(57)【要約】本発明は、培養細胞にトランスフェクトするためのＤＮＡ／トランスフェクション試薬マスターミックスを作製する、拡大容易な方法を提供する。一態様では、本発明は、（１）ＤＮＡ溶液およびトランスフェクション試薬溶液を混合容器に導入して、トランスフェクションマスターミックスを作製するステップと、（２）トランスフェクションマスターミックス中のＤＮＡが定常状態濃度に達するのに十分な時間、機械的揺動デバイスにより混合容器を揺動させるステップと、（３）インキュベーション時間の間、トランスフェクションマスターミックスをインキュベートするステップであって、前記インキュベーション時間の間、トランスフェクションマスターミックスが実質的に静止している、ステップとを包含する、トランスフェクションマスターミックスを調製するための方法を提供する。
2020519258.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスフェクションマスターミックスを調製する方法であって、
（１）ＤＮＡ溶液およびトランスフェクション試薬溶液を混合容器に導入して、トランスフェクションマスターミックスを作製するステップと、
（２）前記トランスフェクションマスターミックス中のＤＮＡが定常状態濃度に達するのに十分な時間、機械的揺動デバイスにより前記混合容器を揺動させるステップと、
（３）インキュベーション時間の間、前記トランスフェクションマスターミックスをインキュベートするステップであって、前記インキュベーション時間の間、前記トランスフェクションマスターミックスが実質的に静止している、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記インキュベーション時間が、５〜１８０分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合容器が、単回使用の使い捨て容器である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記混合容器が、あらかじめ無菌化したものである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記混合容器が、プラスチックバッグである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記混合容器が、単回使用の細胞培養バッグである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記バッグが、膨張させたものである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
前記バッグが、完全に膨張させたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記バッグが、部分的に膨張させたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記トランスフェクション試薬溶液が、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、活性化デンドリマー、およびカチオン性脂質からなる群より選択される化学的トランスフェクション試薬を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスフェクション試薬溶液が、カチオン性ポリマーを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミンである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリエチレンイミンが、１ｋＤａ〜１６０ｋＤａの間の平均分子量を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリエチレンイミンが、４ｋＤａ〜４０ｋＤａの間の平均分子量を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ溶液が、無菌である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記トランスフェクション試薬溶液が、無菌である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ溶液を前記混合容器に導入する前に前記ＤＮＡ溶液を無菌化するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ溶液が、濾過滅菌により無菌化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記トランスフェクション試薬溶液を前記混合容器に導入する前に前記トランスフェクション試薬溶液を無菌化するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記トランスフェクション試薬溶液が、濾過滅菌により無菌化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記機械的揺動デバイスが、揺動プラットフォームを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記混合容器が、前記揺動ステップにおいて前記揺動プラットフォームの上部に配置される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記揺動させるステップが、１自由度におけるものである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記揺動させるステップが、前記トランスフェクションマスターミックスにおいて波動運動を誘導するのに十分である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記揺動させるステップが、５〜１５度の範囲の所定の角度におけるものである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記揺動させるステップが、約１２度の所定の角度におけるものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記揺動させるステップが、約５度の所定の角度におけるものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記揺動させるステップが、所定の速度におけるものである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記所定の速度が、１〜３０ｒｐｍの間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記所定の速度が、５〜２５ｒｐｍの間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記所定の速度が、約１０ｒｐｍである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記所定の速度が、約１２ｒｐｍである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記所定の速度が、約１５ｒｐｍである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１Ｌまたはそれよりも大きい、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、３Ｌまたはそれよりも大きい、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１２Ｌまたはそれよりも大きい、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１５Ｌまたはそれよりも大きい、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、２５Ｌまたはそれよりも大きい、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、５０Ｌまたはそれよりも大きい、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１００Ｌまたはそれよりも大きい、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１Ｌ〜１００Ｌの間である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１Ｌである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、３Ｌである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１２Ｌである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１５Ｌである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、２５Ｌである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、２９Ｌである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
揺動時間が、５分またはそれ未満である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記揺動時間が、約２分である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記揺動時間が、約１分である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記インキュベーション時間が、１０〜６０分の間である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記インキュベーション時間が、２０〜３０分の間である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記インキュベーション時間が、１０〜２０分の間である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、４Ｌであり、前記所定の角度が、７度であり、前記所定の速度が、１０ｒｐｍであり、揺動持続時間が、１〜２分である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１２Ｌであり、前記所定の角度が、１２度であり、前記所定の速度が、１５ｒｐｍであり、揺動持続時間が、１〜２分である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ溶液が、プラスミドＤＮＡから本質的になるＤＮＡを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記ＤＮＡ溶液が、ｃｉｓプラスミド、ｔｒａｎｓ−ｒｅｐ−ｃａｐプラスミド、およびヘルパープラスミドの群から選択されるプラスミドを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記ＤＮＡ溶液および前記トランスフェクション試薬溶液を前記混合容器に導入するステップが、無菌的に達成される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
複数の細胞をトランスフェクトする方法であって、前記請求項のいずれかに記載の方法により生成されたトランスフェクションマスターミックスと前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項６０】
前記細胞が、バイオリアクターに配置され、前記方法が、前記マスターミックスを前記バイオリアクターに無菌的に導入するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記マスターミックスが、ポンプ、または１バッチもしくは複数バッチを伴う重力送りにより前記バイオリアクターに導入される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生成する方法であって、ｒＡＡＶを生成可能な細胞に、請求項５７に記載の方法により生成されたトランスフェクションマスターミックスをトランスフェクトするステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月９日出願の米国仮特許出願第６２／５０３，６６０号の利益および優先権を主張し、この全内容をすべての目的において参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、概して、トランスフェクション試薬を生成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
一過性トランスフェクションは、核酸分子を真核細胞に一時的に導入することである。名称が意味するように、一過性トランスフェクションの作用は、核酸が細胞内に存在し未分解である限りにおいてのみ持続する。一過性トランスフェクションによる一過性の遺伝子発現は、遺伝子サイレンシング、タンパク質生成、ウイルス生成等を包含する広範な適用を可能とする。
【０００４】
一過性トランスフェクションは、安定な細胞株の生成と比較して、迅速で比較的安価であり、そのため、必要とされる材料の量が比較的少ない、毒物学的研究、前臨床試験、および早期臨床試験のための材料を提供するのに魅力的な選択肢となっている。一過性トランスフェクション方法の使用が潜在的可能性を有する１つの領域は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの生成にある。前臨床研究の成功は、臨床環境における患者への治療的遺伝子導入のためのｒＡＡＶベクターの使用を後押しした。臨床試験におけるｒＡＡＶの使用の成功は、高純度のｒＡＡＶ粒子を大量に生成することが可能な、生成および精製システムの必要性を強調した。一過性トランスフェクションは、ｒＡＡＶ生成に必要な遺伝子の一部または全部を多数の培養細胞に迅速に送達し、これによりｒＡＡＶ生成のための生ヘルパーウイルスの使用の必要性を回避し、安定な細胞株に基づくプロセスに必要とされる、開発および安定性試験のための時間を不要とすることが可能な効率的な方法である。
【０００５】
多数の一過性トランスフェクション方法は、当技術分野において公知であり、リポソームをベースとするトランスフェクション；化学物質をベースとするトランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥデキストラン、もしくは活性化デンドリマーを利用する方法；マイクロインジェクション；エレクトロポレーション；磁気ビーズ；ナノ粒子；または細胞圧搾（ｃｅｌｌ  ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）を包含する。しかし、このような方法は、小規模なトランスフェクションには有用であるが、これらが、法外に高価な試薬を必要とするか、もしくは規模を拡大することが非現実的であるため、商業規模の生成（例えば、５０Ｌおよびそれよりも大きい）には非現実的であるか（例えば、ナノ粒子、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションの場合）、またはリン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥデキストラン、および活性化デンドリマーを包含する、多くの化学物質およびリポソームをベースとするトランスフェクション方法の場合のように、規模を拡大した方法を実行するため、および以前に小規模に最適化した方法の規模を拡大するための安定な方法がない。特に、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬マスターミックスを中および大規模に作製するための安定な方法がない。したがって、培養細胞の一過性トランスフェクションのための安定、拡大可能で安価な方法が当技術分野において求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一部分において、機械的揺動デバイスを使用してマスターミックスを揺動させることを含む、トランスフェクションマスターミックスを調製する、確実に有効な方法の発見に基づく。一態様では、本発明は、（１）ＤＮＡ溶液およびトランスフェクション試薬溶液を混合容器に導入して、トランスフェクションマスターミックスを作製するステップと、（２）トランスフェクションマスターミックス中のＤＮＡが定常状態濃度に達するのに十分な時間、機械的揺動デバイスにより混合容器を揺動させるステップと、（３）インキュベーション時間の間、トランスフェクションマスターミックスをインキュベートするステップであって、前記インキュベーション時間の間、トランスフェクションマスターミックスが実質的に静止している、ステップとを包含する、トランスフェクションマスターミックスを調製するための方法を提供する。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、５〜１８０分の間である。一部の実施形態では、方法はまた、細胞とトランスフェクションマスターミックスとを接触させることにより細胞をトランスフェクトするステップを包含する。一部の実施形態では、細胞は、バイオリアクターに配置され、方法はまた、マスターミックスをバイオリアクターに無菌的に導入するステップを包含する。一部の実施形態では、トランスフェクションマスターミックスは、重力送り（順次または同時に１バッチまたは複数バッチで）またはポンプによりバイオリアクターに導入する。特定の実施形態では、トランスフェクションマスターミックスは、例えば、１分あたり１リットル未満もしくはそれと等しい速度、１分あたり１〜４リットルの速度、または１分あたり４リットルよりも大きいかもしくはそれと等しい速度でポンプによりバイオリアクター内に導入する。
【０００７】
本発明の一態様では、トランスフェクションマスターミックスは、ＤＮＡ溶液とトランスフェクション試薬溶液とを混合容器内で組み合わせることにより調製する。ＤＮＡ溶液は、適切な溶媒に溶解したＤＮＡから本質的になることが企図される。ＤＮＡは、任意の形態、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはベクター、例えば、プラスミド中のＤＮＡであり得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ溶液は、ｃｉｓプラスミド、ｔｒａｎｓ−ｒｅｐ−ｃａｐプラスミド、およびヘルパープラスミドの群から選択されるプラスミドを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ溶液は、ｒＡＡＶｃｉｓプラスミド、ｒＡＡＶｔｒａｎｓ−ｒｅｐ−ｃａｐプラスミド、およびｒＡＡＶ生成のためのヘルパープラスミドの群から選択されるプラスミドを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡは、水または細胞培養培地に溶解する。ＤＮＡ溶液は、例えば、濾過滅菌により無菌化され得ることが企図される。一部の実施形態では、ＤＮＡ溶液は、ＤＮＡ溶液を混合容器へ加える前に無菌化される。一部の実施形態では、ＤＮＡ溶液は、混合容器に無菌的に導入する。
【０００８】
トランスフェクション試薬溶液は、適切な溶媒、例えば、水または細胞培養培地に溶解したトランスフェクション試薬から本質的になることが企図される。トランスフェクション試薬は、溶液中のＤＮＡとともに複合体を自然に形成する、任意の化学的トランスフェクション試薬であり得ることが企図される。一部の実施形態では、トランスフェクション試薬は、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、活性化デンドリマー、およびカチオン性脂質からなる群より選択される。特定の実施形態では、トランスフェクション試薬は、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩは、１ｋＤａ〜１６０ｋＤａの間、または４ｋＤａ〜４０ｋＤａの間の平均分子量を有し得る。トランスフェクション試薬溶液は、例えば、濾過滅菌により無菌化され得ることが企図される。一部の実施形態では、トランスフェクション試薬溶液は、トランスフェクション試薬溶液を混合容器に加える前に無菌化する。一部の実施形態では、トランスフェクション試薬溶液は、混合容器に無菌的に導入する。
【０００９】
本発明の一態様では、トランスフェクションマスターミックスは、混合容器において調製する。混合容器は、単回使用の使い捨て容器、および／またはあらかじめ無菌化した容器であり得ることが企図される。混合容器は、プラスチックバッグ、例えば、単回使用の細胞培養バッグであり得ることがさらに企図される。一部の実施形態では、細胞培養バッグは、膨張させたものであり、例えば、細胞培養バッグは、バッグの外面が強固であるように、部分的に膨張させ得るか、または完全に膨張させ得る。混合容器は、少なくとも１Ｌ、例えば、少なくとも５Ｌ、少なくとも１０Ｌ、少なくとも２０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２００Ｌ、少なくとも５００Ｌ、または少なくとも１０００Ｌの容量を有し得ることが企図される。混合容器は、無菌化可能な任意の非毒性材料から作製され得ることが企図される。例示的な材料としては、プラスチック、例えば、ＥＶＡ、ＰＥ、ＬＤＰＥ、ＵＬＤＰＥ、またはＰＶＣが挙げられる。
【００１０】
本発明の一態様では、トランスフェクションマスターミックスは、機械的揺動デバイスを使用して調製する。一部の実施形態では、機械的揺動デバイスは、本発明の方法の揺動ステップにおいて、その上に混合容器が配置されている揺動プラットフォームを含む。一部の実施形態では、機械的揺動デバイスは、１自由度において混合容器を揺動させる。一部の実施形態では、機械的揺動デバイスは、波動運動により混合容器を揺動させる。一部の実施形態では、機械的揺動デバイスは、所定の速度で揺動するように設定することができる。一部の実施形態では、機械的揺動デバイスは、所定の揺動時間、揺動するように設定することができる。一部の実施形態では、機械的揺動デバイスは、所定の揺動角で揺動するように設定することができる。
【００１１】
本発明の一態様では、混合容器は、トランスフェクションマスターミックス中のＤＮＡが定常状態濃度に達するのに十分な時間、揺動させる。揺動は、トランスフェクションマスターミックスにおいて波動運動を誘導するのに十分であることが企図される。一部の実施形態では、揺動は、単一軸に沿ったものである（すなわち、１自由度による）。混合容器は、その開始位置（例えば、０°）から、混合容器の運動が逆転し容器が逆方向に揺動するポイントである最大傾斜角（例えば、１５°、２０°または２５°）まで混合容器を揺動させることにより混合することが企図される。この最大傾斜角は、揺動角と呼ばれる。揺動角は、あらかじめ定められ得ることが企図される。一部の実施形態では、所定の揺動角は、５°〜２０°の範囲であり、例えば、一部の実施形態では、混合容器は、約１５°の所定の角度で揺動させる。一部の実施形態では、混合容器は、約１２°の所定の角度で揺動させる。一部の実施形態では、混合容器は、約７°の所定の角度で揺動させる。混合容器は、所定の速度で揺動させることが企図される。一部の実施形態では、所定の速度は１〜３０ｒｐｍの間、５〜２５ｒｐｍの間、または１０〜２０ｒｐｍの間であり、例えば、所定の揺動速度は、１０ｒｐｍ、１１ｒｐｍ、１２ｒｐｍ、１３ｒｐｍ、１４ｒｐｍ、１５ｒｐｍ、１６ｒｐｍ、１７ｒｐｍまたは１８ｒｐｍであり得る。混合容器は、トランスフェクションマスターミックス中のＤＮＡが定常状態濃度に達するのに十分な時間、揺動させることが企図される。一部の実施形態では、揺動時間は、１０分またはそれ未満、例えば、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、または約１０分である。
【００１２】
本発明の一態様では、マスターミックスは、一定のインキュベーション時間の間、インキュベートする。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、５〜１８０分の間である。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、１０〜６０分の間、例えば、１０〜２０分の間、２０〜３０分の間、２０〜４０分の間、２０〜５０分の間、または２０〜６０分の間である。一部の実施形態では、インキュベーション時間においてマスターミックスが、実質的な静止を維持することが企図される。一部の実施形態では、マスターミックスは、機械的揺動デバイスの揺動プラットフォーム上の混合容器に維持する。一部の実施形態では、インキュベーションは、室温で行う。一部の実施形態では、インキュベーションは、室温未満、例えば、４℃で行う。
【００１３】
本発明の方法により調製するマスターミックスは、１Ｌよりも大きい容量を有することが企図される。例えば、トランスフェクションマスターミックスは、４Ｌもしくはそれよりも大きいか、１２Ｌもしくはそれよりも大きいか、１５Ｌもしくはそれよりも大きいか、２５Ｌもしくはそれよりも大きいか、５０Ｌもしくはそれよりも大きいか、１００Ｌもしくはそれよりも大きいか、２００Ｌもしくはそれよりも大きいか、５００Ｌもしくはそれよりも大きいか、または１０００Ｌもしくはそれよりも大きい容量を有し得る。一部の実施形態では、トランスフェクションマスターミックスは、１Ｌ〜２００Ｌの間、５Ｌ〜１００Ｌの間、または１５Ｌ〜５０Ｌの間の容量を有し得る。例えば、トランスフェクションマスターミックスは、４Ｌ、１２Ｌ、１５Ｌ、２５Ｌ、２７Ｌ、２９Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌまたは２００Ｌの容量を有し得る。
【００１４】
一部の実施形態では、４Ｌの容量を有するトランスフェクションマスターミックスは、７°の所定の角度、１０ｒｐｍの速度で１〜２分間の持続時間、揺動させる。他の一部の実施形態では、１２Ｌの容量を有するトランスフェクションマスターミックスは、１２°の所定の角度、１５ｒｐｍの速度で１〜２分間の持続時間、揺動させる。他の一部の実施形態では、１５Ｌの容量を有するトランスフェクションマスターミックスは、１０°〜１５°、例えば、１２°の所定の角度、１２〜２０ｒｐｍ、例えば、１５ｒｐｍの速度で、１〜４分間、例えば、約１分、約２分、約３分、または約４分間の持続時間、揺動させる。他の一部の実施形態では、２５Ｌの容量を有するトランスフェクションマスターミックスは、１０°〜１５°、例えば、１２°の所定の角度、１２〜２０ｒｐｍ、例えば、１５ｒｐｍの速度で、１〜４分間、例えば、約１分、約２分、約３分、または約４分間の持続時間、揺動させる。他の一部の実施形態では、２９Ｌの容量を有するトランスフェクションマスターミックスは、１０°〜１５°、例えば、１２°の所定の角度、１２〜２０ｒｐｍ、例えば、１５ｒｐｍの速度で、１〜４分間、例えば、約１分、約２分、約３分、または約４分間の持続時間、揺動させる。
【００１５】
本発明の別の態様は、ｒＡＡＶ生成細胞に上記のトランスフェクションミックスをトランスフェクトすることにより、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生成することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、カチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ）を用いた一過性トランスフェクションによるヘルパーを使用しないｒＡＡＶ生成の模式図である。ＡＡＶ生成のためのヘルパーを使用しない一過性トランスフェクションでは、パッケージング細胞に同時トランスフェクトする３つの別々のプラスミドを典型的に利用する。このようなプラスミドは、目的の遺伝子に隣接する逆位末端反復（「ＩＴＲ」）配列を含むｃｉｓプラスミド（プロモーターおよび導入遺伝子を包含する）；ＡＡＶ複製遺伝子およびＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）をコードする遺伝子を含むｔｒａｎｓ−ｒｅｐ−ｃａｐプラスミド；ならびにｒＡＡＶウイルス複製を促進する、アデノウイルスまたは他のヘルパーウイルス遺伝子を含むヘルパープラスミドである。３つのｒＡＡＶパッケージングプラスミドを用いる同時トランスフェクションは、トランスフェクション混合物、すなわち３つのプラスミドおよびトランスフェクション試薬、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の混合物の調製を典型的に含む。ＰＥＩおよびプラスミドの混合は、ｒＡＡＶ生産の規模拡大に有効なＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を形成するために混合方法およびインキュベーション時間を最適化することを必要とする。
【００１７】
【図２】図２は、ＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  ＷＡＶＥ（商標）２５  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒを使用して大規模なトランスフェクションマスターミックスを調製するための方法の模式図である。トランスフェクションミックスは、細胞を含むバイオリアクターに重力送り（１バッチまたは複数バッチ）またはポンプにより導入する。
【００１８】
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、種々の方法により調製したＰＥＩ／ＤＮＡマスターミックスを使用してトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価（ＧＣ／ｍｌ）を示す棒グラフである。図３Ａは、３つの異なる濃度（１０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび２０μｇ／ｍｌのＰＥＩ、２０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌのＰＥＩ、または４０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび８０μｇ／ｍｌのＰＥＩのいずれか）で、１０回の反転の後、室温で２０分のインキュベーションにより調製したマスターミックスをトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価を示す。図３Ｂは、１０回の反転の後、室温で２０分のインキュベーションと、穏やかな撹拌（１００ｒｐｍで２０分）または激しい撹拌（１５０ｒｐｍで２０分）により調製したマスターミックス（２０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌのＰＥＩ）をトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価を示す。各条件の結果は、２回の反復の平均であり、各エラーバーは、標準偏差を表す。図３Ｃは、１０回の反転の後、室温で指示時間のインキュベーションにより調製したマスターミックス（２０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌのＰＥＩ）をトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価を示す。各条件の結果は、２回の反復の平均であり、各エラーバーは、標準偏差を表す。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、種々の方法により調製したＰＥＩ／ＤＮＡマスターミックスを使用してトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価（ＧＣ／ｍｌ）を示す棒グラフである。図３Ａは、３つの異なる濃度（１０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび２０μｇ／ｍｌのＰＥＩ、２０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌのＰＥＩ、または４０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび８０μｇ／ｍｌのＰＥＩのいずれか）で、１０回の反転の後、室温で２０分のインキュベーションにより調製したマスターミックスをトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価を示す。図３Ｂは、１０回の反転の後、室温で２０分のインキュベーションと、穏やかな撹拌（１００ｒｐｍで２０分）または激しい撹拌（１５０ｒｐｍで２０分）により調製したマスターミックス（２０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌのＰＥＩ）をトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価を示す。各条件の結果は、２回の反復の平均であり、各エラーバーは、標準偏差を表す。図３Ｃは、１０回の反転の後、室温で指示時間のインキュベーションにより調製したマスターミックス（２０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌのＰＥＩ）をトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価を示す。各条件の結果は、２回の反復の平均であり、各エラーバーは、標準偏差を表す。
【図３Ｃ】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、種々の方法により調製したＰＥＩ／ＤＮＡマスターミックスを使用してトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価（ＧＣ／ｍｌ）を示す棒グラフである。図３Ａは、３つの異なる濃度（１０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび２０μｇ／ｍｌのＰＥＩ、２０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌのＰＥＩ、または４０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび８０μｇ／ｍｌのＰＥＩのいずれか）で、１０回の反転の後、室温で２０分のインキュベーションにより調製したマスターミックスをトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価を示す。図３Ｂは、１０回の反転の後、室温で２０分のインキュベーションと、穏やかな撹拌（１００ｒｐｍで２０分）または激しい撹拌（１５０ｒｐｍで２０分）により調製したマスターミックス（２０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌのＰＥＩ）をトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価を示す。各条件の結果は、２回の反復の平均であり、各エラーバーは、標準偏差を表す。図３Ｃは、１０回の反転の後、室温で指示時間のインキュベーションにより調製したマスターミックス（２０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌのＰＥＩ）をトランスフェクトした細胞により生じたｒＡＡＶ力価を示す。各条件の結果は、２回の反復の平均であり、各エラーバーは、標準偏差を表す。
【００１９】
【図４Ａ−１】図４Ａは、２０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）において水（４Ｌ、１２Ｌ、１５Ｌ）中に濃縮グルコース溶液（１００ｇ／Ｌまたは４００ｇ／Ｌ）を添加し、表１に示す所定の速度および揺動角で揺動した後、試料採取ポート（図５に示す）において採取したグルコースの濃度を経時的に示すグラフである。図４Ｂは、５０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）において水（２５Ｌ、２６．５Ｌまたは２９Ｌ）中に濃縮したグルコース溶液（４００ｇ／Ｌ）を添加し、表２に示す所定の速度および揺動角で揺動した後、試料採取ポート（図５に示す）において採取したグルコースの濃度を経時的に示すグラフである。
【図４Ａ−２】図４Ａは、２０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）において水（４Ｌ、１２Ｌ、１５Ｌ）中に濃縮グルコース溶液（１００ｇ／Ｌまたは４００ｇ／Ｌ）を添加し、表１に示す所定の速度および揺動角で揺動した後、試料採取ポート（図５に示す）において採取したグルコースの濃度を経時的に示すグラフである。図４Ｂは、５０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）において水（２５Ｌ、２６．５Ｌまたは２９Ｌ）中に濃縮したグルコース溶液（４００ｇ／Ｌ）を添加し、表２に示す所定の速度および揺動角で揺動した後、試料採取ポート（図５に示す）において採取したグルコースの濃度を経時的に示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ａは、２０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）において水（４Ｌ、１２Ｌ、１５Ｌ）中に濃縮グルコース溶液（１００ｇ／Ｌまたは４００ｇ／Ｌ）を添加し、表１に示す所定の速度および揺動角で揺動した後、試料採取ポート（図５に示す）において採取したグルコースの濃度を経時的に示すグラフである。図４Ｂは、５０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）において水（２５Ｌ、２６．５Ｌまたは２９Ｌ）中に濃縮したグルコース溶液（４００ｇ／Ｌ）を添加し、表２に示す所定の速度および揺動角で揺動した後、試料採取ポート（図５に示す）において採取したグルコースの濃度を経時的に示すグラフである。
【００２０】
【図５】図５は、Ｗａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）の模式図である。
【００２１】
【図６】図６は、トランスフェクションマスターミックスを使用してトランスフェクトした細胞から生じたｒＡＡＶ力価（ＧＣ／ｍｌ）に対する、２０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび４０μｇ／ｍｌのＰＥＩを混合後のインキュベーション時間の作用を示すグラフである。閉じた円は、１００ｍｌのビンにおける１０回の反転の後、１０、３０または６０分のインキュベーションにより小規模で生成したトランスフェクションミックスを使用して生じたｒＡＡＶ力価を示す。閉じた四角は、２０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）バイオリアクターチェンバーにおける２分間の機械的揺動の後、１０、２０、３０、４５、６０または８０分のインキュベーションにより大規模（１２Ｌ）で生成したトランスフェクションミックスを使用して生じたｒＡＡＶ力価を示す。結果は、２回の反復の平均を示し、エラーバーは、標準偏差を表す。
【００２２】
【図７】図７は、生じたｒＡＡＶ力価に対するトランスフェクションマスターミックスのポンプ注入の作用を示すグラフである。波動最適化した（ｗａｖｅ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）トランスフェクションミックスを、パッケージング細胞を含むバイオリアクターにポンプで注入してｒＡＡＶを生成した。ｒＡＡＶ力価を各条件下で測定した。結果は、２回の反復の平均を示し、エラーバーは、標準偏差を表す。
【００２３】
【図８】図８は、各トランスフェクションマスターミックスの生成に使用した手動混合および波動混合の方法のｒＡＡＶ収量／細胞（ＧＣ／細胞）を比較したグラフである。前述のように、結果は、平均を表し、標準偏差は、２つのマスターミックスの複数の実行から導出した。
【００２４】
【図９】図９は、トランスフェクションマスターミックス１２Ｌの波動をベースとする調製方法の再現性を実証するグラフである。１２Ｌの各トランスフェクションマスターミックスを使用して２００Ｌの培養物のパッケージング細胞にトランスフェクトし、生じたｒＡＡＶ力価をｑＰＣＲにより定量化した。計５回の実行が行われ、実行２〜実行５から生じた結果は、実行１の平均値に対して正規化した。各実行は、生物学的二重反復の平均である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
化学的トランスフェクション試薬、例えば、ＰＥＩ、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、活性化デンドリマー、およびカチオン性脂質を使用して培養細胞に一過性にトランスフェクトするための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｒ．  Ｅ．ら、（２００３年）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、９−１（リン酸カルシウムトランスフェクション）；Ｅｈｒｈａｒｄｔ，  Ｃ．ら、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，  ａ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ．  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ６．３（２００６年）：１７９〜１８４頁（ＰＥＩトランスフェクション）；Ｓｅｌｄｅｎ，  Ｒ．  Ｆ．２００１年、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．３巻：ＶＩ号：１０．１４：１０．１４．１〜１０．１４．６頁（ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション）；Ｄｅａｎ，  Ｄ．  Ａ．およびＧａｓｉｏｒｏｗｓｋｉ  Ｊ．  Ｚ．「Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ２０１１．３（２０１１年）：ｐｒｏｔ５５８４（デンドリマートランスフェクション）を参照されたい。先行技術による方法は、化学的トランスフェクション試薬を含む溶液をトランスフェクトされるＤＮＡを含む溶液と組み合わせて、マスターミックスを形成するステップと、その後に混合するステップとを一般に含む。混合は、回転振盪により、もしくはマスターミックスを含む容器の反転を繰り返すことにより、または他の手動による混合技術により達成することが多い。先行技術による方法は、何リットルもの多くのマスターミックスの容量が必要とされる大規模な一過性トランスフェクションには一般に不適である。本発明は、安価な装置を使用してマスターミックスを大量に生成するための安定な方法を提供する。
【００２６】
Ａ．トランスフェクション試薬
本発明の方法は、溶液中のＤＮＡと複合体を形成することにより機能する、任意の化学物質またはリポソームのトランスフェクション試薬であって、このＤＮＡ／トランスフェクション試薬複合体の形成が、穏やかに混合することにより促進される、トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクションマスターミックスを調製するために使用し得ることが企図される。本発明のこの方法は、次の一般的ステップ：（１）ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬溶液を別々に調製するステップと、（２）ＤＮＡ溶液およびトランスフェクション試薬溶液を組み合わせて、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬複合体（「マスターミックス」）を形成させるステップと、（３）例えば、マスターミックスを培養細胞の培地に加えることによりＤＮＡ／トランスフェクション試薬複合体と細胞を接触させるステップとを含む、任意のトランスフェクション方法に組み込み得ることが、さらに企図される。
【００２７】
本発明において使用し得る例示的なトランスフェクション試薬としては、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；ならびにＤＥＡＥデキストラン；リン酸カルシウム；デンドリマー；リポフェクション試薬、例えば、カチオン性脂質、例えば、リポフェクタミントランスフェクション試薬、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、および中性膜融合性脂質、例えば、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）が挙げられる。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、アミン基および２つの脂肪族炭素ＣＨ２ＣＨ２スペーサーで構成される繰り返し単位のカチオン性ポリマーである。ＰＥＩは、周知のトランスフェクション試薬であり、特定の理論に拘束されないが、正電荷を有する、凝縮したＰＥＩ／ＤＮＡ粒子を形成することにより機能すると考えられている。このような粒子は、アニオン性の細胞表面残基に結合し、エンドサイトーシスにより細胞に侵入する。細胞内に侵入すると、ＰＥＩの高い緩衝能力により浸透圧膨張が生じ、これによりエンドソームが破裂して、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の細胞質への放出が生じる。例示的なＰＥＩ製品としては、ＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）、ＰＥＩ−Ｍａｘ  ４ｋＤａまたは４０  ｋＤａ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）が挙げられる。
【００２８】
このような各トランスフェクション試薬が、溶液中のＤＮＡと複合体を形成することにより機能し、複合体の形成が、ＤＮＡを細胞に輸送するのに必要であることが理論化されている。しかし、複合体形成の後、トランスフェクション試薬／ＤＮＡ複合体は、複合体間で凝集する可能性があり、このような凝集体が形成されると、トランスフェクション効率が低下する。本発明の方法は、複合体間の凝集を制限しながら、複合体形成を促進するように最適化する。
【００２９】
本発明の方法に使用するトランスフェクション試薬溶液は、当技術分野において公知の標準技術に従って調製することができる。例えば、トランスフェクション試薬は、無血清細胞培養培地を包含する、適切な任意の細胞培養培地に溶解するか、もしくは適切な任意の細胞培養緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解するか、または水に溶解することができる。トランスフェクション試薬溶液は、標準技術によるトランスフェクションマスターミックスの調製に適する任意の濃度、例えば、１０μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌであり得る。
【００３０】
Ｂ．ＤＮＡ溶液
本発明の方法は、真核細胞のトランスフェクションに適する任意の供給源由来のＤＮＡを使用してトランスフェクションマスターミックスを調製するために使用し得ることが企図される。ＤＮＡは、任意の形態、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはベクター、例えば、プラスミド中のＤＮＡであり得る。ＤＮＡ溶液は、当技術分野において公知の標準技術に従って調製することができる。例えば、ＤＮＡは、無血清細胞培養培地を包含する、適切な任意の細胞培養培地中に溶解し得るか、またはＰＢＳもしくは水に溶解し得る。ＤＮＡ溶液は、標準技術によるトランスフェクションマスターミックスの調製に適する任意の濃度、例えば、１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌであり得る。
【００３１】
Ｃ．機械的揺動デバイス
本発明の方法の揺動ステップは、機械的揺動デバイスを使用して混合容器を揺動させて達成し得ることが企図される。機械的揺動デバイスは、混合容器を水平軸に沿って繰り返し傾動可能な任意のデバイスであり得ることが企図される。一実施形態では、機械的揺動デバイスは、揺動プラットフォームを包含し、混合容器は、揺動ステップにおいて揺動プラットフォームの上部に配置され得る。機械的揺動デバイスの運動は、１自由度、および所定の揺動角に制限し得ることが企図される。機械的揺動デバイスは、所定の速度で混合容器を揺動させることが可能であることがさらに企図される。例示的な機械的揺動デバイスとしては、ＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  ＷＡＶＥ（商標）２５（ＧＥ社）、ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）システム２０／５０、２００，および５００／１０００（ＧＥ社）、ＣＨＥＭｃｅｌｌ（登録商標）ＲＯＣＫＥＲ  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲ  ＳＹＳＴＥＭ（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ社）、ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）ＲＭ２０，ＲＭ５０、ＲＭ２００およびＲＭ６００（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）、ならびにＳｍａｒｔＲｏｃｋｅｒシステム（Ｆｉｎｅｓｓｅ社）が挙げられる。上述の各揺動デバイスはまた、製造者の指示に従って操作して、細胞培養バッグを膨張させることができる。
【００３２】
Ｄ．混合容器
本発明による方法は、多様な容器を使用して行われ得ることが企図される。本発明の一部の実施形態では、方法は、あらかじめ無菌化した容器を使用して行う。これに関連して、あらかじめ無菌化したとは、本発明の方法において使用する前に容器を無菌化することを意味し、例えば、容器は、例えば、ガンマ線照射によって、容器の製造者により無菌化し得る。本発明の一部の実施形態では、混合容器は、使い捨てであるか、または単回使用であり得る。本発明の方法は、混合容器としてプラスチックバッグを使用して行われ得ることがさらに企図される。プラスチックバッグは、方法の揺動ステップにおいてトランスフェクションマスターミックスがバッグから漏れないように密封することが可能であり得ることが企図される。方法は、市販の細胞培養バッグを使用して行われ得る。細胞培養バッグは、真核細胞の培養のためのバイオリアクターとして適合している無菌の単回使用のバッグである。本発明における使用のための例示的な細胞培養バッグとしては、バッグ容量が２０Ｌおよび５０ＬのＣＨＥＭｃｅｌｌ（登録商標）６または８ポート細胞培養バッグ（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ社）；バッグ容量が２０Ｌ、５０Ｌ、２００Ｌおよび６００ＬのＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）ＣｕｌｔｉＢａｇｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）；バッグ容量が１０Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、５０Ｌ、５００Ｌおよび１０００ＬのＣｅｌｌｂａｇ（商標）Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ（ＧＥ社）；ならびにバッグ容量が１０Ｌ、２５Ｌおよび５０ＬのＳｍａｒｔＢａｇｓ（Ｆｉｎｅｓｓｅ社）が挙げられる。
【００３３】
Ｅ．マスターミックスの質を決定する方法
ヘルパーウイルスを使用しないｒＡＡＶの一過性トランスフェクションによる生成は、トランスフェクションマスターミックスの質の代用として使用することができる。図１は、例示的ｒＡＡＶ生成プロセスの図式的描写を提供する。ｒＡＡＶベクターは、完全なｒＡＡＶの生成に必要な遺伝子を含む３つのプラスミド：目的の遺伝子に隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含むｃｉｓプラスミド（プロモーターおよび導入遺伝子を一般に包含する）、ＡＡＶ複製遺伝子およびＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）をコードする遺伝子を含むｔｒａｎｓ−ｒｅｐ−ｃａｐプラスミド、ならびにｒＡＡＶウイルス複製を促進するアデノウイルスまたは他のヘルパーウイルス遺伝子を含むヘルパープラスミドをパッケージング細胞に同時トランスフェクトすることにより生成する。適するパッケージング細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ａ５４９、ＢＨＫまたはＶｅｒｏ細胞を包含する。３つのプラスミドは、適する培地に溶解して本発明の方法における使用のためのＤＮＡ溶液を作製し、トランスフェクション試薬溶液と組み合わせてマスターミックスを作製する。次いで、マスターミックスは、混合し、所望されるようにインキュベートする。インキュベーション後、マスターミックスは、例えば、約５％〜６．５％ｖｏｌ．／ｖｏｌ．（ｖ／ｖ）で培養中のパッケージング細胞に加える。次いで、トランスフェクトしたパッケージング細胞は、３〜５日間培養し、その後、ｒＡＡＶ粒子を採取する。ｒＡＡＶ粒子は、細胞を溶解することによりパッケージング細胞から得ることができる。パッケージング細胞の溶解は、細胞を化学的または酵素的に処理してウイルス粒子を放出する方法により達成することができる。このような方法は、ヌクレアーゼ、例えば、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）もしくはＤＮＡｓｅ、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、または洗剤もしくは界面活性剤の使用を包含する。物理的破壊、例えば、均質化もしくは粉砕、または細胞に加圧するマイクロフルイダイザーによる圧力の適用、あるいは凍結解凍サイクルをまた使用することができる。あるいは、上清は、細胞溶解の必要なく、パッケージング細胞から採取することができる。
【００３４】
ｒＡＡＶ力価は、マスターミックスの質の尺度として使用する。ｒＡＡＶ力価は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０巻、１０３１〜１０３９頁（１９９９年））を包含する、多数の方法を使用して定量化することができる。ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（ＤＲＰ−ｑＰＣＲ）によりサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（例えば、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ９６ウェルブロック形式サーモサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））において定量化する。この技術では、ｒＡＡＶ粒子を含む試料は、ＤＮａｓｅＩ（１００Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の存在下に３７℃で６０分間インキュベートし、その後、５０℃で６０分間プロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）消化（１０Ｕ／ｍｌ）を行い、次いで、９５℃で３０分間変性させる。使用するプライマーとプローブのセットは、ｒＡＡＶベクターゲノムの非天然の部分、例えば、目的のタンパク質のポリ（Ａ）配列に特異的でなければならない。ＰＣＲ産物は、プライマー、プローブ、および増幅する配列の長さおよび組成に基づいて、サイクリングパラメータの適切な任意のセットを使用して増幅することができる。代替プロトコルは、例えば、Ｌｏｃｋら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２５巻（２号）：１１５〜１２５頁（２０１４年）に開示されている。
【００３５】
特定の要素を有する、包含する、もしくは含むものとして器具、デバイス、およびシステムを説明するか、または特定のステップを有する、包含する、もしくは含むものとしてプロセスおよび方法を説明する記載を通じて、列挙する要素から本質的になる、もしくはそれからなる本発明の器具、デバイス、およびシステムがさらに存在し、列挙するプロセスステップから本質的になる、もしくはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが企図される。
【００３６】
本発明の実施は、前述の例からより十分に理解され得る。これらは、例示目的のみのために本明細書において示し、決して本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）
本発明の方法は、以下の例示的な実施形態により達成することができ、これはまた、図２に示す。
１．ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬溶液を、溶液ビンまたは適切な他の容器においてトランスフェクション培地または水中に調製する。
２．溶液を調製フラスコから内径（ＩＤ）３／８”のチューブにより０．２μｍのフィルターを通して無菌バッグ内にポンプで注入することにより各溶液を別々に無菌化する。
３．ＤＮＡ溶液およびトランスフェクション試薬溶液を含む無菌バッグをそれぞれ２０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）バイオリアクターチェンバー（「ｃｅｌｌｂａｇ」）の３／８”ＩＤのチューブの配線に無菌的に溶接する。ｃｅｌｌｂａｇをＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  ＷＡＶＥ（商標）２５Ｒｏｃｋｅｒ（「ＷＡＶＥ  ｒｏｃｋｅｒ」）の揺動プラットフォーム上に配置して膨張させ、無菌バッグをｃｅｌｌｂａｇに接続する配線を閉塞するクランプとともに、ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬溶液を含む各無菌バッグをｒｏｃｋｅｒの２〜３フィート上に吊るす。
４．ＤＮＡ溶液を含む無菌バッグをｃｅｌｌｂａｇに接続する配線を閉塞するクランプを開き、重力送りを介して、またはポンプによりＤＮＡ溶液をｃｅｌｌｂａｇに注入させる。
５．ＤＮＡ溶液をｃｅｌｌｂａｇへ追加後、トランスフェクション試薬溶液を含む無菌バッグをｃｅｌｌｂａｇに接続する配線を閉塞するクランプを開き、重力送りを介して、またはポンプによりトランスフェクション試薬溶液をｃｅｌｌｂａｇに注入させて、トランスフェクションマスターミックスを形成する。
６．トランスフェクション試薬溶液をｃｅｌｌｂａｇへ追加した直後に、混合プログラムを開始する。トランスフェクションマスターミックス３Ｌを１分間、１０ｒｐｍで揺動角７°により混合することができ、トランスフェクションマスターミックス１２Ｌを１分間、１５ｒｐｍで揺動角１２°により混合することができる。
７．混合プログラムの完了後、ＷＡＶＥ  ｒｏｃｋｅｒを停止し、マスターミックスを２０分間のインキュベーション時間の間、室温で、ｃｅｌｌｂａｇを移動することもマスターミックスをさらに撹拌することもなく静置する。
８．インキュベーション時間の完了後、マスターミックスを含むｃｅｌｌｂａｇを重力送りまたはポンプによりバイオリアクターに加える。重力送り（Ａ）では、マスターミックスを含むｃｅｌｌｂａｇは、トランスフェクション用の細胞を含むバイオリアクターの２〜３フィート上に穏やかに配置することができ、ｃｅｌｌｂａｇからの導入配線を、バイオリアクターの追加配線に無菌的に溶接してクランプを外し、マスターミックスを重力送りによりバイオリアクターに流入させる。ポンプ（Ｂ）では、ｃｅｌｌｂａｇは、バイオリアクターの追加配線に無菌的に溶接し、標的インキュベーション時間枠に十分にとどまる速度でリアクターにポンプで注入することができる。この速度は、トランスフェクションミックスの容量、チューブのサイズ、ポンプの種類およびサイズに依存する可能性があり、経験的に評価して、望ましくない任意の凝集体が形成されていないことを確認することができる。
９．バイオリアクターにおける細胞の大規模なトランスフェクションでは、マスターミックスの調製および追加は、繰り返して、いくつかのトランスフェクション混合物のバッチによる追加を順次または並行して可能とし、より大容量のバイオリアクターの適切なトランスフェクションを可能とすることができる。本発明は、２０００Ｌまたはそれよりも大規模なバイオリアクターのためのトランスフェクション混合物の調製を可能とし得ることが想定される。
【００３８】
（実施例２）
トランスフェクションマスターミックスを調製するための方法を比較した。ＰＥＩ−ＭＡＸ４０ｋＤａ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を２０、４０および８０μｇ／ｍｌの濃度でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）に溶解することによりＰＥＩ溶液を作製した。図１に示すように、ｃｉｓ  ｒＡＡＶプラスミド、ｔｒａｎｓ−ｒｅｐ−ｃａｐプラスミド、およびヘルパープラスミドを１０、２０および４０μｇ／ｍｌの濃度でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａに溶解することによりＤＮＡ溶液を調製した。１００ｍｌのビン、または２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコのいずれかにおいて、表１に従ってＰＥＩ溶液５０ｍｌをＤＮＡ溶液５０ｍｌに注ぐことによりによりマスターミックス試料を調製した。
【表１】
2020519258.tif 000003
【００３９】
ＰＥＩ溶液をＤＮＡ溶液へ追加後、マスターミックス試料を１０回の反転により手動で混合し、その後、２０分、室温でインキュベートした。
【００４０】
インキュベーション時間の後、各マスターミックス１０ｍｌ、５ｍｌまたは２．５ｍｌをそれぞれ表１に示すように、生成培地（８ｍＭのＬグルタミンおよび０．５ｇ／Ｌのプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）を添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ）１００ｍｌ中にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ社）を均一密度で含むエルレンマイヤー振盪フラスコに加えた。細胞を５日間培養し、その後、ＤＮＡｓｅ耐性粒子ｑＰＣＲアッセイを使用してｒＡＡＶ力価を測定した。
【００４１】
この実験の結果を図３Ａに示す。各トランスフェクションミックスを１０％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖまたは２．５％ｖ／ｖのいずれかでそれぞれ細胞培養物に加えて、等しい総量のＤＮＡおよびＰＥＩを培養物に送達した。各条件の結果は、２回の反復の平均であり、各エラーバーは、標準偏差を表す。高濃度のＤＮＡ（４０μｇ／ｍｌ）およびＰＥＩ（８０μｇ／ｍｌ）で調製したトランスフェクションマスターミックスは、低濃度の混合物（１０μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび２０μｇ／ｍｌのＰＥＩ）と比較して顕著に高いｒＡＡＶ収量をもたらした。しかし、より希薄なトランスフェクションマスターミックスと比較して、ＤＮＡおよびＰＥＩが高濃度である試料において、目に見える沈殿物が、より容易に、特に、より短いインキュベーション時間で、混合条件に対してより感受性に生じたことが観察された。
【００４２】
（実施例３）
トランスフェクション混合物および後続のｒＡＡＶ生成に対する混合速度の影響を検討するために、４０μｇ／ｍｌのＰＥＩおよび２０μｇ／ｍｌのＤＮＡのトランスフェクション混合物を、手動による１０回の反転の後、室温での２０分のインキュベーション、振盪プラットフォーム上で１００ｒｐｍ、２０分間の穏やかな撹拌により、または振盪プラットフォーム上で１５０ｒｐｍ、２０分間の激しい撹拌のいずれかにより調製した。いずれの場合も振盪プラットフォームの軌道直径は、１９ｍｍであった。
【００４３】
この実験の結果を図３Ｂに示す。１０回の反転または穏やかな撹拌により混合したマスターミックスは、激しい撹拌処理と比較して顕著に高いｒＡＡＶ収量をもたらした。激しい撹拌を受けた試料において、目に見える沈殿物が生じたことが観察された。
【００４４】
（実施例４）
ｒＡＡＶ生成に対するインキュベーション時間の作用を検討するために、マスターミックス１００ｍｌを、それぞれを１０回の反転により混合したことを除いて、実施例３に記載のように調製し、マスターミックス試料を、上記のように細胞のトランスフェクションに使用する前に、５分間、２０分間、１時間、または３時間のいずれかでインキュベートした。
【００４５】
この実験の結果を図３Ｃに示す。１０回の反転後にインキュベートしたマスターミックスにより、ｒＡＡＶ生成の最適インキュベーション時間が２０分〜１時間の間であったことが示された。この時間枠（例えば、５分のインキュベーション）未満では、複合体は、十分には形成されない可能性があり、したがって、トランスフェクション効率が低下した。この時間枠（例えば、３時間のインキュベーション）以降では、目に見える沈殿物が形成された。これは、複合体間の凝集が始まったことを示し、またこれにより、トランスフェクション効率が低下した。
【００４６】
（実施例５）
２０Ｌおよび５０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）バイオリアクターチェンバーならびにＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  ＷＡＶＥ（商標）２５Ｒｏｃｋｅｒシステムを使用する混合条件を試験して、マスターミックス生成の最適条件を見出した。２０Ｌおよび５０ＬのＷａｖｅ  Ｃｅｌｌｂａｇ（商標）バイオリアクターチェンバー（「ｃｅｌｌｂａｇ」）（ＧＥ社）を揺動プラットフォームであるＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  ＷＡＶＥ（商標）２５Ｒｏｃｋｅｒ（「ＷＡＶＥ  ｒｏｃｋｅｒ」）（ＧＥ社）上に配置し、４Ｌ、１２Ｌもしくは１５Ｌ（２０Ｌのｃｅｌｌｂａｇ中）または２５Ｌ、２６．５Ｌもしくは２９Ｌ（５０Ｌのｃｅｌｌｂａｇ中）の容量の水で満たした。バッグの膨張を必要とする条件では、バッグが吸気フィルターの配線を介して十分に膨張するまで、ＨＭＩによりエアーオーバーレイをオンにした。
【００４７】
時間０において、ｃｅｌｌｂａｇに４００ｇ／Ｌまたは１００ｇ／Ｌいずれかのグルコース溶液を、４ｇ／Ｌグルコースの最終バルク流体濃度を生じるのに必要な容量、ｃｅｌｌｂａｇの注入ポートを介して添加した。ｃｅｌｌｂａｇの略図を図５に示す。グルコース追加の直後に、時間０での試料をシリンジ試料採取ポートから採取した。時間０での試料の後、表２および３に列挙する、２０Ｌのｃｅｌｌｂａｇまたは５０Ｌのｃｅｌｌｂａｇについてのあらかじめプログラムした混合条件に従って、それぞれ揺動を開始した。試料採取ポートから一定の間隔で試料を採取し、ＡＢＬ９０Ｂｌｏｏｄ  Ｇａｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  Ａｍｅｒｉｃａ社）を使用して、図４に示すようにグルコース濃度を測定した。バルク流体グルコース濃度が４ｇ／Ｌまたはその付近で安定するまで混合および試料採取を継続した。各条件の混合時間は、最終的に採取したグルコース濃度（約４ｇ／Ｌ）の継続的に安定な測定を達成するのにかかった時間により決定した。この方法は、より大容量のマスターミックスの最適な混合条件を見出すために適用することができる。
【００４８】
【表２】
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【表３】
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【００４９】
種々の揺動パラメータの結果を図４Ａ、パネル（ｉ〜ｘｉ）および図４Ｂ、パネル（ｉ〜ｖｉｉｉ）に示す。図４Ａは、評価した２０Ｌのｃｅｌｌｂａｇ条件の条件を示す。図４Ｂは、評価した５０Ｌのｃｅｌｌｂａｇ条件の条件を示す。各試料容量について、最短混合時間で定常状態（４ｇ／Ｌのグルコース）に達するパラメータを特定した。
【００５０】
（実施例６）
大および小規模混合プロトコルにより作製したマスターミックス試料間でトランスフェクション効率を比較した。大規模（１２Ｌ）マスターミックス生成は、次のように達成した：ＤＮＡ溶液（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ中に２０μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ）６ＬおよびＰＥＩ溶液（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ中に４０μｇ／ｍｌのＰＥＩ）６Ｌそれぞれを無菌溶液容器に調製し、０．２μｍのフィルターを通して個々の無菌バッグ内にポンプで注入した。次いで、ＰＥＩ溶液のバッグおよびＤＮＡ溶液のバッグをｃｅｌｌｂａｇ上の２つの別々の３／８”×５／８”配線上に溶接した。ｃｅｌｌｂａｇをＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  ＷＡＶＥ（商標）２５Ｒｏｃｋｅｒの揺動プラットフォームの上部に配置し、ＤＮＡおよびＰＥＩ溶液のバッグをｃｅｌｌｂａｇの２〜３フィート上に吊るした。次いで、ＤＮＡ溶液を、その後ＰＥＩ溶液を、ｃｅｌｌｂａｇに重力送りにより加えた。ＰＥＩの追加直後に、揺動を２分間、１５ｒｐｍおよび１２°の揺動角で開始した。混合後、ｃｅｌｌｂａｇを静止したｒｏｃｋｅｒ上に室温で維持し、次：１０分、２０分、３０分、４５分、６０分、および８０分のインキュベーション時間の後、アリコート５ｍｌを試料採取ポートからシリンジにより二重で取り出した。
【００５１】
小規模マスターミックス生成は、次のように達成した：上記のマスターミックス１２Ｌの生成に使用したものと同一のＤＮＡおよびＰＥＩ溶液のバッグから４０μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液５０ｍｌと２０μｇ／ｍｌのＰＥＩ溶液５０ｍｌとを組み合わせることによりマスターミックスの試料１００ｍｌを調製した。小規模マスターミックスを１０回の反転により混合し、室温で経時的にインキュベートした。アリコート５ｍｌを２つ、１０分、３０分、および６０分のインキュベーション時間に取り出した。各アリコート５ｍｌを５％ｖ／ｖの追加で（１μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび２μｇ／ｍｌのＰＥＩの最終濃度として）１００ｍｌの振盪フラスコ培養物のパッケージング細胞に加えた。細胞を５日間培養し、その後、ＤＮＡｓｅ耐性粒子ｑＰＣＲアッセイを使用してｒＡＡＶ力価を測定した。図６は、トランスフェクションマスターミックスのインキュベーション時間の関数として細胞において生じたｒＡＡＶ力価を示し、トランスフェクションマスターミックスが、大規模な混合方法とその後に行った２０〜３０分のインキュベーションにより作製され、同様に、マスターミックスが、小規模な混合方法により作製されたことを示す。
【００５２】
（実施例７）
トランスフェクションミックスのポンプによる送達を試験するために、トランスフェクション混合物４Ｌを、ＤＮＡ溶液２Ｌを、その後ＰＥＩ溶液２Ｌを、２０Ｌのｃｅｌｌｂａｇに重力送りにより追加することによって調製した。ＰＥＩの追加直後に、揺動を１分間、１０ｒｐｍおよび７°の揺動角で開始した。波動最適化した混合の後、ｃｅｌｌｂａｇを静止したｒｏｃｋｅｒ上に室温で２０分間維持した。インキュベーション時間の後、トランスフェクション混合物４Ｌのアリコート１Ｌを、３／８”×５／８”のチューブから１Ｌの試料容器内に重力送りにより取り出すか、または１Ｌ／分、２Ｌ／分もしくは４Ｌ／分で蠕動ポンプにより注入した。アリコート４．６ｍｌを２つ、２８分、５０分、８０分、および１１０分後に１Ｌの各試料容器から取り出した（重力送り、１Ｌ／分、２Ｌ／分、または４Ｌ／分）。各アリコートを３０ｍｌの振盪フラスコ培養物のパッケージング細胞に均一密度で加えた。細胞を５日間培養し、その後、ＤＮＡｓｅ耐性粒子ｑＰＣＲアッセイを使用してｒＡＡＶ力価を測定した。図７は、重力送りまたはポンプ注入後のインキュベーション時間の関数としてｒＡＡＶ力価を示し、重力送りまたは１Ｌ／分、２Ｌ／分もしくは４Ｌ／分でのポンプ注入による送達によって、生じるｒＡＡＶ力価には殆ど違いがもたらされないことを示す。これまでに観察されたように、トランスフェクションマスターミックスを細胞培養物へ追加するタイミングは重要であり、早い時間（２８分のインキュベーション）に追加すると、後の時間に追加するよりもｒＡＡＶ力価は高くなる。
【００５３】
（実施例８）
手動で調製した大規模マスターミックスと、Ｗａｖｅ  Ｒｏｃｋｅｒを使用して調製した大規模マスターミックスとの間でトランスフェクション効率を比較した。ＰＥＩおよびＤＮＡ溶液を上記のように調製した。手動調製を次のように達成した：ＤＮＡ溶液２Ｌを、その後ＰＥＩ溶液２Ｌを、５ＬのＢｉｏｔａｉｎｅｒのバッグ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）内にポンプで注入した。次いで、バッグの両端を手動で交互に上げ下げすることにより溶液を２分間混合した。ＰＥＩおよびＤＮＡ溶液をｃｅｌｌｂａｇ内に３Ｌまたは１２Ｌの最終容量まで重力送りし、１０ｒｐｍおよび７°の揺動角（３Ｌについて）または１５ｒｐｍおよび１２°の揺動角（１２Ｌについて）のいずれかで２分間混合することにより波動最適化した混合を達成した。次いで、混合後、トランスフェクションミックス試料を室温で２０〜３０分間インキュベートし、６．５％ｖ／ｖの追加により５０Ｌの培養物のパッケージング細胞のトランスフェクションに使用した。その後、ＤＮＡｓｅ耐性粒子ｑＰＣＲアッセイによりｒＡＡＶ力価を測定した。ｒＡＡＶ力価（ＧＣ／ｍｌ）をトランスフェクション時の生細胞密度（生細胞／ｍｌ）により正規化して種々の培養容量にわたる比較を可能とした。図８は、機械的揺動により生成したトランスフェクションマスターミックスでは、手動混合と比較してｒＡＡＶ力価が顕著に高かったことを示す。
【００５４】
（実施例９）
機械的揺動によりトランスフェクションミックスを生成する方法の再現性を試験するために、トランスフェクションマスターミックス１２Ｌを、このトランスフェクション混合物容量について上記の重力送り波動方法を使用してＰＥＩ溶液６ＬおよびＤＮＡ溶液６Ｌを混合することにより生成した。次いで、２００Ｌの培養物のパッケージング細胞に追加する前に、ミックスを２０分間室温でインキュベートした。次いで、ＤＮａｓｅ耐性粒子ｑＰＣＲアッセイによりｒＡＡＶ力価を測定した。各実行では、２回の反復（平均および標準偏差を示した）を含み、同一の実験をさらに４回行った。図９は、５回の実行によるｒＡＡＶ力価を示し、実行２〜実行５は、実行１から生じた平均力価に対して正規化した。
【００５５】
参照による組込み
本明細書において言及する、特許および科学文献のそれぞれの全開示は、すべての目的において参照により組み込まれる。
【００５６】
均等物
本発明は、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなく、特定の他の形態において実施することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の発明を制限するのではなく、あらゆる点で例示的であると考えられる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく、添付の特許請求の範囲により示され、本特許請求の範囲の均等性の意義および範囲において生じるすべての変更は、その特許請求の範囲に包含することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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