(57)【要約】  本明細書には、改善された結合親和性、及び、メソテリンを発現する癌細胞のＴ細胞依存性死滅を媒介する改善された能力を持つ、ＭＳＬＮ結合タンパク質が開示される。本明細書に開示される結合タンパク質を含む医薬組成物、並びにそのような製剤を使用する方法が、更に提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一ドメインメソテリン結合タンパク質であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４２、４３、又は４４と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４２、４３、又は４４に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、１つ以上の保存領域を備えている、単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１に記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項３】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項４】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１、２、又は３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項５】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１、２、又は３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項６】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に相当するアミノ酸の伸張部；及び（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に相当するアミノ酸の伸張部を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項７】
以下の式を含む、単一ドメインメソテリン結合タンパク質であって：
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
式中、ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である
ことを特徴とする単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項８】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４０、５８、及び６０−６２から成る群から選択される配列に対し少なくとも８０％同一の配列を含む、ことを特徴とする請求項１乃至７の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項９】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、該結合タンパク質のヒト化を結果としてもたらす１つ以上の修飾を含む、ことを特徴とする請求項１乃至８の何れ１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項１０】
前記修飾は、アミノ酸残基の置換、付加、又は欠失を含む、ことを特徴とする請求項９に記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項１１】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、１１１〜１２４のアミノ酸を含む、ことを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項１２】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、非ヒトソース由来のＶＨＨドメインを含む、ことを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項１３】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ラマＶＨＨドメインを含む、ことを特徴とする請求項１乃至１２の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項１４】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質はメソテリンのエピトープに結合し、前記エピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基２９６−３９０を含む領域Ｉ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基３９１−４８６を含む領域ＩＩ、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基４８７−５９８を含む領域ＩＩＩに位置する、ことを特徴とする請求項１乃至１３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項１５】
単一ドメインメソテリン結合タンパク質であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、４６、４７、４８、４９、又は５０と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、４６、４７、４８、４９、又は５０に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、１つ以上の保存領域を備えている、単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項１６】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１５に記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項１７】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項１８】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１５、１６、又は１７の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項１９】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１５乃至１８の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２０】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１５乃至１９の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２１】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている、ことを特徴とする請求項１５乃至２０の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２２】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に相当するアミノ酸の伸張部；（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に相当するアミノ酸の伸張部；及び（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に相当するアミノ酸の伸張部を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２３】
以下の式を含む、単一ドメインメソテリン結合タンパク質であって：
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
式中、ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である
ことを特徴とする単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２４】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０−４０、５８、及び６０−６２から成る群から選択される配列に対し少なくとも８０％同一の配列を含む、ことを特徴とする請求項１５乃至２３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２５】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、１１１〜１１９のアミノ酸を含む、ことを特徴とする請求項１５乃至２４の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２６】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、非ヒトソース由来のＶＨＨドメインを含む、ことを特徴とする請求項１５乃至２５の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２７】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ラマＶＨＨドメインを含む、ことを特徴とする請求項１５乃至２６の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２８】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７として明記される配列を含むヒトメソテリンタンパク質に結合する、ことを特徴とする請求項１５乃至２７の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項２９】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質はメソテリンのエピトープに結合し、前記エピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基２９６−３９０を含む領域Ｉ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基３９１−４８６を含む領域ＩＩ、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基４８７−５９８を含む領域ＩＩＩに位置する、ことを特徴とする請求項１５乃至２８の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項３０】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質はキメラ抗体又はヒト化抗体である、ことを特徴とする請求項１乃至２９の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項３１】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は単一ドメイン抗体である、ことを特徴とする請求項１乃至３０の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項３２】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ヒト化単一ドメイン抗体である、ことを特徴とする請求項１５乃至３１の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項３３】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８に明記されるような配列を含む、ことを特徴とする請求項１乃至３２の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項３４】
請求項１乃至３３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項３４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３６】
請求項３５に記載のベクターにより形質転換される、宿主細胞。
【請求項３７】
（ｉ）請求項１乃至３３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質、請求項３３に記載のポリヌクレオチド、請求項３５に記載のベクター、又は請求項３６に記載の宿主細胞、及び（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１乃至３３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質の産生のためのプロセスであって、メソテリン結合タンパク質の発現を可能とする条件下で請求項１乃至３３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターにより形質転換又はトランスフェクトされる宿主を培養する工程、及び、培養物から産生されたタンパク質を回収及び精製する工程を含む、プロセス。
【請求項３９】
増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法であって、必要とする被験体への請求項１乃至３３の何れか１つに記載のメソテリン結合タンパク質の投与を含む、方法。
【請求項４０】
被験体はヒトである、ことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記方法は、請求項１乃至３３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質と組み合わせた薬剤の投与を更に含む、ことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する、ことを特徴とする請求項３９乃至４１の何れか１つに記載の方法。
【請求項４３】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を媒介する、ことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍疾患は固形腫瘍疾患である、ことを特徴とする請求項３９乃至４３の何れか１つに記載の方法。
【請求項４５】
前記固形腫瘍疾患は、中皮腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、又は三種陰性乳癌を含む、ことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記固形腫瘍疾患は転移性である、ことを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
単一ドメインメソテリン結合タンパク質であって、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１−５６及び６３−１７９から選択された１つ以上のＣＤＲを含む、単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項４８】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、５４、及び６３−１０１の何れか１つに明記される配列を含むＣＤＲ１を備える、ことを特徴とする請求項４７に記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項４９】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、５５、及び１０２−１４０の何れか１つに明記される配列を含むＣＤＲ２を備える、ことを特徴とする請求項４７又は４８に記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項５０】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、５６、及び１４１−１７９の何れか１つに明記される配列を含むＣＤＲ３を備える、ことを特徴とする請求項４７乃至４９の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項５１】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０−２１８の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域１（ｆ１）を含む、ことを特徴とする請求項４７乃至５０の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項５２】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９−２５７の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域２（ｆ２）を含む、ことを特徴とする請求項４７乃至５１の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項５３】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５８−２９６の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域３（ｆ３）を含む、ことを特徴とする請求項４７乃至５２の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項５４】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７−３３５の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域４（ｆ４）を含む、ことを特徴とする請求項４７乃至５３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項５５】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４０及び５８の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項４７乃至５４の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質。
【請求項５６】
請求項４７乃至５５の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項５７】
請求項５６に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５８】
請求項５７に記載のベクターにより形質転換される、宿主細胞。
【請求項５９】
（ｉ）請求項４７乃至５５の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質、請求項５６に記載のポリヌクレオチド、請求項５７に記載のベクター、又は請求項５８に記載の宿主細胞、及び（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項６０】
請求項４７乃至５５の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質の産生のためのプロセスであって、メソテリン結合タンパク質の発現を可能とする条件下で請求項４７乃至５５の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターにより形質転換又はトランスフェクトされる宿主を培養する工程、及び、培養物から産生されたタンパク質を回収及び精製する工程を含む、プロセス。
【請求項６１】
増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法であって、必要とする被験体への請求項４７乃至５５の何れか１つに記載のメソテリン結合タンパク質の投与を含む、方法。
【請求項６２】
被験体はヒトである、ことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記方法は、請求項１乃至３３の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質と組み合わせた薬剤の投与を更に含む、ことを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する、ことを特徴とする請求項６１乃至６３の何れか１つに記載の方法。
【請求項６５】
前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を媒介する、ことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記腫瘍疾患は固形腫瘍疾患である、ことを特徴とする請求項６１乃至６５の何れか１つに記載の方法。
【請求項６７】
前記固形腫瘍疾患は、中皮腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、又は三種陰性乳癌を含む、ことを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記固形腫瘍疾患は転移性である、ことを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、各々が全体において参照により本明細書に組み込まれている、２０１７年５月１２日出願の米国仮特許出願６２／５０５，７１９号及び２０１８年４月１３日出願の米国仮特許出願６２／６５７，４１７号の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１８年５月１１日に作成された上記のＡＳＣＩＩのコピーは、４７５１７−７１９＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、１４５，０３９バイトのサイズである。
【０００３】
引用による組み込み
本明細書で言及される刊行物、特許、及び特許出願は全て、あたかも個々の刊行物、特許、又は特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるべく具体的且つ個々に指示されるかのように、及び、その全体にわたって、同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
本開示は、ＭＳＬＮの発現に相関される兆候（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）を診断又は処置するために使用され得るメソテリン（ＭＳＬＮ）結合タンパク質を提供する。メソテリン（ＭＳＬＮ）は、ＧＰＩ結合腫瘍抗原であり、ＭＳＬＮは、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、三種陰性乳癌、及び中皮腫で過剰発現される。ＭＳＬＮの正常組織発現は、胸膜、心膜、及び腹膜腔の内側にある、単細胞の中皮層に制限される。ＭＳＬＮの過剰発現は、肺腺癌及び三種陰性乳癌における予後不良に関連付けられる。ＭＳＬＮは、癌抗原として、抗毒素、ワクチン、抗体薬物複合体、及びＣＡＲＴ細胞を含む多数の様式に対して使用されている。臨床効果の初期の兆候は、標的としてＭＳＬＮを検証したが、効果が改善された治療がＭＳＬＮを発現する癌の処置に必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
一実施形態は、単一ドメインメソテリン結合タンパク質を提供し、該単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４２、４３、又は４４と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、４２、４３、又は４４に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、１つ以上の保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に相当するアミノ酸の伸張部；及び（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に相当するアミノ酸の伸張部を含む。
【０００６】
一実施形態は、以下の式を含む、単一ドメインメソテリン結合タンパク質を提供し：
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
式中、ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−２９、３０−４０、５８、及び６０−６２から成る群から選択された配列に少なくとも８０％同一の配列を含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、該結合タンパク質のヒト化を結果としてもたらす１つ以上の修飾を含む。幾つかの実施形態において、修飾は、アミノ酸残基の置換、付加、又は欠失を含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、１１１〜１２４のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、非ヒトソース由来のＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質はラマＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、前記エピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基２９６−３９０を含む領域Ｉ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基３９１−４８６を含む領域ＩＩ、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基４８７−５９８を含む領域ＩＩＩに位置する。
【０００７】
一実施形態は、単一ドメインメソテリン結合タンパク質を提供し、該単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、４６、４７、４８、４９、又は５０と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、４６、４７、４８、４９、又は５０に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、１つ以上の保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０と同一の配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む、保存領域を備えている。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に相当するアミノ酸の伸張部；（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に相当するアミノ酸の伸張部（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に相当するアミノ酸の伸張部；及び（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に相当するアミノ酸の伸張部を含む。
【０００８】
一実施形態は、以下の式を含む、単一ドメインメソテリン結合タンパク質を提供し：
ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４
式中、ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６と同一である、又はこれに対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含んでおり；及びここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０−４０、５８、及び６０−６２から成る群から選択された配列に少なくとも８０％同一の配列を含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、１１１〜１１９のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、非ヒトソース由来のＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質はラマＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７として明記される配列を含むヒトメソテリンタンパク質に結合する。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質はメソテリンのエピトープに結合し、前記エピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基２９６−３９０を含む領域Ｉ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基３９１−４８６を含む領域ＩＩ、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基４８７−５９８を含む領域ＩＩＩに位置する。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、キメラ抗体又はヒト化抗体である。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質はヒト化単一ドメイン抗体である。
【０００９】
一実施形態は、単一ドメインメソテリン結合タンパク質を提供し、該単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１−５６及び６３−１７９から選択された１つ以上のＣＤＲを含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、５４、及び６３−１０１の何れか１つに明記される配列を含むＣＤＲ１を備える。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、５５、及び１０２−１４０の何れか１つに明記される配列を含むＣＤＲ２を備える。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、５６、及び１４１−１７９の何れか１つに明記される配列を含むＣＤＲ３を備える。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０−２１８の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域１（ｆ１）を含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９−２５７の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域２（ｆ２）を含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５８−２９６の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域３（ｆ３）を含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７−３３５の何れか１つに明記されるような配列を含むフレームワーク領域４（ｆ４）を含む。幾つかの実施形態において、前記単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４０、及び５８の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列を含む。
【００１０】
一実施形態は、上記実施形態何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。更なる実施形態は、上記実施形態のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。更なる実施形態は、上記実施形態に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１１】
一実施形態は、（ｉ）上記実施形態の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質、上記実施形態の何れか１つに記載のポリヌクレオチド、上記実施形態の何れか１つに記載のベクター、又は上記実施形態の何れか１つに記載の宿主細胞、及び（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。
【００１２】
更なる実施形態は、上記実施形態の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質の産生のためのプロセスを提供し、該プロセスは、メソテリン結合タンパク質の発現を可能とする条件下で上記実施形態の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターにより形質転換又はトランスフェクトされる宿主を培養する工程、及び、培養物から産生されたタンパク質を回収及び精製する工程を含む。
【００１３】
一実施形態は、増殖性疾患又は腫瘍疾患の処置又は改善のための方法を提供し、該方法は、必要とする被験体への上記実施形態の何れか１つに記載のメソテリン結合タンパク質の投与を含む。幾つかの実施形態において、被験体はヒトである。幾つかの実施形態において、前記方法は更に、上記実施形態の何れか１つに記載の単一ドメインメソテリン結合タンパク質と組み合わせた薬剤の投与を含む。幾つかの実施形態において、単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞に選択的に結合する。幾つかの実施形態において、単一ドメインメソテリン結合タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞のＴ細胞死滅を媒介する。幾つかの実施形態において、腫瘍疾患は固形腫瘍疾患を含む。幾つかの実施形態において、前記固形腫瘍疾患は、中皮腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、又は三種陰性乳癌を含む。幾つかの実施形態において、固形腫瘍疾患は転移性である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図１】標的タンパク質ＭＳＬＮを発現するＯＶＣＡＲ８細胞の死滅における、本開示に係る抗ＭＳＬＮ結合タンパク質を含む三重特異性分子（２Ａ２及び２Ａ４）を標的とする、典型的なＭＳＬＮの有効性を例示する。
【図２】本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質が、５つのドナー（ドナー０２；ドナー８６；ドナー４１；ドナー８１；及びドナー３５）由来のＴ細胞にＣａｏｖ３細胞を死滅させるよう導くことを示す。この図はまた、対照三重特異性タンパク質（ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ）が、５つのドナー（ドナー０２；ドナー８６；ドナー４１；ドナー８１；及びドナー３５）由来のＴ細胞にＣａｏｖ３細胞を死滅させるよう導かなかったことも示す。
【図３】本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質が、５つのドナー（ドナー０２；ドナー８６；ドナー４１；ドナー８１；及びドナー３５）由来のＴ細胞にＯＶＣＡＲ３細胞を死滅させるよう導くことを示す。この図はまた、対照三重特異性タンパク質（ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ）が、５つのドナー（ドナー０２；ドナー８６；ドナー４１；ドナー８１；及びドナー３５）由来のＴ細胞にＯＶＣＡＲ３細胞を死滅させるよう導かなかったことも示す。
【図４】本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質が、健康なドナー由来のＴ細胞にＭＳＬＮを発現する細胞（ＯＶＣＡＲ３細胞；Ｃａｏｖ４細胞；ＯＶＣＡＲ３細胞；及びＯＶＣＡＲ８細胞）を死滅させるよう導くことができたことを示す。この図は、本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質が、健康なドナー由来のＴ細胞にＭＳＬＮを発現しない細胞（ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞；及びＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞）を死滅させるよう導くことができなかったことを示す。
【図５】本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質が、カニクイザル由来のＴ細胞にヒト卵巣がん細胞（ＯＶＣＡＲ３細胞；Ｃａｏｖ３細胞）を死滅させるよう導くことができたことを示す。この図はまた、対照三重特異性タンパク質（ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ）が、カニクイザル由来のＴ細胞にヒト卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ３細胞；Ｃａｏｖ３細胞）を死滅させるよう導くことができなかったことを示す。
【図６】本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下又は不在下で、Ｔ細胞によってＮＣＩ−Ｈ２０５２中皮腫細胞を発現するＭＳＬＮの死滅を導くことができたことを示す。
【図７】本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質が、ＭＳＬＮ発現Ｃａｏｖ４細胞の存在下で、Ｔ細胞からのＴＮＦ−αの分泌によって実証されるように、４つの健康なドナー（ドナー２；ドナー８６；ドナー３５；及びドナー８１）由来のＴ細胞を活性化することができたことを示す。
【図８】本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質が、ＭＳＬＮ発現ＯＶＣＡＲ８細胞の存在下で、Ｔ細胞上でのＣＤ６９発現の活性化によって実証されるように、４つの健康なドナー（ドナー２；ドナー８６；ドナー３５；及びドナー８１）由来のＴ細胞を活性化することができたことを示す。
【図９Ａ】ＭＳＬＮ発現細胞株又は非ＭＳＬＮ発現細胞株への、本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質の結合を例示する。図９Ａは、本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質に結合したＭＳＬＮ発現細胞（Ｃａｏｖ３細胞−左上パネル；Ｃａｏｖ４細胞−右上パネル；ＯＶＣＡＲ３細胞−左下パネル；ＯＶＣＡＲ８細胞−右下パネル）との結合を示す；図９Ａは更に、対照の三重特異性タンパク質（ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ）の同じ細胞株への結合の欠如を示す。
【図９Ｂ】ＭＳＬＮ発現細胞株又は非ＭＳＬＮ発現細胞株への、本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質の結合を例示する。図９Ｂは、非ＭＳＬＮ発現細胞株（ＭＤＣＡ２ｂ細胞−左パネル；ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞−右パネル）への、本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質及びＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣの両方の結合の欠如を示す。
【図１０】４つの健康なドナー（ドナー２−左上パネル；ドナー３５−右上パネル；ドナー４１−左下パネル；ドナー８１−右下パネル）由来のＴ細胞への、本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質の結合を例示する。
【図１１】本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質が、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を発現するＭＳＬＮを埋め込まれたＮＣＧマウスにおける腫瘍増殖を阻害することができたことを示す。
【図１２】本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質の薬物動態プロファイルを例示する。２匹のカニクイザルへの注射後の様々な時点での、本開示の典型的なＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む三重特異性ＭＳＬＮ標的抗原結合タンパク質の血中濃度は、プロットにおいて示される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され且つ記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、及び置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びその同等物の範囲内の方法及び構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【００１６】
特定の定義
本明細書で使用される用語は、特定の事例のみを記載することを目的としており、本発明を制限することを意図していない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が他に明白に示していない限り、同様に複数形を含むように意図される。更に、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含んだ（ｗｉｔｈ）」、又はそれらの変異形が発明を実施するための形態及び／又は請求項の何れかで使用される程度には、上記のような用語は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の洋式で包括的であることが意図されている。
【００１７】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは部分的には、その値がどのように測定又は決定されるかに、例えば、測定システムの制限に依存する。例えば、「約」とは、任意の値での実施ごとに１又は１を超える標準偏差を意味し得る。特定の値が本出願と請求項に記載されている場合、特段の定めのない限り、「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味するものであると仮定されなければならない。
【００１８】
用語「個体」、「患者」、又は「被験体」は交換可能に使用される。いかなる用語も、医療従事者（例えば、医者、正看護師、臨床看護師、医師助手、看護助手、又はホスピス職員）の監督（例えば、常時又は断続的）を特徴とする状況を必要とせず、且つ、このような状況に限定されない。
【００１９】
用語「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基（又は領域）は、本明細書に定義されるようなＣＤＲ又は超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基を指す。「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択の際に最も一般に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体中の配列で大きく異なり、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合と特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは各々、β−シート構造を接続する、場合によってはβ−シート構造の一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより接続されたβ−シート構造を主に採用している４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて接近して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基の番号付け」又は「Ｋａｂａｔにおけるようなアミノ酸位置の番号付け」、及びその変形は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対して使用される番号付け方式を参照する。この番号付け方式を使用して、実際の線形のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮、或いは可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲへの挿入に対応する、より少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔに係る残基５２ａ）、及び、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに係る残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔの番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔの番号付けされた配列を備えた抗体の配列の相同領域における整列によって、任意の抗体に対して決定され得る。本開示のＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けの慣習に必ず対応するということを意図するものではない。
【００２１】
本明細書で使用されるように、配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、配列を整列させ、ギャップを導入して、必要に応じて最大のパーセント配列同一性を達成した後に、且つ、配列同一性の一部としていかなる保存的置換を考慮せずに、特定の配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として特定される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、当該技術分野内の様々な方法で、例えば、ＥＭＢＯＳＳ  ＭＡＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ  ＷＡＴＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ  ＳＴＲＥＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ  ＮＥＥＤＬＥ、ＥＭＢＯＳＳ  ＬＡＬＩＧＮ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）のソフトウェアなどの公に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成可能である。当業者は、比較されている配列の完全長にわたって最大限の整列を達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、配列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「消失半減期」は、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２１−２５（Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｌｏｕｉｓ  Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ，ａｎｄ  Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．，６ｔｈ  ｅｄ．１９８０）に記載されるように、通常の意味で使用される。簡潔に言えば、この用語は、薬物排泄の時間的経過の定量的測度を包含することを目的としている。薬物濃度が消失プロセスの飽和に必要とされる濃度には通常接近しないので、大半の医薬品の消失は指数関数的である（即ち、一次速度論に従う）。指数関数的なプロセスの速度は、１単位時間当たりの僅かな変化を表すその速度定数ｋによって、或いは、そのプロセスの５０％の完了のために必要とされる時間であるその半減時間ｔ１／２によって、表され得る。これらの２つの定数の単位はそれぞれｔｉｍｅ−１とｔｉｍｅである。反応の一次速度定数と半減時間は、単純に関連づけられ（ｋ×ｔ１／２＝０．６９３）、これに応じて交換されることがある。一次消失動力学は一定の比率の薬物が単位時間ごとに失われるように指示するため、薬物濃度対時間の対数のプロットは、初回の分布相の後（即ち、薬物の吸収と分布が完了した後）は常に線形である。薬物排泄のための半減時間は、こうしたグラフから正確に決定することができる。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「結合親和性」は、それらの結合標的に対する本開示に記載されたタンパク質の親和性を指し、「Ｋｄ」値を数的に使用して表される。２つ以上のタンパク質が、それらの結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、その結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。２つ以上のタンパク質が単一の結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、上記の単一結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。タンパク質が同等の結合親和性で２つ以上の標的に結合すると示されている場合、２つ以上の標的に対する上記タンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。一般に、高いＫｄ値は弱い結合に相当する。幾つかの実施形態において、「Ｋｄ」は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）を使用する、放射標識された抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）又は表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。特定の実施形態において、「オン率（ｏｎ−ｒａｔｅ）」又は「会合速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ又はａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）」、或いは「ｋｏｎ」、及び「オフ率」、又は「解離速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ又はｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）」、或いは「ｋｏｆｆ」も、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）を使用する表面プラズモン共鳴技術により決定される。追加の実施形態において、「Ｋｄ」、「ｋｏｎ」、及び「ｋｏｆｆ」は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定される。ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓを使用して結合親和性を測定する典型的な方法において、リガンド、例えばビオチン化されたヒト又はカニクイザルのＭＳＬＮは、ＯＣＴＥＴ（登録商標）ストレプトアビジン・キャピラリーセンサーの先端面上に固定され、その後、ストレプトアビジン先端は、約２０−５０μｇ／ｍｌのヒト又はカニクイザルのＭＳＬＮタンパク質を使用して製造者の指示に従い活性化される。ＰＢＳ／カゼインの溶液も遮断薬として導入される。会合反応速度測定に関して、ＭＳＬＮ結合タンパク質変異体は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約２ｎｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬに及ぶ濃度で導入される。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合単一ドメインタンパク質は、約２ｎｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬに及ぶ濃縮で使用される。完全な解離は、陰性対照、即ち、結合タンパク質のないアッセイ緩衝液の場合に観察される。その後、結合反応の動力学的パラメータは、適切なツール、例えばＦｏｒｔｅＢｉｏソフトウェアを使用して判定される。
【００２４】
本明細書には、ＭＳＬＮ結合タンパク質、医薬組成物の他、そのようなＭＳＬＮ結合タンパク質を作成するための核酸、組み換え発現ベクター、及び宿主細胞が記載される。また、疾患、疾病、及び障害の予防及び／又は処置において、開示されたＭＳＬＮ結合タンパク質を使用する方法も提供される。ＭＳＬＮ結合タンパク質はＭＳＬＮに特異的に結合することができる。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＣＤ３結合ドメイン及びアルブミン結合ドメインなどの追加のドメインを含む。メソテリン（ＭＳＬＮ）、及び腫瘍疾患におけるその役割
【００２５】
本明細書にはメソテリン結合タンパク質が企図される。メソテリンは、腹膜腔、胸膜腔、及び心膜腔の中皮内膜の細胞の表面に存在する糖タンパク質である。メソテリン遺伝子（ＭＳＬＮ）は、メソテリンと称される４０キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質へと処理される７１ｋＤａの前駆体タンパク質をコードするものであり、細胞表面に存在するグリコシル−ホスファチジルイノシトール−アンカー糖タンパク質である（Ｃｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （１９９６）  ９３：１３６−４０）。メソテリンｃＤＮＡは、ＨＰＣ−Ｙ５細胞株から調製されたライブラリからクローン化された（Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：２１９８４−２１９９０）。ｃＤＮＡはまた、中皮腫を認識するモノクローナル抗体Ｋ１を使用してクローン化された（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１３６−４０）。メソテリンは、正常ヒト組織におけるその発現が、胸膜、心膜、及び腹膜などの体腔に内在する中皮細胞内膜に限定される、分化抗原である。メソテリンはまた、中皮腫、膵臓腺癌、卵巣癌、胃癌、及び肺腺癌を含む、様々な異なるヒトの癌において大いに発現される（Ｈａｓｓａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  （２００８）  ４４：４６−５３）  （Ｏｒｄｏｎｅｚ，  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  （２００３）  ２７：１４１８−２８；  Ｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  （２００７）  １３：１５７１−５）。メソテリンは、良性膵臓組織に見られる稀であり且つ弱い発現を伴う、原発性膵臓腺癌の大部分において過剰発現される。Ａｒｇａｎｉ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００１；  ７（１２）：３８６２−３８６８。上皮悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）は普遍的にメソテリンを発現する一方、肉腫ＭＰＭは恐らくメソテリンを発現しない。最も希薄な上皮卵巣細胞腫、及び関連する原発性腹膜の細胞腫は、メソテリンを発現する。
【００２６】
メソテリンはまた、未変性の膜結合変形と比較して、タンパク質の可溶性形態として腫瘍細胞から脱落する（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  （２００６）  １５：１０１４−２０；  Ｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  （２００６）  １５：１７５１）。構造的に、メソテリンは、６０ｋＤａの前駆体ポリペプチドとして細胞表面に発現され、これは、３１ｋＤａの脱落構成要素（ＭＰＦに相当）及び４０ｋＤａの膜結合構成要素へとタンパク質分解的に処理される（Ｈａｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｒｅｓ．  １０：３９３７−３９４２）。メソテリンは、ＣＡ１２５（ＭＵＣ−１６としても知られる）、即ち、以前に卵巣癌抗原として特定された腫瘍細胞の表面に存在するムチン様の糖タンパク質と相互に作用すると示されている。更に、膜結合メソテリンへのＣＡ１２５の結合は異型の細胞接着を媒介し、ＣＡ１２５及びメソテリンは、進行型の卵巣腺癌において共発現される（Ｒｕｍｐ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：９１９０−９１９８）。腹膜の内膜におけるメソテリンの発現は、卵巣癌の転移形成の好ましい部位に相関し、メソテリン−ＣＡ１２５結合は、卵巣腫瘍の腹膜播種性転移を促進すると考えられている（Ｇｕｂｂｅｌｓ，  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ．  ５：５０）。
【００２７】
メソテリンは卵巣癌における自然な免疫応答の標的であり、癌免疫療法の標的であると提唱されている。Ｂｒａｃｃｉ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７；  １３（２  Ｐｔ  １）：６４４−６５３；  Ｍｏｓｃｈｅｌｌａ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１１；  ７１（１０）：３５２８−３５３９；  Ｇｒｏｓｓ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９９２；  ６（１５）：３３７０−３３７８；  Ｓａｄｅｌａｉｎ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００３；  ３（１）：３５−４５；  Ｍｕｕｌ  Ｌ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００３；  １０１（７）：２５６３−２５６９；  Ｙｅｅ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２００２；  ９９（２５）：１６１６８−１６１７３。膵臓癌の患者におけるメソテリンに特異的なＣＴＬの存在は、全生存期間に相関する。Ｔｈｏｍａｓ  Ａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２００４；  ２００：２９７−３０６。加えて、Ｐａｓｔａｎ及びその同僚は、メソテリンプラス陽性腫瘍を抱える癌患者を処置するための免疫毒素に抱合される抗メソテリン抗体の可溶性抗体フラグメントを使用した。この手法は、膵臓癌における適切な安全性及びある程度の臨床的活性を実証した。Ｈａｓｓａｎ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００７；  ７：２０  ａｎｄ  Ｈａｓｓａｎ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７；  １３（１７）：５１４４−５１４９。卵巣癌において、この治療方針は、ＲＥＣＩＳＴ基準、及び、腹水症が完全に解消した第２の患者の安定した疾患により、１つの軽微な反応をもたらした。
【００２８】
メソテリンはまた、微量のメソテリンがメソテリン陽性癌を抱える一部の患者の血液に検出され得るので、特定の型の癌の診断及び予測のためのマーカーとして使用され得る（Ｃｒｉｓｔａｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：５０７６−５０８１，  ２００７）。メソテリンは、そのカルボキシル末端での欠失を介して、又はその膜結合形態からのタンパク質分解開裂によって、血清へと放出され得る（Ｈａｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １０：３９３７−３９４２，  ２００４）。アスベストにさらされた労働者の間に悪性中皮腫が現われる数年前に、メソテリンの可溶性形態の増加が検出可能であった（Ｃｒｅａｎｅｙ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．  １９：１０２５−１０４０，  ２００５）。更に、卵巣癌、膵臓癌、及び肺癌を抱える患者はまた、血清中の可溶性メソテリンを上昇させている（Ｃｒｉｓｔａｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：５０７６−５０８１，  ２００７；  Ｈａｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １２：４４７−４５３，  ２００６；  Ｃｒｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ．  Ｐｒｅｖ．  ３０：１８０−１８７，  ２００６）。従って、メソテリンは、疾患予防又は処置の方法に対する適切な標的であり、メソテリンに特異的な有効な抗体が必要とされている。
【００２９】
細胞表面の成熟メソテリンが３つの別個のドメイン、即ち、領域Ｉ（残基２９６−３９０を含む）、ＩＩ（残基３９１−４８６を含む）、及びＩＩＩ（残基４８７−５９８を含む）を備えることが示されている。（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  ｃｌｏｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ，  Ｍｏｌ．  Ｃａｎ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １２（４）：  ４１６−４２６，  ２０１３）。
【００３０】
治療的介入のためのメソテリンに対して生成された一次抗体は、メソテリンとＣＡ−１２５との相互作用に干渉するように設計された。ファージディスプレイは、ＦｖＳＳを識別し、これは、親和性を最適化され、且つ、メソテリンを標的とする組み換え免疫毒素、ＳＳ１Ｐを生成するために使用された。ＭＯＲＡｂ−００９抗体アマツキシマブは、ＳＳ１も使用し、領域Ｉ内でメソテリンのアミノ末端基６４アミノ酸における非線形エピトープを認識する。ＳＳ１  Ｆｖも、キメラ抗原受容体で操作されたＴ細胞を生成するために使用された。近年、新たなメソテリンタンパク質は、メソテリンタンパク質の他の領域を認識すると報告されている。
【００３１】
卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、肺癌、胃癌、及び三種陰性乳癌などの、メソテリンの過剰発現に関連する固形腫瘍疾患の処置に対して利用可能な更なるオプションを備える必要性が依然として存在する。本開示は、特定の実施形態において、腫瘍標的細胞の表面上でＭＳＬＮに特異的に結合する単一ドメインタンパク質を提供する。
ＭＳＬＮ結合タンパク質
【００３２】
本明細書には、特定の実施形態において、ＭＳＬＮタンパク質においてエピトープに結合する、抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体又は抗体変異体などの結合タンパク質が提供される。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７の配列を含むタンパク質に結合する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７と比較して短縮した配列を含むタンパク質に結合する。
【００３３】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＭＳＬＮ結合タンパク質は完全長のメソテリンを認識する。特定の実施形態にて、本明細書に開示されるＭＳＬＮ結合タンパク質は、メソテリンの領域Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基２９６−３９０を含む）、領域ＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基３９１−４８６を含む）、又は領域ＩＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のアミノ酸残基４８７−５９８を含む）におけるエピトープを認識する。本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、メソテリンの領域Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの外に位置するエピトープを認識し、且つそれに結合し得ることが企図される。また他の実施形態において、ＭＯＲＡｂ−００９抗体と異なるエピトープを認識し且つそれに結合する、ＭＳＬＮ結合タンパク質が開示される。
【００３４】
幾つかの実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質は、追加の免疫グロブリンドメインを含む多重ドメインタンパク質内で発現される。そのような多重ドメインタンパク質は、免疫毒素に基づく腫瘍成長の阻害、及び抗体依存細胞性細胞毒素（ＡＤＣＣ）の誘導を介して作用することができる。幾つかの実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質を含む多重ドメインタンパク質は、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）活性を示す。幾つかの実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質を含む多重ドメインタンパク質は、メソテリンを発現する癌細胞に対して、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの活性の両方を示す。
【００３５】
更に、幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質を含む多重ドメインタンパク質がＣＤＣを介して作用する場合、ＭＬＳＮ結合タンパク質は、細胞表面に接した、メソテリンタンパク質のＣ末端端部にて立体構造的なエピトープを認識し得る。幾つかの実施形態において、メソテリンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７に明記されるような配列を含み、Ｃ末端端部はアミノ酸残基５３９−５８８を含む。
【００３６】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は抗ＭＳＬＮ抗体又は抗体変異体である。本明細書で使用されるように、用語「抗体変異体」は、本明細書に記載される抗体の変異体及び誘導体を指す。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ＭＳＬＮの抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ＭＳＬＮ抗体のアミノ酸配列変異体は、結合親和性及び／又は抗体の他の生物学的特性を改善するように企図されている。アミノ酸変異体を調製するための典型的な方法は、限定されないが、抗体をコードするヌクレオチド配列へと、又はペプチド合成により、適切な修飾を導入する工程を含む。そのような修飾は例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、前記残基への挿入、及び／又は前記残基の置換を含む。
【００３７】
欠失、挿入、及び置換のあらゆる組み合わせは、最終の構築物に到達するために行うことができるが、最終の構築物が所望の特徴、例えば抗原結合を持つことを前提とする。特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を持つ抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発に対する目的の部位はＣＤＲ及びフレームワーク領域を含む。そのような置換の例が後述される。アミノ酸置換は目的の抗体へと導入することができ、生成物は、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合の減少、免疫原性の減少、又は抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）或いは補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）の改善をスクリーニングした。保存的且つ非保存的なアミノ酸置換が、抗体変異体の調製に企図される。
【００３８】
変異体抗ＭＳＬＮ抗体を作成するための置換の別の例において、親抗体の１つ以上の超可変領域残基が置換される。一般的に、変異体はその後、親抗体に比べて望ましい特性、例えば、親和性の増加、親和性の減少、免疫原性の減少、結合のｐＨ依存性の増加に基づいて選択される。例えば、親和性の成熟した変異体抗体は、例えば、本明細書に記載され且つ当該技術分野で既知のものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して、生成され得る。
【００３９】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、メソテリンに特異的なラマ由来のｓｄＡｂ、ペプチド、リガンド、又は小分子実体の可変ドメイン（ＶＨＨ）などの、単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質のメソテリン結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む、メソテリンに結合する任意のドメインである。特定の実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は単一ドメイン抗体である。他の実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質はペプチドである。更なる実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は小分子である。
【００４０】
一般的に、単一ドメインという用語は、その最も広い意味で本明細書に使用されるように、特異的な生物学的ソース又は特異的な調製法には限定されないことを、留意されたい。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例として、限定されないが、重鎖抗体、軽鎖が自然にない抗体、従来の４鎖状抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、及び抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャホールドが挙げられる。単一ドメイン抗体は、当該技術分野の何れか、或いは、将来の単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含む任意の種に由来し得る。例えば、幾つかの実施形態において、本開示の単一ドメイン抗体は：（１）自然発生の重鎖抗体のＶＨＨドメインの単離によって；（２）自然発生のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現によって；（３）自然発生のＶＨＨドメインの「ヒト化」、又はそのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現によって；（４）任意の動物種、具体的には人間などの一種の哺乳動物由来の自然発生のＶＨドメインの「ラクダ化」、又はそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現によって；（５）「ドメイン抗体」又は「Ｄａｂ」の「ラクダ化」、又はそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現によって；（６）タンパク質、ポリペプチド、又は他のアミノ酸配列の調製のための合成又は半合成の技術を使用することによって；（７）当該技術分野で既知の核酸合成のための技術を使用して単一ドメイン抗体をコードスル核酸の調製、その後に得られた核酸の発現によって；及び／又は（８）前述のものの１つ以上の任意の組み合わせによって、得られる。
【００４１】
一実施形態において、単一ドメイン抗体は、ＭＳＬＮに対して配向された自然発生の重鎖抗体のＶＨＨドメインに相当する。本明細書で更に記載されるように、そのようなＶＨＨ配列は通常、ＭＳＬＮにより一種のラマを適切に免疫化することによって（即ち、ＭＳＬＮに対して配向された免疫応答及び／又は重鎖抗体を上昇させるように）、前記ラマの適切な生体サンプル（血液サンプル、血清サンプル、又はＢ細胞のサンプルなど）を得ることによって、及び、当該技術分野で既知の適切な技術を使用して、前記サンプルから出発して、ＭＳＬＮに対して配向されたＶＨＨ配列を生成することによって、生成又は入手され得る。
【００４２】
別の実施形態において、ＭＳＬＮに対するそのような自然発生のＶＨＨドメインは、例えば、当該技術分野で既知の１つ以上のスクリーニング技術を使用して、ＭＳＬＮ、又はその少なくとも一部、フラグメント、抗原決定基、又はエピトープを用いてライブラリをスクリーニングすることによって、ラクダ科ＶＨＨ配列のナイーブライブラリから得られる。そのようなライブラリ及び技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ３／０２５０２０、及びＷＯ０３／０３５６９４に記載されている。代替的に、例えばＷＯ００／４３５０７に記載されるように、無作為の突然変異誘発及び／又はＣＤＲシャフリングなどの技術によってナイーブＶＨＨライブラリから得られるＶＨＨライブラリなどの、ナイーブＶＨＨライブラリ由来の、改善された合成又は半合成ライブラリが使用される。
【００４３】
更なる実施形態において、ＭＳＬＮに対して配向されたＶＨＨを得るための更に別の技術は、重鎖抗体を発現可能なトランスジェニック哺乳動物を適切に免疫化する工程（即ち、ＭＳＬＮに対して配向された免疫応答及び／又は重鎖抗体を上昇させるように）、前記トランスジェニック哺乳動物の適切な生体サンプル（血液サンプル、血清サンプル、又はＢ細胞のサンプルなど）を得る工程、及び、その後に、当該技術分野で既知の適切な技術を使用して、前記サンプルから出発して、ＭＳＬＮに対して配向されたＶＨＨ配列を生成する工程を含む。例えば、この目的のために、重鎖抗体を発現するラット又はマウス、並びに、ＷＯ０２／０８５９４５及びＷＯ０４／０４９７９４に記載される方法及び技術が、使用され得る。
【００４４】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるような抗ＭＳＬＮ抗体は、アミノ酸配列を含む単一ドメイン抗体を含んでおり、前記アミノ酸配列は、自然発生のＶＨＨドメインのアミノ酸配列に相当するが、（例えば上述のような）人間由来の従来の４鎖抗体のＶＨドメインにおける対応する位置に生じるアミノ酸残基の１つ以上により前記自然発生のＶＨＨ配列のアミノ酸配列（及び具体的にはフレームワーク配列）における１つ以上のアミノ酸残基を置き換えることによって、「ヒト化」されている。これは、当業者に明白である当該技術分野で既知の様式で、例えば本明細書の更なる記載に基づいて、実行可能である。再度、そのような本開示のヒト化抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体は、それ自体で既知の任意の適切な様式で（即ち、上記の点（１）−（８）の下で示されるように）得られ、故に、出発物質として自然発生のＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドではあるが厳密にはそれに限定されないことを、留意されたい。幾つかの追加の実施形態において、本明細書に記載されるような単一ドメインＭＳＬＮ抗体は、アミノ酸配列を含む単一ドメイン抗体を含んでおり、前記アミノ酸配列は、自然発生のＶＨドメインのアミノ酸配列に相当するが、重鎖抗体のＶＨＨドメインの対応する位置に生じるアミノ酸残基の１つ以上により従来の４鎖抗体の自然発生のＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸残基を置き換えることによって、「ラクダ化」されている。そのような「ラクダ化」置換は好ましくは、ＶＨ−ＶＬ界面、及び／又はいわゆるラクダ科ホールマーク残基を形成する、及び／又はそれらに存在する、アミノ酸位置に挿入される（例えば、ＷＯ９４／０４６７８及びＤａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  （１９９４  ａｎｄ  １９９６）を参照）。好ましくは、ラクダ化単一ドメインを生成又は設計するための出発物質又は出発点として使用されるＶＨ配列は好ましくは、哺乳動物のＶＨ配列、より好ましくはＶＨ３配列などの人間のＶＨ配列である。しかし、そのような本開示のラクダ化抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体は、特定の実施形態において、当該技術分野で既知の任意の適切な様式で（即ち、上記の点（１）−（８）の下で示されるように）得られ、故に、出発物質として自然発生のＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドではあるが厳密にはそれに限定されないことを、留意されたい。例えば、本明細書で更に記載されるように、「ヒト化」及び「ラクダ化」は共に、自然発生のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインをそれぞれコードするヌクレオチド配列を提供することにより、及びその後に、新たなヌクレオチド配列が「ヒト化」又は「ラクダ化」単一ドメイン抗体をそれぞれコードするような方法で前記ヌクレオチド配列における１つ以上のコドンを変化させることによって、実行されるその後、この核酸は、本開示の望ましい抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体を提供するように発現され得る。代替的に、他の実施形態において、自然発生のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインそれぞれのアミノ酸配列に基づいて、本開示の望ましいヒト化又はラクダ化抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体それぞれのアミノ酸配列が設計され、��の後に既知のペプチド合成技術を使用して新規に合成される。幾つかの実施形態において、自然発生のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインそれぞれのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に基づいて、本開示の望ましいヒト化又はラクダ化抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体それぞれをコードするヌクレオチド配列が設計され、その後に既知の核酸合成技術を使用して新規に合成され、その後、これにより得られた核酸を、既知の発現技術を使用して発現させて、本開示の望ましい抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体を提供する。
【００４５】
自然発生のＶＨ配列又はＶＨＨ配列から出発する、本開示の抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体及び／又はそれをコードする核酸を得るための、他の適切な方法及び技術は、例えば、本開示の抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体或いはそれをコードするヌクレオチド配列又は核酸を提供するために、適切な様式で、１つ以上の自然発生のＶＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のフレームワーク（ＦＲ）配列及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）配列など）、１つ以上の自然発生のＶＨＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のＦＲ配列又はＣＤＲ配列など）、及び／又は１つ以上の合成又は半合成の配列を組み合わせる工程を含む。
【００４６】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質はかなり小さく、２５ｋＤ未満、２０ｋＤ未満、１５ｋＤ未満、又は１０ｋＤ未満であることが企図される。特定の例において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、ペプチド又は小分子実体である場合に５ｋＤ以下である。
【００４７】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、重鎖可変相補性決定領域ＣＤＲ１、重鎖可変ＣＤＲ２、重鎖可変ＣＤＲ３、軽鎖可変ＣＤＲ１、軽鎖可変ＣＤＲ２、及び軽鎖可変ＣＤＲ３を含む抗ＭＳＬＮ特異抗体である。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＭＳＬＮに結合するドメインを含み、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又は抗原結合フラグメント、例えば単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、及びＦｖフラグメント、１つ以上のＣＤＲで構成されたフラグメント、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント、ヘテロ共役抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｐＦｖフラグメント、重鎖単量体又は二量体、軽鎖単量体又は二量体、並びに１つの重鎖と１つの軽鎖から成る二量体からのドメインが挙げられる。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体は、重鎖可変相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
【００４８】
幾つかの実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質は、式：ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４によって表わされるような、３つの相補性決定領域／配列によって遮られた４つのフレームワーク領域／配列（ｆ１−ｆ４）で構成されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、式中、ｒ１、ｒ２、及びｒ３はそれぞれ相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３であり、ｆ１、ｆ２、ｆ３、及びｆ４はフレームワーク残基である。本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質のフレームワーク残基は、例えば、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９の、９０、９１、９２、９３、又は９４のアミノ酸残基を含み、相補性決定領域は、例えば２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６のアミノ酸残基を含む。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４０から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１に明記されるようなアミノ酸配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２に明記されるような配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に明記されるような配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【００５０】
幾つかの実施形態において、ＣＤＲ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４に明記されるようなアミノ酸配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に明記されるような配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に明記されるような配列、或いは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６における１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【００５１】
本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質は、特定の例において、１つ以上の保存領域を含む。保存領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１−５０に明記されるような配列、又は前記配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む変異体を含む。典型的な実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１−４４から選択される１つ以上の保存領域を含むＭＳＬＮ結合タンパク質、又は前記配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む変異体を含む。場合によっては、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に相当するアミノ酸の伸張部、及び（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に相当するアミノ酸の伸張部を含む。
【００５２】
更に典型的な実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５−５０から選択される１つ以上の保存領域を含むＭＳＬＮ結合タンパク質、又は前記配列に対して１つ以上のアミノ酸残基置換を含む変異体を含む。場合によっては、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に相当するアミノ酸の伸張部、（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に相当するアミノ酸の伸張部、（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９に相当するアミノ酸の伸張部、及び（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に相当するアミノ酸の伸張部を含む。
【００５３】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−２９、５８、及び６０−６２から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００５４】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０−４０、５８、及び６０−６２から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００５５】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質の相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４に明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００５６】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質の相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００５７】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質の相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００５８】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３−１０１の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００５９】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２−１４０の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００６０】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１−１７９の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００６１】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質のフレームワーク領域１（ｆ１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０−２１８の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００６２】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質のフレームワーク領域１（ｆ１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９−２５７の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００６３】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質のフレームワーク領域２（ｆ２）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５８−２９６の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００６４】
様々な実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質のフレームワーク領域３（ｆ３）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７−３３５の何れか１つに明記されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である。
【００６５】
幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパ��質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の配列を含む単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の配列を含む単一ドメイン抗体である。
【００６６】
幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。幾つかの実施形態において、上記実施形態の何れか１つに係るＭＳＬＮ結合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２の配列を含むヒト化単一ドメイン抗体である。
【００６７】
幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、ヒト及びカニクイザルのメソテリンと交差反応する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質はヒトメソテリンに特異的である。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＭＳＬＮ結合タンパク質は、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトメソテリンに結合する。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＭＳＬＮ結合タンパク質は、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルメソテリンに結合する。特定の実施形態において、本明細書に開示されるＭＳＬＮ結合タンパク質は、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）及びヒトＫｄ（ｈＫｄ）をそれぞれ有する、カニクイザルメソテリン及びヒトメソテリンの両方に結合する。幾つかの実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、比較可能な結合親和性（即ち、ｈＫｄ及びｃＫｄの値は、±１０％よりも多く相違しない）によりヒト及びカニクイザルのメソテリンに結合する。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約４５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約４００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約３５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約３００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約２５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約２００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約１５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．１ｎＭ〜約９０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．２ｎＭ〜約８０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．３ｎＭ〜約７０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．４ｎＭ〜約５０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．５ｎＭ〜約３０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．６ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．７ｎＭ〜約８ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．８ｎＭ〜約６ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約０．９ｎＭ〜約４ｎＭの範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ｈＫｄ及びｃＫｄは、約１ｎＭ〜約２ｎＭの範囲に及ぶ。
【００６８】
幾つかの実施形態において、前述のＭＳＬＮ結合タンパク質の何れか（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−４０及び５８の抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体）は、精製の容易さのためにタグ付けされる親和性ペプチドである。幾つかの実施形態において、親和性ペプチドタグは、６Ｘ−ｈｉｓとも称される、６つの連続するヒスチジン残基である。
【００６９】
特定の実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質は、三重特異性タンパク質を標的とするＭＳＬＮへと組み込まれ得る。幾つかの例において、三重特異性結合タンパク質は、本開示に係るＣＤ３結合ドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、及び抗ＭＳＬＮの結合ドメインを含む。幾つかの例において、三重特異性結合タンパク質は、以下の配向：ＭＳＬＮ−ＨＳＡ−ＣＤ３で上述のドメインを含む。
【００７０】
特定の実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質は、可溶性メソテリン上で膜結合メソテリンに優先的に結合する。膜結合メソテリンは、メソテリンを発現する細胞の細胞膜表面における、又はその表面上のメソテリンの存在を指す。可溶性メソテリンは、メソテリンを発現する又は発現した細胞の細胞膜表面中に、又はその上にもはや存在しないメソテリンを指す。特定の例において、可溶性メソテリンは被験体における血液及び／又はリンパ循環に存在する。一実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、可溶性メソテリンよりも少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍大きい膜結合メソテリンに結合する。一実施形態において、本開示の抗原結合タンパク質は、可溶性メソテリンより３０倍大きい膜結合メソテリンに優先的に結合する。可溶性ＭＳＬＮ上での抗原結合タンパク質の膜結合ＭＳＬＮへの優先的な結合の判定は、当該技術分野で周知のアッセイを使用して容易に行われ得る。
【００７１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）への組み込み
本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質、例えば抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体は、特定の例において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）へと組み込むことができる。操作された免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、本明細書に記載されるような抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体を含むＣＡＲを発現するために使用され得る。一実施形態において、本明細書に記載されるような抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体を含むＣＡＲは、ヒンジ領域を介して膜貫通ドメインに、及び更には共刺激ドメイン、例えばＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、又は４−１ＢＢから得られる機能的シグナル伝達ドメインに接続される。幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ３ゼータなどの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を更に含む。
【００７２】
腫瘍成長減少特性
特定の実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質は、メソテリンを発現する腫瘍細胞を有する被験体に投与すると、インビボで腫瘍細胞の成長を減少する。腫瘍細胞の成長の減少の測定は、当該技術分野で周知の複数の異なる方法によって判定され得る。非限定的な実施例は、腫瘍寸法の直接測定、切除した腫瘤の測定及び対照被験体との比較、解析の向上のために同位体又は発光分子（例えばルシフェラーゼ）を使用する又は使用しない画像処理技術（例えばＣＴ又はＭＲＩ）を介した測定などを含む。特異的な実施形態において、本開示の抗原結合剤の投与は結果として、対照の抗原結合剤と比較して、腫瘍成長の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の腫瘍細胞のインビボ成長の減少をもたらし、腫瘍の完全寛解及び消失を示す。更なる実施形態において、本開示の抗原結合剤の投与は結果として、対照の抗原結合剤と比較して、約５０−１００％、約７５−１００％、又は約９０％−１００％の腫瘍細胞のインビボ成長の減少をもたらす。更なる実施形態において、本開示の抗原結合剤の投与は結果として、対照の抗原結合剤と比較して、約５０−６０％、約７０−８０％、約８０−９０％、又は約９０％−１００％の腫瘍細胞のインビボ成長の減少をもたらす。
【００７３】
ＭＳＬＮ結合タンパク質修飾
本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質は、（ｉ）アミノ酸が遺伝子コードによってコードされるものではないアミノ酸残基で置換され、（ｉｉ）成熟ポリペプチドがポリエチレングリコールなどの別の化合物と融合され、又は、（ｉｉｉ）追加のアミノ酸が、リーダー配列、分泌配列、或いは免疫原ドメインを遮断するための及び／又はタンパク質の精製のための配列などのタンパク質に融合される、誘導体又はアナログを包含する。
【００７４】
典型的な修飾としては、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性の添加、及びユビキチン化が挙げられる。
【００７５】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシル終端を含む、本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質のあらゆる場所で行われる。ＭＳＬＮ結合タンパク質の修飾に役立つ特定の一般的なペプチド修飾は、グルタミン酸残基のグリコシル化、脂質結合、硫酸化、ガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、共有結合修飾によるポリペプチド中のアミノ基又はカルボキシル基の遮断、或いはその両方、及びＡＤＰリボシル化を含む。
【００７６】
ＭＳＬＮ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態において、ポリヌクレオチド分子はメッセンジャーＲＮＡ転写産物として提供される。
【００７７】
ポリヌクレオチド分子は、適切なプロモーターに動作可能に結合される抗ＭＳＬＮ結合タンパク質をコードする遺伝子及び随意に適切な転写ターミネーターを組み合わせること、及び、細菌又は例えばＣＨＯ細胞などの他の適切な発現系にそれを発現させることなど、既知の方法によって構築される。
【００７８】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、更なる実施形態を表すベクター、好ましくは発現ベクターに挿入される。この組み換えベクターは既知の方法によって構築可能である。特定の対象のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）、及びコスミドを含んでいる。
【００７９】
様々な発現ベクター／宿主系は、記載されたＭＳＬＮ結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、且つそれを発現するために利用されてもよい。Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のための発現ベクターの例は、ｐＳＫＫ（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）  ２８５（１）：１１１−２７）、哺乳動物細胞中の発現用のｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＩＣＨＩＡＰＩＮＫ（商標）酵母発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＡＣＵＶＡＮＣＥ（商標）バキュロウィルス発現系（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）である。
【００８０】
故に、本明細書に記載されるようなＭＳＬＮ結合タンパク質は、幾つかの実施形態において、上記のようなタンパク質をコードするベクターを宿主細胞へ導入し、且つ、タンパク質ドメインが発現し、単離され、随意に更に精製され得る条件下で上記宿主細胞を培養することにより、生成される。
【００８１】
医薬組成物
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質、ＭＳＬＮ結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、或いはこのベクター及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体によって形質転換された宿主細胞を含む、医薬組成物も提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」としては、限定されないが、成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、且つ、投与される患者にとって毒性ではない任意の担体が挙げられる。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などを含む。こうした担体は、従来の方法によって製剤することができ、適切な投与量で被験体に投与可能である。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物は、防腐剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを更に含み得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤の包含によって確保され得る。更なる実施形態は、凍結乾燥形態で包装される、或いは水性媒体に包装される、抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体又はその抗原結合性フラグメントなどの、上記結合タンパク質の１つ以上を提供する。
【００８２】
医薬組成物の幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質はナノ粒子に封入される。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、デンドリマー、又はナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態において、ＭＳＬＮ結合タンパク質はリポソームに結合する。幾つかの例において、ＭＳＬＮ結合タンパク質はリポソームの表面に抱合される。幾つかの例において、ＭＳＬＮ結合タンパク質は、リポソームのシェル内に封入される。幾つかの例において、リポソームはカチオン性リポソームである。
【００８３】
本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質は、薬物としての使用のために企図されている。投与は、様々な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、又は皮内の投与によって達成される。幾つかの実施形態において、投与経路は、治療の種類と、医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは主治医と他の臨床的要因によって決定される。任意の１人の患者のための用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与時間と投与経路、治療の種類、健康状態、及び同時に投与されている他の薬物を含む多くの因子に依存する。「有効量」は、こうした病状の減少又は緩解をもたらす、疾患の経過と重症度に影響を与えるのに十分な有効成分の量を指し、既知の方法を使用して決定されることもある。
【００８４】
幾つかの実施形態において、本開示のＭＳＬＮ結合剤は、週に１回の頻度で最大１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。場合によっては、用量は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇに及ぶ。幾つかの実施形態において、投与量は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０ｎｇ／ｋｇ、約５ｎｇ／ｋｇ〜約１５ｎｇ／ｋｇ、約１２ｎｇ／ｋｇ〜約２０ｎｇ／ｋｇ、約１８ｎｇ／ｋｇ〜約３０ｎｇ／ｋｇ、約２５ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｎｇ／ｋｇ、約３５ｎｇ／ｋｇ〜約６０ｎｇ／ｋｇ、約４５ｎｇ／ｋｇ〜約７０ｎｇ／ｋｇ、約６５ｎｇ／ｋｇ〜約８５ｎｇ／ｋｇ、約８０ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ、約１２μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ、約３５μｇ／ｋｇ〜約７０μｇ／ｋｇ、約４５μｇ／ｋｇ〜約８０μｇ／ｋｇ、約６５μｇ／ｋｇ〜約９０μｇ／ｋｇ、約８５μｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０９５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。場合によっては、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ；約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約９ｍｇ／ｋｇ、又は約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。投与の頻度は、幾つかの実施形態において、ほぼ毎日（ａｂｏｕｔ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ｄａｉｌｙ）、隔日、１日１回未満、週に２回、毎週、７日に１回、２週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、又は月に１回である。場合によっては、投与の頻度は毎週である。場合によっては、投与の頻度は毎週であり、用量は最大１０ｍｇ／ｋｇである。場合によっては、投与の持続期間は約１日〜約４週間以上である。
【００８５】
処置の方法
本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるようなＭＳＬＮ結合タンパク質の投与を含む、個体の免疫系を刺激するための方法と使用が提供される。幾つかの例において、本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質の投与は、標的抗原を発現する細胞への細胞毒性を引き起こす、及び／又は持続させる。幾つかの例において、細胞は、癌細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、自己反応性のＴ又はＢ細胞、損傷を受けた赤血球、動脈プラーク、或いは繊維症の組織である。
【００８６】
ＭＳＬＮ結合タンパク質、又は本明細書に記載されるＭＳＬＮ結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質を個体に投与する工程を含む、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病の処置のための方法と使用も、本明細書で提供される。標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病としては、限定されないが、ウイルス感染、細菌感染、自己免疫性疾患、移植拒絶反応、アテローム性動脈硬化症、又は線維症が挙げられる。他の実施形態において、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主疾患、又は宿主対移植片疾患である。１つの実施形態において、標的抗原に関連する疾患、障害、又は疾病は癌である。本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質により、及びそれを使用する方法により処置、予防、又は管理され得る癌は、限定されないが、上皮細胞由来の癌を含む。そのような癌の例は、以下を含む：白血病、限定されないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば骨髄芽球、前骨髄球、骨髄単球性、単球、及び赤白血症の白血病、並びに及び骨髄異形成症候群など；慢性白血病、限定されないが、慢性骨髄球（顆粒白血球）白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病など；一次性赤血球増加症；リンパ腫、限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病など；多発性骨髄腫、限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性黒色腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫、及び髄外の形質細胞腫など；ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症；意義不明の単クローン免疫グロブリン症；良性単クローン免疫グロブリン症；重鎖病；骨及び結合組織の肉腫、限定されないが、骨肉腫、骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の繊維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ））、繊維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、、神経鞘腫、横紋筋肉腫、及び滑膜肉腫など；脳腫瘍、限定されないが、神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、非神経膠腫瘍、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽細胞腫、及び原発性脳リンパ腫など；乳癌、限定されないが、乳管癌、腺癌、小葉状（小細胞）癌、分泌管内癌、乳房の髄様癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭癌、パジェット病、及び炎症性乳癌など；副腎癌、限定されないが、褐色細胞腫及び副腎皮質細胞腫など；甲状腺癌、限定されないが、乳頭状又は濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌、及び未分化甲状腺癌など；膵臓癌、限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、及びカルチノイド、又は島細胞腫など；下垂体癌、限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、及び尿崩症；眼癌、限定されないが、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫及び毛様体黒色腫などの眼黒色腫、及び網膜芽細胞腫など；有棘細胞癌、腺癌、及び黒色腫などの膣癌；有棘細胞癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、及びパジェット病などの外陰癌；子宮頚癌、限定されないが、扁平上皮癌及び腺癌；子宮癌、限定されないが、子宮内膜細胞腫及び子宮肉腫など；卵巣癌、限定されないが、卵巣上皮性悪性腫瘍、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、及び間質性腫瘍など；食道癌、限定されないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、及び燕麦細胞（小細胞）癌腫など；胃癌、限定されないが、腺癌、肉芽腫性軟性（ポリープ状）、潰瘍化型、表層進展性、拡散進展性（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、及び癌肉腫など；結腸癌；直腸癌；肝臓癌、限定されないが、肝細胞癌及び肝芽腫；腺癌などの胆嚢癌；胆管癌、限定されないが、乳頭状、結節状、及びびまん性など；肺癌、限定されないが、非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌、及び小細胞肺癌など；精巣癌、限定されないが、胚腫瘍、精上皮腫、退生、古典的（典型的）、精母細胞、非セミノーマ、胎児性癌、奇形腫癌腫、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、限定されないが前立腺上皮内腫瘍、腺癌、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫などの前立腺癌など；腎癌（ｐｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）；限定されないが扁平上皮細胞腫などの口腔癌；基底膜癌；唾液腺癌、限定されないが、腺癌、粘液性類表皮癌、及び腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｉｄｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）など；咽頭癌、限定されないが、扁平上皮癌及び疣贅性など；皮膚癌、限定されないが、基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、ほくろ悪性黒色腫、末端黒子型黒色腫など；腎臓癌、限定されないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、繊維肉腫、移行性細胞癌（腎盂及び／又は尿管）など；ウィルムス腫瘍；膀胱癌、限定されないが、移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫。加えて、癌は、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ脈管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮性悪性腫瘍、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、及び乳頭状腺癌を含む（このような障害に関しては、Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２ｄ  Ｅｄ．，  Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｉｎｆｏｒｍｅｄ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，  Ｖｉｋｉｎｇ  Ｐｅｎｇｕｉｎ，  Ｐｅｎｇｕｉｎ  Ｂｏｏｋｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  Ｉｎｃ．，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａを参照）。
【００８７】
本開示のＭＳＬＮ結合タンパク質は、以下を含む（これらに限定されない）様々な癌又は他の異常な増殖性疾患の処置又は予防にも有用である：膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、頚部、甲状腺、及び皮膚の癌を含む癌腫；扁平上皮癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫を含む、リンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、並びに前骨髄性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉由来の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、悪性奇形腫、神経芽細胞腫、及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及びシュワン細胞腫を含む、中枢神経系と末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む間充織由来の腫瘍；並びに、黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍。また、アポトーシスにおける異常によって引き起こされる癌も、本開示の方法及び組成物により処置されることが、企図される。そのような癌は、限定されないが、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異を持つ癌、乳房、前立腺、及び卵巣のホルモン依存性腫瘍、及び、家族性大腸腺腫症などの前癌正病変を含む。特異的な実施形態において、悪性病変又は悪性増殖（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）変化（異形成及び形成異常症など）、或いは過剰増殖性障害）は、皮膚、肺、結腸、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、膵臓、卵巣又は子宮中で処置又は予防される。他の特異的な実施形態において、肉腫、黒色腫、又は白血病が処置又は予防される。
【００８８】
本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態において、「処置」、「処置すること」、或いは「処置された」とは、望ましくない生理的な疾病、障害、又は疾患を遅らせる（減らす）こと、或いは、有益な又は望ましい臨床結果を得ることを目的とする治療的処置を指す。本明細書に記載される目的のために、有益な又は望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の緩和；疾病、障害、又は疾患の程度の減少；疾病、障害、又は疾患の状態の安定化（即ち、悪化しないこと）；疾病、障害、又は疾患の発症を遅らせること、又はその進行を遅らせること；疾病、障害、又は疾患の状態の改善；及び、検出可能又は検出不可能にかかわらず、疾病、障害、又は疾患の緩解（部分的又は全体）、或いはその亢進又は改善が挙げられる。処置は、過剰なレベルの副作用のない臨床的に有意な反応を誘発することを含む。処置は更に、処置を受けない場合の予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことを含む。他の実施形態において、「処置」、「処置すること」、又は「処置された」とは、予防的な処置を指し、その目的は、例えば、疾患の素因のある人（例えば、乳癌などの疾患に対する遺伝子マーカーをつけた個体）など、望ましくない生理的な疾病、障害、又は疾患の発症を遅らせるか、或いはその重症度を低下させることである。
【００８９】
本明細書に記載される方法の幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるようなＭＳＬＮ結合タンパク質は、特定の疾患、障害、又は疾病の処置のための薬剤と組み合わせて投与される。薬剤としては、限定されないが、抗体、小分子（例えば、化学療法剤）、ホルモン（ステロイド、ペプチドなど）、放射線療法（γ線、Ｘ線、及び／又は、放射性同位体、マイクロ波、ＵＶ放射などの指示された送達）、遺伝子治療（例えば、アンチセンス、レトロウイルス治療など）、及び他の免疫療法に関する治療が挙げられる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるようなＭＳＬＮ結合タンパク質は、下痢止め薬、制吐剤、鎮痛剤、オピオイド、及び／又は非ステロイド性抗炎症薬と組み合わせて投与される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるようなＭＳＬＮ結合タンパク質は、抗癌剤と組み合わせて投与される。本開示の医薬組成物、投薬形態、及びキットを含む、本開示の様々な実施形態に使用され得る抗癌剤の非限定的な例は、以下を含む：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アムボマイシン；アメタントロンアセタート；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテーパ；アズトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ジメシル酸ビスナフィド；ビセレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナーナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベティマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼルシン；セデフィンガル；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デクソロマプラチン；デザグアミン；メシル酸デザグアミン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ドゥアゾマイシン；エダトレキセート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメイト；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロオシタビン；フォスクィダン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン；インターロイキンＩＩ（組み換えインターロイキンＩＩ、又はｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１、インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；���アロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲスロロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；マイトジリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オクシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタマスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロクサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニマスチン；塩酸プロカルバジン；プロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンガル；サフィンゴル塩酸塩；セムスチン；シムトラゼーネ；スパルフォスエートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロマスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェナール；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸トレクサトロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシビリン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンレウロジン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンゾキジン；硫酸ビンゾキジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン。抗癌剤の他の例は、限定されないが以下を含む：２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アキルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アムバマスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラフォライド；血管形成阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背方化形態形成タンパク質−１（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子モジュレータ；細胞死レギュレーター；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリマスチン；アクシナスタチン１；アクシナスタチン２；アクシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾチロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジンイルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビセレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来の阻害剤；カルゼルシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス‐ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチンアナログ；コナゲニン；クラムベシジン（ｃｒａｍｂｅｓｃｉｄｉｎ）８１６；クリスナトール；クリプトファイシン８；クリプトファイシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタンチラキノーズ；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞傷害性因子；シトスタチン；ダクリズマブ；デシタビン；デヒドロジデミンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキフォスダミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ジデミンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオクサマイシン；ジフェニルスピロマスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；ズオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスティン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフール；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチンアナログ；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレツッエラスチン；フラステロン（ｆｌｕａｓｔｅｒｏｎｅ）；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン；フォルフェニメックス；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテクサピリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ハプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロニック酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン（ｉｄｒａｍａｎｔｏｎｅ）；イルモフォシン；イルモスタット；イミダゾアクリドン（ｉｍｉｄａｚｏａｃｒｉｄｏｎｅｓ）；イミキモド；免疫賦活剤ペプチド；インスリン様成長因子Ｉ受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール、４−；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキ��リド；カハラライドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；線形ポリアミンアナログ；親油性二糖類ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ）７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメテレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤（限定されないが、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、シンバスタチン、及びアトルバスタチンなど）；ロクソリビン；ラルトテカン；ルテチウムテクサピリン；リソフィリン；細胞溶解ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メタレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；ミトナファイド；マイトトキシン繊維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリア細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；外発性腫瘍抑圧遺伝子１ベースの治療薬；マスタード抗癌剤；ミカペロキサイドＢ；ミコバクテリウム細胞壁抽出物；ミラポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスティップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ニーリドロニック酸；中性エンドペプチターゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレータ；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアミン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイニン誘発剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オグサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセルアナログ；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミド
ロニック酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリサルフェートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルフォスファミド；ペリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノゲンアクチベータインヒビター；白金複合体；白金化合物；白金トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；タンパク質Ａベースの免疫モジュレータ；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；チロシンホスファターゼタンパク質阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化したヘモグロビン・ポリオキシエチレン抱合体；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レティプチン；レニウムＲｅ  １８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ラビジノンＢ１；ラボキシル；サフィンゴル；セイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ  １模倣物；セムスチン；セネスセンス由来の阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達モジュレータ；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテート；フェニル酢酸ナトリウム；サルバロル；ソマトメジン結合タンパク質；ソナーミン；スパルフォシック酸；スピカマイシンＤ；スピロマスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクワラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分割阻害剤；スティピアミド；ストロメリシン阻害剤；サルフィノジン；超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト；サラディスタ；スラミン；スウェインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロマスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；サリブラスチン；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模倣物；チマルファジン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプロプリン；チラパザミン；チタノセン二塩化物；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシビリン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；テュロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来の成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクターシステム、赤血球遺伝子治療薬；ベラレゾール；ベラミン；アメリカツリスガラ；ベルテポルフ��ン；ビノレルビン；ビンザルチン；Ｖｉｔａｘｉｎ（登録商標）；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマー。追加の抗癌剤は５−フルオロウラシル及びロイコボリンである。サリドマイド及びトポイソメラーゼ阻害剤を利用する方法での使用時、これらの２つの薬剤は特に有用である。幾つかの実施形態において、本開示の抗ＭＳＬＮの単一ドメイン結合タンパク質は、ゲムシタビンと組み合わせて使用される。
【００９０】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるようなＭＳＬＮ結合タンパク質は、手術の前、間、又は後に投与される。
【００９１】
メソテリン発現の検出及びメソテリン関連の癌の診断の方法
本開示の他の実施形態に従い、インビトロ又はインビボでメソテリンの発現を検出するためのキットが提供される。キットは、前述のＭＳＬＮ結合タンパク質（例えば、標識された抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体又はその抗原結合フラグメント）、及びラベルを検出するための１つ以上の化合物を含む。幾つかの実施形態において、ラベルは、蛍光ラベル、酵素ラベル、放射性ラベル、核磁気共鳴活性ラベル、発光ラベル、及び発色団ラベルから成る群から選択される。
【００９２】
場合によっては、メソテリン発現は生体サンプルにおいて検出される。サンプルは、生検、剖検、及び病態の試料由来の組織を含むがこれらに限定されない任意のサンプルであり得る。生体サンプルはまた、組織の切片、例えば組織学目的のために得られた凍結切片を含む。生体サンプルは更に、血液、血清、血漿、痰、髄液、又は尿などの体液を含む。生体サンプルは、ヒト又は非ヒト霊長類などの哺乳動物から典型的に得られる。
【００９３】
一実施形態において、被験体のサンプルを本明細書に開示されるような抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体と接触させることにより、及びサンプルへの単一ドメイン抗体の結合を検出することにより被験体が癌を抱えるかどうか判定する方法が提供される。対照サンプルへの抗体の結合と比較した、サンプルへの抗体の結合の増加は、被験体が癌を抱えていると特定する。
【００９４】
別の実施形態において、癌と診断された被験体のサンプルを本明細書に開示されるような抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体と接触させることにより、及びサンプルへの抗体の結合を検出することにより、被験体の癌の診断を確認する方法が提供される。対照サンプルへの抗体の結合と比較した、サンプルへの抗体の結合の増加は、被験体の癌の診断を確認する。
【００９５】
開示された方法の幾つかの例において、単一ドメイン抗体は直接標識される。
【００９６】
幾つかの例において、前記方法は、単一ドメイン抗体に特異的に結合する二次抗体をサンプルに接触させる工程；及び二次抗体の結合を検出する工程を含む。対照サンプルへの二次抗体の結合と比較した、サンプルへの二次抗体の結合の増加は、被験体の癌を検出し、又は被験体の癌の診断を確認する。
【００９７】
場合によっては、癌は、中皮腫、前立腺癌、肺癌、胃癌、有棘細胞癌、膵臓癌、肝内胆管癌、三種陰性乳癌又は卵巣癌、或いはメソテリンを発現する他のあらゆる種類の癌である。
【００９８】
幾つかの例において、対照サンプルは、癌のない被験体のサンプルである。特定の例において、サンプルは血液又は組織のサンプルである。
【００９９】
場合によっては、メソテリンに結合する（例えば特異的に結合する）抗体は、検出可能なラベルにより直接標識される。別の実施形態において、メソテリン（一次抗体）に結合する（例えば特異的に結合する）抗体は標識されず、メソテリンに特異的に結合する抗体に結合可能な二次抗体又は他の分子が標識される。二次抗体は、一次抗体の特異的な種及びクラスに特異的に結合できるように選択される。例えば、一次抗体がラマＩｇＧである場合、二次抗体は抗ラマＩｇＧであり得る。抗体に結合可能な他の分子は、限定されないが、共に市販で入手可能なプロテインＡ及びプロテインＧを含む。抗体又は二次抗体に適したラベルは上述されており、様々な酵素、補欠分子族団、蛍光体、発光材料、磁性薬剤、及び放射性物質を含む。適切な酵素の非限定的な例は、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含む。適切な補欠分子団複合体の非限定的な例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含む。適切な蛍光体の非限定的な例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンを含む。非限定的で典型的な発光材料はルミノールであり；非限定的で典型的な磁性薬剤はガドリニウムであり、非限定的で典型的な放射性ラベルは１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈを含む。
【０１００】
代替的な実施形態において、メソテリンは、検出可能な物質で標識したメソテリン基準、及びメソテリンに特異的に結合する非標識抗体を利用する競合イムノアッセイによって、生体サンプルにおいてアッセイされ得る。このアッセイにおいて、標識したメソテリン基準、及びメソテリンに特異的に結合する抗体が組み合わせられ、非標識抗体に結合される標識されたメソテリン基準の量が判定される。生体サンプル中のメソテリンの量は、メソテリンに特異的に結合する抗体に結合される標識されたメソテリン基準の量に反比例する。
【０１０１】
本明細書に開示されるイムノアッセイ及び方法は多数の目的のために使用可能である。一実施形態において、メソテリンに特異的に結合する抗体が、細胞培養における細胞中のメソテリンの産生を検出するために使用されてもよい。別の実施形態において、抗体は、組織サンプル、血液又は血清のサンプルなどの生体サンプル中のメソテリンの量を検出するために使用可能である。幾つかの例において、メソテリンは細胞表面メソテリンである。他の例において、メソテリンは、可溶性メソテリン（例えば、細胞培養上清におけるメソテリン、又は血液又は血清のサンプルなどの体液サンプルにおける可溶性メソテリン）である。
【０１０２】
一実施形態において、キットが、血液サンプル又は組織サンプルなどの生体サンプル中のメソテリンの検出のために提供される。例えば、被験体における癌診断を確認するために、生検を実行して組織学的検査のための組織サンプルを得ることができる。代替的に、血液サンプルを得て、可溶性メソテリンタンパク質又はフラグメントの存在を検出することができる。ポリペプチドを検出するためのキットは典型的に、メソテリンに特異的に結合する本開示に係る単一ドメイン抗体を含む。幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖフラグメント、ＶＨドメイン、又はＦａｂなどの抗体フラグメントが、キットに含まれている。更なる実施形態において、抗体は標識される（例えば、蛍光ラベル、放射ラベル、又は酵素ラベルによる）。
【０１０３】
一実施形態において、キットは、メソテリンに結合する抗体の使用手段を開示する教材を含む。説明書が、電子的形態（コンピュータディスケット又はコンパクトディスクなど）に書き込まれてもよく、或いは視覚的なもの（ビデオファイルなど）であってもよい。キットはまた、キットの設計対象となる特定用途を容易にするための付加的な構成要素を含んでもよい。故に、例えばキットは、ラベルを検出する手段（酵素ラベルのための酵素基質、蛍光ラベル検出用のフィルタセット、二次抗体などの適切な第２のラベルなど）を付加的に含んでもよい。キットは付加的に、緩衝剤、及び特定の方法の実施に慣例的に使用される他の試薬を含んでもよい。そのようなキット及び適切な内容物は当業者に周知である。
【０１０４】
一実施形態において、診断キットはイムノアッセイを含む。イムノアッセイの詳細は利用される特定のフォーマットにより変動し得るが、生体サンプル中のメソテリンを検出する方法は通常、免疫学的反応条件下でメソテリンポリペプチドに特異的に反応する抗体に生体サンプルを接触させる工程を含む。抗体は、免疫複合体を形成するために免疫学的反応条件下で特異的に結合することを可能とされ、免疫複合体（結合抗体）の存在が直接又は間接的に検出される。
【０１０５】
細胞表面マーカーの有無を判定する方法が、当該技術分野で周知である。例えば、抗体は、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物又は薬物を含むがこれらに限定されない、他の化合物へと抱合され得る。抗体はまた、限定されないが放射免疫定量法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、又は免疫組織化学アッセイなどのイムノアッセイにおいて利用可能である。抗体はまた、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）に使用可能である。ＦＡＣＳは、細胞を分離又は選別するために、他のより洗練された検出レベルの中で、複数の色チャネル、低角度及び鈍角の光散乱検出チャネル、及びインピーダンスチャネルを利用する（米国特許５，０６１，６２０号を参照）。本明細書に開示されるようなメソテリンに結合する単一ドメイン抗体の何れかは、これらのアッセイに使用可能である。故に、抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学的検査、ウエスタンブロット、又は免疫沈降法を含むがこれらに限定されない、従来のイムノアッセイに使用可能である。
【実施例】
【０１０６】
下記の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、記載された実施形態を更に例示する。
【０１０７】
実施例１：メソテリンを発現する癌細胞のＴ細胞死滅を媒介する、本開示の典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体の能力
典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体配列を、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとトランスフェクトする。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞からの調整培地中の典型的な抗ＭＳＬＮ抗体の量を、プロテインＡチップを備えたＯｃｔｅｔ器機を使用し、且つ標準曲線として対照抗ＭＳＬＮ抗体を使用して、定量する。
【０１０８】
調整培地の滴定をＴＤＣＣアッセイ（Ｔ細胞依存性細胞の細胞毒性試験）に加えて、抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体が、Ｔ細胞と、メソテリンを発現する卵巣癌細胞株、即ちＯＶＣＡＲ８との間にシナプスを形成することができるかどうかを評価する。ＯＶＣＡＲ８細胞の生存率を４８時間後に測定する。典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体がＴ細胞死滅を媒介することを確認する。
【０１０９】
更に、典型的な抗体が、メソテリンを発現しないＬＮＣａＰ細胞のＴ細胞死滅を媒介しないことから、典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体のＴＤＣＣ活性はメソテリンを発現する細胞に特異的であることを、確認する。
【０１１０】
実施例２：本開示に係るＭＳＬＮ結合ドメインを含む様々なＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の結合及び細胞毒性活性を評価する方法
【０１１１】
タンパク質産生
本開示に係るＭＳＬＮ結合タンパク質を含むＭＳＬＮ標的三重特異性分子の配列を、リーダー配列が先行し６ｘヒスチジンタグが後続する、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ  ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローン化した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４５２７）を、Ｅｘｐｉ  ２９３培地中の０．２〜８×１ｅ６細胞／ｍＬ間でＯｐｔｉｍｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆｌａｓｋｓ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）の懸濁液において維持した。精製されたプラスミドＤＮＡを、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４６３５）プロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞へとトランスフェクトし、トランスフェクション後４−６日間維持した。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞からの、調製培地中の試験されている典型的な三重特異性タンパク質の量を、プロテインＡチップを備えたＯｃｔｅｔ器機を使用し、且つ標準曲線に対して対照の三重特異性タンパク質を使用して、定量した。
【０１１２】
細胞毒性アッセイ
【０１１３】
ヒトＴ細胞依存性細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイを使用して、Ｔ細胞が腫瘍細胞を死滅させるよう導く、三重特異性分子を含むＴ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒｓ）の能力を測定した（Ｎａｚａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５．  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ２０：５１９−２７）。このアッセイにおいて、Ｔ細胞及び標的癌細胞株の細胞を、３８４ウェルのプレートにおいて１０：１の比率で一緒に混合し、試験される様々な量の三重特異性タンパク質を加える。腫瘍細胞株を操作して、ルシフェラーゼタンパク質を発現させる。４８時間後、残る生存可能な腫瘍細胞を定量するために、Ｓｔｅａｄｙ−ＧｌｏＲ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。
【０１１４】
本研究において、調整培地の滴定をＴＤＣＣアッセイ（Ｔ細胞依存性細胞の細胞毒性試験）に加えて、抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体が、Ｔ細胞と、メソテリンを発現する卵巣癌細胞株、即ちＯＶＣＡＲ８との間にシナプスを形成することができるかどうかを評価した。ＯＶＣＡＲ８細胞の生存率を４８時間後に測定した。三重特異性タンパク質がＴ細胞死滅を媒介したことを確認した。図１は、三重特異性タンパク質２Ａ２及び２Ａ４の試験による細胞生存率アッセイの例を示す。他の様々な三重特異性タンパク質の試験のＴＤＣＣ活性に対するＥＣ５０を、以下表１に列挙する。
【０１１５】
【表１】
2020519295.tif 000003
【０１１６】
更に、試験されている三重特異性タンパク質が、メソテリンを発現しないＬＮＣａＰ細胞のＴ細胞死滅を媒介しなかったことから、試験されているＭＳＬＮ標的三重特異性タンパク質のＴＤＣＣ活性はメソテリンを発現する細胞に特異的であったことを、観察した。特に三重特異性タンパク質２Ａ２、１１Ｆ３、９Ｈ２、５Ｃ２、１０Ｂ３、２Ｆ４、５Ｆ２、７Ｆ１、２Ｆ４、５Ｈ１、３Ｂ４、及び７Ｈ２は、ＬｎＣａＰ細胞によるいかなるＴＤＣＣ活性も示さなかった。
【０１１７】
実施例３：本開示の典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体のＡＤＣＣ活性
この研究は、本開示の典型的な抗体として配列修飾又は置換を持たない比較対象のラマ抗ＭＳＬＮ抗体と比較して、ＡＤＣＣを媒介する本開示の典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体の能力を判定することを対象とする。両方の抗体は、追加の免疫グロブリンドメインを含む多重ドメインタンパク質として発現される。
【０１１８】
材料
ドナーを白血球泳動し（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｅｄ）、ＮＫ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｉ  ＡｕｔｏＭａｃｓ  Ｐｒｏの負選択システムを使用して細胞精製群によりｌｅｕｋｏｐａｃｋから単離する。ＮＫ細胞をロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）上で４℃で一晩保持し、その後洗浄し、計数して、ＡＤＣＣアッセイでの使用のために完全ＲＰＭＩにおいて４×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。
【０１１９】
標的：腫瘍細胞標的をメソテリン発現に基づいて選択する。標的を洗浄し、計数する。６×１０６の標的を完全ＲＰＭＩに再懸濁し、３７℃、５％のＣＯ２で４０分間、１０μＭのカルセイン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ１３５９−００ＵＬ  ＣＡＬＣＥＩＮ  ＡＭ  ４  ＭＭ  ＩＮ  ＡＮＨＹＤＲＯＵＳ  ＤＭＳＯ）の最終濃度において標識する。細胞をＰＢＳの中で２回洗浄し、完全ＲＰＭＩにおいて再懸濁し、３７℃、５％のＣＯ２で２時間インキュベートした。標識後、標的細胞を洗浄し、再計数し、ＡＤＣＣアッセイでの使用のために完全ＲＰＭＩにおいて０．２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。
【０１２０】
方法
【０１２１】
９６ウェルの丸底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３７９９）においてＡＤＣＣアッセイを実行する。試験タンパク質を、１０％のＦＣＳ（１：１０希釈）を含む１０００μＬの完全ＲＰＭＩのうち１０μＬを運ぶことにより２０μｇ／ｍＬ〜０．０００２μｇ／ｍＬへと滴定する。カルセイン標識された標的５０μＬを加え、１０，０００の細胞を含ませる。標的細胞、及び、典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体又は比較対象の抗体の何れかを含む様々な濃度の多重ドメインタンパク質を、４℃で４０分間インキュベートし、その後、ＮＫ細胞エフェクター５０μＬを加えた、１００，０００の細胞（１０：１のＥ：Ｔ比率）を含ませる。培養物を３７℃で４時間インキュベートし、その後、上清を引き抜き、  Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ  ＨＴＳカウンター上で４８５−５３５ｎｍで蛍光を測定することによりカルセイン放出に対して分析した。１００％の溶解値をＩｇｅｐａｌ  ６３０洗剤（ウェルごとに３μＬ）で標識された標的の６つのウェルを溶解することにより判定し、自発的な溶解値を、標的単独からの上清中の蛍光を単独で測定することにより判定する。
【０１２２】
統計分析
【０１２３】
パーセント（％）特異的な溶解を、（サンプル蛍光）−（自発的な溶解蛍光）／（１００％の溶解−自発的な溶解蛍光）として定めた。自発的な溶解を、標的のみを含むウェルによって判定し、１００％の溶解を、標的がＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ  ６３０洗剤により溶解されるウェルによって判定する。生データを、式を埋め込んだＥｘｃｅｌ表計算に入力して、％特異性溶解を計算し、結果として得た値を、グラフィックプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）に移し、その中でデータを曲線あてはめグラフにおいて変換する。その後の分析（直線回帰計算）をＧｒａｐｈＰａｄにおいて行い、ＥＣ５０値を生成する。
【０１２４】
結果及び議論
【０１２５】
比較対象の抗ＭＳＬＮ抗体を含む多重ドメインタンパク質でインキュベートされたウェルにおけるエフェクターＮＫ細胞はカルセイン標識された標的細胞の死滅を媒介することができない一方、本開示の典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体を含む多重ドメインタンパク質を有するウェルにおけるエフェクターは、特異的な溶解作用（％特異的溶解）によって測定されるように、抗体依存性細胞の細胞毒性を媒介することができる。
【０１２６】
結論
【０１２７】
本開示の典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体は、配列置換、修飾、又はヒト化がない比較対象のラマ抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体よりも、メソテリンを発現する標的細胞の、かなり高いレベルの死滅を媒介する。
【０１２８】
実施例４：本開示の典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体のＣＤＣ活性
癌細胞に対する、本開示に係る典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体の抗腫瘍活性を評価するために、補体のソースとしてヒト血清の存在下でのＡ４３１／Ｈ９及びＮＣＩ−Ｈ２２６細胞モデルの細胞毒性活性を試験する。典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体を、追加の免疫グロブリンドメインを含む多重ドメインタンパク質として発現する。本開示の典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体を含む多重ドメインタンパク質が、Ａ４３１／Ｈ９の約４０％、及びＮＣＩ−Ｈ２２６中皮腫細胞株の３０％よりも多くを死滅させることにより強力なＣＤＣ活性を及ぼし、メソテリン陰性Ａ４３１細胞株に対して活性を示さないことを、確認する。本開示の典型的な抗体として配列修飾又は置換を有していない、比較対象のラマ抗ＭＳＬＮ抗体は、同じ濃度で活性を示さない。
【０１２９】
典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体の抗腫瘍活性における補体の役割を分析するために、フローサイトメトリーを使用して、リツキシマブ、オファツムマブ、及び他の抗ＣＤ２０治療用ｍＡｂｓの特徴づけのための十分に確立されたプロトコルに従い、抗メソテリンヒトｍＡｂｓと反応した癌細胞へのＣ１ｑ結合を判定する（Ｐａｗｌｕｃｚｋｏｗｙｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３：７４９−７５８，  ２００９；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：２４００−２４０８，  ２００８）。ＭＯＲＡｂ−００９のように、（細胞表面から遠く離れた）細胞表面メソテリンの領域Ｉに特異的なＨＮ１ヒトｍＡｂは、メソテリンを発現する癌細胞に対していかなるＣＤＣ活性も示さなかったことが、以前に示されている（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２８：２０２０−２０３０，  ２０１１）。
【０１３０】
しかし、典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体の存在下で、Ｃ１ｑ補体はＡ４３１／Ｈ９又はＮＣＩ−Ｈ２２６細胞に結合することが確認されている。対照的に、Ｃ１ｑ結合は、比較対象のラマ抗ＭＳＬＮ抗体の存在下では見出されなかった。更に、癌細胞へのＣ１ｑの結合は、投与量に反応する様式で典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体の細胞結合に関連付けられる。これらの結果は、典型的な抗ＭＳＬＮ単一ドメイン抗体が、比較対象のラマ抗ＭＳＬＮ抗体に比べて改善されたＣＤＣの活性を実証することを、実証する。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され且つ記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、及び置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びその同等物の範囲内の方法及び構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【０１３２】
実施例５：本開示に係るＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含むＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞がＭＳＬＮ発現卵巣癌細胞を死滅させるよう導く
ヒトＴ細胞依存性細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイを使用して、Ｔ細胞が腫瘍細胞を死滅させるよう導く、三重特異性分子を含むＴ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒｓ）の能力を測定した（Ｎａｚａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５．  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ２０：５１９−２７）。このアッセイに使用されるＣａｏｖ３細胞を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。５つの異なる健康なドナー（ドナー０２、ドナー８６、ドナー４１、ドナー８１、及びドナー３４）からのＴ細胞及び標的癌細胞Ｃａｏｖ３を共に混合し、ＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含む様々な量のＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）を加え、混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。Ｃａｏｖ３細胞及びＴ細胞も、ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子、ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）により３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、残る生存可能な腫瘍細胞を、発光アッセイによって定量した。
【０１３３】
ＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含むＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質が、（図２に示されるように）５つ全ての健康なドナーのＴ細胞に標的癌細胞Ｃａｏｖ３を死滅させるよう導くことができ、一方で対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子が、（図２に示されるように）５つの健康なドナーの何れかのＴ細胞にＣａｏｖ３細胞を死滅させるよう導くことができなかったことが、観察された。
【０１３４】
上記のような同じプロトコルを使用する更なるアッセイを、ＯＶＣＡＲ３細胞を使用して実行した。ＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含むＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質が、（図３に示されるように）５つ全ての健康なドナーのＴ細胞に標的癌細胞ＯＶＣＡＲ３を死滅させるよう導くことができ、一方で対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子が、（図３に示されるように）５つの健康なドナーの何れかのＴ細胞にＯＶＣＡＲ３細胞を死滅させるよう導くことができなかったことが、観察された。
【０１３５】
標的細胞を発現するＭＳＬＮの死滅に対するＥＣ５０値を以下の表ＩＩに列挙する。
【０１３６】
【表２】
2020519295.tif 000004
【０１３７】
実施例６：本開示に係るＭＳＬＮ結合ドメイン（ＭＨ６Ｔ）を含むＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞がＭＳＬＮを発現する細胞を死滅させるよう導くが、ＭＳＬＮを発現しない細胞は死滅されない
このアッセイにおいて、健康なドナーのＴ細胞を、ＭＳＬＮを発現する標的癌細胞（Ｃａｏｖ３細胞、Ｃａｏｖ４細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、及びＯＶＣＡＲ８細胞）、又はＭＳＬＮを発現しない標的癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞、ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞）でインキュベートした。この研究に使用される標的細胞の各々を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。ＭＨ６Ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）ドメインを含む様々な量のＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合性のタンパク質を、上述のＴ細胞と標的癌細胞の混合物に加えた。混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、残る生存可能な標的癌細胞を、発光アッセイによって定量した。
【０１３８】
ＭＨ６Ｔドメインを含むＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質が、Ｔ細胞にＭＳＬＮを発現する標的癌細胞（即ち、図４に示されるような、Ｃａｏｖ３、Ｃａｏｖ４、ＯＶＣＡＲ３、及びＯＶＣＡＲ８細胞）を死滅させるよう導くことができたことを、観察した。しかし、ＭＨ６Ｔドメインを含むＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞に、図４にも示されるＭＳＬＮを発現しない標的癌細胞（ＭＤＡＰＣａ２ｂ及びＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞）を死滅させるよう導くことができなかった。
【０１３９】
ＭＳＬＮを発現する癌細胞の死滅に対するＥＣ５０値を以下の表ＩＩＩに列挙する。
【０１４０】
【表３】
2020519295.tif 000005
【０１４１】
実施例７：本開示に係るＭＳＬＮ結合タンパク質（ＭＨ６Ｔ）を含むＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質は、カニクイザル由来のＴ細胞にヒト卵巣癌細胞株を死滅させるよう導いた
このアッセイにおいて、カニクイザルドナーからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ；Ｔ細胞はＰＢＭＣの構成要素である）を、ＭＳＬＮを発現する細胞（ＣａＯＶ３細胞及びＯＶＣＡＲ３細胞）と混合し、様々な量のＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質（ＭＨ６Ｔドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８を含む）を混合物に加え、３７℃で４８時間インキュベートした。並行して、カニクイザルＰＢＭＣ及びＭＳＬＮ発現細胞の混合物を、上述のように、３７℃で４８時間、ＧＦＰを標的とする様々な量の対照ＴｒｉＴＡＣ分子ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）でインキュベートした。このアッセイに使用される標的癌細胞を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。４８時間後、残る生存可能な標的細胞を、発光アッセイによって定量した。
【０１４２】
（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質は、図５に示されるようにカニクイザルＰＢＭＣにＭＳＬＮ発現細胞（即ち、Ｃａｏｖ３及びＯＶＣＡＲ）を効率よく死滅させるよう導くことができ、一方で対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子は、（図５に示されるように）カニクイザルＰＢＭＣに細胞を死滅させるよう導くことができなかったことを、観察した。（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質に対するＥＣ５０値は、ＯＶＣＡＲ３細胞では２．９ｐＭ、及びＣａｏｖ３細胞では３．０ｐＭであり、これらは、表ＩＩに示されるように、ヒトＴ細胞で観察されたＥＣ５０値とは大きく相違しなかった。
【０１４３】
実施例８：（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質は、ヒト血清アルブミンの存在下又は不在下でＴ細胞によってＭＳＬＮ発現ＮＣＩ−Ｈ２０５２中皮腫細胞の死滅を導いた
この試験の目標は、（ＭＨ６Ｔドメイン；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８を含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質が、Ｔ細胞にＭＳＬＮ発現細胞を死滅させるよう導くタンパク質の能力に影響を与えたかどうかを評価することであった。この研究に使用されるＮＣＩ−Ｈ２０５２中皮腫細胞を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。健康なドナーのＴ細胞及びＭＳＬＮ発現細胞（ＮＣＩ−Ｈ２０５２）を組み合わせ、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）様々な量のＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質を混合物に加えた。混合物をＨＳＡの存在下又は不在下で、３７℃で４８時間インキュベートした。ＮＣＩ−Ｈ２０５２細胞及びＴ細胞の混合物も、ＨＳＡの存在下で、ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子、ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）により３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、残る生存可能な標的細胞を、発光アッセイによって定量した。
【０１４４】
（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質は、ＨＳＡの存在下又は不在下で（図６に示されるように）Ｔ細胞にＮＣＩ−Ｈ２０５２細胞を死滅させるよう効率よく導くことができ、一方で対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子は、（図６に示されるように）細胞の死滅を導くことができなかったことを、観察した。ＨＳＡの存在下で、細胞死滅に関するＥＣ５０値は、（表ＩＶに示されるように）約３．２倍増加したことも観察した。
【０１４５】
更に、ＴＤＣＣアッセイを、追加のＭＳＬＮ発現細胞株を用いて、１５ｍｇ／ｍｌのＨＳＡの存在下又は不在下で、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質により実行し、ＥＣ５０値を表ＩＶに提示する。
【０１４６】
【表４】
2020519295.tif 000006
【０１４７】
実施例９：４つの異なるドナーのＴ細胞は、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質及びＭＳＬＮ発現Ｃａｏｖ４細胞の存在下でＴＮＦ−αを分泌する
このアッセイに使用される標的癌細胞ＣａＯｖ４を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。このアッセイにおいて、４つの異なる健康なドナー（ドナー０２、ドナー８６、ドナー３５、及びドナー８１）からのＴ細胞及びＣａｏｖ４細胞を共に混合し、（ＭＨ６Ｔドメイン；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８を含む）様々な量のＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質を加え、混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。Ｃａｏｖ４細胞及びＴ細胞も、ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子、ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）により３７℃で４８時間インキュベートした。発光アッセイを使用して標的癌細胞の生存率を測定する前に、ＴＤＣＣアッセイからの調整培地を４８時間で集めた。調整培地中のＴＮＦ−αの濃度を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。
【０１４８】
ＴＮＦ−αは、図７に示されるように、Ｃａｏｖ４細胞及び（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の存在下で培地に分泌されたが、Ｃａｏｖ４細胞及び対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子の存在下では分泌されなかったことを、観察した。
【０１４９】
更に、効率的な死滅を、対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子の存在下ではなく、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の存在下で、４つ全ての健康なドナーからのＴ細胞により観察した。ＴＤＣＣアッセイも追加のＭＳＬＮ発現細胞株（Ｃａｏｖ３細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、及びＯＶＣＡＲ８細胞）に対して設定し、同様のＴＮＦ−α発現を観察した。ＴＮＦ−αの（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質で誘導された発現に関するＥＣ５０値を、表Ｖに提示する。しかし、アッセイを、ＭＳＬＮを発現しない癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞、又はＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞）を使用して実行したとき、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質により導かれたＴＮＦ−αの分泌は観察されなかった（図示せず）。故に、この研究は、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質がＭＳＬＮ発現標的癌細胞の存在下でＴ細胞を活性化することができたことを実証した。
【０１５０】
【表５】
2020519295.tif 000007
【０１５１】
実施例１０：（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質及びＭＳＬＮ発現ＯＶＣＡＲ８細胞の存在下での４つの異なるドナーからのＴ細胞上でのＣＤ６９発現の活性化
このアッセイに使用されるＯＶＣＡＲ８細胞を操作し、ルシフェラーゼを発現させた。このアッセイにおいて、４つの異なる健康なドナー（ドナー０２、ドナー８６、ドナー３５、及びドナー８１）からのＴ細胞及びＯＶＣＡＲ８細胞を共に混合し、（ＭＨ６Ｔドメイン；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８を含む）様々な量のＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質を加え、混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。ＯＶＣＡＲ８細胞及びＴ細胞も、ＧＦＰを標的とする対照三重特異性分子、ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）により３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、Ｔ細胞を集め、Ｔ細胞上でのＣＤ６９発現をフローサイトメトリーによって測定した。
【０１５２】
ＣＤ６９発現を、図８に示されるように、陰性対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ及びＯＶＣＡＲ８細胞の存在下ではなく、ＯＶＣＡＲ８細胞及び（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ三重特異性抗原結合タンパク質の存在下で、４つ全ての健康なドナーからのＴ細胞上で検出した。ＴＤＣＣアッセイも追加のＭＳＬＮ発現細胞（Ｃａｏｖ３細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、及びＯＶＣＡＲ８細胞）に対して設定し、同様のＣＤ６９発現を観察した。Ｃａｏｖ３細胞及びＯＶＣＡＲ８細胞におけるＣＤ６９の（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質で誘導された活性化に関するＥＣ５０値を、表ＶＩに提示する。
【０１５３】
【表６】
2020519295.tif 000008
【０１５４】
アッセイを、ＭＳＬＮを発現しない癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞、又はＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞）を使用して実行したとき、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質により導かれたＣＤ６９の活性化は観察されなかった（図示せず）。故に、この研究は、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質がＭＳＬＮ発現標的癌細胞の存在下でＴ細胞を活性化することができたことを実証した。
【０１５５】
実施例１１：ＭＳＬＮを発現する／発現しない細胞株に結合する（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の測定
この研究のために、ＭＳＬＮを発現する特定の標的癌細胞（Ｃａｏｖ３細胞、ＣａＯＶ４細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、及びＯＶＣＡＲ８細胞）及びＭＳＬＮを発現しない特定の癌細胞（ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞及びＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞）を、ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質（ＭＨ６Ｔドメイン；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８を含む）又は対照ＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、未結合のＭＨ６Ｔ又はＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子を取り除き、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７に抱合されるＴｒｉＴＡＣ分子中の抗アルブミンドメインを認識できる二次抗体で更にインキュベートした。（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の結合、又はＭＳＬＮ発現又は非ＭＳＬＮ発現細胞へのＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣの結合を、フローサイトメトリーによって測定した。
【０１５６】
図９Ａに見られるように、ＭＳＬＮを発現する細胞株（Ｃａｏｖ３、Ｃａｏｖ４、ＯＶＣＡＲ３及びＯＶＣＡＲ８）への、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の強健な結合を、観察した（左上パネルは、Ｃａｏｖ３細胞への、ＭＨ６Ｔドメインを含むＭＳＬＮ標的三重特異性標的抗原結合タンパク質の結合を示し；右上のパネルは、Ｃａｏｖ４細胞への、ＭＨ６Ｔドメインを含むＭＳＬＮ標的三重特異性標的抗原結合タンパク質の結合を示し；左下のパネルは、ＯＶＣＡＲ３細胞への、ＭＨ６Ｔドメインを含むＭＳＬＮ標的三重特異性標的抗原結合タンパク質の結合を示し；右下のパネルは、ＯＶＣＡＲ８細胞への、ＭＨ６Ｔドメインを含むＭＳＬＮ標的三重特異性標的抗原結合タンパク質の結合を示す）。図９Ｂに見られるように、結合は、ＭＳＬＮを発現しない細胞株では観察されなかった（左のパネルは、ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞への、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の結合の欠如を示し、右のパネルは、ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ細胞への、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の結合の欠如を示す）。更に、結合は、図９Ａ及び９Ｂの両方に示されるように、細胞型の何れかがＧＦＰ  ＴｒｉＴＡＣ分子でインキュベートされたときに観察されなかった。
【０１５７】
実施例１２：ドナーからのＴ細胞に結合する（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の測定
この研究のために、４つの健康なドナーからのＴ細胞を、陰性対照として、（ＭＨ６Ｔドメイン；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８を含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質又は緩衝液でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、未結合の（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質を取り除き、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質中の抗アルブミンドメインを認識できる、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を抱合した二次抗体で更にインキュベートした。結合をフローサイトメトリーによって測定した。
【０１５８】
図１０に見られるように、強健な結合を、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質で処置した４つ全てのドナーのＴ細胞で観察した（左上のパネルは、ドナー２のＴ細胞への、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の結合を示し；右上のパネルは、ドナー３５のＴ細胞への、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の結合を示し；左下のパネルは、ドナー４１のＴ細胞への、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の結合を示し；右下のパネルは、ドナー８１のＴ細胞への、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の結合を示す）。
【０１５９】
実施例１３：（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質で処置したマウスにおける腫瘍成長の阻害
この研究のために、１０７のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞及び１０７のヒトＰＢＭＣを、ＮＣＧマウスの２つの群（群ごとに８匹のマウス）において共に皮下移植した。５日後、１つの群のマウスに、（ＭＨ６Ｔドメイン；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８を含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質を、１０日間毎日（５−１４日目）、０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量で注入し；他の群のマウスにはビヒクル対照を注入した。腫瘍堆積を数日毎に測定し、３６日目に試験を終了した。図１１に示されるように、ビヒクル対照を注入されたマウスと比較して腫瘍成長の有意な阻害を、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質を注入されたマウスにおいて観察した。
【０１６０】
実施例１２：カニクイザルにおける（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の薬物動態
この研究のために、２匹のカニクイザルに、１０ｍｇ／ｋｇの投与量の（ＭＨ６Ｔドメイン；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８を含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質を静脈内注入し、血清サンプルを注入後の様々な時点で集めた。血清中の（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の量を、電気化学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｉｅｎｔ）アッセイにおいて、（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質を認識する抗イディオタイプ抗体を使用して測定した。図１２は、様々な時点での血清の（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質レベルのプロットを示す。その後、データを使用して、表ＶＩＩに提供されるように（ＭＨ６Ｔドメインを含む）ＭＳＬＮ標的三重特異性抗原結合タンパク質の薬物動態特性を算出した。
【０１６１】
【表７】
2020519295.tif 000009
【０１６２】
【表８−１】
2020519295.tif 000010
【０１６３】
【表８−２】
2020519295.tif 000011
【０１６４】
【表８−３】
2020519295.tif 000012
【０１６５】
【表８−４】
2020519295.tif 000013
【０１６６】
【表８−５】
2020519295.tif 000014
【０１６７】
【表８−６】
2020519295.tif 000015
【０１６８】
【表９】
2020519295.tif 000016
【０１６９】
【表１０】
2020519295.tif 000017
【０１７０】
【表１１】
2020519295.tif 000018
【０１７１】
【表１２−１】
2020519295.tif 000019
【０１７２】
【表１２−２】
2020519295.tif 000020
【０１７３】
【表１３−１】
2020519295.tif 000021
【０１７４】
【表１３−２】
2020519295.tif 000022
【０１７５】
【表１４】
2020519295.tif 000023
【０１７６】
【表１５】
2020519295.tif 000024
【図１】
2020519295.tif 000025
【図２】
2020519295.tif 000026
【図３】
2020519295.tif 000027
【図４】
2020519295.tif 000028
【図５】
2020519295.tif 000029
【図６】
2020519295.tif 000030
【図７】
2020519295.tif 000031
【図８】
2020519295.tif 000032
【図９Ａ】
2020519295.tif 000033
【図９Ｂ】
2020519295.tif 000034
【図１０】
2020519295.tif 000035
【図１１】
2020519295.tif 000036
【図１２】
2020519295.tif 000037
【配列表】
2020519295000001.app
【国際調査報告】
2020519295.tif 000038
2020519295.tif 000039
2020519295.tif 000040