(57)【要約】  本発明は、改変グリコシル化受容部位をもつ免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。具体的に言うと、本発明は、選択されたグリカンで修飾された免疫グロブリン可変ドメインタンパク質、およびその特定のグリカン抱合体を提供する。また本明細書に提供されるのには、グリコシル化された免疫グロブリン可変ドメインおよびそのグリカン抱合体の産生のための方法もある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＩＶＤが、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、以下の式（１）：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）に従って含むアミノ酸配列を含み、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸範囲８３〜８８から選択されるアミノ酸に、および／または、アミノ酸範囲２７〜４０から選択されるアミノ酸に存在するグリコシル化受容部位を有する、前記ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
該ＩＶＤが、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）である、請求項１に記載のＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項３】
該ＩＶＤのグリコシル化受容部位が、Ｎ−グリコシル化され得るアスパラギン残基である、請求項１または２に記載のＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
ＩＶＤが、ＮＸＴ、ＮＸＳ、ＮＸＣまたはＮＸＶモチーフ（前記モチーフ中Ｘは、いずれのアミノ酸でもあり得る）を、ＮＸＴ／ＮＸＳ／ＮＸＣ／ＮＸＶモチーフのアスパラギン残基が、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸範囲８３〜８８から選択されるアミノ酸におよび／またはアミノ酸範囲２７〜４０から選択されるアミノ酸に存在するように、含有する、請求項３に記載のＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項５】
ＩＶＤが、ＩＶＤ中、（AHoナンバリング規則に従って）位置１４および／または４８などに、追加のグリコシル化受容部位を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項８】
細胞が、哺乳動物の細胞もしくは植物細胞などの高等真核細胞、糸状菌細胞もしくは酵母細胞などの下等真核細胞、または原核細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
細胞が、糖鎖改変細胞である、請求項７または８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列にコードされるＩＶＤを含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
グリコシル化されており、かつ１以上のグリカンを含む、請求項１０に記載のＩＶＤを含むポリペプチドであって、前記グリカンが、末端のＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸、グルコース、グルコサミン、ガラクトサミン、バシロサミン、マンノースもしくはマンノース−６−Ｐ糖、またはＧａｌＮＡｚ、ＧｌｃＮＡｚおよびアジド−シアル酸などの化学修飾単糖類を有する、前記ＩＶＤを含むポリペプチド。
【請求項１２】
該ポリペプチドのグリコシル化が、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃ、シアリル−ＬａｃＮＡｃ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、高(hyper-)マンノシル化グリカン、マンノース−６−リン酸グリカン、複合グリカン、ハイブリッドグリカン、およびＧｌｃＮＡｚ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｚ、アジド−シアル酸−ＬａｃＮＡｃなどの化学修飾グリカンからなる群から選択される１以上のグリカンからなる、請求項１０に記載のＩＶＤを含むポリペプチド。
【請求項１３】
グリカン特異的抱合のための、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、および被抱合成分を含む、ＩＶＤ抱合体。
【請求項１５】
該被抱合成分が、Ｎ連結型グリカンへ接続されている、請求項１４に記載のＩＶＤ抱合体。
【請求項１６】
被抱合成分が、半減期延長成分、治療剤、検出ユニットまたは標的化成分を含む、請求項１４または１５に記載の抱合体。
【請求項１７】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生する方法であって、該方法が、請求項６に記載の発現ベクターを好適な細胞に導入すること、該ポリペプチドを発現すること、およびこれを単離することを含む、前記方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のＩＶＤ抱合体を産生する方法であって、該方法が、請求項６に記載の発現ベクターを好適な細胞に導入すること、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現すること、および被抱合成分をポリペプチドへ連結することを含む、前記方法。
【請求項１９】
循環半減期をモジュレートするための、糖タンパク質安定性を増大させるための、選択的標的化のための、免疫原性をモジュレートするための、抗体の事前結合を防止するための、もしくは検出目的のための、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＩＶＤを含むポリペプチドの、または請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のＩＶＤ抱合体の使用。
【請求項２０】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項１４もしくは１６に記載のＩＶＤ抱合体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本願は、グリコシル化工学の分野に、より具体的には、免疫グロブリンドメインおよびグリコシル化されたその誘導体に関する。とりわけ、本発明は、改変グリコシル化受容部位をもつ免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。結果的に、本発明は、選択されたグリカンで修飾された免疫グロブリン可変ドメインタンパク質、およびその特定のグリカン抱合体を提供する。また本明細書に提供されるのには、グリコシル化された免疫グロブリン可変ドメインおよびそのグリカン抱合体の産生のための方法もある。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
組み換え抗体技術の分野は、主にこれらのヒトへの治療的な使用に対する関心のため、この２０年の間に急速に進展した。特定のヒト抗体の、ディスプレー技術による選択能、ならびに分子進化によるそれらの親和性、安定性、および発現レベルの改善能はさらに、この分野を押し上げた。全抗体は、重鎖および軽鎖からなる複合分子である。単離された抗体の重鎖および軽鎖は抗原結合特異性を保持し得るが、それらの親和性および可溶性はしばしば、低減している。
【０００３】
しかしながら、重（ＶＨ）鎖および軽（ＶＬ）鎖の対をなすＮ末可変ドメインは、抗原結合には充分である。かかる抗体フラグメントは、一価抗体フラグメント（Ｆａｂ）として、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として産生され得るが、これらのＶＨおよびＶＬドメインは、ポリペプチドリンカーによって結び合わされている。ラクダ科の動物が、軽鎖がない機能的抗体を産生するという偶然の発見（Hamers-Casterman et al (1993) Nature 363:446-448）は、この分野において新しい考え方を形成した。なぜなら、その後に、それらの単一Ｎ末ドメイン（ＶＨＨ、またNanobody（登録商標）とも称される）が、ドメインの対形成(pairing)を要さずに抗原に結合することが示されたからである。これら重鎖のみの抗体はまた、ＣＨ１ドメインも欠いている。ＣＨ１ドメインは、従来の抗体において、軽鎖に結び付き、その程度は低いが(to a lesser degree)ＶＨドメインと相互作用する。
【０００４】
後に、かかる単一ドメイン抗体はまた、具体的な軟骨魚においても同定された（Greenberg et al (1995) Nature 374:168-173）。これはしばしば、ＶＨＨと一緒に、免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体（ＩＳＶＤ）と指定される。ＩＳＶＤは、これらの小さなサイズ、高い安定性、遺伝子融合による改変の容易さ、および微生物中の良好な産生レベルのおかげで、興味深い治療実現性を提起する。Nanobodies（登録商標）が真核細胞中に産生されたとき、これらの約１０分の１は、グリコシル化されている（Functional Glycomics, June 11, 2009を参照）。しかしながら、グリコシル化は一般に、ＩＳＶＤの産生では避けられるものであり、ゆえにグリコシル化受容部位は、グリカンの存在が不均一性を導入し得るから突然変異させられているが、しかしこれはまた、折り畳みおよび抗原認識に干渉し得るものでもある。またＩＳＶＤの小さいサイズは、それらが患者へ投与されたとき循環(circulation)から急速にクリアランスされることから、治療的な不利な点でもある。
【０００５】
他方、ＩＳＶＤの小さいサイズは、ＩＳＶＤを半減期延長(half-life extension)分子へカップリングするか、または特定の薬物（例として、抗体−薬物抱合体の形成）もしくはトレーサーへカップリングするための好機を与える。様々なカップリング方法は、当該技術分野において記載されており（例として、とくにモノクローナル抗体の改変の分野において適用されており）、これらの技術は、アシル化もしくはアルキル化の夫々による一級アミン基（リシン残基およびＮ末端）を介するかまたはシステインを介する抱合に注目している。しかしながら、抱合の部位制御は一般に低く、完全な均一性は滅多に得られない。モノクローナル抗体のグリカン特異的な抱合は、Synaffix BV（例えば、WO2014065661、WO2015057065、およびWO2015057064を参照）によって記載されるとおり、より高い(more)均一性を与えるが、しかしこのストラテジーは、グリカンが、さらなる化学的カップリングに好適であるという前に、in vitroで調製されなければならないという事実に悩まされている。
【０００６】
ＩＳＶＤにおいて、これらＩＳＶＤの結合機能も折り畳み機能も妨害しないグリカン構造で修飾され得る特定の部位を同定することが所望されるであろう。このことは、好適な産生系において産生されるとき、効率的なグリコシル化に繋がり、かつ均一で、化学的カップリングにすぐに使えるグルカン構造をもたらすであろう。先行技術において、ＩＳＶＤのグリカンでの修飾は、既存の抗ＶＨ自己抗体への結合を防止するのに有用であることが示された（例えば、WO2016150845を参照）。しかしながら、グリコシル化部位の導入のための特定の設計ストラテジーは何ら使用されておらず、その位置も無作為に選ばれたものであって、主にＩＳＶＤのむきだしのＣ末領域に注目したものであった。結果として、ＩＳＶＤの特定の特性に対するグリカンの存在の影響、ならびにグリコシル化の効率は、目下予測不能であり、個々の基準に対して評価されなければならない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の概要
本願の重要な目的は、免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）を含むポリペプチドを提供することであり、ここでＩＶＤは、合理的な設計アプローチを介して同定された特異的選択領域中に存在するグリコシル化受容部位を有する。ＩＶＤ中の特定の領域でのこれら特定のグリコシル化受容部位の存在は、それらのリガンドとのＩＶＤの結合親和性を妨害せずに、かつＩＶＤの折り畳みに干渉せずに、効率的なグリコシル化を可能にさせる。本明細書にさらに解説されるとおりの様々な成分でさらに修飾され得る特定の位置にて均一な形態のグリカンを含む好適な宿主細胞中組み換えで産生され得る。
【０００８】
よって、第１の側面に従うと、以下：ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここでＩＶＤは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、以下の式（１）：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）に従って含むアミノ酸配列；またはいずれのその好適なフラグメントを含み、ここでＩＶＤは、（AHoナンバリング規則(convention)に従って）ＩＶＤのアミノ酸８３〜８８のいずれかおよび／またはアミノ酸２７〜４０のいずれかに存在するグリコシル化受容部位を有する。具体的な側面において、該ＩＶＤは、免疫グロブリン単一可変ドメインである。
【０００９】
ＩＶＤのグリコシル化受容部位は、Ｎ−グリコシル化され得るアスパラギン残基であり得る。具体的に、該ＩＶＤのグリコシル化受容部位は、ＮＸＴ、ＮＸＳ、ＮＸＣ、またはＮＸＶモチーフ（式中Ｘは、プロリン（Ｐ）を除くいずれのアミノ酸でもあり得る）を、ＮＸＴ／ＮＸＳ／ＮＸＣ／ＮＸＶモチーフのアスパラギン残基は、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤの位置８３〜８８のいずれかおよび／または位置２７〜４０のいずれかにて存在するように、含有する。特定の態様において、ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）位置１４および／または４８など、ＩＶＤ中に追加のグリコシル化受容部位を有する。
【００１０】
別の側面において、本発明のヌクレオチド配列にコードされるＩＶＤを含むポリペプチドが、提供される。
他の側面に従うと、該ヌクレオチド配列を含む発現ベクター、および発現ベクターを含む細胞が、提供される。
【００１１】
組み換え細胞は、具体的な態様に従うと、哺乳動物の細胞もしくは植物細胞などの高等真核細胞、糸状菌細胞もしくは酵母細胞などの下等真核細胞、またはある条件において原核細胞でもある。具体的に関連性があるのは(Of particular relevance)、糖鎖改変(glycol-engineered)細胞、具体的に糖鎖改変下等真核細胞である。
【００１２】
より具体的には、本発明に従う高等真核細胞は、脊椎動物細胞、とりわけ哺乳動物の細胞である。例は、これらに限定されないが、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞（例として、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞）を包含する。
これらの細胞を使用すると、合理的に選ばれた特定の部位にてグリカンで修飾されたＩＶＤが、産生され得る。糖鎖改変細胞は、具体的に所望されるグリカンおよび／または均一なグリカンで修飾されたＩＶＤの産生に好ましいところ、具体的に有利である。この均一なグリコシル化プロファイルは、その特性が十分な予測可能である産物が得られるところ、非常に望ましい。
【００１３】
その上、上に記載の細胞は、その細胞中、抱合にとって好ましいＧｌｃＮＡｃグリカン、ＬａｃＮＡｃグリカン、またはシアリル−ＬａｃＮＡｃグリカンで直接修飾されたＩＶＤの産生に有用である。その上、これらの細胞の採用は、均一なグリコシル化プロファイルをもつＩＶＤに繋がる。よって、従来のアプローチを超える具体的な利益は、得られた産物が高度に均一であることから獲得される。これは、さらなる修飾のための開始点としてＧｌｃＮＡｃ残基、Ｇａｌ残基、またはＳｉａ残基を提供する不均一なグリカンのin vitroでの酵素処置を典型的に要する従来のアプローチとは対照的である。高いコストの外に、in vitroでの酵素処置には、不完全な処理、ひいては不均一な産物というリスクがあり得る。別の従来のアプローチは、不均一にグリコシル化されたタンパク質の直接処理に基づくものであって、結果的に、得られる産物は、重ねて(again)、均一性を欠いている。
【００１４】
特定の態様に従うと、本発明に従うポリペプチドは、グリコシル化されたＩＶＤを含む。グリコシル化は、特定の態様に従うと、１以上のグリカンを、１以上のグリカンに存在する末端のＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸、グルコース、グルコサミン、ガラクトサミン、バシロサミン、マンノースもしくはマンノース−６−Ｐ糖(sugar)、またはＧａｌＮＡｚ、ＧｌｃＮＡｚ、もしくはアジド−シアル酸などの化学修飾単糖類(chemically modified monosaccharide)とともに含み得る。
【００１５】
他の特定の態様に従うと、グリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃ（＝ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）、シアリル−ＬａｃＮＡｃ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、複合グリカン、ハイブリッドグリカンおよびＧｌｃＮＡｚ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｚ、およびＬａｃＮＡｃ−アジド−シアル酸（炭水化物の命名法についてはAlan D. McNaught (1996) Pure & Appl. Chem. Vol. 68, No 10, 1919-2008を参照）からなるリストから選択される１以上のグリカンからなる。上に記載のグリカンで、ある位置にて修飾されたＩＶＤは具体的に、グリカン特異的な抱合に有用である。とくに、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃ、またはシアリル−ＬａｃＮＡｃからなるグリコシル化プロファイルは、部位特異的な抱合に有利である。
【００１６】
特定の態様において、本発明に従うポリペプチド、およびグリカンへ抱合された被抱合成分を含むＩＶＤ抱合体が、提供される。合理的に選ばれた位置にてグリカンで修飾されたＩＶＤは、グリカンをベースとした抱合にとって理想的な開始点である。ＩＶＤ上に存在するグリカンへの成分の連結は、例えば、ＩＶＤ抱合体の産生を可能にするが、ここでＩＶＤおよび被抱合成分の比率は明確に定義されている(well-defined)。
【００１７】
とりわけ効率的な抱合を可能にする、均一なグリカンで修飾されたＩＶＤは、さらにいっそう有利である。抱合は、化学的（例として、グリカン構成要素の過ヨウ素酸酸化、およびこれに続く、当該技術分野において知られている方法（オキシムライゲーション、ヒドラゾンライゲーションなど）を介する抱合または還元的アミノ化を介する抱合を使用する）、あるいは酵素的（例として、ガラクトースを酸化するためのガラクトースオキシダーゼ、およびこれに続く、オキシムライゲーション、ヒドラゾンライゲーションを介する抱合または還元的アミノ化を介する抱合を使用する）のいずれかで実施され得る。代わりに、タグ付けされたグリカン残基は組み込まれることで、これに続く抱合反応（例として、突然変異体ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびこれに続く、クリック化学を介する抱合反応を使用する、グリカン鎖中のＧａｌＮＡｚの組み込み）を可能にさせてもよい。
【００１８】
被抱合成分は、半減期延長成分、治療剤、検出ユニット、または標的化成分を含み得る。グリカン抱合の方法論を介する薬物、トレーサー等への抱合のための生体直交型の柄(bio-orthogonal handle)として、本発明に従うＩＶＤ上のグリカンを使用する有利な条件(opportunities)は、本明細書に記載の例に限定されない。
【００１９】
また本願において提供されるのには、本明細書に記載のとおりのＩＶＤを含むポリペプチドおよびＩＶＤ−抱合体を産生する方法もある。具体的に、好適な細胞中、本発明に従うＩＶＤを含むポリペプチドを産生するための方法が提供されるが、以下のステップ：
−  好適な細胞を提供すること
−  該細胞において、本発明に従うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入すること
−  好適な条件においてＩＶＤを含むポリペプチドを発現させること；および
−  ＩＶＤを含むポリペプチドを単離すること
を含む。該方法はさらに、被抱合成分をポリペプチドへ連結することというステップを含み得る。
【００２０】
本発明はまた、ＩＶＤを含むポリペプチドまたはその抱合体を含む組成物にも関する。好ましくは、該組成物は、医薬組成物である。さらにいっそう好ましくは、該組成物はさらに、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含み、および任意に、１つ以上の本発明のポリペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図の簡単な記載
【図１】図１：代表的なＩＳＶＤの３次構造（左）および２次構造のトポロジー（右）、ここでナノボディー（ＰＤＢエントリーｉｄ：3K74からの鎖Ｂ）。数個の仮想領域が、Ｎ連結型グリコシル化シークオン導入（右パネル中、９個の領域が黒色で描かれる）について決定された。
【図２】図２：参照ナノボディーＰＤＢ ｉｄ：3K74（図中のナンバリングは、aHoナンバリングスキームを指す；代わりの（Kabat）ナンバリングについては図９を参照）において、Ｎ連結型グリコシル化シークオンの導入のために選択された１０個の特定の部位（Ｘで示される）。
【００２２】
【図３】図３：ナノボディーＧＢＰの、ナノボディー3K74とのアミノ酸アライメント
【図４】図４：ＧＢＰナノボディーにおけるＮ連結型グリコシル化のサイン(signatures)導入のために選択された特定の部位が描かれている（図中のナンバリングは、aHoナンバリングスキームを指す；代わりの（Kabat）ナンバリングについては図９または１１を参照）。Ｎ−グリコシル化効率が、Ｈｉｓ特異的ウェスタンブロットデータまたは質量分析データに基づき見積もられた。
【図５】図５：Pichia pastoris野生型（ＷＴ）株、GlycoSwitchM5（ＧＳＭ５）株、およびGlycoDelete（ＧＤ）株において発現された、ナノボディーＧＢＰおよびＧＢＰ−Ｒ８６Ｎバリアントのクマシーおよび抗ＨＩＳウェスタンブロット（ＡＨｏナンバリング）。
【００２３】
【図６】図６：Pichia pastoris野生型（ＷＴ）およびGlycoSwitchM5（ＧＳＭ５）において発現された、ＧＢＰのＮ−糖鎖タグ(glycotag)バリアントの、クマシーおよび抗ＨＩＳウェスタンブロット（または同等の専門用語であるＨｉｓ６特異的ウェスタンブロット）分析。試料は、モックで処置された(mock-treated)か、またはＮ−グリカンを除去するためにＰＮＧａｓｅＦで消化されたかのいずれかであった。
【図７】図７：Pichia GlycoSwitchM5（ＧＳＭ５）において発現された、ＧＢＰの９つの「糖鎖バリアント(glycovariants)」のクマシーおよび抗ＨＩＳ ＷＢ分析。試料は、モックで処置されたか、またはＮ−グリカンを除去するためにＰＮＧａｓｅＦで消化されたかのいずれかであった。白色の四角形は、Ｎ（８アミノ酸）末端のまたはＣ（２２アミノ酸）末端の糖鎖タグアミノ酸配列の付加に起因する分子量の増大を示す。
【００２４】
【図８】図８：Pichia pastoris GlycoDelete（ＧＤ）株において産生されたナノボディーＧＢＰ−Ｒ８６ＮのＥＳＩ−ＱＴＯＦ ＭＳ分析。Ｎ−グリコシル化バリアントは、１３６９９Ｄａにて検出される一方、非グリコシル化された画分は、１３４９６Ｄａにて検出される。
【図９】図９：ナノボディーNb 41、F-VHH-4、およびF-VHH-L66と、ナノボディーＧＢＰおよび3K74との配列アライメント
【図１０】図１０：Pichia pastoris野生型（ＷＴ）、GlycoSwitchM5（ＧＳＭ５）、およびGlycoDelete（ＧＤ）において発現された、Nb41およびNb41−Ｋ８６Ｎバリアントのクマシーおよび抗ＨＩＳ ＷＢ分析。試料は、モックで処置されたか、またはＮ−グリカンを除去するためにＰＮＧａｓｅＦで消化されたかのいずれかであった。
【００２５】
【図１１】図１１：ナノボディーＧＢＰグリコシル化部位の概観。
【図１２】図１２：ＧＢＰ糖鎖バリアントの融解曲線。Pichia pastoris GlycoSwitchM5（ＧＳＭ５）（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカン）において産生され、ＩＭＡＣおよびＳＥＣを介して精製され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、上段）またはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、下段）のいずれかにおいて溶離されたナノボディー。ｑＰＣＲ機においてSYPRO Orange染料を使用するサーマルシフト(Thermal shift)アッセイ。
【図１３】図１３：ＧＢＰ Ｎ−グリコシル化バリアント（ＧＢＰ−Ｐ４８Ｎ−Ｋ５０Ｔを除く）は、非修飾ＧＢＰ−ＷＴと同様の特徴をもつそれらの抗原ＧＦＰに結合する。ナノボディーは、Pichia pastoris GlycoSwitchM5（ＧＳＭ５、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカン）において産生され、ＩＭＡＣおよびＳＥＣを介して精製され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）のいずれかにおいて溶離された。バイオレイヤー干渉法(Biolayer interferometry)（ＢＬＩ）が、ストレプトアビジンチップ上に固定化された１００ｎＭ ビオチン化アビタグ(Avitag)−ＧＦＰで実施された。２倍段階希釈のＧＢＰ糖鎖バリアント（８〜０．１２５ｎＭ）に対する親和性が、９６ウェル形式で２５℃にて測定された。親和性パラメータの概要は上に示されて、ForteBio Data Analysis 9.0（エラーバーはＳＥＭを示す）によって算出された。
【００２６】
【図１４】図１４：ＲＳＶ特異的ＶＨＨであるF-VHH-L66についての中和アッセイ。F-VHH-L66は、野生型（ｗｔ）Pichia pastorisと、GlycoSwitchM5（ＧＳＭ５）株およびGlycodelete（ＧＤ）株との両方において産生された。
【図１５】図１５：ナノボディーＧＢＰと、領域２７〜４０（上段）および領域８３〜８８（下段）の糖鎖バリアントとの部分配列アライメント。
【００２７】
【図１６】図１６：Ｎ−グリカンは、ナノボディーＧＢＰ中の２つの選択された領域のうち、事実上いずれの位置でも導入され得るが、しかし部位占有率は可変である。ＧＢＰ糖鎖バリアントは、Pichia pastoris GlycoSwitchM5（ＧＳＭ５）において発現された。すべての組み換えバリアントの上清が回収されて、ＰＮＧａｓｅＦで処置またはモックで処置され、１４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＮ−グリコシル化の存在についてアッセイされ、Bio-Rad TGX染色フリー(stain-free)検出（上段）およびＨｉｓタグ特異的ウェスタンブロット分析（下段）がこれに続いた。野生型ＧＢＰの上清試料、選択された各領域における糖鎖バリアント（領域２７〜４０におけるGBP-P30A-V31N-R33T、および領域８３〜８８におけるGBP-D84N-A85T）、ならびに人工の挿入物（GBP-33-39-longinsert）を含有する糖鎖バリアントが、無傷のタンパク質の(intact protein)質量分析によって分析された（下段右）。後者３つの質量が１２１６Ｄａであることを確認し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカン修飾が図式的に下に示されるとおりに存在する。正規化スペクトルは正規化長（ＮＬ）で示され、ＧＢＰ−ＷＴの場合２．２７Ｅ３、GBP-D83N-A85Tの場合４．２９Ｅ３、GBP-P30T-V31N-R33Tの場合７．６４Ｅ２、およびGBP-33-39-longinsertの場合２．１４Ｅ３。S-S：ジスルフィド単結合、pyroQ：Ｎ末ピログルタミン残基、M5：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカン修飾。
【００２８】
【図１７】図１７：ＬａｃＮＡｃをベースとした過ヨウ素酸酸化を伴う、続くオキシムライゲーションの図式概略図。
【図１８】図１８：シアリル−ＬａｃＮＡｃをベースとした過ヨウ素酸酸化を伴う、続くオキシムライゲーションの図式概略図。
【図１９】図１９：ＧＡＯをベースとしたＬａｃＮＡｃ酸化を伴う、続くオキシムライゲーションの図式概略図。
【図２０】図２０：ＧＡＯ−Ｆ２をベースとしたＧｌｃＮＡｃ酸化を伴う、続くオキシムライゲーションの図式概略図。
【００２９】
【図２１】図２１：アジド修飾形態のＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｚ）の、単一ＧｌｃＮＡｃＮ−グリカンへの化学酵素(chemo-enzymatic)カップリング、続く、歪んだアルキンをもつアジドのクリック化学反応についての図式概略図。
【図２２】図２２：アジド修飾形態のＳｉａ（ＡｚＳｉａ）の、ＬａｃＮＡｃ Ｎ−グリカンへの化学酵素カップリング、続く、歪んだアルキンをもつアジドのクリック化学反応についての図式概略図。
【図２３】図２３：Pichia pastoris野生型（NRRLY11430）、GlycoSwitchM5株、およびGlycoDelete株において産生されたナノボディーF-VHH-4バリアント（上パネル）およびF-VHH-L66バリアント（下パネル）のクマシーおよび抗ＨＩＳウェスタンブロット分析。クマシー分析において、３つの異なるクローンの上清が、各ナノボディー−Pichia株の組み合わせについて試験された；ウェスタンブロット分析については、１つの代表的なクローンの上清が分析された。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な記載
本発明は、具体的な態様に関し、ある図面を参照して記載されるであろうが、しかし本発明はこれらに限定されず、クレームのみによって限定されるものである。クレーム中のいずれの引用符号(reference signs)も、本範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。記載される図面は、概略図でしかなく、非限定的なものである。図面において、要素のいくつかのサイズは、誇張して見せたものもあり、説明目的のためスケール通りに描画されていないものもある。用語「を含む(comprising)」が、本記載およびクレームにおいて使用される場合、他の要素またはステップを排除しない。不明確または明確な項目が、単数名詞、例として「a」または「an」、「the」を参照するときに使用される場合、これは、他にとくに明記されていない限り、その名詞の複数形を包含する。
【００３１】
さらにまた、本記載中および本クレーム中の第１、第２、第３等の用語は、同様の要素どうしを区別するために使用され、必ずしも順序または時系列を記載するために使用されてはいない。そのように使用される用語が適切な状況下で交換可能であること、および本明細書に記載の本発明の態様が本明細書に記載または説明される以外の順番で運用可能であることは、理解されるべきである。
【００３２】
以下の用語または定義は専ら、本発明の理解に役立つために提供されている。本明細書中とくに定義されていない限り、本明細書に使用されるすべの用語は、本発明に係る当業者にとっても同じ意味を有する。実践者は具体的に、当該技術分野の定義および用語について、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012)；およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 114), John Wiley & Sons, New York (2016)を対象にする(directed to)。本明細書に提供される定義は、当業者によって理解されるより小さい範囲を有するものと解釈されるべきではない。
【００３３】
本明細書に使用されるとき、用語「ヌクレオチド配列」は、いずれの長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかのポリマー形態を指す。ヌクレオチド配列は、いずれの３次元構造を有していてもよく、既知または未知のいずれの機能を果たしてもよい。ヌクレオチド配列の非限定例は、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれの配列の単離されたＤＮＡ、制御領域、いずれの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを包含する。ヌクレオチド配列は、直線状であってもよく、または環状であってもよい。
【００３４】
本明細書に使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、コードされているアミノ酸およびコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾ペプチド主鎖(backbones)を有するポリペプチドを包含し得る、いずれの長さのポリマー形態のアミノ酸をも指す。ポリペプチド配列は、ここで下に描かれるとおりたった一文字の（または１文字）アミノ酸コードまたは３文字アミノ酸コードで描かれ得る：
【００３５】
【表１】
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【００３６】
用語「免疫グロブリンドメイン」は、本明細書に使用されるとき、抗体鎖（例として、従来の４鎖抗体の鎖または重鎖抗体の鎖など）の球状領域を、またはかかる球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、２つのベータシート状に配置されて、任意に保存ジスルフィド結合によって安定化されている、約７つの逆平行ベータ鎖の２層サンドイッチからなる、抗体分子の免疫グロブリン折り畳み特徴を保持することを特徴とする。
【００３７】
用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書に使用されるとき、当該技術分野においてかつ本明細書において下に夫々「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」として；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」として；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」として；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」として参照される４つの「フレームワーク領域」であって、当該技術分野においてかつ本明細書において下に夫々「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」として；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」として；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」として参照される３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって中断される前記フレームワーク領域から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味する。よって、免疫グロブリン可変ドメインの一般構造または配列は、以下：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４に示され得る。それは、抗原結合部位を持つことによって抗体へ抗原に対する特異性を授与する免疫グロブリン可変ドメイン（単数または複数）である。
【００３８】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶＤ」と略される）は、用語「単一可変ドメイン」と同等であり、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン上に存在しかつこれによって形成される分子を定義する。これは、「従来の」免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントは別として、２つの免疫グロブリンドメイン、とりわけ２つの可変ドメインが相互作用することで抗原結合部位を形成する免疫グロブリン単一可変ドメインを定める。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、相互作用することで抗原結合部位を形成する。このケースにおいて、ＶＨおよびＶＬ両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原結合部位に寄与するであろう。すなわち合計６つのＣＤＲは、抗原結合部位の形成に関与するであろう。
【００３９】
上の定義の観点から、従来の４鎖抗体（ＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、もしくはＩｇＥ分子など；当該技術分野において知られている）の抗原結合ドメイン、またはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント（ジスルフィド連結ＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメントなど）の抗原結合ドメイン、あるいはかかる従来の４鎖抗体に由来する二重特異性抗体（すべてが当該技術分野において知られている）の抗原結合ドメインは、通常、免疫グロブリン単一可変ドメインとしては見なされないであろう。なぜなら、これらのケースにおいて、抗原の夫々のエピトープへ結合することは、通常、１つの(単一)免疫グロブリンドメインによってではなく、(結び付けられた)免疫グロブリンドメイン（軽鎖および重鎖可変ドメインなど）の対によって、すなわち免疫グロブリンドメインのVH-VL対（夫々の抗原のエピトープへ共同して結合する）によって、生じるからである。
【００４０】
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインとの対形成をせずに、抗原のエピトープへ特異的に結合することが可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨ／ＶＨＨまたはＶＬドメインによって形成されている。ゆえに、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、わずか３つのＣＤＲによって形成されている。
【００４１】
そのため、単一可変ドメインは、単一抗原結合ユニットを形成することが可能である限り（すなわち、本質的に単一可変ドメインからなる機能的な抗原結合ユニットであって、結果として、単一抗原結合ドメインが、別の可変ドメインと相互作用することで機能的な抗原結合ユニットを形成する必要がなくなる）、軽鎖可変ドメイン配列（例として、ＶＬ配列）またはその好適なフラグメント；あるいは重鎖可変ドメイン配列（例として、ＶＨ配列もしくはＶＨＨ配列）またはその好適なフラグメントであってもよい。
【００４２】
本発明の一態様において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列（例として、ＶＨ配列）である；より具体的に言うと、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
【００４３】
例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（単一）ドメイン抗体（もしくは（単一）ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」またはｄＡｂ（もしくはｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、またはNanobody（本明細書に定義されるとおりであって、これに限定されないがＶＨＨを包含する）；他の単一可変ドメイン、またはこれらのいずれか１つの、いずれの好適なフラグメントであってもよい。
【００４４】
とりわけ、免疫グロブリン単一可変ドメインは、Nanobody（登録商標）（本明細書に定義されるとおりの）またはその好適なフラグメントであってもよい。［注記：Nanobody（登録商標）、Nanobodies（登録商標）およびNanoclone（登録商標）は、Ablynx N.V.の登録商標である］Nanobodiesの総記については、さらなる下の記載、ならびに本明細書に引用される先行技術（例として、WO 08/020079（16頁）の記載など）を参照されたい。
【００４５】
「ＶＨＨドメイン」は、またＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、およびＶＨＨ抗体としても知られており、「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖がない抗体」の；Hamers-Casterman et al (1993) Nature 363: 446-448）抗原結合免疫グロブリン（可変の）ドメインとして初めて記載された。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（これは、本明細書中「ＶＨドメイン」または「ＶＨドメイン」と言及される）から、および従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（これは、本明細書中「ＶＬドメイン」または「ＶＬドメイン」と言及される）から区別するために、選ばれた。
【００４６】
ＶＨＨおよびNanobodiesのさらなる記載については、Muyldermans（Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001における総括）による総説、ならびに一般の背景技術として触れられている以下の特許出願：Vrije Universiteit BrusselのWO 94/04678、WO 95/04079、およびWO 96/34103；UnileverのWO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231、およびWO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）のWO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016、およびWO 03/055527；Algonomics N.V.およびAblynx N.V.のWO 03/050531；National Research Council of CanadaによるWO 01/90190；Institute ofAntibodiesによるWO 03/025020（＝EP 1433793）；ならびにAblynx N.V.によるWO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787、およびWO 06/122825、およびAblynx N.V.によってさらに公開された特許出願を参照されたい。
【００４７】
また、これらの出願において触れられているさらなる先行技術、とりわけ国際出願WO 06/040153の41〜43頁に触れられた参考文献のリストも参照されたい。これらのリストおよび参考文献は参照によって本明細書に組み込まれる。これらの参考文献に記載されるとおり、Nanobodies（とりわけＶＨＨ配列および部分的にヒト化されたNanobodies）は、とりわけ、フレームワーク配列の１以上における１以上の「顕著な(Hallmark)残基」の存在によって特徴付けられ得る。Nanobodiesのヒト化および／またはラクダ化、ならびに他の修飾体(modifications)、一部、もしくはフラグメント、誘導体、または「Nanobody融合体」、多価構築物（リンカー配列のいくつかの非限定例を包含する）、およびNanobodiesおよびそれらの調製物の半減期を増加する種々の修飾体を包含する、Nanobodiesのさらなる記載は、例としてWO 08/101985およびWO 08/142164から見出され得る。Nanobodiesのさらなる総記については、本明細書に引用される先行技術（例として、WO 08/020079（16頁）の記載など）を参照されたい。
【００４８】
「ドメイン抗体(Domain antibodies)」は、また「Dabs」、「ドメイン抗体(Domain Antibodies)」、および「dAbs」（用語「ドメイン抗体(Domain Antibodies)」および「dAbs」は、GlaxoSmithKline系の会社による商標として使用されている）としても知られており、例として、EP 0368684、Ward et al.（Nature 341: 544-546, 1989）、Holt et al.（Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003）、およびWO 03/002609、ならびに例えば、Domantis LtdのWO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388、および他の公開された特許出願に記載されている。ドメイン抗体は、本質的に、非ラクダ科の哺乳動物の、とりわけヒトの４鎖抗体のＶＨまたはＶＬドメインに対応する。単一抗原結合ドメインとしてのエピトープに結合するためには、すなわち、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン夫々と対をなさずにエピトープに結合するためには、かかる抗原結合特性にとって特異的な選択が、例としてヒト単一ＶＨまたはＶＬドメイン配列のライブラリを使用することによって、要される。ドメイン抗体は、ＶＨＨのように、およそ１３ｋＤａ〜およそ１６ｋＤａの分子量を有し、完全ヒト配列に由来する場合、例としてヒトにおける治療的使用のためのヒト化を要さない。
【００４９】
また、単一可変ドメインが、ある種のサメに由来し得るものあることも注記すべきことである（例えば、所謂「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えばWO 05/18629を参照）。
【００５０】
よって、本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」は、非ヒト供給源に、好ましくはラクダ科の動物に由来するポリペプチド、好ましくはラクダ科の動物の重鎖抗体を含む。これらは、先に記載のとおり、ヒト化されていてもよい。その上、前記用語は、例として、Davies and Riechmann（FEBS 339: 285-290, 1994；Biotechnol. 13: 475-479, 1995；Prot. Eng. 9: 531-537, 1996）およびRiechmannおよびMuyldermans（J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999）に記載されるとおり、「ラクダ化」されている、非ラクダ科動物の供給源に、例としてマウスまたはヒトに由来するポリペプチドを含む。
【００５１】
ＩＶＤのアミノ酸残基のナンバリングについては、種々のナンバリングスキームが適用され得る。例えば、ナンバリングは、ラクダ科動物からのＶＨＨドメインへ適用されているとおり、Honegger, A.およびPlueckthun, A.（J.Mol.Biol. 309, 2001）によって与えられる、すべての重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のためのAHoナンバリングスキームに従って実施され得る。ＶＨドメインのアミノ酸残基をナンバリングするための代わりの方法は、また類似したやり方でＶＨＨドメインへも適用され得るが、当該技術分野において知られている。例えば、ＦＲ配列およびＣＤＲ配列の描写は、Riechmann, L.およびMuyldermans, S., 231(1-2), J Immunol Methods. 1999の論文においてラクダ科動物からのＶＨＨドメインへ適用されているとおり、Kabatナンバリング系を使用することによってなされ得る。ＣＤＲ領域の決定はまた、種々の方法に従ってなされてもよい。
【００５２】
Kabatに従うＣＤＲ決定において、ＶＨＨのＦＲ１は、アミノ酸残基を位置１〜３０にて含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は、アミノ酸残基を位置３１〜３５にて含み、ＶＨＨのＦＲ２は、アミノ酸を位置３６〜４９にて含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は、アミノ酸残基を位置５０〜６５にて含み、ＶＨＨのＦＲ３は、アミノ酸残基を位置６６〜９４にて含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は、アミノ酸残基を位置９５〜１０２にて含み、およびＶＨＨのＦＲ４は、アミノ酸残基を位置１０３〜１１３にて含む。例のセクションにおいて使用される特定のナノボディーへ適用される２つの異なるナンバリングスキームの概観は、図９または１１に描かれている。しかしながら、本記載およびクレームにおいては、上に記載のとおりAHoに従うナンバリングに倣う。
【００５３】
−ＶＨドメインについて、およびＶＨＨドメインについて、当該技術分野において周知のとおり−ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数が変動してもよく、KabatナンバリングまたはAHoナンバリングによって示されるアミノ酸残基の総数に対応していないくてもよい（つまり、KabatまたはAHoナンバリングに従う１以上の位置は、実際の配列に占有されていなくてもよく、または実際の配列は、KabatナンバリングまたはAHoナンバリングによって考慮される数より多くのアミノ酸残基を含有していてもよい）ことは注記されるべきである。これは、一般に、KabatまたはAHoに従うナンバリングが、実際の配列中のアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応していても、または対応していないくてもよいことを意味する。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、大抵、１１０から１２０までの範囲内、しばしば１１２と１１５との間にあるであろう。しかしながら、より小さい配列およびより長い配列がまた、本明細書に記載の目的にとって好適であってもよいことは注記されるべきである。
【００５４】
ドメイン抗体およびNanobodies（ＶＨＨドメインを包含する）などの免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化に供され得る。とりわけ、Nanobodies（ＶＨＨドメインを包含する）などのヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインは、先の段落において一般に定義されるとおりの免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよいが、前記ドメインにおいて、ヒト化置換（本明細書に定義されるとおり）であるかおよび／またはこれに対応する少なくとも１個のアミノ酸残基（とりわけ、少なくとも１個のフレームワーク残基）が存在する。
【００５５】
潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、密接に関わっている１以上のヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって、解明され得る。その後、こうして決定された潜在的に有用なヒト化置換（またはそれらの組み合わせ）の１以上は、該ＶＨＨ配列中へ（さらに本明細書に記載のとおり、それ自体知られているいずれのやり方においても）導入され得、その結果得られるヒト化ＶＨＨ配列は、標的に対する親和性について、安定性について、発現の容易さおよびそのレベルについて、および／または他の所望される特性について、試験され得る。このように、たかが知れた(a limited degree of)試行錯誤によって(by means of)、他の好適なヒト化置換（またはそれらの好適な組み合わせ）は、本明細書の本開示に基づき、当業者によって決定され得る。また、前の記載にも基づくと、（フレームワーク領域のうち）Nanobody（ＶＨＨドメインを包含する）などの免疫グロブリン単一可変ドメインは、部分的にヒト化されていても、または完全にヒト化されていてもよい。
【００５６】
ドメイン抗体およびNanobodies（ＶＨＨドメインおよびヒト化ＶＨＨドメインを包含する）などの免疫グロブリン単一可変ドメインはまた、１以上のＣＤＲのアミノ酸配列に１以上の変更を導入することによって、親和性成熟にも供され得るが、それらの変更は、その結果得られる免疫グロブリン単一可変ドメインのその夫々の抗原に対して、夫々の親分子と比較して改善された親和性をもたらす。本発明の、親和性が成熟された免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、例えば、Marks et al.（Biotechnology 10:779-783, 1992）、Barbas, et al.（Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994）、Shier et al.（Gene 169: 147-155, 1995）、Yelton et al.（Immunol. 155: 1994-2004, 1995）、Jackson et al.（J. Immunol. 154: 3310-9, 1995）、Hawkins et al.（J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992）、Johnson and Hawkins（Affinity maturation ofantibodies using phage display, Oxford University Press, 1996）によって記載されるとおり、当該技術分野において知られている方法によって調製されてもよい。
【００５７】
免疫グロブリン単一可変ドメイン（ドメイン抗体またはNanobodyなど）から出発して、ポリペプチドを設計／選択するプロセスおよび／または調製するプロセスはまた、本明細書中、該免疫グロブリン単一可変ドメインを「フォーマットする」こととしても言及される；ポリペプチドの一部を構成する免疫グロブリン単一可変ドメインは、「フォーマットされる」か、または該ポリペプチドの「フォーマットで」あると言われる。免疫グロブリン単一可変ドメインがフォーマットされ得る手段の例およびかかるフォーマットの例は、本明細書の本開示に基づき、当業者にとって明確であろう；フォーマットされたかかる免疫グロブリン単一可変ドメインは、本発明のさらなる側面を形成する。
【００５８】
用語「グリコシル化受容部位」は、Ｎ−またはＯ−グリコシル化され得るＩＶＤ内の位置を指す。Ｎ連結型グリカンは、典型的には、アスパラギン（Ａｓｎ）へ付着されている一方で、Ｏ連結型グリカンは、一般的に、セリン側鎖、トレオニン側鎖、チロシン側鎖、ヒドロキシリシン側鎖、またはヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシル酸素へ連結されている。
【００５９】
「ＮＸＴ」、「ＮＸＳ」、「ＮＸＣ」または「ＮＸＶ」モチーフは、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ／ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｃｙｓ／Ｖａｌを指すが、ここでＸａａは、プロリンを除くいずれのアミノ酸でもあり得る（Shrimal, S. and Gilmore, R., J Cell Sci. 126(23), 2013, Sun, S. and Zhang, H., Anal. Chem. 87 (24), 2015）。潜在的なＮ−グリコシル化受容部位は、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ／ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｃｙｓ／Ｖａｌに特異的であることが当該技術分野において周知である。ＡｓｎとＴｈｒ／Ｓｅｒとの間のプロリンの存在が、非効率的なＮ−グリコシル化に繋がることは当該技術分野において示されている。具体的な側面において、本発明に従うＩＶＤまたはＩＳＶＤのＮ連結型グリコシル化受容部位は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）またはトリプトファン（Ｗ）などの天然のまたは改変された芳香族アミノ酸残基のような芳香族残基とともに拡張される。
【００６０】
かかる修飾体は、すなわちPrice, J.L. et al., Biopolymers. 98(3), 2012において、およびMurray, A.N. et al., Chem Biol. 22(8), 2015において記載されている。より具体的な態様において、芳香族残基は、Ｎ連結型グリコシル化シークオン（Ｎ−ｘ−Ｔ／Ｎ−ｘ−Ｓ）中のアスパラギン（Ｎ）残基と比べて、位置−１（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｗ−Ｎ−ｘ−Ｔ／Ｓ）、−２（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｗ−ｘ１−Ｎ−ｘ−Ｔ／Ｓ）、または−３（Ｆ／Ｙ／Ｈ／Ｗ−ｘ２−ｘ１−Ｎ−ｘ−Ｔ／Ｓ）に位置する（Murray AN et al (2015) Chem. Biol. 22(8):1052-62およびPrice JL et al (2012) Biopolymers 98(3):195-211）。かかる修飾体は具体的に、Ｎ−グリコシル化受容部位のグリコシル化効率、グリカン均一性、および糖タンパク質(glycoprotein)安定性の増大に対して有用である。
【００６１】
用語「発現ベクター」は、本明細書に使用されるとき、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター（ラムダファージなど）、ウイルスベクター（アデノウイルスのＡＡＶまたはバキュロウイルスベクターなど）、または人工の染色体ベクター（細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）など）を包含する、当業者に知られているいずれのベクターも包含する。発現ベクターは一般に、所望されるコード配列と、具体的な宿主生物（例として、高等真核生物、下等真核生物、原核生物）中、作動可能に(operably)連結されたコード配列の発現にとって必要な適切なプロモーター配列とを含有する。
【００６２】
典型的には、ベクターは、ヌクレオチド配列を含むが、前記配列中、発現可能なプロモーターまたは調節性ヌクレオチド配列は、調節性ヌクレオチド配列が、結び付けられるヌクレオチド配列の転写または発現をもまた調節できるように、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列もしくはＤＮＡ領域へ動作可能に(operatively)連結されているかまたはこれと結び付けられている。典型的には、ベクターの調節性ヌクレオチド配列またはプロモーターは、結び付けられるヌクレオチド配列に対し、天然に見出される（ゆえに動作可能に連結されるＤＮＡ領域のコード配列とは異種である）もののようには、動作可能に連結されていない。
【００６３】
用語「動作可能に」または「作動可能に」「連結された」は、本明細書に使用されるとき、プロモーター配列が関心のある遺伝子の転写を開始させることができるように、発現可能なプロモーター配列と関心のあるＤＮＡ領域または遺伝子との間の機能的な連結を指し、かつ前記用語は、真核細胞における転写の適正な終止を確実にするために、関心のある遺伝子と転写終止配列との間の機能的な連結を指す。「誘導性プロモーター」は、たとえば、これらに限定されないが、温度、ｐＨ、ある栄養素、特定の細胞シグナル等々の外部刺激に応答してスイッチが「オン」または「オフ」に入れられ得る（それによって、遺伝子転写を調節する）プロモーターを指す。前記誘導性プロモーターは、「構成的プロモーター」と区別するために使用されるが、前記構成的プロモーターとは、スイッチが絶え間なく「オン」に入れられているプロモーターを意図する、すなわち前記構成的プロモーターから、遺伝子転写が構成的に活性がある。
【００６４】
「グリカン」は、本明細書に使用されるとき、一般に、グリコシドが連結された(glycosidically linked)単糖類、オリゴ糖類(oligosaccharides)、および多糖類(polysaccharides)を指す。ゆえに、糖タンパク質、糖脂質(glycolipid)、またはプロテオグリカンなどの糖抱合体(glycoconjugate)の炭水化物部分は、本明細書中「グリカン」と言及される。グリカンは、単糖類残基のホモ−またはヘテロポリマーであり得、直線状または分枝状であり得る。Ｎ連結型グリカンは、また本明細書においてもさらに例示されるとおり、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、および他の単糖類から構成されてもよい。
【００６５】
真核生物において、Ｏ連結型グリカンは、ゴルジ装置中、ペプチド鎖のセリン残基またはトレオニン残基上に、１度に１つの糖が集められる。Ｎ連結型グリカンとは違って、知られているコンセンサス配列はないが、しかし−１または＋３のいずれかでのプロリン残基の位置は、セリンまたはトレオニンと比べて、Ｏ連結型グリコシル化にとって好ましい。
【００６６】
「複合Ｎ−グリカン」は、本願に使用されるとき、典型的には１つ、２つ、またはそれ以上の（例として、最大６つまでの）外部分枝(outer branches)をもつ構造を指し、前記外部分枝は、ほとんどの場合、内核構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２へ連結されている。用語「複合Ｎ−グリカン」は、当業者に周知であり、文献に定義されている。実例として、複合Ｎ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃの少なくとも１つの分枝または少なくとも２つの分枝を交互に有していてもよく、また任意に、様々なオリゴ糖類において終止していてもよいガラクトース（Ｇａｌ）残基（しかし、典型的には、マンノース残基とともには終止していないであろう）も有していてもよい。分かりやすくするために、糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位上に存在する単一のＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃ、シアリル−ＬａｃＮＡｃ、またはこれらのアジド修飾型(version)（よって、内核構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を欠いている）は、複合Ｎ−グリカンとは見なされない。
【００６７】
「高(Hyper)マンノシルグリカン」は、９つを超えるマンノース残基を含むＮ−グリカンである。典型的には、かかる高(hyper)マンノシルグリカンは、酵母細胞などの下等真核細胞、具体的に言うと、野生型Pichia pastorisなどの野生型酵母細胞において産生される。Pichia pastorisなどの酵母細胞において産生されるＮ−グリカンはまた、修飾されたマンノース−６−リン酸でもあり得る。
【００６８】
「高等真核細胞」は、本明細書に使用されるとき、単細胞生物からの細胞ではない真核細胞を指す。言い換えれば、高等真核細胞は、ヒト細胞株または別の哺乳動物の細胞株（例として、ＣＨＯ細胞株）などの多細胞真核生物からの（または細胞培養のケースにおいて、前記多細胞真核生物に由来する）細胞である。典型的には、高等真核細胞は、真菌細胞ではないであろう。具体的に、前記用語は一般に、哺乳動物の細胞、ヒト細胞株、および昆虫細胞株を指す。
【００６９】
より具体的には、前記用語は、脊椎動物細胞を、さらにいっそう具体的には、哺乳動物の細胞またはヒト細胞を指す。高等真核細胞は、本明細書に記載のとおり、典型的には、細胞培養（例として、ＨＥＫ細胞株またはＣＨＯ細胞株などの、細胞株）の一部であろうが、このことは必ずしも、厳密に要されるとは限らない（例として、植物細胞のケースにおいては、植物自体が、組み換えタンパク質を産生するために使用され得る）。
【００７０】
「下等真核細胞」とは、糸状菌細胞または酵母細胞を意図する。酵母細胞は、種Saccharomyces（例として、Saccharomyces cerevisiae）、Hansenula（例として、Hansenula polymorpha）、Arxula（例として、Arxula adeninivorans）、Yarrowia（例として、Yarrowia lipolytica）、Kluyveromyces（例として、Kluyveromyces lactis）、またはKomagataella phaffii（Kurtzman, C.P. (2009) J Ind Microbiol Biotechnol. 36(11)）を形成し得るが、Komagataella phaffiiは、これまでに名付けられていたものであって、旧命名法の下ではPichia pastorisがよく知られており、また本明細書においてもさらに使用される。特定の態様に従うと、下等真核細胞は、Pichia細胞であり、最も具体的な態様において、Pichia pastoris細胞である。特定の態様において、糸状菌細胞は、Myceliopthora thermophila（またDyadic社によるC1としても知られている）、Aspergillus種（例として、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus japonicus）、Fusarium種（例として、Fusarium venenatum）、Hypocrea種およびTrichoderma種（例として、Trichoderma reesei）である。
【００７１】
「原核細胞」は、典型的には、例えば、E. coli、Lactococcus種およびBacillus種などの細菌細胞のような非病原性原核生物に言及する。
【００７２】
具体的な態様に従うと、本発明の細胞は、糖鎖改変細胞である。「糖鎖改変細胞」は、野生型のバックグラウンド(background)と比較して変更されたＮ−グリカン構造および／またはＯ−グリカン構造をもつタンパク質を発現するように遺伝子操作された(genetically modified)細胞を指す。典型的には、糖タンパク質上の天然に存在する修飾は、グリコシル化経路に関与する酵素の遺伝子工学によって変えられている。一般に、Ｎ連結型グリコシル化における糖鎖(sugar chains)は、３つの型に分けられ得る：高(high-)マンノース（典型的には酵母）、複合（典型的には哺乳動物）およびハイブリッド型グリコシル化。その外に、様々なＯ−グリカンパターンが存在し、例えば、哺乳動物の細胞におけるムチン型Ｏ−グリコシル化とは異なる酵母オリゴマンノシルグリカンもある。
【００７３】
Ｎ−およびＯ−グリコシル化の種々の型はすべて、当業者に周知であり、文献に定義されている。相当な努力が、所望されるＮ−および／またはＯ−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生し、かつ当該技術分野において知られている真核細胞を改変するためのストラテジーの同定および最適化へ向けられる（例として、De Pourcq, K. et al., Appl Microbiol Biotechnol. 87(5), 2010）。かかる糖鎖改変発現系の非限定的な一例は、特許出願WO2010015722に記載されており、エンドグルコサミニダーゼおよび標的タンパク質の両方を発現する（高等または下等）真核細胞に関し、ここで組み換え分泌標的タンパク質が、一様なＮ−グリコシル化パターン（とりわけ、ＧｌｃＮＡｃで修飾されたガラクトース（ＬａｃＮＡｃ）などの、１つの単一ＧｌｃＮＡｃ残基（下等真核生物において）もしくはその修飾体、またはシアリル−ＬａｃＮＡｃ（哺乳動物の細胞において）によって特徴付けられる。
【００７４】
また、網羅されるのには、グリコシル化パターンがヒト様(-like)もしくはヒト化であるタンパク質または糖タンパク質（すなわち、複合型糖タンパク質）を発現するように遺伝子操作された細胞もある。これは、不活性化された内在性のグリコシル化酵素を有するか、および／または複合グリコシル化に必要とされる少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの他の外来性の核酸配列を含む、細胞、とりわけ下等真核細胞を提供することによって達成され得る。不活性化され得る内在性のグリコシル化酵素は、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼＯｃｈ１ｐ、Ａｌｇ３ｐ、Ｍｎｎ１ｐファミリーのアルファ−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ、ベータ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼを包含する。
【００７５】
複合グリコシル化に必要とされる酵素は、これらに限定されないが：Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ、およびドナー糖ヌクレオチド合成または輸送に関与する酵素を包含する。ここで想定されるさらに他の糖鎖改変細胞、とりわけ酵母細胞は、高(high)マンノース構造（高(high)マンノース型グリカン）の産生に関与する少なくとも１つの酵素が発現されない点で特徴付けられる。高(high)マンノース構造の産生に関与する酵素は、典型的には、マンノシルトランスフェラーゼである。
【００７６】
とりわけ、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼＯｃｈ１ｐ、Ａｌｇ３ｐ、Ｍｎｎ１ｐファミリーのアルファ−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ、ベータ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼは、発現されていなくてもよい。よって、細胞は、加えてまたは代わりに、具体的なＮ−グリカン構造の高収率での産生を可能にさせる１以上の酵素または酵素活性を発現するように改変され得る。かかる酵素は、宿主細胞内オルガネラの標的にされ得るが、前記オルガネラ中、酵素は、例えば、通常は酵素に結び付けられていないシグナルペプチドを用いて、最適な活性を有するであろう。本明細書に記載の酵素およびそれらの活性が、当該技術分野において周知であることは、明らかなはずである。
【００７７】
本発明に従う「糖鎖改変細胞」として本明細書中、具体的に想定されるのは、WO2010015722およびWO2015032899に記載されるとおりの細胞である（さらに本明細書中、GlycoDelete細胞、またはGlycoDeleteバックグラウンドを有する細胞と指定される）。手短に、かかる細胞は、グリコシル化不均一性を低減するように改変されており、少なくとも、エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、および標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。
【００７８】
グリコシル化における不均一性が、Ｎ連結型糖を起源とするのみならず、糖タンパク質へ付着されているＯ−グリカンもまた起源とするところ、本発明のポリペプチドからそれらの多様な炭水化物鎖を除去することが望ましくあり得る。これは、WO2017005925に記載のとおりの内在性のＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性が減退している細胞においてエンドグルコサミニダーゼ酵素を発現することによって達成され得る。後者の出願に記載の細胞はまた、本発明に従う糖鎖改変細胞としても具体的に想定され、本明細書中GlycoDoubleDelete細胞またはGlycoDoubleDeleteバックグラウンドを有する細胞としてさらに記載される。
【００７９】
また本明細書中、「糖鎖改変細胞」として具体的に言及されるものには、ヒトＮ−グリコシル化経路を模倣するよう改変された非哺乳動物の細胞もある（すなわち、GlycoSwitch（登録商標）、またLaukens, B. et al (2015) Methods Mol Biol. 1321およびJacobs, P.P. et al. (2009) Nat Protoc. 4(1)も参照）。
【００８０】
「ＩＶＤ抱合体」または「ＩＳＶＤ抱合体」は、本明細書中、特定の成分とカップリングされている（または、抱合されている、もしくは接続されている；これらは当該技術分野において同等の用語である）本発明のＩＶＤまたはＩＳＶＤを含むポリペプチドとして言及され、本明細書中、「被抱合成分(conjugated moiety)」としてさらに定義される。ＩＶＤ抱合体とＩＳＶＤ抱合体との間のカップリングは、ＩＶＤまたはＩＳＶＤに存在する特定のアミノ酸（例として、リシン、システイン）を介して生じ得る。好ましくは、カップリングは、該ＩＶＤまたはＩＳＶＤのポリペプチド配列に存在する導入されたグリカン（例として、導入されたＮ−グリカン）を介して生じる。
【００８１】
グリカン特異的な抱合は、ＩＶＤまたはＩＳＶＤの導入されたグリカン部位に存在するグリカンを用いて実施され得る。特定のケースにおいて、グリカンは、「被抱合成分」へカップリングされる前に、さらにin vitroで修飾され得る（例として、特定のエキソグリコシダーゼ酵素でトリミングされる）。加えて、カップリングはまた、ｉ）該ＩＶＤまたはＩＳＶＤに存在する特定のアミノ酸と被抱合成分との間の組み合わせとしても、およびｉｉ）導入されたグリカンと被抱合成分とを介したカップリングとしても、生じ得る。抱合は、当該技術分野において記載されるいずれの方法によって実施されてもよく、いくつかの非限定的な実施態様(illustrative embodiments)は、例のセクションにおいて概説されるであろう。
【００８２】
本明細書に使用されるとき、用語「被抱合成分」は、具体的な生物学的または特定の機能的な活性をもつ薬剤（例として、タンパク質（例として、第２のＩＶＤまたはＩＳＶＤ）、ヌクレオチド配列、脂質、（他の）炭水化物、ポリマー、ペプチド、薬物成分（例として、細胞毒性薬）、トレーサー、および検出剤）を含む。例えば、本発明に従うポリペプチドおよび被抱合成分を含むＩＶＤまたはＩＳＶＤ抱合体は、抱合されていない本発明のＩＶＤまたはＩＳＶＤポリペプチドと比較して、少なくとも１つの追加の機能または特性を有する。例えば、本発明のポリペプチドと被抱合成分である細胞毒性薬とを含むＩＶＤまたはＩＳＶＤ抱合体は、第２の機能としての薬物細胞毒性（すなわち、ＩＶＤまたはＩＳＶＤポリペプチドによって授けられた抗原結合に加えて）をもつ結合ポリペプチドの形成をもたらす。
【００８３】
もう１つの他の例において、第２の結合ポリペプチドの、本発明のＩＶＤまたはＩＳＶＤポリペプチドへの抱合は、追加の結合特性を授けてもよい。ある態様において、被抱合成分が、遺伝子学的にコードされる治療用もしくは診断用のタンパク質またはヌクレオチド配列である場合、被抱合成分は、当該技術分野において周知であるペプチド合成または組み換えＤＮＡ方法のいずれかによって合成されても、または発現されてもよい。別の側面において、被抱合成分が、非遺伝子学的にコードされるペプチド、例として、薬物成分である場合、被抱合成分は、人工的に合成されても、または天然の供給源から精製されてもよい。
【００８４】
本発明は、特定の領域に、とりわけ効率的なグリコシル化を可能にする領域に存在するグリコシル化受容部位を有するＩＶＤまたはＩＳＶＤを含むポリペプチドを提供することを目的とし、そのグリコシル化は、ＩＶＤまたはＩＳＶＤの結合および折り畳みに干渉せず、このことが、さらなる使用、例としてＩＶＤまたはＩＳＶＤ抱合体の産生のために、より受け入れられるものとさせている。
【００８５】
本発明は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供するが、そのポリペプチドは、抗体模倣薬(antibody mimetic)を含み、ここで該抗体模倣薬は、いずれか可能な位置にて導入された、少なくとも１つの人工的に改変されたＮ−グリコシル化部位を有し、ならびに、ここで該グリコシル化受容部位のグリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリル−ＬａｃＮＡｃからなる群から選択される１以上のグリカンからなる。
【００８６】
もう１つの他の態様において、本発明は、ポリペプチドを提供するが、そのポリペプチドは、抗体模倣薬を含み、ここで該抗体模倣薬は、いずれか可能な位置にて導入された、少なくとも１つの人工的に改変されたＮ−グリコシル化部位を有し、ならびに、ここで該グリコシル化受容部位のグリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリル−ＬａｃＮＡｃからなる群から選択される１以上のグリカンからなる。
【００８７】
もう１つの他の態様において、本発明は、ポリペプチドを含む抱合体を提供するが、そのポリペプチドは、抗体模倣薬を含み、ここで該抗体模倣薬は、いずれか可能な位置にて導入された、少なくとも１つの人工的に改変されたＮ−グリコシル化部位を有し、ならびに、ここで該グリコシル化受容部位のグリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリル−ＬａｃＮＡｃ、および該グリカンへカップリングされる被抱合成分からなる群から選択される１以上のグリカンからなる。
【００８８】
用語「抗体模倣薬」は、本明細書に使用されるとき、抗体のように特異的に抗原に結合するが構造的に抗体とは関係のない人工の（ポリ−）ペプチドを指す。これらは、大抵、約３〜２０ｋＤａの分子量をもつ抗体より有意に小さい。抗体模倣薬の非限定例は、アブジュリン(abdurins)、アドネクチン(adnectins)、アフィボディ(affibodies)、アフィリン(affilins)、アフィマー(affimers)、アルファボディ(alphabodies)、アフィチン(affitins)、アンチカリン(anticalins)、アヴィマー(avimers)、DARPins、フィノマー(fynomers)、キュニッツ(Kunits)ドメインペプチド、モノボディ(monobodies)、プロテインＡのＺドメイン、ガンマＢ結晶、ユビキチン、シスタチン、Sulfolobus acidocaldariusからのＳａｃ７Ｄ、リポカリン、膜受容体のＡドメイン、アンキリンリピートモチーフ、ＦｙｎのＳＨ３ドメイン、プロテアーゼインヒビターのキュニッツドメイン、フィブロネクチンの10番目のＩＩＩ型ドメイン、３−もしくは４−ヘリックス束タンパク質、アルマジロリピートドメイン、ロイシンリッチ(-rich)リピートドメイン、ＰＤＺドメイン、ＳＵＭＯまたはＳＵＭＯ様ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、ホスホチロシン結合ドメイン、プレクストリン相同ドメイン、src homology 2ドメイン、または合成ペプチドリガンド、例として、（ランダム）ペプチドライブラリからの合成ペプチドリガンドである。
【００８９】
抗原結合タンパク質の他の例はまた、合成の結合タンパク質も、より具体的に言うと、モノボディも包含する（例として、検討用に(for a review)、Sha et al., 2017. Protein Science. 26:910-924を参照）。モノボディは、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づいて構築された合成タンパク質である。受容体の細胞外ドメイン、キナーゼ、ステロイドホルモン受容体、および調節(modular)タンパク質ドメインを包含する、多岐にわたる(diverse array of)標的に対して高い親和性で結合するモノボディは単離されている（Koide, 2012）。
【００９０】
もう１つの他の態様において、本発明は、ＩＳＶＤポリペプチドを提供するが、そのポリペプチドは、そのポリペプチド配列中いずれか可能な位置にて導入された、少なくとも１つの人工的に改変されたＮ−グリコシル化部位を有し、ならびに、ここで該グリコシル化受容部位のグリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリル−ＬａｃＮＡｃからなる群から選択される１以上のグリカンからなる。
【００９１】
もう１つの他の態様において、本発明は、ＩＳＶＤポリペプチドを含む抱合体を提供するが、そのポリペプチドは、その配列中いずれか可能な位置にて導入された、少なくとも１つの人工的に改変されたＮ−グリコシル化部位を有し、ならびに、ここで該グリコシル化受容部位のグリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリル−ＬａｃＮＡｃ、および該グリカンへカップリングされる被抱合成分からなる群から選択される１以上のグリカンからなる。
【００９２】
もう１つの他の態様において、本発明は、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供するが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸８３〜８８のいずれか、および／またはアミノ酸２７〜４０のいずれかに存在するグリコシル化受容部位を有する。分かりやすくするために、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸８３〜８８のいずれか、および／またはアミノ酸２７〜４０のいずれかに存在するグリコシル化受容部位を有するＩＶＤは、本明細書中、「本発明のＩＶＤ」または「本発明のＩＳＶＤ」としてさらに指定される。
【００９３】
もう１つの他の態様において、本発明は、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供するが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸８３〜８８のいずれかに存在するグリコシル化受容部位を有する。もう１つの他の態様において、本発明は、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供するが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸２７〜４０のいずれかに存在するグリコシル化受容部位を有する。もう１つの他の態様において、本発明は、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供するが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸８３〜８８のいずれか、およびアミノ酸２７〜４０のいずれかに存在するグリコシル化受容部位を有する。
【００９４】
該グリコシル化受容部位は、Ｎ−またはＯ連結型グリカンで修飾され得る（が、必ずしも修飾されるとは限らない）。本発明がＮ−グリコシル化に限定されないことは、本明細書中、具体的に想定されている。本開示は、Ｎ−およびＯ−グリコシル化の両方を採用するための手段を提供する。
【００９５】
本発明に従う態様において、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸84〜88、85〜88、86〜88、87および88、83〜87、84〜87、85〜87、83、84、85、86、87、88、83〜86、84〜86、85および86、83〜85、84および85、または83および84のいずれか、および／またはアミノ酸28〜40、29〜40、30〜40、31〜40、32〜40、33〜40、34〜40、35〜40、36〜40、37〜40、38〜40、39および40、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39および40、27〜39、28〜39、29〜39、30〜39、31〜39、32〜39、33〜39、34〜39、35〜39、36〜39、37〜39、38および39、27〜38、28〜38、29〜38、30〜38、31〜38、32〜38、33〜38、34〜38、35〜38、36〜38、37および38、27〜37、28〜37、29〜37、30〜37、31〜37、32〜37、33〜37、34〜37、35〜37、36および37、27〜36、28〜36、29〜36、30〜36、31〜36、32〜36、33〜36、34〜36、35〜36、27〜35、28〜35、29〜35、30〜35、31〜35、32〜35、33〜35、34および35、27〜34、28〜34、29〜34、30〜34、31〜34、32〜34、33および34、27〜33、28〜33、29〜33、30〜33、31〜33、32および33、27〜32、28〜32、29〜32、30〜32、31および32、27〜31、28〜31、29〜31、30および31、27〜30、28〜30、29および30、27〜29、28および29、または27および28のいずれかに存在するグリコシル化受容部位を有する。
【００９６】
本発明に従うもう１つの他の態様において、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸８６に、および／またはアミノ酸２７に存在するグリコシル化受容部位を有する。
本発明に従うもう１つの他の態様において、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸８６およびアミノ酸２７に存在するグリコシル化受容部位を有する。
【００９７】
本発明に従うもう１つの他の態様において、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸８６に存在するグリコシル化受容部位を有する。
本発明に従うもう１つの他の態様において、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸２７に存在するグリコシル化受容部位を有する。
【００９８】
好ましい態様において、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸８３〜８８のいずれかに存在するグリコシル化受容部位を有する。より具体的に言うと、該ＩＶＤのグリコシル化受容部位は、（AHoナンバリング規則に従って）アミノ酸８４〜８８、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８５〜８８、８６〜８８、８７および８８、８３〜８７、８４〜８７、８５〜８７、８６および８７、８３〜８６、８４〜８６、８５および８６、８３〜８５、８４および８５、または８３および８４に存在する。最も具体的に言うと、該ＩＶＤのグリコシル化受容部位は、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸８６に存在する。
【００９９】
本発明に従う別の態様において、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸２７〜４０のいずれかに存在するグリコシル化受容部位を有する。より具体的に言うと、該ＩＶＤのグリコシル化受容部位は、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、28〜40、29〜40、30〜40、31〜40、32〜40、33〜40、34〜40、35〜40、36〜40、37〜40、38〜40、39および40、27〜39、28〜39、29〜39、30〜39、31〜39、32〜39、33〜39、34〜39、35〜39、36〜39、37〜39、38および39、27〜38、28〜38、29〜38、30〜38、31〜38、32〜38、33〜38、34〜38、35〜38、36〜38、37および38、27〜37、28〜37、29〜37、30〜37、31〜37、32〜37、33〜37、34〜37、35〜37、36および37、27〜36、28〜36、29〜36、30〜36、31〜36、32〜36、33〜36、34〜36、35〜36、27〜35、28〜35、29〜35、30〜35、31〜35、32〜35、33〜35、34および35、27〜34、28〜34、29〜34、30〜34、31〜34、32〜34、33および34、27〜33、28〜33、29〜33、30〜33、31〜33、32および33、27〜32、28〜32、29〜32、30〜32、31および32、27〜31、28〜31、29〜31、30および31、27〜30、28〜30、29および30、27〜29、28および29、または27および28のいずれかに存在する。
【０１００】
最も具体的に言うと、該ＩＶＤのグリコシル化受容部位は、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸２７に存在する。
ＩＶＤ中、位置８３〜８８および／または２７〜４０の次に、グリコシル化される傾向にある追加の位置が選択され得ることは、本明細書に提示される本開示に基づけば当業者にとって明らかなはずである。
【０１０１】
したがって、本発明に従う具体的な態様において、ＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここで該ＩＶＤは、（AHoナンバリング規則に従って）ＩＶＤのアミノ酸８３〜８８に、および／またはアミノ酸２７〜４０に存在するグリコシル化受容部位を有し、かつＩＶＤ中位置１４および／または位置４８などの位置に存在する追加のグリコシル化受容部位を有する。具体的な態様に従うと、本発明のＩＶＤは、該ＩＶＤ中、可能などの位置でもＩＶＤ中に導入される追加のグリコシル化受容部位を有する。他の具体的な態様に従うと、本発明のＩＶＤは、ＩＶＤ中、（AHoナンバリング規則に従って）位置１４に存在する追加のグリコシル化受容部位を有する。他の具体的な態様に従うと、本発明のＩＶＤは、ＩＶＤ中、（AHoナンバリング規則に従って）位置４８に存在する追加のグリコシル化受容部位を有する。
【０１０２】
もう１つの他の態様において、本発明のＩＶＤは、具体的な態様に従うと、位置１６および／または４９および／または１３９に存在する追加のグリコシル化受容部位を有する。
もう１つの他の態様において、本発明のＩＶＤは、余剰の末端アミノ（Ｎ−）末タグおよび／または余剰のカルボキシ末端（Ｃ−）を有するが、それらのタグは、グリコシル化受容部位、具体的にはＮ−グリカン受容部位を包含する。
【０１０３】
よって、本発明の範囲が、本発明のＩＶＤ内の少なくとも２つまたはさらにいっそう多くのグリコシル化受容部位の併用を包含することは明らかである。本願に基づき、当業者は、本発明のＩＶＤ中に同定された特定のグリコシル化受容部位内のまたは前記部位の次に、追加のグリコシル化受容部位を選択する仕方を知っており、かつさらなる位置およびそれらの組み合わせの同定／または使用もまた、提示されるとおりの本発明の範囲内にある。
【０１０４】
特定の態様において、本発明は、本明細書の前に記載のＩＶＤヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドを提供する。
【０１０５】
別の態様に従うと、該ＩＶＤのグリコシル化受容部位は、Ｎ−グリコシル化され得るアスパラギン残基である。より具体的には、該ＩＶＤは、ＮＸＴ、ＮＸＳ、ＮＸＣまたはＮＸＶのモチーフ（前記モチーフ中Ｘは、プロリンを除くいずれのアミノ酸でもあり得る）を、ＮＸＴ／ＮＸＳ／ＮＸＣ／ＮＸＶモチーフのアスパラギン残基がアミノ酸８３〜８８のいずれにもおよび／またはアミノ酸２７〜４０のいずれにも存在できるように含有する。さらにいっそう具体的には、該ＩＶＤは、ＮＸＴ／ＮＸＳモチーフを含有する。
【０１０６】
具体的な態様に従うと、本発明は、前に記載のとおりのＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供するが、ここで該ＩＶＤは、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）である。
【０１０７】
具体的な態様に従うと、前に記載のとおりのＩＳＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここで該ＩＳＶＤは、重鎖可変ドメイン配列である。より具体的な態様に従うと、ＩＳＶＤは、重鎖抗体に、好ましくはラクダ科動物の重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列である。
【０１０８】
別の具体的な態様において、前に記載のとおりのＩＳＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供されるが、ここで該ポリペプチドは、該ＩＳＶＤからなる。もう１つの他の態様において、前に記載のとおりのＩＶＤを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。
【０１０９】
本発明において、用語「ＩＳＶＤを含むポリペプチドを含む」は、ＩＳＶＤが、半減期延長ポリペプチド（例として、血清アルブミンを対象にするＶＨＨ）などの別のポリペプチド、第２のＶＨＨ（二重特異性のまたは二価のＩｇＧを創出するため、など）、酵素、治療用タンパク質、ＩｇＡ ＦｃドメインまたはＩｇＧ ＦｃドメインなどのＦｃドメインへ融合（またはカップリング）され得ることを意味する。
【０１１０】
もう１つの他の態様において、本発明は、本発明に従う発現ベクターを含む細胞を提供する。具体的な態様において、細胞は、哺乳動物の細胞もしくは植物細胞などの高等真核細胞、糸状菌細胞もしくは酵母細胞などの下等真核細胞、または原核細胞である。
【０１１１】
高等真核細胞は、いずれの高等真核生物でもあり得るが、しかし具体的な態様において、哺乳動物の細胞は、想定されるものである。使用される細胞の性質は、典型的には、所望されるグリコシル化特性、および／または本明細書に記載のＩＶＤもしくはＩＳＶＤを産生する容易さおよび費用に応じるであろう。哺乳動物の細胞は、実例として、免疫原性に係る問題を避けるために使用されてもよい。タンパク質産生のための高等真核細胞株は、修飾されたグリコシル化経路をもつ細胞株も包含し、当該技術分野において周知である。
【０１１２】
タンパク質を担持、発現、および産生し、これに続き単離および／または精製するのに好適な動物または哺乳動物の宿主細胞の非限定例は、CHO-K1（ATCC CCL-61）、DG44（Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec.Genet., 12:555-556；およびKolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909）、CHO-K1 Tet-On細胞株（Clontech）、ＣＨＯと指定された(designated)ECACC 85050302（CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK）、ＣＨＯクローン１３（GEIMG, Genova, IT）、ＣＨＯクローンＢ（GEIMG, Genova, IT）、CHO-K1/SFと指定されたECACC 93061607（CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK）、RR-CHOK1と指定されたECACC 92052129（CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ陰性ＣＨＯ細胞（CHO/-DHFR、Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216）、およびdp12.CHO細胞（米国特許第5,721,121号）などの、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞、COS-7、ATCC CRL-1651）；ヒト胎児腎臓細胞（例として、２９３細胞、または２９３Ｔ細胞、または懸濁培養中で成長させるためにサブクローニングされた２９３細胞、Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ATCC CCL-10）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ATCC CCL-70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76、ATCC CRL-1587；VERO、ATCC CCL-81）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251）；ヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ、ATCC CCL-2）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ATCC CCL-34）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ATCC CCL-75）；ヒト肝臓がん細胞（ＨＥＰ−Ｇ２、HB 8065）；マウス乳房腫瘍細胞（MMT 060562、ATCC CCL-51）；バッファローラット(buffalo rat)肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ATCC CRL-1442）；ＴＲＩ細胞（Mather, 1982, Annals NYAcad. Sci., 383:44-68）；ＭＣＲ ５細胞；ＦＳ４細胞を包含する。具体的な態様に従うと、細胞は、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｋ２９３細胞、またはＣＯＳ細胞から選択される哺乳動物の細胞である。さらに具体的な態様に従うと、哺乳動物の細胞は、ＣＨＯ細胞およびＨｅｋ２９３細胞から選択される。
【０１１３】
他の具体的な態様に従うと、本発明に従う細胞は、植物細胞である。典型的な植物細胞は、タバコ、トマト、ニンジン、トウモロコシ、藻類、ムラサキウマゴヤシ、イネ、大豆、Arabidopsis thaliana、Taxus cuspidata、Nicotiana benthamiana、およびCatharanthus roseusからの細胞を含む。本発明に従うＩＶＤまたはＩＳＶＤポリペプチドの産生に有用であり得る、更なる追加の植物種は、Weathers, P.J. et al., Appl Microbiol Biotechnol. 85(5), 2010に記載されている。
【０１１４】
より具体的な態様において、本発明に従う細胞は、糸状菌細胞または酵母細胞などの下等真核細胞である。糸状菌および酵母細胞の特定の例は、本明細書の前に概説されている。
より具体的な態様において、本発明に従う細胞は、E. coli、Lactococcus種またはBacillus種などの原核細胞である。
【０１１５】
より具体的な態様において、前に記載のとおりの本発明に従う細胞は、糖鎖改変細胞である。糖鎖改変細胞は、不要なＮ−グリコシル化および／またはＯ−グリコシル化を除去することが可能であり得る。糖鎖改変細胞という用語は、本明細書の前に概説されている。糖鎖改変細胞はまた、改変されることで前に記載のとおりのヒトグリコシル化経路を模倣する非哺乳動物の細胞でもあり得る。
【０１１６】
具体的な態様において、前に記載のとおりの本発明に従うヌクレオチド配列にコードされるＩＶＤを含むポリペプチドが提供されるが、ここでポリペプチドは、グリカン（または１より多くのグリカン）を含み、ここでグリカンは、末端のＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸、グルコース、グルコサミン、ガラクトサミン、バシロサミン（例えば、Bacillus subtilusおよびCampylobacter jejuniにおいて類型化される(described)希少なアミノ糖（２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシグルコース））、
マンノースもしくはマンノース−６−Ｐ糖、またはＧａｌＮＡｚ、アジド−シアル酸（ＡｚＳｉａ）、もしくはＧｌｃＮＡｚなどの化学修飾単糖類を有する。特定の糖をもつグリカンを含むＩＶＤポリペプチドは、in vivoで作られ得る。
【０１１７】
例えば、高等真核細胞は典型的には末端のシアル酸をもつグリカンを生成するであろうし、酵母細胞は典型的には末端のマンノースまたはマンノース−６Ｐをもつグリカンを生成するであろうし、ある糸状菌は末端のガラクトースをもつグリカンを生成するであろうし、ある糖鎖改変酵母細胞は末端のＧｌｃＮＡｃを産生し（例として、WO2010015722に記載される）、ある糖鎖改変高等真核細胞は末端のＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、およびシアル酸をもつグリカンの混合物を産生し（例として、WO2010015722およびWO2015032899に記載される）、他の糖鎖改変高等真核細胞は末端のＧｌｃＮＡｃをもつグリカンを産生し（WO2017005925を参照）、ある突然変異ガラクトシルトランスフェラーゼを含む真核細胞はＧａｌＮＡｃを非還元ＧｌｃＮＡｃ糖へ酵素的に付着し得（WO2004063344を参照）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ（Ｃ２置換のアジドアセトアミド−ガラクトースＵＤＰ−誘導体）が供給された、突然変異ガラクトシルトランスフェラーゼを含む真核細胞は、グリカンの末端非還元ＧｌｃＮＡｃにてＧａｌＮＡｚを組み込むであろう（WO2007095506およびWO2008029281を参照）。任意に、特定の糖をもつグリカンを含むＩＶＤポリペプチドは、所望される末端の糖が得られるまで、グリカンのin vivoでのトリミング、これに続くin vitroでのトリミングの組み合わせによって作られ得る。例として、WO2015057065（Synaffix）。
【０１１８】
もう１つの他の具体的な態様において、本発明は、本発明のＩＶＤを含むポリペプチドを提供するが、ここでＩＶＤは、グリカン（または１より多くのグリカン）を含み、かつここでグリカンは、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃ、シアリル−ＬａｃＮＡｃ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、高(hyper-)マンノシル化されたグリカン、マンノース−６−リン酸グリカン、複合グリカン、ハイブリッドグリカン、および化学修飾グリカン（ＧｌｃＮＡｚ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｚ、アジド−シアル酸−ＬａｃＮＡｃなど）からなる群から選択されるグリカンからなる。
【０１１９】
もう１つの他の具体的な態様において、本発明は、本発明のＩＶＤを含むポリペプチドを含む組成物を提供するが、ここでＩＶＤは、グリカン（または１より多くのグリカン）を含み、かつここでグリカンは、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃ、シアリル−ＬａｃＮＡｃ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、高(hyper)マンノシルグリカン、マンノース−６−リン酸グリカン、複合グリカン、ハイブリッドグリカン、および化学修飾グリカン（ＧｌｃＮＡｚ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｚ、アジド−シアル酸−ＬａｃＮＡｃなど）からなる群から選択されるグリカンからなり、ここで該ポリペプチド中の具体的な位置（単数または複数）でのこれらのグリカンの１以上の存在は、試料中の同じペプチドに関して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である。
【０１２０】
本明細書の前に記載の様々な宿主細胞が、本発明によって提供されるＩＶＤ上に存在する特定のグリカンを産生するの具体的に有用であり得る一方、組み合わせられたin vivoおよびin vitroアプローチもまた所望のグリカン構造を得ることが可能であることは留意されるべきである。実際に、真核生物宿主中に産生された本発明のＩＶＤまたはＩＳＶＤは精製され得、グリカン構造は、好適なエンドグルコサミニダーゼまたはエキソグリコシダーゼによってトリミングされ得、およびその後、様々なグリコシルトランスフェラーゼ（例として、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ポリシアリルトランスフェラーゼ等）のin vitroでの使用によって再編され(re-built)得る。
【０１２１】
ＩＶＤ−抱合体
具体的な態様において、本発明は、ＩＶＤ−抱合体を提供する。好ましい態様において、本発明に従うＩＶＤまたはＩＳＶＤポリペプチドは、該ＩＶＤまたはＩＳＶＤポリペプチド上に存在するグリカン構造を介して、特定の成分（本明細書の前に定義されるとおりの被抱合成分）へカップリングされる。かかるグリカンの特定の成分への特定のカップリングは、当該技術分野において、グリカン特異的抱合として言及される。ＩＶＤまたはＩＳＶＤポリペプチド上に存在する、本明細書の前に記載されるとおりの、特定の末端炭水化物をもつグリカン構造または特定のグリカン構造は、特定の成分とのカップリングのための開始点として使用される。
【０１２２】
抱合のために使用され得る特定の成分
本発明のＩＶＤまたはＩＳＶＤ中に存在するグリカン構造へのカップリングのために使用され得る被抱合成分は、当該技術分野において多すぎるほど(plethora)存在する。被抱合成分は、例えば、半減期延長成分、治療剤、検出ユニット、標的化成分、または第２の（同じか、もしくは異なる）ＩＶＤもしくはＩＳＶＤポリペプチドでさえも含む。１以上の被抱合成分は、また互いに異なっていてもよいが、本発明のＩＶＤまたはＩＳＶＤへ連結され得る。１つの被抱合成分でさえ、１より多くの機能を有し得る、すなわち半減期延長成分は同時に、標的化成分としても有用であり得る。
【０１２３】
ｉ）  半減期延長成分
様々な半減期延長成分が本明細書において想定されている。非限定的かつ手短には、半減期延長ストラテジーがKontermann, R.E., Expert Opin Biol Ther. 16(7), 2016またはvan Witteloostuijn, S.B., ChemMedChem. 11(22), 2016に記載されている。とりわけ、共有結合の化学的修飾(covalent chemical modification)に依存する様々な半減期延長技法が開発されている。これらの方法は、ＰＥＧ化、非構造(unstructured)ポリペプチドをベースとしたＰＥＧ模倣物への融合、ポリシアリル化の採用（例として、ポリシアリルトランスフェラーゼ酵素の酵素的な使用(enzymatic use)）、ビオチン−カップリング、ポリオキサゾリン−カップリング、大きな多糖類との抱合、脂質化、アルブミンまたはＩｇＧのＦｃドメインもしくはＩｇＡのＦｃドメインへの融合、および自己集合へ向かわせる生体直交型(bio-orthogonal)成分との誘導体化を包含する。もう１つの他の半減期延長成分は、血清アルブミンを対象にするＩＶＤ（ＶＨＨなど）である。
【０１２４】
ｉｉ）  治療成分
ある態様において、被抱合成分は、すなわち抗炎症剤、抗がん剤、細胞毒性剤、抗感染剤（例として、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤等々）、および麻酔治療剤(anesthetic therapeutic agents)を包含する様々な治療剤を含む。特定の態様において、被抱合成分は、プロドラッグを変換することが可能な酵素であり、前記プロドラッグは毒性薬物へ変換される。毒物（例として、毒素、細胞毒性薬、放射性核種）もまた、治療目的上好適であり得、がん治療において具体的に有用である。ゆえに、ＩＶＤ−抱合体の特定の例は、抗体−薬物−抱合体（ＡＤＣ）である。原則として、治療目的上好適であるどの剤も、本明細書において想定されるものである。記載のとおりの治療剤は、典型的には、小分子または生物製剤であるが、しかし治療剤はまた、そもそも、当業者にとって明らかであるはずの別のものでもあり得、かつ本発明はこれらに限定されるべきではない。
【０１２５】
ｉｉｉ）  検出成分
ある態様において、被抱合成分は、検出成分を含む。用語「検出成分」または「検出可能な標識」は、検出目的のために使用され得る特性または機能を保有するいずれかのユニット、すなわち発色団ユニット、蛍光ユニット、リン光ユニット、ルミネセンスユニット、光吸収ユニット、放射性ユニット、および遷移金属同位体質量タグ(mass tag)ユニットを含む群から選択されるものを指す。限定せずに、検出成分は、当業者にとって明らかなはずであるとおり、小分子または巨大分子であり得る。
【０１２６】
好適な蛍光ユニットは、免疫蛍光技術、例として、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法の技術分野から知られているものである。本発明のこれらの態様において、検出ユニットを含む抱合体は、検出ユニットを励起し、およびその結果得られる放射（フォトルミネセンス）を検出することによって検出される。この態様において、検出ユニットは、好ましくは蛍光ユニットである。
【０１２７】
有用な蛍光ユニットは、フィコビリタンパク質などのタンパク質をベースとしたもの、ポリフルオレンなどのポリマー、フルオレセインのようなキサンテン、もしくはローダミン、シアニン、オキサジン、クマリン、アクリジン、オキサジアゾール、ピレン、ピロメテンなどの有機小分子染料、またはＲｕ錯体、Ｅｕ錯体、Ｐｔ錯体などの有機金属錯体であってもよい。単一分子実体(single molecule entities)の外、蛍光タンパク質または有機小分子染料の塊(clusters)、ならびに量子ドット、アップコンバーティング(upconverting)ナノ粒子、金ナノ粒子、染色された(dyed)ポリマーナノ粒子などのナノ粒子もまた、蛍光ユニットとしても使用され得る。
【０１２８】
フォトルミネセンス検出ユニットの別の群は、励起後の光の時間−遅延放射をもつリン光ユニットである。リン光ユニットは、Ｐｄ錯体、Ｐｔ錯体、Ｔｂ錯体、Ｅｕ錯体などの有機金属錯体、またはランタニドがドープされたＳｒＡｌ２Ｏ４などの組み込まれたリン光色素をもつナノ粒子を包含する。
【０１２９】
本発明の別の態様において、検出ユニットを含む抱合体は、照射によって事前に励起されることなく検出される。この態様において、検出ユニットは、放射性標識であり得る。それらは、非放射性同位体をこれらの放射性同位体(counterparts)（トリチウム、３２Ｐ、３５Ｓまたは１４Ｃなど）と交換すること、またはチロシンへ結合されている１２５Ｉ、フルオロデオキシグルコース内１８Ｆ、もしくは有機金属錯体（すなわち、９９Ｔｃ−ＤＴＰＡ）などの、共有結合された標識を導入することによって、放射性同位体を標識するという形態であってもよい。
【０１３０】
別の態様において、検出ユニットは、化学発光(chemiluminescence)を引き起こすことが可能なもの、すなわちルミノール存在下での西洋ワサビペルオキシダーゼ標識である。
本発明の別の態様において、検出ユニットを含む抱合体は、放射線放出(radiation emission)によっては検出されないが、しかしＵＶ、可視光、またはＮＩＲ放射線の吸収によって検出される。好適な光吸収検出成分は、Ｎ−アリールローダミン、アゾ染料、およびスチルベンのような有機小分子クエンチャー染料などの、蛍光放射のない光吸収染料である。
【０１３１】
別の態様において、光吸収検出ユニットは、パルス光レーザーによって、光音響シグナルを生成することによって、照射され得る。
本発明の別の態様において、検出ユニットを含む抱合体は、遷移金属同位体の質量分析検出によって検出される。遷移金属同位体質量タグ標識は、共有結合された有機金属錯体またはナノ粒子の構成要素として導入されてもよい。当該技術分野において知られているのは、ランタニドの同位体タグおよび隣接する後期遷移元素である。
【０１３２】
ｉｖ）  標的化成分
ある態様において、被抱合成分は、標的化成分を含む。本明細書に使用されるとき、用語「標的化成分」は、標的分子へ結合する被抱合成分を指す。小分子または生物製剤は両者とも、標的化成分として採用され得る。標的化成分は、限定せずに、タンパク質、ヌクレオチド配列、脂質、他の炭水化物（例として、特定のグリカン）、およびそれらの組み合わせ（例として、糖タンパク質、糖ペプチド(glycopeputides)、および糖脂質）を含み得る。標的へ結合できるいずれの成分も、本発明に従う標的化成分として採用され得る。
【０１３３】
ＩＶＤ−抱合体において有用なリンカー
ある態様において、ＩＶＤ−抱合体は、グリカンと標的化成分との間にリンカーを含む。あるリンカーは他のリンカーより有用であり、特定のリンカーの使用は本願に応じるであろう。例えば、オキシムおよびヒドラゾン、とりわけ脂肪族アルデヒドに由来するものは、水中またはより低いｐＨにて、経時的により低い安定性を示す。芳香族的に(aromatically)安定化された構造体は、グリカンを被抱合成分へ安定して連結するのにより有用であり得る。安定化されたかかるリンカーもまた、具体的に被抱合成分が腫瘍細胞を死滅させることを意図した毒性物質であるとき、被抱合成分の早過ぎる放出に起因する逆効果を制限し得るところ、本願の範囲内にある。
【０１３４】
具体的に対象にするのは、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン試薬(BICYCLO[6.1.0]NON-4-YNE REAGENTS)、ならびに芳香族的に安定化されたトリアゾールリンカーおよびスルファミドリンカーである。また抱合体の増大した安定性が、該抱合体内に含まれる成分のいずれの凝集傾向をも低減させることは、一般的な専門(technical)知識の範囲内である。安定性が増大されたＩＶＤ抱合体の産生については、読者は、これらに限らないが(non-exclusively)、WO2013036748、WO2014065661、WO2015057064およびWO2016053107を、ならびに本明細書中明示的に述べられたSynaffix B.V.によって出願された他の特許出願を参照されたい。
【０１３５】
一般に、当該技術分野において知られている様々なリンカーが、本発明に従うＩＶＤおよび被抱合成分を連結させるために使用され得る。明らかなはずであるとおり、切断可能および切断不可能なリンカーが、所望の放出プロファイルを獲得するために採用され得る。一般に、リンカーおよび抱合の化学の最適な組み合わせは、ユニークな各面(facet)：ＩＶＤ、被抱合成分、および処置されるべき疾患のプロファイルを相関させるためにユニークに合わせられなければならない。本明細書に使用される抗体−薬物抱合体およびリンカーに関する検討用には、例えば、Jessica R. McCombs and Shawn C. Owen, AAPS J. 17(2), 2015、およびLu, J. et al., Int J Mol Sci. 17(4), 2016、ならびにがんおよび感染性疾患の処置のための抱合体において有用な新規四級アンモニウム塩リンカーを記載するPillow, T.H., Pharm Pat Anal. 6(1), 2017による近年の総説を参照。
【０１３６】
更に他の好適なスペーサーまたはリンカーは、当業者にとっては明らかであろう。これらは一般に、当該技術分野において使用されるいずれのリンカーまたはスペーサーであってもよい。特定の側面において、リンカーまたはスペーサーは、医薬用途(pharmaceutical use)を意図する適用における使用に好適である。例えば、ＩＳＶＤ−抱合体またはＩＶＤ−抱合体中のグリカンと成分との間のリンカーはまた、ある側面において、好適なアミノ酸配列、とりわけ１と５０との間の、またはより具体的に言うと１と３０との間のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよい。かかるアミノ酸配列のいくつかの例は、WO 99/42077に記載のとおりの例えば（ＧＳ）ｎまたは（ＧＧＧＳＳ）ｎまたは（ＧＳＳ）ｎなどのＧｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）リンカー、および本明細書に述べられるAblynxによる出願（例えば、WO 06/040153およびWO 06/122825を参照）に記載の（Ｇ４Ｓ）３、ＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９およびＧＳ７リンカー、ならびに天然に存在する重鎖抗体または同様の配列（WO 94/04678に記載のものなど）のヒンジ領域などのヒンジ様領域を包含する。
【０１３７】
更に他の好適なリンカーは一般に、有機化合物またはポリマー、とりわけ医薬用途のためのポリペプチドにおける使用に好適なものを含む。実例として、ポリ（エチレングリコール）成分は、抗体ドメインを連結するために使用されている、例えばWO 04/081026を参照。リンカーの長さ、柔軟度、および／または他の特性が、本発明の最終ＩＶＤ抱合体の特性（これらに限定されないが、特定の標的に対する親和性、特異性、または結合活性(avidity)を包含する）に対してある影響を及ぼし得ることは、本発明の範囲内に網羅される。本明細書の本開示に基づき、当業者は、本発明の特定のＩＶＤまたはＩＳＶＤにおける使用のための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定的なルーチン実験後に、決定できるであろう。例えば、第１および第２の標的に対して向けられる構成単位(building blocks)を含む本発明の多価ＩＳＶＤにおいて、リンカーの長さおよび柔軟性は、リンカーによって各構成単位がその同種の(cognate)標的へ結合できるようになるのが好ましい。
【０１３８】
また、本明細書の本開示に基づき、当業者は、本発明の特定のＩＶＤまたはＩＳＶＤにおける使用のための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定的なルーチン実験後に、決定できるであろう。最終に、２以上のリンカーが本発明のＩＶＤまたはＩＳＶＤにおいて使用されるとき、これらのリンカーは同じであっても、または異なっていてもよい。また、本明細書の本開示に基づき、当業者は、本発明の特定のポリペプチドにおける使用のための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定的なルーチン実験後に、決定できるであろう。ある特定の態様において、より高い親水性および結果的に改善された水可溶性をもつＩＶＤ抱合体を提供し得る（例えば炭水化物を包含する）より長いリンカーをもつＩＶＤ抱合体を産生することが所望される。よって、より多くの炭水化物をもつリンカーを含むＩＶＤ抱合体もまた、本願の範囲内である。またＰＥＧで修飾されたかまたはＰＥＧからなるリンカーも、ＩＶＤ抱合体の親水特性を増大するのに有用であり得る。
【０１３９】
もう１つの他の態様において、本発明は、本発明のＩＶＤを含むポリペプチドを産生する方法を提供するが、該方法は、好適な発現宿主中に、本発明のＩＶＤをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入すること、本発明の該ＩＶＤを発現すること、およびそれを単離することというステップを含む。好適な条件は、本発明に従うＩＶＤを含むポリペプチドを発現するために選出されなければならない。
【０１４０】
用語「好適な細胞」とは、哺乳動物の細胞または植物細胞などの高等真核細胞、糸状菌細胞または酵母細胞などの下等真核細胞は、任意に糖鎖改変されているが、上に説明されているとおり想定されるものである。
【０１４１】
具体的に本明細書において想定されるものは、本発明に従うＩＶＤまたはＩＶＳＤを含むポリペプチドの産生であるが、ここで該ポリペプチドは、グリコシル化されており、かつ末端のＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸、グルコース、グルコサミン、ガラクトサミン、バシロサミン、マンノースもしくはマンノース−６−Ｐ糖、または化学修飾単糖類（ＧａｌＮＡｚ、ＡｚＳｉａ、もしくはＧｌｃＮＡｚなど）をもつ１以上のグリカンを含む。
【０１４２】
例えば、本発明のＩＶＤを含むポリペプチド（ここでポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されており、かつ末端のＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、またはシアル酸をもつＮ−グリカンの混合物を含む）は典型的には、WO2010015722およびWO2015032899に記載のとおり、本発明に従う高等真核糖鎖改変細胞中の発現によって得られ得る。例えば、本発明のＩＶＤを含むポリペプチド（ここでポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されており、かつ末端のＧｌｃＮＡｃをもつＮ−グリカンを含むかまたはこれを本質的に含む）は、WO2010015722に記載のとおり、下等真核細胞中で産生され得る。例えば、末端のＧｌｃＮＡｃをもつＮ−グリカンは、WO2017005925に記載のとおり、内在性のＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性を欠く(deficient in)糖鎖改変細胞中で産生され得る。
【０１４３】
また具体的に本明細書において想定されるものには、本発明に従うＩＶＤを含むポリペプチドの産生もあるが、ここで該ポリペプチドのグリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃ、シアリル−ＬａｃＮＡｃ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、複合グリカン、ハイブリッドグリカン、およびＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｚからなる群から選択される１以上のグリカンからなる。さらにいっそう具体的に本明細書において想定されるのは、本発明に従うＩＶＤを含むポリペプチドの産生があるが、ここで該ポリペプチドのグリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃ、シアリル−ＬａｃＮＡｃ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、および複合グリカンからなる群から選択される１以上のグリカンからなる。
【０１４４】
本発明のＩＶＤを含むポリペプチド（ここでポリペプチドは、グリコシル化されており、およびここでグリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃグリカン、ＬａｃＮＡｃグリカン、およびシアリル−ＬａｃＮＡｃグリカンからなる）は典型的には、WO2010015722およびWO2015032899に記載のとおり、本発明に従う哺乳動物の糖鎖改変細胞中で得られるが、かかるＧｌｃＮＡｃグリカン、ＬａｃＮＡｃグリカン、およびシアリル−ＬａｃＮＡｃグリカンはまた、下等真核細胞中でも改変され得る（例として、酵母中への、哺乳動物の複合グリコシル化経路の導入を介して）。本発明のＩＶＤを含むポリペプチド（ここでポリペプチドは、グリコシル化されており、およびここでグリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃからなる）は、WO2017005925に記載のとおり内在性のＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性を欠き得る、本発明に従う糖鎖改変細胞中で産生され得る。
【０１４５】
本発明のＩＶＤを含むポリペプチド（ここでポリペプチドは、グリコシル化されており、およびここでグリコシル化は、複合グリカンからなる）は、任意に糖鎖改変されている、本発明に従う高等真核細胞中で産生され得る。本発明のＩＶＤを含むポリペプチド（ここでポリペプチドは、グリコシル化されており、およびここでグリコシル化は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリカン、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２グリカン、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカン、高(hyper)マンノシル化されたグリカン、マンノース−６−リン酸で修飾されたグリカン、および複合グリカンからなる群から選択される１以上のグリカンからなる）は、本発明に従う糖鎖改変細胞中、具体的に酵母細胞中で産生され得る。
【０１４６】
特定成分をＩＶＤへ連結させるためのカップリング方法
もう１つの他の態様において、本発明は、本発明のＩＶＤまたはＩＳＶＤ抱合体を産生するための方法を提供する。一般に、かかる方法は、えり抜きの(of choice)好適な細胞中に、本発明に従うＩＶＤをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入すること、これに続き、しばらくの間ＩＶＤポリペプチドを発現すること、ＩＶＤポリペプチドを精製すること、および特定の被抱合成分を精製されたＩＶＤポリペプチドへ連結することによって始める。カップリング方法自体は一般に、in vitroで実行される。
【０１４７】
当該技術分野において、特定の被抱合成分を本発明のＩＶＤポリペプチドに連結させるための実現性は、幾つか存在する。そこで一般に言われているのは、カップリング反応を実行するための、化学的な、酵素的な、および化学−酵素の組み合わせられた抱合ストラテジーである。
【０１４８】
具体的な態様に従うと、ＩＶＤ−抱合体を産生するための該方法は、
−  本発明のＩＶＤを含むポリペプチドのグリカンに存在する近接のジオールまたはジオールを酸化させること
−  得られた遊離アルデヒド基を、アミノオキシ含有分子と反応させること
というステップを含む。
【０１４９】
酸化のため、過ヨウ素酸ナトリウム、または当該技術分野において知られている数種の他の同等な試薬が使用され得る。特定の態様において、酸化されるべきジオールは、本発明のＩＶＤ上に存在するＬａｃＮＡｃ二糖類(disaccharaide)またはシアリル−ＬａｃＮＡｃ三糖類(trisaccharide)が起源である。オキシムはそれに続き、ＬａｃＮＡｃ／シアリル−ＬａｃＮＡｃ酸化−オキシムライゲーション化学として一般的に記載される、その結果得られた遊離アルデヒド基とアミノオキシ含有分子との反応によって形成される。
【０１５０】
当該技術分野において周知なのは、パラ−フェニレンジアミン、２−アミノフェノール、または２−（アミノメチル）ベンズイミダゾールのような触媒の使用である。オキシムおよびヒドラジンの抱合は、クリック化学、より複雑な生体直交型修飾ストラテジーの有望な代替手段である。還元的アミノ化条件の下、アルデヒド（例として、ガラクトース酸化は、ジ−アルデヒドを生成し、シアル酸酸化は、モノ−アルデヒドを生成する）は、アミンと反応し得、これによって安定なオキサゼピン誘導体がもたらされる。
【０１５１】
別の具体的な態様に従うと、ＩＶＤ−抱合体を産生するための該方法は任意に、
−  本発明のＩＶＤ上に存在する末端ＬａｃＮＡｃ Ｎ−グリカン中のＧａｌ残基のＣ６ヒドロキシル基を酸化すること
−  遊離アルデヒド基を、アミノオキシ含有分子と反応させること
というステップを含む。
【０１５２】
酸化のため、酵素ガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）が使用され得る。上に言及されるステップを採用すると、典型的にはオキシム結合が、任意にカタラーゼの存在下で、形成されるが、これらのすべてが当該技術分野において周知である。
オキシムおよびヒドラゾンの安定性をモジュレートするために、またはこれを具体的に増大させるために、リンカーの使用は、前に記載のとおり、具体的に本明細書において想定されている。
【０１５３】
より具体的な態様において、被抱合成分は、ＩＶＤ上に存在するグリカン、具体的には単一のＧｌｃＮＡｃまたはＬａｃＮＡｃへ、単糖類誘導体を介して連結されている。単糖類誘導体は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、突然変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、突然変異触媒ドメインを含むβ（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、またはＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼの存在下、ＩＶＤ上に存在するグリカンへ連結され得る。単糖類は、アジド基、ケト基、アルキニル基、もしくはチオール基、またはそれらの前駆体から選択され得る、１個、２個、３個、または４個の官能基を含み得る。官能基はまた、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基、またはスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からも選択され得る。詳細なプロトコルについては、読者は、WO2015057064およびWO2015057065を参照されたい。
【０１５４】
更に他の具体的な態様において、被抱合成分は、オキシム結合を介してグリカンへ、および／またはアジド修飾形態のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの、末端ＧｌｃＮＡｃをもつＮ−グリカンへの抱合を介して連結されている。さらにいっそう具体的な態様において、被抱合成分は、修飾ガラクトシルトランスフェラーゼを使用し、これに続きクリック化学をベースとした反応を介して関心のある分子を付着させることで、アジド修飾形態のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの、末端のＧｌｃＮＡｃをもつＮ−グリカンへの抱合を介してグリカンへ連結される。クリック化学をベースとした反応は、本分野において働いている者(those active in this field)には周知であり、また本明細書に提供される例に基づき明らかにもなっている。クリック化学における目下のアプローチに係る総説については、読者は、Jain, N. et al. Pharm Res. 32(11), 2015、Qasba, P.K. et al., Biotechnol Prog. 24(3), 2008、またはNwe, K. and Brechbiel, M.W., Cancer Biother Radiopharm. 24(3), 2009を参照されたい。
【０１５５】
前に記載のとおりのＩＶＤ抱合体の安定性をモジュレートするためのリンカーの使用は、具体的に本明細書において想定されている。
特定の数種の方法は、さらに下の例のセクションにおいて詳細に特定されている。
【０１５６】
本発明のＩＶＤおよびＩＶＤ−抱合体の適用
具体的な態様において、本発明のＩＶＤを含むポリペプチド−抱合体は、循環半減期をモジュレートするため、もしくはＩＶＤ安定性を増大させるために、選択的標的化のために、ＩＶＤ−抱合体の免疫原性をモジュレートするために、または検出目的のために、使用される。
もう１つの他の態様において、本発明のＩＶＤ−抱合体は、医薬として使用される。
【０１５７】
もう１つの他の態様において、本発明のＩＶＤ（いずれに成分とも抱合させていない）は、医薬として使用される。
もう１つの他の態様において、本発明のＩＶＤ（いずれに成分とも抱合させていない）は、抗体の事前結合を防止するために使用される。
もう１つの他の態様において、本発明のＩＶＤ（いずれに成分とも抱合させていない）は、免疫原性を低減するために使用される。
【０１５８】
表現「循環半減期をモジュレートするため」に関し、ポリペプチド（例として、ＩＶＤ−抱合体）の半減期が増加するかまたは減少するかのいずれかであり得ることが意味される。いくつかの用途のために、本発明のＩＶＤを含むポリペプチドまたは本発明のＩＶＤ−抱合体が、クレームされたとおりのポリペプチドまたはＩＶＤ−抱合体の特定の特性を欠如しているポリペプチドまたは抱合体より短い時間、血流中に留まることは有用であり得る。しばしば、多くの治療用分子が、腎での濾過閾より小さくかつ循環から迅速に喪失し、それによってそれらの治療可能性(their therapeutic potential)を限定するところ、長期にわたる(prolonged)半減期も目的としている(aimed)。非限定例として、アルブミンまたは上に参照されたとおりの他の半減期延長成分は、かかる分子の循環半減期を増加させるために、熟練した実践者に知られている様々なやり方において使用され得る。
【０１５９】
「選択的標的化」に関し、本発明のポリペプチドおよびＩＶＤ−抱合体が、関心のある標的に対する排他的な効果を獲得するのに有用であり得ることを意味する。この例は、正常な体細胞と相互作用しないがん細胞の選択的標的化がしばしば失敗している従来の化学治療である。その結果として(As a consequence thereof)、器官損傷を包含する重篤な副作用が引き起こされて、より低用量での(with lower dose)十分に機能を果たさない(impaired)処置を、最終的に低生存率をもたらす。本発明のポリペプチドおよびＩＶＤ−抱合体は、任意に標的化成分を含むが、がん治療に限定されない従来のアプローチの不利な点を克服するのに有用であり得る。
【０１６０】
本発明のポリペプチドおよび抱合体を使用して免疫原性をモジュレートするすることは、クレームされたとおりのポリペプチドまたはＩＶＤ−抱合体の特定の特性を欠如しているポリペプチドまたはＩＶＤ−抱合体と比較すると、達成され得ることである。例えば、長期の(long-term)処置にとって、免疫原性を下げることは好ましいことである。具体的および非限定的には、本明細書に記載のとおりのグリカンは、免疫原性を修正する(modify)ためのツールとして利用され得る。当業者は、一般的な知識および本明細書に提供される本開示に基づき、免疫原性を適応させ得る。
【０１６１】
本明細書に記載のとおりのポリペプチドおよび抱合体は、既存の抗体への結合を防止または低減するために使用され得る。この効果は、ＩＳＶＤ上のグリカンについての文献に記載されている（すなわちWO2016150845を参照）。抗体の事前結合を防止するための本発明に従うポリペプチドおよび抱合体の使用は、本開示の範囲内であり、また本明細書において想定されるものでもある。
【０１６２】
本発明のポリペプチドおよび抱合体はまた、前に説明されたとおり具体的に検出ユニットを含むとき、検出目的のためにも提供される。具体的に、本発明のポリペプチドおよび抱合体は、クレームされたポリペプチドまたは抱合体の特定の特性を欠如しているポリペプチドまたは抱合体より、検出目的に向いている(prone)。よって具体的な態様において、本発明のＩＶＤ−抱合体はまた、診断目的のためにも使用され得る。
【０１６３】
もう１つの他の態様において、本発明は、本発明のＩＶＤを含むキットを提供する。
もう１つの他の態様において、本発明は、本発明のＩＶＤ−抱合体を含むキットを提供する。
別の態様において、前に記載のとおりのＩＶＤを含むポリペプチドまたはＩＶＤ−抱合体を含む医薬組成物が提供される。
【０１６４】
したがって、本発明は、薬学的に許容し得る担体と、薬学的に有効な量の本発明のポリペプチド、ヌクレオチド配列、およびＩＶＤ−抱合体と、薬学的に許容し得る担体から構成される医薬組成物を包含する。薬学的に許容し得る担体は、好ましくは、相対的に非毒性であり、かつ活性成分(active ingredient)の有効な活性と合致した濃度にて患者に無害である担体であって、その担体に起因するいずれの副作用も、活性成分の有益な効果を損なうことがない。
【０１６５】
薬学的に有効な量の本発明のポリペプチド、ヌクレオチド配列、および抱合体と、薬学的に許容し得る担体とは、好ましくは、処置されている具体的な条件で、結果を挙げるかまたは影響を及ぼす量である。本発明のポリペプチド、ヌクレオチド配列、および抱合体と、薬学的に許容し得る担体とは、いずれの有効な従来の剤形（即時放出、徐放、および時限放出の調製物を包含する）も使用し、当該技術分野において周知である薬学的に許容し得る担体とともに投与され得、かついずれの好適なルート（当業者に一般的に知られているいずれのルートなど）によっても投与され得る。
【０１６６】
治療のため、本発明の医薬組成物は、標準的な技法に従っていずれの患者にも投与され得る。投与は、経口的に、非経口的に、局所的に、経鼻的に、点眼的に(ophthalmically)、髄腔内に、脳室内に、舌下に、経直腸的に、経膣的に、等を包含する、いずれの適切な様式によるものであってもよい。ナノ技術としての製剤ならびにエアロゾルおよび吸入薬(inhalant)の更に他の技法もまた、本発明の範囲内である。投薬量および投与の頻度は、患者の年齢、性別、および状態、他の薬物との併用投与、禁忌(counter-indications)、ならびに臨床医によって考慮されるべき他のパラメータに応じるであろう。
【０１６７】
本発明の医薬組成物は、保管のために凍結乾燥され得、使用に先立ち好適な担体において再構成され得る。
【０１６８】
凍結乾燥体または液体として調製されるとき、生理学的に許容し得る担体、賦形剤、安定剤が、本発明の医薬組成物中へ加えられることが必要となる（Remington's Pharmaceutical Sciences 22th edition, Ed. Allen, Loyd V, Jr. (2012)）。担体、賦形剤、および安定剤の投薬量と濃度とは、対象（ヒト、マウス、および他の哺乳動物）に対して安全であるべきであり、それらは、ホスファート、シトラート、および他の有機酸などの緩衝剤；ビタミンＣなどの酸化防止剤、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどの小ポリペプチド、タンパク質；ＰＶＰなどの親水性ポリマー、アミノ酢酸、グルタマート、アスパラギン、アルギニン、リシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなどのグリコース、二糖類、および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール；Ｎａ＋などの対イオン、および／またはTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）、もしくはＰＥＧなどの界面活性剤等を包含する。
【０１６９】
本発明の医薬組成物を含有する調製物は、注射前に滅菌されるはずである。この手順は、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過膜を使用してなされ得る。
医薬組成物は大抵、コルク付きi.v.溶液瓶などの、滅菌されたアクセスポート(access port)付き容器に充填されている。コルクは、皮下注射針によって貫通され得る。
【０１７０】
具体的な態様、特定の立体配置、ならびに材料および／または分子が、本明細書中、本発明に従うヌクレオチド配列、細胞、ポリペプチド、抱合体、および方法について考察されてきたが、様々な変更(changes)または改変(modifications)が、形式上かつ詳細に、本発明の範囲および精神から逸脱せずになされてもよいことは、理解されるべきである。以下の例は、具体的な態様をより良く解説するために提供されるものであって、本願を限定するものとして見なされるべきものではない。本願は、クレームによってしか限定されない。
【０１７１】
例１：Ｎ−グリカンを導入するための合理的な設計アプローチとしての、ＩＳＶＤ構造の結晶学的データの使用
本例において、我々は、代表的な免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチド（RCSB Protein Data Bankまたは手短に言えば：ＰＤＢデータベースから探し出した(isolated from)エントリー3K74からの鎖Ｂ；3K74は、２つの鎖、言い換えれば、Ａ鎖（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）およびＢ鎖（ジヒドロ葉酸レダクターゼに結合するナノボディー）を含有する；本明細書において、さらに我々は、ナノボディー（Ｂ鎖）のみを特定するために3K74を使用する）の入手可能な結晶学的構造から、人工のＮ−グリコシル化部位の導入に好適な構造中の領域を特定することを始めた。この3K74 ＩＳＶＤポリペプチドは、Oyen D. et al (2011) J.Mol.Biol. 407: 138-148によって最初に記載されたナノボディーであり、そのタンパク質２次構造は、図１に図式的に描かれている。
【０１７２】
我々の合理的な設計アプローチにおいて、我々は、Ｎ−グリカンの導入のための２次構造中の潜在的な領域が、抗体の抗原認識部位と干渉すべきでない（または妨害すべきでない）と、重要なことには、折り畳みの間にベータシートの形成を阻止すべきでないと推論した。ナノボディーのＣＤＲ領域が抗原認識に重要であり、かつベータシート構造が正確な折り畳みに重要であるところ、我々は、ＣＤＲ領域とベータ鎖との間のタンパク質領域がおそらくＮ−グリカンの付着などの些細な修飾に対して感受性が低いであろうと仮定した。
【０１７３】
例２：Ｎ−グリコシル化のサイン導入のためのＩＳＶＤ中９つの仮想領域の選択
例１において概説された我々の合理的な設計アプローチおよび特定の基準に基づき、我々は、代表的なナノボディー3K74に存在する合計９つの領域を選択した（図１、右パネルを参照、人工のＮ−グリカン受容部位の導入のために選択された９つの領域は黒色で描かれている）。ベータシート構造要素に存在する領域に加えて、我々は、Ｎ−およびＣ末グリコシル化タグの、配列番号１で表される実際のナノボディーアミノ酸配列への付加を計画した。
【０１７４】
いずれのＮ−およびＣ末タグもない、ナノボディー3K74のアミノ酸配列は、配列番号１で表される。配列番号１中ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の領域に下線を付す。
配列番号２はＣＤＲ１を表し、配列番号３はＣＤＲ２を表し、配列番号４はＣＤＲ３を表し、配列番号５はＦＲ１を表し、配列番号６はＦＲ２を表し、配列番号７はＦＲ３を表し、および配列番号８はＦＲ４を表す。
【０１７５】
配列番号１（１１５アミノ酸）：
QLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYWMYWVRRAPGKGLEWVSMINPGGIITKYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAKDWATGLAKKGQGTQVTVSS
【０１７６】
配列番号２（ＣＤＲ１）：GFTFNNYW
配列番号３（ＣＤＲ２）：INPGGIITK
配列番号４（ＣＤＲ３）：AKDWATGLA
配列番号５（ＦＲ１）：QLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
配列番号６（ＦＲ２）：MYWVRRAPGKGLEWVSM
配列番号７（ＦＲ３）：YAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYC
配列番号８（ＦＲ４）：KKGQGTQVTVSS
【０１７７】
また、例１において概説された基準に基づき、我々は、ナノボディー3K74の９つの選択されたタンパク質領域内の特定のアミノ酸配列を選択した（ナノボディー構造の９つの異なる領域中に導入されるべき１０のＮ−グリカン受容部位案を描く図２を参照）。
【０１７８】
例３：ＧＦＰ結合ナノボディーを使用する概念実証(Proof-of-concept)
ＧＦＰ結合ナノボディー（ＧＢＰと略され、Kubala, M.H. et al (2010) Protein Sci. 19(12)によって公開された）を、例２において特定され、合理的に設計された１０のＮ−グリコシル化受容部位案の導入のためのベンチマーク(benchmark)ＩＳＶＤとして選択した。我々は、人工のＮ末糖鎖タグ付けされたバリアント（QADDANATVQLVESGGA、野生型ＧＢＰ中QVQLVESGGAの代わり）を包含させた。我々はまた、Ｃ末糖鎖(glyco-)ＨＩＳタグ付けされたバリアント（VSSLQAAAAAANATVAAASGDVWDIHHHHHH、野生型（ＨＩＳタグ付けされた）ＧＢＰ中VSSHHHHHHの代わり）も包含させた。ＧＢＰバリアントのすべてが、精製および／または検出を容易にするＣ末ヒスチジンタグ（６×ＨＩＳ）を備えていた。
【０１７９】
ナノボディーＧＢＰのアミノ酸配列は、配列番号９で表される。配列番号９中ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の領域に下線を付す。
配列番号１０はＣＤＲ１を表し、配列番号１１はＣＤＲ２を表し、配列番号１２はＣＤＲ３を表し、配列番号１３はＦＲ１を表し、配列番号１４はＦＲ２を表し、配列番号１５はＦＲ３を表し、および配列番号１６はＦＲ４を表す。
【０１８０】
配列番号９：
QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSSHHHHHH（１２１アミノ酸）
【０１８１】
配列番号１０（ＣＤＲ１）：GFPVNRYS
配列番号１１（ＣＤＲ２）：MSSAGDRSS
配列番号１２（ＣＤＲ３）：NVNVGFE
配列番号１３（ＦＲ１）：QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAAS
配列番号１４（ＦＲ２）：MRWYRQAPGKEREWVAG
配列番号１５（ＦＲ３）：YEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
配列番号１６（ＦＲ４）：YWGQGTQVTVSS
【０１８２】
図３は、ＧＢＰナノボディーと、例１からの参照ナノボディー3K74とのアミノ酸アライメントを描く。Ｎ連結型グリコシル化サインを、3K74参照ナノボディー結晶構造の合理的な分析を通して同定された仮定の場所にて、ＧＢＰタンパク質に導入した。ナノボディーＧＢＰ中Ｎ−グリカン受容部位を得るために導入された特定の突然変異を図４に描く。
【０１８３】
数種のキメラ遺伝子を構築した：図４に描かれるとおり、野生型ＧＢＰナノボディーと、特定の位置に導入されたＮ−グリコシル化受容部位をもつ種々の突然変異体とのコード配列を、Pichia pastorisのＡＯＸ１プロモーター（メタノール誘導性プロモーター）へ作動可能に連結した。その結果得られた発現ベクターを、Pichia pastorisの３つの異なる株：野生型（ＷＴ）、GlycoSwitch M5（ＧＳＭ５）およびGlycoDelete（ＧＤ）に導入した。GlycoSwitch M5株は、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造をもつ、その糖タンパク質を修飾する（Jacobs, P.P. et al., (2009) Nat Protoc. 4(1)）一方、GlycoDelete株中に発現されるタンパク質は、単一のＧｌｃＮＡｃ残基が均一に修飾される（例えば、Claes, K. et al. (2016) ACS Synth Biol. 5(10)、および出願WO2010015722中考察される一般のGlycoDelete技術を参照）。
【０１８４】
続いて、組み換えPichia pastorisの種々の培養物をまず、唯一の炭素供給源としてのグリセロールを含有する培地中４８ｈ、２８℃にて成長させ、続いて、組み換えタンパク質発現を、グリセロールをメタノールに置換することによって誘導した。２８℃にて、もう４８時間後に、成長培地（上清）を、各組み換え培養物から回収した。培養上清を続いて、エンドグリコシダーゼＰＮＧａｓｅＦで処置するか（Ｎ−グリカンを除去するため）またはモックで処置するかのいずれかを行い、クマシーブルー（Coomassie Blue)染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨｉｓタグ特異的ウェスタンブロット(Western Blot)を介してアッセイした。この分析の結果を図５、６および７に示す。
【０１８５】
我々のデータは、Ｎ−グリコシル化の効率に変動はあったが、ナノボディーＧＢＰのグリコシル化が、ほとんどすべてのそれらの糖鎖バリアント（Ｓ７３Ｎ−Ｋ７５Ｔバリアント（aHoナンバリング）を除く）について得られたことを示す。グリコシル化効率を特定する概観については、表１を参照。これはまた図４の上部にも示される（グリコシル化効率について、+++、+、および-として表示される）ことに留意されたい。意外なことに、極めて効率的なグリコシル化に繋がる４つの特定の位置を、ナノボディータンパク質構造から同定した：位置１４、位置２７、位置４８、および位置８６。また意外なことに、これらの位置の２つ（２７および８６）は、Ｎ−グリカン部位の導入に関するナノボディーについて何ら記載されてこなかった。位置１４および４８は、WO2016150845において偶然にも引用されている。位置１４、２７、４８および８６は、Ahoナンバリングに従う。
【０１８６】
Pichia pastoris GlycoDeleteバックグラウンドにおいて産生された−Ｄ鎖とＥ鎖との間のループ中に修飾された−とりわけ高度に効率的にグリコシル化されたＧＢＰ−Ｒ８６Ｎバリアント（aHoナンバリング）をさらに、標準的なＮｉ２＋親和性クロマトグラフィーおよびゲル濾過を使用した精製後に詳細に特徴付けし、続いてＥＳＩ−ＱＴＯＦ質量分析計を使用した分析した。結果を図８に描く。
【０１８７】
ナノボディーＧＢＰ−Ｒ８６Ｎが、主にそのグリコシル化された形態で生じた。我々は、この糖鎖バリアントが極めて効率的なグリコシル化を可能にさせることを示す。
【０１８８】
ナノボディーの機能性が保持されているかどうか検証するため、我々は、非修飾ＧＢＰナノボディーと、位置１４、２７、４８および８６での４つの選択されたグリコシル化バリアントとの両方の熱安定性およびＧＦＰ結合親和性を分析した。選択された糖鎖バリアントを、Pichia pastoris Kai3中、組み換えで産生した（Vervecken, N. et al (2007) Modification of the N-glycosylation pathway to produce homogeneous, human-like glycans using GlycoSwitch plasmids, in: J.M. Cregg (Ed.), Pichia Protocols、Humana Press, New York, pp. 119‐138を参照）。そのPichia株は、組み換えタンパク質上Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２型Ｎ−グリカンを生成する。ＧＢＰ−ＷＴおよびそれらの糖鎖バリアントの融解曲線を、ｑＰＣＲ機においてSYPRO Orange染料を使用するサーマルシフトアッセイから得た（Huynh K & Partch CL in Current Protocols in Protein Sciences 79, 2015）。
【０１８９】
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２型Ｎ−グリカンが、位置１４、２７または４８にて導入された場合、融解曲線の形状は変化する：それは、ＧＢＰ−ＷＴおよび糖鎖バリアントＲ８６Ｎについて得られる２つの変性ピークの代わりに、たった１つの変性ピークしか示さない（図１２を参照）。しかしながら、熱変性が開始する温度はシフトしない。意外なことに、我々は、ナノボディー機能（抗原結合）が、４つの特定の領域中Ｎ−グリカンの存在によって損なわれないことを観察した：ＧＦＰ結合親和性は、ナノモル濃度以下の(sub-nanomolar)範囲にある（図１３を参照）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２型Ｎ−グリカンが位置４８にて生じたときのみ、抗原親和性は穏やかに減少する（解離定数ＫＤは増加する）が、これは大部分が、減少した結合速度(association rate)（ｋｏｎ）に起因する（図１３を参照）。
【０１９０】
例４：アプローチの一般化
我々がこれらの知見を他のナノボディーに当てはめられるか評価するため、我々は、数種の他のナノボディーにＮ連結グリコシル化サインを導入した。ナノボディーNb41（これは、Claes, K. et al (2016) ACS Synth Biol. 5(10)においてＮｂＣＡ４１４１と指定される）において、我々は、参照ナノボディー3K74中のＫ８６ＮおよびＧＢＰナノボディー中のＲ８６Ｎに対応する部位にてＮ−グリコシル化シークオンを導入した。Nb41の配列は、配列番号１７で表される。配列番号１８はＣＤＲ１を表し、配列番号１９はＣＤＲ２を表し、配列番号２０はＣＤＲ３を表し、配列番号２１はＦＲ１を表し、配列番号２２はＦＲ２を表し、配列番号２３はＦＲ３を表し、および配列番号２４はＦＲ４を表す。
【０１９１】
ナノボディーF-VHH-4およびF-VHH-L66（Rossey, I. et al. (2017) Nat. Commun. 8, 14158）において、我々は、ＧＢＰ中Ｇ２７Ｎおよび／またはＲ８６Ｎに対応する部位にてＮ−グリコシル化シークオンを導入し、よって１つまたは２つのＮ連結型グリコシル化サインのいずれかを担持するナノボディーが得られた。F-VHH-4およびF-VHH-L66の配列は夫々、配列番号２５および配列番号２６で表される。
【０１９２】
配列番号１７：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAAISSGGRTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCNVGSWGFRSHSYLSGSSWGQGTQVTVSSHHHHHH（１２９アミノ酸）
３つのＣＤＲ領域に下線を付す。
【０１９３】
配列番号１８（ＣＤＲ１）：GSIFSINA
配列番号１９（ＣＤＲ２）：ISSGGRTN
配列番号２０（ＣＤＲ３）：NVGSWGFRSHSYLSGS
配列番号２１（ＦＲ１）：QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVAS
配列番号２２（ＦＲ２）：MGWYRQAPGKQRELVAA
配列番号２３（ＦＲ３）：YADSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYC
配列番号２４（ＦＲ４）：SWGQGTQVTVSS
【０１９４】
配列番号２５（F-VHH-4）：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYYIGWFRQAPGKEREAVSCISGSSGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATIRSSSWGGCVHYGMDYWGKGTQVTVSSGSHHHHHHHH（１３５アミノ酸）
配列番号２６（F-VHH-L66）：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYYIGWFRQAPGKEREGVSCISSSHGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATVAVAHFRGCGVDGMDYWGKGTQVTVSSGSHHHHHHHH（１３５アミノ酸）
【０１９５】
図９は、ナノボディーNb41、F-VHH-4、およびF-VHH-L66と、ナノボディーＧＢＰおよび3K74との配列アライメントを描く。
【０１９６】
野生型Nb41（いずれのＮ−グリコシル化サインもない）を、例３において概説されたのと同様に、Pichia WTにおいて組み換えで産生した。Nb41において、Ｋ８６Ｎ突然変異は、ＧＢＰ−Ｒ８６Ｎ突然変異と同等である。Nb41-K86Nを、例３において概説されたのと同様に、Pichia WT、Pichia GSM5、およびPichia GlycoDeleteにおいて組み換えで産生した。発現の誘導後、すべての組み換え産生物の上清を回収し、ＰＮＧａｓｅＦ処置またはモック処置し、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはＨｉｓタグ特異的ウェスタンブロット分析を介してアッセイした。データを集積したものを図１０に示す。
【０１９７】
Nb41について、我々は、グリコシル化が、ＷＴナノボディーには存在していなかった（期待されるとおり）一方、位置８６（AHoナンバリング）でのグリコシル化サインの導入が、効率的なＮ−グリカン修飾を可能にさせたことを示す。
【０１９８】
野生型F-VHH-4およびF-VHH-L66（いずれのＮ−グリコシル化サインもない）、ならびにＧ２７Ｎ突然変異および／またはＫ８６Ｎ突然変異（夫々ＧＢＰ中Ｇ２７ＮおよびＲ８６Ｎに対応する；AHoナンバリング）を担持するそれらのバリアントを、例３において概説されたのと同様に、Pichia WT、Pichia GSM5（Pichia Kai3株と同名）およびPichia GlycoDelete中、組み換えで産生した。発現誘導後、すべての組み換え産生の上清を回収し、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、Ｈｉｓタグ特異的ウェスタンブロット分析、および質量分析(mass spectrometry analysis)を介してアッセイした。クマシーブルーおよびウェスタンブロットデータを図２３に示す。
【０１９９】
F-VHH-4およびF-VHH-L66について、我々は、グリコシル化が、ＷＴナノボディーには存在していなかった（期待されるとおり）一方、位置２７または８６（AHoナンバリング）でのグリコシル化サインの導入が、効率的なＮ−グリカン修飾を可能にさせたことを見出した。同じ主鎖中の位置２７でのおよび位置８６でのＮ連結型グリコシル化サインの同時導入によって、両部位での効率的なＮ−グリカン修飾に繋がった。
【０２００】
位置２７および８６（AHoナンバリング）でのグリコシル化効率を客観的に評価するため、我々は、Pichia pastoris GlycoSwitchM5中に産生されたＶＨＨ糖鎖バリアントのＨｉｓタグ特異的ウェスタンブロットに関し密度測定(densitometry)分析を実施した。F-VHH-4-G27Nの部位占有率が９６％と決定され（図２３）、F-VHH-4-R86Nのそれが９３％であり（図２３）、GBP-G27N-P30Tのそれが８６％であり（図７）、GBP-R86Nのそれが９３％であった（図５）。位置２７および８６にてＮ−グリコシル化部位をもつ他のすべてのナノボディーバリアントについて、蛍光の増分が上方のバンド（Ｎ−グリコシル化されたナノボディーに対応する）の過剰曝露を防止するのに十分なほど低く設定されたとしても、下方のバンド（グリコシル化されなかったナノボディーに対応する）は検出され得た。これは、少なくとも８０％のＮ−グリコシル化を示唆する。
【０２０１】
異なる組み換えPichia pastorisバックグラウンドにおけるＧＢＰ、Nb41、F-VHH-4、およびF-VHH-L66ナノボディーを用いて得られたグリコシル化効率を集積したものを表１に要約する（また具体的にはＧＢＰ突然変異体について図１１も参照）。
【表２−１】
2020519261.tif 000003
【表２−２】
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【０２０２】
表１：Ｎ−グリコシル化ナノボディーバリアントの概観。Pichia株：WT＝野生型、GSM5＝GlycoSwitchM5（Pichia Kai3株の代替名）、GD＝GlycoDelete。Ｎ−グリコシル化型：高(High)Man＝高(high-)マンノースＮ−グリコシル化、Man5＝Man5GlcNAc2、およびGlcNAc＝単一GlcNAc残基。＊Pichia GlycoDelete中に産生されたナノボディーGBP-R86Nについて、Ｎ−グリコシル化をＥＳＩ−ＱＴＯＦ質量分析によって検証かつ定量化した。CB＝クマシーブリリアントブルー(Coomassie Brilliant Blue)染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、WB＝Ｈｉｓタグ特異的ウェスタンブロット分析、MS＝質量分析(Mass spectrometric analysis)。
【０２０３】
異なるPichiaバックグラウンドにおいて産生されたＲＳＶ特異的ＶＨＨであるF-VHH-L66およびF-VHH-4（ＷＴ、ＧＳＭ５（GS Man5として図１４に示される）、およびGlycoDelete）を、ＲＳＶ中和アッセイにおいて、それらの中和能力(neutralizing capacity)についてアッセイした。手短に：ベロ細胞を９６ウェルプレート中15.000細胞／ウェルの密度にて播種し、３７℃にて培養した。翌日、Optimem中４倍段階希釈の精製ＶＨＨ（４００ｎｇ／ｍｌにて始める）を等体積のRSV A2（１，３４ＰＦＵ／μｌ）とともに混合し、３０分間３７℃にてインキュベートした。
【０２０４】
続いて、ベロ細胞をOptimemで１度洗浄し、Optimemを５０μｌのＶＨＨ−ウイルス混合物と置き換えた。細胞を３７℃にて３ｈインキュベートした。３ｈ後、５０μｌのＤＭＥＭ＋１．２％アビセル＋１％ＦＣＳを細胞へ加え、細胞をさらに３７℃にて３日間インキュベートした。最後に、細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、ポリクローナルヤギ抗ＲＳＶ抗体で染色して、プラークを計数した。ＶＨＨのF-VHH-L66の結果を図１４に示す。
【０２０５】
我々の結果は、これらのＶＨＨ中のグリコシル化部位の導入が、ＲＳＶへのＶＨＨ結合およびＲＳＶの中和を遮断しないことを示す。それにもかかわらず、存在するグリカン（単数または複数）（の型）の効果は識別され得る。グリカンのサイズは、ＶＨＨの中和能力と逆の相関関係があるようだが、大きな流体力学半径をもつグリカンは、より小さなグリカン（ＷＴグリカン＞Man5グリカン＞GlycoDeleteグリカン）より多く中和に干渉することが示唆される。その上、これらのＶＨＨについて、部位２７（AHoナンバリング）でのグリカンは、部位８６（AHoナンバリング）でのグリカンよりわずかに多く中和を妨害するように見える；両部位でのグリカンの存在は相加効果を有する。
【０２０６】
よって、我々は驚くべきことに、小さなGlycoDelete型グリカン（ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃ、およびシアリル−ＬａｃＮＡｃ）のＶＨＨ中の種々の位置での導入が、ＲＳＶウイルスを対象にするＶＨＨについて本明細書に示されるとおり、ＶＨＨの効率の低減には繋がらないと結論付けられる。
【０２０７】
我々は、効率的なＮ−グリコシル化を可能にさせるＩＳＶＤ内の位置（ここでナノボディーに対して適用される）が、構造基準に基づき合理的に選択され得ること、これらの位置が、ＩＳＶＤ内に保存されていること、および我々の概念が、種々のナノボディーに適応され得ることを結論付けた。ＩＳＶＤの機能を圧迫させずに効率的なＮ−グリカン産生に繋げるＩＳＶＤ配列中の具体的に好ましい位置は、２つの領域８３〜８８および２７〜４０（ＡＨｏナンバリング）である。
【０２０８】
例５：ＩＳＶＤの属における効率的なＮ−グリカン導入のために同定された位置の一般化
２２２のＶＨＨコード鎖の配列（ＰＤＢ検索を、クエリー「ＶＨＨ」またはナノボディーを用いて実行し、巨大分子名が「ナノボディー」、「ｎｂ」、「ｎａｂ」、「ｖｈｈ」もしくは「ｃａｂ」のいずれかを含有する得られたＰＤＢ ＩＤにつき１つの鎖を選択した；または供給源の種は、Camelus dromedarius、Lama glama、もしくはVicugna pacosである；または保存されているアミノ酸配列「ＶＱＬ」が、最初の４０アミノ酸残基にある）をRCSB Protein Data Bank（要するにＰＤＢ）から抽出し、PyMOL（PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3 Schroedinger, LLC.）を使用してアライメントした。これらのＶＨＨの各々において、アミノ酸８３と８８（AHo）との間の領域、およびアミノ酸２７と４０（AHo）との間の領域は、２次構造のベータ鎖を連結するアミノ酸鎖を構成する。
【０２０９】
続いて、これらの保存されているリンカー領域の存在を、Antibody Variable Domain Database（ＡＢＶＤＤＢ）においてアライメントされたＶＨＨコード配列のほとんど１００％（１６６８のうち１６６７）において確認した。具体的な仮説に限定されずに、我々は、これらの選択された領域において、グリカン置換基が、抗原認識への干渉を最小限にするように、抗原結合領域から離れて突き出したものと推論する。我々は、これら２つの保存されている領域内に位置付けらる位置にて導入されたグリコシル化受容部位が、すべてのナノボディーにおいて効率的にＮ−グリコシル化されるであろうと予想される人工のＮ−グリカン部位の導入のために使用され得ると結論付ける。
【０２１０】
次のステップにおいて、我々は、アミノ酸８３と８８（AHo）との間の、およびアミノ酸２７と４０（AHo）との間の単一のどの位置でもＮ−ｘ−Ｔシークオンを導入することによって（ただし、バリアントの各々において、Ｎ（Ａｓｎ）が、シークオン中には存在するが、種々の位置（例として、８２、８３、８４、８５、８５と８６との間の人工的に挿入された配列、８６、８７、８８、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３３と３９との人工的に挿入された配列、３９、または４０）にて存在するように（図１５を参照））、ＧＢＰナノボディーバリアントをコードするいくつかの(a range of)発現プラスミドを生成した。
【０２１１】
具体的に言うと、ＧＢＰナノボディーアミノ酸配列（AHo-ナンバリング）について、位置２８および３４〜３８は存在しないことに留意されたい。これらすべてのナノボディーバリアントを、上に記載のとおり組み換えPichia pastoris Kai3株中で産生した−位置２９および８５にてアルギニンへ突然変異したアミノ酸をもつバリアント（Ｆ２９Ｎ−Ｐ３０Ａ−Ｖ３１ＴおよびＡ８５Ｎ）は、Pichia pastorisにおいて効率的には形質転換せず、評価しなかった。続いて、すべての組み換えバリアントの上清を回収し、ＰＮＧａｓｅＦ処置またはモック処置し、Ｎ−グリコシル化の存在について、クマシーブリリアントブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはＨｉｓタグ特異的ウェスタンブロット分析を介してアッセイした（図１６を参照）。
【０２１２】
Ｎ−グリカンの存在を、発現されたナノボディーバリアントの各々において確認することができた；しかしながら、Ｎ−グリカン付加（部位占有率）の効率は、Ｎ−グリコシル化シークオン導入のために選出された正確なアミノ酸位置に潜在的に応じる（表２を参照）。存在するグリカンが実際に（ＧｌｃＮＡｃ）２Ｍａｎ５であることを確認するため、野生型ＧＢＰ、選択された各領域（領域２７〜４０中のＧＢＰ−Ｐ３０Ａ−Ｖ３１Ｎ−Ｒ３３Ｔ、および領域８３〜８８中のＧＢＰ−Ｄ８４Ｎ−Ａ８５Ｔ）中の糖鎖バリアント、および最初の領域（GBP-33-39-longinsert）中に人工挿入物を含有する糖鎖バリアントの上清試料を、無傷のタンパク質質量分析によって分析した（図１６の右下）。各糖鎖バリアントについて、１２１６Ｄａ（ＧｌｃＮＡｃ）２Ｍａｎ５修飾の存在を示すピークが観察された。
【０２１３】
上の結果は、ナノボディーが、合理的に選出され保存されている領域（Ｎ−グリカンの存在が抗原認識およびタンパク質の折り畳みに影響を及ぼさない）において効果的にグリコシル化され得ることを示す。これらのデータは、グリカン媒介標的化および部位特異的グリカンをベースとした抱合ストラテジーのための道を開く。
【表３】
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【０２１４】
表２：選択された領域内のＮ−グリコシル化ＧＢＰバリアントの概観。Pichia株GSM5＝GlycoSwitchM5。Man5＝Man5GlcNAc2。＊Pichia GlycoDelete中に産生されたナノボディーGBP-R86Nについて、Ｎ−グリコシル化を、クマシーブリリアントブルー（ＣＢ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＨＩＳウェスタンブロット（ＷＢ）検出によって定量化した。pKai61ベクターの起源は、Schoonooghe S et al (2009) BMC Biotechnol. 9, 70に記載されている。
【０２１５】
例６：グリカン特異的抱合方法の開発
先の例からのデータは、ＩＳＶＤ（ナノボディーによって例示される）が、合理的に選出され保存されている領域（グリカンの存在が抗原認識およびタンパク質の折り畳みに影響を及ぼさない）において効果的にグリコシル化され得ることを、説得力をもって示す。これらのデータは、ＩＳＶＤのグリカン媒介標的化および部位特異的グリカンをベースとした抱合ストラテジーのための道を開く。以下の例において、我々は、グリカン特異的抱合方法の本願のため、人工的に改変されたＮ−グリコシル化部位（例３、４および５において概説されたとおり）にて単純かつ均一なＮ連結型グリカンをもつナノボディーを使用している。
【０２１６】
実際に、ＧｌｃＮＡｃのみおよび／またはＬａｃＮＡｃのみおよび／またはシアリル−ＬａｃＮＡｃのみを含むＮ−グリカンは、in vitroアプローチによって得られ得るか、あるいは、WO2010015722に記載されるとおりGlycoDelete技術を介して、またはWO2017005925に記載されるとおりGlycoDoubleDelete技術を介してin vivoで得られる得る。単純なＮ−グリカンは、多種多様の所望される成分−例として、ＰＥＧ鎖、キレーター、毒性薬物等々へのカップリングのために使用され得るタンパク質上に生体直交型の柄を提供する。異なるグリカンをベースとした抱合化学を、市販のビオチン化ＰＥＧを使用して、評価／最適化する。基本的に、抱合のための広範な方法が２つ存在する：例７において例示されるとりの化学方法、および例８において例示されるとおりの化学と酵素とを組み合わせた抱合方法。
【０２１７】
例７：化学抱合ストラテジー
この例において、我々は、位置８６（Ahoナンバリング）にて人工的に導入されたＮ−グリカンをもつナノボディーが、どのようにして、グリカン上にＰＥＧ−ビオチンで特異的に修飾され得るかを示す。ナノボディーを先ず、ＨＥＫ２９３のGlycoDelete細胞（WO2010015722を参照）、ＨＥＫ２９３のGlycoDoubledelete細胞（WO2017005925を参照）、Pichia-GlycoDelete細胞、またはガラクトシルトランスフェラーゼを過剰発現するPichia-GlycoDelete細胞において組み換えで発現させる。使用されるGlycoDelete方法に応じて、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリル−ＬａｃＮＡｃからなる群から選択されるグリカンで修飾されたナノボディーが得られる。
【０２１８】
最初の抱合ストラテジーに従うと、グリカン中の近接ジオール（単数または複数）を、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）によって酸化させる。この化学の初期バージョンは、例として蛍光標識抗体を生成するため、数十年間使用されている。GlycoDelete技術を介して得られた糖鎖改変ナノボディーは、過ヨウ素酸酸化が純粋産物を生産するグリカンを担持する（野生型グリカンの状況とは対照的に）。ＬａｃＮＡｃ型グリカン（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）は、ガラクトース残基中、酸化され得る単一の近接「ｃｉｓ」ジオールを含有する（Ｃ３およびＣ４環位置にて）。
【０２１９】
シアリル−ＬａｃＮＡｃ型グリカンは、ガラクトース残基中の近接ｃｉｓジオールに加えて、末端シアル酸残基のグリセロール側鎖中に近接ジオールを含有するが、前記近接ジオールは過ヨウ素酸酸化を受けやすい。シアル酸中の近接ジオールは、過ヨウ素酸塩(periodate)によって、ガラクトースよりはるかに容易に酸化されるが、依然として産物均一性を保持しつつシアル酸酸化を好む穏やかな酸化条件の使用を可能にさせる。グリカン中に存在する近接ジオールの過ヨウ素酸酸化は、アミノオキシ含有分子と容易に反応することでオキシム（これは即時に水中で安定する）を形成し得る遊離アルデヒド基を創出する。
【０２２０】
代わりに、遊離アルデヒドは、ヒドラジン含有分子と反応することで安定なヒドラゾン連結を形成し得るか、または還元的アミノ化を介してアミン含有分子へ連結され得る。この様式で抱合されたＬａｃＮＡｃおよびシアリル−ＬａｃＮＡｃグリカンは、タンパク質のアスパラギンへ直接連結された無傷のＧｌｃＮＡｃ残基を保持するが、これはリソソーム中の抱合体分解性の観点から好ましい。ＬａｃＮＡｃ−およびシアリル−ＬａｃＮＡｃをベースとした過ヨウ素酸酸化と、これに続くオキシムライゲーションとの図式概略図は、図１７（ＬａｃＮＡｃ）および図１８（シアリル−ＬａｃＮＡｃ）に説明されている。
【０２２１】
手短に、Ｒ８６Ｎ突然変異を担持するＧＢＰを、ＨＥＫ２９３のGlycoDelete細胞中組み換えで産生して精製し、非グリコシル化されたタンパク質と、単一ＬａｃＮＡｃ鎖またはシアリル−ＬａｃＮＡｃ鎖のいずれかを担持するタンパク質との混合物が生産された。精製されたタンパク質を次いで、穏やかな過ヨウ素酸酸化、これに続き、ビオチン化されかつアミノオキシ修飾された短いＰＥＧ鎖へのオキシムライゲーションに供した。質量分析(Mass spec analysis)は、ＰＥＧ鎖がシアリル−ＬａｃＮＡｃ担持ＧＢＰへ選択的に連結されたことを示した。
【０２２２】
例８：化学酵素抱合ストラテジー
この例においては、代替的抱合ストラテジーを適用する。グリカンの過ヨウ素酸酸化の代わりに、我々は、酵素ガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）を使用して、関心のあるナノボディー上に人工的に導入されたＬａｃＮＡｃグリカン（例７において得られたとおり）中のＧａｌ残基のＣ６ヒドロキシル基を酸化させる。この酵素的酸化はまた、遊離アルデヒド基も創出するが、前記基は、例７に記載されるとおりオキシムライゲーション、ヒドラゾンライゲーション、または還元的アミノ化を介して、関心のある分子へ連結され得る（Park, A. et al., Endocrinology 154、2013）。
【０２２３】
ＧＡＯをベースとしたＬａｃＮＡｃ酸化と、これに続くオキシムライゲーションとの図式概略図は、図１９に説明されている。同様のアプローチにおいて、突然変異形態のガラクトースオキシダーゼ（GAO-F2；Rannes, J.B. et al.(2011), J. Am. Chem. Soc., 133, 8436-8439を参照）を使用して、ＧｌｃＮＡｃのＣ６ヒドロキシル基を酸化させ得る；関心のあるカーゴ(cargo)を次いで、ＧｌｃＮＡｃ残基へ直接連結させ得る。GAO-F2をベースとしたＧｌｃＮＡｃ酸化と、これに続くオキシムライゲーションとの図式概略図は、図２０に説明されている。
【０２２４】
手短に、Ｒ８６Ｎ突然変異を担持するＧＢＰを、Pichia GlycoDelete細胞中またはガラクトシルトランスフェラーゼを共発現するPichia GlycoDelete細胞中組み換えで産生した。タンパク質を精製し、非グリコシル化されたタンパク質と単一ＧｌｃＮＡｃ残基を担持するタンパク質（Pichia-GlycoDelete）との混合物、または非グリコシル化されたタンパク質とＧｌｃＮＡｃもしくはＬａｃＮＡｃを担持するタンパク質（ガラクトシルトランスフェラーゼを共発現するPichia-GlycoDelete）との混合物が生産された。
【０２２５】
ガラクトシルトランスフェラーゼを共発現するPichia-GlycoDeleteに由来する精製タンパク質を次いで、ＧＡＯで酸化させて、ワンポット(one-pot)反応で、ビオチン化されかつアミノオキシ修飾された短いＰＥＧ鎖へ連結させた。質量分析は、ＰＥＧ鎖がＬａｃＮＡｃ担持ＧＢＰへ選択的に連結されたことを示した。Pichia-GlycoDeleteに由来する精製タンパク質をＧＡＯ−Ｆ２で酸化させて、ワンポット反応で、ビオチン化されかつアミノオキシ修飾された短いＰＥＧ鎖へ連結させた。質量分析は、ＰＥＧ鎖がＧｌｃＮＡｃ担持ＧＢＰへ選択的に連結されたことを示した。
【０２２６】
代替の化学−酵素ストラテジーにおいて、我々は、酵素ｈＳＴ６Ｇａｌ１（Wu, Z.L., Carbohydrate Research 412, 2015）を使用して、アジド修飾形態のＳｉａ（ＡｚＳｉａ）をＬａｃＮＡｃへ抱合させ得るか、または突然変異形態のヒトベータ−１，４−ガラクトシル／ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（van Geel, R., Bioconjug. Chem. 26, 2015）を使用して、アジド修飾形態のＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｚ）を関心のある我々のナノボディー上に存在する単一ＧｌｃＮＡｃのＮ−グリカンへ抱合させ得る。アジド官能基を介してナノボディー上に導入されたＧａｌＮＡｚ／ＡｚＳｉａを、クリック化学（例として、銅フリーのアジド−アルキンシクロ付加反応）を採用して、ＰＥＧ鎖または関心のある別の分子で、均一におよび部位特異的に官能化させ得る。概略図は、図２１（ＧａｌＮＡｚ）および図２２（ＡｚＳｉａ）に説明されている。
【０２２７】
アジド修飾されたＧｌｃＮＡｃグリカン、ＬａｃＮＡｃグリカン、およびシアリル−ＬａｃＮＡｃグリカンはまた、関心のあるタンパク質を産生するＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞へ、アジド修飾された単糖類前駆体（ＧｌｃＮＡｚ、ＧａｌＮＡｚ、ＡｚＳｉａ）を供給することによっても得られ得る；これは、これに続くクリック化学を介する部位特異的官能化を可能にさせる。
【０２２８】
手短に、Ｒ８６Ｎ突然変異を担持するＧＢＰを、Pichia GlycoDelete細胞中またはガラクトシルトランスフェラーゼを共発現するPichia GlycoDelete細胞中組み換えで産生した。タンパク質を精製し、非グリコシル化されたタンパク質と単一ＧｌｃＮＡｃ残基を担持するタンパク質（Pichia-GlycoDelete）との混合物、または非グリコシル化されたタンパク質とＧｌｃＮＡｃもしくはＬａｃＮＡｃを担持するタンパク質（ガラクトシルトランスフェラーゼを共発現するPichia-GlycoDelete）との混合物が生産された。
【０２２９】
ガラクトシルトランスフェラーゼを共発現するPichia-GlycoDeleteに由来する精製タンパク質を次いで、ＣＭＰ−アジド−シアル酸と、ＡｚＳｉａ残基をＬａｃＮＡｃ鎖へ付加する組み換えｈＳＴ６Ｇａｌ１酵素とともにインキュベートし、続いて、ビオチン化されかつＤＢＣＯ修飾された短いＰＥＧ鎖とのクリック反応に供した。質量分析は、ＰＥＧ鎖がＬａｃＮＡｃ担持ＧＢＰへ選択的に連結されたことを示した。Pichia-GlycoDeleteに由来する精製タンパク質を、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚと、ＧａｌＮＡｚ残基を単一ＧｌｃＮＡｃグリカンへ付加する突然変異形態のヒトベータ−１，４−ガラクトシル／ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ酵素とともにインキュベートし、続いて、ビオチン化されかつＤＢＣＯ修飾された短いＰＥＧ鎖とのクリック反応に供した。質量分析は、ＰＥＧ鎖がＧｌｃＮＡｃ担持ＧＢＰへ選択的に連結されたことを示した。
【図１】
2020519261.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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