(57)【要約】  本明細書には、ＣＤ３に結合するドメイン、半減期延長ドメイン、及びＭＳＬＮに結合するドメインを含むメソテリン（ＭＳＬＮ）標的三重特異性タンパク質が提供される。また、そのようなＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の医薬組成物、同様に、前記ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質を作成するための核酸、組み換え発現ベクター、及び宿主細胞も提供される。また、疾患、疾病、及び障害の予防及び／又は処置において、開示されたＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質を使用する方法も開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メソテリン（ＭＳＬＮ）結合三重特異性タンパク質であって、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；
（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；及び
（ｃ）ＭＳＬＮに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、
ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順で、又はリンカーＬ１及びＬ２によって結合される、メソテリン（ＭＳＬＮ）結合三重特異性タンパク質。
【請求項２】
前記第１のドメインは可変軽ドメイン及び可変重ドメインを含み、その各々がヒトＣＤ３に特異的に結合することができる、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３】
前記第１のドメインはヒト化される、又はヒトである、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項４】
前記第２のドメインはアルブミンに結合する、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項５】
前記第２のドメインは、ｓｃＦｖ、可変重ドメイン（ＶＨ）、可変軽ドメイン（ＶＬ）、ペプチド、リガンド、又は小分子を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項６】
前記第３のドメインは、ＭＳＬＮに特異的に結合するＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、又は小分子実体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項７】
前記第３のドメインはＶＨＨドメインを含む、ことを特徴とする請求項６に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項８】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４２、４３、又は４４と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４２、４３、又は４４に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、１つ以上の保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項７に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項９】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項１０】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項１１】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている、ことを特徴とする請求項８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項１２】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている、ことを特徴とする請求項８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項１３】
前記ＶＨＨドメインは、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に相当するアミノ酸の伸張部、及び（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に相当するアミノ酸の伸張部を含む、ことを特徴とする請求項７に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項１４】
前記ＶＨＨドメインは以下の式を含み：
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
式中、ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である
ことを特徴とする請求項７に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項１５】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−２９から成る群から選択された配列に少なくとも８０％同一の配列を含む、ことを特徴とする請求項７に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項１６】
前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−２９から成る群から選択された配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項１７】
前記第３のドメインはヒト化ＶＨＨドメインである、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項１８】
前記ヒト化ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、４６、４７、４８、４９、又は５０と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、４６、４７、４８、４９、又は５０に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、１つ以上の保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１７に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項１９】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項２０】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項２１】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている、ことを特徴とする請求項１８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項２２】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている、ことを特徴とする請求項１８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項２３】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている、ことを特徴とする請求項１８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項２４】
前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている、ことを特徴とする請求項１８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項２５】
前記ＶＨＨドメインは、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に相当するアミノ酸の伸張部、（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に相当するアミノ酸の伸張部、及び（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に相当するアミノ酸の伸張部を含む、ことを特徴とする請求項１８に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項２６】
前記ヒト化ＶＨＨドメインは以下の式を含み：
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
式中、ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である
ことを特徴とする請求項１７に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項２７】
前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０−４０及び１０２−１０５から成る群から選択された配列を含む、ことを特徴とする請求項１７乃至２６の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項２８】
前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７として明記される配列を含むヒトメソテリンタンパク質に結合する、ことを特徴とする請求項１乃至２７の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項２９】
前記第３のドメインはメソテリンのエピトープに結合し、前記エピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基２９６−３９０を含む領域Ｉ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基３９１−４８６を含む領域ＩＩ、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基４８７−５９８を含む領域ＩＩＩに位置する、ことを特徴とする請求項１乃至２８の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３０】
リンカーＬ１及びＬ２はそれぞれ独立して、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）、或いは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）から選択され、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３１】
リンカーＬ１とＬ２はそれぞれ独立して（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）又は（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）である、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３２】
前記ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順で結合される、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３３】
前記タンパク質は約８０ｋＤａ未満である、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３４】
前記タンパク質は約５０〜約７５ｋＤａである、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３５】
前記タンパク質は約６０ｋＤａ未満である、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３６】
前記タンパク質は少なくとも約５０時間の消失半減期を持つ、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３７】
前記タンパク質は少なくとも約１００時間の消失半減期を持つ、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３８】
前記タンパク質は、同じＭＳＬＮのＩｇＧと比較して増加した組織透過性を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項３９】
前記タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１から成る群から選択された配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項４０】
（ｉ）請求項１乃至３９の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質、及び（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項４１】
請求項１乃至３９の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質の産生のためのプロセスであって、メソテリン結合三重特異性タンパク質の発現を可能とする条件下で請求項１乃至３９の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターにより形質転換又はトランスフェクトされる宿主を培養する工程、及び、培養物から産生されたタンパク質を回収及び精製する工程を含む、プロセス。
【請求項４２】
増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法であって、必要とする被験体への請求項１乃至３９の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質の投与を含む、方法。
【請求項４３】
被験体はヒトである、ことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法は、請求項１乃至３９の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質と組み合わせた薬剤の投与を更に含む、ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する、ことを特徴とする請求項４２乃至４４の何れか１つに記載の方法。
【請求項４６】
前記メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を媒介する、ことを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記腫瘍疾患は固形腫瘍疾患である、ことを特徴とする請求項４２乃至４６の何れか１つに記載の方法。
【請求項４８】
前記固形腫瘍疾患は、中皮腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、又は三種陰性乳癌を含む、ことを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記固形腫瘍疾患は転移性である、ことを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１から成る群から選択された配列を含むメソテリン結合三重特異性タンパク質の投与を含む、増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法。
【請求項５１】
前記メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する、ことを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を導く、ことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記腫瘍疾患は固形腫瘍疾患である、ことを特徴とする請求項５０乃至５２の何れか１つに記載の方法。
【請求項５４】
前記固形腫瘍疾患は、中皮腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、又は三種陰性乳癌を含む、ことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記固形腫瘍疾患は転移性である、ことを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８に明記されるような配列を含むメソテリン結合三重特異性タンパク質の投与を含む、増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法。
【請求項５７】
最大１０ｍｇ／ｋｇの投与量でメソテリン結合三重特異性タンパク質を投与する工程を含む、ことを特徴とする請求項５０乃至５６の何れか１つに記載の方法。
【請求項５８】
前記タンパク質は週に１回投与される、ことを特徴とする請求項５０乃至５７の何れか１つに記載の方法。
【請求項５９】
前記タンパク質は週に２回投与される、ことを特徴とする請求項５０乃至５７の何れか１つに記載の方法。
【請求項６０】
前記タンパク質は隔週で投与される、ことを特徴とする請求項５０乃至５７の何れか１つに記載の方法。
【請求項６１】
前記タンパク質は三週ごとに投与される、ことを特徴とする請求項５０乃至５７の何れか１つに記載の方法。
【請求項６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８に明記されるような配列を含む、メソテリン（ＭＳＬＮ）結合三重特異性タンパク質。
【請求項６３】
メソテリン（ＭＳＬＮ）結合三重特異性タンパク質であって、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；
（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；及び
（ｃ）ＭＳＬＮに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、
ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順で、又はリンカーＬ１及びＬ２によって結合され、且つ、前記第３のドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１−５６及び１０６−２２２から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含む、メソテリン（ＭＳＬＮ）結合三重特異性タンパク質。
【請求項６４】
前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、５４、及び１０６−１４４の何れか１つに明記される配列を含むＣＤＲ１を備える、ことを特徴とする請求項６３に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項６５】
前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、５５、及び１４５−１８３の何れか１つに明記される配列を含むＣＤＲ２を備える、ことを特徴とする請求項６３又は６４に記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項６６】
前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、５６、及び１８４−２２２の何れか１つに明記される配列を含むＣＤＲ２を備える、ことを特徴とする請求項６３乃至６５の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項６７】
前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６２−３００の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域１（ｆ１）を含む、ことを特徴とする請求項６３乃至６６の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項６８】
前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１−３３９の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域（ｆ２）を含む、ことを特徴とする請求項６３乃至６７の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項６９】
前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４０−３７８の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域（ｆ３）を含む、ことを特徴とする請求項６３乃至６８の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項７０】
前記タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１から成る群から選択された配列を含む、ことを特徴とする請求項６３乃至６９の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項７１】
前記タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８に明記されるような配列を含む、ことを特徴とする請求項６３乃至７０の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質。
【請求項７２】
（ｉ）請求項６３乃至７１の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質、及び（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項７３】
請求項６３乃至７１の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質の産生のためのプロセスであって、メソテリン結合三重特異性タンパク質の発現を可能とする条件下で請求項６３乃至７１の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターにより形質転換又はトランスフェクトされる宿主を培養する工程、及び、培養物から産生されたタンパク質を回収及び精製する工程を含む、プロセス。
【請求項７４】
増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法であって、必要とする被験体への請求項６３乃至７１の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質の投与を含む、方法。
【請求項７５】
被験体はヒトである、ことを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記方法は、請求項６３乃至７１の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質と組み合わせた薬剤の投与を更に含む、ことを特徴とする請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する、ことを特徴とする請求項７４乃至７６の何れか１つに記載の方法。
【請求項７８】
前記メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を媒介する、ことを特徴とする請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記腫瘍疾患は固形腫瘍疾患である、ことを特徴とする請求項７４乃至７８の何れか１つに記載の方法。
【請求項８０】
前記固形腫瘍疾患は、中皮腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、又は三種陰性乳癌を含む、ことを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記固形腫瘍疾患は転移性である、ことを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法であって、請求項６３乃至７１の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質の投与を含む、方法。
【請求項８３】
前記メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する、ことを特徴とする請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を導く、ことを特徴とする請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記腫瘍疾患は固形腫瘍疾患である、ことを特徴とする請求項８２乃至８４の何れか１つに記載の方法。
【請求項８６】
前記固形腫瘍疾患は、中皮腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、又は三種陰性乳癌を含む、ことを特徴とする請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記固形腫瘍疾患は転移性である、ことを特徴とする請求項８６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、各々が全体において参照により本明細書に組み込まれている、２０１７年５月１２日出願の米国仮特許出願６２／５０５，７４７号及び２０１８年４月１３日出願の米国仮特許出願６２／６５７，４３４号の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１８年５月１１日に作成された上記のＡＳＣＩＩのコピーは、４７５１７−７２０＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、２９３，２５１バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
個々の細胞又は特定細胞型の選択的な破壊は多くの場合、様々な臨床設定において望まれる。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊しつつ、健康な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残すことが癌治療の主要な目的である。そのような１つの方法は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃および破壊させるために、腫瘍に対する免疫反応を引き起こすことによるものである。
【０００４】
メソテリン（ＭＳＬＮ）は、ＧＰＩ結合腫瘍抗原であり、ＭＳＬＮは、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、三種陰性乳癌、及び中皮腫で過剰発現される。ＭＳＬＮの正常組織発現は、胸膜、心膜、及び腹膜腔の内側にある、単細胞の中皮層に制限される。ＭＳＬＮの過剰発現は、肺腺癌及び三種陰性乳癌における予後不良に関連付けられる。ＭＳＬＮは、癌抗原として、抗毒素、ワクチン、抗体薬物複合体、及びＣＡＲＴ細胞を含む多数の様式に対して使用されている。臨床効果の初期の兆候は、標的としてＭＳＬＮを検証したが、効果が改善された治療がＭＳＬＮを発現する癌の処置に必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
一実施形態はメソテリン結合三重特異性タンパク質を提供し、該メソテリン結合三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；及び（ｃ）ＭＳＬＮに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ドメインはＨ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順で、又はリンカーＬ１及びＬ２によって結合される。幾つかの実施形態において、第１のドメインは、各々がヒトＣＤ３に特異的に結合することができる、可変軽鎖と可変重鎖のドメインを含む。幾つかの実施形態において、第１のドメインはヒト化されるか、又はヒトである。幾つかの実施形態において、第２のドメインはアルブミンに結合する。幾つかの実施形態において、第２のドメインはｓｃＦｖ、可変重ドメイン（ＶＨ）、可変軽ドメイン（ＶＬ）、ペプチド、リガンド、又は小分子を含む。幾つかの実施形態において、第３のドメインは、ＭＳＬＮに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、又は小分子実体を含む。幾つかの実施形態において、第３のドメインはＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４２、４３、又は４４と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４２、４３、又は４４に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、１つ以上の保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に相当するアミノ酸の伸張部、及び（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に相当するアミノ酸の伸張部を含む。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは以下の式を含み：
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
式中、ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−２９から成る群から選択された配列に少なくとも８０％同一の配列を含む。幾つかの実施形態において、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−２９から成る群から選択された配列を含む。幾つかの実施形態において、第３のドメインはヒト化ＶＨＨドメインである。幾つかの実施形態において、前記ヒト化ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、４６、４７、４８、４９、又は５０と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、４６、４７、４８、４９、又は５０に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、１つ以上の保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存ドメインを備えている。幾つかの実施形態において、前記ＶＨＨドメインは、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に相当するアミノ酸の伸張部、（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に相当するアミノ酸の伸張部、及び（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に相当するアミノ酸の伸張部を含む。幾つかの実施形態において、前記ヒト化ＶＨＨドメインは以下の式を含み：
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
式中、ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である。幾つかの実施形態において、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０−４０及び１０２−１０５からなる群から選択された配列を含む。幾つかの実施形態において、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７として明記される配列を含むヒトメソテリンタンパク質に結合する。幾つかの実施形態において、第３のドメインはメソテリンのエピトープに結合し、前記エピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基２９６−３９０を含む領域Ｉ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基３９１−４８６を含む領域ＩＩ、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基４８７−５９８を含む領域ＩＩＩに位置する。幾つかの実施形態において、リンカーＬ１及びＬ２はそれぞれ独立して、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）、或いは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）から選択され、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。幾つかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２はそれぞれ独立して、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）又は（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）である。幾つかの実施形態において、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順で結合される。幾つかの実施形態において、タンパク質は約８０ｋＤａ未満である。幾つかの実施形態において、タンパク質は約５０〜約７５ｋＤａである。幾つかの実施形態において、タンパク質は約６０ｋＤａ未満である。幾つかの実施形態において、タンパク質は少なくとも約５０時間の消失半減期を有する。幾つかの実施形態において、タンパク質は少なくとも約１００時間の消失半減期を有する。幾つかの実施形態において、タンパク質は、同じＭＳＬＮへのＩｇＧと比較して、組織への浸透性を増加させた。幾つかの実施形態において、タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１からなる群から選択された配列を含む。一実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８に明記されるような配列を含む、メソテリン結合三重特異性タンパク質を提供する。一実施形態はメソテリン結合三重特異性タンパク質を提供し、前記タンパク質は：（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；及び（ｃ）ＭＳＬＮに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順で、又はリンカーＬ１及びＬ２によって結合され、且つ、前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１−５６及び１０６−２２２から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含む、第３のドメイン（Ｃ）を含む。幾つかの実施形態において、前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、５４、及び６３−１０１の何れか１つに明記されるような配列を含むＣＤＲ１を備える。幾つかの実施形態において、前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、５５、及び１４５−１８３の何れか１つに明記されるような配列を含むＣＤＲ２を備える。幾つかの実施形態において、前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、５６、及び１８４−２２２の何れか１つに明記されるような配列を含むＣＤＲ２を備える。幾つかの実施形態において、前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６２−３００の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域１（ｆ１）を含む。幾つかの実施形態において、前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１−３３９の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域（ｆ２）を含む。幾つかの実施形態において、前記第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４０−３７８の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域（ｆ３）を含む。幾つかの実施形態において、タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１から成る群から選択された配列を含む。幾つかの実施形態において、タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８に明記されるような配列を含む。
【０００６】
一実施形態は、（ｉ）上記実施形態の何れか１つに記載のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質、及び（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。
【０００７】
一実施形態は、上記実施形態の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質の産生のためのプロセスを提供し、該プロセスは、メソテリン結合三重特異性タンパク質の発現を可能とする条件下で上記実施形態の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターにより形質転換又はトランスフェクトされる宿主を培養する工程、及び、培養物から産生されたタンパク質を回収及び精製する工程を含む。
【０００８】
一実施形態は、増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法を提供し、該方法は、必要とする被験体への上記実施形態の何れか１つに記載のメソテリン結合三重特異性タンパク質の投与を含む。幾つかの実施形態において、被験体はヒトである。幾つかの実施形態において、前記方法は更に、上記実施形態の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質と組み合わせた薬剤の投与を含む。幾つかの実施形態において、メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する。幾つかの実施形態において、メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を媒介する。幾つかの実施形態において、腫瘍疾患は固形腫瘍疾患を含む。幾つかの実施形態において、前記固形腫瘍疾患は、中皮腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、又は三種陰性乳癌を含む。幾つかの実施形態において、固形腫瘍疾患は転移性である。
【０００９】
一実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１から成る群から選択された配列を含むメソテリン結合三重特異性タンパク質の投与を含む、増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法を提供する。幾つかの実施形態において、メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する。幾つかの実施形態において、メソテリン結合三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を導く。幾つかの実施形態において、腫瘍疾患は固形腫瘍疾患を含む。幾つかの実施形態において、前記固形腫瘍疾患は、中皮腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、又は三種陰性乳癌を含む。幾つかの実施形態において、固形腫瘍疾患は転移性である。
【００１０】
一実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８に明記されるような配列を含むメソテリン結合三重特異性タンパク質の投与を含む、増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法を提供する。幾つかの実施形態において、前記方法は、最大１０ｍｇ／ｋｇの投与量でメソテリン結合三重特異性タンパク質を投与する工程を含む。幾つかの実施形態では、タンパク質は週に１回投与される。幾つかの実施形態において、タンパク質は週に２回投与される。幾つかの実施形態において、タンパク質は隔週で投与される。幾つかの実施形態において、タンパク質は３週ごとに投与される。
【００１１】
引用による組み込み
本明細書で言及される出願公開、特許、及び特許出願は全て、あたかも個々の出願公開、特許、或いは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的且つ個々に指示されるように同じ程度にまで、参照により本明細書に組込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図１】典型的なＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の略図であり、該タンパク質は抗ＣＤ３ε単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と抗ＡＬＢ可変重鎖領域を含む不変のコア要素と、ＶＨ、ｓｃＦｖ、非Ｉｇ結合剤、又はリガンドであり得る抗ＭＳＬＮ結合ドメインとを有する。
【図２】標的タンパク質ＭＳＬＮを発現するＯＶＣＡＲ８細胞の死滅における典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（２Ａ２及び２Ａ４）の有効性を例示する。
【図３】本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）が、５つのドナー（ドナー０２；ドナー８６；ドナー４１；ドナー８１；及びドナー３５）由来のＴ細胞にＣａｏｖ３細胞を死滅させるよう導くことができたことを示す。この図はまた、対照ＴｒｉＴＡＣ分子（ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ）が、５つのドナー（ドナー０２；ドナー８６；ドナー４１；ドナー８１；及びドナー３５）由来のＴ細胞にＣａｏｖ３細胞を死滅させるよう導くことができなかったことを示す。
【図４】本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）が、５つのドナー（ドナー０２；ドナー８６；ドナー４１；ドナー８１；及びドナー３５）由来のＴ細胞にＯＶＣＡＲ３細胞を死滅させるよう導くことができたことを示す。この図はまた、対照ＴｒｉＴＡＣ分子（ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ）が、５つのドナー（ドナー０２；ドナー８６；ドナー４１；ドナー８１；及びドナー３５）由来のＴ細胞にＯＶＣＡＲ３細胞を死滅させるよう導くことができなかったことを示す。
【図５】本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）が、健康なドナー由来のＴ細胞にＭＳＬＮを発現する細胞（ＯＶＣＡＲ３細胞；Ｃａｏｖ４細胞；ＯＶＣＡＲ３細胞；及びＯＶＣＡＲ８細胞）を死滅させるよう導くことができたことを示す。この図はまた、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣが、健康なドナー由来のＴ細胞にＭＳＬＮを発現しない細胞（ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞；及びＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞）を死滅させるよう導くことができなかったことを示す。
【図６】本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）が、カニクイザル由来のＴ細胞にヒト卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ３細胞；Ｃａｏｖ３細胞）を死滅させるよう導くことができたことを示す。この図はまた、対照ＴｒｉＴＡＣ分子（ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ）が、カニクイザル由来のＴ細胞にヒト卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ３細胞；Ｃａｏｖ３細胞）を死滅させるよう導くことができなかったことを示す。
【図７】本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下又は不在下で、Ｔ細胞によりＮＣＩ−Ｈ２０５２中皮腫細胞を発現するＭＳＬＮの死滅を導くことができたことを示す。
【図８】本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）が、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ及びＭＳＬＮ発現Ｃａｏｖ４細胞の存在下で、Ｔ細胞由来のＴＮＦ−αの分泌によって実証されるように、４つの健康なドナー（ドナー２；ドナー８６；ドナー３５；及びドナー８１）由来のＴ細胞を活性化することができたことを示す。
【図９】本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）が、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ及びＭＳＬＮ発現ＯＶＣＡＲ８細胞の存在下で、Ｔ細胞上でのＣＤ６９発現の活性化によって実証されるように、４つの健康なドナー（ドナー２；ドナー８６；ドナー３５；及びドナー８１）由来のＴ細胞を活性化することができたことを示す。
【図１０Ａ】ＭＳＬＮ発現細胞株又は非ＭＳＬＮ発現細胞株への本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）の結合を例示する。図１０Ａは、ＭＳＬＮ発現細胞（Ｃａｏｖ３細胞−左上パネル；Ｃａｏｖ４細胞−右上パネル；ＯＶＣＡＲ３細胞−左下パネル；ＯＶＣＡＲ８細胞−右下パネル）へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合を示し；更に、対照のＴｒｉＴＡＣ（ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ）の同じ細胞株への結合の欠如を示す。
【図１０Ｂ】ＭＳＬＮ発現細胞株又は非ＭＳＬＮ発現細胞株への本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）の結合を例示する。図１０Ｂは、非ＭＳＬＮ発現細胞株（ＭＤＣＡ２ｂ細胞−左パネル；ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞−右パネル）へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ及びＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ両方の結合の欠如を示す。
【図１１】４つの健康なドナー（ドナー２−左上パネル；ドナー３５−右上パネル；ドナー４１−左下パネル；ドナー８１−右下パネル）由来のＴ細胞への、本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）の結合を例示する。
【図１２】本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子（ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ）が、ＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を移植したＮＣＧマウスにおける腫瘍成長を阻害することができたことを示す。
【図１３】本開示の典型的なＴｒｉＴＡＣ分子、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの薬物動態プロファイルを例示する。ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子の血中濃度は、２匹のカニクイザルへの注射後の様々な時点で、プロットにおいて示される。
【図１４】本開示の２つの典型的な三重特異性分子であるＴｒｉＴＡＣ７４及びＴｒｉＴＡＣ７５の結合親和性測定からの結果、並びに、２つのＴｒｉＴＡＣ分子によるＳＫＯＶ３及びＯＶＣＡＲの細胞の死滅に対するＥＣ５０値を示す。
【図１５】本開示の２つの典型的なＴｒｉＴＡＣ分子であるＴｒｉＴＡＣ７５及びＴｒｉＴＡＣ７４の薬物動態プロファイルを例示する。ＴｒｉＴＡＣ分子の血中濃度は、匹のカニクイザルへの注射後の様々な時点で、プロットにおいて示される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
メソテリン（ＭＳＬＮ）を標的とする三重特異性タンパク質、その医薬組成物の他、前記タンパク質の製造のための核酸、組み換え体発現ベクター、及び宿主細胞が本明細書に記載される。また、疾患、疾病、及び障害の予防及び／又は処置において、開示されたＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質を使用する方法も提供される。ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ＣＤ３と同様にＭＳＬＮに特異的に結合可能であり、ヒトアルブミン（ＡＬＢ）に結合するドメインなどの半減期拡張ドメインを持つ。図１は、三重特異性ＭＳＬＮ結合タンパク質の１つの非限定的な例を描く。
【００１４】
１つの態様において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメイン（Ａ）、ヒトアルブミン（ＡＬＢ）に特異的に結合するドメイン（Ｂ）、及びＭＳＬＮに特異的に結合するドメイン（Ｃ）を含む。ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質中の３つのドメインは任意の順序で配置される。故に、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のドメイン順序は以下のとおり企図される：
Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、又は
Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ。
【００１５】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は中間ドメインとしてＨＳＡ結合ドメインを有し、それによりドメイン順序は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ又はＨ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨである。ＡＬＢ結合ドメインが中間ドメインであるそのような実施形態において、ＣＤ３及びＭＳＬＮ結合ドメインは、それぞれの標的に結合するための追加の柔軟性を与えられることが、企図される。
【００１７】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、表１に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１）及びそのサブ配列を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表１に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１）に対して少なくとも７０％−９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表１に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含む。
【００１８】
本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員することによりＭＳＬＮを発現する細胞の特異的な標的化を可能にするように設計される。これは、単独の抗原に向けられた完全長の抗体を使用し且つ細胞傷害性Ｔ細胞を直接動員することができないＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）と比較して、有効性を改善する。対照的に、これら細胞上で特異的に発現されたＣＤ３分子を結合することにより、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、非常に特異的な様式で細胞傷害性Ｔ細胞を、ＭＳＬＮを発現する細胞と架橋することができ、それによって、Ｔ細胞の細胞毒性の可能性を標的細胞へ向けることができる。本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ＴＣＲの一部を形成する、表面発現されたＣＤ３タンパク質に結合することによって細胞傷害性Ｔ細胞と結合する。特定の細胞の表面上で発現されたＣＤ３及びＭＳＬＮへの様々なＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質の同時結合は、Ｔ細胞活性化を引き起こし、特定のＭＳＬＮ発現細胞の後の溶解を媒介する。故に、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は強力で、特異的で、且つ効率的な標的細胞死滅を表示するように企図される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、病原性細胞（例えばＭＳＬＮを発現する腫瘍細胞）を排除するために細胞傷害性Ｔ細胞により死滅する標的細胞を刺激する。そのような実施形態の幾つかにおいて、細胞は選択的に排除され、それにより毒性の副作用の可能性が減少する。
【００１９】
本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、従来のモノクローナル抗体及び他の小さな二重特異性の分子を上回る、更なる治療上の利点を与える。一般に、組み換えタンパク質医薬品の有効性は、タンパク質自体の内因性の薬物動態学に極度に依存する。こうした利点の一つは、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質が、ＨＳＡに特異的なドメインなどの半減期拡張ドメインを持っていることにより、薬物動態学的消失半減期を延長させたことである。この点で、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、幾つかの実施形態において、約２、３、約５、約７、約１０、又は約１４日の延長された血清消失半減期を有する。このことは、消失半減期が比較的非常に短いＢｉＴＥ又はＤＡＲＴの分子などの他の結合タンパク質とは対照的である。例えば、ＢｉＴＥ  ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合分子は、消失半減期が短いため持続点滴（静脈内）による薬物送達を必要とする。ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のより長い内因性の半減期は、この問題を解決し、それにより低用量の医薬製剤、定期的な投与の減少、及び／又は新規な医薬組成物などの治療可能性を増加させる。
【００２０】
本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質はまた、組織への浸透と組織への分布を強化するための最適なサイズを有する。サイズが大きければ、標的組織中でのタンパク質の浸透又は分布が制限されるか或いは妨げられる。本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、組織への浸透と分布を増強する小さなサイズを有することによりこれを回避する。従って、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、幾つかの実施形態において、約５０ｋＤ−約８０ｋＤ、約５０ｋＤ−約７５ｋＤ、約５０ｋＤ−約７０ｋＤ、又は約５０ｋＤ−約６５ｋＤのサイズを有する。故に、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のサイズは、約１５０ｋＤであるＩｇＧ抗体よりも、及び、約５５ｋＤであるが半減期が延長されておらず、且つ故に腎臓で即座に排除されるＢｉＴＥ及びＤＡＲＴ二重特異性抗体分子よりも、都合が良い。
【００２１】
更なる実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、増強された組織への浸透と分布に最適なサイズを有する。これら実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は可能な限り小さくなるように構築され、その一方で、その標的に対する特異性を保持する。従って、これら実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、約２０ｋＤ−約４０ｋＤ、約２５ｋＤ−約３５ｋＤ、約４０ｋＤまで、約４５ｋＤまで、約５０ｋＤまで、約５５ｋＤまで、約６０ｋＤまで、約６５ｋＤまでのサイズを有する。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、約５０ｋＤ、４９ｋＤ、４８ｋＤ、４７ｋＤ、４６ｋＤ、４５ｋＤ、４４ｋＤ、４３ｋＤ、４２ｋＤ、４１ｋＤ、４０ｋＤ、約３９ｋＤ、約３８ｋＤ、約３７ｋＤ、約３６ｋＤ、約３５ｋＤ、約３４ｋＤ、約３３ｋＤ、約３２ｋＤ、約３１ｋＤ、約３０ｋＤ、約２９ｋＤ、約２８ｋＤ、約２７ｋＤ、約２６ｋＤ、約２５ｋＤ、約２４ｋＤ、約２３ｋＤ、約２２ｋＤ、約２１ｋＤ、又は約２０ｋＤのサイズを有する。小さなサイズに対する典型的な手法は、ドメインの各々について単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントを使用することによる。例えば、特定のＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質は、ＭＳＬＮに対して抗ＣＤ３  ｓｄＡｂ、抗ＡＬＢ  ｓｄＡｂ、及びｓｄＡｂを有する。これは、典型的なＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のサイズを６０ｋＤ未満に減少させる。故に、幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のドメインは全て単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントである。他の実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ＡＬＢ及び／又はＭＳＬＮのための小分子実体（ＳＭＥ）結合剤を含む。ＳＭＥ結合剤は、平均して約５００〜２０００Ｄａのサイズの小分子であり、ソルターゼ連結反応或いは抱合などの既知の方法によってＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質に結合される。これらの例において、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のドメインの１つは、ソルターゼ認識配列、例えば、ＬＰＥＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）である。ソルターゼ認識配列を備えたＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質にＳＭＥ結合剤を結合させるために、タンパク質はソルターゼとＳＭＥ結合剤でインキュベートされ、それによってソルターゼがＳＭＥ結合剤を認識配列に結合させる。既知のＳＭＥ結合剤は、メソテリンに結合するＭＩＰ−１０７２及びＭＩＰ−１０９５を含む。また他の実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のＭＳＬＮに結合するドメインは、ＭＳＬＮに結合するためのノッチンペプチドを含む。ノッチンは、システインノットスキャフォールドを備えたジスルフィド安定化ペプチドであり、約３．５ｋＤの平均サイズを有する。ノッチンは、ＭＳＬＮなどの特定の腫瘍分子への結合について企図されてきた。更なる実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のＭＳＬＮに結合するドメインは、天然ＭＳＬＮリガンドを含む。
【００２２】
本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の別の特徴は、それらがドメインの柔軟な結合を備えた単一のポリペプチドの設計であるということである。これにより、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の容易な産生と製造が可能になる。なぜなら、これらはベクターに容易に組み入れられる単一のｃＤＮＡ分子によってコード可能であるためである。更に、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質が単量体の単一のポリペプチド鎖であるので、鎖の対形成の問題がなく、二量体化のための要件もない。本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、Ｆｃ−γ免疫グロブリンドメインを備えた二重特異性タンパク質などの他の報告されている分子とは異なり、凝集する傾向が低下している。
【００２３】
本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質において、ドメインは内部リンカーＬ１とＬ２によって結合され、ここで、Ｌ１は、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の第１と第２のドメインに結合し、Ｌ２はＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の第２と第３のドメインに結合する。リンカーＬ１とＬ２は最適化された長さ及び／又はアミノ酸組成を有する。幾つかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は同じ長さとアミノ酸組成を有する。他の実施形態において、Ｌ１とＬ２は異なる。特定の実施形態において、内部リンカーＬ１及び／又はＬ２は「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、或いは１２のアミノ酸残基からなる。故に、特定の例において、内部リンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、内部リンカーはペプチド結合である。特定の実施形態において、内部リンカーＬ１及び／又はＬ２は「長い」、つまり、１５、２０、或いは２５のアミノ酸残基からなる。幾つかの実施形態において、これら内部リンカーは約３〜約１５まで、例えば、８、９、或いは１０の連続したアミノ酸残基からなる。内部リンカーＬ１とＬ２のアミノ酸組成に関して、ペプチドは、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質に対して柔軟性を与え、結合ドメインに干渉せず、同様にプロテアーゼからの切断に抵抗しない特性と共に選択される。例えば、グリシンとセリンの残基は一般にプロテアーゼ抵抗性を与える。ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質中のドメインの結合に適切な内部リンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）、（ＧＧＧＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）、又は（ＧＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）が挙げられ、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。１つの実施形態において、内部リンカーＬ１及び／又はＬ２は、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）、或いは（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）である。
【００２４】
ＣＤ３結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、ＴＣＲによって抗原（主要組織適合複合体、ＭＨＣに関して表示された）の認識によって媒介される。ＴＣＲの一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在する、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体である。完全なＴＣＲを含むために、ＣＤ３は、ＣＤ３ζ（ゼータ）と同様に、ＴＣＲのα（アルファ）とβ（ベータ）鎖と一緒に結合する。固定された抗ＣＤ３抗体などによるＴ細胞上でのＣＤ３のクラスター形成は、Ｔ細胞受容体の結合と同様であるがそのクローンに典型的な特異性とは無関係の、Ｔ細胞活性化を引き起こす。
【００２５】
１つの態様において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。１つの態様において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ヒトＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ＣＤ３γに特異的に結合するドメインを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ＣＤ３δに特異的に結合するドメインを含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ＣＤ３εに特異的に結合するドメインを含む。
【００２６】
更なる実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ＴＣＲに特異的に結合するドメインを含む。特定の例において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ＴＣＲのα鎖に特異的に結合するドメインを含む。ある例では、本明細書に記載される三重特異性の抗原結合タンパク質は、ＴＣＲのβ鎖を特異的に結合するドメインを含む。
【００２７】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との有力なＣＤ３結合親和性を呈するだけではなく、それぞれのカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。幾つかの例において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ３と交差反応性である。特定の例において、ＣＤ３に関するヒト：カニクイザルのＫＤ比率は５−０．２の間である。
【００２８】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含むＣＤ３に結合するあらゆるドメインであり得る。幾つかの例において、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することがＣＤ３結合ドメインにとっては有益である。例えば、ヒトに使用するために、抗体又は抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒト又はヒト化残基を含めることが、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインには有益なことがある。
【００２９】
故に、１つの態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体又はヒト抗体或いは抗体フラグメント、或いはマウス抗体又は抗体フラグメントを含む。１つの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化又はヒト−ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、及び／又は、本明細書に記載されるヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含み、例えばヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、１つ以上、例えば３つ全てのＬＣ  ＣＤＲと１つ以上、例えば３つ全てのＨＣ  ＣＤＲを含む。
【００３０】
幾つかの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化又はヒト軽鎖可変領域を含み、ここでＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域中のヒト又は非ヒト軽鎖ＣＤＲを含む。特定の例において、軽鎖フレームワーク領域はλ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例において、軽鎖フレームワーク領域はκ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
【００３１】
幾つかの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化又はヒト重鎖可変領域を含み、ここでＣＤ３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域中のヒト又は非ヒト重鎖ＣＤＲを含む。
【００３２】
特定の例において、重鎖及び／又は軽鎖の相補性決定領域は、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、ＴＲ−６６、又はＸ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１、及びＷＴ−３１などの既知の抗ＣＤ３抗体に由来する。
【００３３】
１つの実施形態において、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖と重鎖を含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。本明細書で使用されるように、「単鎖可変フラグメント」又は「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖の可変領域を含む抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントとを指し、軽鎖と重鎖の可変領域は、短い柔軟なポリペプチドリンカーによって連続的に結合され、単一のポリペプチド鎖として発現可能であり、及びｓｃＦｖはそれが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。一実施形態において、抗ＣＤ３結合ドメインは以下を含む：本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、又は３つの修飾（例えば置換）を含むが、多くとも３０、２０、又は１０の修飾（例えば置換）しか含まないアミノ酸配列、或いは本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５−９９％の同一性を有する配列を含む、軽鎖可変領域；及び／又は、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、又は３つの修飾（例えば置換）を含むが、多くとも３０、２０、又は１０の修飾（例えば置換）しか含まないアミノ酸配列、或いは本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５−９９％の同一性を有する配列を含む、重鎖可変領域。１つの実施形態において、ヒト化又はヒト抗ＣＤ３結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーによって本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合される。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、例えば、以下の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−重鎖可変領域、或いは重鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−軽鎖可変領域。
【００３４】
幾つかの例において、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖは既知の方法に従って調製される。例えば、ｓｃＦｖ分子は、柔軟なポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨとＶＬの領域を一緒に結合することにより、生成可能である。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さ及び／又はアミノ酸組成を備えるｓｃＦｖリンカー（例えばＳｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。従って、幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖリンカーの長さは、ＣＤ３結合部位を形成するために、ＶＨ又はＶＬのドメインが他の可変ドメインと分子間で会合することができるような長さである。特定の実施形態において、こうしたｓｃＦｖリンカーは「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２のアミノ酸残基からなる。故に、特定の例において、ｓｃＦｖリンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、ｓｃＦｖリンカーはペプチド結合である。幾つかの実施形態において、これらｓｃＦｖリンカーは、約３から約１５、例えば８、９、又は１０の連続的なアミノ酸残基からなる。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸組成に関して、柔軟性を与え、可変ドメインに干渉せず、同様に、機能的なＣＤ３結合部位を形成するために２つの可変ドメインを接合するための鎖間フォールディングを可能にするペプチドが選択される。例えば、グリシンとセリンの残基を含むｓｃＦｖリンカーは一般的にプロテアーゼ耐性を与える。幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖ中のリンカーはグリシンとセリンの残基を含む。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸配列は、例えば、ＣＤ３結合とｓｃＦｖの産生収率を改善するためのファージディスプレイ方法によって最適化可能である。ｓｃＦｖ中の可変軽ドメイン及び可変重ドメインの結合に適切なペプチドｓｃＦｖリンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）、（ＧＧＧＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）、又は（ＧＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）が挙げられ、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。１つの実施形態において、ｓｃＦｖリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）、又は（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）であり得る。リンカー長さの変動は活性を保持又は増強し、活性研究で優れた有効性をもたらすこともある。
【００３５】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＫＤを持つＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する親和性を有する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＫＤを持つ、ＣＤ３ε、γ、或いはδに対する親和性を有する。更なる実施形態において、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に対する低い親和性、つまり、約１００ｎＭ以上を有する。
【００３６】
ＣＤ３に結合する親和性は、例えば、アッセイプレート上にコーティングされた；微生物細胞表面に表示された；溶液中などの、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質自体の、又はＣＤ３結合に結合するそのＣＤ３結合ドメインの能力によって、決定することができる。ＣＤ３に対する本開示のＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質自体又はそのＣＤ３結合ドメインの結合活性は、ビーズ、基質、細胞などに対して、リガンド（例えば、ＣＤ３）又はＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質自体或いはそのＣＤ３結合ドメインを固定することにより分析可能である。薬剤は、所定の温度で一定の期間インキュベートされた適切なバッファーと結合パートナーに加えることができる。未結合材料を取り除くために洗浄した後、結合タンパク質は、例えば、ＳＤＳ、高いｐＨの緩衝液などで放出可能であり、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析可能である。
【００３７】
半減期延長ドメイン
抗原結合ドメインの半減期を延長するドメインが本明細書に企図される。そのようなドメインは、アルブミン結合ドメイン、Ｆｃドメイン、小分子、及び当該技術分野で既知の他の半減期延長ドメインを含むがこれらに限定されないことが企図される。
【００３８】
ヒトアルブミン（ＡＬＢ）（分子量〜６７ｋＤａ）は、血漿中の最も豊富なタンパク質であり、約５０ｍｇ／ｍｌ（６００μＭ）で存在し、ヒトでは約２０日の半減期を有する。ＡＬＢは、血漿ｐＨを維持する役目を果たし、コロイド状の血圧に貢献し、多くの代謝産物と脂肪酸の担体として機能し、及び血漿中の主要な薬物輸送タンパク質として役立つ。
【００３９】
アルブミンとの非共有会合は、短命のタンパク質の消失半減期を延長する。例えば、Ｆａｂフラグメントに対するアルブミン結合ドメインの組み換え融合は、Ｆａｂフラグメントのみの投与と比較して、マウスとウサギの静脈内にそれぞれ投与されたとき、２５倍と５８倍のインビボのクリアランス、及び２６倍と３７倍の半減期延長を結果としてもたらした。別の例において、インスリンがアルブミンとの会合を促進するために脂肪酸でアシル化されると、ウサギ又はブタに皮下注射された時に長期的な効果が観察された。合わせて、これらの研究は、アルブミン結合と持続的な作用との関連性を実証するものである。
【００４０】
一態様において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は半減期延長ドメイン、例えばＡＬＢに特異的に結合するドメインを含む。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のＡＬＢ３結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む、ＡＬＢに結合するあらゆるドメインであり得る。幾つかの実施形態において、ＡＬＢ結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びＨＳＡに特異的なラクダ科由来の単一ドメイン抗体、ペプチド、リガンド、又は少分子実体の可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体である。特定の実施形態において、ＡＬＢ結合ドメインは単一ドメイン抗体である。他の実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインはペプチドである。更なる実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは小分子である。ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインはかなり小さく、幾つかの実施形態においてわずか２５ｋＤ、わずか２０ｋＤ、わずか１５ｋＤ、又はわずか１０ｋＤであることが企図される。特定の例において、ＡＬＢ結合は、ペプチド又は小分子実体である場合に５ｋＤ以下である。
【００４１】
ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質自体の改変された薬動力学及び薬物動態を提供する。上記のように、半減期延長ドメインは消失半減期を延長する。半減期延長ドメインはさらに、三重特異性抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、及び拡散の変質を含む薬力学的な特性を変更する。幾つかの実施形態において、半減期延長ドメインは、半減期延長ドメインのないタンパク質と比較して、改善された組織（腫瘍を含む）標的化、組織分布、組織浸透、組織内での拡散、有効性の増強をもたらす。１つの実施形態において、治療方法は、三重特異性抗原結合タンパク質の減少した量を有効且つ効率的に利用し、非腫瘍細胞毒性の減少などの副作用の減少をもたらす。
【００４２】
更に、半減期延長ドメインの結合親和性は、特定の三重特異性抗原結合タンパク質中の特定の消失半減期を標的とするように選択可能である。故に、幾つかの実施形態において、半減期延長ドメインは高い結合親和性を有する。他の実施形態において、半減期延長ドメインは中程度の結合親和性を有する。また他の実施形態において、半減期延長ドメインは低い又はわずかな結合親和性を有する。典型的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高い）の、１０ｎＭ〜１００ｎＭの間（中程度）の、及び１００ｎＭを超える（低い）Ｋｄ濃度を含む。上記のように、ＡＬＢへの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの既知の方法によって決定される。
【００４３】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＡＬＢ結合ドメインは単一ドメイン抗体を含む。
【００４４】
メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメイン
メソテリンは、腹膜腔、胸膜腔、及び心膜腔の中皮内膜の細胞の表面に存在する糖タンパク質である。メソテリン遺伝子（ＭＳＬＮ）は、細胞表面に存在するグリコシル−ホスファチジルイノシトール−アンカー糖タンパク質である、メソテリンと称される４０ｋＤのタンパク質へと処理される７１ｋＤの前駆体タンパク質をコードするものである（Ｃｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （１９９６）  ９３：１３６−４０）。メソテリンｃＤＮＡは、ＨＰＣ−Ｙ５細胞株から調製されたライブラリからクローン化された（Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：２１９８４−２１９９０）。ｃＤＮＡはまた、中皮腫を認識するモノクローナル抗体Ｋ１を使用してクローン化された（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１３６−４０）。メソテリンは、正常ヒト組織におけるその発現が、胸膜、心膜、及び腹膜などの体腔に内在する中皮細胞内膜に限定される、分化抗原である。メソテリンはまた、中皮腫、膵臓腺癌、卵巣癌、胃癌、及び肺腺癌を含む、様々な異なるヒトの癌において大いに発現される（Ｈａｓｓａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  （２００８）  ４４：４６−５３）  （Ｏｒｄｏｎｅｚ，  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  （２００３）  ２７：１４１８−２８；  Ｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  （２００７）  １３：１５７１−５）。メソテリンは、良性膵臓組織に見られる稀であり且つ弱い発現を伴う、原発性膵臓腺癌の大部分において過剰発現される。Ａｒｇａｎｉ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００１；  ７（１２）：３８６２−３８６８。上皮悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）は普遍的にメソテリンを発現する一方、肉腫ＭＰＭは恐らくメソテリンを発現しない。最も希薄な上皮卵巣細胞腫、及び関連する原発性腹膜の細胞腫は、メソテリンを発現する。
【００４５】
メソテリンはまた、微量のメソテリンがメソテリン陽性癌を抱える一部の患者の血液に検出され得るので、特定の型の癌の診断及び予測のためのマーカーとして使用され得る（Ｃｒｉｓｔａｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：５０７６−５０８１，  ２００７）。メソテリンは、そのカルボキシル末端での欠失を介して、又はその膜結合形態からのタンパク質分解開裂によって、血清へと放出され得る（Ｈａｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １０：３９３７−３９４２，  ２００４）。アスベストにさらされた労働者の間に悪性中皮腫が現われる数年前に、メソテリンの可溶性形態の増加が検出可能であった（Ｃｒｅａｎｅｙ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．  １９：１０２５−１０４０，  ２００５）。更に、卵巣癌、膵臓癌、及び肺癌を抱える患者はまた、血清中の可溶性メソテリンを上昇させている（Ｃｒｉｓｔａｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：５０７６−５０８１，  ２００７；  Ｈａｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １２：４４７−４５３，  ２００６；  Ｃｒｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ．  Ｐｒｅｖ．  ３０：１８０−１８７，  ２００６）。従って、メソテリンは、疾患予防又は処置の方法に対する適切な標的であり、メソテリンに特異的な有効な抗体が必要とされている。
【００４６】
細胞表面の成熟メソテリンが３つの別個のドメイン、即ち、領域Ｉ（残基２９６−３９０を含む）、ＩＩ（残基３９１−４８６を含む）、及びＩＩＩ（残基４８７−５９８を含む）を備えることが示されている。（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  ｃｌｏｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ，  Ｍｏｌ．  Ｃａｎ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １２（４）：  ４１６−４２６，  ２０１３）。治療的介入のためのメソテリンに対して生成された一次抗体は、メソテリンとＣＡ−１２５との相互作用に干渉するように設計された。ファージディスプレイは、ＦｖＳＳを識別し、これは、親和性を最適化され、且つ、メソテリンを標的とする組み換え免疫毒素、ＳＳ１Ｐを生成するために使用された。ＭＯＲＡｂ−００９抗体アマツキシマブは、ＳＳ１も使用し、領域Ｉ内でメソテリンのアミノ末端基６４アミノ酸における非線形エピトープを認識する。ＳＳ１  Ｆｖも、キメラ抗原受容体で操作されたＴ細胞を生成するために使用された。近年、新たなメソテリンタンパク質は、メソテリンタンパク質の他の領域を認識すると報告されている。
【００４７】
卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、肺癌、胃癌、及び三種陰性乳癌などの、メソテリンの過剰発現に関連する固形腫瘍疾患の処置に対して利用可能な更なるオプションを備える必要性が依然として存在する。本開示は、特定の実施形態において、腫瘍標的細胞の表面上でＭＳＬＮに特異的に結合する結合ドメインを含むＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質を提供する。
【００４８】
本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の設計は、ＭＳＬＮに対する結合ドメインが、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む任意のタイプの結合ドメインであり得るという点で、ＭＳＬＮに対する結合ドメインを柔軟なものとすることができる。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮに対する結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ科由来の単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体である。他の実施形態において、ＭＳＬＮに対する結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、即ち、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒｓ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎｓ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）、アヴィマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、クニッツドメインペプチド、及びモノボディなどの抗体模倣物である。更なる実施形態において、ＭＳＬＮに対する結合ドメインは、ＭＳＬＮに結合又は会合するリガンド又はペプチドである。また更なる実施形態において、ＭＳＬＮに対する結合ドメインはノッチンである。また更なる実施形態において、ＭＳＬＮに対する結合ドメインは小分子実体である。
【００４９】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７の配列を含むタンパク質に結合する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７と比較して短縮した配列を含むタンパク質に結合する。
【００５０】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＭＳＬＮ結合ドメインは完全長のメソテリンを認識する。特定の例において、本明細書に開示されるＭＳＬＮ結合ドメインは、メソテリンの領域Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基２９６−３９０を含む）、領域ＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基３９１−４８６を含む）、又は領域ＩＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基４８７−５９８を含む）におけるエピトープを認識する。本開示のＭＳＬＮ結合ドメインは、幾つかの実施形態において、メソテリンの領域Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの外に位置するエピトープを認識し、且つそれに結合し得ることが企図される。また他の実施形態において、ＭＯＲＡｂ−００９抗体と異なるエピトープを認識し且つそれに結合する、ＭＳＬＮ結合ドメインが開示される。
【００５１】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは抗ＭＳＬＮ抗体又は抗体変異体である。本明細書で使用されるように、用語「抗体変異体」は、本明細書に記載される抗体の変異体及び誘導体を指す。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ＭＳＬＮの抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ＭＳＬＮ抗体のアミノ酸配列変異体は、結合親和性及び／又は抗体の他の生物学的特性を改善するように企図されている。アミノ酸変異体を調製するための典型的な方法は、限定されないが、抗体をコードするヌクレオチド配列へと、又はペプチド合成により、適切な修飾を導入する工程を含む。そのような修飾は例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、前記残基への挿入、及び／又は前記残基の置換を含む。
【００５２】
欠失、挿入、及び置換のあらゆる組み合わせは、最終の構築物に到達するために行うことができるが、最終の構築物が所望の特徴、例えば抗原結合を持つことを前提とする。特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を持つ抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発に対する目的の部位はＣＤＲ及びフレームワーク領域を含む。そのような置換の例が後述される。アミノ酸置換は目的の抗体へと導入することができ、生成物は、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合の減少、免疫原性の減少、又はＴ細胞媒介性細胞毒性（ＴＤＣＣ）の改善をスクリーニングした。保存的且つ非保存的なアミノ酸置換が、抗体変異体の調製に企図される。
【００５３】
変異体抗ＭＳＬＮ抗体を作成するための置換の別の例において、親抗体の１つ以上の超可変領域残基が置換される。一般的に、変異体はその後、親抗体に比べて望ましい特性、例えば、親和性の増加、親和性の減少、免疫原性の減少、結合のｐＨ依存性の増加に基づいて選択される。
【００５４】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のＭＳＬＮ結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、メソテリンに特異的なラマ由来のｓｄＡｂ、ペプチド、リガンド、又は小分子実体の可変ドメイン（ＶＨＨ）などの、単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のメソテリン結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む、メソテリンに結合する任意のドメインである。特定の実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは単一ドメイン抗体である。他の実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインはペプチドである。更なる実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは小分子である。
【００５５】
一般的に、単一ドメインという用語は、その最も広い意味で本明細書に使用されるように、特異的な生物学的ソース又は特異的な調製法には限定されないことを、留意されたい。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例として、限定されないが、重鎖抗体、軽鎖が自然にない抗体、従来の４鎖状抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、及び抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャホールドが挙げられる。単一ドメイン抗体は、当該技術分野の何れか、或いは、将来の単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含む任意の種に由来し得る。例えば、幾つかの実施形態において、本開示の単一ドメイン抗体は：（１）自然発生の重鎖抗体のＶＨＨドメインの単離によって；（２）自然発生のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現によって；（３）自然発生のＶＨＨドメインの「ヒト化」、又はそのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現によって；（４）任意の動物種、具体的には人間などの一種の哺乳動物由来の自然発生のＶＨドメインの「ラクダ化」、又はそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現によって；（５）「ドメイン抗体」又は「Ｄａｂ」の「ラクダ化」、又はそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現によって；（６）タンパク質、ポリペプチド、又は他のアミノ酸配列の調製のための合成又は半合成の技術を使用することによって；（７）当該技術分野で既知の核酸合成のための技術を使用して単一ドメイン抗体をコードする核酸の調製、その後に得られた核酸の発現によって；及び／又は（８）前述のものの１つ以上の任意の組み合わせによって、得られる。
【００５６】
一実施形態において、単一ドメイン抗体は、ＭＳＬＮに対して配向された自然発生の重鎖抗体のＶＨＨドメインに相当する。本明細書で更に記載されるように、そのようなＶＨＨ配列は通常、ＭＳＬＮにより一種のラマを適切に免疫化することによって（即ち、ＭＳＬＮに対して配向された免疫応答及び／又は重鎖抗体を上昇させるように）、前記ラマの適切な生体サンプル（血液サンプル、血清サンプル、又はＢ細胞のサンプルなど）を得ることによって、及び、当該技術分野で既知の適切な技術を使用して、前記サンプルから出発して、ＭＳＬＮに対して配向されたＶＨＨ配列を生成することによって、生成又は入手され得る。
【００５７】
別の実施形態において、ＭＳＬＮに対するそのような自然発生のＶＨＨドメインは、例えば、当該技術分野で既知の１つ以上のスクリーニング技術を使用して、ＭＳＬＮ、又はその少なくとも一部、フラグメント、抗原決定基、又はエピトープを用いてライブラリをスクリーニングすることによって、ラクダ科ＶＨＨ配列のナイーブライブラリから得られる。そのようなライブラリ及び技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ３／０２５０２０、及びＷＯ０３／０３５６９４に記載されている。代替的に、例えばＷＯ００／４３５０７に記載されるように、無作為の突然変異誘発及び／又はＣＤＲシャフリングなどの技術によってナイーブＶＨＨライブラリから得られるＶＨＨライブラリなどの、ナイーブＶＨＨライブラリ由来の、改善された合成又は半合成ライブラリが使用される。
【００５８】
更なる実施形態において、ＭＳＬＮに対して配向されたＶＨＨを得るための更に別の技術は、重鎖抗体を発現可能なトランスジェニック哺乳動物を適切に免疫化する工程（即ち、ＭＳＬＮに対して配向された免疫応答及び／又は重鎖抗体を上昇させるように）、前記トランスジェニック哺乳動物の適切な生体サンプル（血液サンプル、血清サンプル、又はＢ細胞のサンプルなど）を得る工程、及び、その後に、当該技術分野で既知の適切な技術を使用して、前記サンプルから出発して、ＭＳＬＮに対して配向されたＶＨＨ配列を生成する工程を含む。例えば、この目的のために、重鎖抗体を発現するラット又はマウス、並びに、ＷＯ０２／０８５９４５及びＷＯ０４／０４９７９４に記載される方法及び技術が、使用され得る。
【００５９】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体は、アミノ酸配列を含む単一ドメイン抗体を含んでおり、前記アミノ酸配列は、自然発生のＶＨＨドメインのアミノ酸配列に相当するが、（例えば上述のような）人間由来の従来の４鎖抗体のＶＨドメインにおける対応する位置に生じるアミノ酸残基の１つ以上により前記自然発生のＶＨＨ配列のアミノ酸配列（及び具体的にはフレームワーク配列）における１つ以上のアミノ酸残基を置き換えることによって、「ヒト化」されている。これは、当業者に明白である当該技術分野で既知の様式で、例えば本明細書の更なる記載に基づいて、実行可能である。再度、そのような本開示のヒト化抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体は、それ自体で既知の任意の適切な様式で（即ち、上記の点（１）−（８）の下で示されるように）得られ、故に、出発物質として自然発生のＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドではあるが厳密にはそれに限定されないことを、留意されたい。幾つかの追加の実施形態において、本明細書に記載されるような単一ドメイン抗ＭＳＬＮ抗体は、アミノ酸配列を含む単一ドメイン抗体を含んでおり、前記アミノ酸配列は、自然発生のＶＨドメインのアミノ酸配列に相当するが、重鎖抗体のＶＨＨドメインの対応する位置に生じるアミノ酸残基の１つ以上により従来の４鎖抗体の自然発生のＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸残基を置き換えることによって、「ラクダ化」されている。そのような「ラクダ化」置換は好ましくは、ＶＨ−ＶＬ界面、及び／又はいわゆるラクダ科ホールマーク残基を形成する、及び／又はそれらに存在する、アミノ酸位置に挿入される（例えば、ＷＯ９４／０４６７８及びＤａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  （１９９４  ａｎｄ  １９９６）を参照）。好ましくは、ラクダ化単一ドメインを生成又は設計するための出発物質又は出発点として使用されるＶＨ配列は好ましくは、哺乳動物のＶＨ配列、より好ましくはＶＨ３配列などの人間のＶＨ配列である。しかし、そのような本開示のラクダ化抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体は、特定の実施形態において、当該技術分野で既知の任意の適切な様式で（即ち、上記の点（１）−（８）の下で示されるように）得られ、故に、出発物質として自然発生のＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドではあるが厳密にはそれに限定されないことを、留意されたい。例えば、本明細書で更に記載されるように、「ヒト化」及び「ラクダ化」は共に、自然発生のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列を提供することにより、及びその後に、新たなヌクレオチド配列が「ヒト化」又は「ラクダ化」単一ドメイン抗体をそれぞれコードするような方法で前記ヌクレオチド配列における１つ以上のコドンを変化させることによって、実行される。その後、この核酸は、本開示の望ましい抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体を提供するように発現され得る。代替的に、他の実施形態において、自然発生のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインそれぞれのアミノ酸配列に基づいて、本開示の望ましいヒト化又はラクダ化抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体それぞれの��ミノ酸配列が設計され、その後に既知のペプチド合成技術を使用して新規に合成される。幾つかの実施形態において、自然発生のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインそれぞれのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に基づいて、本開示の望ましいヒト化又はラクダ化抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体それぞれをコードするヌクレオチド配列が設計され、その後に既知の核酸合成技術を使用して新規に合成され、その後、これにより得られた核酸を、既知の発現技術を使用して発現させて、本開示の望ましい抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体を提供する。
【００６０】
自然発生のＶＨ配列又はＶＨＨ配列から出発する、本開示の抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体及び／又はそれをコードする核酸を得るための、他の適切な方法及び技術は、例えば、本開示の抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体或いはそれをコードするヌクレオチド配列又は核酸を提供するために、適切な様式で、１つ以上の自然発生のＶＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のフレームワーク（ＦＲ）配列及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）配列など）、１つ以上の自然発生のＶＨＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のＦＲ配列又はＣＤＲ配列など）、及び／又は１つ以上の合成又は半合成の配列を組み合わせる工程を含む。
【００６１】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは、重鎖可変相補性決定領域ＣＤＲ１、重鎖可変ＣＤＲ２、重鎖可変ＣＤＲ３、軽鎖可変ＣＤＲ１、軽鎖可変ＣＤＲ２、及び軽鎖可変ＣＤＲ３を含む抗ＭＳＬＮ特異抗体である。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは、ＭＳＬＮに結合するドメインを含み、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又は抗原結合フラグメント、例えば単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、及びＦｖフラグメント、１つ以上のＣＤＲで構成されたフラグメント、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント、ヘテロ共役抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｐＦｖフラグメント、重鎖単量体又は二量体、軽鎖単量体又は二量体、並びに１つの重鎖と１つの軽鎖から成る二量体からのドメインが挙げられる。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体は、重鎖可変相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
【００６２】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは、式：ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４によって表わされるような、３つの相補性決定領域／配列によって遮られた４つのフレームワーク領域／配列（ｆ１−ｆ４）で構成されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、式中、ｒ１、ｒ２、及びｒ３はそれぞれ相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３であり、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である。本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質のフレームワーク残基は、例えば、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９の、９０、９１、９２、９３、又は９４のアミノ酸残基を含み、相補性決定領域は、例えば２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６のアミノ酸残基を含む。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４０及び１０２−１０５から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質のフレームワーク領域１は、ＳＥＱ  ＩＤ：２２３−２６１の何れか１つにおけるような配列を含む。幾つかの実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質のフレームワーク領域２は、ＳＥＱ  ＩＤ：２６２−３００の何れか１つにおけるような配列を含む、幾つかの実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質のフレームワーク領域３は、ＳＥＱ  ＩＤ：３０１−３３９の何れか１つにおけるような配列を含む。幾つかの実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合三重特異性タンパク質のフレームワーク領域４は、ＳＥＱ  ＩＤ：３４０−３７８の何れか１つにおけるような配列を含む。
【００６３】
幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１に明記されるようなアミノ酸配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２に明記されるような配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に明記されるような配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【００６４】
幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４に明記されるようなアミノ酸配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に明記されるような配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に明記されるような配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【００６５】
幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６−１４４の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６−１４４の何れか１つにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５−１８３の何れか１つに明記されるような配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５−１８３の何れか１つにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４−２２２の何れか１つに明記されるような配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４−２２２の何れか１つにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【００６６】
本開示のＭＳＬＮ結合ドメインは、特定の例において、１つ以上の保存領域を含む。保存領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１−４９に明記されるような配列、又は前記配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む変異体を含む。典型的な実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１−４４から選択される１つ以上の保存領域を含むＭＳＬＮ結合タンパク質、又は前記配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む変異体を含む。場合によっては、ＭＳＬＮ結合ドメインは、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に相当するアミノ酸の伸張部、及び（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に相当するアミノ酸の伸張部を含む。
【００６７】
更に典型的な実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５−５０から選択される１つ以上の保存領域を含むＭＳＬＮ結合ドメイン、又は前記配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む変異体を含む。場合によっては、ＭＳＬＮ結合ドメインは、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に相当するアミノ酸の伸張部、（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に相当するアミノ酸の伸張部、及び（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に相当するアミノ酸の伸張部を含む。
【００６８】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−２９から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００６９】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０−４０、及び１０２−１０５から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００７０】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合ドメインの相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６−１４４の何れか１つに明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００７１】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合ドメインの相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５−１８３の何れか１つに明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００７２】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合ドメインの相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４−２２２の何れか１つに明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００７３】
幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパ��質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９の配列を含む単一ドメイン抗体である。
【００７４】
幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。
【００７５】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルのメソテリンと交差反応する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインはヒトメソテリンに特異的である。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＭＳＬＮ結合ドメインは、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトメソテリンに結合する。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＭＳＬＮ結合ドメインは、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルメソテリンに結合する。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＭＳＬＮ結合ドメインは、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）及びヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有する、カニクイザルメソテリン及びヒトメソテリンの両方に結合する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、比較可能な結合親和性（即ち、ｈＫｄ及びｃＫｄの値は、±１０％よりも多く相違しない）によりヒト及びカニクイザルのメソテリンに結合する。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約４５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約４００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約３５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約３００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約２５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約２００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約１５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約９０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．２ｎＭ〜約８０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．３ｎＭ〜約７０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．４ｎＭ〜約５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．５ｎＭ〜約３０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．６ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．７ｎＭ〜約８ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．８ｎＭ〜約６ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．９ｎＭ〜約４ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約１ｎＭ〜約２ｎＭの範囲に及ぶ。
【００７６】
幾つかの実施形態において、前述のＭＳＬＮ結合ドメインの何れか（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４０及びの抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体）は、精製の容易さのためにタグ付けされる親和性ペプチドである。幾つかの実施形態において、親和性ペプチドタグは、６Ｘ−ｈｉｓとも称される、６つの連続するヒスチジン残渣である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７９）。
【００７７】
特定の実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合ドメインは、可溶性メソテリン上で膜結合メソテリンに優先的に結合する。膜結合メソテリンは、メソテリンを発現する細胞の細胞膜表面における、又はその表面上のメソテリンの存在を指す。可溶性メソテリンは、メソテリンを発現する又は発現した細胞の細胞膜表面中に、又はその上にもはや存在しないメソテリンを指す。特定の例において、可溶性メソテリンは被験体における血液及び／又はリンパ循環に存在する。一実施形態において、ＭＳＬＮ結合ドメインは、可溶性メソテリンよりも少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍大きい膜結合メソテリンに結合する。一実施形態において、本開示のＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質は、可溶性メソテリンより３０倍大きい膜結合メソテリンに優先的に結合する。可溶性ＭＳＬＮ上での抗原結合タンパク質の膜結合ＭＳＬＮへの優先的な結合の判定は、当該技術分野で周知のアッセイを使用して容易に行われ得る。
【００７８】
ＴｒｉＴＡＣ分子
本開示の様々な実施形態は、本明細書に記載されるようなＭＳＬＮ結合ドメインを含む三重特異性分子（本明細書でＴｒｉＴＡＣ分子とも称される）を提供する。幾つかの実施形態において、ＴｒｉＴＡＣ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、本開示のＴｒｉＴＡＣ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、本開示のＴｒｉＴＡＣ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１から選択されたアミノ酸配列の完全長と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、本開示のＴｒｉＴＡＣ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８−８６、９８、１００、及び１０１から選択されたアミノ酸配列の完全長の画分と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）への組み込み
本開示のＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質は、特定の例においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）へと組み込むことができる。操作された免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、本明細書に記載されるような抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体を含有する抗ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質を含むＣＡＲを発現するために使用され得る。一実施形態において、本明細書に記載されるような抗ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質を含むＣＡＲは、ヒンジ領域を介して膜貫通ドメインに、及び更には共刺激ドメイン、例えばＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、又は４−１ＢＢから得られる機能的シグナル伝達ドメインに接続される。幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ３ゼータなどの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含む。
【００８０】
腫瘍成長減少特性
特定の実施形態において、本開示のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞を有する被験体に投与すると、インビボで腫瘍細胞の成長を減少させる。腫瘍細胞の成長の減少の測定は、当該技術分野で周知の複数の異なる方法によって判定され得る。非限定的な実施例は、腫瘍寸法の直接測定、切除した腫瘤の測定及び対照被験体との比較、解析の向上のために同位体又は発光分子（例えばルシフェラーゼ）を使用する又は使用しない画像処理技術（例えばＣＴ又はＭＲＩ）を介した測定などを含む。特異的な実施形態において、本開示の三重特異性タンパク質の投与は結果として、対照の抗原結合剤と比較して、腫瘍成長の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の腫瘍細胞のインビボ成長の減少をもたらし、腫瘍の完全寛解及び消失を示す。更なる実施形態において、本開示の三重特異性タンパク質の投与は結果として、対照の抗原結合剤と比較して、約５０−１００％、約７５−１００％、又は約９０％−１００％の腫瘍細胞のインビボ成長の減少をもたらす。更なる実施形態において、本開示の三重特異性タンパク質の投与は結果として、対照の抗原結合剤と比較して、約５０−６０％、約７０−８０％、約８０−９０％、又は約９０％−１００％の腫瘍細胞のインビボ成長の減少をもたらす。
【００８１】
ＭＳＬＮ三重特異性タンパク質修飾
本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、（ｉ）アミノ酸が遺伝子コードによってコードされるものではないアミノ酸残基で置換され、（ｉｉ）成熟ポリペプチドがポリエチレングリコールなどの別の化合物と融合され、又は、（ｉｉｉ）追加のアミノ酸が、リーダー配列、分泌配列、或いは免疫原をするためのタンパク質の精製の配列などのタンパク質に融合される、誘導体又はアナログを包含する。
【００８２】
典型的な修飾は、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合の架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性の加工、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）などのアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性の付加、及びユビキチン化を含む。
【００８３】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシル終端を含む、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のあらゆる場所で行われる。ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の修飾に役立つ特定の一般的なペプチド修飾は、グルタミン酸残基のグリコシル化、脂質結合、硫酸化、ガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、共有結合修飾によるポリペプチド中のアミノ基又はカルボキシル基の遮断、或いはその両方、及びＡＤＰリボシル化を含む。
【００８４】
ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質をコードするポリヌクレオチド
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗ＭＳＬＮ三重特異性結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態において、ポリヌクレオチド分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。
【００８５】
ポリヌクレオチド分子は、ペプチドリンカーによって分離されるか又は他の実施形態においてペプチド結合によって直接結合される３つの結合ドメインをコードする遺伝子を組み合わせ、適切なプロモーター及び随意に適切な転写ターミネーターに動作可能に連結された単一の遺伝子構築物にして、及び、細菌又は例えばＣＨＯ細胞などの他の適切な発現系でそれを発現するなどの既知の方法によって構築される。ＭＳＬＮ結合ドメインが小分子である実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３結合ドメインと半減期延長ドメインをコードする遺伝子を含んでいる。半減期延長ドメインが小分子である実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３とＭＳＬＮとに結合するドメインをコードする遺伝子を含んでいる。利用されるベクター系と宿主に依存して、任意の数の適切な転写、及び構成的で誘導可能なプロモーターを含む翻訳要素が使用されてもよい。プロモーターはそれぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を駆り立てるように選択される。
【００８６】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、更なる実施形態を表すベクター、好ましくは発現ベクターに挿入される。この組み換えベクターは既知の方法に従って構築可能である。特定の対象のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）、及びコスミドを含んでいる。
【００８７】
様々な発現ベクター／宿主系は、記載された三重特異性抗原結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、且つそれを発現するために利用されてもよい。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のための発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのｐＳＫＫ（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  （２００４）  ２８５（１）：１１１−２７）又はｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【００８８】
故に、本明細書に記載されるようなＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、幾つかの実施形態において、上記のようなタンパク質をコードするベクターを宿主細胞へ導入し、且つ、タンパク質ドメインが発現し、単離され、随意に更に精製され得る条件下で上記宿主細胞を培養することにより、生成される。
【００８９】
医薬組成物
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質、ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、或いはこのベクター及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体によって形質転換された宿主細胞を含む、医薬組成物も提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」としては、限定されないが、成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、且つ、投与される患者にとって毒性ではない任意の担体が挙げられる。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などを含む。こうした担体は、従来の方法によって製剤することができ、適切な投与量で被験体に投与可能である。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物は、防腐剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを更に含み得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤の包含によって確保され得る。更なる実施形態は、凍結乾燥形態で包装される、又は水性媒体に包装される上述のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の１つ以上を提供する。
【００９０】
医薬組成物の幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質はナノ粒子に封入される。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、デンドリマー、又はナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態において、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質はリポソームに結合する。幾つかの例において、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質はリポソームの表面に抱合される。幾つかの例において、ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質は、リポソームのシェル内に封入される。幾つかの例において、リポソームはカチオン性リポソームである。
【００９１】
本明細書に記載されるＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、薬物としての使用のために企図されている。投与は様々な方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所的、又は皮内の投与によって達成される。幾つかの実施形態において、投与経路は、治療の種類と、医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは主治医と他の臨床的要因によって決定される。任意の１人の患者のための用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与時間と投与経路、治療の種類、健康状態、及び同時に投与されている他の薬物を含む多くの因子に依存する。「有効量」は、こうした病状の減少又は緩解をもたらす、疾患の経過と重症度に影響を与えるのに十分な有効成分の量を指し、既知の方法を使用して決定されることもある。
【００９２】
幾つかの実施形態において、本開示のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、週に１回の頻度で最大１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。場合によっては、用量は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇに及ぶ。幾つかの実施形態において、投与量は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０ｎｇ／ｋｇ、約５ｎｇ／ｋｇ〜約１５ｎｇ／ｋｇ、約１２ｎｇ／ｋｇ〜約２０ｎｇ／ｋｇ、約１８ｎｇ／ｋｇ〜約３０ｎｇ／ｋｇ、約２５ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｎｇ／ｋｇ、約３５ｎｇ／ｋｇ〜約６０ｎｇ／ｋｇ、約４５ｎｇ／ｋｇ〜約７０ｎｇ／ｋｇ、約６５ｎｇ／ｋｇ〜約８５ｎｇ／ｋｇ、約８０ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ、約１２μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ、約３５μｇ／ｋｇ〜約７０μｇ／ｋｇ、約４５μｇ／ｋｇ〜約８０μｇ／ｋｇ、約６５μｇ／ｋｇ〜約９０μｇ／ｋｇ、約８５μｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０９５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。場合によっては、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ；約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約９ｍｇ／ｋｇ、又は約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。投与の頻度は、幾つかの実施形態において、ほぼ毎日（ａｂｏｕｔ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ｄａｉｌｙ）、隔日、１日１回未満、週に２回、毎週、７日に１回、２週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、又は月に１回である。場合によっては、投与の頻度は毎週である。場合によっては、投与の頻度は毎週であり、用量は最大１０ｍｇ／ｋｇである。場合によっては、投与の持続期間は約１日〜約４週間以上である。
【００９３】
処置の方法
本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるような抗ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の投与を含む、個体の免疫系を刺激するための方法と使用が提供される。幾つかの例において、本明細書に記載される抗ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の投与は、標的抗原を発現する細胞への細胞毒性を引き起こす、及び／又は持続させる。幾つかの例において、細胞は、癌細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、自己反応性のＴ又はＢ細胞、損傷を受けた赤血球、動脈プラーク、或いは繊維症の組織である。
【００９４】
また本明細書には、本明細書に記載される抗ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質を、必要とする個体に投与する工程を含む、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病の処置のための方法と使用も提供される。標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病としては、限定されないが、ウイルス感染、細菌感染、自己免疫性疾患、移植拒絶反応、アテローム性動脈硬化症、又は線維症が挙げられる。他の実施形態において、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主疾患、又は宿主対移植片疾患である。１つの実施形態において、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病は癌である。本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質により、及びそれを使用する方法により処置、予防、又は管理され得る癌は、限定されないが、上皮細胞由来の癌を含む。そのような癌の例は、以下を含む：白血病、限定されないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば骨髄芽球、前骨髄球、骨髄単球性、単球、及び赤白血症の白血病、並びに及び骨髄異形成症候群など；慢性白血病、限定されないが、慢性骨髄球（顆粒白血球）白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病など；一次性赤血球増加症；リンパ腫、限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病など；多発性骨髄腫、限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性黒色腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫、及び髄外の形質細胞腫など；ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症；意義不明の単クローン免疫グロブリン症；良性単クローン免疫グロブリン症；重鎖病；骨及び結合組織の肉腫、限定されないが、骨肉腫、骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の繊維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ））、繊維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、、神経鞘腫、横紋筋肉腫、及び滑膜肉腫など；脳腫瘍、限定されないが、神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、非神経膠腫瘍、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽細胞腫、及び原発性脳リンパ腫など；乳房癌、限定されないが、乳管癌、腺癌、小葉状（小細胞）癌、分泌管内癌、乳房の髄様癌、粘液性乳房癌、管状乳房癌、乳頭癌、パジェット病、及び炎症性乳癌など；副腎癌、限定されないが、褐色細胞腫及び副腎皮質細胞腫など；甲状腺癌、限定されないが、乳頭状又は濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌、及び未分化甲状腺癌など；膵臓癌、限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、及びカルチノイド、又は島細胞腫など；下垂体癌、限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、及び尿崩症；眼癌、限定されないが、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫及び毛様体黒色腫などの眼黒色腫、及び網膜芽細胞腫など；有棘細胞癌、腺癌、及び黒色腫などの膣癌；有棘細胞癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、及びパジェット病などの外陰癌；子宮頚癌、限定されないが、扁平上皮癌及び腺癌；子宮癌、限定されないが、子宮内膜細胞腫及び子宮肉腫など；卵巣癌、限定されないが、卵巣上皮性悪性腫瘍、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、及び間質性腫瘍など；食道癌、限定されないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、及び燕麦細胞（小細胞）癌腫など；胃癌、限定されないが、腺癌、肉芽腫性軟性（ポリープ状）、潰瘍化型、表層進展性、拡散進展性（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、及び癌肉腫など；結腸癌；直腸癌；肝臓癌、限定されないが、肝細胞癌及び肝芽腫；腺癌などの胆嚢癌；胆管癌、限定されないが、乳頭状、結節状、及びびまん性など；肺癌、限定されないが、非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌、及び小細胞肺癌など；精巣癌、限定されないが、胚腫瘍、精上皮腫、退生、古典的（典型的）、精母細胞、非セミノーマ、胎児性癌、奇形腫癌腫、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、限定されないが前立腺上皮内腫瘍、腺癌、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫などの前立腺癌など；腎癌（ｐｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）；限定されないが扁平上皮細胞腫などの口腔癌；基底膜癌；唾液腺癌、限定されないが、腺癌、粘液性類表皮癌、及び腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｉｄｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）など；咽頭癌、限定されないが、扁平上皮癌及び疣贅性など；皮膚癌、限定されないが、基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、ほくろ悪性黒色腫、末端黒子型黒色腫など；腎臓癌、限定されないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、繊維肉腫、移行性細胞癌（腎盂及び／又は尿管）など；ウィルムス腫瘍；膀胱癌、限定されないが、移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫。加えて、癌は、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ脈管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮性悪性腫瘍、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、及び乳頭状腺癌を含む（このような障害に関しては、Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２ｄ  Ｅｄ．，  Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｉｎｆｏｒｍｅｄ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，  Ｖｉｋｉｎｇ  Ｐｅｎｇｕｉｎ，  Ｐｅｎｇｕｉｎ  Ｂｏｏｋｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  Ｉｎｃ．，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａを参照）。
【００９５】
本開示のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、以下を含む（これらに限定されない）様々な癌又は他の異常な増殖性疾患の処置又は予防にも有用である：膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、頚部、甲状腺、及び皮膚の癌を含む癌腫；扁平上皮癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫を含む、リンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、並びに前骨髄性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉由来の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、悪性奇形腫、神経芽細胞腫、及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及びシュワン細胞腫を含む、中枢神経系と末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む間充織由来の腫瘍；並びに、黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍。また、アポトーシスにおける異常によって引き起こされる癌も、本開示の方法及び組成物により処置されることが、企図される。そのような癌は、限定されないが、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異を持つ癌、乳房、前立腺、及び卵巣のホルモン依存性腫瘍、及び、家族性大腸腺腫症などの前癌正病変を含む。特異的な実施形態において、悪性病変又は悪性増殖（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）変化（異形成及び形成異常症など）、或いは過剰増殖性障害）は、皮膚、肺、結腸、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、膵臓、卵巣又は子宮中で処置又は予防される。他の特異的な実施形態において、肉腫、黒色腫、又は白血病が処置又は予防される。
【００９６】
本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態において、「処置」、「処置すること」、或いは「処置された」とは、望ましくない生理的な疾病、障害、又は疾患を遅らせる（減らす）こと、或いは、有益な又は望ましい臨床結果を得ることを目的とする治療的処置を指す。本明細書に記載される目的のために、有益な又は望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の緩和；疾病、障害、又は疾患の程度の減少；疾病、障害、又は疾患の状態の安定化（即ち、悪化しないこと）；疾病、障害、又は疾患の発症を遅らせること、又はその進行を遅らせること；疾病、障害、又は疾患の状態の改善；及び、検出可能又は検出不可能にかかわらず、疾病、障害、又は疾患の緩解（部分的又は全体）、或いはその亢進又は改善が挙げられる。処置は、過剰なレベルの副作用のない臨床的に有意な反応を誘発することを含む。処置は更に、処置を受けない場合の予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことを含む。他の実施形態において、「処置」、「処置すること」、又は「処置された」とは、予防的な処置を指し、その目的は、例えば、疾患の素因のある人（例えば、乳癌などの疾患に対する遺伝子マーカーをつけた個体）など、望ましくない生理的な疾病、障害、又は疾患の発症を遅らせるか、或いはその重症度を低下させることである。
【００９７】
本明細書に記載される方法の幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるようなＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、特定の疾患、障害、又は疾病の処置のための薬剤と組み合わせて投与される。薬剤としては、限定されないが、抗体、小分子（例えば、化学療法剤）、ホルモン（ステロイド、ペプチドなど）、放射線療法（γ線、Ｘ線、及び／又は、放射性同位体、マイクロ波、ＵＶ放射などの指示された送達）、遺伝子治療（例えば、アンチセンス、レトロウイルス治療など）、及び他の免疫療法に関する治療が挙げられる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるような抗ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、下痢止め薬、制吐剤、鎮痛剤、オピオイド、及び／又は非ステロイド性抗炎症薬と組み合わせて投与される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるような抗ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、抗癌剤と組み合わせて投与される。本開示の医薬組成物、投薬形態、及びキットを含む、本開示の様々な実施形態に使用され得る抗癌剤の非限定的な例は、以下を含む：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アムボマイシン；アメタントロンアセタート；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテーパ；アズトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ジメシル酸ビスナフィド；ビセレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナーナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベティマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼルシン；セデフィンガル；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デクソロマプラチン；デザグアミン；メシル酸デザグアミン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ドゥアゾマイシン；エダトレキセート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメイト；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロオシタビン；フォスクィダン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン；インターロイキンＩＩ（組み換えインターロイキンＩＩ、又はｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１、インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；���トロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲスロロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；マイトジリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オクシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタマスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロクサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニマスチン；塩酸プロカルバジン；プロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴル；サフィンゴル塩酸塩；セムスチン；シムトラゼーネ；スパルフォスエートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロマスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェナール；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸トレクサトロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシビリン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンレウロジン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンゾキジン；硫酸ビンゾキジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン。抗癌剤の他の例は、限定されないが以下を含む：２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アキルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アムバマスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラフォライド；血管形成阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背方化形態形成タンパク質−１（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子モジュレータ；細胞死レギュレーター；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリマスチン；アクシナスタチン１；アクシナスタチン２；アクシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾチロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジンイルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビセレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来の阻害剤；カルゼルシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス‐ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチンアナログ；コナゲニン；クラムベシジン（ｃｒａｍｂｅｓｃｉｄｉｎ）８１６；クリスナトール；クリプトファイシン８；クリプトファイシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタンチラキノーズ；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞傷害性因子；シトスタチン；ダクリズマブ；デシタビン；デヒドロジデミンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキフォスダミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ジデミンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオクサマイシン；ジフェニルスピロマスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；ズオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスティン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフール；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチンアナログ；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレツッエラスチン；フラステロン（ｆｌｕａｓｔｅｒｏｎｅ）；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン；フォルフェニメックス；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテクサピリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ハプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロニック酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン（ｉｄｒａｍａｎｔｏｎｅ）；イルモフォシン；イルモスタット；イミダゾアクリドン（ｉｍｉｄａｚｏａｃｒｉｄｏｎｅｓ）；イミキモド；免疫賦活剤ペプチド；インスリン様成長因子Ｉ受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール、４−；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンド��ンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラライドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；線形ポリアミンアナログ；親油性二糖類ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ）７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメテレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤（限定されないが、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、シンバスタチン、及びアトルバスタチンなど）；ロクソリビン；ラルトテカン；ルテチウムテクサピリン；リソフィリン；細胞溶解ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メタレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；ミトナファイド；マイトトキシン繊維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリア細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；外発性腫瘍抑圧遺伝子１ベースの治療薬；マスタード抗癌剤；ミカペロキサイドＢ；ミコバクテリウム細胞壁抽出物；ミラポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスティップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ニーリドロニック酸；中性エンドペプチターゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレータ；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアミン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイニン誘発剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オグサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセルアナログ；パクリタキセル誘導体；パラウアミ
ン；パルミトイルリゾキシン；パミドロニック酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリサルフェートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルフォスファミド；ペリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノゲンアクチベータインヒビター；白金複合体；白金化合物；白金トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；タンパク質Ａベースの免疫モジュレータ；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；チロシンホスファターゼタンパク質阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化したヘモグロビン・ポリオキシエチレン抱合体；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レティプチン；レニウムＲｅ  １８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ラビジノンＢ１；ラボキシル；サフィンゴル；セイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ  １模倣物；セムスチン；セネスセンス由来の阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達モジュレータ；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテート；フェニル酢酸ナトリウム；サルバロル；ソマトメジン結合タンパク質；ソナーミン；スパルフォシック酸；スピカマイシンＤ；スピロマスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクワラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分割阻害剤；スティピアミド；ストロメリシン阻害剤；サルフィノジン；超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト；サラディスタ；スラミン；スウェインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロマスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；サリブラスチン；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模倣物；チマルファジン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプロプリン；チラパザミン；チタノセン二塩化物；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシビリン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；テュロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来の成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクターシステム、赤血球遺伝子治療薬；ベラレゾール；ベラミン��アメリカツリスガラ；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンザルチン；Ｖｉｔａｘｉｎ（登録商標）；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマー。追加の抗癌剤は５−フルオロウラシル及びロイコボリンである。サリドマイド及びトポイソメラーゼ阻害剤を利用する方法での使用時、これらの２つの薬剤は特に有用である。幾つかの実施形態において、本開示の抗ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、ゲムシタビンと組み合わせて使用される。
【００９８】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるような抗ＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質は、手術の前、間、又は後に投与される。
【００９９】
メソテリン発現の検出及びメソテリン関連の癌の診断の方法
本開示の他の実施形態に従い、インビトロ又はインビボでメソテリンの発現を検出するためのキットが提供される。キットは、前述のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質（例えば、標識された抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体又はその抗原結合フラグメントを含む三重特異性タンパク質）、及びラベルを検出するための１つ以上の化合物を含む。幾つかの実施形態において、ラベルは、蛍光ラベル、酵素ラベル、放射性ラベル、核磁気共鳴活性ラベル、発光ラベル、及び発色団ラベルから成る群から選択される。
【０１００】
場合によっては、メソテリン発現は生体サンプルにおいて検出される。サンプルは、生検、剖検、及び病態の試料由来の組織を含むがこれらに限定されない任意のサンプルであり得る。生体サンプルはまた、組織の切片、例えば組織学目的のために得られた凍結切片を含む。生体サンプルは更に、血液、血清、血漿、痰、髄液、又は尿などの体液を含む。生体サンプルは、ヒト又は非ヒト霊長類などの哺乳動物から典型的に得られる。
【０１０１】
一実施形態において、被験体のサンプルを本明細書に開示されるような抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体と接触させることにより、及びサンプルへの単一ドメイン抗体の結合を検出することにより被験体が癌を抱えるかどうか判定する方法が提供される。対照サンプルへの抗体の結合と比較した、サンプルへの抗体の結合の増加は、被験体が癌を抱えていると特定する。
【０１０２】
別の実施形態において、癌と診断された被験体のサンプルを本明細書に開示されるような抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体と接触させることにより、及びサンプルへの抗体の結合を検出することにより、被験体の癌の診断を確認する方法が提供される。対照サンプルへの抗体の結合と比較した、サンプルへの抗体の結合の増加は、被験体の癌の診断を確認する。
【０１０３】
開示された方法の幾つかの例において、三重特異性タンパク質のＭＳＬＮ単一ドメイン抗体は直接標識される。
【０１０４】
幾つかの例において、前記方法は、抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体に特異的に結合する二次抗体をサンプルに接触させる工程；及び二次抗体の結合を検出する工程を含む。対照サンプルへの二次抗体の結合と比較した、サンプルへの二次抗体の結合の増加は、被験体の癌を検出し、又は被験体の癌の診断を確認する。
【０１０５】
場合によっては、癌は、中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、有棘細胞癌、膵臓癌、肝内胆管癌、三種陰性乳癌又は卵巣癌、或いはメソテリンを発現する他のあらゆる種類の癌である。
【０１０６】
幾つかの例において、対照サンプルは、癌のない被験体のサンプルである。特定の例において、サンプルは血液又は組織のサンプルである。
【０１０７】
場合によっては、メソテリンに結合する（例えば特異的に結合する）抗体は、検出可能なラベルにより直接標識される。別の実施形態において、メソテリン（一次抗体）に結合する（例えば特異的に結合する）抗体は標識されず、メソテリンに特異的に結合する抗体に結合可能な二次抗体又は他の分子が標識される。二次抗体は、一次抗体の特異的な種及びクラスに特異的に結合できるように選択される。例えば、一次抗体がラマＩｇＧである場合、二次抗体は抗ラマＩｇＧであり得る。抗体に結合可能な他の分子は、限定されないが、共に市販で入手可能なプロテインＡ及びプロテインＧを含む。抗体又は二次抗体に適したラベルは上述されており、様々な酵素、補欠分子族団、蛍光体、発光材料、磁性薬剤、及び放射性物質を含む。適切な酵素の非限定的な例は、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含む。適切な補欠分子団複合体の非限定的な例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含む；適切な蛍光体の非限定的な例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンを含む。非限定的で典型的な発光材料はルミノールであり；非限定的で典型的な磁性薬剤はガドリニウムであり、非限定的で典型的な放射性ラベルは１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈを含む。
【０１０８】
代替的な実施形態において、メソテリンは、検出可能な物質で標識したメソテリン基準、及びメソテリンに特異的に結合する非標識抗体を利用する競合イムノアッセイによって、生体サンプルにおいてアッセイされ得る。このアッセイにおいて、標識したメソテリン基準、及びメソテリンに特異的に結合する抗体が組み合わせられ、非標識抗体に結合される標識されたメソテリン基準の量が判定される。生体サンプル中のメソテリンの量は、メソテリンに特異的に結合する抗体に結合される標識されたメソテリン基準の量に反比例する。
【０１０９】
本明細書に開示されるイムノアッセイ及び方法は多数の目的のために使用可能である。一実施形態において、メソテリンに特異的に結合する抗体が、細胞培養における細胞中のメソテリンの産生を検出するために使用されてもよい。別の実施形態において、抗体は、組織サンプル、血液又は血清のサンプルなどの生体サンプル中のメソテリンの量を検出するために使用可能である。幾つかの例において、メソテリンは細胞表面メソテリンである。他の例において、メソテリンは、可溶性メソテリン（例えば、細胞培養上清におけるメソテリン、又は血液又は血清のサンプルなどの体液サンプルにおける可溶性メソテリン）である。
【０１１０】
一実施形態において、キットが、血液サンプル又は組織サンプルなどの生体サンプル中のメソテリンの検出のために提供される。例えば、被験体における癌診断を確認するために、生検を実行して組織学的検査のための組織サンプルを得ることができる。代替的に、血液サンプルを得て、可溶性メソテリンタンパク質又はフラグメントの存在を検出することができる。ポリペプチドを検出するためのキットは典型的に、メソテリンに特異的に結合する本開示に係る単一ドメイン抗体を含む。幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖフラグメント、ＶＨドメイン、又はＦａｂなどの抗体フラグメントが、キットに含まれている。更なる実施形態において、抗体は標識される（例えば、蛍光ラベル、放射ラベル、又は酵素ラベルによる）。
【０１１１】
一実施形態において、キットは、メソテリンに結合する抗体の使用手段を開示する教材を含む。説明書が、電子的形態（コンピュータディスケット又はコンパクトディスクなど）に書き込まれてもよく、或いは視覚的なもの（ビデオファイルなど）であってもよい。キットはまた、キットの設計対象となる特定用途を容易にするための付加的な構成要素を含んでもよい。故に、例えばキットは、ラベルを検出する手段（酵素ラベルのための酵素基質、蛍光ラベル検出用のフィルタセット、二次抗体などの適切な第２のラベルなど）を付加的に含んでもよい。キットは付加的に、緩衝剤、及び特定の方法の実施に慣例的に使用される他の試薬を含んでもよい。そのようなキット及び適切な内容物は当業者に周知である。
【０１１２】
一実施形態において、診断キットはイムノアッセイを含む。イムノアッセイの詳細は利用される特定のフォーマットにより変動し得るが、生体サンプル中のメソテリンを検出する方法は通常、免疫学的反応条件下でメソテリンポリペプチドに特異的に反応する抗体に生体サンプルを接触させる工程を含む。抗体は、免疫複合体を形成するために免疫学的反応条件下で特異的に結合することを可能とされ、免疫複合体（結合抗体）の存在が直接又は間接的に検出される。
【０１１３】
細胞表面マーカーの有無を判定する方法が、当該技術分野で周知である。例えば、抗体は、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物又は薬物を含むがこれらに限定されない、他の化合物へと抱合され得る。抗体はまた、限定されないが放射免疫定量法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、又は免疫組織化学アッセイなどのイムノアッセイにおいて利用可能である。抗体はまた、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）に使用可能である。ＦＡＣＳは、細胞を分離又は選別するために、他のより洗練された検出レベルの中で、複数の色チャネル、低角度及び鈍角の光散乱検出チャネル、及びインピーダンスチャネルを利用する（米国特許５，０６１，６２０号を参照）。本明細書に開示されるようなメソテリンに結合する単一ドメイン抗体の何れかは、これらのアッセイに使用可能である。故に、抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学的検査、ウエスタンブロット、又は免疫沈降法を含むがこれらに限定されない、従来のイムノアッセイに使用可能である。
【実施例】
【０１１４】
実施例１：幾つかの例示的なＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の結合及び細胞毒性活性を評価する方法
【０１１５】
タンパク質産生
三重特異性分子の配列を、リーダー配列が先行し、６ｘヒスチジンタグが後続する、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ  ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローン化した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４５２７）は、Ｅｘｐｉ  ２９３培地中の０．２〜８ｘ１ｅ６細胞／ｍＬ間でＯｐｔｉｍｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆｌａｓｋｓ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）の懸濁液中で維持された。精製されたプラスミドＤＮＡを、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４６３５）プロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞へとトランスフェクトし、トランスフェクション後４−６日間維持した。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞からの、調製培地中の試験されている典型的な三重特異性タンパク質の量を、プロテインＡチップを備えたＯｃｔｅｔ器機を使用し、且つ標準曲線に対して対照の三重特異性タンパク質を使用して、定量した。
【０１１６】
細胞毒性アッセイ
【０１１７】
ヒトＴ細胞依存性細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイを使用して、Ｔ細胞が腫瘍細胞を死滅させるよう導く、三重特異性分子を含むＴ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒｓ）の能力を測定した（Ｎａｚａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５．  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ２０：５１９−２７）。このアッセイにおいて、Ｔ細胞及び標的癌細胞株の細胞を、３８４ウェルのプレートにおいて１０：１の比率で一緒に混合し、試験される様々な量の三重特異性タンパク質を加える。腫瘍細胞株を操作して、ルシフェラーゼタンパク質を発現させる。４８時間後、残る生存可能な腫瘍細胞を定量するために、Ｓｔｅａｄｙ−ＧｌｏＲ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。
【０１１８】
本研究において、調整培地の滴定をＴＤＣＣアッセイ（Ｔ細胞依存性細胞の細胞毒性試験）に加えて、抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体が、Ｔ細胞と、メソテリンを発現する卵巣癌細胞株、即ちＯＶＣＡＲ８との間にシナプスを形成することができるかどうかを評価した。ＯＶＣＡＲ８細胞の生存率を４８時間後に測定した。三重特異性タンパク質がＴ細胞死滅を媒介したことを確認した。図２は、三重特異性タンパク質２Ａ２及び２Ａ４の試験による細胞生存率アッセイの例を示す。試験三重特異性タンパク質のＴＤＣＣ活性に対するＥＣ５０を、以下表１に列挙する。
【０１１９】
【表１】
2020519643.tif 000003
【０１２０】
更に、試験されている三重特異性タンパク質が、メソテリンを発現しないＬＮＣａＰ細胞のＴ細胞死滅を媒介しなかったことから、試験されているＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のＴＤＣＣ活性はメソテリンを発現する細胞に特異的であったことを、観察した。特に三重特異性タンパク質２Ａ２、１１Ｆ３、９Ｈ２、５Ｃ２、１０Ｂ３、２Ｆ４、５Ｆ２、７Ｆ１、２Ｆ４、５Ｈ１、３Ｂ４、及び７Ｈ２は、ＬｎＣａＰ細胞による抗（ａｎｔ）ＴＤＣＣ活性も示さなかった。
【０１２１】
実施例２：異種移植片腫瘍モデル
先の実施例のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質を異種移植片モデルにおいて評価する。
【０１２２】
メスの免疫不全ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスを、致死量以下で照射し（２  Ｇｙ）、１×１０６のＮＣＩ−Ｈ２８細胞を右背側側腹部の皮下に接種させる。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３に達すると、動物を３つの処置群へと割り当てる。群２と３（各々８匹の動物）に、１．５×１０７の活性化したヒトＴ細胞を腹腔内注入する。３日後、群３の動物を引き続き、実施例１の５０μｇのＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質（ｑｄｘ９ｄ）の合計９回の静脈内投与で処置する。群１と２をビヒクルのみで処置する。体重と腫瘍体積を３０日間測定する。
【０１２３】
先の実施例のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質で処置した動物は、各ビヒクルで処置した対照群と比較して腫瘍成長が統計的に著しく遅延していることが予想される。
【０１２４】
実施例３：卵巣癌患者への実施例１のＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の投与に対する概念実証臨床試験プロトコル
これは、卵巣癌に対する処置としての実施例１のＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質を試験するための第Ｉ／ＩＩ相臨床試験である。
【０１２５】
研究成果：
【０１２６】
一次：以前の実施例のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の最大耐量
【０１２７】
二次：以前の実施例のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のインビボでの反応が臨床反応に関連するかどうかを判定すること
【０１２８】
第Ｉ相
【０１２９】
最大耐用量（ＭＴＤ）は、試験の第Ｉ相のセクションで判定される。
１．１  最大耐用量（ＭＴＤ）は、試験の第Ｉ相のセクションで判定される。
１．２  適格基準を満たす患者は、以前の実施例のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の試験にエントリーする。
１．３  目標は、参加者への重度の又は対処不可能な副作用なしに安全に投与可能な、以前の実施例のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の最大投与量を同定することである。
与えられる投与量は、先の試験に登録された参加者の数、及び、投与量に対してどれほど十分に耐性があるかに依存する。全ての参加者が同じ投与量を受けるとは限らない。
【０１３０】
第ＩＩ相
２．１  続く第ＩＩ相のセクションでは、以前の実施例のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の治療薬による治療の結果が少なくとも２０％の反応率となるかどうかを判定することを目標として、ＭＴＤにて処置が行われる。
第ＩＩ相に対する一次結果−−−以前の実施例のＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質の治療の結果、患者の少なくとも２０％が臨床反応（爆発的な反応、軽微な反応、部分的な反応、又は完全な反応）を達成するかどうかを判定する
【０１３１】
適格性：
現行のＷｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ２０１４に従い卵巣癌が組織学的に確認されている
上皮表面−間質性腫瘍
性索−間質性の腫瘍
胚細胞腫瘍
悪性、特定不能
年齢≧１８歳
平均寿命≧６週間
【０１３２】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され且つ記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、及び置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びその同等物の範囲内の方法及び構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【０１３３】
実施例４：ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣは、Ｔ細胞がＭＳＬＮ発言卵巣癌細胞を死滅させるよう導く
ヒトＴ細胞依存性細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイを使用して、Ｔ細胞が腫瘍細胞を死滅させるよう導く、三重特異性分子を含むＴ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒｓ）の能力を測定した（Ｎａｚａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５．  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ２０：５１９−２７）。このアッセイに使用されるＣａｏｖ３細胞を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。５つの異なる健康なドナー（ドナー０２、ドナー８６、ドナー４１、ドナー８１、及びドナー３４）からのＴ細胞及び標的癌細胞Ｃａｏｖ３を共に混合し、様々な量の本開示の例示的な三重特異性分子であるＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）を加え、混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。Ｃａｏｖ３細胞及びＴ細胞も、ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子、ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）により３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、残る生存可能な腫瘍細胞を、発光アッセイによって定量した。
【０１３４】
ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子が、（図３に示されるように）５人全ての健康なドナーのＴ細胞に標的癌細胞Ｃａｏｖ３を死滅させるよう導くことができ、一方で対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子が、（図３に示されるように）５つの健康なドナーの何れかのＴ細胞にＣａｏｖ３細胞を死滅させるよう導くことができなかったことが、観察された。
【０１３５】
上記のような同じプロトコルを使用する更なるアッセイを、ＯＶＣＡＲ３細胞を使用して実行した。  ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子が、（図４に示されるように）５人全ての健康なドナーのＴ細胞に標的癌細胞ＯＶＣＡＲ３を死滅させるよう導くことができ、一方で対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子が、（図４に示されるように）５つの健康なドナーの何れかのＴ細胞にＯＶＣＡＲ３細胞を死滅させるよう導くことができなかったことが、観察された。
【０１３６】
標的細胞を発現するＭＳＬＮの死滅に対するＥＣ５０値を以下の表ＩＩに列挙する。
【０１３７】
【表２】
2020519643.tif 000004
【０１３８】
実施例５：ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣは、Ｔ細胞が、ＭＳＬＮを発現しない細胞ではなくＭＳＬＮを発現する細胞を死滅させるよう導く
このアッセイにおいて、健康なドナーのＴ細胞を、ＭＳＬＮを発現する標的癌細胞（Ｃａｏｖ３細胞、Ｃａｏｖ４細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、及びＯＶＣＡＲ８細胞）、又はＭＳＬＮを発現しない標的癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞、ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞）でインキュベートした。この研究に使用される標的細胞の各々を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。様々な量のＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）分子を上述のＴ細胞と標的癌細胞の混合物に加えた。混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、残る生存可能な標的癌細胞を、発光アッセイによって定量した。
【０１３９】
ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子が、Ｔ細胞にＭＳＬＮを発現する標的癌細胞（即ち、図５に示されるような、Ｃａｏｃ３、Ｃａｏｖ４、ＯＶＣＡＲ３、及びＯＶＣＡＲ８細胞）を死滅させるよう導くことができたことを、観察した。しかし、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子は、Ｔ細胞に、図５にも示されるＭＳＬＮを発現しない標的癌細胞（ＭＤＡＰＣａ２ｂ及びＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞）を死滅させるよう導くことができなかった。
【０１４０】
ＭＳＬＮを発現する癌細胞の死滅に対するＥＣ５０値を以下の表ＩＩＩに列挙する。
【０１４１】
【表３】
2020519643.tif 000005
【０１４２】
実施例６：ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣは、カニクイザル由来のＴ細胞がヒト卵巣癌細胞株を死滅させるよう導いた
このアッセイにおいて、カニクイザルドナーからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ；Ｔ細胞はＰＢＭＣの構成要素である）を、ＭＳＬＮを発現する細胞（ＣａＯＶ３細胞及びＯＶＣＡＲ３細胞）と混合し、様々な量のＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）を混合物に加え、３７℃で４８時間インキュベートした。並行して、カニクイザルＰＢＭＣ及びＭＳＬＮ発現細胞の混合物を、上述のように、３７℃で４８時間、ＧＦＰを標的とする様々な量の対照ＴｒｉＴＡＣ分子ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）でインキュベートした。このアッセイに使用される標的癌細胞を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。４８時間後、残る生存可能な標的細胞を、発光アッセイによって定量した。
【０１４３】
ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子は、図６に示されるようにカニクイザルＰＢＭＣにＭＳＬＮ発現細胞（即ち、Ｃａｏｖ３及びＯＶＣＡＲを効率よく死滅させるよう導くことができ、一方で対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子は、（図６に示されるように）カニクイザルＰＢＭＣに細胞を死滅させるよう導くことができなかったことを、観察した。ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子に対するＥＣ５０値は、ＯＶＣＡＲ３細胞では２．９ｐＭ、及びＣａｏｖ３細胞では３．０ｐＭであり、これらは、表ＩＩに示されるように、ヒトＴ細胞で観察されたＥＣ５０値とは大きく相違しなかった。
【０１４４】
実施例７：ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子は、ヒト血清アルブミンの存在下又は不在下でＴ細胞によるＭＳＬＮを発現するＮＣＩ−Ｈ２０５２中皮腫細胞の死滅を導いた
この研究の目標は、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子によるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への結合が、Ｔ細胞にＭＳＬＮを発現する細胞を死滅させるよう導くＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子の能力に影響を与えたかどうか評価することであった。この研究に使用されるＮＣＩ−Ｈ２０５２中皮腫細胞を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。健康なドナーのＴ細胞及びＭＳＬＮ発現細胞（ＮＣＩ−Ｈ２０５２）を組み合わせ、様々な量のＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）分子を混合物に加えた。混合物をＨＳＡの存在下又は不在下で、３７℃で４８時間インキュベートした。ＮＣＩ−Ｈ２０５２細胞及びＴ細胞の混合物も、ＨＳＡの存在下で、ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子、ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）により３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、残る生存可能な標的細胞を、発光アッセイによって定量した。
【０１４５】
ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子は、ＨＳＡの存在下又は不在下で（図７に示されるように）Ｔ細胞にＮＣＩ−Ｈ２０５２細胞を死滅させるよう効率よく導くことができ、一方で対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子は、（図７に示されるように）細胞の死滅を導くことができなかったことを、観察した。ＨＳＡの存在下で、細胞死滅に関するＥＣ５０値は、（表ＩＶに示されるように）約３．２倍増加したことも観察した。
【０１４６】
更に、ＴＤＣＣアッセイを、追加のＭＳＬＮ発現細胞株を用いて、１５ｍｇ／ｍｌのＨＳＡの存在下又は不在下で、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子により実行し、ＥＣ５０値を表ＩＶに提示する。
【０１４７】
【表４】
2020519643.tif 000006
【０１４８】
実施例８：４つの異なるドナーからのＴ細胞は、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ及びＭＳＬＮ発現Ｃａｏｖ４細胞の存在下でＴＮＦ−αを分泌する
このアッセイに使用される標的癌細胞ＣａＯｖ４を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。このアッセイにおいて、４つの異なる健康なドナー（ドナー０２、ドナー８６、ドナー３５、及びドナー８１）からのＴ細胞及びＣａｏｖ４細胞を共に混合し、様々な量のＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）を加え、混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。Ｃａｏｖ４細胞及びＴ細胞も、ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子、ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）により３７℃で４８時間インキュベートした。発光アッセイを使用して標的癌細胞の生存率を測定する前に、ＴＤＣＣアッセイからの調整培地を４８時間で集めた。調整培地中のＴＮＦ−αの濃度を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。
【０１４９】
ＴＮＦ−αは、図８に示されるように、Ｃａｏｖ４細胞及びＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子の存在下で培地に分泌されたが、Ｃａｏｖ４細胞及び対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子の存在下では分泌されなかったことを、観察した。
【０１５０】
更に、効率的な死滅を、対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子の存在下ではなく、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子の存在下で、４人全ての健康なドナーからのＴ細胞により観察した。ＴＤＣＣアッセイも追加のＭＳＬＮ発現細胞株（Ｃａｏｖ３細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、及びＯＶＣＡＲ８細胞）に対して設定し、同様のＴＮＦ−α発現を観察した。ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣで誘導されるＴＮＦ−αの発現に対するＥＣ５０値を、表Ｖに提示する。しかし、アッセイを、ＭＳＬＮを発現しない癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞、又はＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞）を使用して実行したとき、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣにより導かれたＴＮＦ−αの分泌は観察されなかった（図示せず）。故に、この研究は、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子がＭＳＬＮ発現標的癌細胞の存在下でＴ細胞を活性化することができたことを実証した。
【０１５１】
【表５】
2020519643.tif 000007
【０１５２】
実施例９：ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ及びＭＳＬＮ発現ＯＶＣＡＲ８細胞の存在下での４つの異なるドナーからのＴ細胞上でのＣＤ６９発現の活性化
このアッセイに使用されるＯＶＣＡＲ８細胞を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。このアッセイにおいて、４つの異なる健康なドナー（ドナー０２、ドナー８６、ドナー３５、及びドナー８１）からのＴ細胞及びＯＶＣＡＲ８細胞を共に混合し、様々な量のＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）を加え、混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。ＯＶＣＡＲ８細胞及びＴ細胞も、ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子、ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）により３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、Ｔ細胞を集め、Ｔ細胞上でのＣＤ６９発現をフローサイトメトリーによって測定した。
【０１５３】
ＣＤ６９発現を、図９に示されるように、陰性対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ及びＯＶＣＡＲ８細胞の存在下ではなく、ＯＶＣＡＲ８細胞及びＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子の存在下で、４人全ての健康なドナーからのＴ細胞上で検出した。ＴＤＣＣアッセイも追加のＭＳＬＮ発現細胞（Ｃａｏｖ３細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、及びＯＶＣＡＲ８細胞）に対して設定し、同様のＣＤ６９発現を観察した。Ｃａｏｖ３細胞及びＯＶＣＡＲ８細胞におけるＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣで誘導されたＣＤ６９の活性化に対するＥＣ５０値を表ＶＩに提示する。
【０１５４】
【表６】
2020519643.tif 000008
【０１５５】
アッセイを、ＭＳＬＮを発現しない癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞、又はＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞を使用して実行したとき、ＭＨ６Ｔで誘導されるＣＤ６９の活性化は観察されなかった（図示せず）。故に、この研究は、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子がＭＳＬＮ発現標的癌細胞の存在下でＴ細胞を活性化することができたことを実証した。
【０１５６】
実施例１０：ＭＳＬＮ発現／非発現細胞株に結合するＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの測定
この研究のために、ＭＳＬＮを発現する特定の標的癌細胞（Ｃａｏｖ３細胞、ＣａＯＶ４細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、及びＯＶＣＡＲ８細胞）及びＭＳＬＮを発現しない特定の癌細胞（ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞及びＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞）を、ＭＨ６  ＴｒｉＴＡＣ分子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）又は対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、未結合のＭＨ６Ｔ又はＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子を取り除き、ＴｒｉＴＡＣ分子の抗アルブミンドメインを認識できる、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７に抱合される二次抗体で更にインキュベートした。ＭＳＬＮ発現又は非ＭＳＬＮ発現細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ又はＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣの結合を、フローサイトメトリーによって測定した。
【０１５７】
ＭＳＬＮを発現する細胞株（Ｃａｏｖ３、Ｃａｏｖ４、ＯＶＣＡＲ３、及びＯＶＣＡＲ８）へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子の強力な結合が、図１０Ａに見られるように観察され（左上パネルはＣａｏｖ３細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合を示し；右上パネルはＣａｏｖ４細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合を示し；左下パネルはＯＶＣＡＲ３細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合を示し；右下パネルはＯＶＣＡＲ８細胞のＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣへの結合を示す）；及び、図１０Ｂに示されるように、ＭＳＬＮを発現しない細胞株では結合は観察されなかった（左パネルはＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合の欠如を示し、右パネルはＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合の欠如を示す）。更に、結合は、図１０Ａ及び１０Ｂの両方に示されるように、細胞型の何れかがＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子でインキュベートされたときに観察されなかった。
【０１５８】
実施例１１：ドナーからのＴ細胞に結合するＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの測定
この研究のために、４つの健康なドナーからのＴ細胞を、陰性対照としてＭＨ６  ＴｒｉＴＡＣ分子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）又は緩衝液によりインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、未結合のＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子を取り除き、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子の抗アルブミンドメインを認識できる、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を抱合した二次抗体で更にインキュベートした。細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合をフローサイトメトリーによって測定した。
【０１５９】
ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子で処置した４つ全てのドナーからのＴ細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合は、図１１に示されるように観察された（左上パネルはドナー２のＴ細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合を示し；右上パネルはドナー３５のＴ細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合を示し；左下パネルはドナー４１のＴ細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合を示し；右下パネルはドナー８１のＴ細胞へのＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの結合を示す）。
【０１６０】
実施例１２：ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子で処置したマウスにおける腫瘍成長の阻害
この研究のために、１０７のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞及び１０７のヒトＰＢＭＣを、ＮＣＧマウスの２つの群（群ごとに８匹のマウス）において共に皮下移植した。５日後、１つの群のマウスに、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）を、１０日間毎日（５−１４日目）、０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量で注入し；他の群のマウスにはビヒクル対照を注入した。腫瘍堆積を数日毎に測定し、３６日目に試験を終了した。図１２に示されるように、ビヒクル対照を注入されたマウスと比較して腫瘍成長の有意な阻害を、ＭＨ６  ＴｒｉＴＡＣ分子を注入されたマウスにおいて観察した。
【０１６１】
実施例１３：カニクイザルにおけるＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの薬物動態
この研究のために、２匹のカニクイザルに、１０ｍｇ／ｋｇの投与量のＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）を静脈内注入し、血清サンプルを注入後の様々な時点で集めた。血清中のＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣの量を、電気化学発光アッセイにおいて、ＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子を認識する抗イディオタイプ抗体を使用して測定した。図１３は、様々な時点での血清Ｍ６ＨＴ  ＴｒｉＴＡＣレベルのプロットを示す。その後、このデータを使用して、表ＶＩＩで提供されるようにＭＨ６Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ分子の薬物動態特性を算出した。
【０１６２】
【表７】
2020519643.tif 000009
【０１６３】
実施例１４：最大活性に対するＣＤ３ε結合親和性の最適化、及び本開示の２つの典型的な三重特異性分子の曝露
本開示の２つの典型的な三重特異性分子、ＴｒｉＴＡＣ  ７４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）及びＴｒｉＴＡＣ  ７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）の、ＣＤ３ε、ＭＳＬＮ、及びアルブミン結合親和性を、この研究のために測定した。ＴｒｉＴＡＣ７４は、図１４に示されるように、２つの分子の結合親和性が腫瘍標的（ＭＳＬＮ）及びアルブミンに対して同様であったとしても、ヒトＣＤ３εの結合においてＴｒｉＴＡＣ７５よりも約５倍強力であったことを観察した。加えて、ＴＤＣＣアッセイを、ＳＫＯＶ３及びＯＶＣＡＲの細胞を使用して、ＴｒｉＴＡＣ  ７４及びＴｒｉＴＡＣ  ７５分子により実行した。図１４は、ＴＤＣＣアッセイにおいて得られたＥＣ５０値を示す。
【０１６４】
ＣＤ３ε親和性における差異は、表ＶＩＩＩで提供される、（０．０２ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス投与量で）ＴｒｉＴＡＣ分子をカニクイザルに注入した後の薬物動態アッセイにおいて測定されるように、ＴｒｉＴＡＣ  ７５と比較してＡＵＣをおよそ３０％〜５０％増大させたことが分かった。ＴｒｉＴＡＣ分子の血中濃度を、抗イディオタイプ抗体を伴うＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイを使用して、注射後の様々な時点で測定した。ＭＳＤアッセイを、ｎ＝２の反復を使用して実行した。ＭＳＤアッセイで観察された血中濃度を図１５に示し、薬物動態パラメータを表ＶＩＩＩに列挙する。
【０１６５】
【表８】
2020519643.tif 000010
【０１６６】
【表９−１】
2020519643.tif 000011
【０１６７】
【表９−２】
2020519643.tif 000012
【０１６８】
【表９−３】
2020519643.tif 000013
【０１６９】
【表９−４】
2020519643.tif 000014
【０１７０】
【表９−５】
2020519643.tif 000015
【０１７１】
【表９−６】
2020519643.tif 000016
【０１７２】
【表９−７】
2020519643.tif 000017
【０１７３】
【表９−８】
2020519643.tif 000018
【０１７４】
【表９−９】
2020519643.tif 000019
【０１７５】
【表９−１０】
2020519643.tif 000020
【０１７６】
【表９−１１】
2020519643.tif 000021
【０１７７】
【表９−１２】
2020519643.tif 000022
【０１７８】
【表９−１３】
2020519643.tif 000023
【０１７９】
【表９−１４】
2020519643.tif 000024
【０１８０】
【表９−１５】
2020519643.tif 000025
【０１８１】
【表９−１６】
2020519643.tif 000026
【０１８２】
【表１０】
2020519643.tif 000027
【０１８３】
【表１１】
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【０１８４】
【表１２】
2020519643.tif 000029
【０１８５】
【表１３】
2020519643.tif 000030
【０１８６】
【表１４】
2020519643.tif 000031
【０１８７】
【表１５】
2020519643.tif 000032
【０１８８】
【表１６】
2020519643.tif 000033
【図１】
2020519643.tif 000034
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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