(57)【要約】本発明の態様により、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスであって、機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変されたＮＳＧマウスを提供する。具体的な態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧマウスは、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスである。
2020519282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスであって、機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変されたＮＳＧマウス。
【請求項２】
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウスである、請求項１に記載の遺伝子改変ＮＳＧマウス。
【請求項３】
ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスである、請求項１に記載の遺伝子改変ＮＳＧマウス。
【請求項４】
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスである、請求項１に記載の遺伝子改変ＮＳＧマウス。
【請求項５】
ヒト免疫細胞をさらに含む、請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の遺伝子改変ＮＳＧマウス。
【請求項６】
前記ヒト免疫細胞がヒト末梢血単核細胞である、請求項５に記載の遺伝子改変ＮＳＧマウス。
【請求項７】
前記ヒト免疫細胞がヒトＴ細胞である、請求項５に記載の遺伝子改変ＮＳＧマウス。
【請求項８】
ヒト腫瘍細胞をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子改変ＮＳＧマウス。
【請求項９】
機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変された免疫不全マウスであって、但し、β２ｍ（ＭＨＣ  Ｉの構成要素）ノックアウトおよびＩＡβ（ＭＨＣ  ＩＩの軽鎖）ノックアウトによって特徴付けられるＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌマウスではない、免疫不全マウス。
【請求項１０】
ヒト免疫細胞をさらに含む、請求項９に記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
【請求項１１】
前記ヒト免疫細胞がヒト末梢血単核細胞である、請求項１０に記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
【請求項１２】
前記ヒト免疫細胞がヒトＴ細胞である、請求項１０に記載の遺伝子改変免疫不全マウス。
【請求項１３】
ヒト腫瘍細胞をさらに含む、請求項９〜１２のいずれかに記載の遺伝子改変ＮＳＧマウス。
【請求項１４】
遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒト免疫系の効果をモデルとするための方法であって：
請求項５〜８または１０〜１３のいずれかに記載の遺伝子改変免疫不全マウスに、試験物質を投与するステップ；および
前記遺伝子改変免疫不全マウスにおいて前記ヒト免疫系の前記効果をアッセイするステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
前記試験物質が抗がん剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試験物質が免疫療法剤である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験物質が抗がん免疫療法剤である、請求項１４、１５、または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験物質が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、もしくはペンブロリズマブであるか、または前記免疫チェックポイント阻害剤が、前述のいずれか１つの抗原結合性断片を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
実質的に本明細書に記載されるかまたは示される遺伝子改変マウス。
【請求項２２】
実質的に本明細書に記載されるかまたは示される遺伝子改変マウスの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１７年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／５０５，２６４号および２０１８年３月２８日に出願された同第６２／６４９，０９９号からの優先権を主張し、両件の全内容は本明細書に参照により援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより与えられた助成金第１Ｒ２４ＯＤ０１８２５９および助成金第ＯＤ０１１１９０の下なされた。政府は本出願における一定の権利を有する。
【０００３】
一般的に、機能的なヒト細胞および組織のマウスモデルについて記載する。具体的な態様によれば、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが欠損している遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。さらなる具体的な態様によれば、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが欠損し、１）生着させた機能的ヒトＴ細胞、および２）ヒト患者由来腫瘍細胞などの同種異系または異種細胞を含む遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。
【背景技術】
【０００４】
ヒト化マウス、例えば機能的なヒト細胞および組織を生着させた免疫不全マウスは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト免疫細胞機能をモデルとするために広く使用されている。そのようなマウスモデルにおいてヒトＴ細胞機能を研究する場合の主な制限は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の急速な発症であり、これは実験期間枠を短縮するのみならず、最終的にマウスを死亡させる根底にある進行中の急性ＧＶＨＤによりヒトＴ細胞機能の分析を混乱させる。これらの問題により、ヒトＴ細胞機能の研究は妨害されている。
【０００５】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩを欠如するヒト化マウスモデルを生成するために、いくつかの試みが行われた。例えば、Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒらは、Ｈ−２ＫおよびＨ−２Ｄ遺伝子によってコードされるＭＨＣ分子が欠損しているマウスモデル（ＫｂＤｂ−／−マウス）を開示している（Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９５巻：１２４９２〜１２４９７頁、１９９８年）。Ａｓｈｉｚａｗａらは、ＭＨＣクラスＩ／ＩＩがノックアウトされているヒト化免疫不全ＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ）［ＮＯＤ／Ｓｈｉ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ］について記載している（Ａｓｈｉｚａｗａら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；２３巻（１号）、１４９〜１５８頁、２０１７年）。
機能的なヒト細胞および組織に関するマウスモデルが絶えず必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９５巻：１２４９２〜１２４９７頁、１９９８年
【非特許文献２】Ａｓｈｉｚａｗａら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；２３巻（１号）、１４９〜１５８頁、２０１７年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の態様により、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスであって、機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変されたＮＳＧマウスを提供する。具体的な態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧマウスは、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスである。
【０００８】
本発明の態様により、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスであって、機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変されており、ヒト免疫細胞を含むＮＳＧマウスを提供する。具体的な態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧマウスは、ヒト免疫細胞を含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ヒト免疫細胞を含むＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはヒト免疫細胞を含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１ＵｎｃＰｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスである。
【０００９】
本発明の態様により、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスであって、機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変されており、ヒト末梢血単核細胞を含むＮＳＧマウスを提供する。具体的な態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧマウスは、ヒト末梢血単核細胞を含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ヒト末梢血単核細胞を含むＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはヒト末梢血単核細胞を含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスである。
【００１０】
本発明の態様により、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスであって、機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変されており、ヒトＴ細胞を含むＮＳＧマウスを提供する。具体的な態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧマウスは、ヒトＴ細胞を含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ヒトＴ細胞を含むＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはヒトＴ細胞を含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスである。
【００１１】
本発明の態様により、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスであって、機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変されており、ヒト免疫細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＳＧマウスを提供する。具体的な態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧマウスは、ヒト免疫細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ヒト免疫細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはヒト免疫細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスである。
【００１２】
本発明の態様により、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスであって、機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変されており、ヒト末梢血単核細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＳＧマウスを提供する。具体的な態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧマウスは、ヒト末梢血単核細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ヒト末梢血単核細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはヒト末梢血単核細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスである。
【００１３】
本発明の態様により、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスであって、機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変されており、ヒトＴ細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＳＧマウスを提供する。具体的な態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧマウスは、ヒトＴ細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ヒトＴ細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはヒトＴ細胞とヒト腫瘍細胞とを含むＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスである。
【００１４】
本発明のＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウスは、ヒトＩｇＧの投与後２日間で、投与されたヒトＩｇＧの７０％、８０％、または９０％以下のクリアランスなどの６０％以下のクリアランスによって特徴付けられる。
【００１５】
免疫不全マウスは、マウスが機能的な主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）を欠如し、かつ機能的な主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）を欠如するように遺伝子改変されているが、但し免疫不全マウスは、β２ｍ（ＭＨＣ  Ｉの構成要素）ノックアウトおよびＩＡβ（ＭＨＣ  ＩＩの軽鎖）ノックアウトによって特徴付けられるＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌマウスではない。特定の態様によれば、マウスは、ヒト末梢血単核細胞およびヒトＴ細胞などのヒト免疫細胞をさらに含む。特定の態様によれば、マウスは、ヒト末梢血単核細胞およびヒトＴ細胞などのヒト免疫細胞をさらに含み、ヒト腫瘍細胞をさらに含む。
【００１６】
遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒト免疫系またはその１つもしくは複数の構成要素の効果をモデルとするための方法であって、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに試験物質を投与するステップ、および遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒト免疫系またはその１つもしくは複数の構成要素の効果をアッセイするステップを含む、方法を提供する。試験物質は、抗腫瘍抗体；免疫療法剤；ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤を含むがこれらに限定されない免疫チェックポイント阻害剤であり得るが、これらに限定されない。試験物質は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、もしくはペンブロリズマブから選択される免疫チェックポイント阻害剤、または前述のいずれか１つの抗原結合性断片であり得る。試験物質は、抗がん剤であり得る。
【００１７】
遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒトＴ細胞の効果をモデルとするための方法であって、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに試験物質を投与するステップ、および遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒトＴ細胞の効果をアッセイするステップを含む、方法を提供する。試験物質は、抗腫瘍抗体；免疫療法剤；ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤を含むがこれらに限定されない免疫チェックポイント阻害剤であり得るが、これらに限定されない。試験物質は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、もしくはペンブロリズマブから選択される免疫チェックポイント阻害剤、または前述のいずれか１つの抗原結合性断片であり得る。試験物質は、抗がん剤であり得る。
【００１８】
遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒト免疫系またはその１つもしくは複数の構成要素の効果をモデルとするための方法であって、遺伝子改変免疫不全マウスが、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスであり、方法が、遺伝子改変免疫不全マウスに試験物質を投与するステップ、および遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒト免疫系またはその１つもしくは複数の構成要素の効果をアッセイするステップを含む、方法を提供する。試験物質は、抗腫瘍抗体；免疫療法剤；ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤を含むがこれらに限定されない免疫チェックポイント阻害剤であり得るが、これらに限定されない。試験物質は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、もしくはペンブロリズマブから選択される免疫チェックポイント阻害剤、または前述のいずれか１つの抗原結合性断片であり得る。試験物質は、抗がん剤であり得る。
【００１９】
遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒト白血球の効果をモデルとするための方法であって、遺伝子改変免疫不全マウスが、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスであり、方法が、遺伝子改変免疫不全マウスに試験物質を投与するステップ、および遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒト白血球の効果をアッセイするステップを含む、方法を提供する。試験物質は、抗腫瘍抗体；免疫療法剤；ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤を含むがこれらに限定されない免疫チェックポイント阻害剤であり得るが、これらに限定されない。試験物質は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、もしくはペンブロリズマブから選択される免疫チェックポイント阻害剤、または前述のいずれか１つの抗原結合性断片であり得る。試験物質は、抗がん剤であり得る。
【００２０】
遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒトＰＭＢＣの効果をモデルとするための方法であって、遺伝子改変免疫不全マウスが、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスであり、方法が、遺伝子改変免疫不全マウスに試験物質を投与するステップ、および遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒトＰＭＢＣの効果をアッセイするステップを含む、方法を提供する。試験物質は、抗腫瘍抗体；免疫療法剤；ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤を含むがこれらに限定されない免疫チェックポイント阻害剤であり得るが、これらに限定されない。試験物質は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、もしくはペンブロリズマブから選択される免疫チェックポイント阻害剤、または前述のいずれか１つの抗原結合性断片であり得る。試験物質は、抗がん剤であり得る。
【００２１】
遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒトＴ細胞の効果をモデルとするための方法であって、遺伝子改変免疫不全マウスが、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウス、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、またはＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスであり、方法が、遺伝子改変免疫不全マウスに試験物質を投与するステップ、および遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒトＴ細胞の効果をアッセイするステップを含む、方法を提供する。試験物質は、抗腫瘍抗体；免疫療法剤；ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤を含むがこれらに限定されない免疫チェックポイント阻害剤であり得るが、これらに限定されない。試験物質は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、もしくはペンブロリズマブから選択される免疫チェックポイント阻害剤、または前述のいずれか１つの抗原結合性断片であり得る。試験物質は、抗がん剤であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスにおけるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ発現の代表的なフローサイトメトリーを示す。ＮＳＧ、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）、およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌノックアウトマウスからの脾臓を、酵素および機械的消化によって解離した。
【００２３】
図１Ａは、単球由来樹状細胞が生存細胞において、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇｄｉｍ、ＣＤ１１ｃ＋、およびＬｙ６Ｃ−として同定されたことを示すグラフである。
【００２４】
【図１Ｂ】図１Ｂは、各株から回収した単球由来樹状細胞の、マウスＨ２ＫｄおよびＨ２Ｋｂの発現に関する評価の結果を示すグラフである。代表的な染色を、全ての株に関して示す（Ｎ＝２）。
【００２５】
【図１Ｃ】図１Ｃは、各株から回収した単球由来樹状細胞の、マウスＨ２  ＩＡｇ７およびＨ２  ＩＡｂの発現に関する評価の結果を示すグラフである。代表的な染色を全ての株に関して示す（Ｎ＝２）。
【００２６】
【図２】図２は、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスの血清中のヒトＩｇＧの半減期を示すグラフである。マウスに、ヒトＩｇＧ  ２００μｇをＩＶ注射して、示した時点で採血して血清を回収した。血清を循環中のヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析のために使用した。注射の２分後の１回目の採血は、１００％血清ＩｇＧであると考えられた。各点は、月齢２〜３ヶ月の雄性マウス５匹のＩｇＧの平均値±標準誤差を表す。
【００２７】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の注射後のマウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩの両方の発現を欠如するＮＳＧマウスの生存を示す。レシピエントマウスに、ＰＢＭＣ  １０×１０６個を静脈内注射（ＩＶ）し、マウスを全身健康状態および生存に関してモニターした。
【００２８】
図３Ａは、ＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスをＰＢＭＣのレシピエントとして使用した場合の％生存を示すグラフである。データは、３回の独立した実験を表す。ログランク統計値を使用して、群の間の生存分布を検定した。
【００２９】
図３Ｂは、ＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスをＰＢＭＣのレシピエントとして使用した場合の％生存を示すグラフである。データは、３回の独立した実験を表す。ログランク統計値を使用して、群の間の生存分布を検定した。
【００３０】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、ＰＢＭＣの注射後のマウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩの両方の発現を欠如するＮＳＧマウスにおけるヒトＣＤ４５＋細胞キメリズムレベルを示す。レシピエントマウスに、ＰＢＭＣ  １０×１０６個をＩＶ注射し、末梢血（図４Ａおよび図４Ｃ）および脾臓（図４Ｂおよび図４Ｄ）におけるヒトＣＤ４５＋細胞の割合を決定することによって、マウスをヒト細胞キメリズムのレベルに関してモニターした。
【００３１】
図４Ａは、ＰＢＭＣを１０週間にわたって注射したＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスの血液においてモニターしたヒト細胞キメリズムレベルを示すグラフである。データは３回の独立した実験を表す。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各時点での群の間の有意差を決定した。６週目；ＮＳＧとＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１、およびＮＳＧとＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）との比較に関してｐ＜０．００１；ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）とＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１、およびＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）とＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）との比較に関してｐ＜０．００１。
【００３２】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＰＢＭＣを注射した後安楽死させたＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスの脾臓においてモニターしたヒト細胞キメリズムレベルを示すグラフである。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、群の間の有意差を決定した。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表す。
【００３３】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＰＢＭＣを１０週間にわたって注射したＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスの血液においてモニターしたヒト細胞キメリズムレベルを示すグラフである。データは３回の独立した実験を表す。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各時点での群の間の有意差を決定した。４週目；ＮＳＧとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１、およびＮＳＧ−Ｂ２ＭｎｕｌｌとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０５。６週目；ＮＳＧとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０５、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０５、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１。８週目；ＮＳＧとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．００１、ＮＳＧとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．００１、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１。１０週目；ＮＳＧとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１、ＮＳＧとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１、およびＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌとの比較に関してｐ＜０．０１。
【００３４】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＰＢＭＣを注射した後安楽死させたＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスの脾臓においてモニターしたヒト細胞キメリズムレベルを示すグラフである。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、群の間の有意差を決定した。＊＊はｐ＜０．０１を表す。
【００３５】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄは、ＰＢＭＣの注射後のマウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩの両方の発現を欠如するＮＳＧマウスにおけるヒトＴ細胞およびＢ細胞の生着を示す。レシピエントマウスに、ＰＢＭＣ  １０×１０６個をＩＶ注射し、マウスを、末梢血中のヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞（図５Ａおよび図５Ｃ）およびＣＤ２０＋  Ｂ細胞（図５Ｂおよび図５Ｄ）のレベルに関してモニターした。
【００３６】
図５Ａは、ＮＳＧ（Ｎ＝７）、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）（Ｎ＝５）、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（Ｎ＝７）、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）（Ｎ＝８）マウスをＰＢＭＣのレシピエントとして使用した場合のヒトＣＤ３＋細胞（ＣＤ４５の％）を示すグラフである。データは３回の独立した実験を表す。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各時点での群の間の有意差を決定した。＊はｐ＜０．０５を表す。
【００３７】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＮＳＧ（Ｎ＝７）、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）（Ｎ＝５）、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（Ｎ＝７）、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）（Ｎ＝８）マウスをＰＢＭＣのレシピエントとして使用した場合のヒトＣＤ２０＋細胞（ＣＤ４５の％）を示すグラフである。データは３回の独立した実験を表す。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各時点での群の間の有意差を決定した。＊はｐ＜０．０５を表す。
【００３８】
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＮＳＧ（Ｎ＝６）、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ（Ｎ＝６）、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（Ｎ＝５）、およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ（Ｎ＝７）マウスをＰＢＭＣのレシピエントとして使用した場合の、ヒトＣＤ３＋細胞（ＣＤ４５の％）を示すグラフである。データは３回の独立した実験を表す。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各時点での群の間の有意差を決定した。＊はｐ＜０．０５を表す。
【００３９】
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＮＳＧ（Ｎ＝６）、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ（Ｎ＝６）、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（Ｎ＝５）、およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ（Ｎ＝７）マウスをＰＢＭＣのレシピエントとして使用した場合の、ヒトＣＤ２０＋細胞（ＣＤ４５の％）を示すグラフである。データは３回の独立した実験を表す。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各時点での群の間の有意差を決定した。＊はｐ＜０．０５を表す。
【００４０】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｈは、ＰＢＭＣを注射したＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおいて生着したヒトＴ細胞の表現型分析を示す。レシピエントマウスにＰＢＭＣ  １０×１０６個をＩＶ注射し、注射の４週間後、マウスを、末梢血中のヒトＣＤ３＋／ＣＤ４＋およびＣＤ３／ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベル（図６Ａおよび図６Ｄ）ならびにＴ細胞表現型（図６Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｅ〜図６Ｈ）に関してモニターした。データは２回の独立した実験を表す。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して群の間の有意差を決定した。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００５を表し、および＊＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。
【００４１】
図６Ａは、フローサイトメトリーによって決定し、ＣＤ４のＣＤ８  Ｔ細胞に対する比として示したＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のレベルを示すグラフである。
【００４２】
【図６Ｂ】図６Ｂは、フローサイトメトリーによって決定した、ＰＢＭＣを注射したＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスのＣＤ４  Ｔ細胞によるＰＤ−１発現を示すグラフである。
【００４３】
【図６Ｃ】図６Ｃは、フローサイトメトリーによって決定した、ＰＢＭＣを注射したＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスのＣＤ８  Ｔ細胞によるＰＤ−１発現を示すグラフである。
【００４４】
【図６Ｄ】図６Ｄ〜６Ｆは、代表的なＣＤ４、ＣＤ８、およびＰＤ１染色を示すグラフである。
【図６Ｅ】図６Ｄ〜６Ｆは、代表的なＣＤ４、ＣＤ８、およびＰＤ１染色を示すグラフである。
【図６Ｆ】図６Ｄ〜６Ｆは、代表的なＣＤ４、ＣＤ８、およびＰＤ１染色を示すグラフである。
【００４５】
【図６Ｇ】図６Ｇおよび６Ｈは、フローサイトメトリーによってＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の発現に関して評価したＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞をそれぞれ示すグラフである。Ｔ細胞サブセットのパーセンテージを、ナイーブと標識されるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋細胞、セントラルメモリーと標識されるＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋細胞、エフェクター／エフェクターメモリーと標識されるＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−細胞、およびＴＥＭＲＡと標識されるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−細胞で示す。
【図６Ｈ】図６Ｇおよび６Ｈは、フローサイトメトリーによってＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の発現に関して評価したＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞をそれぞれ示すグラフである。Ｔ細胞サブセットのパーセンテージを、ナイーブと標識されるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋細胞、セントラルメモリーと標識されるＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋細胞、エフェクター／エフェクターメモリーと標識されるＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−細胞、およびＴＥＭＲＡと標識されるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−細胞で示す。
【００４６】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｈは、ＰＢＭＣを注射したＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスにおいて生着したヒトＴ細胞の表現型分析を示す。レシピエントマウスにＰＢＭＣ  １０×１０６個をＩＶ注射し、注射の４週間後にマウスを、末梢血中のヒトＣＤ３＋／ＣＤ４＋およびＣＤ３／ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベル（図７Ａおよび図７Ｄ）ならびにＴ細胞表現型（図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｅ〜図７Ｈ）に関してモニターした。データは２回の独立した実験を表す。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して群の間の有意差を決定した。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００５を表し、および＊＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。
【００４７】
図７Ａは、フローサイトメトリーによって決定し、ＣＤ４のＣＤ８  Ｔ細胞に対する比として示すＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のレベルを示すグラフである。
【００４８】
【図７Ｂ】図７Ｂは、フローサイトメトリーによって決定した、ＰＢＭＣを注射したＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスのＣＤ４細胞によるＰＤ−１発現を示すグラフである。
【００４９】
【図７Ｃ】図７Ｃは、フローサイトメトリーによって決定した、ＰＢＭＣを注射したＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスのＣＤ８細胞によるＰＤ−１発現を示すグラフである。
【００５０】
【図７Ｄ】図７Ｄ〜７Ｆは、代表的なＣＤ４、ＣＤ８、およびＰＤ１染色を示すグラフである。
【図７Ｅ】図７Ｄ〜７Ｆは、代表的なＣＤ４、ＣＤ８、およびＰＤ１染色を示すグラフである。
【図７Ｆ】図７Ｄ〜７Ｆは、代表的なＣＤ４、ＣＤ８、およびＰＤ１染色を示すグラフである。
【００５１】
【図７Ｇ】図７Ｇおよび７Ｈは、フローサイトメトリーによってＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の発現に関して評価したＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞をそれぞれ示すグラフである。Ｔ細胞サブセットのパーセンテージを、ナイーブと標識されるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋細胞、セントラルメモリーと標識されるＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋細胞、エフェクター／エフェクターメモリーと標識されるＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−細胞、およびＴＥＭＲＡと標識されるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−細胞で示す。
【図７Ｈ】図７Ｇおよび７Ｈは、フローサイトメトリーによってＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の発現に関して評価したＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞をそれぞれ示すグラフである。Ｔ細胞サブセットのパーセンテージを、ナイーブと標識されるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋細胞、セントラルメモリーと標識されるＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋細胞、エフェクター／エフェクターメモリーと標識されるＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−細胞、およびＴＥＭＲＡと標識されるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−細胞で示す。
【００５２】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｆは、ＰＢＭＣを生着させたＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおけるヒト島同種異系移植片の拒絶を示す。データは２回の独立した実験を表す。ｔ−検定を使用して、群の間の有意差を決定した。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００５を表す。
【００５３】
図８Ａは、ＰＢＭＣ注射の６日前にジフテリア毒素（ＤＴ）４０ｎｇでＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスを処置した後に、ヒト島（４０００  ＩＥＱ）を脾臓内注射によって植え込んだ結果を示すグラフである。０日目に、１つの群のマウスにヒトＰＢＭＣ  ５０×１０６個をＩＰ注射し、１つの群を無処置とした。血糖値をモニターし、２回連続した試験血糖値が３００ｍｇ／ｄｌを超えるマウスは、糖尿病であると考えられた。
【００５４】
【図８Ｂ】図８Ｂは、６週間にわたって末梢血における、および７週目での脾臓におけるＣＤ４５＋細胞の割合を決定することによって、ヒト細胞キメリズムのレベルに関してマウスをモニターした結果を示すグラフである。
【００５５】
【図８Ｃ】図８Ｃおよび８Ｄはそれぞれ、末梢血および脾臓におけるＣＤ３＋／ＣＤ４＋およびＣＤ３＋／ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベルを示すグラフである。
【図８Ｄ】図８Ｃおよび８Ｄはそれぞれ、末梢血および脾臓におけるＣＤ３＋／ＣＤ４＋およびＣＤ３＋／ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベルを示すグラフである。
【００５６】
【図８Ｅ】図８Ｅは、６週目でＥＬＩＳＡによって決定した血漿中の循環中のヒトＣペプチドのレベルを示すグラフである。
【００５７】
【図８Ｆ】図８Ｆは、ＥＬＩＳＡによって７週目に決定した島生着マウスの脾臓の総インスリン含有量を示すグラフである。
【００５８】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｈは、ＰＢＭＣを生着させたＮＳＧマウスおよびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおけるヒトＩＬ２の発現により、ヒトＣＤ４＋  Ｔｒｅｇの生存が増強されることを示す。レシピエントＮＳＧおよびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスに、ＡＡＶ−ＩＬ２粒子２．５×１０１１個をＩＰ注射したか、またはＰＢＳを注射した。２週間後、マウスにＰＢＭＣ  １×１０６個を腹腔内（ＩＰ）注射した。
【００５９】
図９Ａ〜９Ｃは、フローサイトメトリーによって決定した、ヒトＣＤ４５＋細胞（図９Ａ）、ＣＤ３＋  Ｔ細胞（図９Ｂ）、およびＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７−／ＦＯＸＰ３＋  Ｔｒｅｇ（図９Ｃ）のレベルを示すグラフである。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、群の間の有意差を決定した。＊＊＊はｐ＜０．００５を表し、および＊＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。
【００６０】
【図９−２】図９Ｄは、示した群のＣＤ２５、ＣＤ１２７、およびＦＯＸＰ３に関するＣＤ４＋  Ｔ細胞の代表的な染色を示す。
【００６１】
図９Ｅは、レシピエントマウスの％生存をモニターしたことを示すグラフであり、示した群の間の生存分布を、ログランク統計値を使用して検定した。
【００６２】
【図９−３】図９Ｆは、フローサイトメトリーによって決定し、ＣＤ４のＣＤ８  Ｔ細胞に対する比として示したＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のレベルを示すグラフである。黒三角は、ＮＳＧマウスを表し、白三角はＡＡＶ−ＩＬ２を注射したＮＳＧマウスを表し、黒丸はＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスを表し、および白丸は、ＡＡＶ−ＩＬ２を注射したＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスを表す。
【００６３】
図９Ｇは、フローサイトメトリーによるＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の発現に関するＣＤ８  Ｔ細胞の評価の結果を示すグラフである。Ｔ細胞サブセットのパーセンテージを、ナイーブと標識されるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋細胞、セントラルメモリーと標識されるＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋細胞、エフェクター／エフェクターメモリーと標識されるＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−細胞、およびＴＥＭＲＡと標識されるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−細胞で示す。黒三角は、ＮＳＧマウスを表し、白三角はＡＡＶ−ＩＬ２を注射したＮＳＧマウスを表し、黒丸はＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスを表し、および白丸は、ＡＡＶ−ＩＬ２を注射したＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスを表す。
【００６４】
図９Ｈは、フローサイトメトリーによって決定したＣＤ８  Ｔ細胞によるグランザイムＢ発現を示すグラフであり、代表的な染色を示す。ｔ検定を使用してＡＡＶ−ＩＬ２で処置したマウスと対照との間の有意差を決定した。＊＊＊はｐ＜０．００５を表し、＊＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。データは、３回の独立した実験を表す。
【００６５】
【図１０】図１０Ａは、ＰＢＭＣとヒト患者由来腫瘍細胞とを同時注射したＮＳＧマウスの群、およびＰＢＭＣとヒト患者由来腫瘍細胞とを同時注射したＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスの群のパーセント生存を示すグラフである。
【００６６】
図１０Ｂは、１）ヒト患者由来腫瘍細胞を注射したＮＳＧマウス；２）ＰＢＭＣとヒト患者由来腫瘍細胞とを同時注射したＮＳＧマウス；ＰＢＭＣを注射したＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス；およびＰＢＭＣとヒト患者由来腫瘍細胞とを同時注射したＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおける腫瘍成長を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本明細書において使用する科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有すると意図される。そのような用語は、Ｊ．  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  第３版、２００１年；Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；  第５版、２００２年；Ｂ．  Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第４版、Ｇａｒｌａｎｄ、２００２年；Ｄ．Ｌ．  ＮｅｌｓｏｎおよびＭ．Ｍ．  Ｃｏｘ，Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００４年；Ａ．  Ｎａｇｙ、Ｍ．  Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｋ．  Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ、Ｒ．  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  ２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５９１９；Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ（編）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２００２年；１８５巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：９７８０４７０１５１８０８；Ｃｈｕ，  Ｅ．およびＤｅｖｉｔａ，  Ｖ．Ｔ．編、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｄｒｕｇ  Ｍａｎｕａｌ、Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２００５年；Ｊ．Ｍ．  Ｋｉｒｋｗｏｏｄら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第４版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｇｒｏｕｐ、２００１年；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、第２１版、２００５年；Ｌ．Ｖ．  Ａｌｌｅｎ，  Ｊｒ．ら、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第８版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００４年；ならびにＬ．  Ｂｒｕｎｔｏｎら、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’  ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、第１２版、２０１１年を含む様々な標準的な参考文献の文脈において例証として見出され、定義および使用される。
【００６８】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、制限的であると意図されず、明白にそれ以外であることを述べている、または文脈がそれ以外であることを示している場合を除き、複数形を含む。
【００６９】
本明細書において一般的に使用される用語「機能的な」は、対応する天然のタンパク質、複合体、細胞、または他の物質の生物機能を保持しているタンパク質、複合体、細胞、または他の物質を指す。
【００７０】
これに対し、本明細書において一般的に使用される用語「非機能的な」は、対応する天然のタンパク質、複合体、細胞、または他の物質の生物機能を保持していないタンパク質、複合体、細胞、または他の物質を指す。
【００７１】
ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが欠損している遺伝子改変免疫不全マウスが、本発明によって提供される。
【００７２】
態様によれば、ＭＨＣ  Ｉがマウスに存在しないかまたは非機能的であるように、機能的なＭＨＣ  Ｉαタンパク質の発現を低減もしくは排除する、および／または機能的なβ２−ミクログロブリンの発現を低減もしくは排除するために有効な少なくとも１つの変異をそのゲノムに含み、ならびにＭＨＣ  ＩＩがマウスに存在しないかまたは非機能的であるように、機能的なＭＨＣ  ＩＩαタンパク質の発現および／または機能的なＭＨＣ  ＩＩβタンパク質の発現を低減または排除するために有効な少なくとも１つの変異をそのゲノムに含む、遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。
【００７３】
態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスは遺伝子改変ＮＳＧマウスである。本発明の態様によるＮＳＧ  ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウトマウスは、ＧＶＨＤの非存在下でのヒト免疫の研究および抗体に基づく治療の評価を含む様々な応用において有用である。
【００７４】
ＭＨＣ  Ｉ
【００７５】
用語「ＭＨＣ  Ｉ」および「ＭＨＣクラスＩ」は、互換的に使用され、ＭＨＣ  Ｉαタンパク質およびβ２−ミクログロブリンタンパク質によって形成される複合体を指す。
【００７６】
ＭＨＣ  Ｉαタンパク質は、細胞外ドメイン（これは３つのサブドメイン：α１、α２、およびα３を有する）、膜貫通ドメイン、および細胞質テールを含む。α１およびα２サブドメインは、ペプチド結合溝を形成するが、α３サブドメインは、β２−ミクログロブリンと相互作用する。用語「Ｈ２−Ｋ」、「Ｈ２−Ｄ」、および「Ｈ２−Ｌ」は、マウスＭＨＣ  Ｉαタンパク質のサブクラスを指し、その全てがマウス第１７染色体においてコードされる。
【００７７】
β２−ミクログロブリンは、ＭＨＣ  Ｉαタンパク質のα３サブドメインと非共有結合により会合する。マウスβ２−ミクログロブリンをコードする遺伝子は、第２染色体（Ｃｈｒ２：１２２１４７６８６−１２２１５３０８３ｂｐ、＋鎖、ＧＲＣｍ３８）においてコードされる。
【００７８】
ＭＨＣ  ＩＩ
【００７９】
用語「ＭＨＣ  ＩＩ」および「ＭＨＣクラスＩＩ」は、互換的に使用され、２つの非共有結合によって会合したタンパク質：ＭＨＣ  ＩＩαタンパク質およびＭＨＣ  ＩＩβタンパク質によって形成される複合体を指す。用語「Ｈ−２Ａ」および「Ｈ−２Ｅ」（それぞれ、しばしばＩ−ＡおよびＩ−Ｅと略す）は、ＭＨＣ  ＩＩのサブクラスを指す。ＭＨＣ  ＩＩαタンパク質およびＭＨＣ  ＩＩβタンパク質は、細胞膜に及び、各々は細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含有する。ＭＨＣ  ＩＩαタンパク質の細胞外部分は、ＭＨＣ  ＩＩα１およびＭＨＣ  ＩＩα２ドメインを含み、ＭＨＣ  ＩＩβタンパク質の細胞外部分は、ＭＨＣ  ＩＩβ１およびＭＨＣ  ＩＩβ２ドメインを含む。
【００８０】
本明細書において、機能的なＭＨＣ  Ｉαタンパク質、機能的なβ２−ミクログロブリンタンパク質、機能的なＭＨＣ  ＩＩαタンパク質、機能的なＭＨＣ  ＩＩβタンパク質、機能的なＭＨＣ  Ｉまたは機能的なＭＨＣ  ＩＩに関連して使用される用語「機能的な」は、対応する天然のＭＨＣ  Ｉαタンパク質、β２−ミクログロブリンタンパク質、ＭＨＣ  ＩＩαタンパク質、ＭＨＣ  ＩＩβタンパク質、ＭＨＣ  ＩまたはＭＨＣ  ＩＩの生物機能を保持している、ＭＨＣ  Ｉαタンパク質、β２−ミクログロブリンタンパク質、ＭＨＣ  ＩＩαタンパク質、ＭＨＣ  ＩＩβタンパク質、ＭＨＣ  ＩまたはＭＨＣ  ＩＩを指す。
【００８１】
これに対し、本明細書において、非機能的なＭＨＣ  Ｉαタンパク質、β２−ミクログロブリンタンパク質、ＭＨＣ  ＩＩαタンパク質、ＭＨＣ  ＩＩβタンパク質、ＭＨＣ  ＩまたはＭＨＣ  ＩＩに関連して使用される用語「非機能的な」は、対応する天然のＭＨＣ  Ｉαタンパク質、β２−ミクログロブリンタンパク質、ＭＨＣ  ＩＩαタンパク質、ＭＨＣ  ＩＩβタンパク質、ＭＨＣ  ＩまたはＭＨＣ  ＩＩの生物機能を保持していない、ＭＨＣタンパク質、またはＭＨＣ複合体を指す。
【００８２】
本明細書において使用される用語「天然の」は、未変異タンパク質または核酸を指す。
【００８３】
本明細書において使用される用語「遺伝子改変された」は、マウスが機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如するように、機能的なＭＨＣ  Ｉαタンパク質および機能的なβ２−ミクログロブリンのうちの少なくとも１つ；ならびに機能的なＭＨＣ  ＩＩαタンパク質および機能的なＭＨＣ  ＩＩβタンパク質のうちの少なくとも１つの発現を破壊する、マウスにおけるゲノムＤＮＡの改変を指す。
【００８４】
用語「発現」は、対応するｍＲＮＡを産生する核酸配列の転写および／または対応するタンパク質を産生するｍＲＮＡの翻訳を指す。
【００８５】
本明細書において使用される用語「標的遺伝子」は、マウスＭＨＣ  Ｉα遺伝子、マウスβ２−ミクログロブリン遺伝子、マウスＭＨＣ  ＩＩα遺伝子、またはマウスＭＨＣ  ＩＩβ遺伝子を定義する核酸配列を指す。
【００８６】
多様な方法のいずれかを使用して、マウスが機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如するように、そのゲノムが機能的なＭＨＣ  Ｉαタンパク質および機能的なβ２−ミクログロブリンのうちの少なくとも１つ；ならびに機能的なＭＨＣ  ＩＩαタンパク質および機能的なＭＨＣ  ＩＩβタンパク質のうちの少なくとも１つの発現を破壊する遺伝子改変を含む、遺伝子改変免疫不全マウスを産生することができる。
【００８７】
遺伝子改変は、化学的変異誘発、放射線照射、相同組換え、およびアンチセンスＲＮＡのトランスジェニック発現などの、しかしこれらに限定されない遺伝子工学の標準的な方法を使用して産生される。そのような技術は、当技術分野で周知であり、前核マイクロインジェクションおよび胚性幹細胞の形質転換をさらに含むがこれらに限定されない。そのゲノムが使用することができる遺伝子変異を含む遺伝子改変動物を生成するための方法には、Ｊ．  Ｐ．  ＳｕｎｄｂｅｒｇおよびＴ．  Ｉｃｈｉｋｉ編、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｉｃｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：  ２００６年；Ｍ．  Ｈ．  ＨｏｆｋｅｒおよびＪ．  ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ編、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年；Ａ．  Ｌ．  Ｊｏｙｎｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  ２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５９１９；Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ（編）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００２年；１８５巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：９７８０４７０１５１８０；Ｍｅｙｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０７巻（３４号）、１５０２２〜１５０２６頁に記載される方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８８】
好ましい態様によれば、機能的な内因性のＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩの欠如に加えて、非内因性のＭＨＣ  ＩもＭＨＣ  ＩＩも、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスにおいて発現されない。特に、好ましい実施形態によれば、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスには、ヒトリンパ球適合性遺伝子は存在しないか、または発現されない。
【００８９】
本明細書において、遺伝子およびそれらがコードするタンパク質に関連して使用する場合の「内因性」は、その天然遺伝子座でマウスのゲノムに存在する遺伝子を指す。
【００９０】
相同性に基づく組換え遺伝子改変戦略を使用して、内因性のタンパク質（単数または複数）、例えばＭＨＣ  Ｉαタンパク質およびβ２−ミクログロブリンのうちの少なくとも１つ；ならびにＭＨＣ  ＩＩαタンパク質およびＭＨＣ  ＩＩβタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子の「ノックアウト」または他の変異によって、免疫不全マウスを遺伝子改変することができる。
【００９１】
相同性に基づく組換え遺伝子改変戦略には、ホーミングエンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ、トランスポゾンを使用するアプローチ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬ）、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓを使用するヌクレアーゼ媒介プロセス、またはショウジョウバエ組換え関連タンパク質（ＤＲＡＰ）アプローチなどの遺伝子編集アプローチが挙げられる。例えば、Ｃｅｒｂｉｎｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１５年；１０巻（１号）：ｅ０１１６０３２頁；Ｓｈｅｎら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８巻（１０号）：ｅ７７６９６頁；およびＷａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＆  Ｃｅｌｌ、２０１６年２月、７巻、２号、１５２〜１５６頁を参照されたい。
【００９２】
ゲノム編集は、例えば、本明細書に記載される、ならびにＪ．  Ｐ．  ＳｕｎｄｂｅｒｇおよびＴ．  Ｉｃｈｉｋｉ編、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｉｃｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；  ２００６年；Ｍ．  Ｈ．  ＨｏｆｋｅｒおよびＪ．  ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ編、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年；Ａ．  Ｌ．  Ｊｏｙｎｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  ２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５９１９；Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ（編）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００２年；１８５巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：９７８０４７０１５１８０；Ｍｅｙｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２０１０年、１０７巻（３４号）、１５０２２〜１５０２６頁；ならびにＤｏｕｄｎａ，  Ｊ．ら（編）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２０１６年、ＣＳＨＰに詳述されている方法によって実施される。いくつかのゲノム編集技術の簡単な説明を本明細書に記載する。
【００９３】
ヌクレアーゼによる遺伝子改変技術
【００９４】
ヌクレアーゼによる遺伝子編集技術などの、しかしこれらに限定されない遺伝子改変方法、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ、トランスポゾンを使用する方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬ）、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ、またはショウジョウバエ組換え関連タンパク質（ＤＲＡＰ）を使用するヌクレアーゼ媒介プロセスを使用して、所望のＤＮＡ配列をゲノムの既定の標的部位に導入することができる。簡単に説明すると、使用することができる遺伝子改変方法は、標的化されたＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ、またはＤＲＡＰをコードするＲＮＡ分子、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、体細胞、受精卵母細胞、または胚に導入するステップ、次いで、所望の遺伝子改変を有するＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、体細胞、受精卵母細胞、または胚を選択するステップを含む。
【００９５】
例えば、所望の核酸配列を、ＣＲＩＳＰＲ方法論、ＴＡＬ（転写活性化因子様エフェクター）方法論、ジンクフィンガー媒介ゲノム編集、またはＤＲＡＰなどの、しかしこれらに限定されないヌクレアーゼ技術によって、マウスのゲノムの既定の標的部位に導入し、本発明の実施形態により提供される遺伝子改変マウスを産生することができる。
【００９６】
本明細書において、ヌクレアーゼによる遺伝子編集技術の文脈で使用される用語「標的部位」および「標的配列」は、編集される染色体配列の部分を定義し、および結合に関する十分な条件が存在することを条件として、それに対してヌクレアーゼが認識および結合するように操作される核酸配列を指す。
【００９７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム
【００９８】
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）は、シークエンシングした細菌のおよそ４０％およびシークエンシングした古細菌の９０％のゲノムに見出される複数の短鎖直列反復配列を含有する座であり、外来ＤＮＡエレメントに対する抵抗性を付与する、Ｈｏｒｖａｔｈ、２０１０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７巻：１６７〜１７０頁；Ｂａｒｒａｎｇｏｕら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻：１７０９〜１７１２頁；およびＭａｋａｒｏｖａら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ９巻：４６７〜４７７頁を参照されたい。
【００９９】
ＣＲＩＳＰＲ反復配列のサイズは、２４〜４８塩基対の範囲である。それらは通常、何らかの２個１組の対称性を示し、ヘアピンなどの二次構造の形成を暗示しているが、真の回文構造ではない。ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、類似の長さのスペーサーによって隔てられている。
【０１００】
ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子はしばしば、ＣＲＩＳＰＲ反復配列−スペーサーアレイに関連している。４０を超える異なるＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている（Ｈａｆｔら、２００５年、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．  １巻（６号）：ｅ６０頁）。ｃａｓ遺伝子と反復配列構造の特定の組合せを使用して、８個のＣＲＩＳＰＲサブタイプが定義されており、その一部は、反復配列に関連する不可解なタンパク質（ＲＡＭＰ）をコードする追加の遺伝子モジュールに関連している。
【０１０１】
異なる生物において多様なＣＲＩＳＰＲシステムが存在し、その最も単純なものの１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムであり、Ｃａｓ９タンパク質をコードする単一の遺伝子および２つのＲＮＡ、すなわち成熟ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および部分的に相補的なトランス作用ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）のみが、外来ＤＮＡのＲＮＡ誘導サイレンシングにとって必要かつ十分である（Ｇａｓｉｕｎａｓら、２０１２年、ＰＮＡＳ  １０９巻：Ｅ２５７９〜Ｅ２５８６頁；Ｊｉｎｅｋら、２０１２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７巻：８１６〜８２１頁）。ｃｒＲＮＡの成熟は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＲＮアーゼＩＩＩを必要とする（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ、４７１巻：６０２〜６０７頁）。しかし、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を模倣する設計されたヘアピンを含有する操作された低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用することによって、この必要条件は不要となり得る（Ｊｉｎｅｋら、２０１２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７巻：８１６〜８２１頁）。ｓｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対形成は、Ｃａｓ９のエンドヌクレアーゼ活性により、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす。結合特異性は、ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対形成およびＤＮＡ相補的領域に近接する短鎖ＤＮＡモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ［ＰＡＭ］配列：ＮＧＧ）の両方によって決定される（ＭａｒｒａｆｆｉｎｉおよびＳｏｎｔｈｅｉｍｅｒ、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１巻：１８１〜１９０頁）。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムは、２つの分子、すなわちＣａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡ、の最少の組を必要とし、したがって宿主非依存的な遺伝子標的化プラットフォームとして使用することができる。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、標的化挿入などの部位選択的ＲＮＡ誘導性ゲノム編集のために利用することができる、例えばＣａｒｒｏｌｌ、２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：１６５８〜１６６０頁；Ｃｈａｎｇら、２０１３年、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３巻：４６５〜４７２頁；Ｃｈｏら、２０１３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３１巻：２３０〜２３２頁；Ｃｏｎｇら、２０１３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３９巻：８１９〜８２３頁；Ｈｗａｎｇら、２０１３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３１巻：２２７〜２２９頁；Ｊｉａｎｇら、２０１３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３１巻：２３３〜２３９頁；Ｍａｌｉら、２０１３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３９巻：８２３〜８２６頁；Ｑｉら、２０１３年、Ｃｅｌｌ、１５２巻：１１７３〜１１８３頁；Ｓｈｅｎら、２０１３年、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３巻：７２０〜７２３頁；およびＷａｎｇら、２０１３年、Ｃｅｌｌ、１５３巻：９１０〜９１８頁）を参照されたい。特に、Ｗａｎｇら、２０１３年、Ｃｅｌｌ、１５３巻：９１０〜９１８頁は、オリゴヌクレオチドと組み合わせてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する標的化挿入を記載している。
【０１０２】
本発明の態様による遺伝子改変免疫不全マウスの生成は、適切な核酸、例えばＣＲＩＳＰＲにおける使用のための、ｃａｓ９をコードする発現構築物、および標的化される遺伝子に対して特異的なガイドＲＮＡをコードする発現構築物の、着床前胚または幹細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞への注入またはトランスフェクションを含み得る。必要に応じて、ｃａｓ９およびガイドＲＮＡは、単一の発現構築物においてコードされている。
【０１０３】
ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター
【０１０４】
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターまたはＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）は、植物病原性細菌属であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓに由来し、これらのタンパク質は、植物の転写活性化因子を模倣し、植物転写物を操作する。Ｋａｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい。
【０１０５】
ＴＡＬエフェクターは、縦列反復配列の集中ドメインを含有し、各反復配列は、およそ３４アミノ酸を含有し、これはこれらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要である。加えて、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有し、論評に関しては、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋら、２００６年、Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１６３巻（３号）：２５６〜２７２頁；ＳｃｈｏｌｚｅおよびＢｏｃｈ、２０１１年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１４巻：４７〜５３頁を参照されたい。
【０１０６】
ＴＡＬエフェクターの特異性は、縦列反復配列に見出される配列に依存する。反復された配列はおよそ１０２ｂｐを含み、反復配列は典型的に、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、１９８９年、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、２１８巻：１２７〜１３６頁）。反復配列の多型は、通常１２および１３位に位置し、１２および１３位での超可変二残基の同一性と、ＴＡＬ−エフェクターの標的配列における連続ヌクレオチドの同一性との間に一対一の対応が存在するように思われる。ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０１頁；ならびにＢｏｃｈら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照されたい。２つの超可変残基は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として公知であり、それによって１つのＲＶＤが、ＤＮＡ配列の１つのヌクレオチドを認識し、各ＴＡＬ−エフェクターのＤＮＡ結合ドメインは、高い精度で確実に大きい認識部位（１５〜３０ヌクレオチド）を標的化することができる。実験によって、これらのＴＡＬ−エフェクターのＤＮＡ認識のためのコードは、１２および１３位でのＨＤ配列によって、シトシン（Ｃ）に対する結合が起こり、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、およびＩＧがＴに結合するように決定されている。これらのＤＮＡ結合反復配列は、新しい組合せおよび数の反復配列と共にタンパク質にアセンブルされ、新しい配列と相互作用して、植物細胞におけるレポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子を作製する（Ｂｏｃｈら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０９〜１５１２頁）。これらのＤＮＡ結合ドメインは、全ての細胞タイプにおける標的化ゲノム編集または標的化遺伝子調節の分野において一般的応用を有することが示されており、Ｇａｊら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１３年、３１巻（７号）：３９７〜４０５頁を参照されたい。その上、操作されたＴＡＬエフェクターは、天然のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬ効果または哺乳動物におけるタンパク質では本来見出されない、ヌクレアーゼなどの外因性の機能的なタンパク質エフェクタードメインと会合して機能することが示されている。ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＮまたはＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬを、Ｎ末端またはＣ末端でヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩヌクレアーゼドメインと組み合わせることによって構築することができる。Ｋｉｍら、１９９６年、ＰＮＡＳ、９３巻：１１５６〜１１６０頁；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２０１０年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１８６巻：７５７〜７６１頁；Ｌｉら、２０１１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３９巻：６３１５〜６３２５頁；およびＭｉｌｌｅｒら、２０１１年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９巻：１４３〜１４８頁。ＴＡＬＥＮがＮＨＥＪにより欠失を引き起こす機能性は、ラット、マウス、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、メダカ、ラット、およびヒト細胞において示されている。Ａｎｓａｉら、２０１３年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９３巻：７３９〜７４９頁；Ｃａｒｌｓｏｎら、２０１２年、ＰＮＡＳ、１０９巻：１７３８２〜１７３８７頁；Ｈｏ��ｋｅｍｅｙｅｒら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２９巻：７３１〜７３４頁；Ｌｅｉら、２０１２年、ＰＮＡＳ、１０９巻：１７４８４〜１７４８９頁；Ｍｏｏｒｅら、２０１２年、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、７巻：ｅ３７８７７頁；Ｓｔｒｏｕｄら、２０１３年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８８巻：１６８５〜１６９０頁；Ｓｕｎｇら、２０１３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３１巻：２３〜２４頁；Ｗｅｆｅｒｓら、２０１３年、ＰＮＡＳ、１１０巻：３７８２〜３７８７頁。
【０１０７】
ＴＡＬＥＮに関しては、それを作製する方法は、米国特許第８，４２０，７８２号；第８，４５０，４７１号；第８，４５０，１０７号；第８，４４０，４３２号；第８，４４０，４３１号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１３７１６１号および第ＵＳ２０１３０１３７１７４号にさらに記載されている。
【０１０８】
他の有用なエンドヌクレアーゼには、例えばＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ／Ｉ、およびＡｌｗＩが挙げられ得る。いくつかのエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）が二量体としてのみ機能するという事実を利用して、ＴＡＬエフェクターの標的特異性を増強することができる。例えば、一部の例では、各ＦｏｋＩ単量体を、異なるＤＮＡ標的配列を認識するＴＡＬエフェクター配列に融合することができ、２つの認識部位が非常に近位にある場合に限って、不活性な単量体が一体となって機能的な酵素を創出する。ヌクレアーゼを活性化するためにＤＮＡ結合が必要であることによって、高度に部位特異的な制限酵素を創出することができる。
【０１０９】
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含み得る。ＮＬＳは、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼタンパク質の核への標的化を促進して、染色体の標的配列に二本鎖切断を導入するアミノ酸配列である。
【０１１０】
核局在化シグナルは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｍａｋｋｅｒｈら、１９９６年、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  ６巻：１０２５〜１０２７頁を参照されたい。ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原からの配列、Ｋａｌｄｅｒｏｎ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、３９巻：４９９〜５０９頁；Ｄｉｎｇｗａｌｌら、１９８８年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０７巻、８４１〜９頁に詳細に記載されているヌクレオプラスミンからのＮＬＳを含む。さらなる例は、ＭｃＬａｎｅおよびＣｏｒｂｅｔｔ、２００９年、ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ、６１巻、６９７〜７０頁；Ｄｏｐｉｅら、２０１２年、ＰＮＡＳ、１０９巻、Ｅ５４４〜Ｅ５５２頁に記載されている。
【０１１１】
切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが誘導され得るエンドヌクレアーゼの非制限的な例には、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年のカタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．；およびＢｅｌｆｏｒｔら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素、例えばＳＩヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵ＤＮアーゼＩ；ミクロコッカルヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼが公知である。同様にＬｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年を参照されたい。これらの酵素またはその機能的断片の１つまたは複数を切断ドメインの起源として使用してもよい。
【０１１２】
ジンクフィンガー媒介ゲノム編集
【０１１３】
遺伝子編集のための、例えば相同性に基づく修復プロセスを介しての標的化挿入のためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用は十分に確立されている。例えば、Ｃａｒｂｅｒｙら、２０１０年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１８６巻：４５１〜４５９頁；Ｃｕｉら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２９巻：６４〜６８頁；Ｈａｕｓｃｈｉｌｄら、２０１１年、ＰＮＡＳ、１０８巻：１２０１３〜１２０１７頁；Ｏｒｌａｎｄｏら、２０１０年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３８巻：ｅ１５２〜ｅ１５２頁；およびＰｏｒｔｅｕｓ  ＆  Ｃａｒｒｏｌｌ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３巻：９６７〜９７３頁を参照されたい。
【０１１４】
ＺＦＮ媒介プロセスの構成要素は、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを有するジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。そのような構成要素は、例えば、Ｂｅｅｒｌｉら、（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら、（２００１年）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら、（２００１年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら、（２００１年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻：６３２〜６３７頁；ならびにＣｈｏｏら、（２０００年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．、１０巻：４１１〜４１６頁；ならびに米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号に記載されている。標的配列に対してジンクフィンガー結合ドメインを設計および選択する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｅｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年、４１巻、７０７４〜７０８１頁；米国特許第６，６０７，８８２号；第６，５３４，２６１号および第６，４５３，２４２号を参照されたい。
【０１１５】
一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含み得る。ＮＬＳは、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の核への標的化を促進して、染色体の標的配列で二本鎖切断を導入するアミノ酸配列である。核局在化シグナルは当技術分野で公知である。例えば、Ｍａｋｋｅｒｈら、（１９９６年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻：１０２５〜１０２７頁および本明細書に記載の他の文献を参照されたい。
【０１１６】
切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが誘導され得るエンドヌクレアーゼの非制限的な例には、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年のカタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．；およびＢｅｌｆｏｒｔら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が公知である（例えば、ＳＩヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵ＤＮアーゼＩ；ミクロコッカルヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。同様にＬｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年を参照されたい。これらの酵素（またはその機能的断片）の１つまたは複数を切断ドメインの起源として使用してもよい。切断ドメインはまた、切断活性のために二量体化を必要とする上記の酵素またはその一部から誘導され得る。
【０１１７】
各ヌクレアーゼは、活性な酵素二量体の単量体を含むことから、切断のためには２つのジンクフィンガーヌクレアーゼが必要であり得る。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼが、両方の単量体を含み、活性な酵素二量体を創出してもよい。制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡ（認識部位で）に配列特異的に結合することができ、結合部位またはその近傍でＤＮＡを切断する。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖のその認識部位から９ヌクレオチド、および他方の鎖のその認識部位から１３ヌクレオチドでＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号、および第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら、（１９９２年）、ＰＮＡＳ、８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら、（１９９３年）、ＰＮＡＳ、９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら、（１９９４年）、ＰＮＡＳ、９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら、（１９９４年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３１、９７８〜３１、９８２頁を参照されたい。このように、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン、および操作されていてもされていなくてもよい１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含み得る。例示的なＩＩＳ型制限酵素は、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されている。追加の制限酵素もまた、分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらもまた、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら、１９９８年、ＰＮＡＳ  ９５巻：１０、５７０〜１０、５７５頁）。したがって、本開示の目的に関して、ジンクフィンガーヌクレアーゼに使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、切断単量体であると考えられる。このように、ＦｏｋＩ切断ドメインを使用する標的化二本鎖切断に関して、各々がＦｏｋＩ切断単量体を含む２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、活性な酵素二量体を再構成してもよい。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断単量体を含有する単一のポリペプチド分子も同様に使用してもよい。ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号、および第２００８０１３１９６２号に記載されているように、ホモ二量体化を最小限にするかまたは防止する１つまたは複数の操作された切断単量体を含み得る。非制限的な例として、ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位でのアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。絶対ヘテロ二量体を形成する例示的な操作されたＦｏｋＩの切断単量体は、ＦｏｋＩのアミノ酸残基４９０および５３８位で変異を含む第１の切断単量体と、アミノ酸残基４８６および４９９位で変異を含む第２の切断単量体の組を含む。このように、一実施形態では、アミノ酸４９０位での変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に交換し；アミノ酸残基５３８での変異はＩｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に交換し；アミノ酸残基４８６での変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に変換し；および４９９位での変異はＩｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に交換する。具体的には、操作された切断単量体は、１つの切断単量体において４９０位をＥからＫに、および５３８位をＩからＫに変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる操作された切断単量体を産生することによって、ならびに別の切断単量体において４８６位をＱからＥに、および４９９位をＩからＬに変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる操作された切断単量体を産生することによって調製され得る。上記の操作された切断単量体は、異常な切断が最小限にするかまたは取り除かれている絶対ヘテロ二量体変異体である。操作された切断単量体は、適した方法を使用して、例えば米国特許出願公開第２００５００６４４７４号に記載される野生型切断単量体（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によって調製され得る。
【０１１８】
上記のジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的化組み込み部位で二本鎖切断を導入するように操作され得る。二本鎖切断は、標的化組み込み部位であってもよく、または組み込み部位から最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、もしくは１０００ヌクレオチド離れてもよい。一部の実施形態では、二本鎖切断は、組み込み部位から最大１、２、３、４、５、１０、１５、または２０ヌクレオチド離れてもよい。他の実施形態では、二本鎖切断は、組み込み部位から最大１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド離れてもよい。さらに他の実施形態では、二本鎖切断は組み込み部位から最大５０、１００、または１０００ヌクレオチド離れてもよい。
【０１１９】
ＤＲＡＰ技術は、米国特許第６，５３４，６４３号；第６，８５８，７１６号、および第６，８３０，９１０号、ならびにＷａｔｔら、２００６年に記載されている。
【０１２０】
遺伝子改変によってマウスがＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩの欠損となる、そのゲノムが遺伝子改変を含む遺伝子改変免疫不全マウスの生成は、遺伝子標的化ベクターの着床前胚または幹細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、もしくは人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞への導入によって達成することができる。
【０１２１】
用語「遺伝子標的化ベクター」は、標的化遺伝子への挿入または標的化遺伝子の置き換えなどによる、特定の染色体座を組換えおよび変異させるために有効な二本鎖組換えＤＮＡ分子を指す。
【０１２２】
標的化遺伝子破壊、例えば変異に関して、遺伝子標的化ベクターは、組換えＤＮＡ技術を使用して作製され、幹細胞の内因性の標的遺伝子と相同である５’および３’配列を含む。遺伝子標的化ベクターは、必要に応じておよび好ましくはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシン、またはピューロマイシンなどの選択可能マーカーをさらに含む。当業者は、遺伝子標的化ベクターに含める配列を選択し、これらを単なるルーチンの実験によって使用することができる。遺伝子標的化ベクターは、周知の方法論を使用して組換えまたは合成によって生成することができる。
【０１２３】
遺伝子標的化ベクターの着床前胚へのＤＮＡ注入の方法に関して、遺伝子標的化ベクターを線形にした後、非ヒト着床前胚に注入する。好ましくは、遺伝子標的化ベクターは、受精卵母細胞に注入される。受精卵母細胞は、交尾後（０．５ｄｐｃ）の過排卵雌性動物から収集し、発現構築物を注入する。注入した卵母細胞を一晩培養するか、または交尾後０．５日の偽妊娠雌性動物の卵管に直接移入する。過排卵、卵母細胞の採取、遺伝子標的化ベクターの注入、および胚移入のための方法は当技術分野で公知であり、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５９１９に記載されている。子孫を、標的遺伝子破壊、例えば変異の存在に関して、ＤＮＡ分析、例えばＰＣＲ、サザンブロットまたはシークエンシングによって試験することができる。破壊された、例えば変異した標的遺伝子を有するマウスを、ＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロット分析を使用することなどによって標的タンパク質の発現、および／またはＲＴ−ＰＣＲなどによってｍＲＮＡ発現に関して試験することができる。
【０１２４】
あるいは、遺伝子標的化ベクターを、周知の方法、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、およびリポフェクションを使用して幹細胞（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）にトランスフェクトしてもよい。
【０１２５】
マウスＥＳ細胞を、特定の系統に関して最適化した培地中で成長させる。典型的には、ＥＳ培地は、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、または合成もしくは半合成の均等物、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸Ｎａ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ならびに１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ（これに加えて、一部の細胞系統では、化学的分化阻害剤）を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に含有する。詳細な説明は、当技術分野で公知である（Ｔｒｅｍｍｌら、２００８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１章：第１Ｃ．４項。ＥＳ細胞分化の阻害剤の論評に関しては、Ｂｕｅｈｒ，  Ｍ．ら、（２００３年）、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｂ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５８巻、１３９７〜１４０２頁を参照されたい。
【０１２６】
細胞を、標的遺伝子破壊、例えば変異に関して、ＤＮＡ分析、例えばＰＣＲ、サザンブロットまたはシークエンシングによってスクリーニングする。標的遺伝子を破壊する正しい相同組換え事象を有する細胞を、ＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロット分析を使用することなどによって標的タンパク質の発現、および／またはＲＴ−ＰＣＲなどによってｍＲＮＡ発現に関して試験することができる。所望の場合、Ｃｒｅリコンビナーゼで幹細胞を処置することによって選択可能マーカーを除去することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼ処置後、細胞を、標的タンパク質をコードする核酸の存在に関して分析する。
【０１２７】
標的遺伝子を破壊する正しいゲノム事象を有する選択された幹細胞を、着床前胚に注入することができる。マイクロインジェクションに関して、ＥＳまたはｉＰＳ細胞を、トリプシンおよびＥＤＴＡの混合物を使用して単細胞にした後、ＥＳ培地に再懸濁させる。単細胞の群を、マイクロマニピュレーターを備えた倒立顕微鏡を使用して、微細に引き伸ばされたガラス針（内径２０〜２５マイクロメートル）を使用して選択し、胚の透明帯を通して胚盤胞腔（卵割腔）の中に導入する。胚盤胞注入の代替として、幹細胞を初期胚（例えば、２細胞、４細胞、８細胞、前桑実胚、または桑実胚）に注入することができる。レーザーまたは圧電パルスの助けを借りて穴を開けた透明帯に注入を行ってもよい。胚盤胞または８細胞期胚あたりおよそ９〜１０個の選択した幹細胞（ＥＳまたはｉＰＳ細胞）、４細胞期胚あたり６〜９個の幹細胞、および２細胞期胚あたり約６個の幹細胞を注入する。幹細胞の導入後、胚を、５％ＣＯ２、５％Ｏ２の窒素下、３７℃で数時間回復させるか、または一晩培養した後、偽妊娠レシピエント雌性動物に移入する。幹細胞注入のさらなる代替では、幹細胞を、桑実胚期の胚と共に凝集させることができる。これらの方法は全て十分に確立されており、幹細胞キメラを産生するために使用することができる。より詳細な説明に関しては、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ａ．  Ｎａｇｙ、Ｍ．  Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｋ．  Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ、Ｒ．  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  ２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５９１９、Ｎａｇｙら、１９９０年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０巻、８１５〜８２１頁；ＵＳ７５７６２５９：Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、ＵＳ７６５９４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、Ｋｒａｕｓら、２０１０年、Ｇｅｎｅｓｉｓ、４８巻、３９４〜３９９頁）を参照されたい。
【０１２８】
偽妊娠胚レシピエントは、当技術分野で公知の方法を使用して調製する。簡単に説明すると、６〜８週齢の間の受精可能な雌性マウスを精管除去または不妊雄性動物と交尾させ、外科的に導入された胚の維持を助けるホルモン状態を誘導する。交尾後（ｄｐｃ）２．５日目、胚盤胞を含有する幹細胞最大１５個を、子宮−卵管接合部に非常に近い子宮角に導入する。初期胚および桑実胚では、そのような胚を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚盤胞へと培養するか、または胚期に応じて０．５ｄｐｃもしくは１．５ｄｐｃの偽妊娠雌性動物の卵管に植え込む。植え込んだ胚からのキメラの仔は、植え込み時の胚年齢に応じて移入後１６〜２０日目に産まれる。キメラの雄性動物を育種のために選択する。子孫を、ＥＳ細胞ゲノムの伝播に関して、被毛の色、およびＰＣＲ、サザンブロット、またはシークエンシングなどの核酸分析によって分析することができる。さらに、標的遺伝子の発現を、標的ｍＲＮＡ発現、またはタンパク質発現に関して、例えばタンパク質分析、例えばイムノアッセイもしくは機能的アッセイなどによって分析して、標的遺伝子破壊を確認することができる。標的遺伝子破壊、例えば変異を有する子孫を相互交配して、標的遺伝子破壊に関してホモ接合である非ヒト動物を創出する。トランスジェニックマウスを、免疫不全マウスと交配して、標的遺伝子破壊を有するコンジェニック免疫不全株を創出する。
【０１２９】
マウスが標的遺伝子を発現する能力を欠如するように標的遺伝子が破壊されているか否かを決定するために遺伝子改変マウスを評価する方法は周知であり、核酸アッセイ、分光分析アッセイ、イムノアッセイ、および機能的アッセイなどの標準的な技術を含む。
【０１３０】
１つまたは複数の標準を使用して、試料中の標的タンパク質の定量的決定を可能にすることができる。
【０１３１】
標的遺伝子の破壊が推定される動物における機能的な標的タンパク質の評価のためのアッセイを実施することができる。標的遺伝子の破壊が推定される動物における標的タンパク質の機能の評価のためのアッセイを本明細書に記載する。
【０１３２】
必要に応じて、本発明の態様による遺伝子改変免疫不全マウスを、選択的育種によって産生する。第１の所望の遺伝子型を有するマウスの第１の親株を、第２の所望の遺伝子型を有するマウスの第２の親株と交配させて、第１および第２の所望の遺伝子型を有する遺伝子改変マウスである子孫を産生してもよい。例えば、ＭＨＣ  Ｉの発現が存在しないかまたは低減されるように、免疫不全である第１のマウスを、ＭＨＣ  Ｉ遺伝子破壊を有する第２のマウスと交配させて、免疫不全であり、かつＭＨＣ  Ｉの発現が存在しないかまたは低減されるようにＭＨＣ  Ｉ遺伝子破壊を有する子孫を産生してもよい。さらなる例では、ＮＳＧマウスを、標的遺伝子の発現が存在しないかまたは低減されるように、標的遺伝子破壊を有するマウスと交配させて、免疫不全であり、かつ標的タンパク質の発現が存在しないかまたは低減されるように標的遺伝子破壊を有する子孫を産生してもよい。
【０１３３】
本発明の態様は、細胞の実質的に全てに標的遺伝子破壊を含む遺伝子改変免疫不全マウス、ならびに一部の、しかし全てではない細胞に標的遺伝子破壊を含む遺伝子改変マウスを提供する。
【０１３４】
免疫不全
【０１３５】
用語「免疫不全の非ヒト動物」は、機能的な免疫細胞、例えばＴ細胞およびＢ細胞の欠如；ＤＮＡ修復の欠陥；リンパ球上の抗原特異的受容体をコードする遺伝子再構成の欠陥；ならびにＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡなどの免疫機能分子の欠如のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる非ヒト動物を指す。
【０１３６】
本発明の態様によれば、そのゲノムが遺伝子改変を含み、遺伝子改変によって、非ヒト動物のＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ活性が欠損する、本発明の態様により提供される遺伝子改変免疫不全非ヒト動物は、マウスである。本明細書における説明は、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物がマウスである本発明の態様を主に指すが、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物はまた、ラット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヒツジ、または非ヒト霊長類などの哺乳動物であり得る。
【０１３７】
用語「免疫不全マウス」は、機能的な免疫細胞、例えばＴ細胞およびＢ細胞の欠如；ＤＮＡ修復の欠陥；リンパ球上の抗原特異的受容体をコードする遺伝子再構成の欠陥；ならびにＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡなどの免疫機能分子の欠如のうちの１つまたは複数によって特徴付けられるマウスを指す。免疫不全マウスは、Ｒａｇ１およびＲａｇ２（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｍ．Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：１５１７〜１５２３頁、１９９０年；およびＳｃｈａｔｚ，  Ｄ．  Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ、５９巻：１０３５〜１０４８頁、１９８９年）などの免疫機能に関係する遺伝子の１つまたは複数の欠損によって特徴付けることができる。免疫不全マウスは、マウスにおいて異常な免疫機能をもたらすこれらまたは他の欠陥のいずれかを有し得る。
【０１３８】
特に有用な免疫不全マウス株は、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪであり、一般的にＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスと呼ばれ、Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＤら、２００５年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４巻：６４７７〜８９頁に詳細に記載されている。ＮＳＧは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで開発されたマウス亜株を表す。他の類似のマウス亜株を使用してＮＳＧを作製してもよく、それらも本発明に包含されると意図される。他の有用な免疫不全マウス株には、一般的にＮＲＧマウスと呼ばれるＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＤら、２００８年、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５４巻（２号）：２７０〜８４頁を参照されたい；および一般的にＮＯＧマウスと呼ばれ、例えば、Ｉｔｏ，  Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１００巻、３１７５〜３１８２頁（２００２年）に詳細に記載されているＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃまたはＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌが挙げられる。
【０１３９】
用語「重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）」は、Ｔ細胞の非存在およびＢ細胞機能の欠如によって特徴付けられる状態を指す。
【０１４０】
ＳＣＩＤの一般的な形態には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のガンマ鎖遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（−）によって特徴付けられるＸ連鎖ＳＣＩＤ；ならびにＪａｋ３遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（−）、ＡＤＡ遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（−）、ＩＬ−７Ｒアルファ鎖変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）、ＣＤ３デルタまたはイプシロン変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）、ＲＡＧ１／ＲＡＧ２変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（＋）、Ａｒｔｅｍｉｓ遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（＋）、ＣＤ４５遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）によって特徴付けられる常染色体劣性ＳＣＩＤが挙げられる。
【０１４１】
さらなる態様では、遺伝子改変免疫不全マウスは、欠陥のある内因性のＤＮＡ依存的プロテインキナーゼ触媒、サブユニットをマウスに発現させる、ＤＮＡ依存的プロテインキナーゼ、触媒サブユニット（Ｐｒｋｄｃ）をコードする、その内因性の遺伝子に欠陥を、および／もしくは内因性ＤＮＡ依存的プロテインキナーゼ、触媒サブユニットの低減された量を有するか、またはマウスは、内因性のＤＮＡ依存的プロテインキナーゼ、触媒サブユニットを全く発現しなくてもよい。免疫不全マウスは、必要に応じて、機能的な内因性のＰｒｋｄｃ遺伝子を欠如するように、Ｐｒｋｄｃヌルであり得る。）
【０１４２】
本発明の態様による遺伝子改変マウスは、一般的にｓｃｉｄ変異と呼ばれる重症複合免疫不全変異（Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）を有する。ｓｃｉｄ変異は周知であり、Ｂｏｓｍａら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、２９巻：５４〜５６頁、１９８９年に記載されるようにマウス第１６染色体に位置する。ｓｃｉｄ変異に関してホモ接合であるマウスは、機能的なＴ細胞およびＢ細胞の非存在、リンパ球減少症、低グロブリン血症、および正常な造血微小環境によって特徴付けられる。ｓｃｉｄ変異は、例えば、周知の方法、例えばＰＣＲまたはフローサイトメトリーを使用するｓｃｉｄ変異のマーカーの検出によって検出することができる。
【０１４３】
本発明の態様による遺伝子改変マウスは、ＩＬ２受容体ガンマ鎖欠損を有する。用語「ＩＬ２受容体ガンマ鎖欠損」は、ＩＬ２受容体ガンマ鎖の減少を指す。ＩＬ２受容体ガンマ鎖の減少は、遺伝子欠失または変異が原因であり得る。ＩＬ２受容体ガンマ鎖の減少は、例えば周知の方法を使用する、ＩＬ２受容体ガンマ鎖遺伝子の欠失もしくは変異の検出および／またはＩＬ２受容体ガンマ鎖発現の減少の検出によって検出することができる。
【０１４４】
本発明の態様によれば、ゲノムが遺伝子改変を含む遺伝子改変免疫不全ＮＳＧマウスであって、遺伝子改変免疫不全ＮＳＧマウスが機能的なＭＨＣ  Ｉを欠如し、かつ機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如するように、遺伝子改変によって、免疫不全マウスがＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ欠損となる、遺伝子改変免疫不全ＮＳＧマウスを提供する。
【０１４５】
本発明の態様によれば、ゲノムが遺伝子改変を含む遺伝子改変免疫不全ＮＲＧマウスであって、遺伝子改変免疫不全ＮＲＧマウスが機能的なＭＨＣ  Ｉを欠如し、かつ機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如するように、遺伝子改変によって、免疫不全マウスがＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ欠損となる、遺伝子改変免疫不全ＮＲＧマウスを提供する。
【０１４６】
本発明の態様によれば、ゲノムが遺伝子改変を含む遺伝子改変免疫不全ＮＯＧマウスであって、遺伝子改変免疫不全ＮＯＧマウスが機能的なＭＨＣ  Ｉを欠如し、かつ機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如するように、遺伝子改変によって、免疫不全マウスがＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ欠損となるが、但し免疫不全マウスは、β２ｍ（ＭＨＣ  Ｉの構成要素）ノックアウトおよびＩＡβ（ＭＨＣ  ＩＩの軽鎖）ノックアウトによって特徴付けられるＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ｒγｎｕｌｌマウスではない、遺伝子改変免疫不全ＮＯＧマウスを提供する。
【０１４７】
ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス
【０１４８】
本発明の態様によれば、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが欠損している遺伝子改変免疫不全マウスは、機能的なＭＨＣ  Ｉを欠如し、かつ機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如するＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）と略す）マウスである。ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスは、Ｈ２−ＫおよびＨ２−Ｄ  ＭＨＣ  Ｉαタンパク質サブクラスのホモ接合ヌル変異（（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌと略す）により機能的なＭＨＣ  Ｉを欠如する。ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスは、ＭＨＣ  ＩＩのＨ−２Ａサブクラスのホモ接合ヌル変異（ＩＡｎｕｌｌと略す）により機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如する。
【０１４９】
ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスはいずれも、機能的なＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩを欠如するが、意外にもＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおけるヒトＩｇＧクリアランスは、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスのクリアランスとは大幅に異なる。ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスは、遅いヒトＩｇＧクリアランスパターン（ＮＳＧマウスにおいて観察されるパターンと類似の；ＮＳＧマウスは、機能的なＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩを有することに注意されたい）を示すが、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスは、急速なＩｇＧクリアランスを示し（図２を参照されたい）、これにより、このマウスモデルは、抗体試験における使用に適さなくなる。本発明のＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ））マウスは、ヒトＩｇＧの投与後２日間で、投与されたヒトＩｇＧの６０％以下、例えば７０％、８０％、または９０％以下のクリアランスによって特徴付けられる。ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスでは、投与の約２週間後に、約９０％のヒトＩｇＧが除去された。マウスに投与されたヒトＩｇＧに関連して使用される用語「クリアランス」は、マウスからの機能的なヒトＩｇＧの除去のプロセスを指す。
【０１５０】
ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウス
【０１５１】
本発明の態様によれば、機能的なＭＨＣ  Ｉが欠如し、かつ機能的なＭＨＣ  ＩＩが欠如している、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが欠損している遺伝子改変免疫不全マウスは、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ  Ｔｇ（Ｉｎｓ２−ＨＢＥＧＦ）６８３２Ｕｇｆｍ／Ｓｚ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌと略す）マウスである。ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスは、β２ミクログロブリンのホモ接合ヌル変異（Ｂ２Ｍｎｕｌｌと略す）により機能的なＭＨＣ  Ｉを欠如している。ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスは、ＭＨＣ  ＩＩのＨ−２ＡおよびＨ−２Ｅサブクラスのホモ接合ヌル変異（（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌと略す）により機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如している。
【０１５２】
ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）マウスにおいてヒトＩｇＧの急速なクリアランスが観察された。ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）マウスでは、約２日後に約９０％のヒトＩｇＧが除去された、図２を参照されたい。
【０１５３】
ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス
【０１５４】
本発明の態様によれば、機能的なＭＨＣ  Ｉが欠如し、かつ機能的なＭＨＣ  ＩＩが欠如している、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが欠損している遺伝子改変免疫不全マウスは、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ  Ｔｇ（Ｉｎｓ２−ＨＢＥＧＦ）６８３２Ｕｇｆｍ／Ｓｚトランスジェニックマウスであり、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）と略され、これはＮＳＧバックグラウンドに対して、ラットインスリンプロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体を発現する。ラットインスリンプロモーターの制御下でのジフテリア毒素受容体を発現するマウスへのジフテリア毒素（ＤＴ）の注射は、マウス膵ベータ細胞死および高血糖症をもたらす。ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）株は、マウス膵ベータ細胞の完全かつ特異的な除去を可能にし、それによってストレプトゾトシンなどの糖尿病誘発薬の広い毒性効果を回避する。
【０１５５】
同種異系および／または異種細胞を含むマウスモデル
【０１５６】
本発明の態様による遺伝子改変免疫不全マウスは、同種異系および／または異種の細胞または組織をさらに含む。マウスは機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如することから、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の低減または非存在により、同種異系および／または異種の細胞または組織が投与されている本発明の遺伝子改変免疫不全マウスの生存の増加が観察される。例えば機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如する遺伝子改変免疫不全マウスは、遺伝子改変免疫不全マウスに同種異系および／または異種の細胞または組織の投与後、機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如していない同じタイプの免疫不全マウスよりも長く生存する。
【０１５７】
機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如する遺伝子改変免疫不全マウスに投与された同種異系および／または異種の細胞または組織は、起源またはタイプに関して限定されない。機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如する遺伝子改変免疫不全マウスへの同種異系および／または異種の細胞または組織の投与は、投与される同種異系および／または異種の細胞または組織のタイプに応じて、様々な使用のためのマウスモデルを提供する。投与される異種細胞または組織には、ヒト膵細胞；ヒト膵島；ヒト膵ベータ細胞；幹細胞、例えば、しかしこれに限定されないヒトＣＤ３４＋細胞；ヒト患者由来初代ヒト腫瘍細胞；ヒト腫瘍細胞系統細胞；ヒト肝細胞；ヒト造血細胞；分化したヒト血液細胞、例えば白血球、赤血球、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、ＮＫ細胞、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離されたまたは混合集団、および細胞または組織の２つまたはそれより多くのタイプの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５８】
投与される同種異系および／または異種の細胞または組織には、非ヒト膵細胞；非ヒト膵島；非ヒト膵ベータ細胞；幹細胞、例えば、しかしこれに限定されない非ヒトＣＤ３４＋細胞；非ヒト初代腫瘍細胞；非ヒト腫瘍細胞系統細胞；非ヒト肝細胞；非ヒト造血細胞；分化した非ヒト血液細胞、例えば白血球、赤血球、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、ＮＫ細胞、および非ヒト末梢血単核細胞の単離されたまたは混合集団、ならびに細胞または組織の２つまたはそれより多くのタイプの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５９】
必要に応じて、機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如する遺伝子改変免疫不全マウスに投与される同種異系および／または異種の細胞または組織は、遺伝子改変されている。
【０１６０】
本発明の特定の態様によれば、ヒトＴ細胞は、機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如する免疫不全遺伝子改変マウスに投与される。ヒトＴ細胞は、単離されたヒトＴ細胞集団として、マウスにおいてヒトＴ細胞へと分化するヒト幹細胞もしくはヒト前駆細胞の集団として、またはヒトＴ細胞がサブセットである混合細胞集団として投与することができる。
【０１６１】
本発明の特定の態様によれば、ヒト腫瘍細胞は、機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如する免疫不全遺伝子改変マウスに投与される。ヒト腫瘍細胞は、ヒト患者由来初代ヒト腫瘍細胞もしくはヒト腫瘍細胞系統細胞などの、しかしこれらに限定されない単離されたヒト腫瘍細胞集団として、またはヒト腫瘍細胞がサブセットである混合細胞集団として投与することができる。
【０１６２】
本発明の特定の態様によれば、ヒト腫瘍細胞は、機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如する免疫不全遺伝子改変マウスに投与される。ヒト腫瘍細胞は、ヒト患者由来初代ヒト腫瘍細胞もしくはヒト腫瘍細胞系統細胞などの、しかしこれらに限定されない単離されたヒト腫瘍細胞集団として、またはヒト腫瘍細胞がサブセットである混合細胞集団として投与することができる。
【０１６３】
同種異系および／または異種の細胞または組織は、静脈内、または腹腔内投与などの、しかしこれらに限定されない様々な経路を介して本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与することができる。
【０１６４】
同種異系および／または異種の細胞または組織は、遺伝子改変免疫不全マウスに１回または複数回投与することができる。同種異系および／または異種の細胞または組織が投与されている、本発明の機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如している遺伝子改変免疫不全マウスの生存の増加は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の低減または非存在による。
【０１６５】
本発明の態様によれば、分化した同種異系および／または異種の細胞または組織は、免疫不全遺伝子改変マウスにおいて生着し、マウスにおける幹細胞の分化によって分化した細胞または組織を産生する１つまたは複数のタイプの幹細胞を投与することによって、機能的なＭＨＣ  Ｉおよび機能的なＭＨＣ  ＩＩを欠如する免疫不全遺伝子改変マウスに導入される。
【０１６６】
投与される同種異系および／または異種細胞の数は、制限されるとは考えられていない。このため、投与される同種異系および／または異種細胞の数は一般的に、１×１０３〜１×１０８（１，０００〜１００，０００，０００）個の範囲であるが、これより多いまたは少ない数を使用することができる。
【０１６７】
このように、本発明の態様による方法は、約１×１０３（１０００）〜約１×１０８（１００，０００，０００）、約１×１０４（１０，０００）〜約１×１０８（１００，０００，０００）、約１×１０４（１０，０００）〜約１×１０７（１０，０００，０００）、約１×１０５（１００，０００）〜約１×１０７（１０，０００，０００）、約１×１０３（１，０００）〜約１×１０４（１０，０００）、約５×１０３（５，０００）〜約５×１０４（５０，０００）、約１×１０４（１０，０００）〜約１×１０５（１００，０００）、約５×１０４（５０，０００）〜約５×１０５（５００，０００）、約１×１０６（１，０００，０００）〜約１×１０８（１００，０００，０００）、約５×１０６（５，０００，０００）〜約１×１０８（１００，０００，０００）、約１×１０７（１０，０００，０００）〜約１×１０８（１００，０００，０００）、約２×１０４（２０，０００）〜約５×１０５（５００，０００）、または約５×１０４（５０，０００）〜約２×１０５（２００，０００）個の同種異系および／または異種細胞を、免疫不全遺伝子改変マウスに投与するステップを含み得る。方法は、少なくとも約１×１０２（１００）、約２×１０２（２００）、約３×１０２（３００）、約４×１０２（４００）、約５×１０２（５００）、約６×１０２（６００）、約７×１０２（７００）、約８×１０２（８００）、約９×１０２（９００）、約１×１０３（１０００）、約２×１０３（２０００）、約３×１０３（３０００）、約４×１０３（４０００）、約５×１０３（５０００）、約６×１０３（６０００）、約７×１０３（７０００）、約８×１０３（８０００）、約９×１０３（９０００）、約１×１０４（１０，０００）、約２×１０４（２０，０００）、約３×１０４（３０，０００）、約４×１０４（４０，０００）、約５×１０４（５０，０００）、約６×１０４（６０，０００）、約７×１０４（７０，０００）、約８×１０４（８０，０００）、約９×１０４（９０，０００）、約１×１０５（１００，０００）、約２×１０５（２００，０００）、約３×１０５（３００，０００）、約４×１０５（４００，０００）、約５×１０５（５００，０００）、約６×１０５（６００，０００）、約７×１０５（７００，０００）、約８×１０５（８００，０００）、約９×１０５（９００，０００）、約１×１０６（１，０００，０００）、約２×１０６（２，０００，０００）、約３×１０６（３，０００，０００）、約４×１０６（４，０００，０００）、約５×１０６（５，０００，０００）、約６×１０６（６，０００，０００）、約７×１０６（７，０００，０００）、約８×１０６（８，０００，０００）、約９×１０６（９，０００，０００）、約１×１０７（１０，０００，０００）、約２×１０７（２０，０００，０００）、約３×１０７（３０，０００，０００）、約４×１０７（４０，０００，０００）、約５×１０７（５０，０００，０００）、約６×１０７（６０，０００，０００）、約７×１０７（７０，０００，０００）、約８×１０７（８０，０００，０００）、約９×１０７（９０，０００，０００）、または約１×１０８（１００，０００，０００）個の同種異系および／または異種細胞を、免疫不全遺伝子改変マウスに投与するステップを含み得る。当業者は、単なるルーチンの実験を使用して、特定のマウスに投与すべき同種異系および／または異種細胞の数を決定することができるであろう。
【０１６８】
同種異系および／または異種細胞をマウスに投与するステップは、同種異系および／または異種細胞を含む組成物をマウスに投与するステップを含み得る。組成物は、例えば、水、等張性調節剤（例えば、塩化ナトリウムなどの塩）、ｐＨ緩衝剤（例えば、クエン酸）、および／または糖（例えば、グルコース）をさらに含み得る。
【０１６９】
遺伝子改変免疫不全動物における同種異系および／または異種造血幹細胞の生着は、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスにおける分化した同種異系および／または異種細胞、例えば造血細胞の存在によって特徴付けられる。同種異系および／または異種細胞の生着は、細胞の投与後の１つまたは複数の時点での、同種異系および／または異種が投与される動物における細胞のフローサイトメトリーによる分析などの、しかしこれらに限定されない様々な方法のいずれかによって評価することができる。
【０１７０】
腫瘍異種移植片
【０１７１】
本発明の様々な態様は、異種腫瘍細胞を、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与することに関する。
【０１７２】
本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与される異種腫瘍細胞は、腫瘍細胞系統の細胞および初代腫瘍細胞を含むがこれらに限定されない様々な腫瘍細胞のいずれかであり得る。異種腫瘍細胞は、様々な生物のいずれか、好ましくはヒト、非ヒト霊長類、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、およびヒツジを含む哺乳動物に由来してもよい。
【０１７３】
本発明の具体的な態様によれば、異種腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞である。本発明の具体的な態様によれば、ヒト腫瘍細胞は、血液試料、組織試料、またはヒト腫瘍の生検から得た試料などの、しかしこれらに限定されないヒトから得た試料中に存在する。
【０１７４】
ヒトから得た腫瘍細胞は、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに直接投与することができ、または遺伝子改変免疫不全マウスに投与する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養してもよい。
【０１７５】
本明細書に使用される用語「腫瘍」は、前新生物過増殖、上皮内がん、新生物、転移、ならびに固形および非固形腫瘍を含むがこれらに限定されない、無調節な成長によって特徴付けられる細胞を指す。腫瘍の例は、がんによって引き起こされる腫瘍であり、リンパ腫、白血病、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、脳がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、中枢神経系または末梢神経系のがん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、消化管がん、膠芽腫、頭頸部がん、腎臓がん、肝臓がん、鼻咽頭がん、鼻腔がん、中咽頭がん、口腔がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽腫、肉腫、唾液腺がん、皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、膣がん、および外陰がんが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７６】
腫瘍細胞を遺伝子改変免疫不全マウスに投与することは、当技術分野で認識されるように適している任意の方法であり得る。例えば、投与は、注射または植え込み、例えば皮下および／または腹腔内植え込みなどによって、臓器、体腔、または血管に細胞を投与することを含み得る。腫瘍細胞は、腫瘍瘤、腫瘍細胞塊として、または解離した細胞として投与され得る。
【０１７７】
腫瘍細胞は、皮下注射、腹腔内注射、または尾静脈への注射などによる、しかしこれらに限定されない様々な経路によって投与することができる。
【０１７８】
異種腫瘍細胞の生着は、腫瘍形成の兆候に関してマウスの肉眼での検分などの、しかしこれらに限定されない様々な方法のいずれかによって評価することができる。
【０１７９】
生きているマウスにおける測定、生きているマウスから切除した腫瘍の測定、またはｉｎ  ｓｉｔｕでのもしくは死亡したマウスから切除した腫瘍の測定を含むがこれらに限定されない様々な方法のいずれかを使用して、異種腫瘍の成長を測定することができる。測定は、キャリパーなどの測定機器、超音波検査法、コンピューター断層撮影法、陽電子放出断層撮影法、蛍光イメージング、生物発光イメージング、核磁気共鳴画像法などの１つまたは複数の撮像技術を使用する測定、およびこれらまたは他の腫瘍測定法の任意の２つまたはそれより多くの組合せを使用して得ることができる。特に非固形腫瘍の場合、異種腫瘍細胞を有するマウスから得た試料中の腫瘍細胞の数を使用して、腫瘍の成長を測定することができる。例えば、血液試料中の非固形腫瘍の数を評価して、マウスにおける非固形腫瘍の成長の測定を得ることができる。
【０１８０】
投与される腫瘍細胞の数は制限されるとは考えられていない。単一の腫瘍細胞を、本明細書に記載の遺伝子改変免疫不全動物において検出可能な腫瘍に増大させることができる。投与される腫瘍細胞の数は一般的に、腫瘍細胞１０３（１，０００）〜１×１０８（１００，０００，０００）個の範囲であるが、これより多いまたは少ない数を投与することができる。
【０１８１】
このように、本発明の態様による方法は、約１×１０２（１００）〜約１×１０８（１００，０００，０００）、約１×１０３（１，０００）〜約１×１０５（１００，０００）、約１×１０４（１０，０００）〜約１×１０６（１，０００，０００）、約１×１０５（１００，０００）〜約１×１０７（１０，０００，０００）、約１×１０３（１０００）〜約１×１０４（１０，０００）、約５×１０３（５，０００）〜約５×１０４（５０，０００）、約１×１０４（１０，０００）〜約１×１０５（１００，０００）、約５×１０４（５０，０００）〜約５×１０５（５００，０００）、約１×１０５（１００，０００）〜約１×１０６（１，０００，０００）、約５×１０５（５００，０００）〜約５×１０６（５，０００，０００）、約１×１０６（１，０００，０００）〜約１×１０７（１０，０００，０００）、約２×１０４（２０，０００）〜約５×１０５（５００，０００）、または約５×１０４（５０，０００）〜約２×１０５（２００，０００）個の異種腫瘍細胞、例えばヒト腫瘍細胞を遺伝子改変免疫不全マウスに投与するステップを含み得る。方法は、少なくとも約１×１０２（１００）、約２×１０２（２００）、約３×１０２（３００）、約４×１０２（４００）、約５×１０２（５００）、約６×１０２（６００）、約７×１０２（７００）、約８×１０２（８００）、約９×１０２（９００）、約１×１０３（１，０００）、約２×１０３（２，０００）、約３×１０３（３，０００）、約４×１０３（４０００）、約５×１０３（５，０００）、約６×１０３（６，０００）、約７×１０３（７，０００）、約８×１０３（８，０００）、約９×１０３（９，０００）、約１×１０４（１０，０００）、約２×１０４（２０，０００）、約３×１０４（３０，０００）、約４×１０４（４０，０００）、約５×１０４（５０，０００）、約６×１０４（６０，０００）、約７×１０４（７０，０００）、約８×１０４（８０，０００）、約９×１０４（９０，０００）、約１×１０５（１００，０００）、約２×１０５（２００，０００）、約３×１０５（３００，０００）、約４×１０５（４００，０００）、約５×１０５（５００，０００）、約６×１０５（６００，０００）、約７×１０５（７００，０００）、約８×１０５（８００，０００）、約９×１０５（９００，０００）、約１×１０６（１，０００，０００）、約２×１０６（２，０００，０００）、約３×１０６（３，０００，０００）、約４×１０６（４，０００，０００）、約５×１０６（５，０００，０００）、約６×１０６（６，０００，０００）、約７×１０６（７，０００，０００）、約８×１０６（８，０００，０００）、約９×１０６（９，０００，０００）、または約１×１０７（１０，０００，０００）個の異種腫瘍細胞、例えばヒト腫瘍細胞を、免疫不全ＱＵＡＤマウスに投与するステップを含み得る。方法は、約１×１０２（１００）、約２×１０２（２００）、約３×１０２（３００）、約４×１０２（４００）、約５×１０２（５００）、約６×１０２（６００）、約７×１０２（７００）、約８×１０２（８００）、約９×１０２（９００）、約１×１０３（１，０００）、約２×１０３（２，０００）、約３×１０３（３，０００）、約４×１０３���４，０００）、約５×１０３（５，０００）、約６×１０３（６，０００）、約７×１０３（７，０００）、約８×１０３（８，０００）、約９×１０３（９，０００）、約１×１０４（１０，０００）、約２×１０４（２０，０００）、約３×１０４（３０，０００）、約４×１０４（４０，０００）、約５×１０４（５０，０００）、約６×１０４（６０，０００）、約７×１０４（７０，０００）、約８×１０４（８０，０００）、約９×１０４（９０，０００）、約１×１０５（１００，０００）、約２×１０５（２００，０００）、約３×１０５（３００，０００）、約４×１０５（４００，０００）、約５×１０５（５００，０００）、約６×１０５（６００，０００）、約７×１０５（７００，０００）、約８×１０５（８００，０００）、約９×１０５（９００，０００）、約１×１０６（１，０００，０００）、約２×１０６（２，０００，０００）、約３×１０６（３，０００，０００）、約４×１０６（４，０００，０００）、約５×１０６（５，０００，０００）、約６×１０６（６，０００，０００）、約７×１０６（７，０００，０００）、約８×１０６（８，０００，０００）、約９×１０６（９，０００，０００）、約１×１０７（１０，０００，０００）、または約１×１０８（１００，０００，０００）個の異種腫瘍細胞、例えばヒト腫瘍細胞を遺伝子改変免疫不全マウスに投与するステップを含み得る。当業者は、単なるルーチンの実験を使用して、特定のマウスに投与すべき異種腫瘍細胞の数を決定することができるであろう。
【０１８２】
本発明の態様によれば、異種腫瘍細胞および異種白血球は、遺伝子改変免疫不全マウスに投与される。異種腫瘍細胞および異種白血球は、同時にまたは異なる時間に投与することができる。
【０１８３】
本発明の態様によれば、腫瘍細胞は、投与される白血球と同じ種に由来する。態様によれば、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与される腫瘍細胞および白血球の両方は、ヒト細胞である。
【０１８４】
本発明の態様によれば、異種腫瘍細胞および異種Ｔ細胞は、遺伝子改変免疫不全マウスに投与される。異種腫瘍細胞および異種Ｔ細胞は、同時にまたは異なる時間に投与することができる。
【０１８５】
本発明の態様によれば、腫瘍細胞は、投与されるＴ細胞と同じ種に由来する。態様によれば、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与される腫瘍細胞およびＴ細胞の両方は、ヒト細胞である。
【０１８６】
本発明の態様によれば、異種腫瘍細胞および異種ＰＢＭＣは、遺伝子改変免疫不全マウスに投与される。異種腫瘍細胞および異種ＰＢＭＣは、同時にまたは異なる時間に投与することができる。
【０１８７】
本発明の態様によれば、腫瘍細胞は、投与されるＰＢＭＣと同じ種に由来する。態様によれば、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与される腫瘍細胞およびＰＢＭＣの両方は、ヒト細胞である。
【０１８８】
条件付け
【０１８９】
本発明の態様による免疫不全遺伝子改変マウスにおける異種細胞の生着は、異種細胞の投与前に、例えばレシピエント動物への高周波電磁放射線の亜致死量照射、またはガンマ線照射、またはブスルファンもしくはナイトロジェンマスタードなどの放射線模倣薬での処置による、免疫不全遺伝子改変マウスの「条件付け」を含む。条件付けは、造血細胞などの宿主免疫細胞の数を低減させ、白血球、Ｔ細胞、ＰＢＭＣ、もしくは他の細胞などの、しかしこれらに限定されない異種免疫細胞の生着のための適切な微小環境要因を創出する、および／または異種免疫細胞の生着のための微小環境ニッチェを創出すると考えられている。条件付けのための標準的な方法は、本明細書、およびＪ．  Ｈａｙａｋａｗａら、２００９年、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２７巻（１号）：１７５〜１８２頁に記載されるように当技術分野で公知である。
【０１９０】
本発明の態様によれば、白血球、Ｔ細胞、ＰＢＭＣ、または他の細胞などの、しかしこれらに限定されない異種免疫細胞の投与前に免疫不全遺伝子改変マウスを「条件付け」することなく、白血球、Ｔ細胞、ＰＢＭＣ、または他の細胞などの、しかしこれらに限定されない異種免疫細胞を、免疫不全遺伝子改変マウスに投与するステップを含む方法が提供される。本発明の態様によれば、異種免疫細胞の投与前に、免疫不全遺伝子改変マウスを放射線または放射線模倣薬によって「条件付け」することなく、白血球、Ｔ細胞、ＰＢＭＣ、または他の細胞などの、しかしこれらに限定されない異種免疫細胞を、免疫不全遺伝子改変マウスに投与するステップを含む方法が提供される。
【０１９１】
アッセイ
【０１９２】
本発明の態様によれば、推定の治療剤の効果をアッセイする方法であって、同種異系および／または異種の細胞または組織を含む遺伝子改変免疫不全マウスに、推定の治療剤のある量を投与するステップ、および推定の治療剤の効果を測定するステップを含む、方法が提供される。
【０１９３】
本発明の方法において使用される推定の治療剤は、例示的には、合成もしくは天然に存在する化合物、または合成もしくは天然に存在する化合物の組合せ、小有機もしくは無機分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、オリゴ糖、脂質、またはこれらのいずれかの組合せを含む任意の化学実体であり得る。
【０１９４】
アッセイにとって適した標準は、当技術分野で周知であり、使用される標準は、任意の適切な標準であり得る。
【０１９５】
アッセイ結果を、様々な方法のいずれかによる統計分析を使用して分析することができ、例には、パラメトリックまたはノンパラメトリック検定、分散分析、共分散分析、多変量分析のロジスティック回帰、フィッシャーの正確確率検定、カイ二乗検定、スチューデントｔ検定、マン−ホイットニー検定、ウィルコクソンの符号付き順位検定、マクネマー検定、フリードマン検定、およびページのＬ傾向検定が挙げられる。これらおよび他の統計検定は、当技術分野で周知であり、Ｈｉｃｋｓ，  ＣＭ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｓｔｓ：  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（出版社）；  第５版、２００９年；およびＦｒｅｕｎｄ，  ＲＪら、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  第３版、２０１０年に詳述されている。
【０１９６】
本発明の態様により提供される方法および遺伝子改変免疫不全マウスは、ヒトがんに対する物質のｉｎ  ｖｉｖｏ試験などの様々な有用性を有する。
【０１９７】
本発明の態様による試験物質の抗腫瘍活性を同定するための方法は、遺伝子改変免疫不全マウスを用意するステップ；遺伝子改変免疫不全マウスにおいて固形または非固形腫瘍を形成する異種腫瘍細胞を遺伝子改変免疫不全マウスに投与するステップ；試験物質を遺伝子改変免疫不全マウスに投与するステップ；試験物質に対する異種腫瘍および／または腫瘍細胞の応答をアッセイするステップであって、腫瘍および／または腫瘍細胞に対する試験物質の阻害効果により、試験物質が抗腫瘍活性を有すると同定される、ステップを含む。
【０１９８】
本発明の態様による試験物質の抗腫瘍活性を同定するための方法は、生着した異種ＰＭＢＣを有する遺伝子改変免疫不全マウスを用意するステップ；遺伝子改変免疫不全マウスにおいて固形または非固形腫瘍を形成する異種腫瘍細胞を遺伝子改変免疫不全マウスに投与するステップ；試験物質を遺伝子改変免疫不全マウスに投与するステップ；試験物質に対する異種腫瘍および／または腫瘍細胞の応答をアッセイするステップであって、腫瘍および／または腫瘍細胞に対する試験物質の阻害効果により、試験物質が抗腫瘍活性を有すると同定される、ステップを含む。
【０１９９】
本発明の態様による試験物質の抗腫瘍活性を同定するための方法は、生着したヒトＰＢＭＣを有する遺伝子改変免疫不全マウスを用意するステップ；遺伝子改変免疫不全マウスにおいて固形または非固形腫瘍を形成するヒト腫瘍細胞を遺伝子改変免疫不全マウスに投与するステップ；試験物質を遺伝子改変免疫不全マウスに投与するステップ；試験物質に対するヒト腫瘍および／または腫瘍細胞の応答をアッセイするステップであって、腫瘍および／または腫瘍細胞に対する試験物質の阻害効果により、試験物質が抗腫瘍活性を有すると同定される、ステップを含む。
【０２００】
本発明の態様による試験物質の抗腫瘍活性を同定するためのアッセイに使用される遺伝子改変免疫不全マウスは、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス；またはＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ））マウスである。
【０２０１】
本明細書に使用される用語「阻害効果」は、試験物質が、腫瘍の成長、腫瘍細胞の代謝、および腫瘍細胞の分裂のうちの１つまたは複数を阻害する効果を指す。
【０２０２】
試験物質に対する異種腫瘍および／または腫瘍細胞の応答をアッセイするステップは、標準に対する応答を比較して、本発明の方法の態様による異種腫瘍細胞に対する試験物質の効果を決定するステップであって、異種腫瘍細胞に対する試験物質の阻害効果により、試験物質が抗腫瘍組成物として同定される、ステップを含む。標準は当技術分野で周知であり、使用される標準は任意の適切な標準であり得る。一例では、標準は、抗腫瘍効果を有することが公知の化合物である。さらなる例では、比較可能な異種腫瘍の無処置は、試験物質の効果を比較するための処置なしで、腫瘍成長の基礎レベル指標を提供する。標準は、個々の比較可能なマウスにおいて、または比較可能なマウスの集団において予め決定され、呼び出しおよびアッセイ結果との比較のために印刷物または電子媒体に保存されている予想される腫瘍成長の基準レベルであり得る。
【０２０３】
アッセイ結果を、様々な方法のいずれかによる統計分析を使用して分析して、試験物質が腫瘍に対して阻害効果を有するか否かを決定することができ、方法の例には、パラメトリックまたはノンパラメトリック検定、分散分析、共分散分析、多変量分析のロジスティック回帰、フィッシャーの正確確率検定、カイ二乗検定、スチューデントｔ検定、マン−ホイットニー検定、ウィルコクソンの符号付き順位検定、マクネマー検定、フリードマン検定、およびページのＬ傾向検定が挙げられる。これらおよび他の統計検定は、当技術分野で周知であり、Ｈｉｃｋｓ，  ＣＭ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｓｔｓ：  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（出版社）；  第５版、２００９年；およびＦｒｅｕｎｄ，  ＲＪら、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  第３版、２０１０年に詳述されている。
【０２０４】
本発明の方法において使用される試験物質は、例示的には、合成もしくは天然に存在する化合物、または合成もしくは天然に存在する化合物の組合せ、小有機もしくは無機分子、抗体（マウス、キメラ、またはヒト化）、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２）、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、オリゴ糖、脂質、またはこれらのいずれかの組合せを含む任意の化学実体であり得る。
【０２０５】
本発明の態様によれば、試験物質は、免疫療法剤、例えば抗体（マウス、キメラ、またはヒト化）、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２）、またはこれらのいずれかの組合せ、あるいは非免疫療法剤、例えば合成もしくは天然に存在する化合物、合成もしくは天然に存在する化合物の組合せ、小有機もしくは無機分子、抗体でも抗原結合性断片でもないタンパク質もしくはペプチド、核酸、炭水化物、オリゴ糖、脂質、またはこれらのいずれかの組合せである。
【０２０６】
本発明の態様によれば、試験物質は抗がん剤である。本発明の態様によれば、抗がん剤は、抗がん免疫療法剤、例えば抗がん抗体またはその抗原結合性断片である。本発明の態様によれば、抗がん剤は、非免疫療法剤、例えば合成もしくは天然に存在する化合物、合成もしくは天然に存在する化合物の組合せ、小有機もしくは無機分子、抗体でも抗原結合性断片でもないタンパク質もしくはペプチド、核酸、炭水化物、オリゴ糖、脂質、またはこれらのいずれかの組合せである。
【０２０７】
抗がん剤は、例えばＢｒｕｎｔｏｎら（編）、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１２版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、２０１１年に記載されている。
【０２０８】
抗がん剤の例には、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アンボマイシン、アメタントロン、アミフォスチン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン、ジメシル酸ビスナフィド、ビゼレシン、ブレオマイシン、ブレキナル、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カペシタビン、カラセミド、カルベチメル、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、セレコキシブ、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、コビメチニブ、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキセート、エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、エピルビシン、エルブロゾール、エソルビシン、エストラムスチン、エタニダゾール、エトポシド、エトプリン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシン、フルベストラント、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イルモフォシン、インターロイキンＩＩ（ＩＬ−２、組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−ｎ１、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンベータ−Ｉａ、インターフェロンガンマ−Ｉｂ、イプロプラチン、イリノテカン、ランレオチド、レトロゾール、リュープロリド、リアロゾール、ロメトレキソール、ロムスチン、ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ネララビン、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルムナプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマー、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルホセート、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、タリソマイシン、タモキシフェン、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポテカン、トレミフェン、トレストロン、トリシリビン、トリメトレキセート、トリプトレリン、ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベムラフェニブ、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン、ビングリシネート、ビンロイロシン、ビノレルビン、ビンロシジン、ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾレドロネート、ゾルビシンなどが例証として挙げられる。
【０２０９】
本発明の態様によれば、抗がん剤は、抗がん抗体とも呼ばれる抗がん免疫療法剤である。使用される抗がん免疫療法剤は、少なくとも１つのタイプの腫瘍、特にヒト腫瘍を阻害するために有効な任意の抗体、または抗体の有効部分であり得る。抗がん免疫療法剤には、３Ｆ８、８Ｈ９、アバゴボマブ、アビツズマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アデュカヌマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴル、アレムツズマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アネツマブラブタンシン、アポリズマブ、アルシツモマブ、アスクリンバクマブ、アテゾリズマブ、バビツキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブレンツキシマブベドチン、ブロンチクツズマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプロマブペンデチド、カツマクソマブ、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コルツキシマブラブタンシン、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デムシズマブ、デニンツズマブマホドチン、デパツキシズマブマホドチン、デュルバルマブ、デュシギツマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エマクツズマブ、エミベツズマブ、エノブリツズマブ、エンホルツマブベドチン、エナバツズマブ、エプラツズマブ、エルツマクソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィジツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ、ｉｍａｂ３６２、イマルマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブラブタンシン、インデュサツマブベドチン、イネビリズマブ、イノツズマブオゾガマイシン、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イサツキシマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リファスツズマブベドチン、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ、マパツムマブ、マルゲツキシマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミルベツキシマブソラブタンシン、ミツモマブ、モガムリズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ナコロマブタフェナトクス、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オンツキシズマブ、オレゴボマブ、オポルツズマブモナトクス、オトレルツズマブ、パニツムマブ、パンコマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブベドチン、ポラツズマブベドチン、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サシツズマブゴビテカン、サマリズマブ、セリバンツマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、ソフィツズマブベドチン、タカツズマブテトラキセタン、タレクスツマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、テツロマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トベツマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ウブリツキシマブ、ウトミルマブ、バンドルツズマブベドチン、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バルリルマブ、ベセンクマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマホドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザツキシマブなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１０】
本発明の態様によれば、試験物質は、１）細胞表面タンパク質、例えば分化抗原群（ＣＤ）細胞表面分子；２）細胞内タンパク質、例えばキナーゼ；および３）細胞外タンパク質、例えば放出された細胞表面受容体または細胞表面受容体の可溶性リガンドのうちの１つまたは複数を特異的に結合する物質である。
【０２１１】
本発明の態様によれば、試験物質は、白血球（例えば、リンパ球または骨髄系列の白血球）によって発現されるタンパク質を特異的に結合する物質である。さらなる選択肢では、試験物質は、白血球のリガンドを特異的に結合する物質である。なおさらなる選択肢では、試験物質は、がん細胞によって発現される分子を特異的に結合する物質である。
【０２１２】
本発明の態様によれば、試験物質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４を特異的に結合することができる。本発明の態様によれば、試験物質は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤であり得る。本発明の態様によれば、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体であり、それぞれＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤である。本発明の態様によれば、試験物質は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、および前述のいずれか１つの抗原結合性断片から選択される免疫チェックポイント阻害剤である。
【０２１３】
試験物質は、経口、直腸、口腔内、鼻、筋肉内、膣、眼、耳、皮下、経皮、腫瘍内、静脈内、および腹腔内などの、しかしこれらに限定されない任意の適した投与経路によって投与することができる。
【０２１４】
本発明の組成物および方法の実施形態を、以下の実施例に例証する。これらの実施例は、説明目的のために提供され、本発明の組成物および方法の範囲に対する制限とみなされない。
【実施例】
【０２１５】
実施例
【０２１６】
マウス
【０２１７】
これらの研究に使用したマウスは全て、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙでの育種コロニーにおいて育成した。ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ、ＮＳＧ）マウスは、以前にＳｈｕｌｔｚ  ＬＤら、２００５年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４巻：６４７７〜６４８９頁に記載されている。
【０２１８】
ＮＳＧマウスは、兄妹交配を通して維持した。ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）と略す）マウスは、ＴＡＬＥＮを使用して開発した。Ｈ２−Ａｂ１遺伝子のエクソン２を、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌと略す、Ｃｏｖａｓｓｉｎ  Ｌら、２０１３年、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４巻：３７２〜３８８頁を参照されたい）胚において標的化した。ヌルＩＡｂアレル（Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ）を有する子孫をＰＣＲによって同定し、ヌルＩＡｂアレルをホモ接合性に固定した。ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスを、ホモ接合性の兄妹交配を通して維持する。
【０２１９】
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌと略す）を、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ  Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌと略す）マウス（Ｋｉｎｇ  ＭＡら、２００９年、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５７巻：１０４〜１１８頁を参照されたい）とＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＨ２ｄｌＡｂ１−Ｅａ１Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（Ｍａｄｓｅｎ  Ｌら、１９９９年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９６巻：１０３３８〜１０３４３頁を参照されたい）との相互交配およびＦ１後代との相互交配の後に、Ｂ２ｍｔｍ１ＵｎｃおよびＨ２ｄｌＡｂ１−Ｅａアレルに関して二重ホモ接合であるＮＳＧマウスを選択することによって作製した。ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）マウスを、兄妹交配を通して維持した。
【０２２０】
ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）株と略されるＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈ２−Ｋ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｈ２−Ａｂ１ｅｍ１Ｍｖｗ  Ｈ２−Ｄ１ｔｍ１Ｂｐｅ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ  Ｔｇ（Ｉｎｓ２−ＨＢＥＧＦ）６８３２Ｕｇｆｍ／Ｓｚトランスジーンを創出するために、ＲＩＰ−ＤＴＲトランスジーンと略されるＴｇ（Ｉｎｓ２−ＨＢＥＧＦ）６８３２Ｕｇｆｍを、ＮＳＧ株（Ｄａｉ  Ｃ．ら、２０１６年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１２６巻：１８５７〜１８７０頁；およびＹａｎｇ  Ｃら、２０１５年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｓｙｎｄｒ  Ｏｂｅｓ、８巻：３８７〜３９８頁）と戻し交配した後、ＮＳＧ−ＤＴＲ株をＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）株と交配させてＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）株を創出した。これらのマウスを、破壊されたアレルに関しておよびトランスジーンに関してホモ接合性のマウスの兄妹交配によって維持する。
【０２２１】
全ての動物を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの特定病原体無菌施設においてマイクロアイソレーターケージに収容し、オートクレーブ処理した飼料を与え、オートクレーブ処理した酸性水で維持したか、またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌにおいて、オートクレーブ処理した酸性水とスルファメトキサゾール−トリメトプリム処理水（Ｇｏｌｄｌｉｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｔ．Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ、ＦＬ）を週毎に交互に与えた。
【０２２２】
抗体およびフローサイトメトリー
【０２２３】
ＮＳＧ  ＭＨＣノックアウトマウスにおけるマウス細胞の表現型を、Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＤら、２００５年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４巻：６４７７〜６４８９頁に詳細に記載されているように決定した。抗マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、４色のフローサイトメトリー分析に適応するように、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ、またはＰｅｒＣＰコンジュゲートとして購入した。免疫コンピテントＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪ（ＮＯＤ）およびＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスを各実験に使用し、正確なＭＨＣ染色を確実にした。Ｂ６マウスを、１２９胚性幹細胞において作製される古典的にノックアウトされたＥａ遺伝子に隣接する連鎖ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子領域のキャリーオーバーを制御するために含め、これを、ＮＳＧと戻し交配させてＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）マウスを作製した。脾臓を、氷上、血清を含まないＤＭＥＭ中の２００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＤ  １ｍＬ中で小片に刻んだ。さらに２ｍｌのコラゲナーゼＤ溶液を添加して、脾臓をボルテックスした。それらを３７℃の水浴中で、時折ボルテックスおよび混合しながら３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、Ｇｅｙｓ  ＲＢＣ溶解緩衝液に懸濁させ、混合し、氷上で１分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４℃で３０分間染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液２５０μｌに懸濁させ、ヨウ化プロピジウムで染色し、次いで１００，０００事象を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターにおいて分析した。使用した抗マウス抗体は、抗Ｈ２Ｋｂ（クローンＡＦ６−８８５）、Ｈ２Ｋｄ（ＳＦ１−１．１）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、Ｉ−Ａｂ，ｄ  ＩＥｋ，ｄ（Ｍ５／１１４）、Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８）、Ｌｙ６ｃ（ＨＫ１．４）、およびＩ−Ａｇ７（１０−２．１６）であった。
【０２２４】
ヒト免疫細胞集団を、以下のヒト抗原；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した、ＣＤ４５（クローンＨＩ３０）、ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（クローンＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ２０（クローン２Ｈ７）  ＣＤ４５ＲＡ（クローンＨＩ１００）、ＣＣＲ７（クローンＧ０４３Ｈ７）、ＰＤ１（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）、およびグランザイムＢ（クローンＧＢ１１）に対して特異的なｍＡｂを使用してＰＢＭＣ生着マウスにおいてモニターした。マウス細胞を、マウスＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対して特異的なｍＡｂで染色することによって同定し、分析から除外した。
【０２２５】
脾臓の単細胞懸濁液を、生着マウスから調製し、全血をヘパリン中に収集した。細胞１×１０６個の単細胞懸濁液または全血１００μｌを、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．０２％アジ化ナトリウムを補充したＰＢＳ）で洗浄し、次いで、ラット抗マウスＦｃＲ１１ｂ  ｍＡｂ（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にプレインキュベートして、マウスＦｃ受容体への結合を遮断した。次いで、特異的ｍＡｂを試料に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。染色した試料を洗浄し、細胞懸濁液の場合には２％パラホルムアルデヒドで固定したか、または全血の場合にはＢＤ  ＦＡＣＳ溶解溶液で処置した。少なくとも５０，０００事象を、ＬＳＲＩＩまたは  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において獲得した。ヒト細胞表現型決定に関して、マウスＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対して特異的なｍＡｂで染色することによって、マウス細胞を同定し、分析から除外した。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）ソフトウェアによって実施した。
【０２２６】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の収集
【０２２７】
ヒトＰＢＭＣを健康なボランティアから得た。ＰＢＭＣをヘパリン中で収集し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離によって精製し、示した細胞用量でのマウスへの注射のためにＲＰＭＩ中に懸濁させた。一部の実験では、フェレ−シスｌｅｕｋｏｐａｋを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの血液バンクから匿名の廃棄単位として得た。
【０２２８】
ＧＶＨＤプロトコール
【０２２９】
マウスに、様々な用量のＰＢＭＣを腹腔内注射した。マウスの体重を週に２〜３回測定し、体重減少（＞２０％）、前屈みの姿勢、毛の逆立ち、運動性の低減、および頻呼吸を含むＧＶＨＤ様の症状の出現を使用して、安楽死の時期を決定し、生存期間として示す。
【０２３０】
ヒト島移植
【０２３１】
調査用のヒト島を、Ｐｒｏｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）から得た。ヒトＩＥＱ（４０００）を、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスの脾臓に移植した。ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスを、島移植の２〜４日前にジフテリア毒素４０ｎｇで処置した。高血糖症（＞４００ｍｇ／ｄｌ）を、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ  Ａｃｔｉｖｅ血糖値測定器（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して確認した。次いで、血糖値を、移植後週に２回の間隔で決定して、島移植片の機能をモニターした。血漿中のＣペプチドレベルを、ヒトＣペプチドに対して特異的なＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ、Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）を使用して検出した。移植した脾臓内の総インスリン含有量は、以前に記載されているように（Ｈａｒｌａｎ  ＤＭら、１９９５年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４４巻：８１６〜８２３頁）、ヒトインスリンに対して特異的なＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ、Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）を使用して決定した。
【０２３２】
ｄｓＡＡＶベクター
【０２３３】
ｄｓＡＡＶベクターは、以前に記載されているように（Ｈｅ  Ｙら、２０１３年、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２４巻：５４５〜５５３頁）、操作し、パッケージングした。
【０２３４】
簡単に説明すると、ヒトＩＬ２またはＥＧＦＰをコードする完全長のｃＤＮＡを、マウスプレプロインスリンＩＩプロモーター（ｍＩＰ）を含有するｄｓＡＡＶプラスミドにサブクローニングした（ＭｃＣａｒｔｙ  ＤＭら、２００１年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、８巻：１２４８〜１２５４頁）。ｄｓＡＡＶベクターのパッケージングは、以前に記載されているように（Ｇｒｉｅｇｅｒ  ＪＣら、２００６年、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ、１巻：１４１２〜１４２８頁；およびＪｏｈｎｓｏｎ  ＭＣら、２０１３年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、６２巻：３７７５〜３７８４頁）実行したか、またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｈｏｒａｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）のＶｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅによって産生した。レシピエントマウスに、精製ＡＡＶ８−ｈｕＩＬ２（ＡＡＶ−ＩＬ２）の粒子２．５×１０１１個をＩＰ注射した。
【０２３５】
統計分析
【０２３６】
個々のペアワイズ群化を比較するために、ボンフェローニの事後検定を行う一元配置ＡＮＯＶＡまたは二元配置ＡＮＯＶＡ、およびダンの事後検定を行うクラスカル−ウォリス検定を、それぞれ、パラメトリックおよびノンパラメトリックデータに関して使用した。有意差は、ｐ値＜０．０５であると仮定した。統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン４．０ｃ、ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施した。
【０２３７】
結果
【０２３８】
ＮＳＧおよびＮＳＧ  ＭＨＣクラスＩ／ＩＩダブルノックアウトマウスの２つの株の表現型特徴付け
【０２３９】
ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩが二重に欠損している２つのＮＳＧマウス株、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌノックアウト株を創出した。両方の株におけるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの非存在を、フローサイトメトリーによって確認した（図１）。容易に検出可能なレベルのマウス  ＭＨＣ  ＩＩを発現する免疫細胞が存在しないため、脾臓を酵素により解離し、ゲーティングして、樹状細胞集団を分析した。図１Ａは、ダブレットおよび死細胞を除外するゲーティング戦略を示し、単球由来樹状細胞（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ｃｄｉｍ  ＣＤ１１ｃ＋）に対するゲーティングに進むす。ＮＳＧマウスは、ＭＨＣクラスＩに関してＨ２Ｋｄ陽性、Ｈ２Ｋｂ陰性（図１Ｂ）、およびＭＨＣクラスＩＩに関してＩ−Ａｇ７陽性、Ｉ−Ａｂ陰性（図１Ｃ）の予想される染色パターンを示す。ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）ノックアウトマウスはいずれも、ＮＯＤおよびＣ５７ＢＬ／６マウスによって通常発現されるＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子を欠如する。
【０２４０】
循環中でのＩｇＧの半減期の延長に関与する受容体であるマウスＦｃＲｎの適切な発現に対するＢ２Ｍの必要により、両方のマウス血統におけるヒトＩｇＧのクリアランスを比較した。マウスに、ヒトＩｇＧ  ２００μｇをＩＶ注射し、循環中のヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析のために一定間隔で採血した。注射の２分後の１回目の採血は、１００％血清ＩｇＧであると考えられた。ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）マウスにおいてヒトＩｇＧの急速なクリアランスが観察されたが、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおけるＩｇＧクリアランスは、ＮＳＧマウスにおいて観察されたクリアランスと類似であった（図２）。
【０２４１】
ＰＢＭＣ生着ＮＳＧ、ならびにＮＳＧ−ＭＨＣクラスＩノックアウト、ＮＳＧ−ＭＨＣクラスＩＩノックアウト、およびＮＳＧ−ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウトマウスの生存
【０２４２】
ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）：マウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩの非存在が、ＮＳＧ  ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウトマウスにおけるヒトＰＢＭＣ生着後の異種ＧＶＨＤの発生および動態を変化させるか否かを決定するために、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩを欠損するＮＳＧ株、または２つのＮＳＧダブルノックアウト株に、ＰＢＭＣ  １０×１０６個を生着させ、その生存を、ＮＳＧマウスの生存と比較した。以前に報告されたように、ＮＳＧおよびＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）は、ＮＳＧマウスにおいて観察される生存と類似の、比較的短い類似の生存を示した。これに対し、予想されるように、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌマウスは、ＮＳＧマウスと比較して生存期間の延長を有した。しかし、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの両方をＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおいてノックアウトした場合、生存は１００日を超え、これらのＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウトマウス１５匹中１３匹は、ＧＶＨＤの症状なしで、観察期間（１２５日間）終了時でなおも生きていた（図３Ａ）。
【０２４３】
ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）：類似の長期の生存結果が、ＰＢＭＣ生着ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）マウスにおいて観察された。このＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウト株では、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ株ではなく、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ株を対照として使用した。この場合もＮＳＧおよびＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）ノックアウトマウスは、比較的短い生存を有した。ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌマウスの生存は、大幅に増加した。ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおいて観察されたように、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）株では長期間の生存が達成され、１８匹中１５匹は、ＧＶＨＤの症状なしで、実験（１２５日間）終了時で生存していた（図３Ｂ）。
【０２４４】
ＰＢＭＣ生着ＮＳＧ、ならびにＮＳＧ−ＭＨＣクラスＩノックアウト、ＮＳＧ−ＭＨＣクラスＩＩノックアウト、およびＮＳＧ−ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウトマウスにおけるヒト細胞キメリズム
【０２４５】
ＰＢＭＣ生着ＮＳＧ  ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウトマウスの長期間の生存は、ヒト細胞生着の欠如またはＭＨＣクラスＩおよびＩＩの非存在によるＧＶＨＤの欠如のいずれかの結果であり得る。これらの２つの可能性を識別するために、ＰＢＭＣ  １０×１０６個を、両方のＮＳＧ  ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウト株にＩＰ注射し、経時的な循環中のＣＤ４５＋細胞レベルを、ＮＳＧ、ＮＳＧ−クラスＩノックアウトおよびＭＨＣクラスＩＩノックアウトマウスのレベルと比較した。
【０２４６】
ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス：ヒトＣＤ４５細胞生着は、ＮＳＧマウスおよびＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおいて急速に増加した（図４Ａ）。循環中のヒトＣＤ４５＋細胞の経時的なパーセンテージは、ＮＳＧおよびＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）マウスと比較してＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌおよびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスでは低かった。脾臓では、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌマウスにおけるヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージは、ＮＳＧマウスで観察されたパーセンテージと同等であったが、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスの脾臓におけるヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージは、大幅に減少した（図４Ｂ）。
【０２４７】
ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウス：ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ株を、ＮＳＧ  ＭＨＣクラスＩノックアウト（ＫＯ）対照として使用した。ＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）マウス、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおいて観察されたように、循環中のヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージは、ＮＳＧおよびＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）マウスでは、ＮＳＧ−Ｂ２ＭｎｕｌｌおよびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）マウスにおいて観察されたパーセンテージと比較して高かった（図４Ｃ）。ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）マウスの脾臓におけるヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージは、他の３つの株よりも大幅に低かった（図４Ｄ）。
【０２４８】
ＰＢＭＣ生着ＮＳＧ、ＮＳＧ−ＭＨＣクラスＩノックアウト、ＮＳＧ−ＭＨＣクラスＩＩノックアウト、およびＮＳＧ−ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウトマウスにおけるヒトＴ細胞およびＢ細胞の生着
【０２４９】
ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）：循環中のヒトＣＤ４５＋細胞は、ＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌマウスでは主にＣＤ３＋  Ｔ細胞であった（図５Ａ）。同様に、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）におけるＣＤ４５＋細胞の大部分もまたＣＤ３＋  Ｔ細胞であった。ＮＳＧおよびＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）マウスでは、生着後２週間で容易に検出可能な数のＣＤ２０＋  Ｂ細胞が存在したが、これらは生着後４週目までに本質的に検出不能であった（図５Ｂ）。
【０２５０】
ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ：ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌマウスを、比較のためのＭＨＣクラスＩノックアウト対照として使用した。ＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）、およびＮＳＧ−Ｂ２ＭｎｕｌｌマウスにおけるＰＢＭＣ生着は、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスにおいて観察されたように、主にＣＤ３＋  Ｔ細胞からなった（図５Ｃ）。ヒトＣＤ２０＋  Ｂ細胞は、第１の実験では、ＮＳＧおよびＮＳＧ−ＩＡｎｕｌｌマウスにおいて２週目に容易に明白であったが、それらは調べた４つ全ての株では極めて低いレベルで存在し（図５Ｄ）、このことは、ＰＢＭＣ生着ＮＳＧマウスにおいて、時に本発明者らが観察したようにドナー多様性を反映している可能性がある。
【０２５１】
ＰＢＭＣを注射したＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおいて生着したヒトＴ細胞の表現型分析
【０２５２】
ＰＢＭＣ生着後４週目でのＮＳＧマウスにおけるＣＤ４：ＣＤ８比は、およそ４：１であった（図６Ａ）。これに対し、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）マウスでは生着したＣＤ４＋  Ｔ細胞は非常に少なかったが、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌマウスでは高レベルのＣＤ４＋  Ｔ細胞が生着し、そのためそれぞれ、非常に低いおよび高いＣＤ４：ＣＤ８比をもたらした。ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおけるＣＤ３＋  Ｔ細胞のＣＤ４：ＣＤ８比は、ＮＳＧマウスにおいて観察された比と類似であり（図６Ａ）、ヒトＴ細胞サブセットもＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの両方を欠如するマウスにおける生着のために選択的利点を有しないことを示唆した。４つ全ての株におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の大部分は、活性化マーカーであるＰＤ−１を発現した（図６Ｂ、図６Ｃ）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＤ３＋  Ｔ細胞（図６Ｄ）ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞のＰＤ−１染色（図６Ｅ、図６Ｆ）の代表的なヒストグラムを示す。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化状態を決定するために、各サブセットを、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７に関して染色した。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋細胞は、ナイーブＴ細胞と標識し、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋細胞は、セントラルメモリーＴ細胞と標識し、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−細胞は、Ｔエフェクター／エフェクターメモリーＴ細胞と標識し、およびＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−細胞は、エフェクターメモリーＲＡ（ＴＥＭＲＡ）Ｔ細胞と標識する。両方のＣＤ４＋（図６Ｇ）およびＣＤ８＋  Ｔ細胞集団（図６Ｈ）において、ＰＢＭＣ注射後４週目に血液中非常に少数のナイーブＴ細胞が観察された。少数のセントラルメモリーＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞が検出されたが、ＴＥＭＲＡ  ＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞はほとんど存在しなかった。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の大部分は、エフェクター／メモリーＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞であった（図６Ｇ、図６Ｈ）。
【０２５３】
ＰＢＭＣを注射したＮＳＧ、ＮＳＧ−（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌ、およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスに生着しているヒトＴ細胞の表現型分析
【０２５４】
ＮＳＧマウスにおけるＣＤ４：ＣＤ８  Ｔ細胞比は、この場合もおよそ４：１であった（図７Ａ）。ＭＨＣクラスＩＩ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌおよびクラスＩ  ＫＯ  Ｂ２Ｍｎｕｌｌマウスは同様に、ＮＳＧ−（ＩＡｎｕｌｌ）およびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌマウスにおいて観察されたように、それぞれ低いおよび高いＣＤ４：ＣＤ８  Ｔ細胞比を有した（図６Ａ）。ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウス（図７Ａ）は、ＮＳＧにおいておよびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥ）ｎｕｌｌマウスにおいて観察された約３：１の、３：１のＣＤ４：ＣＤ８比を示した（図６Ａ）。ＭＨＣ  ＫＯマウスの４つ全ての株におけるＣＤ４（図７Ｂ）およびＣＤ８（図７Ｃ）細胞の大部分は、活性化マーカーＰＤ−１を発現した。ＣＤ４およびＣＤ８染色（図７Ｄ）ならびに抗ＰＤ−１によるＣＤ４（図７Ｅ）およびＣＤ８（図７Ｆ）染色の代表的なヒストグラムを示す。４つ全ての株では、ＣＤ４（図７Ｇ）またはＣＤ８（図７Ｈ）ナイーブ、またはＴＥＭＲＡ細胞はほとんど観察されなかったが、いくつかのセントラルメモリー細胞は存在した。Ｔ細胞の大部分は、ＣＤ４５−ＣＣＲ７＋エフェクター／エフェクターメモリーサブセットにおいてであった（図７Ｇ、図７Ｈ）。
【０２５５】
ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスに生着したヒトＴ細胞は機能的である
ヒト同種異系島を生着させたＮＳＧマウスへのヒトＰＢＭＣの注射により、島同種異系移植片の拒絶が起こる。ＮＳＧ  ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウトマウスに生着したヒト免疫細胞が機能的であるか否かを決定するために、ラットインスリンプロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体を発現する新たなマウス株、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）を創出した。ジフテリア毒素（ＤＴ）の、ラットインスリンプロモーターの制御下でジフテリア毒素受容体を発現する雄性マウスへの注射により、マウスベータ細胞死、および高血糖症が起こる。ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）株は、マウス膵ベータ細胞の完全かつ特異的な除去を可能にし、ストレプトゾトシンなどの糖尿病誘発薬の広い毒性効果を回避する。図８Ａに示すように、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスへのＤＴの注射は、糖尿病の急速な発症をもたらした。ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）株を使用して、ヒトＰＢＭＣが高血糖性のＮＳＧ  ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウトマウスにおいて島同種異系移植片を拒絶する能力を試験した。
【０２５６】
ヒトＩＥＱ  ４０００個の脾臓内移植は、マウスにおいて１〜２日以内に正常血糖を回復させた。次いで、これらのマウスを２群に分けた。１つの島移植群に同種異系ＰＢＭＣ  ５０×１０６個をＩＰ注射し、他の群にＰＢＭＣを与えずに、同種異系免疫系の非存在下でのヒト島の機能を確認した。ヒト島のみを受けた対照マウスは実験期間を通して正常血糖のままであった（Ｎ＝３）。これに対し、同種異系ヒトＰＢＭＣを受けたマウス４匹中３匹は、３〜４週間後に高血糖症へと逆戻りした（図８Ａ）。
【０２５７】
ＰＢＭＣ注射島移植マウスにおけるヒトＣＤ４５＋細胞の生着レベルは、血液中で経時的により高いパーセンテージに向かう傾向があり、ＰＢＭＣ注射の７週間後に分析すると、脾臓において最大約７０％のヒトＣＤ４５＋細胞が存在した。ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）株におけるこのヒトＣＤ４５＋細胞生着レベルは、ＰＢＭＣ生着ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスで観察されたレベルよりも高かったが（図４Ｂ）、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスでは、細胞１０×１０６個を注射したのと比較して、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスでは、５倍多くの数のヒトＰＢＭＣ（５０×１０６個）を注射した。血液中のＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージが低下したのに対し、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージが劇的に増加したことから、血液中のＣＤ４：ＣＤ８細胞比は、実験期間の間に劇的に変化した（図８Ｃ）。実験の終了時、脾臓におけるＣＤ４：ＣＤ８  Ｔ細胞比もまた、ＣＤ８  Ｔ細胞の劇的な増加を示した（図８Ｄ）。６週目での血液中のヒトＣペプチドレベルは、ヒトＰＢＭＣを受けた島生着マウス４匹中３匹で減少し、高血糖症へと逆戻りしなかったマウス１匹は、同種異系ＰＢＭＣを移植しなかった島レシピエントにおいて観察されたレベルと類似のＣペプチドレベルを有した（図８Ｅ）。しかし、同種異系ＰＢＭＣを与えたマウス４匹全てにおいて、島移植片において観察されたヒトインスリンの量は、ヒトＰＢＭＣを与えられなかった島移植レシピエントと比較して大幅に低かった（図８Ｆ）。
【０２５８】
このように、ＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスに生着したヒトＰＢＭＣは、高血糖症のＮＳＧ−ＲＩＰ−ＤＴＲ（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスに容易に生着した。ヒト島同種異系移植片は、高血糖症への逆戻りによって証明されたように拒絶され、これは組織学的に確認された。このことはまた、循環中のＣペプチドの低減および移植片に残っているインスリンの絶対量の減少によっても確認された。島移植マウスは、血液および脾臓の両方においてＣＤ８  Ｔ細胞の割合を増加させた。このことは、島同種異系移植片の存在が、細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞集団を優先的に刺激し、増大させたことを示唆している。これらのデータは、ヒトＰＢＭＣ機能を、ＧＶＨＤ応答が進行の非存在下でＮＳＧ  ＭＨＣ  Ｉ／ＩＩノックアウトマウスにおいて評価することができることを考証している。
【０２５９】
ＰＢＭＣを移植したＮＳＧおよびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおけるＡＡＶ−ＩＬ２での処置による生着ヒトＴ細胞の調節
【０２６０】
臨床へと進んでいる薬物の多くは、免疫調節剤であり、臨床試験に入っているこれらのうちの１つは、組換えＩＬ２の投与である。高用量ＩＬ２は、がん治療のために使用されているが、低用量ＩＬ２は自己免疫疾患を処置するために使用されている。
【０２６１】
ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスに生着したヒトＴ細胞が機能的である（図８Ａ）が、急性のＧＶＨＤを媒介しない（図３）ことが示されたことから、次に、ヒト組換えＩＬ２の投与がＴ細胞集団を調節することができるか否かを決定した。ＡＡＶ８−ヒトＩＬ２発現ベクターの注射によるヒトＩＬ２の投与により、ヒト胎児肝臓および胸腺の生着によってヒト化したＮＳＧマウス、すなわちＢＬＴモデルにおいてヒトＴｒｅｇの割合が増加した。ＡＡＶ−ｈｕＩＬ２の注射によって、ＰＢＭＣ  １０×１０６個を２週間生着させたＮＳＧおよびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスの血液中のヒトＣＤ４５＋細胞の一過性の増大が起こった（図９Ａ）。ＡＡＶ−ＩＬ２は、ＣＤ３＋であるヒトＣＤ４５＋細胞の割合を８週間の実験にわたって変化させなかった（図９Ｂ）。しかし、ＰＢＭＣの注射後、ＮＳＧマウスでは２、４、および６週目に、ならびにＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスでは２および４週目に、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）表現型（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−ＦＯＸＰ３＋）を発現するＣＤ４＋細胞の割合の大幅な増加があった（図９Ｃ）。ＣＤ２５およびＣＤ１２７に対する抗体によるＣＤ４＋  Ｔ細胞の代表的な染色を上の列に示し、ＡＡＶＩＬ２を投与したまたは投与していないＮＳＧおよびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおける推定のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現を下の列に示す（図９Ｄ）。Ｔｒｅｇ細胞の相対的パーセンテージは、両方の株において、ＰＢＭＣ生着後、２週目から８週目まで着実に減少し、８週目ではＣＤ４＋  Ｔ細胞の正常レベルであった。ＮＳＧおよびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスに与えたＡＡＶ−ＩＬ２ベクターを使用すると、ＩＬ２レベルは、２週目（２１９±４８および２６２±４０ｐｇ／ｍｌ）からそれぞれ４週目（１５９±５９および２１４±６２ｐｇ／ｍｌ）まで、それぞれ６週目（１１０±５３および１３０±７２ｐｇ／ｍｌ；ＮＳＧでは２、４、および６週目でＮ＝８、ならびにＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスでは２週目でＮ＝５、および４および６週目でＮ＝４）まで毎週減少した。循環中のＩＬ２のこの減少は、本実験におけるＴｒｅｇの喪失と相関する。
【０２６２】
しかし、ＡＡＶ−ＩＬ２の投与はまた、ＮＳＧマウスおよびＡＡＶ−ＩＬ２で処置したＮＳＧマウスにおいて観察された生存より、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスの生存を短縮させた（図９Ｅ）。ＡＡＶ−ＩＬ２の注射はまた、ＡＡＶ−ＩＬ２を注射していないマウスと比較して、ＮＳＧおよびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスの両方においてＣＤ４：ＣＤ８比を主にＣＤ８  Ｔ細胞の比へと変化させた（図９Ｆ）。ＣＤ４＋  Ｔ細胞集団におけるＣＤ４およびＣＤ８ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクター／エフェクターメモリーおよびＴＥＭＲＡサブセットの割合は、ＡＡＶ−ＩＬ２処置ありまたはなしのＮＳＧおよびＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスの血液中で差はなかった。ＣＤ８  Ｔ細胞集団におけるＴ細胞サブセットの割合の唯一の差は、エフェクター／エフェクターメモリーＴ細胞サブセットであり、これはＡＡＶ−ＩＬ２で処置したマウスにおいて増加した（図９Ｇ）。ＡＡＶ−ＩＬ２処置ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおけるＣＤ８＋エフェクター／エフェクターメモリーＴ細胞の増加と相関して、グランザイムＢを発現するＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージが増加した（図９Ｈ）。
【０２６３】
ＰＢＭＣおよびヒト患者由来腫瘍細胞の同時投与
【０２６４】
ＮＳＧおよびＮＳＧ−Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスに、ＰＤＸ結腸腫瘍（２ｍｍ３）と共にＳＱを植え込み、１０日後に、非適合ドナーからのＰＢＭＣ  ２０×１０６個をＩＰ注射した。マウスを生存に関しておよび腫瘍成長に関してモニターした。
【０２６５】
図１０Ａは、ＰＢＭＣとヒト患者由来腫瘍細胞とを同時注射したＮＳＧマウスの群、およびＰＢＭＣとヒト患者由来腫瘍細胞とを同時注射したＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスの群のパーセント生存を示すグラフである。
【０２６６】
図１０Ｂは、１）ヒト患者由来腫瘍細胞を注射したＮＳＧマウス；２）ＰＢＭＣとヒト患者由来腫瘍細胞とを同時注射したＮＳＧマウス；ＰＢＭＣを注射したＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウス；およびＰＢＭＣとヒト患者由来腫瘍細胞とを同時注射したＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスにおける腫瘍成長を示すグラフである。このように、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）マウスは、ＰＤＸ腫瘍およびＰＢＭＣの同時生着を支持する。
【０２６７】
２つの異なるＮＳＧ  ＭＨＣクラスＩ／ＩＩノックアウトマウスモデル、ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）株およびＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）株を使用して、これらの実施例は、ヒトＰＢＭＣが生着したが、実験期間の終了まで、一部の例ではＰＢＭＣ生着後１２５日間にわたって、マウスが急性ＧＶＨＤ様疾患を発症しなかったことを示す。これらの生着したヒトＴ細胞は、ヒト島同種異系移植片の拒絶能により示されるように機能的であった。その上、ヒトＴ細胞は、ヒトＴ細胞の増大につながるＡＡＶベクターを使用して組換えヒトＩＬ２を提供することによって証明されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏで調節することができた。ＮＳＧ−（Ｋｂ  Ｄｂ）ｎｕｌｌ（ＩＡｎｕｌｌ）株では、ヒトＩｇＧクリアランスはＮＳＧマウスにおいて観察されたクリアランスと同等であったが、ＮＳＧ−Ｂ２Ｍｎｕｌｌ（ＩＡ  ＩＥｎｕｌｌ）株におけるＩｇＧクリアランスは極めて急速であった。
【０２６８】
本明細書において言及したいかなる特許または刊行物も、あたかも各個々の刊行物が具体的および個々に参照により組み込まれていると示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２６９】
本明細書に記載の組成物および方法は、現在好ましい実施形態を表しており、例示的であり、本発明の範囲に対する制限として意図されない。それらに対する変更および他の使用は、当業者に想起されるであろう。そのような変更および他の使用は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１Ａ】
2020519282.tif 000003
【図１Ｂ】
2020519282.tif 000004
【図１Ｃ】
2020519282.tif 000005
【図２】
2020519282.tif 000006
【図３】
2020519282.tif 000007
【図４Ａ】
2020519282.tif 000008
【図４Ｂ】
2020519282.tif 000009
【図４Ｃ】
2020519282.tif 000010
【図４Ｄ】
2020519282.tif 000011
【図５Ａ】
2020519282.tif 000012
【図５Ｂ】
2020519282.tif 000013
【図５Ｃ】
2020519282.tif 000014
【図５Ｄ】
2020519282.tif 000015
【図６Ａ】
2020519282.tif 000016
【図６Ｂ】
2020519282.tif 000017
【図６Ｃ】
2020519282.tif 000018
【図６Ｄ】
2020519282.tif 000019
【図６Ｅ】
2020519282.tif 000020
【図６Ｆ】
2020519282.tif 000021
【図６Ｇ】
2020519282.tif 000022
【図６Ｈ】
2020519282.tif 000023
【図７Ａ】
2020519282.tif 000024
【図７Ｂ】
2020519282.tif 000025
【図７Ｃ】
2020519282.tif 000026
【図７Ｄ】
2020519282.tif 000027
【図７Ｅ】
2020519282.tif 000028
【図７Ｆ】
2020519282.tif 000029
【図７Ｇ】
2020519282.tif 000030
【図７Ｈ】
2020519282.tif 000031
【図８Ａ】
2020519282.tif 000032
【図８Ｂ】
2020519282.tif 000033
【図８Ｃ】
2020519282.tif 000034
【図８Ｄ】
2020519282.tif 000035
【図８Ｅ】
2020519282.tif 000036
【図８Ｆ】
2020519282.tif 000037
【図９−１】
2020519282.tif 000038
【図９−２】
2020519282.tif 000039
【図９−３】
2020519282.tif 000040
【図１０】
2020519282.tif 000041
【国際調査報告】
2020519282.tif 000042
2020519282.tif 000043
2020519282.tif 000044
2020519282.tif 000045
2020519282.tif 000046
2020519282.tif 000047
2020519282.tif 000048
2020519282.tif 000049