(57)【要約】  本発明は、子宮内膜症を患っている、それの発症リスクを有する、及び／又はそれと診断されている患者の治療及び／又は予防で使用されるＧタンパク質共役受容体８４（ＧＰＲ８４）の拮抗薬若しくは阻害薬、並びにそのような拮抗薬若しくは阻害薬のスクリーニング方法、並びに診断方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜症を患っている患者、子宮内膜症を発症するリスクのある患者、及び／又は子宮内膜症と診断されている患者の治療及び／又は予防での使用のための、Ｇタンパク質共役受容体８４（ＧＰＲ８４）の拮抗薬又は阻害薬。
【請求項２】
ＧＰＲ８４に特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体またはその抗原結合断片若しくは誘導体である、請求項１に記載の拮抗薬又は阻害薬。
【請求項３】
核酸阻害薬である、請求項１に記載の拮抗薬又は阻害薬。
【請求項４】
少なくともＧＰＲ８４タンパク質をコードするポリヌクレオチドのサブストレッチ（ｓｕｂｓｔｒｅｔｃｈ）に特異的に結合する核酸分子を含む、請求項３に記載の拮抗薬又は阻害薬。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、参照番号Ｑ９ＮＱＳ５下にＵｎｉｐｒｏｔに開示されているＡＡ配列、好ましくは配列番号１に記載の配列、を含むＧＰＲ８４タンパク質をコードする、請求項３又は４に記載の拮抗薬又は阻害薬。
【請求項６】
アプタマーである、請求項３に記載の拮抗薬又は阻害薬。
【請求項７】
小分子である、請求項１に記載の拮抗薬又は阻害薬。
【請求項８】
前記抗体、アプタマー又は小分子によって阻害又は拮抗されるＧＰＲ８４タンパク質が、参照番号Ｑ９ＮＱＳ５下にＵｎｉｐｒｏｔに開示されているＡＡ配列、好ましくは配列番号１に記載の配列、を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の拮抗薬又は阻害薬。
【請求項９】
ＧＰＲ８４  ｃＡＭＰ放出アッセイで測定した場合に、
・５ｍＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは９．４ｎＭ以下のＩＣ５０値でエンベリン誘発ＧＰＲ８４活性化を阻害し、及び／又は
・５ｍＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは１６ｎＭ以下のＩＣ５０値で２−ＯＨデカン酸誘発ＧＰＲ８４活性化を阻害し、及び／又は
・５ｍＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは２０ｎＭ以下のＩＣ５０値で６−ｎ−オクチルアミノウラシル誘発ＧＰＲ８４活性化を阻害する、
前記請求項のいずれか１項に記載の拮抗薬又は阻害薬。
【請求項１０】
・ジヒドロピリドイソキノリノン
・ジヒドロピリミジノイソキノリノン
を含むリストから選択される群の一つの構成員である、請求項１及び７〜９のいずれか１項に記載の拮抗薬又は阻害薬。
【請求項１１】
前記子宮内膜症が、
・同所性子宮内膜と比較しての、異所性病変における中鎖遊離脂肪（ＭＣＦＦＡ）酸、及び／又はアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ酵素（ＡＣＯＴ）及び／又は脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）の存在；及び／又は
・対照患者から取ったマクロファージと比較しての、子宮内膜症患者から取ったマクロファージでのＧＰＲ８４の発現増加；及び／又は
・対照患者から取った単球及び／又はマクロファージと比較しての、子宮内膜症患者から取った単球及び／又はマクロファージでのＧＰＲ８４陽性細胞の割合の上昇
を特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の拮抗薬。
【請求項１２】
前記治療が、子宮内膜症関連の炎症性疼痛の治療である、前記請求項のいずれか１項に記載の使用のための拮抗薬。
【請求項１３】
子宮内膜症と診断されている、それを患っている又はそれの発症リスクのあるヒト若しくは動物対象者の治療での、又はそのような状態の予防のための（医薬の製造のための）前記請求項のいずれか１項による拮抗薬又は阻害薬の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の拮抗薬又は阻害薬を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物、及び１以上の他の治療活性化合物の組み合わせ。
【請求項１６】
ＧＰＲ８４の望ましくない発現に関連する子宮内膜症の治療又は予防方法であって、処置を必要とする対象者に対して、有効量の請求項１４に記載の医薬組成物又は請求項１５に記載の組み合わせを投与することを含む方法。
【請求項１７】
子宮内膜症を患っている、それの発症リスクを有する及び／又はそれと診断されている患者における子宮内膜症の治療及び／又は予防で使用される化合物を同定する方法であって、
・５ｍＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは９．４ｎＭ以下のＩＣ５０値でエンベリン誘発ＧＰＲ８４活性化を阻害するか否か、及び／又は
・５ｍＭ、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは１６ｎＭ以下のＩＣ５０値で２−ＯＨデカン酸誘発ＧＰＲ８４活性化を阻害するか否か、及び／又は
・５ｍＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは２０ｎＭ以下のＩＣ５０値で６−ｎ−オクチルアミノウラシル誘発ＧＰＲ８４活性化を阻害するか否か
に関して、ＧＰＲ８４  ｃＡＭＰ放出アッセイで１以上の被験化合物をスクリーニングすることを含む方法。
【請求項１８】
ある化合物が、５ｍＭ以下、最も好ましくは９．４ｎＭ以下のＩＣ５０値で前記エンベリン誘発ＧＰＲ８４活性化を阻害し、及び／又は５ｍＭ以下、最も好ましくは１６ｎＭ以下のＩＣ５０値で前記２−ＯＨデカン酸誘発ＧＰＲ８４活性化を阻害する場合、その化合物が、前記治療及び／又は予防での使用に適していると見なされる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮内膜症の治療及び／又は予防のためのヒトＧＰＲ８４の阻害薬及び拮抗薬の使用に関する。本発明による阻害薬及び拮抗薬は、抗体、核酸、アプタマー又は小分子である。本発明は、そのような阻害薬及び拮抗薬を見いだすためのアッセイ及びスクリーニング技術も提供する。
【背景技術】
【０００２】
子宮内膜症は、出産年齢女性の５〜１０％が患い、主として骨盤腔内で見られる異所での子宮内膜組織の成長と定義される。この子宮外成長は、慢性炎症微小環境を生じ、慢性疼痛症状に寄与する疾患の心臓徴候としての炎症性マクロファージの浸潤を伴う。
【０００３】
子宮内膜症の女性の腹膜病変及び腹水は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び貪食マクロファージなどの白血球［一緒にその疾患を特徴付ける炎症性環境に寄与するＴ−リンパ球類に加えて］の浸潤を特徴とする。浸潤白血球の存在に加えて、子宮内膜症は、サイトカイン類及び二つの疼痛誘発性メディエータであるＴＮＦ−α及びＩＬ−１βなどの増殖因子のような炎症性メディエータのレベル上昇を特徴とする。
【０００４】
中鎖脂肪酸（ＭＣＦＦＡ）は、６〜１２個の炭素の尾部を有する脂肪酸であり、ＧＰＲ８４を活性化することができる。動物代謝のＦＡ類、外因的に誘導される（食事性）ＦＡ類及び内因的に合成されたＦＡ類の二つのソースがある。後者の生合成は、ＦＡＳＮによって触媒される。ＭＣＦＦＡ類は、軟骨細胞におけるＩＬ６の放出を刺激し、ミリスチン酸はヒト冠動脈平滑筋（ＨＣＡＳＭ）及び内皮（ＨＣＥＣ）細胞におけるＩＬ６及びＩＬ８レベルを上昇させる。
【０００５】
ＧＰＲ８４は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）受容体の群に属する。ＦＦＡ受容体の群は、４種類のＧＰＣＲ（ＦＦＡ１−ＦＦＡ２）並びに新たな構成員ＧＰＲ４２及びＧＰＲ８４からなる。ＦＦＡ受容体は、代謝機能及び免疫機能などの生体プロセスに関与する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
より広い発現パターンを有する他の全てのＦＦＡ受容体とは対照的に、ＧＰＲ８４は、主として各種白血球群で発現されると報告されている。
【０００７】
現在までのところ、子宮内膜症には治療法がないが、疼痛の治療及び子宮内膜症関連不妊症の治療という２種類の介入がある。薬物療法に関しては、ホルモン療法（プロゲステロン、プロゲスチン類、外因性エストロゲン類、経口避妊薬、ダナゾール（ダノクリン）、ゲストリノン、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）作動薬又はアロマターゼ阻害薬）、ＮＳＡＩＤ類、オピオイド類、又はペントキシフィリンを投与することができるが、子宮内膜のさらなる外科的切除、癒着、子宮内膜腫の切除、及び正常骨盤構造の回復を用いることができる。薬物介入及び外科的介入によって、ほぼ同等の疼痛緩和の効果が生じる。疼痛の再発が、医薬介入及び外科的介入で、それぞれ４４％及び５３％であることが認められている（２４）。
【０００８】
しかしながら、治療選択肢は、現時点では制限があるとともに不十分であり、効力、持続可能性、副作用低減、患者コンプライアンスなどに関してより良好な治療選択肢がなおも必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これら及びさらなる目的は、本発明の独立クレームによる方法及び手段によって満足される。従属クレームは具体的実施形態に関係するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図1は、Ｔｈｅ  Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ、ＵＳＡ）及びＧＢＩパーマネントレッド（ＧＢＩ、ＵＳＡ）基質溶液を加えて、特異的染色を行った。スライドグラスをさらに、Ｈ＆Ｅで対比染色した顕微鏡写真である。
【図２】図2は、フローサイトメトリー分析によって、対照患者と比べて子宮内膜症患者からのマクロファージでのＧＰＲ８４の発現レベルが高いことが示された図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明について詳細に説明する前に、理解すべき点として、本発明は、記載の機器若しくは組成物の特定の構成部分若しくは行動的特徴又は記載の方法の工程段階に限定されるものではなく、それはそのような機器及び方法が変わり得るものだからである。やはり理解すべき点として、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態の説明のみを目的とするものであり、限定するものではない。単に、一定の数量が相互に異なる従属クレームで引用されているからといって、それが、それらの数量の組み合わせを有利に用いることができないことを示すものではない。特許請求の範囲における参照符号は発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。留意すべき点として、明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により別の意味が明瞭に指示されていない限り、単数及び／又は複数の指示対象を含むものである。さらに、特許請求の範囲において、「を含む」という語は、他の要素や段階を排除するものではない。単に、一定の数量が相互に異なる従属クレームで引用されているといって、それは、それらの数量の組み合わせを有利に用いることができないことを示すものではない。
【００１２】
さらに理解すべき点として、数値によって区切られたパラメータ範囲が提供されている場合、その範囲は、それらの制限値を含むものと見なされる。
【００１３】
さらに理解すべき点として、本明細書に開示の実施形態は、互いに関係しないと考えられる個々の実施形態と理解されるものではない。一つの実施形態で論じられている特徴は、本明細書で示される他の実施形態との関連でも開示されるものである。１例において、ある具体的な特徴が一つの実施形態では開示されているが、別の実施形態では開示されていない場合、それが、当該特徴が当該他の実施形態で開示されていないものであることを必ずしも意味しないことは、当業者には明らかであると考えられる。他の実施形態についても前記特徴を開示することが本願の主旨であるが、明確さのため、及び明細書を扱い易い量に維持するために、それを行っていないことは、当業者であれば理解するものと考えられる。
【００１４】
本発明の文脈での「阻害」又は「軽減」は、対照、例えば未治療対照と比較して少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％だけ測定結果を低下させるものと理解すべきである。本開示の内容を考慮すれば、当業者には適した対照は明らかである。前記阻害又は軽減を求めるのに適したアッセイは、関連文献から当業者には容易に使用可能である。１実施形態において、本明細書において下記で言及されるｃＡＭＰ放出アッセイを用いて、前記阻害又は軽減を測定する。
【００１５】
「阻害」及び「拮抗」並びに「阻害薬」及び「拮抗薬」は、本明細書において互換的に使用される。
【００１６】
好ましい実施形態において、「阻害」という用語は、特異的阻害を指す。「特異的阻害」は、他の受容体はほとんど阻害されずに（好ましくは他のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ））、指定の受容体を阻害することを指す。好ましい実施形態において、「ＧＰＲ８４の特異的阻害」は、１以上の膜輸送体又は他のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、好ましくはノルエピネフリン（ＮＥＴ）、ドーパミン（ＤＡＴ）、カリウムチャンネルｈＥＲＧ、カリウムチャンネル（ＫＡＴＰ）、ＧＰＲ４０からなる群から選択される１以上をほとんど阻害せずに、ＧＰＲ８４活性を阻害することを指す。好ましい実施形態において、「他のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）」は、ＧＰＲ４０を指す。
【００１７】
好ましい実施形態において、ＧＰＲ８４の特異的阻害は、他のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）からなる群から選択される；好ましくはノルエピネフリン（ＮＥＴ）、ドーパミン（ＤＡＴ）、カリウムチャンネルｈＥＲＧ、カリウムチャンネル（ＫＡＴＰ）、及びＧＰＲ４０からなる群から選択される１以上の膜輸送体の活性を阻害することなく、対照と比較して少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％のＧＰＲ８４活性の阻害；最大で７５％、より好ましくは最大で５０％、さらにより好ましくは最大で１０％の阻害を指す。前記阻害又は軽減を測定する上での好適なアッセイは、関連する文献から当業者は容易に使用できるものである。１実施形態において、本明細書において下記で言及されるｃＡＭＰ放出アッセイを用いて、前記阻害又は軽減を測定する。他の受容体の阻害は、実施例の実験で例示の方法に従って評価することができる。
【００１８】
本発明の１実施形態によれば、子宮内膜症
・を患っている患者
・を発症するリスクのある患者、及び／又は
・と診断されている患者
の治療及び／又は予防での使用のために、Ｇタンパク質共役受容体８４（ＧＰＲ８４）の拮抗薬又は阻害薬が提供される。
【００１９】
驚くべきことに、本発明の発明者らは、ＧＰＲ８４が子宮内膜症患者の炎症細胞型及び罹患組織で発現されることを見出し、ＧＰＲ８４阻害が、その状態、例えば炎症疼痛に対する緩和効果を有することも示した。特に、ＧＰＲ８４阻害によって、イン・ビトロ子宮内膜症モデル内での炎症メディエータ及び発痛メディエータ、例えばＩＬ−１β及びＴＮＦαが減少した。従って、ＴＮＦαレベル及びＩＬ−１βレベルの両方の子宮内膜症関連のレベル上昇を低下させる方法を用いることによる、子宮内膜症及びそれの関連する症状の治療は、子宮内膜症の症状及び疾患進行を治療する可能性を有する。ある特定の実施形態において、当該拮抗薬又は阻害薬は、子宮内膜症関連の炎症疼痛を治療するためのものである。
【００２０】
さらに、本明細書において、ＧＰＲ８４作動薬、例えば中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）が、子宮内膜の組織及び病変に存在し、その疾患を特徴付ける炎症メディエータの上昇に寄与することが示される。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ＧＰＲ８４の拮抗薬又は阻害薬」という用語は、直接又は間接に、ＧＰＲ８４の活性を、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％低下又は阻害することができる化合物を指す。前記阻害又は軽減を測定するのに好適なアッセイは、関連文献から当業者には容易に使用できるものである。１実施形態において、本明細書において下記で言及されるｃＡＭＰ放出アッセイを用いて、前記阻害又は軽減が測定される。
【００２２】
好ましくは、ＧＰＲ８４の拮抗薬又は阻害薬は、上記で定義のＧＰＲ８４の選択的阻害薬である。
【００２３】
そのようなＧＰＲ８４活性は、例えば、ヒト及びマウスＰＢＭＣ又はマクロファージにおける炎症メディエータ放出のようなＧＰＲ８４の下流エフェクター機能である。
【００２４】
前記軽減又は阻害は、例えば、内因性及び合成ＧＰＲ８４作動薬結合を低減又は阻害することで行うことができる。作動薬結合の前記軽減又は阻害は、ＧＰＲ８４タンパク質への競合的又はアロステリック結合によって生じ得る。
【００２５】
ＧＰＲ８４の好ましい作動薬は、好ましくは炭素鎖長９〜１４を有する中鎖遊離脂肪酸（ＭＣＦＦＡ）である（２５、１９（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照）。それには、特には２−ＯＨデカン酸及びデカン酸などがあり、それらは特に好ましいＧＰＲ８４作動薬である。
【００２６】
ＧＰＲ８４の人工的作動薬は、６−ｎ−オクチルアミノウラシル（６−ＯＡＵ）である（１７（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照）。他の好ましい人工的作動薬が報告されており、例えば３，３′−ジインドリルメタン（１９（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照）、及びエンベリン（ＷＯ２００７０２７６６１Ａ１（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照）である。下記の表は、いくつかの本発明による選択される作動薬を示すものである。
【表１】
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【００２７】
１実施形態において、拮抗薬は、抗体、好ましくはＧＰＲ８４に特異的に結合するモノクローナル抗体であり、又は抗原結合断片又はそれの誘導体である。その抗体は、好ましくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、均質抗体群、即ち、全免疫グロブリン、又は抗原結合断片若しくはそれの誘導体からなる均質群を有する抗体組成物を指すものである。特に好ましくは、そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ、又はそれらの断片若しくは誘導体からなる群から選択される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、標的結合能力を保持するそのような抗体の断片、例えば
・ＣＤＲ（相補性決定領域）、
・超可変領域、
・可変領域（Ｆｖ）、
・ＩｇＧ重鎖（ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域からなる）、
・ＩｇＧ軽鎖（ＶＬ及びＣＬ領域からなる）、及び／又は
・Ｆａｂ及び／又はＦ（ａｂ）２
を指すものである。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、一般的な抗体の概念とは構造的に異なっているが、なおも一部構造的関係性を有するタンパク質構築物、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び／又はＦ（ａｂ）２、並びに二重、三重又はそれ以上の特異的抗体構築物若しくは一価抗体であって、さらに標的結合能力を保持しているものを指すものである。これらのもの全てについて、下記で説明する。
【００３１】
当業者に公知である他の抗体誘導体は、二重特異性抗体、ラクダ科動物抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖｓ、ＩｇＡｓ（Ｊ鎖及び分泌成分によって結合された二つのＩｇＧ構造）からなる二つの鎖を有する二価ホモ二量体、サメ抗体、新世界霊長類フレームワーク＋新世界霊長類ＣＤＲからなる抗体、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量化構築物、及び抗体複合体（例えば、毒素、サイトカイン、放射性同位体若しくは標識に連結された抗体又は断片又は誘導体）である。これらの種類は、文献に詳細に記載されており、さらなる本発明の活性を加えて、本開示に基づいて当業者が用いることができる。
【００３２】
上記で論じたように、ＧＰＲ８４は十分に特性決定されていることから、当業者はそれに対するモノクローナル抗体などの抗体を作ることができる。常法は、ハイブリドーマ、キメラ化／ヒト化、ファージディスプレイ／トランスジェニック哺乳動物、及び他の抗体操作技術を包含する。
【００３３】
ハイブリドーマ細胞の製造方法は、既報である（［３０］（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照）。実質的には、例えば、マウスをヒトＧＰＲ８４タンパク質で免疫化し、次に当該マウスからＢ細胞を単離し、単離Ｂ細胞をミエローマ細胞と融合させる。
【００３４】
キメラ又はヒト化ｍＡｂｓの製造及び／又は選択方法は当業界で公知である。実質的に、例えば、標的結合に関与しないマウス抗ＧＰＲ８４抗体からのタンパク質配列を、相当するヒト配列に代える。例えば、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＵＳ６３３１４１５にはキメラ抗体の製造について記載されており、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｏｕｎｃｉｌによるＵＳ６５４８６４０にはＣＤＲ移植技術が記載されており、ＣｅｌｌｔｅｃｈによるＵＳ５８５９２０５にはヒト化抗体の製造が記載されている。これらの開示は全て、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３５】
完全ヒトｍＡｂｓの製造及び／又は選択方法は当業界で公知である。これらでは、ヒトＧＰＲ８４で免疫化したトランスジェニック動物の使用、又は好適なディスプレイ技術、例えば酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、Ｂ細胞ディスプレイ又はリボソームディスプレイを用いることができ、ライブラリからの抗体を静止期でヒトＧＰＲ８４に対してスクリーニングする。
【００３６】
イン・ビトロ抗体ライブラリは、特に、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによるＵＳ６３０００６４で、ＭＲＣ／Ｓｃｒｉｐｐｓ／ＳｔｒａｔａｇｅｎｅによるＵＳ６２４８５１６で開示されている。ファージディスプレイ技術は、例えば、ＤｙａｘによるＵＳ５２２３４０９に開示されている。トランスジェニック哺乳動物プラットホームは、例えば、ＴａｃｏｎｉｃＡｒｔｅｍｉｓによるＥＰ１４８０５１５Ａ２に記載されている。これらの開示のいずれも、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３７】
ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び／又はＦ（ａｂ）２は、当業者には公知の抗体形態である。関連する技術が、個々の文献から入手可能である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ］という用語は、抗原結合領域を含むＩｇＧ断片に関するものであり、前記断片は抗体の各重鎖及び軽鎖からの一つの定常領域及び一つの可変領域からなる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「Ｆ（ａｂ）２」という用語は、１以上のジスルフィド結合によって互いに連結された二つのＦａｂ断片からなるＩｇＧ断片に関するものである。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ｓｃＦｖ」という用語は、短いリンカー、通常はセリン（Ｓ）又はグリシン（Ｇ）と一緒に連結された免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合である単鎖可変断片に関するものである。このキメラ分子は、定常領域の除去及びリンカーペプチドの導入にも拘わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【００４１】
改変抗体フォーマットは、例えば、二重若しくは三重抗体構築物、抗体に基づく融合タンパク質、免疫抱合体などである。これらの種類は、文献に詳細に記載されており、さらなる本発明の活性を加えて、本開示に基づいて当業者が用いることができる。さらに、一価抗体も、ＵＳ２００４／００３３５６１Ａ１（その出願ではモノボディと称されている）又はＷＯ２００７０４８０３７（両者とも、参照によって本明細書に組み込まれる。）で既報である。
【００４２】
従って、ＧＰＲ８４のアミノ酸配列の公表されているものに基づいて、例えば活性中心に結合することでＧＰＲ８４の拮抗薬として作用することができる好適な抗体又は断片若しくは又は誘導体を見出すことは、当業者には通常の実務である。
【００４３】
科学研究のためのＧＰＲ８４に対するポリクローナル抗体が、例えば、２〜３の例を挙げると、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ（ＰＡ５−３２８４３）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈ−３００、Ｄ−１５）又はＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＮＢＰ１−８４７６８）から市販されていることから、当業者であれば、ＧＰＲ８４に対する治療抗体を作ることが可能であることがわかる。
【００４４】
ＧＰＲ８４は７−膜貫通受容体タンパク質であることから、その抗体又はそれの断片若しくは誘導体は、ＧＰＲ８４の細胞外ドメイン若しくは細胞内ドメインに結合することができる。後者の場合、抗体又はそれの断片若しくは誘導体を細胞内空間に注ぎ込むか輸送する必要がある。そのためには、別段で（２６〜２８、参照によって本明細書に組み込まれる）開示されている常法を用いることができる。
【００４５】
１実施形態において、拮抗薬又は阻害薬は核酸阻害薬である。この実施形態は、例えば、少なくともＧＰＲ８４タンパク質をコードするポリヌクレオチドのサブストレッチ（ｓｕｂｓｔｒｅｔｃｈ）に特異的に結合する核酸分子を含むことができる。
【００４６】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号１に従って、参照番号Ｑ９ＮＱＳ５下にＵｎｉｐｒｏｔに開示されているＡＡ配列を含むＧＰＲ８４タンパク質をコードする。
【００４７】
核酸阻害薬アプローチの多くが、標的配列を有するそのような阻害性核酸分子、即ちＧＰＲ８４をコードするポリヌクレオチドの塩基対合に信頼するものである。ＧＰＲ８４をコードする前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのいずれかであることができる。
【００４８】
好ましくは、前記阻害薬は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡからなる群から選択される。
【００４９】
ｓｉＲＮＡは、化学的に修飾して安定性を高めることができる短い人工ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは二本鎖であることから、「センス」鎖及び「アンチセンス」鎖の原理も適用される。センス鎖は転写ｍＲＮＡと同じ塩基配列を有し、アンチセンス鎖は相補配列を有する。技術的には、患者に投与されたｓｉＲＮＡ分子は、Ａｒｇｏｎａｕｔと称される細胞内酵素によって結合されて、いわゆるＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成している。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡに導き、そこでアンチセンス鎖は標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし、それは次にＲＩＳＣによって開裂される。そのようにして、個々のｍＲＮＡの翻訳は中断される。次に、ＲＩＳＣは、さらなるｍＲＮＡを開裂させることができる。送達技術は、例えば、別の文献で開示されている（［２９］、参照によって本明細書に組み込まれる）。ＧＰＲ８４の異なるｍＲＮＡアイソフォームの公表されているものに基づいてｓｉＲＮＡの好適な配列を見出すことは、当業者には通常の実務である。
【００５０】
ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現を停止するのに用いることができる強いヘアピンカーブを有する人工ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、例えば、プラスミドによって、又はウィルス若しくは細菌ベクターによって細胞に送達することができる。ｓｈＲＮＡは、比較的低い分解及び代謝速度を有するという点で、ＲＮＡｉの有利なメディエータである。個々のプラスミドは、Ｕ６及びＨ１などのポリメラーゼＩＩＩプロモーター又はポリメラーゼＩＩプロモーターのようなｓｈＲＮＡを発現するのに好適なプロモーターを含む。プラスミド又はベクターがホストゲノムに統合されたら、ｓｈＲＮＡが核に転写される。その産生物はｐｒｉ−マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を模倣するものであり、ドローシャによって処理される。得られたｐｒｅ−ｓｈＲＮＡは、エクスポーチン５によって核から排出される。次に、この産生物はダイサーによって処理され、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に負荷され、その後、ｓｉＲＮＡの場合と同じサイレンシングに従う。ＧＰＲ８４の異なるｍＲＮＡアイソフォームの公表されているものに基づいて、ｓｈＲＮＡに好適な配列を見出すことは、当業者には通常の実務である。
【００５１】
第１の核酸分子は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系のガイドＲＮＡであることができ（３１）、そのガイドＲＮＡはＧＰＲ８４遺伝子のゲノム鎖でハイブリダイズすることができる標的特異的ｃｒＲＮＡ（「小干渉ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）を含む（又は、当該第１の核酸分子はｃｒＲＮＡ単独であることができる。）。ガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡは、エンドヌクレアーゼであるＣａｓ酵素をＧＰＲ８４遺伝子に指向させることができ、そのＣａｓ酵素は配列特異的鎖切断を行う。従って、１以上の二本鎖切断を作ることで、ＧＰＲ８４遺伝子を発現停止させることができる。ＧＰＲ８４のイン・ビボ遺伝子サイレンシングのために前記系を用いるためには、例えば他の文献に記載のように（３２）、脂質ナノ粒子などの送達媒体を含む専用の送達技術が必要である。ＧＰＲ８４遺伝子のゲノム配列の公表されているものに基づいて、ガイドＲＮＡに含まれるｃｒＲＮＡに好適な配列を見出すことは、当業者には通常の実務である。
【００５２】
別の実施形態において、前記第１の核酸分子は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１系のガイドであることもでき（３３）、そのガイドＲＮＡは、標的特異的ｃｒＲＮＡ（「小干渉ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓと同様に、ガイドＲＮＡは、エンドヌクレアーゼであるＣｐｆ１酵素を、ＧＰＲ８４遺伝子を指向させることができる。技術的考察、例えばイン・ビボ投与のための送達及び第１の核酸分子に好適な配列の確認に関して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓと同様の態様が適用される。
【００５３】
ＣＲＩＳＰＲ技術のさらなる実施形態は、異なるエンドヌクレアーゼで現在開発中である。しかしながら、これら全てのアプローチが、標的配列をハイブリダイズする標的特異的ＲＮＡ（ガイドＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ  ＣａｓでのようなｃｒＲＮＡ）を用いる。これら全ての場合で、標的特異的ＲＮＡは、本明細書で記載の好ましい実施形態の意味において第１の核酸分子と見なされる。技術的考察、例えばイン・ビボ投与のための送達及び第１の核酸分子に好適な配列の確認に関して、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓと同様の態様が適用される。
【００５４】
ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略される）は、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後制御で機能する植物、動物及び一部のウィルスで認められる小非コードＲＮＡ分子（約２２のヌクレオチドを含む）である。
【００５５】
１実施形態において、拮抗薬又は阻害薬はアプタマーである。アプタマーは、所定標的への特異的結合特性を有するオリゴヌクレオチドである。それらは、ＳＥＬＥＸ（「指数関数的豊富化によるリガンドの系統的進化」）と称される組み合わせプロセスにより最大１０１５個の異なる配列を含む無作為に合成されたライブラリから得られる。アプタマー特性は、それらの一次配列によって決定される分子内折り畳みから生じるそれらの３Ｄ形状によって示される。アプタマー３Ｄ構造は、水素結合、静電気的相互作用及びスタッキング相互作用によって、それの同種標的の認識に見事に適合される。アプタマーは通常、高いアフィニティを示す（Ｋｄｄは、小分子の場合はミクロモル（μＭ）であり、タンパク質の場合はピコモル（ｐＭ））。
【００５６】
標的特異的アプタマーを得るための技術レパートリーに関する概論が、例えば３４にあり、それは参照によって本明細書に組み込まれる。アプタマーは、３５に開示のように、細胞内空間に送達することもできる（参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００５７】
従って、異なるＧＰＲ８４アイソフォームのアミノ酸配列の公表されているものに基づいて、例えば活性中心に結合させることでＧＰＲ８４の拮抗薬として作用することができる好適なアプタマーを見出すことは、当業者には通常の実務である。
【００５８】
別の特に好ましい実施形態において、拮抗薬又は阻害薬は小分子である。好ましくは、前記小分子は有機分子であり、及び／又は前記小分子は≦５５０ＤＡ、好ましくは≦５００ＤＡ、より好ましくは≦４５０ＤＡより小さい分子量を有する。
【００５９】
好ましくは、抗体、アプタマー又は小分子によって阻害又は拮抗されるＧＰＲ８４タンパク質は、好ましくは配列番号１に従って、参照番号Ｑ９ＮＱＳ５下にＵｎｉｐｒｏｔで開示されているＡＡ配列を含む。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態において、拮抗薬又は阻害薬は、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％作動薬誘発ＧＰＲ８４活性化を低下又は阻害する。前記阻害又は低下を測定するための好適なアッセイは、関連文献から当業者には容易に使用可能である。１実施形態において、本明細書で下記で言及のｃＡＭＰ放出アッセイを用いて、前記阻害又は低下を測定する。
【００６１】
本発明の１実施形態によれば、拮抗薬又は阻害薬は、作動薬誘発ＧＰＲ８４活性化、好ましくは
・５ｍＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは９．４ｎＭ以下のＩＣ５０値でエンベリン誘発ＧＰＲ８４活性化、及び／又は
・５ｍＭ、好ましくは１０μＭ以下、最も好ましくは１６ｎＭ以下のＩＣ５０値で２−ＯＨデカン酸誘発ＧＰＲ８４活性化
を阻害する。
【００６２】
好ましくは、エンベリン誘発ＧＰＲ８４活性化及び／又は２−ＯＨデカン酸誘発ＧＰＲ８４活性化は、ＧＰＲ８４  ｃＡＭＰ放出アッセイで測定される。
【００６３】
阻害薬候補による作動薬誘発ＧＰＲ８４活性化の阻害は、例えば、下記の原理に従ってｃＡＭＰ放出アッセイで調べることができる。
【００６４】
ＧＰＲ８４活性は、細胞でのｃＡＭＰ産生を抑制する。従って、ＧＰＲ８４の阻害によって、細胞でのｃＡＭＰ含有量の増加を生じる。しかしながら、ｃＡＭＰレベルに対する効果を測定することで物質の阻害能力を調べる場合、観察される効果が一般的ｃＡＭＰ誘発効果ではなくＧＰＲ８４誘発効果であることを確認すべきである。好ましい選択肢は、物質（阻害薬候補）がＧＰＲ８４作動薬の阻害効果を逆転させるか否かを調べることである。ＧＰＲ８４によるＧαｉシグナル伝達の作動薬は、膜アデニリルシクラーゼ誘発細胞ｃＡＭＰ産生を阻害する。ＧＰＲ８４阻害薬（又はＧＰＲ８４拮抗薬）の添加により、ＧＰＲ８４作動薬存在下での膜アデニリルシクラーゼ誘発ｃＡＭＰ産生の（再）増加を生じる。従って、ＧＰＲ８４に対する拮抗効果によって、細胞におけるｃＡＭＰ含有量増加を生じる。阻害薬候補の拮抗効果は、好ましくは、ＧＰＲ８４作動薬及び膜アデニリルシクラーゼ活性化剤、例えばホルスコリンの存在下にａへのそれの暴露によって調べる。膜アデニリルシクラーゼ活性化によりｃＡＭＰレベルを非特異的に増加させる他の化合物や物質も用いることができる。ｃＡＭＰの分解を防止する１以上の化合物を加えて、この第二のメッセンジャーの十分な蓄積を確保することができる。そのような化合物には、ホスホジエステラーゼ阻害薬、例えば３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）などがある。
【００６５】
作動性ＧＰＲ８４誘発に対する効果を上記で評価しているように、ＧＰＲ８４特異的阻害を求めることは当業者には理解される。ＧＰＲ８４特異性をさらに強めるために、ＧＰＲ８４を過剰発現する細胞を用いることができ、例えば「ｃＡＭＰ  ＨｕｎｔｅｒＴＭ  ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＰＲ８４  Ｇｉ細胞」（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ；＃９５−０１５８Ｃ２）などがあるが、これに限定されるものではない。
【００６６】
上記で説明したように可能なＧＰＲ８４阻害薬と接触した細胞でのｃＡＭＰ含有量を測定し、それを適切な対照と比較することで、拮抗薬効果を測定することができる。対照と比較したｃＡＭＰ含有量の増加は、ＧＰＲ８４拮抗効果を示すものであり、その化合物を阻害薬と見なすものである。好ましくは、ある物質が、前記阻害薬候補、ＧＰＲ８４の作動薬、膜アデニリルシクラーゼ誘発ｃＡＭＰ産生の活性化剤、及びホスホジエステラーゼ阻害薬と接触した細胞のｃＡＭＰ含有量を、前記阻害薬候補を含まない適切な対照と比較して少なくとも２０％増加させる場合、その物質はＧＰＲ８４の阻害薬と見なされる。
【００６７】
当業者であれば、一般的な技術を用いて細胞中のｃＡＭＰ含有量（レベル）を検出することができる。一般的技術は、例えば、競合アッセイを用いることができる。基本的に、検出可能なトレーサーを、ｃＡＭＰ含有量を求めるサンプルの存在下にｃＡＭＰ結合剤と接触させ、その検出可能なトレーサーは、ｃＡＭＰと競合的にｃＡＭＰ結合剤に結合する。その競合アッセイは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイに適合する色素を用いることで、ｃＡＭＰ結合剤に結合したトレーサーの相対量を検出することができるように構築されるべきである。サンプルの存在下、サンプルに含まれるｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ結合剤への結合においてトレーサーと競合する。サンプルが細胞である場合、それのアッセイを行う前に、細胞を溶解させて、細胞内ｃＡＭＰ含有量を放出させることができる。ｃＡＭＰ結合剤に結合したトレーサーの検出量は、サンプル中のｃＡＭＰ含有量に反比例する。即ち、ｃＡＭＰ結合剤に結合するトレーサーについての強いシグナルは、サンプル中のｃＡＭＰ含有量が低いことを示し、逆に、ｃＡＭＰ結合剤に結合するトレーサーについてのシグナルが相対的に弱いと、サンプル中のｃＡＭＰ含有量が相対的に高いことを示す。最大シグナルは、ｃＡＭＰの非存在下で得られる。従って、細胞内でのｃＡＭＰ含有量の低下は、被験阻害薬の添加後の細胞におけるｃＡＭＰ含有量を、陰性対照及び／又は競合アッセイでの前記阻害薬候補の添加前と比較することで求めることができる。阻害薬候補に暴露されたサンプル中のｃＡＭＰ結合剤に結合するｃＡＭＰが相対的に多く検出されることは、ＧＰＲ８４に対する前記阻害薬候補の阻害（拮抗）効果を示す。従って、競合アッセイでの対照と比較して、阻害薬候補で処理したサンプルについての競合アッセイでのシグナルが弱いことは、ＧＰＲ８４に対する阻害薬候補の阻害効果を示す。
【００６８】
実際のｃＡＭＰ量の定量は、例えば、蛍光色素標識ｃＡＭＰトレーサー（例えば、ｃＡＭＰ−ｄ２、（Ｃｉｓｂｉｏ；ｃＡＭＰフェムト２キット；＃６２ＡＭ５ＰＥＪ・・・］）及びｃＡＭＰ結合剤、例えば標識抗ｃＡＭＰ抗体、例えばＥｕ−クリプテート標識抗ｃＡＭＰ抗体（Ｃｉｓｂｉｏ；ｃＡＭＰフェムト２キット；＃６２ＡＭ５ＰＥＪ）に基づく競合アッセイを用いて行うことができる。細胞溶解の際、存在する細胞ｃＡＭＰは、抗体へのトレーサの結合に関して競合する。そのようなシグナルは、例えば、トレーサー及びｃＡＭＰ結合剤に適合する蛍光色素を用いる場合、ＦＲＥＴを用いて測定することができる。色素に応じて、異なる発光波長及び励起波長を、当業者に明らかなように用いる。例えば上記のｄ２／Ｅｕ−クリプテートの組み合わせに関して、６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでのＦＲＥＴ誘発発光を、適切な高スループット蛍光（ＨＴＲＦ）リーダー（例えばＲｕｂｉＳｔａｒ；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて３３７ｎｍでの励起後に測定する。検出システムの競合性を考慮すると、作動薬治療によってｃＡＭＰレベルが低下し、ＨＴＲＦシグナルが増加する。ホルスコリン、作動薬及び拮抗薬の存在下でのＨＴＲＦシグナルにおける低下は、ＧＰＲ８４による阻害性Ｇαｉシグナル伝達の停止、従ってＧＰＲ８４に対する阻害効果を示すものである。
【００６９】
物質の阻害を検出する手順の例は、下記のように行うことができる。
【００７０】
１．アッセイ即応凍結細胞の製造
凍結細胞（ｃＡＭＰ  ＨｕｎｔｅｒＴＭ  ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＰＲ８４  Ｇｉ細胞；ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ；＃９５−０１５８Ｃ２）の再懸濁のため、１本のバイアルを液体窒素貯蔵庫から取り出し、３７℃の水浴中、ほぼ１〜３分間で急速解凍した。その直後に、予め加温した完全細胞培地（ＨＡＭのＦ１２；１０％ＦＣＳ；選択マーカーなし）１５ｍＬを含む５０ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎ管中に、傾斜法によって細胞を注意深く移す。緩やかな渦攪拌を用いて、それの再懸濁を助ける。次の段階で、直ちに、５分間の低ｇ遠心（Ｈｅｒｅａｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ４  ＫＲ；４００ｒｐｍ；ｒｃｆ＝４４ｇ）によって細胞を回収して、細胞ペレットの過剰圧縮を回避する。やさしく傾斜法分離することで、培地を除く。最後に、細胞ペレットを最終アッセイ培地（ＨＡＭのＦ１２；１０％ＦＣＳ；選択マーカーなし）５ｍＬに注意深く再懸濁させることで、アッセイ即応性とする。最後の段階で、細胞生存率及び実際の細胞数を求めてから（Ｏｍｎｉ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃａｓｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ／Ａｎａｌｙｚｅｒ）、最終播種細胞数に関して体積を補正する（即ち、２５００細胞／μＬ）。細胞播種は、マルチチャンネルピペット又は適切なバルク試薬ディスペンサーを用いて行う。
【００７１】
２．作動作用の試験（３８４ウェル方式）：
アッセイ即応凍結細胞２μＬずつを、非無菌３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；白色；＃７８４０７５；５０００細胞／ウェル）のウェルに直接播種する。直後に、アッセイ培地中（ＨＡＭのＦ１２；１０％ＦＣＳ；２ｍＭグルタミン；選択マーカーなし）で調製した２倍作動薬／２倍ＥＣ８０ホルスコリン（最終濃度＝８μＭ、Ｓｉｇｍａ；＃Ｆ６８８６）溶液２μＬずつを加える。６０分間のインキュベーション時間後、入荷状態のままのｃＡＭＰ−ｄ２トレーサー（Ｃｉｓｂｉｏ；ｃＡＭＰフェムト２キット；＃６２ＡＭ５ＰＥＪ）２μＬずつを加え、次に抗ｃＡＭＰ抗体含有細胞溶解干渉液（製造者の仕様書に従って調製した検出試薬）２μＬずつを別途加える。添加は全て、マルチチャンネルピペット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ｅ１-ＣｌｉｐＴｉｐＴＭ;＃４６７１０１０）又はバルク試薬ディスペンサー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉ）のいずれかを用いて行う。６０分後、適切なＨＴＲＦリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ：Ｐｈｅｒａｓｔａｒ）を用いて、時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）シグナルを測定する。
【００７２】
３．拮抗作用の試験（３８４ウェル方式）：
第１段階で、所定の試験範囲の４倍拮抗薬溶液（アッセイ培地で調製；ＨＡＭのＦ１２；１０％ＦＣＳ；２ｍＭグルタミン；選択マーカーなし）１μＬを、非無菌３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；白色；＃７８４０７５；直後に、アッセイ即応凍結細胞２μＬずつを、プレート（５０００細胞／ウェル）に直接播種する。）のウェルに加える。細胞を阻害薬候補（拮抗薬）の存在下に３０分間インキュベートしてから、やはりアッセイ培地中で調製した４倍作動薬ＥＣ８０（最終濃度：エンベリン＝６．００×１０−６Ｍ、６−ｎ−オクチルアミノウラシル＝１．３４×１０−７Ｍ）／４倍ＥＣ８０ホルスコリン（最終濃度＝８μＭ）溶液１μＬを加える。６０分のインキュベーション後、ｃＡＭＰ−ｄ２トレーサー２μＬを加え、次に抗ｃＡＭＰ抗体の細胞溶解緩衝液中溶液（製造仕様書に従って調製される検出試薬）２μＬを加える。添加は全て、マルチチャンネルピペット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ｅ１-ＣｌｉｐＴｉｐＴＭ;＃４６７１０１０）又はバルク試薬ディスペンサー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉ）のいずれかを用いて行う。６０分後、適切なＨＴＲＦリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ：Ｐｈｅｒａｓｔａｒ）を用いて、時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）シグナルを測定する。
【００７３】
本発明の１実施形態において、本発明による拮抗薬又は阻害薬は、
・ジヒドロピリドイソキノリノン
・ジヒドロピリミジノイソキノリノン
を含むリストから選択される群の一つの構成員である。
【００７４】
好ましくは、前記拮抗薬又は阻害薬は、ＵＳ２０１６２４４４４２Ａ１、ＷＯ２０１６１６９９１１Ａ１、ＵＳ２０１６０３９８０７Ａ１、及び／又はＷＯ２０１５１９７５５０Ａ１（これらの内容は参照によって本明細書に組み込まれる。）のいずれかに開示のジヒドロピリドイソキノリノン類の一つである。同様に好ましくは、前記拮抗薬又は阻害薬は、ＷＯ２０１４０９５７９８Ａ１（これの内容は参照によって本明細書に組み込まれる。）に開示のジヒドロピリミジノイソキノリノン類の一つである。特に好ましい実施形態において、前記拮抗薬又は阻害薬は下記のうちの一つである。
【表２】
2020519662.tif 000003
【００７５】
本発明の１実施形態において、子宮内膜症は下記のことを特徴とする。
【００７６】
・同所性子宮内膜と比較しての、異所性病変における中鎖遊離脂肪（ＭＣＦＦＡ）酸の存在増加、
・対照患者から取った単球及び／又はマクロファージと比較しての、子宮内膜症患者から取った単球及び／又はマクロファージでのＧＰＲ８４の発現増加、
・対照患者から取った単球及び／又はマクロファージと比較しての、子宮内膜症患者から取った単球及び／又はマクロファージでのＧＰＲ８４陽性細胞の割合の上昇。
【００７７】
そこでは、ＭＣＦＦＡという用語は、好ましくは、Ｃ９−Ｃ１４脂肪酸、好ましくはデカン酸及び／又はミリスチン酸を包含し、ＡＣＯＴという用語は、好ましくは、ＡＣＯＴ４及びＡＣＯＴ９を包含する、
本発明はさらに、子宮内膜症のような婦人科状態を特徴付ける方法であって、次の段階：
ａ）患者の異所性子宮内膜病変からサンプル（塗抹、生検、掻き取り）を取ること、
ｂ）そのサンプルでの中鎖遊離脂肪酸（ＭＣＦＡ）の有無を測定及び／又は定量すること、及び
ｃ）得られたパラメータの少なくとも一つを、（ｉ）対照患者又は同一患者の同所性子宮内膜から入手した、又は（ｉｉ）好適な文献若しくはデータベースから得た個々の（対照）パラメータと比較すること
を提供し、
対照と比較したＭＣＦＦＡの存在の増加が子宮内膜症の存在によるものである
方法を提供する。
【００７８】
さらに、本発明は、子宮内膜症のような婦人科状態を特徴付ける方法であって、次の段階：
ａ）単球及び／又はマクロファージを含む患者からのサンプル、好ましくは血液サンプルを取ること、
ｂ）そのサンプルに含まれる単球及び／又はマクロファージ中のＧＰＲ８４の発現を測定及び／又は定量すること、
ｃ）得られたパラメータを、（ｉ）健常患者の単球及び／又はマクロファージから入手した、又は（ｉｉ）好適な文献若しくはデータベースから得た個々の（対照）パラメータと比較すること
を提供し、
対照と比較した単球及び／又はマクロファージ中のＧＰＲ８４の発現増加が子宮内膜症の存在によるものである
方法を提供する。
【００７９】
さらに、本発明は、子宮内膜症のような婦人科状態を特徴付ける方法であって、次の段階：
ａ）単球及び／又はマクロファージを含む患者からのサンプル、好ましくは血液サンプルを取ること、
ｂ）そのサンプルに含まれる単球及び／又はマクロファージ中のＧＰＲ８４陽性細胞の作用を測定及び／又は定量すること、
ｃ）得られたパラメータを、（ｉ）健常患者のそのサンプル中に含まれるものから入手した、又は（ｉｉ）好適な文献若しくはデータベースから得た個々の（対照）パラメータと比較すること
を提供する方法を提供する。
【００８０】
上記３例の全てにおいて、得られたパラメータが対照から逸脱している場合、その婦人科状態は子宮内膜症と見なされる。好ましくは、その婦人科状態は、ＭＣＦＦＡについて測定した対照パラメータと比較してレベルが高い場合；又は単球及び／又はマクロファージ中のＧＰＲ８４の対照パラメータと比較した発現が増加している場合；又は測定されるそのサンプル中に含まれる単球及び／又はマクロファージにおけるＧＰＲ８４陽性細胞の対照パラメータと比較した割合が増加している場合、子宮内膜症と見なされる。別の実施形態において、ＭＣＦＡＡの存在が測定されたら、それは婦人科状態を示すものである。そのような場合、パラメータは、婦人科状態を確認するか、それを示すものであり、本発明の阻害薬又は拮抗薬を患者に投与することができる。
【００８１】
好ましくは、３．４μＭを超えるＭＣＦＦＡ濃度は、子宮内膜症又は病変によるものであり、より好ましくは４．０μＭを超える濃度、さらにより好ましくは４．５μＭを超える濃度、さらにより好ましくは５．０μＭを超える濃度である。
【００８２】
本発明の他の１態様によれば、子宮内膜症と診断されている、それを患っている又はそれの発症リスクのあるヒト若しくは動物対象者の治療での、又はそのような状態の予防のための上記で開示の拮抗薬又は阻害薬の使用（医薬の製造のため）が提供される。さらに、上記開示による拮抗薬又は阻害薬を含む医薬組成物が提供される。さらに、上記開示による医薬組成物の組み合わせ、及び１以上の他の治療活性化合物が提供される。
【００８３】
さらに、ＧＰＲ８４の望ましくない発現に関連する子宮内膜症の治療又は予防方法であって、処置を必要とする対象者に対して、有効量の上記開示による医薬組成物又は組み合わせを含む方法が提供される。
【００８４】
本発明の他の１実施形態によれば、当該拮抗薬又は阻害薬は、完全フロインドアジュバントの投与後にイン・ビボ炎症足モデルで疼痛軽減特性を示す。
【００８５】
本発明の他の１態様によれば、子宮内膜症を患っている、それを発症するリスクのある、及び／又はそれと診断されている患者の治療及び／又は予防で使用される化合物の確認方法であって、ＧＰＲ８４  ｃＡＭＰ放出アッセイで１以上の被験化合物を、それらが、
・５ｍＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは９．４ｎＭ以下のＩＣ５０値でエンベリン誘発ＧＰＲ８４活性化；及び／又は
・５ｍＭ、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは１６ｎＭ以下のＩＣ５０値で２−ＯＨデカン酸誘発ＧＰＲ８４活性化；及び／又は
・５ｍＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは２０ｎＭ以下のＩＣ５０値で６−ｎ−オクチルアミノウラシル誘発ＧＰＲ８４活性化
を阻害するか否かについてスクリーニングすることを含む方法が提供される。
【００８６】
１実施形態において、ある化合物が５ｍＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは９．４ｎＭ以下のＩＣ５０値で前記エンベリン誘発ＧＰＲ８４活性化を阻害し、及び／又は５ｍＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは１６ｎＭ以下のＩＣ５０値で前記２−ＯＨデカン酸誘発ＧＰＲ８４活性化を阻害する場合、その化合物は、前記治療及び／又は予防での使用に適していると見なされる。
【００８７】
本発明の他の１態様によれば、子宮内膜症を患っている、それの発症リスクを有する及び／又はそれと診断されている患者の治療及び／又は予防で使用される化合物を確認する方法であって、
ａ）ＧＰＲ８４リガンド又はＧＰＲ８４作動薬刺激応答、又は
ｂ）未刺激ＧＰＲ８４活性
に対する被験化合物の阻害効果を評価する方法が提供される。好ましくは、前記応答又は活性に対する阻害効果を示す化合物は、前記使用及び／又は治療に適していると考えられる。本発明のさらに別の１態様によれば、子宮内膜症を患っている、それの発症リスクを有する及び／又はそれと診断されている患者における子宮内膜症の治療及び／又は予防で使用される化合物の確認方法であって、当該拮抗薬又は阻害薬の確認を、
ａ１）被験化合物をＧＰＲ８４ポリペプチドと接触させる段階、及び
ｂ１）前記被験化合物の前記ＧＰＲ８４ポリペプチドへの結合を検出する段階；
又は
ａ２）被験化合物のある濃度での又は当該被験化合物の非存在下でのＧＰＲ８４ポリペプチドの活性を測定する段階、及び
ｂ２）前記被験化合物の異なる濃度での前記ポリペプチドの活性を測定する段階；
又は
ａ３）被験化合物のある濃度でのＧＰＲ８４ポリペプチドの活性を測定する段階、及び
ｂ３）ＧＰＲ８４ポリペプチドの制御剤であることが知られている化合物の存在下でのＧＰＲ８４ポリペプチドの活性を測定する段階
を有する方法によって行うことができる方法が提供される。
【００８８】
これら及び他の実施形態は、各種薬剤スクリーニング技術のいずれかで、ＧＰＲ８４又はそれの結合断片を用いることによって治療性化合物をスクリーニングするのに特に有用である。ＧＰＲ８４はＧタンパク質共役受容体であることから、当業界で一般に使用される方法のいずれも、ＧＰＲ８４リガンドを確認するのに用いることが可能であり得る。例えば、ＧＰＲ８４などのＧタンパク質共役受容体の活性は、その受容体の活性化によって、何らかの二次メッセンジャー系、例えばアデニル酸シクラーゼ、グアニル酸シクラーゼ、カルシウム動員、又はイノシトール・リン脂質加水分解のレベルにおける目立った変化が生じる各種の適切な機能アッセイのいずれかを用いて測定することができる。
【００８９】
或いは、そのような試験で用いられるポリペプチド又は断片は、溶液中で遊離しているか、固体担体に固定されているか、細胞表面上に保持されているか、細胞内にある。薬剤スクリーニングの一つの方法は、ポリペプチド若しくは断片を発現する組換え核酸で安定的に形質転換される真核若しくは原核宿主細胞を利用するものである。薬剤を、競合的結合アッセイで、そのような形質転換細胞に対してスクリーニングする。そのような細胞は、生存型又は固定型で、標準的な結合アッセイに用いる。
【００９０】
例えば、ＧＰＲ８４と薬剤の間の複合体形成を測定する。或いは、調べる薬剤が引き起こすＧＰＲ８４とリガンドの間の複合体形成の減少を調べることができる。
【００９１】
従って、本発明は、候補薬剤、薬剤、又はＧＰＲ８４シグナル変換に影響を与えるいずれか他の作用剤のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は当業界で公知であり、そのような作用剤をＧＰＲ８４ポリペプチド若しくはそれの断片と接触させること、及び（ｉ）作用剤とＧＰＲ８４ポリペプチド若しくは断片の間の複合体の存在、又は（ｉｉ）ＧＰＲ８４ポリペプチド若しくは断片と細胞の間の複合体の存在についてのアッセイを行うことを含む。そのような競合的結合アッセイにおいて、代表的には、ＧＰＲ８４ポリペプチド又は断片を標識する。好適なインキュベーション後、遊離ＧＰＲ８４ポリペプチド又は断片を、結合型で存在するものから分離し、遊離若しくは非複合体化標識の量が、その特定の作用剤がＧＰＲ８４に結合する能力又はＧＰＲ８４−作用剤複合体を妨害する能力の尺度である。
【００９２】
別の薬剤スクリーニング技術は、ＧＰＲ８４ポリペプチドに対する好適な結合アフィニティを有する化合物の高スループットスクリーニングを提供する。簡潔に言えば、多数の異なる小ペプチド被験化合物を、プラスチックピン又は何らかの他の表面などの固体基質上で合成する。そのペプチド被験化合物を、ＧＰＲ８４ポリペプチドと反応させ、洗浄する。次に、結合したＧＰＲ８４ポリペプチドを、当業界で公知の方法によって検出する。精製ＧＰＲ８４はまた、上記の薬剤スクリーニング技術で使用するために、プレート上に直接コーティングされる。さらに、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、それを固体担体上に固定化する。
【００９３】
別の技術は、本明細書において上記で、そして実施例の実験で高スループットスクリーニングとしてさらに記載されているｃＡＭＰ放出である。
【００９４】
本発明は、ＧＰＲ８４に結合することができる中和抗体が、ＧＰＲ８４ポリペプチド又はそれの断片への結合について被験化合物と特異的に競合する競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用も想到するものである。このようにして、抗体を用いて、ＧＰＲ８４と１以上の抗原決定基を共有するペプチドの存在を検出する。
【００９５】
本発明の他の１態様によれば、子宮内膜症を患っている、それの発症リスクを有する及び／又はそれと診断されている患者の治療及び／又は予防で使用される化合物を確認する方法であって、
ａ）同所性又は異所性子宮内膜を用いる子宮内膜切片アッセイを提供する段階、
ｂ）被験化合物の存在下又は非存在下に、切片をＧＰＲ８４作動薬で処理する段階、及び
ｃ）被験化合物がＧＰＲ８４作動薬誘発サイトカイン、増殖因子及び／又はケモカイン発現及び／又は分泌を低下させるか否かを確認する段階
を含む方法が提供される。
【００９６】
好ましい実施形態において、段階ｃ）での発現及び分布の低下は、化合物が治療及び／又は予防での前記使用で適していることによるものである。
【００９７】
前記サイトカイン、増殖因子、及びケモカインには、ＩＬ−１β並びにＴＮＦαなどがあるが、これらに限定されるものではない。このアプローチの例は、実験の部に示してある。前記作動薬には、中鎖脂肪酸、好ましくは完全飽和中鎖脂肪酸、より好ましくはデカン酸などがある。
【００９８】
本発明の他の１態様によれば、子宮内膜症を患っている、それの発症リスクを有する及び／又はそれと診断されている患者の治療及び／又は予防で使用される化合物を確認する方法であって、
ａ）ヒト腹膜単核球又はＧＰＲ８４発現単核球系、例えばＴＨＰ１若しくはＵ９３７の製造を提供する段階、
ｂ）被験化合物で細胞を処理する段階、及び
ｃ）末梢血単核球の走化性を誘発するケモカイン、好ましくはＩＬ−１β及びＴＮＦαの放出を低下させるか否かを確認する段階
を含む方法が提供される。
【００９９】
好ましい実施形態において、走化性を誘発するケモカイン、好ましくはＩＬ−１β及びＴＮＦαの前記放出の低下は、化合物が治療及び／又は予防での前記使用に適していることによるものである。
【０１００】
ＧＰＲ８４発現単核球系、例えばＴＨＰ１又はＵ９３７は、当業者には公知である［４及び９（これらは参照によって本明細書に組み込まれる。）を参照する。］。
【０１０１】
好ましくは、段階ｂ）において、ＧＰＲ８４ポリペプチドの活性を示すメッセンジャー分子の放出又は発現の阻害を測定する。好ましくは、当該方法は、ＵＳ２０１５３３０９６８Ａ１（その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。）に開示の方法の一つである。好ましくは、前記被験化合物は、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、２，５−ジヒドロキシ−３−ウンデシル−２，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジオン（エンベリン）、イコサ−５，８，１１，１４−テトライン酸、５Ｓ，６Ｒ−ジヒドロキシ−イコサ−７，９，１１，１４−テトライン酸、ジインドリルメタン及びインドール−３−カルビノールからなる群から選択される。好ましくは、前記メッセンジャー分子は環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）である。
【０１０２】
実施例
本発明について図面及び前述の説明で詳細に説明及び記載したが、そのような説明及び記述は、説明又は例示のためのものと見なすべきであって、本明細書を制限するものと見なすべきではないが、本発明は開示の実施形態に限定されるものではない。開示の実施形態の他の変形形態は、図面、開示内容及び添付の特許請求の範囲について調べることで、特許請求の発明の実施において、当業者が理解及び実施することができる。参照記号は、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【０１０３】
本明細書に開示のアミノ酸配列は全て、Ｎ末端からＣ末端の方に向けて示してあり、本明細書で開示の核酸は全て、５′→３′で示してある。
【０１０４】
実験
イン・ビトロアッセイ１：ＧＰＲ８４リガンド及び拮抗薬特性決定
ＧＰＲ８４作動薬についての用量応答実験を、３８４ウェルプレート方式でｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標名）  ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＰＲ８４  Ｇｉ細胞系（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）（ＤＭＦ１２  ＨＡＭ、９％ＦＢＳ；３００μｇ／ｍＬハイグロマイシン；８００μｇ／ｍＬジェネティシン；２ｍＭグルタミン；１％ペニシリン／ストレプトマイシンで培養したＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）  ＣＨＯ−Ｋ１  ｈＧＰＲ８４  β−アレスチン細胞系）を用いて行った。細胞の生存率及び数を確認してから（Ｏｍｎｉ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃａｓｙ  Ｃｅｌｌカウンター／アナライザー）播種を行い、作動薬処理を行い、次に６０分間インキュベーションすることで、高スループットＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒ装置で時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を用いてｃＡＭＰレベルを測定した。拮抗薬用量−応答に関して、細胞を、拮抗薬の存在下に３０分間インキュベートしてから、表１に記載の作動薬を加えた。６０分間のインキュベーション後、上記で記載のＴＲ−ＦＲＥＴによってｃＡＭＰレベルを測定した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて適合化した。
【０１０５】
得られたデータを表１にまとめてある。
【０１０６】
表１：
【表３】
2020519662.tif 000004
【０１０７】
エクス・ビボアッセイ１：ＧＰＲ８４リガンド関連子宮内膜炎症アッセイ
子宮内膜症病変に代わるものとしてのヒト同所性子宮内膜生検物を小さい切片に切り分け、ＨＢＳＳ緩衝液［Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ、１４１７５０９５］で洗浄し、５％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地［Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ、１１３２０−０３３］で３時間インキュベートした。培地を除去し、ＧＰＲ８４作動薬（デカン酸）及びＧＰＲ８４拮抗薬ＣＭＰＤ１３９の組み合わせを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％ＣＣＳ（活性炭処理済み）で置き換えた。２１時間後、上清中のサイトカインを、供給業者取扱説明書に従ってＢｉｏ−Ｐｌｅｘプラットホームで定量した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＵＳＡ）を用いてデータを解析した。
【０１０８】
この設定で、ＧＰＲ８４リガンドは、驚くべきことに、子宮内膜症に関連することが既に確立しているいくつかの炎症性サイトカイン及び増殖因子のレベルを高めた。これらのメディエータには、ＩＬ１β及びＴＮＦαなどがあった。作動薬としてのデカン酸を組み合わせた１０−５Ｍの拮抗薬ＣＭＰＤ１３９で処理することで、ＧＰＲ８４単独の作動薬による処理と比較して、全ての測定サイトカイン及び増殖因子が低下した。結果を表２に示している。従って、ＧＰＲ８４の活性化は子宮内膜症関連の炎症に寄与し、拮抗薬は炎症を軽減させることができる。
【０１０９】
表２：
【表４】
2020519662.tif 000005
【０１１０】
イン・ビトロアッセイ２：ＰＢＭＣからのＧＰＲ８４リガンド関連ＩＬβ及びＴＮＦα放出
ＰＢＭＣ類を、全血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）密度勾配遠心によって単離した。即ち、ＰＢＭＣ類を２５０ｇで３０秒間遠心し、再懸濁させ、５％ＣＯ２環境下に３７℃で１０％熱不活性化ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（１０ｇ／Ｌ）、ペニシリン（１００ＩＵ／、Ｌ）、及びストレプトマイシン（１００ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地［Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ番号１１８７５０９３］で培養した。細胞をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２４時間刺激し、ＧＰＲ８４作動薬６−ｎ−オクチルアミノウラシル及び拮抗薬ＣＭＰＤ１３９で４時間処理した。ＩＬ−１β濃度及びＴＮＦα濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ドイツ）によって分析した。表３に示したように、ＣＭＰＤ１３９は、ＧＰＲ８４レベルを低下させ、ＩＬ−１β及びＴＮＦαレベルを上昇させた。
【０１１１】
表３：
【表５】
2020519662.tif 000006
【０１１２】
腹膜組織の免疫組織化学
ホルマリン（３．７％）固定パラフィン包埋組織の断面を脱パラフィンし、水和させ、自動Ｌｅｉｃａ  Ｍｕｌｔｉｓｔａｉｎｅｒ及びＣｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｒ（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ５０２０＋ＣＶ５０３０、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）を用いてＨ＆Ｅ［ヘマトキシリン及びエオシン染色］染色した。
【０１１３】
ＧＰＲ８４−及びＣＤ６８−発現細胞を検出するため、抗ＧＰＲ８４−ＩｇＧ（Ａ９１７４２、ウサギポリクローナル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）及び抗ＣＤ６８−ＩｇＧ（ＫＰ１、マウスモノクローナル、Ａｂｃａｍ、ドイツ）を、それぞれ一次抗体として用いた。Ｔｈｅ  Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ、ＵＳＡ）及びＧＢＩパーマネントレッド（ＧＢＩ、ＵＳＡ）基質溶液を加えて、特異的染色を行った。スライドグラスをさらに、Ｈ＆Ｅで対比染色した。図１は、そのようなスライドグラスの顕微鏡写真である。
【０１１４】
子宮内膜症の異所性病変におけるＧＰＲ８４発現の免疫組織化学。異所性腹膜病変には、浸潤性骨髄性細胞（ＣＤ６８）及びＧＰＲ８４による共染色が豊富である。
【０１１５】
子宮内膜症患者と対照の腹腔におけるＧＰＲ８４陽性細胞の確認
腹水（群当たりｎ＝３）からの単核球を、フィコール密度勾配遠心によって回収し、−８０℃で凍結した。ＧＰＲ８４発現を測定するため、細胞を氷上で３０分間解凍させ、ＰＢＳで洗浄した。次に、細胞を製造者取扱説明書に従ってＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６５）で染色し、次に１％固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０８０１）によって固定した。Ｆｃ受容体を２０％ヒト血清及び５μＬ／１００μＬ  Ｈｕｍａｎ  ＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ血清（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０１）によってブロックし、１％ＢＳＡ及び０．１％サポニンを補充したＰＢＳで細胞を透過性とした。次に、透過性細胞を、ＧＰＲ８４抗体（Ｂｉｏｓｓ、カタログ番号ｂｓ−１５３５３Ｒ）及びウサギＩｇＧアイソタイプ対照（Ｂｉｏｓｓ、カタログ番号ｂｓ−０２９５Ｐ−ＰＥ）とともに氷上で１時間インキュベートした。染色後、細胞を２回洗浄し、フローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で取得した。
【０１１６】
フローサイトメトリー分析によって、対照患者と比べて子宮内膜症患者からのマクロファージでのＧＰＲ８４の発現レベルが高いことが示された（図２）。
【０１１７】
子宮内膜組織におけるＭＣＦＡの測定
同所性（子宮内膜）及び異所性（病変）子宮内膜組織における個々の遊離中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ；デカン酸及びミリスチン酸）の含有量を、質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＭＳ）検出（Ａｇｉｌｅｎｔ７８９０  ＧＣ／５９７５  ＭＳＤ）を用いて、それらの相当するメチルエステル誘導体として測定した。サンプルをメタノール性ＨＣｌ溶液で長時間処理することで、遊離脂肪酸をそれのメチルエステルに完全に変換した。四つの特徴的なイオンを用いる選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードでのクロマトグラムを、個々のメチルエステル誘導体の定量のために記録した。デカン酸及びミリスチン酸レベルは、同所性子宮内膜（対照）と比較して子宮内膜病変（病変）において高い。統計解析；対応のないｔ検定、有意差（Ｐ＜０．０５）。
【０１１８】
表４：ＭＣＦＡの濃度
【表６】
2020519662.tif 000007
【０１１９】
ＣＦＡ疼痛モデルにおけるＣＭＰＤ１３９の効果
炎症疼痛に対するイン・ビボでのＣＭＰＤ１３９の効力を、動的体重負荷（ＤＷＢ）モデルでの完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）投与後（２４時間）に炎症のある足で測定した。炎症のマウスＣＦＡモデルでの繰り返し経口及び皮下投与（３回）後の疼痛に対するＣＭＰＤ１３９による繰り返し予防処置の効果を、予防的設定を用いて調べた。ＧＰＲ８４拮抗薬ＣＭＰＤ１３９（９０又は３０ｍｇ／ｋｇ、経口＋皮下、３倍用量）を、第０日にＣＦＡ注射の２時間前及び６〜８時間後に投与した。ＣＦＡ投与から２４時間後に、３回目のＣＭＰＤ１３９の用量を投与し、２時間後にＤＷＢ試験を行った。統計解析は、一元配置分散分析と、次にＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア、＊ｐ＜０．０５を用いる媒体対照群に対するボンフェローニの多重比較検定によって行った。
【０１２０】
表５：
【表７】
2020519662.tif 000008
【０１２１】
参考文献
下記の論文が本明細書で参照されている。本発明の実施可能性のため、それらの内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
１．  Ｍ．  Ｈｉｃｋｅｙ，  Ｋ．  Ｂａｌｌａｒｄ，  Ｃ．  Ｆａｒｑｕｈａｒ，  Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ．  ＢＭＪ  ３４８，  ｇ１７５２  （２０１４）．
２．  Ｊ．  Ａ．  Ｓａｍｐｓｏｎ，  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｎｓｔｒｕａｌ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃａｖｉｔｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １４，  ４２２−４６９  （１９２７）．
３．  Ｃ．  Ｈ．  Ｓｙｒｏｐ，  Ｊ．  Ｈａｌｍｅ，  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ４８，  １−９  （１９８７）．
４．  Ｓ．  Ｈ．  Ａｈｎ，  Ｓ．  Ｐ．  Ｍｏｎｓａｎｔｏ，  Ｃ．  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｓ．  Ｓ．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｒ．  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｃ．  Ｔａｙａｄｅ，  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ  ２０１５，  ７９５９７６  （２０１５）．
５．  Ｄ．  Ｐ．  Ｂｒａｕｎ，  Ｈ．  Ｇｅｂｅｌ，  Ｒ．  Ｈｏｕｓｅ，  Ｎ．  Ｒａｎａ，  Ｎ．  Ｐ．  Ｄｍｏｗｓｋｉ，  Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｂｙ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ．  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ６５，  １１２５−１１２９  （１９９６）．
６．  Ｈ．  Ｎ．  Ｈｏ，  Ｍ．  Ｙ．  Ｗｕ，  Ｙ．  Ｓ．  Ｙａｎｇ，  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３８，  ４００−４１２  （１９９７）．
７．  Ｊ．  Ｗｉｅｓｅｌｅｒ−Ｆｒａｎｋ，  Ｓ．  Ｆ．  Ｍａｉｅｒ，  Ｌ．  Ｒ．  Ｗａｔｋｉｎｓ，  Ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｐａｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｉｇｎａｌｓ  １４，  １６６−１７４  （２００５）．
８．  Ｍ．  Ｍｏｒｏｔｔｉ，  Ｋ．  Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｊ．  Ｂｒａｗｎ，  Ｋ．  Ｔ．  Ｚｏｎｄｅｒｖａｎ，  Ｃ．  Ｍ．  Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐａｉｎ．  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ  ２０，  ７１７−７３６  （２０１４）．
９．  Ｅ．  Ａｌｖａｒｅｚ−Ｃｕｒｔｏ，  Ｇ．  Ｍｉｌｌｉｇａｎ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｍｅｅｔｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  （２０１６）．
１０．  Ｊ．  Ｅ．  Ｌａｔｔｉｎ，  Ｋ．  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  Ａ．  Ｉ．  Ｓｕ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｊ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｔ．  Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，  Ｋ．  Ｓａｉｊｏ，  Ｃ．  Ｋ．  Ｇｌａｓｓ，  Ｄ．  Ａ．  Ｈｕｍｅ，  Ｓ．  Ｋｅｌｌｉｅ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｓｗｅｅｔ，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ４，  ５  （２００８）．
１１．  Ｊ．  Ｘｕ，  Ｈ．  Ｍｏｒｉｎａｇａ，  Ｄ．  Ｏｈ，  Ｐ．  Ｌｉ，  Ａ．  Ｃｈｅｎ，  Ｓ．  Ｔａｌｕｋｄａｒ，  Ｙ．  Ｍａｍａｎｅ，  Ｊ．  Ａ．  Ｍａｎｃｉｎｉ，  Ａ．  Ｒ．  Ｎａｗｒｏｃｋｉ，  Ｅ．  Ｌａｚａｒｏｗｓｋｉ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｏｌｅｆｓｋｙ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｋｉｍ，  ＧＰＲ１０５  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８９，  １９９２−１９９９  （２０１２）．
１２．  Ｓ．  Ｔａｌｕｋｄａｒ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｏｌｅｆｓｋｙ，  Ｏ．  Ｏｓｂｏｒｎ，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＧＰＲ１２０  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ＧＰＣＲｓ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ３２，  ５４３−５５０  （２０１１）．
１３．  Ａ．  Ｓｔｅｉｎｅｒｔ，  Ｋ．  Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ，  Ｊ．  Ｎｉｅｓｓ，  Ｇａｓｔｒｏ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ：  Ｔｈｅ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｓｗｉｓｓ  Ｍｅｄ  Ｗｋｌｙ  １４６，  ｗ１４２９３  （２０１６）．
１４．  Ｋ．  Ｍ．  Ｍａｓｌｏｗｓｋｉ，  Ａ．  Ｔ．  Ｖｉｅｉｒａ，  Ａ．  Ｎｇ，  Ｊ．  Ｋｒａｎｉｃｈ，  Ｆ．  Ｓｉｅｒｒｏ，  Ｄ．  Ｙｕ，  Ｈ．  Ｃ．  Ｓｃｈｉｌｔｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．  Ｒｏｌｐｈ，  Ｆ．  Ｍａｃｋａｙ，  Ｄ．  Ａｒｔｉｓ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｘａｖｉｅｒ，  Ｍ．  Ｍ．  Ｔｅｉｘｅｉｒａ，  Ｃ．  Ｒ．  Ｍａｃｋａｙ，  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＰＲ４３．  Ｎａｔｕｒｅ  ４６１，  １２８２−１２８６  （２００９）．
１５．  Ｎ．  Ｓｉｎｇｈ，  Ａ．  Ｇｕｒａｖ，  Ｓ．  Ｓｉｖａｐｒａｋａｓａｍ，  Ｅ．  Ｂｒａｄｙ，  Ｒ．  Ｐａｄｉａ，  Ｈ．  Ｓｈｉ，  Ｍ．  Ｔｈａｎｇａｒａｊｕ，  Ｐ．  Ｄ．  Ｐｒａｓａｄ，  Ｓ．  Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｍｕｎｎ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ，  Ｖ．  Ｇａｎａｐａｔｈｙ，  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｐｒ１０９ａ，  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｎｉａｃｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｂｕｔｙｒａｔｅ，  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４０，  １２８−１３９  （２０１４）．
１６．  Ｄ．  Ｙ．  Ｏｈ，  Ｓ．  Ｔａｌｕｋｄａｒ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｂａｅ，  Ｔ．  Ｉｍａｍｕｒａ，  Ｈ．  Ｍｏｒｉｎａｇａ，  Ｗ．  Ｆａｎ，  Ｐ．  Ｌｉ，  Ｗ．  Ｊ．  Ｌｕ，  Ｓ．  Ｍ．  Ｗａｔｋｉｎｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｏｌｅｆｓｋｙ，  ＧＰＲ１２０  ｉｓ  ａｎ  ｏｍｅｇａ−３  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ．  Ｃｅｌｌ  １４２，  ６８７−６９８  （２０１０）．
１７．  Ｍ．  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｓ．  Ｔａｋａｉｓｈｉ，  Ｍ．  Ｎａｇａｓａｋｉ，  Ｙ．  Ｏｎｏｚａｗａ，  Ｉ．  Ｉｉｎｏ，  Ｈ．  Ｍａｅｄａ，  Ｔ．  Ｋｏｍａｉ，  Ｔ．  Ｏｄａ，  Ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ＧＰＲ８４，  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８，  １０６８４−１０６９１  （２０１３）．
１８．  Ｃ．  Ｂｏｕｃｈａｒｄ，  Ｊ．  Ｐａｇｅ，  Ａ．  Ｂｅｄａｒｄ，  Ｐ．  Ｔｒｅｍｂｌａｙ，  Ｌ．  Ｖａｌｌｉｅｒｅｓ，  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ８４，  ａ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｇｌｉａ  ５５，  ７９０−８００  （２００７）．
１９．  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  Ｘ．  Ｗｕ，  Ｎ．  Ｓｉｍｏｎａｖｉｃｉｕｓ，  Ｈ．  Ｔｉａｎ，  Ｌ．  Ｌｉｎｇ，  Ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ａｓ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｏｒｐｈａｎ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＰＲ８４．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，  ３４４５７−３４４６４  （２００６）．
２０．  Ｃ．  Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，  Ｆ．  Ｋｕｏ，  Ｔｈｅ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ＧＰＲ８４  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＩＬ−４  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＣＤ３  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  １０１，  １４４−１５３  （２００５）．
２１．  Ｌ．  Ｓ．  Ｎｉｃｏｌ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｄａｗｅｓ，  Ｆ．  Ｌａ  Ｒｕｓｓａ，  Ａ．  Ｄｉｄａｎｇｅｌｏｓ，  Ａ．  Ｋ．  Ｃｌａｒｋ，  Ｃ．  Ｇｅｎｔｒｙ，  Ｊ．  Ｇｒｉｓｔ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｍ．  Ｍａｌｃａｎｇｉｏ，  Ｓ．  Ｂ．  ＭｃＭａｈｏｎ，  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ８４  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３５，  ８９５９−８９６９  （２０１５）．
２２．  Ｍ．  Ｃ．  Ｈｕｎｔ，  Ｍ．  Ｉ．  Ｓｉｐｏｎｅｎ，  Ｓ．  Ｅ．  Ａｌｅｘｓｏｎ，  Ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８２２，  １３９７−１４１０  （２０１２）．
２３．  Ａ．  Ｌａｕｘ−Ｂｉｅｈｌｍａｎｎ，  Ｊ．  Ｂｏｙｋｅｎ，  Ｈ．  Ｄａｈｌｌｏｆ，  Ｎ．  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｔ．  Ｍ．  Ｚｏｌｌｎｅｒ，  Ｊ．  Ｎａｇｅｌ，  Ｄｙｎａｍｉｃ  ｗｅｉｇｈｔ  ｂｅａｒｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｎｏｎ−ｒｅｆｌｅｘｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｐａｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐａｉｎ  ２０，  ７４２−７５２  （２０１６）．
２４．  Ａ．  Ｌａｕｘ−Ｂｉｅｈｌｍａｎｎ，  Ｔ．  ｄ’Ｈｏｏｇｈｅ，  Ｔ．  Ｍ．  Ｚｏｌｌｎｅｒ，  Ｍｅｎｓｔｒｕａｔｉｏｎ  ｐｕｌｌｓ  ｔｈｅ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｉｎ  ｉｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ３６，  ２７０−２７６  （２０１５）．
２５．  Ｃ．  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  β−ａｒｒｅｓｔｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｏｒｐｈａｎ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ，  １８  （５）：  ５９９−６０９  （２０１３）
２６．  Ｂ．  Ｘ．  Ｃｈｅｎ，  Ｂ．Ｆ．  Ｅｒｌａｎｇｅｒ，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ５；８８（２）：  ８７  （２００３）
２７．  Ｇ．Ｙ．  Ｂｅｒｇｕｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｍａｙ；２３（５）：９０７−１７  （２０１５）
２８．  Ｌ．  Ｍｅｕｎｉｅｒ．  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ  −  ＢｉｏＣｅｌｌＣｈａｌｌｅｎｇｅ：  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ａｐｒｉｌ  （２０１４）
２９．  Ｃ．  Ｘｕ，  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ａｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０  （１），  １？１２  （２０１５）
３０．  Ｇ．？Ｋ？ｈｌｅｒ，  Ｃ．？Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５−４９７  （１９７５）
３１．  Ｍ．  Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７；  ３３７（６０９６）：  ８１６−２１  （２０１２），
３２．  Ｈ．  Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３４，３２８？３３３．  （２０１６）
３３．  Ｂ．  Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｐｆ１  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｃｅｌｌ  ２２；１６３（３）：７５９−７１  （２０１５）
３４．  Ｍ．  Ｂｌｉｎｄ，  Ｍ．  Ｂｌａｎｋ．  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ４，  ｅ２２３  （２０１５）
３５．  Ｋ．  Ｗ．  Ｔｈｉｅｌ，  Ｐ．  Ｈ．  Ｇｉａｎｇｒａｎｄｅ．  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｐｔａｍｅｒｓ．  Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ．  １（６）：８４９−６１  （２０１０）
配列番号１−Ｇタンパク質共役受容体８４
ＭＷＮＳＳＤＡＮＦＳＣＹＨＥＳＶＬＧＹＲＹＶＡＶＳＷＧＶＶＶＡＶＴＧＴＶＧＮＶＬＴＬＬＡＬＡＩＱＰＫＬＲＴＲＦＮＬＬＩＡＮＬＴＬＡＤＬＬＹＣＴＬＬＱＰＦＳＶＤＴＹＬＨＬＨＷＲＴＧＡＴＦＣＲＶＦＧＬＬＬＦＡＳＮＳＶＳＩＬＴＬＣＬＩＡＬＧＲＹＬＬＩＡＨＰＫＬＦＰＱＶＦＳＡＫＧＩＶＬＡＬＶＳＴＷＶＶＧＶＡＳＦＡＰＬＷＰＩＹＩＬＶＰＶＶＣＴＣＳＦＤＲＩＲＧＲＰＹＴＴＩＬＭＧＩＹＦＶＬＧＬＳＳＶＧＩＦＹＣＬＩＨＲＱＶＫＲＡＡＱＡＬＤＱＹＫＬＲＱＡＳＩＨＳＮＨＶＡＲＴＤＥＡＭＰＧＲＦＱＥＬＤＳＲＬＡＳＧＧＰＳＥＧＩＳＳＥＰＶＳＡＡＴＴＱＴＬＥＧＤＳＳＥＶＧＤＱＩＮＳＫＲＡＫＱＭＡＥＫＳＰＰＥＡＳＡＫＡＱＰＩＫＧＡＲＲＡＰＤＳＳＳＥＦＧＫＶＴＲＭＣＦＡＶＦＬＣＦＡＬＳＹＩＰＦＬＬＬＮＩＬＤＡＲＶＱＡＰＲＶＶＨＭＬＡＡＮＬＴＷＬＮＧＣＩＮＰＶＬＹＡＡＭＮＲＱＦＲＱＡＹＧＳＩＬＫＲＧＰＲＳＦＨＲＬＨ
【図１】
2020519662.tif 000009
【図２】
2020519662.tif 000010
【配列表】
2020519662000001.app
【国際調査報告】
2020519662.tif 000011
2020519662.tif 000012
2020519662.tif 000013