５】
「分化ＭＳＣ」という用語は、特定の非ＭＳＣ表現型を有し、その表現型のマーカーを発現するよう分化しているが、依然としてＭＳＣ表現型も保持しているＭＳＣを指す。いくつかの実施形態では、部分分化ＭＳＣは、ＭＳＣ表現型と分化細胞型の表現型の両方の特徴が混ざった細胞である。いくつかの実施形態では、他の細胞型は、筋細胞、星状膠細胞、神経幹細胞（ＮＳＣ）および分化神経細胞から選択される。いくつかの実施形態では、筋細胞は衛星細胞および筋芽細胞から選択される。いくつかの実施形態では、分化神経細胞は運動神経細胞である。いくつかの実施形態では、分化神経細胞はオリゴデンドロサイトである。
【００６６】
ＭＳＣを分化させる方法については当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２０１５００３７２９８号に記載されている通りに星状膠細胞表現型への分化を実施する。いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２０１５００３７２９９号に記載されている通りにＮＳＣ表現型または分化神経細胞表現型への分化を実施する。これらの細胞ならびにその分泌エキソソームおよび小胞は、シナプス形成および認知機能を増大させ、内因性の神経再生を促進する。
【００６７】
ＭＳＣから筋表現型を有する細胞への分化は、以下のいずれかのプロトコル単独またはその組み合わせによって達成することができる。
【００６８】
プロトコル１：いくつかの実施形態では、ＭＳＣを準備し、ＭＳＣを酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤および５−ＡＺＡのうち少なくとも１つのものと接触させ、ＭＳＣにＨＧＦまたはＰＤＧＦβを導入し、ＭＳＣにＰＣＡＴ１およびＮＥＡＴ１を導入することによって本発明の細胞を作製することができる。
【００６９】
プロトコル２：いくつかの実施形態では、ＭＳＣを準備し、ＭＳＣを酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤および５−ＡＺＡのうち少なくとも１つのものと接触させ、ＭＳＣにＨＧＦまたはＰＤＧＦβを導入し、ＭＳＣにＧＡＳ５およびＰＴＥＮＰ１発現阻害剤を導入することによって本発明の細胞を作製することができる。
【００７０】
プロトコル３：いくつかの実施形態では、ＭＳＣを準備し；ＭＳＣを酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤および５−ＡＺＡのうち少なくとも１つのものと接触させ、ＭＳＣにＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＢＢ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβおよびＩＧＦ１を含む群より選択される少なくとも１つの成長因子を導入することによって本発明の細胞を作製する。
【００７１】
プロトコル４：いくつかの実施形態では、ＭＳＣにＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィン、ＭｙｏＤおよびＰＡＸ３、ＭｙｏＤおよびＰＡＸ７ならびにＭｙｏＤおよびＭＹＦ５からなる群より選択される少なくとも１つの転写因子を導入することによって本発明の細胞を作製する。
【００７２】
プロトコル５：いくつかの実施形態では、ＭＳＣを準備し；ＭＳＣを酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤および５−ＡＺＡのうち少なくとも１つのものと接触させ；ＭＳＣにＢＩＬ、ＰＡＲ５、ＢＩＣ、ＤＩＳＣ２、ＧＡＳ５ＤＬＧ２ＡＳ、７ＳＫ、Ｙ１、ＬＩＮＣＲＮＡ、ＰＣＡＴ−１、ＳＦＭＢＴ２、Ｙ４、ＳＣＡ８、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＧ３、ＮＥＡＴ１、ＥＧＯ、ＧＡＳ５、ＫＲＡＳＰ１、ＬＯＣ２８５１９、ＢＣ２００およびＨ１９からなる群より選択される少なくとも１つの長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を導入することによって本発明の細胞を作製する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡは、ＰＡＲ５、ＤＩＳＣ２およびＰＣＡＴ１から選択される。
【００７３】
プロトコル６：いくつかの実施形態では、ＭＳＣを準備し；ＭＳＣを酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤および５−ＡＺＡのうち少なくとも１つのものと接触させ；ＭＳＣにｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−５２０、ｍｉＲ−５２４、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−５５０、ｍｉＲ−５６１、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５８２、ｍｉＲ−５８３、ｍｉＲ−５８７、ｍｉＲ−６１３、ｍｉＲ−６１４、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６３４、ｍｉＲ−６４５、ｍｉＲ−６４６、ｍｉＲ−６４９、ｍｉＲ−６６１、ｍｉＲ−６６２、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−８８７、ｍｉＲ−１１８３、ｍｉＲ−１２２４、ｍｉＲ−１２２５、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２３４、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−１２５７、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−１２６９、ｍｉＲ−１２８９、ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−１９０９、ｍｉＲ−１９１１、ｍｉＲ−７５９、ｍｉＲ−３１５０、ｍｉＲ−３１７４、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３１９１、ｍｉＲ−３１９７、ｍｉＲ−４２９２、ｍｉＲ−２１１５、ｍｉＲ−４３１２、ｍｉＲ−９２、９３およびｍｉＲ−９９からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）を導入することによって本発明の細胞を作製する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍｉＲは、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−６１４、ｍｉＲ−３７５およびｍｉＲ−６６８からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲは、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−１２２５およびその組合せから選択される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−１２２５を導入する。
【００７４】
生細胞への遺伝子、ＲＮＡ、核酸またはタンパク質の導入については当業者に周知である。本明細書で使用される「導入」は、細胞内に遺伝子、タンパク質または化合物を外来性に加えることを指す。導入は、内因性の遺伝子発現、タンパク質または化合物を増大させることを指すものではない。このような導入の例としては、特に限定されないが、トランスフェクション、レンチウイルス感染、ヌクレオフェクションまたは形質導入が挙げられる。いくつかの実施形態では、導入はトランスフェクションによるものである。いくつかの実施形態では、導入をｅｘ  ｖｉｖｏで実施する。いくつかの実施形態では、導入をｉｎ  ｖｉｖｏで実施する。いくつかの実施形態では、導入をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施する。いくつかの実施形態では、導入は、目的とする遺伝子を含むベクターを導入することを含む。
【００７５】
ベクターは、非ウイルス法により、またはウイルス法により送達するＤＮＡプラスミドであり得る。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはポックスウイルスベクターであり得る。プロモーターは哺乳動物細胞内で活性を示すものであり得る。プロモーターはウイルスプロモーターであり得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション（例えば、Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５）に記載されているもの）、熱ショック、ウイルスベクターによる感染、小さいビーズもしくは粒子のマトリックス内もしくは表面に核酸を有する小粒子による高速弾道貫通（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７．７０−７３（１９８７））および／またはこれに類するものを含めた標準的方法によって細胞にベクターを導入する。いくつかの実施形態では、ベクター、ｍｉＲ、ｌｎｃＲＮＡまたはＲＮＡ阻害分子をＭＳＣにトランスフェクトする。
【００７７】
いくつかの実施形態では、哺乳動物発現ベクターとしては、特に限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（±）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（±）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社から入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能なｐＴＲＥＳならびにその誘導体が挙げられる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスなどの真核ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターを本発明により使用する。ＳＶ４０ベクターとしては、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、ウシパピローマウイルスに由来するベクターとしてはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタインバーウイルスに由来するベクターとしてはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が挙げられる。その他の例示的ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥおよびＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞での発現に有効であることがわかっている他のプロモーターの指令下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、水平感染および標的化特異性などの利点が得られる組換えウイルスベクターをｉｎ  ｖｉｖｏの発現に使用する。一実施形態では、水平感染は、例えばレトロウイルスの生活環に本来備わっているものであり、単一の感染細胞から多数の子孫ビリオンが生じ、それが出芽して隣接する細胞に感染する過程である。一実施形態では、その結果は、大きな領域が急速に感染し、そのほとんどが最初、元のウイルス粒子に感染していなかったものであるというものである。一実施形態では、水平に伝播することができないウイルスベクターを作製する。一実施形態では、この特徴は、所望の目的が特定の遺伝子を限局された数の標的細胞のみに導入することである場合に有用であり得る。
【００８０】
本発明の発現ベクターを細胞に導入するのに様々な方法を用いることができる。このような方法は一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２），Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９），Ｃｈａｎｇら，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｇａら，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）およびＧｉｌｂｏａら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に記載されており、例えば、安定なトランスフェクションまたは一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組換えウイルスベクターによる感染がこれに含まれる。さらに、ポジティブ−ネガティブ選択法については米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【００８１】
一実施形態では、植物発現ベクターを使用する。一実施形態では、ポリペプチドコード配列の発現を多数のプロモーターにより駆動させる。いくつかの実施形態では、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４（１９８４）］またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕら，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１（１９８７）］を使用する。別の実施形態では、植物プロモーター、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０（１９８４）；およびＢｒｏｇｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３（１９８４）］または熱ショックプロモーター、例えばダイズｈｓｐ１７．５−Ｅもしくはｈｓｐ１７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５（１９８６）］などを使用する。一実施形態では、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび当業者に周知のその他の技術を用いて構築物を植物細胞に導入する。例えば、ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ  ４２１−４６３（１９８８）］を参照されたい。当該技術分野で周知の昆虫および哺乳動物の宿主細胞系などの他の発現系も本発明により使用することができる。
【００８２】
本発明の発現構築物は、（ポリペプチドをコードする）挿入コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む以外に、発現するポリペプチドの安定性、産生、精製、収率または活性を最適化するよう操作した配列も含み得ることが理解されよう。
【００８３】
いくつかの実施形態では、目的とする遺伝子の導入は、細胞への薬物投与により目的とする遺伝子の発現を誘導する誘導ベクターの導入を含む。薬物誘導ベクターについては当該技術分野で周知であり、いくつかの非限定的な例としては、タモキシフェン誘導ベクター、テトラサイクリン誘導ベクターおよびドキシサイクリン誘導ベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、誘導ベクターをＭＳＣにｅｘ−ｖｉｖｏで導入し、ＭＳＣをｉｎ−ｖｉｖｏで誘導薬物と接触させる。このようにして、誘導遺伝子の発現およびその結果としてＭＳＣの刺激または分化がｉｎ−ｖｉｖｏでのみ起こる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣが対象の身体のある位置にホーミングした後に限りＭＳＣの刺激または分化が起こる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、導入は改変ｍＲＮＡの導入を含む。「改変ｍＲＮＡ」という用語は、細胞の細胞質内に導入され、そこでタンパク質に翻訳され得る安定なｍＲＮＡを指す。このようなｍＲＮＡはタンパク質発現に転写を必要とせず、したがって、タンパク質の産生速度が速く、調節を受けにくい。改変ｍＲＮＡについては当該技術分野で周知である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ＴＩＭＰ２、ＧＤＦ１１およびＫＬＯＴＨＯから選択される少なくとも１つの抗老化因子を発現する。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣはｍｉＲ−６７５を発現する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣにＴＩＭＰ２、ＧＤＦ１１、ＫＬＯＴＨＯまたはｍｉＲ−６７５が導入されている。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣに阻害剤ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−３４のうち少なくとも一方が導入されている。いくつかの実施形態では、阻害剤はアンタゴマーである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣにｍｉＲ−３７５が導入されている。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは外来性ｍｉＲ−３７５を発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは外来性ｋｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯを発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣのｍｉＲ−２１が発現抑制されている。いくつかの実施形態では、発現抑制は、細胞にＲＮＡ阻害分子を導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ阻害分子は、標的ｍｉＲに結合してこれを阻害する。いくつかの実施形態では、この分子はアンタゴマーである。いくつかの実施形態では、細胞にｍｉＲ−２１アンタゴマーが導入されている。いくつかの実施形態では、細胞に外来性ｍｉＲ−３７５、ｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯ、ｍｉＲ−２１アンタゴマーまたはその組合せが導入されている。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは外来性ｍｉＲ−１４３を発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは外来性長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）ＭＥＧ３を発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは外来性ｍｉＲ−１４３およびＭＥＧ３を発現したものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−４２４、１９５、１６、４９７、１３５、６７９３、１３３ｂ、２１４および２１のうち少なくとも１つのものが発現抑制されている。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６７５から選択される少なくとも１つの外来性ｍｉＲを発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは外来性ｍｉＲ−１４５を発現する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣはｍｉＲ−１５４が発現抑制されている。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは外来性ｍｉＲ−１４５を発現したものであり、ｍｉＲ−１５４が発現抑制されている。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−６７５、ｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯおよび長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）ＭＥＧ３から選択される少なくとも１つの調節ＲＮＡを発現したものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、外来性のｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５を発現したものである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞の組合せおよび任意選択でそのエキソソームの投与を含む。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣと脱分化ＭＳＣを一緒に投与する。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣと分化ＭＳＣを一緒に投与する。いくつかの実施形態では、分化ＭＳＣと脱分化ＭＳＣを一緒に投与する。いくつかの実施形態では、上記のいずれかの細胞型由来のエキソソームも一緒に投与する。
【００８８】
当業者には、分化ＭＳＣを、治療する老化または老化関連疾患の特定の様相に関連する細胞の表現型を有するよう分化させることが理解されよう。例えば、ＭＳＣを、筋力低下の治療のための筋細胞表現型またはアルツハイマー病の治療のための神経細胞表現型を有するよう分化させる。いくつかの実施形態では、２つの異なる細胞型に分化させたＭＳＣを一緒に投与する。いくつかの実施形態では、筋細胞表現型に分化させた単独のＭＳＣまたはそのエキソソームを有するＭＳＣと、神経細胞表現型に分化させた単独のＭＳＣまたはそのエキソソームを有するＭＳＣとを共投与する。
【００８９】
本明細書で使用される「細胞外小胞」という用語は、特に限定されないが、エキソソームおよび微小胞を含めた、ＭＳＣから分泌されるあらゆる細胞由来小胞を指す。本明細書で使用される「エキソソーム」は、エンドサイト―シスを起源とし、ＭＳＣから分泌される、大きさ５０〜１００ｎｍの細胞由来小胞を指す。非限定的な実施形態として、エキソソーム細胞の生成には、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭおよびエキソソームから枯渇させたヒト血清アルブミンまたは５％ＦＢＳで細胞を維持する。いくつかの実施形態では、エキソソームはあらゆる細胞外小胞を含む。
【００９０】
本明細書で使用される「微小胞」は、細胞膜から生じ、ＭＳＣから分泌される、大きさ１００〜１０００ｎｍの細胞由来小胞を指す。
【００９１】
エキソソーム、細胞外小胞または微小胞は、エキソソームから枯渇させた血清を含む培地中、またはＯｐｔｉＭｅＭなどの無血清培地中でＭＳＣを増殖させ、次いで、超遠心分離によりエキソソームを単離することによって得ることができる。ビーズ、カラム、フィルターおよび抗体によるその他の方法も用いる。いくつかの実施形態では、エキソソームの生成量を増大させるため、細胞を低酸素条件下で増殖させるか、低ｐＨ培地でインキュベートする。他の実施形態では、エキソソームの分泌および生成量を増大させるため、細胞を放射線に曝露する。いくつかの実施形態では、エキソソームを投与に適した担体に懸濁させる。
【００９２】
医薬組成物
本明細書で使用される「担体」、「賦形剤」または「補助剤」という用語は、医薬組成物の成分であって、活性薬剤ではない任意の成分を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、任意のタイプの無毒性で不活性な固体、半固体、液体の充填剤、希釈剤、封入材料、製剤助剤または単に生理食塩水など無菌水性媒体を指す。薬学的に許容される担体としての役割を果たし得る材料のいくつかの例として、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖、コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン、セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；トラガント末；麦芽、ゼラチン、タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；油、例えばラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；無発熱物質水；等張食塩水、リンガー溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液ならびに医薬製剤に使用されるその他の無毒性で適合性のある物質がある。本明細書で担体としての役割を果たし得る物質のいくつかの非限定的な例としては、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、トラガント末、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油、ポリオール、アルギン酸、無発熱物質水、等張食塩水、リン酸緩衝液、カカオ脂（坐剤基剤）、乳化剤ならびに他の医薬製剤に使用されるその他の無毒性で薬学的に適合する物質が挙げられる。ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤および滑沢剤ならびに着色剤、香味剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤および保存剤が存在していてもよい。本明細書で企図される組成物の製剤化には、任意の無毒性、不活性で、かつ効果的な担体を使用し得る。この点で適切な薬学的に許容される担体、賦形剤および希釈剤については当業者に周知であり、例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，第１３版，Ｂｕｄａｖａｒｉら編，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（２００１）；ＣＴＦＡ（米国化粧品工業会）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第１０版（２００４）；および「Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ」，米国食品医薬品局（ＦＤＡ）医薬品評価研究センター（ＣＤＥＲ）管理局に記載されているものなどがある。本発明の組成物に有用な薬学的に許容される賦形剤、担体および希釈剤の例としては、蒸留水、生理的食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス液およびＤＭＳＯが挙げられる。これらの追加の不活性成分ならびに効果的な製剤および投与方法については当該技術分野で周知であり、標準的なテキスト、例えばそれぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉ��ｌｍａｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｇｉｌｍａｎら編，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）；ならびにＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，（２００５）などに記載されている。本明細書に記載される組成物を人工的に作製した構造物、例えばリポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、徐放粒子およびペプチドまたはポリペプチドの血清中での半減期を増大させるその他の媒体などに入れてもよい。リポソームとしては、エマルション、泡、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層などが挙げられる。本明細書に記載されるペプチドとともに使用するリポソームは、一般に中性および負荷電リン脂質ならびにコレステロールなどのステロールを含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は一般に、リポソームの大きさおよび血中での安定性などの考慮事項によって決まる。リポソームの調製には、例えばＣｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに概説されている様々な方法を用いることができ、ほかにも米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号を参照されたい。
【００９３】
担体は全体で、本明細書に記載される医薬組成物の約０．１重量％〜約９９．９９９９９重量％を占め得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、羊膜胎盤ＭＳＣを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＰＢＳ、生理食塩水またはリンガー溶液中にある。
【００９４】
細胞への添加
いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ｌｅｔ７、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６７５から選択される少なくとも１つの外来性ｍｉＲを含む。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、外来性のｌｅｔ７、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５またはｍｉＲ−６７５を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−２１またはｍｉＲ−１３３ｂの発現抑制を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、いずれかの外来性ｍｉＲをいずれかの発現抑制と組み合わせ得る。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１３３ｂのうち少なくとも１つのものの発現抑制を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、外来性ｌｅｔ  ７とｍｉＲ−１３３ｂの発現抑制とを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は筋疾患であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ｌｅｔ７、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６７５から選択される少なくとも１つの外来性ｍｉＲを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は筋疾患であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１３３ｂのうち少なくとも１つのものの発現抑制を含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は筋疾患であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、外来性ｌｅｔ７とｍｉＲ−１３３ｂの発現抑制とを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣはｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯを含む。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣはｍｉＲ−３７５を含む。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは発現抑制されたｍｉＲ−２１を含む。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ｍｉＲ−３７５、ｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯ、発現抑制されたｍｉＲ−２１またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は２型糖尿病であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ｍｉＲ−３７５、ｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯ、発現抑制されたｍｉＲ−２１またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は神経疾患であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは発現抑制されたｍｉＲ−２１を含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は癌またはそのリスクであり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ｍｉＲ−３７５、発現抑制されたｍｉＲ−２１またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、２型糖尿病および癌またはそのリスクであり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ｍｉＲ−３７５、ｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯ、発現抑制されたｍｉＲ−２１またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、神経疾患および癌またはそのリスクであり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ｍｉＲ−３７５、ｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯ、発現抑制されたｍｉＲ−２１またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、神経疾患および癌またはそのリスクであり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは発現抑制されたｍｉＲ−２１を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣはＭＥＧ３を含む。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣはｍｉＲ−１４３を含む。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ＭＥＧ３、ｍｉＲ−１４３またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は変形性関節症であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣはＭＥＧ３を含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は変形性関節症であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣはｍｉＲ−１４３を含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は神経疾患であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ＭＥＧ３、ｍｉＲ−１４３またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は癌であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ＭＥＧ３、ｍｉＲ−１４３またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、変形性関節症および癌もしくはそのリスク、または神経疾患および癌もしくはそのリスクであり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、ＭＥＧ３、ｍｉＲ−１４３またはその組合せを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは外来性ｍｉＲ−１４５を含む。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣはｍｉＲ−１５４の発現抑制を含む。いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、外来性ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５４の発現抑制またはその組合せを含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は筋疾患であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、外来性ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５４の発現抑制またはその組合せを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、外来性のｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５を含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は筋疾患であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、外来性のｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５を含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は神経疾患であり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、外来性のｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５を含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患はＨＧＰＳであり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、外来性のｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５を含む。いくつかの実施形態では、老化関連疾患は、筋疾患、神経疾患、ＨＧＰＳおよびその組合せのうちいずれか１つのものであり、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、外来性のｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは、その細胞表面またはそのエキソソームの表面に標的化部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、疾患は筋疾患であり、標的化部分は筋肉標的化部分である。いくつかの実施形態では、この部分は、衛星細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞および心筋細胞から選択される筋細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、疾患は神経疾患であり、標的化部分は神経細胞標的化部分である。いくつかの実施形態では、この部分は、ＮＳＣ、運動神経細胞、副交感神経細胞、ＧＡＢＡ作動性神経細胞、星状膠細胞および有髄神経細胞から選択される神経細胞を標的とする。標的化部分については当該技術分野で周知であり、これらの部分を細胞表面および細胞の細胞外小胞上に発現させる方法についても同様である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、未改変ＭＳＣ、脱分化ＭＳＣまたは分化ＭＳＣは治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、治療剤は筋肉治療剤である。いくつかの実施形態では、治療剤は神経細胞治療剤である。いくつかの実施形態では、治療剤は、薬物、リードスルー薬、ＲＮＡ、ＤＮＡ分子、ベクター、エクソンスキリング（ｅｘｏｎ  ｓｋｉｌｌｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンタゴマー、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）およびウイルスからなる群より選択される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、薬物は、オキシトシン、メラトニン、Ｇ−ＣＳＦ、ボルテゾミブおよびメトホルミンから選択される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法を疾患または病態の標準治療とともに実施する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、抗老化薬を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗老化薬は、オキシトシン、メラトニン、Ｇ−ＣＳＦおよびメトホルミンからなる群より選択される。
【０１０４】
別の態様では、老化対象または罹患対象に正常な酸化ストレスを回復させるためのＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣに由来するミトコンドリアの使用が提供される。いくつかの実施形態では、この使用は、正常な代謝を回復させることを含む。いくつかの実施形態では、この使用は、正常レベルのＲＯＳを回復させることを含む。いくつかの実施形態では、この使用は、栄養因子、エキソソームおよび細胞外小胞のうち少なくとも１つのものの正常な発現を回復させることを含む。
【０１０５】
別の態様では、必要とする対象の正常な酸化ストレスを回復させる方法が提供され、この方法は、対象に担体と、ＵＣまたはＣＨ−ＭＳＣに由来するミトコンドリアとを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０１０６】
ＭＳＣ組成物
別の態様では、外来性ｌｅｔ−７と、ｍｉＲ−１３３ｂを発現抑制するＲＮＡ阻害分子とを発現する、ＭＳＣが提供される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは筋疾患の治療に使用するものである。
【０１０７】
別の態様では、ｌｅｔ７、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６７５から選択される少なくとも１つの外来性ｍｉＲを発現する、ＭＳＣが提供される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは筋疾患の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５４およびｍｉＲ−１３３ｂのうち少なくとも１つのものを発現抑制する少なくとも１つのＲＮＡ阻害分子をさらに発現する。
【０１０８】
別の態様では、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５４およびｍｉＲ−１３３ｂのうち少なくとも１つのものを発現抑制する少なくとも１つのＲＮＡ阻害分子を発現する、ＭＳＣが提供される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは筋疾患の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ｌｅｔ７、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６７５から選択される少なくとも１つの外来性ｍｉＲをさらに発現する。
【０１０９】
別の態様では、外来性ｍｉＲ−３７５、外来性ｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯ、ｍｉＲ−２１を発現抑制するＲＮＡ阻害分子およびその組合せのうちいずれか１つのものを発現する、ＭＳＣが提供される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは２型糖尿病の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは癌の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ｍｉＲ−２１に結合してこれを阻害するＲＮＡ阻害分子を発現し、神経老化の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは癌の発症リスクの治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、２型糖尿病および癌または癌の発症リスクの治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、神経老化および癌または癌の発症リスクの治療に使用するものである。
【０１１０】
別の態様では、外来性ｌｎｃＲＮＡ  ＭＥＧ３、外来性ｍｉＲ−１４３およびその組合せのうち少なくとも１つのものを発現する、ＭＳＣが提供される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは関節炎の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、関節炎は変形性関節症である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは神経疾患の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは癌の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは癌の発症リスクの治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、関節炎および癌または癌の発症リスクの治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、神経疾患および癌または癌の発症リスクの治療に使用するものである。
【０１１１】
別の態様では、外来性ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５４を発現抑制するＲＮＡ阻害分子およびその組合せのうちいずれか１つのものを発現する、ＭＳＣが提供される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは筋疾患／老化の治療に使用するものである。
【０１１２】
別の態様では、外来性のｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５を発現するＭＳＣが提供される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは筋疾患／老化の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは神経疾患／老化の治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣはＨＧＰＳの治療に使用するものである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、筋疾患／老化、神経疾患／老化、ＨＧＰＳおよびその組合せのうちいずれか１つのものの治療に使用するものである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは遺伝子改変ＭＳＣである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは単離されている。
【０１１４】
別の態様では、薬学的に許容される担体、補助剤または賦形剤と、少なくとも１つの本発明の遺伝子改変ＭＳＣとを含む、医薬組成物が提供される。医薬組成物は、組成物中にある細胞と用途が同じであることが理解されよう。
【０１１５】
本明細書で使用される「投与すること」、「投与」という用語およびこれに類する用語は、妥当な医療行為において、活性薬剤を含有する組成物を治療効果が得られるように対象に送達する任意の方法を指す。本発明の主題の一態様は、必要とする対象に治療有効量の本発明の主題の組成物を経口投与することを提供する。その他の適切な投与経路としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、頭蓋内、鼻腔内または腹腔内が挙げられる。
【０１１６】
投与する用量は、被投与者の年齢、健康状態および体重、実施する場合は同時に実施する治療の種類、治療の頻度および望まれる効果の性質によって決まる。
【０１１７】
本明細書で使用される特定の用語の定義が本明細書に記載される。別途定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似しているか、同等のものであり、本発明の実施に使用することが可能な方法および材料が多数認識されよう。実際、本発明は、決して記載される方法および材料に限定されることはない。
【０１１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容からそうでないことが明らかでない限り、複数形の指示対象を包含する。例えば、「ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（核酸）」と言う場合、それは２つ以上の核酸の組合せなどを包含する。
【０１１９】
本明細書で使用される「約」は、当業者によって理解されるものであり、それが使用される文脈によってある程度異なる。この用語が、それが使用されている文脈を考慮に入れても当業者に明確でない形で使用されている場合、「約」は、列挙される数値の最大±１０％を意味する。
【０１２０】
以下の実施例を検討すれば、当業者には本発明のほかの目的、利点および新規な特徴が明らかになるが、これらの実施例は限定することを意図するものではない。さらに、上に詳述され、のちの請求項の節で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様はそれぞれ、以下の実施例で実験的に裏付けられる。
【０１２１】
（実施例）
材料および方法
胎盤由来ＭＳＣおよび臍帯由来ＭＳＣの調製
以下のプロトコルに従い、ヒト、イヌから胎盤ＭＳＣおよび臍帯ＭＳＣを単離した。組織をＰＢＳで洗浄した。羊膜および絨毛膜を機械的に小片に断片化し、次いで、２段階の酵素消化を実施した。（１）上皮細胞を除去するため、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡと３７℃で３０分間インキュベートした。（２）３７℃にて０．１％コラゲナーゼＩＶで６０分間処理した後、ウシ胎児血清で失活させた。次いで、細胞懸濁液を１００μＭのフィルターでろ過し、遠心分離した細胞を１５％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンからなるＤＭＥＤ培地／栄養素混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）の入った７５ｃｍ２のＣｏｒｎｉｎｇフラスコに播種した。あるいは、細胞を無血清ＭＳＣ培地で維持した。臍帯由来ＭＳＣの調製にも同様の手順を用いた。次いで、細胞をＲｏｃｋ阻害剤と１日間インキュベートした後、低酸素条件下でさらに２４時間インキュベートした。エキソソームを取り除いた培地で細胞を維持した。
【０１２２】
ＲＯＳ検出
ミオスタチンで処理した後、ＲＯＳ−Ｇｌｕ  Ｈ２Ｏ２およびＧＳＨ／ＧＳＳＧ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて細胞の酸化ストレスをアッセイした。ＪＣ−１キット（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いてミトコンドリア膜電位を測定した。
【０１２３】
エキソソーム単離
多段階遠心分離により細胞培地からのエキソソーム単離を４℃で実施した。簡潔に述べれば、培地を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して大きな残屑を除去し、次いで、０．２２μｍのフィルターでろ過して小さい細胞残屑を除去した。次いで、上清を１００，０００×ｇで１〜２時間遠心分離した。電子顕微鏡法およびナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）でＣＤ６３、ＣＤ９およびＡＬＩＸの発現によりエキソソームを同定した。総タンパク質濃度の測定およびＣＤ６３  ＥＬＩＳＡ（ＳＢＩ社）によりエキソソームの定量化を解析した。
【０１２４】
ｑＲＴ  ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉキットを製造業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ社）通りに用いて全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ  ２μｇを用いて逆転写反応を実施した。各プライマーセットについてプライマー最適化段階を検討して最適なプライマー濃度を求めた。プライマー、２×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２５μＬおよびｃＤＮＡ試料３０〜１００ｎｇを総体積５０μＬのＰＣＲ増幅溶液に再懸濁させた。以下のプライマーを使用した：ＧＤＦ１１Ｆ：ＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＣ；ＧＤＦ１１Ｒ：ＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＣＣ；ＴＩＭＰ２Ｆ：ＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＧ；ＴＩＭＰ２Ｒ：ＡＴＧＴＡＧＣＡＣＧＧＧＡＴＣＡＴＧＧＧ；ＫＬＯＴＨＯＦ：ＡＣＴＣＣＣＣＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡ；ＫＬＯＴＨＯＲ：ＴＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＣＣＡＴＴＧＣＴＧＴＣ。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）で反応を実施した。ＡＢＩ  ７０００ソフトウェアからサイクル閾値（Ｃｔ）の値を得た。対照として各ＲＮＡ試料のＳ１２レベルまたはβアクチンレベルも求めた。
【０１２５】
新生筋線維のカウント
ＰＢＳに溶かした心臓毒２５μｌをマウスのＴＡ筋肉に注射し、７日後にマウスを屠殺した。筋肉を切り出し、胚ミオシン重鎖（ＭＹＨ１）を染色し、ＭＹＨ１陽性で核が中心部に位置する細胞を新生された筋肉としてスコア化した。あるいは、ＭｙｏＤとＰａｘ７が二重陽性の細胞を非対称に分裂中の衛星細胞とし、ＮＣＡＭが陽性の細胞を再生中の細胞とした。
【０１２６】
実施例１：ＭＳＣは抗老化因子を発現する
ＭＳＣが様々な臨床モデルに示す細胞に対する効果および治療上の影響は、入手原によって異なることが明らかになった。より特異的で効率的な臨床応用のための特定の特徴および関連性を有する様々な入手源および亜集団の特徴を明らかにするため、これらの細胞の様々なパラメータを比較し、解析した。６種類の入手源、すなわち、骨髄（ＢＭ）、脂肪（ＡＤ）、羊膜胎盤（ＡＭ）、臍帯（ＵＣ）、絨毛膜胎盤（ＣＨ）および歯髄（ＤＰ）に由来するＭＳＣについて、抗老化特性を有することがわかっている因子を検討した。解析では、ＴＩＭＰ２、ＧＤＦ１１およびＫＬＯＴＨＯの３つの特定の因子が際立っていた。
【０１２７】
ＴＩＭＰ２は、年齢とともに減少し、認知機能ならびに神経細胞の健康および可塑性の改善に関与すると考えられている既知の長寿遺伝子である。ＭＳＣは６種類ともＴＩＭＰ２をある程度発現したが、発現はＢＭ−ＭＳＣが最も低かった（図１Ａ）。ＡＤ、ＤＰおよびＡＭはわずかに高いレベルでＴＩＭＰ２を発現したが、最も高いレベルはＣＨ−ＭＳＣおよびＵＣ−ＭＳＣで観察され、絨毛膜に由来するＭＳＣが最も発現レベルが高かった。
【０１２８】
ＧＤＦ１１の長寿遺伝子としての役割については多少議論の余地があるが、ＧＤＦ１１は筋肉の成長および再生を増強するほか、骨格、腱および神経の老化に拮抗する役割も果たしている可能性があるとする広範なデータが存在する。ここでも同じく、ＭＳＣは６種類ともＧＤＦ１１を発現し、ＢＭ−ＭＳＣでの発現が最も低く、ＡＤ−ＭＳＣ、ＡＭ−ＭＳＣおよびＤＰ−ＭＳＣがこれに次ぎ、ＣＨ−ＭＳＣおよびＵＣ−ＭＳＣはここでも発現が最も高かった（図１Ｂ）。
【０１２９】
ＫＬＯＴＨＯはよく知られた長寿遺伝子であり、反応性酸化種（ＲＯＳ）を減少させること、およびＫＬＯＴＨＯが発現するあらゆる細胞型の年齢に伴う減少に拮抗することに関与すると考えられている。ＴＩＭＰ２およびＧＤＦ１１とは異なり、ＫＬＯＴＨＯは全被験ＭＳＣに発現したというわけではなく、むしろ、ＢＭ−ＭＳＣおよびＡＤ−ＭＳＣには全くみられなかった（図１Ｃ）。ＡＭ−ＭＳＣ、ＤＰ−ＭＳＣおよびＵＣ−ＭＳＣには中程度の発現が観察されたが、ＣＨ−ＭＳＣは群を抜いて高い発現を示し、他の３種類のＭＳＣで観察された発現のほぼ２倍であった。
【０１３０】
実施例２：絨毛膜ＭＳＣおよび臍帯ＭＳＣはＲＯＳ産生を減少させる
ミオスタチンは、筋肉の成長および再生に対する既知の阻害剤であり、ミオスタチン処理は、老化している筋肉および損傷を受けた筋肉で産生される反応性酸化種（ＲＯＳ）の増加を反映するものであることから、筋肉の消耗および変性のモデルとなっている。ＫＬＯＴＨＯはＲＯＳ産生を減少させることがわかっているため、ＣＨ−ＭＳＣおよびＵＣ−ＭＳＣもミオスタチンによって誘導されるＲＯＳ産生を減少させることが可能であるかどうかを検討した。ヒト筋芽細胞をＵＣ−ＭＳＣまたはＣＨ−ＭＳＣとともに３日間、０．４μＭのトランスウェルプレートで培養しミオスタチン（４０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。ＣＨ−ＭＳＣまたはＵＣ−ＭＳＣとの共培養によりＲＯＳ産生がそれぞれ４３％または５８％減少した（図２）。トランスウェルの設定では細胞同士の接触ができないことから、ＭＳＣの効果が細胞外小胞または可能性として分泌ＫＬＯＴＨＯなどの分泌因子によって媒介されるはずである。
【０１３１】
実施例３：ＭＳＣは筋肉再生を増強し線維症を軽減する
老化による筋量減少であるサルコペニアは、いくつかの方法で、例えば、筋組織の再生速度を増大させることによって、または失われた筋肉を新生筋細胞に置き換えることによって治療することが可能である。さらに、筋肉が老化するのに伴って、特に心筋の線維症のリスクが大幅に増大する。様々な組織由来のＭＳＣをｍｄｘマウス（筋ジストロフィーモデル）の四頭筋内に注射し（１回当たり５×１０５個）、４週間後、再生および線維症と関係のある複数の重要な因子の発現を検討した。再生を四頭筋そのものでモニターし、線維症を心臓および横隔膜で測定した。
【０１３２】
ＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣはともに、２種類の細胞再生マーカー、胚ミオシン重鎖（ＭＹＨ１、約４倍増加、データ不掲載）およびＮＣＡＭの四頭筋でのｍＲＮＡ発現の有意な増大を引き起こした（図３Ａ）。さらに、ＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣは、線維症マーカーであるコラーゲンＩの横隔膜および心臓での発現を有意に低下させ、ＢＭ−ＭＳＣ、ＡＤ−ＭＳＣおよびＡＭ−ＭＳＣは何ら効果を示さなかった（図３Ｂ）。最後に、ＵＣ−ＭＳＣおよびＨＣ−ＭＳＣはともに、ＴＮＦαおよびＩＮＦγなどの炎症性マーカーの発現を低下させ（図３Ａ）、ＢＭ由来ＭＳＣ、ＡＭ由来ＭＳＣおよびＡＤ由来ＭＳＣではこれより低い効果が観察された。エキソソームのみを注射したところ、わずかに少ないものの、同じ遺伝子発現の変化が観察された（図３Ｂ）が、それでも四頭筋での再生量は有意に増加した（図３Ｃ）。さらに、ＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣは、機能的にジストロフィンの代替となり得るタンパク質であるユートロフィンの発現を有意に増大させた（図３Ａ、３Ｄ）。ＢＭ−ＭＳＣ、ＡＤ−ＭＳＣおよびＡＭ−ＭＳＣは、統計的に有意ではないごくわずかなユートロフィン発現増大を引き起こすにとどまった。
【０１３３】
マウス細胞系Ｃ２Ｃ１２およびヒト筋細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で、ＭＳＣによって引き起こされる発現の変化を確認した。ヒト筋細胞をＭＳＣとともにトランスウェルプレートで共培養したところ、ＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣのみがユートロフィン発現を増大させることがわかった（図３Ｅ）。これらの細胞に由来するエキソソームについても同じであった。筋管の形成（図３Ｆ）およびミオシン重鎖２の発現（図３Ｇ）による測定では、ＡＤ−ＭＳＣ、ＣＨ−ＭＳＣおよびＵＣ−ＭＳＣならびにそのエキソソームによってそれぞれ筋細胞分化も増大した。一方、ＤＭＤ患者由来の筋細胞をＭＳＣとともに共培養した場合、ＣＨ−ＭＳＣおよびＵＣ−ＭＳＣのみが筋管の形成を増大させた（図３Ｈ）。ヒト衛星細胞とＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣならびにそのエキソソームとの共培養では非対称分裂（ＭｙｏＤ発現）の増大がみられたが、ＢＭ−ＭＳＣではそのような増大はみられなかった（図３Ｉ）。また、Ｃ２Ｃ１２マウス筋細胞との共培養でも同様の結果がみられた（図３Ｊ）。
【０１３４】
実施例４：ＭＳＣは筋細胞生着効果を増大させる
ＭＳＣはその細胞表面にＭＨＣＩＩ分子を発現することはなく、このため、移植細胞としての耐容性に優れている。さらに、ＭＳＣは移植を受ける者に免疫調節効果を示し、それにより免疫抑制が生じ、耐容性がさらに改善される。これまで、筋疾患、筋ジストロフィーおよび筋損傷の多くが筋細胞補充療法で治療することが可能であると提唱されてきたが、このような治療法は移植片に対する拒絶反応のため実施するのが困難であることが明らかにされている。このため、ＭＳＣ（ＣＨおよびＵＣ）を移植片中に含めた場合、それが拒絶反応を減少させ、外来細胞の生着を増大させるかどうかを検討した。全般的には、以下の実験全体を通じて、ＣＨ  ＭＳＣまたはＵＣ  ＭＳＣが治療効果の可能性および筋原性の可能性が最も高かったため、これらを常に使用した。絨毛膜組織および羊膜組織以外に胎盤絨毛などの他の胎盤領域についても検討したが、絨毛膜が示した治療効果の可能性を示す領域はなかった。
【０１３５】
ＭＳＣを蛍光赤の細胞追跡子で標識したヒト筋細胞とともに野生型マウスの前脛骨筋（ＴＡ）内に共移植した。２週間後、筋肉中の赤色蛍光のレベルを顕微鏡法により測定し、筋芽細胞生着および衛星細胞生着をともに検討した。ＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣはともに、いずれのＭＳＣも用いない移植と比較して、筋芽細胞および衛星細胞の生着が有意に増大した（図３Ｋ）。ＵＣ−ＭＳＣの共移植は筋芽細胞の生着に優れ、ＣＨ−ＭＳＣの共移植は衛星細胞の生着に優れているのが観察されたが、その差は統計的に有意ではなかった。移植の４週間後でも同様の結果が観察された。
【０１３６】
ヒト星状膠細胞および神経幹細胞（ＮＳＣ）の移植についても検討した。ＵＣ−ＭＳＣまたはＣＨ−ＭＳＣを蛍光赤で標識した細胞とともに髄腔内に共移植し、別個の実験で２週間後および４週間後に脊髄内の赤色蛍光を測定した。星状膠細胞移植後の赤色蛍光のレベルは、ＵＣ−ＭＳＣが４．５５（±０．６７）、ＣＨ−ＭＳＣが３．８９（±０．５４）であり、ＮＳＣの移植でも同様の結果がみられた（対照蛍光を１に設定した）。以上の実験をＭＤＸマウスおよび筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のラットモデルで繰り返し、いずれの場合もＭＳＣの共移植によって筋細胞生着が改善することがわかった。
【０１３７】
実施例５：ＭＳＣは老化筋肉モデルの衛星細胞の非対称分裂を増大させる
筋肉再生は衛星細胞として知られる筋肉幹様細胞のグループによって媒介される。これらの細胞は非対称に分裂し、分裂毎に新たな衛星細胞と分化筋芽細胞とを生じる。筋肉の老化に伴い、衛星細胞の増殖能および非対称分裂能が低下する。ＭＳＣを注射した筋肉に観察される再生が衛星細胞機能の増強によるものであるかどうかを検討するため、ヒト衛星細胞を若年者（１５〜２０歳）および高年者（５５〜６０歳）の血清とインキュベートした。高年者血清とのインキュベーションでは、細胞が筋芽細胞に非対称に分裂する能力（ＭｙｏＤレベルによって測定される）が５０％超低下した（図４）。ＣＨ−ＭＳＣ、ＤＰ−ＭＳＣおよびＵＣ−ＭＳＣとのトランスウェル培養では、筋芽細胞の産生がそれぞれ３倍超、３倍および４倍増大した。ＭＳＣの存在下では、高年者血清では依然として非対称分裂のレベルの低下がみられたが、約４０％および４５％にとどまり、さらに重要なこととして、ＭＳＣおよび高年者血清の存在下でのＭｙｏＤの発現レベルは依然として、ＭＳＣを含まない若年者血清のレベルの２倍を上回った。培養物に加えたこれらのＭＳＣに由来するエキソソームでも、値は低いものの筋芽細胞産生に対して同様の効果がみられた。ヒト細胞の代わりにマウスＣ２Ｃ１２細胞を用いた場合にも同様の効果が観察された。高年個体の血清（１２〜２０か月齢）の方が若年個体の血清（３〜４か月齢）よりもＭｙｏＤ発現が低下し、ＭＳＣによりその効果を逆転させ、ＭｙｏＤレベルを対照レベルさえ超えさせることができた。したがって、ＵＣ−ＭＳＣ、ＤＰ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣのパラクリン効果は実際に衛星細胞の機能ならびに増殖能および分化能を改善し、したがって、老化が進行していても、これらのＭＳＣは衛星細胞が新たな筋肉を生じさせる能力増大させるのではないかと思われる。ＡＭ−ＭＳＣでも、低いながらも同様の効果が観察された。
【０１３８】
実施例６：ＭＳＣは老化モデルの神経幹細胞自己再生を増大させる
上記の若年者および高年者の血清を用いた実験を、衛星細胞の代わりにヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）を用いても実施した。ＮＳＣ自己再生のマーカーにはダブルコルチンを使用し、筋肉で観察されたのとまったく同じように、高年者血清との培養ではダブルコルチンの発現レベルが低下した。ＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣならびにそのエキソソームとの共培養でも、それらがダブルコルチン発現を増大させるという同じ効果がみられ、高年者血清でも発現レベルが若年者血清のみと培養したＮＳＣのものを上回った。
【０１３９】
神経老化をさらにモデル化するため、ヒドロキシウレアを添加して、または添加せずにヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）を培養した。ヒドロキシウレアは、脳老化のモデルとなる損傷剤である。ＮＳＣをその通常の増殖条件、すなわち、ＤＭＥＭ＋ＥＧＦおよびＦＧＦ（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ）で維持し、ニューロスフェアとして維持した。次いで、細胞を分離し、段階希釈により個々に播種した。個々のＮＳＣを１つのウェルで増殖させ、コロニー形成により自己再生能を測定した。ウェルを培地のみあるいはＣＨ−ＭＳＣ、ＤＰ−ＭＳＣもしくはＵＣ−ＭＳＣまたはその小胞の入ったトランスウェルディッシュに入れた。ＭＳＣまたはそのエキソソームではＮＳＣの自己再生の増大がみられ、ＣＨ−ＭＳＣで最も強力な効果がみられた（図５Ａ）。ヒドロキシウレアによりＮＳＣ自己再生が６５％低下し、このような低いレベルはＭＳＣまたはその小胞の存在下では２倍超であった（図５Ｂ）。
【０１４０】
これまでに、臍帯血には脳病態を治療するうえでいくつか利点があることが報告されている。このため、臍帯血の効果も検討した。臍帯血単独では両種類のＭＳＣおよびその小胞に劣っていたが、臍帯血とＭＳＣとを組み合わせると相加効果が得られた（図５Ａ〜Ｂ）。
【０１４１】
実施例７：ＭＳＣからさらに幹様性の高い細胞への脱分化
ＭＳＣは多能性細胞であるが、細胞をさらに幹様性の高い運命に脱分化させれば、それを老化関連障害および疾患の治療に細胞補充療法として使用できる可能性が高まるものと考えられる。ＭＳＣがのちの諸因子に応答して分化する能力を増大させるため、様々な方法を用いてＭＳＣに一過性の幹細胞の特徴を誘導した。共培養の前にＭＳＣに改変Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ（このようなｍＲＮＡは細胞質内で安定であり、直ちに翻訳され得る）をトランスフェクトしたところ、全体的な幹細胞性が増大し、ＭＳＣを５−アザシチジン（５−ＡＺＡ）と１日間インキュベートした場合も同様であった。トランスフェクトした細胞を５−ＡＺＡとインキュベートすることで２つの処理を組み合わせたところ、幹細胞性の増大が増強された。酸性培地中または低酸素状態でさらにインキュベートしたところ、脱分化がさらに増大した。これらの細胞に由来する細胞外小胞でもＭＳＣと同じ効果がみられ、これらの転写因子の一部を「老化した」細胞に送達することも可能であった。
【０１４２】
一過性の幹細胞表現型を発現するよう刺激したＭＳＣでは、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４およびＫＬＦ４が未処理ＭＳＣで観察されたレベルよりも高いレベルで発現したほか、ＲＴＶＯ−１が低レベルで発現した。しかし、これらの細胞では依然としてＭＳＣマーカーのＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１４６およびＣＤ４４が発現し、ＭＨＣＩＩは発現しなかった。このように、同細胞は分化能が増大すると同時に、依然として未処理ＭＳＣで観察された有益なパラクリン効果を発揮した。同細胞は依然として非免疫原性であり、抗炎症能および免疫抑制能を有した。これらの細胞に由来する細胞外小胞でも同様の結果が観察された。
【０１４３】
実施例８：脱分化ＭＳＣは筋肉再生を改善する
脱分化細胞はＭＳＣの特徴の多くを保持しているだけでなく、分化能も増大していることから、脱分化細胞が筋肉再生を増大させ、線維症を軽減する能力の点で未処理ＭＳＣにどの程度匹敵するかを検討した。未処理のＣＨ−ＭＳＣおよびＵＣ−ＭＳＣをｍｄｘマウスの左側の四頭筋内に注射し（５×１０５個）、脱分化したＣＨ−ＭＳＣおよびＵＣ−ＭＳＣを右側の四頭筋の筋内に注射した（５−ＡＺＡにより分化させた細胞５×１０５個）。前に観察されたように、両組織に由来するＭＳＣは、横隔膜および心臓の線維症（コラーゲンＩ発現）を軽減し、注射した筋肉での再生（ＮＣＡＭ発現）を増大させたが、注目すべきことに、脱分化ＭＳＣは再生レベルがほぼ２倍になったが、線維症の軽減に変化はみられなかった（図６Ａ）。四頭筋に細胞外小胞を０．５×１０９個注射した場合にも結果が観察された。
【０１４４】
実施例９：サルコペニア治療への脱分化ＭＳＣおよび未処理ＭＳＣの使用
次に、未処理ＭＳＣおよび脱分化ＭＳＣがミオスタチンによって引き起こされた筋損傷を改善することができるかどうかを検討した。ヒト筋管をミオスタチン（４０ｎｇ／ｍｌ）で３日間処理し、筋管の直径をモニターした。ミオスタチン処理は筋萎縮症およびサルコペニアの作用を模倣するものであり、筋管の直径が平均４２％減少することがわかった（図６Ｂ、対照）。ＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣと筋小管を共培養することにより、平均直径がそれぞれ２９％および２２％減少するにとどまった。さらに、ミオスタチンを添加しない場合、共培養により筋小管の直径が事実上増加したことから、ミオスタチンによって引き起こされる減少により、筋管の直径が野生型のレベルと同じまたはそれをわずかに下回る程度にとどまった。筋管にＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣ由来のエキソソームを添加した場合も、直径の減少がそれぞれ２９％および２２％であったことから、ＭＳＣそのものとほぼ同じ効果がみられた。しかし、エキソソームは、ＭＳＣの場合とまったく同じ大きさまで直径を増大させたわけではないため、ミオスタチン処理後の平均直径はわずかに減少した。最後に、５−ＡＺＡまたは筋肉との共培養で刺激しても％減少がほぼ同じであったＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣでは、ミオスタチン処理の後でさえ筋管の直径が未処理対照と比較してわずかに増大したため、最終的な筋管の直径が最も大きいものとなった（図６Ｂ）。このことは、刺激されたＭＳＣがまとまって筋管になったことによるものであると思われる。
【０１４５】
次に、未処理ＭＳＣおよび脱分化ＭＳＣがｉｎ  ｖｉｖｏで新たな筋肉の形成を誘導することができるかどうかを検討した。野生型マウスの前脛骨筋（ＴＡ）にＰＢＳ、ＣＨ−ＭＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣ、脱分化ＣＨ−ＭＳＣまたは脱分化ＵＣ−ＭＳＣ（いずれも５×１０５個）を注射し、次いで、心臓毒で処理して筋損傷を誘導した。７日後、マウスを屠殺し、中心部に位置する核のＭＹＨ１染色を記録することにより、腓腹筋に新たに生じた筋線維をカウントした。ＵＣ−ＭＳＣでは新たな筋細胞の数が２倍超になり、ＣＨ−ＭＳＣでは３倍になった（図６Ｃ）。脱分化ＭＳＣではさらに強力な効果がみられ、処理ＵＣ−ＭＳＣまたは処理ＣＨ−ＭＳＣでは新たな筋細胞の数がそれぞれ３４４％および３８７％増大した。これらの細胞に由来する細胞外小胞でも同程度の効果がみられた。ＵＣ由来小胞（０．５×１０９個）では２．３８±０．３４５倍増大し、ＣＨ由来小胞では２．９２±０．３９７倍増大した。同様に、脱分化ＵＣ細胞から単離した小胞では新たな筋細胞の数が３．２４±０．４２倍増大し、脱分化ＣＨ由来の小胞では３．５９±０．４１９倍増大した。
【０１４６】
誘導された筋細胞表現型のマーカーの測定に加えて、栄養因子ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＣＮＴＦおよびＩＧＦ１の発現も検討した。ＭＳＣは、神経機能を支える多数の栄養因子を発現することが知られている。このような発現が低下すると、筋細胞表現型への分化に望ましくない副次的影響となり得る。特筆すべきことに、ハイブリッド細胞（および刺激された細胞）では、上記の４種類の栄養因子の発現が保持されているばかりでなく、実際に発現が４種類とも未処理ＭＳＣで観察された発現よりも大幅に増大した。この増大は、ＵＣ−ＭＳＣ由来のハイブリッド細胞で最も大きく、ＶＥＧＦ発現が１０倍超の増加、ＩＧＦ１発現が６倍超の増加、ＧＤＮＦ発現が５倍超の増加、ＣＮＴＦ発現が４倍超の増加であった。ＣＨ−ＭＳＣでも、３種類の因子がいずれも４倍超の増加であった。１つ目の分化プロトコルでも２つ目の分化プロトコルでも同様の結果が観察された。
【０１４７】
以上の結果を総合的にみると、ＭＳＣは筋細胞および神経細胞をともに改善／補助することによって、筋肉機能の低下を正常に戻し、老化に関連する能力を回復させることが示唆される。このように、ＭＳＣおよびＭＳＣ細胞外小胞を主体とする治療法は神経筋接合部の両要素を標的とするものである。
【０１４８】
実施例１０：ＭＳＣおよびその分泌エキソソームは２型糖尿病に対して阻害効果を示す。
２型糖尿病の発症率は年齢とともに増加する。その若年型の対応する１型糖尿病とは異なり、２型糖尿病の発症には膵臓の老化が少なくとも一部の原因となっている。２型糖尿病をモデル化するため、マウスの低用量ストレズプトシン（ｓｔｒｅｚｐｔｏｃｉｎ）処理に高脂肪食を組み合わせて用いた。この糖尿病マウスを対照（ＰＢＳ）で処置したところ、血糖レベルの上昇がみられた。このマウスの四頭筋内にＣＨ−ＭＳＣもしくはＵＣ−ＭＳＣまたはその細胞外小胞を筋肉内注射により投与した。マウスの処置から１０日後、いずれの処置でも血清中グルコースレベルの低下が観察された（図７Ａ）。ＣＨ−ＭＳＣの方がＵＣ−ＭＳＣよりもわずかに優れており（４５％低下対３５％低下）、その小胞についても同様であった（４２％低下対３８％低下）。
【０１４９】
ＭＳＣの効果を改善するため、細胞にｍｉＲ−３７５を異所性に発現させるとともに、ｍｉＲ−２１を発現抑制した。これらの細胞では、血糖レベルに対するさらに強力な効果が観察され（図７Ｂ）、ＣＨ−ＭＳＣおよびその小胞によりレベルが５０％超低下した。ＭＳＣにｌｎｃＲＮＡ  ＰＬＵＴＯも発現させた。ＰＬＵＴＯを発現するＣＨ−ＭＳＣではグルコースレベルが４５０から２０７±２６．４に低下し、その小胞では２２０±２８．９に低下した。ｍｉＲ−３７５およびＰＬＵＴＯをともに発現するＣＨ−ＭＳＣおよびその小胞でも同様の結果が観察され、この場合、グルコースレベルに対する効果がさらに長時間持続した。ＰＬＵＴＯ発現ＭＳＣはインスリンｍＲＮＡを発現することが明らかになり、このことは、このような持続的効果を説明する１つの理由であると考えられる。
【０１５０】
実施例１１：ＭＳＣおよびそのエキソソームは変形性関節症を治療する
変形性関節症は、関節軟骨の変性を原因とする関節痛ならびに関節の形態および機能の喪失を呈する臨床症候群である。軟骨細胞の老化がこの過程の顕著な特徴の１つとなっている。したがって、変形性関節症に対するＭＳＣの効果を検討するためのモデルには、ＩＬ−１ベータによってヒト軟骨細胞に誘導される老化を用いた。ヒト軟骨細胞をトランスウェル培養で増殖させ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ベータで処理した。５日後、陽性ＳＡベータｇａｌ活性を老化の代理として測定した。対照として、他の細胞を加えずにトランスウェルで培養したものを用い、１に設定した。ＩＬ−１ベータで処理したころ、老化が５倍増大した。ＭＳＣおよびその小胞により老化がほぼ未処理レベルまで再び低下し、ＣＨ−ＭＳＣおよびその小胞が最も強力な効果を示した（図８Ａ）。ＭＳＣに、減少が変形性関節症を引き起こすことが知られているｌｎｃＲＮＡ  ＭＥＧ３もトランスフェクトした。ＭＳＣでＭＥＧ３が発現することにより、さらに強力な老化の抑制が得られた。
【０１５１】
変形性関節症は、老化したペット集団にみられる消耗性病態でもある。このため、イヌ由来の軟骨細胞についても検討した。上の実験に並行して実験を設定し、イヌ軟骨細胞でもヒトＭＳＣが老化を大幅に抑制した（図８Ｂ）。
【０１５２】
実施例１２：ＭＳＣおよびそのエキソソームは認知障害を治療する
未改変のＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣならびに星状膠細胞、ＮＳＣおよび神経細胞の表現型を有するよう分化させたＵＣ−ＭＳＣおよびＣＨ−ＭＳＣが、アルツハイマー病、早老症および認知症などの老化に関連する精神病態に対する保護効果を有することがわかった。ＣＨ−ＭＳＣおよびこの細胞由来の小胞によりＡＰＰ／ＰＳ１（アミロイド前駆体タンパク質／プレセニリン１）二重トランスジェニックマウスモデルの認知症発現を遅らせた。未処置マウスには、６〜７か月齢で脳内にアミロイドｂの沈着物および斑が認められ、約８か月齢で空間学習／記憶の有意な低下がみられた。２種類のアッセイを用いてＭＳＣの効果を解析した。認識指標の測定では、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに２３．７％の低下がみられ、ＣＨ−ＭＳＣにより低下が１８．７％抑えられ、ＣＨ−ＭＳＣの小胞により低下が１５．２３％抑えられた。プラットフォーム交差の測定では、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに交差の減少がみられ、対照マウスの交差回数が平均４．５６回、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの交差回数が平均でわずか１．５８回であった。ＣＨ−ＭＳＣ処置マウスでは交差回数が３．２３回に増加し、小胞で処置したマウスでは２．９９回に改善した。
【０１５３】
脳への放射線誘発損傷は重度で進行性の認知機能障害を引き起こし、神経変性障害、脳老化、脳卒中および反復性頭部損傷症候群との類似点が多数ある。本発明者らは、脳への放射線照射のマウスモデルを用い、ＰＢＳ（対照）、ＣＨ−ＭＳＣ、ＣＨ小胞、ＣＨ−ＭＳＣ＋ｍｉＲ−２１アンタゴマーおよびＣＨ小胞＋ｍｉＲ−２１アンタゴマーで処置したマウス（１２週齢）の認知機能を解析した。マウスに放射線照射を５Ｇｙで１０日間実施した。２週間後、マウスにＭＳＣまたはエキソソームによる頭蓋内処置を実施した。処置の６週間後、マウスを試験環境に慣れさせる訓練を２週間実施し、次いで、マウスが新奇物体を認識する能力を検討した。
【０１５４】
認識指数は１〜−１である。数が小さいほど新奇物体を認識する能力が低い。ＰＢＳで処置した放射線照射マウスの認識指数は−０．５４であることがわかった。これに対し、ＣＨ−ＭＳＣで処理したマウスは指数が０．４９であった。ＣＨ小胞では指数が０．４１であり、ＣＨ−ＭＳＣ＋ｍｉＲ−２１アンタゴマーでは指数が０．６２であり、ＣＨ小胞＋ｍｉＲ−２１アンタゴマーでは指数が０．６７であった。ＭＳＣまたはその小胞の鼻腔内投与でも同様の結果が得られた。以上の結果を考え合わせると、ＣＨ−ＭＳＣおよびその小胞により、放射線誘発損傷を原因とする（および老化および外傷による）認知障害から脳を保護することができることがわかる。
【０１５５】
放射線照射により、ＮＳＣが増殖する能力も３９．７％低下した。しかし、ＣＨ−ＭＳＣおよびＣＨ小胞により、この増殖がそれぞれ６９．４％および６２．３％増大した。ＭＳＣとｍｉＲ−２１アンタゴマーおよびその小胞ではさらに高い効果が得られ、ＣＨ−ＭＳＣ＋ｍｉＲ−２１アンタゴマーでは増殖が８４．５％増大し、ＣＨ小胞＋ｍｉＲ−２１アンタゴマーでは増殖が８１．５％増大した。このモデルは神経変性疾患、脳老化、脳卒中、反復性脳損傷症候群および血管性認知症に関する情報を与えるものであることから、上記のＭＳＣおよびその小胞はこれらの病態にも有益なものであり得る。
【０１５６】
実施例１３：分化ＭＳＣは細胞機能を改善し細胞補充物としての役割を果たす
ＭＳＣは、星状膠細胞様細胞、神経幹細胞（ＮＳＣ）様細胞、運動神経細胞様細胞および筋細胞様細胞に分化し得る。しかし、この部分的分化の後でも、細胞は依然としてＭＳＣ様の特徴を保持している。これにより、細胞は損傷および疾患の部位にホーミングすることが依然として可能であり、抗炎症効果および免疫調節効果を発揮することが依然として可能である。しかし、これらの細胞には、損傷した、または老化した細胞および組織を治療するための補充物としての作用できるというさらなる有益性がある。
【０１５７】
ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）は、小児に全身性の早期老化を引き起こすまれな遺伝障害である。これは、短縮され毒性のあるプロジェリンとも呼ばれるタンパク質ラミンＡをコードする、ＬＭＮＡと呼ばれる遺伝子の変異に起因するものである。この毒性タンパク質の産生はＳＲＳＦ１と呼ばれるＲＮＡ結合タンパク質にも影響を受ける。ＣＨ−ＭＳＣおよびそれに由来する小胞により、ＨＧＰＳ患者由来の線維芽細胞でのプロジェリン発現がそれぞれ３４．１％および３６．９％低下した。さらに、Ｃｈ−ＭＳＣおよびその小胞により、ＳＲＳＦ１の発現もそれぞれ４９．６％および５２．４％低下した。
【０１５８】
ＭＳＣ、特にＵＣおよびＣＨに由来するＭＳＣは、衛星細胞表現型および筋芽細胞表現型を有するよう分化させると、筋肉老化、サルコペニアおよび筋線維症の治療にさらなる治療的有益性をもたらすことがわかった。このさらなる有益性は、既存の筋合胞体と盛んに融合し、ＭＳＣのパラクリン効果に加えて細胞補充療法としての役割を果たす細胞によるものであると思われる。
【０１５９】
実施例１４：ＭＳＣでのＲＮＡ治療剤の過剰発現
筋肉、運動神経細胞および末梢神経細胞の疾患および損傷に有望であると考えられる治療剤がいくつか存在する。しかし、多くの場合、治療剤を受傷領域または罹患領域に直接かつ特異的に送達するのは困難である。ＭＳＣにはホーミング能があると同時に、その分泌小胞のレパートリーにも幅があることから、ＭＳＣが筋肉および神経細胞に理想的な送達薬剤としての役割を果たす可能性があるとする仮説を立てた。
【０１６０】
この仮説を検証するため、未改変のＣＨ−ＭＳＣおよびＵＣ−ＭＳＣに由来するエキソソームにユートロフィン発現を低下させることが知られている数種類のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）（抗ｍｉＲ−４２４、１９５、１６、４９７、１３５、６７９３および２１）に対するアンタゴマーを搭載し、ヒト筋芽細胞とインキュベートした。これらのエキソソームとのインキュベーションにより筋芽細胞でのユートロフィンｍＲＮＡ発現が大幅に増大し、これらのエキソソームにより筋芽細胞へのアンタゴマー導入が成功したことが示された（図９Ａ）。
【０１６１】
同様に、ｌｅｔ−７アンタゴマーまたはｍｉＲ−１３３ｂアンタゴマーをトランスフェクトしたＣＨ−ＭＳＣでもｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋細胞にアンタゴマーが導入され、それによりユートロフィンタンパク質発現が増大した（図９Ｂ）。これらの細胞に由来するエキソソームでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでユートロフィンタンパク質発現の増大に成功した（図９Ｃ）。次に、エキソソーム表面のＭカドヘリンエピトープによって筋細胞に標的化したエキソソームを筋細胞／星状膠細胞混合培養物に投与した。抗ｌｅｔ−７を含有する標的化エキソソームでは、培養物中の星状膠細胞の５５〜６８％の細胞だけでなく、培養物中の筋細胞の８５〜９２％の細胞にもユートロフィン発現の増大がみられた（図９Ｃ、筋細胞溶解物について掲載）。このことから、エキソソームがアンタゴマーを導入することだけでなく、エキソソーム（またはＭＳＣ）上の筋肉標的化部分が導入の効果を増大させることも示された。ｌｅｔ−７はミオシン重鎖の発現を低下させ、それにより筋肉再生を阻害することも知られている。ｌｅｔ−７アンタゴマーによりミオシン重鎖の発現も有意に増大し（図９Ｄ）、これにより二重の治療的有益性が得られた。
【０１６２】
ジストロフィンタンパク質の送達も盛んに検討された治療手段であるが、組換えジストロフィンは強い免疫原性応答を誘導し、効果的な送達システムは未だ発見されていない。ＭＳＣには免疫抑制能があることから、免疫応答を引き起こさずにジストロフィンを発現させることができるのではないかと考え、未改変ＣＨ−ＭＳＣにジストロフィンおよびマイクロジストロフィンを発現するウイルスベクターを感染させた。これらのプラスミドの効果をさらに増強するため、ジストロフィンを標的とするｍｉＲであるｍｉＲ−２１４に対するアンタゴマーを発現するＭＳＣも用いた。ジストロフィンプラスミドと抗ｍｉＲ−２１４の複合効果は顕著なものであり、ジストロフィン発現が約４．５倍増大した。重要なことに、この処置によりユートロフィン発現も増大した。このように、抗ｍｉＲ−２１４送達によりジストロフィンおよびユートロフィンの発現がともに増大することから、抗ｍｉＲ−２１４送達にも二重の治療的有益性がある。
【０１６３】
ＭＳＣおよびエキソソームに改変ｍｙｏＤ  ｍＲＮＡを搭載することにより、エキソソームおよびＭＳＣが治療剤を送達する能力をさらに検討した。このようなｍＲＮＡは、細胞の細胞質内に入ると、直ちにタンパク質に翻訳され得る。ｍｙｏＤ搭載エキソソームをトランスウェルプレートの筋芽細胞および搭載ＭＳＣと筋芽細胞の共培養物に直接添加したところ、ｍｙｏＤ陽性核の数による測定で盛んなｍｙｏＤ発現がみられた（図９Ｅ）。陽性対照として、細胞への改変ｍｙｏＤ  ｍＲＮＡの直接トランスフェクションを用い、実際、エキソソームまたは共培養物によるｍＲＮＡの伝達は、トランスフェクションによる直接投与とほぼ同程度に効果的なものであった。このように、ＭＳＣおよびそのエキソソームにより、改変ｍＲＮＡを他のＲＮＡ分子と同じように効果的に送達することができる。
【０１６４】
また、ＣＨ−ＭＳＣにｍｉＲ−１４５とｍｉＲ−１５４に対するアンタゴマーとをトランスフェクトし、細胞が線維症を治療する能力をモニターした。身体の様々な筋肉の線維症は老化進行の顕著な特徴の１つである。ＴＧＦベータ誘発線維症をモデルとして用いた。骨格筋細胞および心筋細胞をトランスウェル培養で増殖させ、３０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦベータで処理した。３日後、コラーゲン１Ａ１の発現をＲＴ−ＰＣＲによりモニターした。非改変ＭＳＣの存在下では、ＴＧＦベータ−によりコラーゲン発現が約５倍増大したが、ｍｉＲ−１４５、アンタゴマー−１５４および両者の組合せを発現するＭＳＣにより線維症が大幅に軽減された（図１０）。ｍｉＲ−１４５および抗ｍｉＲ−１５４を発現するＣＨ−ＭＳＣに由来する細胞外小胞でも同様の結果が観察された。ＵＣ−ＭＳｃおよびその分泌エキソソームでもｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−１５４アンタゴマーを搭載した場合に組織線維症が減少したが、その効果は低いものであった。
【０１６５】
既に記載した通り、ＭＥＧ３発現は変形性関節症に有用であるだけでなく、神経細胞の自己再生にも何らかの役割を果たしている。ＮＳＣ再生に関する前の実験と同様に、ＮＳＣとＭＥＧ３、ｍｉＲ−１４３または両者の組合せを発現するＣＨ−ＭＳＣとをトランスウェルで増殖させた。それぞれのＭＳＣでＮＳＣ自己再生が増大し、両者の組合せでは自己再生が２倍超であった（図１１Ａ）。同様に、上記のＭＳＣおよびその小胞でも神経老化のモデルであるヒドロキシウレアで処理するＮＳＣの自己再生が増大した（図１１Ｂ）。
【０１６６】
最後に、ＣＨ−ＭＳＣにｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−３７３およびｍｉＲ−１２２５をトランスフェクトした。これらの細胞をトランスウェルディッシュで衛星細胞と共培養したところ、衛星細胞の増殖および分化がそれぞれ５．２倍および３．７８倍増大することがわかった。これらの同じ細胞によりヒドロキシウレア処理後のＮＳＣ自己再生も４．１２倍増大した。さらに、同細胞によりＨＧＰＳ患者由来の線維芽細胞でのプロジェリン発現が４２．１％低下した。最後に、これらの遺伝子改変ＭＳＣは、癌細胞系、原発性癌細胞および癌幹細胞でも抗腫瘍効果を発揮した。
【０１６７】
実施例１５：ＭＳＣおよびそのエキソソームは複数の腫瘍に対する効果を発揮する
老化は腫瘍発生率の増大を特徴とするものである。このため、いかなる抗老化治療についても、腫瘍促進性ではないか、さらに好ましくは抗腫瘍効果を有することを確認するべきである。ＣＨ−ＭＳＣおよびその細胞外小胞について、９種類の異なる癌（神経膠腫、髄膜腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、白血病、肺転移および神経芽腫）に対する効果を検討した（図１２Ａ）。検討したいずれの癌でも、ＭＳＣおよびその小胞が癌細胞増殖に対して強力な阻害効果を有する。さらに、ｍｉＲ−３７５を過剰発現し、ｍｉＲ−２１が発現抑制されたＭＳＣおよび細胞由来の小胞の方が強い抗腫瘍効果を発揮した。ＵＣ−ＭＳＣおよびその小胞の両方でもに同様の結果が得られた。外来性ＭＥＧ３およびｍｉＲ−１４３を発現するＣＨ−ＭＳＣについても、それが肺腫瘍幹細胞の自己再生を阻害する能力を検討した。この実験はＮＳＣで実施したものとほぼ同じであり、この場合のみ、ＭＳＣが腫瘍幹細胞の自己再生を阻害し、ＭＥＧ３とｍｉＲ−１４３の組合せでも８０％の減少が得られた（図１２Ｂ）。
【０１６８】
ここまで、本発明をその特定の実施形態とともに説明してきたが、当業者には多数の代替形態、修正形態および変形形態が明らかになることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲に含まれるこのような代替形態、修正形態および変形形態はいずれも包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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