【手続補正書】
【提出日】平成28年11月21日(2016.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
【図１】（Ａ）実施例で用いたPEI-D-GlcNAc-ICGの構造を表す化学式である。（Ｂ）実施例で合成したポリマーのFT-IRスペクトル図である。（Ｃ）PEI-DおよびPEI-D-GlcNAcの1H-NMRスペクトルである。１．９ｐｐｍがGlcNAcのCOCH3で、２．２−３．０ｐｐｍがPEIのNHCH2CH2である。（Ｄ）PEI-D-GlcNAcとPEI-D-GlcNAc-ICGのＵＶスペクトル図である。
【図２】（Ａ）PEI-D-GlcNAc-ICGとsiRNAを用いた複合体（nanocomplex）の形成を表す模式図である。（Ｂ）DTT存在下（右）および非存在下（左）での、複合体のアガロース電気泳動によるゲルシフトアッセイの結果を示す写真である。
【図３】（Ａ）TEMによるPEI-D-GlcNAc-siRNAの形態とサイズを観察した写真である。（Ｂ）DLS計算により得られた各複合体(PEI-D-GlcNAc-siRNAおよびPEI-D-GlcNAc-ICG-siRNA)のサイズとサイズ分布を示すグラフである。（Ｃ）DTT添加による複合体のサイズ変化を示すグラフである。（Ｄ）DTT添加による蛍光強度の変化を示すグラフである。
【図４】HSCsに対する合成したポリマーの細胞毒性の有無を確認するために、細胞生存率をMTTアッセイにより調べた結果を示すグラフである。データは平均±標準偏差（n=3）として示す。
【図５】細胞によるFITC結合siRNA／ポリマー複合体の取り込みを確認するために、共焦点顕微鏡により細胞を蛍光観察した写真である。（Ａ）複合体と細胞内デスミンの相互作用を示す共焦点顕微鏡の蛍光観察写真である。（Ｂ）複合体とHSCs細胞表面のデスミンとの相互作用を示す共焦点顕微鏡の蛍光観察写真である。なお、蛍光観察写真（Ａ）および（Ｂ）中の赤色はデスミン、緑色はFITC結合SiRNA、青色はDAPIである。（Ｃ）（左）複合体によるsiTGFβ1のトランスフェクション後のα−SMAおよびTGFβ1のウェスタンブロット法による分析結果を示す写真である（スケールバー：５０μｍ）。（右）β−アクチンバンドに対するα−SMAおよびTGFβ1それぞれの相対的強度のデンシメータ分析の結果を示すグラフである（p<0.05）。
【図６】ICG蛍光のInvivoイメージングの結果を示す写真である。（Ａ）PEI-D-GlcNAc-ICGを投与した後の、肝線維症マウス（Fibrosis）と健常マウス(Normal)の光学イメージ写真である。（Ｂ）PEI-D-ICGおよびPEI-D-GlcNAc-ICG注射後の肝線維症マウスのイメージ写真である。（Ｃ）臓器（肝臓、脾臓および腎臓）のEx vivo 蛍光イメージ写真である。左がPEI-D-GlcNAc-ICG投与６日後、右がICG単独投与６日後である。
【図７】（Ａ）PEI-D-GlcNAc-ICG、PEI-D-ICGまたはPEI-D-HA-ICG投与後の共焦点顕微鏡を用いた肝臓低温切片の免疫組織化学分析の結果を示す写真である。写真中の緑色はデスミン、赤色はICG、青色はDAPIである。（Ｂ）デスミン陽性細胞のICG導入細胞に対する割合を示すグラフである。平均±標準偏差。各サンプルについて独立に１０箇所観察したものである。
【図８】（Ａ）（左）複合体を用いてsiTGFβ1を投与した後の肝組織中のα−SMAおよびTGFβ1のウェスタンブロット法の結果を示す写真である。（右）β−アクチンバンドに対するα−SMAおよびTGFβ1それぞれの相対的バンド強度のデンシメータ分析の結果を示すグラフである。（Ｂ）PEI-D-GlcNAcを用いたsiTGFβ1投与後の肝臓切片のH&E染色写真である(p<0.05)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
（肝線維症のイメージングおよび治療）
肝線維症の診断および治療のために、PEI-D-GlcNAc-ICG/TGFβ1 siRNA複合体をマウスに静脈注射し（２００μｌ）、最初の注射から３日後、PEI-D-GlcNAc /TGFβ1 siRNA複合体をマウスに静脈注射した。複合体およびICGを注射されたマウスを、１日後、２日後に、IVIS Luminaイメージングシステム(Xenogen社)にて、ICGフィルターセットを用いて観察した。PEI-D-GlcNAc-ICG/TGFβ1 siRNA複合体の治療効果を、最初のトランスフェクションから７日後に、ウェスタンブロット、Ｈ&Ｅ染色を行い確認した。Ex vivoイメージングを行うために、複合体の注射から６日後に、マウスを解剖し、肝臓、脾臓および腎臓を、上記イメージングシステムによって観察した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
（ナノ複合体を用いた肝線維症のイメージング）
肝線維症を、ICG結合複合体を用いて観察した。マウスに対して、四塩化炭素を用いて線維症を誘導し、ヘマトキシリン、エオシン染色(H&E染色)による組織分析を通じて確認した。健常マウスおよび肝線維症マウスの尾静脈へのPEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体の注射の後、複合体は当初肝臓内に局在した。１日後、複合体の蛍光シグナルは、線維症マウスのみで観察され、健常マウスでは消失した（図６Ａ参照）。さらに、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体は、２日後の肝線維症マウスにおいて、PEI-D-ICG/siRNA複合体よりも強く蛍光シグナルを発した（図６Ｂ参照）。Ex vivo実験において、健常マウスおよび肝線維症マウスを注射後６日後に解剖し、肝臓、脾臓および腎臓を単離した。図６Ｃに示されるように、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体は、肝線維症の肝臓にのみ強く局在し、健常マウスの肝臓には蓄積していなかった。一方、ICG単独を注射した場合、健常マウス、肝線維症マウスの双方において蛍光シグナルは検出されなかった。ICGは病変の診断に一般的に用いられるが、蛍光シグナルが早期に消失してしまうことが病変状態のイメージングにおける長年の課題であった。PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体は、肝線維症マウスにおいてのみ、ICG単独よりも長く保持された。従って、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体の長期に渡る蛍光シグナルは、より安定な肝線維症の診断を可能にすると考えられる。肝線維症に深く関与するHSCsがPEI-D-GlcNAc-ICG/siRNA複合体と相互作用するかどうかを調べるために、免疫染色を行った。図７Ａが示すように、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体はデスミン陽性のHSCsのほぼ全てと相互作用した。一方、PEI-D-ICG/siRNA複合体およびPEI-D-HA-ICG/siRNA複合体は、HSCsのみならず他の細胞とも共局在した。ICG蛍光細胞に対するデスミン陽性細胞の計量により、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNAナノ複合体の注入後、全ICG陽性細胞のうち７９％がHSCsであったことが明らかとなった。これに対して、PEI-D-ICG/siRNA複合体およびPEI-D-HA-ICG/siRNA複合体の注入後では、それぞれ３０％、３２％のICG陽性細胞がHSCsであった（図７Ｂ参照）。これらの結果は、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体が、肝繊維症に関連するHSCsとほぼ独占的に相互作用し、それによって肝臓の繊維領域に対してのみ選択的に輸送することが可能であると考えられる。ICGは１５分後の蛍光残存率による肝機能の測定に用いられてきた。PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体が、健常な肝臓と肝線維症の肝臓とで、注入後長時間を経た後でも蛍光残存率においてより大きな違いをもたらすことが期待される。従って、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体を用いることで、より正確な肝線維症の分析が可能となる。