(57)【要約】  本発明は、ＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質およびそれらの医薬的用途を提供する。さらに、本発明は、ＰＤ−Ｌ１抗体標的化部分およびＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメインを含む二官能性融合タンパク質、ＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに抗癌剤の製造におけるそれらの使用を提供する。
2020519289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化部分およびＴＧＦ−β受容体部分を含む、ＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質であって、ここで、該ＴＧＦ−β受容体部分が、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインのＮ末端切断型である、ＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項２】
ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインのＮ末端切断型が、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインのＮ末端の２６個またはそれより少ない個数の連続アミノ酸の欠失、好ましくは１４から２６個の連続アミノ酸の欠失、より好ましくは１４から２１個の連続アミノ酸の欠失、最も好ましくは１４、１９または２１個の連続アミノ酸の欠失を含む、請求項１に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項３】
ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインの配列が、配列番号１３に示されており、最も好ましくは、配列番号１４、１５または１６の配列を含む、請求項１または２に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項４】
標的化部分が、細胞特異的な標的化部分であり、好ましくは、癌細胞特異的な標的化部分である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項５】
癌細胞特異的な標的化部分が、抗体またはその抗原結合フラグメント、増殖因子、ホルモン、ペプチド、受容体およびサイトカインからなる群より選択される、請求項４に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項６】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、完全長抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、小抗体、二重特異性抗体、および三重特異性抗体またはそれらの混合物からなる群より選択される、請求項５に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項７】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、免疫チェックポイント分子、ＣＤ３３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ１５２、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−５、ＩＬ−１７、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１、ＩＬ−２Ｒ、ＢＬＹＳ、ＰＣＳＫ９、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＲＳＶＦ、ＩｇＥ、ＲＡＮＫ、ＢＬｙＳ、α４β７、ＰＤ−１、ＣＣＲ４、ＳＬＡＭＦ７、ＧＤ２、ＣＤ２１、ＣＤ７９ｂ、ＩＬ２０Ｒα、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７２、ＩＧＦ−１ＲおよびＲＡＮＫＬからなる群より選択されるポリペプチドまたはタンパク質の１以上に結合し、好ましくは該抗体またはその抗原結合フラグメントが、免疫チェックポイント分子に結合する、請求項５または６に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項８】
抗体が抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり、好ましくは、該抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９およびＭＰＤＬ３２８０Ａからなる群より選択されるか、または配列番号１のＨＣＤＲ１もしくはその変異体；配列番号２のＨＣＤＲ２もしくはその変異体；配列番号３のＨＣＤＲ３もしくはその変異体；配列番号４のＬＣＤＲ１もしくはその変異体；配列番号５のＬＣＤＲ２もしくはその変異体；および配列番号６のＬＣＤＲ３もしくはその変異体からなる群より選択される１以上のＣＤＲを含む、請求項５から７のいずれか一項に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項９】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、キメラ抗体もしくはその機能的フラグメント、ヒト化抗体もしくはその機能的フラグメント、またはヒト抗体もしくはその機能的フラグメントである、請求項５から８のいずれか一項に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項１０】
ヒト化抗体が、配列番号７の重鎖可変領域、好ましくは配列番号９の重鎖可変領域を含む、請求項９に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項１１】
ヒト化抗体が、配列番号１１の重鎖をさらに含む、請求項９に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項１２】
ヒト化抗体が、配列番号８もしくは配列番号１０の軽鎖可変領域またはそれらの変異体を含む、請求項９に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項１３】
ヒト化抗体が、配列番号１２の軽鎖を含む、請求項９に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項１４】
ＴＧＦ−β受容体を含む融合タンパク質が、一般式（Ｉ）：
Ａｂ−Ｌ−ＴＧＦ−βＲＩＩ ＥＣＤ    （Ｉ）
で示され、
式中、ＴＧＦ−βＲＩＩ ＥＣＤは、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインの切断型であり、Ａｂは抗体であり、Ｌはリンカーである、
請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項１５】
リンカーが（Ｇ４Ｓ）ｘＧであり、式中、ｘは３から６であり、好ましくは４から５である、請求項１４に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質。
【請求項１６】
治療的有効量の請求項１から１５のいずれか一項に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞であって、該宿主細胞が、細菌、酵母および哺乳動物細胞からなる群より選択され、好ましくは哺乳動物細胞である、細胞。
【請求項２０】
腫瘍の処置のための医薬の製造を目的とする、好ましくはＰＤ−Ｌ１介在性腫瘍、より好ましくはＰＤ−Ｌ１を発現する癌を処置するための医薬の製造を目的とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質または請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
治療的有効量の請求項１から１５のいずれか一項に記載のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質または請求項１６に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、腫瘍の処置方法または予防方法。
【請求項２２】
ＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメインが、配列番号１３のＮ末端の２６個またはそれより少ない連続アミノ酸の欠失、好ましくはＮ末端の１４から２６個の連続アミノ酸の欠失、より好ましくはＮ末端の１４から２１個の連続アミノ酸の欠失を含み、最も好ましくはＴＧＦ−βＲＩＩの該切断型細胞外ドメインが、配列番号１４または配列番号１５の配列を含む、ＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメイン。
【請求項２３】
治療的有効量の請求項２２に記載のＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメイン、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
癌細胞増殖または転移に関連する疾患または障害の処置または阻害のための医薬の製造を目的とする、請求項２２に記載のＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメインまたは請求項２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２５】
治療的有効量の請求項２２に記載のＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメインまたは請求項２３に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、腫瘍の処置方法または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、腫瘍免疫療法剤の分野に関する。特に、本発明は、標的化分子および免疫調節因子（ＴＧＦ−βＲＩＩなど）を含む融合タンパク質を包含する、癌の処置のための融合タンパク質に関する。より具体的には、本発明は、標的化分子ＰＤ−Ｌ１抗体および免疫調節因子（ＴＧＦ−βＲＩＩなど）により形成される融合タンパク質、それを含む医薬組成物、ならびにそれらの抗癌剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌の処置において、人々は化学療法によって引き起こされる高い毒性、および薬剤耐性の癌細胞を産生する可能性のある悪影響を認識している。該処置が、腫瘍の生存に関連している過剰発現されたまたは活性化されたタンパク質を標的としたとしても、癌細胞は、変異することにより、標的療法により標的とされる経路への依存を減らすか、もしくは避けることができ、また他の経路により生存することができる。腫瘍免疫療法は、近年注目されており、癌処置の焦点となっている。薬剤耐性を獲得することは困難であり、これはこの療法の顕著な利点である。免疫学的理論および方法に基づき、腫瘍免疫療法は、主に、腫瘍細胞の免疫原性を増強し、そしてエフェクター細胞による細胞致死に対する感受性を高め、刺激し、抗腫瘍免疫応答を増強し、さらに宿主に免疫細胞およびエフェクター分子を注入して、腫瘍細胞を致死させ、腫瘍増殖を阻害するために免疫系を協調させる。
【０００３】
プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）は、ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞上に発現され、それは２つのリガンドＰＤ−Ｌ１（プログラムされた細胞死リガンド１）およびＰＤ−Ｌ２を有する。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞上のＰＤ−１と相互作用し、免疫応答の負の調節に重要な役割を果たす。タンパク質ＰＤ−Ｌ１の発現は、多くのヒト腫瘍組織で検出され得る。腫瘍微小環境は、腫瘍細胞上でＰＤ−Ｌ１の発現を誘導し得る。ＰＤ−Ｌ１の発現は、腫瘍の発生および増殖に有利であり、抗腫瘍Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路阻害剤は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を阻止し、負の調節シグナルを阻害し、そしてＴ細胞活性を回復させて免疫応答を高める。従って、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を標的とする免疫調節は、腫瘍抑制に重要である。
【０００４】
形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）は、細胞の増殖および分化を制御するＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する。ＴＧＦ−βは、２つのタイプＩおよび２つのタイプＩＩの膜貫通セリン／スレオニンキナーゼ受容体で構成されるヘテロ四量体受容体複合体を介してシグナルを伝達する。
【０００５】
ＴＧＦ−βは、細胞依存的または背景依存的方法で腫瘍抑制作用または腫瘍促進作用を発揮する多機能性サイトカインである。ＴＧＦ−βシグナル伝達の腫瘍抑制効果は、複数の遺伝子の発現を誘導する能力によるものである。腫瘍の発達中に変異または後成的な修飾が生じ、癌細胞は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害に徐々に耐性を獲得し、最終的に腫瘍の発生が引き起こされる。
【０００６】
本試験において、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を阻害することは、腫瘍の転移を低減できることが見いだされた。切断型Ｓｍａｄ２／３ドミナントネガティブ変異体は、乳癌細胞株のＴＧＦ−βシグナル伝達経路を阻害するために用いられ、腫瘍細胞の転移能を阻害することが見いだされた。直腸癌のマイクロサテライト不安定性の研究で、ＴＧＦ−βＲＩＩの不活性変異が転移を減少させ、術後生存期間を延長することが見いだされた。しかしながら、一般的に、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤の単独使用は、臨床治療において効果が低く、これは主に腫瘍細胞におけるＴＧＦ−βの高発現およびシグナル伝達経路阻害剤のバイオアベイラビリティに関連すると思われる。
【０００７】
従って、腫瘍微小環境でのＴＧＦ−βの阻害および中和に基づくＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の阻害は、Ｔ細胞活性を回復させ、免疫応答を増強させ、そして腫瘍進行の抑制効果を改善し得る。ＰＤ−Ｌ１抗体は、本発明者らの先の出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／１０４３２０によって提供されている。
【０００８】
今日までに、ＷＯ２００６０７４４５１Ａ２、ＷＯ２００９１５２６１０Ａ１、ＷＯ２０１１１０９７８９Ａ２、ＷＯ２０１３１６４６９４Ａ１、ＷＯ２０１４１６４４２７Ａ１、ＷＯ２０１５０７７５４０Ａ２、ＷＯ９３０９２２８Ａ１、ＷＯ９４０９８１５Ａ１、ＷＯ２０１５０７７５４０Ａ２、ＷＯ２０１５１１８１７５Ａ２に、抗体／ＴＧＦ−β受容体融合タンパク質が記載され、報告されている。しかしながら、一部の融合タンパク質には、依然として、不安定性または低発現性の問題がある。製造方法および臨床使用の両面においてよりよい性能を有する製品をさらに開発する必要が未だある。本発明は、製造上有益であり、より安定した性能をもたらす、技術的解決を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明は、標的化部分およびＴＧＦ−β受容体部分を含むＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質を提供し、ここで、ＴＧＦ−β受容体部分は、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインのＮ末端切断型である。
【００１０】
本発明の好ましい態様において、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインのＮ末端切断型は、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインのＮ末端の２６個またはそれより少ない数の連続アミノ酸の欠失、好ましくは１４から２６個の連続アミノ酸の欠失、より好ましくは１４から２１個の連続アミノ酸の欠失、最も好ましくは１４から２１個の連続アミノ酸の欠失を含む。非限定的例として、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインのＮ末端切断型は、配列番号１４または配列番号１５の配列を含む。
【００１１】
本発明の好ましい態様において、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインの配列は、配列番号１３に示されている。
【００１２】
本発明の好ましい態様において、標的化部分は、細胞特異的な標的化部分である。好ましくは、標的化部分は、癌細胞特異的な標的化部分である。
【００１３】
本発明の好ましい態様において、癌細胞特異的な標的化部分は、抗体またはその抗原結合フラグメント、増殖因子、ホルモン、ペプチド、受容体およびサイトカインからなる群より選択される。
【００１４】
本発明の好ましい態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、完全長抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、小抗体（small antibody）、二重特異性抗体、および三重特異性抗体またはこれらの混合物からなる群より選択される。
【００１５】
本発明の好ましい態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、免疫チェックポイント分子、ＣＤ３３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ１５２、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−５、ＩＬ−１７、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１、ＩＬ−２Ｒ、ＢＬＹＳ、ＰＣＳＫ９、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ６０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＲＳＶＦ、ＩｇＥ、ＲＡＮＫ、ＢＬｙＳ、α４β７、ＰＤ−１、ＣＣＲ４、ＳＬＡＭＦ７、ＧＤ２、ＣＤ２１、ＣＤ７９ｂ、ＩＬ２０Ｒα、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７２、ＩＧＦ−１ＲおよびＲＡＮＫＬからなる群より選択されるポリペプチドまたはタンパク質の１以上に結合する。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫チェックポイント分子に結合する。
【００１６】
本発明の好ましい態様において、抗体は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。好ましくは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９およびＭＰＤＬ３２８０Ａからなる群より選択されるか、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、以下からなる群より選択される１以上のＣＤＲまたはその変異体を含む：
ＨＣＤＲ１：    ＳＹＷＭＨ                                     配列番号１
ＨＣＤＲ２：    ＲＩ  Ｘ１ＰＮＳＧ  Ｘ２ＴＳＹＮＥＫＦＫＮ      配列番号２
ＨＣＤＲ３：    ＧＧＳＳＹＤＹＦＤＹ                           配列番号３
ＬＣＤＲ１：    ＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨ                 配列番号４
ＬＣＤＲ２：    ＡＡＳＮＬＥＳ                                 配列番号５
ＬＣＤＲ３：    ＱＱＳＦＥＤＰＬＴ                             配列番号６；
(式中、Ｘ１は、ＨまたはＧであり、好ましくはＧである。Ｘ２は、ＧまたはＦであり、好ましくはＦである。）
【００１７】
本発明の好ましい態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、キメラ抗体またはその機能的フラグメント、ヒト化抗体またはその機能的フラグメント、あるいはヒト抗体またはその機能的フラグメントである。
【００１８】
本発明の好ましい態様において、ヒト化抗体は、配列番号７の重鎖可変領域、好ましくは配列番号９の重鎖可変領域を含む。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、ヒト化抗体は、配列番号１１の重鎖をさらに含む。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、ヒト化抗体は、配列番号８もしくは１０の軽鎖可変領域またはそれらの変異体を含む。
【００２１】
本発明の好ましい態様において、ヒト化抗体は、配列番号１２の軽鎖を含む。
【００２２】
本発明の好ましい態様において、ＴＧＦ−β受容体を含む融合タンパク質は、一般式（Ｉ）に示されるとおりである：
Ａｂ−Ｌ−ＴＧＦ−βＲＩＩ ＥＣＤ     （Ｉ）
(式中、ＴＧＦ−βＲＩＩ ＥＣＤは、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインの切断型であり、Ａｂは抗体であり、Ｌはリンカーである）。
【００２３】
本発明の好ましい態様において、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｘＧ（式中、ｘは３−６であり、好ましくは４−５である。）である。
【００２４】
本発明はさらに、治療的有効量の上記のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、上記のＴＧＦ−β受容体を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、上記のＤＮＡ分子を含む発現ベクターを提供する。
【００２７】
本発明はさらに、上記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、ここで該宿主細胞は、細菌、酵母および哺乳動物細胞からなる群より選択され、好ましくは哺乳動物細胞である。
【００２８】
本発明はさらに、腫瘍の処置のための医薬の製造を目的とした、好ましくはＰＤ−Ｌ１介在性腫瘍、より好ましくはＰＤ−Ｌ１を発現する癌を処置するための医薬の製造を目的とした、上記のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質またはそれを含む医薬組成物の使用を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、治療的有効量の上記のＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、腫瘍を処置または予防する方法を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、ＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメインを提供し、ここで、該ＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメインは、配列番号１３のＮ末端の２６個またはそれより少ない個数の連続アミノ酸の欠失、好ましくはＮ末端の１４から２６個の連続アミノ酸の欠失、より好ましくはＮ末端の１４から２１個の連続アミノ酸の欠失を含む。ＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメインの限定されない例としては、配列番号１４または配列番号１５の配列が挙げられる。
【００３１】
本発明はさらに、治療的有効量の本発明のＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメイン、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、癌細胞増殖または転移と関連する疾患または障害の処置または阻害のための医薬の製造を目的とする、本発明のＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメインまたはそれを含む医薬組成物の使用を提供する。
【００３３】
本発明はさらに、治療的有効量の本発明のＴＧＦ−βＲＩＩの切断型細胞外ドメインまたはそれを含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、腫瘍の処置または予防方法を提供する。
【００３４】
本明細書に記載される腫瘍または癌は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頚部癌、肝臓癌、上咽頭癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌（Meck Cell carcinoma）、神経膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫および骨髄異形成症候群からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１：融合タンパク質の構造の模式図。
【図２】図２：インビトロでの、融合タンパク質のヒトＴＧＦ−β１への結合を示す結果。
【図３】図３：インビトロでの融合タンパク質のヒトＴＧＦ−β１への結合を示す結果。
【図４】図４：インビトロでの融合タンパク質のヒトＰＤ−Ｌ１への結合を示す結果。
【図５】図５：インビトロでの融合タンパク質によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の阻害の検出を示す結果。
【図６】図６：融合タンパク質は、用量依存的にＴＧＦβ誘導性ｐＳＭＡＤ３レポーター活性を阻害する。
【図７】図７：全ての融合タンパク質サンプルは、活性化Ｔリンパ球によるサイトカインＩＦＮ−γの分泌を促進する。
【図８】図８：腫瘍保持マウスの腫瘍重量に対する融合タンパク質の効果。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
用語
本発明をよりよく理解するために、特定の技術用語および科学用語を以下で具体的に定義する。本明細書中、特にこれと異なる定義がされない限り、本明細書で用いる全ての他の技術用語および科学用語は、一般的に、本発明の属する分野における当業者によって通常理解される意味を有する。
【００３７】
本明細書で用いる、アミノ酸の一文字表記および三文字表記は、J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558に記載されている。
【００３８】
本明細書で用いる“抗体”は、鎖間ジスルフィド結合により連結された２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖により形成される４つのペプチド鎖構造である免疫グロブリンを意味する。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸組成および配列を示し、それ故に、異なる抗原性を示す。従って、免疫グロブリンは、免疫グロブリンアイソタイプとも呼ばれる５つのカテゴリー、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥに分類され得る；それらの対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖、ε鎖である。ヒンジ領域のアミノ酸組成ならびに重鎖ジスルフィド結合の番号および位置に応じて、免疫グロブリンは異なるサブカテゴリーに分けることができ、例えばＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分けることができる。軽鎖は、異なる定常領域に基づいて、κ鎖またはλ鎖に分けることができる。これらの５つのカテゴリーのうちＩｇの各カテゴリーは、κ鎖またはλ鎖を含む。
【００３９】
本発明において、本明細書に記載の抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスのκ鎖、λ鎖またはそれらの変異体を含む、軽鎖定常領域をさらに含む。
【００４０】
本発明において、本明細書に記載の抗体重鎖は、ヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体を含む、重鎖定常領域をさらに含む。
【００４１】
抗体重鎖および軽鎖のＮ末端において、約１１０個のアミノ酸が大きく異なっており、それは可変領域（Ｆｖ領域）として知られている。Ｃ末端のアミノ酸配列は比較的安定であり、それは定常領域として知られている。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）および比較的保存された配列を有する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られ、抗体の特異性を決定する。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４の順に並ぶ、３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域からなる。３つの軽鎖ＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を意味する。３つの重鎖ＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を意味する。本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントのＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域におけるＣＤＲ領域のアミノ酸残基の番号および位置は、既知のＫａｂａｔの番号付け基準に準拠するか（ＬＣＤＲ１-３、ＨＣＤＲ２-３）、またはｋａｂａｔおよびｃｈｏｔｈｉａの番号付け基準に準拠する（ＨＣＤＲ１）。
【００４２】
本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体からなる群より選択される全長抗体を含み、好ましくはヒト化抗体である。
【００４３】
本発明における用語“マウス抗体”は、本発明の分野における知識および技術に応じて調製される抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を意味する。調製中、試験対象にＰＤ−Ｌ１抗原を注射し、その後、所望の配列または機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離した。本発明の好ましい態様において、マウスＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ鎖、λ鎖またはそれらの変異体の軽鎖定常領域をさらに含むか、あるいはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはそれらの変異体の重鎖定常領域をさらに含む。
【００４４】
用語“キメラ抗体”とは、マウス抗体誘導性免疫応答を緩和するために、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることにより形成される抗体である。キメラ抗体を確立するために、初めに、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを確立し、次に、可変領域遺伝子をマウスハイブリドーマ細胞からクローニングし、その後、ヒト抗体の定常領域遺伝子を必要に応じてクローニングし、マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子と連結させて、ヒトベクターに挿入できるキメラ遺伝子を形成し、最終的に、該キメラ抗体分子を真核生物または原核生物の生産システムで発現させる。本発明の好ましい態様において、ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体の軽鎖は、ヒトκ鎖、λ鎖またはそれらの変異体に由来する軽鎖定常領域をさらに含む。ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体に由来する重鎖定常領域（複数可）をさらに含む。ヒト抗体の定常領域（複数可）は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体に由来する重鎖定常領域（複数可）から選択され得て、好ましくはヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４に由来する重鎖定常領域、あるいはアミノ酸変異後のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞毒性）を有さないＩｇＧ４を含む。
【００４５】
用語“ヒト化抗体”は、ＣＤＲ移植抗体としても知られ、マウスＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域フレームワークに移植することによって作製される抗体、すなわち異なるタイプのヒト生殖系列抗体フレームワーク配列から作製された抗体を意味する。ヒト化抗体は、多数のマウス構成要素を含むキメラ抗体によって誘導される不利な強い抗抗体反応を克服する。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を網羅する公的なＤＮＡデータベース、または公開された文献から、入手することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、ヒト生殖系列配列データベース“ＶＢａｓｅ”（ウェブwww.mrccpe.com.ac.uk/vbaseで入手可能）および Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed で見ることができる。免疫原性の低下による活性の低下を避けるために、ヒト抗体の可変領域フレームワークは最小限の復帰突然変異を受けて活性を維持する。本発明のヒト化抗体はまた、ファージディスプレイによるＣＤＲ親和性成熟をさらに受けたヒト化抗体を含む。
【００４６】
用語“ヒト抗体”および“ヒト由来の抗体”は、互換的に用いられ、１以上の可変領域および定常領域が、ヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。好ましい態様において、可変領域および定常領域の全てはヒト免疫グロブリン配列に由来し、すなわち、“完全にヒト由来の抗体”または“完全ヒト抗体”である。これらの抗体は、ファージディスプレイ技術を含む様々な方法；ヒトＰＢＭＣ、脾臓またはリンパ節からのＢ細胞の単離；天然一本鎖ファージヒト抗体ライブラリーの構築；または、ヒト抗体軽鎖および重鎖を発現するトランスジェニックマウスの免疫化；および、こうして得られた抗体をスクリーニングすることにより、取得可能である。
【００４７】
本明細書で用いる“抗原結合フラグメント”または“機能的フラグメント”は、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント、ならびにヒトＰＤ−Ｌ１と結合するＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントを意味する。Ｆｖフラグメントは、全ての抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントであり、Ｆｖフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むが、定常領域を含まない。一般的に、Ｆｖ抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、抗原結合に必要な構造を形成する。また、異なるリンカーを用いて、２つの抗体の可変領域を連結させて、一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と称されるポリペプチドを形成することができる。本明細書で用いる用語“ＰＤ−Ｌ１との結合”とは、ヒトＰＤ−Ｌ１と相互作用する能力を意味する。本明細書で用いる用語、本発明の“抗原結合部位”とは、本発明の抗体または抗原結合フラグメントによって認識される、抗原上の不連続な三次元部位を意味する。
【００４８】
本明細書でも用いる用語“ＡＤＣＣ”は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性と称され、抗体のＦｃセグメントを認識することにより抗体でコーティングされた標的細胞を直接殺すＦｃ受容体を発現する細胞を意味する。抗体のＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧのＦｃセグメントを改変することで減少または排除できる。修飾とは、ＩｇＧ１のＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａから選択される突然変異；ＩｇＧ２／４キメラ；または、ＩｇＧ４のＦ２３４Ａ/Ｌ２３５Ａ突然変異など、抗体重鎖定常領域上の突然変異を意味する。
【００４９】
本発明の“突然変異配列”における“突然変異”には、“復帰突然変異”、“保存的修飾”または“保存的置換（conservative replacement or substitution）”が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中、“保存的修飾”または“保存的置換（conservative replacement or substitution）”は、タンパク質の生物学的活性を変えることなく頻繁に変更を加えることができるように、タンパク質中のアミノ酸の、類似の特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖の立体構造および剛性など）を有する他のアミノ酸での置換を意味する。当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed)を参照のこと）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低くなる。
【００５０】
本発明で用いる“突然変異配列”は、本発明のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が置換、挿入または欠失されていることを意味し、このようにして得られたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、本発明のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と種々のパーセンテージの同一性を有する。
【００５１】
本明細書で用いる“同一性”とは、２つの核酸配列間または２つのアミノ酸配列間の類似の程度を示す。本発明における配列同一性は、少なくとも８５％、９０％または９５％、好ましくは少なくとも９５％である。代表的な例としては、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％が挙げられるが、これらに限定されない。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、米国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Institute）のウェブサイトで利用できる、ＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのデフォルト設定を用いて、達成することができる。
【００５２】
本発明の“ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合タンパク質”には、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかが含まれ得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、商業的に入手可能であるか、または文献に開示されており、ＰＤ−Ｌ１抗体 ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ＵＳ２０１４３４１９１７、ＵＳ２０１３００３４５５９、ＵＳ８７７９１０８を参照のこと）などが挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、抗原結合活性を有するＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに抗原に結合するＦｖフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントが挙げられる。
【００５３】
例示的なＰＤ−Ｌ１抗体の製造方法としては、ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／１０４３２０を参照し、ＰＤ−Ｌ１抗体は以下の重鎖可変領域のＣＤＲを含む：
ＨＣＤＲ１：  ＳＹＷＭＨ                                  配列番号１
ＨＣＤＲ２：  ＲＩ Ｘ１ＰＮＳＧ Ｘ２ＴＳＹＮＥＫＦＫＮ     配列番号２
ＨＣＤＲ３：  ＧＧＳＳＹＤＹＦＤＹ                        配列番号３。
【００５４】
別の態様において、Ｘ１はＨまたはＧから選択され、Ｘ２はＧまたはＦから選択される。
【００５５】
別の態様において、本発明の例示的ＰＤ−Ｌ１抗体は、以下の軽鎖可変領域のＣＤＲ配列をさらに含む：
ＬＣＤＲ１：  ＲＡＳＥＳＶＳＩＨＧＴＨＬＭＨ        配列番号４
ＬＣＤＲ２：  ＡＡＳＮＬＥＳ                        配列番号５
ＬＣＤＲ３：  ＱＱＳＦＥＤＰＬＴ                    配列番号６。
【００５６】
別の態様において、上記のＣＤＲ領域は、ＣＤＲ移植によりヒト化されており、ヒト化軽鎖鋳型のＦＲは、ＩＧＫＶ７−３＊０１およびｈｊｋ２．１であり、ヒト化重鎖鋳型のＦＲは、ＩＧＨＶ１−４６＊０１およびｈｊｈ６．１であり、そしてヒト化可変領域配列は、以下の通りである：
ヒト化重鎖可変領域（配列番号７）:
【化１】
2020519289.tif 000003
ヒト化軽鎖可変領域（配列番号８）:
【化２】
2020519289.tif 000004
特記：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順であり、イタリック部分はＦＲ配列を示し、下線部分はＣＤＲ配列を示す。
【００５７】
別の態様において、本発明のヒト化抗体の復帰突然変異設計が実施された。以下の表を参照のこと：
【表１】
2020519289.tif 000005
特記：例えば、Ｙ９１Ｆは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って、位置９１でのＹからＦへの復帰突然変異を示す。
【００５８】
“移植”とは、マウス抗体ＣＤＲが、ヒト生殖系ＦＲ配列中に移植されたことを示している。
【００５９】
新規のヒト化抗体は、上記表に示される重鎖および軽鎖における変異の種々の組合せにより取得可能である。
【００６０】
本発明の別の側面において、ヒト化クローンの構築のための一態様は、以下のように提供される：
プライマーを設計し、各ヒト化抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントをＰＣＲで構築し、その後、完全長抗体発現ベクター：ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ−ｐＨｒ／ＶＫ−ＣＬ−ｐＨｒを構築するために、発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１−Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを含む）に挿入して、相同組換えを実施した。
【００６１】
１．プライマー設計：
オンラインソフトウェアＤＮＡＷｏｒｋｓ（ｖ３．２.２）（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて、組み換えに必要とされる遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫ：５’−３０ｂｐシグナルペプチド＋ＶＨ／ＶＫ＋３０ｂｐ ＣＨ１／ＣＬ−３’の合成のための複数のプライマーを設計した。
【００６２】
２．フラグメントスプライシング：
タカラバイオ株式会社（TaKaRa Company）製のプライマーＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼの取扱説明書に従って、上記のプライマーを用いて、組み換えに必要な遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫを、二段階のＰＣＲ増幅により得た。
【００６３】
３．発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを含む）の構築および酵素消化：
発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを含む）を、ある配列と制限部位の間の特徴的差異を認識するＢｓｍＢＩのようないくつかの特別な制限エンドヌクレアーゼを用いて、設計し、構築した。ＢｓｍＢＩはベクターを消化し、その後、消化されたフラグメントをゲルを用いて抽出して、以後の使用のために保存した。
【００６４】
４．発現ベクター ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ−ｐＨｒ／ＶＫ−ＣＬ−ｐＨｒの組換え構築
組み換えに必要とされる遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫおよびＢｓｍＢＩで消化された発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを含む）を、ＤＨ５Ｈコンピテント細胞に３：１の比で添加し、氷上にて０℃で３０分間インキュベートし、４２℃で９０分間熱ショックを与え、５倍容量のＬＢ培地を添加し、３７℃で４５分間インキュベートし、ＬＢ−Ａｍｐプレートに播種し、３７℃で一晩培養した。単一クローンを配列決定のために採取し、目的のクローンを得た。
【００６５】
５．プラスミドを本実施例の設計に従って構築した後、タンパク質を精製し、得られたタンパク質の親和性を、実施例ＳＰＲに記載の検出法により測定した。
【００６６】
６．最後に、ヒト化復帰突然変異体またはハイブリドーマ抗体のヒトＰＤ−Ｌ１−ｈｉｓへの親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥにより測定した。スクリーニングを介した、得られたヒト化復帰突然変異部位および配列の組合せは、以下の通りである：
重鎖可変領域（配列番号９）：
【化３】
2020519289.tif 000006
ここで、ＣＤＲ２は、配列番号７のＸ１がＧであり、Ｘ２がＦである配列である。
軽鎖可変領域（配列番号１０）：
【化４】
2020519289.tif 000007
特記：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順であり、イタリック部分はＦＲ配列を示し、下線部分はＣＤＲ配列を示す。
【００６７】
本発明の別の側面において、抗ＰＤ−Ｌ１ヒトＩｇＧ４タイプ抗体を構築および発現するための一態様を提供し、融合タンパク質構築物のために用いられるＰＤ−Ｌ１抗体をさらに提供する。ＰＤ−Ｌ１抗体はまた、本発明の試験例における対照分子として用いられ得る。
【００６８】
ＰＤ−Ｌ１は活性化Ｔ細胞でも発現されるため、野生型ＩｇＧ１定常領域の使用は、活性化Ｔ細胞の減少をもたらし得る、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどのＦｃ介在性作用を引き起こし得る。本発明は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣのない抗体を得るために変異ＩｇＧ４を選択する。親和性成熟により得られたクローンをＩｇＧ４タイプに変換し、Ｓ２２８Ｐ変異を含むＩｇＧ４のコアヒンジ領域、ならびにＦ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異をさらに導入した（ｍＡｂｓ ４：３、３１０−３１８；２０１２年５月／６月）。同時に、リンカーペプチド（ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインを連結するために用いられる）を導入したとき、抗体重鎖のＣ末端に生じる破損を避けるために、ＰＤ−Ｌ１抗体重鎖の最後のアミノ酸ＫをさらにＡに変異させて、融合タンパク質の安定性を高めた。融合タンパク質構築に用いられる本発明のＰＤ−Ｌ１抗体配列は、以下の通りである：
ＰＤ−Ｌ１抗体重鎖：ＩｇＧ４（ＡＡ） （Ｓ２２８Ｐ）（配列番号１１）
【化５】
2020519289.tif 000008
ＰＤ−Ｌ１抗体軽鎖（配列番号１２）：
【化６】
2020519289.tif 000009
註記：下線部分は、抗体重鎖または軽鎖の可変領域配列であるか、あるいはそれらをコードするヌクレオチド配列である；残りの部分は、抗体定常領域配列およびそれらをコードするヌクレオチド配列である。
【００６９】
本明細書で用いる、本発明の融合タンパク質は、ＤＮＡ組換え技術により２つの遺伝子を共発現することにより得られるタンパク質産物である。抗体および抗原結合フラグメントを産生および精製する方法は当技術分野で周知であり、例えば、“Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor”の第５−８章および第１５章に見出すことができる。例えば、マウスをヒトＰＤ−Ｌ１またはそのフラグメントで免疫化した後、得られた抗体を再生させ、精製し、そしてアミノ酸配列を当技術分野で周知の常套法を用いて配列決定することができる。抗原結合フラグメントもまた、常套法により作製可能である。本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体由来のＣＤＲを１以上のヒトＦＲ中に移植するよう操作される。ＭＯＥソフトウェアをを用いてＩＭＧＴヒト抗体可変領域生殖細胞系のデータベースに対してアライメントすることにより、ヒトフレームワーク生殖系配列を、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ウェブサイト http://imgt.cines.frから、または“The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351”から入手することができる。
【００７０】
本発明の改変された抗体または抗原結合フラグメントは、公知の方法を用いて調製および精製され得る。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローン化し、ＧＳ発現ベクターに組み込むことができる。次いで、改変された免疫グロブリン発現ベクターを、ＣＨＯ細胞中に安定的にトランスフェクトし得る。当分野で、より推奨される公知の方法として、哺乳動物発現系は、一般的に、Ｆｃ領域の高度に保存されたＮ末端部位で、抗体のグリコシル化をもたらし得る。ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体の発現により、安定なクローンが得られ得る。バイオリアクターでの抗体産生のために、陽性クローンを無血清培地で増殖させることができる。その中に抗体が分泌される培養培地を、常套法により精製することができる。例えば、培地を、適合する緩衝液で平衡化した、プロテインＡまたはＧ セファロースＦＦカラム上に負荷し得る。カラムを洗浄して、非特異的結合成分を除去する。結合抗体をｐＨ勾配により溶出し、抗体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出して、採取することができる。抗体を、通常の方法を用いて濾過および濃縮することができる。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除またはイオン交換などの一般的な方法で効果的に除去できる。生成物は、例えば−７０℃で直ちに凍結するか、または凍結乾燥してもよい。
【００７１】
本発明の“免疫調節分子”は、細胞の免疫寛容を緩和するために用いられ得る。本発明は、融合タンパク質における免疫調節分子としてＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインの切断型を用いる。“ＴＧＦ−β受容体ＩＩ（ＴＧＦ−βＲＩＩ）”は、リガンド ＴＧＦ−β１および３に高親和性で結合する。ＴＧＦ−β ＲＩＩ／ＴＧＦ−β複合体は、ＴＧＦ−β ＲＩを動員して、シグナル伝達複合体を形成する（Won et al, Cancer Res. 1999; 59: 1273-7）。ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインは、ＴＧＦ−βＲＩＩ 細胞外ドメインのＮ末端から１３６アミノ酸残基ペプチドであり、その一例は配列番号１３に示される。長さが約１３６アミノ酸で、かつＴＧＦ−βＲＩＩのヒト細胞外ドメインに由来する他の変異体はまた、ＴＧＦ−β１および３に結合することができ、本発明のＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインに属する。本発明は、ＴＧＦ−βＲＩＩ 細胞外ドメインのＮ末端連続切断型の構造および機能は、非切断型分子よりも安定であることを見い出した。ＴＧＦ−βＲＩＩ 細胞外ドメインのＮ末端非切断型を含む融合タンパク質（配列番号１３のアミノ酸１−１３６として示されるポリペプチド）は、切断に対して感受性である。特に、そのＮ末端の最大２６アミノ酸の欠失を含む切断型は、より安定であり、好ましくは１４−２６アミノ酸の切断型、より好ましくはより高い発現レベルを有する１４−２１アミノ酸の切断型であり、最も好ましくは、Ｎ末端の１９または２１連続アミノ酸の切断型である。
【００７２】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器または体液に適用される“投与”および“処置”は、外因性の医薬品、治療薬、診断薬または組成物の動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、または体液への接触を意味する。“投与”および“処置”は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究および実験方法を意味する場合がある。細胞の処置は、細胞への試薬の接触、ならびに流体が細胞と接触している場合の流体への試薬の接触を包含する。“投与”および“処置”はまた、インビトロおよびエクスビボ処置も意味し、例えば、細胞に対する処置、試薬、診断薬、結合化合物による処置、または別の細胞による処置も意味する。ヒト、家畜または研究対象に適用されるとき、“処置”とは、治療的処置、予防または予防的手段、研究および診断用途を意味する。
【００７３】
“処置”とは、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、該治療薬が既知の治療活性を有する１以上の疾患症状を有する患者に体内的に、または体外的に投与されることを意味する。一般的には、薬剤は、処置されるべき患者または患者集団における１以上の疾患症状を緩和するのに有効な量で投与されて、臨床的に測定可能な程度から、そのような症状（複数可）の寛解をもたらす、またはその進行を妨げる。特定の疾患症状を緩和するのに有効な治療薬の量（“治療的有効量”とも称される）は、患者の病状、年齢および体重、ならびに患者に望ましい応答を誘導する薬剤の能力などの因子によって変わり得る。疾患症状が緩和されてかどうかは、症状の重篤度または進行状況を評価するために、医師または他の熟練の医療従事者により一般的に用いられる臨床測定によって評価され得る。本発明の一態様（例えば、処置方法または製品）は、すべての患者における標的疾患症状（複数可）を緩和するのに有効ではないかもしれないが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン＆ホイットニーのＵ検定、クラスカル−ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール−タプストラ検定およびウィルコクソン検定などの、当技術分野で公知の任意の統計的検定によって決定される、統計的に有意な数の患者における標的疾患症状（複数可）を緩和すべきである。
【００７４】
“保存的修飾”または“保存的置換”とは、タンパク質内のアミノ酸を、類似の特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖の立体配座および剛性など）を有する他のアミノ酸に置換することを意味し、タンパク質の生物活性を変えることなく頻繁に改変を加えることができる。当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が実質的に生物活性を変化させないことを認識する（例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)を参照のこと）。加えて、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を阻害する可能性が低い。
【００７５】
“有効量”には、疾患の症状または兆候を改善または予防するのに十分な量が含まれる。有効量とはまた、診断を許可または遂行するのに十分な量も意味する。特定の患者または動物対象に対する有効量は、処置されている病状、患者の全体的な健康状態、投与の経路および用量、ならびに副作用の重篤度などの要因によって異なり得る。有効量は、重大な副作用または毒性作用を回避する最大用量または投与プロトコルであり得る。
【００７６】
“外因性（Exogenous）”とは、状況に応じて、生物、細胞または人体の外部で生成される物質を意味する。“内因性（Endogenous）”とは、状況に応じて、細胞、生物または人体内で生成される物質を意味する。
【００７７】
“相同性”とは、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を意味する。分子は、比較されるべき配列の両方におけるこの位置が、同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットにより占有されているとき、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンにより占有されているとき、１つの位置で相同とみなされる。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列に共有される一致または相同な位置の数を、比較されるべき全ての位置の数で割り、それに１００を乗じた値の関数である。例えば、最適にアライメントされた場合に、２つの配列において１０個のうち６個の位置が一致するか、相同であれば、該２つの配列は６０％相同である。一般的に、２つの配列が最大の相同性％を与えるようにアライメントされるとき、比較がなされる。
【００７８】
“免疫チェックポイント分子”としては、刺激性免疫チェックポイント分子および阻害性免疫チェックポイント分子が挙げられ、例示分子としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡなどが挙げられる。
【００７９】
本明細書で用いる表現“細胞”、“細胞株”および“細胞培養物”は互換的に用いられ、そのような表示は全てそれらの子孫を含む。従って、用語“形質転換体”および“形質転換細胞”は、継代数に関係なく、それに由来する初代対象細胞および培養物を含む。また、意図的または意図的でない変異のため、すべての子孫がＤＮＡ含有量の面で正確に同一ではない可能性があることも理解されるべきである。元々の形質転換細胞と同じ機能活性または生物活性を有する変異体子孫が、スクリーニングによって得られ、本発明に包含されるべきである。これと異なるものを指すことが意図されている場合、そのことが文脈から明らかに理解され得るものである。
【００８０】
本明細書で用いる“ポリメラーゼ連鎖反応”または“ＰＣＲ”とは、核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの少量の特定のセグメントを、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載の方法により増幅させる、方法または技術を意味する。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように、目的の領域の末端またはそれを超えての配列情報が必要とされる。これらのプライマーの配列は、増幅される鋳型の反対の鎖と同一またはそれに類似していてよい。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅される材料の末端と一致している。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡ由来の特定のＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などを増幅するために用いられ得る（一般的に、Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)を参照のこと）。本発明で用いられるＰＣＲは、核酸試験サンプルを増幅するためのポリメラーゼ反応法の１つの例であると考えられるが、それだけではない。この方法は、特定の核酸セグメントを増幅または産生するためのプライマーおよび核酸ポリメラーゼとしての既知の核酸の使用を含む。
【００８１】
“任意の”または“必要に応じて”とは、それに続く事象または状況が発生する可能性があるが、必ずしもそうとは限らないことを意味し、本明細書中、事象または状況が発生する場合または発生しない場合が含まれる。例えば、“必要に応じて、１−３個の抗体重鎖可変領域を含む”とは、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が存在し得るが、必ずしも存在するとは限らないことを意味する。
【００８２】
“医薬組成物”とは、本発明の１以上の化合物またはその生理的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグおよび他の化合物を含む混合物を意味し、該化合物は、例えば生理的／薬学的に許容される担体（複数可）および賦形剤（複数可）である。医薬組成物は、生物による投与を促進し、有効成分の吸収を促進し、それにより生物学的効果を発揮することを目的としている。
【実施例】
【００８３】
実施例および試験例
以下、実施例を参照して本発明をさらに説明する。しなしながら、本発明の範囲はこれに限定されない。
【００８４】
本発明の実施例において、特定の条件が記載されていないとき、その実験は、一般的に、従来の条件下で、または材料もしくは製品の製造者によって提案された条件下で、実施される。Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Modern Molecular Biology Methods, Ausubel et al., Greene Publishing Association, Wiley Interscience, NY. を参照のこと。試薬の供給元が具体的に記載されていないとき、該試薬は市販されている常套の試薬である。
【００８５】
実施例
実施例１：融合タンパク質ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップのクローニングおよび発現
ＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメイン（配列番号１３の完全長または切断型）は、融合タンパク質の免疫調節分子の一部として用いられ、ＰＤ−Ｌ１抗体は、融合タンパク質のターゲティング部分として用いられて、ＰＤ−Ｌ１抗体／ＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメイン融合タンパク質（ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップ）を形成する。研究の結果、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインの切断型が比較的安定していること、とりわけ該切断型が、そのＮ末端の２６個未満のアミノ酸の欠失、好ましくは１４−２６アミノ酸の欠失、より好ましくは、１４−２１個の連続アミノ酸の欠失；より好ましくは、１４、１９または２１個の連続アミノ酸の欠失を含み、それがより高い発現および安定な構造を示すことを見い出した。本発明のＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメインおよびその短縮型の限定されない例の配列は、以下の通りである：
ＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメインの配列：ＥＣＤ（１−１３６）（配列番号１３）：
【化７】
2020519289.tif 000010
Ｎ末端の１９個の連続アミノ酸の欠失を伴う、切断型ＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメインの配列：ＥＣＤ（２０−１３６）（配列番号１４）：
【化８】
2020519289.tif 000011
Ｎ末端の２１個の連続アミノ酸の欠失を伴う、切断型ＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメインの配列：ＥＣＤ（２２−１３６）（配列番号１５）：
【化９】
2020519289.tif 000012
Ｎ末端の１４個の連続アミノ酸の欠失を伴う、切断型ＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメインの配列：ＥＣＤ（１５−１３６）（配列番号１６）：
【化１０】
2020519289.tif 000013
【００８６】
本発明のＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖Ｃ末端アミノ酸は、リンカー（Ｇ４Ｓ）ｘＧにより、相同組換え技術によって長さの変わっているＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインに連結され、そして、軽鎖と共に、２９３発現系によって通常発現され、得られた融合タンパク質を表２に示す：
【００８７】
【表２】
2020519289.tif 000014
註記：Ａｂは、本発明のＰＤ−Ｌ１抗体を示し、配列の説明におけるＥＣＤ（ｎ−１３６）は、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインの全長または切断型を示し、ｎは、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインの切断後のアミノ酸の開始番号を示す。本発明の融合タンパク質の構造を図１に示す；Ｎ１９Ａは、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインの位置１９のアミノ酸がＡに変異されたことを示す。
【００８８】
ＰＤ−Ｌ１抗体をコードするヌクレオチド配列、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列、およびリンカータンパク質フラグメント（（Ｇ４Ｓ）ｘＧ）のヌクレオチド配列は、当技術分野の従来技術により得られる。ＰＤ−Ｌ１抗体のＣ末端ヌクレオチドは、相同組換え技術により、リンカータンパク質を介して、異なる長さのＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインのＮ末端ヌクレオチドに連結され、次いで、Ｐｈｒ−ＢｓｍｂＩベクター中にクローン化された。組換えＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップを、実施例２に記載のように、２９３細胞で発現させ精製した。精製されたタンパク質を、以下の実施例の実験に用い得る。
【００８９】
実施例２：ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップ融合タンパク質の精製
細胞培養培地を高速で遠心分離し、上清を集め、精製の第一段階を親和性クロマトグラフィーにより行った。クロマトグラフ媒体は、プロテインＡまたはＧＥのMabselectなどのＦｃと相互作用する誘導フィラーである。平衡化緩衝液は、１×ＰＢＳ（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）であった。５カラム容量を平衡化後、細胞上清を結合のためにロードし、試料が１分以上カラム上に残るように、流速をコントロールした。試料を負荷後、カラムを、Ａ２８０読み取り値がベースラインまで減少するまで１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。その後、カラムを０．１Ｍ グリシン（ｐＨ３．０）溶出緩衝液で洗浄し、溶出ピークをＡ２８０紫外線吸収ピークに従って集め、集めた溶出サンプルを１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）で中和した。
【００９０】
中和した溶出サンプルを限外濾過により濃縮し、その後、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。緩衝液は１×ＰＢＳであり、カラムはＸＫ２６/６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＧＥ）であった。流速は４ｍｌ／分にコントロールし、負荷量は５ｍｌ未満であり、そしてＡ２８０紫外線吸収により、標的タンパク質ピークを集めた。取得されたタンパク質の純度は、９５%以上であり、これはＳＥＣ−ＨＰＬＣによって同定され、ＬＣ−ＭＳによって確認された。確認されたサンプルを、使用のために分注した。ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップを得た。
【００９１】
本発明のパフォーマンスおよび利点は、以下に示す生化学的試験方法によって検証される。
【００９２】
インビトロでの生物活性の評価
試験例１：インビトロでのＴＧＦ−β１に結合するＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップのＥＬＩＳＡ検出
検出プロセスは以下の通りである：
ａ．９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍｌ濃度のヒトＴＧＦ−β１（８９１５ＬＣ、ＣＳＴ）を１００μｌ／ウェルで用いて、４℃で一晩コーティングした。
ｂ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、２５０μｌの５％ミルクＰＢＳを添加して３７℃で２時間ブロッキングした。
ｃ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップの段階希釈、ＴＧＦ−βトラップおよび陽性対照を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
ｄ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。
ｅ．１００μｌの抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰ（１：４０００）を各ウェルに添加して、３７℃で４０分間インキュベートした。
ｆ．１００μｌのＴＭＢを各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートし、反応を１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させた。
ｇ．４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、そしてデータをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５で分析した。
【００９３】
インビトロでの融合タンパク質のヒトＴＧＦ−β１への結合の結果を図２および３に示す。ＥＬＩＳＡは、表２の融合タンパク質１が、ヒトＴＧＦ−β１への結合活性を保持しないことを示した。質量分析は、融合タンパク質１（すなわち、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメインの非切断型（１−１３６））が不安定であり、そして、壊れやすく、重鎖ＴＧＦ−βＲＩＩになりやすく、かつ陽性対照も同じ欠陥を有することを示した。ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインのＮ末端切断型を含む融合タンパク質、例えば、融合タンパク質７、９、１０、１２−１５は、ヒトＴＧＦ−β１へ特異的に結合する。
【００９４】
試験例２：インビトロでのＰＤ−Ｌ１に結合するＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップのＥＬＩＳＡ検出
検出に用いた抗原：ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（配列番号１７）
【化１１】
2020519289.tif 000015
【００９５】
検出プロセスは以下の通りである：
ａ．９６ウェル王レートを、５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（配列番号１７）を１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩コーティングした。
ｂ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、２５０μｌの５％ミルクＰＢＳを添加して３７℃で２時間ブロッキングした。
ｃ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップの段階希釈、陽性対照としてのＰＤ−Ｌ１抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
ｄ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。
ｅ．１００μｌの抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰ（１：４０００）を各ウェルに添加して、３７℃で４０分間インキュベートした。
ｆ．１００μｌのＴＭＢを各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートし、反応を１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させた。
ｇ．４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、そしてデータをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５で分析した。
【００９６】
インビトロでの、本発明の融合タンパク質のヒトＰＤ−Ｌ１への結合の結果を、図４に示す。ＥＬＩＳＡは、すべての融合タンパク質が、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合活性を保持していることを示した。
【００９７】
試験例３：インビトロでのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のブロッキング検出
１．試験目的：
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路上のＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップのブロッキング効果を調べるために、細胞ベースの抗体のブロッキング試験を、それぞれPromagaにより構築されたヒトＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１受容体分子を担持する細胞上で実施した。
【００９８】
２．試験サンプル
（１）ＰＤ−Ｌ１抗体：配列番号１１、配列番号１２；
（２）対照１（２０Ｔ−Ｆｃ）：ＥＣＤ（２０−１３６）−Ｆｃ、切断型ＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメインフラグメントＥＣＤ（２０−１３６）およびＦｃを含む融合タンパク質
配列は以下の通りである（配列番号１８）：
【化１２】
2020519289.tif 000016
（３）対照２（２２Ｔ−Ｆｃ）：ＥＣＤ（２２−１３６）−Ｆｃ、切断型ＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメインフラグメントＥＣＤ（２２−１３６）およびＦｃを含む融合タンパク質
配列は以下の通りである（配列番号１９）：
【化１３】
2020519289.tif 000017
（４）融合タンパク質９、融合タンパク質１５；
（５）ヒトＩｇＧ：ブランク対照、プロテインＡなどの常套の親和性クロマトグラフィー法を用いた精製により混合型正常ヒト血清から得られたヒト免疫グロブリン；
（６）陽性対照（Ｍ７８２４、引用特許文献ＷＯ２０１５１１８１７５により調製）：ＰＤ−Ｌ１抗体／ＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメイン融合タンパク質；
ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖アミノ酸配列（配列番号２０）：
【化１４】
2020519289.tif 000018
ＰＤ−Ｌ１抗体重鎖／ＴＧＦ−βＲＩＩ細胞外ドメイン（１−１３６）のＨ鎖アミノ酸配列（配列番号２１）：
【化１５】
2020519289.tif 000019
【００９９】
３．試験方法
ＣＨＯ／ＰＤ−Ｌ１細胞（ＣＳ１８７１０８、Promega）を消化し、Ｆ−１２栄養素混合物（Ｈａｍ）完全培地に再懸濁させた。細胞密度を、細胞数の結果に応じて完全培地を用いて、４×１０５／ｍＬに調整した。細胞懸濁液をローディングタンクに入れ、マルチチャンネルピペットを用いて１００μＬ／ウェルを９６ウェルプレートに添加し、そして３７℃、５％ ＣＯ２ のインキュベーターで、２０から２４時間インキュベートした；Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ−１（ＣＳ１８７１０２、Promega）細胞懸濁液を翌日に調製し、細胞数の結果に従ってアッセイ培地を用いて細胞を再懸濁させて、細胞密度を１．２５×１０６／ｍＬに調整した。ＣＨＯ／ＰＤ−Ｌ１ 細胞を含む細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、マルチチャンネルピペットを用いてウェル毎に９５μＬの培養液を取り除き、勾配希釈した融合タンパク質、ＰＤ−Ｌ１抗体および陽性対照（Ｍ７８２４）をそれぞれ４０μＬ／ウェル添加した。その後、Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ−１細胞懸濁液をローディングタンクに移し、細胞培養プレートに４０μＬ／ウェルで加え、３７℃、５％ ＣＯ２で５から６時間インキュベートした。タンパク質とのインキュベートの間、Bio-Glo（商標）試薬を取りだし、室温に戻しておいた。細胞培養プレートを取り出し、室温で５から１０分間静置した。その後、４０μＬのＢｉｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬を各ウェルに添加し、安全キャビネットで５から１０分間インキュベートし、そして多機能マイクロプレートリーダーを用いて化学発光シグナル値を読み取った。
【０１００】
４．結果
図５に示す通り、陽性対照分子と同様に、本発明の融合タンパク質９は、ＰＤ−１を発現するＪｕｒｋａｔ細胞のＣＨＯ／ＰＤ−Ｌ１細胞への結合を効果的にブロックすることができ、薬物濃度に沿って用量依存的に効果を示した。融合タンパク質１５は、融合タンパク質９と同程度のブロッキング能を有する。
【０１０１】
試験例４：Ｂｉａｃｏｒｅによるインビトロでの結合親和性および結合動態検出
試験分子のヒトもしくはマウスＴＧＦ−β１またはヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質への親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）により決定した。実験手順は以下の通りである：
【０１０２】
ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップの特定量は、プロテインＡチップを用いて捕捉され、その後、ヒトもしくはマウスＴＧＦ−β１（８９１５ＬＣ、ＣＳＴ）またはヒトＰＤ−Ｌ１（Sino Biological）をチップ表面に流した。反応シグナルをＢｉａｃｏｒｅを用いてリアルタイムで検出し、結合および解離曲線を得た。次いで、バイオチップを洗浄し、グリシン−塩酸（ｐＨ１．５、ＧＥ）で再生させた。実験で用いた緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ）であった。実験データは、BIAevaluation バージョン ４．１ ソフトウェア（ＧＥ）を用いて（１：１）ラングミュアモデルに適合させて、表３に示される親和性値を得た。
【０１０３】
【表３】
2020519289.tif 000020
【０１０４】
融合タンパク質結合活性を表３に示す。結果は、本発明の融合タンパク質９および１５が、ヒト、マウスＴＧＦ−β１およびヒトＰＤ−Ｌ１に対して極めて高い親和性を有することを示す。
【０１０５】
試験例５：ＳＭＡＤ３レポーター遺伝子阻害アッセイ
１．試験目的：
この試験では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むＳｍａｄ３結合エレメント（ＳＢＥ）をＨｅｐＧ２細胞中で発現させて、ＴＧＦ−β誘導Ｓｍａｄ３活性化に対するＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップの阻害効果を調べ、インビトロでのＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップの活性をＩＣ５０値により評価した。
【０１０６】
２．試験サンプル：
融合タンパク質９、陽性対照（Ｍ７８２４）
【０１０７】
３．試験プロセス
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＭＥＭ完全培地（GE、SH30243.01）中で培養し、３日毎に継代した。試験の第１日目に、１ウェル当たり２５，０００細胞を９６ウェルプレート（Corning、3903）に接種し、３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間培養した。翌日、細胞培養プレートの培地を廃棄し、１００ｎｇの３ＴＰ−Ｌｕｘプラスミドをウェル毎にトランスフェクトした。細胞をさらに、３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間培養した。試験サンプルの添加前６時間に、９６ウェルプレートの完全培地を捨て、８０μＬの不完全培地（ＭＥＭ ＋ ０．５％ ＦＢＳ）を各ウェルに添加した。６時間後、不完全培地（終濃度２ｎｇ／ｍＬ）で調製した１０μＬのヒトＴＧＦ−β１（R&D、240-B-010）溶液および１０μＬの試験サンプル（終濃度５００、５０、５、０．５、０．０５、０．００５、０．０００５および０ｎＭ）を添加し、ヒトＴＧＦ−β１溶媒を対照として用いて、細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２でさらに１８時間培養した。次いで、１００μＬの調製されたルシフェラーゼ基質ONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（promega、E6110）を各ウェルに添加して、室温で１０分間、暗所にてインキュベートした後、発光シグナル値を、Victor3 マルチプレートリーダー（Perkin Elmer）を用いて読み取った。試験サンプルのＩＣ５０値を、データソフトウェア・グラフパッドプリズム ５．０を用いて計算することにより得た。
【０１０８】
図６は、融合タンパク質９が、用量依存的にＴＧＦβ誘導性ｐＳＭＡＤ３活性を阻害することを示し、陽性対照Ｍ７８２４と同等の有効性およびＩＣ５０（最大活性の５０％を阻害するのに要される濃度）を有した。ＰＤ−Ｌ１抗体の試験結果は、阻害物効果がないことを示した（ＩＣ５０＞５００ｎＭ）。
【０１０９】
試験例６：インビトロでの、ツベルクリン（ＴＢ）刺激による、ＰＢＭＣによるＩＦＮγ分泌の検出
１．試験目的
ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップによるＴリンパ球の活性を調べるために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取し、精製して、ツベルクリン（ＴＢ）で刺激した後、５日間、ＩＦＮγの分泌を検出した。
【０１１０】
２．試験サンプル
（１）ヒトＩｇＧ；（２）ＰＤ−Ｌ１抗体；（３）融合タンパク質９；（４）対照１（20T-Fc）：ＥＣＤ（２０−１３６）−Ｆｃ；（５）ＰＤ−Ｌ１抗体＋対照１（20T-Fc）。
【０１１１】
３．試験プロセス：
１５ｍｌの精製した新鮮なＰＢＭＣ、約３×１０７細胞、および２０μＬのツベルクリンをそれに添加し、インキュベーター中、３７℃、５％ ＣＯ２で５日間インキュベートした。６日目に、培養細胞を集め、遠心し、ＰＢＳで１回洗浄して、新鮮な培地に密度１×１０６細胞／ｍｌに調整して再懸濁させ、９０μｌの再懸濁細胞を９６ウェルプレートに添加した。１０μＬ／ウェルの異なる濃度の抗体を上記９６ウェル細胞培養プレートの対応するウェルに別々に添加し、１０μｌ ＰＢＳを対照群およびブランク群にそれぞれ添加した。その後、細胞培養プレートを、インキュベーター内で３７℃、５％ ＣＯ２で３日間インキュベートした。細胞培養プレートを取りだし、遠心（４０００ｒｐｍ、１０分）後に各ウェルから上清を採取した。１０倍希釈後、ＩＦＮ−γの分泌をＥＬＩＳＡ（ヒトＩＦＮ−γ検出キット、Xinbosheng、EHC 102g.96）により検出した。具体的な操作は、試薬の指示書に従った。図面に示す通り、ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップ融合タンパク質サンプルは、活性化Ｔリンパ球によるサイトカインＩＦＮ−γの分泌を増強することができ、薬物濃度用量効果を有した。
【０１１２】
【表４】
2020519289.tif 000021
【０１１３】
４．結果
図７および表４に示す通り、融合タンパク質９は、活性化Ｔリンパ球を増強して、用量依存的にサイトカインＩＦＮ−γ分泌を増大することができ、そしてＰＤ−Ｌ１抗体および２０Ｔ−ＦＣよりも強い活性を有した。
【０１１４】
薬物動態学評価
試験例７：
３匹のＳＤラット（メス）を、Jiesijie Experimental Animal Co., Ltdから購入し、１２／１２−時間の明暗サイクル（温度は２４±３℃、相対湿度は５０−６０％）に維持した。該ラットを、水および食餌を自由に摂取できるようにした。実験の日に、ＳＤラットに、６ｍｇ／ｋｇの用量で、かつ５ｍｌ／ｋｇの注射量で尾静脈に融合タンパク質を注射した。
【０１１５】
投与後、１５分、７時間（１日目の）、２４時間（２日目）、３日目、４日目、６日目、８日目、１０日目および１５日目に、ラットの眼底静脈から２００μｌの血液（１００μｌの血清に相当）を採血した。血液サンプルを室温で３０分間置いて凝集させ、その後、１００００ｇで１０分間、４℃にて遠心した。上清を採取し、直ちに−８０℃で保存した。血清中の融合タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１１６】
測定プロセスは以下の通りである。
ａ．９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌ濃度のヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓを１００μｌ／ウェル用いて、４℃で一晩コーティングした。
ｂ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで４回洗浄し、２５０μｌの５％ミルクＰＢＳを添加して３７℃で３時間ブロッキングした。
ｃ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで４回洗浄し、勾配希釈した血清サンプル１００μｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。融合タンパク質９を陽性対照として用いた。
ｄ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで５回洗浄した。
ｅ．１００μｌ／ウェルのビオチニル化抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体（R&D）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
ｆ．２５０μｌの１×ＰＢＳＴで５回洗浄した。
ｇ．１００μｌ／ウェルのＴＭＢを添加し、室温で１０分間インキュベートし、反応を１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させた。
ｈ．４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、そしてデータをGraphpad Prism5で分析した。
【０１１７】
【表５】
2020519289.tif 000022
【０１１８】
ＰＫ分析の結果は、ラットにおける本発明の融合タンパク質９の半減期が約２３６時間（９．８日）であることを示した（表５を参照のこと）。
【０１１９】
インビボでの生物活性評価
試験例８：ヒト乳癌 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のマウス皮下異種移植に対するＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップの効果
この試験に用いたマウス系統は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤメスマウス（Cavens）であった。この試験に用いたヒト末梢血単核細胞を、新たに採血した血液から抽出し、その抽出法は以下の通りであった：ヘパリン抗凝固処理静脈血を、同じ容量の２％ＦＢＳを含有するＰＢＳと混合し、混合後、２５ｍｌの希釈血液を１５ｍｌのリンパ球分離溶液を含む遠心管にゆっくり添加し、１２００ｇで１０分間、室温で遠心した。リンパ球層をピペットで別の遠心管に移し、細胞をＰＢＳで洗浄して、３００ｇで８分間、室温にて遠心した。１回繰り返した後、細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁させ、細胞を、ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、４０ｎｇ/ｍｌ）であらかじめコーティングした６ウェルプレートに２×１０６細胞／ウェル（２ｍｌ）で添加して、その後、３７℃のインキュベーターに４日間入れた。
【０１２０】
試験サンプル：
（１）ブランク対照：ＰＢＳ；（２）融合タンパク質９−４．８ｍｐｋ；（３）融合タンパク質９−２４ｍｐｋ；（４）ＰＤ−Ｌ１抗体−４ｍｐｋ；（５）ＰＤ−Ｌ１抗体−２０ｍｐｋ；（６）ＰＤ−Ｌ１抗体−４ｍｐｋ ＋対照１(20T-Fc)−２．１４ｍｐｋ；（７）対照１（20T-Fc）−２．１４ｍｐｋ。
【０１２１】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁させ、等量のマトリゲルと混合し、１００μｌ（２．３×１０６）を、ＮＯＤ/ＳＣＩＤマウスの右側腹部に皮下接種した。１１日後、特大のまたは小さい腫瘍を担持する動物を除き、マウスを無作為にグループ分けして、各グループに９匹の動物とした。５×１０５ の刺激したＰＢＭＣ（６０μｌ）を腫瘍組織に注射し、残りのＰＢＭＣを刺激することなくさらに培養した。１週間後、５ × １０６ ＰＢＭＣ（１００μｌ）を、初回の注射として、腫瘍を有するマウスに腹腔内注射した。２回半ラウンドの試験期間を通して、合計５回のＰＢＭＣ注射投与を実施した。最初の腫瘍内注射の日に、腹腔内投与を実施し、１週間に３回、合計１４回投与した。投与レジメンを表６に示した。腫瘍体積および重量を、週に２回測定した。試験結果を表７に示した。
【０１２２】
【表６】
2020519289.tif 000023
【０１２３】
【表７】
2020519289.tif 000024
註記：０日目：初回投与時；スチューデントのｔ検定により、ＰＢＳと比較して、*p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001。
【０１２４】
抗体融合タンパク質９（４．８、２４ｍｇ／ｋｇ）は、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のマウス皮下異種移植片の増殖を顕著に阻害することができるという結果を、図８に示した。高用量と低用量の間には用量依存的な関係があり、それぞれ等モル用量の対照薬物ＰＤ−Ｌ１抗体（４、２０ｍｇ／ｋｇ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ調節分子２０Ｔ−ＦＣ（２．１４ｍｇ／ｋｇ）およびその組合せグループ（ＰＤ−Ｌ１抗体−４ｍｇ／ｋｇ＋２０ Ｔ−ＦＣ −２．１４ｍｇ／ｋｇ）よりも優れていた。各用量の融合タンパク質９は、ＰＤ−Ｌ１抗体−２０ｍｐｋと比較したとき、投与後１４日目以降、理想的な抗腫瘍効果を維持し、高用量の融合タンパク質９は、明らかに有益であった（ｐ＜０．０５）。投与後２５日目に、各抗体の抗腫瘍効果は最適レベルに達した。融合タンパク質９とＰＤ−Ｌ１抗体との組合せグループ（高用量および低用量の両方で）により達成される阻害率は、それぞれ３７．２４％、５２．３８％、３０．２４％、２８．０１％および３１．３８％であった。投与後３２日目に、融合タンパク質９の抗腫瘍効果は未だ極めて顕著であった。低用量群および高用量後の％ＴＧＩは、それぞれ３６．６８％および５０．７６％であり、腫瘍体積は、対照群と比較したとき統計学的に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。 
【０１２５】
試験例９：ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−βトラップの物理的安定性
この試験例を用いて、融合タンパク質９および融合タンパク質１５の安定性を試験した。
【０１２６】
ＤＳＣ（示差走査熱量測定）を用いて、種々の抗体の熱安定性を試験し、種々の緩衝系における安定性を比較した。緩衝系としては、例えば１０ｍＭ アセテート／１３５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）および１０ｍＭ アセテート／９％トレハロース（ｐＨ５．５）が挙げられる。
【０１２７】
サンプルを対応する緩衝液に溶解し、そして濃度を約５０ｍｇ／ｍｌに制御した。試験を、ＭｉｃｒｏＣａｌ＊ ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（Malvern）により実施した。試験前に、各サンプルおよびブランク緩衝液を、１から２分間、真空脱ガス装置を用いて、脱気した。プレートの各ウェルに４００μｌのサンプルまたはブランク緩衝液を添加した（ローディング量は３００μｌ）。最後に、二対のウェルプレートに１４％デコン９０およびｄｄＨ２Ｏをそれぞれ添加し、洗浄のための準備をした。サンプルをプレートにローディングし、その後、プレートをプレートをプラスチックカバーで密封した。温度２５℃でスキャン（走査）を開始し、１００℃で終了した。スキャン速度は６０℃／時である。融合タンパク質９および融合タンパク質１５の両方がこれら２つの試験系で良好な熱安定性を示すことを示唆する結果を、表８に示す。
【０１２８】
【表８】
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【０１２９】
TＳＥＣ−ＨＰＬＣにより純度をモニタリングして特定の濃度での周期的な安定性を調査し、その例示的条件は、例えば、サンプルの濃度を約５０ｍｇ／ｍｌに制御した。１０ｍＭ アセテート／１３５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）における種々の抗体の安定性を、５サイクルの−８０℃での凍結融解および１カ月間の４０℃での保存の条件下で比較した。Ｘｂｒｉｄｇｅタンパク質ＢＥＨ ＳＥＣ ２００Ａ （Waters）ＨＰＬＣカラムを検出のために用いた。結果を以下の表９に示し、これら２つの融合タンパク質は良好な安定性を示した。
【０１３０】
【表９】
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【０１３１】
試験例１０：融合タンパク質の化学的安定性
脱アミド化は、後の段階で抗体の安定性に影響を与え得る一般的な化学修飾である。とりわけ、ＣＤＲ領域のアミノ酸の過剰脱アミド化は避けなければならないか、またはこれらの領域における変異を減らすことが好ましい。１６００μｇの試験すべき抗体を、２００μｌの１０ｍＭ アセテート／１３５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）中に溶解させ、４０℃のインキュベーター中に置いた。酵素加水分解アッセイのために、０日目、１４日目および２８日目にサンプル採取した。異なる時点で採取した１００μｇの各サンプルを、１００μｌの０．２Ｍ Ｈｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ Ｇｕａ−ＨＣｌ溶液、ｐＨ６．０に溶解させた。３μｌの０．１ｇ／ｍＬ ＤＴＴを添加し、次いで、サンプルを、５０℃の水浴中、１時間、インキュベートした。その後、サンプルを、０．０２Ｍ Ｈｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）を用いて２回限外濾液し、３μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬ トリプシンを添加することにより、３７℃で一晩、水浴中で消化した。脱アミド化修飾をAgilent 6530 Q-TOF LC-MSを用いて試験し、結果を以下の表１０に示す。
【０１３２】
【表１０】
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註記：Ｎは検出可能な修飾アスパラギンを表し、数字はＮ末端から軽鎖または重鎖の位置を表す。パーセント含有量は、ＬＣ−ＭＳによって検出された脱アミド化修飾の、その部位のすべてのペプチドのシグナルに対する比率を表す。
【０１３３】
質量分析の結果は、２つの融合タンパク質が明らかに脱アミド化修飾部位を有していないことを示し、このことは、融合タンパク質が良好な化学的安定性を有することを示唆した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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