【手続補正書】
【提出日】平成29年8月15日(2017.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＷＭＶ及びＺＹＭＶに対する耐性を方向づける少なくとも２種の劣性遺伝的決定因子を含む、栽培されたペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）植物であって、前記少なくとも２種の劣性遺伝的決定因子が、以下、
ａ）前記遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位ＺＮであって、前記ＺＹＭＶに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能であるマーカ遺伝子座位ＺＮ、および／または
ｂ）前記遺伝的決定因子マーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２であって、ＭＷＭＶ耐性形質を伴って同時分離し、かつ、それぞれ、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出において、および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能であるマーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２、ならびに／もしくは
ｃ）前記遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位Ｎｉ＋であって、前記ＺＹＭＶに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能であるマーカ遺伝子座位Ｎｉ＋、
を含むリストから選択され、
前記少なくとも２種の遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７として、ＮＣＩＭＢに寄託されている）のゲノムから得られることを特徴とするペポカボチャ植物。
【請求項２】
ＭＷＭＶ及びＺＹＭＶに対する耐性を方向づける４種の遺伝的決定因子を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記遺伝的決定因子が、相互に独立に分離する、請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
カボチャ植物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物から得られ得る植物材料であって、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養物、または特に植物に育成された場合に依然としてポティウイルス耐性表現型を示す前記植物のその他の部分または生成物を含み、それらに限定されないことを特徴とする植物材料。
【請求項６】
ＺＹＭＶおよびＭＷＭＶ耐性カボチャ植物を育成できることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のカボチャ植物の種子。
【請求項７】
ＺＹＭＶおよびＭＷＭＶ耐性カボチャ植物を育成するための請求項６に記載の種子の使用。
【請求項８】
ＺＹＭＶおよびＭＷＭＶに対する耐性を方向づける少なくとも２種の劣性遺伝的決定因子を含むカボチャ植物の種子を得る方法であって、
ａ）ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対する耐性を方向づける前記遺伝的決定因子を含む第１のカボチャ植物を得る工程、
ｂ）前記第１のカボチャ植物と第２のカボチャ植物とを交雑する工程であって、前記第２のカボチャ植物が、前記遺伝的決定因子を欠いている工程、
ｃ）ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対する高い耐性を示し、かつ前記ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶ耐性を伴って同時分離する少なくとも１種のＤＮＡマーカを含む、交雑に由来する植物を同定する工程、および
ｄ）前記ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶ耐性を伴って同時分離する少なくとも１種のＤＮＡマーカを含む子孫種子を前記交雑から収穫する工程、
を含み、
前記遺伝的決定因子が、以下、
i）前記遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位ＺＮであって、前記ＺＹＭＶに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能であるマーカ遺伝子座位ＺＮ、および／または
ii）前記遺伝的決定因子マーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２であって、ＭＷＭＶ耐性形質を伴って同時分離し、かつ、それぞれ、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出において、および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能であるマーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２、ならびに／もしくは
iii）前記遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位Ｎｉ＋であって、前記ＺＹＭＶに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能であるマーカ遺伝子座位Ｎｉ＋、
を含むリストから選択されることを特徴とする方法。
【請求項９】
ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対する耐性を示すカボチャ植物の生産方法であって、
ａ）ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対する耐性を方向づける少なくとも２種の劣性遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を選抜する工程であって、前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７として、ＮＣＩＭＢに寄託されている）のゲノムから入手され、
前記遺伝的決定因子が、以下、
i）前記遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位ＺＮであって、前記ＺＹＭＶに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能であるマーカ遺伝子座位ＺＮ、および／または
ii）前記遺伝的決定因子マーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２であって、ＭＷＭＶ耐性形質を伴って同時分離し、かつ、それぞれ、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号９および／または配列番号１０による検出において、および／または配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能であるマーカ遺伝子座Ｗ１および／またはＷ２、ならびに／もしくは
iii）前記遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位Ｎｉ＋であって、前記ＺＹＭＶに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能であるマーカ遺伝子座位Ｎｉ＋、
を含むリストから選択される工程、
ｂ）工程ａ）の前記植物と、ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対して感受性であるか、または、ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対して中レベルの耐性を示すカボチャ植物とを交雑させる工程；ならびに
ｃ）ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対する耐性表現型を示す子孫を前記交雑から選抜する工程であって、前記耐性表現型は、工程ａ）の前記１種のマーカ遺伝子座を伴って分離する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対して耐性であるカボチャのハイブリッド種子を産生する方法であって、
ａ．雄性不稔性雌植物および雄性稔性植物を植える工程であって、前記雄性不稔性雌植物または雄性稔性植物の一方が請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物である工程、
ｂ．両方の系統間で他家受粉させる工程、
ｃ．前記植物を実どまりするまで育成する工程、
ｄ．前記果実を採取する工程、および
ｅ．前記ハイブリッド種子を得る工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶ耐性カボチャ植物を得る方法であって、
ａ．請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物と他の植物との交雑に由来する生育不能な種間胚芽を提供する工程、
ｂ．前記胚芽を救出する工程、
ｃ．工程ｂ）の前記胚芽から植物を再生する工程、および
ｄ．ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対して耐性である工程ｃ）の植物を選抜する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対する耐性を方向づける劣性遺伝的決定因子であって、前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）の前記ゲノムから入手され、
ａ）前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子が、マーカ遺伝子座位ＺＮであって、前記ＺＹＭＶに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号７および／または配列番号８による検出において、同定可能であり、および／または
ｂ）前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子が、マーカ遺伝子座Ｗ２であって、ＭＷＭＶ耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号１１および／または配列番号１２による検出において、同定可能であり、ならびに／または
ｃ）前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子が、マーカ遺伝子座位Ｎｉ＋であって、前記ＺＹＭＶに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、によるＤＮＡ断片の増幅によるＰＣＲ、続いて、配列番号１５および／または配列番号１６による検出において、同定可能である、
ことを特徴とする劣性遺伝的決定因子。
【請求項１３】
ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対する耐性を方向づける少なくとも２種の劣性遺伝的決定因子を含むカボチャ植物の同定方法であって、前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ（Ｃ．ｐｅｐｏ  ｃｖ．２６８ＮｉＷ）（その代表種子は受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１７２７でＮＣＩＭＢに寄託されている）のゲノムから入手され、前記ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶ耐性表現型の少なくとも１種を伴って同時分離し、かつ、以下、
i)  もしマーカ遺伝子座位が、ＺＮである場合には、配列番号７および／または配列番号８による検出を伴う、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、および／または
ii)  もしマーカ遺伝子座位が、Ｗ１である場合には、配列番号９および／または配列番号１０による検出を伴う、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、および／または
iii)  マーカ遺伝子座が、Ｗ２である場合には、配列番号１１および／または配列番号１２による検出を伴う、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、および／または
iv)  マーカ遺伝子座がＮｉ＋である場合には、配列番号１５および／または配列番号１６による検出を伴う、配列番号１３の順方向プライマーおよび配列番号１４の逆方向プライマー、
を含む少なくとも１対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによってＰＣＲにおいて同定できることを特徴とする方法。
【請求項１４】
ＭＷＭＶおよびＺＹＭＶに対し耐性であるカボチャ果実を得る方法であって、
ａ）請求項６に記載の植物の種子を播種する工程、および
ｂ）前記植物を育種して、果実を生産し、かつ前記植物によって生産された前記果実を収穫する工程、
を含むことを特徴とする方法。