(57)【要約】  本発明は、特にｓｍａｌｌＲＮＡ配列のデータの正規化に使用するための、新規のｓｐｉｋｅ  ｉｎオリゴヌクレオチドに関する。具体的には、本発明は、それぞれが一本鎖の核酸分子の少なくとも２つのサブセットを含むセットであって、各核酸分子は、５’ 末端にリン酸塩と、少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、標的配列と比較して少なくとも１つのミスマッチを含む少なくとも８個のコアヌクレオチドのコア配列と、３’末端に修飾とを含み、各サブセットは、同一のコアヌクレオチド配列および異なるランダム化したヌクレオチドを有する複数の核酸分子を含み、各サブセットの核酸分子は、コアヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なるセット、ならびに前記セットを含むライブラリーの作製を提供する。また本発明は、サンプル中の標的配列の量を決定するための、ヌクレオチドシーケンシングにおける参照値、および方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖核酸分子の少なくとも２つのサブセットを含むセットであって、各核酸分子が、５’から３’への方向に、
ａ）５’末端にリン酸塩と、
ｂ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｃ）標的配列と比較して配列が２つ以上のミスマッチを含む少なくとも８つのヌクレオチドのコア配列と、
ｄ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｅ）３’末端に修飾と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
前記各サブセットの核酸分子が、前記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なる、
セット。
【請求項２】
前記複数の核酸分子が、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの全ての４つのヌクレオチドの組み合わせを含むランダム化したヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のセット。
【請求項３】
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、特には、特にｓｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、およびｔＲＮＡ、ならびにそれらのいずれかの前駆体からなる群から選択される、ｓｍａｌｌＲＮＡを特異的に模倣したＲＮＡ分子である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のセット。
【請求項４】
前記コアヌクレオチド配列が、８〜２５個のヌクレオチド、好ましくは１０〜２０個のヌクレオチド、好ましくは１２〜１８個のヌクレオチド、好ましくは１３個のヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のセット。
【請求項５】
前記ランダム化したヌクレオチドの配列が、３〜７個のヌクレオチド、好ましくは３〜５個のヌクレオチド、好ましくは４個のヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のセット。
【請求項６】
５’末端のリン酸塩が、一リン酸塩、二リン酸塩、および三リン酸塩の群から選択され、３’末端の修飾が、２’−Ｏ−メチル化［２’−Ｏ−メチル基］およびヒドロキシル化［ヒドロキシル基］からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のセット。
【請求項７】
前記サブセットが、１〜１００００ａｍｏｌ、好ましくは１０〜５０００ａｍｏｌの量で存在し、特に、各サブセットで異なる量を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のセット。
【請求項８】
前記標的配列が、目的のいずれかの配列、特に、生物のゲノムまたはトランスクリプトーム、ウイルス、細菌、動物、植物から生じる配列とすることができ、特に、ＲＮＡ、ｓｍａｌｌＲＮＡ、動的なｓｍａｌｌＲＮＡの集合である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のセット。
【請求項９】
シーケンシングデータを正規化するためのｓｐｉｋｅ  ｉｎプローブとしての、請求項１〜８のいずれか１項に記載のセットの使用。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のセットを使用して、サンプル、特に細胞、組織、または臓器のサンプルにおける１つ以上の標的配列の絶対量を決定するための方法。
【請求項１１】
ヌクレオチドシーケンシングにおける参照値を決定するための方法であって、
標的配列の混合物に、請求項１〜９のいずれか１項に記載のセットを添加することにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、
前記ライブラリーにアダプターをライゲートするステップと、
任意選択で前記ライブラリーを増幅するステップと、
ヌクレオチドのシーケンシング法を行うステップと、
参照値として各サブセットの核酸分子の量を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
異なる細胞種由来のｓｍａｌｌＲＮＡ分子の複製数を比較する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルにおける核酸分子の数を決定するための方法であって、
ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載のセットを前記サンプルに添加して、核酸分子の混合物を得ることにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、
ｂ）任意選択で前記ライブラリーを増幅するステップと、
ｃ）前記核酸分子からＲＮＡ配列の読み取りをもたらす、前記ライブラリーの次世代シーケンシングを行うステップと、
ｄ）前記セットおよび前記サンプルからの読み取りの数を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
ｓＲＮＡライブラリーの調製の間に起こるクローニングのバイアスを評価するための、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１５】
一般式：ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）（Ｎ）ｍ−２’−Ｏ−メチル
のオリゴヌクレオチド：
（式中、
ｐは、リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかを含む８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８のヌクレオチド長を有する、標的配列と比較して少なくとも２つのミスマッチを含むコア配列であり、
ｍは、３、４、または５である）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチド配列データの定量的正規化に使用するための、新規のｓｐｉｋｅ  ｉｎオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、少なくとも２つのサブセットを含むセットであって、各サブセットが複数の一本鎖の核酸分子を含み、各一本鎖の核酸分子が、５’末端にリン酸塩と、少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、標的配列と相補的ではない少なくとも８個のヌクレオチドのコア配列と、少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、３’末端に修飾とを含む、セットを提供する。サブセットの核酸分子は、コアヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なる。また本発明は、上記セットを含むライブラリーの作製、ならびにサンプル中の標的配列の量を決定するためのヌクレオチドシーケンシングにおける参照値および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００５年に初めて市場に導入されてから、超並列シーケンシングまたはディープシーケンシング技術といった次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、ゲノム研究に多大な影響を与えてきた。この次世代技術は、ゲノムシーケンシングおよび再シーケンシングなどの標準的なシーケンシングへの適用、ならびにサンガーシーケンシングによって以前には探索されなかった新規の応用に、使用されている。全てのＮＧＳプラットフォームは、並行して数百万のＤＮＡの小さなフラグメントのシーケンシングを行い、よって、読み取り（リード：ｒｅａｄ）の長さは犠牲になるが、費用対効果の高い配列のスループットの顕著な向上を提供する。
【０００３】
ｓｍａｌｌＲＮＡのＮＧＳライブラリーの構築は、入力（ｉｎｐｕｔ）としてｓｍａｌｌＲＮＡを採用しており、対応するｃＤＮＡのライブラリーをもたらす。このことは、短いヌクレオチドの配列、すなわち読み取りをもたらす。どのＲＮＡ分子が元のサンプルに存在しているかを推測するために、読み取りを、参照のゲノムもしくはトランスクリプトームにマッピングもしくはアライメントするか、または配列の重複に基づきｄｅ  ｎｏｖｏ構築する。バイオインフォマティクスの解析が、参照ゲノムに対して個々の読み取りをマッピングすることによりこれらフラグメントをまとめてつなぎ合わせるために、使用される。
【０００４】
ハイスループットのｓｍａｌｌＲＮＡのシーケンシング（ｓＲＮＡ−Ｓｅｑ）の実験由来のデータは、通常、正規化され、ＲＰＭ（ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｅ−ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｒｅａｄｓ）１などの相対的なタームで記録される。相対的な正規化は、ｓＲＮＡの下位集合がプロファイリングされる異なる組織種を通して等しい割合を有すると想定される場合に、良好に作用する。しかしながら、この想定は多くの場合無効であり、これは、ｓＲＮＡの集合が、異なる組織種を通しておよび様々な変異のバックグラウンドにおいて、高頻度で動的であるためである２−７。たとえば、ｍｉＲＮＡの定量化において同一の開始材料に基づく解析により、ｃＤＮＡ構築物における別の方法が全く異なるｍｉＲＮＡ発現レベルのプロファイルをもたらすことが示された３３。ＲＮＡの末端の修飾に関与する酵素は、相対的な発現レベルのバイアスを引き起こす明らかな候補であるが、逆転写およびＰＣＲの増幅のステップも同様に、テンプレートの優先傾向を表す可能性があり、よって、他よりも一部のＲＮＡの増幅を優先させる可能性がある。よって、相対的に正規化したｓＲＮＡ−Ｓｅｑの値を比較する標準的な技法は、誤解される結果をもたらす可能性がある。対照的に、ｓＲＮＡ−Ｓｅｑデータの絶対的な正規化は、ゲノムワイドな規模での、異なる細胞種、変異組織、または疾患状態におけるｓｍａｌｌＲＮＡレベルの正確な比較を可能にする。しかしながら、ｓＲＮＡ−Ｓｅｑデータの絶対的な正規化のために外来性ｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用しようとする以前の試みは、成功にばらつきがあり８−１０、よって、幅広くは使用されていない。Ｌｏｃａｔｉらは、大きさの選択をモニタリングするため、およびｓＲＮＡ−Ｓｅｑにおいてデータの正規化を行うために、それぞれ１１および１９のオリゴリボヌクレオチドからなる、合成ＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎの２つの別々のセットを使用した（Ｌｏｃａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１５  Ａｕｇ  １８；４３（１４））。特定のｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎの様々なシーケンシングの有効性は、その固有の特性、たとえば、ｓＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの構築の間にそのライゲーション効率に影響を与える可変的な二次構造およびＲＮＡアダプターのコフォールディング（ｃｏｆｏｌｄｉｎｇ）によるものである可能性が最も高い１１−１３。たとえば、以前に、サンプルに添加される外来性ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎのモル量と対応するシーケンシングした読み取りの数との間の非線形の関係を考慮するため、個々のｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎの量を調節するためのさらなる補正因子が、必要とされていた１０。
【０００５】
よって、ＮＧＣは、新規の遺伝子の発見および良好に調節された転写のプロファイリングにとって強力なツールではあるが、未だに、現在利用可能な技術を使用しても解決されない以下の問題が存在する。
【０００６】
‐ｓｍａｌｌＲＮＡに対するアダプターのライゲーションは、二次構造および恐らくはヌクレオチドのバイアスにより、バイアスがかかっており；よって、特定のｓｍａｌｌＲＮＡが、最終的なデータセットにおいて、過剰または過少に提示される場合がある。１つの解決策として、ｓｍａｌｌＲＮＡにライゲートするアダプターを使用して、ランダム化した末端部分を伴う、数百万のクローン化したｓｍａｌｌＲＮＡの「ライブラリー」を作製することが行われてきた。これらはバイアスの低減を支援するが、いずれのｓｍａｌｌＲＮＡの実験にも重要であろうバイアスが、未だどの程度存在するかは知られていない。
【０００７】
‐ＲＮＡ−Ｓｅｑは、単に、絶対数（たとえば分子の数）ではなく、ｓｍａｌｌＲＮＡレベルの相対的な数（ＲＰＭ：ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｅ−ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｒｅａｄｓ）を記録しており；よって、動的なｓｍａｌｌＲＮＡの集合を備える様々な組織（多くの場合、この事例である）からのｓｍａｌｌＲＮＡ−Ｓｅｑのデータを比較すること、ならびに、これら集合を変える変異体（たとえば異なるｓｍａｌｌＲＮＡのバイオジェネシスのファクターをかく乱する既知の変異体および未知の変異体）の間を比較することは不可能である。
【０００８】
Ｑｕａｉｌらは、３つの固有のバーコードを付与したＤＮＡフラグメントのセットを、シーケンシングのサンプルに加えて、全ての読み取りが元のサンプルに由来し、混入物質に由来しないことを検証する、ＳＡＳＩ−Ｓｅｑというプロセスを開発した（Ｑｕａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１５，  １５：１１０）。
【０００９】
Ｊｉａｎｇらは、様々な長さ、ならびにｓｐｉｋｅ  ｉｎの対照としての２２０の濃度範囲を有するＧＣ含有量を有する、９６種の合成ＲＮＡのプールを使用して、ＲＮＡ−Ｓｅｑの実験の感受性、正確性、およびバイアスを測定し、転写物の存在量を定量化するための標準曲線を導出した（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２０１１，  ２１：  １５４３−１５５１）。
【００１０】
国際特許公開公報第２０１６／００７９５１号は、ｕｌｔｒａ−ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにおいて少ないコピー数から希少な核酸配列のバリアントを推定するためのインプロセスの対照として人工的な参照配列を使用することを記載している。
【００１１】
国際特許公開公報第２０１４／０８２０３２号は、核酸の標準化されたシーケンシングのための方法であって、当該核酸に関する個々の競合性の内部増幅対照と、サンプル中の少なくとも１つの核酸の少なくとも１つの天然の標的のシーケンシング事象の比例した関係を測定して、核酸のコピー数の再現性を提供する、方法を記載している。
【００１２】
国際特許公開公報第２０１６／００１７３６号は、合成核酸コンストラクトを含む組成物、特に、少なくとも１つの挿入された野生型または標的の核酸配列を、ＮＧＳまたはデジタルＰＣＲのための参照物質または対照として所定のモル比で含むプラスミドを使用することを記載している。
【００１３】
国際特許公開公報第２０１５／１１８５１３号は、とりわけＮＧＳにより、解析されるサンプル物質を含む反応容器に添加され得る対照の核酸の使用を記載している。
【００１４】
Ｂｕｓｃｈｍａｎｎらは、実験の設計および解析前のサンプルの処理、ライブラリーの調製の標準化、およびシーケンシング反応に関するガイドラインを確立することにより、ｓｍａｌｌＲＮＡ−Ｓｅｑのワークフローを標準化すること、ならびにデータ解析を容易にすることを目的とした（Ｂｕｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０１６  Ｖｏｌ．  ４４  Ｎｏ．  １３，  ５９９５−６０１８）。
【００１５】
ハイスループットなＲＮＡおよびＤＮＡのシーケンシングデータの正規化は、異なるサンプルを通して、ＲＮＡまたはＤＮＡ、特にｓＲＮＡのレベルを比較するために必要とされている。一般的に使用されている相対的な正規化の手法は、変動するＲＮＡの集合、たとえば組織間のｓｍａｌｌＲＮＡの集合のため、誤った結論を引き起こす可能性がある。よって、より正確であり再現可能なアセスメントを可能にする方法および製品、特にシーケンシングデータの絶対的な正規化が必要とされている。
【発明の概要】
【００１６】
これら問題は、本発明の主題によって解決される。
【００１７】
本明細書中、一本鎖核酸分子の少なくとも２つのサブセットを含むセットであって、各核酸分子が、５’から３’への方向に、
ａ）５’末端にリン酸塩、任意選択で一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩と、
ｂ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｃ）標的配列と相補的ではない少なくとも８つのヌクレオチドのコア配列と、
ｄ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｅ）３’末端に修飾、任意選択で２’−Ｏ−メチル化またはヒドロキシル化と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の一本鎖の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、上記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なる、
セットを、提供する。
【００１８】
一実施形態では、一本鎖核酸分子の少なくとも２つのサブセットを含むセットであって、各核酸分子が、５’から３’への方向に、
ａ）５’末端にリン酸塩、任意選択で一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩と、
ｂ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｃ）標的配列と比較して配列が２つ以上のミスマッチを含む少なくとも８つのヌクレオチドのコア配列と、
ｄ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｅ）３’末端に修飾、任意選択で２’−Ｏ−メチル化またはヒドロキシル化と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、上記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なる、
セットが、提供される。
【００１９】
本発明は、具体的には、ｍＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎオリゴヌクレオチドと共に使用される場合は、ｓＲＮＡ：ｍＲＮＡの化学量論のゲノムワイドな推測を可能にし、かつ、独立した実験を通した、ｓＲＮＡ−Ｓｅｑデータの絶対的で定量的な正規化を可能にする、ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎオリゴヌクレオチド（ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎ）のセットを提供する。
【００２０】
サンプルにおけるｓｍａｌｌＲＮＡ分子の数の絶対的な定量化は、ｓｍａｌｌＲＮＡ−Ｓｅｑのデータセット間の比較を可能にするだけでなく、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃ製のＥＲＣＣ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎ  ｍｉｘなどの外来性なｓｐｉｋｅ  ｉｎも使用する、ｓｍａｌｌＲＮＡ−ＳｅｑおよびｍＲＮＡ−Ｓｅｑのデータセットの間の比較をも可能にする。
【００２１】
本発明のｓｍａｌｌＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎのセットは、その後の解析のためのアライメント可能な読み取りの１．２％のみを必要とする、ｓＲＮＡ−Ｓｅｑ実験に有用な内部標準となるだけでなく、異なる供給源、たとえば異なる治療、組織の種類、または研究グループからのｓＲＮＡ−Ｓｅｑデータを正規化するために使用することもできる。さらに、これらは、前駆体：ｓＲＮＡおよびｓＲＮＡ：標的の、分子スケールでこれらの関係を理解するために重要である化学量論の正確な比較およびゲノムワイドな推測に必須であり得る、ｓＲＮＡ分子の絶対的な定量化を可能にする。本発明のｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎのセットはまた、様々なｓＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー作製プロトコルに存在するクローニングのバイアスについて評価および改善するために使用することができる。
【００２２】
また、上記ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎは、ｓＲＮＡ−ＳｅｑおよびｍＲＮＡ−Ｓｅｑにより作製される値を比較するために、市販のｍＲＮＡ−ｓｐｉｋｅ  ｉｎオリゴヌクレオチド混合物と併用して使用することもできる。
【００２３】
本発明の特定の実施形態では、一本鎖核酸分子の少なくとも２つのサブセットを含むセットであって、各核酸分子が、５’から３’への方向に、
ａ）５’末端にリン酸塩、任意選択で一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩と、
ｂ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｃ）標的配列と比較して２つ以上のミスマッチを含む少なくとも８つのヌクレオチドのコア配列と、
ｄ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｅ）３’末端に修飾、任意選択で２’−Ｏ−メチル化またはヒドロキシル化と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、上記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なる、
セットが、提供される。
【００２４】
一実施形態では、コア配列は、標的配列と相補的ではない。
【００２５】
本発明の一実施形態では、ランダム化したヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのうちのいずれか１つである。
【００２６】
本発明の一実施形態では、複数の核酸分子は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの全ての４つのヌクレオチドの組み合わせを含むランダム化したヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
本発明の一実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、特には、ｓｍａｌｌＲＮＡを模倣したＲＮＡ分子であり、特にｓｍａｌｌＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、およびｔＲＮＡ、ならびにそれらのいずれかのｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体である。
【００２８】
本発明の特定の実施形態では、コアヌクレオチド配列は、８〜２５個のヌクレオチド、好ましくは１０〜２０個のヌクレオチド、好ましくは１２〜１８個のヌクレオチド、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個のヌクレオチドを含む。異なるサブセットのコア配列は、特に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチドにおいて異なっている。
【００２９】
特に、コア配列は、標的配列に対して３つ以上のミスマッチな核酸塩基を含む。
【００３０】
特に、コア配列は、それぞれの標的配列と比較して１００％ミスマッチを含む。たとえば、コア配列が８ヌクレオチド長である場合、コアヌクレオチド配列は、標的配列と比較して、８個、特に７、５、４、３、または２個のミスマッチな核酸塩基を含む。さらなる例として、２５個のヌクレオチドのコアオリゴヌクレオチドは、標的配列と比較して、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、５、４、３、または２つのミスマッチな核酸塩基を含む。
【００３１】
同様に、目的の生物の遺伝子またはゲノムとは異なる、すなわち相補的ではないコアヌクレオチドも、本明細書中に包有される。特に、コアヌクレオチド配列は、標的配列と比較して少なくとも２つのミスマッチな核酸塩基を含み、より具体的には、コア配列は、目的の生物の遺伝子またはゲノムと比較して、１００％、９７．５％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、またはそれ以上のミスマッチを含む。
【００３２】
特定の実施形態では、ランダム化したヌクレオチドの配列は、３〜７個のヌクレオチド、好ましくは３〜５個のヌクレオチド、好ましくは４個のヌクレオチドを含む。あるいはこれは、３、４、５、６、７個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。
【００３３】
本発明のセットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個、またはそれ以上のサブセットを、特にはサブセットあたり０．００１〜５００００ａｍｏｌ、特には０．０１〜２５０００ａｍｏｌ、特には１〜１００００ａｍｏｌ、特には１０〜５０００ａｍｏｌの量で含むことができる。
【００３４】
本発明により使用される標的配列は、目的の配列のいずれかとすることができ、特にこれは、ウイルス、細菌、動物、植物由来の配列といった生物のゲノムとすることができ、特にこれは、トランスクリプトーム、ＲＮＡ、ｓｍａｌｌＲＮＡ、動的なｓｍａｌｌＲＮＡの集合とすることができる。
【００３５】
さらに本発明のセットは、サンプル、具体的には、細胞、組織、または臓器のサンプルにおける１つ以上の標的配列の量を決定するための方法に、使用することができる。
【００３６】
別の態様では、シーケンシング方法において使用するための、核酸、特にｓｍａｌｌＲＮＡまたはｓＲＮＡ模倣体を含む核酸のライブラリーを作製するための方法であって、本発明の１つ以上のセットを、標的の核酸分子と混合する、方法が、本明細書中に提供される。上記ライブラリーは、当然さらに増幅させることができる。
【００３７】
別の態様では、ヌクレオチドのシーケンシングにおける参照値を決定するための方法であって、標的配列の混合物に、本発明に係る１つ以上のセットを添加することにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、上記核酸分子にアダプターをライゲートするステップと、任意選択で上記ライブラリーを増幅するステップと、ヌクレオチドのシーケンシング法を行うステップと、参照値として各サブセットの核酸分子の量を決定するステップとを含む、方法が、本明細書中に提供される。
【００３８】
別の態様では、標的配列の絶対量を決定するための方法であって、標的の量を参照値と比較する、方法が、本明細書中に提供される。
【００３９】
さらに本発明は、サンプルにおける核酸分子の数を決定するための方法であって、
ａ．本発明のセットを上記サンプルに添加して、核酸分子の混合物を入手することにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、
ｂ．上記ライブラリーをライゲートし、任意選択で増幅するステップと、
ｃ．上記核酸分子からのＲＮＡ配列の読み取りをもたらす、上記ライブラリーの次世代シーケンシングを行うステップと、
ｄ．上記セットおよび上記サンプルからの読み取りの数を決定するステップと
を含む、方法を包有する。
【００４０】
特には、上記方法は、サンプルにおけるｓｍａｌｌＲＮＡ分子の絶対的な定量化のため、より具体的には、異なる供給源からのｓＲＮＡ配列のデータの絶対的な正規化のために、使用することができる。
【００４１】
代替的な実施形態として、本発明は、一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）ｎ（Ｎ）ｍ−２’−Ｏ−メチル
により記載されるオリゴヌクレオチドを提供する：
（式中、
Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ、またはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムなヌクレオチドであり；
Ｘは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかを含み、標的配列と比較して２つ以上のミスマッチを含む、コアヌクレオチド配列であり；
ｍは、３、４、または５であり；
ｎは、８〜６７の範囲の整数であり；
ｐはリン酸塩である）。
【００４２】
特定の実施形態では、コア配列は、標的配列に対して相補的ではない。
【００４３】
別の態様では、シーケンシングのためのｓｐｉｋｅ  ｉｎを調製するための方法であって、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチド、具体的には、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇの可能性のある全てのヌクレオチドの組み合わせを含む、上述の複数のオリゴヌクレオチドを使用する、方法が、本明細書中提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】クローニングのバイアスを試験するためおよび絶対的なｓｍａｌｌＲＮＡのレベルを推定するためのツールとしての、ｓｍａｌｌＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎの設計および使用。（ａ）Ｃｏｌ−０の花（バイオロジカルレプリケート１）における絶対的なｓｍａｌｌＲＮＡのレベル（総ＲＮＡ（μｇ）あたりの分子）と比較した相対的なｓｍａｌｌＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎのレベル（ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｅ−ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｒｅａｄｓ）の散布図。ピアソンのγ値が示されており、プロットした値から導出した線形モデルを表す破線が示されている。（ｂ）花芽の総ＲＮＡ（μｇ）あたりの個々のｍｉＲＮＡファミリー分子の密度のプロット。縦方向の破線は、ｍｉＲＮＡファミリーあたりの分子の数の中央値を表す。
【図２】ｓｍａｌｌＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎは、ｓｍａｌｌＲＮＡのレベルの正確な比較を可能にする。（ａおよびｂ）相対的な単位（ａ）または絶対的な単位（ｂ）のいずれかにおける個々のｍｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡのファミリーのレベルのバイオリン図。ｐ値は、２つのサンプルのコルモゴロフ−スミルノフ検定に基づくものであった。Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、およびＰ＜０．００１は、それぞれ、＊、＊＊、および＊＊＊により表されている。バイオリン図は、各サンプルにおいて１以上のＲＰＭの、９３個のｍｉＲＮＡ、１４個のｔａｓｉＲＮＡ、６，３６１個の２０〜２２ｎｔのｓｉＲＮＡ、および５，９５２個の２３〜２４ｎｔのｓｉＲＮＡのファミリーから構成されている。２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルが、バイオリン図の縦方向の黒いバーの下部および上部により表されており、中央値は、縦方向の黒いバーの中の白色の点により表されている。上部および下部の細い線（ｗｈｉｓｋｅｒ）は、１．５倍の四分位範囲内にて、縦方向の黒いバーから極値まで延びている。バイオリンの幅は、サンプルの密度に比例している。（ｃおよびｄ）相対的なＲＰＭ（ｃ）または絶対的なＭＰＵ（ｄ）のタームのいずれかにおける、Ｃｏｌ−０の花ｖｓＣｏｌ−０の葉（左）およびＣｏｌ−０の花ｖｓ  ｄｃｌ２３４の葉（右）のｍｉＲＮＡファミリーのレベルの散布図。黒色の点は、それぞれ有意に増加したレベルおよび有意に減少したレベルを有するｍｉＲＮＡファミリーを表す。有意に異なるｍｉＲＮＡのレベルは、２倍以上異なると定義されており、偽発見率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）は、２つのサンプルのスチューデントｔ検定に基づきＰ値＜０．０５に調節した。
【図３】ｓｍａｌｌＲＮＡおよびポリ（Ａ）ＲＮＡのｓｐｉｋｅ  ｉｎの併用した使用は、ｓｍａｌｌＲＮＡ−ＳｅｑのデータとｍＲＮＡ−Ｓｅｑのデータとの直接的な比較を可能にする。（ａ）相対的（ＴＰＭ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）および絶対的（総ＲＮＡ（μｇ）あたりの分子）なＥＲＣＣのポリ（Ａ）のｓｐｉｋｅ−ｉｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）のレベルの散布図。ピアソンのｒ値が表されており、プロットした値から導出した線形モデルを表す破線が表されている。（ｂ）Ｃｏｌ−０の葉、Ｃｏｌ−０の花、およびｄｃｌ２３４の花におけるｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ前駆体およびｔａｓｉＲＮＡ／ｔａｓｉＲＮＡ前駆体のレベルの１次元の散布図。（ｃ）Ｃｏｌ−０の葉、Ｃｏｌ−０の花、およびｄｃｌ２３４の花におけるｍｉＲＮＡ／標的およびｔａｓｉＲＮＡ／標的のレベルのバイオリン図。バイオリン図は、図２の凡例に記載される通りである。Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．００１は、それぞれ＊＊および＊＊＊で表されており、２つのサンプルのコルモゴロフ−スミルノフ検定で計算された。試験したｍｉＲＮＡ：標的およびｔａｓｉＲＮＡ：標的の相互作用の数が、表されている。
【図４】ｓｍａｌｌＲＮＡの集合の長さの分布。Ｃｏｌ−０の葉（ａ）、Ｃｏｌ−０の花（ｂ）、およびｄｃｌ２３４の花（ｃ）におけるｓＲＮＡの異なる大きさのクラスに関する、ＲＰＭの積み重ね棒グラフのプロット。色は表記のヌクレオチドで開始するｓＲＮＡ−Ｓｅｑの割合を表す。
【図５】総ＲＮＡ（μｇ）あたりのｍＲＮＡ分子の数を推定するために使用した標準曲線。野生型（Ｃｏｌ−０）の花（バイオロジカルレプリケート１）（ａ）、Ｃｏｌ−０の葉（バイオロジカルレプリケート１および２）（ｂおよびｃ）、ならびにｄｃｌ２３４の花（バイオロジカルレプリケート１および２）（ｄおよびｅ）から作製したｍＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーにおける、相対的（ＴＰＭ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）および絶対的（総ＲＮＡ（μｇ）あたりの分子）なＥＲＣＣのポリ（Ａ）のｓｐｉｋｅ−ｉｎのレベルの散布図。ピアソンのｒ値が表されており、プロットした値から導出した線形モデルを表す破線が表されている。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
本明細書を通して使用される特定の用語は、以下の意味を有する。
【００４６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、本明細書中使用される場合、同意語として使用することができ、さらなるメンバーまたは部分または要素を許容する、オープンな定義として理解すべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、「からなる」の定義の特性のさらなる要素を含まない最も閉鎖的な定義とみなされている。よって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、これよりも広く、「からなる」の定義を含む。
【００４７】
本明細書中使用される場合、用語「約」は、所定の値の同じ値または±１０％異なる値を表す。
【００４８】
本明細書中使用される場合、用語「分子」は、共有結合により複数の原子から構成された単一の実体または粒子を表す。分子は、１つのクラスの物質またはそれらの組み合わせから構成される、異なる部分を含み得る。複数のクラスの物質として、たとえば、限定するものではないが、化学的な修飾を伴うＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ペプチド、または他の有機化合物がある。分子は、様々な長さ、大きさ、または分子量であってもよく、当業者に知られているかおよび／または望ましいいずれかの活性を有することができる。
【００４９】
本明細書中使用される場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「ポリ核酸」は、互換可能に使用することができ、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドの化学的に修飾した形態またはアナログのいずれかおよび上記の組み合わせの重合体の形態を表す。核酸は、細胞に対して外来性または内在性であり得る。核酸は、無細胞の環境で存在することができる。核酸は、遺伝子またはそのフラグメントとすることができる。核酸は、ＤＮＡとすることができる。核酸は、ＲＮＡとすることができる。核酸は、１つ以上のアナログ（たとえば変更された骨格、糖、または核酸塩基）を含み得る。アナログの一部の非限定的な例として、５−ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルフォリノ、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７−デアザ−ＧＴＰ、フルオロフォア（たとえば、糖に結合したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光ベースのアナログ、ＣｐＧアイランド、メチル−７−グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｄｉｎｅ）、ジヒドロウリジン、クエオシン、およびワイオシン（ｗｙｏｓｉｎｅ）が挙げられる。また、一本鎖核酸は、変性した二本鎖のＤＮＡのうちの一本鎖の核酸とすることもできる。あるいは、これは、いずれの二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖の核酸とすることができる。一態様では、テンプレートの核酸は、ＲＮＡである。別の態様では、テンプレートはＤＮＡである。この用語は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、それらの合成形態および混合したポリマーのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。またこの用語は、一本鎖（ＳＳ）および二本鎖（ｄｓ）の立体構造を含む、いずれかの位相幾何学的な立体構造を含む。
【００５０】
核酸は、新規または改良された特性（たとえば安定性の改善）を有する核酸を提供するために、１つ以上の修飾（たとえば塩基の修飾、骨格の修飾）を含むことができる。核酸は、核酸のアフィニティタグを含み得る。ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせとすることができる。ヌクレオシドの塩基部分は、複素環式の塩基とすることができる。このような複素環式の塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。
【００５１】
ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖の部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドとすることができる。ペントフラノシル糖を含むこれらヌクレオシドでは、リン酸基は、この糖の、２’、３’、または５’のヒドロキシル部分に結合し得る。核酸を形成する場合、リン酸基は、直鎖重合体の化合物を形成するため、近くのヌクレオシドと互いに共有結合し得る。核酸の中でリン酸基は、一般に、核酸のヌクレオシド間の骨格を形成するとみなすことができる。核酸の結合または骨格は、３’−５’ホスホジエステル結合とすることができる。核酸は、修飾した骨格および／または修飾したヌクレオシド間結合を含み得る。修飾した骨格は、骨格にリン原子を保持する骨格および骨格にリン原子を有さない骨格を含み得る。その中にリン原子を含む適切な修飾した核酸骨格は、たとえば、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、たとえば３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラルなホスホネート、ホスフィナート、ホスホルアミダート（３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、ホスホロジアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノリン酸塩、および通常の３’−５’結合を有するボラノリン酸塩、２’−５’結合のアナログ、ならびに、１つ以上のヌクレオチド間結合が、３’−３’結合、５’−５’結合、または２’−２’結合である逆極性（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｐｏｌａｒｉｔｙ）を有するものを含み得る。
【００５２】
核酸は、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖のヘテロ原子もしくは複素環式のヌクレオシド間結合により形成されるポリヌクレオチド骨格を含み得る。これらは、モルフォリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホンの骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルの骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルの骨格；リボアセチルの骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノの骨格；スルホナートおよびスルホンアミドの骨格；アミドの骨格；ならびに混合した、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の構成要素部分を有する他のものを含み得る。
【００５３】
また核酸は、核酸塩基（多くの場合単純に「塩基」と呼ばれる）の修飾または置換を含み得る。本明細書中使用される場合、核酸塩基は、プリン塩基（たとえばアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））、ならびにピリミジン塩基（たとえばチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ））を含む。
【００５４】
ＲＮＡ模倣体は、天然の内在性ＲＮＡを模倣する化学的に修飾された二本鎖のＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ模倣体は、天然に存在する成熟したｍｉｃｒｏＲＮＡを刺激し、たとえば、これらは、非天然または人工的な二本鎖のｍｉＲＮＡ様のＲＮＡフラグメントを含む。
【００５５】
動的なｓｍａｌｌＲＮＡは、異なる発達段階、組織、細胞種、および細胞区画において差次的に発現するｓｍａｌｌＲＮＡを表す。
【００５６】
用語「核酸分子」は、本明細書中使用される場合、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらのアナログまたは誘導体を含むことが意図されている。この用語は、化学的に合成された核酸分子、化学的に修飾された核酸分子、または組み換え技術により産生された核酸分子などの、合成核酸分子を含む。適切な核酸分子は、これらに限定されるものではないが、たとえばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、およびｔＲＮＡといった、いずれかのｓｍａｌｌＲＮＡを含むＲＮＡである。
【００５７】
本発明の核酸分子は、特には、一本鎖（ｓｓ）である。特に、この一本鎖の核酸分子は、ＲＮＡ分子である。一本鎖の核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖とすることができる。
【００５８】
本明細書中使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、約２〜２００ヌクレオチド長、特には２〜１００、特には２〜７５オリゴヌクレオチド長のヌクレオチドである一本鎖の多量体を表す。オリゴヌクレオチドは、合成のものであってもよく、または酵素によりもたらされてもよい。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドのモノマー（すなわちオリゴリボヌクレオチドであり得る）、またはデオキシリボヌクレオチドのモノマー、またはリボヌクレオチドのモノマーおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーの両方を、含み得る。オリゴヌクレオチドは、限定するものではないが、２〜７５、４〜５０、５〜４０、１０〜３５、１５〜３０、１７〜２５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２５、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長を有し得る。
【００５９】
ｓｍａｌｌＲＮＡの模倣体はまた、本発明のオリゴヌクレオチドセットに使用することができ、５’末端の一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩を含み、３’末端のＯＨまたはＯ−メチル、または２’Ｏ−メチルを含む、異なる５’修飾および３’修飾を伴うｓｍａｌｌＲＮＡとすることができる。ｓｍａｌｌＲＮＡの模倣体は、２００未満のヌクレオチド、特に１００未満のヌクレオチド、特に７５未満のヌクレオチド、特に５０未満のヌクレオチド、特に８〜５０ヌクレオチド、より具体的には２０〜３５ヌクレオチドを含む。植物のＲＮＡを模倣した人工的なＲＮＡオリゴヌクレオチドは、たとえば、５’末端に一リン酸塩および３’末端にＯＨを含むオリゴヌクレオチドとすることができる。
【００６０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（Ｘ）（Ｎ）ｎ２’−Ｏ−メチル
により特徴づけられ得る：
（式中、
ｐはリン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ、またはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムなヌクレオチドであり、
Ｘは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ；またはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかを含む、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７の長さを有する、標的配列と比較して２つ以上の核酸塩基のミスマッチを配列が含むコア配列であり、
ｍ、ｎは、３、４、または５である）。
【００６１】
特に、ミスマッチの数は、標的配列に相補的ではないコア配列をもたらす方法において決定される。
【００６２】
用語「化学的に修飾したヌクレオチド」は、従来のヌクレオチドと化学的な構造において異なるヌクレオチドであって、塩基、糖、および／またはリン酸塩の化学的な構造に修飾を有する、ヌクレオチドを表す。ヌクレオチドは、これら構造のいずれかの位置で修飾され得る。修飾した核酸塩基は、他の合成核酸塩基および天然の核酸塩基、たとえば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシル、シトシンおよび他のピリミジン塩基のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ））、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換型アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換型ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含み得る。修飾した核酸塩基は、三環系のピリミジン、たとえばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇクランプ、たとえば置換されたフェノキサジンシチジン（たとえば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）を含み得る。
【００６３】
本明細書中使用される場合、用語「アダプター（ａｄａｐｔｅｒまたはａｄａｐｔｏｒ）」と同義で使用される用語「アダプター配列」は、特に、知られていないＤＮＡ配列を探索するための、他のＤＮＡ分子の末端に結合するように使用される、短い、化学的に合成された二本鎖のＤＮＡ分子を表す。一実施形態として、短い配列が、標的配列のフラグメントの末端に結合され、本発明のセットに含まれるオリゴヌクレオチドに結合される。アダプター配列は、ＤＮＡのランダムなフラグメントのシーケンシングに有用である。短いヌクレオチド配列の付加により、次世代シーケンシング用のフローセルに、いずれかのＤＮＡフラグメントを結合させることが可能となる。アダプター配列を使用したライブラリー構築の方法に関する例が、Ｈｅａｄ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ５６（２），  ６１−ｐａｓｓｉｍ）に記載されている。例として、アダプターは、ＮＥＢＮＥＸＴ  ＳｍａｌｌＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａのユーザーのマニュアル（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ，  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／〜／ｍｅｄｉａ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ａｌｌ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／７Ｄ０６４５０７５ＥＡＡ４Ａ０７８４３１９４Ｃ６９ＥＢ３９１Ａ７／Ｄａｔａｃａｒｄｓ％２０ｏｒ％２０Ｍａｎｕａｌｓ／ｍａｎｕａｌＥ７３３０．ｐｄｆ）に記載されるように使用され、特に、３’アダプターは、配列：５’−ｒＡｐｐＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴ−ＮＨ２−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ９）であり、５’アダプターは、配列５’−ｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＡｒＧｒＵｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＧｒＵｒＣｒＣｒＧｒＡｒＣｒＧｒＡｒＵｒＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １０）である。別の方法として、当業者が提供できる他のいずれのアダプターも、使用され得る。
【００６４】
用語「相補性」または「相補的な」は、本明細書中使用される場合、従来のワトソン−クリックまたは本明細書中記載される他の非伝統的な種類の結合のいずれかによる、１つの核酸配列と別の核酸配列との間の水素結合の形成または存在を表す。完全なまたは１００％の相補性は、核酸配列の全ての連続した残基（核酸塩基）が、第２の相補的な核酸配列における同数の連続した残基と水素結合することを意味する。特定の態様では、第１の核酸配列の連続した残基は、第２の配列の連続した核酸と同一である。「非相補性」は、２つの核酸配列の間にバルジ、ループ、またはオーバーハングをもたらし得る、核酸分子の中の様々なミスマッチまたは塩基対形成されていないヌクレオチド（たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のミスマッチ、非ヌクレオチドリンカー、または塩基対形成されていないヌクレオチド）を含む。このような非相補性は、塩基対形成されていないヌクレオチドの数により決定される相補性（％）により表すことができ、すなわち、関与するヌクレオチドの総数の中の、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などにより、表すことができる。完全性のため、逆相補性もまた、本明細書中に包有されている。
【００６５】
本明細書中、コア配列に「相補的ではない」との文言は、塩基対形成されていないヌクレオチドの数により決定される相補性（％）により表すことができ、すなわち、目的の標的配列を基準にして、少なくとも５０％、特に少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の塩基対形成されていないヌクレオチド、または少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のコア配列のうちの配列のミスマッチを表す。
【００６６】
本明細書中使用される場合、用語「水素結合」は、電気的に陰性の原子と炭素の電気陰性度を超える第２の原子に結合した水素原子と間の結合の形態を表す。水素原子と共有する自由電子対を有する電気陰性の原子は、いわゆる水素結合のアクセプターであり、窒素、酸素、硫黄、またはフッ素であり得る。電気陰性の原子に結合した水素原子は、一般に、水素結合のドナーと呼ばれている。本明細書中使用される場合、用語電気陰性および電気陽性は、非対照的な電子の分布をもたらし、よって双極子モーメントの形成をもたらすように、共有結合の電子対を誘引する原子の傾向を意味することが、当業者によって容易に理解されるであろう。水素結合は、ファンデルワールス相互作用よりも強いが、共有結合またはイオン結合よりも弱い。
【００６７】
用語「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」または「アニールする（ａｎｎｅａｌ）」は、平行または好ましくは逆平行の方向にて、特定のハイブリダイゼーションの条件下で一体となる核酸の鎖の性質を表す。これら核酸の鎖は、反対の鎖の塩基間の水素結合を介して相互作用し、安定または準安定（ｑｕａｓｉ−ｓｔａｂｌｅ）した二本鎖のらせん構造を形成し、三重または他のより高次の構造の形成をもたらし得る。水素結合は、通常、アデニンとチミンまたはウラシルとの間（ＡとＴまたはＵとの間）、またはシトシンとグアニンとの間（ＣとＧとの間）に形成するが、他の塩基対が形成される場合がある（たとえばＡｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  １１ｔｈ  ｅｄ．，  １９９２）。互いにハイブリダイズする２つのヌクレオチド配列の性質は、２つのヌクレオチド配列の相補性の度合いに基づいており、よって、一致する相補的なヌクレオチド対のフラクションに基づく。所定の配列において、別の配列に相補的であるヌクレオチドが多いほど、ハイブリダイゼーションに関する条件がよりストリンジェントになり得、２つの配列の結合性がより特異的になるであろう。ストリンジェンシーの増大は、温度の上昇、共溶媒の割合の増加、塩濃度の低下などにより、達成される。
【００６８】
当業者に明らかであるように、ストリンジェントな条件は、配列に依存しており、異なる状況で異なる。たとえば、長いフラグメントは、短いフラグメントよりも、特定のハイブリダイゼーションに関して高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。相補的な鎖の塩基の組成および長さ、有機溶媒およびイオンの存在、ならびに塩基のミスマッチの度合いなどの他の要因が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与え得るため、これらパラメータの組み合わせは、いずれか１つのパラメータ単独の絶対的な大きさよりも重要であり得る。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、高温または０．１ＸＳＣＣなどの高いストリンジェンシー条件下で発生させることができる。高いストリンジェントな条件の例は、当該分野で知られており、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９、およびＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌを参照されたい。一般的に、ハイブリダイゼーションを行う温度を上げることは、ストリンジェンシーを増大させる。また、本明細書中記載のハイブリダイゼーションの反応は、望ましいハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて異なる温度で行うことができる。ハイブリダイゼーションの温度は、５℃程度、またはさらには５℃未満とすることができるが、通常、２２℃超であり、より典型的には、約３０℃超であり、さらにより典型的には、３７℃超である。他の実施形態では、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、さらに、緩衝溶液の成分の添加または除去により変更することができる。一部の実施形態では、中程度（ｍｅｄｉｕｍ）のストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションが容認される。他の実施形態では、低いストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションが、容認される。一部の実施形態では、２つ以上のミスマッチが、ハイブリダイズした分子間またはハイブリダイズした分子の一部の間に存在する。
【００６９】
２つ以上の核酸配列の観点からの用語「同一性」または「同一な」は、以下に記載の配列比較のアルゴリズムのうちの１つ（たとえばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴＮ、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、またはニードルペアワイズシーケンスアライメント（ｎｅｅｄｌｅ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（ＥＭＢＯＳＳソフトウェア）もしくは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を使用するか、または目視の検査により測定される、最大の一致について比較およびアライメントされる際に同じであるヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列または下位配列を表す。適用に応じて、「同一性」（パーセント）は、比較される配列の領域にわたり存在し得、たとえば、比較される２つの配列の完全長にわたり存在し得る。配列比較のため、通常、１つの配列は、試験配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用して、試験配列および参照配列がコンピュータに入力される場合、必要に応じて、下位配列の座標は指定されており、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定されている。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムのパラメータに基づき、参照配列と比較した試験配列に関する配列同一性（パーセント）を計算する。比較に最適な配列のアライメントを、たとえば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１）の局地的相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）により、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３  （１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）により、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）の類似性の方法に関する検索により、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視の検査（一般に以下の（ｉｎｆｒａ）Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，を参照）により、行うことができる。
【００７０】
同一ではないことは、１００％未満の核酸の配列同一性が存在すること、すなわち、第１の配列由来の少なくとも２、３、４、５個、またはそれ以上のヌクレオチドが、第２の配列由来のヌクレオチドと異なることを意味する。あるいは、配列同一性は、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、またはそれ以下である。
【００７１】
本明細書中使用される場合、用語「遺伝子」は、１つ以上の転写物を形成するために転写される配列を含む遺伝子のヌクレオチドに関連する。具体的には、遺伝子は、適切な制御配列に作動可能に結合している場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＲＮＡに転写するヌクレオチド（ＤＮＡ）から構成されているＤＮＡの遺伝子座（または領域）を表す。遺伝子は、コード領域の前および後にある制御領域、たとえば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列または「リーダー」配列、および３’ＵＴＲまたは「トレイラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）を含み得る。特に、遺伝子は、タンパク質をコードしている（たとえばｍＲＮＡ）が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、またはｒＲＮＡ、ならびにそれらの前駆体、ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡおよびｐｒｅ−ｒＲＮＡを含む、制御ＲＮＡ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ＲＮＡ）または触媒ＲＮＡなどの非タンパク質コード転写物も規定されている。
【００７２】
用語「目的の遺伝子」または「目的のゲノム」は、限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物などのいずれかの生物由来のサンプル由来の、遺伝子もしくはその機能的なフラグメントもしくはゲノム、またはいずれかの生物に由来するいずれかの合成遺伝子もしくは修飾した遺伝子を表す。
【００７３】
用語「トランスクリプトーム」は、所定のサンプルもしくは生物におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子、リボソーム（ｒＲＮＡ）分子などの転写物の全体的なセット、または特定の細胞種に存在する転写物の特定のサブセットを表す。所定の細胞株に関してほぼ固定されている（変異は除く）ゲノムとは異なり、トランスクリプトームは、外部環境の条件に応じて変動し得る。細胞における全ての転写物を含むため、トランスクリプトームは、転写の減弱などのｍＲＮＡの分解現象を除き、所定の時間に活発に発現する遺伝子を反映している。一部の実施形態では、トランスクリプトームは、ｍＲＮＡ種などの転写物の種を表すだけでなく、サンプルにおける各種の量をも表す。一部の実施形態では、トランスクリプトームは、サンプルにおける各ｍＲＮＡ分子、たとえば単一の細胞における全てのｍＲＮＡ分子を含む。
【００７４】
「標的配列」は、たとえば、限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、動物、植物から生じるかまたは由来するヌクレオチド配列などの、目的の核酸分子、目的の遺伝子もしくは目的のゲノム、または、それらの一部、誘導体、もしくはフラグメントを含む、目的のヌクレオチド配列を表す。また標的配列は、トランスクリプトーム、ＲＮＡ配列またはそれらのフラグメント、特に、任意の供給源由来のＲＮＡ、総ＲＮＡ、大きさの選択された総ＲＮＡ、ｓｍａｌｌＲＮＡおよび動的なｓｍａｌｌＲＮＡであり得る。特に、標的配列は、非コード配列またはコード配列、またはそれらの組み合わせである。具体的には、標的配列は、代謝経路または生合成経路、またはこのような経路の一部、たとえば当該経路の各酵素または調節因子を、コードまたは制御する。特に、標的配列は、単一の生体分子、たとえば酵素、またはリガンド結合タンパク質、抗体、構造タンパク質、または他の機能を有するタンパク質、リボザイム、リボスイッチ、制御ＲＮＡ、もしくは他のいずれかのＲＮＡ分子、または細胞の経路、制御ネットワーク、代謝経路、もしくは細胞のサブシステムを形成する生体分子のグループ、または上記のいずれかの一部をコードする。
【００７５】
様々な実施形態では、核酸は増幅される。当該分野で知られているいずれかの増幅方法が、使用され得る。使用できる増幅技術の例として、限定するものではないが、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、ＱＦ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＰＣＲ）、ＭＦ−ＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限酵素断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ（ｐｉｃｏｔｉｔｅｒ  ＰＣＲ）およびエマルジョンＰＣＲが挙げられる。他の適切な増幅方法として、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自家持続配列複製法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、標的のポリヌクレオチド配列の選択的な増幅、コンセンサス配列により刺激されるポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＣＰ−ＰＣＲ）、ＡＰ−ＰＣＲ（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＤＯＰ−ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ）、およびＮＡＢＳＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＢＳＡ）が挙げられる。
【００７６】
用語「シーケンシング」は、核酸の配列を決定するいずれかの方法を含む。このような方法として、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、チェーン・ターミネーション法、ショットガンシーケンシング、ＰＣＲシーケンシング、ブリッジＰＣＲ、ＭＰＳＳ（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、Ｐｏｌｏｎｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、パイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、イオン半導体シーケンシング（ｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＤＮＡ  ｎａｎｏｂａｌｌシーケンシング、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ  単一分子シーケンシング（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＳＭＲＴ（Ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ）シーケンシング、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＤＮＡシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、質量分析を用いるシーケンシング、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓａｎｇｅｒシーケンシング、顕微鏡ベースの技術、ＲＮＡＰシーケンシング、（インビトロウイルス）ハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ）が挙げられる。
【００７７】
用語「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」は、いわゆる並行した合成によるシーケンシング、またはｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、およびＲｏｃｈｅなどにより現在使用されているライゲーションのプラットフォームによるシーケンシングを表す。次世代シーケンシング法はまた、ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンシング法または電子的検出ベースの方法、たとえば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより市販されているＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術を含み得る。
【００７８】
具体的には、ＮＧＳは、並行して数千または数百万のシーケンシング反応を行うハイスループットシーケンシング技術を表す。異なるＮＧＳプラットフォームは、様々なアッセイ化学を使用するが、これらは全て、多数のテンプレート上で同時に行われる多数のシーケンシング反応から配列データを作成する。通常、配列データは、スキャナを使用して収集され、次に、アセンブルされ、バイオインフォマティクスを用いて解析される。よって、シーケンシング反応は、並行して、行われ、読み取られ、アセンブルされ、解析される；たとえば、Ｂｅｈｊａｔｉ  Ｓ  ａｎｄ  Ｔａｒｐｅｙ，  Ｐ．，  ２０１３（Ａｒｃｈ．Ｄｉ．Ｃｈｉｌｄ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒａｃｔ  Ｅｄ  ２０１３，  ９８，  ２３６−２３８）；  Ｈｅａｄ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ５６（２），  ６１−ｐａｓｓｉｍ）を参照されたい。
【００７９】
ＮＧＳ法の中には、テンプレートの増幅を必要とするものと、必要としないものがある。増幅を必要とする方法として、パイロシーケンシング（たとえば米国特許第６，２５８，５６８号、Ｒｏｃｈｅにより商品化）；Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａのプラットフォーム（たとえば米国特許第６，８３３，２４６号、同７，１１５，４００号、および同６，９６９，４８８号）；ならびにＳＯＬｉＤ（Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）プラットフォーム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；たとえば米国特許第５，９１２，１４８号および同６，１３０，０７３号）が挙げられる。増幅を必要としない方法、たとえば単一分子のシーケンシング法として、ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンシング（ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ）（米国特許第７，１６９，５６０号；同７，２８２，３３７号；同７，４８２，１２０号；同７，５０１，２４５号；同６，８１８，３９５号；同６，９１１，３４５号；および同７，５０１，２４５号）；合成によるリアルタイムシーケンシング（たとえば米国特許第７，３２９，４９２号参照）；ＺＭＷ（ｚｅｒｏ−ｍｏｄｅ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ）を使用したＳＭＲＴ（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ）ＤＮＡシーケンシング法；ならびに、米国特許第７，１７０，０５０号；同第７，３０２，１４６号；同７，３１３，３０８号；および同第７，４７６，５０３号、米国特許公開公報第２０１３０２７４１４７号；米国特許公開公報第２０１４００３８８３１号；およびＭｅｔｚｋｅｒ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １１（１）：３１−４６（２０１０）に記載されるものを含む他の方法が、挙げられる。あるいは、ハイブリダイゼーションベースのシーケンス法または他のハイスループット法、たとえばマイクロアレイ解析、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ、または他のシーケンシングプラットフォームも使用することができる。
【００８０】
用語「サブセット」は、本明細書中記載される同一のコア配列および異なるランダム化したヌクレオチドを有する一本鎖の核酸分子を表す。各セットの核酸分子はまた、３’位および５’位に、同じまたは異なる修飾を有し得る。特には、１つのセットの核酸分子は、同一の３’および／または５’位の修飾を含む。また、サブセットは、同一のコア配列を有する、特定の量または数の核酸分子を表す。
【００８１】
各サブセットは、約０．００１〜５００００ａｍｏｌ、１〜１００００ａｍｏｌ、約１〜８０００ａｍｏｌ、１０〜５０００ａｍｏｌの量の核酸分子を含み得る。特に、サブセットは、約０．００１、０．０１、０．１、１、１０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００ａｍｏｌの量の核酸分子を含み得る。
【００８２】
用語「セット」は、同じまたは異なる量のオリゴヌクレオチドを含み得る、核酸分子の２つ以上のサブセットを表す。セットのサブセットの数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上とすることができるが、これらに限定されるものではない。１つ以上のセットを、１つのシーケンシングに使用することができる。
【００８３】
本明細書中使用される場合、「複数の」核酸分子は、少なくとも２つのメンバーを含む。特定の状況では、複数は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８または少なくとも１０９、またはそれ以上のメンバーを有し得る。特に、用語複数は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上のメンバーを表す。
【００８４】
本発明のセットは、実験、特にＮＧＳのようなシーケンシング法における測定値を較正するために使用されるＲＮＡ転写物であるｓｐｉｋｅ  ｉｎ  プローブとして、使用することができる。ｓｐｉｋｅ  ｉｎは、サンプルのセットを通して一定のレベルの外部参照（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）である。ｓｐｉｋｅ  ｉｎは、異なるデータセット間の客観的な正規化を容易にできる、合成の、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、またはＤＮＡの配列である。最適化された本発明のｓｐｉｋｅ  ｉｎは、これらｓｐｉｋｅ  ｉｎが、標的配列の特定の配列または領域とハイブリダイズしないか、または低いハイブリダイゼーションを示すように設計されている。本発明の既知の量のセットまたはオリゴヌクレオチドが、調製の間に、目的の配列と混合される。異なる量のサブセットを含有するｓｐｉｋｅ  ｉｎを、ｓｐｉｋｅ  ｉｎカクテルとして使用することができる。好適には、ｓｐｉｋｅ  ｉｎは、特に参照のセットとして、サンプルの調製の間の早い段階、特にアダプターのライゲーションまたは検出または定量化の方法の前に、この参照のセットが全てまたは大部分の調製ステップの間に存在するように添加される。シーケンシングの後に、ｓｐｉｋｅ  ｉｎの配列のリードカウントを使用して、リードカウントと標的配列との間の直接的な対応が決定される。よって、定量化のため、実験用の遺伝子、エクソン、または標的配列の発現レベルを表すシグナル強度（リードカウント）は、既知の量を含み、絶対的な参照として定義された標準物質に関連している。発達の研究では、この技術は、転写の動態を決定するために使用される。本発明の発明のセットを使用することにより、これら遺伝子が全ての発達段階で同じレベルではほとんど発現しないので、内部のＲＮＡ標準の使用によるいずれの誤差をも回避する適切な対照を提供することができる。
【００８５】
「ミスマッチ」は、特には標的のヌクレオチド配列であるテンプレートのヌクレオチド配列と比較した、核酸塩基の変化を表す。特に、コアヌクレオチド配列は、セミランダム化（ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ）配列である。特に、核酸塩基のミスマッチまたは点変異（特にコアヌクレオチドに導入されるもの）は、少なくとも２つの核酸塩基またはヌクレオチドの置換、挿入または欠失、コドンの置換、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され、特に核酸塩基のミスマッチは、単一、二重、または三重の連続したミスマッチであり得る。
【００８６】
用語「ランダム化」または「ランダム化した配列」は、所定の領域における特定のヌクレオチド配列の修飾を表す。ランダム化は、核酸のレパートリーをもたらす。ランダム化は、原則上は、所定の長さにわたるいずれかの可能性のある配列を有する核酸のセグメントを説明するために使用される用語である。ランダム化した配列は、必要に応じて、約２ヌクレオチドから１００超のヌクレオチドの範囲の、様々な長さとすることができる。ランダム配列のセグメントが作製される化学反応または酵素反応は、存在し得る未知のバイアスまたはヌクレオチドの優先度により、数学的にランダムな配列をもたらさない場合がある。現在知られている技術、たとえばシーケンシャルな化学合成において、大きな逸脱が起こることは知られていない。２０ヌクレオチド以下の短いセグメントでは、存在し得るいずれかの小さなバイアスは、無視できる結果を有し得る。単一合成の配列が長いほど、いずれのバイアスの効果も大きくなる。
【００８７】
ランダムな核酸は、多くの方法により得ることができる。たとえば、完全なまたは部分的な配列のランダム化は、核酸（もしくはその一部）の直接的な化学合成、または核酸（もしくはその一部）が適切な酵素の使用により調製できるテンプレートの合成により、容易に達成することができる。非限定的な濃度の４つのヌクレオチド三リン酸塩の存在下でターミナルトランスフェラーゼにより触媒される末端の付加は、あるセグメントにランダム化した配列を付加することができる。
【００８８】
また、核酸における配列の多様性を、ゲノムＤＮＡ調製物または細胞のＲＮＡ調製物などの大きな天然の核酸の部分的に消化された（または切断された）調製物の大きさを選択したフラグメントを使用することにより、もたらすことができる。３０ヌクレオチドのランダム化した配列は、計算された、１０１８個の異なる候補配列を含むであろう。
【００８９】
本発明のランダム配列は、「Ｎ」と表される。Ｎは、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の異なるヌクレオチドのランダムなオリゴヌクレオチド配列を含む。６以下、特には５以下、特には４以下のランダムな配列が好ましい。長さＸの、可能性のあるヌクレオチド配列の数は、４Ｘであり、よって、短い長さであってもランダムなヌクレオチドが、多くの可能性のある固有のヌクレオチド配列をコードし得る。Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔのいずれかであり得る。
【００９０】
ランダム配列は、それぞれの合成のテンプレートオリゴヌクレオチドを、正確に定量化することが可能である。合成のテンプレートオリゴヌクレオチドのプールを増幅させた後、シーケンシングのアウトプットで観察される固有のランダムヌクレオチド配列は、それぞれ、投入した材料の単一の分子を表す。よって、増幅反応に添加された合成のテンプレートオリゴヌクレオチドの投入された数は、固有のランダムなヌクレオチド配列の数を計測することにより決定することができる。さらに、合成のテンプレートオリゴヌクレオチドの投入された数は、特定のバーコードに関連している。
【００９１】
セミランダム配列は、異なる方法により作製され得る。例示的な、最もｍｉＲＮＡが多いコア配列のｍｉＲＮＡの位置（ｍｉＲＮＡの５’末端から計測）に関する塩基の同一性の比率からなるマトリックスを、作製することができ、これを使用して、特定の長さ、たとえば８〜２１ヌクレオチド、特には、１３ヌクレオチドの長さを有する、数百および最大１０００以上の配列をセミランダムに選択することができる。目的のゲノムと完全にそろわない配列を、さらに考察してもよく、可能性のある全ての４塩基の組み合わせを、ランダム配列として、５’末端および３’末端の両方に付加することによりセットあたりの全体の配列を作製することができる。全ての合成されたＲＮＡの最小自由エネルギーを、当該分野で知られている方法を使用して決定することができる。これらの最小自由エネルギーの分布を調べることができ、注釈が付されたｍｉＲＮＡに類似する分布を有するＲＮＡ配列のセットを、選択および合成することができる。
【００９２】
一実施形態では、コア配列は、セミランダム化により作製されたヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
また、単一のヌクレオチドの変更によりそれぞれが異なる、バリアントオリゴヌクレオチドのプールからなる、セミランダム配列のライブラリーを、使用してもよい。
【００９４】
本発明は、配列データ、特にｓｍａｌｌＲＮＡの配列データの絶対的な正規化のための方法、およびオリゴヌクレオチドサブセットのセットであって、上記セットが、一本鎖核酸分子の少なくとも２つのサブセットを含み、各核酸分子が、５’から３’の方向に、
ａ）５’末端にリン酸塩と、
ｂ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｃ）標的配列と比較して配列が少なくとも２つのミスマッチを含む少なくとも８つのヌクレオチドのコア配列と、
ｄ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｅ）３’末端に修飾と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、上記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なる、
方法およびセットを提供する。
【００９５】
好ましい実施形態では、コア配列は、標的配列に相補的ではない。特に、コア配列は、標的配列とハイブリダイゼーションを行わないか、または標的配列に結合しない。
【００９６】
５’末端のリン酸塩は、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩とすることができる。
【００９７】
３’末端の修飾は、２’−Ｏメチル化、すなわち２’−Ｏメチル基が３’末端に結合する２’−Ｏメチル化、またはヒドロキシル化、すなわちヒドロキシル基がオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するヒドロキシル化、とすることができる。
【００９８】
コアヌクレオチド配列は、シーケンシングのためのｓｐｉｋｅ  ｉｎとして使用するために適切な任意の長さとすることができるが、この長さは、８〜２５ヌクレオチド、好ましくは１０〜２０ヌクレオチド、好ましくは１２〜１８ヌクレオチド、好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチドであることが好ましい。
【００９９】
特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）ｎ（Ｎ）ｍ−２’−Ｏ−メチル
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、一リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、３、４、または５であり
ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）。
【０１００】
特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）ｎ（Ｎ）ｍ−２’−Ｏ−メチル
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、一リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、３、４、または５であり
ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）。
【０１０１】
さらなる特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）ｎ（Ｎ）ｍ−２’−Ｏ−メチル
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、一リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、４であり
ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）。
【０１０２】
さらなる特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）ｎ（Ｎ）ｍ−２’−Ｏ−メチル
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、一リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、４であり
ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）。
【０１０３】
さらなる特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（Ｎ）ｍ−２’−Ｏ−メチル
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、一リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは４である）。
【０１０４】
さらなる特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（Ｎ）ｍ−２’−Ｏ−メチル
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、一リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、互いに独立して、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、４である）。
【０１０５】
本発明の一実施形態では、（Ｘ）ｎまたは（Ｘ）１３は、標的配列と比較して少なくとも２つのミスマッチを配列が含むコア配列であり、たとえば、標的配列と相補的ではないか、または同一ではなく、特にこれは、セミランダム配列である。
【０１０６】
上記に列挙したサブセットのうちの１つ以上を含むセットは、植物の内在性ｓｍａｌｌＲＮＡまたはＤＮＡを模倣したｓｐｉｋｅ  ｉｎとして、有用であり得る。
【０１０７】
具体的には、各セットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜８のうちの１つを含む。
【０１０８】
さらなる代替的な実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）ｎ（Ｎ）ｍ−ＯＨ
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、３、４、または５であり、
ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）。
【０１０９】
特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）ｎ（Ｎ）ｍ−ＯＨ
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、互いに独立して、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、３、４、または５であり、
ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）。
【０１１０】
さらなる特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）ｎ（Ｎ）ｍ−ＯＨ
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、４であり、
ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）。
【０１１１】
さらなる特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）ｎ（Ｎ）ｍ−ＯＨ
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、互いに独立して、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、４であり、
ｎは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）。
【０１１２】
さらなる特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（Ｎ）ｍ−ＯＨ
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、４である）。
【０１１３】
さらなる特定の実施形態では、本発明に係るサブセットは、具体的には、５’から３’の方向に、以下の一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（Ｎ）ｍ−２’−Ｏ−メチル
の核酸分子を含む：
（式中、
ｐは、二リン酸塩または三リン酸塩であり、
Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、互いに独立して、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかであり、
ｍは、４である）。
【０１１４】
本発明の一実施形態では、（Ｘ）ｎまたは（Ｘ）１３は、標的配列と比較して少なくとも２つのミスマッチを含むコア配列であり、たとえば、標的配列に相補的ではないか、または標的配列と同一ではなく、具体的には、これはセミランダム配列である。
【０１１５】
上記に列挙したサブセットのうちの１つ以上を含むセットは、動物または植物の内在性ｓｍａｌｌＲＮＡまたはＤＮＡを模倣したｓｐｉｋｅ  ｉｎとして、有用であり得る。
【０１１６】
シーケンシング方法に使用するための核酸のライブラリーは、所望の長さの標的の核酸分子または標的配列のフラグメントと、オリゴヌクレオチドを含む１つ以上のセットを混合し、この核酸鎖を二本鎖ＤＮＡに変換し、フラグメント／オリゴヌクレオチドの末端にアダプターを結合させ、シーケンシングのための最終的なライブラリー産物を定量化することにより、作製することができる。
【０１１７】
ヌクレオチドシーケンスにおける参照値は、目的の標的配列の混合物に異なる量の本発明のサブセットを含むセットを添加することにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、核酸分子にアダプターをライゲートするステップと、ライブラリーの核酸分子を増幅するステップと、核酸分子をシーケンシングするステップと、参照値としての各サブセットの核酸分子の絶対量を決定するステップと、任意に次に、参照値と標的の核酸分子の量を比較するステップとにより、決定することができる。
【０１１８】
好適には、ライブラリーは、整合性の高い、コーディングＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子間のＲＮＡを含む、トランスクリプトーム全体を網羅している。あるいは、ライブラリーは、コーディングｍＲＮＡ転写物のみを包有しているか、またはさらなる代替策として、ｓｍａｌｌＲＮＡ、たとえばｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｔＲＮＡがプロファイリングされている。
【０１１９】
ｓｍａｌｌＲＮＡは、５００未満のｎｔ（ヌクレオチド）長であり、通常、ノンコーディングＲＮＡ分子である。ＲＮＡのサイレンシングは、多くの場合、これら分子の機能であり、ここで最も一般的な良好に試験された例は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）であり、内在性の発現したｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または外来性の生成された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、相補的なメッセンジャーＲＮＡの分解を誘導する。ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ：ｓｎｏＲＮＡ）、ｔｓＲＮＡ（ｔＲＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｍａｌｌＲＮＡ）、ｓｒＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｒＤＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ、およびその亜種のｒａｓｉＲＮＡ（ｒｅｐｅａｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ＳＲＰ  ＲＮＡ（Ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ＲＮＡ）、７ＳＫ  核内低分子ＲＮＡ、ＲＮａｓｅ、およびＭＲＰＲＮＡを含む他のクラスのｓｍａｌｌＲＮＡが同定されている。
【０１２０】
シーケンシングライブラリーを調製する場合、主な目的は、バイアスを低減することである。
【０１２１】
バイアスは、実験の設計による、データの組織的な歪曲として定義することができる。本発明のセットおよびその使用は、好適には、バイアスを著しく最小限にするか、またはバイアスを排除する。絶対数、たとえば分子の数を決定できる方法を提供することにより、動的なｓｍａｌｌＲＮＡの集合またはこれら集合を変える変異と、様々な組織由来のｓｍａｌｌＲＮＡの配列データを比較することが可能である。
【０１２２】
よって、本発明のｓｐｉｋｅ  ｉｎおよび方法は、異なる細胞種由来のｓｍａｌｌＲＮＡ分子の複製数を比較することに特に好適である。よって、たとえば、異なる臓器または組織または区画由来のｓＲＮＡの下位集合を比較することができ、上記方法は、データ正規化のために使用することができる。特に、異なるｓｍａｌｌＲＮＡの集合を有する組織、臓器、または区画由来のｓＲＮＡ配列データの絶対的な正規化を決定することができ、よって、全体および個々のｓＲＮＡのレベルの正確な比較を可能にすることができる。
【０１２３】
本発明は、サンプルにおける核酸の数を決定するための新規の方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドのセットを上記サンプルに添加して核酸分子の混合物を入手することにより、核酸分子のライブラリーを作製し、アダプターを上記ライブラリーの核酸分子にライゲートし、任意選択で上記ライブラリーを増幅させ、上記増幅したライブラリーの次世代シーケンシングを行うことにより、上記核酸分子からのＲＮＡ配列の読み取りをもたらし、上記セットおよび上記サンプルからの読み取りの数を決定する、方法を提供する。次に、上記セットの読み取りの数を、目的のゲノム由来の標的配列にアライメントしてもよく、同一のコア配列を含む読み取りは、任意選択で、さらなる解析のためまとめてグループ分けされている。
【０１２４】
サンプルにおける１つ以上の標的配列の量を、決定することができ、任意選択で、サンプルの核酸分子の相対的な定量化（たとえばｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）、またはサンプル中の核酸分子の絶対的な定量化（マイクログラムあたりの分子）を、決定することができる。
【０１２５】
さらに、本発明の参照値を決定するための方法は、異なる供給源由来のｓＲＮＡ配列データを正規化するため、およびｓＲＮＡライブラリーの調製の間に起こるクローニングのバイアスを評価するために、使用することができる。
【０１２６】
さらに本発明は、以下の付記項を包有する。
【０１２７】
１．一本鎖核酸分子の少なくとも２つのサブセットを含むセットであって、各核酸分子が、５’から３’への方向に、
ａ）５’末端にリン酸塩と、
ｂ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｃ）標的配列と比較して２つ以上のミスマッチを含む少なくとも８つのヌクレオチドのコア配列と、
ｄ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｅ）３’末端に修飾と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、前記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なる、
セット。
【０１２８】
２．一本鎖核酸分子の少なくとも２つのサブセットを含むセットであって、各核酸分子が、５’から３’への方向に、
ａ）５’末端にリン酸塩と、
ｂ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｃ）標的配列と比較して配列が２つ以上のミスマッチを含む少なくとも８つのヌクレオチドのコア配列と、
ｄ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｅ）３’末端に修飾と
を含み、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、前記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なる、
セット。
【０１２９】
３．一本鎖核酸分子の少なくとも２つのサブセットを含むセットであって、各核酸分子が、
ａ）５’末端にリン酸塩と、
ｂ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｃ）標的配列と比較して２つ以上のミスマッチを含む少なくとも８つのヌクレオチドのコア配列と、
ｄ）少なくとも３つのランダム化したヌクレオチドの配列と、
ｅ）３’末端に修飾と
からなり、
各サブセットが、同一のコアヌクレオチド配列と、異なるランダム化したヌクレオチドとを有する複数の核酸分子を含み、
各サブセットの核酸分子が、前記コアヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチドにおいて異なる、
セット。
【０１３０】
４．前記ランダム化したヌクレオチド配列が、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれか１つである、付記項１〜３のいずれか１項に記載のセット。
【０１３１】
５．前記複数の核酸分子が、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの全ての４つのヌクレオチドの組み合わせを含むランダム化したヌクレオチド配列を含む、付記項１〜４のいずれか１項に記載のセット。
【０１３２】
６．前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、特にはｓｍａｌｌＲＮＡを模倣したＲＮＡ分子である、付記項１〜５のいずれか１項に記載のセット。
【０１３３】
７．ｓｍａｌｌＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、およびｔＲＮＡ、またはそれらの前駆体からなる群から選択される、付記項１〜６のいずれか１項に記載のセット。
【０１３４】
８．前記コアヌクレオチド配列が、８〜２５個のヌクレオチド、好ましくは１０〜２０個のヌクレオチド、好ましくは１２〜１８個のヌクレオチド、好ましくは１３個のヌクレオチドを含む、付記項１〜７のいずれか１項に記載のセット。
【０１３５】
９．前記各サブセットのコアヌクレオチド配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のヌクレオチドにおいて異なる、付記項１〜８のいずれか１項に記載のセット。
【０１３６】
１０．前記コアヌクレオチド配列が、セミランダム配列である、付記項１〜９のいずれか１項に記載のセット。
【０１３７】
１１．前記コアヌクレオチド配列が、目的の生物のゲノムまたはトランスクリプトームと異なる、付記項１〜１０のいずれか１項に記載のセット。
【０１３８】
１２．前記ランダム化したヌクレオチドの配列が、３〜７個のヌクレオチド、好ましくは３〜５個のヌクレオチド、好ましくは４個のヌクレオチドを含む、付記項１〜１１のいずれか１項に記載のセット。
【０１３９】
１３．５’末端のリン酸塩が、一リン酸塩、二リン酸塩、および三リン酸塩の群から選択される、付記項１〜１２のいずれか１項に記載のセット。
【０１４０】
１４．３’末端の修飾が、２’−Ｏ−メチル化およびヒドロキシル化からなる群から選択される、付記項１〜１３のいずれか１項に記載のセット。
【０１４１】
１５．３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個、またはそれ以上のサブセットを含む、付記項１〜１４のいずれか１項に記載のセット。
【０１４２】
１６．前記サブセットが、１〜１００００ａｍｏｌ、好ましくは１０〜５０００ａｍｏｌの量で存在する、付記項１〜１５のいずれか１項に記載のセット、
【０１４３】
１７．異なる量の各サブセットを含む、付記項１〜１６のいずれか１項に記載のセット。
【０１４４】
１８．前記標的配列が、目的のいずれかの配列、特には生物のゲノムまたはトランスクリプトーム、ウイルス、細菌、動物、植物由来の配列、特には、ＲＮＡ、特にはｓｍａｌｌＲＮＡ、特には動的なｓｍａｌｌＲＮＡとすることができる、付記項１〜１７のいずれか１項に記載のセット。
【０１４５】
１９．シーケンシングデータを正規化するためのｓｐｉｋｅ  ｉｎ  プローブとしての、付記項１〜１８のいずれか１項に記載のセットの使用。
【０１４６】
２０．付記項１〜１８のいずれか１項に記載のセットを使用して、サンプル、特には細胞、組織、または臓器のサンプルにおける１つ以上の標的配列の絶対量を決定するための方法。
【０１４７】
２１．シーケンシング法に使用するための核酸のライブラリーを作製するための方法であって、付記項１〜１８のいずれか１項に記載の１つ以上のセットを、標的の核酸分子と混合する、方法。
【０１４８】
２２．前記核酸ライブラリーが、ｓｍａｌｌＲＮＡを含む、付記項２１に記載の方法。
【０１４９】
２３．さらに前記ライブラリーを増幅する、付記項２１または２２に記載の方法。
【０１５０】
２４．ヌクレオチドシーケンシングにおける参照値を決定するための方法であって、
標的配列の混合物に、付記項１〜１８のいずれか１項に記載のセットを添加することにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、
前記ライブラリーにアダプターをライゲートするステップと、
任意選択で前記ライブラリーを増幅するステップと、
ヌクレオチドのシーケンシング法を行うステップと、
参照値として各サブセットの核酸分子の量を決定するステップと
を含む、方法。
【０１５１】
２５．標的配列の絶対量を決定するための方法であって、前記標的配列の量を、付記項２４に記載の方法により得られる参照値と比較する、方法。
【０１５２】
２６．異なる細胞種由来のｓｍａｌｌＲＮＡ分子の複製数を比較する、付記項２５に記載の方法。
【０１５３】
２７．サンプルにおける核酸分子の数を決定するための方法であって、
ａ）付記項１〜１８のいずれか１項に記載のセットを、前記サンプルに添加して、核酸分子の混合物を得ることにより、核酸分子のライブラリーを作製するステップと、
ｂ）前記ライブラリーを増幅するステップと、
ｃ）前記核酸分子からＲＮＡ配列の読み取りをもたらす、前記ライブラリーの次世代シーケンシングを行うステップと、
ｄ）前記セットおよび前記サンプルからの読み取りの数を決定するステップと
を含む、方法。
【０１５４】
２８．前記セットの読み取りの数を、標的配列、たとえば目的のゲノム由来の標的配列にアライメントし、同一のコア配列を含む読み取りを、任意選択で、さらなる解析のためまとめてグループ分けする、付記項２６に記載の方法。
【０１５５】
２９．前記サンプルにおける１つ以上の標的配列の量を決定するための、付記項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【０１５６】
３０．サンプルにおけるｓｍａｌｌＲＮＡ分子の絶対的な定量化のための、付記項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【０１５７】
３１．異なる供給源由来のｓＲＮＡ配列データを正規化するための、付記項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【０１５８】
３２．ｓＲＮＡライブラリーの調製の間に起こるクローニングのバイアスを評価するための、付記項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法の使用。
【０１５９】
３３．一般式：
ｐ−（Ｎ）ｍ（ｘ）（Ｎ）ｍ−２’−Ｏ−メチル
により記載されるオリゴヌクレオチド：
（式中、
Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかのランダムヌクレオチドであり、
Ｘは、標的配列と比較して、１つ以上のミスマッチを含み、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかを含む８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチド長を有する、コア配列であり、
ｍは、３、４、または５である）。
【０１６０】
３４．付記項３３に記載の少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドを使用する、シーケンシングのためのｓｐｉｋｅ  ｉｎを調製するための方法。
【０１６１】
３５．前記ｓｐｉｋｅ  ｉｎが、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇの可能性のある全てのヌクレオチドの組み合わせを含む、付記項３２に記載の複数のオリゴヌクレオチドを含む、付記項３４に記載の方法。
【０１６２】
本発明は、さらに以下の実施例により例示されるが、これらに限定されるものではない。
【０１６３】
実施例
方法
植物の材料
ｄｃｌ２３４変異体は、以前に記述されているように、ｄｃｌ２−１、ｄｃｌ３−１、およびｄｃｌ４−２ｔのアレルから構成されていた１７。植物は、１６時間の明期／８時間の暗期で、２０℃〜２２℃に制御された成長チャンバーの中で成長させた。Ｃｏｌ−０の葉のサンプルは、ロゼットに由来するものであり、茎生葉を、４〜６週齢の植物から単離した。開花していない花芽を、葉のサンプルと同じ植物（Ｃｏｌ−０の花）または同一条件下で成長させたｄｃｌ２３４の植物（ｄｃｌ２３４の花）から、回収した。
【０１６４】
ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎの設計
上位５０の、最も豊富なｍｉＲＮＡの５〜１７位（ｍｉＲＮＡの５’末端から計測）のｍｉＲＮＡに関する塩基同一性の割合からなるマトリックスを作製し、１０００個の１３ｎｔ配列をセミランダムに選択するために使用した。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＣｏｌ−０のゲノムに完全にアライメントしなかった２５２の配列をさらに考察し、２５６個の可能性のある全ての４塩基の組み合わせを、５’末端および３’末端の両方に付加し、セットあたり６５，５３６の総配列を作製した。６５，３５６の配列の２５２セットの中の全ての２１ｎｔのＲＮＡ最小自由エネルギーを、ＲＮＡｆｏｌｄを使用して決定した２５。次に、最小自由エネルギーの分布を試験し、注釈が付されたｍｉＲＮＡに類似の分布を有する２１ｎｔのＲＮＡ配列の８つのセットを、合成に選択し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から注文した。この混合比は、注釈が付されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｍｉＲＮＡの動的な範囲に及ぶように組み立てられた。
【０１６５】
ｓｍａｌｌＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎのオリゴヌクレオチドの設計。ｓｍａｌｌＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎの鍵となる特性を、この鍵に対応して太線またはイタリック体で示す。総ＲＮＡ（μｇ）あたりの付加されたオリゴヌクレオチドのモル量は、括弧で表されている。
【化１】
2020519256.tif 000002
【０１６６】
５’末端のリン酸塩および２’−Ｏ−メチル基を含むＲＮＡオリゴは、内在性ｓｍａｌｌＲＮＡを模倣しており；この例は、典型的な植物のｓｍａｌｌＲＮＡおよび動物のｓｉ−ＲＮＡに関するものであり得るが、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−ｍｅ）基は、基準の動物のｍｉｃｒｏＲＮＡを模倣するために、ヒドロキシル基と置き換えられ得ることが可能であった。
【０１６７】
５’末端および３’末端にある４つのランダム化したヌクレオチドは、それぞれのオリゴが４８（６５，５３６）個の可能性のある組み合わせを有し、（絶対的な分子の定量化に関する）正確な標準曲線の作製およびクローニングのバイアスの検出を可能にする。
【０１６８】
セミランダムなゲノムに一致しない（ｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｅ−ｍａｔｃｈｉｎｇ）コア  １３量体。上記の設計は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに関するものであり、恐らくは、多くの他の植物に適しているだけでなく、いずれの生物にも適合し得るものであった。
【０１６９】
ＲＮＡのシーケンシング
図１ａで示されるｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ  ｉｎの混合物を、２倍に希釈し、５００ｎｇの総ＲＮＡに添加した後、ポリアクリルアミドゲルのサイズセレクション、次いでＮＥＢｎｅｘｔ  ｓｍａｌｌＲＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）を使用してｓＲＮＡクローニングを行った。ＥＲＣＣ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎ  ｍｉｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）を２００倍に希釈し、１μｌを、５００ｎｇの総ＲＮＡに添加した。１０ｎｇの総ＲＮＡを使用して、Ｐｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌらが記載する通り２６ｍＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを作製した。サンプルを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉ−Ｓｅｑ  ２５００のシーケンシング機において、シングルリード５０ｂｐ（ｓＲＮＡ−Ｓｅｑ）モードまたはペアエンドリード５０ｂｐ（ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ）モードのいずれかでシーケンシングを行った。
【０１７０】
データ解析
アダプター配列を除去した後に、ｓＲＮＡ−Ｓｅｑの読み取りを、完全な一致を必要とし、読み取りあたり最大１００のアライメントを可能にするＢｏｗｔｉｅ  ｓｈｏｒｔ−ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｅｒ２７を使用して、ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎを伴うシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌ−０のゲノム（ＴＡＩＲ１０）にアライメントした（表１および２）。次に、共通する１３ｎｔ配列のｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎを含む読み取りを、さらなる解析のためまとめてグループ分けした。
【表１】
2020519256.tif 000003
【０１７１】
【表２】
2020519256.tif 000004
【０１７２】
次に、ｓｍａｌｌＲＮＡ−Ｓｅｑの読み取りを、それらが、２０〜２２ｎｔ長であり、それぞれｍｉＲＢａｓｅ２１２８およびＡｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２９における注釈に従いｍｉＲＮＡおよびｔａｓｉＲＮＡのセンス鎖の±２ｎｔ以内に含まれていた場合、成熟したｍｉＲＮＡまたはｔａｓｉＲＮＡにアライメントした。次に、一般的なファミリーに属している個々のｍｉＲＮＡまたはｔａｓｉＲＮＡに関する値を、合計し、個々のファミリーに関する読み取りの総量を入手した。２０〜２２ｎｔ長または２３〜２４ｎｔ長のいずれかであり、ＴＡＩＲ１０の注釈が付されたトランスポゾン（すなわち転位性のエレメントおよび転位性のエレメントの遺伝子）のいずれかの鎖と重複したｓｍａｌｌＲＮＡの読み取りを、マッピングしたトランスポゾンにしたがいグループ分けした。ペアエンドのｍＲＮＡ−Ｓｅｑの読み取りを、ＲＳＥＭ３０を使用して、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）  Ｃｏｌ−０のゲノム（ＴＡＩＲ１０）およびＥＲＣＣ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎにアライメントした。最大２０のアライメントを伴う読み取りを保持し、Ａｒａｐｏｒｔ１１の注釈３１に基づき、ＥＲＣＣのｓｐｉｋｅ  ｉｎまたは転写物のモデルに割り当てた。統計的な解析およびグラフィックスを、Ｒ３２を用いて行った。
【０１７３】
ｓＲＮＡ−Ｓｅｑのデータの絶対的な正規化のための外来性ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎのセットを作製するために、本出願人らは、３つの主な特性を有する２１ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計した（図１ａ）。第１に、ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎは、内在性植物のＲＮＡを模倣するために、５’末端の一リン酸塩および２’−Ｏ−メチル基を含んでいた。２’−Ｏ−メチル基は、植物のｓｍａｌｌＲＮＡに共通しているが１４、この修飾は、たとえば動物のｍｉＲＮＡを調査する場合には除外することが可能であった。第２に、ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎは、目的のゲノム（たとえばこの試験ではシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））に一致しないセミランダムな１３ｎｔのコア配列を含んでいた。第３に、これらのセミランダムな１３ｎｔのコア配列は、５’末端および３’末端の両方に、４つのランダム化したヌクレオチドのセットが配置されている。異なる１３ｎｔのコア配列を含む８つのｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎを設計し、図１ａに示すように特定のモル比で混合した。これらを、総ＲＮＡに添加した後、ｓＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの調製を行った。シーケンシング後に、非ゲノムに一致する１３ｎｔの固有のタグを使用して、各ｓＲＮＡ−ｓｐｉｋｅ−ｉｎに特に由来する読み取りを定量化した。これら１３ｎｔのコア配列は、それぞれ、最大６５，５３６の可能性のある２１ｎｔの配列により表すことができる。個々のｓＲＮＡ配列は、様々な特性、たとえば最終的なｓＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーにおけるそれらの表示にバイアスをかける二次構造を有するため１１−１３、それぞれの１３ｎｔのｓＲＮＡのコア配列に割り当てられ得る多数の様々な配列は、総じて、各ｓｐｉｋｅ  ｉｎのセットのクローニングのバイアスを最小限にすることが予測される。よって、ｓＲＮＡのｓｐｉｋｅ  ｉｎは、総ＲＮＡ（μｇ）あたりの分子（ＭＰＵ）の観点から、絶対的なデータの正規化に関する標準曲線の確固たる作製を可能にした（図１ｂ）。ほぼ完全な正の相関（全てが、Ｐｅａｒｓｏｎのｒ値≧０．９９およびＰ＜７．４２×１０−６を有した）が、ｓＲＮＡ−Ｓｅｑにより記録される相対的なＲＰＭレベル、および各サンプルに添加したｓＲＮＡのｓｐｉｋｅ  ｉｎの既知の絶対的なＭＰＵ量をプロットした際に、観察された（図１ｂ）。概念実証として、相対的な値と絶対的な値との間の高度に線形の関係を使用して、野生型（Ｃｏｌ−０）の花から単離した総ＲＮＡ（μｇ）あたりのｍｉＲＮＡ分子の数を予測するための線形モデルを作製した（図１ｃ）。
【０１７４】
ｓＲＮＡのｓｐｉｋｅ  ｉｎは、正確なデータの正規化を可能にしたため（図１）、本出願人らは、相対的なＲＰＭおよび絶対的なＭＰＵのタームでｓＲＮＡの下位集合を比較して、２つの正規化の手法が異なる結果をもたらすかどうかを判定した。同様の解析がいずれの種でも行うことができたが、本出願人らは、良好に注釈が付されたｓＲＮＡおよび転写物、容易に利用可能な異なる組織種、および主要なｓＲＮＡの下位集合を欠いている生存可能な変異体のため、ｓＲＮＡのｓｐｉｋｅ  ｉｎの有用性を試験するためにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）を試験した。植物のｓＲＮＡの集合は、４つの主なクラス：タンパク質をコードする遺伝子を転写後に制御する傾向のある２０〜２２ｎｔのｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、ならびに、通常トランスポゾンから生じ、トランスポゾンをサイレンシングする２０〜２２ｎｔおよび２３〜２４ｎｔの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる１５。ｓＲＮＡの下位集合の割合は、花と葉とで異なり（図４）、相対的に正規化した葉および花のｓＲＮＡの値の比較では誤差が生じやすい。たとえば、Ｃｏｌ−０の花およびＣｏｌ−０の葉のそれぞれのｓＲＮＡの集合の３０％および５３％が、２０〜２２ｎｔの配列から構成されていたが（図４ａ〜ｃ）、これは、葉に２０〜２２ｎｔより多くのｓＲＮＡが絶対的に存在するかどうか、またはこの相対的な増加が単に花の組織と比較した葉における２３〜２４ｎｔのｓｉＲＮＡのレベルの低減によるものであるかどうかを決定することはできない。ｓＲＮＡのｓｐｉｋｅ  ｉｎを使用することにより、本出願人らは、Ｃｏｌ−０の花および葉におけるｓＲＮＡの下位集合に関する相対的な正規化および絶対的な正規化の方法を比較した。この２つの正規化の方法は、異なる結果をもたらした。たとえば、総ｍｉＲＮＡのレベルは、Ｃｏｌ−０の花と比較してＣｏｌ−０の葉において有意に高いＲＰＭを有し（１．７倍；；Ｐ＝３．２×１０−３；２つのサンプルのスチューデントｔ検定）、ｍｉＲＮＡの絶対数は、Ｃｏｌ−０の花と比較してＣｏｌ−０の葉において有意ではなく（ｎｏｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）１．５倍低下している（Ｐ＝０．１３；２つのサンプルのスチューデントｔ検定）（図４ｅ、ｆ）。さらに、相対的ではない、絶対的な正規化は、ｍｉＲＮＡのファミリーが、Ｃｏｌ−０の葉と比較してＣｏｌ−０の花において有意に大きなレベルを有することを示している（図２ａ、ｂ）。（Ｐ＝４．１×１０−３；２つのサンプルコルモゴロフ−スミルノフ検定）。よって、ｓＲＮＡ−Ｓｅｑの相対的な正規化の後に組織種間の比較を行うことは、誤解を招く結果をもたらす場合があり、このことは、ｓＲＮＡのｓｐｉｋｅ  ｉｎの使用を介して軽減される。
【０１７５】
さらに、ｓＲＮＡの集合の変化がどのように相対的な正規化に影響し得るかを試験するために、本出願人らは、ｓｉＲＮＡ欠失型の花由来のｓＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを作製し、これらを、Ｃｏｌ−０の花のデータセットと比較した。より具体的には、本出願人らは、ＤＩＣＥＲ−ＬＩＫＥ２（ＤＣＬ２）、ＤＣＬ３、およびＤＣＬ４のリボヌクレオチドをコードする３つの遺伝子におけるヌル変異を有する花（すなわちｄｃｌ２３４の花）由来のｓＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー作製した。ＤＣＬ３およびＤＣＬ４は、それぞれ、２３〜２４ｎｔのｓｉＲＮＡおよびｔａｓｉＲＮＡのバイオジェネシスに必要である１６−２０（図４ｃ）。よって、ｄｃｌ２３４の花は、低いレベルのｔａｓｉＲＮＡおよび２３〜２４ｎｔのｓｉＲＮＡを有することが予測される。２０〜２４ｎｔのｓｉＲＮＡのレベルにおける相対的および絶対的な正規化の方法の比較は、同様の結果をもたらした（図４のｄ、ｅ、および図２のａ、ｂ）。しかしながら、総ｔａｓｉＲＮＡに関する相対的なＲＰＭのレベルは、Ｃｏｌ−０の花と比較してｄｃｌ２３４の花において有意に低減せず；対して総ｔａｓｉＲＮＡに関する絶対的なＭＰＵは、有意に低減した（ＰＲＰＭ＝０．０８、ＰＭＰＵ＝０．０４；２つのサンプルのスチューデントｔ検定）（図４のｄ、ｅ）。相対的に正規化したｔａｓｉＲＮＡのファミリーおよび絶対的に正規化したｔａｓｉＲＮＡのファミリーのレベルは、ｄｃｌ２３４の花において有意に低減したが、この減少は、絶対的なタームを使用した場合により顕著となる（ＰＲＰＭ＝１．０×１０−３、ＰＭＰＵ＝１．６×１０−４；２つのサンプルのコルモゴロフ−スミルノフ検定（図２ａ、ｂ）。また、本出願人らは、ｍｉＲＮＡの総数が、Ｃｏｌ−０の花と比較してｄｃｌ２３４の花において有意に高いＲＰＭおよびＭＰＵの両方を有することを見出した（ＰＲＰＭ＝０．０４、ＰＭＰＵ＝０．０２；２つのサンプルのスチューデントｔ検定）（図４のａ、ｂ）。よって、ｓｉＲＮＡの非存在下では、ｍｉＲＮＡは、以前に提案された通り増大した２１。
【０１７６】
個々のｓＲＮＡのレベルは、多くの場合、特定のｓＲＮＡがいつおよびどこで最も多く存在するかを決定するために、様々な組織種からのＲＮＡ−Ｓｅｑのデータセットを通して比較される。本出願人らは、２つの正規化の方法が異なる結果をもたらすかどうかを判定するために、Ｃｏｌ−０の花対Ｃｏｌ−０の葉またはｓｃｌ２３４の花における９３のｍｉＲＮＡのファミリーに関する、相対的に正規化した値および絶対的に正規化した値を比較した。実際に、ＲＰＭベースの値の比較から、１３および６つのｍｉＲＮＡのファミリーが、それぞれ、Ｃｏｌ−０の花と比較してＣｏｌ−０の葉においてそれぞれ増加したレベルおよび減少したレベルを有することが示唆される（図２ｃ）。対照的に、花におけるより高い絶対的なｍｉＲＮＡレベルのため（図４ｅおよび図２ｂ）、ＭＰＵベースの値の比較は、花と比較してＣｏｌ−０の葉においてｍｉＲＮＡファミリーが増加せず、１９のｍｉＲＮＡのファミリーが、Ｃｏｌ−０の葉において減少することを表す（図２ｄ）。さらに、３５のｍｉＲＮＡのファミリーは、ＲＰＭの値に基づきＣｏｌ−０の花と比較してｄｃｌ２３４において増加したレベルを有し、対して１６のｍｉＲＮＡのファミリーのみが、比較のためＭＰＵ値を使用した際に、Ｃｏｌ−０の花と比較してｄｃｌ２３４の花において増加する（図２ｃ、ｄ）。本出願人らの結果に基づき、異なる基本ｓｍａｌｌＲＮＡの集合を伴う組織由来のｓＲＮＡ−Ｓｅｑの絶対的な正規化は、総ｓＲＮＡのレベルおよび個々のｓＲＮＡのレベルのより正確な比較を可能にする。
【０１７７】
ｓＲＮＡのレベルとそれらの前駆体または標的の存在量との間の関係は、ｍｉＲＮＡのバイオジェネシスおよび機能を理解するために重要である。ｓｍａｌｌＲＮＡおよびそれらのより長いＲＮＡ前駆体／標的は、選択およびＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーへのクローニングに関して異なる手法を必要とするため、ｓＲＮＡとそれらの前駆体または標的との間の化学量論を推定するために相対的な正規化の手法を使用することは不可能である。本出願人らは、市販のｍＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎ（ＥＲＣＣ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎ  ｍｉｘ；ＬｉｆｅＴｅｃｈ）と共にｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎが、ｓＲＮＡ−ＳｅｑのデータセットとｍＲＮＡ−Ｓｅｑのデータセットの間の相互比較を可能にするかどうかを試験した。より具体的には、本出願人らは、上述のｓＲＮＡ−Ｓｅｑのデータセットを作製するために使用した同じ総ＲＮＡサンプルから、ｍＲＮＡ−Ｓｅｑのデータセットを作製し、ＥＲＣＣ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎ  ｍｉｘを総ＲＮＡに添加した後に、ｍＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの構築を行った。ＥＲＣＣの転写物の相対数（ＴＰＭ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｍｉｌｌｉｏｎ）と、既知の、総ＲＮＡ（μｇ）あたり添加された分子の数との間にある強力な正の相関が、少なくとも０．９６のピアソンのｒ値およびＰ＜１．４４×１０−１２を有し、６つ全てのデータセットで観察された（図３ａおよび図５ａ−ｅ）。次に、本出願人らは、これらの関係を使用して線形モデルを作製し、これらをＴＰＭ≧１．０のｍＲＮＡに適用して、６つ全てのデータセットにおけるゲノムワイドなｍＲＮＡ  ＭＰＵを推定した。このことによって、その後本出願人らは、成熟したｓＲＮＡのＭＰＵを、それらの前駆体または標的のいずれかのＭＰＵと比較することができた。本出願人らは、ｍｉＲＮＡ／前駆体の比が、Ｃｏｌ−０の葉、Ｃｏｌ−０の花、およびｄｃｌ２３４の花において類似している（ここでそれぞれのｍｉＲＮＡ／前駆体の比の中央値は２．１、１．６、および１．５である）ことを見出した（図３ｂ）。ｔａｓｉＲＮＡとそれらの前駆体との間の比は、Ｃｏｌ−０の葉およびＣｏｌ−０の花におけるｍｉＲＮＡ／前駆体の比よりも高いが、有意に異なるものではなく、ここでのｔａｓｉＲＮＡ／前駆体の比の中央値は、それぞれ、３．７および４．４であった（図３ｂ）。対照的に、ｔａｓｉＲＮＡ前駆体は、ｄｃｌ２３４の花において、成熟したｔａｓｉＲＮＡのレベルよりも存在量が多く、ここでの前駆体の中央値は、ｔａｓｉＲＮＡよりも４２．４倍多かった（図３ｂ）。このことは、ｔａｓｉＲＮＡのバイオジェネシスに関するＤＣＬ４の既知の要件、および対応するｄｃｌ２３４の組織におけるｔａｓｉＲＮＡ前駆体のレベルの増加と一致している１６−１８，２０，２２。
【０１７８】
次に、本出願人らは、ゲノムワイドなｍｉＲＮＡとそれらの標的との間の化学量論を調査した。本出願人らは、公的に入手可能なＣｏｌ−０の花由来のｓＲＮＡ切断産物のデータセット（すなわちｄｅｇｒａｄｏｍｅデータセット）を使用して、ｍｉＲＮＡおよびｔａｓｉＲＮＡの標的を選択した２３、２４。ｍｉＲＮＡとそれらの標的との間の比は、Ｃｏｌ−０およびｄｃｌ２３４の花においては有意に異なるものではなく、それぞれ、３．９および０．６３の中央値の値を有していた。対照的に、ｔａｓｉＲＮＡ／標的の比は、予測されるようにＣｏｌ−０およびｄｃｌ２３４の花において有意に異なっており（Ｐ＝５．０ｅ−１６；２つのサンプルのコルモゴロフ−スミルノフ検定）、ここで、標的のＭＰＵは、ｔａｓｉＲＮＡのＭＰＵと比較して、それぞれ１．５倍および２１０．８倍であった（図３ｃ）。よって、ｍＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎと組み合わせた、ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎは、前駆体：ｓＲＮＡおよびｓＲＮＡ：標的の化学量論のゲノムワイドな推定を可能にする。
【０１７９】
ｓｍａｌｌＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎは、その後の解析のためアライメント可能な読み取りのうち１〜２％のみを必要とするｓＲＮＡ−Ｓｅｑ実験に有用な内部標準となるだけでなく、異なる治療、組織種、または研究グループ由来のｓＲＮＡ−Ｓｅｑデータを正規化するために使用することもできる。さらに、これらは、ｓＲＮＡ分子の絶対的な定量化を可能にし、このことは、正確な比較、ならびに、分子スケールでこれらの関係を理解するために重要である、前駆体：ｓＲＮＡおよびｓＲＮＡ：標的の化学量論のゲノムワイドな推定に、重要であり得る。最後に、ｓＲＮＡ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎは、様々なｓＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの作製プロトコルに存在するクローニングのバイアスに関して評価および改善するために、使用することができる。
【０１８０】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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