(57)【要約】  持続放出性デポー形態の酢酸グラチラマーを非経口投与することと、中枢神経系に脂肪由来幹細胞を投与することと、を含む多発性硬化症を治療する方法が提供される。いくつかの態様によれば、併用治療は相乗効果を提供する。特に、併用療法は、進行型の多発性硬化症の恩恵をもたらす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症の治療方法であって、酢酸グラチラマーを含み、持続放出性デポー形態の医薬組成物を、それを必要とする対象に非経口投与することと、前記対象のヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することと、を含む方法。
【請求項２】
酢酸グラチラマー及び前記ｈＡＤＳＣを含む前記医薬組成物が同じ日に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酢酸グラチラマー及び前記ｈＡＤＳＣを含む前記医薬組成物が別々の日に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物の投与と前記ｈＡＤＳＣの投与の間の期間が、１〜１４日の範囲である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、１〜６週ごとに１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、４週ごとに１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｈＡＤＳＣが１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｈＡＤＳＣが２回以上投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｈＡＤＳＣが、２〜８ヶ月ごとに投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が前記ｈＡＤＳＣの前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が前記ｈＡＤＳＣの後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、筋肉内投与用に製剤化され、前記投与が筋肉内注射によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が皮下移植用に製剤化され、前記投与が皮下注射によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｈＡＤＳＣの投与が髄腔内投与によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｈＡＤＳＣの投与が、脳室内又は側脳室内（ＩＣＶ）投与によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｈＡＤＳＣが、脂肪吸引によってヒト皮下脂肪から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｈＡＤＳＣが自己である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｈＡＤＳＣが同種異系である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｈＡＤＳＣが、前記細胞の少なくとも９５％がＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現し、前記細胞の少なくとも９０％がＣＤ１０５を発現し、かつ前記細胞の少なくとも９５％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ及びＨＬＡＤＲを発現しないことによって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｈＡＤＳＣが、さらに、前記細胞の０．１〜１０％がＣＤ３４を発現することによって特徴付けられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｈＡＤＳＣの投与が、１回の投与あたり約１０５〜３×１０８個の細胞を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記酢酸グラチラマーが、約０．１４のグルタミン酸、約０．４３のアラニン、約０．１０のチロシン及び約０．３３のリジンのモル比でＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、及びＬ−チロシンの酢酸塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記酢酸グラチラマーが、約１５〜約１００個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、酢酸グラチラマーの医薬として許容される生分解性又は非生分解性担体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記担体が、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリオルトエステル、ポリアルカン無水物、ゼラチン、コラーゲン、酸化セルロース、及びポリホスファゼンからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、水中油中水型二重乳化プロセスによって調製される微粒子の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記微粒子が、治療有効量の酢酸グラチラマーを含む内部水相、生分解性及び非生分解性ポリマーから選択される担体を含む水不混和性ポリマー相、及び外部水相を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記水不混和性ポリマー相が、ＰＬＡ及びＰＬＧＡから選択される生分解性ポリマーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記外部水相が、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリソルベート、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体及びセルロースエステルから選択される界面活性剤を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、酢酸グラチラマーを約２０〜５００ｍｇ含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が、進行型の多発性硬化症を患っている、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
酢酸グラチラマーを含む医薬組成物であって、中枢神経系（ＣＮＳ）に投与されるヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）と組み合わせて多発性硬化症の治療に使用するための、非経口投与用の持続放出性デポー形態の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラチラマーの医薬として許容される塩の長時間作用性剤形の投与及び脂肪由来幹細胞の投与を含む、多発性硬化症のための治療レジメンに関する。特に、本発明は、持続放出性酢酸グラチラマーの筋肉内又は皮下投与、及び脂肪由来幹細胞の脳室内又は髄腔内投与を含む併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、典型的には若年成人で生じ、男性よりも女性により見られる中枢神経系（ＣＮＳ）の慢性炎症性疾患である。ＭＳは、脳及び脊髄中の神経細胞同士が互いに伝達し身体機能を制御する能力に影響を与える。臨床障害は、ＣＮＳの軸索の周りの保護鞘であるミエリンの炎症と関連し、それは自己免疫攻撃及び神経変性プロセスによって損傷している。その結果、脳及び脊髄の白質は、局所性病変（プラーク）によって瘢痕化し、神経機能障害をもたらす。ＭＳの症状にはいくつかのパターンがある。ほとんどの患者は、再発寛解（ＲＲＭＳ）過程を初期の段階で経験し、これは予測不可能な再発後の部分的回復又は完全な回復（寛解）期間を特徴とし、ある時点で進行型（ＰＭＳ）になる。そのような進行型ＭＳは、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）として分類される。一部の患者は症状の発症から進行型の過程を経験し、そのような疾患パターンは一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）として分類される。
【０００３】
再発寛解型ＭＳ患者は、典型的には、急性発作（再発）の間はコルチコステロイドで治療され、新たな再発及び障害の進行を防ぐために、免疫調節薬又は免疫抑制薬で治療される。より重篤な場合には、これらには、インターフェロンβ（アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標））、レビフ（Ｒｅｂｉｆ（登録商標））、ベタセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）））、酢酸グラチラマー（コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））、ジメチルフマレート（テクフィデラ（Ｔｅｃｆｉｄｅｒａ（登録商標））、フィンゴリモド（ジレニア（Ｇｉｌｅｎｙａ（登録商標））、ナタリズマブ（タイサブリ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））及び化学療法剤ミトキサントロンが含まれる。進行型ＭＳは、同様の薬を用いて治療される場合もあるが、治療は主に、症状及びリハビリテーションを管理することに焦点が当てられている。最近の調査では、進行型ＭＳは現在利用できる疾患修飾治療薬が不足していることを強調している（Ｄｏｓｈｉ  ａｎｄ  Ｃｈａｔａｗａｙ，２０１６，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６（６）：ｓ５３−ｓ５９）。オクレリズマブ（オクレブス（ＯＣＲＥＶＵＳ（商標））は、２０１６年に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によってＰＰＭＳのための画期的治療薬指定を許可されたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である（Ｉｎｖｅｓｔｏｒ  Ｕｐｄａｔｅ  ｂｙ  Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １７，２０１６）。
【０００４】
ＭＳのための全ての治療選択肢は、部分的にしか効果的ではない。
【０００５】
酢酸グラチラマー：
酢酸グラチラマー（ＧＡ）としても知られ、コパキソン（登録商標）という商品名で市販されているコポリマー１は、ミエリン塩基性タンパク質で発見されたＬ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン及びＬ−リジンの４個のアミノ酸で構成されるランダムポリマー（平均分子量６．４ｋＤ）である。アミノ酸の平均モル分率は、それぞれ、０．１４１、０．４２７、０．０９５及び０．３３８であり、コポリマー１の平均分子量は４，７００〜１１，０００ダルトンである。酢酸グラチラマーは、Ｌ−アラニン、Ｌ−リジン及びＬ−チロシンを有するＬ−グルタミン酸ポリマー、酢酸塩（塩）と化学的に命名される。その構造式は、（Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ）ｘＣＨ３ＣＯＯＨ又は（Ｃ５Ｈ９ＮＯ４＿Ｃ３Ｈ７ＮＯ２＿Ｃ６Ｈ１４Ｎ２Ｏ２＿Ｃ９Ｈ１１ＮＯ３）ｘＣ２Ｈ４Ｏ２［ＣＡＳ−１４７２４５−９２−９］、おおよその比はＧｌｕ１４Ａｌａ４３Ｔｙｒ１０Ｌｙｚ３４ｘ（ＣＨ３ＣＯＯＨ）２０である。コパキソン（登録商標）は、皮下注射用の透明で、無色からわずかに黄色の、滅菌済み非発熱性溶液である。各ミリリットルは、２０ｍｇの酢酸グラチラマー及び４０ｍｇのマンニトールを含有する。溶液のｐＨ範囲は、約５．５〜７．０である。コパキソン（登録商標）は、再発型の多発性硬化症を有する患者の治療に適応される。
【０００６】
この共重合体のいくつかの重要な免疫学的性質は現れているが、酢酸グラチラマーの作用機序は不明である。酢酸グラチラマーの投与は、Ｔ細胞の集団が炎症促進性Ｔｈ１細胞から炎症応答を抑制する制御性Ｔｈ２細胞にシフトさせる（ＦＤＡ  コパキソン（登録商標）ラベル）。ミエリン塩基性タンパク質に似ていることを考慮すると、酢酸グラチラマーはまた、デコイとしても作用し、ミエリンに対する自己免疫応答を迂回させることができる。しかしながら、血液脳関門の完全性は、少なくとも治療の初期段階では、酢酸グラチラマーによってはっきりとした影響は受けない。
【０００７】
酢酸グラチラマーのデポーシステム：
米国特許第８，３７７，８８５号は、多発性硬化症の治療における皮下若しくは筋肉内注入又は注射に適するデポー形態の治療有効量のグラチラマーを含む長時間作用性経口医薬組成物、特に、治療有効量の酢酸グラチラマーを含む組成物を開示している。
【０００８】
米国特許第８，７９６，２２６号は、酢酸グラチラマー及び少なくとも１種類の追加の薬物を含むデポー組成物を開示している。
【０００９】
自己免疫疾患及び／又は神経変性疾患の治療のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）：
ＭＳＣは、もともと成人骨髄内で特定された多能性自己再生細胞源である。自然に、それらは分化して、骨芽細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞を生成する。ＭＳＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞に代わる多能性幹細胞の入手しやすい源を提供する。ＭＳＣは、自己供給源に由来することができ、また、同種の使用に有利な免疫特権的性質によって特徴付けられるので、細胞療法における免疫抑制の必要性を潜在的に回避する。
【００１０】
ＭＳＣベースの治療は、移植片対宿主病、脳卒中、心筋梗塞、肺線維症及び自己免疫疾患を含むいくつかの症状の前臨床試験において有効であることが示されている。ＭＳＣはまた、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）及び多発性硬化症（ＭＳ）などの神経変性疾患に対する治療ツールとして広く研究されている。ＭＳＣは、神経変性疾患の文脈内の２つの態様、すなわち、特定の条件下で神経細胞に分化転換するその能力と、その神経保護作用及び免疫調節作用に関連して議論されてきた。脳に移植すると、ＭＳＣは、損傷組織を保護し、その再生を誘導する神経栄養因子及び成長因子を生成する。さらに、ＭＳＣはまた、例えば、脳におけるグリア由来又は脳由来の神経栄養因子を過剰発現するように遺伝子改変されている遺伝子送達ビヒクルとして検討されている。ＭＳＣが関与する臨床試験は、現在、ＭＳ、ＡＬＳ、外傷性脳損傷、脊髄損傷及び脳卒中のために進められている。
【００１１】
脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）：
過去数十年にわたって、脂肪組織が、エネルギー貯蔵所としての主な機能に加えて、多能ストローマ細胞のための豊富な供給源であることも示されている（Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００２；１３：４２７９−４２９５）。
【００１２】
ＷＯ２０１０／０４５６４５は、脂肪組織から脂肪幹細胞を回収する方法を開示している。
【００１３】
米国特許第８，０２１，８８２号は、脂肪幹細胞の培養物を提供し、その上清を収集することにより、神経傷害の治療のための幹細胞馴化培地を生成する方法を開示している。
【００１４】
Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，２７（１０）：２６２４−３５は、慢性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスへの脂肪由来間葉系幹細胞の静脈内投与を研究した。
【００１５】
Ｓｔｅｐｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．２０１６は、自家脂肪幹細胞の髄腔内注入で治療されたＲＲＭＳ又はＳＰＭＳのＭＳ患者の１年間の経過観察を報告している。
【００１６】
ＷＯ  ２００６／０５７００３では、とりわけ、グラチラマーと組み合わせて骨髄由来の幹細胞を用いる幹細胞治療の方法を開示している。
【００１７】
Ａｈａｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，２１５（１−２）：７３−８３では、脳室内又は腹腔内いずれかに移植される筋前駆細胞（ＭＰＣ）と酢酸グラチラマーでのＥＡＥ誘導マウスの同時治療を報告している。
【００１８】
多発性硬化症、特に進行型の疾患を有する患者を治療するための改善された方法が当技術分野において必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、いくつかの態様によると、多発性硬化症（ＭＳ）のための併用療法であって、治療有効量のグラチラマーの医薬として許容される塩、例えば、酢酸グラチラマーを含む長時間作用性医薬組成物と脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を使用する併用療法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、多発性硬化症の治療方法であって、持続放出性デポー形態で酢酸グラチラマーを非経口投与することと、中枢神経系に脂肪由来幹細胞を投与することと、を含む方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、多発性硬化症の動物モデルにおける臨床スコアに対するデポー形態の酢酸グラチラマーと脂肪由来幹細胞の組み合わせの相乗効果に一部基づいている。組み合わせは、疾患スコアを低下させ、その発症を遅延させることに特に有効であること、また疾患の進行を有意に遅らせることが分かった。予想外に、低用量の酢酸グラチラマーのデポー製剤は、高用量に比べて細胞と組み合わせた場合に、より効果的であることが分かった。そのため、いくつかの実施形態によれば、本明細書に提供する方法及び組成物は、酢酸グラチラマーを単独で投与した場合に必要とされる用量に比べて、患者に与えられる酢酸グラチラマーの用量を低下させることを可能にする。
【発明の効果】
【００２１】
一態様によれば、本発明は、多発性硬化症を治療する方法であって、それを必要とする対象に、酢酸グラチラマーを含み、持続放出性デポー形態の医薬組成物を非経口投与することと、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することと、を含む方法を提供する。
【００２２】
別の態様によれば、本発明は、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物であって、中枢神経系（ＣＮＳ）に投与されるヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）と組み合わせて、多発性硬化症の治療に使用するための非経口投与用持続放出性デポー形態の医薬組成物を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、酢酸グラチラマー及びｈＡＤＳＣを含む医薬組成物は、同じ日に投与される。
【００２４】
他の実施形態によれば、酢酸グラチラマー及びｈＡＤＳＣを含む医薬組成物は、別々の日に投与される。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物の投与とｈＡＤＳＣの投与との間の期間は、１〜１４日の範囲である。追加の実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物の投与とｈＡＤＳＣの投与との間の期間は、１〜２週の範囲である。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、１〜１５週ごとに１回投与される。追加の実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、１〜１０週ごとに１回投与される。さらに追加の実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、２〜６週ごとに１回投与される。いくつかの特定の実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、４週ごとに１回投与される。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは１回投与される。
【００２８】
他の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは、２回以上、例えば、２回、３回、４回など投与される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは、２〜８ヶ月ごとに１回投与される。追加の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは、３〜１２ヶ月ごとに１回投与される。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、ｈＡＤＳＣの投与前に最初に投与される。
【００３０】
他の実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、ｈＡＤＳＣの投与後に２番目に投与される。
【００３１】
他の実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、皮下移植のために製剤化され、投与は皮下注射による。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの投与は髄腔内投与によるものである。
【００３３】
他の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの投与は、脳室内投与又は側脳室内（ＩＣＶ）投与、すなわち、脳室への投与によるものである。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは、脂肪吸引によって得られるヒト皮下脂肪に由来する。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは自己である。
【００３６】
他の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは同種である。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは、細胞の少なくとも９５％がＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現し、細胞の少なくとも９０％がＣＤ１０５を発現し、かつ細胞の少なくとも９５％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ及びＨＬＡＤＲを発現しないことによって特徴付けられる。いくつかの実施形態によれば、ｈＡＤＳＣは、さらに、細胞の０．１〜１０％がＣＤ３４を発現することによって特徴付けられる。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの投与は、１回の投与あたり約１０５〜３×１０８個の細胞を投与することを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、酢酸グラチラマーは、約０．１４のグルタミン酸、約０．４３のアラニン、約０．１０のチロシン、及び約０．３３のリジンのモル比でＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、及びＬ−チロシンの酢酸塩を含む。
【００４０】
他の実施形態によれば、酢酸グラチラマーは、約１５〜約１００個のアミノ酸を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、酢酸グラチラマーを２０〜５００ｍｇ含む。追加の実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、酢酸グラチラマーを２０〜２５０ｍｇ含む。さらに追加の実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、酢酸グラチラマーを２０〜１００ｍｇ含む。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、医薬として許容される生分解性又は非生分解性担体を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、担体は、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリオルトエステル、ポリアルカン無水物、ゼラチン、コラーゲン、酸化セルロース、及びポリホスファゼンからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物は、水中油中水型二重乳化プロセスによって調製される微粒子の形態である。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、微粒子は、治療有効量の酢酸グラチラマーを含む内部水相、生分解性及び非生分解性ポリマーから選択される担体を含む水不混和性ポリマー相、及び外部水相を含む。いくつかの特定の実施形態において、水不混和性ポリマー相は、ＰＬＡ及びＰＬＧＡから選択される生分解性ポリマーを含む。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００４６】
追加の実施形態において、外部水相は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリソルベート、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、及びセルロースエステルから選択される界面活性剤を含む。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００４７】
本明細書に記載のように治療される対象は、典型的にはヒトである。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法及び組成物は、進行型の多発性硬化症（ＭＳ）の治療に有用である。したがって、いくつかの実施形態によれば、対象は、進行性ＭＳを患っている対象である。いくつかの特定の実施形態において、進行型ＭＳ、二次性進行型ＭＳである。追加の特定の実施形態において、進行型ＭＳは、一次性進行型ＭＳである。
【００４８】
本発明のこれらの態様及び特徴並びにさらなる態様及び特徴は、以下の詳細な説明、実施例及び特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】２８日目までのＡＵＣ臨床スコア分析によって決定した時のＥＡＥに対するＧＡデポー及びＡＤＳＣの影響。薬剤を、０日目に単独で、又は一緒に投与した（ＧＡデポー、２ｍｇ又は１０ｍｇのＩＭ、ＡＤＳＣ、２×１０５個の細胞、ＩＣＶ）。ＷＦＩ及びコパキソン（Ｃｏｐａｘｏｍｅ（登録商標））（ＳＣ注入）は対照として機能した。＊１０ｍｇのＧＡデポー及び２×１０５のＡＤＳＣ以外の全てのグループと比較してＰ＜０．０５；＊＊コパキソン（登録商標）（２ｍｇ／日）又はＷＦＩと比較してｐ＜０．０５；＊＊＊ＷＦＩと比較してＰ＜０．０５、不等分散を仮定した単一因子ＡＮＯＶＡ、続いて、片側二標本Ｔ検定、ｎ＝１０／グループ、＋／−標準誤差。
【図２】２８日目までの平均最大スコア分析によって決定した時のＥＡＥに対するＧＡデポー及びＡＤＳＣの影響。薬剤を、０日目に単独で、又は一緒に投与した（ＧＡデポー、２ｍｇ又は１０ｍｇのＩＭ、ＡＤＳＣ、２×１０５個の細胞、ＩＣＶ）。ＷＦＩ及びコパキソン（Ｃｏｐａｘｏｍｅ（登録商標））（ＳＣ注入）は対照として機能した。＊ＡＤＳＣ及び１０ｍｇのＧＡデポー及び２×１０５のＡＤＳＣ以外の全てのグループと比較してＰ＜０．０５；＊＊２×１０５のＡＤＳＣ及び２ｍｇのＧＡデポー及び２×１０５のＡＤＳＣ以外の全てのグループと比較してＰ＜０．０５；＊＊＊ＧＡ以外の全てのグループと比較してＰ＜０．０５、不等分散を仮定した単一因子ＡＮＯＶＡ、続いて、片側二標本Ｔ検定、ｎ＝１０／グループ、＋／−標準誤差。
【図３】２８日目までの平均発症日分析によって決定した時のＥＡＥに対するＧＡデポー及びＡＤＳＣの影響。薬剤を、０日目に単独で、又は一緒に投与した（ＧＡデポー、２ｍｇ又は１０ｍｇのＩＭ、ＡＤＳＣ、２×１０５個の細胞、ＩＣＶ）。ＷＦＩ及びコパキソン（Ｃｏｐａｘｏｍｅ（登録商標））（ＳＣ注入）は対照として機能した。＊全てのグループと比較してＰ＜０．０５；＊＊２×１０５のＡＤＳＣ及び２ｍｇのＧＡデポーと比較してＰ＜０．０５；＊＊＊２×１０５のＡＤＳＣと比較してＰ＜０．０５、不等分散を仮定した単一因子ＡＮＯＶＡ、続いて、片側二標本Ｔ検定、ｎ＝１０／グループ、＋／−標準誤差。
【図４】２８日目までの平均臨床スコア分析によって決定した時のＥＡＥに対するＧＡデポー及びＡＤＳＣの影響。対照（ＳＣ注射用の水）、ＧＡデポー、２ｍｇのＩＭ；ＧＡデポー、１０ｍｇのＩＭ；ＡＤＳＣ  ２×１０５個の細胞のＩＣＶ；ＧＡデポー  １０ｍｇのＩＭ及びＡＤＳＣ  ２×１０５個の細胞ＩＣＶ；ＧＡデポー２ｍｇのＩＭ及びＡＤＳＣ ２×１０５個の細胞のＩＣＶ；コパキソン（登録商標）（即時放出酢酸グラチラマー）２ｍｇのＳＣでの免疫後０〜２８日目の平均臨床スコア。ｎ＝１０／グループ、＋／−標準誤差。統計解析のための表４を参照されたい。
【図５】２８日目までのＭＯＧ誘発性ＥＡＥマウスの体重に対するＧＡデポーとＡＤＳＣの影響。体重を０日〜２８日目まで毎日測定した。死んだ動物については、動物が死ぬ前の最終重量測定値を最終体重として記録した。ｎ＝１０／グループ、＋／−標準誤差。統計解析については表５を参照されたい。
【図６】２８日目までのＡＵＣ臨床スコア分析によって決定した時のＥＡＥに対するＡＤＳＣの示された用量と組み合わせたＧＡデポーの影響。＊ＰＢＳと比較してＰ＜０．０５。
【図７】２８日目までの平均最大スコア分析によって決定した時のＥＡＥに対するＡＤＳＣの示された用量と組み合わせたＧＡデポーの影響。＊ＰＢＳと比較してＰ＜０．０５。
【図８】２８日目までの平均発症日分析によって決定した時のＥＡＥに対するＡＤＳＣの示された用量と組み合わせたＧＡデポーの影響。＊＊２００Ｋ、デポー、ＰＢＳと比較してＰ＜０．０５；＊ＰＢＳと比較してＰ＜０．０５。
【図９】２８日目までの平均臨床スコア分析によって決定した時のＥＡＥに対するＡＤＳＣの示された用量と組み合わせたＧＡデポーの影響。＋／−標準誤差。
【図１０】ＭＯＧ誘発性ＥＡＥマウスの体重に対するＡＤＳＣの示された用量と組み合わせたＧＡデポーの影響。体重を４５日目まで経過観察した。体重を、０〜４５日まで毎日測定した。死んだ動物については、動物が死ぬ前の最終重量測定値を最終体重として記録した。ｎ＝１０／グループ、＋／−標準誤差。
【図１１】継代数に応じたＡＤＳＣの細胞表面マーカーの発現。実施例の節に記載されているように、細胞を脂肪組織から単離し、培養し、示されたマーカーの発現について分析した。結果は、９つの試料の平均値＋／−標準偏差である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、いくつかの態様によると、中枢神経系に投与される脂肪由来幹細胞と組み合わせた長時間作用性注入用製剤中の酢酸グラチラマー（又はグラチラマーの任意の他の医薬として許容される塩）を用いて多発性硬化症を治療する組成物及び方法を提供する。
【００５１】
酢酸グラチラマー長時間作用製剤（ＧＡデポー）は、以前に説明され、インビトロでは酢酸グラチラマー放出プロファイルの分析で、かつインビボでは、マウスにおいてミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）で誘導される実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を用いて評価された。これらの研究では、ＧＡデポーは、ＥＡＥ症状の改善におけるコパキソン（登録商標）と同等の効力を実証した。ＧＡデポーの１０ｍｇ用量の１回投与は、疾患症状の低減及び全ての場合において、一貫して有効であり、２ｍｇのコパキソン（登録商標）の毎日投与及び２ｍｇのＧＡデポーの１回投与よりも優れていた。また、別の実験設定において、ＧＡデポーの同様の有効性が、４〜１０ｍｇの用量範囲で認められた。
【００５２】
本発明の発明者らは、疾患の転帰に対するＧＡデポーと脂肪由来間葉系幹細胞の併用治療の効果を評価するために、ＭＯＧ誘発性ＥＡＥモデルを利用した。ＭＯＧは、中枢神経系（ＣＮＳ）における神経ミエリン形成の過程において重要であると考えられている糖タンパク質である。ＭＯＧ ３５〜５５ペプチドでの免疫化は、一般的に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける慢性ＥＡＥの誘導のために使用される。ＡＤＳＣがマウスの脳室（ＩＣＶ）に注入されると、ＥＡＥはＭＯＧを用いて誘導された。マウスを、幹細胞単独、ＧＡデポー単独又はＡＤＳＣと２ｍｇ若しくは１０ｍｇのＧＡデポーの組み合わせで処置した。
【００５３】
本発明において初めて開示される驚くべき観察から、臨床スコア、平均発症日、最大平均疾患スコア及び罹患期間を含む、ＥＡＥに対するＧＡデポーとヒトＡＤＳＣの組み合わせの相乗効果を実証する。
【００５４】
そのため、本発明は、非経口投与による持続放出のための、グラチラマーの医薬として許容される塩、好ましくは酢酸グラチラマーの医薬製剤の投与、及びヒト間葉系脂肪由来幹細胞の投与を含む、治療方法並びに治療レジメンを提供する。これらの併用治療は、ＧＡ又は幹細胞での単独治療よりも優れた多発性硬化症の治療効果を与える。併用治療は、様々な臨床スコアによって決定されるように、効果の改善及び効果の長期化をもたらした。
【００５５】
現在では、酢酸グラチラマーの長時間作用性剤形及び脂肪由来幹細胞の投与を含む、多発性硬化症の治療のための方法並びにレジメンは利用できない。このような併用療法は、多くの患者に、特に、神経症状又は身体障害を伴う疾患が進行した患者に有益である。具体的には、この治療は、多発性硬化症の進行型の患者に恩恵をもたらす。
【００５６】
本明細書で使用される「治療」という用語は、多発性硬化症の発症後の症状の抑制又は軽減を指す。「治療」はまた、疾患、又はその少なくとも１つの症状の進行の速度を低下させることを包含する。多発性硬化症の発症後の一般的な症状には、視力低下又は視力喪失、つまずき及び不均一歩行、不明瞭な発語、並びに頻尿及び失禁が含まれるが、これらに限定されない。加えて、多発性硬化症は、気分の変化及びうつ病、筋肉の痙攣及び重度の麻痺を引き起こし得る。特に、該疾患は、衰弱、しびれ、震え、視力喪失、疼痛、麻痺、バランスの喪失、膀胱及び腸の機能障害、及び認知変化（一次症状）などの症状；繰り返される尿路感染症、廃用、姿勢調整及び胴体制御の不良、筋肉の不均衡、骨密度の低下、浅く非効率的な呼吸、及び床ずれ（二次症状）；並びにうつ病（三次症状）によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、治療には、（ｉ）病態の抑制、すなわち、その進行の停止；又は（ｉｉ）病態の緩和、すなわち、病態を後退させることが含まれる。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。いくつかの特定の実施形態において、本発明による多発性硬化症の治療は、疾患の進行を遅らせること、すなわち、障害の進行を遅らせることを含む。
【００５７】
薬物が投与される「対象」は、哺乳動物、好ましくは、限定されないがヒトである。対象は、多発性硬化症を患っている、すなわち、多発性硬化症と診断される。
【００５８】
本明細書で使用する「多発性硬化症」という用語は、上述の症状のうちの１以上を伴う中枢神経系の自己免疫疾患を指す。いくつかの実施形態において、ＭＳは再発寛解型ＭＳである。他の実施形態において、ＭＳは進行型ＭＳである。いくつかの実施形態において、進行型ＭＳは二次性進行型ＭＳである。他の実施形態において、進行型ＭＳは一次性進行型ＭＳである。追加の実施形態において、進行型ＭＳは進行性再発型ＭＳである。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、酢酸グラチラマー組成物は、２〜６週ごとに投与される。いくつかの実施形態によれば、酢酸グラチラマー組成物は、４週間ごとに投与される。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、ＡＤＳＣは１回投与される。いくつかの実施形態によれば、ＡＤＳＣは、複数回、例えば、２〜８ヶ月ごとに、３〜１２ヶ月ごとに、又はより少ない頻度で投与される。
【００６１】
いくつかの実施形態によれば、ＡＤＳＣは１回投与され、酢酸グラチラマー組成物は、２〜６週ごとに１回、例えば、４週ごとに１回投与される。
【００６２】
追加の実施形態によれば、ＡＤＳＣは、３〜１２ヶ月ごとに１回、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月ごとに１回投与され、酢酸グラチラマー組成物は、２〜６週ごとに１回、例えば、４週ごとに１回に投与される。
【００６３】
追加の実施形態によれば、ＡＤＳＣ及び酢酸グラチラマー組成物は、交互スケジュールに従って投与される。
【００６４】
脂肪由来幹細胞
本発明は、脂肪由来間葉系幹細胞を利用する。本明細書で使用される場合、「ＡＤＳＣ」又は「ｈＡＤＳＣ」（すなわち、ヒト脂肪由来幹細胞）と略記される「脂肪由来間葉系幹細胞」又は「脂肪由来幹細胞」という用語は、脂肪組織から採取されるプラスチック接着性の多能性細胞を指す。細胞集団は、細胞の少なくとも９５％がＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現し、細胞の少なくとも９０％がＣＤ１０５を発現し、かつ細胞の少なくとも９５％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ及びＨＬＡＤＲを発現しないことによって特徴付けられる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、細胞集団は、細胞の少なくとも９８％がＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現し、細胞の少なくとも９０％がＣＤ１０５を発現し、かつ細胞の少なくとも９８％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ及びＨＬＡＤＲを発現しないことによって特徴付けられる。
【００６６】
細胞集団はさらに、細胞の最大１０％〜２０％がＣＤ３４を発現することによって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、細胞集団は、細胞の最大５％、６％、７％、８％、９％又は１０％がＣＤ３４を発現することによって特徴付けられる。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００６７】
いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも５０％は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＣＤ９０について陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ及びＨＬＡＤＲについて陰性である。
【００６８】
いくつかの実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの９０〜１００％は、マーカー：ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０について陽性である。追加の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの少なくとも９５％は、マーカー：ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０について陽性である。さらに追加の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの少なくとも９８％は、マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０について陽性である。
【００６９】
いくつかの実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの６５〜１００％は、ＣＤ１０５について陽性である。追加の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの８０〜１００％は、ＣＤ１０５について陽性である。さらに追加の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの９０〜１００％は、ＣＤ１０５について陽性である。さらに追加の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの８０〜９５％は、ＣＤ１０５について陽性である。
【００７０】
いくつかの実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの０．１〜２０％は、マーカーＣＤ３４を発現する。追加の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの０．１〜１０％は、マーカーＣＤ３４を発現する。さらに追加の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの０．１〜５％は、マーカーＣＤ３４を発現する。さらに追加の実施形態によれば、ヒトＡＤＳＣの０．５〜２％は、マーカーＣＤ３４を発現する。
【００７１】
他の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの２〜１０％は、マーカーＣＤ３４について陽性である。他の実施形態によれば、ｈＡＤＳＣの２〜５％は、マーカーＣＤ３４について陽性である。いくつかの実施形態によれば、細胞の少なくとも９０％は、例えば、細胞の少なくとも９５％は、マーカーＣＤ３４について陰性である。
【００７２】
いくつかの実施形態によれば、投与されるヒトＡＤＳＣの少なくとも９０％は、マーカー：ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ及びＨＬＡＤＲについて陰性である。追加の実施形態によれば、投与されるヒトＡＤＳＣの少なくとも９５％は、マーカー：ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ及びＨＬＡＤＲについて陰性である。さらに追加の実施形態によれば、投与されるヒトＡＤＳＣの少なくとも９８％は、マーカー：ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ及びＨＬＡＤＲに対して陰性である。
【００７３】
いくつかの実施形態によれば、注入されるヒトＡＤＳＣの少なくとも５０％は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＣＤ９０について陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ、及びＨＬＡＤＲについて陰性である。追加の実施形態によれば、注入されるヒトＡＤＳＣの少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＣＤ９０について陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ及びＨＬＡＤＲに対して陰性である。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００７４】
細胞表面マーカー発現の特徴付けは、当技術分野で公知の方法、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いることによって行うことができる。ＦＡＣＳプロトコルは、例えば、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ６９９  ２０１１，編集者：Ｔｅｒｅｓａ  Ｓ．Ｈａｗｌｅｙ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｇ．Ｈａｗｌｅｙ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓの中で概説されている。例示的な手順は、以下に記載されている。
【００７５】
多能性間質細胞／幹細胞の供給源としての脂肪組織は、他の供給源に比べていくつかの利点を有する（Ｂａｅｒ  ＰＣ，Ｇｅｉｇｅｒ  Ｈ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔ  ２０１２；２０１２：８１２６９３）。例えば、皮下脂肪は、ヒトでは遍在しており、脂肪吸引法による吸引によって大量に容易に利用できる。脂肪吸引法は良好な耐容性手順であり、組織吸引物が大量に得られる。脂肪吸引物は、典型的には、医療廃棄物として廃棄され、脂肪由来間質細胞／幹細胞（ＡＳＣ）の単離のための良好な出発物質として認められる。組織は、単離され、培養物中で増殖させることができる多数の多能性細胞を含有している。
【００７６】
いくつかの実施形態によれば、ＡＤＳＣは、ヒトの皮下脂肪に由来する。特定の実施形態によれば、細胞は、脂肪吸引法による吸引によって得られるヒト皮下脂肪に由来する。ＡＤＳＣは、胃、臀部、大腿部、腕、首及び尻を含む身体の様々な領域における脂肪吸引手順によって得られ得る。脂肪吸引法のいずれかの手順は、当技術分野で知られているように、レーザ、超音波及び腹部形成術による脂肪除去を含むがこれらに限定されないＡＤＳＣを得るために本発明に従って使用され得る。
【００７７】
脂肪組織は、例えば、以下の実施例１に記載の手順に従って、脂肪由来幹細胞を単離するために処理される。調製方法は、典型的には、ＰＢＳ及び生理食塩水などの緩衝剤、並びに／又はＤＭＥＭ、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）若しくはＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅなどの成長培地で組織を洗浄する工程、並びにコラゲナーゼなどの組織解離酵素で組織を処理する工程、並びに／又は組織を機械的攪拌／破壊に供する工程、を含む。試料の消化はまた、ディスパーゼ及びコラゲナーゼの組み合わせを用いて行うことができる。一般的に凝集されるリポソームは、遠心分離によって、幹細胞、並びに赤血球、内皮細胞、及び線維芽細胞などの他の細胞を含む遊離間質細胞から分離することができる。赤血球は、適切な溶解緩衝液を用いて懸濁ペレットから溶解することができ、残りの細胞は濾過又は遠心分離することができる。
【００７８】
必要に応じて、細胞は、細胞選別によって分離されるか、又は免疫組織化学的に分離され得る。Ｂｕｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ．，４５（２）：１１５−１２０は、ＡＤＳＣの単離の方法について概説している。
【００７９】
いくつかの好ましい実施形態において、ＡＤＳＣは、それを必要とする対象に供給される前（又は後の使用のために貯蔵される前）に培養される。好ましくは、細胞は、異物を含まない培地で培養される。いくつかの実施形態において、ＡＤＳＣは、約８０〜１００％集密度、例えば、約８０％集密度まで成長させ、対象への投与前に３〜１０、好ましくは３〜５、又は３〜４の継代数まで継代培養される。そのため、いくつかの実施形態において、投与される細胞は３〜５回継代される。いくつかの実施形態において、ＡＤＳＣは、３回の継代数まで継代培養される。いくつかの実施形態において、ＡＤＳＣは、４回の継代数まで継代培養される。いくつかの実施形態において、ＡＤＳＣは、５回の継代数まで継代培養される。
【００８０】
投与前に細胞を計数し、注入用に医薬として許容される希釈剤／担体で調製される。典型的には、細胞は、対象への投与前に濃縮される。濃度は、典型的には、１．６×１０４／ｍｌ〜１００×１０６／ｍｌの範囲である。
【００８１】
本発明の方法によれば、単回投与のための幹細胞組成物は、いくつかの実施形態において、１０５〜３×１０８個のヒトＡＤＳＣを含む。いくつかの実施形態によれば、組成物は、１０５〜１０８個のヒトＡＤＳＣを含む。追加の実施形態によれば、１０６〜１０７個のヒトＡＤＳＣは、１回の投与で注入される。さらに追加の実施形態によれば、２００×１０６〜３００×１０６個のヒトＡＤＳＣは、１回の投与で注入される。さらに追加の実施形態によれば、１０７〜２×１０８個のヒトＡＤＳＣは、１回の投与で注入される。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、本発明のＡＤＳＣ組成物は、全身投与によって使用するためのものである。典型的には、投与は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）への投与である。そのような投与は、血液脳関門をバイパスすることを目的とし得る。さらに他の実施形態によれば、ＡＤＳＣは、脳の特定の領域に直接投与される。
【００８３】
いくつかの実施形態によれば、組成物は、例えば、髄腔内投与によりＣＮＳに投与される。いくつかの実施形態によれば、組成物は脊髄内投与される。他の実施形態によれば、組成物は、脳室内経路又は側脳室内（ＩＣＶ）経路、すなわち、脳室への投与によるものである。
【００８４】
脳室内薬物送達は、槽（Ｃ１〜２椎骨）及び頭蓋内脳室の脳脊髄液への薬剤の送達である。薬剤を直接投与することにより、必要とされる薬剤が少ないほど、経口投与された薬物に見られる副作用と比べて、副作用は少ない。当技術分野で知られているように、薬剤は、典型的には、ポンプに接続された移植カテーテルを介して送達される。ポンプは、プログラム可能であり、埋込型又は体外型のいずれかであり得る。。
【００８５】
髄腔内投与は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に達するように脊柱管、より具体的には、クモ膜下腔への注入を介する薬物の投与経路であり、脊椎麻酔、化学療法、又は疼痛管理の適用において有用である。この経路は、特に神経外科後に、特定の感染症と闘う薬物を導入するために使用される。薬物は、血液脳関門を回避するために、この方法を付与される必要がある。髄腔内及び硬膜外薬物送達は、薬物投与の脊髄内経路を含む。各経路は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に薬物を送達する。髄腔内送達は脊柱の髄腔内空間内のＣＳＦへの薬物の直接注入を含むが、硬膜外腔に注入される薬物は、ＣＳＦに到達するために硬膜を通過しなければならない。そのようなものとして、硬膜外投与される薬物はまた全身循環に達する一方で、髄腔内投与される薬物は、脊柱及び脳室中を循環しているＣＳＦ内に限定される。
【００８６】
グラチラマー製剤
本明細書で使用する「酢酸グラチラマー」という用語は、コパキソン（登録商標）という商品名で販売されており、それぞれ０．１４１、０．４２７、０．０９５、及び０．３３８の平均モル分率を有する４個の天然アミノ酸：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−リジンを含有する合成ポリペプチドの酢酸塩からなるコポリマー１として以前に知られていた化合物を指す。コパキソン（登録商標）中の酢酸グラチラマーの平均分子量は４，７００〜１１，０００ダルトン（ＦＤＡコパキソン（登録商標）ラベル）であり、アミノ酸の数は約１５〜約１００個のアミノ酸の範囲である。この用語はまた、化学的誘導体及び化合物の類似体を指す。典型的には、化合物は、米国特許第５，９８１，５８９号、同第６，０５４，４３０号、同第６，３４２，４７６号、同第６，３６２，１６１号、同第６，６２０，８４７号、及び同第６，９３９，５３９号のいずれかで指定されるように調製され、特徴付けられ、これらの参考文献の各々の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
本明細書で使用する「非経口」という用語は、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、腹腔内（ＩＰ）などから選択される経路を指す。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００８８】
いくつかの実施形態において、グラチラマー製剤は、筋肉内、皮下、経皮、静脈内、又は吸入投与によって投与される。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。ある特定の実施形態によれば、グラチラマー製剤は、皮下又は筋肉内注入のためのものである。
【００８９】
本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、多発性硬化症の症状、又は少なくとも１つの疾患症状の軽減という目標を達成するグラチラマーの量とみなすことを意図する。適切な用量は、各剤形を２０
７５０ｍｇ含むが、これらに限定されない。しかしながら、投与されるグラチラマーの量は、選択された投与経路、患者の年齢、体重、及び患者の症状の重症度を含む様々なパラメータに応じて、医師によって決定されることが理解される。本発明の様々な実施形態によれば、グラチラマーの治療有効量は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ／日の範囲である。あるいは、そのようなグラチラマーの治療有効量は、約２０ｍｇ〜約１００ｍｇ／日である。
【００９０】
本明細書で使用する「長時間作用性」という用語は、対象の全体的な全身循環へ又は対象における局所的な作用部位へ、グラチラマー塩の長期放出性、持続放出性又は延長放出性を提供する組成物を指す。この用語は、さらに、対象におけるグラチラマー塩の作用（薬物動態）期間を、長期化、持続化又は延長化させる組成物を指し得る。そのような組成物はまた、本明細書では「持続放出性デポー形態」と呼ばれる。特定の実施形態において、本発明の長時間作用性医薬組成物は、１週間に１回から６ヶ月ごとに１回の範囲の投薬レジメンを提供する。それは、約１週から約６ヶ月の期間にわたって、治療有効量の医薬として許容されるグラチラマー塩を放出する。現在、より好ましい実施形態によれば、投薬レジメンは、週に１回から、月に２回（約２週ごとに１回）、月１回の範囲である。必要な作用期間に応じて、デポー製剤は、典型的には、活性成分を約２０〜７５０ｍｇ含有し、数週間から数ヶ月の範囲の期間にわたって放出されるように設計されている。
【００９１】
特定の実施形態において、グラチラマー製剤は、担体１ｍＬあたり２０〜３０ｍｇのＧＡの濃度で投与される。特定の実施形態において、担体は、注入用水（ＷＦＩ）である。本明細書で使用する「注入用水」又は「ＷＦＩ」という用語は、一般に、例えば、微粒子、溶解固形物、有機物、無機物、微生物及びエンドトキシン混入物の規制基準を満たす滅菌純水を意味する。特定の実施形態において、懸濁化剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ＣＭＣ）、緩衝剤（例えば、クエン酸塩）及び／又は等張化剤（例えば、ＮａＣｌ）を含有するＷＦＩ又は緩衝液中のグラチラマー製剤が投与される。
【００９２】
特定の実施形態において、グラチラマー製剤は、１０％〜４０％の固体を含む。追加の実施形態において、グラチラマー製剤は、２０％〜３０％の固体を含む。特定の実施形態において、グラチラマー製剤は、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）共重合体を含む。特定の実施形態において、ＰＬＧＡ共重合体は、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（５０:５０）共重合体である。いくつかの実施形態において、グラチラマー製剤は、ＧＡ４０ｍｇあたり１５０〜１５００ｍｇのＰＬＧＡ共重合体を含む。いくつかの特定の実施形態において、グラチラマー製剤は、ＧＡ４０ｍｇあたり５５０ｍｇのＰＬＧＡ共重合体を含む。特定の実施形態において、ＰＬＧＡ共重合体は、少なくとも部分的にＧＡをカプセル化する。特定の実施形態において、ＰＬＧＡ共重合体は、ＧＡをカプセル化する。
【００９３】
特定の実施形態において、ＧＡの３０％未満は、連続攪拌下、３７℃のＰＢＳ中でデポー製剤から７日以内に放出される。特定の実施形態において、ＧＡの２０％超は、連続撹拌下、３７℃のＰＢＳ中でデポー製剤から７〜５日以内に放出される。特定の実施形態において、ＧＡの４５％未満は、連続撹拌下、３７℃のＰＢＳ中でデポー製剤から１４日以内に放出される。特定の実施形態において、ＧＡの９０％超は、連続撹拌下、３７℃のＰＢＳ中でデポー製剤から２８日以内に放出される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法で使用されるデポー製剤は、水、油若しくはワックス相中のグラチラマー又はその医薬として許容される塩の懸濁液、グラチラマー又はその医薬として許容される塩の難溶性高分子電解質複合体；グラチラマー又はその医薬として許容される塩と水混和性溶媒の組み合わせに基づく「インサイツ」ゲル形成マトリックス；及びグラチラマー又はその医薬として許容される塩が組み込まれた生分解性ポリマー微粒子を含むが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。特定の実施形態において、本発明の組成物は、グラチラマー又はその医薬として許容される塩が、生分解性又は非生分解性の担体中に捕捉されている注入可能な微粒子の形態である。本発明の微粒子組成物は、水中油中水型二重乳濁液を含んでよい。本発明の範囲内に、グラチラマー又はその任意の医薬として許容される塩を含む内部水相、生分解性又は非生分解性ポリマーを含む油相又は水不混和相、及び外部水相を含む微粒子組成物がある。外部水相は、さらに、界面活性剤、好ましくは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリソルベート、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体又はセルロースエステルを含み得る。「油相」及び「水不混和相」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
【００９５】
特定の実施形態によれば、本発明の長時間作用性医薬組成物は、水中油中水型二重乳化プロセスによって調製された微粒子の形態である。現在の好ましい実施形態において、本発明の長時間作用性医薬組成物は、治療有効量の医薬として許容されるグラチラマーの塩を含む内部水相、生分解性及び非生分解性ポリマーから選択される担体を含む水不混和性ポリマー相、及び外部水相を含む。他の現在の好ましい実施形態において、水不混和性ポリマー相は、ＰＬＡ及びＰＬＧＡから選択される生分解性ポリマーを含む。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。追加の実施形態において、外部水相は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリソルベート、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、及びセルロースエステルから選択される界面活性剤を含む。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００９６】
いくつかの実施形態において、組成物は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、酢酸塩、硝酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸、プロピオール酸塩（ｐｒｏｐｉｏｌａｔｅ）、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、コハク酸トコフェリル、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、マンデル酸塩などの塩を含むが、これらに限定されない任意の他の医薬として許容されるグラチラマーの塩を含み得る。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００９７】
共重合体は、当業者に利用可能な任意の手順によって作製することができる。例えば、共重合体は、縮合条件下で、溶液中の所望のモル比のアミノ酸を用いて、又は固相合成法によって作製することができる。縮合条件は、適切な温度、ｐＨ、及び一方のアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基を縮合させてペプチド結合を形成するための溶媒の条件を含む。縮合剤、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドは、ペプチド結合の形成を促進するために使用することができる。
【００９８】
ブロッキング基は、望ましくない副反応に対して、側鎖部分及びアミノ基又はカルボキシル基の一部などの官能基を保護するために使用することができる。内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第３，８４９，５５０号に開示されたプロセスは、本発明の共重合体を調製するために使用することができる。例えば、チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタメート及びＮ，ε−トリフルオロアセチルリジンのＮ−カルボキシ無水物は、周囲温度で、無水ジオキサン中で開始剤としてのジエチルアミンと共重合する。グルタミン酸のγ−カルボキシル基は、氷酢酸中、臭化水素によって脱ブロックすることができる。トリフルオロアセチル基は、１モルのピペリジンによってリジンから除去される。プロセスは、グルタミン酸、アラニン、チロシン、又はリジンのうちのいずれか１つに関連する反応を選択的に除去することによって、所望のアミノ酸、すなわち、コポリマー１の中の４個のアミノ酸のうちの３つを含有するペプチド及びポリペプチドを作製するために調整することができることを当業者なら容易に理解する。内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，６２０，８４７号、同第６，３６２，１６１号、同第６，３４２，４７６号、同第６，０５４，４３０号、同第６，０４８，８９８号及び同第５，９８１，５８９号は、酢酸グラチラマー（Ｃｏｐ−１）を調製するための改良された方法を開示している。本出願の目的のために、「周囲温度」及び「室温」という用語は、典型的には、約２０℃〜約２６℃の範囲の温度を意味する。
【００９９】
ＧＡの長時間作用性デポー製剤は、例えば、米国特許第８，３７７，８８５号に開示されている。非限定的な例では、ＧＡデポーは、ＧＡを装填したポリグラクチン微粒子を含む無菌凍結乾燥粉末である。この製剤は、注入用水に懸濁され、例えば、４週ごとに１回の筋肉内投与を意図している。
【０１００】
共重合体の分子量は、ポリペプチド合成中又はポリマーが作製された後に調整することができる。ポリペプチド合成中に分子量を調節するために、合成条件又はアミノ酸の量は、ポリペプチドがおおよそ所望の長さに達した時に、その合成が停止するように調整される。合成後、所望の分子量を有するポリペプチドは、分子量サイズ分類カラム又はゲル上でのポリペプチドのクロマトグラフィーなどの任意の利用可能なサイズ選択手順、及び所望の分子量範囲の収集によって得ることができる。本発明のポリペプチドはまた、例えば、酸又は酵素的加水分解によって、部分的に加水分解して、高分子量種を除去し、次いで、精製して酸又は酵素を除去することができる。
【０１０１】
一実施形態において、所望の分子量を有する共重合体は、保護されたポリペプチドと臭化水素酸とを反応させて、所望の分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチルポリペプチドを形成することを含むプロセスにより調製され得る。反応は、１以上の試験反応によって予め決定された時間及び温度で行われる。試験反応中に、時間及び温度は変更され、所与のバッチの試験ポリペプチドの分子量範囲が決定される。そのバッチのポリペプチドの最適分子量範囲を提供する試験条件が、バッチのために使用される。そのため、所望の分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチルポリペプチドは、試験反応によって予め決定された時間及び温度で、保護されたポリペプチドと臭化水素酸とを反応させることを含むプロセスにより生成することができる。次いで、さらに、所望の分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチルポリペプチドを水性ピペリジン溶液で処理して、所望の分子量を有する脱保護ポリペプチドを形成させる。
【０１０２】
現在の好ましい実施形態において、所与のバッチからの保護されたポリペプチドの試験試料を、約２０〜２８℃の温度で、臭化水素酸と約１０〜５０時間反応させる。そのバッチの最高の条件は、いくつかの試験反応を実行することによって決定される。例えば、一実施形態において、保護されたポリペプチドは、約２６℃の温度で、臭化水素酸と約１７時間反応させる。
【０１０３】
特定の実施形態において、剤形には、ＰＬＧＡベースの注入可能なデポーシステム、非ＰＬＧＡベースの注入可能なデポーシステム、及び注入用生分解性ゲル若しくは分散液などの生分解性の注入可能なデポーシステムが含まれるが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。本明細書で使用する「生分解性」という用語は、少なくとも部分的に、周囲の組織液中に見られる物質との接触に起因して、又は細胞作用によって、経時的にその表面で侵食又は分解する成分を指す。特に、生分解性成分は、ポリラクチド、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、すなわち、ＰＬＡなどの乳酸系ポリマー；ポリグリコリド（ＰＧＡ）、例えば、Ｄｕｒｅｃｔ社のＬａｃｔｅｌ（登録商標）などのグリコール酸系ポリマー；ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）、すなわち、ＰＬＧＡ、（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社のＲｅｓｏｍｅｒ（商標）ＲＧ−５０４、Ｒｅｓｏｍｅｒ（商標）ＲＧ−５０２、Ｒｅｓｏｍｅｒ（商標）ＲＧ−５０４Ｈ、Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ−５０２Ｈ、Ｒｅｓｏｍｅｒ（商標）ＲＧ−５０４Ｓ、Ｒｅｓｏｍｅｒ（商標）ＲＧ−５０２Ｓ、Ｄｕｒｅｃｔ社のＬａｃｔｅｌ（登録商標））；ポリ（ｅ−カプロラクトン）、すなわち、ＰＣＬ（Ｄｕｒｅｃｔ社のＬａｃｔｅｌ（登録商標））などのポリカプロラクトン；ポリ無水物；ポリ（セバシン酸）ＳＡ；ポリ（リシノール酸（ｒｉｃｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）ＲＡ；ポリ（フマル酸）、ＦＡ；ポリ（脂肪酸ダイマー（ｄｉｍｍｅｒ））、ＦＡＤ；ポリ（テレフタル酸）、ＴＡ；ポリ（イソフタル酸）、ＩＰＡ；ポリ（ｐ−（カルボキシフェノキ）メタン）、ＣＰＭ；ポリ（ｐ−（カルボキシフェノキシ）プロパン）、ＣＰＰ；ポリ（ｐ−（カルボキシフェノキシ）ヘキサン）ｓ  ＣＰＨ；ポリアミン、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル（ＣＨＤＭ：シス／トランス−シクロヘキシルジメタノール、ＨＤ：１，６−ヘキサンジオール；ＤＥＴＯＵ：（３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロウンデカン））；ポリジオキサノン；ポリヒドロキシブチレート；ポリアルキレンオキサレート；ポリアミド；ポリエステルアミド；ポリウレタン；ポリアセタール；ポリケタール；ポリカーボネート；ポリオルトカーボネート；ポリシロキサン；ポリホスファゼン；コハク酸塩；ヒアルロン酸；ポリ（リンゴ酸）；ポリ（アミノ酸）；ポリヒドロキシバレレート；ポリアルキレンコハク酸塩；ポリビニルピロリドン；ポリスチレン；合成セルロースエステル；ポリアクリル酸；ポリ酪酸；トリブロック共重合体（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、トリブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）トリブロック共重合体（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）、ポリ吉草酸；ポリエチレングリコール；ポリヒドロキシアルキルセルロース；キチン；キトサン；ポリオルトエステル及び共重合体、ターポリマー；コレステロール、レシチンなどの脂質；ポリ（グルタミン酸−コ−グルタミン酸エチル）など、又はそれらの混合物などのポリマーであるが��これらに限定されない。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアルカン無水物（ｐｏｌｙａｌｋａｎｅａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ゼラチン、コラーゲン、酸化セルロース、及びポリホスファゼンなどから選択されるが、これらに限定されない生分解性ポリマーを含む。各可能性は、別々の実施形態を表す。
【０１０５】
現在の好ましい生分解性ポリマーは、乳酸系ポリマー、より好ましくは、ポリラクチド、又はポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）、すなわち、ＰＬＧＡである。好ましくは、生分解性ポリマーは、組成物の約１０％〜約９８％ｗ／ｗの量で存在する。乳酸系ポリマーは、１００：０〜約０：１００、好ましくは、１００：０〜約１０:９０の範囲内の乳酸対グリコール酸のモノマー比を有し、約１，０００〜２００，０００ダルトンの平均分子量を有する。しかしながら、生分解性ポリマーの量は、使用期間などのパラメータによって決定されることが理解される。
【０１０６】
本発明の組成物は、さらに、共界面活性剤、溶媒／共溶媒、水不混和性溶媒、水、水混和性溶媒、油性成分、親水性溶媒、乳化剤、防腐剤、酸化防止剤、消泡剤、安定剤、緩衝剤、ＰＨ調整剤、浸透圧剤、チャネル形成剤、浸透圧調整剤、又は当技術分野で公知の任意の他の賦形剤から選択されるが、これらに限定されない１種以上の医薬として許容される賦形剤（複数可）を含み得る。適切な共界面活性剤には、ポリエチレングリコール、「ポロキサマー」として知られるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体、デカグリセリルモノラウレート及びデカグリセリルモノミリステートなどのポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタンモノステアレートなどのソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンモノステアレートなどのポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油並びにポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの硬化ヒマシなど、又はそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。適切な溶媒／共溶媒には、アルコール、トリアセチン、ジメチルイソソルビド、グリコフロール、炭酸プロピレン、水、ジメチルアセトアミドなど、又はそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。適切な消泡剤には、シリコン乳濁液又はセスキオレイン酸ソルビタンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物中の成分の劣化を防止又は減少させるための適切な安定剤には、グリシン、α−トコフェロール又はアスコルビン酸、ＢＨＡ、ＢＨＴなどの抗酸化剤、又はそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。適切な張度調整剤には、マンニトール、塩化ナトリウム、及びグルコースが含まれるが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。適切な緩衝剤には、適切な陽イオンを有する酢酸塩、リン酸塩、及びクエン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１０７】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。現在好ましいのは、コロイド状送達システム、例えば、生分解性微粒子へのグラチラマー又はその塩の共重合体の配合であり、そのため、粒子のポリマー壁を通る拡散によって、及び体内の水媒体又は生体液でのポリマー分解によって放出遅延が可能になる。本発明の組成物は、「二重乳化」として知られるプロセスによって注入可能な微粒子の形態で調製することができる。簡単に説明すると、水溶性共重合体の濃縮液を、水不混和性揮発性有機溶媒（例えば、塩化メチレン、クロロホルムなど）中の生分解性又は非生分解性ポリマー溶液中に分散させる。次いで、このようにして得られた「油中水型」（ｗ／ｏ）乳濁液を、界面活性剤（例えば、ポリビニルアルコール−ＰＶＡ、ポリソルベート、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体、セルロースエステルなど）を含有する連続外部水相に分散させて、「水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）二重乳濁液」の液滴を形成する。有機溶媒を蒸発させた後に、微粒子を固化し、濾過又は遠心分離によって収集する。収集した微粒子（ＭＰ）を精製水で洗浄し、界面活性剤及び非結合ペプチドの大部分を除去して、再び遠心分離する。洗浄したＭＰを収集し、添加剤なしに、又は凍結防止剤（マンニトール）を添加して凍結乾燥し、それらのその後の再構成を容易にする。
【０１０８】
「水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）二重乳濁液」の粒子サイズは、この工程で加えられる力の量、混合速度、界面活性剤の種類及び濃度などを含むが、これらに限定されない様々なパラメータによって決定することができる。適切な粒子サイズは、約１〜１００μｍの範囲である。
【０１０９】
本発明のデポーシステムは、当業者に公知の任意の形態を包含する。適切な形態には、生分解性又は非生分解性ミクロスフェア、移植可能なロッド、移植可能なカプセル、及び移植可能なリングを含む任意の適切な幾何学的形状のインプラントが含まれるが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。さらに企図されるのは、長期放出性ゲルデポー及び浸食性マトリックスである。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。適切な移植可能なシステムは、例えば、その内容全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００８／００６３６８７号に記載されている。移植可能なロッドは、適切なマイクロ押出機を用いて、当技術分野で知られているように調製することができる。
【０１１０】
本発明の原理によれば、本発明の長時間作用性医薬組成物は、副作用の発生率の低下、局所レベル及び／又は全身レベルでの副作用の重症度の低下と共に、市販の毎日注入可能な剤形と同等又は優れた治療効果を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、実質的に類似の用量の酢酸グラチラマーの即時放出製剤と比較して、対象におけるグラチラマーの長期放出性又は長期作用を提供する。
【０１１１】
本発明に包含されるのは、酢酸グラチラマー又はグラチラマーの任意の他の医薬として許容される塩と、脂肪由来幹細胞及び必要に応じて少なくとも１種の他の活性薬剤との併用療法である。本発明の範囲内の活性剤には、インターフェロン、例えば、ペグ化若しくは非ペグ化α−インターフェロン、又はβ−インターフェロン、例えば、インターフェロンβ−１ａ又はインターフェロンβ−１ｂ、又はτ−インターフェロン；必要に応じて抗増殖／抗新生物活性を有する免疫抑制剤、例えば、ミトキサントロン、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロホスファミド、又はステロイド、例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン又はデキサメタゾン、又はステロイド分泌剤、例えば、ＡＣＴＨ；アデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えば、クラドリビン；様々なＴ細胞表面マーカーに対するＩＶ免疫グロブリンＧ（例えば、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｍａｙ  ５０（５）：１２７３−８１に開示されているような）モノクローナル抗体、例えば、ナタリズマブ（ＡＮＴＥＧＲＥＮ（登録商標））又はアレムツズマブ；ＴＨ２促進サイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、又はＴＨ１促進サイトカインの発現を阻害する化合物、例えば、ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えば、ペントキシフィリン；バクロフェン、ジアゼパム、ピラセタム、ダントロレン、ラモトリギン、リフルゾール（ｒｉｆｌｕｚｏｌｅ）、チザニジン、クロニジン、ベータ遮断薬、シプロヘプタジン、オルフェナドリン又はカンナビノイドを含む抗痙縮剤；ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体アンタゴニスト、例えば、２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ（ｆ）キノキサリン、[１，２，３，４，−テトラヒドロ−７−モルホリン−イル−２，３−ジオキソ−６−（トリフルオロメチル）キノキサリン−ｉ−イル]メチルホスホネート、１−（４−アミノフェニル）−４−メチル−７，８−メチレンジオキシ−５Ｈ−２，３−ベンゾジアゼピン、又は（−）１−（４−アミノフェニル）−４−メチル−７，８−メチレン−ジオキシ−４，５−ジヒドロ−３−メチルカルバモイル−２，３−ベンゾジアゼピン；ＶＣＡＭ−１発現の阻害剤又はそのリガンドのアンタゴニスト、例えば、α４β１インテグリンＶＬＡ−４及び／又はα−４−β−７インテグリンのアンタゴニスト、例えば、ナタリズマブ（ＡＮＴＥＧＲＥＮ（登録商標））；抗マクロファージ遊走阻止因子（抗ＭＩＦ）；ｘｉｉ）カテプシンＳ阻害剤；ｘｉｉｉ）ｍＴｏｒ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。現在の好ましい１つの他の活性剤は、免疫抑制剤のクラスに属するＦＴＹ７２０（２−アミノ−２−[２−（４−オクチルフェニル）エチル]プロパン−１，３−ジオール；フィンゴリモド）である。
【０１１２】
本発明は、ＡＤＳＣの投与と共に、多発性硬化症の治療のために、それを必要とする個体への移植に適するデポー形態の酢酸グラチラマー又はグラチラマーの任意の他の医薬として許容される塩の使用を包含する。
【０１１３】
本発明は、酢酸グラチラマー又はグラチラマーの任意の他の医薬として許容される塩を含む医薬組成物であって、多発性硬化症の治療においてｈＡＤＳＣと共に使用するための持続放出性デポー形態である医薬組成物を包含する。
【０１１４】
本発明はまた、少なくとも１つの追加の薬物、好ましくは、免疫抑制剤、特にフィンゴリモドと、酢酸グラチラマー及びＡＤＳＣの組み合わせを包含する。
【０１１５】
本発明はさらに、多発性硬化症の治療においてｈＡＤＳＣと共に使用するための医薬の製造のための、それを必要とする対象に投与又は／対象への移植に適した、持続放出性デポー形態の酢酸グラチラマーの使用を包含する。
【０１１６】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより完全に説明するために提示されている。しかしながら、それらは、決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される原理の多くの変形及び変更を容易に考案することができる。
【０１１７】
実施例
実施例１−Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＯＧ誘導性慢性ＥＡＥに対するＧＡデポー及びヒトＡＤＳＣの効果
材料及び方法
酢酸グラチラマー：（商品名コパキソン（登録商標））予め充填されたシリンジ中２０ｍｇ／ｍｌ、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｐｅｔａｈ−Ｔｉｋｖａ，Ｉｓｒａｅｌ）。皮下注射（ＳＣ）用。
【０１１８】
酢酸グラチラマー（ＧＡ）デポーの生成及びＧＡ放出プロファイル：ＧＡデポーを、米国特許第８，３７７，８８５号に記載されているように調製し、凍結乾燥し、保存した。ＧＡデポー製剤からのＧＡの放出プロファイルを、以下のように決定した：既知量の凍結乾燥ＧＡデポー粉末をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、３４日間、３７℃で撹拌した。規則的な間隔で、試料を撹拌懸濁液から回収し、ＧＡの量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて決定した。ＧＡの含有率を、懸濁液中の既知量のＧＡデポーに基づいて計算した。投与（筋肉内、ＩＭ）のために、凍結乾燥ＧＡデポー粉末を注入用滅菌水（ＷＦＩ）に懸濁した。
【０１１９】
脳室内（ＩＣＶ）注入用のヒト脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の単離、特徴付け、培養及び調製：
細胞調製のプロトコル：
ＡＤＳＣの単離：
ヒト組織由来の脂肪吸引物を、室温（ＲＴ）で等量のＰＢＳで４回洗浄した。次いで、脂肪吸引物を振盪しながら、コラゲナーゼ（ＮＢ４、Ｓｅｒｖａ）を用いて３７℃で３０分間消化した。その後、消化した試料をＲＴで１０分間、３００〜５００ｇで遠心分離し、未消化の脂肪を含む上部液体を除去した。異物を含まない増殖培地（ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｔｙｉ）を等量添加することによって反応を停止させた後、ＲＴで１０分間、５００ｇでさらに遠心分離した。得られたペレットを５０ｍｌの遠心分離管に移し、培地で洗浄し、同じ条件で遠心分離した。上清を除去し、ペレットを、２５ｍｌの赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて、ＲＴで１０分間再懸濁した。２５ｍｌのＰＢＳを添加し、試料を５分間５００ｇで遠心分離した。ペレットを、１０ｍｌの培地に再懸濁し、１００μｍフィルターを通して濾過し、その後、さらに１０ｍｌの培地を添加した。溶液を５分間、５００ｇで遠心分離した。手順を、４０μｍのフィルターを用いて繰り返し、細胞を計数した。得られた細胞を間質血管画分（ＳＶＦ）と呼ぶ。
【０１２０】
細胞培養：
ＳＶＦを、７５ｃｍ２あたり約２×１０６個の細胞密度で播種した。細胞を約８０％集密度まで増殖させ、トリプシン処理し、最高３〜４回継代培養した。次いで、細胞を収集し、マーカー：ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ、ＨＬＡＤＲ及びＣＤ３４についてＦＡＣＳによって分析した。細胞を、使用するまで液体窒素中で凍結保存した。使用する場合は、凍結した細胞を解凍し、５０，０００細胞／ｃｍ２の濃度で播種し、一晩インキュベートした。細胞ＩＣＶ注入の前に、細胞をトリプシン処理し、計数し、２×１０５細胞／ＰＢＳ４μｌの濃度で注入用に調製し、３０分以下の間、使用するまで氷上に置いた。ＩＣＶ注入を、定位システムを用いて行い、マウスの脳を傷つけないように注意した。
【０１２１】
動物：全ての動物試験は、地元の倫理委員会によって承認された。７〜９週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、平均重量が同じ対照グループ又は治療グループに無作為に分けた。動物に、実験中、食物及び水を自由に与えた。
【０１２２】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘導：ＥＡＥを誘導するために、改変された完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）中のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）３５−５５（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）の乳濁液を、以下のように調製した：熱殺菌Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株Ｈ３７ＲＡ（Ｓｉｇｍａ）をＣＦＡに添加し、最終濃度を４ｍｇ／ｍＬにした。その後、２ｍｇ／ｍＬのＭＯＧ ３５〜５５を、等量の改変ＣＦＡで乳化した。毛を剃ったマウスの背中の一箇所にこの乳濁液を皮下（ＳＣ）注射することによってＥＡＥを誘導した後、０日目及びＭＯＧ免疫後４８時間の時点で、ＰＢＳ中のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内注射した。
【０１２３】
測定：
疾患症状の発症から２８日目まで、体重を毎日測定した。ＥＡＥを、免疫後０日目から２８日目に、１日１回マウスの臨床スコアリングにより評価した（表１）。死んだ動物には臨床スコア５を与え、動物の死ぬ前の最終重量測定値を最終体重として記録した。
【０１２４】
表１：ＥＡＥ臨床スコア
【表１】
2020519658.tif 000002
【０１２５】
以下の計算は、臨床スコアの生データから導き出された：
最大スコアの平均値：
分析の指定日までの特定のグループ内の各マウスについて記載された最高スコアの平均値である。
平均疾患期間：
（各マウスについての分析の日−疾患発症日）の合計／（１グループ当たりのマウスの数）
平均発症日：
各マウスの疾患発症の日の合計／１グループあたりのマウスの数
臨床スコアの曲線下面積（ＡＵＣ）：
マイクロソフトエクセルを用いて計算され、疾患負荷を表す。
【０１２６】
実験計画：
ＥＡＥモデルの実験計画を表２に詳述する（各グループにおいてｎ＝１０）。
【０１２７】
表２：実験計画
【表２】
2020519658.tif 000003
【０１２８】
統計解析：各データセットを、一要因分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いて、不等分散を仮定する両側二標本スチューデントＴ検定、ｎ＝１０／グループ、＋／−標準誤差を用いて解析した。
【０１２９】
結果
試験物の最初の注射から２８日まで計算された試験結果を、表３及び図１〜５に記載する。
細胞の表現型
【表３】
2020519658.tif 000004
【０１３０】
表３：ＥＡＥに対するＧＡデポー及びＡＤＳＣの効果
【表４】
2020519658.tif 000005
【０１３１】
統計解析を以下に詳述する。
表４：平均臨床スコアの統計解析（図４）
【表５】
2020519658.tif 000006
2020519658.tif 000007
表５：平均臨床スコアの統計解析（図５）
【表６】
2020519658.tif 000008
【０１３２】
対照と比較してより低い平均最大スコア及び臨床スコアのＡＵＣによって反映されるように、ＡＤＳＣ単独は、最大疾患スコア及び疾患負荷に対する有益な効果を示した。疾患スコアに対する有益な効果は、２０日目付近でのみ始まった。ＡＤＳＣ単独は、対照と比較して疾患発症に対する効果を示さなかった。
【０１３３】
ＧＡデポー２ｍｇ／１０ｍｇ単独は、対照と比較して疾患の発症に対して有益な効果を示した。デポー単独は、最大疾患スコア又は疾患負荷に対する効果を示さなかった。
【０１３４】
ＡＤＳＣとＧＡデポー２ｍｇ／１０ｍｇの組み合わせは、対照と比較して最大疾患スコア及び疾患負荷に対して有益な効果を示し、疾患の発症を遅らせた。重要なことに、これらの組み合わせは、全ての他のグループと比較して、いくつかの時点で実験を通して臨床スコアのより遅い増加（すなわち、より遅い疾患進行）を示し、成分間の相乗作用を示した。予想外に、ＡＤＳＣとより低い用量のＧＡデポー（２ｍｇデポー）の組み合わせは、特にこの点で有益であった。
【０１３５】
実験データは、ＩＣＶ注射されるＡＤＳＣと共に、ＩＭ注射されるＧＡデポーの明確な利点を示す。ＧＡデポーとＡＤＳＣの併用は、ＥＡＥ症状の減衰に対して長期的な効果をもたらし、疾患負荷の大幅な低減につながった。
【０１３６】
実施例２−ＡＤＳＣの用量応答
ＭＯＧ誘発性ＥＡＥにおけるＡＤＳＣの細胞用量治療効果を評価するために（上記のように）、異なる量（１×１０５又は２×１０５）のＡＤＳＣを単独で、又は２ｍｇのＧＡデポーのＩＭ注射と組み合わせて、ＩＣＶ投与のために使用した。実験計画を表６に詳述する（各グループにおいてｎ＝１０）。
【０１３７】
表６：実験計画
【表７】
2020519658.tif 000009
【０１３８】
結果
試験物の最初の注入から２８日まで計算した試験結果を図６〜１０に記載する。
【０１３９】
細胞用量効果が観察され、より高い用量の２×１０５細胞は、疾患負荷及び疾患スコアの低減において１×１０５用量よりも効果的であった。
【０１４０】
重要なことに、ＡＤＳＣとＧＡデポーの組み合わせは、全ての他のグループと比較して、疾患の発症及びより遅い疾患進行において有意な遅延と共に明確な相乗効果を示した。
【０１４１】
実施例３−ＡＤＳＣの細胞表面マーカーの分析
表７〜１５に、上記の実施例１に記載したように調製し、１〜５回継代したＡＤＳＣの９つの試料のＦＡＣＳ分析をまとめる。表１６〜１７及び図１１は、平均値＋標準偏差（「ＳｔＤｅｖ」）の値を示す。表及び図に見られるように、マーカーは、Ｐ３の後に安定化される。継代数Ｐ３〜Ｐ４は、約１４以下の集団倍加と同等である。
【０１４２】
表７
【表８】
2020519658.tif 000010
【０１４３】
表８
【表９】
2020519658.tif 000011
【０１４４】
表９
【表１０】
2020519658.tif 000012
【０１４５】
表１０
【表１１】
2020519658.tif 000013
【０１４６】
表１１
【表１２】
2020519658.tif 000014
【０１４７】
表１２
【表１３】
2020519658.tif 000015
【０１４８】
表１３
【表１４】
2020519658.tif 000016
【０１４９】
表１４
【表１５】
2020519658.tif 000017
【０１５０】
表１５
【表１６】
2020519658.tif 000018
【０１５１】
表１６−平均
【表１７】
2020519658.tif 000019
【０１５２】
表１７−標準偏差
【表１８】
2020519658.tif 000020
【０１５３】
本発明を具体的に記載してきたが、当業者なら、多くの変形及び改変がなされ得ることを理解する。したがって、本発明は、具体的に記載された実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、本発明の範囲及び概念は、以下の添付の特許請求の範囲を参照することにより容易に理解される。
【図１】
2020519658.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月14日(2020.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸グラチラマーを含む医薬組成物であって、中枢神経系（ＣＮＳ）に投与されるヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）と組み合わせて多発性硬化症の治療に使用するための、非経口投与用の持続放出性デポー形態の医薬組成物。
【請求項２】
ｈＡＤＳＣと同じ日に投与するための、またはｈＡＤＳＣとは別々の日に投与するための、請求項１に記載の医薬組成物であって、酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物の投与と前記ｈＡＤＳＣの投与の間の期間が１〜１４日の範囲である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
１〜６週ごとに１回投与するための、または４週ごとに１回投与するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ｈＡＤＳＣの前に投与するための、またはｈＡＤＳＣの後に投与するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
筋肉内投与用に製剤化された、筋肉内注射による投与のための、または
皮下移植用に製剤化された、皮下注射による投与のための、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
髄腔内投与、脳室内投与又は側脳室内（ＩＣＶ）投与によって投与されるｈＡＤＳＣと組み合わせて多発性硬化症の治療に使用するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ｈＡＤＳＣが自己である、または前記ｈＡＤＳＣが同種異系である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ｈＡＤＳＣが、前記細胞の少なくとも９５％がＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現し、前記細胞の少なくとも９０％がＣＤ１０５を発現し、かつ前記細胞の少なくとも９５％がＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１１Ｂ及びＨＬＡＤＲを発現しないことによって特徴付けられ、任意選択で、前記ｈＡＤＳＣが、前記細胞の０．１〜１０％がＣＤ３４を発現することによってさらに特徴付けられてもよい、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
１回の投与あたり約１０５〜３×１０８個の細胞という用量で投与されるｈＡＤＳＣと組み合わせて投与するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記酢酸グラチラマーが、約０．１４のグルタミン酸、約０．４３のアラニン、約０．１０のチロシン及び約０．３３のリジンのモル比でＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、及びＬ−チロシンの酢酸塩を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記酢酸グラチラマーが、約１５〜約１００個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
酢酸グラチラマーの医薬として許容される生分解性又は非生分解性の担体を含む、請求項１に記載の医薬組成物であって、任意選択で、前記担体は、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリオルトエステル、ポリアルカン無水物、ゼラチン、コラーゲン、酸化セルロース、及びポリホスファゼンからなる群から選択されてもよい、医薬組成物。
【請求項１３】
酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、水中油中水型二重乳化プロセスによって調製される微粒子の形態である、請求項１に記載の医薬組成物であって、
任意選択で、前記微粒子は、治療有効量の酢酸グラチラマーを含む内部水相と、生分解性ポリマー及び非生分解性ポリマーから選択される担体を含む水不混和性ポリマー相と、外部水相と、を含んでもよく、
任意選択で、前記水不混和性ポリマー相は、ＰＬＡ及びＰＬＧＡから選択される生分解性ポリマーを含んでもよく、前記外部水相は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリソルベート、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体及びセルロースエステルから選択される界面活性剤を含んでもよい、
医薬組成物。
【請求項１４】
酢酸グラチラマーを約２０〜５００ｍｇ含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
進行型の多発性硬化症を患っている対象に投与するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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