(57)【要約】本発明は、組成物、ならびに乏突起膠細胞を保護し、維持する方法、および脱髄障害を治療する方法におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の脱髄障害の治療における使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項２】
前記脱髄障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、視神経脊髄炎スペクトラム障害、視神経炎、横断性脊髄炎、および急性弛緩性脊髄炎からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項３】
前記ＣＤ２４タンパク質が乏突起膠細胞を維持する、請求項１に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項４】
乏突起膠細胞の変換を促進する別の薬剤が前記対象に投与される、請求項１に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項５】
乏突起膠細胞によるミエリン産生を促進する別の薬剤が前記対象に投与される、請求項１に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項６】
前記ＣＤ２４タンパク質が成熟ヒトＣＤ２４またはその変異体を含む、請求項１に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項７】
前記成熟ヒトＣＤ２４が配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項８】
前記ＣＤ２４タンパク質がタンパク質タグをさらに含み、前記タンパク質タグが前記ＣＤ２４タンパク質のＮ末端またはＣ末端で融合される、請求項６に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質タグが哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質の一部分を含む、請求項８に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｉｇ部分がヒトＩｇタンパク質のＦｃ領域である、請求項９に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｆｃ領域が前記ヒトＩｇタンパク質のヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、前記ＩｇがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＡからなる群から選択される、請求項１０に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項１２】
前記Ｆｃ領域がＩｇＭのヒンジ領域ならびにＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインを含む、請求項１０に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項１３】
前記ＣＤ２４タンパク質が配列番号６、１１、または１２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項１４】
前記ＣＤ２４タンパク質が可溶性である、請求項１に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項１５】
前記ＣＤ２４タンパク質がグリコシル化されている、請求項１に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項１６】
前記ＣＤ２４タンパク質が真核生物タンパク質発現系を使用して産生される、請求項１に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項１７】
前記発現系が、チャイニーズハムスター卵巣細胞株に含まれるベクターまたは複製欠損レトロウイルスベクターを含む、請求項１６に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【請求項１８】
前記複製欠損レトロウイルスベクターが真核細胞のゲノムに安定して組み込まれる、
請求項１７に記載の使用のためのＣＤ２４タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物、ならびに乏突起膠細胞を保護し、維持する方法、および脱髄障害を治療する方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミエリン鞘は脂質に富んだ層状構造であり、軸索を包み込み、それらに沿って跳躍シグナル伝導を媒介し、栄養的サポートを提供する。中枢神経系（ＣＮＳ）では、ミエリン鞘は乏突起膠細胞によって形成される。ミエリンは、多発性硬化症（ＭＳ）などの神経免疫障害を含む脱髄疾患の標的である。再ミエリン化は、乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）を誘導して、中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄軸索上に新しいミエリン鞘を産生することができる細胞である乏突起膠細胞を形成するプロセスである。ミエリン変性に応じて、乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）と呼ばれる多能性実質前駆細胞が活性化され、損傷部位に補充される。これは、体内で自然に調節されるプロセスであり、健康な中枢神経系では非常に効率的である傾向がある。しかし、神経免疫障害のある人々では、再ミエリン化がますます不完全になり、軸索が永久に脱髄されて変性しやすくなり、多くの患者では最終的に機能しなくなり、より進行性の疾患形態に至る。
【０００３】
ＭＳなどの疾患における再ミエリン化不全の理由は未だ完全には理解されておらず、複雑であると予想されている。いくつかの研究により、慢性的に脱髄したＭＳ病変の一部には、再ミエリン化乏突起膠細胞に分化することができないＯＰＣが含まれていることが実証されている。乏突起膠細胞は、再ミエリン依存性および非依存性の両方のメカニズムによる神経保護において重要な役割を果たしており、ＭＳ、アルツハイマー病、および潜在的なパーキンソン病を含む、中枢神経系が関与する炎症性疾患および変性疾患の両方において保護を与える（１〜４）。
【０００４】
したがって、乏突起膠細胞の保護および維持を促進し、ミエリン化活性を促進することによる脱髄障害の治療に対する大きな満たされていない医学的ニーズがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、乏突起膠細胞を維持し、ミエリン化を促進し、中枢神経系が関与する炎症性疾患および変性疾患を含む脱髄障害を治療する方法を提供する。本方法は、ＣＤ２４タンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。脱髄障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、視神経脊髄炎スペクトラム障害、視神経炎、横断性脊髄炎、または急性弛緩性脊髄炎であり得る。ＣＤ２４タンパク質は、乏突起膠細胞を維持することができる。本方法は、乏突起膠細胞の変換を促進するか、または乏突起膠細胞によるミエリン産生を促進する別の薬剤を投与することをさらに含み得る。
【０００６】
ＣＤ２４タンパク質は、成熟ヒトＣＤ２４またはその変異体を含み得る。成熟ヒトＣＤ２４は、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ２４タンパク質は、ヒトＣＤ２４の細胞外ドメインのうちのいずれかまたはすべてを含み得る。ＣＤ２４タンパク質の配列は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み得るＣＤ２４のシグナルペプチド配列を含み得る。シグナルペプチド配列は、タンパク質を発現する細胞からの分泌を可能にし得る。シグナルペプチド配列は、別の膜貫通タンパク質もしくは分泌タンパク質上に見られるもの、または当該技術分野で知られている既存のシグナルペプチドから修飾されたものであってもよい。ＣＤ２４タンパク質は可溶性であり得る。ＣＤ２４タンパク質はグリコシル化されていてもよい。ＣＤ２４タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株に含まれるベクターまたは複製欠損レトロウイルスベクターを含み得る、真核生物タンパク質発現系を使用して産生され得る。複製欠損レトロウイルスベクターは、真核細胞のゲノムに安定して組み込まれ得る。
【０００７】
ＣＤ２４タンパク質は、タンパク質タグを含み得、これは、ＣＤ２４タンパク質のＮ末端またはＣ末端で融合され得る。タンパク質は、哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部分を含み得、これは、ヒトＩｇタンパク質のＦｃ領域であり得る。ヒトＩｇタンパク質は、ヒトＩｇタンパク質のヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み得、ヒトＩｇタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＡであり得る。Ｆｃ領域は、ＩｇＭのヒンジ領域、ならびにＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインも含み得る。ＣＤ２４タンパク質は、配列番号５、６、８、９、１１、または１２に記載のアミノ酸配列を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】全長ＣＤ２４融合タンパク質ＣＤ２４Ｆｃ（本明細書ではＣＤ２４Ｉｇとも称される）（配列番号５）のアミノ酸組成を示す。下線の２６個のアミノ酸は、ＣＤ２４（配列番号４）のシグナルペプチドであり、これがタンパク質を発現する細胞からの分泌中に切断され、したがってタンパク質（配列番号６）の処理バージョンから失われる。配列の太字部分は、融合タンパク質（配列番号２）で使用される成熟ＣＤ２４タンパク質の細胞外ドメインである。成熟ＣＤ２４タンパク質中に通常存在する最後のアミノ酸（ＡまたはＶ）は、免疫原性を回避するために構築物から欠失されている。下線のない太字でない文字は、ヒンジ領域ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃの配列（配列番号７）である。
【図１Ｂ】ＣＤ２４ＶＦｃの配列（配列番号８）を示し、ここで、成熟ヒトＣＤ２４タンパク質（太字）は、配列番号１のバリン多型変異体である。
【図１Ｃ】成熟ヒトＣＤ２４タンパク質（太字）が配列番号１のアラニン多型変異体であるＣＤ２４ＡＦｃの配列（配列番号９）を示す。図１Ｂおよび１Ｃの融合タンパク質の様々な部分が図１Ａのようにマークされ、変異体バリン／アラニンアミノ酸には二重下線が引かれている。
【図２】マウス由来の成熟ＣＤ２４タンパク質（配列番号３）とヒト由来の成熟ＣＤ２４タンパク質（配列番号１）との間のアミノ酸配列変異を示す。潜在的なＯグリコシル化部位は太字であり、Ｎグリコシル化部位には下線が引かれている。
【図３Ａ】ＣＤ２４ＩｇＧ１（ＣＤ２４Ｆｃ）の薬物動態のＷｉｎＮｏｎｌｉｎコンパートメントモデリング分析。開いた円は３匹のマウスの平均を表し、線は予測された薬物動態曲線である。１ｍｇのＣＤ２４ＩｇＧ１の静脈内注射。
【図３Ｂ】ＣＤ２４ＩｇＧ１（ＣＤ２４Ｆｃ）の薬物動態のＷｉｎＮｏｎｌｉｎコンパートメントモデリング分析。開いた円は３匹のマウスの平均を表し、線は予測された薬物動態曲線である。１ｍｇのＣＤ２４ＩｇＧ１（ＣＤ２４Ｆｃ）の皮下注射。
【図３Ｃ】ＣＤ２４ＩｇＧ１（ＣＤ２４Ｆｃ）の薬物動態のＷｉｎＮｏｎｌｉｎコンパートメントモデリング分析。開いた円は３匹のマウスの平均を表し、線は予測された薬物動態曲線である。曲線下面積（ＡＵＣ）、半減期、および最大血中濃度により測定された、血中の抗体の総量の比較。全体的に、皮下注射のＡＵＣおよびＣ最大は静脈内注射の約８０％であるが、その差は統計的に有意ではないことに留意されたい。
【図４Ａ】ＣＤ２４−シグレックＧ（１０）相互作用は、ＰＡＭＰとＤＡＭＰとを識別する。ＰＡＭＰに対する宿主応答は、ＣＤ２４−シグレックＧ（１０）相互作用の影響を受けなかった。
【図４Ｂ】ＣＤ２４−シグレックＧ（１０）相互作用は、ＰＡＭＰとＤＡＭＰとを識別する。ＣＤ２４−シグレックＧ（１０）相互作用は、おそらくシグレックＧ／１０関連ＳＨＰ−１を通じて、ＤＡＭＰに対する宿主応答を抑止する。
【図５】インビトロでのＣＤ２４Ｆｃとミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）との結合
【図６】マウスＥＡＥにおけるヒトＣＤ２４融合タンパク質の治療効果。図４の凡例に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスをＭＯＧペプチドで免疫付与した。免疫付与後１４〜２１日で、２．５〜３．５のＥＡＥスコアに達したマウスを無作為に３つのグループに分け、ＣＤ２４融合タンパク質（２００または５０μｇ／注射）または対照タンパク質（２００μｇ／注射）のいずれかを１日おきに５回注射することにより治療した。示されているデータは、臨床スコアの平均およびＳＥである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。全体的に、２００μｇの融合タンパク質を投与すると、有意な治療効果が観察された（Ｐ＝０．００８３）。治療効果は、グループごとに合計７〜１２匹のマウスを用いた２つの独立した実験において観察された。
【図７】ＣＤ２４Ｆｃは、ＭＯＧプライムＴ細胞による自己免疫破壊を防ぐ。６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目にＣＦＡ中のＭＯＧペプチドで免疫付与した。臨床症状がほとんどのマウスに見られなくなった、免疫付与後７日目に、矢印で示されているように、対照ヒトＩｇＧ  ＦｃまたはＣＤ２４Ｆｃのいずれかを腹腔内（２００μｇ／注射／マウス）に１日おきに合計５回注射することでマウスを治療した。マウスを毎日検査して、臨床症状をスコア付けした。示されているデータは、グループごとに９匹および１０匹のマウスの平均およびＳＥＭである。（Ｐ＝０．００１９、フィッシャーのＰＬＳＤ検定）。治療効果は別の実験で再現されている。
【図８】マウスにおけるＣＤ２４Ｆｃの最小有効用量の同定。Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＭＯＧで免疫付与し、図４の凡例に詳述されるように、ＣＤ２４Ｆｃで治療した。最初の１か月の累積疾患スコアを使用して、ＣＤ２４Ｆｃによって引き起こされた阻害の割合を計算した。ＩｇＧ１Ｆｃ治療群のスコアを基準値として使用した。対数曲線近似を使用して、最小有効用量を計算した。
【図９】ＳＪＬモデルにおける再発性寛解ＥＡＥのＣＤ２４Ｆｃ治療。６週齢の雌ＳＪＬマウスを、０日目にＣＦＡ中のＰＬＰペプチドで免疫付与した。臨床症状がほとんどのマウスに見られなくなった、免疫付与後７日目に、対照ヒトＩｇＧ  ＦｃまたはＣＤ２４  Ｉｇのいずれかを腹腔内（２００μｇ／注射／マウス）に１日おきに（７、９、１１、１３、および１５日目）合計５回注射することでマウスを治療した。マウスを毎日検査して、臨床症状をスコア付けした。示されているデータは、各グループの１４匹または１５匹のマウスの平均およびＳＥＭである。Ｐ＝０．００３９、フィッシャーのＰＬＳＤ検定。ＳＪＬモデルの治療効果は３回繰り返されている。ＩｇＧＦｃは、このモデルを含む一部の実験で疾患スコアを悪化させたため（したがって、治療効果が増大したため）、このモデルではＧＭＰグレードのビヒクル（ＰＢＳ）を使用した。
【図１０】ナイーブおよびＥＡＥマウスの中枢神経系におけるＣＤ２４Ｆｃの濃度。ＥＡＥは、４００μｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の２００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドによる皮下免疫によって、８〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥＡＥを誘導した。免疫付与後、２００ｎｇの百日咳毒素を４８時間後に直ちに再び静脈内注射した。ＥＡＥ誘導後１１日目に、マウスに１ｍｇのＣＤ２４Ｆｃを静脈内投与した。年齢を合わせたナイーブ雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにも、同量のＣＤ２４Ｆｃを静脈内投与した。２４時間後、２つのグループのマウスから脳脊髄液（ＣＳＦ）を採取し、中枢神経系のＣＤ２４Ｆｃ濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。この研究では、ＰＢＳを投与したナイーブマウスの脳脊髄液を負の対照として使用した。
【図１１Ａ】Ｃｄ２４またはシグレックｇのいずれかの標的突然変異は、乏突起膠細胞のクプリゾン（ＣＰＺ）治療に対する感受性を高める。分析された脳梁組織切片の位置。
【図１１Ｂ】Ｃｄ２４またはシグレックｇのいずれかの標的突然変異は、乏突起膠細胞のクプリゾン（ＣＰＺ）治療に対する感受性を高める。ＷＴ、Ｃｄ２４−／−、およびシグレックｇ−／−マウスのブレグマ−１脳領域におけるオリゴ−２染色の代表的な画像。８週齢で、屠殺前の２〜５週間、マウスに０．２重量％のＣＰＺを含む食餌を与えた。追加の動物にＣＰＺを含む食餌を５週間給餌し、その後、屠殺の前にさらに１０日間回復（食餌からＣＰＺを除去）させた。対照は通常の食餌で維持された。マウスを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で心内膜灌流し、続いてＰＢＳ中の冷たい４％のパラホルムアルデヒドで灌流した。脳を摘出し、４％のパラホルムアルデヒドで一晩固定し、凍結保護溶液に移した。冠状凍結切片（３０μｍ、自由浮遊）をライカ製スライド式ミクロトームで切断した。自由浮遊切片をＰＢＳですすぎ、室温で１時間、５％の通常のロバまたはヤギの血清でブロックした。次に、切片を、室温で２時間、抗オリゴ２抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号Ａｂ９６１０、１：２０００の希釈で使用される）で、続いて室温で１時間、蛍光５５５結合ロバ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ−３１５７２）でインキュベートした。その後、切片を洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、スライドガラスに設置し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇでカバースガラスをかぶせた。
【図１１Ｃ】Ｃｄ２４またはシグレックｇのいずれかの標的突然変異は、乏突起膠細胞のクプリゾン（ＣＰＺ）治療に対する感受性を高める。ＷＴ、Ｃｄ２４−／−、およびシグレックｇ−／−脳のブレグマ‐１領域の乏突起膠細胞の数に対するＣＰＺへの影響に関する要約データ。示されているデータは、２つの独立した実験の代表例である。Ｐ値は、スチューデントｔ検定を使用して決定された。データは平均および標準偏差として示される。
【図１１Ｄ】Ｃｄ２４またはシグレックｇのいずれかの標的突然変異は、乏突起膠細胞のクプリゾン（ＣＰＺ）治療に対する感受性を高める。ＣＤ２４Ｆｃ（１０ｍｇ／マウス）の単回全身投与後に、ＣＳＦおよび血清中に検出されたＣＤ２４Ｆｃ濃度。これらのデータは、２つの別々の実験、Ｎ＝４を表している。データは平均および標準偏差として示される。
【図１１Ｅ】Ｃｄ２４またはシグレックｇのいずれかの標的突然変異は、乏突起膠細胞のクプリゾン（ＣＰＺ）治療に対する感受性を高める。治療実験の研究スケジュール。
【図１１Ｆ】Ｃｄ２４またはシグレックｇのいずれかの標的突然変異は、乏突起膠細胞のクプリゾン（ＣＰＺ）治療に対する感受性を高める。ＣＤ２４Ｆｃ治療の単回投与（１０ｍｇ／マウス）後２週間または４週間でのブレグマ−１のオリゴ２＋細胞の数。示されているデータは、２つの独立した実験の代表例である。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって決定された。Ｎ＝４。データは平均および標準偏差として示される。すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行われた。データは平均および標準偏差として示される。
【図１２】ヒト対象におけるＰＫ評価可能集団に対する治療による平均血漿ＣＤ２４Ｆｃ濃度（±ＳＤ）のプロットを示す。ＰＫ＝薬物動態、ＳＤ＝標準偏差。
【図１３】ＰＫ評価可能集団についてのＣＤ２４Ｆｃ  Ｃ最大対用量の用量比例プロットを示す。
【図１４】ＰＫ評価可能集団についてのＣＤ２４Ｆｃ  ＡＵＣ０〜４２日対用量の用量比例プロットを示す。
【図１５】ＰＫ評価可能集団についてのＣＤ２４Ｆｃ  ＡＵＣ０〜無限対用量の用量比例プロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＤ２４の可溶性形態が乏突起膠細胞の維持および脱髄に関連する神経免疫障害の治療に非常に効果的であることを発見した。その効果は、損傷に関連する分子パターンを介して媒介され得る。パターン認識は、それぞれＰＡＭＰおよびＤＡＭＰと呼ばれる病原体関連および組織損傷関連分子パターンの両方によって引き起こされる炎症反応に関与している。理論に縛られないが、ＤＡＭＰに対する悪化した宿主応答は、炎症性および自己免疫疾患の病因に関与する可能性がある。ＤＡＭＰは、炎症性サイトカインおよび自己免疫疾患の産生を促進することがわかっており、結果として、動物モデルにおいて、ＨＭＧＢ１およびＨＳＰ９０などのＤＡＭＰの阻害剤は、関節リウマチ（ＲＡ）を改善することがわかった（４〜６）。ＴＬＲ、ＲＡＧＥ−Ｒ、ＤＮＧＲ（Ｃｌｅｃ９Ａによりコードされた）、およびＭｉｎｃｌｅは、様々なＤＡＭＰによって開始される炎症の媒介に関与する受容体であることが示されている（２、７〜１４）。
【００１０】
本発明者らは、ＣＤ２４−シグレックＧ相互作用がＰＡＭＰからのＤＡＭＰに対する自然免疫を識別することを実証した（１５、１６）。シグレックタンパク質は、様々なシアル酸含有構造を認識する膜関連免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。ほとんどのシグレックには、ＳＨＰ−１、−２、およびＣｂｌ−ｂと結合して炎症反応の重要な調節因子を制御する細胞内免疫チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）がある。ＣＤ２４は、シグレック、マウスではシグレックＧ、ヒトではシグレック１０に対する最初の天然リガンドとして同定された（１５）。シグレックＧは、シアル化ＣＤ２４と相互作用して、ＳＬＥ病因に重要なＳＨＰ−１／２シグナル伝達メカニズム（１５）を介して、ＨＭＧＢ１などのＤＡＭＰに対するＴＬＲ媒介性宿主応答を抑制する（２）。シグレックＧはまた、Ｃｂｌと結合してＲＩＧ−Ｉの分解を引き起こし、ヒト狼瘡病因の重要な要因であるＩ型インターフェロン応答の抑制をもたらす（１７）。
【００１１】
加えて、本発明者らは、ＣＤ２４が組織または器官の損傷の結果として放出される細胞ＤＡＭＰに対する宿主応答を負に調節し、少なくとも２つの重複するメカニズムがこの活性を説明することができることを実証した。第１に、ＣＤ２４は、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＭＧＢ１、およびヌクレオリンを含むいくつかのＤＡＭＰに結合し、これらのＤＡＭＰに対する宿主応答を抑止する。これを行うためには、ＣＤ２４が炎症性刺激を捕捉して、その受容体であるＴＬＲまたはＲＡＧＥとの相互作用を防ぐ可能性があると推定される。第２に、ＣＤ２４は、その受容体シグレックＧとの相互作用を通じて、組織損傷に対する宿主応答に対して強力な負の調節を提供する。この活性を達成するために、ＣＤ２４は、シグレックＧに結合し、シグレックＧに関連するＳＨＰ１が負の調節を引き起こすシグレックＧによるシグナル伝達を刺激する可能性がある。どちらの遺伝子の標的突然変異を有するマウスもはるかに強い炎症反応を起こすため、両方のメカニズムが協調して作用する可能性がある。実際、ＣＤ２４−／−またはシグレックＧ−／−マウスのいずれか由来の骨髄から培養したＤＣは、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、またはＨＳＰ９０のいずれかで刺激すると、より高いレベルの炎症性サイトカインを産生した。本発明者らの知る限り、ＣＤ２４は、ＤＡＭＰによって引き起こされる炎症を遮断できる唯一の阻害性ＤＡＭＰ受容体であり、組織損傷に対する宿主の炎症反応を特異的に標的とする薬物は現在利用することができない。さらに、外因性の可溶性ＣＤ２４タンパク質は、関節リウマチ、多発性硬化症、および移植片対宿主病のマウスモデルにおけるＤＡＭＰ媒介性自己免疫疾患を緩和する。
【００１２】
ヒトＣＤ２４は、ＣＤ２４遺伝子の２４０個の塩基対のオープンリーディングフレームによってコードされる小さなＧＰＩアンカー分子である（２８）。８０個のアミノ酸のうち、最初の２６個はシグナルペプチドを構成し、最後の２３個はＧＰＩテールの付着を可能にする切断のためのシグナルとして機能する。結果として、成熟ヒトＣＤ２４分子は３１個のアミノ酸しか有していない。３１個のアミノ酸のうちの１つは、ヒト集団の中でも特に多型である。オープンリーディングフレームのヌクレオチド１７０でのＣからＴへの遷移は、アラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）への置換をもたらす。この残基は切断部位のすぐＮ末端にあり、置き換えは非保存的であるため、これらの２つの対立遺伝子は細胞表面上で異なる効率で発現する可能性がある。実際、ｃＤＮＡを用いたトランスフェクション研究により、ＣＤ２４ｖ対立遺伝子が細胞表面上でより効率的に発現されることが実証された（２８）。これと一致して、ＣＤ２４ｖ／ｖＰＢＬは、特にＴ細胞上でより高いレベルのＣＤ２４を発現した。
【００１３】
本発明者らは、ＤＡＭＰに対する生来の炎症反応を選択的に調節する軸を形成するＣｄ２４またはシグレックｇのいずれかの標的突然変異が、クプリゾン誘導性乏突起膠細胞喪失からマウスを保護することを発見した。本発明者らは、さらに、シグレックＧシグナル伝達を刺激し、インビボで炎症反応を抑制することが知られているＣＤ２４タンパク質（ＣＤ２４Ｆｃ）の全身投与が、クプリゾンへの慢性曝露から乏突起膠細胞を保護することを発見した。したがって、細胞損傷に対する宿主応答は、乏突起膠細胞喪失に積極的に関与し、病理学的条件下で乏突起膠細胞を維持するための新しいアプローチを提供する。
【００１４】
したがって、中枢神経系が関与する炎症性疾患および変性疾患を緩和、最小化、または治療するために、本明細書に記載の方法を使用して神経保護を提供することができる。特に、本明細書に記載の方法を使用して、多発性硬化症（ＭＳ）、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）、視神経炎（ＯＮ）、および横断性脊髄炎（ＴＭ）を含み、急性弛緩性脊髄炎（ＡＦＭ）であり得る、神経免疫障害を治療することができる。
１．定義．
【００１５】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００１６】
本明細書における数値範囲の列挙のために、数値の間に介在する各数値は、同程度の精度で明示的に検討される。例えば、６〜９の範囲では、６および９に加えて数字７および８が検討され、６．０〜７．０の範囲では、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に検討される。
【００１７】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列であり、天然、合成、または天然と合成との修飾もしくは組み合わせであり得る。
【００１８】
「実質的に同一」とは、第１および第２のアミノ酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアミノ酸の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを意味し得る。
【００１９】
「治療」または「治療する」とは、動物を疾患から保護することを指す場合、疾患を予防、抑制、抑止、または完全に排除することを意味する。疾患の予防は、疾患の発症前に本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患の抑制は、疾患の誘導後、その臨床的出現の前に本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患の抑止は、疾患の臨床的出現後に本発明の組成物を動物に投与することを含む。
【００２０】
「変異体」とは、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドを意味し得る。「生物学的活性」の代表的な例には、トール様受容体に結合する能力および特定の抗体によって結合される能力が含まれる。変異体はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、典型的に軽微な変化を伴うものとして当該技術分野で認識されている。これらの小さな変化は、当該技術分野で理解されているように、部分的にアミノ酸のハイドロパシー指数を考察することにより特定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性および電荷の考察に基づいている。当該技術分野では、同様のハイドロパシー指数のアミノ酸を置換することができ、それでもなおタンパク質機能を保持することができることが知られている。一態様では、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸を置換する。アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考察により、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算が可能になり、これは抗原性および免疫原性とよく相関すると報告されている有用な尺度である。参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号。同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野で理解されているように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。互いの±２以内の親水性値を有するアミノ酸で置換を行ってもよい。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方が、そのアミノ酸の特定の側鎖による影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能と互換性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性によって明らかにされるように、アミノ酸の相対的類似性、特にこれらのアミノ酸の側鎖に依存することが理解されている。
２．ＣＤ２４
【００２１】
本明細書では、成熟ＣＤ２４またはその変異体を含み得るＣＤ２４タンパク質を提供する。成熟ＣＤ２４は、ＣＤ２４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対応している。成熟ＣＤ２４は、ヒトまたは別の哺乳動物に由来し得る。上記のように、成熟ヒトＣＤ２４タンパク質は３１アミノ酸長であり、通常、そのＣ末端：
【００２２】
ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ（Ｖ／Ａ）（配列番号１）に可変アラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）残基がある。
【００２３】
Ｃ末端のバリンまたはアラニンは免疫原性である可能性があり、ＣＤ２４タンパク質から除外される場合があり、その免疫原性を低下させ得る。したがって、ＣＤ２４タンパク質は、Ｃ末端アミノ酸を欠くヒトＣＤ２４のアミノ酸配列：
【００２４】
ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ（配列番号２）を含み得る。
【００２５】
マウスおよびヒト由来の成熟ＣＤ２４タンパク質のアミノ酸配列にはかなりの配列変異があるが、ヒトＣＤ２４Ｆｃはマウスにおいて活性があることが示されているため、機能的に同等である。ヒトＣＤ２４  ＥＣＤのアミノ酸配列は、マウスタンパク質による何らかの配列保存を示す（３９％の同一性、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３３９７６）。しかしながら、ＣＤ２４  ＥＣＤは、その長さが種によって異なるが、わずか２７〜３１アミノ酸長であり、シグレック１０／Ｇなどのその受容体（複数可）の一部への結合が、糖タンパク質のシアル酸および／またはガラクトース糖によって媒介されるため、同一性パーセントがそれほど高くないことは驚くべきことではない。ヒトシグレック−１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３１０２３３）およびそのマウスホモログシグレック−Ｇ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿７６６４８８）受容体タンパク質の細胞外ドメイン間のアミノ酸配列同一性は６３％である（図２）。主にＣ末端および豊富なグリコシル化部位でのマウスＣＤ２４とヒトＣＤ２４との間の配列保存の結果として、ＣＤ２４タンパク質を使用する際に、特にそれらの変異がＣ末端に保存された残基に影響を与えないか、またはマウスＣＤ２４またはヒトＣＤ２４のいずれかからのグリコシル化部位に影響を与えない場合、成熟ＣＤ２４タンパク質の有意な変異が忍容され得る。したがって、ＣＤ２４タンパク質は、成熟マウスＣＤ２４のアミノ酸配列：
【００２６】
ＮＱＴＳＶＡＰＦＰＧＮＱＮＩＳＡＳＰＮＰＴＮＡＴＴＲＧ（配列番号３）を含み得る。
【００２７】
ヒトＣＤ２４  ＥＣＤのアミノ酸配列は、マウスよりもカニクイザルタンパク質（５２％の同一性、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｉ７ＧＫＫ１）でより多くの配列保存を示す。繰り返しとなるが、ＥＣＤはこれらの種においてわずか２９〜３１アミノ酸長であるため同一性パーセントがそれほど高いことと、その受容体（複数可）への結合における糖残基の役割とを考慮すると、これは驚くべきことではない。カニクイザルシグレック−１０受容体のアミノ酸配列は決定されていないが、ヒトシグレック−１０タンパク質とアカゲザルシグレック−１０タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１１１６３５２）との間のアミノ酸配列の同一性は８９％である。したがって、ＣＤ２４タンパク質は、成熟したカニクイザル（またはアカゲザル）のＣＤ２４のアミノ酸配列：
【００２８】
ＴＶＴＴＳＡＰＬＳＳＮＳＰＱＮＴＳＴＴＰＮＰＡＮＴＴＴＫＡ（配列番号１０）も含み得る。
【００２９】
ＣＤ２４タンパク質は可溶性であり得る。ＣＤ２４タンパク質は、タンパク質を発現する細胞からの分泌を可能にするために、Ｎ末端シグナルペプチドをさらに含み得る。シグナルペプチド配列は、アミノ酸配列ＭＧＲＡＭＶＡＲＬＧＬＧＬＬＬＬＡＬＬＬＰＴＱＩＹＳ（配列番号４）を含み得る。あるいは、シグナル配列は、他の膜貫通タンパク質または分泌タンパク質上で見られるもの、または当該技術分野で知られている既存のシグナルペプチドから修飾されたもののうちのいずれかであり得る。
ａ．融合
【００３０】
ＣＤ２４タンパク質は、そのＮ末端またはＣ末端で、ヒトもしくはマウスであり得るか、または他の種に由来し得る、哺乳動物Ｉｇタンパク質の一部分を含み得るタンパク質タグに融合され得る。この部分は、Ｉｇタンパク質のＦｃ領域を含み得る。Ｆｃ領域は、Ｉｇタンパク質のヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインのうちの少なくとも１つを含み得る。Ｉｇタンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＡであり得、Ｆｃ領域は、Ｉｇのヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み得る。Ｆｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）アイソタイプ配列番号７を含み得る。Ｉｇタンパク質はＩｇＭであってもよく、Ｆｃ領域は、ＩｇＭのヒンジ領域ならびにＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインを含み得る。タンパク質タグは、タンパク質の精製を支援する親和性タグ、および／または機能性タンパク質の溶解度および回収率を高める溶解度増強タグであり得る。タンパク質タグは、ＣＤ２４タンパク質の原子価を高める場合もある。タンパク質タグには、ＧＳＴ、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、チオレドキシン（ＴＲＸ）、小さなユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン（Ｕｂ）、アルブミン、またはラクダ科動物Ｉｇも含まれ得る。融合タンパク質を作製し、融合タンパク質を精製するための方法は、当該技術分野でよく知られている。
【００３１】
前臨床研究に基づいて、実施例で同定された融合タンパク質ＣＤ２４Ｆｃの構築のために、ＧＰＩシグナル切断部位の前の最終的な多型アミノ酸を欠く３０アミノ酸の天然ＣＤ２４分子の切断型（すなわち、配列番号２を有する成熟ＣＤ２４タンパク質が使用されている。成熟ヒトＣＤ２４配列は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号７）に融合される。完全長のＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質は配列番号５（図１）に提供され、細胞から分泌される（すなわち切断されるシグナル配列を欠く）ＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質の処理バージョンは配列番号６に提供される。ＩｇＧ１  Ｆｃと融合した成熟ＣＤ２４（すなわち、配列番号１を有する成熟ＣＤ２４タンパク質）の処理された多型変異体は、配列番号１１または１２を含み得る。
ｂ．産生
【００３２】
ＣＤ２４タンパク質は高度にグリコシル化されている可能性があり、免疫細胞の共刺激および損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）との相互作用など、ＣＤ２４の機能に関与している可能性がある。ＣＤ２４タンパク質は、真核生物発現系を使用して調製することができる。発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるベクターからの発現を伴う場合がある。発現系はまた、真核細胞に感染するために使用され得る複製欠損レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。ＣＤ２４タンパク質は、ベクターまたは細胞ゲノムに組み込まれたベクターの一部分からＣＤ２４タンパク質を発現する安定した細胞株から産生されてもよい。安定した細胞株は、組み込まれた複製欠損レトロウイルスベクターからＣＤ２４タンパク質を発現し得る。発現系はＧＰＥｘ（商標）であり得る。
ｃ．医薬組成物
【００３３】
ＣＤ２４タンパク質は、薬学的に許容される量のＣＤ２４タンパク質を含み得る医薬組成物中に含まれる場合がある。医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。医薬組成物は、ＣＤ２４タンパク質を長期間にわたって安定して保つことができる溶媒を含み得る。溶媒はＰＢＳである場合があり、これはＣＤ２４タンパク質を−２０°Ｃ（−１５〜−２５°Ｃ）で少なくとも６６か月間安定して保つことができる。溶媒は、別の薬物と組み合わせてＣＤ２４タンパク質を収容することができる場合がある。
【００３４】
医薬組成物は、注射または持続注入を含むがこれらに限定されない非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液の形態であってもよく、懸濁剤、安定剤、および分散剤を含むがこれらに限定されない製剤を含み得る。組成物はまた、無菌の発熱物質を含まない水を含むがこれに限定されない好適なビヒクルで再構成するための粉末形態で提供され得る。
【００３５】
医薬組成物はまた、埋め込みまたは筋肉内注射により投与され得るデポ製剤として製剤化され得る。組成物は、好適なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容される油中の乳濁液として）、イオン交換樹脂、または難溶性誘導体（例えば、難溶性塩として）とともに製剤化され得る。皮下注射用の製剤は、狼瘡ならびにその関連する症状および合併症のような適応症に特に関連する場合がある。
ｄ．投与量
【００３６】
ＣＤ２４タンパク質の用量は、臨床試験を通じて最終的に決定され、許容される毒性および臨床効果を備えた用量が決定され得る。げっ歯類およびヒト以外の霊長類の薬物動態および毒性研究を通じて、初期臨床用量を推定することができる。ＣＤ２４タンパク質の用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇであり得、１〜５００ｍｇ／ｋｇであり得、これは、乏突起膠細胞の維持の所望の程度、または治療中の神経免疫障害、および投与経路によって異なる。ＣＤ２４タンパク質は、静脈内注入または皮下、壁内（すなわち、腔または器官の壁内）、もしくは腹腔内注射によって投与することができ、用量は、１０〜１０００ｍｇ、１０〜５００ｍｇ、１０〜２４０ｍｇ、１０〜１２０ｍｇ、または１０、３０、６０、１２０、もしくは２４０ｍｇ（対象がヒトである場合）であり得る。
３．治療方法
【００３７】
本明細書では、本明細書に記載のＣＤ２４タンパク質を、それを必要とする対象に投与することにより、乏突起膠細胞を維持する方法を提供する。本明細書では、さらに、ＣＤ２４タンパク質を、それを必要とする対象に投与することにより、脱髄障害であり得る神経免疫障害を治療する方法を提供する。ＣＤ２４タンパク質は、神経免疫障害または脱髄障害を有するか、または発症するリスクがある対象に投与され得る。乏突起膠細胞は、乏突起膠細胞のミエリン化活性を増強または改善することにより、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）内に維持され得る。
【００３８】
本明細書では、ＣＤ２４タンパク質を、それを必要とする対象に投与することにより、対象に神経保護を提供する方法も提供する。ＣＤ２４タンパク質は、中枢神経系内の細胞に神経保護を提供し得る。神経保護は、中枢神経系が関与する炎症性疾患または変性疾患を緩和、最小化、または治療し得る。炎症性疾患または変性疾患は、多発性硬化症、アルツハイマー病、またはパーキンソン病であり得る。
【００３９】
神経免疫障害は、ＭＳ、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）、視神経炎（ＯＮ）、または横断性脊髄炎（ＴＭ）であり得、急性弛緩性脊髄炎（ＡＦＭ）であり得る。ＣＤ２４タンパク質を使用して、神経免疫障害を緩和、軽減、または治療することもできる。
ａ．投与
【００４０】
医薬組成物の投与経路は非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内、関節内、および直接注射が含まれるがこれらに限定されない。医薬組成物は、ヒト患者、ネコ、イヌ、大型動物、または鳥類に投与することができる。組成物は、１日に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回投与され得る。
ｂ．併用治療
【００４１】
本明細書に記載のＣＤ２４タンパク質は、再ミエリン化を促進するために使用されるか、または乏突起膠細胞における乏突起膠細胞前駆細胞の変換を促進する別の治療と組み合わせることができる。そのような治療の例には、抗Ｌｉｎｇｏ−１、ＮＤＣ−１３０８、抗エフリンＢ３、フマル酸クレマスチン、フルオロサミン、およびフィンゴリモドが含まれる。ＬＩＮＧＯ−１は、未成熟細胞が乏突起膠細胞になるのを防ぐ中枢神経系によって産生されるタンパク質であり、抗Ｌｉｎｇｏ（オピシヌマブ）は、ＬＩＮＧＯ−１の作用をブロックして、これらの細胞を乏突起膠細胞に成熟させることができる。ＮＤＣ−１３０８は、脱髄した神経線維のミエリン鞘を修復するように設計されており、運動ニューロンの損傷を治癒することを特に目的としている。エフリンＢ３は、ＭＳの損傷ニューロンの再ミエリン化をブロックする膜結合シグナル伝達タンパク質であるため、抗エフリンは、このブロックを解消するように設計されている。フルオロサミンは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を防ぎ、乏突起膠細胞機能を促進することにより、マウスの再ミエリン化を促進することが見られた。同様に、神経炎症を予防するために再発性多発性硬化症の患者に承認された薬物であるフィンゴリモド（ＧＩＬＥＮＹＡ）は、その抗炎症特性から部分的に独立した方法で神経再生を直接増強し、再ミエリン化を増加させることにより、これらの患者にも役立つ可能性がある。
【００４２】
ＣＤ２４タンパク質は、他の治療と同時にまたはメトロノーム的に投与され得る。本明細書で使用される「同時の」または「同時に」という用語は、ＣＤ２４タンパク質および他の治療薬が、互いに４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらにより好ましくは６時間以内、最も好ましくは３時間以内に投与されることを意味する。本明細書で使用される「メトロノーム的に」という用語は、他の治療とは異なる時点で、反復投与と比較して特定の頻度で薬剤を投与することを意味する。
【００４３】
ＣＤ２４タンパク質は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含む別の治療の前の任意の時点で投与され得る。ＣＤ２４タンパク質は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含むＣＤ２４タンパク質の２回目の治療の前の任意の時点で投与され得る。
【００４４】
ＣＤ２４タンパク質は、約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間、７８時間、８０時間、８２時間、８４時間、８６時間、８８時間、９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間、１１０時間、１１２時間、１１４時間、１１６時間、１１８時間、および１２０時間を含む別の治療の後の任意の時点で投与され得る。ＣＤ２４タンパク質は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含む以前のＣＤ２４治療の後の任意の時点で投与され得る。
【実施例】
【００４５】
実施例１
マウスのＣＤ２４薬物動態
１ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ（ＣＤ２４Ｆｃ）をナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに注射し、各時点で３匹のマウスを用いて異なる時点（５分、１時間、４時間、２４時間、４８時間、７日、１４日、および２１日）に血液試料を収集した。血清を１：１００に希釈し、捕捉抗体として精製抗ヒトＣＤ２４（３．３μｇ／ｍｌ）を使用し、検出抗体としてペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ＣＤ２４Ｆｃのレベルを検出した。図３Ａに示されるように。ＣＤ２４Ｆｃの減衰曲線は、タンパク質の典型的な二相減衰を明らかにした。最初の生体内分布相の半減期は１２．４時間であった。２番目の相は、中央コンパートメントからの１次消去のモデルに従う。２番目の相の半減期は９．５４日であり、これはインビボでの抗体の半減期に類似している。これらのデータは、融合タンパク質が血流中で非常に安定していることを示唆している。融合タンパク質を皮下注射した別の研究では、９．５２日のほぼ同一の半減期が観察された（図３Ｂ）。さらに重要なことに、ＣＤ２４Ｆｃが血中のピークレベルに達するには約４８時間かかったが、ＡＵＣにより測定された血中の融合タンパク質の総量は、どちらの注射経路でもほぼ同じであった。したがって、治療の観点から、注射経路の違いが薬物の治療効果に影響を与えるべきではない。この観察により、霊長類の毒性および臨床試験の実験計画が大幅に簡素化された。
実施例２
組織損傷に対する宿主応答におけるＣＤ２４−シグレック１０相互作用
【００４６】
２０年近く前、マチンガーは一般に危険理論と呼ばれるものを提案した。本質的に、彼女は、宿主の危険を感知すると免疫系がオンになると主張した。当時、危険の性質は明確には定義されていなかったが、壊死は、危険に関連する分子パターンについて、ＤＡＭＰと呼ばれるＨＭＧＢ１および熱ショックタンパク質などの細胞内成分の放出に関連していると判断された。ＤＡＭＰは、炎症性サイトカインおよび自己免疫疾患の産生を促進することがわかっている。動物モデルでは、ＨＭＧＢ１およびＨＳＰ９０の阻害剤がＲＡを改善することがわかった。ＤＡＭＰの関与により、ＲＡ治療のためにＤＡＭＰに対する宿主応答についての負の調節を模索することができるという見通しが立てられた。
【００４７】
アセトアミノフェン誘導性の肝臓壊死を使用し、炎症を確実にすると、シグレックＧ相互作用を通じて、ＣＤ２４が組織損傷に対する宿主応答に強力な負の調節を提供することが観察された。ＣＤ２４はＧＰＩアンカー分子であり、造血細胞および他の組織幹細胞中に広く発現している。多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ＲＡ、および巨細胞性関節炎を含む、ヒトの様々な自己免疫疾患の遺伝子解析により、ＣＤ２４多型と自己免疫疾患のリスクとの間の有意な関連性が示された。シグレックＧは、シアル酸含有構造を認識する能力によって定義されるＩ−レクチンファミリーのメンバーである。シグレックＧは、ＣＤ２４上のシアル酸含有構造を認識し、樹状細胞による炎症性サイトカインの産生を負に調節する。ＣＤ２４と相互作用するその能力の点では、ヒトシグレック１０およびマウスシグレックＧは機能的に同等である。しかしながら、マウスおよびヒトのホモログ間に１対１の相関関係があるかどうかは不明である。そのメカニズムは完全には解明されていないが、シグレックＧに関連するＳＨＰ１が負の調節に関与している可能性があることはもっともらしいと思われる。これらのデータは、ＣＤ２４−シグレックＧ／１０相互作用がＤＡＭＰからの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の識別に重要な役割を果たす新規モデルを導いた（図４）。
【００４８】
少なくとも２つの重複するメカニズムにより、ＣＤ２４の機能を説明することができる。第１に、様々なＤＡＭＰに結合することにより、ＣＤ２４は、炎症性刺激を捕捉して、ＴＬＲまたはＲＡＧＥとのそれらの相互作用を防ぐことができる。この見解は、ＣＤ２４がＨＳＰ７０、９０、ＨＭＧＢ１、およびヌクレオリンを含むいくつかのＤＡＭＰ分子と関連しているという観察によって裏付けられている。第２に、おそらくＤＡＭＰに関連付けられた後、ＣＤ２４は、シグレックＧによるシグナル伝達を刺激し得る。どちらの遺伝子の標的突然変異を有するマウスもはるかに強い炎症反応を起こすため、両方のメカニズムが協調して機能し得る。実際、ＣＤ２４−／−またはシグレックＧ−／−マウスの骨髄から培養したＤＣは、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、またはＨＳＰ９０のいずれかで刺激すると、はるかに高い炎症性サイトカインを産生した。対照的に、ＬＰＳおよびＰｏｌｙＩ：Ｃなど、ＰＡＭＰに対するそれらの応答には効果が見られなかった。これらのデータは、自然免疫系が病原体と組織損傷を区別するメカニズムを提供するだけでなく、ＣＤ２４およびシグレックＧが組織損傷に関連する疾患の潜在的な治療標的であることも示唆している。
実施例３
ＣＤ２４Ｆｃとミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）とのインビトロでの結合
【００４９】
シグレック−４としても知られるミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）は、シアル酸含有構造を認識するシグレックファミリーのメンバーであり、ニューロンの軸索上に発現し、軸索伸長およびニューロン再生についての負の調節因子として機能する。ＭＡＧタンパク質は、マウスとヒトとの間で保存されているため、マウスモデルでＣＤ２４Ｆｃを試験することができる。ＭＡＧへのＣＤ２４Ｆｃの結合を確認するために、ポリペプチドリンカーによってヒトＩｇＧ１のカルボキシル末端Ｆｃ領域に融合したラットＭＡＧの細胞外ドメインを含む組換えＭＡＧ−Ｆｃ融合タンパク質を使用した（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｍ  ５０６３）。ヒトＭＡＧ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２３５２）およびラットＭＡＧ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５８８８６）の細胞外ドメインは９６％同一である。
【００５０】
ＣＤ２４ＦｃとＭＡＧとの相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって検出した。簡単に説明すると、ＣＤ２４ＦｃおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃ対照の両方をビオチン化して、ストレプトアビジンで事前に固定したセンサーチップ上に固定した。センサーチップ表面の準備後、異なる濃度（１、６、および２４μＭ）の１０μｌのＭＡＧ−Ｆｃをフローチャネルに連続的に注射した。各注射の後に、溶離液としてＨＢＳで洗浄することにより１０分間の解離を行った。センサー表面上に固定したＣＤ２４ＦｃまたはヒトＩｇＧ  ＦｃへのＭＡＧ−Ｆｃの結合は、結合質量に比例する応答を生成した。応答は、異なる濃度のＭＡＧ−Ｆｃの注射後に記録されたシグナル変化を反映した共鳴ユニット（ＲＵ）として測定される。
【００５１】
時間に対する応答単位のリアルタイムグラフは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃと比較して、ＣＤ２４Ｆｃの方がＭＡＧ−Ｆｃに対する結合性が高いことを実証した。特異的結合は用量依存的に提示される（図５）。したがって、ＣＤ２４Ｆｃは、軸索の成長およびニューロンの再生中にＭＡＧの機能をブロックする可能性がある。
実施例４
前臨床モデルにおけるＣＤ２４Ｆｃの治療効果
【００５２】
ＥＡＥの臨床症状が継続している動物の治療。
【００５３】
８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＦＡ（１ミリリットルあたり４００μｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中に総容量１００μＬのＭＯＧ（ラット由来のペプチド３５〜５５（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）を２００μｇ皮下に免疫付与した。各マウスは、２００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を２００μＬのＰＢＳに入れて、免疫直後および４８時間後に再び尾静脈に投与した。マウスを１日おきに観察し、中間スコアについては０．５の段階変化で、０〜５のスケールでスコア付けした：０、臨床症状なし、１、テールトーンの喪失、２、不安定な歩行、３、後肢麻痺、４、後肢および前肢の麻痺、ならびに５、死。免疫付与後１４〜２１日目に、臨床スコアが２．５〜３．５のマウスを無作為に２つのグループに分け、対照ＩｇＧ１  ＦｃまたはＣＤ２４Ｆｃのいずれかで治療した。１日おきに２００μｇ／マウスの５回の注射を腹腔内（ｉ．ｐ．）に行った。図６に示されるように、ＣＤ２４Ｆｃには有意で用量依存的な治療効果があった。
【００５４】
自己反応性プライムＴ細胞による動物の治療。
【００５５】
ＣＤ２４Ｆｃが自己反応性Ｔ細胞の破壊を防ぐことができるかどうかを試験するために、免疫付与後７日目に免疫付与マウスを治療した。この時点で、リンパ節にＭＯＧ反応性Ｔ細胞を見つけることができたが、臨床症状は観察されなかった。免疫付与後７日目に、免疫付与マウスを１グループあたり９匹のマウスの２つのグループに分け、対照免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質のいずれかを腹腔内（２００μｇ／注射／マウス）に１日おきに合計５回注射して（７、９、１１、１３、および１５日目）治療した。上記のように、マウスを毎日検査して臨床症状をスコア付けした。
【００５６】
図７に示されるように、対照ＩｇＧまたはＣＤ２４Ｆｃのいずれかの投与の２日後、ＣＤ２４Ｆｃで治療したグループは、対照グループと比較して、臨床症状の発症の遅延を示した。２つのグループからのすべてのデータを考察すると、２つの統計分析により、非常に有意な差が明らかになった（Ｐ＝０．００１９、フィッシャーのＰＬＳＤ検定）。これらの結果は、ＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質による治療で、ＥＡＥの臨床症状を遅延および軽減することができることを実証している。
【００５７】
最小有効用量を決定するために、１００、５０、および２５μｇ／注射のＣＤ２４ＦｃをＭＯＧ免疫付与マウスに注射した。エンドポイントとして、１か月間の累積疾患スコアを５０％削減した。図８に示されるように、用量依存的阻害が観察された。用量反応曲線は対数曲線とよく適合し、８０μｇ／注射により累積疾患スコアが５０％減少することが示された。
【００５８】
ＳＪＬモデルにおける再発性寛解ＥＡＥの治療。
【００５９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＥＡＥには、ＭＳ患者の圧倒的多数に見られる慢性経過とは異なる急性臨床経過がある。ＭＳ患者の大部分に再発性寛解臨床経過があり、これはＥＡＥのＳＪＬモデルにおいて最もよく模倣されている。したがって、ＳＪＬモデルにおける治療の可能性を試験した。治療計画は上記の実験と同じであった。簡単に説明すると、免疫付与後７日目に、免疫付与マウスを１グループあたり１４匹または１５匹のマウスの２つのグループに分け、ビヒクル対照または本発明のＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質のいずれかを腹腔内（２００μｇ／注射／マウス）に１日おきに合計５回注射して（７、９、１１、１３、および１５日目）治療した。図９に示されるように、ＣＤ２４ＦｃによるＳＪＬマウスの治療は、臨床スコアの実質的な減少をもたらした（Ｐ＝０．００３９、フィッシャーのＰＬＳＤ検定）。
実施例５
進行中の実験的自己免疫性脳脊髄炎を有するマウスにおける中枢神経系へのＣＤ２４Ｆｃの生体内分布。
【００６０】
中枢神経系（ＣＮＳ）は、多発性硬化症の免疫療法の標的器官である。この研究の目的は、ナイーブマウスおよび進行中の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を有するマウスの中枢神経系におけるＣＤ２４Ｆｃの生体内分布を調査することである。
【００６１】
図１０の結果は、ＣＤ２４Ｆｃ投与の２４時間後に、ナイーブマウスが、非常に低いが検出可能なレベルのＣＤ２４Ｆｃ（２３ｎｇ／ｍｌ）を有したことを示している。しかしながら、進行中のＥＡＥを有するマウスでは、ＣＤ２４Ｆｃレベルは約１８μｇ／ｍｌであり、ナイーブマウスの中枢神経系よりも７８０倍以上高い。この増加は非常に顕著である（Ｐ＜０．００１、ノンパラメトリックマン・ホイットニーＴ検定）。中枢神経系のＣＤ２４Ｆｃのレベルは、十分にインビトロ阻害アッセイに基づいた有効範囲内である。したがって、ＣＤ２４Ｆｃは中枢神経系にアクセスし、多発性硬化症（ＭＳ）の患者の中枢神経系に局所的に治療効果をもたらす可能性がある。
実施例６
脱髄疾患および神経保護の治療のためのＣＤ２４の使用
【００６２】
この実施例は、ＣＤ２４タンパク質を使用して、脱髄疾患および神経免疫疾患を治療し、神経保護を提供し、乏突起膠細胞を維持することができることを実証している。クプリゾンの慢性曝露は、げっ歯類の乏突起膠細胞喪失を誘導する古典的なモデルである（５）。いくつかのグループが、乏突起膠細胞の喪失における炎症の重要な役割について報告している。しかしながら、乏突起膠細胞喪失についての開始シグナルの性質は明確には描写されていない。Ｊａｎｅｗａｙは、自然免疫は主に病原体関連分子パターンまたはＰＡＭＰと呼ばれる微生物産物のパターン認識を通じて開始されることを提案している（６、７）。その後、Ｍａｔｚｉｎｇｅｒは、先天性免疫応答を開始するための鍵として、後に他者によってＤＡＭＰと呼ばれる危険シグナルを提案した（８）。本発明者らの研究は、いずれかの遺伝子の標的突然変異が、ＰＡＭＰに影響を与えることなくＤＡＭＰに対する宿主応答を選択的に増強するため、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰによって誘導される炎症をＣＤ２４−シグレックＧ相互作用によって識別することができることを示した（９、１０）。ここでは、ＣＤ２４の潜在的な新しい用途に対する発明者らの洞察に続いて、慢性クプリゾン治療後の乏突起膠細胞の生存におけるＣｄ２４またはシグレックｇ遺伝子の標的突然変異の影響を評価することにより、ＤＡＭＰに対する先天性免疫応答の潜在的な寄与を模索した。
【００６３】
年齢および性別を合わせたＷＴ、Ｃｄ２４‐／‐、およびシグレックｇ‐／‐マウス（９、１０）をＣＰＺで４週間治療し、治療後４週間でマウスを安楽死させた。乏突起膠細胞の回復を監視するために、マウスを最初に５週間治療し、通常の食餌で１０日間回復させ、その後分析のために安楽死させた。ブレグマ−１領域（図１１Ａ）を切断し、乏突起膠細胞系列のすべての細胞に特異的に結合する抗オリゴ−２抗体を使用した免疫蛍光染色により、乏突起膠細胞の数を分析した。代表的な画像を図１１Ｂに示し、要約データを図１１Ｃに示す。図１１Ｂに示されるように、マウスの３つの系統はすべて、ＣＰＺ治療前に同数の乏突起膠細胞を有していた。これらのデータは、Ｃｄ２４およびシグレックＧがこの領域の乏突起膠細胞の発達に関与していないことを示唆している。しかしながら、Ｃｄ２４またはシグレックｇ遺伝子のいずれかの標的突然変異により、ＣＰＺ治療後４週間で乏突起膠細胞のより深刻な枯渇がもたらされた。さらに、ＷＴマウスでは１０日間の回復期間後に乏突起膠細胞数が完全に回復したが、Ｃｄ２４‐／‐およびシグレックｇ‐／‐脳では部分的な回復のみが観察された（図１１Ｃ）。これらのデータは、ＣＤ２４−シグレックＧ軸がＣＰＺ毒性から乏突起膠細胞を保護することを実証している。
【００６４】
乏突起膠細胞を保護するためにシグレックＧアゴニストＣＤ２４Ｆｃ（９、１０）（米国特許公開第２０１３／０２３１４６４号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）を全身投与することができるかどうかを決定するために、まず、ＣＤ２４Ｆｃを、全身投与を通じて中枢神経系に送達することができるかどうかを決定した。１０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃを８週齢のマウスに腹腔内注射した。血清およびＣＳＦを１、７、１４、２１、および２８日目に収集し、ＣＤ２４Ｆｃの量をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。図１１Ｄに示されるように、ＣＤ２４Ｆｃは４週間の観察期間全体を通してＣＳＦ中に見られる可能性があり、そのレベルは血漿で観察されたレベルとほぼ平行している。ＣＳＦ  ＣＤ２４Ｆｃレベルは、血漿レベルの約０．２〜０．３％である。４週間で見つかったレベルは、マクロファージによる炎症性サイトカインの産生を阻害するアッセイにおけるＣＤ２４ＦｃのＩＣ５０よりも高かった。
【００６５】
Ｏｌｉｇｏ２＋乏突起膠細胞のインサイチュ分析に基づいて、ＣＰＺ治療の２週間後および４週間後に、ＣＤ２４Ｆｃの保護効果を分析した。脳梁の乏突起膠細胞数ブレグマ−１の位置（図１１Ｅ）は、この領域がＣＰＺ治療中により多くの病理学的損傷を受けたために分析された。ＣＤ２４Ｆｃ治療は、ＣＰＺ治療後２週間および４週間の両方で乏突起膠細胞数を有意に増加させることが観察された（図１１Ｆ）。
【００６６】
乏突起膠細胞の喪失は、通常、再ミエリン化の減少に関連しているため、シグレックｇ遺伝子のいずれかのＣＤ２４の標的突然変異が脱髄の加速を引き起こすかどうかをさらに調査した。驚くべきことに、どちらの系統のマウスでも、より深刻な脱髄は観察されなかった。これらのデータは、乏突起膠細胞の生存率の改善は、再ミエリン化を誘導するのに十分ではない可能性があることを示唆した。
【００６７】
まとめると、本明細書に記載のデータは、ＣＤ２４−シグレックＧ軸がＣＰＺの殺傷から乏突起膠細胞を保護し、したがってＣＰＺモデルにおける乏突起膠細胞の喪失についての認識されていない原因としてＤＡＭＰに対する宿主応答を暗に示している。乏突起膠細胞喪失の病因に関する新たな洞察は、インビボでの乏突起膠細胞の生存を促進する新しいアプローチを示唆している。この見解と一致して、ＤＡＭＰに結合し（９、１０）、シグレックＧのアゴニストとして機能する（９、１０）ＣＤ２４Ｆｃの全身投与は、乏突起膠細胞をＣＰＺによる殺傷から保護するのに十分であることが示されている。乏突起膠細胞の喪失は複数の神経変性疾患に関係しているため（１〜４）、データは、これらの難治性神経疾患の治療法の開発のために細胞傷害における宿主応答を模索することができることを暗に示している。最後に、ＣＤ２４は、自己反応性Ｔ細胞（１２）および肝内ＣＤ４  Ｔ細胞（１３）を含むＴ細胞（１１）の活性化のための共刺激分子としても知られていることに留意するべきである。これに対応して、ＣＤ２４Ｆｃは自己免疫疾患を阻害することも示された（１４）。ＣＤ２４Ｆｃは自己免疫疾患におけるＣｄ２４遺伝子の遺伝的欠陥を表現模写するため（１２、１４）、アンタゴニストとして異なるメカニズムを通じて機能する可能性が高い。
実施例７
ヒトのＣＤ２４薬物動態
【００６８】
この実施例は、ヒトにおけるＣＤ２４タンパク質の薬物動態の分析を示す。これは、健康な男性および女性の成人対象におけるＣＤ２４Ｆｃの安全性、忍容性、およびＰＫを評価するための、第Ｉ相、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、単回用量漸増試験から得られた。この研究には、それぞれ８人の対象からなる５つのコホートで合計４０人の対象が登録された。各コホートの８人の対象のうち６人に試験薬を投与し、２人の対象にプラセボ（０．９％の塩化ナトリウム、生理食塩水）を投与した。最初のコホートには１０ｍｇを投与した。後続のコホートには、３０ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ、および２４０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃまたは適合するプラセボを投与し、少なくとも３週間おきに投与して、以前の各コホートの安全性および忍容性のデータを確認できるようにした。適切な安全性および忍容性が実証された場合にのみ、対象の新しいコホートへの次の高用量の投与が許可された。
【００６９】
各コホートでは、最初の２人の対象は、１日目の試験薬受容者１人およびプラセボ受容者１人であった。３日目〜５日目および６日目〜８日目までの対象は、７日目の後に（サブグループ間で最低２４時間おきに）投与された。各対象は、同じサブグループで少なくとも１時間おきに投与された。必要に応じて、そのコホートの最初または２番目のサブグループが関与する投与後期間中に発生した可能性のある任意の重大な安全性問題が確認されるまで、残りの対象の投与を遅らせた。その後のコホートは、以前のコホートの少なくとも３週間後に投与された。
【００７０】
スクリーニング期間
【００７１】
スクリーニング受診（受診１）は、積極的な治療期間の開始の２１日前までに行われた。インフォームドコンセントを提供した後、対象は適格性についてのスクリーニング手順を受けた。
【００７２】
治療期間
【００７３】
対象は１日目（受診２）に臨床薬理学ユニット（ＣＰＵ）に入院し、１０時間の最低一晩の絶食に続いて１日目に無作為化治療期間が開始された。対象は、単回投与としてＣＤ２４Ｆｃまたはプラセボによる治療に無作為に割り当てられた。対象は４日目の朝まで閉じ込められたままであった。
【００７４】
ファローアップ
【００７５】
すべての対象は、フォローアップ受診（受診３、受診４、受診５、受診６、および受診７）のために７日目、１４日目、２１日目、２８日目、および４２日目（±１日）にＣＰＵに戻った。受診７は、すべての対象についての最終受診であった。
【００７６】
治療期間：各対象についての総研究期間は最大６３日であった。単回投与は１日目に行われた。
【００７７】
対象数
【００７８】
予定：４０人の対象
【００７９】
スクリーニング：２２４人の対象
【００８０】
無作為化：４０人の対象
【００８１】
完了：３９人の対象
【００８２】
中止：１人の対象
【００８３】
診断および主な包含基準：この研究のための母集団は、１８ｋｇ／ｍ２〜３０ｋｇ／ｍ２を含めた肥満度指数を有する、１８歳〜５５歳を含めた年齢の健康な男性および女性であった。
【００８４】
被験薬および比較薬の情報
【００８５】
ＣＤ２４Ｆｃ：静脈内注入を介して投与される、１０ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ、または２４０ｍｇの単回用量、ロット番号：０９ＭＭ−０３６。ＣＤ２４Ｆｃは、ヒトＣＤ２４の成熟配列およびヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１Ｆｃ）の断片結晶化可能領域からなる完全にヒト化された融合タンパク質であった。ＣＤ２４Ｆｃは、静脈内投与用の無菌、透明、無色の、防腐剤を含まない水溶液として供給された。ＣＤ２４Ｆｃは、１０ｍｇ／ｍＬの濃度および７．２のｐＨで、単回用量の注射液として製剤化された。各ＣＤ２４Ｆｃバイアルには、１６ｍＬ±０．２ｍＬのＣＤ２４Ｆｃ中に、１６０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ、５．３ｍｇの塩化ナトリウム、３２．６ｍｇのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、および１４０ｍｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物が含まれていた。ＣＤ２４Ｆｃは、クロロブチルゴムストッパーおよびアルミニウムフリップオフシール付きの透明なホウケイ酸ガラスバイアルで供給された。
【００８６】
静脈内注入を介して投与された適合するプラセボ（０．９％の塩化ナトリウム、生理食塩水）、ロット番号：Ｐ２９６８５５、Ｐ３１１８５２、Ｐ３００７１５、Ｐ３１５９５２。
【００８７】
治療意図（ＩＴＴ）集団は、少なくとも１用量の試験薬を投与されたすべての対象で構成された。ＩＴＴ集団は、対象情報および安全性評価についての一次分析集団であった。
【００８８】
臨床実験室評価（化学、血液学、および尿検査）を、治療および受診ごとに要約した。基準値からの変化も要約した。バイタルサイン（血圧、心拍数、呼吸数、および体温）を治療および時点ごとに要約した。基準値からの変化も要約した。すべての身体検査データを列挙した。心電図パラメータおよび基準値からの変化を要約した。全体的な解釈を列挙した。
【００８９】
血漿ＣＤ２４Ｆｃ濃度
【００９０】
図１２に示されるように、ＣＤ２４Ｆｃの平均血漿濃度は、投与されたＣＤ２４Ｆｃの用量に比例して増加した。１２０ｍｇを除くすべての用量群について、投与後１時間でＣＤ２４Ｆｃの最大平均血漿濃度に達した。１２０ｍｇのグループについては、投与後２時間でＣＤ２４Ｆｃの最大平均血漿濃度に達した。４２日目（９８４時間）までに、すべてのグループのＣＤ２４Ｆｃの平均血漿濃度は、最大平均血漿濃度の２％〜４％まで減少した。
【００９１】
表１は、ＰＫ評価可能集団についての治療ごとの血漿ＣＤ２４Ｆｃ  ＰＫパラメータを要約している。
【表１−１】
2020519627.tif 000002
【表１−２】
2020519627.tif 000003
【００９２】
血漿ＣＤ２４Ｆｃ用量比例分析
【００９３】
図１３は、ＰＫ評価可能集団についてのＣＤ２４Ｆｃ  Ｃ最大対用量の用量比例プロットを示す。図１４は、ＰＫ評価可能集団についてのＣＤ２４Ｆｃ  ＡＵＣ０〜４２日対用量の用量比例プロットを示す。図１５は、ＰＫ評価可能集団についてのＣＤ２４Ｆｃ  ＡＵＣ０〜無限対用量の用量比例プロットを示す。表２は、用量比例の検出力分析を示す。
【表２】
2020519627.tif 000004
【００９４】
Ｃ最大勾配推定値は１．１７２であり、９０％ＣＩは１．１０５〜１．２４０であった。ＡＵＣ０〜４２日勾配推定値は１．０８８であり、９０％ＣＩは１．０２７〜１．１４８であった。ＡＵＣ０〜無限勾配推定値は１．０８７であり、９０％ＣＩは１．０２６〜１．１であった。
【００９５】
薬物動態の結論
【００９６】
血漿ＣＤ２４ＦｃのＣ最大およびＡＵＣは、マウス、サル、およびヒトに投与された用量に比例して増加した。血漿ＣＤ２４Ｆｃは、１．０１〜１．３４時間でＴ最大に達した。血漿ＣＤ２４Ｆｃのｔ１／２は、２８０．８３〜３２７．１０時間の範囲であった。
【００９７】
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１１  Ｆａｎｇ，Ｘ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｐ．，Ｔａｎｇ，Ｊ．＆Ｌｉｕ，Ｙ．ＣＤ２４：ｆｒｏｍ  Ａ  ｔｏ  Ｚ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７，１００−１０３（２０１０）．
１２  Ｂａｉ，Ｘ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．ＣＤ２４  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  Ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００，４４７−４５８（２００４）．
１３  Ｚｈｅｎｇ，Ｃ．，Ｙｉｎ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｙｕ，Ｙ．＆Ｘｉｅ，Ｘ．ＣＤ２４  ａｇｇｒａｖａｔｅｓ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｍｉ．２０１６．５７（２０１７）．
１４  Ｂａｉ，Ｘ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５，１２２７−１２３２（２０００）．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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