(57)【要約】  本発明は、黒色腫を治療するまたは予防するために有用な、式（Ｅ）2020519646.tif 000104によって表される化合物に関する。
2020519646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒色腫の治療または予防において使用するための、
式（Ｅ）によって表される化合物
【化１】
2020519646.tif 000094
［式中、
Ｘ、ＹおよびＬは、−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｒ３）＝、−Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ＝，−Ｏ−および−Ｓ−から独立して、方向性を伴わずに選択され、
ＭおよびＺは、
【化２】
2020519646.tif 000095
から独立して、方向性を伴わずに選択され、
−−−−は、任意選択の二重結合を表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲン、−Ｃ１〜４アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ１〜４アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜４アルキルおよびＣ６〜１０アリールから独立して選択され、ここで、前記アリール環は、Ｃ１〜４アルキルまたはハロゲンによって置換されていてよく、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択され、
ＲＥ１は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＥ５ＲＥ６から選択され、
ＲＥ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＥ５ＲＥ６から選択されるか、または
ＲＥ１およびＲＥ２が、隣接する炭素原子と結合している場合、ＲＥ１およびＲＥ２は、一緒になって、構造−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−｛ここで、Ｔは、ＣＲＥ９ＲＥ１０、ＮＲ＊およびＯから選択され、Ｖは、ＣＲＥ９ＲＥ１０、ＮＲ＊およびＯから選択される｝および二重結合が存在する対応する構造を、代替として、方向性を伴わずに形成することができ、
ＲＥ５およびＲＥ６は、水素およびＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
ＲＥ７およびＲＥ８は、独立して、ＨまたはＦであり、
ＲＥ９およびＲＥ１０は、独立して、ＨまたはＦであり、
ｎは、１から３であり、
ＲＥ３は、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基であり、
ｍは、０から２であり、
ＲＥ４は、ハロゲン原子、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基であり、
ｐは、０から２であり、
Ｒは、水素原子またはカチオンであり、
Ｒ＊は、水素原子またはＣ１〜６アルキル基である］
および式（Ｅ）によって表される前記化合物の、エーテル、エステル、溶媒和物または塩。
【請求項２】
式（Ｅ）によって表される前記化合物が、式（Ａ）または（Ｂ）によって表される化合物
【化３】
2020519646.tif 000096
［式中、
ｍ、ｎ、ｐ、Ｔ、Ｖ、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｍ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ＲＥ７、ＲＥ８、ＲおよびＨａｌは、請求項１のように定義され、
式（Ａ）において、
ＲＡ１およびＲＡ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＡ５ＲＡ６からそれぞれ独立して選択されるか、または
ＲＡ１およびＲＡ２の少なくとも一方は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシもしくは−ＮＲＡ５ＲＡ６であることを条件とし、
代替として、ＲＡ１およびＲＡ２は、一緒になって、構造−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−を、方向性を伴わずに形成することができ、
ＲＡ３は、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基であり、
ＲＡ４は、ハロゲン原子、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基であり、
ＲＡ５およびＲＡ６は、水素およびＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
式（Ｂ）において、
ＲＢ１は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＢ５ＲＢ６から選択され、
ＲＢ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＢ５ＲＢ６から選択され、
ＲＢ３は、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基であり、
ＲＢ４は、ハロゲン原子、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基であり、
ＲＢ５およびＲＢ６は、水素およびＣ１〜６アルキルから独立して選択される］
である、請求項１に記載の使用のための化合物、
ならびに式（Ａ）または（Ｂ）によって表される前記化合物のエーテル、エステル、溶媒和物または塩。
【請求項３】
環Ｄが、下記の構造：
【化４】
2020519646.tif 000097
［式中、
Ｒ８は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンおよびＣ６〜１０アリールから選択され、ここで、前記アリール環は、Ｃ１〜４アルキルまたはハロゲンによって置換されていてよく、
Ｒ９は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンおよびＣ６〜１０アリールから選択され、ここで、前記アリール環は、Ｃ１〜４アルキルまたはハロゲンによって置換されていてよい］
から、方向性を伴って選択される、請求項１または２に記載の使用のための化合物、
ならびにこれらの化合物のエーテル、エステル、溶媒和物または塩。
【請求項４】
前記環Ｄが、下記の構造：
【化５】
2020519646.tif 000098
［式中、
Ｒ８は、請求項３で定義される通りであり、
Ｒ９は、Ｈである］
から、方向性を伴って選択される、請求項３に記載の使用のための化合物、
ならびにこれらの化合物のエーテル、エステル、溶媒和物または塩。
【請求項５】
【化６】
2020519646.tif 000099
および二重結合が−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−中に存在する対応する構造、
【化７】
2020519646.tif 000100
［式中、
ｎ、Ｔ、Ｖ、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｍ、Ｚ、ＲＥ７、ＲＥ８およびＨａｌは、請求項１のように定義され、
ＲＡ７は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
ＲＡ８は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
ＲＡ９は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
ＲＡ１０は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
ＲＢ７は、ＨまたはＣ１〜４アルキルである］
からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための化合物、
ならびにこれらの化合物のエーテル、エステル、溶媒和物または塩。
【請求項６】
【化８】
2020519646.tif 000101
［式中、
Ｒ８は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）および−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンから選択され、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択され、
ＲＥ７およびＲＥ８は、独立して、ＨまたはＦであり、
ＲＡ７は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
ＲＡ８は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
ＲＡ９は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
ＲＡ１０は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
ＲＢ７は、ＨまたはＣ１〜４アルキルであり、
Ｒは、Ｈまたはカチオンである］
からなる群から選択される、請求項５に記載の使用のための化合物、
ならびにこれらの化合物のエーテル、エステル、溶媒和物または塩。
【請求項７】
【化９】
2020519646.tif 000102
［式中、ＲＥ７、ＲＥ８、ＲＡ９、ＲＡ１０、Ｒ８、ｎおよびＨａｌは、請求項５で定義される通りである］
からなる群から選択される、請求項６に記載の使用のための化合物、
ならびにこれらの化合物のエーテル、エステル、溶媒和物または塩。
【請求項８】
前記環Ｄが、
【化１０】
2020519646.tif 000103
［式中、Ｒ、Ｘ、ＹおよびＬは、請求項１で定義される通りである］
からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための化合物、
ならびにこれらの化合物のエーテル、エステル、溶媒和物または塩。
【請求項９】
ｐが、０または１、好ましくは０である、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための化合物、
ならびにこれらの化合物のエーテル、エステル、溶媒和物または塩。
【請求項１０】
ＲＥ１が、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＥ５ＲＥ６から選択され、
ＲＥ２が、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＥ５ＲＥ６から選択されるか、または
ＲＥ１およびＲＥ２が、隣接する炭素原子と結合している場合、ＲＥ１およびＲＥ２は、一緒になって、構造−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−［ここで、Ｔは、ＣＲＥ９ＲＥ１０、ＮＲ＊およびＯから選択され、Ｖは、ＣＲＥ９ＲＥ１０、ＮＲ＊およびＯから選択される］および二重結合が存在する対応する構造を、代替として、方向性を伴わずに形成することができ、
ＲＥ１が、−ＮＲＥ５ＲＥ６である場合、ＲＥ１は、前記炭素原子に対してパラ位で結合しており、これは、前記フェニル環を環Ｄに結合する、
請求項１から９のいずれか一項に記載の使用のための化合物、
ならびにこれらの化合物のエーテル、エステル、溶媒和物または塩。
【請求項１１】
黒色腫を治療するまたは予防するための医薬組成物の調製のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
黒色腫を治療するまたは予防する方法であって、治療有効量の請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒色腫の治療または予防において使用するための、式（Ｅ）によって表される化合物に関する。
本明細書の本文全体を通して、いくつかの文書が引用される。本明細書において引用される文書の開示内容（あらゆる製造業者の仕様書、説明書等を含む）は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
黒色腫は、最も侵攻型の皮膚がんである。黒色腫を発生するリスクは、過去２５年間で４倍超になり、黒色腫の世界的な発生率は、驚くべき速度で上昇し続ける。黒色腫はまた、すべての皮膚がん関連死の７５％を占め、２５から２９歳の女性において、黒色腫は今や、３０から３４歳の女性における乳がんに次いで、２番目に蔓延しているがんである。アメリカがん協会は、米国だけで、２０１８年におよそ９１，２７０人の新たな黒色腫が診断され、約９，３２０人の人々が黒色腫により死亡するであろうと推定する。黒色腫患者の大部分において、該疾患は、散発的に発症し、全症例のおよそ１０％において、遺伝性である。さらに、日光への曝露中に日焼けしやすい皮膚等、ある特定のリスク要因を伴う個体は、その他よりも黒色腫を発生する可能性が高い。
【０００３】
黒色腫進行を定義する段階は、非定型母斑（ＡＮ）＞非侵襲的な、黒色腫発生の第１段階である黒色腫インサイチュ（ＭＩＳ）＞基底層を通って真皮に貫通し、そのため侵襲的黒色腫の第１段階を代表する、放射状成長期の黒色腫（ＲＧＰ黒色腫）＞真皮およびその先に深く浸潤した、垂直成長期の原発性黒色腫（ＶＧＰ黒色腫）＞リンパ節、遠位の臓器および少なくない頻度で脳まで広がった転移性黒色腫（ＭＧＰ黒色腫）である。黒色腫を持つ患者の臨床予後は、診断時における黒色腫のサイズおよび浸潤の深度に直接関係する。しかしながら、予後は、黒色腫が転移すると深刻であり、なぜなら、化学療法および／または放射線治療は、進行性黒色腫の経過に影響を及ぼさないからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
それ故、黒色腫の治療および予防のための新規化合物を同定する必要性があり、免疫チェックポイント阻害剤療法に対する持続的な奏効率は、治療される黒色腫患者の４０％超において未だ見られない。それ故、黒色腫の治療および予防のための新規化合物を同定する継続的な必要性がある。
【０００５】
ＷＯ２０１０／００３７２において、タンパク質の凝集を阻害する際に有効であることが示された化合物が開示された。広域スクリーニングは、強度蛍光標的を走査すること（ＳＩＦＴ）ならびにα−シヌクレイン（ＰＤ）およびプリオンタンパク質（ＣＪＤ）の凝集の量を測定する細胞アッセイの組合せに基づくものであった。このスクリーニングにおいて、３，５−ジフェニルピラゾール（ＤＰＰ）化合物を含むある特定の化合物は、有機合成によって簡単に修飾され得る高活性足場であることが判明した。このクラスにおける２５０前後の化合物のアレイが合成され、化合物は、種々の言及した疾患（ＡＤ、ＣＪＤ、ＰＤ）を模倣する動物モデルにおいて、経口アベイラビリティおよび効能を評価された。下記の構造：
【０００６】
【化１】
2020519646.tif 000003
【０００７】
を有する「ａｎｌｅ１３８ｂ」と称される化合物は、パーキンソン病（ＰＤ）およびクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）（Ｊ．Ｗａｇｎｅｒら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、１２５、７９５〜８１３（２０１３）；Ｊ．Ｌｅｖｉｎら、Ａｃｔ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．、１２７、７７９〜７８０（２０１４））ならびにアルツハイマー病（ＡＤ）（Ｊ．Ｗａｇｎｅｒら、Ａｃｔ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．、１３０、６１９〜６３１（２０１５）（ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４１−０１５−１４８３−３））を模倣する動物モデルにおいて、オリゴマー形成をモジュレートする際に効果的であると同定された。
【０００８】
ＥＰ１５１９９９７２．９は、水溶性が改善された、ＷＯ２０１０／００３７２に従う化合物の誘導体を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
α−シヌクレインは、その生理学的機能が不明確なままである天然変性タンパク質である。しかしながら、これは、凝集する際に、毒性オリゴマーおよび最終的には原線維を形成し、これが、パーキンソン病（ＰＤ）の特質であるレビー小体を形成する。毒性オリゴマーの形成は、神経機能不全および最終的にはニューロン死の理由となる可能性が高い。α−シヌクレイン毒性オリゴマーを除去することにより、ａｎｌｅ１３８ｂおよび関連ＤＰＰ化合物は、α−シヌクレイン凝集の有害作用からドーパミン作動性ニューロンを救う。実施例１および２において例示される通り、α−シヌクレインの高レベル発現は、黒色腫細胞の生存を確実にし、これは、ドーパミン作動性ニューロンに対してα−シヌクレインが有する効果とは正反対である。ａｎｌｅ１３８ｂおよび関連ＤＰＰ化合物は、ドーパミン作動性ニューロンの機能および生存に有益であることから、黒色腫細胞の機能および生存にも利益になることが同様に期待される。実施例３において例示される通り、黒色腫細胞に対するａｎｌｅ１３８ｂおよび関連ＤＰＰ化合物の効果は、正反対であることが判明する。これは、がんおよび神経変性の分野における専門家にさえも、完全に予見不可能かつ予測不可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】正常な皮膚ならびに母斑および黒色腫組織における、α−シヌクレイン／ＳＮＣＡの発現の図である。抗α−シヌクレイン抗体でプロービングされ、ヘマトキシリンで対比染色された、選択した正常な皮膚、母斑ならびにＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫ＴＭＡコアの画像。棒グラフ：正常な皮膚（ＮＳ）、良性母斑（ＢＮ）、非定型母斑（ＡＮ）、黒色腫インサイチュ（ＭＩＳ）、ＶＧＰ黒色腫およびＭＧＰ黒色腫における、事前に行われた全ゲノム発現プロファイリングを介して決定された、ＳＮＣＡ遺伝子の発現。
【図１Ｂ】正常な皮膚ならびに母斑および黒色腫組織における、ＬＲＲＫ２／ＰＡＲＫ８の発現の図である。ＬＲＲＫ２に対する抗体でプロービングされ、ヘマトキシリンで対比染色された、母斑、ＶＧＰ黒色腫およびＭＧＰ黒色腫（皮下転移）の選択画像。棒グラフ：正常な皮膚（ＮＳ）、良性母斑（ＢＮ）、非定型母斑（ＡＮ）、黒色腫インサイチュ（ＭＩＳ）、ＶＧＰ黒色腫およびＭＧＰ黒色腫における、事前に行われた全ゲノム発現プロファイリングを介して決定された、ＰＡＲＫ８（ＬＲＲＫ２）遺伝子の発現。
【図１Ｃ】正常な皮膚ならびに母斑および黒色腫組織における、Ｐａｒｋｉｎ／ＰＡＲＫ２の発現の図である。抗パーキン抗体でプロービングされ、ヘマトキシリンで対比染色された、母斑、ＶＧＰ黒色腫およびＭＧＰ黒色腫（皮下転移）の選択画像。棒グラフ：正常な皮膚（ＮＳ）、良性母斑（ＢＮ）、非定型母斑（ＡＮ）、黒色腫インサイチュ（ＭＩＳ）、ＶＧＰ黒色腫およびＭＧＰ黒色腫における、事前に行われた全ゲノム発現プロファイリングを介して決定された、ＰＡＲＫ２遺伝子の発現。
【図２】黒色腫細胞におけるα−シヌクレインタンパク質のモノマーおよびオリゴマー種の発現および存在の図である。Ａ．ＶＧＰ黒色腫細胞株ＷＭ９８３−Ａ（レーン１）における、ＭＧＰ黒色腫細胞株ＷＭ９８３−Ｂ（レーン２）、ＳＫ−ＭＥＬ−５（レーン３）、ＷＭ８５２（レーン４）における、およびＲＧＰ／ＶＧＰ黒色腫細胞株ＷＭ１１５８（レーン５）における、α−シヌクレイン発現のイムノブロット分析。１０μｇずつの全細胞溶解液が、１、２および３のレーンにロードされた。低レベルα−シヌクレイン発現黒色腫細胞株、ＷＭ８５２およびＷＭ１１５８におけるα−シヌクレインタンパク質の発現を明確に視覚化するために、２０μｇずつの全細胞溶解液が、レーン５および６にロードされた（レーン４は空白のままにされた）。抗アクチン抗体でのプロービングは、ローディング対照として役立った。Ｂ．α−シヌクレインまたはリン酸化α−シヌクレインに対する抗体（ｐＳｅｒ１２９）でプロービングされた、ＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞におけるα−シヌクレイン発現の免疫蛍光分析。Ｃ．ＳＥＣ−フィルター・トラップ・アッセイによって検出された、ＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞におけるモノマーおよびα−シヌクレインオリゴマー種の存在。ニトロセルロース膜に塗布された収集画分（Ａ１＞Ａ１５、Ｂ１＞Ｂ１５、Ｃ１＞Ｃ１５、Ｄ１＞Ｄ１１）は、抗α−シヌクレイン抗体でプロービングされた。
【図３Ａ】α−シヌクレインオリゴマーモジュレーター、ａｎｌｅ１３８ｂまたはａｎｌｅ１３８ｃを用いる黒色腫細胞の処理が、細胞の形態学を変化させ、それらの増殖を阻害する図である。４８時間にわたってＤＭＳＯのみを受けた、または４８時間にわたって単回用量（１０μＭ）のａｎｌｅ１３８ｂまたはａｎｌｅ１３８ｃで処理された、ＷＭ９８３−ＢおよびＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫細胞の形態学を示す、１０倍率で捕捉された位相差画像。
【図３Ｂ】α−シヌクレインオリゴマーモジュレーター、ａｎｌｅ１３８ｂを用いる黒色腫細胞の処理が、細胞の形態学を変化させ、それらの増殖を阻害する図である。４８時間で１０μＭの化合物を補充して、ＤＭＳＯのみを受けた、または１０μＭのａｎｌｅ１３８ｂで２４、４８もしくは７２時間にわたって処理された、ＷＭ９８３−ＡおよびＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞の増殖。各時点および細胞株について示されるのは、分析した三連の試料の平均である（ｎ＝１）。
【図４Ａ】α−シヌクレインオリゴマーモジュレーター、ａｎｌｅ１３８ｂを用いる黒色腫細胞の処理が、原形質膜損傷、ミトコンドリア機能不全、および黒色腫細胞オートファジーの異常調節による黒色腫細胞殺滅につながることを示す図である。４８時間で各等価用量を補充して、２、５、１０または１５μＭのオリゴマーモジュレーターで９６時間にわたって処理された、ＷＭ８５２およびＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞のａｎｌｅ１３８ｂ処理誘発性細胞殺滅のＬＤＨ放出に基づく定量化。各用量および細胞株について示されるのは、分析した４つの複製の平均である（ｎ＝１）。
【図４Ｂ】α−シヌクレインオリゴマーモジュレーター、ａｎｌｅ１３８ｂを用いる黒色腫細胞の処理が、原形質膜損傷、ミトコンドリア機能不全、および黒色腫細胞オートファジーの異常調節による黒色腫細胞殺滅につながることを示す図である。４８時間にわたってＤＭＳＯのみを受けた、または２４もしくは４８時間にわたって単回用量（１０μＭ）のａｎｌｅ１３８ｂで処理された、マイトトラッカー色素で染色されたＷＭ９８３−Ｂ、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＷＭ１１５８黒色腫細胞の共焦点像の積み重ねの最大強度投影。４８時間にわたってａｎｌｅ１３８ｂで処理された、ＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫細胞の画像における差し込み図は、蛍光を可視にするために、５倍高いレーザー出力で捕捉された。
【図４Ｃ】α−シヌクレインオリゴマーモジュレーター、ａｎｌｅ１３８ｂを用いる黒色腫細胞の処理が、原形質膜損傷、ミトコンドリア機能不全、および黒色腫細胞オートファジーの異常調節による黒色腫細胞殺滅につながることを示す図である。４８時間にわたってＤＭＳＯのみを受けた、または単回用量（１０μＭ）のａｎｌｅ１３８ｂで２４もしくは４８時間にわたって処理された、ＷＭ９８３−ＢおよびＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫細胞におけるＬＣ３発現の共焦点免疫蛍光画像分析。抗ＬＣ３Ｂ抗体でプロービングされた黒色腫細胞は、蛍光ＤＲＡＱ５で対比染色された。
【図４Ｄ】α−シヌクレインオリゴマーモジュレーター、ａｎｌｅ１３８ｂを用いる黒色腫細胞の処理が、原形質膜損傷、ミトコンドリア機能不全、および黒色腫細胞オートファジーの異常調節による黒色腫細胞殺滅につながることを示す図である。４８時間で等価用量を補充して、ａｎｌｅ１３８ｂ（７．５μＭ）で２４（レーン１）、４８（レーン２）または７２時間（レーン３）にわたって処理した、ＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞におけるｐ６２／ＳＱＳＴＭ１発現のイムノブロット分析。４８時間で補充して、７２時間にわたってＤＭＳＯのみを受けた（レーン４）ＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞は、対照として役立った。ローディング対照についてのイムノブロットは、抗ＧＡＰＤＨ抗体でプロービングされた。
【図５】ａｎｌｅ１３８ｂの、高レベルα−シヌクレイン発現ヒト黒色腫異種移植片への全身投与が、それらの形態学およびオートファジーに影響を及ぼすことを示す図である。Ａ〜Ｄ．ａｎｌｅ１３８ｂを含有しないＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片の１つＡ．Ｂ．から、およびａｎｌｅ１３８ｂと混合された飼料ペレットを受けた動物から切除されたＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片の１つＣ．Ｄ．から調製された、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された組織切片。Ａ．Ｃ．に示される写真は１００倍率で、およびＢ．Ｄ．に示される写真は４０倍率で撮影された。ＥおよびＦ．ａｎｌｅ１３８ｂを含有しない飼料ペレットを受けた動物から切除されたＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片の１つから、（Ｅ）およびａｎｌｅ１３８ｂと混合された飼料ペレットを受けた動物から切除されたＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片の１つ（Ｆ）から調製された、組織切片（１００倍率）のＬＣ３免疫組織化学染色。（Ｆ）における差し込み図は、アレクサ−４８８二次抗体のみでプロービングされ、対比染色された、ａｎｌｅ１３８ｂ含有ＷＭ９８３−Ｂ腫瘍からの組織切片を示す。
【図６】黒色腫細胞株ＷＭ９８３−Ａ、ＷＭ９８３−Ｂ、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＷＭ１１５８における、α−シヌクレインタンパク質の発現の免疫蛍光分析の図である。６３倍率で捕捉された、抗α−シヌクレイン抗体でプロービングされた黒色腫細胞のバックグラウンドを引いたおよび平均フィルターをかけた蛍光画像は、同じレーザー出力およびゲイン設定で撮影された１２から１６の切片の最大強度投影である。ＷＭ１１５８黒色腫細胞の画像における差し込み図は、細胞の蛍光を可視にするために、３倍高いレーザー出力で捕捉された。
【図７】ＷＭ９８３−Ｂ黒色腫全細胞溶解液のサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルの図である。サイズ排除クロマトグラフィーによって分離されたＷＭ９８３−Ｂ黒色腫全細胞溶解液のクロマトグラム。合計５６の画分が収集された。画分についての分子量サイズは、ゲル濾過標準を使用して評価された（ウシサイログロブリン−６７０ｋＤ、ウシｙ−グロブリン−１５８ｋＤ、ニワトリアルブミン−４４ｋＤ、ウマミオグロビン−１７ｋＤ、ビタミンＢ１２−１．３５ｋＤ）。
【図８Ａ】ａｎｌｅ１３８ｂまたはａｎｌｅ１３８ｃで処理されたＷＭ９８３−Ａ（ＶＧＰ）黒色腫細胞の形態学の図である。４８時間で等価用量の各化合物またはＤＭＳＯのみを補充して、ＤＭＳＯのみを受けた、または、単回用量（１０μＭ）のａｎｌｅ１３８ｂもしくはａｎｌｅ１３８ｃで３６、４８、７５もしくは９６時間にわたって処理された、Ａ．ＷＭ９８３−Ａ黒色腫細胞の形態学を示す、１０倍率で捕捉された位相差画像。
【図８Ｂ】ａｎｌｅ１３８ｂまたはａｎｌｅ１３８ｃで処理されたＷＭ１１５８（ＲＧＰ／ＶＧＰ）黒色腫細胞の形態学の図である。４８時間で等価用量の各化合物またはＤＭＳＯのみを補充して、ＤＭＳＯのみを受けた、または、単回用量（１０μＭ）のａｎｌｅ１３８ｂもしくはａｎｌｅ１３８ｃで３６、４８、７５もしくは９６時間にわたって処理された、Ｂ．ＷＭ１１５８黒色腫細胞の形態学を示す、１０倍率で捕捉された位相差画像。
【図９】ａｎｌｅ１３８ｂで処理された、マイトトラッカー色素で染色されたＷＭ９８３−Ｂ、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＷＭ１１５８黒色腫細胞の微分干渉コントラスト画像の図である。４８時間にわたってＤＭＳＯのみを受けた、または２４もしくは４８時間にわたって単回用量（１０μＭ）のａｎｌｅ１３８ｂで処理された、マイトトラッカー色素で染色されたＷＭ９８３−Ｂ、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＷＭ１１５８黒色腫細胞の形態学を示す微分干渉コントラスト画像。
【図１０】ａｎｌｅ１３８ｂと混合された飼料ペレットを受けたヌードマウスから、およびａｎｌｅ１３８ｂを含有しない飼料ペレットを受けたヌードマウスから切除された、高レベルα−シヌクレイン発現ＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片の分析的高速液体クロマトグラフィーの図である。Ａ．Ｂ．ａｎｌｅ１３８ｂと混合された飼料ペレットを受けた動物から切除された２つの腫瘍における、ａｎｌｅ１３８ｂの存在を示すクロマトグラム。Ｃ．ａｎｌｅ１３８ｂを含有しない飼料ペレットを受けた動物から切除された１つの腫瘍のクロマトグラム。Ｄ．ａｎｌｅ１３８ｂ  ＤＰＰ化合物（参照試料）のクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、特許請求の範囲に収載される実施形態によって要約される。以後および特許請求の範囲に収載される好ましい実施形態のすべての組合せは、本発明の範囲内であるとして企図されることが理解される。
【００１２】
本発明は、黒色腫の治療または予防において使用するための、一般式（Ｅ）によって表される化合物に関する。
【００１３】
【化２】
2020519646.tif 000004
【００１４】
環Ｄにおいて、Ｘ、ＹおよびＬは、−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｒ３）＝、−Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ＝、−Ｏ−および−Ｓ−から独立して、方向性を伴わずに選択され、
ＭおよびＺは、
【００１５】
【化３】
2020519646.tif 000005
【００１６】
から独立して、方向性を伴わずに選択され、
−−−−は、任意選択の二重結合を表す。
Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＬおよびＭが、原子価および安定性が許す限り選択されるであろうことは、自明である。
【００１７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲン、−Ｃ１〜４アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ１〜４アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜４アルキルおよびＣ６〜１０アリールから独立して選択され、ここで、アリール環は、Ｃ１〜４アルキルまたはハロゲンによって置換されていてよい。Ｃ６〜１０アリール基は、特に限定されず、例えば、フェニルおよびナフチルから選択され得る。ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり得、典型的には、ＦまたはＣｌである。
【００１８】
好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲン、−Ｃ１〜４アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ１〜４アルコキシおよび−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜４アルキルから独立して選択される。より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）および−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンから選択される。
【００１９】
置換基の選択は、式（Ｅ）の化合物の用途によって決まり得る。１つの好ましい実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうちの少なくとも１つ（より好ましくはＲ４）は、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンである。化合物は、凝集タンパク質の沈着を撮像するためのプローブとして用いられる場合に特に有用であり、なぜなら、その後、検出可能なハロゲン同位体等の検出可能な標識でそれらを迅速かつ効率的に標識化することが可能であるからである。検出可能なハロゲン同位体の例は、１８Ｆ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、７７Ｂｒおよび７６Ｂｒ、特に１８Ｆを含む。当然ながら、検出可能なハロゲン同位体を、フェニル環と結合しているハロゲン原子等、本発明において有用な化合物中に存在する他のハロゲン原子のいずれかとして使用することが可能である。
【００２０】
代替的な好ましい実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素およびＣ１〜４アルキルから独立して選択され、好ましくは水素である。
別の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）から選択される。好ましい実施形態において、Ｒ４は、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲン、−Ｃ１〜４アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ１〜４アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜４アルキルおよびＣ６〜１０アリールから独立して選択され、ここで、アリール環は、Ｃ１〜４アルキルまたはハロゲンによって置換されていてよい。Ｃ６〜１０アリール基は、特に限定されず、例えば、フェニルおよびナフチルから選択され得る。ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり得、典型的には、ＦまたはＣｌである。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲン、−Ｃ１〜４アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ１〜４アルコキシおよび−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜４アルキルから独立して選択される。より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５は、水素、Ｃ１〜４アルキルおよび−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンから選択される。これらの化合物は、水溶性が増大しているため、特に有利である。
【００２１】
環Ｄは、特に限定されない。その典型的な例は、
【００２２】
【化４】
2020519646.tif 000006
【００２３】
を含む。
一実施形態において、例は、
【００２４】
【化５】
2020519646.tif 000007
【００２５】
を含む。
別の実施形態において、その例は、
【００２６】
【化６】
2020519646.tif 000008
【００２７】
を含む。
環Ｄの好ましい例は、
【００２８】
【化７】
2020519646.tif 000009
【００２９】
である。
環Ｄの特に好ましい例は、
【００３０】
【化８】
2020519646.tif 000010
【００３１】
である。
上記の式において、Ｒ８は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲン、−Ｃ１〜４アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ１〜４アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜４アルキルおよびＣ６〜１０アリール（フェニルおよびナフチル等）から選択され、ここで、アリール環は、Ｃ１〜４アルキルまたはハロゲンによって置換されていてよい。好ましくは、Ｒ８は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）、Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲン、−Ｃ１〜４アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ１〜４アルコキシおよび−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜４アルキルから選択される。さらに好ましくは、Ｒ８は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンおよびＣ６〜１０アリール（フェニルおよびナフチル等）から選択され、ここで、アリール環は、Ｃ１〜４アルキルまたはハロゲンによって置換されていてよい。より好ましくは、Ｒ８は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンから選択される。一実施形態において、Ｒ８は、水素およびＣ１〜４アルキルから選択され、より好ましくは水素である。代替的な実施形態において、Ｒ８は、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンである。別の好ましい実施形態において、Ｒ８は、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）である。上記で説明した通り、Ｒ８は、所望ならば、検出可能に標識化されることができる。
【００３２】
上記の式において、Ｒ９は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲン、−Ｃ１〜４アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ１〜４アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜４アルキルおよびＣ６〜１０アリールから選択され、ここで、アリール環は、Ｃ１〜４アルキルまたはハロゲンによって置換されていてよい。好ましくは、Ｒ９は、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲン、−Ｃ１〜４アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ１〜４アルコキシおよび−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜４アルキルから選択される。より好ましくは、Ｒ９は、水素、Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンから選択される。一実施形態において、Ｒ９は、水素およびＣ１〜４アルキルから選択され、より好ましくは水素である。代替的な実施形態において、Ｒ９は、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンである。上記で説明した通り、Ｒ９は、所望ならば、検出可能に標識化されることができる。
【００３３】
さらなる実施形態において、Ｒ８およびＲ９は、水素である。また別の実施形態において、Ｒ８は、−Ｃ１〜４アルキレン−ハロゲンであり、Ｒ９は、水素である。また別の実施形態において、Ｒ８は、−ＣＨ２Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ）であり、Ｒ９は、水素である。
【００３４】
一実施形態において、環Ｄは、好ましくは、
【００３５】
【化９】
2020519646.tif 000011
【００３６】
［式中、Ｒ８、Ｘ、ＹおよびＬは、上記で定義された通りである］から選択される。より好ましくは、環Ｄは、
【００３７】
【化１０】
2020519646.tif 000012
【００３８】
から選択される。
一実施形態において、環Ｄは、好ましくは、
【００３９】
【化１１】
2020519646.tif 000013
【００４０】
［式中、Ｘ、ＹおよびＬは、上記で定義された通りであり、Ｒは、以下で定義される通りである］から選択される。より好ましくは、環Ｄは、
【００４１】
【化１２】
2020519646.tif 000014
【００４２】
［式中、Ｒは、以下で定義される通りである］
から選択される。
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択され、好ましくはＦ、ＣｌまたはＢｒ、より好ましくはＣｌまたはＢｒ、最も好ましくはＢｒである。
【００４３】
ＲＥ１は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＥ５ＲＥ６から選択される。
ＲＥ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＥ５ＲＥ６から選択され、好ましくは、ＲＥ２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＥ５ＲＥ６から選択される。
【００４４】
代替的な実施形態において、ＲＥ１およびＲＥ２は、それらが隣接する炭素原子と結合している場合、一緒になって、構造−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−および二重結合が存在する対応する構造を、方向性を伴わずに形成することができる。この構造において、Ｔは、ＣＲＥ９ＲＥ１０、ＮＲ＊およびＯから選択され、Ｖは、ＣＲＥ９ＲＥ１０、ＮＲ＊およびＯから選択される。一実施形態において、Ｔは、ＣＲＥ９ＲＥ１０、ＮＨおよびＯから選択され、Ｖは、ＣＲＥ９ＲＥ１０、ＮＨおよびＯから選択される。好ましくは、ＴおよびＶの少なくとも一方は、ＮＲ＊またはＯ、例えば、ＮＨまたはＯである。そのような構造の例は、−Ｏ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−ＣＲＥ９ＲＥ１０−、−ＮＲ＊−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−ＮＲ＊−、−ＮＲ＊−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｏ−、−ＮＲ＊−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−ＣＲＥ９ＲＥ１０−、または二重結合が存在する対応する構造を含む。そのような構造のさらなる好ましい例は、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＦ２）ｎ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−、−ＮＲ＊−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ＊−、−ＮＲ＊−（ＣＦ２）ｎ−ＮＲ＊−、−ＮＲ＊−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−、−ＮＲ＊−（ＣＦ２）ｎ−Ｏ−、−ＮＲ＊−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−、または二重結合が存在する対応する構造を含む。そのような構造の一層さらなる好ましい例は、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＦ２）ｎ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、−ＮＨ−（ＣＦ２）ｎ−ＮＨ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−、または二重結合が存在する対応する構造を含む。本明細書において使用される場合、表現「二重結合が存在する対応する構造」は、１つまたは複数の二重結合が、対応する構造中に存在し得ることを意味する。例えば、ｎ＝１である場合、−Ｎ＝ＣＨ−ＮＨ−は、二重結合が存在し、−ＮＨ−ＣＨ２−ＮＨ−に対応する構造である。−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨ−は、二重結合が存在する構造のさらなる例である。これは、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２−に対応する。例えば、ｎ＝２である場合、−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ−は、二重結合が存在し、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−に対応する構造である。これらの部分において、Ｈの１つまたは複数は、Ｃ１〜４アルキル（例えば、メチル）基またはハロゲン原子（例えば、Ｆ）によって置きかえられ得る。
【００４５】
−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−の例は、−Ｏ−（ＣＨ２）−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−、−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＲ＊−、−ＣＨ２−（ＣＨ２）２−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−および−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−を含む。これらの部分において、Ｈの１つまたは複数は、Ｃ１〜４アルキル（例えば、メチル）基またはハロゲン原子（例えば、Ｆ）によって置きかえられ得る。
【００４６】
好ましくは、ＲＥ１およびＲＥ２は、一緒になって、構造−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−を形成する。その例は、−Ｏ−（ＣＨ２）−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−および−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−、好ましくは−Ｏ−（ＣＨ２）−Ｏ−および−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−を含む。この基はまた、対応するヒドロキシ基にインビボで加水分解されるかもしれないと想定される。
【００４７】
ｎは、１から３であり、好ましくは、ｎは、１または２である。一実施形態において、ｎは、２である。別の実施形態において、ｎは、１である。
ＲＥ５およびＲＥ６は、水素およびＣ１〜６アルキルから独立して選択され、好ましくは、ＲＥ５およびＲＥ６は、水素およびＣ１〜４アルキルから独立して選択される。
【００４８】
ＲＥ７およびＲＥ８は、独立して、Ｈ、ＦまたはＣ１〜６アルキルであり、好ましくは、独立して、ＨまたはＦであり、より好ましくはＨである。
ＲＥ９およびＲＥ１０は、独立して、Ｈ、ＦまたはＣ１〜６アルキルであり、好ましくは、独立して、ＨまたはＦであり、より好ましくはＨである。
【００４９】
ＲＥ１およびＲＥ２がフェニル環と結合している位置は、変動し得る。
一実施形態において、ＲＥ１およびＲＥ２は、独立して、ヒドロキシであるか、またはアルコキシは、フェニル環を環Ｄに結合する炭素原子に対してメタおよびパラに結合している。
【００５０】
第２の実施形態において、ＲＥ１およびＲＥ２は、構造−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−、または、二重結合が存在し、フェニル環を環Ｄに結合する炭素原子に対してメタおよびパラに結合している、対応する構造である。構造−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−についての上記の好ましい定義は、この実施形態にも同様に当てはまる。
【００５１】
第３の実施形態において、ＲＥ１は、−ＮＲＥ５ＲＥ６であり、炭素原子に対してパラ位で結合しており、これは、フェニル環を環Ｄに結合する。
ＲＥ１およびＲＥ２に加えて、さらなる置換基ＲＥ３が、フェニル環上に場合により存在し得る。ＲＥ３は、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基（フェニルまたはナフチル基等）、好ましくはＣ１〜６アルキル基、より好ましくはＣ１〜４アルキル基であり得る。置換基数ｍは、特に限定されず、典型的には、０から２の範囲内、好ましくは０または１、典型的には０である。
【００５２】
さらなる置換基ＲＥ４が存在することもできる。それらは、典型的には、ハロゲン原子、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基（フェニルまたはナフチル基等）、好ましくはハロゲン原子またはＣ１〜６アルキル基、より好ましくはＣ１〜６アルキル基、最も好ましくはＣ１〜４アルキル基である。置換基数ｐは、特に限定されず、典型的には、０から２の範囲内、好ましくは０または１、典型的には０である。
【００５３】
Ｒは、水素原子またはカチオンである。カチオンは、この種の化合物のための薬学的に許容される任意のカチオンであり得る。例は、ナトリウム、リチウム、カリウム、アンモニウム、特にナトリウムである。化合物のホスフェート基と適合性の基のさらなる例は、エタノールアミン、コリン、リシン、メグルミン、ピペラジンおよびトロメタミン等の構造Ｒ’Ｒ’’Ｒ’’’Ｎの基を含む。化合物において、両方のＲが水素であり得るか、両方のＲがカチオン（同じまたは異なるカチオン）であり得るか、または一方のＲが水素であり得、他方がカチオンであり得る。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋およびＺｎ２＋等の二価カチオンもＡｌ３＋等の三価カチオンも好適ではなく、なぜなら、得られる塩がプロドラッグとして好適であるのに十分水溶性ではないからである。好ましい実施形態において、両方のＲがナトリウムである。
【００５４】
Ｒ＊は、水素原子またはＣ１〜６アルキル基であり、好ましくは、Ｒ＊は、水素原子またはＣ１〜４アルキル基、より好ましくは水素原子である。
式（Ｅ）によって表される化合物の好ましい例は、式（Ａ）によって表される化合物
【００５５】
【化１３】
2020519646.tif 000015
【００５６】
を含む。
式（Ｅ）に関して上記で記載されたＸ、Ｙ、Ｚ、Ｍ、Ｌ，環Ｄ、ｍ、ｐおよびＨａｌの定義は、式（Ａ）にも同様に当てはまる。
【００５７】
ＲＡ１およびＲＡ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＡ５ＲＡ６からそれぞれ独立して選択され、ただし、ＲＡ１およびＲＡ２の少なくとも一方は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシまたは−ＮＲＡ５ＲＡ６であることを条件とする。好ましくは、ＲＡ１およびＲＡ２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＡ５ＲＡ６から独立して選択される。
【００５８】
代替として、ＲＡ１およびＲＡ２は、一緒になって、構造−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−を、方向性を伴わずに形成することができる。そのような構造を形成するＲＥ１およびＲＥ２に関して上記で記載する説明、ならびに、特にＲＥ７、ＲＥ８、Ｔ、ｎおよびＶの上記の定義は、この構造を形成するＲＡ１およびＲＡ２にも同様に当てはまる。
【００５９】
一実施形態において、ＲＡ１およびＲＡ２は、独立して、ヒドロキシまたはアルコキシである。
第２の実施形態において、ＲＡ１およびＲＡ２は、構造−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−、または、二重結合が存在する対応する構造である。構造−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−についての上記の好ましい定義は、この実施形態にも同様に当てはまる。
【００６０】
第３の実施形態において、ＲＡ１は、−ＮＲＡ５ＲＡ６であり、ＲＡ２は、水素である。
ＲＡ１およびＲＡ２に加えて、さらなる置換基ＲＡ３が、フェニル環上に場合により存在し得る。ＲＡ３は、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基（フェニルまたはナフチル基等）、好ましくはＣ１〜６アルキル基、より好ましくはＣ１〜４アルキル基であり得る。
【００６１】
さらなる置換基ＲＡ４が存在することもできる。それらは、典型的にはハロゲン原子、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基（フェニルまたはナフチル基等）、好ましくはハロゲン原子またはＣ１〜６アルキル基、より好ましくはＣ１〜６アルキル基、最も好ましくはＣ１〜４アルキル基である。
【００６２】
ＲＡ５およびＲＡ６は、水素およびＣ１〜６アルキルから独立して選択され、好ましくは、ＲＡ５およびＲＡ６は、水素およびＣ１〜４アルキルから独立して選択される。
式（Ｅ）によって表される化合物の好ましい例は、式（Ｂ）によって表される化合物
【００６３】
【化１４】
2020519646.tif 000016
【００６４】
を含む。
式（Ｅ）に関して上記で記載されたＸ、Ｙ、Ｚ、Ｍ、Ｌ、環Ｄ、ｍ、ｐおよびＨａｌの定義は、式（Ｂ）にも同様に当てはまる。
【００６５】
ＲＢ１は、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＢ５ＲＢ６から選択される。好ましくは、ＲＢ１は、ヒドロキシまたはＣ１〜６アルコキシである。
ＲＢ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＢ５ＲＢ６から選択され、好ましくは、ＲＢ２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシおよび−ＮＲＢ５ＲＢ６から選択される。
【００６６】
一実施形態において、ＲＢ１は、ヒドロキシまたはＣ１〜６アルコキシであり、ＲＢ２は、水素である。
ＲＢ５およびＲＢ６は、水素およびＣ１〜６アルキルから独立して選択され、好ましくは、ＲＢ５およびＲＢ６は、水素およびＣ１〜４アルキルから独立して選択される。
【００６７】
ＲＢ１およびＲＢ２に加えて、さらなる置換基ＲＢ３が、フェニル環上に場合により存在し得る。ＲＢ３は、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基（フェニルまたはナフチル基等）、好ましくはＣ１〜６アルキル基、より好ましくはＣ１〜４アルキル基であり得る。
【００６８】
さらなる置換基ＲＢ４が存在することもできる。それらは、典型的にはハロゲン原子、Ｃ１〜６アルキル基またはＣ６〜１０アリール基（フェニルまたはナフチル基等）、好ましくはハロゲン原子またはＣ１〜６アルキル基、より好ましくはＣ１〜６アルキル基、最も好ましくはＣ１〜４アルキル基である。
【００６９】
本発明において有用な好ましい化合物は、
【００７０】
【化１５】
2020519646.tif 000017
【００７１】
ならびに二重結合が−Ｔ−（ＣＲＥ７ＲＥ８）ｎ−Ｖ−中に存在する対応する構造、
【００７２】
【化１６】
2020519646.tif 000018
【００７３】
を含む。
さらなる好ましい化合物は、
【００７４】
【化１７】
2020519646.tif 000019
【００７５】
を含む。
さらなる好ましい化合物は、
【００７６】
【化１８】
2020519646.tif 000020
【００７７】
を含む。
より好ましい化合物は、
【００７８】
【化１９】
2020519646.tif 000021
【００７９】
を含む。
より好ましい化合物は、
【００８０】
【化２０】
2020519646.tif 000022
【００８１】
を含む。
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｍ、Ｌ、環Ｄ、Ｔ、Ｖ、ｎ、ＲＥ７、ＲＥ８、ＲＡ７、ＲＡ８、ＲＡ９、ＲＡ１０、ＲＢ７、Ｒ８およびＨａｌに関して上記で記載された定義は、これらの化合物にも同様に当てはまる。
【００８２】
ＲＡ７は、ＨまたはＣ１〜６アルキル、好ましくはＨまたはＣ１〜４アルキルである。
ＲＡ８は、ＨまたはＣ１〜６アルキル、好ましくはＨまたはＣ１〜４アルキルである。
ＲＡ９は、ＨまたはＣ１〜６アルキル、好ましくはＨまたはＣ１〜４アルキルである。
【００８３】
ＲＡ１０は、ＨまたはＣ１〜６アルキル、好ましくはＨまたはＣ１〜４アルキルである。
ＲＢ７は、ＨまたはＣ１〜６アルキル、好ましくはＨまたはＣ１〜４アルキルである。
【００８４】
下記の化合物が特に好ましい：
【００８５】
【化２１】
2020519646.tif 000023
【００８６】
［式中、Ｈａｌは、ＣｌまたはＢｒであり、好ましくは、Ｈａｌは、Ｂｒである］。
最も好ましいのは、現在、下記の化合物である。
【００８７】
【化２２】
2020519646.tif 000024
【００８８】
一部の具体的な好ましい化合物は、
下記の構造によって定義されるＡｎｌｅ１３８ｂ（５−（３−ブロモフェニル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール）：
【００８９】
【化２３】
2020519646.tif 000025
【００９０】
下記の構造によって定義されるＳｅｒｙ３３５ｂ（５−（３−クロロフェニル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラゾール）：
【００９１】
【化２４】
2020519646.tif 000026
【００９２】
下記の構造によって定義されるＡｎｌｅ２５３ｂ（５−（３−ブロモフェニル）−３−（４−ジメチルアミノフェニル）−１Ｈ−ピラゾール）：
【００９３】
【化２５】
2020519646.tif 000027
【００９４】
を含む。
上記で言及した具体的な化合物を含む本発明の化合物は、安定であり、故に、ヒトにおける経口使用のためのプロドラッグとして特に好適な、ホスフェート誘導体の形態で提供され得る。
【００９５】
ＥＰ１５１９９９７２．９において開示される通り、環Ｄ上における、特に、３，５−ジフェニル−ピラゾールまたは３，５−ジフェニル−イミダゾール化合物のジアゾール環中の１個の窒素におけるホスフェート置換は、安定性を損なうことなく、水溶性を改善させる。この化学修飾は、下記の異性体構造：
【００９６】
【化２６】
2020519646.tif 000028
【００９７】
［式中、ＹおよびＬの一方はＮであるか、またはＸおよびＬの一方はＮであり、それぞれ、他方はＣＲ１０であり、
ここで、Ｒ１０は、水素、Ｃ１〜４アルキル、少なくとも１個のハロゲンで置換されているＣ１〜４アルキル、およびＣ６〜１０アリールから選択され、ここで、アリール環は、Ｃ１〜４アルキルまたはハロゲンによって置換されていてよく、
Ｑは、
【００９８】
【化２７】
2020519646.tif 000029
【００９９】
である］
によって定義される、この価値ある治療剤のプロドラッグの提供につながる。一実施形態において、Ｑは、
【０１００】
【化２８】
2020519646.tif 000030
【０１０１】
、例えば
【０１０２】
【化２９】
2020519646.tif 000031
【０１０３】
であり、Ｈａｌは、塩素または臭素から選択されるハロゲンである。別の実施形態において、Ｑは、
【０１０４】
【化３０】
2020519646.tif 000032
【０１０５】
、例えば
【０１０６】
【化３１】
2020519646.tif 000033
【０１０７】
であり、Ｈａｌは、臭素であり、
各Ｒは、独立して、水素またはカチオンである。
好ましい実施形態において、それぞれ、Ｙは、Ｎであり、Ｌは、−ＣＨ−であるか、またはＸは、Ｎであり、Ｌは、−ＣＨ−である。
【０１０８】
好ましい実施形態において、化合物は、下記の異性体構造：
【０１０９】
【化３２】
2020519646.tif 000034
【０１１０】
［式中、Ｈａｌは、塩素または臭素から選択されるハロゲンであり、各Ｒは、独立して、水素またはカチオンから選択される］
によって定義される。
【０１１１】
さらなる好ましい実施形態において、化合物は、下記の異性体構造：
【０１１２】
【化３３】
2020519646.tif 000035
【０１１３】
［式中、Ｈａｌは、塩素または臭素から選択されるハロゲンであり、各Ｒは、独立して、水素またはカチオンから選択される］
によって定義される。
【０１１４】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の化合物の誘導体は、下記の異性体構造：
【０１１５】
【化３４】
2020519646.tif 000036
【０１１６】
［式中、各Ｒは、独立して、水素またはカチオンから選択される］
を持つａｎｌｅ２５３ｂのホスフェート誘導体である。
ホスフェート誘導体において、カチオンは、この種の化合物のための薬学的に許容される任意のカチオンであり得る。例は、ナトリウム、リチウム、カリウム、アンモニウム、特にナトリウムである。化合物のホスフェート基と適合性の基のさらなる例は、エタノールアミン、コリン、リシン、メグルミン、ピペラジンおよびトロメタミン等の構造Ｒ’Ｒ’’Ｒ’’’Ｎの基を含む。化合物において、両方のＲが水素であり得るか、両方のＲがカチオン（同じまたは異なるカチオン）であり得るか、または一方のＲが水素であり得、他方がカチオンであり得る。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋およびＺｎ２＋等の二価カチオンもＡｌ３＋等の三価カチオンも好適ではなく、なぜなら、得られる塩がプロドラッグとして好適であるのに十分水溶性ではないからである。好ましい実施形態において、両方のＲがナトリウムである。
【０１１７】
さらに、ホスフェート誘導体の遊離酸形態も、プロドラッグとして好適である。
リン酸二ナトリウム誘導体は、安定であり、脳および血液中において高レベルの活性化合物を産出することが分かっている。
【０１１８】
好ましい実施形態において、化合物は、下記の構造の１つのリン酸二ナトリウムまたはそれらの混合物：
【０１１９】
【化３５】
2020519646.tif 000037
【０１２０】
である。
好ましい実施形態において、ホスフェート誘導体は、治療剤ａｎｌｅ１３８ｂ、すなわち、上記に示した通りの化合物のメチルリン酸二ナトリウムであり、ここで、Ｈａｌは、塩素または臭素である。前者の誘導体は、ｓｅｒｙ３３５ｂと称され、後者の誘導体は、ｓｅｒｙ４３３と称される。いずれも、異性体の１つの形態であり得るか、または両方の異性体の混合物であり得る。異性体ｓｅｒｙ４３３ａまたはｓｅｒｙ４３３ｂが以下に示される：
【０１２１】
【化３６】
2020519646.tif 000038
【０１２２】
好ましい実施形態において、ｓｅｒｙ４３３は、例えば、２Ｄ−ＮＯＥＳＹ  ＮＭＲによって取得された実験データによれば、ｓｅｒｙ４３３ｂ：ｓｅｒｙ４３３ａ＝２：３の比を持つ、ｓｅｒｙ４３３ａおよびｓｅｒｙ４３３ｂの異性体混合物である。いずれの異性形態も、体内で生物活性薬に変換される。
【０１２３】
驚くべきことに、ホスフェート誘導体化は、下記の好都合な特徴：
・通常の貯蔵条件下での安定性、
・非毒性、および
・口から消化管への通過中における安定性
を持つ治療用化合物を提供することが分かった。
【０１２４】
ホスフェート誘導体は、１ｍＭ超の水への溶解度によって特徴付けられる。ホスフェート誘導体は、それらの水中での安定性によっても特徴付けられる。
ホスフェート誘導体を使用する場合、治療活性化合物は、脳および血液中において、増大した量で見られる。理論に縛られることなく、活性治療用化合物は、膜結合腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）によってホスフェート誘導体から放出され、故に、消化管上皮に近接し、ここで、血流中に直接移されると想定される。おそらく、化合物は、主として単分散形態で放出され、次いでこれが、消化管から血液へ吸い上げられ得る。ホスフェート誘導体の薬物動態学的特徴は、マウスおよびラットにおいて、脳および血液中における活性化合物の治療的に有用なレベルにつながる。
【０１２５】
例えば、活性化合物ａｎｌｅ１３８ｂは、膜結合腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）による化合物からのホスフェート基の酵素的開裂により、腸壁においてプロドラッグｓｅｒｙ４３３から放出される。理論に縛られることなく、血液および脳中における高レベルの活性化合物は、腸壁における活性化合物の濃度が、活性化合物の沈殿につながる濃度を下回ることから可能であることが企図される。さらに、ＩＡＰは、開裂時に活性治療用化合物を消化管の内腔中へは放出せず、血液中への受動輸送のために消化管膜へまたはそれを通って通過するまで、化合物に留まることが企図される。
【０１２６】
本発明の化合物は、特許請求の範囲において定義される通りの化合物の少なくとも１つと、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物として提供され得る。組成物は、本発明の化合物の一方の互変異性形態または両方の互変異性形態を含むことができる。組成物は、１つを超える化合物を含むこともでき、組成物において使用される化合物のいずれも、両方の互変異性体のいずれか一方またはそれらの混合物であり得る。故に、黒色腫を治療する際に使用するための治療用組成物は、異性体の一方または両方の異性体の混合物を含むことができる。いずれの異性形態も、体内で生物活性薬に変換される。組成物は、当業者に公知であるような少なくとも１つの賦形剤をさらに含むことができる。賦形剤は、この目的のために公知である任意の化合物であり得、具体的な組成物に使用される賦形剤の量および種類は、通常使用されるものであり、組成物の形態および種類によって決まる。
【０１２７】
本発明の化合物は、そのエーテル、エステル、溶媒和物または塩の形態で存在することもできる。
本発明の化合物は、塩を形成し、これも本発明の範囲内である。本明細書における本発明において有用な化合物への言及は、別段の指示がない限り、その塩への言及を含むと理解される。用語「塩」は、本明細書において用いられる場合、無機および／または有機酸および塩基と形成される酸性および／または塩基性塩を示す。加えて、化合物が塩基性部分および酸性部分の両方を含有する場合、両性イオン（「内塩」）が形成されてよく、本明細書において使用される場合、用語「塩」内に含まれる。薬学的に許容される（すなわち、非毒性、生理学的に許容される）塩が好ましいが、他の塩、例えば、単離または精製ステップにおいて調製中に用いられ得るものも有用である。本発明の化合物の塩は、例えば、化合物を、当量等、ある量の酸または塩基と、塩が沈殿するもの等の媒体中または水性媒体中で反応させること、続いて、凍結乾燥によって形成され得る。
【０１２８】
塩基性部分を含有する化合物は、多様な有機および無機酸と塩を形成し得る。例示的な酸付加塩は、酢酸塩（酢酸またはトリハロ酢酸、例えば、トリフルオロ酢酸と形成されたもの等）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素、ヒドロキシエタンスルホン酸塩（例えば、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩（例えば、２−ナフタレンスルホン酸塩）、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチネート（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩（例えば、３−フェニルプロピオン酸塩）、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩（例えば、硫酸と形成されたもの）、スルホン酸塩（例えば、本明細書において言及されるもの）、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩等のトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩等を含む。
【０１２９】
酸性部分を含有する化合物は、多様な有機および無機塩基と塩を形成し得る。例示的な塩基性塩は、アンモニウム塩、ナトリウム、リチウムおよびカリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、ベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ−ビス（デヒドロアビエチル）エチレンジアミンと形成された）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グリカミド、ｔ−ブチルアミン等の有機塩基（例えば、有機アミン）との塩、ならびにアルギニン、リシン等のアミノ酸との塩等を含む。塩基性窒素含有基は、低級アルキルハロゲン化物（例えば、塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルおよびブチル）、硫酸ジアルキル（例えば、硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミル）、長鎖ハロゲン化物（例えば、塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリル）、アルキルハロゲン化物（例えば、臭化ベンジルおよびフェネチル）およびその他等の作用物質で四級化されてよい。
【０１３０】
本発明の化合物の溶媒和物も本明細書において企図される。本発明の化合物の溶媒和物は、例えば、水和物を含む。
用語「プロドラッグ」は、本明細書において用いられる場合、対象への投与時に、代謝的または化学的プロセスによる化学変換を受けて、特許請求の範囲において定義される通りの化合物またはその塩および／もしくは溶媒和物を産出する化合物を示す。
【０１３１】
本発明の化合物のエステルは、Ｃ１〜６アルキルエステル、好ましくはＣ１〜４アルキルエステルを含む。
本発明の化合物のエーテルは、Ｃ１〜６アルキルエーテルまたはハロゲン化Ｃ１〜６アルキルエーテル（ＣＦ３等）、好ましくはＣ１〜４アルキルエーテルまたはハロゲン化Ｃ１〜４アルキルエーテルを含む。
【０１３２】
本発明の化合物は、それらの互変異性形態で（例えば、アミドまたはイミノエーテルとして）存在してよい。ピラゾールの場合、例えば、化合物は、２つの互変異性形態：
【０１３３】
【化３７】
2020519646.tif 000039
【０１３４】
で存在する。
したがって、「ａｎｌｅ１３８ｂ」は、下記の構造式：
【０１３５】
【化３８】
2020519646.tif 000040
【０１３６】
によって記述され得る。
すべてのそのような互変異性形態は、本明細書において、本発明の一部として企図される。明細書において、上記で言及した構造の１つが開示される場合にはいつでも、他の構造および両方の構造の混合物が包括されるように意図される。ホスフェート誘導体、例えば、ｓｅｒｙ３３５ｂおよびａｎｌｅ２５３ｂ等のＤＰＰ化合物のホスフェート誘導体を記述する他の構造式にも、同じことが当てはまる。
【０１３７】
鏡像異性形態およびジアステレオマー形態を含む、本発明の化合物のすべての立体異性体（例えば、種々の置換基上の不斉炭素により存在し得るもの）は、本発明の範囲内で企図される。本発明の化合物の個々の立体異性体は、例えば、他の異性体を（例えば、指定された活性を有する純粋なまたは実質的に純粋な光学異性体として）実質的に含まなくてよく、あるいは、例えばラセミ体として、または他のすべてのもしくは他の選択された立体異性体と、混和されてよい。本発明の化合物のキラル中心は、ＩＵＰＡＣ１９７４勧告によって定義される通り、ＳまたはＲ配置を有し得る。
【０１３８】
ラセミ形態は、ジアステレオマー誘導体の分別結晶、分離もしくは結晶化またはキラルカラムクロマトグラフィーによる分離等の物理的方法によって、分割され得る。個々の光学異性体は、限定されないが、光学的に活性な酸との塩形成、続いて、結晶化を含む、任意の好適な方法によって、ラセミ体から取得され得る。
【０１３９】
本発明の化合物のすべての立体配置異性体は、混和または純粋なもしくは実質的に純粋な形態のいずれかで企図される。本発明において有用な化合物の定義は、シス（Ｚ）およびトランス（Ｅ）アルケン異性体、ならびに環状炭化水素またはヘテロシクロ環のシスおよびトランス異性体の両方を内包する。
【０１４０】
明細書全体を通して、基およびその置換基は、安定な部分および化合物を提供するために選択されてよい。
式（Ｅ）の化合物は、薬学的に許容される担体を場合により含む、医薬組成物の形態で提供され得る。
【０１４１】
本発明はさらに、黒色腫の治療または予防において使用するための、本発明の化合物およびそのエーテル、エステル、溶媒和物または塩を指す。さらなる実施形態は、黒色腫を治療するまたは予防するための医薬組成物の調製のための本発明の化合物の使用、ならびに、黒色腫を治療するまたは予防する方法であって、治療有効量の本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法である。
【０１４２】
本発明においては、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト患者への投与のための組成物に関する。医薬組成物は、上記で列挙した化合物、ならびに、場合により、本発明の化合物の特徴を変更することができ、それにより、例えば、それらの機能を、安定させる、モジュレートするおよび／または活性化する、さらなる分子を含む。組成物は、固体、液体または気体形態であってよく、とりわけ、粉末、錠剤、溶液またはエアゾールの形態であってよい。医薬組成物は、場合によりかつ追加で、薬学的に許容される担体を含んでよい。好適な医薬担体の例は、当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルション等のエマルション、種々の種類の湿潤剤、滅菌溶液、ＤＭＳＯを含む有機溶媒等を含む。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化され得る。
【０１４３】
医薬組成物は、個々の患者の臨床状態、医薬組成物の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および実践者に公知である他の要因を考慮し、医学行動規範と一致する方式で、製剤化および投薬されることになる。故に、本明細書における目的のための医薬組成物の「有効量」は、そのような検討によって決定される。当業者ならば、個体に投与される医薬組成物の有効量が、とりわけ、化合物の性質によって決まることを知っている。
【０１４４】
医薬組成物は、経口的に、経直腸的に、非経口的に、大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）に、腟内に、腹腔内に、局所的に（散剤、軟膏剤、液滴または経皮パッチ剤のように）、口腔内（ｂｕｃａｌｌｙ）に、または経口もしくは鼻腔用スプレーとして、投与されてよい。「薬学的に許容される担体」によって意味されるのは、任意の種類の、非毒性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤化助剤である。用語「非経口」は、本明細書において使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入を含む投与モードを指す。
【０１４５】
医薬組成物はまた、持続放出システムによって好適に投与される。持続放出組成物の好適な例は、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２：５４７〜５５６（１９８３））、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１５：１６７〜２７７（１９８１）およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、１２：９８〜１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、同上）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８）を含む。持続放出医薬組成物は、リポソームに封入された化合物も含む。医薬組成物を含有するリポソームは、それ自体が公知の方法によって調製される：ＤＥ３２１８１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８〜３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０〜４０３４（１９８０）；ＥＰ５２３２２；ＥＰ３６６７６；ＥＰ８８０４６；ＥＰ１４３９４９；ＥＰ１４２６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ１０２３２４。通常は、リポソームは、脂質含有量が約３０ｍｏｌ％より大きいコレステロールである、小さい（約２００〜８００オングストローム）単一ラメラ型のものであり、選択される割合は、最適療法に合わせて調整される。
【０１４６】
非経口投与のために、医薬組成物は、概して、所望の純度のそれを、単位投薬注射可能形態（溶液、懸濁液またはエマルション）で、薬学的に許容される担体、すなわち、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに非毒性であり、製剤の他の原料と適合性であるものと混合することにより、製剤化される。
【０１４７】
概して、製剤は、医薬組成物の成分を、液体担体もしくは微粉化した固体担体または両方と、均一にかつ密接に接触させることによって調製される。次いで、必要ならば、生成物は、所望の製剤に造形される。好ましくは、担体は、非経口担体、より好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液である。そのような担体ビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む。固定油およびオレイン酸エチル等の非水性ビヒクル、ならびにリポソームも、本明細書において有用である。担体は、等張性および化学的安定性を強化する物質等、少量の添加物を好適に含有する。そのような材料は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩等の緩衝液；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）（ポリ）ペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン等のアミノ酸；単糖、二糖、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース（ｍａｎｏｓｅ）またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の対イオン；ならびに／あるいはポリソルベート、ポロキサマーまたはＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４８】
治療的投与に使用される医薬組成物の成分は、無菌でなくてはならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２μｍの膜）を通す濾過によって容易に遂行される。医薬組成物の治療成分は、概して、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈注射溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０１４９】
医薬組成物の成分は、通常は、水溶液としてまたは復元用の凍結乾燥製剤として、単回または複数回用量容器、例えば、密閉アンプルまたはバイアル内に貯蔵されることになる。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍｌのバイアルに５ｍｌの滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）水溶液が充填され、得られた混合物が凍結乾燥される。輸液は、静菌性注射用水を使用して、凍結乾燥化合物を復元することによって調製される。
【０１５０】
本発明はさらに、黒色腫を治療するまたは予防する方法であって、治療有効量の本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法に関する。
本明細書において使用される場合、用語「治療有効量」は、所望の生物学的応答を導出するための十分な量を指す。本発明において、所望の生物学的応答は、黒色腫細胞の殺滅／死滅である。
【０１５１】
本発明の化合物は、皮膚黒色腫および非皮膚黒色腫を包括するすべての臨床的、病理学的および組織学的種類および段階を含む黒色腫を治療するおよび／または予防するために使用され得る。本発明の化合物は、すべての皮膚および非皮膚黒色腫ならびにそれらの前駆病変を予防する際に、ならびに、すべての皮膚およびすべての非皮膚黒色腫を包括するすべての臨床的、病理学的および組織学的段階の治療において、使用され得ることが理解される。本発明の化合物は、単独で、または、任意の他の公知の黒色腫標的療法もしくは免疫療法と組み合わせて、使用され得る。黒色腫のための公知の療法の例は、ＢＲＡＦキナーゼまたはＭＥＫに対する小分子阻害剤を用いる標的療法およびチェックポイント阻害剤を用いる免疫療法である（Ｍａｒｇｏｌｉｎ  Ｋ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｃｕｒｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  Ｏｎｃｏｌ、２０１６年９月、１７（９）：４８。Ｐｒｉｅｔｏ  ＰＡ、Ｒｅｕｂｅｎ  Ａ、Ｃｏｏｐｅｒ  ＺＡ、Ｗａｒｇｏ  ＪＡ、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ、２０１６年３月〜４月、２２（２）：１３８〜４６）。
【０１５２】
本発明において有用な化合物は、ＷＯ２０１０／０００３７２およびＥＰ１５１９９９７２．９から公知である。化合物の定義および好ましい実施形態ならびに化合物を調製する方法を含むこれらの文書の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の化合物は、有機合成の適用可能な技術のいずれかによって調製され得る。多くのそのような技術は、Ｌ．Ｆ．Ｔｉｅｔｚｅ、Ｔｈ．Ｅｉｃｈｅｒ「Ｒｅａｋｔｉｏｎｅｎ  ｕｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｎ」、２．Ａｕｆｌａｇｅ（Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、ＮＹ、１９９１）、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第３版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９９）、およびＪ．Ｍａｒｃｈ「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第３版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９８５）において詳細に述べられている。
【０１５３】
概して、温度、反応時間、溶媒、ワークアップ手順等の反応条件は、実施される特定の反応のために当該技術分野において一般的なものとなる。列挙した参考資料は、その中で列挙した資料と一緒に、そのような条件の詳細な記述を含有する。典型的には、温度は、−８０℃から１５０℃となり、溶媒は、非プロトン性またはプロトン性となり、反応時間は、１０秒間から１０日間となる。ワークアップは、典型的には、あらゆる未反応試薬をクエンチすること、続いて、水／有機層システム間の分配（抽出）、および生成物を含有する層を分離することからなる。
【０１５４】
無水反応条件（例えば、不活性ガス環境）の使用等の標準的な合成技術は、当該技術分野において一般的であり、適用可能な場合には適用されるであろう。
以下のスキームのそれぞれの修飾は、以下で生成される具体的な例示的材料の種々の類似体につながる。有機合成の好適な方法を記述する、以下で記載される引用は、そのような修飾に適用可能である。
【０１５５】
以下の例示的なスキームのそれぞれにおいて、反応生成物を互いからおよび／または出発材料から分離することは、有利である場合がある。各ステップの所望生成物は、当該技術分野において一般的な技術により、分離され、かつ／または所望の均質度まで精製される（以後、分離される）。典型的には、そのような分離は、多相抽出、溶媒もしくは溶媒混合物からの結晶化、蒸留、昇華、またはクロマトグラフィーを包含する。クロマトグラフィーは、例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィー、高、中または低圧クロマトグラフィー、小規模および分取薄層または厚層クロマトグラフィー、ならびに小規模薄層およびフラッシュクロマトグラフィーの技術を含む任意の数の方法を包含することができる。
【０１５６】
別のクラスの分離方法は、所望生成物、未反応の出発材料、反応副産物等に結合するかまたはそうでなければ分離可能にするように選択された試薬による、混合物の処理を包含する。そのような試薬は、活性炭、分子篩、イオン交換媒体等の吸着剤を含む。代替として、試薬は、塩基性材料の場合には酸、酸性材料の場合には塩基、結合試薬、例えば抗体、結合タンパク質、選択的キレート剤、例えばクラウンエーテル、液体／液体イオン抽出等であり得る。
【０１５７】
適切な分離方法の選択は、関与する材料の性質によって決まる。例えば、蒸留および昇華における沸点および分子量、クロマトグラフィーにおける極性官能基の有無、多相抽出における酸性および塩基性媒体中での材料の安定性等である。当業者ならば、所望の分離を達成する可能性が最も高い技術を適用するであろう。
【０１５８】
特に、本発明の化合物は、例えば、Ｍ．Ｏｎｏら（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６（２００８）６８６７〜６８７２）、ＷＯ２００８／１３１１４８、ＷＯ２００４／０８０９７２、ＷＯ２００４／０７２０５０およびＷＯ９８／１７６５２において開示されている手順に類似する様式で調製され得る。好ましいルートは、本発明の実施例の項ならびにＷＯ２０１０／０００３７２およびＥＰ１５１９９９７２．９においても例示されている。
【０１５９】
これらの方法は、そのような調製物の性質を例証するように意図されており、適用可能な方法の範囲を限定することは意図されていない。
下記の例は、本発明を例証するように意図されている。しかしながら、それらは限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６０】
材料および方法
すべての出発材料および溶媒は、ＡＢＣＲ、Ａｃｒｏｓ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＭｅｒｃｋから購入され、別段の注記がない限り、そのまま使用された。
【０１６１】
融点は、オープンガラスキャピラリーを使用するスチュアート・サイエンティフィック（ＢＩＢＢＹ、ＵＫ）融点装置で決定され、較正されなかった。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌプレコートシート、０．２５ｍｍのＡＬＵＧＲＡＭ（登録商標）ＳＩＬ  Ｇ／ＵＶ２５４プレート、ＵＶを用いる、および／または１０ｗｔ％エタノール性リンモリブデン酸試薬とともに炭化させ、続いて、２００℃で加熱することによる検出。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０（０．０６３〜０．１００ｍｍ）を使用することによって実施された。分析的および分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、Ｗａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイ検出器付きのＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステムを使用することによって実施された。すべての分離は、水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｖ／ｖ）（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）の移動相を包含した。ＨＰＬＣは、逆相（ＲＰ）カラムユーロスファー（Ｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）ＲＰ１８、１００Å、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ（分析的）および２５０×１６ｍｍ（分取）を、１ｍＬ分−１（分析的）および７ｍＬ分−１（分取）の流速で使用することによって実施された。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）および液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）分析は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ４０００質量分析計を、上述したＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ装置と併用して使用することによって取得された。ＮＭＲスペクトルは、２９８Ｋの温度で、ＴＸＩ  ＨＣＮ  ｚ−勾配プローブを備えた４００ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒアバンス分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＧ、Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって記録された。すべてのスペクトルは、ＴＯＰＳＰＩＮ２（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＧ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって加工された。１Ｈ  ＮＭＲ化学シフト（δ）は、内部標準としてのＣＨＣｌ３および［Ｄ５］ＤＭＳＯに対するパーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）で報告される。データは、次の通りに報告される：化学シフト、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｂ＝太線、ｍ＝多重線）、カップリング定数（Ｊ、Ｈｚで記載される）、統合。１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト（δ）は、内部標準としてのＣＤＣｌ３および［Ｄ６］ＤＭＳＯに対するパーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）で報告される。下記の実験は、化合物の共鳴を記録するために使用された：１Ｈ−１Ｄ、１３Ｃ−１Ｄ  ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ−ＡＰＴ（１／１４５秒の単一Ｊ放出時間を用いる結合プロトン試験、第４級およびメチレン基が正符号を、ならびにメチルおよびメチン基が負符号を有するようにスペクトルが加工される）。共鳴の重なりを分割し、１ＨおよびＡＰＴスペクトルにおける検出不可能な共鳴を回復するために、２Ｄ−［１３Ｃ，１Ｈ］−ＨＳＱＣ（異核種単一量子コヒーレンス法）、２Ｄ−［１３Ｃ，１Ｈ］−ＨＭＢＣ（異核多結合相関分光法）および２Ｄ−ＮＯＥＳＹがいくつかの化合物について記録された。エノール形態がスペクトルを支配するという事実にもかかわらず、１，３−ジアリールプロパン−１，３−ジオンは、図においてジケトンとして提示される。
【０１６２】
下記の化合物は、今までに報告され、公開されたプロトコール１に従って合成されてきた：ａｎｌｅ１３８ｂ、ａｎｌｅ１３８ｃ、ａｎｌｅ１４５ｃ、ａｎｌｅ１８６ｂ、ａｎｌｅ２５３ｂ、ａｎｌｅ２７０、ｓｅｒｙ８５、ｓｅｒｙ１０９、ｓｅｒｙ１１７、ｓｅｒｙ１４０、ｓｅｒｙ２９２ｂ、ｓｅｒｙ３１５ｂ、ｓｅｒｙ３３５ｂ、ｓｅｒｙ３４５、ｓｅｒｙ３６３ａ、ｓｅｒｙ３２０ｃ、ｓｅｒｙ３８３、ｓｅｒｙ３９２ｂ。
【０１６３】
合成例１：ｓｅｒｙ４３３、ＩＡＰによって開裂されるａｎｌｅ１３８ｂのプロドラッグの合成
【０１６４】
【化３９】
2020519646.tif 000041
【０１６５】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチルクロロメチルホスフェート（ｓｅｒｙ４３０）
化合物ｓｅｒｙ４３３は、公開されたプロトコール（Ｃ．Ｅ．Ｍｕｌｌｅｒ、「Ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ」、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ６、２０７１〜２０８３（２００９）；ＥＰ２１３３３５５Ａ１  ２００９）に従って調製した。リン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカリウム（３５ｇ、１４１ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ（１２７ｇ、５５７ｍｍｏｌ）、ｎ−Ｂｕ４ＮＨＳＯ４（４ｇ、１１ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（１２５ｍｌ）およびｔＢｕＯＭｅ（１７０ｍｌ）の混合物に、ｔＢｕＯＭｅ（３５ｍｌ）中のクロロ硫酸クロロメチル（３５ｇ、２１２ｍｍｏｌ）の溶液を、継続的に激しく撹拌しながら、０℃にて２５分間で滴下添加した。添加が完了した後、撹拌を室温で２時間にわたって続けた（内部温度が３０℃を超えた場合には、反応混合物を冷却した）。反応混合物をＨ２Ｏ（３５０ｍｌ）およびｔＢｕＯＭｅ（２００ｍｌ）でクエンチし、有機相を分離し、１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４水溶液（２００ｍｌ）、水（２００ｍｌ）、ブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。硫酸ナトリウムを濾過した後、ｎ−Ｂｕ３Ｎ（３ｍｌ）を溶液に添加し、溶液を減圧下で濃縮して、生成物を油（３４．４ｇ、９４％）として提供した。冷凍庫（−２１℃）内での貯蔵中に安定性を増大させるために、追加分のｎ−Ｂｕ３Ｎ（３ｍＬ）を生成物に添加した。
【０１６６】
Ｓｅｒｙ４３２
ＤＭＳＯ（２００ｍｌ）中の、ａｎｌｅ１３８ｂ（１）（２５ｇ、７２．８ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（３５．６ｇ、１０９ｍｍｏｌ）の混合物に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルクロロメチルホスフェート（２８．１ｇ、１０９ｍｍｏｌ）を一度に添加した。室温で５時間にわたって撹拌した後、反応混合物を水（１２００ｍｌ）で希釈し、ジエチルエーテル（５００＋２００＋１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機画分を、水（５００ｍｌ）、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。硫酸ナトリウムを濾過した後、溶液を減圧下で濃縮して、生成物を油（合計４９．５ｇ、４０．８ｇのｓｅｒｙ４３２、８２％、比２：３を持つ２つの異性体の混合物）として提供した。得られた生成物は、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルに基づき、１０．５％のｓｅｒｙ４３０および７．１％のＢｕ３Ｎも含有する。生成物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。Ｓｅｒｙ４３２は、比２：３の異性体の混合物である（１Ｈ  ＮＭＲ）。
【０１６７】
Ｓｅｒｙ４３３
ＤＣＭ（４００ｍｌ）中のｓｅｒｙ４３２（３４．４ｇ、６０．９ｍｍｏｌ）の冷却溶液に、ＴＦＡ（２３．５ｍｌ）を、継続的に激しく撹拌しながら０℃にて５分間で添加した。２時間後、追加分のＴＦＡ（２３ｍｌ）を添加し、反応混合物を０℃で８時間にわたって撹拌した。冷トルエン（３００ｍｌ）による希釈後、反応混合物を０℃にて減圧下で濃縮し、残留物を冷トルエン（３００ｍｌ）と混合し、０℃で再度濃縮した（ＤＣＭを５０〜１００ｍｂａｒで蒸発させ、ＴＦＡおよびトルエンを高真空ローター（ｒｏｔｏｒ）エバポレーターで蒸発させた）。得られた混合物を冷アセトニトリル（３００ｍｌ）で希釈し、０℃で１時間にわたって撹拌した。白色沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥させて、酸形態のｓｅｒｙ４３３（合計３１．０ｇ、２９．０ｇの酸形態のｓｅｒｙ４３３および２ｇのアセトニトリル）を提供した。酸形態の粗製ｓｅｒｙ４３３に、１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（１２９ｍｌ、１２９ｍｍｏｌ、２当量）および水（８０ｍｌ）を添加し、得られた溶液を濾過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅエクスプレスプラスフィルター）、濾液を凍結乾燥して、二ナトリウム塩ｓｅｒｙ４３３（３０．０ｇ、９９％、比２：３を持つ２つの異性体の混合物）を白色粉末として提供した。
【０１６８】
ｓｅｒｙ４３３、ホスフェート誘導体の２つの異性体が以下に示される。
【０１６９】
【化４０】
2020519646.tif 000042
【０１７０】
合成例２：ａｎｌｅ４２３ｂ（ａｎｌｅ２５３ｂのプロドラッグ）の合成
【０１７１】
【化４１】
2020519646.tif 000043
【０１７２】
Ａｎｌｅ４２３ａ
ＤＭＳＯ（５ｍｌ）中の、ａｎｌｅ２５３ｂ（５００ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（６２０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）の混合物に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルクロロメチルホスフェート（５２５ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）を一度に添加した。室温で１５時間の撹拌後、反応の完全性が薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（ＳｉＯ２、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１、Ｒｆ遊離体０．３３、Ｒｆ生成物０．１８）によって示された。反応混合物を水（３０ｍｌ）で希釈し、酢酸エチル（２×１５ｍｌ）で抽出した。合わせた抽出物を、水（１０ｍｌ）、ブライン（１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、生成物を油（１．０８ｇ）として提供した。生成物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。
【０１７３】
Ａｎｌｅ４２３ｂ（二アンモニウム塩）
ＤＣＭ（１０ｍｌ）中のａｎｌｅ４２３ａ（１．０８ｇ）の冷却懸濁液に、ＴＦＡ（２ｍｌ）を、継続的に激しく撹拌しながら０℃にて１分以内に添加し、反応混合物を０℃で８時間にわたって撹拌した。混合物を濾過し（ＧＨＰ  ０．４５μｍ）、トルエン（１０ｍｌ）で希釈し、２０℃にて減圧下で濃縮し、残留物をトルエン（１０ｍｌ）と混合し、２０℃で再度濃縮した（ＤＣＭを５０〜１００ｍｂａｒで蒸発させ、ＴＦＡおよびトルエンを高真空ローターエバポレーターで蒸発させた）。得られたガラス状の粘性残留物を冷アセトン（３０ｍｌ）で細砕し、０℃で１時間にわたって撹拌した。白色沈殿物を濾過し、アセトン（１０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させて、酸形態のａｎｌｅ４２３ｂ（４４８ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ、６８％、２Ｄ−ＮＯＥＳＹ  ＮＭＲ実験によれば、比ａｎｌｅ４２３ｂａ：ａｎｌｅ４２３ｂｂ＝３：２を持つ２つの異性体の混合物）を帯黄色粉末として提供した。ａｎｌｅ４２３ｂ（二酸、１５６ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）に、水（３ｍＬ）および２５％ＮＨ４ＯＨ（１２．６Ｍ、１５０μＬ、１．８９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を溶解が完了するまで撹拌し、得られた溶液を凍結させ、凍結乾燥して、二アンモニウム塩ａｎｌｅ４２３ｂ（１６１ｍｇ、３３１μｍｏｌ、９６％、比ａｎｌｅ４２３ｂａ：ａｎｌｅ４２３ｂｂ＝３：２を持つ２つの異性体の混合物）を帯黄色粉末として提供した。
【０１７４】
【化４２】
2020519646.tif 000044
【０１７５】
実施例１
α−シヌクレインが黒色腫において発現されること（Ｍａｔｓｕｏ  ＹおよびＫａｍｉｔａｎｉ  Ｔ、２０１０、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、５（５）：ｅ１０４８１）およびその過剰発現がＢ１６マウス黒色腫の増殖を強化すること（Ｉｓｒａｅｌｉ  Ｅら、２０１１、α−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６（５）：ｅ１９６２２）が報告されている。しかしながら、母斑および黒色腫において互いに並び合う３つの主要なＰＤ関連遺伝子／タンパク質−α−シヌクレイン／ＳＮＣＡ、ＬＲＲＫ２／ＰＡＲＫ８およびパーキン／ＰＡＲＫ２−の発現の状態およびレベルに関する科学データは、入手不可であった。したがって、黒色腫発生の異なる段階において、これらの３つの遺伝子／タンパク質のいずれが、どの程度まで発現されるかを決定するために、本発明者らは、遺伝子ＳＮＣＡ、ＰＡＲＫ８またはＰＡＲＫ２によってコードされるそれぞれのタンパク質に対する抗体で、母斑＞黒色腫進行組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の同じ組織をプロービングした（Ｗａｔｓｏｎ−Ｈｕｒｓｔ  ＫおよびＢｅｃｋｅｒ  Ｄ、２００６、Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ，ＭＣＡＭ  ａｎｄ  ｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、５（１０）：１３７５〜１３８２）。
【０１７６】
図１Ａにおいて描写されるのは、異なる臓器側面から取得された、母斑、垂直成長期における３つの原発性黒色腫（ＶＧＰ黒色腫）および転移成長期における４つの黒色腫（ＭＧＰ黒色腫）を表す、ＴＭＡコアにおけるα−シヌクレイン発現の例である。
【０１７７】
この分析の結果は、α−シヌクレインが、ＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫組織コアの両方のならびに母斑組織コアの黒色腫細胞において排他的にとは言わないまでも主に発現され、表皮真皮接合部に沿って在るメラノサイトにおいて主に発現されたことを明らかにし、これは、以前に報告されたデータ（Ｍａｔｓｕｏ  ＹおよびＫａｍｉｔａｎｉ  Ｔ、２０１０、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、５（５）：ｅ１０４８１）と合致する知見であった。本発明者らの分析が進行性黒色腫を表すＴＭＡコアにおけるα−シヌクレインの最強発現を実証したことから、本発明者らは、本発明者らが事前に行った全ゲノム発現プロファイリング研究（Ｓｍｉｔｈ  ＡＰ、Ｈｏｅｋ  ＫおよびＢｅｃｋｅｒ  Ｄ（２００５）、Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｍａｒｋｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｅｖｉ／ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｎｄ  ａｄｖａｎｃｅｄ−ｓｔａｇｅ  ｍｅｌａｎｏｍａｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、４（９）：１０１８〜１０２９）から、正常な皮膚＞ＭＧＰ黒色腫の範囲の組織におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現レベルについて、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）ＤａｔａＳｅｔ  ＧＳＥ４５８７を検索した。正常な皮膚（ＮＳ）、良性母斑（ＢＮ）、非定型母斑（ＡＮ）、黒色腫インサイチュ（ＭＩＳ）、ならびにＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫を表す非顕微解剖組織試料のプロファイリング時に取得された本発明者らのデータは、ＳＮＣＡが、ＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫において、ＭＩＳおよびＡＮと比較して高いレベルで発現されることを示唆する（図１Ａ、棒グラフ）。
【０１７８】
ＬＲＲＫ２に対する抗体を用いてＴＭＡを調べたところ（図１Ｂ）、α−シヌクレインとは異なり、ＬＲＫＫ２がＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫ＴＭＡコアのすべての黒色腫細胞においては発現されず、母斑ＴＭＡコアにおいてはほんのわずかなメラノサイトだけがＬＲＲＫ２の発現を示すことを示した（図１Ｂ）。さらに、ＰＡＲＫ８（ＬＲＲＫ２）発現プロファイル（図１Ｂ、棒グラフ）は、ＰＡＲＫ８（ＬＲＲＫ２）遺伝子の発現が、ＭＩＳにおいてならびにＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫において、ＢＮおよびＡＮと比較して高いことを示唆するが、その発現レベルは、ＮＳにおいて最も高い。パーキン（図１Ｃ）に関して、本発明者らのＴＭＡ分析は、黒色腫細胞において主に発現されるが、α−シヌクレインの場合と異なり、黒色腫ＴＭＡコアのすべてがパーキンの発現を明らかにするわけではなく、母斑組織コアにおけるメラノサイトが比較的弱い発現を示すことを示した。さらに、本発明者らの全ゲノム発現プロファイリングデータ（図１Ｃ、棒グラフ）は、ＰＡＲＫ２遺伝子の発現が、ＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫において、ＮＳ、ＢＮ、ＡＮおよびＭＩＳと比較して低いことを示唆する。
【０１７９】
実施例２
ＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫細胞におけるα−シヌクレインタンパク質の発現レベル、細胞内局在および状態
進行性黒色腫を表す腫瘍に由来する細胞株における、α−シヌクレインタンパク質の発現レベルおよび細胞内局在を決定するために、本発明者らは、ＶＧＰ黒色腫細胞株ＷＭ９８３−Ａ、３つのＭＧＰ黒色腫細胞株ＷＭ９８３−Ｂ、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＷＭ８５２、および放射状成長期（ＲＧＰ）／ＶＧＰにおける表在拡大型黒色腫から確立されたＷＭ１１５８黒色腫細胞株のイムノブロット分析を実施した。図２Ａに示される通り、同じ患者のＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫に由来した細胞株ＷＭ９８３−ＡおよびＷＭ９８３−ＢならびにＭＧＰ黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−５は、高レベルのα−シヌクレインを発現する。比較すると、ＷＭ８５２（ＭＧＰ）およびＷＭ１１５８（ＲＧＰ／ＶＧＰ）黒色腫細胞株は、より低レベルのα−シヌクレインタンパク質を含有する（図２Ａ）。
【０１８０】
これらの細胞株におけるα−シヌクレインの細胞内局在を決定するために、本発明者らは、α−シヌクレインに対する２つの異なる抗体を用いて、免疫蛍光研究を実施した。両方の抗体は、黒色腫細胞株ＷＭ９８３−Ｂ（図２Ｂおよび図６）、ＷＭ９８３−ＡおよびＳＫ−ＭＥＬ−５（図６）の核および細胞質を介してα−シヌクレインを、ならびにＷＭ１１５８（図６）においては低レベルで、検出した。
【０１８１】
今までに、Ｓｅｒ１２９におけるリン酸化後、α−シヌクレインは、細胞表面に転座することが報告されており（Ｌｅｅ  ＢＲ、Ｍａｔｓｕｏ  Ｙ、Ｃａｓｈｉｋａｒ  ＡＧおよびＫａｍｉｔａｎｉ  Ｔ（２０１３）Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｅｒ１２９  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１２６（２号）：６９６〜７０４）、ＳＫ−ＭＥＬ−５細胞の場合（Ｈａｎｓｅｎ  Ｃら、（２０１１）ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｔｏ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｅｅｄｓ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１２１（２）：７１５〜７２５）に示される通り、ここから、α−シヌクレインは、おそらく黒色腫エキソソームを介して放出され、それを細胞内に取り込む他の細胞へと広がる。
【０１８２】
免疫蛍光分析を実施して、本発明者らは、α−シヌクレインがＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞のＳｅｒ１２９においてリン酸化されることの証拠を取得した（図２Ｂ）。加えて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分離されたＷＭ９８３−Ｂ黒色腫全細胞溶解液（図７）、続いて、抗α−シヌクレイン抗体を用いる収集画分のフルタートラップ−ドットブロット分析は、モノマーα−シヌクレインならびに１７から１５８ｋＤの間および６７０ｋＤ超の高分子量種の画分におけるその分布を示し（図２Ｃ）、これらの細胞において、α−シヌクレインがオリゴマー化され、他のタンパク質とも相互作用している可能性が高いことを示した。
【０１８３】
実施例３
高レベルのα−シヌクレインを発現している黒色腫細胞の、α−シヌクレインに影響を及ぼすオリゴマーモジュレーターを用いる処理は、黒色腫細胞形態学において明白な変化を引き起こし、黒色腫細胞増殖を阻害する
進行性黒色腫におけるα−シヌクレインタンパク質の考えられる機能への洞察を得るために、本発明者らは、黒色腫細胞株ＷＭ９８３−Ａ、ＷＭ９８３−Ｂ、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＷＭ８５２およびＷＭ１１５８を、ジフェニル−ピラゾール（ＤＰＰ）化合物のパネルで処理した。プリオンタンパク質凝集の阻害、続いて、ＤＰＰ化合物の医薬品化学最適化によって、小分子ＤＩＶＥＲＳｅｔライブラリー（Ｃｈｅｍ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から同定されたＤＰＰ足場は、ａｎｌｅ１３８ｂおよびａｎｌｅ１３８ｃの同定につながった（Ｗａｇｎｅｒら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、２０１３年６月；１２５（６）：７９５〜８１３）。これらの２つの化合物のいずれもα−シヌクレインモノマーとは結合しない（Ｄｅｅｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．、２０１５、１８５０（９）：１８８４〜９０）が、これらはいずれも毒性オリゴマーの、したがって、間接的に原線維の形成も低減させる。
【０１８４】
ＤＰＰライブラリーからの１６の化合物の初期スクリーニングから、本発明者らは、ａｎｌｅ１３８ｂ、ｓｅｒｙ３３４ｂ、ａｎｌｅ１３８ｃおよびａｎｌｅ２５３ｂが、高レベルα−シヌクレイン発現細胞株ＷＭ９８３−Ｂに有意に影響を及ぼすことを見出した。最強かつ最も迅速な効果は、ａｎｌｅ１３８ｂについて観察された。
【０１８５】
異なる黒色腫細胞株、ＷＭ９８３−Ａ、ＷＭ９８３−ＢおよびＳＫ−ＭＥＬ−５に対するａｎｌｅ１３８ｂおよびａｎｌｅ１３８ｃの考えられる影響を評価するために、本発明者らは、それらを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した漸増用量のいずれかの化合物で処理し、無血清培養培地に添加した。高レベルのα−シヌクレインを発現している２つの黒色腫細胞株ＷＭ９８３−ＢおよびＳＫ−ＭＥＬ−５は、最初に細胞クラスターの形成、およびそれに続く、組織培養皿の表面からの脱離の増大として現れた主要な形態学的変化を、時間および用量依存的に示した。図３Ａは、４８時間にわたって単回用量の１０μＭのａｎｌｅ１３８ｂまたはａｎｌｅ１３８ｃのいずれかで処理された、ＷＭ９８３−ＢおよびＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫細胞の代表的な画像を示す。本発明者らは、ａｎｌｅ１３８ｂによる処理が、ａｎｌｅ１３８ｃよりも迅速な形態学的変化を引き起こすことも観察した。２つのａｎｌｅ化合物の効果が、細胞によって生成されるα−シヌクレインの量に関係するか否かを決定するために、本発明者らは、各ａｎｌｅ化合物を４８時間で補充して、（ＶＧＰ）ＷＭ９８３−Ａ高レベルおよび（ＲＧＰ／ＶＧＰ）ＷＭ１１５８低レベルα−シヌクレイン生成黒色腫細胞の増殖を、９６時間にわたって比較した（図８ＡおよびＢ）。ＷＭ９８３−ＡおよびＷＭ１１５８細胞株における形態学的変化は、ＭＧＰ黒色腫細胞株ＷＭ９８３−ＢおよびＳＫ−ＭＥＬ−５の場合ほど迅速には出現しなかった。しかしながら、９６時間で組織培養皿と結合したままであった残留ＷＭ９８３−Ａ細胞は、ａｎｌｅ１３８ｂ含有培養培地の除去、続いて、新鮮培地で３回すすぎ、その後、無血清培地中でインキュベーション後、再度増殖することができなかった。対照的に、ＷＭ１１５８細胞は、ａｎｌｅ１３８ｂまたはａｎｌｅ１３８ｃでの処理による有意に変更された形態学を示さず、４８時間後にのみ増殖の低減を示し、９６時間でのａｎｌｅ１３８ｂの除去および血清を含有する新鮮培養培地の添加後に、増殖を正常に回復することができた。
【０１８６】
高レベルα−シヌクレイン発現黒色腫細胞における形態学的変化が、ａｎｌｅ１３８ｃよりもａｎｌｅ１３８ｂの添加後により迅速に出現したことから、本発明者らは、主にａｎｌｅ１３８ｂを用いてその後の研究を実施したが、これは、抗酸化効果を有さず、α−シヌクレインの発現も分解も損なわず、ａｎｌｅ１３８ｃとは異なり、優れた経口バイオアベイラビリティおよび血液脳関門の浸透を有する（Ｗａｇｎｅｒら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、２０１３年６月；１２５（６）：７９５〜８１３）。
【０１８７】
α−シヌクレインを高レベルで発現している黒色腫細胞の増殖に、ａｎｌｅ１３８ｂがいかに迅速に影響を及ぼすかを比較するために、本発明者らは、４８時間で化合物（１０μＭ）を補充して、黒色腫細胞株ＷＭ９８３−Ａ（ＶＧＰ）およびＷＭ９８３−Ｂ（ＭＧＰ）を、２４、４８または７２時間にわたって、１０μＭのａｎｌｅ１３８ｂで処理した。図３Ｂに示される通り、わずか２４時間で、単回用量の１０μＭのａｎｌｅ１３８ｂは、両方の細胞株の増殖を有意な程度まで阻害した。
【０１８８】
実施例４
黒色腫細胞のＡｎｌｅ１３８ｂ処理は、それらの原形質膜を損傷し、それらのミトコンドリア膜電位を破壊し、オートファジーを異常調節する
黒色腫細胞生存率に対する漸増用量のａｎｌｅ１３８ｂの効果ならびにそれが細胞に細胞毒性であるか否か、故にそれらの原形質膜完全性を損ねるか否かを決定するために、本発明者らは、４８時間で等価用量の化合物を補充して、９６時間にわたって漸増用量のａｎｌｅ１３８ｂで処理されたＷＭ９８３−ＢおよびＷＭ８５２黒色腫細胞から収集した培養上清の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイを実施した。図４Ａに示される通り、高レベルα−シヌクレイン発現ＷＭ９８３−Ｂ細胞は、おそらく無血清培地中におけるこの用量を上回るその低溶解度により１０μＭ用量のａｎｌｅ１３８ｂで最大に到達する強い殺滅を示した。比較すると、ａｎｌｅ１３８ｂ処理に応答して殺滅された細胞の数は、低レベルα−シヌクレイン発現ＷＭ８５２細胞の場合には有意に低かった（図４Ａ）。
【０１８９】
ａｎｌｅ１３８ｂの添加後、ＷＭ９８３−Ａ、ＷＭ９８３−ＢおよびＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫細胞株における形態学的変化は極めて迅速に出現したが、それらは、細胞がアポトーシスを受けていることを示すものではなかった。この観察は、ａｎｌｅ１３８ｂおよびａｎｌｅ１３８ｃ処理細胞のいずれもクロマチンの異常な凝縮および断片化を呈さず、開裂カスパーゼ３に対しても陽性ではなかったという事実によって裏付けられた。しかしながら、図４Ｂに示される通り、ＷＭ９８３−ＢおよびＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫細胞のミトコンドリア膜電位は、単回１０μＭ用量のａｎｌｅ１３８ｂの添加後早くも２４時間で有意に低減されたのに対し、低レベルα−シヌクレイン発現ＷＭ１１５８細胞は、ａｎｌｅ１３８ｂ処理の４８時間後初めて、ミトコンドリア膜電位において若干の低減を示し始めた。同じパネルからのａｎｌｅ１３８ｂ処理ＷＭ９８３−Ｂ、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＷＭ１１５８黒色腫細胞の形態学の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像は、図９に示される。
【０１９０】
本発明者らは、黒色腫細胞のオートファジー経路に対するａｎｌｅ化合物の明確な効果を観察した。ａｎｌｅ１３８ｂで処理されたＷＭ９８３−Ｂ細胞は、２４時間で依然として結合している細胞の約６０％においておよび４８時間で細胞培養皿上に残っている細胞の９５％において、オートファゴソームマーカー、微小管関連タンパク質１軽鎖３Ｂ（ＬＣ３）の顕著な点状上方調節を示したのに対し、ＤＭＳＯのみを受けたＷＭ９８３−Ｂ細胞は、９６時間でＬＣ３点を持つ１％未満の細胞を示した（図４Ｃ）。ａｎｌｅ１３８ｃの添加後、効果は、２４時間で８％および９６時間後に７８％のレベルで後に見られた。同様のレベルの点状ＬＣ３遺伝子座は、ＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫細胞についてもａｎｌｅ１３８ｂでの処理時に（図４Ｃ）、およびａｎｌｅ１３８ｃではさらに高いレベルで、観察された。
【０１９１】
高レベルα−シヌクレイン発現黒色腫細胞へのａｎｌｅ１３８ｂの添加後いかに早くオートファジーが異常調節されるか、ならびに１０μＭを下回る用量のａｎｌｅ１３８ｂで足りるか否かを決定するために、本発明者らは、４８時間で等価用量の化合物を補充して、ＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞を７．５μＭのａｎｌｅ１３８ｂで２４、４８または７２時間にわたって処理した。ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｅｄ）タンパク質の凝集およびオートファジーを介するそれらのクリアランスに必要とされるタンパク質、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１に対する抗体を用いてＷＭ９８３−Ｂ黒色腫全細胞溶解液を調べたところ、２４時間にわたるａｎｌｅ１３８ｂ処理が、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１発現における増大につながらないことが示された（図４Ｄ、レーン１）。しかしながら、ａｎｌｅ１３８ｂ処理の４８および７２時間後（図４Ｄ、レーン２、３）、このオートファジー・カーゴ・アダプター・タンパク質の発現レベルは、ＤＭＳＯのみを受けたＷＭ９８３−Ｂ細胞と比較して、著しく上昇した（図４Ｄ、レーン４）。
【０１９２】
実施例５
高レベルα−シヌクレイン発現ヒト黒色腫異種移植片を担持するヌードマウスに全身的に投与されたＡｎｌｅ１３８ｂは、腫瘍に到達し、それらの形態学およびオートファジーに影響を及ぼす
ＤＰＰ化合物ａｎｌｅ１３８ｂが、ヌードマウスにおいて皮下腫瘍として成長させたヒトＭＧＰ黒色腫細胞に全身的に投与された場合、腫瘍に到達するか否かを決定するために、本発明者らは、下記の研究を実施した。その右下およびその左下背側に高レベルα−シヌクレイン発現（ＭＧＰ）ＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片を担持するヌードマウスに、ａｎｌｅ１３８ｂと混合された飼料ペレットを、７日間にわたって受けさせた。その右下およびその左下背側に同じくＷＭ９８３−Ｂ腫瘍を担持する第２のヌードマウスに、ａｎｌｅ１３８ｂを含有しない同じ種類の飼料ペレットを７日間にわたって受けさせた。マウスを屠殺した後、本発明者らは、死後切除されおよびその後凍結保存された腫瘍について、下記の分析を実施した。
【０１９３】
第一に、切除された腫瘍の本発明者らの薬物動態（ＰＫ）分析の結果は、ａｎｌｅ１３８ｂが、ａｎｌｅ１３８ｂと混合された飼料ペレットを受けたＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片担持動物の、右背側から切除された腫瘍（腫瘍の重量−５７ｍｇ）（図１０Ａ）においては１２５μＭのレベルで、および左背側から切除された腫瘍（腫瘍の重量−２１８ｍｇ）（図１０Ｂ）においては１１０μＭのレベルで、存在したことを示した。対照的に、ａｎｌｅ１３８ｂは、ａｎｌｅ１３８ｂのない飼料ペレットを受けたＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片担持マウスから切除された腫瘍においては検出されなかった（図１０Ｃ）。第二に、ａｎｌｅ１３８ｂと混合された飼料ペレットを受けた動物から切除されたＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片の１つから調製された、組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（図５ＣおよびＤ）は、これらの腫瘍細胞の形態学が、組織のアーキテクチャにおいて巣状の明瞭な乱れを伴う分散したパターンになっており、ａｎｌｅ１３８ｂを含有しないＷＭ９８３対照腫瘍における腫瘍細胞の形態学とは異なっていることを示した（図５ＡおよびＢ）。第三に、抗ＬＣ３抗体でプロービングされた、ａｎｌｅ１３８ｂ含有飼料ペレットを受けた動物から切除されたＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片からの組織切片は、ａｎｌｅ１３８ｂを含有しないＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片対照腫瘍の１つから調製された抗ＬＣ３抗体でプロービングされた組織切片（図５Ｅ）と比較して、より多くのＬＣ３陽性対照（図５Ｆ）を示した。
【０１９４】
考察
世界で推定７００から１０００万人に影響を及ぼすＰＤと、すべての皮膚がん関連死の７５％を占める最も侵攻型の皮膚がんである進行性黒色腫との間の疫学的関連の理由である根本的な機序に関する利用可能な情報は未だほとんどなく、あったとしてもわずかである。遺伝的要因がこれら２つの疾患を関連付けることは認められないため、本発明者らは、関連性が、ＰＤの主要調節因子である、α−シヌクレイン、ＬＲＲＫ２またはパーキンであり得る可能性を探究した。
【０１９５】
本発明者らは、ＬＲＲＫ２およびパーキンとは異なり、α−シヌクレインこそが、黒色腫細胞においてほぼ排他的に発現されるという組織ベースの証拠を提供する。興味深いことに、ＮＣＩ−６０がん細胞株パネルのＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）プロファイルは、９つの異なる原発型（乳、中枢神経系、結腸、白血病、黒色腫、非小細胞性肺、卵巣、前立腺、腎）からのがん組織に由来する細胞株と比較して、悪性黒色腫細胞株が、全体的に最高レベルのＳＮＣＡ発現を有することも示す（ＮＣＢＩ−Ｇｅｏ  ＤａｔａＳｅｔ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ＧＤＳ４２９６［ＡＣＣＮ］ｓｎｃａ）。同様に、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）において利用可能な情報は、他の種類の皮膚がんを含む他の悪性腫瘍と比較して、進行性黒色腫におけるα−シヌクレインの強い発現を示す。
【０１９６】
ＳＮＣＡ遺伝子における突然変異は稀であるのに対し、２５２７アミノ酸長マルチドメインＬＲＲＫ２タンパク質をコードするＰＡＲＫ８遺伝子における突然変異は、常染色体優性ＰＤの最も一般的な原因である。本発明者らの母斑＞進行性黒色腫ＴＭＡ分析のデータは、ＬＲＲＫ２が、母斑細胞および黒色腫細胞のすべてではないが一部において種々のレベルで発現されることを実証した。さらに、ＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫ＴＭＡコアの一部において、本発明者らは、腫瘍細胞を散在させている細胞におけるＬＲＲＫ２発現も検出した。Ｅ３−ユビキチンリガーゼパーキンをコードするＰＡＲＫ２遺伝子における突然変異は、常染色体劣性若年性ＰＤの最も高頻度な遺伝子的原因である。α−シヌクレインの場合のように、本発明者らのＴＭＡ分析は、パーキンが黒色腫細胞において発現されることを示した。しかしながら、α−シヌクレインと比較して、ＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫ＴＭＡコアにおけるパーキン発現のレベルは、有意に低く、黒色腫ＴＭＡコアのすべてがパーキンの発現を示したわけではなく、これは、黒色腫において、ＰＡＲＫ２が腫瘍抑制因子であるという示唆を裏付ける（Ｈｕ  ＨＨら、２０１６、ＰＡＲＫＩＮ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｎｋｓ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｏ  Ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、１０８（３））。ＰＤと関連しているとされてきた２つの他の遺伝子は、ＤＪ−１およびＡＴＰ１３Ａ２である。本発明者らは、母斑＞進行性黒色腫の範囲の組織におけるＤＪ−１の発現の状態を決定しなかったが、病理組織学的研究は、皮膚黒色腫において、ＤＪ−１の細胞質発現が減少する（Ｈｉｎｔｓａｌａ  ＨＲ、Ｓｏｉｎｉ  Ｙ、Ｈａａｐａｓａａｒｉ  ＫＭおよびＫａｒｉｈｔａｌａ  Ｐ、２０１５、Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄｏｘ−ｓｔａｔｅ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ  ｓｋｉｎ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、６７（３）：３４８〜３５７）のに対し、転移性ブドウ膜黒色腫を持つ患者の血清においては、上昇する（Ｃｈｅｎ  ＬＬら、２０１５、ＤＪ−１：ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｕｖｅａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、１４１（２）：３１５〜３２１、Ｐａｒｄｏ  Ｍら、２００６）ことを示した。ブドウ膜黒色腫腫瘍細胞の浸潤表現型の特徴付けは、ＭＵＣ１８およびＨＭＧ−１転移マーカーの存在を示し、潜在的な血清バイオマーカーとしてのＤＪ−１の同定につながる。Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１１９（５）：１０１４〜１０２２）。現在までのところ、ＡＴＰ１３Ａ２が黒色腫において役割を果たすか否かは不明であるが、α−シヌクレインとのその推定相互作用（Ｌｏｐｅｓ  ｄａ  Ｆｏｎｓｅｃａ  ＴおよびＯｕｔｅｉｒｏ  ＴＦ、２０１４、ＡＴＰ１３Ａ２  ａｎｄ  Ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ：ａ  Ｍｅｔａｌ  Ｔａｓｔｅ  ｉｎ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、２３（４）：３１４〜３２３）を踏まえると、本発明者らの事前に行わ��た全ゲノム発現プロファイリング研究からのＡＴＰ１３Ａ２特異的なデータセットが、α−シヌクレインの場合のように、ＡＴＰ１３Ａ２遺伝子が母斑＞黒色腫の進行で上方調節されることを示すことは、注目に値する。
【０１９７】
進行性黒色腫への妥当な生存促進機序および経路への重要な洞察を得ることは、この疾患を持つ患者への有効な療法を見つけるための欠かせないタスクの１つを構成する。本明細書において提示される新規かつ重要な知見は、α−シヌクレインおよび式（Ｅ）によって表されるプリオンタンパク質オリゴマーモジュレーター、特にａｎｌｅ１３８ｂまたはａｎｌｅ１３８ｃを用いる高レベルα−シヌクレイン発現ＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫細胞の処理が、原形質膜損傷、ミトコンドリア膜電位の深刻な低減、およびオートファジーの主要な異常調節により、急速な黒色腫細胞死につながることである。さらに、進行性黒色腫への潜在的な将来の臨床応用の観点で、本発明者らは、前臨床ヒト黒色腫異種移植片研究の設定において、式（Ｅ）によって表される全身的に投与された化合物、特にａｎｌｅ１３８ｂが、腫瘍に到達するだけでなく、腫瘍細胞において高レベルで存在もすること、ならびにそれらが腫瘍細胞の形態学およびオートファジーに影響を及ぼすという第１の証拠を提供する。
【０１９８】
ａｎｌｅ１３８ｂを用いる高レベルα−シヌクレイン発現黒色腫細胞の処理が、黒色腫細胞オートファジーの異常調節につながるという本発明者らの知見と、これに対する、タウオパシーのマウスモデルにおいて、ａｎｌｅ１３８ｂ処理がオートファジーマーカー、ＬＣ３およびｐ６２／ＳＱＳＴＭ１のレベルを変化させなかったという知見（Ｗａｇｎｅｒ  Ｊら、２０１５、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔａｕ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｌｅ１３８ｂ  ｄｅｌａｙｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ、１３０（５）：６１９〜６３１）は、ａｎｌｅ１３８ｂを用いる処理の生物学的結果が細胞型特異的であることを示唆する。この特異性は、ＰＤ等のシヌクレイノパチーにおいてニューロンに対してα−シヌクレインが有する有害作用と関連している場合があり、一方、進行性黒色腫等の侵攻性悪性腫瘍において、α−シヌクレインの高レベル発現は、細胞の生存に対して有益であるだけでなく、ほぼ確実に、黒色腫エキソソームを介して広がる（Ｈａｎｓｅｎ  Ｃら、２０１１、ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｔｏ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｅｅｄｓ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１２１（２）：７１５〜７２５）ことによって、この疾患が特に起こしやすい黒色腫脳転移の形成および成長をおそらく促進もする。
【０１９９】
これまでに、正常細胞においてはオートファジーが保護的役割を有するのに対し、がんにおいてはこれががん発生の初期段階における抑制因子として、および進行段階におけるファシリテーター／プロモーターとしての二重の役割を有することは、十分に確立されている（Ｇａｌｌｕｚｚｉ  Ｌら、２０１５、Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ、３４（７）：８５６〜８８０、Ｗｈｉｔｅ  Ｅ、２０１５、Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１２５（１）：４２〜４６、Ｗｈｉｔｅ  Ｅ、２０１２、Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、１２（６）：４０１〜４１０、Ｋｒｏｅｍｅｒ  ＧおよびＬｅｖｉｎｅ  Ｂ、２００８、Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：ｔｈｅ  ｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ａ  ｍｉｓｎｏｍｅｒ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、９（１２）：１００４〜１０１０）。これまでのところ、母斑＞黒色腫進行において、および黒色腫ではその初期対進行段階において、オートファジーがどの程度まで役割を果たすのかはほとんど知られていない。しかしながら、ＲＧＰ、ＶＧＰおよび特にＭＧＰ黒色腫は、母斑よりも優位に低いレベルのＬＣ３で発現すること（Ｍｉｒａｃｃｏ  Ｃら、２０１０、Ｂｅｃｌｉｎ  １  ａｎｄ  ＬＣ３  ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ、Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ、４１（４）：５０３〜５１２）、ならびに中央値ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１発現レベルは、対がん米国合同委員会（ＡＪＣＣ）段階Ｉ／ＩＩ黒色腫においてよりもＡＪＣＣ段階ＩＩＩ／ＩＶにおいてのほうが低いこと（Ｅｌｌｉｓ  ＲＡら、２０１４、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｐ６２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１３４（５）：１４７６〜１４７８）が報告されている。これは、ＤＭＳＯのみを受けた２つのＭＧＰ黒色腫細胞株、ＷＭ９８３−ＢおよびＳＫ−ＭＥＬ−５が、細胞の１％未満においてＬＣ３陽性ファゴソームシグナルを示した、およびＤＭＳＯで処理したＷＭ９８３−Ｂ細胞におけるｐ６２／ＳＱＳＴＭ１発現のレベルが低かったという本発明者らの知見と一致する。他方で、黒色腫の文脈で主に取得された最近の増大しつつある証拠−ＢＲＡＦ阻害剤耐性研究は、オートファジーが進行性黒色腫の妥当な生存機序であることを示唆する（Ｘｉｅ  Ｘ、Ｋｏｈ  ＪＹ、Ｐｒｉｃｅ  Ｓ、Ｗｈｉｔｅ  ＥおよびＭｅｈｎｅｒｔ  ＪＭ、２０１５、Ａｔｇ７  Ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ＢｒａｆＶ６００Ｅ−Ｄｒｉｖｅｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ、５（４）：４１０〜４２３、Ｇｏｏｄａｌｌ  ＭＬら、２０１４、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎｈｉｂ��ｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ、Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  １０（６）：１１２０〜１１３６、Ｍａ  ＸＨら、２０１４、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ＢＲＡＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１２４（３）：１４０６〜１４１７、Ｍａｅｓ  ＨおよびＡｇｏｓｔｉｎｉｓ  Ｐ、２０１４、Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ、１９  Ｐｔ  Ａ：５８〜６８、Ｍａｄｄｏｄｉ  Ｎら、２０１０、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＢＲＡＦ、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１３０（６）：１６５７〜１６６７）。
【０２００】
要約すると、本明細書において提示される本発明者らの知見は、ＰＤにおいて深刻な毒性機能を発揮するα−シヌクレインが、その進行段階における黒色腫の生存を促進し、それにより、高度に有益であるという第一の証拠を提供する。加えて、本発明者らのデータは、α−シヌクレインの凝集を妨げることによってＶＧＰおよびＭＧＰ黒色腫細胞におけるオートファジーを異常調節することが、ａｎｌｅ１３８ｂ等の式（Ｅ）によって表される化合物、進行性黒色腫の主要調節因子を標的とする小分子阻害剤および強力な免疫刺激抗体の展開を包括する、三剤併用療法への新規かつ強力なアプローチとなり得ることを示唆する。
【０２０１】
材料および方法
黒色腫細胞株、ＴＭＡ、ＧＥＯデータセット
ヒト黒色腫細胞株ＷＭ９８３−Ａ、ＷＭ９８３−Ｂ、ＷＭ８５２およびＷＭ１１５８を、記述された通りにインビトロで繁殖させた（Ｂｅｃｋｅｒ  Ｄ、Ｍｅｉｅｒ  ＣＢおよびＨｅｒｌｙｎ  Ｍ、１９８９、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａｓ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＭＢＯ  Ｊ、８（１２）：３６８５〜３６９１）。ＣＬＳ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ＧｍｂＨ（Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入したヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−５を、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）中で繁殖させた。
【０２０２】
抗原賦活化後および各抗体について最適希釈（シグナル対ノイズ性能）を決定するための試験ＴＭＡの染色前に、母斑＞黒色腫進行ＴＭＡの組織コア（Ｗａｔｓｏｎ−Ｈｕｒｓｔ  ＫおよびＢｅｃｋｅｒ  Ｄ、２００６、Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ，ＭＣＡＭ  ａｎｄ  ｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、５（１０）：１３７５〜１３８２）を、α−シヌクレイン［ＭＪＦＲ１］、ＬＲＲＫ２［ＭＪＦＦ２］またはパーキンに対する抗体を用いる標準的な免疫組織化学（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、続いて、Ａｐｅｒｉｏスキャンスコープを用いるＴＭＡスライドの走査（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）によってプロービングして、抗体でプロービングされた組織コアのデジタル画像を生成させた。
【０２０３】
ＮＣＢＩ  ＧＥＯデータベース（ＤａｔａＳｅｔ  ＧＳＥ４５８７）に以前寄託した、本発明者らの全ゲノム発現プロファイリング研究のデータセット（Ｓｍｉｔｈ  ＡＰ、Ｈｏｅｋ  ＫおよびＢｅｃｋｅｒ  Ｄ（２００５）Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｍａｒｋｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｅｖｉ／ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｎｄ  ａｄｖａｎｃｅｄ−ｓｔａｇｅ  ｍｅｌａｎｏｍａｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、４（９）：１０１８〜１０２９）から、本発明者らは、プロファイルＧＤＳ１９８９／２３６０８１下、ＮＳ（ｎ＝２）、ＡＮ（ｎ＝２）、ＭＩＳ（ｎ＝２）、ＶＧＰ黒色腫（ｎ＝２）、ＭＧＰ黒色腫（ｎ＝５）について収載された値の平均からのＳＮＣＡの、プロファイルＧＤＳ１９８９／２２９５８４下ＰＡＲＫ８（ＬＲＲＫ２）の、およびプロファイルＧＤＳ１９８９／２０７０５８下ＰＡＲＫ２の、発現レベルを得た。
【０２０４】
イムノブロット分析
α−シヌクレインタンパク質発現の分析のために、全細胞溶解液を、１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に移し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で室温にて３０分間の処理によって架橋させ、５％粉乳でブロックし、α−シヌクレインに対する抗体［ＭＪＦＲ１］（Ａｂｃａｍ）でプロービングし、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＰＲ）二次抗体およびスーパーシグナルウエストピコ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とともにインキュベーションした。タンパク質ローディングは、抗アクチン［ａｂ１８０１］抗体（Ａｂｃａｍ）での二次プロービングによって決定した。
【０２０５】
ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質発現の分析のために、ＷＭ９８３−Ｂ黒色腫全細胞溶解液を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜上に移し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、抗ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）でプロービングし、続いて、対応するＨＰＲコンジュゲート二次抗体および化学発光基質（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）とともにインキュベーションした。タンパク質ローディングは、抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）での二次プロービングによって決定した。
【０２０６】
ＳＥＣ−フィルター・トラップ・アッセイ
ＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞を、０．５％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ中で溶解させた。タンパク質溶解物（２．２ｍｇ／０．５ｍｌ）を０．４５μｍの遠心分離管フィルターに通して濾過した後、ＡＫＴＡ精製装置１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）と接続されたスーパーロース６  １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＵＳＡ）にロードした。収集画分を１０分間にわたって９５℃の水に入れ、その後、すべての収集画分の全体積を、ドットブロット真空システムによってニトロセルロース膜上にロードした。５％脱脂粉乳を含有するトリス緩衝生理食塩水−ツイーン２０（ＴＢＳＴ）中でブロックした後、マウスモノクローナル抗α−シヌクレイン［Ｓｙｎ−１］抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で膜をプロービングし、続いて、対応するＨＲＰコンジュゲート二次抗体および化学発光基質（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともにインキュベーションした。ＳＥＣ−フィルター・トラップ・アッセイを２回繰り返した。
【０２０７】
Ａｎｌｅ１３８ｂおよびａｎｌｅ１３８ｃ阻害剤処理、ならびに黒色腫細胞増殖分析
ａｎｌｅ１３８ｂまたはａｎｌｅ１３８ｃの１０または３０ｍＭストック溶液を、ＤＭＳＯ中で作製した。ａｎｌｅ１３８ｂおよびａｎｌｅ１３８ｃはＦＢＳに強く結合するため、１０％ＦＢＳを含有する組織培養培地中で２４時間にわたって平板培養した黒色腫細胞を、無血清培地で３回すすいだ後、無血清培地中の、ａｎｌｅ１３８ｂ、ａｎｌｅ１３８ｃ、または等価体積のＤＭＳＯのみを添加した。４８時間後、細胞培養培地を除去し、続いて、無血清培養培地中の、等価用量のａｎｌｅ１３８ｂもしくはａｎｌｅ１３８ｃまたはＤＭＳＯのみを添加した。ＷＭ１１５８（ＲＧＰ／ＶＧＰ）黒色腫細胞が無血清培養培地中で十分に増殖しないことから、２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を、ａｎｌｅ１３８ｂまたはａｎｌｅ１３８ｃを用いるこれらの細胞の処理中に、無血清培養培地に添加した。ＤＭＳＯのみを受けた、またはａｎｌｅ１３８ｂで処理した黒色腫細胞の増殖は、血球計を用いて細胞をカウントすることによって決定した。
【０２０８】
ＬＤＨ細胞毒性分析
ＷＭ９８３−ＢおよびＷＭ８５２黒色腫細胞の複製を、３５ｍｍの組織培養プレート中、ウェル当たり３×１０５細胞で平板培養した。２４時間後、細胞を無血清培地で３回すすぎ、続いて、漸増用量のａｎｌｅ１３８ｂまたはＤＭＳＯのみを添加した。４８時間後、細胞培養培地を除去し、続いて、無血清培地中の、等価用量のａｎｌｅ１３８ｂまたはＤＭＳＯのみを添加した。４８時間後に収集された培養培地を、遠心分離してペレット化し、細胞残屑を除去した。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＧｍｂＨ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および分光光度吸収測定を使用して、組織培養培地中へのＬＤＨ酵素活性の放出を、ＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。ＤＭＳＯのみを受けたＷＭ９８３−ＢおよびＷＭ８５２黒色腫細胞からの無血清培養培地上清は、バックグラウンド対照として役立ち、それらの値を引いた。ＤＭＳＯ対照からの細胞を、製造業者の説明書に従って、トリプシン処理し、カウントし、溶解させた。殺滅された黒色腫細胞の数は、各用量のａｎｌｅ１３８ｂについて記録されたＬＤＨ放出を、公知の数の黒色腫細胞の溶解時に放出されたＬＤＨに対して正規化することによって取得した（較正曲線）。両方の細胞株についての標準曲線は、重ね合わせることができなかった。
【０２０９】
細胞学および免疫蛍光
細胞形態学。ａｎｌｅ１３８ｂもしくはａｎｌｅ１３８ｃで種々の時間にわたって処理された、またはＤＭＳＯのみを受けた黒色腫細胞の位相差またはＤＩＣ画像を、浜松ホトニクス株式会社オルカ電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ付きＺｅｉｓｓアキソバート１００顕微鏡上の１０×ＮＡ０．６対物レンズで捕捉した。培養皿当たり無作為な領域で、各時点について少なくとも４つの画像を記録した。
【０２１０】
ミトコンドリア膜電位。黒色腫細胞株ＷＭ９８３−Ｂ、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＷＭ１１５８を、２４または４８時間にわたって、ａｎｌｅ１３８ｂで処理するか、またはＤＭＳＯのみを受けさせた。３．７％ＰＦＡによる固定の前に、細胞を、２００ｎＭマイトトラッカーレッドＣＭＸＲｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）とともに３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。共焦点像の積み重ねを、蛍光および透過モードのＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０メタ共焦点顕微鏡上の６３×ＮＡ１．２アポクロマート水浸対物レンズで捕捉した。
【０２１１】
α−シヌクレイン染色。４％ＰＦＡで固定し、５ｍｇ／ｍｌの０．０５％トリトン−Ｘ１００／ＰＢＳ中ＢＳＡで３７℃にて３０分間にわたってブロックしたＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞を、ウサギポリクローナル抗−α−シヌクレイン［Ｃ−２０］抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ）またはマウスモノクローナル抗リン酸化α−シヌクレイン［ｐＳｙｎ番号６４］抗体（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ、Ｎｅｕｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でプロービングし、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００Ｂ倒立顕微鏡上の４０×／０．６０対物レンズで鏡像した。黒色腫細胞株、ＷＭ９８３−Ａ、ＷＭ９８３−Ｂ、ＳＫ−ＭＥＬ−５およびＷＭ１１５８中におけるα−シヌクレインタンパク質発現の免疫蛍光比較は、３．７％ＰＦＡ中で２０分間にわたる増殖細胞の固定、透過化、ブロッキング、およびマウスモノクローナル抗α−シヌクレイン［Ｓｙｎ２１１］抗体（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、続いて、ヤギ抗マウスアレクサ−５４６二次抗体による染色によって為された。共焦点像の積み重ねを、同じゲインおよびレーザー出力のＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０メタ共焦点顕微鏡上の６３×ＮＡ１．４油浸対物レンズで獲得した。
【０２１２】
オートファジー。２４または４８時間にわたってａｎｌｅ１３８で処理されたまたはＤＭＳＯのみを受けたＷＭ９８３−ＢおよびＳＫ−ＭＥＬ−５細胞を、３．７％ＰＦＡで２０分間にわたって固定し、透過化し、ブロックし、抗ＬＣ３Ｂ［クローン２Ｇ６］抗体（ｎａｎｏＴｏｏｌｓ  Ａｎｔｉｋｏｒｐｅｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｔｅｎｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、続いて、ロバ抗マウスアレクサ−４８８二次抗体およびＤｒａｑ５  ＤＮＡ対比染色でプロービングした。共焦点像の積み重ねを、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０メタ共焦点顕微鏡上の６３×ＮＡ１．２対物レンズで取得した。
【０２１３】
黒色腫異種移植片研究
４週齢の雌ヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｃｒｌ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ  ＧｍｂＨ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の右下および左下背側に、ＷＭ９８３−Ｂ（ＭＧＰ）ヒト黒色腫細胞（片側１×１０７細胞）を皮下注射した。腫瘍が任意の方向に２．３から３．０ｍｍのサイズに到達したら、動物のうち１匹の通常の飼料ペレット食を、ａｎｌｅ１３８ｂと混合された飼料ペレット［１ｋｇの飼料ペレット当たり２ｇのａｎｌｅ１３８ｂ］（ｓｓｎｉｆｆ  Ｓｐｅｚｉａｌｄｉａｔｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に置きかえたのに対し、他の動物の通常の飼料ペレット食は、ａｎｌｅ１３８ｂを含有しない飼料ペレット（ｓｓｎｉｆｆ  Ｓｐｅｚｉａｌｄｉａｔｅｎ  ＧｍｂＨ）に置きかえた。ａｎｌｅ１３８を加えたまたは加えない飼料ペレットを受けさせた７日後に、両方の腫瘍担持動物を屠殺し、切除された腫瘍を直ちに液体窒素中で凍結した。これらの研究は、承認ＬＡＶＥＳプロトコール（３３．１９−４２５０２−０４−１４／１７２４）下で行った。
【０２１４】
凍結保存されたＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片組織を４℃にした後、それらをプリセリーズＣＫＭｉｘ−２ｍＬの組織均質化チューブに移し、０．５から１．００ｍｌのアセトニトリル中、プリセリーズエボリューションスーパーホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｎｔｉｇｎｙ−ｌｅ−Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して均質化した。均質化（６８００ｒｐｍ、サイクル間に３０秒の休止をはさんで３０秒間で８サイクル）を４回繰り返した。その後、ホモジネートを２５℃で２分間にわたって超音波処理し、２分間にわたって遠心分離した。１００μｌアリコートの上清を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムに注入した。分析的ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイ検出器付きのＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。すべての分離は、水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｖ／ｖ）（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）の移動相を包含した。ＨＰＬＣは、逆相（ＲＰ）カラムユーロスファーＲＰ１８、１００Å、５μｍ、２５０×４．６ｍｍを、１ｍｌ／分の流速で使用し、５０分間で０％から１００％の溶媒Ｂの勾配を用いて実施した。流出物を、２６０ｎｍでＵＶ吸収についてモニターした。化合物の外部標準に対するピーク面積比を使用して、試料を定量化した。
【０２１５】
ＷＭ９８３−Ｂヒト黒色腫異種移植片から調製した組織切片を、メタノールで固定し、ブロッキング溶液（ヤギ血清−０．２５％トリトンＸ−１００）で処理し、抗ＬＣ３［ＮＢ１００−２２２０］抗体（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ  Ｎｏｒｄｅｎｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でプロービングし、続いて、ヤギ抗ウサギアレクサ−４８８二次抗体を添加し、蛍光４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）および蛍光封入剤（Ｄａｋｏ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で対比染色した。抗ＬＣ３抗体でプロービングおよび対比染色された組織切片の画像を、Ｚｅｉｓｓ  ＡＸＩＯ撮像装置Ｍ１落射蛍光および明視野顕微鏡上の１０×ＮＡ０．４５対物レンズで取得した。Ｈ＆Ｅ染色は、標準的なプロトコールに従って実施した。
【０２１６】
（２Ｅ）−１−（３−ブロモフェニル）−３−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］プロパ−２−エン−１−オン（ａｎｌｅ４５８ａ）
【０２１７】
【化４３】
2020519646.tif 000045
【０２１８】
この化合物は、以前に報告されている（ＣＡＳ２９１７０−７６−１）。ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）中の、１−（３−ブロモフェニル）エタノン（１．９９ｇ、１０ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（１．４９ｇ、１０ｍｍｏｌ）、Ｂａ（ＯＨ）２・Ｈ２Ｏ（２００ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）および４０％ＮａＯＨ水溶液（１ｍＬ、１４．３ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で１８時間にわたって撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、得られた沈殿物を濾過によって収集し、水およびｎ−ヘキサン（それぞれ１０ｍＬ）で洗浄し、風乾させて、生成物ａｎｌｅ４５８ａ（１．４７ｇ、４．４５ｍｍｏｌ、４４％）を黄色固体として提供した。
【０２１９】
【数１】
2020519646.tif 000046
【０２２０】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配３０分間で５０％ＣＨ３ＣＮ／５０％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間１７．１分および質量３３０．０６（１００％）、３３２．０１（９７％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１０８〜９℃。
【０２２１】
４−［３−（３−ブロモフェニル）−１，２−オキサゾール−５−イル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（ａｎｌｅ４５８ｃ）
【０２２２】
【化４４】
2020519646.tif 000047
【０２２３】
クロロホルム（２０ｍＬ）中のａｎｌｅ４５８ａ（１．３４ｇ、４．０６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、クロロホルム（５ｍＬ）中の臭素（６５０ｍｇ、４．０７ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で滴下添加した。混合物を０℃で撹拌し、真空で濃縮した。残留物をエタノール（３０ｍＬ）に懸濁し、ヒドロキシルアミン塩酸塩（８３４ｍｇ、１２ｍｍｏｌ）および５０％ＮａＯＨ水溶液（１．９２ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を撹拌しながら１４時間にわたって還流下で加熱し、室温に冷却した。得られた沈殿物を濾過し、風乾させ、エタノールから再結晶させて、生成物ａｎｌｅ４５８ｃ（２ステップにわたって２５１ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ、１８％）を白色固体として得た。
【０２２４】
【数２】
2020519646.tif 000048
【０２２５】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配３０分間で５０％ＣＨ３ＣＮ／５０％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間２０．５分および質量３４３．０４（１００％）、３４５．１２（９７％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１４１〜２℃。
【０２２６】
３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（３，５−ジクロロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（ａｎｌｅ１７１１２９）
【０２２７】
【化４５】
2020519646.tif 000049
【０２２８】
ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボキシミドアミド（１８０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）および３，５−ジクロロ安息香酸メチル（３０８ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）の溶液に、粉末ＮａＯＨ（６０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を迅速に添加した。１５分間の撹拌後に、固体が沈殿する。不均質混合物を室温で２時間にわたって撹拌した（ＴＬＣ対照、ＳｉＯ２、ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１、遊離体Ｒｆ＝０．３２、生成物Ｒｆ＝０．９１）。反応混合物を冷水（３０ｍＬ）で希釈した。得られた沈殿物を濾過し、水（３×１０ｍＬ）で洗浄し、５０℃で風乾させて、生成物ａｎｌｅ１７１１２９を白色結晶性固体（２６４ｍｇ、７８８μｍｏｌ、７９％）として得た。
【０２２９】
【数３】
2020519646.tif 000050
【０２３０】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配３０分間で５０％ＣＨ３ＣＮ／５０％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間２７．１分および質量３３５．０４（１００％）、３３７．１２（６５％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１８２〜３℃。
【０２３１】
５−［５−（３−ブロモフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］−１−メチル−１Ｈ−インドール（ａｎｌｅ２５３ＭＩＮ）
【０２３２】
【化４６】
2020519646.tif 000051
【０２３３】
ＤＭＳＯ（７．５ｍＬ）およびＴＨＦ（１．９ｍＬ）中の１−（１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）エタノン（５２０ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）および３−ブロモ安息香酸メチル（８３９ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（油中６０％、３．９ｍｍｏｌ、１５６ｍｇ）を添加した。反応混合物を２０℃で１５時間にわたって撹拌し、ＡｃＯＨ（４５０μＬ）を含有する６０ｍＬの氷および水に注ぎ入れ、１時間にわたって撹拌し、ＣＨＣｌ３（４×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。残留物に、ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）８０％ヒドラジン水和物（５４７μＬ、５６３ｍｇ、９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を７８℃で１５時間にわたって撹拌し、冷却し、得られた沈殿物を濾過し、冷（０℃）ＭｅＯＨで洗浄し、２０℃にて高真空で１５時間にわたって乾燥させて、生成物５−［５−（３−ブロモフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］−１−メチル−１Ｈ−インドール（２ステップにわたって６２３ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ、５９％）を黄褐色固体として得た。
【０２３４】
【数４】
2020519646.tif 000052
【０２３５】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配３０分間で５０％ＣＨ３ＣＮ／５０％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間１５．９分および質量３５２．１２（１００％）、３５４．０１（９７％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点２０４〜６℃。
【０２３６】
１−（３−ブロモフェニル）−３−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イル）プロパン−１，３−ジオン（ａｎｌｅ１８０２１６）
【０２３７】
【化４７】
2020519646.tif 000053
【０２３８】
ＤＭＳＯ（６ｍＬ）およびＴＨＦ（１．５ｍＬ）中の１−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イル）エタノン（５００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）および３−ブロモ安息香酸メチル（６７１ｍｇ、３．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（油中６０％、３．１２ｍｍｏｌ、１２５ｍｇ）を添加し、混合物を２０℃で９６時間にわたって撹拌した。反応混合物を１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７（１０ｍＬ）に注ぎ入れ、ＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）で抽出した。抽出物を、１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。粗製１−（３−ブロモフェニル）−３−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，５−ベンゾジオキセピン−７−イル）プロパン−１，３−ジオンの残留物をＥｔＯＨ（１０ｍＬ）に溶解し、ヒドラジン一水和物（１１５μＬ、１１９ｍｇ、２．３７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を７８℃で５時間にわたって撹拌し、冷却し、水（２０ｍＬ）で希釈した。得られた沈殿物を濾過し、水（４×５ｍＬ）、ｎ−ヘキサン（２×５ｍＬ）で洗浄し、風乾させて、生成物（２ステップにわたって３７０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、３８％）を白色固体として得た。
【０２３９】
【数５】
2020519646.tif 000054
【０２４０】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配３０分間で５０％ＣＨ３ＣＮ／５０％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間１６．５分および質量３７１．０９（１００％）、３７３．１０（９７％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１５５〜６℃。
【０２４１】
５−（３−フルオロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−１，２−オキサゾール（ａｎｌｅ４６１ａ）
【０２４２】
【化４８】
2020519646.tif 000055
【０２４３】
４−ニトロベンズアルデヒド（１．５１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、４０ｍＬの１：１  ｔ−ＢｕＯＨ：Ｈ２Ｏ中のヒドロキシルアミン塩酸塩（７３０ｍｇ、１０．５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。これに、ＮａＯＨ（４２０ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で３０分間にわたって撹拌した後、ＴＬＣ分析は、オキシム形成が完了したことを示した。クロラミン−Ｔ三水和物（２．９６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を少量ずつ５分間かけて、続いて、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（７５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）および銅切削屑（およそ２５ｍｇ）を添加した。１−エチニル−３−フルオロベンゼン（１．２６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加し、数滴の１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液の添加によってｐＨをおよそ６に調整し、撹拌をもう１５時間にわたって続けた。反応混合物を氷／水（７５ｍＬ）に注ぎ入れ、０．５ｍＬの２５％ＮＨ４ＯＨ水溶液を添加して、すべての銅塩を除去した。生成物を濾過によって収集し、風乾させ、アセトニトリル（１００ｍＬ）に再溶解し、シリカゲルのショートプラグに通過させて、蒸発後に、表題化合物（１．２ｇ、４．２ｍｍｏｌ、４２％）を白色固体として得た。
【０２４４】
【数６】
2020519646.tif 000056
【０２４５】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配３０分間で５０％ＣＨ３ＣＮ／５０％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間１７．２分および質量２８５．００（１００％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１８８〜９℃。
【０２４６】
４−［５−（３−フルオロフェニル）−１，２−オキサゾール−３−イル］アニリン（ａｎｌｅ４６１ｂ）
【０２４７】
【化４９】
2020519646.tif 000057
【０２４８】
ジオキサン（４．５ｍＬ）中の５−（３−フルオロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−１，２−オキサゾールａｎｌｅ４６１ａ（５６８ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水（４．５ｍＬ）中の硫化ナトリウム三水和物（６６０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）の温（およそ６０℃）溶液を８０℃で一度に添加した。混合物を２時間にわたって撹拌し、室温まで冷却し、氷水（２０ｍＬ）に注ぎ入れた。０℃で３０分間撹拌した後、得られた沈殿物を濾過し、冷水（３×５ｍＬ）で洗浄し、風乾させた。粗生成物（４０９ｍｇ）を沸騰アセトニトリルに溶解し、濾過し（ＧＨＰ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルター０．４５μｍ）、蒸発させて、表題化合物（３６０ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、７１％）を橙色固体として得た。
【０２４９】
【数７】
2020519646.tif 000058
【０２５０】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配３０分間で５０％ＣＨ３ＣＮ／５０％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間６．５分および質量２５４．９４（１００％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１６０〜１℃。
【０２５１】
４−［５−（３−フルオロフェニル）−１，２−オキサゾール−３−イル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（ａｎｌｅ４６１ｃ）
【０２５２】
【化５０】
2020519646.tif 000059
【０２５３】
アセトニトリル（５ｍＬ）中の４−［５−（３−フルオロフェニル）−１，２−オキサゾール−３−イル］アニリンａｎｌｅ４６１ｂ（２５４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびホルムアルデヒド（１０Ｍ水溶液、１ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１８９ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を添加した。酢酸（１１４μＬ、１２０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２時間にわたって撹拌した。次いで、追加の酢酸（１１４μＬ、１２０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌を６時間にわたって続けた。混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液およびブライン（それぞれ５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、表題化合物（２１０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、７４％）を帯黄色固体として得た。
【０２５４】
【数８】
2020519646.tif 000060
【０２５５】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配３０分間で５０％ＣＨ３ＣＮ／５０％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間１２．２分および質量２８２．９８（１００％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１５２〜３℃。
【０２５６】
７−［５−（３−ブロモフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］−４−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン（ａｎｌｅ１８０２２２）
【０２５７】
【化５１】
2020519646.tif 000061
【０２５８】
ジシクロヘキシルカルボジイミド（８０７ｍｇ、３．９１ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）中の４−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−７−カルボン酸（ＣＡＳ５３２３９１−８９−２）（６８５ｍｇ、３．５５ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノール（６５３ｍｇ、３．５５ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に添加した。撹拌を１７時間にわたって続け、その時までに、無色沈殿物が形成された。混合物を濾過し、蒸発させ、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解し、蒸発させて、粗製エステルペンタフルオロフェニル４−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−７−カルボキシレート（１．４ｇ、３．９０ｍｍｏｌ、１００％）を黄色油性固体として得、これを、精製することなく次のステップにおいて使用した。ｉＰｒ２ＮＥｔ（５２３μＬ、３８８ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の１−（３−ブロモフェニル）エタノン（１９９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびＭｇＢｒ２・Ｅｔ２Ｏ（６４６ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に添加した。得られた懸濁液を１５分間にわたって撹拌し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中のペンタフルオロフェニル４−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−７−カルボキシレート（４３１ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を滴下添加した。２４時間後、１−（３−ブロモフェニル）エタノン（１９９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＭｇＢｒ２・Ｅｔ２Ｏ（６４６ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（５２３μＬ、３８８ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌をさらに２４時間にわたって続けた。１Ｎリン酸緩衝液ｐＨ６（２０ｍＬ）を添加し、１０分間にわたって撹拌し、有機相を分離し、水性相をＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。残留物をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／クロロホルム＝１：１、Ｒｆ０．１５）によって精製して、３６２ｍｇの粗生成物を黄色泡状物として得、これを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の粗製１−（３−ブロモフェニル）−３−（４−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−７−イル）プロパン−１，３−ジオン（３６２ｍｇ）の溶液に、ヒドラジン一水和物（１９４μＬ、２００ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を７８℃で１５時間にわたって撹拌し、室温まで冷却し、溶媒および過剰のヒドラジン一水和物をロータリーエバポレーターで除去した。トルエン（２０ｍＬ）を添加し、混合物を濃縮乾固した。粗生成物（３８０ｍｇ）をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１００：１、Ｒｆ０．２６）によって精製して、生成物（３ステップにわたって３０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、８％）を白色固体として得た。
【０２５９】
【数９】
2020519646.tif 000062
【０２６０】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配３０分間で５０％ＣＨ３ＣＮ／５０％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間１５．５分および質量３７０．０８（１００％）、３７２．０３（９７％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点２１０℃。
【０２６１】
１−（ベンゾフラン−５−イル）−３−（３−ブロモフェニル）プロパン−１，３−ジオン（ｓｅｒｙ４２８ａ）
【０２６２】
【化５２】
2020519646.tif 000063
【０２６３】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した１。鉱油中水素化ナトリウムの６０％懸濁液（０．０４８ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を、石油ベンジン（２０ｍｌ）で２回洗浄し、無水ＤＭＳＯ（２ｍｌ）を添加した。アルゴン下、室温で３０分間にわたって撹拌した後、フラスコを１５℃まで冷却し、ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中の３−ブロモ安息香酸メチル（０．２７ｇ、１．２ｍｍｏｌ）および６−アセチルベンゾフラン（０．１５ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）の溶液を滴下添加した。添加が完了したら、反応混合物を室温で１５時間撹拌し、次いで、８５％リン酸（０．２５ｍｌ）を含有するクラッシュアイス（５０ｇ）にゆっくりと注ぎ入れた。得られた沈殿物を濾過によって収集し、水（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させて、粗製ｓｅｒｙ４２８ｂ（０．２５ｇ）を黄色粉末として提供し、これを、精製することなく次のステップにおいて使用した。
【０２６４】
３−（ベンゾフラン−５−イル）−５−（３−ブロモフェニル）−１Ｈ−ピラゾール（ｓｅｒｙ４２８ｂ）
【０２６５】
【化５３】
2020519646.tif 000064
【０２６６】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した１。エタノール（８ｍｌ）中のｓｅｒｙ４２８ａ（２５０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（５０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を、撹拌しながら１２時間還流下で加熱した。透明黄色溶液を減圧下で蒸発させ、水を添加し、得られた沈殿物を濾過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させ、エタノールから再結晶させて、ｓｅｒｙ４２８ｂ（１２４ｍｇ、５０％）をベージュ色粉末として提供した。
ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．３７。
【０２６７】
【数１０】
2020519646.tif 000065
【０２６８】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間４０．９分および質量３３９．０５（１００％）、３４１．０１（１００％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点２０１〜２０２℃。
【０２６９】
５−（３，４−ジクロロフェニル）−オキサゾール（ｓｅｒｙ５３７）
【０２７０】
【化５４】
2020519646.tif 000066
【０２７１】
表題化合物は、以前に報告されている（ＣＡＳ５０３５９６−５０−７）。これは、公開されたプロトコールに従って調製した２。メタノール（５０ｍＬ）中の３，４−ジクロロベンズアルデヒド（１．７５ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＴｏｓＭＩＣ（２．０５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、炭酸カリウム（２．７６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を一度に添加した。室温で３０分間にわたって撹拌した後、得られた反応混合物を４時間にわたって還流下で加熱し、減圧下で濃縮し、水（１００ｍｌ）で処理した。得られた沈殿物を濾過によって収集し、水（２０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させて、ｓｅｒｙ５３７（２．０８ｇ、９７％）を黄色固体として提供した。
ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．４４。
【０２７２】
【数１１】
2020519646.tif 000067
【０２７３】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間３９．３分および質量２１３．８７（１００％）、２１５．９（６５％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１００〜１０１℃。
【０２７４】
５−（３，４−ジクロロフェニル）−２−（３−ニトロフェニル）オキサゾール（ｓｅｒｙ５３９）
【０２７５】
【化５５】
2020519646.tif 000068
【０２７６】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した３。乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の、ｓｅｒｙ５３７（１．０７ｇ、５ｍｍｏｌ）、１−ヨード−３−ニトロベンゼン（１．４９ｇ、６ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（１．１４ｇ、６ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（２６５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびＮａ２ＣＯ３（１．０６ｇ、１０ｍｍｏｌ）の混合物を、不活性雰囲気（Ａｒ）下、１６０℃で２時間にわたって撹拌した。室温に冷却した後、混合物を２Ｍ塩化アンモニウム水溶液（１５０ｍｌ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機画分をブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。得られた固体をアセトニトリルから再結晶させて、ｓｅｒｙ５３９（０．８７ｇ、５２％）を黄色固体として提供した。
ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．５３。
【０２７７】
【数１２】
2020519646.tif 000069
【０２７８】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配３０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮおよび５分間で１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間３１．７分および質量３３５．０９（１００％）、３３７．０５（６５％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１９９〜２０１℃。
【０２７９】
２−（３−アミノｍフェニル（ａｍｉｎｏｍｐｈｅｎｙｌ））−５−（３，４−ジクロロフェニル）オキサゾール（ｓｅｒｙ５４０）
【０２８０】
【化５６】
2020519646.tif 000070
【０２８１】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した１。ジオキサン（１０ｍＬ）中のｓｅｒｙ５３９（８６０ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水（１０ｍＬ）中の硫化ナトリウム三水和物（８５５ｍｇ、６．５ｍｍｏｌ）の温（およそ６０℃）溶液を８０℃で一度に添加した。混合物を２時間にわたって撹拌し、室温まで冷却し、氷水（２０ｍＬ）に注ぎ入れた。０℃で３０分間撹拌した後、得られた沈殿物を濾過し、冷水（２×１０ｍＬ）で洗浄し、風乾させた。粗生成物をｎ−ブタノールから再結晶させて、ｓｅｒｙ５４０（４３３ｍｇ、５５％）を褐色固体として提供した。
ＴＬＣ（クロロホルム：ＭｅＯＨ、４０／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．４４。
【０２８２】
【数１３】
2020519646.tif 000071
【０２８３】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間３３．５分および質量３０５．０２（１００％）、３３６．９８（６５％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１７９〜１８０℃。
【０２８４】
２−（３−ブロモフェニル）−４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）オキサゾール（ｓｅｒｙ５３４）
【０２８５】
【化５７】
2020519646.tif 000072
【０２８６】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した４。アセトニトリル（５０ｍｌ）中の１−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）エタノン（８９０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）およびＨＤＮＩＢ（２．８１ｇ、６．０ｍｍｏｌ）の混合物を、２．５時間にわたって還流下で加熱した。３−ブロモベンズアミド（３．０ｇ、１５ｍｍｏｌ）を一度に添加し、撹拌を還流しながらさらに１２時間にわたって続けた。室温に冷却した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。ＤＣＭ（１００ｍｌ）、水（５０ｍｌ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍｌ）を、残留固体に添加した。有機相を分離し、水（５０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ｎ−ヘキサン＝２：１  ｖ／ｖ）によって精製して、ｓｅｒｙ５３４（７００ｍｇ、３９％）を白色固体として提供した。
ＴＬＣ（ＤＣＭ／ｎ−ヘキサン、２：１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．５２。
【０２８７】
【数１４】
2020519646.tif 000073
【０２８８】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間４５．２分および質量３５８．０９（１００％）、３５９．９８（１００％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１２５〜１２６℃。
【０２８９】
２−（３−ブロモｍフェニル（ｂｒｏｍｏｍｐｈｅｎｙｌ））−５−（３−メトキシフェニル）−１Ｈ−イミダゾール（ｓｅｒｙ５４７）
【０２９０】
【化５８】
2020519646.tif 000074
【０２９１】
表題化合物は、わずかな修正を加えて、公開されたプロトコールに従って調製した１。ＴＨＦ（１０ｍｌ）および水（２．５ｍｌ）中の３−ブロモベンズアミジン塩酸塩（７０６ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（８４０ｍｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の混合物を、還流下で加熱した。ＴＨＦ（２．５ｍｌ）中の２−ブロモ−１−（３−メトキシフェニル）エタノン（６８７ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）の溶液を、混合物を還流下に保ちながら、１０分間かけて滴下添加した。添加後、混合物を６時間にわたって還流下で加熱し、ＴＨＦを減圧下で蒸発させた。酢酸エチル（２０ｍｌ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍｌ）を混合物に添加した。有機相を分離し、ブライン（１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。得られた粗生成物を、石油エーテル／クロロホルム（２／１  ｖ／ｖ）の混合物から再結晶させて、ｓｅｒｙ５４７（６４０ｍｇ、６５％）を白色固体として提供した。
ＴＬＣ（クロロホルム：ＭｅＯＨ、１００／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．３４。
【０２９２】
【数１５】
2020519646.tif 000075
【０２９３】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間２９．２分および質量３２８．９９（１００％）、３３１．０１（１００％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１３６〜１３７℃。
【０２９４】
５−（３−クロロフェニル）−３−（４−メトキシフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（ｓｅｒｙ５６２）
【０２９５】
【化５９】
2020519646.tif 000076
【０２９６】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した５。ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の４−メトキシベンズアミドオキシム（３３２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）および３−クロロ安息香酸メチル（５５４ｍｇ、３ｍｍｏｌ）の溶液に、粉末ＮａＯＨ（１２０ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を迅速に添加した。１５分間の撹拌後に、固体沈殿物が形成された。不均質混合物を室温で３時間にわたって撹拌した。反応混合物を冷水（６０ｍＬ）で希釈した。得られた沈殿物を濾過し、水（３×３０ｍＬ）で洗浄し、風乾させて、生成物ｓｅｒｙ５６２を白色結晶性固体（５２０ｍｇ、９１％）として提供した。
ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、７／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．５０。
【０２９７】
【数１６】
2020519646.tif 000077
【０２９８】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間４６．８分および質量２８７．０６（１００％）、２８８．９５（３５％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１３０℃。
【０２９９】
３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（３−ブロモフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（ｓｅｒｙ５６４）
【０３００】
【化６０】
2020519646.tif 000078
【０３０１】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した５。ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシ−１，３−ベンゾジオキソール−５−カルボキシミドアミド（３６０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）および３−ブロモ安息香酸メチル（６４５ｍｇ、３ｍｍｏｌ）の溶液に、粉末ＮａＯＨ（１２０ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を迅速に添加した。１５分間の撹拌後に、固体沈殿物が形成された。不均質混合物を室温で３時間にわたって撹拌した。反応混合物を冷水（６０ｍＬ）で希釈した。得られた沈殿物を濾過し、水（３×３０ｍＬ）で洗浄し、風乾させて、生成物ｓｅｒｙ５６４を白色結晶性固体（５４５ｍｇ、７９％）として提供した。
ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、７／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．５５。
【０３０２】
【数１７】
2020519646.tif 000079
【０３０３】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間４６．９分および質量３４４．９２（１００％）、３４６．９５（１００％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１６３〜１６４℃。
【０３０４】
１−（３−クロロフェニル）−３−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）プロパン−１，３−ジオン（ｓｅｒｙ５９５）
【０３０５】
【化６１】
2020519646.tif 000080
【０３０６】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した１。鉱油中水素化ナトリウムの６０％懸濁液（０．２ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を石油ベンジン（２０ｍｌ）で２回洗浄し、無水ＤＭＳＯ（４ｍｌ）を添加した。アルゴン下、室温で３０分間にわたって撹拌した後、フラスコを１５℃まで冷却し、ＤＭＳＯ（４ｍｌ）中の３−クロロ安息香酸メチル（０．８５３ｇ、５．０ｍｍｏｌ）および１−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）エタノン（０．７１２ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下添加した。添加が完了したら、反応混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで、８５％リン酸（１ｍｌ）を含有するクラッシュアイス（５０ｇ）にゆっくりと注ぎ入れた。得られた沈殿物を濾過によって収集し、水（５０ｍｌ）で洗浄し、風乾させた。得られた粗生成物をメタノールから再結晶させて、ｓｅｒｙ５９５（５９０ｍｇ、４７％）を薄黄色粉末として提供した。
ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．５３。
【０３０７】
【数１８】
2020519646.tif 000081
【０３０８】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間４５．８分および質量３１７．０４（１００％）、３１８．９９（３５％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１０６〜１０７℃。
【０３０９】
３−（３−クロロフェニル）−５−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール（ｓｅｒｙ５９９）
【０３１０】
【化６２】
2020519646.tif 000082
【０３１１】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した１。エタノール（１０ｍｌ）中のｓｅｒｙ５９５（４００ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（９５ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）の溶液を、撹拌しながら１４時間還流下で加熱した。熱い反応混合物への水（１ｍｌ）の添加後、溶液を室温まで冷却し、−２０℃で１時間保った。得られた沈殿物を濾過によって収集し、水（５ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ、メタノールから再結晶させて、ｓｅｒｙ５９９（３３５ｍｇ、８４％）を白色粉末として提供した。
ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．２５。
【０３１２】
【数１９】
2020519646.tif 000083
【０３１３】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間３７．９分および質量３１３．０５（１００％）、３１４．９４（３５％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１５５〜１５６℃。
【０３１４】
１−（３−ブロモフェニル）−３−（キノキサリン−６−イル）プロパン−１，３−ジオン（ｓｅｒｙ６０６）
【０３１５】
【化６３】
2020519646.tif 000084
【０３１６】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した１。ジシクロヘキシルカルボジイミド（６８１ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）中の６−キノキサリンカルボン酸（５２２ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノール（５５２ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に添加した。撹拌を１５時間にわたって続け、その時までに、無色沈殿物が形成された。混合物を濾過し、沈殿物を、フィルター上、ジオキサン（５ｍｌ）で洗浄し、合わせた溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解し、蒸発させて、６−キノキサリンカルボン酸の粗製ペンタフルオロフェニルエステルを油性固体として得、これを、精製することなく次のステップにおいて使用した。ｉＰｒ２ＮＥｔ（８９０ｍｇ、６．９ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の１−（３−ブロモフェニル）エタノン（４５９ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）およびＭｇＢｒ２・Ｅｔ２Ｏ（１．４９ｇ、５．７５ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に添加した。得られた懸濁液を１５分間にわたって撹拌し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の６−キノキサリンカルボン酸（４３１ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェニルエステルを滴下添加した。室温で７時間の撹拌後、１−（３−ブロモフェニル）エタノン（１５０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌をさらに１４時間にわたって続けた。得られた溶液を、水（１００ｍｌ）、ＤＣＭ（３００ｍｌ）および１Ｍ  ＨＣｌ水溶液（７ｍｌ）の混合物に注ぎ入れ、有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍｌ）（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。残留物をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／クロロホルム＝２／１）によって精製して、７７０ｍｇの粗生成物をベージュ色粉末として得、これを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。
ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、１００／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．３４。
【０３１７】
３−（３−ブロモフェニル）−５−（キノキサリン−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール（ｓｅｒｙ６０７）
【０３１８】
【化６４】
2020519646.tif 000085
【０３１９】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した１。エタノール（１５ｍｌ）中のｓｅｒｙ６０６（６２０ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（２００ｍｇ、４ｍｍｏｌ）の溶液を、撹拌しながら２４時間還流下で加熱した。反応混合物の室温への冷却後、得られた沈殿物を濾過によって収集し、冷エタノール（１０ｍｌ）で、次いで水（２×１０ｍｌ）で洗浄し、風乾させて、ｓｅｒｙ６０７（４２０ｍｇ、６８％）を白色粉末として提供した。
ＴＬＣ（クロロホルム：ＭｅＯＨ、９５／５  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．２３。
【０３２０】
【数２０】
2020519646.tif 000086
【０３２１】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間４２．０分および質量３５１．００（１００％）、３５３．０２（１００％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点２２８〜２２９℃。
【０３２２】
（２Ｅ）−１−（３−ブロモフェニル）−３−（３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル）プロパ−２−エン−１−オン（ｓｅｒｙ５９６）
【０３２３】
【化６５】
2020519646.tif 000087
【０３２４】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した１。ＭｅＯＨ（７ｍＬ）中の、１−（３−ブロモフェニル）エタノン（４９７ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−カルボキサルデヒド（４７５ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）、Ｂａ（ＯＨ）２・Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）およびＮａＯＨ（３ｍｇ）の溶液を、室温で２４時間にわたって撹拌した。反応混合物を−２０℃で２時間にわたって保ち、得られた沈殿物を濾過によって収集し、冷メタノール（３ｍｌ）で洗浄し、風乾させて、生成物ｓｅｒｙ５９６（７１０ｍｇ、７７％）を黄色固体として提供した。
ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、７／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．５１。
【０３２５】
【数２１】
2020519646.tif 000088
【０３２６】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間４６．８分および質量３７１．１２（１００％）、３７３．０７（１００％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１２７〜１２８℃。
【０３２７】
２，３−ジブロモ−１−（３−ブロモフェニル）−３−（３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル）プロパン−１−オン（ｓｅｒｙ５９７）
【０３２８】
【化６６】
2020519646.tif 000089
【０３２９】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した１。クロロホルム（７ｍｌ）中のｓｅｒｙ５９６（３７１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、クロロホルム（７ｍｌ）中の臭素（１６０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で滴下添加した。０℃で３０分間、続いて室温で４時間にわたって撹拌した後、反応混合物を真空で濃縮した。残留物をｎ−ヘキサン（１５ｍｌ）中で細砕し、得られた沈殿物を濾過によって収集し、ｎ−ヘキサン（５ｍｌ）で洗浄し、風乾させて、ｓｅｒｙ５９７（３１０ｍｇ、５８％）を白色固体として提供した。
ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．４９。
【０３３０】
【数２２】
2020519646.tif 000090
【０３３１】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間４０．２分および質量５３０．１１（５０％）、５３２．２０（１００％）、５３４．０３（５０％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１３５℃。
【０３３２】
５−（３−ブロモフェニル）−３−（３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール（ｓｅｒｙ６０３）
【０３３３】
【化６７】
2020519646.tif 000091
【０３３４】
表題化合物は、公開されたプロトコールに従って調製した１。エタノール（４ｍｌ）中のｓｅｒｙ５９７（２００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（１００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液を、撹拌しながら１６時間還流下で加熱し、次いで、減圧下で濃縮した。酢酸エチル（２０ｍｌ）および水（１５ｍｌ）を混合物に添加した。有機相を分離し、水（１０ｍｌ）およびブライン（１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（勾配ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン＝１：５  ｖ／ｖからＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン＝１：４  ｖ／ｖ）によって精製して、ｓｅｒｙ６０３（６０ｍｇ、４１％）を白色固体として提供した。
ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３／１  ｖ／ｖ）：ＲＦ＝０．３６。
【０３３５】
【数２３】
2020519646.tif 000092
【０３３６】
ＬＣ  ＭＳ（ＲＰ１８〜１００Å、勾配５０分間で０％ＣＨ３ＣＮ／１００％Ｈ２Ｏ→１００％ＣＨ３ＣＮ）、保持時間４４．１分および質量３８３．１３（１００％）、３８５．０９（１００％）（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
融点１８２〜１８３℃。
【０３３７】
参考文献：
1. Wagner, J. et al. Anle138b: a novel oligomer modulator for disease-modifying therapy of neurodegenerative diseases such as prion and Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 125, 795-813 (2013).
2. Besselievre, F. et al. Ligandless microwave-assisted Pd/Cu-catalyzed direct arylation of oxazoles. J. Org. Chem. 73, 3278-3280 (2008).
3. Yoshizumi, T. et al. Synthesis of 2,5-diaryloxazoles through van Leusen reaction and copper-mediated direct arylation. Tetrahedron Lett. 50, 3273-3276 (2009).
4. Lee, J. C. et al. Facile synthesis of oxazoles starting from ketones. Synth. Commun. 33, 1611-1614 (2003)
5. Baykov, S. et al. The first one-pot ambient-temperature synthesis of 1,2,4-oxadiazoles from amidoximes and carboxylic acid esters. Tetrahedron 73, 945-951 (2017).
【０３３８】
実施例６
高レベルα−シヌクレイン発現ヒト黒色腫細胞の形態学および細胞死に対するＤＰＰ化合物の効果
高レベルα−シヌクレイン発現ヒト黒色腫細胞に対するＤＰＰ化合物の影響を決定するために、ＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞を、１２ウェル組織培養プレート内、１０％ウシ胎児血清を含有する細胞培養培地中、二連で平板培養した。２４時間後、細胞を無血清培地で３回すすぎ、続いて、各ＤＰＰ化合物を１０μＭの用量で含有する無血清培地を添加した。３７℃で４８時間にわたるＤＰＰ化合物処理細胞のインキュベーション後、各ＤＰＰ化合物を細胞に２回目の１０μＭの用量で添加した。光学顕微鏡法を使用して、細胞の形態学における変化＞細胞培養皿からの細胞の脱離／細胞培養培地中における浮遊＞細胞死を、ＤＰＰ化合物の添加後２４時間、４８時間、７２時間および９６時間の時点において、０、＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋の尺度で記録した。ＤＭＳＯのみを受けたＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞およびＤＰＰ化合物もＤＭＳＯも受けなかったＷＭ９８３−Ｂ黒色腫細胞は、対照として役立った。結果が表１に示される。
【０３３９】
【表１】
2020519646.tif 000093
【０３４０】
無血清培養培地中で繁殖した細胞への１０μＭ用量の化合物の添加時に、読み出した活性を細胞死として記録した。
ＤＰＰ化合物を、α−シヌクレイン発現ＷＭ９８３−Ｂヒト転移性黒色腫細胞に添加した。評価されたＤＰＰ化合物の活性は、
＋＋＋＋  ＤＰＰ化合物の添加４８時間後における１００％の細胞死
＋＋＋  ＤＰＰ化合物の添加９６時間後における１００％の細胞死
＋＋  ＤＰＰ化合物の添加９６時間後における５０〜９０％の細胞死
＋  ＤＰＰ化合物の添加９６時間後における２０〜５０％の細胞死
−  ＤＰＰ化合物の添加または培地中の化合物の沈殿９６時間後における２０％未満の細胞死
であった。
【図１Ａ】
2020519646.tif 000105
【図１Ｂ】
2020519646.tif 000106
【図１Ｃ】
2020519646.tif 000107
【図２】
2020519646.tif 000108
【図３Ａ】
2020519646.tif 000109
【図３Ｂ】
2020519646.tif 000110
【図４Ａ】
2020519646.tif 000111
【図４Ｂ】
2020519646.tif 000112
【図４Ｃ】
2020519646.tif 000113
【図４Ｄ】
2020519646.tif 000114
【図５】
2020519646.tif 000115
【図６】
2020519646.tif 000116
【図７】
2020519646.tif 000117
【図８Ａ】
2020519646.tif 000118
【図８Ｂ】
2020519646.tif 000119
【図９】
2020519646.tif 000120
【図１０】
2020519646.tif 000121
【国際調査報告】
2020519646.tif 000122
2020519646.tif 000123
2020519646.tif 000124
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