(57)【要約】  一般式（Ｉ）、式中、Ｒ１が、ハロゲンおよびＣ１〜Ｃ３アルコキシからなる群から選択される１または２の置換基で置換されるフェニル、あるいは１または２の窒素原子を有する６員ヘテロアリールであって、非置換であるか、または−ＮＨ２、ハロゲン、アルキルＣ１−Ｃ４、アルコキシＣ１−Ｃ３、ならびにＮおよびＯからなる群から選択される１または２のヘテロ原子を含む６員ヘテロ環である、からなる群から選択される置換基で置換されている、前記6員ヘテロアリールを表す化合物、またはその酸付加塩。化合物は、キナーゼＪＡＫ１／ＪＡＫ３阻害活性を有し、慢性の炎症性および自己免疫性疾患の処置における使用を見出すことができる。
2020519631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2020519631.tif 000042
(I)
式中、
Ｒ１は：
−ハロゲンおよびＣ１〜Ｃ３アルコキシからなる群から選択される１または２の置換基で置換されているフェニル；
あるいは
−１または２の窒素原子を有する６員ヘテロアリールであって、非置換であるか、または
−ＮＨ２、
−ハロゲン、
−アルキルＣ１−Ｃ４、
−アルコキシＣ１−Ｃ３、ならびに
−ＮおよびＯからなる群から選択される１または２のヘテロ原子を含む６員ヘテロシクリル：
からなる群から選択される置換基で置換される、前記６員ヘテロアリール、
を表す、
の化合物あるいはその酸付加塩。
【請求項２】
Ｒ１が、ハロゲンおよびＣ１−Ｃ３アルコキシからなる群から選択される１または２の置換基で置換されるフェニルを表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって
式中、
Ｒ１が、１または２の窒素原子を有する６員ヘテロアリールであって、非置換であるか、または
−ＮＨ２、
−ハロゲン、
−アルキルＣ１−Ｃ４、
−アルコキシＣ１−Ｃ３、ならびに
−ＮおよびＯからなる群から選択される１または２のヘテロ原子を含む６員ヘテロ環：からなる群から選択される置換基で置換される、前記６員ヘテロアリール、
を表す、前記化合物。
【請求項４】
ヘテロアリールがピリジニルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
ヘテロアリールがピリミジニルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
請求項４または５に記載の化合物であって、ヘテロアリールがアルキルＣ１〜Ｃ４、アルコキシＣ１〜Ｃ３、ならびにＮおよびＯからなる群から選択される１または２のヘテロ原子を含む６員ヘテロ環からなる群から選択される置換基で置換される、前記化合物。
【請求項７】
請求項４に記載の化合物であって、ピリジニル、特にピリジン−２−イル、ピリジン―３−イルまたはピリジン−４−イルが、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシで置換されている、前記化合物。
【請求項８】
請求項５に記載の化合物であって、ピリミジニル、特にピリミジン−５−イルが、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシで置換されている、前記化合物。
【請求項９】
以下の群：
１）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（４−メトキシ−フェニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
２）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−フルオロ−５−メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
３）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（ピリジン−３−イル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
４）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
５）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−エトキシ−ピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
６）（Ｒ）−２−（６−アミノピリジン−３−イル）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチル−ピペリジン−４−イル）アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
７）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−モルホリノ−ピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
８）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−メトキシ−ピリミジン−５−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
９）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−エトキシ−ピリミジン−５−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
１０）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−フルオロピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
１１）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−メトキシ−ピリジン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
１２）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
１３）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−モルホリノピリジン−４−イル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
１４）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−メトキシピリジン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド塩酸塩
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−メトキシピリジン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミドである、請求項１に記載の化合物またはその酸付加塩。
【請求項１１】
医薬としての使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
慢性の炎症性および自己免疫性疾患の処置方法における使用のための請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
活性成分として請求項１〜１０のいずれか一項に定義されたとおりの化合物を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
哺乳動物の対象における慢性の炎症性および自己免疫性疾患の処置方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に定義されるとおりの化合物を治療有効量を当該対象に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はチロシンキナーゼＪＡＫ、特にＪＡＫ１／ＪＡＫ３、阻害剤の活性を示す新規化合物、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体に関する。化合物は疾患の処置における使用を見出すことができ、その発症はキナーゼＪＡＫ１およびＪＡＫ３に関与する。特に、化合物は免疫応答モジュレーターとしての、例えば、移植学の分野における免疫抑制剤としての、ならびに自己免疫性のおよび炎症性疾患の処置における使用を見出すことができる。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
ヤーヌスキナーゼＪＡＫは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル経路においてシグナルを誘導するサイトカインおよびケモカインの細胞内伝達に関連する非受容体型チロシンキナーゼのファミリーである。それらは、他の炎症メディエーターをコードする遺伝子の中で、ＳＴＡＴタンパク質の活性化および遺伝子転写の開始において重要な役割を果たす。細胞における転写因子ＳＴＡＴの活性はそのリン酸化レベルに依存する。細胞におけるリン酸化レベルの増大はキナーゼＪＡＫ活性に依存する；キナーゼの阻害はリン酸化の減少およびＳＴＡＴタンパク質の転写活性をもたらし、結果的に調製された遺伝子の発現の減少を引き起こす。したがって、キナーゼＪＡＫ阻害剤は、自己免疫疾患を強調する炎症の誘導および維持の原因となる特異的な信号伝達を妨げる。炎症疾患の発症と臨床経過に関連するサイトカインがＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を活性化することが繰り返し確認され、これは間接リウマチ、乾癬、喘息などのかかる疾患の発症および臨床経過における公社の重要な要素を作る。炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインにより誘導されるリンパ球ＴにおけるＪＡＫキナーゼの刺激はＳＴＡＴ転写因子の活性化へと導く。これはリンパ球Ｂを刺激して免疫グロブリンＥの製造を増強し、好酸球の補充および成熟の原因となるリンパ球Ｔの差別化に作用し、これは部分的な炎症応答の発症へと導く。ＳＴＡＴ因子、キナーゼ阻害剤のリン酸化を妨げるために、キナーゼＪＡＫ阻害剤はリンパ球Ｔ集団および炎症応答の差別化を阻害することができ、それゆえ、炎症疾患の処置において有益であり得る。
【０００３】
ＪＡＫファミリーは４つの既知のメンバー、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２を含む。キナーゼＪＡＫ１、ＪＡＫ２およびＴＹＫ２は普遍的に発現され、一方、キナーゼＪＡＫ３は、主に造血細胞に発現される。したがって、ＪＡＫ３阻害効果は免疫系に限定されるだろう。ＪＡＫ３は膜貫通γｃ受容体を介して、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１によって活性化される。ＪＡＫ３と同様に、ＪＡＫ１はＩＬ−２受容体と関連しており、ＪＡＫ３と一緒にＩＬ−２シグナル伝達カスケードを媒介してＴ細胞増殖を調節する。ＪＡＫ１はまた、炎症応答に関連するＩＬ−６およびＩＦＮ−ガンマシグナル伝達において役割を担う。ＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１阻害剤は、免疫応答モジュレーターとしての使用を見いだすことができる医薬の探索、特に移植学における移植による拒絶反応を防ぐためのおよび自己免疫性および炎症性疾患の治療における興味深い標的である。
【０００４】
キナーゼＪＡＫ１および／またはＪＡＫ３阻害の活性を発現する、特にＪＡＫ２を超えて選択的である化合物が探索される。
ＷＯ２０１４／０３９５９５Ａ１は、ＪＡＫ２を超えて選択的なＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１阻害剤および慢性炎症性疾患および自己免疫疾患の処置のための潜在的な医薬として式
【化１】
2020519631.tif 000003
のイミダゾ［１，２ｂ］−ピリダジン−６−カルボキシアミドコアを有する化合物を開示する。
ＷＯ２０１２／１２５８９３は、ＪＡＫ２を超えて選択的なＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１阻害剤ならびに慢性炎症性および自己免疫疾患の処置のための潜在的な医薬として式
【化２】
2020519631.tif 000004
のピロロ［１，２−ｂ］−ピリダジン−６−カルボキシアミドコアを有する化合物を開示する。
【０００５】
ＷＯ２０１２／１２５８８６は、ＪＡＫ２を超えて選択的なＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１阻害剤ならびに慢性炎症性および自己免疫疾患の処置のための潜在的な医薬として式
【化３】
2020519631.tif 000005
のピロロ［１，２−ｂ］−ピリダジン−６−カルボキシアミドコアを有する化合物を開示する。
ＷＯ２０１１／０１４８１７は、式
【化４】
2020519631.tif 000006
の二環式複素環コアを有するＪＡＫ３阻害剤化合物を開示し、ピロロ［１，２ｂ］ピリダジン−６−カルボキシアミドコアを有する誘導体のみが特定の化合物として開示している。
【０００６】
ＵＳ２０１０／０１０５６６１は、望ましくないまたは異常なサイトカインシグナル伝達に関連する疾患における使用のためのキナーゼＪＡＫ３阻害剤として、式
【化５】
2020519631.tif 000007
のピロロ［２，３−ｂ］ピリジンコアを有する化合物を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
炎症性および自己免疫疾患の処置おいて潜在的に有用であり得る高い有効性および／または選択性のキナーゼＪＡＫ阻害能を発現する新しい化合物の必要性がある。この課題が本発明によって解決される。
本発明の目的は、一般式（Ｉ）
【化６】
2020519631.tif 000008
(I)
式中、
Ｒ１は：
−ハロゲンおよびＣ１〜Ｃ３アルコキシからなる群から選択される１または２の置換基で置換されるフェニル；
あるいは
−１または２の窒素原子を有する６員ヘテロアリールであって、
非置換であるか、または
−ＮＨ２、
−ハロゲン、
−アルキルＣ１−Ｃ４、
−アルコキシＣ１−Ｃ３、ならびに
−ＮおよびＯからなる群から選択される１または２のヘテロ原子を含む６員ヘテロシクリル、
からなる群から選択される置換基で置換される、前記６員ヘテロアリール、
を表す、
の化合物あるいはその酸付加塩である。
【０００８】
式（Ｉ）の化合物は、ＪＡＫ２を超えて、キナーゼＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１を選択的な阻害能力を有し、自己免疫性および炎症性疾患の処置における使用を見出すことができる。
さらなる側面において、本発明はまた、医薬としての使用のための上に定義した通りの式（Ｉ）の化合物に関する。
さらなる側面において、本発明はまた、上で定義される通りの式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物に関する。
さらなる側面において、本発明はまた、自己免疫性および炎症性疾患の処置における使用のための医薬の調製のための上に定義した通りの式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０００９】
さらなる側面において、本発明はまた、哺乳動物の対象における自己免疫性および炎症性疾患の処置方法であって、該対象に上に定義した通りの式（Ｉ）の化合物を治療上有効量で投与することを含む、前記方法に関する。
さらなる側面において、本発明はまた哺乳動物の対象における自己免疫性および炎症性疾患の処置方法における使用のための上に定義した通りの式（Ｉ）の化合物に関する。
【００１０】
発明の詳細な説明
発明の好ましい態様は、以下の詳細な説明および添付した特許請求の範囲に記載される。発明の様々な側面がより詳細に本明細書に定義される。したがって、他に明確に示されない限り、各定義される側面は任意の他の側面（単数）または側面（複数）と組み合わせられてもよい。特に、好ましいまたは有利なものとして示される任意の特徴は、好ましいまたは有利なものとして示される他の特徴（単数）または特徴（複数）と組み合わせられてもよい。
【００１１】
明細書を通して「１つの態様」または「ある態様」は、この態様に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの態様に含まれることを意味する。したがって、本明細書の様々な部分における「１つの態様において」または「ある態様において」という語句の任意の出現は、必ずしも同じものに関するものではないが、そうであることができる。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、1以上の態様において、本開示の当業者に理解されるように、任意の適切な方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載されるいくつかの態様は、いくつかを含み、他の態様に含まれる他の特徴を含まないが、当業者には理解されるように、様々な態様の特徴の組み合わせが本発明の範囲に含まれることができ、態様の様々な例を形成することができる。例えば、添付の特許請求の範囲において、任意のクレームされる態様は、任意の組み合わせで使用され得る。
【００１２】
１つの側面において、本発明は以下の式（Ｉ）
【化７】
2020519631.tif 000009
(I)
式中、Ｒ１は：
−ハロゲンおよびＣ１−Ｃ３アルコキシからなる群から選択される１または２の置換基で置換されたフェニル；または
−１または２の窒素原子を有する６員ヘテロアリールであって、非置換であるか、または
−ＮＨ２、
−ハロゲン、
−アルキルＣ１−Ｃ４、
−アルコキシＣ１−Ｃ３、および
−ＮおよびＯからなる群から選択された１または２のヘテロ原子を含む６員ヘテロシクリル：
からなる群から選択される置換基で置換される、１または２の窒素原子を有する６員ヘテロアリール、
を表す、
の化合物、またはその酸付加塩を提供する。 
【００１３】
本発明のある態様において、Ｒ１は、ハロゲン原子およびＣ１−Ｃ３アルコキシからなる群から選択される１または２の置換基で置換されたフェニルを表す。
本発明のある態様において、Ｒ１は、１または２のハロゲン原子、好ましくは１または２のフッ素原子で置換されたフェニルを表す。有利には、Ｒ１は１つのフッ素原子で置換されたフェニルを表す。また有利には、Ｒ１は２つのフッ素原子で置換されたフェニルを表す。
本発明のある態様において、Ｒ１は、２−メトキシフェニル、４−メトキシフェニルおよび５−メトキシフェニル、特に４−メトキシフェニルおよび５−メトキシフェニルを含む、１または２のＣ１−Ｃ３アルコキシ基、好ましくはメトキシ基、特に１つのメトキシ基で置換されたフェニルを表す。
【００１４】
本発明のある態様において、Ｒ１は、１つのハロゲン原子、好ましくはフッ素原子、および１つのＣ１−Ｃ３アルコキシ基、特にメトキシで置換されたフェニルを表す。有利には、Ｒ１は、１つのフッ素原子および１つのメトキシ基で置換されたフェニルを表す。かかる置換の例は、２−フルオロ−５−メトキシフェニルおよび２−フルオロ−４−メトキシフェニル、特に２−フルオロ−５−メトキシフェニルを含む。
【００１５】
本発明のある態様において、Ｒ１は、１または２の窒素原子を含み、非置換またはＮＨ２；ハロゲン；Ｃ１−Ｃ４アルキル；Ｃ１−Ｃ３アルコキシ；ならびにＮおよびＯからなる群から選択される１または２のヘテロ原子を含む６員ヘテロシクリルで置換された、６員ヘテロアリールを表す。
ある態様において、Ｒ１は、非置換の６員ヘテロアリール、特にピリジニルまたはピリミジニルを表す。
【００１６】
もう１つの態様において、Ｒ１は、ＮＨ２；ハロゲン；Ｃ１−Ｃ４アルキル；Ｃ１−Ｃ３アルコキシ；およびＮおよびＯからなる群から選択される１または２のヘテロ原子を含む、６員ヘテロシクリル、からなる群から選択される置換基によって置換されている、６員ヘテロアリール、特にピリジニルまたはピリミジニルを表す。
特に、上述の６員ヘテロアリール、好ましくはピリジニルまたはピリミジニルは、
ＮＨ２；ハロゲン、特にフッ素；Ｃ１−Ｃ４アルキル、特にメチルまたはエチル；Ｃ１−Ｃ３アルコキシ、特にメトキシまたはエトキシ；およびＮおよびＯからなる群から選択される１つまたは２つのヘテロ原子を含む６員ヘテロシクリル、特に４−モルホリニルからなる群から選択される置換基によって置換される。有利には、上述の態様において、Ｒ１は、ピリジン−２−イル、ピリジン−３−イルまたはピリジン−４−イルを表すか、あるいはＲ１は、ピリミジン−２−イルまたはピリミジン−５−イルを表す。
特に、上述の６員ヘテロアリールは、Ｃ１−Ｃ３−アルコキシ、特にメトキシまたはエトキシで置換されているピリジニル、特にピリジン−２−イル、ピリジン−３−イルまたはピリジン−４−イルである。
【００１７】
特に、上述の６員ヘテロアリールは、メトキシで置換された、ピリジニル、特にピリジン−２−イル、ピリジン−３−イルまたはピリジン−４−イルである。
特に、上述の６員ヘテロアリールは、Ｃ１−Ｃ３−アルコキシで、特にメトキシまたはエトキシで置換された、ピリミジニル、特にピリミジン−２−イルまたはピリミジン−５−イルである。
【００１８】
定義
本明細書において用いられる用語「アルキル」は、単独でまたはもう１つの置換基の一部として、直鎖または分岐鎖を有し、炭素−炭素単結合で連結し、定義において示された炭素原子の数、例えばＣ１−Ｃ４またはＣ１−Ｃ３を有する、炭化水素基に関する。炭素原子の後ろに与えられる数字は基に含まれ得る炭素原子の数に関する。したがって、例えば、Ｃ１−Ｃ４−アルキルは、１〜４個の炭素原子を有するアルキルを意味し、Ｃ１−Ｃ３−アルキルは、１〜３個の炭素原子を有するアルキルを意味する。Ｃ１−Ｃ３−アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、およびイソプロピルであり、およびＣ１−Ｃ４アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルである。
本明細書で使用される用語「ヘテロシクリル」は、ヘテロ環基に由来する置換基、すなわち、示された数の員環ならびに示された数および種類のヘテロ原子を有する脂環式飽和炭化水素基、に関する。「ヘテロシクリル」は、酸素（Ｏ）および窒素（Ｎ）から選択される１または２のヘテロ原子を含む６員飽和ヘテロ環式環、例えば、モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、およびジオキサニル、特にピペリジニル、モルホリニルおよびピロリジニル、を含む。
【００１９】
本明細書で使用される用語「ヘテロアリール」は、ヘテロアリール基に由来する置換基、すなわち、示された数の員環ならびに示された数および種類のヘテロ原子を有する芳香族炭化水素環式基、に関する。６員のヘテロアリールは、特にピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニルおよびピラジニル、特にピリジニルおよびピリミジニルを含む。
ハロゲンは、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）またはヨウ素（Ｉ）原子、特にフッ素原子に関する。
【００２０】
本発明の式（Ｉ）の化合物の酸付加塩は、特に医薬的に許容される無機または有機酸を有する塩を包含する。医薬的に許容される塩は好ましいものである。塩基性窒素原子を含む化合物と医薬的に許容される塩を形成してもよい無機および有機酸は技術分野でよく知られている。無機酸を有する塩は、特に、塩酸、臭化水素酸、硫酸（ＶＩ）、硝酸（Ｖ）、およびリン酸（Ｖ）の塩を含む。有機酸を有する塩は、特に、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸および安息香酸の塩を含む。本発明は、本発明の化合物の調製、単離および精製の工程における中間体として特に有用な薬学的に許容される塩以外の塩もまたその範囲に含むということが理解されるべきである。
酸付加塩は、かかる通り一般的に知られている方法で調製され得る。典型的に、例えば有機溶媒中の溶液中の式（Ｉ）の化合物を、水性または水性アルコール溶液、例えば水性メタノールまたはエタノール溶液中の酸と反応させ、沈殿塩を従来の方法、例えばろ過、洗浄および乾燥によって単離する。
【００２１】
本発明の特定の化合物は、以下の化合物およびその、無機および有機酸付加塩を含む、酸付加塩からなる群から選択される：
１）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（４−メトキシ−フェニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
２）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−フルオロ−５−メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
３）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（ピリジン−３−イル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
４）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
５）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−エトキシ−ピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
６）（Ｒ）−２−（６−アミノピリジン−３−イル）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチル−ピペリジン−４−イル）アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
７）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−モルホリノ−ピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
【００２２】
８）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−メトキシ−ピリミジン−５−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
９）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−エトキシ−ピリミジン−５−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
１０）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−フルオロピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
１１）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−メトキシ−ピリジン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
１２）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
１３）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−モルホリノピリジン−４−イル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド；
１４）（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−メトキシピリジン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド塩酸塩
【００２３】
さらなる側面において、本発明は、上で定義され、薬剤としての使用のためのいずれか１つの提示された態様による式（Ａ）の化合物に関する。
さらなる態様において、本発明は、医薬賦形剤と組み合わせて、上に定義された式（Ａ）の化合物を含み、且つ有効成分としてのいずれか１つの提示された態様による医薬組成物に関する。
キナーゼＪＡＫ１／ＪＡＫ３阻害剤として、上で定義された式（Ａ）の化合物は、慢性炎症性および自己免疫疾患の処置に有用であり得る。
したがって、本発明は、ヒトを含む、哺乳動物の慢性炎症性および自己免疫疾患の処置方法における使用のための上に定義された式（Ｉ）の化合物に関する。
【００２４】
したがって、本発明は、ヒトを含む、哺乳動物の慢性炎症性および自己免疫疾患の処置方法における使用のための薬剤の調製のための上に定義された式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
本発明はまた、ヒトを含む、哺乳動物における慢性炎症および自己免疫疾患の処置方法にも関し、それは当該哺乳動物に上に定義された式（I）の化合物または上に定義された式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を治療有効量を投与することを含む。
【００２５】
慢性炎症性および自己免疫疾患には、連結する組織の全身性疾患、特に関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症；非特異的な炎症性腸疾患、特にクローン病および潰瘍性大腸炎;副腎疾患、特に多発性硬化症および筋無力症;皮膚疾患、特に乾癬; ならびに喘息（astma）を含む。
本発明の化合物はまた、移植学における移植拒絶の防止のための使用を見出すことができる。
本発明の化合物を、スキーム１で表される工程により調製することができる。
以下では次の略語が使用される：
ＡｃＯＥｔ‐酢酸エチル；Ｂｏｃ‐ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基；ＣＮ‐ニトリル基；（ＣＯＣｌ）２‐オキサリルクロリド；Ｅｔ‐エチル；ＥｔＯ‐エトキシ；ＬｉＯＨ‐水酸化リチウム；Ｍｅ‐メチル；ＭｅＣＮ‐アセトニトリル；ＭＳ−ＥＳＩ‐エレクトロスプレー質量分析；ｍ／ｚ‐質量電荷比；ＮＨ４ＯＨ‐水性アンモニア、アンモニア水；ＮＭＲ‐核磁気共鳴；Ｐｄ／Ｃ‐パラジウム炭素；ＰＯＣｌ３‐オキシ塩化リン（Ｖ）；ＴＦＡ‐トリフルオロ酢酸。
【００２６】
【化８】
2020519631.tif 000010
【００２７】
スキーム１に示す通り、式（Ｉ）の化合物は、式ＩＩの５−アミノ−３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾールから出発して調製される。
式ＩＩの化合物は、酢酸中還流温度で、１〜２モル当量の量において用いたジエチル２−（エトキシ−メチレン）マロナートＩＩＩを用いて環化され、式ＩＶのピラゾロ［１，２−ｂ］ピリミジンを得る。
式ＩＶの化合物のヒドロキシ基は、オキシ塩化リン（Ｖ）、五塩化リン、塩化チオニル、好ましくはオキシ塩化リン（Ｖ）などの試薬を、２〜３０モル当量の量で使用して、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、キノリン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリンなどのアミン、１〜５モル当量の量の存在下、またはアミンなしで、テトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウムまたはベンジルトリエチルアンモニウムブロミドまたはクロリドなどの塩を１〜３モル当量の量で添加または無添加で、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、トルエン、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、クロロホルムなどの非プロトン性溶媒中、または溶媒なしで、６０〜１２０℃でまたは還流下で塩素と置換される。
【００２８】
式Ｖの化合物をＷＯ２０１４／０３９５９５Ａ１（中間体４）に記載の手順にしたがって得られる、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−４−アミノ−３，３−ジメチルピペリジン−１−カルボキシラートＶＩを１〜１．５モル当量の量で用いて、１〜３モル当量の量のトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンまたはピリジンなどのアミンの存在下、０〜３０℃で反応させ、式ＶＩＩの化合物を得る。
その後、式ＶＩＩの化合物のエステル基を加水分解して、０〜８０℃、好ましくは４０〜５５℃で、溶媒、例えば水／アルコール、できれば水／メタノールなどの溶媒の混合物中で、金属水酸化物、好ましくは水酸化リチウムなどの塩基を２〜１０モル当量の量で使用して、酸ＶＩＩＩを得る。
【００２９】
式ＶＩＩＩの化合物を２ステップの工程において式ＩＸの対応するアミドに変換する。第１ステップにおいて、２〜４モル当量の量におけるオキサリルクロリドと、触媒量のジメチルホルムアミドとの０〜３０℃での反応において酸塩化物を調製する。続いて、酸塩化物を、５〜２０モル当量の量におけるアンモニア水と０〜３０℃で反応させる。
式ＩＸの化合物中のアミン保護ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基は、ジクロロメタン溶液中１０〜４０モル当量のトリフルオロ酢酸を使用して０〜３０℃で除去され、式Ｘの化合物を得る。
【００３０】
その後、式Ｘの化合物を、非プロトン性溶媒、例えばジメチルホルムアミドまたはジクロロメタン、あるいはプロトン性溶媒、例えばメタノールまたはエタノールにおいて、２〜１０モル当量の量におけるアミン、例えばトリエチルアミン、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンまたはピリジンの存在下で、１〜１．５モル当量の量における６−クロロピリダジン−３−カルボニトリルを使用してアリール化し、式ＸＩの化合物を得る。
最終ステップにおいて、式ＸＩの化合物を、１〜２のモル当量の量における、対応するボロン酸ＸＩＩａまたは式ＸＩＩｂのボロン酸ピナコールエステルと、パラジウム触媒、例えば、酢酸パラジウム（ＩＩ）、ビス（ジベンジリデンアセトン）−パラジウム（０）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィン）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリドジクロロメタン付加物、または他の従来の鈴木カップリング触媒、０．０５〜０．２モル当量の量の存在下、１〜３モル当量の量で固体としてまたは水溶液として用いられる無機塩基、例えば、炭酸ナトリウム、カルシウム、またはセシウム、リン酸ナトリウム、またはカリウム、水酸化リチウム、ナトリウムまたはカリウム、あるいは有機塩基、例えばナトリウムまたはカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドの添加を伴って、溶媒、例えば、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エタノール、Ｃ３〜Ｃ６の脂肪族アルコール、ジメチルホルムアミドまたはジメトキシエタン中で、８０〜４０℃で、好ましくは還流温度で、鈴木カップリング反応を用いて、反応させる。
【００３１】
式ＶＩの化合物（ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−４−アミノ−３，３−ジメチルピペリジン−１−カルボキシラート）をスキーム３に従って、ＵＳ２００５／１８２０９５Ａ１およびＷＯ２０１４／０３９５９５Ａ１に記載される手順により得ることができる。
式ＶＩの化合物は、市販されているｔｅｒｔ−ブチル４−オキソピペリジン−１−カルボキシラートＸＶＩＩＩからｔｅｒｔ−ブチル３，３−ジメチル−４−オキソピペリジン−１−カルボキシラートＸＩＸを得るための、２〜３モル当量の量において用いられるメチル化剤、例えばヨウ化メチルとの反応において、２〜３モル当量の量において用いられる塩基、例えば水素化ナトリウム、ナトリウムメタノラート、ナトリウムｔｅｒｔ−ブタノラート、ｎーブチルリチウム、炭酸カリウム、好ましくは水素化ナトリウムの存在下、非プロトン性溶媒、例えば、テトラヒドロフラン、トルエン、ジクロロメタン、アセトニトリル、好ましくはテトラヒドロフラン中における反応において得ることができる。
【００３２】
次のステップにおいて、式ＸＩＸの化合物を２段階の還元的アミノ化反応において変換する。
第一に、式ＸＩＸの化合物を、１〜２モル当量の量において使用される（Ｒ）−１−フェニルエタン−１−アミンＸＸと、任意に０．０５〜１モル当量の量における酸、例えばパラ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸または硫酸、好ましくはパラ−トルエンスルホン酸の存在下で、非プロトン性溶媒、例えばトルエン、ベンゼンまたはキシレン、好ましくはトルエンにおいて、共沸蒸留のためのディーンシュタークトラップを備えた反応器において還流温度で反応させ、式ＸＸＩのｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−３，３−ジメチル−４−（（１−フェニルエチル）イミノ）ピペリジン−１−カルボキシラートを得、これは分離することなくさらなる反応のために使用される。
【００３３】
その後、式ＸＸＩの化合物との反応混合物を−７８から０℃の温度に冷却し、アルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、好ましくはエタノール、および還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを２〜３モル当量の量で加え、式ＸＸＩＩのｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−３，３−ジメチル−４−（（（Ｒ）−１−フェニルエチル）−アミノ）ピペリジン−１−カルボキシラートを得る。
最後のステップにおいて、式ＸＸＩＩの化合物におけるアミン基を保護する１−フェニルエチル基を除去する。１−フェニルエチル基は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、好ましくはエタノールなどの溶媒において、水素および０．０１〜０．０２モル当量の量において用いられるＰｄ／Ｃ触媒を使用する還元により除去され、式ＶＩの化合物、すなわちｔｅｒｔ−ブチル（（Ｒ）−４−アミノ−３，３−ジメチルピペリジン−１−カルボキシラートを得る。
【００３４】
式ＩＩ（５−アミノ−３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾール）の化合物は市販されている。J. Org. Chem. 1986, 51, 4656-4660およびJ. Med. Chem. 2010, 53, 1238-1249に記載される手順を使用して、１Ｈ−ピラゾールＸＩＶからスキーム２で表される方法によっても得ることができる。
【化９】
2020519631.tif 000011
【００３５】
本発明はまた、薬学的に許容される賦形剤との混合物における、活性成分として上で定義された式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を提供する。
上述の疾患および障害の処置において、本発明の式（I）の化合物は化合物（chemical compound）として投与することができるが、通常、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体（単数または複数）および補助物質（単数または複数）と組み合わせて含む医薬組成物の形態において使用するだろう。
【００３６】
上述の疾患および障害の処置において、本発明の医薬組成物は、任意の適切なルート、好ましくは経口、非経口または吸入ルートによって投与することができ、意図する投与ルートに依存して、医薬における使用を目的とする製剤の形態となるだろう。
【００３７】
経口投与用の組成物は、固体または液体製剤の形態を有することができる。 例えば、固体製剤は、結合剤（例えば、アルファコーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、サッカロース、カルボキシメチルセルロース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；崩壊剤（例えば、クロスポビドン、コーンスターチ、またはデンプングリコール酸ナトリウム）; 潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される不活性賦形剤から従来の方法において製造された錠剤またはカプセルの形態を有することができる。錠剤を、当技術分野で周知のコーティング、例えば単純コーティング、遅延/制御放出コーティングまたは腸溶コーティングで被覆することができる。例えば、経口投与用の液体製剤は、溶液、シロップまたは懸濁液の形態であることができ、または使用前に水または他の適切なビヒクルで再構成するための乾燥固体製品の形態を有することができる。かかる液体製剤は、薬学的に許容される不活性賦形剤、例えば、懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油）、乳化剤（例えばレシチンまたはアカシアゴム）、非水性ビヒクル（例えばマンデルオイル、オイルエステル、エチルアルコールまたは分画植物油）、および防腐剤（たとえば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルあるいはソルビン酸）から従来の手段を使用して調製できる。調製物はまた、適切な緩衝剤、香味剤、着色剤および甘味料も含むことができる。
【００３８】
経口投与用の製剤は、当業者に知られている方法を使用して活性化合物の制御された放出を得るように製剤化されることができる。
【００３９】
投与の非経口ルートは、筋肉内および静脈内注射による投与、ならびに静脈内注入を含む。非経口投与のための組成物は、例えば、防腐剤の添加を伴う、単位剤形、例えばアンプル、または複数用量の容器の形を有することができる。組成物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態を有することができ、賦形剤、例えば、懸濁化剤、安定剤、および/または分散剤など、を含むことができる。あるいは、活性成分は、適切な担体、例えば、滅菌した発熱物質を含まない水において、使用前に再構成するための粉末として製剤化することができる。
【００４０】
吸入ルートを介した投与のための組成物は、吸入形態を有することができ、噴霧により投与される。かかる製剤には、エアロゾルとして投与される活性物質および補助物質（単数または複数）、すなわち、気体中に懸濁される固体または液体物質の細かく分割された小粒子系が含まれる。噴霧において使用される補助物質は、例えば、等張剤としての塩化ナトリウム、ｐＨ調整剤および安定剤としての無機酸および水酸化物、防腐剤としての塩化ベンザルコニウム、緩衝剤としてのクエン酸ナトリウム、界面活性剤としてのポリソルベート８０、共溶媒としてのエタノールおよびプロピレングリコール、および抗酸化剤としての硫酸塩（ＶＩ）であり得る。吸入ルートによる投与のための製剤は、圧力吸入器または乾燥粉末吸入器の形態を有し得る。
【００４１】
本発明の化合物の使用を用いた処置方法は、治療有効量の本発明の化合物の、好ましくは医薬組成物の形態における、かかる処置を必要とする対象への投与を含む。本発明の化合物の提案された用量は、単回投与または分割投与で、１日あたり０．１〜約１０００ｍｇである。所望の生物学的効果を得るために必要とされる投与量の選択は、多くの要因、例えば特定の化合物、症状、投与方法、患者の年齢および状態に依存するだろうということ、および正確な投与量は最終的に主治医によって決定されるだろうということは、当業者に明らかであろう。
【００４２】
例
以下の実施例は例示目的のためであり、本発明の化合物の調製に使用される中間体の合成のために使用される従来の合成方法を示す。
中間体
本発明の化合物の調製のための中間体を以下に記載の通り調製する。
【００４３】
中間体Ｐ１．化合物ＶＩ  ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−４−アミノ−３，３−ジメチルピペリジン−１−カルボキシラート
【化１０】
2020519631.tif 000012
ステップＡ：化合物ＸＩＸ−ｔｅｒｔ−ブチル３，３−ジメチル−４−オキソピペリジン−１−カルボキシラート
【化１１】
2020519631.tif 000013
０℃に冷却したｔｅｒｔ−ブチル４−オキソピペリジン−１−カルボキシラートＸＶＩＩＩ（５０．０ｇ、２４６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０００ｍＬ）溶液に、水素化ナトリウム（パラフィン油中６０％懸濁液、２１．６ｇ、５４１ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。反応混合物を０℃で２時間撹拌した。この混合物に、テトラヒドロフラン（６０ｍＬ）中のヨードメタン（３４ｍＬ、５４１ｍｍｏｌ）溶液を１５分間滴加した。反応混合物を０℃でさらに２時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム溶液（５００ｍＬ）を混合物に加えた。混合物を酢酸エチル（３ｘ５００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出液：ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝９：１、ｖ／ｖ）で精製した。生成物を熱ヘキサンからの結晶化により精製した。生成物は白色結晶として得られた。（３９．８ｇ、１７５ｍｍｏｌ）、収率７１％。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 3.62 (t, J=6.4 Hz, 1H), 3.39 (s, 1H), 2.42 (t, J=6.4 Hz, 1H), 1.46-1.39 (m, 6H), 0.99 (s, 3H)。
【００４４】
ステップＢ：化合物ＸＸＩＩ‐ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−３，３−ジメチル−４−（（（Ｒ）−１−フェニルエチル）−アミノ）−ピペリジン−１−カルボキシラート
【化１２】
2020519631.tif 000014
トルエン（１５００ｍＬ）中、ｔｅｒｔ−ブチル３，３−ジメチル−４−オキソピペリジン−１−カルボキシラートＸＩＸ（１００ｇ、４１８ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｒ）−１−フェニルエタン−１−アミンＸＸ（５９．７ｍＬ、４６０ｍｍｏｌ）およびパラ−トルエンスルホン酸（０．８０ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、共沸ディーンスタークトラップ下で２４時間還流して撹拌した。その後、化合物ＸＸＩを含む得られた混合物を分離せずに−７０℃に冷却し、エタノール（１００ｍＬ）を加え、水素化ホウ素ナトリウム（１９．０ｇ、５０２ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。温度をゆっくりと室温まで上げながら、反応混合物を３時間撹拌した。混合物に水（３００ｍＬ）を加え、その容量の１／３に濃縮した。混合物をＡｃＯＥｔ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝９：１、ｖ／ｖ）により精製した。生成物を無色オイル（６７．３ｇ、４１８ｍｍｏｌ）として収率４８％で得た。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.37-7.25 (m, 4H), 7.22-7.15 (m, 1H), 3.85-3.70 (m, 1H), 3.72 (q, J=6.5 Hz, 1H), 3.58-3.42 (m, 1H), 2.70-2.40 (m, 2H), 2.16 (dd, 1H, J=10.7, 6.51 Hz, 1H), 1.44 (s, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.22 (d, J=6.5 Hz, 3H), 1.18-1.02 (m, 1H), 0.92 (s, 3H), 0.76 (s, 3H)。
【００４５】
ステップＣ：化合物ＶＩ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−４−アミノ−３，３−ジメチルピペリジン−１−カルボキシラート
【化１３】
2020519631.tif 000015
エタノール（１１５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−３，３−ジメチル−４−（（（Ｒ）−１−フェニルエチル）−−アミノ）−ピペリジン−１−カルボキシラートＸＸＩＩ（４４．９ｇ、１３５ｍｍｏｌ）の脱気された溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（４．０ｇ）を加えた。反応混合物を室温で水素雰囲気下２０時間撹拌した。混合物をセライトのベッドを通して濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：ＡｃＯＥｔ〜ＡｃＯＥｔ：メタノール＝５０：５０、ｖ／ｖ）で精製した。生成物を無色のオイル（２６．５ｇ、１１６ｍｍｏｌ）として８６％の収率で得た。 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.20-3,88 (m, 1H), 3.85-3.53 (m, 1H), 2.95-2.70 (m, 1H), 2.60-2.45 (m, 1H), 2.50 (dd, J=10.9, 4.2 Hz, 1H), 1.68-1.54 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.45-1.32 (m, 1H), 1.13 (bs, 2H), 0.93 (s, 3H), 0.82 (s, 3H)。
【００４６】
中間体Ｐ２：（Ｒ）−２−ブロモ−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド（化合物ＸＩＩ）
【化１４】
2020519631.tif 000016
ステップ１：エチル２−ブロモ−７−ヒドロキシピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシラートＩＶ
【化１５】
2020519631.tif 000017
５−アミノ−３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾールＩＩ（２０．０ｇ、１２１ｍｍｏｌ）の酢酸中（２００ｍＬ）の溶液に、ジエチルエトキシメチレンマロナートＩＩＩ（２５．９ｍＬ、１２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を撹拌しながら２０時間加熱還流した。その後、混合物を室温に冷却し、沈殿した固体を濾過し、エタノールおよびジエチルエーテルで洗浄した。生成物をクリーム状固体（２７．９ｇ、９７．４ｍｍｏｌ）として収率８１％で得た。ＭＳ−ＥＳＩ：（ｍ／ｚ）Ｃ９Ｈ７ＢｒＮ３Ｏ３［Ｍ−Ｈ］−について計算＝２８４．０、検出２８４．０。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.37 (s, 1H), 6.15 (s, 1H), 4.50 (bs, 1H), 4.14 (q, J=7.1 Hz, 2H), 1.24 (t, J=7.1 Hz, 3H)。
【００４７】
ステップ２：エチル２−ブロモ−７−クロロピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシラートＶ
【化１６】
2020519631.tif 000018
トリエチルアミン（２２．９ｍＬ、１６３ｍｍｏｌ）をステップ１において得られる、アセトニトリル（１８０ｍＬ）中のエチル２−ブロモ−７−ヒドロキシピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシラートＩＶ（９．３４ｇ、３２．６ｍｍｏｌ）およびテトラブチルアンモニウムクロリド（１８．９ｇ、６５．３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。続いて、オキシ塩化リン（Ｖ）（３０．４ｍＬ、３２６ｍｍｏｌ）を１５分間滴加した。反応混合物を撹拌しながら２０時間加熱還流した。室温に冷却後、反応混合物を飽和炭酸ナトリウムおよび氷の混合物に注いだ。混合物を酢酸エチル（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：ヘプタン：ＡｃＯＥｔ＝９：１〜８：２、ｖ／ｖ）で精製した。生成物は薄い黄色のアモルファス固体（６．８６ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）として６９％の収率で得られた。MS-ESI: (m/z) C9H8BrClN3O2 [M+H]+について計算= 303.9、検出303.9. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.97 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 4.49 (q, J=7.1 Hz, 2H), 1.46 (t, J=7.1 Hz, 3H)。
【００４８】
ステップ３：エチル（Ｒ）−２−ブロモ−７−（（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３，３−ジメチルピリジン−４−イル）−アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシラートＶＩＩ
【化１７】
2020519631.tif 000019
トリエチルアミン（８．０５ｍＬ、５７．７ｍｍｏｌ）をステップ２で得られるエチル２−ブロモ−７−クロロピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシラートＶＩ（５．８６ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１５０ｍＬ）溶液に加えた。続いて、アセトニトリル（３０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−４−アミノ−３，３−ジメチルピリジン−１−カルボキシラートＶＩ（中間体Ｐ１）（４．６１ｇ、２０．２ｍｍｏｌ）の混合物溶液を１５分間滴加した。反応混合物を室温で２０時間撹拌し、その後減圧下で濃縮した。残渣をＡｃＯＥｔ（１００ｍＬ）に溶解し、水（１００ｍＬ）を加えた。相分離の後、水相をＡｃＯＥｔ（２ｘ１００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：へプタン：ＡｃＯＥｔ＝９５：５〜８５：１５、ｖ／ｖ）により精製した。生成物はクリーム状の無定形固体（８．０８ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）として収率８５％で得られた。MS-ESI:(m/z) C21H31BrN5O4 [M+H]+ について計算 = 496.2、検出496.2. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.84 (d, J=8.8 Hz, 1H), 8.70 (s, 1H), 6.47 (s, 1H), 5.32 (t, J=8.6 Hz, 1H), 4.38 (q, J=7.1 Hz, 2H), 4.20-3.95 (m, 1H), 3.93-3.65 (m, 1H), 3.13-2.93 (m, 1H), 2.90-2.70 (m, 1H), 2.08-1.95 (m, 1H), 1.80-1.65 (m, 1H), 1.48 (s, 9H), 1.41 (t, J=7.1 Hz, 3H), 1.09 (s, 3H), 1.00 (s, 3H)。
【００４９】
ステップ４：（Ｒ）−２−ブロモ−７−（（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）−アミノ）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボン酸ＶＩＩＩ
【化１８】
2020519631.tif 000020
エタノール（２００ｍＬ）と水（５０ｍＬ）の混合物中の混合物において、ステップ３で得られたエチル（Ｒ）−２−ブロモ−７−（（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３，３−ジメチロピペリジン−４−イル）−アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシラートＶＩＩ（８．０６ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム（３．４１ｇ、８１．２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を９０分間撹拌しながら５５℃で加熱した。室温に冷却後、エタノールを減圧下で混合物から蒸発させた。残渣に水（１００ｍＬ）を加え、続いて白色固体が沈殿するまで１Ｍ塩酸水溶液を加えた。固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥させた。次に、固体をジクロロメタンに溶解し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で蒸発させた。９７％の収率でクリーム状の固体（７．３７ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）として得られた粗生成物を精製せずに次のステップで使用した。
【００５０】
ステップ５：ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−４−（（２−ブロモ−６−カルバモイルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イル）−アミノ）−３，３−ジメチルピペリジン−１−カルボキシラートＩＸ
【化１９】
2020519631.tif 000021
ステップ４からの粗（Ｒ）−２−ブロモ−７−（（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３，３−ジメチル−ピペリジン−４−イル）−アミノ）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボン酸ＶＩＩＩ（７．３７ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下乾燥ジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解した。冷却後、混合物を０℃に冷却し、オキサリルクロリド（２．７２ｍＬ、３１．５ｍｍｏｌ）を加えた。その後、ジメチルホルムアミドの滴（０．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。続いて、反応混合物を減圧下で蒸発させた。残渣を乾燥ジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解させた。混合物に２５％アンモニア水（２４．２ｍＬ、１５７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、ジクロロメタンを減圧下で蒸発させた。残渣に水（２００ｍＬ）を加えた。混合物をＡｃＯＥｔ（３ｘ２００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製した（シリカゲル、溶離液：ジクロロメタン：メタノール＝９７：３，ｖ／ｖ）。生成物が白色結晶（５．２１ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）として収率７１％で得られた。ＭＳ−ＥＳＩ：（ｍ／ｚ）Ｃ１９Ｈ２８ＢｒＮ６Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋について計算＝４６７．１、検出４６７．１。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.72 (d, J=9.0 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.04 (bs, 2H), 5.27 (t, J=8.4 Hz, 1H), 4.20-3.93 (m, 1H), 3.90-3.63 (m, 1H), 3.15-2.90 (m, 1H), 2.90-2.67 (m, 1H), 2.02 (dq, J=7.3, 3.4 Hz, 1H), 1.80-1.65 (m, 1H), 1.47 (s, 9H), 1.08 (s, 3H), 0.99 (s, 3H)。
【００５１】
ステップ６：（Ｒ）−２−ブロモ−７−（（３，３−ジメチルピぺリジン−４−イル）アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン−６−カルボキシアミドＸ
【化２０】
2020519631.tif 000022
ジクロロメタン（８０ｍＬ）中のステップ５からのｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−４−（（２−ブロモ−６−カルバモイルピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン−７−イル）−アミノ）−３，３−ジメチルピペリジン−１−カルボキシラートＩＸ（５．２１ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（８．５３ｍＬ、１１１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。揮発物を減圧下で蒸発させた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。揮発物を減圧下で蒸発させた。残渣に水（１００ｍＬ）を加えた後、ｐＨ＝１２まで６Ｍ水酸化ナトリウムを加えた。白色固体を混合物から沈殿させた。混合物をＡｃＯＥｔ（３ｘ１００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。収率１００％で白色固体として得られた粗生成物（４．０９ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）を、さらなる精製なしで次のステップにおいて使用した。
【００５２】
ステップ７：（Ｒ）−２−ブロモ−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピリジン−４−イル）−アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミドＸＩＩ
【化２１】
2020519631.tif 000023
ステップ６からの粗（Ｒ）−２−ブロモ−７−（（３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）ピラゾロ−［１，５−ａ］−ピリミジン−６−カルボキシアミドＸＩ（２．０５ｇ、５．５８ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下乾燥ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（３．９１ｍＬ，２７．９ｍｍｏｌ）の溶液に、その後６−クロロピリダジン−３−カルボニトリル（９６３ｍｇ、６．６９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を撹拌しながら８０℃で１時間加熱した。室温に冷却した後、１００ｍＬの水を加え、混合物をＡｃＯＥｔ（３ｘ１００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、乾燥させ、減圧下で蒸発させた。残渣にトルエン（５０ｍＬ）を加え、減圧下で蒸発させた。これを２回繰り返した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製した（シリカゲル、溶離液：ジクロロメタン：メタノール＝９８：２、ｖ／ｖ）。生成物が淡黄色の固体（２．３５ｇ、４．９９ｍｍｏｌ）として８９％の収率で得た。
MS-ESI: (m/z) C19H21BrN9O [M+H]+について計算= 470.1,検出470.1。 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 11.06 (d, J=8.3 Hz, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.50 (d, J=9.7 Hz, 1H), 6.99 (d, J=9.7 Hz, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.04 (bs, 2H), 5,49 (dd, J=10.6, 4.2 Hz, 1H), 4.48 (d, J=13,3 Hz, 1H), 4,29 (d, J=13.6 Hz, 1H), 3.40 (ddd, J=13.6, 9.4, 3.3 Hz, 1H), 3.17 (d, J=13.7 Hz, 1H), 2.26 (dq, J=11.3, 3.6 Hz, 1H), 1.96-1.80 (m, 1H), 1.11 (s, 3H), 1.10 (s, 3H)。
【００５３】
本発明の化合物を、以下の例に記載される通り、一般的な手順に従って、中間体Ｐ２および各ボロン酸ＸＩＩａまたはボロン酸ピナコールエステルＸＩＩｂから調製した。
一般的な手順：シュレンクフラスコ中の脱気されたジオキサン（２０ｍＬ／１ｍｍｏｌＰ２）中の（Ｒ）−２−ブロモ−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド（中間体Ｐ２）（１ｅｑ．）、［１，１′−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）ジクロロメタン錯体（０，１ｅｑ．）および各ボロン酸（２ｅｑ）またはボロン酸ピナコールエステルの混合物に、脱気した２Ｍリン酸カリウム（３ｅｑ．）水溶液を加えた。反応混合物を通してアルゴンを１５分間パージした。フラスコを固く締め、反応混合物を３時間撹拌しながら１２０℃に加熱した。その後、反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、セライトのベッドを通して濾過し、減圧下で濃縮した。油状残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：溶離液：ヘキサン：ＡｃＯＥｔ）により精製して生成物を得た。
【００５４】
例１）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（４−メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキサミド
【化２２】
2020519631.tif 000024
化合物Ｐ２（５１ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および（４−メトキシフェニル）ボロン酸（３３ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を用いて、白色アモルファス固体（２９ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）として収率５３％で調製した。MS-ESI: (m/z) C26H28N9O2 [M+H]+ について計算 = 498.2,検出498.2。1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 8.51 (s, 1H), 7.92 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.66 (d, J=9.7 Hz, 1H), 7.67-7.47 (m, 2H), 7.35 (d, J=9.9 Hz, 1H), 7.03 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6.71 (s, 1H), 5.82-5.70 (m, 1H), 4.67-4.55 (m, 1H), 4.42-4.25 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.50-3.38 (m, 1H), 3.21 (d, J=14.3 Hz, 1H), 2.42-2.27 (m, 1H), 2.05-1.85 (m, 1H), 1.12 (s, 6H)。
【００５５】
例２）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−フルオロ−５−メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化２３】
2020519631.tif 000025
化合物Ｐ２（４７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）および（２−フルオロ−５−メトキシ−フェニル）ボロン酸（３４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）から白色アモルファス固体（２５ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）として収率４９％で調製した。MS-ESI: (m/z) C26H27FN9O2 [M+H]+について計算=516.2、検出516.2。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.22 (bs, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.19 (bs, 1H), 7.87 (d, J=9.7 Hz, 1H), 7.59 (dd, J=5.8, 3.2 Hz, 1H), 7.55 (bs, 1H), 7.49 (d, J=9.8 Hz, 1H), 7.33 (dd, J=10.6, 9.2 Hz, 1H), 7.06 (dt, J=9.0, 3.5 Hz, 1H), 6.88 (d, J=3.3 Hz, 1H), 5.58-5.46 (m, 1H), 4.68 (d, J=13.7 Hz, 1H), 4.33 (d, J=13.5 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.34-3.24 (m, 1H), 3.13 (d, J=13.7 Hz, 1H), 2.36-2.24 (m, 1H), 1.92-1.74 (m, 1H), 1.05 (s, 3H), 1.04 (s, 3H)。
【００５６】
例３）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（ピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化２４】
2020519631.tif 000026
化合物Ｐ２（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボラン−２−イル）ピリジン（４５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）から黄色アモルファス固体（４０ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）として収率７８％で得た。MS-ESI: (m/z) C24H25N10O [M+H]+ について計算 = 469.2,検出469.2。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.23 (d, J=6.2 Hz, 1H), 9.26 (dd, J=2.0, 0.5 Hz, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.65 (dd, J=4.7 Hz, 1H), 8.41 (dt, J=8.0, 1.9 Hz, 1H), 8.17 (bs, 1H), 7.87 (d, J=9.7 Hz, 1H), 7.56 (ddd, J=7.9, 4.8, 0.7 Hz, 1H), 7.53 (bs, 1H), 7.49 (d, J=9.8 Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 5.58-5,47 (m, 1H), 4.63 (d, J=12.2 Hz, 1H), 4.33 (d, J=14.0 Hz, 1H), 3.44-3,34 (m, 1H), 3.22 (d, J=13.5 Hz, 1H), 2.32-2,20 (m, 1H), 1.90-1,74 (m, 1H), 1.04 (s, 3H), 1.03 (s, 3H)。
【００５７】
例４）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化２５】
2020519631.tif 000027
化合物Ｐ２（４７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）および（６−メトキシピリジン−３−イル）ボロン酸（３１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）から白色アモルファス固体（３３ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）として収率６６％で調製した。ＭＳ−ＥＳＩ：（ｍ／ｚ）Ｃ２５Ｈ２７Ｎ１０Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算＝４９９．２、検出４９９．２。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.20 (d, J=5.9 Hz, 1H), 8.87 (d, J=1.3 Hz, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.32 (dd, J=8.6, 1.7 Hz, 1H), 8.14 (bs, 1H), 7.87 (d, J=9.7 Hz, 1H), 7.50 (bs, 1H), 7.49 (d, J=9.7 Hz, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.98 (d, J=8.7 Hz, 1H), 5.58-5.45 (m, 1H), 4.62 (d, J=12.3 Hz, 1H), 4.33 (d, J=13.4 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.44-3.34 (m, 1H), 3.22 (d, J=13.6 Hz, 1H), 2.31-2.,19 (m, 1H), 1.90-1.72 (1H), 1.04 (s, 3H), 1.02 (s, 3H)。
【００５８】
例５）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−エトキシ−ピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化２６】
2020519631.tif 000028
化合物Ｐ２（５３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および（６−エトキシピリジン−３−イル）ボロン酸（３７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）からクリーム状アモルファス固体（３４ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）として収率６０％で調製した。。ＭＳ−ＥＳＩ：（ｍ／ｚ）Ｃ２６Ｈ２９Ｎ１０Ｏ−２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算＝５１３．２、検出５１３．２。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 11.26 (d, J=8.2 Hz, 1H), 8.74 (s, 2H), 8.04 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.46 (d, J=9.5 Hz, 1H), 6.91 (d, J=9.6 Hz, 1H), 6.84 (d, J=8.6 Hz, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.21 (bs, 2H), 5.78-5.65 (m, 1H), 4.53 (d,J=12.9 Hz, 1H), 4.42 (t, J=7.1 Hz, 2H), 4.32 (d, J=13.6 Hz, 1H), 3.44 (t, J=11.5 Hz, 1H), 3.19 (d, J=13.9 Hz, 1H), 2.36 (d, J=11.2 Hz, 1H), 2.06-1.86 (m, 1H), 1.44 (t, J=7,1 Hz, 3H), 1.16 (s, 6H).
【００５９】
例６）
（Ｒ）−２−（６−アミノピリジン−３−イル）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化２７】
2020519631.tif 000029
化合物Ｐ２（４８ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）および５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ピリジン−２−アミン（４４ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）から白色のアモルファス固体として収率４６％で調製した（２２ｍｇ，０．０４６ｍｍｏｌ）。MS-ESI: (m/z) C24H26N11O [M+H]+ について計算= 484.2、検出484.2。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 11.03-10.91 (m, 1H), 8.56 (dd, J=2.3, 0.7 Hz, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.08 (dd, J=2.4, 0.7 Hz, 1H), 7.96 (dd, J=8.7, 2.3 Hz, 1H), 7.63 (dd, J=8.7, 2.5 Hz, 1H), 7.49 (d, J=9.6 Hz, 1H), 6.98 (d, J=9.7 Hz, 1H), 6.66 (ddd, J=8.7, 2.1, 0.7 Hz, 2H), 6.62 (s, 1H), 5.67 (dd, J=10.3, 3.8 Hz, 1H), 4.53 (d, J=13.7 Hz, 1H), 4.30 (d, J=13.1 Hz, 1H), 3.48-3.35 (m, 2H), 2.42-2.30 (m, 1H), 2.03-1.86 (m, 1H), 1.14 (s, 6H)。
【００６０】
例７）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−モルホリノピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化２８】
2020519631.tif 000030
化合物Ｐ２（５１ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および４−（５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ピリジン（pirydyn）−２−イル）モルホリン（５８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）からクリーム状アモルファス固体として収率３３％で調製した（２０ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）。MS-ESI: (m/z) C28H32N11O2 [M+H]+について計算= 554.3、検出554.2. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.87 (d, J=8.8 Hz, 1H), 8.78 (d, J=2.1 Hz, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.97 (dd, J=8.9, 2.4 Hz, 1H), 7.44 (d, J=9.6 Hz, 1H), 6.90 (d, J=9.7 Hz, 1H), 6.73 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 5.94 (bs, 2H), 5.71 (ddd, J=10.3, 8.9, 4.2 Hz, 1H), 4.52 (d, J=13.3 Hz, 1H), 4.29 (d, J=13.5 Hz, 1H), 3.88-3.82 (m, 4H), 3.64-3.57 (m, 4H), 3.49-3.37 (m, 1H), 3.17 (d, J=13.7 Hz, 1H), 2.42-2.30 (m, 1H), 1.94 (ddd, J=15.2, 11.7, 4.6 Hz, 1H), 1.14 (s, 6H)。
【００６１】
例８）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−メトキシ−ピリミジン−５−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化２９】
2020519631.tif 000031
化合物Ｐ２（５３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および（２−メトキシピリミジン−５−イル）ボロン酸（３４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）から白色アモルファス固体として収率７６％で調製した（４２ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）。MS-ESI: (m/z) C24H26N11O2 [M+H]+ について計算= 500.2、検出500.2。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 11.18 (d, J=8.1 Hz, 1H), 9.03 (s, 2H), 8.63 (s, 1H), 7.46 (d, J=9.6 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.13 (bs, 2H), 5.72-5.57 (m, 1H), 4.52 (d, J=12.7 Hz, 1H), 4.33 (d, J=13.7 Hz, 1H), 4.10 (s, 3H), 3.42 (t, J=10.9 Hz, 1H), 3.17 (d, J=13.7 Hz, 1H), 2.42-2,24 (m, 1H), 2,06-1,90 (m, 1H), 1.16 (s, 3H), 1.15 (s, 3H)。
【００６２】
例９）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−エトキシ−ピリミジン−５−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化３０】
2020519631.tif 000032
化合物Ｐ２（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および（２−エトキシピリミジン−５−イル）−ボロン酸（３７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）から白色アモルファス固体として収率３０％で調製した（１７ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）。ＭＳ−ＥＳＩ：（ｍ／ｚ）Ｃ２５Ｈ２８Ｎ１１Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算＝５１４．２、検出５１４．２。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 11.07 (d, J=8.8 Hz, 1H), 9.00 (s, 2H), 8.54 (s, 1H), 7.45 (d, J=9.5 Hz, 1H), 6.90 (d, J=9.7 Hz, 1H), 6.76 (s, 1H), 6.04 (bs, 2H), 5.70-5,58 (m, 1H), 4.50 (q, J=7.0 Hz, 3H), 4.32 (d, J=13.6 Hz, 1H), 3.41 (t, J=11.4 Hz, 1H), 3.16 (d, J=13.6 Hz, 1H), 2.34 (d, J=10.5 Hz, 1H), 2,10-1,94 (m, 1H), 1.47 (t, J=7.1 Hz, 3H), 1.15 (s, 3H), 1.14 (s, 3H)。
【００６３】
例１０）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−フルオロ−ピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化３１】
2020519631.tif 000033
化合物Ｐ２（４７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）および（６−フルオロピリジン−３−イル）ボロン酸（２８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）からクリーム状のアモルファスの固体として収率７８％で調製した。MS-ESI: [M+H]+について計算(m/z) = 487.2、検出487.2。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 11.06 (d, J=8.8 Hz, 1H), 8.79 (d, J=2.4 Hz, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.29 (ddd, J=8.3, 7.8, 2.5 Hz, 1H), 7.48 (d, J=9.7 Hz, 1H), 7.09 (dd, J=8.5, 2.8 Hz, 1H), 6.95 (d, J=9.7 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 5.65 (dd, J=10.4, 4.1 Hz, 1H), 4.52 (d, J=13.3 Hz, 1H), 4.31 (d, J=13.5 Hz, 1H), 3.50-3.34 (m, 1H), 3.18 (d, J=13.8 Hz, 1H), 2.40-2,28 (m, 1H), 2.06-1.88 (m, 1H), 1.15 (s, 6H)。
【００６４】
例１１）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−メトキシ−ピリジン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化３２】
2020519631.tif 000034
化合物Ｐ２（２０１ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）および２−メトキシ−６−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ピリジン（２０２ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）から白色アモルファス固体として収率６７％で調製した（１４４ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ)。MS-ESI: (m/z) C25H27N10O2 [M+H]+ について計算= 499.2、検出499.2。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.32 (d, J=8.8 Hz, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.65 (d, J=5.1 Hz, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.94 (d, J=9.8 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.87 (d, J=5.1 Hz, 1H), 7.60 (bs, 1H), 7.57 (d, J=9.8 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 5.62-5.50 (m, 1H), 4.73 (d, J=11.9 Hz, 1H), 4.42 (d, J=13.5 Hz, 1H), 3.52-3.40 (m, 1H), 3.28 (d, J=13.7 Hz, 1H), 2.64 (s, 3H), 2.35 (d, J=9,7 Hz, 1H), 1.98-1.80 (m, 1H), 1.11 (s, 3H), 1.10 (s, 3H)。
【００６５】
例１２）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−メチル−ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化３３】
2020519631.tif 000035
化合物Ｐ２（４９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）および２−メチル−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ピリジン（４４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）から白色の、アモルファス固体として収率４１％で調製した（２０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）。ＭＳ−ＥＳＩ：（ｍ／ｚ）Ｃ２５Ｈ２７Ｎ１０Ｏ［Ｍ＋Ｈ］＋について計算＝４８３．２、検出４８３．２。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.89 (d, J=8.5 Hz, 1H), 8.62 (d, J=5.4 Hz, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.66-7.57 (m, 2H), 7.46 (d, J=9.6 Hz, 1H), 6.92 (d, J=9.5 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H), 5.86-5.61 (m, 3H), 4.58 (d, J=13.0 Hz, 1H), 4.33 (d, J=13.6 Hz, 1H), 3.44 (t, J=12.3 Hz, 1H), 3.19 (d, J=13.6 Hz, 1H), 2.6 (s, 3H), 2.40 (dd, J=13.4, 3.7 Hz, 1H), 2.07-1.90 (m, 1H), 1.16 (s, 6H)。
【００６６】
例１３）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（２−モルホリノピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化３４】
2020519631.tif 000036
化合物Ｐ２（５２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）および（２−モルホリノピリジン−４−イル）−ボロン酸（４６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）から白色アモルファス固体（３０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）として収率４９％で調製した。ＭＳ−ＥＳＩ：（ｍ／ｚ）Ｃ２８Ｈ３２Ｎ１１Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋について計算＝５５４．３、検出５５４．２。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 11.05 (d, J=8.2 Hz, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.29 (d, J=5.2 Hz, 1H), 7.49 (d, J=9.6 Hz, 1H), 7.20 (dd, J=5.2, 1.1 Hz, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.97 (d, J=9.7 Hz, 1H), 6.78 (s, 1H), 5.68 (dd, J=10.3, 4.0 Hz, 1H), 4.55 (d, J=13.4 Hz, 1H), 4.28 (d, J=13.8 Hz, 1H), 3.91 ‐ 3.84 (m, 4H), 3.64 ‐ 3.56 (m, 4H), 3.43-3,31 (m, 1H), 3.18 (d, J=13.7 Hz, 1H), 2.45 ‐ 2.30 (m, 1H), 2.05-1.89 (m, 1H), 1.15 (s, 6H)。
【００６７】
例１４）
（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）アミノ）−２−（６−メトキシ−ピリジン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド
【化３５】
2020519631.tif 000037
３７％の塩酸水溶液（１７０μｌ、２．０１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をアセトン（１０ｍＬ）中の（Ｒ）−７−（（１−（６−シアノピリダジン−３−イル）−３，３−ジメチルピペリジン−４−イル）−アミノ）−２−（６−メトキシピリジン−２−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−カルボキシアミド（１００ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）溶液に加えた。沈殿した白色固体をろ過し、アセトンで洗浄し、乾燥させて、生成物（９０ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ）を収率８４％で得た。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.20 (d, J=6.6 Hz, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.57 (bs, 1H), 7.95-7.78 (m, 4H), 7.50 (d, J=9.8 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.94 (d, J=9,8 Hz, 1H), 5.70-5.50 (m, 1H), 4.63 (d, J=13.2 Hz, 1H), 4.35 (d, J=13.7 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.39 (t, J=11.3 Hz, 1H), 3.23 (d, J=13.7 Hz, 1H), 2.35-2.22 (m, 1H), 1.95-1.77 (m, 1H), 1.08 (s, 3H), 1.05 (s, 3H)。
【００６８】
本発明の化合物の生物学的活性
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＪＡＫキナーゼ阻害アッセイ
本発明の化合物の効果を、以下に記載するキナーゼＪＡＫ阻害アッセイを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した。
試験された化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し、得られた貯蔵溶液を反応バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭ  ＤＴＴ）において連続希釈した。組換えキナーゼＪＡＫ１（ＰｒｏＱｉｎａｓｅ）、ＪＡＫ２、またはＪＡＫ３（Ｃａｒｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ）において最終濃度３ｎｇ／μＬ（ＪＡＫ１）、０．１ｎｇ／μＬ（ＪＡＫ２）、または０．２ｎｇ／μＬ（ＪＡＫ３）まで希釈した。得られた化合物の溶液５μＬおよび各キナーゼの溶液５μＬを９６ウェルプレートのウェルに加えた。試験化合物と酵素との相互作用を開始するために、プレートを、プレート-サーモシェーカーにおいて４００ｒｐｍで軌道撹拌しながら２５℃で１０分間インキュベートした。ネガティブコントロールのウェルは、試験化合物およびキナーゼを除く上記の全ての試薬を含み、ポジティブコントロールのウェルには、試験化合物を除く上記の全ての試薬を含んだ。以下の溶液１５μＬの添加により、酵素反応が開始された：５倍濃縮された反応バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭ  ＤＴＴ）、水、３０μＭ  ＡＴＰおよび特にキナーゼ：ＪＡＫ１‐６０μＭペプチド  ＩＲＳ−１（Ｅｎｚｏ）、ＪＡＫ２またはＪＡＫ３‐１０μＭペプチドＩＧＦ−１Ｒｔｉｄｅ（Ｌｉｐｏｐｈａｒｍ）。その後、プレートをプレート−サーモシェーカーにおいて２５°Ｃで１時間、４００ｒｐｍで軌道撹拌しながらインキュベートした。その後、酵素反応において形成されたＡＤＰの検出をＡＤＰ−Ｇｌｏキナーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。この目的のために、９６ウェルプレートのウェルに２５μＬのＡＤＰ−Ｇｌｏ試薬を加え、プレートを４００ｒｐｍで軌道撹拌しながら、プレート−サーモシェーカーにおいて２５°Ｃで４０分間インキュベートした。その後、９６ウェルプレートのウェルに５０μＬのキナーゼ検出試薬を加え、プレートをプレートサーモシェーカー内で２５℃で３０分間、４００ｒｐｍで軌道撹拌した。インキュベーション後、Ｖｉｃｔｏｒ  ｘ  Ｌｉｇｈｔルミノメーターを使用して発光強度を測定した（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．）。
【００６９】
さまざまな濃度の試験化合物を含むウェルにおけるおよびコントロールウェルにおける発光測定に基づいて、ＩＣ５０値を決定した。これらの値は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄソフトウェアｖ．５．０３を用いて、非線形回帰法の曲線の点を合わせることにより決定された。各コントロールの少なくとも３つのウェルを使用して、２つの９６ウェルプレートで、各化合物を少なくとも６回の繰り返し（６ウェル）で試験した。
【００７０】
本発明の選択された化合物のキナーゼＪＡＫ阻害活性の平均された結果を以下の表１に提示する。提示されたデータは、本発明の化合物がＪＡＫ１およびＪＡＫ３キナーゼをキナーゼＪＡＫ２を超えて優先的に阻害できることを示す。
【表１】
2020519631.tif 000038
【００７１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＦ−１細胞の生存率のアッセイ
本発明の化合物の活性の効果は、以下に記載される細胞生存率アッセイを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験された。
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し、得られたストック溶液をＯｐｔｉＭＥＭ培地（Reduced Serum Medium-Thermo Fisher Scientific）で連続的に希釈した。５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３または２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４の存在下で、培養培地（８０％ＲＰＭＩ  １６４０  ＋  ２０％ＦＢＳ）におけるＴＦ−１細胞（ＤＳＭＺ  ｎｏ．：ＡＣＣ３３４）をウェルあたり９０μｌの容量で、ウェルあたり１万個の細胞で９６−ウェルプレートに播いた。９６ウェルプレートのウェルに、化合物の調製された１０Ｘ貯蔵溶液１０μＬ。９６ウェルプレート上の細胞を、化合物とともに、３７°Ｃ、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。続いて、ＡＴＰｌｉｔｅキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、細胞の生存率を測定した。この目的のために、溶解バッファー（哺乳動物細胞溶解溶液）５０μＬを９６ウェルプレートのウェルに加え、プレートを６００ｒｐｍで軌道撹拌しながらプレートサーモシェーカーで２５℃で１０分間インキュベートした。その後、９６ウェルプレートのウェルに５０μＬの基質（基質溶液）を加え、６００ｒｐｍで軌道撹拌しながらプレートサーモシェーカーで暗所で１５分間インキュベートした。インキュベーション時間後、Ｖｉｃｔｏｒ  ｘ  Ｌｉｇｈｔルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｉｎｃ．）を使用して、ウェル内の発光強度を測定した。
【００７２】
さまざまな濃度の試験化合物を含むウェルにおけるおよびコントロールウェルにおける発光強度測定に基づいて、ＥＣ５０値を決定した。これらの値は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄソフトウェアｖ．５．０３を用いて非線形回帰法を使用して曲線の点を合わせることにより、決定された。各コントロールの少なくとも３つのウェルを使用して、２つの９６ウェルプレートで、各化合物を少なくとも６回の繰り返し（６ウェル）で試験した。
【００７３】
本発明の選択された化合物に対するＩＬ−３（ＪＡＫ２活性化）またはＩＬ−４（ＪＡＫ１／ＪＡＫ３活性化）の存在下での細胞ＴＦ−１の生存率の阻害活性の平均化された結果を以下の表２に示す。提示されたデータは、本発明の化合物がＪＡＫキナーゼを阻害できること、およびキナーゼＪＡＫ２阻害を越えてより強いＪＡＫ１／ＪＡＫ３キナーゼ阻害が見られることを示す。
【表２】
2020519631.tif 000039
【００７４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのリンパ球ＴによるＴＮＦaおよびＩＮＦγ産生の阻害アッセイ
本発明の化合物の活性は、以下に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して試験された。
試験した化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し、得られた貯蔵溶液をＯｐｔｉＭＥＭ培地（Reduced Serum Medium-Thermo Fisher Scientific）で連続希釈した。リンパ球は、ヒト末梢血から得られた白血球のトップコート層から分離された。末梢血単核細胞の分離は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＋  Ｌｅｕｃｏｓｅｐｔグラジエント法を使用し、ＣＤ４＋Ｔ細胞分離キットを使用したリンパ球分離、およびＴ細胞活性化／拡張キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した活性化を使用して行った。培養培地中の分離された細胞（９０％ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＢＳ）を４５０μＬ／ウェル、３０万／ウェルで１２ウェルプレートに分注し、試験化合物の調製された１０Ｘ貯蔵溶液５０μＬを加えた。４８時間後、分泌されたサイトカインのレベルを決定するために上清を収集した。決定前に、細胞を１０００ｇで１０分間遠心分離した。ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘヒトＴｈサイトカインキットを使用して、フローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒで決定を行った。結果を、コントロール細胞を参照したリンパ球Ｔによって分泌されるＴＮＦaｉＩＮＦγサイトカインの阻害の百分率として表３に提示する。
【表３】
2020519631.tif 000040
【００７５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＴＡＴ６リン酸化阻害アッセイ
本発明の化合物の活性を、以下に記載されるインビトロアッセイを使用して試験した。
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し、得られた貯蔵溶液をＯｐｔｉＭＥＭ培地（Reduced Serum Medium-Thermo Fisher Scientific）に連続的に入れた。２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４の存在下で培養培地（８０％ＲＰＭＩ  １６４０  ＋  ２０％ＦＢＳ）のＴＦ−１細胞（ＤＳＭＺ  ｎｏ  ．：  ＡＣＣ  ３３４）を９００μｌ／ウェル、７０万の細胞／ウェルで１２ウェルプレート上に篩過した。１２ウェルプレートのウェルに、得られた化合物の１０Ｘ溶液１００μＬを加えた。１２ウェルプレート上の細胞を試験化合物と３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＥＤＴＡ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を加えたＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、氷上で５分間インキュベートした。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。タンパク質溶解物を８％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、その後ニトロセルロース膜に湿式転写し、試験タンパク質を抗体の製造者の使用上の注意に従って検出した。
化学発光強度の測定に基づいて濃度測定（densitometric）分析を行い、さまざまな濃度の試験化合物で処理される細胞で得られた結果をコントロール細胞で得られた結果と比較し、ＩＣ５０値を決定した。
【００７６】
これらの値は、非線形回帰法を使用して曲線のポイントをフィッティングすることにより、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄソフトウェアｖ．５．０３で決定された。各化合物を少なくとも３回繰り返して試験した。本発明の選択された化合物の存在下でのＴＦ−１細胞におけるＳＴＡＴ６タンパク質リン酸化の、または本発明の選択された化合物のＩＬ−４（ＪＡＫ１／ＪＡＫ３活性化）の阻害活性の平均された結果を以下の表４に示す。
【表４】
2020519631.tif 000041
【国際調査報告】
2020519631.tif 000043
2020519631.tif 000044
2020519631.tif 000045