(57)【要約】  ｈＡＦＰ１５８を特異的に認識するＴ細胞受容体およびそれらの使用方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、または１０と少なくとも９０％の配列同一性を含む操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）Ｖα鎖ポリペプチドであって、前記ｍＴＣＲが、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）に特異的に結合する、前記操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）Ｖα鎖ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１１、１２、１３、または１４と少なくとも９０％の配列同一性を含む操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）Ｖβ鎖ポリペプチドであって、前記ｍＴＣＲが、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）に特異的に結合する、前記操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）Ｖβ鎖ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３と少なくとも９０％の配列同一性を含む操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）全長α鎖ポリペプチドであって、前記ｍＴＣＲが、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）に特異的に結合する、前記操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）全長α鎖ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２４、２５、２６、または２７と少なくとも９０％の配列同一性を含む操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）全長β鎖ポリペプチドであって、前記ｍＴＣＲが、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）に特異的に結合する、前記操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）全長β鎖ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲ３領域を含む操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）α鎖ポリペプチドであって、前記ｍＴＣＲが、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）に特異的に結合する、前記操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）α鎖ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３７、３８、３９、または４０と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲ３領域を含む操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）β鎖ポリペプチドであって、前記ｍＴＣＲが、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）に特異的に結合する、前記操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）β鎖ポリペプチド。
【請求項７】
ａ）配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号２８と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、
ｂ）配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと
を含む、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）。
【請求項８】
ａ）配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号２９と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、
ｂ）配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと
を含む、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）。
【請求項９】
ａ）配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３０と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、
ｂ）配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３８と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと
を含む、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）。
【請求項１０】
ａ）配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、
ｂ）配列番号１３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３９と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと
を含む、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）。
【請求項１１】
ａ）配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３２と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、
ｂ）配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと
を含む、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）。
【請求項１２】
ａ）配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３３と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、
ｂ）配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号４０と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと
を含む、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）。
【請求項１３】
ａ）配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、
ｂ）配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと
を含む、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）。
【請求項１４】
ａ）配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３５と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、
ｂ）配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと
を含む、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）。
【請求項１５】
ａ）配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３６と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、
ｂ）配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと
を含む、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）。
【請求項１６】
ヒト化されている、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）。
【請求項１７】
請求項７〜１６のいずれか一項に記載のｍＴＣＲを発現するように操作された、Ｔ細胞。
【請求項１８】
ヒトのＴ細胞である、請求項１７に記載のＴ細胞。
【請求項１９】
自己由来である、請求項１８に記載のＴ細胞。
【請求項２０】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３のＱ２１〜Ｌ２４２を含む、可溶性ｍＴＣＲ  α鎖。
【請求項２１】
配列番号５０、５１、５２、もしくは５３、または
配列番号２４、２５、２６、もしくは２７のＥ１８〜Ｙ２７６
を含む、操作されたｍＴＣＲ  β鎖の細胞外ドメイン。
【請求項２２】
配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、または６２と少なくとも９０％の配列同一性を含む、融合タンパク質。
【請求項２３】
配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、または７１と少なくとも９０％の配列同一性を含む、核酸。
【請求項２４】
ａ）配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸残基２１〜１３２と少なくとも９０％の配列同一性を有するα鎖可変ドメイン（Ｖα）と、
ｂ）配列番号１１、１２、１３、または１４のアミノ酸残基１８〜１３１と少なくとも９０％の配列同一性を有するβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）と
を含む、非天然起源ｈＡＦＰ１５８エピトープ特異的マウスＴ細胞受容体。
【請求項２５】
配列番号１１、１２、１３、または１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のポリペプチドに結合した、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項２６】
配列番号２４、２５、２６、または２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のポリペプチドに結合した、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項２７】
配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、または７１によってコードされるｍＴＣＲを発現するように操作された、Ｔ細胞。
【請求項２８】
ヒトのＴ細胞である、請求項２７に記載のＴ細胞。
【請求項２９】
ＴＣＲ  αおよびβ鎖を欠損したドナー細胞に融合したＣＤ８＋Ｔｅｔ１５８＋細胞を含む、ハイブリドーマ。
【請求項３０】
ｈＡＦＰ＋腫瘍細胞に応答する、請求項２９に記載のハイブリドーマ。
【請求項３１】
ＩＬ−２を分泌する、請求項２９に記載のハイブリドーマ。
【請求項３２】
配列番号１１、１２、１３、１４、２４、２５、２６、または２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のポリペプチドに結合した、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のポリペプチドを含み、一本鎖抗ＣＤ３抗体に結合している、融合タンパク質。
【請求項３３】
腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療するための方法であって、
請求項７〜１６のいずれか一項に記載のｍＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を遺伝子的に操作することと、
前記操作されたＴ細胞を前記対象における腫瘍負荷を低減するのに有効な量で前記対象に投与することと
を含む、前記方法。
【請求項３４】
前記腫瘍が肝細胞癌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｔ細胞が自己Ｔ細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１〜１５および２４〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項３７】
肝細胞癌を検出するための方法であって、請求項３６に記載のポリペプチドまたはタンパク質を細胞の試料に接触させることを含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質の、細胞への特異的な結合が、肝細胞癌細胞を示す、前記方法。
【請求項３８】
請求項１〜６および２０〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／５０５，４０６号、２０１７年１２月２２日に出願された第６２／６０９，６１４号、および２０１８年２月１日に出願された第６２／６２５，０５１号の優先権を主張し、許可される場合、その全ては、それらの全体が参照によって組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によるＲ０１ＣＡ１６８９１２号の下に政府支援を受けて行われた。政府は、発明において特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
２０１８年４月２６日に作成され、１７１，８１８バイトのサイズを有する「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ  ０６４４６６．０６７＿ＳＴ２５」と命名されたテキストファイルとして、２０１８年５月１日に提出された配列表は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従って参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
本発明の技術分野
本発明は概して免疫学に、特にＴ細胞受容体、および癌を含む免疫障害の治療におけるそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
毎年の新規症例が約８００，０００件であり、肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界で５番目に最も一般的な癌である。米国では、米国癌学会によると、肝臓癌（それらの大部分はＨＣＣ）の数は、米国においてここ１０年で２倍となり、主に肥満の流行によって、最も急成長している悪性腫瘍のうちの１つを代表する。ＨＣＣ罹患率は、多数の既存の慢性ＨＢＶおよびＨＣＶ患者ならびに世界的に流行する肥満によって、高いままである可能性が高いであろう。さらに悪いことに、有効な管理の欠如によって、ＨＣＣは成人男性における癌死亡の２番目の主因となっている。よって、新規療法を開発する緊急の必要性がある。腫瘍特異的Ｔ細胞の養子移入は、顕著な毒性なしに腫瘍成長を制御する大きな可能性を有する。ほとんどの固形腫瘍（黒色腫以外）からの腫瘍特異的Ｔ細胞の単離が困難であるため、患者の自己Ｔ細胞を腫瘍抗原特異的ＴＣＲ遺伝子で遺伝子的に操作することは、養子細胞移入免疫療法のための機能的な腫瘍特異的Ｔ細胞を提供する可能性が高いであろう。
【０００６】
ＨＣＣは、しばしば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）としてヒトグリピカン３（ｈＧＰＣ３）およびヒトアルファフェトタンパク質（ｈＡＦＰ）を再発現する。これらの抗原は、診断のためのバイオマーカーとして役立つだけでなく、免疫療法の標的にもなり得る。最近では、ｈＧＰＣ３特異的ヒトＴＣＲ遺伝子がクローニングされ、免疫低下マウスにおける異種移植ＨＣＣモデルを用いて抗腫瘍有効性が示された（Ｄａｒｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。しかしながら、ＴＡＡは多くの場合ＨＣＣ全体を通して同等レベルでは発現しないので、抗ｈＧＰＣ３治療は、ｈＧＰＣ３陰性細胞を選択して、再発を引き起こし得る。理論では、ＴＣＲの組み合わせを異なるエピトープおよび異なる腫瘍抗原に対して使用することで、腫瘍免疫逃避を回避または遅延することができる。４つのＨＬＡ−Ａ２制限ｈＡＦＰエピトープが特定されている（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。エピトープｈＡＦＰ１５８は、しばしばＨＣＣ腫瘍細胞によって提示され、ｈＡＦＰ１５８特異的免疫細胞は、ＨＣＣ患者において見られる（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）が、おそらくヒトｈＡＦＰ１５８特異的Ｔ細胞が低親和性であるために、抗腫瘍効果は弱かった（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。よって、高親和性ｈＡＦＰ１５８特異的ＴＣＲを見つけることは、ＡＦＰ抗原を標的とする抗腫瘍有効性を増加させ得る。
【０００７】
２つのｈＡＦＰ１５８特異的ＴＣＲ遺伝子が報告された。ｈＡＦＰ１５８エピトープに特異的なヒトＴＣＲに関する１つの最近の特許（ＣＮ１０４０８７５９２Ａ）は、限られた抗腫瘍効果を示した（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。より弱い抗腫瘍効果は、ｈＡＦＰ１５８エピトープに特異的な野生型ヒトＴＣＲが、ヒト  ＨＣＣ腫瘍細胞と共培養される場合にいずれのエフェクター機能も生成しなかった、Ａｄａｐｔｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏからの別の特許出願（ＵＳ２０１６／０１３７７１５Ａ１）によってさらに確認された。よって、ＨＣＣ腫瘍細胞の認識を増加させるように野生型ヒトＴＣＲのＣＤＲ領域を突然変異させることによって、ｈＡＦＰ１５８特異的高親和性ＴＣＲが作製され、特許で保護された（ＵＳ２０１６／０１３７７１５Ａ１）。しかし、そのようなＴＣＲ修飾Ｔ細胞（ＴＣＲ−Ｔ）が実際にインビボで抗腫瘍効果を生じることができることを示す入手可能な臨床データはない。さらに、高親和性ＴＣＲ−Ｔ細胞の養子移入が重度のオフターゲット毒性と関連しているという最近の報告（Ｃａｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｌｉｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を考慮して、高い抗腫瘍効果および低い毒性を有する最適なＴＣＲを見つける可能性を高めるために利用可能なより多くのＴＣＲを有することが望ましい。よって、免疫療法のために患者の自己Ｔ細胞を操作するのに使用することができるＴＡＡに特異的な追加のＴＣＲを特定することに対する真の需要がある。
【発明の概要】
【０００８】
ｈＡＦＰ１５８を特異的に認識するＴ細胞受容体が提供される。一実施形態は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、または１０と少なくとも９０％の配列同一性を有する操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）Ｖα鎖ポリペプチドを提供し、ｍＴＣＲは、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）を特異的に認識する。
【０００９】
別の実施形態は、配列番号１１、１２、１３、または１４と少なくとも９０％の配列同一性を有する操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）Ｖβ鎖ポリペプチドを提供し、ｍＴＣＲは、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）を特異的に認識する。
【００１０】
また別の実施形態は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３と少なくとも９０％の配列同一性を有する操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）全長α鎖ポリペプチドを提供し、ｍＴＣＲは、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）を特異的に認識する。
【００１１】
別の実施形態は、配列番号２４、２５、２６、または２７と少なくとも９０％の配列同一性を有する操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）全長β鎖ポリペプチドを提供し、ｍＴＣＲは、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）を特異的に認識する。
【００１２】
一実施形態は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲ３領域を有する操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）α鎖ポリペプチドを提供し、ｍＴＣＲは、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）を特異的に認識する。
【００１３】
別の実施形態は、配列番号３７、３８、３９、または４０と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲ３領域を有する操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）β鎖ポリペプチドを提供し、ｍＴＣＲは、ｈＡＦＰ１５８（配列番号１）を特異的に認識する。
【００１４】
開示されるポリペプチド配列のいずれかの１つのリーダー配列を除去することができる。
【００１５】
一実施形態は、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号２８と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと、を有する、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）を提供する。
【００１６】
別の実施形態は、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号２９と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと、を有する、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）を提供する。
【００１７】
別の実施形態は、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３０と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３８と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと、を有する、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）を提供する。
【００１８】
また別の実施形態は、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、配列番号１３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３９と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと、を有する、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）を提供する。
【００１９】
一実施形態は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３２と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと、を有する、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態は、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３３と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号４０と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと、を有する、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）を提供する。
【００２１】
別の実施形態は、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと、を有する、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）を提供する。
【００２２】
さらに別の実施形態は、配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３５と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと、を有する、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）を提供する。
【００２３】
一実施形態は、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶαドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３６と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖαドメインと、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するＶβドメインであって、ＣＤＲ３領域が、配列番号３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｖβドメインと、を有する、操作されたマウスＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）を提供する。開示されるｍＴＣＲのいずれもヒト化することができる。
【００２４】
一実施形態は、開示されるｍＴＣＲのいずれかを発現するように操作されたＴ細胞である。Ｔ細胞は、ヒトのＴ細胞であり得る。Ｔ細胞はまた、自己Ｔ細胞であり得る。
【００２５】
別の実施形態は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３のＱ２１〜Ｌ２４２を含む可溶性ｍＴＣＲ  α鎖を提供する。
【００２６】
別の実施形態は、配列番号５０、５１、５２、もしくは５３を含む操作されたｍＴＣＲ  β鎖、または配列番号２４、２５、２６、もしくは２７のＥ１８〜Ｙ２７６の細胞外ドメインを提供する。
【００２７】
一実施形態は、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、または６２と少なくとも９０％の配列同一性を有する融合タンパク質を提供する。
【００２８】
別の実施形態は、ｍＴＣＲタンパク質またはポリペプチドのいずれか１つをコードするベクターを提供する。
【００２９】
別の実施形態は、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、または７１と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を提供する。
【００３０】
別の実施形態は、
ａ）配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸残基２１〜１３２と少なくとも９０％の配列同一性を有するα鎖可変ドメイン（Ｖα）と、
ｂ）配列番号１１、１２、１３、または１４のアミノ酸残基１８〜１３１と少なくとも９０％の配列同一性を有するβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）と
を含む、非天然起源ｈＡＦＰ１５８エピトープ特異的マウスＴ細胞受容体を提供する。
【００３１】
別の実施形態は、配列番号１１、１２、１３、または１４に従ったアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のポリペプチドに結合した、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、または１０に従ったアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。
【００３２】
別の実施形態は、配列番号２４、２５、２６、または２７に従ったアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のポリペプチドに結合した、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に従ったアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。
【００３３】
別の実施形態は、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、または７１によってコードされるＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞を提供する。Ｔ細胞は、ヒトのＴ細胞であり得る。
【００３４】
別の実施形態は、ＴＣＲ  αおよびβ鎖を欠損するドナー細胞に融合したＣＤ８＋Ｔｅｔ１５８＋細胞を有するハイブリドーマを提供する。ハイブリドーマは、典型的には、ｈＡＦＰ＋腫瘍細胞に応答する。特定の実施形態では、ハイブリドーマは、ＩＬ−２を分泌する。
【００３５】
別の実施形態は、配列番号１１、１２、１３、１４、２４、２５、２６、または２７に従ったアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２のポリペプチドに結合した、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、または１０に従ったアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のポリペプチドを有する融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、一本鎖抗ＣＤ３抗体に結合している。
【００３６】
別の実施形態は、開示されるｍＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を遺伝子的に操作し、操作されたＴ細胞を対象における腫瘍負荷を低減するのに有効な量で対象に投与することによって、腫瘍の治療を必要とする対象において腫瘍を治療するための方法を提供する。特定の実施形態では、腫瘍は、肝細胞癌である。Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞であり得る。
【００３７】
別の実施形態は、開示されるポリペプチドまたはタンパク質を細胞の試料に接触させることによって肝細胞癌を検出するための方法を提供し、ポリペプチドまたはタンパク質の細胞への特異的な結合は、肝細胞癌細胞を示す。
【００３８】
別の実施形態は、開示されるポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１Ａ−１〜１Ａ−４は、Ｔｈｙ１．２＋Ｔ細胞に対するゲーティングによってＣＤ８およびＩＦＮ−γについて分析するためのｈＡＦＰ１５８ペプチドで刺激されたマウス末梢血液細胞のドットプロットである。図１Ａ−５は、ｌｖ予備刺激ありまたはなしでの総脾臓細胞のＣＤ８＋ＩＦＮｇ＋の％のグラフである。図１Ｂ−１〜１Ｂ−３は、ＨｅｐＧ２（ＡＦＰ−）（図１Ｂ−１）、ＨｅｐＧ２（ＡＦＰ＋）（図１Ｂ−２）、およびｈＡＦＰ１５８ペプチド（図１Ｂ−３）で刺激された脾臓Ｔ細胞のドットプロットである。図１Ｂ−４は、ＨｅｐＧ２（ＡＦＰ−）、ＨｅｐＧ２（ＡＦＰ＋）、およびｈＡＦＰ１５８ペプチドで刺激された総脾臓細胞のＣＤ８＋ＩＦＮｇ＋の％のグラフである。図１Ｃ−１〜１Ｃ−３は、脾臓細胞と共培養されたＨｅｐＧ２細胞の顕微鏡写真である。図１Ｃ−４は、生き残っているＨｅｐＧｅ細胞（ＯＤ５９５） 対 Ｅ／Ｔ比率のグラフであり、（●）はＬｖ＋ペプチドであり、（■）はペプチド＋ペプチドである。
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、免疫化ＡＡＤマウス脾臓細胞の養子移入がマウスの腫瘍チャレンジを防止し、ＮＳＧマウスにおいてＨｅｐＧ２腫瘍異種移植片を根絶することを示す。図２Ａは、免疫化マウス脾臓細胞の約１０％がｈＡＦＰ１５８ペプチドに応答してＩＦＮｇを産生したことを示すドットプロットである。図２Ｂは、ナイーブまたは免疫化マウスの１５００万個の総脾臓細胞（１５０万個のｈＡＦＰ１５８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞）をＮＳＧマウスに注射し、これを次いでＨｅｐＧ２腫瘍細胞でチャレンジしたことを示す。図２Ｃは、腫瘍サイズが直径２ｃｍに到達するとき、ＮＳＧマウスに免疫化マウスの１５０万個の脾臓細胞を注射したことを表す図である。図２Ｄは、対照（●）およびＡＣＴ（■）における腫瘍接種後の日数に対する腫瘍サイズ（ｍｍ３）の線グラフである。図２Ｅは、マウス１（□）、マウス２（□）、マウス３（□）、およびマウス４（□）における腫瘍接種後の日数に対する腫瘍体積（ｍｍ３）の線グラフである。
【図３−１】図３Ａは、ｈＡＦＰ１５８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の純度を示すドットプロットである。図３Ｂは、ｈＡＦＰ１５８特異的ＩＦＮ□産生細胞のパーセントを示すドットプロットである。図３Ｃは、インフルエンザＭ１特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の純度を示すドットプロットである。図３Ｄは、インフルエンザＭ１特異的ＩＦＮ□産生細胞のパーセントを示すドットプロットである。図３Ｅは、Ｌｖ＋ｈＡＦＰ１５８（□）のＣＤ８またはインフルエンザ＋Ｍ１のＣＤ８で処置されたマウスについての腫瘍接種後の日数に対する腫瘍体積（ｍｍ３）の線グラフである。
【図３−２】図３Ｆ〜３Ｈは、Ｔｅｔ１５８四量体染色およびセルソーターによってＴｅｔ１５８＋およびＴｅｔ１５８−細胞にさらに分離された、ｈＡＦＰ免疫化マウス由来精製ＣＤ８  Ｔ細胞のドットプロットである。選別前および後の純度を提示する。図３Ｉは、Ｔｅｔ１５８＋（□）またはＴｅｔ１５８−（□）細胞で処置されたマウスについての腫瘍接種後の日数に対する腫瘍サイズ（ｍｍ３）の線グラフである。図３Ｊ〜３Ｏは、図３Ｉからのマウスの画像である。
【図４−１】図４Ａは、Ｔ細胞ハイブリドーマクローンからのＩＬ−２（ｐｇ／ｍｌ）の棒グラフである。ＢＷ−Ｌｙｔ２．４融合パートナー細胞および５つの異なるハイブリドーマクローンを、ｈＡＦＰ＋（□）またはｈＡＦＰ−（□）ＨｅｐＧ２腫瘍細胞と３通りに共培養し、ＩＬ−２産生をＥＬＩＳＡによって検出した。
【図４−２】図４Ｂ〜４Ｇは、抗Ｖβ８．３抗体で染色されたハイブリドーマクローンのヒストグラムである。図４Ｈ〜４Ｍは、Ｔｅｔ１５８四量体で染色されたハイブリドーマクローンのヒストグラムである。
【図５−１】図５Ａは、ＴＣＲ遺伝子を発現する組み換えｌｖの概略図である。ペアとなるＴＣＲ  αおよびβ鎖遺伝子をＥＦ１αプロモーターの制御下で単一分子として発現した。Ｐ２Ａ配列をＴＣＲ  αおよびβ鎖の間に挿入してその同数の生成を可能にした。図５Ｂ〜５Ｅは、３つの異なるＴＣＲ−ｌｖでの形質導入後のヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞のＴｅｔ１５８四量体染色のヒストグラムである。ヒストグラムおよびＭＦＩを提示した。図５Ｇ〜５Ｊ、５Ｌ〜５Ｏ、および５Ｑ〜５Ｔは、Ｔｅｔ１５８＋ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞のパーセントおよびＭＦＩを示すＴＣＲ−ｌｖｓが形質導入された３つの異なるドナーからの初代ヒトＴ細胞のドットプロットである。モック形質導入細胞に、ｌｖ形質導入なしまたはＧＦＰ−ｌｖ形質導入ありで同じＣＤ３／ＣＤ２８処理を行った。図５Ｆ、５Ｋ、５Ｐ、および５Ｕは、３つの異なるドナーからの形質導入Ｔ細胞上のＴｅｔ１５８のＭＦＩを示す棒グラフである。ＴＣＲ−Ｔ細胞を示す。ＣＤ８またはＣＤ４  Ｔ細胞のみをゲーティングし、代表的なプロットに示した。
【図５−２】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−３】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−４】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−５】図５−１の説明を参照のこと。
【図６−１】図６Ａは、ＴＣＲ遺伝子が形質導入され、ＡＦＰ−ＨｅｐＧ２（灰色網掛）、Ｈｕｈ７（塗りつぶし）、または  ＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２（網掛なし）で処理された、初代ヒトＴ細胞からのＩＦＮ−ｇ  （ｐｇ／ｍｌ）の棒グラフである。
【図６−２】図６Ｂ〜６Ｅは、ＣＤ８によるＩＦＮ□およびＩＬ−２の細胞内染色を示すドットプロットである。図６Ｆ〜６Ｉは、ＣＤ４によるＩＦＮ□およびＩＬ−２の細胞内染色を示すドットプロットである。
【図６−３】図６Ｊ〜６Ｏは、ｈＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２腫瘍細胞によるＣＤ８およびＣＤ４  ＴＣＲ−Ｔ細胞増殖の誘発を示すドットプロットおよびヒストグラムである。実験を同様のデータで２回繰り返した。
【図７−１】図７Ａは、ＴＣＲ遺伝子が形質導入され、ＡＦＰ−ＨｅｐＧ２（灰色網掛）、Ｈｕｈ７（塗りつぶし）、または  ＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２（網掛なし）で処理された、ＨＬＡ−Ａ２＋ヒト初代Ｔ細胞による殺滅パーセントの棒グラフである。図７Ｂは、ＴＣＲ（□）およびモック（□）についての殺滅パーセント 対 Ｅ：Ｔ比率の線グラフである。図７Ｃ、７Ｄ、および７Ｅは、ＴＣＲ遺伝子形質導入後に磁気ビーズによって分離されたドナーＣＤ８およびＣＤ４  ＴＣＲ−Ｔ細胞を示すドットプロットである。図７Ｆ〜７Ｋは、モック形質導入、ＣＤ４、またはＣＤ８  ＴＣＲ−Ｔ細胞とＨｅｐＧ２腫瘍細胞との共培養の顕微鏡写真である。写真は共培養の２時間および２４時間後に撮影した。図７Ｅは、ＴＣＲまたはモック形質導入ヒトＴ細胞におけるＣＤ４細胞（黒色棒）、ＣＤ８細胞（白色棒）、および総Ｔ細胞（灰色棒）の殺滅パーセントを測定するＬＤＨアッセイの結果を示す棒グラフである。図７Ｍ〜７Ｏは、図Ｌからの代表的な細胞の写真である。
【図７−２】図７−１の説明を参照のこと。
【図８】ＴＣＲ−１発現レンチウイルスベクターであるｐＣＤＨ−ＥＦ１−ｃｏＴＣＲ−１のマップである。
【図９】ＴＣＲ−１発現レンチウイルスベクターであるｐＣＤＨ−ＥＦ１−ｃｏＴＣＲ−２のマップである。
【図１０】ＴＣＲ−１発現レンチウイルスベクターであるｐＣＤＨ−ＥＦ１−ｃｏＴＣＲ−３のマップである。
【図１１】図１１Ａは、免疫化マウスからのＴｅｔ１５８＋ＣＤ８＋脾臓細胞のパーセントを示すドットプロットである。図１１Ｂ〜１１Ｐは、異なる抗Ｖベータ鎖抗体を用いるＣＤ８＋、Ｔｅｔ１５８＋細胞におけるＶベータ発現を示すヒストグラムである。
【図１２】図１２Ａ〜Ｄは、組み換えｌｖでの初代ヒトＴ細胞の形質導入を示す。図１２Ａは、ＧＦＰ−ｌｖプロモーターの例示である。図１２Ｂおよび１２Ｃは、ＧＦＰ発現初代Ｔ細胞の代表的な画像である。図１２Ｄは、ＧＦＰ＋Ｔ細胞のヒストグラムである。
【図１３】図１３Ａは、抗Ｖベータ鎖抗体で染色されたＴＣＲ−Ｔ細胞のパーセントを示すヒストグラムである。図１３Ｂは、Ｔｅｔ１５８四量体で染色されたＴＣＲ−Ｔ細胞のパーセントを示すヒストグラムである。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｉは、ＡＦＰ１５８ペプチドパルスＨＬＡ−Ａ２マウス脾臓細胞を特異的に認識するヒトＴＣＲ−Ｔ細胞を示す。図１４Ａは、ＡＡＤマウス脾臓細胞で刺激され、ペプチドなし（灰色棒）、インフルエンザＭ１ペプチド（黒色棒）、またはＡＦＰ１５８ペプチド（白色棒）を用いてパルスされた、モックＴ細胞、ＴＣＲ１  Ｔ細胞、ＴＣＲ２  Ｔ細胞、またはＴＣＲ３  Ｔ細胞におけるＩＦＮ−ｇ産生（ｐｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｉは、ＡＦＰ１５８ペプチドパルスＨＬＡ−Ａ２マウス脾臓細胞を特異的に認識するヒトＴＣＲ−Ｔ細胞を示す。図１４Ｂ〜１４Ｅは、ｈＡＦＰ１５８ペプチドパルスＨＬＡ−Ａ２細胞で刺激されたＩＦＮｇ染色ヒトＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８の両方を含有する）のパーセントを示すヒストグラムである。図１４Ｆ〜１４Ｉは、ｈＡＦＰ１５８ペプチドパルスＨＬＡ−Ａ２細胞で刺激されたＩＬ−２染色ヒトＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８の両方を含有する）のパーセントを示すヒストグラムである。
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｔは、ヒトＴＣＲ−Ｔの養子移入が、ＮＳＧマウスにおけるＨｅｐＧ２腫瘍に対する抗腫瘍効果を生じることを示す。図１５Ａは、総ヒトＴＣＲ−Ｔ細胞のうちのＴｅｔ１５８＋細胞％を示すドットプロットである。図１５Ｂは、対照およびＴＣＲ−Ｔ群における腫瘍接種後の日数に対する腫瘍過成長（腫瘍フリーマウス％）を表す線グラフである。図１５Ｃは、対照（●）およびＴＣＲ−Ｔ（■）における腫瘍接種後の日数に対する腫瘍サイズ（ｍｍ３）を表す線グラフである。図１５Ｄ〜１５Ｋは、モックＴ処置（Ｄ１〜４）およびＴＣＲ−Ｔ処置（Ｄ５〜８）マウスにおける接種後３１日目のＨｅｐＧ２腫瘍の写真である。図１５Ｌ〜１５Ｏは、総マウス血液細胞のうちのヒトＣＤ４５＋細胞のパーセントを示す代表的なドットプロットである。図１５Ｐは、対照（●）およびＴＣＲ−Ｔ（■）についての総マウス血液細胞のうちのヒトＣＤ４５＋細胞パーセントを表す線グラフである。図１５Ｑ〜１５Ｒは、ＮＳＧマウスにおける移入ヒトＴ細胞のうちのＴｅｔ１５８＋細胞のパーセンテージを示す代表的なドットプロットである。図１５Ｓは、ＡＣＴ後の日数に対する総移入ヒトＴ細胞のうちのＴｅｔ１５８＋細胞のパーセントを表す線グラフである。図１５Ｔは、ＡＣＴ後の日数に対する総移入ＣＤ８（□）およびＣＤ４（□）Ｔ細胞のうちのＴｅｔ１５８＋細胞のパーセントを表す線グラフである。
【図１５−２】図１５−１の説明を参照のこと。
【図１６−１】９つのｍＴＣＲ配列のＶ領域の概略的な比較である。
【図１６−２】図１６−１の説明を参照のこと。
【図１７】９つのｍＴＣＲ  α鎖（図１７Ａ）およびβ鎖（図１７Ｂ）のＣＤＲ３のアミノ酸配列の概略的な比較である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用される「抗原特異性を有する」という表現は、ＴＣＲの癌抗原への結合が免疫応答を誘導するように、ＴＣＲが癌抗原に特異的に結合し、これを免疫学的に認識することができることを意味する。
【００４１】
「Ｔｅｔ１５８」という用語は、ＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８四量体を指す。
【００４２】
「ｈＡＦＰ１５８」という用語は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するヒトアルファフェトタンパク質ポリペプチドを指す。
【００４３】
「ＴＣＲ」という頭文字語は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示される抗原を特定する役割を果たすＴ細胞の表面上の特定の受容体であるＴ細胞受容体を指す。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を有する免疫グロブリン分子を示すことが意図される。「可変領域」という用語は、免疫グロブリンのそのようなドメインを抗体によって広く共有されるドメイン（抗体Ｆｃドメインなど）と区別することが意図される。可変領域は、その残基が抗原結合の役割を果たす「超可変領域」を含む。超可変領域は、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、典型的には、近似的に軽鎖可変ドメインにおける残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、および８９−９７（Ｌ３）、ならびに近似的に重鎖可変ドメインにおける残基２７−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５−１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、および９１−９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。抗体という用語は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０、Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｕｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１：２５３、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５、国際公開第ＷＯ９４／０４６７８号および同第ＷＯ９４／２５５９１号、米国特許第６，００５，０７９号参照）、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）参照）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗体に対する抗Ｉｄおよび抗−抗Ｉｄ抗体を含む）を含む。特に、そのような抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子を含む。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗体の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）および任意に抗体の「可変領域」抗原認識部位を含むフレームワーク残基を含有し、抗原に免疫特異的に結合する能力を示す、抗体の１つ以上の部分を指す。そのような断片は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）、およびそれらの突然変異体、天然起源バリアント、ならびに抗体の「可変領域」抗原認識部位および異種タンパク質（例えば、毒素、異なる抗原の抗原認識部位、酵素、受容体または受容体リガンドなど）を含む融合タンパク質を含む。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「断片」という用語は、少なくとも５個の連続アミノ酸残基、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１５個の連続アミノ酸残基、少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、少なくとも２５個の連続アミノ酸残基、少なくとも４０個の連続アミノ酸残基、少なくとも５０個の連続アミノ酸残基、少なくとも６０個の連続アミノ酸残基、少なくとも７０個の連続アミノ酸残基、少なくとも８０個の連続アミノ酸残基、少なくとも９０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１００個の連続アミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続アミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続アミノ酸残基、少なくとも２００個の連続アミノ酸残基、少なくとも２５０個の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「調節する」という用語は、効果、結果、または活性（例えば、シグナル伝達）を変更する能力を指す。そのような調節は、作動的または拮抗的であり得る。拮抗的調節は、部分的であり得る（すなわち、無効にするのではなく、弱める）か、またはそのような活性を完全に無効化（例えば、中和）することができる。調節は、抗体の結合後の受容体の内在化、または標的細胞上での受容体の発現の低減を含むことができる。作動的調節は、活性（例えば、シグナル伝達）を増強またはそうでなければ増加もしくは増強させることができる。またさらなる実施形態では、そのような調節は、誘導されるシグナル伝達の性質を変更するために、リガンドとその同源の受容体との間の相互作用の性質を変更することができる。例えば、分子は、リガンドまたは受容体に結合することによって、他のリガンドまたは受容体に結合するそのような分子の能力を変更し、それによってそれらの全体的な活性を変更することができる。好ましくは、そのような調節は、測定可能な免疫系活性における少なくとも１０％の変更、より好ましくは、そのような活性における少なくとも５０％の変更、もしくは少なくとも２倍、５倍、１０倍、またはさらにより好ましくは、そのような活性における少なくとも１００倍の変更を提供するであろう。
【００４８】
結合または示される効果の文脈で使用される「実質的に」という用語は、観察される効果が生理学的または治療的に意義があることを示すことが意図される。よって、例えば、分子は、遮断の程度が生理学的または治療的に意義がある場合（例えば、そのような程度が、６０％超の完全性、７０％超の完全性、７５％超の完全性、８０％超の完全性、８５％超の完全性、９０％超の完全性、９５％超の完全性、または９７％超の完全性である場合）、リガンドまたは受容体の活性を実質的に遮断することができる。同様に、分子は、そのような免疫特異性および特徴が、６０％超の同一性、７０％超の同一性、７５％超の同一性、８０％超の同一性、８５％超の同一性、９０％超の同一性、９５％超の同一性、または９７％超の同一性である場合、別の分子と実質的に同じ免疫特異性および／または特徴を有するといわれる。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、「キメラ抗体」は、抗体の異なる部分が非ヒト抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（通常はマウスまたはラット）免疫グロブリンからの１つ以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９９％、好ましくは約９５％以上同一であるべきである。よって、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、場合によってはＣＤＲを除き、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、キメラ抗体の可変領域全体は非ヒトのものであるので、例えば、ヒト化抗体は典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「内因性濃度」という用語は、分子が細胞（その細胞は正常細胞、癌細胞、または感染細胞であり得る）によって天然に（すなわち、発現ベクターまたは組み換えプロモーターの不在下で）発現するレベルを指す。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療すること」、「治療」、および「治療的使用」という用語は、疾患または障害の１つ以上の症状の除去、低減、または改善を指す。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「治療有効量」は、そのような症状の臨床的に意義のある除去、低減、または改善を媒介するのに十分な治療剤の量を指す。効果は、その規模がレシピエント対象の健康または予後に影響を及ぼすのに十分である場合、臨床的に意義がある。治療有効量は、疾患の発症を遅延または最小化、例えば、癌の拡散を遅延または最小化するのに十分な治療剤の量を指し得る。治療有効量は、疾患の治療または管理において治療的利益を提供する治療剤の量も指し得る。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「予防剤」という用語は、そのような障害または疾患のいずれかの症状の検出前に障害または疾患の予防において使用することができる薬剤を指す。「予防有効」量は、そのような保護を媒介するのに十分な予防剤の量である。予防有効量は、疾患の予防において予防的利益を提供する予防剤の量も指し得る。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「癌」という用語は、細胞の異常な制御されない成長からもたらされる新生物または腫瘍を指す。本明細書で使用されるとき、癌は、白血病およびリンパ腫を明示的に含む。「癌」という用語は、遠位部位に転移し、非癌細胞のものとは異なる表現型形質、例えば、軟寒天などの３次元基質におけるコロニーの形成、または３次元基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物におけるチューブ状ネットワークもしくはウェブ状マトリックスの形成を示す可能性を有する細胞を含む疾患を指す。非癌細胞は、軟寒天においてコロニーを形成せず、３次元基底膜または細胞外マトリックス調製物において明瞭な球体状構造を形成する。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「免疫細胞」は、これらに限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、およびマクロファージを含む、造血器由来の任意の細胞を指す。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「結合価」は、分子あたりの利用可能な結合部位の数を指す。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「免疫的」、「免疫学的」、または「免疫」応答という用語は、レシピエント患者におけるペプチドに対する有益な液性（抗体媒介性）および／または細胞（抗原特異的Ｔ細胞またはそれらの分泌産物によって媒介される）応答の発現である。そのような応答は、免疫原の投与によって誘発される活性応答または抗体もしくは予備刺激したＴ細胞の投与によって誘発される受動応答であり得る。細胞免疫応答は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子と関連したポリペプチドエピトープの提示によって誘導される。応答は、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小膠細胞、好酸球の活性化、好中球または先天性免疫の他の成分の活性化または動員も含み得る。細胞媒介性免疫学的応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイによって決定することができる。免疫原の保護または治療効果への液性および細胞応答の相対的な寄与は、免疫化同系動物からの抗体およびＴ細胞を別々に単離し、第２の対象における保護または治療効果を測定することによって区別することができる。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「免疫原性物質」または「免疫原」は、任意に補助剤と共に哺乳動物に投与することによりそれ自体に対する免疫学的応答を誘発することができる。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、交換可能に使用され、これらに限定されないが、ヒト、齧歯類、例えば、マウスおよびラット、ならびに他の実験動物を含む、哺乳動物を指す。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」という用語は、修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）にかかわらず、任意の長さのアミノ酸の鎖を指す。ポリペプチドという用語は、タンパク質およびその断片を含む。ポリペプチドは、「外因性」であり得、それらが細菌細胞によって産生されるヒトポリペプチドなどの、使用される宿主細胞とは「異種」、すなわち、異質であることを意味する。ポリペプチドは、本明細書においてアミノ酸残基配列として開示される。それらの配列は、アミノ酸からカルボキシ末端への方向で左から右へと記載される。標準的な用語体系に従って、アミノ酸残基配列は、以下に示されるように３文字または１文字コードのいずれかで呼ばれる。アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、「バリアント」という用語は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは異なるが、本質的な特性を保持するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドの典型的なバリアントは、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、相違は、参照ポリペプチドおよびバリアントの配列が全体的には密接に類似しており、多くの領域において同一であるように限定される。バリアントおよび参照ポリペプチドは、アミノ酸配列が１つ以上の修飾（例えば、置換、付加、および／または欠失）によって異なり得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされたものであってもなくてもよい。ポリペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントなどの天然起源であってもよく、または天然起源であることが知られていないバリアントであってもよい。
【００６３】
開示のポリペプチドの構造において修飾および変更を行いかつ依然としてポリペプチドと類似する特徴を有する分子を得ることができる（例えば、保存的アミノ酸置換）。例えば、特定のアミノ酸は、明らかな活性の喪失なしに配列において他のアミノ酸に置換することができる。ポリペプチドの生物学的機能的活性を定義するものがポリペプチドの相互作用能力および性質であるので、ポリペプチド配列において特定のアミノ酸配列置換を行い、それにもかかわらず同様の特性を有するポリペプチドを得ることができる。
【００６４】
そのような変更を行う際に、アミノ酸の疎水親水度指数が考慮され得る。ポリペプチドに相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水親水度アミノ酸指数の重要性は、一般的には当該技術分野で理解されている。特定のアミノ酸を、類似する疎水親水度指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換し、依然として類似する生物学的活性を有するポリペプチドをもたらすことができることが知られている。各アミノ酸には、その疎水性および電荷の特徴に基づく疎水親水度指数が割り当てられている。それらの指数は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
【００６５】
アミノ酸の相対的な疎水親水度の特徴は、得られるポリペプチドの二次構造を決定し、これはひいてはポリペプチドの、酵素、基質、受容体、抗体、抗原、および補因子などの他の分子との相互作用を定義すると考えられる。アミノ酸を類似する疎水親水度指数を有する別のアミノ酸によって置換し、依然として機能的に同等のポリペプチドを得ることができることが当該技術分野で知られている。そのような変更において、その疎水親水度指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
【００６６】
特にそれによって作製される生物学的機能的同等のポリペプチドまたはペプチドを免疫学的実施形態において使用することが意図される場合、親水性に基づく同様のアミノ酸の置換も行うことができる。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、プロリン（−０．５±１）、トレオニン（−０．４）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を類似する親水性値を有する別のものに置換し、依然として生物学的に同等の、特に免疫学的に同等のポリペプチドを得ることができることが理解される。そのような変更において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
【００６７】
上で概説されるように、アミノ酸置換は、一般的には、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。様々な前述の特徴を考慮する例示的な置換は、当業者に周知であり、（元の残基：例示的な置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｒｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、および（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）を含む。本開示の実施形態は、よって、上記のようなポリペプチドの機能的または生物学的同等物を企図する。特に、ポリペプチドの実施形態は、目的のポリペプチドと約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するバリアントを含むことができる。
【００６８】
「配列同一性パーセント（％）」という用語は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後の、参照核酸配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージとして定義される。配列同一性パーセントを決定する目的のアラインメントは、当該技術分野の技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成することができる。比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータは、既知の方法によって決定することができる。
【００６９】
本明細書における目的のために、所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列Ｃの、所与の核酸配列Ｄに対する配列同一性％（これは代替的には、所与の配列Ｄに対して特定の配列同一性％を有するか、または含む所与の配列Ｃと表現することができる）は、以下の通り計算され、
１００×Ｗ／Ｚ、
式中、Ｗは、配列アラインメントプログラムによってそのプログラムのＣおよびＤのアラインメントにおいて完全な一致として評価されるヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さとは等しくない場合、Ｃ対Ｄの配列同一性％がＤ対Ｃの配列同一性％とは等しくならないことが理解されるであろう。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される担体」という用語は、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝食塩溶液、水、および乳剤、例えば、油／水または水／油乳剤、ならびに様々なタイプの湿潤剤のいずれかを包含する。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「抗原決定基」および「エピトープ」という用語は、交換可能に使用され、抗体によって認識される構造を指す。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、「立体構造エピトープ」は、抗原のアミノ酸配列の不連続部分を含むエピトープである。抗体は、抗原の３−Ｄ表面特徴、形状、または三次構造に基づく立体構造エピトープに結合する。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「線状エピトープ」は、抗原からのアミノ酸の連続配列によって形成されるエピトープである。線状エピトープは、典型的には、約５〜約１０個の連続アミノ酸残基を含む。抗体は、抗原の一次配列に基づく線状エピトープに結合する。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「抗原結合部位」とも呼ばれる「パラトープ」は、抗原を認識し、これに結合する、抗体の一部である。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、「養子細胞移入」またはＡＣＴは、患者独自のＴ細胞が収集され、エクスビボ増殖され、患者に再注入される、免疫療法のタイプである。ＡＣＴの２つのタイプは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞療法である。両方の技法は、特定の抗原を認識および攻撃するＴ細胞受容体の能力を向上させる。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体と呼ばれるそれらの表面上の受容体を産生するように操作される。受容体は、Ｔ細胞が腫瘍細胞上の抗原を認識および結合することを可能にする。ＴＣＲ−Ｔ細胞療法では、Ｔ細胞は、患者から収集され、腫瘍抗原に特異的なＴＣＲを発現するように修飾され、エクスビボで増殖され、患者に再注入される。
【００７６】
ＩＩ．Ｔ細胞受容体組成物
癌細胞の表面で発現する、ｈＡＦＰ、好ましくはｈＡＦＰ１５８に特異的に結合する受容体をコードするＴ細胞受容体遺伝子が提供される。ＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８に特異的なマウスＴＣＲ  αおよびβ鎖遺伝子の９ペアを特定および合成した。ＴＣＲ遺伝子のアミノ酸および核酸配列を以下に提供する。ＴＣＲ遺伝子のうちの１つ以上を含有するベクターも提供される。
【００７７】
別の実施形態は、ヒトＨｅｐＧ２細胞をインビトロで認識および殺滅し、ＮＳＧマウスにおいてラージＨｅｐＧ２腫瘍異種移植片を根絶するｈＡＦＰ１５８特異的（Ｔｅｔ１５８）マウスＣＤ８  Ｔ細胞を提供する。
【００７８】
また別の実施形態は、Ｔｅｔ１５８  ＣＤ８  Ｔ細胞から作製されるＴ細胞ハイブリドーマを提供する。Ｔ細胞ハイブリドーマは、ペアとなるＴＣＲ  αおよびβ鎖遺伝子の特定を可能にした。一実施形態は、ＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８に特異的なマウスＴＣＲ  αおよびβ鎖遺伝子が形質導入された健康なドナーＣＤ８  Ｔ細胞を提供する。遺伝子的に操作されたＴＣＲは、非常に低いＥ／Ｔ比率でドナー細胞がＨｅｐＧ２腫瘍細胞を認識および効果的に殺滅するのを可能にする。ＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８に特異的なこれらのマウスＴＣＲ遺伝子は、養子細胞移入を介して患者の自己Ｔ細胞を修飾およびリダイレクトしてＨＣＣ腫瘍を治療する可能性を有する。
【００７９】
別の実施形態は、可溶性Ｔ細胞受容体を提供する。一実施形態では、可溶性ＴＣＲは、ＴＣＲポリペプチドの細胞外ドメインを含む。
【００８０】
Ａ．遺伝子的に操作されたＴ細胞受容体
開示されるＴＣＲ遺伝子は、組み換えｌｖ予備刺激したおよびペプチドブーストしたＡＡＤマウスからのものである。よって、技術的には、これらのＴＣＲは「天然起源」ではない。加えて、ＴＣＲのＶαおよびＶβ領域を得た後、全長αおよびβ鎖を、αおよびβ鎖の特定されたＶ領域、ならびにｈｇｐ１００に特異的なＨＬＡ−Ａ２マウスＴＣＲのαおよびβ鎖の定常領域（Ｃ領域）を用いることによって設計した。よって、ＴＣＲ全体およびそれらの遺伝子は天然起源ではない。
【００８１】
１．ｍＴＣＲ−１、２、３、６、８、１０、１１、１７、および３８Ｖαドメインのタンパク質配列
一実施形態は、（配列番号２）と少なくとも９０％、９５％、９９または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１Ｖα（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ３０＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000002
【００８２】
別の実施形態は、（配列番号３）と９０％、９５％、９９または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−２Ｖα（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ３０＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000003
ｍＴＣＲ−１α鎖Ｖ領域をｍＴＣＲ−２α鎖と比較して、２アミノ酸のみの相違（太字かつ下線）がある。
【００８３】
別の実施形態は、（配列番号４）と少なくとも９０％、９５％、９９または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−３Ｖα（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000004
ｍＴＣＲ−１α鎖とｍＴＣＲ−３α鎖との間には複数のアミノ酸の相違がある（太字かつ下線）。実際には、Ｊセグメントが異なる（ＴＲＡＪ３０の代わりに、ＴＲＡＪ１２がｍＴＣＲ−３  Ｖαに使用される）。
【００８４】
一実施形態は、（配列番号５）と少なくとも９０％、９５％、９９または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−６Ｖα（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ３０＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000005
【００８５】
別の実施形態は、（配列番号６）と９０％、９５％、９９または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−８Ｖα（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000006
ｍＴＣＲ−６α鎖とｍＴＣＲ−８α鎖との間には複数のアミノ酸の相違がある（太字かつ下線）。実際には、Ｊセグメントが異なる（ＴＲＡＪ３０の代わりに、ＴＲＡＪ１２がｍＴＣＲ−８  Ｖαに使用される）。
【００８６】
別の実施形態は、（配列番号７）と少なくとも９０％、９５％、９９または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１０Ｖα（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000007
ｍＴＣＲ−６α鎖Ｖ領域をｍＴＣＲ−８α鎖と比較して、１アミノ酸のみの相違（太字かつ下線）がある。
【００８７】
別の実施形態は、（配列番号８）と少なくとも９０％、９５％、９９または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１１Ｖα（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000008
ｍＴＣＲ−６α鎖Ｖ領域をｍＴＣＲ−８α鎖と比較して、２アミノ酸のみの相違（太字かつ下線）がある。
【００８８】
一実施形態は、（配列番号９）と少なくとも９０％、９５％、９９または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１７Ｖα（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000009
【００８９】
別の実施形態は、（配列番号１０）と少なくとも９０％、９５％、９９または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−３８Ｖα（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000010
【００９０】
特定の実施形態では、先導メチオニンおよび／またはシグナル配列は、翻訳後修飾タンパク質において切断される。
【００９１】
２．ｍＴＣＲ−１、２、３、６、８、１０、１１、１７、および３８Ｖβドメインのタンパク質配列
一実施形態は、（配列番号１１）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１、２、８、１１、１７、および３８Ｖβドメイン（ＴＲＢＶ１３−１＊０１／ＴＲＢＪ２−４＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000011
【００９２】
別の実施形態は、（配列番号１２）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−３Ｖβドメイン（ＴＲＢＶ１３−１＊０１／ＴＲＢＪ２−４＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000012
ｍＴＣＲ−１およびｍＴＣＲ−２とＴＣＲ−３Ｖβとの間には１アミノ酸のみの相違（太字かつ下線）がある。
【００９３】
別の実施形態は、（配列番号１３）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−６Ｖβドメイン（ＴＲＢＶ１３−１＊０１／ＴＲＢＪ２−４＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000013
ｍＴＣＲ−１、２、８、および１１とは１アミノ酸のみの相違、ｍＴＣＲ−３とは２アミノ酸の相違、ｍＴＣＲ−１０とは３アミノ酸の相違がある。
【００９４】
別の実施形態は、（配列番号１４）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１０Ｖβドメイン（ＴＲＢＶ１３−１＊０１／ＴＲＢＪ２−４＊０１）を提供する。
2020519293.tif 000014
ｍＴＣＲ−６ＶβとＴＣＲ−１０Ｖβとの間には３アミノ酸の相違（太字かつ下線）がある。
【００９５】
特定の実施形態では、先導メチオニンおよび／またはシグナル配列は、翻訳後修飾タンパク質において切断される。
【００９６】
３．全長ｍＴＣＲ−１、２、３、６、８、１０、１１、１７、および３８α鎖のタンパク質配列
別の実施形態は、（配列番号１５）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１α鎖（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ３０＊０１／ＴＲＡＣ）を提供する。
2020519293.tif 000015
【００９７】
ｍＴＣＲ−１、２、３、６、８、１０、および１１α鎖の定常領域（Ｃα）（太字）は同じであり、それらはＨＬＡ−Ａ２  Ｔｇマウスからのｈｇｐ１００特異的ＴＣＲ  α鎖Ｃ領域と同一である。
【００９８】
別の実施形態は、（配列番号１６）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−２α鎖（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ３０＊０１／ＴＲＡＣ）を提供する。
2020519293.tif 000016
【００９９】
別の実施形態は、（配列番号１７）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−３α鎖（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１／ＴＲＡＣ）を提供する。
2020519293.tif 000017
【０１００】
別の実施形態は、（配列番号１８）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−６α鎖（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ３０＊０１／ＴＲＡＣ）を提供する。
2020519293.tif 000018
【０１０１】
別の実施形態は、（配列番号１９）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−８α鎖（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１／ＴＲＡＣ）を提供する。
2020519293.tif 000019
【０１０２】
別の実施形態は、（配列番号２０）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１０α鎖（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１／ＴＲＡＣ）を提供する。
2020519293.tif 000020
【０１０３】
別の実施形態は、（配列番号２１）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１１α鎖（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１／ＴＲＡＣ）を提供する。
2020519293.tif 000021
【０１０４】
一実施形態は、（配列番号２２）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１７α鎖（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１／ＴＲＡＣ）を提供する。
2020519293.tif 000022
【０１０５】
別の実施形態は、（配列番号２３）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−３８α鎖（ＴＲＡＶ７Ｄ−２＊０１／ＴＲＡＪ１２＊０１／ＴＲＡＣ）を提供する。
2020519293.tif 000023
【０１０６】
特定の実施形態では、先導メチオニンおよび／またはシグナル配列は、翻訳後修飾タンパク質において切断される。
【０１０７】
一実施形態では、ＩＭＧＴおよびＵｎｉｐｒｏｔウェブサイトの用語体系に基づいて、ｍＴＣＲ  α鎖の特徴は以下の通りであると考えられる。
１．Ｍ１〜Ｓ２０：ＴＣＲ  α鎖の成熟で除去されるリーダー配列
２．Ｑ２１〜Ｓ２６８：ＴＣＲ−１、２、３α鎖
３．Ｑ２１〜Ｎ１３２（またはＤ１３２）：α鎖Ｖ領域
４．Ｉ１３３〜Ｓ２６８：ｈｇｐ１００（ＤＱ４５２６１９）に特異的なＨＬＡ−Ａ２マウスＴＣＲと同一のＴＣＲ  α鎖Ｃ領域
５．Ｑ２１〜Ｌ２４２：ＴＣＲ  α鎖細胞外ドメイン
６．Ｓ２４３〜Ｌ２６３：成熟ＴＣＲ  α鎖の膜貫通領域
７．Ｒ２６４〜Ｓ２６８：成熟ＴＣＲ  α鎖の細胞内領域
【０１０８】
４．全長ｍＴＣＲ−１、２、３、６、８、１０、１１、１７、および３８β鎖のタンパク質配列
別の実施形態は、（配列番号２４）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１、２、８、１１、１７、および３８β鎖（ＴＲＢＶ１３−１＊０１／ＴＲＢＪ２−４＊０１／ＴＲＢＣ１）を提供する。
2020519293.tif 000024
ｍＴＣＲ−１、２、３、６、８、１０、１１、１７、および３８β鎖の定常領域（Ｃβ）（太字）は同じであり、それらはＨＬＡ−Ａ２  Ｔｇマウスからのｈｇｐ１００特異的ＴＣＲ  β鎖Ｃ領域と同一である。
【０１０９】
特定の実施形態では、先導メチオニンおよび／またはシグナル配列は、翻訳後修飾タンパク質において切断される。
【０１１０】
別の実施形態は、（配列番号２５）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−３β鎖（ＴＲＢＶ１３−１＊０１／ＴＲＢＪ２−４＊０１／ＴＲＢＣ１）を提供する。
2020519293.tif 000025
【０１１１】
別の実施形態は、（配列番号２６）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−６β鎖（ＴＲＢＶ１３−１＊０１／ＴＲＢＪ２−４＊０１／ＴＲＢＣ１）を提供する。
2020519293.tif 000026
【０１１２】
別の実施形態は、（配列番号２７）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１０β鎖（ＴＲＢＶ１３−１＊０１／ＴＲＢＪ２−４＊０１／ＴＲＢＣ１）を提供する。
2020519293.tif 000027
【０１１３】
特定の実施形態では、先導メチオニンおよび／またはシグナル配列は、翻訳後修飾タンパク質において切断される。
【０１１４】
一実施形態では、ＩＭＧＴおよびＵｎｉｐｒｏｔウェブサイトの用語体系に基づいて、ｍＴＣＲ  α鎖の特徴は以下の通りである。
１．Ｍ１〜Ｍ１７：ｍＴＣＲ  β鎖の成熟で除去されるリーダー配列
２．Ｅ１８〜Ｓ３０４：ｍＴＣＲ  β鎖
３．Ｅ１８〜Ｌ１３１：ｍＴＣＲ  β鎖Ｖ領域（Ｄ領域としてＳ１１３（ＴＣＲ−１＆２）またはＡ１１３（ＴＣＲ−３）〜Ａ１１６を有するＴＲＢＶ１３−１＊０１／ＴＲＢＪ２−４＊０１）
４．Ｅ１３２〜Ｓ３０４：ｈｇｐ１００（ＤＱ４５２６２０）に特異的なＨＬＡ−Ａ  ｍＴＣＲの  ｍＴＣＲ  β鎖Ｃ１領域
５．Ｅ１８〜Ｙ２７６：ｍＴＣＲ  β鎖細胞外領域
６．Ｅ２７７〜Ｍ２９８：成熟ｍＴＣＲ  β鎖の膜貫通領域
７．Ｖ２９９〜Ｓ３０４：成熟ｍＴＣＲ  β鎖の細胞内（トポロジカル）領域
【０１１５】
５．ｍＴＣＲ−１、２、３、６、８、１０、１１、１７、および３８α鎖のＣＤＲ３領域のタンパク質配列
一実施形態は、（配列番号２８）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１α鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000028
【０１１６】
別の実施形態は、（配列番号２９）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−２α鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000029
【０１１７】
一実施形態は、（配列番号３０）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−３α鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000030
【０１１８】
一実施形態は、（配列番号３１）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−６α鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000031
【０１１９】
別の実施形態は、（配列番号３２）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−８α鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000032
【０１２０】
一実施形態は、（配列番号３３）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１０α鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000033
【０１２１】
一実施形態は、（配列番号３４）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１１α鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000034
【０１２２】
別の実施形態は、（配列番号３５）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１７α鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000035
【０１２３】
一実施形態は、（配列番号３６）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−３８α鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000036
【０１２４】
６．ｍＴＣＲ−１、３、６、および１０β鎖のＣＤＲ３領域のタンパク質配列
一実施形態は、（配列番号３７）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１β鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000037
【０１２５】
一実施形態は、（配列番号３８）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−３β鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000038
【０１２６】
別の実施形態は、（配列番号３９）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−６β鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000039
【０１２７】
一実施形態は、（配列番号４０）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するｍＴＣＲ−１０β鎖ＣＤＲ３領域を提供する。
2020519293.tif 000040
【０１２８】
７．ｍＴＣＲ−１、２、３、６、８、１０、１１、１７、および３８α鎖（可溶性ＴＣＲ）の細胞外ドメイン（下線はＶα）
ＴＣＲ  αおよびβ鎖は、可溶性ＴＣＲを形成することができる。それらが検出可能な標識、例えば、蛍光分子で標識される場合、それらは腫瘍細胞上で提示されるＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８複合体を検出するために使用することができる。標識された可溶性ＴＣＲは、血液中の循環する腫瘍細胞を検出し、腫瘍組織における同種抗原エピトープ提示を決定するための診断試薬としての可能性を有し、これは養子細胞移入療法の環境におけるそのようなＴＣＲ−Ｔ細胞の使用の成功にとって重要である。
【０１２９】
一実施形態は、（配列番号４１）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−１α鎖（Ｑ２１〜Ｌ２４２）を提供する。
2020519293.tif 000041
【０１３０】
別の実施形態は、（配列番号４２）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％を有する可溶性ｍＴＣＲ−２α鎖（Ｑ２１〜Ｌ２４２）を提供する。
2020519293.tif 000042
【０１３１】
別の実施形態は、（配列番号４３）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−３α鎖（Ｑ２１〜Ｌ２４２）を提供する。
2020519293.tif 000043
【０１３２】
別の実施形態は、（配列番号４４）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−６α鎖（Ｑ２１〜Ｌ２４２）を提供する。
2020519293.tif 000044
【０１３３】
別の実施形態は、（配列番号４５）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−８α鎖（Ｑ２１〜Ｌ２４２）を提供する。
2020519293.tif 000045
【０１３４】
別の実施形態は、（配列番号４６）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−１０α鎖（Ｑ２１〜Ｌ２４２）を提供する。
2020519293.tif 000046
【０１３５】
別の実施形態は、（配列番号４７）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−１１α鎖（Ｑ２１〜Ｌ２４２）を提供する。
2020519293.tif 000047
【０１３６】
一実施形態は、（配列番号４８）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−１７α鎖（Ｑ２１〜Ｌ２４２）を提供する。
2020519293.tif 000048
【０１３７】
別の実施形態は、（配列番号４９）と９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−３８α鎖（Ｑ２１〜Ｌ２４２）を提供する。
2020519293.tif 000049
【０１３８】
８．ＴＣＲ−１、２、３、６、８、１０、および１１β鎖の細胞外ドメイン（下線はＶβ）
一実施形態は、（配列番号５０）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−１、２、８、１１β鎖（Ｅ１８〜Ｙ２７６）を提供する。
2020519293.tif 000050
【０１３９】
また別の実施形態は、（配列番号５１）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−３β鎖（Ｅ１８〜Ｙ２７６）を提供する。
2020519293.tif 000051
【０１４０】
別の実施形態は、（配列番号５２）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−６β鎖（Ｅ１８〜Ｙ２７６）を提供する。
2020519293.tif 000052
【０１４１】
別の実施形態は、（配列番号５３）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する可溶性ｍＴＣＲ−１０β鎖（Ｅ１８〜Ｙ２７６）を提供する。
2020519293.tif 000053
【０１４２】
９．指定されたｍＴＣＲの融合タンパク質配列
融合タンパク質
別の実施形態では、第１のポリペプチドドメインおよび第２のポリペプチドを含有する融合タンパク質が提供される。融合タンパク質は、任意に、融合タンパク質特異的細胞または組織、例えば、腫瘍細胞または腫瘍細胞関連血管新生を標的とするターゲティングドメインを含有することができる。
【０１４３】
融合タンパク質はまた、任意に、第１のポリペプチドを抗原結合ドメインから分離するペプチドまたはポリペプチドリンカードメインを含有する。
【０１４４】
本明細書で開示される融合タンパク質は、式Ｉ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ
のものであり、式中、「Ｎ」は、融合タンパク質のＮ末端を表し、「Ｃ」は、融合タンパク質のＣ末端を表し、「Ｒ１」は、開示されるα  ｍＴＣＲ鎖またはその断片のうちの１つである。「Ｒ２」は、ペプチド／ポリペプチドリンカードメインであり、「Ｒ３」は、β  ｍＴＣＲ鎖またはその断片である。代替実施形態では、Ｒ１は、β  ｍＴＣＲ鎖またはその断片であり、Ｒ３は、α  ｍＴＣＲ鎖である。
【０１４５】
任意に、融合タンパク質は、２つ以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化するように機能するドメインを追加で含有する。融合タンパク質を二量体化または多量体化するように機能するドメインは、別々のドメインであり得るか、またはあるいは、融合タンパク質の他のドメインのうちの１つの中に含有され得るかのいずれかである。
【０１４６】
融合タンパク質は、二量体化または多量体化され得る。二量体化または多量体化は、二量体化または多量体化ドメインにより２つの融合タンパク質間またはそれより多くの融合タンパク質の間で発生し得る。あるいは、融合タンパク質の二量体化または多量体化は、化学架橋によって発生し得る。形成される二量体または多量体は、ホモ二量体／ホモ多量体またはヘテロ二量体／ヘテロ多量体であり得る。
【０１４７】
融合タンパク質のモジュラー性質および異なる組み合わせで二量体化または多量体化するそれらの能力は、腫瘍細胞微小環境への免疫応答を増強させるように機能するターゲティング分子の豊富な選択肢を提供する。
【０１４８】
別の実施形態は、式ＩＩ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ２−Ｒ４−Ｃ
による融合タンパク質を提供し、式中、「Ｎ」は、融合タンパク質のＮ末端を表し、「Ｃ」は、融合タンパク質のＣ末端を表し、「Ｒ１」は、開示されるα  ｍＴＣＲ鎖またはその断片のうちの１つである。「Ｒ２」は、ペプチド／ポリペプチドリンカードメインであり、「Ｒ３」は、β  ｍＴＣＲ鎖またはその断片であり、「Ｒ４」は、抗ＣＤ３一本鎖抗体である。抗ＣＤ３一本鎖抗体は、当該技術分野で知られており、市販されている。
【０１４９】
一実施形態は、（配列番号５４）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−１（α鎖は下線、Ｐ２Ａは太字、β鎖は二重下線）の融合タンパク質を提供する。
2020519293.tif 000054
α鎖は下線であり、β鎖は二重下線であり、Ｐ２Ａおよびフーリン切断部位（ＵＳ２０１６／０１３７７１５  Ａ１から）は太字である。
【０１５０】
別の実施形態は、（配列番号５５）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−２（α鎖、Ｐ２Ａ、およびβ鎖）を提供する。
2020519293.tif 000055
【０１５１】
別の実施形態は、（配列番号５６）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−３（α鎖、Ｐ２Ａ、およびβ鎖）を提供する。
2020519293.tif 000056
【０１５２】
別の実施形態は、（配列番号５７）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−６（α鎖、Ｐ２Ａ、およびβ鎖）を提供する。
2020519293.tif 000057
【０１５３】
別の実施形態は、（配列番号５８）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−８（α鎖、Ｐ２Ａ、およびβ鎖）を提供する。
2020519293.tif 000058
【０１５４】
別の実施形態は、（配列番号５９）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−１０（α鎖、Ｐ２Ａ、およびβ鎖）を提供する。
2020519293.tif 000059
【０１５５】
別の実施形態は、（配列番号６０）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−１１（α鎖、Ｐ２Ａ、およびβ鎖）を提供する。
2020519293.tif 000060
【０１５６】
一実施形態は、（配列番号６１）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−１７（α鎖、Ｐ２Ａ、およびβ鎖）を提供する。
2020519293.tif 000061
【０１５７】
一実施形態は、（配列番号６２）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−３８（α鎖、Ｐ２Ａ、およびβ鎖）を提供する。
2020519293.tif 000062
【０１５８】
１０．指定されたＴＣＲ−１、ＴＣＲ−２、ＴＣＲ−３、ＴＣＲ−６、ＴＣＲ−８、ＴＣＲ−１０、ＴＣＲ−１１、ＴＣＲ−１７、およびＴＣＲ−３８のヌクレオチド配列
配列は、上記タンパク質配列に基づき、ヒト細胞における発現についてコドン最適化される。
【０１５９】
一実施形態は、（配列番号６３）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％配列同一性である核酸配列を有する指定されたｍＴＣＲ−１（αは下線、Ｐ２Ａは太字、βは二重下線）を提供する。
2020519293.tif 000063
【０１６０】
別の実施形態は、（配列番号６４）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−２（αは下線、Ｐ２Ａは太字、βは二重下線）を提供する。
2020519293.tif 000064
【０１６１】
別の実施形態は、（配列番号６５）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−３（αは下線、Ｐ２Ａは太字、βは二重下線）を提供する。
2020519293.tif 000065
【０１６２】
別の実施形態は、（配列番号６６）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−６（αは下線、Ｐ２Ａは太字、βは二重下線）を提供する。
2020519293.tif 000066
【０１６３】
別の実施形態は、（配列番号６７）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−８（αは下線、Ｐ２Ａは太字、βは二重下線）を提供する。
2020519293.tif 000067
【０１６４】
別の実施形態は、（配列番号６８）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−１０（αは下線、Ｐ２Ａは太字、βは二重下線）を提供する。
2020519293.tif 000068
【０１６５】
別の実施形態は、（配列番号６９）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−１１（αは下線、Ｐ２Ａは太字、βは二重下線）を提供する。
2020519293.tif 000069
【０１６６】
一実施形態は、（配列番号７０）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−１７（αは下線、Ｐ２Ａは太字、βは二重下線）を提供する。
2020519293.tif 000070
【０１６７】
別の実施形態は、（配列番号７１）と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する指定されたｍＴＣＲ−３８（αは下線、Ｐ２Ａは太字、βは二重下線）を提供する。
2020519293.tif 000071
【０１６８】
Ｂ．遺伝子的に操作されたＴ細胞
別の実施形態は、開示されるマウスＴＣＲ遺伝子を発現して、腫瘍細胞の表面で発現したｈＡＦＰまたはその断片に特異的に結合するＴＣＲを産生する、遺伝子的に操作されたＣＤ８＋免疫細胞を提供する。好ましくは、免疫細胞は、ヒトＴ細胞、例えば、ヒト細胞傷害性Ｔ細胞である。操作されたヒト細胞傷害性Ｔ細胞は、自己ヒト細胞傷害性Ｔ細胞であり得る。ＴＣＲ遺伝子は、コドン最適化され得る。
【０１６９】
別の実施形態は、開示されるマウスＴＣＲ遺伝子を発現するように遺伝子的に操作された、ＣＤ４＋免疫細胞、好ましくはヒトＣＤ４＋免疫細胞を提供する。ＣＤ４＋細胞は、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞を含む。操作されたヒトＣＤ４＋免疫細胞は、自己ヒトＴヘルパー細胞であり得る。ＴＣＲ遺伝子は、コドン最適化され得る。
【０１７０】
この研究において特定される９つのｈＡＦＰ１５８特異的マウスＴＣＲは、ＣＤ４  Ｔ細胞に、Ｔｅｔ１５８四量体に結合する能力を与えることができ、このことは、それらが高親和性であり、ＣＤ８補助から独立していることを示す。養子細胞療法におけるＣＤ４の役割は、明確ではない。しかし、ＨｅｐＧ２腫瘍細胞刺激に応答したＣＤ４  ＴＣＲ−Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生は、Ｔ細胞増殖を維持するためのサイトカインを提供し得る。加えて、ＣＤ４  ＴＣＲ−Ｔ細胞は、ＨｅｐＧ２腫瘍細胞に対して低い細胞傷害性を示す。よって、ＣＤ８  ＴＣＲ−ＴはｈＡＦＰ＋腫瘍細胞を殺滅するための主要プレーヤーであり得るが、ＣＤ４  ＴＣＲ−ＴはＴ細胞増殖の補助を提供することができ、これはインビボで抗腫瘍効果を生じるために重要であり得る。
【０１７１】
マウスＴＣＲは、ヒトＴＣＲと比較してヒト宿主細胞の表面での増加した発現を提供し得ると考えられる。マウスＴＣＲはまた、ヒト宿主細胞の表面上の内因性ＴＣＲを、外因性ヒトＴＣＲよりも効果的に置換することができる。しかしながら、ｍＴＣＲのヒト化は、ＴＣＲ−Ｔ細胞の反復使用での抗ＴＣＲ応答を回避するのに必要であり得る。ｍＴＣＲをヒト化する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、それらの全体が参照によって組み込まれる、米国特許第５，８６１，１５５号および同第５，８５９，２０５号、ＷＯ２００７／１３１０９２、ＥＰ０４６０１６７、ならびにＤａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１６：５８５２−５８６１（２０１０）を参照されたい。一実施形態では、開示されるｍＴＣＲ遺伝子は、Ｔ細胞に導入されるか、またはヒト対象に投与される前にヒト化される。
【０１７２】
Ｃ．Ｔ細胞ハイブリドーマ
別の実施形態は、開示されるｍＴＣＲポリペプチドを発現するＴ細胞ハイブリドーマを提供する。例えば、ハイブリドーマは、選別されたマウスＣＤ８＋Ｔｅｔ１５８＋細胞と、ＴＣＲ  αおよびβ鎖が欠損し、記載されるように選択されるＢＷ−Ｌｙｔ２．４細胞とを融合する融合の結果であり得る（Ｈｅ．，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：３８０８−３８１７（２００５））。ハイブリドーマを作製する方法は、実施例に提供される。
【０１７３】
Ｄ．抗体
一実施形態は、開示されるｍＴＣＲタンパク質に特異的に結合する抗体、例えば、配列番号２〜６２を提供する。好適な抗体は、当業者によって調製することができる。したがって、抗体または抗原結合断片は、ｍＴＣＲのアゴニストまたはアンタゴニストであり得るか、またはｍＴＣＲもしくはそのポリペプチドに特異的に結合する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、開示される抗体およびその抗原結合断片は、ｍＴＣＲまたはそのポリペプチドに免疫特異的に結合する（例えば、配列番号２〜６２のいずれか１つ）。いくつかの実施形態では、抗体は、ｍＴＣＲの細胞外ドメインに結合する（配列番号４１〜５３）。
【０１７５】
例えば、
（Ｉ）細胞（特に生細胞）の表面上に整列されるか、または
（ＩＩ）細胞（特に生細胞）の表面上に内因性濃度で整列される
開示されるｍＴＣＲポリペプチドに免疫特異的に結合することができる分子が提供される。
【０１７６】
可溶性内因性ｍＴＣＲポリペプチドに免疫特異的に結合することができる組成物も提供される。いくつかの実施形態では、分子は、可溶性ｍＴＣＲポリペプチドを低減するか、またはそのリガンドとの結合もしくはそうでなければ相互作用を防止する。
【０１７７】
抗体またはその抗原結合断片は、以下でより詳細に論じられるものなどの当該技術分野で知られている任意の好適な方法を用いて調製することができる。
【０１７８】
１．ヒトおよびヒト化抗体
開示されるｍＴＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体は、ヒトまたはヒト化であり得る。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギに由来するもの）は、ヒトにおいて天然に抗原性であり、よってヒトに投与される場合に望ましくない免疫応答を引き起こし得る。したがって、方法におけるヒトまたはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与される抗体が望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を低下させるのに役立つ。
【０１７９】
免疫化後に内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用することができる。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジ後にヒト抗体の産生をもたらすであろう。
【０１８０】
任意に、抗体は、他の種において産生され、ヒトにおける投与のために「ヒト化」される。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体でもインポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見られない残基も含有し得る。一般的には、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含有するであろう。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含有するであろう。
【０１８１】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。一般的には、ヒト化抗体は、非ヒト供給源である供給源からこれに導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「インポート」残基と呼ばれ、これは典型的には「インポート」可変ドメインに由来する。抗体ヒト化技法は、一般的には、抗体分子の１つ以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組み換えＤＮＡ技術の使用を含む。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることによって本質的に行うことができる。したがって、非ヒト抗体（またはその断片）のヒト化形態は、インタクトなヒト可変ドメインに実質的に満たないものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換された、キメラ抗体または断片である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位からの残基によって置換されている、ヒト抗体である。
【０１８２】
ヒト化抗体の作製に使用される軽および重の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために、非常に重要である。「ベストフィット」方法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。齧歯類のそれに最も近いヒト配列は、次いでヒト化抗体についてヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容される。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の下位群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る。
【０１８３】
抗体は、抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しながら、ヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の３次元モデルを用いる、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析のプロセスによって、調製することができる。３次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択される候補免疫グロブリン配列の起こり得る３次元立体構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の調査は、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。この方法では、ＦＲ残基は、所望の抗体の特徴、例えば、標的抗原（複数可）に対する増加した親和性が達成されるように、コンセンサスおよびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般的には、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすのに直接的かつ最も実質的に関与する。
【０１８４】
抗体は、基質に結合するか、または検出可能な部分で標識するか、または結合および標識の両方を行うことができる。本組成物で企図される検出可能な部分は、蛍光、酵素、および放射性マーカーを含む。
【０１８５】
２．一本鎖抗体
開示されるｍＴＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体は、一本鎖抗体であり得る。一本鎖抗体の産生のための方法は、当業者に周知である。一本鎖抗体は、短ペプチドリンカーを用いて重鎖および軽鎖の可変ドメインを一緒に融合し、これによって単一分子上で抗原結合部位を再構成することによって作製される。一方の可変ドメインのＣ末端が他方の可変ドメインのＮ末端に１５〜２５個のアミノ酸のペプチドまたはリンカーによってテザーされる一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖｓ）は、抗原結合または結合の特異性を著しく破壊することなく開発された。リンカーは、重鎖および軽鎖がそれらの適切な立体構造配向において一緒に結合することを可能にするように選択される。これらのＦｖは、天然抗体の重鎖および軽鎖に存在する定常領域（Ｆｃ）が欠損している。
【０１８６】
３．一価抗体
開示されるｍＴＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体は、一価抗体であり得る。一価抗体を調製するためにインビトロ方法を使用することができる。その断片、特にＦａｂ断片を産生する抗体の消化は、当該技術分野で知られている日常的な技法を用いて達成することができる。例えば、消化は、パパインを用いて行うことができる。抗体のパパイン消化は、典型的には、各々単一の抗原結合部位を有する、Ｆａｂ断片と呼ばれる、２つの同一の抗原結合断片、および残余Ｆｃ断片を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができる、Ｆ（ａｂ’）２断片と呼ばれる断片をもたらす。
【０１８７】
抗体消化において産生されるＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメインも含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ドメインのカルボキシ末端でのいくつかの残基の添加によってＦａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂ’断片を含む二価断片である。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における表示である。抗体断片は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして産生された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【０１８８】
４．ハイブリッド抗体
開示されるｍＴＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体は、ハイブリッド抗体であり得る。ハイブリッド抗体において、１つの重鎖および軽鎖のペアは、１つのエピトープに対する抗体において見られるものと相同であり、他の重鎖および軽鎖のペアは、別のエピトープに対する抗体において見られるペアと相同である。これは、多機能結合価の特性、すなわち、少なくとも２つの異なるエピトープに同時に結合する能力をもたらす。そのようなハイブリッドは、それぞれの成分抗体を産生するハイブリドーマの融合によって、または組み換え技法によって形成することができる。そのようなハイブリッドは、もちろん、キメラ鎖を用いて形成してもよい。
【０１８９】
５．抗体断片のコンジュゲート体または融合
抗体のターゲティング機能は、抗体またはその断片を治療剤と結合させることによって治療的に使用することができる。抗体または断片の（例えば、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分での）治療剤とのそのような結合は、抗体または抗体断片および治療剤を含む、イムノコンジュゲートを作製することによって、または融合タンパク質を作製することによって、達成することができる。
【０１９０】
抗体または断片の治療剤とのそのような結合は、抗体または抗体断片および治療剤を含む、イムノコンジュゲートを作製することによって、もしくは融合タンパク質を作製することによって、または抗体もしくは断片をｓｉＲＮＡなどの核酸に結合することによって、達成することができる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、抗体は、その半減期を変更するように修飾される。いくつかの実施形態では、より長時間にわたって循環中または治療の部位に存在するように、抗体の半減期を増加させることが望ましい。例えば、延長時間にわたって循環中または治療される場所にある抗体の力価を維持することが望ましい場合がある。抗体は、例えば、Ｘｔｅｎｄ（商標）抗体半減期延長技術（Ｘｅｎｃｏｒ、Ｍｏｎｒｏｖｉａ、ＣＡ）を用いて、半減期を延長するＦｃバリアントで操作することができる。他の実施形態では、抗ＤＮＡ抗体の半減期を減少させて、潜在的な副作用を低減する。開示されるコンジュゲートは、所与の生物学的応答を修飾するために使用することができる。薬物部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるものではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質は、例えば、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素を含み得る。
【０１９２】
開示される抗体およびｍＴＣＲポリペプチドは、１つ以上の検出可能な標識にコンジュゲートまたは結合することができる。開示される抗体およびｍＴＣＲポリペプチドは、少なくとも１つの薬剤に結合して、検出用コンジュゲートを形成することができる。診断としての分子の有効性を増加させるために、従来的には、少なくとも１つの所望の分子または部分に結合または共有結合または複合する。そのような分子または部分は、これに限定されないが、少なくとも１つのレポーター分子であり得る。レポーター分子は、アッセイを用いて検出され得る任意の部分として定義される。抗体またはポリペプチドにコンジュゲートされたレポーター分子の非限定的な例には、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、クロモフォア、発光分子、光親和性分子、有色粒子および／またはリガンド、例えば、ビオチンが含まれる。
【０１９３】
Ｅ．製剤
開示される抗体、融合タンパク質、およびｍＴＣＲポリペプチドを、薬学的組成物に製剤化することができる。抗体、融合タンパク質、またはｍＴＣＲポリペプチドを含有する薬学的組成物は、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、または皮下注射）、経皮（受動またはイオントフォレシスもしくはエレクトロポレーションを用いるもののいずれか）、または経粘膜（鼻腔、膣内、直腸、または舌下）投与経路によるか、または生体分解可能な挿入物を用いる投与のためのものであり得、各投与経路に適した剤形で製剤化され得る。
【０１９４】
いくつかのインビボアプローチでは、本明細書で開示される組成物は、対象に治療有効量で投与される。本明細書で使用されるとき、「有効量」または「治療有効量」という用語は、治療される障害の１つ以上の症状を治療、阻害、もしくは軽減するか、またはそうでなければ所望の薬理および／もしくは生理効果を提供するのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、対象依存変数（例えば、年齢、免疫系の健康状態など）、疾患、および行われる治療のような様々な因子に従って変動するであろう。
【０１９５】
開示される組成物について、さらなる研究が行われるとき、様々な患者における様々な状態の治療に適した投与量レベルに関する情報が出現し、通常の熟練従事者は、レシピエントの治療の文脈、年齢、および一般的な健康状態を考慮して、適切な投与を確認することができるであろう。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、および所望の治療期間に依存する。開示される免疫調節剤について、一般的には毎日体重の０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇの投与量レベルが哺乳動物に投与される。一般的には、静脈内注射または注入について、投与量はより低い場合がある。
【０１９６】
特定の実施形態では、開示される組成物は、例えば、直接的な治療される部位への注射によって、局所投与される。典型的には、注射は、全身投与によって達成することができるものよりも大きい増加した局在化濃度の組成物をもたらす。組成物は、治療される部位外でのポリペプチドの受動拡散を低減することによって、増加した局在化濃度のポリペプチド組成物の作製を補助するために、上記のようなマトリックスと組み合わせることができる。
【０１９７】
１．非経口投与のための製剤
いくつかの実施形態では、ペプチドおよびポリペプチドを含有するものを含む、本明細書で開示される組成物は、非経口注射によって、水溶液中で投与される。製剤はまた、懸濁剤または乳剤の形態であり得る。一般的には、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含む薬学的組成物が提供され、任意に薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤、および／または担体を含む。そのような組成物は、任意に下記：希釈剤、滅菌水、様々な緩衝剤含有量（例えば、トリス−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨ、およびイオン強度の緩衝食塩水；ならびに添加剤、例えば、洗浄剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ  ２０（ポリソルベート−２０）、ＴＷＥＥＮ  ８０（ポリソルベート−８０））、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに防腐剤（例えば、チメルソール、ベンジルアルコール）およびバルク化物質（例えば、ラクトース、マンニトール）について１つ以上を含む。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびコーン油などの植物油、ゼラチン、ならびにエチルオレエートなどの注射可能な有機エステルである。製剤は、凍結乾燥され、使用直前に再溶解／再懸濁され得る。製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、滅菌剤を組成物に組み込むことによって、組成物を照射することによって、または組成物を加熱することによって、安定化され得る。
【０１９８】
２．経口投与のための製剤
実施形態では、組成物は、経口送達のために製剤化される。経口固体剤形は、一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．１９９０  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．１８０４２）  ａｔ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ８９に記載されている。固体剤形には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤もしくはロゼンジ剤、カシェ剤、ペレット剤、散剤、または顆粒剤、あるいは材料をポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー化合物の微粒子状調製物に、またはリポソームに組み込むものが含まれる。そのような組成物は、開示されるものの物理状態、安定性、インビボ放出率、およびインビボクリアランス率に影響を及ぼし得る。例えば、本明細書に参照により組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２）ｐａｇｅｓ  １４３５−１７１２を参照されたい。組成物は、液体形態で調製され得るか、または乾燥粉末（例えば、凍結乾燥）形態であり得る。組成物を製剤化するために、リポソームまたはプロテイノイドカプセル化を使用してもよい。リポソームカプセル化を使用してもよく、リポソームを様々なポリマーで誘導体化してもよい（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｉｎ：Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，１９７９も参照されたい。一般的には、製剤は、ペプチド（またはその化学修飾形態）および胃環境においてペプチドを保護し、腸において生物学的活性材料を放出する不活性成分を含むであろう。
【０１９９】
薬剤は、誘導体の経口送達が有効であるように、化学修飾することができる。一般的には、企図される化学修飾は、少なくとも１つの部分の成分分子自体への結合であり、部分は、胃もしくは腸からの血流への取り込み、または直接的な腸粘膜への取り込みを可能にする。また望ましいものは、成分（複数可）の全体的な安定性の増加および体内の循環時間の増加である。ＰＥＧ化は、薬学的な使用のための例示的な化学修飾である。使用され得る他の部分には、プロピレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ−１，３−ジオキソラン、およびポリ−１，３，６−チオキソカンが含まれる［例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（１９８１）“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ，”  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ．Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）ｐｐ．３６７−３８３、およびＮｅｗｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９を参照されたい］。
【０２００】
別の実施形態は、不活性希釈剤；湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤などの補助剤；ならびに甘味剤、香味剤、および芳香剤を含む他の成分を含有し得る、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、およびシロップ剤を含む、経口投与のための液体剤形を提供する。
【０２０１】
制御放出経口製剤が望ましい場合がある。薬剤は、拡散機構または浸出機構のいずれか、例えば、ガムによる放出を可能にする不活性マトリックスに組み込むことができる。ゆっくり変性するマトリックスも製剤に組み込まれ得る。制御放出の別の形態は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づき、すなわち、薬物は、水を入れて浸透効果によって薬物を単一の小開口を通して押し出すことを可能にする半透膜に封入される。
【０２０２】
経口製剤について、放出の位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸、または回腸）、または大腸であり得る。いくつかの実施形態では、放出は、薬剤（または誘導体）の保護によって、または胃環境を越えた、例えば、腸における、薬剤（または誘導体）の放出によってのいずれかで、胃環境の有害作用を回避するであろう。完全な胃の抵抗性を確保するために、少なくともｐＨ５．０まで不浸透性のコーティングは必須である。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ（商標）、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ（商標）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ（商標）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ（商標）、およびＳｈｅｌｌａｃ（商標）である。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用され得る。
【０２０３】
３．局所投与のための製剤
開示される免疫調節剤は、局所適用することができる。局所投与は、ほとんどのペプチド製剤についてうまく機能しないが、特に肺、鼻、口腔（舌下、頬）、膣、または直腸粘膜に適用される場合に有効であり得る。
【０２０４】
組成物は、吸入しながら肺に送達することができ、約５ミクロン未満の空気動力学的直径を有するエアロゾルまたはスプレー乾燥粒子のいずれかとして送達される場合、肺上皮内層を血流まで横断する。
【０２０５】
これらに限定されないが、全て当業者によく知られている、ネブライザー、定量吸入器、およびパウダー吸入器を含む、治療製品の肺送達のために設計された広範囲の機械デバイスを使用することができる。市販のデバイスのいくつかの具体的な例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、Ａｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎ．Ｃ．）、およびＳｐｉｎｈａｌｅｒパウダー吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）である。Ｎｅｋｔａｒ、Ａｌｋｅｒｍｅｓ、およびＭａｎｎｋｉｎｄは全て、技術を本明細書に記載される製剤に適用することができた場合、承認されているか、または臨床試験中の吸入可能なインスリン粉末調製物を有する。
【０２０６】
粘膜への投与のための製剤は、典型的には、錠剤、ゲル剤、カプセル剤、懸濁剤、または乳剤に組み込まれ得るスプレー乾燥された薬物粒子であろう。標準的な薬学的賦形剤は、任意のフォーミュレータから入手可能である。
【０２０７】
経皮製剤も調製され得る。これらは、典型的には、全て標準的な技術を用いて調製することができる、軟膏、ローション、スプレー、またはパッチであろう。経皮製剤は、透過増強剤を含むことを必要とし得る。
【０２０８】
４．制御送達ポリマーマトリックス
融合タンパク質、ｍＴＣＲポリペプチド、および本明細書で開示される抗体はまた、制御放出製剤で投与することができる。制御放出ポリマーデバイスは、ポリマーデバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）の移植または注射（マイクロ粒子）後の全身長期放出のために作製することができる。マトリックスは、薬剤が固体ポリマーマトリックスまたはマイクロカプセル内で分散される場合、コアがポリマーシェルとは異なる材料を有し、ペプチドがコアにおいて分散または懸濁され、これが本質的に液体または固体であり得る場合、マイクロスフェアなどのマイクロ粒子の形態であり得る。本明細書で具体的に定義されない限り、マイクロ粒子、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルは、交換可能に使用される。あるいは、ポリマーは、ナノメートルから４センチメートルまでの範囲の薄スラブもしくはフィルム、粉砕もしくは他の標準的な技法によって製造される粉末、またはハイドロゲルなどのゲルとしても鋳造され得る。
【０２０９】
非生分解性または生分解性いずれかのマトリックスは、融合ポリペプチド、抗体、またはｍＴＣＲポリペプチドもしくはそれらをコードする核酸の送達に使用することができるが、いくつかの実施形態では、生分解性マトリックスが好ましい。これらは天然または合成ポリマーであり得るが、いくつかの実施形態は、分解および放出プロファイルのより良好な特徴付けによって、合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が望ましい期間に基づいて選択される。いくつかの場合、線形放出が最も有用であり得るが、他では、パルス放出または「バルク放出」がより有効な結果を提供し得る。ポリマーは、（典型的には最大約９０重量％の水を吸収する）ハイドロゲルの形態であり得、任意に多価イオンまたはポリマーと架橋することができる。
【０２１０】
マトリックスは、溶媒蒸発、スプレー乾燥、溶媒抽出、および当業者に知られている他の方法によって形成することができる。生体分解可能なマイクロスフェアは、例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５：１３−２２（１９８７）、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，６：２７５−２８３（１９８７）、およびＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．，３５：７５５−７７４（１９８８）によって記載されるように、薬物送達のためのマイクロスフェアを作製するために開発された方法のいずれかを用いて調製することができる。
【０２１１】
デバイスは、移植または注射の領域を治療するために、局所放出のために配合することができ、これは典型的には、全身の治療、または全身送達のための投与量よりもかなり低い投与量を送達するであろう。これらは筋肉、脂肪に皮下移植もしくは注射、または服用することができる。
【０２１２】
ＩＩＩ．使用方法
特定の実施形態では、開示される抗体、ｍＴＣＲポリペプチド、および操作免疫細胞を使用して癌を検出または治療することができる。検出、診断、または治療される好ましい癌には、肝細胞癌またはｈＡＦＰを発現する任意の他の癌が含まれる。
【０２１３】
Ａ．養子移入
一実施形態では、免疫細胞は、開示されるｍＴＣＲを発現するように操作される。免疫細胞は、Ｔ細胞、好ましいヒトＴ細胞である。細胞は、自己または異種であり得る。細胞は、典型的にはインビトロで形質導入される。形質導入細胞は、任意にインビトロで増殖させ、それを必要とする対象に投与することができる大きな集団の形質導入細胞を得ることができる。そのような対象は、典型的には、ｈＡＦＰを発現する癌または腫瘍を有するか、またはこれを有すると考えられる。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋であり得る。形質導入細胞は、対象に１つ以上の用量で投与することができる。
【０２１４】
養子移入は、癌の治療のための他の療法と組み合わせることができる。そのような追加の療法には、化学療法、放射線療法、および外科手術、またはそれらの組み合わせが含まれる。ＴＣＲ−Ｔの養子移入は、ＴＣＲ−Ｔがインビボでさらに増殖して移入ＴＣＲ−Ｔ細胞の数および関連する毒性を低減するように、癌ワクチンと組み合わせることができる。
【０２１５】
一実施形態は、開示されるｍＴＣＲのうちの１つを発現する操作Ｔ細胞を投与することによってそれを必要とする対象において腫瘍負荷を低減するための方法を提供し、操作ｍＴＣＲ細胞は、ｈＡＦＰを発現する腫瘍を阻害または低減する。対象は、癌のための共療法で任意に治療することができる。治療される好ましい癌は、肝細胞癌である。
【０２１６】
Ｂ．検出または診断
開示される抗体またはｍＴＣＲポリペプチドは、上記で論じられるように標識することができる。標識されたポリペプチドは、癌細胞の試料に適用することができ、癌細胞の試料への標識されたポリペプチドの特異的結合は、肝細胞癌を含むｈＡＦＰ特異的癌を示す。
【０２１７】
標識の検出は、任意に定量化して、試料中の癌細胞の数を決定することができる。試料は、典型的には、肝臓組織試料であるが、血液または血清試料を含むことができる。
【０２１８】
ＩＶ．組成物およびキット
また提供されるものは、組成物およびキットである。そのようなキットは、本発明の実施をサポートするために、例えば、マーカーに既に結合しているか、もしくは任意に結合剤を抗体（およびマーカー自体）に結合するための試薬を伴う、１つ以上の結合剤（抗体）、緩衝剤、および／または試薬を含む、方法において使用される様々な試薬（典型的には濃縮形態）、のうちの１つ以上を各々有する容器、ならびに（任意に顕微解剖による）単離のための機器を含むことができる。本発明のリガンド検出方法におけるキット成分を記載するラベルもしくはインジケーター、またはその使用説明のセットも典型的には含まれ、説明は、キットまたはその成分の添付文書および／またはパッケージングに関連し得る。
【０２１９】
追加の実施形態は、本明細書に記載される免疫検出方法での使用のための免疫検出キットを提供する。抗体またはｍＴＣＲポリペプチドがｈＡＦＰを検出するために一般的に使用されるように、抗体およびｍＴＣＲポリペプチドは、キットに一般的に含まれるであろう。免疫検出キットはよって、好適な容器手段において、ｍＴＣＲポリペプチドおよび／または任意に、免疫検出試薬に結合する第１の抗体を含むであろう。
【０２２０】
キットの免疫検出試薬は、所与の抗体に関連および／または結合した検出可能な標識を含む、様々な形態のいずれか１つをとり得る。二次結合リガンドに関連および／または結合した検出可能な標識も企図される。例示的な二次リガンドは、第１の抗体に対する結合親和性を有する二次抗体である。
【０２２１】
本キットにおける使用のためのさらなる好適な免疫検出試薬は、第１の抗体に対する結合親和性を有する二次抗体と、第２の抗体に対する結合親和性を有する第３の抗体とを共に含み、第３の抗体が検出可能な標識に結合している、２成分試薬を含む。本明細書で留意されるように、多数の例示的な標識は、当該技術分野で知られているか、および／または全てのそのような標識は、本発明に関して好適に使用され得る。
【０２２２】
キットは、開示されるｍＴＣＲポリペプチドを発現する操作免疫細胞のような、癌の治療のための治療剤をさらに含み得る。
【実施例】
【０２２３】
実施例１：ｌｖ予備刺激およびペプチドブーストでのＡＡＤマウスの免疫化は、ヒトＨｅｐＧ２腫瘍細胞を認識および殺滅することができる高レベルのｈＡＦＰ１５８−特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を誘導する
材料および方法
マウス：ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＡＡＤマウス（Ｐｉｃｈａｒｄ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３１：２４６−２５３（２００８））およびＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、特定病原体除去動物施設に収容した。動物プロトコルは、Ａｕｇｕｓｔａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験委員会によって承認された。
【０２２４】
免疫化：マウスを、記載されるようにｈＡＦＰまたはインフルエンザウイルスＭ１タンパク質を発現する組み換えレンチウイルスベクター（ｌｖ）で皮下免疫化した（Ｍｏｒｇａｎ，ＲＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３６：１３３−１５１（２０１３））。１２日後、マウスを、記載されるようにＰｏｌｙＩ：Ｃおよび抗ＣＤ４０抗体と共にｈＡＦＰ１５８（ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ）（配列番号１）またはＭ１５８（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）（配列番号７２）ペプチドでブーストした（Ｌｉｎｅｔｔｅ，Ｇ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２２：８６３−８７１（２０１３））。
【０２２５】
結果
ヒトＨＬＡ−Ａ２提示ｈＡＦＰエピトープを認識することができるマウスＣＤ８  Ｔ細胞を誘導するために、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＡＡＤマウスを組み換えｈＡＦＰ−ｌｖで免疫化した。ＡＡＤマウスは、マウスＣＤ８分子に結合して免疫プライミングを補助するヒトＨＬＡ−Ａ２  α１−α２ドメインおよびマウスＨ−２ｄ  α３ドメインのキメラＭＨＣ  Ｉ分子を発現する（Ｐｉｃｈａｒｄ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３１：２４６−２５３（２００８））。ｈＡＦＰ−ｌｖ免疫化は、ＡＡＤマウスにおいて控えめなレベルのｈＡＦＰ１５８エピトープ特異的ＣＤ８応答を再現可能に誘発したことが見出された（図１Ａ）。しかしながら、検出ＣＤ８応答は、ヒトにおいて以前特定された他の３つのｈＡＦＰエピトープ（ｈＡＦＰ１３７、ｈＡＦＰ３２５、およびｈＡＦＰ５４２）に対して検出されなかった（Ｖｏｒａ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１４：７１７−７２５（２００９））（データは示されず）。ｈＡＦＰ１５８ペプチド単独での免疫化は、測定可能なＣＤ８応答を誘発しなかった。しかし、ｈＡＦＰ１５８エピトープでのブースト免疫化は、ｈＡＦＰ１５８ペプチドで予備刺激したマウスではなく、ｈＡＦＰ−ｌｖで予備刺激したマウスにおいてｈＡＦＰ１５８特異的ＣＤ８応答の規模を著しく増加させた（図１Ａ）。決定的に、免疫化マウスからのマウスＣＤ８  Ｔ細胞は、ｈＡＦＰ−ではなく、ｈＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２腫瘍細胞との共培養後にＩＦＮγを生成することができた（図１Ｂ）。このデータは、ｈＡＦＰワクチン活性化マウスＣＤ８  Ｔ細胞がｈＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２腫瘍細胞を認識し、これに応答することができることを示す。加えて、免疫化マウスからの脾臓細胞との一晩の共培養後、ｈＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２腫瘍細胞を用量依存的に殺滅した（図１Ｃ）。一緒に、これらのデータは、ＡＡＤマウスのｈＡＦＰ−ｌｖ予備刺激およびｈＡＦＰ１５８ペプチドブーストでの免疫化が、ｈＡＦＰ＋ヒトＨｅｐＧ２腫瘍細胞を認識および殺滅することができる高レベルのｈＡＦＰ１５８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を誘導することができることを示す。
【０２２６】
実施例２：ｈＡＦＰ−ｌｖおよびｈＡＦＰ１５８で免疫化されたＡＡＤマウスの脾臓細胞の養子移入は、ＮＳＧマウスにおいてラージＨｅｐＧ２腫瘍異種移植片を防止するだけでなく根絶する
材料および方法
ナイーブまたは免疫化マウスの１５００万個の総脾臓細胞（１５０万個のｈＡＦＰ１５８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞）をＮＳＧマウスに注射し、これを次いでＨｅｐＧ２腫瘍細胞でチャレンジした。治療モデルでは、腫瘍サイズが直径２ｃｍに到達するとき、ＮＳＧマウスに免疫化マウスの１５００万個の総脾臓細胞を注射した。実験を同様のデータで２回行った。
【０２２７】
結果
この養子移入実験では、ナイーブマウスからのものではなく、ｈＡＦＰ−ｌｖおよびｈＡＦＰ１５８ペプチドで免疫化されたＡＡＤマウスからの脾臓細胞が、ＮＳＧマウスにおいてＨｅｐＧ２腫瘍細胞チャレンジを完全に防止することができたことを見出された（図２Ａおよび２Ｂ）。免疫化マウス脾臓細胞の約１０％は、ｈＡＦＰ１５８ペプチドに応答してＩＦＮγを生成した。著しく、免疫化ＡＡＤマウスからの脾臓細胞の養子移入は、直径２０ｍｍほどのＨｅｐＧ２腫瘍を完全に根絶することができた（図２Ｃ）。
【０２２８】
実施例３：ｈＡＦＰ１５８特異的マウスＣＤ８  Ｔ細胞の養子移入は、ＮＳＧマウスにおいてヒトＨｅｐＧ２腫瘍を根絶する
材料および方法
樹立されたＨｅｐＧ２腫瘍を根絶する要因である免疫細胞をさらに特定するために、ｈＡＦＰ−ｌｖおよびｈＡＦＰ１５８ペプチドで免疫化されたＡＡＤマウスからのＣＤ８  Ｔ細胞を、磁気ＣＤ８ビーズを使用して単離した（図３Ａ）。ｌｖ発現インフルエンザウイルスＭ１抗原およびＭ１５８ペプチドで免疫化されたＡＡＤマウスからのＣＤ８  Ｔ細胞も単離し、対照として使用した。
【０２２９】
細胞株：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２は、ＡＴＣＣから購入した。Ｈｕｈ７（ＨＬＡ−Ａ１１）のＨＣＣ細胞株は、Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＤｒ．Ａｎｄｅの寄贈品であり、ＡＦＰ−ＨｅｐＧ２細胞は、Ａｕｇｕｓｔａ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．Ｊｉｎｇｘｉｏｎｇ  Ｓｈｅによって提供された。ｈＡＦＰ発現およびＨＬＡ型は、ウエスタンブロットおよび免疫学的染色によって検証した。細胞は、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ培地において培養した。
【０２３０】
免疫化：マウスを、記載されるようにｈＡＦＰまたはインフルエンザウイルスＭ１タンパク質を発現する組み換えレンチウイルスベクター（ｌｖ）で皮下免疫化した（Ｍｏｒｇａｎ，ＲＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３６：１３３−１５１（２０１３））。１２日後、マウスを、記載されるようにＰｏｌｙＩ：Ｃおよび抗ＣＤ４０抗体と共にｈＡＦＰ１５８（ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ）（配列番号１）またはＭ１５８（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）（配列番号７２）ペプチドでブーストした（Ｌｉｎｅｔｔｅ，Ｇ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２２：８６３−８７１（２０１３））。
【０２３１】
腫瘍接種：５００万個のＨｅｐＧ２腫瘍細胞をＮＳＧマウスの横腹に接種した。腫瘍成長を一日置きにモニターした。
【０２３２】
結果
ｈＡＦＰ免疫化マウスからのＣＤ８  Ｔ細胞の養子移入は、ＮＳＧマウスにおいてＨｅｐＧ２腫瘍を根絶することができることが見出された（図３Ｂ）。対照的に、ＨｅｐＧ２腫瘍は、インフルエンザウイルスＭ１抗原免疫化マウスからのＣＤ８  Ｔ細胞を受けたＮＳＧマウスにおいて成長し続けた。次に、ｈＡＦＰ１５８−特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を、Ｔｅｔ１５８四量体染色および細胞選別によってさらに単離した（図３Ｃ）。養子移入後、Ｔｅｔ１５８−ＣＤ８  Ｔ細胞はＨｅｐＧ２腫瘍成長を阻害しなかったが、Ｔｅｔ１５８＋ＣＤ８  Ｔ細胞はＮＳＧマウスにおいてＨｅｐＧ２腫瘍を根絶することができた（図３Ｄ）。一緒に、インビトロおよびインビボデータは、ＨＬＡ−Ａ２提示ｈＡＦＰ１５８エピトープに特異的なマウスＣＤ８  Ｔ細胞が、ヒトＨＣＣ腫瘍細胞を認識および殺滅することができることを検証する。
【０２３３】
実施例４：Ｔｅｔ１５８＋ＣＤ８  Ｔ細胞から作製されたＴ細胞ハイブリドーマは、ＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８四量体に結合し、一部はｈＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２腫瘍細胞に対するＩＬ−２応答を生成する
材料および方法
Ｔ細胞ハイブリドーマ：選別されたマウスＣＤ８＋Ｔｅｔ１５８＋細胞を、記載されるようにＴＣＲ  αおよびβ鎖を欠損しかつ選択されるＢＷ−Ｌｙｔ２．４細胞と融合することによって、Ｔ細胞ハイブリドーマを作製した（Ｈｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：３８０８−３８１７（２００５））。
【０２３４】
免疫学的および四量体染色：脾臓細胞は、表面マーカーおよび抗Ｖβ抗体パネル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色した。ＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８四量体（Ｔｅｔ１５８）は、Ｅｍｏｒｙ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＮＩＨ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙの厚意により提供された。
【０２３５】
結果
単一Ｔ細胞からのペアとなるＴＣＲ  αおよびβ鎖遺伝子を特定およびクローニングするために、Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞株を樹立した。Ｔ細胞ハイブリドーマを作製する前に、抗Ｖβパネル抗体を用いてＴＣＲ  Ｖβ鎖を特徴付けた。データは、Ｔｅｔ１５８＋ＣＤ８  Ｔ細胞の＞９０％を抗Ｖβ８．３抗体で染色することができることを示した（図１１Ａ−Ｂ）。Ｔｅｔ１５８＋ＣＤ８  Ｔ細胞の他方の１０％未満は、Ｖβ２、Ｖβ５．１／５．２、Ｖβ４、およびＶβ１１に対する抗体で染色することができた。次に、Ｔｅｔ１５８四量体によって染色することができた合計３９個のＴ細胞ハイブリドーマクローンを、選別されたＴｅｔ１５８＋ＣＤ８  Ｔ細胞を用いる２細胞融合実験から得た（データは示されない）。それらの中では、５個のクローンはｈＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２腫瘍細胞の刺激に応答し、ＩＬ−２を生成することができたが（図４Ａ）、他の３４個のハイブリドーマはＩＬ−２を生成しなかったか、または非常に低レベルのＩＬ−２を生成した（データは示されない）。全ての５個のハイブリドーマは、抗Ｖβ８．３抗体によって染色することができた（図４Ｂ）。さらなる分析は、５個のＴ細胞ハイブリドーマが、異なる平均蛍光強度（図４Ｃ）であるが、Ｔｅｔ１５８四量体に結合することができることを示し、それらのＴＣＲがＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８複合体について異なる親和性を有し得ることを示した。他方で、残りの３４個のＴ細胞ハイブリドーマのうちの４個は、抗Ｖβ８．３抗体で染色することができなかったＶβ鎖からなる（データは示されない）。
【０２３６】
実施例５：９セットのペアとなるＴＣＲ  αおよびβ鎖遺伝子を１４個のＴ細胞ハイブリドーマから特定する
材料および方法
ＴＣＲαおよびβ鎖遺伝子の特定：トータルＲＮＡをＴ細胞ハイブリドーマから単離した。５−ＲＡＣＥ技法（Ｈｏｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，５９：１４４８−１４５８（２０１４））を行って、ＴＣＲ  αおよびβ鎖遺伝子を増幅した。ｃＤＮＡをオリゴｄＴプライマーで作製し、次いでＰｏｌｙＣをｃＤＮＡの５末端に添加した。ＰＣＲを、５’ｐＧＩプライマー
2020519293.tif 000072
およびα鎖の定常（Ｃ）領域に対応する３’プライマー
2020519293.tif 000073
またはβ鎖の定常（Ｃ）領域に対応する３’プライマー
2020519293.tif 000074
を用いることによって行った。ＴＣＲ  αおよびβ可変（Ｖ）領域の得られた部分配列に基づいて、α鎖のＶ領域に対応する特定のプライマー
2020519293.tif 000075
またはβ鎖のＶ領域に対応する特定のプライマー
2020519293.tif 000076
を、αＣ領域の内部プライマー
2020519293.tif 000077
またはβＣ領域の内部プライマー
2020519293.tif 000078
と共に使用して、Ｖ領域を増幅および検証した。最後に、ＴＣＲ  αおよびβ鎖を入手および検証した。
【０２３７】
結果
この実験では、ＨｅｐＧ２腫瘍細胞での共培養後にＩＬ−２を生成することができる１４個のハイブリドーマからのペアとなるＴＣＲαおよびβ鎖遺伝子を増幅および配列決定した。結果を表１にまとめた。１４個のハイブリドーマのうち、ＴＣＲ遺伝子の９個のユニークなセットが特定された。ＴＣＲ２（クローン１Ｇ８）およびＴＣＲ４（クローン２Ｆ６）の配列は同一であり、ＴＣＲ３（クローン１０Ａ３）およびＴＣＲ５（クローン６Ｄ９）も同様である。ＴＣＲ６（クローン５Ｂ３）、ＴＣＲ７（クローン５Ｂ１０）、およびＴＣＲ１３（クローン１１Ｂ１０）は同一であり、ＴＣＲ３８（クローン２Ｃ３）およびＴＣＲ３９（クローン３Ｅ４）も同様である。ＴＣＲ１−３、６、８、１０、１１、１７、および３８のαおよびβ鎖のアミノ酸配列を次いでＮＣＢＩおよびＩＭＧＴデータバンクと比較した。配列データは、全ての９個のＴＣＲ  α鎖が同じ可変領域（ＴＲＡＶ７Ｄ−２）を示し、ＴＣＲ  β鎖も同じ可変領域（ＴＲＢＶ１３−１）を共有したことを示し、これは抗Ｖβ８．３抗体染色からのデータと一貫している（図１６）。詳細分析は、ＴＣＲ１およびＴＣＲ２が非常に類似していることを明らかにする。ＴＣＲ１およびＴＣＲ２のβ鎖は同一であり、ＴＣＲ１およびＴＣＲ２のα鎖はＶ−Ｊジャンクションにおいて２つのアミノ酸の相違を有した。他方で、ＴＣＲ３はＴＣＲ１およびＴＣＲ２から、より相違している。ＴＣＲ３のβ鎖はＴＣＲ１およびＴＣＲ２とは１つのアミノ酸のみが異なり、α鎖のＪ領域は異なるＪ遺伝子によってコードされる。ＴＣＲ１およびＴＣＲ２α鎖のＪ遺伝子はＴＲＡＪ３０であり、ＴＣＲ３α鎖Ｊ遺伝子はＴＲＡＪ１２である。
本明細書で特定される９個のＴＣＲ遺伝子におけるアミノ酸の相違の全ては、α（図１７Ａ）およびβ（図１７Ｂ）鎖のＣＤＲ３領域に見られる。
【０２３８】
（表１）ＴＣＲ遺伝子クローンの要約
2020519293.tif 000079
表１．１４ペアのＴＣＲαおよびβ鎖をまとめる。ＴＣＲ４およびＴＣＲ２は同一である。ＴＣＲ５およびＴＣＲ３は同一である。ＴＣＲ６、ＴＣＲ７、およびＴＣＲ１３は同一である。ＴＣＲ３８およびＴＣＲ３９は同一である。
１．ＴＣＲＡ−１およびＴＣＲＡ−２のタンパク質配列は、Ｖ−Ｊジャンクション間に２アミノ酸の相違を有する。
２．ＴＣＲＡ−３は、ＴＣＲＡ−１およびＴＣＲＡ−２とは有意に異なる。実際に、ＴＣＲＡ−３のＪ領域は、ＴＣＲＡ−１およびＴＣＲＡ−２とは完全に異なる。
３．ＴＣＲＢ−１およびＴＣＲＢ−２のタンパク質配列は同一である。
４．ＴＣＲＢ−３およびＴＣＲＢ−１のタンパク質配列は、Ｖ−Ｄジャンクション間のセリン（１１６Ｓ）からアラニン（１１６Ａ）への１つのアミノ酸を除き、同一である。
５．Ｖ−Ｊ間のＴＣＲＢにおけるＤ領域は、データバンクにおける任意の配列との明白な相同性を有さない９ｎｔである。
【０２３９】
実施例６：初代ヒトＴ細胞におけるペアとなるＴＣＲ  αおよびβ鎖遺伝子の発現は、Ｔｅｔ１５８四量体に結合する機能的ＴＣＲを形成する
材料および方法
ＴＣＲ遺伝子および組み換えｌｖ：ＴＣＲ  αおよびβ鎖遺伝子は、上記で特定されたＶ−Ｄ−Ｊ領域およびＣ領域を用いることによって設計および合成した。Ｐ２Ａ配列（Ｃｈｏ，Ｈ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６９：９０１２−９０１９（２００９））をαおよびβ鎖の間に挿入して、αおよびβ鎖を分離する。遺伝子全体をコドン最適化し、ｌｖにクローニングした。
【０２４０】
ヒトＴ細胞の形質導入：ヒトＴ細胞を陰性選択によってバフィーコートから単離した。ＣＤ３／ＣＤ２８四量体抗体複合体（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）を次いで添加して、細胞を２日間活性化した後、それらに組み換えｌｖを形質導入した。
【０２４１】
結果
この実験では、ｈＡＦＰ特異的ＴＣＲ遺伝子によりヒトＴ細胞を操作してＴＣＲリダイレクトＴ細胞（ＴＣＲ−Ｔ）を作製することができたか、そのようなＴＣＲ−Ｔ細胞がｈＡＦＰ＋腫瘍細胞を特異的に認識および殺滅する能力を獲得するかを調査した。この目的で、３つのＴＣＲ遺伝子（ＴＣＲ１、ＴＣＲ２、およびＴＣＲ３）を合成し、ｌｖにクローニングした。Ｐ２Ａ配列をＴＣＲ  αおよびβ遺伝子の間に挿入して、標的Ｔ細胞において同数のＴＣＲ  αおよびβ鎖を生成した（図５Ａ）。ＴＣＲ  αおよびβ鎖が発現後に機能的ＴＣＲを形成することができるかを研究するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞にＴＣＲ−ｌｖを形質導入し、その結果、ＴＣＲ遺伝子の３セットのいずれかの遺伝子移入は、Ｊｕｒｋａｔ細胞にＴｅｔ１５８四量体に結合する能力を効果的に与えることができたことが見出され、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子発現が機能的ＴＣＲを形成することができることを示した（図５Ｂ）。次に、これらのＴＣＲ遺伝子により初代ヒトＴ細胞を操作して、ＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８複合体を認識するようにそれらをリダイレクトすることができたかを研究した。まず、健康なドナーのヒトＴ細胞にＣＤ３／ＣＤ２８活性化後に組み換えｌｖを効果的に形質導入することができたことが見出された。ＧＦＰをレポータータンパク質として使用して、１０のＭＯＩで、ヒトＴ細胞の約６０％にＧＦＰ−ｌｖを形質導入することができる（図１２）。次に、初代ヒトＴ細胞のＴＣＲ遺伝子での形質導入は、それらの約２０〜３０％がＴｅｔ１５８四量体に効果的に結合することができたことを明らかにした（図５Ｃ）。異なるドナーからのＴ細胞は異なる有効性で形質導入され得るが、３セットのＴＣＲ遺伝子の間には有意な形質導入の相違はなかった。しかしながら、Ｔｅｔ１５８四量体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＴＣＲ３遺伝子形質導入ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞上でＴＣＲ１およびＴＣＲ２形質導入細胞よりも一貫して高く、ＴＣＲ３がＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８についてのより高い親和性を有し得ることを示し、これはハイブリドーマ細胞上でのＴｅｔ１５８四量体染色のデータと一致している（図４Ｃ）。ＣＤ８およびＣＤ４  ＴＣＲ−Ｔ細胞の両方は、Ｔｅｔ１５８四量体に結合することができ、ＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８に結合するＴＣＲは、ＣＤ８から独立している。しかしながら、ＣＤ８  ＴＣＲ−Ｔ上でのＴｅｔ１５８染色のＭＦＩは、ＣＤ４  ＴＣＲ−Ｔ細胞上のそれよりも常に高く（図５Ｄ）、ＣＤ８がＨＬＡ−Ａ２／ｈＡＦＰ１５８複合体へのＴＣＲの結合を向上させるのを助けることを示す。加えて、ＴＣＲ−Ｔ細胞を、抗ＴＣＲ  Ｖβ  ８．３またはＴｅｔ１５８四量体で染色した。Ｔｅｔ１５８四量体＋細胞のパーセントは、抗ＴＣＲ  Ｖβ８．３＋細胞のパーセントとほぼ同一である（図１３）。
【０２４２】
実施例７：ＨＬＡ−Ａ２提示ｈＡＦＰ１５８ペプチドによって特異的に活性化されたヒトＴＣＲ−Ｔ細胞
材料および方法
ＴＣＲ遺伝子形質導入ヒトＴ細胞を一晩ＨＬＡ−Ａ２＋ｈＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２細胞、ＨＬＡ−Ａ２＋ｈＡＦＰ−ＨｅｐＧ２細胞、またはＨＬＡ−Ａ２−ｈＡＦＰ＋腫瘍細胞と共培養した後、ＩＦＮγをＥＬＩＳＡによって検出した。
【０２４３】
結果
ヒトＴＣＲ−Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２提示ｈＡＦＰ１５８ペプチドによって特異的に活性化することができるかを研究するために、ヒトＴＣＲ−Ｔのサイトカイン生成を、ｈＡＦＰ１５８ペプチドを用いてパルスされたＨＬＡ−Ａ２マウス脾臓細胞での刺激後に測定した。データは、ｈＡＦＰ１５８ペプチドを用いてパルスされたＨＬＡ−Ａ２細胞によって、ヒトＴＣＲ−Ｔ細胞を、ＩＦＮγを生成するように特異的に刺激することができたことを示した。対照的に、ＩＦＮγは、インフルエンザウイルスＭ１ペプチドでの刺激後のヒトＴＣＲ−Ｔ培養においては検出されなかった。モック形質導入ヒトＴ細胞は、ｈＡＦＰ１５８ペプチド刺激に応答しない（図１４Ａ）。ＩＦＮγ生成は、主にＣＤ８  Ｔ細胞（図１４Ｂ）からのものであり、ＩＬ２はまた、ＣＤ４  Ｔ細胞によって生成された（図１４Ｃ）。次に、本発明者らは、ヒトＴＣＲ−Ｔ細胞はＨＬＡ−Ａ２＋ｈＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２腫瘍細胞によって活性化されて、ＩＦＮγを生成することができることを見出した。対照的に、ＨＬＡ−Ａ２＋ｈＡＦＰ−またはＨＬＡ−Ａ２−ｈＡＦＰ＋ヒト腫瘍細胞は、ＴＣＲ−Ｔ細胞を活性化することができなかった（図６Ａ）。再び、ＩＦＮγ生成は、主にＣＤ８  ＴＣＲ−Ｔ細胞において生成された（図６Ｂ）。しかし、ＣＤ４（図６Ｃ）およびＣＤ８（図６Ｂ）両方のＴＣＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ−２を生成することができる。同様に、３つのＴＣＲの間には有意な相違はない。さらに、ＨｅｐＧ２腫瘍細胞によるＴＣＲ−Ｔ増殖の誘発を研究した。本発明者らは、ＨｅｐＧ２腫瘍細胞との共培養後、ヒトＴＣＲ−Ｔ細胞、特にＣＤ８  Ｔ細胞は、顕著に増殖した（図６Ｄ）。
【０２４４】
実施例８：ヒトＣＤ８  ＴＣＲ−Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２＋ｈＡＦＰ＋腫瘍細胞に対する強く特異的な細胞傷害性を有する
材料および方法
サイトカインのＥＬＩＳＡ：ＩＦＮγおよびＩＬ−２のＥＬＩＳＡを、製造業者によって指示されるように行った（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
【０２４５】
細胞傷害性アッセイ：ＴＣＲ−Ｔ細胞を成長するＨｅｐＧ２腫瘍細胞に添加した。細胞傷害性アッセイを、指示されるようにＬＤＨアッセイを使用して行った（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
【０２４６】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色：死細胞を、指示されるようにＰＩで染色した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
【０２４７】
結果
この実験では、ヒトＴＣＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性活性を研究した。ＬＤＨアッセイを使用して、本発明者らはまず、ヒトＴＣＲ−Ｔ細胞がＨｅｐＧ２腫瘍細胞の８０％を５のＥ／Ｔ比率での共培養の２４時間以内に効果的に殺滅し得ることを示した。対照的に、ＴＣＲ−Ｔ細胞は、ＡＦＰ−またはＨＬＡ−Ａ２−腫瘍細胞に対する有意な細胞傷害性効果を生じなかった（図７Ａ）。ＨｅｐＧ２腫瘍細胞に対する細胞傷害性は、用量依存的であった（図７Ｂ）。０．５のＥ／Ｔ比率でも（Ｔｅｔ１５８＋細胞は約３０％であり、よってＴｅｔ１５８四量体＋Ｔ細胞 対 標的細胞の比率は０．１５にすぎない）、共培養の２４時間後に＞５０％の殺滅があった。精製されたＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞を使用して細胞傷害性アッセイを行うことによって、本発明者らは、ＨｅｐＧ２腫瘍細胞殺滅活性が主にＣＤ８  Ｔ細胞からのものであることを示した（図７Ｃ〜Ｅ）。しかしながら、ＣＤ４  ＴＣＲ−Ｔ細胞はまた、より低レベルの細胞傷害性を有し、１．５／１の比率で１５％のＨｅｐＧ２腫瘍細胞の特異的殺滅をもたらした（図７Ｅ）。共培養の２４時間後、ＣＤ８  ＴＣＲ−Ｔ細胞はＨｅｐＧ２腫瘍細胞を取り囲んで（これに引き付けられ得）、クラスターを形成した（図７Ｄ）。他方で、ＣＤ４  ＴＣＲ−Ｔおよびモック形質導入Ｔ細胞は、明白なクラスターを形成しなかった。加えて、ＰＩ染色は、クラスター中の腫瘍細胞のほとんどが死細胞であったことを明らかにした（図７Ｆ）。ＬＤＨアッセイと一貫して、細胞傷害性アッセイのほとんどは、ＣＤ８  ＴＣＲ−Ｔ細胞からのものであった。ＰＩ染色は、ＣＤ４  ＴＣＲ−Ｔ細胞がｈｅｐＧ２腫瘍細胞殺滅のより低い活性（１５％）を有したことを示し、これはＬＤＨアッセイと一致している。モック形質導入ヒトＴ細胞は、ＨｅｐＧ２腫瘍細胞の細胞死を誘発しなかった。
【０２４８】
実施例９：ヒトＴＣＲ−Ｔの養子移入は、ＮＳＧマウスにおけるＨｅｐＧ２腫瘍に対する抗腫瘍効果を生じる
材料および方法：
ヒトＴＣＲ−Ｔのインビボ抗腫瘍効果を研究するために、４日のＨｅｐＧ２腫瘍を保有するＮＳＧマウスに、２千万個のヒトＴＣＲ−Ｔ細胞を養子移入した。腫瘍成長を、長さ、幅、および高さを測定することによってモニターした。腫瘍体積を１／２（長さ×幅×高さ）として計算した。
【０２４９】
結果：
この実験では、ヒトＴＣＲ−Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果を研究した。初代ヒトＴ細胞をｌｖで形質導入し、総Ｔ細胞の約４０％（ＣＤ８  Ｔ細胞の２５％およびＣＤ４  Ｔ細胞の５４％）が、養子移入前に、Ｔｅｔ１５８＋ＴＣＲ−Ｔ細胞であった（図１１Ａ）。本発明者らは、ヒトＴＣＲ−Ｔ細胞の養子移入がＮＳＧマウスにおけるＨｐｅＧ２腫瘍過成長を阻害することができたことを見出した（図１１Ｂ）。ＴＣＲ−Ｔ処置マウスの１つは腫瘍を発症したが、腫瘍は養子移入の３週間までに根絶した（図１１Ｃ〜Ｄ）。移入されたヒトＴ細胞の動態は、モックＴおよびＴＣＲ−Ｔ細胞の両方がヒトＩＬ−２の不在下で約３〜４週間存在したことを示した（図１１Ｅ）。しかし、モックＴ細胞と比較して、ＴＣＲ−Ｔ、特に移入後８日目のＣＤ４  ＴＣＲ−Ｔ細胞の間でＴｅｔ１５８＋細胞の割合の有意な増加があり（図１１Ｆ）、抗原誘発性ＴＣＲ−Ｔ増殖があり得ることを示した。
【図１−１】
2020519293.tif 000080
【図１−２】
2020519293.tif 000081
【図２】
2020519293.tif 000082
【図３−１】
2020519293.tif 000083
【図３−２】
2020519293.tif 000084
【図４−１】
2020519293.tif 000085
【図４−２】
2020519293.tif 000086
【図５−１】
2020519293.tif 000087
【図５−２】
2020519293.tif 000088
【図５−３】
2020519293.tif 000089
【図５−４】
2020519293.tif 000090
【図５−５】
2020519293.tif 000091
【図６−１】
2020519293.tif 000092
【図６−２】
2020519293.tif 000093
【図６−３】
2020519293.tif 000094
【図７−１】
2020519293.tif 000095
【図７−２】
2020519293.tif 000096
【図８】
2020519293.tif 000097
【図９】
2020519293.tif 000098
【図１０】
2020519293.tif 000099
【図１１】
2020519293.tif 000100
【図１２】
2020519293.tif 000101
【図１３】
2020519293.tif 000102
【図１４−１】
2020519293.tif 000103
【図１４−２】
2020519293.tif 000104
【図１５−１】
2020519293.tif 000105
【図１５−２】
2020519293.tif 000106
【図１６−１】
2020519293.tif 000107
【図１６−２】
2020519293.tif 000108
【図１７】
2020519293.tif 000109
【配列表】
2020519293000001.app
【国際調査報告】
2020519293.tif 000110
2020519293.tif 000111
2020519293.tif 000112
2020519293.tif 000113
2020519293.tif 000114