【手続補正書】
【提出日】平成29年4月27日(2017.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）及び（Ｂ）に記載の特徴を有する、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子；
（Ａ）下記（ａ１）に記載の遺伝子を構成するエクソン内に、コード蛋白質における２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う変異を有する特徴、
（ａ１）配列番号５に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列、からなる蛋白質をコードする遺伝子であって、グルコエルシンからグルコラファサチンへの合成反応に関与する蛋白質をコードする遺伝子、
（Ｂ）ダイコンゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座が当該機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子のホモ型となった場合に、肥大根部のグルコラファサチン含量が３μｍоｌ／ｇ以下となる特徴。
【請求項２】
さらに下記（Ｃ）に記載の特徴を有する、請求項１に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子；
（Ｃ）上記（Ａ）に記載の変異が、少なくとも１ｋｂｐの塩基配列の挿入を伴う変異である。
【請求項３】
上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む遺伝子である、請求項１又は２に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかにおける上記（Ａ）に記載の変異の存在の有無を検出することを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定方法。
【請求項５】
下記（Ｄ）及び（Ｅ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなることを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用キット；
（Ｄ）請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異の存在を検出可能な位置に設計された少なくとも１２塩基からなる塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、
（Ｅ）請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ｄ）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な位置にある塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項６】
上記（Ｄ）に記載のプライマーが、下記（ｄ１）又は（ｄ２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項５に記載の遺伝子型判定用キット；
（ｄ１）上記（Ａ）に記載の変異が挿入変異である場合において、当該変異を構成する塩基配列又はその相補配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｄ２）上記（Ａ）に記載の変異をその配列内に含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項７】
さらに、下記（Ｆ）及び（Ｇ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなる、請求項５又は６に記載の遺伝子型判定用キット；
（Ｆ）請求項１〜３のいずれかにおける上記（ａ１）に記載のグルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異の不存在を検出可能な位置に設計された少なくとも１２塩基からなる塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、
（Ｇ）請求項１〜３のいずれかにおける上記（ａ１）に記載のグルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ｆ）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な位置にある塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項８】
下記（Ｈ）又は（Ｉ）に記載のオリゴヌクレオチドプローブを含んでなることを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用キット；
（Ｈ）請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異が挿入変異である場合における当該変異を構成する塩基配列又はその相補配列、を含むオリゴヌクレオチドプローブ、
（Ｉ）請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異をその配列内に含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項９】
下記（Ｊ）、（Ｋ）、及び（Ｌ）に記載の特徴を有する、請求項５〜８のいずれかに記載の遺伝子型判定用キット；
（Ｊ）上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子である特徴、
（Ｋ）上記グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号２に記載の塩基配列からなるグルコラファサチン合成酵素遺伝子である特徴、
（Ｌ）上記染色体上の領域が、配列番号１における第１番目から第２９７１番目までの塩基からなる塩基配列で構成される領域、及び、配列番号１における第４７５９番目から第７４２４番目までの塩基からなる塩基配列で構成される領域、である特徴。
【請求項１０】
請求項５又は６における上記（Ｄ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座にホモ型で有し、肥大根部の乾燥重量に対するグルコラファサチン含量が３μｍоｌ／ｇ以下であることを特徴とするダイコン系統。
【請求項１２】
下記（Ｍ）〜（Ｏ）のいずれかに記載のダイコンを自殖操作し又は所望のダイコンと交配し、その後代集団から選抜して得られた、請求項１１に記載のダイコン系統；
（Ｍ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に、請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が導入されたダイコン、
（Ｎ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子に機能欠損型変異が導入されたダイコンであって、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコン、
（Ｏ）上記（Ｍ）又は（Ｎ）に記載のダイコンの後代集団から得られたダイコンであって、請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子をゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に有するダイコン。
【請求項１３】
上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子である、請求項１１又は１２に記載のダイコン系統。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のダイコン系統の植物体から得られた、根、胚軸部、肥大根部、葉、葉柄、茎、花蕾、花、種子、スプラウト、ベビーリーフ、又は苗。
【請求項１５】
下記（Ｐ）に記載の工程を含むことを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン欠失系統の作出方法；
（Ｐ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコンを、自殖操作又は所望のダイコンと交配する工程。
【請求項１６】
前記（Ｐ）に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコンが、下記（Ｑ）〜（Ｓ）に記載のいずれかのダイコンである、請求項１５に記載の作出方法；
（Ｑ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に、請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が導入されたダイコン、
（Ｒ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子に機能欠損型変異が導入されたダイコンであって、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコン、
（Ｓ）上記（Ｑ）又は（Ｒ）に記載のダイコンの後代集団から得られたダイコンであって、請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子をゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に有するダイコン。
【請求項１７】
請求項４に記載の遺伝子型判定方法を使用して行うものである、請求項１５又は１６に記載の作出方法。
【請求項１８】
さらに下記（Ｔ）に記載の工程を含むことを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれかに記載の作出方法；
（Ｔ）上記（Ｐ）に記載の工程により得られた後代集団から、請求項４に記載の遺伝子型判定方法を使用して、グルコラファサチン欠失性を示すダイコン個体を選抜する工程。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法により作出されたダイコン系統を用いることを特徴とする、ダイコン植物体を生産する方法。
【請求項２０】
前記ダイコン植物体が、根、胚軸部、肥大根部、葉、葉柄、茎、花蕾、花、種子、スプラウト、ベビーリーフ、又は苗である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の方法により得られたダイコン植物体を用いることを特徴とする、大根加工飲食品又は大根を利用した製品の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明は、上記知見に基づいて想到されたものであり、具体的には以下の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子及びその利用に係る発明に関する。
［１］
下記（Ａ）及び（Ｂ）に記載の特徴を有する、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子；
（Ａ）下記（ａ１）に記載の遺伝子を構成するエクソン内に、コード蛋白質における２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う変異を有する特徴、
（ａ１）配列番号５に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列、からなる蛋白質をコードする遺伝子であって、グルコエルシンからグルコラファサチンへの合成反応に関与する蛋白質をコードする遺伝子、
（Ｂ）ダイコンゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座が当該機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子のホモ型となった場合に、肥大根部のグルコラファサチン含量が３μｍоｌ／ｇ以下となる特徴。
［２］
さらに下記（Ｃ）に記載の特徴を有する、前記［１］に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子；
（Ｃ）上記（Ａ）に記載の変異が、少なくとも１ｋｂｐの塩基配列の挿入を伴う変異である。
［３］
上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む遺伝子である、前記［１］又は［２］に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子。
［４］
前記［１］〜［３］のいずれかにおける上記（Ａ）に記載の変異の存在の有無を検出することを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定方法。
［５］
下記（Ｄ）及び（Ｅ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなることを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用キット；
（Ｄ）前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異の存在を検出可能な位置に設計された少なくとも１２塩基からなる塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、
（Ｅ）前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ｄ）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な位置にある塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
［６］
上記（Ｄ）に記載のプライマーが、下記（ｄ１）又は（ｄ２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーである、前記［５］に記載の遺伝子型判定用キット；
（ｄ１）上記（Ａ）に記載の変異が挿入変異である場合において、当該変異を構成する塩基配列又はその相補配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｄ２）上記（Ａ）に記載の変異をその配列内に含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
［７］
さらに、下記（Ｆ）及び（Ｇ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなる、前記［５］又は［６］に記載の遺伝子型判定用キット；
（Ｆ）前記［１］〜［３］のいずれかにおける上記（ａ１）に記載のグルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異の不存在を検出可能な位置に設計された少なくとも１２塩基からなる塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、
（Ｇ）前記［１］〜［３］のいずれかにおける上記（ａ１）に記載のグルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ｆ）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な位置にある塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
［８］
下記（Ｈ）又は（Ｉ）に記載のオリゴヌクレオチドプローブを含んでなることを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用キット；
（Ｈ）前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異が挿入変異である場合における当該変異を構成する塩基配列又はその相補配列、を含むオリゴヌクレオチドプローブ、
（Ｉ）前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異をその配列内に含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプローブ。
［９］
下記（Ｊ）、（Ｋ）、及び（Ｌ）に記載の特徴を有する、前記［５］〜［８］のいずれかに記載の遺伝子型判定用キット；
（Ｊ）上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子である特徴、
（Ｋ）上記グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号２に記載の塩基配列からなるグルコラファサチン合成酵素遺伝子である特徴、
（Ｌ）上記染色体上の領域が、配列番号１における第１番目から第２９７１番目までの塩基からなる塩基配列で構成される領域、及び、配列番号１における第４７５９番目から第７４２４番目までの塩基からなる塩基配列で構成される領域、である特徴。
［１０］
前記［５］又は［６］における上記（Ｄ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用のオリゴヌクレオチドプライマー。
［１１］
前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座にホモ型で有し、肥大根部の乾燥重量に対するグルコラファサチン含量が３μｍоｌ／ｇ以下であることを特徴とするダイコン系統。
［１２］
下記（Ｍ）〜（Ｏ）のいずれかに記載のダイコンを自殖操作し又は所望のダイコンと交配し、その後代集団から選抜して得られた、前記［１１］に記載のダイコン系統；
（Ｍ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が導入されたダイコン、
（Ｎ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子に機能欠損型変異が導入されたダイコンであって、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコン、
（Ｏ）上記（Ｍ）又は（Ｎ）に記載のダイコンの後代集団から得られたダイコンであって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子をゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に有するダイコン。
［１３］
上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子である、前記［１１］又は［１２］に記載のダイコン系統。
［１４］
前記［１１］〜［１３］のいずれかに記載のダイコン系統の植物体から得られた、根、胚軸部、肥大根部、葉、葉柄、茎、花蕾、花、種子、スプラウト、ベビーリーフ、又は苗。
［１５］
下記（Ｐ）に記載の工程を含むことを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン欠失系統の作出方法；
（Ｐ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコンを、自殖操作又は所望のダイコンと交配する工程。
［１６］
前記（Ｐ）に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコンが、下記（Ｑ）〜（Ｓ）に記載のいずれかのダイコンである、前記［１５］に記載の作出方法；
（Ｑ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が導入されたダイコン、
（Ｒ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子に機能欠損型変異が導入されたダイコンであって、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコン、
（Ｓ）上記（Ｑ）又は（Ｒ）に記載のダイコンの後代集団から得られたダイコンであって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子をゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に有するダイコン。
［１７］
前記［４］に記載の遺伝子型判定方法を使用して行うものである、前記［１５］又は［１６］に記載の作出方法。
［１８］
さらに下記（Ｔ）に記載の工程を含むことを特徴とする、前記［１５］〜［１７］のいずれかに記載の作出方法；
（Ｔ）上記（Ｐ）に記載の工程により得られた後代集団から、前記［４］に記載の遺伝子型判定方法を使用して、グルコラファサチン欠失性を示すダイコン個体を選抜する工程。
［１９］
前記［１５］〜［１８］のいずれかに記載の方法により作出されたダイコン系統を用いることを特徴とする、ダイコン植物体を生産する方法。
［２０］
前記ダイコン植物体が、根、胚軸部、肥大根部、葉、葉柄、茎、花蕾、花、種子、スプラウト、ベビーリーフ、又は苗である、前記［１９］に記載の方法。
［２１］
前記［１９］又は［２０］に記載の方法により得られたダイコン植物体を用いることを特徴とする、大根加工飲食品又は大根を利用した製品の製造方法。