【手続補正書】
【提出日】平成29年6月28日(2017.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有する改変アマドリアーゼ：
（ａ）配列番号１７２に示すアミノ酸配列に１〜10個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、配列番号１７２に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している；
（ｂ）配列番号１７２に示すアミノ酸配列に１〜10個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、配列番号１７２に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している。
【請求項２】
配列番号１７２に示すアミノ酸配列の以下（ｃ）から（ｔ）よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、前記置換を行う前の未改変のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しているか、および／または前記置換を行う前の未改変のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とする改変アマドリアーゼ。
（ｃ）配列番号１の９８位のグルタミン酸
（ｄ）配列番号１の２５９位のバリン
（ｅ）配列番号１の１５４位のセリン
（ｆ）配列番号１の１２５位のヒスチジン
（ｇ）配列番号１の２６１位のチロシン
（ｈ）配列番号１の２６３位のグリシン
（ｉ）配列番号１の１０６位のアスパラギン酸
（ｊ）配列番号１の１０３位のグリシン
（ｋ）配列番号１の３５５位のアラニン
（ｌ）配列番号１の９６位のアスパラギン酸
（ｓ）配列番号１の６６位のリジンまたは／および６７位のバリン
（ｍ）配列番号１の７０位のグルタミン
（ｏ）配列番号１の１００位のスレオニン
（ｐ）配列番号１の１１０位のグルタミン
（ｑ）配列番号１の１１３位のアラニン
（ｒ）配列番号１の１１４位のロイシン
（ｔ）配列番号１の１５６位のアスパラギン酸
【請求項３】
配列番号１７２に示すアミノ酸配列に１〜10個の置換欠失付加を有するアミノ酸配列を含むアマドリアーゼであって、
当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の以下の（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下の（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換されており、
（ｔ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸が、プロリン以外のアミノ酸、すなわちグルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換されている；
（ｕ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸が、アラニン、システイン、またはセリンに置換されている；
（ｖ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸が、グリシン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、またはシステインに置換されている；
（ａｇ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、リジン、またはアルギニンに置換されている；
かつ以下の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有する改変アマドリアーゼ：
（ａ）前記（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）に記載の置換を有しない改変前の親アマドリアーゼと比較して、当該（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び／又は（ａｇ）に記載の置換を有することによりα−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している；
（ｂ）前記（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）に記載の置換を有しない改変前の親アマドリアーゼと比較して、当該（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び／又は（ａｇ）に記載の置換を有することによりα−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している。
【請求項４】
配列番号１７２に示すアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアマドリアーゼであって、
当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の以下の（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下の（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換されており、
（ｔ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸が、プロリン以外のアミノ酸、すなわちグルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換されている；
（ｕ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸が、アラニン、システイン、またはセリンに置換されている；
（ｖ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸が、グリシン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、またはシステインに置換されている；
（ａｇ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、リジン、またはアルギニンに置換されている；
かつ以下の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有する改変アマドリアーゼ：
（ａ）前記（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）に記載の置換を有しない改変前の親アマドリアーゼと比較して、当該（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び／又は（ａｇ）に記載の置換を有することによりα−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している；
（ｂ）前記（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）に記載の置換を有しない改変前の親アマドリアーゼと比較して、当該（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び／又は（ａｇ）に記載の置換を有することによりα−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している。
【請求項５】
配列番号２４１、配列番号１８８、配列番号１９７、若しくは配列番号２１３に示すアミノ酸配列に１〜10個の置換欠失付加を有するアミノ酸配列を含むアマドリアーゼ、
配列番号１８８、配列番号１９７、若しくは配列番号２１３に示すアミノ酸配列を含むアマドリアーゼ、又は、
配列番号２４１、配列番号１８８、配列番号１９７、若しくは配列番号２１３に示すアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアマドリアーゼであって、
当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の以下の（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下の（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換されており、
（ｔ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸が、プロリン以外のアミノ酸、すなわちグルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに置換されている；
（ｕ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸が、アラニン、システイン、またはセリンに置換されている；
（ｖ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸が、グリシン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、またはシステインに置換されている；
（ａｇ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、リジン、またはアルギニンに置換されている；
かつ以下の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有する改変アマドリアーゼ：
（ａ）前記（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）に記載の置換を有しない改変前の親アマドリアーゼと比較して、当該（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び／又は（ａｇ）に記載の置換を有することによりα−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している；
（ｂ）前記（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び（ａｇ）に記載の置換を有しない改変前の親アマドリアーゼと比較して、当該（ｔ）、（ｕ）、（ｖ）及び／又は（ａｇ）に記載の置換を有することによりα−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している。
【請求項６】
改変前の親アマドリアーゼと比較して、さらに、当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の以下の（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｈ）、（ａｉ）、及び（ａｊ）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下の（ｗ）、（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）、（ａａ）、（ａｂ）、（ａｃ）、（ａｄ）、（ａｅ）、（ａｆ）、（ａｈ）、（ａｉ）、及び（ａｊ）の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼ：
（ｗ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１２５位のヒスチジンに対応する位置のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、またはアルギニンに置換されている；
（ｘ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の２６１位のチロシンに対応する位置のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはリジンに置換されている；
（ｙ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の２６３位のグリシンに対応する位置のアミノ酸が、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸に置換されている；
（ｚ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン酸よりも分子量の小さいアミノ酸、すなわちグリシン、アラニン、セリン、バリン、スレオニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、またはアスパラギンに置換されている；
（ａａ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１０３位のグリシンに対応する位置のアミノ酸が、リジン、アルギニン、またはヒスチジンに置換されている；
（ａｂ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸が、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸に置換されている；
（ａｃ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の９６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸が、アラニン、アスパラギン、ヒスチジン、またはセリンに置換されている；
（ａｄ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の６６位のリジンに対応する位置のアミノ酸が、グリシンにまたは／および６７位のバリンがプロリンに置換されている；
（ａｅ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の７０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸が、プロリンに置換されている；
（ａｆ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１００位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸が、アルギニンに置換されている；
（ａｈ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置のアミノ酸が、グルタミン酸、またはリジンに置換されている；
（ａｉ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１１４位のロイシンに対応する位置のアミノ酸が、リジン、またはアルギニンに置換されている；
（ａｊ）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１５６位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギンに置換されている。
【請求項７】
さらに、以下の（ba）から（be）よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を含む、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変アマドリアーゼ：
（ba）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（bb）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換；
（bc）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のグルタミンへの置換および当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換；
（bd）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（be）当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換、当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および当該アマドリアーゼのアミノ酸配列中における、配列番号１に示すアミノ酸配列の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換。
【請求項８】
配列番号１７２に示すアミノ酸配列、又は配列番号１７２に示すアミノ酸配列に１〜10個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／若しくは置換がなされたアミノ酸配列を有し、当該アミノ酸配列においてさらに、配列番号１の９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、配列番号１の１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および配列番号１の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換を有し、前記置換を行う前の未改変のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しており、かつ前記置換を行う前の未改変のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とする改変アマドリアーゼ。
【請求項９】
配列番号１７２に示すアミノ酸配列、又は配列番号１７２に示すアミノ酸配列に１〜10個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／若しくは置換がなされたアミノ酸配列を有し、当該アミノ酸配列においてさらに、以下の（ca）から（cc）よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有し、前記置換を行う前の未改変のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しており、かつ前記置換を行う前の未改変のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とする改変アマドリアーゼ：
（ca）配列番号１の９８位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、配列番号１の１１０位のリジンに対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および配列番号１の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（cb）配列番号１の９８位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換および配列番号１の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（cc）配列番号１の１１０位のリジンに対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および配列番号１の２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の改変アマドリアーゼのアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
アマドリアーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
（ａｋ）請求項１２に記載の宿主細胞を培養する工程；
（ａｌ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；および
（ａｍ）培養物から改変アマドリアーゼを単離する工程。
【請求項１４】
請求項１から請求項９のいずれかに記載の改変アマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるためのキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼにおける特定のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、これを一実施形態として包含する本発明を完成した。