(57)【要約】凝固第ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸ因子の新規の変異体ならびに例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂなどの凝固障害を有する対象を治療する方法におけるその新規の変異体の使用が本願に開示される。
2020519272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６２もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列、
配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つの残基２０〜１４５８と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列、または
配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）の残基２１〜４４４と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むｆＶＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記ｆＩＸタンパク質が、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６２もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６１として記載されるアミノ酸配列を含む、
前記ｆＶＩＩＩタンパク質が、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つの残基２０〜１４５８として記載されるアミノ酸配列を含む、または
前記ｆＶＩＩタンパク質が、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）のいずれか１つの残基２１〜４４４として記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記核酸配列が、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド及びプロペプチドに結合されるｆＩＸタンパク質をコードする、
前記核酸配列が、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドに結合されるｆＶＩＩＩタンパク質をコードする、または
前記核酸配列が、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）のいずれか１つと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドに結合されるｆＶＩＩタンパク質をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記シグナルペプチド及びプロペプチドに結合される前記ｆＩＸタンパク質が、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）として記載されるアミノ酸配列を含む、
前記シグナルペプチドに結合される前記ｆＶＩＩＩタンパク質が、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つとして記載されるアミノ酸配列を含む、または
前記シグナルペプチドに結合される前記ｆＶＩＩタンパク質が、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）のいずれか１つとして記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記核酸配列がｃＤＮＡ配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記ｆＩＸタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号９のヌクレオチド１３９〜１３８９もしくは配列番号１０のヌクレオチド１３９〜１３８６として記載される前記配列を含む、
前記ｆＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１１〜１４のいずれか１つのヌクレオチド５８〜４３７７として記載される前記配列を含む、または
前記ｆＶＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１５もしくは配列番号１６のヌクレオチド６１〜１３３５として記載される前記配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記ｆＩＸタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号９もしくは配列番号１０として記載される前記配列を含む、
前記ｆＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１１〜１４のいずれか１つとして記載される前記配列を含む、または
前記ｆＶＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１５もしくは配列番号１６として記載される前記配列を含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
動作可能にプロモーターに結合した請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子またはベクターによってコードされる単離されたｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質。
【請求項１２】
前記ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質が変異体ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質である、請求項ＸＸに記載の単離されたｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質を生成する方法であって、
前記核酸分子の発現または発現ベクターに十分なｉｎ  ｖｉｔｒｏでの条件下で請求項１３に記載の宿主細胞をインキュベートし、前記ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質を生成することと、
前記ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質を精製することとを含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の精製されたｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質。
【請求項１６】
薬学的に許容されるキャリアに請求項１〜１２または１５のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクターまたはタンパク質を含む組成物。
【請求項１７】
必要とする対象に血液凝固を誘発する方法であって、
前記対象に治療上有効量の請求項１〜１２または１５〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクター、タンパク質または組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
凝固障害を有する対象を治療する方法であって、
前記凝固障害を有する対象を選択することと、
前記対象に治療上有効量の請求項１〜１２または１５〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクター、タンパク質または組成物を投与することとを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記凝固障害が血友病Ａであり、前記対象が前記ｆＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸分子を含むベクターを投与される、
前記凝固障害が血友病Ｂであり、前記対象が前記ｆＩＸタンパク質をコードする前記核酸分子を含むベクターを投与される、または
前記凝固障害が先天性プロコンベルチン欠乏症であり、前記対象が前記ｆＶＩＩタンパク質をコードする前記核酸分子を含むベクターを投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２または１５〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクター、タンパク質または組成物の使用であって、それを必要とする対象に血液凝固を誘発する及び／または凝固障害を有する対象を治療するための前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年５月９日に出願された米国仮出願第６２／５０３，７６６号の優先権を主張する。本仮出願はその全体が参照によりに援用される。
【０００２】
本発明は、凝固第ＩＸ因子、凝固第ＶＩＩＩ因子及び凝固第ＶＩＩ因子タンパク質などの新規の凝固因子タンパク質、凝固因子タンパク質をコードする組換え核酸分子及びベクター、ならびに血友病などの凝固障害の治療のために対象に使用する関連方法に関する。
【０００３】
政府支援の承認
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＧｒａｎｔ  Ｎｏ．１  Ｒ５６  ＨＬ  １３１０５９に従い、政府の支援によって行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
凝固第ＶＩＩＩ因子（ｆＶＩＩＩ）遺伝子における突然変異により、血友病Ａを引き起こす凝固因子（ｆＶＩＩＩ）タンパク質が減少または欠失することになる。血友病Ａは出血が止まりにくいことを特徴とする。同様に、血友病Ｂは凝固第ＩＸ因子（ｆＩＸ）と関係する。同様に、プロコンベルチン欠乏症、すなわち血友病様疾患は凝固第ＶＩＩ因子（ｆＶＩＩ）と関係する。血友病Ａ、血友病Ｂ及びプロコンベルチン欠乏症などの凝固障害の治療は、患者の失われた凝固因子活性を置き換えるために、通常、複数週ごとにヒト血漿に由来するまたは組換え凝固因子の静脈内注入を一生必要とする。コストが高いため、このような治療を受けているのは全世界の血友病人口の３０％未満である。さらに、凝固因子置換生成物で治療される患者の約２５％は、更なる治療を無効化する中和抗体を産生する。したがって、向上された治療法を同定する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
対応する天然ヒト凝固因子タンパク質に対して増加した凝固因子活性を有する凝固第ｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩ及びｆＩＸ因子の変異体が本明細書に開示される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６２または配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６２または配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６１として記載のアミノ酸配列を含むｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）または配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）または配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）で表されるアミノ酸配列を含むｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号９のヌクレオチド１３９〜１３８９または配列番号１０のヌクレオチド１３９〜１３８６を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号９または配列番号１０で表される配列を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）または配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）の残基２０〜１４５８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）または配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）の残基２０〜１４５８で表されるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）または配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）または配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）で表されるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は配列番号１１〜１４のいずれか１つのヌクレオチド５８〜４３７７を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１１〜１４のいずれか１つで表される配列を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）または配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）の残基２１〜４４４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｆＶＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）または配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）の残基２１〜４４４で表されるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）または配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｆＶＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）または配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）で表されるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は配列番号１５または配列番号１６のヌクレオチド６１〜１３３５を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１５または配列番号１６で表される配列を含む。
【０００９】
核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのベクター、ならびに核酸分子でコードされた単離されたｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩ及びｆＩＸタンパク質も提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、必要とする対象に血液凝固を誘発する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される組換え凝固因子をコードするベクター（ＡＡＶベクターなど）の治療上有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は血友病Ａまたは血友病Ｂなどの凝固障害を有する対象である。いくつかの実施形態では、凝固障害は血友病Ａであり、対象は組換えｆＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを投与される。他の実施形態では、凝固障害は血友病Ｂであり、対象は組換えｆＩＸタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを投与される。いくつかの実施形態では、凝固障害は先天性プロコンベルチン欠乏症であり、対象は組換えｆＶＩＩタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを投与される。
【００１１】
本発明の先述の及び他の特徴及び長所は、添付の図面を参照して進めるいくつかの実施形態の次の詳細な説明から、さらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】Ａｎ１０２  ｆＩＸ（配列番号２５）、Ａｎ９７  ｆＩＸ（配列番号２４）、Ａｎ９６  ｆＩＸ（配列番号２３）、Ａｎ９５  ｆＩＸ（配列番号２２）、Ａｎ８４  ｆＩＸ（配列番号２０）、Ａｎ６３  ｆＩＸ（配列番号１７）、Ａｎ８８  ｆＩＸ（配列番号２１）、Ａｎ６５  ｆＩＸ（配列番号１８）及びＡｎ７０  ｆＩＸ（配列番号１９）タンパク質を含むヒトｆＩＸ（配列番号４２）、ならびにそのいくつかの変異体の配列アラインメントを示す。
【図１Ｂ】Ａｎ１０２  ｆＩＸ（配列番号２５）、Ａｎ９７  ｆＩＸ（配列番号２４）、Ａｎ９６  ｆＩＸ（配列番号２３）、Ａｎ９５  ｆＩＸ（配列番号２２）、Ａｎ８４  ｆＩＸ（配列番号２０）、Ａｎ６３  ｆＩＸ（配列番号１７）、Ａｎ８８  ｆＩＸ（配列番号２１）、Ａｎ６５  ｆＩＸ（配列番号１８）及びＡｎ７０  ｆＩＸ（配列番号１９）タンパク質を含むヒトｆＩＸ（配列番号４２）、ならびにそのいくつかの変異体の配列アラインメントを示す。
【図２】示されたｆＩＸ変異体をコードするＡＡＶベクターを用いてＨｅｐＧ２細胞中に発現される種々のｆＩＸ変異体のｆＩＸ活性レベルを示す。
【図３】示されたｆＩＸ変異体をコードするＡＡＶベクターで治療されたｆＩＸ欠失マウスの血清におけるｆＩＸ活性レベルのｉｎ  ｖｉｖｏでのデータを示す。
【図４】肝臓に誘導されたプロモーター（ＨＣＢ）を含み、示されたｆＩＸ変異体をコードするＡＡＶ２／８ベクターで治療されたｆＩＸ＋／＋マウスの血清におけるｆＩＸ活性レベルのｉｎ  ｖｉｖｏでのデータを示す。ＡＡＶ投与前後のｆＩＸ活性レベルの変化をプロットする。一方向ＡＮＯＶＡ及びＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ事後分析により統計比較がなされた。アスタリスクはＰ＜０．０５を示す。
【図５】示されたｆＶＩＩＩ変異体をコードするプラスミドＤＮＡ発現ベクターを用いてＨＥＫ２９３Ｔ１７細胞中に発現される種々のｆＶＩＩＩ変異体のｆＶＩＩＩ活性レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
配列表
添付の配列表に記載された核酸配列及びアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されるヌクレオチド塩基の標準略号及びアミノ酸の３文字表記を用いて示される。各核酸配列の鎖１つだけが示されるが、示された鎖の任意の参照によって、含まれる相補鎖が理解される。ファイル名「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」（約３４８ｋｂ）の形で２０１８年５月２日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイルとして、配列表が提出され、これは参照により本明細書に援用される。
【００１４】
Ｉ．用語
特に明記しない限り、技術用語は従来の使用に従って使用される。分子生物学の一般用語の定義は、Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｅｗｉｎ’ｓ  ｇｅｎｅｓ  ＸＩＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２０１７；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，２００９（ＩＳＢＮ  ９７８０６３２０２１８２６）に見出すことができる。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、分脈に明確に示されない限り、複数の参照対象を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、ＢまたはＡ及びＢを含むことを意味する。本明細書に記載される方法及び材料に類似または同等の方法及び材料は、本開示の実施または試験に使用することができるけれども、好適な方法及び材料は後述する。さらに、材料、方法及び実施例は一例に過ぎず、制限することを意図していない。不一致がある場合、用語の説明を含む本明細書が優先される。本開示の種々の実施形態のレビューを容易にするために、特定の用語の説明を以下に提供する。
【００１５】
５’及び／または３’：核酸分子（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、「５’末端」及び「３’末端」を有すると言われる。なぜならば、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその隣の３’酸素にホスホジエステル結合を介して一方向に結合するように、モノヌクレオチドが反応して、ポリヌクレオチドを形成するためである。したがって、５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合しない場合、鎖状ポリヌクレオチドの一端は「５’末端」と呼ばれる。ポリヌクレオチドの３’酸素が他のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に結合しない場合、そのポリヌクレオチドの他端は「３’末端」と呼ばれる。モノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその隣のモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合するにも関わらず、内側の核酸配列も５’及び３’末端を有する場合がある。
【００１６】
鎖状または環状核酸分子において、別々の内部要素は「上流」または「下流」の５’側または３’要素と呼ばれる。ＤＮＡに関して、この専門用語はＤＮＡ鎖に沿って５’から３’の方向に転写が進むことを示す。連結した遺伝子の転写を指示するプロモーター及びエンハンサー要素は、通常、コード領域の５’または上流に位置する。しかし、エンハンサー要素がプロモーター要素及びコード領域の３’に位置する場合でも、それらの効果を発揮することができる。転写終結及びポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’または下流に位置する。
【００１７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：ヒト及び他の霊長類を感染させる小さい、複製欠陥がある非エンベロープウイルス。ＡＡＶが疾患を引き起こし、非常に軽度の免疫応答を誘発することは知られていない。ＡＡＶを使用した遺伝子治療ベクターは、分裂細胞及び静止状態の細胞を感染させることができ、宿主細胞のゲノムに統合されることなく、染色体外状態で残存することができる。これらの特徴のため、ＡＡＶは遺伝子治療に魅力的なウイルスベクターになる。現在、ＡＡＶ（ＡＡＶ１−１１）の認識された血清型が１１個存在する。
【００１８】
投与／投与する：任意の有効なルートで対象に治療薬（例えば、組換えＡＡＶ）などの薬剤を提供または付与すること。代表的な投与経路は、注入（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内及び静脈内）、経口、腺管内、舌下、直腸、経皮、経鼻、経腟及び吸入ルートを含むが、これらに限定されない。
【００１９】
出血時間アッセイ：対象の血液が凝固するのにかかる時間を測定するために使用されるアッセイ。血圧計カフを上腕に配置し、膨らませる。前腕に切開を２回行う。この切開は長さ約１０ｍｍ（１／２インチ未満）及び深さ１ｍｍ（最小の出血を引き起こすのに十分な深さ）である。直ちに血圧計カフをすぼませる。出血が止まるまで吸い取り紙を３０秒毎切り口に当てる。切り口から出血が止まるのにかかる時間を記録する。正常な非血友病者では、出血が約１〜１０分以内に止まり、アッセイが測定される方法に応じて、研究室から研究室に変えることができる。対照的に、適切な凝固因子の正常レベルの１％未満を有する重篤な血友病患者は、全血凝固時間が６０分を超える。マウスでは、尾部の先端を横切開して、凝塊が尾部の先端で形成されるまで定期的に吸い取り紙を当てることによって、出血時間を測定する。正常な場合の出血時間は２〜４分間である。対照的に、適切な凝固因子の正常レベルの１％未満を有する血友病マウスは、出血時間が１５分を超える。
【００２０】
ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）：転写を決定するＤＮＡが欠失している内部の非コード配列（イントロン）及び調節配列の一部。ｃＤＮＡは、細胞から抽出されるメッセンジャーＲＮＡから逆転写によって研究室で合成される。ｃＤＮＡはまた、対応するＲＮＡ分子中に翻訳制御に関与する非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み得る。
【００２１】
凝固障害：弱い血液凝固及び持続出血に導く広範囲の医療問題に関する一般用語。医師も、例えば、凝血異常、異常な出血及び出血障害などの用語によって凝固障害を意味する。凝固障害は、異常な（または病理学的な）出血をもたらす任意の先天性、後天性または誘発された欠陥を含む。例としては、血友病Ａ（ｆＶＩＩＩの欠乏）、血友病Ｂ（ｆＩＸの欠乏）、血友病Ｃ（第ＸＩ因子の欠乏）、プロコンベルチン欠乏症（ｆＶＩＩの欠乏）、異常レベルの凝固因子阻害剤、血小板障害、血小板減少、ビタミンＫ欠乏症及びフォンヴィレブランド病などの不十分な凝固または止血の障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
いくつかの凝固障害は出生時に存在し、場合によっては遺伝性障害である。具体例としては、血友病Ａ、血友病Ｂ、タンパク質Ｃ欠乏症及びフォンヴィレブランド病が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの凝固障害は、特定の疾患（例えば、ビタミンＫ欠乏症、重度の肝疾患）または治療（例えば、抗凝固薬の使用または抗生物質の長期使用）の間に発症する。
【００２３】
凝固第ＶＩＩ因子（ｆＶＩＩ）：ｆＶＩＩは、血液の効率的な凝固のために必要とされるビタミンＫ依存性チモーゲンタンパク質。組織因子と組み合わせて、ｆＶＩＩはタンパク質分解性に活性化され（ｆＶＩＩａ）、凝固において第ＩＸ因子及び第Ｘ因子のアクチベーターとして機能する。超生理学的なレベルで、ｆＶＩＩａは組織因子非依存性凝血促進性活性も示し得る。血液のｆＶＩＩの約０．５μｇ／ｍＬの濃度は正常とみなされる。ｆＶＩＩの欠乏は、先天性プロコンベルチン欠乏症と関係する。先天性プロコンベルチン欠乏症は血友病様出血障害の症状を示す。ｆＶＩＩは、Ｎ末端シグナルペプチド（ほぼ残基−２０〜−１）、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）が豊富なドメイン（ほぼ残基１〜６３）、２つの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン（ほぼ残基６４〜１００［ＥＧＦ１］及び１０１〜１７０［ＥＧＦ２］）及び不顕性Ｃ末端セリンプロテアーゼドメイン（ほぼ残基１７１〜４４４）を有するドメイン構造を含む単鎖チモーゲンとして生合成される。活性化のために、ｆＶＩＩはＡｒｇ１９０〜Ｉｓｏ１９１で単一ペプチド結合開裂を必要とする。このため、プロテアーゼドメインを含むＨ鎖に単一ジスルフィド結合を介して連結されるＧｌａ、ＥＧＦ１及びＥＧＦ２ドメインからなるＬ鎖からなるｆＶＩＩａが形成される。ｆＶＩＩタンパク質の構造及び機能について相当な情報量が利用可能である。例えば、Ｖａｄｉｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”ｉｎ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ−Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｍａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ．）．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｅｎｓ，２０１３．Ｐａｇｅｓ  ２０８−２３２を参照。これは、全体が参照により本明細書に援用される。ｆＶＩＩ核酸及びタンパク質配列は公的に利用可能である（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｐ０８７０９．１を参照）。血液凝固のため、ｆＶＩＩ活性を増加させたｆＶＩＩ変異体が本明細書に提供される。
【００２４】
凝固第ＶＩＩＩ因子（ｆＶＩＩＩ）：ｆＶＩＩＩは、血液の効率的な凝固のために必要とされるタンパク質であり、凝固においてｆＩＸによる第Ｘ因子の活性化の補助因子として機能する。ｆＶＩＩＩは複数のドメイン（Ａ１−Ａ２−Ｂ−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）を含み、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に結合する不活性型で血液中を循環している。ＶＷＦが最終的にｆＩＸを介してフィブリンを形成しながら、トロンビンがｆＶＩＩＩを切断し、分離を引き起こす。先天性血友病ＡはｆＶＩＩＩ遺伝子における遺伝子組換えと関係し、ｆＶＩＩＩを循環させる正常なレベルより低いため、結果として凝固が損なわれる。血液中ｆＶＩＩＩに対する約１００ｎｇ／ｍｌの濃度は、正常範囲内とみなされる。患者が正常量の約１％未満のｆＶＩＩＩ（すなわち、血液１ｍｌあたり約１ｎｇ未満のｆＶＩＩＩ）を有する場合、血友病Ａの重篤な症状が生じ得る。ｆＶＩＩＩはほぼ２３５１アミノ酸単鎖前駆体タンパク質として合成される。そのアミノ酸単鎖前駆体タンパク質はタンパク質分解性に処理される。ヒト因子ＶＩＩＩ遺伝子（１８６，０００個の塩基対）は、大きさが６９〜３，１０６ｂｐの範囲である２６個のエキソン及び３２．４キロベース（ｋｂ）と同じ大きさのイントロンからなる。ｆＶＩＩＩ核酸及びタンパク質配列の例は、公的に利用可能である（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｋ０１７４０、Ｍ１４１１３及びＥ００５２７を参照）。血液凝固のため、ｆＶＩＩＩ活性を増加させたが、大きさが小さくなるｆＶＩＩＩ変異体、例えば、ｆＶＩＩＩ  Ｂドメインを欠き、ｆＶＩＩＩ活性の増加に備える１つ以上のアミノ酸変異も有するｆＶＩＩＩ変異体が本明細書に提供される。
【００２５】
凝固第ＩＸ因子（ｆＩＸ）：ｆＩＸは血液の効率的な凝固のために必要とされるビタミンＫ依存性タンパク質であり、凝固において第Ｘ因子のアクチベーターとして機能する。血液中ｆＩＸの約１〜５μｇ／ｍｌの濃度は、正常範囲内とみなされる。ｆＩＸの欠乏は血友病Ｂと関係し、ｆＩＸの濃度がｆＩＸの正常濃度の約１％未満（すなわち、血液１ｍｌあたり約０．０１〜０．０５μｇ未満のｆＩＸ）である場合、重症になる。ｆＩＸはＮ末端シグナルペプチド（ほぼ残基−２８〜−１）、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）が豊富なドメイン（ほぼ残基１〜４０）、短疎水性セグメント（ほぼ残基４１〜４６）、２つの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン（ほぼ残基４７〜８４［ＥＧＦ１］及び８５〜１２７［ＥＧＦ２］）、活性ペプチド（ほぼ残基１４６〜１８０）及び不顕性Ｃ末端セリンプロテアーゼドメイン（ほぼ残基１８１〜４１５）を有するドメイン構造を含む単鎖チモーゲンとして生合成される。活性化のために、ｆＩＸは２つのペプチド結合開裂、すなわちＡｒｇ１４５〜Ａｌａ１４６で１つ及びＡｒｇ１８０〜Ｖａｌ１８１で１つのペプチド結合開裂を必要とし、３５残基活性化ペプチドを放出する。このため、プロテアーゼドメイン（１８５〜４１５）を含むＨ鎖に単一ジスルフィド結合を介して連結されるＧｌａ、ＥＧＦ１及びＥＧＦ２ドメインからなるＬ鎖からなる活性化ｆＩＸ（ｆＩＸａ）が形成される。ｆＩＸタンパク質の構造及び機能について相当な情報量が利用可能である。例えば、Ｖａｄｉｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”ｉｎ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ−Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｍａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｅｎｓ，２０１３．Ｐａｇｅｓ２０８−２３２を参照。これは全体が参照により本明細書に援用される。ｆＩＸ核酸及びタンパク質配列は公的に利用可能である（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｒｅｆ．Ｎｏ．Ｐ００７４０．２を参照）。血液凝固のため、ｆＩＸ活性を増加させたｆＩＸ変異体が本明細書に提供される。
【００２６】
コドンの最適化：「コドン最適化」された核酸は、コドンが特定の系（例えば、特定の種または種の群）における発現に最適になるように変化させた核酸配列を意味する。例えば、核酸配列は、哺乳動物細胞または特定の哺乳動物種（例えば、ヒト細胞）における発現に最適化させることができる。コドン最適化は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変えない。
【００２７】
「肝臓特異的アミノ酸コドン」という用語は、ヒトゲノムのコード領域全体のコドン使用に比べて高度にヒト肝臓内に発現する遺伝子中に差次的に利用され、現れるコドンを意味する。例えば、肝臓細胞中における低量のコドンマッチングｔＲＮＡによりタンパク質翻訳がより遅くなるため、肝臓−コドン最適化戦略では最大量の肝臓特異的アミノ酸コドン探索を使用し、標本として不十分であるコドンを避ける。
【００２８】
コントロール：参照標準。いくつかの実施形態では、コントロールは健常な患者から得られる陰性のコントロール試料である。他の実施形態では、コントロールは血友病と診断された患者から得られる陽性のコントロール試料である。さらに他の実施形態では、コントロールは、歴史的なコントロール、標準基準値または値域（例えば、既知の予後または結果を有する血友病Ａ患者の群または基線もしくは正常値を表す試料の群などの前に試験されたコントロール試料）である。
【００２９】
試験用試料とコントロールの違いは増加または逆に減少であってもよい。違いは質的な違いまたは定量的な違い、例えば、統計的に有意な違いであってもよい。いくつかの例では、違いはコントロールに対して少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または５００％を超える増加または減少である。
【００３０】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）：ＤＮＡはほとんどの生体（いくつかのウイルスはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む遺伝子を有する）の遺伝物質を含む長鎖ポリマーである。ＤＮＡポリマー中の繰り返し単位は４つの異なるヌクレオチドである。そのそれぞれがリン酸基が結合するデオキシリボース糖に結合する４つの塩基、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）の１つを含む。ヌクレオチド（コドンと呼ばれる）のトリプレットは、ポリペプチドにおける各アミノ酸または終止シグナルを指定する。コドンという用語も、ＤＮＡの配列が転写されるｍＲＮＡにおける３つヌクレオチドの対応する（及び相補的な）配列に使用される。
【００３１】
特に明記しない限り、ＤＮＡ分子への任意の参照はそのＤＮＡ分子の逆相補を含むことを意図する。本明細書のテキストによって一本鎖が必要とされる場合を除き、ＤＮＡ分子は一本鎖のみを示すために描かれるけれども、二本鎖ＤＮＡ分子の両鎖を包含する。したがって、特異的タンパク質またはその断片をコードする核酸分子への参照は、センス鎖及びその逆相補を包含する。例えば、開示された核酸分子の逆相補配列からプローブまたはプライマーを生成することが適切である。
【００３２】
発現：核酸配列の転写または翻訳。例えば、コード核酸配列（例えば、遺伝子）のＤＮＡがＲＮＡまたはＲＮＡ断片に転写される場合、コード核酸配列が発現され得る。いくつかの例では、ＲＮＡまたはＲＮＡ断片は処理され、ｍＲＮＡになる。コード核酸配列（例えば、遺伝子）のｍＲＮＡがタンパク質またはタンパク質断片などのアミノ酸配列に転写される場合、そのコード核酸配列が発現されてもよい。特定の例では、異種遺伝子がＲＮＡに転写される場合、その異種遺伝子が発現される。他の例では、異種遺伝子のＲＮＡがアミノ酸配列に翻訳される場合、その異種遺伝子が発現される。発現の調整は、コントロールの生成後、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送及びプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解、または特定のタンパク質分子の活性化、非活性化、区画化もしくは分解に関するコントロールを含み得る。
【００３３】
発現コントロール配列：効果をもたらすように連結される異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現コントロール配列が核酸配列の転写及び必要に応じて、翻訳を制御し、調節する場合、発現コントロール配列は核酸配列に効果をもたらすように連結される。したがって、発現コントロール配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にする遺伝子の正しい読み枠の保守及び終止コドンを含み得る。「コントロール配列」という用語は、存在が発現に影響し得る成分を最低限含むことを意図し、存在が有利な、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列である更なる成分も含み得る。発現コントロール配列はプロモーターを含み得る。
【００３４】
遺伝子：ｍＲＮＡまたは別の方法で、ＲＮＡの転写に必要なコントロール及びコード配列を含む核酸配列、一般的にはＤＮＡ配列。例えば、遺伝子は、プロモーター、１つ以上のエンハンサーまたはサイレンサー、ＲＮＡ及び／またはポリペプチドをコードする核酸配列、下流の調節配列及びおそらく、ｍＲＮＡの発現の調節に伴う他の核酸配列を含んでもよい。
【００３５】
当該技術分野において周知のように、ほとんどの真核細胞遺伝子はエキソン及びイントロンを含む。「エキソン」という用語は、連続配列を成熟ｍＲＮＡ転写物に貢献することをバイオインフォマティクス的に予測する及び／または実験的に確認するゲノムＤＮＡにおいて見られる核酸配列を意味する。「イントロン」という用語は、連続配列を成熟ｍＲＮＡ転写物に貢献しないが、むしろ転写物のプロセシング時、「スライスした」ことを予測する及び／または確認するゲノムＤＮＡにおいて見られる核酸配列を意味する。
【００３６】
遺伝子治療：１つ以上の受容細胞への異種核酸分子の導入、この場合、受容細胞における異種核酸の発現は細胞の機能に影響を及ぼし、対象において治療効果をもたらす。例えば、異種核酸分子はタンパク質をコードしてもよく、そのタンパク質は受容細胞の機能に影響を及ぼす。
【００３７】
血友病：欠失した凝固因子活性によって生じる血液凝固障害。この欠失した凝固因子活性は止血を低減させる。凝固因子の濃度が正常な対象における凝固因子の正常な濃度の約１％未満である場合、重篤な形態が起因する。いくつかの対象において、血友病は、凝固因子の発現を損なう遺伝子変異によるものである。他の対象において、血友病は、後天性血友病と呼ばれる自己免疫障害である。この自己免疫障害は、対象における凝固因子に対して産生する抗体により止血を低減させることになる。
【００３８】
血友病Ａは機能的な凝固ｆＶＩＩＩの欠乏から生じるが、血友病Ｂは機能的な凝固ｆＩＸの欠乏から生じる。遺伝子突然変異によるこれらの症状はＸ染色体上に位置する欠陥遺伝子を有する遺伝性伴性劣性の形質によって生じるため、この疾患は一般的に男性のみに見られる。症状の重症度はこの疾患に伴って変化し、重篤な形態は早くから明らかになる。出血は疾患の特徴であり、通常、男児が環状切除されるときに発生する。男児が可動性になるときに更なる出血症状の発現が外見に現れる。手術または外傷に応じて軽症が発生する場合、人生の後期まで気づかないこともある。内出血はどこでも発生し、関節への出血は普通である。
【００３９】
止血：血栓形成による出血の停止。血液凝固時間は、活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ＡＰＴＴ）の使用または出血時間の測定による、末梢血が凝固するのにかかる時間の長さである。特定の実施形態では、本明細書に記載される適切な凝固因子をコードする治療用ベクターの投与の前の対象の血液凝固時間と比較して、血液凝固時間は少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または約１００％（すなわち、血液凝固時間は正常な対象について観察されるものと似ている）減少する。さらに別の実施形態では、影響を受けた対象における血液凝固時間は、適切な凝固因子の治療上有効量を経口投与後、正常な対象の５０％、正常な対象の約７５％、正常な対象の約９０％、例えば、約９５％、例えば１００％に補正される。本明細書で使用される「約」は基準値からプラスマイナス５％を意味する。したがって、約５０％は４７．５％〜５２．５％を意味する。
【００４０】
単離された：「単離された」生体成分（例えば、核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞）は、生物の細胞もしくは組織、または生物自身において他の生体成分から実質的に分離されるまたは精製される。その生物においては、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質、ならびに細胞などの成分は自然に産生する。「単離された」核酸分子及びタンパク質は、標準精製法によって精製されたものを含む。この用語は宿主細胞における組換え発現によって調製される核酸分子及びタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子及びタンパク質も包含する。
【００４１】
核酸分子：ヌクレオチドのポリマー形態であり、このヌクレオチドはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成形態のセンス鎖及びアンチセンス鎖、ならびに上記のＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成形態の混合ポリマーを含み得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの改質形態を意味する。本明細書で使用される「核酸分子」という用語は「核酸」及び「ポリヌクレオチド」と同義である。特に明記しない限り、核酸分子は通常少なくとも１０塩基の長さである。この用語はＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、ならびに天然に存在する及び／もしくは天然に存在しないヌクレオチド結合によって連結した改質ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。「ｃＤＮＡ」は、一本鎖または二本鎖形態において、ｍＲＮＡと相補的または同一であるＤＮＡを意味する。「コードする」はヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）の規定された配列またはアミノ酸の規定された配列を有する生物学的プロセスにおいて、他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として機能する遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の性質、ならびにそれから得られる生物学的性質を意味する。
【００４２】
動作可能に連結される：第１核酸配列が第２核酸配列との機能的な関係にある場合、第１核酸配列は第２核酸配列と動作可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に動作可能に連結される。一般的に、動作可能に連結されたＤＮＡ配列は連続し、２つのタンパク質コード領域を接続するために必要な場合、同じ読み枠に存在する。
【００４３】
薬学的に許容されるキャリア：使用の薬学的に許容されるキャリアは従来通りである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  ｅｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３では、開示されたベクターの医薬送達に適した組成物及び製剤を記述する。
【００４４】
一般に、キャリアの性質は採用される投与の特別の様式に依存する。例えば、非経口製剤はビヒクルとして通常、水、生理食塩液、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセリンなどの薬学的及び生理的に許容される流体を含む注入可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉、ピル、錠剤またはカプセル形態）について、従来の無毒性固体キャリアは、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与される医薬組成物（例えば、ベクター組成物）は少量の、湿潤剤または乳化剤、防腐剤及びｐＨ緩衝剤などの無毒性補助物質、具体的には、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含み得る。特定の実施形態では、対象への投与に適したキャリアは、無菌である、及び／または懸濁するもしくは別の方法で、所望の免疫応答を誘発するのに適した組成物の１つ以上の測定した用量を含む単位剤形で含有していてもよい。これには治療目的の用途のために、薬物療法も伴ってもよい。単位剤形は、例えば、無菌の内容物または対象への注入用シリンジを含む密封されたバイアル内であってもよく、あるいは次の可溶化及び投与のためにまたは固体もしくは徐放投与量で凍結乾燥されてもよい。
【００４５】
精製された：精製されたという用語は絶対純度を必要としない。むしろ、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたタンパク質製剤はタンパク質（例えば、ｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩまたはｆＩＸタンパク質）が細胞内で自然環境にあるペプチドまたはタンパク質よりも濃縮されたものである。一実施形態では、製剤はタンパク質が製剤の総タンパク質含有量の少なくとも５０％となるように精製される。
【００４６】
ポリペプチド：長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらないアミノ酸の任意の鎖。「ポリペプチド」は、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーを含み、１つ以上のアミノ酸残基が非自然アミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の人為的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマーにあてはまる。「残基」は、アミド結合またはアミド結合の模倣物によってポリペプチドに組み込まれたアミノ酸またはアミノ酸模倣物を意味する。ポリペプチドはアミノ末端（Ｎ末端）及びカルボキシ端末（Ｃ末端）を有する。「ポリペプチド」はペプチドまたはタンパク質と同じ意味で使われ、本明細書でアミノ酸残基のポリマーを意味するために使われる。
【００４７】
疾患を予防する、治療するまたは寛解すること：疾患（例えば、血友病）を「予防する」は、疾患の完全な発症を阻害することを意味する。「治療する」は疾患または病態が発症し始めた後、疾患または病態の徴候または症状を寛解する治療的介入を意味する。「寛解する」は、疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を意味する。
【００４８】
プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を命令／開始するＤＮＡの領域。プロモーターは転写の開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。通常、プロモーターは、プロモーターが転写する遺伝子の近くに位置する。プロモーターは転写の開始部位から数千の塩基対と同程度に位置することができる遠位性エンハンサーまたはリプレッサー要素も任意に含む。組織特異的プロモーターは、主に単一種類の組織または細胞において転写を命令／開始するプロモーターである。例えば、肝臓特異的プロモーターは、肝臓組織において他の組織の種類より実質的に大きな範囲に転写を命令／開始するプロモーターである。
【００４９】
タンパク質：遺伝子または他のコード核酸（例えば、ｃＤＮＡ）によって発現され、アミノ酸からなる生体分子。
【００５０】
精製された：「精製された」という用語は絶対純度を必要としない。むしろ、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物は、自然に関連するタンパク質及び他の汚染物質から全体的にまたは部分的に単離されたものである。ある種の実施形態では、「実質的に精製された」という用語は細胞、細胞培養培地または他の粗製剤から単離され、分画を行って、タンパク質、細胞破片及び他の成分などの初期製剤の各種成分を除去したペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物を意味する。
【００５１】
組換え：組換え核酸分子は自然に存在しない、例えば、１つ以上の核酸の置換、欠失または挿入を含む及び／または配列の２つの別の分離したセグメントの人為的な組み合わせにより形成される配列を有するものである。この人為的な組み合わせは、化学合成によってまたはより一般的には、核酸の単離したセグメントの人為的な操作によって、例えば、遺伝子工学技術によって達成することができる。
【００５２】
組換えウイルスは組換え核酸分子を含むゲノムを含むものである。本明細書で使用される「組換えＡＡＶ」は組換え核酸分子（例えば、凝固因子をコードする組換え核酸分子）がパッケージングされたＡＡＶ粒子を意味する。
【００５３】
組換えタンパク質は、自然に存在しない配列または配列の２つの別の分離したセグメントの人為的な組み合わせにより形成される配列を有するものである。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、細菌性細胞または真核細胞などの宿主細胞にまたは組換えウイルスのゲノムに導入された異種（例えば、組換え）核酸によってコードされる。
【００５４】
配列同一性：２つ以上の核酸配列、つまり２つ以上のアミノ酸配列の同一性または類似性は、配列間の同一性または類似性に関して表される。配列同一性は同一率に関して測定することができる。同一率が高いほど、配列はより同一になる。配列類似性は類似率（保存アミノ酸の置換を考慮する）に関して測定することができる。類似率が高いほど、配列はより類似している。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは標準方法を用いてアラインメント化する場合、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。オルソログタンパク質またはｃＤＮＡが、関連がより密接である種（例えば、ヒト及びマウス配列）に由来する場合、関連がより遠い種（例えば、ヒト及びＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）に比べてホモログはより顕著である。
【００５５】
比較用配列のアラインメントは当該技術分野において周知である。Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７−４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０，１９８８；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，１５５−６５，１９９２及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７−３１，１９９４に、様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０は、配列アラインメント法及びホモロジ形成の詳細な考察を示す。
【００５６】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、ならびに配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに接続して使用するためのインターネット上を含むいくつかの供給元から入手可能である。追加の情報は、ＮＣＢＩウェブサイトで見つけることができる。
【００５７】
本明細書で使用される「少なくとも９０％の同一性」に参照とは、特定の参照配列の「少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％もの同一性」を意味する。
【００５８】
対象：生きている多細胞脊髄動物であり、ヒト及びヒトを除く哺乳動物を含む部類。
【００５９】
治療上有効量：凝固因子をコードする開示した組換えＡＡＶベクターなどの薬剤の、障害または疾患の症状及び／または潜在的な原因を防止、治療（予防を含む）、低減及び／または寛解する、例えば、血友病を防止、阻害、及び／または治療するのに十分な量。例えば、この量は、対象の血液が凝固するのにかかる時間を減少させるのに十分な量の凝固因子を生成する本明細書に記載された新規の凝固因子をコードする組換えＡＡＶベクターの量とすることができる。
【００６０】
一例では、所望の応答は対象（例えば、血友病を有する対象）で、例えば、出血時間アッセイを使用して測定する凝固時間を減少させるためである。凝固時間を、方法が有効である血友病に罹患していない正常な健常者の凝固時間に完全に戻す必要はない。例えば、本明細書に開示されるベクター（例えば、ｆＩＸコードベクター）の治療上有効量の投与により、所望量、例えば、好適なコントロールに比べて、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％以上によって、凝固時間（または血友病の他の症状）を減少させることができる。
【００６１】
疾患または症状に対して治療反応を得るには治療薬の複数回の投与が必要であり得ることが理解される。したがって、治療上有効量は、患者における治療転帰を達成するために、前のまたはその後の投与と組み合わせて貢献する分割量を包含する。例えば、薬剤の治療上有効量は、治療経過中、例えば、毎日一回量でまたは複数回で投与され得る。しかし、治療上有効量は、治療される対象、治療される症状の重篤度及び種類、ならびに投与の様式に依存し得る。薬剤の単位剤形は、例えば、無菌成分を有するバイアル（例えば、貫通可能な蓋を有する）またはシリンジに、治療薬の治療量でまたは倍数単位でパッケージングされ得る。
【００６２】
ベクター：ベクターは複製及び／または宿主細胞に一体化するベクターの能力を崩壊させることなく、外部の核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは複製開始点などの宿主細胞において複製することができる核酸配列を含み得る。ベクターは１つ以上の選択マーカー遺伝子及び他の遺伝要素も含み得る。発現ベクターは必要な調節配列を含み、挿入された１つ以上の遺伝子の転写及び翻訳を可能にするベクターである。本明細書におけるいくつかの実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはガンマ−レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。
【００６３】
ＩＩ．新規の凝固因子
血液凝固系は、タンパク質分解のカスケードである。血液凝固因子は血漿中にチモーゲンとして、言い換えると不活性型で存在する。この不活性型は活性化上、タンパク質分解開裂を受け、前駆体分子から活性因子を放出する。最終的な目的は、トロンビンを生成することである。トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、これにより凝塊を形成する。
【００６４】
第Ｘ因子は共通経路の第１分子であり、血小板表面上に存在する活性化ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩ、カルシウム及びリン脂質を含む分子の複合体によって活性化される。ｆＶＩＩＩはトロンビンによって活性化され、ｆＩＸａによって第Ｘ因子の活性化を容易にする。先天性血友病Ａは、ｆＶＩＩＩ遺伝子における遺伝子突然変異と関連し、結果としてｆＶＩＩＩを循環させる正常なレベルより低いため、凝固が損なわれる。同様に、血友病ＢはｆＩＸ遺伝子の遺伝子突然変異と関連する。同様に、プロコンベルチン欠乏症はｆＶＩＩ遺伝子の突然変異と関連する。
【００６５】
実施例１〜３で記述されるように、新規のｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩ及びｆＩＸ配列は対応する先祖の変異体から同定され、凝固因子活性について評価された。いくつかの配列は対応するヒト凝固因子に対する凝固因子活性の増加を提供する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、配列番号１の残基４７〜４６２として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド及びプロペプチドを有さないＡｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＩＸ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。配列番号１の残基１〜４６は、ｆＩＸシグナルペプチド及びプロペプチドである。いくつかの実施形態では、配列番号１として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド及びプロペプチドを有するＡｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＩＸ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。代替の実施形態では、異なるシグナルペプチド及び／またはプロペプチドが、ＩＬ２シグナルペプチド及び／または第Ｘ因子プロペプチドなどの配列番号１のシグナルペプチド及び／またはプロペプチドの代わりに使われ得る。
【００６７】
実施例１で記載されるように、Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａをコードするヌクレオチド配列は、ヒト肝臓における発現にコドン最適化された。代表的な肝臓コドン最適化されたＡｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ配列は、配列番号９として提供される。いくつかの実施形態では、配列番号９のヌクレオチド１３９〜１３８９として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号９として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたＡｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ配列内のＣｐＧモチーフが除去され、ＣｐＧが欠失した肝臓コドン最適化されたＡｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ配列を提供することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、配列番号２の残基４７〜４６１として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド及びプロペプチドを有さないＡｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＩＸ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。配列番号２の残基１〜４６は、ｆＩＸシグナルペプチド及びプロペプチドである。いくつかの実施形態では、配列番号２として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチド及びプロペプチドを有するＡｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＩＸ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。代替の実施形態では、異なるシグナルペプチド及び／またはプロペプチドが、ＩＬ２シグナルペプチド及び／または第Ｘ因子プロペプチドなどの配列番号２のシグナルペプチド及び／またはプロペプチドの代わりに使われ得る。
【００６９】
実施例１で記載されるように、Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａをコードするヌクレオチド配列はヒト肝臓における発現にコドン最適化された。代表的な肝臓コドン最適化されたＡｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ配列は、配列番号１０として提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１０のヌクレオチド１３９〜１３８６として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１０として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたＡｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ配列内のＣｐＧモチーフが除去され、ＣｐＧが欠失した肝臓コドン最適化されたＡｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ配列を提供することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、配列番号３の残基２０〜１４５８として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有さないＡｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。配列番号３の残基１〜１９は、ｆＶＩＩＩシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、配列番号３として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有するＡｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。代替の実施形態では、異なるシグナルペプチド及び／またはプロペプチドが、ＩＬ２シグナルペプチド及び／または第Ｘ因子プロペプチドなどの配列番号３のシグナルペプチド及び／またはプロペプチドの代わりに使われ得る。
【００７１】
実施例２で記載されるように、Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤをコードするヌクレオチド配列はヒト肝臓における発現にコドン最適化された。代表的な肝臓コドン最適化されたＡｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列は、配列番号１１として提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１のヌクレオチド５８〜４３７７として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたＡｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列内のＣｐＧモチーフが除去され、ＣｐＧが欠失した肝臓コドン最適化されたＡｎ８４  ｆＶＩＩＩ配列を提供することができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、配列番号４の残基２０〜１４５８として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有さないＡｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。配列番号４の残基１〜１９は、ｆＶＩＩＩシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、配列番号４として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有するＡｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。代替の実施形態では、異なるシグナルペプチド及び／またはプロペプチドが、ＩＬ２シグナルペプチド及び／または第Ｘ因子プロペプチドなどの配列番号４のシグナルペプチド及び／またはプロペプチドの代わりに使われ得る。
【００７３】
実施例２で記載されるように、Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤをコードするヌクレオチド配列はヒト肝臓における発現にコドン最適化された。代表的な肝臓コドン最適化されたＡｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列は、配列番号１２として提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２のヌクレオチド５８〜４３７７として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１２として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたＡｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列内のＣｐＧモチーフが除去され、ＣｐＧが欠失した肝臓コドン最適化されたＡｎ６３  ｆＶＩＩＩ配列を提供することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、配列番号５の残基２０〜１４５８として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有さないＡｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。配列番号５の残基１〜１９は、ｆＶＩＩＩシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、配列番号５として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有するＡｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。代替の実施形態では、異なるシグナルペプチド及び／またはプロペプチドが、ＩＬ２シグナルペプチド及び／または第Ｘ因子プロペプチドなどの配列番号５のシグナルペプチド及び／またはプロペプチドの代わりに使われ得る。
【００７５】
実施例２で記載されるように、Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤをコードするヌクレオチド配列はヒト肝臓における発現にコドン最適化された。代表的な肝臓コドン最適化されたＡｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列は配列番号１３として提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３のヌクレオチド５８〜４３７７として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたＡｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列内のＣｐＧモチーフが除去され、ＣｐＧが欠失した肝臓コドン最適化されたＡｎ９６  ｆＶＩＩＩ配列を提供することができる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、配列番号６の残基２０〜１４５８として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有さないＡｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。配列番号６の残基１〜１９は、ｆＶＩＩＩシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、配列番号６として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有するＡｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。代替の実施形態では、異なるシグナルペプチド及び／またはプロペプチドが、ＩＬ２シグナルペプチド及び／または第Ｘ因子プロペプチドなどの配列番号６のシグナルペプチド及び／またはプロペプチドの代わりに使われ得る。
【００７７】
実施例２で記載されるように、Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤをコードするヌクレオチド配列はヒト肝臓における発現にコドン最適化された。代表的な肝臓コドン最適化されたＡｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列は配列番号１４として提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４のヌクレオチド５８〜４３７７として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたＡｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列内のＣｐＧモチーフが除去され、ＣｐＧが欠失した肝臓コドン最適化されたＡｎ９７  ｆＶＩＩＩ配列を提供することができる。
【００７８】
Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ、Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ、Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ及びＡｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤタンパク質は、Ｂドメイン欠失ｆＶＩＩＩタンパク質であり、ここで、Ａ２ドメイン及び活性化ペプチドはＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号３の残基７６１〜７７４）として記載のリンカーで融合された。いくつかの実施形態では、代替のリンカー配列は、その代替のリンカー配列がＢドメインのＰＡＣＥ／フューリンプロセシング配列に対するＲＨＱＲ（配列番号３の残基７７０〜７７４）認識配列を含み、ｆＶＩＩＩタンパク質のフォールディング及び機能を損なわない限り置換されてもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、配列番号７の残基２１〜４４４として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有さないＡｎ８１  ｆＶＩＩ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。配列番号７の残基１〜２０は、ｆＶＩＩシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、配列番号７として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有するＡｎ８１  ｆＶＩＩ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。代替の実施形態では、異なるシグナルペプチドがＩＬ２シグナルペプチドなどの配列番号７のシグナルペプチドの代わりに使われ得る。
【００８０】
実施例３で記載されるように、Ａｎ８１  ｆＶＩＩをコードするヌクレオチド配列はヒト肝臓における発現にコドン最適化された。代表的な肝臓コドン最適化されたＡｎ８１  ｆＶＩＩ配列は、配列番号１５として提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１５のヌクレオチド６１〜１３３５として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１５として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたＡｎ８１  ｆＶＩＩ配列内のＣｐＧモチーフが除去され、ＣｐＧが欠失した肝臓コドン最適化されたＡｎ８１  ｆＶＩＩ配列を提供することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、配列番号８の残基２１〜４４４として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有さないＡｎ６１  ｆＶＩＩ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。配列番号８の残基１〜２０はｆＶＩＩシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、配列番号８として記載のアミノ酸配列（シグナルペプチドを有するＡｎ６１  ｆＶＩＩ）、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｆＶＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。代替の実施形態では、異なるシグナルペプチドがＩＬ２シグナルペプチドなどの配列番号８のシグナルペプチドの代わりに使われ得る。
【００８２】
実施例３で記載されるように、Ａｎ６１  ｆＶＩＩをコードするヌクレオチド配列はヒト肝臓における発現にコドン最適化された。代表的な肝臓コドン最適化されたＡｎ６１  ｆＶＩＩ配列は、配列番号１６として提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１６のヌクレオチド６１〜１３３５として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１６として記載のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたＡｎ６１  ｆＶＩＩ配列内のＣｐＧモチーフが除去され、ＣｐＧが欠失した肝臓コドン最適化されたＡｎ６１  ｆＶＩＩ配列を提供することができる。
【００８３】
更なる実施形態では、本明細書に提供されるｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩまたはｆＩＸ配列のいずれかによってコードされる単離された成熟したｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩまたはｆＩＸタンパク質が提供される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６２として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＩＸ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＩＸ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６１として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＩＸ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＩＸ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）の残基２０〜１４５８として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）の残基２０〜１４５８として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。
【００８８】
いくつかの実施形態では、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）の残基２０〜１４５８として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）の残基２０〜１４５８として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）の残基２１〜４４４として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）の残基２１〜４４４として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）として記載のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列と少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であり、ｆＶＩＩ活性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質が提供される。
【００９２】
上述の単離されたタンパク質は、凝固因子タンパク質である。いくつかの実施形態で、凝固因子タンパク質は凝固因子活性を有する成熟した凝固因子タンパク質である。
【００９３】
したがって、開示された新規の凝固因子ならびに凝固因子の精製された形態をコードする核酸分子（例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ分子）が提供される。これらの分子をコードする核酸は、本明細書に提供されるアミノ酸配列及び遺伝コードを使用して直ちに産生され得る。いくつかの実施形態で、核酸分子は宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）において発現され、開示された凝固因子が産生され得る。
【００９４】
遺伝コードは配列が異なるが、同じポリペプチド配列をコードする核酸などの様々な機能的に等価な核酸配列を構築するために使用することができる。
【００９５】
本明細書に開示される新規の凝固因子をコードする核酸分子は、例えば、適切な配列のクローニングを含む任意の好適な方法によってまたは標準方法による直接化学合成によって調製され得る。化学合成により一本鎖オリゴヌクレオチドが産生される。これを、相補配列を有するハイブリダイゼーションによってまたはテンプレートとして一本鎖を使用したＤＮＡポリメラーゼとの重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換することができる。
【００９６】
代表的な核酸は、クローン技術によって調製され得る。適切なクローン技術及びシークエンシング技術の例は、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，２０１７）において、見付けることができる。
【００９７】
核酸はまた、増幅方法によって調製され得る。増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）及び自立配列複製システム（３ＳＲ）を含む。
【００９８】
核酸分子は、細菌、植物、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞などの遺伝子組換え的に作成された細胞において発現され得る。凝固因子をコードするＤＮＡ配列は、好適な宿主細胞へのＤＮＡ転移によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され得る。細胞は原核または真核であってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母、ならびにＣＯＳ，ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びミエローマ細胞などの種々の高等真核細胞を含むタンパク質の発現を使用可能な多数の発現系は、開示された新規の凝固因子を発現するために使用することができる。外部のＤＮＡが宿主において連続的に維持されることを意味する、安定した転写の方法は当該技術分野において既知である。
【００９９】
本明細書に記載される開示された新規の凝固因子をコードする核酸の発現は、プロモーター（構成性または誘導性である）にＤＮＡまたはｃＤＮＡを動作可能に連結することによって達成され、次に発現カセットへ取り込まれる。プロモーターはＨＣＢプロモーターなどの肝臓特異的プロモーターを含む対象となる任意のプロモーターであり得る。任意には、サイトメガロウイルスエンハンサーなどのエンハンサーは構造物に含まれる。カセットは原核生物または真核生物において複製及び統合に好適であり得る。通常の発現カセットはタンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節に役立つ特定の配列を含む。例えば、発現カセットは適切なプロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするその遺伝子の正しい読み枠の保守のための配列及び終止コドンを含み得る。ベクターは、薬剤耐性（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン抵抗）をコードするマーカーなどの選択マーカーをコードすることができる。
【０１００】
クローン化した遺伝子の高レベルの発現を得るために、例えば、転写を指示する強いプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（例えば、内部リボソーム結合配列）及び転写／翻訳ターミネーターを含む発現カセットを構築することが望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉについて、これはＴ７、ｔｒｐ、ｌａｃまたはλプロモーターなどのプロモーター、リボソーム結合部位及び好ましくは転写終決シグナルを含み得る。真核細胞について、制御配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＨＴＬＶ、ＳＶ４０またはサイトメガロウイルスに由来するプロモーター及び／またはエンハンサー、ならびにポリアデニル化配列を含み、さらにスプライスドナー及び／またはアクセプター配列（例えば、ＣＭＶ及び／またはＨＴＬＶスプライスアクセプター及びドナー配列）を含み得る。カセットは、変換またはＥ．ｃｏｌｉ及びリン酸カルシウム治療ためのエレクトロポレーション、エレクトロポレーションまたは哺乳動物細胞のためのリポフェクションなどの周知の方法によって選ばれた宿主細胞に転写され得る。カセットによって形質転換された細胞は、ａｍｐ、ＧＰｔ、ｎｅｏ及びｈｙｇ遺伝子などのカセットに含まれる遺伝子によって与えられる抗生物質耐性によって選択され得る。
【０１０１】
修飾は、その生物活性を減少することなく、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸にすることができる。いくつかの修飾を行うと、クローニング、発現またはターゲティング分子の融合タンパクへの取り込みを容易にすることができる。このような修飾は、例えば、終止コドン、好都合に位置した制限部位を作成する配列及びアミノ末端でメチオニンを加えて、開始部位を提供する配列または精製工程において役立つ付加アミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を含む。
【０１０２】
一度発現すると、開示された新規の凝固因子は硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む、当該分野において標準的な手順に従って精製され得る（一般に、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｂａｓｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００９を参照）。開示された新規の凝固因子は純度１００％である必要はない。一旦部分的にまたは希望通り、治療に使われるように均一性に精製されると、ポリペプチドはエンドトキシンを実質的に含まない。
【０１０３】
ＩＩＩ．組換えベクター及び遺伝子治療の応用
ｆＩＸタンパク質、ｆＶＩＩＩタンパク質、ｆＶＩＩタンパク質またはその変異体をコードする上記の組換え核酸分子のいずれかが細胞または対象における発現ためのベクター（例えば、ＡＡＶベクター）に含まれ得る。
【０１０４】
本明細書に開示される核酸配列はベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）の産生に有用であり、アンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクターまたはワクチンベクターにも有用である。ある種の実施形態では、本開示は遺伝子送達ベクター及び本明細書に開示される核酸配列を含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、選択されたベクターは静脈内注入、ｅｘ  ｖｉｖｏでの形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコートペレット、ウイルス感染またはプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって対象に送達され、コントロールに導入遺伝子を導入してもよい。
【０１０５】
ある種の実施形態では、本開示は本明細書に開示されるｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩまたはｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルス粒子、例えば、キャプシドに関する。ウイルス粒子、キャプシド及び組換えベクターは、標的細胞へのｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩまたはｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列の送達に有用である。核酸は、様々なベクター系、キャプシド及び宿主細胞において容易に利用され得る。ある種の実施形態では、核酸は、ＡＡＶキャプシドタンパク質ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び超可変領域を含むキャプシドタンパク質を含むキャプシドに含まれるベクター内にある。
【０１０６】
ある種の実施形態では、ｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩまたはｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞に送達され得る任意の遺伝要素（ベクター）の一部、例えば、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、非ウイルス送達ビヒクル（例えば、脂質ベースのキャリア）中のタンパク質、ウイルスなどであり得る。これらは、その要素に担持される配列を転写する。
【０１０７】
ある種の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベースのベクター（レンチウイルス遺伝子または配列を含む）、例えば、ＶＳＶＧまたはＧＰ６４シュードタイプまたはその両方に由来する核酸配列を有してもよい。ある種の実施形態では、ＶＳＶＧまたはＧＰ６４シュードタイプに由来する核酸配列は、遺伝子または断片と５０、６０、７０、８０、９０、９５または９９％を超える同一性を有する１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０または２５を超える連続ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の少なくとも１つまたは２つ以上の遺伝子または遺伝子断片でもよい。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸及びプロモーター配列は、ＡＡＶベクターの産生に有用である。ＡＡＶはＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科及びＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する。ＡＡＶは線状一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージングする小さい非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ  ＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は等しい頻度でＡＡＶキャプシドにパッケージングされた。ＡＡＶゲノムは２つの読み取り枠（ＯＲＦ）の側面に位置する２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を特徴とする。ＡＡＶ２ゲノムにおいて、例えば、ＩＴＲの最初の１２５ヌクレオチドはパリンドロームである。パリンドロームはそれ自体が折りたたまれ、塩基対を最大にし、Ｔ字状のヘアピン構造を形成する。Ｄ配列と呼ばれるＩＴＲのその他の２０塩基は、不対のままである。ＩＴＲはＡＡＶ  ＤＮＡ複製にとって重要なｃｉｓ作用性配列である。ＩＴＲは、複製開始点であり、ＤＮＡポリメラーゼによる第２鎖合成のためプライマーとして機能する。二本鎖ＤＮＡはこの合成時に形成され、これは複製型モノマーと呼ばれ、セルフプライミング複製の２回目に使われ、複製ダイマーを形成する。これらの二本鎖の中間体は、鎖置換機構を介して処理され、結果としてパッケージングに使われる一本鎖ＤＮＡ及び転写に使われる二本鎖ＤＮＡになる。Ｒｅｐ結合要素及び末端分解部位（ＴＲＳ）は、ＩＴＲ内に位置する。これらの特徴は、ＡＡＶ複製時にウイルス調節タンパク質Ｒｅｐにより使用され、二本鎖の中間体を処理する。ＡＡＶ複製における役割に加えて、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムパッケージング、転写、非許容条件下の負の調節及び部位特異的統合にとっても重要である（Ｄａｙａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２１（４）：５８３−５９３，２００８）。
【０１０９】
ＡＡＶの左のＯＲＦはＲｅｐ遺伝子を含み、その遺伝子は４つのタンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする。右のＯＲＦはＣａｐ遺伝子を含み、その遺伝子は３つのウイルス性キャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）を産生する。ＡＡＶキャプシドは二十面体対称に配置される６０のウイルス性キャプシドタンパク質を含む。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、１：１：１０のモル比で存在する（Ｄａｙａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２１（４）：５８３−５９３，２００８）。
【０１１０】
ＡＡＶベクターは、通常ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を置き換えるＩＴＲ間で導入遺伝子発現カセットを含む。ベクター粒子は、ベクターゲノムを含むプラスミド及びトランスでｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質を発現するパッケージング／ヘルパー構造物を有する細胞の同時トランスフェクションによって産生される。感染時、ＡＡＶベクターゲノムは細胞核に入り、複数の分子状態で残ることができる。第２鎖合成または相補鎖組合せによる二本鎖の環状エピソームへのＡＡＶゲノムの変換が共通の結果である。
【０１１１】
ＡＡＶベクターの関係において、開示されたベクターは通常以下の構造を含む組換えゲノムを有する。
（５’ＡＡＶ  ＩＴＲ）−（プロモーター）−（導入遺伝子）−（３’ＡＡＶ  ＩＴＲ）
【０１１２】
上記のように、これらの組換えＡＡＶベクターはｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を置き換えるＩＴＲ間の導入発現カセットを含む。ベクター粒子は、例えば、組換えベクターゲノムを含むプラスミド及びトランスにｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質を発現するパッケージング／ヘルパー構造物を有する細胞の同時トランスフェクションによって産生される。
【０１１３】
導入遺伝子の側面に５’Ｋｏｚａｋ配列及び／または３’ポリアデニル化シグナルなどの調節配列が配置され得る。
【０１１４】
ＡＡＶ  ＩＴＲ及び本明細書に記載される他の選択されたＡＡＶ成分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びその機能変異体を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶセロタイプの中から容易に選択されてもよい。これらのＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、ＡＡＶセロタイプから当業者が利用可能な技術を用いて容易に単離されてもよい。このようなＡＡＶは単離、または学究的、商業的もしくは公的な供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から入手してもよい。あるいは、ＡＡＶ配列は文献、またはＧｅｎＢａｎｋもしくはＰｕｂＭｅｄなどのデータベースにおいて利用可能な発表された配列の参照により合成または他の好適な手段によって得てもよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶベクターゲノムは、ＷＯ２０１６／１６８７２８に記載のＨＣＢ、ＨＳｈ−ＨＣＢ、５’ＨＳｈ−ＨＣＢ、３’ＨＳｈ−ＨＣＢ、ＡＢＰ−ＨＰ１−Ｇｏｄ−ＴＳＳ、ＨＳｈ−ＳｙｎＯ−ＴＳＳまたはｓＨＳ−ＳｙｎＯ−ＴＳＳプロモーターなどの肝臓特異的プロモーターを有することができ、この特許全体は参照により本明細書に援用される。
【０１１６】
現在、ＡＡＶは最も頻繁に使用される遺伝子治療用ウイルスの１つである。ＡＡＶがヒト及びいくつかの他の霊長類を感染させるが、ＡＡＶが疾患を発症することは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは分裂細胞及び静止細胞を感染させることができ、宿主細胞のゲノムに統合されることなく、染色体外状態で持続することができる。ＡＡＶの有利な特徴のため、本開示は組換え核酸分子のためのＡＡＶの使用及び本明細書に開示される方法を考察する。
【０１１７】
ＡＡＶは標的細胞を結合する及び標的細胞に入る能力、核に入る、長期間核において発現される能力、ならびに低毒性を含む遺伝子治療ベクターのため、いくつかの望ましい特徴を有する。しかし、ＡＡＶゲノムのサイズが小さいと、組み込まれ得る異種ＤＮＡのサイズが制限される。この問題を最小化するために、Ｒｅｐ及び統合効率要素（ＩＥＥ）をコードしていないＡＡＶベクターが構成されてきた。ＩＴＲがパッケージングに必要とされるｃｉｓシグナルである場合、ＩＴＲは保持される（Ｄａｙａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２１（４）：５８３−５９３，２００８）。
【０１１８】
遺伝治療に好適なｒＡＡＶを生成する方法は既知であり（例えば、米国特許第２０１２／０１００６０６号、同第２０１２／０１３５５１５号、同第２０１１／０２２９９７１号及び同第２０１３／００７２５４８号、ならびにＧｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １３（４）：３２１−３２９，２００６を参照）、組換え核酸分子及び本明細書に開示される方法とともに利用することができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸は発現カセットまたは導入遺伝子の一部である。例えば、米国特許出願第２０１５０１３９９５３号を参照。発現カセットは導入遺伝子及び調節配列、例えば、プロモーター及び５’及び３’ＡＡＶは末端逆位配列（ＩＴＲ）からなる。望ましい一実施形態では、ＡＡＶセロタイプ２または８のＩＴＲが使用される。しかし、他の好適なセロタイプに由来するＩＴＲが選択されてもよい。発現カセットは通常キャプシドタンパク質にパッケージングされ、選択された宿主細胞に送達される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本開示はＡＡＶセロタイプキャプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはそのタンパク質を産生する方法を提供する。このような方法はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）セロタイプキャプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能性ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）及び導入遺伝子からなる発現カセット、ならびに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することに関連し、ＡＡＶキャプシドタンパク質への発現カセットのパッケージングを可能にする。例えば、米国特許出願第２０１５０１３９９５３号を参照。
【０１２１】
ＡＡＶキャプシドにおけるＡＡＶ発現カセットをパッケージングする宿主細胞における培養のための成分は、トランスに宿主細胞に提供され得る。あるいは、成分（例えば、発現カセット、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列及び／またはヘルパー機能）の任意の１つ以上が、当業者に既知の方法を使用して必要な成分の１つ以上を含むために、遺伝子操作によって作成された安定した宿主細胞によって提供され得る。最も好適には、このような安定した宿主細胞は誘導性プロモーターの制御下で成分（複数可）を含む。しかし、必要な成分（複数可）は構成性プロモーターの制御下であってもよい。さらに別の代替例では、選択された安定な宿主細胞は構成性プロモーターの制御下で選択された成分（複数可）及び１つ以上の誘導性プロモーターの制御下で他の選択された成分（複数可）を含み得る。例えば、２９３個の細胞（構成性プロモーターの制御下でのＥ１ヘルパー機能を含む）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下でのｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質を含む安定した宿主細胞が生成され得る。さらに他の安定した宿主細胞は当業者によって生成され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本開示は、導入遺伝子と動作可能に組み合わせて、肝臓特異的プロモーター核酸配列を含む組換えベクターに関する。導入遺伝子は、本明細書に開示される新規のｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩまたはｆＩＸタンパク質、ならびに任意に１つ以上の対象となる追加のタンパク質をコードする導入遺伝子の側面に位置するベクター配列に非相同な核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞に導入遺伝子転写、翻訳及び／または発現が可能になるよう調節成分に効果をもたらすように連結される。
【０１２３】
発現カセットは、宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミドに担持することができる。本開示に有用なプラスミドは、プラスミドが複製、任意に原核細胞、哺乳動物細胞またはその両方への統合に好適であるように遺伝子操作によって作成され得る。これらのプラスミド（または５’ＡＡＶ  ＩＴＲ非相同分子−３’ＩＴＲを担持する他のベクター）は、真核生物及び／または原核生物、ならびにこれらの系のための選択マーカーにおける発現カセットの複製を許容する配列を含む。好ましくは、発現カセットを担持する分子は細胞にトランスフェクトし、細胞には一時的に分子が存在してもよい。あるいは、発現カセット（５’ＡＡＶ  ＩＴＲ非相同分子−３’ＩＴＲを担持する）は染色体的にまたはエピソームとして宿主細胞のゲノムに安定して統合してもよい。ある種の実施形態では、発現カセットは複数のコピーに任意に頭−頭、頭−尾または尾−尾コンカテマーに存在してもよい。好適なトランスフェクション技術は既知であり、発現カセットを宿主細胞に送達するために容易に利用してもよい。
【０１２４】
通常、トランスフェクションによって発現カセットを含むベクターを送達する場合、ベクター及び宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量が調整され、選択されたベクターとして因子、送達方法及び選択された宿主細胞を考慮に入れ得る。発現カセットに加えて、宿主細胞は、宿主細胞におけるＡＡＶキャプシドタンパク質を発現させる配列及び発現カセットにおいて見つかるＡＡＶ  ＩＴＲのセロタイプと同じセロタイプまたはクロス相補セロタイプのｒｅｐ配列を含む。ｒｅｐ及びｃａｐを提供する分子（複数可）が、宿主において一時的に（すなわち、トランスフェクションで）存在し得るが、例えば、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質の１つまたは両方及び発現を制御するプロモーター（複数可）は宿主細胞に、例えば、エピソームまたは宿主細胞の染色体への統合によって安定して発現されることが好ましい。
【０１２５】
本開示のｒＡＡＶをパッケージングするためには、通常、パッケージング宿主細胞はヘルパー機能も含む。任意には、これらの機能はヘルペスウイルスによって供給され得る。最も望ましくは、上記されたものなどヒトまたはヒト以外の霊長類アデノウイルス源から必要なヘルパー機能がそれぞれ提供される及び／またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．（ＵＳ）を含む様々な供給源から入手可能である。所望のヘルパー機能は、細胞における発現を可能にする任意の手段を使用して提供され得る。
【０１２６】
ベクターの宿主細胞への導入は、中でもトランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコートペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を含む当該分野において既知であり、上記に開示される任意の手段によって達成され得る。アデノウイルス遺伝子の１つ以上は、宿主細胞のゲノムに安定して統合されるエピソームとして発現されるまたは一時的に発現され得る。遺伝子産物はすべて、エピソーム上に一時的に発現され、安定して統合されてもよく、あるいは他が一時的に発現されながら、遺伝子産物のいくつかが安定して発現され得る。さらに、各アデノウイルス遺伝子のそれぞれに対するプロモーターは構成性プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然アデノウイルスプロモーターから独立して選択され得る。プロモーターは、例えば、微生物または細胞の特定の生理学的状態（すなわち、分化状態によってまたは複製細胞もしくは静止細胞において）または外因的に付加した因子によって調整され得る。
【０１２７】
ＡＡＶ技術は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子送達のために上記の及び他のウイルスベクター系において使用に適合することができる。ある種の実施形態では、本開示では種々のｒＡＡＶ及び非ｒＡＡＶベクター系における本明細書に開示される核酸及びベクターの使用を考える。このようなベクター系は中でも例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクチンウイルス及びアデノウイルス系を含み得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるウイルス粒子、核酸及びベクターが治療用タンパク質の遺伝子発現のための治療用分子の送達を含む様々な目的に有用であることが考えられる。
【０１２９】
本明細書に報告される核酸（例えば、プロモーターと動作可能に組み合わせて）によってコードされる治療用タンパク質は、血友病Ｂ（例えば、本明細書に提供されるｆＩＸタンパク質を使用して）、血友病Ａ（例えば、本明細書に提供されるｆＶＩＩＩタンパク質を使用して）及び先天性プロコンベルチン欠乏症（例えば、本明細書に提供されるｆＶＩＩタンパク質を使用して）を含む凝固障害の治療のために使われるものを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、必要とする対象に血液凝固を誘発する方法が提供される。この方法は、本明細書に開示されるｆＶＩＩ、ｆＶＩＩＩまたはｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列コードベクター（例えば、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター）の治療上有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は血友病Ａまたは血友病Ｂなどの凝固障害を有する対象である。いくつかの実施形態では、凝固障害は血友病Ａであり、対象はｆＶＩＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを投与される。他の実施形態では、凝固障害は血友病Ｂであり、対象はｆＩＸ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを投与される。他の実施形態では、凝固障害は先天性プロコンベルチン欠乏症であり、対象はｆＶＩＩ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを投与される。
【０１３１】
血友病Ａと診断される患者のための治療選択肢は、ｆＶＩＩＩ補充療法と呼ばれることがある組換えｆＶＩＩＩの外因性投与である。類似の補充療法は血友病Ｂ（外因性ｆＩＸの投与を使用する）及び先天性プロコンベルチン欠乏症（外因性ｆＶＩＩの投与を使用する）の治療に使用される。いくつかの実施形態では、血友病ＡまたはＢを有する患者は本明細書に開示される組換えｆＶＩＩＩまたはｆＩＸタンパク質の投与によって治療され得る。数人の患者において、これらの治療法により投与された凝固因子に結合する抗体が発生し得る。その後、通常インヒビターと呼ばれる凝固因子−抗体結合接合体が、血液凝固を引き起こす外因性凝固因子の能力と干渉するまたは妨害する。抑制性自己抗体は、後天性血友病と呼ばれる血友病などの凝固障害を有するリスクを遺伝的に持たない対象に自発的に発生することがある。抗凝固療法が有効であるかどうかを決定するために、外因性凝固因子治療の前に抑制性抗体アッセイが通常実行される。
【０１３２】
「ベセスダアッセイ」は、ｆＶＩＩＩ結合抗体の抑制強度及び濃度を定量するために、歴史的に使用されてきた。このアッセイにおいては、例えば、手術前に患者の血漿の系列希釈物を準備し、各希釈物をｆＶＩＩＩの供給源として等量の正常な血漿と混合する。２時間培養した後、希釈混合物のそれぞれにおけるｆＶＩＩＩの活性を測定する。希釈を複数回繰り返した後のｆＶＩＩＩ凝固活性を阻害する抗体インヒビター濃度を有することは、制御されていない出血のリスクが高まることを示す。約１０回の希釈後のインヒビター力価を有する患者は、出血を止める外因性ｆＶＩＩＩ注入に反応しにくいように感じる。ベセスダ力価は、結果として正常なヒト血漿に存在するｆＶＩＩＩ活性の５０％阻害になる希釈の逆数として定義される。１０を超えるベセスダ力価は、ｆＶＩＩＩ補充療法に対する反応の閾値と考えられる。
【０１３３】
ある種の実施形態では、本開示は血液凝固を誘発する方法であって、それを必要とする対象に本明細書に開示される血液凝固因子をコードする核酸を含むベクターを含むウイルス粒子またはキャプシドの有効量を投与することを含む方法に関する。
【０１３４】
ある種の実施形態では、対象は血友病ＡもしくはＢ、または後天性血友病と診断される、あるいは外因性凝固因子注入（例えば、ベセスダアッセイ結果に基づく）に反応しにくい。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本開示は遺伝子送達ビヒクルとしてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターコードヒトｆＩＸを使用して、血友病Ｂの治療のための遺伝子導入方法に関する。血友病ＢのいくつかのこのようなＡＡＶベースの遺伝子治療法がヒト臨床試験に入ったが、この治療法は疾患の部分補正のみで起こるウイルスの投与後の治療用タンパク質である凝固ｆＩＸの低発現により妨害された。ＡＡＶベクター毒性により安全に投与され得るウイルスの用量が制限される。通常、ベクターは毒性の閾値より低いウイルス用量でｆＩＸの効能のある発現を提供する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本開示は遺伝子送達ビヒクルとしてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターコードヒトｆＶＩＩＩを使用して、血友病Ａの治療のための遺伝子導入方法に関する。血友病ＡのいくつかのこのようなＡＡＶベースの遺伝子治療法がヒト臨床試験に入ったが、この治療法は疾患の部分補正のみで起こるウイルスの投与後の治療用タンパク質である凝固ｆＶＩＩＩの低発現により妨害された。ＡＡＶベクター毒性により安全に投与され得るウイルスの用量が制限される。通常、ベクターは毒性の閾値より低いウイルス用量でｆＶＩＩＩの効能のある発現を提供する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本開示は遺伝子送達ビヒクルとしてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターコードヒトｆＶＩＩを使用して、先天性プロコンベルチン欠乏症の治療のための遺伝子導入方法に関する。血友病ＡのＡＡＶベースの遺伝子治療法がヒト臨床試験に入ったが、この治療法は疾患の部分補正のみで起こるウイルスの投与後の治療用タンパク質である凝固ｆＶＩＩの低発現により妨害された。ＡＡＶベクター毒性により安全に投与され得るウイルスの用量が制限される。通常、ベクターは毒性の閾値より低いウイルス用量でｆＶＩＩの効能のある発現を提供する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本開示は遺伝子送達ビヒクルとしてレンチウイルスベクターコードヒトｆＩＸを使用して、血友病Ｂの治療のための遺伝子導入方法に関する。導入遺伝子をコードするレンチウイルスベクターの送達は、例えば、対象への直接投与によるまたはベクターを有する造血幹細胞及び前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの形質導入及び移植によることが可能である。通常、ベクターは毒性の閾値より低いウイルス用量でｆＶＩＩの効能のある発現を提供する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本開示は遺伝子送達ビヒクルとしてレンチウイルスベクターコードヒトｆＶＩＩＩを使用して、血友病Ａの治療のための遺伝子導入方法に関する。導入遺伝子をコードするレンチウイルスベクターの送達は、例えば、対象への直接投与によるまたはベクターを有する造血幹細胞及び前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの形質導入及び移植によることが可能である。通常、ベクターは毒性の閾値より低いウイルス用量でｆＶＩＩの効能のある発現を提供する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本開示は遺伝子送達ビヒクルとしてレンチウイルスベクターコードヒトｆＶＩＩを使用して、先天性プロコンベルチン欠乏症の治療のための遺伝子導入方法に関する。導入遺伝子をコードするレンチウイルスベクターの送達は、例えば、対象への直接投与によるまたはベクターを有する造血幹細胞及び前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの形質導入及び移植によることが可能である。通常、ベクターは毒性の閾値より低いウイルス用量でｆＶＩＩの効能のある発現を提供する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸を含む組換えウイルス粒子、キャプシドまたはベクターは、肝動脈を介して、門脈を介してまたは静脈により肝臓に運搬され、血液中に治療レベルの治療用タンパク質または凝固因子を得ることができる。キャプシドまたはベクターは好ましくは生理学的に適合性のあるキャリア中に懸濁され、ヒトまたは非ヒトの哺乳動物患者に投与されてもよい。好適なキャリアは、導入ウイルスが目的とする適応症の観点から当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの好適なキャリアは生理食塩水を含み、この生理食塩水は様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）と配合されてもよい。他の代表的なキャリアとしては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、胡麻油及び水が挙げられる。
【０１４２】
任意には、本開示の組成物は防腐剤または化学安定剤などの他の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。好適な代表的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
【０１４３】
十分な量の組換えウイルス粒子、キャプシドまたはベクターが投与されると、細胞をトランスフェクトし、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供し、過度の副作用が生じないまたは医学的に許容される生理学的効果を有する治療上の利点を提供する。この生理学的効果は医療分野における当業者によって判断され得る。従来の薬学的に許容される投与経路は、所望の器官（例えば、肝臓（任意に肝動脈を介して）または肺）への直接送達、経口、吸入、経鼻、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内及び他の親経路の投与が挙げられるが、これに限定されない。所望する場合、投与経路は併用してもよい。
【０１４４】
組換えウイルス粒子、キャプシドまたはベクターの用量は、治療される症状、患者の年齢、体重及び健康などの要因に主に左右されるため、患者に応じて変わり得る。例えば、ウイルスベクターのヒトの治療上有効量の範囲は、一般的にゲノムウイルスベクターが濃度約１×１０９〜１×１０１６である溶液約０．１ｍｌ〜約１００ｍｌである。
【０１４５】
本開示の組換えウイルスベクターは、微生物がタンパク質に対する中和抗体を有するようなｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで選択された宿主細胞に選択されたタンパク質を送達することができる効率的な遺伝子導入ビヒクルを提供する。一実施形態では、本明細書に開示されるベクター及び細胞はｅｘ  ｖｉｖｏで混合される。感染細胞は従来の方法論を用いて培養される。形質導入された細胞は患者に再注入される。
【実施例】
【０１４６】
次の実施例は、特定の特徴及び／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、記載される特定の特徴または実施形態に本開示を制限するものではない。
【０１４７】
実施例１
先祖のタンパク質再構成による凝固第ＩＸ因子の生体工学
本実施例は凝固因子活性を向上するｆＩＸ配列の最適化、タンパク質発現の実用性及び遺伝子治療などの治療用途を例示する。
【０１４８】
血友病Ｂの治療のためのｆＩＸなどの凝固因子の大きさ、不安定性、免疫原性及び生合成非効率性によって変化させる血友病治療の開発が妨げられてきた。このため、活性を増加させた（例えば、血清半減期の増加または酵素活性の増加による）更なるｆＩＸ配列を見つけ出すことが望ましい。これにより、完全な予防を今まで通り達成しながら、注入の頻度を減らすことができるためである。
【０１４９】
血友病Ｂの向上された凝固因子補充療法を容易にすることができる更なるｆＩＸ配列を探すために、対応する祖先ノード（Ａｎ）配列を有する哺乳動物のｆＩＸ系統樹がＰＡＭＬ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１でＤＮＡ及びアミノ酸ベースモデルを用いてベイズの推論により構築された。まず、再構築のため、９個のＡｎ−ｆＩＸ配列が以下のように選択された。
【化１】
2020519272.tif 000003
【化２】
2020519272.tif 000004
【０１５０】
図１はｈｆＩＸ配列を有する上記のｆＩＸタンパク質の配列アラインメントを示す。ｈｆＩＸ配列は配列番号４２として提供される。
【化３】
2020519272.tif 000005
【０１５１】
さらに、「Ｐａｄｕａ」突然変異はこの突然変異の追加により第ＩＸ因子活性が増加するかどうかを決定するために、Ａｎ９６及びＡｎ９７  ｆＩＸタンパク質に導入された。Ｐａｄｕａ突然変異は、ｆＩＸ活性を増加させる成熟したｆＩＸアミノ配列におけるＲ３３８Ｌ置換である（「ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ」、Ｐａｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ，“Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ；３６１：１６７１−１６７５，２００９参照）。Ｐａｄｕａ突然変異（太字の下線に示される）を有するＡｎ９６及びＡｎ９７  ｆＩＸタンパク質の配列は以下の通りである。
【化４】
2020519272.tif 000006
【０１５２】
配列番号１において、残基１〜２８はシグナルペプチド（太字、成熟したｆＩＸ残基−４６〜−１８と呼ばれる）であり、残基２９〜４６はプロペプチド（イタリック体、ｆＩＸ残基−１８〜−１と呼ばれる）であり、残基４７〜４６２は成熟したｆＩＸ配列（成熟したｆＩＸ残基＋１〜４１５と呼ばれる）である。配列番号２において、残基１〜２８はシグナルペプチド（太字のイタリック体、成熟したｆＩＸ残基−４６〜−１８と呼ばれる）であり、残基２９〜４６はプロペプチド（イタリック体、ｆＩＸ残基−１８〜−１と呼ばれる）であり、残基４７〜４６１は成熟したｆＩＸ配列（成熟したｆＩＸ残基＋１〜４１５と呼ばれる）である。配列番号１を参照すると、残基４７〜９２はＧＬＡドメインであり、残基９３〜１２９は第１ＥＧＦ様ドメインであり、残基１３０〜１９２は第２ＥＧＦ様ドメインであり、残基１９３〜２２７は活性化ペプチドであり、残基２２８〜４６２は触媒ドメインである。対応するドメインは配列番号２においても存在する。
【０１５３】
これらのｆＩＸタンパク質をコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列は、例えば、ＷＯ２０１６／１６８７２８に記載の肝臓コドン最適化プロトコルを使用して、ヒトに対応する非コドン最適化配列をコードする天然に存在するヌクレオチド配列と比較して、ヒト肝臓細胞に特異的なコドン使用バイアスを実現することにより最適化された。肝臓組織における発現に対するコドン最適化される配列番号１及び配列番号２をコードする核酸配列が産生され、以下の通り提供される。
【化５】
2020519272.tif 000007
【０１５４】
配列番号９及び配列番号１０では、シグナルペプチドが太字で示され、プロペプチドが太字のイタリック体で示され、Ｐａｄｕａ突然変異の変異ヌクレオチドが太字の下腺で示される。肝臓コドン最適化されたｆＩＸ  Ｐａｄｕａ配列はベクター（例えば、ＡＡＶベクター）に含まれ、プロモーター（例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ＨＣＢプロモーター）に動作可能に連結され、対象への投与により、例えば、対象の血友病Ｂを治療することができる。
【０１５５】
最適化されたｆＩＸ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現は、対応するｆＩＸ発現ベクターで一過性にトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞において評価された（図２を参照）。１０％ＦＢＳ及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで補充されるＤＭＥＭを含む２４ウェルプレートに１ウェルあたり３００，０００個のＨｅｐＧ２細胞を播種した。この細胞は、トランスフェクションの日に約７０〜８０％コンフルエントであった。トランスフェクション複合混合物を最終濃度０．５μｇのプラスミドＤＮＡ、１．５μｌのＴｒａｎｓＩＴ−Ｘ２トランスフェクション試薬及び最終体積最大５０μｌに補充されたＯｐｔｉＭＥＭで調製した。Ａｎ−ｆＩＸ導入遺伝子のすべては、Ａｎ−ｆＩＸを発現する内部ＥＦ１αプロモーターを含む自己不活性化レンチウイルスベクター発現カセットにクローニングされた。ヒトｆＩＸ−Ｐａｄｕａ（Ｒ３３８Ｌ）構造物は、ヒトｆＩＸ導入遺伝子の前にマウスイントロンのＨＨＳ４エンハンサー−トランスチレチンプロモーター及び微小ウイルスを含むｓｃＡＡＶ３  ＩＴＲカセットから発現された。トランスフェクション複合体をピペットで吸引して混合し、培養細胞上への滴下及び均一分布のための穏やかな振盪前に室温で１５〜３０分間インキュベートすることができた。１０％ＦＢＳ及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで補充されるＤＭＥＭに対する培地が２４時間後に変更され、条件付き培地が１段階凝固アッセイを用いてｆＸ活性について分析された。各Ａｎ−ｆＩＸタンパク質は、基質としてヒト血友病Ｂ血漿を利用する凝固アッセイの活性を示し、このようにして進化哺乳動物の適合性を証明する。図２に示すように、Ｐａｄｕａ突然変異をＡｎ９６及びＡｎ９７配列に組み込むことにより対応する未変性のＡｎ９６及びＡｎ９７タンパク質に対してｆＩＸ活性を実質的に増加させた。さらに、Ａｎ９６  Ｐａｄｕａ及びＡｎ９７  Ｐａｄｕａタンパク質は、ヒトｆＩＸタンパク質（ｈｆＩＸ）より実質的に多くのｆＩＸ活性を提供した。このヒトｆＩＸタンパク質も肝臓コドン最適化された配列によってコードされた（約３．７倍の増加）。
【０１５６】
さらに、最適化されたｆＩＸ配列のｉｎ  ｖｉｖｏでの発現は、血友病Ｂマウスにおいて評価された（図３）。肝臓コドン最適化されたヒトｆＩＸ  Ｐａｄｕａ（Ｒ３３８Ｌ）、Ａｎ９６  ｆＩＸ及びＡｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ（Ｒ３３８Ｌ、配列番号９）導入遺伝子は、プラスミドを含むｓｃＡＡＶ３−ＩＴＲ−ＨＨＳ４−ＴＴＲ−ＭＶＭ−ＦＩＸ−ｓＰａ組換えＡＡＶ発現カセットにクローニングされた。プラスミドはＩＴＲＳ隣接導入遺伝子を保存した酵素を使用して線状化され、２０分間６５℃で熱失活した。ＤＮＡの品質比較のために、各分解産物を検査し、注入前に許容可能であることが示された。３７℃に温めたＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＥＥ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して、マウスをランダム化し、プラスミドＤＮＡ希釈を５μｇ／ｍｌで行った。各実験動物を、８ｓ以下で流体力学様式で送達された０．５μｇ／ｇの線状化プラスミドＤＮＡを受け入れた。１）ｓｃＡＡＶ３−ＨＨＳ４−ＴＴＲ−ＭＶＭ−ｆＩＸ＿Ａｎ９６−ＬＣＯ−ｓＰａ、２）ｓｃＡＡＶ３−ＨＨＳ４−ＴＴＲ−ＭＶＭ−ｆＩＸ＿Ａｎ９６−Ｐａｄｕａ−ＬＣＯ−ｓＰａ、３）ｓｃＡＡＶ３−ＨＨＳ４−ＴＴＲ−ＭＶＭ−ｆＩＸ−１４８Ｔ−Ｐａｄｕａ−ＬＣＯ−ＮＣＯ−ｓＰＡの３つの処置群及び第４のコントロール生理食塩水のみ注入群について、盲検的に注入を行った。９〜１１週齢の範囲である実験マウス合計１５頭を使用した。各処置群はマウス５頭であった。１２週齢の血友病Ａ  Ｅ１６マウス３頭をコントロールとして選択した。前日に各マウスを穿孔し、計量した。プラスミド投与後１、３、７及び１４日目にマウスから血を抜いた。血漿を処理し、１段階凝固アッセイを使用してｆＩＸ活性について分析した。Ａｎ９６  ｆＩＸまたはｈｆＩＸ処置動物ではなく、Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａベクターで処置された動物は２週を超えて超生理的血漿ｆＩＸ活性レベル（それぞれ、約１５〜２０ＩＵ／ｍｌｆＩＸ活性対０〜１０ＩＵ／ｍｌｆＩＸ活性）の持続を達成した。
【０１５７】
さらに、最適化されたｆＩＸ配列のｉｎ  ｖｉｖｏでの発現は、最適化されたｆＩＸ＋／＋マウスにおいて評価された（図４）。肝臓に誘導されたプロモーター（ＨＣＢ）、マウスイントロンの１つの微小ウイルス及び３つのｆＩＸ導入遺伝子（ヒトｆＩＸ−Ｐａｄｕａ）の１つ、Ａｎ９６−ｆＩＸ−Ｐａｄｕａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）またはｈｆＩＸ  Ｑ１１Ｒ−Ｅ２４０Ｋ−Ｈ２４３Ｐ−Ｒ３３８Ｌを含むＡＡＶ２／８ベクターを生成した。ランダム化されたｗｔ  ｆＩＸ＋／＋マウスについて、盲検的にアッセイを行った。９〜１１週齢、雄のｗｔ  ｆＩＸ＋／＋マウスに、組換えＡＡＶ（ｎ＝３／群）の１ｋｇ当たり５×１０１１個のベクターゲノムを尾静脈を介して注入した。ＡＡＶ投与前の基線で及びＡＡＶ投与後４週間目に、マウスから血が抜かれ、プラズマｆＩＸ活性レベルを１段階凝固アッセイによって評価した。図４では、ＡＡＶ投与前後のｆＩＸ活性レベルの変化がプロットされた。一方向ＡＮＯＶＡ及びＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ事後分析により統計比較がなされた。アスタリスクはＰ＜０．０５を示す。ＡＡＶ−２／８−ＡＮ９６−ｆＩＸ−ＰＡｇｕａで処置されたマウスは、コントロール、ｈｆＩＸ−ＰａｄｕａまたはｈｆＩＸ  Ｑ１１Ｒ−Ｅ２４０Ｋ−Ｈ２４３Ｐ−Ｒ３３８Ｌマウスより著しく高いｆＩＸ活性の増加を示した。他の群と互いに有意差はなかった。
【０１５８】
実施例２
先祖のタンパク質再構成による凝固第ＶＩＩＩ因子の生体工学
本実施例は凝固因子活性を向上するｆＶＩＩＩ配列の最適化、タンパク質発現及び遺伝子治療などの治療用途を例示する。
【０１５９】
血友病Ａの治療のためのｆＶＩＩＩなどの凝固因子の大きさ、不安定性、免疫原性及び生合成非効率性によって、変化させる血友病治療の開発が妨げられてきた。既存の脊椎動物種に由来するｆＶＩＩＩオルソログの研究を通して、ヒトｆＶＩＩＩの限定のいくつかを克服することができるユニークな分子、細胞及び生化学的性質が発見された。このアプローチにより後天性血友病Ａのための組換えブタｆＶＩＩＩの開発が容易になったが、改善がまだ必要であった。例えば、活性を増加させた（例えば、血清半減期の増加または酵素活性の増加による）更なるｆＶＩＩＩ配列を見つけ出すことが望ましい。これにより完全な予防を今まで通り達成しながら、注入の頻度を減らすことができるためである。
【０１６０】
血友病Ａの向上された凝固因子補充療法を容易にすることができる更なるｆＶＩＩＩ配列を探すために、対応する祖先ノード（Ａｎ）配列を有する哺乳動物のｆＶＩＩＩ系統樹がＰＡＭＬ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１でＤＮＡ及びアミノ酸ベースモデルを用いてベイズの推論により構築された。まず、再構築のため、９個のＡｎ−ｆＶＩＩＩ配列が以下のように選択された。
【化６】
2020519272.tif 000008
【化７】
2020519272.tif 000009
【化８】
2020519272.tif 000010
【化９】
2020519272.tif 000011
【化１０】
2020519272.tif 000012
【化１１】
2020519272.tif 000013
【０１６１】
Ａｎ８４、Ａｎ６３、Ａｎ９６及びＡｎ９７  ｆＶＩＩＩタンパク質の配列を修飾して、Ｂドメインを除去し、ペプチドリンカー（Ｂドメイン欠失型または「ＢＤＤ」ｆＶＩＩＩタンパク質）によってＡ２ドメインを活性化ペプチドに連結する。修飾アミノ酸配列は以下の通りである。
【化１２】
2020519272.tif 000014
【化１３】
2020519272.tif 000015
【０１６２】
配列番号３として提供されるＡｎ８４  ｆＶＩＩＩ配列は、シグナルペプチド（配列番号３の残基１〜１９、太字で示される）、Ａ１ドメイン（配列番号３の残基２０〜３９３）、Ａ２ドメイン（配列番号３の残基３９４〜７６０）、リンカーで連結したＡ２ドメイン及び活性化ペプチドを有するＢドメイン欠失（配列番号３の残基７６１〜７７４、太字の下線で示される）、活性化ペプチド（配列番号３の残基７７５〜８１５）、Ａ３ドメイン（配列番号３の残基８１６〜１１４５）、Ｃ１ドメイン（配列番号３の残基１１４６〜１２９８）及びＣ２ドメイン（配列番号３の残基１２９８〜１４５８）を含む。対応するドメインは配列番号４〜６にも存在する。
【０１６３】
これらのｆＩＸタンパク質をコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列は、例えば、ＷＯ２０１６／１６８７２８に記載の肝臓コドン最適化プロトコルを使用して、ヒトに対応する非コドン最適化配列をコードする天然に存在するヌクレオチド配列と比較して、ヒト肝臓細胞に特異的なコドン使用バイアスを実現することにより最適化された。肝臓組織における発現に対するコドン最適化される配列番号３〜６をコードする核酸配列が生成され、以下の通り提供される。
【化１４】
2020519272.tif 000016
【化１５】
2020519272.tif 000017
【化１６】
2020519272.tif 000018
【化１７】
2020519272.tif 000019
【化１８】
2020519272.tif 000020
【０１６４】
配列番号１２〜１４では、シグナルペプチドが太字で示される。肝臓コドン最適化されたｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列はベクター（例えば、ＡＡＶベクター）に含まれ、プロモーター（例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ＨＣＢプロモーター）に動作可能に連結され、対象への投与により、例えば、対象の血友病Ａを治療することができる。
【０１６５】
最適化されたｆＶＩＩＩ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの凝固活性が評価された（図５を参照）。ＡＮ６３、Ａｎ８４、ＡＮ９６、Ａｎ９７、Ａｎ１０２、ＨＳＱ、Ｅｔ３及び５３ＫｆＶＩＩＩタンパク質は、一過性にトランスフェクトされた発現ベクターを用いてＨＥＫ２９３Ｔ１７細胞において発現された。２４ウェルプレートに２：１（ｗ：ｗ）の比でＰＥＩを使用してｆＶＩＩＩタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ５００ｎｇでＨＥＫ２９３Ｔ１７細胞を一過性にトランスフェクトした。培地は上澄み取り出しの２４時間前に無血清ＳＦＭ４ＣＨＯ培地に変更した。各構築物は３回トランスフェクトし、ｆＶＩＩＩ活性を１段階凝固アッセイで測定した。すべての構造物は肝臓コドン最適化され、導入遺伝子はＥＦ１αプロモーターによって動かされた。
【０１６６】
実施例３
先祖のタンパク質再構成による凝固第ＶＩＩＩ因子の生体工学
本実施例は凝固因子活性を向上するｆＶＩＩ配列の最適化、タンパク質発現及び遺伝子治療などの治療用途を例示する。
【０１６７】
先天性プロコンベルチン欠乏の治療のためのｆＶＩＩなどの凝固因子の大きさ、不安定性、免疫原性及び生合成非効率性によって、変化させる血友病治療の開発が妨げられてきた。このため、活性を増加させた（例えば、血清半減期の増加または酵素活性の増加による）更なるｆＶＩＩ配列を見つけ出すことが望ましい。これにより、完全な予防を今まで通り達成しながら、注入の頻度を減らすことができるためである。
【０１６８】
凝固因子補充療法などの治療法の改善を容易にすることができる更なるｆＶＩＩ配列を探すために、対応する祖先ノード（Ａｎ）配列を有する哺乳動物のｆＶＩＩ系統樹がＰＡＭＬ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１でＤＮＡ及びアミノ酸ベースモデルを用いてベイズの推論により構築された。まず、再構築のため、９個のＡｎ−ｆＶＩＩ配列が以下のように選択された。
【化１９】
2020519272.tif 000021
【化２０】
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【０１６９】
配列番号７のｆＶＩＩ配列を参照すると、残基１〜２０はシグナルペプチドであり、残基２１〜８３はＧＬＡドメインであり、残基８４〜１２０は第１ＥＧＦ様ドメインであり、残基１２１〜１９０は第２ＥＧＦ様ドメインであり、残基１９１〜４４４は触媒ドメインである。対応するドメインは配列番号８及び３５〜４１にも存在する。
【０１７０】
これらのｆＶＩＩタンパク質をコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列は、上記するように、ヒトに対応する非コドン最適化配列をコードする天然に存在するヌクレオチド配列と比較して、ヒト肝臓細胞に特異的なコドン使用バイアスを実現することにより最適化された。肝臓組織における発現に対するコドン最適化される配列番号３〜６をコードする核酸配列が生成され、以下の通り提供される。
【化２１】
2020519272.tif 000023
【０１７１】
配列番号１５及び１６では、シグナルペプチドが太字で示される。肝臓コドン最適化されたｆＶＩＩ配列はベクター（例えば、ＡＡＶベクター）に含まれ、プロモーター（例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ＨＣＢプロモーター）に動作可能に連結され、対象への投与が、例えば、対象の血友病Ｂを治療することができる。
【０１７２】
実施例４
ＡＡＶベースの遺伝子治療を用いたヒト血友病Ａの治療
本実施例は血友病Ａの治療のためのｆＶＩＩＩをコードするＡＡＶベクターの臨床用のための例示的な方法を記載する。
【０１７３】
血友病Ａと診断される患者は、治療のために選択される。患者にＨＣＢプロモーターの制御下で治療上有効量のＡｎ８４  ＢＤＤ  ｆＶＩＩＩ変異体（例えば、配列番号１１）をコードする組換えＡＡＶが投与される。組換えＡＡＶは静脈内に投与され得る。適切な治療量は医者によって選択され得る。場合によっては、治療上有効量の範囲は、１ｋｇあたりウイルス粒子１×１０１２個（ｖｐ）などの１ｋｇあたり１×１０１１〜１×１０１４ｖｐである。ほとんどの場合、患者は単回投与される。対象の健康は時間経過とともにモニタリングし、治療の効果を決定することができる。
【０１７４】
実施例５
ＡＡＶベースの遺伝子治療を用いたヒト血友病Ｂの治療
本実施例は血友病Ｂの治療のためのｆＩＸをコードするＡＡＶベクターの臨床用のための例示的な方法を記載する。
【０１７５】
血友病Ｂと診断される患者は治療のために選択される。患者にＨＣＢプロモーターの制御下で治療上有効量のＡｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（例えば、配列番号９）をコードする組換えＡＡＶが投与される。組換えＡＡＶは静脈内に投与され得る。適切な治療量は医者によって選択され得る。場合によっては、治療上有効量の範囲は、１ｋｇあたりウイルス粒子１×１０１２個（ｖｐ）などの１×１０１１〜１×１０１４ｖｐである。ほとんどの場合、患者は単回投与される。対象の健康は時間経過とともにモニタリングし、治療の効果を決定することができる。
【０１７６】
記載される方法または組成物の明確な詳細は記載される実施形態の趣旨を逸脱しない範囲で変更または修飾され得ることが明らかである。我々は下記の請求項の範囲及び趣旨の範囲となるこのような修飾及び変更すべてを請求する。
【図１Ａ】
2020519272.tif 000024
【図１Ｂ】
2020519272.tif 000025
【図２】
2020519272.tif 000026
【図３】
2020519272.tif 000027
【図４】
2020519272.tif 000028
【図５】
2020519272.tif 000029
【配列表】
2020519272000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月15日(2020.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２３（Ａｎ９６  ｆＩＸ）の残基４７〜４６２、配列番号２４（Ａｎ９７  ｆＩＸ）の残基４７〜４６１、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６２もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列、
配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つの残基２０〜１４５８と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列、または
配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）の残基２１〜４４４と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むｆＶＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記ｆＩＸタンパク質が、配列番号２３（Ａｎ９６  ｆＩＸ）の残基４７〜４６２、配列番号２４（Ａｎ９７  ｆＩＸ）の残基４７〜４６１、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６２もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６１として記載されるアミノ酸配列を含むか、
前記ｆＶＩＩＩタンパク質が、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つの残基２０〜１４５８として記載されるアミノ酸配列を含むか、または
前記ｆＶＩＩタンパク質が、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）のいずれか１つの残基２１〜４４４として記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記核酸配列が、配列番号２３（Ａｎ９６  ｆＩＸ）、配列番号２４（Ａｎ９７  ｆＩＸ）、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、シグナルペプチド及びプロペプチドに結合されるｆＩＸタンパク質をコードするか、
前記核酸配列が、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、シグナルペプチドに結合されるｆＶＩＩＩタンパク質をコードするか、または
前記核酸配列が、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）のいずれか１つと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む、シグナルペプチドに結合されるｆＶＩＩタンパク質をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記シグナルペプチド及びプロペプチドに結合される前記ｆＩＸタンパク質が、配列番号２３（Ａｎ９６  ｆＩＸ）、配列番号２４（Ａｎ９７  ｆＩＸ）、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）として記載されるアミノ酸配列を含むか、
前記シグナルペプチドに結合される前記ｆＶＩＩＩタンパク質が、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つとして記載されるアミノ酸配列を含むか、または
前記シグナルペプチドに結合される前記ｆＶＩＩタンパク質が、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）のいずれか１つとして記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記核酸配列がｃＤＮＡ配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記ｆＩＸタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号９のヌクレオチド１３９〜１３８９もしくは配列番号１０のヌクレオチド１３９〜１３８６として記載される配列を含むか、
前記ｆＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１１〜１４のいずれか１つのヌクレオチド５８〜４３７７として記載される配列を含むか、または
前記ｆＶＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１５もしくは配列番号１６のヌクレオチド６１〜１３３５として記載される配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記ｆＩＸタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号９もしくは配列番号１０として記載される配列を含むか、
前記ｆＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１１〜１４のいずれか１つとして記載される配列を含むか、または
前記ｆＶＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１５もしくは配列番号１６として記載される配列を含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
動作可能にプロモーターに結合した請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子またはベクターによってコードされる単離されたｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質。
【請求項１２】
前記ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質が成熟したｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質である、請求項１１に記載の単離されたｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質を生成する方法であって、
前記核酸分子または発現ベクターの発現に十分なｉｎ  ｖｉｔｒｏでの条件下で請求項１３に記載の宿主細胞をインキュベートし、前記ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質を生成することと、
前記ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質を精製することとを含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の精製されたｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質。
【請求項１６】
薬学的に許容されるキャリアに請求項１〜１２または１５のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクターまたはタンパク質を含む組成物。
【請求項１７】
必要とする対象に血液凝固を誘発するための組成物であって、
請求項１〜１２または１５〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクター、タンパク質または組成物を含む、前記組成物。
【請求項１８】
凝固障害を有する対象を治療するための組成物であって、
請求項１〜１２または１５〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクター、タンパク質または組成物を含み、治療上有効量の前記組成物が前記凝固障害を有する前記対象に投与されることを特徴とする、前記組成物。
【請求項１９】
前記凝固障害が血友病Ａであり、前記対象が前記ｆＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸分子を含むベクターを投与されるか、
前記凝固障害が血友病Ｂであり、前記対象が前記ｆＩＸタンパク質をコードする前記核酸分子を含むベクターを投与されるか、または
前記凝固障害が先天性プロコンベルチン欠乏症であり、前記対象が前記ｆＶＩＩタンパク質をコードする前記核酸分子を含むベクターを投与される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１２または１５〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクター、タンパク質または組成物を含み、それを必要とする対象に血液凝固を誘発する及び／または凝固障害を有する対象を治療するための組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の先述の及び他の特徴及び長所は、添付の図面を参照して進めるいくつかの実施形態の次の詳細な説明から、さらに明らかになるであろう。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６２もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むｆＩＸタンパク質をコードする核酸配列、
配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つの残基２０〜１４５８と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むｆＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列、または
配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）の残基２１〜４４４と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むｆＶＩＩタンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
（項目２）
前記ｆＩＸタンパク質が、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６２もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）の残基４７〜４６１として記載されるアミノ酸配列を含む、
前記ｆＶＩＩＩタンパク質が、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つの残基２０〜１４５８として記載されるアミノ酸配列を含む、または
前記ｆＶＩＩタンパク質が、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）のいずれか１つの残基２１〜４４４として記載されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３）
前記核酸配列が、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド及びプロペプチドに結合されるｆＩＸタンパク質をコードする、
前記核酸配列が、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドに結合されるｆＶＩＩＩタンパク質をコードする、または
前記核酸配列が、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）のいずれか１つと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドに結合されるｆＶＩＩタンパク質をコードする、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目４）
前記シグナルペプチド及びプロペプチドに結合される前記ｆＩＸタンパク質が、配列番号１（Ａｎ９６  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）もしくは配列番号２（Ａｎ９７  ｆＩＸ  Ｐａｄｕａ）として記載されるアミノ酸配列を含む、
前記シグナルペプチドに結合される前記ｆＶＩＩＩタンパク質が、配列番号３（Ａｎ８４  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号４（Ａｎ６３  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）、配列番号５（Ａｎ９６  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）もしくは配列番号６（Ａｎ９７  ｆＶＩＩＩ  ＢＤＤ）のいずれか１つとして記載されるアミノ酸配列を含む、または
前記シグナルペプチドに結合される前記ｆＶＩＩタンパク質が、配列番号７（Ａｎ８１  ｆＶＩＩ）もしくは配列番号８（Ａｎ６１  ｆＶＩＩ）のいずれか１つとして記載されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目５）
前記核酸配列がｃＤＮＡ配列である、項目１〜４のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
（項目６）
前記ｆＩＸタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号９のヌクレオチド１３９〜１３８９もしくは配列番号１０のヌクレオチド１３９〜１３８６として記載される前記配列を含む、
前記ｆＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１１〜１４のいずれか１つのヌクレオチド５８〜４３７７として記載される前記配列を含む、または
前記ｆＶＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１５もしくは配列番号１６のヌクレオチド６１〜１３３５として記載される前記配列を含む、先行項目のいずれか１項に記載の核酸分子。
（項目７）
前記ｆＩＸタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号９もしくは配列番号１０として記載される前記配列を含む、
前記ｆＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１１〜１４のいずれか１つとして記載される前記配列を含む、または
前記ｆＶＩＩタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１５もしくは配列番号１６として記載される前記配列を含む、項目６に記載の核酸分子。
（項目８）
動作可能にプロモーターに結合した項目１〜７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
（項目９）
前記ベクターがウイルスベクターである、項目８に記載のベクター。
（項目１０）
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、項目９に記載のベクター。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子またはベクターによってコードされる単離されたｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質。
（項目１２）
前記ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質が変異体ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質である、項目ＸＸに記載の単離されたｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質。
（項目１３）
項目１〜１０のいずれか１項に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞。
（項目１４）
ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質を生成する方法であって、
前記核酸分子の発現または発現ベクターに十分なｉｎ  ｖｉｔｒｏでの条件下で項目１３に記載の宿主細胞をインキュベートし、前記ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質を生成することと、
前記ｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質を精製することとを含む、前記方法。
（項目１５）
項目１４に記載の精製されたｆＩＸ、ｆＶＩＩＩまたはｆＶＩＩタンパク質。
（項目１６）
薬学的に許容されるキャリアに項目１〜１２または１５のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクターまたはタンパク質を含む組成物。
（項目１７）
必要とする対象に血液凝固を誘発する方法であって、
前記対象に治療上有効量の項目１〜１２または１５〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクター、タンパク質または組成物を投与することを含む、前記方法。
（項目１８）
凝固障害を有する対象を治療する方法であって、
前記凝固障害を有する対象を選択することと、
前記対象に治療上有効量の項目１〜１２または１５〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクター、タンパク質または組成物を投与することとを含む、前記方法。
（項目１９）
前記凝固障害が血友病Ａであり、前記対象が前記ｆＶＩＩＩタンパク質をコードする前記核酸分子を含むベクターを投与される、
前記凝固障害が血友病Ｂであり、前記対象が前記ｆＩＸタンパク質をコードする前記核酸分子を含むベクターを投与される、または
前記凝固障害が先天性プロコンベルチン欠乏症であり、前記対象が前記ｆＶＩＩタンパク質をコードする前記核酸分子を含むベクターを投与される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
項目１〜１２または１５〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子、ベクター、タンパク質または組成物の使用であって、それを必要とする対象に血液凝固を誘発する及び／または凝固障害を有する対象を治療するための前記使用。
【国際調査報告】
2020519272.tif 000030
2020519272.tif 000031
2020519272.tif 000032
2020519272.tif 000033
2020519272.tif 000034